Некоторые физико-химические и биологические характеристики трехмерных конструкций на основе альгината натрия и фосфатов кальция, полученных методом 3D-печати и предназначенных для реконструкции костных дефектов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТРЕХМЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ОСНОВЕ АЛЬГИНАТА НАТРИЯ И ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ Зй-ПЕЧАТИ И ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ

Н.С. Сергеева 1, В.С. Комлев 223, И.К. Свиридова 1, В.А. Кирсанова 1, С.А. Ахмедова 1, Я.Д. Шанский 1, Е.А. Кувшинова 1, А.Ю. Федотов 2, А.Ю. Тетерина 2, А.А. Егоров 2, Ю.В. Зобков 2, С.М. Баринов 2

1 Московский научно-исследовательский онкологический институт имени им. П.А. Герцена -филиал Национального медицинского исследовательского радиологического центра, Москва, Россия

2 Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН, Москва, Россия

3 Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Москва, Россия

Some physicochemical and biological characteristics of 3D printed constructions based on sodium alginate and calcium phosphates for bone defects reconstruction

N.S. Sergeeva 1, V.S. Komlev2, I.K. Sviridova 1, VA. Kirsanova 1, SA. Akhmedova 1, Ya.D. Shanskiy1, EA. Kuvshinova 1, A.Yu. Fedotov 2, A.Yu. Teterina 2, AA. Egorov2, Yu.V. Zobkov 2, S.M. Barinov 2

1 P.A. Herzen Moscow Research Institute of Oncology - a branch of the National Medical Research Radiological Center, Moscow, Russia

2 A.A. Bajkov Institute of Metallurgy and Materials Science of RAS, Moscow, Russia

3 Institute of Laser and Information Technologies of RAS, Moscow, Russia

Создание персонализированных конструкций для тканевой инженерии костной ткани является одним из перспективных направлений развития биомедицинских технологий . Цель работы — изучение физико-химических характеристик, цито- и биосовместимости 3й-конструкций на основе альгината натрия и трех видов фосфатов кальция (трикаль-цийфосфата, карбонатгидроксиапатита и октакальцийфос-фата), полученных методом трехмерной струйной печати .

Методика получения трехмерных конструкций включала 3й-печать геля, содержащего фосфаты кальция в присутствии сшивающего агента (CaCl2), замораживание, сублимационную сушку, стерилизацию у-облучением (15 КГр) . Исследована структура 3й-конструкций, пористость и прочностные характеристики . На модели линии остеосаркомы человека MG-63 in vitro в динамике культивирования изучена цитосовместимость и цитотоксич-ность (МТТ-тест) 3й-конструкций . На модели подкожной имплантации мышам исследована биосовместимость 3й-конструкций в динамике до 12 нед .

Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что все 3 типа конструкций имеют пластинчатую структуру альгинатной составляющей со сферическими вкраплениями гранул фосфатов кальция; общая пористость образцов — 54,5—63,9% . Фосфаты кальция в составе конструкций сохраняли свой фазовый состав . Прочность 3й-конструкций при сжатии зависела от неорганической составляющей и составила 1,8—3,7 МПа с предельной деформацией 12,3—12,6% . Все типы 3й-конструкций оказались цитосовместимыми in vitro с удовлетворительными матрикс-ными свойствами и поддерживали пролиферацию клеток на протяжении двух недель При in vivo исследованиях все 3 типа конструкций продемонстрировали биосовместимость по гистологическим признакам с медленной биорезорбцией органической и неорганической составляющих

Совокупность полученных данных свидетельствует о перспективности дальнейшего совершенствования технологии 3й-принтинга и исследований описанных 3й-конструкций как остеопластических материалов .

Ключевые слова: 3й-печать, альгинат натрия, фосфаты кальция, биосовместимые материалы, регенерация костной ткани

e-mail: prognoz . 06@mail . ru

A creation of personalized constructions for tissue engineering of bone tissue is very perspective biomedical technological trend . An aim of our work was studying physicochemical characteristics, cyto- and biocompatibility of 3D printed constructions based on sodium alginate and three calcium phosphates species (tricalcium phosphates, carbonated hydroxyapatite, and octacalcium phosphate).

The methods of 3D constructions producing included 3D printing of components with crosslinking agent (CaCl2), their freezing, sublimation, "forced shrinkage", y-ray sterilization (15 kGr) . A structure of 3D constructions, their porosity and strength characteristics were studied . The cytocompatibility of 3D constructions and matrix-for-cell properties were investigated in vivo on a model of human osteosarcoma MG-63 cell line by means of MTT assay . The biocompatibility of 3D constructions was studied on the model of subcutaneous implantation in mice up to 12 weeks .

Using scanning electron microscopy it was found that all 3 types of constructions have a lamellar structure of alginate component with spherical inclusions of calcium phosphate Total porosity of species was 54,5-63,9% . Calcium phosphates in the constructions reserved initial phase composition Compressive strength of 3D constructions depended on inorganic component and was 1,8-3,7 MPa with ultimate strain 12,3-12,6% . All types of 3D constructions were cytocompatible in vitro, demonstrated good matrix-for-cells properties, and had supported cell proliferation for 2 weeks . in results of subcataneous in vivo test all constructions demonstrated biocompatibility with slow bioresorption of organic and inorganic components

Received data proved the promising outlook for further improvement of 3D printing and investigations of described 3D constructions as osteoplastic materials

Keywords: 3D-printing, sodium alginate, calcium phosphates, biocompatible materials, bone regeneration

Введение

Создание персонализированных конструкций для тканевой инженерии костной ткани методами трехмерной печати является одним из перспективных направлений развития аддитивных технологий. Для этой цели используют биосовместимые полимеры различной природы и(или) кальцийфосфатные соединения [1—3]. Особый интерес представляют материалы на основе альгината, характеризующиеся биосовместимостью [4, 5]. В свою очередь, материалы на основе фосфатов кальция (ФК) — аналогов минеральной составляющей костной ткани — широко используют для изготовления остеопластических материалов и матриксов для тканеинженерных эквивалентов костных тканей [6]. Особый интерес представляет разработка композиционных материалов, адаптированных к трехмерной струйной печати, так как твёрдые ткани живых организмов включают минеральную составляющую, обогащенную соединениями фосфатов кальция и биологических полимеров В настоящей работе представлены результаты реализации предлагаемого принципа струйной печати трехмерных структур с заданной архитектурой на основе композиционных материалов: биополимер альгинат натрия — соединения ФК .

Целью исследования было изучение физико-химических характеристик и цито- и биосовместимости 30-конструкций на основе альгината и различных фосфатов кальция, полученных методом трехмерной струйной печати

Материал и методы

Методика получения трехмерных

конструкций

Трехмерную струйную печать образцов конструкций в работе осуществляли на лабораторной установке ИПЛИТ 50/01. В качестве «чернил» использовали композиционный гидрогель на основе 2% водного раствора альгината натрия (CAS 9005-38-3, Acros) с 30 масс . % гранулированных ФК: трикаль-цийфосфата (ТКФ), карбонатгидроксиапатита (КГА), октакальцийфосфата (ОКФ) . Гранулы ФК были получены по керамической технологии [7]. По завершении процесса печати трехмерные конструкции помещали на 1 ч . в морозильную камеру (-50°C), далее подвергали сублимационной сушке и затем обрабатывали сшивающим агентом (10% раствор хлорида кальция, 1 ч . , 35—37°C). Образцы «сшитых» трехмерных конструкций помещали в термостат (37°C) до полного высыхания

Для повышения прочности конструкций проводили их дополнительную 2—3 кратную «принудительную усадку», обрабатывая водно-спиртовым раствором (вода/спирт = 3/7) в течение 1 ч . с последующей сушкой в термостате Образцы трехмерных конструкций вышеперечисленных составов имели форму цилиндра диаметром 4,0—4,5 мм, высотой 3—4 мм, средним весом ~4,4 мг .

Физико-химические исследования трехмерных конструкций

Физико-химические исследования трехмерных конструкций на основе альгината натрия и ФК включали: изучение их микроструктуры посредством ска-

нирующей электронной микроскопии (СЭМ) (Tescan Vega ii SBU, Чехия), оценку фазового состава методом рентгенофазового анализа (РФА) (рентгеновский дифрактометр Ultima iV, Япония) и прочностных характеристик (прочность на сжатие, растяжение) (электродинамическая испытательная система ElectroPuls E3000, instron, США).

Биомедицинские исследования трехмерных

конструкций in vitro и in vivo

В экспериментах in vitro оценивали цитосовме-стимость, а in vivo — биосовместимость образцов трехмерных конструкций Эксперимент in vitro выполнен на модели перевиваемой клеточной линии остеосаркомы человека MG-63 (Институт цитологии РАН, Российская коллекция клеточных культур, Санкт-Петербург) . Экспериментальные образцы материалов стерилизовали у-облучением (15 кГр) и раскладывали в 96-луночные культуральные планшеты (Costar, США; 1 планшет на каждый срок инкубации; каждая проба — в триплетах), 3—4 ч . насыщали полной ростовой средой (ПРС) до стабилизации рН среды на уровне 7,0—7,2 . Далее на поверхности образцов наносили клетки MG-63: из лунок удаляли ПРС, и на влажные образцы конструкций трех составов («альгинат натрия + ТКФ»; «альгинат натрия + КГА»; «альгинат натрия + ОКФ») и без них (контроль) наслаивали суспензию клеток (2х104 тыс. клеток на образец в объеме 20,0 мкл ПРС) и помещали планшеты на 3 ч . в СО2-инкубатор (37°С, 5% СО2) . Далее в каждую лунку добавляли по 180 мкл ПРС и инкубировали в течение 1—14 сут . с регулярной (дважды в неделю) заменой ПРС Все манипуляции осуществляли в стерильных условиях

В каждый срок эксперимента рассчитывали величину пула жизнеспособных клеток (ПЖК) по отношению к контролю по результатам МТТ-теста [8]. Положительная величина пула свидетельствовала о приросте количества клеток, отрицательная —

0 гибели части популяции

Образец конструкции считали нетоксичным в отношении клеточной линии при значениях ПЖК через

1 сут . культивирования >60% . Образец конструкции считали цитосовместимым при отсутствии цитоток-сичности и способности длительно (не менее двух недель) поддерживать пролиферацию клеток

Биосовместимость трехмерных конструкций оценивали на модели их подкожной имплантации мелким лабораторным животным с соблюдением принципов гуманности и требований, сформулированных в Директивах Совета Европейского Сообщества 2010/63/EU «Об использовании животных для экспериментальных исследований» Перед оперативным вмешательством образцы конструкций описанных трех составов «замачивали» в физиологическом растворе . Далее мышам-самцам линии BDF1 (ФГБУН Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России, филиал «Андреевка») под наркозом (смесь кетамин/реланиум в отношении 1:1, вну-трибрюшинно по 0,1мл) под кожу спины в области грудного отдела позвоночника имплантировали по

1 образцу стерильного трехмерного изделия . Протокол оперативного вмешательства описан ранее [9] Было сформировано 3 группы по 10 животных по количеству вариантов имплантированных трехмерных конструкций: 1 группа — «альгинат натрия + ТКФ»;

2 группа — «альгинат натрия + КГА», 3 группа —

«альгинат натрия + ОКФ» . Через 2, 4, 8 и 12 нед . после операции мышей выводили из эксперимента (по два животных на каждый срок), образцы материалов извлекали, проводили их визуальную оценку (видеокомплекс на основе стереомикроскопа и цифровой видеокамеры Olympus, Япония), далее фиксировали в 10% растворе формалина, изготавливали парафиновые блоки и гистологические препараты по стандартной методике . Окраску препаратов осуществляли гематоксилином и эозином .

Статистический анализ

Обработку результатов осуществляли с использованием стандартных методов вариационной статистики (пакет программ «Microsoft Excel 2000»). Статистическую значимость различий оценивали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента; статистически значимыми считали различия при р<0,05 .

Результаты

При анализе изображений, полученных при СЭМ трехмерных конструкций, было установлено, что все изделия, вне зависимости от вида ФК, имели нерегулярную пластинчатую структуру альгинатной составляющей с толщиной пластин ~2—3 мкм и размером пор между ними 300—600 мкм, и близкую к сферической форму кальцийфосфатных керамических гранул (рис. 1).

Пористость образцов трехмерных конструкций при наличии 30 масс % гранул ФК в композите для образца «альгинат натрия + ТКФ» составляла 63,9%, «альгинат натрия + КГА» — 54,5% и «альгинат натрия + ОКФ» — 62,6%, т . е . более половины объема образцов занимали поры .

Согласно данным РФА, фазовый состав фосфатов кальция при введении в композиционный материал конструкции не изменялся, а незначительное снижение интенсивности их пиков было обусловлено присутствием в образце полисахаридной составляющей (рис. 2) .

Показатель прочности на сжатие трехмерных конструкций зависел от вида ФК в композите: для образцов, содержащих гранулы ТКФ и ОКФ, он оказался в 2 раза выше, чем для конструкций с гранулами КГА (табл . 1).

При исследовании цитосовместимости in vitro было показано, что в контроле

В экспериментальных группах через 24 ч . культивирования клеток на поверхности образцов трехмерных конструкций показатель ПЖК составил 81,2—95,4% относительно контроля, что свидетельствует о том, что данные трехмерные матриксы и продукты их биодеградации не обладали острой цитотоксичностью в отношении линии клеток MG-63 .

За 2 нед . культивирования клеток линии MG-63 на трехмерных матриксах оптическая плотность раствора формазана во всех экспериментальных группах нарастала, однако скорость пролиферации MG-63 на конструкциях разного состава несколько различалась . Так, если для групп «альгинат натрия + КГА» на всех сроках наблюдения и «альгинат натрия + ТКФ», начиная с 7 сут . , не выявлено статистически значимых различий с контролем, то на образцах трехмерной конструкции на основе «альгинат натрия + ОКФ» клетки пролиферировали достоверно медленнее, чем в контроле (табл . 2) .

Рис. 1. Общий вид трехмерной конструкции (А) и микроструктура образцов различного состава: Б — «альгинат натрия+ТКФ»; В — «альгинат натрия+КГА». Сканирующая электронная микроскопия

А

ю

15

Альгинат+ТКФ

ТКФ

.......  г г . . ,  П Г...... [................I.....................

20 25 30 3 5 40 45 50

Б

20

25 30 35

40

Альгинат+КГА

КГА

45

50

55

В

Альгинат + ОКФ

Рис. 2.

Результаты рентгенофазового анализа гранул фосфатов кальция в трехмерных конструкциях: А — «альгинат натрия+ТКФ»; Б — «альгинат натрия+КГА»; В — «альгинат натрия+ОКФ».

Сравнение проводилось с ТКФ

Таблица 1. Прочностные характеристики образцов трехмерных конструктций разных составов

№ образца Состав образца *осж, мПа M±m **5,% M±m

3 Альгинат натрия + ТКФ 3,5±0,4 12,4±0,4

4 Альгинат натрия + КГА 1,8±0,1 12,3±0,2

5 Альгинат натрия + ОКФ 3,7±0,3 12,6±0,7

о — прочность при сжатии; **5 — прочность при растяжении .

Таблица 2. Величина оптической плотности раствора формазана

материалы ОД

1 3 7 10 14

Полистирен (контроль) 0,351±0,011 100% 0,606±0,027 100% 0,713±0,029 100% 1,042±0,019 100% 1,300±0,038 100%

Альгинат натрия + ТКФ 0,287±0,010* 81,8% 0,508±0,008* 83,8% 0,682±0,014 95,6% 0,943±0,052 90,5% 1,141±0,065 87,8%

Альгинат натрия + КГА 0,335±0,019 95,4% 0,558±0,019 92,1% 0,813±0,050 114,0% 0,861±0,011* 82,6% 1,196±0,064 92,0%

Альгинат натрия + ОКФ 0,285±0,010* 81,2% 0,446±0,020* 73,6% 0,674±0,034 94,5% 0,732±0,035* 70,2% 0,887±0,038* 68,2%

* — статистически достоверные различия с контролем (р<0,05).

Представленные результаты позволяют сделать заключение о цитосовместимости с наличием удовлетворительных адгезионных свойств поверхности для перевиваемой линии остеосаркомы человека MG-63 у образцов экспериментальных групп 1 и 2, и цитосовместимости с наличием умеренно выраженных адгезионных свойств поверхности конструкций «альгинат натрия + ОКФ» .

На заключительном этапе работы была оценена биосовместимость трехмерных конструкций всех трех типов . Показано, что через 2 нед . после опе-

рации вокруг образцов формировалась тонкая прозрачная соединительнотканная капсула, интимно прилегающая к материалам, с отчетливым капиллярным рисунком поверхности (рис . 3А—В) . С увеличением сроков наблюдения до 8—12 нед . сосуды запустевали и макроскопически уже практически не визуализировались К макропризнакам биодеградации этих конструкций, которые проявляются на сроках 8—12 нед . после имплантации, можно отнести разреженность внутренней структуры имплантатов и их незначительную деформацию (рис . 3 А—В) .

При гистологическом исследовании трехмерных конструкций состава «альгинат натрия + ТКФ» в ранний после имплантации срок (2 нед . ) обнаружена тонкая (до 8—10 слоев клеток) фиброзная капсула с расположенными параллельно к поверхности им-плантата волокнами соединительной ткани и кровеносными сосудами . Уже в эти сроки отмечался активный процесс фрагментации альгинатной составляющей данного композита, миграция фибробластов внутрь конструкции, заполнение пространств между гранулами ТКФ (на микрофотографиях — пустоты вследствие декальцинации) незрелой волокнистой соединительной тканью между фрагментами альги-ната (рис . 4А). С увеличением сроков наблюдения до 8—12 нед . отмечено нарастание соединительнотканного компонента между гранулами ТКФ . На биосовместимость образца данного трехмерной конструкции указывает интеграция капсулы с окружающими тканями и отсутствие реакции воспаления на всех сроках эксперимента . О начавшемся процессе биодеградации образцов указывает уменьшение размера гранул ТКФ и самой конструкции, появление в новообразованной соединительной ткани гигантских клеток инородных тел (рис . 4А) .

На гистологических препаратах, полученных на ранних (2 нед ) сроках после имплантации образцов «альгинат натрия + КГА» определялась рыхлая

фиброзная капсула, в которой отмечались нейтро-фильные лейкоциты, что является признаком асептического воспаления (рис . 4Б). Васкуляризация в стенке капсулы и внутри имплантата практически отсутствовала Описанные признаки воспаления исчезали к 4-8-й нед . наблюдения . В эти сроки весь имплантат был окружен тонкой, правильно организованной фиброзной капсулой, консолидированной с окружающими тканями, и заполнен новообразованной соединительной тканью с «вкрапленными» в нее гранулами КГА . Через 12 нед . после имплантации гистологическая картина была сходной (рис . 4Б).

Новообразованная капсула вокруг образцов трехмерной конструкции состава «альгинат натрия + ОКФ» на ранних сроках после имплантации была представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью с правильной ориентацией волокон, выраженной нейтрофильной инфильтрацией и активной васкуляризацией (рис . 4В) . Через 4 нед . после операции асептическое воспаление в зоне имплантации сохранялось и стихало через 8—12 нед . наблюдения (рис 4В) На гистологических препаратах прослеживалось изменение данной конструкции, выражавшееся в активном замещении её компонентов — как альгината, так и ОКФ — соединительной тканью со сравнительно небольшим количеством

А

Б

В

Рис. 4. Трехмерные конструкции различных составов 2—12 нед. после имплантации: А — «альгинат натрия+ТКФ»; Б — «альгинат натрия+КГА»; В — «альгинат натрия+ОКФ». Окр.: гематоксилин, эозин

сосудов . Клеточный состав в зоне имплантации был представлен, главным образом, полиморфно-ядерными лейкоцитами (на ранних сроках), фибробла-стоподобными клетками и гигантскими многоядерными клетками инородных тел

В целом, в эксперименте т vivо на модели подкожной имплантации была показана биосовместимость всех трех вариантов трехмерных конструкций Выявлено, что по скорости биодеградации кальций-фосфатного компонента на морфологическом уровне данные образцы формируют следующий ряд: «аль-гинат натрия + ОКФ» > «альгинат натрия + ТКФ» > «альгинат натрия + КГА» .

Обсуждение

В настоящем исследовании представлен первый опыт 3й-принтинга эластичных композиционных материалов в системе «альгинат натрия + ФК», предназначенных для замещения костных дефектов . В качестве минеральной составляющей 3й-конструкций использованы ФК, хорошо зарекомендовавшие себя как материалы для костной пластики — трикальций-фосфат (ТКФ), карбонатгидроксиапатит (КГА) и окта-кальцийфосфат (ОКФ) . Доля ФК в 3й-конструкциях составила 30 масс% . Представлена технология изготовления 3й-конструкций, включающая принтинг компонентов в присутствии сшивающего агента (СаС12), их замораживание и последующую сублимацию, «принудительную усадку», стерилизацию, подготовку к физико-химическим и биомедицинским исследованиям .

С помощью СЭМ установлено, что все 3 типа конструкций (по видам ФК) имеют пластинчатую

структуру альгинатной составляющей со сферическими вкраплениями гранул ФК; общая пористость образцов — 54,5—63,9% . ФК в составе конструкций сохраняли свой фазовый состав . Прочность композитов при сжатии зависела от ФК-составляющей: 1,8 МПа (для КГА); 3,7 МПа (для ОКФ); прочность при растяжении — 1,8—3,7 МПа с предельной деформацией 12,3-12,6% . .

При in vitro исследованиях с использованием линии клеток остеосаркомы человека MG-63 все типы 3й-конструкций оказались цитосовместимыми с удовлетворительными адгезионными свойствами поверхности, не препятствовали пролиферации клеток на протяжении 2 нед При in vivo исследованиях в подкожном тесте у мышей все три типа 3й-конструкций продемонстрировали биосовместимость по гистологическим признакам (до 12 нед . наблюдения) с медленной биорезорбцией органической и неорганической составляющих .

Совокупность полученных данных свидетельствует о перспективности дальнейшего совершенствования технологии 3й-принтинга и исследования композиционных 3й-конструкций как остеопластических материалов

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства образования и науки (Соглашение № 14.604.21.0132, в части разработки подходов трехмерной печати и биологических испытаний) и грантом РНФ (№ 15-13-00108, в части разработки исходных материалов).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Bergmann C ., Lindner M ., Zhang W . et al . 3D printing of bone substitute implants using calcium phosphate and bioactive glasses . J . Eur . Ceram . Soc . 2010; 12: 2563-7 .

2 . Popov V. K ., Komlev V. S ., Chichkov B . N . Calcium phosphate blossom for bone tissue engineering . Mater. Today . 2014; 2: 96-7 .

3 . Stoppato M ., Vahabzadeh S ., Bandyopadhyay A. Bone tissue engineering using 3D printing . Bioact . Compat . Polym . 2013; 28: 16-32 .

4 . Pawar S . N ., Edgar K.J . Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications . Biomaterials 2012; 33:3279305

5 . Ong S .Y ., Wu J ., Moochhala S . M . et al . Development of a chitosan-based wound dressing with improved hemostatic and antimicrobial properties Biomaterials 2008; 29: 4323-32

6 . Баринов С . М ., Комлев В . С . Биокерамика на основе фосфатов кальция . М .: Наука, 2005 .

7 . Komlev V . S ., Barinov S . M . , Koplik E .V . A method to fabricate porous spherical hydroxyapatite granules intended for time-controlled drug release . Biomaterials 2002; 23: 3449-54.

8 . Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays . J . Immunol . Methods . 1983; 65: 55-63 .

9 . Чиссов В . И ., Свиридова И . К ., Сергеева Н . С . с соавт. Исследование in vivo биосовместимости и динамики замещения дефекта голени крыс пористыми гранулированными биокерамическими материалами . Клеточные технологии в биологии и медицине 2008; 3:151-7 .

Поступила: 20.06.2015