КОНЪЮГИРОВАННАЯ ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ПЕПТИДА АНТИГЕНА WT1
CONJUGATE VACCINE ON BASIS OF ANTIGEN WT1 PEPTIDE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001]
Настоящее изобретение принадлежит к области иммунотерапии рака и относится к конъюгированной вакцине, которая может быть подвергнута укорочению пептидазой ERAP1, получена конъюгированием пептидных предшественников, происходящих из белка антигена WT1, посредством ковалентной дисульфидной связи и эффективно индуцировать цитотоксические Т клетки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Для уничтожения раковых клеток в организме клеточный иммунитет, в частности, цитотоксическая Т-клетка (цитотоксический Т лимфоцит, цитотоксическая Т-клетка, в дальнейшем обозначаются CTL) в основном играет важную роль. CTL образуется путем дифференцировки и пролиферации предшественника Т клетки, который узнает комплекс, образованный пептидом антигена, происходящим из белка ракового антигена (пептид ракового антигена), и молекулой МНС I класса, и атакует раковые клетки.
[0003]
Раковый супрессорный ген опухоли Вильмса, WT1 (ген WT1) рассматривают в качестве нового белка ракового антигена лейкемии и солидных опухолей (смотри не являющийся патентным документ 1).
[0004]
Что касается белка WT1, например, представленные ниже пептиды ракового антигена, которые связываются с молекулами МНС I класса и представляются ими, уже опубликованы (смотри документы патента 1, 2).
126-134
Пептид WT1: RMFPNAPYL (Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu) (SEQ ID NO: 2),
235-243
Пептид WT1: CMTWNQMNL (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu) (SEQ ID NO: 3),
10-18
Пептид WT1: ALLPAVPSL (Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Pro-Ser-Leu) (SEQ ID NO: 5),
187-195
Пептид WT1: SLGEQQYSV (Ser-Leu-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val) (SEQ ID NO: 6),
302-310
Пептид WTl: RVPGVAPTL (Arg-Val-Pro-Gly-Val-Ala-Pro-Thr-Leu) (SEQ ID NO: 7) и тому подобное.
[0005]
В иммунотерапии рака активация клетки Т хелпера также важна для активации других Т клеток, включая CTL. В целом, белок антигена распадается под действием внутриклеточной лизосомы, часть пептидных фрагментов, образованной пептидами, состоящими приблизительно из 13-17 аминокислотных остатков, связывается в качестве пептида антигена с молекулой МНС II класса и презентируется комплексу TCR клетки Т-хелпера⋅CD3 для активации клетки Т-хелпера. Что касается белка WT1, например, представленные ниже пептиды ракового антигена, которые презентируются путем связывания с МНС II класса были уже опубликованы (смотри документы патента 1-3).
332-347
Пептид WT1: KRYFKLSHLQMHSRKH (Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His) (SEQ ID NO: 8),
328-349
Пептид WT1: PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (Pro-Gly-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His-Thr-Gly) (SEQ ID NO: 10),
122-140
Пептид WT1: SGQARMFPNAPYLPSCLES (Ser-Gly-Gln-Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser-Cys-Leu-Glu-Ser) (SEQ ID NO: 11) и тому подобное.
[0006]
В качестве вакцинного антигена WT1, в основном используется сам белок антигена или упомянутый выше пептид антигена, происходящий из белка антигена (смотри не относящийся к патенту документ 2). Поскольку противораковая вакцина с использованием белка, как правило, содержит различные пептиды ракового антигена, она может одновременно индуцировать множество CTL и клеток Т хелперов. С другой стороны, поскольку проблемы противораковой белковой вакцины связаны со стабильностью поставок и контролем качества, пептиды, которые облегчают продукцию и контроль качества, широко используются в качестве ракового антигена WT1. В целом, однако, поскольку общепринятые пептидные вакцины, в основном, образованы одним презентированным молекулой МНС I класса пептидным антигеном, в последние годы было отмечено, что эффективная индукция CTL требует дальнейшего совершенствования (смотри не относящийся к патенту документ 3).
[0007]
Одним из способов решения проблемы является мультивалентный антигенный пептид, представляющий собой пептидную противораковую вакцину WT1. В качестве такой пептидной противораковой вакцины были зарегистрированы коктейльная вакцина, содержащая смесь из множества пептидных антигенов, презентируемых молекулами МНС класса I и класса II (смотри не относящийся к патенту документ 4), длинноцепочечная пептидная вакцина, содержащая пептидные антигены, презентируемые молекулами МНС класса I и класса II, которые связаны амидной связью и тому подобное (смотри не относящийся к патенту документ 5). В случае коктейльной вакцины, однако, поскольку каждый пептидный антиген, состоящий из различных аминокислот, обладает различными свойствами, разработка оптимальной лекарственной формы, способной эффективно индуцировать CTL, соответствующие поставленной цели, зачастую проблематична. В случае длинноцепочечной пептидной вакцины, ее получение иногда сопряжено с рядом проблем как у белка. Более того, поскольку пептидные антигены, презентируемые молекулами класса I и II, связаны посредством какого-либо пептидного спейсера в длинноцепочечной пептидной вакцине, контроль и прогнозирование сайтов расщепления внутриклеточным ферментом затруднительны. В то же время, о димере пептида, в котором два мономера пептида взаимосвязаны дисульфидной связью, уже сообщалось (смотри документ патента 6). В отличие от коктейльной вакцины, два отдельных пептида связаны, и, следовательно, они обладают одним физическим свойством и могут быть беспрепятственно произведены. С другой стороны, для образования конъюгата, пептиды ракового антигена WT1 должны содержать цистеин в их аминокислотной последовательности, и, следовательно, их применение ограничено. Кроме того, измененное соединение, полученное конденсацией N-концевого цистеина пептида ракового антигена с цистеином, глутатионом или тиогликолевой кислотой дисульфидной связью также было опубликовано (смотри документ патента 7).
[0008]
Процесс презентации пептида ракового антигена на молекулах МНС I класса включает в себя множество пептидаз. Среди таких пептидаз, аминопептидаза 1 эндоплазматического ретикулума (в дальнейшем именуемая ERAP1) является одним из ферментов укорочения в эндоплазматическом ретикулуме (в дальнейшем упоминается как ER), и, как сообщалось, распознает определенную последовательность пептида антигена и длину пептида, и расщепляет предшественника пептида ракового антигена с N-конца для контроля длины, оптимальной для связывания с молекулами МНС I класса (смотри не относящиеся к патенту документы 6-8). Однако, на сегодняшний день, нет ни одного сообщения о предшественнике пептидного ракового антигена WT1, содержащем цистеин, длина которого контролируется с N-конца с помощью функции укорочения ERAP1.
[ПЕРЕЧЕНЬ ДОКУМЕНТОВ]
[ДОКУМЕНТЫ ПАТЕНТА]
[0009]
Документ 1 патента: WO 00/06602
Документ 2 патента: WO 00/18795
Документ 3 патента: WO 2005/045027
Документ 4 патента: WO 2007/047764
Документ 5 патента: WO 2007/120673
Документ 6 патента: WO 2004/063217
Документ 7 патента: WO 2007/063903
[НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ]
[0010]
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 1: The Journal of Immunology, 2000; 164(4); 1873-1880
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 2: The Oncologist, 2012; 17(2); 250-259
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 3: Cancer Journal, 2011; 17(5); 343-350
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 4: Blood, 2010; 166(2); 171-179
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 5: Cancers, 2011; 3; 3991-4009
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 6: Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 2005; 102(47); 17107-17112
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 7: The Journal of Immunology, 2009; 183; 5526-5536
НЕПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ 8: The Journal of Immunology, 2 010; 184; 4725-4732
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011]
Задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в создании конъюгированной вакцины WT1, которая эффективно индуцирует CTL.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
[0012]
Авторы настоящего изобретения выполнили интенсивные исследования в попытке решить вышеупомянутую проблему, и, рассматривая внедрение в практику конъюгированной вакцины, сформулировали идею добавления цистеина в пептид ракового антигена WT1, и также подтвердили, что результаты фармакологических и им подобных тестов с использованием модели на животных in vivo, убедительно показывают, что ERAP1 расщепляет цистеин с N-конца предшественника пептида ракового антигена WT1, который образуется путем внутриклеточного восстановительного расщепления дисульфидной связи, чтобы эффективно преобразовывать то же самое в пептид ракового антигена, который в свою очередь привел к выявлению поливалентного антигенного пептида, представляющего конъюгированную вакцину, способную индуцировать CTL в организме, и завершению настоящего изобретения.
Более конкретно, в процессе изучения способов решения вышеуказанной проблемы, они получили представление о методе введения цистеина, который необходим для образования конъюгата двух различных пептидов ракового антигена WT1, в любое положение N-конца или С-конца, не влияя на презентацию антигена молекулой МНС I класса. В результате дальнейшего исследования они создали пептид путем введения 0-5 аминокислот, содержащих цистеин, в N-конец пептида ракового антигена WT1, и конъюгат пептидов, содержащих дисульфидную связь посредством цистеина. Кроме того, авторы настоящего изобретения впервые подтвердили, что указанный пептид и конъюгат подвержены укорочению под действием ERAP1 in vitro и/или in vivo, которые, в свою очередь, приводят к образованию пептида ракового антигена и, таким образом, осуществили настоящее изобретение.
Несмотря на то, что была запланирована разработка нового поливалентного антигенного пептида WT1, представляющего пептидную противораковую вакцину, которая может быть легко получена, применима в разных областях и индуцирует CTL с высокой эффективностью, конъюгат, изобретенный авторами настоящего изобретения, позволил осуществить разработку конъюгированной вакцины WT1, которая эффективно индуцирует CTL, обладает лучшими физико-химическими свойствами, может быть легко получена, облегчает управление производством, и применима в различных областях.
[0013]
Соответственно, настоящее изобретение относится к следующему.
[0014]
1. Первый вариант осуществления изобретения
[0015]
1. Соединение, представленное формулой (1):
[0016]
[0017]
а
a
а
a
a
в которой Х и Y каждый независимым образом представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков, и общее количество аминокислотных остатков для Х и количество аминокислотных остатков для Y является целым числом от 0 до 4, пептид А ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида А ракового антигена связывается с Y в формуле (1), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида А ракового антигена связывается с гидроксильной группой в формуле (1),
1
R представляет собой атом водорода, группу, представленную формулой (2):
[0018]
[0019]
b
b
b
b
b
1
в которой X и Y каждый независимым образом представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков, и общее количество аминокислотных остатков для X и количество аминокислотных остатков для Y представляет собой целое число 0-4, пептид В ракового антигена имеет последовательность, отличную от пептида А ракового антигена, и является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида В ракового антигена связывается с Y в формуле (2), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида В ракового антигена связывается с гидроксильной группой в формуле (2), и тиоэфирная группа в формуле (2) связывается с тиоэфирной группой в формуле (1), или пептид С ракового антигена, где пептид С ракового антигена имеет последовательность, отличную от пептида А ракового антигена, и является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, или рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, и тиоэфирная группа остатка цистеина в пептиде С ракового антигена связывается с тиоэфирной группой в формуле (1), при условии, что R представляет собой атом водорода, последовательность соединения, представленного формулой (1), не совпадает с частью последовательности белка WT1, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0020]
а
a
а
a
а
a
а
a
а
a
а
a
2. Соединение по пункту 1, в котором Х является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 2 аминокислотных остатков, и Y представляет собой одинарную связь, или Х и Y каждый независимым образом представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или Х представляет собой одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 2 аминокислотных остатков, или Х представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка и Y представляет собой одинарную связь, или Х представляет собой одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или Х и Y каждый обозначает одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0021]
а
a
3. Соединение по пункту 1 или 2, в котором Х представляет собой одинарную связь, и Y представляет собой одинарную связь, остаток аланина, остаток лейцина или остаток метионина, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0022]
а
a
4. Соединение по пункту 1 или 2, в котором Х представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или фармацевтически приемлемая соль вышеперечисленного;
[0023]
а
a
5. Соединение по любому из пунктов 1-4, в котором Х и Y каждый представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0024]
6. Соединение по любому из пунктов 1-5, в котором пептид А ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0025]
7. Соединение по любому из пунктов 1-6, в котором пептид А ракового антигена является пептидом, содержащим любую аминокислотную последовательность, выбранную из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), или
пептидом, содержащим измененную аминокислотную последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка (ов), и обладающие индуцирующей CTL активностью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0026]
8. Соединение по любому из пунктов 1-7, в котором пептид А ракового антигена является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0027]
1
9. Соединение по любому из пунктов 1-8, в котором R является атомом водорода, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0028]
10. Соединение по любому из пунктов 1-9, в котором соединение, представленное формулой (1), является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13),
CCMTWNQMNL (SEQ ID NO: 14),
CCYTWNQMNL (SEQ ID NO: 15),
CALLPAVPSL (SEQ ID NO: 16),
CSLGEQQYSV (SEQ ID NO: 17) и
CRVPGVAPTL (SEQ ID NO: 18),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0029]
1
11. Соединение по любому из пунктов 1-8, в котором R является группой, представленной формулой (2), или его фармацевтически приемлемая соль;
[0030]
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
12. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11, в котором X является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 2 аминокислотных остатков, и Y представляет собой одинарную связь, или X и Y каждый независимым образом обозначает двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X представляет собой одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 2 аминокислотных остатков, или X представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или X представляет собой одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X и Y каждый является одинарной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0031]
b
b
13. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-12, в котором X представляет собой одинарную связь, и Y представляет собой одинарную связь, остаток аланина, остаток лейцина или остаток метионина, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0032]
b
b
14. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-12, в котором X представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0033]
b
b
15. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-14, в котором X и Y каждый является одинарной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0034]
16. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-15, в котором пептид В ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0035]
17. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-16, в котором пептид В ракового антигена представляет собой пептид, содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), или
пептид, содержащий измененную аминокислотную последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и имеющая индуцирующую CTL активность, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0036]
18. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-17, в котором пептид В ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0037]
19. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-18, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (3):
[0038]
[0039]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0040]
1
20. Соединение по любому из пунктов 1-8, в котором R является пептидом С ракового антигена или его фармацевтически приемлемая соль;
[0041]
21. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 20, в котором пептид С ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0042]
22. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 20-21, в котором пептид С ракового антигена представляет собой пептид, содержащий приведенную ниже аминокислотную последовательность:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3), или
пептид, содержащий измененную аминокислотную последовательность, которая является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающая индуцирующей CTL активность, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0043]
23. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 20-22, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) и
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0044]
24. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 20-23, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (4):
[0045]
[0046]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или соединением, представленным формулой (5):
[0047]
[0048]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью,
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0049]
25. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 20, в котором пептид С ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 14-30 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0050]
26. Соединение по любому из пунктов 1-8, 20 и 25, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, содержащим любую аминокислотную последовательность, выбранную из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), или
пептидом, содержащим измененную аминокислотную последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 10-11 и 19-24, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающей индуцирующей клетки Т хелперов активностью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0051]
27. Соединение по любому из пунктов 1-8, 20 и 25-26, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0052]
28. Соединение по любому из пунктов 1-8, 20 и 25-27, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (6):
[0053]
[0054]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, соединением, представленным формулой (7):
[0055]
[0056]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, соединением, представленным формулой (8):
[0057]
[0058]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или
соединением, представленным формулой (9):
[0059]
[0060]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0061]
29. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пунктов 1-28, или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель;
[0062]
30. Фармацевтическая композиция по пункту 29, которая используется в качестве противораковой вакцины;
[0063]
31. Применение соединения по любому из пунктов 1-28 или его фармацевтически приемлемой соли для производства противораковой вакцины;
[0064]
32. Способ лечения или профилактики рака, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества соединения по любому из пунктов 1-28 или его фармацевтически приемлемой соли больному раком, положительному по WT1, нуждающемуся в данном лечении; и
[0065]
33. Способ получения двух разных рестриктированных молекулой МНС I класса эпитопов или рестриктированного молекулой МНС I класса эпитопа и рестриктированного молекулой МНС II класса эпитопа, включающий взаимодействие соединения по любому из пунктов 1-28 или его фармацевтически приемлемой соли с ERAP1.
[0066]
2. Второй вариант осуществления изобретения
[0067]
1. Соединение, представленное формулой (1):
[0068]
[0069]
а
a
а
a
a
в которой Х и Y каждый независимым образом представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков, общее количество аминокислотных остатков для Х и количество аминокислотных остатков для Y является целым числом от 0 до 4, пептид А ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида А ракового антигена связывается с Y в формуле (1), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида А ракового антигена связывается с гидроксильной группой в формуле (1),
1
R представляет собой атом водорода, группу, представленную формулой (2):
[0070]
[0071]
b
b
b
b
b
1
в которой X и Y каждый независимым образом представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков, и общее количество аминокислотных остатков для X и количество аминокислотных остатков для Y является целым числом от 0 до 4, пептид В ракового антигена имеет последовательность, отличную от последовательности пептида А ракового антигена, и является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида В ракового антигена связывается с Y в формуле (2), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида В ракового антигена связывается с гидроксильной группой в формуле (2), и тиоэфирная группа в формуле (2) связывается с тиоэфирной группой в формуле (1), или пептид С ракового антигена, в котором пептид С ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, отличным по последовательности от пептида А ракового антигена и состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, или рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, и тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида С ракового антигена связывается с тиоэфирной группой в формуле (1), при условии, что R представляет собой атом водорода, последовательность соединения, представленного формулой (1), не совпадает с частью последовательности белка WT1, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0072]
а
a
а
a
а
a
а
a
а
a
а
a
2. Соединение по пункту 1, в котором Х является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 2 аминокислотных остатков и Y представляет собой одинарную связь, или Х и Y каждый независимым образом представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или Х представляет собой одинарную связь и Y является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 2 аминокислотных остатков, или Х является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 1 аминокислотного остатка и Y представляет собой одинарную связь, или Х представляет собой одинарную связь и Y является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 1 аминокислотного остатка, или Х и Y каждый обозначает одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0073]
а
a
3. Соединение по пункту 1 или 2, в котором Х представляет собой одинарную связь, и Y представляет собой одинарную связь, аланиновый остаток, лейциновый остаток или метиониновый остаток, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0074]
а
a
4. Соединение по пункту 1 или 2, где Х представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0075]
а
a
5. Соединение по любому из пунктов 1-4, в котором Х и Y каждый обозначает одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0076]
6. Соединение по любому из пунктов 1-5, в котором пептид А ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0077]
7. Соединение по любому из пунктов 1-6, в котором пептид А ракового антигена представляет собой пептид, содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), или
пептид, содержащий измененную аминокислотную
последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающий индуцирующей CTL активностью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0078]
8. Соединение по любому из пунктов 1-7, в котором пептид А ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0079]
1
9. Соединение по любому из пунктов 1-8, в котором R обозначает атом водорода, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0080]
10. Соединение по любому из пунктов 1-9, в котором соединение, представленное формулой (1), является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13),
CCMTWNQMNL (SEQ ID NO: 14),
CCYTWNQMNL (SEQ ID NO: 15),
CALLPAVPSL (SEQ ID NO: 16),
CSLGEQQYSV (SEQ ID NO: 17) и
CRVPGVAPTL (SEQ ID NO: 18),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0081]
1
11. Соединение по любому из пунктов 1-8, в котором R обозначает группу, представленную формулой (2), или его фармацевтически приемлемая соль;
[0082]
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
12. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11, в котором X обозначает двухвалентную пептидную группу, состоящей из 2 аминокислотных остатков, и Y обозначает одинарную связь, или X и Y каждый независимым образом представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X представляет собой одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 2 аминокислотных остатков, или X обозначает двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или X обозначает одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X и Y каждый обозначает одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0083]
b
b
13. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-12, в котором X обозначает одинарную связь, и Y представляет собой одинарную связь, аланиновый остаток, лейциновый остаток или метиониновый остаток, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0084]
b
b
14. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-12, в котором X представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0085]
b
b
15. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-14, в котором X и Y каждый обозначает одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0086]
16. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-15, в котором пептид В ракового антигена представляет собой рестриктированный молекулой МНС I класса пептид WT1, состоящий из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0087]
17. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-16, в котором пептид В ракового антигена представляет собой пептид, содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), или
пептид, содержащий измененную аминокислотную последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающий индуцирующей CTL активностью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0088]
18. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-17, в котором пептид В ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0089]
19. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-18,
в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (3):
[0090]
[0091]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0092]
b
20. Соединение по пункту 13, в котором Y представляет собой аланиновый остаток или его фармацевтически приемлемая соль;
[0093]
21. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 11-13 и 20, в котором когда пептид В ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, содержащим один цистеиновый остаток, тиоэфирная группа в пептиде В ракового антигена связана с тиоэфирной группой в формуле (16):
[0094]
[0095]
d
d
d
d
d
в котором X и Y каждый независимым образом представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков, и общее количество аминокислотных остатков для X и количество аминокислотных остатков для Y является целым числом от 0 до 4, пептид D ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида D ракового антигена связывается с Y в формуле (16), а карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида D ракового антигена связывается с гидроксильной группой в формуле (16) или с тиоэфирной группой цистеинового остатка пептида Е ракового антигена, который является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0096]
22. Соединение по пункту 21, в котором пептид В ракового антигена представляет собой рестриктированный молекулой МНС I класса пептид WT1, состоящий из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0097]
23. Соединение по любому из пунктов 21-22, в котором пептид В ракового антигена является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) и
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0098]
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
24. Соединение по любому из пунктов 21-23, в котором X представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 2 аминокислотных остатков, и Y представляет собой одинарную связь, или X и Y, каждый независимым образом представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X представляет собой одинарную связь, и Y является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 2 аминокислотных остатков, или X представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка и Y представляет собой одинарную связь, или X представляет собой одинарную связь и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X и Y каждый представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0099]
d
d
25. Соединение по любому из пунктов 21-24, в котором X представляет собой одинарную связь, Y представляет собой одинарную связь, аланиновый остаток, лейциновый остаток или метиониновый остаток, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0100]
d
d
26. Соединение по любому из пунктов 21-24, в котором X представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из одного аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0101]
d
d
27. Соединение по любому из пунктов 21-26, в котором X и Y каждый представляет собой одинарную связь или его фармацевтически приемлемая соль;
[0102]
28. Соединение по любому из пунктов 21-27, в котором пептид D ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 14-30 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0103]
29. Соединение по любому из пунктов 21-28, в котором пептид D ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) и
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244), или его фармацевтически приемлемая соль;
[0104]
30. Соединение по любому из пунктов 1-8, 11-13 и 20-29, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (15):
[0105]
[0106]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0107]
31. Соединение по любому из пунктов 21-23, в котором пептид Е ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 14-30 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0108]
32. Соединение по любому из пунктов 21-23 и 31, в котором пептид Е ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), или его фармацевтически приемлемая соль;
[0109]
1
33. Соединение по любому из пунктов 1-8, в котором R представляет собой пептид С ракового антигена, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0110]
34. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 33, в котором пептид С ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0111]
35. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 33-34, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, содержащим представленную ниже аминокислотную последовательность:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3), или
пептидом, содержащим измененную аминокислотную последовательность, которая является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, но содержащая изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающая индуцирующей CTL активностью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0112]
36. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 33-35, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) и
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0113]
37. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 33-36, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (4):
[0114]
[0115]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или соединением, представленным формулой (5):
[0116]
[0117]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0118]
38. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 33, в котором, когда пептид, состоящий из 1-4 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, дополнительно связан с N-концом пептида С ракового антигена, тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида, связанного с N-концом пептида С ракового антигена присоединена к тиоэфирной группе в формуле (16):
[0119]
[0120]
d
d
d
d
d
в котором X и Y каждый независимым образом представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков, и общее количество аминокислотных остатков для X и количество аминокислотных остатков для Y является целым числом от 0 до 4, пептид D ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида D ракового антигена присоединена к Y в формуле (16), а карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида D ракового антигена присоединена к гидроксильной группе в формуле (16) или к тиоэфирной группе цистеинового остатка пептида Е ракового антигена, который является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0121]
39. Соединение по пункту 38, в котором пептид, состоящий из 1-4 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, связанный с N-концом пептида С ракового антигена, является дипептидом, состоящим из СА, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0122]
40. Соединение по любому из пунктов 38-39, в котором пептид С ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС I класса пептидом WT1, состоящим из 7-15 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0123]
41. Соединение по любому из пунктов 38-40, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) и
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0124]
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
42. Соединение по любому из пунктов 38-41, в котором X представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 2 аминокислотных остатков, и Y представляет собой одинарную связь, или X и Y каждый независимым образом представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, или X представляет собой одинарную связь, и Y представляет собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из 2 аминокислотных остатков, или X является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 1 аминокислотного остатка и Y представляет собой одинарную связь, или X представляет собой одинарную связь и Y является двухвалентной пептидной группой, состоящей из 1 аминокислотного остатка, или X и Y каждый представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0125]
d
d
43. Соединение по любому из пунктов 38-42, в котором X представляет собой одинарную связь, и Y представляет собой одинарную связь, аланиновый остаток, лейциновый остаток или метиониновый остаток, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0126]
d
d
44. Соединение по любому из пунктов 38-42, в котором X представляет собой одинарную связь или двухвалентную пептидную группу, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0127]
d
d
45. Соединение по любому из пунктов 38-4 4, в котором X и Y каждый представляет собой одинарную связь, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0128]
46. Соединение по любому из пунктов 38-45, в котором пептид D ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 14-30 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0129]
47. Соединение по любому из пунктов 38-46, в котором пептид D ракового антигена является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) и
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244)
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0130]
48. Соединение по любому из пунктов 38-47, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (14):
[0131]
[0132]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0133]
49. Соединение по любому из пунктов 38-41 и 44, в котором пептид Е ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24)
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0134]
50. Соединение по любому из пунктов 38-41 и 49, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (12):
[0135]
[0136]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0137]
51. Соединение по любому из пунктов 1-8 и 33, в котором пептид С ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС II класса пептидом WT1, состоящим из 14-30 аминокислотных остатков, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0138]
52. Соединение по любому из пунктов 1-8, 33 и 51, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, содержащим любую аминокислотную последовательность, выбранную из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), или
пептидом, содержащим измененную аминокислотную последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 10-11 и 19-24, но содержащая изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающая индуцирующей клетки Т хелперов активностью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0139]
53. Соединение по любому из пунктов 1-8, 33 и 51-52, в котором пептид С ракового антигена является пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0140]
54. Соединение по любому из пунктов 1-8, 33 и 51-53, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (6):
[0141]
[0142]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, соединением, представленным формулой (7):
[0143]
[0144]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, соединением, представленным формулой (8):
[0145]
[0146]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или соединением, представленным формулой (9):
[0147]
[0148]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0149]
55. Измененная форма рестриктированного молекулой МНС II класса пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков;
[0150]
56. Измененная форма по пункту 55, которая является представленной ниже аминокислотной последовательностью:
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) или
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243);
[0151]
57. Соединение, представленное формулой (10):
[0152]
[0153]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0154]
58. Композиция, включающая соединение, выбранное из группы, состоящей из соединения, представленного формулой (3):
[0155]
[0156]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, соединения, представленного формулой (4):
[0157]
[0158]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, и соединения, представленного формулой (5):
[0159]
[0160]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, и
пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из представленных ниже аминокислотных последовательностей:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) и
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243);
[0161]
59. фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пунктов 1-54 и 57, или его фармацевтически приемлемую соль, или композицию по пункту 58 и фармацевтически приемлемый носитель;
[0162]
60. Фармацевтическая композиция по пункту 59, которая используется в качестве противораковой вакцины;
[0163]
61. Применение соединения по любому из пунктов 1-54 и 57, или его фармацевтически приемлемой соли, или композиции по пункту 58 для получения противораковой вакцины;
[0164]
62. Способ лечения или профилактики рака, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества соединения по любому из пунктов 1-54 и 57 или его фармацевтически приемлемой соли или композиции по пункту 58 больному раком, положительному по WT1, нуждающемуся в таком лечении;
[0165]
63. Способ получения двух различных рестриктированных молекулой МНС класса I эпитопов, или рестриктированного молекулой МНС класса I эпитопа и рестриктированного молекулой МНС класса II эпитопа, включающий взаимодействие соединения по любому из пунктов 1-54 и 57 или его фармацевтически приемлемой соли с ERAP1; и
[0166]
64. Способ синтеза соединения, включающий следующие стадии:
(1) стадию синтеза, используя Fmoc-C(Mmt)A-SBn и пептид С ракового антигена, пептида, в котором связаны карбонильная группа С-концевой аминокислоты С(Mmt)А и N-концевая аминогруппа пептида С ракового антигена, в котором пептид С антигена является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, или рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина,
(2) стадию синтеза, используя пептид, полученный на вышеуказанной стадии (1), и пептид А ракового антигена, в котором один цистеиновый остаток, защищенный группой Npys, присоединен к N-концу, пептида, в котором тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида С ракового антигена в пептиде, полученном на вышеуказанной стадии (1), и тиоэфирная группа цистеинового остатка, присоединенного к N-концу пептида А ракового антигена, образуют связь, в котором пептид А ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, и
(3) стадию синтеза, используя пептид, полученный на вышеуказанной стадии (2), и пептид D ракового антигена, содержащий цистеиновый остаток, защищенный группой Spy, пептида, в котором тиоэфирная группа цистеинового остатка, присоединенного к N-концу пептида А ракового антигена в пептиде, полученном на вышеуказаной стадии (2), и тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида D ракового антигена образуют связь, в котором пептид D ракового антигена является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, присоединенный к N-концу или рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина,
[0167]
3. Третий вариант осуществления изобретения
[0168]
1. Соединение, представленное формулой (1):
[0169]
[0170],
а
a
в котором Х и Y каждый обозначает одинарную связь,
пептид А ракового антигена представляет собой пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7),
a
аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида А ракового антигена присоединена к Y в формуле (1), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты пептида А ракового антигена присоединена к гидроксильной группе в формуле (1),
1
R представляет собой пептид С ракового антигена,
пептид С ракового антигена имеет последовательность, отличную от таковой пептида А ракового антигена, который является пептидом, состоящим из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) и
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4), и тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида С ракового антигена присоединена к тиоэфирной группе в формуле (1),
или его фармацевтически приемлемая соль;
[0171]
2. Соединение по пункту 1, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (4):
[0172]
[0173]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0174]
3. Соединение по пункту 1, в котором соединение, представленное формулой (1), является соединением, представленным формулой (5):
[0175]
[0176]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль;
[0177]
4. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пунктов 1-3, или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель;
[0178]
5. Фармацевтическая композиция по пункту 4, включающая, по крайней мере, один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) и
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243); и
[0179]
6. Композиция, включающая соединение, выбранное из группы, состоящей из соединения, представленного формулой (4):
[0180]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, и соединения, представленного формулой (5):
[0181]
[0182]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, и, по крайней мере, один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242) и
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0183]
В соответствии с настоящим изобретением, может быть предоставлено вышеуказанное соединение, представленное формулой (1) (в дальнейшем иногда именуемое соединением по настоящему изобретению), пригодное в качестве противоракового иммунотерапевтического средства. В соответствии с соединением по настоящему изобретению, могут быть предоставлены противораковые вакцины и противораковые иммунотерапевтические средства, которые эффективно индуцируют CTL in vivo и in vitro. В частности, в соответствии с соединением по настоящему изобретению, в настоящее время стало возможным продуцировать два рестриктированных молекулой МНС класса I пептида WT1, имеющих различные последовательности, или два рестриктированных молекулой МНС класса I эпитопа WT1, имеющих различные последовательности, рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1 и рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1, рестриктированный молекулой МНС класса I эпитопа WT1 и рестриктированный молекулой МНС класса II эпитопа WT1, два рестриктированных МНС класса I пептида WT1 и рестриктированный МНС класса II пептид WT1, имеющие различные последовательности, или два рестриктированных молекулой МНС класса I эпитопа WT1 и рестриктированный молекулой МНС класса II эпитоп WT1, которые имеют различные последовательности in vivo и in vitro и эффективно индуцируют CTL.
В отношении подтипов HLA двух рестриктированных молекулой МНС класса I пептидов WT1, имеющих различные последовательности, особенно предпочтительным является соединение по настоящему изобретению (конъюгат), полученное комбинированием пептида А02 типа (А-0201, А0206 и тому подобное) и пептида А24 типа (А-2402 и тому подобное). У европейцев и американцев (представителей белой европеоидной расы) численность популяции подтипа HLA-A0201 или подтипа HLA-A0206 является наивысшей и составляет приблизительно 47%, соответственно подтип HLA-A2402 составляет приблизительно 13%, а общее количество этих подтипов составляет приблизительно 5 6%, исключая дубликаты (т.е., повторную количественную оценку людей, имеющих оба подтипа) (Human Immunol 62: 1009; 2001.). У японцев и им подобных численность популяции подтипа HLA-A2402 является наивысшей и составляет приблизительно 60%, соответственно HLA-A0201 или HLA-A0206 составляет приблизительно 39%, и общая численность популяций этих подтипов составляет приблизительно 81%, исключая дубликаты (т.е., повторную количественную оценку людей, имеющих оба подтипа) (www.bmdc.irc.or.jp/GF-A.htm). Таким образом, преимуществом соединения по настоящему изобретению является, в частности, то, что большая часть популяции охватывается при использовании одного соединения по настоящему изобретению, и выявление подтипа HLA у пациентов до назначения препарата не является обязательным и тому подобное. Ввиду такого рода преимуществ соединения по настоящему изобретению, соединение, представленное формулой (3), формулой (4) или формулой (5), является предпочтительным, и соединение, представленное формулой (5), является более предпочтительным.
Кроме того, в соответствии с соединением по настоящему изобретению, может быть предоставлена активная составляющая противораковой вакцины, превосходящая по физико-химическим свойствам и стабильности и легко получаемая и легко контролируемая. В результате была упрощена разработка композиции противораковой вакцины.
В частности, примеры физико-химических свойств включают растворимость, вязкость раствора, как следствие вышеперечисленного легкость очистки, удобство в обращении после лиофилизации, как следствие вышеперечисленного легкость очистки и тому подобное. Стабильность включает стабильность после высаливания, гигроскопичность, термостабильность, стабильность после образования эмульсии и т.п. Фармакологическая активность включает эффективность в качестве противораковой вакцины, отличительное свойство, обусловленное API (активный фармацевтический ингредиент), взаимодействие с вспомогательным веществом в лекарственном препарате и т.п. Среди них отличительное свойство, обусловленное API, является отличительным свойством касательно противоопухолевой вакцины вследствие влияния API. В частности, в случае двух API, значительно различающихся по растворимости, API с меньшей растворимостью склонен осаждаться, и легко ожидать, что стерилизация фильтрованием через мембранный фильтр, которая является необходимым требованием для фармацевтических продуктов, не может быть выполнена. Даже если стерилизация фильтрованием API с небольшой растворимостью едва возможна, считается, что количество API, содержащегося в фильтрате, заметно снижается, и способность индуцировать ЦТЛ, необходимая для противораковой вакцины, заметно снижается. Таким образом, нежелательное свойство в виде значительного снижения эффективности производства API с небольшой растворимостью, легко предсказуемо.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0184]
Фиг. 1 представляет собой чертеж, демонстрирующий результаты тестирования Экспериментального Примера 1 в отношении зависящего от времени изменения N-концевого аминокислотного укорочения под действием ERAP1 каждого пептида с последовательностью SEQ ID NO: 13, 16, 17 и 18, синтезированного в Примерах 2-5.
Фиг. 2 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 2 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 3 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 2 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A2402.
Фиг. 4 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 4 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (3), синтезированного в Примере 6, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 5 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 5 в отношении способности соединения, представленного формулой (6), синтезированного в Примере 7, индуцировать клетки, взаимодействующие с пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201 в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 24.
Фиг. 6 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 5 в отношении способности соединения, представленного формулой (6), синтезированного в Примере 7, индуцировать клетки, взаимодействующие с пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201 в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 24.
Фиг. 7 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 6 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (8), синтезированного в Примере 9, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2 методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 8 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 6 в отношении способности соединения, представленного формулой (8), синтезированного в Примере 9, индуцировать клетки, взаимодействующие с пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, in vivo, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201 в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 22.
Фиг. 9 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 8 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (7), синтезированного в Примере 8 в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 10 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 8 в отношении способности соединения, представленного формулой (7), синтезированного в Примере 8, индуцировать клетки, взаимодействующие с пептидом, представленным SEQ ID NO: 23, in vivo, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201 в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 23.
Фиг. 11 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 9 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (9), синтезированного в Примере 10, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 5, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 12 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 9 в отношении способности соединения, представленного формулой (9), синтезированного в Примере 10, индуцировать клетки, взаимодействующие с пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201 в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 24.
Фиг. 13 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Сравнительного Примера 1 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности пептидов, представленных SEQ ID NO: 238 и 239, синтезированных в Ссылочных Примерах 8 и 9, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 14 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Сравнительного Примера 1 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности пептидов, представленных SEQ ID NO: 238 и 239, синтезированных в Ссылочных Примерах 8 и 9, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 4, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A2402.
Фиг. 15 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Сравнительного Примера 2 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности пептидов, представленных SEQ ID NO: 24 0 и 241, синтезированных в Ссылочных Примерах 10 и 11, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 16 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Сравнительного Примера 2 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности пептидов, представленных SEQ ID NO: 24 0 и 241, синтезированных в Ссылочных Примерах 10 и 11, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 4, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A2 4 02.
Фиг. 17 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 11 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (10), синтезированного в Примере 13, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 18 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Сравнительного Примера 3 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (11), синтезированного в Примере 12, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 19 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 12 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (12), синтезированного в Примере 14, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 20 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 12 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (12), синтезированного в Примере 14, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 4, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A2402.
Фиг. 21 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 13 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (14), синтезированного в Примере 15, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 22 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 13 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности соединения, представленного формулой (14), синтезированного в Примере 15, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 4, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A2402.
Фиг. 23 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 14 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности коктейльной вакцины на основе соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 22, синтезированного в Ссылочном Примере 1, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 24 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 15 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности коктейльной вакцины на основе соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 244, синтезированного в Ссылочном Примере 13, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 25 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 16 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности коктейльной вакцины на основе соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 24, синтезированного в Ссылочном Примере 2, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 26 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 17 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности коктейльной вакцины на основе соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 242, синтезированного в Примере 11, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
Фиг. 27 представляет собой Чертеж, демонстрирующий результаты тестирования в рамках Экспериментального Примера 18 в отношении in vivo индуцирующей CTL способности коктейльной вакцины на основе соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 243, синтезированного в Примере 11, в режиме активации или отсутствия активации пептидом SEQ ID NO: 2, методом IFNγ ELISPOT, используя трансгенную мышь HLA-A0201.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0185]
Вариант осуществления настоящего изобретения излагается детально следующим образом.
[0186]
«Аминокислотный остаток» в настоящем изобретении означает область, соответствующую одной единице аминокислоты, являющейся составной частью пептида или белка в молекуле пептида или белка. Примеры «аминокислотного остатка» включают природный или не встречающийся в природе μ-аминокислотный остаток, β-аминокислотный остаток, γ-аминокислотный остаток или δ-аминокислотный остаток. Конкретные примеры вышеперечисленного включают природный α-аминокислотный остаток, орнитиновый остаток, гомосериновый остаток, гомоцистеиновый остаток, β-аланин, γ-аминобутановая кислота или γ-аминопентановой кислота и тому подобное. Когда «аминокислотный остаток» может быть оптически активным веществом, он может принимать любую L-форму и D-форму, при этом L-форма является предпочтительной.
[0187]
Когда «аминокислотный остаток» в настоящем изобретении представлен в виде аббревиатуры, показан на сокращение, используются следующие аббревиатуры.
Ala или А: остаток аланина
Arg или R: остаток аргинина
Asn или N: остаток аспарагина
Asp или D: остаток аспарагиновой кислоты
Cys или С: остаток цистеина
Gln или Q: остаток глутамина
Glu или Е: остаток глутаминовой кислоты
Gly или G: остаток глицина
His или Н: остаток гистидина
Ile или I: остаток изолейцина
Leu или L: остаток лейцина
Lys или K: остаток лизина
Met или М: остаток метионина
Phe или F: остаток фенилаланина
Pro или Р: остаток пролина
Ser или S: остаток серина
Thr или Т: остаток треонина
Trp или W: остаток триптофана
Tyr или Y: остаток тирозина
Val или V: остаток валина
Abu: остаток 2-аминомасляной кислоты (также называемый остатком α-аминомасляной кислоты)
Orn: остаток орнитина
Cit: остаток цитруллина
[0188]
Аминокислотная последовательность «пептида» в настоящем изобретении описана в соответствии с общепринятым способом, в котором аминокислотный остаток N-концевой аминокислоты расположен слева, а аминокислотный остаток С-концевой аминокислоты расположен справа. В «пептиде», если особым образом не указано, аминогруппа аминокислотного остатка N-концевой аминокислоты связана с атомом водорода, и карбонильная группа аминокислотного остатка С-концевой аминокислоты связана с гидроксильной группой. Двухвалентная группа пептида означает группу, присоединенную посредством аминогруппы аминокислотного остатка N-концевой аминокислоты и карбонильной группы аминокислотного остатка С-концевой аминокислоты.
В соединении настоящего изобретения, например, в соединениях, представленных формулами (3)-(9), и в отношении пептида, который является частью структуры вышеперечисленного, если особым образом не указано, аминогруппа аминокислотного остатка N-концевой аминокислоты связана с атомом водорода, и карбонильная группа аминокислотного остатка С-концевой аминокислоты связана с гидроксильной группой.
[0189]
а
a
а
a
а
a
а
a
а
a
а
a
«Х» и «Y» в настоящем изобретении означают, независимым образом, одинарную связь или двухвалентную группу пептидов, состоящую из 1-4 аминокислотных остатков. Общее число аминокислотных остатков для Х и таковое для Y является целым числом от 0 до 4. Например, целое число указанной суммы величиной 0 означает, что Х и Y каждый представляет собой одинарную связь. Когда сумма является целым числом равным 4, примеры этому включают Х и Y, независимым образом являясь двухвалентными группами пептида, состоящих из 2 аминокислотных остатков, Х представляя собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 3 аминокислотных остатков, и Y представляя собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 1 аминокислотного остатка, Х представляя собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 4 аминокислотных остатков, и Y представляя собой одинарную связь и тому подобное.
а
a
Целое число указанной суммы предпочтительно равно 0-2, более предпочтительно равно 0-1, наиболее предпочтительно равно 0. Таким образом, Х и Y наиболее предпочтительно являются одинарными связями.
а
a
а
a
а
a
Когда сумма является целым числом равным 2, примеры этому включают Х, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 2 аминокислотных остатков, и Y представляющий собой одинарную связь, Х и Y независимым образом представляющие собой двухвалентные группы пептида, состоящие из 1 аминокислотного остатка, или Х представляющий собой одинарную связь и Y представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 2 аминокислотных остатков.
а
a
а
a
а
a
Когда сумма является целым числом равным 1, примеры этому включают Х, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y, представляющий собой одинарную связь, и Х, представляющий собой одинарную связь и Y, представляющий собой двухвалентную группой пептида, состоящую из 1 аминокислотного остатка. Из них предпочтительным является Х, представляющий собой одинарную связь и Y, представляющий собой остаток аланина, остаток лейцина или остаток метионина.
[0190]
a
«Пептид А ракового антигена» в настоящем изобретении является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков. В пептиде А ракового антигена в формуле (1), аминогруппа N-концевой аминокислоты присоединена к Y в формуле (1), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты присоединена к гидроксильной группе в формуле (1).
[0191]
«Рестриктированный молекулой МНС класса I» в настоящем изобретении означает свойство индуцировать CTL путем связывания с молекулой МНС класса I, которая является классом I главного комплекса гистосовместимости (МНС).
[0192]
W
МНС у человека называется человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA). HLA, соответствующий молекуле МНС класса I, подразделяют на подтипы HLA-A, В, C, F и G и тому подобное. Предпочтительные примеры «рестриктированного молекулой МНС класса I» включают HLA-A-рестриктированный, HLA-B-рестриктированный и HLA-CW-рестриктированный.
Полиморфизм (аллель) каждого подтипа HLA известен. Примеры полиморфизма HLA-A включают не менее 27 видов, таких как HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A24 и тому подобное, примеры полиморфизма HLA-B включают не менее 59 видов, таких как HLA-B7, HLA-B40, HLA-B4403 и тому подобное, и примеры полиморфизма HLA-CW включают не менее 10 видов, таких как HLA-Cw0301, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 и тому подобное. Среди этих полиморфизмов предпочтительными являются HLA-A0201 и HLA-A24.
[0193]
«Пептид WT1» в настоящем изобретении является частью (составляющей, компонентом) пептида, состоящего из непрерывных 7-30 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности WT1 человека, описанной в SEQ ID NO: 1.
[0194]
Таким образом, «рестриктированный молекулой МНС класса I пептида WT1» в настоящем изобретении представляет собой пептид, который связывается с антигеном МНС класса I in vitro и/или in vivo и представляется в виде комплекса и индуцирует ЦТЛ в результате распознавания комплекса предшественниками Т-клеток. Число аминокислотных остатков в «рестриктированном молекулой МНС класса I пептиде WT1» составляет 7-30, предпочтительно 7-15, более предпочтительно 8-12, более предпочтительно 8-11, наиболее предпочтительно 8 или 9.
[0195]
«Рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1», состоящий из 7-12 или предпочтительно 9 аминокислотных остатков также называют «рестриктированный молекулой МНС класса I эпитоп WT1». «Рестриктированный молекулой МНС класса I эпитоп WT1» в настоящем изобретении означает пептид в чистом виде, который связывается с антигеном МНС класса I и представляется в виде комплекса. То есть, из «рестриктированного молекулой МНС класса I пептида. WT1» образуется «рестриктированный молекулой МНС класса I эпитоп WT1» in vitro и/или in vivo, путем внутриклеточной декомпозиции соединения по настоящему изобретению протеосомой и/или протеазой, такими как гамма-интерферон-индуцибельной лизосомальной тиолредуктазой (GILT, GLT) и тому подобное (протеолиз, восстановительное расщепление дисульфидной связи), и/или расщепление до оптимального количества остатков (также называемое укорочением) под действием аминопептидазы 1 эндоплазматического ретикулума (ERAP1, ER-аминопептидаза). В этом преобразовании, в основном, рассматривается способ получения, в котором С-концевая аминокислота «рестриктированного молекулой МНС класса I эпитопа WT1» сначала образуется вследствие расщепления под действием протеосомы и/или протеазы, после которого N-концевая аминокислота «рестриктированного молекулой МНС класса I эпитопа WT1» образуется путем укорочения (расщепления) под действием ERAP1. В этом преобразовании, однако, также возможен процесс, отличный от данного способа получения. В настоящее время, ERAP1 также называется ERAAP (ассоциированная с представлением антигена аминопептидаза ER) и также используется как A-LAP, PILS-AP или ARTS-1.
[0196]
Таким образом, «рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1» является предпочтительно пептидом, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, образуемого добавлением 1-23 аминокислотных остатков к карбонильной группе С-концевой аминокислоты «рестриктированного молекулой МНС класса I эпитопа WT1», состоящего из 7-12 аминокислотных остатков.
[0197]
Примеры «рестриктированного молекулой МНС класса I пептида WT1» включают пептиды, описанные в Таблицах 1-44. В каждой таблице «позиция» означает расположение в аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1.
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
Предпочтительные примеры «рестриктированного молекулой МНС I класса пептида WT1» включают пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5), SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6) и
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7), и
пептид, включающий измененную аминокислотную
последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7, но содержащая изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающая индуцирующей CTL активностью, более предпочтительно пептид любой аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7.
[0243]
«Пептид, включающий аминокислотную последовательность» в настоящем изобретении означает, как правило, пептид, в котором дополнительная аминокислота добавлена к N-концевой аминокислоте и/или С-концевой аминокислоте аминокислотной последовательности. Когда «рестриктированный молекулой МНС I класса пептид WT1» добавляют в «пептиде А ракового антигена» и «пептиде В ракового антигена», предпочтительным является добавление пептида к С-концу. Когда добавляют «рестриктированный молекулой МНС I класса эпитоп WT1», предпочтительным является добавление к С-концу.
[0244]
«Пептид, включающий измененную аминокислотную последовательность, которая содержит изменение аминокислотного(ых) остатка(ов) в аминокислотной последовательности, и обладающий индуцирующей CTL активностью» в настоящем изобретении также называется «измененным киллерным пептидом». Измененный киллерный пептид означает пептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 3 аминокислот делетированы, заменены и/или добавлены, и связывается с молекулой МНС I класса для индукции CTL. Позиция замещения замещенной аминокислоты включает 1-е положение (N-концевое), 2-е положение, 3-е положение или 9-е положение для пептида, состоящего из 9 аминокислотных остатков. Число добавляемых аминокислот (также включая инсерцию) предпочтительно равно 1 или 2, более предпочтительно 1. Предпочтительным является добавление в С-концевой позиции. Число аминокислот, подлежащих делетированию, предпочтительно равно 1. При внесении изменений, аминокислота, подлежащая добавлению, или аминокислота, подлежащая замещению, может быть не встречающейся в природе аминокислотой, отличной от 20 видов аминокислот, кодируемых геном.
[0245]
Известно, что аминокислотная последовательность пептида, способного связываться с антигеном HLA, имеет регулярную последовательность (мотив связывания) для каждого полиморфизма подтипа HLA. Например, пептид, состоящий из 8-11 аминокислотных остатков, в котором аминокислотой во 2-м положении является Tyr, Phe, Met или Trp, и С-концевой аминокислотой является Phe, Leu, Ile, Trp или Met, известен в качестве мотива связывания HLA-A24 (J. Immunol., 152, р3913, 1994, J. Immunol., 155, р4307, 1994, Immunogenetics, 41, р178, 1995). Соответственно, например, в случае пептида, состоящего из 9 аминокислотных остатков, 2-положение может быть замещено Tyr, Phe, Met или Trp и/или 9-е положение может быть замещено Phe, Leu, Ile, Trp или Met, и пептид, имеющий такие замены, является предпочтительным в качестве измененного киллерного пептида. Аналогично, пептид, состоящий из 8-11 аминокислотных остатков, в котором аминокислота во 2-м положении является Leu или Met, и С-концевая аминокислота является Val или Leu, называется мотивом связывания HLA-A0201. Соответственно, например, в случае пептида, состоящего из 9 аминокислотных остатков, 2-е положение может быть замещено Leu или Met и/или 9-е положение может быть замещено Val или Leu, и пептид, имеющий такие замены, является предпочтительным в качестве измененного киллерного пептида.
[0246]
Примеры измененного киллерного пептида включают представленные ниже пептиды.
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 223) (смотри WO 03/106682),
FMFPNAPYL (SEQ ID NO: 224),
RLFPNAPYL (SEQ ID NO: 225),
RMMPNAPYL (SEQ ID NO: 226),
RMFPNAPYV (SEQ ID NO: 227) и
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 228) (смотри WO 2009/072610), которые являются измененными киллерными пептидами RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2);
[0247]
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) (смотри WO 02/79253);
Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 229)
(в котором Xaa является Ser или Ala) и
Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 230)
(в котором Xaa является Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe или Asn) (смотри WO 2004/026897), которые являются киллерными пептидами CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3);
[0248]
AYLPAVPSL (SEQ ID NO: 231) (смотри WO 2003/106682), который является измененным киллерным пептидом ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5);
[0249]
FLGEQQYSV (SEQ ID NO: 232),
SMGEQQYSV (SEQ ID NO: 233) и
SLMEQQYSV (SEQ ID NO: 234) (WO 2009/072610), которые являются измененными киллерными пептидами SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6); и
[0250]
RYPGVAPTL (SEQ ID NO: 235) (WO 2003/106682), который является измененным киллерным пептидом RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7).
[0251]
1
«R» в настоящем изобретении представляет собой атом водорода, группу, представленную приведенной выше формулой (2) или пептид С ракового антигена, предпочтительно группу, представленную приведенной выше формулой (2), или пептид С ракового антигена.
[0252]
1
Когда R представляет собой атом водорода, соединение формулы (1) является соединением, представленным формулой (1-1):
[0253]
[0254]
а
a
в которой Х, Y и пептид А ракового антигена определены как указано выше для формулы (1), и Cys является цистеиновым остатком, а именно, пептидом.
[0255]
1
Соединение формулы (1), в котором R представляет собой атом водорода, то есть пептид, представленный формулой (1-1), имеет последовательность, отличную от частичной последовательности белка WT1. Требование формулы (1), «имеет последовательность, отличную от частичной последовательности белка WT1» означает, что пептид, представленный формулой (1-1), не является частичным пептидом, состоящим из непрерывных 8-35 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1.
1
1
1
а
a
138-146
138-146
138-146
137-146
138-146
137-146
То есть, соединение формулы (1), где R представляет собой атом водорода, не является частичным пептидом, состоящим из непрерывных 8-35 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1. В качестве примера приводится конкретное объяснение случая, когда пептид А ракового антигена представляет собой пептид WT1. Пептид WT1 представляет собой частичный пептид, состоящий из непрерывных 9 аминокислотных остатков в 138-м положении-146-м положении аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанной в SEQ ID NO: 1, и имеет аминокислотную последовательность LESQPAIRN (SEQ ID NO: 78). В SEQ ID NO: 1, 137-я позиция в направлении от N-конца пептида WT1 представляет собой С. Таким образом, пептид WTI (CLESQPAIRN) (SEQ ID NO: 236) соответствует частичному пептиду, состоящему из непрерывных 10 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1. С другой стороны, руководствуясь требованием по настоящему изобретению, «соединение формулы (1), в которой R представляет собой атом водорода, не является частичным пептидом, состоящим из непрерывных 8-35 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1», в соединении формулы (1), в которой R представляет собой атом водорода, когда пептид А ракового антигена является пептидом WT1 (LESQPAIRN) (SEQ ID NO: 78), пептид WT1 (CLESQPAIRN) (SEQ ID NO: 236) исключают из соединения по настоящему изобретению, и, следовательно, Х и Y не представляют собой одновременно одинарную связь.
[0256]
1
В качестве соединения формулы (1), в которой R представляет собой атом водорода, пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13), CCMTWNQMNL (SEQ ID NO: 14),
CCYTWNQMNL (SEQ ID NO: 15),
CALLPAVPSL (SEQ ID NO: 16),
CSLGEQQYSV (SEQ ID NO: 17) и
CRVPGVAPTL (SEQ ID NO: 18) является предпочтительным.
[0257]
1
Когда «R» является группой, представленной вышеуказаной формулой (2), соединение формулы (1) является соединением, представленным формулой (1-2):
[0258]
[0259]
а
a
b
b
в которой Х, Y и пептид А ракового антигена определены как указано выше для формулы (1), и X, Y и пептид В ракового антигена определены как указано выше для формулы (2)
[0260]
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
«X» и «Y» в настоящем изобретении означают, независимым образом, одинарную связь или двухвалентную группу пептидов, состоящих из 1-4 аминокислотных остатков. Сумма числа аминокислотных остатков для X и таковая для Y является целым числом от 0 до 4. Например, целое число указанной суммы равное 0 означает, что X и Y каждый обозначает одинарную связь. Когда сумма является целым числом равным 4, примеры включают X и Y, независимо представляющие собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 2 аминокислотных остатков, X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 3 аминокислотных остатков, и Y, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 1 аминокислотного остатка, X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 4 аминокислотных остатков и Y, представляющий собой одинарную связью и тому подобное.
b
b
Целое число указанной суммы предпочтительно равно от 0 до 2, более предпочтительно от 0 до 1, наиболее предпочтительно 0. То есть, X и Y наиболее предпочтительно представляют собой одинарную связь.
b
b
b
b
b
b
Когда сумма является целым числом равным 2, примеры этому включают X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 2 аминокислотных остатков, и Y, представляющий собой одинарную связь, X и Y независимым образом представляющие собой двухвалентные группы пептида, состоящего из 1 аминокислотного остатка, и X, представляющий собой одинарную связь и Y, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 2 аминокислотных остатков.
b
b
b
b
b
b
Когда сумма является целым числом равным 1, примеры этому включают X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 1 аминокислотного остатка, и Y, представляющий собой одинарную связь, и Х, представляющий собой одинарную связью и Y, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящего из 1 аминокислотного остатка. Из них предпочтительным является X, представляющий собой одинарную связью, и Y, представляющий собой остаток аланина, остаток лейцина или остаток метионина.
[0261]
«Пептид В ракового антигена» в настоящем изобретении является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков. «Рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1» определен как указано выше. Однако в соединении, представленном формулой (1), пептид А ракового антигена и пептид В ракового антигена одновременно не являются одним и тем же пептидом. То есть, пептид В ракового антигена ограничен требованием «отличный от пептида А ракового антигена».
1
а
b
a
b
Поскольку пептид А ракового антигена и пептид В ракового антигена одновременно не являются одним и тем же пептидом, соединение формулы (1), в которой R является группой, представленной приведенной выше формулой (2), не является гомодимером, а является гетеродимером, даже когда Х и X одинаковы и Y и Y одинаковы. Гомодимер означает димер, в котором одни и те же пептидные мономеры димеризуются, и гетеродимер означает димер, в котором различные пептидные мономеры димеризуются.
[0262]
b
b
В пептиде В ракового антигена аминогруппа N-концевой аминокислоты присоединена к Y в формуле (2) (то есть, также присоединена к Y в формуле (1-2)), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты присоединена к гидроксильной группе в формуле (2).
[0263]
1
В качестве соединения формулы (1), в которой R является группой, представленной формулой (2), то есть соединения формулы (1-2), соединение, представленное формулой (3):
[0264]
[0265]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью, является предпочтительным.
[0266]
В настоящем изобретении, кроме того, когда «пептид В ракового антигена» представляет собой рестриктированный молекулой МНС I класса пептид WT1, содержащий один остаток цистеина, соединение формулы (1) может представлять собой соединение, в котором тиоэфирная группа в пептиде В ракового антигена присоединена к тиоэфирной группе в формуле (16):
[0267]
[0268]
или к тиоэфирной группе цистеинового остатка пептида Е ракового антигена.
[0269]
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
«X» и «Y» в настоящем изобретении означают независимыми образом одинарную связь или двухвалентную группу пептидов, состоящих из 1-4 аминокислотных остатков. Сумма числа аминокислотных остатков для X и таковая для Y является целым числом от 0 до 4. Например, целое число указанной суммы равное 0 означает, что X и Y каждый представляет собой одинарную связь. Когда сумма является целым числом равным 4, примеры этому включают X и Y, независимым образом представляющие собой двухвалентные группы пептида, состоящие из 2 аминокислотных остатков, X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 3 аминокислотных остатков, и Y, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 1 аминокислотного остатка, X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 4 аминокислотных остатков, и Y, представляющий собой одинарную связь и тому подобное.
d
d
Целое число указанной суммы предпочтительно равно 0-2, более предпочтительно 0-1, наиболее предпочтительно 0. То есть, X и Y наиболее предпочтительно являются одинарными связями.
d
b
d
d
d
d
Когда сумма является целым числом равным 2, примеры этому включают X, представляющий собой двухвалентную группой пептида, состоящую из 2 аминокислотных остатков, и Y, представляющий собой одинарную связь, X и Y, независимым образом представляющие собой двухвалентные группы пептида, состоящие из 1 аминокислотного остатка, или X, представляющий собой одинарную связь, и Y, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 2 аминокислотных остатков.
d
d
d
d
d
d
Когда сумма является целым числом равным 1, примеры этому включают X, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 1 аминокислотного остатка, и Y, представляющий собой одинарную связь, и X, представляющий собой одинарную связь, и Y, представляющий собой двухвалентную группу пептида, состоящую из 1 аминокислотного остатка. Из них предпочтительным является X, представляющий собой одинарную связь, и Y, представляющий собой аланиновый остаток, лейциновый остаток или метиониновый остаток.
[0270]
d
«Пептид D ракового антигена» в настоящем изобретении представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1, состоящий из 7-30 аминокислотных остатков. В формуле (16) аминогруппа N-концевой аминокислоты пептида D ракового антигена связывается с Y в формуле (16), и карбонильная группа С-концевой аминокислоты связывается с гидроксильной группой в формуле (16).
[0271]
В настоящем изобретении «рестриктированный молекулой МНС класса II» означает свойство индуцировать клетки Т-хелперов путем связывания с молекулой МНС класса II, и это определение дано для указаного ниже «пептида С ракового антигена».
[0272]
HLA, соответствующий молекуле МНС класса II, подразделяют на подтипы HLA-DR, DQ и DP и тому подобное. Предпочтительные примеры «рестриктированного молекулой МНС класса II» включают HLA-DR-рестриктированный, HLA-DQ-рестриктированный и HLA-DP-рестриктированный.
[0273]
Таким образом, «рестриктированный молекулой МНС класса пептид WT1» в настоящем изобретении представляет собой пептид, который связывается с антигеном МНС класса II in vitro и/или in vivo и индуцирует клетки Т-хелперов. Число аминокислотных остатков «рестриктированного молекулой МНС класса II пептида» составляет от 7 до 30, предпочтительно от 14 до 30.
[0274]
В качестве «пептида D ракового антигена» подобно аминокислотной последовательности, описанной в указаном ниже определении «пептид С ракового антигена», может быть упомянут пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) и
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244).
[0275]
В соединении формулы (1), кроме того, когда «пептид В ракового антигена» представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1, содержащий один остаток цистеина, в качестве соединения, в котором тиоэфирная группа в пептиде В ракового антигена присоединена к тиоэфирной группе в формуле (16), предпочтительно, соединение, представленное формулой (15):
[0276]
[0277]
в котором связь между С и С представляет собой дисульфидную связь, может быть указано.
[0278]
В настоящем изобретении «пептид Е ракового антигена» представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса II пептид, состоящий из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, и ему дано определение как для «рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина» в указаном ниже определении «пептид С ракового антигена».
[0279]
В качестве «пептида Е ракового антигена», подобно аминокислотной последовательности, описанной в указаном ниже определении «пептид С ракового антигена», может быть упомянут пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24).
[0280]
1
Когда R представляет собой пептид С ракового антигена, тиоэфирная группа остатка цистеина пептида С ракового антигена присоединена к тиоэфирной группе в формуле (1).
Пептид С ракового антигена представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса I пептидом WT1, состоящий из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, или рестриктированный молекулой МНС класса II пептидом WT1, состоящий из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток.
[0281]
1
В «рестриктированном молекулой МНС класса I пептиде WT1, состоящем из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина» в настоящем изобретении, аминокислотная последовательность пептида должна только содержать, как минимум, один остаток цистеина. Количество входящих в состав остатков цистеина должно быть равным предпочтительно от 1 до 3, более предпочтительно от 1 до 2, наиболее предпочтительно 1. Определение «рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1» представлено выше. Кроме того, соединение формулы (1), в которой R представляет собой «рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1, состоящий из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина» не является гомодимером, а является гетеродимером.
[0282]
Предпочтительные примеры «рестриктированного молекулой МНС класса I пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина» включают пептиды, описанные в Таблицах 45-52. В каждой Таблице «позиция» означает положение в аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1.
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291]
Более предпочтительные примеры «рестриктированного молекулой МНС класса I пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток» включают пептид, содержащий приведенную ниже аминокислотную последовательность:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3)
и пептид, содержащий измененную аминокислотную последовательность, которая является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, но содержащая изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающий индуцирующей CTL активностью. Смысловое значение указанных фраз «содержащий аминокислотную последовательность» и «пептид, состоящий из измененной аминокислотной последовательности, содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов) в аминокислотной последовательности, и обладающий индуцирующей CTL активностью» определено выше. Наиболее предпочтительно, может быть упомянут пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) и
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4).
[0292]
1
В качестве соединения формулы (1), в которой R является «рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, состоящим из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток», соединение, представленное формулой (4):
[0293]
[0294]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, или соединение, представленное формулой (5):
[0295]
[0296]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, предпочтительно. Из них соединение, представленное формулой (5), является более предпочтительным.
[0297]
В настоящем изобретении, кроме того, когда пептид, состоящий из 1-4 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, дополнительно присоединен к N-концу «пептида С ракового антигена», который является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, соединение формулы (1) может представлять собой соединение, в котором тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида, присоединенного к N-концу пептида С ракового антигена, соединена с тиоэфирной группой в формуле (16):
[0298]
[0299]
или с тиоэфирной группой цистеинового остатка пептида Е ракового антигена.
[0300]
d
d
d
d
«X», «Y», «пептид D ракового антигена» и «пептид Е ракового антигена» в настоящем изобретении являются такими, как определено для вышеуказаного «X», «Y», «пептид D ракового антигена» и «пептид Е ракового антигена»
[0301]
В настоящем изобретении, пептид, состоящий из 1-4 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, который присоединен к N-концу «пептида С ракового антигена», который является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, предпочтительно представляет собой дипептид, состоящий из СА.
[0302]
В соединении формулы (1), когда пептид, состоящий из 1-4 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина, дополнительно присоединен к N-концу «пептида С ракового антигена», который является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, соединение, в котором тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида, присоединенного к N-концу пептида С ракового антигена, соединена с тиоэфирной группой в формуле (16), является предпочтительным соединением, представленным формулой (14):
[0303]
[0304]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
[0305]
Кроме того, в соединении формулы (1), когда пептид, состоящий из 1-4 аминокислотных остатков, содержащих один цистеиновый остаток, дополнительно присоединен к N-концу «пептида С ракового антигена», который является рестриктированным молекулой МНС класса I пептидом WT1, соединение, в котором тиоэфирная группа остатка цистеина пептида, связанного с N-концом пептида С ракового антигена, присоединена к тиоэфирной группе в «пептиде Е ракового антигена», является предпочтительным соединением, представленным формулой (12):
[0306]
[0307]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
[0308]
В «рестриктированном молекулой МНС класса II пептиде WT1, состоящем из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина» в настоящем изобретении, аминокислотная последовательность пептида должна только содержать, как минимум, один остаток цистеина. Количество входящих в состав остатков цистеина должно быть равным предпочтительно от 1 до 3, более предпочтительно от 1 до 2, наиболее предпочтительно 1.
[0309]
В настоящем изобретении «рестриктированный молекулой МНС класса II» означает свойство индуцировать клетки Т-хелперы путем связывания с молекулой МНС класса II.
[0310]
HLA, соответствующий молекуле МНС класса II, подразделяется на подтипы HLA-DR, DQ и DP и тому подобное. Предпочтительные примеры термина «рестриктированный молекулой МНС класса II» включают HLA-DR-рестриктированный, HLA-DQ- рестриктированный и HLA-DP-рестриктированный.
[0311]
Таким образом, «рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1» в настоящем изобретении представляет собой пептид, который связывается с антигеном МНС класса II in vitro и/или in vivo и индуцирует клетки Т-хелперы. Число аминокислотных остатков «рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1» равно 7-30, предпочтительно 14-30.
[0312]
Примеры «рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина», включают пептиды, описанные в Таблице 53. В каждой Таблице «позиция» означает положение в аминокислотной последовательности человеческого WT1, описанного в SEQ ID NO: 1.
[0313]
[0314]
В качестве «рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина», пептид, содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11) и
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
или
пептид, содержащий измененную аминокислотную последовательность, которая является любой аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 10-11, но содержащей изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), и обладающий индуцирующей клетки Т-хелперы активностью, является предпочтительным.
[0315]
«Пептид, включающий аминокислотную последовательность» означает, как указано выше, пептид, в котором дополнительная аминокислота добавлена к N-концевой аминокислоте и/или С-концевой аминокислоте аминокислотной последовательности. При добавлении к «рестриктированному молекулой МНС класса II пептиду WT1, содержащему один остаток цистеина», добавление может быть сделано с N-концевой стороны и/или С-концевой стороны.
[0316]
«Пептид, включающий измененную аминокислотную последовательность, содержащую изменение аминокислотного(ых) остатка(ов) в аминокислотной последовательности, и обладающий индуцирующей клетки Т-хелперы активностью» в настоящем изобретении также называется «измененным хелперным пептидом». Измененный хелперный пептид означает пептид, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 3 аминокислот делетированы, замещены и/или добавлены, и связывается с молекулой МНС класса II для индукции клетки Т-хелпера. Число аминокислот, подлежащих добавлению (в том числе инсерция), предпочтительно равно 1-3. Число аминокислот, подлежащих делетированию, предпочтительно равно 1-5. При внесении изменения, аминокислота, подлежащая добавлению, или аминокислота, подлежащая замещению, может быть не встречающейся в природе аминокислотой, отличной от 20 видов аминокислот, кодируемых геном.
[0317]
В качестве измененного хелперного пептида, например, могут упоминаться приведенные ниже пептиды:
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12) (смотри патентный документ 6),
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19) и
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25), которые являются измененными хелперными пептидами SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11); и
[0318]
GCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), которые являются хелперными пептидами PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10).
[0319]
В качестве «рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1, состоящего из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина», пептид, состоящий из любой аминокислотной последовательности, выбранной из приведенных ниже аминокислотных последовательностей:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) и
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24), является более предпочтительным.
[0320]
В качестве соединения формулы (1), в которой R1 представляет собой «рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1, состоящий из 7-30 аминокислотных остатков, содержащих один остаток цистеина», соединение, представленное формулой (6):
[0321]
[0322]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, соединение, представленное формулой (7):
[0323]
[0324]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, соединение, представленное формулой (8):
[0325]
[0326]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, и соединение, представленное формулой (9):
[0327]
[0328]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, являются предпочтительными.
[0329]
Настоящее изобретение также предоставляет композицию, включающую соединение по настоящему изобретению и один или более одного рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1.
[0330]
Примеры соединения по настоящему изобретению, которое должно входить в состав композиции по настоящему изобретению, включают
[0331]
соединение, представленное формулой (3):
[0332]
[0333]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, соединение, представленное формулой (4):
[0334]
[0335]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, и соединение, представленное формулой (5):
[0336]
[0337]
в котором связь между С и С является дисульфидной связью.
[0338]
Примеры рестриктированного молекулой МНС класса II пептида №11, который должен входить в состав композиции по настоящему изобретению, включают приведенные ниже аминокислотные последовательности:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 2 42) и
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).
[0339]
Настоящее изобретение также предоставляет способ синтеза соединения, в котором два различающихся пептида WT1, рестриктированного молекулой МНС класса I пептида WT1 и рестриктированного молекулой МНС класса II пептида WT1, или два различающихся эпитопа WT1, рестриктированного молекулой МНС класса I эпитопа WT1 и рестриктированного молекулой МНС класса II эпитопа WT1, каждый соединен посредством дисульфидной связи. Способ по настоящему изобретению включает следующие стадии (1)-(3).
[0340]
На стадии (1) по настоящему изобретению, пептид, в котором карбонильная группа С-концевой аминокислоты C(Mmt)A и N-концевая аминогруппа пептида С ракового антигена образуют связь, синтезируют путем использования Fmoc-C(Mmt)A-SBn и пептида С ракового антигена.
[0341]
«Пептид С ракового антигена» является таковым, как определено для вышеуказаного «пептида С ракового антигена». «Fmoc» представляет собой 9-флуоренилметоксикарбонильную группу. «Mmt» представляет собой монометокситритильную группу. «SBn» представляет собой тиобензильную группу.
[0342]
На стадии (2) по настоящему изобретению, пептид, в котором тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида С ракового антигена в пептиде, полученном на вышеуказанной стадии (1), и тиоэфирная группа цистеинового остатка, присоединенного к N-концу пептида А ракового антигена, связаны, синтезируют с использованием пептида, полученного на вышеуказанной стадии (1), и пептида А ракового антигена, в котором один остаток цистеина, защищенный группой Npys, присоединен к N-концу.
[0343]
«Пептид А ракового антигена» является таковым, как определено для вышеуказаного «пептида А ракового антигена». «Npys» представляет собой 3-нитро-2-пиридилтиогруппу.
[0344]
На стадии (3) по настоящему изобретению, пептид, в котором тиоэфирная группа остатка цистеина, присоединенного к N-концу пептида А ракового антигена в пептиде, полученном на вышеуказанной стадии (2), и тиоэфирная группа цистеинового остатка пептида D ракового антигена связаны, синтезируют с использованием пептида, полученного на вышеуказанной стадии (2), и пептида D ракового антигена, содержащего остаток цистеина, защищенного группой Spy.
[0345]
«Пептид D ракового антигена» является таковым, как определено для вышеуказаного «пептида D ракового антигена». «Spy» является 2-пиридилсульфидной группой.
[0346]
Соединение и пептид по настоящему изобретению, и пептиды, являющиеся их промежуточными продуктами, могут быть получены в соответствии со способом, описанном в Примерах настоящего описания изобретения, или способом, как правило, используемым для синтеза пептидов. Примеры метода производства включают методы, описанные в документах (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development of Pharmaceutical Product subsequent vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) и тому подобное.
Примеры вышеперечисленного включают способ получения с помощью твердофазного синтезатора, используя метод Fmoc или метод Вое, и способ получения последовательной конденсацией Boc-аминокислоты или Z-аминокислоты методом жидкофазного синтеза (Fmoc является 9-флуоренилметоксикарбонильной группой, Boc является трет-бутоксикарбонильной группой, и Z является бензилоксикарбонильной группой).
В промежуточном соединении для получения соединения по настоящему изобретению, функциональная группа, такая как аминогруппа, карбоксигруппа, меркаптогруппа и т.п., может быть защищена подходящей защитной группой или с нее может быть снята защита при необходимости, используя технологию создания защиты и снятия защиты. В качестве предпочтительных защитных групп, метод создания защиты и метод снятия защиты подробно описаны в «Protective Groups in Organic Synthesis 2nd Edition (John Wiley & Sons, Inc.; 1990)» и тому подобное. Примеры меркапто-защитных групп включают ацетамидометильную группу, тритильную группу и тому подобное.
[0347]
Когда соединение по настоящему изобретению имеет дисульфидную связь, дисульфидная связь может быть образована между двумя различными пептидами, содержащими остаток цистеина, или между пептидом, содержащим остаток цистеина и цистеином в соответствии с методом, как правило, используемым в области химии пептидов. Примеры способа образования дисульфидной связи включают методы, описанные в документах (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics and Experiment of peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development of Pharmaceutical Product sequential vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) и тому подобное.
[0348]
В частности, когда пептид содержит один остаток цистеина, соединение, имеющее дисульфидную связь (дисульфидное соединение) может быть получено удалением всех защитных групп, включая меркапто-защитную группу на боковой цепи цистеина, и окислением в инертном растворителе. Кроме того, он может быть получен смешиванием двух промежуточных соединений, имеющих меркаптогруппу в подходящем растворителе, чтобы обеспечить окисление. В качестве способа окисления в случае необходимости может быть выбран общепризнанный способ образования дисульфидной связи в обычном синтезе пептидов. Например, могут быть упомянуты окисление йода, способ, включающий реакцию окисления воздухом в щелочных условиях, способ образования дисульфидной связи добавлением окислителя в щелочных или кислых условиях и тому подобное. В настоящем документе, в качестве окислителя могут быть упомянуты йод, диметилсульфоксид (DMSO), ферроцианид калия и тому подобное. В качестве растворителя могут быть использованы вода, уксусная кислота, метанол, хлороформ, DMF, DMSO и тому подобное или смесь вышеперечисленного. В ходе реакции окисления, как правило, получают смесь симметричных, асимметричных дисульфидных соединений. Целевое соединение асимметричного дисульфида может быть получено путем очистки с помощью разнообразных способов хроматографии, рекристаллизации и тому подобное. Альтернативно, промежуточное соединение, имеющее активированную меркаптогруппу, и промежуточное соединение, имеющее меркаптогруппу, смешивают с образованием селективной дисульфидной связи. В качестве промежуточного соединения, имеющего активированную меркаптогруппу, может быть упомянута меркаптогруппа, связанная с группой Npys (3-нитро-2-пиридинсульфинильная группа) и тому подобное. Альтернативно, одно промежуточное соединение и, например, 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин) предварительно смешивают, чтобы активировать меркаптогруппу, а затем добавляют другое промежуточное соединение, в результате чего может быть образована селективная дисульфидная связь (Tetrahedron Letters. Vol. 37. No. 9, pp. 1347-1350).
[0349]
Кроме того, когда два или более остатков цистеина содержатся в пептиде, может быть использован способ, подобный вышеуказаному. В этом случае, получают изомер с другим способом образования дисульфидной связи. Димер, в котором дисульфидная связь образуется между цистеиновыми остатками объекта, может быть получен, используя определенную комбинацию защитных групп боковых цепей цистеина. В качестве вышеуказаной комбинации защитных групп, в качестве которых могут быть упомянуты MeBzl (метилбензильная) группа и Acm (ацетамидометильная) группа, Trt (тритильная) группа и Acm группа, Npys (3-нитро-2-пиридилтиольная) группа и Acm группа, S-Bu-t (S-трет-бутильная) группа и Acm группа и тому подобное. Например, в случае комбинации группы MeBzl и группы Acm, может быть упомянут способ образования дисульфидной связи между остатками цистеина, защищенных группой Acm, который включает удаление защитной группы, отличной от группы MeBzl и боковой цепи цистеина, подвергая раствор, содержащий мономер пептида, реакции окисления на воздухе с образованием дисульфидной связи между цистеиновыми остатками со снятой защитой, и затем выполнение снятия защиты йодом и окислением и тому подобное.
[0350]
Полученное соединение, пептид и промежуточное соединение по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со способом, известным специалистам в данной области техники, и способом, как правило, используемым в области химии пептидов. Например, они могут быть очищены разнообразными методами хроматографии (например, колоночной хроматографией на силикагеле, ионообменной колоночной хроматографией, гель-фильтрацией, обращенно-фазовой хроматографией), рекристаллизацией и тому подобное. Например, в качестве растворителя для рекристаллизации могут быть использованы спиртовые растворители, такие как метанол, этанол, 2-пропанол и т.п., эфирные растворители, такие как диэтиловый эфир и тому подобное, сложноэфирные растворители, такие как этилацетат и т.п., ароматические углеводородные растворители, такие как бензол, толуол и тому подобное, кетоновые растворители, такие как ацетон и т.п., углеводородные растворители, такие как гексан и тому подобное, апротонные растворители, такие как диметилформамид, ацетонитрил и тому подобное, вода, смесь вышеперечисленных растворителей и тому подобное. В качестве других методов очистки могут быть использованы методы, описанные Jikken Kagaku Kouza (The Chemical Society of Japan ed., Maruzen), том 1, и тому подобное.
Методы очистки дисульфидных соединений описаны в документах (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics and Experiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development of Pharmaceutical Product sequential vol. 14 peptide synthesis, Hirokawa Shoten, 1991) и тому подобное. Среди них предпочтительным является HPLC.
[0351]
Когда соединение по настоящему изобретению имеет одну или несколько асимметричных точек, оно может быть получено в соответствии с общепринятым способом и путем использования исходного материала, имеющего асимметричные точки (аминокислота). Для увеличения оптической чистоты соединения по настоящему изобретению, кроме того, оптическое разделение и тому подобное могут быть выполнены на подходящей стадии получения. В качестве способа оптического разделения может быть использован, например, метод разделения диастереоизомеров, включая образование соли соединения по настоящему изобретению или его промежуточного соединения с оптически активной кислотой (например, монокарбоновыми кислотами, такими как миндальная кислота, N-бензилоксиаланин, молочная кислота и подобные, дикарбоновыми кислотами, такими как винная кислота, о-диизопропилиденвинная кислота, яблочная кислота и подобные, или сульфоновыми кислотами, такими как камфорсульфоновая кислота, бромкамфорсульфоновая кислота и подобные) в инертном растворителе (например, спиртовых растворителях, таких как метанол, этанол, 2-пропанол и подобные, эфирных растворителях, таких как диэтиловый эфир и подобные, сложноэфирных растворителях, таких как этилацетат и подобные, углеводородных растворителях, таких как толуол и подобные, апротонных растворителях, таких как ацетонитрил и подобные, и смесях этих растворителей). Когда соединение по настоящему изобретению или промежуточное соединение имеет кислотную функциональную группу, такую как карбоксильная группа и подобное, оптическое разделение также может быть выполнено образованием соли с оптически активным амином (например, органическим амином, таким как α-фенетиламин, кинин, хинидин, цинхонидин, цинхонин, стрихнин и подобные).
[0352]
Температура для образования соли выбрана из диапазона в пределах от комнатной температуры до точки кипения растворителя. Для улучшения оптической чистоты желательно сразу поднять температуру приблизительно до точки кипения растворителя. Когда осажденная соль собрана путем фильтрации, ее можно охладить по мере необходимости, чтобы увеличить выход. Подходящее количество оптически активной кислоты или амина, подлежащие использованию, находятся в диапазоне приблизительно от 0,5 до приблизительно 2,0 эквивалентов, предпочтительно равно приблизительно 1 эквиваленту, по отношению к субстрату. При необходимости кристаллы могут быть рекристаллизованы в инертном растворителе (например, спиртовых растворителях, таких как метанол, этанол или 2-пропанол и подобные, эфирных растворителях, таких как диэтиловый эфир и подобные, сложноэфирных растворителях, таких как этилацетат и подобные, углеводородных растворителях, такие как толуол и подобные, апротонных растворителях, таких как ацетонитрил и подобные, и смесь вышеперечисленных растворителей) также с целью получения оптически активной соли высокой степени чистоты. При необходимости оптически разделенная соль может быть обработана кислотой или основанием общепринятым способом для получения свободной формы.
[0353]
Примеры «фармацевтически приемлемой соли» в настоящем изобретении, включают соль присоединения кислоты и соль присоединения основания. Примеры соли присоединения кислоты включают соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, гидройодид, нитрат, фосфат и подобные, и соли органических кислот, такие как цитрат, оксалат, ацетат, формиат, пропионат, бензоат, трифторацетат, малеат, тартрат, метансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и подобное. Примеры соли присоединения основания включают соли с неорганическим основанием, такие как натриевая соль, калиевая соль, соль кальция, соль магния, соли аммония и подобное, соли с органическим основанием, такие как соль триэтиламмония, соль триэтаноламмония, соль пиридиния, соль диизопропиламмония и тому подобное, кроме того, соли аминокислот основных или кислых аминокислот, таких как аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и подобные.
[0354]
Настоящее изобретение также включает гидраты, сольваты, такие как этаноловый сольват и подобное соединения по настоящему изобретению или фармацевтически приемлемая соль вышеперечисленного. Кроме того, настоящее изобретение включает любые стереоизомеры, такие как любой диастереомер, энантиомер и подобное, и любые кристаллы в любых вариантах осуществления изобретения, соединения, представленного формулой (1), которые могут присутствовать.
[0355]
Как правило, в ходе производства пептида различные побочные продукты, такие как пептид с нарушенной аминокислотной последовательностью, пептид, деградированный гидролизом, окислением и подобным, пептид с рацемизированной аминокислотой и тому подобное, образуются на стадии конденсации оптически активной α-аминокислоты, стадии удаления различных защитных групп, стадии расщепления пептида из смолы и тому подобное. В рамках лаборатории различные виды хроматографии (например, колоночная хроматография на силикагеле, ионообменная колоночная хроматография, гель-фильтрация и обращенно-фазовая хроматография) совмещают для удаления таких примесей, в результате чего пептид и соединение высокой степени чистоты могут быть получены. Однако не простой задачей является получение пептида и соединения высокой степени чистоты в промышленном масштабе для производства фармацевтических препаратов.
Соединение по настоящему изобретению обладает физико-химическими свойствами, обеспечивающими массовое производство лекарственного вещества для фармацевтических препаратов. В частности, оно обладает высокой растворимостью, превосходит по стабильности в растворе, с трудом становится гелеобразным при концентрировании и тому подобное, и соединение может быть легко продуцировано в качестве лекарственного вещества высокой степени чистоты в больших масштабах на стадии очистки с помощью колоночной хроматографии, такой как обращенно-фазовая HPLC и тому подобное.
[0356]
Полученное таким образом соединение по настоящему изобретению превосходит по устойчивости к окислителю и тому подобное в растворе, поскольку остатки цистеина образуют дисульфидную связь и тому подобное, и сохраняет данное качество в виде лекарственного вещества лекарственного препарата и эффективную индуцирующую CTL активность.
Соединение по настоящему изобретению является пригодным в качестве активного ингредиента индуцирующего CTL агента для иммунотерапии рака, активного ингредиента противораковой вакцины или активного ингредиента фармацевтической композиции. То есть соединение по настоящему изобретению, как показано в Примерах настоящего описания изобретения, обладает исключительной иммуногенностью и может эффективно проявлять более высокую индуцирующую CTL активность. Кроме того, клетки CTL, индуцированные соединением по настоящему изобретению, могут поразительным образом распознавать частичный пептид WT1 природного происхождения, от природы присутствующего в раковых клетках.
Индуцирующая CTL активность может быть определена измерением количества CTL методом HLA-тетрамеров (Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)) or limiting dilution method (Nat. Med.: 4, 321-327 (1998)). Алльтернативно, например, HLA-A24-рестриктированная индуцирующая CTL активность может быть проанализирована путем использования мышиной модели HLA-A24, описанной в WO 02/47474 и Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002) и тому подобное.
[0357]
Таким образом, соединение по настоящему изобретению может быть использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства (средство профилактики рецидива заболевания) в случае злокачественной опухоли, экспрессирующей ген WT1 или злокачественной опухоли, ассоциированной с увеличением уровня экспрессии гена WT1. Примеры злокачественной опухоли включают злокачественную опухоль гематологического происхождения, такую как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома, злокачественная лимфома и тому подобное, и солидную опухоль, такую как рак желудка, колоректальный рак, рак легких, рак молочной железы, герминогенный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки, рак яичников, опухоль головного мозга и тому подобное.
[0358]
Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль может быть активным ингредиентом индукцирующего CTL агента для клеточной иммунотерапии рака, активным ингредиентом противораковой вакцины и/или активным ингредиентом фармацевтической композиции, путем создания рецептуры каждого соединения или соли в подходящей форме.
[0359]
Соединение по настоящему изобретению может быть назначено вместе с носителем, приемлемым в качестве лекарственного средства, таким как подходящий адъювант, таким образом, чтобы он обеспечил эффективный клеточно-опосредованный иммунитет. В качестве адъюванта применимы описанные в документе (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) и тому подобное. В частности, могут быть упомянуты компоненты грибкового происхождения, GM-CSF, цитокины, такие как интерлейкин-2, интерлейкин-7, интерлейкин-12 и тому подобное, компоненты растительного происхождения, происходящие из морских организмов компоненты, минеральный гель, такой как гидроксид алюминия, лизолецитин, поверхностно-активные вещества, такие как полиол плуроника, полианион, пептид, масляная эмульсия (препарат эмульсии) и тому подобное. В качестве компонентов грибкового происхождения могут быть упомянуты липид А, монофосфорил липида А, который является его производным, мертвых бактерий (бактерий Mycobacterium, таких как бактерии BCG, и тому подобное), белки бактериального происхождения, полинуклеотиды, неполный адъювант Фрейнда, полный адъювант Фрейнда, компоненты каркаса клеточной стенки (например, BCG-CWS и тому подобное), димиколат трегалозы (TDM) и тому подобное.
Кроме того, соединение по настоящему изобретению также можно назначать в форме препарата липосом, препарата в виде частиц, включая связывание с шариками диаметром равным несколько μm, препарата, включая связывания с липидом и подобным.
Кроме того, соединение по настоящему изобретению (конъюгат) может быть назначен вместе с рестриктированным молекулой МНС классом II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом). В качестве метода для совместного назначения, конъюгат и хелперный пептид могут быть индивидуально назначены. Коктейльный препарат (коктейльный агент, коктейль), содержащий конъюгат и хелперный пептид в единой фармацевтической композиции, является наиболее предпочтительным. Коктейльный препарат содержит конъюгат, способный продуцировать рестриктированный молекулой МНС класса I пептид WT1 (т.е., киллерный пептид) и рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1 (а именно, хелперный пептид). Следовательно, при назначении коктейльного препарата, содержащего хелперный пептид в качестве противораковой вакцины для иммунотерапии рака, могут быть также активированы клетки Т-хелперы, важные для функциональной стимуляции других Т-клеток, включая CTL, и могут быть улучшены функция и эффективность (клеточная иммунокомпетенция и тому подобное) конъюгата.
Рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1 (а именно, хелперный пептид) является таковым, как описано в описании изобретения. Примеры хелперного пептида для коктейльного препарата включают приведенные ниже аминокислотные последовательности:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 2 42) и
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243). Из них
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) является предпочтительным.
Можно найти подтверждение тому, что коктейльный препарат демонстрирует улучшенную эффективность в качестве противораковой вакцины, такую как клеточная иммуннокомпетентность и тому подобное, как показано, например, в Примерах и Экспериментальных Примерах в описании изобретения.
[0360]
Хотя дозу соединения по настоящему изобретению в препарате можно надлежащим образом контролировать в соответствии с заболеванием объекта лечения, возраста и массы тела пациентов и тому подобное, она, как правило, составляет 0,0001 мг-1000 мг, предпочтительно 0,001 мг-1000 мг, более предпочтительно 0,1 мг-10 мг.
В качестве способа введения могут быть упомянуты внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутривенное введение, чрескожное введение и тому подобное. Внутрикожное введение и подкожное введение являются предпочтительными, поскольку такие способы введения эффективно индуцируют CTL. В то время как частота введения и интервалы введения можно надлежащим образом контролировать в соответствии с профилактикой или лечением заболевания объекта и индивидуальными различиями пациентов, как правило, назначают многократное введение, и назначение один раз в несколько дней до нескольких месяцев является предпочтительным.
При назначении фармацевтической композиции, содержащей такое соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента положительным по WT1 пациентам, может быть предложен метод профилактики или лечения рака.
Примеры
[0361]
Настоящее изобретение конкретно описано в следующем со ссылкой на Примеры, которыми, однако, данное изобретение не ограничивается.
[0362]
Пример 1
Синтез соединения, представленного формулой (5):
[0363]
[0364]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
[0365]
Стадия 1. Синтез H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH
(синтез С(Npys)RMFPNAPYL)
2
Используя Fmoc-Leu-Alko-смолу (Alko является п-алкоксибензиловым спиртом), 282 мг, (производство Watanabe Chemical; 0,71 ммоль/г, 0,2 ммоль) в качестве исходного материала, пептидная цепь была собрана путем твердофазного синтеза по методу Fmoc/tBu. Твердофазный синтез выполняли, используя пептидный синтезатор CS336X, изготовленный CS Bio, и удаление защитной группы Fmoc осуществляли обработкой DMF-раствором 20% пиперидина в течение 5 мин и в течение 20 мин. Взаимодействие защищенной аминокислоты выполняли реакцией с DMF-раствором 1,05 ммоль защищенной аминокислоты, 1 ммоль HBTU и 2 ммоль DIPEA в течение 1 часа. Полученную смолу промывали с помощью DMF и эфира, и высушивали при пониженном давлении с получением Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr (tBu)-Leu-Alko-смолы (630 мг). К этой пептидной смоле добавляли смесь TFA/HO/TIS=95/2,5/2,5 (10 мл), и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смолу отфильтровывали, и реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Реакционную смесь охлаждали на льду, и добавляли диэтиловый эфир (50 мл). Полученный осадок был собран фильтрованием, промыт эфиром и высушен при пониженном давлении с получением неочищенного пептида (217 мг). Полученный неочищенный пептидный раствор разводили в смеси 20% водной уксусной кислоты (7 мл) и ацетонитрила (1 мл) и очищали обращенно-фазовой HPLC.
насос: изготовлен Shimadzu; LC-8A
колонка: YMC ODS-A 3 cmϕ×25 cmL, 10 мкм
2
Элюат 1: HO/0,l% TFA
3
Элюат 2: CHCN/0,1% TFA
скорость потока: 20 мл/мин
детекция: УФ 22 0 нм
Неочищенный пептидный раствор наносили на колонку, уравновешенную 15% элюатом 2. Затем концентрацию элюата 2 увеличили до 37% в течение 10 мин, и затем увеличивали со скоростью 0,24% в минуту. Фракции, содержащие целевой продукт, собирали и лиофилизировали с получением H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (53 мг).
масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд=1366,1 [М+1]
+
(расчетная величина = 1366,6)
[0366]
Стадия 2. Синтез дисульфидной связи (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-ОН)
[То есть, синтез соединения, представленного формулой (5):
[0367]
[0368]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью].
H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (50 мг), полученный на стадии 1, и H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-ОН (то есть, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)) (43 мг), синтезированный общеизвестным методом (например, WO 07/063903), смешивали, добавляли DMSO (1 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Реакционную смесь разбавляли водным раствором 0,1% TFA (5 мл) и очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC.
насос: изготовлен Shimadzu; LC-8A
колонка: YMC ODS-A 3 cmϕ×25 cmL, 10 мкм
2
Элюат 1: HO/0,l% TFA
3
Элюат 2: CHCN/0, 1% TFA
скорость потока: 20 мл/мин
детекция: УФ 220 нм
Реакционный раствор наносили на колонку, уравновешенную 2 5% элюатом 2. Затем концентрацию элюата 2 увеличивали со скоростью 0,25% в минуту. Фракции, содержащие целевой продукт, собирали, лиофилизировали, подвергали повторной очистке обращенно-фазовой HPLC, и лиофилизировали для получения дисульфидной связи (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) (т.е., соединения, представленного формулой (5), 21 мг).
масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд = 1191,8 [М+2]
2+
(расчетная величина = 1191,9)
[0369]
Пример 2
Синтез пептида, состоящего из следующей аминокислотной последовательности:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13)
[0370]
2
Стадия 1. Используя Fmoc-Leu-Alko-смолу (Alko является п-алкоксибензиловым спиртом), (338 мг, производство Watanabe Chemical; 0,74 ммоль/г, 0,25 ммоль) в качестве исходного материала, твердофазный синтез как в методе, описанном в Примере 1, проводили дважды для получения H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-смолы (1,54 г). К этой пептидной смоле добавляли смесь TFA/HO/TIS=95/2,5/2,5 (15 мл), и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смола была отфильтрована, и реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Реакционную смесь охлаждали льдом и добавляли диэтиловый эфир (50 мл). Полученный осадок собирали фильтрованием, промывали эфиром и высушивали при пониженном давлении с получением неочищенного пептида (637 мг).
масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд = 1211,9 [М+1]
+
(расчетная величина = 1212,5)
[0371]
2
3
Стадия 2. Неочищенный пептид (321 мг), полученный на стадии 1, растворяли в TFA (10 мл), и загружали, с помощью насоса HPLC, в колонку YMC ODS-A 3 cmϕ×25 cmL, уравновешенную элюатом 1 = НО/0,1% TFA HPLC (производство Shimadzu; LC6AD). Это состояние поддерживали в течение приблизительно 20 мин и, после 20 мин, концентрацию элюата 2 = CHCN/0,1% TFA увеличивали до 27%. Затем, контролируя элюат целевого пептида при УФ 22 0 нм, концентрацию элюата 2 увеличивали со скоростью 0,25% в минуту и собирали фракции, содержащие целевой продукт. Пептид (100 мг), полученный после лиофилизации, повторно очищали методом обращенной фазы при тех же условиях, и ацетонитрил выпаривали при пониженном давлении, и остаток лиофилизировали для получения целевого пептида (CRMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13), 37,2 мг).
насос: изготовлен Shimadzu; LC-6A
колонка: YMC ODS-A 3 cmϕ×25 cmL, 10 мкм
2
Элюат 1: HO/0,1% TFA
3
Элюат 2: CHCN/0,1% TFA
скорость потока: 20 мл/мин
детекция: УФ 220 нм
масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд = 1212,0 [М+1]
+
(расчетная величина = 1211,6)
[0372]
Примеры 3-5
Методом, аналогичным приведенному в Примере 2, были синтезированы пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, 18 или 17. В Таблице 54 представлено синтезированное количество и результаты масс-спектрометрии.
[0374]
Экспериментальный Пример 1
Временная зависимость укорочения N-концевой аминокислоты под действием ERAP1
Пептиды SEQ ID NO: 13, 16, 18 и 17, синтезированные в Примерах 2-5, были проанализированы на предмет укорочения N-концевой аминокислоты под действием ERAP1 (PLoS One November 2008, vol. 3, Issue 11, e3658).
30 мкл ERAP1 (2,0 мг/мл) в буферном растворе PBS были добавлены к 2 58 мкл буфера Трис⋅HCl. Раствор DMSO (12,0 μl) каждого 10 мМ пептида был добавлен в вышеуказанный раствор ERAP1, и смесь тщательно перемешивали и выдерживали при комнатной температуре. Спустя 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 ч, 50 μl образца были добавлены к 150 μl МеОН для остановки реакции, 25 μl наносили на колонку UFLC (условия анализа представлены ниже), и определяли AUC целевого пептида. Пептид, полученный укорочением, отдельно синтезировали химическим способом и анализировали в тех же условиях в отсутствии фермента. Скорость образования пептида, полученного путем укорочения, была определена по результатам полученной AUC.
Условия анализа
насос: UFLC производства Shimadzu
колонка: Shim-pack XR-ODS 3,0 mmi.d. ×75 mm
2
3
раствор: 0,1% TFA HO(A) - 0,1% TFA CHCN(B)
температурный режим термостата: 40°С
скорость потока: 1,0 мл/мин
длина волны детектирования: λ=220 нм
градиент:
1. Концентрация РАСТВОРА В была увеличена от 1,0% до 70% в диапазоне от 0,0 мин до 5,0 мин
2. Концентрация РАСТВОРА В была увеличена от 1,0% до 50% в диапазоне от 0,0 мин до 5,0 мин
целевой пептид:
Что касается пептидов, синтезированных в Примерах 2-5, аминокислотные последовательности пептидов, полученных
укорочением N-концевой аминокислоты под действием ERAP1, приведены в Таблице 55.
[0375]
[0376]
Временная зависимость скорости образования пептидов, полученных в результате укорочения, представлена в Таблице 56 и на Фиг. 1.
[0377]
[0378]
Результаты укорочения убедительно свидетельствуют о том, что в любых Cys-удлиненных пептидах (SEQ ID NO: 13, 16, 17 и 18), Cys на уддлиненном N-конце селективно расщепляется ERAP-1, а именно, Cys-удлиненный пептид подвергается соответствующему укорочению под действием ERAP-1 без выраженной зависимости от последовательности пептида и, в конечном итоге преобразуется в целевой пептид ракового антигена (SEQ ID NO: 2, 5, 6 или 7).
[0379]
Экспериментальный Пример 2
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402
[0380]
Соединение, представленное формулой (5), синтезированное в Примере 1, оценивали на способность индуцировать CTL путем проведения in vivo теста индуцирования CTL с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 и трансгенной мыши HLA-A2402. Соединение, представленное формулой (5):
[0381]
[0382]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, является, в частности, соединением вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) и пептида В ракового антигена является CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT, и CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) является HLA-A24-рестриктированным пептидом WT1.
[0383]
b
b
b
Трансгенная мышь HLA-A0201 (C57BL/6CrHLA-A2.1DR1) является мышью, дефектной по мышиному МНС, и экспрессирует химеру HLA человеческого МНС HLA-A0201 и мышиного МНС H-2D, и HLA-DRB1*0101. Используя эту мышь, может быть отобран HLA-A02-положительный пептид, способный индуцировать CTL у человека (Eur J Immunol. 2004; 34: 3060-9). С другой стороны, трансгенная мышь HLA-A2402 (C57BL/6CrHLA-A2402/K) является мышью, которая экспрессирует химеру HLA человеческого МНС HLA-A2 4 02 и мышиного МНС Н-2K. Используя эту мышь, может быть отобран HLA-A24-положительный пептид, способный индуцировать CTL у человека (Int J Cancer 2002; 100: 565-70).
[0384]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2, 4), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 4) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5).
[0385]
6
6
2
В частности, соединение, представленное формулой (5), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 40 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 5 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 4 участка основания хвоста мыши в количестве 2 50 мкг/участок. Через неделю, мышь подвергали эвтаназии действием CO2, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,15×10 клеток/лунка и выделенные из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоциты высевали в количестве 1×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 4) растворяли в DMS0 до 4 0 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI164 0, содержащей 10% FBS до 4 0 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Кроме того, разведенный пептид (SEQ ID NO: 4) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A2402, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 20 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0386]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 2, и результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A2402 трансгенной мыши показаны на Фиг. 3.
На каждом Чертеже вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 2 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов в присутствии или в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и на Фиг. 3, черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоцитов в присутствии или в отсутствии целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество специфичных к каждому пептиду CTL, индуцированных у мыши in vivo при введении соединения, представленного формулой (5).
На каждом Чертеже значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из соответствующей трансгенной мыши в отсутствие целевого пептида не реагируют вовсе. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах, и продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в выделенных из трансгенных мышей HLA-A2402 спленоцитов.
[0387]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (5), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 4. Были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (5), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мыши in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (5), которое является одним из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов WT1 образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать два различных вида CTL in vivo.
[0388]
Ссылочные Примеры 1-7
Способом, аналогичным приведенному в Примере 2, были синтезированы соответствующие пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 22, 24, 23, 2, 4, 6 и 5. В Таблице 57 представлены результаты масс-спектрометрии. Поскольку SEQ ID NO: 22, 24, 23, 2, 4, 6 и 5 не являются соединением по настоящему изобретению, они описаны как ссылочные.
[0389]
[0390]
Примеры 6-9
Способом, аналогичным приведенному в Примере 1, были синтезированы соответствующие соединения (конъюгаты), представленные формулами (3), (6), (7) и (8). В Таблице 58 представлены результаты масс-спектрометрии. (В каждой формуле связь между С и С является дисульфидной связью).
[0391]
[0392]
Экспериментальный Пример 3
Измерение растворимости
Стадия 1. Приготовление изотонического буфера
1. 75% водный раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 5,53% водный раствор лимонной кислоты смешивали, и готовили соответствующие буферы (рН 6,0 и 7,4).
Стадия 2. Получение испытуемого раствора
Приблизительно 1 мг испытуемого продукта было измерено, добавлен изотонический буфер (0,5 мл), и полученная смесь была использована в качестве испытуемого раствора. Приготовленный испытуемый раствор встряхивали при комнатной температуре в течение 90 мин (условия встряхивания: RECIPRO SHAKER SR-1N производства TAITEC, скорость = 8), центрифугировали (15000 оборотов в минуту, 5 минут, комнатная температура), и супернатант после центрифугирования был использован в качестве испытуемого раствора.
Стадия 3. Получение стандартного раствора
Приблизительно 1 мг испытуемого продукта были точно измерены, растворены в 0,1% водном TFA/ацетонитрил = 1/1, приготовлено общее количество 10 мл, и данный раствор был использован в качестве стандартного раствора испытуемого продукта.
Стадия 4. Измерение концентрации испытуемого продукта
Стандартный раствор испытуемого продукта и испытуемый раствор анализировали методом HPLC (условия анализа описаны в Таблице 59), и растворимость испытуемого продукта была вычислена по отношению к площади пика стандартного раствора.
Условия измерения методом HPLC
колонка: ChemcoPack Quicksorb (4,6 mmϕ×150 mm, 5 mkm) производства Chemco Scientific Co., Ltd.
подвижная фаза: РАСТВОР A; 0,1% водный раствор TFA, РАСТВОР В; 0,1% раствор TFA/ацетонитрил
температура колонки: комнатная температура
скорость потока: 1 мл/мин
длина волны детектирования: УФ 254 нм, 230 нм (двухволновое детектирование)
объем вносимого на колонку образца: 10 мкл
[0393]
[0394]
Пептиды, синтезированные в Ссылочных примерах 1-2 и 4-7, и соединения (конъюгаты), синтезированные в примерах 1, 7 и 9, подвергали вышеуказанному измерению растворимости. Каждое значение растворимости приведено в Таблице 60.
[0395]
[0396]
Экспериментальный Пример 4
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0397]
Соединение, представленное формулой (3), синтезированное в Примере 6, исследовали на индуцирующую CTL способность с помощью анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201. Соединение, представленное формулой (3):
[0398]
[0399]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в котором пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), и пептида В ракового антигена является SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) и SLGEQQYSV (SEQ ID NO: б) представляют собой ША-А0201-рестриктированные пептиды WT1.
[0400]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальном Примере 2.
[0401]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (3), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2, 6), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 6) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (3).
[0402]
2
2
6
В частности, соединение, представленное формулой (3), растворяли в воде для инъекций до 10 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 500 мкг/участок. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI164 0, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,75×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 6) растворяли в DMSO до 4 0 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 4 0 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2, 6) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 20 ч при 37°С, 5% СО, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0403]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 4.
На Фиг. 4 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 4 черный столбец и заштрихованный столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации каждым пептидом, представленным SEQ ID NO: 2, 6, и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного или заштрихованного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и что результатом введения соединения, представленного формулой (3), была индукция CTL, специфичных к каждому пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, 6, in vivo у мыши. На Чертеже 4 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, 6, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах.
[0404]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (3), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, 6. Были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (3), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мыши in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2 и 6. То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (3), которое является одним из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать два различных вида CTL in vivo.
[0405]
Экспериментальный Пример 5
Оценка способности индуцировать CTL in vivo с использованием трансгенной мыши HLA-A0201
[0406]
Соединение, представленное формулой (6), синтезированное в Примере 7, тестировали на способность индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201. Соединение, представленное формулой (6):
[0407]
[0408]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), и пептид С ракового антигена является CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 24) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0409]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальном Примере 2. Используя эту мышь, HLA-A02-положительный пептид, способный индуцировать CTL у человека, может быть выбран, также как может быть оценена активность повышения индукции CTL хелперного пептида, способного индуцировать клетки Т-хелперы путем связывания с HLA-DRB1*0101 человека.
[0410]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (6), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), и клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом (SEQ ID NO: 24), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 24) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (6). Кроме того, спленоциты, полученные из вышеуказаной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (6), и спленоциты, полученные из вышеуказаной мыши, которой вводили соединение, представленное SEQ ID NO: 2, были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2), и сравнивали число клеток, продуцирующих IFNγ.
[0411]
2
2
6
6
В частности, пептид, представленный SEQ ID NO: 2, растворяли в воде для инъекций до 6 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированный пептид внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Соединение, представленное формулой (6), растворяли в воде для инъекций (19,8 мг/мл), и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 4 95 мкг/участок. Число молей пептида SEQ ID NO: 2, содержащееся в дозе соединения, представленного формулой (6), в расчете на одну мышь, корректировали так, чтобы быть равным таковому пептида SEQ ID NO: 2, содержащегося в дозе в расчете на одну мышь. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка или 0,5×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 24) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 4 0 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2, 24) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-А0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 20 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0412]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 5 и 6.
На Фиг. 5 и 6 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета, и горизонтальная ось показывает соединение или пептид, вводимые в мышь. На Фиг. 5 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 2, и белый столбец отображает результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и что результатом введения пептида, представленного SEQ ID NO: 2, или соединения, представленного формулой (6), была индукция CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, in vivo у мыши. На Чертеже 5 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах. Более того, на Фиг. 5 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которые были индуцированы введением соединения, представленного формулой (6), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, индуцированных введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2.
Более того, на Фиг. 6 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, и белый столбец отображает результаты, полученные в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество взаимодействующих с пептидом клеток, и результатом введения соединения, представленного формулой (6), была индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo у мышей, и введение соединения, представленного SEQ ID NO: 2, не вызвало индукцию клеток, взаимодействующих с пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo у мышей. На Чертеже 6 значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом.
[0413]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (6), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и клетки, взаимодействующие с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24. Были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (6), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мышей in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2 и 24. Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, образуемого из соединения, представленного формулой (6), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и было обнаружено много IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, при сравнении с введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (6), которое является одним из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и взаимодействующие с хелперным пептидом клетки in vivo.
[0414]
Экспериментальный Пример 6
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0415]
Соединение, представленное формулой (8), синтезированное в Примере 9, оценивали на способность индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201. Соединение, представленное формулой (8):
[0416]
[0417]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) и пептид С ракового антигена является CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0418]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0419]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (8), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), и клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом (SEQ ID NO: 22), оценивали по ответной реакции клетки, руководствуясь измерением продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 22) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (8). Кроме того, спленоциты, полученные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (8), и спленоциты, полученные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное SEQ ID NO: 2, были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2), и сравнивали число клеток, продуцирующих IFNγ.
[0420]
2
2
6
6
В частности, пептид, представленный SEQ ID NO: 2, растворяли в воде для инъекций до 6 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированный пептид внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Соединение, представленное формулой (8), растворяли в воде для инъекций (18 мг/мл), и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 450 мкг/участок. Число молей пептида SEQ ID NO: 2, содержащееся в дозе соединения, представленного формулой (8), в расчете на одну мышь, корректировали так, чтобы быть равным таковому пептида SEQ ID NO: 2, содержащегося в дозе в расчете на одну мышь. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием СО, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка или 0,5×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 22) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 4 0 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2, 22) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-А0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 20 ч при 37°С, 5% СО, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0421]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201, представлены на Фиг. 7 и 8.
На Фиг. 7 и 8 вертикальная ось показывает число клеток, которые вступают во взаимодействие в лунках планшета, а горизонтальная ось показывает соединение или пептид, которые вводят мыши. На Фиг. 7 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 2, и белый столбец отображает результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и что результатом введения пептида, представленного SEQ ID NO: 2, или соединения, представленного формулой (8), была индукция CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, in vivo у мыши. На Чертеже 7 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах. Более того, на Фиг. 7 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которые были индуцированы введением соединения, представленного формулой (8), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, индуцированных введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2.
Более того, на Фиг. 8 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, и белый столбец отображает результаты, полученные в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество взаимодействующих с пептидом клеток, и результатом введения соединения, представленного формулой (8), была индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, in vivo у мышей, и введение пептида, представленного SEQ ID NO: 2, не вызвало индукцию клеток, взаимодействующих с пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, in vivo у мышей. На Чертеже 8 значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом.
[0422]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (8), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и клетки, взаимодействующие с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 22. Были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (8), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мышей in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2 и 22. Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, образуемого из соединения, представленного формулой (8), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и было обнаружено много IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, при сравнении с введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (8), которое является одним из вариантов осуществления по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и взаимодействующие с хелперным пептидом клетки in vivo.
[0423]
Пример 10
Методом, аналогичным приведенному в Примере 1, были синтезированы соответствующие соединения (конъюгаты), представленные формулой (9). В Таблице 61 представлены результаты масс-спектрометрии. (В каждой формуле связь между С и С является дисульфидной связью).
[0424]
[0425]
Ссылочный Пример 8-9
Методом, аналогичным приведенному в Примере 2, были синтезированы пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 238-239. Результаты масс-спектрометрии представлены в Таблице 62. Поскольку пептиды, описанные в Таблице, не являются соединением по настоящему изобретению, они указаны как Ссылочные Примеры.
[0426]
[0427]
Ссылочные Примеры 10-11
Методом, аналогичным приведенному в Примере 2, были синтезированы пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 240-241. Результаты масс-спектрометрии представлены в Таблице 63. Поскольку пептиды, описанные в Таблице, не являются соединением по настоящему изобретению, они указаны как Ссылочные Примеры.
[0428]
[0429]
Пептиды, представленные в Таблице 63, были синтезированы со ссылкой на непатентный документ Cancer Science January 2012, Vol. 103, no. 1, 150-153.
[0430]
Экспериментальный Пример 7
Анализ стабильности конъюгата и коктейльной вакцины
[0431]
Стадия 1
Конъюгат (формула №: (6)) (2,4 мг) растворяли в 120 мкл воды для инъекций и хранили в темном месте при комнатной температуре.
Стадия 2
В качестве коктейльной вакцины, пептид, представленный SEQ ID NO: 2 (1,1 мг), растворяли в 180 мкл воды для инъекций, 123 мкл этого раствора было использовано для растворения пептида, представленного SEQ ID NO: 24 (1,3 мг), и раствор хранили в темном месте при комнатной температуре.
Стадия 3
Растворы (2,5 мкл), полученные на стадии 1 и стадии 2, разбавляли водой для инъекций (50 мкл) и подвергали HPLC-анализу (условия анализа приведены ниже), и процентное содержание конъюгата и пептида в водном растворе измеряли по значению площади сразу после начала хранения, принятое за 100%. Процентное содержание конъюгата представлено в Таблице 64, и таковое каждого пептида в коктейльной вакцине представлено в Таблице 65.
Условия анализа
насос: UFLC производства Shimadzu
колонка: Kinetex 2,6u С18 100А внутренний диаметр 3,0 мм ×75 мм
подвижная фаза: РАСТВОР А; водный 0,1% TFA, РАСТВОР В; ацетонитриловый раствор 0,1% TFA
температура колонки: 40°С
скорость потока: 1 мл/мин
длина волны детектирования: УФ 220, 254 нм (двухволновое определение)
Объем вводимого на колонку образца: 10 мкл
[0432]
[0433]
[0434]
В экспериментальном Примере 7, конъюгат, представленный формулой №: (6), в растворе препарата содержал 96% соединения, представленного формулой (6), в момент времени 2 недели. Напротив, в смешанном растворе SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 24, который представляет собой коктейльную вакцину, процентное содержание SEQ ID NO: 24 снизилось до 65% по истечении 1 дня и до 6% через 2 недели. Эти результаты показывают, что конъюгат, хранимый в форме водного раствора, был стабильнее коктейльной вакцины, хранимой в тех же условиях.
[0435]
Экспериментальный Пример 8
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0436]
Соединение, представленное формулой (7), синтезированное в Примере 8, оценивали по способности индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201. Соединение, представленное формулой (7):
[0437]
[0438]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) и пептид С ракового антигена представляет собой CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 23) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0439]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0440]
Вызывает ли введение соединения, представленное формулой (7), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), и клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом (SEQ ID NO: 23), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 23) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (7). Кроме того, спленоциты, полученные из вышеуказаной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (7), и спленоциты, полученные из вышеуказаной мыши, которой вводили соединение, представленное SEQ ID NO: 2, были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2), и сравнивали число клеток, продуцирующих IFNγ.
[0441]
2
2
6
6
В частности, пептид, представленный SEQ ID NO: 2, растворяли в воде для инъекций до 6 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированный пептид внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Соединение, представленное формулой (7), растворяли в воде для инъекций (19 мг/мл), и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 475 мкг/участок. Число молей пептида SEQ ID NO: 2, содержащееся в дозе соединения, представленного формулой (7), в расчете на одну мышь, корректировали так, чтобы быть равным таковому пептида SEQ ID NO: 2, содержащегося в дозе в расчете на одну мышь. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Для измерения продукции IFNγ был использован коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка или 0,5×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 23) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2, 23) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-А0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 17 ч при 37°С, 5% СО, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0442]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 9 и 10. На Фиг. 9 и 10 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета, и горизонтальная ось показывает соединение или пептид, вводимые в мышь. На Фиг. 9 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 2, и белый столбец отображает результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и результатом введения пептида, представленного SEQ ID NO: 2, или соединения, представленного формулой (7), была индукция CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, in vivo у мыши. На Чертеже 9 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах. Более того, на Фиг. 9 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которые были индуцированы введением соединения, представленного формулой (7), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, индуцированных введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2.
Более того, на Фиг. 10 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 23, и белый столбец отображает результаты, полученные в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество взаимодействующих с пептидом клеток, и результатом введения соединения, представленного формулой (7), была индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 23, in vivo у мышей, и введение пептида, представленного SEQ ID NO: 2, не вызвало индукцию клеток, взаимодействующих с пептидом, представленным SEQ ID NO: 23, in vivo у мышей. На Фиг. 10 значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом.
[0443]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (7), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и клетки, взаимодействующие с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 23. Были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (7), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мышей in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2 и 23. Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 23, образуемого из соединения, представленного формулой (7), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и было обнаружено много IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, при сравнении с введением соединения, представленного SEQ ID NO: 2.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (7), которое является одним из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и взаимодействующие с хелперным пептидом клетки in vivo.
[0444]
Экспериментальный Пример 9
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0445]
Соединение, представленное формулой (9), синтезированное в Примере 10, оценивали по способности индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201. Соединение, представленное формулой (9):
[0446]
[0447]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5) и пептид С ракового антигена является CNKRYFKLSHLQMHSRKHG (SEQ ID NO: 24). ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5) является HLA-A0201- и HLA-A2402- рестриктированным пептидом WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRKHG (SEQ ID NO: 24) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0448]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0449]
Вызывает ли введение соединения, представленное формулой (9), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 5), и клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом (SEQ ID NO: 24), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 5, 24) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (9). Кроме того, спленоциты, полученные из вышеуказаной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (9), и спленоциты, полученные из вышеуказаной мыши, которой вводили соединение, представленное SEQ ID NO: 5, были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 5), и сравнивали число клеток, продуцирующих IFNγ.
[0450]
2
2
6
6
В частности, пептид, представленный SEQ ID NO: 5, растворяли в воде для инъекций до 6 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированный пептид внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Соединение, представленное формулой (9), растворяли в воде для инъекций (23,6 мг/мл), и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 590 мкг/участок. Число молей пептида SEQ ID NO: 5, содержащееся в дозе соединения, представленного формулой (9), в расчете на одну мышь, корректировали так, чтобы быть равным таковому пептида SEQ ID NO: 5, содержащегося в дозе в расчете на одну мышь. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка или 0,75×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 5, 24) растворяли в DMS0 до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 4 0 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 5, 24) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-А0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 17 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0451]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 11 и 12. На Фиг. 11 и 12 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета, и горизонтальная ось показывает соединение или пептид, вводимые в мышь. На Фиг. 11 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 5, и белый столбец отображает результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и результатом введения пептида, представленного SEQ ID NO: 5, или соединения, представленного формулой (9), была индукция CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 5, in vivo у мыши. На Фиг. 11 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 5, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах. На Фиг. 11 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 5, которые были индуцированы введением соединения, представленного формулой (9), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, индуцированных введением пептида, представленного SEQ ID NO: 5.
Более того, на Фиг. 12 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, и белый столбец отображает результаты, полученные в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество взаимодействующих с пептидом клеток, и результатом введения соединения, представленного формулой (9), была индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo у мышей, и введение пептида, представленного SEQ ID NO: 5, не вызвало индукцию клеток, взаимодействующих с пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, in vivo у мышей. На Чертеже 12 значение белого столбца едва определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали в отсутствие активации целевым пептидом.
[0452]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (9), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 5, и CTL, взаимодействующие с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24. Были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (9), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мышей in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 5 и 24. Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, образуемого из соединения, представленного формулой (9), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 5, и было обнаружено много IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 5, при сравнении с введением соединения, представленного SEQ ID NO: 5.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (9), которое является одним из вариантов осуществления по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и взаимодействующие с хелперным пептидом клетки in vivo.
[0453]
Ссылочный Пример 1
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402
[0454]
Соединение, представленное формулой (5), синтезированное в Примере 1, и пептид, представленный SEQ ID NO: 238 и 239, синтезированный в Ссылочных Примерах 8 и 9, были исследованы на предмет способности индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402. Соединение, представленное формулой (5):
[0455]
[0456]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой таковое, как описано в Экспериментальном Примере 2. Пептид, представленный SEQ ID NO: 238 и 239, является длинноцепочечным пептидом, в котором RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), который является HLA-А0201-рестриктированным пептидом WT1, и CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4), который является HLA-A2402-рестриктированным пептидом WT1, связаны друг с другом посредством амидной связи.
[0457]
Трансгенная мышь HLA-A0201 и трансгенная мышь HLA-A2402 являются таковыми, как описано в Экспериментальном Примере 2.
[0458]
Вызывает ли введение соединения, представленное формулой (5), и пептида, представленного SEQ ID NO: 238, 239, индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2, 4), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 4) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 238, 239.
[0459]
2
2
6
6
В частности, соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 238, 239, каждый растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 40 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 5 мг/мл и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 4 участка основания хвоста мыши в количестве 250 мкг/участок. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Для измерения продукции IFNγ был использован коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка и выделенные из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоциты высевали в количестве 1×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 4) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Кроме того, разведенный пептид (SEQ ID NO: 4) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A2402, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 18 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0460]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201, представлены на Фиг. 13, и результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A2402 представлены на Фиг. 14.
На каждом Чертеже вертикальная ось показывает число клеток, которые отвечают на воздействия в лунках плашки. На Фиг. 13 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов в присутствии или в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и на Фиг. 14. черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоцитов в присутствии или в отсутствии целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество специфичных к каждому пептиду CTL, индуцированных у мыши in vivo при введении соединения, представленного формулой (5), и пептида, представленного SEQ ID NO: 238, 239.
На каждом Чертеже значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты из соответствующей трансгенной мыши не реагируют вовсе в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили соединение, представленное формулой (5), и продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A2402, которым вводили соединение, представленное формулой (5). С другой стороны, в то же время, продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, детектировали в спленоцитах, полученных из трансгенной мыши HLA-А0201, которой вводили пептид, представленный SEQ ID NO: 238; однако, при сравнении со спленоцитами, выделенными из трансгенной мыши HLA-A2402, которой вводили соединение, представленное формулой (5), их количество было очень маленьким. Продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A2402, которым вводили пептид, представленный SEQ ID NO: 238. В то же время, продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили пептид, представленный SEQ ID NO: 239; однако, при сравнении со спленоцитами, выделенными из трансгенной мыши HLA-A0201, которой вводили соединение, представленное формулой (5), их количество было маленьким. Продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A2402, которым вводили пептид SEQ ID NO: 239.
[0461]
На основании этого, было выяснено, что соединение, представленное формулой (5) настоящего изобретения, способно эффективно индуцировать CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 4. С другой стороны, длинноцепочечный пептид, представленный SEQ ID NO: 238, 239, не обладал способностью эффективно индуцировать как CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, так и CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 4.
[0462]
Сравнительный Пример 2
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402.
[0463]
Соединение, представленное формулой (5), синтезированное в Примере 1, и пептиды, представленные SEQ ID NO: 240 и 241, синтезированные в Ссылочных Примерах 10 и 11, исследовали на предмет способности индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402. Соединение, представленное формулой (5):
[0464]
[0465]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, является таковым, как описано в Экспериментальном Примере 2. Пептид, представленный SEQ ID NO: 240 и 241, является длинноцепочечным пептидом, в котором RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), который является HLA-А0201-рестриктированным пептидом WT1, и CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4), который является HLA-A2402-рестриктированным пептидом WT1, связаны друг с другом амидной связью посредством 6 глицинов в качестве пептидного спейсера.
[0466]
Трансгенная мышь HLA-A0201 и трансгенная мышь HLA-A2 4 02 являются таковыми, как указано в Экспериментальном Примере 2.
[0467]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), и пептида SEQ ID NO: 240, 241, описанных результатами по индуцированию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2, 4), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 4) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5), и пептида, представленного SEQ ID NO: 240, 241.
[0468]
2
2
6
6
В частности, соединение, представленное формулой (5), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 10 мг/мл и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 500 мкг/участок. Кроме того, пептиды, представленные SEQ ID NO: 240, 241, растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 11 мг/мл и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 550 мкг/участок. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием СО, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка и выделенные из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоциты высевали в количестве 1,5×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 4) растворяли в DMSO до 4 0 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Кроме того, разведенный пептид (SEQ ID NO: 4) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A2402, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 17 ч при 37°С, 5% СО, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0469]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201, представлены на Фиг. 15, и результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A2402 представлены на Фиг. 16.
На каждом Чертеже вертикальная ось показывает число клеток, которые отвечают на воздействия в лунках плашки. На Фиг. 15 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов в присутствии или в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и на Фиг. 16. черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоцитов в присутствии или в отсутствии целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество специфичных к каждому пептиду CTL, индуцированных у мыши in vivo при введении соединения, представленного формулой (5), и пептидов, представленных SEQ ID NO: 240, 241.
На каждом Чертеже значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из соответствующей трансгенной мыши не реагировали вовсе в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили соединение, представленное формулой (5), и продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A2 4 02, которым вводили соединение, представленное формулой (5). С другой стороны, продукция IFNγ, специфичная для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, была в значительной степени меньшей в спленоцитах, полученных из трансгенной мыши HLA-A0201, которой вводили пептид, представленный SEQ ID NO: 24 0; однако продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A02402, которым вводили соединение, представленное SEQ ID NO: 240. При этом продукция IFNγ, специфичная для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, была в значительной степени меньшей в спленоцитах, полученных из трансгенной мыши HLA-A0201, которой вводили пептид, представленный SEQ ID NO: 241. В то же время, продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, детектировали в спленоцитах, выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201, которой вводили пептид, представленный SEQ ID NO: 241; однако, при сравнении со спленоцитами, выделенными из трансгенной мыши HLA-A2402, которой вводили соединение, представленное формулой (5), их количество было очень малым.
[0470]
На основании этого, было выяснено, что соединение, представленное формулой (5) настоящего изобретения, способно эффективно индуцировать CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 4. С другой стороны, длинноцепочечный пептид, содержащий пептидный спейсер, представленный SEQ ID NO: 240, 241, не обладал способностью эффективно индуцировать как CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, так и CTL, специфичные для пептида, представленного SEQ ID NO: 4.
[0471]
Экспериментальный Пример 10
Пептид, синтезированный в Ссылочном Примере 3, и соединения (конъюгаты), синтезированные в Примерах 6 и 9, были подвергнуты измерению растворимости методом, подобным таковому в Экспериментальном Примере 3. Каждое значение растворимости представлено в Таблице 66.
[0472]
[0473]
Примеры 11-12
Методом, подобным таковому в Примере 2, были синтезированы пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 242-243. Результаты масс-спектрометрии представлены в Таблице 67. Пептиды, представленные в Таблице 67, являются соединениями по настоящему изобретению.
[0474]
[0475]
Пример 13
Методом, подобным таковому в Примере 1, было синтезировано каждое соединение (конъюгат), представленное формулой 10. Результаты масс-спектрометрии показаны в Таблице 68, в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
[0476]
[0477]
Ссылочный Пример 12
Методом, подобным таковому в Примере 1, было синтезировано каждое соединение (конъюгат), представленное формулой 11. Результаты масс-спектрометрии показаны в Таблице 69, в которой связь между С и С является дисульфидной связью. Пептид, представленный в Таблице, не является соединением по настоящему изобретению, и, следовательно, описывается в качестве Ссылочного Примера.
[0478]
[0479]
Пример 14
Синтез соединения, представленного формулой (12):
[0480]
[0481]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью
[0482]
Стадия 1. Синтез Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn (Mmt является 4-метокситритилом)
(Синтез Fmoc-C(Mmt)A-SBn)
Раствор Fmoc-Cys(Mmt)-ОН (4,80 г), N,N-диизопропилэтиламина (2,56 мл), гексафторфосфорной кислоты (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония(4,50 г) и H-Ala-SBn, синтезированные общепринятым методом (например, Journal of Organic Chemistry, Vol. 64, No. 24 8761-8769) в хлороформе (20 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали колоночной хроматографией (растворитель для элюирования, гексан/этилацетат) для получения целевого соединения, Fmoc-C(Mmt)A-SBn (2,80 г).
1
3
ЯМР: Н ЯМР (CDCl) δ 7, 72 (т, J=7, 6 Гц, 2Н), 7,54 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 7, 38-7, 34 (м, 7Н), 7, 29-7,25 (м, 6Н), 7,23-7,15 (м, 7Н), 6, 76 (д, J=8,8 Гц, 2Н), 6,15 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 4,95 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 4,57 (квин., J=7,6 Гц, 1Н), 4,35 (д, J=6,8 Гц, 2Н) 4,19-4,17 (м, 1Н), 4,04 (с, 2Н), 3,73 (с, 3Н), 2,72 (дд, J=13,2, 8,4 Гц, 1Н), 2,61 (д, J=9,6 Гц, 1Н), 1,31 (д, J=7,2 Гц, 3Н).
[0483]
Стадия 2. Синтез H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH
(Синтез С(Mmt) ACYTWNQMNL)
Раствор Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn (11 мг), полученного на стадии 1, H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (21 мг), синтезированного общепринятым методом (например, WO 07/063903), N,N-диизопропилэтиламина (200 мл), 3,3',3''-фосфонитрил трипропионовой кислоты гидрохлорида (1 мг), 4-меркаптофенилуксусной кислоты (1 мг) и 0,1М натрий-фосфатный буфер (рН 7,5, 2 00 мкл) в DMF (4 00 мкл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. К реакционной смеси был добавлен диэтиламин (200 мкл), и смесь дополнительно перемешивали в течение 15 мин. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой HPLC для получения целевого соединения, С(Mmt)ACYTWNQMNL (7 мг).
2+
Масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд=810,2 [М+2Н] (расчетная величина = 810,5)
[0484]
Стадия 3. Синтез дисульфидной связи (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH)
[т.е., синтез соединения, представленного формулой (13):
[0485]
[0486]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
Раствор H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-ОН (51 мг), полученного на стадии 2, и (H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (43 мг), полученного в Примере 1, стадии 1 в DMF (4 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой HPLC для получения 39 мг целевого соединения, дисульфидной связи (Н-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) [т.е., соединения, представленного формулой (13)].
2+
Масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд=1414,4 [М+2Н] (расчетная величина = 1415,2)
[0487]
Стадия 4. Синтез H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH
(Синтез С(SPy) NKRYFKLSHLQMHSRK)
20% раствор (в/в) H-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (182 мг), полученного в Ссылочном Примере 1, и 2,2'-дипиридилдисульфид (0,2 М раствор изопропанола, 54 4 мкл) в водном растворе уксусной кислоты (4 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 17 ч. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой HPLC для получения целевого соединения, H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (177 мг).
2+
Масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд=1143,5 [М+2Н] (расчетная величина = 1142,9)
[0488]
Стадия 5. Синтез соединения, представленного формулой (12):
[0489]
[0490]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
Раствор дисульфидной связи (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH), полученной на стадии 3 [т.е., соединения, представленного формулой (13)] (9 мг), H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (24 мг), полученного на стадии
4, и триизопропилсилана (10 мкл) в трифторуксусной кислоте (190 мкл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой HPLC для получения целевого соединения, соединения, представленного формулой 12 (5 мг).
3+
Масс-спектрометрия: LC-ESI/MS масса/заряд=1577,2 [М+3Н] (расчетная величина = 1577,9)
[0491]
Примеры 15-16
Способом, подобным таковому в Примере 14, было синтезировано каждое соединение (конъюгат), представленное формулой 14 или 15. Результаты масс-спектрометрии представлены в Таблице 70, в которой связь между С и С является дисульфидной связью.
[0492]
[0493]
Ссылочный Пример 13
Способом, подобным таковому в Примере 2, были синтезированы пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 244. В Таблице 71 представлены результаты масс-спектрометрии. Пептид, описанный в Таблице, не является соединением по настоящему изобретению, и, следовательно, он описан в качестве Ссылочного Примера.
[0494]
[0495]
Экспериментальный Пример 11
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0496]
Соединение, представленное формулой (10), синтезированное в Примере 13, было исследовано на предмет способности индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201. Соединение, представленное формулой (10):
[0497]
[0498]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) и пептид В ракового антигена является WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244). RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, и WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 24 4) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0499]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0500]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (10), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (10). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 24 4) в живом организме оценивали сравнением числа продуцирующих IFNγ клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (10), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили пептид, представленный (SEQ ID NO: 2), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0501]
2
2
6
В частности, соединение, представленное (SEQ ID NO: 2), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 3 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Кроме того, соединение, представленное формулой (10), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 8,5 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA). Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 425 мкг/участок. Число молей пептида SEQ ID NO: 2, содержащееся в дозе соединения, представленного формулой (10), в расчете на одну мышь, корректировали так, чтобы быть равным числу молей, содержащихся в дозе пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в расчете на одну мышь. Кроме того, был также задан один и тот же уровень концентрации DMSO, содержащегося в каждой эмульсии. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI164 0, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,125×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 4) растворяли в DMSO до 4 0 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI164 0, содержащей 10% FBS, до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 19 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0502]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 17. На Фиг. 17 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета, и горизонтальная ось показывает соединение или пептид, вводимые в мышь. На Фиг. 17 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 2, и белый столбец отображает результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и что результатом введения пептида, представленного SEQ ID NO: 2, или соединения, представленного формулой (10), была индукция CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, in vivo у мыши. На Фиг. 17 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах. Более того, на Фиг. 17 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которые были индуцированы введением соединения, представленного формулой (10), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, индуцированных введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2.
[0503]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (10), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. При введении соединения, представленного формулой (10), было выявлено большое количество продуцирующих IFNγ клеток, специфичных для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, при сравнении с введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2. Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24 4, образуемого из соединения, представленного формулой (10), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Таким образом, были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (10), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мыши in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2 и 244.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (10), которое является одним из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором два различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, показанной в формуле (1), и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и отвечающие на хелперный пептид клетки in vivo.
[0504]
Ссылочный Пример 3
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0505]
Соединение, представленное формулой (11), синтезированное в Ссылочном Примере 12, было исследовано на предмет способности индуцировать CTL методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201. Соединение, представленное формулой (11):
[0506]
[0507]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой, в частности, соединение вышеуказанной формулы (1), в которой пептид А ракового антигена является RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) и пептид С ракового антигена является WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243).
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2) является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, и WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0508]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0509]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (11), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (11). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 244) в живом организме оценивали сравнением числа продуцирующих IFNγ клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (11), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили пептид, представленный (SEQ ID NO: 2), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0510]
Способом, аналогичным приведенному в Экспериментальном Примере 11, был выполнен анализ индукции CTL.
[0511]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 18. На Фиг. 18 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета, и горизонтальная ось показывает соединение или пептид, вводимые в мышь. На Фиг. 18 черный столбец отображает результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов при активации пептидом, представленным SEQ ID NO: 2, и белый столбец отображает результаты, полученные на культуре в отсутствие активации. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, и что результатом введения пептида, представленного SEQ ID NO: 2, или соединения, представленного формулой (11), была индукция CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, in vivo у мыши. На Фиг. 18 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из трансгенной мыши HLA-A0201 не реагировали вовсе в отсутствие активации целевым пептидом. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201 спленоцитах. С другой стороны, на Фиг. 18 увеличение числа продуцирующих IFNγ клеток, специфичных для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением пептида, представленного SEQ ID NO: 2, не могло быть выявлено при введении соединения, представленного формулой (11).
[0512]
Результаты Экспериментального Примера 11 и Ссылочного Примера 3 предполагают, что когда WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) используют в качестве рестриктированного молекулой МНС класса II пептида, WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244) в качестве пептида В ракового антигена в вышеуказанной формуле (1) является более предпочтительным вариантом осуществления изобретения нежели WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243) в качестве пептида С ракового антигена.
[0513]
Экспериментальный Пример 12
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402
[0514]
Индуцирующую CTL способность соединения, представленного формулой 12, синтезированного в Примере 14, оценивали методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201 и трансгенную мышь HLA-A2402. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (12):
[0515]
[0516]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой HLA-A0201-рестриктированный пептид WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) представляет собой HLA-A2402-рестриктированный пептид WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22) представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1 (а именно, хелперный пептид).
[0517]
Трансгенная мышь HLA-A0201 и трансгенная мышь HLA-A2402 являются таковыми, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0518]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (12), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2, 4), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 4) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (12). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 22) в живом организме оценивали сравнением числа продуцирующих IFNγ клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (12), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5) были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2, 4).
[0519]
2
2
6
В частности, соединение, представленное формулой (5), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 3 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством Montanide ISA51VG. Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Кроме того, соединение, представленное формулой (12), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 8 0 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 6 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством Montanide ISA51VG. Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 300 мкг/участок. Число молей соединения, представленного формулой (5), содержащееся в дозе соединения, представленного формулой (12), в расчете на одну мышь, корректировали так, чтобы быть равным числу молей, содержащихся в дозе соединения, представленного формулой (5), в расчете на одну мышь. Кроме того, был также задан один и тот же уровень концентрации DMSO, содержащегося в каждой эмульсии. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием СО, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты и выделенные из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка каждые на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2, 4) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-A0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Кроме того, разведенный пептид (SEQ ID NO: 4) был добавлен к выделенным из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоцитам в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 17 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0520]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 19, и результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A2402 показаны на Фиг. 20.
На каждом Чертеже вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 19 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии и в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и на Фиг. 20 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоцитов, в присутствии и в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением соединений, представленных формулой (5) и формулой (12).
На каждом Чертеже значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты из соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201,, которым вводили соединения, представленные формулой (5) и формулой (12), и детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A2402 спленоцитах, которым вводили соединения, представленные формулой (5) и формулой (12). На Фиг. 19 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением соединения, представленного формулой (12), было выше числа IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, которое было индуцировано введением соединения, представленного формулой (5). С другой стороны, на Фиг. 20 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 4, которое было индуцировано введением соединения, представленного формулой (12), незначительно отличалось от числа IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, которое было индуцировано введением соединения, представленного формулой (5).
[0521]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (12), может индуцировать CTL, специфичные к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, 4. При введении соединения, представленного формулой (12), было выявлено большое количество продуцирующих IFNγ клеток, специфичных для пептида, представленного SEQ ID NO: 2, при сравнении с введением соединения, представленного формулой (5). Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, образуемого из соединения, представленного формулой (12), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Предположили, что отсутствие значительной разницы по числу IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 4, между введением соединения, представленного формулой 12 и введением соединения, представленного формулой (5), обусловлено отсутствием индукции клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, поскольку трансгенная мышь HLA-A2402 не экспрессировала молекулу МНС класса II. Таким образом, были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (12), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мыши in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2, 4 и 22.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (12), которое является одним из вариантов осуществления по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором три различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и отвечающие на хелперный пептид клетки in vivo.
[0522]
Экспериментальный Пример 13
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201 и трансгенную мышь HLA-A2402
[0523]
Индуцирующую CTL способность соединения, представленного формулой 14, синтезированного в Примере 15, оценивали методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201 и трансгенную мышь HLA-A2402. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (14):
[0524]
[0525]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой HLA-А0201-рестриктированный пептид WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) представляет собой HLA-A2402-рестриктированный пептид WT1, и WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244)представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1 (а именно, хелперный пептид).
[0526]
Трансгенная мышь HLA-A0201 и трансгенная мышь HLA-A2402 являются таковыми, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0527]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (14), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2, 4), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2, 4) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (14). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 244) в живом организме оценивали сравнением числа IFNγ-продуцирующих клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (14), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0528]
Методом, аналогичным описанному в Экспериментальном Примере 12, был выполнен анализ индуцирования CTL. Соединение, представленное формулой (14), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, разводили водой для инъекций до 5,6 мг/мл и смешивали с равным количеством Montanide ISA51VG для получения эмульсии. Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 280 мкг/участок.
[0529]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 21, и результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-А2402 показаны на Фиг. 22.
На каждом Чертеже вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 21 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии и в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, и на Фиг. 22 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A2402 спленоцитов, в присутствии и в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением соединений, представленных формулами (5) и (14).
На каждом Чертеже значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты из соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили соединения, представленные формулами (5) и (14), и детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 4, в выделенных из трансгенных мышей HLA-A2402 спленоцитах, которым вводили соединения, представленные формулами (5) и (14). На Фиг. 21 и 22 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, 4, которое было индуцировано введением соединения, представленного формулой (14), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, которое было индуцировано введением соединения, представленного формулой (5).
[0530]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что соединение, представленное формулой (14), может индуцировать CTL, специфичные к пептидам, представленным SEQ ID NO: 2 и 4. Было предположено, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24 4, образуемого из соединения, представленного формулой (14), усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, и было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, когда вводили соединение, представленное формулой (14), при сравнении с введением соединения, представленного формулой (5). С другой стороны, было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 4, когда вводили соединение, представленное формулой (14), при сравнении с введением соединения, представленного формулой (5). Предположили, что пептид, представленный SEQ ID NO: 24 4, связывался с мышиной молекулой МНС класса II, экспрессируемой в трансгенной мыши HLA-A2402, для индукции клетки, взаимодействующей с хелперным пептидом, который, в свою очередь, усиливал индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 4. Таким образом, были веские основания предполагать, что соединение, представленное формулой (14), подвергается расщеплению по дисульфидной связи и соответствующему укорочению под действием ERAP-1 у мыши in vivo, и действительно подвергается процессингу с образованием пептидов, представленных SEQ ID NO: 2, 4 и 244.
То есть, было выяснено, что соединение, представленное формулой (14), которое является одним из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором три различных вида пептидов образуют комплексное соединение посредством дисульфидной связи, и представляет собой конъюгированную вакцину на основе пептида ракового антигена WT1, которая действительно может индуцировать CTL и отвечающие на хелперный пептид клетки in vivo.
[0531]
Экспериментальный Пример 14
Оценка индуцирующей CTL способности in vivo с использованием трансгенной мыши HLA-A0201
[0532]
Коктейльную вакцину, которая является смесью соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 22, синтезированного в Ссылочном Примере 1, исследовали на предмет индуцирующей CTL способности методом анализа индукции CTL in vivo с использованием трансгенной мыши HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (5):
[0533]
[0534]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой HLA-A0201-рестриктированный пептид WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) представляет собой HLA-A2402-рестриктированный пептид WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 22) представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1 (а именно, хелперный пептид).
[0535]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0536]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 22), смешанный с соединением формулы (5), в живом организме оценивали сравнением числа IFNγ-продуцирующих клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили лишь одно соединение, представленное формулой (5), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили коктейльную вакцину соединения, представленного формулой (5), и пептида, представленного (SEQ ID NO: 22), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0537]
2
2
6
В частности, соединение, представленное формулой (5), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 8 0 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 3 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством Montanide ISA51VG. Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Кроме того, соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный (SEQ ID NO: 22), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, разводили водой для инъекций и смешивали таким образом, чтобы концентрация после разведения составила 3 мг/мл для соединения, представленного формулой (5), и 2,7 мг/мл для пептида, представленного (SEQ ID NO: 22). Разведенный раствор смешивали с равным количеством Montanide ISA51VG для получения эмульсии. Коктейльную вакцину, содержащую соединение, представленное формулой (5) в количестве 150 мкг/участок, и пептид, представленный SEQ ID NO: 22, в количестве 137 мкг/участок внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши. Концентрация DMSO каждой эмульсии была одинаковой. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-А0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 17 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0538]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 23.
На Фиг. 23 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 23 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии и в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением коктейльной вакцины, содержащей соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид (SEQ ID NO: 22).
На Фиг. 23 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201,, которым вводили только лишь соединение, представленное формулой (5), и коктейльную вакцину, содержащую хелперный пептид (SEQ ID NO: 22). На Фиг. 23 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением коктейльной вакцины, содержащей хелперный пептид (SEQ ID NO: 22), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, которое было индуцировано введением только лишь соединения, представленного формулой (5).
[0539]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 22, может индуцировать CTL, специфичные к пептидам, представленным SEQ ID NO: 2. Кроме того, было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, когда вводили коктейльную вакцину при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5). Предположили, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 22, содержащимся в коктейльной вакцине, усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Таким образом, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид, может в значительной степени индуцировать CTL в мышином организме при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5).
[0540]
Экспериментальный Пример 15
Оценка индуцирующей CTL способности in vivo с использованием трансгенной мыши HLA-A0201
[0541]
Индуцирующую CTL способность коктейльной вакцины соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 244, синтезированного в Ссылочном Примере 13, оценивали методом анализа индукции CTL in vivo с использованием трансгенной мыши HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (5):
[0542]
[0543]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, представляет собой HLA-А0201-рестриктированный пептид WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) представляет собой HLA-A2402-рестриктированный пептид WT1, и WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244)представляет собой рестриктированный молекулой МНС класса II пептид WT1 (а именно, хелперный пептид).
[0544]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0545]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 244), смешанный с соединением формулы (5), в живом организме оценивали сравнением числа IFNγ-продуцирующих клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили лишь одно соединение, представленное формулой (5), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили коктейльную вакцину соединения, представленного формулой (5), и пептида, представленного (SEQ ID NO: 244), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0546]
Методом, аналогичным таковому в Экспериментальном Примере 14, был выполнен анализ индукции CTL. Для получения коктейльной вакцины соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный (SEQ ID NO: 244), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций и смешивали таким образом, чтобы концентрация после разведения была равной 3 мг/мл для соединения, представленного формулой (5), и 2,3 мг/мл для пептида, представленного (SEQ ID NO: 244). Разведенный раствор смешивали с равным количеством Montanide ISA51VG для получения эмульсии. Коктейльную вакцину, содержащую соединение, представленное формулой (5) в количестве 150 мкг/участок, и пептид, представленный SEQ ID NO: 244, в количестве 115 мкг/участок внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши.
[0547]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 24.
На Фиг. 24 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 2 4 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии или в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением коктейльной вакцины, содержащей соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид (SEQ ID NO: 244).
На Фиг. 24 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201,, которым вводили только лишь соединение, представленное формулой (5), и коктейльную вакцину, содержащую хелперный пептид (SEQ ID NO: 244). На Фиг. 24 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением коктейльной вакцины, содержащей хелперный пептид (SEQ ID NO: 244), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, которое было индуцировано введением только лишь соединения, представленного формулой (5).
[0548]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 244, может индуцировать CTL, специфичные к пептидам, представленным SEQ ID NO: 2. Кроме того, было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, когда вводили коктейльную вакцину при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5). Предположили, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 244, содержащимся в коктейльной вакцине, усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Таким образом, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид, может в значительной степени индуцировать CTL в мышином организме при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5).
[0549]
В качестве одного варианта производства вакцины, содержащей два пептида антигена WT1, можно упомянуть коктейльную вакцину, содержащую два различных пептида в виде одного препарата. При производстве коктейльной вакцины, свойства пептидов ракового антигена, подлежащих смешиванию, имеют одну проблему. Как показано в Таблице 60 и Таблице 66, производство коктейля двух пептидов антигена WT1 означает процессинг двух пептидов, имеющих различную растворимость, а именно, свойство, в одном препарате. Напротив, конъюгат по настоящему изобретению представляет собой соединение, в котором два пептида антигена WT1 связаны посредством дисульфидной связи, и обладают единой растворимостью, а именно, свойством. Это означает, что конъюгат по настоящему изобретению имеет единое свойство, а также имеет свойство, соответствующее двум пептидам антигена WT1, как показано в Экспериментальном Примере 2.
В этом аспекте было показано, что конъюгат по настоящему изобретению является соединением, способным индуцировать ответ на два пептида антигена WT1 без необходимости рассматривать взаимодействие между двумя пептидами антигена WT1 и тому подобное в отличие от коктейльных вакцин.
[0550]
Экспериментальный Пример 16
Оценка индуцирующей CTL способности in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0551]
Индуцирующая CTL способность коктейльной вакцины соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 24, синтезированного в Ссылочном Примере 2, оценивали методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-А0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (5):
[0552]
[0553]
в которой связь между С и С является дисульфидной связью, является HLA-A0201- рестриктированным пептидом WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) является HLA-A2402-рестриктированным пептидом WT1, и CNKRYFKLSHLQMHSRKTG (SEQ ID NO: 24) является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом (а именно, хелперным пептидом).
[0554]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0555]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 24), смешанный с соединением формулы (5), в живом организме оценивали сравнением числа IFNγ-продуцирующих клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили лишь одно соединение, представленное формулой (5), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили коктейльную вакцину соединения, представленного формулой (5), и пептида, представленного (SEQ ID NO: 24), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0556]
2
2
6
В частности, соединение, представленное формулой (5), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 8 0 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций до 3 мг/мл, и эмульгировали смешиванием с равным количеством Montanide ISA51VG. Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши в количестве 150 мкг/участок. Кроме того, соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный (SEQ ID NO: 24), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, разводили водой для инъекций. Их смешивали таким образом, чтобы концентрация после разведения составила 3 мг/мл для соединения, представленного формулой (5), и 3,11 мг/мл для пептида, представленного SEQ ID NO: 24. Разведенный раствор смешивали с равным количеством Montanide ISA51VG для получения эмульсии. Коктейльную вакцину, содержащую соединение, представленное формулой (5) в количестве 150 мкг/участок, и пептид, представленный SEQ ID NO: 24, в количестве 156 мкг/участок внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши. Концентрация DMSO каждой эмульсии была одинаковой. Через неделю мышь подвергали эвтаназии действием CO, извлекали селезенку и выделяли спленоциты. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay был использован для измерения продукции IFNγ. За день до выделения спленоцитов планшет ELISPOT был обработан антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокирован средой RPMI1640, содержащей 10% FBS. Выделенные из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоциты высевали в количестве 0,25×10 клеток/лунка на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 2) растворяли в DMSO до 40 мг/мл, и дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 2) добавляли к спленоцитам, полученным из трансгенной мыши HLA-А0201, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Спленоциты с добавленным пептидом культивировали в течение 19 ч при 37°С, 5% CO, в результате чего была выполнена повторная стимуляция пептидом in vitro. После культивирования удаляли супернатант, и в планшете ELISPOT проводили цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряли системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
[0557]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 25.
На Фиг. 25 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 25 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии и в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением коктейльной вакцины, содержащей соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид (SEQ ID NO: 24).
На Фиг. 25 значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили только лишь соединение, представленное формулой (5), и коктейльную вакцину, содержащую хелперный пептид (SEQ ID NO: 24). На Фиг. 25 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением коктейльной вакцины, содержащей хелперный пептид (SEQ ID NO: 24), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, которое было индуцировано однократным введением лишь одного соединения, представленного формулой (5).
[0558]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 24, может индуцировать CTL, специфичные к пептидам, представленным SEQ ID NO: 2. Кроме того, было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, когда вводили коктейльную вакцину при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5). Предположили, что индуцирование клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 24, содержащимся в коктейльной вакцине, усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Таким образом, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид, может в значительной степени индуцировать CTL в мышином организме при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5).
[0559]
Экспериментальный Пример 17
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0560]
SEQ ID NO: 242, синтезированный в Примере 11, является пептидом, представленным SEQ ID NO: 24 4, имеющий протяженный цистеин на N-конце. SEQ ID NO: 244 в коктейльной вакцине в Экспериментальном Примере 15 демонстрирует усиливающую индукцию CTL активность. В этом тесте, таким образом, индуцирующая CTL способность коктейльной вакцины соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 242, оценивали методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (5):
[0561]
[0562]
в которой связь между С и С представляет собой дисульфидную связь, является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) является HLA-A2402-рестриктированным пептидом WT1, и WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244), содержащийся в CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242), является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0563]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0564]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 242), смешанный с соединением формулы (5), в живом организме оценивали сравнением числа IFNγ-продуцирующих клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили лишь одно соединение, представленное формулой (5), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили коктейльную вакцину соединения, представленного формулой (5), и пептида, представленного (SEQ ID NO: 242), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0565]
Способом, аналогичным таковому в Экспериментальном Примере 16, был выполнен анализ индукции CTL. Для получения коктейльной вакцины соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный (SEQ ID NO: 242), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, дополнительно разводили водой для инъекций и смешивали таким образом, чтобы концентрация после разведения была равной 3 мг/мл для соединения, представленного формулой (5), и 2,42 мг/мл для пептида, представленного (SEQ ID NO: 242). Разведенный раствор смешивали с равным количеством Montanide ISA51VG для получения эмульсии. Коктейльную вакцину, содержащую соединение, представленное формулой (5) в количестве 150 мкг/участок, и пептид, представленный SEQ ID NO: 242, в количестве 121 мкг/участок внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши.
[0566]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 26.
На Фиг. 26 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 26 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии или в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением коктейльной вакцины, содержащей соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид (SEQ ID NO: 242).
На Фиг. 26 значение белого столбца не определяется. Это означает, что спленоциты соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили только одно соединение, представленное формулой (5), и коктейльную вакцину, содержащую хелперный пептид (SEQ ID NO: 242). На Фиг. 26 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением коктейльной вакцины, содержащей хелперный пептид (SEQ ID NO: 242), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, которое было индуцировано введением только одного соединения, представленного формулой (5).
[0567]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 242, может индуцировать CTL, специфичные к пептидам, представленным SEQ ID NO: 2. Кроме того, было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, когда вводили коктейльную вакцину при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5). Предположили, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 244, содержащимся в пептиде, представленном SEQ ID NO: 242, содержащемся в коктейльной вакцине, усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Таким образом, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид, может в значительной степени индуцировать CTL в мышином организме при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5).
[0568]
Экспериментальный Пример 18
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201
[0569]
SEQ ID NO: 243, синтезированный в Примере 12, является пептидом, представленным SEQ ID NO: 244, имеющий протяженный цистеин на N-конце. SEQ ID NO: 244 в коктейльной вакцине в Экспериментальном Примере 15 демонстрирует усиливающую индукцию CTL активность. В этом тесте, таким образом, индуцирующая CTL способность коктейльной вакцины соединения, представленного формулой (5), синтезированного в Примере 1, и пептида, представленного SEQ ID NO: 243, оценивали методом анализа индукции CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-A0201. RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2), содержащийся в соединении, представленном формулой (5):
[0570]
[0571]
в которой связь между С и С представляет собой дисульфидную связь, является HLA-A0201-рестриктированным пептидом WT1, CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4) является HLA-A2402-рестриктированным пептидом WT1, и WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244), содержащийся в WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243)является рестриктированным молекулой МНС класса II пептидом WT1 (а именно, хелперным пептидом).
[0572]
Трансгенная мышь HLA-A0201 является таковой, как описано в Экспериментальных Примерах 2 и 5.
[0573]
Вызывает ли введение соединения, представленного формулой (5), индукцию CTL, специфичных для целевого пептида (SEQ ID NO: 2), оценивали на основании измерения продукции IFNγ при повторной стимуляции пептидом (SEQ ID NO: 2) спленоцитов, полученных из вышеуказанной мыши, которой вводили соединение, представленное формулой (5). Работает или нет хелперный пептид (SEQ ID NO: 243), смешанный с соединением формулы (5), в живом организме оценивали сравнением числа IFNγ-продуцирующих клеток, при условии, что спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили лишь одно соединение, представленное формулой (5), и спленоциты, выделенные из вышеуказанной мыши, которой вводили коктейльную вакцину соединения, представленного формулой (5), и пептида, представленного (SEQ ID NO: 243), были повторно стимулированы пептидом (SEQ ID NO: 2).
[0574]
Методом, аналогичным таковому в Экспериментальном Примере 16, был выполнен анализ индукции CTL. Для получения коктейльной вакцины соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный (SEQ ID NO: 243), растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до 80 мг/мл, разводили водой для инъекций и смешивали таким образом, чтобы концентрация после разведения была равной 3 мг/мл для соединения, представленного формулой (5), и 2,42 мг/мл для пептида, представленного SEQ ID NO: 243. Разведенный раствор смешивали с равным количеством Montanide ISA51VG для получения эмульсии. Коктейльную вакцину, содержащую соединение, представленное формулой (5) в количестве 150 мкг/участок, и пептид, представленный SEQ ID NO: 243, в количестве 121 мкг/участок внутрикожно вводили в 2 участка основания хвоста мыши.
[0575]
Результаты анализа IFNγ ELISPOT с использованием трансгенной мыши HLA-A0201 показаны на Фиг. 27.
На Фиг. 27 вертикальная ось показывает число прореагировавших клеток в лунках планшета. На Фиг. 27 черный столбец и белый столбец отображают результаты, полученные на культуре выделенных из трансгенной мыши HLA-A0201 спленоцитов, в присутствии или в отсутствие целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2. То есть, разница в значениях черного столбца и белого столбца демонстрирует количество пептид-специфичных CTL, индуцированных у мышей in vivo введением коктейльной вакцины, содержащей соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид (SEQ ID NO: 243).
На Фиг. 27 значение белого столбца не определено. Это означает, что спленоциты соответствующей трансгенной мыши не реагировали в отсутствие целевого пептида. В результате этого теста детектировали продукцию IFNγ, специфичную для целевого пептида, представленного SEQ ID NO: 2, в спленоцитах, выделенных из трансгенных мышей HLA-A0201, которым вводили только одно соединение, представленное формулой (5), и коктейльную вакцину, содержащую хелперный пептид (SEQ ID NO: 243). На Фиг. 27 число IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, которое было индуцировано введением коктейльной вакцины, содержащей хелперный пептид (SEQ ID NO: 243), было выше числа пептид-специфичных IFNγ-продуцирующих клеток, которое было индуцировано введением только одного соединения, представленного формулой (5).
[0576]
Исходя из вышеизложенного, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и пептид, представленный SEQ ID NO: 243, может индуцировать CTL, специфичные к пептидам, представленным SEQ ID NO: 2. Кроме того, было обнаружено большое количество IFNγ-продуцирующих клеток, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2, когда вводили коктейльную вакцину при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5). Предположили, что индукция клеток, взаимодействующих с хелперным пептидом, представленным SEQ ID NO: 244, содержащимся в пептиде, представленном SEQ ID NO: 24 3, содержащемся в коктейльной вакцине, усиливала индукцию CTL, специфичных к пептиду, представленному SEQ ID NO: 2. Таким образом, было выяснено, что коктейльная вакцина, содержащая соединение, представленное формулой (5), и хелперный пептид, может в значительной степени индуцировать CTL в мышином организме при сравнении с однократным введением соединения, представленного формулой (5).
[0577]
В качестве одного варианта получения вакцины, содержащей два пептида антигена WT1, можно упомянуть коктейльную вакцину, содержащую два различных пептида в виде одного препарата. При производстве коктейльной вакцины, свойства пептидов ракового антигена, подлежащих смешиванию, имеют одну проблему. Как показано в Таблице 60 и Таблице 66, производство коктейля двух пептидов антигена WT1 означает процессинг двух пептидов, имеющих различную растворимость, а именно, свойство, в одном препарате. Напротив, конъюгат по настоящему изобретению представляет собой соединение, в котором два пептида антигена WT1 связаны посредством дисульфидной связи, и обладают единой растворимостью, а именно, свойством. Это означает, что конъюгат по настоящему изобретению имеет единое свойство и также имеет свойство, соответствующее двум пептидам антигена WT1, как показано в Экспериментальном Примере 2. В этом аспекте было показано, что конъюгат по настоящему изобретению является соединением, способным индуцировать ответ на два пептида антигена WT1 без необходимости рассматривать взаимодействие между двумя пептидами антигена WT1 и тому подобное в отличие от коктейльных вакцин.
[0578]
Экспериментальный Пример 19
Оценка способности индуцировать CTL in vivo, используя трансгенную мышь HLA-24 02 после фильтрации фильтром
b
Гомодимер, представленный SEQ ID NO: 4, образуемый посредством дисульфидной связи, и соединение, представленное формулой (5), растворяют в воде для инъекций до 3-10 мг/мл. Фармакологическую активность каждого соединения оценивали, используя трансгенную мышь HLA-A2402 (C57BL/6CrHLA-A2402/K) с указанием индуцирующей CTL активности в качестве индекса. Для введения в трансгенную мышь HLA-A2402 соединение растворяли в воде для инъекции, стерилизовали фильтрацией, используя фильтр низкого связывания с белками (мембранный фильтр категории, нацеленной на стерилизационную обработку инъекционного раствора), и смешивали с неполным адъювантом Фрейнда для получения эмульсии.
2
Эмульгированное соединение внутрикожно вводили в основание хвоста трансгенной мыши HLA-A2402. Через неделю, мышь подвергали эвтаназии действием CO2, извлекали селезенку или паховые лимфатические узлы, и выделяли спленоциты или клетки лимфатических узлов. Коммерческий набор IFNγ ELISPOT assay используют для измерения продукции IFNγ. За день до выделения клеток планшет ELISPOT обрабатывают антимышиными антителами к IFNγ и на следующий день блокируют средой RPMI164 0, содержащей 10% FBS. Выделенные из мыши клетки высевают на блокированный планшет ELISPOT. Пептид (SEQ ID NO: 4) растворяют в DMSO до 4 0 мг/мл, и дополнительно разводят средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, до 40 мкг/мл. Разведенный пептид (SEQ ID NO: 4) добавляют к спленоцитам или клеткам лимфатических узлов, полученным из трансгенной мыши HLA-A2402, в конечной концентрации 10 мкг/мл. Клетки с добавленным пептидом культивируют в течение 16-20 ч при 37°С, 5% CO, таким образом осуществляя повторную стимуляцию пептидом in vitro. После культивирования удаляют супернатант, и в планшете ELISPOT проводят цветную реакцию в соответствии с прилагаемым протоколом. Число образуемых цветовых пятен измеряют системой детекции ImmunoSpot Analyzer (производство C.T.L.).
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0579]
Соединение по настоящему изобретению пригодно в качестве активного ингредиента противоопухолевой вакцины, которая эффективно индуцирует CTL, и его легко производить. В основе данной заявки лежат заявки на патент №2013-072173 (дата регистрации: 29 марта 2013 года) и №2013-158383, зарегистрированной в Японии (дата регистрации: 31 июля 2013 года), все содержимое которых включено в данное описание изобретения.
Подписи к чертежам.
1. Фиг. 1
2. Скорость производства / %
3. Время / час
4. Пример 2
5. Пример 3
6. Пример 4
7. Пример 5
8. Фиг. 2
5
9. Пятно / 1,5×10 клеток
10. с
12. Фиг. 3
6
13. Пятно / 10 клеток
14. Активированные пептидом SEQ ID NO: 4
15. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 4
16. Фиг. 4
5
17. Пятно / 7,5×10 клеток
18. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
19. Активированные пептидом SEQ ID NO: 6
20. В отсутствие активации
21. Фиг. 5
5
22. Пятно / 2, 5×10 клеток
23. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
24. Введенный пептид формулы (6)
25. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
26. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
27. Фиг. 6
5
28. Пятно / 5×10 клеток
29. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
30. Введенный пептид формулы (6)
31. Активированные пептидом SEQ ID NO: 24
32. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 24
33. Фиг. 7
5
34. Пятно / 2,5×10 клеток
35. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
36. Введенный пептид формулы (8)
37. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
38. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
39. Фиг. 8
5
40. Пятно / 5×10 клеток
41. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
42. Введенный пептид формулы (8)
43. Активированные пептидом SEQ ID NO: 22
44. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 22
45. Фиг. 9
5
46. Пятно / 2,5×10 клеток
47. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
48. Введенный пептид формулы (7)
49. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
50. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
51. Фиг. 10
5
52. Пятно / 5×10 клеток
53. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
54. Введенный пептид формулы (7)
55. Активированные пептидом SEQ ID NO: 23
56. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 23
57. Фиг. 11
5
58. Пятно / 2,5×10 клеток
59. Введенный пептид SEQ ID NO: 5
60. Введенный пептид формулы (9)
61. Активированные пептидом SEQ ID NO: 5
62. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 5
63. Фиг. 12
5
64. Пятно / 7,5×10 клеток
65. Введенный пептид SEQ ID NO: 5
66. Введенный пептид формулы (9)
67. Активированные пептидом SEQ ID NO: 24
68. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 24
69. Фиг. 13
5
70. Пятно / 2,5×10 клеток
71. Введенный пептид формулы (5)
72. Введенный пептид SEQ ID NO: 238
73. Введенный пептид SEQ ID NO: 239
74. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
75. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
76. Фиг. 14
6
77. Пятно / 1×10 клеток
78. Введенный пептид формулы (5)
79. Введенный пептид SEQ ID NO: 238
80. Введенный пептид SEQ ID NO: 239
81. Активированные пептидом SEQ ID NO: 4
82. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 4
83. Фиг. 15
5
84. Пятно / 2,5×10 клеток
85. Введенный пептид формулы (5)
86. Введенный пептид SEQ ID NO: 24 0
87. Введенный пептид SEQ ID NO: 241
88. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
89. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
90. Фиг. 16
5
91. Пятно / 1,5×10 клеток
92. Введенный пептид формулы (5)
93. Введенный пептид SEQ ID NO: 24 0
94. Введенный пептид SEQ ID NO: 241
95. Активированные пептидом SEQ ID NO: 4
96. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 4
97. Фиг. 17
5
98. Пятно / 1,25×10 клеток
99. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
100. Введенный пептид формулы (10)
101. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
102. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
103. Фиг. 18
5
104. Пятно / 1,25×10 клеток
105. Введенный пептид SEQ ID NO: 2
106. Введенный пептид формулы (11)
107. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
108. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
109. Фиг. 19
5
110. Пятно / 1,25×10 клеток
111. Введенный пептид формулы (5)
112. Введенный пептид формулы (12)
113. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
114. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
115. Фиг. 20
5
116. Пятно / 2,5×10 клеток
117. Введенный пептид формулы (5)
118. Введенный пептид формулы (12)
119. Активированные пептидом SEQ ID NO: 4
120. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 4
121. Фиг. 21
5
122. Пятно / 2,5×10 клеток
123. Введенный пептид формулы (5)
124. Введенный пептид формулы (14)
12 5. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
12 6. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
127. Фиг. 22
5
128. Пятно / 2,5×10 клеток
12 9. Введенный пептид формулы (5)
130. Введенный пептид формулы (14)
131. Активированные пептидом SEQ ID NO: 4
132. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 4
133. Фиг. 23
5
134. Пятно / 2,5×10 клеток
135. Введенный пептид формулы (5)
136. Введенный пептид формулы (5) и пептид SEQ ID NO: 22
137. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
138. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
139. Фиг. 24
5
140. Пятно / 2,5×10 клеток
141. Введенный пептид формулы (5)
142. Введенный пептид формулы (5) и пептид SEQ ID NO: 244
143. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
144. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
145. Фиг. 25
5
146. Пятно / 2,5×10 клеток
147. Введенный пептид формулы (5)
148. Введенный пептид формулы (5) и пептид SEQ ID NO: 24
149. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
150. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
151. Фиг. 26
5
152. Пятно / 2,5×10 клеток
153. Введенный пептид формулы (5)
154. Введенный пептид формулы (5) и пептид SEQ ID NO: 242
155. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
156. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2
157. Фиг. 27
5
158. Пятно / 2,5×10 клеток
159. Введенный пептид формулы (5)
160. Введенный пептид формулы (5) и пептид SEQ ID NO: 24 3
161. Активированные пептидом SEQ ID NO: 2
162. В отсутствие активации пептидом SEQ ID NO: 2