НОВОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ ПРЕСЕПСИНА
NEW ANTI-PRESEPSIN ANTIBODY

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение относится к антителам против пресепсина или их антигенсвязывающим фрагментам антител, которые можно использовать для измерения пресепсина в образце.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] CD14 представляет собой известных гликопротеин, экспрессируемых на поверхности мембран моноцитов и выполняет функцию рецептора LPS (липополисахарида). Существует 2 формы молекул CD14. Одна представляет собой мембраносвязанную форму CD14 (mCD14), экспрессируемую на клеточной поверхности. Другая форма представляет собой растворимый CD14 (sCD14). sCD14, которые имеют молекулярную массу приблизительно 55 кДа и приблизительно 49 кДа (далее в настоящем документе обозначены как «sCD14 с высокой молекулярной массой»), известны в данной области и сообщалось, что эти sCD14 демонстрируют высокий уровень в крови пациента с многими заболеваниями, такими как сепсис, синдром приобретенного иммунодефицита (AIDS), острый дыхательный дистресс-синдром (ARDS) и системная красная волчанка (SLE). По этой причине эти sCD14 с высокой молекулярной массой не считают специфичными маркерами заболеваний. См. непатентные документы 1 и 2.
[0003] С другой стороны, сообщалось о том, что существуют новые молекулярные частицы sCD14, sCD14-ST (растворимый подтип антигена CD14, также обозначаемый как пресепсин), концентрация которого в крови характеристически возрастает у пациентов с сепсисом.
[0004] sCD14-ST (пресепсин) отличается миграцией к молекулярной массе 13±2 кДа в SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях для всех sCD14, и он содержит N-концевую область CD14. sCD14-ST (пресепсин) имеет аминокислотную последовательность, в которой C-концевая область по большей части удалена по сравнению с аминокислотными последовательностями sCD14 с высокой молекулярной массой и, в отличие от sCD14 с высокой молекулярной массой, sCD14-ST (пресепсин) не обладает способностью связывать LPS. Кроме того, пресепсин демонстрирует иммуногенность, отличающуюся от иммуногенности sCD14 с высокой молекулярной массой, и, следовательно, молекулы можно различать с использованием антитела. Концентрация пресепсина в кровь, в частности, возрастает у пациентов с сепсисом (см. патентный документ 1). Кроме того, сообщалось, что концентрация пресепсина в крови демонстрирует более высокий уровень в крови пациентов с сепсисом по сравнению с пациентами с синдромом системной воспалительной реакции (SIRS), который сложно отличить от сепсиса. Таким образом, пресепсин считают специфичным диагностическим маркером сепсиса (см. непатентный документ 3).
[0005] Раскрыты поликлональное антитело, полученное у кролика, (антитело S68) и моноклональное антитело, полученное у крысы, (F1146-17-2), которые специфично распознают пресепсин (см. патентные документы 1 и 2).
[0006] В настоящее время, при измерении пресепсина на практике используют измерительную систему с использованием полученного у кролика поликлонального антитела в качестве специфичного антитела к пресепсину, и измерительные наборы для осуществления измерительной системы представлены на рынке в Европе и Японии (PATHFAST™ Presepsin, Mitsubishi Chemical Medience Corporation).
[0007] Предпринята попытка получения моноклонального антитела против пресепсина человека, которое можно использовать на практике, но антитело, обладающее удовлетворительной эффективностью, не было получено.
Документ уровня техники
Патентный документ
[0008] Патентный документ 1: WO 2005/108429
Патентный документ 2: WO 2004/044005
[0009] Непатентный документ 1: Hayashi, et al., Infection and Immunity, 67: 417-420, 1999
Непатентный документ 2: Lawn, et al., Clinical & Experimental Immunology, 120: 483-487, 2000
Непатентный документ 3: Yaegashi, et al., Journal of Infection and Chemotherapy, 11: 234-238, 2005
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМА, ПОДЛЕЖАЩАЯ РЕШЕНИЮ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Цель изобретения состоит в том, чтобы предоставить новое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые обладают превосходной реактивностью с пресепсином и подходят для измерения пресепсина в образце.
[0011] Кроме того, другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые предоставляют значение измерения пресепсина, которое благоприятно коррелирует со значением измерения с помощью антитела S68 (поликлональное антитело, полученное посредством иммунизации кролика с использованием пептида S68, описанного в примере 1 из WO 2004/044005).
[0012] Кроме того, другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые предоставляют значение измерения пресепсина и которые не подвержены влиянию мешающего вещества (например, триглицеридов) в образце, и могут делать возможным измерение пресепсина с высокой воспроизводимостью, даже в случае образца, который имеет множество фоновых факторов.
СРЕДСТВО РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
[0013] Как предусмотрено в настоящем документе, множество моноклональных антител получали из множества гибридом, полученных посредством иммунизации кролика пептидом S68 через множество стадий отбора, таких как активность связывания с пептидом S68 и активность связывания с пресепсином. Разрабатывали ELISA систему для измерения пресепсина. В результате исследований реактивности к пресепсину получали антитела, в которых реактивность антитела к пресепсину усовершенствовали приблизительно в 10000 раз по сравнению с ELISA системой, в которой используют F1146-17-2 (моноклональное антитело, полученное посредством иммунизации крысы пептидом S68, описанным в примере 2 из WO 2004/044005 A1). Аминокислотная последовательность части CDR вариабельной области F1146-17-2 описана в SEQ ID № с 42 до 47.
[0014] Уровни пресепсина в крови множества пациентов с сепсисом измеряли в ELISA системе с использованием каждого из этих моноклональных антител кролика и осуществляли анализ корреляции со значениями измерения с помощью ELISA системы с использованием антитела S68. Как результат, определяли, что имели место некоторые антитела, демонстрирующие высокую корреляцию, и некоторые антитела, демонстрирующие низкую корреляцию. Кроме того, определяли, что мешающее действие триглицеридов (TG) в образце может входить в различия в значениях корреляции. Для того чтобы получить антитело, которое благоприятно коррелирует со значением измерения пресепсина для антитела S68, которое препятствует мешающему действию TG в образце и которое подходит для измерения пресепсина в образце, продолжали исследования и определяли, что различия в эффективности антитела создают в зависимости от эпитопа, который распознает антитело. Другими словами, определяли, что причиной различий служили мешающее действие триглицерида (также обозначаемого как TG) в образце и/или эпитоп.
[0015] Определяли, что антитело, демонстрирующее предпочтительную эффективность при измерении пресепсина, распознает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 1 (krvdadadpr; или область, соответствующую от положения 52 до положения 61 в последовательности № 3 (полноразмерный растворимый CD14 человека)). Это представляет собой новый эпитоп, который впервые открыт в настоящем изобретении.
[0016] Антитело, распознающее эту последовательность P03 в качестве эпитопа, конкурентно ингибировали в реакции между антителом и пресепсином на 50% или больше с помощью последовательности аминокислотных остатков, состоящей из последовательности P03. С другой стороны, конкурентное ингибирование для реакции между антителом и пресепсином с помощью каждой последовательности аминокислотных остатков, состоящей из с SEQ ID № 35 до SEQ ID № 41, составляло меньше чем 20%, что обозначает, что конкурентное ингибирование с помощью последовательности аминокислотных остатков, состоящей из SEQ ID № 36 (соответствующей от положения 49 до положения 58 полноразмерного растворимого CD14 человека: также обозначаемой как P02 последовательность), последовательности аминокислотных остатков, состоящей из SEQ ID № 37 (соответствующей от положения 55 до положения 64 полноразмерного растворимого CD14 человека: также обозначаемой как последовательность P04), или последовательности аминокислотных остатков, состоящей из SEQ ID № 38 (соответствующей от положения 58 до положения 67 полноразмерного растворимого CD14 человека: также обозначаемой как последовательность P05) составляло меньше чем 20%. Таким образом, определяли, что антитело, распознающее последовательность P03 в качестве эпитопа, обладает высокой специфичностью к последовательности P03.
[0017] Одновременно, также наблюдали, что среди антител, полученных из гибридом, антитела, распознающие последовательность P04 и последовательность P05 в пресепсине, не подходят для измерения пресепсина, поскольку эти антитела восприимчивы к мешающему действию TG в образце во время измерения пресепсина, и так далее. Таким образом, не ожидали, что небольшое различие в положении эпитопа, распознаваемого антителом, влияет на эффективность антитела.
[0018] Кроме того, в последовательности аминокислотных остатков, в которой в положении 8 аспарагиновую кислоту из последовательности P03 (SEQ ID № 1) заменяют на аланин, конкурентное ингибирование реакции между антителом и пресепсином составляло меньше чем 20%. С другой стороны, обнаружено, что последовательность аминокислотных остатков, в которой любые из аминокислот от положения 2 до положения 7, в положении 9 и положении 10 последовательности P03 (SEQ ID № 1) заменяют на аланин (или глицин), конкурентно ингибирует реакцию между антителом и пресепсином на 50% или больше.
[0019] Кроме того, чтобы получить антитело, которое обладает предпочтительной эффективностью для измерения пресепсина, изменения CDR последовательностей осуществляли на основании последовательностей антител, распознающих последовательность P03 в качестве эпитопа. Кроме того, антитела получали с использованием способа фагового дисплея. Получаемые антитела отбирали на основании стандарта, чтобы получать антитела, которые имеют равную или более высокую эффективность, чем эффективность антител, полученных из гибридом.
[0020] Антитела, распознающие последовательность P03 в качестве эпитопа, которые получали из гибридом, и отобранные измененные антитела получали и подтверждали наличие чрезвычайно высокой аффинность к пресепсину и сопротивления влиянию мешающего вещества (в частности, триглицерида) в образце. Эти антитела благоприятно коррелируют с измерительной системой, в которой используют антитело S68. Эти антитела подходят для измерения пресепсина в образце, например, в сэндвич-ELISA анализе для измерения пресепсина.
[0021] Настоящее изобретение описано далее.
1. Антитело против пресепсина или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, в которых антитело или фрагмент специфично распознает эпитоп, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с вышеприведенным 1), в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит:
1
2
3
4
(i) определяющую комплементарность область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), состоящую из последовательности XXXMX;
5
6
7
8
9
10
11
12
13
(ii) CDR2 VH, состоящую из последовательности IXXXXYAXXXXX; и
14
15
16
(iii) CDR3 VH, состоящую из последовательности XXX; и
17
18
19
20
21
22
23
24
(iv) CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), состоящую из последовательности XXXXXXXX;
25
26
27
28
29
(v) CDR2 VH, состоящую из последовательности KXXXXXS; и
30
31
32
33
34
35
36
37
(vi) CDR3 VH, состоящую из последовательности XXXY XXXXX,
1
37
в которых с X до X представляют собой одну или несколько аминокислотных последовательностей, которые определены ниже в таблицах с 1 до 6.
Таблица 1
CDR1 VH
Базовая последовательность
X<sub>1</sub>
X<sub>2</sub>
X<sub>3</sub>
M
X<sub>4</sub>
Вариант выбора
R, S, A, M, P, V, I, D, E, H, T, Q, Y, G, K, N, W, L, F или C
Y или F
T, A или W
G или S
Таблица 2
CDR2 VH
Базовая последовательность
I
X<sub>5</sub>
X<sub>6</sub>
X<sub>7</sub>
X<sub>8</sub>
Y
A
X<sub>9</sub>
X<sub>10</sub>
X<sub>11</sub>
X<sub>12</sub>
X<sub>13</sub>
Вариант выбора
IилиV
NSGA, YRNIK, ANSGA, SSDGG, SDIDQ,илиSDIDD
T,IилиL
Y,VилиF
SилиT
WилиA
AилиG
KилиA
GилиA
Таблица 3
CDR3 VH
Базовая последовательность
X<sub>14</sub>
X<sub>15</sub>
X<sub>16</sub>
Вариант выбора
G, A, L или S
D, F, S, P, H, I, N, R, V, G или L
F, A, S, P, H, D, I, N, R, L, E или H
Таблица 4
CDR1 VL
Базовая последовательность
X<sub>17</sub>
X<sub>18</sub>
X<sub>19</sub>
X<sub>20</sub>
X<sub>21</sub>
X<sub>22</sub>
X<sub>23</sub>
X<sub>24</sub>
Вариант выбора
QилиA
AилиG
SилиA
QS,EDилиQN
IилиA
GSN, ISN, GSD или SNY,
LилиA
AилиS
Таблица 5
CDR2 VL
Базовая последовательность
K
X<sub>25</sub>
X<sub>26</sub>
X<sub>27</sub>
X<sub>28</sub>
X<sub>29</sub>
S
Вариант выбора
A или T
S или A
K или T
L или A
A или E
Таблица 6
CDR3 VL
CDR3 VL
Базовая последовательность
X<sub>30</sub>
X<sub>31</sub>
X<sub>32</sub>
Y
X<sub>33</sub>
X<sub>34</sub>
X<sub>35</sub>
X<sub>36</sub>
X<sub>37</sub>
Вариант выбора
QилиA
CилиS
SилиT
TилиY
AIGNY, ESTTF,AIGNAYилиRSTTTY
GилиA
HилиN
V,AилиT
1
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с 2 выше, в которых X представляет собой R, S, A, M, P, V, I, D, E, H, T, Q, Y, G, K, N или W.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 3 выше, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, а также CDR1 VL, CDR2 VL, и CDR3 VL, в которых CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH выбирают из аминокислотных последовательностей, описанных в таблице 7, а CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL выбирают из аминокислотных последовательностей, описанных в таблице 8.
Таблица 7
V<sub>H</sub>
CDR1
CDR2
CDR3
RYAMG
IIANSGATYYASWAKG
GDF
RYTMG
IINSGATYYASAAKG
GGL
SFWMS
IINSGATYYASWAAG
ADF
SYTMG
IINSGATYYASWAKA
GDA
AYTMG
IINSGATYYASWGKG
LDF
MYTMG
IIYRNIKTYYATWAKG
SDF
PYTMG
IINSGATYYASWAKG
GFF
VYTMG
IVSSDGGIYYASWAKG
GSF
IYTMG
IISDIDQIVYATWAKG
GPF
DYTMG
IISDIDDLFYASWAKG
GHF
EYTMG
GIF
HYTMG
GNF
TYTMG
GRF
QYTMG
GDS
YYTMG
GDP
GYTMG
GDH
KYTMG
GDD
NYTMG
GDI
WYTMG
GDN
GDR
GVL
GGE
GLH
Таблица 8
V<sub>L</sub>
CDR1
CDR2
CDR3
QASEDIISNLA
KASTLAS
QSSYTESTTFGHV
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
QASQSAGSNLA
KTSTLES
QCSYTAIGNAYGHV
QASQSISNYLA
KASKAAS
QCSYTAIGNYGHA
QAAQSIGSNLA
KAAKLAS
QCSYTAIGNYAHV
QGSQSIGSNLA
ACSYTAIGNYGHV
QASQSIGSNAA
QSTYYRSTTTYGNT
AASQSIGSNLA
QASQNIGSDLS
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 4 выше, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, а также CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, в которых CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, а также CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL выбирают из аминокислотных последовательностей, описанных в таблице 9-1, таблице 9-2 и таблице 9-3.
Таблица 9-1
Антитело
V<sub>H</sub>
V<sub>L</sub>
CDR1
CDR2
CDR3
CDR1
CDR2
CDR3
5810
RYTMG
IIANSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5844
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNAYGHV
5858
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSAGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5875
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KTSTLES
QCSYTAIGNYGHV
5878
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSISNYLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5807
RYTMG
IINSGATYYASAAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5808
RYTMG
IINSGATYYASWAAG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5809
RYTMG
IINSGATYYASWAKA
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5812
RYTMG
IINSGATYYASWGKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5842
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHA
5843
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYAHV
5859
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QAAQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5860
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QGSQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5861
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
ACSYTAIGNYGHV
5862
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKAAS
QCSYTAIGNYGHV
5863
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KAAKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5864
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNAA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5865
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
AASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5784
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
ADF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5793
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDA
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5795
RYAMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
Таблица 9-2
5803
SYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5826
RYTMG
IIYRNIKTYYATWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5811
AYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5874
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QSSYTESTTFGHV
5684
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASEDIISNLA
KASTLAS
QSSYTESTTFGHV
5877
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASTLAS
QCSYTAIGNYGHV
5884
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASEDIISNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5920
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
LDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5926
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
SDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5932
MYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5933
PYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5934
VYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5935
IYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5937
DYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5938
EYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5939
HYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5940
TYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5941
QYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5942
YYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5943
GYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5944
KYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5945
NYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5946
WYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5976
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GFF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
Таблица 9-3
5977
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GSF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5978
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GPF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5979
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GHF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5980
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GIF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5981
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GNF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5982
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GRF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5983
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDS
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5984
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDP
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5985
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDH
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5986
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDD
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5987
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDI
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5988
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDN
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5989
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDR
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
6026
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GVL
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
6028
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GGE
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
6029
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GLH
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5824
RYTMG
IVSSDGGIYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5827
RYTMG
IISDIDQIVYATWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5841
RYTMG
IISDIDDLFYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
5910
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQNIGSDLS
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
F1466-5
RYAMG
IIYRNIKTYYATWAKG
GDF
QASEDIISNLA
KASTLAS
QSSYTESTTFGHV
F1466-26
RYTMG
IINSGATYYASWAKG
GDF
QASQSIGSNLA
KASKLAS
QCSYTAIGNYGHV
F1466-16
SFWMS
IISDIDDLFYASWAKG
GGL
QASQSISNYLA
KTSTLES
QSTYYRSTTTYGNT
6. Антитело против пресепсина или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, в которых антитело или фрагмент содержит:
(a) VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 97, и CDR3 VH состоящую из последовательности SEQ ID № 9, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 22, CDR2 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 23, и CDR3 VL состоящую из последовательности SEQ ID № 24; или
(b) VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 8, и CDR3 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 94, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 22, CDR2 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 23, и CDR3 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 24.
7. Антитело против пресепсина или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, в которых антитело или фрагмент содержит:
(a) VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 4, CDR2 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 5, и CDR3 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 6, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 19, CDR2 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 20, и CDR3 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 21;
(b) VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 8, и CDR3 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 9, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 22, CDR2 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 23, и CDR3 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 24; или
(c) VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10, CDR2 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 11, и CDR3 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 12, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 25, CDR2 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 26, и CDR3 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 27.
-8
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 7 выше, в которых антитело или фрагмент связывается с пресепсином с аффинностью меньше чем 10 M (KD).
9. Антитело или его антителосвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 8 выше, где связывание между антителом или фрагментом и пресепсином конкурентно ингибируют на 50% или больше в реакционной системе, в которой последовательность аминокислотных остатков, состоящую из последовательности SEQ ID № 1, подвергают конкурентной реакции (поглощение) с тем, чтобы ингибировать связывание между антителом или фрагментом и пресепсином.
10. Антитело или его антителосвязывающий фрагмент антитела в соответствии с 9 выше, где реакционная система представляет собой сэндвич-ELISA с использованием (a) вышеуказанного антитела или фрагмента и (b) антитела F1106-13-3 или антитела F1031-8-3.
11. Антитело или его антителосвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 10 выше,
в которых конкурентное ингибирование связывания между антителом и пресепсином с помощью последовательности аминокислотных остатков составляет меньше чем 20% в реакционной системе, в которой последовательность аминокислотных остатков подвергают конкурентной реакции (поглощение) с тем, чтобы ингибировать связывание между антителом или фрагментом и пресепсином,
в которых последовательность аминокислотных остатков состоит из последовательности SEQ ID №№ 35, 36, 37, 38, 39, 40 или 41.
12. Антитело или его антителосвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 11 выше,
в которых конкурентное ингибирование связывания между антителом и пресепсином с помощью последовательности аминокислотных остатков составляет меньше чем 20% в реакционной системе, в которой последовательность аминокислотных остатков подвергают конкурентной реакции (поглощение) с тем, чтобы ингибировать связывание между антителом или фрагментом и пресепсином,
в которых последовательность аминокислотных остатков состоит из последовательности, в которой аспарагиновая кислота в положении 8 в SEQ ID № 1.
13. Антитело или его антителосвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 12 выше, в которых связывание между антителом или фрагментом и пресепсином конкурентно ингибируют на 50% с помощью последовательности аминокислотных остатков в реакционной системе, в которой последовательность аминокислотных остатков подвергают конкурентной реакции (поглощение) с тем, чтобы ингибировать связывание между антителом или фрагментом и пресепсином,
в которых последовательность аминокислотных остатков состоит из последовательности, в которой какие-либо аминокислоты со положения 2 до положения 7, в положении 9 и положении 10 SEQ ID № 1 заменяют на аланин (или глицин).
14. Антитело или его антителосвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 13 выше, в которых антитело имеет активность связывания с последовательностью аминокислотных остатков, состоящей из последовательности SEQ ID № 1, которую иммобилизуют на твердой фазе.
15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 14 выше, которые получают с использованием пептида в соответствии с SEQ ID № 2 в качестве антигена для введения.
16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 15 выше, в которых антитело не обладает специфичным связыванием с растворимым CD14 с высокой молекулярной массой.
17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 16 выше, в которых доля образца, которая проявляет степень расхождения значения измерения пресепсина±20% или меньше, когда концентрация триглицеридов (TG) составляет 20 мг/мл в образце, показывает 50% или больше в тесте на мешающее действие TG на множестве образцов, который выполняли с использованием вышеуказанного антитела.
18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 17 выше, в которых усредненная степень расхождения значения измерения пресепсина составляет±20% или меньше в то время, как TG имеет концентрацию 20 мг/мл в образце, в тесте на мешающее действие TG на множестве образцов, который выполняли с использованием вышеуказанного антитела.
19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 18 выше, в которых доля образца, которая демонстрирует степень расхождения значения измерения пресепсина±100% или меньше в то время, как TG имеет концентрацию 10 мг/мл в образце, показывает 50% или больше в тесте на мешающее действие TG на множестве образцов, который выполняли с использованием вышеуказанного антитела.
20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 19 выше, в которых значение измерения пресепсина, получаемое с использованием вышеуказанного антитела в образце, демонстрирует коэффициент корреляции 0,9 или больше со значением измерения, получаемым с использованием антитела S68 в образце.
21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с 20 выше, в котором коэффициент корреляции составляет 0,95 или больше.
22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 21 выше, в которых антитело связывается с rsCD14ST-Fc с аффинностью ниже чем 1,08E-08 (значение KD).
23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 22 выше, в котором активность связывания антитела с пресепсином демонстрирует улучшение доли концентрации пресепсина в 10000 раз или больше по сравнению с активностью связывания антитела против пресепсина, полученного у крысы, (F1146-17-2) с пресепсином.
24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 23 выше, в которых активность связывания (поглощение) антитела с sCD14ST-Fc, иммобилизованным на твердой фазе, демонстрирует активность, в 2 или более раз превышающую связывание антитела S68 с sCD14ST-Fc, иммобилизованным на твердой фазе.
25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 24 выше, в которых антитело или фрагмент представляет собой моноклональное антитело.
26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 25 выше, в которых антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab', F (ab')2, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V области (диатела), стабилизованной дисульфидными связями V области (dsFv), sc(Fv)2, полипептида, содержащего CDR, полипептида, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, и полипептида, содержащего вариабельную область легкой цепи.
27. Полинуклеотид, который кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше.
28. Рекомбинантный вектор, который содержит полинуклеотид в соответствии с 27 выше.
29. Трансформированный штамм, полученный посредством введения рекомбинантного вектора в соответствии с 28 выше в клетку-хозяина.
30. Трансформированный штамм в соответствии с 29 выше, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.
31. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента антитела, где способ включает культивирование трансформированного штамма в соответствии с 29 или 30 выше.
32. Набор для измерения пресепсина, где набор содержит по меньшей мере антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше.
33. Набор для обнаружения сепсиса или содействия обнаружению/диагностированию сепсиса, где набор содержит по меньшей мере антитело или фрагмент в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше.
34. Набор для измерения пресепсина в соответствии с 32 выше, где набор для измерения пресепсина используют для обнаружения или оценки по меньшей мере одного заболевания, выбранного из проведения различий между сепсисом и синдромом системной воспалительной реакции (SIRS), оценки риска для сепсиса определенной тяжести, прогностического предсказания сепсиса (предсказания смертности), оценки степени тяжести сепсиса, обнаружения инфекций операционного поля, обнаружения диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC), обнаружения инфекционного DIC, обнаружения заболевания сердца, обнаружения дыхательных инфекций, связанных с бактериальной инфекцией, обнаружения воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона, язвенного колита), обнаружения фебрильной нейтропении (FN), обнаружения гемофагоцитарного синдрома (HPS) и оценки функции фагоцитов.
35. Использование антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше в наборе для измерения пресепсина.
36. Способ измерения пресепсина, где способ включает стадию контакта по меньшей мере с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше и образцом, содержащим пресепсин.
37. Способ обнаружения сепсиса или содействия обнаружению/диагностированию сепсиса, который включает по меньшей мере стадии, как описано ниже:
1) стадия измерения концентрации пресепсина в образце от субъекта с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше, и
2) стадия определения того, представляет ли собой концентрация пресепсина, полученная в 1) выше, высокое значение по сравнению с пороговым значением или нет.
38. Способ обнаружения заболевания или содействия обнаружению/оценке заболевания, который включает по меньшей мере стадии, как описано ниже:
где обнаружение или оценка представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из проведения различий между сепсисом и синдромом системной воспалительной реакции (SIRS), оценки риска для сепсиса определенной тяжести, прогностического предсказания сепсиса (предсказания смертности), оценки степени тяжести сепсиса, обнаружения инфекций операционного поля, обнаружения диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC), обнаружения инфекционного DIC, обнаружения заболевания сердца, обнаружения дыхательных инфекций, связанных с бактериальной инфекцией, обнаружения воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона, язвенного колита), обнаружения фебрильной нейтропении (FN), обнаружения гемофагоцитарного синдрома (HPS) и оценки функции фагоцитов.
1) стадия измерения концентрации пресепсина в образце с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше, и
2) стадия определения того, представляет ли собой концентрация пресепсина, полученная в 1) выше, высокое значение по сравнению с пороговым значением или нет.
39. Способ скрининга антитела против пресепсина или антигенсвязывающего фрагмента антитела, где способ включает по меньшей мере стадии, как описано ниже:
1) стадия конструирования измерительной системы для пресепсина с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела из кандидата; и
2) стадия определения влияния концентрации TG в образце на значение измерения пресепсина с использованием измерительной системы.
40. Способ скрининга антитела против пресепсина или антигенсвязывающего фрагмента антитела, где способ включает по меньшей мере стадии, как описано ниже:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина или антигенсвязывающего фрагмента-кандидата антитела, и
2) стадия отбора антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, на которой связывание между антителом и пресепсином конкурентно ингибируют на 50% или больше в реакционной системе, в которой последовательность аминокислотных остатков, состоящую из SEQ ID № 1, подвергают конкурентной реакции с тем, чтобы ингибировать связывание между указанным антителом и пресепсином.
41. Способ скрининга антитела против пресепсина или антигенсвязывающего фрагмента антитела, где способ включает по меньшей мере стадии, как описано ниже:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина или антигенсвязывающего фрагмента-кандидата антитела, и
2) стадия отбора антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, который специфично распознает аминокислотную последовательность SEQ ID № 1 в пресепсине в качестве эпитопа.
42. Способ лечения сепсиса, который включает выполнение лечения сепсиса у субъекта, который был субъектом для обнаружения сепсиса или содействия обнаружению или диагностированию сепсиса посредством определения концентрации пресепсина в образце от субъекта с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше.
43. Способ скрининга тестового лекарственного средства, который включает стадию определения концентрации пресепсина в образце от субъекта, которому вводили тестовое лекарственное средство, с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с любым одним из с 1 до 26 выше.
44. rsCD14ST-Fc, который содержит последовательность от положения 1 до положения 64 в SEQ ID № 3 (полноразмерный растворимый CD14 человека) и Fc-область тяжелой цепи антитела.
45. rsCD14ST-Fc в соответствии с 44 выше, в котором последовательность, облегчающую разрезание, вставляют между последовательностью от положения 1 до положения 64 в SEQ ID № 3 (полноразмерный растворимый CD14 человека) и Fc-областью тяжелой цепи антитела.
46. rsCD14ST-Fc в соответствии с 45 выше, в котором последовательность, облегчающая разрезание, представляет собой последовательность распознавания тромбина.
47. rsCD14ST-Fc в соответствии с любым одним из с 44 до 46 выше, в котором Fc-область тяжелой цепи антитела представляет собой Fc-область тяжелой цепи антитела IgGI, полученного у человека.
48. Способ получения rsCD14ST-Fc, который включает стадию введения вектора, который содержит последовательность от положения 1 до положения 64 в SEQ ID № 3 (полноразмерный растворимый CD14 человека) и последовательность Fc-области тяжелой цепи антитела, в клетку-хозяина и культивирование клетки-хозяина.
49. Способ получения rsCD14-ST, который включает стадию разрезания Fc-области из rsCD14ST-Fc в соответствии с 48 выше.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0022] В соответствии с настоящим изобретением, предоставлены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые обладают превосходной реактивностью с пресепсином и подходят для измерения пресепсина в образце, посредством чего можно достичь повышения качества и точности измерения пресепсина. Настоящее изобретение предусматривает способность предоставлять антитела, которые обладают высокой аффинностью к пресепсину, которые также можно адаптировать к количественному определению незначительного количества пресепсина на уровне нормального человека, и делает возможным повышение чувствительности. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способность предоставлять антитело, которое препятствует влиянию мешающего вещества в образце, что делает возможным измерение в системе сэндвич-ELISA для того, чтобы избегать влияния индивидуального отличия (фонового фактора субъекта) образца сыворотки и проводить измерения с высокой воспроизводимостью. Такие измерения, обладающие высокой специфичностью, возможны только при использовании антитела, которое специфически связывается только с пресепсином, и не связывается специфично с sCD14 с высокой молекулярной массой, в системе сэндвич-ELISA.
[0023] Можно решить проблемы, касающиеся измерения пресепсина с использованием поликлональных антител (в том числе, обеспечение однородности между партиями, сложность производства, стоимость и т. п.), посредством чего можно предоставлять антитело, которое обладает превосходной практичностью. Другими словами, моноклональное антитело имеет такое преимущество, что его можно получать при низкой стоимости, стабильно и эффективно, а также можно поддерживать однородное качество такого антитела.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0024] На фиг. 1 представлены результаты из серии тестов на мешающее действие TG в сыворотке крови нормального человека с использованием антитела F1466-26 (A), F1466-5 (B) и F1466-19 (C).
На фиг. 2 представлен список вариантов, полученных в примере 8 и примере 12.
На фиг. 2-1 представлен список вариантов, полученных в примере 8 и примере 12, который продолжен с фиг. 2.
На фиг. 2-2 представлен список вариантов, полученных в примере 8 и примере 12, который продолжен с фиг. 2-1.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0025] Далее в данном документе настоящее изобретение описано более подробно.
[0026] 1. Антитело против пресепсина или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или фрагмент специфично распознает эпитоп, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу против пресепсина или его антигенсвязывающему фрагменту антитела, где антитело или фрагмент специфично распознает аминокислотную последовательность SEQ ID № 1 в качестве нового эпитопа пресепсина.
[0027] Выражение «специфично распознает эпитоп, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1» указывает на то, что антитело специфично распознает, в качестве эпитопа, последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, среди последовательностей пресепсина.
[0028] Как используют в настоящем документе, фраза «антигенсвязывающий фрагмент антитела» указывает, среди частичных фрагментов антитела, специфично распознающего эпитоп, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, фрагмент, который имеет такое же свойство связывания антигена, что и исходное антитело.
[0029] Как используют в настоящем документе, «идентичность последовательностей» или «гомология последовательностей» относится к связи между двумя или более полинуклеотидными последовательностями или аминокислотными последовательностями, а именно эталонной последовательностью и заданной последовательностью, подлежащей сравнению с эталонной последовательностью. Идентичность последовательностей или гомологию определяют посредством сравнения заданной последовательности с эталонной последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей, чтобы получить наибольшую степень сходства последовательностей, как определяют по совпадению между строками таких последовательностей. При таком выравнивании идентичность последовательностей определяют от положения к положению, например, последовательности являются «идентичными» в конкретном положении, если в этом положении нуклеотиды или остатки идентичны. Затем общее число таких идентичных положений делят на общее число нуклеотидов или остатков в эталонной последовательности, чтобы получать % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей можно легко вычислять известными способами, включая в качестве неограничивающих примеров те, которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, part I, GrifEn A. M., and GrifEn H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. and Devereux J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); и Carillo H., and Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Предпочтительные способы определения идентичности последовательностей разработаны так, чтобы давать наибольшее совпадение между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности последовательностей закодированы в общедоступных компьютерных программах, которые определяют идентичность последовательностей между заданными последовательностями. Примеры таких программ включают, но не ограничиваясь этим, пакет GCG программ (Devereux et al., Nuc. Ac. Res., 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al, J. Molec. Biol, 215:403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна в NCBI и других источниках.
[0030] Способ определения эпитопа конкретно не ограничен в настоящем изобретении, например, определение можно выполнять с помощью способа, описанного в примере 6.
[0031] Антитело по настоящему изобретению может отличаться конкурентным ингибированием 50% или больше для связывания между антителом и пресепсином в соответствии с реакционной системой (предпочтительно, с использованием поглощения), в которой пептид P03 (аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 1) используют для конкурентной реакции для того, чтобы ингибировать связывание между антителом и пресепсином. Предпочтительно, реакционная система представляет собой сэндвич-ELISA. Более предпочтительно, реакционная система представляет собой сэндвич-ELISA с использованием (a) антитела или фрагмента по настоящему изобретению и (b) антитела F1106-13-3 или антитела F1031-8-3. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 1, соответствует от положения 52 до положения 61 аминокислотной последовательности (SEQ ID № 3) полноразмерного растворимого CD14 человека. Предпочтительно, конкурентное ингибирование для связывания между антителом по настоящему изобретению и пресепсином составляет меньше чем 20% с помощью пептида P01 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 46 до положения 55 в SEQ ID № 3), пептида P02 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 49 до положения 58 в той же последовательности), пептида P05 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 58 до положения 67 в той же последовательности), пептида P06 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 61 до положения 70 в той же последовательности), пептида P07 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 64 до положения 73 в той же последовательности) или пептида P08 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 67 до положения 76 в той же последовательности). Предпочтительно конкурентное ингибирование для связывания между антителом по настоящему изобретению и пресепсином составляет меньше чем 20% с помощью пептида P04 (аминокислотная последовательность, представленная от положения 55 до положения 64 в SEQ ID № 3).
[0032] Альтернативно, в качестве одного из других способов определения эпитопа также возможно наблюдать активность связывания между частичной последовательностью (например, пептидом P03) целевого антигена и антителом, как описано, например, в примере 9-(4).
[0033] Один из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривает антитело против пресепсина, которое связывается с последовательностью, в которой заменяют одну или несколько аминокислот, отличных от аспарагиновой кислоты в положении 8 в последовательности P03 (SEQ ID № 1). Число заменяемых аминокислот предпочтительно составляет две или меньше аминокислот и более предпочтительно одну аминокислоту.
[0034] Например, в одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает антитело против пресепсина, которое связывает P03 или аминокислотную последовательность с 90% идентичностью последовательностей или более. Целевой эпитоп может обладать 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью последовательностей с P03. В некоторых вариантах осуществления антитело против пресепсина, специфичное к последовательности, обладающей 90% идентичность последовательностей или больше с P03, может представлять собой моноклональное антитело.
[0035] Антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое специфично распознает пресепсин. Пресепсин (sCD14-ST) представляет собой растворимый фрагмент CD14 и обозначает вещество, которое обладает следующими свойствами с 1) до 3).
- Молекулярная масса 13±2 кДа в соответствии с SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях,
- Он имеет аминокислотную последовательность от положения 1 до положения 11 из SEQ ID № 3 в N-концевой последовательности, и
- Он специфически связывается с антителом, полученным с использованием пептида, состоящего из 16 аминокислотных остатков, описанных в в SEQ ID № 2 для антигена.
Как используют в настоящем документе, пресепсин обозначает пресепсин человека, пока конкретно не проиллюстрировано иное.
[0036] Кроме того, в настоящем изобретении пресепсин может представлять собой вещество, обладающее активностью пресепсина, такое как не только стандартный пресепсин (rsCD14-ST, описанный в примере 16 из WO 2005/108429), но также rsCD14ST-Fc (как описано в примере 9-(2) далее), и т. п.
-7
[0037] Как описано в настоящем документе, «антитело специфично распознает» обозначает антитело, которое иммунологически распознает субъект для специфичного распознавания, и/или антитело, которое демонстрирует типичную реакцию антиген-антитело с субъектом для специфичного распознавания. Когда связывание между антителом и субъектом для специфичного распознавания выражают с помощью аффинности, равновесная константа диссоциации (KD) в целом составляет меньше чем 10 M. Антитело по настоящему изобретению специфично распознает только пресепсин. Основной растворимый CD14, присутствующий в крови человека, представляет собой растворимый CD14 приблизительно 55 кДа и приблизительно 49 кДа (sCD14 с высокой молекулярной массой). Антитело по настоящему изобретению не связывается специфично с sCD14 с высокой молекулярной массой. Что касается sCD14 с высокой молекулярной массой, можно использовать полноразмерный CD14 человека, состоящий из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID № 3, или его можно получать посредством адсорбции на аффинной колонке с использованием антитела 3C10, например, из текучего вещества организма нормального человека (см. пример 23 из WO 2005/108429).
[0038] В одном из аспектов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению обладает превосходной реактивностью к пресепсину и, следовательно, его можно использовать для измерения пресепсина в образце. Например, пресепсин в образце можно измерять посредством создания системы сэндвич-ELISA с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению.
[0039] По сравнению с F1146-17-2 (моноклональное антитело, полученное у крысы, которое описано в примере 2 из WO 2004/044005), антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению является более подходящим для обнаружения пресепсина, присутствующего в следовом количестве в образце, ввиду того факта, что в системе сэндвич-ELISA реактивность к пресепсину увеличена приблизительно в 10000 раз (пример 4). Другими словами, по сравнению с F1146-17-2, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может отличаться наличием реактивности к пресепсину, которая увеличена в 10000 раз или больше в отношении доли концентрации пресепсина.
[0040] Сообщалось о том, что у пациентов с сепсисом концентрация пресепсина в крови характеристически повышена. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению желательно используют для обнаружения сепсиса. Антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент антитела предпочтительно представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, для которого видно разницу в значении измерения пресепсина, когда конструируют сэндвич-ELISA с использованием данного антитела и измеряют образец пациента с сепсисом и образец нормального человека, как показано в примере 1.
[0041] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению подходящим образом представляет собой антитело, которое не имеет проблемы влияния мешающего вещества в образце, когда измерение пресепсина в образце осуществляют посредством создания измерительной системы.
[0042] В настоящем изобретении мешающее вещество обозначает вещество, присутствие которого потенциально имеет влияние на значение измерения пресепсина (ниже в настоящем документе также обозначаемого как «мешающее»). Его примеры включают триглицерид (также обозначаемый как TG), билирубин, гемоглобин, ревматоидный фактор и холестерин. В настоящем изобретении, предпочтительное мешающее вещество для оценки антитела представляет собой триглицериды (TG).
[0043] В качестве одного индикатора оценки для теста на мешающее действие отклонение значения измерения пресепсина в момент добавления определенного количества мешающего вещества в образец от значения измерения пресепсина в том же образце без добавления какого-либо мешающего вещества можно выражать в виде степени расхождения (%). Кроме того, степень расхождения (%) можно использовать в качестве индикатора оценки для теста на мешающее действие. Степень расхождения значения измерения в соответствии с добавлением мешающего вещества выражают следующим образом:
Степень расхождения (%)={(значение измерения пресепсина после добавления мешающего вещества)-(значение измерения пресепсина без добавления мешающего вещества)}/(значение измерения пресепсина без добавления мешающего вещества)×100.
[0044] Как используют в настоящем документе, выражение «не имеет проблемы влияния мешающего вещества» можно описать следующим образом: в тесте на мешающее действие с использованием множества образцов, например, доля образца, демонстрирующая степень расхождения±20% или меньше и более предпочтительно±10% или меньше, высока, где степень расхождения показывает значение, получаемое при измерении пресепсина в соответствии с добавлением определенного количества мешающего вещества. Выражение «доля образца высока» во множестве образцов в целом обозначает 50% или больше, предпочтительно 60% или больше, более предпочтительно 70% или больше, даже более предпочтительно 80% или больше и особенно предпочтительно 90% или больше от множества образцов.
[0045] В отношении теста на мешающее действие TG, например, возможно, что тест на мешающее действие осуществляют для множества образцов и то, что имеет высокую долю образца, которая демонстрирует степень расхождения значения измерения пресепсина±20% или меньше и более предпочтительно±10% или меньше, когда концентрация TG составляет 20 мг/мл в образце за счет добавления TG, используют в качестве одного индикатора. Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения состоит в том, что когда тест на мешающее действие TG осуществляют с использованием измерительной системы, использующей антитело по настоящему изобретению, в которой антитело демонстрирует высокую долю образца, в котором степень расхождения значения измерения пресепсина составляет±20% или меньше и более предпочтительно±10% или меньше, когда концентрация TG составляет 20 мг/мл.
[0046] Альтернативно, например, степень расхождения значения измерения пресепсина когда концентрация TG в образце составляет 20 мг/мл, можно получать в множестве образцов, и ее можно использовать в качестве одного показателя, при котором усредненная степень расхождения составляет±20% или меньше и более предпочтительно±10% или меньше. Один из предпочтительных вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению представляет собой антитело, у которого усредненная степень расхождения значения измерения пресепсина при концентрации TG в образце 20 мг/мл составляет±20% или меньше и более предпочтительно±10% или меньше, когда тест на мешающее действие TG в отношении множества образцов осуществляют с помощью измерительной системы с использованием антитела.
[0047] В NCEP-ATPIII, которое представляет собой руководство по дислипидемии в США, описано, что меньше чем TG150 мг/дл составляет норму, TG150 до 200 мг/дл составляет пограничное значение, TG200 до 499 мг/дл составляет высокое значение (высокое) и 500 мг/дл или больше составляет чрезвычайно высокое значение (очень высокое). Можно сказать, что концентрация TG 20 мг/мл (=2000 мг/дл) в образце может быть при состоянии, когда концентрация TG крайне высока в свете указанного выше стандарта.
[0048] В тесте на мешающее действие TG из данного примера степень расхождения значения измерения пресепсина измеряют в трех точках концентрации TG в образце 6,7 мг/мл, 13,3 мг/мл и 20 мг/мл. Наблюдали такую тенденцию, что степень расхождения также мала при концентрации TG в образце 6,7 мг/мл и 13,3 мг/мл для антитела, у которого степень расхождения мала при концентрации TG в образце 20 мг/мл (измерительная система), по сравнению с антителом, у которого степень расхождения велика.
[0049] Тест на мешающее действие TG можно осуществлять с использованием сыворотки нормального человека. Поскольку образец от нормального человека (т. е. человека без сепсиса) имеет низкую концентрацию пресепсина, когда он подвергается мешающему действию TG, степень расхождения значения измерения легко становится большой. Если с помощью данного теста можно измерять незначительное количество пресепсина в образце, это показывает, что тест имеет хорошую воспроизводимость. Например, степень расхождения значения измерения пресепсина при концентрации TG в образце предпочтительно составляет±100% или меньше, более предпочтительно±70% или меньше, более предпочтительно±50% или меньше и особенно предпочтительно±20% или меньше. Желательно осуществлять тест с использованием множества образцов, как в указанном выше тесте.
[0050] Кроме того, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению также можно оценивать на основании сравнения между степенью расхождения значения измерения пресепсина, получаемого посредством добавления мешающего вещества, для антитела и степенью расхождения антитела S68 в тех же условиях. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антитело по настоящему изобретению и антитело S68 демонстрируют схожие степени расхождения.
[0051] По отношению к тесту на мешающее действие TG, оценку также можно создавать, имея высокую долю образца, который демонстрирует 20% или меньше и более предпочтительно 10% или меньше разницы между степенью расхождения значения измерения пресепсина, когда концентрация TG составляет 20 мг/мл в образце в соответствии с добавлением TG в измерительную систему с использованием антитела по настоящему изобретению, и степенью расхождения антитела S68 в тех же условиях. В отношении разницы в степени расхождения, например, когда степень расхождения значения измерения, получаемого для антитела по настоящему изобретению, составляет +5%, а степень расхождения значения измерения, получаемого для антитела S68 составляет -10%, вычисление разности в степени расхождения дает 15%.
[0052] В качестве образца, используемого в тесте на мешающее действие, можно использовать образцы, описанные во втором варианте осуществления настоящего изобретения. В случае теста на мешающее действие TG, образец предпочтительно представляет собой сыворотку или плазму.
[0053] В отношении антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению, антитело, проявляющее хорошую корреляцию со значением измерения, получаемым с использованием антитела S68, является предпочтительным, когда пресепсин в образце измеряют посредством создания измерительной системы. «Хорошая корреляция» обозначает, что коэффициент корреляции предпочтительно составляет 0,9 или больше и более предпочтительно 0,95 или больше.
-7
-8
-9
-10
-11
-7
-14
-8
-13
[0054] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может специфично связываться с пресепсином и аффинность к пресепсину (равновесная константа диссоциации, значение KD) предпочтительно составляет меньше чем 10 M, более предпочтительно меньше чем 10 M, даже более предпочтительно меньше чем 10 M, особенно предпочтительно меньше чем 10 M и наиболее предпочтительно меньше чем 10 M. Равновесная константа диссоциации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению для пресепсина предпочтительно находится в диапазоне от 10 M до 10 M, более предпочтительно в диапазоне от 10 M до 10 M. В качестве пресепсина можно использовать rsCD14ST-Fc.
[0055] Аффинность (равновесная константа диссоциации, значение KD) можно измерять с использованием, например, BIACORE (GE Healthcare).
[0056] В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения аффинность (значение KD) для пресепсина у антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента антитела является превосходной по сравнению с аффинностью к пресепсину у антитела S68. Желательно, чтобы аффинность (значение KD) для rsCD14ST-Fc (описан в Пресепсин: пример 9-(2)) у антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента антитела демонстрировала числовое значение на том же уровне или ниже чем 1,08E-08 аффинность (значение KD) для rsCD14ST-Fc для антитела S68, и желательно, чтобы аффинность демонстрировала предпочтительно 1/2 значения KD для антитела S68 (5,40E-09) или меньше и более предпочтительно 1/10 значения KD для антитела S68 (1,08E-09) или меньше.
[0057] Один из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой превосходную активность связывания антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента антитела с пресепсином в сравнении с антителом S68.
[0058] Например, rsCD14ST-Fc (пресепсин) фиксируют на твердой фазе и проводят реакцию с антителом, а активность связывания антитела с пресепсином можно оценивать посредством поглощения или тому подобного, как описано в примере 10-(2).
[0059] Когда тест осуществляют согласно примеру 10 и поглощение в реакции антитела S68 и rsCD14ST-Fc определяют как равное 1, коэффициент поглощения, когда проводят реакцию антитела по настоящему изобретению и rsCD14ST-Fc, предпочтительно составляет 1 или больше, более предпочтительно 2 или больше, более предпочтительно 4 или больше и особенно предпочтительно 5,5 или больше.
[0060] Настоящее изобретение предусматривает антитело, описанное любым из следующих путей.
Эти антитела представляют собой антитела против пресепсина. Поскольку следующее антитело по (a), (b) или (c) и его антигенсвязывающий фрагмент антитела специфично распознают эпитоп, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, присутствующей в пресепсине, они являются предпочтительными примерами первого варианта осуществления. Более предпочтительным является антитело по (a) или (b) или его антигенсвязывающий фрагмент антитела.
(a) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, который содержит VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 4, CDR2 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 5, и CDR3 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 6, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 19, CDR2 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 20, и CDR3 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 21;
(b) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, который содержит VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 8, и CDR3 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 9, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 22, CDR2 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 23, и CDR3 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 24; или
(c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, который содержит VH, содержащую CDR1 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10, CDR2 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 11, и CDR3 VH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 12, и VL, содержащую CDR1 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 25, CDR2 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 26, и CDR3 VL, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID № 27.
[0061] Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту антитела, который содержит аминокислотную последовательность области CDR, описанную на фиг. с 2 до 2-2. Эти антитела также специфично распознают эпитоп, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, представленной в пресепсине. Более предпочтительным является антитело, которое содержит аминокислотную последовательность CDR 5793, 5810, 5864, 5979, 5983, 5988 или 6028, или его антигенсвязывающий фрагмент антитела.
[0062] Настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий CDR, описанную в любом из следующего. Более предпочтительным является полипептид по (i), (ii), (iv) или (v).
(i) полипептид, содержащий CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 4, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 5, и CDR3 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 6
(ii) полипептид, содержащий CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 8, и CDR3 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 9
(iii) полипептид, содержащий CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 10, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 11, и CDR3 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 12
(iv) полипептид, содержащий CDR1 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 19, CDR2 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 20, и CDR3 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 21
(v) полипептид, содержащий CDR1 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 22, CDR2 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 23, и CDR3 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 24
(vi) полипептид, содержащий CDR1 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 25, CDR2 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 26, и CDR3 VL, состоящую из последовательности SEQ ID № 27
[0063] Настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий CDR1 VH, CDR2 VH, и CDR3 VH, состоящие из каждой аминокислотной последовательности, описанной на фиг. с 2 до 2-2. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий CDR1 VL, CDR2 VL, и CDR3 VL, состоящие из каждой аминокислотной последовательности, описанной на фиг. с 2 до 2-2. Более предпочтительным является полипептид, содержащий CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 8, и CDR3 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 94 (5793), или полипептид, содержащий CDR1 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 7, CDR2 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 97, и CDR3 VH, состоящую из последовательности SEQ ID № 9 (5810).
[0064] Настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий вариабельную область, описанную в любом из следующего. Более предпочтительным является полипептид по (i), (ii), (iv) или (v).
(i) вариабельная область тяжелой цепи (VH), которая содержит CDR1, состоящую из последовательности SEQ ID № 4, CDR2, состоящую из последовательности SEQ ID № 5, CDR3, состоящую из последовательности SEQ ID № 6
(ii) VH, которая содержит CDR1, состоящую из последовательности SEQ ID № 7, CDR2, состоящую из последовательности SEQ ID № 8, CDR3, состоящую из последовательности SEQ ID № 9
(iii) VH, которая содержит CDR1, состоящую из последовательности SEQ ID № 10, CDR2, состоящую из последовательности SEQ ID № 11, CDR3, состоящую из последовательности SEQ ID № 12
(iv) вариабельная область легкой цепи (VL), которая содержит CDR1, состоящую из последовательности SEQ ID № 19, CDR2, состоящую из последовательности SEQ ID № 20, CDR3, состоящую из последовательности SEQ ID № 21
(v) VL, которая содержит CDR1, состоящую из последовательности SEQ ID № 22, CDR2, состоящую из последовательности SEQ ID № 23, CDR3, состоящую из последовательности SEQ ID № 24
(vi) VL, которая содержит CDR1, состоящую из последовательности SEQ ID № 25, CDR2, состоящую из последовательности SEQ ID № 26, CDR3, состоящую из последовательности SEQ ID № 27
[0065] Настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий VH, которая содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, состоящие из каждой аминокислотной последовательности, описанной на фиг. с 2 до 2-2.
Настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий VL, которая содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, состоящие из каждой аминокислотной последовательности, описанной на фиг. с 2 до 2-2.
[0066] В настоящем изобретении полипептид предпочтительно представляет собой антигенсвязывающее вещество, которое обладает активностью связывания с пресепсином.
[0067] Вышеуказанное антитело или полипептид может содержать замену, делецию, добавление и/или инсерцию (называемые заменой или тому подобным) одной или нескольких аминокислот в последовательности CDR. Антитело или полипептид после замены или тому подобного одной или нескольких аминокислот предпочтительно имеет ту же активность или эффективность, что и перед выполнением замены или тому подобного, в отношении активности связывания с антигеном, характеристик во время измерения пресепсина или тому подобного. Как описано в настоящем документе, антитело или полипептид после замены или тому подобного, который имеет ту же или более хорошую активность или эффективность, что и перед выполнением замены или тому подобного, включает как вариант, полученный посредством искусственной модификации на основании известного способа генетической инженерии, так и вариант, возникающий естественным путем (так называемый аллельный вариант). Число замен аминокислот конкретно не ограничено, и замена может включать 1 или больше. Однако предпочтительны три аминокислоты или меньше, более предпочтительно две аминокислоты или меньше и даже более предпочтительна одна аминокислота в одном CDR. В одном из вариантов осуществления антитело или полипептид по настоящему изобретению может иметь аминокислотную последовательность CDR с 90% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью CDR, обозначенной с помощью SEQ ID №, как описано выше. Идентичность последовательностей может составлять 92% или более, 95% или более, 97% или более или 99% или более. Такое антитело или полипептид предпочтительно обладает тем же уровнем активности или эффективности, что и антитело или полипептид, обозначенный с помощью SEQ ID №.
[0068] Каркасную область (FR) антитела, подлежащую соединению с CDR, выбирают так, что CDR образуют хороший антигенсвязывающий участок. FR, используемая для вариабельной области по настоящему изобретению, конкретно не ограничена и можно использовать любые FR. В случае необходимости, одну или несколько аминокислоты в FR можно заменять, удалять, добавлять и/или вставлять с тем, чтобы CDR могли формировать подходящий антигенсвязывающий участок. Например, в соответствии с измерением и оценкой активности связывания антитела, в котором используют FR с замененной аминокислотой, с антигеном, также можно выбирать вариант последовательности FR, имеющий желаемое свойство. В одном из вариантов осуществления FR может представлять собой аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность 80% или более с последовательностью, обозначаемой с помощью SEQ ID №. Идентичность последовательностей может составлять 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более или 99% или более. Например, в соответствии с измерением и оценкой активности связывания антитела, в котором используют FR с замененной аминокислотой, с антигеном, также можно выбирать вариант последовательности FR, обладающий желаемым свойством.
[0069] Например, общеизвестную FR, которую можно получать из базы данных (например, GenBank), FR антитела, полученного в настоящем изобретении, или тому подобное можно использовать в качестве каркасной области. (например, AAO06511.1, AAT02391.1, AAG13973.1 и AGT29816.1 приведены в качестве примера аминокислотной последовательности. AY596429.1, AY171772.1, KC020056.1 и AF294966.1 приведены в качестве примера полинуклеотидной последовательности.) SEQ ID №№ с 48 до 84 пригодны для использования в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения. Они представляют собой FR, которые можно получать из базы данных, или FR из антитела, полученного в настоящем изобретении. Каркасные области можно получать у различных животных, несмотря на то, что в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительно используют кролика. Предпочтительные FR области антител по настоящему изобретению включают те, которые представлены в SEQ ID №№ 64-84, или более предпочтительно SEQ ID №№ 65, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 83 или 84.
[0070] В одном из вариантов осуществления предпочтительные примеры вариабельных областей антитела по настоящему изобретению представляют собой следующее.
(1) (i) VH, которая содержит CDR VH из варианта, описанного на фиг. с 2 до 2-2 (например, CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из антитела 5810) и FR из последовательности SEQ ID № 64, SEQ ID № 67, SEQ ID № 70 и SEQ ID № 73; и
(ii) VL, которая содержит CDR VL из варианта, описанного на фиг. с 2 до 2-2 (например, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из антитела 5810) и FR из последовательности SEQ ID № 74, SEQ ID № 77, SEQ ID № 80 и SEQ ID № 84.
(2) (i) VH, которая содержит CDR VH из F1466-5, F1466-26 или F1466-16 (например, CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из F1466-26) и FR из последовательности SEQ ID № 64, SEQ ID № 67, SEQ ID № 70 и SEQ ID № 73; и
(ii) VL, которая содержит CDR VL из F1466-5, F1466-26 или F1466-16 (например, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из F1466-26) и FR из последовательности SEQ ID № 74, SEQ ID № 77, SEQ ID № 80 и SEQ ID № 84.
(3) (i) VH, которая содержит CDR VH из варианта, описанного на фиг. с 2 до 2-2 (например, CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из антитела 5810) и FR из последовательности SEQ ID № 65 (или 66), SEQ ID № 68 (или 69), SEQ ID № 71 (или 72) и SEQ ID № 73; и
(ii) VL, которая содержит CDR VL из варианта, описанного на фиг. с 2 до 2-2 (например, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из антитела 5810) и FR из последовательности SEQ ID № 75 (или 76), SEQ ID № 78 (или 79), SEQ ID № 81 (или 82 или 83) и SEQ ID № 84.
(4) (i) VH, которая содержит CDR VH из F1466-5, F1466-26 или F1466-16 (например, CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH из F1466-26) и FR из последовательности SEQ ID № 65 (или 66), SEQ ID № 68 (или 69), SEQ ID № 71 (или 72) и SEQ ID № 73; и
(ii) VL, которая содержит CDR VL из F1466-5, F1466-26 или F1466-16 (например, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL из антитела 5810) и FR из последовательности SEQ ID № 75 (или 76), SEQ ID № 78 (или 79), SEQ ID № 81 (или 82 или 83) и SEQ ID № 84.
[0071] В вариабельной области одну или несколько аминокислот (например, пять или меньше аминокислот, и предпочтительно три или меньше аминокислот) можно заменять, удалять, добавлять и/или вставлять. Антитело или полипептид после замены или тому подобного одной или нескольких аминокислот предпочтительно имеет ту же активность или эффективность, что и перед выполнением замены или тому подобного, в отношении активности связывания с антигеном, характеристик во время измерения пресепсина или тому подобного. В одном из вариантов осуществления, когда вариабельную область точно определяет последовательность, как описано выше, вариабельная область может иметь аминокислотную последовательность 80% идентичностью или более с последовательностью, обозначенной с помощью аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID №. Идентичность последовательностей может составлять 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более или 99% или более. Такая вариабельная область предпочтительно имеет тот же уровень активности или эффективности, что и вариабельная область, обозначенная с помощью аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID №.
[0072] Константная область, используемая для антитела по настоящему изобретению конкретно не ограничена, и можно использовать любую константную область. Предпочтительные примеры константной области, которую используют для антитела по настоящему изобретению, включают константную область IgG, полученную у мыши, крысы, кролика или человека. Константная область может иметь одну или несколько аминокислот, которые заменяют, удаляют, добавляют и/или вставляют в пределах диапазона, в котором они не изменяют активность связывания с антигеном, характеристики во время измерения пресепсина и т. п.
[0073] Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело, то есть, моноклональное антитело против пресепсина. Моноклональное антитело представляет собой антитело, секретируемое антителопродуцирующей клеткой из моноклона. По сравнению с поликлональным антителом, моноклональное антитело имеет такую характеристику, что можно получать антитело с высоким титром и гомогенной антигенной специфичностью или тому подобное. Теоретически, моноклональное антитело имеет такое преимущество, что оно имеет меньшую массу антитела, необходимую для измерения антигена, по сравнению с поликлональным антителом. Как описано в настоящем документе, термин «антитело» можно использовать в значении «антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела».
[0074] Моноклональное антитело по настоящему изобретению предпочтительно можно получать с использованием пептида S68, описанного в SEQ ID № 2, в качестве антигена для введения. Моноклональное антитело по настоящему изобретению можно получать, например, посредством иммунизации животного пептидом S68, получения гибридомы с использованием антителопродуцирующих клеток иммунизированного животного и миеломных клеток, отбора и культивирования гибридомы, полученной в виде одной клетки, и очистки культурального супернатанта.
[0075] Вид животного, у которого извлекают антитела, конкретно не ограничен и его примеры включают мышь, крысу, хомяка и кролика. Предпочтительно оно является кроликом. Другими словами, антитело по настоящему изобретению может представлять собой моноклональное антитело против пресепсина, полученное у кролика (также обозначают как моноклональное антитело кролика против пресепсина).
[0076] В качестве миеломных клеток можно использовать различные известные клетки. Их примеры включают SKO-007, полученные у человека, SHM-D33 гетеромиеломы человека-мыши, P3, NS-1, P3U1 и SP2/0, полученные у мыши, и YB2/0 и Y3-Ag1, 2, 3, полученные у крысы. Также можно использовать бессмертные B-лимфоциты или тому подобное, полученные у кролика.
[0077] В соответствии с настоящим изобретением, также предпочтительно получать гибридому кролик-кролик посредством слияния между клетками селезенки кролика и бессмертными B-лимфоцитами или тому подобным, полученными у кролика, или получать гибридому кролик-мышь посредством слияния с клетками, полученными у бессмертной клеточной линии мыши.
[0078] Слияние между антителопродуцирующими клетками и миеломными клетками можно осуществлять известным способом, и примеры средства, способствующего слиянию, которое можно использовать, включают полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай. В отношении культурального раствора, используемого для слияния клеток, можно использовать культуральный раствор RPMI1640, культуральный раствор MEM или тому подобное.
[0079] Гибридому, сформированную посредством слияния, культивируют в течение от нескольких суток до трех недель или около этого. Кроме того, используя селективную среду, такую как среда, которая содержит гипоксантин, тимидин и аминоптерин (среда HAT), например, слитные гибридомы можно отделять от неслитных клеток. Полученную гибридому дополнительно отбирают, основываясь на антителе, продуцируемом ей. В соответствии с препаратом отобранной гибридомы в виде отдельного клона в соответствии с известным предельным разведением, из нее получают устойчивую антителопродуцирующую гибридому.
[0080] Очистку антитела можно осуществлять известным способом, таким как ионообменная хроматография, аффинная хроматография (колонка с белком A, колонка с белком G или тому подобное), способ высаливания, преципитация спиртом, изоэлектрическое фокусирование, электрофорез, центрифуга или гель-фильтрация.
[0081] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению также можно получать способом генетической рекомбинации, который может использовать специалист в данной области. Например, на основании последовательности полученного антитела против пресепсина, полинуклеотид, кодирующий антитело или часть антитела получают и экспрессируют в подходящем организме-хозяине после введения в экспрессирующий вектор.
[0082] Получение полинуклеотида, кодирующего антитело или часть антитела, можно осуществлять, например, посредством экстрагирования мРНК из гибридомы, продуцирующей антитело по настоящему изобретению, и синтеза кДНК. Это можно осуществлять с использованием коммерчески доступного набора или тому подобного.
[0083] Альтернативно, антитело, в котором часть его последовательности изменяют, также можно получать на основании последовательности антитела против пресепсина, используя способ генной рекомбинации, который может использовать специалист в данной области. Вектор, содержащий целевую последовательность, можно получать и экспрессировать в подходящем организме-хозяине.
[0084] Вектор, используемый для настоящего изобретения, конкретно не ограничен. Однако, предпочтительно он представляет собой вектор и/или экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии гена антитела. Его примеры включают, но не ограничиваясь этим, вектор, который содержит промотор EF-1α и/или энхансер CMV.
[0085] Примеры вектора, который можно использовать, также включают, но не ограничиваясь этим, плазмиду, полученную у E. coli (например, pBR322, pBR325, pUC12 и pUC13), плазмиду, полученную у Bacillus subtilis (например, pUB110, pTP5 и pC194), плазмиду, полученную у дрожжей (например, pSH19 и pSH15), бактериофаг, такой как фаг λ и вирус такой как ретровирус, вирус осповакцины и бакуловирус.
[0086] Промотор, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой какой-либо промотор, который подходит для организма-хозяина, используемого для экспрессии гена. Например, когда организм-хозяин представляет собой клетку животного, можно использовать промотор, полученный у SV40, промотор ретровируса, промотор теплового шока, цитомегаловирусный промотор, промотор EF1α или тому подобное.
[0087] Если необходимо, вектор может содержать энхансер, сигнал сплайсинга, сигнал полиприсоединения, селективный маркер и точку начала репликации SV40.
[0088] Примеры селективного маркера, который можно использовать, включают, но не ограничиваясь этим, дегидрофолатредуктазу (dhfr), ген устойчивости к метотрексату (MTX) и ген устойчивости к ампициллину.
[0089] Клетка-хозяин, используемая для настоящего изобретения, конкретно не ограничена. Например, используют бактериальные клетки (E. coil или тому подобное), дрожжи, клетки амфибий (клетки ооцитов Xenopus laevis или тому подобное), насекомых или клетки насекомых (sf9 или тому подобное), клетки животных и т. п. Примеры клеток животных, которые можно использовать, включают клетки COS-1, клетки COS-7, клетки CHO, клетки CHO с дефицитом гена DHFR (клетки dhfr-CHO), клетки 3T3 мыши, клетки HEK293 человека и миеломные клетки.
[0090] Способ введения экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно осуществлять с помощью известного способа, и его примеры включают, но не ограничиваясь этим, способ липофекции, способ с фосфатом кальция, способ электропорации и способ микроинъекции.
[0091] После введения экспрессирующего вектора в клетку-хозяина, клетки культивируют в среде для культивирования, подходящей для каждой клетки-хозяина. Например, в случае клеток животного, можно использовать среду для культивирования клеток животного, такую как среда RPMI1640 и среда GIT, или те среды, в которые добавляют различные добавки, такие как FCS. Посредством культивирования полученных трансформированных клеток в среде, антитело можно экспрессировать и накапливать в культуральном супернатанте. Для очистки антитела в культуральном супернатанте можно использовать способ, описанный выше. Кроме того, количество экспрессии антитела и антигенную активность антитела можно измерять с помощью ELISA или тому подобного.
[0092] Антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент антитела можно создавать с помощью способа фагового дисплея. Получение антитела с помощью способа фагового дисплея можно осуществлять с помощью способа, который может использовать специалист в данной области. (см. CARLOS F. BARBAS et al., Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press) и т. д.) Например, ген получают из селезеночных лимфоцитов, полученных посредством иммунизации животного пептидом S68, и лигируют с фагмидным вектором или тому подобным и так далее, а после этого, осуществляют стандартный способ получения антитела.
[0093] Кроме того, чтобы получать измененное антитело, в котором изменяют только конкретную последовательность CDR (например, CDR3 VH), также возможно использовать способ фагового дисплея. Это также можно осуществлять с использованием способа, который может использовать специалист в данной области, применяя плазмиду, которая содержит тяжелую цепь и легкую цепь антитела в качестве матрицы и конкретные праймеры.
[0094] Примеры антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению включают Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечное антитело (scFv), димеризованную V область (диатело), стабилизованную дисульфидными связями V область (dsFv), sc(Fv)2 и полипептид, содержащий CDR, полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи. Любой из этих фрагментов антител обладает свойством связывания антигена, которое является таким же как у антитела по настоящему изобретению, для распознавания эпитопа, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1. Эти фрагменты антител можно получать с использованием способов генетической рекомбинации, известных специалисту в данной области.
[0095] Fab обозначает, среди фрагментов, полученных посредством обработки IgG протеазой папаин, фрагмент антитела, который обладает свойством связывания антигена, в котором приблизительно половина N-концевой стороны цепи H вся цепь L соединены через дисульфидную связь.
[0096] F(ab')2 обозначает, среди фрагментов, полученных посредством обработки IgG протеазой пепсин, то, что получают посредством соединения Fab с использованием дисульфидной связи шарнирной области.
[0097] Fab' обозначает фрагмент антитела, обладающий активностью связывания антигена, который получают посредством расщепления дисульфидной связи шарнирной области F(ab')2. Fab' можно получать посредством обработки F(ab')2 восстанавливающим реактивом дитиотреитол.
[0098] scFv представляет собой полипептид, в котором одну VH и одну VL соединяют друг с другом через подходящий пептидный линкер, и он представляет собой фрагмент антитела, который обладает активностью связывания антигена.
[0099] Диатело обозначает фрагмент антитела, который обладает двухвалентной активностью связывания антигена, как получают посредством димеризации scFv.
[00100] dsFv обозначает полипептид, который имеет замену одного аминокислотного остатка из каждой из VH и VL на остаток цистеина, которые соединяют через дисульфидную связь.
[00101] sc(Fv)2 обозначает антигенный фрагмент, полученный в виде одной цепи на основании соединения двух VH и двух VL через линкер или тому подобное. sc(Fv)2 можно получать, например, посредством соединения scFv через линкер.
[00102] В предпочтительных вариантах осуществления, полипептид, содержащий CDR, является таким же, как тот, что описан выше, и он представляет собой фрагмент, который обладает активностью связывания антигена. Пептид, содержащий несколько CDR, можно соединять непосредственно или через подходящий линкер.
[00103] Полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи, представляют собой то, что описано выше.
[00104] В настоящем изобретении в качестве линкера можно использовать любой пептидный линкер, который можно ввести посредством генетической инженерии. Линкер, предпочтительный в настоящем изобретении, представляет собой пептидный линкер. Длина пептидного линкера конкретно не ограничена, и ее можно подходящим образом выбирать в зависимости от цели. Однако в целом она составляет от 1 до 100 аминокислоты, предпочтительно от 3 до 50 аминокислот и более предпочтительно от 5 до 20 аминокислот. Когда соединяют четыре вариабельных области антитела, в целом необходимы три линкера. Множество линкеров может представлять собой одно и то же или можно использовать различные линкеры.
[00105] Антитело по настоящему изобретению включает химерное антитело и гуманизированное антитело. Химерное антитело представляет собой молекулу антителу, получаемую посредством объединения части молекул антител от двух или более различных видов. Химерное антитело, предпочтительное в настоящем изобретении, представляет собой антитело, которое имеет вариабельную область, полученную у моноклонального антитела кролика, и константную область от другого вида (например, человека); однако, в настоящем документе предусмотрены другие химерные комбинации, известные в данной области. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, полученное посредством пересадки CDR от являющихся человеком биологических видов в антитело человека. Химерные антитела и гуманизированные антитела можно получать с помощью основных способов, которые известны в данной области.
[00106] Настоящее изобретение содержит антитело, в которое один или несколько аминокислотных остатков добавляют в аминокислотную последовательность по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению также может содержать слитный белок, где антитело сливают с другим пептидом или полипептидом. Получение слитного белка можно осуществлять с использованием способа, известного специалисту в данной области. Например, после соединения полинуклеотида, кодирующего антитело по настоящему изобретению, с полинуклеотидом, кодирующим другой пептид или полипептид, так, что они имеют перекрывающуюся рамку, и введения его в экспрессирующий вектор, можно осуществлять экспрессию в клетке-хозяине. Другие пептиды или полипептиды, используемые для связывания с антителом по настоящему изобретению, конкретно не ограничены. Их примеры включают, но не ограничиваясь этим, FLAG, 6×His, состоящую из шести остатков His (гистидина), полигистидиновый сегмент, гемагглютинин гриппа (HA), метку T7, метку HSV, GST (глутатион-S-трансферазу), константную область иммуноглобулина (Fc-область), β-галактозидазу и мальтозусвязывающий белок.
[00107] 2. Способ измерения пресепсина
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения, это раскрытие предусматривает способ иммунологического измерения пресепсина с использованием по меньшей мере антитела или его антигенсвязывающего фрагмент антитела по настоящему изобретению, и он включает стадию контакта антитела или его антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с образцом, содержащим пресепсин. В настоящем изобретении, термин «измерять» можно использовать взаимозаменяемо с таким терминами, как «обнаруживать», «определять количество», «анализировать» или тому подобное, и его используют в значении, которое включает количественное и качественное определение. Измерение пресепсина предпочтительно осуществляют in vitro.
[00108] Поскольку пресепсин известен как маркер, используемый для обнаружения сепсиса, можно сказать, что приведенный выше способ представляет собой способ обнаружения сепсиса, который включает стадию контакта антитела или его антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с образцом, содержащим пресепсин.
[00109] Также можно сказать, что в другом аспекте настоящее изобретение представляет собой способ обнаружения сепсиса или способ содействия обнаружению сепсиса, который включает по меньшей мере 1) стадию измерения концентрация пресепсина в образце от субъекта с использованием антитела по настоящему изобретению, и 2) стадию определения того, представляет ли собой концентрация пресепсина высокое значение по сравнению с пороговым значением или нет. Пороговое значение может составлять от 314 до 600 пг/мл, предпочтительно от 400 до 580 пг/мл, более предпочтительно от 450 до 550 пг/мл и более предпочтительно 500 пг/мл.
[00110] Как используют в настоящем документе, «обнаружение заболевания» можно использовать взаимозаменяемо с «содействием обнаружению заболевания» или «содействием диагностированию заболевания».
[00111] Кроме того, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела можно использовать для обнаружения или оценки по меньшей мере одного заболевания, включая в качестве неограничивающих примеров, проведение различий между сепсисом и синдромом системной воспалительной реакции (SIRS), оценку риска для сепсиса определенной тяжести, прогностическое предсказание сепсиса (предсказание смертности), оценку степени тяжести сепсиса, обнаружение инфекций операционного поля, обнаружение диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC), обнаружение инфекционного DIC, обнаружение заболевания сердца, обнаружение дыхательных инфекций, связанных с бактериальной инфекцией, обнаружение воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона, язвенного колита), обнаружение фебрильной нейтропении (FN), обнаружение гемофагоцитарного синдрома (HPS) и оценку функции фагоцитов.
[00112] Термин «инфекция операционного поля», как используют в настоящем документе, обозначает инфекционные заболевания, которые возникают после хирургического вмешательства, и они включают все инфекции, обусловленные хирургическим вмешательством и дополнительной терапией, требуемой для него. Инфекции операционного поля включают все заболевания, диагностируемые в качестве инфекций операционного поля на основании Guideline for prevention of surgical site infection, 1999 (CDC).
[00113] Заболевание сердца включает, но не ограничиваясь этим, острый коронарный синдром (ACS), острую сердечную недостаточность, острую декомпенсированную сердечную недостаточность (ADHF), хроническую сердечная недостаточность, болезнь коронарных артерий, стенокардию, инфаркт миокарда, ишемический инсульт, геморрагический инсульт и транзиторную ишемическую атаку головного мозга и т. п.
[00114] Дыхательная инфекция, связанная с бактериальной инфекцией, может включать инфекции нижних дыхательных путей или пневмонию. Инфекции нижних дыхательных путей включают острые инфекции нижних дыхательных путей и хронические инфекции нижних дыхательных путей. Острые инфекции нижних дыхательных путей включают острый трахеит, острый бронхит и острый бронхиолит. Большинство из них развиваются посредством вирусных инфекций верхних дыхательных путей, которые распространяются в нижние дыхательные пути, и при некоторых из этих заболеваний также затем возникает вторичная бактериальная инфекция. Введение антибиотиков можно адаптировать, если наблюдают признаки бактериальной вторичной инфекции. Хроническая инфекция нижних дыхательных путей представляет собой патологическое состояние, при котором персистирующую бактериальную инфекцию находят в нижних дыхательных путях, имеющих органические нарушения, обусловленные бронхоэктазом или хроническим обструктивным заболеванием легких, и она включает персистирующую инфекцию и острый приступ. Заболевания, вызывающие органические нарушения в нижних дыхательных путях, включают бронхоэктаз, хроническое обструктивное заболевание легких, хронический бронхит, диффузный панбронхиолит, остаточный туберкулез легких, пневмокониоз, нетуберкулезные микобактериальные инфекции, аллергический бронхолегочный аспергиллез, фиброз легких, и хроническую бронхиальную астму. В обоих случаях персистирующей инфекции и острого приступа применяют введение антибиотиков. Пневмония включает внебольничную пневмонию и внутрибольничную пневмонию. Предпочтительно пневмония представляет собой внебольничную пневмонию.
[00115] Оценка функции фагоцитарных клеток обозначает (a) измерение фагоцитарной активности нейтрофилов, гранулоцитов и/или белых клеток крови, (b) оценку иммунной функции посредством измерения фагоцитарной активности нейтрофилов, гранулоцитов и/или белых клеток крови, (c) качественную оценку имплантируемых клеток при аутологической трансплантации клеток или аллогенной трансплантации клеток и (d) обнаружение заболеваний, связанных с фагоцитозом фагоцитарных клеток. Заболевания, связанные с фагоцитозом фагоцитарных клеток включают, например, аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит, мастит, подагру, гломерулонефрит, язвенный колит, средиземноморскую лихорадку, отит среднего уха, ринит, пневмонию, туберкулез, цистит, инфекционные заболевания амниотической жидкости и пиемию. Образец, используемый при обнаружении заболеваний, связанных с фагоцитозом фагоцитарных клеток представляет собой тканевое текучее вещество, лимфу, синовиальное текучее вещество, молоко, цереброспинальное текучее вещество, гной, слюну, слезы, слизь, отделяемое носа, мокроту, мочу, асцит, амниотическое текучее вещество, текучие вещества организма, такие как семя, а также смывное текучее вещество, полученное после промывания носовой полости, бронхов, легких, кожи, перитонеальной полости, различных органов, суставов, костей и т. п.
[00116] Примеры способа иммунологического измерения пресепсина с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению включают иммуноферментный анализ (ниже в настоящем документе также описанный как ELISA или EIA), хемилюминесцентный иммуноферментный анализ (CLEIA), хемилюминесцентный иммунологический анализ (CLIA), флуоресцентный тест на антитела (FAT), флуоресцентный иммуноферментный анализ (FEIA), электрохемилюминесцентный иммунологический анализ (ECLIA), радиоиммунный анализ (RIA), иммунохроматографию, способ агглютинации и конкурентный способ, но без ограничения этим. В настоящем изобретении можно использовать любые из прямого способа и непрямого способа. Также можно использовать способ сенсибилизации, включающий формирование и обнаружение биотин-авидинового (стрептавидинового) комплекса.
[00117] EIA представляет собой один из примеров иммунологического анализа с использованием антитела, меченного ферментом, и его примеры включают прямой способ и непрямой способ. Их предпочтительные примеры включают ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).
[00118] Сэндвич-ELISA представляет собой способ, в котором измерение осуществляют с использованием двух или более антител с различными участками распознавания антигена. Одно антитело предварительно иммобилизуют на твердой фазе и посредством формирования комплекса антитело-антиген-антитело с антигеном возможно обнаружение указанного антигена, который расположен между антителами двух типов.
[00119] Хемилюминесцентный иммуноферментный анализ (CLEIA) представляет собой способ, в котором антитело, иммобилизованное на магнитных частицах или гранулах, вступает в реакцию с антигеном в образце, после чего следует реакция с антителом, меченным ферментом, и промывание (разделение связанного/свободного), ферментативную реакцию осуществляют посредством добавления хемилюминесцентного субстрата и измеряют интенсивность люминесценции.
Например, возможно, что антитело, конъюгированное с биотином, вступает в реакцию с антигеном в образце в жидкой фазе, антитело захватывают с помощью магнитных частиц, связанных со стрептавидином, антитело, меченное ферментом, вступает в реакцию после промывания (разделения связанного/свободного) и осуществляют ту же обработку, что и выше.
TM
[00120] Когда в качестве метящего фермента используют щелочную фосфатазу (ALP), в качестве хемилюминесцентного субстрата предпочтительно использовать CDP-Star, AMPPD или CSPD. Когда метящим ферментом является HRP, в качестве хемилюминесцентного субстрата предпочтительно используют люминол.
[00121] В целом, полагают, что чувствительность обнаружения является высокой в порядке хемилюминесценция > флуоресценция > абсорбция (образование окраски), и способ измерения можно выбирать в зависимости от желаемой чувствительности.
[00122] Хемилюминесцентный иммунологический анализ (CLIA) представляет собой способ, в котором антитело, иммобилизованное на магнитных частицах, или тому подобное вступает в реакцию с антигеном в образце, антитело, меченное хемилюминесцентным субстратом, вступает в реакцию с ним, после чего следует промывание (разделение связанного/свободного) и измерение интенсивности люминесценции. В качестве метящего вещества используют акридиний или тому подобное.
[00123] Флуоресцентный иммуноферментный анализ (FEIA) представляет собой способ, в котором иммобилизованное антитело вступает в реакцию с антигеном в образце, после чего следует реакция с антителом, меченным ферментом, и промывание (разделение связанного/свободного), ферментативную реакцию осуществляют посредством добавления флуоресцентного субстрата, и измеряют интенсивность флуоресценции. В качестве метящего фермента используют HRP или ALP или тому подобное. Когда метящий фермент представляет собой HRP, в качестве флуоресцентного субстрата используют AmplexRed. Когда метящий фермент представляет собой ALP, предпочтительно используют 4-MUP (4-метилумбеллифенил фосфат), AttoPhos и т. п.
[00124] Электрохемилюминесцентный иммунологический анализ (ECLIA) представляет собой способ, в котором антитело, иммобилизованное на магнитных частицах, антиген в образце и антитело, меченное электрохемилюминесцентным вещестом, вступают в реакцию друг с другом, после чего следует промывание (разделение связанного/свободного) и измеряют интенсивность люминесценции, возникающей за счет электрической энергии. В качестве метящего вещества используют рутений или тому подобное. В качестве метящего вещества используют Ru(bpy)3 или тому подобное. В соответствии с окислением на основании зарядки на электроде и реакции восстановления трипропиламином (TPA), повторяют люминесценцию возбуждения.
125
125
[00125] Радиоиммунный анализ (RIA) представляет собой способ измерения, в котором используют метящее тело из радиоактивного изотопа. Например, посредством реакции антигена в образце и антитела, иммобилизованного на гранулах или тому подобном, и посредством их реакции с антителом, меченным радиоизотопом (I или тому подобное), после чего следует промывание (разделение связанного/свободного), можно измерять радиоактивность I.
[00126] Иммунохроматография представляет собой иммунологический способ измерения, в котором применяют капиллярный феномен, возникающий при миграции тестового материала наряду с растворением реактива на тестовой полоске. В частности, из трех веществ, то есть, антигена в образце, меченного антитела на тестовой полоске и захватывающегол нтитела, формируют иммунный комплекс и определяют цвет меченного продукта. Для мечения антитела используют коллоидное золото, фермент, флуоресцентное вещество или тому подобное. Когда используют антитело, меченное ферментом, образование окраски обусловлено нанесением субстрата фермента на тестовую полоску.
[00127] Проточный способ представляет собой способ, в котором антиген в качестве тестового вещества образует, с раствором в образце, комплекс антитело-антиген-антитело на мембране в качестве нерастворимой мембраны. В это время вещество, не иммобилизованное на мембране большей частью проходит в перпендикулярном направлении от поверхности к задней поверхности мембраны и его удаляют.
[00128] Способ агглютинации представляет собой способ, в котором антиген в образце вступает в реакцию с антителом в реактиве и наблюдают агглютинацию. Его примеры включают способ, в котором не используют твердую фазу, способ агглютинации частиц (PA), в котором искусственно полученные частицы используют в качестве твердой фазы, и способ латексной агглютинации (LA), в котором латексные частицы используют наряду с PA.
[00129] в соответствии с конкурентным способом, например, антитело связывается с твердой фазой и одновременно в реакцию вступает образец для теста и определенное количество меченного антигена и, таким образом, количество антигена в образце можно измерять по количеству связанного меченного продукта.
[00130] В одном из аспектов, антитело по настоящему изобретению можно использовать в любом из раскрытых выше способов обнаружения для использования в способе обнаружения пресепсина в образце или диагностирования индивидуума, у которого подозревают сепсис.
Образец, используемый для измерения пресепсина, конкретно не ограничен. Однако предпочтительно он представляет собой водный образец. Его примеры включают текучее вещество организма, такое как кровь (цельная кровь, плазма, сыворотка или тому подобное), моча, тканевое текучее вещество, лимфатическое текучее вещество, суставное текучее вещество, молоко, цереброспинальное текучее вещество, гной, слюна, слезное текучее вещество, текучее вещество слизи, отделяемое носа, мокрота, абдоминальное текучее вещество, использованное текучее вещество или семя, смывное текучее вещество после промывания носовой полости, бронхиальных трубок, легких, кожи, абдоминальной полости, различных органов, суставов, костей или тому подобного, супернатант клеточной культуры и элюент колонки. Эти образцы можно использовать для измерения или непосредственно или после разведения или экстрагирования с использованием различных буферов, после чего следует концентрирование.
[00131] Кроме того, в случае использования цельной крови в качестве образца, образец цельной крови можно анализировать в пределах 72 часов, в пределах 48 часов, в пределах 24 часов, в пределах 12 часов, в пределах 6 часов или в пределах 4 часов после взятия образца цельной крови. Взятие образца цельной крови можно осуществлять с использованием пробирки для взятия крови с EDTA или пробирки для взятия крови с гепарином. Предпочтительно, образец цельной крови анализируют в пределах 6 часов после ее взятия в пробирки для взятия крови с EDTA или в пределах 4 часов после ее взятия в пробирки для взятия крови с гепарином.
[00132] 3. Набор для измерения sCD14-ST
В третьем варианте осуществления настоящего изобретения это раскрытие предусматривает набор для измерения пресепсина, который содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по первому варианту осуществления в качестве неотъемлемого составляющего элемента.
TM
[00133] Измерительный набор по настоящему изобретению предпочтительно содержит вспомогательный реактив для измерения пресепсина. Примеры вспомогательного реактива включают первичное антитело, вторичное антитело, меченное антитело, метящий фермент, метящее вещество, такое как коллоидное золото, хромогенный субстрат, флуоресцентный субстрат (Amplex Red, AttoPhos, 4-MUP или тому подобное), хемилюминесцентный субстрат (люминол, CDP-Star, AMPPD, CSPD или тому подобное), специфичное связывающее вещество, такое как биотин-стрептавидин, нерастворимый носитель, блокирующее средство, разбавляющий раствор, промывающую жидкость и эталонный материал, но они не ограничены этим.
[00134] Вспомогательный реактив можно использовать в подходящей комбинации в зависимости от способа измерения пресепсина по второму варианту осуществления. Первичное антитело предпочтительно представляет собой антитело, которое связывается с пресепсином. Более предпочтительно, оно представляет собой антитело, распознающее эпитоп, который отличается от антитела по настоящему изобретению. Его примеры включают антитело F1106-13-3 и антитело F1031-8-3, которые описаны в примере 3 из WO 2004/044005.
[00135] Любое из антител по настоящему изобретению и первичного антитела можно использовать в качестве меченного антитела. Когда ни одно из антитела по настоящему изобретению и первичного антитела не мечено, также можно использовать меченное вторичное антитело.
[00136] Примеры нерастворимых носителей включают, но не ограничиваясь этим, магнитные частицы, гранулы, стекло, целлюлозу, нитроцеллюлозу, пористый синтетический полимер, стеклянное волокно, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, пластмассовую чашку, латексные частицы, нетканый текстиль, фильтровальную бумагу и так далее.
[00137] Для мечения антитела предпочтительно используют фермент, такой как пероксидаза (HRP), щелочная фосфатаза (ALP) и β-галактозидаза, коллоидное золото и т. п., но без ограничения этим.
[00138] Когда HRP используют, в качестве хромогенного субстрата можно отметить, например, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB), о-фенилендиамин (OPD) или тому подобное. Когда используют ALP, в качестве хромогенного субстрата можно отметить р-нитрофенилфосфат (pNPP) или тому подобное. Когда используют β-галактозидазу, в качестве примера хромогенного субстрата приведен о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (ONPD) или тому подобное.
[00139] Измерительный набор для сэндвич-ELISA, который может содержать, например, антитело по настоящему изобретению и первичное антитело (любое антитело можно метить ферментом), хромогенный субстрат, разбавляющий раствор, эталонный материал или тому подобное. Когда ни одно из антитела по настоящему изобретению и первичного антитела не мечено, также может содержаться меченное вторичное антитело.
[00140] Измерительный набор для хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (CLEIA) может содержать, например, антитело, иммобилизованное на магнитных частицах, антитело, меченное ферментом, хемилюминесцентный субстрат, разбавляющий раствор, промывающую жидкость или тому подобное.
[00141] Измерительный набор для флуоресцентного иммуноферментного анализа (FEIA) может содержать, например, антитело, иммобилизованное на магнитных частицах, антитело, меченное ферментом, флуоресцентный субстрат, разбавляющий раствор, промывающую жидкость или тому подобное.
[00142] Измерительный набор для электрохемилюминесцентного иммуноферментного анализа (ECLIA) может содержать, например, биотинилированное антитело, антитело, меченное Ru(bpy)3, магнитные частицы, покрытые стрептавидином, трипропиламин или тому подобное.
[00143] Измерительный набор на основании иммунохроматографии представляет собой тестовую полоску, на которой часть для добавления образца, часть для реактива, обнаруживающую часть и абсорбционную часть располагают так, что жидкий образец, добавляемый в часть для добавления для теста, подвергается миграции в указанном выше порядке. Например, возможно предусмотреть связывание нерастворимого носителя с первичным антителом в обнаруживающей часть посредством импрегнации меченного вторичного антитела в части для реактива.
[00144] В отношении тестовой полоски, использование пористого носителя или тому подобного приведено в качестве примера. Примеры пористого носителя включают, но не ограничиваясь этим, нитроцеллюлозу, целлюлозу, производные целлюлозы, нейлон, нейлоновое волокно, стеклянное волокно и пористый синтетический полимер. Примеры абсорбционной части включают, но не ограничиваясь этим, абсорбирующий полимер, такой как губка, состоящий из материала, абсорбирующего воду, целлюлозная фильтровальная бумага, фильтровальная бумага и так далее.
[00145] Поскольку сообщалось о том, что концентрация пресепсина в крови характеристически повышена у пациентов с сепсисом, набор для измерения пресепсина по третьему варианту осуществления настоящего изобретения можно использовать в качестве набора для обнаружения сепсиса или набора для содействия обнаружению или диагностированию сепсиса.
[00146] Также набор для измерения пресепсина по третьему варианту осуществления настоящего изобретения можно использовать в качестве диагностического средства для сепсиса или дополнительного средства для диагностирования сепсиса. Когда используют с целью обнаружения сепсиса или содействия диагностированию, определяют, что субъект имеет вероятность сепсиса, когда концентрация пресепсина в образце от субъекта, измеряемого с использованием антитела по настоящему изобретению, представляет собой значение выше порогового значения, и это может содействовать обнаружению или диагностированию. В одном из аспектов, пороговое значение может составлять от 314 до 600 пг/мл, предпочтительно от 400 до 580 пг/мл, более предпочтительно от 450 до 550 пг/мл и более предпочтительно 500 пг/мл.
[00147] Кроме того, набор для измерения пресепсина можно использовать для обнаружения или оценки по меньшей мере одного заболевания, выбранного, например, из проведения различий между сепсисом и синдромом системной воспалительной реакции (SIRS), оценки риска для сепсиса определенной тяжести, прогностического предсказания сепсиса (предсказания смертности), оценки степени тяжести сепсиса, обнаружения инфекций операционного поля, обнаружения диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIC), обнаружения инфекционного DIC, обнаружения заболевания сердца, обнаружения дыхательных инфекций, связанных с бактериальной инфекцией, обнаружения воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона, язвенного колита), обнаружения фебрильной нейтропении (FN), обнаружения гемофагоцитарного синдрома (HPS) и оценки функции фагоцитов. Набор для измерения пресепсина может представлять собой набор для обнаружения или оценки по меньшей мере одного заболевания, описанного выше.
[00148] 4. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела, описанные в первом варианте осуществления
В четвертом варианте осуществления настоящего изобретения раскрытие предусматривает полинуклеотид или нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по первому варианту осуществления настоящего изобретения. Полинуклеотид включает ДНК (геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК или тому подобное) и РНК (мРНК или тому подобное). Полинуклеотид может быть или одноцепочечным (смысловым или антисмысловым) и двухцепочечным. Например, возможно, что мРНК экстрагируют из гибридомы, продуцирующей антитело по настоящему изобретению, с использованием коммерчески доступного набора и синтезируют кДНК. Целевой ген можно амплифицировать с помощью способа ПЦР или тому подобного.
[00149] В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению может иметь идентичность по меньшей мере 80% или более с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует тяжелую цепь или легкую цепь вариабельной области. В отношении последовательности CDR, она может иметь идентичность по меньшей мере 80% или более с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует всю CDR антитела (CDR VH от 1 до 3 и CDR VL от 1 до 3). С точки зрения чувствительности обнаружения, она может проявлять идентичность 85% или более, идентичность 90% или более, идентичность 95% или более, идентичность 96% или более, идентичность 97% или более, идентичность 98% или более или идентичность 99% или более.
Кроме того, в соответствии с определенным вариантом осуществления, антитело, кодируемое нуклеотидной последовательностью, которая при строгих условиях образует гибрид с комплементарной последовательностью нуклеотидной последовательности, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, также включено в антитело по настоящему изобретению.
rd
[00150] Гибридизацию можно осуществлять с помощью известного способа или способа на его основании, например, способа, описанного в Molecular Cloning 3 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).
[00151] Строгие условия обозначают условия, в которых происходит образование специфичного гибрида, но при это не происходит образование неспецифичного гибрида. Типичные строгие условия включают, например, осуществление гибридизации при концентрации калия приблизительно от 25 мМ приблизительно до 50 мМ и концентрации магния приблизительно от 1,0 мМ приблизительно до 5,0 мМ. Специалист в данной области может без труда выбрать условия посредством модификации реакции гибридизации или концентрации соли в реакционном растворе для гибридизации.
[00152] 5. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, описанный в четвертом варианте осуществления
В пятом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает вектор, в которой введен полинуклеотид, который кодирует аминокислоту антитела или фрагмент антитела, связывающий антиген, по настоящему изобретению. Вектор предпочтительно представляет собой вектор и/или экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии гена антитела, который описан в первом варианте осуществления. Его можно получать с помощью способа, который может быть использован специалистом в данной области.
[00153] 6. Клетки, продуцирующие антитело или фрагмент антитела, связывающий антиген, которые описаны в первом варианте осуществления
В шестом варианте осуществления настоящего изобретения раскрытие предусматривает клетки, которые продуцируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению. Примеры клеток включают гибридому, трансформант и генетически рекомбинантные клетки, в которые введен ген антитела по настоящему изобретению.
[00154] Конкретные примеры гибридомы для получения антитела включают клон, описанный в примере 1.
[00155] Трансформант можно получать посредством введения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий аминокислоту вышеуказанного антитела или его фрагмента антитела, связывающего антиген, по настоящему изобретению в клетку-хозяина, описанную в первом варианте осуществления (например, клетки COS-1 и клетки CHO).
[00156] Способ получения гибридомы или трансформанта может представлять собой то же, что описано для первого варианта осуществления.
[00157] 7. Способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела с использованием трансформанта
В седьмом варианте осуществления настоящего изобретения раскрытие предусматривает способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, который включает стадию культивирования трансформанта, содержащего вектор, в который введен нуклеотид, который кодирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по первому варианту осуществления.
[00158] Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по первому варианту осуществления получают в культуре трансформанта и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела по первому варианту осуществления собирают из культуры. Используемые способы могут представлять собой те же, что описаны в первом варианте осуществления.
[00159] 8. Способ скрининга антитела против пресепсина
В восьмом варианте осуществления настоящего изобретения, раскрытие предусматривает способ скрининга антитела для получения антитела против пресепсина, которое можно использовать для измерения пресепсина в образце, где способ включает по меньшей мере следующие стадии:
- стадия конструирования измерительной системы для пресепсина с использованием антитела кандидата,
- стадия определения влияния концентрации TG в образце на значение измерения пресепсина с использованием измерительной системы
Другими словами, способ отличается тем, что тест на мешающее действие TG осуществляют с использованием измерительной системы, в которой используют антитело. Способ получения антитела-кандидата (предпочтительно, антитела против пресепсина) может представлять собой то же, что описано в первом варианте осуществления или седьмом варианте осуществления. В некоторых вариантах осуществления система для измерения пресепсина представляет собой измерительную систему, допускающую измерение значения пресепсина в образце, и конкретно не ограничена. Ее примеры включают, но не ограничиваясь этим, измерительную систему, описанную во втором варианте осуществления, и можно использовать, например, сэндвич-ELISA или тому подобное.
[00160] В отношении стадии определения влияния концентрации TG в образце на значение измерения пресепсина, влияние можно определять ввиду расхождения между двумя значениями измерения, то есть, на основании сравнения между значением измерения пресепсина в образце без TG и значения измерения пресепсина в том же образце с добавлением определенного количества TG. Например, когда тест на мешающее действие TG осуществляют с использованием множества образцов, и доля образца, который демонстрирует степень расхождения значения измерения пресепсина в то время, как TG имеет концентрацию 20 мг/мл в образце, по сравнению со значением измерения пресепсина в момент без добавления какого-либо TG, составляет±20% или меньше и более предпочтительно±10% или меньше, высока, можно определять, что влияние TG в образце на значение измерения пресепсина мало, а также можно определять, поскольку маловероятно находится под влиянием мешающего действия TG, что антитело можно использовать для измерения пресепсина.
[00161] Альтернативно, в качестве другого способа оценки, оценку можно выполнять посредством сравнения степени расхождения после выполнения теста на мешающее действие TG с использованием антитела-кандидата и антитела S68. В качестве одного предпочтительного варианта осуществления, когда расхождение значения измерения пресепсина в момент выполнения теста на мешающее действие TG с использованием антитела-кандидата схоже со степенью расхождения антитела S68 в тех же условиях, антитело можно найти в качестве антитела, которое можно использовать для измерения пресепсина в образце. В качестве примера, для измерительной системы, в которой тест на мешающее действие TG осуществляют с использованием множества образцов и используют антитело-кандидат, определяют различие между степенью расхождения, имея концентрацию TG 20 мг/мл в образце после добавления TG, и степенью расхождения измерительной системы, в которой используют антитело S68, в тех же условиях, и если доля образца, демонстрирующего разность в степени расхождения в 20% или меньше и предпочтительно 10% или меньше, высока, то можно определять, что антитело представляет собой антитело, которое можно использовать для измерения пресепсина в образце.
[00162] Способ скрининга по настоящему изобретению необязательно может включать стадию определения активности связывания между антителом-кандидатом и пептидом S68 или пресепсином. Кроме того, способ скрининга по настоящему изобретению необязательно может включать стадию измерения образца от нормального человека (т. е. человека без сепсиса) и пациента, имеющего сепсис, с использованием измерительной системы для пресепсина, в которой используют антитело-кандидат, и сравнения разности в значениях измерения. В одном из вариантов осуществления скрининг можно осуществлять в соответствии с описаниями из примера 1.
[00163] Один из предпочтительных вариантов осуществления способа скрининга представляет собой способ, который включает по меньшей мере следующие стадии:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина с использованием процесса получения и т. п., описанного в первом варианте осуществления настоящего изобретения, и
2) стадия конструирования измерительной системы для пресепсина с использованием антитела-кандидата и отбор антитела, имеющего коэффициент обнаружения 50% или больше, которое демонстрирует степень расхождения значения измерения пресепсина±20% или меньше, когда концентрацию TG корректируют до 20 мг/мл посредством добавления TG
[00164] В этом способе концентрация TG (в настоящем документе, 20 мг/мл) в образце, степень расхождения значения измерения пресепсина (в настоящем документе, ±20%) и долю образца можно менять надлежащим образом. Альтернативно, стадию (2) также можно осуществлять посредством замены ее на другие тесты на мешающее действие TG и/или способы оценки, описанные в первом варианте осуществления настоящего изобретения.
[00165] Другой предпочтительный вариант осуществления в восьмом варианте осуществления настоящего изобретения представляет собой способ скрининга антитела по настоящему изобретению, который включает по меньшей мере следующие стадии:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина, и
2) стадия определения, специфично ли антитело распознает аминокислотную последовательность SEQ ID № 1 в качестве эпитопа или нет
[00166] В этом способе стадия (2) может представлять собой способ определения эпитопа и т. п., описанное в первом варианте осуществления настоящего изобретения, можно использовать, без какого-либо ограничения.
Например, стадия (2) дополнительно может включать следующую стадию:
2) стадия отбора антитела, в которой связывание между антителом и пресепсином конкурентно ингибируют на 50% или больше в реакционной системе так, что последовательность аминокислотных остатков, состоящую из SEQ ID № 1, подвергают конкурентной реакции (поглощение) с тем, чтобы ингибировать связывание между указанным антителом и пресепсином.
Следующую стадию (3) необязательно можно добавлять в способ определения эпитопа:
3) стадия отбора антитела, на которой конкурентное ингибирование связывания между указанным антителом и пресепсином из-за по меньшей мере одной из последовательностей аминокислотных остатков, состоящей из SEQ ID №№ 35, 36, 37, 38, 39, 40 и 41, составляет меньше чем 20%, в реакционной системе, где последовательность аминокислотных остатков подвергают конкурентной реакции (поглощение) с тем, чтобы ингибировать связывание между указанным антителом и пресепсином.
[00167] Кроме того, другой предпочтительный вариант осуществления в восьмом варианте осуществления настоящего изобретения представляет собой способ скрининга антитела по настоящему изобретению, который включает по меньшей мере следующие стадии:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина с использованием процесса получения и т. п., описанного в первом варианте осуществления настоящего изобретения, и
2) стадия отбора указанного антитела, на которой коэффициент корреляции со значением измерения пресепсина в образце с использованием антитела S68 демонстрирует 0,9 или больше
[00168] Этот способ можно осуществлять в соответствии с описаниями по первому варианту осуществления настоящего изобретения и примером 5. Коэффициент корреляции также можно менять надлежащим образом.
[00169] Кроме того, другой предпочтительный вариант осуществления представляет собой способ скрининга антитела по настоящему изобретению, который включает по меньшей мере следующие стадии:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина, и
-8
2) стадия отбора антитела, связывающегося с пресепсином с аффинностью (равновесная константа диссоциации, значение KD) меньше чем 10 M
Альтернативно, стадию (2) можно заменить на следующую стадию:
2) стадия отбора антитела, на которой активность связывания антитела с пресепсином является превосходной по сравнению с активностью связывания антитела S68 с пресепсином
[00170] Возможно осуществлять измерение аффинности (равновесной константы диссоциации, значения KD) и активность связывания в соответствии с описанием первого варианта осуществления настоящего изобретения. Активность связывания можно оценивать посредством коэффициента поглощения. Предпочтительно, коэффициент поглощения, когда антитело по настоящему изобретению и пресепсин вступают в реакцию, составляет 2 или больше, когда поглощение антитела S68 и пресепсина находят равным 1.
[00171] Способ скрининга антитела по настоящему изобретению, как описано выше, можно осуществлять посредством объединения соответствующих стадий. Предпочтительная комбинация представляет собой, например, следующее:
Способ скрининга антитела против пресепсина, который включает по меньшей мере следующие стадии:
1) стадия получения антитела-кандидата против пресепсина,
2) стадия отбора антитела, на которой связывание между указанным антителом и пресепсин конкурентно ингибируют на 50% или больше в реакционной системе (предпочтительно, поглощение), где последовательность аминокислотных остатков, состоящую из SEQ ID № 1, подвергают конкурентной реакции с тем, чтобы ингибировать связывание между указанным антителом и пресепсином, и
3) стадия отбора антитела, на которой активность связывания антитела с пресепсином является превосходной по сравнению с активностью связывания антитела S68 с пресепсином.
[00172] 9. Способ лечения пациента с сепсисом
В девятом варианте осуществления настоящего изобретения, раскрытие предусматривает способ лечения пациента с сепсисом, который включает осуществление лечения сепсиса у субъекта, которого подвергали способу содействия обнаружению сепсиса с использованием антитела по первому варианту осуществления настоящего изобретения или его антигенсвязывающего фрагмента антитела.
[00173] Способ содействия обнаружению сепсиса может представлять собой то же, что описано во втором варианте осуществления настоящего изобретения. Лечение сепсиса конкретно не ограничено, но включает введение антибактериального средства или стероида, сосудосуживающего средства, раствора восполнителя, введение кислорода, искусственное поддержание дыхания, непрерывный фильтрационный диализ крови и замещение плазмы.
[00174] 10. Способ скрининга тестового лекарственного средства (или терапевтического средства)
В десятом варианте осуществления настоящего изобретения раскрытие предусматривает способ скрининга тестового лекарственного средства (или терапевтического средства), который включает стадию определения концентрации пресепсина в образце от субъекта, которому вводили тестовое лекарственное средство (или терапевтическое средство), с использованием антитела по первому варианту осуществления настоящего изобретения или его антигенсвязывающего фрагмента антитела, или набора по третьему варианту осуществления. Заболевание, на которое направлено тестовое лекарственное средство, конкретно не ограничено при условии, что оно представляет собой заболевание, при котором повышена концентрация пресепсина в образце от субъекта. Предпочтительно, концентрацию пресепсина в образце от субъекта сравнивают между до и после введения тестового лекарственного средства для того, чтобы определять, является ли концентрация пресепсина после введения тестового лекарственного средства сниженной по сравнению с до введения или нет. Альтернативно, можно определять, снижена ли концентрация пресепсина в образце от субъекта после введения тестового лекарственного средства по сравнению с нормальным человеком, который не получал тестовое лекарственное средство.
[00175] Настоящее изобретение предусматривает способ скрининга тестового лекарственного средства, который включает следующую стадию:
1) стадия определения концентрации пресепсина в образце от субъекта, которому вводили тестовое лекарственное средство.
[00176] 11. rsCD14ST-Fc
rsCD14ST-Fc имеет структуру, которая содержит последовательность от положения 1 до положения 64 в SEQ ID № 3 (полноразмерный растворимый CD14 человека) и Fc-область тяжелой цепи антитела.
rsCD14ST-Fc можно получать, например, трансфекцией плазмиды для временной экспрессии, которая экспрессирует rsCD14ST-Fc, обладающий последовательностью, которая содержит последовательность распознавания тромбина ниже по направлению считывания от последовательности с положения 1 до положения 64 в sCD14 человека и последовательность Fc-области тяжелой цепи антитела IgG1, полученного у человека, в клетку-хозяина, такую как клетка COS-1, культивированием клетки-хозяина и извлечением и очисткой получаемого культурального супернатанта.
[00177] Желательно последовательность, облегчающую разрезание, вставляют между последовательностью от положения 1 до положения 64 sCD14 человека и Fc, и в дополнение к последовательности распознавания тромбина можно использовать, например, распознающую последовательность фактора Xa, распознающую последовательность PreScission Protease и т. п. без конкретного ограничения. Это не принципиально, что rsCD14ST-Fc содержит последовательность, облегчающую разрезание.
[00178] Fc-область тяжелой цепи антитела в rsCD14ST-Fc не ограничена. В дополнение к Fc-области, полученной из антитела IgGI, полученного у человека, можно использовать Fc-области всех других известных антител. Клетка-хозяин также конкретно не ограничена.
[00179] Поскольку rsCD14ST-Fc получают посредством культивирования клетки-хозяина, такой как клетка COS-1 и т. п., экспрессия является легкой, и поскольку Fc специфически связывается с белком A и для очистки можно использовать колонку с белком A, он имеет при получении такое преимущество, что очистка также является легкой. Очистка после разрезания Fc-области возможна с использованием стандартного способа в дополнение к колонке с белком A, и очистку можно осуществлять, например, с использованием способа, описанного в примере 13 из WO 2005/108429 или тому подобного.
[00180] Также rsCD14ST-Fc можно использовать в качестве rsCD14-ST посредством разрезания Fc-области или можно использовать в качестве rsCD14ST-Fc без разрезания Fc-области, и оба они специфично связываются с антителом против пресепсина.
[00181] rsCD14ST-Fc, полученный в примере 9-(2), содержит ту же тромбиновую последовательность, что и в стандарте rsCD14-ST, которую вставляют между rsCD14ST и Fc. rsCD14ST, полученный посредством разрезания Fc-области тромбином, имеет ту же последовательность, что и стандартный rsCD14ST, и обладает эквивалентными свойствами (см. WO 2005/108429).
[00182] При получении rsCD14 из rsCD14ST-Fc, после разрезания Fc, один Fc можно легко удалять посредством пропускания его через колонку с белком A и получение также является легким. Средство для разрезания Fc-области в rsCD14ST-Fc можно надлежащим образом выбирать в соответствии со вставленной последовательностью, облегчающей разрезание.
[00183] Поскольку rsCD14ST-Fc имеет активность rsCD14-ST без разрезания Fc-области, его можно использовать в качестве антигена.
[00184] Предыдущий стандарт rsCD14-ST получают посредством экспрессии rsCD14, в который вставляют сайт узнавания тромбина между положением 64 и положением 65 в sCD14 человека, в клетке-хозяине и разрезания rsCD14 в сайте узнавания тромбина. Структура rsCD14 содержит rsCD14-ST, но он демонстрирует небольшую реактивность в виде rsCD14-ST. Только после разрезания и очистки rsCD14-ST приобретает активность, которую можно использовать. С другой стороны, поскольку rsCD14ST-Fc можно использовать подобно rsCD14-ST или стандарту, независимо от того, разрезана ли Fc-область. Таким образом, можно экономить усилия на разрезание и его просто можно использовать.
ПРИМЕРЫ
[00185] Пример 1: получение моноклонального антитела против синтетического пептида в качестве антигена
1-(1) Иммунизация кролика
Получение антигена для введения и иммунизации кролика осуществляли в соответствии со способом, описанным в примере 1 из WO 2004/044005 A1. В частности, пептид получали с помощью пептида, в котором цистеин вставляли в N-конец пептида (далее в настоящем документе описанного как пептид S68), состоящего из последовательности, описанной в SEQ ID № 2 (соответствующей последовательности от положения 53 до положения 68, описанной в SEQ ID № 3). Этот пептид связывали с KLH (PIERCE) и его использовали в качестве антигена для введения (далее в настоящем документе описанного как пептид S68-KLH).
[00186] 100 мкг пептида S68-KLH смешивали с таким же объемом полным адъювантом Фрейнда (DIFCO) и вводили внутрикожно в спину новозеландского белого кролика (в возрасте трех месяцев). После двух недель и также через одну неделю после этого 100 мкг пептида S68-KLH смешивали с тем же объемом неполного адъюванта Фрейнда (DIFCO) и вводили внутрикожно в спину. Кроме того, 20 мкг пептида S68-KLH вводили два раза в ушную вену.
[00187] Через одну неделю после завершения введения, брали образцы крови из ушной вены и отделяли антисыворотку в соответствии со стандартным способом и определяли титр антител и реактивность для пресепсина с использованием сэндвич-ELISA. В частности, F1106-13-3 иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341, производства Nunc) и блокировали. Каждую антисыворотку от кролика разводили в D-PBS (pH 7,4) и подвергали квадратичному серийному разведению от ×1/1000 до ×1/32000 раз (8 точек). Эталонный стандарт пресепсина (rsCD14-ST, описанный в примере 16 из WO 2005/108429) разводили в разбавляющем растворе (0,1% BSA/D-PBS) для того, чтобы получать стандартный раствор 3 нг/мл. После добавления серии разведений антисыворотки в планшет впоследствии добавляли стандартный раствор 3 нг/мл. Планшет инкубировали в течение часа и впоследствии планшет промывали пять раз в физиологическом растворе, содержащем 0,05% Tween20. Затем 100 мкл раствора, полученного посредством разведения, добавляли антитело против Ig кролика, конъюгированное с HRP, (DAKO, P448) и планшет инкубировали в течение часа при 25°C. После промывания планшета аналогичным образом пять раз добавляли раствор тетраметилбензидина (TMB, производства BioFix) и проводили реакцию в течение 10 минут при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение при 450/650 нм измеряли с использованием Multiskan JX (производства Thermolab Systems). На основании результата измерения поглощения выбирали часть с высоким титром антител.
[00188] За четверо суток до сбора селезенки 400 мкг пептида S68-KLH вводили в ушную вену. После асептического сбора селезенки извлекали лимфоциты.
[00189] 1-(2) Слияние клеток и клонирование
8
8
Согласно способу, описанному в патенте США № 7429487, 2×10 клеток лимфоцитов и 1×10 клеток бессмертных B-лимфоцитов, полученных у кролика в качестве партнер для слияния, смешивали друг с другом, и слияние клеток осуществляли два отдельных раза. Слитные клетки высевали на 96-луночный планшет и культивировали в соответствии с общим способом.
[00190] В отношении культурального супернатанта полученных 286 клонов, активность связывания для введенного антигена определяли с использованием пептида S68-BSA и отбирали 72 клона с подтвержденной активностью связывания.
[00191] В отношении 72 клонов, обладающих подтвержденной активностью связывания для введенного антигена, активность связывания с эталонным стандартом пресепсина определяли с помощью системы сэндвич-ELISA, которая является такой же, как 1-(1), и отбирали клоны с подтвержденной активностью связывания.
[00192] В отношении клонов с подтвержденной активностью связывания с эталонным стандартом пресепсина, определяли специфичность для пресепсина в крови пациента. В частности, три сыворотки от нормального человека (приобретали в ProMedDx) и три сыворотки от пациента, имеющего сепсис (приобретали в Bioreclamation) разводили пять раз в разбавляющем растворе и проводили определение с помощью системы сэндвич-ELISA, которая является такой же, как 1-(1). Как результат, отбирали пять клонов, которые обладают хорошей реактивностью в отношении эталонного стандарта пресепсина и у которых поглощение не возрастает в образце от нормального человека и поглощение возрастает в образце от пациента, имеющего сепсис. Каждый клон клонировали посредством предельного разведения и получали каждую замороженную ампулу.
[00193] 1-(3) Анализ характера связывания с помощью BIACORE
Для того чтобы определять характер связывания между каждым антителом, которое получали из отобранного клона, и пресепсином, осуществляли анализ с использованием BIACORE3000 (производства GE Health Care). На чипе CM5 (производства GE Health Care) стандартным способом антитело F1106-13-3 иммобилизовали и дополнительно добавляли эталонный стандарт пресепсина (1 мкг/мл). Кроме того, туда добавляли разведенный культуральный супернатант (0,5 мкг/мл) и строили сенсограмму. Все клоны демонстрировали хороший характер связывания, при котором в фазе диссоциации не наблюдают диссоциацию.
[00194] 1-(4) Получение моноклонального антитела кролика
Используя полученную гибридому, которая продуцирует моноклональное антитело кролика против пресепсина, получали моноклональное антитело кролика. В частности, в соответствии со стандартным способом, размораживали замороженную ампулу и клетки собирали после культивирования в RPMI1640 (производства Sigma), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку и 8% Supplement A (производства Abcam), и клетки культивировали с использованием среды IS-MAB-CD (производства Irvine) в соответствии с протоколом для CELLine (производства Integra Bioscience) и собирали культуральный супернатант, содержащий антитело. Затем антитело очищали от полученного культурального супернатанта с использованием rmp-Protein A Sepharose FF (производства GE Health Care). Элюированный раствор, содержащий очищенное антитело, концентрировали и впоследствии диализировали против D-PBS (pH 7,4). Концентрацию белка антитела измеряли с помощью способа Брэдфорда, используя коровий IgG (производства BioRad) в качестве стандарта. Полученное антитело анализировали посредством SDS-PAGE, и как результат идентифицировали одну полосу с молекулярной массой приблизительно 150 кДа. Кроме того, в результате восстановления идентифицировали тяжелую цепь приблизительно 50 кДа и легкую цепь приблизительно 25 кДа.
[00195] Пример 2: получение рекомбинантного антитела
2-(1) Конструкция плазмиды для экспрессии и определения аминокислотной последовательности в вариабельной области моноклонального антитела кролика
Из каждой гибридомы, полученной в примере 1, экстрагировали общую РНК с использованием набора RNeasy Mini (производства Quiagen) и синтезировали одноцепочечную кДНК с использованием SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (производства Invitrogen). С использованием Rabbit Ig-Primer Set (Rader C, et al. JBC 2000; 275: 13668-76, and Lang I, et al. Gene 1996; 172: 295-8), в котором используют полученную одноцепочечную кДНК в качестве матрицы, вариабельную область амплифицировали посредством ПЦР и определяли нуклеотидную последовательность каждой вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи стандартным способом.
[00196] В базе данных осуществляли поиск в отношении информации о последовательности, отличной от вариабельной области, и конструировали 5'-концевой праймер и 3'-концевой праймер. С использованием этих праймеров осуществляли ПЦР для того, чтобы амплифицировать каждую из полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, которые затем клонировали в pTK-2433, содержащую промотор EF-1α и энхансер CMV, то есть, вектор для временной экспрессии в клетках млекопитающих. В соответствии со стандартным способом определяли нуклеотидную последовательность каждой из полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи и аминокислотную последовательность, кодируемую ими. Аминокислотные последовательности части CDR вариабельной области антитела проиллюстрированы в таблице 10 (тяжелая цепь) и таблице 11 (легкая цепь).
[00197]
Таблица 10
Название антитела
Тяжелая цепь
CDR1
CDR2
CDR3
F1466-5
RYAMGSEQ ID № 4
IIYRNIKTYYATWAKGSEQ ID № 5
GDFSEQ ID № 6
F1466-26
RYTMGSEQ ID № 7
IINSGATYYASWAKGSEQ ID № 8
GDFSEQ ID № 9
F1466-16
SFWMSSEQ ID № 10
IISDIDDLFYASWAKGSEQ ID № 11
GGLSEQ ID № 12
F1466-12
SYDMISEQ ID № 13
YIGSPGTTYYGSWAKGSEQ ID № 14
SGDITNRFNLSEQ ID № 15
F1466-19
NYDMISEQ ID № 16
YIGSPGTTYYASWAKGSEQ ID № 17
SGDITNRFNLSEQ ID № 18
[00198]
Таблица 11
Название антитела
Легкая цепь
CDR1
CDR2
CDR3
F1466-5
QASEDIISNLASEQ ID № 19
KASTLASSEQ ID № 20
QSSYTESTTFGHVSEQ ID № 21
F1466-26
QASQSIGSNLASEQ ID № 22
KASKLASSEQ ID № 23
QCSYTAIGNYGHVSEQ ID № 24
F1466-16
QASQSISNYLASEQ ID № 25
KTSTLESSEQ ID № 26
QSTYYRSTTTYGNTSEQ ID № 27
F1466-12
QASERIRNWLSSEQ ID № 28
RASTLESSEQ ID № 29
QCSAGGNAGNASEQ ID № 30
F1466-19
QASERIRNWLSSEQ ID № 31
RASTLESSEQ ID № 32
QCSAGGNAGNGSEQ ID № 33
[00199] 2-(2) Получение рекомбинантного антитела для временной экспрессии
Плазмиды для временной экспрессии, которые получали выше в 2-(1) (экспрессирующая плазмида, которая содержит последовательность тяжелой цепи, и экспрессирующая плазмида, которая содержит последовательность легкой цепи) смешивали друг с другом в одинаковом количестве и смесью трансфицировали клетки COS-1 (ATCC: CRL-1650). В частности, после смешивания реактива для трансфекции 2 мкл/мл и плазмиды 4 мкг/мл и их добавления в среду, туда добавляли клетки COS-1 и культивировали при 37°C. Через 72 часа культуральный супернатант собирали и снова добавляли в свежую среду. Через 96 часов культуральный супернатант собирали и фракции, полученные с помощью двух сборов, смешивали и фильтровали через 0,22 мкм фильтр (Sterivac, производства Millipore). Полученный культуральный супернатант очищали с помощью способа, описанного в приведенном выше 1-(4), и в результате анализа посредством SDS-PAGE идентифицировали рекомбинантное антитело, демонстрирующее одну полосу приблизительно 150 кДа.
[00200] 2-(3) Конструкция плазмиды для стабильной экспрессии рекомбинантного антитела
Используя рестрикционный фермент, фрагмент гена, кодирующий тяжелую цепь, и фрагмент гена, кодирующий легкую цепь, вырезали из плазмид для временной экспрессии, которые получали в приведенном выше 2-(2), и соединяли с плазмидой (pTK-2577; описана в JP 2007-215546 A), содержащей промотор EF-1α и экспрессионную единицу DHFR мыши [SV40 промотор в качестве промотора (не содержит энхансерную область), полиA сигнал, полученный у SV40], чтобы получать плазмиду для стабильной экспрессии в клетках млекопитающих животных.
[00201] Пример 3: получение антител с помощью клеток CHO
3-(1) Получение рекомбинантной антителопродуцирующей клетки CHO для моноклонального антитела кролика
6
2
2
2
Клетки CHO с дефицитом гена DHFR (CHO DXB11) трансфицировали плазмидой для стабильной экспрессии, которую конструировали в приведенном выше 2-(3), и получили устойчивые трансформированные клетки CHO, продуцирующие антитело кролика. В частности, CHO DXB11, которые акклиматизировали и культивировали с использованием EX-CELL 302 PF CHO (производства JRH Bioscience), содержащими добавку для среды HT (50×) Hybri-Max (производства Sigma; использовали в 1× конечной концентрации) и 200 мМ L-глутамина (производства Sigma; использовали в конечной концентрации 4 мМ) центрифугировали в день трансфекции и инокулировали в колбу в концентрации 8×10 клеток/150 см Roux. Используя 125 мкл FuGENE6 (производства Promega), получали 12,5 мкг экспрессирующей плазмиды в соответствии с протоколом, приложенным к FuGENE6, и затем вводили в CHO DXB11. После культивирования в течение двух суток при 37°C, 5% CO, клетки собирали и промывали два раза в среде EX-CELL 302 PF CHO без HT, содержащей L-глутамин 4 мМ (ниже в настоящем документе описана как EX-CELL (HT-)), и ресуспендировали в EX-CELL (HT-). Затем клетки снова высевали в 96-луночный планшет пот 12500-50000 клеток/лунка и непрерывно культивировали при 37°C, 5% CO. Половину объема среды заменяли на свежую EX-CELL (HT-) каждые трое или четверо суток. После продолжения культивирования в течение приблизительно двух недель клетки в лунке, где возникала колония, переносили в новый планшет.
[00202] Скрининг антитела в культуральном супернатанте клеток CHO с помощью способа ELISA, в котором используют пептидный антиген S68, в качестве твердой фазы и затем отбирали пять типов клеток CHO, продуцирующих антитело, связывающееся с пептидом S68.
[00203] 3-(2) Амплификация гена с использованием метотрексата
2
Посредством осуществления процесса амплификации гена, эти трансформированные клетки CHO для экспрессии рекомбинантного антитела, полученных в 3-(1), отбирали и культивировали в среде EX-CELL (HT-), содержащей метотрексат (ниже в настоящем документе описана как MTX), отбирали клоны, в которых увеличено количество образовавшегося целевого рекомбинантного антитела. В частности, трансформированные клетки, полученные в примере 3-(1), суспендировали в среде EX-CELL (HT-), содержащей 30 нМ MTX и затем помещали в 96-луночный планшет. Половину объема среды заменяли каждые трое или четверо суток на свежую EX-CELL (HT-), содержащую 30 нМ MTX, и культивирование продолжали при 37°C, 5% CO до образования колоний. Концентрацию IgG в культуральном супернатанте полученной колонии определяли способом ELISA и отбирали клоны, демонстрирующие повышенное образованное количество. Как результат, получали трансформант, демонстрирующий повышение образованного количества от двух до десяти. Между тем, подвергая трансформант с амплифицированным геном повторному отбору и культивированию в среде, в которой концентрация MTX повышена от трех до десяти раз, возможно было получать клоны, имеющее дополнительно повышенное образованное количество.
[00204] 3-(3) Получение рекомбинантного антитела с помощью клеток CHO
5
Клоны, полученные в 3-(2), инокулировали в среду CHO-SFM (HT-) (производства GIBCO), содержащую 30 нМ MTX, чтобы иметь 1×10 клеток/мл, и культивировали в течение семи суток при 37°C. Полученный культуральный супернатант использовали для очистки антитела. Антитело очищали от культурального супернатанта с использованием колонки с белком A (Prosep-A, производства Millipore). В результате анализа очищенного рекомбинантного антитела посредством SDS-PAGE идентифицировали антитело, демонстрирующее ту же молекулярную массу, что и антитело полученное из гибридомы.
[00205] Пример 4: оценка реактивности каждого антитела в системе сэндвич-ELISA
Реактивность с пресепсином оценивали для 5 типов моноклональных антител кролика, полученных в примере 2, антитела S68, описанного в примере 1 из WO 2004/044005 A1 (поликлональное антитело, полученное посредством иммунизации кролика пептидом S68) и F1146-17-2, описанного в примере 2 из WO 2004/044005 A1 (моноклональное антитело, полученное посредством иммунизации крысы пептидом S68). В частности, каждое антитело разводили до 5 мкг/мл в PBS (pH 7,4) и 50 мкл его добавляли в каждую лунку IMMUNO PLATE (Maxisorb, производства NUNC). После реакции в течение ночи при 4°C, пять раз осуществляли промывание ионообменной водой и осуществляли блокирование посредством добавления в каждую лунку 200 мкл PBS, содержащего 0,1% StabilGuard (производства SurModics, Inc) и 0,1% Tween20 (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Затем эталонный стандарт пресепсина разводили до 1000 нг/мл с использованием разбавляющего раствора и впоследствии разводили в соотношении три раза для того, чтобы получать серийное разведение эталонного материала. Серийное разведение эталонного стандарта добавляли в количестве 50 мкл на лунку и проводили реакцию в течение часа при 25°C. После завершения реакции, ее пять раз промывали физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween20, и в каждую лунку добавляли 50 мкл антитела F1106-13-3, меченного пероксидазой, которое разводили до 0,25 мкг/мл. После реакции в течение двух часов при 25°C, промывание осуществляли пять раз аналогичным образом, как приведено выше, и в каждую лунку добавляли раствор TMB. После реакции в течение 20 минут при комнатной температуре, реакцию останавливали с использованием 0,5 M раствора серной кислоты и измеряли поглощение на 450 нм (длина парциальной волны для 650 нм) с использованием спектрофотометра для планшетов (производства Molecular Devices).
[00206] Результаты измерений представлены в таблице 12. Любая измерительная система с использованием каждого моноклонального антитела кролика, полученного в примере 2, имела превосходную реактивность с эталонным стандартом пресепсина и демонстрировала реактивность, почти эквивалентную измерительной системе, в которой используют антитело S68.
[00207] С другой стороны, измерительная система с использованием F1146-17-2 демонстрировала низкую реактивность и поглощение 0,368, когда концентрация пресепсина составляла 1000 нг/мл. Это поглощение почти эквивалентно поглощению, продемонстрированному при концентрации пресепсина от 0,03 до 0,1 нг/мл в измерительной системе с использованием моноклонального антитела кролика. Как сказано выше, обнаружено, что измерительная система с использованием моноклонального антитела кролика имеет реактивность, усовершенствованную приблизительно в 10000 раз по сравнению с измерительной системой с использованием F1146-17-2. Поскольку концентрация пресепсина в образце нормального человека обычно составляет приблизительно от 50 до 300 пг/мл, было показано, что в измерительной системе с использованием F1146-17-2 измерение невозможно.
[00208]
Таблица 12
Концентрация пресепсина(нг/мл)
Антитело S68
F1466-5
F1466-26
F1466-16
F1466-12
F1466-19
F1146-17-2
0
0,022
0,019
0,025
0,021
0,013
0,014
0,02
0,03
0,316
0,253
0,472
0,112
0,144
0,27
0,022
0,1
0,723
0,684
1,197
0,321
0,465
0,791
0,022
3
1,897
2,326
2,292
1,598
1,915
2,12
0,021
30
2,026
2,217
2,34
1,743
1,99
2,319
0,03
1000
1,697
2,155
2,274
1,69
1,869
1,985
0,368
[00209] Пример 5: измерение образца от пациента и тест на мешающее действие
Значения пресепсина в образцах крови от 30 пациентов с сепсисом измеряли с помощью системы сэндвич-ELISA, описанной в примере 4, используя каждое антитело, полученное в примере 2, и анализировали их корреляцию со значениями измерения с помощью системы сэндвич-ELISA с использованием антитела S68.
[00210] Как результат, в каждой системе ELISA, в которой используют моноклональное антитело кролика, имели место два типа систем, одна система демонстрирует хорошую корреляцию со значением измерения с помощью ELISA системы, в которой используют антитело S68, а другая система демонстрирует слабую корреляцию. Результаты демонстрируют, что коэффициенты корреляции для моноклональных антител кролика F1466-12 и F1466-19 хуже по сравнению с другими. Коэффициенты корреляции соответствующих антител составляли F1466-12=0,89, F1466-19=0,93 и F1466-26=0,98.
[00211] Затем исследовали влияние мешающих веществ в крови (билирубин F, билирубин C, гемоглобин, ревматоидный фактор и триглицериды) на значение измерения пресепсина в системах сэндвич-ELISA, полученных с использованием каждого из моноклональных антител кролика и антитела S68, соответственно. Каждое из мешающих веществ в ступенчатых концентрациях добавляли в сыворотку здоровых добровольцев, которые содержали фиксированное количество пресепсина и измеряли концентрацию пресепсина, а также оценивали влияние каждого из мешающих веществ на значение измерения на основании значения измерения, когда мешающее вещество не добавляли.
[00212] Как результат, мешающее действие билирубина F, билирубина C, гемоглобина и ревматоидного фактора не достигает уровня проблемы в измерительных системах с использованием любого антитела.
[00213] С другой стороны, триглицериды (TG) оказывали влияние на измерительную систему с использованием некоторых антител. Тест на мешающее действие TG осуществляли, как описано ниже. Сыворотку человека от здоровых добровольцев, в которые добавляли определенное количество пресепсина, использовали в качестве образца. Образцы, разведенные последовательно до концентрации TG 20 мг/мл в образцах, получали с использованием 20% Intralipid transfusion (Fresenius SE & Co. KGaA). TG, исходно содержавшиеся в сыворотке образцов не учитывают при этой концентрации TG. Разведенные образцы дополнительно разводили в 20 раз раствором для разведения образцов и значение пресепсина измеряли посредством ELISA. Этот тест на мешающее действие TG осуществляли для множества образцов.
[00214] Как результат, добавление TG оказывало влияние на значение измерения пресепсина в измерительной системе, где используют антитела F1466-12 и F1466-19, и доля образца, демонстрирующего больше чем±20% степени расхождения значения измерения пресепсина, была высока, когда концентрация TG в образце составляла 20 мг/мл.
[00215] Кроме того, степень расхождения значения измерения пресепсина при концентрации TG в образце 20 мг/мл получали во множестве образцов, и усредненную степень расхождения вычисляли для каждого антитела. Как результат, усредненная степень расхождения демонстрирует±20% или меньше в измерительной системе, в которой используют антитела S68, F1466-5 и F1466-26.
[00216] С другой стороны, в измерительной системе, в которой используют антитела F1466-12, F1466-19 и F1466-16, результат усредненной степени расхождения превышал±20%.
[00217] Кроме того, степени диссоциации для значений измерения пресепсина посредством добавления TG сравнивали между аналитической системой, в которой используют каждое моноклональное антитело кролика, и аналитической системой, в которой используют антитело S68. Таким образом, когда концентрация TG в образце составляла 20 мг/мл за счет добавления TG, образцы, демонстрирующие больше чем 20% повторное представление как в разности между степенью диссоциации измерительной системы с F1466-12 и степенью диссоциации измерительной системы с антителом S68, так и разностью между степенью диссоциации измерительной системы с F1466-19 и степенью диссоциации измерительной системы с антителом S68, высоки.
[00218] Это предполагает возможность, что разность в эффективностях антител в тесте на мешающее действие TG оказывает влияние на корреляционный анализ, как описано выше.
[00219] Тест мешающего вещества пробовали для F1146-17-2, но данные не получали из-за низкой реактивности.
[00220] Пример 6: специфичность антитела; анализ эпитопа
Анализировали эпитопы каждого из моноклональных антител кролика и F1146-17-2, полученного в примере 2 (моноклональное антитело, полученное посредством иммунизации крысы пептидом S68).
[00221] Синтезировали 8 типов пептидов, состоящих из 10 аминокислот, содержащих частичный фрагмент пептидной последовательности SEQ ID № 2, которую использовали в качестве антигена для введения в примере 1 (см. таблицу 13). Последовательность эпитопа изучали посредством наблюдения реакции конкурентного ингибирования с эталонным стандартом пресепсина с использованием системы сэндвич-ELISA, описанной в примере 4. В частности, планшеты для иммобилизации каждого антитела получали в соответствии со способом, описанным в примере 4. Затем 400 пг/мл эталонного стандарта пресепсина и 20 мкг/мл синтетических пептидов, представленных в таблице 13 (с P01 до P08), добавляли в 25 мкл, соответственно, в планшеты и проводили реакцию. В качестве отрицательного контроля использовали пробу без добавления пептида (описано как PBS) и пептид для отрицательного контроля (описан как NC: последовательность CGDKTTATDIKGKE (SEQ ID № 34)). Кроме того, пептид S68 использовали в качестве положительного контроля. Развитее окраски в реакционной системе осуществляли с использованием TMB после завершения реакции. Если синтетический пептид, вступавший в реакцию с антителом, происходило снижение поглощения, поскольку ингибировали связывание эталонного стандарта пресепсина с антителом. Когда вычисляли степень ингибирования для каждого пептида, поглощение PBS брали за 100%.
[00222] В качестве результатов, антитело, распознающее только P03, антитело, распознающее от P03 до P04, и антитело, распознающее от P04 до P05, подтверждали, как показано в таблице 14. Кроме того, обнаружено, что F1146-17-2 распознавало от P04 до P05. В качестве результатов, обнаружено, что получали моноклональное антитело, распознающее местоположение P03 в качестве эпитопа. Обнаружено, что F1466-12 и F1466-19, которые демонстрировали более низкие результаты в тесте на мешающее действие TG и корреляцию с измерительной системой, в которой используют антитело S68, в примере 5, распознавали от P04 до P05 и не распознавали P03 в качестве эпитопа, аналогично моноклональному антителу крысы (F1146-17-2). Другие антитела распознавали P03 в качестве эпитопа. Это предполагает, что имеет место связь между подходящей способностью антитела измерять пресепсин и эпитопом, который это антитело распознает. Кроме того, пресепсин имеет аминокислотную последовательность, которая значительно дефицитна в C-концевой части sCD14 с высокой молекулярной массой, и полагают, что длина ее аминокислоты имеет вариацию. Возможно, что различие в специфичности антитела влияло на корреляцию со значением измерения с использованием антитела S68 в примере 5.
[00223]
Таблица 13
Местоположение аминокислоты в SEQ ID № 3
Аминокислотная последовательность
SEQ ID №
пептид S68
От положения 53 до положения 68
rvdadadprqyadtvk
2
P01
От положения 46 до положения 55
nlepflkrvd
35
P02
От положения 49 до положения 58
pflkrvdada
36
P03
От положения 52 до положения 61
krvdadadpr
1
P04
От положения 55 до положения 64
dadadprqya
37
P05
От положения 58 до положения 67
adprqyadtv
38
P06
От положения 61 до положения 70
rqyadtvkal
39
P07
От положения 64 до положения 73
adtvkalrvr
40
P08
От положения 67 до положения 76
vkalrvrrlt
41
[00224]
Таблица 14
F1466-5
F1466-26
F1466-16
F1466-12
F1466-19
F1146-17-2
P01
-
-
-
-
-
-
P02
-
-
-
-
-
-
P03
++
++
++
-
-
-
P04
-
-
++
++
++
++
P05
-
-
-
++
++
++
P06
-
-
-
-
-
-
P07
-
-
-
-
-
-
P08
-
-
-
-
-
-
S68
++
++
++
++
++
++
Остаточная реактивность (%)-:80% или больше, +:50% или больше и меньше чем 80%, ++ меньше чем 50%
[00225] Пример 7: детальный анализ эпитопа
В отношении моноклонального антитела кролика, распознающего пептид P03, изучали реактивность с пептидами, полученными посредством модификации пептида P03 на одну аминокислоту. Синтезировали пептиды (пептиды с P031 до P039), полученные посредством замены аминокислот от положения 53 до положения 61 на аланин (глицин, когда исходная аминокислота представляет собой аланин) на одну аминокислоту в пептиде P03 (соответствующем аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 и аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности от положения 52 до положения 61 в SEQ ID № 3), и реактивности между пептидами от P031 до P039 и антителом подтверждали посредством системы сэндвич-ELISA в соответствии с описанием в примере 4.
[00226] Как результат, утрачивали активность связывания с антителом, когда аспарагиновую кислоту в положении 59 в SEQ ID № 3 в пептиде P03 (соответствующем положению 8 в SEQ ID № 1) заменяли на аланин.
[00227] Активность связывания с антителом сохраняли, когда аминокислоты от положения 53 до положения 58 в SEQ ID № 3 (соответствующие аминокислотам от положения 2 до положения 7 в SEQ ID № 1), положении 60 и положении 61 в SEQ ID № 3 в пептиде P03 (соответствующие положению 9 и положению 10 в SEQ ID № 1) заменяли на аланин (или глицин).
[00228] Как описано выше, подтверждено, что антитело, распознающее пептид P03 в качестве эпитопа, распознает пептиды в качестве эпитопа, эти пептиды получали посредством замены аминокислот от положения 53 до положения 58, в положении 60 и положении 61, описанных в SEQ ID № 3, в пептид P03 на аланин (или глицин) на одну аминокислоту.
[00229] Пример 8: получение варианта моноклонального антитела против пресепсина, полученного у кролика
На основании последовательности моноклональных антител против пресепсина, полученных у кролика, которые описаны в примере 1, получали варианты.
[00230] 8-(1) Анализ последовательности CDR
В результате анализа последовательности CDR пяти типов антител против пресепсина, которые получали в примере 1, предположили, что последовательность каждого антитела имеет последовательность, влияющую на активность антитела, и последовательность, не влияющую на активность антитела. Таким образом, используя в качестве основы последовательность CDR антитела F1466-26, которое представляет собой одно из антител, для которых четко продемонстрировано распознавание последовательности P03 (SEQ ID № 1) в качестве эпитопа в примере 6, модификацию аминокислоты в каждой последовательности CDR осуществляли для того, чтобы получать вариант, и оценивали активность варианта. Получали приблизительно 100 вариантов. Модификацию аминокислоты осуществляли посредством замены, инсерции или делеции аминокислоты или замены последовательности с несколькими аминокислотами.
[00231] Вариант, содержащий полноразмерную тяжелую цепь антитела F1466-26 и полноразмерную легкую цепь антитела F1466-5 также получали и оценивали аналогичным образом, как приведено выше.
[00232] 8-(2) Получение плазмиды для получения модифицированного продукта тяжелой цепи
Плазмиду для модифицированного продукта тяжелой цепи получали следующим образом. Несмотря на то, что описания приведены для плазмиды pTK-5793, другие плазмиды также конструировали в соответствии с тем же способом. Используя в качестве матрицы плазмиду для временной экспрессии тяжелой цепи (pTK-5605), содержащую полноразмерную тяжелую цепь из F1466-26, полученного в примере 2, и пару праймеров (IgG кролика (14-12)-e: 3'-концевой праймер и Aor13HI-IgV2 кролика: 5'-концевой праймер), осуществляли ПЦР. Также используя амплифицированный фрагмент, полученный в качестве матрицы, и пару праймеров (IgG кролика (14-12)-e и Aor13HI-IgV2 кролика), осуществляли ПЦР. Амплифицированный фрагмент, полученный в ней, клонировали в плазмиду pT7-Blue и затем фрагмент, содержащий желаемую последовательность, получали с использованием рестрикционного фермента Aor13HI. Кроме того, pTK-4273 (производства компании авторов изобретения), имеющую промотор EF-1α и энхансер CMV, и дополнительную генную последовательность, содержащую другие части, отличные от вариабельной области тяжелой цепи IgG кролика, которая представляет собой вектор для временной экспрессии в клетках млекопитающих, расщепляли рестрикционным ферментом Aor13HI для того, чтобы получать фрагмент вектора. Полученный фрагмент, который содержит желаемую последовательность, клонировали во фрагмент вектора для того, чтобы получать pTK-5793.
[00233] 8-(3) Получение плазмиды для получения модифицированного продукта легкой цепи
Плазмиду для модифицированного продукта легкой цепи получали следующим образом. Несмотря на то, что описания приведены для плазмиды pTK-5844, другие плазмиды также конструировали в соответствии с тем же способом. Используя в качестве матрицы плазмиду для временной экспрессии легкой цепи (pTK-5608), содержащую полноразмерную легкую цепь F1466-26, полученного в примере 2, и пару праймеров (pEF2ce-28: 3'-концевой праймер и pEF2ce-49: 5'-концевой праймер), осуществляли ПЦР. Также используя амплифицированный фрагмент, полученный в качестве матрицы, и пару праймеров (pEF2ce-28 и pEF2ce-49), осуществляли ПЦР. Амплифицированный фрагмент, полученный в ней, клонировали в плазмиду pT7-Blue и затем фрагмент, содержащий желаемую последовательность, получали с использованием рестрикционных ферментов BamHI и XbaI. Кроме того, pTK-2433 (производства компании авторов изобретения), который представляет собой вектор для временной экспрессии в клетках млекопитающих, расщепляли рестрикционными ферментами BamHI и XbaI для того, чтобы получать фрагмент вектора. Полученный фрагмент, который содержит желаемую последовательность, клонировали во фрагмент вектора для того, чтобы получать pTK-5844.
[00234] Последовательность праймеров
IgG кролика (14-12)-e: 5' GGG GGT CCG GAG GTC GCC TGG TCA CGC CTG G 3'(SEQ ID № 85)
Aor13HI-IgV2 кролика: 5' GGG TCC GGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3'(SEQ ID № 86)
pEF2ce-28: 5' TTC ATT CTC AAG CCT CAG AC 3'(SEQ ID № 87)
pEF2ce-49: 5' TTT TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT 3'(SEQ ID № 88)
[00235] 8-(4) Получение рекомбинантного антитела во временной экспрессирующей системе
Ниже в настоящем документе в качестве репрезентативного примера представлен способ временной экспрессии антитела с использованием плазмиды pTK-5793 для получения модифицированного продукта тяжелой цепи. Плазмиду (pTK-5793) для получения модифицированного продукта тяжелой цепи, которую получали в примере 8-(2), и плазмиду (pTK-5608) для временной экспрессии легкой цепи, которая описана в примере 8-(3), смешивали в одинаковых количествах и трансфицировали ими клетки COS-1 (ATCC: CRL-1650) с использованием реактива для трансфекции (FuGENE (зарегистрированный товарный знак) 6, Promega KK). В частности, используя Opti-MEM (зарегистрированный товарный знак) Reduced Serum Medium (производства Life Technologies) в качестве жидкости для разведения, реактив для трансфекции и плазмиду получали в концентрации 0,96 мкл/25 мкл и 0,48 мкг/25 мкл, соответственно. После смешивания и добавления в среду, их добавляли к клеткам COS-1, которые затем культивировали при 37°C. После культивирования в течение 72 часов собирали культуральный супернатант.
[00236] Подобно приведенному выше, плазмиду для получения каждого модифицированного продукта тяжелой цепи использовали после смешивания с плазмидой (pTK-5608) для временной экспрессии легкой цепи. Плазмиду для получения каждого модифицированного продукта легкой цепи использовали после смешивания с плазмидой (pTK-5605) для временной экспрессии тяжелой цепи. Модифицированный продукт, содержащий полноразмерную тяжелую цепь антитела F1466-26 и полноразмерную легкую цепь антитела F1466-5, получали посредством смешивания с pTK-5605 и плазмидой для временной экспрессии легкой цепи, которая содержит полноразмерную легкую цепь F1466-5.
[00237] Пример 9: оценка варианта (1)
Шестнадцать типов вариантов (антител IgG), которые получали посредством экспрессии в клетках COS-1 в примере 8, очищали и оценивали реактивность c пресепсином, специфичность и аффинность (значение KD) каждого антитела.
[00238] 9-(1) Очистка антитела
Культуральный супернатант клеток COS-1, полученных в 8-(4), собирали и фильтровали через 0,22 мкм фильтр (Sterivac, Merck Millipore). Полученный культуральный супернатант очищали с использованием Prosep vA (Merck Millipore). Элюат, содержащий очищенный продукт, концентрировали и впоследствии диализировали против D-PBS (pH 7,4). Концентрацию белка получали способом Лоури с использованием IgG (BioRad Laboratories, Inc.) в качестве стандарта. Полученное антитело анализировали с помощью SDS-PAGE. Как результат, определяли рекомбинантное антитело, дающее одну полосу приблизительно 150 кДа.
[00239] 9-(2) Получение rsCD14ST-Fc во временной экспрессирующей системе
Сначала, используя в качестве матрицы pTK356H (TB64) (плазмиду, которая имеет последовательность, кодирующую rsCD14, который описан в примере 13 из WO 2005/108429), пару праймеров (hCD14-a, hCD14-d) и Taq-полимеразу (TAKARA BIO INC.), осуществляли реакцию ПЦР. Амплифицированный фрагмент, полученный в ней (содержащий последовательность распознавания тромбина ниже по направлению считывания относительно последовательности от положения 1 до положения 64 в sCD14 человека, которая содержит сигнальную последовательность и сайт рестрикционного фермента на обоих концах) использовали для TA клонирования в вектор pT7Blue (Merck Millipore). После подтверждения последовательности, ее использовали в качестве pTK-3047. Затем фрагмент, полученный посредством расщепления pTK-3047 рестрикционными ферментами EcoRI и BamHI, вставляли во фрагмент вектора, который получали предварительно посредством рестрикции pTK-2233 (плазмиды для экспрессии в клетках млекопитающих, которая содержит последовательность, кодирующую Fc-область тяжелой цепи из тяжелой цепи антитела IgG1, полученного у человека) с использованием EcoRI и BamHI, и полученный клон использовали в качестве pTK-3053.
[00240]
Последовательность hCD14-a 5'-GGGAATTCGCCGCCACCATGGAGCGCGCGTCCTGC-3' (SEQ ID №:89)
Последовательность hCD14-d 5'-GGGATCCACGCGGAACCAGAGCATACTGCCGCGGG-3' (SEQ ID №:90)
[00241] Клетки COS-1 (ATCC: CRL-1650) трансфицировали плазмидой pTK-3053 для временной экспрессии для экспрессии rsCD14ST-Fc. В частности, реактив для трансфекции и плазмиду смешивали друг с другом по 2 мкл/мл и 4 мкг/мл, соответственно. После смешивания и добавления в среду, их добавляли к клеткам COS-1, которые затем культивировали при 37°C. После культивирования в течение 72 часов, собирали культуральный супернатант и дополнительно туда добавляли свежую среду. После культивирования в течение 96 часов, культуральный супернатант собирали и фракции, полученные при двух сборах, смешивали и фильтровали через 0,22 мкм фильтр (Sterivac, Merck Millipore). Полученный культуральный супернатант очищали с использованием Prosep vA (Merck Millipore). Элюат, содержащий очищенный продукт, концентрировали и впоследствии диализировали против D-PBS (pH 7,4). Концентрацию белка получали способом Лоури с использованием BSA (BioRad Laboratories, Inc.) в качестве стандарта. Полученный rsCD14ST-Fc анализировали посредством SDS-PAGE. Как результат, определяли одну полосу с молекулярной массой приблизительно 75 кДа. Активность связывания полученного rsCD14ST-Fc с антителом против пресепсина определяли посредством ELISA, в котором антиген иммобилизуют на твердой фазе.
[00242] 9-(3) Создание сэндвич-ELISA
Используя вариант, который очищали в 9-(1), создавали сэндвич-ELISA. В частности, каждый вариант иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование. Затем, посредством добавления стандартного продукта пресепсина (от 0 до 300 пг/мл), реакцию в планшете проводили в течение одного часа при 25°C. Впоследствии, планшет промывали пять раз в физиологическом растворе, содержащем 0,05% Tween 20. Затем раствор, содержащий разведенное F1106-13-3 F(ab')2-HRP, добавляли в каждую лунку и реакции позволяли протекать в течение 2 часов при 25°C. Аналогичным образом, после промывания планшета пять раз, добавляли раствор TMB и реакции позволяли протекать в течение 20 минут при комнатной температуре. После выполнения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение при 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов.
[00243] 9-(4) Оценка специфичности (1)
Для того чтобы оценивать специфичность варианта, который очищали в 9-(1), ELISA осуществляли с использованием планшета, на котором иммобилизовали пептид P03 (SEQ ID № 1, полученный в примере 6). Для сравнения также осуществляли оценку F1466-26.
В частности, BSA или пептид P03-BSA иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование.
[00244] На основании результата концентрации белка, который получали в 9-(1), выполняли разведение в D-PBS и получали препарат, который содержит 500 нг/мл. Каждый разведенный раствор добавляли в количестве 50 мкл на лунку и реакции позволяли протекать в планшете в течение одного часа. Впоследствии, планшет промывали пять раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween 20. Затем раствор, в котором разводили антитело против Ig кролика, конъюгированное с HRP (DAKO, P448), добавляли в каждую лунку и реакции позволяли протекать в течение одного часа при комнатной температуре. Аналогичным образом, после промывания планшета, добавляли раствор TMB и реакции позволяли протекать в течение от 3 до 5 минут при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов (Molecular Devices). Результаты представлены в таблицах с 16 до 22 вместе с модифицированной последовательностью CDR для конкретного варианта.
[00245] Как результат, обнаружено, что 87% вариантов связываются с пептидом P03 и, таким образом, демонстрировано, что они распознают участок P03 в качестве эпитопа. В частности, демонстрировано, что 5795, 5803, 5811, 5810, 5784, 5793, 5858, 5878, 5875, 5876, 5844, 5874 и 5684 распознавали участок P03 в качестве эпитопа среди полученных модифицированных продуктов.
[00246] 9-(5) Оценка аффинности
Оценивали аффинность (KD) варианта к пресепсину (использовали rsCD14ST-FC, полученный в 9-(2)), пептиду P03 и пептиду S68. Также аналогичным образом оценку выполняли для антитела S68, моноклонального антитела, полученного у крысы (F1146-17-2), и F1146-26.
[00247] Измерение аффинности осуществляли с использованием BIACORE3000 (GE Healthcare). На чипе CM5 (GE Healthcare), иммобилизовали каждое из rsCD14ST-Fc, P03-BSA и S68-BSA в соответствии с обыкновенным способом и добавляли серию разведений каждого антитела (от 1,6 до 1000 нМ) и определяли характер связывания для каждого антигена. Строили сенсограмму, и вычисляли равновесную константу диссоциации (KD) посредством получения константы скорости ассоциации (Ka) и константы скорости диссоциации (Kd).
[00248] Результат измерения аффинности (KD) антитела S68, моноклонального антитела, полученного у крысы, (F1146-17-2) и F1146-26 к rsCD14ST-FC представлен в таблице 15.
[00249] Как результат, обнаружено, что F1146-26 (значение KD 1,48E-09) имеет аффинность к пресепсину, которая приблизительно в раз выше, чем у антитела S68 (значение KD 1,08E-08) в единицах значения KD. Также обнаружено, что F1146-26 имеет аффинность к пресепсину (значение KD), которое приблизительно в десять тысяч раз выше, чем у моноклонального антитела, полученного у крысы (F1146-17-2: значение KD 1,08E-05).
[00250] Результат измерения аффинности (KD) каждого варианта для rsCD14ST-FC представлен в таблицах с 16 до 22, вместе с модифицированной последовательностью CDR. Как результат, обнаружено, что 80% вариантов имеет аффинность, которая больше или равна таковой у антитела S68. В соответствии с модификацией последовательности CDR в F1146-26 получали вариант (5810), имеющий аффинность к пресепсину (значение KD), которая приблизительно в одну тысячу раз выше, чем у F1146-26.
-8
[00251] Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой антитело, которое имеет более высокую аффинность антитела к пресепсину по сравнению с аффинностью антитела S68 к пресепсину. Когда сравнение выполняли в единицах значения KD, примеры предпочтительного антитела включали F1466-26 и 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844 и 5684 в качестве варианта. Кроме того, антитело, демонстрирующее значение KD антитела меньше чем 10, также является благоприятным, и также отмечены F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784, 5793, 5858, 5844 и 5684. Кроме того, антитело, имеющее превосходную аффинность к пресепсину посредством пресепсина, демонстрирующее значение KD, которое составляет 1/2 или меньше от значения KD антитела S68, также является предпочтительным, и также отмечали F1466-26, 5795, 5803, 5810, 5784 и 5793. В частности, превосходное значение KD демонстрировали 5793 (7,3E-10) и 5810 (6,52E-12).
[00252] Обнаружено, что вариант 5684, в котором комбинируют полноразмерную тяжелую цепь из F1146-26 и полноразмерную легкую цепь из F1146-5, сохраняет специфичность к P03 и активность связывания с пресепсином. Поскольку F1146-26 и F1146-5 представляют собой антитела, которые распознают один и тот же участок P03 в качестве участка эпитопа, демонстрировано, что активность антитела возможно сохранять, даже когда выполняют замену последовательностей между антителами, обладающими одинаковой специфичностью.
[00253] Как показано в примере 2, какая-либо одна из последовательности CDR3 тяжелой цепи из F1146-5 и F1146-26, которая распознает P03 в качестве эпитопа, представляет собой GDF и состоит из относительно короткой последовательности, то есть трех аминокислот. По существу, полагают, что это является характеристикой данного антитела.
[00254] Кроме того, поскольку увеличение аффинности наблюдали в варианте 5793 в соответствии с модификацией 3-й в CDR3 тяжелой цепи, демонстрировали, что 3-я в последовательности CDR3 тяжелой цепи, возможно, оказывает эффект на активность антитела.
[00255]
Таблица 15
Антитело
Эпитоп
rsCD14ST-Fc (KD)
Антитело S68
1,08E-08
F1466-17-2 (крыса)
P04-05
1,08E-05
F1146-26 (кролик)
P03
1,48E-09
[00256]
Таблица 16 - CDR1 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR1 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(KD)
F1466-26
R
Y
T
M
G
0,822
1,48E-09
5795
A
2,480
1,71E-09
5803
S
1,631
4,20E-09
5811
A
1,030
1,13E-08
[00257]
Таблица 17 - CDR2 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR2 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(KD)
F1466-26
I
I
N
S
G
A
T
Y
Y
A
S
W
A
K
G
0,822
1,48E-09
5810
A
2,048
6,52E-12
В 5810 A вставляли между I во 2-й и N в 3-й.
[00258]
Таблица 18 - CDR3 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR3 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(KD)
F1466-26
G
D
F
0,822
1,48E-09
5784
A
1,018
3,73E-09
5793
A
0,881
7,30E-10
5794
A
A
A
0,582
4,06E-07
[00259]
Таблица 19 - CDR1 легкой цепи модифицированной области
Антитело
CDR1 VL
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(KD)
F1466-26
Q
A
S
Q
S
I
G
S
N
L
A
0,822
1,48E-09
5858
A
0,946
9,04E-09
5878
S
N
Y
2,327
1,43E-08
5879
S
I
Y
0,352
8,42E-07
[00260]
Таблица 20 - CDR2 легкой цепи модифицированной области
Антитело
CDR2 VL
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(KD)
F1466-26
K
A
S
K
L
A
S
0,822
1,48E-09
5875
T
T
E
1,038
1,96E-08
5876
T
T
D
0,657
1,97E-06
[00261]
Таблица 21 - CDR3 легкой цепи модифицированной области
Антитело
CDR3 VL
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(KD)
F1466-26
Q
C
S
Y
T
A
I
G
N
Y
G
H
V
0,822
1,48E-09
5844
A
0,677
9,82E-09
5874
S
E
S
T
T
F
2,108
1,95E-08
В 5844 A вставляли между N в 9-й и Y в 10-й.
[00262]
Таблица 22 - Полноразмерная легкая цепь в модифицированной области
Антитело
VL
P03 (OD)
rsCD14ST-FC (KD)
F1146-26
-
0,822
1,48E-09
5684
-
1,137
7,37E-09
[00263] 9-(6) Оценка специфичности (2) -реакция конкурентного ингибирования пептидом
Согласно примеру 6, осуществляли тест на реакцию конкурентного ингибирования пептидами от P01 до P08 для реакции между каждым вариантом и пресепсином.
Тест осуществляли с использованием ELISA, в котором вариант иммобилизуют в твердой фазе. В частности, вариант иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование. Затем стандарт пресепсина (300 пг/мл) добавляли в каждую лунку в количестве 25 мкл на лунку. Впоследствии каждый пептид, который разводили (от 0,01 до 10 мкг/мл) добавляли в количестве 25 мкл. Реакции позволяли протекать в планшете в течение одного часа при 25°C. Впоследствии, планшет промывали пять раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween 20. Затем раствор, в котором разводят F1106-13-3 F(ab')2-HRP, добавляли в каждую лунку в количестве 50 мкл на лунку и реакции позволяли протекать в течение 2 часов при 25°C. Аналогичным образом, после промывания планшета пять раз, добавляли раствор TMB и реакции позволяли протекать в течение от 30 до 40 минут при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение при 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов. В качестве отрицательного контроля использовали образец без добавления пептида (описан как PBS). В качестве положительного контроля использовали пептид S68. Взяв поглощение PBS за 100%, вычисляли степень ингибирования каждого пептида. Как результат, все варианты, которые тестировали, подтверждали, что специфично распознают последовательность P03, как показано в таблице 23.
[00264]
Таблица 23
5793
5795
5803
5810
5811
5858
5874
P01
-
-
-
-
-
-
-
P02
-
-
-
-
-
-
-
P03
++
++
++
++
++
++
++
P04
-
-
-
-
-
-
-
P05
-
-
-
-
-
-
-
P06
-
-
-
-
-
-
-
P07
-
-
-
-
-
-
-
P08
-
-
-
-
-
-
-
S68
++
++
++
++
++
++
++
Остаточная реактивность (%)«-» 80% или больше, «+» 50% или больше и меньше чем 80%, «++» меньше чем 50%
[00265] Пример 10: оценка варианта (2)
Среди вариантов, полученных в примере 8, оценивали активность связывания для пресепсина и специфичность для варианта, который не оценивали в примере 9.
[00266] 10-(1) Измерение концентрации антитела с помощью ELISA
Для того, чтобы определять концентрацию IgG в культуральном супернатанте, полученном в примере 8-(4), концентрацию IgG измеряли с использованием сэндвич-ELISA. В частности, антитело против антител кролика (DAKO, Z196) иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование. Используя очищенное моноклональное антитело кролика в качестве стандарта, стандартный раствор от 100 до 1,56 нг/мл получали в соответствии с разведением с использованием буфера для разведения (0,1% BSA/D-PBS). Затем собранный культуральный супернатант разводили в буфере для разведения (0,1% BSA/D-PBS). Разведенный раствор культурального супернатанта или серию разведений стандарта добавляли в лунки и реакции позволяли протекать в течение одного часа в планшете. Впоследствии планшет промывали пять раз в физиологическом растворе, содержащем 0,05% Tween 20. Затем раствор, в котором разводили антитело против Ig кролика, конъюгированное с HRP (DAKO, P399) добавляли в каждую лунку и реакции позволяли протекать в течение одного часа при комнатной температуре. Аналогичным образом, после промывания планшета пять раз, раствор тетраметилбензидина (TMB, BioFix) добавляли и реакции позволяли протекать в течение 10 минут при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение на 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов (Molecular Devices). Концентрацию антител в каждом культуральном супернатанте измеряли с использованием калибровочной кривой, которую получали из серийного разведения стандарта концентрации.
[00267] 10-(2) Оценка активности связывания и специфичности к пресепсину
Для того чтобы оценивать активность связывания и специфичность к пресепсину у вариантов, осуществляли ELISA с использованием планшета, в котором антиген иммобилизуют на твердой фазе.
В частности, BSA, rsCD14ST-Fc или пептид P03-BSA иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование.
[00268] На основании результата концентрации IgG в культуральном супернатанте, выполняли разведение культурального супернатанта в D-PBS, чтобы иметь 500 нг/мл (для образца с низкой концентрацией антитела использовали исходный маточный культуральный супернатант). Каждый разведенный раствор супернатанта добавляли в количестве 50 мкл на лунку и реакции позволяли протекать в планшете в течение одного часа. Впоследствии, планшет промывали пять раз в физиологическом растворе, содержащем 0,05% Tween20. Затем раствор, в котором разводили антитело против Ig кролика, конъюгированное с HRP (DAKO, P448), добавляли в каждую лунку и реакции позволяли протекать в течение одного часа при комнатной температуре. Аналогичным образом, после промывания планшета, раствор TMB добавляли и реакции позволяли протекать в течение от 3 до 5 минут при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение на 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов (Molecular Devices).
[00269] Для сравнения также осуществляли оценку антитела S68 с оценкой активности связывания с пресепсином. Активность связывания с пресепсином представлена в виде коэффициента поглощения во время реакции между каждым антителом и rsCD14ST-Fc, когда поглощение во время реакции между антителом S68 и sCD14ST-Fc задавали равным 1. Вместе с модифицированной последовательностью каждого варианта, результаты представлены в таблицах с 24 до 29.
[00270] Как результат, обнаружено, что большинство антител связываются с пептидами P03 и, таким образом, демонстрировано, что участок P03 распознают 76% антител в качестве эпитопа.
[00271] Кроме того, обнаружено, что F1466-26 и большинство вариантов демонстрировали коэффициент поглощения, который выше приблизительно в 4-5 раз по сравнению с антителом S68, и, таким образом, они обладают превосходной активностью связывания с пресепсином. По сравнению со значением KD и коэффициентом поглощения F1466-26 для пресепсина, полагают, что значение KD этих антител будет на том же уровне, что и благоприятное значение KD антител, измеренных в примере 9.
[00272] Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой антитело, которое имеет активность связывания с пресепсином выше, чем у антитела S68. Например, в отношении поглощения, как описано в примерах, полагают, что предпочтительным является антитело, демонстрирующее поглощение выше, чем у антитела S68, предпочтительно антитело, демонстрирующее поглощение выше по меньшей мере в 2 раза, чем у антитела S68.
Антителом, которое демонстрирует, в качестве активности связывания с пресепсином, поглощение в 5 или больше раз превышающее поглощение антитела S68 и имеет особенно превосходное связывающее свойство, являлись 5934, 5935, 5939, 5944, 5808, 5809, 5824, 5979, 5980, 5983, 5984, 5987, 5988, 5860, 5864 и 5863 среди полученных антител, 5979, 5983, 5988 и 5864 демонстрировали поглощение 5,5 или больше раз превышающее поглощение антитела S68 и имели особенно в частности превосходную активность связывания с пресепсином среди них.
[00273]
Таблица 24 - CDR1 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR1 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
R
Y
T
M
G
2,314
4,9
5932
M
2,194
4,3
5933
P
2,244
4,8
5934
V
2,281
5,1
5935
I
2,237
5,0
5937
D
2,200
4,5
5938
E
2,221
4,5
5939
H
2,207
5,0
5940
T
2,199
4,8
5941
Q
2,257
4,0
5942
Y
2,252
4,9
5943
G
2,253
4,6
5944
K
2,258
5,0
5945
N
2,177
4,1
5946
W
2,214
4,5
5804
D
A
L
N
0,033
1,1
[00274]
Таблица 25 - CDR2 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR2 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
I
I
N
S
G
A
T
Y
Y
A
S
W
A
K
G
2,314
4,9
5807
A
2,253
4,3
5808
A
2,267
5,3
5809
A
2,296
5,1
5812
G
2,269
4,5
5824
VSSD
G
I
2,269
5,3
5825
YAGG
S
0,028
0,5
5826
YRNIK
T
2,277
4,4
5827
SDIDQIV
T
1,849
4,2
5841
SDIDDLF
2,169
4,3
[00275]
Таблица 26 - CDR3 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR3 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
G
D
F
2,314
4,9
5912
T
0,027
0,3
5914
Q
1,345
1,7
5918
E
0,023
0,2
5920
L
1,498
3,1
5921
M
0,853
3,8
5922
P
0,038
0,2
5923
W
1,235
0,4
5924
Y
0,204
2,7
5926
S
2,301
4,4
5927
V
0,036
0,2
5928
D
0,033
0,2
5929
R
2,130
0,9
5976
F
2,204
4,7
5977
S
2,241
4,7
5978
P
2,288
4,6
5979
H
2,309
5,5
5980
I
2,293
5,3
5981
N
2,289
4,4
5982
R
2,251
4,7
5983
S
2,287
5,5
5984
P
2,186
5,1
5985
H
2,317
4,9
5986
D
2,346
4,4
5987
I
2,357
5,2
5988
N
2,337
5,6
5989
R
2,342
4,5
[00276]
Таблица 27 - CDR1 легкой цепи модифицированной области
Антитело
CDR1 VL
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
Q
A
S
Q
S
I
G
S
N
L
A
2,314
4,9
5859
A
2,282
4,6
5860
G
2,248
5,2
5865
A
2,276
4,7
5864
A
2,253
5,7
5884
E
D
I
2,221
4,7
5885
E
R
R
N
W
S
1,549
3,8
5910
N
D
S
2,129
4,2
[00277]
Таблица 28 - CDR2 легкой цепи модифицированной области
Антитело
CDR2 VL
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
K
A
S
K
L
A
S
2,314
4,9
5862
A
2,211
4,4
5863
A
2,241
5,2
5877
T
2,210
4,6
[00278]
Таблица 29 - CDR3 легкой цепи модифицированной области
Антитело
CDR3 VL
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
Q
C
S
Y
T
A
I
G
N
Y
G
H
V
2,314
4,9
5842
A
2,313
4,7
5843
A
2,290
4,7
5861
A
2,235
4,5
5880
S
Y
G
G
S
S
L
Y
N
I
0,036
0,2
5882
G
A
N
A
0,023
0,2
5905
S
T
YRSTTT
N
0,031
0,2
5907
L
G
V
V
G
S
T
S
D
D
F
A
0,019
0,2
[00279] Пример 11: получение моноклонального антитела с использованием способа фагового дисплея, в котором используют синтетический пептид в качестве антигена
В отношении примера 1-(1), используя лимфоциты, которые брали у кролика, иммунизированного пептидом S68-KLH в качестве антигена для введения, моноклональное антитело получают в соответствии со способом фагового дисплея.
[00280] 11-(1) Создание иммунной фаговой библиотеки F(ab)
Согласно способу, описанному CARLOS F. BARBAS III, et. al, Phage Display A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press), общую РНК экстрагируют из лимфоцитов, полученных из селезенки, которую брали в примере 1-(1), с использованием реактива TRIZOL (Life Technologies). Затем с использованием SuperScript III First-Strand Synthesis System для RT-ПЦР (Life Technologies), синтезировали одноцепочечную кДНК. Из этой кДНК, с использованием праймера, специфичного к гену антитела кролика, о котором сообщали BARBAS III, et al., получали фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи. Используя амплифицированные фрагменты полученной вариабельной области тяжелой цепи кролика и CH1 тяжелой цепи человека в качестве матрицы, химерный фрагмент тяжелой цепи кролика/человека амплифицировали посредством ПЦР. Кроме того, используя амплифицированные фрагменты вариабельной области легкой цепи кролика (тип κ или тип λ) и константной области легкой цепи человека в качестве матрицы, амплифицировали химерный фрагмент легкой цепи кролика/человека. Используя эти полученные фрагменты химерной тяжелой цепи кролика/человека и химерной легкой цепи кролика/человека в качестве матрицы, наконец получали химерный Fab фрагмент кролика/человека. Затем, в соответствии с расщеплением pCDisplay-4 (Creative Biogene), которая представляет собой фагмиду для экспрессии антител, используя рестрикционные ферменты SacI и SpeI, получают фагмиду. Аналогичным образом, в соответствии с расщеплением химерного Fab фрагмента кролика/человека с использованием SacI и SpeI и инсерцией фрагмента кДНК в полученный таким образом фрагмент фагмиды, получают плазмиду для экспрессии фаговой библиотеки.
[00281] 11-(2) Получение раствора фага для фагового дисплея
Придерживаясь обыкновенного способа, штамм TG1 E. coli (Alient Technologies) трансформировали плазмидой, которую получали в 11-(1), и раствор, содержащий E. coli, инокулировали в планшет со средой LB с добавлением ампициллина. После культивирования при 37°C, сформированные колонии собирали для того, чтобы получать библиотеку E. coli. Часть библиотеки культивировали и, после добавления ампициллина и глюкозы в суспензию E. coli, ее культивировали при встряхивании в течение одного часа при 37°C. После этого их трансфицировали хелперным фагом M13KO7 (Life Technologies) и снова при встряхивании продолжали культивирование в течение одного часа. Клетки собирали с помощью центрифуги, и после удаления культурального раствора их суспендировали в 10 мл 2× культурального раствора YT, после чего следовало культивирование при встряхивании и 37°C. На следующие сутки культуральный супернатант отделяли посредством центрифуги и 8 мл супернатант переносили в другую пробирку. После добавления 2 мл раствора PEG/NaCl следовало смешивание, его выполняли на льду в течение одного часа. Затем преципитированный фаг собирали посредством центрифуги и использовали в качестве раствора фага для фагового дисплея.
[00282] 11-(3) Отбор целевого антитела способом пэннинга
Из раствора фага, полученного в 11-(2), антитело отбирают способом пэннинга. Пэннинг осуществляют в соответствии с двумя типами способа. Первый способ осуществляют в соответствии со способом BARBAS et. al. В частности, S68-BSA иммобилизуют на твердой фазе на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следует блокирование. После добавления, в количестве 50 мкл на лунку, D-PBS, который содержит 4% снятое молоко и 0,2% TritonX-100, туда добавляют 50 мкл раствора фага, полученного в 11-(2). Реакцию проводят в планшете в течение одного часа. Впоследствии, его промывают в D-PBS, содержащем 0,1% TritonX-100. Затем выполняют элюирование в течение 10 минут с использованием 100 мМ глицин-HCl (pH 2,2) и полученный раствор нейтрализуют 1 M Tris-HCl (pH 7,4). Элюат и штамм TG1 E. coli смешивают друг с другом и проводят реакцию при 37°C. Штамм TG1 снова трансфицируют фагом, связанным с пептидным антигеном S68. В культуральный раствор добавляют ампициллин и хелперный фаг M13K07. После их реакции при 37°C, E. coli собирают, чтобы добавить к ним среду и канамицин, и культивируют в течение ночи. Из культурального раствора собирают супернатант посредством центрифуги и получают раствор фага посредством обработки PEG. Повторяя одну и ту же процедуру три раза, концентрируют фаг, специфично связывающийся с пептидом S68.
[00283] В качестве второго способа, пэннинг также осуществляют три раза с использованием способа, описанного в примере 12-(2), чтобы концентрировать фаг со специфичностью к пресепсину.
[00284] 11-(4) Измерение активности связывания антитела и интерпретация последовательности CDR
Культуральный раствор TG1 из 11-(3), который трансфицировали фагом, инокулировали в планшет LB, содержащий ампициллин, чтобы формировать колонии. Из каждой колонии снова получали раствор фага и определяли реактивность посредством ELISA. В частности, каждое из BSA, S68-BSA, P03-BSA и sCD14ST-Fc иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование. После добавления D-PBS, содержащего 4% снятое молоко и 0,2% TritonX-100, в него добавляли собранный раствор фага. Реакцию проводили в планшете в течение одного часа. Впоследствии планшет промывали пять раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween20. Затем раствор, в котором разводили HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate (GE Healthcare), добавляли в каждую лунку и реакцию проводили в течение одного часа при комнатной температуре. Аналогичным образом, после промывания планшета пять раз, добавляли раствор TMB и реакцию проводили в течение от 10 до 20 минут при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение на 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов (ThermoMax, Molecular Devices). Как результат, подтверждали связывание для некоторых типов фага. Из этих колоний выделяли фагмиду и определяли последовательность.
[00285] В соответствии со способом фагового дисплея, получают антитело против пресепсина, которое специфически связывается с P03 и пресепсином и представляет собой последовательность, отличную от последовательности CDR, полученной гибридомным способом.
[00286] Пример 12: получение варианта последовательности CDR3 тяжелой цепи с использованием способа фагового дисплея
Поскольку ожидали, что последовательность CDR3 тяжелой цепи оказывает эффект на активность фермента, вариант последовательности CDR3 тяжелой цепи получали с использованием способа фагового дисплея и оценивали.
[00287] 12-(1) Получение модифицированного варианта последовательности CDR3 цепи VH с использованием способа фагового дисплея
Для того чтобы получать библиотеку случайных мутаций CDR3 VH, осуществляли ПЦР с использованием плазмиды pTK-5956, содержащей тяжелую цепь и легкую цепь F1466-26 в качестве матрицы, пару праймеров (p-nnk3-2s; 5' фосфорилированный-GGT NNK NNK NNK TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC T-3'(SEQ ID:91), p-nnk3-2a; 5' фосфорилированный-GCC ACA AAA ATA AGT GGC CGT GTC CTC GGT TGT CGG ACT G-3'(SEQ ID:92) (N обозначает любое одно из G, A, T, и C, и K обозначает G или T)) и термостабильную ДНК полимеразу (TAKARA BIO INC.). Амплифицированный фрагмент, полученный из них лигировали с самим собой с использованием ДНК лигазы. Получаемое трансформировали в E. coli XL1-Blue (Agilent Technologies) и культивировали на чашке с агаром, содержащей LB/ампициллин/тетрациклин. На следующие сутки образовавшиеся колонии собирали с использованием 2× культурального раствора YT. В суспензию E. coli, добавляли ампициллин, тетрациклин и глюкозу и культивирование осуществляли в течение одного часа при 37°C при встряхивании. После этого его трансфицировали хелперным фагом M13KO7 (Life Technologies) и снова культивировали при встряхивании в течение одного часа. Клетки собирали посредством центрифуги и после удаления культурального раствора, их суспендировали в 10 мл 2× культурального раствора YT, после чего следовало культивирование при встряхивании при 32°C. На следующие сутки культуральный супернатант отделяли посредством центрифуги и 8 мл супернатанта переносили в другую пробирку. После добавления 2 мл раствора PEG/NaCl, после чего следовало смешивание, ее держали на льду в течение одного часа. Затем преципитированный фаг собирали посредством центрифуги и использовали в качестве раствора фага библиотеки случайных мутаций CDR3 VH.
[00288] 12-(2) Отбор целевого антитела способом пэннинга
С использованием библиотеки, полученной в 12-(1), пэннинг осуществляли для того, чтобы отбирать антитело. В частности, проводили реакцию раствора фага (2 мл), полученного в 12-(1), и 6 мкг sCD14ST-Fc при 37°C. Двумя часами позже туда добавляли 200 мкл смолу на основе белка A (Prosep-vA, Merck Millipore), после чего следовала реакция в течение 20 минут. После промывания пять раз в PBS, содержащем 0,05% Tween20, в смолу добавляли элюент (Tris-HCl, Глицин (pH 2,2)) и держали 8 минут. Затем собирали элюированный раствор фага и нейтрализовали раствор. Собранный раствор и культуральный раствор E. coli XL-1 Blue смешивали друг с другом и проводили реакцию при 37°C. Через один час туда добавляли L-глутамин, ампициллин и хелперный фаг M13K07 (Invitrogen) и реакции позволяли протекать при 37°C. Снова, через один час среду заменяли на 2× среду YT, после чего следовало культивирование в течение ночи. Таким образом, собирали фаги, которые специфично связывались с rsCD14ST-Fc. Повторяя одну и ту же процедуру три раза, концентрировали целевое антитело.
[00289] 12-(3) Получение фага, содержащего специфичную к пресепсину последовательность, и определение последовательности CDR
XL-1 Blue снова трансфицировали раствором фага, в конечном счете полученного в 12-(2), и культуральный супернатант инокулировали в 2× среду YT для того, чтобы получать колонию. Получаемую колонию снова культивировали с XL-1 Blue и, посредством добавления хелперного фага, получали раствор фага, содержащего один фаг. Затем, используя полученный раствор фага, подтверждали реактивность на основании ELISA. В частности, sCD14ST-Fc иммобилизовали на планшете, а именно IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование. Раствор фага разводили (×2) с использованием D-PBS, содержащего 4% снятое молоко и 0,2% TritonX-100, и реакции позволяли протекать в планшете в течение одного часа. Впоследствии, планшет промывали пять раз в физиологическом растворе, содержащем 0,05% Tween 20. Затем раствор, в котором разводили HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate (GE Healthcare), добавляли в количестве 50 мкл на лунку и реакции позволяли протекать в течение одного часа при комнатной температуре. Аналогичным образом, после промывания планшета пять раз, добавляли раствор TMB и реакции позволяли протекать при комнатной температуре. После завершения реакции, реакцию останавливали с использованием 1 M раствора серной кислоты. Поглощение на 450/650 нм измеряли с использованием считывателя планшетов (ThermoMax, Molecular Devices). Затем E. coli трансфицировали раствором фага с подтвержденной активностью связывания, и после сбора плазмиды в соответствии с обыкновенным способом, определяли генную последовательность.
[00290] 12-(4) Получение антитела IgG
Из полученных фагов-кандидатов собирали фагмиду и получали фрагмент, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи. В соответствии со способом, описанным в примере 8, получали плазмиду для получения варианта тяжелой цепи. Затем ее использовали для трансфекции клеток COS-1, вместе с плазмидой (pTK-5608) для временной экспрессии легкой цепи, содержащей полноразмерную легкую цепь F1466-26. Клетки COS-1 культивировали при 37°C. Через 72 часа собирали культуральный супернатант.
[00291] 12-(5) Оценка варианта последовательности CDR3 тяжелой цепи
Полученный вариант подвергали тому же тесту, что и в примере 10-(2) с тем, чтобы оценивать активность связывания с пресепсином (rsCD14ST-Fc) и специфичность к P03. Результаты представлены в таблице 30, вместе с последовательностью CDR модифицированной тяжелой цепи CDR3.
[00292] Как результат, вариант 6027, в котором заменяли 3 аминокислоты CDR3 тяжелой цепи, демонстрировал слегка пониженную реактивность к пресепсину по сравнению с другими вариантами. Однако по сравнению с антителом S68 он демонстрировал почти ту же реактивность. Варианты 6026, 6028 и 6029 демонстрировали превосходную реактивность для пресепсина, даже несмотря на то, что заменяли две аминокислоты. На основании этих результатов, демонстрировано, что активность антитела возможно сохранять даже когда CDR3 тяжелой цепи состоит из трех аминокислот и две его аминокислоты заменяют. Вариант 6028 демонстрировал особенно превосходную активность связывания с пресепсином.
[00293]
Таблица 30 - CDR3 тяжелой цепи модифицированной области
Антитело
CDR3 VH
P03(OD)
rsCD14ST-Fc(OD)
Антитело S68
1,0
F1466-26
G
D
F
1,516
4,9
6026
V
L
1,542
4,6
6027
S
N
C
1,382
0,9
6028
G
E
1,531
5,5
6029
L
H
1,576
5,1
[00294] Пример 13: тест на мешающее действие триглицеридов (TG)
Согласно примеру 5 и пример 6, продемонстрировано, что TG в образце без труда мешает измерению пресепсина с использованием антитела, которое распознает P04-05 в качестве эпитопа, но TG едва ли мешает измерению пресепсина с использованием антитела, которое распознает P03 в качестве эпитопа.
[00295] 13-(1) Тест на мешающее действие TG (1) с использованием сыворотки крови нормального человека
Для дополнительного подтверждения, определяли влияние TG на нормальный тестовый образец. Тест на мешающее действие TG осуществляли для F1466-26 (специфичность: P03), F1466-5 (P03) и F1466-19 (P04-05) с использованием сыворотки крови нормального человека.
[00296] В тестовый образец от нормального человека (8 образцов) (EDTA плазма крови, TENECEE BLOOD SERVICIES) добавляли TG до конечной концентрации 10 мг/мл и значение измерения пресепсина сравнивали до и после добавления. В отношении концентрации TG в это время, TG, исходно содержавшиеся в тестовом образце, не учитывали. Оценку выполняли с использованием планшета, в котором каждое антитело иммобилизовали на твердой фазе, и системы сэндвич-ELISA, описанной в примере 9-(3). Результаты представлены на фиг. 1.
[00297] Как результат, антитела F1466-26 и F1466-5, которые распознают P03 в качестве эпитопа, почти не демонстрировали изменения значения измерения до и после добавления TG. Однако добавление TG значительно влияло на значение измерения для антитела F1466-19, которое распознает P04-05 в качестве эпитопа. Ожидают, что, подобно F1466-19, измерение с использованием антитела, у которого на значение измерения пресепсина значительно влияют TG, присутствующие в тестируемом образце, демонстрирует высокое значение измерения для здорового человека, который обычно демонстрирует низкое значение. В этом случае, сложно иметь разницу между нормальным значение и анормальным значением. Таким образом, можно сказать, что такое антитело не подходит для измерения пресепсина в тестируемом образце. Между тем, подтверждено, что на антитело, которое распознает P03 в качестве эпитопа, едва ли влияют TG, присутствующие в тестируемом образце, и, таким образом, оно представляет собой антитело, подходящее для измерения пресепсина, присутствующего в тестируемом образце.
[00298] Кроме того, тест с использованием этой сыворотки нормального человека, подтверждает, что перекрестная реакция с sCD14 с высокой молекулярной массой ничтожна в аналитической системе с использованием антитела, распознающего P03 в качестве эпитопа.
[00299] В сыворотке нормального человека концентрация пресепсина составляет несколько сотен пг/мл, тогда как sCD14 с высокой молекулярной массой присутствует в концентрации приблизительно от 5,6 до 11,2 мкг/мл (WO 2005/108429, пример 12), и если антитело вступает в реакцию с sCD14 с высокой молекулярной массой, невозможно измерять незначительное количество пресепсина.
[00300] В соответствии с данным примером, подтверждено, что, в аналитической системе с использованием антитела, распознающего P03 в качестве эпитопа, не возникает перекрестная реакция с sCD14 с высокой молекулярной массой, и возможно измерять пресепсин в незначительном количестве приблизительно в несколько сотен пг/мл.
[00301] 13-(2) Тест на мешающее действие TG (2) с использованием варианта
Тест на мешающее действие TG осуществляли аналогичным образом, как в примере 5, для вновь полученных вариантов и определяли влияние TG, присутствующих в тестовом образце. Вариант использовали после очистки.
В частности, вариант иммобилизовали на IMMUNO PLATE (MAXISORP, C96, 430341) производства Nunc, после чего следовало блокирование. Разведение стандартного пресепсина выполняли с использованием буфера для разведения, чтобы получать серию концентраций пресепсина (от 15,6 до 500 пг/мл). В три типа тестовых образцов человека добавляли триглицериды (Intralipid, производства Fresenius Kabi Japan), чтобы иметь конечную концентрацию 6,7, 13,3 или 20 мг/мл. Что касается тестовых образцов человека, использовали один тестовый образец сыворотки крови, который получали от пациента с сепсисом, и два тестовых образца сыворотки, которые получали от нормального человека, и в них дополнительно добавляли определенное количество пресепсина. Кроме того, TG, которые исходно содержались в тестируемом образце, не учитывали в концентрации TG. Тестовый образец разводили (×20) с использованием буфера для разведения, и в каждую лунку добавляли образец, в который не добавляли TG или добавляли TG в каждой концентрации или серии разведений стандарта. Измерение осуществляли с использованием сэндвич-ELISA, подобно примеру 9-(3). Доля (%) тестового образца, который демонстрирует скорость диссоциации±20% или меньше для измерения пресепсина, когда концентрация TG составляет 20 мг/мл в тестируемом образце, показана в таблице 31.
Как результат, подтверждено, что триглицериды едва ли влияют антитело, распознающее P03 в качестве эпитопа.
[00302]
Таблица 31
Антитело
Эпитоп
Модифицированная область
Доля (%) тестового образца со скоростью диссоциации ±20% или меньше
5793
P03
CDR3
100
5795
P03
CDR1
100
5810
P03
CDR2
100
5803
P03
CDR1
100
5811
P03
CDR1
100
5826
P03
CDR2
100
5942
P03
CDR1
100
5945
P03
CDR1
100
[00303] Пример 14: список модифицированных продуктов с желаемыми свойствами
Последовательность CDR антител с желаемыми свойствами, которые получали в примерах 8 и 12 по настоящему изобретению, представлена на фиг. с 2 до 2-2 (от SEQ ID № 93 до SEQ ID №:156). Общее число антител, полученных в примерах 8 и 12, составляло 109, а число предпочтительных антител составляло 65.
-8
-9
-7
Антитела, обладающие аффинностью к пресепсину (значение KD) меньше чем 10 M, оценивали как  и антитела, обладающие аффинностью меньше чем 10 M, оценивали как . Антитела, обладающие значением KD меньше чем 10 M, но демонстрирующие аффинность, почти эквивалентную аффинности антитела S68 к пресепсину, оценивали как . В соответствии с оценкой значения KD, обнаружено, что антитела, которые обладают особенно превосходной активностью связывания с пресепсином, представляли собой варианты 5793 и 5810.
Активность связывания с пресепсином оценивали посредством коэффициента поглощения, полученного в реакции между каждым антителом и rsCD14ST-Fc против поглощения, полученного в реакции между антителом S68 и rsCD14ST-Fc, когда поглощение, полученное в реакции между антителом S68 и rsCD14ST-Fc, считали равным 1. Антитело с коэффициентом поглощения 4 или больше оценивали как  и антитело с коэффициентом поглощения 5,5 или больше оценивали как . В соответствии с оценкой на основании сравнения поглощения, обнаружено, что антитела, которое обладают особенно превосходной активностью связывания с пресепсином, представляли собой вариант 5864, 5979, 5983, 5988 и 6028.
[00304]
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
<120>  Новое антитело против пресепсина
<130>  MD1040WO,G1025WO
<150>  61/944,674
<151>  2014-02-26
<160>  156
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  1
Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg
1               5                   10
<210>  2
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  2
Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
<210>  3
<211>  356
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  3
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val
1               5                   10                  15
Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys
20                  25                  30
Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu
35                  40                  45
Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala
50                  55                  60
Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala Ala
65                  70                  75                  80
Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala Tyr
85                  90                  95
Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly Thr
100                 105                 110
Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser Leu
115                 120                 125
Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala Glu
130                 135                 140
Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln
145                 150                 155                 160
Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro Ala
165                 170                 175
Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg Gly
180                 185                 190
Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn Leu
195                 200                 205
Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ile Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala Ala
210                 215                 220
Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His Asn
225                 230                 235                 240
Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp Ser
245                 250                 255
Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln Val
260                 265                 270
Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys Asn
275                 280                 285
Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp Asn
290                 295                 300
Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser
325                 330                 335
Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala
340                 345                 350
Arg Gly Phe Ala
355
<210>  4
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  4
Arg Tyr Ala Met Gly
1               5
tag gta tgc aat ggg
<210>  5
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  5
Ile Ile Tyr Arg Asn Ile Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
atc att tat aga aat att aag aca tac tac gcg acc tgg gcc aaa ggc
<210>  6
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  6
Gly Asp Phe
1
ggg gac ttt
<210>  7
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  7
Arg Tyr Thr Met Gly
1               5
tag gta tac aat ggg
<210>  8
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  8
Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
atc att aat agt ggt gcc aca tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc
<210>  9
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  9
Gly Asp Phe
1
ggg gac ttt
<210>  10
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  10
Ser Phe Trp Met Ser
1               5
tag ctt ctg gat gag
<210>  11
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  11
Ile Ile Ser Asp Ile Asp Asp Leu Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
att att agt gat att gat gac cta ttc tac gcg agc tgg gcg aaa ggc
<210>  12
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  12
Gly Gly Leu
1
ggt ggt ttg
<210>  13
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  13
Ser Tyr Asp Met Ile
1               5
agc tac gac atg atc
<210>  14
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  14
Tyr Ile Gly Ser Pro Gly Thr Thr Tyr Tyr Gly Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
tac att ggg agt ccc ggg acc aca tac tac ggg agc tgg gcg aaa ggc
<210>  15
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  15
Ser Gly Asp Ile Thr Asn Arg Phe Asn Leu
1               5                   10
tct ggt gat att act aat aga ttt aac ttg
<210>  16
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  16
Asn Tyr Asp Met Ile
1               5
aac tac gac atg atc
<210>  17
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  17
Tyr Ile Gly Ser Pro Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
tac att ggg agt ccc ggg acc act tac tac gcg agc tgg gcg aaa ggc
<210>  18
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  18
Ser Gly Asp Ile Thr Asn Arg Phe Asn Leu
1               5                   10
tct ggt gat atc aca aat aga ttt aat ttg
<210>  19
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  19
Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ile Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
cag gcc agt gag gat att att agt aat tta gcc
<210>  20
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  20
Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1               5
aag gca tcc act ctg gca tct
<210>  21
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  21
Gln Ser Ser Tyr Thr Glu Ser Thr Thr Phe Gly His Val
1               5                   10
cag agc agt tat act gag agt act act ttt gga cat gtt
<210>  22
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  22
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
cag gcc agt cag agt att ggt agt aat tta gcc
<210>  23
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  23
Lys Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1               5
aag gca tct aaa ctg gca tct
<210>  24
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  24
Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Gly His Val
1               5                   10
caa tgc agt tat act gca att ggt aat tat gga cat gtt
<210>  25
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  25
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
cag gcc agt cag agc att agt aac tac tta gcc
<210>  26
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  26
Lys Thr Ser Thr Leu Glu Ser
1               5
aag aca tcc act ctg gaa tct
<210>  27
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  27
Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Thr Thr Tyr Gly Asn Thr
1               5                   10
caa agt act tat tat agg agt act aca act tat ggt aat act
<210>  28
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  28
Gln Ala Ser Glu Arg Ile Arg Asn Trp Leu Ser
1               5                   10
cag gcc agt gag agg att agg aat tgg tta tcc
<210>  29
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  29
Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser
1               5
agg gcc tcc act cta gaa tct
<210>  30
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  30
Gln Cys Ser Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn Ala
1               5                   10
caa tgt agt gct ggt ggc aat gct ggt aat gct
<210>  31
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  31
Gln Ala Ser Glu Arg Ile Arg Asn Trp Leu Ser
1               5                   10
cag gcc agt gag agg att agg aat tgg tta tcc
<210>  32
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  32
Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser
1               5
agg gcc tcc act cta gaa tct
<210>  33
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  33
Gln Cys Ser Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn Gly
1               5                   10
caa tgt agt gct ggt ggc aat gct ggt aat ggt
<210>  34
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  34
Cys Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu
1               5                   10
<210>  35
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  35
Asn Leu Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp
1               5                   10
<210>  36
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  36
Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala
1               5                   10
<210>  37
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  37
Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala
1               5                   10
<210>  38
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  38
Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val
1               5                   10
<210>  39
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  39
Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu
1               5                   10
<210>  40
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  40
Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg
1               5                   10
<210>  41
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens (человек)
<400>  41
Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr
1               5                   10
<210>  42
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus (крыса)
<400>  42
Asp Tyr Phe Met Asn
1               5
<210>  43
<211>  19
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus (крыса)
<400>  43
Gln Ile Arg Asn Lys Asn Tyr Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
1               5                   10                  15
Leu Glu Gly
<210>  44
<211>  4
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus (крыса)
<400>  44
Thr Phe Asp Cys
1
<210>  45
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus (крыса)
<400>  45
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1               5                   10                  15
<210>  46
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus (крыса)
<400>  46
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  47
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus (крыса)
<400>  47
Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  48
<211>  29
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  48
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
20                  25
<210>  49
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  49
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1               5                   10
<210>  50
<211>  30
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  50
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile
1               5                   10                  15
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val
20                  25                  30
<210>  51
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  51
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  52
<211>  29
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  52
Gln Ser Val Glu Gly Ser Arg Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn
20                  25
<210>  53
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  53
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1               5                   10
<210>  54
<211>  31
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  54
Arg Tyr Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  55
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  55
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  56
<211>  43
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  56
Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu
20                  25                  30
Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys
35                  40
<210>  57
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  57
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  58
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  58
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  59
<211>  44
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  59
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
20                  25                  30
Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro
35                  40
<210>  60
<211>  23
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  60
Asp Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys
20
<210>  61
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  61
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  62
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  62
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  63
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  63
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Lys Gly Lys
1               5                   10
<210>  64
<211>  48
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (15)..(16)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (42)..(42)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (45)..(46)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  64
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Ser Xaa Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20                  25                  30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Xaa Ser Gly Xaa Xaa Leu Ser
35                  40                  45
<210>  65
<211>  48
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  65
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Ser Xaa Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20                  25                  30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35                  40                  45
<210>  66
<211>  48
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (15)..(16)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  66
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20                  25                  30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
35                  40                  45
<210>  67
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (11)..(12)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  67
Trp Val Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Xaa Ile Gly
1               5                   10
<210>  68
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  68
Trp Val Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1               5                   10
<210>  69
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  69
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  70
<211>  31
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (6)..(8)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (30)..(31)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  70
Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ser Thr Thr Xaa Asp Leu Lys Xaa
1               5                   10                  15
Thr Ser Xaa Thr Thr Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Xaa Xaa
20                  25                  30
<210>  71
<211>  31
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (31)..(31)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  71
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Xaa Thr Thr Val Asp Leu Lys Xaa
1               5                   10                  15
Thr Ser Xaa Thr Thr Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Xaa
20                  25                  30
<210>  72
<211>  31
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (7)..(8)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  72
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Xaa Xaa Ser Thr Thr Xaa Asp Leu Lys Met
1               5                   10                  15
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Gly
20                  25                  30
<210>  73
<211>  37
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  73
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala
1               5                   10                  15
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser
20                  25                  30
Thr Val Thr Leu Gly
35
<210>  74
<211>  46
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (23)..(25)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (35)..(37)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  74
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Xaa Xaa Xaa Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20                  25                  30
Ser Val Xaa Xaa Xaa Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys
35                  40                  45
<210>  75
<211>  46
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (25)..(25)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (35)..(37)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  75
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Xaa Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20                  25                  30
Ser Val Xaa Xaa Xaa Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys
35                  40                  45
<210>  76
<211>  45
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  76
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20                  25                  30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys
35                  40                  45
<210>  77
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  77
Trp Xaa Gln Gln Lys Xaa Gly Gln Pro Pro Lys Xaa Leu Ile Xaa
1               5                   10                  15
<210>  78
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  78
Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  79
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  79
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Xaa Leu Ile Xaa
1               5                   10                  15
<210>  80
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (1)..(3)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (6)..(7)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (21)..(23)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (28)..(29)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (31)..(31)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  80
Xaa Xaa Xaa Ser Arg Xaa Xaa Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Xaa
1               5                   10                  15
Leu Thr Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Ala Asp Ala Xaa Xaa Tyr Xaa Cys
20                  25                  30
<210>  81
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (28)..(28)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  81
Gly Val Xaa Ser Arg Xaa Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Xaa
1               5                   10                  15
Leu Thr Xaa Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Xaa Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  82
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  82
Val Phe Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Ser Cys
20                  25                  30
<210>  83
<211>  32
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (29)..(29)
<223>  Xaa может представлять собой любую аминокислоту, встречающуюся в природе
<400>  83
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Xaa Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  84
<211>  36
<212>  Белок
<213>  Oryctolagus cuniculus (кролик)
<400>  84
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
20                  25                  30
Val Thr Ile Val
35
<210>  85
<211>  31
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  85
gggggtccgg aggtcgcctg gtcacgcctg g                                      31
<210>  86
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  86
gggtccggag gagacggtga ccagggtgcc                                        30
<210>  87
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  87
ttcattctca agcctcagac                                                   20
<210>  88
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  88
ttttcactgc attctagttg tggt                                              24
<210>  89
<211>  35
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  89
gggaattcgc cgccaccatg gagcgcgcgt cctgc                                  35
<210>  90
<211>  35
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  90
gggatccacg cggaaccaga gcatactgcc gcggg                                  35
<210>  91
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (4)..(5)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (7)..(8)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  смешанный признак
<222>  (10)..(11)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<400>  91
ggtnnknnkn nktggggcca aggcaccctg gtcaccgtct                             40
<210>  92
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Синтез
<400>  92
gccacaaaaa taagtggccg tgtcctcggt tgtcggactg                             40
<210>  93
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  93
Ala Asp Phe
1
<210>  94
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  94
Gly Asp Ala
1
<210>  95
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  95
Arg Tyr Ala Met Gly
1               5
<210>  96
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  96
Ser Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  97
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  97
Ile Ile Ala Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  98
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  98
Ala Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  99
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  99
Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Ala Tyr Gly His Val
1               5                   10
<210>  100
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  100
Gln Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  101
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  101
Gln Ser Ser Tyr Thr Glu Ser Thr Thr Phe Gly His Val
1               5                   10
<210>  102
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  102
Lys Thr Ser Thr Leu Glu Ser
1               5
<210>  103
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  103
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  104
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  104
Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Ala Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  105
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  105
Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Ala Gly
1               5                   10                  15
<210>  106
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  106
Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
<210>  107
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  107
Ile Ile Asn Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  108
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  108
Ile Val Ser Ser Asp Gly Gly Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  109
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  109
Ile Ile Tyr Arg Asn Ile Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  110
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  110
Ile Ile Ser Asp Ile Asp Gln Ile Val Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  111
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  111
Ile Ile Ser Asp Ile Asp Asp Leu Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>  112
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  112
Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Gly His Ala
1               5                   10
<210>  113
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  113
Gln Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Ala His Val
1               5                   10
<210>  114
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  114
Gln Ala Ala Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  115
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  115
Gln Gly Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  116
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  116
Ala Cys Ser Tyr Thr Ala Ile Gly Asn Tyr Gly His Val
1               5                   10
<210>  117
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  117
Lys Ala Ser Lys Ala Ala Ser
1               5
<210>  118
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  118
Lys Ala Ala Lys Leu Ala Ser
1               5
<210>  119
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  119
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Ala Ala
1               5                   10
<210>  120
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  120
Ala Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  121
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  121
Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1               5
<210>  122
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  122
Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ile Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  123
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  123
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Asp Leu Ser
1               5                   10
<210>  124
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  124
Leu Asp Phe
1
<210>  125
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  125
Ser Asp Phe
1
<210>  126
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  126
Met Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  127
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  127
Pro Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  128
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  128
Val Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  129
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  129
Ile Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  130
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  130
Asp Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  131
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  131
Glu Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  132
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  132
His Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  133
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  133
Thr Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  134
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  134
Gln Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  135
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  135
Tyr Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  136
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  136
Gly Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  137
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  137
Lys Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  138
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  138
Asn Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  139
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  139
Trp Tyr Thr Met Gly
1               5
<210>  140
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  140
Gly Phe Phe
1
<210>  141
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  141
Gly Ser Phe
1
<210>  142
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  142
Gly Pro Phe
1
<210>  143
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  143
Gly His Phe
1
<210>  144
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  144
Gly Ile Phe
1
<210>  145
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  145
Gly Asn Phe
1
<210>  146
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  146
Gly Arg Phe
1
<210>  147
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  147
Gly Asp Ser
1
<210>  148
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  148
Gly Asp Pro
1
<210>  149
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  149
Gly Asp His
1
<210>  150
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  150
Gly Asp Asp
1
<210>  151
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  151
Gly Asp Ile
1
<210>  152
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  152
Gly Asp Asn
1
<210>  153
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  153
Gly Asp Arg
1
<210>  154
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  154
Gly Val Leu
1
<210>  155
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  155
Gly Gly Glu
1
<210>  156
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Синтез
<400>  156
Gly Leu His
1
<---