Способ выявления эндотелиальных клеток на гистологических препаратах
METHOD FOR DETECTING ENDOTHELIAL CELLS ON HISTOLOGICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к медико-биологическим наукам, в частности к иммуноморфологической ангиологии и гистологии, и может быть использовано в клинической практике и медицинской диагностике.
Наиболее частой проблемой оперативного лечения варикозного расширения вен, является реканализация тромбов, т.е. процесс восстановления проходимости сосуда путем лизиса сгустка, естественного врастания в тромб соединительной ткани и эндотелия.
Основной клеточной популяцией, препятствующей формированию тромбов и способствующей их реканализации, являются эндотелиоциты интимы сосудов. Соответственно, серьезное внимание в современной иммуноморфологической ангиологии уделяется проблеме определения маркеров функциональной активности эндотелия, обладающих высокой прогностической ценностью в отношении предсказания исходов оперативного лечения.
Возможным кандидатом на роль такого маркера выступает специфический белок системы гемостаза - фактор Виллебранда (фВ). Этот мультимерный гликопротеин обеспечивает адгезию тромбоцитов, их прикрепление к сосудистой стенке в зоне повреждения эндотелия. Его отсутствие или недостаток приводит к нарушению процессов коагуляции, в частности, к развитию болезни Виллебранда - наследственному заболеванию крови, которое характеризуется возникновением эпизодических спонтанных кровотечений, схожих с кровотечениями при гемофилии. Болезнь передается от родителей к детям каждое поколение и чаще встречается у женщин.
Этот белок экспрессируется только двумя популяциями клеток - эндотелиоцитами и мегакариоцитами. Мегакариоциты не встречаются на гистологических срезах кровеносных сосудов и это дает возможность считать фактор Виллебранда специфическим маркером эндотелиоцитов (Коржевский Д.Э. и соавт., Фактор Виллебранда эндотелиоцитов кровеносных сосудов и его использование в иммуноморфологических исследованиях. // Мед. Акад. Журн., 2017. Т. 17, №1. С. 34-40).
Определение уровня плазменного фВ имеет важное значение для диагностики болезни Виллебранда и дифференциации некоторых форм этого заболевания с гемофилией А, а также для прогноза развития тромбозов. Но в плазме крови присутствует лишь небольшое количество десквамированных клеток эндотелия и много тромбоцитов с высоким содержанием фактора Виллебранда, а также свободных форм фВ. Это препятствует выявлению эндотелиоцитов в плазме крови и актуализирует методы выявления эндотелиальных клеток на гистологических срезах с использованием фВ.
В клинико-лабораторной практике известен косвенный способ определения фактора Виллебранда, основанный на подсчете количества единичных тромбоцитов в препарате плазмы крови и вычислении индекса ристомициновой агрегации отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов (авт. свид. SU №1827624, дата подачи 09.04.1990). Однако этот способ дает весьма приблизительные результаты, характеризуется высокой трудоемкостью и низкой производительностью.
Известен морфологический способ выявления фВ в клетках эндотелия in situ, основанный на выявлении телец Вейбеля-Палада при помощи электронной микроскопии (Коржевский Д.Э. и соавт., Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. 2006. Т. 129, №3. С. 63-64.). Этот метод позволяет точно визуализировать организованные в трубчатые структуры мультимеры фВ, содержащиеся в тельцах Вейбеля-Палада, но он очень трудоемкий и при этом не дает возможности оценить общее распределение фВ вне этих органелл как внутри клетки, так и в субэндотелиальном слое. Следует также отметить, что при электронной микроскопии не всегда удается определить тельца Вейбеля-Палада в силу особенностей восприятия этими ультраструктурами контрастирующих веществ.
Содержание фВ на гистологических препаратах можно определить способом двух- или трехступенчатой иммуногистохимической реакции (ИГХ) с дальнейшим выявлением продукта реакции с помощью 3,3-диаминобензидина (ДАБ) или флуоресцентной метки (Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Колос Е.А., Сухорукова Е.Г., Алексеева О.С., Гусельникова В.В., Карпенко М.Н., Меркульева Н.С., Шкорбатова П.Ю., Михалкин А.А. Иммуноцитохимия и конфокальная микроскопия. Санкт-Петербург: СпецЛит. 2018. 103 с). Для этого при двухступенчатом способе в качестве первичных антител используют высокоспецифичные моноклональные или поликлональные антитела против фВ человека и лабораторных животных (например, кроличьи поликлональные антитела к фактору Виллебранда (А008202, Agilent, США)), а в качестве вторичных антител - антитела, конъюгированные с пероксидазной меткой (например, реагент HRP Conjugate из набора Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System (Spring Bioscience, США) или флуорохромами (например, антитела, конъюгированные с тетраметилродамин-изотиоцианатом (TRITC) (Dako, Дания). При трехступенчатом способе в качестве первичных антител можно использовать имеющийся в настоящее время большой набор высокоспецифичных моноклональных и поликлональных антител против фВ человека и лабораторных животных (например, кроличьи поликлональные антитела к фактору Виллебранда (А008202, Agilent, США)), а в качестве вторичных антител - последовательно биотинилированные антитела (например, Link из набора LSAB2 System-HRP (Agilent, США)) и конъюгат стрептавидина с флуорохромом, например, Су2 (Jackson ImmunoResearch, США)).
Однако и эта группа методов наряду с высокой трудоемкостью имеет существенные недостатки. Так, при иммуногистохимической реакции с использованием пероксидазной метки, выявление продукта реакции происходит с помощью диаминобензидина, обладающего высокой канцерогенной активностью, что требует особых мер предосторожности от оператора.
Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, явилось создание более эффективного (позволяющего добиться высокого разрешения при микроскопии препаратов), менее затратного (в финансовом плане и в плане трудозатрат) и более промышленно безопасного (без использования экологически вредных и опасных для оператора веществ) иммуногистохимического способа определения фВ.
Для решения этой задачи нами предложено использовать флуорохромы, обладающие коротковолновой эмиссией (сине-зеленая часть спектра), например, Brilliant Violet, Су2 или FITC, что позволяет достичь более высокого разрешения при изучении малых объектов, какими являются тельца Вейбеля-Палада в эндотелии кровеносных сосудов или тромбоциты. Подкраску ядер в этом случае удобно осуществлять красителем с более длинноволновой эмиссией (в красной части спектра), например, 7-AAD.
Предлагаемый способ заключается в том, что в иммуногистохимической реакции используют первичные антитела, уже конъюгированные с флуорохромом FITC, предназначенные для использования в диагностике ИФА (например, ab8822, AbCam, Великобритания), при этом нет необходимости в использовании вторичных антител.
Способ осуществляют следующим образом.
1. Материал для исследования фиксируют в 10% формалине в течение 24 часов при комнатной температуре. Обезвоживают и заливают материал в парафин любым из способов, рекомендованных для иммуноцитохимических исследований. Из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы толщиной от 5 до 10 микрометров и наклеивают их на предметные стекла с заранее нанесенным адгезивным покрытием, например, Histo Bond (Marienfeld, Германия).
2. Проводят депарафинизацию срезов в ксилоле с проводкой по спиртам понижающей концентрации.
3. После 5-минутной промывки срезов в дистиллированной воде, их подвергают в течение 22 минут процедуре теплового демаскирования в пароварке в сосуде Хелендахела с модифицированным цитратным буфером рН 6,1 (S1700; Dako, Дания), предварительно прогретом до 45-60°С. Снимают крышку с пароварки и, не вынимая стекла со срезами из сосуда Хелендахела, дают раствору остыть.
4. Остывшие предметные стекла со срезами промывают дистиллированной водой, оставляют в стаканчике с 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4 (ФСБ) на 5 мин при комнатной температуре. Буферный раствор может быть приготовлен из таблетированной формы.
5. Аккуратно промакивают фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов (для образования сухого поля) и обводят срезы гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.), не допуская высыхания срезов.
6. Наносят на срезы достаточное количество (для их покрытия) блокировочного раствора, например, Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставляют при комнатной температуре на 10 мин.
7. Сливают излишек блокировочного раствора и, не промывая препараты, наносят на срезы достаточное количество смеси антител к фактору Виллебранда (ab8822, AbCam, Великобритания) в разведении 1:100, конъюгированных с флуоресцентным красителем FITC, и флуоресцентного ядерного красителя 7AAD (7-аминоактиномицин D) в разведении 1:50, например, из набора Select FX (Invitrogen, США). Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения антител. Размещают стекла во влажной камере (например, в квадратные чашки Петри 100×100 мм, SARSTEDT: 82.9923.422, Австралия) и ставят их в термостат 27°С на 48 часов. Перед началом инкубации в каждую влажную камеру необходимо налить примерно по 5-10 мл дистиллированной воды. В качестве подставок под предметные стекла можно использовать крышки от маленьких (40 мм) пластиковых чашек Петри для предотвращения контакта предметных стекол с водой.
8. Промывают препараты в трех сменах дистиллированной воды по 5 минут в каждой.
9. Заключают препараты в водорастворимую среду Prolong Glass (Agilent, США) или другие аналогичные водорастворимые среды.
При проведении флуоресцентной микроскопии иммунопозитивные структуры клеток, содержащие фВ, проявляют зеленую флуоресценцию, ядра клеток проявляют красную флуоресценцию.
Метод прост для воспроизведения, не требует использования дорогостоящих и опасных для здоровья веществ, применим для исследования архивного материала, хранящегося в парафиновых блоках, обработки тонких срезов.
Для оценки преимуществ предлагаемого метода, по сравнению с известными методами определения фактора Виллебранда, осуществлен хронометраж последовательных этапов их выполнения, результаты которого приведены в таблице.
Из приведенной выше таблицы видно, что суммарное время постановки реакций во всех случаях существенно не отличается. Однако большое преимущество предлагаемого метода заключается в значительном, практически в два раза, сокращении количества операций и, следовательно, уменьшении трудоемкости, увеличении надежности за счет снижения вероятности ошибки.
Еще одним важным преимуществом предлагаемого метода является использование первичных антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, которая по своим размерам значительно меньше комплексов, образованных при полимерной реакции с пероксидазной меткой или комплексов, которые формируются при биотин-стрептавидиновой амплификации. На фиг. 1 изображена схема образования визуализируемых комплексов антител с меткой для последующей микроскопии. Номера комплексов соответствуют столбикам приведенной выше таблицы. Крупные комплексы при визуализации не позволяют различить более мелкие структуры, расположенные рядом, закрывая их и объединяя в единый видимый объект, тогда как заявляемый способ обеспечивает более высокую различительную способность.
На фиг. 2 приведена микрофотография капилляров сердца человека (указаны стрелками). Иммуногистохимическая реакция на фактор Виллебранда, визуализация с помощью флуорохрома FITC (зеленый цвет), ядра окрашены красителем 7AAD (7-аминоактиномицин D) (красный цвет). Флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок равен 20 мкм.
Несмотря на кажущуюся небольшой разницу во времени проведения ИГХ-реакции, предлагаемый способ требует значительно меньше трудозатрат оператора при однозначно более высокой степени выявления продукта реакции.