СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИНАМИКИ ОСЕДАНИЯ КЛЕТОК КРОВИ
METHOD FOR DETERMINING BLOOD CELL SEDIMENTATION DYNAMICS

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной клинической диагностике. Изобретение может быть использовано для проведения лабораторных анализов в педиатрической практике, а также в исследовательских целях.
Величина скорости оседания эритроцитов (СОЭ) является неспецифическим показателем, широко используемым в клинической практике для оценки наличия воспалительных процессов в организме человека при различных заболеваниях и позволяющим следить за ходом заболевания и его лечения.
Известен принятый в России (классический) способ оценки скорости оседания эритроцитов, выполненный по методу Панченкова. Стеклянную градуированную трубку до установленного уровня наполняют смесью крови с 3,8% цитратом натрия (антикоагулянт) в соотношении 4:1 и помещают вертикально в штатив под зажимом (для устранения вытекания крови). Через час после начала измерения по делениям на трубке определяют расстояние (в мм), на которое опустился столбик эритроцитов от исходного уровня [Лабораторные методы исследования в клинике. / Под ред. Меньшикова В.В. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.].
Недостатком данного способа является длительное время анализа (более 1 часа), а также трудности, возникающие при заборе необходимого для исследования объема капиллярной крови (не менее 0.3 мл) и связанные с данным фактом нарушения правил забора и подготовки крови к исследованию. Кроме того, на процесс исследования значительное влияние оказывают субъективные факторы, связанные с профессиональной подготовкой медицинского персонала, чистота трубок, точность смешивания крови с антикоагулянтом, температурная стабилизация образца в процессе исследования. В целом, все эти факты ведут к ошибке анализа. Также признано, что единичное измерение, проводимое через 1 час с момента размещения трубок в штативе, дает только усредненное значение СОЭ и является недостаточным. Важно регистрировать динамику процесса оседания эритроцитов, что повышает информативность анализа.
Известен способ определения динамики оседания клеток крови, включающий смешивание цельной крови с антикоагулянтом, забор смеси в стандартную пипетку для измерений, установку ее вертикально в штатив и регистрацию в процессе оседания клеток положения границы эритроциты-плазма через равные промежутки времени (RU 2103672, опубл. 27.01.1998).
Данный способ исследования СОЭ занимает не менее 1 часа и требует для проведения, как и в классическом методе Панченкова, около 0,3 мл крови.
Известен способ определения динамики изменения скорости оседания эритроцитов, включающий стандартную пробоподготовку крови, забор ее в капилляры для измерения гематокрита и размещение их в вертикальном положении по периметру в роторе центрифуги. В процессе вращения центрифуги измеряют через заданные промежутки времени в капиллярах высоту столба плазмы, свободной от эритроцитов (RU 2256917, опубл. 20.07.2005).
Использование капилляров меньших размеров, чем стандартные трубки для измерения СОЭ, позволяет сократить объем необходимой крови, а центрифугирование - сократить время, за которое происходит оседание клеток, а соответственно, и время исследования. Однако уменьшение диаметра трубки значительно меняет условия оседания эритроцитов, так как значительное влияние оказывает контакт оседающих агрегатов со стенкой сосуда, что ведет к ошибочным результатам и недостаточной воспроизводимости результатов исследования. Использование центрифугирования трубок нарушает "физиологичность" процесса оседания, что также нежелательно.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является способ определения динамики оседания клеток крови, сущность которого заключается в том, что используют стандартный одноразовый иммунологический планшет, в лунку которого с помощью автоматического дозатора помещают исследуемую кровь с антикоагулянтом и регистрируют динамику оседания клеток крови путем измерения в течение заданного времени изменения интенсивности люминесценции плазмы крови над верхней границей слоя оседающих клеток крови (RU 2313091, опубл. 20.12.2007).
Недостатком данного способа является необходимость добавления в образец веществ, увеличивающих люминесценцию плазмы, которые могут неоднозначно повлиять на скорость оседания клеток.
Задачей настоящего изобретения является уменьшение количества крови, требуемой для проведения исследования, сокращение времени анализа, повышение информативности анализа, а также снижение числа случайных факторов, влияющих на процесс оседания клеток.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе определения динамики оседания клеток крови, так же как и в прототипе, с помощью автоматического дозатора помещают исследуемое количество крови с антикоагулянтом на прозрачную гидрофобную поверхность и освещают световым потоком.
Согласно изобретению анализируемую кровь располагают на прозрачной горизонтальной гидрофобной поверхности в форме лежащей капли, которую освещают снизу падающим перпендикулярно основанию капли световым потоком и регистрируют динамику оседания клеток путем измерения в течение заданного интервала времени изменений величин интенсивности светового потока, прошедшего через каплю крови в ее центральной осевой области.
Использование для исследования динамики оседания клеток пробы в виде лежащей капли существенно (до 20-30 мкл) снижает объем необходимой для исследования крови.
Процесс оседания клеток в капельной пробе (при высоте капли около 2 мм) заканчивается в зависимости от скорости оседания примерно через 10-40 мин, и, следовательно, требуется меньшее время для проведения исследования по сравнению с классическим способом.
Получение в ходе исследования кривых, отражающих динамику оседания клеток, позволяет повысить информативность анализа, так как данные графики являются характеристичным для каждого обследуемого и изменяются в зависимости его от физиологического состояния и, соответственно, могут дать дополнительную информацию о состоянии обследуемого. Кроме этого, начальный участок кривой фотометрирования капельного образца крови несет информацию об агрегационных процессах, происходящих в пробе, и ведущих в дальнейшем к оседанию клеток.
Ввиду отсутствия при оседании контакта клеток со стенкой сосуда устраняется действие случайных факторов, связанных с чистотой капилляра и влиянием пристеночных эффектов на процесс оседания.
Сущность предлагаемого способа поясняется описанием и чертежами.
На фиг.1 показана схема реализации способа оценки динамики оседания клеток крови.
На фиг.2 схематично показан ряд процессов, происходящих при оседании клеток в капельном образце крови.
Фиг.3 - структурная схема устройства, которое было использовано для реализации предложенного способа оценки динамики оседания клеток крови.
вых
На фиг.4 представлена экспериментальная зависимость изменения величины выходного напряжения (U) усилителя фототока (УС) от высоты слоя плазмы (h) над поверхностью оседающего слоя клеток в капельном образце (в соответствии с данными фиг.5) и линейная аппроксимация экспериментальных данных (пунктирной линией).
На фиг.5 представлен график 5.1, показывающий изменение во времени величины выходного напряжения усилителя фототока (УС) при изменении высоты слоя плазмы (h) над поверхностью оседающего слоя клеток в капельном образце, показанном на графике 5.2. Точкой "а" обозначен момент появления четко видимой границы раздела фаз клетки крови - плазма. Точкой "б" обозначен характерный участок перегиба кривой фотометрирования.
На фиг.6 показаны снимки боковой проекции капли крови, в которой идет оседание клеток, сделанные в начальный момент оседания - фото 6.1, через 3 минуты - фото 6.2, через 5 минут - фото 6.3, через 7 минут - фото 6.4, через 9 минут - фото 6.5, через 13 минут - фото 6.6.
На фиг.7 приведены экспериментальные графики, отражающие динамику оседания клеток крови в капле для проб крови с различной величиной СОЭ (измеренной по Панченкову), где кривая 7.1 для 2 мм/ч, кривая 7.2 для 8 мм/ч, кривая 7.3 для 17 мм/ч, кривая 7.4 для 23 мм/ч, кривая 7.5 для 42 мм/ч, кривая 7.6 для 70 мм/ч.
t10
t0
На фиг.8 представлена зависимость между параметром U-U, характеризующим скорость оседания клеток в капле, и величиной СОЭ исследуемого образца крови, измеренного методом Панченкова.
На фиг.9 представлены экспериментальные графики, отражающие динамику изменения оседания клеток крови в капле для больных до (кривая "а") и после лечения через 13 дней (кривая "б").
График 9.1. Пациент В., жен. 16 лет, диагноз пневмония, СОЭ (по Панченкову) до лечения 25 мм/ч, после лечения 12 мм/ч.
График. 9.2. Пациент X., муж. 33 года, диагноз - пневмония, СОЭ до лечения 46 мм/ч, после лечения 16 мм/ч.
График. 9.3. Пациент И., жен. 35 лет, диагноз - пневмония, СОЭ до лечения 70 мм/ч, после лечения 60 мм/ч.
График 9.4. Пациент С., жен. 62 года, диагноз - пневмония, СОЭ до лечения 14 мм/ч, после лечения 15 мм/ч.
График. 9.5. Пациент Т., жен. 69 лет, диагноз - пневмония, СОЭ до лечения 36 мм/ч, после лечения 42 мм/ч.
График 9.6. Пациент И., муж. 76 лет, диагноз - гангрена нижней конечности, СОЭ до лечения 60 мм/ч, после лечения 60 мм/ч. Наблюдалось ухудшение состояния.
Принцип способа оценки динамики оседания клеток крови поясняет фиг.1. Исследуемую кровь в виде лежащей капли 1 размещают на прозрачной гидрофобной кювете 2 между соосно расположенными источником оптического излучения 3 и приемником оптического излучения 4. Причем источник оптического излучения располагается под каплей 1, а приемник оптического излучения 4 - над ней. Прозрачная гидрофобная кювета 2 конструктивно выполнена так, что расположенная на ней капля 1 не растекается и сохраняет свою форму. Световой поток от источника оптического излучения 3 падает перпендикулярно основанию капли 1 и проходит через ее центральную осевую часть. Приемник оптического излучения 4 регистрирует излучение, прошедшее через каплю 1 в ее осевой области. Интенсивность светового потока, попадающего на приемник оптического излучения 4, определяется оптическими свойствами просвечиваемого образца и меняется с течением времени в зависимости от процессов, протекающих в капельной пробе 1.
В капельной пробе цельной крови с антикоагулянтом, так же как и в стеклянном капилляре, происходят процессы агрегации эритроцитов и оседания их под действием силы тяжести.
Процесс образования клеточных агрегатов ведет к увеличению прозрачности образца, и данный факт широко используется в современных оптических агрегометрах.
Ряд процессов являются специфичными при оседании клеток именно в капельной пробе, которые и были положены в основу предложенного способа.
На фиг.2 схематично показан ряд процессов, происходящих при оседании клеток в капельном образце крови, влияющих на его оптические свойства. Несмотря на то что поверхность капли на границе раздела кровь-воздух имеет форму, близкую к сферической, верхняя граница оседающего слоя клеток в капле практически плоская. То есть, происходит перераспределение клеток, оседающих в центральной осевой области капли по всему объему оседающего слоя (фиг.2а). Это приводит к уменьшению числа клеток в осевой области и, соответственно, увеличению прозрачности этой области капли.
Образование прозрачного слоя плазмы в виде линзы 5 над оседающим слоем клеток 6 (фиг.2.б) ведет к изменению рассеивающих свойств капельной пробы - "фокусировке" светового потока - и, соответственно, увеличению плотности светового потока над каплей.
В результате протекания этих основных процессов интенсивность светового потока, прошедшего через осевую область исследуемой капли крови 1 и попадающего на фотоприемник 4, меняется с течением времени и отражает процессы агрегации и оседания клеток в капельном образце.
Для осуществления способа использовалось устройство (патент на ПМ РФ №47526, 2005 г.), структурная схема которого представлена на фиг.3. Устройство состоит из термостабилизированной камеры первичного преобразователя 7 (ПП), включающей вертикально соосно расположенные источник оптического излучения 3 (ИИ) и приемник оптического излучения 4 (ИИ), между которыми размещается кювета с исследуемой капельной пробой жидкости 1 (ПР). В состав камеры первичного преобразователя 7 (ПП) входят также термодатчик 8 (ТД) и нагревательный элемент 9 (НЭ). В боковую стенку камеры первичного преобразователя 7 (ПП) встроен объектив видеокамеры 10 (ВК), сфокусированный на капельной пробе 1 (ПР). Видеокамера 10 (ВК) электрически связана с платой ввода видеоизображения персонального компьютера 11 (ПК). Кроме того, устройство включает: источник стабильного тока 12 (ИСТ), подключенный к источнику оптического излучения 3 (ИИ); блок терморегуляции 13 (ТР), электрически связанный с термодатчиком 8 (ТД) и нагревательным элементом 9 (НЭ); усилитель фототока 14 (УС), электрически связанный с приемником оптического излучения 4 (ПИ) и регистрирующим устройством 15 (РУ). Источник питания 16 (ИП) электрически подключен к блоку терморегуляции 13 (ТР), источнику стабильного тока 12 (ИСТ) и усилителю фототока 14 (УС). Для уменьшения испарения жидких проб в камере имеется система поддержания повышенной влажности.
вых
Усилитель фототока 14 (УС) представляет собой преобразователь ток (фотодиода) - напряжение и имеет линейную зависимость выходного напряжения (U) от интенсивности светового излучения, попадающего на связанный с ним приемник светового излучения 4 (ПИ). Световой поток от источника оптического излучения коллимирован и имеет диаметр 1-1,5 мм. Приемник оптического излучения 4 (ПИ) имеет угловую апертуру 5-10° и располагается над поверхностью капельной пробы на расстоянии 2-3 мм.
В качестве регистрирующего устройства 15 (РУ) использовался цифровой вольтметр В7-38.
Способ осуществляется следующим образом.
Устройство (фиг.3) для проведения исследований должно быть включено за 30 минут до начала исследования для установления в камере первичного преобразователя необходимого режима: температура 37°С±0,1°С, относительная влажность воздуха 100%.
Производится забор крови из пальца (вены) обследуемого по стандартной методике в пробирку необходимого размера. Взятую кровь сразу же разводят раствором 3,8% цитрата натрия в соотношении 4:1. Трубки (или другие устройства), с помощью которых производят забор крови, также должны быть ополоснуты раствором 3,8% цитрата натрия для устранения свертывания крови. Исследование динамики оседания клеток крови по предлагаемому способу желательно проводить сразу после вышеописанных процедур подготовки крови. Возможны другие варианты подготовки крови в зависимости от целей исследования.
Перед исследованием пробирку с кровью аккуратно встряхивают в течение 5-10 с. С помощью автоматического пипеточного дозатора на поверхность прозрачной гидрофобной кюветы наносят пробу подготовленной крови в виде лежащей капли объемом 20-30 мкл и диаметром основания 4-5 мм. Не допускается растекание капли крови за границу кюветы и наличие в ней пузырьков воздуха.
Кювету с капельной пробой в течение 10 с помещают в камеру первичного преобразователя 8 (ПП) устройства между источником 3 (ИИ) и приемником оптического излучения 4 (ПИ) и облучают световым потоком от источника оптического излучения 3 (ИИ). Прошедший через капельную пробу 1 (ПР) световой поток попадает на приемник оптического излучения 4 (ПИ), сигнал с которого усиливается усилителем фототока 14 (УС) и подается на регистрирующее устройство 15 (РУ).
вых
В течение заданного интервала времени, начиная с момента постановки кюветы с каплей в камеру первичного преобразователя и далее через каждые 30 с (или чаще) с помощью регистрирующего устройства 13 (РУ) измеряют величины выходного напряжения U усилителя фототока 14 (УС) устройства. Экспериментально показано, что наиболее информативный диапазон времени исследования при оседании клеток в капельном образце составляет 15-20 мин.
вых
вых
Изменение величины выходного напряжения U усилителя фототока, зарегистрированное описанным способом, линейно связано с увеличением высоты слоя плазмы (h) над поверхностью оседающего слоя клеток (фиг.4). Следовательно, график, построенный по результатам измерений значений выходного напряжения U усилителя фототока от времени (график 5.1 на фиг.5), отражает изменение положения верхней границы слоя оседающих клеток в капельном образце (график 5.2 на фиг.5), то есть динамику оседания клеток крови, и может быть использован для анализа процесса оседания.
вых
Значение высоты слоя плазмы (h) над поверхностью оседающего слоя клеток для доказательства линейной зависимости изменения выходного напряжения U усилителя фототока от данного параметра измеряли по увеличенным снимкам боковой проекции капли (фиг.6), полученным в процессе оседания с помощью видеокамеры 9 (ВК) устройства.
В ходе клинических исследований предложенного способа оценки динамики оседания клеток крови было обследовано 74 человека в возрасте от 16 до 79 лет (30 женщин и 44 мужчины). Исследованная группа включала как субъективно здоровых людей, так и больных, имеющих воспалительные процессы в организме (острый аппендицит, острый холецистит, гнойные раны, гангрена, отморожения, острая пневмония бронхиальная астма и др.).
Для каждого обследуемого проводилась процедура забора и исследования крови предложенным способом. Одновременно с исследованием крови предложенным способом проводилось измерения СОЭ крови обследуемых по стандартному методу Панченкова. На фиг.7. приведены примеры графиков, полученных в ходе исследования, отражающие динамику оседания клеток в капельном образце для проб крови с разным значением величины СОЭ измеренной по Панченкову.
вых
t0
t10
t10
t0
При анализе результатов сопоставляли показатели динамики оседания клеток в капельном образце со значениями СОЭ, полученными по стандартной методике Панченкова. Наиболее тесная связь величины значений СОЭ, полученных методом Панченкова, наблюдается с показателем, отражающим изменение величины выходного напряжения U усилителя фототока 14 (УС), измеренного в начальный момент оседания U() и на 10 мин U(): U-U. Как видно из зависимости, представленной на фиг.8, которая построена на основе анализа данных 74 обследованных, наблюдается прямо пропорциональная связь этих показателей с коэффициентом корреляции не ниже 0,93.
У ряда больных, подвергшихся этиотропной и патогенетической терапии, был проведен повторный анализ проб крови. Ряд сравнительных экспериментальных графиков представлен на фиг.9.1-9.6. Было установлено, что при обследовании больных, проходивших лечение и имеющих положительную динамику в развитии патогенетического процесса, повторные кривые динамики оседания клеток имели меньшую скорость нарастания (фиг.9.1-9.4). Для больных, у которых болезнь прогрессировала, кривые при повторных измерениях имели большую скорость нарастания или практически мало отличались от исходных кривых (фиг.9.5-9.6).
Начальный участок кривой фотометрирования капельного образца (1-2 мин) до характерного перегиба, обозначенной точкой "б" (фиг.5), после которого резко увеличивается скорость нарастания кривой, несет информацию об агрегационных процессах в пробе и также может быть учтен при анализе процесса оседания.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет уменьшить количество крови, требуемой для проведения исследования, сократить время анализа, повысить информативности анализа, а также снизить число случайных факторов, влияющих на процесс оседания клеток.