Питательные среды в производствах медицинских и ветеринарных препаратов

УДК 619.15

О. В. Федорова, С. А. Понкратова, Р. Т. Валеева, И. Р. Исламгулов

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ В ПРОИЗВОДСТВАХ МЕДИЦИНСКИХ И ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Ключевые слова: питательные среды, микроорганизмы.

Представлен обзор разнообразия составов питательных сред, применяемых при культивировании микроорганизмов в производстве медицинских и ветеринарных препаратов. Приведена классификация питательных сред, требования, предъявляемые к ним, возможные варианты использования отходов перерабатывающей промышленности и агропромышленного комплекса, как компонентов питательных сред

Key words: culture media, microorganisms.

An overview of the diversity of the compositions of culture media used in the cultivation of microorganisms in the production of medical and veterinary preparations. Classification of culture media, the demands placed upon them, the possible uses for the waste processing industry and agriculture, as components of culture media

Питательные среды являются основой исследовательской и производственной работы микробиологов и определяют ее успех [1]. Первые питательные среды были сконструированы во времена классических исследований Пастера и Коха. Особая роль принадлежит Роберту Коху. Постулировав необходимость выделения чистой культуры микроба, он определил необходимые условия решения этой задачи. Важнейшим из них явился состав питательной среды, на которой можно было бы получить рост микроорганизмов. Внедрение в микробиологическую практику в 1881 г. плотных питательных сред (сама идея их использования возникла раньше и принадлежит немецкому исследователю Бредфель-ду) позволило осуществить в контролируемых условиях рост колоний. Им же предложен первый отвер-дитель - желатин, как компонент плотной среды. Привычный для современных микробиологов агар-агар предложила в 1881 г. немецкая исследовательница Хессе, а в повседневную практику он внедрен Фростом значительно позже, в 1919 г. Идеи и практическая деятельность Коха получили в конце XIX и первой четверти XX века интенсивное развитие. Именно в этот период исследователи ряда стран предложили питательные среды различного назначения, роль которых для практической микробиологии и биотехнологии была и остается определяющей и в настоящее время [2]. Большой вклад в разработку составов питательных сред внесен многими отечественными учеными. Среди них можно отметить следующих авторов:

- С.Н. Виноградский - конструирование и широкое использование селективных питательных сред,

- И.Е. Минкевич и И.И. Рогозин - жидкая питательная среда для обнаружения кишечной палочки,

- Н.В. Плоскирев - селективная среда для выделения шигелл и сальмонелл,

- Г.Н. Чистович - элективно-дифференциальная среда для выделения патогенных стафилококков,

- А.М. Безредка - питательная среда для выращивания туберкулёзных бактерий.

В XX веке конструирование питательных сред получило дальнейшее развитие в связи с увеличением разнообразия практического применения микро-

биологических технологий [3]. При получении жизнеспособного посевного материала, прежде всего, необходим подбор питательной среды. Питательная среда предназначена для обеспечения жизнедеятельности, для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, синтеза целевого продукта. В состав питательной среды должны входить органогенные элементы, макроэлементы и микроэлементы, которые должны входить в среду в легкоусвояемом для микроорганизмов виде.

Количество используемых составов питательных сред (с учетом модификаций) по различным источникам превысило 5000 прописей [4]. Все большее развитие получают многокомпонентные синтетические среды, на сегодняшний день все больше появляется питательных сред, содержащих стандартные компоненты, что позволяет контролировать качество питательных сред, а также качество проводимых с их использованием исследовательских работ.

Все питательные среды, использующиеся в лабораторной практике, подлежат регистрации в Рос-здравнадзоре [4].

По своему составу питательные среды подразделяются на:

- естественные среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения и имеющие неопределенный химический состав: кровяные, молочные, картофельные, яичные, а также овощные и фруктовые соки;

- полусинтетические среды, в состав которых, наряду с веществами неопределенного состава входят соединения известной химической природы:

среды, в состав которых входят источника азота и углерода, пептоны, полученные путем неполного расщепления белков с помощью ферментов пепсина и трипсина, различные гидролизаты, такие, как рыбные, казеиновые, мясные, дрожжевые;

- синтетические среды, содержащие только химически чистые соединения в точно указанных концентрациях, с полностью известным составом [5, 6].

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в состав таких сред входят все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако данные среды имеют сложный

непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии, обмена веществ микроорганизмов, так как в значительной степени не позволяют строго учесть потребление многих компонентов питательной среды и образование продуктов обмена по ходу развития. Естественные среды используются для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и в диагностических целях. Это мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, картофельные среды [3].

К числу натуральных сред неопределенного состава относят и полусинтетические среды, в состав которых входят соединения известной химической природы и вещества неопределенного состава: мясо-пептонный бульон с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро [4].

К полусинтетическим средам относятся среды, содержащие соединения известного состава - углеводы, нитраты, фосфаты и, в незначительных количествах, соединения неопределенного состава - гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, добавляемые в качестве факторов роста [4].

Для выращивания микроорганизмов чаще используются полусинтетические питательные среды, так как в этих средах такие ценные пищевые продукты как мясо заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови. Так в состав мясопептонных сред, кроме мясного экстракта и пептона, входят и минеральные компоненты такие, как поваренная соль, фосфат калия. Полусинтетические среды хороши для выращивания определенных групп микроорганизмов и для выделения из среды продуктов их жизнедеятельности: антибиотиков, витаминов [7].

Для культивирования микроорганизмов - выращивания в искусственных условиях in vitro - необходимы особые субстраты — питательные среды разного химического состава, соответствующие требованиям данного вида.

Питательные среды являются основным звеном в системе микробиологических и биотехнологических работ, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Питательные среды должны создавать наилучшие (оптимальные) условия для жизнедеятельности культур и должны удовлетворять следующим требованиям:

- содержать все необходимые для развития микроорганизмов питательные вещества;

- иметь оптимальное значение водородного показателя рН для выращиваемого вида микроорганизмов;

- иметь достаточную влажность, так как транспорт питательных веществ к клеткам определяется законами диффузии и осмоса;

- обладать изотоничностью;

- быть стерильными, обеспечивая, тем самым, возможность выращивания чистых культур.

Огромную роль в технологическом процессе приготовления питательных сред играет вода, к которой предъявляются большие требования. Основной частью питательной среды является вода и все процессы жизнедеятельности протекают только вводной среде. Для протекания химических

реакций в живых организмах необходима вода в доступной для них форме - жидкой фазе. Вода составляет большую часть около 80-90% массы живых микроорганизмов. При недостатке воды нарушается обмен веществ в клетке. Не менее важную роль играет вода как один из основных компонентов среды, в которой растворены источники питания и продукты метаболизма, поступающие из клеток. Вода является функциональным элементом, определяющим биохимическую деятельность клеток, как бы продолжением внутренней среды клеток. Вода должна быть биологически чистая, прозрачная, бесцветная с минимальным количеством бактериальных загрязнений, содержание солей в воде обязательно регламентируется специальным ГОСТом. В воде, используемой для приготовления питательных субстратов, должно содержаться не более 50 мг/л хлоридов и 60 мг/л сульфитов. Ионы металлов не должны превышать следующих пределов, мг/л: свинец - 0,2; мышьяк - 0,05; фтор -1,5; цинк - 5,0; медь - 3,0.

Для проведения обязательного технохимическо-го контроля (микроскопирование, определение оптической плотности) и получения более точных данных экспериментальных исследований необходимо, чтобы питательные среды были по консистенции прозрачными — без посторонних примесей [8].

Достоинством синтетических питательных сред является стандартность и воспроизводимость с высокой степенью точности. Данные среды наиболее удобны для проведения экспериментальных исследований в области обмена веществ микроорганизмов [3].

На сегодняшний день существует большое разнообразие типов питательных сред [9]:

Белковые среды:

- с нативными и натуральными белками;

- с высоким содержанием «белкового азота»;

- с незначительным содержанием или практически свободные от «белкового азота».

Среды промежуточные между белковыми и синтетическими:

- полусинтетические без «белкового азота»;

- с основой в виде кислотного гидролизата казеина;

- с синтетической основой из аминокислот и незначительным содержанием кислотного, триптиче-ского или грибного казеинового гидролизата глубокого расщепления или дрожжевого автолизата.

Синтетические, полусинтетические и казеиновые среды [10]:

- гликоколовая синтетическая среда ВКЛ (среда Вакенгут, Козловской и Лещинской - 1944 г.) в производстве вакцины BGG;

- модифицированная среда ВКЛ;

- для микобактерий;

- для выращивания в условиях глубинного роста при аэрации дизентерийных и паратифозных бактерий в производстве кишечных вакцин;

- для выращивания бактерий в производстве поливакцины против кишечных инфекций и столбняка;

- для выращивания дизентерийных бактерий Флекснера в производстве поливакцины из полных антигенов;

- казеиновые среды в производстве поливакцины из полных антигенов;

- полусинтетическая казеиново - грибная среда для микобактерий;

- казеиново - грибная среда для микобактерий при изготовлении альттуберкулина;

- для выращивания тифозных бактерий.

Среды на основе рыбо - костной муки [11]:

- рыбо - грибная среда для глубинного выращивания бактерий в производстве кишечных вакцин при аэрации;

- среда из гидролизата рыбо-костной муки для производства токсина Bacillus oedematiens.

Комбинированные среды из рыбо - костной муки и казеина:

- из грибных гидролизатов рыбо - костной муки и казеина для получения токсина Bacillus perfringens;

- комбинированная среда из рыбо - кукурузного и казеинового гидролизатов для производства боту-линических и столбнячного токсинов;

- казеиново - рыбная среда для получения столбнячного токсина - анатоксина.

Рыбные среды [12]:

- рыбо - желатиновая среда в производстве сухой живой туляремийной вакцины из глубинной культуры;

- из рыбных автолизатов для получения дифтерийного токсина - анатоксина.

Среды из китовой муки:

- из китовой муки для изготовления дифтерийного токсина - анатоксина;

- с гидролизатом китовой муки для глубинного выращивания бруцелл при производстве бруцеллина и туляремийной вакцины.

Мясные среды [13]:

- мясной бульон Хоттингера в производстве кишечных вакцин из аэрированных культур;

- плотная среда типа Хеддльсона на мартеновском

пептоне с настоем печени для производства бруцеллезной вакцины;

- жидкая среда для производства бруцеллезной вакцины;

- мартеновский бульон в производстве

дифтерийного анатоксина;

- среда триптического ферментолиза для производства дифтерийного анатоксина;

- среда триптического ферментолиза с поджелудочной железой, энтерокиназой и мальтозой для получения дифтерийного токсина;

- среда с рисовым сиропом - модификация среды Попе для получения дифтерийного токсина;

- мясо - грибная среда для получения токсина Bacillus perfringens;

- мясная среда папаинового переваривания для получения токсина Bacillus oedematiens.

Комбинированные мясные среды:

- комбинированный мясной бульон для производства скарлатинозного токсина;

- комбинированные мясо - казеиновые среды для получения столбнячного токсина - анатоксина;

- среда на основе казеиново - мясного бульона на пептоне по Легру и Рамону;

- среда на основе казеиново - мясного бульона на гидролизате по Глузману, Червякову и Ста-робинцу;

- среда для выращивания стрептококка и стафилококка при изготовлении препарата против ревматизма.

Растительные среды [14]:

- среда с автолизатом гороха для глубинного культивирования бактерий кишечной группы, обогащенная дикарбоновыми кислотами;

- среда на основе триптического гидролизата семян сои для выращивания холерного микроба в условиях аэрации;

- картофельный агар для выращивания бруцелл в производстве сухой вакцины;

- картофельная среда Борде - Жангу с кровью для производства коклюшной вакцины;

- растительные среды в производстве бактериофага [15].

Несмотря на то, что существует значительное количество прописей питательных сред, до сегодняшнего дня ведутся многочисленные исследовательские работы по увеличению выхода целевых продуктов микробиологических стадий производств биопрепаратов на основе подбора составов питательных сред. Это работы по аэробному культивированию спиртовых дрожжей [16], кормовых дрожжей [17], пробиотических препаратов [18, 19].

При этом возрастает объем исследований по применению в микробиологическом и биотехнологическом производстве универсальных, стандартизованных, экономически выгодных и доступных видов сырья, используемых для приготовления питательных сред [20]. В частности, тестируются способы использования в качестве компонентов питательных сред отходов перерабатывающей промышленности: мясоперерабатывающей - кровяная, костная мука; промышленного рыбного лова и рыбопереработки - рыбная мука [21]; крахмало-паточного и глюкозного производства - кукурузный экстракт

[22]; сахарного производства - свекловичный жом

[23]; отходы агропромышленного комплекса - отходы растительного сырья: кукурузные кочерыжки, солома, подсолнечный шрот [24, 25].

Значительный объем новых разработок посвящен и производству пробиотических препаратов. Алгоритм конструирования унифицированных составов питательных сред для массового производства про-биотических препаратов включает несколько необходимых этапов:

- предварительный выбор питательных субстратов с учетом критериев биологической ценности, доступности и экономичности;

- получение питательных составов и оценка их эффективности сравнением с моделями регламентированных питательных сред;

- разработка и оценка способов получения питательных сред с учетом критериев технологичности и трудоемкости;

- балансировка состава питательных сред [26]. Таким образом, для выделения и культивирования микроорганизмов могут применяться среды из различного сырья. Располагая широким набором компонентов, можно более эффективно осуществлять конструирование питательных сред различного назначения, и, прежде всего тех, которые могут изготавливаться из доступных дешевых продуктов непищевого назначения отечественного производства. Замена сырья животного происхождения непищевым в настоящее время диктуется экономическими факторами и рассматривается как важнейшее направление научных исследований в области разработки и производства питательных сред [1].

Литература

1. О.Л. Старцева, дисс. канд. биол. наук, Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, Ставрополь, 2005. 160 с.

2. Дж. Мейнел, Э. Мейнел, Мир, 46-83, (1967).

3. М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич, ЭЛБИ-СПб, Санкт-Петербург, 2002, 80 с.

4. Письмо Федеральной службы от 27.03.2009 №01И-170/09 «О Методических рекомендациях по классификации питательных сред для медицинской микробиологии (лабораторная диагностика in vitro) в целях регистрации изделий медицинского назначения» // ФС РФ, 2009.

5. А.И. Коротяев, С.А. Бабичев, Специальная литература, Санкт-Петербург, 1998, 558 с.

6. Д.А. Евглевский, А.А. Евглевский, В.В. Семенютин, И.И. Смирнов, К.В. Татарников, Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии 4, 64-66, (2011).

7. А.П. Асташкина, Томский политехнический университет, Томск, 2015, 19 с.

8. Н.В. Прозоркина, П.А. Рубашкина, Феникс, Ростов-на-Дону, 2002, 168 с.

9. И.Н. Виноградова, В.Е. Власова, Н.А. Палкина, Микробиология 2, 61-65, (1956).

10. В.Е. Власова, И.Н. Виноградова, Н.А. Палкина, Микробиология 2, 108-114, (1960).

11. А.Б. Мазрухо, дисс. докт. мед. наук, Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ростовский-на-Дону ордена трудового красного знамени научно-исследовательский противочумный институт федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Ростов-на-Дону, 2016. 302 с.

12. А.А. Трифонова, А.В. Тереножкина, Микробиология и иммунология особо опасн. инф., 287-290, (1964).

13. Ю.А. Козлов, Медгиз, Москва, 1950, 252 с.

14. А.М. Носов, Биотехнология 5, 8-28, (2010).

15. М.М. Меджидов, З.З. Султанов, Дагестанское книжное

издательство, Махачкала, 1986, 72 с.

16. Н.К. Филиппова, Биотехнология 1, 49-53, (2002).

17. Р.Т. Валеева, Э.И. Нуретдинова, С.Г. Мухачев, М.Ю. Шурбина, О.В. Красильникова, Вестник Казанского технологического университета 24, 133-135, (2014).

18. Ю.И. Иванов, С.Г. Мухачев, Р.Т. Валеева, Сборник

тезисов - Архангельск, 170-171, (2014).

19. А.П. Лиморенко, дисс. канд. биол. наук, Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва, 2002. 149 с.

20. В.М. Аристовский, И.Е. Минкевич, С.М. Фрид, Медгиз, Москва, 1945, 492 с.

21. Р.Т. Валеева, О.В. Федорова, С.Г. Мухачев, Вестник технологического университета 22, 147-150, (2016).

22. Р.Т. Валеева, О.В. Красильникова, А.Ф. Мухутдинова,

Р.М. Нуртдинов, Вестник технологического университета

9, 267-268, (2015).

23. Р.Т. Валеева, Э.И. Нуретдинова, А.С. Понкратов, О.В.

Ананьева, М.Ю. Шурбина, Вестник технологического

университета 13, 161-163, (2016).

24. Р.Т. Валеева, А.Р. Минмуллина, О.В. Ананьева, Э.Р. Гайфуллина, Ч.Р. Зайдуллина, Вестник Казанского технологического университета 15, 151-153, (2016).

25. Р.Т. Валеева, С.Г. Мухачев, О.В. Красильникова, Вестник Казанского технологического университета 1, 219-221, (2014).

26. В.А. Несчисляев, Е.Г. Арчакова, В.Б. Моховикова, И.В. Белова, Фундаментальные исследования 12, 48-49, (2007).

© О. В. Федорова - магистрант 2 курса группы 615-М9 каф. химической кибернетики КНИТУ; С. А. Понкратова - канд. техн. наук доцент той же кафедры; Р. Т. Валеева - канд. техн. наук доцент той же кафедры, уаМ2008@гатЫег.га; И. Р. Ис-ламгулов - магистрант 2 курса группы 615-М8 той же кафедры, jti_tatar@mail.ru.

© О. V. Fedоrоvа - mаster, Depаrtment оf ^етка1 СуЬег^^, KNRTU; S. A. Ponkratova - cаndidаte оf Летюа1 science, аssоciаte Prоfessоr Depаrtment оf ^етка1 СуЬех^^, KNRTU; R. T. Vаleevа cаndidаte оf Летка1 science, аssоciаte Prоfessоr Depаrtment оf Chem^l Cуbernetics, KNRTU, vаlrt2008@rаmbler.ru; I. R. Islamgulov mаster, Depаrtment оf Chem^l Cуbernetics, KNRTU, jti_tatar@mail.ru.