MONOCLONAL ANTIBODIES TO ALPHA-SYNUCLEIN FOR PREVENTING TAU-PROTEIN AGGREGATION
Моноклональные антитела к альфа-синуклеину для предотвращения агрегации тау-белка

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к новому применению моноклонального антитела, которое иммуноспецифически связывается с альфа синуклеином, а также к способам применения таких молекул и их фрагментов, связывающих альфа-синуклеин, в лечении таупатий, таких как болезнь Альцгеймера (AD).
Ссылка на перечень последовательностей
et seq
[0002] Настоящая заявка включает один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821 ., которые раскрыты как на бумажных, так и на машиночитаемых носителях, и эти бумажные и машиночитаемые раскрытия включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Предпосылки изобретения
[0003] В настоящее время возрастные нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD) и деменция, являются одной из крупнейших проблем, стоящих перед обществом. По оценкам Всемирной организации здравоохранения траты на уход за лицами старшего возраста будет продолжать возрастать, а число диагностированных случаев деменции к 2050 году утроится (World Health Organization and Alzheimer's Disease International - Status Report (2012) DEMENTIA: A public health priority, WHO). Первыми средствами для лечения AD были модуляторы нейромедиаторов, такие как ингибиторы ацетилхолинэстеразы, и модуляторы NMDA-рецепторов. Данные терапевтические средства стали доступными на рубеже тысячелетий и по-прежнему образуют краеугольный камень для облегчения симптомов нарушений памяти, связанных с деменцией и AD. Однако данные лекарственные средства не воздействуют целенаправленно на первопричины AD - накопление агрегатов пептида β-амилоида (Aβ) и тау-белка и ассоциированную с этим утрату нейронных синапсов и, в конечном счете, нейронов.
et al
et al
et al
et al
et al
et al
[0004] Долгосрочные повторные исследования людей пожилого возраста в рамках всего сообщества (Weiner, M.W. . (2014) ADNI; Breteler, M.M. . (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 23-28; Launer, L.J. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 2-13) совместно с масштабными полногеномными исследованиями ассоциаций (Lambert, J.C. . (2013) Nat. Genet. 45, 1452-1458) показали, что AD представляет собой неоднородную смесь из разных форм деменции, при этом у вплоть до 10 процентов пациентов с запущенной формой AD отсутствует амилоидная патология (Crary, J.F. . (2014) Acta Neuropathol. 128, 755-766). Кроме того, фундаментальные патологоанатомические исследования, проведенные Braak и Braak (Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12), продемонстрировали четкую корреляцию между степенью патологии в виде нейрофибриллярных клубков и состоянием когнитивных способностей до проведения вскрытия. Эти наблюдения были подкреплены несколькими исследователями (Nelson, P.T. . (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381) и в недавних долгосрочных повторных исследованиях биомаркеров, которые указывают на то, что уровни тау-белка и фосфорилированного тау белка в спинномозговой жидкости (CSF) повышаются на всем протяжении ранних и поздних стадий заболевания (Jack, C.R., Jr. . (2013) Lancet Neurol. 12, 207-216).
et al
et al.
et al.
[0005] Как указано выше, ассоциированный с микротрубочками тау-белок и его гиперфосфорилированный вариант образуют основной компонент внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, которые являются одним из главных характерных признаков AD. Кроме того, специфические варианты гена тау-белка ассоциированы с семейными формами лобно-височной деменции (FTD). Проявление тау-патологии при AD происходит по четко выраженному пространственному паттерну, начиная с энторинальной области коры с последующим переходом в зоны гиппокампа и коры (Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12). Специфическая стадия тау-патологии также хорошо коррелирует с когнитивными способностями (Nelson, P.T. . (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381; Braak, E. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249 Suppl 3, 14-22). Вместе взятые, эта информация составляют основу гипотезы, что развитие AD обусловлено тау-белком. Она подразумевает, что внутриклеточное накопление тау-белка приводит к разрушению микротрубочек и коллапсу дендритных шипиков. В результате этого нарушается коммуникация между нейронами и наступает гибель клеток. Недавно также было показано, что тау-белок сам по себе может образовывать эндопатогенные разновидности, которые могут способствовать распространению нейродегенерации от одной клетки к другой (Clavaguera, F. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913).
Тау-белок в качестве эндопатогена
et al.
et al.
et al
et al
et al
et al
et al
et al
et al.
[0006] Clavaguera и соавторы продемонстрировали, что тау-белок сам по себе может действовать в качестве эндопатогена (Clavaguera, F. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913). Экстракты головного мозга, получаемые при низкой скорости центрифугирования, выделяли из трансгенных по тау-белку мышей P301S (Allen, B. (2002) J. Neurosci. 22, 9340-9351), разбавляли и инъецировали в гиппокамп и корковые зоны молодых мышей ALZ17. Мыши ALZ17 представляют собой трансгенную по тау-белку линию мышей, у которых патология развивается только на позднем этапе (Probst, A. . (2000) Acta Neuropathol. 99, 469-481). У подвергнутых инъекции мышей ALZ17 быстро развивалась патология в виде плотных филаментов, а введение подвергнутых иммунному истощению экстрактов головного мозга от мышей P301S или экстрактов от мышей дикого типа не индуцировало тау-патологию. Фракционирование экстрактов головного мозга на растворимый (S1) и нерастворимый в саркозиле (P3) таубелок (Sahara, N. . (2013) J. Alzheimer's. Dis. 33, 249-263) и их инъекция мышам ALZ17 продемонстрировали, что фракция P3 в наибольшей степени способна индуцировать патологию. Большую часть ее составляют внутриклеточные филаменты гиперфосфорилированного тау-белка. В большинстве случаев патологию также можно было индуцировать при инъекции экстрактов от P301S в головной мозг мышей дикого типа, но NFT не образовывались. В последующих исследованиях Clavaguera показали, что тау-белок человека, экстрагированный посмертно из ткани головного мозга с другими таупатиями (болезнь аргирофильных зерен (AGD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP) и кортикобазальная дегенерация (CBD)), также может индуцировать тау-патологию в модели ALZ17 (Clavaguera, F. . (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 9535-9540). С момента представления этих данных сообщалось о некоторых других моделях затравочного действия и распространения тау-белка (Ahmed, Z. . (2014) Acta Neuropathol. 127, 667-683; Walker, L.C. . (2013) JAMA Neurol. 70, 304-310). Основной вывод этих исследований указывает на механизм, посредством которого патогенный тау-белок во внутриклеточных включениях секретируется из клетки в периплазматическое пространство. Патологический материал тау-белка затем транспортируется в оболочке синаптических везикул как в антероградном, так и ретроградном направлении и затем захватывается соседними клетками посредством крупноразмерного эндоцитоза. Этот механизм объясняет, почему распространение патологии, наблюдаемое при заболевании человека, следует четко выраженному анатомическому паттерну. Весьма любопытно, что периферическое введение патологического тау-белка может ускорять формирование тау-патологии у мышей ALZ17 (Clavaguera, F. (2014) Acta Neuropathol. 127, 299-301).
Связь между альфа-синуклеином и тау-патологией
[0007] Альфа-синуклеин является членом семейства белков, в которое входит бета и гамма-синуклеин и синоретин. В норме экспрессия альфа-синуклеина ассоциирована с синапсами, и полагают, что он играет роль в регуляции высвобождения из синаптических везикул и за счет этого воздействует на нейронную пластичность, способность к обучению и память.
[0008] В нескольких исследованиях было показано, что альфа-синуклеин играет центральную роль в патогенезе болезни Паркинсона (PD). При патологических состояниях этот белок может агрегироваться с образованием внутриклеточных нерастворимых фибрилл. Например, синуклеин накапливается в тельцах Леви (LB) (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). Мутации в гене альфа-синуклеина, а также дупликации и трипликации этого гена, косегрегируют с редкими наследственными формами паркинсонизма (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7).
[0009] Важным открытием было то, что альфа-синуклеин может секретироваться в плазму крови и спинномозговую жидкость (CSF) и присутствовать в них. В нескольких исследованиях, например, осуществленных Pacheco et al. (2015) и другими (Conway et al., (2000) Proc Natl Acad Sci США, 97:571-576; Volles et al., J. Biochem. (2003) 42:7871-7878), было высказано предположение, что внеклеточный синуклеин играет патогенную роль в головном мозге. Они продемонстрировали, что альфа-синуклеин характеризуется нейротоксичностью в отношении плазматических мембран нейронов головного мозга, подвергающихся непосредственному воздействию олигомеров внеклеточного синуклеина. Другая интересная гипотеза, основанная на данных по секреции синуклеина, заключается в том, что в основе прогрессирования болезни Паркинсона и других синуклеопатий лежит прионоподобное распространение альфа-синуклеина (Lee et al., Hansen et al. (2011) J. Clin Invest 121:715-725). Эти результаты породили надежду на то, что внеклеточный синуклеин может выступать в качестве мишени для иммунотерапии (Vekrellis et al. (2011) Lancet Neurol 10:1015-1025), и она будет потенциальным средством лечения альфа-синуклеопатий. В дополнение к мутациям, альтернативный сплайсинг гена альфа-синуклеина и посттрансляционные модификации белка, такие как фосфорилирование, убиквитинирование, нитрование и усечение, могут приводить к формам белка альфа-синуклеина, которые обладают повышенной способностью к образованию агрегированных и/или токсических форм альфа-синуклеина (Beyer and Ariza, Mol Neurobiol. 2013 Apr; 47(2):509-24). Однако точные патологические разновидности альфа-синуклеина при альфа-синуклеопатиях остаются неизвестными. Токсичность связывали с различными неправильно уложенными/агрегированными/секретируемыми разновидностями, варьирующими от олигомеров до фибрилл, и различными посттрансляционными модификациями, но все еще отсутствует единое мнение относительно того, какая из них является наиболее важной, если такая единственная токсическая молекула действительно существует.
[00010] Одновременное проявление патологий, например телец Леви, бляшек бета-амилоида и нейрофибриллярных клубков у подгрупп пациентов с PD или тельцами Леви в подгруппе пациентов с AD (Galpern and Lang, Ann. Neurol. (2008), 59: 449-458), привело к исследованиям, касающимся того, в какой степени склонные к агрегации белки могут оказывать перекрестное затравочное действие в отношении друг друга. Сообщалось, что альфа-синуклеин и тау-белок могут индуцировать образование фибрилл у каждого при совместной инкубации in vitro (Giasson et al., (2003) Science 300: 636-640). В случае клеточных систем имеется информация, как подтверждающая перекрестное затравочное действие тау-белка и фибрилл альфа-синуклеина, так и не подтверждающая его. Holmes et al. не смогли продемонстрировать перекрестное затравочное действие тау-белка и фибрилл, образованных из полноразмерного альфа-синуклеина, в клеточной линии с репортерным тау-белком с помощью FRET-анализа (Holmes et al., (2014) PNAS doi/10.1073: E4376-E4385). Агрегацию таубелка также не смогли индуцировать с помощью фибриллярного полноразмерного альфа-синуклеина A53T или осажденных в PTA (для обогащения в отношении фибрилл альфа-синуклеина) образцов головного мозга от пациента с множественной системной атрофией (MSA) (Woerman et al., (2015) PNAS doi/10.1073: E4949-E4958). Другие авторы сообщали, что при некоторых условиях альфа-синуклеин может индуцировать агрегацию тау-белка, например, было показано, что фибриллы альфа-синуклеина, образованные из альфа-синуклеина, усеченного на N-конце (21-140), индуцируют фосфорилирование тау-белка в клетках QBI293 (Waxman and Giasson (2011) J. Neurosci 31: 7604-7618). В культурах нейронов фибриллярный полноразмерный альфа-синуклеин действительно оказывает затравочное действие на агрегацию тау-белка. Однако фибриллярный альфа-синуклеин, образованный из усеченного альфа-синуклеина (1-120 или 32-140), можно задействовать для повторного самозатравочного действия в клетках (5 или 10% фибриллярного альфа-синуклеина из каждого пассажа включали в качестве затравочных частиц для образования фибрилл в следующем пассаже) (Guo el at., (2013) Cell 154: 109-117).
[00011] Насколько известно авторам настоящего изобретения, отсутствуют исследования, в которых предполагалось бы, что секретируемые олигомерные или фибриллярные формы альфа-синуклеина могут быть фактором, обуславливающим ранний патогенез AD или других таупатий, в целом независимых от видимых включений альфа-синуклеина. В сообщениях, в которых удалось продемонстрировать перекрестное затравочное действие тау-белка и альфа-синуклеина, основное внимание уделялось объяснению того, почему у некоторых пациентов с PD при явно выраженной агрегации альфа-синуклеина (тельца Леви) наблюдаются нейрофибриллярные клубки. В этих исследованиях высказывается предположение, что перекрестное затравочное действие может происходить в зонах, в которых существует тесная физиологическая связь отложений тау-белка и альфа-синуклеина (Giasson et al., (2003) Science 300: 636-640; Waxman and Giasson (2011) J. Neurosci 31: 7604-7618; Guo el at., (2013) Cell 154: 109-117). Идея, что растворимые внеклеточные олигомерные/фибриллярные формы альфа-синуклеина, а не внутриклеточные агрегаты в форме телец Леви или нейритов Леви являются важными факторами, обуславливающим образование нейрофибриллярных клубков тау-белка, является новой.
Иммунотерапевтические средства против альфа-синуклеина
[00012] Антитела, связывающиеся с альфа-синуклеином, были разработаны в качестве потенциальных терапевтических средств для лечения синуклеопатий, также известных как болезни телец Леви (LBD). Для синуклеопатий характерно отложение внутриклеточных белковых агрегатов, различимых под микроскопом в виде телец Леви (LB) и/или нейритов Леви, в которых основным компонентом служит белок альфа-синуклеина (Jellinger, Mov Disord. 2012 Jan;27(1):8-30; McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Синуклеопатии включают болезнь Паркинсона (включая идиопатическую болезнь Паркинсона) и болезнь диффузных телец Леви (DLB) (также известную как деменция с тельцами Леви (DLB)), вариант болезни Альцгеймера с тельцами Леви (LBV), комбинированную болезнь Альцгеймера и Паркинсона (PD), истинную вегетативную недостаточность и множественную системную атрофию (MSA, например, оливопонтоцеребеллярная атрофия, стрионигральная дегенерация и синдром Шая-Дрейджера).
[00013] Было показано, что несколько различных антител к альфа-синуклеину оказывают терапевтический эффект на доклинических животных моделях. Было показано, что как антитело, нацеленное на эпитоп, включающий остатки 91-99 альфа-синуклеина, так и антитела, нацеленные на эпитоп, включающий остатки 118-126 альфа-синуклеина, оказывали воздействие на двигательные и когнитивные нарушения у трансгенных мышей (Games et al. 2014). Наиболее эффективным из этих антител является гуманизированное антитело на основе моноклонального мышиного антитела 9Е4, которое нацелено на эпитоп, который включает остатки 118-126 альфа-синуклеина, и которое сейчас проходит клинические испытания фазы I. Также было показано, что антитело, которое нацелено на аминоконцевой эпитоп альфа-синуклеина, обладает возможным терапевтическим потенциалом по предотвращению распространения патологии и токсического воздействия на мышиной модели прионоподобного переноса (Tran et al. 2014), и также было показано, что С-концевое антитело 274, которое нацелено на эпитоп, который включает остатки 120-140 альфа-синуклеина (Bae et al. 2012), в доклинической модели оказывало воздействие на распространение патологии от клетки к клетке. В дополнение к этому было показано, что антитела, нацеленные на конформационные разновидности, такие как олигомеры и фибриллы альфа-синуклеина, могут по меньшей мере снижать уровни этих предположительно токсических молекул альфа-синуклеина ( et al. 2014 и Spencer et al. 2014). Также было показано, что такие конформационные антитела, снижающие уровни олигомеров альфа-синуклеина in vivo, такие как mab47, нацелены на эпитопы на С-конце альфа-синуклеина, охватывающие аминокислоты 121-125 (US20120308572). Другие конформационные антитела, специфические в отношении фибрилл и олигомеров, также нацелены на C-концевые последовательности (Vaikath et al. Neurobiol Dis. 2015 Apr 30;79:81-99). Важно отметить, что ни для одного из этих антител к альфа-синуклеину не заявлялось о его способности предотвращать агрегацию тау-белка и, следовательно, потенциальной способности обеспечивать лечение таупатий.
[00014] В настоящем изобретении авторы неожиданно обнаружили, что агрегированный/фибриллярный альфа-синуклеин может индуцировать агрегацию тау-белка, и что некоторые антитела, полученные для связывания альфа-синуклеина, способны предотвращать такую агрегацию. Авторы настоящего изобретения показывают, что панель из различных антител к альфа-синуклеину способна предотвращать агрегацию тау-белка в клеточной модели: антитело (GM37), которое может связываться с предполагаемым токсическим фрагментом альфа-синуклеина 1-119/122 (путем связывания с аминокислотами 112-117 альфа-синуклеина) и нейтрализовать эту усеченную форму альфа-синуклеина; антитело (2E6), которое связывается с аминокислотами 136-140 альфа-синуклеина; антитело (GM63), которое связывается с аминокислотами 126-138 альфа-синуклеина; и антитело 9E4, которое связывается с аминокислотами 118-126 альфа-синуклеина. Для подтверждения того, что фибриллярные формы альфа-синуклеина могут обуславливать раннюю патологию при AD, авторы настоящего изобретения демонстрируют присутствие фибриллярного альфа-синуклеина в головном мозге от пациентов с AD независимо от присутствия патологии в виде телец Леви. Это подтверждает, что растворимые внеклеточные формы фибриллярного альфа-синуклеина потенциально могут обуславливать тау-патологию, в частности, при таупатиях у всех пациентов с AD, а не только при таких, которые характеризуются наличием видимых агрегатов альфа-синуклеина (определенных с помощью визуализации головного мозга или посмертного окрашивания).
Краткое описание изобретения
[00015] Настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, связывающего альфа-синуклеин, для подавления агрегации тау-белка.
[00016] Антитела по настоящему изобретению, раскрытые в данном документе и в формуле изобретения, можно применять в лечении пациентов с болезнью Альцгеймера или пациентов с таупатией, такой как болезнь аргирофильных зерен (AGD), психоз, в частности, психоз, обусловленный AD, или психоз у пациентов с AD, психиатрические симптомы у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), лобно-височная деменция (FTD или ее варианты), TBI (травматическое повреждение головного мозга, острая или хроническая форма), кортикобазальная дегенерация (CBD), болезнь Пика, первичная возрастная таупатия (PART), сенильная деменция с преобладанием нейрофибриллярных клубков, деменция боксеров, хроническая травматическая энцефалопатия, инсульт, восстановление после инсульта, нейродегенерация, связанная с болезнью Паркинсона, паркинсонизм, сцепленный с хромосомой, болезнь Литико-Бодига (гуамский комплекс болезнь Паркинсона-деменция), ганглиоглиома и ганглиоцитома, менингиоангиоматоз, постэнцефалитический паркинсонизм, подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Хантингтона, свинцовая энцефалопатия, туберозный склероз, болезнь Галлервордена-Шпатца и липофусциноз. В более типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD) и болезни Пика.
Краткое описание фигур
[00017] На фиг. 1 показаны протоколы иммунизации для получения гибридом. В таблице указаны различия иммуногенов и линий мышей, которые были использованы для выявления GM37 и GM285. Различных мышей HCo17-Balb/c и HCo12/Balb/c иммунизировали независимо (описание этих мышей приведено ниже). Гибридому, экспрессирующую GM37, идентифицировали у мышей, иммунизированных фибриллами полноразмерного альфа-синуклеина, содержащего аминокислоты 1-140, и простимулированных усеченными фрагментами альфа-синуклеина 1-60 и 1-119 из полноразмерного (FL) альфа-синуклеина (SEQ ID NO 10). Гибридома, экспрессирующая антитело GM285, получена согласно протоколу иммунизации, в котором мышей HCo12-Balb/c иммунизировали полноразмерным мономерным альфа-синуклеином, содержащим аминокислоты 1-140, с последующей стимуляцией полноразмерным фибриллярным альфа-синуклеином (пример 1).
[00018] На фиг. 2 (панели A-C) показаны результаты скрининга GM37 в отношении связывания с альфа-синуклеином, гомологами и ортологами альфа-синуклеина.
[00019] A) Связывание антитела GM37 с альфа-синуклеином по результатам ELISA без применения промывочного раствора (FMAT).
[00020] B) По результатам SPR (Fortebio) связывание антитела GM37 является специфическим в отношении альфа-синуклеина (панель “альфа”), и оно не связывает другие родственные белки семейства синуклеинов, бета-синуклеин (панель “бета”) и гамма-синуклеин (панель “гамма”). Измерения проводили с помощью SPR (Fortebio Octetred). GM37 демонстрирует аналогичное связывание с альфа-синуклеином от яванского макака (панель Cyno) и мыши (панель “мышь”) (пример 1).
[00021] С) По результатам SPR (Fortebio Octetred) связывание антитела GM285 является специфическим в отношении альфа-синуклеина, и оно не связывает другие родственные белки семейства синуклеинов, бета-синуклеин и гамма-синуклеин. Измерения проводили с применением SPR (Fortebio Octetred), которое продемонстрировало аналогичное связывание GM285 с альфа-синуклеином от яванского макака (Cyno) и мыши (“мышь”) (пример 1).
[00022] На фиг. 3 (панели A-C) показана аффинность связывания GM37 в режиме реального времени.
[00023] A) Связывание антитела GM37 с альфа-синуклеином, измеренное в RU (относительных единицах) (ось y) в зависимости от времени (ось X), определенное с помощью SPR (BIAcore 3000). Антитело козы к IgG человека иммобилизировали на чипе CM5. GM37 захватывалось на чипе с иммобилизированным антителом козы к IgG человека и серию концентраций альфа-синуклеина человека (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 нМ) тестировали на связывание с поверхностью. В промежутке между каждым циклом регенерировали поверхность сенсора.
[00024] B) Сигнал связывания при различных концентрациях, преобразованный в кривую связывания.
[00025] C) Рассчитанные константы связывания для антитела GM37 (обозначенного как hlgG1-6004-037-C106S) (пример 2).
[00026] На фиг. 4 (панели A-C) показана аффинность связывания GM285 в режиме реального времени.
[00027] A) Связывание антитела GM285 с альфа-синуклеином, измеренное в RU (ось y) в зависимости от времени (ось X), определенное с помощью SPR (BIAcore 3000). Антитело козы к IgG человека иммобилизировали на чипе CM5. GM285 захватывалось на чипе с иммобилизированным антителом козы к IgG человека и серию концентраций альфа-синуклеина человека (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 нМ) тестировали на связывание с поверхностью. В промежутке между каждым циклом регенерировали поверхность сенсора.
[00028] B) Сигнал связывания при различных концентрациях, преобразованный в кривую связывания.
[00029] C) Рассчитанные константы связывания антитела GM285 (обозначенного как hlgG1-6004-285) (пример 2).
[00030] На фиг. 5 (панели A-C) показано связывание антитела сравнения 9E4 в режиме реального времени.
[00031] A) Показано связывание 9E4 с альфа-синуклеином, измеренное в RU (ось y) в зависимости от времени (ось X), определенное с помощью SPR (BIAcore 3000). Антитело козы к IgG человека иммобилизировали на чипе CM5. 9E4 захватывалось на чипе за счет его связывания с антителом козы к IgG человека, которое было иммобилизировано на чипе. Серию концентраций альфа-синуклеина человека (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 нМ) тестировали на связывание с поверхностью. В промежутке между каждым циклом регенерировали поверхность сенсора.
[00032] B) Сигнал связывания при различных концентрациях, преобразованный в кривую связывания.
[00033] C) Рассчитанные константы связывания для антитела 9E4 (пример 2).
[00034] На фиг. 6 (панели A-B) показаны результаты картирования эпитопа для антитела GM37 и GM285. Данные ELISA, демонстрирующие относительные уровни связывания антител с последовательными пептидами (20-мерами), происходящими из аминокислотной последовательности из аминокислот 95-132 альфа-синуклеина (остальные несвязывающиеся пептиды не показаны).
[00035] A) Для полного связывания эпитопа с GM37 необходима пептидная последовательность ILEDMP (SEQ ID NO:9).
[00036] B) Для полного связывания GM285 необходим пептид ILED (SEQ ID NO:19) (пример 3).
[00037] На фиг. 7 показана таблица, в которой сравниваются кинетические параметры скорости связывания GM37 и вариантов 1-3 с иммобилизированным рекомбинантным альфа-синуклеином человека. Связывание измеряли с применением SPR, а показатели скорости определяли с применением алгоритма связывания 1:1 (BIAcore T200).
[00038] Фиг. 8. Агрегация тау-белка, индуцированная затравочными частицами альфа-синуклеина, предотвращается за счет антител к альфа-синуклеину. На верхней панели фигуры 7 показано, что агрегация тау-белка может эффективно индуцироваться за счет затравочных частиц альфа-синуклеина (фибриллярного рекомбинантного альфа-синуклеина) в типе клеточной модели, широко применяемой для оценки эффекта средств, препятствующих агрегации тау-белка. Агрегацию тау-белка, индуцированную затравочными частицами альфа-синуклеина, можно предотвращать с помощью антител к альфа-синуклеину в целом - в качестве примеров приведены антитела 9E4 (Elan, Prothena) и HLD1, GM37 ("37") и GM63 ("63") от Lundbeck. Антитела к тау-белку, фосфорилированному по серину 396 (D1.2, C10.2 и гуманизированное (h) c10.2, а также еще одно антитело к тау-белку, обозначенное как Lu0041G) и контрольные антитела, не обладающие аффинностью в отношении альфа-синуклеина, не оказывают воздействия на агрегацию тау-белка, что подтверждает важность взаимодействия терапевтического антитела с разновидностями, оказывающими затравочное действие, а не с эндогенным белком (пример 12). На нижней панели фигуры 8 показана схема анализа агрегации в клетках HEK293. Клетки трансфицируют с помощью кДНК, кодирующей полноразмерный тау-белок человека с мутацией P301L. Спустя двадцать четыре часа клетки обрабатывают затравочными частицами альфа-синуклеина в комбинации с антителами. Через 48 часов уровень агрегации тау-белка измеряют в гомогенатах клеток с применением биохимического анализа (пример 5).
[00039] Фиг. 9. Присутствие агрегатов альфа-синуклеина в лобной коре от всех 50 пациентов с AD - группа поделена на AD на промежуточной стадии (Braak III/IV) и AD на поздней стадии (Braak V/VI). 2 образца от пациентов с DLB включены в качестве контроля (две верхние линии на A). В образцах от пациентов с AD не выявлен альфа-синуклеин, фосфорилированный по серину 129. Образцы от пациентов с деменцией с тельцами Леви (DLB) включены в качестве положительных контролей.
На A и B продемонстрировано присутствие агрегированного альфа-синуклеина в лобной коре 50 пациентов с AD, измеренное биохимическим способом. Пациентам был поставлен клинический диагноз AD, и диагноз подтверждали за счет посмертного гистологического окрашивания тау-белка и бета-амилоида. Патология в виде телец Леви (агрегированный альфа-синуклеин, фосфорилированный по серину 129) не наблюдалась ни у одного из пациентов, фигура 9C. Присутствие у всех пациентов агрегатов альфа-синуклеина и отсутствие альфа-синуклеина, фосфорилированного по серину 129 (маркер телец Леви), поддерживает гипотезу о том, что агрегированные формы альфа-синуклеина присутствуют у всех пациентов с AD до того, как альфа-синуклеиновая патология может проявиться в виде телец Леви. Авторы настоящего изобретения предполагают, что такие агрегированные формы альфа-синуклеина - предшественники телец Леви могут действовать в качестве фактора, обуславливающего индуцирование тау-патологии (фигура 8). Подводя итог всему вышесказанному, авторы настоящего изобретения высказывают предположение, что любое антитело к альфа-синуклеину, которое способно нейтрализовать агрегаты альфа-синуклеина (затравочные частицы) или другими способами предотвращать попадание агрегатов альфа-синуклеина в нейроны или глиальные клетки и облегчение агрегации тау-белка, будет иметь терапевтический потенциал для лечения таупатий.
[00040] ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[00041] Используемый в данном документе термин "альфа-синуклеин" является синонимом термина "белок альфа-синуклеина" и относится к любой из изоформ белка альфа-синуклеина (идентифицируемых, например, в UniProt под номером P37840, 1-3). Нумерация аминокислот альфа-синуклеина приведена относительно SEQ ID NO:10, показанной ниже, причем метионин (М) является аминокислотным остатком 1:
SEQ ID NO:10:
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
[00042] Настоящее изобретение относится к антителам и фрагментам антител, которые способны иммуноспецифически связываться с альфа-синуклеином, и в частности с альфа-синуклеином человека, и согласно одному варианту осуществления проявляют способность иммуноспецифически связываться с эпитопом в пределах аминокислот 110-140 альфа-синуклеина человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитела связываются с эпитопом в пределах аминокислот 112-117, 112-115, 118-126, 126-138 или 136-140 альфа-синуклеина человека.
[00043] Под термином "таупатия", как правило, подразумевают нейродегенеративные заболевания, ассоциированные с патологической агрегацией тау-белка. В типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD), болезни Пика, первичной возрастной таупатии (PART), сенильной деменции с преобладанием нейрофибриллярных клубков, деменции боксеров, хронической травматической энцефалопатии, инсульта, восстановления после инсульта, нейродегенерации, связанной с болезнью Паркинсона, паркинсонизма, сцепленного с хромосомой, болезни Литико-Бодига (гуамского комплекса болезнь Паркинсона-деменция), ганглиоглиомы и ганглиоцитомы, менингиоангиоматоза, постэнцефалитического паркинсонизма, подострого склерозирующего панэнцефалита, болезни Хантингтона, свинцовой энцефалопатии, туберозного склероза, болезни Галлервордена-Шпатца и липофусциноза. В более типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD) и болезни Пика. В частности, таупатии могут быть выбраны из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD и психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви.
[00044] Термин "антитело" (Ab) в контексте настоящего изобретения относится к молекуле иммуноглобулина или, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, фрагменту молекулы иммуноглобулина, которые обладают способностью специфически связываться с эпитопом молекулы ("антигена"). Встречающиеся в природе антитела обычно представляют собой тетрамер, который обычно состоит из по меньшей мере двух тяжелых (Н) цепей и по меньшей мере двух легких (L) цепей. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе VH) и константной области тяжелой цепи, обычно состоящей из трех доменов (CH1, CH2 и CH3). Тяжелые цепи могут относиться к любому изотипу, включая IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе VL) и константной области легкой цепи (CL). Легкие цепи включают каппа-цепи и лямбда-цепи. Вариабельная область тяжелой и легкой цепей, как правило, отвечает за распознавание антигена, тогда как константная область тяжелой и легкой цепей может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые “определяющими комплементарность областями”, которые чередуются с областями с более консервативной последовательностью, называемыми "каркасными областями" (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR-доменов и четырех FR-доменов, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2CDR2-FR3-CDR3-FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей составляют домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Особенно актуальными являются антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты, которые были "выделены" для того, чтобы они находились в физической среде, отличающейся от той, в которой они могут встречаться в природе, или которые были модифицированы для того, чтобы они отличались аминокислотной последовательностью от встречающегося в природе антитела.
et al
et al
[00045] Используемый в данном документе термин "эпитопсвязывающий фрагмент антитела" означает фрагмент антитела, способный иммуноспецифически связываться с эпитопом. Эпитопсвязывающий фрагмент может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 CDR-доменов такого антитела и, несмотря на то, что он способен иммуноспецифически связываться с таким эпитопом, может проявлять иммуноспецифичность, аффинность или селективность в отношении такого эпитопа, который отличается от эпитопа для такого антитела. Предпочтительно, однако, чтобы эпитопсвязывающий фрагмент содержал все 6 CDR-доменов такого антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой одну полипептидную цепь (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет аминоконец и карбоксильный конец (например, диатело, Fab-фрагмент, Fab2-фрагмент и т. д.). Фрагменты антител, которые проявляют способность к связыванию с эпитопом, можно получить, например, путем расщепления интактных антител протеазами. Несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, более предпочтительно, чтобы с помощью рекомбинантных способов такие генные последовательности или кодирующие их кДНК можно было соединить гибким линкером, который обеспечивает возможность их получения в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH ассоциируют друг с другом с образованием одновалентных эпитопсвязывающих молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv), см., например, Bird ., (1988) Science 242:423-426; и Huston . (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883). В качестве альтернативы путем использования гибкого линкера, который является слишком коротким (например, содержит меньше приблизительно 9 остатков), чтобы обеспечить возможность ассоциации друг с другом областей VL и VH одной полипептидной цепи, можно получать биспецифическое антитело, диатело или аналогичную молекулу (в которой две такие полипептидные цепи ассоциированы друг с другом с образованием двухвалентной антигенсвязывающей молекулы) (описание диател см., например, в PNAS США 90(14), 6444-8 (1993)). Примеры эпитопсвязывающих фрагментов, охватываемых настоящим изобретением, включают (i) Fab'-или Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VN-, CL- и CH1-доменов, или одновалентное антитело, описанное в WO2007059782; (ii) F(ab')2-фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab- фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, фактически состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, фактически состоящий из VL- и VH-доменов, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который фактически состоит из VH-домена и также называется доменным антителом (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov; 2i(II): 484-90); (vi) антитела верблюдовых или нанотела (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5_(l) : l ll-24) и (vii) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных способов за счет синтетического линкера, который обеспечивает возможность их получения в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH образуют пару с формированием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (scFv), см., например, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) и Huston et al., PNAS США 85, 5879-5883 (1988)). Эти и другие фрагменты антител, применимые в контексте настоящего изобретения, дополнительно обсуждаются в данном документе. Также следует понимать, что термин антитело, если не указано иное, также включает антителоподобные полипептиды, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела, и фрагменты антител, сохраняющие способность специфически связываться с антигеном (антигенсвязывающие фрагменты), получаемые с помощью любой известной методики, такой как ферментативное расщепление, пептидный синтез и рекомбинантные методики. Полученное антитело может иметь любой изотип. Используемый в данном документе "изотип" относится к классу иммуноглобулинов (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), который кодируется генами константной области тяжелой цепи. Такие фрагменты антител получают с помощью общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники; при этом подходящие фрагменты, способные связываться с требуемым эпитопом, можно без труда подвергнуть скринингу в отношении применимости таким же образом, как и интактное антитело.
[00046] Подразумевается, что антитело GM37, 37 или GM37wt (используемые в данном документе взаимозаменяемо) означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1-3 тяжелой цепи, приведенные под SEQ ID NO:1-3, и CDR1-3 легкой цепи, приведенные под SEQ ID NO:4-6, или состоящие из них.
[00047] Варианты 1, 2 и 3 GM37 отличаются от GM37 отличием(-ями) в последовательности CDR 2 тяжелой цепи, как приведено в CDR2 тяжелой цепи варианта 1 GM37 под SEQ ID NO: 33; CDR2 тяжелой цепи варианта 2 GM37 под SEQ ID NO: 34; CDR2 тяжелой цепи варианта 3 GM37 под SEQ ID NO: 35.
[00048] Подразумевается, что антитело GM285 или IgG-6004-285(используемые в данном документе взаимозаменяемо) означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1-3 тяжелой цепи, приведенные под SEQ ID No 20-22, и CDR1-3 легкой цепи, приведенные под SEQ ID No 23-25, или состоящие из них.
[00049] Подразумевается, что антитело GM63 или 63 (используемые в данном документе взаимозаменяемо) означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1-3 тяжелой цепи, приведенные под SEQ ID No 51-53, и CDR1-3 легкой цепи, приведенные под SEQ ID No
54-56, или состоящие из них.
[00050] Подразумевается, что антитело 9E4 означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1-3 тяжелой цепи, приведенные под SEQ ID No 44-46, и CDR1-3 легкой цепи, приведенные под SEQ ID No 47-49, или состоящие из них.
[00051] Подразумевается, что антитело 2E6 или m2E6 означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR1-3 тяжелой цепи, приведенные под SEQ ID No 62-64, и CDR1-3 легкой цепи, приведенные под SEQ ID No 65-67, или состоящие из них.
[00052] Варианты 2E6, ch2E6, 2E6-HLD1, 2 или 3 имеют различия в своих тяжелой цепи и легкой цепи за пределами областей CDR относительно 2E6.
[00053] ch2E6 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 70 или состоит из нее, и
содержит легкую цепь под SEQ ID NO: 71 или состоит из нее
[00054] 2E6-HLD-1 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 72 или состоит из нее, и
содержит легкую цепь под SEQ ID NO: 73 или состоит из нее
[00055] 2E6-HLD-2 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 74 или состоит из нее, и
содержит легкую цепь под SEQ ID NO: 75 или состоит из нее
[00056] 2E6-HLD-2 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 76 или состоит из нее, и содержит легкую цепь под SEQ ID NO: 77 или состоит из нее.
[00057] Формы HLD1 с созревшей аффинностью, 7A10, 5A1, 9D7, 9G11, 7C4, L3, 8D9, 9C12 или 6B6, имеют отличия в своих областях CDR, как определено в перечне последовательностей и формуле изобретения, относительно 2E6.
[00058] Подразумевается, что антитело "'6B6" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 120 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 121.
[00059] Подразумевается, что антитело "5A1" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 104 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 105.
[00060] Подразумевается, что антитело "9D7" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 106 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 107.
[00061] Подразумевается, что антитело "9G11" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 108 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 109.
[00062] Подразумевается, что антитело "L3" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 112 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 113.
[00063] Подразумевается, что антитело "7A10" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 114 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 115.
[00064] Подразумевается, что антитело "8D9" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 116 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 117.
[00065] Подразумевается, что антитело "9C12" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 118 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 119.
[00066] Подразумевается, что антитело "7C4" означает антитело, состоящее из легкой цепи под SEQ ID NO 110 и тяжелой цепи под SEQ ID NO 111.
[00067] Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в данной области соответствует IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991).
[00068] Вышеупомянутые антитела можно применять в лечении пациентов с болезнью Альцгеймера или пациентов с таупатией, такой как болезнь аргирофильных зерен (AGD), психоз, в частности, психоз, обусловленный AD, или психоз у пациентов с AD, психиатрические симптомы у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), лобно-височная деменция (FTD или ее варианты), TBI (травматическое повреждение головного мозга, острая или хроническая форма), кортикобазальная дегенерация (CBD), болезнь Пика, первичная возрастная таупатия (PART), сенильная деменция с преобладанием нейрофибриллярных клубков, деменция боксеров, хроническая травматическая энцефалопатия, инсульт, восстановление после инсульта, нейродегенерация, связанная с болезнью Паркинсона, паркинсонизм, сцепленный с хромосомой, болезнь Литико-Бодига (гуамский комплекс болезнь Паркинсона-деменция), ганглиоглиома и ганглиоцитома, менингиоангиоматоз, постэнцефалитический паркинсонизм, подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Хантингтона, свинцовая энцефалопатия, туберозный склероз, болезнь Галлервордена-Шпатца и липофусциноз. В более типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD) и болезни Пика.
[00069] Антитело "к альфа-синуклеину" представляет собой антитело, которое специфически связывается с альфа-синуклеином или фрагментом альфа-синуклеина.
[00070] Подразумевается, что используемый в данном документе термин "человеческое антитело" включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные за счет случайного или сайтспецифического мутагенеза in vitro, или во время перестройки гена, или за счет соматической мутации in vivo).
[00071] Используемые в данном документе термины "моноклональное антитело" или "композиция на основе моноклонального антитела" относятся к препарату из молекул антител с единым молекулярным составом. Композиция на основе моноклонального антитела проявляет одну специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа.
et al.
Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response
et al.
et al.
Reshaping Human Antibodies for Therapy
et al.
Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity
et al.
Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation
et al.
Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity
et al.
Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody
et al.
Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo
et al.
Humanized Antibodies For Antiviral Therapy
et al.
Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy
et al.
Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen
[00072] Антитела по настоящему изобретению и их фрагменты, связывающие эпитоп альфа-синуклеина, предпочтительно являются "гуманизированными," в частности, если используются для терапевтических целей. Термин "гуманизированный" относится к химерной молекуле, обычно полученной с применением рекомбинантных методик, которая имеет антигенсвязывающий сайт, происходящий из иммуноглобулина вида, отличного от человека, и остальную часть структуры иммуноглобулина, в основе которой лежит структура и/или последовательность иммуноглобулина человека. Антигенсвязывающий сайт может содержать либо полные вариабельные домены антитела, отличного от человеческого, слитые с человеческими константными доменами, либо только определяющие комплементарность области (CDR) таких вариабельных доменов, привитые на соответствующие человеческие каркасные области человеческих вариабельных доменов. Остатки, составляющие каркасные области таких гуманизированных молекул, могут быть дикого типа (например, полностью человеческими), или они могут быть модифицированы, вследствие чего содержат одну или несколько аминокислотных замен, которые не встречаются в человеческом антителе, последовательность которого послужила основой для гуманизации. Гуманизация уменьшает или устраняет вероятность того, что константная область молекулы будет действовать как иммуноген для человека, однако возможность выработки иммунного ответа на чужеродную вариабельную область сохраняется (LoBuglio, A.F. (1989) "," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Другой подход концентрируется не только на получении константных областей человеческого происхождения, но также и на модификации вариабельных областей для того, чтобы придать им форму как можно более близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей содержат три определяющие комплементарность области (CDR), которые отличаются по ответу на рассматриваемые антигены и определяют способность к связыванию, фланкированные четырьмя каркасными областями (FR), которые являются относительно консервативными у данного вида и которые предположительно обеспечивают остов для CDR. Если для связывания конкретного антитела получены отличные от человеческих антитела, вариабельные области можно "переформатировать" или "гуманизировать" путем прививания CDR, происходящих из отличного от человеческого антитела на FR, присутствующие в человеческом антителе, подлежащем модификации. О применении такого подхода к различным антителам сообщалось в Sato, K. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. (1988) "," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. (1988) "," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. (1991) "," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. (1991) "," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. (1991) "," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. (1991) "," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. (1991) "," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. (1992) "," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. (1992) "," J. Immunol. 148:1149-1154. Согласно некоторым вариантам осуществления гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). Согласно другим вариантах осуществления гуманизированные антитела содержат одну или несколько CDR (одну, две, три, четыре, пять, шесть), которые изменены по сравнению с таковыми исходного антитела, при этом их также называют одной или несколькими CDR, "происходящими из" одной или нескольких CDR из исходного антитела. Возможность гуманизации антигена хорошо известна (см., например, патенты США №№ 5225539, 5530101, 5585089, 5859205, 6407213, 6881557).
-7
-8
-9
[00073] Считается, что используемые в данном документе антитело или его эпитопсвязывающий антигенсвязывающий фрагмент "иммуноспецифически" связывают область другой молекулы (т. е. эпитоп), если они реагируют или ассоциируют с данным эпитопом более часто, более быстро, с большей длительностью и/или с большей аффинностью или авидностью по сравнению с альтернативными эпитопами. Также при прочтении этого определения следует понимать, что, например, антитело или его эпитопсвязывающий антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с первой мишенью, могут специфически или преимущественно связываться со второй мишенью или могут не делать этого. Используемый в данном документе термин "связывание" в контексте связывания антитела с предварительно заданным антигеном, как правило, относится к связыванию с аффинностью, соответствующей KD, составляющей приблизительно 10 M или меньше, как, например, приблизительно 10 M или меньше, как, например, приблизительно 10 M или меньше, при определении с помощью, например, технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore 3000 с применением антигена в качестве лиганда и антитела в качестве аналита, и к связыванию с предварительно заданным антигеном с аффинностью, соответствующей KD, которая в по меньшей мере десять раз ниже, как, например, в по меньшей мере 100 раз ниже, например, в по меньшей мере 1000 раз ниже, как, например, в по меньшей мере 10000 раз ниже, например, в по меньшей мере 100000 раз ниже, чем его аффинность при связывании с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), отличным от предварительно заданного антигена или близкородственного антигена. Степень, в которой аффинность является более низкой, зависит от KD антитела, вследствие чего, если KD антитела является очень низкой (то есть антитело является высокоспецифическим), то степень, в которой аффинность к антигену является более низкой, чем аффинность к неспецифическому антигену, может быть по меньшей мере 10000-кратной.
[00074] Используемый в данном документе термин "kd" (с-1 или 1/с) относится к константе скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена. Указанное значение также обозначают как значение koff.
[00075] Используемый в данном документе термин "ka" (М-1 x с-1 или 1/М) относится к константе скорости ассоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена.
[00076] Используемый в данном документе термин "KD" (M) относится к равновесной константе диссоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена.
[00077] Используемый в данном документе термин "KA" (M-1 или 1/M) относится к равновесной константе ассоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена, и ее получают путем деления ka на kd.
et al
et al
Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins
et al
SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity
[00078] В некоторых антителах для сохранения связывания гуманизированного антитела необходима только часть CDR, а именно подмножество остатков CDR, требуемых для связывания, которые называются SDR. Остатки CDR, не контактирующие с антигеном и не относящиеся к SDR, можно идентифицировать на основании предыдущих исследований (например, зачастую не являются необходимыми остатки H60-H65 в CDR H2) в областях CDR по Kabat, лежащих за пределами гипервариабельных петель по Chothia (см. Kabat . (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, National Institutes of Health Publication No. 91-3242; Chothia, C. . (1987) "", J. Mol. Biol. 196:901-917), с помощью молекулярного моделирования и/или эмпирическим путем, или как описано в Gonzales, N.R. . (2004) "," Mol. Immunol. 41:863-872. В таких гуманизированных антителах в положениях, в которых отсутствуют один или несколько остатков донорной CDR или в которые не включена вся донорная CR, аминокислота, занимающая такое положение, может представлять собой аминокислоту, занимающую соответствующее положение (согласно нумерации по Kabat) в последовательности акцепторного антитела. Число таких замен акцепторных аминокислот на донорные в CDR, подлежащих включению, отражает оптимальное соотношения разнонаправленных факторов. Такие замены потенциально являются преимущественными для снижения числа мышиных аминокислот в гуманизированном антителе и, следовательно, снижения потенциальной иммуногенности. Однако замены также могут вызывать изменения аффинности, и предпочтительно избегать значимого снижения аффинности. Положения для замены в пределах CDR и подлежащие замене аминокислоты также можно выбрать эмпирическим путем.
etc
Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity
Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?
et al
Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes
Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective
[00079] Тот факт, что изменение одной аминокислоты в остатке CDR может привести к утрате функционального связывания (Rudikoff, S. . (1982) "", Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 79(6):1979-1983), обеспечивает средства для систематической идентификации альтернативных функциональных последовательностей CDR. Согласно одному предпочтительному способу получения таких вариантов CDR полинуклеотид, кодирующий CDR, подвергают мутагенезу (например, посредством случайного мутагенеза или с помощью сайт-направленного способа (например, с амплификацией, опосредованной полимеразной цепной реакцией, с праймерами, которые кодируют мутантный локус)) с получением CDR, имеющего аминокислотный остаток-замену. Путем сравнения соответствующего остатка в исходной (функциональной) последовательности CDR с остатком в замещенной (нефункциональной) вариантной последовательности CDR для этой замены можно определить вес замены согласно BLOSUM62.iij. В системе BLOSUM предусмотрена матрица аминокислотных замен, созданная путем анализа базы данных последовательностей с надежными выравниваниями (Eddy, S.R. (2004) "," Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks", Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 89:10915-10919; Karlin, S. . (1990) "", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "", J. Mol. Biol. 219, 555-565. В настоящее время наиболее совершенной базой данных BLOSUM является база данных BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). В таблице 1 представлены значения веса замен согласно BLOSUM62.iij (чем больше вес, тем более консервативной является замена и, следовательно, более вероятно, что замена не будет влиять на функцию). Если, например, антигенсвязывающий фрагмент, содержащий полученную в результате CDR, не может связываться с ROR1, то полагают, что вес замены согласно BLOSUM62.iij свидетельствует о ее недостаточной консервативности, и выбирают и производят новую кандидатную замену, имеющую больший вес замены. Так, например, если исходный остаток представлял собой глутамат (E), а нефункциональный заменяющий остаток представлял собой гистидин (H), то вес замены согласно BLOSUM62.iij будет равен 0, и предпочтительными являются более консервативные изменения (например, аспартат, аспарагин, глутамин или лизин).
[00080] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрено применение случайного мутагенеза для идентификации улучшенных CDR. В контексте настоящего изобретения консервативные замены могут быть определены как замены в пределах классов аминокислот, охарактеризованных в одной или нескольких из следующих трех таблиц.
Классы аминокислотных остатков для консервативных замен
Альтернативные классы аминокислотных остатков для консервативных замен
Альтернативные физические и функциональные классификации аминокислотных остатков
[00081] Группы более консервативных замен включают валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.
[00082] Дополнительные группы аминокислот также могут быть составлены с применением принципов, описанных, например, в Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W. H. Freeman and Company.
et al
et al
et al
et al
[00083] В качестве альтернативы можно применять технологию фагового дисплея для повышения (или снижения) аффинности CDR. В этой технологии, обозначаемой как созревание аффинности, используется мутагенез или "прогулка по CDR" и повторный отбор с применением антигенамишени или его антигенного антигенсвязывающего фрагмента для идентификации антител с CDR, которые связываются с более высокой (или более низкой) аффинностью с антигеном по сравнению с первоначальным или исходным антителом (см., например, Glaser . (1992) J. Immunology 149:3903). Мутагенез кодонов полностью, а не отдельных нуклеотидов, приводит к полуслучайному набору аминокислотных мутаций. Можно конструировать библиотеки, состоящие из пула вариантных клонов, каждый из которых отличается изменением одной аминокислоты в одной CDR и который содержит варианты, представляющие каждую возможную аминокислотную замену для каждого остатка CDR. Мутантов с повышенной (или пониженной) аффинностью связывания с антигеном можно подвергнуть скринингу путем приведения иммобилизованных мутантов в контакт с меченым антигеном. Для идентификации мутантных антител с повышенной или пониженной аффинностью к антигену можно применять любой известный из уровня техники способ скрининга (например, ELISA) (см. Wu . 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton ., 1995, J. Immunology 155:1994). Возможно применение методики "прогулки по CDR", с помощью которой рандомизируют легкую цепь (см. Schier ., 1996, J. Mol. Bio. 263:551).
et al
An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody
et al
Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas
et al
Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes
et al
Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41
et al
Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic
Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth
et al
Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions
et al
Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development
et al
In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification
et al
Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling
[00084] Способы осуществления такого созревания аффинности описаны, например, в Krause, J.C. . (2011) "", MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. . (2010) "", Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. . (2010) "", J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. . (2009) "", MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. . (2009) "", Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. . (2009) "", J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. . (2009) "", Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. . (2008) "", Mol. Immunol. 46(1):135-144; и Barderas, R. . (2008) "", Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 105(26):9029-9034.
[00085] Таким образом, последовательность вариантов CDR у охватываемых антител или их эпитопсвязывающих фрагментов может отличаться от последовательности CDR у исходного антитела вследствие замен; например, заменам 4 аминокислотных остатков, 3 аминокислотных остатков, 2 аминокислотных остатков или 1 аминокислотного остатка. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения дополнительно предусматривается то, что аминокислоты в областях CDR можно заменять посредством консервативных замен, определенных в 3 таблицах ниже. Например, кислотный остаток Asp можно заменить на Glu без существенного воздействия на характеристики связывания антитела.
[00086] Термин "эпитоп" означает антигенную детерминанту, способную иммуноспецифически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические характеристики трехмерных структур, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, в отличие от последнего, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые не принимают непосредственного участия в связывании, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются пептидом, специфически связывающимся с антигеном (другими словами, аминокислотный остаток находится в пределах области узнавания пептида, специфически связывающегося с эпитопом).
[00087] Термин "трансгенное животное, отличное от человека" относится к животному, отличному от человека, имеющему геном, содержащий один или несколько трансгенов или трансхромосом, кодирующих тяжелую и/или легкую цепь человека (интегрированные или не интегрированные в природную геномную ДНК животного), и которое способно экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген, кодирующий легкую цепь человека, и либо трансген, кодирующий тяжелую цепь человека, либо трансхромосому, кодирующую тяжелую цепь человека, вследствие чего у мыши вырабатывается человеческое антитело к альфа-синуклеину при иммунизации антигеном, представляющим собой альфа-синуклеин, и/или клетками, экспрессирующими альфа-синуклеин. Трансген, кодирующий тяжелую цепь человека, может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных мышей, например мышей HuMAb, таких как мыши HCo7 или HCo12, или трансген, кодирующий тяжелую цепь человека, может сохраняться внехромосомно, как в случае трансхромосомных мышей KM, описанных в WO02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (в совокупности называемые в данном документе "трансгенными мышами") способны к выработке нескольких изотипов человеческих моноклональных антител к указанному антигену (таких как IgG, IgA, IgM, IgD и/или IgE) за счет прохождения V-D-J-рекомбинации и переключения изотипа.
[00088] Трансгенное животное, отличное от человека, также можно использовать для выработки антител к специфическому антигену путем введения генов, кодирующих такое специфическое антитело, например, за счет образования функциональной связи генов с геном, экспрессируемым в молоке животного.
[00089] Используемый в данном документе термин "лечение" или "осуществление лечения" означает облегчение, замедление или обращение прогрессирования или тяжести заболевания или нарушения или облегчение, замедление или обращение одного или нескольких симптомов или побочных эффектов такого заболевания или нарушения. Кроме того, для целей настоящего изобретения "лечение" или "осуществление лечения" означает подход для получения благоприятных или требуемых клинических результатов, где "благоприятные или требуемые клинические результаты" включают без ограничения облегчение симптома, снижение степени нарушения или заболевания, стабилизацию (т. e. отсутствие ухудшения) стадии заболевания или нарушения, задержку или замедление прогрессирования стадии заболевания или нарушения, облегчение или смягчение стадии заболевания или нарушения и ремиссию заболевания или нарушения, будь то частично или полностью, поддающихся выявлению или не поддающихся выявлению.
[00090] "Эффективное количество", если оно применяется в отношении антитела по настоящему изобретению, относится к количеству, которое при введении в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени является достаточным для достижения намеченного биологического эффекта или требуемого терапевтического результата, в том числе без ограничения клинических результатов. Подразумевается, что фраза "терапевтически эффективное количество", если она применяется в отношении антитела по настоящему изобретению, обозначает количество антитела, которое является достаточным для облегчения, смягчения, стабилизации, обращения, замедления или задержки прогрессирования стадии нарушения или заболевания или симптома расстройства или заболевания. Согласно варианту осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает введение антитела в комбинациях с другими соединениями. В таких случаях "эффективное количество" представляет собой количество комбинации, достаточное для того, чтобы вызывать намеченный биологический эффект.
[00091] Терапевтически эффективное количество антитела к альфа-синуклеину может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способности антитела к альфа-синуклеину вызывать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты превосходят любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела.
[00092] Как указано выше, настоящее изобретение, в частности, относится к моноклональному антителу, способному иммуноспецифически связываться с эпитопом в пределах аминокислот 110-140 альфа-синуклеина человека. Согласно одному варианту осуществления антитело способно конкурировать с антителом GM37 за связывание с эпитопом 112-117 альфа-синуклеина. Согласно другому варианту осуществления антитело способно конкурировать с антителом GM285 за связывание с эпитопом 112-115 альфа-синуклеина. Согласно другому варианту осуществления антитело способно конкурировать с антителом GM63 за связывание с эпитопом 126-138 альфа-синуклеина. Согласно другому варианту осуществления антитело способно конкурировать с антителом 2E6 за связывание с эпитопом 126-140 альфа-синуклеина. Согласно еще одному варианту осуществления антитело способно конкурировать с антителом 9E4 за связывание с эпитопом 118-126 альфа-синуклеина.
[00093] Антитело предпочтительно представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.
[00094] Антитела по настоящему изобретению дополнительно определены в формуле изобретения.
[00095] В настоящем изобретении также предусмотрен способ снижения образования клубков тау-белка у пациента, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела по настоящему изобретению.
[00096] Кроме того, антитела могут находиться в композиции вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или стабилизатором. Антитела по настоящему изобретению можно применять в терапии. В частности, антитела по настоящему изобретению можно применять в лечении таупатии. В типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD), болезни Пика, первичной возрастной таупатии (PART), сенильной деменции с преобладанием нейрофибриллярных клубков, деменции боксеров, хронической травматической энцефалопатии, инсульта, восстановления после инсульта, нейродегенерации, связанной с болезнью Паркинсона, паркинсонизма, сцепленного с хромосомой, болезни Литико-Бодига (гуамского комплекса болезнь Паркинсона-деменция), ганглиоглиомы и ганглиоцитомы, менингиоангиоматоза, постэнцефалитического паркинсонизма, подострого склерозирующего панэнцефалита, болезни Хантингтона, свинцовой энцефалопатии, туберозного склероза, болезни Галлервордена-Шпатца и липофусциноза. В более типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD) и болезни Пика. В частности, таупатии могут быть выбраны из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD и психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви.
[00097] Лечение может быть длительным, и пациент может получать лечение в течение по меньшей мере 2 недель, например, в течение по меньшей мере 1 месяца, 6 месяцев, 1 года или более.
[00098] Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой, например, моноклональные антитела, получаемые с помощью способа с применением гибридомы, впервые описанного в Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), или могут быть получены способами с применением рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела также можно выделять из фаговых библиотек антител с помощью методик, описанных, например, в Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) и Marks et al., J. MoI. Biol. 222, 581-597 (1991). Моноклональные антитела можно получать из любого подходящего источника. Так, например, моноклональные антитела можно получать из гибридом, полученных из B-лимфоцитов селезенки мыши, полученных от мышей, иммунизированных представляющим интерес антигеном, например, в виде клеток, экспрессирующих антиген на поверхности, или нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес антиген. Моноклональные антитела также можно получать из гибридом, происходящих из клеток, экспрессирующих антитела, от иммунизированных людей или млекопитающих, отличных от человека, таких как крысы, кролики, собаки, овцы, козы, приматы и т. д.
[00099] В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело. Человеческие моноклональные антитела, направленные против альфа-синуклеина, можно получать с применением трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека вместо иммунной системы мыши. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, называемых в данном документе соответственно мышами HuMAb и мышами KM, и в совокупности они называются в данном документе "трансгенными мышами".
[000100] Мышь HuMAb содержит минилокус гена иммуноглобулина человека, который кодирует нереаранжированные последовательности вариабельных и константных доменов тяжелых цепей (μ и Y) и вариабельных и константных доменов легких цепей (K) иммуноглобулина человека, а также имеет целевые мутации, которые инактивируют эндогенные локусы, кодирующие μ- и K-цепи (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Соответственно, у таких мышей проявляется сниженная экспрессия мышиных IgM или IgK, а в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека подвергаются переключению класса и образованию соматических мутаций с образованием высокоаффинных человеческих моноклональных антител IgG, κ (Lonberg, N. et al. (1994), выше; обзор в Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) и Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). Получение мышей HuMAb подробно описано в Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). См. также US 5545806, US 5569825, US 5625126, US 5633425, US 5789650, US 5877397, US 5661016, US 5814318, US 5874299, US 5770429, US 5545807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 и WO 01/09187.
[000101] Мыши HCo7 характеризуются разрушением JKD в их эндогенных генах легкой (каппа) цепи (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), разрушением CMD в их эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере 1 из WO 01/14424), несут трансген легкой каппа-цепи человека KCo5 (как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) и трансген тяжелой цепи человека HCo7 (как описано в US 5770429).
[000102] Мыши HCo12 характеризуются разрушением JKD в их эндогенных генах легкой (каппа) цепи (как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), разрушением CMD в их эндогенных генах тяжелой цепи (как описано в примере 1 из WO 01/14424), несут трансген легкой каппа-цепи человека KCo5 (как описано в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) и трансген тяжелой цепи человека HCo12 (как описано в примере 2 из US 01/14424).
[000103] У мышей линии KM эндогенный ген легкой каппа-цепи мыши был подвергнут гомозиготному разрушению, как описано в Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993), а эндогенный ген тяжелой цепи мыши был подвергнут гомозиготному разрушению, как описано в примере 1 из WO 01/09187. Эта линия мышей несет трансген легкой каппа-цепи человека KCo5, описанный в Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Эта линия мышей также несет трансхромосому тяжелой цепи человека, состоящую из фрагмента hCF (SC20) хромосомы 14, как описано в WO 02/43478.
[000104] Спленоциты от этих трансгенных мышей можно применять для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела, в соответствии с хорошо известными методиками. Человеческие моноклональные антитела по настоящему изобретению или антитела по настоящему изобретению, происходящие от других видов, также можно получать трансгенным путем посредством получения другого млекопитающего, отличного от человека, или растения, являющихся трансгенными по представляющим интерес последовательностям тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, и получения из них антитела в извлекаемой форме. Что касается получения антител млекопитающих трансгенным путем, антитела могут быть получены в молоке коз, коров или других млекопитающих и извлечены из него. См., например, US 5827690, US 5756687, US 5750172 и US 5741957.
[000105] Антитело по настоящему изобретению может относиться к любому изотипу. Выбор изотипа обычно будет определяться требуемыми эффекторными функциями, такими как индукция ADCC. Иллюстративными изотипами являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Можно использовать константные области легких цепей человека одного из двух типов, каппа- или лямбда-цепей. При необходимости, класс антитела к альфа-синуклеину по настоящему изобретению можно переключить с помощью известных способов. Например, антитело по настоящему изобретению, которое изначально представляло собой IgM, можно подвергнуть переключению класса с получением антитела IgG по настоящему изобретению. Кроме того, методики переключения класса можно применять для превращения одного подкласса IgG в другой, например из IgGI в IgG2. Таким образом, эффекторную функцию антител по настоящему изобретению можно изменить путем переключения изотипа, например, с получением антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различных путей терапевтического применения. Согласно одному варианту осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело IgG1, например IgG1, κ.
[000106] Согласно одному варианту осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело, предпочтительно антитело IgG, в частности, антитело IgG1, κ. Согласно другому варианту осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела или одноцепочечное антитело.
[000107] Фрагменты антитела можно получать, например, путем фрагментации с применением общепринятых методик, и подвергать фрагменты скринингу на применимость таким же образом, как описано в данном документе для полных антител. Например, F(ab')2-фрагменты можно получать путем обработки антитела пепсином. Полученный в результате F(ab')2-фрагмент можно обработать для восстановления дисульфидных мостиков с получением Fab'-фрагментов. Fab-фрагменты можно получать путем обработки антитела IgG папаином; Fab'-фрагменты можно получать путем расщепления антитела IgG пепсином. F(ab')-фрагмент также можно получать путем связывания описанного ниже Fab'-фрагмента с помощью тиоэфирной связи или дисульфидной связи. Fab'-фрагмент представляет собой фрагмент антитела, полученный путем разрезания дисульфидной связи в шарнирном домене F(ab')2. Fab'-фрагмент можно получать путем обработки F(ab')2-фрагмента восстановителем, таким как дитиотреитол. Фрагмент антитела можно также получать посредством экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих такие фрагменты, в рекомбинантных клетках (см., например, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Например, химерный ген, кодирующий часть F(ab')2-фрагмента, может включать последовательности ДНК, кодирующие CH1-домен и шарнирный домен H-цепи, за которыми расположен стоп-кодон трансляции, чтобы получать такую молекулу, представляющую собой усеченный фрагмент антитела.
[000108] Согласно одному варианту осуществления антитело к альфа-синуклеину представляет собой одновалентное антитело, предпочтительно одновалентное антитело, как описано в WO2007059782 (который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), с делецией в шарнирной области. Соответственно, согласно одному варианту осуществления антитело представляет собой одновалентное антитело, где указанное антитело к альфа-синуклеину сконструировано с помощью способа, предусматривающего: i) обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь указанного одновалентного антитела, при этом указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL выбранного антигенспецифического антитела к альфа-синуклеину, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область CL из Ig, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VL выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область CL из Ig, функционально связаны друг с другом, и где в случае подтипа IgG1 нуклеотидная последовательность, кодирующая область CL, была модифицирована таким образом, чтобы область CL не содержала каких-либо аминокислот, способных формировать дисульфидные связи или ковалентные связи с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность области CL, в присутствии поликлонального IgG человека или при введении животному или человеку; ii) обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь указанного одновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область CH Ig человека, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH, была модифицирована таким образом, чтобы область, соответствующая шарнирной области и, если того требует подтип Ig, другие области области CH, такие как область CH3, не содержали каких-либо аминокислотных остатков, которые участвуют в формировании дисульфидных связей или ковалентных или стабильных нековалентных связей между тяжелыми цепями с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность области CH из Ig человека, в присутствии поликлонального IgG человека или при введении животному человеку, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VH выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH указанного Ig, функционально связаны друг с другом; iii) обеспечение клеточной системы экспрессии для получения указанного одновалентного антитела; iv) получение указанного одновалентного антитела путем совместной экспрессии конструкций нуклеиновой кислоты из (i) и (ii) в клетках клеточной системы экспрессии из (iii).
[000109] Аналогично, согласно одному варианту осуществления антитело к альфа-синуклеину представляет собой одновалентное антитело, которое содержит:
(i) вариабельную область антитела по настоящему изобретению, описанного в данном документе, или антигенсвязывающую часть указанной области, и
(Ii) область CH иммуноглобулина или ее антигенсвязывающий фрагмент, содержащие области CH2 и CH3, где область CH или ее антигенсвязывающий фрагмент модифицированы таким образом, чтобы область, соответствующая шарнирной области и, если иммуноглобулин не относится к подтипу IgG4, другие области области CH, такие как область CH3, не содержали каких-либо аминокислотных остатков, способных формировать дисульфидные связи с идентичной областью CH или другие ковалентные или стабильные нековалентные связи между тяжелыми цепями с идентичной областью CH в присутствии поликлонального IgG человека.
[000110] В дополнительном варианте осуществления тяжелая цепь одновалентного антитела к альфа-синуклеину была модифицирована таким образом, чтобы подвергнуть делеции всю шарнирную область.
[000111] В другом дополнительном варианте осуществления последовательность указанного одновалентного антитела была модифицирована таким образом, чтобы она не содержала каких-либо акцепторных сайтов для N-связанного гликозилирования.
[000112] Антитела к альфа-синуклеину по настоящему изобретению также включают одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела представляют собой пептиды, в которых области Fv тяжелой и легкой цепи соединены. Согласно одному варианту осуществления в настоящем изобретении предусмотрен одноцепочечный Fv (scFv)-фрагмент, причем в Fv-фрагменте тяжелые и легкие цепи антитела к альфа-синуклеину по настоящему изобретению соединены с помощью гибкого пептидного линкера (как правило, состоящего из приблизительно 10, 12, 15 или более аминокислотных остатков) в одну пептидную цепь. Способы получения таких антител описаны, например, в US 4946778, Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) и McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если используются только одна VH и VL, двухвалентным, если используются две VH и VL, или поливалентным, если используется более двух VH и VL.
[000113] В целом, антитела к альфа-синуклеину, описанные в данном документе, можно модифицировать путем включения любого подходящего количества модифицированных аминокислот и/или ассоциаций с такими конъюгированными заместителями. В данном контексте подходящее число обычно определяется по способности по меньшей мере в значительной степени сохранять селективность в отношении альфа-синуклеина и/или специфичность в отношении альфа-синуклеина, ассоциированные с недериватизированным исходным антителом к альфа-синуклеину. Включение одной или нескольких модифицированных аминокислот может приносить пользу, например, с точки зрения увеличения периода полужизни полипептида в сыворотке крови, снижения антигенности полипептида или повышения стабильности полипептида при хранении. Аминокислоту(-ы) модифицируют, например, одновременно с трансляцией или посттрансляционно во время получения рекомбинантным путем (например, N-связанное гликозилирование в мотивах N-X-S/T во время экспрессии в клетках млекопитающих) или модифицируют с помощью синтетических способов. Неограничивающие примеры модифицированной аминокислоты включают гликозилированную аминокислоту, сульфатированную аминокислоту, пренилированную (например, фарнезилированную, геранилгеранилированную) аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, ацилированную аминокислоту, пегилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту, карбоксилированную аминокислоту, фосфорилированную аминокислоту и т.д. В литературе представлено множество источников, подходящих в качестве руководства по модификации аминокислот для специалиста. Примеры протоколов находятся в Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ. Модифицированную аминокислоту можно выбрать, например, из гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидным фрагментом, или аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим средством.
[000114] Антитела к альфа-синуклеину также можно модифицировать химическим путем посредством ковалентной конъюгации с полимером, например, для увеличения их периода полужизни в кровотоке. Иллюстративные полимеры и способы присоединения их к пептидам приведены, например, в US 4766106, US 4179337, US 4495285 и US 4609546. Дополнительные иллюстративные полимеры включают полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (PEG) (например, PEG с молекулярной массой от приблизительно 1000 до приблизительно 40000, например, от приблизительно 2000 до приблизительно 20000, например, приблизительно 3000-12000 г/моль).
[000115] В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей:
- антитело к альфа-синуклеину, определенное в данном документе, и
- фармацевтически приемлемый носитель.
[000116] Фармацевтические композиции можно составлять с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с любыми другими известными вспомогательными средствами и наполнителями согласно общепринятым методикам, таким как, например, методики, раскрытые в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2005.
[000117] Фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также любые другие известные вспомогательные средства и наполнители должны быть пригодными для выбранного соединения по настоящему изобретению и выбранного способа введения. Пригодность носителей и других компонентов фармацевтических композиций определяют, исходя из отсутствия значимого отрицательного влияния на требуемые биологические свойства выбранного соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению (например, менее чем значительное влияние (относительное ингибирование на 10% или меньше, относительное ингибирование на 5% или меньше и т. д.) на связывание с антигеном).
[000118] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может содержать разбавители, заполнители, соли, буферы, детергенты (например, неионогенный детергент, такой как Tween-20 или Tween-80), стабилизаторы (например, сахара или свободные протеиногенные аминокислоты), консерванты, фиксаторы для тканей, солюбилизаторы и/или другие материалы, подходящие для включения в фармацевтическую композицию. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнкса. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав также могут содержать другие носители или нетоксичные нетерапевтические неиммуногенные стабилизаторы и т.п. Композиции также могут содержать крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (например, функционализированную латексом сефарозу, агарозу, целлюлозу и т.п.), полимеры аминокислот, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (например, капли масла или липосомы).
[000119] Фактические уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно изменять для того, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения терапевтического ответа, требуемого для конкретного пациента, композиции и способа введения. Выбранный уровень дозы будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, в том числе активности конкретных используемых композиций по настоящему изобретению или их амидов, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза подвергаемого лечению пациента, а также подобных факторов, хорошо известных в области медицины.
[000120] Для профилактического и/или терапевтического лечения фармацевтическую композицию можно вводить любым подходящим путем и способом, в том числе парентеральным, местным, пероральным или интраназальным способом. Согласно одному варианту осуществления фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят парентерально. Используемые в данном документе фразы "парентеральное введение" и "вводимый парентерально" означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно осуществляемые путем инъекции, и они включают эпидермальную, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, внутрисухожильную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, внутричерепную, интраторакальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.
[000121] Дополнительные подходящие in vivo и in vitro пути введения соединения по настоящему изобретению хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны рядовыми специалистами в данной области.
[000122] Согласно одному варианту осуществления эту фармацевтическую композицию вводят посредством внутривенной или подкожной инъекции или инфузии.
[000123] Фармацевтически приемлемые носители включают самые разнообразные подходящие растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, средства для обеспечения изотоничности, антиоксиданты и средства, замедляющие абсорбцию, и т.п., которые являются физиологически совместимыми с соединением по настоящему изобретению.
[000124] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают воду, солевой раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, этанол, декстрозу, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.), а также их пригодные смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло и кунжутное масло, коллоидные растворы карбоксиметилцеллюлозы, трагакантовую камедь и пригодные для инъекций сложные органические эфиры, такие как этилолеат, и/или различные буферы. Другие носители хорошо известны в области фармацевтики.
[000125] Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно из уровня техники. За исключением случаев, когда какие-либо общепринятые среда или средство являются несовместимыми с активным соединением, предполагается их применение в фармацевтических композициях по настоящему изобретению.
[000126] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут содержать фармацевтически приемлемые антиоксиданты, например, (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т. п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т. п.; и (3) металлохелаторы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т. п.
[000127] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут содержать средства для обеспечения изотоничности, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, глицерин, или хлорид натрия, в композициях.
[000128] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут содержать одно или несколько вспомогательных средств, подходящих для выбранного пути введения, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы, диспергирующие вещества, консерванты или буферы, которые могут увеличить срок хранения или эффективность фармацевтической композиции. Соединения по настоящему изобретению можно получать с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, как, например, в виде состава с контролируемым высвобождением, в том числе имплантатов, трансдермальных пластырей и микроинкапсулированных систем доставки. Такие носители могут включать желатин, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена и винилацетата, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочную кислоту отдельно или вместе с воском, или другие материалы, хорошо известные из уровня техники. Способы получения таких составов в целом известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[000129] Согласно одному варианту осуществления соединения по настоящему изобретению можно составлять для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Фармацевтически приемлемые носители для парентерального введения включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно из уровня техники. За исключением случаев, когда какие-либо общепринятые среда или средство являются несовместимыми с активным соединением, предполагается их применение в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.
[000130] Фармацевтические композиции для инъекций, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композицию можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой водный или неводный растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включение в композицию средств для обеспечения изотоничности, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как глицерин, маннит, сорбит, или хлорида натрия. Длительного всасывания инъекционных композиций можно достичь путем включения в композицию средства, замедляющего всасывание, например, моностеаратных солей и желатина. Стерильные инъекционные растворы можно получать путем помещения активного соединения в требуемом количество в соответствующий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, например, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизующей микрофильтрацией. Обычно дисперсии получают путем помещения активного соединения в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, например, из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов примерами способов получения являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), в результате которых получают порошкообразный активный ингредиент с любым дополнительным требуемым ингредиентом из их раствора, предварительно подвергнутого стерилизующей фильтрации.
[000131] Стерильные инъекционные растворы можно получать путем помещения активного соединения в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизующей микрофильтрацией. Обычно дисперсии получают путем помещения активного соединения в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов примерами способов получения являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), в результате которых получают порошкообразный активный ингредиент с любым дополнительным требуемым ингредиентом из их раствора, предварительно подвергнутого стерилизующей фильтрации.
[000132] Схемы приема в вышеуказанных способах лечения и путях применения корректируют для получения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить однократную болюсную дозу, можно вводить несколько разделенных доз в течение некоторого времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, как определяется потребностями терапевтической ситуации. Композиции для парентерального введения можно составлять в виде единичной лекарственной формы для простоты введения и равномерности дозирования. Используемая в данном документе единичная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению; при этом каждая единица содержит предварительно заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Технические требования к единичным лекарственным формам по настоящему изобретению продиктованы (a) уникальными характеристиками активного соединения и конкретным терапевтическим эффектом, которого необходимо достичь, и (b) ограничениями, присущими области составления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов, и непосредственно зависят от них.
[000133] Эффективные дозы и схемы приема антител к альфа-синуклеину зависят от заболевания или состояния, подлежащих лечению, и могут быть определены специалистами в данной области. В любой указанный день, когда назначена доза, доза может варьироваться в диапазоне от приблизительно 0,0001 до приблизительно 100 мг/кг и чаще от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг/кг массы тела реципиента. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или варьироваться в диапазоне 1-10 мг/кг массы тела. Таким образом, иллюстративные дозы включают от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг/массы тела, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мг/кг/массы тела, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг/кг/массы тела, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мг/кг/массы тела, например, приблизительно 0,15 мг/кг/массы тела, приблизительно 0,2 мг/кг/массы тела, приблизительно 0,5 мг/кг/массы тела, приблизительно 1 мг/кг/массы тела, приблизительно 1,5 мг/кг/массы тела, приблизительно 2 мг/кг/массы тела, приблизительно 5 мг/кг/массы тела или приблизительно 10 мг/кг/массы тела.
[000134] Врач или ветеринар стандартной квалификации в данной области легко может определить и назначить эффективное количество необходимой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз антитела к альфа-синуклеину, используемого в фармацевтической композиции, уровни которых являются более низкими, чем необходимы для достижения требуемого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу до достижения требуемого эффекта. В целом, подходящей суточной дозой композиции по настоящему изобретению будет такое количество соединения, которое является наиболее низкой дозой, эффективной для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза обычно будет зависеть от факторов, описанных выше. Введение может быть, например, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным, и, например, введение можно осуществлять в непосредственной близости от местоположения мишени. При необходимости эффективную суточную дозу фармацевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более частей дозы, вводимых по отдельности с соответствующими интервалами в течение дня, необязательно в виде единичных лекарственных форм. Хотя соединение по настоящему изобретению можно вводить отдельно, предпочтительно вводить соединение в виде фармацевтической композиции, описанной выше.
Перечень последовательностей
Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения
1. Моноклональное антитело, связывающее альфа-синуклеин, или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в ингибировании агрегации тау-белка.
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 1, где антитело связывает агрегированные растворимые формы альфа-синуклеина.
in vivo
in vitro
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1 или 2, где ингибирование агрегации тау-белка происходит или .
4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело к альфа-синуклеину вводится пациенту с болезнью Альцгеймера.
5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, где у пациента отсутствует вариант болезни Альцгеймера с тельцами Леви или комбинированная болезнь Паркинсона и Альцгеймера.
6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-3, где указанное антитело к альфа-синуклеину вводят пациенту с таупатией, выбранной из группы, включающей болезнь аргирофильных зерен (AGD), психоз, в частности, психоз, обусловленный AD, или психоз у пациентов с AD, психиатрические симптомы у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), лобно-височную деменцию (FTD или ее варианты), TBI (травматическое повреждение головного мозга, острую или хроническую форму), кортикобазальную дегенерацию (CBD), болезнь Пика, первичную возрастную таупатию (PART), сенильную деменцию с преобладанием нейрофибриллярных клубков, деменцию боксеров, хроническую травматическую энцефалопатию, инсульт, восстановление после инсульта, нейродегенерацию, связанную с болезнью Паркинсона, паркинсонизм, сцепленный с хромосомой, болезнь Литико-Бодига (гуамский комплекс болезнь Паркинсона-деменция), ганглиоглиому и ганглиоцитому, менингиоангиоматоз, постэнцефалитический паркинсонизм, подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Хантингтона, свинцовую энцефалопатию, туберозный склероз, болезнь Галлервордена-Шпатца и липофусциноз. В более типичном случае таупатия выбрана из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни аргирофильных зерен (AGD), психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, психиатрических симптомов у пациентов с деменцией с тельцами Леви, прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), лобно-височной деменции (FTD или ее вариантов), TBI (травматического повреждения головного мозга, острой или хронической формы), кортикобазальной дегенерации (CBD) и болезни Пика.
7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело к альфа-синуклеину связывается с C-концевой частью альфа-синуклеина.
8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 7, где антитело связывается с эпитопом в пределах C-концевых аминокислот 110-140 альфа-синуклеина человека.
9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 7 или 8, где указанный эпитоп находится в пределах аминокислот 112-117, 112-115, 118-126, 126-138 или 136-140 альфа-синуклеина человека (SEQ ID NO 10).
10. Моноклональное антитело по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело связывает эпитоп в пределах аминокислот 112-117 (SEQ ID NO:9 (ILEDMP)) альфа-синуклеина человека (SEQ ID NO:10), или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает указанный эпитоп.
11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело способно конкурировать с антителом, содержащим вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:8 и вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:7, 30, 31 или 32, за связывание с указанным эпитопом.
12. Моноклональное антитело по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело способно к специфическому связыванию с эпитопом в пределах аминокислот 112-115 (SEQ ID NO:19 (ILED) альфа-синуклеина человека (SEQ ID NO:10)), или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает указанный эпитоп.
13. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело способно конкурировать с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:26 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:27, за связывание с указанным эпитопом
14. Моноклональное антитело по пункту 9, где указанное антитело связывает эпитоп в пределах аминокислот 118-126 (такой как SEQ ID NO:36 (NEAYE)) альфа-синуклеина человека (SEQ ID NO:10), или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает указанный эпитоп.
15. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 9, где указанное антитело способно конкурировать с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:42 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:43, за связывание с указанным эпитопом.
16. Моноклональное антитело по пункту 9, где указанное антитело связывает эпитоп в пределах аминокислот 126-138 (SEQ ID NO:50 (EMPSEEGYQD) альфа-синуклеина человека (SEQ ID NO:10), или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает указанный эпитоп.
17. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 9, где указанное антитело способно конкурировать с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:57 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:58, за связывание с указанным эпитопом.
18. Моноклональное антитело по пункту 9, где указанное антитело связывает эпитоп в пределах аминокислот 126-140 (SEQ ID NO:61 (EMPSEEGYQDYEPEA) альфа-синуклеина человека (SEQ ID NO:10), или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает указанный эпитоп.
19. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 18, где указанное антитело способно конкурировать с антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:68 и вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:69, за связывание с указанным эпитопом.
20. Моноклональное антитело по любому из предыдущих пунктов, содержащее интактное антитело или состоящее из него.
21. Моноклональное антитело по любому из предыдущих пунктов, где моноклональное антитело выбрано из группы, состоящей из антител подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
22. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, содержащие антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fv-фрагментов (например, одноцепочечного Fv и связанного дисульфидной связью Fv), Fab-подобных фрагментов (например, Fab-фрагментов, Fab'-фрагментов и F(ab)2-фрагментов) и доменных антител (например, одиночных вариабельных доменов VH или вариабельных доменов VL), или состоящие из него.
23. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент проявляют одно или несколько из следующих свойств:
a) аффинность связывания (KD) с альфа-синуклеином в диапазоне 0,5-10 нМ, например 1-5 нМ или 1-2 нМ;
b) способность подавлять усечение протеазами фибрилл альфа-синуклеина;
c) способность обращать нарушение базальной синаптической передачи у трансгенных мышей F28-snca;
d) способность снижать уровни альфа-синуклеина в гиппокампе мыши, как измерено с помощью микродиализа in vivo;
e) способность при длительном введении восстанавливать двигательную функцию в крысиной модели болезни Паркинсона;
f) способность предотвращать затравочное действие альфа-синуклеина (такое как накопление нерастворимого фосфорилированного альфа-синуклеина in vitro и/или в мышиной модели болезни Паркинсона) и/или
g) способность связывать усеченный альфа-синуклеин в головном мозге человека.
24. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, которые представляют собой человеческое, гуманизированное, рекомбинантное или химерное антитело.
25. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-11, где антитело или его фрагмент содержат:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 2;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:5 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:6.
26. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 25, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:7 или вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:8.
27. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 25, содержащие тяжелую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:7, и легкую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:8.
28. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-11, где антитело или его фрагмент содержат:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:5 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:6.
29. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 28, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:30 или вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:8.
30. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 28, содержащие тяжелую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:30, и легкую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:8.
31. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-11, где антитело или его фрагмент содержат:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 34;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:5 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:6.
32. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 31, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:31 или вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:8.
33. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 31, содержащие тяжелую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:31 и вариабельного домена под SEQ ID NO:8.
34. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-11, где антитело или его фрагмент содержат:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 35;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:5 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:6.
35. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 34, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:32 или вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:8.
36. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 34, содержащие тяжелую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:32 и вариабельного домена под SEQ ID NO:8.
37. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пунктов 1-13, где антитело или его фрагмент содержат:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:20;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 21;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:22;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:23;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:24 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:25.
38. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 37, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи под SEQ ID NO:26 или вариабельный домен легкой цепи под SEQ ID NO:27.
39. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 37, содержащие тяжелую цепь, состоящую из вариабельного домена под SEQ ID NO:26 и вариабельного домена под SEQ ID NO:27.
40. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 16-17, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:51;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 52;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:53;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56.
41. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 40, содержащие вариабельную область тяжелой цепи под SEQ ID NO:57 или вариабельную область легкой цепи под SEQ ID NO:58.
42. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 40, содержащие вариабельную область тяжелой цепи под SEQ ID NO:57 и вариабельную область легкой цепи под SEQ ID NO:58.
43. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 14-15, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
(a) CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:44;
(b) CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 45;
(c) CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:46;
(d) CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:47;
(e) CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:48 и
(f) CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:49.
44. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 43, содержащие вариабельную область тяжелой цепи под SEQ ID NO:42 или вариабельную область легкой цепи под SEQ ID NO:43.
45. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 43, содержащие вариабельную область тяжелой цепи под SEQ ID NO:42 и вариабельную область легкой цепи под SEQ ID NO:43.
46. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 94 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
47. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 46, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 94, 66 и 67.
48. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 46 или 47, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 97 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 64 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
49. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 48, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 97, 63 и 64.
50. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 46 или 47, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:110 или состоящую из нее.
51. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 48 или 49, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:111 или состоящую из нее.
52. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 50 и 51, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:110 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:111 или состоящую из нее.
53. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 95 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
54. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 53, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 95, 66 и 67.
55. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по предыдущим пунктам 53 или 54, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие CDR:
SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 103 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
56. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 55, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 62, 63 и 103.
57. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 53 или 54, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:114 или состоящую из нее.
58. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 55 или 56, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:115 или состоящую из нее.
59. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 57 и 58, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:114 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:115 или состоящую из нее.
60. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 53 или 54, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:116 или состоящую из нее.
61. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 55 и 56, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:117 или состоящую из нее.
62. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 60 и 61, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:116 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:117 или состоящую из нее.
63. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 65 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 96 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
64. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 63, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 65, 66 и 96.
65. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по предыдущим пунктам 63 или 64, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие CDR:
SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 64 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
66. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 65, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 62, 63 и 64.
67. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 63 или 64, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:112 или состоящую из нее.
68. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 65 или 66, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:113 или состоящую из нее.
69. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 67 и 68, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:112 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:113 или состоящую из нее.
70. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 65 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
71. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 70, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 65, 66 и 67.
72. Применение по предыдущим пунктам 70 или 71, предусматривающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие CDR:
SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 98 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 101 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
73. Применение по пункту 72, предусматривающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 62, 98 и 101.
74. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 70 или 71, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:104 или состоящую из нее.
75. Применение пунктов 72 или 73, предусматривающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105 или состоящую из нее.
76. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 74 и 75, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:104 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:105 или состоящую из нее.
77. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 65 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
78. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 77, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 65, 66 и 67.
79. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по предыдущим пунктам 77 или 78, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие CDR:
SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 99 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 64 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
80. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 79, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 62, 99 и 64.
81. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 77 или 78, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:108 или состоящую из нее.
82. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 79 или 80, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:109 или состоящую из нее.
83. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 81 и 82, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:108 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:109 или состоящую из нее.
84. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 65 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
85. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 84, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 65, 66 и 67.
86. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по предыдущим пунктам 84 или 85, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие CDR:
SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 100 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 64 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
87. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 86, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 62, 100 и 64.
88. Применение по пунктам 84 или 85, предусматривающее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 118 или состоящую из нее.
89. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 86 или 87, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:119 или состоящую из нее.
90. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов 88 и 89, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:118 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:119 или состоящую из нее.
91. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-9 и пунктам 18-19, где указанное антитело к альфа-синуклеину содержит:
SEQ ID NO: 65 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 66 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 67 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
92. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 91, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 65, 66 и 67.
93. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по предыдущим пунктам 91 или 92, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующие CDR:
SEQ ID NO: 62 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием;
SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием; и
SEQ ID NO: 102 или аминокислотную последовательность с не более 4 аминокислотными отличиями, или не более 3 аминокислотными отличиями, или не более 2 аминокислотными отличиями, или не более 1 аминокислотным отличием.
94. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 93, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR под SEQ ID NO 62, 63 и 102.
95. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 91 или 92, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:106 или состоящую из нее.
96. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 93 или 94, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:107 или состоящую из нее.
97. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 95 или 96, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:106 или состоящую из нее, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:107 или состоящую из нее.
98. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент по любому из пунктов 25-97.
99. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, или препарат по любому из пунктов 25-97 и фармацевтически приемлемый носитель.
100. Способ лечения заболевания по пунктам 5 или 6 у субъекта, при этом указанный способ предусматривает введение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пунктов 1-97 указанному субъекту в эффективном количестве.
101. Способ по пункту 100, где лечение является длительным.
102. Способ по пункту 101, где длительное лечение продолжается по меньшей мере 2 недели.
103. Способ по пункту 100, где субъектом является человек.
104. Набор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 1-97, для применения в способе согласно пункту 100.
105. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 5 или 6, где моноклональное антитело по пунктам 1-97 помечено с помощью выявляемой метки.
106. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пункту 105, где указанная выявляемая метка представляет собой флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, парамагнитную метку, радиоизотопную метку или ферментную метку.
107. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 105-106 для применения в выявлении присутствия или измерении количества указанного альфа-синуклеина в головном мозге или любом другом органе или физиологической жидкости субъекта.
108. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 105-107, где указанное выявление или измерение предусматривает in vivo визуализацию указанного антитела к синуклеину, связавшегося с указанным альфа-синуклеином.
109. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пунктам 105-108, где указанное выявление или измерение предусматривает ex vivo визуализацию указанного антитела к синуклеину или его указанного антигенсвязывающего фрагмента, связавшихся с указанным альфа-синуклеином.
110. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пунктов 1-97 для применения в изготовлении лекарственного препарата для лечения, диагностики или визуализации заболевания по пунктам 5 или 6.
111. Способ задержки прогрессирования заболевания по пунктам 5 или 6 у пациента, при этом указанный способ предусматривает снижение или ослабление накопления патологического тау-белка у указанного пациента за счет введения антитела, определенного в пунктах 1-97.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Скрининг антител
1. Получение иммуногена и лиганда
[000135] Для применения в качестве иммуногенов приобретали или получали следующие белки, показанные на фиг. 1. Мышей иммунизировали тремя иммуногенами: фибриллами полноразмерного рекомбинантного альфа-синуклеина человека; рекомбинантным белком альфа-синуклеина человека, содержащим аминокислоты 1-60 (Rpeptide, Богарт, Джорджия), и рекомбинантным белком альфа-синуклеина человека, содержащим аминокислоты 1-119. Для получения фибрилл полноразмерного альфа-синуклеина применяли лиофилизированный продукт от Rpeptide, Богарт, Джорджия (номер по каталогу S-1001-2). Его растворяли в буфере на основе 20 мМ Tris и 300 мМ NaCl до концентрации белка 1 мг/мл. Для получения фибрилл раствор белка инкубировали в виде 170 мкл аликвот в 96-луночном планшете с керамической гранулой диаметром 70 мкм в каждой лунке при 200 об./мин. в инкубаторе с шейкером Vortemp 56 (Labnet International, Эдисон, Нью-Джерси, США) при 37ХС в течение 7 суток, а после образования фибрилл добавляли тиофлавин Т и измеряли флуоресценцию в одной из лунок. Рекомбинантный альфа-синуклеин, содержащий аминокислоты 1-60, растворяли в воде с получением концентрации 1 мг/мл.
[000136] Рекомбинантный альфа-синуклеин, содержащий аминокислоты 1-119, получали с применением следующей конструкции. Синтетический ген, кодирующий гистидиновую метку из 6 аминокислот, за которой следует сайт расщепления фактором Xa и последовательность, кодирующая аминокислоты 1-119 альфа-синуклеина человека:
MAHHHHHHIE GRMDVFMKGL SKAKEGVVAA AEKTKQGVAE AAGKTKEGVL YVGSKTKEGV VHGVATVAEK TKEQVTNVGG AVVTGVTAVA QKTVEGAGSI AAATGFVKKD QLGKNEEGAP QEGILEDMPV D (SEQ ID NO:16)
синтезировали в Genscript и клонировали в сайт NdeI-XhoI в векторе экспрессии pET24a(+) (Novagen).
[000137] Вектор экспрессии вводили с помощью трансформации в E. coli штамма BL21 и отдельную колонию отбирали для экспрессии с помощью системы аутоиндукции экспрессии на протяжении ночи от компании Novagen (пользовательский протокол TB383, изд. H1005). Масштаб конечного объема культуры составлял 500 мл. Клетки собирали посредством центрифугирования в течение 10 мин. при 6000 g, а затем лизировали с помощью реагента для экстракции белка BugBuster (пользовательский протокол TB245, изд. 0304). После лизиса образец осветляли путем центрифугирования, а супернатант применяли для дальнейшей очистки.
[000138] Белок с His-меткой очищали на 5-мл колонке HisTrap (GE healthcare), уравновешенной с помощью 20 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 1 М NaCl (A-буфер). После внесения образца и промывки с помощью A-буфера белок элюировали в градиенте до 0,25 М имидазола в A-буфере с помощью 20 объемов колонки. Фракции по 5 мл собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE. Фракции с представляющим интерес белком объединяли, концентрировали и вносили в колонку для эксклюзионной хроматографии S200 (26/60) (GE healthcare) в 10 мМ Tris, рН 7,4, 300 мМ NaCl. Фракции вновь объединяли на основании наличия в SDS-PAGE полоски с ожидаемым размером молекул.
[000139] Для удаления N-концевой метки очищенный альфа-синуклеин 1-119 с His-меткой инкубировали с фактором Ха в соотношении 1:50 с применением набора от Novagen (69037-3FRX). После инкубации на протяжении ночи фактор Xa удаляли порциями с применением агарозы Xarrest. Расщепленный альфа-синуклеин 1-119 окончательно очищали с помощью гель-проникающей хроматографии HisTrap, как описано выше. Из элюата получали очищенный альфа-синуклеин 1-119 и концентрировали его до ~400 мкг/мл с помощью концентрирующих устройств Centricon.
[000140] Альфа-синуклеин (Rpeptide) регидратировали в PBS до 2 мг/мл и по каплям при перемешивании добавляли пероксинитрит (100 мкл/мг белка). Затем нитрозилированный альфа-синуклеин подвергали диализу в 5 л PBS и хранили при -20°C.
[000141] Для окисления альфа-синуклеина применяли дофамин. Объединяли равные объемы 200 мкМ раствора дофамина-HCL (Sigma P5244), приготовленного в 10 мМ PBS, pH 7,4, и 28 мкМ раствора альфа-синуклеина (Rpeptide) в 10 мМ PBS, pH 7,4. Полученный раствор с 14 мкМ альфа-синуклеина/100 мкМ дофамина инкубировали при 37°С O/N (на протяжении ночи). Затем окисленный альфа-синуклеин подвергали диализу в PBS и хранили при -20°C.
[000142] Для проведения скрининга библиотеки с разнообразными антителами к альфа-синуклеину получали различные нативные и химерные версии белков синуклеина. Конструкции для скрининга включали следующее: альфа-синуклеин человека, мыши, крысы и яванского макака, бета-синуклеин человека, гамма-синуклеин человека и, наконец, производное альфа-синуклеина, у которого отсутствовали остатки 120-140 альфа-синуклеина. Кроме того, получали серию из 4 конструкций, полученных с помощью шаффлинга: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP (SEQ ID NO:11-14). Эти конструкции содержали линейные отрезки альфа-синуклеина человека (А), бета-синуклеина человека (В) и альфа-синуклеина курицы (К). Для облегчения сайт-специфического биотинилирования каждого из лигандов клонировали гены, содержащие метку в виде биотин-акцепторного пептида (BAP), слитую с С-концом лигандов. Биотинилирование обеспечивало возможность присоединения лигандов к гранулам, используемым в формате ELISA в растворе. Конструировали векторы экспрессии в клетках млекопитающих, несущие различные слитые конструкции альфа-синуклеина с BAP-меткой (ASynBAP). Лиганды экспрессировали в клетках HEK 293 с применением транзиентной трансфекции (Genmab A/S).
2. Иммунизация
[000143] Антитела HuMab к синуклеину получали за счет иммунизаций линии мышей HuMAb HCo17-BALB/c и HCo12-BALB/c, мышей с двойным нокаутом по тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig) мыши и легкой каппа-цепи мыши, что предотвращает экспрессию антител, которые являются полностью мышиными (человеческое моноклональное антитело, Medarex Inc., Сан-Хосе, Калифорния, США). Различные линии мышей делали трансгенными путем вставки локусов, кодирующих тяжелую цепь Ig человека, и локусов, кодирующих легкую каппа-цепь Ig человека, и они отличались по количеству генов VH (вариабельного домена тяжелой цепи) и VL (вариабельного домена легкой цепи) человека.
[000144] 48 мышей иммунизировали поочередно, внутрибрюшинно (IP) с помощью 20 мкг антигенов и подкожно (SC, в основание хвоста) тем же иммуногеном, с интервалом 14 суток. Осуществляли максимум восемь иммунизаций: 4 IP и 4 SC.
[000145] Первую иммунизацию проводили альфа-синуклеиновыми иммуногенами в полном адъюванте Фрейнда (CFA, Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США), последующие иммунизации - в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). Когда оказывалось, что сывороточные титры являются достаточными (разведение сыворотки 1/50 или менее было положительным в скрининговом анализе на специфичность к антигену, как описано выше, в по меньшей мере двух последовательных, проводимых два раза в неделю скринингах), мышей дополнительно дважды стимулировали внутривенно (IV) с помощью 10 мкг белка альфа-синуклеинового иммуногена в 100 мкл PBS, за четверо и трое суток перед проведением слияния.
[000146] Протоколы иммунизации показаны на фиг. 1.
[000147] Антитело GM37 получили за счет протокола иммунизации, в котором применяли фибриллы полноразмерного α-синуклеина человека, чередуя их с усеченными на C-конце формами альфа-синуклеина с аминокислотами 1-60 и 1-119.
[000148] Антитело GM285 получили за счет протокола иммунизации, в котором для первых 4 иммунизаций применяли мономер α-синуклеина человека из аминокислот 1-140. Если титр отсутствовал, иммунизацию продолжали фибриллами (ip/sc), в противном случае ее продолжали мономером.
3. Получение гибридомы HuMab
[000149] Мышей HuMAb, у которых сформировался достаточно высокий антигенспецифический титр, как определено выше, умерщвляли и собирали селезенку и лимфатические узлы, прилегающие к брюшной аорте и полой вене. Слияние спленоцитов и клеток лимфатических узлов с линией клеток миеломы мыши выполняли за счет электрослияния с применением системы для электрослияния CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Глен Берни, Мэриленд, США), фактически согласно инструкциям производителя. Слитые клетки высевали в среду для культивирования слитых клеток, содержащую 10% бычьей сыворотки FetalClone I (Perbio), 1 мМ пирувата натрия (Cambrex), 0,5 ед./мл пенициллина, 0,5 ед./мл стрептомицина (Cambrex), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Invitrogen), 600 нг/мл интерлейкина 6 (IL-6) (Strathmann), 1 x HAT (Sigma) и 0,5 мг/мл канамицина (Invitrogen) в HyQ mADCF-Mab (Perbio). Через десять суток супернатант собирали и к клеткам добавляли среду для сбора, содержащую 10% бычьей сыворотки FetalClone I, 0,5 ед./мл пенициллина, 0,5 ед./мл стрептомицина, 600 нг/мл IL-6 и 1 x proHT (Cambrex) в HyQ mADCF-Mab. Супернатанты гибридомных культур подвергали скринингу посредством первичных скрининговых анализов. Для супернатантов определяли характеристики связывания с восемью различными лигандами. В их число входили 4 ортолога: белок человека, мыши, крысы и яванского макака, альфа-синуклеин человека, бета-синуклеин и гамма-синуклеин человека (SEQ ID NO: 37-41), и, наконец, их тестировали в отношении их способности связываться с производным альфа-синуклеина человека, у которого отсутствовали остатки 120-140 альфа-синуклеина.
[000150] Скрининг антител к альфа-синуклеину проводили в формате высокоэффективного ELISA в суспензии с применением автоматизированных систем обработки жидкости (Genmab A/S). Считывание планшетов выполняли с помощью двух систем: FMAT 8200 от Applied Biosystems применяли для считывания 384-луночных планшетов, а цитометр ImageXpress Velos от Molecular Devices применяли для считывания 1536-луночных планшетов.
[000151] В ходе первичного скрининга определяли характеристики клонов по их способности связываться с 8 различными лигандами. В их число входила серия из 4 конструкций, полученных с помощью шаффлинга: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP (SEQ ID NO:11-14), альфа-синуклеин-BAP с делецией по 120-140, нитрованный альфа-синуклеин-BAP человека и окисленный альфа-синуклеин-BAP человека.
[000152] Вкратце, сыворотки или супернатант, потенциально содержащие специфические в отношении альфа-синуклеина антитела, добавляли к гранулам для обеспечения возможности связывания с альфа-синуклеином и/или конструкциями, полученными на основе альфа-синуклеина. Связывание антител к альфа-синуклеину выявляли с применением флуоресцентного конъюгата, антитела козы к IgG человека, Fc-специфического, конъюгированного с DyLight649. В качестве положительных контролей в скрининги включали два известных мышиных антитела к альфа-синуклеину, LB509 и Syn211. Для гарантии специфического выявления антител к альфа-синуклеину при скрининге титра в 384-луночном формате в качестве отрицательного контроля применяли сывороточный пул антител к альфа-синуклеину, в то время как в анализе на основе 8 гранул в 1536-луночном формате применяли IgG человека ChromPure.
[000153] Клетки гибридомы из первичных лунок с наилучшим результатом высевали в полутвердую среду, изготовленную из 40% CloneMedia (Genetix, Гэмпшир, Великобритания) и 60% полной среды HyQ 2x (Hyclone, Уолтем, США). При использовании каждой первичной лунки ее содержимое высевали в лунку 6-луночного черного планшета Genetix. Из каждой лунки отбирали 25 субклонов с помощью системы ClonePix (Genetix). Субклоны отбирали в среду для сбора. Через семь суток супернатанты субклонов вновь подвергали скринингу в отношении специфического связывания IgG человека с синуклеином и измеряли концентрацию IgG человека с помощью платформы Octet (Fortebio, Менло-Парк, США). Из каждой первичной лунки выбирали наилучший субклон и размножали его в среде для размножения, содержащей только 600 нг/мл IL-6, 0,5 ед./мл пенициллина, 0,5 ед./мл стрептомицина и 1 x proHT. Субклоны размножали в следующем порядке: одна лунка 96-луночного планшета - одна лунка 24-луночного планшета - четыре лунки 24-луночного планшета - шесть лунок 6-луночного планшета. Клоны, полученные в результате этого процесса, были обозначены как первичные клоны (PC).
[000154] Дополнительные исследования по связыванию антитела проводили с использованием Octet 384RED (Fortebio, Менло-Парк, США). Растворы антител HuMab с концентрацией 2 мкг/мл получали путем разведения в разбавителе для образцов (ForteBio, арт. №18-5028). Способные вступать в реакцию с аминогруппами сенсоры (ForteBio, арт. №18-0008) применяли для иммобилизации HuMab. Перед связыванием со способными вступать в реакцию с аминогруппами сенсорами HuMab разводили в буфере MES, pH 6,0 (18-5027). Связывание осуществляли при 30°C и 1000 об./мин. следующим образом. Способные вступать в реакцию с аминогруппами сенсоры предварительно смачивали в PBS и затем активировали с помощью раствора для активации EDC/NHS (ForteBio. арт. №18-1033/18-1034) (в соответствии с инструкцией изготовителя) в течение 300 секунд. Иммобилизацию HuMab на активированных сенсорах проводили в течение 600 секунд.
[000155] На фигуре 2 показано связывание GM37 и GM285 с рекомбинантным альфа-синуклеином человека, яванского макака и мыши и отсутствие связывания с бета- или гамма-синуклеином человека, выполняемое на платформе Octet.
4. Анализ последовательностей вариабельных доменов HuMab, специфических в отношении синуклеина, и клонирование в векторы экспрессии
[000156] Из 0,2-5х106 клеток гибридомы получали общую РНК, а из 100 нг общей РНК получали 5'-RACE-комплементарную ДНК (кДНК) с применением набора для амплификации кДНК SMART RACE (Clontech). Области, кодирующие VH и VL, амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали напрямую в рамку считывания в векторы экспрессии p33G1f и p33Kappa (содержащие последовательности, кодирующие константные домены IgG1/каппа-цепи человека) посредством клонирования, не зависящего от лигирования (Aslanidis, C. and PJ de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18 (20): 6069-74). Для каждого антитела секвенировали 16 клонов VL и 16 клонов VH. Для дополнительного изучения и экспрессии отбирали клоны с правильной открытой рамкой считывания (ORF). Осуществляли совместную транзиентную экспрессию всех комбинаций векторов, несущих тяжелые цепи и легкие цепи, в клетках FreestyleTM 293-F с применением 293fectin.
[000157] При секвенировании GM37 в области VH идентифицировали дополнительный цистеин в положении 106 CDR3-домена. Чтобы исключить возможность неправильного сворачивания и потенциальной потери активности антител вследствие формирования дисульфидной связи в положении 106, цистеин мутировали в серин.
[000158] Антитело сравнения 9E4 получали на основе последовательностей VH и VL, полученных за счет гибридомы PTA-8221 (патент США 20080175838) (SEQ ID NO 42 и 43).
5. Экспрессия/очистка антител
[000159] Антитела получали путем трансфекции клеток HEK293 6E с применением векторов pTT5 и PEIpro в качестве средства для транзиентной трансфекции (Канадский национальный совет по научным исследованиям). Вкратце, тяжелые и легкие цепи трансфицировали в клетки HEK293 с применением PEIpro (VWR) и через 24 часа после трансфекции к клеткам добавляли TN1 (Sigma). Клетки выращивали до тех пор, пока жизнеспособность не достигала 50%, и выход антител измеряли с помощью набора Easy IgG titre (Thermo). Супернатант культуры фильтровали через тупиковые фильтры с размером пор 0,2 мкм, загружали на 5-мл колонки с белком А (rProtein A FF, Amersham Bioscience) и элюировали с помощью 0,1 М лимонной кислоты-NaOH, pH 3. Элюат немедленно нейтрализовали посредством 2 М Tris-HCl, pH 9, и подвергали диализу в 12,6 мМ NaH2PO4, 140 мМ NaCl, pH 7,4 (B.Braun), O/N. После диализа образцы подвергали стерилизации фильтрацией через тупиковые фильтры с размером пор 0,2 мкм. Чистоту определяли с помощью SDS-PAGE, а концентрацию измеряли с помощью нефелометрии и поглощения при 280 нм. Очищенные антитела разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.
Пример 2. Определение характеристик антител с помощью поверхностного плазмонного резонанса
[000160] Связывание антител с альфа-синуклеином в режиме реального времени измеряли с помощью BIAcore 3000. Поверхность для захвата получали путем иммобилизации по аминогруппе поликлонального антитела кролика к антителам мыши (часть набора для захвата антител мыши, GE Healthcare, № по кат. BR-1008-38) в первой проточной ячейке (Fc1) и второй проточной ячейке (Fc2) чипа CM5 (BIAcore). Антитело мыши захватывали в Fc2 при концентрации, необходимой для достижения уровня лиганда около 500 RU. Обеспечивали стабилизацию исходного уровня в течение 10 мин. перед введением аналита (ASynBAP) в Fc1-2 при 30 мкл/мин. ASynBAP прогоняли при 100-3200 нМ и 25-3200 RU, соответственно. Наивысшую концентрацию в каждой серии титрования прогоняли в двух повторностях. Поверхность регенерировали с помощью 10 мМ глицина-HCl, pH 1,7 (30 с инъекция), для удаления захваченного антитела мыши и аналита в конце каждого цикла. HBS-EP (GE Healthcare, № по кат. BR-1001-88) использовали в качестве подвижного буфера и разбавителя образца во всех экспериментах, а анализ проводили при 25°С. Все образцы хранили при 4°C до проведения захвата.
[000161] Ответ, зарегистрированный в Fc1, в которой было иммобилизировано антитело захвата, но отсутствовало захваченное антитело к альфа-синуклеину, вычитали из ответа в Fc2. Для аппроксимации набора данных использовали алгоритм связывания 1:1 или 2:1 с применением программного обеспечения BIAevaluation версии 4.1.1. Результаты можно видеть на фиг. 3, 4 и 5, на которых показано связывание антитела GM37, GM285 и 9E4 с альфа-синуклеином человека.
Пример 3. Картирование эпитопов
2
2
[000162] Картирование эпитопов для антител к альфа-синуклеину проводили с помощью матриц с перекрывающимися линейными пептидами в Pepscan (Pepscan Zuidersluisweg 2 8243 RC, Лелистад, Нидерланды). Связывание антитела с каждым из синтезированных 20-мерных пептидов тестировали в ELISA на основе Pepscan. Матрицу с линейными пептидами, охватывающими всю кодирующую последовательность альфа-синуклеина, а также все пептиды с окисленными остатками метионина или нитрозилированными остатками тирозина, инкубировали с раствором первичного антитела (на протяжении ночи при 4°С). После промывки матрицы с пептидами инкубировали с 1/1000 разведением конъюгата антитела и пероксидазы (SBA, № по кат. 2010-05) в течение одного часа при 25°С. После промывки добавляли субстрат для пероксидазы, 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфонат (ABTS) и 2 мкл/мл 3-процентного HO. Через один час измеряли проявление цвета. Проявление цвета оценивали количественно с помощью камеры с полупроводниковой светочувствительной матрицей (CCD) и системы обработки изображений. При обработке данных с применением CCD-камеры получали значения в диапазоне от 0 до 3000 mAU, аналогично со стандартным ридером для 96-луночных планшетов при ELISA. Результаты количественно оценивали и сохраняли в базе данных Peplab. В редких случаях лунка содержала воздушный пузырек, что приводило к ложноположительному значению, тогда снимки проверяли вручную, а любые значения, вызванные воздушным пузырьком, оценивали как 0. Данные связывания для антитела GM37 и GM285 с пептидами, содержащими последовательность ILEDMP или ILED, соответственно, можно увидеть на фигуре 6.
Пример 4. GM37 и варианты GM37
[000163] Антитела к альфа-синуклеину получали в культуре клеток млекопитающих в условиях, которые имитируют условия получения, которые будут применяться для получения клинического материала для применения у пациентов. Хорошо известно, что белки, полученные таким образом, подвергаются посттрансляционным модификациям, которые могут влиять как на терапевтическую эффективность антитела, так и на биофизические свойства, которые влияют на стабильность антитела с течением времени. Эмпирические знания, полученные в течение десятилетий исследований, позволили идентифицировать набор посттрансляционных модификаций, которые, как известно, подвергают риску разработку конкретной молекулы. Было показано, что такие посттрансляционные модификации коррелируют с группами аминокислот, присутствующими в первичной последовательности белков тяжелых и легких цепей. Были созданы алгоритмы, с помощью которых можно идентифицировать эти последовательности и определить потенциальный риск, который они будут оказывать на изготовление и разработку терапевтического антитела.
[000164] Чтобы снизить риск при разработке молекулы в качестве терапевтического средства, можно применять in silico анализ первичной последовательности антитела. В частности, с помощью подробного анализа областей VH и VL можно идентифицировать уникальные аминокислоты, которые считаются важными для активности молекул, но также могут обладать потенциальным риском с точки зрения их стабильности с течением времени. Было идентифицировано, что потенциальный риск для белковых структур несет специфическое в отношении последовательностей дезамидирование. Дезамидирование белков может происходить по амидным боковым цепям остатков глутамина или аспарагина и превращать их в карбоксилатную группу (Lorenzo et al. PLOSone, DOI:10.1371, Dec. (2015)). Неферментативное дезамидирование при нейтральном рН происходит быстрее по аспарагину, и поэтому считается, что он несет более высокий риск, чем глутамин. На активность дополнительно оказывает влияние следующая аминокислота в последовательности, и такое изменение активности может происходить со скоростью, которая исчисляется днями или годами. Фактическую судьбу белка, который подвергается дезамидированию, необходимо оценивать экспериментально для определения влияния данного изменения как на его стабильность, так и на его активность.
[000165] Авторы настоящего изобретения идентифицировали сайт для дезамидирования в пределах VH-домена GM37. Аминокислотный остаток 54 представляет собой аспарагин (N), за которым следует глицин (G) в положении 55. N54 подвергается высокому риску самопроизвольного дезамидирования. Для снижения данного риска авторы настоящего изобретения получили набор из 3 вариантов, в которых аспарагин (N) заменен на серин (S), глутамин (Q) или гистидин (H). Все 3 варианта получали в культуре клеток млекопитающих с применением способов транзиентной трансфекции. Для всех 3 вариантов показаны свойства экспрессии и очистки, аналогичные таковым для GM37wt.
7
2
[000166] Для получения каждого из восьми продуктов в объеме 400 мл осуществляли транзиентную трансфекцию с применением клеток CHOK1SV GS-KO, которые до этого культивировали в течение минимум 2 недель. Клетки пересевали за 24 часа до проведения трансфекции. Все трансфекции проводили посредством электропорации с помощью Gene Pulse XCell (Bio-Rad). При проведении каждой трансфекции жизнеспособные клетки ресуспендировали в предварительно нагретой среде CD-CHO, дополненной 6 мМ L-глутамина, до 2,86× 10 клеток/мл. Аликвоту по 40 мкг каждой установленной ДНК SGV, содержащей соответствующие тяжелые и легкие цепи, вносили в каждую кювету (кювета Bio-Rad, GenePulser, зазор 0,4 см, 165-2088) и добавляли 700 мкл клеточной суспензии. Клетки подвергали электропорации при 300 В, 900 мкФ. Подвергнутые трансфекции клетки переносили в повторно нагретую среду в колбах Эрленмейера и также переносили в колбы содержимое кювет, дважды промытых предварительно нагретой средой. Культуры трансфектантов инкубировали во встряхивающем термостате при 36,5°C, 5% CO, 85% влажности, 140 об./мин. в течение 6 суток. Жизнеспособность клеток измеряли во время сбора с помощью автоматизированного устройства для подсчета клеток Cedex HiRes (Rosche).
[000167] Чтобы оценить важности остатка 54 для связывания с альфа-синуклеином человека, авторы настоящего изобретения проанализировали способность к связыванию у вариантов в двух различных экспериментах. Применяя формат конкурентного ELISA, авторы настоящего изобретения оценили, будет ли изменение остатка 54 оказывать влияние на способность GM37 связывать альфа-синуклеин в растворе. Путем оценки концентрации синуклеина, которая могла подавлять связывание антитела с синуклеином, которым были покрыты планшеты для ELISA, авторы настоящего изобретения показали, что все три варианта сохраняли такое же связывание, что и GM37wt, и связывались с альфа-синуклеином с высокой аффинностью, что дало в результате IC50 1-2 нМ (фиг. 7). Конкурентный анализ проводили с применением предварительной инкубации каждого из следующих антител: GM37 (под названием GM 37wt), варианта 1 GM37, варианта 2 GM37 и варианта 3 GM37 при фиксированной концентрации (0,3 мкг/мл) с альфа-синуклеином человека в диапазоне концентраций 0-1000 нМ в течение 60 минут при комнатной температуре. Оставшееся несвязанным антитело захватывали и измеряли на планшетах для ELISA, покрытых 100 нг/мл рекомбинантного альфа-синуклеина человека, с применением антитела для выявления антител человека путем электрохемилюминесценции (MSD, Гейтерсберг, Мэриленд). Значения IC50 взаимодействия составляли 1,9 нМ, 1,6 нМ, 2,1 нМ и 1,4 нМ для GM37 wt, варианта 1 GM37, варианта 2 GM37 и варианта 3 GM37, соответственно (по результатам определения с помощью Prism Graphpad).
[000168] Применяя поверхностный плазмонный резонанс (SPR), авторы настоящего изобретения оценили в режиме реального времени кинетику связывания GM37 wt (2 партии) и трех вариантов (пример 2). Альфа-синуклеин человека захватывали на предметном стекле (в качестве лиганда) и каждое из антител, в качестве аналитов, тестировали при нескольких концентрациях. Анализ кривых связывания в присутствии антитела при нескольких концентрациях показал, что скорости ассоциации были одинаковыми для всех четырех антител, аналогично, при удалении антитела из буфера, измеренные скорости диссоциации не демонстрировали статистической разницы у разных антител. При использовании алгоритма связывания 1:1 все 4 антитела имели почти идентичные константы связывания (фиг. 7). проблемы с потерей активности.
Пример 5. Агрегацию тау-белка, индуцированную затравочными частицами альфа-синуклеина, можно предотвратить с помощью антител к альфа-синуклеину
Описание получения фибрилл (затравочных частиц) альфа-синуклеина
Фибриллы альфа-синуклеина можно получать согласно несколько отличающимся протоколам.
Рекомбинантный альфа-синуклеин, приобретенный у rPeptide (номер по каталогу S-1001-2), согласно рекомендациям производителя растворяли в бидистиллированной воде с получением 1 мг/мл раствора в 20 мМ Tris-HCl/100 мМ NaCl, pH = 7,4. Преформированные фибриллы альфа-синуклеина (PFF) получали из мономерного альфа-синуклеина с применением протокола Вирджинии Ли/Кельвина Лука (Luk et al, Science, 2012, 16;338(6109):949-53). 1 мг/мл раствор инкубировали при 37°C с перемешиванием (300 об./мин.) в течение 2 суток, затем делали паузу на 3 суток, затем 1 сутки перемешивали, затем делали паузу на 1 сутки, затем 4 суток перемешивали. После этого фибриллы собирали и хранили при -20°C до применения. Когда фибриллы применяли в клеточных анализах, непосредственно перед добавлением их всегда подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин., при настройке 5,50% цикл, с помощью устройства для ультразвуковой обработки с зондом.
В качестве альтернативы 1 мг/мл раствор непрерывно встряхивают в течение 5-7 суток при 37°C. Конечный продукт называют "неочищенными фибриллами". После ультразвуковой обработки их называют "неочищенными затравочными частицами". Неочищенные фибриллы можно подвергать центрифугированию и осадок, содержащий агрегированный альфа-синуклеин, суспендируют в свежем PBS и называют "очищенными фибриллами". "Очищенные затравочные частицы" получают путем ультразвуковой обработки очищенных фибрилл.
Ингибирование затравочного действия тау-белка антителами к альфа-синуклеину
Чтобы продемонстрировать эффект ингибирования затравочного действия внутриклеточного тау-белка антителом к альфа-синуклеину, была разработана схема анализа затравочного действия на основе клеток HEK293 (схема анализа проиллюстрирована на фигуре 8, нижняя панель). Клетки HEK293 высевали по 100000 клеток/лунка в 24-луночные планшеты и через 24 часа после посева подвергали транзиентной трансфекции с помощью кДНК, кодирующей тау-белок человека-P301L-FLAG. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки подвергали затравочному действию (с применением трансфекции липофектамином 2000) агрегированного фибриллярного альфа-синуклеина (затравочные частицы) с антителами или без них в течение 24 часов с последующим разделением и пересевом клеток, в также сбором через дополнительные 24 часа. Клетки лизировали и подвергали ультразвуковой обработке в буфере PBS, дополненном 1% triton X, ингибитором фосфатаз PhosSTOP и ингибитором протеаз cOmplete (Roche). Общие клеточные лизаты анализировали с применением анализа агрегации тау-белка от Cisbio. В основе данного анализа лежит флуоресценция с временным разрешением с применением одного и того же антитела в качестве как донорного (конъюгированного с Tb3+), так и акцепторного (конъюгированного с d2) антитела в FRET. Образец объемом 10 мкл смешивали со смесью антител объемом 10 мкл и инкубировали в течение 20 ч. Планшет прочитывали на планшет-ридере PHERAstar для оценки флуоресценции с временным разрешением (сигнала FRET, измеренного/интегрированного после переключения возбуждающего света). Анализ позволяет измерять содержание агрегированного тау-белка, не только в секционном материале головного мозга человека от пациентов с AD, материале головного мозга от трансгенных по таубелку мышей (rTg4510), но и в клетках HEK293, подвергнутых действию затравочных частиц, с высокой специфичностью и чувствительностью. Используя различные препараты фибриллярного тау-белка в качестве затравочных частиц, данный тип анализа затравочного действия на основе клеток HEK293 был эффективно применен для отбора кандидатных антител к тау-белку для клинического применения.
Результаты показаны на фигуре 8, верхняя панель. При трансфекции только затравочных частиц альфа-синуклеина (300 нг неочищенных затравочных частиц) относительная агрегация тау-белка составляла около 100 (альфа-синуклеин, 3-й столбик), что указывает на то, что альфа-синуклеин эффективно индуцировал перекрестное затравочное действие на эндогенный тау-белок. На эффект затравочного действия не оказывала влияния совместная трансфекция с B12 (контрольное антитело) и следующими антителами к тау-белку: mC10-2, mD1.2, тау-белоксвязывающим антителом под названием LU0041G и гуманизированным (h) C10-2. При совместной инкубации клеток с четырьмя различными антителами к альфа-синуклеину: HLD1, GM37 (37), GM63 (63) и 9E4 - однако происходило частичное обращение агрегации тау-белка, например антитело 9E4 приводило к повышению относительной агрегации до 20 (по сравнению с 100 в контролях без обработки). Все антитела трансфицировали совместно с неочищенными затравочными частицами (2,4 мкг антитела и 300 нг затравочных частиц в общем объеме 400 мкл).
Пример 6. Обнаружение антитела 2E6 и варианты 2E6
A. Иммунизация/скрининг гибридом
Моноклональные антитела к альфа-синуклеину получали путем иммунизации мышей различными агрегатами синуклеина, перекрестно сшитыми, например, с помощью реакционно-способных альдегидов. Первый антиген получили из рекомбинантного лиофилизированного альфа-синуклеина от Rpeptide (4241 Mars Hill Road, Богарт, Джорджия 30622, США). Его получали путем растворения белка в PBS с получением раствора, содержащего 70 мкМ альфа-синуклеина (1 мг/мл). Раствор инкубировали 18 часов при 37°C и замораживали в виде аликвот по 100 мкл. Второй антиген получали аналогичным образом из рекомбинантного альфа-синуклеина (Rpeptide) путем растворения из расчета 70 мкМ в 20 мМ Tris (pH=7,4), 0,15 M NaCl. Реакционноспособный альдегид ONE (4-оксо-2-ноненаль, № по кат. 10185 от Cayman Chemicals, Анн-Арбор, Мичиган) добавляли при молярном соотношении 20:1 для ковалентного перекрестного сшивания олигомеров альфа-синуклеина. Раствор инкубировали в течение 18 часов при 37°C (без встряхивания). Непрореагировавший ONE удаляли с помощью спин-колонки Vivaspin500 (10 кДа MWCO), а образцы подвергали диализу против 20 мМ Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl и замораживали в виде аликвот. Третий антиген представлял собой фрагмент рекомбинантного альфа-синуклеина из аминокислот 1-60 (Rpeptide), который отправляли в виде лиофилизированного порошка (исходный материал от Rpeptide). Вкратце, трех самок мышей (возрастом 4-7 недель) иммунизировали и стимулировали до трех раз. Кровь отбирали за счет кровопускания из хвоста и подвергали скринингу на наличие антител к синуклеину с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) по антигену. Титр определяют на основе разбавлений сыворотки, необходимых для достижения значения OD в 3 раза превышающего исходный уровень при ELISA. Для проведения слияний отбирали мышей, демонстрирующих титр выше чем 1:50000 по сравнению с контролем. Собранные спленоциты сливали с клетками миеломы мыши SP2/0, разбавляли и высевали клетки, полученные в результате отдельных слияний клеток. Супернатанты собирали через 14 суток после слияния и подвергали скринингу в отношении выработки антител. За счет применения ELISA по синуклеину из ~1000 лунок выделили 50 положительных клонов. Для изотипирования иммуноглобулинов применяли набор Clonotyping System/AP (Southern Biotechnology, Бирмингем, Алабама). 50 супернатантов, содержащих антитела к альфа-синуклеину, подвергали скринингу на снижение накопления агрегатов альфа-синуклеина, меченных Atto, в анализе с использованием клеток SKMEL5, описанном ниже. В качестве положительного контроля включали коммерческое антитело LB509. Было установлено, что из 50 антисывороток только 4 антисыворотки снижали внутриклеточное накопление альфа-синуклеина, и эти антитела отбирали для дальнейшего клонирования. Эти четыре антитела затем тестировали в анализе зависимости "доза-ответ". Антитело, проявляющее самый большой эффект, 2E6, выбрали для дальнейшего определения характеристик на подходящих моделях PD.
Описание получения фибрилл
Рекомбинантный альфа-синуклеин заказывали в Rpeptide (№ по кат. S-1001-2) и растворяли согласно рекомендациям производителя в бидистиллированной воде с получением 1 мг/мл раствора в 20 мМ Tris-HCl/100 мМ NaCl, pH = 7,4. К альфа-синуклеину присоединяли флуоресцентную метку Atto488 с применением набора для мечения белков Atto488 от Sigma (№ 38371). Готовили смесь из 30% альфа-синуклеина, меченного Atto488, и 70% немеченого альфа-синуклеина и данную смесь затем инкубировали при 37°C с перемешиванием (300 об./мин.) в течение 2 суток, затем делали паузу на 3 суток, затем 1 сутки перемешивали, затем делали паузу на 1 сутки, затем 4 суток перемешивали. После этого фибриллы собирали и хранили при -20°C до применения. Когда фибриллы применяли в клеточных анализах, непосредственно перед добавлением их всегда подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин., при настройке 5,50% цикл, с помощью устройства для ультразвуковой обработки с зондом.
Опосредованное антителами ингибирование накопления в клетках SK-mel5
Клеточную линию меланомы человека SK-mel5 (ATCC, HTB-70) выращивали согласно рекомендациям ATCC. Клетки высевали при плотности 3000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты Falcon BD и оставляли на ночь для прикрепления. Фибриллы альфа-синуклеина, меченные Atto488, добавляли к клеткам (0,01 мг/мл) вместе с антителом m2E6 (0,01 мг/мл) и пептидами из аминокислот 113-125 или 126-140 альфа-синуклеина (0,01 мг/мл). После 24 часов инкубации клетки дважды промывали в PBS и фиксировали с помощью 4% параформальдегида. Затем клетки окрашивали с помощью Hoechst и считывали на Cellomics ArrayScan. Ядра выявляли в одном канале, и по ним определяли количество пригодных объектов. Фибриллы альфа-синуклеина, меченные Atto488, выявляли в другом канале в предварительно заданной кольцеобразной зоне, окружающей ядро, которая, таким образом, представляла собой цитоплазму клеток. Количественно оценивали процент клеток, содержащих бляшки альфа-синуклеина. Результат свидетельствует о том, что если к клеткам не добавляли фибриллы, наблюдали лишь очень низкий фоновый уровень клеток, содержащих бляшки (фоновый уровень, вероятно, был обусловлен аутофлуоресценцией), фиг. 7C. Среди клеток, к которым добавляли только фибриллы, 75% клеток характеризовались внутриклеточными бляшками. Среди клеток, которые инкубировали совместно с фибриллами и антителом m2E6, наблюдали только около 30% клеток, положительных в отношении бляшек. Если клетки инкубировали совместно с фибриллами, m2E6 и пептидом 126-140, наблюдали около 60% положительных клеток, таким образом данный пептид в значительной степени ингибировал эффект m2E6. Совместная инкубация пептида 113-120 с фибриллами и 2E6 не приводила к изменению эффекта m2E6. Инкубация фибрилл вместе с одним из пептидов 113-120 или 126-140 не оказывала эффекта на накопление фибрилл в клетках. Таким образом, m2E6 связывается с фибриллами альфа-синуклеина в растворе и ингибирует их накопление в клетках.
При обработке возрастающими дозами 2E6-HLD1 было показано дозозависимое снижение процента клеток с бляшками. У клеток, обработанных неподходящим контрольным антителом (B12), показано отсутствие эффекта.
B. ELISA с синуклеином
Слияния, положительные по выработке антител, анализировали в отношении связывания с применением антигенспецифического анализа ELISA. 96-луночные планшеты с высокой способностью к связыванию от Corning покрывали с помощью 100 нг агрегированного синуклеина. Лунки блокировали с применением 5% раствора молока в PBS в течение 1 часа (ч.) при комнатной температуре (RT). Планшеты промывали 3 раза с применением PBS+1% Tween 20. В каждую лунку добавляли по сто микролитров супернатанта гибридомы и планшеты инкубировали при RT. Затем в каждую лунку добавляли вторичное антитело козы к IgG мыши, конъюгированное с HRP (специфическое к цепи H&L или специфическое к γ-цепи), для выявления присутствия связавшегося антитела к синуклеину. Для количественной оценки добавляли субстрат, One component TMB, и планшеты измеряли при OD 620.
C. Определение последовательности ДНК вариабельных доменов HC и LC антитела
Отобрали четыре гибридомы, положительные по выработке антител к альфа синуклеину, и из клеточных осадков экстрагировали мРНК. кДНК из каждого препарата мРНК получали с помощью обратной транскриптазы с применением праймеров олиго(dT). Затем проводили реакции ПЦР с применением праймеров для вариабельных доменов для амплификации как областей VH, так и VL, генов HC и LC. Амплифицированную ДНК разделяли на агарозном геле и продукты VH и VL выделяли, очищали от геля, клонировали в pCR2.1 (Invitrogen) и трансформировали в клетки TOP10. Для определения последовательностей областей VH и VL отбирали как минимум 6 положительных колоний и их анализировали путем секвенирования ДНК.
Пример 7. Разработка антител
Экспрессия моноклональных антител
Культуры клонов гибридомы размножали и мышиные моноклональные антитела очищали из культуральных супернатантов с применением хроматографии с белком G. Рекомбинантные мышиные, человеческие и химерные антитела получали с применением транзиентной совместной трансфекции генов тяжелой и легкой цепи в клетки HEK293, размножения культур, сбора супернатантов и очистки посредством хроматографии белков. В тех случаях, когда неоднократно возникала необходимость количестве антител в масштабе граммов, стабильные клеточные линии создавали на основе клеток CHO. При необходимости такие стабильные клеточные линии можно было размножать и очистку антител проводили, как указано выше.
Клонирование рекомбинантных антител
Рекомбинантные моноклональные антитела получали с помощью генного синтеза из генов тяжелой и легкой цепи (Geneart A/G). Синтезированные гены затем клонировали в стандартные векторы экспрессии (например, pcDNA3.1) для экспрессии в культуре клеток млекопитающего.
Гуманизация
Гуманизацию m2E6 проводили путем прививания CDR на основе структуры. Аминокислотные последовательности доменов VL и VH 2E6 подвергали скринингу на гомологию со всеми аминокислотными последовательностями каркасных областей VL и VH человеческих антител, найденных в базах данных PDB и IMGT. Моделирование структуры проводили на области Fv m2E6 с применением антитела 20SL из базы данных PDB. Аминокислотные последовательности 20SL на 82,7% и 83,2% гомологичны доменам VH и VL 2E6, соответственно. Важно отметить, что структуру 20SL определяли при разрешении  Структурное выравнивание гуманизированной каркасной области 2E6 с 20SL позволило определить важные остатки в каркасных областях, которые потенциально могли бы оказать влияние на сворачивание или локальную структуру посредством стерического несоответствия или силы стерического взаимодействия. Теоретическое моделирование структуры антитела в случае гуманизированного антитела использовали для указания предполагаемой важности сохранения специфических остатков в виде исходных мышиных аминокислот в гуманизированной версии 2E6, чтобы сохранить специфичность и аффинность связывания. Моделирование структуры использовали для оптимизации активности гуманизированного 2E6.
Гуманизацию области VH 2E6 проводили путем прививания CDR VH на каркасную область гена зародышевой линии человека, IGHV1-46*01 (гомология 69%). Между мышиным 2E6 и выбранными каркасными областями человеческого антитела существовали отличия по 23 аминокислотам. С помощью моделирования структуры идентифицировали 7 аминокислотных положений, в которых изменение на человеческий остаток могло оказать негативное воздействие на активность 2E6. Такие остатки подвергали обратному мутированию в исходные мышиные аминокислоты. Получили три различные версии гуманизированной тяжелой цепи. Гуманизированное HLD-1 содержало все 7 обратных мутаций M37V, I48M, A68V, L70M, V72R, K74T, A79V, HLD-2 содержало I48M, A68V, L70M, V72R, K74T, A79V, и HLD-3 содержало M37V, I48M, L70M, V72R, K74T, A79V.
Гуманизацию области VL 2E6 проводили путем прививания CDR VL на каркасную область гена зародышевой линии человека, IGKV3-11*01 (гомология 64%). Между мышиным 2E6 и выбранными каркасными областями человеческого антитела существовали отличия по 26 аминокислотам. С помощью моделирования структуры идентифицировали 4 аминокислотных положения, R45L, W46L, V57I, Y70F, в которых изменение на человечески остаток могло оказать негативное воздействие на активность 2E6. Все 4 остатка в HLD-1, HLD-2 и HLD-3 подвергали обратному мутированию в исходные мышиные аминокислоты.
HLD-1, HLD-2 и HLD-3 экспрессировали транзиентно в клетках HEK 293. Антитела очищали из культуральных супернатантов и затем анализировали в отношении связывания с синуклеином с помощью SPR (Biacore 3000) с применением формата синуклеин в качестве лиганда (таблица 5).
Созревание аффинности HLD1 осуществляли посредством случайных мутаций в CDR3 легкой цепи за счет вырожденных на основе кодонов праймеров для ПЦР и, аналогичным образом, посредством случайных мутации в CDR3 тяжелой цепи за счет вырожденных на основе кодонов праймеров для ПЦР, а также применяя in vitro эволюцию с помощью ПЦР с ошибками. Антитела очищали из культуральных супернатантов и затем анализировали в отношении связывания с синуклеином с помощью SPR (Biacore 3000) с применением IgG, захваченных с применением Ab к IgG человека, иммобилизированных на чипе CM5 (таблица 6).
После первого раунда созревания аффинности авторы настоящего изобретения сконструировали 4 набора мутаций (A, B, C, D): A) объединение двух мутации: в CDR2 тяжелой цепи (мутирование KYNVNFKT в KYNVNIKT) и CDR3 тяжелой цепи (мутирование LGHYGNLYAMDY в LGHYGNLYAKDY); B) включение мутации CDR1 легкой цепи (мутирование SASSSVSYMH в SASSSVSYIH) в легкую цепь L3-11; C) включение мутации каркасной области легкой цепи (мутирование PRRWIY в PRRLIY непосредственно перед CDR2) в легкую цепь L3-11; и D) включение мутации CDR1 легкой цепи (мутирование SASSSVSYMH в SASSSVSYIH) и мутации каркасной области легкой цепи (мутирование PRRWIY в PRRLIY) в легкую цепь L3-11. На основании данных Biacore и последовательности антитела авторы настоящего изобретения тестировали совместную экспрессию различных комбинаций легкой цепи и тяжелой цепи:
1. Легкая цепь L3-11 + тяжелая цепь 9C12
2. Легкая цепь L3-11 + тяжелая цепь 8D9
3. Легкая цепь 7A10 + тяжелая цепь 9C12
4. Легкая цепь L3-11 + A
5. Легкая цепь 7A10 + A
9. B + тяжелая цепь 9C12
10. C + тяжелая цепь 9C12
11. D + тяжелая цепь 9C12
12. B + тяжелая цепь 8D9
13. C + тяжелая цепь 8D9
14. D + тяжелая цепь 8D9
15. B + тяжелая цепь
16. C + тяжелая цепь
17. D + тяжелая цепь
Антитела очищали из культуральных супернатантов и затем анализировали в отношении связывания с синуклеином с помощью SPR (Biacore 3000) с применением IgG, захваченных с применением Ab к IgG человека, иммобилизированных на чипе CM5 (таблица 7).
Пример 8
Образец лобной коры от пациентов с AD гомогенизировали в ледяном стерильном PBS и гомогенизировали с помощью ножевого гомогенизатора, подвергали ультразвуковой обработке с применением ультразвукового дезинтегратора Branson (5 импульсов за 0,9 секунды, выход 2) и очищали при 3000 g, 5 мин. при 4°C. Супернатанты собирали и за счет BCA определяли концентрации белков. Образцы, применяемые для определения уровня агрегатов альфа-синуклеина, содержали от 2,1 до 4,8 мкг/мкл белка. Содержание агрегатов альфа-синуклеина измеряли с применением коммерчески доступного анализа для определения агрегации альфа-синуклеина от Cisbio (№ по кат. 6FASYPEG). Содержание альфа-синуклеина, фосфорилированного по серину 129 (синуклеина-p129), маркера телец Леви, измеряли с применением планируемого к выпуску коммерчески доступного анализа для определения агрегации синуклеина-p129 от Cisbio. Оба анализа проводили согласно протоколам производителей с применением соответствующих буферов из каждого набора. Вкратце, все 10% гомогенаты последовательно разводили 1:12 и 1:72 в одном из буферов для лизиса и образец объемом 10 мкл смешивали с 10 мкл соответствующей смеси антител (5 мкл антитела, конъюгированного с криптатом Tb, и 5 мкл конъюгированного с d2) и инкубировали в течение 20 часов. FRET с временным разрешением измеряли на планшет-ридере Pherastar и для каждого образца рассчитывали соотношение сигнал-шум и нормализовали по белку.
Пятьдесят свежезамороженных образцов ткани лобной коры от пациентов с AD получали через программу донорства головного мозга и тела (Brain and Body Donation program, BBDP) от Исследовательского института здравоохранения Бэннер в Сан-Сити (Banner Sun Health Research Institute), Сан-Сити Аризона, США. Получили 25 образцов от пациентов с AD на промежуточной стадии (стадия III/IV по Braak) и 25 образцов от пациентов с AD на поздней стадии (стадия V/VI по Braak). Сообщалось, что ни один из образцов не содержал иммуногистохимических доказательств альфа-синуклеиновой патологии.
Результаты показаны на фигуре 9. Содержание агрегатов альфа-синуклеина можно было измерить для всех 50 случаев AD. На фигуре 9A первичные данные, полученные для 12- и 72-кратных разведений 10% гомогенатов головного мозга (вес/объем), демонстрируют зависимую от концентрации интенсивность сигнала. Два образца от пациентов с деменцией с тельцами Леви (DLB) включали в качестве положительных контролей (красные линии на фигуре 9A). На фигуре 9B данные, полученные для разведения 1:12, нормализованы к общему белку в образцах, при этом присутствие агрегатов альфа-синуклеина показано на аналогичных уровнях как в случае AD на промежуточной стадии (стадия III/IV по Braak), так и в случае AD на поздней стадии (стадия V/VI по Braak).
Альфа-синуклеин, фосфорилированный по серину 129, не выявили ни в одном из образцов от пациентов с AD, при этом он явно присутствовал в образцах от пациентов с DLB (фигура 9C). Альфа-синуклеин, фосфорилированный по серину 129, является маркером проявленной патологии в виде телец Леви, и гистологическое окрашивание посмертного головного мозга с помощью антител к альфа-синуклеину с фосфосерином-129 традиционно применяют для подтверждения диагноза синуклеопатий, таких как болезнь Паркинсона и DLB. Отсутствие этого маркера в 50 образцах от пациентов с AD может указывать на то, что агрегаты альфа-синуклеина всегда присутствуют в образцах головного мозга от пациентов с AD, а также, что агрегаты синуклеина могут присутствовать при отсутствии проявленной патологии в виде телец Леви.
На основании этих результатов в сочетании с результатами на фигуре 8 авторы настоящего изобретения предположили, что любое антитело к альфа-синуклеину, которое способно нейтрализовать агрегаты альфа-синуклеина (затравочные частицы) или другими способами предотвращать поступление агрегатов альфа-синуклеина в нейроны или глиальные клетки и облегчение агрегации тау-белка, будут иметь терапевтический потенциал для лечения таупатий.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Х. ЛУНДБЕКК А/С
<120> Моноклональные антитела к альфа-синуклеину для предотвращения
агрегации тау-белка
<130> 1055
<160> 121
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 1 тяжелой цепи GM37
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи GM37
<400> 2
Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи GM37
<400> 3
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи GM37
<400> 4
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 легкой цепи GM37
<400> 5
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 3 легкой цепи GM37
<400> 6
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR тяжелой цепи GM37
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr
<210> 8
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь GM 37
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эпитоп 112-117
<400> 9
Ile Leu Glu Asp Met Pro
1 5
<210> 10
<211> 140
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Альфа-синуклеин
<400> 10
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 11
<211> 165
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> A-Syn-AAKK-BAP
<400> 11
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Leu Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly
100 105 110
Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr
115 120 125
Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
145 150 155 160
Ile Glu Trp His Glu
165
<210> 12
<211> 165
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> A-Syn-BAAK-BAP
<400> 12
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly
100 105 110
Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr
115 120 125
Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
145 150 155 160
Ile Glu Trp His Glu
165
<210> 13
<211> 162
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> A-Syn-BBAA-BAP
<400> 13
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val
35 40 45
Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser
50 55 60
His Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly Ser Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
145 150 155 160
His Glu
<210> 14
<211> 165
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> A-Syn-BBKK-BAP
<400> 14
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val
35 40 45
Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser
50 55 60
His Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Leu Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly
100 105 110
Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr
115 120 125
Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly
130 135 140
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
145 150 155 160
Ile Glu Trp His Glu
165
<210> 15
<211> 141
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> A-Syn-120-140_Del-BAP
<400> 15
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu
115 120 125
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
130 135 140
<210> 16
<211> 131
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Аминокислоты 1-119 альфа-синуклеина
<400> 16
Met Ala His His His His His His Ile Glu Gly Arg Met Asp Val Phe
1 5 10 15
Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val Ala Ala Ala Glu
20 25 30
Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly
35 40 45
Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val Val His Gly Val
50 55 60
Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly
65 70 75 80
Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly
85 90 95
Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu
100 105 110
Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met
115 120 125
Pro Val Asp
130
<210> 17
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Каппа (константная область LC)
<400> 17
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 18
<211> 329
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> IgG1 (константная область HC)
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 19
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эпитоп 112-115 GM285
<400> 19
Ile Leu Glu Asp
1
<210> 20
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи GM285
<400> 20
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Thr Met Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи GM285
<400> 21
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи GM285
<400> 22
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи GM285
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи GM285
<400> 24
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи GM285
<400> 25
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 26
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> GM285 VH
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Thr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr
<210> 27
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> GM285 VL
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 329
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Константная область IgG1 GM285
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 29
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Каппа-цепь GM285
<400> 29
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 30
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь варианта 1 GM37
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr
<210> 31
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь варианта 2 GM 37
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser Gln Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr
<210> 32
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь варианта 3 GM 37
<400> 32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser His Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr
<210> 33
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 тяжелой цепи варианта 1 GM37
<400> 33
Ala Ile Arg Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 тяжелой цепи варианта 2 GM37
<400> 34
Ala Ile Arg Ser Gln Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 тяжелой цепи варианта 3 GM37
<400> 35
Ala Ile Arg Ser His Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Эпитоп связывания 9E4
<400> 36
Asn Glu Ala Tyr Glu
1 5
<210> 37
<211> 134
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Бета-синуклеин человека
<400> 37
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val
35 40 45
Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser
50 55 60
His Leu Gly Gly Ala Val Phe Ser Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu
85 90 95
Glu Val Ala Gln Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met
100 105 110
Glu Pro Glu Gly Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln
115 120 125
Glu Tyr Glu Pro Glu Ala
130
<210> 38
<211> 127
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гамма-синуклеин человека
<400> 38
Met Asp Val Phe Lys Lys Gly Phe Ser Ile Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Gly Ala Val Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Met Tyr Val Gly Ala Lys Thr Lys Glu Asn Val
35 40 45
Val Gln Ser Val Thr Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Asn
50 55 60
Ala Val Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Val Asn Thr Val Ala Thr Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Glu Ala Glu Asn Ile Ala Val Thr Ser Gly Val Val Arg
85 90 95
Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala Ser
100 105 110
Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp
115 120 125
<210> 39
<211> 140
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Ортолог альфа-синуклеина для яванского макака
<400> 39
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ile Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Gln Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 40
<211> 140
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Ортолог альфа-синуклеина для крысы
<400> 40
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Ser Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 41
<211> 140
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Ортолог альфа-синуклеина для мыши
<400> 41
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 42
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> HC 9E4
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 43
<211> 220
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> LC 9E4
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 44
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи 9E4
<400> 44
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи 9E4
<400> 45
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи 9E4
<400> 46
Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи 9E4
<400> 47
Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 48
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи 9E4
<400> 48
Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи 9E4
<400> 49
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Эпитоп 126-138 для GM63
<400> 50
Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro
1 5 10
<210> 51
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи GM63
<400> 51
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Ile Ile
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи GM63
<400> 52
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asn
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи GM63
<400> 53
Thr Arg Ala His Trp Gly Arg Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи GM63
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи GM63
<400> 55
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи GM63
<400> 56
Gln Gln Phe Lys Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 57
<211> 114
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> GM63 VH
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Ile Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ala His Trp Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr
<210> 58
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> GM63 VL
<400> 58
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Lys Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 701
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Константный домен тяжелой цепи GM63
<400> 59
Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys
1 5 10 15
Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly
35 40 45
Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala
50 55 60
Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly
65 70 75 80
Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys
85 90 95
Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys
115 120 125
Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys
130 135 140
Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys
145 150 155 160
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly
165 170 175
Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys
180 185 190
Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala
195 200 205
Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly
210 215 220
Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys
225 230 235 240
Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala
245 250 255
Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala
260 265 270
Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly
275 280 285
Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala
290 295 300
Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala
305 310 315 320
Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys
325 330 335
Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys
340 345 350
Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr
355 360 365
Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys
370 375 380
Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys
385 390 395 400
Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys
405 410 415
Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys
420 425 430
Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala
435 440 445
Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala
450 455 460
Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly
465 470 475 480
Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly
485 490 495
Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala
500 505 510
Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly
515 520 525
Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala
530 535 540
Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys
545 550 555 560
Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly
565 570 575
Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala
580 585 590
Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala
595 600 605
Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys
610 615 620
Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys
625 630 635 640
Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr
645 650 655
Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys
660 665 670
Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys
675 680 685
Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr
690 695 700
<210> 60
<211> 323
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Константный домен легкой каппа-цепи GM63
<400> 60
Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys
1 5 10 15
Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys
20 25 30
Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys
35 40 45
Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys
50 55 60
Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys
65 70 75 80
Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr
85 90 95
Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala
100 105 110
Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly
115 120 125
Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala
130 135 140
Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala
145 150 155 160
Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly
165 170 175
Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala
180 185 190
Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly
195 200 205
Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys
210 215 220
Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala
225 230 235 240
Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys
245 250 255
Cys Thr Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys
260 265 270
Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys
275 280 285
Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr
290 295 300
Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys
305 310 315 320
Thr Gly Ala
<210> 61
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Эпитоп 126-140 для 9E4
<400> 61
Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
1 5 10 15
<210> 62
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 VH
<400> 62
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 VH
<400> 63
Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 64
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 VH
<400> 64
Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 VL
<400> 65
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 VL
<400> 66
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 VL
<400> 67
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 68
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> m2E6 VH
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr
115
<210> 69
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> m2E6 VL
<400> 69
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Asp Thr Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 70
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> ch2E6 VH
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr
115
<210> 71
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> ch2E6 VL
<400> 71
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Asp Thr Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 72
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 2E6-HLD1 VH
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 73
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 2E6-HLD1 VL
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 74
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> 2E6-HLD2 VH
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 75
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 2E6-HLD2 VL
<400> 75
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 76
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> VH 2E6-HLD 3
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 77
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> VL 2E6-HLD 3
<400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Asn
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 78
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 1 легкой цепи D1.2
<400> 78
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 79
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 легкой цепи D1.2
<400> 79
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 3 легкой цепи D1.2
<400> 80
Ser Gln Ser Thr His Val Pro
1 5
<210> 81
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 1 тяжелой цепи D1.2
<400> 81
Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Ile His
1 5 10
<210> 82
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 тяжелой цепи D1.2
<400> 82
Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 83
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 3 тяжелой цепи D1.2
<400> 83
Ser Arg Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 84
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь D1.2
<400> 84
Asp Val Met Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 85
<211> 451
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь D1.2
<400> 85
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val
195 200 205
Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu
370 375 380
Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp Ile
405 410 415
Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg
420 425 430
His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 86
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 1 легкой цепи C10.2
<400> 86
Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 87
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 легкой цепи C10.2
<400> 87
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 3 легкой цепи C10.2
<400> 88
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro
1 5
<210> 89
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 1 тяжелой цепи C10.2
<400> 89
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 90
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 2 тяжелой цепи C10.2
<400> 90
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR 3 тяжелой цепи C10.2
<400> 91
Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 92
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Легкая цепь C10.2
<400> 92
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 93
<211> 439
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Тяжелая цепь C10.2
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 94
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 VL 7C4
<400> 94
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met His
1 5 10
<210> 95
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 VL 7A10/8D9
<400> 95
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 VL L3
<400> 96
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Phe
1 5
<210> 97
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR1 VH 7C4
<400> 97
Arg Tyr Trp Met His
1 5
<210> 98
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 VH 5A1
<400> 98
Arg Val Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 99
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 VH 9G11
<400> 99
Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val His Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 100
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR2 VH 9C12
<400> 100
Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 101
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 VH 5A1
<400> 101
Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Asn Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 VH 9D7
<400> 102
Leu Gly His Tyr Ser Lys Val Leu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> CDR3 VH 7A10/8D9
<400> 103
Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr
1 5 10
<210> 104
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 5A1 VL
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 5A1 VH
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Gln Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Tyr Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Thr Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 106
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 9D7 VL
<400> 106
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 9D7 VH
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Ser Lys Val Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 108
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 9G11 VL
<400> 108
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 109
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 9G11 VH
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val His Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Thr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 110
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 7C4 VL
<400> 110
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 111
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 7C4 VH
<400> 111
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 112
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> L3 VL
<400> 112
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 113
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> L3 VH
<400> 113
Gln Val Gln Leu Val Gln Gln Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 114
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 7A10 VL
<400> 114
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Asn
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 115
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 7A10 VH
<400> 115
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 116
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 8D9 VL
<400> 116
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 117
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 8D9 VH
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 118
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 9C12 VL
<400> 118
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 119
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 9C12 VH
<400> 119
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 120
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 6B6 VL
<400> 120
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> 6B6 VH
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<---