СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОМАТЕРИАЛА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ОКСИДА ГРАФЕНА И НАНОЧАСТИЦ ОКСИДОВ СЕРЕБРА И МЕДИ
METHOD OF PRODUCING NANOMATERIAL FOR BIOTECHNOLOGICAL PURPOSES BASED ON GRAPHENE OXIDE AND NANOPARTICLES OF SILVER AND COPPER OXIDES

Изобретение относится к способу получения наноматериала с антимикробными свойствами на основе оксида графена и наночастиц оксида серебра и оксида меди (II) и может найти применение главным образом в области биотехнологии и медицины для изготовления препаратов, подавляющих жизнедеятельность патогенных микроорганизмов.
Повышение резистентности различных патогенных микроорганизмов к антибиотикам является серьезной проблемой, чреватой неприятными последствиями. Проблема резистентности микроорганизмов не нова, она существовала еще до открытия первого антибиотика. В связи с широким и часто ненаправленным применением антибиотиков в последнее время особенно заметно возросло число штаммов, резистентных к одному или нескольким антибиотикам. Штаммы некоторых бактерий обладают первичной резистентностью к определенным антибиотикам (например, Pseudomonas к ампициллину), другие же, в принципе чувствительные, могут стать резистентными [1-2]. (1. Антибиотики: современная точка зрения. URL: http://www.lvrach.ru/1998/01/4526487/. 2. Проблема резистентности (устойчивости) к антибиотикам. URL: http://biofile.ru/bio/4271.html).
В последние десятилетия в связи с широким использованием антибиотиков и химических консервантов ускоряется процесс появления резистентных штаммов микрофагов. Серебро и медь, в отличие от органических (химических) консервантов и дезинфектантов - естественные элементы, не загрязняющие природу. Это - экологически чистые, «зеленые» продукты. Являясь сильными биоцидами для микробов и вирусов, серебро и медь, в отличие от других металлов, в то же время гораздо менее токсичны для многоклеточных организмов. Серебро не создает резистентных штаммов, убивая возбудителей на 100% и не давая им мутировать и размножаться. Однако у серебра существенным недостатком является не только высокая стоимость, но его дефицитность при массовом внедрении в экологическую практику. Поэтому представляется актуальным использовать совместно с оксидом графена наночастицы оксида серебра и оксида меди (II). Такая композиция позволяет получить более эффективный материал за счет синергетического взаимодействия компонентов.
Одним из перспективных направлений в решении данной проблемы является применение нанобиотехнологий, направленных на совершенствование специфических свойств наночастиц металлов, определяемых их структурной модификацией, что позволяет достигать различных биологических эффектов, в т.ч. и антибактериальных (Шульгина Т.А., Норкин И.А., Пучиньян Д.М. Антибактериальное действие водных дисперсий наночастиц серебра на грамотрицательные микроорганизмы (на примере Escherichia coli) // Фундаментальные исследования. 2012. №7 (ч. 2). С. 424-426). Благодаря широкому нахождению в природе, выполнению разнообразных функций внутри большинства живых организмов, относительно низкой себестоимости и экологической безопасности наночастицы меди (Cu) обладают высоким потенциалом для применения в качестве антимикробного агента, заменяя серебро и композиты других благородных металлов при разработке антибактериальных средств (Veerapandian М., Sadhasivam S., Choi J., Yun K. Glucosamine functionalized copper nanoparticles: Preparation, characterization and enhancement of anti-bacterial activity by ultraviolet irradiation // Chemical Engineering Journal. 2012. V. 209. P.558-567).
В работе Maqusood Ahamed et al. (Maqusood Ahamed, Hisham A. Alhad-laq, M.A. Majeed Khan, Ponmurugan Karuppiah and Naif A. Al-Dhabi. Synthesis, Characterization, and Antimicrobial Activity of Copper Oxide Nanoparticles // Volume 2014 (2014). Article ID 637858. 4 p.) были исследованы антимикробные свойства наночастиц оксида меди, синтезированных методом простого осаждения. Наночастицы CuO показали отличную антимикробную активность в отношении различных штаммов бактерий (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Enterococcus faecalis, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus) причем, Escherichia coli и Enterococcus faecalis показали наибольшую чувствительность к воздействию наночастиц меди, в то время как Klebsiella pneumonia была наименее чувствительна.
2
2
2
В работе греческих ученых Giannousi K. et al. (Giannousi K., Lafazanis K., Arvanitidis J., Pantazaki A., Dendrinou-Samara C. Hydrothermal synthesis of copper based nanoparticles: antimicrobial screening and interaction with DNA // Journal of Inorganic Biochemistry. 2014. V. 133. P. 24-32) исследована антибактериальная активность наночастиц меди синтезированных гидротермальным путем в отношении грамположительных (Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Xanthomonas campestris, Escherichia coli) бактерий в зависимости от состава (CuO, CuO, CuO/CuO) и размера частиц. Результаты исследования показывают, что при воздействии различных по составу и размеру частиц проявляются видоспецифичные биологические эффекты. Наибольшую бактерицидную активность, вызывающую деградацию ДНК, проявили наночастицы оксида меди (CuO) в отношении грамположительных бактерий. В связи с этим дополнительно было проведен анализ производства активных форм кислорода (АФК) и перекисного окисления липидов, который показал, что количество ионов меди в дистиллированной воде и в питательной среде, ниже критического значения, подавляющего рост бактерий, что может говорить о преобладающем наноразмерном эффекте.
В работе И.В. Бабушкиной и др. (Изучение антибактериального действия наночастиц меди на клинические штаммы Staphylococcus aureus. Саратовский научно-медицинский журнал, 2010, том 6, №1, с. 11-14) установлено, что характер влияния наночастиц на рост клинических штаммов и выраженность антибактериального эффекта зависят от вида наночастиц, их концентрации, времени воздействия. Антибактериальная активность наночастиц меди выражена в широком диапазоне концентраций от 0,001 до 1 мг/мл, даже при кратковременном воздействии (30 мин) наблюдается уменьшение количества микробных клеток, выросших на твердой питательной среде, на 97-100% по сравнению с контролем. Таким образом, наночастицы меди обладают выраженным антибактериальным действием при использовании низких концентраций.
В статье Ding-Bang Xiong et al. (Ding-Bang Xiong, Mu Cao, Qiang Guo, Zhanqiu Tan, Genlian Fan, Zhiqiang Li & Di Zhang High content reduced graphene oxide reinforced copper with a bioinspired nano-laminated structure and large recoverable deformation ability. Scientific Reports volume 6, Article number: 33801 (2016) DOI: 10.1038/srep33801) рассмотрен вопрос об уменьшении расхода оксида графена при изготовлении композитного материала на основе оксида графена и оксида меди за счет синергетического эффекта, возникающего при совместном использовании этих компонентов. Авторы считают, что изготовление смеси оксида графена с нанопорошком оксида меди возможно с высоким содержанием оксида графена (~ 45 объемных %) при изготовлении композита в виде сэндвича при одновременном снижении содержания оксида меди. Этот процесс реализован с обеспечением равномерной дисперсии и упорядочением содержания графена в металлической матрице. Установлено, что механические свойства резко возрастают, слоистый композит показал величину упругой деформации, по меньшей мере, на порядок большую, чем из чистой меди, а также наблюдалось увеличение специфической прочности из-за высокого содержания оксида графена.
В статье, принятой в качестве прототипа (Бактерицидное действие оксида графена / Cu / Ag нанодеривативы против Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, золотистый стафилококк и метициллин-устойчивый золотистый стафилококк/Автор: В. Янкаускайте и др. /ИИЛ: S0378-5173(16)30611-1, ДОИ: http://dx.doi.org/doi: 10.1016/j. ijpharm. 2016.06.121, Ссылка: Место 15878, Международный фармацевтический журнал. Дата получения: 24-3-2016), описан способ получения наноматериала с антибактериальными свойствами. Высококонцентрированная дисперсия оксида графена (GO) в воде (концентрация-5 г/л; состав-углерод (79%), кислород(20%); размер хлопьев-0,5-5 мкм; толщина-1 атомный слой - ≥60%) была приобретена у Graphene Laboratories Inc. и использовалась по мере поступления. Методы синтеза наночастиц металлов были выбраны на основе их простоты и экономичности. Коллоидные растворы Cu (~0,25 мг/л) были приготовлены путем растворения соответствующего количества дигидрата хлорида меди (II) растворяли в деионизированной воде. L-аскорбиновую кислоту по каплям добавляли к водному раствору соли меди при интенсивном перемешивании при температуре 80°С в масляной ванне. Коллоидные растворы Ag (~0,25 мг/л) были приготовлены путем растворения соответствующего количества нитрата серебра в деионизированной воде. Затем раствор смешивали с поливинилпирролидоном (ПВП), растворяют в этаноле и разогревают в микроволновой печи в течение 5 мин. Коллоидные растворы Cu и Ag получали путем смешивания коллоидных растворов Cu и Ag в соотношении 1:1, а растворы GO-Cu-Ag получали путем смешивания высококонцентрированной дисперсии GO в воде с коллоидными растворами Cu и Ag в соотношении 1:1:1 соответственно.
Описанный выше способ характеризуется следующими недостатками: способ технологически сложен и недостаточно эффективен (используются коллоидные растворы серебра и меди, которые менее активны, чем те же материалы в ионной форме, что резко увеличивает нормы расхода. Выбранное соотношение компонентов 1:1:1 экономически неоправданно из-за разницы в стоимости материалов (оксид графена на порядок дороже наночастиц серебра, которые дороже примерно в 10 раз наночастиц меди, кроме того наночастицы меди легко агрегируют в растворе, поэтому их требуется примерно в 2 раза больше). Кроме того, «высококонцентрированная дисперсия оксида графена (GO) в воде (концентрация - 5 г / л), произведенная ф. Graphene Laboratories Inc, уступает оксиду графена с содержанием дисперсии в воде 1%, т.е. 10 г/л.
Технический результат заключается в упрощении технологии, снижении затрат на изготовление наноматериала и повышении воспроизводимости свойств получаемого противомикробного наноматериала.
Технический результат достигается способом получения наноматериала с антимикробными свойствами на основе оксида графена и наночастиц оксида серебра и оксида меди (II), отличающегося тем, что в водную суспензию оксида графена поочередно вводят наночастицы оксида серебра и оксида меди (II) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Оксид графена
2-6
Наночастицы оксида серебра
4-8
Наеночастицы оксида меди (II)
8-16
Вода дистиллированная
остальное,
и процесс осуществляют при температуре 40-45°С и воздействии ультразвуком в течение 6 ч.
Способ также достигается использованием в качестве водной суспензии оксида графена суспензии с содержанием оксида графена 1%.
Способ также достигается тем, что для применения полученный наноматериал разбавляют водой.
Получение наноматериала биотехнологического назначения на основе оксида графена и наночастиц оксида серебра и оксида меди (II), при котором в водную суспензию оксида графена поочередно вводят наночастицы оксида серебра и оксида меди (II) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Оксид графена
2-6
Наночастицы оксида серебра
4-8
Наеночастицы оксида меди (II)
8-16
Вода дистиллированная
остальное,
и процесс осуществляют при температуре 40-45°С и воздействии ультразвуком в течение 30 мин после каждого введения наночастиц, что обеспечивает:
- упрощение технологии синтеза композиционного материала за счет сокращения номенклатуры применяемых материалов, проведения технологического процесса в одном аппарате, сокращения продолжительности синтеза композита и уменьшение расхода воды на промывку;
- минимизацию количества применяемого оборудования и соответственно снижение капитальных затрат;
- повышении качества за счет изготовления компонентов на специализированных предприятиях.
Использование наночастиц оксида серебра и оксида меди (II) и суспензии оксида графена обеспечивают повышение качества за счет применения серийно выпускаемых продуктов.
Использование в качестве водной суспензии оксида графена суспензии оксида графена с содержанием оксида графена 1% обеспечивает снижение затрат за счет уменьшения стоимости исходных компонентов и удобства пользования за счет уменьшения объема материала.
Разбавление для применения полученного наноматериала водой позволяет снизить расходы на транспортирование и хранение и повысить удобство применения.
Далее приводятся данные, доказывающие возможность осуществления заявляемого способа и его эффективность.
Для осуществления изобретения применялись следующие исходные вещества.
Оксид графена дисперсия 1% представляет собой окисленные двумерные графеновые пластины толщиной до 15 нм в виде водной суспензии. Основой оксида графена является химически диспергированный графит, содержащий незначительное количество неуглеродных примесей в виде серы. Оксид графена предназначен для использования в химической и нефтеперерабатывающей промышленности в качестве сырьевого компонента для придания конечному продукту (смазочные материалы, противоизносные составы и т.д.) триботехнических и противоизносных свойств. По физико-химическим показателям оксид графена должен соответствовать нормам, указанным в табл. 1.
Наночастицы оксида серебра
Описание
2
Химическая формула: AgO
Физико-химические данные представлены в табл. 2:
Внешний вид: порошок коричнево-черного цвета.
По физико-химическим показателям наночастицы оксида серебра должны соответствовать нормам, указанным в табл. 3.
Гарантийный срок хранения 1 год.
Наночастицы оксида меди (II).
Наночастицы оксида меди (CuO, высокой чистоты, 99.95%, 25-55 нм)
Чистота наночастиц CuO: 99.95% мин
Цвет наночастиц: коричневый, черный
Средний размер наночастиц CuO: 25-55 нм
3
Коэффициент увеличения объема: 13,98 см/г
Морфология наночастиц CuO: почти сферическая
3
Насыпная плотность: 0,79 г/см
3
Истинная плотность: 6,4 г/м
По составу примесей наночастицы CuO должны соответствовать нормам, указанным в табл. 4.
Наночастицы оксида меди (CuO), область применения: Практически нерастворимы в воде. Медленно растворяются в спирте или растворе аммиака. Растворимы в разбавленных кислотах, NH4Cl, (NH4) 2СО3, растворе цианида калия. При высокой температуре оксид меди реагирует с водородом или монооксидом углерода, может восстановиться до металлической меди. Наночастицы оксида меди (II) являются широко используемым материалом. Применяются при получении катализаторов, сверхпроводящих материалов, термоэлектрических материалов, чувствительных материалов, стекла, керамики и в других областях. Кроме того могут использоваться в качестве катализатора сгорания ракетного топлива. Среди прочих сфер применения - керамические резисторы, газовые датчики, магнитные носители, культиваторы ближнего инфракрасного диапазона, фотопроводящие и фототермальные приложения, полупроводники, преобразование солнечной энергии, катализаторы, высокотехнологичные сверхпроводники.
Пример 1.
В 2-литровый стакан залили 600 мл водной суспензии оксида графена, что соответствует введению 6 г сухого оксида графена и поместили в водяную баню с температурой 45°С и после выдержки в течение 30 мин в водную суспензию ввели поочередно 4 г наночастиц оксида серебра и 8 г наночастиц оксида меди (II) и прилили 394 мл дистиллированной воды. Получили 1000 мл раствора с массой сухого остатка 18 г. Смесь обработали ультразвуком в течение 6 часов при перемешивании механической мешалкой (400 об/мин). Получили черную, прозрачную в тонком слое, дисперсию наноматериалов без осадка. Выход полученного наноматериала составил 98% с содержанием в нем оксида серебра 0.4% и оксида меди (II) 0,8%. Размер наночастиц 1.7-8.0 нм по данным просвечивающей электронной микроскопии. Средний размер наночастиц 5.0 нм.
Для проверки устойчивости порцию полученной дисперсии (80 мл) пропустили через центрифугу (30 мин при 5000 об/мин). Осадок был незначителен, оптическая плотность пробы отцентрифугированной дисперсии составляла 0,941 (98% от исходной). Дисперсия была устойчивой при хранении в течение, по крайней мере, недели.
Пример 2.
В 2-литровый стакан залили 200 мл водной суспензии оксида графена, что соответствует введению 2 г сухого оксида графена и поместили в водяную баню с температурой 45°С и после выдержки в течение 30 мин в водную суспензию ввели поочередно 4 г наночастиц оксида серебра и 16 г наночастиц оксида меди (II) и прилили 390 мл дистиллированной воды. Получили 1000 мл раствора с массой сухого остатка 22 г. Смесь обработали ультразвуком в течение 6 часов при перемешивании механической мешалкой (400 об/мин). Получили черную, прозрачную в тонком слое, дисперсию наноматериалов без осадка. Выход полученного наноматериала составил 99% с содержанием в нем оксида серебра 0.4% и оксида меди 1,6%. Размер наночастиц 2-7,5 нм по данным просвечивающей электронной микроскопии. Средний размер наночастиц 5,2 нм.
Для проверки устойчивости порцию полученной дисперсии (80 мл) пропустили через центрифугу (30 мин при 5000 об/мин). Осадок был незначителен, оптическая плотность пробы отцентрифугированной дисперсии составляла 0,940 (97% от исходной). Дисперсия была устойчивой при хранении в течение, по крайней мере, недели.
Пример 3.
В 2-литровый стакан залили 300 мл водной суспензии оксида графена, что соответствует введению 3 г сухого оксида графена и поместили в водяную баню с температурой 45°С и после выдержки в течение 30 мин в водную суспензию ввели поочередно 8 г наночастиц оксида серебра и 12 г наночастиц оксида меди и прилили 390 мл дистиллированной воды. Получили 1000 мл раствора с массой сухого остатка 23 г. Смесь обработали ультразвуком в течение 6 часов при перемешивании механической мешалкой (400 об/мин). Получили черную, прозрачную в тонком слое, дисперсию наноматериалов без осадка. Выход полученного наноматериала составил 99% с содержанием в нем оксида серебра 0.8% и оксида меди 1,2%. Размер наночастиц 1.7-8.5 нм по данным просвечивающей электронной микроскопии. Средний размер наночастиц 6.0 нм.
Для проверки устойчивости порцию полученной дисперсии (80 мл) пропустили через центрифугу (30 мин при 5000 об/мин). Осадок был незначителен, оптическая плотность пробы отцентрифугированной дисперсии составляла 0,941 (98% от исходной). Дисперсия была устойчивой при хранении в течение, по крайней мере, недели.
Пример 4.
В 2-литровый стакан залили 800 мл водной суспензии оксида графена, что соответствует введению 8 г сухого оксида графена и поместили в водяную баню с температурой 45°С и после выдержки в течение 30 мин в водную суспензию ввели поочередно 8 г наночастиц оксида серебра и 20 г наночастиц оксида меди (II) и прилили 186 мл дистиллированной воды. Получили 1000 мл раствора с массой сухого остатка 36 г. Смесь обработали ультразвуком в течение 6 часов при перемешивании механической мешалкой (400 об/мин). Получили черную, прозрачную в тонком слое, дисперсию наноматериалов без осадка. Выход полученного наноматериала составил 95% с содержанием в нем оксида серебра 0.8% и оксида меди 2%. Размер наночастиц 4-10 нм по данным просвечивающей электронной микроскопии. Средний размер наночастиц 7.0 нм.
Для проверки устойчивости порцию полученной дисперсии (80 мл) пропустили через центрифугу (30 мин при 5000 об/мин). Осадок был значителен. Дисперсия непригодна для хранения.
Изучение антимикробного действия полученного наноматериала проводили методом двукратных серийных разведений на референтных штаммах микроорганизмов (Candida albicans АТСС №24433, Staphylococcus aureus АТСС №25923, Escherichia coli АТСС №25922, Enterococcus faecalis АТСС №22212, Pseudomonas aeruginosa ATCC №27853).
Чувствительность опытных штаммов микроорганизмов к полученным наноматериалам определяли invitro на виноградно-сахарном бульоне (ВСБ) и среде Сабуро (по стандартам МУК 4.21890-04) на основании динамики роста культуры. Антимикробную активность оценивали в диапазоне концентраций от 2% до 0,02% (от 20 мг/мл до 0,1875 мг/мл). Препарат предварительно разводили в ВСБ. Тестируемые штаммы микроорганизмов добавляли по 0,1 мл (0, 6 единиц по стандарту мутности МакФарланда) в 5 мл каждого разведения исследуемого вещества.
В результате проведенных экспериментов установлено, что наноматериал, полученный с использованием в качестве стабилизирующей матрицы оксид графена, сорбирующего наночастицы оксида серебра и оксида меди (II) обладает антимикробной активностью в отношении исследуемых штаммов микроорганизмов. В контрольных пробах, т.е. в отсутствие наночастиц оксида серебра и оксида меди (II), наблюдается рост тест-культур.
Предлагаемые способ обеспечивает получение наноматериалов на основе оксида графена и наночастиц оксида серебра и оксида меди (II) и характеризуется простотой способа и стабильностью работы.