СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ АНЕУПЛОИДИИ ЭМБРИОНОВ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ЖЕНЩИН С ЭНДОМЕТРИОЗ-АССОЦИИРОВАННЫМ БЕСПЛОДИЕМ
METHOD FOR PREDICTION OF EMBRYO ANEUPLOIDY IN THE EXTRACORPORAL FERTILIZATION PROGRAM IN WOMEN WITH ENDOMETRIOSIS-ASSOCIATED INFERTILITY

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии и медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
Актуальность. Эндометриоз – это состояние, при котором определяется наличие функционально активных желез и стромы эндометрия за пределами полости матки, что вызывает хронический воспалительный процесс в этих тканях. Эндометриоз, по мнению большинства исследователей, является одним из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, поражающих женщин активного репродуктивного возраста [A prospective cohort study of endometriosis and subsequent risk of infertility / J. Prescott [et al.] // Human Reproduction. – 2016. – Vol. 31, № 7. – P. 1475–1482]. Бесплодие — один из самых значимых, в том числе социально, симптомов эндометриоза. Эндометриозом страдают 25 - 50% инфертильных женщин, а 30 - 50% женщин с эндометриозом имеют бесплодие [Reproducibility of the Endometriosis Fertility Index: a prospective inter-/intra-rater agreement study / C. Tomassetti [et al.] // BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. - 2020. - Т. 127, № 1. - С. 107-114].
Эндометриоз-ассоциированное бесплодие, которое наиболее часто встречается при распространенном генитальном эндометриозе III-IV стадии [Mahajan N. Endometrial receptivity array: clinical application // J. Human ReprodSci. – 2015. – Vol. 8, № 3. - P. 121-129], на сегодняшний день является одним из показаний к применению вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в частности метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ) в полость матки. Успех выполнения программы ЭКО в значительной мере определяется качеством получаемых эмбрионов [Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов в программе ЭКО как способ профилактики наследственной патологии / И.Н. Фетисова [и др.] // Вестник Ивановской медицинской академии. – 2018. – Т. 23, № 3. - С. 10-13]. Генетическая неполноценность эмбрионов наиболее часто обусловлена анеуплоидией – наличием численных или структурных (делеции и дупликации) хромосомных аномалий.
Наиболее простым, но наименее точным методом выбора эмбрионов для переноса в полость матки является оценка их морфологических характеристик. Однако данный метод оценки качества эмбрионов является субъективным и не позволяет исключить наличие хромосомных аномалий даже у эмбрионов хорошего качества [Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study / M.G. Minasi [et al.] // Hum Reprod. - 2016. - Vol. 31, № 10. - C. 2245-2254].
В последние годы активно внедряется преимплантационное генетическое тестирование на предмет выявления анеуплоидии (ПГТ-А), которое позволяет диагностировать генетическую аномалию эмбриона на этапе до переноса в полость матки. Перенос эуплоидного эмбриона существенно повышает шансы, наступления беременности [Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial / R.T. Scott [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - Vol. 100, № 3. - P. 697-703], однако ПГТ-А является дорогостоящим методом диагностики, что значительно ограничивает его широкое использование.
Таким образом, разработка способа прогнозирования анеуплоидии эмбрионов у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием позволит выделить женщин в группу риска по получению у них анеуплоидных эмбрионов и обеспечить персонифицированный подход к назначению ПГТ-А, что позволит снизить расходы на проведение генетического тестирования и повысить эффективность процедуры ЭКО.
Известен способ прогнозирования качества эмбриона в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием путем исследования периферической венозной крови. До начала овариальной стимуляции в лейкоцитах определяют полиморфизм генов HLA II класса. При обнаружении аллелей DQBl*06 и/или DRBl*13 прогнозируют высокое качество эмбрионов, при отсутствии аллелей DQBl*06 и DRBl*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов [Патент № 2474823 Российская Федерация. Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения / Малышкина А.И., Липин М.А., Фетисова И.Н., Дюжев Ж.А., Богатова И.К., Полумискова Е.В. // Изобретения. Полезные модели. – 2013. - № 4].
Данный способ имеет ряд недостатков:
1. Данный способ предназначен для прогнозирования морфологических характеристик эмбрионов и не позволяет прогнозировать анеуплоидию.
2. Для системы генов HLA характерно явление множественного аллелизма, то есть в генофонде популяции присутствуют десятки и сотни аллелей одного гена. Подобное аллельное разнообразие может затруднять интерпретацию полученных данных.
3. Высокая стоимость исследования.
Известен способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток. Сущность способа заключается в том, что пациентку генотипируют по полиморфным локусам, по результатам генотипирования определяют вероятность получения эмбрионов низкого качества по формуле р=1/(1+е-z), где Z=-2236-0,79*AMHT/G - 20,621*AMHG/G +0,993*FSHRA/G+ 0,364*FSHRG/G - 1,206*LHCGR(935 A>G)A/G + 1,164*LHCGR(935 A>G)A/A + 22,888*LHCGR(872 A>G)A/G + 21,6*LHCGR(872 A>G)A/A. При значениях p больше 0,5 прогнозируют получение эмбрионов низкого качества, а при значениях р меньше 0,5 не прогнозируют получение эмбрионов низкого качества [Патент № 2577729 Российская Федерация. Способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток / Донников А.Е., Калинина Е.А., Владимирова И.В., Сухих Г.Т. // Изобретения. Полезные модели. -  2016. - № 8].
Данный способ имеет следующие недостатки:
1. Данный способ предназначен для прогнозирования морфологических характеристик эмбрионов и не позволяет прогнозировать анеуплоидию.
2. Большое количество исследуемых генов и наличие сложных математических расчетов затрудняет использование способа.
3. Высокая стоимость исследования.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения [Патент № 2657769 Российская Федерация. Способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения / Сафонова Н.А., Донников А.Е., Калинина Е. А., Макарова Н.П., Бурменская О.В., Долгушина Н.В., Горшинова В. К., Сухих Г.Т. // Изобретения. Полезные модели. – 2018. - № 17]. Способ заключается в том, что на основании анализа уровня экспрессии мРНК гена PFKP в кумулюсных клетках определяют вероятность наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества по формуле:
p=exp(logit)/(1+exp(logit),
где logit=-2,59+0,48*PFKP,
где PFKP - уровень экспрессии мРНК гена PFKP;
р - искомая вероятность наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества, и при значениях р выше 0,5 прогнозируют наличие хромосомных аномалий в данной группе эмбрионов.
Данный способ имеет следующие недостатки:
1. Метод предполагает использование инвазивной процедуры: трансвагинальная пункция яичников, которая имеет риск тяжелых осложнений.
2. Методика забора кумулюсных клеток для исследования увеличивает время нахождения ооцитов вне инкубатора, что может неблагоприятно сказываться на их оплодотворении и последующем развитии эмбрионов.
3. Данный способ предполагает забор и исследование кумулюсных клеток каждого ооцита, полученного после стимуляции овуляции у женщин, независимо от дальнейшего развития и качества эмбрионов, что увеличивает затраты расходных материалов.
4. После забора кумулюсных клеток, каждый ооцит (а в последующем и эмбрион) необходимо культивировать в отдельной капле среды, что потребует большего количества затрачиваемых на 1 пациентку культуральных сред, расходных материалов и оборудования.
5. Кумулюсные клетки отражают процессы, происходящие в каждом конкретном ооците, полученном в данной программе ЭКО, что обуславливает необходимость повторного исследования при проведении последующих циклов ВРТ.
6. Данный метод позволяет прогнозировать хромосомные аномалии только у эмбрионов удовлетворительного и плохого качества и не предназначен для прогнозирование хромосомных нарушений при получении эмбрионов хорошего качества.
7. Высокая стоимость исследования.
Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.
Техническим результатом является расширения арсенала способов прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе ЭКО у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
MTHFR
MTHFR
Технический результат достигается тем, что у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием в лейкоцитах периферической крови определяют полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( C677T) и при выявлении носительства аллеля  677T в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют анеуплоидию эмбрионов с точностью 77%.
MTHFR
Проведено определение полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( C677T) у 41 женщины с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием до начала вступления в программу ЭКО с последующей оценкой наличия анеуплоидии эмбрионов с помощью метода сравнительной геномной гибридизации на чипах (aCGH - comparative genomic hybridization) с использованием оборудования фирмы  Agilent Technologies (США).
MTHFR
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать анеуплоидию эмбрионов в программе ЭКО у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием путем определения у них полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( C677T) в лейкоцитах периферической крови.
MTHFR
Ранее определение полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( C677T)  использовалось для прогнозирования риска развития привычного невынашивания беременности [Полиморфизм генов фолатного обмена у женщин с первичной привычной потерей беременности ранних сроков / А.С. Добролюбов [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - 2006. - T. XIII, № 4. - С. 60], наружного генитального эндометриоза [Полиморфизмы генов фолатного обмена у женщин с наружным генитальным эндометриозом / М.Л. Добрынина [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - 2007. - Т. XIV, № 1. - С. 110-112], быстрого роста миомы матки [Малышкина А.И., Фетисова И.Н., Дюжев Ж.А. Генетические маркеры предрасположенности к быстрому росту лейомиомы матки // Проблемы репродукции. - 2012 - (Специальный выпуск) – С. 188-189].
MTHFR
В литературе отсутствуют сведения об использовании определения полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( C677T) для прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
Как известно, 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза является ключевым ферментом в процессе синтеза метионина из гомоцистеина. Гомо- и гетерозиготное носительство аллеля MTHFR 677Т обусловливает снижение активности энзима и, соответственно, приводит к развитию гипергомоцистеинемии. Повышение уровня содержания гомоцистеина является фактором риска развития тромбофилических осложнений, вероятность которых еще более повышается в период беременности вследствие перестройки свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем организма. Тромбофилический и атерогенный эффект гипергомоцистеинемии сказывается в нарушении плацентации и прерывании беременности [Рудзевич А.Ю., Кукарская И.И., Фильгус Т.А. Влияние врожденной тромбофилии на беременность и возможность коррекции // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 4. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27781 (дата обращения: 07.12.2020)].
Возможно недостаточная активность ферментов фолатного обмена может быть причиной снижения метилирования в половых клетках. При этом изменение профиля метилирования центромерных районов хромосом в процессе гаметогенеза может способствовать нарушению расхождения гомологов в мейозе и формированию несбалансированных гамет и как следствие анеуплоидных эмбрионов.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
I. Забор крови для исследования.
Кровь у пациенток получают методом венепункции локтевой вены (объем 3 мл) в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом. В качестве консерванта используют 0,5М раствор ЭДТА в соотношении консервант : кровь – 1:10
II. Выделение и очищение ДНК.
Выделение тотальной геномной ДНК из 100 мкл цельной венозной крови проводят сорбентным методом с использованием набора «Проба-ГС-Генетика» («ДНК-технология», Россия) по протоколу производителя.
MTHFR
III. Изучают полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы C677T (rs1801133) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием амплификатора детектирующего ДТпрайм («ДНК-технология», Россия) и набора реагентов «Генетика метаболизма фолатов» («ДНК-технология», Россия).
MTHFR
При выявлении носительства аллеля  677T гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют получение анеуплоидных эмбрионов в программе ЭКО у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.
MTHFR
MTHFR
Отличительные признаки способа: в лейкоцитах периферической крови женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием определяют полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( C677T) и при выявлении носительства аллеля  677Т в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют получение анеуплоидных эмбрионов.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1.
Женщина А., 28 лет, диагноз: Первичное бесплодие. Распространенный генитальный эндометриоз IV стадии: эндометриоидные кисты обоих яичников, ретроцервикальный эндометриоз, экстрагенитальный эндометриоз (эндометриоз мочевого пузыря, кишечника).
MTHFR
MTHFR
MTHFR
При молекулярно-генетическом тестировании генов фолатного цикла было определено гомозиготное носительство аллеля   677С в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( 677С/С), то есть отсутствие в генотипе аллеля  677Т.
Заключение: прогноз отсутствия анеуплоидии у эмбриона.
Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 2 зрелых ооцита. После проведения экстракорпорального оплодотворения получено 2 эмбриона. На 5 день культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы. В результате преимплантационного генетического тестирования методом сравнительной гибридизации на чипах было выявлено отсутствие анеуплоидии у обоих эмбрионов.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2.
MTHFR
MTHFR
Женщина К., 30 лет, диагноз: Первичное бесплодие. Распространенный генитальный эндометриоз IV стадии: эндометриоидная киста правого яичника, ретроцервикальный эндометриоз, экстрагенитальный эндометриоз (эндометриоз мочевого пузыря). Согласно предложенному способу при молекулярно-генетическом тестировании генов фолатного цикла было определено гомозиготное носительство аллеля  677Т в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( 677T/Т).
Заключение: прогноз наличия анеуплоидии эмбрионов.
Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 4 ооцита. После проведения экстракорпорального оплодотворения получено 4 эмбриона. На 5 день культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы. В результате преимплантационного генетического тестирования методом сравнительной гибридизации на чипах было выявлено наличие анеуплоидии у всех четырех эмбрионов.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 3.
Женщина В., 29 лет, диагноз: Первичное бесплодие. Распространенный генитальный эндометриоз III стадии: ретроцервикальный эндометриоз с распространением патологического процесса на крестцово-маточные связки.
MTHFR
MTHFR
Согласно предложенному способу при молекулярно-генетическом тестировании генов фолатного цикла было определено гетерозиготное носительство аллеля  677Т в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы ( 677 C/T).
Заключение: прогноз наличия анеуплоидии эмбрионов.
Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 3 зрелых ооцита. После проведения экстракорпорального оплодотворения получено 3 эмбриона. На 5 день культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы. В результате преимплантационного генетического тестирования методом сравнительной гибридизации на чипах было выявлено наличие анеуплоидии всех трех эмбрионов.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Результаты исследования приведены в таблице 1.
Таблица №1
Показатель
Количество
Всего обследовано
41
Истинно-положительный результат
14
Ложно-положительный результат
9
Истинно-отрицательный результат
14
Ложно-отрицательный результат
4
Чувствительность метода: 77,0%
Специфичность метода: 61,0%
Точность метода: 68,0%
Преимущества заявляемого метода:
1. Так как метод основан на оценке полиморфизма генов, исследование проводится один раз в жизни.
2. Способ позволяет прогнозировать анеуплоидию эмбрионов не зависимо от их качества.
3. Способ не оказывает влияние на проведение процедуры ЭКО, так как материалом для исследования является периферическая кровь.
4. Способ неинвазивен для ооцитов и эмбрионов.
5. Способ позволяет выделить женщин в группу риска по получению у них анеуплоидных эмбрионов, обеспечивает персонифицированный подход к назначению преимплантационного генетического тестирования, что способствует повышению эффективности процедуры ЭКО.
6. Доступность и небольшая стоимость способа.