УКОРОЧЕННАЯ СЕКРЕТИРУЕМАЯ АСПАРТИЛ-ПРОТЕИНАЗА 2
CURTAILED SECRETABLE ASPARTYL-PROTEINASE 2

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к укороченной форме секретируемой аспартил-протеиназы 2 (Sap2), а также к молекулам нуклеиновой кислоты, которые ее кодируют. Такой укороченный Sap2 полипептид (tSap2) очень стабилен, имеет полную иммуногенность при интравагинальном применении и обеспечивает полную защиту по отношению к контрольному интравагинальному заражению грибом рода Candida. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит tSap2, и к применению tSap2 при получении указанной композиции.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Инфекции, вызываемые Candida albicans и другими родственными видами, продолжают устойчиво распространяться по всему миру (Nyirijesy American Family Physician (2001) 63:697-702). Широкий спектр кандидозов и их клинических форм стимулирует повышенный интерес к пониманию разнообразия грибов и компонентов системы клетка-хозяин, участвующих в патогенезе этих заболеваний. С.albicans является симбионтом человека, его взаимодействие с иммунной системой хозяина играет важную роль как при симбиозе, так и в управлении указанной инфекцией. Для целей создания иммунологических средств борьбы с кандидозами были исследованы несколько потенциальных антигенных мишеней, ответственных за реакцию хозяина на воздействие С.albicans. К наиболее изученным антигенным мишеням относятся маннопротеины (МП), некоторые из которых имеют адгезивные или рецепторподобные функции, белки теплового шока, енолаза (фосфопируватгидратаза) и секретируемые аспартил-протеиназы (Sap) (Schaller et. al., J. of Invet. Dermatology (2000) 114: 712-717). Наряду с недавними достижениями в области механизмов противокандидозных иммунных ответов эти исследования легли в основу дальнейшего изучения в сфере избирательного применения некоторых вышеописанных мишеней в качестве потенциальных терапевтических или профилактических вакцин, а также для получения антител для пассивной вакцинации.
Ранее было установлено, что для развития инфекции вида C.albicans крайне необходима экспрессия одного из белков семейства Sap - Sap2, a интравагинальная или даже назальная иммунизация полноразмерным Sap2 дикого типа придает повышенную степень защиты против инфекции Candida (de Bernardis, Infect and Imm.(2002) 70, 2725-2729). Однако было показано, что белок Sap2 дикого типа обладает ферментативной активностью, очень нестабилен и потенциально токсичен (Schaller et al., Infect and Imm (2003), 71, 3227-3234), что ограничивает выбор вакцин.
Таким образом, существует потребность в антигене Sap2, который способен эффективно вызывать опосредованные антителами и клеточные иммунные реакции на C.albicans и не имеющий недостатков, которые присутствуют у полноразмерного Sap2 дикого типа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение удовлетворяет указанным потребностям в получении, обеспечивает укороченный полипептид Sap2 дикого типа (tSap2). tSap2 согласно настоящему изобретению стабилен, имеет высокую иммуногенность при интравагинальном применении и обеспечивает полную защиту по отношению к контрольному интравагинальному заражению грибом рода Candidas.
В своем первом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, который содержит в себе любую из следующих аминокислотных последовательностей:
(a) аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1 на протяжении всей длины SEQ ID NO:1, причем указанная аминокислотная последовательность соответствует полипептиду, функционально эквивалентному полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(c) аминокислотную последовательность, которую кодирует последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется при жестких условиях гибридизации с последовательностью, комплементарной SEQ ID NO:2, причем указанная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 15 аминокислот и соответствует полипептиду, который функционально эквивалентен полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1;
(d) аминокислотная последовательность, которая является фрагментом аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1, и где вышеуказанная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 15 аминокислот в длину и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
при этом последовательность аминокислот указанного полипептида, который содержит любую из последовательностей аминокислот (a)-(d), не соответствует SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:7.
В предпочтительном варианте реализации полипептид согласно настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, который включает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из следующих вариантов:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO:2;
(b) последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна последовательности (а);
(c) последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(d) последовательность нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO:2 на протяжении всей длины SEQ ID NO:2, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(e) последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью (b), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 45 нуклеотидов и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1;
(f) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ ID NO:2, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 45 нуклеотидов и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1;
при этом последовательность указанного полинуклеотида не представляет собой последовательности SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:8.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO:2.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, который содержит полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вышеуказанный вектор.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один полипептид и/или по меньшей мере один полинуклеотид согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте реализации указанная композиция представляет собой препарат вакцины. Дополнительно, композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или более дополнительный компонент, выбранный из эксципиента, растворителя, адъюванта, виросомы и т.п.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно настоящему изобретению в качестве иммуногена и/или антигена. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению применяют в препарате вакцины. Более того, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного указанного полипептида и/или по меньшей мере одного указанного полинуклеотида согласно настоящему изобретению при получении фармацевтического препарата для лечения или профилактики инфекции Candida. Предпочтительно инфекция Candida представляет собой инфекциию Candida albicans.
Применение согласно настоящему изобретению подразумевает использование одного или более дополнительного компонента, выбранного из: наполнителя, разбавителя, адъюванта, носителя и т.п. Предпочтительно в качестве носителя применяют виросому. Если в качестве носителя используют виросому, то полипептид и/или полинуклеотид согласно настоящему изобретению могут быть связаны с поверхностью виросомы. В качестве альтернативы или дополнительно полипептид и/или полинуклеотид может содержаться в полости виросомы. Еще одной альтернативой служит применение полипептида и/или полинуклеотида согласно настоящему изобретению совместно с виросомой, причем указанную виросому применяют в качестве отдельного компонента.
В предпочтительном варианте реализации инфекция Candida затрагивает слизистые оболочки и/или весь организм. В другом предпочтительном варианте реализации инфекция Candida затрагивает слизистую оболочку, а заболевание, вызванное указанной инфекцией, выбрано из вульвовагинального или эзофагеального кандидоза.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к набору, который содержит по меньшей мере один полипептид и/или по меньшей мере один полинуклеотид согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте реализации указанный набор предназначен для диагностики инфекции Candida in vitro. Предпочтительно инфекция Candida представляет собой инфекцию Candida albicans. Указанный набор согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать реагент для обнаружения комплексов, включающих указанный полипептид. Предпочтительно выявление комплексов осуществляют с применением способа анализа, выбранного из группы иммуногистохимических способов анализов, иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноферментного анализ (RIA), анализа Вестерн-блотинг (Western blot analysis), анализа с применением сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS analysis), иммунофлуоресцентного анализа и иммуноанализа с эмиссией света.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 демонстрирует повышенную стабильность препарата укороченной Sap2 (tSap2) по сравнению с активной формой фермента Sap2 дикого типа. 3 мкг (для способа электрофореза в SDS-ПААГ) или 0,3 мкг (для Вестерн-блот) рекомбинантно экспрессированных Sap2 и tSap2 подвергали инкубации в фосфатном буферном растворе (ФРБ) в течение разных промежутков времени (от 30 мин до 24 или 48 ч) при комнатной температуре и при 37°С. После инкубации оба препарата подвергали электрофорезу в SDS-ПААГ и окрашивали Кумасси синим. Фигура 1А: результаты SDS-ПААГ электрофореза tSap2, окрашенного Кумасси синим при комнатной температуре (слева) и при 37°С (справа). Фигура 1В: результаты SDS-ПААГ электрофореза Sap2, окрашенного Кумасси синим при комнатной температуре (слева) и при 37°С (справа). Фигура 1C: результаты Вестерн-блота tSap2 с поликлональной анти-Sap2.
Фигура 2 демонстрирует, что укороченный Sap2 (tSap2) индуцирует более высокий уровень антител в вагинальной жидкости иммунизированных крыс по сравнению с активной в формой фермента Sap2 (Sap2) дикого типа. Было обнаружено, что в основном увеличивается выработка иммуноглобулина А, главного иммуноглобулина, участвующего в защитных свойствах слизистых оболочек. С помощью ELISA измерили уровень антител в вагинальной жидкости крыс, прошедших иммунизацию препаратом Sap2 дикого типа, и крыс, прошедших иммунизацию препаратом укороченной рекомбинантной Sap2 (tSap2). Наличие антител в вагинальной жидкости выражали в единицах спектральной поглощательной способности, которую считывали при λ=405 нм.
На Фигуре 3 показано, что на экспериментальной модели контрольного заражения животных, иммунизация крыс белком (tSap2) укороченной формы приводит к подавлению вагинальной инфекции C.albicans быстрее, чем лечение белком (Sap2) дикого типа. Две группы по пять женских особей оварэктомированных крыс троекратно с недельными интервалами иммунизировали интравагинальным путем: одна группа получала 100 мкг/доза Sap2 дикого типа (квадраты), в то время как другая - 50 мкг/доза Sap2 укороченной формы (треугольники). Спустя одну неделю после последней иммунизации всех крыс инфицировали вызывающей вагинопатию дозой C.albicans штамма SA-40. Клиренс клеток гриба у обработанных крыс оценивался путем подсчета колоний образующих единиц (КОЕ) C.albicans в вагине через 21 день после заражения. В частности, дрожжевые клетки (1 мл образца вагинальной жидкости) культивировали на агаре Сабуро, содержащем хлорамфеникол, при температуре 28°С в течение 72 ч, а затем их подсчитывали.
Фигура 4 показывает, что полученные на основе виросом препараты, содержащие Sap2 белок, индуцируют более высокий уровень анти-Sap2 иммуноглобулинов G и А в вагине иммунизированных крыс, чем усеченный белок сам по себе. Уровень антител оценивали с помощью ELISA, который проводили в пулах вагинальной жидкости крыс, обработанных различными препаратами. Наличие антител в вагинальной жидкости выражали в единицах спектральной поглощательной способности, которую считывали при λ=405 нм.
Фигура 5 показывает, что в вагине инфицированных крыс укороченный белок, связанный с виросомами, обеспечивает более высокую скорость клиренса инфекции по сравнению с самим белком. Скорость клиренса оценивали путем мониторинга состояния вагинальной инфекции у иммунизированных и зараженных крыс. Колониеобразующие единицы (КОЕ) подсчитывали через 1, 2, 7, 13, 21 и 28 дней после заражения.
На фигуре 6 показано, что укороченный белок в комплексе с виросомами обеспечивает более высокую скорость инфекционного клиренса, чем тот же белок сам по себе. Добавление мукозного адъюванта HLT (термолабильного токсина F.Coli) к препарату на основе виросом не дает какого-либо преимущества относительно защитных реакций организма. За течением вагинальной инфекции наблюдали в течение 28 дней.
Фигура 7 демонстрирует эффект инравагинального введения моноклональных антител (mAbs), направленных на tSap2 (NL2/2A8 и NL2/9b9). Изотипически сходное неспецифичное антитело (моноклональное антитело к енолазе; NL2/7C9), так же как и штамм SA40 C.albicans, служили в качестве контроля. Специфичность каждого моноклинального антитела проверяли способом Вестерн-блота; за 30 мин до заражения интравагинально вводили все моноклональные антитела в одинаковых концентрациях, рассчитанных по белку. Оба моноклональных антитела к tSap2 (NL2/2A8 и NL2/9b9) обеспечивали защитные свойства у крыс за счет индуцирования очень быстрого клиренса клеток гриба из вагины по сравнению с контрольными крысами, то есть с теми, которые получили только клетки C.albicans или моноклональное антитело к енолазе. В условиях теста эффект моноклональных антител к Sap2 в значительной степени сопоставим с действием флуконазола, популярного противогрибкового препарата, или пепстатина, хорошо известного Sap-ингибитора.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
th
nd
Аминокислоты и аминокислотные остатки, описанные в данном документе, обозначены согласно принятым одному или трем буквенным кодам, которые описаны в учебниках, хорошо известных специалистам в данной области: Stryer, Biochemistry, 4 Ed., Freeman and Co., New York, 1995 и Creighton, Proteins, 2 Ed., Freeman and Co., New York, 1993. В данном документе термины «пептид» и «полипептид» используют как синонимы и их значение, в широком смысле слова, относится к молекуле, состоящей из двух или более аминокислотных остатков или аналогов аминокислот. Остатки аминокислот могут быть соединены пептидными связями или в качестве альтернативы другими связями, например сложноэфирными, эфирными и т.д. В данном документе оба термина «аминокислота» и «аминокислотный остаток» относятся к естественным и/или искусственным или синтетическим аминокислотам, включающим как D, так и L энантиомерные формы и аналоги аминокислот.
Термины «tSap2», « tSap2 полипептид» и «tSap2 белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к укороченной форме Sap2 белка дикого типа, из которого удалены 76 аминокислот с N-конца. Термины «Sap2», «Sap2 полипептид/белок», «Sap2 дикого типа» и «Sap2 полипептид/белок дикого типа» используют взаимозаменяемо и они относятся к нативной полноразмерной форме Sap2 (форме дикого типа), которая соответствует SEQ ID NO:3. Sap2 дикого типа состоит из 398 аминокислот, первые 56 из которых кодируют предварительную (prepro) последовательность, а остальные аминокислоты (57-398) кодируют зрелую форму Sap2.
«Идентичность последовательности» родственных полипептидов и полинуклеотидов можно определить посредством стандартных методик. Как правило, используют специальные компьютерные программы с алгоритмами, учитывающими особые требования. Чтобы определить идентичность между двумя последовательностями, для целей настоящего изобретения использовали BLASTP-программу (для сравнения аминокислотных последовательностей) и BLASTN-программу (для сравнения последовательностей нуклеотидов), как описано, например, Altschul S et al., Nucl Acid Res 25: 3389-3402 (1997). BLAST-программу можно получить в Национальном Центре Биотехнологической Информации (НЦБИ) и других источниках (например, BLAST-справочник, Altschul S et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al., J. Mol. 215: 403-410 (1990)). Для целей настоящего изобретения использовали BLASTN- и BLASTP-алгоритмы со следующими настройками:
BLASTN
Параметры оценки: Совпадение/Несовпадение 1, -2
Цена разрыва: Присутствие: 5, Расширение: 2
Фильтры и Маскирование: Выбрана зона низкой сложности
Специфичные видовые повторы для: выбраны (человек)
Шаблон для таблицы соответствия только - выбраны
Шаблон строчных букв не выбран
BLASTP
Параметры оценки:
Матрикс: BLOSUM62
Цена разрыва: Присутствие: 11, Расширение: 1
Поправки к составу: статистика на основе состава
Фильтры и Маскирование: ни один не выбран
Расширенные программные опции
-G Значение для открытого промежутка [целое число]
По умолчанию =5 для нуклеотидов 11 для белков
-Е Значение для расширения промежутка
По умолчанию =2 нуклеотиды 1 белки
-q Штраф при несовпадении нуклеотида [целое число]
По умолчанию =-3
-r Успех при совпадении нуклеотида [целое число]
По умолчанию =1
-е ожидать значение [вещественное число]
-W длина машинного слова [целое число]
По умолчанию =11 нуклеотиды 3 протеины
-у Расхождение (X) для BLAST-расширений в битах (по умолчанию, если зеро)
По умолчанию =20 для BLASTN 7 для других программ
-X Расхождение значения Х для промежуточного выравнивания (в битах)
По умолчанию =15 для всех программ, кроме BLASTN, для которого не применимо
-Z Окончательное расхождение значения Х для промежуточного выравнивания (в битах)
50 для BLASTN 25 для других программ
Для сравнения последовательностей в качестве последовательности, с которой сравнивают родственную последовательность, применяли полные последовательности tSap2 (SEQ ID NO:1 и 2 соответственно). А именно, чтобы определить степень идентичности полипептида неизвестной природы по отношению к tSap2 полипептиду согласно настоящему изобретению, аминокислотную последовательность вышеупомянутого первого полипептида сравнивают с аминокислотной последовательностью полипептида tSap2, с последовательностью SEQ ID NO:1 на всем протяжении SEQ ID NO:1. Аналогично определяли идентичность полинуклеотида неизвестного происхождения по отношению к полинуклеотиду tSap2 согласно настоящему изобретению, последовательность нуклеиновой кислоты вышеупомянутого первого нуклеотида сравнивают с последовательностью нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ ID NO:2 на всем протяжении SEQ ID NO:2.
Эталон «жестких условий» для гибридизации соответствовал описанному у Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000). К примеру жестких условий гибридизации относятся обработка 0.1 М раствором хлорида и цитрата натрия /0,1% раствором додецилсульфата натрия в течение 15 мин при температуре 68°С.
Полипептид считается «функционально эквивалентным» по отношению к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, если он по существу имеет те же характеристики, что и полипептид tSap2 с последовательностью SEQ ID NO:1. «По существу те же характеристики» значит, что по меньшей мере одно из свойств, которое может быть приписано tSap2 (такие, как повышение стабильности, увеличение антигенности по сравнению с Sap2 дикого типа), также присутствует у функционально эквивалентного полипептида. Стабильность полипептида можно определить следующим образом: полипептид подвергают инкубации в течение разных промежутков времени, а затем окрашивают Кумасси синим (см. Пример 1, Фигура 1). Стабильность увеличивается по сравнению со стабильностью Sap2 дикого типа, если функционально эквивалентный полипептид поддается обнаружению в течение более длительного времени или присутствует в большем количестве после аналогичного периода времени, что и Sap2 дикого типа. Антигенность полипептида можно определить путем измерения титра антител, полученных при иммунизации животных, как, например, в модели вагинальной инфекции Candida у крыс (см. Пример 4 и 5). Антигенность «увеличивается» по сравнению с антигенностью Sap2 дикого типа, если функционально эквивалентный полипептид вызывает более высокие титры иммуноглобулина А и иммуноглобулина G, чем Sap2 дикого типа (см. Фигуру 2).
Отдельные аминокислоты tSap2 полипептида можно консервативным образом заменить аминокислотами эквивалентного размера, заряда и/или полярности. Более того, к любому концу tSap2 полипептида можно присоединить соответствующий линкер или метку (например, гистидиновую метку), чтобы способствовать внедрению tSap2 в носитель и/или слиянию с антигенами-мишенями и/или облегчить очистку и/или обнаружение tSap2.
Термин «эпитоп», используемый в данном документе, относится к тем участкам молекулы, которые распознаются Т и В клеточными рецепторами. Термин «антиген» используют в данном документе для описания молекулы, которая связывается с Т клеточным рецептором или антителом и иммуногенность которой можно повысить или усилить с помощью адъювантов, описанных в данном документе.
Термин «адъювант» относится к веществу, которое отлично от антигена-мишени и способно усиливать активацию эффекторных клеток иммунного ответа. Под термином «адъювантная система» понимают комбинацию различных иммуностимулирующих белков, таких как полипептид tSap2 согласно настоящему изобретению с адъювантами, например хемотоксинами или термолабильными токсинами, с целью увеличить эффект стимулирования иммунной системы; по сравнению с эффектом каждого компонента системы, применяемого отдельно, так же как и их комбинацию с соответствующей системой носителей (виросомы), что дополнительно может увеличить стимулирующий иммунный эффект.
Термин «введение» или «применение» означает использование одного или более tSap2 полипептидов или белоксодержащих композиций согласно настоящему изобретению в качестве лекарства, пролекарства, метаболита лекарства или вакцины индивидуумом, который в этом нуждается. Вакцина представляет собой антигенный препарат, который применяют для формирования иммунитета против заболевания. Препарат вакцины обычно содержит антиген, состоящий из целых вызывающих заболевание организмов (убитых или ослабленных) или частей таких организмов (например, антигенный белок или ДНК), и применяется для формирования иммунитета против заболевания, которое вызывает вышеуказанный организм. Вакцины бывают натуральными, синтетическими или полученными способом рекомбинантных ДНК. Вакцины могут быть терапевтическими и профилактическими (например, для предотвращения или облегчения течения будущей инфекции, вызванной любым естественным или «диким» патогенном).
«Эффективное количество» - это количество фармацевтического препарата, которое само по себе или с дополнительными дозами стимулирует желаемый ответ.
В данном документе термин «виросома» относится к полученной in vitro везикуле, которая состоит из липидов и по крайней мере одного белка оболочки вирусного. Липиды получают или из биологического источника (например, из яиц, растений, животных, клеточных культур, бактерий, вирусов), или синтетическим путем (химический синтез). Виросома может быть восстановленной оболочкой вируса, которую можно получить из разных вирусов и которая не содержит инфекционного нуклеокапсида и генетического материала исходного вируса, например, такой, как иммуностимулирующая восстановленная виросома гриппа (IRIV). Таким образом, виросома - это особый тип липидной везикулы, заключающей в своей липидной мембране по меньшей мере один белок оболочки вируса. В данном документе под термином «белок оболочки вируса» подразумевают любой белок, кодируемый оболочечным вирусом, который частично или полностью служит источником для виросомы согласно настоящему изобретению, а указанный белок находится в липидной мембране виросомы. Иногда белки оболочечных вирусов функционируют как «вирусные белки слияния», когда они участвуют в слиянии вирусов или виросом с мембранами клеток-мишеней. Белки оболочки могут быть рекомбинантными белками при условии, что биохимические свойства белка позволяют физически соединить его с липидной мембраной. Такие оболочечные белки отвечают за функциональные свойства виросом. Используемая в настоящем изобретении виросома также может быть химерной виросомой, которая состоит из белков оболочечных вирусов, происходящих по меньшей мере от двух разных штаммов вирусов. В отличие от вирусных систем виросомы безопасны, поскольку удален инфекционный нуклеокапсид вируса.
Полипептиды
Настоящее изобретение обеспечивает укороченный Sap2 полипептид, который содержит любую из следующих аминокислотных последовательностей:
(a) аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(b) аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1 на всем протяжении SEQ ID NO:1, причем указанная последовательность аминокислот кодирует полипептид, функционально эквивалентный полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1;
(c) аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью, комплементарной SEQ ID NO:2, причем вышеуказанная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 15 аминокислот и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(d) аминокислотную последовательность, которая является фрагментом аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, причем вышеуказанная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 15 аминокислот и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
при этом последовательность полипептида, который содержит любую из последовательностей аминокислот (a)-(d), не представляет собой последовательность SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:7.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения полипептид имеет последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO:1.
Согласно другим предпочтительным вариантам реализации полипептид (b) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Также предпочтительно использовать полипептиды, которые состоят из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации последовательность аминокислот (с) и (d) имеет длину по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот.
Полинуклеотиды
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает полинуклеотид, кодирующий укороченный полипептид Sap2 (tSap2), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из нижеследующих:
(a) последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ ID NO:2;
(b) последовательности нуклеиновой кислоты, которая комплементарна последовательности (а);
(c) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(d) последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, соответствующей SEQ ID NO:2 на всем протяжении SEQ ID NO:2, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1;
(e) последовательности нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью (b), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 45 нуклеотидов в длину и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1;
(f) последовательности нуклеиновой кислоты, которая является фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ ID NO:2, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 45 нуклеотидов в длину и кодирует полипептид, который функционально эквивалентен полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:1;
при этом указанный полинуклеотид не имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:8.
В предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO:2.
Согласно дополнительному предпочтительному варианту реализации указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2. Также предпочтительно применять полинуклеотид, который состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации последовательность нуклеиновой кислоты (е) и (f) имеет длину по меньшей мере 60, 75, 90, 195, 120, 135, 150, 300, 450, 600, 750 или 900 нуклеотидов.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, который содержит полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит вышеуказанный вектор.
Композиции и способы применения
Настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один полипептид и/или по меньшей мере один полинуклеотид согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте реализации указанная композиция представляет собой препарат вакцины. Дополнительно композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или более дополнительный компонент, выбранный из эксципиента, растворителя, адъюванта, виросомы и т.п.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно настоящему изобретению в качестве иммуногена и/или антигена. В предпочтительном варианте реализации полипептид согласно настоящему изобретению применяют в препарате вакцины. Более того, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного полипептида и/или по меньшей мере одного полинуклеотида согласно настоящему изобретению при получении фармацевтической композиции для лечения или профилактики инфекции Candida. Предпочтительно инфекция Candida представляет собой инфекцию Candida albicans.
Применение согласно настоящему изобретению может включать применение одного или более дополнительного компонента, выбранного из наполнителя, разбавителя, адъюванта, носителя и т.п. В предпочтительном варианте реализации в качестве носителя применяют виросому. Если в качестве носителя применяют виросому, то полипептид и/или полинуклеотид согласно настоящему изобретению могут быть связаны с поверхностью виросомы. В качестве альтернативы или в качестве дополнения, указанные полипептид и/или полинуклеотид могут содержаться в полости виросомы. Еще одной альтернативой служит применение полипептида и/или полинуклеотида согласно настоящему изобретению совместно с виросомой, когда виросому применяют в качестве отдельного компонента.
В предпочтительном варианте реализации инфекция Candida поражает слизистые оболочки и/или весь организм. В другом предпочтительном варианте реализации инфекция Candida представляет собой инфекцию слизистой, а заболевание, вызванное указанной инфекцией, выбрано из вульвовагинального или эзофагеального кандидоза.
Настоящее изобретение обеспечивает новую в предпочтительном варианте реализации пептидную вакцину против кандидозов, которая не несет риска побочных токсических эффектов, связанных с использованием Sap2 дикого типа, и демонстрирует более высокую стабильность по сравнению с Sap2 дикого типа, в то же время обеспечивая мощную стимуляцию иммунных реакций по отношению к инфекции C.albicans. Укороченная стабильная форма Sap2, которую можно синтезировать способом рекомбинантных ДНК, решает хорошо известные проблемы, связанные с получением, очисткой и стандартизацией природного антигена (de Bernardis, Infect and Imm. 2002 70, 2725-2729). Соответственно, новый Sap2 полипептид, у которого отсутствуют первые 76 аминокислот N-конца полипептида дикого типа, можно без труда синтезировать в клетках прокариот или эукариот в виде рекомбинантного продукта, в качестве варианта в виде 6-гистидин-меченного белка для облегчения очистки. Укороченный полипептид Sap2 (tSap2) согласно настоящему изобретению обладает высокой стабильностью. Указанный рекомбинантный tSap2 высокореактивен в вестерн-блотах как с моноклинальными антителами, которые вырабатываются против нативного Sap2, так и с анти-Sap антителами, присутствующими в сыворотке крови инфицированных пациентов. Более того, моноклональные антитела, активные в отношении tSap2, распознают фермент дикого типа.
Иммунизация tSap2 обеспечивает антитело-опосредованную защиту по отношению к инфекции С.albicans в экспериментальной модели вагинитов у крыс. Настоящее изобретение показывает, что моноклональные антитела, направленные на tSap2 полипептид, обеспечивают пассивную защиту в отношении вагинального заражения грибами (Фигура 7). Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новые средства для активной и пассивной защиты от очень распространенной, часто хронической и иногда не поддающейся лечению микотической инфекции у женщин.
Для дальнейшего усиления иммуностимулирующего эффекта tSap2 полипептида согласно настоящему изобретению указанные композиции могут содержать tSap2 полипептид и один или более адъювант.
В качестве альтернативы полипептид tSap2 может быть связан с поверхностью носителя, такого как виросома, описанными в данном документе способами. В качестве альтернативы полипептид tSap2 может быть инкапсулирован в носитель описанными в данном документе способами. В качестве другой альтернативы tSap2 полипептид может быть одновременно инкапсулирован в носитель и связан с его поверхностью. Тем не менее композиция, которая содержит связанный или инкапсулированный полипептид tSap2, может дополнительно содержать один или более адъювант.
Адъювант можно выбрать из адъюванта Фройнда (полного и неполного), микобактерий, таких как БЦЖ, M.vaccae или Corynebacterium parvum, токсинов холеры или столбняка, термолабильных токсинов E.Coli, смесей Quil-сапонинов (сапонинов из Quillaja saponaria molina), таких как QS-21 (SmithKline Beecham), MF59 (Chiron) и разных водомасляных эмульсий (например, IDEC-AF), MALP-2, Иском-вакцин (ISCOMs). He ограничиваясь вышеперечисленным, можно применять другие адъюванты: минеральные соли или минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция; поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиоли, полианионы, пептиды, гемоцианин лимфы улитки и динитрофенол; иммуностимулирующие молекулы, такие как сапонины, производные мурамил-дипептидов и мурамил-трипептидов; короткие участки последовательности нуклеиновой кислоты, такие как ГЦ-богатые динуклеотиды, ГЦ-богатые олигонуклеотиды, монофосфорил Липид А и полифосфазены; макро- и микрогранулярные адъванты, такие как эмульсии, липосомы, виросомы, кохлеаты (cochleates) или иммуностимулирующие комплексные адъюванты. Также можно применять цитокины, обладающие лимфоцит-стимулирующими свойствами. Специалисту в данной области известно большое количество цитокинов, которые можно применять для указанных целей: интерлейкин 2 (IL2), IL12, GM-CSF и многие другие. Более того, можно использовать лиганды семейства хемокинов, такие как RANTES, липопротеин, липопептид, компонент клеточной стенки дрожжей, двухцепочечную РНК, бактериальный поверхностный липополисахарид (ЛПС), флагеллин, U-богатую одноцепочечную РНК, супрессоры 61 цитокиновых сигналов малой интерферирующей РНК, Pan DR-эпитоп (PADRE) и смеси из них.
tSap2 полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен путем химического синтеза или быть рекомбинантного происхождения. tSap2 можно синтезировать рекомбинантным способом с использованием молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок. В дополнение, последовательность этого белка можно модифицировать до тех пор, пока он будет сохранять способность стимулировать иммунные реакции на C.albicans.
Более того, настоящее изобретение охватывает функциональные варианты полипептида tSap2. Используемый в данном документе термин «функциональный вариант» или «вариант» tSap2 полипептида относится к белку, который содержит одну или более модификацию по сравнению с первичной аминокислотной последовательностью иммуностимулирующего tSap2 полипептида и при этом сохраняет иммуностимулирующее действие, описанное в данном документе. Если функциональный вариант tSap2 полипептида содержит замены аминокислот, то обычно предпочтение отдают консервативным заменам аминокислот, то есть заместителям, сохраняющим свойства первоначальной аминокислоты, например заряд, гидрофобность, конформацию и прочее. Примеры консервативных замен аминокислот включают замены, полученные среди аминокислот в рамках следующих групп: (1) М, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) К, R, Н' (4) A, G; (5) S, Т; (6) Q, N и (7) E, D.
Модификации, которые приводят к появлению функциональных вариантов t8ap2 полипептида, получают с целью увеличить стабильность белка в системе экспрессии, увеличить стабильность белок-белковых связей, таких как связи с HLA-пептидом, или чтобы увеличить авидность иммунных рецепторов. Для получения модифицированных или вариантных белков можно использовать любые способы, например синтез модифицированного или вариантного белка или его рекомбинантное получение с применением мутантной молекулы нуклеиновой кислоты.
Идентификация дополнительных или оптимизированных иммуностимулирующих tSap2 полипептидов может также включать этап сравнения стимуляции Т- или В-клеток tSap2 полипептидом со стимуляцией Т- или В-клеток функциональным вариантом для определения эффективности стимуляции иммунных эффекторных клеток указанным функциональным вариантом. Путем сравнения функционального варианта tSap2 полипептида с исходным tSap2 полипептидом могут быть получены белки с увеличенными иммуностимулирующими свойствами.
Отдельный tSap2 полипептид может содержать одну или более аминокислоту, присоединенную к одному или к обоим концам. Так, например, линкерную или спейсерную аминокислоту присоединяют к С- или N-концу белка или к обоим из них, что обеспечивает подходящее связывание пептидов с таким носителем, как виросома. В некоторых случаях желательно добавить к tSap2 пептиду гистидиновую метку, чтобы облегчить его очистку и/или манипуляции с ним.
Настоящее изобретение также демонстрирует, что комбинирование tSap2 полипептида согласно настоящему изобретению с виросомами в качестве совместимых с человеком иммуностимулирующих транспортных агентов усиливает стимуляцию эффективного иммунного ответа в отношении кандидозов. Так, настоящее изобретение обеспечивает новый tSap2 полипептид, иммуногенетическая эффективность которого в дальнейшем может быть увеличена путем комбинации указанного tSap2 полипептида с иммуностимулирующей транспортной системой и/или с одним или более адъювантом. Несмотря на то, что наиболее подходящей транспортной системой является иммуностимулирующая восстановленная виросома вируса гриппа (IRIVs), большое количество других переносчиков (носителей), таких как липосомы, вирусоподобные частицы, мультиантигенные пептиды (MAPs) и т.п., также доступны для квалифицированного специалиста в данной области. Виросомы представляют собой сферические однослойные вирусоподобные частицы, полученные из смеси поверхностных гликопротеинов вируса гриппа и фосфолипидов, но они не содержат каких либо нуклеиновых кислот вируса. Мембранный гликопротеин гемаглютинина вируса гриппа играет ключевую роль в механизме действия виросом. Этот основой антиген вируса гриппа представляет собой индуцирующий слияние мембранный компонент, который способствует доставке антигена к иммунокомпетентной клетке. Известно, что виросомы действуют как высокоэффективные средства усиления иммунного ответа с высокой степенью безопасности.
Виросомная транспортная система согласно настоящему изобретению дополнительно увеличивает иммунный ответ, вызванный полипептидом tSap2 согласно настоящему изобретению по отношению к инфекциям Candida. Виросомы могут одновременно связываться с несколькими разными эпитопами Т- и В-клеток (Poltl-Frank F. et al., Clin. Exp.Immunol., 1999, 117, 496; Moreno A. P. et al., J. Immunol., 1993, 151: 489), включая эпитопы универсальных Т-хэлперов (Kumar A. et al., J.Immunol. 1992, 148, 1499-1505) и другие эпитопы, известные специалистам в данной области.
Согласно приведенным в данном документе результатам, у виросом есть большой потенциал в отношении создания комбинированных систем типа вакцина/адъювант. Более того, пептидные вакцины на основе виросом безопасны и также продемонстрировали очень хорошие показатели безопасности для человека (Glueck R., Vaccina 1999, 17, 1782). Взаимодействие tSap2 полипептида согласно настоящему изобретению по выбору комбинированного с адъювантом, таким как токсин холеры или термолабильный токсин (мукозный поверхностный белок, полученный из E.Coli), совместно с применением виросом в качестве эффективной, совместимой с человеком системы доставки, представляет собой существенное достижение в создании как профилактических, так и терапевтических вакцин против кандидозов, включая вагинальный, эзофагеальный или генерализованный кандидоз.
th
Настоящее изобретение также обеспечивает применение таких иммуностимулирующих композиций, как tSap2 полипептид в сочетании с подходящим адъювантом и/или виросомой или эквивалентными носителями в соответствующей фармацевтической форме. Таким образом, исходя из индивидуальных потребностей один или более полипептид или композицию, содержащую полипептид согласно настоящему изобретению, можно применять при получении профилактических или терапевтических вакцин. Такую вакцину, которая содержит одну или более tSap2-содержащую композицию согласно настоящему изобретению, можно применять в качестве основного или второстепенного активного ингредиента в широком диапазоне терапевтических/профилактических форм дозирования в сочетании с традиционными носителями для введения через слизистые оболочки (назально, вагинально, орально), для местного, общего применения и парентерального введения. Так, настоящее изобретение обеспечивает композиции для парентерального введения, которые содержат раствор tSap2 полипептида, факультативно в сочетании с соответствующим адъювантом и/или виросомами или эквивалентными переносчиками, которые растворены или находятся в суспензии с соответствующим носителем, который предпочтительно представляет собой водный носитель. Можно применять разнообразные водные носители, такие как забуференная вода, 0.4% соляной раствор, 0.3% глицина, гиалуроновая кислота и т.п. Эти композиции стерилизуют с помощью традиционных, хорошо известных стерилизационных технологий или через стерилизующие фильтры. Полученные водные растворы расфасовывают в исходном виде или подвергают лиофилизации; лиофилизированный препарат перед введением предварительно разводят в стерильном растворе. Композиции могут содержать приемлемые с фармацевтической точки зрения дополнительные компоненты, необходимые для создания условий, приближенных к физиологическим, например агенты, регулирующие значение рН, буферные вещества, агенты, регулирующие тоничность, смачивающие агенты и т.п., например, в числе многих других ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитмонолаурат, триэтаноламинолеат. Современные способы получения парентеральных препаратов хорошо известны, или понятны, квалифицированным специалистам в данной области и более подробно описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy ("Remington's Pharmaceutical Sciences") Gennaro AR ed. 20 edition, 2000: Williams Wilkins PA, USA, включенный в данный документ посредством ссылки.
Способ и схема применения препарата будут меняться в зависимости от стадии и тяжести заболевания и могут быть определены квалифицированным специалистом-практиком. Например, tSap2 полипептид и его композиции используют для получения фармацевтических композиций, которые применяют подкожно, внутрикожно, местно, через слизистые оболочки (вагинально, назально) или внутримышечно. Согласно настоящему изобретению предпочтительной вариантом применения фармацевтических композиций является интравагинальное введение. Все указанные формы хорошо известны специалистам в области фармацевтики.
Преимущественно подходящие лекарственные препараты согласно настоящему изобретению можно, например, вводить в форме дневных доз, которые повторяют ежедневно, еженедельно или ежемесячно. Более того, соединения согласно настоящему изобретению, в особенности содержащие виросомы или липосомы, можно вводить в интравагинальной или интраназальной форме, а также трансдермальным путем, которые известны специалистам в этой области. Для применения в форме трансдермальной системы доставки дозирование будет носить скорее непрерывный характер, а не прерывистый режим введения.
tSap2 полипептид согласно настоящему изобретению и содержащие его композиции можно применять при получении фармацевтической композиции, которая содержит активное соединение в комбинации с приемлемым с точки зрения фармацевтики носителем, адаптированным к интравагинальному применению. Например, интравагинальные фармацевтические препараты могут быть адаптированы к слизистым оболочкам и находиться в форме раствора, крема, мази, геля, бальзама, пены или аэрозоля. Обычно такие интравагинальные препараты, содержащие соединения согласно настоящему изобретению, содержат от 0.005% до 5% массовой доли активного вещества в смеси с соответствующим носителем.
Профилактические и терапевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения в форме приемлемых с фармацевтической точки зрения препаратов. Такие препараты, как правило, могут содержать приемлемые концентрации соли, буферные вещества, консерванты, совместимые носители, вспомогательные иммуностимулирующие агенты, такие как адъюванты и цитокины, и факультативно другие лекарственные агенты. Препараты согласно настоящему изобретению вводят в эффективных количествах. Эффективное количество представляет собой количество фармацевтического препарата, которое само по себе или с дополнительными дозами достаточно для стимуляции желаемого ответа. Обычно дозы иммуногенов считаются эффективными в пределах от 0,01 мкг/кг до 500 мкг/кг массы тела и зависят от формы введения. Предпочтительные значения находятся в пределах от 0,1 мкг/кг до 10 мкг/кг массы тела. Абсолютное количество будет зависеть от нескольких факторов: используемой композиции препарата, будет ли введение одноразовым или многократным, и от индивидуальных параметров пациента, таких как возраст, физическое состояние, вес, рост и стадия заболевания. Эти факторы хорошо известны квалифицированному специалисту и могут быть определены при обычном осмотре.
Режим дозирования композиций согласно настоящему изобретению выбирают с учетом нескольких факторов, таких как: тип, возраст, вес и медицинское состояние пациента, стадия и тяжесть текущего заболевания.
Среднестатистический врач сможет легко определить и прописать эффективное количество вакцины, чтобы предупредить, воздействовать на заболевание или остановить злокачественное развитие или инфекционное заболевание. Оптимальная точность в получении концентрации лекарства в известных пределах, которые эффективны или в отсутствие токсичности, или в случае приемлемой токсичности, требует схемы применения препарата, основанной на кинетике способности лекарства достигать цели. Этот процесс включает анализ распространения, равновесия и выведения лекарства и доступен специалиста-практика.
Относительно областей применения настоящего изобретения описанные в данном документе соединения представляют собой активный ингредиент, и их вводят обычно в смеси с соответствующими фармацевтическими растворителями или эксципиентами, которые выбирают в зависимости от форм применения, таких как таблетки для приема внутрь, капсулы, эликсиры, сиропы и т.п., на основе соответствующих фармацевтических правил. Например, активный компонент вакцины в форме таблеток или капсул для вагинального применения можно комбинировать с нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерол, вода и т.п. Более того, при желании или необходимости в смесь включают соответствующие связующие и смягчающие компоненты (лубриканты), красители и дезинтегрирующие агенты. К соответствующим связующим веществам без ограничений относятся крахмал, желатин, натуральные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, подсластители из кукурузы, натуральные и синтетические смолы, например аравийская камедь, трагакантовая камедь или альгинат натрия, карбоксиметил целлюлозы, полиэтиленгликоль, воски и т.п. Используемые в этих лекарственных формах лубриканты без ограничений включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. К дезинтегрирующим агентам без ограничений относятся крахмал, метилцеллюлоза, агар, бентонит, ксантановая камедь и т.п.
Для парентерального применения предпочтительно использовать стерильные суспензии и растворы. При внутривенном введении желательно применять изотонические растворы, которые в содержат подходящие консерванты. Интравагинальные и интраэзофагеальные препараты, содержащие активный лекарственный компонент, могут содержать разные вещества-носители, например алкоголь, гель алоэ вера, глицерин, витамины А и Е, минеральное масло, PPG2 миристилпропионат и т.п., и образовывать, например, спиртовые растворы, очищающие средства местного (наружного) применения, очищающие кремы, гели, пены и лосьоны в лекарственных средствах в форме кремов и гелей, которые особенно подходят для лечения слизистых оболочек.
tSap2 полипептид согласно настоящему изобретению, содержащие его композиции или лекарственные средства можно связывать с биодеградируемыми полимерами, которые используют для контролируемого высвобождения лекарства. Примерами таких полимеров являются полилактоновая кислота, полиэпсилон-капролактон, полигидроксид масляной кислоты, полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианоакрилаты и поперечно-сшитые или амфифильные сополимеры гидрогелей. Обычно пациент получает интравагинальным путем эффективное количество tSap2 полипептида и его композиции или в сочетании с системой доставки, например виросомами и/или дополнительными адъювантами, или отдельно от них. tSap2 полипептид согласно настоящему изобретению также можно применять для получения фармацевтической композиции, которую можно вводить с помощью липосомных транспортных систем, таких как малые моноламеллярные везикулы, большие моноламеллярные везикулы и мультиламеллярные везикулы. Липосомы получают из разных соединений, содержащих, например, холестерол, стеариламин и различные фосфатидилхолины.
Согласно стандартному протоколу иммунизации за начальными дозами можно вводить бустерные-дозы. Иммуностимулирующий эффект композиций и способов согласно настоящему изобретению можно дополнительно усилить путем сочетания любых из вышеупомянутых композиций tSap2 полипептида, включая его комбинацию с виросомами и с веществом, стимулирующим иммунный ответ. Такие соединения классифицируют как адъюванты или цитокины. Адъюванты могут усиливать иммунологическую реакцию посредством создания резервуара антигена (внеклеточно или внутри макрофагов), активации макрофагов и стимуляции специфических групп лимфоцитов.
В случае применения согласно изобретению полипептида при получении фармацевтической композиции для лечения инфекционного заболевания, такого как кандидоз, желаемая реакция представляет собой сдерживание инфекции и/или очищения организма от инфекционных агентов. В случае профилактики желательная реакция на антиген - это защитный иммунитет, проявляющийся во вторичных иммунных реакциях на воздействие агента или антигена. За проявившимися реакциями можно наблюдать с помощью стандартных способов или диагностических способов, обсуждаемых в данном документе. Настоящее изобретение не ограничено рамками специфических вариантов реализации, описанных в данном документе. Наоборот, различные модификации изобретения в добавление к уже описанным в данном документе будут очевидны специалистам в этой области из дальнейшего описания, в том числе и из примеров. Такие модификации входят в состав прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ
nd
Следующие примеры предназначены для лучшей иллюстрации заявленного изобретения и не должны интерпретироваться как ограничивающие область охвата настоящего изобретения. Следует понимать, что упомянутые конкретные материалы предназначены только для целей демонстрации, но не ограничения изобретения. Если не оговорено другое, используются способы биохимической и молекулярной биологии, которые описаны в Voet, Biochemistry, Wiley, 1990; Stryer 1995; Peptide Chemistry. A Practical Textbook, 2 ed., Miklos Bodanszky, Springer-Verlag, Berlin, 1993; Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000).
Квалифицированный специалист может создать эквивалентные средства или реагенты, не изменяя объема настоящего изобретения и не выходя за его рамки. Подразумевается, что в композициях и методиках, описанных в данном документе, можно осуществить множество вариаций, но несмотря на это они остаются в пределах объема настоящего изобретения. Также предполагается, что при известных структурных и химических сходствах, таких как полярность, величина или ориентация, между боковыми цепями аминокислот пептидные последовательности с аминокислотами или структурными замещениями, эквивалентными тем, что описаны в данном документе, будут сохранять аналогичные функции. Авторы настоящего изобретения включили в такие вариации в объем настоящего изобретения.
Пример 1: Материалы и Методы
1.1 Микроорганизмы и условия роста
s
-
-
-
-
+
+
-1
-1
В этом исследовании как источник ДНК гриба использовали C.albicans АТСС20955. Его выращивали на питательной среде Винга (0.3% экстракт дрожжей, 0.2% глюкоза, питательная среда Дифко). Eschrichia coli M15 (nal, ara, gal, mtl, F, recA, uvr, [pUHA1]) использовали как штамм-носитель рекомбинантных плазмид. Клетки Е. coli обычно культивировали на питательной среде Лурия-Бертани (1% триптон, 0.5% экстракт дрожжей, 0.5% раствор хлорида натрия, рН 7.00) или на чашках Лурия-Бертани (1% триптон, 0.5% экстракт дрожжей, 0.5% раствор хлорида натрия, 1.5% агар, рН 7.00), при необходимости с добавлением ампициллина (50 мг мл), канамицин (50 мг мл) (Boehringer). C.albicans SA-40, первоначально выделенный из вагинального секрета объекта с острым вагинитом, использовали для экспериментального вагинита. Динамика роста гриба, его индукция и оценка экспериментальной вагинальной инфекции у оварэктомированных крыс были описаны ранее (Cassone A. et al., Infect. Immun. (1995), 63: 2619-2624; De Bernardis F. et al., Infect. Immun. (1997), 65: 3309-3405).
1.2 Клонирование SAP2-кодирующей последовательности
Для молекулярного клонирования 8АР2-кодирующей последовательности ее амплифицировали способом ПЦР из геномной ДНК с олигонуклеотидами Са70 и Са71. Чтобы проверить соответствующий размер ПЦР-продукта, использовали 1% агарозный гель и получили только одну полосу с предполагаемым размером приблизительно в 1200 п.н. После разрезания с помощью рестриктаз ПЦР-продукт экстрагировали из геля и провели его очистку. Кодирующую последовательность лигировали в линеаризованный вектор с получением pRLV141 плазмиды. pRLV141 и pRLV143 полностью секвенировали в компании Genenco (Италия), чтобы проверить последовательность вставок в основную последовательность рекомбинантных гистамин-меченных белков.
1.3 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков C.albicans
600
Экспрессию рекомбинантных 6xhis-Sap2 проводили в Е. coli М15, несущей плазмиду pUHA1, продуцирующую Lac-репрессор (La Valle R. et al., Infect. Immun. (1995), 63: 4039-4045; Hochuli Е. et al., Biotechnology (1988), 6: 1321-1325). Индукцию проводили на питательной среде Лурия-Бертани, содержащей канамицин и ампициллин, посредством добавления изопропил-бета-Р-1-тиогалактопиранозида (Boehringer) в конечной концентрации 1 мМ, в культуру с O.D.=0.7 (плотность клеточной суспензии), которую затем подвергали инкубации при 37°С в течение 5 ч. Рекомбинантный 6xhis-меченный белок очищали способом никель-хелатной аффинной хроматографии (Hochuli Е. et al., Bio/Technology (1988), 63: 1321-1325) согласно инструкциям производителя (Qiagen; условия денатурации). Фракции, содержащие очищенный полипептид, объединяли и осаждали в 3-кратном объеме абсолютного этанола, ресуспендировали в воде и хранили при -20°С. В индуцированных клетках наблюдали новую полосу, соответствующую белку с молекулярным размером около 48 кДа, что соответствовало предположительному размеру 6xhis-SAP2.
Пример 2
2.1 Получение рекомбинантных плазмид и продуцирование укороченного рекомбинантного Sap2 (tSap2)
Клонирование полноразмерного SAP описано в Примере 1. Для получения укороченной формы Sap2 плазмиду pRLV141 расщепили BamHI, чтобы извлечь фрагмент, соответствующий нуклеотидам последовательности Sap2, кодирующим аминокислоты с 1 по 76. Расщепленную плазмиду лигировали с получением pRLV143 и с ее помощью трансформировали бактериальные клетки. Полученные колонии анализировали на длину ДНК-вставок способом рестрикционного картирования, ПЦР и ДНК-секвенирования (данные не показаны).
В качестве альтернативы, синтетическим путем получили укороченный полипептид Sap2, который содержал His-tag и сайт расщепления протеазы (тромбина) между His-tag и tSap2 (Geneart, Регенсбург, Германия). Для оптимальной экспрессии в системе-хозяине частоту использования кодона адаптировали к частоте использования кодонов хозяина (например, Geneart, Регенсбург, Германия). Ген tSap2 белка синтезировали с двумя сайтами рестрикции Ndel (5'-конец) и BamHI (3'-конец) и клонировали в Ndel/BamHI сайты рестрикции вектора экспрессии pET-14b (Novagen / Merck Biosciences, Дармштадт, Германия) с получением плазмиды рЕТ-14-tSap2. Нуклеотидную последовательность tSap2 в составе вектора подтвердили способом секвенирования.
В качестве альтернативы укороченный Sap2, у которого отсутствует His-tag, получили синтетически. Для оптимальной экспрессии в системе-хозяине частоту использования кодона адаптировали к частоте использования кодонов у хозяина (Geneart, Регенсбург, Германия). Ген tSap2 белка синтезировали с двумя сайтами рестрикции Ncol (5'-конец) и BamHI (3'-конец) и клонировали в Ncol/BamHI сайты рестрикции вектора экспрессии pET-14b (Novagen / Merck Biosciences, Дармштадт, Германия) с получением плазмиды рЕТ - tSap2. Нуклеотидная последовательность tSap2 в этом векторе подтвердили способом секвенирования.
2.2 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков C.albicans
77-398
600
Экспрессию рекомбинантных 6xhis-tSAP2 (6xhis-SAP2) проводили в Е. coli М15, несущей плазмиду pUHA1, продуцирующую Lac-penpeccop (La Valle R. et al., Infect. Immun. (1995), 63: 4039-4045; Hochuli Е. et al., Biotechnology (1988), 6: 1321-1325). Индукцию проводили на питательной среде Лурия-Бертани, содержащей канамицин и ампициллин, посредством добавления изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозида (Boehringer) в конечной концентрации 1 мМ, к культуре с O.D.=0.7 (плотность клеточной суспензии), которую подвергали последующей инкубации при 37°С в течение 5 ч. Рекомбинантный 6xhis-меченный белок очищали способом никель-хилатной аффинной хроматографии (Hochuli Е. et al., Bio/Technology (1988), 63: 1321-1325) согласно инструкциям производителя (Qiagen; условия денатурации). Фракции, содержащие очищенный полипептид, соединяли и осаждали в 3-кратном объеме абсолютного этанола, затем ресуспендировали в воде и хранили при -20°С. В индуцированных клетках наблюдали новую полосу, соответствующую полипептиду с молекулярным размером около 35.5 кДа, что соответствовало предположительному размеру 6xhis-tSAP2.
Экспрессию рЕТ14 - t8ap2 и рЕТ - t8ap2 выполняли в экспрессионной системе-хозяине, которая является лизогеном бактериофага ADE3, например, Е. coli BL21 (DE3) или Е coli Origami (DE3) (Novagen / Merck Biosciences, Дармштадт, Германия) в условиях, описанных выше.
Протеолитическое удаление His-tag и изоляцию/очистку полученного рекомбинантного tSap2 белка (без His-tag) проводили следующим образом:
6xhis-меченный белок с сайтом расщепления тромбина (из вектора рЕТ14 - tSap2) очищали способом никель-хилатной аффинной хроматографии на HiTrap FF Crude колонке согласно инструкциям производителя (GE Healthcare, Дюбендорф, Швейцария).
Чтобы удалить у белка tSap2 6xhis метку, пул очищенных белков обрабатывали протеазой тромбин. Для этого пул очищенных белков подвергали инкубации с тромбин-агарозными шариками в течение 5 ч при комнатной температуре, как рекомендовано производителем (Sigma, Buchs, Швейцария). Немеченый tSap2 белок загружали в ионно-обменную хроматографическую колонку (HiTrap Q FF, GE Healthcare, Дюбендорф, Швейцария) и элюировали в буфере В (1 х ФБР, рН 7.4; 1.5 М NaCl) с градиентом 100% буфера В сверх 5-кратного объема колонки (ОК). Фракции, содержащие tSap2, объединяли и диализировали против 1×ФБР, рН 7.4.
Изоляцию/очистку полученного рекомбинантного tSap2 белка без His-tag проводили следующим образом.
Экспрессию рЕТ - tSap2 вектора в Е. coli выполнили, как описано выше для рЕТ14 - tSap2. После культивирования клетки центрифугировали для осаждения и обрабатывали реагентом BugBuster, как указано производителем (Novagen / Merck Biosciences, Дармштадт, Германия), чтобы изолировать тельца включения (ТВ). В конце ТВ ресуспендировали в 20 мл лизирующего буфера на литр бактериальной культуры (лизирующий буфер: 1×ФБР, рН 7.4; 4 М мочевина). Этот раствор загружали в HiTrap Q FF колонку (GE Healthcare, Дюбендорф, Швейцария) и элюировали в буфере В (1×ФБР, рН 7.4; 4 М мочевина, 1 М NaCl) с градиентом 100% буфера В сверх к 5-кратного объема колонки (ОК). Фракции, содержащие tSap2, объединяли и диализировали в 1 х ФБР, рН 7.4, 0.25 М мочевины в несколько этапов: (4 М мочевины - >2 М мочевины - >1 М мочевины - >0.5 М мочевины - >0.25 М мочевины), каждый из которых длился в течение 24 ч при 4°С в 1 л объема. Затем этот материал загружали в колонку HiTrap Q FF (GE Healthcare, Дюбендорф, Швейцария) с буфером А (1 х ФБР, рН 7.4; 10 мМ NaCl) и буфером В (1 х ФБР, рН 7.4; 1.5 М NaCl) и градиентом 100% буфера В сверх 5-кратного ОК. Фракции, содержащие tSap2, объединяли и концентрировали в Амикон Ультра 10К ячейке (Millipore, Цуг, Швейцария) согласно инструкциям. Буфер меняли на буфер 1×ФБР, рН 7.4; 1.5 М NaCl путем добавления NaCl. Этот материал загружали в колонку HiTrap Phenyl FF (GE Healthcare, Дюбендорф, Швейцария) с буфером А (1×ФБР, рН 7.4, 1.5 М NaCl) и буфером В (1×ФБР, рН 7.4; 10 мМ NaCl) и градиентом 100% буфера В сверх 10-кратного ОК. Фракции, содержащие tSap2, объединяли, концентрировали в Амикон Ультра 10К ячейке (Millipore, Цуг, Швейцария) и промывали 3 раза буфером (1×ФБР, рН 7.4; 10 мМ NaCl). Белок замораживали и хранили в аликвотах при 4°С.
Пример 3: Стабильность рекомбинантных Sap и tSap2
Рекомбинантные Sap и tSap2 экспрессировали и проводили очистку, как описано в Примерах 1 и 2. 3 мкг рекомбинантного Sap и tSap2 подвергали инкубации в ФБР в течение разных промежутков времени (от 30 мин до 24 или 48 ч) при комнатной температуре и при 37°С. После инкубации оба препарата подвергали электрофорезу и окрашивали Кумасси синим.
Укороченный рекомбинантный tSap2 сохранял полную стабильность и полную реакционоспособность с анти-8ар2 иммунной сывороткой в течение 24 ч (Фигура 1А) и 48 ч (данные не показаны) без каких-либо признаков деградации. При последующей инкубации при комнатной температуре (при 37°С) этот пептидный препарат был также очень стабилен и демонстрировал незначительную деградацию на небольшие низкомолекулярные пептидные цепочки в реакционной иммунной сыворотке в течение от 24 до 48 ч. Напротив, Препарат Sap2 дикого типа по время инкубации в промежутке от 6 до 24 ч был нестабильным даже при комнатной температуре и совершенно разрушался после короткой, 30-мин инкубации при 37°С (Фигура 1В).
Пример 4
Стандартные способы, используемые в следующих экспериментах:
4.1 Иммуногенность рекомбинантных Sap и tSap2
4.1.1 Животные
Во время всего исследования использовали женских особей оварэктомированных крыс Wistar (80-100 г) из Лаборатории по воспроизводству Чарльза Ривера (Кальке, Италия). Содержание животных и полный уход за ними описаны De Bernardis F. et al., Infect. Immun. (1997), 65: 3309-3405.
4.1.2 Интравагинальная иммунизация крыс
Для активной иммунизации группам по пять крыс вводили, в совокупности 3 раза с еженедельными интервалами, 1-100 мкг рекомбинантного SAP2 и ISAP2 препарата, факультативно вместе с адъювантами (например, термолабильный токсин), интравагинальным путем (и.в.п.). Контрольные животные получали только стерильный физиологический раствор.
4.1.3 Вагинальное промывание
Вагинальную полость крысы промывали путем аккуратного впрыскивания и последующего удаления 0.5 мл ФБР. Собранные жидкости объединяли для каждой экспериментальной группы; полученные в результате 2.5 мл центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 3500×g в охлаждаемой центрифуге Biofuge, a надосадочную жидкость анализировали на вагинальные антитела.
4.2 ELISA для определения антител против компонентов C.albicans в вагинальной жидкости
Наличие антител в вагинальной жидкости анализировали предварительно описанным способом - твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (Cassone A. et al., Infect. Immun. (1995), 63: 2619-2624; De Bernardis F. et at., Infect. Immun. (2000), 68: 3297-3304). 200 мкл очищенного препарата нативного Sap2 (любезно предоставленного Р.А. Sullivan, Massey, University, Северный Палмерстон, Новая Зеландия) (5 мкг/мл в 0.2 М карбонате натрия), который использовали как антиген покрытия для определения антител, распределили по лункам на полистироловом микротитровальном планшете, который всю ночь держали при температуре 4°С. После трехразового промывания буфером Твин 20 ФБР вагинальную жидкость, разведенную в отношении 1:2, распределяли по лункам в трех повторениях, затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Каждую лунку повторно промывали буфером Твин 20 ФБР и заранее приготовленными оптимальными разбавителями щелочной конъюгат-фосфатазы; добавляли антитела овцы против иммуноглобулинов IgG и Ig А крысы (полученные из Serotec Ltd; Кидлинтон, Оксфорд, Великобритания). Связанную щелочную фосфатазу определяли путем добавления раствора пара-фенилфосфата в буфер диэтаноламина, а результаты с планшет считывали при 405 нм с использованием автоматического микроридера (Labsystem Multiscan, MS, Финляндия), с сигналом от воздуха в качестве базового. Вагинальную жидкость считали положительной на определяемые антитела, когда O.D. была больше чем в два раза, чем значение для лунки, заполненной тем же антигеном, и тестируемой вагинальной жидкостью от неиммунизированных, неинфицированных крыс.
2
Количественные переменные тестировали на предмет наличия нормального распределения и сравнивали с помощью двустороннего критерия Стьюдента. Разницы в групповых пропорциях оценивали с использованием х -критерия, для малого количества применяли точный критерий Фишера. Для сравнения парных образцов использовали дисперсионный анализ. Для определения статистической значимости применяли двусторонний критерий с уровнем значимости р<0.05. Статистический анализ выполняли с использованием пакета программ Intercooled Stata (Stat Corporation, Техас).
Пример 5: Выявление tSap2 антител у иммунизированных крыс
Две группы по пять женских особей оварэктомированных крыс троекратно с еженедельными перерывами иммунизировали интравагинальным путем: одна группа получила 100 мкг/доза Sap2 дикого типа, тогда как второй группе ввели 20 мкг/доза укороченного Sap2. Спустя неделю после последней иммунизации у каждой группы были собраны пулы вагинальной жидкости, а затем разбавлены в отношении 1:2 для ELISA (стандартный способ, кратко описанный в Примере 4). В иммунологическом анализе препарат Sap2 дикого типа применили как антиген покрытия для детекции антител. Наличие в вагинальной жидкости антител, специфичных к Sap2 дикого типа, выражали в единицах спектральной поглощательной способности, считываемой при λ=405 нм. Было замечено, что в основном увеличивается выработка иммуноглобулина А - главного иммуноглобулина, участвующего в защитных свойствах слизистых оболочек. Результаты представлены на Фигуре 2 и демонстрируют, что в вагинальной жидкости иммунизированных крыс укороченный Sap2 (tSap2) индуцирует более высокий уровень антител, чем активная форме фермента Sap2 дикого типа (Sap2).
Пример 6: Защита от заражения C.albicans после вакцинации Sap2 и tSap2
7
Спустя неделю после последней иммунизации всех животных заразили C.albicans интравагинальным путем в количестве 10 клеток. За инфекцией наблюдали путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ), как описано De Bernardis F. et al., Infect. Immun. (1997), 65: 3309-3405; De Bernardis F. et al., Infect. Immun. (2000), 68: 3297-3304. Проводили два независимых эксперимента. Для анализа антител образцы вагинальной жидкости от каждой особи систематически отбирали путем аккуратного промывания вагинальной полости 0.5 мл ФБР, как описано De Bernardis F. et al., Infect. Immun. (1997), 65: 3309-3405; De Bernardis F. et al., Infect. Immun. (2000), 68: 3297-3304. Собранную жидкость центрифугировали при 3500×g в течение 15 мин в охлаждаемой центрифуге Biofuge, затем анализировали надосадочную жидкость, как описано выше. Результаты показаны на Фигуре 3.
Пример 7: Препараты на основе виросом, содержащие tSap2, индуцируют более высокий уровень IgG и IgA.
Три группы по пять крыс троекратно с еженедельными интервалами иммунизировали интравагинальным путем: первая группа получила 20 мкг/доза только укороченного белка; вторая группа получила 20 мкг/доза укороченного белка, связанного с поверхностью виросомы, а третью группу обработали буфером. Спустя одну неделю после последней иммунизации пулы вагинальной жидкости собрали у каждой группы и развели в отношении 1:2 для ELISA. Препарат Sap2 дикого типа в иммунологическом анализе использовали как антиген покрытия для детекции антител. Наличие в вагинальной жидкости антител выражали в единицах спектральной поглощательной способности, считываемой при λ=405 нм. Результаты показаны на Фигуре 4.
Пример 8: Препараты на основе виросом, содержащие tSap2, обеспечивают более высокий коэффициент инфекционного клиренса
Три группы по пять женских особей оварэктомированных крыс иммунизировали различными препаратами, следуя обычной схеме иммунизации: первая группа получила 20 мкг/доза одного укороченного белка, вторая группа - 20 мкг/доза укороченного белка, связанного с поверхностью виросомы, а третью группу обработали буфером. Через четыре недели после последней иммунизации все крысы были инфицированы вызывающей вагинопатию дозой C.albicans, штамм SA-40. Колониеобразующие единицы (КОЕ) Candid подсчитывали через 1, 2, 7, 13, 21 и 28 дней после заражения. Результаты показаны на Фигуре 5.
Четыре группы женских особей оварэктомированных крыс троекратно с еженедельными интервалами иммунизировали интравагинальным путем следующими препаратами: 1) укороченный белок Sap2, связанный с виросомами (20 мкг/доза); 2) укороченный белок Sap2, связанный с виросомами и в сочетании с HLT (20 мкг/доза); укороченный белок Sap2 (20 мкг/доза); 4) буфер. Спустя месяц после последней обработки все крысы были инфицированы вызывающей вагинопатию дозой C.albicans. За течением вагинальной инфекции наблюдали в течение 28 дней. Результаты показаны на Фигуре 6.
Пример 9: Виросомы, содержащие tSap2 белок, обеспечивают лучшую защиту
3
В данном эксперименте in vivo две группы женских особей оварэктомированных крыс троекратно с еженедельными интервалами и интравагинально иммунизировали укороченным белком, который содержался в виросомах, и отдельно укороченным белком соответственно. Спустя четыре недели после последней иммунизации всех крыс инфицировали вызывающей вагинопатию дозой C.albicans, штамм SA-40. За течением инфекции наблюдали в течение 28 дней путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). Крысу считали инфицированной, когда КОЕ≥1×10/мл вагинальной жидкости. Результаты показаны в Таблице 1.
Таблица 1
Препарат
Нулевой день
7-й день
КОЕ/мл вагинальной жидкости ×10<sup>3</sup>
Инфицированные крысы
КОЕ/мл вагинальной жидкости ×10<sup>3</sup>
Инфицированные крысы
tSap2+IRIV
>100
5/5
4±3
2/5
tSap2
>100
5/5
6±2
3/5
ФБР
>100
5/5
>100
5/5
Таблица 1: В таблице показано, что на модели заражения животного виросомы, содержащие укороченный белок, обеспечивают лучшую защиту, чем укороченный белок сам по себе. А именно, через одну неделю количество инфицированных крыс, иммунизированных препаратом на основе виросом, меньше, чем количество крыс, обработанных только укороченным белком.
Пример 10: Связывание Sap2/tSap2 с фосфоэтаноламином
10.1 Присоединение белка Candida к фосфоэтаноламину через цистеиновые группы
Для получения 4 мл препарата виросом отобрали указанное количество белка и ресуспендировали его в 1 мл 100 мМ ОЭГ в ФБР. Этот раствор добавили к 50 мг иммобилизованного на амберлитовых шариках (Merck Biosciences Novabiochem, Лойфельфинген, Швейцария) Трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Шарики удаляли, а в раствор добавляли 4 мг свежего N-MCC-PE (4.3 мкмоль; Avanti Polar Lipids, Алабастр, Алабама) и подвергали инкубации при постоянном встряхивании при температуре 30°С по меньшей мере в течение 4 ч. В конце неиспользованные малеимидные группы фосфоэтаноамина нейтрализовали путем добавления следовых количеств Трис буфера рН 7.4. Раствор хранили при 4°С до использования.
10.2 Связывание белка Candida с фосфоэтаноламином через первичные аминогруппы
Для получения 4 мл виросомального препарата взяли указанное количество белка и ресуспендировали его в 0.1-0.5 мл ФБР рН 7.4, 10 мМ ЭДТА. Полученный раствор добавляли к 12.5 мг Sulfo-SMCC реагента (примерно 25 мкмоль; Apollo Scentific, Чешир, Великобритания) и в течение 1 ч подвергали инкубации при комнатной температуре при медленном встряхивании. Неиспользованный Sulfo-SMCC реагент удаляли путем гель-фильтрации через колонку Sephadex (GE Healthcare, Отельфинген, Швейцария) и 100 мМ ОЭГ в ФБР до окончательного объема 1 мл. Затем к этой смеси добавляли 4 мг свежего N-MCC-PE (4.3 мкмоль; Avanti Polar Lipids, Алабастр, Алабама) и подвергали инкубации при комнатной температуре при постоянном встряхивании в течение по меньшей мере 4 ч. В конце неиспользованные малеимидные группы фосфоэтаноамина нейтрализовали путем добавления имеющегося количества Трис буфера рН 7.4. Раствор хранили при 4°С до использования.
Пример 11: Вакцина, содержащая tSap2 или Sap2 в комбинации с виросомами
11.1 Реагенты, используемые в препаратах и демонстрационных примерах
12
8
Реагенты: октаэтиленгликоль-моно-(п-додецил)-эфир (ОЭГ, СЕ) приобрели у Fluka Chemie GmbH-(Буш, Швейцария). Сахарозу (Eur. Phar.) приобретали у Merck (Dietikon, Swityeland). Яичный фосфатидилхолин (PC) получили от Lipoid (Хам, Швейцария). 1-олеил-3-пальмитил-Р-глицеро-2-фосфоэтаноламин приобрели у Bachem (Бубендорф, Швейцария). Биошарики SM2 приобрели Bio-Rad Laboratories (Глатбруг, Швейцария). Холестерил-N-(триэтиламмонийэтил)карбамата хлорид (TN-chol) (Merck Eprova Шаффхаузен, Швейцария).
Вирусы гриппа штамма A/Singapore/6/86 (A/Sing) и другие виды гриппа А штаммов, размноженные в аллантоидной полости куриных эмбрионов, получены от Berna Biotech AG (Берн, Швейцария) и очищены, как описано Skehel J. et al. (1971), Virology 44: 396). Отношение гемагглютинин/фосфолипид определяли согласно Bottcher (Bottcher et al., (1961), Anal. Chim. Acta 24,203). Количественную оценку гемагглютинина (НА) проводили с помощью экстракционного способа Кумасси, как описано Ball (Ball (1986) Anal. Biochem. 155, 23).
11.2 Получение виросом
Для получения РЕ-миметика-IRIV раствор гемагглютинина очищенного вируса гриппа A/ Singapore (4 мг) центрифугировали при 100000 g в фосфатном буферном растворе (ФБР) в течение 30 мин, осадок растворяли в ФБР (1.33 мл), содержащего 100 мМ октаэтиленгликольмонодецилэфира (ФБР-ОЭГ). Амилоид-пептид-фосфатидилэтаноламиновые конъюгаты (4 мг), фосфатидилхолин (32 мг; Lipoid, Людвигсхафен, Германия) и фосфатидилэтаноламин (РЕ; 6 мг) растворяли в общем объеме 2.66 мл ФБР- ОЭГ. Фосфолипиды и гемагглютининовые растворы смешивали и подвергали воздействию ультразвука в течение 1 мин. Этот раствор центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч; надосадочную жидкость стерилизовали с помощью фильтрации. Виросомы получали путем удаления детергента (SM, BioBeads, BioRad, Глатбруг, Швейцария).
11.3 Получение SAP2/tSAP2, присоединенных к виросомам (белок-GIRIVs)
Белок-GIRIVs получали способом удаления детергента. Для приготовления 4 мл конечного объема 32 мг яичного PC и 4 мг РЕ растворяли в 2 мл ФБР, 100 мМ ОЭГ (ФБР-ОЭГ), а полученный конъюгат белка-РЕ (1 мл ФБР-ОЭГ; см. выше) добавляли к этой смеси. НА инактивированного вируса гриппа A/ Singapore /6/68 центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч при температуре 4°С, а осадок растворяли в 1 мл ФБР-ОЭГ. Растворенные в детергенте фосфолипиды и вирусы смешивали и подвергали воздействию ультразвука в течение 1 мин. Эту смесь центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч при 18°С; надосадочную жидкость отбирали для дальнейших этапов. Виросомы получали обычно способом удаления детергента, посредством двойного использования 1.5 г смоченных SM2 Bio-beads в течение 1 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Раствор виросом хранили при 4°С.
Пример 12: Вакцина, содержащая tSap2 или Sap2 в комбинации с лиофилизированными виросомами
12.1 Получение виросом, содержащих TC-chol
Виросомы, содержащие TC-chol, получали способом удаления детергента. Для приготовления 4 мл конечного объема 32 мг яичного PC, 8 мг ОРРЕ и 5 мг холестерил-N-(триметиламмонийэтил)карбамата хлорид (TC-chol) растворяли в 2.6 мл ФБР, 100 мМ ОЭГ (ФБР-ОЭГ). 2 мг НА инактивированного A/ Singapore /6/86 вируса гриппа или другого вируса гриппа штамма А центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч при 4°С, осадок растворяли в 1 мл ФБР-ОЭГ. Растворенные в детергенте фосфолипиды и вирусы смешивали с 0.4 мл 50% (в весовом соотношении) сахарозы и подвергали воздействию ультразвука в течение 1 мин. Эту смесь центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч при 18°С. Виросомы получали обычно способом удаления детергента, когда дважды использовали 1.5 г смоченных SM2 Bio-beads в течение 1 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Затем стерилизовали только что полученные виросомы путем фильтрации (0.22 мкм) и разделяли на аликвоты в стерильные стеклянные пробирки. Закрытые пробирки замораживали при -70°С, затем лиофилизировали сначала при температуре -40°С в течение 20 ч и 10°С в течение 2 ч. Закрытые пробирки до использования хранили замороженными.
12.2 Получение SAP2/tSAP2, соединенные с лиофилизированными виросомами (белок-TIRIVs)
Чтобы получить TIRIVs с белком Candida, сцепленного с фрагментом фосфолипида, белок связывали с РЕ, как описано выше, и растворяли в растворе, содержащем яичные PC, РЕ и TC-chol в ФБР-ОЭГ, перед соединением с растворенным в детергенте вирусным НА инактивированного H1N1 вируса гриппа. Растворенные в детергенте фосфолипиды и вирусы смешивали с сахарозой до конечной концентрации 5% (в весовом отношении) и подвергали воздействию ультразвука в течение 1 мин. Эту смесь центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч при 18°С. Виросомы с белком Candida, присоединенным к их мембране, затем получали способом удаления детергента, посредством двухкратного использования 1.5 г смоченных SM2 Bio-beads в течение 1 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Виросомы стерилизовали путем фильтрации (0.22 мкм) и разделяли на аликвоты в стерильные стеклянные пробирки. Закрытые пробирки замораживали при -70°С, затем лиофилизировали сначала при температуре -40°С в течение 20 ч и 10°С в течение 2 ч. Закрытые пробирки до использования хранили замороженными.
Лиофилизированный TIRIVs восстанавливали эквивалентным объемом стерильной воды.
Пробирку энергично встряхивали в течение 10 сек в вортексе на средней интенсивности и хранили при 4°С до использования.
Пример 13: Моноклональные антитела против tSAP2 обеспечивают пассивную защиту
7
Группы по пять крыс интравагинально инокулировали антителами против tSAP2, которые элюировали из иммунной вагинальной жидкости путем их абсорбции на покрытых tSAP2 Dynabeads, за 30 мин до введения провокационной дозы в количестве 10 клеток С.albicans (штамм SA-40). Моноклональные анти-tSAP2 (MAbs) антитела были в концентрации 100 мкг/мл. Во время всего исследования использовали MAb NL2/2A8, MAb NL2/9B9, которые специфичны к укороченному Sap2 белку, и MAb NL2/7C9 против рекомбинантного белка енолазы.
2
Количественные переменные тестировали на соответствие нормальному распределению и сравнивали с помощью двустороннего критерия Стьюдента. Разницы в пропорциях групп оценивали с использованием х критерия, для малого количества применяли точный критерий Фишера. Для сравнения парных образцов использовали дисперсионный анализ. Для определения статистической значимости применяли двусторонний критерий с уровнем значимости р<0.05. Все статистические анализы были выполнены с использованием пакета программ Intercooled Stata.
Как показано на фигуре 7, оба моноклональных антитела к tSap2 (NL2/2A8 и NL2/9B9) обеспечивают защитные свойства у крыс путем индуцирования очень быстрого клиренса клеток грибка из вагины по сравнению с контрольными крысами, то есть с теми, которые получили только клетки C.albicans или моноклональное антитело к енолазе. В условиях теста эффект моноклональных антител к Sap2 в значительной степени сопоставим с эффектом флуконазола, популярного противогрибкового препарата, или пепстатина, хорошо известного Sap-ингибитора.