Способ уменьшения клинических проявлений атопического дерматита у детей, находящихся на грудном вскармливании
METHOD FOR REDUCING THE CLINICAL MANIFESTATIONS OF ATOPIC DERMATITIS IN BREASTFED CHILDREN

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в микробиологической и клинической практике.
Сразу после рождения организм новорожденного ребенка начинает контактировать с агрессивной окружающей средой. Первыми с ней встречаются открытый эпителиальный барьер - эпителий кожи, дыхательной, мочеполовой систем и желудочно-кишечного тракта. Функционирующий сообща, целостный защитный барьер предупреждает проникновение патогенов во внутреннюю среду организма.
2
В адаптации к новым условиям жизни важную роль играет желудочно-кишечный тракт, эпителиальная выстилка которого имеет наибольшую площадь (200-300 м) [Jakaitis В.М., Denning P.W. Human breast milk and the gastrointestinal innate immune system. Clin Perinatol. 2014; 41 (2): 423-35. DOI: 10.1016/j.clp.2014.02.011]. Нарушение адаптации ведет к развитию различных патологических состояний. В раннем возрасте чаще всего диагностируется пищевая аллергия и нередко связанный с пищевой сенсибилизацией атопический дерматит. Высокую частоту распространения данных заболеваний в детской популяции объясняют гигиенической теорией, в соответствии с которой ограниченный контакт младенца с нормальными бактериями - роды путем кесарева сечения, стерилизация бутылок для питания, использование для прикорма стерилизованной еды, редкий контакт с домашними животными и людьми - препятствует формированию кожного и кишечного микробиоценоза. Вследствие обеднения микробного разнообразия на физиологических барьерах нарушается естественное развитие иммунной толерантности, обусловленное воздействием разного рода микроорганизмов, в том числе бактерий, вследствие чего повышается риск развития различных аллергических состояний [Rachid R., Chatila Т.А. The role of the gut microbiota in food allergy. Curr Opin Pediatr. 2016; 6 (28): 748-75].
Заселение кишечника грудного ребенка начинается с момента рождения. Впоследствии оно продолжается во время грудного вскармливания через грудное молоко матери, в котором содержатся бифидобактерии и другие факторы, способствующие росту бактерий-комменсалов [Fleischer D.M., Spergel J.M., Assa А.Н. et al. Primary prevention of allergic disease through nutritional interventions. J Allergy Clin Immunol Pract. 2008; 1: 29-36]. Заселение кишечника более чем 400 видами таких бактерий - основа формирования его микробиома. Бактерии-комменсалы способны поддерживать гомеостаз в кишечнике, устанавливать симбиотические отношения на поверхности эпителия [Jakaitis В.М., Denning P.W. Human breast milk and the gastrointestinal innate immune system. Clin Perinatol. 2014; 41 (2): 423-35]. Полноценно сформированный микробиоценоз кишечника защищает ребенка от развития аллергии посредством формирования Th-1 ответа лимфоцитов.
По данным последних исследований грудное молоко матери способствует формированию кишечной микробиоты младенцев благодаря содержанию в нем растворимых Toll-подобных рецепторов и CD 14, лактадгерина, лактоферрина, β-дефенсинов и олигосахаридов [Hakansson А.Р. Protective effects of human milk antimicrobial peptides against bacterial infection. J Pediatr (Rio J.). 2015; 91 (1): 4-5]. Эти вещества формируют защитный механический барьер слизистой оболочки кишечника, препятствуя колонизации патогенных микроорганизмов и вирусов, а в случае их распространения - убивая патогены [Jing Wu, Ruo-Lan Gong, Qing-Feng Hu et al. Immunoregulatory effect of human β-defensin 1 on neonatal cord blood monocyte-derived dendritic cells and T cells. Mol Immunol. 2019; 109: 99-107]. Дефенсины - известные факторы врожденного иммунитета, представляющие собой эндогенные вещества [Metz-Boutigue М.-Н., Shooshtarizadeh P., Prevost G. et al. Antimicrobial Peptides Present in Mammalian Skin and Gut are Multifunctional Defence Molecules, Curr Pharm Des. 2010; 16: 1024] с широкой антибактериальной активностью против грамположительных бактерий, а также против грибов и вирусов [Savilahti Е.М., Kukkonen А.K., Kuitunen М., et al. Soluble CD14, α- and β-defensins in breast milk: Association with the emergence of allergy in a high-risk population. Innate Immunity. 2015; 21 (3): 332-7]. В соответствии с классификацией эти факторы относят к 4 классу антимикробных пептидов.
В зависимости от структуры выделяют α- (вырабатываются нейтрофилами) и β- (только эпителиальными клетками) дефенсины. Важно отметить, что дефенсины типов β2-5 вырабатываются в разном количестве, их секреция повышается при инфекции, воздействии патогенов и цитокинов.
Известно, что для атопического дерматита характерна иммунная недостаточность с нарушением функционирования Т-клеточного звена иммунитета, выработки цитокинов и дефенсинов [Metz-Boutigue М.-Н., Shooshtarizadeh P., Prevost G. et al. Antimicrobial Peptides Present in Mammalian Skin and Gut are Multifunctional Defence Molecules, Curr Pharm Des. 2010; 16: 1024]. При данном заболевании в коже накапливается большое число активированных Т-лимфоцитов, вырабатывающих провоспалительные цитокины, свойственные Th-2 воспалительному ответу (Ил-4, 5, 13). На фоне изменений липидного слоя кожи, недостаточной продукции антимикробных пептидов - дефенсинов часто развиваются рецидивирующие вирусные и бактериальные инфекции. В патологический процесс вовлекается весь комплекс факторов - генетических, иммунных и внешней среды.
Для детей грудного возраста среди факторов врожденного иммунитета наибольшее значение имеют дефенсины типа β2 (HBD2) [Baricelli J., Rocafull М.А., VDzquez D. et al. Defensin-2 in breast milk displays a broad antimicrobial activity against pathogenic bacteria. J Pediatr (Rio J.). 2015; 91 (1): 36-43]. Они формируют защитные барьеры, препятствуя колонизации кожи и кишечника патогенной и условно-патогенной флорой. Часть дефенсинов продуцируют эпителиальные клетки защитных барьеров, другую часть ребенок получает с молоком матери. Антимикробные пептиды вырабатываются секреторными клетками молочной железы, поступая в грудное молоко. Чем меньше времени прошло после рождения, тем выше титр дефенсинов типа β2 в раннем грудного молоке. Снижение концентрации дефенсинов на поверхности защитных барьеров (кожи и ЖКТ), как следствие снижения фоновой концентрации дефенсинов типа β в грудном молоке способствует повышению их проницаемости и в дальнейшем сенсибилизации организма ребенка к чужеродных белкам. Известно, что дебют атопического дерматита чаще всего приходится на первые 6 месяцев жизни, в период формирования иммунной системы и защитных эпителиальных барьеров. Несмотря на наличие большого числа исследований по оценке влияния внешних факторов на развитие аллергической патологии у детей раннего возраста, роль компонентов грудного молока остается до сих пор малоизученной [Munblit D., Treneva М., Peroni D.G. et al. Immune Components in Human Milk Are Associated with Early Infant Immunological Health Outcomes: A Prospective Three-Country Analysis. Nutrients. 2017; 9 (6): 532].
Целью изобретения является разработка способа уменьшения клинических проявлений атопии у скомпрометированных детей, находящихся на грудном вскармливании.
Из уровня техники известны способы, заключающиеся в попытке влиять на состав грудного молока, в частности увеличивать синтез дефенсинов, путем назначения различных препаратов в последнем триместре беременности или в период грудного вскармливания. Одним из таких способов является способ, выбранный в качестве наиболее близкого аналога и описанный в источнике Emma М Savilahti et al., Soluble CD14, α-and β- defensins in breast milk: Association with the emergence of allergy in a high-risk population, Innate Immunity 2015, Vol. 21 (3) 332-337.
9
9
8
9
В известном способе женщинами назначались капсулы, содержащие Lactobacillus rhamnosus GG (АТСС 53103) 5×10, L. rhamnosus LC705 (DSM 7061) 5×10, Bifidobacterium breve Bb99 (DSM 13692) 2×10 и Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (DSM 7076) 2×10 дважды в день примерно в течение 4 недель.
Однако, использование предложенного способа по результатам проведенного в дальнейшем анализа не привело достоверному увеличению синтеза дефенсинов β2 в молоке женщин. Соответственно, способ не оказал влияния на клинические проявления атопии у детей.
Техническим результатом предлагаемого способа является достоверное увеличение количества дефенсинов β2 в грудном молоке и их доказанное положительное влияние на течение атопии у детей в виде уменьшения клинических проявлений.
Предложенный способ осуществляется следующим образом:
В качестве лечебного средства применяли определенный штамм лактобактерий в виде БАДа НАРИНЭ.
«Наринэ» производится на основе истинного штамма лактобактерий Lactobacillus sp. штамм n.v. Ер 317/402 (NARINE), ООО «Нарэкс» (Республика Армения).
НАРИНЭ - средство, изготавливаемое на основе чистой культуры молочнокислых бактерий Lactobacillussp., штамма n.v. Ер 317/402 (NARINE) и повышающий колонизацию кишечной стенки полезными и непатогенными микроорганизмами, бактериями. Компоненты устойчивы к действию соляной кислоты и желчи в ЖКТ, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, что указывает на возможность его применения при острых и хронических кишечных инфекциях, вызванных клебсиеллой, протеем, стафилококком, патогенной кишечной палочкой, шигеллой, сальмонеллой и др.), а также при диспепсии различной этиологии.
Следует отметить важную особенность препарата: он не разрушается при одновременном приеме антибактериальных, химиотерапевтических и антисептических средств, которые при длительном применении оказывают отрицательное воздействие на микробиоту кишечника. НАРИНЭ в короткие сроки восстанавливает соотношение представителей анаэробной флоры (лактобактерий и бифидобактерии), повышает защитную функцию непатогенной кишечной палочки.
В патентной и научно-технической литературе авторам не удалось найти сведения о свойстве Наринэ повышать выработку дефенсинов типа β эпителиальными клетками грудной железы, способных защищать внутреннюю среду организма от воздействия патогенов, формируя нормальную микробиоту кишечника.
Для достижения поставленной цели были отобраны образцы грудного молока матерей детей с АД до и на фоне приема НАРИНЭ и грудного молока матерей контрольной группы, имеющих здоровых детей.
В работе исследовали образцы грудного молока матерей детей с верифицированным диагнозом Атопический дерматит на основании критериев Hanifit&Pajka (1980 г).
Критерии включения в исследование:
В исследование вошли матери, дети которых находились исключительно на грудном вскармливании, дебют атопии которых отмечался в течение последних 6 месяцев. В контрольную группу вошли матери здоровых детей без каких-либо патологических изменений со стороны кожного покрова.
Критерии исключения из исследования:
В исследование не были включены дети, получающие смешанное вскармливание. Также не анализировались данные матерей, получавших системную антибактериальную терапию в момент исследования и в течение последних 6 месяцев и, если на момент взятия молока у них отмечались клинические симптомы мастита.
В основную группу было включено 26 образцов грудного молока от матерей, чьи дети в течение последних 6 мес заболели атопическим дерматитом (АД). Средний возраст детей этой группы составил 9,0±2,9 мес. Дети имели в основном легкое течение АД, индекс СКОРАД составил в среднем 34,5+/-13,4. В контрольную группу вошли образцы грудного молока от 11 матерей здоровых детей (средний возраст - 11,5±3,5 мес) (табл. 1).
Все дети из основной группы получали стандартную наружную терапию атопического дерматита: местная терапия глюкокортикостероидами, местная терапия антисептиками при признаках вторичного инфицирования очагов поражения, эмоленты.
Путем ручного сцеживания (врачом или женщиной) в стерильный контейнер получали около 5 мл грудного молока с обеих молочных желез. Иммуноферментный анализ для определения бета-дефенсинов 2 типа проводился с помощью набора ELISA Kit for Defensin Beta 2 (DEFb2) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя (исследования проводились в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ вакцин и сывороток им И.М. Мечникова).
Также изучался посев молока для выявления штаммов стафилококка. Исследования проведены в лаборатории микробиологии ФГБУ ЦНИИС и ЧЛХ МЗ России. Посев молока брали до начала лечения путем сцеживания его чистыми руками в стерильную пробирку. В дальнейшем производился посев материала на кровяной агар. Полученные изоляты идентифицировали до вида по общепринятым методикам с использованием автоматического микробного анализатора "Walka-way 96 plus", Siemens Healthcare Diagnostics, Germany.
Для оценки влияния биологически активную добавку (БАД) НАРИНЭ на продукцию дефенсина HBD2 (дефенсинов β2) участники исследования, кормящие матери, были разделены на 3 группы: 1 группу (n=17) составили матери, получающие БАД НАРИНЭ по 2 капсулы (180 мг в одной капсуле) 2 раза в сутки в течение 20 дней, во 2 группу вошли матери, получающие ПЛАЦЕБО по 2 капсулы 2 раза в день в течение 20 дней (n=9), в контрольную группу - матери здоровых детей (n=11). В процессе анализа из первой и второй групп было исключено по 4 человека, из группы контроля - 1, данные которых вызывали сомнения.
Для оценки динамики показателей экспрессии на фоне приема НАРИНЭ и ПЛАЦЕБО образцы были взяты дважды: до начала исследования и по окончании курса лечения - на 21 день.
В связи с тем, что пациентов было немного (n<30), полученные результаты оценивались с помощью непарного t-критерия Стьюдента и t-теста Уэлча. Достоверность отличия определяли по критерию Стьюдента. Различия определяли значимыми при р<0,05; выборки подчинялись нормальному закону распределения. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel.
Исследование на обсемененность грудного молока стафилококком показало, что в 56% случаев молоко было стерильно, в 44% случаев высевался эпидермальный стафилококк, при этом не было корреляции в группе матерей здоровых или больных АД детей. Ни в одном случае не было обнаружено штаммов золотистого стафилококка.
В качестве отправной точки были выбраны значения дефенсина в грудном молоке женщин, имеющих здоровых детей и данные, полученные до начала терапии. В группе матерей, имеющих детей с АД (основная группа), уровень HBD2 (дефенсинов β2) был достоверно ниже, чем у матерей здоровых детей 1,29±0,29 против 3,21±1,16 пг относительно белка (1 мг) (р<0,05).
На фоне проводимой терапии биологической активной добавкой НАРИНЭ (см табл 2) в грудном молоке участников основной группы отмечено значимое повышение уровня дефенсина HBD2 по сравнению с группой 2 (р<0,05). Так, уровень дефенсина изучаемого типа в первой группе повышался в 5,2 раза (6,67 vs 1,29); при применении ПЛАЦЕБО показатель в сравнении с данными до начала терапии увеличивался лишь в 2,4 раза (3,07 vs 1,29) (табл. 2).
Также было исследовано изменение уровня изучаемого дефенсина при приеме НАРИНЭ и ПЛАЦЕБО в сравнении с данными, полученными при оценке уровня HBD2 у матерей здоровых детей Так, на фоне приема НАРИНЭ отмечалось достоверное (р<0,05) увеличение значений дефенсина (см. таблицу 3), при приеме ПЛАЦЕБО он достигал значений, полученных в контрольной группе, но достоверность не подтверждена (р>0,05).
Поскольку в работе авторы анализировали НАРИНЭ при текущем наличии проявлений атопии у детей (атопическом дерматите), одновременно с определением титров дефенсинов проводили анализ динамики клинической картины поражения кожи. На фоне использования добавки не было случаев обострения заболевания. Использование НАРИНЭ в дополнение к наружной противовоспалительной терапией привело к достижению ремиссии во всех обследованных группах пациентов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии пробиотического препарата НАРИНЭ на уровень продукции эпителиальными клетками молочных желез антимикробных пептидов, в нашем случае HBD2. Учитывая последние научные данные, свидетельствующие о положительном действии антимикробных пептидов на развитие микробиоценоза кишечника у детей, находящихся на грудном вскармливании, а также полученные результаты наших исследований, очевидно, что данный эффект препарата сможет предупреждать развитие или облегчать течение АД, связанного с высокой проницаемостью кишечника и риском развития пищевой аллергии. Использование чистой культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus spp.пробиотического препарата НАРИНЭ может быть рекомендовано для лечения и предупреждения таких аллергических заболеваний, как атопический дерматит и пищевая аллергия. При этом, проведенные ранее исследования с другими пробиотическими препаратами не показали достоверного увеличения синтеза дефенсинов β2, что свидетельствует о том, что в лечении атопии необходимо использовать именно предложенный препарат, содержащий чистую культуру бактерий Lactobacillus spp (Наринэ), а дальнейшие исследования авторов позволили установить, что снижение дозировки препарата не позволяет получить заявленный эффект в виде достоверного увеличения содержания дефенсинов β2, а увеличение количества препарата или длительности его приема не приводит к дозозависимому увеличению синтеза необходимых дефенсинов. Таким образом, указанный в материалах заявки технический результат может быть достигнут, а назначение способа реализовано только при использовании заявленного препарата (Наринэ) в предложенных дозировках (2 капсулы по 180 мг 2 раза в день) и с той длительностью приема (20 дней), которые подтвердили свою эффективность в рамках проведенных исследований.