Характеристика энтерогеморрагической Escherichia coli О145:Н28, выделенной от пациента с гемолитико-уремическим синдромом

ба (P.aeruginosa) хлорамином его специфические амплитудно-спектральные характеристики исчезают, в отличие от контрольных объектов сравнения (хлорамин-водный раствор). Время исследования 2 — 3 мин.

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, установлено, что каждый вид исследованных бактерий характеризуется индивидуальными спектральными линиями рамановского рассеяния, которые позволяют идентифицировать их в короткое время (1 — 2 мин), что определяет возможность одновременной идентификации большого количества культур. Предлагаемый способ отличается высокой чувствительностью (105 — 106 КОЕ/мл), быстротой идентификации микроорганизмов. Портативность прибора (вес 2 — 2,5 кг в зависимости от комплектации, включая компактный кейс) позволяет использовать его в мобильных (передвижных) лабораториях. В настоящее время разработанная аппаратура и технология проходят сертификацию [1 — 3, 5].

Применение ЛКД (гигантского рамановского рассеяния и люминесценции) как новой технологии открывает возможности экспресс-индикации микроорганизмов, определения их видовой принадлежности, ускоренного определения чувствительности к антимикробным препаратам в различных областях клинической микробиологии на основе принципиального требования современной медицины — диагностика по месту лечения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Александров М.Т. Лазерная клиническая биофотометрия. М., Техносфера, 2008.

2. Александров М.Т., Таубинский И.М., Козьма С.Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате. Патент РФ №97100364 от 21.01.97.

3. Александров М.Т., Нестерова М.В., Пашков Е.П., Морозова О.А. Метод флюоресцентной диагностики — метод индикации микрофлоры человека в норме и при патологии. Журн. микробиол. 2001, 3: 63-66.

4. Акципетров О.А. Гигантские нелинейно-оптические явления на поверхности металлов. Соросовский образовательный журнал. 2001, 7: 109.

5. Пашков Е.П. Лазерно-флюоресцентный метод экспресс-индикации микроорганизмов при гнойно-воспалительных заболеваниях, дисбактериозах и другой патологии микробной этиологии. Автореф. дисс. д-ра мед. наук. М., 2002.

Поступила 12.02.13

Контактная информации: Александров Михаил Тимофеевич, д.м.н., проф., 111558, Москва, ул. Погодинская,10, р.т. (495)300-58-80

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

Л.А.Кафтырева1, М.А.Макарова1, Т.А.Коновалова2, З.Н.Матвеева1

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ESCHERICHIA COLI О145:Н28, ВЫДЕЛЕННОЙ ОТ ПАЦИЕНТА С ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург; Центральный НИИ эпидемиологии, Москва

Цель. Определение этиологической значимости клинических штаммов E.coli О145:Н28, изолированных из испражнений пациента с гемолитико-уремическим синдромом (ГУС). Материалы и методы. Исследованы 20 штаммов E.coli, выделенные из испражнений пациен-

та с ГУС, развившимся после ОКИ. Определяли антигенную структуру штаммов методом секвенирования rfb и fliC генов; наличие генов вирулентности (pap, aaf, sfa, afa, eaeА, bfpA, ial, hly, cnf, stx1, stx2, LT, ST и aer) в ПЦР; продукцию БЛРС методом двойных дисков, гены БЛРС в ПЦР. Результаты. Штаммы содержали rfb ген, кодирующий О145, fliC ген, кодирующий Н7. Выявлены гены, кодирующие синтез stx2-токсина и интимина (eaeА). Штаммы были резистентны к Р-лактамам за счет продукции БЛРС класса СТХ-М. Заключение. От пациента с ГУС изолирован возбудитель E.coli О145:Н28, продуцирующий stx2-токсин и БЛРС класса СТХ-М, ранее не регистрируемый в РФ.

Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 100—104

Ключевые слова: E.coli О145:Н28, ГУС, гены вирулентности, БЛРС L.A.Kaftyreva1, M.A.Makarova1, T.A.Konovalova2, Z.N.Matveeva1

CHARACTERISTICS OF ENTEROHEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI О145:Н28 ISOLATED FROM A PATIENT WITH HEMOLYTIC-UREMIC SYNDROME

1Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg; 2Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russia

Aim. Determine etiologic significance of clinical strains of E. coli О145:Н28 isolated from feces of a patient with hemolytic-uremic syndrome (HUS). Materials and methods. 20 E. coli strains isolated from feces of a patient with HUS that developed after an acute intestine infection were studied. Antigenic structure of strains was determined by sequencing of rfb and fliC genes; presence of virulence genes (pap, aaf, sfa, afa, eaeА, bfpA, ial, hly, cnf, stx1, stx2, LT, ST and aer) — in PCR; ESBL production — by double disk method, ESBL genes — in PCR. Results. The strains contained rfb gene coding О145, fliC gene coding H7. Genes coding synthesis of stx2-toxin and intimin (eaeA) were detected. The strains were resistant to P-lactams due to production of CTX-M class ESBL. Conclusion. A causative agent E. coli О145:Н28 was isolated from a patient with HUS that produces stx2-toxin and CTX-M class ESBL and has not been previously registered in Russian Federation.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 100—104

Key words: E. coli О145:Н28, HUS, virulence genes, ESBL

Среди возбудителей, способных вызывать вспышки острых кишечных инфекций (ОКИ), особое место занимает группа энтерогеморрагических E. coli (EHEC) в связи с возможностью развития у пациентов осложнений в виде тяжелых поражений почек (гемолитико-уремический синдром, ГУС, почечная недостаточность), а также тромбоцитопенической пурпуры. E. coli О157:Н7 из этой группы является наиболее известным патогеном для человека. Возникшая в 2011 г. пищевая вспышка в Европе, вызванная EHEC О104:Н4, продуцирующей stx-токсин и ß-лактамазу расширенного спектра (БЛРС), показала, что EHEC других сероваров (не-О157) способны к широкому эпидемическому распространению и могут вызывать тяжелые формы инфекции [1]. E. coli серогрупп О26, О111, О145, продуцирующие stx-токсин, широко распространены как возбудители ОКИ и ГУС в странах, в которых налажена их лабораторная диагностика [14, 15]. В США ежегодно они вызывают 37 000 случаев заболеваний, из них 30 с летальным исходом [10]. Эпидемиологические данные указывают, что крупный рогатый скот и другие животные являются носителями этого возбудителя и потенциальным источником заражения человека [11, 12].

Серологическая группа E. coli О145 включает несколько серотипов, штаммы которых продуцируют stx-токсины (О145:Н-, О145:Н8, О145:Н16, О145:Н25, О145:Н28) и вызывают ОКИ с развитием осложнений в виде ГУС во многих странх [4, 14, 15]. По данным 43 американских лабораторий, которые присылали отчеты в CDC в 1983 — 2002 гг., этот серовар входил в число шести возбудителей, часто вызывающих спорадические случаи ОКИ у людей, а также носительство у животных [5]. В Бельгии этим возбудителем было контаминировано мороженое, которое послужило фактором передачи крупной вспышки ОКИ, протекающей в тяжелой форме [6].

В России клинические лаборатории могут идентифицировать штаммы EHEC только двух сероваров О157:Н7 и О104:Н (МУК 4.2.992-00, МУК 4.2.2963-11). EHEC некоторых серотипов, для которых отсутствуют сыворотки для детекции О-антигена, в настоящее время могут быть идентифицированы только в лабораториях НИИ и референс-центрах, имеющих современное оборудование.

Изучены 20 штаммов E.coli, выделенных из пробы испражнений с использованием классического бактериологического и молекулярно-генетического методов пациента дошкольного возраста, находившегося в отделении гемодиализа с ГУС, развившимся на фоне гемоколита неясной этиологии. У пациента отмечалось снижение диуреза, коагулопатия, гемолитическая анемия, тромбоцитопения, выраженный лейкоцитоз с ускорением СОЭ и сдвигом влево до миелоцитов, что свидетельствовало о развитии ГУС. Ферментативные свойства, чувствительность к антимикробным препаратам (АМП) и антигенная характеристика были изучены общепринятыми методами с использованием микробиологического анализатора «Vitek 2 compact» (BioMerieux), сывороток диагностических эшерихиозных ОК поливалентных (ОАО «Биомед» им. И.И.Мечникова), иммунохроматографического теста «Singlepath E.coli O157» (Merk). Интерпретация результатов тестирования чувствительности к АМП проводили согласно критериям EUCAST 2011 г. Продукцию БЛРС подтверждали методом двойных дисков согласно МУК 4.12.1890-04. Тип БЛРС определяли в ПЦР со специфическими праймерами [7]. Для детекции О- и Н-антигенов использовали секвенирование генов, ответственных за продукцию О- и Н-антигенов (rfb-ген и АЮ-ген, соответственно). Определение ну-клеотидной последовательности продуктов амплификации проводили с использованием автоматического анализатора «PRISMTM ABI-3100 Genetic Analyzer» (PE/Appled Biosystems). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ Vector NTI Suite 9, MEGA 4.0. Нуклеотидные последовательности референтных штаммов, использованные в работе, были получены из базы данных Национального центра биотехнологической информации (GenBank NCBI, США). Маркеры вирулентности E. coli выявляли в ПЦР с наборами специфических праймеров к 14 генам вирулентности эшерихий (диареегенных и уропатогенных), кодирующим способность к адгезии (pap, aaf1, sfa, afa, eaeА, bfpA), инвазии (ial), токсинообразованию (hly, cnf, stx1, stx2, lt, st) и персистенции (aer) [2, 13]. Для выделения ДНК использовали наборы «InstaGene Matrix» (Bio-Rad). При постановке ПЦР использовали наборы НПО «СибЭнзим». ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 50 мкл в амплификаторе «С1000 Thermal Cycler» (Bio-Rad). Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 2% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, 0,5 М TBE буферной системе рН 8,0. В качестве маркеров использовали GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Положительным контролем служили штаммы энтеробактерий: E.coli 10-407 (гены lt, st), E.coli 217 (гены bfpA, eaeA), E.coli J157:H7/EDL933 (гены stx1, stx2, hly), E.coli KS52 (ген afa), E.coli J96 (гены pap, sfa, cnf), E.coli 99-196 (ген aer), E.coli 17-2 (ген aaf1); S.flexneri 98-11741 (ген ial). Отрицательным контролем служили штаммы Hafnia (ген aaf1) и E.coli Hb101 для других перечисленных генов.

При традиционном бактериологическом исследовании проб испражнений возбудители ОКИ (шигеллы, сальмонеллы, известные диареегенные эшерихии, включая E. coli О157:Н7) выделены не были. Детальное изучение 20 лактозоположительных колоний, выросших на среде Эндо, показало, что они имели типичные культурально-ферментатив-ные свойства, характерные для E. coli — представителя нормальной микробиоты кишечника. Штаммы не агглютинировались в поливалентных сыворотках (ОКА, ОКВ, ОКС, ОКД, ОКЕ), давали отрицательный результат в иммунохроматографическом экспресс-тесте «Singlepath E.coli O157» (Merk). Продукция stx-токсина была выявлена в тесте «Duopath Verotoxin» (Merk), что свидетельствовало о принадлежности штаммов E. coli к группе EHEC.

Штаммы проявляли резистентность к цефалоспоринам широкого спектра (цефтриак-сону, цефтазидиму и цефепиму) за счет БЛРС CTX-M класса (продукция подтверждена в тесте синергизма методом двойных дисков и наличием гена CTX-M). К АМП других групп сохранялась хорошая чувствительность.

Секвенирование генов, ответственных за продукцию О- и Н-антигенов (rfb-ген и ШС-ген, соответственно), позволило установить серологическую группу О145 и антиген под-

вижности Н28 (антигенная формула E. coli О145:Н28). У штаммов выявлены гены, кодирующие факторы вирулентности EHEC: продукцию stx2-токсина (ген stx2) и интимина (ген eaeA) — фактора адгезии, что позволило отнести их к классическим EHEC. Не выявлены гены, наличие которых характерно для других групп диареегенных и уропатоген-ных E. coli. Секвенсы генов rfb 145 и fli С 28 депонированы в GenBank JX112707-JX112708.

Штаммы E. coli О145 как представители EHEC были в числе первых шести серогрупп, выделенных от пациентов с гемоколитами и ГУС во многих странах, где налажена целенаправленная лабораторная диагностика EHEC. Они нередко вызывали групповые заболевания ОКИ в странах Европы, США и Японии [3, 8, 9, 15]. Факторами передачи служили разнообразные пищевые продукты животного и растительного происхождения.

Серологическая группа О145 гетерогенна по Н-антигену и включает, по крайней мере, четыре серотипа (О145:Н8, О145:Н16, О145:Н25, О145:Н28). Исследования fliC гена неподвижных штаммов серогруппы О145 показало их идентичность антигенам Н28 и Н25 [14]. В данной работе приведена характеристика штаммов E. coli О145:Н28, ранее не регистрируемой в РФ. По антигенной структуре, факторам вирулентности (ген stx2 и ген eaeA) штамм принадлежал к классическим EHEC, широко распространенным во многих странах.

Опыт выделения штаммов группы EHEC показывает, что без детекции генов вирулентности такие штаммы не могли быть идентифицированы в практических бактериологических лабораториях. Этот случай остался случаем «неясной этиологии», так как О-сыворотка для детекции E.coli О145 в РФ не производится. Тревожным является тот факт, что впервые выявленные в РФ штаммы E.coli О145:Н28 характеризовались резистентностью к АМП, как и штамм E.coli О104:Н4, вызвавший эпидемию в Европе весной — летом 2011 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кафтырева Л.А., Егорова С.А., Макарова М.А. и др. Характеристика биологических свойств E.coli 0104:H4 — возбудителя крупной пищевой вспышки, возникшей в Германии в мае 2011 г. Клин. лаб. диагн. 2012, 1: 44-46.

2. Afset J., Bevanger L., Romundstad P., Bergh K. Association of atypical enteropathogenic Esherichia coli (EPEC) with prolonged diarrhea. J. Med. Microbiol. 2004, 53: 1137-1144.

3. Bielaszewska M., Karch N. Non-O157:H7 Shiga toxin verocyto-toxin-producing Escherihia coli strains: epidemiological significance and microbiological diagnosis. World J. Microbiol. Biotechnol. 2000, 16: 711-718.

4. Blanco J.E., Blanco M., Alonso M.P. еt al. Serotypes, virulence genes, and intimin types of Shiga toxin (verotoxin)-producing Escherichia coli isilates from human patients: prevalence in Lugo, Spain, from 1992-1999. J. Clin. Microbiol. 2004, 42: 311-319.

5. Brooks J.T., Sowers E.G., Wells J.G. et al. Non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli infections in the United States, 1983-2002. J. Infect. Dis. 2005, 192: 1422-1429.

6. De Schrijver K., Buvens G., Posse B. at al. Outbreak of verocytotoxin-producing E. coli O145 and O26 infections associated with the consumption of ice cream produced at a farm, Belgium, 2007. Eurosurveillance. 2008, 13:8041. Available at: http://eurosurveillance.org/ViewArticle aspx?Articleid=8041.

7. Egorova S., Kaftyreva L., Grimont P.D.,Weill F-X. Prevalence and characterization of extended-spectrum cephalosporin-resistant nontyphoidal Salmonella isolates in adults in Saint Petersburg, Russia (2002-2005). Microbial Drug Resistance. 2007,13 (2): 102-107.

8. Eklund M., Scheutz F, Siitonen A. Clinical isolates of non-O157 Shiga toxin-producing Escherihia coli: serotypes, virulence characteristics, and molecular profiles of strains of the same serotype. J. Clin. Microbiol. 2001, 39: 2829-2834.

9. Johnson James R. Virulence factors in Escherihia coli. J. Clin. Microbiol. 2005, 43 (12): 62216222.

10. Mead P.S., Slutsker L., Dietz V. еt al. Food-related illness and death in the United States. Emerg. Infect. Dis. 1999, 5: 607-625.

11. Montenegro M.A., Bulte M., Trumpf T. et al. Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle. J. Clin. Microbiol. 1990, 28: 1417-1421.

12. Padola N.L., Blanco M., Etheverria A.I. еt al. First isolation of enterohaemorrhagic Escherichia coli O145:H from cattle in feedlot in Argentina. BMC Microbiology. 2002, 2: 2-6.

13. Piva I., Pereira A., Ferraz L. еt al. Virulance markers of enteroaggregative Escherichia coli iso-

lated from children and adults with diarrhea in Brasilia. J. Clin. Microbiol. 2003, 41 (5): 18271832.

14. Sonntag A.K., Prager R., Bielaszewska M. еt al. Phenotypic and genotypic analyses of enterohem-orrhagic Escherichia coli O145 strains from patients in Germany. J. Clin. Microbiol. 2004: 954962.

15. Tozzi A.E., Caprioli A.F., Minelli F.A. еt al. Hemolytic uremic syndrome study group. Shiga toxin-producing Escherichia coli infections associated with hemolytic uremic syndrome, Italy, 1988-2000. Emerg. Infect. Dis. 2003, 9: 106-108.

Поступила 12.02.13

Контактная информация: Кафтырева Лидия Алексеевна, д.м.н.,

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812) 232-48-83

© А.В. ВАЛЫШЕВ, Н.В. ГЕРЦЕН, 2013 А.В.Валышев, Н.В.Герцен

БАКТЕРИОЦИНОГЕНИЯ ЭНТЕРОКОККОВ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

Цель. Характеристика бактериоциногенности и бактериоциночувствительности энтерококков, выделенных из фекалий человека. Материалы и методы. Для выявления бактериоци-ногении микроорганизмов использовали принцип отсроченного антагонизма на плотной питательной среде (120х120 культур). У высокоактивных штаммов определяли факторы пато-генности (продукция гемолизина, желатиназы, ДНКазы), а также антагонизм в отношении бактерий рода Listeria. Результаты. Внутриродовой антагонизм был обнаружен у 65% культур бактерий. Почти четверть (23,1%) бактериоциногенных штаммов подавляли рост более 50 культур энтерококков. Хотя данный признак отмечен у представителей 4 видов, подавляющее большинство (77,8%) изолятов с широким спектром действия было отнесено к виду Enterococcus faecium. В условиях in vitro эти культуры проявляли выраженное антилистериозное действие, у них не было экспрессии факторов патогенности. Заключение. Большая распространенность внутри- и межродового антагонизма у энтерококков объясняет существенное значение бактерий этой группы кишечного микробиома в колонизационной резистентности биотопа организма хозяина.

Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 104—107

Ключевые слова: энтерококки, листерии, кишечная микрофлора, колонизационная резистентность, бактериоцины, патогенность, цитолизин, гемолизин, желатиназа, дезоксири-бонуклеаза

A.V.Valyshev, N.V.Gertsen

BACTERIOCINOGENIA OF ENTEROCOCCI OF HUMAN INTESTINE MICROFLORA

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

Aim. Characteristics of bacteriocinogenicity and bacteriocin-sensistivity of enterococci isolated from human feces. Materials and methods. Principle of delayed antagonism on solid nutrient medium (120x120 cultures) was used for detection of bacteriocinogenicity of microorganisms. Factors of pathogenicity (production of hemolysin, gelatinase, DNase) as well as antagonism against Listeria genus bacteria were determined in highly active strains. Results. Intrageneric antagonism was detected in 65% of bacterial cultures. Almost a quarter (23.1%) of bacteriocinogenic strains suppressed growth of more than 50 cultures of enterococci. This feature however was noted in members of 4 species, vast majority (77.8%) of the isolates with a wide specter of activity was attributed to Enterococcus faecium