БИОСОВМЕСТИМЫЙ БИОДЕГРАДИРУЕМЫЙ ПОРИСТЫЙ КОМПОЗИЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
BIOCOMPATIBLE, BIODEGRADABLE POROUS COMPOSITE MATERIAL AND METHOD OF PRODUCING SAID MATERIAL

Область техники
Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, точнее к биосовместимым биодеградируемым пористым композиционным материалам на основе хитозана и гидросиликатного наполнителя, и технологии их получения.
Изобретение может найти применение в медицине, ветеринарии, фармакологии, биотехнологии, пищевой промышленности. Заявляемые биосовместимые биодеградируемые пористые композиционные материалы предназначены для использования в качестве матриц для адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии (конструирование раневых покрытий, оболочек для инкапсулирования клеток и лекарственных средств и др.). Они могут быть применены в качестве сорбентов для очистки воды от ионов металлов, а также антибактериальных и антимикотических агентов при консервировании продуктов питания.
Уровень техники
В современной биотехнологии чрезвычайно актуальны биосовместимые биодеградируемые пористые материалы. В качестве основы для этих материалов особый интерес представляет хитозан, биосовместимый биодеградируемый полимер, получаемый из природного полимера хитина, входящего в состав панцирей ракообразных.
При разработке биосовместимых биодеградируемых пористых композиционных материалов, пригодных в качестве матриц для клеточных технологий, необходимо соблюсти несколько условий. Важной характеристикой материала является отсутствие цитотоксичности. Определенные требования предъявляются к пористой структуре материала. Размер пор должен обеспечить адгезию и распластывание клеток на их поверхности. Для пролиферации клеток в объеме матрицы поры должны иметь форму сообщающихся каналов, по которым возможно движение клеток. Для обеспечения обменных процессов в клетках необходима высокая проницаемость материала для жидкостей и газов. В клеточных технологиях матрицы помещают в водные среды, включающие аминокислоты, ионы металлов, клеточный субстрат и т.д. При этом большинство известных матриц со временем набухают в водных растворах, что приводит к изменению их пористой структуры, уменьшению транспортных свойств. Поэтому сохранение параметров пористой структуры (размера пор, их формы) в жидкой среде является необходимым условием и актуальной технологической задачей при создании материала для матрицы.
Известно несколько способов создания пористых полимерных структур, в том числе и для хитозана. Например, в расплав или раствор полимера вводят порообразователь (аэросил). Также возможно формование пористого материала из раствора в жесткую осадительную ванну, при этом осадитель интенсивно замещает растворитель. Для получения пористой структуры полимерные пленки бомбардируют α-частицами с последующим травлением их в щелочи. Во всех этих известных способах используют химические реагенты, остатки которых могут длительное время сохраняться в пористом материале. Наличие инородных химических веществ, в случае использования пористого материала в биотехнологиях, вызывает его цитотоксичность. Устранение этого недостатка является важной технологической проблемой.
Композиционные биосовместимые биодеградируемые пористые материалы на основе хитозана не известны.
Известны биосовместимые биодеградируемые пористые материалы на основе полисахаридов: альгината, крахмала, хитозана (патент US 5840777). При получении известных материалов порообразование происходит при интенсивном механическом перемешивании и взбалтывании водного раствора полимера. Для повышения пористости через раствор полимера пропускают газ. Увеличение содержание газа в растворе полимера достигается повышением температуры. Полученные материалы обладают хорошей пористостью, но набухают в воде. Пористая структура нарушается, и теряется ее проницаемость.
Известны биосовместимые биодеградируемые пористые материалы из хитина и хитозана в виде пористых пленок и блоков. При получении известных материалов для создания пористой структуры использовали поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, гидроксиэтилцеллюлозу (Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов - хитина и хитозана / Е.Ф.Панарин, Л.А.Нудьга, В.А.Петрова и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2009. Т.4, №3. С.42-46). Для повышения устойчивости размеров и формы материалов в водных средах пленки подвергали термической обработке. Показано, что известные материалы на основе хитина и хитозана могут быть использованы в качестве матриц для культивирования фибробластов. При этом лучшие результаты показаны при использовании хитина. В известных материалах при проведении на них клеточных тестов наблюдаются признаки цитотоксичности. Известные матрицы со временем набухают в водных растворах и становятся непроницаемыми вследствие «схлопывания пор».
Известны биосовместимые пористые материалы на основе химически модифицированного хитозана. Материал получали методом лиофилизации жидкой композиции из хитозана, лактоферрина и глутарового альдегида. Известные материалы могут быть использованы в качестве раневых покрытий, тампонов и других изделий медицинского назначения, в виде сорбентов для тестирования биоматериалов, диагностики инфекционных заболеваний (заявка на патент US 20110021431). Известные материалы со временем набухают в водных растворах, становятся непроницаемыми и теряют стабильность пространственно-структурной организации и механических свойств, поэтому не используются в клеточных технологиях.
Для уменьшения набухания образца и сохранения структуры пор хитозан обрабатывали гликозаминоглицаном, а также применяли последовательное дегидрирование в растворе этанола (Madihally S.V., Matthew H.W.T. Porous chitosan scaffolds for tissue engineering // Biomaterials. 1999. T.20. С.1133-1142). Для получения пористых материалов применяли метод лиофилизации растворов модифицированного гликозаминоглицаном хитозана в уксусной кислоте. Показана зависимость размеров пор от температуры лиофилизации Т=-5 - -196°C. Тем не менее, известные материалы, изготовленные согласно указанной технологии, также со временем набухают в водных растворах и становятся непроницаемыми для жидкостей и газов. При проведении клеточных тестов в них наблюдаются признаки цитотоксичности.
Наиболее близкими к заявляемому изобретению являются биосовместимые биодеградируемые пористые материалы и способ их получения, описанные в заявке на патент US 20070254016 (аналог-прототип).
++
++
++
++
Известный материал-губка состоит из сшитого полисахарида, в частности хитозана, в нем также присутствуют остатки вводимых в технологическом процессе порообразующих добавок - метилцеллюлозы, гидрокси-пропилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, альбумина и пропиленгликоль альгината, гельформирующих ионов (Ca, Ba, Cu, Zn и др.), пластификатора (глицерин, сорбитол). Диаметр пор составляет 5-1000 мкм.
Известный способ получения губок заключается в следующем. Предварительно получают водорастворимую солевую форму хитозана (хитозан хлорид, хитозан ацетат, хитозан глутамат, хитозан лактат и др.). В частности, хитозан ацетат получают растворением исходного полимера в 1%-ном растворе уксусной кислоты и последующей сушкой. Приготавливают 4%-ный раствор соли хитозана в воде, вводят в него пластификатор сорбитол или глицерин и порообразователь гидроксипропилцеллюлозу. Смесь интенсивно перемешивают в течение 2,5 мин, полученную пену сушат при температуре 80°C в течение 30-60 мин. В сухом состоянии полученная губка эластичная и мягкая, имеет развитую систему открытых пор. При помещении в воду губка быстро набухает и при приложении небольших усилий резко изменяет форму.
Для повышения стабильности размеров губки во влажном состоянии хитозан подвергали межмолекулярному сшиванию. Для этого губку во влажном состоянии обрабатывают парами раствора сшивающего агента Na-трифосфата, сушат при температуре 80°C в течение 1-2 ч.
При набухании в воде полученная губка меньше деформируется, чем несшитая. В сухом состоянии она мягкая и эластичная, ее структура характеризуется системой открытых пор. Однако по проницаемости сшитая губка уступает несшитой. В известных материалах наблюдаются следы химических реагентов, используемых в способе получения, что не исключает цитотоксичности.
Известный материал может быть использован в качестве раневых покрытий различного назначения, матриц для клеточных технологий, эффективных сорбентов.
Анализ приведенных выше аналогов заявляемого изобретения свидетельствует о том, что ресурс улучшения стабильности пористой структуры материала в водных средах и предотвращения его цитотоксичности за счет химической модификации хитозана практически исчерпан. В то же время поиск новых подходов при создании биосовместимых биодеградируемых пористых материалов из хитозана по-прежнему актуален, т.к. он является одним из немногих доступных природных полимеров, перспективных с точки зрения использования в клеточных технологиях и тканевой инженерии.
Один из таких новых подходов, использованных авторами заявляемого изобретения, - создание полимерных композиционных биоматериалов с нанонаполнителями с оригинальными ценными практическими свойствами. Разработка технологии получения композитов является в настоящее время сравнительно молодой и перспективной областью материаловедения, которая позволяет на базе сочетания уже известных и выпускаемых полимеров более эффективно и быстро придать им принципиально новые свойства по сравнению с трудоемким и длительным путем создания новых синтетических материалов. Использование в качестве регуляторного механизма не вызывающих цитотоксичности наночастиц может существенно расширить возможности варьирования физико-химических свойств таких биоматериалов и, соответственно, их клинического применения.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является создание биосовместимого биодеградируемого пористого материала на основе хитозана с системой открытых пор и со стабильной пористой структурой в водных средах для использования в биотехнологии, например в клеточных технологиях. Создаваемый материал не должен содержать следов химических веществ, потенциально обладающих цитотоксичностью.
Эта задача решается заявляемой группой из двух изобретений - биосовместимым биодеградируемым пористым композиционным материалом и способом его получения.
Заявляемый биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал характеризуется следующей совокупностью существенных признаков.
1. Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и гидросиликатный наполнитель в количестве 0,05-10% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 5-1000 мкм.
2. Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал включает гидросиликатный наполнитель из ряда: монтмориллонит, галлуазит, бентонит.
3. Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал включает гидросиликатный наполнитель в интеркалированном, и/или эксфолиированном, и/или нативном состоянии.
В интеркалированном состоянии межслоевое расстояние наполнителя по сравнению с нативным увеличено под действием внешних факторов. В эксфолиированном состоянии наполнитель диспергирован до базисных слоев.
Совокупность существенных признаков заявляемого материала обеспечивает получение технического результата - наличие системы свкозных пор и обеспечение стабильной пористой структуры материала в водных средах, а также отсутствие цитотоксичности.
Заявляемый материал отличается от известного материала-прототипа тем, что он является композиционным, включает хитозан и гидросиликатный наполнитель. Материал-прототип не композиционный, он состоит из химически модифицированного сшитого хитозана.
Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала.
Из уровня техники известны два непористых композиционных материала на основе хитозана.
Известен непористый композиционный материал на основе хитозана и гидросиликатного наполнителя монтмориллонита (заявка на патент CN 101524635, 2009). Для получения указанного материала в раствор хитозана в уксусной кислоте добавляют 0,05-0,4 мас.% монтмориллонита. Полученную смесь перемешивают при температуре 50-60°C в течение 10-16 ч, затем выпаривают растворитель. Полученные порошки набухают в воде, но не превращаются в гель. Порошки известных материалов могут быть использованы в качестве адсорбентов для очистки воды, консервирования продуктов питания.
Известен непористый композиционный материал на основе хитозана и гидросиликатного наполнителя монтмориллонита (патент CN 1431044, 2003). Для получения указанного материала смесь монтмориллонита, хитозана и желатина распыляют в холодный осадитель. Частицы полученного композита промывают, сушат и стерилизуют. Получен абсорбент для очистки крови в виде порошка. Материал обладает биологической совместимостью, абсорбционной способностью к токсинам.
Оба известных материала не порочат новизну заявляемого изобретения, т.к. они не являются пористыми, получены в виде порошка, а не губки, и поэтому не могут быть использованы в качестве матрицы для клеточных технологий. В известных патентах не указано использование полученных материалов для клеточных технологий.
Только совокупность существенных признаков заявляемого биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала позволяет достичь указанного технического результата. Совершенно неожиданным явился факт, что из несшитого химически хитозана удастся получить биосовместимый биодеградируемый пористый материал со стабильной и высокопроницаемой пористой структурой в водных средах, к тому же не имеющий в порах следов химических реагентов и не обладающий цитотоксичностью. Как указывалось выше, известны патенты с использованием монтмориллонита для получения композиционных порошков хитозана, которые не превращаются в гель в воде. Можно предположить, что монтмориллонит был добавлен с целью меньшего набухания порошков в воде. Однако неочевидно, что добавление к хитозану монтмориллонита при получении более сложных по структуре, чем порошки, пористых материалов приведет не только к эффекту сохранения формы и размеров губки, но и к сохранению открытости пор, проницаемости губки во объеме и стабильности пористой системы. Кроме того, в заявляемом материале в отличие от известных гидросиликатный наполнитель присутствует не в виде частиц продажного материала, а в обработанном состоянии. Это позволяет утверждать о соответствии заявляемого материала условию охраноспособности «изобретательский уровень» («неочевидность»).
Заявляемый способ получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала обладает следующей совокупностью существенных признаков.
1. Способ получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала, заключающийся в том, что смешивают предварительно диспергированный в водной среде с pH 5-7 в ультразвуковом поле с частотой v=20-100 кГц в течение 5-60 мин гидросиликатный наполнитель с хитозаном в количестве, соответствующем его концентрации в растворе 1-4 мас.%, при этом количество наполнителя составляет 0,05-10% от массы хитозана, интенсивно перемешивают полученную смесь при температуре 20-50°C в течение 20-60 мин, добавляют концентрированную уксусную кислоту в количестве, соответствующем получению в смеси водного раствора уксусной кислоты концентрацией 1-3%, интенсивно перемешивают смесь при температуре 20-50°C в течение 20-250 мин, охлаждают ее до температуры -5 - -196°C, удаляют растворитель в вакууме, обрабатывают полученный целевой материал нейтрализующим реагентом, промывают водой до pH 5-7 и высушивают.
2. Используют гидросиликатный наполнитель из ряда: монтмориллонит, галлуазит, бентонит.
3. В качестве нейтрализующего реагента берут спирт, спиртовые растворы аммиака или щелочи.
Совокупность существенных признаков заявляемого способа позволяет достичь технического результата: упрощения и удешевления способа, обеспечения контроля над операциями и морфологией конечного продукта, получение материала лучшего качества, чем у аналогов.
Предлагаемый способ получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала отличается от известного тем, что в нем исключены стадии приготовления солевой формы хитозана, добавления эмульгатора, пластификатора, модификации пористого хитозана сшивающим агентом. Предлагаемый способ проще, т.к. материал получают непосредственно из хитозана в растворе уксусной кислоты, следов которой не наблюдают в конечном продукте. В заявляемом способе вводят гидросиликатный наполнитель и получают в отличие от способа-прототипа композиционный материал.
Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну способа.
Только совокупность существенных признаков заявляемого способа получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала позволяет достичь указанного технического результата. Совершенно неочевидным явилась сама возможность получения биосовместимого биодеградируемого пористого материала, сохраняющего стабильную пористую структуру, минуя стадию химической сшивки, напрямую из хитозана. Применение монтмориллонита само по себе не гарантировало получение стабильной и высокопроницаемой пористой структуры. Следует подчеркнуть, что заявляемая технология в отличие от известных предполагает введение наполнителя в специальном обработанном состоянии - эксфолиированном, интеркалированном или нативном. Только оригинальная совокупность условий способа привела к целевому результату. Это позволяет утверждать о соответствии заявляемого способа условию охраноспособности «изобретательский уровень» («неочевидность»).
Таким образом, группа заявляемых изобретений в целом обладает новизной и неочевидностью.
Предлагаемая группа изобретений позволяет решить задачу получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала для биотехнологии со стабильной структурой и не обладающего цитотоксичностью.
Графические материалы
На фиг.1 приведена фотография хитозановой (а) и композитных матриц, содержащих 0,05 мас.% монтмориллонита (б) и 3 мас.% монтмориллонита (в), после выдержки в матриксе в течение 48 ч и последующей сушки. До контакта с матриксом указанные образцы имели одинаковые размеры и форму.
На фиг.2 приведены результаты культивирования дермальных фибробластов человека на поверхности композитной матрицы, содержащей 3 мас.% монтмориллонита.
На фиг.3 показана эффективность адгезии дермальных фибробластов человека на поверхности покровного стекла (I) (контроль), хитозановых (II) и композитных матриц, содержащих 3 мас.% монтмориллонита (III).
На фиг.4 показано иммунофлуоресцентное окрашивание фибробластов человека антителами против гамма-Н2АХ гистона; а - клетки, в течение 6 суток культивированные на композитной матрице, содержащей 5 мас.% монтмориллонита.
На фиг.5 приведена микрофотография мезенхимных стволовых клеток жировой ткани человека на поверхности композитной матрицы на основе хитозана и 5 мас.% монтмориллонита.
На фиг.6 показано культивирование стволовых клеток в губке на основе хитозана, содержащего 5 мас.% монтмориллонита (а) и без наполнителя (б).
Для подтверждения соответствия заявляемой группы изобретений требованию «промышленная применимость» приводим примеры конкретной реализации.
Реактивы
Хитозан производства фирмы BioChemika (Япония) из панцирей крабов, степень деацетилирования 2-95%, молекулярная масса 5-450 кДа, содержание нерастворимых веществ менее 1%.
Гидросиликатный наполнитель
4
4
10
8
2
Монтмориллонит (Na-MMT) производства фирмы Southern Clay Products, Inc. (США), катион-обменная емкость 92,6 мэкв/100 г; галлуазит (Al[SiO](OH)×4HO) производства фирмы Natural Nano, Inc. (США), средний диаметр частиц составляет ~100 нм, длина 0,5-1,2 мкм; бентонит - коммерческий продукт (Россия).
Уксусная кислота ХЧ ледяная, NaOH ХЧ, аммиак ХЧ, этанол, метанол, пропанол, ЗАО Вектон (Россия).
Ультразвуковую обработку наполнителя в водной среде проводили на установке ИЛ 100-6.
Методы и приборы для определения характеристик биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала
Исследования пористой структуры пленок проводили с помощью растрового электронного микроскопа Supra 55VP (C.Zeiss), перед измерениями по стандартной методике на поверхность образцов напыляли тонкий слой золота.
Газо- и водопроницаемость материала определялась по форме пор в виде сквозных каналов по данным электронно-микроскопических исследований.
Контроль состояния наполнителя проводили методом рентгеновской дифракции на многофункциональном дифрактометре ULTIMA IV фирмы Rigaku (Япония) по угловому положению и/или интенсивности базисного рефлекса наполнителя.
Модуль упругости Е в сухом и влажном состояниях определяли методом динамического механического анализа (ДМА) на приборе Netsch, частота 1 Гц, амплитуда 20 мкм, образец в виде диска диаметром 15 мм, высотой 2,1 мм, перед испытанием во влажном состоянии образец выдерживали в воде в течение 2 мин.
Для исследования формоустойчивости губок вырезали диски диаметром 30 мм и толщиной 7 мм, образцы выдерживали в водной среде, представляющей собой водный раствор аминокислот, в течение 48 ч, сушили на воздухе до постоянной массы, после чего проводилась фотофиксация образцов.
Примеры получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала
Пример 1
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в эксфолиированном состоянии в количестве 0,05% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 5-150 мкм.
Получение материала
Диспергируют 0,005 г монтмориллонита в 1000 мл воды, pH 7, в ультразвуковом поле с частотой v=20 кГц в течение 10 мин с получением дисперсии монтмориллонита в эксфолиированном состоянии.
Смешивают диспергированный в водной среде монтмориллонит и хитозан со степенью деацетилирования 95%, молекулярной массой 50 кДа в количестве 10 г, соответствующем концентрации раствора 1 мас.%, при этом количество монтмориллонита составляет 0,05% от массы хитозана. Полученную смесь перемешивают со скоростью 700 об/мин при температуре 20°C в течение 20 мин, добавляют концентрированную уксусную кислоту в количестве 10 мл, соответствующем получению в смеси водного раствора уксусной кислоты концентрацией 1%. Интенсивно перемешивают смесь при температуре 20°C в течение 20 мин, охлаждают ее до температуры -5°C. Удаляют растворитель в вакууме. Обрабатывают полученный пористый материал этанолом, промывают водой до pH 5 и высушивают. Обрабатывают полученный пористый материал смесью этанола и 10%-ного водного раствора NaOH в соотношении 1:1, промывают водой до pH 7 и высушивают целевой материал.
Диаметр пор 5-150 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=0,334 МПа, во влажном - Е=0,095 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в эксфолиированном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме отсутствует базисный рефлекс монтмориллонита (001). После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры (фиг.1б).
Пример 2
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в интеркалированном состоянии в количестве 10% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 70-150 мкм.
Получение материала
Диспергируют 4 г монтмориллонита в 1000 мл воды, подкисленной уксусной кислотой до pH 6, в ультразвуковом поле с частотой v=100 кГц в течение 60 мин с получением дисперсии монтмориллонита в интеркалированном состоянии. Смешивают диспергированный в водной среде монтмориллонит и хитозан со степенью деацетилирования 60%, молекулярной массой 250 кДа в количестве 40 г, соответствующем концентрации раствора 4 мас.%, при этом количество монтмориллонита составляет 10% от массы хитозана. Интенсивно перемешивают полученную смесь при температуре 50°C в течение 60 мин, добавляют концентрированную уксусную кислоту в количестве 30 мл, соответствующем получению в смеси водного раствора уксусной кислоты концентрацией 3%. Интенсивно перемешивают смесь при температуре 50°C в течение 250 мин, охлаждают ее до температуры -194°C. Удаляют растворитель в вакууме. Обрабатывают полученный пористый материал этанолом, промывают водой до pH 7 и высушивают.
Диаметр пор 70-150 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=1,461 МПа, во влажном - Е=0,435 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в интеркалированном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме базисный рефлекс монтмориллонита смещен на угол 2θ=4,5°, что соответствует межслоевому расстоянию d=l,96 нм. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры.
Пример 3
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в интеркалированном и эксфолиированном состоянии в количестве 0,05% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 10-150 мкм.
Получение материала проведено согласно примеру 1. Для получения монтмориллонита в интеркалированном и эксфолиированном состоянии его диспергируют в ультразвуковом поле с частотой v=25 кГц в течение 30 мин. Обрабатывают полученный пористый материал смесью этанола и 10%-ного водного раствора NaOH в соотношении 1:1, промывают водой до pH 7 и высушивают целевой материал.
Диаметр пор 10-150 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=0,295 МПа, во влажном - Е=0,056 МПа. После выдержки в водной среде и последующей сушки образец не изменил форму и размеры. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в интеркалированном и эксфолиированном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме наблюдается уменьшение интенсивности базисного рефлекса 001 и его смещение на угол 2θ=5,5°, что соответствует межслоевому расстоянию d=1,605 нм.
Пример 4
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в эксфолиированном состоянии в количестве 3,0% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 20-100 мкм.
Получение материала
Диспергируют 1,2 г монтмориллонита в 1000 мл воды, подкисленной уксусной кислотой до pH 5, в ультразвуковом поле с частотой v=25 кГц в течение 60 мин с получением дисперсии монтмориллонита в эксфолиированном состоянии. Смешивают диспергированный в водной среде монтмориллонит и хитозан со степенью деацетилирования 60%, молекулярной массой 250 кДа в количестве 40 г, соответствующем концентрации раствора 4 мас.%, при этом количество монтмориллонита составляет 3% от массы хитозана. Интенсивно перемешивают полученную смесь при температуре 20°C в течение 60 мин, добавляют концентрированную уксусную кислоту в количестве 20 мл, соответствующем получению в смеси водного раствора уксусной кислоты концентрацией 2%. Интенсивно перемешивают смесь при температуре 20°C в течение 200 мин, охлаждают ее до температуры -196°C. Удаляют растворитель в вакууме. Обрабатывают полученный пористый материал водным раствором аммиака, промывают водой до pH 7 и высушивают целевой материал.
Диаметр пор 20-100 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=1,174 МПа, во влажном - Е=0,353 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в эксфолиированном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме отсутствует базисный рефлекс монтмориллонита (001). После выдержки в водной среде и последующей сушки образец не изменил форму и размеры (фиг.1в).
Пример 5
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в нативном состоянии в количестве 5% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 50-150 мкм.
Диспергируют 0,005 г монтмориллонита в 1000 мл воды, pH 7, ультразвуковом поле с частотой v=20 кГц в течение 5 мин с получением дисперсии монтмориллонита в нативном состоянии.
Смесь наполнителя и полимера в растворе уксусной кислоты концентрацией 2% перемешивают в течение 200 мин при скорости 700 об/мин.
Диаметр пор 50-150 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=0,953 МПа, во влажном - Е=0,252 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в нативном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме присутствует базисный рефлекс монтмориллонита (001) на угле 2θ≈7,4°, что соответствует межслоевому расстоянию d=1,3 нм.
После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры.
Пример 6
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в интеркалированном, эксфолиированном и нативном состоянии в количестве 0,05% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 800-1000 мкм.
Получение материала проведено согласно примеру 1. Для получения монтмориллонита в интеркалированном, эксфолиированном и нативном состоянии его диспергируют в ультразвуковом поле с частотой v=20 кГц в течение 200 мин. Используют хитозан со степенью деацетилирования 60%, молекулярной массой 450 кДа. Обрабатывают полученный пористый материал смесью этанола и 10%-ного водного раствора NaOH в соотношении 1:1, промывают водой до pH 7 и высушивают целевой материал.
Диаметр пор 800-1000 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=0,894 МПа, во влажном - Е=0,125 МПа. После выдержки в водной среде и последующей сушки образец не изменил форму и размеры. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в интеркалированном, эксфолиированном и нативном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме наблюдается уменьшение интенсивности и смещение базисного рефлекса монтмориллонита (001), соответствующие всем трем состояниям наполнителя.
Пример 7
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и монтмориллонит в эксфолиированном и интеркалированном состоянии в количестве 3,0% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 250-300 мкм.
Получение материала проведено согласно примеру 3. Используют хитозан со степенью деацетилирования 2%, молекулярной массой 5-20 кДа. Обрабатывают полученный пористый материал пропанолом промывают водой до pH 7 и высушивают целевой материал.
Диаметр пор 250-300 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=1,254 МПа, во влажном - Е=0,256 МПа. После выдержки в водной среде и последующей сушки образец не изменил форму и размеры. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в интеркалированном и эксфолиированном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме наблюдается уменьшение интенсивности базисного рефлекса 001 и его смещение на угол 2θ=5,5°.
Пример 8
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и бентонит в нативном состоянии в количестве 3,0% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 50-150 мкм.
Получение материала проведено согласно примеру 5.
Диаметр пор 50-150 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=0,783 МПа, во влажном - Е=0,123 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в нативном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме присутствует базисный рефлекс бентонита (001). После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры.
Пример 9
Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и галлуазит в нативном состоянии в количестве 3,0% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 50-150 мкм.
Получение материала проведено согласно примеру 6. Наполнитель диспергируют в ультразвуковом поле с частотой v=20 кГц в течение 30 мин.
Диаметр пор 50-150 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=0,852 МПа, во влажном - Е=0,251 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в нативном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов; на рентгенограмме присутствует базисный рефлекс галлуазита (001). После выдержки в водной среде и последующей сушки образец не изменил форму и размеры.
Применение
Одной из основных задач клеточных технологий и тканевой инженерии является разработка матриц для пролиферации стволовых клеток. Материал для таких матриц должен обладать комплексом свойств: биосовместимостью, биодеградируемостью, уровнем прочностных и эластичных характеристик, необходимым для манипуляции с ними в жидких средах.
Для визуализации и исследования характера адгезии клеток к данному материалу и особенностей их пролиферации были использованы матрицы из заявляемого материала в пленочном виде, содержащие 1, 3, 5, 7 мас.% монтмориллонита и не содержащие монтмориллонит. Для использования матриц при культивировании фрагменты пленок прошли стерилизационную обработку путем автоклавирования в дистиллированной воде (температура 121°C, давление 1 атм, время 20 мин). Матрицы, содержащие монтмориллонит, после автоклавирования не подвергались деформациям и могли быть использованы по назначению. В то время как матрицы, не содержавшие монтмориллонита, помутнели и подверглись деформации.
Далее для предотвращения поглощения из культуральной среды при культивировании ионов (прежде всего кальция), а также для насыщения компонентами внеклеточного матрикса пленки были выдержаны в течение 3 сут в смеси (1:1) свежей и кондиционированной фибробластами культуральной среды. После подобной обработки матрицы, содержащие монтмориллонит, не подвергались деформациям. Матрицы, не содержащие монтмориллонит, подверглись дополнительным деформациям (в частности, были склонны к скручиванию, что затрудняло их практическое использование).
При культивировании дермальных фибробластов человека на поверхности матриц были выявлены следующие закономерности адгезии, пролиферации и клеточной подвижности. Показано, что на поверхности пленочного композита на основе хитозана, содержащего 3 мас.% монтмориллонита, наблюдается хорошая адгезия и стабильная пролиферация фибробластов. Структура роста клеток не искажается, видны типичные для фибробластов человека дугообразные траектории роста, без признаков включений наполнителя (фиг.2). Клетки имели типичную морфологию и размеры, что свидетельствует об оптимальных условиях адгезии, распластывания, движения и пролиферации, а также об отсутствии цитотоксичности.
Эффективность адгезии первичных дермальных фибробластов человека к пленкам на основе хитозана, а также композитным пленкам, содержащим 3 мас.% наполнителя, сопоставлялась с адгезией клеток к покровному стеклу. Показано, что добавление монтмориллонита улучшает адгезивные свойства пленки (фиг.3).
Исследование цитотоксического действия наполнителя на фибробласты человека показало, что в клетках, культивированных в течение 6 суток на пленках, содержащих 5 мас.% монтмориллонита, не выявлено стабилизации в ядре фокусов гамма-Н2АХ гистона (фиг.4).
При 3D-культивировании в губке на основе хитозана, содержащего 5 мас.% монтмориллонита, мезенхимных стволовых клеток жировой ткани человека происходит хорошая адгезия (фиг.5), равномерное распределение клеток по всему объему матрицы (фиг.6а). В матрицах, не содержащих монтмориллонита, наблюдалось ограничение роста клеток и формирование отдельных колоний (фиг.6б). Объемная равномерная пролиферация клеток на матрицах, содержащих монтмориллонит, обусловлена стабильностью структуры, сохранением сквозной пористости в жидкой среде, что обеспечивает проникновение к клетке питательных веществ из культуральной среды, нормальное протекание обменных процессов.
При высоком набухании хитозановой матрицы, не содержащей наполнителя, возможно сужение диаметра пор, вплоть до их слипания, что приводит к уменьшению диффузионных процессов. Следствием этого является ограничение роста клеток, формирование отдельных колоний, неравномерное распределение клеток в объеме матрицы. Кроме того, губки без монтмориллонита, находившиеся в жидкой среде, не обладали необходимой жесткостью, что вызывало затруднения при манипуляциях.
Реализация заявляемого изобретения не исчерпывается приведенными примерами.
Выход за рамки нижних границ заявляемых интервалов приводит к резкому снижению качества заявляемого материала - сильному набуханию в водной среде, ограничению роста клеток, формированию отдельных колоний, неравномерному распределению клеток в объеме матрицы либо вообще к невозможности получения пористого композиционного материала.
Выход за рамки верхних границ заявляемых интервалов приводит к невозможности получения наполнителя в интеркалированном или эксфолиированном состояниях, резко увеличивает вязкость смеси наполнителя и раствора хитозана в уксусной кислоте, что существенно осложняет процесс получения открытой пористой структуры матрицы и равномерного распределения наполнителя.
Данные, приведенные в примерах 1-9, свидетельствуют о том, что в результате реализации заявляемой группы изобретений получены биосовместимые биодеградируемые пористые композиционные материалы, стабильно сохраняющие размеры, форму, сквозную пористую систему, проницаемую в водных средах. Они не цитотоксичны, в отличие от аналогов эти материалы получены, не прибегая к использованию химической сшивки, что способствует хорошей воспроизводимости при формировании пористой структуры. Выращивание клеток на матрицах из заявляемых материалов показало хорошую адгезию и быстрый рост в объеме матрицы мезенхимных стволовых клеток костного мозга и стволовых клеток жировой ткани человека.