Питательная среда для получения биомассы листерий
NUTRIENT MEDIUM FOR OBTAINING LISTERIA BIOMASS

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения биомассы листерий.
Совершенствование лабораторной диагностики листериоза связано с разработкой питательной среды для получения микробной массы листерий, необходимой при производстве листериозной агглютинирующей сыворотки. Основным условием этого этапа является сохранение S-формы выращиваемой культуры, и получение ее в количестве достаточном для приготовления антигена при иммунизации животных-продуцентов. Это обеспечивает получение высокоактивной специфичной гипериммунной стабильной листериозной агглютинирующей сыворотки.
Поэтому разработка питательных сред, которые позволяют получать достаточное количество биомассы листерий с сохранением S-формы выращиваемой культуры, остается актуальной задачей.
В настоящее время для получения биомассы листерий используют питательный агар, в состав которой входят: панкреатический гидролизат казеина, пептон мясной, дрожжевой экстракт, литий хлористый, эскулин, железо лимонноаммиачное зеленое или коричневое, натрий углекислый, натрий хлористый, агар, селективная добавка (ГОСТ Р 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes, п. 6.2.4.1) и питательный бульон для выделения листерий, в состав которой входят: панкреатический гидролизат казеина, пептон мясной, дрожжевой экстракт, литий хлористый, натрий хлористый, натрий углекислый, селективная добавка (ГОСТ Р 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes, п. 6.2.2.1). Однако данные питательные среды не дают возможность получить достаточное количество биомассы микроорганизма.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда плотная для культивирования возбудителя листериоза, содержащая ферментативный гидролизат бобов сои, ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, натрий хлористый, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов (патент РФ №2525637, Опубл. 20.05.2014, Бюл. №14). Недостатком данной питательной среды является небольшой выход биомассы листерий. Кроме того, питательная среда достаточно дорога.
Задача изобретения - расширение арсенала питательных сред для получения биомассы листерий, повышение эффективности питательной среды (увеличение выхода микробных клеток с 1 мл питательной среды).
1
Технический результат достигается тем, что предлагаемая питательная среда содержит гидролизат речной рыбы панкреатический, гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический, ферментированный яичный желток, хлорид натрия, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, витамин В, глюкозу, агар микробиологический и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический
10,0-12,0
гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический
8,5-9,5
ферментированный яичный желток
1,12-1,30
хлорид натрия
2,9-3,5
калий фосфорнокислый однозамещенный
2,2-2,8
натрий фосфорнокислый двузамещенный
7,2-7,8
витамин В<sub>1</sub>
0,04-0,06
глюкоза
5,0-5,5
агар микробиологический
9,0-11,0
вода дистиллированная
до 1 л
1
Сравнение с прототипом показало, что предлагаемая питательная среда отличается от известной тем, что она содержит гидролизат речной рыбы панкреатический, гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический, ферментированный яичный желток, калий фосфорнокислый однозамещенный, витамин В и глюкозу в предлагаемых количествах. Таким образом, данная питательная среда соответствует критерию изобретения "новизна".
Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы показал, что предлагаемое техническое решение отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найдена питательная среда для получения биомассы листерий, которая содержала бы такие же компоненты в предлагаемом количественном соотношении. А именно такие компоненты, взятые в предлагаемом количественном соотношении, позволяют решить поставленную задачу - повысить эффективность питательной среды с сохранением S-формы выращиваемой культуры
Предлагаемая питательная среда может использоваться для получения достаточного количества биомассы листерий, необходимой при производстве листериозной агглютинирующей сыворотки, и, в частности, получение в короткие сроки достаточного количество наиболее иммуногенного штамма L. monocytogenes 766 с максимально выраженными О-антигенами.
Таким образом, предлагаемая питательная среда соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
1
Предлагаемую питательную среду готовят следующим образом: навеску, содержащую гидролизат речной рыбы панкреатический (10,0-12,0 г), гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический (8,5-9,5 г), ферментированный яичный желток (1,12-1,30 г), хлорид натрия (2,9-3,5 г), калий фосфорнокислый однозамещенный (2,2-2,8 г), натрий фосфорнокислый двузамещенный (7,2-7,8 г), витамин В, (0,04-0,06 г), глюкозу (5,0-5,5 г) и агар микробиологический (9,0-11,0 г) размешивают в 950 мл дистиллированной воды, доводят до кипения при помешивании, кипятят в течение 6-8 мин, доводят до 1 литра стерильной дистиллированной водой, разливают в стерильную посуду и стерилизуют в течение (15±2) мин при температуре (112±2)°С.
При этом, гидролизат речной рыбы панкреатический готовят следующим образом:
В качестве сырья используют речную рыбу - сорогу. Не очищая от внутренностей и чешуи, рыбу режут на крупные куски (вместе с головой), взвешивают и моют проточной водой. В кипящую дитиллированную воду опускают рыбу из расчета 1,5 л на 1 кг рыбы и варят ее 20-30 мин с момента закипания. Вареную рыбу вынимают из бульона и размельчают. Бульон охлаждают до температуры (50±5)°С.
В 20-ти литровые бутыли закладывают по 3,5 кг варенной измельченной рыбной массы (вмести с костями) и наливают по 7 л бульона (делят поровну). Устанавливают в смеси рН 8,0-8,2 при помощи 40% раствора натрия гидрооксида (NaOH). Затем добавляют в каждую бутыль фарш поджелудочной железы (1%) и хлороформ (1-1,5%). Все тщательно перемешивают, бутыли закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при температуре (45±2)°С на 5-10 дней. В первый день перемешивают 10-12 ч через каждые 30 мин, в последующие дни - 3-5 раз за рабочий день. В течение первых двух дней исправляют рН до 7,8-8,0 добавлением 40% раствора натрия гидрооксида. Хранят с добавлением 1,5-2% хлороформа в прохладном месте (6±2)°С в течение 6 месяцев. Содержание аминного азота в полученном гидролизате - 500-560 мг % (Дятлов И.А., Кутырев В.В., Храмов М.В. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы. М.: ФБУН ГНЦ ПМБ, 2012. 415 с.).
Гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический получали в соответствии с промышленным регламентом №01898090-03-06 (регистрационный номер ГИСК им. Л.А. Тарасевича №1733-06): в реактор заливают 128 л питьевой воды, добавляют в нее 1,2 л 20% раствора натрия гидроокиси (для доведения рН до 7,8-8,0), 32 кг измельченных отходов производства мясной воды, 11,7 кг измельченной поджелудочной железы и 1,28 кг хлороформа. Гидролиз проводят при температуре 43±2°С в течение 7 суток. После фильтрации (для консервации) к готовому гидролизату на 122 л добавляют 2,28 л хлороформа. Содержание аминного азота 6,0±0,25 мг/мл.
Ферментированный яичный желток изготавливается из свежих отборных куриных яиц высокого качества. Механическим способом желток отделяется от белка, ферментизируется и сушится выкуумно-распылительным методом. Сухой термостабильный яичный желток более устойчив к воздействию высоких температур и обладает лучшей вязкостью. Введение в состав яичного желтка способствует восстановлению поврежденных клеток микроорганизма.
Оценка качества питательной среды для получения биомассы листерий по биологическим показателям.
9
-7
Для контроля использовали суточную агаровую культуру L. monocytogenes 766. Готовили взвесь листерий в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида рН 7,2±0,1, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ФГБУ «НЦЭСМП» ОСО 42-28-85-2018, эквивалентную 2,2×10 м.к./мл. Приготовленную взвесь в объеме 1,0 мл стерильной пипеткой переносили в пробирку, содержащую 4,5 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида. Затем осуществляют десятикратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси тест-штамма L. monocytogenes 766 в пробирки, содержащие 4,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида до разведения 10, тщательно перемешивая и меняя пипетки после каждого разведения.
-6
-7
Тест-штамм L. monocytogenes 766 из разведений 10 и 10 высевали в объеме 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и тщательно просушенные агаровые пластинки в чашки Петри с питательной средой для наращивания биомассы листерий. Посевной материал равномерно распределяли покачиванием чашки. Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч.
Питательная среда для получения биомассы листерий считается пригодной, если на ней вырастают типичные по морфологии колонии L. monocytogenes, диаметром не менее 1,0 мм, в количестве 30% от расчетной посевной дозы 100 м.к., при наличии единичных колоний на 3 чашках Петри с посевной дозой 10 м.к. Расчет ведется по среднему числу колоний на всех чашках.
Пример 1. Питательную среду готовят, как описано выше, при этом используют следующее соотношение компонентов, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический
10,0
гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический
8,5
ферментированный яичный желток
1,12
хлорид натрия
2,9
калий фосфорнокислый однозамещенный
2,2
натрий фосфорнокислый двузамещенный
7,2
витамин В<sub>1</sub>
0,04
глюкоза
5,0
агар микробиологический
9,0
вода дистиллированная
до 1 л
При таком соотношении компонентов количество колоний L. monocytogenes 766, выросших на питательной среде для накопления биомассы листерий, при посевной дозе 100 и 10 м.к. через 24 ч инкубации составило соответственно 78 и 9 колоний диаметром от 1,5 до 3,5 мм, а через 48 ч инкубации диаметр колоний составил от 3,0 до 4,0 мм. Колонии листерий круглые, выпуклые с ровным краем, белые с сероватым оттенком, полупрозрачные, гладкие, структура однородная, консистенция слизистая.
Пример 2. Питательную среду готовят, как описано выше, при этом используют следующее соотношение компонентов, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический
12,0
гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический
9,5
ферментированный яичный желток
1,30
хлорид натрия
3,5
калий фосфорнокислый однозамещенный
2,8
натрий фосфорнокислый двузамещенный
7,8
витамин B<sub>1</sub>
0,06
глюкоза
5,5
агар микробиологический
11,0
вода дистиллированная
до 1 л
При таком соотношении компонентов количество колоний L. monocytogenes 766, выросших на питательной среде для накопления биомассы листерий, при посевной дозе 100 и 10 м.к. через 24 ч инкубации составило соответственно 79 и 8 колоний диаметром от 1,5 до 3,5 мм, а через 48 ч инкубации диаметр колоний составил от 3,0 до 4,0 мм. Колонии листерий круглые, выпуклые с ровным краем, белые с сероватым оттенком, полупрозрачные, гладкие, структура однородная, консистенция слизистая.
Таким образом, заявленная питательная может применяться для получения биомассы листерий.
Предлагаемый состав среды позволяет повысить эффективность питательной среды по выходу микробных клеток с 1 мл питательной среды за 24 ч инкубации листериозного микроба. Количество выросших колоний листерий на предлагаемой среде в 1,3 раза больше, чем на среде-прототипе. Среда проста в приготовлении и экономически выгодна. Установлено, что биомасса листерий, выращенная на заявленной питательной среде, отвечает всем требованиям нормативной документации по изготовлению и проверке качества иммуногена, предназначенного для иммунизации животных-продуцентов при производстве листериозной агглютинирующей сыворотки. Производственный штамм L. monocytogenes 766 формирует на предлагаемой среде гладкие колонии, обладающие максимально выраженным О-антигеном, являясь наиболее иммуногенными.
Таким образом, предлагаемая среда, позволяет получать биомассу листерий с сохранением S-формы выращиваемой культуры в количестве, достаточном для приготовления антигена, предназначенного для иммунизации животных.