Морфофункциональная организация пластинки роста тела позвонка крыс в условиях глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса и применения антиоксиданта тиофана…

8. Плотников, М.Б. Лекарственные препараты на основе диквертина / М.Б. Плотников, Н.А. Тюкавина, Т.М. Плотникова. - Томск: Изд-во ТгУ, 2005. - 228 с.

9. Поздняков, О.Г. Возрастные и тканеспецифические особенности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной системы у крыс на раннем этапе холодового воздействия: дис. ... канд. биол. наук /

О.Г. Поздняков. - Астрахань, 2005.

10. Пшенникова, М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии / М.Г. Пшенникова // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 2001. - №1. - С. 23-26.

11. Сейдахметова, З.Ж. Влияние иммобилизационного стресса на реактивность симпато-адреналовой системы и резистентность эритроцитов у крыс в периоды маммо- и лактогенеза / З.Ж. Сейдахметова, Г.К. Ташенова // Бюл. СО РАМН. - 2005. - № 3-4 (118). - С. 93-95.

12. Федоров, Б.М. Стресс и система кровообращения / Б.М. Федоров. - М., 1991.

13. Jessen, R. An essesment of human regulatory chanisnis of nonshivering thermogenesis / R. Jessen // Acta anaesthesiol. - 1980. - Vol.24. - P.138-143.

14. Stoltz, J.E. New trends in clinical hemorheology:an introduction to the concept of the hemorheological profile / J.E. Stoltz, M. Donner// Schweiz. Med. Wochenschr. - 1991. - Vol.43. - P.41-49.

УДК 616.153.915-39-07 А.А. Макеев, А.В. Сахаров, А.Е. Просенко

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЛАСТИНКИ РОСТА ТЕЛА ПОЗВОНКА КРЫС В УСЛОВИЯХ ГЛЮКОКОРТИКОИД-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И ПРИМЕНЕНИЯ АНТИОКСИДАНТА ТИОФАНА

Длительное применение глюкокортикоида преднизолона в период полового созревания крыс приводит к нарушению структурно-функциональной организации хрящевой пластинки роста тела позвонка. Одним из механизмов повреждения пластинки роста являются высокотоксичные продукты свободнорадикального пе-рекисного окисления липидов. Использование фенольного серосодержащего антиоксиданта тиофана в условиях преднизолоновой нагрузки оказывает протективный эффект на клетки и матрикс пластинки роста.

Ключевые слова: окислительный стресс, антиоксидантная система, пластинка роста, антиоксидант тиофан.

А.А. Makeev, A.V. Sakharov, A.Ye. Prosenko

MORPHOFUNCTIONAL ORGANIZATION OF THE RAT CARTILAGE GROWTH PLATES IN CASE OF GLUCOCORTICOID-INDUCED OXIDATIVE STRESS AND ANTIOXIDANT THIOFAN APPLICATION

The article shows that long-term application of a glucocorticoid prednizolon during puberty period of rats leads to infringement of the structural and functional organization of growth plate cartilage. One of the mechanisms of growth plate damage is highly toxic products of free radical peroxide lipid oxidation. The application of phenolic sulfur-containing antioxidant thiophan in conditions of prednizolon load exerts protective effect on cells and matrix of the growth plate.

Key words: oxidative stress, antioxidant status, plate growth, thiophan antioxidant.

Терапия глюкокортикоидами (ГК) является одним из эффективных методов лечения многих заболеваний костно-суставного аппарата [7]. Вместе с тем длительное применение ГК приводит к развитию окислительного стресса [3], что не всегда учитывается в клинической практике. Образующиеся продукты свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) оказывают цитотоксический эффект на клетки и матрикс хрящевой ткани, клетки которой характеризуются эволюционно закрепившимся дефицитом ферментов антиоксидантной защиты [5].

Поиск эффективных препаратов для профилактики осложнений глюкокортикоидной терапии обусловливает актуальность настоящих исследований.

Цель исследований - изучить влияние антиоксиданта тиофана на пластинку роста тела позвонка крыс в условиях глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса.

Материалы и методы исследований. Экспериментальная часть работы выполнена на самцах крыс линии Вистар двухмесячного возраста массой 220-250 г. Животные были разделены на три группы: 1 контрольная и 2 опытные. Контролем служили интактные животные, которые содержались в стандартных условиях вивария. Крысам опытных групп вводили преднизолон (per os) в дозе 50 мг/кг в течение 14 суток согласно общепринятой методике [1]. Животных первой опытной группы не лечили, крысы второй опытной группы через 3 часа после введения преднизолона получали антиоксидант тиофан в дозе 100 мг/кг в течение всего периода эксперимента.

На 15-е сутки эксперимента всех животных под эфирным наркозом выводили из эксперимента и получали материал для проведения биохимических и морфологических исследований. Объектом исследований служила плазма крови крыс и фрагменты тел позвонков всех групп.

В плазме крови крыс определяли содержание основных продуктов свободнорадикального окисления

- малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов (ДК), а также активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ). Содержание МДА определяли в реакции с 3-хлоруксусной и тиобарбитуровой кислотами в присутствии ионов меди [4]; концентрацию ДК выявляли реакцией с гептан-изопропаноловой смесью [6]. Активность ферментов антиоксидантной защиты - СОД

- регистрировали по степени ингибирования хемилюминесценции в растворе с ксантиноксидазой [8]; активность КАТ определяли реакцией перекиси водорода с добавлением молибдата аммония [2]. Реакции оценивали спектрофотометрически при соответствующей длине волны.

Материалом для проведения морфологического и гистохимического анализов служили пластинки роста тел позвонков крыс всех групп. Из грудного отдела позвоночника выделяли тела позвонков и фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, а затем декальцинировали в забуференном растворе трило-на Б. Исследуемые образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. На санном микротоме готовили серийные срезы толщиной 5-7 мкм и монтировали на предметные стекла. Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Кислые гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли альциановым синим по Стидме-ну, гликоген и гликопротеины - ШИК-реакцией по Мак Манусу. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты биохимического анализа плазмы крови крыс первой опытной группы, свидетельствуют, что содержание интегральных показателей СПОЛ статистически достоверно превышает аналогичные показатели крыс интактной группы. Установлено, что концентрация ДК на 55,39 (р<0,001), а МДА на 97,22 % (р<0,001) статистически достоверно выше соответствующих показателей крыс интактной группы.

Исследование антиоксидантного статуса плазмы крови крыс первой опытной группы позволяет отметить снижение активности исследуемого ферментативного звена антиоксидантной защиты. В частности, отмечается снижение уровня активности СОД на 24,75 % (р<0,001), а КАТ - на 48,55 % (р<0,01) относительно аналогичного показателя интактных крыс.

Превышение уровня продуктов перекисного окисления липидов и депрессия ферментов антиокси-дантной защиты в плазме крови крыс первой опытной группы являются доказательством развития окислительного стресса при длительном применении глюкокортикоидов.

Анализ биохимических показателей содержания высокотоксичных продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов в плазме крови крыс при совместном использовании преднизолона и антиоксиданта тиофана выявил снижение концентрации МДА и ДК относительно аналогичных показателей крыс, получавших только преднизолон. Установлено, что концентрация ДК статистически достоверно снижена на 31,55 (р<0,001), а МДА - на 42,25 % (р<0,001).

Полученные данные относительно активности исследуемого ферментативного звена антиоксидантной системы свидетельствуют, что уровень активности СОД в 1,3 раза (р<0,001), а КАТ в 1,9 раза (р<0,001) превышает активность соответствующих ферментов крыс первой опытной группы. Это позволяет сделать заключение о том, что совместное применение глюкокортикоида преднизолона и антиоксиданта тиофана снижает развитие окислительного стресса при глюкокортикоидной терапии.

Влияние токсичных продуктов СПОЛ на хрящевую ткань пластинки роста тела позвонка крыс изучали методами морфогистохимического анализа. Исследование образцов пластинок роста крыс контрольной и опытных групп, выполненных в сагиттальной плоскости, свидетельствует о нарушении роста позвоночника крыс при окислительном стрессе.

У животных первой опытной группы, так же как и у контрольной, идентифицируются все зоны пластинки роста. Однако имеются некоторые различия, касающиеся как толщины определенных зон, так и их морфологии. Типичным для образцов пластинки роста животных данной группы является увеличение толщины слоя пролиферирующего хряща за счет количества клеток и их площади. Хондроциты этого слоя крупные, располагаются в широких лакунах округлой формы, которые по морфологической характеристике приближаются к клеткам гипертрофированного хряща. Цитоплазма клеток слабо выражена, неравномерно окрашивается эозином и содержит многочисленные мелкие, оптически прозрачные вакуоли. По сравнению с контрольными образцами возрастает количество клеток с пикнотичным ядром и плазморексисом цитоплазмы. Хроматин в виде крупных глыбок локализован на периферии ядерной мембраны. Цитоплазма неравномерно окрашивается гематоксилином и не имеет чётких контуров. Делящиеся клетки располагаются в разных плоскостях. Матрикс слабо выражен. В цитоплазме клеток содержатся единичные гранулы, положительно реагирующее с реактивом Шиффа. Интенсивность реакции практически не изменяется после ферментативной обработки срезов в растворе амилазы.

При постановке гистохимической реакции на суммарные кислые ГАГ в цитоплазме и территориальном матриксе альцианпозитивный материал имеет вид сливных гранул. Иногда встречаются бесклеточные лакуны, заполненные бесструктурным альцианпозитивным веществом.

Слабое базофильное окрашивание на периферии цитоплазмы отражает низкую метаболическую активность в этой области клетки. Подтверждением этого может служить незначительное содержание в цитоплазме гликогена, который обеспечивает клетку энергией.

Типичным признаком является изменение клеток и матрикса ПР, которые имеют ярко выраженный деструктивный характер. В центре зоны пролиферирующего хряща отмечается формирование сосудистых каналов. Деструкция хрящевого матрикса в толще зоны пролиферации ПР приводит к его оссификации и началу формирования примитивных костных балок, на периферии которых располагаются многочисленные остеобласты.

По сравнению с контрольными образцами колонковые структуры искривлены, местами сужены, а в отдельных случаях не определяются. По морфологическим характеристикам клетки этой зоны неоднородны. Встречаются кластеры из 5-6 клеток в лакуне с базофильной цитоплазмой и центрально расположенным ядром. Эти хондроциты представляют собой типичные клетки изогенной группы, которые не формируют колонковые структуры. Кроме того, плоскость их деления не имеет строгой векторной направленности.

Результаты гистохимического исследования показали, что у животных 1-й опытной группы в межклеточном веществе этой зоны отмечается снижение интенсивности реакции с альциановым синим и реактивом Шиффа по сравнению с контролем.

Толщина зоны гипертрофических клеток значительно сужена и представлена 2-3-мя слоями клеток против 5-6-ти в норме.

В зоне энхондрального остеогенеза ПР происходит глубокая инвазия кровеносными сосудами хрящевого матрикса. Дистрофия матрикса и кальцификация осуществляется вплоть до клеток зоны пролиферации, в отличие от крыс контрольной группы. Это приводит к практически полному исчезновению гипертрофических клеток и интенсивному замещению хряща в зоне созревания и гипертрофии первичной грубоволокнистой костной тканью, которая плотно перекрывает ПР на уровне зоны пролиферации.

На гистологических препаратах животных, которым на фоне глюкокортикоидной нагрузки вводили антиоксидант тиофан, пластинка роста имела равномерную толщину. В отличие от крыс 1-й опытной группы, зона пролиферирующего хряща ПР содержит хондроциты преимущественно овальной формы. Матрикс хорошо развит и характеризуется гомогенным умеренно базофильным окрашиванием.

Зона колонковых структур и гипертрофированного хряща увеличена по сравнению с животными первой опытной группы. Кроме того, клетки этой зоны пластинки роста сохраняют типичную морфологию. При постановке реакции на кислые ГАГ матрикс этой зоны имеет интенсивную альцианпозитивную окраску.

В зоне энхондрального остеогенеза сосуды инвазируют хрящевой матрикс только вокруг лакун гипертрофических клеток. На поверхности формирующихся костных балок определяются многочисленные остеобласты и отложения остеоида.

Результаты проведенного морфогистохимического анализа позволяют вполне обоснованно заключить, что длительное применение глюкокортикоида преднизолона приводит к развитию окислительного стресса. Интенсивная гибель клеток и деструкция матрикса хрящевой ткани ПР может являться отражением локального проявления окислительного стресса, что, в конечном итоге, обусловливает нарушение роста осевого скелета крыс. Применение фенольного серосодержащего антиоксиданта тиофана в условиях преднизолоновой нагрузки оказывает про-тективный эффект на клетки и матрикс пластинки роста, что указывает на один из ведущих механизмов нарушения структурно-функциональной организации хрящевой ткани ПР - свободнорадикальный.

Литература

1. Зиганшина, Л.Е. Сравнительное изучение эффективности димефосфона и ксидофона при стероидном остеопорозе у крыс / Л.Е. Зиганшина, З.А. Бурнашева, И.Х. Валеева // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2002. - № 6. - С.55-56.

2. Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк // Лаб. дело. - 1988. - №1. -С.16-19.

3. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков,

В.З. Ланкин [и др.]. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.

4. Определение резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови: метод. рекомендации / Ю.И. Рагина, М.И. Душкин. - Новосибирск, 1998. - 11 с.

5. Павлова, В.Н. Хрящ / В.Н. Павлова. - М.: Медицина, 1988. - 320 с.

6. Стальная, И.Д. Современные методы в биохимии / И.Д. Стальная. - М.: Медицина, 1977. - 391 с.

7. Gulko, P.S. Glucocorticoid-induced osteoporosis: pathogenesis, prevention anf treatment / P.S. Gulko,

A.L. Mulloy // Clin. Exp. Rheumatol. - 1996. - Р. 199-206.

8. Laihia, J.K. Lucigenin and linoleate enhanced chemiluminescent assay for superoxide dismutase activity / J.K. Laihia, C.T. Jansen, M. Ahotupa// Free Radic. Biol. Med. - 1993. - Vol. 14.- P. 457-461.

УДК 619:618.24:636.2 Н.В. Гребенькова

ФОРМИРОВАНИЕ И РАЗВИТИЕ ОРГАНОВ РАЗМНОЖЕНИЯ В ПРЕНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

С помощью гистологических и гистохимических методов исследования изучено формирование и развитие органов размножения коров в период от 20 до 90 суток пренатального онтогенеза. Во время стадии закладки органов раннего этапа развития (20-34 сут.) происходит формирование гонад. Во время среднего этапа и в начале позднего этапа развития формируются основные структуры яичника, завершается процесс дивергентной дифференцировки пола (34-45 сут.), происходит размножение половых клеток в овариальных железах, образование яйцепроводов, матки и влагалища (45-90 сут.).

Ключевые слова: корова, пренатальный онтогенез, репродуктивные органы, матка.

N.V. Grebenkova REPRODUCTIVE ORGAN FORMATION AND DEVELOPMENT IN THE PRENATAL ONTOGENESIS

Formation and development of cow reproductive organs in period from 20 to 90 days of prenatal ontogenesis by means of histological and histochemical techniques are studied. Gonads formation occures in the early period of organ formation( 20 to 34 days). At the middle stage and at the beginning of the later stage of development, basic ovarian structures form and the process of sex divergent difference completes (34-45 days); genital cells generation in ovarian glands and fallopian tubes, uterine and vagina formation take place.

Key words: cows, prenatal ontogenesis, reproductive organs, uterine.

Введение. Нарушения формирования и развития органов размножения в период их закладки приводят к врожденному бесплодию животных. Поэтому интерес к изучению репродуктивных органов в пренатальном онтогенезе имеет большое практическое значение [4-6]. Формирование, рост и развитие репродуктивных органов необходимо исследовать с ранних сроков онтогенеза, начиная с появления зачатков гонад, так как уже в этот период могут формироваться аномалии развития, такие, как пороки генетического пола (наследственная гипоплазия гонад, химеризм по половым хромосомам), пороки гонадного пола (гермафродитизм, фримартинизм). Развитие половой системы является сложным процессом, включающим большое