Ингибирование активности белка теплового шока 90: подходы к селективной радиосенсибилизации опухолей

Ингибирование активности белка теплового шока 90: подходы к селективной радиосенсибилизации опухолей

Кудрявцев В.А., Хохлова А.В., Мосина В.А., Кабаков А.Е.

МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, Обнинск

Белок теплового шока 90 (БТШ90) участвует в регуляторных и сигнальных реакциях, обеспечивающих радиорезистентность раковых клеток. Рассматриваются возможности ингибирова-ния этого белка с целью радиосенсибилизации злокачественных опухолей и повышения эффективности лучевой терапии. В данном исследовании сравнивались эффекты известных ингибиторов функциональной активности БТШ90 (гелданамицин, радицикол, 17AAG) на радиочувствительность клеточных линий, происходящих из карцином (HeLa, MCF-7, и нормальных тканей (293, BJ) человека. После предобработки клеток ингибитором БТШ90 и последующего воздействия у-излучения в дозах 2-6 Гр оценивались такие параметры как клеточная жизнеспособность и клоногенность, а также количество двунитевых разрывов в ядерной ДНК и динамика их репарации. Из полученных результатов следует, что с помощью наномолярных (т.е. клинически достижимых) концентраций ингибиторов активности БТШ90 можно добиться значительной радиосенсибилизации раковых клеток без какого-либо повышения радиочувствительности нормальных клеток. На молекулярном уровне селективное радиосенсибилизирующее действие ингибиторов активности БТШ90 было обусловлено торможением процессов репарации ядерной ДНК в облучённых раковых клетках и отсутствием аналогичного эффекта в облучённых нормальных клетках. Такие результаты позволяют надеяться, что радиосенсибилизаторы на основе ингибиторов активности БТШ90 будут селективно усиливать радиационный ответ опухоли, не увеличивая риска осложнений из-за лучевого поражения прилегающих нормальных тканей.

Ключевые слова: клеточная радиорезистентность, радиочувствительность, у-излучение, шаперон, молекулярная мишень, разрывы ДНК, фосфорилирование гистонов, репарация ДНК, опухолевые клетки, лучевая терапия.

Введение

Борьба с онкологическими заболеваниями является важнейшей задачей современной медицины, и лучевая терапия считается одним из наиболее действенных способов лечения солидных опухолей. Существуют, однако, две серьёзные проблемы, ограничивающие применение лучевой терапии и снижающие её эффективность: 1) многие опухоли радиорезистентны; 2) бывает риск осложнений из-за радиационного повреждения нормальных тканей. Обе эти проблемы можно решить или, по крайней мере, минимизировать путё создания и использования селективных радиосенсибилизаторов - специальных веществ, которые способны повышать радиочувствительность злокачественных клеток, не повышая при этом радиочувствительности нормальных клеток. Чтобы подобрать эффективный радиосенсибилизатор, необходима предварительная исследовательская работа по идентификации молекулярных мишеней, ответственных за радиорезистентность раковых клеток, а также по целевому скринингу разнообразных соединений, реагирующих с этими мишенями.

В качестве молекулярных мишеней для лучевой терапии обычно рассматриваются внутриклеточные белки, влияющие на радиационный ответ опухоли (например, компоненты систем репарации ДНК, регуляторы клеточного цикла, факторы устойчивости к апоптозу и пр.) [1]. Соответственно, модуляторы экспрессии или биологической активности таких белков могли бы

Кудрявцев В.А. - научн. сотр.; Хохлова А.В. - мл. научн. сотр.; Мосина В.А. - научн. сотр.; Кабаков А.Е.* - зав. лаб., к.б.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России.

•Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (484) 399-71-88 или (484) 399-33-97; e-mail: aekabakov@hotmail .com.

использоваться как радиосенсибилизаторы опухолей. Белок теплового шока 90 (БТШ90) является АТФ-зависимым шапероном и выглядит особенно перспективной молекулярной мишенью, поскольку его функционирование необходимо для реализации нескольких радиопротекторных механизмов, действующих в облучённых раковых клетках; в частности, БТШ90 активирует ферменты репарации ДНК и помогает избежать апоптоза или «митотической катастрофы» [2-4]. АТФ-связывающий каталитический центр БТШ90 имеет уникальную молекулярную структуру, что позволяет находить или создавать специфичные ингибиторы функциональной активности этого белка [5]. Сейчас известно около 2-х десятков природных и синтетических ингибиторов БТШ90, и некоторые из них проходят доклиническое тестирование или I-III стадии клинических испытаний как потенциальные противоопухолевые агенты [6]. Для нескольких ингибиторов БТШ90 описано их радиосенсибилизирующее действие на опухолевые клетки, растущие in vitro или в мышах [7-10]. Все это позволяет обсуждать возможности применения ингибиторов БТШ90 в лучевой терапии, а также мотивирует дальнейшее изучение вызываемых ими эффектов.

В настоящей работе изучалось, как ингибирование шаперонной активности БТШ90 действует на радиочувствительность раковых и нормальных клеток человека. Результаты этого сравнительного исследования демонстрируют, что клинически достижимые (наномолярные) концентрации ингибиторов БТШ90 (гелданамицин, радицикол, 17AAG) оказывают существенное радиосенсибилизирующее действие только на раковые клетки, не ослабляя радиорезистентности нормальных клеток. Полученные данные подтверждают перспективность создания селективных радиосенсибилизаторов на основе ингибиторов активности БТШ90.

Материалы и методы

Объектами исследования были клетки опухолевых линий, происходящих из карцином молочной железы (MCF-7), щитовидной железы (КТС-1) и шейки матки (HeLa) человека. Для сравнительных экспериментов использовали неопухолевые клетки эпителия эмбриональной почки (линия 293) и фибробласты кожи (линия BJ) человека. Все эти клеточные культуры выращивались в среде DMEM с добавлением 10%-ной телячьей фетальной сыворотки, 2 моль/л L-глютамина и 10000 IU/мл пенициллин/стрептомицина (Hyclone, США), в инкубаторе с влажной атмосферой и 5% СО2 при 37 °C.

Ингибиторы шаперонной активности БТШ90 [гелданамицин, радицикол (оба от Biomol, США) и 17AAG (Sigma, США)] были растворены в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавлялись в среду роста к клеточным культурам за 20-24 ч до радиационного воздействия. Аликвоты ДМСО вносились в контрольные образцы.

Пластиковые флаконы с распластанными клетками подвергали прямому воздействию у-излучения на радиотерапевтической установке «Луч-1» (Латвия) с у-источником 60Со и интенсивностью 0,9-1 Гр/мин, так чтобы экспонированные клетки получали дозы 2-8 Гр в течение нескольких минут.

Цитотоксические эффекты облучения и пост-радиационное выживание культивируемых клеток оценивали в МТТ-тесте и по вырастанию клеточных колоний (тест на клоногенность), как описано ранее [11]. Значения D0 и «факторы изменения дозы» (ФИД) рассчитывались из кривых выживания.

Места локализации фосфорилированного H2AX гистона, которые называются «yH2AX фокусами» и являются сайтами двунитевых разрывов ядерной ДНК и их репарации, выявляли согласно описанному протоколу [12] с помощью мышиных моноклональных антител к фосфо-рилированному H2AX гистону и «вторых» антител, конъюгированных с флуорохромом alexa-fluor 488 (оба от Millipore, США). Препараты окрашенных клеток анализировали на конфокальном микроскопе (Leica TCS SPE, Германия) с использованием программы интегрального анализа изображений LAS software.

Все количественные результаты представлены как усреднённые данные (+ разброс) 4-6 независимых экспериментов с 3-мя параллелями для каждой точки. Достоверность различий оценивали с помощью программы ANOVA и подтверждали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для нашего исследования были взяты 5 клеточных линий, происходящих из опухолей или нормальных тканей и обладающих разной радиочувствительностью, что видно при сравнении величин D0 (табл. 1), рассчитанных из кривых выживания. Из полученных данных следует, что наиболее радиочувствительной была культура 293 (неопухолевые клетки), а самой радиорезистентной - культура HeLa (клетки цервикальной карциномы). При оценке эффектов 3-х ингибиторов БТШ90 (гелданамицин, радицикол и 17AAG) на необлучённые клетки было обнаружено, что их концентрации в диапазоне до 300 нМ не оказывали цитотоксического действия на неопухолевые клеточные культуры 293 и BJ (данные не приведены); именно такие клинически значимые концентрации ингибиторов затем использовались в экспериментах по радиосенсибилизации.

Таблица 1

Средние значения D0, рассчитанные из 4-5 кривых выживания

для каждой клеточной линии

Клетки HeLa MCF-7 KTC-1 293 BJ

Do(Гр) 4 + 0,4 2 + 0,3 3 + 0,35 1,6 + 0,2 2 + 0,2

Влияние ингибитора БТШ90 на пост-радиационное выживание клеточных колоний (клоно-генность) показано на рис. 1, где хорошо видно, что предобработка 17AAG радиосенсибилизи-ровала опухолевые культуры HeLa, КТС-1 и MCF-7, не снижая при этом клоногенность облучённых неопухолевых клеток линии BJ и более радиочувствительной линии 293. Очень похожие результаты с такой же селективностью радиосенсибилизирующего действия по отношению к опухолевым клеткам получались с 2-мя другими ингибиторами - гелданамицином и радицико-лом, и средние значения «фактора изменения дозы» (ФИД), рассчитанные для 10% выживания, представлены в табл. 2. Важно, что клинически достижимые (35-300 нМ) концентрации ингибиторов БТШ90 давали возможность селективно радиосенсибилизировать клетки карциномы HeLa (рис. 1), изначально обладающие довольно высокой радиорезистентностью (см. табл. 1); это позволяет надеяться, что аналогичный подход можно будет применять in vivo для селективного усиления радиационного ответа опухолей, устойчивых к лучевой терапии.

Таблица 2

Средние значения фактора изменения дозы (ФИД), рассчитанные для 10% выживаемости опухолевых клеток и 3-х концентраций радиосенсибилизатора 17ДДО

Клетки Концентрации 17AAG и значения ФИД

HeLa 35 нМ 17AAG ФИД = 1,29 + 0,07 100 нМ 17AAG ФИД = 1,66 + 0,11 200 нМ 17AAG ФИД = 2,05 + 0,15

Mcf-7 35 нМ 17AAG ФИД = 1,22 + 0,06 100 нМ17AAG ФИД = 1,57 + 0,12 200 нМ17AAG ФИД = 1,88 + 0,14

КТС-1 35 нМ 17AAG ФИД = 1,20 + 0,05 100 нМ17AAG ФИД = 1,55 + 0,10 200 нМ17AAG ФИД = 1,82 + 0,14

MCF-7 клетки

HeLa клетки

100

10

100

10

100

10

I -— I ——

0 Гр 3 Гр 5 Гр доза KTC-1 клетки

0 Гр 3 Гр 5 Гр доза

BJ клетки

0 Гр

3 Гр

5 Гр доза

100

10

^ 100

10

0 Гр 3 Гр 293 клетки

5 Гр

доза

0 Гр

3 Гр

5 Гр

доза

Рис. 1. Разница в эффектах ингибитора БТШ90 17AAG на пост-радиационную выживаемость колоний опухолевых (MCF-7, HeLa, FRO) и неопухолевых (293, BJ) клеток.

1

1

1

Результаты МТТ-теста частично представлены на рис. 2 и тоже демонстрируют селективность радиосенсибилизируещего эффекта ингибитора БТШ90: 100 нМ 17AAG нисколько не усиливал падения жизнеспособности облучённых клеток неопухолевых линий 293 (рис. 2) и BJ (не показано) и не замедлял пост-радиационного восстановления их пролиферативной активности, тогда как в обработанных таким же образом клетках опухолевых линий HeLa (рис. 2), КТС-1 и MCF-7 (не показано) изменения этих параметров свидетельствовали о радиосенсибилизации. Такое же, как у 17AAG, различие во влиянии на жизнеспособность облучённых опухолевых и неопухолевых клеток обнаруживалось при тестировании гелданамицина и радицикола (данные не приведены). Следовательно, результаты МТТ-теста вполне совпадают с данными сравнительного анализа клоногенности (см. рис. 1) и подтверждают возможность селективной радиосенсибилизации опухолей человека с помощью наномолярных концентраций ингибиторов активности БТШ90.

Рис. 2. Результаты МТТ-теста, показывающие разницу в эффектах 17AAG на жизнеспособность и пролиферативную способность опухолевых клеток HeLa и неопухолевых клеток линии 293.

1 - контроль (без ингибитора); 2 - эффект 17AAG (100 нмоль/л); * - достоверное отличие от соответствующих значений в контроле (кривая 1), р<0,05.

При исследовании молекулярных механизмов радиосенсибилизации мы оценивали влияние ингибирования активности Hsp90 на динамику образования и исчезновения фосфо-гистоновых (yH2AX) фокусов в ядрах нормальных и опухолевых клетках после их облучения (3 Гр), что отражало скорость репарации двунитевых разрывов ДНК [12]. В клетках карциномной линии MCF-7 ингибитор Hsp90 17AAG замедлял образование ядерных yH2AX фокусов в первые часы после облучения, а также увеличивал время их последующего исчезновения (рис. 3Б). На рис. 3 видно, что ядра необработанных ингибитором клеток имеют максимальное количество фосфо-гистонов через 1 час после облучения, а через 24 часа уровень yH2AX фокусов возвра-

щается к контрольному, что говорит о завершении процессов репарации разрывов ядерной ДНК. Через 24 часа после облучения обработанных 35 нМ 17AAG опухолевых клеток MCF-7 в их ядрах наблюдалось достоверно повышенное содержание ядерных yH2AX фокусов по сравнению с контролем, что свидетельствует о замедлении репарации ДНК или о том, что ее процесс не доведен до конца из-за дисфункции БТШ90 (рис. 3Б). Напротив, в неопухолевых клетках линии 293 такая же предобработка 17AAG никак не влияла на пост-радиационную динамику возникновения и исчезновения ядерных yH2AX фокусов (рис. 3А) и, значит, не тормозила репарацию разрывов ДНК. Аналогичная разница в эффектах имела место при сравнении опухолевых клеток HeLa и KTC-1 с неопухолевыми клетками BJ, а также при действии 2-х других ингибиторов БТШ90 - гелданамицина и радицикола.

Наши эксперименты по выявлению ядерных yH2AX фокусов (рис. 3) дали важную информацию о молекулярной природе данного феномена радиосенсибилизации и причинах её избирательности. Действительно, если проникший в клетку ингибитор БТШ90 не позволит «вовремя» завершить пост-радиационную репарацию двунитевых разрывов ДНК, это с большой вероятностью приведёт к апоптозу или «митотической катастрофе», т.е. закончится гибелью облучённой клетки. Соответственно, раз ингибирование БТШ90 замедляет репарацию разрывов ДНК в облучённых опухолевых клетках и не замедляет её в облучённых неопухолевых клетках, - это даёт селективную радиосенсбилизацию и, в сочетании с лучевой терапией, может усилить элиминацию злокачественных клеток опухоли без увеличения клеточной гибели в окружающих нормальных тканях и органах. Что касается конкретного участия БТШ90 в процессе репарации ДНК, ранее были сообщения [2-4], что этот белок катализирует активацию АТМ, ДНК-полимеразы-p и апурин/апиримидиновой эндонуклеазы - ферментов, распознающих и сшивающих разрывы ядерной ДНК; однако клеточная регуляция этих механизмов требует более детального изучения. Известно также, что дисфункция БТШ90 в раковой клетке способствует активации каспаз [5, 10], что может предопределить прохождение апоптотического сценария в ответ на внешний стрессовый стимул (например, облучение).

Рис. 3. Гистограммы, показывающие средние количества y-H2AX фокусов на клеточное ядро через разные периоды времени после облучения (3 Гр).

A - линия 293 (нормальные клетки) - нет достоверных отличий между эффектами 17AAG и контролем; Б - линия MCF-7 (опухолевые клетки) - все эффекты 17AAG достоверно отличаются от соответствующих контрольных величин, p<0,05.

Очень интересным представляется вопрос: почему ингибиторы БТШ90 не сенсибилизируют нормальные клетки? Согласно нашим наблюдениям, наномолярные (35-300 нМ) концентрации 17AAG и радицикола не подавляли шаперонной функции БТШ90 в неопухолевых клетках, хотя полностью инактивировали этот шаперон в опухолевых клетках. Вероятно, так происходит, потому что в раковых клетках почти весь БТШ90 находится в гипер-активированном состоянии с особой молекулярной конфигурацией, аффинность которой к ингибиторам типа 17AAG более чем в 100 раз выше, чем у «латентного» БТШ90 в нормальных клетках [13]. Тогда для инактивации БТШ90 в опухолевых клетках потребуются гораздо более низкие концентрации ингибиторов, чем в случае неопухолевых клеток. In vivo такое большое различие в аффинности должно приводить к накоплению молекул ингибитора БТШ90 преимущественно в раковых клетках, где и будут локально проявляться эффекты шаперонной дисфункции, в том числе радиосенсибилизация. Отсюда же следует, что при использовании в лучевой терапии, ингибирующие БТШ90 радиосенсибилизаторы будут действовать селективно на опухоль-мишень без усиления радиационных повреждений прилегающих нормальных тканей.

Заключение

Наши результаты, полученные на экспериментальной модели in vitro, демонстрируют принципиальную возможность селективной радиосенсибилизации злокачественных опухолей человека с помощью клинически достижимых (наномолярных) концентраций ингибиторов активности БТШ90. Для полного доказательства эффективности и селективности такого подхода необходимы сравнительные исследования in vivo - с опухолями, растущими в лабораторных животных, и затем - клинические испытания. В целом, создание радиосенсибилизаторов на основе ингибиторов БТШ90 выглядит весьма перспективным, поскольку это поможет усилить радиационный ответ опухоли и снизить риск развития пост-лучевых осложнений.

Литература

1. Kimple R.J. Strategizing the clone wars: pharmacological control of cellular sensitivity to radiation //Mol. Interv. 2010. V. 10, N 6. P. 341-353.

2. Noguchi M., Yu D., Hirayama R., Ninomiya Y., Sekine E., Kubota N., Ando K., Okayasu R. Inhibition of homologous recombination repair in irradiated tumor cells pretreated with Hsp90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 351. P. 658-663.

3. Dote H., Burgan W.E., Camphausen K., Tofilon J. Inhibition of Hsp90 compromises the DNA damage response to radiation //Cancer Res. 2006. V. 66. P. 9211-9220.

4. Koll T.T., Feis S.S., Wright M.H., Teniola M.M., Richardson M.M., Robles A.I., Bradsher J., Capala J., Varticovski L. HSP90 inhibitor, DMAG, synergizes with radiation of lung cancer cells by interfering with base excision and ATM-mediated DNA repair //Mol. Cancer Ther. 2008. V. 7. P. 1985-1992.

5. Trepel J., Mollapour M., Giaccone G., Neckers L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer //Nat. Rev. Cancer. 2010. V. 10. P. 537-549.

6. Jhaveri K., Taldone T., Modi S., Chiosis G. Advance in the clinical development of heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitors in cancer //Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1823. P. 742-766.

7. Camphausen K., Tofilon P.J. Inhibition of Hsp90: multitarget approach to radiosensitization //Clin. Cancer Res. 2007. V. 13. P. 4326-4330.

8. Kabakov A.E., Kudryavtsev V.A., Gabai V.L. Hsp90 inhibitors as promising agents for radiotherapy //J. Mol. Med. 2010. V. 88. P. 241-247.

9. Кабаков А.Е., Кудрявцев В.А., Макарова Ю.М. Ингибиторы активности белка теплового шока 90: новый класс радиосенсибилизаторов опухолей //Радиац. биология. Радиоэкология. 2010. Т. 50, № 5. С. 528-535.

10. Kabakov A.E, Kudryavtsev V.A. Heat shock proteins as molecular targets for anticancer therapy: approaches, agents, and trends //Heat shock proteins. Classifications, functions, and applications /Ed. S. Usmani. New York: Nova Science Publishers, 2013. P. 25-56.

11. Kabakov A.E., Kudryavtsev V.A., Gabai V.L. Methods of cell survival or death determination //Methods Mol. Biol. 2011. V. 787. P. 231-244.

12. Sharma A., Singh K., Almasan A. Histone H2AX phosphorylation: a marker for DNA damage //Methods Mol. Biol. 2012. V. 920. P. 613-626.

13. Kamal A., Thao L., Sensintaffar J., Zhang L, Boehm M.F., Fritz L.C., Burrows F.J. A high-affinity conformation of Hsp90 confers tumour selectivity on Hsp90 inhibitors //Nature. 2003. V. 425. P. 407-410.

Inhibition of the heat shock protein 90 activity: approaches to the selective

radiosensitization of tumors

Kudryavtsev V.A., Khokhlova A.V., Mosina V.A., Kabakov A.E.

A. Tsyb MRRC, Obninsk

Heat shock protein 90 (HSP90) is involved in regulatory and signal responses ensuring the radioresistance of cancer cells. Possibilities are considered towards inhibition of this protein for radiosensitizing malignant tumors and increasing the efficacy of radiation therapy. In the present study, effects were compared of known inhibitors of the functional activity of HSP90 (geldanamycin, radicicol, 17AAG) on the radiosensitivity of cell lines derived from human carcinomas (Hela, MCF-7, KTC-1) and normal tissues (293, BJ). After the inhibitory pretreatment of cells and subsequent y-radiation exposure at 2-8 Gy, such parameters were evaluated as the cell viability and clonogenicity, and also amounts of double-strand DNA breaks and dynamics of their repair. It follows from the data obtained that, using nanomolar (i.e. clinically achievable) concentrations of the HSP90 activity inhibitors, it was possible to induce significant radiosensitization of tumor cells without any increasing the radisensitivity of normal cells. At the molecular level, the selective radiosensitizing action of inhibitors of the HSP90 activity was due to a retardation of repair processes in nuclear DNA of irradiated cancer cells and the absence of analogous effect in irradiated normal cells. Such results allow to hope that HSP90 activity inhibitor-based radiosensitizers will selectively enhance the radiation response of tumors with no increasing a risk of complications through radiation damage to adjacent normal tissues.

Key words: cellular radioresistance, radiosensitivity, j-radiation, chaperone, molecular target, DNA breaks, phosphorylation of histones, DNA repair, tumor cells, radiation therapy.

References

1. Kimple R.J. Strategizing the clone wars: pharmacological control of cellular sensitivity to Radiation. Mol. Interv., 2010, vol. 10, no. 6, pp. 341-353.

2. Noguchi M., Yu D., Hirayama R., Ninomiya Y., Sekine E., Kubota N., Ando K., Okayasu R. Inhibition of homologous recombination repair in irradiated tumor cells pretreated with Hsp90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, vol. 351, pp. 658-663.

3. Dote H., Burgan W.E., Camphausen K., Tofilon J. Inhibition of Hsp90 compromises the DNA damage response to radiation. Cancer Res., 2006, vol. 66, pp. 9211-9220.

4. Koll T.T., Feis S.S., Wright M.H., Teniola M.M., Richardson M.M., Robles A.I., Bradsher J., Capala J., Varticovski L. HSP90 inhibitor, DMAG, synergizes with radiation of lung cancer cells by interfering with base excision and ATM-mediated DNA repair. Mol. Cancer Ther., 2008, vol. 7, pp. 1985-1992.

5. Trepel J., Mollapour M., Giaccone G., Neckers L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat. Rev. Cancer, 2010, vol. 10, pp. 537-549.

6. Jhaveri K., Taldone T., Modi S., Chiosis G. Advance in the clinical development of heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitors in cancer. Biochim. Biophys. Acta, 2012, vol. 1823, pp. 742-766.

7. Camphausen K., Tofilon P.J. Inhibition of Hsp90: multitarget approach to radiosensitization, Clin. Cancer Res., 2007, vol. 13, pp. 4326-4330.

8. Kabakov A.E., Kudryavtsev V.A., Gabai V.L. Hsp90 inhibitors as promising agents for Radiotherapy. J. Mol. Med, 2010, vol. 88, pp. 241-247.

Kudryavtsev V.A. - Researcher; Khokhlova A.V. - Junior Researcher; Mosina V.A. - Researcher; Kabakov A.E.* - Head of Lab, C. Sc., Biol. A. Tsyb MRRC.

Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (484) 399-71-88 or (484) 399-33-97; e-mail: aekabakov@hotmail.com.

9. Kabakov A.E., Kudryavtsev V.A., Makarova Yu.M. Inhibitors of the heat shock protein 90 activity: a novel class of radiosensitizers of tumors. Radiats. biologia. Radioecologia - Radiation Biology. Radioecology, 2010, vol. 50, no. 5, pp. 528-535. (In Russian).

10. Kabakov A.E, Kudryavtsev V.A. Heat shock proteins as molecular targets for anticancer therapy: approaches, agents, and trends. Heat shock proteins. Classifications, functions, and applications /Ed. S. Usmani. New York, Nova Science Publishers, 2013. pp. 25-56.

11. Kabakov A.E., Kudryavtsev V.A., Gabai V.L. Methods of cell survival or death determination. Methods Mol. Biol., 2011, vol. 787, pp. 231-244.

12. Sharma A., Singh K., Almasan A. Histone H2AX phosphorylation: a marker for DNA Damage. Methods Mol. Biol., 2012, vol. 920, pp. 613-626.

13. Kamal A., Thao L., Sensintaffar J., Zhang L, Boehm M.F., Fritz L.C., Burrows F.J. A high-affinity conformation of Hsp90 confers tumour selectivity on Hsp90 inhibitors. Nature, 2003, vol. 425, pp. 407-410.