СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ВВ И СОДЕРЖАЩЕЕ ЕГО СРЕДСТВО ДЛЯ АКТИВАЦИИ ПРОДУЦИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, СРЕДСТВО ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СРЕДСТВО ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ
AGENT FOR PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR BB PRODUCTION SIMULATION AND AGENT CONTAINING IT AND APPLICABLE FOR MESENCHYMAL STEM CELL PRODUCTION ACTIVATION, AGENT FOR STEM CELL STABILISATION AND AGENT FOR SKIN REGENERATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к средству для стимуляции продуцирования тромбоцитарного фактора роста ВВ (PDGF-BB) и к средству для активации продуцирования мезенхимальных стволовых клеток, средству для стабилизации стволовых клеток и средству для регенерации кожи, содержащему средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB.
Уровень техники
Стволовые клетки представляют собой клетки, которые обладают как свойством плюрипотентности, т.е. способности дифференцироваться в разные клетки, так и свойством самовоспроизведения, т.е. способности образовывать при клеточном делении идентичные клетки. Стволовые клетки, полученные из эмбриона на ранних стадиях развития оплодотворенной яйцеклетки, известны как эмбриональные стволовые клетки (ES-клетки). Человеческие ES клетки весьма перспективны в отношении применения в регенеративной медицине, однако этические проблемы, касающиеся использования оплодотворенных яйцеклеток, мешают разработке новых ES-клеток человека.
В последнее время в центре внимания также находились индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS клетки) как клетки, имеющие свойства, подобные ES-клеткам. Однако при создании iPS клеток столкнулись с многочисленными проблемами, включая появление признаков злокачественности клеток и эффективность получения iPS. С другой стороны, соматические стволовые клетки, которые обладают способностью дифференцироваться в определенные ткани, извлекают из собственных тканей организма пациента, например костного мозга, и, следовательно, при этом не появляются этические проблемы, связанные с эмбриональными стволовыми клетками.
Хорошо известно, что эпидермальные стволовые клетки (непатентный документ 1) присутствуют в базальном эпидермальном слое кожи, а фолликулярные эпителиальные стволовые клетки (непатентный документ 2) или стволовые клетки меланоцитов (непатентный документ 3) были описаны в области, известной как область утолщения фолликула. С другой стороны фибробласты, имеющие удлиненную веретенообразную форму, присутствуют в волокнистых компонентах в дерме, которые преимущественно состоят из коллагена, но все еще не установлено, присутствуют или нет стволовые клетки в дермальных фибробластах. К тому же, несмотря на то, что известно, что в коже присутствуют кожные предшественники (SKP), которые дифференцируются в многочисленные линии клеток, такие как жировые клетки, клетки глии, хряща и мышцы (непатентный документ 4), взаимоотношение между дермальными фибробластами и SKP все еще не объяснено.
Мезенхимальные стволовые клетки, которые выделяют из костного мозга как предшественники фибробластов (непатентный документ 5), дифференцируются в целый ряд клеток мезенхимы (костные клетки, мышечные клетки, хондроциты, клетки сухожилий, адипоциты и т.д.), и, следовательно, их применение в регенеративной медицине для восстановления костей, кровеносных сосудов и мышц является многообещающим. Недавно было предположено, что они могут присутствовать в большом количестве в ткани, которая содержит мезенхимальную ткань, причем мезенхимальные стволовые клетки также были выделены из жира, пуповины и плаценты (непатентные документы 6-8).
Последние открытия показывают, что мезенхимальные стволовые клетки присутствуют в центральных кровеносных сосудах как перициты и функционируют для поддержания устойчивости (стабилизации) сосудов и тканевого гомеостаза (непатентные документы 9 и 10).
Когда кровеносные сосуды разрушаются в местах повреждения тканей или на периферии, мезенхимальные стволовые клетки или перициты отделяются от кровеносных сосудов и пролиферируют для восполнения потерянных клеток (непатентные документы 11-14), в то же время высвобождая биологически активные факторы для защиты ткани (непатентные документы 15-19) и осуществляя функции по восстановлению и обновлению (регенерации) поврежденной ткани. Сообщалось, что эти выделяемые факторы функционируют не только для обеспечения ангиогенеза и антиапоптоза, но также для того, чтобы значительно ингибировать иммунитет (непатентные документы 21 и 22), и подавить разрушение ткани, поврежденной Т или В-клетками (непатентные документы 9 и 22).
Кроме того, известно, что мезенхимальные стволовые клетки оказывают антифибринолитическое действие (непатентные документы 23 и 24) и действуют против рассеянного склероза и диабета (непатентный документ 9).
С другой стороны, становится ясно, что хроническое воспаление представляет собой основную патологию, общую для целого ряда состояний (например, метаболический синдром, артериосклеротическая болезнь, рак, нейродегенеративное заболевание и аутоиммунное заболевание) (непатентный документ 25). Например, сообщалось, что дисфункция эндотелиальных клеток и устойчивость к инсулину вызываются хроническим воспалением, приводя к различным болезням, таким как диабет или артериосклеротическая болезнь (непатентный документ 26). Более того, было обнаружено, что сама жировая ткань приводит к воспалительным изменениям (непатентные документы 27-29). Тот факт, что хроническое воспаление наблюдается поблизости от кровеносных сосудов, наводит на мысль, что хроническое воспаление также связано с недостаточным взаимодействием между мезенхимальными стволовыми клетками (перицитами) и кровеносными сосудами.
Исходя из этого предполагают, что стимуляция образования и стабилизация (обеспечение устойчивости) мезенхимальных стволовых клеток, может оказаться высоко эффективным для решения целого ряда задач, включая стабилизацию сосудов, поддержание тканевого гомеостаза, восстановление и регенерацию поврежденной ткани, предотвращение фиброза, предотвращение и лечение таких болезней, как рассеянный склероз и диабет, и предотвращение и облегчение состояний, связанных с хроническим воспалением, таких как метаболический синдром.
Изобретатели уже сообщали, что мезенхимальные стволовые клетки также присутствуют в дерме, и разработали способ эффективного выделения мезенхимальных стволовых клеток из дермы (Японская патентная заявка №2009-213291). Принимая во внимание описанную выше функцию мезенхимальных стволовых клеток, полагают, что стабилизация и стимулирование образования мезенхимальных стволовых клеток в дерме также является эффективным для улучшения состояния и регенерации кожи.
Кроме того, изобретатели локализовали области, в которых находятся мезенхимальные стволовые клетки в дерме и подкожно-жировой клетчатке, и обнаружили, что тромбоцитарный фактор роста ВВ (PDGF-BB) вовлечен в локализацию мезенхимальных стволовых клеток, в то же время было установлено, что стимуляция образования PDGF-BB в эндотелиальных клетках сосудов способствует повышенному продуцированию и стабилизации мезенхимальных стволовых клеток (Японская патентная заявка №2010-209705).
Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) является фактором роста, который связан с регуляцией миграции и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток, включая фибробласты, гладкомышечные клетки и клетки глии, и вырабатывается целым рядом клеток, например эпителиальными клетками и эндотелиальными клетками. Существует по меньшей мере 4 типа PDGF, PDGF-A, В, С и D; цепь А и цепь В образуют гомо- или гетеродимерные структуры путем образования дисульфидных связей, давая в результате 3 изоформы (PDGF-AA, АВ, ВВ). Известно, что PDGF оказывает свое физиологическое действие через PDGF-рецептор (PDGFR), тирозинкиназный рецептор. Ген PDGF-B известен и был генетически клонирован (непатентный документ 30).
Ожидается, что открытие компонента, эффективного для стимуляции образования PDGF-BB, будет полезным для стимуляции образования мезенхимальных стволовых клеток и стабилизации стволовых клеток и, таким образом, будет эффективным для целого ряда целей, как описано выше.
Перечень ссылок
Непатентная литература
[Непатентный документ 1] Watt FM, J Dermatol Sci, 28:173-10 180, 2002
[Непатентный документ 2] Cotsarelis G et al., Cell, 57:201-209, 1989
[Непатентный документ 3] Nishimwa EK et al., Nature, 416:854-860, 2002
[Непатентный документ 4] Wong CE al., J Cell Biol, 175:1005-1015, 2006
[Непатентный документ 5] Pittenger MF et al., Science, 284:143-147, 1999
[Непатентный документ 6] Park KW et al., Cell Metab, 208:454-457, 2008
[Непатентный документ 7] Flynn A et al., Cytotherapy, 9:717-726, 2007
[Непатентный документ 8] Igura К et al., Cytotherapy, 6:543-553, 2004
[Непатентный документ 9] da Silva Meirelles L et al., Stem Cells, 2008 Sep; 26 (9):2287-2299
[Непатентный документ 10] da Silva Meirelles L et al., J Cell Sci, 2006; 119:2204-2213
[Непатентный документ 11] Dai WD et al., Circulation, 2005; 112:214-223
[Непатентный документ 12] Fazel S et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2005; 130:1310-1318
[Непатентный документ 13] Noiseux N et al., Mol Ther, 2006; 14:840-850 35
[Непатентный документ 14] Zhao LR et al., Exp Neurol, 2002; 174:11-20
[Непатентный документ 15] Gnecchi M et al., Nat Med, 2005; 11:367-368
[Непатентный документ 16] Kinnaird Т et al., Circ Res, 2004; 94:678-685
[Непатентный документ 17] Kinnaird T et al., Circulation, 5 2004; 109:1543-1549
[Непатентный документ 18] Tang YL et al., Ann Thorac Surg, 2005; 80:229-237
[Непатентный документ 19] Zhang M et al., FASEB J, 2007; 21:3197-3207
[Непатентный документ 20] Le Blanc К et al., J Intern Med, 2007; 262:509-525
[Непатентный документ 21] Uccelli A et al.. Trends Immunol, 2007; 28:219-226
[Непатентный документ 22] Caplan Al et al., J Cell Biochem, 2006; 98:1076-1084
[Непатентный документ 23] Fang BJ et al., Transplantation,2004; 78:83-88
[Непатентный документ 24] Ortiz LA et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2003; 100:8407-841
[Непатентный документ 25] Ogawa, Y., Jikken Igaku, 28:1680-1687, 2010
[Непатентный документ 26] Medzhitov R, Nature, 454:428-35, 2008
[Непатентный документ 27] Hotamisligil GS, Nature, 25 444 (7121):860-7, 2006
[Непатентный документ 28] Wellen KE et al., J Clin Invest, 115 (5):1111-9, 2005
[Непатентный документ 29] Sugami, Т et al., Jikken Igaku, 28:1717-1723, 2010
[Непатентный документ 30] Dalla-Favera R et al., Nature, 292:31-35, 1981
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение выполнено на основе данных, описанных выше, а его целью является предоставление средства, эффективного для стимуляции образования PDGF-BB, а также предоставление средства, эффективного для стимуляции образования и/или стабилизации мезенхимальных стволовых клеток путем его использования.
Настоящие изобретатели провели большое исследование на целом ряде материалов и в результате скрининга средств, способствующих продуцированию PDGF-BB, осуществили данное изобретение на основании обнаружения того, что растительные производные брусники, мангустана и корня шлемника, а также инозитол и инозитолфосфат оказывают значительное влияние на продуцирование PDGF-BB.
Настоящая заявка, таким образом, содержит следующие изобретения.
[1] Средство для стимуляции продуцирования тромбоцитарного фактора роста ВВ (PDGF-BB), содержащий один или более компонентов, выбранных из числа производных брусники, производных мангустана, производных корня шлемника, инозитола и инозитолфосфата в качестве активного ингредиента.
[2] Средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB по п.[1], который содержит инозитол и дополнительно содержит дрожжевой экстракт.
[3] Средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB по п.[1] или [2], в котором инозитол представляет собой инозитолфосфат, полученный из рисовых отрубей.
[4] Средство для активации продуцирования мезенхимальных стволовых клеток, содержащий средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB по любому из пп.[1]-[3].
[5] Средство для стабилизации стволовых клеток, содержащий средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB по любому из пп.[1]-[3].
[6] Средство для регенерации кожи, содержащее средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB по любому из пп.[1]-[3].
Осуществление изобретения
Согласно изобретению предоставляется средство, эффективное для стимуляции образования PDGF-BB, а также средство, эффективное для стимуляции образования и стабилизации мезенхимальных стволовых клеток, которое использует вышеупомянутое средство.
Лучший вариант осуществления изобретения
Производные брусники
Брусника (научное название Vaccinium vitis-idaea L.) представляет собой растение семейства Ericaceae, рода Vaccinium. Согласно изобретению производные брусники могут быть цветками брусники, цветущими spikes, семенными коробочками, кожурой (шелухой), плодами, стеблями, листьями, ветвями, боковыми листьями, черенками, корой, корневищами, корой корней, корнями, семенами или целым растением, которое измельчается и спрессовывается или экстрагируется с помощью растворителя после измельчения или разлагается после измельчения посредством обработки, например ферментативной обработки или механической обработки.
Раствором для экстракции брусники может быть любой желательный раствор, например, можно использовать воду или органические растворители, включая спирты, такие как метанол, этанол, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль или глицерин, водосодержащие спирты, хлороформ, дихлорэтан, четыреххлористый углерод, ацетон, этилацетат и тому подобное или отдельно или в комбинациях.
Экстракцию можно провести при обычной температуре или при нагревании (например, используя подогретый растворитель, например теплую воду или горячую воду).
Можно непосредственно использовать экстракт, полученный при экстракции растворителем, или можно использовать концентрированный экстракт, или экстракт можно очистить от примесей путем адсорбции с использованием ионообменной смолы или тому подобного, или можно провести адсорбцию на колонке с пористым полимером (например, AMBERLITE XAD-2) и затем элюировать метанолом или этанолом и концентрировать. Также можно использовать экстракт, полученный известным методом разделения (например, метод разделения с использованием воды/этилацетата).
После того как брусника разлагается, может быть получен "одноклеточный препарат", в котором межклеточные вещества являются избирательно расщепленными с сохранением клеточных форм. Например, можно упомянуть способ, описанный в Японской нерассмотренной патентной публикации №2002-193734. Более точно, при такой обработке растение подвергается ферментативному разложению (энзимолизу), механическому разрушению или тому подобному ради избирательного расщепления или разрушения межклеточных веществ, при этом в сущности без разложения клеточных стенок, для растворения (разложения) вещества внутри клеточных единиц, имеющих сохраненные клеточные формы, и получения пастообразной формы, жидкой композиции или сублимированного продукта. Для завершения избирательного расщепления можно использовать ферментативную обработку. Например, можно использовать продукты, которые выделены или выделены и очищены с помощью общеизвестных методов из ферментных материалов, таких как Rhizopus или Aspergillus, или можно использовать коммерческие продукты. В тех случаях, когда такие ферменты одноклеточных препаратов используются для брусники, предпочтительно, что они дают возможность ферменту действовать при оптимальных условиях, таких как оптимальная температура и оптимальное значение рН для фермента в минимально необходимых количествах. Оптимальная температура для фермента одноклеточного препарата составляет 30-45°С, а оптимальное значение рН составляет 4-6. Для получения производного брусники, которое можно добавить к композиции для наружного применения, оставшуюся после ферментативной реакции часть можно удалить, используя сито приблизительно от 20 до 30 меш.
Кроме того, в дополнение к суспензии одноклеточного препарата, суспензия может быть приготовлена в виде одноклеточной пасты (моноклеточной пасты) или ее высушенной формы, полученной путем дегидратации с помощью разделения центрифугированием, для применения согласно изобретению.
Раньше бруснику использовали как наружный препарат, содержащий одноклеточный препарат брусники (Японская нерассмотренная патентная публикация №2002-193734), в качестве бактерицидного, антибактериального косметического средства или косметического средства против перхоти (Японская нерассмотренная патентная публикация SHO №61-238719), в качестве ингибитора активности эластазы (Японская нерассмотренная патентная публикация №2002-363088), в качестве средства для удаления активного фермента (Японская нерассмотренная патентная публикация №2002-363027), в качестве ингибитора продуцирования меланина (Японская нерассмотренная патентная публикация №2002-363057), в качестве ингибитора продуцирования липидного пероксида (Японская нерассмотренная патентная публикация №2002-363089), в качестве ингибитора активности коллагеназы (Японская нерассмотренная патентная публикация №2003-12531), в качестве ингибитора активности гиалуронидазы (Японская нерассмотренная патентная публикация №2003-73287), в качестве ингибитора экспрессии металлопротеазы (Японская нерассмотренная патентная публикация №2002-193738), в качестве ингибитора гликозилирования (гликирования) (Японский патент с открытым доступом №2004-505007) и как средство, регулирующее повреждение кожи, при кожных нарушениях, таких как пахидермия и склеродермия (Японская нерассмотренная патентная публикация №2005-306850); однако до сих пор было совершенно неизвестно, что производные брусники обладают действием, способствующим продуцированию PDGF-ВВ, обладают действием, способствующим продуцированию мезенхимальных стволовых клеток, действием, стабилизирующим стволовые клетки, и стабилизирующими эффектами на дерму, причем эти эффекты были обнаружены впервые настоящими изобретателями.
Производные мангустана
Мангустан (научное название Garcinia mangostand) представляет собой растение семейства Otogiriso, рода Garcinia. Согласно изобретению производное мангустана может быть семенными коробочками, шелухой, плодами, стеблями, листвой, ветвями, боковыми листьями, стеблями, корой, корневищами, корой корней, корнями, семенами или целым растением мангустана, которое измельчается и спрессовывается или экстрагируется с помощью растворителя после измельчения.
Когда необходимо провести экстракцию, в качестве растворителя для экстракции можно использовать любой растворитель, дающий возможность проведения экстракции, например, экстракцию можно осуществить с помощью любого из многих органических растворителей, включая низшие спирты, такие как метанол, этанол, пропиловый спирт, изопропиловый спирт, бутанол или изобутанол, или водные низшие спирты, многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль или 1,3-бутиленгликоль или водосодержащие многоатомные спирты, ацетон, этилацетат или этиловый эфир уксусной кислоты и тому подобное, причем впоследствии растворитель отгоняется.
Экстракцию можно провести при обычной температуре или с нагреванием (например, используя подогретый растворитель, например теплую воду или горячую воду).
Для обработки экстракта к растворителю также можно добавить фермент. Добавление фермента может разрушить клеточную ткань плода и дополнительно увеличить эффективность экстракции. Используемый фермент предпочтительно является ферментом, разрушающим клеточные ткани. Примеры таких ферментов включают пектиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы, α-амилазы и фитазы. Любой из этих ферментов можно использовать по отдельности или два или более из них можно использовать в комбинации.
Экстракт, полученный с использованием растворителя, можно использовать непосредственно, или растворитель для экстракции можно отогнать, а экстракт использовать после высушивания, по необходимости.
Мангустан в прошлом использовали как поглотитель ультрафиолетовых лучей (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №9-87155), как ингибитор ММР (Японская нерассмотренная патентная публикация №2003-252745) и как средство для активации фибробластов (Японская нерассмотренная патентная публикация №2006-249051), причем было известно, что он влияет на продуцирование производных ксантона и продуцирование коллагена (Японская нерассмотренная патентная публикация №2009-84169); однако до сих пор было совершенно неизвестно, что производные мангустана обладают действием, способствующим продуцированию PDGF-BB, действием, способствующим продуцированию мезенхимальных стволовых клеток, действием, стабилизирующим стволовые клетки, и стабилизирующим действием на дерму, причем эти эффекты были обнаружены впервые настоящими изобретателями.
Производные корня шлемника
Шлемник (научное название Scutellaria baicalensis Georgi, Labiatae) представляет собой растение семейства Lamiaceae, род Scutellaria. Согласно изобретению производным (корня) шлемника может быть семенная коробочка, шелуха, плод, стебель, листва, ветвь, боковые листья, черенок, корневище, кора корня, корень, семя или целое растение шлемника, которое измельчается и спрессовывается или экстрагируется с помощью растворителя после измельчения.
Для проведения экстракции корня шлемника растворителем для экстракции может быть любой желательный растворитель, который обычно используется для экстракции растений, примеры включают воду, низшие спирты, такие как метанол, этанол, изопропанол и н-бутанол, многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль и 1,3-бутиленгликоль или водные формы этих спиртов и растворители на углеводородной основе, такие как н-гексан и толуол. Они могут использоваться отдельно или любые два или более из них могут использоваться в комбинации. Предпочтительно используются низшие спирты, такие как метанол или этанол.
Экстракцию можно провести при обычной температуре или с нагреванием (например, используя подогретый растворитель, такой как теплая вода или горячая вода).
Для обработки экстракта к растворителю также можно добавить фермент. Добавление фермента может разрушить клеточную ткань плода и дополнительно увеличить эффективность экстракции. Используемый фермент предпочтительно является ферментом, разрушающим клеточные ткани. Примеры таких ферментов включают пектиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы, α-амилазы и фитазы. Любой из этих ферментов можно использовать по отдельности или два или более из них можно использовать в комбинации.
Экстракт, полученный с использованием растворителя, можно использовать непосредственно, или растворитель для экстракции можно отогнать, а экстракт использовать после высушивания, по необходимости.
Корень шлемника использовали в прошлом как средство, активирующее волосяные сосочки (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №11-240823), как средство, усиливающее продуцирование гиалуроновой кислоты (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №10-95735), как средство для иммуностимуляции для предотвращения потери иммунологической функции кожи, вызванной ультрафиолетом (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №11-71295), как противовоспалительное средство (Японская нерассмотренная патентная публикация №2006-8536) и как антиоксидант (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №5-238925); однако, до сих пор было совершенно неизвестно, что производные (корня) шлемника обладают действием, способствующим продуцированию PDGF-BB, действием, способствующим продуцированию мезенхимальных стволовых клеток, действием, стабилизирующим стволовые клетки, и стабилизирующим действием на дерму, причем эти эффекты были обнаружены впервые настоящими изобретателями.
Инозитол/Инозитолфосфат
Считается, что инозитол является формой витамина В, а также известно, что в организме он биосинтезируется из глюкозы. Инозитол обнаружен в растениях, например зерновых, фасоли, бобах и фруктах. Инозитол часто находится в форме с фосфорилированными гидроксигруппами (инозитолфосфат). Согласно изобретению также можно использовать инозитолфосфат. Различные стереоизомеры инозитола также включаются в инозитол, использованный для изобретения. Стереоизомеры инозитола включают цис-инозитол (1,2,3,4,5,6/0-инозитол), эпи-инозитол (1,2,3,4,5/6-инозитол), алло-инозитол (1,2,3,4/5,6-инозитол), мио-инозитол (1,2,3,5/4,6-инозитол), муко-инозитол (1,2,4,5/3,6-инозитол), нео-инозитол (1,2,3/4,5,6-инозитол), хиро-инозитол (1,2,4/3,5,6-инозитол) и сцилло-инозитол (1,3,5/2,4,6-инозитол). Инозитолфосфат может быть соединением, у которого любая одна или более из 6 гидроксигрупп инозитола являются фосфорилированными. Предпочтительной является фитиновая кислота, которая представляет собой соединение, у которого все 6 гидроксигрупп инозитола фосфорилированы. Предпочтительно, использованный в изобретении инозитол или инозитолфосфат, получают из рисовых отрубей. Любые соли инозитолфосфата также можно использовать в изобретении.
Согласно варианту осуществления изобретения инозитол и инозитолфосфат могут использоваться как соответствующие растворы, полученные путем растворения простого порошка в среде.
R
Инозитол и инозитолфосфат также можно объединить с другими веществами, чтобы улучшить действие, способствующее продуцированию PDGF-BB. Подобные вещества могут быть дрожжевыми экстрактами, такими как Biodyne EMPP (продукт компании Arch Personal Care Products L.P.). При использовании таких экстрактов, экстракт добавляют к среде в количестве около 0,1%, из расчета концентрации от сухого остатка экстракта.
Инозитол и инозитолфосфат раньше использовали как инозитол-содержащие косметические композиции для зрелой кожи и/или для кожи, подвергнутой разрушительному действию стресса (Японский патент с открытым доступом №204-501069), как косметические композиции, содержащие инозитолфосфат (главным образом фитиновую кислоту и ее соли), для уменьшения или предотвращения признаков жирового отека (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №8-253406) и как композиции для сохранения влажности кожи и/или защиты кожи и/или предотвращения старения кожи (Японская нерассмотренная патентная публикация №2010-150258). Примеры включают наружные препараты для кожи, активизирующие клетки и содержащие витамины В2 и В6 (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №9-241146), и антиоксиданты, содержащие витамин В (Японская нерассмотренная патентная публикация HEI №7-277939 и Японская нерассмотренная патентная публикация №205306831). Однако было полностью неизвестно, что витамины В и инозитол или инозитолфосфат обладают действием, способствующим продуцированию PDGF-BB, действием, способствующим продуцированию мезенхимальных стволовых клеток, действием, стабилизирующим стволовые клетки, и стабилизирующим действием на дерму, причем эти эффекты были обнаружены впервые настоящими изобретателями.
Средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB, средство для активации продуцирования мезенхимальных стволовых клеток, средство для стабилизации стволовых клеток и средство для регенерации кожи.
Средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB изобретения содержит один или более компонентов, выбранных из числа производных брусники, производных мангустана, производных корня шлемника, инозитола и инозитолфосфата, в качестве активного ингредиента. Средство для активации продуцирования мезенхимальных стволовых клеток, средство для стабилизации стволовых клеток и средство для регенерации кожи изобретения содержит средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB изобретения, который включает активный ингредиент, как описано выше. Средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB, средство для активации продуцирования мезенхимальных стволовых клеток, средство для стабилизации стволовых клеток и средство для регенерации кожи изобретения (ниже они будут вместе называться "средства изобретения") может содержать любой из вышеупомянутых активных ингредиентов отдельно или два или более из них в любой желательной комбинации или пропорции.
Исходя из знаний настоящих изобретателей, как упоминалось выше, PDGF-BB участвует в местонахождении мезенхимальных стволовых клеток и оказывает содействие продуцированию PDGF-BB эндотелиальными клетками сосудов, тем самым оказывая содействие продуцированию и стабилизации мезенхимальных стволовых клеток (Японская патентная публикация №заявка 2010-209705). То есть средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB изобретения может весьма эффективно использоваться для стимуляции образования и стабилизации мезенхимальных стволовых клеток.
Кроме того, как уже отмечалось, известно, что стимуляция образования и стабилизация мезенхимальных стволовых клеток являются высоко эффективными для стабилизации сосудов, сохранения тканевого гомеостаза, восстановления и регенерации поврежденной ткани (в частности, средство для регенерации кожи), предотвращения фиброза, предотвращения и лечения таких болезней, как рассеянный склероз и диабет, и предотвращения и облегчения состояний, связанных с хроническим воспалением, таких как метаболический синдром. Таким образом, средство для активации продуцирования мезенхимальных стволовых клеток и средство для стабилизации стволовых клеток изобретения, использующий (содержащий) средство для стимуляции продуцирования PDGF-BB изобретения, может очень эффективно служить для подобных целей.
Средства изобретения могут быть приготовлены как композиции, содержащие вышеупомянутый активный ингредиент в комбинации с одним или более другими компонентами, такими как эксципиенты (вспомогательные вещества), носители и/или разбавители.
Состав и форма композиции могут быть выбраны в зависимости от назначения и использованного активного ингредиента. Композиция может быть приготовлена стандартными способами в комбинации с эксципиентом, носителем и/или разбавителем или другими компонентами в зависимости от лекарственной формы.
Средства изобретения могут быть смешаны с различными пищевыми продуктами и напитками или кормами (кормом для домашних животных или т.п.) для потребления человеком или животным. Их также можно соединить в косметических средствах или тому подобном для людей и животных или вводить как медицинские препараты для людей или животных.
В частности, когда средство изобретения добавляется к пищевому продукту или напитку или корму, содержание (сухой вес) растения или его экстракта должным образом определяется в соответствии с типом растения, целью, формой и способом применения. Например, содержание может быть таким, что потребление растения или его экстракта в день для взрослых составляет 0,5 мг - 1 г (сухой остаток) экстракта индийского крыжовника (эмблики лекарственной) или около 0,5 мг - 3 г экстракта брусники. В частности, когда средство используется в качестве лечебного питания или напитка, его предпочтительно добавляют в количестве до 10 мг - 500 мг (сухой остаток) к экстракту индийского крыжовника или 10 мг - 1,5 г (сухой остаток) к экстракту брусники в день для взрослых, так, чтобы желательный эффект активного ингредиента изобретения достаточно проявлялся.
Форма пищевого продукта, или напитка, или корма может быть любой, например, их можно изготовить в виде гранул, частиц или в виде пастообразной, гелеобразной, твердой или жидкой формы. Изготовленные формы могут быть объединены с различными известными веществами, разрешенными для добавления к продуктам питания и напиткам, включая эксципиенты, такие как связующие вещества, дезинтеграторы, загустители, диспергирующие вещества, ускорители реабсорбции (всасывания), средства, изменяющие вкус, буферные вещества, поверхностно-активные вещества, растворяющие средства, консерванты, эмульгаторы, изотонирующие вещества, средства для стабилизации и регуляторы рН.
В случаях когда средство изобретения добавляется к косметическому препарату, содержание (сухая масса) растения или его экстракта может быть приблизительно определено в соответствии с типом растения, целью, формой и способом применения. Например, экстракт индийского крыжовника или экстракт брусники может быть добавлен из расчета 0,00001%-50% (исходя из сухого веса) и более предпочтительно 0,0001%-5% (исходя из сухого веса) всего косметического препарата.
В дополнение к вышеупомянутым компонентам при необходимости могут быть добавлены компоненты, которые обычно используются в наружных препаратах для кожи, таких как косметические препараты или фармацевтические препараты, включая антиоксиданты, масла, средства, защищающие от ультрафиолета, поверхностно-активные вещества, загустители, спирты, порошкообразные компоненты, красящие вещества, водосодержащие компоненты, вода и питательные вещества для кожи, в пределах, которые не мешают эффекту изобретения.
Кроме того, также могут быть добавлены соответствующие количества хелаторов ионов металлов, такие как динатрия эдетат, тринатрия эдетат, цитрат натрия, полифосфат натрия, метафосфат натрия и глюконовая кислота, антисептические средства, такие как метилпарабен, этилпарабен и бутилпарабен, лекарственные средства, включая кофеин, танин, верапамил, транексамовую кислоту и ее производные, экстракт из корня солодки, глабридин, горячая вытяжка плода китайской айвы, галеновые препараты, токоферола ацетат, глицирризиновая кислота и ее производные и соли, кожные отбеливатели, такие как витамин С, магний аскорбат фосфат, гликозид аскорбат, арбутин и койевая кислота, и сахариды, такие как глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза и трегалоза.
Эти наружные препараты для кожи могут широко использоваться в косметических средствах, лечебно-профилактической косметике и тому подобном, что наружно применяется на коже, и наиболее предпочтительно в косметических средствах. Лекарственная форма может быть любой, которая может применяться на коже, такой как раствор, солюбилизированная форма, эмульсия, дисперсия порошка, двойной слой вода-масло, тройной слой вода-масло-порошок, мазь, косметическая вода, гель, аэрозоль или тому подобное.
В случаях когда средство изобретения должно использоваться как косметическое средство, оно предпочтительно используется в форме косметической воды, латекса, крема-основы, губной помады, крема для губ, очищающего крема, массажного крема, маски, крема для рук, порошка для рук, шампуня для тела, лосьона для тела, крема для тела, косметического средства для ванны или тому подобного, в этом случае компоненты, обычно добавляемые и включаемые в состав с подобными формами, могут быть включены в случае необходимости, включая такие компоненты, как увлажняющие вещества, ароматические вещества, солюбилизирующие средства, стабилизирующие средства, поглотители ультрафиолетовых лучей, средства, рассеивающие ультрафиолет, и тому подобное.
В тех случаях, когда средство изобретения используется как наружный препарат, содержимое (сухая масса) растения или его экстракта может быть уместно определено в соответствии с типом растения, целью, формой и способом применения. Например, в косметике оно предпочтительно используется при содержании 0,00001%-50% (исходя из сухой массы), а в продукте питания или напитке предпочтительно при содержании 0,0001%-5% (исходя из сухой массы).
В тех случаях, когда средство изобретения используется как лечебно-профилактическое средство, композицию можно использовать в подходящей или пероральной или парентеральной форме (для внутривенного введения, внутрибрюшинного введения и тому подобного). Лекарственная форма может быть выбрана по желанию и может быть соответствующим образом приготовлена известными методами для любой формы, включая пероральные твердые композиции, такие как таблетки, гранулы, порошки или капсулы, пероральные жидкие композиции, такие как внутренние жидкие лекарственные средства или сиропы, или парентеральные жидкие композиции, такие как инъекции. Такие медицинские препараты могут соответственно содержать обычно используемые эксципиенты, такие как связующие вещества, дезинтеграторы, загустители, диспергирующие вещества, средства для активации реабсорбции, средства, исправляющие вкус, буферные вещества, поверхностно-активные вещества, растворяющие средства, консервирующие вещества, эмульгаторы, изотонирующие вещества, средства для стабилизации и регуляторы рН.
В большинстве случаев наружный препарат может использоваться в такой форме, как мазь, и предпочтительно он используется в форме лосьона, суспендирующего агента, эмульсии, жидкого лекарственного препарата, мази или медицинского пластыря. Формы, которые могут использоваться для средства изобретения, не ограничиваются этими лекарственными формами.
Уровень экспрессии гена PDGF-BB в мезенхимальных стволовых клетках после введения средства изобретения может быть определен и оценен, например, при помощи измерения уровня PDGF-BB. Предпочтительно, измерение проводится известным в данной области способом с использованием антител, специфических к PDGF-BB, и, например, измерение можно провести посредством метода иммуноокрашивания, используя флуоресцентное вещество, краситель, фермент и тому подобное, или с помощью вестерн-блоттинга или иммунологическим методом, таким как ELISA или RIA. Также для исследования и оценки можно экстрагировать общую РНК в мезенхимальных стволовых клетках и измерить количество мРНК, кодирующей PDGF-B. Методы экстракции и измерения мРНК хорошо известны в данной области так, например, РНК количественно оценивают с помощью количественной полимеразной цепной реакции (PCR), такой как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR). Выбор праймера, подходящего для RT-PCR, можно осуществить с помощью метода, известного специалистам в данной области техники.
Примеры
Настоящее изобретение теперь будет проиллюстрировано более подробно с помощью примеров. Однако изобретение ни в коей мере не ограничивается примерами.
Примеры оценки
В качестве образцов для определения стимуляции продуцирования, способствующего выработке PDGF-BB, использовали:
Инозитол:
Коммерчески доступный порошкообразный инозитол (мио-инозитол, продукт компании Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) растворили в PBS и затем использовали в количестве 10 ppm в среде, описанной ниже.
Фитиновая кислота:
Коммерчески доступная фитиновая кислота (50% водный раствор, продукт компании Nacalai Tesque, Inc.) использовали в количестве 10 ppm в среде, описанной ниже.
Экстракт корня шлемника
Корни шлемника с удаленной кожицей экстрагировали этанолом 70 об.% (смесь воды и этанола в объемном отношении 3:7) и использовали экстракт. Экстракт высушили и хранили и непосредственно перед использованием добавляли 70 об.% этанол в количестве 15 ppm для растворения в среде, описанной ниже (исходя из сухого веса экстракта).
Брусника CRS (система отделения клеток):
Использованная суспензия содержала 1,3-BG, добавленный в количестве 40 об.% к клеточной суспензии, полученной путем обработки листьев брусники цитолитическим ферментом (мацерозим А). Суспензию хранили в виде жидкости и использовали в количестве 30 ppm в среде, описанной ниже (исходя из сухого веса экстракта).
Экстракт коры мангустана:
Кору мангустана экстрагировали 70 об.% 1,3-BG (смесь воды и 1,3-BG в объемном соотношении 3:7) и использовали полученный экстракт. Экстракт высушили и хранили и непосредственно перед использованием добавляли 70 об.% 1,3-BG для растворения в количестве 10 ppm в среде, описанной ниже (исходя из сухого веса экстракта).
Оценка действия, способствующего продуцированию PDGF-BB, на эндотелиальных клетках сосудов.
2
Эндотелиальные клетки сосудов человека HUVEC пересевали в среде EGM-2 (Sanko Junyaku Co., Ltd.), клетки четвертого пассажа суспендировали в среде Humedia-EG2 без VEGF-A (Kurabo Industries, Ltd.) и высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты (Asahi 5 Glass Co., Ltd.) в количестве клеток 20000 и культивировали при 37°С в присутствии 5% CO в течение 3-5 дней до тех пор, пока клетки не сливались. Затем среду заменили на среду Humedia-EG2 (Kurabo Industries, Ltd.), содержащую образец, добавленный в установленной концентрации, или растворитель, добавленный для растворения каждого образца, и продолжали культивирование в течение 2 дней. мРНК экстрагировали и очистили от культивируемых клеток, используя реактив для экстракции РНК из набора MagNA Pure LC mRNA HS kit (Roche) и автоматический аппарат для экстрагирования нуклеиновых кислот MagNA Pure LC 1.0 Instrument (Roche), в соответствии с протоколом производителя. Для каждого образца в качестве матрицы использовали одинаковый объем мРНК для одностадийного количественного анализа в реальном времени (RT)-PCR гена PDGF-B, используя пары праймеров SEQ ID NO: 1 и 2, перечисленные ниже, набор реактивов QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen) и реактор LightCycler (Roche). Условия реакции были согласно протоколу Qiagen. Условия RT-PCR были следующие RT реакция при 50°С в течение 20 минут, начальная денатурация при 95°С в течение 15 минут, денатурация при 94°С в течение 15 секунд, отжиг при 60°С в течение 20 секунд и удлинение при 72°С в течение 30 секунд. В качестве внутреннего стандарта использовали G3PDH (пара праймеров SEQ ID NO:3 и 4), а уровень мРНК калибровали относительно контроля.
PDGF-B:
Прямой праймер: 5'-CCTGGCATGCAAGTGTGA-3' (SEQ ID NO:1)
Обратный праймер: 5'-CCAATGGTCACCCGATTT-3' (SEQ ID NO:2) G3PDH:
Прямой праймер: 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' (SEQ ID NO:3)
Обратный праймер: 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3' (SEQ ID NO:4)
Оценка результатов
Уровни экспрессии PDGF-BB мРНК для каждого образца показаны в следующей таблице по сравнению с уровнями экспрессии контролей (растворитель, в котором растворялся каждый оцениваемый образец), которые получены с помощью метода оценки, описанного выше. Следующие результаты показывают, что компоненты обладают активностью, способствующей экспрессии PDGF-BB.
Таблица 1
Название средства
Концентрация (отношение к среде)
Экспрессия PDGF-BB (против контроля)
Инозитол
10 ppm
1,37
Фитиновая кислота
10 ppm
1,20
Экстракт корня шлемника
15 ppm
1,56
Брусника CRS
30 ppm
1,85
Экстракт коры мангустана
10 ppm
1,31