МНОГОКАНАЛЬНЫЙ КОНФОКАЛЬНЫЙ МИКРОСКОП (ВАРИАНТЫ)
MULTICHANNEL CONFOCAL MICROSCOPE (VERSIONS)

Многоканальный конфокальный микроскоп относится к области приборостроения, связанной с производством оптико-электронной аппаратуры для анализа, исследования и визуализации различных характеристик материалов и биологических объектов.
Использование в микроскопах конфокальной схемы предложил Марвин Минский в 1961 г. (заявка US 3013467 A, 1961-12-19). Конфокальный микроскоп имеет повышенное по сравнению с обычным микроскопом разрешение как латеральное (поперечное), так и по глубине. Это достигается путем оптической фильтрации фонового света, идущего из глубины образца с помощью дополнительной (конфокальной) диафрагмы. Следующим шагом в развитии конфокальной микроскопии стало создание сканирующих конфокальных микроскопов. Например, известны схемы, предложенные в патентах RU 2018891 C1, RU 2140661 С1 и заявке RU 2007131539 А. Основной недостаток таких схем - низкая скорость сканирования исследуемых объектов, поскольку сканирование осуществляется единственным световым лучом (луч лазера), а прием сигналов, соответственно, одним фотодатчиком.
Отмеченный недостаток устраняется в предлагаемых, в последнее время, многоканальных конфокальных микроскопах, в которых свет источника осветительного блока микроскопа преобразуется в совокупность (матрицу) независимых лучей, число которых определяет количество одновременно сканируемых точек исследуемого объекта, при этом для одновременного приема информации от множества сканирующих лучей применяется многоканальная детектирующая схема на основе регистрирующей матрицы фотоприемников.
Известны заявки США, в которых излучение лазерного источника преобразуется в матрицу лучей, а приемником служит матрица фотодетекторов, обеспечивая, таким образом, многоканальность: US 2004/0051976 A1; US 6,248,988 B1; US 6,578,961 B2; US 2001012069 A1, 09.08.2001; US 2008308730 A1, 17.12.2008; US 2002141051, 03.10.2002.
Близким аналогом заявляемого устройства является система, представленная в заявке US 2001012069 Al, 09.08.2001 "Confocal microscope with a motorized scanning table" (Фиг. 1b), содержащая сканирующий столик и матрицы диафрагм. Недостатки данного способа сканирования связаны со сравнительно большой инертностью столика, т.е. с его скоростью перемещения, а следовательно, и временем построения одного изображения. Предел данного способа построения изображения ограничен несколькими кадрами в минуту.
В другом устройстве из заявки US 2008308730 A1, 17.12.2008 "Real-time, 3D, non-linear microscope measuring system and method for application of the same" используется массив микролинз с волоконным заведением света для создания многоканальной системы освещения объекта. Сканирование матрицы лучей по поверхности объекта в объектной плоскости осуществляется с помощью сдвиговых сканеров на основе плоскопараллельных пластин, установленных на осях роторов, ортогонально расположенных друг к другу. Недостатки данного устройства - в использовании матрицы микролинз и акустооптического модулятора, последовательно переключающего каналы.
Еще один вариант устройства (US 2002141051, 03.10.2002) включает в себя сканирующий элемент (Фиг. 3, 5), выполненный в виде поворотного зеркала на оси электродвигателя в осветительном канале, и аналогичный сканирующий элемент в канале регистрации, содержащего матрицу фотодетекторов. Оба сканирующих элемента синхронизованы между собой. Недостатком такой системы является использование зеркальных гальванометров для сканирования луча по объекту, что ухудшает разрешающую способность сканирования, за счет относительно низкой разрешающей способности измерения угла поворота зеркала и удвоения угла отклонения сканирующих лазерных лучей. Для более прецизионного шага по углу в данном случае можно использовать поворотное устройство на основе пьезокерамического актюатора, однако последний сравнительно дорогое устройство, реально работающее только в диапазоне малых углов и частот.
Наиболее близким к предлагаемому решению является устройство, опубликованное в заявке US 6,248,988 B1 "Conventional and confocal multi-spot scanning optical microscope". Здесь предложена оптическая схема, в которой присутствуют лазер, служащий источником излучения, расширитель (коллиматор)лазерного луча, матрица микролинз. Образованные микролинзами световые лучи проходят последовательно через матрицу конфокальных диафрагм, формирующую оптику и попадают на светоделительную пластину. Световые лучи, прошедшие через пластину без изменения направления распространения, попадают на модуль сканирования на основе акустооптического дефлектора и далее после фокусирующего объектива на исследуемый объект. Световые лучи, отклоненные светоделительной пластиной, подаются, в частности, в блок нормирования лучей по интенсивности. Отраженный от объекта свет собирается фокусирующим объективом, проходит формирующую оптику, попадает на акустооптический дефлектор, отклоняется светоделительной пластиной в регистрирующий блок и с помощью объектива фокусируется на чувствительных элементах матрицы фотодетекторов. Недостатки данной конструкции заключаются в использовании массива микролинз для создания матрицы лучей, а также в применении в модуле сканирования акустооптического дефлектора для перемещения луча в плоскости объекта (сканирование объекта). Технологические ограничения на пути уменьшения геометрических размеров отдельной микролинзы значительно затрудняют изготовление матрицы с высокой плотностью микролинз высокого качества, что увеличивает апертуру оптических элементов, аберрации и усложняет оптическую схему, в итоге снижая количество одновременно сканируемых точек исследуемого объекта, увеличивая время сканирования для построения изображения объекта. Значительный разброс оптических характеристик микролинз приводит к неравномерности распределения энергии в матрице лучей, что снижает динамический диапазон построения изображения.
Массив микролинз может использоваться только для небольшого количества лучей и по другой причине, так как с увеличением их количества усложняется процесс изготовления отдельной микролинзы, кроме этого, снижение лучевой эффективности может быть из-за дополнительного расширения пучка, освещающего матрицу микролинз с целью выравнивания интенсивности излучения в пучках.
Недостаток, заключающийся в применении акустооптического дефлектора, состоит в том, что при двухкоординатном отклонении лазерного луча акустооптическим дефлектором в сечении луч принимает эллиптическую форму, что может приводить к эллиптичной форме сфокусированного на образце пятна, а также к различным плоскостям фокусировки для ортогональных сечений профиля луча. Помимо этого, применение такого дефлектора требует дорогостоящих согласующих устройств для управления лазерами с разными длинами волн.
В предлагаемых устройствах (вариантах) отмеченные недостатки устраняются. Технический результат достигается за счет того, что в многоканальном конфокальном микроскопе, в котором коллимированный свет лазерного источника расщепляется в квадратную матрицу лучей, направляемых затем через последовательно расположенные вдоль оптической оси квадратную матрицу конфокальных диафрагм, светоделительный кубик, и при последовательном отклонении или сканировании матрицы лучей по двум ортогональным координатам попадают через фокусирующую оптику на исследуемый объект, упомянутая матрица световых лучей первоначально формируется из лазерного луча дифракционным оптическим элементом, одновременно выполняющим предварительную фокусировку световых лучей в плоскость матрицы диафрагм, а отклонение или сканирование матрицы лучей по двум координатам исследуемого объекта осуществляется с помощью модуля сканирования на основе двух преломляющих плоскопараллельных пластин, установленных на ортогонально ориентированных относительно друг друга осях роторов электродвигателей или гальваносканеров, и формирующей оптики, причем движение пластины по каждой координате синхронизировано с движением пластины аналогичного модуля сканирования, установленного в регистрирующем блоке, содержащем матрицу фотодетекторов. Отраженный от исследуемого объекта оптический сигнал возвращается в обратном направлении до светоделительного кубика, отклоняется кубиком и попадает на регистрирующую матрицу детекторов через дополнительную матрицу конфокальных диафрагм, модуль сканирования на основе преломляющих плоскопараллельных пластин и фокусирующую оптику в одном варианте устройства.
В другом варианте устройства, в осветительном блоке упомянутая матрица световых лучей первоначально формируется из лазерного луча дифракционным оптическим элементом и одновременно выполняет предварительную фокусировку световых лучей через светоделительный кубик в плоскость матрицы диафрагм. Далее отклонение или сканирование матрицы лучей по двум координатам исследуемого объекта осуществляется модулем сканирования на основе двух преломляющих плоскопараллельных пластин, установленных на ортогонально ориентированных относительно друг друга осях роторов электродвигателей или гальваносканеров, и формирующей оптики, причем движение пластины по каждой координате синхронизировано с движением пластины аналогичного модуля сканирования, установленного в регистрирующем блоке, содержащем матрицу фотодетекторов. Свет от объекта возвращается в обратном направлении до светоделительного кубика, отклоняется кубиком и попадает на регистрирующую матрицу фотодетекторов через светофильтр, модуль сканирования на основе преломляющих плоскопараллельных пластин и фокусирующую оптику.
Помимо указанных отличительных особенностей изготовление предлагаемых устройств проще в сравнении с выявленными аналогами и прототипом за счет примененной системы сканирования. Использование системы сканирования на основе прозрачных в широком спектральном диапазоне плоскопараллельных пластин с относительно малой дисперсией упрощает построение микроскопов для лазерных источников, работающих в широком спектральном диапазоне, особенно при работе с несколькими лазерными источниками с разными длинами волн одновременно, и при этом латеральное разрешение и точность предлагаемых вариантов микроскопа выше по сравнению с многоканальными конфокальными микроскопами на основе систем сканирования с акустооптическими модуляторами или линзорастровыми сканирующими системами (Petran Metal 1985 The tandem scanning reflected light microscope Part 1: the principle, and its design Proc. RMS 20 125-9). Существенным преимуществом представленных схем микроскопов является их высокая световая энергетическая эффективность (свыше 90%), которую легко получить за счет использования неподвижных конфокальных диафрагм и высокоэффективного мультиплексора лазерных лучей на основе ДОЭ (более 90 % эффективности), по сравнению с линзорастровыми сканирующими системами (около 40 %), где диафрагмы, формирующие матрицу сканирующих лучей, и конфокальные диафрагмы могут быть подвижными.
Многоканальное освещение объекта в предлагаемых вариантах микроскопа обеспечивается разделением коллимированного лазерного излучения на квадратную матрицу световых лучей с помощью дифракционного оптического элемента (ДОЭ). Достоинством специально разработанного дифракционного оптического элемента является то, что он может формировать как большое количество лучей (например, 100×100 и выше), так и энергетическую эффективность свыше 90% с гауссовской аподизацией каждого луча (в случае многоуровневых, голографических ДОЭ), что имеет большую лучевую эффективность. Принцип работы ДОЭ основан на эффекте дифракции падающего светового луча и формировании в дальней зоне (Фраунгофера) заданного распределения интенсивности. Это происходит за счет создания на поверхности ДОЭ определенного фазового рельефа. Данный рельеф предварительно рассчитывается численными методами и формируется на поверхности кварцевой подложки с использованием методов фотолитографии. ДОЭ может иметь свойства нескольких оптических элементов, например, помимо пространственного мультиплексора (умножителя) лучей с заданной интенсивностью может включать еще и линзу, с помощью которой лучи из матрицы могут фокусироваться на заданном расстоянии в одной плоскости. Более подробную информацию о смысловом содержании используемого дифракционно-оптического элемента и методах его расчета можно прочитать в кн.: «Методы компьютерной оптики»./Под ред. В.А. Сойфера: Учеб. для вузов. - 2-е изд., испр. - М.: ФИЗМАТЛИТ, 2003. - 688 с. - ISBN 5-9221-0434-9, например п. 5.4. Фокусаторы в двумерную область. Метод согласованных прямоугольников. Также можно ознакомиться с аналогичными коммерческими продуктами, например, фирмы Holoeye (http://holoeye.com/diffractive-optics/standard-doe-plasticsA, и конкретно изделие «Dot Matrix» соответствует ДОЭ в данной заявке.
В предлагаемых вариантах многоканального конфокального микроскопа (МКМ) сканирование матрицы лучей по исследуемому объекту осуществляется с помощью дефлектора (сканера), выполненного на основе поворотной плоскопараллельной прозрачной пластины в тандеме с формирующей (тубусной) линзой. Пластина установлена на оси ротора электродвигателя (гальваносканера), может поворачиваться в малых углах (примерно 0.1 рад) и позволяет работать на частотах до нескольких кГц. При этом одна пластина используется для развертки сканирования только по одной координате. Для развертки по ортогональной координате используется второй аналогичный дефлектор. Оси вращения пластин - ортогональны.
В прототипе в качестве матрицы детекторов представлен массив 32×32 элементов, при этом каждому элементу матрицы диафрагм соответствует элемент указанного массива. Последовательное сканирование матрицы сфокусированных лучей по зоне объекта ограничено расстоянием между сфокусированными пятнами. Для построения изображения необходимо сделать N×N кадров, где N - количество последовательных перемещений между соседними пятнами в матрице лучей. При этом изображения пятен фиксируются на одних и тех же элементах регистрирующей матрицы детекторов. Из набора полученных последовательных изображений синтезируется изображение объекта. Такой режим построения изображения называется последовательным режимом. В отличие от прототипа, предлагаемые МКМ позволяют работать как в последовательном, так и в параллельном варианте построения изображения. В случае параллельного режима построения изображения в регистрирующем блоке используется дополнительная развертка по одной или по двум координатам на основе плоскопараллельных пластинок. При этом происходит перемещение изображения пятен по чувствительным элементам регистрирующей матрицы, и полное конфокальное изображение объекта может быть сформировано за время одного кадра (при двухкоординатной развертке) или за N последовательных кадров (при однокоординатной развертке).
Предлагаемые варианты многоканального конфокального микроскопа иллюстрируются графическим материалом, где изображено:
Фиг. 1 - структурная схема варианта МКМ для сканирования отражающих объектов.
Фиг. 2 - структурная схема варианта МКМ для детектирования сигнала от флюоресцирующих объектов.
Фиг. 3 - Оптическая схема осветительного блока многоканального конфокального микроскопа: 3 - дифракционный оптический элемент (ДОЭ), 4 - матрица конфокальных диафрагм, 24 - преломляющая плоскопараллельная пластина, 7 - тубусная линза, 8 - микроскопный объектив, 9 - объектная плоскость.
Фиг. 4 - Оптическая схема осветительного блока с наклоненной преломляющей плоскопараллельной пластиной (три луча): 3 - ДОЭ, 4 - матрица конфокальных диафрагм, 24 - преломляющая плоскопараллельная пластина, 25 - преломляющая плоскопараллельная пластина под углом, 7 - тубусная линза, 8 - микроскопный объектив, 9 - объектная плоскость.
Фиг. 5 - Сканирование объекта с помощью преломляющей плоскопараллельной пластины (три луча): 24 - преломляющая плоскопараллельная пластина, 25 - преломляющая плоскопараллельная пластина под углом, 7 - тубусная линза.
Фиг. 6 - Ход лучей в объектной области: 8 - микроскопный объектив, 9 - объектная плоскость.
Фиг. 7 - Фотоснимок экспериментального макета МКМ (номера элементов соответствуют обозначениям на структурной схеме варианта МКМ (Фиг. 2).
Многоканальный конфокальный микроскоп, показанный на схеме Фиг. 1, состоит из трех блоков 16, 17, 18 (блоки выделены пунктирными линиями). Осветительный блок 16 содержит: лазер 1; расширитель луча 2; ДОЭ 3; матрицу конфокальных диафрагм (МКД) 4; светоделительный кубик 5; сканерный модуль 19, состоящий из преломляющих плоскопараллельных пластин 6; формирующей оптики (тубусной линзы) 7; фокусирующий объектив 8; исследуемый объект 9. Регистрирующий блок 17 содержит: МКД 4, сканерный модуль 23, состоящий из преломляющих плоскопараллельных пластин 10 формирующей оптики 11; объектив матрицы фотодетекторов 12; регистрирующую матрицу фотодетекторов 13.
В варианте, показанном на схеме Фиг. 2, присутствует три блока 18, 20, 21 (блоки выделены пунктирными линиями). Осветительный блок 20 содержит: лазер 1; расширитель луча 2; ДОЭ 3; светоделительный кубик 5; матрицу конфокальных диафрагм 4; сканерный модуль 19, содержащий поворотные плоскопараллельные пластины 6, формирующую оптику (тубусную линзу) 7; фокусирующий объектив 8; исследуемый объект 9. Регистрирующий блок 21 содержит: светофильтр 22; сканерный модуль 23, содержащий преломляющие плоскопараллельные пластины 10, формирующую оптику (тубусную линзу) 11; объектив матрицы фотодетекторов 12; регистрирующая матрица фотодетекторов 13.
Нормировочный блок 18 состоит из объектива 14 и матрицы фотодетекторов 15.
В многоканальной схеме каждому лучу из матрицы лучей достаточно осветить только часть поверхности объекта, и он может сканироваться только в пределах своей области (размер этой области определяется расстоянием между лучами в объектной плоскости). Таким образом, время сканирования уменьшается в N×M раз, где N - количество лучей по одной координате матрицы, а М - количество лучей по другой координате матрицы.
Оптическая схема сканерного модуля представляет собой две преломляющих плоскопараллельных пластины с просветленными гранями, установленных на ортогонально расположенных относительно друг друга осях роторов электродвигателей или гальвано-сканеров и формирующей оптики. Использование в этом модуле преломляющих плоскопараллельных пластинок и формирующей оптики позволяет применять лазеры на нескольких длинах волн без значимых хроматических аберраций и обеспечивает повышенное латеральное разрешение.
Поясним работу МКМ, выполненного по первому варианту (Фиг. 1).
Источником света 1 является амплитудно модулируемый лазер. Для согласования с ДОЭ 3 лазерный луч проходит через расширитель 2 (коллиматорная линза). В ДОЭ 3 излучение разделяется на массив (матрицу) независимых лучей размером N*M (N, М=25-100), которые затем проходят с целью пространственной фильтрации паразитных дифракционных порядков через отверстия матрицы конфокальных диафрагм 4 такой же размерности N×M и попадают на светоделительный кубик 5. Кубик служит для ответвления лазерного освещающего света в нормировочный блок 18, а сигнального света, отраженного от объекта, - в регистрирующий блок 17. Грани кубика просветлены для прохождения лазерного излучения. Световые лучи, проходящие через светоделительную грань кубика 5 без изменения направления распространения, поступают в модуль сканирования 19, содержащий преломляющие плоскопараллельные пластины 6 и формирующую оптику 7. Сканерный модуль последовательно отклоняет матрицу коллимированных лучей в соответствии с заданной программой. Далее матрица лучей фокусируется объективом 8 на исследуемом объекте 9 (в качестве формирующей оптики 7 и объектива 8 могут быть применены тубусная линза и объективы серийных микроскопов). Линза 7 и объектив 8 согласовываются по минимальной величине аберраций. Отраженный от объекта световой поток, в котором присутствует информация об объекте, возвращается через элементы 8, 7, 6 и отклоняется светоделителем 5 в регистрирующий блок 17, в котором последовательно расположены: вторая матрица конфокальных диафрагм 4, сканерный модуль 23 на основе преломляющих плоскопараллельных пластин 10 и формирующей оптики 11, синхронизированный со сканерным модулем 19 осветительного блока. Затем с помощью объектива 12 световой поток фокусируется на регистрирующей матрице фотодетекторов 13. Функция матрицы конфокальных диафрагм 4 в регистрирующем блоке заключается в пространственном ограничении прохождения света таким образом, чтобы через нее проходил в основном только тот поток света, который исходит из областей объекта, находящихся в фокальной области фокусировки каждого осветительного луча (конфокальная схема). Это приводит к повышению контраста изображения. Для построения изображения производится сканирование с помощью последовательного углового перемещения сканерными преломляющими плоскопараллельными пластинами 6 сканерного блока 19 матрицы сфокусированных лучей по зоне объекта, ограниченной расстоянием между сфокусированными пятнами. Для построения изображения в последовательном режиме необходимо сделать N×M кадров, где N, М - количество последовательных перемещений между соседними пятнами в матрице лучей. При этом изображения пятен фиксируются на одних и тех же элементах регистрирующей матрицы фотодетекторов. Из набора полученных последовательных изображений синтезируется изображение объекта. В случае параллельного режима построения, в регистрирующем блоке используется развертка по одной или по двум координатам на основе преломляющих плоскопараллельных пластин 10 сканерного блока 23. При этом происходит перемещение изображения пятен по чувствительным элементам регистрирующей матрицы фотодетекторов, и полное конфокальное изображение объекта может быть сформировано за время одного кадра (при двухкоординатной развертке) или за N(M) последовательных кадров (при однокоординатной развертке).
Нормировочный блок 18 используется для непрерывной нормировки и калибровки освещающих лучей. Здесь фиксируются значения интенсивности света в каждом луче, вариации мощности лазера, особенности формы профиля каждого луча. Эта информация используется при построении синтезированного изображения.
Во втором варианте многоканального конфокального микроскопа (Фиг. 2), в отличие от схемы на Фиг. 1, после ДОЭ 3, световой поток проходит через светоделительный кубик 5, фокусируется в плоскости матрицы диафрагм 4 и далее через сканерный модуль 19 фокусируется объективом 8 на объекте 9. Свет, отраженный от объекта 9, проходит последовательно через элементы 8, сканерный модуль 19, состоящий из элементов 7 и 6, матрицу конфокальных диафрагм 4 до светоделительного кубика 5. Светоделительный кубик 5 направляет лучи через светофильтр 22. Излучение через сканерный модуль 23 и объектив 12 попадает на регистрирующую матрицу фотодетекторов 13. Для сигнальных лучей матрица конфокальных диафрагм 4 создает конфокальную схему (повышение контрастности изображения), как и для лазерных лучей осветительного блока 20 (от лазера 1 до объекта 9).
Поясним принципы работы модуля сканирования на основе преломляющих плоскопараллельных пластин. В отличие от стандартных схем отклонения лучей с помощью зеркальных угловых сканеров, пьезокерамических угловых подвижек, сканирующих столиков и акустооптических дефлекторов, в предлагаемых устройствах используется прозрачная плоскопараллельная пластина, при повороте смещающая матрицу лучей. Формирующая линза преобразует смещение лучей в их угловое отклонение. Рассмотрим прохождение лучей через основные элементы осветительного блока 16 (Фиг. 3). Здесь показана только часть осветительного блока схемы, начиная с ДОЭ 3, без светоделительного кубика 5. Три луча, границы каждого изображены двумя параксиальными лучами, фокусируются в отверстия матрицы диафрагм 4, а затем распространяются в виде конических расходящихся лучей через плоскопараллельную пластинку 24 и формирующую оптику (тубусную линзу) 7, через объектив 8 к объекту 9. В данном случае пластинка 24 располагается перпендикулярно оптической оси системы.
1
0
Если пластинку наклонить под углом, это приводит к смещению преломленных лучей в поперечном направлении и к соответствующему смещению лучей в области объекта (Фиг. 4). Из чертежа видно, что смещенные лучи от подложки в положении 25, показанные штриховыми линиями, распространяются под теми же углами, параллельно лучам от пластинки в положении 24, однако за счет поперечного смещения и отклонения тубусной линзой 7 фокусируются на объекте в других позициях. Если величина латерального смещения после пластинки Δx (Фиг. 5), то в параксиальном приближении это приводит к смещению сфокусированного пятна в области объекта на Δх (Фиг. 6):
где М - латеральное увеличение оптической системы тубусная линза - объектив. Смещение сфокусированного пятна луча в плоскости объекта позволяет осуществлять сканирование.
Экспериментальный образец многоканального конфокального микроскопа (первый вариант) создан в Институте автоматики и электрометрии СО РАН. На Фиг. 7 приведен фотоснимок макета МКМ без нормировочного канала.
Оптические характеристики экспериментального образца:
-2
- Диаметр луча по уровню е профиля интенсивности от максимального значения в плоскости ДОЭ - 5.5 мм.
- Количество лазерных лучей после ДОЭ - 25×25.
- Расстояние фокусировки ДОЭ - 150 мм.
- Диаметр отверстий - 100 мкм.
- Расстояние между отверстиями в матрице диафрагм - 300 мкм.
- Полный размер матрицы диафрагм - 7.2×7.2 мм
- Фокусное расстояние тубусной линзы - 180 мм.
- Апертура тубусной линзы - 25 мм.
- Фокусное расстояние объектива - 3 мм.
- Апертура объектива - 5.5 мм.
t
ob
- Коэффициент поперечного (латерального) увеличения системы - M=f/f=60.
- Размер матрицы лучей на объекте (расстояние между центрами крайних точек по одной из поперечных осей) - 120 мкм.
- Расстояние между соседними пятнами лучей в плоскости объекта - 5 мкм.
Эксперименты подтвердили работоспособность предлагаемых вариантов новых многоканальных конфокальных микроскопов, отличающихся от известных авторам устройств подобного назначения.