СПОСОБ СОЗДАНИЯ ОПТИЧЕСКИХ ОКОН ПРОЗРАЧНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ ОБЛАСТИ
METHOD FOR CREATING OPTICAL TRANSPARENCY WINDOWS OF BIOLOGICAL TISSUE FOR DIAGNOSTICS AND TREATMENT IN THE ULTRAVIOLET AREA

Настоящее изобретение относится к способу создания оптических окон прозрачности биологических тканей в ультрафиолетовой (УФ) области электромагнитного спектра для диагностики и лечения, в частности к способу повышения прозрачности таких тканей в областях с центрами на длинах волн 230 нм и 300 нм.
Путем частичной и временной (обратимой) замены мобильной межтканевой воды данной биологической ткани иммерсионным агентом достигается уменьшение рассеяния света и, как следствие, улучшение передачи оптического излучения в более глубокие слои, что позволяет улучшить диагностические и лечебные процедуры. Этот метод уже известен в видимой и инфракрасной областях электромагнитного спектра, но пока неизвестен в УФ области. Таким образом, становится возможным использовать УФ-свет для получения улучшенных контрастных изображений более глубоких слоев биологической ткани и, таким образом, для установления более надежного диагноза и/или неинвазивного лечения. Таким образом, настоящее изобретение относится к технической области биомедицинской инженерии, медицины и клинической визуализации, в частности, оно относится к методам диагностики и лечения с использованием света в УФ-диапазоне электромагнитного спектра.
Подавляющее большинство биологических тканей, включая кровь, в своем естественном состоянии являются оптически мутными, обладая высокими рассеивающими свойствами, что ограничивает глубину проникновения света в эти ткани.
Существуют различные методы увеличения оптического пропускания биологических тканей, например, основанные на механическом сжатии или растяжении, эффектах изменения температуры и коагуляция ткани, на обесцвечивании тканей и иммерсии их в растворах. Некоторое время механические методы использовались для утончения слоев ткани и уменьшения рассеяния за счет создания более компактного и организованного внутреннего расположения компонентов ткани. Однако повышенная прозрачность, достигаемая механическими методами, не всегда достаточна и может приводить к деструкции клеток и тканей. Методы, основанные на изменении температуры и эффектах коагуляции, мало используются, поскольку имеют побочные эффекты и другие недостатки.
Способ повышения прозрачности путем дегидратации и иммерсии в растворах интуитивно использовался с древних времен, поскольку народы северной Европы делали стены своих жилищ из обезвоженной кожи животных и окна из обезвоженного кишечника тюленя, чтобы обеспечить дневное освещение. Первое серьезное исследование этого метода было сделано более века назад немецким анатомом Вернером Спалтехольцем, который обнаружил, что мышечная ткань повышает свою прозрачность под микроскопом при обработке ее спиртом, а затем гвоздичным или ксилоловым маслом, и дальнейшей заливкой Канадским бальзамом. Спалтехольцу сразу стало понятно о существовании механизма согласования показателей преломления компонентов мышечной ткани, а доказательство существования механизма дегидратации путем оценки истончения образцов было опубликовано в 1939 году. Однако только в конце 1980-х и начале 1990-х годов, когда появились методы оптической диагностики и лечения, этот метод начал использоваться для преодоления возникающих трудностей при распространении света в биотканях.
in vivo
ex vivo
Иммерсионный метод повышения прозрачности ткани в настоящее время является предпочтительным, поскольку воздействие, применяемое для замены тканевой воды на биологически совместимый агент, является временным и обратимым. Эти действия в идеале могут сделать ткань полностью прозрачной, как недавно продемонстрировали на органах мелких животных. Обратимость этого метода может быть обеспечена за счет естественной или вспомогательной регидратации, в зависимости от того, находится ли ткань в состоянии  или .
T
c
Был изучен целый ряд иммерсионных агентов и определен их потенциал для расширения окон прозрачности в видимом и ближнем ИК диапазонах для различных тканей и крови. Наиболее распространенные иммерсионные агенты представляют собой сахар, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, маннитол; спирты, такие как глицерин; органические растворители, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), пропиленгликоль; или коммерческие рентгеноконтрастные агенты, такие как Тразограф™ или Омнипак™. Когда эти агенты наносят или в них погружают такие ткани, как кожа, мышечная ткань, склера или ткани желудочного тракта, то наблюдается увеличение коллимированного пропускания ткани () и достигается лучший контраст оптических изображений, полученных из более глубоких слоев ткани. Таким образом, метод иммерсионного оптического просветления позволяет расширять оптические окна прозрачности ткани, которые дают возможность диагностировать и лечить патологии с помощью света. До настоящего времени такие окна наблюдались только в видимой и ближней инфракрасной области спектра.
T
c
Недавние исследования показывают, что когда биологические ткани анализируются во время воздействия иммерсионных агентов, окно прозрачности, расположенное между длинами волн 600 и 1000 нм, становится более широким и эффективным, что хорошо видно по поведению коллимированного пропускания ткани  в этой области. Некоторые недавние обзорные статьи подтверждают растущее число публикаций и исследований, проводимых в этой области исследований за последние 20 лет, что указывает на эффективность этого метода для улучшения глубинной визуализации тканей и для его применения в сочетании с методами неинвазивной диагностики и лечения с использованием света.
На эту тему опубликован ряд патентов:
Например, патент US6275726 описывает усиление пропускания биологической ткани в спектральной области между видимым и ближним инфракрасным диапазоном при использовании иммерсионных агентов. CN102749231 описывает новый иммерсионный агент для увеличения прозрачности костной ткани. CN101487775 описывает приготовление растворов борнеола для использования в качестве иммерсионных агентов.
Точно так же в заявках CN104568553A и CN1063900138A описано получение других растворов, содержащих иммерсионный агент и другой дополнительный агент, который облегчает диффузию иммерсионного агента в ткани.
Однако все эти изобретения направлены на обеспечение роста прозрачности тканей в видимой и ближней инфракрасной области в области уже существующих окон прозрачности с помощью иммерсионных агентов, причем ни один из них не рассматривает метод иммерсионного просветления в УФ-диапазоне.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на демонстрацию принципиальной возможности существенного снижения мутности (рассеяния света) биологических тканей в УФ-диапазоне при использовании иммерсионных агентов и доказательство того, что в этой области спектра эффективность увеличения прозрачности имеет существенно большую величину, чем в видимой или инфракрасной области, путем создания двух новых окон прозрачности биологических тканей, расположенных на длинах волн 230 нм и 300 нм, которые позволяют улучшить диагностические и лечебные процедуры с использованием света на этих длинах волн.
характеризуется тем, чт
Заявляемый способ создания оптических окон прозрачности биологических тканей для оптической диагностики и терапии, о окна прозрачности создают в ультрафиолетовой (УФ) области электромагнитного спектра за счет частичной и временной замены мобильной воды, присутствующей в межтканевой жидкости биологической ткани, по крайней мере, одним биологически совместимым иммерсионным агентом, которым пропитывают биологическую ткань, при этом иммерсионный агент имеет малое значение коэффициента поглощения и высокий показатель преломления в УФ области электромагнитного спектра.
-1
Биологически совместимый иммерсионный агент выбирают из условия, что его коэффициент поглощения меньше или равен коэффициенту поглощения межтканевой жидкости, а показатель преломления выше, чем у межтканевой жидкости во всем диапазоне длин волн от 155 до 400 нм, а именно коэффициент поглощения меньше 1,0 для 155 нм и 0,1 см для 400 нм, а показатель преломления больше 1,46 для 155 нм и 1,35 для 400 нм, а для всех остальных длин волн диапазона значения лежат между указанными величинами.
В качестве иммерсионных агентов выбирают один из следующих агентов: глюкоза, фруктоза, этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин, диметилсульфоксида (ДМСО) или агент с установленным потенциалом просветления биологической ткани, имеющий высокий показатель преломления и хорошую прозрачность в УФ области, позволяющий сделать биологические ткани прозрачными в этой области спектра.
По меньшей мере один из иммерсионных агентов имеет концентрацию от 20 до 100%, предпочтительно от 20 до 60%, более предпочтительно от 40 до 60%.
Создают два УФ оптических окна прозрачности путем воздействия иммерсионным агентом в течение 1-10 мин, а именно одно узкое с центром вблизи 230 нм и шириной от 210 до 250 нм, а другое широкое с центром вблизи 300 нм и шириной от 280 до 400 нм.
Для обеспечения дополнительного комфорта и увеличения скорости диффузии иммерсионного агента, иммерсионный агент предварительного нагревают до температуры, равной температуре биологической ткани 37-39°C.
Иммерсионный агент выбирают из числа тех, которые обладают высокой скоростью диффузии в биологической ткани и обеспечивают обратимую дегидратацию биологической ткани, приемлемую в клинических процедурах.
В качестве иммерсионного агента используют водные растворы, содержащие глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль или другой агент в концентрациях от 70 до 100%.
В качестве иммерсионного агента используют водные растворы ДМСО в концентрации от 50 до 100% или глюкозы в концентрации от 40 до 60%, или фруктозы в концентрации от 40 до 80%, или сахарозы в концентрации от 40% до 70%.
В качестве иммерсионного агента используют водные растворы, содержащие до 30% спирта и 50% сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, сахароза или мальтоза.
Иммерсионное просветление осуществляют совместно с одним из оптических методов визуализации ткани, такими как оптическая когерентная томография (ОКТ), диффузионная томография, конфокальная микроскопия (КМ), многофотонная томография (МФТ), микроскопия комбинационного рассеяния (КР).
Для лечения псориаза, витилиго и других кожных заболеваний иммерсионное просветление осуществляют совместно с одним из терапевтических методов, использующих ультрафиолетовые лучи в диапазоне 320-400 нм и/или ультрафиолетовые лучи в диапазоне 280-320 нм.
Иммерсионное просветление осуществляют совместно с методом УФ-спектрофотометрии и проводят анализ содержания ДНК и белков в тканях по виду полученных спектров.
Иммерсионное просветление осуществляют совместно с методом УФ-спектрофотометрии и проводят анализ степени диссоциации белковых молекул, а также обратимости диссоциации при регидратации биологических тканей по виду полученных спектров в областях, характерных для белков, а именно вблизи 225 и 280 нм.
Иммерсионное просветление сочетают с методом УФ-спектрофотометрии и проводят анализ степени диссоциации белковых молекул в нормальных и патологических тканях во время терапии и по виду полученных спектров в областях, характерных для белков, а именно вблизи 225 и 280 нм, судят о степени диссоциации и соответственно эффективности терапии.
Изобретение поясняется чертежами.
Фиг. 1. Сравнительный пример. Он представляет собой зависимость ПП от длины волны при 20°C для воды - кривая 8, для белков мышечной ткани - кривая 10 и для этиленгликоля (ЭГ) - кривая 9, который является иммерсионным просветляющим агентом. Ось 1 представляет собой длину волны в нм, а ось 7 представляет ПП, который является безразмерной величиной. Кривые 8, 9 и 10 показывают аналогичное поведение - ПП уменьшается с увеличением длины волны. Что касается белков, то их дисперсия известна для меньшей спектральной области, чем для воды и ЭГ.
a
s
-1
Фиг. 2. Сравнительный пример. Представлена зависимость коэффициента поглощения (μ) от длины волны - кривая 15, для приведенного коэффициента рассеяния (μ') - кривая 16 и для глубины проникновения света (δ) - кривая 14 для ткани брюшины. Из-за разницы в масштабе между этими параметрами кривая 14 относится к оси 13, которая представлена в мм, а кривые 15 и 16 относятся к оси 12, которая представлена в см. Локальные максимальные значения δ находятся в пределах оптических окон биотканей, которые обозначены римскими цифрами.
T
T
T
T
c
c
c
c
Фиг. 3. Сравнительный пример. Он показывает зависимость коллимированного пропускания  от длины волны (спектр) для образца мышечной ткани прямой кишки человека. На этом рисунке ось 1 представляет длину волны в нм, а ось 17 представляет  в %. 18 представляет  спектр образца прямой кишки человека. Это типичный спектр для мягких тканей, для длин волн выше 400 нм  растет с длиной волны почти линейно. Полоса Соре миоглобина наблюдается на длине волны 418 нм, и из-за низкого содержания крови в анализируемой ткани характерные Q-полосы гемоглобина между 500 и 600 нм не наблюдаются.
T
c
Фиг. 4. Сравнительный пример. Он показывает спектры поглощения белка и ДНК в различных концентрациях. Представленные данные, объясняют низкие значения  на Фиг. 3 для длин волн ниже 280 нм, указывая на то, что эта область спектра с трудом может быть использована для применения оптических методов в клинических процедурах.
T
T
c
c
Фиг. 5. Сравнительный пример. Показывает последовательность спектров  прямой кишки человека во время иммерсии в растворах: 20%-глицерина (а), 40%-глицерина (б) и 60%-глицерина (в), образцов мышечной ткани, измеренные в спектральной области между 200 и 1000 нм, где длина волны представлена в нм на оси абсцисс 1, время иммерсии представлено в мин на оси 3, а  представлено в % по оси ординат 17.
T
T
T
c
c
c
Можно видеть, что для воздействия 20%-глицерина (Фиг. 5 (а)), спектр  (19), увеличивается в первые 2-3 мин воздействия агента, а затем зависимость стабилизируется. Подобное поведение наблюдается для спектров 21 на Фиг. 5 (с) для воздействия 60%-глицерина, но с более высокими значениями величины благодаря тому, что концентрация глицерина выше в используемом растворе. При воздействии 40%-глицерина (Фиг. 5 (б)), мы наблюдали плавный рост спектров (20) на протяжении всего воздействия из-за баланса между содержанием мобильной воды в ткани и воды в растворе агента. В этой случае измерения  чувствительны только к потоку глицерина в ткани. Временные зависимости, показанные на графиках Фиг. 5 для длин волн выше 400 нм являются типичными для спектров  и уже наблюдались в предыдущих исследованиях. Для длин волн короче 400 нм ни один из графиков на Фиг. 5 не показывает явного роста.
T
T
T
c
c
c
Фиг. 6. Пример изобретения. Показывает последовательность спектров  в спектральном диапазоне между 200 и 300 нм для мышечной ткани прямой кишки человека во время иммерсии образцов в 20%-глицерине (а), 40%-глицерине (b) или 60%-глицерине (с); длина волны представлена в нм на оси 1 по оси абсцисс, время иммерсии представлено в мин на оси 3, а  представлено в % на оси ординат (17). Эти графики показывают, что  увеличивается как справа, так и слева от полосы поглощения ДНК, которая находится в центре интервала 250-260 нм (Фиг. 4). Это означает, что в УФ области формируются два оптических окна прозрачности - одно для длин волн ниже 260 нм и еще одно - для длин волн выше 260 нм.
T
T
T
T
t
t
T
t
c
c
c
c
c
Фиг. 7. Пример изобретения. Сравнение эффективности роста  в УФ, видимой и ближней инфракрасной областях показывает, что эффективность роста  во время иммерсии образца ткани в 20%-глицерине (а), 40%-глицерине (b) и 60%-глицерине (с), где эффективность роста  по всей спектральной области (от 200 до 1000 нм) получают из измерений, показанных на Фиг. 5, путем расчета, выполненного с помощью уравнения 1, где (λ, ) представляет собой спектр, измеренный в любой момент времени  иммерсии, и (λ,  = 0) представляет естественный спектр ткани до иммерсии,
. (1)
T
c
На всех графиках Фиг. 7 ось 1 представляет длину волны в нм, ось 2 представляет увеличение  в % (эффективность), а ось 3 представляет время в мин. Графики Фиг. 7 дают гораздо больше информации, чем графики Фиг. 5 и 6. Во-первых, на этих графиках хорошо видно, где создаются оптические окна. Первое формируется между длинами волн 200 и 260 нм, с пиком на 230 нм (4). Второе - находится между 260 и 400 нм, а его пик - на 300 нм (6). Это второе окно соседствует с окном прозрачности в видимой и ближней инфракрасной области, но имеет гораздо большую эффективность, чем таковая на длинах волн выше 400 нм. Причина, по которой эти два окна разделены, заключается в том, что полоса поглощения ДНК находится на длине волны 260 нм (5). Это второе окно имеет большие величины прироста прозрачности только для высоких концентраций глицерина в иммерсионном растворе.
Принимая во внимание спадающую зависимость показателя преломления (ПП) от длины волны для компонентов биологических тканей, как показано на Фиг. 1, можно оценить, что разница ПП имеет большую величину в УФ области по сравнению с видимым и инфракрасным диапазонами, что позволяет эффективнее управлять ПП в УФ области при действии иммерсионных агентов.
Для того чтобы согласование ПП было более эффективным, иммерсионные агенты должны быть хорошо прозрачными и иметь высокий ПП в УФ области спектра. Примерами агентов с такими характеристиками являются глюкоза, этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин и ДМСО.
В широком диапазоне медицинских применений источники света, работающие в УФ области спектра, имеют ряд достоинств по сравнению с источниками, излучающими в видимой или ближней инфракрасной зоне. Вот некоторые из них: обеззараживание воздуха или воды от всевозможных микроорганизмов, дезинфекция поверхности, дезинфекция медицинского оборудования или пищевых продуктов, УФ-фототерапия псориаза и витилиго, а также многочисленные другие терапевтические и диагностические применения. Биомолекулы, такие как триптофан, никотинамид-адениндинуклеотид (НАД), тирозин, дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), имеют полосы поглощения в УФ-спектральной области, поэтому возбуждение флуоресценции метаболитов, содержащих эти компоненты, а также использование спектроскопии комбинационного рассеяния (СКР) при возбуждении в глубоком УФ, открывает перспективу исследований биологических тканей на молекулярном уровне при создании новых окон прозрачности в УФ области.
В последние годы предпринимаются серьезные усилия по разработке новых УФ светодиодов (СД) для различных применений, которые могут быть основой для создания недорогих и компактных медицинских устройств для прикроватной (point-of-care) медицины. Создание двух новых оптических окон в УФ спектральной области может дать новый интерес и мотивацию для разработки новых источников света, других оптических инструментов и методов для использования в диагностических и лечебных целях.
Кроме того, использование УФ излучения в медицинской визуализации, хирургических или терапевтических процедурах представляет большой интерес, поскольку УФ фотоны имеют более высокую частоту и соответственно энергию, чем фотоны видимой и инфракрасной областей. Более высокие энергии могут быть более эффективными для прецизионной резекции опухолей, а также для получения новой информации при визуализации патологий ткани с помощью флуоресцентного метода и СКР, что позволяет поставить более надежный и точный клинический диагноз.
Сильное рассеяние света связано с тем, что внеклеточные жидкости, цитоплазма в клетках и плазма в крови имеют низкие значения показателя преломления (ПП) по сравнению с другими компонентами, такими как органеллы в клетках, клеточные мембраны, межклеточный матрикс и белковые волокнистые структуры соединительных тканей, а также гемоглобин в крови. В качестве примера на Фиг. 1 представлена зависимость ПП (7) для основных компонентов скелетно-мышечной ткани от длины волны λ, выраженной в нанометрах (1), белки показывают высокие значения ПП (кривая (10)) по сравнению с ПП воды (кривая (8)). Для этой ткани вода составляет более 90% межтканевой жидкости, что означает, что при разнице в значениях ПП между межтканевой жидкостью и белками происходит значительное рассеяние света. Кривая (9) на рисунке 1 представляет собой зависимость ПП иммерсионного агента, этиленгликоля (ЭГ), от длины волны. Поскольку этот агент имеет более высокие значения ПП, чем вода, частичный обмен межтканевой воды на ЭГ уменьшает разницу между значениями ПП белка и межтканевой жидкости в скелетной мышце и, следовательно, рассеяние света в этой ткани. Этот механизм повышения прозрачности, который создается путем замены воды на иммерсионный агент, хорошо известен в видимой и инфракрасной областях спектра и называется иммерсионным оптическим просветлением.
a
s
Зависимости от длины волны (так называемые спектры) для коэффициентов поглощения (μ) и рассеяния (μ) являются индивидуальными характеристиками для каждой из различных биологических тканей, будь то мягкие или твердые биоткани, или биологические жидкости. Изучение спектров поглощения и рассеяния различных биологических тканей интенсивно проводилось в последние годы. В этих исследованиях был обнаружен ряд спектральных признаков, которые обусловлены полосами поглощения компонентов биологических тканей, таких как вода, белки и липиды, или компонентов крови, таких как миоглобин и гемоглобин.
Природа оптических свойств биологических тканей в широком спектральном диапазоне от ультрафиолетового до ближнего инфракрасного излучения хорошо описана в литературе, когда наличие рассеивателей (оптических неоднородностей компонентов ткани) обуславливает режим рассеяния Ми или Рэлея в зависимости от соотношения их размеров и длины волны. С другой стороны, в литературе также указывается, что рассеяние связано с неоднородностью ПП среды за счет разницы ПП между тканевыми компонентами на всех длинах волн от 200 до 2000 нм и далее.
a
s
s
В литературе также описана зависимость от длины волны для μ и μ и другие связанные свойства. Из-за вкладов рассеяния Ми и Рэлея в полное рассеяние света, μ демонстрирует экспоненциальный спад с ростом длины волны от УФ до ближнего инфракрасного диапазона, как описано уравнением:
.        (2)
f
b
a
Ray
Mie
a
a
a
В этом уравнении  представляет фракцию рассеяния Рэлея, а  характеризует средний диаметр частиц в ткани, которые создают рассеяние Ми. Учитывая, что в уравнении длина волны λ нормирована на значение 500 нм, ' представляет значение  на этой длине волны; μ также демонстрирует поведение затухания с ростом длины волны для длин волн более 400-420 нм - см. кривую (15) на Фиг. 2. Для более длинных видимых или ближних инфракрасных волн, μ имеет тенденцию оставаться постоянным до сильного роста в инфракрасном диапазоне выше 1350 нм (Фиг. 2) за счет поглощения воды, μ очень чувствителен к присутствию различных компонентов биологических тканей. Из-за содержания крови в мягких тканях наблюдаются пики поглощения гемоглобина на длинах волн ~ 418 нм и ~ 510 и ~ 575 нм в спектрах биологических тканей. Для мышечной ткани присутствуют линии поглощения миоглобина, которые близки к линиям поглощения гемоглобина в этой области спектра.
a
a
a
s
s
a
a
s
-1
В тканях, которые содержат липиды, пик в спектре μ может появляться вблизи 750 нм. Из-за наличия этих пиков, спектральная зависимость для µ негладкая. Как μ, так и μ обычно представлены в единицах см, и для большинства биологических тканей значения μ имеют более высокие значения, чем μ. В биологических тканях есть некоторые компоненты, которые имеют пики поглощения, расположенные на длинах волн в УФ области. Бычий альбумин имеет пик поглощения на 280 нм, белки (актин и миозин) имеют пик поглощения на 260 нм, а ДНК имеет пик поглощения также на 260 нм. Гемоглобин крови имеет локальный пик на 274 нм. Несмотря на то, что эти отдельные пики повышают значение μ в УФ области, однако значения μ имеют гораздо более высокие значения в соответствии с экспоненциальным затуханием, описываемым уравнением 1. С другой стороны, из-за присутствия пиков поглощения в области 260 - 280 нм, ожидается, что иммерсионное оптическое просветление может создать ранее неизвестное новое окно прозрачности на длинах волн несколько ниже 260 нм и еще одно на длинах волн несколько выше 280 нм в биологических тканях, содержащих большое количество белка, крови и ДНК. Если содержимое этих компонентов невелико, окна, создаваемые в УФ области, могут расширяться до длин волн, превышающих 260 и меньших 280 нм.
Другим оптическим свойством биологических тканей является показатель преломления (ПП). Как видно на Фиг. 1, ПП биологических тканей и их компонентов также уменьшается с ростом длины волны (это так называемая дисперсионная зависимость или дисперсия ПП). Дисперсию ПП рассеивающих компонентов биологических тканей трудно измерить, но ее можно восстановить из измерений зависимости ПП от длины волны для биоткани при условии, что дисперсия ПП межтканевой жидкости, основу которой составляет вода, известна. Согласно Фиг. 1 существует большая разница между ПП твердых (рассеивателей) и жидких (базовое вещество) компонентов ткани, особенно в УФ-диапазоне.
Более 90% жидкости в жидких биологических тканях составляет вода, остальное - небольшое количество солей и растворенных органических соединений. Для эталонной длины волны рефрактометра Abbe (589,6 нм) биологические тканевые жидкости имеют ПП от характеризующийся до 1,37, в то время как рассеиватели имеют более высокие значения, обычно от 1,39 до 1,47. Для некоторых компонентов возможны и более высокие значения ПП, например, белки скелетных мышц (актин и миозин) в обезвоженном состоянии имеют ПП, равный 1,58, как это показано на Фиг. 1. Другой случай - это меланин кожи, ПП которого составляет 1,60.
В естественных условиях белки мышечной ткани не полностью обезвожены. Они связываются с некоторым количеством воды, поэтому гидратированы. Таким образом, твердые рассеиватели, состоящие из комбинации белка и воды, имеют более низкий ПП, чем представлено кривой (10) на Фиг. 1 для дегидратированных белков. С другой стороны, из-за того, что соли и органические компоненты растворяются в воде межтканевой жидкости, ПП этой жидкости также будет несколько выше, чем кривая (8) на Фиг. 1 для чистой воды. Даже принимая это во внимание, наблюдаемое различие между значениями ПП рассеивателей и межтканевой жидкости все еще остается довольно значительным. Такое различие лежит в основе сильного рассеяния света в биологических тканях.
Если подвижная вода в межклеточной жидкости, например мышечной ткани, заменена на ЭГ, несоответствие между значениями ПП уменьшается, как мы уже видели для видимой и ближней инфракрасной области спектра, и, следовательно, уменьшается мутность мышечной ткани. В результате мышечная ткань увеличивает прозрачность, что позволяет ей пропускать больше света в более глубокие слои ткани.
В случае in vivo исследований биологических тканей имеют место аналогичные проблемы, обусловленные несоответствием между значениями ПП рассеивателей и жидкостей, содержащих воду, что приводит к сильному рассеяние света, которое ограничивает пропускание и проникновение света при использовании оптических методов в клинической диагностике и лечении, в том числе получают низкоконтрастные изображения только самых поверхностных слоев ткани, что делает применение медицинских оптических методов весьма ограниченным.
Различные неинвазивные оптические методы диагностики и лечения часто используют свет с длинами волн, которые расположены в так называемых «оптических окнах прозрачности», где ослабление света в биотканях минимальное. Такие окна в настоящее время известны только в видимой и ближней инфракрасной областях электромагнитного спектра и обозначены римскими цифрами на Фиг. 2.
Таким образом, согласно изобретению предлагается временно создавать оптические окна прозрачности в УФ области, уменьшая разницу показателей преломления компонентов биологических тканей путем применения иммерсионного просветления, которое обеспечивает частичное временное (обратимое) замещение межтканевой воды ткани иммерсионным просветляющим агентом с более высоким ПП, чем вода, и близким к ПП рассеивателей, составляющих биологические ткани.
Глюкоза, глицерин, ДМСО или водные растворы этих агентов являются примерами иммерсионных просветляющих агентов и могут быть использованы в любых биологических тканях человеческого организма, включая кровь, для повышения их прозрачности.
Выбор агента или его концентрации в водном растворе зависит от величины эффекта прозрачности, который должен быть получен, с учетом того, что глицерин имеет одно из самых высоких значений ПП в УФ области.
В рамках настоящего изобретения биологическая ткань, которая может быть нормальной или патологической, включает органическое вещество живого организма человека или животного, твердые или мягкие ткани и жидкости организма, такие как кровь. Примерами биологических тканей в рамках настоящего изобретения являются мышечная ткань, костная ткань, соединительная ткань, нервная ткань, эпителиальная ткань, все ткани глаза, ткани желудочно-кишечного тракта, ткань печени, кожа, ткани мозга, ткани сердца, кровь и др.
ex vivo
in vivo
in vivo
Оптическое просветление может быть достигнуто путем погружения ткани  непосредственно в сам иммерсионный агент или водный его раствор, или путем его местного нанесения на ткань . В первом случае диффузия агента происходит через обе поверхности ткани, которая обычно подготавливается в виде среза хорошо определенной и равномерной толщины с использованием криотома. Во втором случае , диффузия происходит только через открытую поверхность ткани, или, если ткань недоступна, агент можно вводить непосредственно в ткань с помощью шприца и иглы.
Образцы ткани забирались в хирургическом отделении Португальского института онкологии в г. Порту (IOP-Porto). Образцы мышечного слоя стенки прямой кишки человека были подготовлены для использования в экспериментальных исследованиях по иммерсионному просветлению, которые привели к открытию этого явления. Образцы ткани круглой формы диаметром около 1 см и равномерной толщиной 0,5 мм нарезали с помощью криотома.
T
t
T
t
c
c
Спектры коллимированного пропускания (λ, ) были измерены для части этих образцов без иммерсионного просветления, а для другой части во время их погружения в растворы, содержащие глицерин в концентрациях 20%, 40% и 60%. Используя уравнение 2, рассчитывали прирост пропускания в процентах для всех спектров (λ, ), измеренных для каждого из иммерсионных растворов, наблюдая за созданием двух окон оптической прозрачности в УФ области, первое с центром на длине волны 230 нм, а второе на 300 нм. Первое окно прозрачности появляется при любой концентрации иммерсионного агента, а его величина увеличивается с увеличением концентрации глицерина в используемом растворе. Второе окно показывает высокие значения эффективности просветления только для высоких концентраций глицерина в растворе. Создание этих двух окон прозрачности позволит проводить диагностику и лечение с использованием света в УФ области вблизи этих длин волн.
Примеры
Пример 1. Подготовка образцов мышечной ткани
Используя послеоперационный материал срезов ректальной ткани человека, выполненных в Португальском институте онкологии в г. Порту (IOP-Porto), разделялись различные слои стенки прямой кишки. С помощью криотома были подготовлены образцы здоровой мышечной ткани круглой формы, диаметром приблизительно 1 см и фиксированной толщины приблизительно 0,5 мм. Готовили три образца этих размеров, каждый из которых погружали в водный раствор с заданной концентрацией глицерина.
Пример 2. Приготовление растворов глицерина
Были приготовлены три водных раствора с различными концентрациями органического иммерсионного агента, глицерина, а именно: раствор А = 20% глицерина; раствор B = 40% глицерина и раствор C = 60% глицерина. Эти растворы готовили при 20°C путем смешивания дистиллированной воды и чистого глицерина в контейнере до тех пор, пока ПП смеси не получит значение, соответствующее значение для желаемой концентрации. Значения ПП растворов глицерина с различными концентрациями хорошо известны из опубликованной литературы для температуры 20°C и длины волны 589,6 нм, которая является эталонной длиной волны рефрактометра, который мы использовали для контроля приготовления растворов.
Т
с
Пример 3. Обработка и измерение  спектров образцов
Т
Т
Т
Т
Т
с
с
с
с
с
Для первого образца ткани проводили измерения спектра коллимированного пропускания. Для этой цели образец помещали в экспериментальную установку, содержащую кювету, в которой размещается образец и раствор для иммерсионного просветления и которая позволяет осветить одну сторону образца и записать спектр  на противоположной стороне кюветы. Затем кювету заполняли раствором А по объему на 10% больше, чем объем образца ткани, чтобы обеспечить непрерывный поток глицерина в ткань, и -спектры образца записывали во время действия агента с временным разрешением 15 сек в течение 30 мин. Что касается длины волны, каждый измеренный спектр имеет разрешение 1 нм между 200 и 1000 нм. Эту процедуру повторяли для двух других образцов ткани, которые были погружены в растворы B и C. Для справочных целей и для понимания того, как  зависит от длины волны для одного из трех образцов спектр измерялся во всем широком диапазоне от 200 и 1000 нм. Этот график показывает, что мышечная ткань имеет сравнительно низкие значения  для длин волн короче 400 нм.
Т
Т
с
с
Чтобы понять величину эффекта прозрачности, создаваемого тремя растворами в тканях, были построены графики Фиг. 5, которые представляют собой последовательности спектров  для каждого из растворов. Эти графики показывают аналогичную временную зависимость для длин волн между 400 и 1000 нм -  сильно возрастает в первые 2-3 мин действия агента, а затем стабилизируется при действии растворов A и C. При действии раствора В этот рост становится более плавным и медленным в течение всего времени действия агента благодаря равновесию между содержанием мобильной воды в ткани и в растворе.
Т
с
Из графиков на Фиг. 6 за счет увеличения масштаба по сравнению с Фиг. 5 хорошо видно, что для длин волн между 200 и 400 нм рост  происходит в течение всего времени воздействия агента и для любого из растворов, для длин волн как слева, так и справа от полосы поглощения ДНК, которая находится на длине волны 260 нм.
Т
Т
с
с
Для того, чтобы оценить величину роста  в УФ области, мы рассчитали с помощью уравнения 2 прирост  в процентах для каждой временной точки для всех трех растворов глицерина, представляя эти графики на Фиг. 7. На этих графиках мы наблюдаем создание двух окон оптической прозрачности с центральными длинами волн, лежащими в УФ, а именно 230 и 300 нм. Первое окно образуется при действии всех растворов с малыми и большими концентрациями, а его величина растет с увеличением концентрации глицерина в растворе. Второе оптическое окно не так эффективно при действии агентов с малыми концентрациями, но при действии раствора С оно имеет величину роста приблизительно такую же, как и для первого окна, что указывает на то, что при отсутствии поглощения ДНК, оба окна слились бы в одно окно.
in vivo
Пример 4. Создание УФ окон в тканях  и их оценка.
Т
in vivo
in vivo
in vivo
in vivo
Т
R
с
с
d
Выполнение измерений коллимированного пропускания , которые мы использовали для получения описанных выше результатов не всегда можно обеспечить в случае исследований. Однако эффекты прозрачности, получаемые с помощью используемых растворов, также следует ожидать в  тканях. В условиях  растворы можно наносить местно на ткани или вводить с помощью шприца в интерстициальное пространство исследуемой ткани. Чтобы оценить создание УФ окон, наблюдаемых в условиях , вместо измерений  можно использовать измерения диффузного отражения () или методы визуализации, такие как когерентная оптическая томография (ОКТ).
Пример 5. Методы, которые можно оптимизировать при использовании УФ окон прозрачности на длинах волн 230 и 300 нм.
С созданием этих двух УФ окон прозрачности оказывается возможным разрабатывать новые методы диагностики или лечения или качественно улучшать существующие методы, применяя их на новых линиях излучения в области 230 или 300 нм в сочетании иммерсионным оптическим просветлением. Примерами являются методы флуоресцентной диагностики и спектроскопии комбинационного рассеяния с возбуждением в глубоком УФ.