СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR PREPARING CELL MATERIAL FROM HUMAN PLACENTA

Изобретение относится к медицине и может использовано для получения клеточного материала из неонатальных органов человека (плаценты) после родов на 38-40 неделе гестации, используемого в широком спектре медицинских клеточных технологий с возможностью длительного хранения перед применением.
Известен способ получения клеточной культуры [RU 2455357, C1, C12N 15/08, A61K 35/50, 10.07.2012], основанный на том, что выделенные из плаценты человека после родов на 38-40 неделе гестации и культивированные мезенхимальные стволовые клетки переводят в суспензию и помещают в среду для транспортировки, содержащую физиологический раствор, причем используют среду для транспортировки, включающую также лекарственное средство в виде раствора, выбранного из следующего ряда: лекарственное средство на основе янтарной кислоты, или лекарственное средство, стимулирующее анаэробный гликолиз, или лекарственное средство, оказывающее протективное действие, при следующем их соотношении, об. %: лекарственное средство - 20-80, физиологический раствор - остальное до 100, при этом готовый продукт содержит от 0,1 до 5 млн клеток в 1 мл среды для транспортировки.
Недостатком способа является относительно узкая область применения, что не позволяет получать клеточный материал с высокими потребительскими свойствами, в частности, способ не обеспечивает получение клеточного материала с большими сроками хранения, обеспечивающими возможность его оперативного использования.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ [RU 2347579, C1, A61K 35/50, A61K 35/44, C12N 15/08, A61P 25/00, 27.02.2009], основанный на том, что выделяют из пуповины новорожденного после нормальных родов культуру стволовых клеток, осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 100 ед./мл амфотерицина в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°C в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспензированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°C, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора.
Недостатком способа является относительно узкая область применения, что не позволяет получать клеточный материал с высокими потребительскими свойствами, в частности, способ не обеспечивает получение клеточного материала с большими сроками хранения, обеспечивающими возможность его оперативного использования.
Задачей, которая решается в изобретении, является получение клеточного материала с высокими потребительскими свойствами, в частности, с большими сроками хранения без существенной потери лечебных свойств, обеспечивающими возможность оперативного использования клеточного материала.
Технический результат, который реализуется при использовании предложенного способа, заключается в получении клеточного материала с высокими потребительскими свойствами, в частности, с большими сроками хранения, обеспечивающими возможность его оперативного использования.
2
2
2
2
2
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, согласно способу, основанному на том, что выделяют из плаценты новорожденного после нормальных родов культуру аллогенных мезенхимальных стволовых клеток, согласно изобретению амнион плаценты вместе с неглубоким захватом хориона нарезают на небольшие кусочки, промывают их от крови путем их помещения в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл раствора Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика и последующего энергичного встряхивания, промытые кусочки ткани измельчают и инкубируют 1-2 ч при 37°C в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 10 см из расчета 1 кусочек ткани на 1 чашку Петри с 10 мл раствора фермента, полученную суспензию из каждой чашки Петри переносят в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл и осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 300 g, полученные осадки суспензии из каждой чашки Петри ресуспендируют в 15 мл ростовой среды DMEM: F12; 10% фетальная телячья сыворотка; р-р гентамицин/стрептомицин/глутамина 0,25 мг ципрофлоксацина, содержимое каждой пробирки переносят в отдельный культуральный флакон площадью 75 см, культивируют со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности и переводят в суспензию с использованием раствора 0,25%-ного трипсина с версеном (1:1) и рассевают в культуральные флаконы площадью 75 см в соотношении 1:3, клетки отделяют от внутренних стенок пробирки смесью растворов версена и трипсина в отношении 1:1 и переносят в центрифужную пробирку объемом 15-50 мл и центрифугируют 5 мин, 300 g, после чего осадок ресуспендируют для криозаморозки в среде: 90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида, подсчитывают количество клеток в полученной суспензии и разбавляют ее средой для криозаморозки до конечной концентрации 1 млн клеток/мл, разливают в криопробирки требуемых объемов и осуществляют замораживание в течение первых суток в низкотемпературном холодильнике при -80°C с последующим переносом в сосуд Дьюара с жидким азотом при -196°C, а при подготовке к применению клетки восстанавливают при температуре 37-40°C на водяной бане до таяния льда, содержимое криопробирки переносят в культуральный флакон 75 см с фильтром, содержащий 10 мл полной ростовой среды, культивируют одни сутки 24 ч в CO-инкубаторе при 37°C, 5% CO, 80% влажности с последующей разовой заменой ростовой среды на 10 мл свежей и последующих периодической сменой ростовой среды через каждые трое суток до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности.
В качестве графических материалов представлены:
на фиг. 1 - сравнительная оценка зависимости жизнеспособности различных пассажей фибробластов кожи (верхняя кривая), МСК из плаценты (средняя кривая) и костного мозга (нижняя кривая) человека после криоконсервации в течение 60 сут в жидком азоте (-196°C);
на фиг. 2 - результаты определения жизнеспособности различных пассажей МСК из плаценты человека после криоконсервации в течение 60 сут. в жидком азоте (-196°C).
на фиг. 3 - образец паспорта для клеточного материала из плаценты человека.
Предложенный способ получения клеточного материала из плаценты человека реализуется следующим образом.
Предложенный способ получения клеточного материала из плаценты человека предполагает, что имеются показания, гарантирующие безопасность их последующего применения, в частности, нормальное течение беременности и родов, отсутствие инфекционных заболеваний у донора. Технология не может быть использована из-за нарушений требований к безопасности, в частности, при наличии в крови донора вирусов: гепатита В и/или С, иммунодефицита человека (ВИЧ), сифилиса, наличии у донора онкологических заболеваний в анамнезе, при наличии у донора системных аутоиммунных заболеваний в анамнезе, генетических заболеваний, психических расстройств психосоматического характера, при наличии у плода выраженных уродств и мальформаций, при мертворождении или внутриутробной гибели плода.
2
Способ может быть реализован при наличии соответствующих оборудования (центрифуга, СО-инкубатор, ламинарный шкаф, инвертированный микроскоп, автоматическая пипетка, микропипетка, замораживатель, сосуд Дьюара, низкотемпературный холодильник, бытовой холодильник, камера Горяева, водяная баня, термос, сумка холодильник), реактивов (антибиотики, антимикотики, питательная среда ДМЕМ/F12, фетальная телячья сыворотка, Версен, 0,25%-ный раствор трипсина, ДМСО, раствор Хенкса, физиологический раствор, коллагеназа 1-го типа, трипановый синий) и расходных материалов (одноразовая культуральная пластиковая посуда (флаконы, пробирки, серологические пипетки, чашки Петри, наконечники для микропипеток, криопробирки); покровные стекла, набор медицинских инструментов (пинцет, хирургические ножницы, глазные ножницы, скальпель, шпатель, карцанг), вакутейнеры, хладагенты).
При соблюдении указанных выше условий способ реализуется следующим образом.
1. Получение плаценты
Забор плаценты должен осуществляться сразу после родов.
Плацента помещается в стерильный герметичный контейнер, который помещается на лед в сумку-холодильник (температура +2°…+8°C).
Транспортировка плаценты может осуществляться до трех суток при условии соблюдения герметичности, стерильности и температурного режима.
К транспортируемой плаценте прилагается следующий пакет документов: анамнез донора (матери) плаценты, результаты диагностики крови донора (матери) плаценты на вирусы (в соответствии с приказным списком).
2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека и их культивирование
Все манипуляции по выделению и культивированию мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.
Амнион плаценты, вместе с неглубоким захватом хориона, нарезается на небольшие кусочки, достаточные для помещения в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл.
Кусочки ткани энергично промываются от крови. Для этого каждый кусочек помещается в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл раствора Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика (Gibco, США) и энергично встряхивается.
Промытые кусочки ткани измельчаются и инкубируются 1-2 ч при 37°C в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 10 см из расчета 1 кусочек ткани: 1 чашка Петри: 10 мл раствора фермента.
Полученная суспензия из каждой чашки Петри переносится в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл и осаждается центрифугированием (5 мин, 300 g).
Полученные осадки ресуспендируются каждый в 15 мл ростовой среды: DMEM:F12; 10% фетальная телячья сыворотка; р-р гентамицин/стрептомицин/глутамина (все - Gibco, США); 0,25 мг ципрофлоксацина.
2
Содержимое каждой пробирки переносится в отдельный культуральный флакон площадью 75 см и культивируется со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-уой конфлюэнтности.
2
При достижении монослоем 80%-уой конфлюэнтности, клетки переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-yjго трипсина с версеном (1:1) и рассеваются в культуральные флаконы площадью 75 см в соотношении 1:3.
3. Подготовка и длительное хранение (криоконсервация) мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека
Замораживание клеток проводят на уровне не старше V пассажа для создания запаса клеток, которые можно впоследствии восстановить, или для сохранения невостребованных клеток. Все манипуляции по криоконсервации клеточных линий, предназначенных для длительного хранения, проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.
Подготовка клеток к замораживанию
Клетки отделяют от пластика смесью растворов версена и трипсина в отношении 1:1 и переносят в центрифужную пробирку (15-50 мл в зависимости от полученного обьема клеточной суспензии) и центрифугируют (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендируют в среде для криозаморозки (90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида (DMSO).
Подсчитывают количество клеток в полученной суспензии и разбавляют ее средой для криозаморозки до конечной концентрации 1 млн клеток/мл. Полученную клеточную суспензию разливают в криопробирки требуемых объемов и сразу начинают процесс замораживания.
Режим криозамораживания
Для замораживания криопробирки с клетками переносят в контейнер для замораживания пробирок Mr. Frosty™ (Thermo Scientific, США) и помещают его в низкотемпературный холодильник (-80°C).
Через сутки ампулы с клетками переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом (-196°C).
Размораживание криоконсервированного клеточного материала.
Клетки восстанавливают при температуре 37-40° на водяной бане до таяния льда. Замороженные клетки достаточно хрупкие, плохо переносят пипетирование, взбалтывание и потому требуют особенно аккуратного обращения.
Все манипуляции, связанные с размораживанием клеток, следует проводить максимально быстро и не допускать передержки клеток в размороженном криоконсерванте.
2
Содержимое криопробирки переносится в культуральный флакон 75 см с фильтром, содержащий 10 мл полной ростовой среды.
2
2
Клетки культивируются 24 ч в CO-инкубаторе (37°C, 5% CO, 80% влажности), затем старая среда, содержащая криоконсервант, удаляется и заменяется на 10 мл свежей полной ростовой среды.
Полученные клетки культивируются со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности.
2
При достижении монослоем 80%-ной конфлюэнтности клетки переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-ного трипсина с версеном (1: 1) и рассеваются в культуральные флаконы площадью 75 см в соотношении 1:3.
Исключение инфекционных агентов в мезенхимальных стволовых клетках, выделенных из плаценты чловека, выполняется в клинико-диагностической лаборатории однократно. Стандартное обследование проводится после пассирования in vitro образца клеточной линии в количестве не менее 500 тыс. клеток.
Приготовление мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека, для транспортировки и медицинского применения
2
Отобранные образцы клеточных культур, не старше V пассажа, переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-ного трипсина с версеном (1:1). Для этого ростовая среда удаляется, а монослой дважды промывается физиологическим раствором, а затем инкубируется в растворе 0,25%-ного трипсина с версеном (1:1) при 37°C из расчета 3 мл раствора на культуральный флакон площадью 75 см.
Полученная суспензия переносится в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, после чего осуществляется подсчет количества в ней клеток при помощи камеры Горяева.
Далее суспензия промывается физиологическим раствором. Для этого клетки осаждаются центрифугированием (5 мин, 300g), а осадок ресуспендируется в физиологическом растворе. Манипуляция повторяется дважды.
Полученный осадок клеток в количестве, предусмотренном лечебным стандартом конкретной патологии, ресуспендируется в стерильной среде транспортировки, состоящей из физиологического раствора и разрешенного к применению лекарственного средства, обеспечивающего лучшую выживаемость клеток и улучшение лечебных характеристик технологии.
Процент жизнеспособных клеток в препарате определяется с помощью окраски трипановым синим и подсчетом в камере Горяева. Для медицинского применения необходим уровень не ниже 80% жизнеспособных клеток в суспезии.
Полученная суспензия переносится стерильно в вакуумную пробирку для забора крови (вакутейнер, Gibco, США).
Вакутейнер с готовым клеточным материалом помещается в термос со льдом и транспортируется к месту назначения. Транспортировка и хранение клеточного материала осуществляется стерильно при температурном режиме +2…+8°C. Срок годности клеточного материала для медицинского применения указан в сопровождающем его паспорте клеточного материала.
Используют готовое лекарственное средство в виде раствора для инъекций или для инфузий.
Жизнеспособность различных пассажей культур мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека после криоконсервации была подтверждена в процессе выполнения исследований, результаты которых отражены на фиг. 1 и фиг. 2. В результате были выбраны оптимальные номера пассажей для криозаморозки, с наибольшей жизнеспособностью после размораживания, а следовательно, и с наилучшими лечебными свойствами в случае их дальнейшего клинического применения.
2
2
Для исследований использовалась стандартная криоконсервационная среда: FBS («Gibco», США) с 10% ДМСО («ПанЭко», РФ). МСК из плаценты человека получали по описанной выше методике и пассировали в 75 см пластиковых флаконах («Greiner», США). После выделения (0 пассаж) и после каждого пассажа (с I-го по VI-й) по 1 млн жизнеспособных клеток в 1 мл криоконсервационной среды помещали в 1.8 мл криопробирки («Greiner», США), замораживали в замораживателе MrFroster («Greiner», США) и хранили в сосудах Дьюара с жидким азотом (-196°C) в течение 60 сут. Затем образцы размораживали на водяной бане (37°C) и рассевали в 75 см пластиковых флаконах («Greiner», США). Через 12 ч клетки снимали с пластика смесью трипсина и версена и проводили пятикратный подсчет жизнеспособности клеток в камере Горяева с трипановым синим.
Выбор срока хранения образцов клеточных культур в условиях криоконсервации (60 сут) связан с тем, что при клиническом использовании клеточного материала стандартная процедура повторяется с интервалом, как правило, в 2 мес, т.е. именно через этот срок приходится размораживать клетки для их повторного приготовления. Поэтому проверка жизнеспособности клеток через 60 суток криоконсервации имела не только теоретическое, но и очевидное практическое значение.
Непосредственно после выделения (0 пассаж) клетки обычно не закладывают на долговременное хранение, поскольку, во-первых, вследствие их немногочисленности, во-вторых,  в силу недостаточной гомогенности клеточной культуры. Поздние пассажи, старше IV, также стараются не консервировать. Однако в данной работе была поставлена цель установить основной тренд зависимости жизнеспособности от номера пассажа, поэтому и нулевой пассаж, и V-VI пассажи были включены в эксперимент по криоконсервации.
Результаты исследований представлены на фиг. 1.
Зависимость жизнеспособности после размораживания от номера пассажа для МСК из плаценты человека имеет постепенно (с учетом статистических погрешностей - монотонно) убывающий характер. Падение жизнеспособности после размораживания в зависимости от пассажа довольно четко выражено для исследованной клеточной культуры: примерно с 94% до 79%. При этом снижение жизнеспособности достоверно для всех пар пассажей, за исключением разницы между IV и V пассажами (фиг. 2). Была проведена оценка зависимости жизнеспособности различных пассажей МСК из плаценты человека по сравнению с фибробластами кожи и МСК костного мозга человека после криоконсервации в течение 60 суток в жидком азоте (196°C) (фиг. 1), где показано, что жизнеспособность у МСК плаценты человека после криоконсервации немного ниже, чем у фибробластов кожи человека, но значительно выше, чем у МСК, выделенных из костного мозга человека.
Таким образом, в проведенные исследования подтверждают, что предложенный способ получения клеточного материала позволяет обеспечить большой срок его хранения без существенной потери лечебных свойств, что обеспечивает возможность оперативного использования клеточного материала. При этом результаты исследований позволяют учитывать номер пассажа клеточной культуры при ее размораживании для подготовки клеточного материала в случае его клинического применения.