Эффективность образования и регенерации протопластов клеток штаммов дикого типа Bacillus thuringiensis

культивирования и не отличался особой интенсивностью. Различие между штаммами наблюдали только по максимальной концентрации жизнеспособных клеток, достигаемой в стационарную фазу в используемом объеме среды. Для штаммов 49 и 2002 она составила 3,6 х 108 кл/мл и 0,7 х 108 кл/мл, соответственно. Для клонов штамма 1003 конечная концентрация клеток была на порядок выше — 1,7 х 109 кл/мл, что может быть обусловлено большей устойчивостью клеток данного штамма к увеличению плотности популяции и присутствию в среде продуктов метаболизма.

В период логарифмического роста доля R-вариантов в культурах трех штаммов колебалась без видимой закономерности и составляла в среднем для штамма 49 — 0,3 %, для штамма 2002 — 2,7 %, а для штамма 1003 — 4,6 %. Однако, начиная с 48 часов культивирования (поздняя стационарная фаза), наблюдали существенное увеличение доли морфологических вариантов в культурах всех исследуемых штаммов. К 72 часам культивирования доля R-вариантов у S-клонов штамма 49 возрастала в среднем до 16,1 %, у штамма 2002 — до 25,7 %, а у штамма 1003 — до 54 %. Частота возникновения R-вариантов, оцененная по частоте их встречаемости после известного числа генераций, колебалась у клонов штамма 49 в пределах 1,2 х 10-4 — 3,4 х 10-4, у клонов штамма 2002 — 0,8 х 10-3 — 1,2 х 10-4, а для клонов штамма 1003 составила 5,1 х 10-3 на одно клеточное деление, что сравнимо с частотами диссоциации по другим признакам разных видов микроорганизмов.

Анализ параметров роста R-вариантов исследуемых штаммов в аналогичных условиях периодической культуры выявил отсутствие достоверных отличий с S-вариантами, что исключало селективное преимущество R — вариантов в условиях стационарной фазы. Так, время генерации в логарифмическую фазу роста для R-вариантов штамма 49 колебалось от 0,72 до 0,8 ч, штамма 2002 — 0,75 — 0,83 ч, штамма 1003 — 0,8 ч. Через 24 часа культивирования различий в максимальной для данного объема среды концентрации клеток у S- и R-вариантов штаммов 49 и 2002 не наблюдали, а для штамма 1003 R-варианты достигали концентрации 8,3 х 108 кл/мл, что было на порядок ниже, чем у S-вариантов.

В отличие от индукции R-вариантов у S-клонов в стационарную фазу роста увеличения частоты появления S-вариантов в процессе культивировании R-клонов не происходило. Частота их встречаемости у трех штаммов и разных клонов одного и того же штамма была различна. У всех R-клонов штамма 1003 были обнаружены S-варианты, их доля в культуре незначительно варьировала в процессе роста и в среднем составила 3,3%. Аналогично для штамма 2002 доля S-вариантов в среднем равнялась 1,06 % и также колебалась без видимой закономерности. Среди 3462 проанализированных колоний R-клонов штамма 49 в исследуемый период было встречено 17 S-вариантов, что составило 0,49 %. Частота R^-S перехода, определенная флуктуационным тестом для штамма 49 составила 5,4 х 10-4 на клетку на генерацию, для штамма 2002 — 0,8 — 7,3 х 10-3, для штамма 1003 — 1,3 — 10—3 на одно клеточное поколение. Полученные данные могут косвенно свидетельствовать о различии механизмов, лежащих в основе S^-R и R^-S диссоциации.

Как видно из приведенных данных, процесс S^-R диссоциации характеризуется общей для трех штаммов разных подвидов ВТ закономерностью и индуцируется в позднюю стационарную фазу роста культур. Результатом процесса, как отмечалось и другими исследователями, является наследуемое нарушение споро- и кристаллообразования у некоторой доли клеток. При обратном R^S переходе общим является более низкая частота и разнообразие по способности к восстановлению S-морфологии.

Установленные закономерности позволяют нам предполагать наличие такого же процесса у представителей вида Bacillus anthracis и рекомендовать использовать его для получения у данного вида стабильных аспорогенных форм в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов с целью изготовления диагностических препаратов.

Л.В. Маланушенко, В.И. Немерилова

эффективность образования и регенерации протопластов клеток штаммов дикого типа bacillus thuringiensis

ГОУ ВПО Иркутский государственный университет

Метод искусственного получения протопластов бактерий и их слияния эффективно используется для достижения различных целей: получения внутри- и межвидовых гибридов, изучения генетического взаимодействия полноценных геномов, установления сцепления и экспрессии генов и их картирования, трансформации плазмидной и хромосомной ДНК, клонирования генов, селекции промышленных штаммов. С появлением метода слияния протопластов начаты генетические исследования некоторых важных в практическом отношении микроорганизмов, не имеющих хорошо развитой системы генетического обмена, к которым можно отнести энтомопатогенный вид B. thuringiensis и других представителей группы Bacillus cereus. В ранее проведенных немногочисленных исследованиях на этих объектах было выявлено,

что эффективность формирования протопластов и регенерации их в бациллярную форму зависит от условий, а также от изучаемого штамма.

Целью данной работы явилось определение оптимального времени обработки лизоцимом клеток штаммов двух подвидов Bacillus thuringiensis для получения максимального количества протопластов и их эффективного восстановления на регенерационной среде.

В исследовании использовали штаммы B. thuringiensis: 49 ssp. dendrolimusи 2002 ssp. thuringiensis, полученные нами из коллекции Музея микробиологии Иркутского государственного университета. Клетки культуры, находящейся в логарифмической стадии роста, осаждали центрифугированием (5000 об./мин; 15 мин) и ресуспензировали в среде для протопластирования на основе фосфатного буфера с 7 % сахарозы. Добавляли лизоцим (2 мг/мл, Sigma, USA) и выдерживали при 37 °С. Эффективность протопластирования и регенерации протопластов определяли через 30, 45, 60, 75, 90, 105 мин как разность числа КОЕ/мл, образованных в обычных и гипертонических условиях, после разведения и высева на соответствующие плотные среды. Было проведено по 4 повторности эксперимента для каждого штамма.

В результате проведенного исследования было установлено, что эффективность протопластирования исследованных штаммов уже через 30 мин обработки лизоцимом превышала 80 % для клеток штамма 49 и 90 % — для штамма 2002. Далее она немного повышалась, а после 60 мин оставалась на одном уровне и составила 88,8 ± 0,33 для штамма 49 и 97,6 ± 0,87 для штамма 2002, не снижаясь и не достигая 100 % к концу наблюдения. Способность к регенерации в бациллярную форму была ниже, чем способность к образованию протопластов, и максимально достигала 70 % у штамма 49 и 90 % — у штамма 2002. В динамике эффективности регенерации наблюдали перелом в период от 60 до 75 мин экспозиции. До 60 мин экспозиции доля регенерировавших клеток не превышала 50 % у обоих штаммов. В период 60 — 75 мин она достигала максимума и колебалась от 65,1 % до 81,7 % для штамма 49 и 72,6 % до 97,4 % для штамма 2002 в разных экспериментах. При экспозиции 90 мин эффективность регенерации протопластов обоих штаммов резко снижалась и составляла всего 15 — 20 % как у штамма 49, так и у штамма 2002 и сохранялась на этом уровне в течение последних 15 мин экспозиции. Исходя из этого, экспозицию в лизоциме клеток исследованных штаммов в течение 60 — 75 мин можно считать наилучшей для получения протопластов. Лимитирующим фактором в выборе времени экспозиции является время, обеспечивающее наилучшие условия для регенерации клеточной стенки. Принадлежность к штамму сказывается только на доле формируемых и восстанавливающих клеточную стенку протопластов. Как видно из результатов, клетки штамма 49 более устойчивы к действию лизоцима, а протопласты обладают меньшей способностью к восстановлению клеточной стенки по сравнению со штаммом 2002.

В заключение следует отметить, что клетки двух исследованных штаммов, принадлежащих к подвидам dendrolimus и thuringiensis, имеют сходный характер в динамике формирования протопластов в присутствии лизоцима и их регенерации в исходную форму. Можно полагать, что существуют общие закономерности данных процессов у всех представителей группы Bacillus cereus, так как полученные нами результаты согласуются с данными по образованию протопластов и их регенерации у штаммов, принадлежащих к подвиду galleriae в иных условиях культивирования.

Б.А. Мамонтова, Е.Н. Тарасова, А.А. Мамонтов

использование биоиндикаторов в эколого-гигиенической оценке загрязнения территорий полихлорированными бифенилами

Институт геохимии им. А.П. Виноградова СО РАН

Для полихлорированных бифенилов (ПХБ), как и для всех стойких органических загрязнителей (СОЗ), характерны высокая устойчивость в окружающей среде, перенос на большие расстояния от места их производства или использования и неблагоприятное воздействие на здоровье живых организмов, в том числе человека. В группу ПХБ входят 209 конгенеров с разной степенью токсичности для человека и животных и распространенностью в окружающей среде. ПХБ производились и использовались в электротехнической промышленности в разных странах под названиями совол и трихлорбифенил (ТХБ) (СССР), арохлор (США), фенохлор (Франция), фенхлор (Италия) и др. Общее количество ПХБ, произведенного в мире, оценивается в 1,3 — 1,5 млн т, в том числе в бывшем СССР около 180 000 т ПХБ (AMAP, 2000). Во многих странах в 1970-х годах производство и применение ПХБ было ограничено и/или запрещено. В России оборудование, содержащее ПХБ, еще продолжает использоваться и/или храниться на складах (AMAP, 2000). Кроме того, ПХБ образуются как побочные продукты хлорорганического синтеза. Особенно мощный и длительно действующий источник атмосферного загрязнения ПХБ в Иркутской области обнаружен ранее в районе г. Усолья-Сибирского, где расположен крупный химический комбинат «Усольехимпром» (Mamontov et al., 2000; Полихлорированные бифенилы..., 2005 и др.).