НАНОАНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИГЕН Chlamydia trachomatis, СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ Chlamydia trachomatis
NANOANTIBODIES BINDING CHLAMYDIA TRACHOMATIS ANTIGEN, METHOD OF INHIBITING INFECTION CAUSED BY CHLAMYDIA TRACHOMATIS

Область техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к получению и использованию однодоменных наноантител для детекции и блокирования инфекции, вызванной патогенными микроорганизмами, в частности Chlamydia trachomatis.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
C.trachomatis - патогенная для человека грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования. Характерный для хламидий двухфазный цикл развития включает две формы существования патогена: внеклеточные элементарные тельца и внутриклеточные ретикулярные тельца.
Урогенитальная инфекция (УГИ), вызванная С.trachomatis, является наиболее распространенной ИППП бактериальной природы как у мужчин, так и у женщин.
Среди болезней, обусловленных видом С.trachomatis, насчитывается более 20 нозологических форм, особое место среди которых занимают, так называемые, урогенитальные хламидиозы (УГХ), поражающие мочеполовой тракт человека, передающиеся половым путем. Урогенитальные хламидиозы - цервицит, уретрит, проктит, эндометрит, сальпенгит, перегепатит - у женщин; уретрит, эпидедимит, проктит, простатит - у мужчин - наиболее распространены среди населения активного полового возраста.
При бесплодии хламидии обнаруживают в 50-57% случаев. При этом наблюдают не только функциональные нарушения репродуктивной деятельности, но и вовлечение в процесс систем регуляции гомеостаза, иммунокомпетентных клеткок и др. Частота хламидийного инфицирования при трубном бесплодии составляет 41-54%. После первого случая хламидиоза риск трубного бесплодия возрастает на 10%, а после третьего - на 50%. В бесплодных браках 50-55% мужчин стерильны, из них у 64% стерильность обусловлена УГХ. Хламидии могут вызвать бесплодие в результате прямого воздействия на сперматозоиды вследствие плотного прилипания хламидии к мужским гаметам, что препятствует оплодотворению яйцеклетки. Некоторыми авторами отмечено, что развитие вторичного бесплодия у женщин при восходящей хламидийной УГИ наблюдается в 6 раз чаще, чем при гонорее.
При эктопической беременности С.trachomatis обнаруживают в 9-30% случаев. За последние годы отмечено увеличение числа хламидиоза беременных (10-40%) и новорожденных. Инфицированные женщины в 40-60% случаев передают инфекцию новорожденным.
В возрасте 15-19 лет УГХ диагностируется у 46%, в 20-24 лет - у 30%. Уровень заболеваемости достаточно высок не только среди взрослого населения и подростков, ведущих активную половую жизнь, но и среди детей младшего возраста, не живущих половой жизнью. Так, при обследовании мальчиков до 12 лет, обратившихся в детский кабинет УГИ, у 67,4% была выявлена С.trachomatis. При этом клиническая картина УГХ соответствовала уретриту, а у 7,9% детей по УЗИ имелись следы перенесенного простатита.
Очень важно, что у 75% женщин и 40% мужчин отмечено асимптомное течение заболевания, а у подростков в 30-40% случаев имеет место скрытая хламидийная инфекция, которая протекает в течение 2-5 лет. Бессимптомное течение характерно не только для урогенитальной локализации, но также для инфекций других органов. Эпидемиологическая значимость бессимптомных хламидиозов доказана еще в работах основоположника хламидиологии в России, А.А.Шаткина. Хламидии не являются представителями нормальной микрофлоры человека. Их обнаружение указывает на наличие инфекционного процесса, а отсутствие клинических симптомов заболевания определяет лишь временное равновесие, возникшее между паразитом и хозяином в условиях, ограничивающих, но не препятствующих размножению патогенного внутриклеточного микроорганизма. В этой связи хламидийная инфекция с клиническим бессимптомным течением является не менее опасной, чем ее манифестные формы и требует проведения лечебных и профилактических мероприятий. Наибольшую ответственность за распространение инфекции в настоящее время несут не выявленные, не лечащиеся или неправильно лечащиеся больные с острыми, подострыми или вяло текущими хламидийными воспалительными процессами.
Во многих развитых европейских странах и США уже более 25 лет проводятся национальные программы по контролю за УГХ, основанные на скрининговом обследовании населения групп риска, своевременном лечении, обследовании и лечении партнеров. Несмотря на эти меры, заболеваемость первичным хламидиозом и случаи повторного инфицирования продолжают возрастать.
В течение последних лет в Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем, и уступает по частоте только трихомонозу.
По данным ФГУ ЦНИИОИЗ Росздрава г.Москвы в 2004 г. заболеваемость УГХ по сравнению с 1994 г выросла в 1,7 раза (61,4 против 101,7). В 2005 г. общее количество случаев заболеваний ИППП составили 503,6 на 100000 населения, в 2006 году уменьшилось на 4,1%. Однако УГХ в 2005 году составил 95.9 на 100000 (взрослые) и 3,1 на 100000 (дети); в 2006 году 97,2 на 100000; в 2007 году 91,1 на 100000 (взрослые) и 3,2 на 100000 (дети).
В 2008 году зарегистрировано 611634 случая заболеваний инфекциями, передаваемыми половым путем, что составило 403,5 на 100000 населения. Хламидийная инфекция составила 20,8%. За последние 3 года в целом по России прослеживается снижение числа больных ИППП, в том числе хламидийной инфекцией на 8,4%. Заболеваемость хламидийной инфекцией в России в 2008 году составила 89,5 на 1000000 взрослого населения и 2,8 на 100000 (дети).
Таким образом, медико-социальное значение хламидийной инфекции обусловлено, в первую очередь, высоким уровнем заболеваемости и часто возникающими осложнениями, а также влиянием на демографические показатели в связи с тем, что УГХ - самая частая причина женского и мужского бесплодия.
Лечение урогенитального хламидиоза представляет собой наиболее сложный аспект рассматриваемой проблемы, что связано и с особенностями возбудителя инфекции и с циклом его развития, а также с тем, что в 70% случаев хламидиоз сочетается с другой инфекцией: уреаплазмой, вирусом простого герпеса, гарднереллой и др. Этиотропная терапия основана на чувствительности хламидий к антибиотикам. Вполне обоснованно широкое распространение в лечении хламидиоза получили антибиотики тетрациклинового ряда: доксициклин, метациклин, миноциклин, тетрациклин. Согласно рекомендациям ВОЗ: доксициклин 100 мг перорально 2 раза в день или тетрациклин 500 мг перорально 4 раза в день, курс лечения 7 дней. Необходимо отметить, что за последнее время количество случаев неэффективного лечения значительно возросло, что, возможно, связано с развитием устойчивости возбудителя к антибиотику в популяции. По-видимому, дозы и длительность лечения необходимо корректировать в зависимости от течения урогенитального хламидиоза (острое или хроническое, восходящая инфекция, рецидив и т.д.). Наибольшие разногласия исследователей связаны с применением антибиотиков фторхинолонового ряда: офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин. Одни авторы сообщают об успешной терапии офлоксацином в 81-100% случаев (200-300 мг перорально 2 раза в день в течение 7 дней); другие отмечают высокий процент неудач и худшие отдаленные результаты.
Лечение хронических, осложненных форм хламидиоза представляет очень серьезную и нерешенную в настоящее время проблему. Это, в первую очередь, связано с тем, что при хронизации инфекционного процесса в организме образуются, так называемые, персистирующие формы хламидий - формы патогена, адаптированные к длительному выживанию и утратившие чувствительность к антибиотикам. Поэтому лечение антибиотиками хронических форм урогенитального хламидиоза, как показали многочисленные клинические и микробиологические исследования, неэффективно. Такая ситуация диктует необходимость разработки новых антибактериальных препаратов, механизм действия которых будет принципиально отличаться от воздействия антибиотиков.
В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести мышиные моноклональные антитела к основному белку наружной мембраны (МОМР) C.trachomatis. Антитела были получены по стандартной методике получения моноклональных антител на основе гибридомной технологии при иммунизации мышей. Полученные антитела связывались с МОМР C.trachomatis, распознавая эпитопы, локализованные на поверхности хламидийной клетки. В опытах in vivo антитела снижали токсичность возбудителя для мышей.
Zhang, Y.-X., S.J.Stewart, and H.D.Caldwell. Protective monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis serovar- and serogroup-specific major outer membrane protein determinants. / Протективные моноклональные антитела к Chlamydia trachomatis, специфичные в отношении к сероваро- и серогруппоспецифических детерминант основного белка наружной мембраны. Infect. Immun. 1989, 57:636-638 (ПРИЛОЖЕНИЕ 1)
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества фармацевтической композиции и способу его использования, выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.
Недостатками прототипа являются:
1) Относительно дорогостоящее производство антител, сложность поддержания и хранения продуцента, очень высокие требования к качеству используемых реактивов и условий культивирования.
2) Относительно большой размер, что влечет за собой пониженную проницаемость тканей.
3) Структурные особенности накладывают ограничение на узнавание некоторых «скрытых» эпитопов, таких как находящихся в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.
4) Ограниченность и относительная трудоемкость генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, сложность создания многовалентных и многофункциональных производных.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител - антиген-узнающих молекул, лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих хламидии трахоматис (C.trachomatis).
Задачей настоящего изобретения является создание новых антител, способных эффективно связывать антигены хламидии C.trachomatis и ингибировать развитие хламидийной инфекции. Их получение, производство и хранение должны быть экономичны, эффективны и относительно просты. Размер должен быть существенно меньше, чем у классических антител.
Поставленная задача решается за счет того, что создано наноантитело, специфически связывающее поверхностный антиген Chlamydia trachomatis и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Создано также наноантитело, специфически связывающее поверхностный антиген Chlamydia trachomatis и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Наноантитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, подавляет развитие хламидийной инфекции, вызванной хламидией C.trachomatis. Наноантитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, подавляет развитие хламидийной инфекции, вызванной хламидией C.trachomatis. Заявлен способ подавления развития хламидийной инфекции in vitro, вызванной хламидией C.trachomatis, включающий в себя предварительную обработку элементарных телец хламидии C.trachomatis терапевтически эффективным количеством наноантитела, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, перед их добавлением к инфицируемым клеткам-мишеням. Заявлен также способ подавления развития хламидийной инфекции in vitro, вызванной хламидией C.trachomatis, включающий в себя предварительную обработку элементарных телец хламидии C.trachomatis терапевтически эффективным количеством наноантитела, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, перед их добавлением к инфицируемым клеткам-мишеням.
В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, кои рассматриваются в качестве прототипа, а малые наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела с молекулярной массой около 12-15 кДа на порядок меньше по размеру традиционных антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Существует эффективные способы получения и селекции таких антител в отношении различных антигенов, а благодаря своей низкой иммуногенности наноантитела могут применятся для лечения инфекций, вызванных патогенами данной группы.
Полным эквивалентом термина "наноантитела" для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX «NANOBODY», а также «однодоменное мини-антитело» и «однодоменное наноантитело».
Рекомбинантные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства Верблюдовых (и у некоторых видов хрящевых рыб). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса lgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (-листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти [Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. / «Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов». TIBS 2001; 26: 230-235]. В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако, имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3). При исследовании кристаллических структур VHH было показано, что эти цистеиновые остатки формируют дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком VHH являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае VH домена является высоко консервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом VL легкой цепи. VHH-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию VHH и VL. Эти замены также объясняют высокую растворимость VHH, наноантитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка [Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].
По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.
Характерными особенностями наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии, являются следующие [см. обзор: Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].
1) Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.
2) Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа, улучшенная проницаемость клеток.
3) Структурные особенности, а именно, способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.
4) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры). Возможна их наработка в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.
5) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.
6) Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.
Возможность получения рекомбинантных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина без легких цепей, специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом [Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. / «Существующие в природе антитела без легких цепей». Nature 1993; 363: 446-448]. Техническая реализация отбора наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага - «фаговый дисплей».
Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов [Brissette R & Goldstein Nl. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. / «Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаметальных исследований и исследований трансляции». Methods Mol Biol. 2007; 383: 203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces./ «Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов». Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 481-7]. Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов [Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries./ «Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител». Nat Biotechnol. 2005; 23: 1105-16]. Обычно, вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменениями. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к аггрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.
Наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцией антигенов, как в исследовательских, так и в диагностических целях, блокированием активности белка-антигена, специфической доставкой за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом. Также, наноантитела могут быть исходными модулями - блоками - более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также: комбинированное объединение в одну конструкцию наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов [Conrath КЕ, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. / «Верблюжьи однодоменные антитела в качестве модулярныйх строительных единиц в биспецифичных и бивалентных конструкциях антител». J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents./ «Пентамеризация однодоменных антител из фаговых библиотек: новая стратегия быстрого получения реагентов антител с высокой авидностью». J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1); 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. / «Эффективная раковая терапия конъюгатами на основе нанотел». Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stijiemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor. / «Экспериментальная терапия африканской трипаносомии с помощью человеческого трипанолитического фактора, конъюгиованного с наотелом». Nat. Med. 2006 May; 12 (5): 580-4; Coppieters K, Dreier Т, Silence К, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. / «Форматированные анти-TNFalpha VHH-белков, выделенные из верблюдовых, демонстрируют высокое сродство к воспаленным суставам в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита». Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66]; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы [Harbury P.В., Zhang T.,Kim P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. / «Перключение между двух-, трех- и четырех-цепочечными спиральными структурами в мутантах GCN4-«лейциновой молнии»». Science, 1993, 262: 1401-1407; Shirashi Т., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. / «Усиленная цитотоксичность растворимого Fas-лиганда вследствие его соединения с мотивом «изолейциновой молнии»». Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; ChenchikA., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides./ «Реагенты и методы для получения биоактивных секретируемых пептидов». 2010. US Patent Application 20100305002], или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы [Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. / «Дизайн мультивалентных комплексов используя модуль барназа-барстар». Nat Biotechnol. 2003, 21(12): 1486-92.].
Также было показано [Vincke С., Loris R., Saerens D., et al. // J.Biol.Chem. 2009. V.284. №5. P.3273-3284], что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / «Однодоменные антитела: многообещающие экспериментльные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета». Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].
Раскрытие изобретения.
Способ получения наноантител, связывающих антигены хламидии C.trachomatis, проводят на основании селекции методом фагового дисплея, генно-инженерных модификаций кодирующих эти антитела последовательностей и использования в качестве продуцента действующего вещества (антитела) бактерии E.coli. Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.
Несмотря на то, что, главным образом, в иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.
Способ получения наноантител описан в примерах 1 и 2. Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:
1) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры.
2) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.
3) Высокая экономическая рентабельность производства.
Авторы настоящего изобретения исходили из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности наноантител, могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования. Так, наноантитела могут быть исходными модулями-блоками - более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата наноантитела, например, увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами наноантител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином «наноантитела» как первичные, исходно получаемые, «минимальные» аминокислотные последовательности наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптации или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.
Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках, указанных в перечне последовательностей как CDR, на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты консервативных замен.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное наноантитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.
Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают
мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.
Полипептиды наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более, чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, и подпадающих под объем настоящего изобретения.
Получение функционально-активных наноантител, распознающих антигены хламидии C.trachomatis, показано в примерах 3, 4.
Эффективность ингибирующего действия терапевтически эффективного количества наноантител на развитие хламидийной инфекции продемонстрирована примере 5.
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности двух отобранных наноантител, aCt1 и aCt2, полученные параллельно одним и тем же способом и обладающие искомыми свойствами: способностью специфически связывать Chlamydia trachomatis. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие два отобранных наноантитела были определены для aCt1 - SEQ ID NO: 1; для aCt2 - SEQ ID NO: 3, и из них были выведены соответствующие аминокислотные последовательности отбранных наноантител: для aCt1 - SEQ ID NO: 2; для aCt2 - SEQ ID NO: 4. В указанных последовательностях подчеркнуты соответственно слева направо, от N- к С-концу гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 антигенузнающих последовательностей отобранных наноантител. Стрелками указаны позиции аминокислотных остатков, являющихся характеристическими для вариабельных доменов особых одноцепочечных антител, отличающихся от остатков в вариабельных доменах тяжелых цепей классических антител.
На фиг.2 представлены результаты микроиммунофлуоресцентного (МИФ) анализа, демонстрирующего специфическое связывание C.trachomatis наноантителами aCt1 и aCt2. Детекцию связавшихся наноантител проводили с помощью анти-НА антител мыши и вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Специфическое связывание характеризуется ярко-зеленым свечением. Х 1500, где,
А - микрофотографии результатов МИФ с aCt1 (10 мкг/мл)
Б - микрофотографии результатов МИФ с aCt2 (10 мкг/мл)
1 - C.trachomatis, 2 - белок овальбумин, 3 - C.pneumoniae, 4 - C.mundarum, 5 - C.psittaci.
На фиг.3 представлены результаты анализа специфического связывания однодоменных наноантител специфически с C.trachomatis, формирующей внутриклеточные включения в эукариотических клетках, где,
1 - клетки МсСоу, инфицированные C.trachomatis и окрашенные наноантителами aCt1 2 - неинфицированные клетки МсСоу окрашенные наноантителами aCt1
3 - клетки МсСоу, инфицированные C.trachomatis и окрашенные наноантителами aCt2
4 - неинфицированные клетки МсСоу окрашенные наноантителами aCt2
На фиг.4 представлены результаты анализа ингибирующего действия наноантител aCt1 и aCt2 на C.trachomatis in vitro в реакции нейтрализации внеклеточных форм - элементарных телец хламидий.
1 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis (контроль)
2 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
1 мкг/мл aCt1
3 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
5 м кг/мл aCt1
4 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
10 мкг/мл aCt1
5 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
1 мкг/мл aCt2
6 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
5 мкг/мл aCt2
7 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
10 мкг/мл aCt2
Примеры осуществления настоящего изобретения
Пример 1
Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител
Иммунизация.
Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда. В качестве антигена использовали препарат нативных очищенных элементарных телец C.trachomatis штамма Bu-434 (целые бактериальные клетки), инактивированных УФ-облучением и препарат комплекса белков наружной мембраны клеточной стенки C.trachomatis штамма Bu-434 без ЛПС. Вторую иммунизацию проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще две иммунизации. Взятие крови (150 мл) проводили через 6 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (100 ед./мл) и ЭДТА (3 мМ).
Кровь разводили в 2 раза стандартным солевым раствором (PBS), содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800×g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.
Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем, на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.
-
15
Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу [Sambrook et al., 1989] с использованием обратной транскриптазы HM-MuLV и праймера олиго(dT) в качестве затравки.
Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol(Pstl) и Notl в фагмидный вектор, как описано ранее [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006]. Процедедуру селекции проводили также аналогично тем, что в указанных работах. Она базировалась на методе фагового дисплея, в которой в качестве фага-помощника использовали бактериофаг M13KO7 (New England Biolabs, США).
Пример 2
Селекция наноантител, специфически узнающих C.trachomatis
Селекцию наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием 2-х препаратов: очищенных элементарных телец C.trachomatis Bu-434 и комплекса белков наружной мембраны клеточной стенки C.trachomatis штамма Bu-434 без ЛПС, иммобилизованных на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген однодоменного наноантитела внутри, а экспрессирующееся однодоменное наноантитело - в составе поверхностного фагового белка pIII) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили как описано в публикациях Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman С., Atarhouch Т., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448.; Nguyen V.K., DesmyterA., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K.J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].
Последовательности клонов отобранных наноантител группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (Hinfl, Mspl, Rsal). Последовательности кДНК наноантител (SEQ ID NO: 1 и 3) были определены (фиг.1). В указанных последовательностях подчеркнуты соответственно (слева направо) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 антиген-узнающих последовательностей отобранных наноантител.
Продукция нанонтител
Последовательности кДНК отобранного наноантитела переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор - модифицированный вектор pHEN6 [Conrath KE, Lauwereys M, Galleni M, Matagne A, Frere JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. / «Бэта-лактомазные ингибиторы, происходящие из фрагментов однодоменных антител, индуцированных у Верблюдовых». Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: 2807-12] позволяющий присоединение к С-концу наноантитела (His)6-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом, кодируемым в векторе pHEN6). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (pelB) нарабатываемый рекомбинантный белок (наноантитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию наноантител проводили в Е. coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).
Пример 3
Демонстрация специфичности связывания наноантител aCt1 и aCt2 с C.trachomatis.
Способность однодоменных наноантител специфично связывать антигены C.trachomatis проверяли с использованием метода микроиммунофлуоресцентного анализа (МИФ) с иммобилизованными антигенами C.trachomatis, C.pneumoniae, С.muridarum, C.psittaci no стандартному протоколу (К.Persson, J.Boman. Comparison of Five Serologic Tests for Diagnosis of Acute Infections by Chlamydia pneumoniae / Сравнение пяти серологических тестов для диагностики острых инфекций, вызванных Chlamydia pneumoniae. Clin. Diagn. Lab. Immunology, 2000, Vol.7, No.5, p.739-740). (ПРИЛОЖЕНИЕ 2) В качестве негативного контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур (неспецифический белок). Детекцию связавшихся aCt1 и aCt2 проводили с помощью анти-НА антител мыши, вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Результаты оценивали при просмотре в люминесцентном микроскопе при увеличении 1500. В случае специфического связывания антител с антигеном наблюдается ярко-зеленое свечение.
На фиг.2 представлены результаты анализа, из которых следует, что наноантитела специфически связываются с иммобилизованными антигенами C.trachomatis, но не связываются с C.pneumoniae, C.muridarum, C.psittaci.
А - микрофотографии результатов МИФ с aCt1 (10 мкг/мл)
Б - микрофотографии результатов МИФ с aCt2 (10 мкг/мл)
2 - C.trachomatis, 2 - белок овальбумин, 3 - C.pneumoniae, 4 - C.muridarum, 5 - C.psittaci.
В случае иммобилизованного антигена C.trachomatis на фрагментах рисунка А1 и Б1 наблюдается ярко-зеленое свечение, характерное для ФИТЦ, что свидетельствует о положительной реакции связывания наноантител aCt1 и aCt2 с клетками C.trachomatis. В случае других иммобилизованных антигенов (A3, А4, А5), отрицательного контроля (А2) для наноантител aCt1, а также антигенов (Б3, Б4, Б5), отрицательного контроля (Б2) для наноантител aCt2 свечение не наблюдается. Это свидетельствует об отсутствии связывания выбранных наноантител с антигенами хламидий других видов и об отсутствии неспецифического связывания с белком овальбумином.
Пример 4
Демонстрация связывания наноантител aCt1 и aCt2 эукариотическими клетками, инфицированными C.trachomatis in vitro.
Эукариотическая культура клеток МсСоу была заражена C.trachomatis по стандартной методике (Bashmakov YK, Zigangirova NA, Pashko YP, Kapotina LN, Petyaev IM. Chlamydia trachomatis growth inhibition and restoration of LDL-receptor level in HepG2 cells treated with mevastatin/ Ингибирование роста Chlamydia trachomatis и восстановление уровня рецепторов ЛНП в клетках HepG2, обработанных мевастатином. Comp Hepatol., 2010, 28; 9:4). (ПРИЛОЖЕНИЕ 3). Суточный монослой клеток заражали штаммом C.trachomatis Bu-434 внесением культуры C.trachomatis в культуральную среду с последующим центрифугированием. Клетки инкубировали при 37°С в течение 48 часов. Затем клетки фиксировали ацетоном. Способность наноантител aCt1 и aCt2 связываться с C.trachomatis, формирующей внутриклеточные включения в эукариотических клетках, проверяли с использованием метода иммунофлуоресцентного анализа по стандартному протоколу. В качестве контроля использовали фиксированные незараженные клетки. Детекцию связавшихся aCt1 и aCt2 проводили с помощью анти-НА антител мыши и вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). В случае специфического связывания антител с хламидиями в инфицированных эукариотических клетках выявляются вакуоли, называемые включениями, содержащие хламидии и имеющие ярко-зеленое свечение.
На фиг.3 представлены результаты анализа, из которых следует, что однодоменные наноантитела специфически связываются с C.trachomatis, формирующей внутриклеточные включения в эукариотических клетках, но не связываются с незараженными клетками.
1 - клетки МсСоу, инфицированные C.trachomatis и окрашенные наноантителами aCt1 2 - неинфицированные клетки МсСоу окрашенные наноантителами aCt1
3 - клетки МсСоу, инфицированные C.trachomatis и окрашенные наноантителами aCt2
4 - неинфицированные клетки МсСоу окрашенные наноантителами aCt2
На фрагментах 1 и 3 внутри инфицированных клеток выявляются хламидийные включения, имеющие ярко-зеленое свечение. На фрагментах 2 и 4 свечение в неинфицированных клетках отсутствует. Это свидетельствует о специфическом связывании наноантител aCt1 и aCt2 с C.trachomatis, в цитоплазме инфицированных клеток.
Таким образом, заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции доказали свою применимость для детекции C.trachomatis in vitro.
Пример 5
Демонстрация эффективности ингибирующего действия наноантител aCt1 и aCt2 на развитие хламидийной инфекции.
5
Для демонстрации эффективности ингибирующего действия наноантител на развитие хламидийной инфекции в культуре клеток оценивали нейтрализующий эффект наноантител на внеклеточные формы C.trachomatis - элементарные тельца. Для этого наноантитела разводили в ФСБ. C.trachomatis (10 ВОЕ) добавляли к разведениям наноантител и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. После этого прединкубированные элементарные тельца наносили на монослой клеток МсСоу, клетки центрифугировали 1 час при 1500 об/мин и инкубировали в течение 48 часов в среде DMEM с циклогексимидом (1 мг/мл). Клетки фиксировали ацетоном, после чего окрашивали моноклональными антителами к белку МОМР C.trachomatis конъюгированными с ФИТЦ с добавлением синьки Эванса. Препараты просматривали в люминесцентном микроскопе при увеличении 1500. Хламидийные внутриклеточные включения выявляются в виде вакуолей, имеющих ярко-зеленое свечение, на фоне красных клеток.
На фиг.4 представлены результаты характеристики ингибирующего действия наноантител на C.trachomatis in vitro в реакции нейтрализации внеклеточных форм - элементарных телец хламидий.
1 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения (контроль)
2 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
1 мкг/мл aCt1
3 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
5 мкг/мл aCt1
4 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
10 мкг/мл aCt1
5 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
1 мкг/мл aCt2
6 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
5 мкг/мл aCt2
7 - клетки МсСоу через 48 часов после заражения C.trachomatis, прединкубированной с
10 мкг/мл aCt2
B контрольном препарате через 48 часов после заражения C.trachomatis в клетках выявляются крупные внутриклеточные хламидийные включения, имеющие ярко-зеленое свечение. В случае прединкубации элементарных телец C.trachomatis с наноантителами aCt1 и aCt2 при концентрациях наноантител 5 и 10 мкг/мл, наблюдается значительное снижение количества включений в монослое клеток, а также уменьшение их размеров при сравнении с контролем.
Таким образом, продемонстрировано ингибирующее действие наноантител aCt1 и aCt2 на внутриклеточное развитие C.trachomatis in vitro.
Таким образом, приведенные примеры с иллюстрациями подтверждают выполнение задачи настоящего изобретения, а именно, создание новых антител, способных эффективно связывать антигены хламидии C.trachomatis и ингибировать развитие хламидийной инфекции. Эти новые антитела обладают следующими преимуществами по отношению к прототипу (классическому моноклональному антителу): их получение, производство и хранение более экономично, они эффективны и относительно просты; их размер существенно меньше, чем у классических антител; они обладают новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных анител эпитопы; особенности их компактной структуры должны приводить к относительной простоте всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможности создания на их основе различных многовалентных и многофункциональных производных.