СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА У КРЫС
METHOD OF MODELLING EXPERIMENTAL AMYLOIDOSIS IN RATS

Данное изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей.
Амилоидоз - системное заболевание с поражением многих органов и различных тканевых структур, характеризующееся нарушением белкового обмена и внеклеточным отложением в них сложного белково-полисахаридного комплекса. Развитие амилоидоза связано с извращением белково-синтетической функции ретикуло-эндотелиальной системы, накоплением в плазме крови аномальных белков, служащих аутоантигенами. В результате взаимодействия антигена с антителом происходит осаждение грубодисперсных белков, участвующих в образовании амилоида. Откладываясь в тканях, амилоид накапливается в больших количествах и вытесняет функционально специализированные элементы органа, что приводит к атрофии, склерозу и функциональной недостаточности органов.
Амилоид является сложным гликопротеидом, в состав которого входят плазменные белки, находящиеся в тесной связи с полисахаридами. Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает γ-глобулин (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan-Mar. - 6 (1 Pt 2). P.-107-116). Свойственное амилоиду двойное лучепреломление в поляризованном свете при окраске конго красным определяется строением амилоида, состоящего из двух полипептидных цепей.
В связи с актуальностью амилоидоза возникла необходимость разработки и создания способов его моделирования для получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза.
За последние 50 лет разработано множество различных способов экспериментального воспроизведения амилоидоза у животных. Большинство из них основываются на введении животным биологических или химических веществ. Известен классический способ моделирования экспериментального амилоидоза (Грицман А.Ю. Некоторые вопросы экспериментальной терапии амилоидоза и резорбции амилоида. // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук, М., 1974), заключающийся в введении белым мышам через день по 0,5 мл 5% казеината натрия подкожно в течение 60 дней. Недостатком его является то, что приготовление раствора казеината связано с определенными сложностями, такими как поиск чистого казеина, необходимость растворения его точной навески в кипящем 0,25% растворе гидроокиси натрия, фильтрование, стерилизация, хранение. Готовый раствор казеината натрия имеет щелочную реакцию, высокое содержание натрия, что резко ограничивает применение данной модели при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.
В литературе описаны различные способы амилоидогенеза с помощью химических веществ, чаще всего с канцерогенными и токсическими свойствами: 3-methylcholanthrene (Akamatsu Y., Ikegami R., Watanabe K., Kikui M., 1968), 4-(dimethylamino)azobenzene (Akamatsu Y., Ikegami R., 1968).
Наиболее часто применяются биологические способы амилоидогенеза. Имеются данные о развитии амилоидоза при введении лабораторным животным бактериальных вакцин (Schechter D., Fields M., Laufer A. 1975) Существует способ получения амилоидоза у хомяков путем их заражения кожным лейшманиозом (Kennedy J.S., Anderson J.D, 1983). Описано также развитие системного амилоидоза при заражении животных различными возбудителями хронических инфекций: Mycobacterium butiricum (Cui D., Kawano H., Takahashi M.B и др., 2002).
За прототип нами взят способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных (патент РФ на изобретение №2269825, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 10.02.2006 заявка №2004127649/14 от 15.09.04 г. МПК′ G09B 23/28), заключающийся в введении белым мышам через день по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно в течение 30 дней.
Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая то, что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров, а также сложность и длительность воспроизведения модели амилоидоза.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего однократное введение нативного яичного альбумина в равнодолевой смеси с полным адъювантом Фрейнда (Mycobacterium butiricum) в пять точек инъекций.
Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что для моделирования экспериментального амилоидоза используются старые крысы-самцы (возраст 18-24 мес, масса 350-380 г), которым однократно проводятся инъекции равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций (внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области слева и справа подкожно) с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных. Однократное введение равнодолевой смеси полного адъюванта Фрейда и нативного яичного альбумина в дозе по 0,2 мл в 5 точек инъекций приводит к развитию системного вторичного амилоидоза с преимущественным поражением почек, селезенки, печени в течение 60 дней эксперимента.
Для получения экспериментального системного амилоидоза однократно проводятся инъекции равнодолевой смеси полного адъюванта Фрейда и нативного яичного альбумина в дозе по 0,2 мл в 5 точек инъекций (внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа) старым крысам-самцам линии «Вистар» (возраст 18-24 мес, масса тела 350-380 г).
Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
Экспериментальным животным (старые крысы-самцы в возрасте 18-24 мес, массой тела 350-400 г) однократно вводят равнодолевую смесь нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций, что обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом.
Для получения экспериментального системного амилоидоза в качестве экспериментальных животных выбраны крысы-самцы линии «Вистар» массой 350-400 г в возрасте 18-24 мес, так как именно старческая брадитрофия тканей позволяет ставить вопрос о моделировании амилоидоза. На молодых крысах амилоидоз не воспроизводится из-за особенностей обмена веществ, а крысы старше 24 мес погибают в ходе эксперимента. Для моделирования системного амилоидоза экспериментальным животным однократно проводятся инъекции равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций (внутрибрюшинно, в паховые и подмышечные области подкожно слева и справа). У контрольных и опытных животных исследуется 6-часовой спонтанный диурез. Клубочковая фильтрация определяется по клиренсу эндогенного креатинина, рассчитывается канальцевая рабсорбция воды. Содержание натрия и калия в моче определяется методом пламенной фотометрии, содержание кальция - спектрофотометрически. Основные процессы мочеобразования и экскреция электролитов определяются по истечении 1 и 2 месяцев.
Животные забиваются под наркозом в сроки: 14, 30, 45, 60 дней эксперимента. Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска гематоксилином и эозином, конго красным) подвергаются внутренние органы: почки (фиг.1), печень (фиг.3), селезенка (фиг.4), сосуды (фиг.2). Образцы тканей фиксируются в 10% нейтральном формалине с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго красным. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.
Сущность заявляемого способа подтверждается функционально и морфологически.
Исследования показали, что в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения нативного яичного альбумина в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда отмечается увеличение диуреза через 1 месяц и его снижение через 2 месяца (табл. 1). Увеличение диуреза обусловлено снижением канальцевой реабсорбции воды, несмотря на уменьшение скорости клубочковой фильтрации (СКФ). В течение второго месяца эксперимента спонтанный диурез снижается ниже фоновых значении, что связано с резким уменьшением СКФ, при этом канальцевая реабсорбция воды также продолжает снижаться.
Под влиянием введения нативного яичного альбумина отмечалось прогрессивное увеличение протеинурии более чем в 2 раза на протяжении 2 месяцев (табл. 1).
Экскреция натрия под влиянием амилоидогена в условиях спонтанного 6-часового диуреза повышается на протяжении обоих месяцев. Экскреция калия и кальция под влиянием нативного яичного альбумина в условиях спонтанного диуреза также возрастает на протяжении эксперимента, особенно по истечении 2 месяцев (табл.2).
Таблица 1
Изменения объема спонтанного диуреза и основных процессов мочеобразования при формировании амилоидной нефропатии
Условия опыта
Статистич. показатель
Процессы мочеобразования
Содержание белка, мг/мл
Диурез мл/час/100
СКФ м/час/100
Реабсорбция, %
Фон
M±m
0,086±0,0053
21,60±0,712
99,61±0,024
13,99±0,942
1 мес эксперимента
M±m
0,123±0,0031
17,70±0,615
99,31±0,030
29,25±0,885
2 мес эксперимента
M±m
0,045±0,0051
6,02±0,489
99,25±0,041
41,15±1,07
Таблица 2
Изменения экскреции электролитов с мочой при формировании амилоидной нефропатии
Условия опыта
Статистич. показатель
Электролитовыделительная функция
Экскреция Ca
Экскреция Na
Экскреция K
Фон
M±m
0,16±0,006
7,92±0,623
4,67±0,370
1 мес эксперимента
M±m
0,189±0,0031
15,25±0,602
6,59±0,303
2 мес эксперимента
M±m
0,192±0,0038
16,21±0,605
8,18±0,419
Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически:
Фиг.1. Отложение амилоида в клубочках и канальцах почек. Выраженная конгофилия клубочков и канальцев почек, отек интерстиция. Выраженная паренхиматозная дистрофия канальцев.
Фиг.2. Отложения амилоида в стенках сосудов всех исследуемых органов, в основном в интиме и мышечном слое. Утолщение и разрыхление стенок сосудов.
Фиг.3. Паренхиматозная дистрофия гепатоцитов, нарушение балочного стороения. Отложение амилоида в печени преимущественно в центрах долек вокруг сосудов, по ходу ретикулярной стромы. Отмечается очаговая диффузная конгофилия гепатоцитов.
Фиг.4. Отложение амилоида в селезенке преимущественно вокруг лимфоидных фолликулов и в стенке сосудов.
Пример
Проведены серии опытов из 2-х групп:
1-я группа - (20 крыс-самцов линии «Вистар») - контрольная
2-я группа (20 крыс-самцов линии «Вистар») - амилоидная - старым крысам-самцам (возраст 18-24 мес, масса тела 350-380 г) однократно проводились инъекции равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций.
Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска конго красным) подвергнуты внутренние органы, кровеносные сосуды.
В результате проведенных исследований получены морфологические доказательства эффективности применения нативного яичного альбумина для моделирования экспериментального амилоидоза у старых крыс-самцов.
Гистологически у 2-й группы животных в почках (фиг.1) при окраске срезов красным конго отмечалась выраженная конгофилия медуллярных и кортикальных стромально-сосудистых структур (артериол и капилляров) почки, в большей степени проявлявшаяся в мальпигиевых клубочках, капсуле Шумлянского-Боумена, базальных мембранах канальцев, гистоструктурах почечной лоханки и чашечек. Выявлялась слабая эндотелиальная реакция капилляров клубочков и сосудов микроциркуляторного русла стромы почки, особенно коркового слоя.
Исходя из полученных результатов исследования, обосновывается использование равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций для моделирования амилоидоза у старых крыс.
Для наглядности изменений в органах микрофотографии повторяются в цветном виде.
Подводя итог, следует отметить, что однократное подкожное введение старым крысам равнодолевой смеси нативного яичного альбумина и полного адъюванта Фрейнда из расчета по 0,2 мл в 5 точек инъекций является эффективным способом моделирования экспериментального амилоидоза.