СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ДИСФУНКЦИЙ КРОВЯНЫХ ПЛАСТИНОК ПРИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЯХ ПИЩЕВАРЕНИЯ У НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ
METHOD OF THROMBOCYTE DYSFUNCTION CORRECTION IN FUNCTIONAL DIGESTIVE DISORDERS IN NEWBORN CALVES

Изобретение относится к ветеринарии, в области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для выбора корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения.
Аналогов способа выбора корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения не существует.
В качестве эффективных стимуляторов жизнедеятельности растущего организма в современной ветеринарии применяются фоспренил - препарат на основе фосфатов полипренолов, получаемых из хвои (Деева А.В., Салахова З.А., Лобова Т.П. и др. Повышение сохранности и продуктивности поросят при использовании фоспренила и гамавита. // Ветеринария. - 2006. - № 4, - с.13-15), полизон - фосфорнокислая соль 2-амино-4-метилтио-(S-оксо-S-амино)-масляной кислоты представляет собой слабо растворимый в воде порошок от белого до кремового цвета (Овчинников А. и др. Полизон - стимулятор роста // Птицеводство, 2006. - № 12, - с.14-15) и крезацин - производный ароксиалкилкарбоновых кислот. Он оказывает эффективное стимулирующее действие на живые организмы, повышая выживаемость животных в неблагоприятных и экстремальных условиях, стимулируя или нормализуя жизненные процессы (Байматов В.Н., Латыпов М.М. Влияние крезацина на состояние птицы. Ветеринария, 2006, № 11, с.49-51).
Целью изобретения является повышение эффективности выбора лечебного подхода для коррекции тромбоцитопатии у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что для выбора корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения из вены берется кровь в пробирку с последующим выделением из нее тромбоцитов, определением в них активности каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), содержания малонового диальдегида (МДА) и расчета фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов (ФАСТ).
По полученным значениям ФАСТ у каждого конкретного теленка возможно определять степень повреждающего действия продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) на тромбоцитарные функции. По состоянию ФАСТ регистрируется способность тромбоцитов противостоять вредным воздействиям элементов патогенеза функциональных нарушений пищеварения. По величине ФАСТ также можно определить какое лечение необходимо назначить в данном случае, чтобы стабилизировать ПОЛ кровяных пластинок при ослаблении в них активности каталазы и СОД и тем самым нивелировать причинные факторы развития тромбоцитопатии.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно производить выбор корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения, способного привести к полной нормализации состояния тромбоцитарных функций, и эффективную профилактику возникновения тромбозов различных сосудов.
По завершению лечебных мероприятий возможно повторное обследование с определением ФАСТ с целью контроля адекватности проводимых мер.
9
9
9
Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Взятие крови производят в утренние часы. Кровь берут из вены в количестве 20 мл через толстую иглу самотеком в пробирку. В качестве консерванта используют 5% раствор трилона-Б из расчета 1,5 мл консерванта на 20 мл цельной крови. Затем кровь с консервантом осторожно и тщательно перемешивают и для осаждения эритроцитов и лейкоцитов центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочный слой, который содержит основную массу тромбоцитов, отсасывают в отдельную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. При этом оставшиеся в надосадочном слое эритроциты и лейкоциты оказываются в осадке. Осадок удаляют, а супернатант помещают в отдельную пробирку и центифугируют при 2200 об/мин в течение 15 мин. В результате получают осадок, состоящий из одних тромбоцитов. Выход тромбоцитов составляет 1,5×10-2,5×10 клеток из 20 мл цельной крови. Полученные тромбоциты отмывают следующим образом. Недосадочную жидкость после третьего центрифугирования удаляют, а к осадку тромбоцитов добавляют 6 мл 0,85% раствора натрия хлорида, приготовленного на 2,7% растворе трилона Б. Осадок кровяных пластинок осторожно перемешивают и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 10 мин. Затем супернатант удаляют, а к осадку вновь добавляют физиологический раствор на трилоне Б в тех же количествах. Эту процедуру повторяют трижды. Следует отметить, что выделение и отмывание тромбоцитов проводят при комнатной температуре. Часть клеток в процессе отмывания теряется и количество тромбоцитов, выделенных из 20 мл цельной крови, в итоге составляет в среднем 1,8×10 клеток. В каждом конкретном случае количество тромбоцитов подсчитывается в камере Горяева.
Последующая оценка активности каталазы и СОД осуществляется следующим способом.
2
2
2
6
Определение каталазы в крови. Принцип метода состоит в том, что каталаза разрушает субстрат HO, а оставшуюся неразрушенной часть перекиси водорода измеряют с помощью молибдата натрия. Как известно, для молибдена характерно образование при взаимодействии с перекисью водорода перекисных соединений состава NaMoO, которые имеют желтую окраску. Интенсивность окраски образующихся перекисных соединений молибдена зависит от количества перекиси водорода в растворе, т.е. от активности каталазы в пробе.
Реагенты.
(1) 0,3%-ный водный раствор перекиси водорода (1 мл концентрированного раствора перекиси водорода доводят дистиллированной водой до 100 мл).
(2) 4%-ный водный раствор молибдата натрия.
Таблица 1.
Схема определения каталазы в крови
Вводимые реагенты
Холостая проба
Исследуемая проба
Раствор H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, мл
2,000
2,000
Суспензия тромбоцитов, мл
-
0,010
Раствор молибдата, мл
1,000
1,000
В табл.1 приведено описание методики.
Раствор молибдата добавляют к каждой пробе по отдельности и сразу же после перемешивания реакционной смеси измеряют экстинкцию при 410 нм против дистиллированной воды. Экстинкция холостой пробы около 0,350. Чем больше в пробе каталазы, тем меньше перекиси водорода остается неразрушенной и тем меньше образуется перекисей молибдата. Результат оценивают по степени разрушения перекиси водорода каталазой или степени блокирования образования конечных продуктов перекисей молибдата и выражают в процентах. Расчет проводят по формуле
,
х.пр
исс.пр
9
где Е и Е - экстинкция соответственно холостой и исследуемой проб. С помощью калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов каталазы (схема 1), оценивают активность каталазы в пробе на основании рассчитанного процента разрушения перекиси водорода. Активность каталазы относят к концентрации тромбоцитов (в МЕ/10 тр.) в исследуемой взвеси тромбоцитов.
9
По оси абсцисс схемы отложена активность каталазы в МЕ/10 тр., по оси ординат - блокирование реакции в %.
Определение СОД. Принцип определения основан на восстановлении нитротетразолия супероксидными радикалами, которые образуются при реакции между феназинметасульфатом и восстановленной формой никотинамиддинуклеотида (NAD·H). Образование нитроформазана, продукта восстановления нитротетразолия, блокируется наличием в пробе СОД. Так, на основании количества нитроформазана можно оценить активность СОД.
Реагенты.
2
4
2
4
(1) 0,15 М фосфатный буфер (pH 7,8) (4,48 г NaHPO, 0,25 г KHPO растворяют в 500 мл дистиллированной воды).
2
(2) Инкубационную смесь 37 мг ЭДТА-Na, 330 мг нитротетразолия голубого, 55 мг феназинметасульфата смешивают с 300 мл фосфатного буфера, оставляют стоять на ночь. Утром фильтруют.
(3) Раствор NAD·H (152 мг NAD·H растворяют в 10 мл трис-ЭДТА-буфера).
(4) Трис-ЭДТА-буфер, рН 8,0 (37 мг ЭДТА-Na, 24 мг трис растворяют в 100 мл дистиллированной воды).
В суспензии тромбоцитов определяют СОД (табл.2).
Таблица 2.
Схема определения СОД.
Добавляемые реагенты
Холостая проба
Исследуемая проба
Инкубационная смесь, мл
1,500
1,500
Дистиллированная вода, мл
0,100
Суспензия тромбоцитов, мл
0,100
Раствор NAD·H, мл
0,050
0,050
Смешивают смесь, оставляют стоять при комнатной температуре и измеряют экстинкцию холостой и исследуемой проб при 540 нм на спектрофотометре. Экстинкция холостой пробы составляет около 0,680. Расчет производят по формуле
9
9
Активность СОД определяют с помощью калибровочной кривой (схема 2). Активность СОД в крови выражают в ME /10 тр. По оси абсцисс схемы отложены активность СОД в МЕ/10 тр., по оси ординат - блокирование восстановления нитротетразолия в %.
Определение МДА. Уровень МДА определяется тиобарбитуровым методом в отмытых и ресуспендированных тромбоцитах, принцип метода Smith I.B., Jngerman С.М., Silver M.I. Malondialdehyde formation as an indicator of prostaglandin production by human platelet. // J. Lab. Clin. Med. - 1976. - Vol.88. - № 1. - P.167-172, в модификации Кубатиев A.A., Андреев С.В. Перекиси липидов и тромбоз. // Бюллетень экспериментальной биологии. - 1979. - № 5, - с.414-417.
В пробу 0,5 мл суспензии тромбоцитов добавляют 0,5 мл 50% трихлоруксусной кислоты на 1 N HCl и 0,5 мл 0,9% тиобарбитуровой кислоты. Сразу после смешивания реактивов проба помещается на кипящую водяную баню на 15-30 мин. После этого ее охлаждают при комнатной температуре и центрифугируют при 3000 об/мин.
Супернатант фотометрируют при λ=532 нм. Контролем служит проба, в которую вносили 0,5 мл физиологического раствора. Расчет ведется по формуле
ε - экстинкция пробы;
5
1,5·10 - коэффициент молярной экстинкции;
3 - коэффициент учитываемого разведения;
9
10 - коэффициент перехода в нМ.
9
Концентрация МДА в пересчете на 10 тромбоцитов определяется следующим образом:
9
2
С (нМ·10 тромбоцитов)=ε·2·10/N,
N - число тромбоцитов в мкл, деленное на 100000.
Оценка полученных результатов.
Для характеристики антиоксидантного состояния тромбоцитов применяется расчетно-определяемый фактор, величина которого комплексно оценивает активность важных антиоксидантных энзимов и уровень сдерживаемого ими перекисного окисления липидов кровяных пластинок (С.Чевари, Т.Андял, Я.Штрегер. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте. // Лабор. дело. 1991. - № 10. - с.9-13). Этот фактор антиоксидантного состояния выражается формулой
По полученным значениям ФАСТ у каждого конкретного новорожденного теленка с диспепсией возможно подбирать необходимое лечение, достаточное для коррекции тромбоцитарного гемостаза, в данном случае, способное оптимизировать ФАСТ и устранить ведущую причину возникновения тромбоцитопатии, сняв повреждающее влияние на тромбоциты высокого количества в них продуктов перекисного окисления липидов тромбоцитов и повысив активность каталазы и СОД.
Выбор корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения осуществляется следующим образом. После взятия крови, ее стабилизации, выделения из крови тромбоцитов, оценки активности в них каталазы и суперсиддисмутазы и содержания малонового диальдегида, производится расчет величины ФАСТ, по которой осуществляется выбор корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у обследуемых новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения.
6
6
2
9
6
6
2
9
6
9
При нахождении фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения в границах 6,4×10-5,5×10 МЕ/нмоль×10 тр. полную коррекцию тромбоцитарных нарушений можно проводить с помощью фоспренила 0,8 мл/кг внутримышечно в течение 5 суток. При нахождении значения фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения в границах 5,4×10-4,7×10 МЕ/нмоль×10 тр. полную нормализацию тромбоцитарных нарушений возможно провести с помощью полизона 5 мг/кг, включая его в схему выпаивания на 6 суток. В случае величины фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения 4,6×10 МЕ/нмоль×10 тр. и ниже коррекцию тромбоцитарных нарушений можно проводить с помощью крезацина 4 мг/кг, включая его в течение 7 суток в схему выпаивания.
При проведении соответствующих лечебных мероприятий возможно повторное обследование с определением ФАСТ с целью контроля адекватности проводимых мер.
Таблица 3.
Антиоксидантные параметры крови у обследованных новорожденных телят
Категория обследованных
Число наблюдений
Каталаза МЕ/10<sup>9</sup> тр.
СОД МЕ/10<sup>9</sup> тр.
МДА нмоль/10<sup>9</sup> тр.
ФАСТ МЕ<sup>2</sup>/нмоль×10<sup>9</sup> тр.
Здоровые новорожденные телята
40
11600,0-9050,0
2500,0-1750,0
0,35-0,98
82,8×10<sup>6</sup>-16,1×10<sup>6</sup>
Новорожденные телята с ФНП и риском тромбоцитарных нарушений
52
9049,0-6500,0
1749,0-1500,0
0,99-1,49
16,0×10<sup>6</sup>-6,5×10<sup>6</sup>
Новорожденные телята с ФНП и тромбоцитарными нарушениями
49
6499,0-4800,0
1499,0-1200,0
1,50-2,20
6,4×10<sup>6</sup> и ниже
Таким образом, с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно осуществить выбор корректирующего лечебного подхода для нивелирования тромбоцитопатии у конкретного новорожденного теленка с функциональными нарушениями пищеварения с полным исключением риска возникновения тромбозов различных сосудов.
Внедрение данного способа выбора корректирующего подхода для лечения тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения в ветеринарных учреждениях позволит проводить своевременную и эффективную коррекцию тромбоцитопатии у новорожденных телят в каждом конкретном случае, оздоровить молодняк крупного рогатого скота.
2
2
2
2
9
9
9
6
2
9
6
2
9
9
9
9
Пример 1. Новорожденный теленок № 24, 6 сутки жизни, с функциональными нарушениями пищеварения 2-й день обследован в условиях телятника. У теленка была взята и исследована кровь. Выявлено повышение агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 29,0 с., коллаген 28,0 с., тромбин 40,0 с., HO 37,0 с., адреналин 84,0 с., АДФ + адреналин 25,0 с., АДФ + коллаген 24,0 с., адреналин+коллаген 24,0 с.) и усиление внутрисосудистой активности (ВАТ) (дискоциты 70%, диско-эхиноциты 16%, сфероциты 8%, сферо-эхиноциты 4%, биополярные формы 2%). Обследование установило ослабление активности каталазы 6200,0 МЕ/10 тр., СОД 1400,0 МЕ/10 тр., повышение МДА тромбоцитов 1,5 нмоль/10 тр. ФАСТ составил 5,7×10 МЕ/нмоль×10 тр. Это указывало на необходимость назначения теленку для коррекции тромбоцитарных нарушений фоспренила 0,8 мл/кг внутримышечно на 5 суток. Через 3 суток функциональные нарушения пищеварения полностью купировались, а через 5 суток лечения нормализовался ФАСТ 32,4×10 МЕ/нмоль×10 тр., (каталаза 10500,0 МЕ/10 тр., СОД 1850,0 МЕ/10 тр., МДА тромбоцитов 0,6 нмоль/10 тр.). Полностью нивелировались тромбоцитарные нарушения: оптимизировалась агрегационная активность тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 36,2 с., коллаген 34,0 с., тромбин 49,0 с., HO 42,0 с., адреналин 102,0 с., АДФ + адреналин 34,0 с., АДФ+коллаген 29,0 с., адреналин + коллаген 28,0 с.) и нормализовались ВАТ (дискоциты 82%, диско-эхиноциты 9%, сфероциты 5%, сферо-эхиноциты 2%, биполярные формы 2%).
В дальнейшем рациональный режим кормления данного теленка в течение 2 недель закрепил полученный эффект, исключив риск возникновения тромбоцитарных нарушений.
2
2
9
9
9
6
2
9
Пример 2. Новорожденный теленок №92, 7 суток, с функциональными нарушениями пищеварения 3 суток обследован в условиях телятника. У больного теленка была взята и исследована кровь с оценкой агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 27,0 с., коллаген 22,0 с., тромбин 31,0 с., HO 25,0 с., адреналин 65,0 с., АДФ+адреналин 19,0 с., АДФ + коллаген 17,0 с., адреналин + коллаген 17,0 с.). Установлено усиление ВАТ (дискоциты 57%, диско-эхиноциты 20%, сфероциты 14%, сферо-эхиноциты 7%, биполярные формы 2%), что позволило у него диагносцировать тромбоцитопатию с наклонностью к гиперагрегации. В тромбоцитах зарегистрирована следующая активность каталазы 6000,0 МЕ/10 тр., СОД 1300,0 МЕ/10 тр., содержание МДА 1,6 нмоль/10 тр. Рассчитан ФАСТ 4,8×10 МЕ/нмоль×10 тр. По величине ФАСТ было принято решение назначить теленку на 6 суток полизон 5 мг/кг в схеме выпаивания.
6
2
9
9
9
9
2
2
Это позволило купировать у него функциональные нарушения пищеварения в течение 3 суток. Нормализовались ФАСТ 27,6×10 МЕ/нмоль×10 тр. (каталаза 9600,0 МЕ/10 тр., СОД 2300,0 МЕ/10 тр., МДА тромбоцитов 0,8 нмоль/10 тр.). Через 6 суток лечения нормализовались исследованные параметры тромбоцитарного гемостаза: агрегационная активность тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 37,0 с., коллаген 34,0 с., тромбин 49,0 с., HO 42,0 с., адреналин 91,0 с., АДФ + адреналин 32,0 с., АДФ + коллаген 27,0 с., адреналин + коллаген 29,0 с.) и ВАТ (дискоциты 82%, диско-эхиноциты 7%, сфероциты 5%, сферо-эхиноциты 4%, биполярные формы 2%).
Дальнейшее кормление теленка в рациональном режиме в течение 2 недель закрепило полученный эффект, исключая рецедивирование тромбоцитопатии.
2
2
9
9
9
6
9
Пример 3. Новорожденный теленок № 55, 9 суток, с функциональными нарушениями пищеварения 4 суток обследован в условиях телятника. У больного теленка была взята и исследована кровь с оценкой агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 27,0 с., коллаген 32,0 с., тромбин 29,0 с., HO 21,0 с., адреналин 55,0 с., АДФ+адреналин 17,0 с., АДФ+коллаген 14,0 с., адреналин + коллаген 13,0 с.) и ВАТ (дискоциты 52%, диско-эхиноциты 24%, сфероциты 14%, сферо-эхиноциты 7%, биполярные формы 3%), что позволило у него диагносцировать тромбоцитопатию с наклонностью к гиперагрегации. В тромбоцитах зарегистрирована следующая активность каталазы 5800,0 МЕ/10 тр., СОД 1200,0 МЕ/10 тр., содержание МДА 2,0 нмоль/10 тр. Рассчитано ФАСТ 3,5×10 ME /нмоль×10 тр. По величине ФАСТ было принято решение назначить теленку на 7 суток крезацин 4 мг/кг в схеме выпаивания.
6
2
9
9
9
9
2
2
Это позволило купировать у него функциональные нарушения пищеварения через 7 суток лечения, нормализуя ФАСТ 36,4×10 МЕ/нмоль×10 тр. (каталаза 9800,0 МЕ/10 тр., СОД 2600,0 МЕ/10 тр., МДА тромбоцитов 0,7 нмоль/10 тр.), и перевести на уровень контроля исследованные параметры тромбоцитарного гемостаза: агрегационная активность тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 39,0 с., коллаген 36,0 с., тромбин 49,0 с., HO 48,0 с., адреналин 104,0 с., АДФ + адреналин 33,0 с., АДФ + коллаген 32,0 с., адреналин + коллаген 31,0 с.) и ВАТ (дискоциты 83%, диско-эхиноциты 8%, сфероциты 6%, сферо-эхиноциты 2%, биполярные формы 1%).
Дальнейшее кормление теленка в рациональном режиме в течение 2 недель закрепило полученный эффект, исключая рецедивирование тромбоцитопатии.