ИЗОЛИРОВАННЫЙ ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА LACTOBACILLUS PLANTARUM TAK 59 NCIMB42150 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
ISOLATED LACTOBACILLUS PLANTARUM TAK 59 NCIMB42150 STRAIN AND ITS APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области биотехнологии и используется в пищевой промышленности. Изобретение касается силосной добавки и ее применения в брожении корма с целью увеличения качества брожения и корма.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
На данный момент в точном животноводстве с высокомолочным производством решающим моментом является обеспечение того, чтобы животные круглый год получали корм высокого качества. Было доказано, что силос является таким кормом. Силос представляет собой материал, полученный путем контролируемого брожения сельскохозяйственной культуры с высоким содержанием влаги (McDonald P., Henderson, A.R., Heron, S.J.E. 1991. The biochemistry of silage. 2nd ed. Chalcombe Publications, Marlow, Bucks UK, p. 340). В дополнение к траве и бобовым силосным кормовым растениям, зерновым культурам, зернофуражным культурам (включая маис), для корма также могут сбраживаться побочные продукты (т.е. влажная барда, пивная дробина, пульпа) производства спирта и сахара.
Силосование представляет собой совокупность нескольких различных химических и микробиологических процессов и их согласованности. Естественное брожение корма является трудно управляемым. Однако силосование считается процессом молочнокислого брожения в отсутствии кислорода (Rooke J., А. and Hatfield, G., D., 2003. Biochemistry of Ensiling. In: Silage Science and Technology. D.R. Buxton, R.E. Muck, and J.H. Harrison, eds. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA, pp. 95-139). Это означает, что в анаэробных условиях микроорганизмы (в идеале, молочнокислые бактерии) сбраживают водорастворимые углеводы до органических кислот. В подходящих условиях в процессе брожения образуется молочная кислота, вследствие чего pH силоса начинает уменьшаться. Это уменьшение pH препятствует росту и активности нежелательных микроорганизмов, и, следовательно, корм сохраняется. Чем быстрее pH силоса уменьшается до pH равного 4, тем быстрее стабилизируется корм, и тем больше питательных веществ может быть сохранено.
Успех или трудности силосования зависят от качества растительного материала, подвергаемого силосованию, и технологических способов, используемых для производства силоса. Силосование растительного материала с низким содержанием сухого вещества, и водорастворимых углеводов, а также растительного материала, который имеет низкую буферную емкость является затруднительным (Pahlow G., Rammer С., Slottner, D., Tuori M. Ensiling of legumes. In: Wilkins R. J. and Paul C. (eds): Legumes Silages for Animal Production - LEGSIL. Braunschweig, FAL, 2002, стр. 27-31). Согласно Регламенту Комиссии Европейского Союза №429/2008 от 25 апреля 2008 года, считается, что трудно силосуемыми кормовыми растениями являются те, которые содержат менее 1,5% водорастворимых углеводов (WSC), умеренно трудно силосовать кормовые растения, содержащие 1,5-3,0% WSC, и еще легче, если материал имеет содержание водорастворимых углеводов более 3% WSC. Кроме того, погодные условия также влияют на процесс силосования и на качество силоса. В субоптимальных погодных условиях растительный материал не может вянуть с целью увеличения доли сухого вещества и содержание WSC и уменьшения буферной емкости, т.е. увеличения способности растительного материала к силосованию. Трудные условия силосования также способствуют развитию нежелательных микроорганизмов (энтеропатогенов, клостридий, бацилл, грибков, листерий), которые вызывают порчу корма. К сожалению, никто не может выбрать погоду уборки урожая в течение стадии оптимальной обработки силосных культур. Химический состав силоса зависит главным образом от стадии обработки урожая и качества брожения растительного материала. Силос с низкой питательной ценностью, который выполнен из растений, собранных в поздней стадии роста, снижает производительность животных, питающихся им, пока испорченный корм не может быть скормлен животным. Показатели брожения являются важными для оценки качества силоса. Чем больше показателей для оценки успешности силосования, тем полнее общее представление о качестве корма. Наиболее важными показателями брожения являются (представлены не по порядку их значимости): концентрации этанола, летучих жирных кислот (уксусной, пропионовой, масляной кислоты) и молочной кислоты, pH и содержание аммиачного азота в общем азоте. Виды продуктов, образующихся в ходе брожения, зависят от силосной культуры, от технологических способов, используемых для производства силоса, от популяции микроорганизмов в силосуемом материале при хранении, и от воздухонепроницаемости хранилища.
Силосные добавки используются для того, чтобы положительным образом влиять на процесс силосования. Под силосными следует понимать добавки, которые улучшают молочнокислое брожение и ускоряют снижение pH в ходе силосования и/или подавляют активность нежелательных микроорганизмов в растительном материале при хранении и, следовательно, предотвращают порчу произведенных из него продуктов.
Наиболее широко распространенными силосными добавками являются ферменты, сахара, кислоты, соли и бактериальные инокулянты (Kung L., Stokes М. R., Lin С.J., 2003. Silage additives. In: Silage Science and Technology. D.R. Buxton, R.E. Muck, and J.H. Harrison, eds. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA, pp. 305-360).
Большинство силосных добавок не являются универсальными, а являются специфичными для силосной культуры или проблемы. Силосные добавки подходят для силосных культур, которые являются легко, умеренно трудно или трудно силосуемыми или для подавления действия грибков, клостридий или других микроорганизмов, которые вызывают порчу корма.
Задача применения силосных добавок заключается в том, чтобы способствовать желаемому брожению и подавлять действие нежелательных микроорганизмов. Химические добавки ограничивают брожение благодаря кислотам, которые уменьшают кислотность силосуемой культуры, или содержат другие химические вещества, которые подавляют активность нежелательных микроорганизмов. Химические силосные добавки обычно применяются в субоптимальных условиях силосования, когда достоверно не доказано положительное влияние биологических силосных добавок в таких условиях. Брожение возбуждается/усиливается биологическими силосными добавками, содержащими сахара, ферменты или молочнокислые бактерии. При добавлении силосного инокулянта на основе молочнокислых бактерий, данные полезные бактерии становятся преобладающими в растительном материале. Следовательно, конкурентоспособность молочнокислых бактерий увеличивается, и процесс брожения ускоряется. Молочная кислота, вырабатываемая молочнокислыми бактериями, обуславливает кислую среду в хранящемся силосе и обеспечивает успешное консервирование корма. Быстрое уменьшение pH подавляет активность нежелательных микроорганизмов (включая протеолитические и патогенные микроорганизмы, такие как клостридий, бациллы, листерии и энтеропатогены) в силосе. В результате чего предотвращается образование вредоносных компонентов распада недостаточного брожения (таких как аммиак и масляная кислота), которые обуславливают сниженное потребление корма и проблемы со здоровьем у домашнего скота. В силосе не желательно присутствие пропионовой кислоты, высокое содержание уксусной кислоты или этанола, вырабатываемых дрожжевыми грибками. Благодаря снижению жизнеспособности микроорганизмов, вызывающих порчу силоса, в корме сохраняются питательные вещества, которые могут использоваться в животноводческом производстве. Поскольку молочнокислые бактерии являются частью естественной микрофлоры растений, силосные добавки, основанные на молочнокислых бактериях, составляют натуральные продукты, которые легко применять, и в отличие от химических добавок они не требуют специального хранения, и не будут ни разрушаться, ни наносить вред окружающей среде. В вышеупомянутом Регламенте Комиссии Европейского Союза силосные добавки упомянуты в качестве технологических добавок.
Применение молочнокислых бактерий для повышения качества брожения силоса описано в нескольких патентных заявках и патентах.
В Европейском патенте ЕР 0369198 (J. Setala et al., Valio 1993) описана кормовая добавка, содержащая Lactobacillus plantarum DSM 4904 (AIV 755).
В заявке на Европейский патент ЕР0580236 (В.B. Ten et al., Duphar International Research B.V.) описаны штаммы микроорганизмов Lactobacillus plantarum CBS 342.92 и CBS 343.92. Они обеспечивают фактор, уменьшающий клостридий, а именно белковый фактор.
В Европейском патенте ЕР 0880323 (S.P. Mann et al., Biotal Ltd 2001) описано применение Lactobacillus buchneri (NCIMB 40788), подавляющего дрожжевые и плесневые грибки, а также бактерии, обуславливающие пористую структуру корма и силоса.
В патенте Великобритании GB 2356125 (D. Davies et al., Genus Pic, 2003) описаны Lactobacillus plantarum NCIMB 41028 и Lactobacillus paracasei sp.paracasei NCIMB 41029 (используются в брожении трудно силосуемого материала). Данные штаммы способны разлагать фруктан (состоящий из остатков фруктозы) в силосуемом материале, бедном углеводами.
В заявке на Европейский патент ЕР 2312955 (опубл. WO 2010017568) (Е.М. Binder et al, 2010) описаны силосные добавки, содержащие по меньшей мере два микроорганизма из следующих: Enterococcus faecium (DSM 3530), Lactobacillus brevis (DSM 19456), Lactobacillus plantarum (DSM 19457), Lactobacillus kefiri (DSM 19455), Trichosporon spec. nov. (DSM 14153), Trichosporon mucoides (DSM 14156), Trichosporon dulcitum (DSM 14162) и Eubacterium (DSM 11798), а также неорганическое вещество с большой площадью внутренней поверхности, например, силикат алюминия, что уменьшает микотоксины в силосе, а также выделение метана животными.
В патенте США US 6403084 (Chan R.K-F. et al., Pioneer Hi-Bred International, Inc., 2002) описано применение гомоферментативной молочной бактерии Lactobacillus plantarum совместно с гетероферментативной Lactobacillus buchneri или Lactobacillus brevis и микроорганизмом Enterococcus faecium в отношении увеличения аэробной стабильности силоса. В международной заявке WO 2006007395 (Charley R. С et al., Lallemand Animal Nutrition North America, 2006) описано применение микроорганизма Lactobacillus diolivorans для предотвращения аэробной порчи силоса.
Проблема заключается в том, что большинство силосных добавок являются специфичными к культуре, подвергаемой силосованию, а не к конкретной проблеме. Это означает, что силосная добавка подходит или для силосования культур, которые являются легко, умеренно трудно или трудно силосуемыми, или подавляет активность дрожжевых грибков, плесневых грибков или других микроорганизмов, вызывающих порчу корма.
Штаммы микроорганизмов, предлагаемые данным изобретением, подходят для силосования любых культур, т.е. культур, которые являются легко, умеренно трудно или трудно силосуемыми, подавляя активность микроорганизмов, вызывающих порчу корма.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение раскрывает изолированный штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 и корм, кормовую добавку и композицию, содержащую указанный штамм. Корм может быть сброженным кормом, например силосом. Кормовая добавка может быть силосной добавкой. В качестве других ингредиентов композиции могут быть включены подходящие вспомогательные вещества.
Следующим объектом изобретения является применение упомянутого микроорганизма для: ускорения брожения корма, увеличения концентрации молочной кислоты, снижения pH и уменьшения потери питательных веществ в корме и концентраций аммиачного азота и масляной кислоты в корме. Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 применим для силосования культур, которые являются легко, умеренно трудно или трудно силосуемыми. Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 улучшает молочнокислое брожение, в результате чего выработанная молочная кислота ускоряет снижение pH силоса.
Изобретение также раскрывает применение указанного микроорганизма для подавления активности протеолитических и патогенных микроорганизмов в корме. Например, протеолитические и патогенные микроорганизмы могут содержать энтеропатогены, клостридий и дрожжевые грибки. Указанные энтеропатогены микроорганизмы выбирают из группы, содержащей Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salmonella Enteritidis, S. entericaserovar Typhimurium, Shigella sonnei, Escherichia coli, Enterobacter sakazakii, Staphylococcus aureus и т.д. Вышеуказанные клостридий могут быть Clostridium tyrobutyricum, С. Butyricum, С. Sporogenes и т.д.
Исходя из исследований противомикробных свойств, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 подавляет рост и активность нежелательных микроорганизмов.
В результате быстрого и значительного снижения pH посредством направленного молочнокислого брожения со штаммом Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, подавляется влияние ферментов и нежелательных протеолитических патогенных микроорганизмов и продуцирование компонентов распада, выработанных ими. При применении Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 концентрации аммиачного азота и масляной кислоты (выработанных протеолитическими микроорганизмами в силосе) в корме значительно ниже по сравнению с контрольным силосом или силосом, произведенным с химическими силосными добавками. Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 также снижает концентрации этанола (выработанного дрожжевыми грибками) и концентрации уксусной кислоты (выработанной уксусными бактериями и энтеробактериями в корме).
Следующим объектом изобретения является способ продления сохранности корма путем посева Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150. Домашний скот необходимо обеспечивать высококачественным кормом с высокой питательной ценностью. Поскольку во многих странах с высокомолочным производством вегетационный период не длится весь год, необходимый корм приходится консервировать. Таким консервированным кормом является силос, произведенный в ходе анаэробного молочнокислого брожения растительного материала.
В дополнение к траве и бобовым силосным кормовым растениям, зерновым культурам, зернофуражным культурам (включая маис), побочные продукты (т.е. влажные зерновые дистилляты, пивоваренные зерновые культуры, пульпа) производства спирта и сахара также могут подвергаться брожению.
Благодаря засеву растительного материала, подвергаемого брожению, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, процесс брожения ускоряется за счет того, что вырабатывается больше молочной кислоты и за счет снижения pH корма. Это в свою очередь приведет к подавлению роста и активности нежелательных микроорганизмов в силосе и уменьшению потери питательных веществ в корме. В случае подавления активности микроорганизмов, которые вызывают порчу (включая протеолитические и патогенные микроорганизмы) в корме, сброженном вышеописанным способом, обеспечен высококачественный корм, который является стабильным и который может быть сохранен в анаэробных условиях на несколько месяцев. Это то, как можно продлить сохранность корма.
5
6
Микроорганизм Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 добавляют в корм в количестве 1×10-1×10 КОЕ/г на сброженный корм.
Описание штамма
Объект настоящего изобретения, штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum TAK 59 NCTMB42150 был изолирован в Эстонии (Пярнумаа) в силосе естественно сброженной бобовой кормовой культуры (более 75%) без использования добавок. Для определения количественного состава лактобактерий в образце силоса, из растворов была приготовлена суспензия (с убывающими концентрациями) с применением способа десятичного разведения в физиологическом растворе (0,9% NaCl); и был сделан посев на Агар Рогоза (OXOID, U.K.), который подвергался инкубации при 37°C в аэробной среде (термостат IG 150, Jouan, Франция) в течение 48 часов. Развившиеся колонии были описаны, определено подсчитанное и общее количество микробов. Для описания морфологии микробов, с помощью метода окраски бактерий по Граму были приготовлены препараты и были выполнены микроскопические исследования. Штамм был изолирован на основе колонии и морфологии клеток, характерной для Lactobacillus ssp. Затем была выполнена предварительная идентификация и детальная идентификация, описанная ниже.
Штамм Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 был депонирован в соответствии с «Депонированием микроорганизмов для целей патентной процедуры» к Будапештскому договору в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria) (NCIMB) в Соединенном Королевстве 29 мая 2013 под номером NCIMB42150.
Морфологические характеристики культуры были определены после роста в агаре MRS и питательном бульоне (OXOID). Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 является грамположительной палочкообразной неспорообразующей бактерией, палочки имеют правильную форму, обладают средней толщиной и длиной, встречаются по отдельности или парами.
Физиолого-биохимические свойства
2
2
2
Бульон MRS (для 24-48 часов) является подходящим для культивирования микробного штамма TAK 59 NCIMB42150, после которого происходит гомогенный мутящий рост. После культивирования в течение 48 часов в среде агара MRS при 37°C в микроаэробной среде (CO/O/N: 10/5/85%) колонии имели белый цвет, были выпуклыми, блестящими и с правильными границами и диаметром 1-2,5 мм.
Оптимальная температура роста штамма составляет 37°C; штамм также воспроизводится при 15°C, но не при 45°C. Оптимальная среда роста имеет pH равный 6,5.
Штамм Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 является каталаза отрицательным и оксидаза отрицательным, при необходимости гетероферментативным, не гидролизует аргинин и не вырабатывает газ во время брожения глюкозы.
Lactobacillus plantarum TAK 59 NCTMB42150 идентифицировали на основании биохимической активности с использованием тест-набора API 50CHL System (bioMerieux, Франция) в качестве Lactobacillus plantarum (совпадение с типовым штаммом: отличное, ID %-99,9, Т-индекс - 1,0).
Идентификация по последовательности: Lactobacillus plantarum (16S pPHK сходство с типовым штаммом: 99%).
Профиль брожения углеводов Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 на основании API CHL 50 описан ниже. Ферменты штамма: L-арабиноза, рибоза, D-галактоза, D-глюкоза, D-фруктоза, D-манноза, D-маннитол, D-сорбитол, метил-αD-маннопиранозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиоза, мальтоза, D-лактоза, D- мелибиоза, D-сахароза, D-трегалоза, D-мелецитоза, D-рафиноза, гентибиоза, D-тураноза, N-глюконат.
Устойчивость к антибиотикам
Способ: Восприимчивость Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 к антибиотикам испытывали с помощью Е-теста (АВ Biodisk, Сольна). Минимальную ингибирующую концентрацию определяли в соответствии с эпидемиологическими контрольными значениями, рекомендованными Европейским агентством по безопасности продуктов питания (EFSA).
Микробный штамм считается чувствительным, если его рост подавляется при концентрации, которая меньше или равна предельному значению конкретного антимикробного компонента (S> × мг/л).
Микробный штамм считается резистентным, если его рост подавляется при концентрации, которая больше граничного значения конкретного антимикробного компонента (S> × мг/л).
Штамм Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 не показал устойчивость к испытанным антибиотикам (Таблица 1.)
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ШТАММА
Профиль короткоцепочечных жирных кислот
9
2
Способ: 24-часовой штамм Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, культивированный в агаре MRS, суспендировали в физиологическом растворе в соответствии со стандартом мутности МакФарланда до 10 микробов/мл, 0,5 мл засевали на PYG (при 4,65 мл) и инкубировали в микроаэробной среде (10% CO) в термостате при 37°C в течение 24 и 48 часов.
Профиль короткоцепочечных жирных кислот определялся с помощью газового хроматографа HP 6890 Series GC System и с использованием капиллярной колонки HP-INNOWax (15 м × 0,25 мм; 0,15 мкм). Температурная программа колонки 60°C на 1 мин, 20°C/мин 120°C 10 мин, детектор (FID) 250°C (Таблица 2).
Противомикробная активность по отношению к лактобактериям и патогенам растительного происхождения.
Для оценки противомикробных свойств по отношению к патогенам использовался чашечный метод ( Р, Shchepetova J, Loivukene K, Kullisaar Т, Mikelsaar М. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entro- and uropathogens. J Appl Microbiol. 2006; 100 (6): 1324-32).
В способе окрашенной струи зона подавления роста целевого патогена измерялась в миллиметрах. Аналогично, вычисляли среднее арифметическое и стандартное отклонение на основании результатов образца, используемого согласно  et al. (2006); так, следующим образом оценивали антагонистическую активность штаммов: слабая < 20,9; средняя 21,0-23,9; сильная > 24; зона подавления в анаэробной среде (мм-с): слабая < 20,9; средняя 21,0-22,9; сильная > 23.
Зона подавления в микроанаэробной среде (мм-с): слабая < 20,9; средняя 21,0-23,9; сильная > 24.
Зона подавления в анаэробной среде (мм-с): слабая < 20,9; средняя 21,0-22,9; сильная > 23.
Противомикробная активность по отношению к клостридиям определялась следующим образом.
620нм
Супернатант был изолирован из 24-часовой культуры Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (BHI). Суспензия клостридий добавлялась в стерилизованный (фильтрацией) супернантант или в бульон BHI (положительная проба). Результаты оценивались после 48 часов при OD. Подавление роста клостридий рассчитывалось как , где
t
OD - супернатант добавлен;
C
OD - без добавления супернатанта.
Противомикробные компоненты, вырабатываемые Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, снижали рост клостридий растительного происхождения на 19,81%.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 - Улучшение качества брожения легко силосуемых кормовых растений, вместе с штамма L. plantarum TAK 59 NCIMB42150, где а этанол, г/кг сухого вещества; b - уксусная кислота, г/кг сухого вещества; с - пропионовая кислота, г/кг сухого вещества; d - масляная кислота, г/кг сухого вещества; е - молочная кислота, г/кг сухого вещества; f - pH; g - аммиачный азот от общего азота, %;
Фиг. 2 - Улучшение качества брожения умеренно трудно силосуемых кормовых растений, вместе с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, где а - этанол, г/кг сухого вещества; b - уксусная кислота, г/кг сухого вещества; с - пропионовая кислота, г/кг сухого вещества; d - масляная кислота, г/кг сухого вещества; е -молочная кислота, г/кг сухого вещества; f - pH; g - аммиачный азот от общего азота, %;
Фиг. 3 - Улучшение качества брожения трудно силосуемых кормовых растений, вместе с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, где а - этанол, г/кг сухого вещества; b - уксусная кислота, г/кг сухого вещества; с - пропионовая кислота, г/кг сухого вещества; d - масляная кислота, г/кг сухого вещества; е - молочная кислота, г/кг сухого вещества; f - pH; g - аммиачный азот от общего азота, %.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Пример 1. Улучшение качества брожения растительного материала легко силосуемых кормовых растений с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150.
Пробу готовили из смеси кормовых растений, красного клевера (Trifolium pratense L.) и тимофеевки луговой (Phleum pratense L.) при соотношении 25:75. Содержание водорастворимых углеводов в силосуемом материале составляло 3,01%. Свежие кормовые растения срезались и увядали в течение 48 часов. Увядшие кормовые растения собирали, измельчали и готовили контрольный силос. Контрольный силос был изготовлен без силосных добавок.
5
Второй силос засевали Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, а третий силос готовили с химической силосной добавкой следующего содержания: 42,5% муравьиной кислоты, 30,3% формиата аммония, 10,0% пропионовой кислоты, 1,2% бензойной кислоты, 1,0% этил бензоата и 15,0% воды. Силосуемые кормовые растения засевали Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 при концентрации 1,2×10 КОЕ/г силосующегося свежего растительного материала (корм). Пробы силоса открывали после 100 дней силосования.
Пробы анализировали в соответствии с общепринятыми способами (АОАС, 2005. Official methods of analysis of AOAC International, 18th ed. Association of Official Analytical Chemists International, Gaithersburg, MD, USA).
™
220
™
Для определения содержания сухого вещества образец силоса высушивали в термостате при 130°C до постоянной массы. Для определения содержания сырой золы образец силоса сжигали в муфельной печи при 550°C в течение 6 часов. Содержание протеина определяли анализатором Kjeltec 2300 с применением способа Кьельдаля (N×6,25). Для определения нейтрально-детергентной клетчатки (NDF) и кислотно-детергентной клетчатки (ADF) использовали способ, описанный Ван Соестом и др. (Van Soest, P. J., Robertson, J. В., Lewis, B. A. 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition - J. Dairy Sci. 74: 3583-3597), a также анализатор клетчатки ANCOM. Для определения содержаний кислоты и этанола в силосе использовали газовый хроматограф Agilent 7890А. Содержание аммиачного азота от общего азота определяли анализатором Kjeltec 2300. Для определения pH силоса использовали pH-метр Hanna Instruments pH 210.
В сравнении с контрольным силосом, микроорганизм Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 улучшал брожение силоса (см. Таблицу 4 и Фиг. 1). Инокуляция штаммом Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 увеличивала содержание молочной кислоты и уменьшала pH до 4,1. Таким образом, в силосе подавлялся рост и активность нежелательных микроорганизмов, что выражается в меньшем содержании этанола (вырабатываемого дрожжевыми грибками) и уксусной кислоты (вырабатываемой уксусными бактериями и энтеропатогенами). Силос, полученный с использованием Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, имел более низкое содержание аммиачного азота и масляной кислоты (вырабатываемых протеолитическими микроорганизмами).
Несмотря на условия, способствующие легкому силосованию в вышеупомянутом примере, показатели качества брожения силоса (посредством естественной популяции лактобактерий) были хуже, чем силоса с добавлением Lactobacillus plantarum TAK 59.
Следовательно, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 улучшал брожение силосной массы, которая являлась легко силосующейся, и тем самым улучшал качество корма. Более существенное уменьшение pH подавляло рост и активность нежелательных протеолитических микроорганизмов и энтеропатогенов, которые вызывают порчу, и тем самым уменьшало потери питательных веществ в корме. В корме, сброженном таким образом, подавляется активность микроорганизмов, вызывающих порчу, pH остается низким и корм хранится в анаэробных условиях на несколько месяцев.
Пример 2. Улучшение качества брожения умеренно трудно силосуемых кормовых растений с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150.
5
Пробу готовили из смеси кормовых растений, овсяницы луговой (Festuca pratensis) и тимофеевки луговой (Phleum pratense L.) при соотношении 50:50. Свежие кормовые растения срезались и увядали в течение 48 часов. Увядшие кормовые растения собирали, измельчали и готовили контрольный силос. Содержание водорастворимых углеводов в силосуемом материале составляло 2,15%. Контрольный силос был изготовлен без силосных добавок. Второй силос засевали Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, а третий силос готовили с химической силосной добавкой следующего содержания: 76,0% муравьиной кислоты, 5,5% формиата аммония, 18,5% воды. Силосуемые кормовые растения засевали Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 при концентрации 2,4×10 КОЕ/г свежего растительного материала (корм). Пробы силоса открывали после 90 дней силосования.
Пробы анализировали в соответствии со способами, описанными в первом примере.
Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 улучшал качество брожение силоса из сбраживаемой массы, которая является умеренно трудно силосуемой (Таблица 5 и Фиг. 2). При содержании сухого вещества 36%, вместе с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 уровень pH составлял 3,9; соответствующий показатель pH силоса без силосной добавки составлял 4,2. pH силоса напрямую связан с содержанием молочной кислоты, следовательно, в силосе, приготовленном вместе с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, продуцировалось больше молочной кислоты и он имел более низкий уровень pH. Это означает, что инокуляция штаммом Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 ускоряла молочнокислое брожение в корме и предотвращала выработку продуктов брожения, которые могли образовываться в связи с нежелательным брожением силоса. При более быстром брожении потери питательных веществ были меньше. По сравнению с контрольным силосом, инокуляция Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 уменьшала содержание этанола, уксусной кислоты, масляной кислоты и аммиачного азота в силосе. Содержание масляной кислоты уменьшалось в 5,2 раза, а аммиачного азота и этанола в 1,5 и 1,8 раза, соответственно.
Таким образом, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 улучшал брожения силосной культуры, которая являлась умеренно трудно силосуемой, улучшая тем самым качество корма. Более существенное уменьшение pH подавляло рост и активность нежелательных протеолитических микроорганизмов и энтеропатогенов, которые вызывают порчу, и, следовательно, уменьшая потери питательных веществ в корме. В корме, сброженном таким образом, подавляется активность микроорганизмов, вызывающих порчу, pH остается низким и стабильным, а качество корма сохраняется в анаэробных условиях на несколько месяцев.
Пример 3. Улучшение качества брожения трудно силосуемых кормовых растений с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150.
Силосная добавка Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 также оказывает действие в условиях, трудных для силосования, и проба, использующая смесь кормовых растений, красного клевера (Trifolium pratense L.) и тимофеевки луговой (Phleum pratense L.) была изготовлена для того, чтобы продемонстрировать это. Их подходящее соотношение составляло 25:75. Свежие кормовые растения собирали, измельчали и готовили контрольный силос. Содержание водорастворимых углеводов в собранном материале составляло 0,91%. Контрольный силос был изготовлен без силосных добавок, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 засевали во второй силос, а третий силос готовили с химической силосной добавкой следующего содержания: 42,5% муравьиной кислоты, 30,3% формиата аммония, 10,0% пропионовой кислоты, 1,2% бензойной кислоты, 1,0% этил бензоата и 15,0% воды.
5
Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 засевали в силосуемые кормовые растения при концентрации 1,2×10 КОЕ/г свежего материала (корма). Пробы силоса открывали после 100 дней силосования.
Пробы силоса анализировали в соответствии со способами, описанными в первом примере.
Трудно силосуемые кормовые растения характеризуются низким содержанием сухого вещества и сахара, а также тем, что силос, приготовленный без силосной добавки, демонстрирует очень низкие показатели брожения (Таблица 6, Фиг. 3). Контрольный силос содержал много масляной кислоты и аммиачного азота, что указывает на обширный протеолиз в ходе брожения. В контрольном силосе содержание масляной и молочной кислоты было приблизительно одинаковым, из которых первое считалось слишком высоким, а второе слишком низким; такой силос не может быть скормлен животным. С другой стороны, силос, приготовленный с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, содержал вдвое больше молочной кислоты, а содержание масляной кислоты (вырабатываемой клостридиями) было незначительным. При силосовании кормовых растений, которые являются трудно силосуемыми, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 снижал pH силоса до 4,4, при этом pH контрольного силоса составлял 5,1. Аналогичным образом, по сравнению с контрольным силосом, силос, приготовленный с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, обладает лучшими показателями для аммиачного азота, пропионовой кислоты и этанола. Силосы, инокулированные молочнокислыми бактериями Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, были однородными в отношении качества, при этом соответствующие показатели контрольного силоса значительно менялись. В отличие от контрольного силоса, pH силоса, приготовленного с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCTMB42150, в ходе брожения снижался быстрее, и на большую величину, и подавлялся рост и активность нежелательных микроорганизмов, а потери питательных веществ в корме уменьшались.
Таким образом, Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 улучшал брожение кормовых растений, которые являются трудно силосуемыми, тем самым улучшал качество корма. Более существенное уменьшение pH подавляло рост и активность нежелательных протеолитических микроорганизмов и энтеропатогенов, которые вызывают порчу, и тем самым уменьшало потери питательных веществ в корме. В корме, сброженном таким образом, подавляется активность микроорганизмов, вызывающих порчу, pH остается низким и стабильным, а качество корма сохраняется в анаэробных условиях на несколько месяцев.
Во всех трех примерах показатели молочной кислоты и аммиачного азота были также лучше у силосов, приготовленных с Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150, чем у силосов, приготовленных с химическими силосными добавками. Это еще раз указывает на эффективность Lactobacillus plantarum TAK 59 NCIMB42150 при силосовании силосных культур с различными степенями трудности силосования.