СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПАРЫ ТЯЖЕЛАЯ-ЛЕГКАЯ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Выделенная антигенсвязывающая полипептидная конструкция, содержащая по меньшей мере первый гетеродимер и второй гетеродимер,
первый гетеродимер, содержащий полипептидную последовательность тяжелой цепи первого иммуноглобулина (H1) и полипептидную последовательность легкой цепи первого иммуноглобулина (L1); и второй гетеродимер, содержащий полипептидную последовательность тяжелой цепи второго иммуноглобулина (H2) и полипептидную последовательность легкой цепи второго иммуноглобулина (L2), при этом по меньшей мере одна из последовательностей H1 или L1 первого гетеродимера отличается от соответствующей последовательности H2 или L2 второго гетеродимера, и при этом
H
H1
каждая из H1 и H2 содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (V домен) и константный домен тяжелой цепи (C домен);
L
L
каждая из L1 и L2 содержит по меньшей мере вариабельный домен легкой цепи (V домен) и константный домен легкой цепи (C домен); и
по меньшей мере одна из H1, H2, L1 и L2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по меньшей мере одного константного домена и/или по меньшей мере одного вариабельного домена, при этом H1 предпочтительно образует пары с L1 по сравнению с L2, и H2 предпочтительно образует пары с L2 по сравнению с L1.
H3
H3
2. Конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что конструкция дополнительно содержит гетеродимерный Fc, содержащий по меньшей мере две последовательности C, при этом Fc связан с первым гетеродимером и вторым гетеродимером при помощи одного или нескольких линкеров или без них, при этом димеризованные последовательности C имеют температуру плавления (Tпл) около 68°C или выше, как измерено посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), и при этом конструкция является
биспецифической.
3. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что H1 предпочтительно образует пары с L1 по сравнению с L2, и H2 предпочтительно образует пары с L2 по сравнению с L1, когда H1, H2, L1 и L2 совместно экспрессируются в клетке или в клетке млекопитающего, или когда H1, H2, L1 и L2 совместно экспрессируются в бесклеточной системе экспрессии, или когда H1, H2, L1 и L2 совместно производятся, или когда H1, H2, L1 и L2 совместно производятся при помощи окислительно- восстановительной системы производства.
H
L
H1
L
4. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна из H1, H2, L1 и L2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию домена V и/или V и по меньшей мере одну аминокислотную модификацию домена C и/или C, так что H1 предпочтительно образует пары с L1 по сравнению с L2, и/или H2 предпочтительно образует пары с L2 по сравнению с L1.
H1
L
H
L
5. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что если H1 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в домене C, то по меньшей мере одна из L1 и L2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в домене C; и/или если H1 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в домене V, то по меньшей мере одна из L1 и L2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в домене V.
6. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что H1, L1, H2 и/или L2 содержат по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных мутаций.
7. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна из H1, H2, L1 и L2 содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотные модификации по меньшей мере одного константного домена и/или по меньшей мере одного вариабельного домена.
8. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что когда обе L1 и L2 совместно экспрессируются с по меньшей мере одной из H1 и H2, относительное образование пар по меньшей мере одной из гетеродимерных пар H1-L1 и H2-L2 с соответствующей гетеродимерной парой H1-L2 или H2-L1 составляет больше чем 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, и при этом относительное образование пар модифицированной гетеродимерной пары H1-L1 или H2-L2 является большим по сравнению с соответствующим относительным образованием пар, наблюдаемым в соответствующей гетеродимерной паре H1-L1 или H2-L2 без по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
9. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что
термостабильность, определенная посредством измерения температуры плавления (Tпл), как измерено посредством DSC, по меньшей мере одного из первого и второго гетеродимеров, находится в пределах около 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°C Tпл соответствующего гетеродимера без по меньшей мере одной аминокислотной модификации; или
отличающаяся тем, что термостабильность, определенная посредством измерения температуры плавления (Tпл), как измерено посредством DSC, каждого гетеродимера, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, находится в пределах около 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°C Tпл соответствующего гетеродимера без по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
10. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что аффинность каждого гетеродимера к антигену, с которым он связывается, находится в пределах около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50-кратной аффинности соответствующего немодифицированного гетеродимера к тому же антигену, как измерено посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или FACS.
11. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что
по меньшей мере одна из H1 и L1 содержит по меньшей мере один домен, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, что приводит к большей стерической комплементарности аминокислот при спаривании H1 с L1 по
сравнению с L2; или
отличающаяся тем, что по меньшей мере одна из H2 и L2 содержит по меньшей мере один домен, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, что приводит к большей стерической комплементарности аминокислот при спаривании H2 с L2 по сравнению с L1; или
отличающаяся тем, что по меньшей мере одна из H1 и L1 содержит по меньшей мере один домен, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, что приводит к большей электростатической комплементарности между заряженными аминокислотами при спаривании H1 с L1 по сравнению с L2; или
отличающаяся тем, что по меньшей мере одна из H2 и L2 содержит по меньшей мере один домен, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, что приводит к большей электростатической комплементарности между заряженными аминокислотами при спаривании H2 с L2 по сравнению с L1.
12. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна аминокислотная модификация выбрана из одной или более модификаций, продемонстрированных в Таблице 29, Таблице 30 или Таблице 31.
H3
13. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что конструкция дополнительно содержит Fc, который содержит по меньшей мере две последовательности C, при этом Fc связан с первым гетеродимером и вторым гетеродимером при помощи одного или нескольких линкеров или без них.
14. Конструкция по п. 13, отличающаяся тем, что Fc представляет собой Fc человека, Fc IgG1 человека, Fc IgA человека, Fc IgG человека, Fc IgD человека, Fc IgE человека, Fc IgM человека, Fc IgG2 человека, Fc IgG3 человека или Fc IgG4 человека.
15. Конструкция по п. 13, отличающаяся тем, что Fc представляет собой гетеродимерный Fc.
H3
16. Конструкция по п. 13, отличающаяся тем, что Fc содержит одну или больше модификаций по меньшей мере в одной из последовательностей C.
17. Конструкция по любому из пп. 14-16, отличающаяся тем,
H3
что димеризованные последовательности C имеют температуру плавления (Tпл), как измерено посредством DSC, около 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 77,5; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84 или 85°C или выше.
18. Конструкция по любому из пп. 14-16, отличающаяся тем, что Fc представляет собой гетеродимер, который при производстве получен с чистотой более чем около 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%; или отличающаяся тем, что Fc представляет собой гетеродимер, полученный с чистотой более чем около 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% при экспрессии или при экспрессии в единственной клетке.
H3,
19. Конструкция по любому из пп. 14-16, отличающаяся тем, что Fc содержит одну или больше модификаций по меньшей мере в одной из последовательностей C которые способствуют получению гетеродимерного Fc со стабильностью, сравнимой со стабильностью гомодимерного Fc дикого типа.
H2
20. Конструкция по любому из пп. 14-16, отличающаяся тем, что Fc дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность C.
H2
21. Конструкция по п. 20, отличающаяся тем, что последовательность(-и) C Fc содержит(-ат) одну или несколько модификаций.
22. Конструкция по любому из пп. 14-16 или 21, отличающаяся тем, что Fc содержит одну или несколько модификаций, чтобы способствовать селективному связыванию Fc-гамма рецепторов.
23. Конструкция по любому из пп. 14-16 или 21, отличающаяся тем, что Fc связан с гетеродимерами посредством одного или нескольких линкеров или отличающаяся тем, что Fc связан с H1 и H2 посредством одного или нескольких линкеров.
24. Конструкция по п. 23, отличающаяся тем, что один или несколько линкеров представляют собой один или несколько полипептидных линкеров.
25. Конструкция по п. 23, отличающаяся тем, что один или несколько линкеров содержат один или несколько шарнирных
участков антитела.
26. Конструкция по п. 23, отличающаяся тем, что один или несколько линкеров содержат один или несколько шарнирных участков IgG1.
27. Конструкция по любому из пп. 24–26, отличающаяся тем, что один или несколько линкеров содержат одну или несколько модификаций.
28. Конструкция по п. 27, отличающаяся тем, что одна или более модификаций способствуют селективному связыванию Fc-гамма рецепторов.
29. Конструкция по любому из пп. 1, 2, 14-16, 21, 24-26 или 28, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна аминокислотная модификация представляет собой по меньшей мере одну аминокислотную мутацию или в которой по меньшей мере одна аминокислотная модификация представляет собой по меньшей мере одну аминокислотную замену.
30. Конструкция по любому из пп. 1, 2, 14-16, 21, 24-26 или 28, отличающаяся тем, что последовательности каждой из H1, H2, L1 и L2 получают из человеческих последовательностей.
31. Конструкция по любому из пп. 1, 2, 14-16, 21, 24-26 или 28, отличающаяся тем, что конструкция является мультиспецифической или биспецифической.
32. Конструкция по любому из пп. 1, 2, 14-16, 21, 24-26 или 28, отличающаяся тем, что конструкция является поливалентной или двухвалентной.
33. Выделенный полинуклеотид или набор выделенных полинуклеотидов, содержащих по меньшей мере одну последовательность, которая кодирует конструкцию по любому из пп. 1–32.
34. Выделенный полинуклеотид или набор выделенных полинуклеотидов по п. 33, отличающийся тем, что выделенный полинуклеотид или набор выделенных полинуклеотидов представляет собой кДНК.
35. Вектор или набор векторов, содержащих один или несколько выделенных полинуклеотидов или набор выделенных полинуклеотидов по п. 33 или 34.
36. Вектор или набор векторов по п. 35, которые выбраны из группы, состоящей из плазмиды, мультицистронного вектора, вирусного вектора, неэписомного вектора млекопитающих, вектора экспрессии и рекомбинантного вектора экспрессии.
37. Выделенная клетка, которая содержит выделенный полинуклеотид или набор выделенных полинуклеотидов по пп. 33 или 34 или вектор или набор векторов по п. 35 или 36.
38. Выделенная клетка по п. 37, отличающаяся тем, что клетка представляет собой гибридому, клетку яичника китайского хомячка (CHO) или клетку HEK293.
39. Фармацевтическая композиция, содержащая конструкцию по любому из пп. 1–32 и фармацевтически приемлемый носитель.
40. Фармацевтическая композиция по п. 39, дополнительно содержащая одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из буфера, антиоксиданта, молекулы с низкой молекулярной массой, лекарственного средства, белка, аминокислоты, углевода, липида, хелатирующего агента, стабилизатора и вспомогательного вещества.
41. Применение конструкции по любому из пп. 1–32 или фармацевтической композиции по п. 39 или 40 для лечения заболевания или расстройства, или злокачественной опухоли, или сосудистого заболевания у индивида, или в производстве лекарственного средства.
42. Способ лечения индивида, имеющего заболевание или расстройство, или рак, или сосудистое заболевание, включающий введение индивиду конструкции по любому из пп. 1–32 или фармацетвической композиции по любому из пп. 39 или 40.
43. Способ ингибирования, уменьшения или блокирования сигнала в пределах клетки или к ней, включающий приведение в контакт клетки с конструкцией по любому из пп. 1–32 или с фармацевтической композицией по любому из пп. 39 или 40.
44. Способ получения конструкции по любому из пп. 1–32 из культуры клеток-хозяев, при этом способ включает следующие стадии:
получение культуры клеток-хозяев, содержащей по меньшей мере одну клетку-хозяина, содержащую одну или несколько
последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих указанную конструкцию; и
извлечение конструкции из культуры клеток-хозяев.
45. Способ получения конструкции по любому из пп. 1–32, который включает следующие стадии:
получение H1, L1, H2 и L2;
предоставление возможности H1 образовывать пары предпочтительно с L1 по сравнению с L2 и H2 образовывать пары предпочтительно с L2 по сравнению с L1; и
получение конструкции.
46. Способ получения конструкции по любому из пп. 1–32, который включает:
a. получение выделенного полинуклеотида или набора выделенных полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере одну конструкцию;
b. определение оптимальных соотношений каждого из выделенных полинуклеотидов или набора выделенных полинуклеотидов для введения по меньшей мере в одну клетку-хозяина, где оптимальные соотношения определяют путем оценки количества гетеродимерных пар Н1-L1 и H2-L2, образованных при экспрессии H1, L1, H2 и L2 по сравнению с ошибочно спаренными гетеродимерными парами Н1-L2 и H2-L1, образующимися при экспрессии H1, L1, H2 и L2;
c. выбор предпочтительного оптимального соотношения, при котором трансфекция по меньшей мере одной клетки-хозяина предпочтительным оптимальным соотношением выделенного полинуклеотида или набора выделенных полинуклеотидов, приводит к экспрессии конструкции;
d. трансфекцию по меньшей мере одной клетки-хозяина оптимальным соотношением выделенного полинуклеотида или набора выделенных полинуклеотидов; и
e. культивирование по меньшей мере одной клетки-хозяина, чтобы экспрессировать конструкцию.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что выбор оптимального соотношения оценивают путем трансфекции в системе временной трансфекции.
48. Способ по п. 46 или 47, отличающийся тем, что трансфекция по меньшей мере одной клетки-хозяина предпочтительным оптимальным соотношением выделенного полинуклеотида или набора выделенных полинуклеотидов приводит к оптимальной экспрессии конструкции.
H3
49. Способ по любому из пп. 46 или 47, отличающийся тем, что конструкция содержит Fc, который содержит по меньшей мере две последовательности C, при этом Fc связан с первым гетеродимером и вторым гетеродимером при помощи одного или нескольких линкеров или без них.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что Fc представляет собой гетеродимер, необязательно содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций.
51. Машиночитаемый носитель хранения данных, содержащий
H
H1
L
L
набор данных, представляющих комплементарные мутации в первом гетеродимере, содержащем полипептидную последовательность тяжелой цепи первого иммуноглобулина (H1) и полипептидную последовательность легкой цепи первого иммуноглобулина (L1); и во втором гетеродимере, содержащем полипептидную последовательность тяжелой цепи второго иммуноглобулина (H2) и полипептидную последовательность легкой цепи второго иммуноглобулина (L2), при этом каждая из H1 и H2 содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (V домен) и константный домен тяжелой цепи (C домен); при этом каждая из L1 и L2 содержит по меньшей мере вариабельный домен легкой цепи (V домен) и константный домен легкой цепи (C домен), и где набор данных комплементарных мутаций содержит данные, представляющие те мутации, что перечислены в таблицах 29, 30 или 31, или подмножество этих мутаций; и
рабочую компьютерную программу для определения вероятности того, будет ли H1 образовывать пары предпочтительно с L1 по сравнению с L2 и/или будет ли H2 образовывать пары предпочтительно с L2 по сравнению с L1.
52. Способ на основе программного обеспечения для определения предпочтительного образования пар, включающий:
получение набора данных, содержащего данные, представляющие
H
H1
L
L
комплементарные мутации в первом гетеродимере, содержащем полипептидную последовательность тяжелой цепи первого иммуноглобулина (H1) и полипептидную последовательность легкой цепи первого иммуноглобулина (L1); и втором гетеродимере, содержащем полипептидную последовательность тяжелой цепи второго иммуноглобулина (H2) и полипептидную последовательность легкой цепи второго иммуноглобулина (L2), при этом каждая из H1 и H2 содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (V домен) и константный домен тяжелой цепи (C домен); при этом при этом каждая из L1 и L2 содержит по меньшей мере вариабельный домен легкой цепи (V домен) и константный домен легкой цепи (C домен), и где набор данных комплементарных мутаций содержит данные, представляющие те мутации, что перечислены в Таблицах 29, 30 или 31, или подмножество этих мутаций; и
определение при помощи процессора компьютера вероятности того, будет ли H1 образовывать пары предпочтительно с L1 по сравнению с L2 и/или будет ли H2 образовывать пары предпочтительно с L2 по сравнению с L1.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает производство конструкции по любому из пп. 1–32.
H
H1
L
L
54. Способ получения биспецифической антигенсвязывающей полипептидной конструкции, в котором указанная биспецифическая конструкция содержит первый гетеродимер, содержащий полипептидную последовательность тяжелой цепи первого иммуноглобулина (H1) и полипептидную последовательность легкой цепи первого иммуноглобулина (L1) из первого моноспецифического антигенсвязывающего полипептида; и второй гетеродимер, содержащий полипептидную последовательность тяжелой цепи второго иммуноглобулина (H2) и полипептидную последовательность легкой цепи второго иммуноглобулина (L2) из второго моноспецифического антигенсвязывающего полипептида, при этом каждая из H1 и H2 содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (V домен) и константный домен тяжелой цепи (C домен); при этом каждая из L1 и L2 содержит по меньшей мере вариабельный домен легкой цепи (V домен) и константный домен легкой цепи (C
домен), при этом указанный способ включает:
a. получение набора данных, содержащих данные, представляющие набор аминокислотных модификаций в H1, H2, L1 и L2 таким образом, что при введении подмножества модификаций в H1, H2, L1 и/или L2, в тестовой системе H1 предпочтительно образует пары с L1 по сравнению с L2, и H2 предпочтительно образует пары с L2 по сравнению с L1;
b. введение подмножества одной или более модификаций из набора данных в первый гетеродимер и/или второй гетеродимер; и
c. совместную экспрессию первого гетеродимера и второго гетеродимера по меньшей мере в одной клетке-хозяине для получения продукта экспрессии, содержащего биспецифическую конструкцию.
55. Способ по п. 54, который дополнительно включает определение количества биспецифической конструкции в продукте экспрессии по сравнению с другими полипептидными продуктами.
56. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что биспецифическую конструкцию получают с чистотой более чем 70% по сравнению с другими полипептидными продуктами.
57. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что набор данных представляет собой набор данных по п. 51.
58. Способ по п. 54 или 55, который включает стадию добавления дополнительных аминокислотных модификаций по меньшей мере к одной из H1, H2, L1 или L2, чтобы повысить чистоту биспецифической конструкции по сравнению с другими полипептидными продуктами.
H3
59. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что конструкция содержит Fc, который содержит по меньшей мере две последовательности C, при этом Fc связан с первым гетеродимером и вторым гетеродимером при помощи одного или нескольких линкеров или без них.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что Fc представляет собой гетеродимер, необязательно содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций.
61. Способ по любому из пп. 54, 55 или 60, отличающийся тем, что биспецфическая антигенсвязывающая полипептидная конструкция представляет собой антитело, Fab или scFv.