ПРОТОКОЛ СМЕШАННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ ДЛЯ УСТРОЙСТВА МАГНИТНОГО БИОДАТЧИКА
COMPOUND EXCITATION PROTOCOL FOR MAGNETIC BIOSENSOR DEVICE

Область изобретения
Изобретение относится к устройствам магнитного биодатчика, в частности к приведению магнитных частиц в движение к чувствительной поверхности устройства биодатчика.
Предпосылки изобретения
В наши дни все больше растет спрос на биодатчики. Обычно биодатчики обеспечивают возможность обнаружения данной специфической молекулы в пределах аналита, причем количество или концентрация упомянутой молекулы-мишени типично является небольшим(ой). Например, может быть измерено количество лекарств или сердечных маркеров в слюне или крови. Лекарства, допускающие злоупотребление, обычно являются небольшими молекулами, которые обладают лишь одним эпитопом и по этой причине не могут быть обнаружены, например, при помощи сэндвич-анализа. Конкурентный анализ или анализ ингибирования является предпочтительным способом обнаружения этих молекул. Хорошо известная схема конкурентного анализа заключается в том, чтобы присоединить интересующие молекулы-мишени на поверхность и связать антитела с меткой или меткой обнаружения, которая может быть ферментом, флуорофором или магнитными шариками. Эта система используется для выполнения конкурентного анализа между молекулами-мишенями из образца и молекулами-мишенями на поверхности, используя помеченные антитела. Для исследования на дороге анализ должен быть быстрым и надежным.
В биодатчике магнитных меток измерение присутствия конкретных биохимических агентов, таких как лекарства или сердечные маркеры, основывается на молекулярном захвате и пометке магнитными частицами или шариками. Магнитное притяжение шариков, также называемое возбуждением, является существенным для того, чтобы увеличить производительность, т.е. скорость, биодатчика для применений в точке оказания помощи. Направление магнитного притяжения может быть либо к поверхности, где осуществляется фактическое измерение, либо от этой поверхности. В первом случае магнитное возбуждение обеспечивает повышение концентрации магнитных частиц около чувствительной поверхности, ускоряя процесс связывания магнитных частиц на чувствительной поверхности. Во втором случае частицы удаляются от поверхности, что называется магнитной очисткой. Магнитная очистка может заменить традиционный этап жидкостной очистки. Она является более точной и уменьшает число рабочих действий.
В типичной установке устройства магнитного биодатчика, такого как устройство биодатчика на основе нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО), магнитные шарики размещаются в измерительной камере картриджа датчика. По меньшей мере один участок чувствительной поверхности в измерительной камере датчика подготавливается для обнаружения молекул-мишеней. Для выполнения исследования картридж размещается в считывателе, содержащем магнитные блоки для генерации магнитного поля у чувствительной поверхности и средство обнаружения для обнаружения присутствия магнитных шариков около чувствительной поверхности. Когда картридж помещен в считыватель, для увеличения скорости реакции молекул-мишеней в жидкости, которая введена в картридж, магнитные блоки, размещенные под картриджем, генерируют магнитное поле для притягивания шариков к чувствительной поверхности.
Из-за магнитного притяжения число магнитных шариков около чувствительной поверхности устройства биодатчика увеличивается, и сигнал датчика увеличивается во времени. Для притяжения частиц к поверхности может быть использовано так называемое расписание импульсного магнитного притягивания. В такой схеме магнитное поле периодически включают и выключают, как описано, например, в WO 2008/102218 A1. Когда магнитное поле включено, шарики притягиваются по направлению к области, близкой к поверхности. Когда магнитное поле выключено, шарики будут диффундировать к поверхности или от поверхности, в зависимости от их исходного местоположения. Во время измерений в целом наблюдается, что при такой импульсной схеме притягивания сигнал около центра притягивающего магнита увеличивается быстрее, чем сигнал около одного из полюсных наконечников магнита.
Этот эффект замедляет общую скорость анализа, так как на эту скорость доминирующее влияние оказывают местоположения около полюсных наконечников. На практике эту проблему можно обойти, используя лишь несколько местоположений или интересующих областей около центра магнита. Это не является ограничением в том случае, когда следует измерить только один тип молекул-мишеней. Однако в случае многоаналитных анализов или многокамерных конфигураций это является ограничением.
Сущность изобретения
Существует потребность в увеличении общей скорости и/или равномерности оптического сигнала в устройстве магнитного биодатчика. В частности, многоаналитные анализы или многокамерные конфигурации должны стать возможными при использовании текущей конфигурации аппаратных средств.
Согласно настоящему изобретению предусмотрено устройство магнитного биодатчика, содержащее картридж датчика для приема подлежащей исследованию пробы, электромагнитный блок для создания магнитного поля у чувствительной поверхности картриджа датчика и средство обнаружения для обнаружения присутствия магнитных частиц вблизи чувствительной поверхности. Электромагнитный блок выполнен с возможностью создавать магнитное поле, имеющее по меньшей мере первую и вторую напряженность магнитного поля, прикладываемого для притяжения шариков к чувствительной поверхности. Отношение величины времени прикладывания первой напряженности магнитного поля к величине времени полного периода прикладывания первой и второй напряженности магнитного поля изменяется во время измерения. В случае, когда вторая напряженность магнитного поля равна нулю, тогда как первая напряженность магнитного поля равна заданной напряженности поля, притягивающей шарики к чувствительной поверхности, это отношение называется продолжительностью включения. Таким образом, продолжительность включения меняется определенным образом во время измерения.
В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения отношение величины времени прикладывания первой напряженности магнитного поля к величине времени периода прикладывания первой и второй напряженности поля уменьшается во время измерения. Изменение отношения во время измерения может выполняться непрерывным образом или пошаговым образом, имея по меньшей мере одно заданное отношение в начале измерения и другое заданное отношение в конце измерения.
Предпочтительно, отношение в начале измерения составляет больше, чем 50%, предпочтительно 85%, тогда как отношение в конце измерения составляет меньше, чем 50%, предпочтительно примерно 15%.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения средство обнаружения, содержащееся в устройстве магнитного биодатчика, содержит источник света для направления света на чувствительную поверхность под углом полного внутреннего отражения и детектор для обнаружения света, отраженного от чувствительной поверхности. То есть устройство магнитного биодатчика основано на измерении нарушенного полного внутреннего отражения.
Другой пример изобретения описывает первый электромагнитный блок, который генерирует первую напряженность магнитного поля, по существу перпендикулярную чувствительной поверхности, и второй электромагнитный блок, который генерирует вторую напряженность магнитного поля, по существу параллельную чувствительной поверхности, причем первый и второй электромагнитные блоки выполнены с возможностью поочередно создавать первую напряженность магнитного поля и вторую напряженность магнитного поля соответственно с некоторым периодом времени между генерацией первой напряженности магнитного поля и второй напряженности магнитного поля, в котором никакого магнитного поля не генерируется. Эта конфигурация последовательно обеспечивает напряженность магнитного поля, по существу параллельную чувствительной поверхности, при помощи второго электромагнитного блока и напряженность магнитного поля, по существу перпендикулярную чувствительной поверхности, при помощи первого электромагнитного блока. Оказалось выгодным, когда оба электромагнитных блока бездействуют в течение некоторого времени между теми моментами, когда первый и второй электромагнитные блоки включены для создания соответствующего магнитного поля. Таким образом, временная последовательность описывается тремя этапами, причем первый этап - это импульс поля, параллельный чувствительной поверхности, второй этап - это импульс поля, перпендикулярный поверхности, а третий этап - это некоторая длительность времени, меньшая, чем другие длительности импульсов, без приложенного магнитного поля. При помощи описанного трехэтапного способа и соответствующего устройства достигается эффект рандомизации и перемешивания магнитных частиц, которые равномерно растворены в текучей среде.
Более того, настоящее изобретение предусматривает способ притягивания магнитных шариков в устройстве магнитного биодатчика.
Эти и другие аспекты изобретения будут очевидны из описанных ниже вариантов воплощения и будут объяснены со ссылкой на них.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 иллюстрирует процесс кластеризации магнитных шариков во время непрерывного притягивания к чувствительной поверхности;
Фигура 2 схематично показывает направление линий магнитного поля, типично создаваемого у чувствительной поверхности устройства магнитного биодатчика;
Фигура 3 показывает оптические сигналы, записанные в центре магнитного блока в устройстве магнитного биодатчика с использованием различных протоколов возбуждения;
Фигура 4 показывает отношение сигналов, записанных в центре и у полюсных наконечников магнитного блока в устройстве магнитного биодатчика с использованием различных протоколов возбуждения;
Фигура 5 показывает схематичный вид примера изобретения с чувствительной поверхностью, одним электромагнитным блоком над чувствительной поверхностью, одним электромагнитным блоком под чувствительной поверхностью и двумя электромагнитными блоками по сторонам чувствительной поверхности для того, чтобы обеспечить возможность магнитного возбуждения с различными направлениями сил по отношению к чувствительной поверхности; и
Фигура 6 показывает кривую, полученную при помощи примера оптического обнаружения биодатчиком и минимизации неспецифических связей, показанных как падение кривой.
Подробное описание вариантов воплощения
Причина того, почему в устройстве магнитного биодатчика протокол импульсного возбуждения работает лучше, чем протокол непрерывного магнитного возбуждения при условии, что оба способа потребляют одинаковое количество энергии, может быть объяснена следующим.
На первый взгляд, можно предположить, что непрерывное магнитное возбуждение лучше, чем импульсное возбуждение, поскольку магнитные шарики притягиваются к поверхности в течение большего количества времени. Но это является верным лишь отчасти. Действительно, за одинаковое количество времени при непрерывном притяжении около чувствительной поверхности 2 собирают больше магнитных частиц 10, также называемых шариками или частицами в последующем. Однако, исходя из экспериментов, было показано, что лишь небольшая доля частиц 10, которые собраны около поверхности, будут фактически способны достигнуть поверхности и связаться с нею. Это вызвано магнитным взаимодействием шарик-шарик, как проиллюстрировано на Фиг.1.
На Фиг.1 схематично показана нижняя стенка 1 измерительной камеры в картридже 1 датчика для магнитного биодатчика. Термин «магнитный биодатчик» определен здесь как датчик, содержащий биологическую пробу, в котором магнитные частицы 10 принимают участие в процессе связывания подлежащих обнаружению аналитов с биологической пробой, что хорошо известно в данной области техники. Стенка 1 образует чувствительную поверхность 2 измерительной камеры. Под чувствительной поверхностью 2 размещается электромагнитный блок, который типично образован двумя полюсными наконечниками, расположенными близко к краям чувствительной поверхности (см. также полюсные наконечники 3, показанные на Фиг.2). При прикладывании магнитной силы, как проиллюстрировано стрелкой 11, шарики 10 притягиваются к чувствительной поверхности 2. Как только поверхность 2 покрывается определенным количеством шариков 10, например, приблизительно 10% в центре, а еще меньше около полюсных наконечников 3 близко к краю чувствительной поверхности 2, приближающиеся к поверхности 2 шарики 10 будут притянуты шариками 10, которые уже присутствуют на поверхности 2, из-за силы магнитного возбуждения. Этот процесс известен как «кластеризация». Так как магнитное поле образовывает угол с поверхностью, кластеризованные шарики 10 будут находится вне области 21 обнаружения чувствительной поверхности 2, т.е. рассеянного поля в случае биодатчика на основе НПВО.
ON
OFF
Таким образом, хотя эти шарики 10 притянуты магнитным полем, они не придут в контакт с поверхностью 2, а следовательно, не смогут соединиться с поверхностью 2. Только когда магнитное поле выключено, кластеризованные шарики 10 будут высвобождены и за счет диффузии смогут прийти в контакт с поверхностью 2. Когда магнитное поле включено непрерывно, кластеризованные шарики 10 никогда не придут в контакт с поверхностью, и сигнал останется слабым, типично только 3-10% от доступного 100%-го сигнала. Поэтому для протокола импульсного возбуждения важны как время притяжения t, так и время, когда магнитное поле выключено, t.
ON
ON
OFF
В течение времени притяжения шарики переносятся в область около поверхности, где концентрация шариков увеличивается. В течение того времени, когда магнитное поле выключено, шарики могут фактически достигать поверхности за счет диффузии и связываться. Отношение t/(t+t) называется «продолжительностью включения» (от англ. "duty-cycle", DC) протокола возбуждения. Для того, чтобы быстро добиться сильного сигнала, число шариков, перенесенных в область около поверхности во время фазы включения, должно совпадать с числом шариков, перенесенных к поверхности посредством диффузии во время фазы выключения. Это может быть задано в виде следующего уравнения:
<mrow><msub><mi>R</mi><mrow><mi>O</mi><mi>N</mi></mrow></msub><mo>⋅</mo><msub><mi>t</mi><mrow><mi>O</mi><mi>N</mi></mrow></msub><mo>=</mo><msub><mi>R</mi><mrow><mi>O</mi><mi>F</mi><mi>F</mi></mrow></msub><mo>⋅</mo><msub><mi>t</mi><mrow><mi>O</mi><mi>F</mi><mi>F</mi></mrow></msub><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>1</mn><mo stretchy="false">)</mo><mo>,</mo></mrow>
ON
OFF
где R и R соответственно являются коэффициентами переноса, выраженными в шариках/сек, во время фазы включения (ON) и фазы выключения (OFF), т.е. коэффициентами переноса во время магнитного притяжения и диффузии. Поэтому оптимальная продолжительность включения импульсного сигнала может быть выражена в коэффициентах переноса:
<mrow><mfrac><mrow><msub><mi>R</mi><mrow><mi>O</mi><mi>F</mi><mi>F</mi></mrow></msub></mrow><mrow><msub><mi>R</mi><mrow><mi>O</mi><mi>N</mi></mrow></msub><mo>+</mo><msub><mi>R</mi><mrow><mi>O</mi><mi>F</mi><mi>F</mi></mrow></msub></mrow></mfrac><mo>=</mo><mi>D</mi><mi>C</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>2</mn><mo stretchy="false">)</mo><mo>.</mo><mtext> </mtext></mrow>
Это уравнение показывает, что продолжительность включения импульсного сигнала возбуждения является важной и должна быть оптимизирована, учитывая коэффициенты переноса в системе.
OFF
Как проиллюстрировано на Фиг.2, магнитное поле притягивающего магнита пересекает поверхность 2 под определенным углом. Этот угол является нулевым точно между полюсными наконечниками 3 идеального магнита и может быть равным нескольким десяткам градусов, например 30 градусам, около полюсных наконечников 3. Поэтому в центре направление магнитного поля параллельно поверхности 2, хотя около полюсных наконечников 3 оно направлено больше вверх или вниз. Направление магнитного поля определяет то направление, в котором образуются кластеры шариков 10. Если кластеры образовались под действием магнитного возбуждения, а впоследствии поле отключили, шарики должны диффундировать к поверхности 2. Чем больше угол кластера, тем больше времени занимает диффундирование шариков 10. Поэтому коэффициент переноса за счет диффузии около полюсных наконечников 3 будет меньше, чем в центре магнита. Из уравнения 2 можно видеть, что, когда коэффициент переноса R становится меньше, следует выбрать меньшую продолжительность включения для импульсного возбуждения, выражающую то, что больше времени требуется для этапа диффузии.
На Фиг.3 записанные оптические сигналы в центральном местоположении, т.е. в центре между полюсными наконечниками магнитного блока, показаны для трех различных протоколов возбуждения. Так как скорость диффузии в центре чувствительной поверхности между полюсными наконечниками является высокой (шарики должны перемещаться только на короткое расстояние к поверхности), увеличение продолжительности включения и, таким образом, увеличение скорости сбора шариков в области около поверхности увеличивает скорость сигнала.
Согласно первому протоколу (штриховая кривая) продолжительность включения приложенного импульсного магнитного поля составляет 50% во время всего измерения, во втором протоколе (точечная кривая) продолжительность включения составляет 75% во время всего измерения, и в третьем протоколе (непрерывная кривая) применяется сочетание продолжительностей включения, причем продолжительность включения составляет 85% в начале измерения и 15% в конце измерения. Ясно видно, что в этом случае 50%-я продолжительность включения дает более медленный сигнал, чем 75%-ая продолжительность включения.
На Фиг.4 построен график отношения между сигналом около полюсного наконечника и сигналом в центре поверхности. Отношение, равное 1, указывает, что сигнал около полюсного наконечника равен по силе сигналу в центре. Это является предпочтительной ситуацией, и цель протокола возбуждения состоит в том, чтобы установить это равное 1 отношение как можно точнее и как можно скорее. Более низкое отношение указывает, что сигнал около полюсных наконечников отстает от сигнала в центре. Очевидно, что отношение улучшается, когда в протоколе возбуждения дается больше времени для диффузии, т.е. когда применяется более низкая продолжительность включения. 50%-я продолжительность включения дает лучшее отношение, чем 75%-я продолжительность включения. Однако для центрального местоположения верно противоположное: 75%-я продолжительность включения дает более быстрый сигнал, чем 50%-я продолжительность включения.
Сочетание продолжительностей включения, как показано непрерывной кривой, например, на первом этапе с продолжительностью включения 85% для быстрого сбора шариков около поверхности, а на втором этапе с большим временем диффузии для улучшения скорости сигнала около полюсных наконечников, улучшает отношение между полюсным наконечником и центром без ухудшения сигнала в центре.
Соответственно, протокол возбуждения, состоящий из двух или более этапов с различными продолжительностями включения, может улучшить общую производительность системы оптического биодатчика. Он увеличивает используемую площадь на поверхности между полюсами магнита, улучшает равномерность сигналов между различными точками измерения и/или делает возможными многоаналитные анализы и/или многокамерные конфигурации.
Из-за различий в направлении магнитного поля по поверхности, которые могут быть результатом конфигурации аппаратных средств магнита, те коэффициенты переноса, с которыми шарики могут быть приведены в контакт с поверхностью, зависят от местоположения на поверхности. Протокол возбуждения с изменяющейся продолжительностью включения во время измерения, например, состоящий из последовательных этапов с различными продолжительностями включения, может улучшить общую скорость и равномерность записываемого сигнала.
В последующем описан дополнительный пример изобретения с обращением к Фиг.5. Фиг.5 показывает схематичный вид описанной выше чувствительной поверхности 2 как части картриджа 1 устройства биодатчика, которое использует магнитные частицы 10, также называемые магнитными шариками. В показанной конфигурации реализованы несколько электромагнитных блоков 3a, 3b, 3c, 3c' для генерации картины магнитного поля, пригодной для рандомизации и перемешивания текучей среды, нанесенной на чувствительную поверхность 2. В этом примере один электромагнитный блок 3а, например, управляемая катушка, размещен над чувствительной поверхностью 2, один электромагнитный блок 3b размещен под чувствительной поверхностью 2, и два электромагнитных блока 3c, 3c' размещены на сторонах чувствительной поверхности 2, электромагнитный блок 3с - слева от чувствительной поверхности 2, а электромагнитный блок 3c' - справа от чувствительной поверхности 2. Конфигурация, показанная на Фиг.5, дает возможность магнитного возбуждения с различными направлениями сил по отношению к чувствительной поверхности 2. В соответствии с теорией электромагнитного поля, электромагнитные блоки 3a, 3b притягивают или отталкивают магнитные частицы 10 в зоне над чувствительной поверхностью 2 в зависимости от направления сгенерированного магнитного поля. Притягивание в связи с этим происходит, когда линии магнитных полей направлены сверху вниз плоскости изображения, как показано, т.е. в направлении чувствительной поверхности 2 для достижения связывания с нанесенной там пробой. Соответственно, отталкивание происходит, когда линии магнитного поля направлены снизу вверх плоскости изображения, как показано. Другими словами, генерируется магнитное поле, по существу перпендикулярное чувствительной поверхности 2. В последнем случае магнитная сила воздействует на магнитные частицы 10 от чувствительной поверхности 2 для удаления магнитных частиц 10 с чувствительной поверхности 2. Могут быть сконструированы и другие конфигурации, например, с двумя электромагнитными блоками 3b под чувствительной поверхностью 2 на картридже 1 и одним электромагнитным блоком 2 над ней. Более того, еще один электромагнитный блок 3с располагается слева от картриджа 1 с чувствительной поверхностью 2, а другой электромагнитный блок 3с' располагается справа от картриджа 1 с чувствительной поверхностью 2. Электромагнитные блоки 3c, 3c' генерируют магнитные поля с линиями магнитных полей, которые направлены по существу параллельно картриджу 1 с датчиком и с чувствительной поверхностью 2 в любом направлении слева или справа от плоскости изображения. Дополнительные электромагнитные блоки 3c, 3c' по сторонам чувствительной поверхности 2 улучшают характеристики связывания аналита с пробой на чувствительной поверхности 2. При прикладывании магнитного поля, которое направлено не только перпендикулярно, но и параллельно чувствительной поверхности 2, достигаются рандомизация и перемешивание магнитных частиц 10, которые обычно притягиваются к обнаруживаемому биодатчиком аналиту. Было обнаружено, что управление четырьмя электромагнитными блоками 3a, 3b, 3c, 3c' улучшает процесс связывания аналита с пробой, в частности, может быть повышено количество специфических связей. Это означает, что обнаружение эффективного количества аналита в текучей среде улучшается, поскольку больше аналитов в текучей среде связываются с пробой по сравнению с процессом с только перпендикулярными чувствительной поверхности 2 магнитными полями. Дополнительное усовершенствование процесса специфического связывания достигается при управлении электромагнитными блоками 3a, 3b, 3c, 3c' таким образом, что сначала прикладывается импульс магнитного поля параллельно чувствительной поверхности 2, затем прикладывается импульс магнитного поля перпендикулярно чувствительной поверхности 2, а затем в течение короткого периода времени магнитное поле не прикладывается. Периоды времени с приложенными магнитными полями и период времени без магнитного поля находятся в диапазоне нескольких секунд. Описанная выше конфигурация предназначена для эффективного переноса магнитных частиц 10 и притянутого аналита из текучей среды или объема к чувствительной поверхности 2.
Фиг.6 показывает кривую в качестве результата измерения биодатчика, например, выполненного способом оптического обнаружения, например, при помощи нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО), с конфигурацией, описанной согласно Фиг.5. По оси Х отложено время в минутах, по оси Y отложена процентная величина оптического сигнала, обнаруженного биодатчиком. Как видно на Фиг.6, сигнал сначала имеет почти постоянный высокий уровень, затем применены рандомизация и перемешивание, как описано, при помощи возбуждения электромагнитных блоков 3a, 3b, 3c, 3c'. Оптический сигнал ухудшается и снова достигает почти постоянного уровня, который является более низким, чем исходный уровень сигнала. Этот более низкий постоянный уровень сигнала объясняется уменьшением неспецифических связей в текучей среде, причем специфические связи по отношению к неспецифическим связям возросли. Как показано, на несколько секунд магнитное поле выключают, что приводит к возрастанию измеренного оптического сигнала от минимума до почти постоянного уровня, своего рода диффузной релаксации. Следуя процессу, описанному согласно Фиг.5, возбужденное магнитное поле приводит к другому падению сигнала, пока не будет достигнут минимум сигнала. И снова, период времени, когда никакое магнитное поле не генерируется, приводит к увеличению сигнала вплоть до почти постоянного уровня, который снова меньше, чем уровень сигнала, измеренный до этого. И снова часть сигнала, вызванная неспецифическим связыванием, уменьшается. Повторное применение процесса означает минимизацию части сигнала, вызванной неспецифическим связыванием, и повышение корректного сигнала, вызванного специфическими связями.
Хотя изобретение было проиллюстрировано и описано подробно на чертежах и в вышеприведенном описании, такая иллюстрация и описание должны считаться иллюстративными или примерными, а не ограничивающими; таким образом, изобретение не ограничено раскрытыми вариантами воплощения. Вариации в раскрытых вариантах воплощения могут быть поняты и осуществлены специалистами в данной области техники при применении заявленного изобретения на практике, при изучении чертежей, раскрытия и прилагаемой формулы изобретения. В формуле изобретения слово "содержащий" не исключает других элементов и этапов, а единственное число существительного не исключает множества. Один единственный процессор или другой блок может выполнять функции нескольких элементов, указанных в формуле изобретения. Просто тот факт, что определенные меры указаны во взаимно различных зависимых пунктах формулы изобретения, не указывает на то, что не может быть с выгодой использовано сочетание этих мер. Любые ссылочные обозначения в формуле изобретения не должны быть истолкованы как ограничивающие ее объем.