14-е рабочее совещание европейской исследовательской группы по лизосомным болезням (Подебрады, Чехия, 18-21 сентября 2003 г. )

ИНФОРМАЦИЯ

А.Б. Пупышев

14-Е РАБОЧЕЕ СОВЕЩАНИЕ ЕВРОПЕЙСКОЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ ГРУППЫ ПО ЛИЗОСОМНЫМ БОЛЕЗНЯМ

Впервые Европейская исследовательская группа по ли-зосомным болезням (ЕИГЛБ) проводила свою работу в Восточной Европейской стране, представленной в Совете группы Председателем Восточно-европейского сектора проф. Миланом Элледером. Совещание группы проходило 18-21 сентября 2003 г. в курортном городке Подебрады в 50 км от Праги. Возникший в начале XX века курорт Подебрады известен своей бальнеотерапией и лечебной минеральной водой “Подебрадка”. Но не менее привлекательны и его садово-парковая и ландшафтная архитектура, и множество открытых кафе, и средневековый замок на Лабе.

Совещание собрало 126 участников из стран Европы и Америки, в том числе - 5 участников из России (Москва, Новосибирск). Программа совещания включала в себя сессии по биологии лизосом, биохимии и молекулярной биологии лизосомных болезней, клиническим и биохимическим фенотипам лизосомных болезней, новым подходам к их терапии, моделированию болезней у животных, генной терапии. Уже в структуре программы совещания и последующих докладах выделяется тенденция наступления на расшифровку механизмов формирования болезней; перехода к анализу фенотипических признаков болезни в зависимости от генного полиморфизма, генного окружения, от функций и экспрессии белков, ассоциированных в системы, в первую очередь в состав клеточных органоидов. Это тенденция к переходу к протеомике органелл.

С пленарной лекцией, посвященной молекулярным основам множественной недостаточности сульфатаз (MSD), выступил проф. Курт фон Фигура (Гёттинген, ФРГ), отмеченный ФЕБО как лучший биохимик Европы. Он обратил внимание на то, что для MSD молекулярный дефект обнаружен на посттрансляционном уровне и заключен в потере Са-формил-глицинового остатка, входящего в активный центр фермента арилсульфатазы. Дефект образуется еще в ходе синтеза белка в ЭПР. Был выделен микросо-мальный фермент FGE, ответственный за образование данного остатка; оценен его молекулярный вес (41 КДа); определена аминокислотная последовательность; идентифицирован ген SUMF1, кодирующий фермент. Определение геномных и кДНК 22 больных MSD позволило идентифицировать 19 различных мутаций. Удалось показать, что транс-дукция клеток больных MSD с помощью кДНК гена FGE восстанавливает активность арилсульфатаз до 100%. Механизм действия фермента FGE состоит в замене атома S в се-рине на О, и реакция линейно зависит от содержания кислорода. Установлено, что С-концевой субдомен, на 90% идентичный у всех ортологов эукариотов, является “горячей точкой” мутаций MSD.

Сессию по биологии лизосом открывала лекция проф. N. Andrews (Нью Хавен, США), посвященная участию эк-зоцитоза в восстановлении повреждения плазматической мембраны и роли синаптотагмина VII. Семейство белков

синаптотагминов характеризуется функцией сенсоров Са2+ в процессах слияния мембран. А синаптотагмин VII, локализующийся в мембранах лизосом, включается в процессы регуляции восстановления плазматической мембраны после инвазии Trypanosoma cruzi, вызывающей Са2+-опосре-дованный экзоцитоз лизосом. При этом фибробласты с генотипом Syt VII -/- менее устойчивы к бактериальной инвазии и обнаруживают недостаточность экзоцитоза лизосом и репарации плазматической мембраны. У этих же мышей Syt VII-/- обнаружен обширный фиброз кожи и скелетных мышц, сопровождающийся воспалительной миопатией с лейкоцитарной инфильтрацией и накоплением коллагена, ростом освобождения креатинкиназы. Как и при миозите/дерматомиозите у данных мышей наблюдается накопление антинуклеарных антител, свойственных аутоиммунным заболеваниям. Предполагается, что микробы стимулируют локальное появление токсинов, вызывающих пермеа-лизацию плазматической мембраны, вход Са2+, что, в свою очередь, стимулирует внутриклеточное перемещение лизосом к плазматической мембране, их экзоцитоз и заживление повреждения слиянием лизосомных мембран с плазматической.

Исследуя инвазию Salmonella, авторы нашли, что внутриклеточный рост микроба, происходящий в компартмен-те, не сливающимся с лизосомами, активирован в Syt VII-дефектных клетках и, в том числе, макрофагах. При этом процессы эндоцитоза ЭФР и его транспорта в лизосо-мы не нарушены. Установлено, что Syt VII опосредует ранние постлизосомные слияния везикул. Выдвинута смелая гипотеза, что экзоцитоз является природным механизмом восстановления плазматической мембраны после микробной инвазии.

В докладе А. Пшежецкого (Монреаль) предпринята попытка построения протеомики органелл на модели му-кополисахаридоза III A (МПС IIIA) (Б. Санфилиппо IIIA), обусловленного недостаточностью N-ацетил-трансферазы. Моделирование “интегративной биологии” предполагает характеристику экспрессии широкого круга генов; получение информации о положении и состоянии их активности, внутриклеточной локализации белка-продукта и его биологической функции в “интерьере” активности других генов и их продуктов. Изучение протеомики органелл начато с лизосом, подвергнутых глубокой очистке (в 700 раз). В выделенном препарате идентифицированы 550 белков, из которых 87 ранее не были известны. Комбинацией методов степень очистки N-ацетил-трансферазы повысили до 1000 раз, обнаружив фермент в составе белкового комплекса с молекулярным весом 240 КДа. Анализ чистоты препарата показал присутствие маркеров других органелл. Из 123 показателей 50 принадлежали лизосомам, 5 - ЭПР, 3 - митохондриям и т. д. Данные протеомики лизосомной мембраны были интегрированы с геномной информацией, базой

данных нуклеотидных последовательностей, полученных от больных МПС IIIA и их родственников.

Д-р Г. Бах (Иерусалим) сообщил об обнаружении нового белка, участвующего в поздних стадиях эндоцитоза при муколипидозе IV типа. Был идентифицирован мутантный ген MCOLN1, кодирующий муколипин 1, предположительно белок кальциевого канала из семейства TRP. Ранее нашли, что гетерогенность накапливающегося при МЛ IV материала связана с аномальным транспортом мембранных компонент на поздних стадиях эндоцитоза и переноса материала в лизосомы. Методами конфокальной микроскопии установлена исключительная локализация муколипи-на 1 в лизосомах и/или поздних эндосомах. Фермент содержит 580 аминокислот, 6 трансмембранных доменов, сигнальный фрагмент, активность киназы. При МЛ IV происходит перемещение мутантного белка в аппарат Гольджи или плазматическую мембрану. Сходный эффект достигался при мутации сайта ди-лейцина, обусловливающего лизосомную адресацию белка. Трансфецированные фиб-робласты больных МЛ IV, приобретавшие нормальную кДНК MCOLN1, не обнаруживали лизосомного накопления Bodypy-LacCer, характерного для МЛ IV-фибробластов.

В сообщении д-ра V. Seyrantepe (Монреаль) описан новый 4-й изофермент сиалидазы, участвующий в формировании сиалидазной недостаточности. Ранее были известны сиалидаза лизосом (Neu 1), цитозоля (Neu 2) и плазматической мембраны (Neu 3). Анализ геномного материала указывал на наличие 4-го гена сиалидазы во 2-й хромосоме. С помощью нортенблоттинга обнаружено, что подобно Neu 1 ген Neu 4 экспрессируется во всех тканях человека, особенно в скелетных мышцах, сердце и печени, а в почке экспрессия сильно различалась. Neu 4 оказался в значительной мере мембраносвязанным белком, первично локализованным в лизосомах, что подтвердилось при конфокальном иммунофлуоресцентном анализе. Таким образом, в лизосомах установлены 2 пула сиалидазы со сходной активностью и специфичностью, что может иметь значение для терапевтической тактики при лечении недостаточности сиалидазы, наблюдающейся при сиалидозе и галакто-сиалидозе.

Возможности влияния стимуляции ras белков на экспрессию лизосомных ферментов рассмотрены в докладе С. Emeliani (Перуджа, Италия). Отмечено, что между лизо-сомными болезнями и болезнью Альцгеймера существует определенное сходство в преимущественном поражении нервной системы и продуктах накопления. Кроме того, болезнь Альцгеймера сопровождается ростом активности лизосомных гликогидролаз и параллельно позитивной реакции ras онкогенов. Исследовали вызванную мутацию повышенной экспрессии ras (pBABE-PUROretrovirus-ras V12), ведущую к преждевременному старению. Эта модификация генома сопровождалась увеличением активности лизосомных ферментов а-маннозидазы, Р-гексозаминида-зы, Р-галактозидазы, вероятно, сопутствующем старению клетки. В этих же условиях активность катепсина D снижалась. На мышиных фибробластах NIH/3T3 подобная онко-генная трансформация активацией сайта ras также приводила к снижению экспрессии катепсина D. Результаты исследования показывают, что повышение уровня ras и p38MARK регулирует уровень гликогидролаз и катепсина D в различных направлениях, что наблюдается также и при болезни Альцгеймера, и таким образом, у болезни Альцгеймера выявлены дополнительные признаки родства с лизосомными болезнями.

В рамках сессии “Биохимическая и молекулярная биология лизосомных болезней накопления” проф. Konrad Sandhoff (Бонн, ФРГ) доложил о новых механизмах регуляции переваривания мембранных липидов. Синтез гангли-озидов, как известно, протекает во внутримембранных слоях гликофосфолипидов благодаря диффузии продукта в плоскости бислоя, и только лишь некоторые гликозил-трансферазы участвуют в этом синтезе по механизму “flip-flop”. Новосинтезированный материал мембран из аппарата Гольджи поступает в плазматическую мембрану, интернализуется в ходе эндоцитоза, переносится в везикулы поздних эндосом (мультивезикулярные тельца MVB или компартмент CURL) и далее либо рециклирует в плазматическую мембрану, либо в виде мелких везикул поступает в лизосомы. Наружная поверхность везикул легко переваривается в лизосомах, тогда как внутренняя - устойчива к деградации. Причиной является водонераствори-мость внутреннего слоя липидов, устойчивость к действию водорастворимых гидролаз, влияние эндогенных факторов гидрофилизации липидов. Катаболизм мембраносвязанных сфинголипидов, накапливающихся при сфинголипидозах, синергично стимулируется как фактором активации сфин-гомиелиназы pSAP, так и липидом бис-(моноацилглице-ро)фосфатом (BMP). В случае дефицита pSAP развивается болезнь кожи, в норме выполняющей функцию водонепроницаемого барьера. В мембранах обнаруживается дефицит BMP в S-конфигурации, тормозится гидролиз GM1 гангли-озидов. В результате в фибробластах кожи накапливается много холестерина и глюкозилцерамида.

Д-р A.H. Futerman (Реговот, Израиль) исследовал молекулярные аспекты сфинголипидозов. На мышиной модели болезни Гоше (Gba), сопровождающейся накоплением глюкозилцерамида (GluCer), обнаружено значительное увеличение скорости освобождения Ca2+ из ЭПР с участием рианодинового рецептора (RyaR). Это приводит к росту цитозольного уровня Ca2+, обусловливающего повышенную чувствительность клеток к некрогенным воздействиям. Микросомы, полученные из мозга больного Гоше, также характеризовались повышенным освобождением Ca2+ via RyaR. В нейронах мышей Gba-/- был ускорен и синтез глицеролипидов, особенно фосфатидилхолина, в результате прямой активации скорость-лимитирующего фермента цитидилтрансферазы глюкозилцерамидом. Подобный эффект получается и на макрофагах, обработанных ингибитором Р-глюкозидазы кондуритол-Р-эпоксидом, когда усиление синтеза фосфолипидов сопровождается ростом макрофагов.

Однако на мышиной модели болезни Зандхофа (Hex b-/-) темпы роста нейронных аксонов и синтеза фосфатидилхолина замедлены. Цитозольный уровень Ca2+ в нейронах повышен, как установлено, за счет торможения его утилизации в ЭПР. Этот эффект может быть обращен скармливанием мышам ингибитора синтеза гликозилцерамидов N-бутилдезоксинойиримицина (Zevesca). Установлено, что нейроны мышей Hexb-/- более чувствительны к трапсигар-гину, стимулирующему апоптоз. В результате авторы показали активную роль Ca2+ в формировании сфинголипидозов и гибели нейронов.

Д-р A.M. Vaccaro (Рим) представила новые данные о патогенезе болезни Ниманна-Пика (NP), характеризующейся дефектом белкового фактора, обеспечивающего рециклирование неэстерифицированного холестерина и других липидов из поздних эндосом/лизосом в аппарат Гольджи и далее вне клетки. В работе изучен механизм накопления гликосфинголипидов, идущий параллельно с накопле-

нием холестерина. Ранее было известно, что внутриклеточная активность сфингомиелиназы и глюкозилцерамидазы у больных NPC снижена. Авторы полагают, что уменьшается не только активность, но и количество белка-фермента, что, в свою очередь, обусловлено накоплением холестерина. Оказалось, что при NPC предшественник глюкозилцерамидазы синтезируется нормально, но количество зрелой формы фермента снижено, как полагают, за счет ее ускоренной деградации, нестабильности фермента. Действительно, работа глюкозилцерамидазы нуждается в присутствии белка-активатора сапозина С (Sap C). Ранее установлен факт, что при низких значениях рН (как в лизосомах) Sap C плотно связывается с мембранами, содержащими анионные фосфолипиды, что способствует связыванию и созданию необходимой конформации активного центра фермента. В нормальных фибробластах все эти компоненты локализуются в поздних эндосомах/лизосомах. А в фибробластах NPC образование этого комплекса глюкозилцерамидазы, лизобисфосфатидиловой кислоты (LBPA) и Sap C частично нарушено. Причинами являются торможение превращения просапозина С в сапозин С, уменьшение содержания LBPA. Авторы приходят к выводу, что нестабильность глюкозилцерамидазы вызвана препятствиями в образовании данного комплекса фермента с кофакторами.

Роль секреции лизосомных ферментов в течении ряда наследственных болезней рассмотрена в докладе F. Gallo (Оксфорд, Англия). Активно секретирующими являются прежде всего клетки иммунной системы, но подобная функция существует и у меланоцитов, секретирующих меланин. Авторы изучили связь генетических болезней, нарушающих пигментацию, с состоянием иммунной системы, оцениваемой по цитотоксической реакции лимфоцитов. Эта реакция происходит посредством контакта лимфоцита с клеткой-жертвой с образованием “иммунологического синапса”, инициацией экзоцитоза гранул в синаптической области с индукцией каскадного процесса с участием гранзимов, Fas, каспаз, приводящего к апоптозу.

При болезни Чедиак-Хигаси страдает секреция лизосомных ферментов (экзоцитоз гранул), что отражается потерей киллерной функции лимфоцитов. Обнаружено, что меланосомы и секреторные гранулы перемещаются вдоль микротрубочек, но в разные направления. Секреторные гранулы теряют способность концентрироваться в области плазматической мембраны. Найдено, что белком, ответственным за это перемещение, является цитозольный адаптор AP3 лимфоцитов.

Вопросы транспорта и стабильности гепаран-^суль-фатаз (сульфамидаз) при синдроме Санфилиппо IIIA были рассмотрены в докладе N. Muschol (Гамбург, ФРГ). Болезнь, сопровождающаяся накоплением гепаран-сульфата, стимулирует гиперактивность, агрессивность поведения, нарушение сна, формирование умственной отсталости. Для установления связи мутации с течением болезни в кДНК сульфамидаз вводили ряд мутантных последовательностей и трансфецировали клетки СНО или ВНК.

Все внедренные мутации давали нулевую остаточную активность сульфамидазы, однако судьба молекулы фермента была различной. У дикого типа сульфамидаза синтезируется в виде предшественника (62 КДа), созревающего до 56 КДа-формы. При этом в среду секретируется значительное количество незрелой формы. Мутация R233X приводила к блоку синтеза белка, тогда как новосинтезирован-ные формы у мутантов R74C и 1027^С были нестабильными и быстро деградировали. Все другие мутации не препятствовали транспорту фермента в лизосомы, что было подтверждено методами двойной иммунофлуоресценции.

Полученные данные представляют ценность для восстановления остаточной активности фермента.

Д-р T. Reinheckel (Фрайбург, ФРГ) представил новые результаты исследования лизосом у (катепсин L)-knockout мышей (ctsl-/-), отличающихся повышенным катаболизмом белка. В ряде органов и клеток (кератиноциты, кардиомио-циты, тиреоциты) обнаружены укрупненные и полиморфные эндосомы/лизосомы. С помощью градиента плотности Percoll выделили лизосомы сердечной мышцы, оказавшиеся тяжелее у ctsl-/- мышей. У них же было повышено содержание Lamp-1, Р-гексозаминидазы, а также цитохромокси-дазы С, но активность катепсинов B и D была в 2 раза снижена. Таким образом, кроме специфических эффектов, связанных с функцией катепсина L (презентация МНС II-инвариантной цепи, солюбилизация тиреоглобулина, процессинг нейропептидов), недостаток фермента вызывает изменения лизосом, влияющих на патофизиологию болезни, фенотип, миопатию.

На этих же мышах изучено также влияние удаления гена катепсина L на рециклирование поверхностных рецепторов ЭФР в лизосомно-везикулярном аппарате керати-ноцитов. Первичная культура кератиноцитов ctls-/- отличается ускоренной пролиферацией клеток при инкубации с ЭФР. Интернализация и катаболизм 125ЬЭФР оказались не нарушенными, а рециклирование рецепторов на клеточную поверхность активировано у дефектных клеток. Исследовали также влияние ctsl-/- на профили ЭФР/РЭФР-опосре-дованной экспрессии генов. Используя технологию “microarrays” (чип кДНК N1A 15K) вкупе с обратной транскрипцией общей РНК кератиноцитов, нашли, что из 15000 различных кДНК мыши 55 генов обнаруживали модифицированную экспрессию, из них 35 генов - неизвестных. Из 20 малоизученных генов 14 проявляли повышающую регуляцию (в том числе сигнальный мессенджер РЭФР деко-рин) и 6 - понижающую. Но экспрессия собственно РЭФР и FGFR2 оставалась неизменной. Данные скрининга были подтверждены методом “real-time ПЦР”.

Сессию, посвященную биохимическим и клиническим аспектам лизосомных болезней, открыл проф. J.M.F.G. Aerts (Амстердам) докладом о состоянии и новых возможностях использования хито- триозидазы как информативного маркера при болезни Гоше. Диагностический потенциал фермента связан с тем, что его активность в плазме крови при данной патологии возрастает в несколько тысяч раз. Фермент с молекулярным весом 50 Кда является гомологом хитиназы низших и, вместе с тем, представляет средство иммунной защиты, обладает выраженным фунгиста-тическим действием. Уровень фермента в плазме индуцируется также при саркоидозе, лейшманиозе, артрите и некоторых других заболеваниях. Плазменный уровень хитот-риозидазы коррелирует с выраженностью синдрома лизо-сомного накопления в макрофагах и, таким образом, информирует о состоянии болезни, эффективности терапии. Однако практическое использование теста хитотриозидазы сталкивается с той трудностью, что примерно у 6% людей, включая больных Гоше, полностью отсутствует активность этого фермента (как установлено, в результате единственной мутации 24 bp-дупликации в гене хитотриозидазы). Около 35% людей являются носителями этой мутации и имеют половинный уровень активности фермента. К счастью, состояние гена хитотриозидазы может быть быстро и точно проверено методами ПЦР. Другой сложностью является феномен субстратного ингибирования фермента (снижение активности фермента при его насыщении субстратом). Это означает, что точное определение активности фермента должно производиться в ненасыщающих кон-

центрациях субстрата, когда активность пропорциональна содержанию фермента. До сих пор даже в ведущих лабораториях Европы активность фермента выявляется не полностью.

Авторы получили кристаллическую форму фермента и показали, что хитотриозидаза имеет также и высокую трансгликозилазную активность, являющуюся причиной субстратного ингибирования гидролитической активности. В результате удалось синтезировать новый субстрат (отличающийся одной дезоксигруппировкой), хорошо работающий в насыщающих концентрациях и позволяющий чувствительное, точное и удобное выявление активности фермента.

Другим индикатором состояния болезни Гоше может служить хемокин СCL18/PARC (R.G. Boot). Его содержание в плазме больных повышено в 29 раз. Заместительная энзимотерапия болезни снижает уровень хемокина сравнимо с таковым хитотриозидазы. С помощью иммуногистохимии показано, что источником повышенного уровня хемокина являются клетки Гоше (как и хитотриозидазы). Данный показатель может применяться для оценки эффективности терапии, особенно для пациентов с недостаточностью хитотриозидазы, однако корреляция с клиническими проявлениями болезни была менее четкой, чем у хи-тотриозидазы.

Из других показателей, имеющих диагностическое значение при болезни Гоше, было информативным слежение за уровнем интерлейкина IL-10 (M. de Fost).

В сообщении д-ра G. Ciana (Триест, Италия) рассмотрена распространенность болезни Паркинсона у больных Гоше. Хотя 1-я форма болезни Гоше обычно не сопровождается нейропатологией, болезнь Паркинсона выявлена у 6,9% обследованных пациентов. Лечение больных Гоше с помощью заместительной энзимотерапии аглюцера-зой/имиглюцеразой не оказывало эффекта на нейрологиче-ские проявления.

В докладе организаторов совещания (D. Karetova) приведена клиническая картина болезни Фабри у женщин. Новизна вопроса состоит в том, что эта патология связана с Х-хромосомой и степень проявления болезни у гетерозиготных женщин ранее недооценивалась. Авторы обследовали 38 гетерозиготных женщин с установленным диагнозом болезни Фабри и нашли широкую выраженность сердечно-сосудистой патологии, наступающей после 30-летнего возраста и влекущей сокращение срока жизни.

В докладе проф. М. Elleder (Прага) предложена новая классификация болезни Ниманна-Пика, учитывающая существование промежуточных форм между NP1 A и NP1 B и зависящая от выраженности нейродегенеративных и висцеральных проявлений.

Сессию, посвященную новым подходам к терапии болезней накопления, открыл д-р Ch. von Kalle (Фрайбург, ФРГ) докладом о селекции гематопоэтических клеток в ходе лечения МПС VI пересадкой клеток костного мозга с присоединенным нормальным геном арилсульфатазы В. Сначала на мышах подтвердили эффективность генной терапии болезни с помощью векторов, несущих ген нормального фермента человека, а затем добавили ген устойчивости к химиотерапии и in vivo применили селекцию лекарственно-устойчивых гепатопоэтических клеток. Были опробованы 6 различных ретровирусных векторов, экспрессирующих человеческую арисульфатазу В (AsB) вместе с мутантной метилгуанинметилтрансферазой. Трансдуциро-ванные клетки костного мозга трансплантировали МПС VI-реципиентам с последующей хемотерапевтической селекцией. Показано существенное увеличение активности

hAsB в крови, а также снижение содержания гликозаминог-ликанов (ГАГ) в моче (с >40 до 5 мг/мМ креатинина) и органах. Повышенная активность фермента сохранялась в течение 6 месяцев после хемотерапевтического воздействия и проявлялась и у реципиентов, подвергнутых вторичной трансплантации. Таким образом, показан эффективный прием длительной энзимотерапии МПС VI с помощью переноса гена недостающего фермента в гематопоэтические клетки.

Д-р V. Scarpa (Падуя, Италия) представил ре- зультаты исследования терапии лизосомного накопления с помощью подсадки особых структур - полиальгинальных биореакторов, содержащих генетически исправленные алло-генные клетки, окруженные оболочкой из альгинат-по-ли^-лизин-альгината (АПА). Такие структуры являются защищенными от иммунной атаки, стабильны в течение нескольких месяцев, а проницаемость капсулы позволяет клеткам секретировать недостающий фермент. Ранее подобные капсулы были успешно опробованы для лечения МПС VII мышей. Авторы получили трансгенные клоны клеток С2С12, активно экспрессирующие идуронат-2-суль-тафазу (IDS). А затем два наиболее активных клона поместили в капсулы АПА и ввели IDS-knockout мышам в перитонеальную область (некоторым мышам подавляли иммунную систему с помощью анти-CD4-антител). Данный терапевтический прием вызывал значительное увеличение плазматической и тканевой активности IDS через 8 недель после имплантации. Лизосомное накопление недеградированных ГАГов в селезенке и других органах снижалось до нормального уровня. Антитела к рекомбинированному ферменту не обнаружены. Авторы полагают, что данные биореакторы обладают преимуществом перед традиционной энзимотерапией, требующей еженедельной инфузии фермента в больших количествах.

A. Zimran (Иерусалим) оценил эффект ингибитора синтеза гликозиллипидов OGT-918 (N-бутилдезоксинойири-мицина) в лечении болезни Гоше. Результатом 3-годично-го приема препарата стало стабильное улучшение состояния по ряду симптомов (объем органов, гематологические и биохимические показатели, диарея, потеря веса), отсутствие прогрессирования нефропатии. Рекомендуется с помощью OGT-918 лечить средние и легкие формы болезни Гоше, особенно в ситуациях, когда противопоказана заместительная энзимотерапия.

2,5-годичный опыт использования фабразима (Genzy-me) для лечения болезни Фабри был представлен в докладе N. Guffon (Лион, Франция) от лица Международной исследовательской группы по болезни Фабри. После 20-недельной терапии у всех 58 пациентов наблюдалось снижение глоботриаозилцераимдов (GL-3) эндотелиальных клеток капилляров почек, сердца, кожи. Для 51 пациента лечение было продолжено в течение 2 лет. Функция почек, оцениваемая по скорости гломерулярной фильтрации, оставалась стабильно близкой к норме в течение всего периода наблюдения, равно как и уровень протеинурии. Авторы полагают, что раннее начало лечения болезни Фабри с помощью фабразима тормозит прогрессирование или предотвращает почечную недостаточность. Ожидаемые осложнения (озноб, головные боли и т. д.) с течением времени были менее выражены.

В программе стендовых сообщений была представлена последняя разнообразная информация о клинических исследованиях, результаты генетического анализа мутаций, статистика лизосомных болезней в разных регионах, ряд фундаментальных исследований. В постере R. Steinfeld (Гамбург) сообщалось о том, что при нейрональном липо-

фусцинозе отмечается лизосомное накопление аутофлуоресцирующих продуктов, сопровождающееся дегенерацией нейронов, атрофией коры мозга и мозжечка, но не ор-ганомегалией, свойственной многим лизосомным болезням. Показан дефект активности лизосомной трипептидил-пептидазы 1 (TPP 1). Для установления роли TPP 1 авторы использовали мощный пептидный ингибитор фермента, добавлявшийся к клеткам NT2 дикого типа (предшественникам нейронов человека). Ингибитор вызывал специфическое и дозозависимое торможение пролиферации и двукратную стимуляцию апоптоза, но не действовал на TPP 1-трансфецированные клетки. Таким образом, инактивация TPP 1 является проапоптотическим фактором, вероятно, участвующим в формировании нейронального липо-фусциноза.

Диагностическое значение хитотриозидазы уже приобрело большое практическое значение при установлении болезней Гоше, Ниманна-Пика, Краббе (R. Rodrigues, Порто, Португалия). Однако этот фермент отсутствует примерно у 6% населения в результате мутации 24 bp. Авторы применили ПЦР в реальном времени с использованием SybrGreen и нашли, что 39% португальцев являются носителями данной мутации, а примененный метод является эффективным и недорогим для проведения скрининга.

Неожиданные результаты диагностики а-маннозидоза получены в Беларуси (Н. Гусина, Минск). Частота болезни в республике оказалась сопоставима с таковой болезни Гоше, наиболее распространенной лизосомной аномалией; болезнь локализуется в основном в Западной Беларуси на границе с Литвой.

A. Czartoryska (Варшава) представила данные о распространенности болезни Фабри в Польше. С 1875 г. выявлен 21 больной (13 семей). Поскольку болезнь Фабри неизбежно вызывает почечную недостаточность, больных выявляли среди пациентов, подвергавшихся диализу (ожидаемая частота - 1-1,5%). Обследовали 1100 мужчин и 800 женщин, используя пересылку высушенных кровяных пятен в Италии для анализа лейкоцитов на ферментопатию. У мужчин выявлены 2 больных, у женщин случаев болезни не выявлено. Рекомендуется использовать как более информативное определение а-галактозидазы в лейкоцитах крови, но для носителей мутаций больше подходит определение а-галактозидазы в сыворотке.

Проф. T. Levade (Тулуза, Франция) сообщил о новых данных относительно участия лизосом в апоптозе. Учитывая, что в целом проапоптотическая роль лизосомных ка-тепсинов широко документирована, авторы изучили значение аспартильной протеиназы катепсина D в стресс-ин-дуцируемой гибели клеток на модели фибробластов овцы,

пораженной врожденным цероидным липофусцинозом. Мутация затрагивала активный центр катепсина D. Выявлено, что этот дефект не защищал клетки от активирующего каспазного каскада и токсичности, вызванных доксору-бицином, цитотоксическими воздействиям, такими, как облучение, применение стауроспорина, сфингозина и мембранопроникающего церамида. После применения доксору-бицина внутриклеточный уровень церамида был одинаков у контрольных и катепсин D-дефицитных клеток. Ингибитор катепсина D - пепстатин - не предотвращал апоптоза клеток. Однако на другой модели - муколипидозе II (I-cell disease), характеризующемся дефектом доставки лизосомных ферментов в лизосомы, - показано, что такие клетки приобретают частичную устойчивость к действию ТНФ, стауроспорина, сфингозина, то есть лизосомные ферменты (но не катепсин D) участвуют в индукции апоптоза.

Проблема фенотипического полиморфизма лизосомных болезней рассмотрена в сообщении A. Tylky-Shimans-ky (Варшава). Отмечено, что при МПС одни и те же мутации могут сопровождаться совершенно различными уровнями активности страдающего фермента, отличающимися в несколько раз, а уровень активности фермента слабо коррелирует с остротой заболевания. Авторы считают, что имеет значение целый ряд факторов, таких, как активность экспрессии гена, зависящая от активности промотора, который в свою очередь зависит от общих и специфических транскрипционных факторов и т. д. На последних этапах экспрессии имеет значение активность сплайсинга и трансляции, протекающих также с участием целого ряда белков. На конечный эффект влияет и степень стабильности мРНКи белка-фермента, зависящая от активности гидро-лаз, сильно варьирующей у разных индивидов. Накопление ГАГов в существенной мере определяется скоростью их синтеза, подверженного множественным регуляторным воздействиям, и так же, как и остаточная активность фермента, нуждается в точной оценке. Авторы предлагают для прогноза болезни (МПС) использовать соотношение скорости синтеза ГАГов к остаточной активности фермента.

Были представлены также последние достижения динамично развивающейся области генной терапии лизосомных болезней. Успехи генной терапии заслуживают отдельного рассмотрения, которое планируется опубликовать здесь же другим автором (участником совещания) проф. Т.А. Короленко (ИФ СО РАМН).

На совещании рассмотрены и некоторые организационные вопросы. Учреждены гранты для стажировок и экспериментальной работы молодых ученых в ведущих лабораториях Европы. Предложено ограничить приглашение докладчиков за пределами Европы. Намечено провести следующее рабочее совещание ЕИГЛБ в 2005 году в Норвегии.