СПОСОБ ОТБОРА РАСТЕНИЙ КОНОПЛИ НА СОДЕРЖАНИЕ В НИХ КАННАБИНОИДОВ
METHOD OF HEMP PLANTS SAMPLING FOR CONTENT OF CANNABINOIDS IN THEM

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве.
Известен способ отбора растений конопли на содержание в них каннабиноидов, включающий анализ органов растений (Патент №2324334, кл. А01Н, 2008) [1]. Однако данный известный способ позволяет отобрать растения только в период созревания семян. Поскольку конопля перекрестноопыляющееся растение, то при ее селекции на содержание каннабиноидов важно, чтобы селекционируемые растения уже ко времени цветения были идентичны по содержанию этих веществ, то есть необходимо проводить отбор до фазы начала цветения, что сократит в целом селекционный процесс.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является упрощение и сокращение времени отбора, снижение трудозатрат и затрат материальных средств.
Достигается это тем, что в способе отбора растений конопли на содержание в них каннабиноидов, включающем анализ признаков органов растений и отбор по этим признакам, отличающемся тем, что в качестве органа растения, на котором проводят визуальный анализ, используют черешки и пластинки верхушечных листьев, сформированных до фазы начала цветения, определяют признак интенсивности их антоциановой окраски и в качестве растений с минимальным содержанием каннабиноидных соединений отбирают растения с максимально интенсивной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
Рекомендуется в качестве селекционной элиты отбирать растения с темно-красной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
120
90
90
Пример 1. В 1996 году на четырех питомниках исходного материала, пространственно изолированных друг от друга и других посевов, определяли частоту появления в фазе бутонизации растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев в популяциях разных сортов однодомной конопли. Высокий агрофон на данных участках создавали внесением под предпосевную обработку почвы минеральных удобрений из расчета N P К кг/га действующего вещества. Посев семян - ручной, под маркер, площадь питания растений - 5×70 см.
Структурный анализ растений по признаку «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев» выполнили в фазе бутонизации. На все растения с указанным признаком привязывали пергаментные этикетки. Чтобы растения не ломались и не полегали, рядом с каждым растением в почву вставляли деревянные палочки (диаметр 3,0-5,0 см, длина 250-300 см). Перед началом цветения все отобранные растения накрывали пергаментными изоляторами (длина 210-250 см, ширина 20-30 см). Верхний конец изоляторов привязывали шпагатом к деревянным палочкам. Такой изолятор при необходимости легко приподнимался и снимался.
Для анализа содержания каннабиноидных соединений в намеченных исходных растениях образцы отбирали в период созревания 75% семян в соцветиях. Содержание каннабиноидов определяли на хроматографе «Кристалл 2000М» с программированием температуры. Разделение каннабиноидов проводили на капиллярной колонке. Пики идентифицировали по времени удерживания. Содержание рассчитывали по методу внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали метилстеарит.
Результаты исследований приведены в таблицах 1-2. На фиг.1 показан верхушечный лист растения конопли с антоциановой окраской черешков и листовых пластинок.
Впервые в практике отечественного коноплеводства зафиксирован факт, что в популяциях однодомных сортов конопли на ранних этапах вегетации (до цветения) могут появляться растения с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев с частотой 5,38-8,37%.
Выявленный фенотипический маркер вполне может быть использован при решении генетико-селекционных задач по созданию перспективного исходного материала: в отобранных растениях вариабельность содержания наркотически активного тетрагидроканнабинола (ТГК) составляет 0,017-0,020%.
Пример 2. В 1997-2001 годах на селекционных питомниках, пространственно изолированных от других посевов, изучали влияние непрерывного методического отбора в популяциях селекционных элит на частоту появления в ранний период вегетации (фаза бутонизации) растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
Селекционной элитой называли лучшие родоначальные растения.
120
90
90
Высокий агрофон на селекционном питомнике первого цикла отбора (1997 год) создавали внесением под предпосевную обработку почвы минеральных удобрений из расчета N P Kкг/га действующего вещества. Для посева использовали семена лучших отобранных в питомнике исходного материала родоначальных растений (1996 год). Посев семян - ручной, под маркер, площадь питания растений - 5×45 см.
В фазе бутонизации ежедневно путем визуального осмотра проводили структурный анализ потомств селекционных элит по признаку «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев». На растения с максимально выраженным признаком привязывали пергаментные этикетки, а растения без антоциановой окраски выбраковывали. Данные визуальной оценки записывали в журнал.
Уборку проводили в фазе созревания 75% семян в соцветиях. Отобранные растения собирали в снопы, обмолачивали, семена доводили до требований посевного стандарта и высевали в будущем году на селекционном питомнике второго цикла отбора.
Так продолжали до тех пор, пока не получали однотипный по селектируемому признаку материал.
Результаты исследований приведены в таблице 3.
Экспериментальные данные позволяют констатировать, что отбор растений до цветения по предложенному фенотипическому маркеру, действительно, дает возможность целенаправленно регулировать процесс перекрестного оплодотворения между теми растениями, которые представляют наибольший селекционный интерес. Самое главное, признак «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев», как любой другой жизненно важный, в процессе непрерывного отбора может приобрести положительное значение: в наших экспериментах, например, в результате непрерывного четырехкратного отбора доля растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев увеличилась в 7 раз.
Пример 3. В 1997-2008 годах, учитывая выявленные закономерности, начали селекционный процесс по созданию безгашишного сорта однодомной конопли южносозревающего типа.
Для анализа содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) образцы отбирали в период созревания 75% семян в соцветиях. Содержание ТГК определяли на хроматографе «Кристалл 2000М» с программированием температуры. Разделение каннабиноидов проводили на капиллярной колонке. Пики идентифицировали по времени удерживания. Содержание рассчитывали по методу внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали метилстеарит.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Табличный материал показывает, что признак «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев» вполне может служить основой для диагностики и отбора растений без психотомиметически активных каннабиноидных соединений. В селекционном материале, созданном новым способом в результате непрерывного четырехкратного отбора, в сравнении с известным содержание тетрагидроканнабинола оказалось в 3 раза ниже.
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет упростить процесс отбора, сократить затраты труда, времени и материальных средств, в конечном итоге, сократить селекционный процесс и создать южносозреваюшую форму конопли с нокаутированными генами синтеза тетрагидроканнабинола.
Таблица 1
Частота появления в фазе бутонизации растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев в популяциях сортов однодомной конопли (питомники исходного материала, 1996 год)
Сорт
Всего растений
В том числе с антоциановой окраской
штук
%
Фибримон 56 (К=452)
372
20
5,38
ЮСО-21 (К=503)
367
26
7,08
ЮСО-14 (К=499)
427
33
7,73
Однодомная бернбургская (К=220)
490
41
8,37
Таблица 2
Характеристика исходных растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев по содержанию каннабиноидных соединений (питомник исходного материала, 1996 год)
Сорт
Кол-во растений
Содержание каннабиноидов, %
КБД
ТГК
КБН
Фибримон 56 (К=452)
20
0,37
0,020
0,009
ЮСО-21 (К=503)
26
0,34
0,019
0,008
ЮСО-14 (К=499)
33
0,32
0,017
0,007
Однодомная бернбургская (К=220)
41
0,31
0,017
0,007
Примечание: КБД - каннабидиол;
ТГК - тетрагидроканнабинол;
КБН - каннабинол.
Таблица 3
Влияние непрерывного методического отбора в популяциях селекционных элит на частоту появления в ранний период вегетации (фаза бутонизации) растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев (селекционный питомник)
Год
Всего растений
В том числе с антоциановой окраской
штук
%
1997
1485
212
14,27
1998
1640
470
28,65
1999
1724
980
56,84
2000
1964
1630
83,00
2001
2018
1971
97,67
Таблица 4
Степень изменчивости содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) в потомствах растений с антоциановой окраской вегетативных органов в зависимости от способа и кратности их отбора (селекционный питомник)
Год
Всего растений
Содержание ТГК, %
Среднее
До 0,0009
0,001-0,009
0,010-0,019
0,020-0,029
Более 0,030
Известный способ (прототип)
1997
160
-
1
49
102
8
0,021
1998
366
-
4
123
221
18
0,021
1999
299
-
7
114
165
13
0,020
2000
537
3
24
215
274
21
0,019
2001
528
6
42
242
219
19
0,017
2002
520
23
78
227
179
13
0,015
2003
699
63
190
226
210
10
0,013
2004
676
118
203
191
161
3
0,011
2005
660
144
232
179
105
-
0,009
2006
636
169
244
161
62
-
0,008
2007
632
171
246
158
57
-
0,007
2008
537
145
210
134
48
-
0,007
Новый способ
1997
340
-
17
200
120
3
0,017
1998
634
24
188
332
80
10
0,012
1999
701
146
252
230
68
5
0,008
2000
763
163
384
200
16
-
0,006
2001
772
201
410
150
11
-
0,005
2002
780
203
413
156
8
-
0,005
2003
801
208
424
160
9
-
0,005
2004
824
214
437
165
8
-
0,005
2005
840
219
445
168
8
-
0,005
2006
864
225
458
173
8
-
0,005
2007
868
226
460
174
8
-
0,005
2008
963
250
510
193
10
-
0,005