Разработка метода оценки показателя «Подлинность» вакцины менингококковой группы а полисахаридной с помощью ИФА

.ПРЕПАРАТЫ

Q>

О

Разработка метода оценки показателя «подлинность» вакцины менингококковой группы А полисахаридной с помощью ИФА

Немировская Т.И., Абрамцева М.В., Тарасов А.П., Мовсесянц А.А.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

СС

1

Development of identification assessment method for meningococcal group A polysaccharide vaccine by ELISA

Nemirovskaya T.I., Abramtseva M.V., TarasovA.P., Movsesyants A.A.

Federal State Budgetary Institution «Scientific Center for Expertise of Medical Application Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow

л

Согласно действующей ФСП на менингококковую группы А полисахаридную вакцину, ее подлинность оценивается в РТПГА. Указанный метод не всегда обеспечивает получение достоверных результатов, особенно при использовании его микромодификации. Большое значение при постановке данной реакции имеет и качество используемых реагентов: диагностических сывороток и эритроцитарных диагностикумов. В этой связи для доказательства точности получаемых результатов возникает необходимость в разработке препарата сравнения в виде отраслевого стандартного образца (ОСО). Была предпринята попытка разработки метода оценки показателя «Подлинность» менигококковой группы А полисахаридной вакцины в ИФА. Показано, что в диапазоне концентраций активного вещества 50-5 мкг/мл, наблюдается специфическая цветная реакция с гомологичной сывороткой. Подтверждено достоверное отличие результатов, полученных в гомологичной системе от результатов в ге-терологичной системе (99,9% по критерию Стьюдента).

Ключевые слова: вакцина, менингококк, полисахарид серогруппы А, полисахарид серогруппы С, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция торможения гемагглютинации (РТПГА), отраслевой стандартный образец (ОСО), достоверность, подлинность, иммуногенность.

Библиографическое описание: Немировская Т.И., Абрамцева М.В., Тарасов А.П., Мовсесянц А.А. Разработка метода оценки показателя «подлинность» вакцины менингококковой группы А полисахаридной с помощью ИФА // Биопрепараты. 2013. № 2. С. 39-43.

According to the current manufacturer’s monograph the identification of meningococcal group A polysaccharide vaccine is estimated by hemagglutination-ihibition reaction. This method does not always give reliable results, especially when its micromodification is used. Setup of this reaction also depends a lot on the quality of reagents used: diagnostic sera and red blood cell diagnostics. In this regard, in order to prove the accuracy of the results obtained, there is a need to develop a reference preparation in the form of industry reference standard (IRS). An attempt was made to develop a method for estimating the «identification» criterion for menigococcal group A polysaccharide vaccine by ELISA. It has been discovered that a specific colour reaction with homologous serum is observed in the range of concentration of active substance of 50-5 yg/ml. Significant difference between the results obtained in the homologous system and the results obtained in a heterologous system was confirmed (99.9% according to the Student’s t-distribution).

Key words: vaccine, meningococcus, serogroup A polysaccharide, serogroup C polysaccharide, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), hemagglutination inhibition test (HIR), industry reference standard (IRS), accuracy, identification, immunogenicity.

Bibliographic description: Nemirovskaya T.I., Abramtseva M.V., Tarasov A.P., Movsesyants A.A. Development of identification assessment method for meningococcal group A polysaccharide vaccine by ELISA//Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 2. P. 39-43.

Для корреспонденции:

Немировская Т.И. - начальник лаборатории бактериальных вакцин ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.

Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России,

119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41 e-mail: lot85@mail.ru

Статья поступила 02.04.2013 г, принята к печати 22.05.2013 г

Менингококковая инфекция широко распространена во всем мире. Заболеваемость может носить как эндемичный, так и эпидемический характер. Наиболее частой причиной менингитов менингококковой этиологии является Neisseria meningitidis серогрупп А, C и В. В Российской Федерации лидирующую позицию в качестве причины менингококковой инфекции занимает менингококк серогруппы А. Так, в Москве на долю заболеваний, обусловленных менингококком серогруппы А, приходится около 70,0% из числа возбудителей, выделенных от больных менингококковой инфекцией. Показатель летальности от генерализованных форм инфекции составляет 12,5% [3].

Наиболее эффективным средством для профилактики данной инфекции является вакцинация.

Вакцина менингококковая группы А полисахаридная производства НПО «Микроген», представляет собой капсульный специфический полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы А. В практике отечественного здравоохранения вакцина применяется с 1981 г. для профилактики генерализованных форм менингококко-вой инфекции у детей от 1 года, подростков и взрослых и с целью экстренной профилактики в очагах инфекции, вызванной менингококком серогруппы А. Введение вакцины приводит к быстрому и интенсивному нарастанию в крови вакцинированных людей специфических антител, обеспечивающих через одну неделю невосприимчивость к менингококковой инфекции, вызываемой менингококками серогруппы А и сохраняющуюся не менее двух лет

Технология получения вакцины менингококковой группы А полисахаридной предусматривает культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде Франца с последующим выделением из полученной биомассы менингококкового специфического полисахарида и его очисткой.

Требования к качеству менингококковых полисахаридных вакцин изложены в рекомендациях ВОЗ [7-12] и Европейской Фармакопее [6].

Вследствие невосприимчивости лабораторных животных к менингококковой инфекции, удовлетворительная экспериментальная модель оценки специфической активности менингококковых полисахаридных вакцин отсутствует. Изучение иммуногенности этой группы вакцин осуществляется в реакции иммунного бактериолиза в парных сыворотках привитых людей. Такие испытания проводят при разработке новых вакцин, а также при освоении производственного выпуска или любом изменении технологии производства препарата. Рутинный контроль вакцины менингококковой группы А полисахаридной предусматривает эксперти-

зу качества по следующим параметрам: «Описание», «Потеря в массе при высушивании», «Механические включения», «Фосфор», «Молекулярные параметры», «Подлинность», «Стерильность», «Пирогенность», «Аномальная токсичность», «Прозрачность», «Цветность», «Время растворения», «Точность розлива», «Пирогенность», «Содержание лактозы».

В настоящее время на предприятии ФГУП «НПО «Микроген» произошло изменение места производства вакцины менингококковой группы А полисахаридной со значительным усовершенствованием технологии ее изготовления и внесением изменений в методы контроля ряда показателей качества.

Согласно требованиям действующей ФСП, подлинность вакцины менингококковой группы А полисахаридной и субстанции для ее приготовления оценивается полуколичественным методом в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) [4]. При этом вакцина должна тормозить реакцию пассивной гемагглютинации в гомологичной «А» системе (сыворотка диагностическая менингококковая серогруппы А, диагностикум эритроцитарный менингококковый серогруппы А) в концентрации не выше 0,4 мкг полисахарида в 1 мл при отсутствии тормозящего эффекта в гетерологичной «С» системе (сыворотка диагностическая менингококковая серогруппы С, диагностикум эритроцитарный менингококковый серогруппы С) в концентрации полисахарида 50 мкг в 1 мл. Указанный метод не всегда обеспечивает получение достоверных результатов, особенно при использовании его микромодификации. Большое значение при постановке данной реакции имеет и качество используемых реагентов: диагностических сывороток и эритроцитарных диагно-стикумов. В этой связи для доказательства точности получаемых результатов возникает необходимость в разработке препарата сравнения в виде отраслевого стандартного образца (ОСО). Кроме того, существенным недостатком метода РТПГА является то, что данный метод не позволяет судить о количественном содержании полисахарида в вакцине. В связи с вышеизложенным, целью наших исследований была разработка альтернативного или дополнительного метода оценки показателя «Подлинность» вакцины менингококковой группы А полисахаридной. Согласно требованиям Европейской Фармакопеи [6], показатели «Подлинность» и «Серологическая специфичность» менингококковых полисахаридных вакцин следует определять при помощи иммунохимических методов. В частности, имму-ноферментный анализ используется при контроле зарубежных вакцин против менингококковой инфекции: Менцевакс АCWY (вакцина менингококковая полисаха-

ПРЕПАРАТЫ

ридная серогрупп АCWY) и Менюгейт (вакцина менин-гококковая группы С олигосахаридная конъюгированная). Однако основные реагенты, используемые при постановке ИФА зарубежных препаратов, как правило, имеют некоммерческое происхождение и определяются как «НД фирмы». Нами была предпринята попытка разработки метода оценки показателей «Подлинность» и «Серологическая специфичность» отечественной ме-нингококковой группы А полисахаридной вакцины с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) [5, 9].

Материалы и методы:

1. Используемое оборудование:

- микропланшеты плоскодонные для иммунохими-ческих реакций NUNC<Maxisorp>, Дания

- спектрофотометр Multiscan EX («Thermo», Финляндия);

- шейкер PSU-2 («Биосан», Латвия);

- рН-метр рН-410 («НПКФ Аквилон», Россия);

- дозатор многоканальный 50-300 мкл (Ленпипет Россия);

- дозатор 100-1000 мкл (Eppendorf, Германия);

- дозатор 1-10 мкл (Ленпипет, Россия);

- вошер Wellwash 4MK2 («Thermo», Финляндия);

- холодильник с температурой 4оС.

2. Реагенты:

- Вакцина менингококковая группы А полисахаридная, ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России;

- сыворотка диагностическая менингококковая серогруппы А неадсорбированная, ООО «БиоДиагностика», ТУ 9388-004-68925985-10;

- сыворотка диагностическая менингококковая серогруппы С неадсорбированная, ООО «БиоДиагностика», ТУ 9388-004-68925985-10;

- конъюгат антител козы против иммуноглобулина кролика со щелочной фосфатазой, «Сигма».

3. Растворы:

- карбонат-бикарбонатный буфер 0,05 М, рН 9,6 (КББ);

- промывочный буфер(фосфатный) с Твин 20 0,1 % (ПБТ), рН 7,4 0,05 М;

- фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,4 (ФБР) 0,05 М;

- диэтаноламиновый буферный раствор, рН 9,8 (ДЭБ) 1 М;

- 1 и 0,5% растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере (ФБР);

- раствор субстрата щелочной фосфатазы (0,132% лара-нитрофенилфосфат в ДЭБ);

- 10% раствор едкого натра.

4. Описание методики

Содержимое ампулы вакцины менингококковой группы А полисахаридной, составляющее 250 мкг полисахарида, растворяли в 2,5 мл КББ. Получали рабочее разведение вакцины в растворе КББ, которое соответствовало 100 мкг/мл. Из рабочего разведения вакцины готовили четыре разведения с концентрацией полисахарида 50, 20, 10 и 5 мкг/мл. Все разведения вакцины готовили в стерильных пробирках из лабораторного стекла.

Для постановки ИФА использовали два микропланшета. По 100 мкл каждого из исследуемых разведений вакцины вносили в четыре расположенные рядом колонки микропланшета. Один планшет использовали для двух исследуемых разведений вакцины. В колонки 1-4 вносили одну концентрацию вакцины, например,

50 мкг/мл. В колонки 5-8 вносили следующую концентрацию, например, 20 мкг/мл. Оставшиеся колонки, а именно 9-12 на каждом планшете служили в качестве контрольных. В контрольные лунки вносили 1% раствор БСА в ФБР Микропланшеты инкубировали при 4-60С в течение 16-18 ч. Затем трижды производили отмывку микропланшета ПБТ с помощью вошера. После отмывки во все лунки вносили по 200 мкл 1% раствора БСА в ФБР Инкубировали в течение 90 мин при температуре 20-220С на шейкере в режиме 5-6 колебаний/с. Трижды проводили отмывку микропланшета с помощью во-шера.

Далее готовили разведения диагностических менин-гококковых сывороток серогрупп А и С. Содержимое ампул с лиофилизированной сывороткой растворяли в 1 мл дистиллированной воды (исходное разведение). Для получения разведения сывороток 1:2000 к 6 мкл исходного разведения добавляли 12 мл 0,5% раствора БСА в ФБР В первые две колонки для каждого исследуемого разведения вакциныт (т.е. в колонки 1-2 и 5-6) вносили по 100 мкл менингококковой сыворотки серогруппы А в разведении 1:2000, а в колонки 3-4 и 7-8 вносили по 100 мкл менингококковой сыворотки серогруппы С в разведении 1:2000. Далее микропланшеты инкубировали на шейкере в режиме 5-6 колебаний/с при температуре 20-220С в течение 90 мин. На следующем этапе микропланшеты пятикратно отмывали ПБТ Затем конъюгат антител козы против иммуноглобулина кролика со щелочной фосфатазой разводили в соотношении 1:2000 при помощи 0,5% раствора БСА в ФБР Разведенный таким образом конъюгат, вносили по 100 мкл в каждую лунку микропланшета и инкубировали на шейкере 90 мин при комнатной температуре. На следующем этапе микропланшеты пятикратно отмывали ПБТ, затем вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата щелочной фосфатазы и инкубировали в течение 10 мин в темноте. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл 10% раствора едкого натра. Затем проводили измерение оптической плотности реакционной смеси с помощью спектрофотометра при 405 нм, осуществляли необходимые расчеты и оценку результатов.

Для исследований использовалась одна и та же серия микропланшетов. Десять отобранных случайным образом микропланшетов заполняли дистиллированной водой по 350 мкл на лунку. Затем проводили измерение оптической плотности при 405 нм. Средняя оптическая плотность в лунках составляла 0,025 ед. оптической плотности. Среднеквадратическое отклонение составило

0,002 ед. оптической плотности. Таким образом, микропланшеты можно считать стандартными; их показатели собственной оптической плотности не могли оказать существенного влияния на полученные результаты.

С1

Подлинность и серологическая специфичность вакцины менингококковой группы А полисахаридной в ИФА

Концентрация полисахарида гр. А в вакцине, мкг/мл Средняя опт. плотность в лунках с сывороткой серогруппы А, х ± 2,7с, ед. опт. плотн. Средняя опт. плотность в лунках с сывороткой серогруппы С, х ± 2,7с, ед. опт. плотн.* Фактическая разность опт. плотности

50 3,017+0,225 0,156+0,079 2,861 0,136 Достоверно

20 2,898+0,231 0,115+0,084 2,783 0,113 Достоверно

10 2,457+0,344 0,156+0,073 2,301 0,151 Достоверно

5 2,466+0,301 0,116+0,054 2,350 0,148 Достоверно

‘Средняя величина оптической плотности рассчитывалась, исходя из 48 измерений для каждой концентрации вакцины.

**Для определения достоверности различий средних величин оптической плотности использовали следующие формулы [1, 2]:

Д= |Хср1 — Хср2| > 1р Э

£(х-Хср)12+£(х-Хср)22 п1+п2-2

где

X ср1 - средняя оптическая плотность при использовании сыворотки диагностической менингококковой серогруппы А;

Хср2 - средняя оптическая плотность при использовании сыворотки диагностической менингококковой серогруппы С;

критерий Стьюдента для числа степеней свободы, равного 4о, и уровня достоверности, равного 0,1% (достоверность различий средних величин составляет 99,9%), принят равным 3,55 [2];

п1 - число измерений для сыворотки серогруппы А (п1= 48); п2 - число измерений для сыворотки серогруппы С (п2= 48).

Результаты и обсуждение

Как видно из таблицы, вакцина менингококковая группы А полисахаридная в концентрациях 50, 20, 10 и 5 мкг/мл вступает в иммунохимическую реакцию с диагностической менингококковой сывороткой серогруппы А, в результате чего наблюдается выраженная цветная реакция с показателями оптической плотности >2,4 оптических единиц. При использовании в аналогичной постановке эксперимента диагностической менингококковой сыворотки серогруппы С наблюдается незначительный фон с показателями оптической плотности <0,2 оптических единиц, не зависящий от концентрации вакцины. Достоверность различия в показателях оптической плотности при использовании обеих сывороток > 99,9 % (критерий Стьюдента t=3,55 при числе степеней свободы = 46).

Таким образом, метод иммуноферментного анализа в разработанной нами модификации может быть использован для подтверждения подлинности и специфичности вакцины менингококковой группы А полисахаридной. Концентрация вакцины, позволяющая получить стабильные достоверные результаты, определена нами, как 5 мкг/мл. Однако для правильной интерпретации получаемых результатов в ИФА необходим препарат сравнения в виде ОСО.

В следующей серии экспериментов для постановки ИФА использовали концентрации вакцины, составляющие 5, 4, 3, 2, 1 и 0,5 мкг/мл. В результате реакции на-

блюдалась линейная зависимость оптической плотности от концентрации вакцины. Показатели оптической плотности изменялись в пределах 2,5-1,0 ед. оптической плотности (±20%). Эта зависимость свидетельствует о принципиальной возможности использования ИФА для количественного определения содержания полисахарида серогруппы А в вакцине менингококковой группы А полисахаридной.

Мы предлагаем следующие критерии оценки подлинности вакцины:

1. Оптическая плотность в лунках с отрицательным контролем (в лунках без сыворотки) не должна превышать 0,150 ед.

2. Отношение оптических плотностей в лунках, где использовалась сыворотка серогруппы А и в лунках, где использовалась сыворотка серогруппы С должно быть более 4 (на практике достоверность 2 показателей считается доказанной, если их соотношение превосходит значение критерия Стьюдента (^ для данного числа степеней свободы (п) и для данного уровня значимости (р); в нашем случае для одного планшета п = 15, р=0,001, следовательно t=4,1).

Выводы:

1. Разработанный метод оценки показателей «Подлинность» и «Серологическая специфичность» отечественной менингококковой группы А полисахаридной

ПРЕПАРАТЫ

вакцины с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет достоверно определять подлинность вакцины менингококковой группы А полисахаридной.

2. Использование метода оценки показателя «Подлинность» вакцины менингококковой группы А полисахаридной с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) подчеркивает необходимость разработки в качестве препарата сравнения стандартного образца (ОСО).

3. Рекомендованная концентрация вакцины для метода оценки показателей «Подлинность» отечественной менингококковой группы А полисахаридной вакцины с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) - 5 мкг/мл.

Литература:

1. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: ГИЗМЛ, 1962. С. 31-33.

2. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая Школа, 1980. С. 270-271.

3. Письмо Департамента здравоохранения г. Москвы от 19.07.2010 № 31/210 «О состоянии заболеваемости менингококковой инфекцией».

4. Пол У. Иммунология. М.: Мир, 1989. Т. 3. С. 77-82.

5. Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. С. 162-170.

6. European Pharmacopoeia 6.0. 2008.

7. Recommendations to assure the quality, safety and efficacy of group A eningococcal conjugate vaccines. Geneva, 2006.

8. Recommendations for the production and control of meningococcal group C Conjugate vaccines Geneva, 2004.

9. Tijssen P. Practice and theory of immunoassays. Amsterdam-New-York: Elseviеr, 1985. P. 10-36.

10. WHO technical reports series No 594. Geneva. 1976.

11. WHO technical reports series No 627. Geneva. 1978.

12. WHO technical reports series No 658. Geneva. 1981.