СУСПЕНДИРОВАНИЕ И КЛАСТЕРИЗАЦИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С ЦЕЛЬЮ ИХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ПАНКРЕАТИЧЕСКИЕ ЭНДОКРИННЫЕ КЛЕТКИ

1. Способ получения трехмерного кластера клеток, содержащий следующие стадии:
a. выращивание плюрипотентных стволовых клеток на плоской прикрепленной культуре,
b. выращивание плюрипотентных стволовых клеток в агрегированные кластеры клеток и
c. перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток с плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензионную культуру с использованием ферментативного или хелатирующего агента, где формируется трехмерный кластер клеток.
2. Способ по п. 1, где перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток с плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензионную культуру происходит с использованием фермента, выбранного из нейтральной протеазы и Accutase.
3. Способ по п. 2, в котором фермент представляет собой нейтральную протеазу.
4. Способ по п. 1, в котором клеточные кластеры поддерживают плюрипотентность.
5. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки выбираются из следующих: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки, полученные из ткани пуповины человека, партеноты, человеческие эмбриональные стволовые клетки (клетки hES) и клетки, извлеченные из амниотической жидкости.
6. Способ по п. 5, в котором клетки представляют собой клетки линии H1 hES.
7. Способ по п. 1, в котором агрегированные клетки экспрессируют CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-и 1-81 и лишены экспрессии CXCR4.
8. Способ по п. 1, где перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток с плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензионную культуру происходит с использованием хелатирующего агента.
9. Способ по п. 8, в котором хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
10. Способ выращивания и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, способ содержит:
a. выращивание плюрипотентных стволовых клеток на плоской прикрепленной культуре,
b. выращивание плюрипотентных стволовых клеток в агрегированные кластеры клеток,
c. перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток с плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензионную культуру с использованием ферментативного или хелатирующего агента.
d. поддержание кластеров клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, где кластеры стволовых клеток экспрессируют CD9, SSEA4, TRA-1-60 и TRA-1-81 и лишены экспрессии CXCR4, и
e. дифференцировку, кластеров плюрипотентных клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе для генерирования популяции панкреатических клеток-предшественников, популяции нейронных клеток-предшественников или популяции кардиомиотических клеток-предшественников.
11. Способ по п. 10, в котором плюрипотентные стволовые клетки выбираются из следующих: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки, полученные из ткани пуповины человека, партеноты, человеческие эмбриональные стволовые клетки (клетки hES) и клетки, извлеченные из амниотической жидкости.
12. Способ по п. 10, в котором по данному способу генерируются панкреатические клетки-предшественники, экспрессирующие фактор транскрипции β-клеток.
13. Способ по п. 10, в котором факторами транскрипции являются PDX1 и/или NKX6.1.
14. Трансплантируемый продукт стволовых клеток, содержащий популяцию дифференцированный панкреатических клеток-предшественников, произведенных по способу по п. 10.
15. Культуральная система биореактора для дифференцировки агрегированных кластеров плюрипотентных стволовых клеток, содержащая:
кластеры плюрипотентных стволовых клеток поддерживающиеся в суспензионной среде, где кластеры стволовых клеток экспрессируют CD9, SSEA4, TRA-1-60 и TRA-1-81 и лишены экспрессии CXCR4,
стеклянный биореактор с перемешиванием суспензии,
среда для дифференцировки и
блок управления для регулировки температуры и уровней pH и кислорода.
16. Культуральная система биореактора по п. 15, где суспензионной средой является среда mTeSR.
17. Способ выращивания и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в суспензионной культуральной системе, содержащий следующие шаги:
a. выращивание плюрипотентных стволовых клеток на плоской прикрепленной культуре,
b. удаление плюрипотентных стволовых клеток с плоской прикрепленной культуры с использованием фермента,
c. крепление плюрипотентных стволовых клеток к микроносителям в статической культуре,
d. выращивание плюрипотентных стволовых клеток, прикрепленных к микроносителям, в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, и
e. дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе в популяцию панкреатических клеток-предшественников.
18. Способ по п. 17, в котором динамически перемешиваемая суспензионная культуральная система содержит центрифужную пробирку.
19. Способ производства панкреатических клеток, вырабатывающих инсулин, где вырабатывающие инсулин клетки произведены в суспензионной культуре из плюрипотентных стволовых клеток, и где плюрипотентные стволовые клетки культурированы и агрегированы в суспензионной культуре.
20. Способ по п. 19, в котором дифференцировочная среда суспензии включает уровень кислорода от гипоксии до приблизительно 30% стандартного, уровень липидов от 1% до приблизительно 2% или их комбинацию.
21. Способ по п. 19, в котором клетки находятся в суспензионной культуре, содержащей менее 11 мМоль глюкозы.
22. Способ по п. 19, в котором клетки находятся в суспензионной культуре, содержащей более 25 мМоль глюкозы.
23. Неферментативный метод инициации суспензионной культуры плюрипотентных клеток из плоской или прикрепленной культуры, при котором поддерживается плюрипотентность перенесенных клеток, содержащий обработку плоской культуры хелатирующим агентом.
24. Способ повышения индукции брахиурических клеток, содержащий культивирование плюрипотентных клеток в виде агрегированных кластеров клеток в условиях, подходящих для дифференцировки.
25. Способ увеличения процента клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла, способ содержит культивирование плюрипотентных клеток в виде агренгированных кластеров клеток, с использованием малых молекул для индуцирования дифференциации из плюрипотентного состояния.
26. Способ по п. 25, в котором малая молекула представляет собой МСХ.
27. Способ дифференцировки плюрипотентных клеток в суспензионной культуре в клетки дефинитивной энтодертмы за 18-30 часов, в котором культуральная среда не содержит активина А, WNT3A или любого вещества из семейства TGFβ, способ содержит культуральную среду, содержащую как минимум одну малую молекулу.
28. Способ по п. 27, в котором малая молекула представляет собой МСХ.
29. Способ дифференцировки клеток в клеточной культуре в клетки дефинитивной энтодертмы, в котором культуральная среда содержит МСХ и GDF8 или WNT3A и активин А.
30. Способ направления дифференцировки плюрипотентных клеток в закрытой системе суспензионной культуры, в котором дифференцировка индуцируется гипоксией.
31. Способ направления дифференцировки плюрипотентных клеток в суспензионной культуре для дифференцировки в панкреатические клетки, где культуральная среда не содержит Noggin.
32. Способ по п. 31, в котором культуральная среда содержит агонист PKC, ТРРВ или их комбинацию.