СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ КАРДИОМИОЦИТОВ (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF CARDIOMYOCYTE SELECTION (VERSIONS)

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу очистки кардиомиоцитов из клеточной популяции, образованной из стволовых клеток и эмбрионов, а также к способу их применения.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Поскольку кардиомиоцит теряет пролиферативную способность во взрослом организме, то при лечении тяжелых заболеваний сердца, таких как инфаркт миокарда или кардиомиопатия, необходимо проводить трансплантацию сердца. Однако в настоящее время, поскольку доступно недостаточное количество донорских сердец, существует срочная необходимость в разработке способа лечения, отличного от трансплантации сердца.
ex vivo
С другой стороны, привлечение полученных  кардиомиоцитов, как ожидают, является наиболее перспективным способом обеспечения облегчения у пациентов, нуждающихся в трансплантации сердца. Были исследованы различные способы получения кардиомиоцитов, такие как способ дифференцировки стволовых клеток (эмбриональных стволовых клеток или различных взрослых стволовых клеток) в кардиомиоциты или способ выделения кардиомиоцитов из эмбрионов.
Дифференцировку кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток положительно индуцируют посредством образования клеточной массы (эмбриоидного тельца) с помощью устранения из культуральной среды подавляющих дифференцировку факторов (таких как фидерные клетки, лейкозингибирующий фактор: LIF) в случае эмбриональных стволовых клеток мыши или подавляющих дифференцировку факторов (таких как фидерные клетки, основной фибробластный фактор роста: bFGF, трансформирующий фактор роста: TGF) в случае эмбриональных стволовых клеток человека.
in vitro
in vitro
in vitro
Способ дифференцировки  частично соответствует процессу физиологического развития. В частности, в отношении процессов раннего развития существует много общего между способом физиологического развития оплодотворенных яйцеклеток и способом дифференцировки . В ходе дифференцировки кардиомиоцитов , так же как и при физиологическом развитии, сначала получают недифференцированные мезобластные клетки, часть которых изменяется до запрограммированных кардиомиоцитов (прекардиальных мезобластных клеток), а затем дифференцируется в кардиомиоциты. Однако поскольку эмбриональные стволовые клетки могут дифференцироваться в клетки любого типа, которые образуют органы в организме, технически трудно дифференцировать эмбриональные стволовые клетки только в один тип клеток.
in vitro
Кроме того, поскольку не в физиологических условиях () также является трудным индуцировать дифференцировку эмбриональных стволовых клеток во все типы клеток, частично остаются недифференцированные клетки. Более того, мезенхимные стволовые клетки, находящиеся в костном мозге или пуповине, и тканевые стволовые клетки, находящиеся в различных типах тканей (такие как нейрональные стволовые клетки, стволовые клетки жировой ткани и стволовые клетки скелетных мышц), рассматривают как взрослые стволовые клетки, которые, как считают, обладают способностью дифференцироваться в кардиомиоциты. Полагают, что эти клетки дифференцируются не только в кардиомиоциты, но также в клетки различных типов. Хотя детали механизмов дифференцировки из каких-либо взрослых стволовых клеток в кардиомиоциты не выяснены полностью, известно, что в течение определенного периода после прохождения переходной фазы эти клетки образуют кардиомиоциты, другие дифференцированные клетки и клеточную популяцию, содержащую недифференцированные клетки.
В общих словах, все стволовые клетки приводят к некоторым общим неблагоприятным для клинического применения особенностям, состоящим в том, что существуют клетки, отличные от кардиомиоцитов, которые образуются из стволовых клеток в качестве побочных продуктов, или недифференцированные клетки. Поскольку недифференцированные клетки обладают пролиферативной активностью и способностью дифференцироваться во многие типы клеток, клеточную популяцию, содержащую кардиомиоциты, полученные индукцией дифференцировки, нельзя трансплантировать в живой организм при лечении.
Таким образом, для безопасного проведения лечения с использованием стволовых клеток и достижения идеального эффекта лечения необходимо разработать способ очистки кардиомиоцитов из клеточной популяции.
До настоящего времени кардиомиоциты очищали способом очистки кардиомиоцитов посредством специфичной экспрессии флуоресцентного маркера, такого как GFP, в кардиомиоцитах и селекцией клеток, экспрессирующих флуоресцентный маркер с использованием клеточного сортера (Непатентный документ 1), или способом очистки кардиомиоцитов посредством специфичной экспрессии устойчивого к антибиотику белка в кардиомиоцитах и селекцией клеток с использованием антибиотика (Непатентный документ 2). Однако поскольку эти способы должны вовлекать генетическое изменение, которое приводит к связанным с безопасностью проблемам, эти способы нельзя применять для получения кардиомиоцитов в целях трансплантации в клинике. Кроме того, поскольку эти способы вовлекают генетическое изменение, то с геномным изменением ассоциированы этические вопросы и некоторый непредсказуемый серьезный риск, такой как изменение скорости трансформации (Непатентный документ 3).
В данной области известно, что сердце может использовать молочную кислоту, образованную тканью, отличной от сердца (такой как скелетная мышца), в качестве источника энергии (Непатентный документ 4). Однако в предшествующем уровне техники не пытались очищать кардиомиоциты с использованием этого признака.
Кроме того, в сердце, печени и почке используются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота для транспорта NADH в митохондрии, механизм которого отличается от механизма в других тканях (Непатентный документ 5). Транспорт NADH в митохондрии необходим для выработки энергии в митохондриях. Однако в предшествующем уровне техники не пытались очищать кардиомиоциты с использованием этого отличия в данном механизме.
Непатентный документ 1: Muller M, et al., FASEB J. 2000; 14: 2540-2548
Непатентный документ 2: Klug M.G., et al., J. Clin. Invest. 1996; 98: 216-224
Непатентный документ 3: Schroder AR, et al., Cell. 2002; 110: 521-529
Непатентный документ 4: Khairallah M, et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 286, H1461-1470
Непатентный документ 5: Chatham JC, et al., J Biol Chem 1995; 270: 7999-8008
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМА, РЕШАЕМАЯ ЭТИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
Целью настоящего изобретения является разработка способа очистки кардиомиоцитов с высокой степенью очистки и с высоким выходом из клеточной смеси, содержащей кардиомиоциты, полученные из эмбриона, и стволовые клетки, с использованием различных признаков, которые ранее не предполагали применять для очистки кардиомиоцитов или которые являются вновь выявленными, при этом указанный способ проводят без какого-либо генетического изменения или без добавления каких-либо специальных белков или биологически активных веществ.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
В целях создания системы для эффективной продукции кардиомиоцитов, образованных из эмбриональных стволовых клеток, авторы настоящего изобретения провели исчерпывающее исследование различных типов композиций культуральных сред. Исходя из результатов, касающихся исследования концентрации каждого из компонентов различных культуральных сред или исследования распределения во времени изменений концентраций каждого из компонентов различных культуральных сред, полученных изменением составов компонентов различных культуральных сред, авторы настоящего изобретения выявили следующие события:
(1) событие, при котором происходит ингибирование дифференцировки/роста клеток и индукция направленной не на кардиомиоциты гибели клеток, когда клеточную среду, содержащую кардиомиоциты и некардиомиоциты, культивируют в условиях низкой подпитки сывороткой или в бессывороточных условиях;
(2) событие, при котором происходит индукция направленной не на кардиомиоциты гибели клеток, когда клеточную среду, содержащую кардиомиоциты и некардиомиоциты, культивируют в культуральной среде со средней кислотностью;
(3) событие, при котором происходит ингибирование дифференцировки/роста клеток и индукция направленной не на кардиомиоциты гибели клеток, когда клеточную смесь, содержащую кардиомиоциты и некардиомиоциты, культивируют в культуральной среде с низким содержанием кальция;
(4) событие, при котором некардиомиоциты селективно подвергаются клеточной гибели, когда кардиомиоциты культивируют в культуральной среде с низким содержанием питательных веществ;
(5) событие, при котором потребление энергии ингибируется ослаблением автономной пульсации кардиомиоцитов, когда кардиомиоциты культивируют в условиях низкого содержания кальция;
(6) событие, при котором спонтанное образование клеточной массы кардиомиоцитов усиливается в условиях низкой подпитки сывороткой или в бессывороточных условиях; и
(7) событие, при котором жизнеспособность кардиомиоцитов значительно снижается, когда кардиомиоциты культивируют после разделения клеточной массы кардиомиоцитов.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что кардиомиоциты, образованные из эмбриональных стволовых клеток, можно подвергать селекции или очищать эффективно и в высокой степени посредством оптимизированного способа с использованием одного или нескольких процессов, соответствующих этим событиям. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что способы, разработанные, исходя из свойств эмбриональных стволовых клеток, также являются применимыми для селекции и очистки кардиомиоцитов, образованных из эмбриона, или для селекции или очистки кардиомиоцитов, образованных из взрослых стволовых клеток. Исходя из этих открытий авторы изобретения осуществили настоящее изобретение.
Более конкретно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу селекции кардиомиоцитов из клеточной смеси, содержащей кардиомиоциты и некардиомиоциты, образованной из эмбриональных стволовых клеток, взрослых стволовых клеток или эмбрионов, где указанную клеточную смесь культивируют в культуральной среде в следующих условиях: (i) условия низкой подпитки глюкозой; и (ii) одно или несколько условий, выбранных из группы, состоящей из условий низкого содержания кальция, условий низкого содержания питательных веществ, условий подпитки молочной кислотой, условий подпитки аспарагиновой кислотой/глутаминовой кислотой и условий подпитки пировиноградной кислотой. В этом варианте осуществления клеточную смесь можно получать индукцией дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, образованием эмбриоидных телец, содержащих запрограммированные кардиомиоциты (недифференцированные мезобластные клетки), культивированием эмбриоидных телец в культуральной среде в условиях низкой подпитки сывороткой и/или в условиях среднекислых значений pH.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу селекции кардиомиоцитов, образованных из эмбриональных стволовых клеток, где селекцию кардиомиоцитов проводят посредством следующих стадий: индукция дифференцировки эмбриональных стволовых клеток с образованием эмбриоидных телец, содержащих недифференцированные мезобластные клетки; затем культивирование эмбриоидных телец в культуральной среде в условиях низкой подпитки сывороткой и/или условиях среднекислого значения pH с получением клеточной смеси, содержащей запрограммированные кардиомиоциты; и продолжение культивирования клеточной смеси в указанной культуральной среде с получением кардиомиоцитов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1. На фиг. 1 представлено изображение кардиомиоцитов в эмбриоидном тельце после культивирования в прикрепляющейся культуре.
Фиг. 2. На фиг. 2 представлено изображение кардиомиоцитов в прикрепленных эмбриоидных тельцах, которые культивировали в бессывороточных условиях.
Фиг. 3. На фиг. 3 представлена успешная селекция запрограммированных кардиомиоцитов в бессывороточных условиях.
Фиг. 4. На фиг. 4 представлен эффект условий низкого содержания кальция.
Фиг. 5. На фиг. 5 представлена успешная селекция запрограммированных кардиомиоцитов из массы эмбриональных стволовых клеток в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH.
Фиг. 6-1. На фиг. 6-1 представлен анализ запрограммированных кардиомиоцитов в массе эмбриональных стволовых клеток в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH.
Фиг. 6-2. На фиг. 6-2 представлен анализ запрограммированных кардиомиоцитов в массе эмбриональных стволовых клеток в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH.
Фиг. 7. На фиг. 7 представлена масса кардиомиоцитов, которые отобрали посредством культивирования эмбриональных стволовых клеток в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH.
Фиг. 8. На фиг. 8 представлена селекция кардиомиоцитов посредством культивирования клеток в условиях без сахаров, без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 9. На фиг. 9 представлены изображения кардиомиоцитспецифичного окрашивания для клеток, которые подвергали селекции и собирали посредством культивирования клеток в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 10. На фиг. 10 представлены массы кардиомиоцитов и массы погибших клеток сразу после селекции культивированием клеток в условиях без сыворотки/со средней кислотностью/с низким содержанием кальция/без сахаров и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 11. На фиг. 11 показан результат способа элиминации агрегатов с высокой плотностью, состоящих из масс погибших клеток, с использованием центрифугирования в градиенте плотности.
Фиг. 12-1. На фиг. 12-1 представлены массы кардиомиоцитов, подвергнутые селекции культивированием клеток в условиях без сыворотки/со средней кислотностью/с низким содержанием кальция/без сахаров и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 12-2. На фиг. 12-2 представлены массы кардиомиоцитов, подвергнутых селекции посредством культивирования клеток в условиях без сыворотки/со средней кислотностью/с низким содержанием кальция/без сахаров и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 13. На фиг. 13 показаны кардиомиоциты, очищенные посредством культивирования клеток в условиях без сыворотки/со средней кислотностью/с низким содержанием кальция/без сахаров и с подпиткой аспарагиновой кислотой/глутаминовой кислотой.
Фиг. 14. На фиг. 14 показаны результаты очистки кардиомиоцитов из стволовых клеток костного мозга.
Фиг. 15. На фиг. 15 показаны результаты очистки кардиомиоцитов из эмбрионов.
Фиг. 16. На фиг. 16 показаны области, содержащие автономно пульсирующие клетки в условиях без сыворотки/со средней кислотностью/с низким содержанием кальция/без сахаров и с подпиткой пировиноградной кислотой.
Фиг. 17. На фиг. 17 показаны массы кардиомиоцитов мартышки, подвергнутые селекции культивированием клеток в течение 15 суток в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 18. На фиг. 18 показаны изображения кардиомиоцитспецифичного окрашивания клеток мартышки, которые подвергают селекции и собирают культивированием клеток в условиях без сыворотки/со средней кислотностью/с низким содержанием кальция/без сахаров и с подпиткой молочной кислотой.
Фиг. 19. На фиг. 19 показано, что клетки мартышки, которые подвергают селекции и собирают культивированием в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой, успешно пересаживают в сердце реципиента.
Фиг. 20. На фиг. 20 показаны картина клеточных масс, образованных из эмбриональных стволовых клеток человека, которые получали культивированием в условиях присутствия сахара (контроль) (т.е. в контрольных условиях), и картина клеточных масс, образованных из эмбриональных стволовых клеток человека, которые были получены с помощью селективного для кардиомиоцитов культивирования в условиях без сахаров (селекция кардиомиоцитов) в течение 15 суток (то есть в условиях селекции кардиомиоцитов).
Фиг. 21. На фиг. 21 показаны изображения иммунного окрашивания клеточных масс, образованных из эмбриональных стволовых клеток человека с использованием антитела против актинина и антитела против Nkx2.5, где клеточные массы были образованы кардиомиоцитами с продолжающейся автономной пульсацией. Клеточные массы получали культивированием эмбриональных стволовых клеток человека в условиях без сахаров (селекция кардиомиоцитов) в течение 1 суток с последующей сменой условий культуральной среды.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пригодный способ обработки для индукции дифференцировки кардиомиоцитов, как правило, приводит к дифференцировке стволовых клеток, обладающих способностью дифференцироваться в кардиомиоциты (то есть эмбриональных стволовых клеток и взрослых стволовых клеток, таких как стволовые клетки костного мозга). Возможной является индукция дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты с использованием способа "висячей капли", в котором, например, эмбриональные стволовые клетки мыши инкубируют в суспензионной культуре в условиях отсутствия лейкозингибирующего фактора (LIF) с образованием клеточной массы (эмбриоидного тельца). Также, аналогично, для индукции дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты можно использовать эмбриональные стволовые клетки мартышки или эмбриональные стволовые клетки человека.
Данный способ можно применять в случае стволовых клеток, полученных из млекопитающих любых видов. Например, примеры видов млекопитающих, из которых получают стволовые клетки, используемые в данном способе, включают, но не ограничиваются ими, мышь, корову, козу, собаку, кошку, мартышку, макаку резус, человека и т.д. Примеры стволовых клеток, используемых для настоящего изобретения, включают клетки ES млекопитающих, которые широко используют в данной области, такие как клетки ES мыши, клетки ES обезьяны и клетки ES человека.
Конкретные примеры клеток ES мыши включают клетки EB3, клетки E14, клетки D3, клетки CCE, клетки R1, клетки 129SV, клетки J1 и т.д. Клетки ES мыши, используемые для настоящего изобретения, доступны от Американской коллекции типовых культур (ATCC), Chemicon and Cell ＆ Molecular Technologies и т.д.
Примеры клеток ES обезьяны включают клетки ES, полученные от макаки резус (Macaca mulatta) (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:7844), клетки ES, полученные от яванской макаки (Macaca fascicularis) (Suemori et al., Dev. Dyn. 2001; 222: 273-279), и клетки ES, полученные от обыкновенной игрунки (Callithrix jacchus) (Sasaki et al., Stem cells. 2005; 23: 1304-1313), все из которых доступны в данной области. Например, клетки ES мартышки доступны от Central Institute for Experimental Animals (Kawasaki, Japan).
К настоящему времени в мире получено несколько дюжин типов клеток ES человека, и множество клеточных линий ES зарегистрировано в перечне United States National Institute of Health (http://stemcells.nih.gov/registry/index.asp) и являются доступными. В США некоторые клеточные линии ES человека также коммерчески доступны от Cellartis, ES Cell International, Wisconsin Alumni Research Foundation, и т.д. Также в Японии некоторые клеточные линии ES человека доступны от Stem Cell Research Center (Institute for Frontier medical Sciences, Kyoto University) (Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006; 345: 926-932).
Кроме того, также были получены клетки ES коровы (Mitalipova et al., Cloning 2001; 3: 59-67), клетки ES курицы (Petitte et al., Mech. Dev. 2004; 121: 1159-1168) и клетки ES данио-рерио (Fishman, M. C., Science 2001; 294: 1290-1291).
Главным образом, клетки ES получают культивированием раннего эмбриона. В дополнение к этому способу можно получать клетки ES из раннего эмбриона, который подвергают ядерной трансплантации ядрами соматических клеток (Munsie et al., Curr. Biol. 10:989, 2000; Wakayama et al., Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303: 1669, 2004). Также существует несколько сообщений о попытках выделения стволовых клеток следующим образом: способ получения клеток ES из партеногенетических эмбриональных клеток, развитых до стадии, эквивалентной стадии бластоцисты (публикация патента США №02/168763; Vrana K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11911-6, 2003), и способ получения клеток ES, обладающих генетической информацией, исходно содержащейся в ядре соматических клеток, посредством слияния клеток ES и соматических клеток (WO 00/49137; Tada et al., Curr. Biol. 11:1553, 2001). Примеры клеток ES, используемых в настоящем изобретении, включают клетки ES, полученные способом, описанным выше, или клетки, в которых один или несколько генов на хромосоме клеток ES изменены способами генетической инженерии.
Кроме того, примеры стволовых клеток, используемых в способе по настоящему изобретению, включают не только клетки ES, но также любые стволовые клетки, обладающие характеристиками, сходными с характеристиками клеток ES, которые образованы из клеток взрослых органов или тканей млекопитающих, клеток костного мозга, клеток крови и клеток эмбрионов или плодов. В этом контексте выражение "характеристики, сходные с характеристиками клеток ES" можно определить клеточными биологическими характеристиками, специфичными для клеток ES (такими как наличие поверхностного (антигенного) маркера, специфичного к клеткам ES, специфичная для клеток ES экспрессия генов, или способность образовывать тератому или химерную мышь). Конкретные примеры стволовых клеток, имеющих характеристики, сходные с характеристиками клеток ES, включают клетки EG, образующиеся из первичных зародышевых клеток, клетки GS, образующиеся из тестикулярных зародышевых клеток, и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (клетки iPS), образующиеся из соматических клеток, таких как фибробласт, с использованием специального способа генетической инженерии. Считают, что в этом способе эмбриоидные тельца через 3-6 суток после начала индукции дифференцировки, проводимой культивированием стволовых клеток с помощью суспензионной культуры в отсутствие LIF, включают недифференцированные мезобластные клетки и запрограммированные кардиомиоциты, которые в будущем дифференцируются в кардиомиоциты. В данной области известно, что в случае индукции эмбриональных стволовых клеток кардиомиоцит появляется через 7 суток после начала индукции дифференцировки (в случае эмбриональных стволовых клеток человека через 10 суток после начала индукции дифференцировки). Однако полученные таким способом эмбриоидные тельца с использованием эмбриональных стволовых клеток включают не только кардиомиоциты, описанные выше, а также клетки, которые не обладают способностью дифференцироваться в кардиомиоциты (такие как недифференцированные клетки, эндотелий-эпителийподобные клетки и нейрональные клетки). В настоящем изобретении любые клетки, отличные от кардиомиоцитов, или клетки, которые в будущем дифференцируются в кардиомиоциты (такие как недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты), обозначают как "некардиомиоциты".
Авторы настоящего изобретения исследовали эффекты условий культивирования, таких как условия низкой подпитки сывороткой, условия низкой подпитки глюкозой, условия низкого содержания питательных веществ, условия низкого содержания кальция и условия среднекислого значения pH, на селекцию кардиомиоцитов, в целях специфичного отделения кардиомиоцитов или клеток, которые в будущем дифференцируются в кардиомиоциты, от некардиомиоцитов, находящихся в полученных таким образом эмбриоидных тельцах.
В результате авторы настоящего изобретения выявили, что когда клеточную смесь, содержащую недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты, культивируют в одном или нескольких условиях, выбранных из группы, состоящей из условий низкой подпитки сывороткой, условий низкой подпитки глюкозой, условий низкого содержания питательных веществ, условий низкого содержания кальция, условий среднекислого значения pH, отдельно или в любом сочетании, кардиомиоциты или клетки, которые в будущем дифференцируются в кардиомиоциты, являются менее чувствительными в таких условиях к цитотоксическому эффекту по сравнению с некардиомиоцитами.
Исходя из этого открытия в настоящем изобретении клетки, которые являются жизнеспособными даже в указанных выше условиях, были способны проходить селекцию в качестве запрограммированных кардиомиоцитов и кардиомиоцитов из клеточной смеси, содержащей недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты, посредством культивирования клеточной смеси в условиях низкой подпитки глюкозой в сочетании с любым одним или любыми сочетаниями из условий низкой подпитки сывороткой, условий низкого содержания питательных веществ, условий низкого содержания кальция и условий среднекислого значения pH.
Описанный выше способ селекции представляет собой селекцию представляющих интерес клеток культивированием клеточной смеси в условиях, к которым кардиомиоциты являются физиологически устойчивыми, и, таким образом, его называют "способом основанной на физиологической устойчивости селекции". Способ основанной на физиологической устойчивости селекции по настоящему изобретению характеризуется культивированием клеточной смеси, содержащей кардиомиоциты, в культуральной среде в условиях, выбранных из условий низкой подпитки глюкозой, условий низкой подпитки сывороткой, условий низкого содержания питательных веществ, условий низкого содержания кальция или условий среднекислого значения pH.
in vivo
В настоящем изобретении термин "условия низкой подпитки глюкозой" определяют как условия, при которых клеточную смесь культивируют в культуральной среде со сниженным уровнем сахаров (то есть группы веществ, включающей полисахариды и моносахариды (такие как глюкоза, галактоза, фруктоза, манноза), которые являются биохимически растворимыми и превращаются  или внутриклеточно для конечного катаболизма гликолитической системой). В предпочтительном варианте осуществления термин "условия низкой подпитки глюкозой" означает, что клеточную смесь культивируют в культуральной среде в отсутствие указанных выше сахаров или в культуральной среде, в которой уровень сахаров ограничен до менее 1% по сравнению с уровнем сахаров в культуральной среде, используемой для индукции дифференцировки. В настоящем изобретении является желательным устранение из культуральной среды глюкозы, среди прочих, насколько это возможно. Например, коммерчески доступные культуральные среды, которые, как правило, используют в данной области (такие как α-MEM, MEM [BSS Хэнка], DMEM), содержат 1 г/л D-глюкозы (5,56 мМ), RPMI 1640 содержит 2,0 г/л D-глюкозы (11,12 мМ), и F-12 Хэма содержит 1,82 г/л D-глюкозы (10,12 мМ) соответственно. Таким образом, культуральная среда с уровнем сахаров, сниженным до 1%, означает культуральную среду, содержащую 55,60-111,20 мкМ сахаров.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда клеточную смесь культивируют в культуральной среде с ограниченным уровнем сахаров до менее 1% по сравнению с уровнем сахаров, обычно используемым в данной области, некардиомиоциты подвергаются клеточной гибели, в то время как недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты могут выживать в культуральной среде в таких условиях. В настоящем изобретении условия низкой подпитки глюкозой могут быть достигнуты с использованием, например, культуральной среды RPMI (без сахаров) и культуральной среды DMEM (без сахаров) (обе от GIBCO).
Как используют в настоящем документе, термин "компонент сыворотки" включает саму сыворотку, компоненты биологически активных веществ, содержащиеся в сыворотке животных или человека, и рекомбинантно или искусственно полученные компоненты биологически активного вещества. В настоящем описании термин "условия низкой подпитки сывороткой" относится к условиям, где уровень сыворотки или компонента сыворотки, или рекомбинантно или искусственно продуцированных компонентов биологически активного вещества ограничен до 0-10% по сравнению с уровнем сыворотки, которой дополняют культуральную среду, используемую для получения недифференцированных мезобластных клеток, который рассматривают как 100%, и включают, например, "бессывороточные условия". Таким образом, примером "условий низкой подпитки сывороткой" является случай, когда для получения недифференцированных мезобластных клеток культуральную среду дополняют 10% сывороткой, и тогда концентрация сыворотки в культуральной среде для селекции запрограммированных кардиомиоцитов или кардиомиоцитов ограничена до менее 1%. Авторы настоящего изобретения открыли, что, когда уровни компонентов сыворотки, содержащихся в культуральной среде, ограничены до менее 10% по сравнению с уровнями компонентов сыворотки в культуральной среде, обычно используемой в данной области, некардиомиоциты подвергаются клеточной гибели, в то время как недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты могут выживать в культуральной среде.
В настоящем изобретении термин "условия низкого содержания питательных веществ" относится к условиям, где уровни всех питательных компонентов, находящихся в культуральных средах, которые обычно используют в данной области (такие как культуральная среда RPMI, культуральная среда DMEM, культуральная среда MEM, культуральная среда F12 и культуральная среда α-MEM) ограничены до уровня менее 10% по сравнению с уровнями питательных компонентов в культуральной среде, обычно используемой в данной области. В настоящем изобретении является желательным ограничение уровней питательных компонентов до 10%. Авторы настоящего изобретения открыли, что, когда уровни питательных компонентов в культуральной среде ограничены до 10% по сравнению с уровнями питательных компонентов в культуральной среде, обычно используемыми в данной области, некардиомиоциты подвергаются клеточной гибели, в то время как недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты могут выживать в культуральной среде. Такие "условия низкого содержания питательных веществ" в культуральной среде могут быть достигнуты разбавлением 1 объема культуральной среды, обычно используемой в данной области (культуральной среды RPMI, культуральной среды DMEM, культуральной среды MEM, культуральной среды F12 и культуральной среды α-MEM), с использованием 9 объемов физиологического раствора (такого как BSS Хэнка (без сахаров) или PBS).
В настоящем изобретении термин "условия низкого содержания кальция" относится к условиям, где концентрация кальция, находящегося в культуральной среде, варьирует между 0,3-1,3 мМ. Культуральные среды, обычно используемые для дифференцировки в кардиомиоциты (такие как культуральная среда DMEM, культуральная среда MEM и культуральная среда α-MEM), содержат 1,8 мМ концентрацию кальция в культуральной среде. В данной области известно, что для дифференцировки в кардиомиоциты на протяжении периода культивирования концентрацию кальция поддерживают на уровне приблизительно 1,8 мМ. Авторы настоящего изобретения открыли, что когда концентрация кальция в культуральной среде ограничена до концентрации кальция 0,3-1,3 мМ до величин, значительно меньших, чем концентрация кальция в культуральной среде, обычно используемой в данной области, некардиомиоциты подвергаются клеточной гибели, в то время как недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты могут выживать в культуральной среде. Культуральную среду RPMI и культуральную среду F12 (обе от GIBCO) можно использовать в качестве примеров культуральных сред с "условиями низкого содержания кальция" по настоящему изобретению.
2
В настоящем изобретении термин "условия среднекислого значения pH" относится к условиям, где значение pH культуральной среды варьирует между pH 6-7. В данной области известно, что условия pH культуральной среды, обычно используемой для индукции дифференцировки кардиомиоцитов (такой как культуральная среда RPMI, культуральная среда DMEM, культуральная среда MEM, культуральная среда F12 и культуральная среда α-MEM), обычно необходимо поддерживать на уровне приблизительно pH 7,5, который является таким же, как и физиологические условия. Значение pH основной BSS доводят приблизительно до pH 6,5 в инкубаторе с 5% CO. Авторы настоящего изобретения открыли, что когда значение pH культуральной среды снижают до значения pH 6,5, которое является более кислым, чем значение pH культуральной среды, обычно используемой в данной области, некардиомиоциты подвергаются клеточной гибели, в то время как недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты могут выживать в культуральной среде. Культуральную среду с "условиями среднекислого значения pH" по настоящему изобретению можно получать коррекцией pH культуральной среды с использованием сбалансированного солевого раствора Хэнка (BSS Хэнка).
В настоящем изобретении кардиомиоциты можно очищать более эффективно, воздействуя на упомянутую выше клеточную смесь любым сочетанием двух или более пригодных условий культуральной среды (то есть способом основанной на физиологической устойчивости селекции).
Авторы настоящего изобретения открыли, что, когда культуральную среду лишают сахаров, некардиомиоциты подвергаются клеточной гибли в эмбриоидных тельцах, образованных из эмбриональных стволовых клеток. Авторы настоящего изобретения далее исследовали альтернативный субстрат, который может предпочтительно обеспечивать кардиомиоциты энергией, отличный от сахаров, в целях дальнейшего улучшения селективности недифференцированных мезобластных клеток, запрограммированных кардиомиоцитов и кардиомиоцитов, находящихся в эмбриоидных тельцах.
В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что является эффективным дополнение культуральной среды молочной кислотой (лактат, 0,1-5 мМ), сочетанием аспарагиновой кислоты (20-100 мг/л) и глутаминовой кислоты (20-100 мг/л), или пировиноградной кислотой (0,5-5 мМ), или любым их сочетанием вместо сахаров. Исходя из этих открытий, полагают, что такие заместители сахаров могут специфично обеспечить кардиомиоциты необходимыми питательными веществами.
Описанный выше способ селекции обозначают в настоящем описании как "способ, основанный на метаболизме селекции", поскольку в способе селекции кардиомиоцитов используется метаболическая способность кардиомиоцитов. Способ, основанный на метаболизме селекции, по настоящему изобретению характеризуется культивированием клеточной смеси, содержащей кардиомиоциты, в условиях подпитки молочной кислотой, условиях подпитки аспарагиновой кислотой/глутаминовой кислотой или в условиях подпитки пировиноградной кислотой.
В настоящем изобретении можно использовать два типа способов селекции кардиомиоцитов (то есть способ основанной на физиологической устойчивости селекции и способ основанной на метаболизме селекции) в сочетании для очистки кардиомиоцитов с высокой степенью чистоты. Также указанные выше способы проводят неоднократно для достижения последующей высокой степени очистки.
Клеточную смесь, содержащую недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты, которые используют в настоящем изобретении в качестве источника кардиомиоцитов, также можно получать из стволовых клеток или эмбрионов. В этом контексте термин "стволовые клетки" включает, но не ограничивается ими, тотипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в любые типы клеток (такие как эмбриональные стволовые клетки) и плюрипотентные клетки, которые могут дифференцироваться во множество конкретных типов клеток (такие как взрослые стволовые клетки, образованные в костном мозге).
Полагают, что в ходе получения кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток, по мере прохождения дифференцировки, эмбриональные стволовые клетки дифференцируются в недифференцированные мезобласты и затем последовательно переходят в запрограммированные кардиомиоциты и в конце образуют кардиомиоциты. В настоящем документе "недифференцированные мезобластные клетки" относятся к клеткам, которые экспрессируют белок Brachyury (специфичный маркер недифференцированных мезобластных клеток). При этом "запрограммированные кардиомиоциты" относятся к клеткам, которые экспрессируют специфичные для недифференцированных мезобластных клеток белки, такие как белок Brachyury, но не экспрессируют специфичные для кардиомиоцитов белки, такие как Nkx2.5 и актинин. Запрограммированные кардиомиоциты обладают способностью дифференцироваться исключительно в кардиомиоциты без необходимости в дополнении культуральной среды какими-либо дополнительными веществами. "Кардиомиоциты" относятся к автономно пульсирующим клеткам, когда клетки являются жизнеспособными, а также к клеткам, экспрессирующим некоторые маркеры, такие как Nkx2.5, GATA4 и актинин, которые могут быть выявлены после фиксации.
Например, когда в качестве источника кардиомиоцитов используют эмбриональные стволовые клетки мыши, популяцию клеток, которые могут выжить в этих условиях культивирования, можно отбирать в качестве популяции клеток, состоящей из запрограммированных кардиомиоцитов или кардиомиоцитов, из клеток, составляющих эмбриоидные тельца, посредством следующих стадий: индукция дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши посредством устранения LIF из культуральной среды, затем инкубация эмбриональных стволовых клеток мыши в течение 4-7 суток с образованием эмбриоидных телец и культивирование эмбриоидных телец способом основанной на физиологической устойчивости селекции и/или способом основанной на метаболизме селекции для селекции популяции жизнеспособных клеток в качестве запрограммированных кардиомиоцитов или кардиомиоцитов.
В качестве примера через 5 суток после начала индукции дифференцировки клетки подвергали селекции в течение дополнительных 24 часов в условиях низкой подпитки глюкозой и любого одного или любых сочетаний четырех типов условий (то есть условия низкой подпитки сывороткой, условия низкого содержания питательных веществ, условия низкого содержания кальция и условия среднекислого значения pH). Хотя подвергнутые селекции клетки представляли собой клетки без способности к пульсации, клеточную популяцию без способности к пульсации подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против Brachyury, маркера недифференцированных мезобластных клеток, что привело к положительным по Brachyury изображениям практически во всех клетках. Это означает, что настоящий способ представляет собой способ эффективной селекции недифференцированных мезобластных клеток.
Кроме того, положительные по Brachyury клетки подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против Nkx2.5 (который представляет собой наиболее ранний известный в настоящее время связанный с развитием гомеозисный белковый маркер, специфичный к кардиомиоцитам), что приводит к отрицательным изображениям практически для всех клеток. Тем не менее, продолжение культивирования клеток приводило к дифференцировке приблизительно 80-90% клеток в кардиомиоциты. Таким образом, полагают, что недифференцированные мезобластные клетки, отобранные в представленном выше способе, представляют собой неизвестные, но наиболее незрелые запрограммированные кардиомиоциты.
В качестве другого примера для селекции кардиомиоцитов эмбриоидные тельца, образованные из эмбриональных стволовых клеток через 4-6 суток после начала индукции дифференцировки, можно культивировать в течение приблизительно 3 суток в бессывороточной культуральной среде, изготовленной смешиванием MEM (минимальной необходимой среды) [BSS Хэнка] (Invitrogen) и α-MEM (SIGMA) в соотношении MEM [BSS Хэнка]:α-MEM = 9:1-1:9, дополненной ITS [инсулин (10 мг/л), трансферрин (5,5 мг/л) и селенит натрия (6,7 мг/л)] (GIBCO) (в этом случае концентрация кальция составляла приблизительно 1,3 мМ). Эти условия культуральной среды соответствуют условиям низкой подпитки сывороткой, условиям низкого содержания кальция и условиям среднекислого значения pH. Полученные таким образом запрограммированные кардиомиоциты можно постоянно культивировать в указанной культуральной среде для дифференцировки в кардиомиоциты. Когда указанное выше манипулирование с клеточной смесью проводят через 5 суток после начала индукции дифференцировки, особенно после индукции автономно пульсирующих кардиомиоцитов, можно эффективно проводить селекцию кардиомиоцитов простым культивированием в MEM [BSS Хэнка] в условиях низкой подпитки сывороткой и условиях среднекислого значения pH. Полученные таким образом кардиомиоциты можно постоянно культивировать в смешанной культуральной среде MEM и α-MEM для дифференцировки в мышцу предсердий и мышцу желудочков.
В качестве следующего примера эмбриоидные тельца, образованные из эмбриональных стволовых клеток, промывали с использованием не содержащей сахаров среды, такой как BSS Хэнка (GIBCO), для полного устранения сахаров, а затем культивировали в течение 3-7 суток в культуральной среде (BSS Хэнка [не содержащей сахаров]/DMEM [не содержащей сахаров] = 9:1) в условиях низкой подпитки сывороткой, условиях низкого содержания питательных веществ (таких как условия, полученные 10-кратным разведением коммерчески доступной культуральной среды изотоническим буферным раствором), условиях среднекислого значения pH и в условиях низкого содержания кальция, которая была дополнена 1 мМ молочной кислотой (условия подпитки молочной кислотой), 20 мг/л аспарагиновой кислоты и 20 мг/л глутаминовой кислоты (условия подпитки аспарагиновой кислотой/глутаминовой кислотой), или 1 мМ пировиноградной кислотой (условия подпитки пировиноградной кислотой). В результате является возможной эффективная селекция кардиомиоцитов указанным выше способом.
Для целей получения кардиомиоцитов с использованием взрослых стволовых клеток, полученных из костного мозга, описанные выше способы также применимы для селекции кардиомиоцитов из клеточной смеси взрослых стволовых клеток. Здесь кардиомиоциты, полученные из костного мозга мыши, индуцировали с использованием клеток и способа, как описано в WO01/048151 (PCT/JP00/09323). Таким образом, клетки CMG культивируют в IMDM (модифицированной по Дульбекко среде Искова) (GIBCO), дополненной 20% эмбриональной телячьей сывороткой (в отношении способа получения клеток CMG, смотри J. Clin. Invest., 1999, Vol.103, p697-705), культивируют в течение дополнительных 24 часов в культуральной среде, дополненной 5-азацитидином (SIGMA) в конечной концентрации 3 мкмоль/л, а затем культивируют в течение 2-3 недель в указанной выше культуральной среде без 5-азацитидина. В результате, этот способ селекции обеспечивает индукцию дифференцировки клеток в автономно пульсирующие кардиомиоциты. Кардиомиоциты можно получать дальнейшим культивированием клеточной смеси, содержащей автономно пульсирующие кардиомиоциты, в способе основанной на физиологической устойчивости селекции и/или в способе основанной на метаболизме селекции.
Кроме того, в ходе получения кардиомиоцитов из эмбрионов мыши кардиомиоциты можно подвергать селекции и очищать после 7 суток жизни эмбриона (момент времени, когда впервые появляются кардиомиоциты; в случае человека этот момент времени соответствует 16 суткам после оплодотворения) следующим способом, а именно: асептическое извлечение эмбрионов мыши, промывание их с использованием BSS Хэнка [не содержащей сахаров] четыре раза, пипетирование несколько раз с использованием 10-мл пипетки для разделения эмбриона на отдельные клеточные массы, культивирование клеточных масс способом, основанным на физиологической устойчивости селекции, и/или способом, основанным на метаболизме селекции, и селекция кардиомиоцитов.
Таким образом, в настоящем изобретении клеточную смесь, содержащую недифференцированные мезобластные клетки, запрограммированные кардиомиоциты и кардиомиоциты, используемые в качестве источника кардиомиоцитов, культивируют способом, основанным на физиологической устойчивости селекции, и/или способом, основанным на метаболизме селекции, для получения масс кардиомиоцитов, которые образуются прикреплением кардиомиоцитов друг к другу. Однако поскольку полученные таким образом массы кардиомиоцитов покрыты слоем погибших некардиомиоцитов, необходимо устранить из масс слой погибших некардиомиоцитов перед трансплантацией масс кардиомиоцитов. В отношении этого вопроса авторы настоящего изобретения проводили исследование, как описано ниже.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда клеточные массы обрабатывают основным способом разделения клеток (таким как способы с использованием случайных протеолитических ферментов, таких как трипсин или хелатирующие ионы агенты, такие как ЭДТА), существенно снижается жизнеспособность разделенных клеток. Таким образом, существует необходимость в новом способе эффективной элиминации погибших клеток, прикрепленных к поверхности эмбриоидных телец с сохранением масс кардиомиоцитов.
Главным образом, полагают, что конъюгация клетка-клетка достигается связыванием через внеклеточный матрикс (например, коллаген, фибронектин и эластин) или прямым связыванием между мембранными белками. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что расщепление масс кардиомиоцитов с использованием коллагеназы или эластазы (которые обладают высокой специфичностью к матриксным белкам) может эффективно элиминировать погибшие некардиомиоциты, прикрепленные к поверхности клеточных масс кардиомиоцитов, с сохранением формы масс без разделения на отдельные клетки. Исходя из этих результатов адгезию клетка-клетка между кардиомиоцитами достигают прямым связыванием через N-кадгерин или коннексин.
В настоящем изобретении можно эффективно элиминировать погибшие клетки, например, встряхиванием эмбриоидных телец в присутствии 0,01-0,1% коллагеназы типа III (Wortington) в течение 20 минут на водяной бане при 37°C, отделением погибших клеток от кардиомиоцитов, повторяющимся центрифугированием и заменой супернатанта четыре раза для полного отмывания коллагеназы, и получением конечного продукта.
TM
TM
Однако даже после обработки коллагеназой полученные таким образом агрегаты возможно и нежелательно могут содержать погибшие клетки некардиомиоцитов. Чем более длительно проводят основанную на метаболизме селекцию, тем более часто могут возникать агрегаты, содержащие погибшие клетки. При исследовании плотности таких агрегатов, содержащих погибшие клетки, авторы настоящего изобретения обнаружили, что плотность и удельная масса погибших клеток превышают плотность и удельную массу живых клеток, а также они обнаружили, что живые клетки можно отделять от погибших клеток с использованием пригодного способа центрифугирования в градиенте плотности. Средство, используемое для отделения жизнеспособных клеток от погибших клеток способом центрифугирования в градиенте плотности, включает, но не ограничиваясь ими, Percoll (Pharmacia), Ficoll (Pharmacia), Optiprep (GIBCO).
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Образование селективных агрегатов кардиомиоцитов при культивировании эмбриональных стволовых клеток мыши в условиях низкой подпитки сывороткой или в бессывороточных условиях
Этот пример предназначен для исследования эффектов устранения сыворотки на клеточные массы, содержащие кардиомиоциты (эмбриоидные тельца), более конкретно, эффекта устранения сыворотки на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец) культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в бессывороточной культуральной среде.
2
Эмбриональные стволовые клетки мыши (клеточная линия называется EB3, Nat. Genet., 2000; 24: 372-376) были любезно предоставлены Dr. Hitoshi Niwa из RIKEN, Japan. Эмбриональные стволовые клетки мыши культивируют в течение всего 7 суток с использованием способа, сходного с существующим способом (Differentiation 2001, 68, p31-43), то есть 75 клеток ES на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение всего 7 суток в культуральной среде [α-MEM (минимальная необходимая среда) (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), 100 единиц/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли". После дифференцировки в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, с использованием указанного выше способа культивировали эмбриоидные тельца, прикрепленные на чашку для культивирования с использованием описанной выше культуральной среды в течение c 3-5 суток при 37°C в 5% CO. Описанный выше способ представляет собой общепринятый способ дифференцировки кардиомиоцитов. На фиг. 1 представлено изображение клеточных масс, полученных общепринятым способом, указанным выше. Здесь, на фиг. 1A, представлена микроскопическая картина эмбриоидного тельца; на фиг. 1B представлено изображение области расположения кардиомиоцитов в эмбриональном тельце, которую выявляли специфичным флуоресцентным иммунным окрашиванием с использованием антитела против актинина (SIGMA); и на фиг. 1C показано изображение области расположения кардиомиоцитов в эмбриоидном тельце, которую идентифицировали флуоресцентным иммунным окрашиванием и которая изображена на фазово-контрастном микроскопическом изображении фиг. 1A. Как показано на схеме расположения кардиомиоцитов в прикрепленном эмбриоидном тельце (фиг. 1D), кардиомиоциты были окружены другими клетками и их было трудно отделить и очистить из эмбриоидного тельца.
С другой стороны, эмбриональные стволовые клетки мыши дифференцировали в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты в указанных условиях, культивировали в течение 5 суток прикрепленными к чашке для культивирования, а затем культивировали в течение дополнительных 3 суток в не содержащей сыворотку среде с получением эмбриоидных телец, содержащих кардиомиоциты.
Результаты представлены на фиг. 2. Здесь, на фиг. 2A, показаны микроскопические изображения прикрепленных эмбриоидных телец, подвергнутых селективному культивированию в указанных выше условиях, и на фиг. 2B показано изображение области автономно пульсирующих кардиомиоцитов в эмбриоидных тельцах, которую идентифицировали анализом видеоизображения. Как представлено на схеме расположения кардиомиоцитов в эмбриоидных тельцах после селективного культивирования (фиг. 2C), клеточная популяция кардиомиоцитов располагается в поверхностной области эмбриоидных телец, где кардиомиоциты, как было выявлено, образуют друг с другом агрегаты.
ПРИМЕР 2: Образование селективных агрегатов запрограммированных кардиомиоцитов и образование агрегатов, содержащих высокую долю кардиомиоцитов при культивировании эмбриональных стволовых клеток мыши в условиях низкой подпитки сывороткой или в бессывороточных условиях
Целью этого примера является исследование эффекта устранения сыворотки на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты, более конкретно,  эффекта устранения сыворотки на селекцию запрограммированных кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец), содержащих запрограммированные кардиомиоциты в бессывороточной культуральной среде.
2
Эмбриональные стволовые клетки мыши культивировали в течение 5 суток с использованием стандартного способа, описанного в примере 1, в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)], т.е. 75 клеток ES на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в указанной выше культуральной среде с использованием способа «висячей капли» в течение 5 суток при 37°C в 5% CO с образованием эмбриоидных телец. Автономно пульсирующие клетки наблюдали в эмбриоидных тельцах на 7-е сутки после начала культивирования для дифференцировки клеток с использованием существующего способа культивирования (как определено в примере 1). Затем через 5 суток после начала культивирования для дифференцировки клеток, на стадии, когда еще не наблюдали каких-либо автономно пульсирующих кардиомиоцитов, клетки культивировали в бессывороточных условиях в течение дополнительных 1 суток (24 часов) (указанные результаты получают в обоих случаях, когда культивирование начинают на 4-е сутки или на 6-е сутки после начала культивирования для дифференцировки). На фиг. 3A показана морфологическая картина эмбриоидных телец, которые культивировали в нормальных условиях с подпиткой сывороткой в течение 6 суток, в то время как на фиг. 3B показана морфологическая картина эмбриоидных телец приблизительно на той же стадии, что и на фиг. 3A, которые культивировали в бессывороточных условиях в течение дополнительных 1 суток (24 часов) на 5-е сутки после начала культивирования.
Когда клеточные массы, представленные на фиг. 3B, которые получали культивированием в бессывороточных условиях в течение дополнительных 1 суток (24 часов) на 5-е сутки после начала культивирования (то есть посредством следующих стадий: перенос культуральной среды, содержащей эмбриоидные тельца, в пробирку для центрифугирования с последующим спонтанным осаждением, удаление супернатанта, промывание один раз с использованием бессывороточной культуральной среды [α-MEM (SIGMA), инсулин/трансферрин/селен (GIBCO), и пенициллин/стрептомицин (GIBCO)], с последующей заменой той же культуральной средой), далее культивировали в течение дополнительных 1-4 суток, культивируемые клетки дифференцировались в клеточную массу, содержащую высокую долю автономно пульсирующих кардиомиоцитов. Таким образом, результаты показывают, что клеточные массы, содержащие запрограммированные кардиомиоциты, которые не являются автономно пульсирующими, но которые запрограммированы для дифференцировки в кардиомиоциты в будущем, могут образовываться с высокой долей, посредством культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточных условиях в течение дополнительных 1 суток (24 часов), на 5-е сутки после начала культивирования.
ПРИМЕР 3: Селективное ингибирование дифференцировки/роста клеток, отличных от кардиомиоцитов, посредством культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши в условиях культуральной среды с низким содержанием кальция
Целью этого примера является исследование эффекта сниженной концентрации кальция на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, эффекта сниженной концентрации кальция на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в культуральной среде при пониженной концентрации кальция.
Эмбриональные стволовые клетки мыши культивировали в течение всего 7 суток с использованием стандартного способа, описанного в примере 1, в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)], то есть, 75 клеток ES на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в культуральной среде с использованием способа "висячей капли" в течение всего 7 суток с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты. Концентрация кальция в культуральной среде для дифференцировки кардиомиоцитов составляла 1,8 мМ. В случае этого способа культивирования содержание кардиомиоцитов составляло приблизительно 10%, в то время как другие клетки состояли из недифференцированных клеток, нейрональных клеток и эпителиальных клеток.
С другой стороны, в этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение 5 суток в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с образованием эмбриоидных телец с использованием способа "висячей капли", которые затем прикрепляли к культуральному планшету и далее культивировали в указанной культуральной среде в течение дополнительных 1 суток (24 часов). Затем через 6 суток после начала культивирования для дифференцировки, то есть через 1 сутки (24 часов) после прикрепления эмбриоидных телец к планшету, в контрольной группе эмбриоидные тельца культивировали в культуральной среде RPMI (концентрация кальция 1,8 мМ), дополненной 10% FBS, до 8 суток культивирования (фиг. 4A), в то время как в экспериментальной группе эмбриоидные тельца культивировали в культуральной среде RPMI (концентрация кальция 0,4 мМ; GIBCO), дополненной 10% FBS (фиг. 4B). В результате по сравнению с необработанными эмбриоидными тельцами в случае эмбриоидных телец, обработанных в условиях низкого содержания кальция, рост клеток плоской формы подавлялся в области периферии эмбриоидных телец, или ингибировалась дифференцировка эмбриоидных телец в нейрональные клетки (фиг. 4B).
ПРИМЕР 4: Селекция запрограммированных кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH
Целью этого примера является исследование комплексного эффекта устранения сыворотки и условий среднекислого значения pH на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты, более конкретно, комплексного эффекта устранения сыворотки и среднекислых значений pH на селекцию запрограммированных кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в культуральной среде в бессывороточных условиях и условиях среднекислого значения pH.
2
2
В этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение 5 суток после начала дифференцировки в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли" с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты. В этом примере через 5 суток после начала культивирования клеток для дифференцировки на стадии, когда еще не наблюдалось каких-либо автономно пульсирующих кардиомиоцитов, клетки далее культивировали в MEM (минимальной необходимой среде) (GIBCO), дополненной инсулином/трансферрином/селеном (GIBCO) в течение дополнительных 1 суток (24 часов) (те же результаты получают в обоих случаях, когда культивирование начинают на 4-е сутки или 6-е сутки после начала культивирования для дифференцировки). Поскольку условия pH этой культуральной среды доводят приблизительно до pH 6,5 в условиях 5% CO, клетки культивировали в среднекислой культуральной среде в условиях 5% CO.
Культивирование приводило к образованию клеточных масс, содержащих высокую долю запрограммированных кардиомиоцитов без автономной пульсации. На фиг. 5A показана морфологическая картина прикрепленного эмбриоидного тельца, которое культивировали в нормальных условиях с подпиткой сывороткой, на фиг. 5B показана морфологическая картина эмбриоидного тельца, которое культивировали в течение 1 суток (24 часов) в бессывороточных условиях, и на фиг. 5C показана морфологическая картина эмбриоидного тельца, которое культивировали в течение 2 суток (48 часов) в бессывороточных условиях соответственно. В условиях, представленных на фиг. 5C, клетки, находящиеся рядом с поверхностью эмбриоидного тельца, селективно подвергаются клеточной гибели, в то время как клетки в центральной части эмбриоидного тельца не подвергались клеточной гибели (фиг. 5). На фиг. 5D показано изображение области запрограммированных кардиомиоцитов исходя из анализа, представленного на фиг. 5C, а также показаны погибшие клетки, указанные стрелками.
Авторы изобретения получили два типа клеточных масс в этом примере: один тип клеточных масс был отобран культивированием эмбриоидных телец через 5 суток после их образования в течение дополнительных 24 часов в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH; другой тип клеточных масс был отобран дальнейшим культивированием клеточных масс, полученных, как указано выше, в течение дополнительных 3 суток (72 часов). Были получены замороженные срезы этих клеточных масс для иммунного окрашивания с использованием антитела против Brachyury (Santacruz) против белка Brachyury (который представляет собой маркер недифференцированных мезобластных клеток) (фиг. 6A-6D). В результате, доля положительных по Brachyury клеток, культивированных в течение 24 часов в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH (фиг. 6B и 6D), была значительно выше по сравнению с долей положительных по Brachyury клеток, культивированных в течение 24 часов в культуральной среде, включающей условия подпитки сывороткой и нейтрального значения pH (фиг. 6A и 6C). Почти все клетки клеточных масс, отобранные культивированием в течение дополнительных 3 суток, представляют собой положительные по Brachyury клетки (данные не представлены). Клеточные массы, культивированные в течение дополнительных 3 суток, подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против Nkx2.5 (антитело против Nkx2.5 (Santacruz)) (фиг. 6E-6N). Полагают, что маркер Nkx2.5 является наиболее ранним маркером развития, экспрессируемым в запрограммированных кардиомиоцитах, и известно, что он постоянно экспрессируется в дифференцированных кардиомиоцитах. На фиг. 6E-H показана морфологическая картина эмбриоидных телец (EB), которые были получены культивированием в течение 24 часов в культуральной среде, содержащей сыворотку и находящейся при нейтральных значениях pH, с последующим культивированием в течение дополнительных 3 суток в той же культуральной среде. Показано, что в этих условиях культивирования часть клеток внутри EB дифференцировалась в кардиомиоциты. Кроме того, доля клеток, дифференцированных в кардиомиоциты, была сходной с долей положительных по Brachyury клеток (фиг. 6A и 6C). С другой стороны, в случае EB, которые культивировали в течение 24 часов в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH (показано на фиг. 6I-N), доля клеток, дифференцированных в кардиомиоциты, составляла вплоть до 80% от общего количества клеток, что было сходным с долей положительных по Brachyury клеток (фиг. 6B и 6D).
Клетки, отобранные посредством способа 5 суток + 1 сутки (24 часа), были положительными по антителу против Brachyury, но отрицательными по антителу против Nkx2.5 (фиг. 6, линии O и P). В то же время клеточные массы, отобранные способом 5 суток + 1 сутки (24 часа) + 3 суток, были отрицательными по антителу против Brachyury, но положительными по антителу против Nkx2.5.
Таким образом, клеточные массы, содержащие высокую долю автономно пульсирующих кардиомиоцитов, дифференцировали культивированием этих клеточных масс в течение дополнительных 1-4 суток. Следовательно, подтвердилось, что клетки, отобранные способом 5 суток + 1 сутки (24 часа), представляют собой запрограммированные кардиомиоциты.
ПРИМЕР 5: Селекция кардиомиоцитов из эмбриональных стволовых клеток мыши культивированием в бессывороточных условиях/условиях среднекислого значения pH
Целью этого примера является исследование комплексного эффекта устранения сыворотки и условий среднекислого значения pH на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, комплексного эффекта устранения сыворотки и условий среднекислого значения pH на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец) культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в бессывороточной культуральной среде в условиях среднекислого значения pH.
В этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение 5 суток после начала дифференцировки в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли" с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты. В этом примере через 5 суток после начала культивирования для дифференцировки клеток на стадии, когда еще не наблюдалось каких-либо автономно пульсирующих кардиомиоцитов, клетки далее культивировали в бессывороточной культуральной среде MEM (GIBCO), дополненной инсулином/трансферрином/селеном (GIBCO) в течение дополнительных 2 суток (те же результаты получают в обоих случаях, когда культивирование начинают на 4-е сутки или 6-е сутки после начала культивирования для дифференцировки). Полученные таким образом клеточные массы запрограммированных кардиомиоцитов далее культивировали в течение дополнительных 2 суток для дифференцировки в кардиомиоциты. На фиг. 7A показано микроскопическое изображение полученных таким образом масс кардиомиоцитов, и на фиг. 7B показана схема латерального изображения эмбрионального тельца с фиг. 7A.
В указанных выше условиях клетки, отличные от кардиомиоцитов, подвергаются селективной клеточной гибели, в то время как кардиомиоциты проявляют сильную и автономную пульсацию, не подвергаясь клеточной гибели. В результате, в этом примере получены клеточные массы, содержащие высокую долю кардиомиоцитов (фиг. 7A и фиг. 7B).
ПРИМЕР 6: Селекция кардиомиоцитов культивированием в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой и получение кардиомиоцитов
Целью этого примера является исследование комплексного эффекта устранения сыворотки и устранения сахаров на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, комплексного эффекта на устранение сыворотки и устранение сахаров на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в не содержащей сахаров и бессывороточной культуральной среде.
in vivo
В этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB в качестве клеточных масс культивировали в течение всего 7 суток в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли" с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты. Эмбриоидные тельца, культивированные в течение 10 суток после начала дифференцировки, промывали 4-5 раз с использованием культуральной среды D-MEM (модифицированной по Дульбекко среды Игла) (без сахаров) (GIBCO) для полного устранения сахаров из культуральной среды, а затем культивировали в течение 7 суток в культуральной среде D-MEM (GIBCO), дополненной молочной кислотой в конечной концентрации 1 мМ (это необходимо для визуального определения жизнеспособности автономно пульсирующих кардиомиоцитов и других клеток в многократных экспериментах и для коррекции периода культивирования между 5-10 сутками исходя из жизнеспособности). Поскольку концентрация молочной кислоты  повышается приблизительно до 4 мМ в физиологических условиях, "1 мМ" концентрация молочной кислоты, используемая в способе этого примера, находится в физиологическом диапазоне.
Как показано на фиг. 8, образовывалась куполообразная клеточная сеть, состоящая из жизнеспособных кардиомиоцитов. Таким образом, на фиг. 8A представлено изображение сетеобразной структуры, образованной отобранными кардиомиоцитами, и на фиг. 8B показана схема латерального изображения эмбриодного тельца с фиг. 8A.
ПРИМЕР 7: Элиминация погибших клеток, прикрепленных к массам кардиомиоцитов
Поскольку к клеточным массам, полученным в примере 6, были прикреплены погибшие клетки или белки внеклеточного матрикса, для очистки масс необходимо удалить погибшие клетки или белки внеклеточного матрикса из масс кардиомиоцитов. Однако посредством предварительного исследования было показано, что фермент, вызывающий неспецифичный протеолиз (такой как трипсин), значительно снижает жизнеспособность кардиомиоцитов.
Таким образом, целью этого примера является исследование условий для селективного удаления погибших клеток или белков внеклеточного матрикса из масс, содержащих кардиомиоциты.
Клеточные массы, полученные в примере 6 (показано на фиг. 8), обрабатывали 0,01-0,1% коллагеназой, которая селективно расщепляет коллаген, один из белков внеклеточного матрикса, при 37°C в течение 20 минут. После обработки только коллагеназой клеточные массы промывали изотоническим раствором, обладающим физиологическим осмотическим давлением. На этой стадии, поскольку кардиомиоциты образуют клеточные массы (диаметром не менее 40 мкм), клеточные массы промывали с заменой раствора через коммерчески доступную мембрану с порами диаметром 40 мкм, а затем разделенные клетки, отличные от кардиомиоцитов, селективно удаляли. Стадию промывания повторяли 4-5 раз. Собранные клеточные массы культивировали, а затем подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против актинина саркомера (SIGMA) в качестве индикатора кардиомиоцитов (красный: [окрашивание поперечно-полосатого волокна в цитоплазме], синий: [окрашивание ядра посредством DAPI (Molecular probe)]).
В результате было показано, что доля кардиомиоцитов в массах, очищенных посредством способа этого примера, составляет 80% от общего количества клеток (фиг. 9).
ПРИМЕР 8: Очистка кардиомиоцитов культивированием в условиях без сыворотки/средней кислотности/низкого содержания кальция/без сахаров и с подпиткой молочной кислотой
Целью этого примера является исследование комплексного эффекта устранения сыворотки, условий средне-кислого значения pH, условий низкого содержания кальция и устранения сахаров на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, комплексного эффекта устранения сыворотки, условий средне-кислого значения pH, условий низкого содержания кальция и устранения сахаров на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в культуральной среде в условиях без сыворотки, средней кислотности, без кальция и без сахаров.
В этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение 5 суток после начала дифференцировки в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO), пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли" с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты. В этом примере через 5 суток после начала культивирования для дифференцировки клеток на стадии, когда еще не наблюдалось каких-либо автономно пульсирующих кардиомиоцитов, клетки далее культивировали в бессывороточной культуральной среде MEM (GIBCO), дополненной инсулином/трансферрином/селеном (GIBCO) в течение дополнительных 2 суток (те же результаты получают в обоих случаях, когда культивирование начинают на 4-е сутки или 6-е сутки после начала культивирования для дифференцировки). Полученные таким образом массы запрограммированных кардиомиоцитов культивировали в течение дополнительных 2 суток для дифференцировки в кардиомиоциты. На этой стадии были получены клеточные массы, содержащие высокую долю кардиомиоцитов.
Затем клеточные массы промывали 4-5 раз с использованием культуральной среды D-MEM (без сахаров) (GIBCO) для полного устранения сахаров из культуральной среды, а затем культивировали в течение 7 суток в культуральной среде D-MEM (GIBCO), дополненной молочной кислотой в конечной концентрации 1 мМ (это необходимо для визуального определения жизнеспособности автономно пульсирующих кардиомиоцитов и других клеток в многократных экспериментах и для коррекции периода культивирования между 5-10 сутками исходя из жизнеспособности). Как показано на фиг. 10, образовывались массы кардиомиоцитов, состоящие только из жизнеспособных кардиомиоцитов.
2
4
4
Клеточные массы обрабатывали 0,01-0,1% коллагеназой, которая селективно расщепляет коллаген, один из белков внеклеточного матрикса, при 37°C в течение 20 минут. После обработки коллагеназой клеточные массы промывали с использованием буфера, обладающего физиологическим осмотическим давлением (116 мМ NaCl, 20 мМ Hepes, 12,5 мМ NaHPO, 5,6 мМ глюкоза, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO, pH 7,35). Клеточные массы промывали 4-5 раз с заменой раствора через коммерчески доступную мембрану, имеющую поры диаметром 40 мкм. В результате собирали клеточные массы, состоящие только из кардиомиоцитов, и агрегаты с высокой плотностью, состоящие из погибших клеток (фиг. 10A). На фиг. 10C показано увеличенное изображение заключенной в прямоугольную рамку области с фиг. 10A. Кроме того, расположение погибших клеток на фиг. 10A и 10C показано на фиг. 10B и 10D соответственно.
В этом примере было показано, что агрегаты с высокой плотностью, состоящие из погибших клеток, представленных на фиг. 10, можно селективно удалять с использованием подходящего центрифугирования в градиенте плотности, более конкретно, с использованием центрифугирования в градиенте плотности с 58,5% Percoll™ (Pharmacia) (фиг. 11). Затем полученные таким образом клеточные массы культивировали и подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против актинина саркомера и антитела против GATA4 (Santacruz) в качестве индикатора кардиомиоцитов. На фиг. 12A представлены прикрепленные массы кардиомиоцитов. На периферии прикрепленных масс находилось несколько суспендированных погибших клеток, в то время как не было выявлено прикрепленных некардиомиоцитов. На фиг. 12B представлены флуоресцентные изображения, полученные иммунным окрашиванием клеточных масс с фиг. 12A посредством актинина саркомера (красный: цитоплазма) и DAPI (Molecular probe) (синий; ядра). На фиг. 12C представлены флуоресцентные изображения, полученные иммунным окрашиванием клеточных масс с фиг. 12A посредством GATA4 (красный; ядра) и DAPI (синий; ядра). Совместно окрашенные ядра являются фиолетовыми. В результате было показано, что доля кардиомиоцитов в массах, очищенных посредством способа этого примера, составляет 99,0% от общего количества клеток (фиг. 12C).
ПРИМЕР 9: Очистка кардиомиоцитов культивированием в условиях без сыворотки/средней кислотности/низкого содержания кальция/без сахаров и с подпиткой аспарагиновой кислотой/глутаминовой кислотой
Целью этого примера является исследование эффекта компенсации аспарагиновой кислоты/глутаминовой кислоты на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, эффекта компенсации аспарагиновой кислоты/глутаминовой кислоты на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в культуральной среде, дополненной аспарагиновой кислотой/глутаминовой кислотой в условиях без сыворотки, средней кислотности, без кальция и без сахара.
2
4
4
В этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение 5 суток после начала дифференцировки в культуральной среде [α-MEM (SIGMA), 10% FBS (EQUITEC BIO) пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли" с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты. В этом примере через 5 суток после начала культивирования для дифференцировки клеток на стадии, когда еще не наблюдалось каких-либо автономно пульсирующих кардиомиоцитов, клетки культивировали в культуральной среде в условиях без сыворотки, со среднекислыми значениями pH и в условиях низкого содержания кальция в течение 3 суток (те же результаты получают в обоих случаях, когда культивирования начинают на 4-е сутки или 6-е сутки после начала культивирования для дифференцировки). На этой стадии полученные клеточные массы содержали очень высокую долю кардиомиоцитов. Затем клеточные массы промывали 4-5 раз с использованием культуральной среды D-MEM (без сахаров) (GIBCO) для полного устранения сахаров в культуральной среде с заменой раствора через коммерчески доступную мембрану, имеющую поры диаметром 40 мкм. В заключение клеточные массы культивировали в течение 5 суток в культуральной среде DMEM (без сахаров), дополненной 20 мг/л глутаминовой кислоты (SIGMA) и 20 мг/л аспарагиновой кислоты (SIGMA) (это необходимо для визуального определения жизнеспособности автономно пульсирующих кардиомиоцитов и других клеток в многократных экспериментах и для коррекции периода культивирования между 3-10 сутками, исходя из жизнеспособности). В результате образованные массы кардиомиоцитов состояли только из кардиомиоцитов. Клеточные массы обрабатывали, при встряхивании, при 37°C на водяной бане в течение 20 минут, с 0,03% коллагеназой, которая селективно расщепляет коллаген, один из белков внеклеточного матрикса. После обработки коллагеназой клеточные массы промывали изотоническим раствором, имеющим физиологическое осмотическое давление (116 мМ NaCl, 20 мМ Hepes, 12,5 мМ NaHPO, 5,6 мМ глюкоза, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO, pH 7,35). Клеточные массы промывали 4-5 раз с заменой раствора через коммерчески доступную мембрану, имеющую поры диаметром 40 мкм. В результате собранные клеточные массы состояли только из кардиомиоцитов. Полученные таким образом клеточные массы культивировали и подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против актинина саркомера и антитела против GATA4 в качестве индикаторов кардиомиоцитов (фиг. 13).
Кроме того, клетки подвергали статистическому анализу, в котором имеющиеся данные сравнивали с известными данными (фиг. 13). На фиг. 13A представлены микроскопические изображения колоний автономно пульсирующих кардиомиоцитов, и на фиг. 13B представлены изображения окрашивания колоний автономно пульсирующих кардиомиоцитов по актинину саркомера (красный; цитоплазма), окрашивания по GATA-4 (зеленый; ядра) и окрашивания DAPI (синий; ядра).
В результате было показано, что доля кардиомиоцитов в массах, очищенных посредством способа этого примера, составляла 99,8% от общего количества клеток. Это показывает, что степень очистки была более высокой, чем степени очистки, показанные любыми известными способами очистки кардиомиоцитов (например, FASEB J. 2000; 14: 2540-2548; J Clin Invest. 1996; 98: 216-224; FASEB J. 2003; 17: 740-742; J Mol Cell Cardiol. 2003; 35: 1461-1472). Таким образом, способ этого примера обеспечивает очистку кардиомиоцитов с высокой степенью очистки и с высоким выходом (таблица 1).
<b>Таблица 1</b><b>Сравнение чистоты и выхода между способом по настоящему изобретению и способом αMHC-промотор/neo</b>
<b>Field et al. </b>J. Cln. Invest, 1996, vol. 98, 216-224)
<b>Получение</b>
<b>Положительные по миозину саркомера клетки</b>
<b>Отрицательные по миозину саркомера клетки</b>
<b>Доля кардиомиоцитов</b>
Без селекции*
11
2000
0,55
Физическое выделение<sup>1</sup>
68
2000
3,4
Селекция по G418<sup>1</sup>
791
3
99,6
<b>Положительные по актину саркомера и GATA4 клетки</b>
<b>Отрицательные по актину саркомера и GATA4 клетки</b>
<b>Hattori</b>
<b>5041</b>
<b>10</b>
<b>99,8</b>
<b>Включенные клетки ES</b>
<b>Полученные кардиомиоциты</b>
<b>Field et al.</b>
<b>10</b><sup>6</sup>
<img file="00000001.tif" he="3" wi="4" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>10</b><sup>6</sup>
<b>Hattori</b>
<b>7500</b>
<img file="00000001.tif" he="3" wi="4" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>15000</b>
ПРИМЕР 10: Очистка кардиомиоцитов, полученных из взрослых стволовых клеток из костного мозга мыши
Целью этого примера является получение кардиомиоцитов из взрослых стволовых клеток, полученных из костного мозга мыши, называемых мезенхимными стволовыми клетками, которые затем отбирают и очищают.
Кардиомиоциты, дифференцированные из взрослых стволовых клеток, полученных из костного мозга мыши (самки мыши C3H/He), индуцировали с использованием клеток и способа, описанных в WO01/048151. Таким образом, клетки CMG культивировали в культуральной среде IMDM (модифицированной по Дульбекко среде Искова) (GIBCO), дополненной 20% эмбриональной телячьей сывороткой (в отношении способа получения клеток CMG, смотри, J. Clin. Invest, March 1999, Vol.103, p697-705), культивировали в течение дополнительных 24 часов в культуральной среде, дополненной 5-азацитидином (SIGMA) в конечной концентрации 3 мкмоль/л, а затем культивировали в течение 2-3 недель в указанной выше культуральной среде без 5-азацитидина, индуцируя в результате дифференцировку кардиомиоцитов. После подтверждения наличия автономно пульсирующих кардиомиоцитов клетки культивируют в течение 5 суток в культуральной среде D-MEM (GIBCO), дополненной 1 мМ молочной кислотой, в условиях без сыворотки/со среднекислыми значениями pH/с низким содержанием кальция/без сахаров. После периода культивирования погибшие клетки удаляли и оставшиеся жизнеспособные клетки подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела против актинина саркомера в качестве индикатора кардиомиоцитов.
На фиг. 14A представлена картина культивированных клеток перед селекцией. На фиг. 14A область, содержащая пульсирующие клетки, показана пунктирной линией. На фиг. 14B-C показаны отобранные клетки. На фиг. 14B представлено фазово-контрастное микроскопическое изображение, и на фиг. 14C представлено флуоресцентное изображение с иммунным окрашиванием по актинину саркомера для того же поля обзора, что и на фиг. 14B, соответственно. В результате было показано, что доля кардиомиоцитов в массах, полученных посредством способа этого примера, составляла приблизительно 90% от общего количества клеток (фиг. 14).
ПРИМЕР 11: Очистка кардиомиоцитов, полученных из эмбрионов мыши
Целью этого примера является очистка кардиомиоцитов из эмбрионов мыши.
Сначала на 7-9-е сутки жизни эмбриона из материнской матки извлекали эмбрион мыши, из которого осторожно удаляли внеэмбриональную ткань, затем пипетировали для разделения эмбриона на отдельные клеточные массы. Полученные таким образом клеточные массы культивировали в течение 5 суток в культуральной среде, дополненной 0,5 мМ молочной кислотой в условиях без сыворотки/среднекислых значений pH/низкого содержания кальция/без сахаров (это необходимо для визуального определения жизнеспособности автономно пульсирующих кардиомиоцитов и других клеток в многократных экспериментах и для коррекции периода культивирования между 3-10 сутками исходя из жизнеспособности). Используемую культуральную среду получали смешиванием BSS Хэнка [без сахаров]:RPMI [без сахаров] = 9:1. Очищенные кардиомиоциты подвергали культивированию в прикрепленной культуре, и после культивирования погибшие клетки удаляли и оставшиеся жизнеспособные клетки подвергали иммунному окрашиванию по актинину саркомера (зеленый: цитоплазма) в качестве индикатора кардиомиоцитов, и DAPI (красный: ядра).
На фиг. 15A представлены фазово-контрастные микроскопические изображения двух колоний, показывающих популяцию пульсирующих клеток. На фиг. 15B представлены объединенные изображения окрашивания по актинину саркомера и окрашивания по DAPI для четырех колоний. В результате было показано, что доля кардиомиоцитов в массах, полученных посредством способа этого примера, составляет приблизительно 99% от общего количества клеток (фиг. 15).
ПРИМЕР 12: Очистка кардиомиоцитов в условиях без сыворотки/средней кислотности/низкого содержания кальция/без сахаров, и с подпиткой пировиноградной кислотой
Целью этого примера является исследование эффекта компенсации пировиноградной кислоты на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, эффекта компенсации пировиноградной кислоты на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в культуральной среде, дополненной пировиноградной кислотой в условиях без сыворотки, среднекислых значений pH, без кальция и без сахаров.
В этом примере 75 клеток ES мыши на одно EB культивировали в качестве клеточных масс в течение 5 суток после начала дифференцировки в культуральной среде [α-MEM (SIGMA) 10% FBS (EQUITEC BIO) пенициллин/стрептомицин (GIBCO)] с использованием способа "висячей капли" с образованием эмбриоидных телец, которые затем дифференцировались в клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие запрограммированные кардиомиоциты. В этом примере через 5 суток после начала культивирования для дифференцировки клеток на стадии, когда еще не наблюдалось каких-либо автономно пульсирующих кардиомиоцитов, клетки культивировали в течение дополнительных 2 суток в бессывороточной культуральной среде MEM (GIBCO), дополненной инсулином/трансферрином/селеном (GIBCO) (те же результаты получают в обоих случаях, когда культивирование начинают на 4-е сутки или 6-е сутки после начала культивирования для дифференцировки). Полученные таким образом массы запрограммированных кардиомиоцитов культивировали в течение дополнительных 2 суток для дифференцировки в кардиомиоциты. На этой стадии полученные клеточные массы содержали очень высокую долю кардиомиоцитов. Затем клеточные массы промывали 4-5 раз с использованием культуральной среды D-MEM (без сахаров) (GIBCO) для полного устранения сахаров в культуральной среде с заменой раствора через коммерчески доступную мембрану, имеющую поры диаметром 40 мкм. После стадии промывания клеточные массы культивировали в течение 5 суток в культуральной среде D-MEM (без сахаров) (GIBCO), дополненной пировиноградной кислотой до конечной концентрации 1 мМ.
2
4
4
Затем клеточную массу обрабатывали при встряхивании 0,05% коллагеназой  типа 3 (Worthington Biochemical Corp), которая селективно расщепляет коллаген, один из белков внеклеточного матрикса, при 37°C в течение 20 минут. После обработки коллагеназой клеточные массы промывали изотоническим раствором, имеющим физиологическое осмотическое давление (116 мМ NaCl, 20 мМ Hepes, 12,5 мМ NaHPO, 5,6 мМ глюкоза, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO, pH 7,35). В результате было показано, что доля автономно пульсирующих клеток в массах, очищенных посредством способа этого примера, составляла более 90% от общего количества клеток (фиг. 16).
ПРИМЕР 13: Селекция и очистка кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток примата-мартышки в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой
Целью этого примера является исследование комплексного эффекта устранения сыворотки и устранения сахаров на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, комплексного эффекта устранения сыворотки и устранения сахаров на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), полученных из эмбриональных стволовых клеток примата-мартышки, культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в культуральной среде без сыворотки и без сахаров.
Эмбриональные стволовые клетки мартышки являются доступными из Central Institute for Experimental Animals (Kawasaki, Japan). Эмбриональные стволовые клетки мартышки культивировали, поддерживая недифференцированное состояние, с использованием эмбриональных фибробластов мыши (MEF) с инактивированным ростом, которые были обработаны митомицином C. Использовали культуральную среду [KO-DMEM (GIBCO), 20% KO-SERUM (GIBCO), 1,6 мМ L-глутамин, 0,1 мМ заменимые аминокислоты (MEM), 0,2 мМ β-меркаптоэтанол (2-ME; Sigma), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата и 8 нг/мл рекомбинантного лейкоз-ингибирующего фактора человека (LIF; Chemicon), рекомбинантного основного фибробластного фактора роста человека (bFGF; Peprotech)]. При пассировании для разделения колоний ES использовали 0,1% коллагеназу типа III (Wortington) при 37°C в течение 10 минут.
После этого для отделения MEF и ES друг от друга раствор пассировали через сито, имеющее поры диаметром 100 мкм, получая, таким образом, клеточные массы, которые не могут проходить через сито, имеющее поры диаметром 40 мкм. Эти клеточные массы представляют собой полностью очищенные массы клеток ES. При дифференцировке клеточные массы, содержащие 50-1000 клеток ES на одно EB, культивировали в качестве эмбриоидного тельца в течение всего 15-30 суток с использованием способа бактериальных чашек, с последующей дифференцировкой в эмбриоидные тельца, содержащие кардиомиоциты. Используемая для дифференцировки культуральная среда была такой же, как и культуральная среда, описанная в данном примере, за исключением bFGF [т.е. KO-DMEM (GIBCO), 20% KO-SERUM (GIBCO), 1,6 мМ L-глутамин, 0,1 мМ заменимые аминокислоты (MEM), 0,2 мМ β-меркаптоэтанол (2-ME; Sigma), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 8 нг/мл рекомбинантного лейкозингибирующего фактора человека (LIF; Chemicon)].
in vivo
Для устранения из культуральной среды сахаров, насколько это возможно, эмбриоидные тельца переносили в пробирку для центрифугирования, промывали пять раз культуральной средой D-MEM (без сахаров) (GIBCO) и, наконец, культивировали в течение 15 суток в культуральной среде D-MEM (без сахаров) (GIBCO), дополненной 1 мМ молочной кислотой. Поскольку концентрация молочной кислоты  возрастает приблизительно до 4 мМ в физиологических условиях, "1 мМ" концентрация молочной кислоты, используемая в способе этого примера, находится в физиологическом диапазоне.
Изображение клеточных масс после культивирования в течение 15 суток представлено на фиг. 17. Как представлено на фиг. 17, из этого результата было показано, что образовавшаяся структура клеток в виде пузыря состояла из кардиомиоцитов в качестве жизнеспособных клеток. Иными словами, на фиг. 17A-C показано, что кардиомиоциты, образующие структуру в форме пузыря, были селективно жизнеспособными в культуральной среде в условиях без сахаров + с подпиткой молочной кислотой (1 мМ). На фиг. 17A показано, что часть эмбриоидных телец или целые эмбриоидные тельца со значительно сниженной оптической прозрачностью уже подверглись клеточной гибели. Также в случаях эмбриоидных телец, представленных на фиг. 17B и фиг. 17B', клетки, имеющие структуру в форме пузыря на поверхности эмбриоидного тельца, были жизнеспособными. Фиг. 17C представляет собой увеличенное изображение фиг. 17B.
Полученные таким образом эмбриоидные тельца культивировали в течение 3-7 суток в том же объеме культуральной среды (без bFGF). Жизнеспособные кардиомиоциты продолжают автономно пульсировать. После достижения стабильного состояния погибшие клетки отделяли от кардиомиоцитов встряхиванием эмбриоидных телец в присутствии 0,1% коллагеназы типа III (Wortington) в течение 10 минут при 37°C. Погибшие клетки устраняли способом, описанным в примере 8. Полученные таким образом эмбриоидные тельца были прикреплены на покрытые фибронектином (SIGMA) чашки для культивирования клеток (фиг. 18, слева). После фиксации 4% параформальдегидом эмбриоидные тельца окрашивали антителом против актинина (SIGMA), как в примере 8, и окрашивали антителом против Nkx2.5 (Santacruz), как в примере 4 (фиг. 18, справа соответственно).
В результате было показано, что кардиомиоциты были селективно получены культивированием эмбриональных стволовых клеток мартышки в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой.
ПРИМЕР 14: Трансплантация кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток примата-мартышки, в сердце иммунодефицитной мыши, и подтверждение их приживления
Целью этого примера является исследование трансплантации кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток примата-мартышки, в сердце и приживление в организме.
2
4
4
Очищенные кардиомиоциты мартышки, полученные способом примера 13, суспендировали в буферном растворе, имеющем физиологическое осмотическое давление (116 мМ NaCl, 20 мМ Hepes, 12,5 мМ NaHPO, 5,6 мМ глюкоза, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO, pH 7,35), дополненном 0,2% коллагеназой типа III (Wortington) и 0,125% трипсином (GIBCO). Суспендированный раствор обрабатывали при встряхивании в течение 20 минут при 37°C в шприце, к которому присоединена игла 29 калибра (Terumo). Для применения в целях трансплантации было получено приблизительно 1-30 небольших клеточных масс, состоящих из кардиомиоцитов. Аспирировали 100 мкл указанного выше содержащего кардиомиоциты буфера, имеющего физиологическую концентрацию солей.
Самца иммунодефицитной мыши NOD-SCID в возрасте 7 недель (Clea Japan, Inc.) подвергали анестезии посредством ингаляции анестетика FORANE (изофлурана) (Abbott Japan). Затем грудную клетку мыши вскрывали с дыхательным контролем посредством искусственного дыхания с использованием интратрахеальной интубации. Иглу для инъекций помещали в стенку выведенного на поверхность сердца в направлении от верхушки сердца к основанию сердца, а затем в стенку сердечной ткани инъецировали приблизительно 30 мкл суспендированного раствора на одну область. Затем грудную клетку мыши закрывали, анестезию прекращали и мышь продолжали поддерживать.
Через 15 суток после трансплантации под действием анестезии вырезали сердце мыши, которое фиксировали в 4% параформальдегиде. Получали замороженные срезы толщиной 10 мкм и подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела козы против Nkx2.5 (Santacruz) в качестве первичного антитела и антитела осла против антител козы Alexa 488 (проявляющегося зеленым цветом) (Molecular probes) в качестве второго антитела (фиг. 19B), или подвергали иммунному окрашиванию с использованием антитела мыши против актинина саркомера (Sigma) в качестве первичного антитела и антитела кролика против антител мыши Alexa 594 (проявляющегося красным цветом) (Molecular probes) в качестве второго антитела (фиг. 19D).
in vitro
С другой стороны, антитело мыши против ядерного антигена человека (которое реагирует с любыми ядерными антигенами приматов всех видов) (Chemicon) и антитело козы против антител мыши Alexa 633 (Molecular probes) реагируют друг с другом  с образованием комплекса. Далее, нормальную сыворотку мыши использовали для ингибирования реактивности избытка антитела козы против антител мыши Alexa 633 (инфракрасное). Полученный таким образом комплекс антител реагировал с указанными выше замороженными срезами, проявляя три цвета (фиг. 19B-19D).
Все изображения иммунного окрашивания получали с использованием конфокального микроскопа (Carl Zeiss). Результаты представлены на фиг. 19.
В результате было показано, что представленные на фигуре клетки, обладающие более крупными ядрами, были получены из мартышки. Иными словами, на этой фигуре показано, что некоторые клетки приматов, экспрессирующие Nkx2.5, индикаторный маркер, специфичный для кардиомиоцитов, наблюдались в кардиомиоцитах, окрашенных по актинину. Это означает, что кардиомиоциты, полученные из клеток ES мартышки, успешно прижились в сердце мыши.
ПРИМЕР 15: Селекция и получение кардиомиоцитов, образованных из эмбриональных стволовых клеток человека в условиях без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой
Целью этого примера является исследование комплексного эффекта устранения сыворотки и устранения сахаров на клеточные массы (эмбриоидные тельца), содержащие кардиомиоциты, более конкретно, комплексного эффекта устранения сыворотки и устранения сахаров на селекцию кардиомиоцитов из клеточных масс (эмбриоидных телец), образованных из эмбриональных стволовых клеток человека, культивированием клеточных масс (эмбриоидных телец) в условиях без сыворотки и без сахаров.
Эмбриональные стволовые клетки человека получали из Stem Cell Research Center (Institute for Frontier medical Sciences, Kyoto University) (центр по клеткам ES, на основе National Bioresourse Project). Эмбриональные стволовые клетки человека культивировали, поддерживая недифференцированное состояние, с использованием эмбриональных фибробластов мыши (MEF) с инактивированным ростом, которые обрабатывали митомицином C. Культивирование проводили с использованием культуральной среды [F12/DMEM (1:1) (SIGMA, продукт номер D6421), 20% KO-SERUM (GIBCO), 1,6 мМ L-глутамин, 0,1 мМ заменимые аминокислоты (MEM), 0,1 мМ β-меркаптоэтанол (2-ME; SIGMA), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, и рекомбинантный основной фибробластный фактор роста человека (bFGF; Peprotech)]. При пассировании использовали 0,1% коллагеназу типа III (Wortington) при 37°C в течение 10 минут для разделения колоний ES.
in vivo
После этого для отделения MEF и ES друг от друга раствор пассировали через сито, имеющее поры 40 мкм, получая посредством этого клеточные массы, которые не могут проходить через сито, имеющее поры диаметром 40 мкм. Эти клеточные массы представляли собой очищенные массы клеток ES. При дифференцировке клеточные массы, содержащие 50-1000 клеток ES на одно EB, культивировали в качестве эмбриоидного тельца в течение всего 15-30 суток с использованием способа бактериальной чашки (с использованием культуральной среды, описанной выше, за исключением отсутствия bFGF), с последующей дифференцировкой в эмбриоидные тельца, содержащие кардиомиоциты. Для устранения из культуральной среды сахаров, насколько это возможно, эмбриоидные тельца переносили в пробирку для центрифугирования, промывали пять раз культуральной средой D-MEM (без сахаров) (GIBCO, продукт номер 11966) и, наконец, культивировали в течение 15 суток в культуральной среде D-MEM (без сахаров) (GIBCO, продукт номер 11966), дополненной 1 мМ молочной кислотой. Поскольку концентрация молочной кислоты  в физиологических условиях возрастает приблизительно до 4 мМ, "1 мМ" концентрация молочной кислоты, используемая в способе этого примера, находится в физиологическом диапазоне.
Картина клеточных масс, культивированных в условиях с содержанием сахаров (контрольные условия), и клеточных масс, культивированных в течение 15 суток в условиях без сахаров, для селекции кардиомиоцитов (селективные условия для кардиомиоцитов) представлена на фиг. 20, левая панель, в качестве фазово-контрастных изображений. Для того чтобы показать, являются ли эти клетки жизнеспособными или нет, клетки окрашивали посредством TMRM (Molecular Probes), который может выявлять мембранный потенциал (в качестве индикатора жизнеспособных клеток) и создавать флуоресценцию в зависимости от мембранного потенциала (фиг. 20, правая панель). Как показано на фиг. 20, верхняя панель, все эмбриоидные тельца группы с условиями с содержанием сахаров (контроль) приводят к флуоресценции (т.е. все эмбриоидные тельца состоят из жизнеспособных клеток); и в то же время, как показано на фиг. 20, нижняя панель, клеточные массы, которые не приводят к флуоресценции (т.е., клеточные массы, состоящие из погибших клеток), появлялись при культивировании в условиях без сахаров (селекция кардиомиоцитов). Кроме того, все клеточные массы, которые были жизнеспособными в условиях без сахаров (селекция кардиомиоцитов), показали автономную пульсацию.
Полученные таким образом эмбриоидные тельца культивировали в течение 3-7 суток в том же объеме указанной культуральной среды (без bFGF). Жизнеспособные кардиомиоциты продолжали автономно пульсировать. После достижения стабильного состояния погибшие клетки отделяли от кардиомиоцитов встряхиванием эмбриоидных телец в присутствии 0,1% коллагеназы типа III (Wortington) в течение 10 минут при 37°C. Погибшие клетки устраняли способом, описанным в примере 8. Затем эмбриоидные тельца прикрепляли к покрытой фибронектином (SIGMA) чашке для культивирования клеток.
После фиксации 4% параформальдегидом эмбриоидные тельца окрашивали антителом против актинина (SIGMA), как в примере 8, и окрашивали антителом против Nkx2.5 (Santacruz), как в примере 4 (фиг. 21). Как показано на этой фигуре, клеточные ядра, окрашенные DAPI (фиг. 21a), обязательно перекрывались с клеточными ядрами, окрашенными антителом против Nkx2.5, индикаторного маркера, специфичного для кардиомиоцитов (фиг. 21c). Когда изображение, полученное иммунным окрашиванием посредством антитела против актинина, другого индикаторного маркера, специфичного для кардиомиоцитов (фиг. 21d), объединяли с изображением, полученным иммунным окрашиванием посредством антитела против Nkx2.5, было выявлено, что клетки, подвергнутые иммунному окрашиванию посредством антитела против Nkx2.5, полностью перекрывались с клетками, подвергнутыми иммунному окрашиванию антителом против актинина (фиг. 21e).
Эти результаты отчетливо показывают, что когда эмбриональные стволовые клетки человека очищают культивированием в условиях культивирования без сахаров/без сыворотки и с подпиткой молочной кислотой, можно селективно собирать кардиомиоциты.