СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МАЛОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ПЫЛЕЙ
METHOD FOR CYTOTOXICITY TEST FOR POORLY SOLUBLE OCCUPATIONAL DUSTS

Изобретение относится к медицине, к области гигиены и касается сравнительной экспериментальной оценки способности пылевых частиц к повреждению клеточных мембран, именуемой цитотоксичностью, в качестве одного из подходов к ускоренной оценке биологической агрессивности малорастворимых производственных пылей.
В гигиенической практике для ускоренной оценки цитотоксичности малорастворимых пылей "in vitro" применяется сравнительный принцип, когда наряду с вновь изучаемыми исследуются пылевые частицы, известные своей высокой или низкой цитотоксичностью. Из предшествующего уровня техники известны способы сравнительной оценки цитотоксичности "in vitro" путем измерения тех или иных показателей (активности ферментов-маркеров, хемилюминесценции, жизнеспособности по невключению специального красителя, гемолитической активности) в культурах изолированных макрофагов, эритроцитов при инкубации их с вновь изучаемыми и с известными своей высокой или низкой цитотоксичностью пылевыми частицами [1, 2, 6, 9].
Все эти тесты на сравнительную цитотоксичность, основанные на различных эффектах действия пылевых частиц на клеточную культуру, могут рассматриваться как аналоги предлагаемого способа. Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ определения цитотоксичности пылевых образцов по степени их гемолитической активности [9]. Определение гемолитической способности пыли выполняется на предварительно отмытых троекратно в изотоническом фосфатном буфере эритроцитах человека [9] или белых беспородных крыс [2] и ресуспендированных в буфере до рабочей концентрации. Исследуемые образцы пыли суспензируются в том же буфере до рабочей концентрации. Для опыта сливают вместе эритроцитарную и пылевую суспензии и инкубируют 45 минут при 37°C в водяной бане при многократном встряхивании. В контрольную пробу вместо пылевой суспензии вносят буферный раствор. Затем пробы центрифугируют и колориметрируют надосадочную жидкость. По величине оптической плотности супернатанта судят о степени выраженности цитотоксичности.
Недостатками способа-прототипа и указанных выше аналогов являются сложность и трудоемкость выполнения отдельных технологических операций, применение дорогостоящих реактивов и оборудования.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является реализация простого, чувствительного и широкодоступного способа сравнительной оценки цитотоксичности пылей. Данная задача решается благодаря использованию в качестве показателя цитотоксичности при действии определенной дозы пыли на культуру эритроцитов - повышение уровня окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) в активированном эталонном водном растворе. Предложенный способ основан на использовании известного эффекта бесконтактной активации эталонного водного раствора за счет излучения от исследуемого раствора, переведенного в термодинамически неравновесное состояние физическими, химическими или биологическими процессами. Бесконтактное воздействие наблюдается через полимерные, химически инертные диэлектрические перегородки, в результате в эталонном водном растворе при неизменном химическом составе регистрируются сдвиги окислительно-восстановительного потенциала [3, 7, 8].
Способ осуществляется следующим образом.
9
В качестве биологического материала используется стандартная эритроцитарная масса, приготовленная из донорской человеческой крови и содержащая 4×10 клеток/мл. Исследуемые образцы пыли респирабельной фракции приготовляют в виде взвеси в среде Хенкса из расчета 50,0 мг/мл.
8
Исследование проводится на измерительном комплексе, принципиальная схема которого для бесконтактной регистрации динамики физических, химических и биохимических процессов в водных растворах известна [3]. Емкость вместительностью 300 мл заполняют дистиллированной водой и закрывают крышкой с двумя отверстиями, в которые вставляют электрод редоксметрический и цилиндрическую емкость на 12 мл из полимерного материала (полипропилен, полиэтилен) с толщиной стенок 0,1-0,2 мм, с помощью термостата доводят температуру воды до 37°C. Затем в цилиндрическую емкость последовательно вносят 8,0 мл среды Хенкса, 1,0 мл эритроцитарной массы и 1,0 мл пылевой суспензии (предварительно температура указанных компонентов доводится до 37°C). Таким образом, проба содержит 4×10 эритроцитов и 5 мг пыли в 1 мл. В контрольную пробу вместо пылевой суспензии вносят 1,0 мл среды Хенкса. Затем включают механическую мешалку и на измерительно-аналитическом комплексе, состоящем из редоксметрического электрода, анализатора (pH - метр - иономер высокоточный, с расширенным диапазоном измерения ЭДС) с программным обеспечением, проводят в течение 30 минут измерение окислительно-восстановительного потенциала в эталонной дистиллированной воде. Данные измерения ОВП выводятся и обрабатываются на компьютере.
Для оценки цитотоксичности каждая проба пыли испытывается в 3 параллельных измерениях, причем наряду с вновь изучаемыми испытываются пылевые частицы, известные своей высокой, средней или низкой цитотоксичностью. Показателем цитотоксичности пыли является выраженное в процентах повышение среднего за период инкубации уровня ОВП в активированной эталонной воде по сравнению со средним уровнем ОВП в активированной эталонной воде при воздействии контрольной эритроцитарной суспензии без пыли. По средним для каждой исследуемой пыли значениям этого показателя устанавливается шкала сравнительной цитотоксичности, при этом учитывается близость показателя цитотоксичности, характеризующего вновь изучаемую пыль, к показателю, характеризующему пыль известной цитотоксичности.
Заявленный способ испытан для сравнительной оценки цитотоксичности ряда производственных пылей в сопоставлении с оценкой, полученной при использовании способа прототипа, а именно, определение цитотоксичности пылевых образцов по степени их гемолитической активности колориметрическим методом. В качестве иллюстрации приводятся результаты двух экспериментов, выполненных в пяти повторных исследованиях (см.табл.1 и 2).
В первом эксперименте заявленным способом была проведена оценка цитотоксичности практически не изученной, в отношении действия на организм, пыли летучей золы (ЛЗ) предприятий теплоэнергетики (ПТЭ), в сравнении с высокоцитотоксичной пылью природного кварца, среднецитотоксичными - пыль отвальных шлаков, конверторная пыль медеплавильного производства и слабоцитотоксичной пылью элементарной серы [1, 2, 4].
Из таблицы 1 видно, что исследуемая пыль ЛЗ ПТЭ обладает цитотоксичностью, однако она оказалась статистически значимо менее цитотоксичной, чем кварцевая пыль, и статистически значимо более цитотоксичной, чем пыль элементарной серы, и практически сходной с конверторной пылью и пылью отвальных шлаков медеплавильного производства. Таким образом, пыль ЛЗ ПТЭ по степени цитотоксичности можно отнести к группе средней цитотоксичности. Данное заключение подтверждается результатами исследования авторов по изучению биологического действия пыли ЛЗ ПТЭ в хроническом эксперименте на животных [5].
Таблица 1
Значения окислительно-восстановительного потенциала в активированной эталонной воде (в процентах от контроля, М±m)
Образцы пыли
%%
Природный кварц
512,08±18,70
Конверторная пыль
311,18±12,03<sup>*</sup> <sub>**</sub>
Металлургический шлак
334,06±10,01<sup>*</sup> <sub>**</sub>
Элементарная сера
203,50±15,26<sup>*</sup>
Летучая зола ПТЭ
301,30±19,75<sup>*</sup> <sub>**</sub>*
* - разница с кварцем статистически значима (p<0,05)
** - разница с элементарной серой статистически значима (p<0,05)
* - разница с конверторной пылью и металлургическим шлаком статистически не значима (p>0,05)
Как видно из таблицы 2, результаты второго эксперимента по определению цитотоксичности пылевых образцов по степени их гемолитической активности колориметрическим методом фактически совпадают с результатами, полученными в ходе испытания нового способа.
Таблица 2
Гемолитическая активность исследуемых образцов пыли
Образцы пыли
Гемолиз в % % от контроля (М±m)
Природный кварц
393,10±27,61
Конверторная пыль
269,03±17,10<sup>*</sup> <sub>**</sub>
Металлургический шлак
280,78±14,84<sup>*</sup> <sub>**</sub>
Элементарная сера
120,70±11,50<sup>*</sup>
Летучая зола ПТЭ
262,07±16,11<sup>*</sup> <sub>**</sub>*
<sup>*</sup> - разница с кварцем статистически значима (p<0,05)
<sup>**</sup> - разница с элементарной серой статистически значима (p<0,05)
<sup>*</sup> - разница с конверторной пылью и металлургическим шлаком статистически не значима (p>0,05)
Таким образом, заявленный способ по своей чувствительности и информативности не уступает наиболее широко применяемому прототипу, каким является оценка цитотоксичности пыли по гемолитической активности колориметрическим методом. При этом отсутствие в новом способе действий, связанных с предварительным троекратным промыванием эритроцитов в изотоническом фосфатном буфере, центрифугированием опытных и контрольных проб, определением оптической плотности супернатанта, значительно упрощает технологию определения цитотоксичности. Кроме того, в отличие от прототипа заявленный способ дает возможность оценивать динамику гемолитического процесса, развивающегося в результате взаимодействия мембраны эритроцита с пылевыми частицами, что видно на диаграмме, представленной фигурой 1.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Величковский Б.Т. Определение цитотоксичности пыли методом хемилюминесценции / Б.Т.Величковский, Л.Г.Коркина, Т.Б.Суслова // Гиг. труда, - 1983. - №5. - С.31-34.
2. Величковский Б.Т. Производственные аэрозоли в металлургии цветных металлов / Б.Т.Величковский, Б.А.Петров, Н.К.Вознесенский // Киров. - 2003. - 132 с.
3. Казанкин Д.С. Универсальный комплекс "ИКАР-ТЕСТ" для бесконтактной регистрации динамики физических, химических и биохимических процессов в водных растворах /Д.С.Казанкин, О.В.Широносов, В.Г.Широносов // Сб. тезисов ВНКСФ-13, Ростов-на-Дону - Таганрог, 20-26 апреля 2007. - С.464-465.
4. Петров С.Б. Оценка биологического действия пыли, входящей в состав атмосферных выбросов медеплавильного производства: Вятский медицинский вестник. - Спец. вып. - Материалы Всероссийской НПК "Актуальные вопросы современной биохимии". - 2007. - №4. - С.140-142.
5. Петров С.Б. Исследование биологического действия летучей золы в составе пылегазовой смеси / С.Б.Петров, Б.А.Петров, П.И.Цапок, Т.И.Шешунова // Экология человека. - 2009. - №12. - С.13-16.
6. Шарапова Н.Е. Способ сравнительной оценки цитотоксичности малорастворимых пылей по снижению активности 5'-нуклеотидазы в культуре макрофагов / Н.Е.Шарапова // Мед. труда и пром. экология. - 1994. - №8. - С.16-20.
7. Широносов В.Г. Физические основы резонансной активации воды / В.Г.Широносов // Материалы 1-го Международного симпозиума по электроактивации, г.Москва, 4-5 ноября 1997 г., стр.220-221.
8. Широносов В.Г. Резонанс в физике, химии и биологии. Монография / В.Г.Широносов. - Ижевск: Издательский дом "Удмуртский университет", 2001. - 92 с.
9. Szentei E.: Die Hamolyse durch Quarzstaub und ihre Hemmung / E.Szentei // In Buch "Ergebnisse von Untersuchungen auf dem Gebiet der Staub - und Silikosebekampfung im Steinkohlenbergbau". - Detmold, Verlag Hermann Bos-mann GmbH, 1967. - Bd 6. - S.149-156. - прототип.