СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ПАТОЛОГИИ
METHOD OF PREDICTING RISK OF DEVELOPMENT OF OCCUPATIONAL BRONCHOPULMONARY PATHOLOGY

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии при воздействии на организм вредных производственных факторов.
Известен способ прогнозирования риска развития бронхолегочной патологии, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности на основании этого определение полиморфных вариантов гена (см. Веселовская М.В. Роль полиморфных вариантов генов-кандидатов хронической обструктивной болезни легких в особенностях течения заболевания автореферат. Автореферат диссертации к.м.н., Москва, 2007 г., с.11-12).
Однако данный способ имеет низкую пропускную способность ввиду невысокой скорости проведения обследования пациентов, что затрудняет прогнозирование риска развития бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Задачей настоящего изобретения является повышение достоверности прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
Техническим результатом изобретения является повышение скорости проведения прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии.
Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена матриксной металлопротеиназы 1 - полиморфизм 1607delG, при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры MP1-F 138F BIOTIN - GCG ТСA AGA CTG ATA TCT TAC TCA TAA АСА ATA и MP1-R 138R АСА TgT TAT gCC ACT TAg ATg Agg AAA, а после проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее производят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют, какой вариант полиморфизма 1607delG имеет место в нуклеотидной последовательности, причем при выявлении отсутствия инсерций/делеций гуанина - прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии менее 20%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, при выявлении гиперсекреторного гетерозиготного варианта 1G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (30÷50)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, а при выявлении гиперсекреторного гомозиготного варианта 2G мутации в нуклеотидной последовательности, прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (60÷80)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов.
Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".
Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.
Следовательно, заявленный способ является доступным, и, следовательно, практически применимым.
Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить повышение скорости проведения прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии при воздействии на организм вредных производственных факторов, что, в свою очередь, повышает достоверность прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени
На фиг.1 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту не имеющему инсерций/делеций гуанина G/G в нуклеотидной последовательности - соответствует норме (пример 1). На фиг.2 изображена пирограмма с вариантом гетерозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему инсерцию гуанина G/-(1G) (пример 2). На фиг.3 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему делецию гуанина в исследуемой области гена -/-(2G) (пример 3).
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов.
У пациентов осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК- сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.
Объем Полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом используют реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса используют специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «MP1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cyclen» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCyclen» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95°- 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.
После проведения амплификации осуществляют пробоподготовку образцов для секвенирования. После амплификации ПЦР-фрагмент связывается с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином, за счет образования комплекса биотин-стрептавидин, очищается от свободных компонентов реакционной смеси с помощью серии отмывок и проходит стадию щелочной денатурации. В результате остается амплифицированный с биотинилированного праймера одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который используют в качестве матрицы в реакции секвенирующего синтеза.
На одноцепочечный ПЦР-ампликлон, выступающий в качестве матрицы, гибридизуется секвенирующий праймер «MP1-S» в концентрации 0,3 пМ, разведенный в буфере для отжига.
После проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала.
С помощью прибора пиросеквенатора, например, «PyroMаrk Q96 MD» или «PyroMаrk Q24» (Германия), проводят пиросеквенирование (фиг.1).
Принципиальная схема метода представлена на фиг.2.
На данной стадии в ходе секвенирования комплементарной к матричному фрагменту цепи высвобождающийся пирофосфат проходит серию ферментативных превращений, в результате чего регистрируется хемилюминесцентный сигнал (фиг.3). Проводят инкубацию исследуемого иммобилизированного фрагмента ДНК в присутствии четырех ферментов (сульфурилазы, люциферазы, апиразы, Taq-полимеразы) и субстратов (аденозин-5-фосфосульфата (APS) и люцеферина) для преобразования высвобождающегося пирофосфата в хемилюминисцентный сигнал. Реакция пиросеквенирования включает следующие стадии:
- Добавляют один из четырех дезоксинуклеотид-3-фосфатов (dNTP) в реакционную смесь. В том случае, если добавленный нуклеотид комплементарен матричной цепи ДНК, происходит встраивание в растущую цепь, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Каждый акт включения нуклеотида в цепь ДНК сопровождается высвобождением пирофосфата (PPi) в эквимолярном количестве.
- Фермент сульфурилаза катализирует процесс образования молекулы АТФ-аденозин 3 фосфат из высвободившегося пирофосфата и присутствующего в реакционной смеси аденозин-5-фосфосульфата (APS).
- Созданная молекула АТФ-аденозин-3-фосфат (АТР) запускает процесс превращения люциферина в оксилюциферин, катализируемого ферментом люциферазой, в результате чего генерируется хемилюминесцентный сигнал, величина которого пропорциональна количеству АТР.
- Хемилюминисцентный сигнал регистрируют CCD-камерой, он отображается в виде пика на пирограмме. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТР таким образом, что новый нуклеотид добавляется в цепь ДНК только при полной деградации не встроившихся дезоксинуклеотид-3-фосфатов. Последовательное добавление dNTP обеспечивает появление пиков на пирограмме, составляющих нуклеотидную последовательность исследуемого генетического локуса (фиг.3).
Далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют какой вариант мутации имеет место в нуклеотидной последовательности.
При воздействии на организм вредных производственных факторов и выявлении отсутствия инсерций/делеций гуанина - прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии менее 20%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, при выявлении гиперсекреторного гетерозиготного варианта 1G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (30÷50)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, а при выявлении гиперсекреторного гомозиготного варианта 2G мутации в нуклеотидной последовательности, прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (60÷80)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов.
Пример 1. Больной В., 52 года
Кровь исследовали заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем Полимерной цепной реакции - 25 мкл, использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «МР1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергали пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD» (Германия).
При анализе результатов был выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, не имеющий инсерций/делеций гуанина G/G - соответствует нормальному содержанию фермента ММП-1 (фиг.1).
При анализе анамнеза и проф. маршрута пациента было выявлено, что больной В. работал газорезчиком, а течение 22 лет на предприятии асбестоцементных изделий, подвергаясь воздействию асбестоцементной пыли (величина пылевой нагрузки - менее 100 грамм за весь период работы), неблагоприятных микроклиматических условий, труд был связан с физическим напряжением. По результатам обследования был поставлен диагноз нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу.
По данным биохимических исследований: нормальное содержания про-ММП-1 и нейтрофильной эластазы, повышение ТИМП-1.
Вывод: у больного В. был выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, не имеющий инсерций/делеций гуанина G/G - соответствует нормальному содержанию фермента ММП-1. Профессиональной бронхолегочной патологии не наблюдается. Риск развития профессиональной бронхолегочной патологии - менее 20%.
Пример 2. Больной И., 42
Кровь исследовали заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «МР1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергали пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD».
При анализе результатов был выявлен гетерозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий инерцию гуанина G/-(1G) (фиг.2).
При анализе анамнеза и профмаршрута пациента было выявлено, что больной И. в течение 8 лет работал на Тульском заводе точного машиностроения формовщиком и заливщиком металла в контакте с повышенными концентрациями кварцсодержащей пыли; в течение 4 лет - котлочистом в контакте с повышенными концентрациями угольной пыли. Через 7 лет после начала работы был поставлен диагноз пневмокониоз. При обследовании в НИИ МТ РАМН диагноз был подтвержден и уточнен: Силикоз. Эмфизема легких. Очаговый туберкулез легких.
По данным биохимических исследований: снижение содержания про-ММП-1 и повышение содержания ММП-2,8; нейтрофильной эластазы и ТИМП-1
Вывод: у больного И. был выявлен гетерозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий инерцию гуанина G/-(1G), свидетельствующий о повышении уровней фермента, что и явилось причиной развития профессионального бронхолегочного заболевания, при воздействии вредных производственных факторов.
Пример 3. Больной Н., 65 лет
Кровь исследовали заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем Полимерной цепной реакции - 25 мкл, использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «МР1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергали пиросеквенированию (на приборах «РyrоMark Q96 MD» или «PyroMark Q24», германия).
При анализе результатов выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий делецию гуанина в исследуемой области гена -/- (2G) (фиг.3).
3
3
3
3
3
3
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больной Н. 2 года работал в литейном цехе АМО «ЗИЛ» заливщиком металла, 4 года - вагранщиком в литейном цехе АМО «ЗИЛ», 11 лет - вагранщиком в литейном цехе АМО «ЗИЛ», подвергаясь воздействию кварцсодержащей пыли, превышающей ПДК (2 мг/м) 6,0 мг/м - 25,4 мг/м; оксида углерода, в концентрациях, превышающих ПДК (20 мг/м) до 34,63 мг/ м - 100 мг/м; производственного шума; неблагоприятных микроклиматических условий. Через 1 год после начала работы в легких впервые были выявлены изменения, характер которых уточнен не был, больной продолжал работать. Через 15 лет после этого больного стала беспокоить одышка при ранее переносимой физической нагрузке, еще раньше появился сухой кашель, затем стала отделяться скудная мокрота, однако больной не придавал этому значения, к врачам обращался редко. С 1983 г. наблюдается по месту работы с диагнозом: Хронический бронхит. При детальном обследовании в клинике ГУ НИИ МТ РАМН был диагностирован пылевой бронхит 1 ст. Ретенционная киста правого легкого. ДН-1 ст, с 1991 г. является инвалидом 2 профессиональной группы. При повторных обследованиях в клинике (ежегодно с 1994 г.) было выявлено дальнейшее прогрессирование легочного процесса (за счет инфекционного компонента) в виде появления регионарного пневмосклероза нижней доли справа, бронхоэктазий, эмфиземы легких, нарастания дыхательной недостаточности и гипоксемии.
По данным биохимических исследований: снижение содержания про-ММП-1, а также повышение нейтрофильной эластазы и ТИМП-1.
Вывод: у больного И. был выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий делецию гуанина в исследуемой области гена -/- (2G), свидетельствующий о повышении уровней фермента, что и явилось причиной развития профессионального бронхолегочного заболевания при воздействии вредных производственных факторов.
Предлагаемый способ прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии позволяет повысить скорость проведения прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, что, в свою очередь, повышает достоверность прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Он может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.