Хитиназы и экологическая безопасность продуктов питания

УДК 632.9:57.088.3

Е. В. Петухова, А. Ю. Крыницкая

ХИТИНАЗЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

Ключевые слова: микотоксины, биопрепарат, фунгицидная активность, хитиназа, адсорбция на хитине, электрофорез.

На основе анализа литературных данных по применению микроорганизмов в качестве биопрепаратов в сельском хозяйстве показана перспективность использования хитинолитических ферментов для защиты культур от патогенных организмов. Проведена очистка хитиназ мутантного штамма Serratia marcescens путем адсорбции на хитине. Показано наличие в очищенном препарате двух хитиназ с молекулярными массами 58 и 52 кДа, обладающих выраженной фунгицидной активностью.

Keywords: mycotoxins, biological products, fungicidal activity, chitinase, colloidal chitin, adsorption on chitin, еlectrophoresis.

Based on an analysis of literature data on the use of microorganisms as biological products in agriculture is a promising use of chitinolytic enzymes to protect crops against pathogenic microorganisms. Carried out the purification of chitinases mutant strain of Serratia marcescens by adsorption on chitin. Demonstrated the presence of a purified preparation of two chitinases with molecular masses of 58 and 52 kDa, with pronounced fungicidal activity.

Введение

Для обеспечения здорового питания населения важной задачей является получение экологически безопасной продукции животноводства и растениеводства. Из природных экотоксикантов наибольшую опасность для здоровья населения и животных представляют микроскопические грибы и их токсины — микотоксины, обладающие токсическим эффектом в малых количествах и способные весьма интенсивно диффундировать вглубь продукта. Из более 300 выделенных микотоксинов в качестве загрязнителей пищевых продуктов выступают лишь около 20. Среди них афлатоксины, трихотеценовые микотоксины, охратоксины, патулин, зеараленон и зеараленол, многие из которых обладают мутагенными и канцерогенными свойствами.

Одной из причин возрастания микотоксикоза сельскохозяйственной продукции является широкое применение пестицидов. С целью минимизации их использования интенсивно разрабатываются методы биологической защиты растений и соответствующие биопрепараты.

Среди немногочисленных видов бактерий с фунгицидным действием Bacillus subtilis (препараты: бактофит, алирин-Б, гамаир, бисолбисан, фитос-порин, баксис); ВасШш spp. (бациспецин БМ); Bacillus nigrum (бактрил); Pseudomonas fluorescens (би-норам, планриз); Pseudomonas aerofaciens (псевдо-бактерин-2) [1,2,3,4].

В настоящее время в сельскохозяйственном производстве является перспективным применение биопрепаратов комплексного действия, обладающих кроме фунгицидного эффекта другими видами активности, например, рострегулирующей, азотфик-сирующей, фосфатмобилизующей, оказывающих благоприятное воздействие на плодородие почвы. С этой целью в составе препаратов широко используются спорообразующие бактерии рода Bacillus, являющиеся продуцентами биологически активных веществ (БАВ), в том числе ферментов, антибиотиков полипептидного и аминогликозидного ряда. Важной особенностью бациллярных культур является также устойчивость к неблагоприятным усло-

виям внешней среды за счет способности к спорообразованию.

В соответствии с результатами исследований к препаратам комплексного воздействия могут быть отнесены вид Bасillus thuringiensis и биопрепарат бацикол на его основе, сочетающий антифунгаль-ный и энтомоцидный эффекты с ростстимулирую-щим действием на растения [1], а также региональный штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 и препарат на его основе базизулин, обладающий кроме антагонистической активности к широкому спектру возбудителей заболеваний растений ростстимупирующим действием, а также хитиназ-ной, фосфатазной и нитрогеназной активностями [5]. Использование базизулина при протравливании семян яровых культур пшеницы и ячменя снижает уровень пораженности зерна на 96.5-100.0% возбудителями черной и базальной пятнистости, оливковой плесенью, а также плесневыми грибами родов Pеnicillium и Мисог [5].

Антифунгальный эффект бациллярных культур обусловлен совместным действием антибиотических веществ и миколитических ферментов. Так миколитический комплекс штамма Bacillus sp. 739, предложенного в качестве основы для препарата «Бациспецин БМ», включает глюканазу, хитиназу и хитозаназу [3,4]. Миколитический комплекс другого штамма бацилл Bacillus Cohn состоит из Р-1,3-глюканазы, протеазы, хитиназы и хитозаназы [6].

Хитиназам наряду с фосфатазами, ацетилаза-ми, лектинами, глюканазами, протеин-киназами, отводится роль защитных белков - РЯ-белков (inducible defense-related proteins), ответственных за оперативную систему противодействия растения стрессу [7]. Так при инфицировании томатов грибом Cladosporium fulvitum в пораженных листьях выявлено несколько хитиназ с молекулярными массами (М.М.) от 26 до 32 кДа и две 1,3-р-глюканазы, что свидетельствует об участии этих ферментов в деградации клеточных стенок грибов [8]. Хитиназы наряду с хитоолигосахаридами выступают в качестве элиситоров - модуляторов ответных реакций растения на атаку фитопатогена [9].

Хитинолитические ферменты и секретирую-щие их микроорганизмы широко используются для борьбы не только с возбудителями грибковых заболеваний растений, но и с другими вредителями сельскохозяйственных культур (насекомые, нематоды и др.). Важным преимуществом фунгицидных и инсектицидных препаратов на основе хитиназ является высокая избирательность их действия. Есть данные о роли этих ферментов в усилении инсектицидной активности энтомопатогенных бактерий и бакуловирусов [10]. Добавление хитиназы в композицию из вируса ядерного полиэдроза капустной совки и Bacillus thuringiensis обеспечило сокращение нормы расхода биопрепарата без снижения эффекта против комплекса чешуекрылых фитофагов капусты [11].

Одним из наиболее продуктивных источников хитинолитических ферментов является представитель семейства Enterobacteriaceae Serratia marcescens. В культуральной жидкости этого микроорганизма обнаруживается несколько белков с хитиназной активностью.

Результаты применения хитиназы, выделенной из культуральной жидкости мутантного штамма Serratia marcescens М-1, при искусственном заражении однолетних побегов малины возбудителем пурпурной пятнистости D. applanata. показали сокращение размера некроза сердцевины в 3.4 раза и ксилемы в 9 раз, уменьшение протяженности внутреннего некроза в 6.5 раз по сравнению с контрольным вариантом. Также при использовании данного биопрепарата не наблюдалось формирования плодовых тел грибом, и авторами [12,13] высказано предположение о дополнительном иммунизирующем действии на растение хитинолитических ферментов, выступающих в качестве элиситоров, вызывающих ответную реакцию синтеза фитоалексинов. Наряду с хитиназой отмечено подавление развития заболевания хитином. Наблюдалось сокращение площади пораженных участков под влиянием хитина в 2 раза, а под влиянием суспензии хитина в 4.1 раза [12,13]. В настоящее время хитин в составе препаратов «Аг-рохит», «Хитозар Ф» широко применяется для обработки семенного и посадочного материала в качестве фунгистатика, регулятора роста и иммуномо-дулятора, а также рекомендован для внесения в почву c целью снижения уровня патогенов [14,15,16].

Целью работы было изучение фунгистатиче-ской активности хитиназ мутантного штамма Д5 Serratia marcescens.

Объекты и методы исследования

В работе использовали мутантный штамм S. marcescens Д5, полученный на кафедре микробиологии Казанского государственного университета методом индуцированного мутагенеза из исходного штамма Вй 211 АТСС 9986 с последующим отбором колоний с повышенной хитиназной активностью, а также штаммы микромицетов из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии КГУ: Rhizoctonia solani, Alternaria sp., Fusarium

graminearum, Alternaria brassicicola, Bipolar is sorokiniana.

Бактерии выращивали на модифицированной среде Бантинг [17].

Коллоидный хитин получали по методике Чи-галейчика с соавторами [18].

Общую хитиназную активность определяли по количеству образующихся при гидролизе хитина редуцирующих сахаров с динитросалициловым реагентом [18]. Эндохитиназную активность определяли вискозиметрически по действию на гликольхи-тин, полученный из хитина по методике Ямады и Имото [19].

Сульфат-аммонийную фракцию (САФ) получали путем насыщения культуральной жидкости сульфатом аммония до 90% и выдерживания в течение 12 часов. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием, растворяли в минимальном количестве воды и проводили диализ против дистиллированной воды, а затем против 0.125 М трис-HCl рН 6.8 до отрицательной реакции на анион SO42- . Затем проводили концентрирование САФ используя лио-фильную сушку.

Частичную очистку хитиназ проводили путем адсорбции на коллоидном хитине [20].

Разделение белков проводили с помощью вертикального электрофореза в 12,5 %-ном полиак-риламидном геле (ПААГ) в присутствии додецил-сульфата натрия Ds-Na [21]. Определение хитиназ-ной активности белковых фракций в геле после электрофореза в денатурирующих условиях осуществляли по методике с применением флуоресцентного красителя Calcofluor white M2R [22].

Чувствительность фитопатогенных микроми-цетов к хитиназе проверяли методом бумажных дисков, которые раскладывали на картофельно-глюкозном агаре, засеянного спорами грибов. На диски наносили по 25 мкл исследуемых препаратов хитиназы. О степени подавления судили по размеру стерильной зоны вокруг диска.

Результаты и обсуждение

Проведена очистка хитиназ культуральной жидкости мутантного штамма S. marcescens Д5 путем осаждения белков сульфатом аммония при 90% -ном насыщении с последующей адсорбцией на хитине. Для получения достаточно очищенных хи-тиназ адсорбцию ферментов на хитине повторяли дважды. Данные по удельной активности хитиназ по стадиям очистки представлены в таблице 1.

Как видно из результатов, представленных в таблице, отмечен достаточно высокий уровень как общей, так и эндохитиназной активности, что свидетельствует об одновременной индукции мутант-ным штаммом как экзо-, так и эндохитиназ. В процессе адсорбции хитиназ на хитине степень очистки возрастает в 12.3 раза при измерении активности ДНС- методом и в 18.5 раз - при вискозиметриче-ском измерении.

Таблица 1 - Изменение удельной активности хи-тиназ Б. тагсв8сеп8 Д5 в процессе очистки на хитине

ДНС- Сте- Вискози- Сте-

метод, пень метриче- пень

мг очи- скии очи-

N-АГА- стки метод, стки

мг-1 виск. ед.-

белка мг-1 белка

Культу- 27.4 1.0 60.0 10.0

ральная

жидкость

САФ 32.4 1.2 73.0 1.2

Хитиназа 338.8 12.3 1107.7 18.5

после

адсорбции

на хитине

Суперна- 55.0 2.0 180.0 3.0

тант после

адсорбции

на хитине

Результаты ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией и обнаружением хитиназной активности в геле показали (рис. 1), что в САФ содержатся четыре белка с М.М. 58, 52, 38 и 21 кДа, обладающие хитиназной активностью. В очищенном препарате присутствуют два белка с молекулярными массами 58 и 52 кДа, соответствующие хитиназам А и В. Поскольку хи-тиназа А является экзоферментом по механизму действия на хитин [23], а в очищенном препарате наблюдается довольно высокий уровень эндохити-назной активности (табл. 1), можно предположить, что хитиназа В - эндофермент. Хитиназы с молекулярными массами 38 и 21 кДа (хитиназы С и С1), присутствующие в САФ, не связываются с хитином и остаются в супернатанте.

I 2 3 12

Рис. 1 - Электрофореграмма фракций, полученных в процессе очистки хитиназ на хитине: 1 -САФ, 2 - очищенные хитиназы, первичная сорбция на хитине, 3 - очищенные хитиназы, вторичная сорбция на хитине; а - окраска кумасси бриллиантовым синим R250, б - окраска Calcofluor white M2R; цифрами указаны молекулярные массы хитиназ

Изучена фунгистатическая активность хити-наз методом бумажных фильтров. Показано, что САФ обладает слабой фунгистатической активностью, возможно, вследствие низкой концентрации хитиназ (рис. 2). Препарат, содержащий 58 и 52 кДа - белки с хитиназной активностью, подавляет рост всех изучаемых культур микромицетов. Суперна-тант, содержащий 38 и 21 кДа хитиназы, практически не проявляет фунгицидной активности. Не исключено, что для проявления выраженной фунги-статической активности необходимо сочетание хи-тиназ с различным механизмом действия (экзо- и эндохитиназы).

Рис. 2 - Действие хитиназ Б. татсенсеш на рост фитопатогенных микромицетов (слева направо): 1 - контроль (вода), 2 - САФ, 3 - препарат хитиназы после очистки на хитине, 4 - супернатант, содержащий хитиназы 38 и 21 кДа

Выводы

1. Проведена очистка хитиназ мутантного штамма X тагсваепб путем адсорбции на хитине.

2. Степень очистки хитиназ в процессе их адсорбции на хитине возрастает в 12.3 - 18.5 раз в зависимости от метода определения активности.

3. Методом ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях показано, что в очищенном препарате содержатся хитиназы с молекулярными массами 58 и 52 кДа.

4. Очищенный комплекс хитиназ обладает выраженной фунгистатической активностью и может быть рекомендован в качестве биопрепарата.

5. Супернатант, содержащий 38 и 21 кДа хи-тиназы, практически не проявляет фунгицидной активности.

Литература

1. О.В. Смирнов, С. Д., Гришечкина Сельскохозяйственная биология, 3, С. 123-126 (2011).

2. А.Ю. Крыницкая, В.С. Гамаюрова, М.Н. Астраханцева, П.П. Суханов, Ю.Е. Седельников, Е.В. Петухова, Вест. Каз. Технол. Ун-та, 7, 181-183 (2011).

3. А.И. Мелентьев. Дисс. докт. биол. наук, Российский научный центр Институт биологии РАН, Уфа, 2000. 302с.

4. Г.Э. Актуганов. Дисс. канд. биол. наук, Российский научный центр Институт биологии РАН, Уфа, 2000. 107 с.

5. З.Ю. Сираева. Дисс. канд. биол. наук, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, 2012. 181с.

6. А.В. Широков. Дисс. канд. биол. наук, Российский научный центр Институт биологии РАН, Уфа, 2004. 149 с

7. И.В. Максимов Дисс. докт. биол. наук, РАН Уфимский научный центр Институт биохимии и генетики, Уфа, 2005. 349 с.

8. Т.М. Одинцова. Дисс. докт. биол. наук, Инст. общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 2010. 464 с.

9. Р.М. Хайруллин. Дисс. докт. биол. наук, Институт биохимии и генетики, Уфа, 2001. 292 с.

10. Пат. Ш 2059368

11. Л. А. Овчинникова. Дисс. канд. сельс. наук, Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск, 2002. 128 с

12. А.А. Беляев, Т.В. Шпатова, М.В. Штерншис, А.В. Ду-жак, З.И. Панфилова. АгрсХП, 7-9, С. 23-24

13. А. А. Беляев Дисс. докт. сельс. наук, Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск, 2010. 347 с.

14. И.В. Максимов, Известия Уфимского научного центра РАН, 2, 38-61 (2013).

15. Н.Г. Васильева, Вест. Каз. Технол. Ун-та, 17, 16, 110111 (2014).

16. Н.А. Собгайда, В.Ф. Абдулин, Н.А. Влазнева, Д.А. Лавренов, К. И. Шайхиева, Вест. Каз. Технол. Ун-та, 17, 14, 397-399 (2014).

17. А.Г. Чигалейчик, Д.А. Пириева, С.С. Рылкин, Приклад. биох. и микробиол., 12, 4, 581-586 (1976).

18. И. А. Стояченко, В.П. Варламов, В. А. Даванков, Н.Я. Кобзева, Н.А. Тиунова, А.М. Безбородов, Приклад. биох. и микробиол., 27, 1, 45-52 (1991).

19. H.Yamada, T.A. Imoto, Carbohudr. Res, 92, 160-162

(1981).

20. R.L. Roberts, Cabib E. Anal.Biochem, 127, 402-412

(1982).

21. U.K. Laemmli, Nature

22. J. Trudel, A. Asselin, Anal. Biochem, 189, 2, 249-253

23. E. Vorgias, In Chitin Handbook. Europian Chitin Society, 1997, P. 321-330.

© Е. В. Петухова - канд. биол. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, petel07@yandex.ru; А. Ю. Крыницкая -канд. тех. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, paulalla@yandex.ru

© E. V. Petukhova - Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnolody, KNRTU, petel07@yandex.ru; A. Y. Krynicka -Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnolody, KNRTU, paulalla@yandex.