Исследование хронического действия никотина на M. soleus крысы при помощи силиконовых имплантатов

А. В. Прокофьев, И. А. Разговорова, В. В. Кравцова, И. И. Кривой

ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НИКОТИНА НА Ы. ЯОЬЕиЯ КРЫСЫ

ПРИ ПОМОЩИ СИЛИКОНОВЫХ ИМПЛАНТАТОВ*

Введение

В скелетной мышце никотиновые холинорецепторы (нХР) опосредуют синаптическую передачу сигнала от двигательного нерва к мышце. Одним из физиологически активных компонентов табака является алкалоид никотин — специфический экзогенный лиганд нХР. Изучение хронического воздействия никотина, циркулирующего в крови при курении, на функции нХР самых разных систем организма (ЦНС, периферическая нервная система, скелетная мускулатура) важно для понимания механизмов никотиновой интоксикации. Поскольку нХР регулируют нейрональную активность в структурах мозга, относящихся к системе естественного подкрепления, которая ответственна за формирование зависимости не только к никотину, но и к другим наркотикам [15], основное внимание исследователей во всем мире сосредоточено на роли никотина именно в ЦНС. Что касается скелетной мускулатуры, содержащей большой пул нХР, — потенциальных мишеней циркулирующего никотина, то имеются лишь единичные работы о влиянии курения и хронической никотинизации на скелетные мышцы [9, 10, 12, 16]. Не известно, происходят ли при этом какие-то изменения на уровне молекулярно-клеточных процессов, обеспечивающих электрогенез, возбудимость, сократимость и работоспособность скелетной мышцы.

Недавно была продемонстрирована функциональная связь нХР и Ма,К-АТФазы, на основе которой был предложен новый принцип долговременной регуляции электрогенеза скелетной мышцы циркулирующими холинергическими лигандами [1, 2, 3, 8, 17]. Ряд данных подтверждает возможность хронического действия холинергических лигандов на Ма,К-АТФазу. Показано негативное влияние хронического никотина на экспрессию Ма,К-АТФазы в мозге крысы [19]. Множество данных свидетельствуют о влиянии хо-линомиметиков на активность и индукцию Ма,К-АТФазы в зрелой скелетной мышце и в культуре скелетных мышечных клеток. Так, показано, что неквантовый ацетилхолин (АХ), постоянно присутствующий в синаптической щели, вызывает гиперполяризацию синаптического района скелетного волокна за счет активации Ма,К-АТФазы [13, 18]. В развивающихся мышечных клетках линии С2С12 постоянная аппликация в течение 4 суток негидролизуемого аналога АХ — карбахолина (10 мкмоль/л) вызывает гиперполяризацию мембраны клеток за счет увеличения количества Ма,К-АТФазы. Более того, установлено, что такая регуляция реализуется через нХР [6, 7]. Подобные исследования в условиях хронического действия никотина в отношении зрелой скелетной мышцы ранее не проводились.

Обычно применяемые способы хронической никотинизации животных (инъекции, применение специальных помп, доставка с питьевой водой) сопровождаются побочными системными эффектами. В данной работе мы исследовали, как никотин в относительно высокой (микромолярной) концентрации, локально доставляемый к скелетной

* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №07-04-01027).

© А. В. Прокофьев, И. А. Разговорова, В. В. Кравцова, И. И. Кривой, 2010

мышце крысы в течение 3 суток, влияет на ее электрогенез и сократительные характеристики. Локальную доставку никотина осуществляли с помощью специального нетоксичного силиконового геля, имплантируемого к т. вокив крысы.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на самцах белых крыс линии Вистар (вес 180-200 г.). Сразу после экстирпации т. 8о1еш с отрезком нерва помещали в экспериментальную камеру с проточным физиологическим раствором следующего состава (в мМ): МаС1-137; КС1-5; СаС12-2; MgCl2-2; МаНС03-24; МаН2Р04-1; глюкоза-11 (pH 7.4). Раствор постоянно аэрировали карбогеном (95% О2 + 5% СО2), температура раствора составляла 28°С. Перед началом эксперимента мышцы выдерживали в этих условиях в течение 60 мин. Часть опытов проведена в тех же условиях на полоске левой полудиафрагмы шириной около 10 мм с входящим в нее нервом.

Электрофизиологические и механографические исследования. Величину мембранного потенциала покоя (МПП) регистрировали внутриклеточно с помощью стандартной микроэлектродной техники во внесинаптическом районе мышечных волокон. Сразу после погружения микроэлектрода в мышечное волокно нажатием кнопки формировался синхроимпульс, который запускал аналого-цифровой преобразователь и автоматическую регистрацию МПП. После этого микроэлектрод выводили из данного волокна, и такая процедура регистрации МПП в данный отрезок времени повторялась с 20-25-ю волокнами (подробнее см.: [8]).

Одиночные и тетанические (стимуляция пачками импульсов с частотой 66 имп/с; длительность пачки — 0,4 с) сокращения в ответ на прямое раздражение (длительность стимула 0,5 мс) регистрировали в изометрическом режиме при помощи механотрона FT03 С. Раздражение осуществляли с помощью хлорсеребряных электродов, один из которых располагался под мышцей, а другой — на ней. Электроды располагали в без-нервной части мышцы.

Локальная доставка к мышце никотина. Для локальной доставки никотина к т. 8о1еш был использован метод имплантации силиконового геля, заполненного исследуемым веществом, что позволяет в течение нескольких суток осуществлять локальную аппликацию исследуемого вещества к мышце [4]. Данный метод ранее применялся для доставки к нервам или мышцам таких веществ, как нейротоксины, блокаторы ионных каналов, ингибиторы протеаз. Применительно к никотину этот метод использован нами впервые.

В раствор силиконовой резины (3140 RTV, Dow Согш^, GmbH) массой 350 мг добавляли сухую, механически измельченную соль МаС1 в количестве 140 мг, необходимом для получения физиологической концентрации 0,9%, а также никотин. Все составляющие смешивались до однородной массы и раскатывались на гладкой поверхности до 1 мм толщиной. Полученный раствор высушивали при комнатной температуре в течение 3 суток, после чего хранили при температуре 4°С. Из готового материала вырезали имплантат (фрагмент размерами ~ 1 х 2 х 5 мм). В ходе операции, проводимой под гексеналовой анестезией, данный имплантат вживляли в задние конечности крысы таким образом, чтобы имплантат контактировал с т. 8о1еш, причем во внесинаптиче-ском районе мышцы (рис. 1). Все процедуры были выполнены в стерильных условиях. Стерилизация помещения осуществлялась с помощью ультрафиолетового облучателя 0БН-05 (Россия). Прооперированные животные также находились в стерильных условиях. Через трое суток после вживления имплантата извлекали т. 8о1еи8 для проведения экспериментов.

Рис. 1. Схема расположения силиконового имплантата на поверхности камбаловидной мышцы задней конечности крысы

Использовали различные варианты геля: с низким содержанием никотина (ГНСН,

0,1 мг никотина на 350 мг геля) и с высоким содержанием никотина (ГВСН, 2 мг никотина на 350 мг геля). Гель, не содержащий никотин, использовали в качестве контроля.

Все регистрируемые сигналы оцифровывались аналого-цифровыми преобразователями (частота квантования 44 000/с в микроэлектродных опытах и 5000/с в опытах с механографией) и далее анализировались на персональном компьютере с помощью специально разработанных программ. Для статистической обработки применяли программу ORIGIN 6.1. В тексте и на рисунках приведены средние значения величин с их ошибками (M±m).

Результаты исследований и их обсуждение

Чтобы оценить диапазон концентраций никотина, диффундирующих из геля, предварительно было проведено специальное физиологическое тестирование. Для этого была поставлена отдельная серия экспериментов на изолированной диафрагме крысы как тест-объекте. В этих экспериментах полоски силиконового геля с разным содержанием никотина или гель, не содержащий никотин (контроль), прикладывались к диафрагмальной мышце, которая была расположена в экспериментальной камере и омывалась нормальным физиологическим раствором. Во всех экспериментах образцы геля располагались во внесинаптическом районе диафрагмальной мышцы. Регистрировали МПП мышечных волокон до наложения геля и в течение 60 мин действия геля. Регистрация МПП происходила в непосредственной близости от района прилегания геля к мышечным волокнам диафрагмы.

Гель без никотина (контроль, 6 мышц) не вызывал достоверных изменений МПП в течение 60 мин после наложения. Образцы геля с никотином вызывали деполяри-

зацию мышечных волокон в течение первых 5 мин после наложения. Деполяризация, вызываемая действием геля с низким содержанием никотина (ГНСН, 6 мышц) составила 2,9±0,8 мВ (р < 0,01). В случае геля с высоким содержанием никотина (ГВСН, 6 мышц) деполяризация достигала 5,0±0,8 мВ (р < 0,01) по сравнению с исходным уровнем МПП (рис. 2).

Рис. 2. Влияние наложения образцов силиконового геля на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы.

Кружки — контрольные опыты с гелем без никотина; квадраты — опыты с гелем с низким содержанием никотина (ГНСН); треугольники — опыты с гелем с высоким содержанием никотина (ГВСН). Отметка «0 мин» —величина МПП непосредственно перед наложением геля. Горизонтальной полоской отмечено время присутствия геля на поверхности диафрагмальной мышцы.

Наблюдаемая деполяризация существенно снижалась уже через 15 мин после наложения геля с никотином и практически исчезала к 60-й мин действия геля. Полученные данные подтвердили, что никотин действительно диффундирует из приготовленных нами образцов геля. Наблюдаемая начальная деполяризация соответствует эффектам микромолярных концентраций никотина, а ее последующее исчезновение объясняется десенситизацией нХР [11].

Далее было важно проверить, как долго никотин может диффундировать из геля. Для этого образцы протестированного на диафрагме геля помещали в пробирку с нормальным физиологическим раствором на трое суток, после чего повторяли физиологический тест. Оказалось, что и после столь длительного пребывания в физиологическом растворе образцы геля с никотином вызывали аналогичную деполяризацию мышечных волокон диафрагмальной мышцы (рис. 3). Эти опыты подтвердили, что никотин в течение трех суток стабильно выделяется из образцов геля.

В последующих опытах величину МПП мышечных волокон и параметры сокращений регистрировали через трое суток после имплантации геля к т. 8о1еш.

В контрольной группе из 8 крыс исходная величина МПП составила -64,1 ±0,3 мВ (308 волокон). Через трое суток использования ГНСН не наблюдалось достоверных изменений МПП по сравнению с контрольной группой, распределения МПП были сходными в обоих случаях (рис.4, А). В группе крыс, которым имплантировали ГВСН, значение МПП составило -61,7±0,3 мВ (290 волокон), т. е. было ниже на 2,4±0,3 мВ (р < 0, 01), чем в контрольной группе (рис. 4, Б). И в этом случае в обеих группах распределения МПП были сходными, но у крыс с ГВСН распределение было сдвинуто в сторону деполяризации по сравнению с контролем (см. рис. 4, Б).

После регистрации МПП исследуемые мышцы переносили на механографическую установку, где исследовали их сократительные характеристики. Регистрировали зави-

МПП,

~711 -72-73-74-75-76-77-78-79-80-

мВ

15

30

45 60

Время, мин

Рис. 3. Влияние одного и того же образца силиконового геля с никотином на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы при первичном тестировании

Результаты единичных экспериментов: А — опыты с гелем с низким содержанием никотина (ГНСН); Б — опыты с гелем с высоким содержанием никотина (ГВСН). Горизонтальной полоской отмечено время присутствия геля на поверхности диафрагмальной мышцы.

Рис. 4. Гистограммы распределения МПП мышечных волокон ш. зоієиз у контрольных крыс

А — гель с низким содержанием никотина (ГНСН); Б — гель с высоким содержанием никотина (ГВСН). Темные столбцы — контроль; заштрихованные столбцы — никотин; п — количество волокон.

симость силы сокращений от амплитуды приложенного стимула (прямая стимуляция), а также исследовали динамику утомления. Оказалось, что через трое суток действия геля с никотином наблюдается увеличение возбудимости мышечных волокон т. вокив по сравнению с контролем (рис. 5). Причиной этого явления могла бы быть незначительная деполяризация, наблюдаемая через трое суток использования ГВСН, которая,

в свою очередь, могла бы приводить к снижению порога возбудимости мышечных волокон. Однако такое же увеличение возбудимости наблюдалось и после применения ГНСН, когда величина МПП не отличалась от контрольной. В настоящее время трудно дать ясное объяснение механизма данного эффекта. Этот вопрос требует отдельного изучения.

Рис. 5. Зависимость силы сокращений (г) ш. всієш от амплитуды (В) приложенного стимула (прямая стимуляция) в контрольных мышцах (гель без никотина) и в мышцах после трех суток действия геля с никотином

1 — контрольные мышцы; 2 — гель с низким содержанием никотина (ГНСН); 3 — гель с высоким содержанием никотина (ГВСН).

В условиях утомляющей стимуляции мышц (один раз в секунду пачками стимулов с частотой 66 имп/с, длительность пачки 0,4 с) не наблюдалось достоверных изменений динамики утомления ш. 8о1еи8 через трое суток использования обоих типов геля с никотином по сравнению с контролем (рис. 6).

Рис. 6. Динамика утомления ш. воієив через трое суток после имплантации геля Черный цвет — гель без никотина (контроль); серый цвет — гель с никотином. Стимуляция тетану-сами один раз в секунду пачками стимулов с частотой 66 имп/с (длительность пачки 0,4 с). А — опыты с гелем с низким содержанием никотина (ГНСН); Б — опыты с гелем с высоким содержанием никотина (ГВСН). По оси ординат — максимальная сила тетанических сокращений относительно первого сокращения в процентах.

Таким образом, в ходе наших экспериментов установлено, что в отличие от культуры скелетных мышечных клеток С2С12, где аппликация агониста нХР карбахолина (10 мкмоль/л) в течение 4 суток вызывала гиперполяризацию мембраны [6, 7], трехсуточная доставка к зрелой т. 8о1еш крысы никотина в микромолярном диапазоне концентраций приводила к хронической деполяризации мышечных волокон на 2,4±0,3 мВ

(р < 0, 01).

Поскольку эксперименты с хронической доставкой никотина к зрелой скелетной мышце выполнены впервые, трудно со всей определенностью говорить о механизме наблюдаемой деполяризации и о причинах отличия эффекта от культуры клеток С2С12. Хорошо известно, что мышечный электрогенез во многом определяется активностью Ма,К-АТФазы. Как уже отмечалось выше, множество данных свидетельствуют о влиянии холиномиметиков на активность и индукцию Ма,К-АТФазы в зрелой скелетной мышце и в культуре скелетных мышечных клеток С2С12 [6, 7, 13, 18]. Что касается никотина, показано, что этот агонист с разным знаком модулирует электрогенную активность Ма,К-АТФазы в скелетной мышце крысы в зависимости от продолжительности его действия [17].

Предполагается, что функциональная связь между нХР и Ма,К-АТФазой является механизмом, за счет которого никотиновые агонисты способны модулировать Ма,К-АТФазу и мышечный электрогенез [1, 2, 3, 8, 17]. Ранее уже сравнивались эффекты АХ в культуре клеток С2С12, ооцитах Хвпорпв с экспрессированными нХР и в зрелой скелетной мышце [3]. Полученные в процитированной работе данные позволили предположить, что образование функционального комплекса нХР с Ма,К-АТФазой требует наличия определенных факторов или выполнения определенных условий, которые характерны только для зрелой мышечной клетки, но отсутствуют в таких моделях, как клетки С2С12 или ооциты. Возможно, это обстоятельство является причиной отличия хронических эффектов карбахолина в культуре клеток С2С12 и никотина в зрелой скелетной мышце.

Проведенное нами исследование было важно и с той точки зрения, что в условиях локальной доставки никотина к мышце можно было проверить принципиальную возможность хронического влияния никотина на мышцу без побочных системных эффектов, которые неизбежно сопутствуют другим способам хронической никотинизации (инъекции, применение специальных помп, доставка с питьевой водой). Например, хронически циркулирующий никотин вызывает как активацию, так и десенситизацию нейрональных никотиновых холинорецепторов [11, 14]. Это может существенно изменять функционирование холинергических структур ЦНС и косвенно сказываться на скелетной мускулатуре. Возможны и другие пути, запускаемые системными эффектами никотина. Так, нельзя исключить повышения уровня эндогенных дигиталисоподобных ингибиторов Ма,К-АТФазы, секреция которых может модулироваться никотином [5], что могло бы хронически изменять активность и/или экспрессию Ма,К-АТФазы. Наши опыты подтвердили способность никотина непосредственно модулировать мышечный электрогенез помимо системных эффектов, возможных при других способах хронической никотинизации.

Литература

1. Кравцова В. В., Драбкина Т. М., Прокофьев А. В. и др. Действие никотина на электро-генный вклад изоформ Na,K-АТФазы и сократительные характеристики скелетной мышцы крысы // Рос. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. 2008. Т. 94, №10. С. 1181-1190.

2. Кривой И. И., Драбкина Т. М., Васильев А.Н. и др. Анализ взаимодействия никотино-

вого холинорецептора и Na+ ,К+-АТФазы в скелетной мышце крысы и мембранном препарате электрического органа Torpedo // Рос. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. 2006. Т. 92, №2. С. 191-203.

3. Кривой И. И., Драбкина Т. М., Добрецов М. Г. и др. Функциональная связь никотиновых холинорецепторов и Na,K-АТФазы в скелетной мышце // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2004. Т. 90, №1. С. 59-72.

4. Connold A. L., Greensmith L., Tyc F., Vrbova G. A simple method for local delivery of various substances to the rat neuromuscular system // Brain Research Protocols. 1997. Vol. 1. P. 79-82.

5. Gooz M., Toth M., Vakkuri O. et al. Endogenous ouabain-like factor (OLF) secretion is modulated by nicotinic mechanisms in rat adrenocortical cells // Life Sci. 2004. Vol. 74. P. 21112128.

6. Henning R.H., Nelemans S. A., van den Akker J., den Hertog A. Induction of Na+ /K+-ATPase activity by long-term stimulation of nicotinic acetylcholine receptors in C2C12 myotubes // Br. J. Pharmacol. 1994. Vol. 111. P. 459-464.

7. Kragenbrink R., Higham S. C., Sansom S. C., Pressley T. A. Chronic stimulation of acetylcholine receptors: differential effects on Na,K-ATPase isoforms in a myogenic cell line // Synapse. 1996. Vol. 23. P. 219-223.

8. Krivoi 1.I., Drabkina T. M., Kravtsova V. V. et al. On the functional interaction between nicotinic acetylcholine receptor and Na+,K+-ATPase // Pflug. Archiv — Eur. J. Physiol. 2006. Vol. 452, N 6. P. 756-765.

9. Larsson L., Orlander J. Skeletal muscle morphology, metabolism and function in smokers and non-smokers. A study on smoking discordant monozygous twins // Acta Physiol. Scand. 1984. Vol. 10. P. 343-352.

10. Larsson L., Orlander J., Ansved T., Edstrom L. Effects of chronic nicotine exposure on contractile enzyme-histochemical and biochemical properties of fast- and slow-twitch muscles in the rat // Acta Physiol. Scand. 1988. Vol. 134. P. 519-527.

11. Lester R. A., Dani J. A. Acetylcholine receptor desensitization induced by nicotine in rat medial habenula neurons // J. Neurophysiol. 1995. Vol. 74. P. 195-206.

12. Mandel F., Drabkina T.M., Vasiliev A. N. et al. Chronic nicotine exposure affects the ouabain-sensitive (a2) isoform of Na,K-ATPase in rat diaphragm muscle // J. Gen. Physiol. 2005. Vol. 126. P. 6^-62а.

13. Nikolsky E. E., Zemkova H., Voronin V. A., Vyskocil F. Role of non-quantal acetylcholine release in surplus polarization of mouse diaphragm fibres at the endplate zone // J. Physiol. 1994. Vol. 477. P. 497-502.

14. Pidoplichko V. I., De Biasi M., Williams, J. T. Dani J. A. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons // Nature. 1997. Vol. 390. P. 401-404.

15. Pierce R. C., Kumaresan V. The mesolimbic dopamine system: The final common pathway for the reinforcing effect of drugs of abuse? // Neurosci. Biobehav. Rev. 2006. Vol. 30. P. 215-238.

16. Price T. B., Krishnan-Sarin S., Rothman D. L. Smoking impairs muscle recovery from exercise // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. Vol. 285. P. 116-122.

17. Prokofiev A. V., Drabkina T. M., Kravtsova V. V. et al. Nicotine in low doses modulates Na,K-ATPase in the rat diaphragm in a time-dependent and isoform-specific manner // 12th Int. ATPase Conf.: Na,K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease. Abstract. Aarhus, Denmark, August 5-10, 2008. P. 152.

18. Vyskocil F., Nikolsky E., Edwards C. An analysis of the mechanisms underlying the non-quantal release of acetylcholine at the mouse neuromuscular junction // Neurosci. 1983. Vol. 9, N 2. P. 429-435.

19. Wang L., McComb J. G., Weiss M. H. et al. Nicotine downregulates a2 isoform of Na,K-ATPase at the blood-brain barrier and brain in rats // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 199. P. 1422-1427.

Статья поступила в редакцию 15 октября 2009 г.