Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на терапевтический патоморфоз опухоли в эксперименте

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

вЛИЯНИЕ НИЗКИх ТЕРА1

концентраций озонирова физиологического раствора на терапевтический патоморфо; опухоли в эксперименте

УДК 616.006:612.014.464—092 Поступила 28.06.2010 г.

А.В. Алясова, д.м.н., профессор кафедры онкологии ФПКВ;

К.Н. Конторщикова, д.б.н., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики ФПКВ;

И.Г. Терентьев, д.м.н., зав. кафедрой онкологии ФПКВ, проректор по научной работе

Нижегородской государственной медицинской академии;

И.П. Иванова, д.б.н., зав. научной проблемной лабораторией физико-химических исследований

НИИ прикладной и фундаментальной медицины;

С.С. Кузнецов, д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии;

А.И. Сазанов, аспирант кафедры клинической лабораторной диагностики ФПКВ

Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород

Цель исследования — оценить влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на лечебный патоморфоз опухоли в экспериментальных условиях.

Материалы и методы. Исследование выполнено на лабораторных животных — белых нелинейных крысах-самках (75 особей) массой 250±10 г. Экспериментальную модель неоплазии создавали перевивкой штамма рака молочной железы РМК-1 подкожно в область правой подмышечной впадины. Животных включали в эксперимент на 45-е сутки после перевивки опухоли, объем которой к этому времени достигал 6—8 см3. На 11-е сутки после начала эксперимента под эфирным наркозом осуществляли декапитацию животных и забор ткани опухоли. Озонированный физиологический раствор получали барботажем 0,9% раствора NaCl озоно-кислородной смесью. Гистологическое исследование опухолевой ткани осуществляли общепринятым способом. Биохимические исследования включали анализ индуцированной биохемилюминесценции и измерение уровней продуктов липопероксидации гомогенатов ткани опухоли.

Результаты. Сочетанное воздействие низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора и док-сорубицина оказывало на опухолевую ткань наиболее выраженный деструктивный эффект. Использование озонированного физиологического раствора потенцировало противоопухолевую активность доксорубицина, что проявлялось в статистически значимо более выраженном угнетении митотической активности опухолевых клеток и в снижении числа их жизнеспособных элементов, тем самым вызывая более глубокие проявления терапевтического патоморфоза.

Ключевые слова: озонированный физиологический раствор, рак молочной железы, терапевтический патоморфоз.

English

Influence of the ozonized physiologic salt solution low therapeutic concentrations on a tumor therapeutic pathomorphosis in experiment

A.V. Alyasova, M.D., professor of the PhQIF oncology chair;

K.N. Kontorshickova, B.D., head of the PhQIF clinical laboratory diagnosis chair;

I.G. Terentiev, M.D., head of the PhQIF oncology chair; vice-rector on scientific work of the Nizhny Novgorod state medical academy;

I.P. Ivanova, B.D., head of the applied and fundamental medicine SRI physicochemical investigation scientific problem laboratory;

S.S. Kuznetsov, M.D., professor of a pathologic anatomy chair;

A.I. Sazanov, post-graduate of the PhQIF clinical laboratory diagnosis chair

Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod

Для контактов: Алясова Анна Валерьевна, тел. раб. 8(831)433-31-09, тел. моб. +7 920-252-42-48; e-mail: alyasovaav68@mail.ru.

Aim of investigation is assessment of the ozonized physiologic salt solution low therapeutic concentration influence on a tumor medical pathomorphosis in experimental conditions.

Materials and methods. An investigation is made on laboratory animals — white nonlinear female-rats (75 specimen) with a mass of 250±10g. An experimental model of neoplasia was created by twisting of the RMC-1 mammary gland cancer strain subcutaneously into the right axillary cavity area. The animals were included into experiment on the 45 days after a tumor twisting, a volume of which at that moment was 6—8 cm3. A decapitation of animals and taking of a tumor tissue were made on the 11 days after the experiment beginning under an ether anesthesia. The ozonized physiologic salt solution was received by barbotage of a NaCl solution 0.9% with an ozonooxygenous mixture. A histological investigation of a tumoral tissue was accomplished by a generally accepted method. An analysis of induced biochemiluminescence and a measurement of the tumor tissue homogenate lipoperoxidation product levels were included into biochemical investigations.

Results. A combined influence of the ozonized physiologic salt solution low therapeutic concentrations and a doxorubicin more expressively and destructively effected a tumoral tissue. A use of ozonized physiologic salt solution potentiated a doxorubicin antitumoral activity, which was manifested in a statistically more expressed depression of the tumoral cell mitotic activity and a decrease of their viable elements, causing the more profound manifestations of a therapeutic pathomorphosis.

Key words: ozonized physiologic salt solution, mammary gland cancer, therapeutic pathomorphosis.

Для лечения злокачественных опухолей в эксперименте и клинике по-прежнему применяют три основных способа воздействия: хирургические вмешательства, лучевую терапию и химиотерапию [1]. Однако использование этих методов не позволяет получить полной эрадикации малигнизированных клеток. Кроме того, резистентность злокачественных клеток к противоопухолевым препаратам затрудняет лечение и значительно ухудшает прогноз. Все это обусловило разработку методов потенцирования действия противоопухолевых агентов.

С целью повышения эффективности химиотерапии разработаны различные медикаментозные (использование таргетных препаратов [2], интерферонов [3], нутритивной терапии [4]) и немедикаментозные методы (гипертермия [5], рефлексотерапия [6]), в условиях эксперимента изучается применение ультразвукового воздействия. Однако сочетанное воздействие цитоста-тиков и низких физиологических концентраций озонированного физиологического раствора на опухолевую ткань остается недостаточно изученным.

Цель исследования — оценить влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на лечебный патоморфоз опухоли в экспериментальных условиях.

Материалы и методы. Исследование выполнено на лабораторных животных — белых нелинейных крысах-самках (75 особей) массой 250±10 г. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями нормативных правовых актов, регламентирующих выполнение исследований по безопасности и эффективности фармакологических веществ в РФ (Приказ МЗ РФ «Об утверждении правил лабораторной практики» №267 от 19.06.2003 г.), и международных правил правовых и этических норм использования животных. Животных содержали в полипропиленовых клетках размером 32х22х9,5 см, покрытых железной проволочной сеткой с расстоянием между прутьями 0,75 см. Крысы получали корм и водопроводную воду без ограничений. Модель неоплазии создавали перевивкой штамма рака молочной железы РМК-1 подкожно в область правой подмышечной впадины. РМК-1 получен В.П. Коноплевым и Н.Д. Лаговой (1960) от спонтанной опухоли. Перевива-

ется на беспородных крыс. Гистологически — это альвеолярный рак молочной железы [7]. Штамм опухоли приобретен в Банке опухолевых штаммов РОНЦ им.

Н.Н. Блохина РАМН (Москва).

Животных включали в эксперимент на 45-е сутки после перевивки опухоли, объем которой к этому времени достигал 6—8 см3. Животные были разделены на 5 групп по 15 особей в каждой:

1-я группа — крысы с неоплазией, не подвергавшиеся каким-либо лечебным воздействиям;

2-я группа — крысы с неоплазией, получавшие в качестве лечебного средства химиопрепарат доксоруби-цин в дозе 0,04 мг на особь через день, всего 5 процедур, препарат вводили внутрибрюшинно;

3-я группа — крысы с неоплазией, которым внутри-брюшинно вводили озонированный физиологический раствор в объеме 0,02 мл с дозой озона 20 мкг; всего выполнялось 6 процедур через день;

4-я группа — крысы с неоплазией, которым вводили внутрибрюшинно через день 5 доз доксорубицина и 6 инъекций озонированного физиологического раствора.

Озонированный физиологический раствор получали барботажем 0,9% раствора NaCl озоно-кислородной смесью с помощью серийного отечественного генератора озона ф. «Квазар» (Н. Новгород). Концентрацию озона в физиологическом растворе определяли с помощью серийного отечественного анализатора концентраций.

5-я группа — интактные животные (контрольная группа).

На 11-е сутки после начала эксперимента под эфирным наркозом осуществляли декапитацию животных и забор ткани опухоли. Для морфологического и биохимического исследований отбирали участки опухолевой ткани, расположенные между зоной некроза и зоной интенсивного роста.

Гистологическое исследование опухолевой ткани осуществлялось общепринятым способом. Препараты фиксировали раствором эозином метиленовым синим по Маю—Грюнвальду и окрашивали азур-эозиновым красителем по Романовскому—Гимзе в течение 3 мин.

Для оценки результатов исследования были выбраны показатели, отражающие наличие в опухолевой

ткани вторичных спонтанных регрессивных изменений: некрозов, дистрофии, митотически делящихся клеток, сохраненных клеточных элементов.

Биохимические исследования включали анализ индуцированной биохемилюминесценции [8]. Для регистрации использовался биохемилюминометр (БХЛ-06), сопряженный с компьютером IBM PC/AT в диалоговом режиме. Результат распечатывался в унифицированной форме в виде хемилюминограммы с расчетом следующих параметров:

индекс Imax, где Imax (мВ) — максимальная интенсивность свечения, показывающая потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению липидов;

индекс S, где S (мВ) — светосумма хемилюминес-ценции за 30 с, отражающая содержание радикалов в исследуемом образце. Эта величина обратно пропорциональна антиоксидантной активности пробы крови;

tg2a — показатель, характеризующий скорость снижения процессов свободно-радикального окисления в плазме.

Определение уровней продуктов липопероксида-ции — первичных (диеновых — ДК и триеновых — ТК конъюгатов) и конечных (основания Шиффа — ОШ) — осуществляли по методу И.А. Волчегорского (1989) [9]. Содержание выражали в относительных единицах.

Полученные результаты были обработаны с помощью пакета статистических программ Sta^stica 6.0.

Результаты и обсуждение. У животных 1-й группы, не получавших какого-либо противоопухолевого лечения, ткань опухоли имела солидную структуру (рис. 1). Проявления спонтанного патоморфоза были минимальны. Изменения со стороны стромы и опухолевых клеток практически отсутствовали, носили спонтанный характер.

В ткани опухоли животных, получавших доксоруби-цин (2-я группа), патоморфоз характеризовался появлением мозаично расположенных, разного размера участков тотального некроза ткани новообразования (рис. 2). Частота встречаемости таких очагов была статистически значимо выше, чем в опухолях животных,

Рис. 1. Инфильтрирующая дольково-протоковая карцинома молочной железы (экспериментальный материал). Окраска гематоксилин-эозином: а — ув. 90; б — ув. 300

не получавших никакого лечения. При этом в сохраненных участках часть клеток находилась в состоянии необратимых форм дистрофий и ядерных повреждений. Количество подобных клеток было значимо выше,

V V у, 1 '

б

* Б * * * '

г/*';;

* • , 4Г

ж> ^ *

Ш\ «V £

Л1.

‘_____/i____

Рис. 2. Инфильтрирующая дольково-протоковая карцинома молочной железы (экспериментальный материал). Новообразование после использования доксорубицина. Окраска гематоксилин-эозином: а — ув. 120; б — ув. 300

чем в 1-й группе. Среднее число митозов, из которых большая часть представлена патологическими, нежизнеспособными формами, в данной группе также было достоверно выше, чем у животных, не получавших противоопухолевую терапию. Однако на фоне представленных изменений одна треть опухолевых клеток сохраняла свою жизнеспособность (табл. 1). Отмечалась отечность стромы.

В группе крыс, получавших озонированный физиологический раствор (3-я группа), тотальный некроз представлен в виде одного-двух фокусов (рис. 3). Площадь очагов некроза была статистически значимо меньше, чем в опухолях, подвергшихся воздействию доксорубицина. В сохранившихся зонах количество клеток с необратимыми повреждениями также оказалось статистически значимо меньше, чем у животных из предыдущей группы, и не отличалось от показателей животных, не подвергавшихся противоопухолевому лечению. Число клеток, находившихся в состоянии митоза, в данной группе не отличалось от их количества в 1-й и 2-й группах. Почти две трети опухолевых клеток не имели видимых повреждений. Обращало на себя внимание развитие коллапса стромы, по-видимо-

му, вследствие процессов дегидратации и формирования скудных лимфоидных инфильтратов вокруг групп погибающих клеток.

В опухолях животных 4-й группы, получавших озонированный физиологический раствор и доксоруби-цин, выявлено наличие мозаичных участков полной деструкции (рис. 4), общая площадь которых статистически значимо не отличалась от соответствующего показателя во 2-й группе и превосходила значения в 1-й и 3-й группах. Не выявлено различий со 2-й группой и по числу клеток с необратимыми формами дистрофий и повреждений ядер. Однако имело место статистически значимое снижение числа митотически делящихся элементов и оставшихся жизнеспособными опухолевых клеток, по сравнению не только с 1-й и 3-й, но и со

2-й группой. Наблюдалась умеренно выраженная отечность стромы.

Таким образом, сочетанное воздействие низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора и доксорубицина оказывало наиболее выраженное повреждающее воздействие на опухолевую ткань. Использование озонированного физиологического раствора потенцировало противоопу-

Таблица 1

Морфологические изменения в опухолях лабораторных животных в зависимости от вида проводимого лечения, %

Группы животных Морфологические изменения

Некрозы Дистрофии Митозы Сохраненные опухолевые клетки

1-я (опухоль без лечения) 1,96±0,31 25,71±5,79 2,00±0,23 72,28±5,78

2-я (доксорубицин) 41,75±5,30* 44,80±2,87* 2,81±0,23- 34,43±5,58'+

3-я (озон) 8,46±3,68* 22,60±3,32* 2,47±0,27 69,00±4,24*

4-я(доксорубицин + озон) 40,90±8,64-+ 49,00±8,18*+ 0,53±0,19'+* 9,40±2,20"+*

Примечание: * — статистически значимая разница с группой животных, получавших только доксорубицин (р<0,05); • — с группой животных, не получавших лечения, р<0,05; + — с группой животных, получавших только озонированный физиологический раствор, р<0,05.

.°У^Усч*Ч-

Рис. 3. Инфильтрирующая дольково-протоковая карцинома молочной железы (экспериментальный материал). Новообразование после использования озона. Окраска гематоксилин-эозином: а — ув. 120; б — ув. 250

I*7 ^ И * ♦

лД* 'У5 ^

б

Рис. 4. Инфильтрирующая дольково-протоковая карцинома молочной железы (экспериментальный материал). Новообразование после сочетанного применения доксорубицина и озона. Окраска гематоксилин-эозином: а — ув. 200; б — ув. 300

Таблица 2

показатели хемилюминограммы гомогената ткани опухоли экспериментальных животных

Группы животных Показатели хемилюминограммы Ітах^

Ітах, мВ S, мВ tg

1-я 1029,5±11,2 4951±31,5 403,6±12,4 0,207±0,012

2-я 1744±13,1* 5878±39,1* 838,3±10,9* 0,2967±0,019*

3-я 1709±15,2* 7993±41,4* 696,7±9,8* 0,2314±0,021*

4-я 1589±13,2* 5864±36,6* 727,5±11,3* 0,2709±0,022*

* — различия статистически значимы по сравнению с группой животных, не получавших лечения (р<0,05).

Т а б л и ц а 3

Содержание продуктов липопероксидации в гомогенате ткани опухоли экспериментальных животных (X±m), отн. ед.

Группы животных Продукты липопероксидации ОШ/ДК+ТК

ДК ТК ОШ

1-я 0,098±0,005 0,081±0,001 1,34±0,12 7,44±0,81

2-я 0,100±0,006 0,098±0,003 1,52±0,20 7,67±0,63

3-я 0,082±0,005* 0,067±0,002* 1,61±0,21 10,80±0,51*

4-я 0,043±0,006* 0,074±0,003* 1,69±0,19* 14,40±0,72*

* — статистически значимые различия по сравнению с группой животных, не получавших лечения, р<0,05.

холевую активность доксорубицина, что статистически значимо проявлялось в более выраженном угнетении митотической активности опухолевых клеток, в снижении числа их жизнеспособных элементов.

Анализ показателей хемилюминограмм гомогенатов ткани опухоли экспериментальных животных, полученных методом биохемилюминесценции, индуцированной железом и перекисью водорода (табл. 2), продемонстрировал статистически значимое повышение значений параметров Ітах и S, характеризующих интенсивность свободно-радикального окисления, и одновременно параметров 1д(-2а) и коэффициента Ітах^, представляющих общую антиоксидантную активность. При этом

показатели 1д(-2а) и 1тах^ гомогенатов ткани опухоли крыс из 4-й группы, которым вводили озон и доксору-бицин, занимали промежуточное положение между показателями у крыс из 2-й и 3-й групп.

Содержание ДК и ТК в гомогенате ткани опухоли (табл. 3) было статистически значимо более низким у животных из 3-й и 4-й групп по сравнению с животными, не получавшими лечение. В то же время содержание конечных продуктов липопероксидации — ОШ — было статистически значимо выше только в опухолях животных 4-й группы. Статистически значимым у животных этой группы по сравнению со всеми другими группами было увеличение коэффициента ОШ/ДК+ТК, отража-

ющего направленность процесса липопероксидации в сторону преобладания в ткани опухоли жестких продуктов, которые разрушают клеточную мембрану и тем самым способствуют деструкции клеток опухоли. Полученные данные подтверждают отмечаемые морфологические изменения в ткани опухоли.

Заключение. Морфологическое и биохимическое исследования влияния низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на патоморфоз опухоли показали, что после сочетанного воздействия низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора и доксо-рубицина деструктивные процессы в опухолевой ткани наиболее выражены. Озонированный физиологический раствор потенцирует противоопухолевую активность доксорубицина (процессы липопероксидации в опухолевой ткани возрастают, снижается митотическая активность опухолевых клеток и уменьшается число жизнеспособных элементов), что позволяет рекомендовать его для использования в химиотерапии опухолей.

Литература

1. Онкология. Под ред. И.В. Поддубной. М: МЕДПресс-информ; 2009; 768 с.

2. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. М: Практическая медицина; 2006; 503 с.

3. Вахромеева Н.С., Сакеева Д.Д. Лейкинферон как протектор гемопоэза при химиотерапии злокачественных опухолей. Российский биотерапевтич журнал 2003; 1: 5.

4. Манзюк Л.В., Салтанов А.И., Сельчук В.Ю., Снеговой А.В. Нутритивная поддержка при проведении химиотерапии. Русский медицинский журнал. Онкология 2008; 27: 47—49.

5. Van der Zee J., Van Rhoon G.C. Hyperthermia in clinical oncology. Strahlentherapie und Oncologie 1991; 167: 46—61.

6. Алясова А.В. Рефлекторная иммунокоррекция у больных злокачественными лимфомами в процессе их цитостатической терапии (клинико-нейрофизиологическое и иммунологическое исследование). Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Н. Новгород; 1996.

7. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. М: Медгиз; 1962.

8. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной ХЛ для оценок свободно-радикальных реакций в биологических субстратах. Биохимия и биофизика микробиологов 1983; 2: 41—48.

9. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов ПОЛ в гептан-изопропаноль-ных экстрактах крови. Вопросы медицинской химии 1989; 1: 127—131.