СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
METHODS AND COMPOSITIONS FOR STEM CELL TRANSPLANTATION

Ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США №62/194460, поданной 20 июля 2015 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Включение посредством ссылки
Для целей только тех юрисдикций, которые разрешают включение посредством ссылки, все приведенные в настоящем раскрытии ссылки полностью включены посредством ссылки. Кроме того, инструкции и каталоги любых производителей для любых продуктов, приведенных или упомянутых в настоящем документе, включены посредством ссылки. Документы, включенные посредством ссылки в этот текст, или любые положения в нем, могут быть использованы в практике настоящего изобретения.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для улучшения терапии стволовыми клетками и, в частности, к способам и композициям для облегчения наращивания и приживления гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников и иммунного восстановления гемопоэтической системы реципиента трансплантата стволовых клеток.
Введение
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников (HSCT) представляет собой критический компонент лечения широкого спектра гематологических нарушений. Как правило, существует два типа HSCT: аутологичная и аллогенная трансплантация. Аутологичная трансплантация предусматривает инфузию собственных клеток реципиента после миелоаблативного лечения. Трансплантация аутологичных клеток сводит к минимуму риск заболевания трансплантат против хозяина (РТПХ) и приводит к уменьшению осложнений. Аллогенная трансплантация предусматривает инфузию донорских стволовых клеток, как правило, с использованием донора, который соответствует MHC реципиента. Однако трансплантаты совместимых неродственных доноров (MUD) также связаны с более сильной реакцией трансплантат против хозяина и, следовательно, приводят к более высокой смертности.
et al.
et al.
Существует три основных источника гемопоэтических стволовых клеток и/или клеток-предшественников (HSPC): костный мозг, периферическая кровь и пуповинная кровь. Пуповинная кровь (UCB) является практическим альтернативным источником для других источников гемопоэтических предшественников (например, костного мозга и мобилизованной периферической крови) для родственной и неродственной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. К сожалению, однако, хотя пуповинная кровь легко доступна и демонстрирует более низкие показатели заболеваемости трансплантат против хозяина, она характеризуется замедленным приживлением мультилинейных клеток (например, нейтрофилов, тромбоцитов, эритроцитов), все из которых важны для успешного и клинически значимого восстановление иммунитета. Соответственно, хотя существует огромная перспектива для лечения гематологических нарушений с помощью полученных из пуповинной крови HSPC, медленная скорость гемопоэтического восстановления остается основным препятствием, Laughlin, , N. Eng. J. Med. 351:22; 2265-2275 (2004), и эффективность приживления все еще значительно меньше, чем с HSC из костного мозга или периферической крови. Rocha , N. Eng. J. Med. 351:22; 2276-2285 (2004).
et al.
et al.
et al.
et al.
Гемопоэтические стволовые клетки могут быть нарощены размножены в различных средах, содержащих смесь цитокинов. Способы наращивания стволовых клеток известны в настоящей области техники, включая в себя, например, патент США № 6326198, патент США № 6338942; патент США № 6335195. Kobayashi и Butler недавно описали получение прогемопоэтической сосудистой ниши, происходящей из первичных эндотелиальных клеток человека (EC) путем трансдукции с аденовирусным геном E4ORF1, который минимально активирует путь Akt/Mtor, что приводит к экспрессии прогемопоэтических сигналов выживания и пролиферации. Kobayashi , Nature Cell Biology 12, 1046-1056 (2010); Butler , Blood 120, 1344-1347 (2012). Типичные процедуры наращивания HSPC/EC предусматривают совместное культивирование HSPC на монослое EC, внесенных в небольшую колбу для культивирования клеток, с использованием исходных соотношений EC:HSPC от 6:1 до 3:1. Через 24-48 часов HSPC удаляют и наносят на дополнительный монослой EC во второй колбе и так далее до тех пор, пока не будет получено требуемое количество HSPC. Тем не менее, одним из значительных отклонений от таких основанных на колбах наращиваний является большое количество открытых событий, в том числе 1800 для типичной процедуры, которые резко увеличивают риск заражения.
in vitro
Потребность в культуральных способах и системах , способных к клинически применимой амплификации человеческих CD34+ HSPC, а также других гемопоэтических элементов продолжается. Система, способная производить большие количества определенных элементов костного мозга, необходима для обеспечения достаточного количества этих элементов для применения в терапевтических целях у человека, например, в качестве трансплантации костного мозга, трансфузионных компонентов крови или генетической терапии. Описанные в настоящем документе способы отвечают этим и другим потребностям.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение рассматривает и успешно разрешает эту давнюю потребность в настоящей области техники, обеспечивая беспрецедентные уровни наращивания HSPC путем совместного культивирования HSPC с эндотелиальными клетками в биореакторах с замкнутой системой с использованием исходных соотношений EC/HSPC по меньшей мере 25:1, 50:1, 100:1 или 500:1 и еще более предпочтительно 1000:1, 2000:1 или 3000:1. Существенно, что взаимодействие между HSPC и EC остается без изменений во время стадии наращивания, тем самым поддерживая непрерывную межклеточную связь между HSPC и EC, повышая эффективность и общий выход наращивания. Кроме того, количество открытых событий уменьшается по сравнению с открытым окружением клеточной культуры, таким как колбы для культивирования, тем самым значительно снижая риск заражения.
in vivo
HSPC, размноженная в соответствии с описанными в настоящем документе способами, оказывают благоприятные фармакологические эффекты, особенно при введении реципиенту HSCT в комбинации с EC, причем поддерживается непрерывное взаимодействие между HSPC и EC при наращивании и введении. Временное существование этих аллогенных эндотелиальных клеток в кровообращении и/или в ткани дает полезные результаты в HSCT, такие как усиленное мультилинейное приживление и большая продолжительность приживления, а также относительно быстрое начальное приживление, как измерено, например, по количеству нейтрофилов. Как продемонстрировано впервые в настоящем документе, это верно, даже если эндотелиальные клетки облучаются до совместного культивирования с HSC и не могут реплицироваться.
Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способам трансплантации стволовых клеток у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающим: (а) наращивание кроветворных стволовых клеток или клеток- предшественников (HSPC) путем контактирования HSPC с эндотелиальными клетками (EC) в исходном соотношении EC/HSPC для первого периода времени в условиях, позволяющих наращивание HSPC, для получения расширенной клеточной популяции, содержащей HSPC и EC, в расширенном соотношении HSPC/EC; и (b) трансфузию расширенной клеточной популяции, полученной на стадии (а), субъекту; причем поддерживается непрерывное взаимодействие между HSPC и EC на протяжении всей стадии наращивания и трансфузии.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к композициям, содержащим HSPC и EC, для применения в трансплантации стволовых клеток у нуждающегося в этом субъекта, причем трансплантация стволовых клеток предусматривает описанные в настоящем документе способы. Предпочтительно, EC находятся в непосредственной близости от HSPC на всех стадиях наращивания и трансфузии, как описано и показано в настоящем документе. Еще более предпочтительно, EC находятся в непрерывном контакте с HSPC во время по меньшей мере стадии наращивания.
Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 200:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 300:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 400:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 500:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 600:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 700:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 1000:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 2000:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 3000:1.
Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от 10:1 до 1:10. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 9:1 до приблизительно 2:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 8:1 до приблизительно 3:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 7:1 до приблизительно 4:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 6:1 до приблизительно 5:1.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к наборам или системам для выделения, наращивания, сохранения и введения HSPC и эндотелиальных клеток в соответствии с описанными в настоящем документе способами.
Краткое описание графических материалов
Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что графические материалы предназначены только для иллюстрации и не предназначены для любого ограничения объема идей настоящего изобретения.
На фиг. 1 показаны изображения фазовой микроскопии влияния радиационного воздействия на E4ORF1+ сконструированные ЕС. EC собирали в стандартных условиях культивирования и трансдуцировали с E4ORF1. Затем клетки разделяли на две колбы и далее культивировали до 100% конфлюэнтности. Один сосуд оставляли без манипуляций (левая панель), а другой сосуд облучали 1500 кГр от цезиевого облучателя (правая панель). Не было обнаружено различий между двумя колбами посредством фазовой микроскопии.
На фиг. 2 показаны изображения последовательной фазовой микроскопии облученных (нижние ряды) и необлученных (верхние ряды) E4ORF1+ сконструированных ЕС в течение одной недели в культуре. Две колбы клеток культивировали до неполной конфлюэнтности, после чего одну колбу (нижние панели) облучали 1500 сГр с использованием цезиевого облучателя. Обе колбы дополнительно культивировали в течение одной недели, а изображения фазовой микроскопии получали через 1, 5 и 7 дней после облучения.
На фиг. 3 показаны изображения фазовой микроскопии HSPC в совместной культуре с облученными (нижние ряды) и необлученными (верхние ряды) E4ORF1+ сконструированными EC. Очищенные HSPC (CD34+) из пуповинной крови совместно культивировали в 6-луночных планшетах с конфлюэнтными монослоями необлученных и облученных посредством 1500 сГР E4ORF1 EC. По завершению 11-дневного наращивания и последовательного пересевания клеток изображения фазовой микроскопии получали как из исходной культуральной лунки («материнская лунка», «левая колонка»), так и одной из конечных лунок («конечная лунка», «правая колонка»), полученной последовательным пересеванием.
На фиг. 4 показаны данные проточной цитометрии совместных культур HSPC с облученными (нижние панели) и необлученными E4ORF1+ сконструированными EC (верхние панели). Очищенные HSPC (CD34+) из пуповинной крови совместно культивировали в 6-луночных планшетах с конфлюэнтными монослоями либо облученных, либо необлученных E4ORF1 EC. По окончанию 11-дневного наращивания гемопоэтические клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. В левой колонке показаны результаты клеток, окрашенных на экспрессию CD45 (поверхностный маркер гемопоэтических клеток). Правая панель показывает результаты клеток, дважды окрашенных на экспрессию CD34 (положительный маркер для HSPC) и CD38 (отрицательный маркер для HSPC).
На фиг. 5 представлены репрезентативные изображения фазовой микроскопии краткосрочного (левая панель) и долгосрочного (правая панель) совместного культивирования HSPC-E4ORF1+ сконструированных EC и полученного уменьшения EC. Очищенные HSPC (CD34+) из пуповинной крови совместно культивировали в 6-луночном планшете с конфлюэнтными монослоями EC. По мере того, как популяция HSPC наращивалась, неадгезивные клетки осторожно удаляли и помещали на больший и свежий слой EC. Оригинальную лунку, называемую «материнской лункой», снабжали дополнительными средами. Этот процесс повторяется приблизительно каждые 48 часов для всех совместно культивированных лунок. В течение 7 дней совместного культивирования E4ORF1+ сконструированные EC в материнской лунке исчерпывались (правая панель) по сравнению только с 1 днем совместного культивирования тех же наращивающихся HSPC, нанесенных на свежие E4ORF1 EC (левая панель).
На фиг. 6 показана количественная оценка наращивания всех гемопоэтических клеток в биореакторе с непрерывным контактом E4ORF1+ сконструированных EC и HSPC по сравнению с наращиванием только с цитокинами и с наращиванием с прерывистым контактом E4ORF1+ сконструированных EC и HSPC. Очищенные HSPC (CD34+) из пуповинной крови наращивали в колбе только с цитокинами, в колбе на монослоях E4ORF1+ сконструированных EC или в биореакторах с полыми волокнами, предварительно загруженных E4ORF1+ сконструированными EC. Наращивание только с цитокинами и наращивание на E4ORF1+ сконструированных EC в колбе требовали нарушения процесса культивирования для промывания и перенесения клеток во время наращивания. На 6-й день культивирования проводили подсчет клеток и подсчет популяции CD45+ клеток посредством проточной цитометрии.
На фиг. 7 представлена количественная оценка колониеобразующих анализов наращивания HSPC в биореакторе с непрерывным контактом E4ORF1+ сконструированных EC и HSPC по сравнению с наращиванием только с цитокинами и наращиванием с прерывистым контактом E4ORF1+ сконструированных EC и HSPC. Аббревиатура «КОЕ» относится к колониеобразующим единицам. Частоты колоний в нескольких полях зрения микроскопа использовали для экстраполяции количества КОЕ в общей расширенной популяции.
Подробное описание изобретения
Определения
В отношении настоящего раскрытия технические и научные термины, используемые в описаниях в настоящем документе, будут характеризоваться значениями, как правило, понимаемые специалистом в настоящей области техники, если специально не определено иначе. Соответственно, следующие термины характеризуются следующими значениями.
«Аллогенная» относится к происхождению, возникновению или принадлежности к одному и тому же виду, где представители генетически родственны или генетически неродственны, но генетически схожи. «Аллогенная трансплантация» относится к передаче клеток или органов от донора реципиенту, где реципиент является того же самого вида, что и донор.
«Аутологичная» относится к происхождению от одного или того же субъекта или пациента. «Аутологичная трансплантация» относится к сбору и повторной трансплантации собственных клеток или органов субъекта.
«Коммитированная миелоидная клетка-предшественник» или «миелоидная клетка-предшественник» или «МР» относится к мультипотентной или унипотентной клетке-предшественнику, способной в конечном счете развиваться в любую из терминально дифференцированных клеток миелоидной линии, но которые, как правило, не дифференцируются в клетки лимфоидной линии. Следовательно, «миелоидная клетка-предшественник» относится к любой клетке-предшественнику в миелоидной линии. Коммитированные клетки-предшественники миелоидной линии включают в себя олигопотентную CMP, GMP и MEP, как определено в настоящем документе, но также включают в себя унипотентные эритроидные клетки-предшественники, клетки-предшественники мегакариоцитов, клетки-предшественники гранулоцитов и клетки-предшественники макрофагов. Различные клеточные популяции миелоидных клеток-предшественников отличаются от других клеток их потенциалом дифференцировки и наличием характерного набора клеточных маркеров.
«Общая миелоидная клетка-предшественник» или «CMP» относится к клетке, характеризующейся способностью производить клетки-предшественники гранулоцитов/моноцитов (GMP) и клетки-предшественники мегакариоцитов/эритроидов (MEP). Эти клетки-предшественники ограничены или не обладают способностями к самообновлению, но способны производить миелоидные дендритные, миелоидные эритроидные, эритроидные клетки, мегакариоциты, гранулоциты/макрофаги, гранулоциты и макрофаги.
Используемое в настоящем документе «непрерывное взаимодействие» относится по меньшей мере к постоянной близости HSPC к EC в течение одной или нескольких стадий процесса, описанных в настоящем документе. «Близость» в этом контексте относится к объединенному присутствию HSPC и EC в той же среде, например, в культуральной среде, среде для трансфузии или в любой среде, используемой во время любой необязательной стадии между стадиями наращивания и трансфузии, такими как сбор расширенной популяции клеток или получение фармацевтической композиции, содержащей расширенную клеточную популяцию. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC и EC находятся в непрерывной близости во время объединенных стадий наращивания и трансфузии. Другими словами, HSPC и EC одновременно присутствуют в одной и той же среде на протяжении всей стадии наращивания и до тех пор, пока стадия трансфузии не будет завершена. Например, нигде во время стадии наращивания HSPC не удаляются из среды наращивания, например, для контакта HSPC с дополнительными EC. Кроме того, согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы не предусматривают какой-либо стадии очистки, посредством которой эндотелиальные клетки удаляются из расширенной клеточной популяции, содержащей размноженные HSPC до стадии трансфузии. Используемое в настоящем документе «непрерывное взаимодействие» может также относиться к непрерывному контакту между HSPC и ЕС в течение одной или нескольких стадий описанного в настоящем документе процесса. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC и EC находятся в непрерывном контакте во время стадии наращивания. В этом контексте термин «контакт» между HSPC и эндотелиальными клетками относится к пространственной связи, причем расстояние между HSPC и EC составляет ≤500 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления расстояние между HSPC и EC составляет ≤400 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления расстояние между HSPC и EC составляет ≤300 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления расстояние между HSPC и EC составляет ≤200 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления расстояние между HSPC и EC меньше или равно внутреннему размеру сосуда, в котором выполняется наращивание.
«Культивирование» относится к распространению клеток или организмов на средах различных видов или в них. «Совместное культивирование» относится к распространению двух или более отдельных типов клеток или организмов на средах различных видов или в них, например, согласно некоторым вариантам осуществления HSPC и эндотелиальные клетки могут быть совместно культивированы.
Термин «сконструированный», когда он используется по отношению к клеткам,
относится к клеткам, которые были сконструированы человеком для получения
указанного фенотипа (например, E4ORF1+) или для экспрессии указанной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Термин «сконструированные клетки» не предназначен для охвата встречающихся в природе клеток, но вместо этого предназначен для охвата, например, клеток, которые содержат рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, или клеток, которые иным образом были искусственно изменены (например, путем генетической модификации), например, так, чтобы они экспрессировали полипептид, который они иным образом не экспрессировали, или чтобы они экспрессировали полипептид на существенно более высоких уровнях, чем тот, который наблюдался в несконструированных эндотелиальных клетках.
Термин «наращивание» в контексте клеток относится к увеличению количества клеток определенного типа или типов из начальной популяции клеток, которые могут быть или не быть идентичными. Исходные клетки, используемые для наращивания, не обязательно должны быть такими же, как клетки, произведенные в результате наращивания. Например, нарощенные размноженные клетки могут быть получены путем роста и дифференциации исходной популяции клеток. Исключением из термина «наращивание» является ограничивающие анализы разбавления, используемые для характеристики потенциала дифференциации клеток.
in vivo
in vitro
«Генетическая модификация» или «генетически модифицированный» относится к любому добавлению, делеции или нарушению нормальных нуклеотидов клеток. Способы по настоящему изобретению предназначены для охвата любого способа генетической модификации экзогенного или чужеродного переноса гена (или переноса последовательности нуклеиновых кислот) в HSPC или эндотелиальные клетки. Термин «генетическая модификация» охватывает применение наполнителя доставки гена и включает в себя, без ограничения, трансдукцию (опосредованную вирусом передачу нуклеиновой кислоты реципиенту либо , либо ), трансфекцию (захват клетками выделенной нуклеиновой кислоты), опосредуемый липосомами перенос и другие средства, хорошо известные в настоящей области техники.
«Болезнь трансплантат против хозяина» или «GVH» или «GVHD» относится к клеточному ответу, который возникает, когда лимфоциты другого класса MHC вводятся в организм хозяина, что приводит к реакции лимфоцитов против хозяина.
«Клетка-предшественник гранулоцитов/макрофагов» или «GMP» относится к клетке, полученной из общих миелоидных клеток-предшественников, и характеризуется ее способностью давать рост клеткам гранулоцитов и макрофагов, но которая как правило не приводит к образованию эритроидных клеток или мегакариоцитов миелоидной линии.
«Гемопоэтическое заболевание» относится к любому нарушению крови, включая в себя, без ограничения, гемопоэтические злокачественные опухоли, гемоглобинопатию и иммунодефицит.
«Гемопоэтическая стволовая клетка или клетка-предшественник», или «HSPC» охватывает HSC, как определено в настоящем документе, а также мультипотентные не самовосстанавливающиеся клетки-предшественники, которые способны в конечном счете дифференцироваться во все типы клеток гемопоэтической системы, и олигопотентные и унипотентные клетки-предшественники, способные дифференцироваться в определенные клеточные типы гемопоэтической системы. HSPC включают в себя CMP, MP, MEP и GMP, как определено в настоящем документе.
«Гемопоэтическая стволовая клетка» или «HSC» относится к клоногенной, самообновляющейся плюрипотентной клетке, способной в конечном счете дифференцироваться во все типы клеток гемопоэтической системы, включая в себя В-клетки, Т-клетки, клетки NK, лимфоидные дендритные клетки, миелоидные дендритные клетки, гранулоциты, макрофаги, мегакариоциты и эритроидные клетки. Как и в других клетках гемопоэтической системы, HSC, как правило, определяются наличием характерного набора клеточных маркеров.
Термин «выделенный» относится к продукту, соединению или композиции, которые отделены по меньшей мере от одного другого продукта, соединения или композиции, с которыми они связаны в своем природном состоянии, независимо от природы, или как получено синтетически.
«Маркерное фенотипирование» относится к идентификации маркеров или антигенов на клетках для определения их фенотипа (например, состояния дифференциации и/или клеточного типа). Это может быть сделано путем иммунофенотипирования, в котором используются антитела, которые распознают присутствующие на клетке антигены. Антитела могут быть моноклональными или поликлональными, но, как правило, выбирают так, чтобы они характеризовались минимальной перекрестной активностью с другими клеточными маркерами. Следует понимать, что определенные маркеры клеточной дифференцировки или клеточной поверхности уникальны для видов животных, от которых происходят клетки, тогда как другие клеточные маркеры будут общими для разных видов. Эти маркеры, определяющие эквивалентные типы клеток между видами, получают идентичную идентификацию маркера даже несмотря на наличие различий в структуре (например, аминокислотную последовательность). Клеточные маркеры включают в себя молекулы клеточных поверхностей, также упоминаемые в определенных ситуациях как маркеры дифференцировки клеток (CD) и маркеры экспрессии генов. Маркеры экспрессии генов представляют собой те наборы экспрессированных генов, которые указывают на тип клеток или состояние дифференцировки. Частично, профиль экспрессии генов будет отражать маркеры клеточной поверхности, хотя они могут включать неклеточные поверхностные молекулы.
«Мегакариоцитарная/эритроидная клетка-предшественник» или «MEP» относится к клетке, полученной из общих миелоидных клеток-предшественников, и характеризуется ее способностью производить эритроидные клетки и мегакариоциты, но которая, как правило, не приводит к образованию гранулоцитов, макрофагов или миелоидных дендритных клеток.
«Миелоаблативная» или «миелоаблация» относится к ухудшению или разрушению гемопоэтической системы, как правило, путем воздействия цитотоксическим средством или облучением. Миелоаблация охватывает полную миелоаблацию, вызванную высокими дозами цитотоксического средства или облучением всего тела, которое разрушает гемопоэтическую систему. Она также включает в себя менее полное миелоаблативное состояние, вызванное немиелоаблативным кондиционированием. Таким образом, немиелоаблативное кондиционирование представляет собой воздействие, которое не полностью разрушает гемопоэтическую систему субъекта.
«Самообновление» относится к способности клетки делиться и производить по меньшей мере одну дочернюю клетку с идентичными (например, самообновляющимися) характеристиками исходной клетки. Вторая дочерняя клетка может передавать определенный путь дифференциации. Например, самообновляющаяся гемопоэтическая стволовая клетка делится и образует одну дочернюю стволовую клетку и другую дочернюю клетку, коммитированную на дифференцировку в миелоидный или лимфоидный путь. Коммитированная клетка-предшественник, как правило, теряет способность к самообновлению и после деления клетки производит две дочерние клетки, которые проявляют более дифференцированный (т.е. ограниченный) фенотип.
В отношении клеток «сортировка» относится к разделению клеток на основе физических характеристик или наличия маркеров (например, сортировка с использованием бокового светорассеяния (SSC) и прямого светорассеивания (FSC), или сортировка флуоресцентно активированных клеток (FACS) с использованием меченых антител), или анализу клеток на основе наличия клеточных маркеров, например, FACS без сортировки.
«Стволовая клетка» относится к стволовым клеткам различных клеточных типов, таких как мышечные, эпителиальные, нервные и костные стволовые клетки. В частности, в настоящем изобретении рассматриваются HSPC.
Термины «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся, за исключением тех случаев, когда это указано, к млекопитающим, таким как люди и нечеловекообразные приматы, а также кролики, крысы, мыши, козы, свиньи и другие виды млекопитающих.
«По существу чистая клеточная популяция» относится к популяции клеток, имеющих указанную характеристику маркера клетки и потенциал дифференциации, которые составляют по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75-80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85-90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% клеток от составляющих общую популяцию клеток. Таким образом, «по существу чистая клеточная популяция» относится к популяции клеток, которая содержит менее чем приблизительно 50%, предпочтительно менее чем приблизительно 20-25%, более предпочтительно менее чем приблизительно 10-15% и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% клеток, которые не демонстрируют указанную характеристику маркера и потенциал дифференциации в определенных условиях анализа.
«Терапевтический ген» относится ко всему гену или только функционально активному фрагменту гена. Терапевтический ген может быть способен компенсировать дефицит у пациента, который возникает из дефектного или отсутствующего эндогенного гена. Кроме того, терапевтический ген может быть таким, который противодействует образованию или функционированию инфекционного патогена, противодействует патологическим процессам, улучшает генетический состав хозяина, облегчает приживление или терапевтическую эффективность стволовых клеток.
«Ксеногенная» относится к получению или происхождению от различных видов, например, человека и грызунов, человека и свиньи, человека и шимпанзе и т.д.
«Ксеногенный трансплантат» относится к передаче клеток или органов от донора к реципиенту, где реципиент представляет собой вид, отличный от вида донора.
Наращивание гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников
В настоящем раскрытии описаны способы, композиции и системы или наборы для облегчения приживления HSPC. Согласно одному аспекту предусмотрены способы улучшения приживления HSPC у нуждающегося в этом пациента, которые предусматривают совместное культивирование и совместную инфузию HSPC с EC, одновременно поддерживая непрерывное взаимодействие между HSPC и EC. Как показано впервые в настоящем документе, поддержание непрерывного взаимодействия между HSPC и ЕС на протяжении всех стадий наращивания и трансфузии повышает эффективность наращивания и приживление полученных размноженных HSPC, тем самым улучшая скорость и полноту восстановления иммунной системы, а также следовательно, выживаемость пациентов с трансплантацией, получавших трансплантат HSPC.
et al.
et al.
et al.
et al.
Гемопоэтические стволовые клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, способные к самообновлению, и характеризуются способностью расти в пермиссивных условиях ко всем клеточным типам гемопоэтической системы. Самообновление HSC относится к способности клетки HSC делиться и производить по меньшей мере одну дочернюю клетку с тем же потенциалом самообновления и дифференцировки HSC; то есть деление клеток приводит к дополнительным HSC. Самообновление обеспечивает постоянный источник недифференцированных стволовых клеток для пополнения гемопоэтической системы. Фенотипы маркеров, применимые для идентификации HSC, будут такими, которые, как правило, известны в настоящей области техники. Для человеческих HSC фенотипы клеточных маркеров предпочтительно включают в себя CD34+ CD38- CD90(Thy1)+ Lin-. Для мышиных HSC иллюстративный фенотип маркера клетки представляет собой Sca-1+ CD90+ (смотрите, например, Spangrude, G. J. , Science 1:661-673 (1988)) или c-kit+ Thylo Lin- Sca-1+ (смотрите, Uchida, N. , J. Clin. Invest. 101(5):961-966 (1998)). Также могут быть применимы альтернативные маркеры HSC, такие как альдегиддегидрогеназа (смотрите Storms , Proc. Nat’l Acad. Sci. 96:9118-23 (1999), AC133 (смотрите Yin , Blood 90:5002-12 (1997) и CD150 (SLAM) (смотрите Kiel Cell 2005, 121 (7) 1109-21).
et al.
et al.
et al.
HSC могут быть получены из различных источников, включающих в себя костный мозг, периферическую кровь, пуповинную кровь и другие источники, которые, как известно, содержат гемопоэтические и миелоидные клетки-предшественники, включая в себя печень, особенно фетальную печень. Периферическая и пуповинная кровь представляет собой богатый источник HSC. Клетки получают с использованием способов, известных и, как правило, применяемых в настоящей области техники. Например, способы получения клеток костного мозга описаны в Sutherland , Bone Marrow Processing and Purging: A Practical Guide (Gee, A. P. ed.), CRC Press Inc. (1991)). HSC также могут быть получены из первичных источников стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки (Thomson , Science 282:1145 (1998)) и зародышевые клетки (Shamblott , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726 (1998)) с использованием соответствующих способов наращивания и дифференциации.
Клетки HSC получают из любых видов животных с гемопоэтической системой, как это в общем описано в настоящем документе. Предпочтительно подходящими животными являются млекопитающие, включая в себя, в качестве примера, а не ограничения, грызунов, кроликов, собак, кошек, свиней, лошадей, коров, приматов (например, человека) и тому подобное.
Один аспект настоящего изобретения относится к способам трансплантации стволовых клеток у нуждающегося в этом субъекта, которые предусматривают: (а) наращивание гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников (HSPC) путем контактирования HSPC с эндотелиальными клетками (EC) при исходном соотношении EC/HSPC в течение первого периода времени в условиях, позволяющих наращивание HSPC, для получения нарощенной расширенной клеточной популяции, содержащей HSPC и EC, в нарощенном расширенном соотношении HSPC/EC; и (b) трансфузию нарощенной расширенной клеточной популяции, полученной на стадии (а), субъекту; причем поддерживается непрерывное взаимодействие между HSPC и EC на протяжении всех стадий наращивания и трансфузии
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к композициям, содержащим HSPC и EC, для применения в трансплантации стволовых клеток у нуждающегося в этом субъекта, причем трансплантация стволовых клеток предусматривает:(a) наращивание HSPC путем контактирования HSPC с EC в исходном соотношении EC/HSPC в течение первого периода времени в условиях, позволяющих наращивание HSPC, для получения нарощенной расширенной клеточной популяции, содержащей HSPC и EC, в нарощенном расширенном соотношении HSPC/EC; и (b) трансфузию нарощенной расширенной клеточной популяции, полученной на стадии (а), субъекту; причем поддерживается непрерывное взаимодействие между HSPC и EC на протяжении всех стадий наращивания и трансфузии.
Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC являются аллогенными по отношению к субъекту. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC представляют собой HSPC пуповинной крови. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC являются аутологичными по отношению к субъекту.
Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC представляют собой полученные из костного мозга генетически модифицированные HSPC в стационарном состоянии.
et al.
et al.
et al
Согласно некоторым предпочтительным вариантам осуществления эндотелиальные клетки генетически модифицированы. Ранняя область 4 (E4) аденовируса содержит по меньшей мере 6 открытых рамок считывания (E4ORF). Было показано, что вся область E4 регулирует ангиогенез и способствует выживанию, но не пролиферации, эндотелиальных клеток (смотрите, например, Zhang (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66). Использование всей области E4, как клинически, так и экспериментально, для индуцирования ангиогенеза или для содействия выживанию или пролиферации эндотелиальных клеток, может быть нежелательным, поскольку некоторые из E4ORF могут оказывать вредное воздействие. Например, известно, что ген E4ORF6 индуцирует апоптоз (Yamano (1999) J. Virol. 73:10095-103). Кроме того, E4ORF являются иммуногенными, и поэтому введение всех E4ORF субъектам может быть нежелательным. Rafii . (WO2008089448) идентифицировали последовательности в области E4ORF, которые применимы для индуцирования ангиогенеза и для содействия выживанию и пролиферации эндотелиальных клеток.
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
Несколько представителей семейства E-двадцать шесть (ETS) факторов транскрипции (TF), включая в себя ETV2 (Lee , Cell stem cell, 2: 497-507 (2008); Sumanas , Blood, 111: 4500-4510 (2008)), FLU (Liu , Current Bio. 18: 1234-1240 (2008)) и ERG (McLaughlin , Blood, 98: 3332-3339 (2001)), были вовлечены в регуляцию сосудистого развития и ангиогенеза (De Val , Dev Cell, 16: 180-195 (2009); Sato , Cell Struct Funct, 26: 19-24 (200)). Эти TF непосредственно регулируют экспрессию генов, связанных с развитием и функцией EC. Взрослые EC конститутивно экспрессируют несколько факторов ETS, таких как FLU, ERG (изоформы 1 и 2), ETS1, ETS2, Elfl, Elkl, VEZF и ETV6, тогда как ETV2 временно экспрессируется во время эмбрионального развития и отсутствует во взрослых EC (Kataoka , Blood, 118: 6975-6986 (2011); Lelievre , The International Journal Of Biochemistry and Cell Biology, 33: 391-407 (2001)).
Согласно некоторым вариантам осуществления ЕС конструируют для экспрессии полипептида E4ORF1 аденовируса (т.е. они представляют собой E4ORF1+ сконструированные эндотелиальные клетки). Согласно некоторым вариантам осуществления эндотелиальные клетки конструируют для экспрессии одного или нескольких факторов транскрипции семейства ETS, таких как перечисленные выше (т.е. они представляют собой ETS+ сконструированные эндотелиальные клетки). Согласно некоторым вариантам осуществления эндотелиальные клетки конструируют для экспрессии транскрипционного фактора ETV2 семейства ETS (т.е. они представляют собой ETV2+ сконструированные эндотелиальные клетки). Согласно некоторым вариантам осуществления EC представляют собой E4ORF1+ ETV2+ сконструированные эндотелиальные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления EC представляют собой E4ORF1+ ETS+ сконструированные эндотелиальные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления EC также представляют собой E4ORF6+. Согласно некоторым вариантам осуществления ЕС содержат рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует фактор транскрипции семейства ETS. Согласно некоторым вариантам осуществления ЕС содержат рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид ETV2. Согласно некоторым вариантам осуществления ЕС содержат рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса. Согласно некоторым вариантам осуществления EC содержат рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид E4ORF6 аденовируса. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты находится в форме плазмидного вектора. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты интегрируется в геномную ДНК сконструированных ЕС. Согласно некоторым вариантам осуществления ЕС представляют собой дифференцированные ЕС. Согласно некоторым вариантам осуществления EC представляют собой взрослые EC. Согласно некоторым вариантам осуществления EC не представляют собой эмбриональные EC. Согласно некоторым вариантам осуществления EC представляют собой человеческие EC. Согласно некоторым вариантам осуществления EC представляют собой первичные EC. Согласно некоторым вариантам осуществления ЕС представляют собой EC пупочной вены человека (HUVEC).
Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 200:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 300:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 400:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 500:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 600:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 700:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 800:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 900:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 1000:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 1100:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 1200:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 1300:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет по меньшей мере приблизительно 1400:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет приблизительно 1500:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет приблизительно 2000:1. Согласно некоторым вариантам осуществления исходное соотношение EC/HSPC составляет приблизительно 3000:1.
Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет от приблизительно 1 дня до приблизительно 24 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет от приблизительно 1 дня до приблизительно 12 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 1 день. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 2 дня. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 3 дня. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 4 дня. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 5 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 6 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 7 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 8 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 9 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 10 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 11 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 12 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 13 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 14 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 15 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 16 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 17 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 18 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 19 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 20 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 21 день. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 22 дня. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 23 дня. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 24 дня. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 25 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 26 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 27 дней. Согласно некоторым вариантам осуществления первый период времени составляет приблизительно 28 дней.
Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от 10:1 до 1:10. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от 9:1 до приблизительно 1:9. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 8:1 до приблизительно 1:8. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 7:1 до приблизительно 1:7. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 6:1 до приблизительно 1:6. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 1:5. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 4:1 до приблизительно 1:4. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 3:1 до приблизительно 1:3. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно от 2:1 до приблизительно 1:2. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 9:1 до приблизительно 2:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 8:1 до приблизительно 3:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 7:1 до приблизительно 4:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет от приблизительно 6:1 до приблизительно 5:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 10:1. Согласно некоторым вариантам осуществления  расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 9:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 8:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 7:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 6:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 5:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 4:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 3:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 2:1. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенное соотношение HSPC/EC составляет приблизительно 1:1.
Согласно некоторым вариантам осуществления кратность наращивания HSPC составляет от приблизительно 20 до приблизительно 30000 на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления кратность наращивания HSPC составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 10000 на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 1000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 2000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 3000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 3500 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 4000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 5000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 6000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 7000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 8000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 9000 раз на стадии наращивания. Согласно некоторым вариантам осуществления HSPC наращиваются приблизительно в 10000 раз на стадии наращивания.
Согласно некоторым вариантам осуществления непрерывное взаимодействие между HSPC и EC содержит непрерывный контакт между HSPC и EC во время стадии наращивания и непрерывную близость HSPC и EC во время стадий наращивания и трансфузии. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы дополнительно предусматривают сбор расширенной популяции клеток и получение фармацевтической композиции, содержащей расширенную популяцию клеток для применения на стадии трансфузии. Согласно некоторым вариантам осуществления непрерывное взаимодействие между HSPC и EC предусматривает непрерывную близость HSPC и EC во время объединенных стадий наращивания, сбора, подготовки фармацевтической композиции и трансфузии. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы не предусматривают стадию очистки, посредством которой эндотелиальные клетки отделяются от размноженных HSPC перед трансфузией. Согласно некоторым вариантам осуществления не происходит воздействия или нарушения человеком наращивания в течение первого периода времени. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительные цитокины добавляют в течение первого периода времени. Согласно некоторым вариантам осуществления в течение первого периода времени добавляют 50 нг/мл тромбопоэтина (TPO), лиганда Flt3 (связанной с FMS тирозинкиназы 3) и фактора стволовых клеток (SCF). Согласно некоторым вариантам осуществления стадия наращивания содержит не более шести открытых событий.
et al.
et al.
Перед наращиванием HSPC и EC могут подвергаться селекции и очистке, которые могут предусматривать способы как положительной, так и отрицательной селекции для получения по существу чистой популяции клеток. Согласно одному аспекту сортировка флуоресцентно активированных клеток (FACS), также называемая проточной цитометрией, используется для сортировки и анализа различных популяций клеток. Клетки, содержащие клеточные маркеры, специфические для популяций HSPC или EC, помечают антителом или, как правило, смесью антител, которые связывают клеточные маркеры. Каждое антитело, направленное к другому маркеру, конъюгировано с обнаруживаемой молекулой, в частности флуоресцентным красителем, который можно отличить от других флуоресцентных красителей, связанных с другими антителами. Поток меченных или «окрашенных» клеток пропускают через источник света, который возбуждает флуорохром, и обнаруживается спектр излучения от клеток для определения наличия конкретного меченого антитела. При одновременном обнаружении различных флуорохромов, также упоминаемых в настоящей области техники как многоцветная сортировка флуоресцентно активированных клеток, клетки, отображающие различные наборы клеточных маркеров, могут быть идентифицированы и выделены из других клеток в популяции. Другие параметры FACS, включающие в себя, в качестве примера, а не ограничения, боковое светорассеяние (SSC), прямое светорассеяние (FSC) и окрашивание витальными красителями (например, с пропидиум иодидом) позволяют выбирать клетки на основе размера и жизнеспособности. Сортировка и анализ FACS HSPC описывается, среди прочего, в патентах США №5137809, 5750397, 5840580; 6465249; Manz, M.G. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11872-11877 (2002) и Akashi, K. , Nature 404(6774):193-197 (2000)). Общее руководство по сортировке флуоресцентно активированных клеток описано, например, в Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 4th Ed., Wiley-Liss (2003) и Ormerod, M.G., Flow Cytometry: A Practical Approach, 3rd Ed., Oxford University Press (2000).
Следует понимать, что очистка клеток также предусматривает комбинации описанных в настоящем документе способов. Типичная комбинация может предусматривать начальную процедуру, которая эффективна для удаления основной массы нежелательных клеток и клеточного материала, например, лейкафарез. Вторая стадия может предусматривать выделение клеток, экспрессирующих маркер, общий для одной или нескольких популяций клеток-предшественников, посредством иммуноадсорбции на антителах, связанных с субстратом. Например, магнитные гранулы, содержащие антитела к CD34, способны связывать и захватывать клетки HSC, CMP и GMP, которые, как правило, экспрессируют антиген CD34. Дополнительная стадия, обеспечивающая более высокое разрешение различных типов клеток, таких как сортировка FACS с антителами к набору специфических клеточных маркеров, может быть использована для получения по существу чистых популяций желаемых клеток. Другая комбинация может предусматривать начальное разделение с использованием магнитных гранул, связанных с антителами к CD34, с последующим дополнительным циклом очистки с помощью FACS.
Места для осуществления наращивания хорошо известны специалистам в настоящей области техники и включают в себя, например, открытое оборудование для культивирования клеток, такое как колбы для культивирования, и закрытое оборудование для культивирования клеток, такое как одноразовые биореакторы с замкнутой системой с модификацией или без модификации для адгезии клеток и мини-биореакторы с замкнутой системой, например, мини-биореакторы, содержащие полые волокна или другие системы или покрытия, обеспечивающие адгезию клеток, если это необходимо. Согласно некоторым вариантам осуществления местом осуществления является система для наращивания клеток Quantum(Terumo BCT, Lakewood, CO).
Количество клеток, необходимое для достижения терапевтического эффекта, будет определяться эмпирически в соответствии с обычными процедурами для конкретной цели. Как правило, для введения клеток в терапевтических целях клетки вводят в фармакологически эффективной дозе. Термин «фармакологически эффективное количество» или «фармакологически эффективная доза» означает количество, достаточное для получения желаемого физиологического эффекта, или количество, способное достичь желаемого результата, особенно для приживления или выживания субъекта. Терапевтическая польза также включает в себя остановку или замедление прогрессирования основного заболевания или нарушения, независимо от того, реализовано ли улучшение. Фармакологически эффективная доза, как определено выше, будет также применяться к терапевтическим соединениям, используемым в комбинации с клетками, как дополнительно описано ниже.
6
8
6
8
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
Трансплантат гемопоэтических стволовых клеток может широко варьировать в зависимости от возраста, массы и состояния здоровья пациента, характера и тяжести показателя. Соответствующие диапазоны доз для HSPC варьируют в соответствии с этими соображениями. Согласно некоторым вариантам осуществления трансплантат будет содержать от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит от приблизительно 1,0 × 10 до приблизительно 1,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 1,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 2,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 3,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 4,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 5,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 6,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 7,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 8,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 9,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 1,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 2,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 3,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 4,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 5,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 6,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 7,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 8,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 9,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления расширенная клеточная популяция содержит приблизительно 1,0 × 10 HSPC/кг массы субъекта.
Единица пуповинной крови представляет собой кровь, собранную из одной плаценты и пуповины. Количество ядросодержащих клеток в единице пуповинной крови варьирует. Кроме того, количество ядросодержащих клеток в единице пуповинной крови может быть меньше после замораживания и оттаивания. Таким образом, при введении HSPC рекомендуется указывать, до или после оттаивания единицы проводили измерения количества ядросодержащих клеток.
Трансплантация клеток пациенту осуществляется с помощью способов, обычно используемых в настоящей области техники. Предпочтительным способом введения является внутривенная инфузия. Как описано выше, количество трансфузированных клеток будет учитывать такие факторы, как пол, возраст, масса, типы заболевания или нарушения, стадия нарушения, процентная доля желаемых клеток в клеточной популяции (например, чистота клеточной популяция) и количество клеток, необходимых для получения терапевтического эффекта.
Клетки можно вводить в одной инфузии или путем последовательных инфузий в течение определенного периода времени, достаточного для создания терапевтического эффекта. Различные популяции клеток можно вводить, когда лечение включает последовательные инфузии. Фармацевтически приемлемый носитель, как дополнительно описано ниже, может быть использован для инфузии клеток пациенту. Они, как правило, содержат, например, забуференный физиологический раствор (например, забуференный фосфатом физиологический раствор) или базально-клеточную культуральную среду без добавок, или известную в настоящей области техники среду.
Описанные в настоящем документе способы трансплантации гемопоэтических стволовых клеток могут быть использованы для лечения различных нарушений. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение относится к недостаткам в гемопоэзе, вызванном заболеванием или миелоаблативным лечением. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой гемопоэтическое заболевание. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой нарушение, которое требует трансплантации гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой инфекционный или генетический иммунодефицит. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой инфекционный иммунодефицит. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой генетический иммунодефицит. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой гематологическое заболевание, включающее в себя инфекционные заболевания/генетические заболевания, влияющие на Т-клетки (например, ВИЧ, SCID, соответственно) и генетические заболевания, влияющие на эритроциты (гемоглобинопатии). Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой анемию. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой анемию Фанкони. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой гемопоэтическую злокачественность. Используемый в настоящем документе термин «лечение» относится к терапевтическому или профилактическому лечению или к подавляющей мере заболевания, нарушения или нежелательного состояния. Лечение предусматривает введение исследуемых клеток в соответствующей форме до появления симптомов заболевания и/или после клинических проявлений или других проявлений заболевания или состояния, чтобы уменьшить тяжесть заболевания, остановить прогрессирование заболевания или устранить заболевание. Профилактика заболевания предусматривает продление или задержку возникновения симптомов нарушения или заболевания, предпочтительно у субъекта с повышенной восприимчивостью к нарушению. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой человека.
Кроме того, в настоящем раскрытии предусмотрены усовершенствованные способы HSCT в области трансплантации твердых органов, клеток или тканей. В качестве примера, но не как ограничение, в настоящем раскрытии дополнительно предусмотрены размноженные эндотелиальными клетками HSPC для применения в трансплантации сердца, печени, легкого, почек, островковых клеток, кожи, эндокринных органов или поджелудочной железы.
Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл через приблизительно от 15 дней до приблизительно 35 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл через приблизительно от 20 дней до приблизительно 30 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 20 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 21 день после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 22 дня после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 23 дня после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 24 дня после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 25 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 26 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 27 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 28 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 29 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления количество тромбоцитов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 20000/мкл приблизительно через 30 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции.
Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкл через приблизительно от 5 дней до приблизительно 20 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкл приблизительно через 5 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 6 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 7 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 8 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 9 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 10 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкл приблизительно через 11 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 12 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкл приблизительно через 13 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 14 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкл приблизительно через 15 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 16 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкл приблизительно через 17 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 18 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 19 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 100 мкМ приблизительно через 20 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл через приблизительно от 10 дней до приблизительно 25 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции.
Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 10 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 11 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 12 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 13 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 14 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 15 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 16 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 17 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 18 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 19 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 20 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 21 день после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 22 дня после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 23 дня после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 24 дня после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 25 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции.
Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 100 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 200 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 300 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 400 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 500 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 600 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 700 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 800 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 900 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления абсолютное количество нейтрофилов в циркулирующей крови субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 500 мкл приблизительно через 1000 дней после трансфузии субъекту расширенной клеточной популяции.
Дополнительное лечение
При использовании описанных в настоящем документе способов можно применять множество дополнительных способов лечения. Согласно одному аспекту дополнительные способы лечения включают в себя, среди прочего, противогрибковые средства, антибактериальные средства и противовирусные средства.
Candida krusei, Candida glabrata, Candida albicans, Candida tropicalis
Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus
Rhizobium arrhizus, Absidia corymbifera, Rhizomucor pusillus
Histoplasma capsulatum
Coccidioides immitis
Согласно одному аспекту дополнительно вводимое средство представляет собой противогрибковое средство. Грибковые инфекции представляют собой серьезную проблему у пациентов, перенесших миелоаблативную терапию и HSCT. Реципиенты с задержкой приживления и пациенты, у которых развивается РТПХ, как правило, подвергаются высокому риску грибковых инфекций. Типы грибковых инфекций разнообразны и включают, среди прочего, кандидоз (например, с ), аспергиллез (например, с ), мукормикоз (например, с ), криптококкоз, и .
Противогрибковые средства для дополнительного введения, как правило, представляют собой системное противогрибковое средство. Одним из применимых противогрибковых средств этого типа является амфотерицин В из семейства полиеновых макролидных антибиотиков. Амфотерицин В доступен в различных составах, в том числе в виде комплекса с дезоксихолатом; в коллоидной суспензии с холестеарилсульфатом и инкапсулированый в липосомы, изготовленные из соевого лецитина, холестерина и дистеароилфосфатидилглицерина, другие составы также известны в настоящей области техники.
Другим противогрибковым средством является флуцитозин, фторированный пиримидин. Дезаминирование флуцитозина грибом приводит к образованию 5-фторурацила, ингибитора антиметаболита и синтеза ДНК. Флуцитозин, как правило, применяется для криптококковых и кандидозных инфекций. Хотя он применяется отдельно, флуцитозин, как правило, применяют в комбинации с амфотерицином B.
Candida albicans, Candida glabrata
Candida neoformans
Имидазолы и триазолы представляют собой широкий класс противогрибковых средств на основе азола. Считается, что имидазолы и триазолы ингибируют стерол-14-α- деметилазу, что приводит к нарушению биосинтеза эргостерина и нарушению активности на клеточной мембране, такой как перенос электронов. Азолевые противогрибковые средства эффективны против некоторых типов кандидоза, таких как и . Типичные азольные противогрибковые средства, пригодные для системного введения, включают в себя, среди прочего, кетоконзаол, итраканазол, флуконазол, эконазол, вориконазол и тераконазол.
Streptococcus
Staphylococcus aureus
E. coli
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza
В дополнение к грибковым инфекциям, пациент с нейтропенией чувствителен к инфекции с различными бактериальными патогенами. Пациенты, подвергающиеся миелоаблативным схемам лечения и HSCT, характеризуются высокими показателями бактериальной инфекции как с грамположительными (например, и ), так и грамотрицательными бактериями (например, и ). Септемия представляет собой обычное явление. Кроме того, замедленное приживление и нарушенное восстановление иммунных реакций против инкапсулированных бактерий, таких как или , увеличивает заболеваемость РТПХ реципиентов трансплантатов.
Дополнительная антибактериальная терапия может использовать любые известные антибиотики, подходящие для конкретного бактериального патогена. К ним относятся как антибиотики широкого спектра действия, так и более направленные антибактериальные соединения. Различные классы подходящих антибактериальных средств с размноженными миелоидными клетками, включают в себя, в качестве примера, а не ограничения, хинолоны и фторхинолоны, β-лактамные антибиотики, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды и различные их когенераторы. Иллюстративные хинолоновые соединения включают в себя ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин, ломефлоксацин и моксифлоксацин. Иллюстративные β-лактамные антибиотики включают в себя пенициллины (например, пенициллин G, пенициллин V), ампициллин, карбенициллин, метициллин, карбапенем и цефалоспорины (например, цефалотин, цефамандол, цефаклор, цефонид, цефотетан, цефатоксим, цефтазидим, цефтизоксим, цефепим). Иллюстративные аминогликозиды включают в себя неомицин, стрептомицин, канамицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин и нетилмицин. Иллюстративные макролиды включают в себя эритромицин, кларитромицин, азитромицин и солитромицин. Другие антибиотики будут очевидны квалифицированному специалисту в настоящей области техники.
Вирусные инфекции также представляют собой проблему у миелоаблатированных пациентов и HSCT. Как правило, повышенный риск вирусной инфекции является следствием нарушения клеточного иммунитета, вызванного миелоаблативной терапией. Многие из этих инфекций возникают в результате реактивации скрытого вируса, существующего у серопозитивного пациента или в клетках серопозитивного донора. Обычно встречающиеся вирусы включают в себя, среди прочего, цитомегаловирус, вирус простого герпеса, вирус ветряной оспы, вирус герпеса-6, вирус Эпштейна Барра, аденовирусы и тому подобное. В качестве дополнения к клеточной инфузии выбранные противовирусные соединения представляют собой те, которые соответствуют вирусам, с которыми сталкивается пациент. Применимые противовирусные соединения включают в себя, например, ацикловир, цидофовир, ганцикловир, идоксуридин, пенцикловир, валганцикловир, валацикловир, видарабин, амантадин, римантадин, занамивир, фомивирсен, имиквимод и рибавирин. Терапевтические средства, направленные против ретровирусов, включают в себя, среди прочего, нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (например, зидовудин, диданозин, ставудин, зальцитабин, ламивудин), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (например, невирапин, эфавиренц,дельвирудин) и ингибиторы протеазы (например, саквинивир, индинавир, ритонавир,  нелфинавир, ампренавир и лопинавир).
Противогрибковые, антибактериальные и противовирусные средства могут быть использованы в качестве профилактики для предотвращения возникновения инфекции или при появлении заболевания. Профилактика особенно показана для грибковых инфекций, распространенных у пациентов с ослабленным иммунитетом, а также для вирусных инфекций у пациентов с серопозитивными заболеваниями или у доноров серопозитивных трансплантатов. Соответственно, варианты осуществления для терапевтических целей предусматривают комбинации HSPC, MP-клеток и противогрибковых, антибактериальных или противовирусных соединений.
et al.
et al.
Согласно дополнительному варианту осуществления вспомогательное вводимое средство представляет собой цитокин или фактор роста, который усиливает дифференцировку и мобилизацию терминально дифференцированных миелоидных клеток, особенно гранулоцитов, макрофагов, мегакариоцитов и эритроидных клеток. Для улучшения развития гранулоцитов могут применяться цитокины C-CSF и GM-CSF. G-CSF эффективен в ускорении приживления и производства нейтрофилов в HSCT. Согласно другому варианту осуществления цитокин или фактор роста представляет собой тромбопоэтин. Введение ТРО усиливает приживление трансплантированных клеток-предшественников и способствует развитию мегакариоцитов и тромбоцитов (Fox, N , J. Clin. Invest. 110:389-394 (2002); Akahori, H. , Stem Cells 14(6):678-689 (1996)).
Для вспомогательной терапии могут применяться различные наполнители и вспомогательные вещества и пути введения, что будет очевидно специалисту в настоящей области техники. Репрезентативная технология составления представлена, в частности, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000).
Фармацевтические композиции, как правило, будут содержать фармацевтически приемлемый носитель и фармакологически эффективное количество соединений или их смесей, или их подходящих солей. Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде порошков, гранул, растворов, суспензий, аэрозолей, твердых веществ, пилюль, таблеток, капсул, гелей, кремов для локального применения, суппозиториев, трансдермальных пластырей и других составов, известных в настоящей области техники.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любой из стандартных фармацевтически приемлемых носителей, известных специалистам в настоящей области разработки фармацевтических композиций. Таким образом, соединения, сами по себе, такие как присутствующие в виде фармацевтически приемлемых солей или в виде конъюгатов, могут быть получены в виде составов в фармацевтически приемлемых разбавителях; например, физиологическом растворе, фосфатном буферном солевом растворе (PBS), водном этаноле или растворе глюкозы, манните, декстране, пропиленгликоле, масле (например, растительных маслах, животных маслах, синтетических маслах и т.д.), микрокристаллической целлюлозе, карбоксиметилцеллюлозе, гидроксилпропилметилцеллюлозе, стеарате магния, фосфате кальция, желатине, полисорбате 80 или тому подобном или в виде твердых препаратов в подходящих вспомогательных веществах.
Фармацевтические композиции часто будут дополнительно содержать один или несколько буферов (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или такие аминокислоты, как глицин, антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия, бутилированный гидрокситолуол, бутилированный гидроксианизол и т.д.), бактериостаты, хелатирующие средства, такие как ЭДТА или глутатион, растворенные вещества, которые делают композицию изотонической, гипотонической или слабо гипертонической с кровью реципиента, суспендирующие средства, загущающие средства, консерванты, ароматизаторы, подслащивающие средства и красители.
Хотя любой подходящий носитель, известный специалистам в настоящей области техники, может быть использован в композициях, тип носителя, как правило, изменяется в зависимости от способа введения. Терапевтические композиции могут быть составлены для любого подходящего способа введения, включая в себя, например, пероральное, назальное, слизистое, ректальное, вагинальное, местное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутрикожное, подкожное и внутримышечное введение.
Описанные в настоящем документе фармацевтические композиции могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, таких как герметичные ампулы или флаконы. Такие контейнеры, как правило, герметизируют таким образом, чтобы сохранить стерильность и стабильность состава до использования. Как правило, композиции могут храниться в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях, как указано выше. Альтернативно, фармацевтическая композиция может храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением.
Количество, вводимое хозяину, будет варьировать в зависимости от того, что вводится, назначения введения, такого как профилактика или лечение, состояние хозяина, способа введения, количества введений, интервала между введениями и т.п. Это может быть определено эмпирически специалистами в настоящей области техники и может быть скорректировано с учетом степени терапевтического ответа. Факторы, которые следует учитывать при определении соответствующей дозы, включают в себя, без ограничения, размер и массу субъекта, возраст и пол субъекта, тяжесть симптома, стадию заболевания, способ доставки средства, период полувыведения средств и эффективность средств. Стадия заболевания предусматривает рассмотрение того, является ли заболевание острым или хроническим, рецидивирующим или находится в ремиссионной фазе и прогрессирует ли оно.
in vitro
Определение дозировок и времени введения для терапевтически эффективного количества соответствует навыкам среднего специалиста в настоящей области техники. Например, начальную эффективную дозу можно оценить из культуры клеток или других анализов . Затем дозу можно составить на животных моделях для получения циркулирующей концентрации или концентрации в тканях, включая в себя IC50, как определено посредством анализов клеточной культуры.
Наборы
Описанные в настоящем документе способы могут быть облегчены с помощью набора для повышения приживления HSPC. Наборы могут содержать клетки, включая в себя, без ограничения, HSPC, EC, включая в себя нарощенные размноженные и выделенные клетки и/или вспомогательные терапевтические соединения, средства для выделения или наращивания HSPC и EC, средства для введения клеток пациенту или любую их комбинацию. Наборы могут необязательно содержать любой или все из следующего: фармацевтически приемлемый носитель, физиологически приемлемый носитель, инструкции по применению, контейнер, сосуд для введения, антитела или любую их комбинацию. Как правило, к комплекту прилагается этикетка, и она включает в себя любой записанный материал, который может представлять собой электронную или машиночитаемую форму (например, диск, оптический диск, чип памяти или лента), предоставляющую инструкции или другую информацию по применению содержимого набора.
et al.
Практика настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, традиционные техники клеточной биологии, молекулярной биологии, культивирования клеток, иммунологии и т.п., которые находятся в компетенции специалиста в настоящей области техники. Эти способы полностью раскрыты в текущей литературе, и ссылка делается, в особенности, на Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); серию Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.) и Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow , eds., (1987).
ПРИМЕРЫ
Аспекты настоящего учения могут быть дополнительно поняты в свете следующих примеров, которые не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего учения каким-либо образом.
Пример 1. Наращивание HSPC с необлученными EC
Необлученные E4ORF1+ сконструированные ЕС характеризуются пролиферативной способностью, которая должна пересеваться при расщеплении 1:4 приблизительно 15-20 раз в традиционной основанной на колбах культуре. В этом способе необлученные E4ORF1+ сконструированные EC могут быть размножены до достаточных количеств в сосудах для культивирования с плоской поверхностью. Количество высеянных клеток будет зависеть от количества исходного материала и продолжительности наращивания. Например, для 10-дневного наращивания может потребоваться эквивалент 3-х планшетов с чашками на 6 лунок (каждая диаметром приблизительно 35 мм). E4ORF1+ EC культивируют в готовой питательной среде до конфлюэнтности в этих лунках. При конфлюэнтности среды заменяют кондиционированными средами. Через 24 часа в кондиционированных средах очищенные CD34+ клетки, например, из пуповинной крови (UCB), можно высевать на предварительно засеянные E4ORF1+ EC лунки с цитокинами, состоящими из 50 нг/мл каждого из тромбопоэтина (TPO), лиганда связанной с Fms тирозинкиназы 3 (Flt-3L) и фактора стволовых клеток (SCF). Через два дня среду собирают, клетки осаждают и повторно суспендируют в свежей содержащей цитокин среде и диспергируют в две дополнительные лунки, которые были предварительно кондиционированы как первая. Первая лунка, называемая «материнская лунка» или «материнская колба», также повторно питается дополнительными содержащими цитокины средами. Этот процесс повторяется через день до 10-го дня. На этой стадии все лунки содержат размноженные HSPC и E4ORF1+ EC. В некоторых случаях может быть использован биореактор, такой как биореактор с полыми волокнами. Полые волокна могут быть грунтованы, покрыты, кондиционированы (например, согласно инструкциям производителя) и засеяны приблизительно 5х107 E4ORF1+ EC в готовой питательной среде. Биореактор «питает» клетки и может допускать наращивание в течение 6 дней. В этот момент, когда в биореакторе наблюдается почти конфлюэнтность, среда заменяется кондиционирующей средой без цитокинов для замены сыворотки (например, фетальной бычьей сыворотки (FBS)), которая в противном случае могла бы привести к преждевременной дифференциации HSPC. Через 24 часа E4ORF1+ EC готовы принять HSPC. Образцы UCB могут храниться в замороженном виде в виде обедненного эритроцитами (RBC) продукта в диметилсульфоксиде (ДМСО). Этот клеточный материал промывают перед очисткой и наращиванием примитивной популяции CD34+. Чтобы достичь этого, образец оттаивают в бане при температуре 37°C. При визуальном осмотре оставшегося льда единицу объединяют в стерильных условиях с жидкостями устройства Miltenyi Prodigy или аналогичной системой. Клетки инкубируют в это время с ДНКазой, так как содержание нуклеиновой кислоты в любых нежизнеспособных клетках после оттаивания может привести к сгущению и вязкости. Устройство Miltenyi Prodigy или сопоставимое устройство способно промывать клетки для удаления криопротекторов и дальнейшего истощения образца на эритроциты. Все еще находясь в устройстве Miltenyi Prodigy, клетки инкубируют с микрогранулами CD34 для очистки HSPC. Наконец, выполняются стадии отмывания. Затем клетки CD34+, связанные с микрогранулами, вводят в устройство Miltenyi CliniMacs или аналогичное устройство для магнитной очистки меченых клеток CD34+. Ожидается восстановление 50-70% доступных CD34+ клеток.
Затем очищенную CD34+ фракцию вводят в 200 мкл среды наращивания HSPC, дополненной цитокинами, SCF, TPO и Flt3L в концентрации 50 нг/мл каждый. Затем эта среда вводится в биореактор в той же внутренней камере, что и E4ORF1+ сконструированные EC (день 0 наращивания). Во время наращивания среда наращивания HSPC (без цитокинов) непрерывно подается через внешнюю камеру со скоростью приблизительно 0,4 мл/мин для обмена метаболитов и циркулирует со скоростью приблизительно 30 мл/мин в цикле рециркуляции, который включает газообменный модуль, снабженный 90% N2, 5% O2 и 5% CO2. Кроме того, на 2-й день и 4-й день наращивания во внутреннюю камеру добавляют болюс объемом 200 мл среды наращивания HSPC, дополненной цитокинами, SCF, TPO и Flt3L со скоростью 50 нг/мл. Наращивание прекращается на 6-й день наращивания, после чего собирают весь клеточный материал.
Пример 2. Наращивание HSPC с облученными EC
E4ORF1+ сконструированные EC являются полностью компетентными для наращивания HSPC после получения митотического стимула инактивации, такого как излучение или митомицин C. Чтобы использовать клетки после митотической инактивации, стимулятор митотической инактивации вводят, когда клетки находятся в их конечном сосуде для культивирования в состоянии конфлюэнтности и разрешены 24 часа для восстановления в полной среде до перехода на кондиционированную среду. Для использования митотически инактивированных клеток в биореакторах, E4ORF1+ сконструированные EC или ETV2+ E4ORF1+ сконструированные EC, или E4ORF1+ E4ORF6+ сконструированные EC выращиваются до тех пор, пока не будет приблизительно 1 миллиард клеток. Клетки могут быть криоконсервированы после воздействия митотическим инактивирующим стимулом. Затем весь митотически инактивированный образец ЕС вводят в биореактор и ему позволяют прикрепляться в течение 24 часов. Кондиционирование среды следует после дополнительных 24 часов. Клетки CD34+, например, из UCB, затем вводят в тот же отсек биореактора, что и E4ORF1+ сконструированные EC, дополненные цитокинами (50 нг/мл TPO, Flt-3L, SCF). С этого момента клетки не отделены друг от друга. На 2 и 4 дни подают 200 мл болюса среды, дополненной цитокинами. Условия сбора и все остальные условия такие же, как в примере 1.
Пример 3. Анализы CFU
Колониеобразующие единицы или «КОЕ» представляют собой средство для оценки стволовости клеток в модели in vitro. Известное количество клеток высевают на колбу для культивирования с покрытием из метилцеллюлозы с определенной средой (т.е. Methocult). Через две недели презумптивными стволовыми клетками образуются колонии с определенными морфологиями. Эти колонии являются поддающимися количественной оценке и могут быть использованы для определения HPSC в данной популяции. Скорости наращивания HSPC были самыми высокими в биореакторе, за которым следовало основанное на колбах наращивание с E4ORF1+ EC и наращивание только с цитокинами, обеспечивающее наименьшее количество наращивания HSPC (смотрите фиг. 7).
Пример 4. Проточная цитометрия
Гемопоэтические клетки из свежей выделенной пуповинной крови (без манипуляций), из клеток, нарощенных размноженных только с помощью цитокинов в течение 6 дней, из клеток, нарощенных размноженных на E4ORF1+ EC в колбе в течение 6 дней, или из клеток, нарощенных размноженных на E4ORF1+ EC в полом волокне биореактора в течение 6 дней, анализировали с помощью проточной цитометрии. Популяции клеток окрашивали одновременно на CD34, CD45 и CD38. Каждый параметр был различим с помощью уникальных флуорофоров, конъюгированных с антителами, специфическими к этим клеточным поверхностным антигенам. CD45-клетки идентифицировали как E4ORF1+ сконструированные EC. CD45 представляет собой пан- гемопоэтический маркер. CD45+CD34+ клетки содержат более примитивную популяцию HSPC в общей популяции CD45+ по сравнению с CD45+ CD34- клетками. CD45+ CD34+ CD38- клетки содержат еще более примитивную популяцию HSPC. Скорости наращивания этих примитивных популяций были последовательно самыми высокими в биореакторе, за которым следовало наращивание на основе колб с E4ORF1+ сконструированными EC, а воздействие только цитокином обеспечивало наименьшее количество наращивания.
Пример 5. Трансплантация нарощенных размноженных HSPC
HSPC, нарощенные размноженные путем непрерывного контакта с E4ORF1+ сконструированными EC, могут давать превосходный пригодный для трансплантации продукт, например, по сравнению с HSPC, полученными с помощью наращиваний, где взаимодействие нарушается посредством последовательного пассирования и повторного высевания HSPC. Исключив это нарушение, HSPC, нарощенные размноженные в этом новом способе, могут привести к более быстрому приживлению лимфоидных, миелоидных и эритроидных линий, в результате чего соответствующие показатели крови возвращаются быстрее после миелоаблации. Это также должно улучшить долгосрочное приживление, поскольку предполагается, что использование E4ORF1+ сконструированных ЕС для наращивания предположительно будет удерживать долгосрочную репопуляцию стволовых клеток. Наращивание путем непрерывного контакта с E4ORF1+ сконструированными EC может также приводить к образованию достаточного материала HSPC для одного взрослого для получения трансплантата из одной единицы UCB от одного донора или даже множественных трансфузий трансплантата одному взрослому человеку, или для множественных трансфузий от одного донора UCB нескольким взрослым. Ожидаемое быстрое приживление может также приводить к ряду других преимуществ, включая в себя, возможное снижение периода госпитализации, более низкие показатели РТПХ всех классов, снижение уровня рецидива, снижение смертности, связанной с трансплантацией (TRM), снижение риска инфицирования, снижение числа случаев отказа от трансплантата, способности использовать небольшие количества пуповинной крови, которые в противном случае были бы непригодны для применения, увеличения доступа к донациям UCB для пуповинной крови редкого типа HLA, общее снижение стоимости лечения, увеличение продолжительности жизни для реципиентов трансплантатов и/или повышение качества жизни реципиентов трансплантата.
Вышеуказанные описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения были представлены в целях иллюстрации и описания. Они не должны быть исчерпывающими или ограничивать настоящее изобретение раскрытыми точными формами, и, очевидно, многие модификации и варианты возможны в свете вышеприведенного учения. Варианты осуществления были выбраны и описаны для лучшего объяснения принципов настоящего изобретения и его практического применения, чтобы тем самым дать возможность специалистам в настоящей области техники лучше всего использовать настоящее изобретение и различные варианты осуществления с различными модификациями, которые подходят для конкретного рассмотренного применения.
Все патенты, заявки на патенты, публикации и ссылки, приведенные в настоящем документе, явно включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.