ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК Mycobacterium paratuberculosis - ВОЗБУДИТЕЛЯ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD OF DETECTING DNA OF Mycobacterium paratuberculosis THAT IS PARATUBERCULOSIS AGENT BY METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано для экспресс-диагностики паратуберкулезной инфекции, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению полиморфизма Mycobacterium paratuberculosis (M.paratuberculosis).
В настоящее время паратуберкулез в России остается менее изученным, чем другие хронические болезни. Представляют научный интерес механизмы взаимодействия возбудителя с макроорганизмом, особенности инфекционного и эпизоотического процессов, биологические свойства возбудителя, что связано с исключительными трудностями выделения и культивирования М. paratuberculosis на искусственных питательных средах, с воспроизводством модельной инфекции как на лабораторных, так и на восприимчивых животных (Овдиенко Н.П. Профилактика и меры борьбы с паратуберкулезом животных / Н.П.Овдиенко, А.Х.Найманов, Н.Г.Толстенко и др.// Ветеринария. - 2007. - №12, - с.3-7).
Известны стандартные процедуры выявления возбудителя паратуберкулеза, которые начинаются с микроскопических исследований биоматериала на наличие кислотоустойчивых микобактерий с последующим посевом материала и биохимическим тестированием выращенных на питательных средах микроорганизмов с целью идентификации вида обнаруженных микобактерий. По наличию M.paratuberculosis ставят диагноз наличия паратуберкулезного процесса (Benazzi S. Paratuberculosis in sheep flocks in Morocco: a serological, microscopical and cultural survey / S.Benazzi, M. el Hamidi, and Т. Schliesser // Zentbl. Veterinarmed. - 1996. - V.43. - P.213-219). Недостатком способа является длительность проведения анализа из-за медленного роста микобактерий. При этом получение культур M.paratuberculosis из заведомо инфицированного материала удается не всегда и при окрашивании мазков кроме M.paratuberculosis выявляется множество различных видов кислото-спирто-антиформиноустойчивых микроорганизмов. Известна также автоматизированная система ВАСТЕС MGIT (Becton Dickenson) и МВ/ВасТ (Organon Teknika) для выделения микобактерий на жидких средах, дающая возможность получить результаты, начиная с 4-го дня после поступления диагностического материала в 81% случаев. При этом необходимо отметить, что автоматизированные системы ВАСТЕС MGIT (Becton Dickenson) и МВ/ВасТ (Organon Teknika) импортного производства и дорогостоящие (Патент РФ №2163022 от 28.05.1999).
Известны методы диагностики паратуберкулеза, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип метода состоит в увеличении в 106-108 раз копий специфического участка ДНК (дезоксирибонуклеотиновая кислота) микроорганизма, активизируемого ДНК-полимеразой в автоматическом режиме. Это высокоспецифичный и чрезвычайно чувствительный тест, с помощью которого принципиально возможно идентифицировать в анализируемой пробе наличие даже одной-единственной молекулы ДНК возбудителя. В качестве маркера для выявления и идентификации возбудителя паратуберкулеза наиболее часто используется последовательность IS900, которая присутствует в количестве 14-16 копий в пределах генома M.paratuberculosis (Mobius P. Comparison of 13 singleround and nested PCR assays targeting IS900, ISMav 2, fa57 and locus 255 for detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis / P.Mobius, H.Hotzel, A.Rassbach et al // Vet. Microbiol. - 2008. - V.126. - PP.324-333).
Прототипом данного изобретения являются праймеры и способ выявления ДНК возбудителя паратуберкулеза, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение ДНК M.paratuberculosis, синтез олигонуклеотидных праймеров на последовательность IS900, амплификацию ДНК в гнездовой ПЦР и идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле (Bull Т. J. Detection and verification of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis in fresh ileocolonic mucosal biopsy specimens from individuals with and without Crohn's disease / T.J.Bull, E.J.McMinn, K.Sidi-Boumedine et al // J Clin Microbiol. 2003 July; 41(7): 2915-2923). Способ включает детекцию ДНК M.paratuberculosis в исследуемом материале путем проведения двухэтапной ПЦР с использованием на первом этапе двух внешних праймеров и матрицы в виде участка ДНК с получением амплификата, а на втором этапе - двух внутренних праймеров и матрицы в виде полученного на первом этапе амплификата с последующим определением полученных на втором этапе продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле. При этом используются наружные праймеры для первого раунда амплификации: SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Внутренние праймеры для второго раунда амплификации: SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4.
К недостаткам данного способа можно отнести то, что он проводится методом гнездовой ПЦР и требует синтез двух пар праймеров (внутренних и наружных) и соответственно проведения реакции в два раунда.
Задача изобретения заключается в расширении способов выявления возбудителя паратуберкулеза в исследуемом материале с использованием молекулярно-биологических методов, в частности одностадийной полимеразной цепной реакции.
Поставленная задача решается тем, что синтезируются олигонуклеотидные праймеры, комплементарные специфичной для M.paratuberculosis области генома IS900, использующиеся для выявления ДНК Mycobacterium paratuberculosis - возбудителя паратуберкулеза, имеющие следующий нуклеотидный состав:
(SEQ ID NO:5) gaagggtgttcggggccgtcgcttagg
(SEQ ID NO:6) ggcgttgaggtcgatcgcccacgtgac.
Задача решается также тем, что в способе выявления ДНК Mycobacterium paratuberculosis - возбудителя паратуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающем выделение ДНК, амплификацию ДНК M.paratuberculosis на олигонуклеотидных праймерах, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидные последовательности (SEQ ID NO:5) и (SEQ ID NO:6), в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 413 п.н.
Задача решается также тем, что ПЦР проводится в 1 раунд.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Получение олигонуклеотидных праймеров. Получение праймеров осуществляют на основе известных последовательностей штаммов M.paratuberculosis, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nim.nih.gov/ Genbank/GenbankOverview.html), при помощи программного обеспечения «Lasergen». Полученные последовательности нескольких пар праймеров тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе «Vector NTI Suit».
В результате выбраны олигонуклеотидные праймеры (SEQ ID NO:5) и (SEQ ID NO:6), специфичные для M.paratuberculosis.
Химический синтез праймеров осуществляется по нашему заказу в ООО «Лаборатория Медиген», там же определяется концентрация олигонуклеотидов в маточном растворе.
2+
Пример 2. Выделение ДНК и постановка ПЦР. ДНК M.paratuberculosis выделяют с использованием набора ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ) согласно прилагаемой инструкции. Отработку условий амплификации для данной пары праймеров проводят с использованием музейного штамма М. paratuberculosis, который включает в себя: отработку времени денатурации при 94°С - 30 сек - 1 мин, температуру отжига праймеров 58°С, 59°С, 60°С, 61°С, концентрацию ионов Mg - от 0,8 до 2,5 mM, время циклов каждой стадии амплификации от 30 сек до 1 мин и количество циклов для каждой стадии от 20 до 35. Критерием правильности выбранного режима для каждого этапа проводимой реакции служит показательность результата - наличие или отсутствие искомого фрагмента ДНК определенного размера на электрофореграмме.
Для ПЦР применяют готовую ПЦР-смесь GenPack PCR Universal, a также готовят инкубационную смесь конечным объемом 50 мкл, которая содержит 10 мМ Mg-буфер, 10 мМ dNTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК-матрицы, 1ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. В качестве матрицы используют ДНК стандартизированного штамма M.paratuberculosis (Центрально-Любинского), выделенную из биоматериала зараженных животных и из музейной культуры. Для идентификации ДНК M.paratuberculosis используют праймеры (SEQ ID NO: 5) и (SEQ ID NO: 6), гомологичные участку IS900, специфичному для M.paratuberculosis. Выбран следующий режим амплификации: денатурация при 94°С - 1 минута, затем 30 циклов, каждый из которых состоял из денатурации при 93°С - 30 секунд, отжига при 58°С - 1 минута, синтеза при 72°С - 30 секунд и 1 цикл при 72°С в течение 7 минут. Продукты ПЦР анализируют в 2% агарозном геле с нанесением в лунки 6 мкл амплификата. Электрофорез проводят в течение 30 минут при напряжении 300 В.
Пример 3. Определение продуктов диагностической ПЦР.
Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2% агарозном геле в стандартном трис-боратном или трис-ацетатном буфере (рН 8,0).
5 мкл амплификата смешивают с 1 мкл буфера для нанесения проб на гель, а в случае использования набора GenPack PCR Universal 6 мкл амплификата вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (не менее 30 минут). Результаты элекрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Используют маркеры молекулярного веса pBluescript/Msp I и pUC19/KzoI. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру 413 п.н. При этом в отрицательном контроле (реакционная смесь, не содержащая ДНК матрицу) продукты амплификации отсутствуют.
Таким образом, указанный способ позволяет выявлять ДНК M.paratuberculosis в исследуемом материале.
Пример 4. Определение специфичности ПЦР. Результаты испытаний на специфичность ПЦР для выявления ДНК M.paratuberculosis. Во избежание ложноположительных результатов, в связи с возможным присутствием в исследуемых образцах возбудителей других инфекций была проанализирована комплементарность праймеров к геномным последовательностям следующих микроорганизмов: Citrobacter frendii, Escherichia coli, Staphylococcus albus. Кроме того, была выяснена возможность неспецифического связывания праймеров с участками гена следующих видов микобактерий: M.avium str. 104, М. intracellulare, M. tuberculosis Нз7Ку, М. bovis str. 14 (СибНИВИ), M. smegmatis (ВГНКИ), М. fortuitum (ВГНКИ), М. terrae (полевой изолят).
Таблица
Результаты испытаний на специфичность ПНР для выявления ДНК M.paratuberculosis.
Микроорганизм
Результаты ПНР
Стандартизированный штамм M.paratuberculosis (Центрально-Любинский)
+
M.avium str. 104
-
M.intracellulare
-
M.tuberculosis H<sub>37</sub>R<sub>v</sub>
-
M.bovis str. 14 (СибНИВИ)
-
M.smegmatis (ВГНКИ)
-
M.fbrtuitum (ВГНКИ)
-
M.terrae (полевой изолят)
-
Escherichia coli
-
Staphylococcus albus
-
Citrobacter frendii
-
Примечание: "+" - положительный результат, "-" - отрицательный результат
Таким образом, олигонуклеотидные праймеры, позволяющие выявлять ДНК возбудителя паратуберкулеза, не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие ДНК M.paratuberculosis - возбудителя паратуберкулеза, а способ выявления ДНК M.paratuberculosis высокочувствителен и прост в исполнении.
Использование заявленного способа позволит повысить скорость проведения и надежность диагностики паратуберкулеза за счет использования специфической амплификации свойственного для M.paratuberculosis участка IS900.