2-ГИДРОКСИ-4-МЕТИЛФЕНИЛ-4-ОКСО-2-БУТЕНОАТ ТИАЗОНИЛАММОНИЯ, ОБЛАДАЮЩИЙ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ И НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
2-HYDROXY-4-METHYLPHENYL-4-OXO-2-BUTENOATE OF THIAZONYL AMMONIUM, POSSESSING HYPOGLYCEMIC AND NOOTROPIC ACTIVITY

Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов гетериламмония, а именно к 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеноату тиазолиниламмония (1) формулы
обладающему гипогликемической и ноотропной активностью, что позволяет предположить его использование в медицине в качестве гипогликемического средства с сопутствующей ноотропной активностью.
Ближайшим аналогом по структуре заявляемому соединению является 2-гидрокси-4-оксо-4-фенил-2-бутеноат тиазолиниламмония (2) [Гипогликемическая активность производных ароилпировиноградных кислот. / Н.А.Пулина, Т.А.Юшкова, А.И.Краснова [и др.] // Фармация. - 2009. - №7. - С.36-38] формулы
Структурный аналог 2 не обладает гипогликемической и ноотропной активностью.
Эталонами сравнения выбраны:
1) антидиабетический препарат метформин, широко применяемый в лечебной практике и являющийся аналогом по действию [Машковский, М.Д. Лекарственные средства.- 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Новая волна», 2005. - Т.2. - С.562-563].
2) ноотропный препарат пирацетам, широко применяемый в лечебной практике и являющийся аналогом по действию [Машковский, М.Д. Лекарственные средства.- 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - с.159-160].
Задачей изобретения является поиск в ряду 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов гетериламмония веществ с выраженной гипогликемической и ноотропной активностью, а также низкой токсичностью.
Поставленная задача достигается получением 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеноата тиазолиниламмония (1), обладающего гипогликемической и ноотропной активностью.
Заявляемое соединение 1 получают взаимодействием 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеновой кислоты (3) с 2-аминотиазолином в спирте этиловом при эквимолярном соотношении реагентов, при температуре 20-25°С с последующим выделением целевого продукта известными методами по схеме
14
16
2
4
3
6
3
2
2
6
4
3
-1
+
1
4
1
Пример получения соединения 1. К суспензии 1.02 г (0.01 моль) 2-аминотиазолина в 20 мл спирта этилового прибавляли раствор 2.06 г (0.01 моль) 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеновой кислоты (3) в 15 мл спирта этилового. Реакционную смесь перемешивали при температуре 20-25°С до полного растворения реагента. Реакционную смесь охлаждали до 5-0°С, выпавший осадок отфильтровывали, перекристаллизовывали из хлороформа. Выход 2.74 г (89%). Т.пл. 178-180°С. Найдено, %: С 53.97; Н 5.14; N 9.01. CHNOS. Вычислено, %: С 54.53; Н 5.23; N 9.08. ИК-спектр (Specord M80, вазелиновое масло, ν, см): 3150 ш (NH, ОН), 1665 (С=О), 1610 ш, 1590 (С=О, C=N, C=C). Спектр ЯМР H (BS-567A (100 МГц), ДМСО-d, ГМДС, δ, м.д.): 2.33 с (3Н, СН), 3.47 т (2Н, CH, J 7.4 Гц), 3.83 т (2Н, CH, J 7.4 Гц), 7.14 с (1Н, СН), 7.24-8.03 м (7Н, СН, NН).
Заявляемое соединение 1 представляет собой бесцветное кристаллическое вещество, растворимое в воде, спирте этиловом, трудно растворимое в хлороформе.
50
Острую токсичность заявляемого соединения 1 при пероральном введении изучали на белых мышах обоего пола массой 18-20 г с определением ЛД экспресс-методом по Прозоровскому [Прозоровский, В.Б. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки. / В.Б.Прозоровский, М.П.Прозоровская, В.И.Демченко // Фармакология и токсикология. - 1978. - №4. - С.497-502]. Вещество вводили перорально в виде взвеси в 2% крахмальном растворе из расчета 0,1 мл/10 г, однократно, после чего животные находились под непрерывным наблюдением 24 часа. Общая продолжительность наблюдения составила 2 недели. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора [Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп.. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.41-54].
Гипогликемическая активность соединения 1 изучена на модели аллоксанового диабета. Опыты выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г. Экспериментальную гипергликемию моделировали внутрибрюшинным введением аллоксана тригидрата («Alfa Aesar») в дозе 170 мг/кг. Соединение 1 вводили перорально крысам с аллоксановым диабетом в дозе 50 мг/ кг в виде взвеси в 2% крахмальном растворе. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора. Концентрацию глюкозы в крови животных определяли глюкозооксидазным методом [Волчегорский, И.А. Антиоксиданты при экспериментальном сахарном диабете. / И.А.Волчегорский, Л.М.Рассохина, И.Ю.Мирошниченко // Проблемы эндокринологии. - 2008. - Т. 54, №5. - С.43-50]. Крыс лишали пищи за 16 часов до опыта и на время его проведения. Степень гипогликемической активности соединения 1 и препарата-эталона (метформина в дозе 50 мг/кг) оценивали через 120 минут после их введения путем сравнения с фоновыми показателями уровня глюкозы до введения веществ.
Для изучения ноотропной активности соединение 1 было исследовано на формирование и воспроизведение памятного следа на белых нелинейных здоровых крысах в тесте «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ), а также оценивалась его антигипоксическая активность на модели нормобарической гиперкапнии на белых нелинейных мышах. Препарат сравнения - пирацетам вводили перорально в дозе 50 мг/кг. Кроме того, аналогичными методиками изучен гипогликемический препарат метформин в дозе 50 мг/кг [Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп.- М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.153-158].
Формирование УРПИ осуществляли в экспериментальной установке, представляющей собой две смежные камеры: большую, освещенную и малую, затемненную с электрофицированным полом. В первый день эксперимента крыс помещали в освещенный отсек камеры и в течение 3 минут регистрировали время захода в затемненный отсек (латентный период (ЛП)) и время, проведенное в темном отсеке. По истечении 3-х минут на пол темной камеры подавали электрический ток (0,45 мА). Влияние исследуемого соединения на прочность сформированной реакции характеризовали степенью ее сохранения через 24 часа. Исследуемое вещество вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2% крахмальном растворе за 1 час до помещения в экспериментальную установку. При оценке сохранности УРПИ учитывали число животных в %, зашедших в затемненный «опасный» отсек камеры, время первого захода и общее время пребывания в нем при тестировании.
3
Для воспроизведения нормобарической гиперкапнии у мышей исследуемое соединение вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2% крахмальном растворе, через час животных поодиночке сажали в герметически закрывающиеся сосуды (200 см). По мере потребления кислорода животными его концентрация в сосуде снижается, что приводит к их гибели. Регистрировали продолжительность жизни животных, по которой судили об эффективности исследуемого вещества. Мышам контрольной группы в том же объеме вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора.
Полученные результаты подвергали статистической обработке. Данные всех выборок подвергались оценке на соответствие нормальному распределению при помощи критерия Шапиро-Уилки. Выборочные значения подчинялись нормальному закону распределения. Для анализа нормально распределенных количественных признаков при сравнении двух независимых выборок применяли t-критерий Стьюдента. В случае наблюдений в последовательные моменты времени достоверность различий определяли путем дисперсионного анализа повторных измерений с последующим вычислением t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Результаты представлены в виде М±m (М - среднее значение, m - средняя арифметическая ошибка). Различия считали достоверными при уровне р<0,05. Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась при помощи программы математической статистики Sigma Stat 3.5 для Windows, а также статистических программ Windows XP (Excel). Результаты испытаний представлены в таблицах 1, 2.
50
Установлено, что ЛД соединения 1 составляет 4700 мг/кг (таблица 1). Согласно классификации опасности химической продукции по ГОСТу 53856-2010, соединение 1 относится к 5 классу токсичных веществ [Юрасова, А.А. Внедрение в Российской Федерации современной модели классификации опасности химической продукции. / А.А.Юрасова, А.С.Макарова, Д.О.Скобелев // Токсикологич. вестник. - 2011. - №1. - С.2-10].
Таблица 1Гипогликемическое действие при аллоксановом диабете и острая токсичность соединения 1
Серии опытов
ЛД<sub>50</sub>, мг/кг
Доза, мг/кг
Кол-во животных
Уровень глюкозы, ммоль/л
0 мин
120 мин
Контроль (интактный)
-
-
6
4,83±0,32
4,56±0,29
Контроль (аллоксановый диабет)
-
-
6
16,88±0,98
16,41±0,64
<sup>***1 ***3</sup>
Соединение 1
4700(3800-6800)
50
6
16,89±0,84
6,57±0,73
<sup>*1 ***2</sup>
Метформин
1266(1050-1485)
50
6
16,65±0,76
7,58±0,62
<sub>**1 ***2</sub>
Примечание: ***=р<0,001;1 - по отношению к контролю (интакт); 2 - по отношению к контролю (алл. диабет); 3 - по отношению к метформину.
Как видно из таблицы 1, соединение 1 проявило гипогликемическую активность на модели аллоксанового диабета и оно не уступает по действию препарату сравнения - метформину. При этом соединение 1 в 3,7 раза менее токсично, чем препарат-эталон. Вещество 1 оказывает ноотропную активность в тесте УРПИ, что характеризуется отсутствием негативного влияния на формирование и воспроизведение памятного следа у экспериментальных животных, а также проявляет выраженное антигипоксическое действие (таблица 2), в то время как метформин данным эффектом практически не обладает. Это является положительным фактором, так как заявляемое вещество 1 может препятствовать развитию когнитивного дефицита при диабетической энцефалопатии и гипоксических состояний, являющихся осложнениями сахарного диабета.
Таблица 2Ноотропная активность соединения 1 в тестах «условная реакция пассивного избегания» и нормобарической гиперкапнии
Соединение
Воспроизведение УРПИ
Нормобарическая гиперкапния
1-й день (до обучения)
2-й день (после обучения)
ЛП
n/N
%<sup>1</sup>
ЛП
n/N
%<sup>1</sup>
t
%<sup>2</sup>
Контроль (интакт)
73,7±13,8
6/6
0
171,8±8,1
<sup>***1*3</sup>
1/6
83,3
1482,5±110,6
-
Соединение 1
63,3±11,2
6/6
0
180,0±0,0
<sup>***1*4</sup>
0/6
100
2574,4±107,2
<sup>***5**6**7</sup>
73,7
Пирацетам
66,8±11,5
6/6
0
180,0±0,0
<sup>***1*4</sup>
0/6
100
3022,1±118,5
<sup>***7</sup>
103,9
Метформин
84,5±13,2
6/6
0
162,7±12,0
<sup>***1</sup>
2/6
66,7
1568,8±113,8
<sup>***6</sup>
5,8
Примечание; *=р<0,05, **=р<0,01, ***=р<0,001;1 - по отношению к ЛП до обучения; 2 - к ЛП контрольной группы; 3 - к ЛП группы с пирацетамом; 4 - ЛП группы с метформином; 5 - по отношению к времени жизни контрольной группы; 6 - по отношению к времени жизни группы с пирацетамом; 7 - по отношению к времени жизни группы с метформином.ЛП - латентный период, сек; n/N-количество животных в группе, посетивших темный отсек в тесте УРПИ, из общего числа животных в группе (N); % <sup>1</sup> - процент животных, не зашедших в темный отсек;t - время жизни, сек; % <sup>2</sup> - процент увеличения продолжительности жизни.
Таким образом, 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеноат бензотиазолиниламмония (1) оказывает выраженное гипогликемическое и ноотропное действие и обладает значительно меньшей токсичностью по сравнению с метформином, что делает возможным его использование в медицине для создания новых гипогликемических лекарственных препаратов с сопутствующей ноотропной активностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гипогликемическая активность производных ароилпировиноградных кислот. / Н.А.Пулина, Т.А.Юшкова, А.И.Краснова [и др.] // Фармация. - 2009. - №7. - С.36-38.
2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Новая волна», 2005. - С.159-160, 562-563.
3. Прозоровский, В.Б. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки. / В.Б.Прозоровский, М.П.Прозоровская, В.И.Демченко // Фармакология и токсикология. - 1978. - №4. - С.497-502.
4. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.41-54.
5. Волчегорский, И.А. Антиоксиданты при экспериментальном сахарном диабете. / И.А.Волчегорский, Л.М.Рассохина, И.Ю.Мирошниченко // Проблемы эндокринологии. - 2008. - Т. 54, №5. - С.43-50.
6. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.153-158.
7. Юрасова, А.А. Внедрение в Российской Федерации современной модели классификации опасности химической продукции. / А.А.Юрасова, А.С.Макарова, Д.О. Скобелев // Токсикологич. вестник. - 2011. - №1. - С.2-10.