ЧИПЫ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МНОЖЕСТВЕННЫХ ТРАНСДУКТОРОВ СИГНАЛОВ В РЕДКИХ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ КЛЕТКАХ

1. Способ осуществления мультиплексного высокопроизводительного иммуноанализа с особо широким динамическим диапазоном, включающий:
(a) инкубацию экстракта клеток с множеством серийных разведении первичных антител, иммобилизованных на твердом подложке и специфичных в отношении одного или более аналитов в экстракте клеток, с образованием множества связанных аналитов;
(b) инкубацию множества связанных аналитов с вторичными антителами, специфичными в отношении соответствующих аналитов, с образованием множества детектируемых связанных аналитов; детекция включает:
(1) множество не зависимых от активированности антител, меченных вспомогательным компонентом, и
(2) множество зависимых от активированности антител, меченных первым членом пары усиления сигнала,
причем вспомогательный компонент дает окисляющий агент, который достигает первого члена пары усиления сигнала и взаимодействует с ним;
(c) инкубацию множества детектируемых связанных аналитов с вторым членом пары амплификации сигнала с образование усиленного сигнала; и
(d) детекцию усиленного сигнала, созданного первым и вторым членами усиливающей сигнал пары.
2. Способ по п.1, в котором экстракт клеток включает экстракт циркулирующих клеток солидной опухоли.
3. Способ по п.2, в котором клетки выделяют из образца взятого у пациента материала путем иммуномагнитной сепарации.
4. Способ по п.3, в котором взятый у пациента образец выбирают из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюну, мочи, мокроты, промывной жидкости бронхиального лаважа, слезной жидкости, аспирата из соска, лимфы, тонкоигольного пунктата и их комбинаций.
5. Способ по п.3, в котором выделенные клетки выбирают из группы, состоящей из циркулирующих опухолевых клеток, раковых стволовых клеток циркулирующих эндотелиальных клеток, циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и их комбинаций.
6. Способ по п.3, в котором выделенные клетки стимулировали in vitro факторами роста.
7. Способ по п.6, в котором выделенные клетки перед стимуляцией факторами роста инкубировали с противораковым лекарством.
8. Способ по п.7, в котором противораковое лекарство выбирают из группы, состоящей из моноклональных антител, ингибиторов тирозинкиназы, иммуносупрессивных агентов и их комбинаций.
9. Способ по п.6, в котором выделенные клетки после стимуляции факторами роста лизировали, чтобы получить экстракт клеток.
10. Способ по п.1, в котором один или более аналитов содержат множество молекул - трансдукторов сигналов.
11. Способ по п.1, в котором твердую подложку выбирают из группы, состоящей из стекла, пластика, металлических пластин, стержней, фильтров, гранул, бумаги, мембран, пучков волокон и их комбинаций.
12. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела также содержат детектируемый компонент.
13. Способ по п.12, в котором детектируемый компонент является флуорофором.
14. Способ по п.12, в котором количество детектируемого компонента коррелирует количеством одного или более аналитов.
15. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела непосредственно мечены компонентом, опосредующим передачу сигнала.
16. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела мечены компонентом, опосредующим передачу сигнала, посредством гибридизации олигонуклеотида, конъюгированного с не зависимым от активированности антителом, с комплементарным олигонуклеотидом, конъюгированным с компонентом, опосредующим передачу сигнала.
17. Способ по п.1, в котором зависимые от активированности антитела непосредственно мечены первым членом пары усиления сигнала.
18. Способ по п.1, в котором зависимые от активированности антитела мечены первым членом пары усиления сигнала посредством связывания первого члена аффинной пары, конъюгированного с зависимым от активированности антителом, с вторым членом аффинной пары, конъюгированным с первым членом пары усиления сигнала.
19. Способ по п.18, в котором первый член аффинной пары является биотином.
20. Способ по п.18, в котором второй член аффинной пары является стрептавидином.
21. Способ по п.1, в котором компонент, опосредующий передачу сигнала, является глюкозоокидазой.
2
2
22. Способ по п.21, в котором окисляющий агент является перекисью водорода (HO)
23. Способ по п.22, в котором первый член пары усиления сигнала является пероксидазой.
24. Способ по п.23, в котором пероксидаза является пероксидазой хрена (HRP).
25. Способ по п.23, в котором второй член пары усиления сигнала является тирамидным реагентом.
26. Способ по п.25, в котором тирамидный реагент представляет собой биотин-тирамид.
27. Способ по п.26, в котором усиленный сигнал создается пероксидазным окислением биотин-тирамида с образованием активированного тирамида.
28. Способ по п.27, в котором активированный тирамид определяется непосредственно.
29. Способ по п.27, в котором активированный тирамид определяется после добавления реагента, детектирующего сигнал.
30. Способ по п.29, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является флуорофор, меченный стрептавидином.
31. Способ по п.29, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является комбинация пероксидазы, меченной стрептавидином, и хромогенного реагента.
32. Способ по п.31, в котором хромогенным реагентом является 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ).
33. Чип, обладающий особо широким динамическим диапазоном и включающий серию разведении первичных антител, специфичных к одному или более аналитам в экстракте клеток иммобилизованных на твердой подложке.
34. Чип по п.33, в котором экстракт клеток содержит экстракт циркулирующих клеток солидной опухоли.
35. Чип по п.34, в котором клетки выделяют из взятого у пациента образца путем иммуномагнитной сепарации.
36. Чип по п.35, в котором взятый у пациента образец выбирают из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюну, мочи, мокроты, промывной жидкости бронхиального лаважа, слезной жидкости, аспирата из соска, лимфы, тонкоигольного пунктата и их комбинаций.
37. Чип по п.35, в котором выделенные клетки выбирают из группы, состоящей из циркулирующих опухолевых клеток, раковых стволовых клеток циркулирующих эндотелиальных клеток, циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и их комбинаций.
38. Чип по п.35, в котором выделенные клетки стимулируют in vitro факторами роста.
39. Чип по п.38, в котором выделенные клетки перед стимуляцией факторами роста инкубировали с противораковым лекарством.
40. Чип по п.39, в котором противораковое лекарство выбирают из группы, состоящей из моноклональных антител, ингибиторов тирозинкиназы, иммуносупрессивных агентов и их комбинаций.
41. Чип по п.38, в котором выделенные клетки после стимуляции факторами роста лизируют, чтобы получить экстракт клеток.
42. Чип по п.33, в котором один или более аналитов содержат множество молекул - трансдукторов сигналов.
43. Чип по п.33, для которого твердую подложку выбирают из группы, состоящей из стекла, пластика, металлических пластин, стержней, фильтров, гранул, бумаги, мембран, пучков волокон и их комбинаций.
44. Чип по п.33, в котором каждая серия разведении первичного антитела включает по меньшей мере 3 уменьшающихся концентрации.
45. Чип по п.33, в котором каждая серия разведении первичного антитела включает по меньшей мере 6 уменьшающихся концентрации.
46. Чип по п.33, в котором первичные антитела в каждой серии разведении последовательно разводятся по меньшей мере в 2 раза.
47. Чип по п.33, когда один или более аналитов определяются в около 1 клетке.
48. Способ осуществления мультиплексного высокопроизводительного иммуноанализа с особо широким динамическим диапазоном, включающий:
(a) инкубацию экстракта клеток с множеством серийных разведении первичных антител, иммобилизованных на твердом подложке и специфичных в отношении одного или более аналитов в экстракте клеток, с образованием множества связанных аналитов;
(b) инкубацию множества связанных аналитов с вторичными антителами, специфичными в отношении соответствующих аналитов, с образованием множества детектируемых связанных аналитов;
(c) инкубацию множества детектируемых связанных аналитов с первым и вторым членами пары амплификации сигнала с образование усиленного сигнала; и
(d) детекцию усиленного сигнала, созданного первым и вторым членами усиливающей сигнал пары.
49. Способ по п.48, в котором экстракт клеток включает экстракт циркулирующих клеток солидной опухоли.
50. Способ по п.49, в котором клетки выделяют из взятого у пациента образца путем иммуномагнитной сепарации.
51. Способ по п.50, в котором взятый у пациента образец выбирают из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюну, мочи, мокроты, промывной жидкости бронхиального лаважа, слезной жидкости, аспирата из соска, лимфы, тонкоигольного пунктата и их комбинаций.
52. Способ по п.50, в котором выделенные клетки выбирают из группы, состоящей из циркулирующих опухолевых клеток, раковых стволовых клеток, циркулирующих эндотелиальных клеток, циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и их комбинаций.
53. Способ по п.50, в котором выделенные клетки стимулируют in vitro факторами роста.
54. Способ по п.53, в котором выделенные клетки перед стимуляцией факторами роста инкубируют с противораковым лекарством.
55. Способ по п.54, в котором противораковое лекарство выбирают из группы, состоящей из моноклональных антител, ингибиторов тирозинкиназы, иммуносупрессивных агентов и их комбинаций.
56. Способ по п.53, в котором выделенные клетки после стимуляции факторами роста лизируют, чтобы получить экстракт клеток.
57. Способ по п.48, в котором один или более аналитов содержат множество молекул - трансдукторов сигналов.
58. Способ по п.48, в котором твердую подложку выбирают из группы, состоящей из стекла, пластика, металлических пластин, стержней, фильтров, гранул, бумаги, мембран, пучков волокон и их комбинаций.
59. Способ по п.48, в котором вторичные антитела содержат первый член аффинной пары.
60. Способ по п.59, в котором первый член аффинной пары является биотином.
61. Способ по п.48, в котором первый член пары усиления сигнала содержит второй член аффинной пары.
62. Способ по п.61, в котором второй член аффинной пары является стрептавидином.
63. Способ по п.61, в котором первый член пары усиления сигнала является пероксидазой.
64. Способ по п.63, в котором пероксидаза является пероксидазой хрена (HRP).
65. Способ по п.63, в котором второй член пары усиления сигнала является тирамидным реагентом.
66. Способ по п.65, в котором тирамидный реагент является биотин-тирамидом.
67. Способ по п.66, в котором усиление сигнала достигается пероксидазным окислением биотин-тирамида с образованием активированного тирамида.
68. Способ по п.67, в котором активированный тирамид детектируется непосредственно.
69. Способ по п.67, в котором активированный тирамид детектируется после добавления реагента, детектирующего сигнал.
70. Способ по п.69, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является флуорофор, меченный стрептавидином.
71. Способ по п.69, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является комбинация пероксидазы, меченной стрептавидином, и хромогенного реагента.
72. Способ по п.71, в котором хромогенным реагентом является 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ).