СИСТЕМА ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ ПРОГНОЗА И ПОЛЬЗЫ ОТ ВСПОМОГАТЕЛЬНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ДЛЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА II И III СТАДИИ
SYSTEM FOR PREDICTION OF PROGNOSIS AND USE OF ADJUVANT CHEMOTHERAPY FOR PATIENTS WITH STOMACH CANCER OF II AND III STAGE

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к системе для предсказания прогноза и пользы от вспомогательной химиотерапии для больных прогрессирующим раком желудка с использованием значений количественного анализа экспрессии мРНК для группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов у больных прогрессирующим раком желудка.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Во всем мире рак желудка является третьей по величине смертности злокачественной опухолью среди всех типов злокачественной опухоли и, в частности, наиболее распространенной злокачественной опухолью, за исключением рака щитовидной железы, который характеризуется относительно хорошим прогнозом в Корее. В Корее показатель выживаемости больных раком желудка был значительно улучшен благодаря раннему выявлению с помощью национальных медицинских осмотров, хирургической стандартизации и развития химиотерапии, но несмотря на стандартизированное в настоящее время лечение по меньшей мере половина больных прогрессирующим раком желудка II и III стадии по-прежнему испытывают рецидив.
Злокачественная опухоль была признана генетическим заболеванием, и предпринимали попытку классифицировать злокачественную опухоль по ее молекулярным и биологическим характеристикам, а не по существующим анатомическим и патологическим фенотипам, в соответствии с развитием методик генетического тестирования, таких как секвенирование следующего поколения (NGS). Недавно сообщали, что рак желудка в широком смысле классифицируется на четыре типа в соответствии с различными молекулярными характеристиками в проекте Атлас генома рака (TCGA). Это означает, что, хотя злокачественная опухоль находится с анатомической точки зрения на одной и той же стадии, прогноз и степень ответа на химиотерапию могут варьировать в зависимости от его молекулярных и биологических характеристик.
Согласно недавно опубликованному результату проекта TCGA для 295 больных раком желудка рак желудка подразделяют на четыре типа, в том числе  позитивный по вирусу Эпштейна-Барр (EBV) рак желудка, рак желудка с высокой нестабильностью микросателлита (MSI-H),  рак желудка с хромосомной нестабильностью (CIN) и  геномно стабильный (GS) рак желудка. Согласно такому массивному секвенированию генома рака можно выяснить, что рак желудка подразделяется на молекулярно-генетические разные подгруппы, а не на один тип злокачественной опухоли. Следовательно, это показывает, что для персонализированного лечения рака желудка необходимо разработать и применять мишеневые гены в соответствии с подгруппами на основе молекулярно-генетических и патологических характеристик. Кроме того, при исследовании рака желудка сообщали о результате, согласно которому прогноз может быть классифицирован в соответствии с подтипами рака желудка.
Если прогноз больного можно предсказать после химиотерапии после хирургического вмешательства по поводу рака желудка, это послужит доказательственными материалами для установления подходящей терапевтической стратегии в соответствии с каждым прогнозом. В современной стандартизированной лечебной практике лечение вспомогательной химиотерапией после хирургического вмешательства используют для всех больных прогрессирующим раком желудка II и III стадии. То есть клиническое значение может иметь разработка стратегии для дополнительных терапевтических способов, отличных от имеющегося стандартного лечения, в отношении больных с плохим прогнозом.
Кроме того, поскольку больные подразделяются на группу отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S) и группу неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), подробные доказательственные данные для установления терапевтической стратегии больного могут быть обеспечены путем предоставления информации о существующих терапевтических способах в совокупности с прогностической информацией. Таким образом, чрезмерное лечение непрерывно с использованием традиционной химиотерапии может быть предотвращено для группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R) и группы с хорошим прогнозом (прогностический кластер I), при этом применение традиционного терапевтического способа может быть назначено для группы отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), и классификация, которая может стимулировать активное развитие нового терапевтического способа, возможна для группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R) и группы с плохим прогнозом (прогностический кластер III).
С 2010 года было установлено, что в случае прогрессирующего рака желудка II и III стадии вспомогательная химиотерапия после стандартизированной гастрэктомии D2 увеличивает выживаемость больного раком желудка, и на данный момент она является стандартной терапией. Традиционно рак желудка классифицируют в соответствии с анатомическими и патологическими фенотипами, и если стадию рака желудка определяют как стадия 2 или выше в соответствии с классификацией TNM, то применяют химиотерапевтическое лечение, но не существует способа предсказания прогноза в соответствии с химиотерапевтическим лечением кроме определения стадии согласно TNM.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Техническая задача
Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции для предсказания прогноза прогрессирующего рака желудка или отвечаемости на химиотерапию с использованием значений анализа для группы маркерных генов, которая способна определять послеоперационный прогноз или отвечаемость на химиотерапию у больных прогрессирующим раком желудка (II стадии - III стадии, на основании 6-го издания AJCC), и группы эталонных генов.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа обеспечения информации для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию с точки зрения выживаемости больного с использованием значений анализа для группы маркерных генов, которая способна предсказывать послеоперационный прогноз или отвечаемость на химиотерапию у больных прогрессирующим раком желудка, и группы эталонных генов.
Решение технической задачи
Для достижения данных целей настоящее изобретение относится к композиции для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии, которая включает в себя
средство для измерения уровня экспрессии мРНК в группе связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, включающей в себя WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4; и
средство для измерения уровня экспрессии мРНК в группе эталонных генов, включающей в себя АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Настоящее изобретение также относится к набору для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии, при этом набор включает в себя композицию для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии.
Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения информации для предсказания прогноза рака желудка II и III стадии, при этом способ предусматривает
измерение уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, включающей в себя WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, и группы эталонных генов, включающей в себя АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1, в биологическом образце, полученном из опухоли рака желудка II и III стадии, и вычисление значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов согласно приведенному ниже уравнению 1; и
сравнение с конечными пороговыми значениями предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов,
классификацию группы как группы с хорошим прогнозом (прогностический кластер I), если значения ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце превышают конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных GZMB и WARS, и
при условии, что по меньшей мере одно значение ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных GZMB или WARS, классификацию группы как группы с промежуточным прогнозом (прогностический кластер II), если значение ΔCq SFRP4 в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенного эталонного SFRP4, и группы как группы с плохим прогнозом (прогностический кластер III), если значение ΔCq SFRP4 в биологическом образце превышает конечное пороговое значение предварительно определенного эталонного SFRP4,
при этом конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов составляют -2,14, -5,18, -2,69 и -3,63 по отношению к WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, соответственно, и
вычисление конечного порогового значения путем получения значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, в том числе WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, от образцов опухолевой ткани рака желудка II и III стадии, вычисление значения адаптивной регрессии для гена с использованием значения
ΔCq и добавление корректирующего значения для гена к значению адаптивной регрессии, при этом значения адаптивной регрессии WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4 составляют -2,54, -5,58, -3,59 и -4,53, соответственно, а их корректирующие значения составляют +0,4, +0,4, +0,9 и +0,9, соответственно.
Уравнение 1
ΔCq = (значение Cq группы эталонных генов) - (значение Cq связанного с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерного гена).
В данном случае значение Cq группы эталонных генов относится к среднему значению Cq эталонных генов, в том числе АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения информации для прогнозирования отвечаемости на химиотерапию при раке желудка II и III стадии, при этом способ предусматривает
измерение уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, включающей в себя WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, и группы эталонных генов, включающей в себя АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1, в биологическом образце, полученном из опухоли рака желудка II и III стадии, и вычисление значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов согласно приведенному ниже уравнению 1; и
сравнение с конечными пороговыми значениями предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов,
классификацию группы как группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), если значения ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце превышают конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных GZMB и WARS, и
при условии, что по меньшей мере одно значение ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных GZMB или WARS, классификацию группы как группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), если значение ΔCq CDX1 в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных CDX1, и группы как группы отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), если значение ΔCq CDX1 в биологическом образце превышает конечное пороговое значение предварительно определенного эталонного CDX1,
при этом конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов составляют -2,14, -5,18, -2,69 и -3,63 по отношению к WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, соответственно, и
вычисление конечного порогового значения путем получения значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, в том числе WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, от образцов опухолевой ткани рака желудка II и III стадии, вычисление значения адаптивной регрессии для гена с использованием значения ΔCq и добавление корректирующего значения для гена к значению адаптивной регрессии, при этом значения адаптивной регрессии WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4 составляют -2,54, -5,58, -3,59 и -4,53, соответственно, а их корректирующие значения составляют +0,4, +0,4, +0,9 и +0,9, соответственно.
Уравнение 1
ΔCq = (значение Cq группы эталонных генов) - (значение Cq связанного с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерного гена).
В данном случае значение Cq группы эталонных генов относится к среднему значению Cq эталонных генов, в том числе АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Полезные эффекты
В соответствии с настоящим изобретением разработан алгоритм, который может предсказывать прогноз и отвечаемость на химиотерапию с использованием результатов количественного анализа уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов при прогрессирующем раке желудка в отношении выживаемости, такой как общая выживаемость и выживаемость без признаков заболевания, и который может быть использован в качестве дополнительной информации для определения способа лечения больного раком желудка.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показан результат подтверждения уровня экспрессии мишеневого гена в парафинированном образце для отбора эталонного гена.
На фиг. 2 показаны значения ΔCq, представляющие значение адаптивной регрессии связанных с предсказанием прогноза и отвечаемости на химиотерапию маркерных генов, к которым добавлены корректирующие значения +0,4, +0,4, +0,9 и +0,9 WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, соответственно, для определения конечных пороговых значений.
На фиг. 3 показан результат, иллюстрирующий группу с хорошим прогнозом (прогностический кластер I), классифицированную по иммунной оси в первом уровне основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 4 показан результат, иллюстрирующий группу неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), классифицированную по иммунной оси в первом уровне основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 5 показан результат, иллюстрирующий группы с промежуточным и плохим прогнозом (прогностический кластер II и III), классифицированные по оси клеток, подобных стволовым, во втором уровне основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 6 показан результат, иллюстрирующий группу отвечающих на химиотерапию и группу неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S и R), которые классифицируют по эпителиальной оси во втором уровне основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 7 представлена схематическая диаграмма основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы, которая представляет собой способ классификации для прогностических групп (прогностический кластер I, II, III) и связанных с отвечаемостью на химиотерапию групп (предиктивный кластер R и S) в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 8 показаны (а) кривые Каплана-Мейера и (b) результаты теста логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости в прогностических группах согласно алгоритму, который может предсказывать прогноз и отвечаемость на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 9 показаны (а) кривые Каплана-Мейера и (b) результаты теста логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания в прогностических группах согласно алгоритму, который может предсказывать прогноз и отвечаемость на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 10 показаны (а) р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости, и (b) р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания, у больных раком желудка, которые получали химиотерапию (СТХ), не получали химиотерапию (только хирургическое вмешательство), после перенесения гастрэктомии.
На фиг. 11 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости у больных раком желудка, которые получали химиотерапию (СТХ), не получали химиотерапию (только хирургическое вмешательство), после перенесения гастрэктомии группой отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 12 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания у больных раком желудка, которые получали химиотерапию (СТХ), не получали химиотерапию (только хирургическое вмешательство), после перенесения гастрэктомии группой отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 13 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости у больных раком желудка, которые получали химиотерапию (СТХ), не получали химиотерапию (только хирургическое вмешательство), после перенесения гастрэктомии группой неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 14 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания у больных раком желудка, которые получали химиотерапию (СТХ), не получали химиотерапию (только хирургическое вмешательство), после перенесения гастрэктомии группой неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 15 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости в группе больных, которые получали кселоду + оксалиплатин (XELOX), химиотерапевтическое лечение (СТХ), и в группе только с наблюдением (только хирургическое вмешательство) в выборке клинического испытания CLASSIC.
На фиг. 16 показаны (а) кривые Каплана-Мейера и (b) результаты теста логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости в группе классификации прогноза по отношению к выборке клинического испытания CLASSIC согласно алгоритму, который может предсказывать прогноз и отвечаемость на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 17 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания в группе больных, которые получали кселоду + оксалиплатин (XELOX), химиотерапевтическое лечение (СТХ), и группе только с наблюдением (только хирургическое вмешательство) в выборке клинического испытания CLASSIC.
На фиг. 18 показаны (а) кривые Каплана-Мейера и (b) результаты теста логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания в группах прогностической классификации по отношению к выборке клинического испытания CLASSIC согласно алгоритму, который может предсказывать прогноз и отвечаемость на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 19 показаны (а) кривые Каплана-Мейера и (b) результаты теста логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости в группе больных, которые получали кселоду + оксалиплатин (XELOX), химиотерапевтическое лечение (СТХ), и в группе только с наблюдением (только хирургическое вмешательство) в выборке клинического испытания CLASSIC согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 20 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания в группе больных, которые получали кселоду + оксалиплатин (XELOX), химиотерапевтическое лечение (СТХ), и в группе только с наблюдением (только хирургическое вмешательство) по отношению к выборке клинического испытания CLASSIC согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 21 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для общей 5-летней выживаемости в группе больных, которые получали кселоду + оксалиплатин (XELOX), химиотерапевтическое лечение (СТХ), и группе только с наблюдением (только хирургическое вмешательство), в получающей XELOX группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), по отношению к выборке клинического испытания CLASSIC согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 22 показаны р-значения, полученные по кривым Каплана-Мейера и тесту логарифмических рангов для 5-летней выживаемости без признаков заболевания в группе больных, которые получали кселоду + оксалиплатин (XELOX), химиотерапевтическое лечение (СТХ), и группе только с наблюдением (только хирургическое вмешательство), в получающей XELOX группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), по отношению к выборке клинического испытания CLASSIC согласно алгоритму, который может прогнозировать вероятность ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 23 показаны кривые Каплана-Мейера для общей 5-летней выживаемости в прогностической группе при оценке клинической эффективности алгоритма, который определяет прогноз прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Способы осуществления настоящего изобретения
Далее описание настоящего изобретения будет дополнено подробностями.
Настоящее изобретение относится к композиции для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии, при этом композиция включает в себя
средство для измерения уровня экспрессии мРНК в группе связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, включающей в себя WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4; и
средство для измерения уровня экспрессии мРНК в группе эталонных генов, включающей в себя АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Композиция для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии в соответствии с настоящим изобретением может быть использована для предсказания прогноза и отвечаемости на химиотерапию у больных прогрессирующим раком желудка в отношении выживаемости.
Используемый в настоящем документе термин «прогрессирующий рак желудка» относится к раку желудка II или III стадии на основании 6-го издания AJCC
Используемый в настоящем документе термин «связанный с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерный ген» относится к маркеру, который может различать нормальные и патологические состояния, прогнозировать 5-летнюю выживаемость после лечения или объективно измерять предсказание ответа на лечение. В соответствии с настоящим изобретением маркерным геном является ген, который может быть использован для предсказания прогноза и отвечаемости на химиотерапию прогрессирующего рака желудка, а также ген, характеризующийся дифференциальным уровнем экспрессии мРНК, который является повышенным или пониженным, согласно прогнозу или отвечаемости на химиотерапию. Согласно типичному варианту осуществления настоящего изобретения отбирают общей сложностью четыре маркерных гена для рака желудка, характеризующегося гетерогенностью, при этом маркерными генами являются, например, маркерные гены (WARS и GZMB), которые могут представлять иммунный модуль, и маркерные гены (SFRP4 и CDX1), которые могут представлять модуль клеток, подобных стволовым, и эпителиальный модуль, которые стабильно измеряются путем обеспечения статистической значимости в микроматричных данных и данных RT-qPCR свежезамороженной ткани, а также данных RT-qPCR запаянного в парафин образца пробы.
Используемый в настоящем документе термин «эталонный ген» относится к гену, который всегда стабильно экспрессируется. То есть, поскольку ген регулярно экспрессируется в любой ткани, эталонный ген используют для проверки уровня экспрессии маркерного гена при сравнении его уровня экспрессии. То есть поскольку существует качественное различие между образцами и вариацией в зависимости от организации хранения, даже если измеряется уровень экспрессии гена, трудно определить, что измеренное значение является биологической вариацией. Следовательно, уровень экспрессии гена (ΔCq) между образцами определяют путем нормализации. В качестве традиционных способов нормализации могут быть применены способ с использованием квантиля, способ общей нормализации и способ с использованием эталонного гена, но в соответствии с настоящим изобретением применяют нормализацию с использованием эталонного гена. Кроме того, точность способа с использованием одного гена в качестве эталонного гена может быть снижена, и, таким образом, могут быть выбраны различные гены, и может быть исследована степень вариации для отбора эталонного гена, подходящего для характеристик ткани. В соответствии с настоящим изобретением выбирают ген, раскрытый в литературе, связанный с раком желудка или используемый в традиционном коммерчески доступном продукте, проверяют, что выбранный ген подходит в качестве объекта, а затем используют в качестве эталонного гена. Согласно типичному варианту осуществления настоящего изобретения 21 эталонный ген, раскрытый в литературе, сравнивают с генами ткани рака пищевода, поджелудочной железы, желудка или толстой кишки и нормальной тканью, и среди них с помощью qPCR выбирают ген с наименьшей вариацией в качестве эталонного гена. Затем в качестве эталонных генов, используемых в коммерциализированных продуктах, отбирают и подвергают qPCR АСТВ, АТР5Е, HPRT1, PGK1, GPX1, RPL29, UBB и VDAC2 и, наконец, в качестве эталонных генов, используемых для предсказания вероятности прогноза или ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением, применяют группу генов АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Используемый в настоящем документе термин «измерение уровня экспрессии мРНК» относится к измерению уровня мРНК с помощью процесса подтверждения экспрессии мРНК связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов или эталонных генов в биологическом образце для предсказания вероятности прогноза или ответа на химиотерапию прогрессирующего рака желудка. Способы анализа экспрессии мРНК предусматривают полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR), конкурентную RT-PCR, RT-PCR в режиме реального времени, анализ защиты от РНКазы (RPA), нозерн-блоттинг и ДНК-чип, но настоящее изобретение не ограничивается ими.
В композиции в соответствии с настоящим изобретением средство для измерения уровней экспрессии мРНК связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и эталонных генов включает в себя праймер, зонд или антисмысловой нуклеотид, специфически связывающиеся с мРНК связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и эталонных генов. Поскольку информация о связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и эталонных генов известна из GenBank, UniProt и т.д., на основании этой информации праймер, зонд или антисмысловой нуклеотид, специфически связывающиеся с мРНК гена, могут быть легко сконструированы рядовым специалистом в данной области.
Используемый в настоящем документе термин «праймер» представляет собой фрагмент, который распознает мишеневую генную последовательность, и пару праймеров, которая включает в себя пару прямого и обратного праймеров, но предпочтительно представляет собой пару праймеров, которая обеспечивает результат анализа, характеризующегося специфичностью и чувствительностью. Поскольку последовательность нуклеиновой кислоты праймера представляет собой последовательность, которая несовместима с не являющейся мишеневой последовательностью, присутствующей в образце, если праймер является праймером, который амплифицирует только мишеневую генную последовательность, содержащую комплементарный сайт связывания с праймером, и не вызывает неспецифическую амплификацию, может быть обеспечена высокая специфичность. Согласно типичному варианту осуществления настоящего изобретения может быть использован ряд праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 1-18. Более конкретно, SFRP4 может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 1 и 2, в отношении NM_003014.2 1298-1361, GZMB может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 3 и 4, в отношении NM_004131.3 213-277, WARS может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 5 и 6, в отношении NM_173701.1 408-480, CDX1 может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 7 и 8, в отношении NM_001804.2 1319-1385, АСТВ может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 9 и 10, в отношении NM_001101 278-349, АТР5Е может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 11 и 12, в отношении NM_006886 117-189, HPRT1 может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 13 и 14, в отношении NM 000194.1 531-597, GPX1 может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 15 и 16, в отношении NM_000581.2 308-378, a UBB может быть выявлен с использованием ряда праймеров, изложенных под SEQ ID NO: 17 и 18, в отношении NM_018955.2 61-138.
Используемый в настоящем документе термин «зонд» относится к материалу, который может специфически связываться с мишеневым материалом, подлежащим выявлению в образце, для специфической идентификации присутствия мишеневого материала в образце с помощью связывания. Тип зонда представляет собой тип, который традиционно используют в уровне техники без ограничения, и может представлять собой пептидную нуклеиновую кислоту (PNA), закрытую нуклеиновую кислоту (LNA), пептид, полипептид, белок, РНК или ДНК. Более конкретно, зонд представляет собой биоматериал, который может быть получен из организма, подобен таковому или изготовлен in vitro, например, фермент, белок, антитело, микроорганизм, животные или растительные клетки или органы (органеллы), нейроны, ДНК и РНК, при этом ДНК может включать в себя кДНК, геномную ДНК, олигонуклеотид, РНК включает в себя геномную РНК, мРНК и олигонуклеотид, а белок может включать в себя антитело, антиген, фермент и пептид. Согласно типичному варианту осуществления настоящего изобретения могут быть использованы зонды под SEQ ID NO: 19-27 для измерения с помощью qPCR. Предпочтительно, зонды могут быть флуоресцентно меченными.
Используемый в настоящем документе термин «антисмысловой» относится к олигомеру, имеющему последовательность нуклеотидных оснований и скелет между субъединицами, при этом олигомер гибридизируется с мишеневой последовательностью в РНК путем образования пар оснований Уотсона-Крика, что обычно позволяет образовать гетеродимер РНК:олигомер с мРНК в мишеневой последовательности. Олигомер может характеризоваться точной комплементарностью последовательностей или приблизительной комплементарностью по отношению к мишеневой последовательности.
Используемый в настоящем документе термин «предсказание прогноза или отвечаемости на химиотерапию» включает в себя определение восприимчивости субъекта к определенному заболеванию или расстройству, прогноз субъекта с определенным заболеванием или расстройством (например, идентификацию состояния предметастатической или метастатической злокачественной опухоли, определение стадии злокачественной опухоли или отвечаемости злокачественной опухоли на лечение), или терапевтические показатели (например, мониторинг состояния субъекта для обеспечения информации о терапевтической эффективности). Цель настоящего изобретения заключается в предсказании прогноза и отвечаемости на химиотерапию у больных раком желудка после хирургического вмешательство в отношении выживаемости, такой как общая выживаемость и выживаемость без признаков заболевания.
Композиция для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтически приемлемый носитель включает в себя носители и среды-носители, как правило, используемые в фармацевтической области, и, в частности, включает в себя ионообменные смолы, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки (например, человеческий сывороточный альбумин), буферные материалы (например, все типы фосфатов, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия и частичную глицеридную смесь насыщенных растительных жирных кислот), воду, соли или электролиты (например, протаминсульфат, гидрофосфат натрия, гидрофосфат кальция, хлорид натрия и соль цинка), коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, субстрат на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий карбоксиметилцеллюлозу, полиарилат, воск, полиэтиленгликоль или ланолин, но настоящее изобретение не ограничивается ими.
Кроме того, композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать в себя смазочное средство, увлажняющее средство, эмульсию, суспендирующее средство или консервант, а также вышеупомянутые компоненты.
Настоящее изобретение также относится к набору для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии, при этом набор включает в себя композицию для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии.
Предпочтительно, набор может представлять собой набор для RT-PCR или набор ДНК-чипа.
Набор для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии может дополнительно включать в себя композицию, раствор или устройство, в том числе один или несколько типов компонентов, которые подходят для способа анализа. Предпочтительно, набор для диагностики может дополнительно включать в себя основные элементы для выполнения RT-PCR. Набор для RT-PCR включает в себя пару праймеров, специфическую в отношении генов, кодирующих маркерные белки. Праймер представляет собой нуклеотид с последовательностью, специфической по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты гена, и может иметь длину приблизительно 7-50 п. о. и более предпочтительно длину приблизительно 10-30 п. о. Кроме того, набор для RT-PCR также может включать в себя праймер, специфический по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты контрольного гена. Помимо этого, набор для RT-PCR может включать в себя тестовую пробирку или другой подходящий контейнер, реакционные буферные растворы (различные рН и концентрации магния), дезоксинуклеотиды (dNTP), ферменты, такие как Taq-полимераза и обратная транскриптаза, ингибиторы ДНКазы и РНКазы, DEPC-вода и стерилизованная вода.
Кроме того, набор для предсказания прогноза или отвечаемости на химиотерапию против рака желудка II и III стадии в соответствии с настоящим изобретением может включать в себя важные элементы для выполнения способа с помощью ДНК-чипа. Набор ДНК-чипа может включать в себя субстрат, к которому присоединяются кДНК или олигонуклеотид, которые соответствуют гену или его фрагментам, а также реагенты, средства и ферменты для получения флуоресцентно меченных зондов. Кроме того, субстрат может включать в себя кДНК или олигонуклеотид, которые соответствуют контрольному гену или его фрагментам.
Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения информации для предсказания прогноза рака желудка II и III стадии, при этом способ предусматривает
измерение уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, включающей в себя WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, и группы эталонных генов, включающей в себя АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1, в биологическом образце, полученном из опухоли рака желудка II и III стадии, и вычисление значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов согласно приведенному ниже уравнению 1; и
сравнение с конечными пороговыми значениями предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов,
классификацию группы как группы с хорошим прогнозом (прогностический кластер I), если значения ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце превышают конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных GZMB и WARS, и
при условии, что по меньшей мере одно значение ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных GZMB или WARS, классификацию группы как группы с промежуточным прогнозом (прогностический кластер II), если значение ΔCq SFRP4 в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных SFRP4, и группы как группы с плохим прогнозом (прогностический кластер III), если значение ΔCq SFRP4 в биологическом образце превышает конечное пороговое значение предварительно определенных эталонных SFRP4,
при этом конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов составляют -2,14, -5,18, -2,69 и -3,63 по отношению к WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, соответственно, и
вычисление конечного порогового значения путем получения значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, в том числе WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, от образцов опухолевой ткани рака желудка II и III стадии, вычисление значения адаптивной регрессии для гена с использованием значений ΔCq и добавление корректирующего значения для гена к значению адаптивной регрессии, при этом значения адаптивной регрессии WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4 составляют -2,54, -5,58, -3,59 и -4,53, соответственно, а их корректирующие значения составляют +0,4, +0,4, +0,9 и +0,9, соответственно.
Уравнение 1
ΔCq = (значение Cq группы эталонных генов) - (значение Cq связанного с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерного гена).
В данном случае значение Cq группы эталонных генов относится к среднему значению Cq эталонных генов, в том числе АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения информации для прогнозирования отвечаемости на химиотерапию при раке желудка II и III стадии, при этом способ предусматривает
измерение уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, включающей в себя WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, и группы эталонных генов, включающей в себя АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1, в биологическом образце, полученном из опухоли рака желудка II и III стадии, и вычисление значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов согласно приведенному ниже уравнению 1; и
сравнение с конечными пороговыми значениями предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов,
классификацию группы как группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), если значения ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце превышают конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных GZMB и WARS, и
при условии, что по меньшей мере одно значение ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных GZMB или WARS, классификацию группы как группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), если значение ΔCq CDX1 в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных CDX1, и группы как группы отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), если значение ΔCq CDX1 в биологическом образце превышает конечное пороговое значение предварительно определенного эталонного CDX1,
при этом конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов составляют -2,14, -5,18, -2,69 и -3,63 по отношению к WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, соответственно, и
вычисление конечного порогового значения путем получения значений ΔCq связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, в том числе WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, от образцов опухолевой ткани рака желудка II и III стадии, вычисление значения адаптивной регрессии для гена с использованием значений ΔCq и добавление корректирующего значения для гена к значению адаптивной регрессии, при этом значения адаптивной регрессии WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4 составляют -2,54, -5,58, -3,59 и -4,53, соответственно, а их корректирующие значения составляют +0,4, +0,4, +0,9 и +0,9, соответственно.
Уравнение 1
ΔCq = (значение Cq группы эталонных генов) - (значение Cq связанного с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерного гена).
В данном случае значение Cq группы эталонных генов относится к среднему значению Cq эталонных генов, в том числе АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Способ обеспечения информации для предсказания прогноза рака желудка II и III стадии или отвечаемость на химиотерапию в соответствии с настоящим изобретением будет подробно описан по стадиям.
Первая стадия включает в себя стадию измерения уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов в биологическом образце, полученном из опухоли рака желудка II и III стадии, и вычисление значения ΔCq каждого связанного с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерного гена.
Уровни экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов могут быть измерены с помощью RT-PCR, конкурентной RT-PCR, RT-PCR в режиме реального времени, анализа защиты от РНКазы, нозерн-блоттинга или ДНК-чипа. Более предпочтительно, уровень экспрессии мРНК измеряется с помощью RT-PCR в режиме реального времени или может быть получен в виде значения количественного цикла (Cq).
Значение ΔCq вычисляют согласно следующему уравнению 1 с использованием значений Cq группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, полученной выше, и группы эталонных генов.
Уравнение 1
ΔCq = (значение Cq группы эталонных генов) - (значение Cq связанного с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерного гена).
В данном случае значение Cq группы эталонных генов относится к среднему значению Cq эталонных генов, в том числе АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Значение ΔCq относится к значению, полученному путем нормализации уровня экспрессии маркерного гена, и чем выше значение ΔCq, тем выше уровень экспрессии.
Вторая стадия представляет собой стадию классификации прогностических групп биологического образца по сравнению с конечными пороговыми значениями предварительно определенных эталонных связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов.
Для классификации прогностических групп предварительно определяют конечное пороговое значение, которое становится стандартом связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов.
С этой целью из образца опухолевой ткани рака желудка II и III стадии и образца нормальной ткани получают значения Cq в соответствии с уровнями экспрессии мРНК связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов, в том числе WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, вычисляют значение ΔCq согласно уравнению 1 и
вычисляют значение адаптивной регрессии (A.R.V.) путем применения значения ΔCq к методике адаптивной регрессии. Как правило, в то время как данные обрабатывают на основе медианы или среднего значений, выбранных с помощью матрицы, в алгоритме в соответствии с методикой адаптивной регрессии точку, имеющую наибольшую вариансу отделенных средних интервальных значений, полученных, когда произвольную точку всех данных определяют как эталонную точку, определяют как значение адаптивной регрессии (или пороговое значение). То есть пороговое значение является контрольной точкой, которая различает высокую экспрессию и низкую экспрессию соответствующего гена, который является биологически значимым, в нормальной и раковой ткани. Значение адаптивной регрессии рассчитывают следующим образом.
Подбор способом адаптивной регрессии
при этом SSR: регрессионная сумма квадратов; SSTOT: общая сумма квадратов; SSE: остаточная сумма квадратов; MSR: регрессионное среднеквадратическое; MSB: среднеквадратическое ошибки; и F: F-распределение.
В данном случае р-значение, соответствующее вероятности больших отклонений F-распределения, определяют следующим образом:
при этом  представляет собой рандомную переменную F-распределения.
В описанном выше процессе чем меньше р-значение, тем лучшим можно считать подбор.
Определение стадийной функции
12
В данном случае F представляет собой относительно лучший подбор функции между одной стадией и двумя стадиями.
В способе в соответствии с настоящим изобретением, если произвольную точку определяют как эталонную точку в общих данных гена с использованием описанного выше одностадийного способа, точка, в которой статистические показатели являются самыми высокими, определяют как A.R.V. и добавляют корректирующее значение к A.R.V. для определения конечного порогового значения.
Корректирующие значения маркерных генов могут быть определены на основании клинической пользы и безопасности. То есть корректирующие значения определяют путем получения значения A.R.V, которое является аналитической характеристикой, для значения ΔCq, и выбора комбинации, составляющей оптимальное отношение рисков с точки зрения прогноза, и комбинации, составляющей взаимосвязи между химиотерапией и предиктивными кластерами с точки зрения отвечаемости на химиотерапию, путем скрининга комбинации 0,4 к 0,5 для WARS и GZMB, 0,8 к 0,9 для SFRP4 и 0,8 к 0,9 для CDX1 на основании ΔCq для WARS, GZMB и SFRP4, составляющих ось прогноза, и WARS, GZMB и CDX1, составляющих предиктивную ось.
Предпочтительно, при этом значения адаптивной регрессии WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4 составляют -2,54, -5,58, -3,59 и -4,53, соответственно, а их корректирующие значения могут составлять +0,4, +0,4, +0,9 и +0,9, соответственно.
Маркерные гены, то есть конечные пороговые значения WARS, GZMB, CDX1 и SFRP4, которые получают путем добавления корректирующих значений к значениям адаптивной регрессии, составляют -2,14, -5,18, -2,69 и -3,63, соответственно.
Если определены конечные пороговые значения эталонных маркерных генов, классификацию на прогностические группы и группы отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер) выполняют с помощью основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы. Другими словами, классификация на группы согласно алгоритму для предсказания вероятности прогноза или ответ на химиотерапию прогрессирующего рака желудка в соответствии с настоящим изобретением конкретно показана на фиг. 7, и означает, что, когда значения ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце превышают конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных GZMB и WARS, группу классифицируют как группу с хорошим прогнозом (прогностический кластер I), и при условии, что по меньшей мере одно значение ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных GZMB или WARS, если значение ΔCq SFRP4 в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных SFRP4, группа может быть классифицирована как группа с промежуточным прогнозом (прогностический кластер II), и если значение ΔCq SFRP4 в биологическом образце превышает конечное пороговое значение предварительно определенных эталонных SFRP4, группа может быть классифицирована как группа с плохим прогнозом (прогностический кластер III).
Кроме того, если значения ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце превышают конечные пороговые значения предварительно определенных эталонных GZMB и WARS, то группу классифицируют как группу неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), и при условии, что по меньшей мере одно значение ΔCq GZMB и WARS в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных GZMB или WARS, если значение ΔCq CDX1 в биологическом образце ниже конечного порогового значения предварительно определенных эталонных CDX1, то группу классифицируют как группу неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), и если значение ΔCq CDX1 в биологическом образце превышает конечное пороговое значение предварительно определенного эталонного CDX1, то группа может быть классифицирована как группа отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S).
Биологический образец может представлять собой свежую опухолевую ткань, замороженную опухолевую ткань, парафинированную опухолевую ткань, жидкость тонкоигольной аспирационной биопсии, перитонеальные выпоты, раствор промывания трубок или плевральную жидкость и предпочтительно представляет собой парафинированную опухолевую ткань.
Кроме того, измерение уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов может быть выполнено с помощью RT-PCR, конкурентной RT-PCR, RT-PCR в режиме реального времени, анализа защиты от РНКазы, нозерн-блоттинга или ДНК-чипа. Предпочтительно, измерение выполняют с помощью RT-PCR в режиме реального времени.
Далее преимущества и характеристики настоящего изобретения и способы его осуществления можно будет легко понять при обращении к подробному описанию типичных вариантов осуществления и сопроводительных графических материалов. Однако настоящее изобретение не ограничивается типичными вариантами осуществления, описываемыми ниже, и может быть осуществлено во многих других формах. Эти типичные варианты осуществления представлены исключительно для того, чтобы дополнить раскрытие настоящего изобретения и полностью передать объем настоящего изобретения рядовым специалистам в данной области, и настоящее изобретение должно определяться только прилагаемой формулой изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Разработка алгоритма, который предсказывает прогноз или вероятность отвечаемости на химиотерапию прогрессирующего рака желудка
Делали 3-мм пору, включающую в себя 50% или больше опухоли, в парафинированной ткани прогрессирующего рака желудка и экстрагировали РНК из перфорированной ткани согласно протоколу. Получали по меньшей мере 400 нг общей РНК. Элемент необходимого QC составлял А260/А280 ≥ 1,8.
Для эксперимента RT-qPCR использовали набор nProfiler I, использовали общую РНК (400 нг/18 мкл) больного и смесь ген-специфического праймера (GSP) (3 мкл) диспергировали в образце. Температуру термоциклера 2720 (Applied Biosystems) повышали до 50°С, а затем образец помещали в циклер. Образец РНК денатурировали при 65°С в течение 5 минут и термоциклер останавливали. Для RT добавляли 6 мкл буфер для RT и 2 мкл смеси RT, синтез ДНК выполняли при 37°С в течение 60 минут и ДНК выдерживали при 70°С в течение 15 минут. Для выполнения qPCR смешивали смесь кДНК (3 мкл) и каждой из девяти смесей праймер-зонд (2 мкл, Gene-1 - Gene-9 из набора). Образец подвергали одному циклу ферментной активации при 95°С в течение 120 секунд, 40 циклам денатурации при 95°С в течение 10 секунд и выявлению при 60°С в течение 30 секунд. Извлеченные данные анализировали с использованием программы nDxI (Novomics Co., Ltd.).
Процессы RT и qPCR подготавливали с помощью nProfiler I, при этом nProfiler I представляет собой набор для qPCR на основе мРНК, состоящий из 9 генов рака желудка. Реагенты, используемые в настоящем документе, показаны в таблице 1.
Вышеупомянутые 9 генов представляют собой четыре маркерных гена, характеризующихся статистической значимостью в данных микроматрицы и данных RT-qPCR свежезамороженной ткани, а также данных RT-qPCR пробы парафинированного образца и пять эталонных генов. Разрабатывали анализ рака желудка с помощью nProfiler I, который представляет собой набор для диагностики, который может классифицировать прогноз по уровням экспрессии окончательно отобранных генов. Процесс отбора эталонных генов является следующим.
Эталонные гены, специфически применяемые к раку желудка, подвергали литературному исследованию в следующих статьях:
Идентификация эталонных генов, подходящих для поиска генной экспрессии при раке желудка с помощью RT-qPCR (Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR. Rho et al. BMC Cancer 2010, 10:240); изменение эталонного гена в тканях рака толстой и прямой кишки, пищевода и желудка (Housekeeping gene variability in normal and cancerous colorectal, pancreatic, esophageal, gastric and hepatic tissues. Claudia Rubie et al. Mol Cell Probes. 2005); исследование клинического случая для эталонных генов как подобных продуктов США с использованием qPCR: эталонные гены рака молочной железы (A Multigene Assay to Predict Recurrence of Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer. Paik S et al. N Engl J Med. 2004 Dec); эталонные гены рака толстой и прямой кишки (Interaction Between Tumor Gene Expression and Recurrence in Four Independent Studies of Patients With Stage II/III Colon Cancer Treated With Surgery Alone or Surgery Plus Adjuvant Fluorouracil Plus Leucovorin. O'Connell et al. J Clin Oncol. 2010).
Кроме того, проверяли эталонные гены, которые используются в коммерчески доступных в настоящее время продуктах, связанных с солидным раком. Ген, выбранный на основе этих генов, был проверен с помощью предшествующего исследования на предмет того, подходит ли он в качестве эталонного гена клинического образца, и, наконец, выбран.
На основании вышеизложенного, в первую очередь, отбирали общей сложностью 8 эталонных генов в качестве кандидатов.
Наконец, отбирали 5 генов, которые имеют наименьшую степень вариации при объединении в 30 парафинированных образцов (с использованием geNorm) в качестве эталонных генов (см. фиг. 1): АСТВ/АТР5Е/GPX1/UBB/НPRT1.
Затем для разработки алгоритма выполняли RT-PCR в режиме реального времени для 310 оставшихся проб парафинированного образца (3-мм ядро), полученных от больных раком желудка II или III стадии, которые перенесли хирургическое вмешательство в больнице Северанс университета Йонсей с 2006 года по 2010 год.
Маркерные гены представляют собой гены, которые могут различать гетерогенность рака желудка и могут стабильно выявляться в ткани злокачественной опухоли, и существует четыре маркерных гена, таких как маркерные гены (WARS, GZMB), которые могут представлять иммунную ось, маркерный ген (SFRP4), который может представлять собой ось клеток, подобных стволовым, и маркерный ген (CDX1), который может представлять эпителиальную ось.
Маркерные гены, разработанные, как указано выше, и эталонные гены, описываемые выше, показаны в приведенной ниже таблице 2.
Затем определяли пороговые значения для гена в группах связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группах эталонных генов с тем, чтобы установить стандарт для классификации связанных с прогнозом групп (прогностический кластер I: группа с хорошим прогнозом, прогностический кластер II: группа с промежуточным прогнозом и прогностический кластер III: группа с плохим прогнозом) и связанных с отвечаемостью на химиотерапию групп (предиктивный кластер S: группа отвечающих на химиотерапию и предиктивный кластер R: группа неотвечающих на химиотерапию).
Для установления такого стандарта классификации группы генов классифицировали на прогностические группы (прогностические кластеры) и группы отвечающих на химиотерапию (предиктивные кластеры) с использованием основанной на бинарном сигнале двухуровневой системы.
Значение ΔCq каждого маркерного гена вычисляли согласно приведенному ниже уравнению 1 с использованием значений Cq группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов, которые получали с помощью RT-PCR в режиме реального времени с нормализацией тем самым уровня экспрессии мРНК:
уравнение 1
ΔCq = значение Cq группы эталонных генов - значение Cq маркерного гена.
В данном случае значение Cq группы эталонных генов относится к среднему значению Cq эталонных генов, в том числе АСТВ, АТР5Е, GPX1, UBB и HPRT1.
Чем выше значение ΔCq, тем выше генная экспрессия.
Значение адаптивной регрессии (A.R.V.) вычисляли путем применения значения ΔCq для методики адаптивной регрессии. Как правило, в то время как данные обрабатывали на основе медианы или среднего значений, отобранных с помощью матрицы, в алгоритме в соответствии с методикой адаптивной регрессии точку, имеющую наибольшую вариансу отделенных средних интервальных значений, полученных, когда произвольную точку всех данных определяли как эталонную точку, определяли как значение адаптивной регрессии (или пороговое значение). То есть пороговое значение являлось контрольной точкой, которая различает высокую экспрессию и низкую экспрессию соответствующего гена, который является биологически значимым, в нормальной и раковой ткани. Значение адаптивной регрессии рассчитывали следующим образом.
Подбор способом адаптивной регрессии
при этом SSR: регрессионная сумма квадратов; SSTOT: общая сумма квадратов; SSE: остаточная сумма квадратов; MSR: регрессионное среднеквадратическое; MSB: среднеквадратическое ошибки; и F: F-распределение.
В данном случае р-значение, соответствующее вероятности больших отклонений F-распределения, определяют следующим образом:
при этом  представляет собой рандомную переменную F-распределения.
В описанном выше процессе чем меньше р-значение, тем лучшим можно считать подбор.
Определение стадийной функции
12
В данном случае F представляет собой относительно лучший подбор функции между одной стадией и двумя стадиями.
В способе в соответствии с настоящим изобретением, если произвольную точку определяли как эталонную точку в общих данных гена с использованием описанного выше одностадийного способа, точка, в которой статистические показатели являются самыми высокими, определяли как A.R.V. и добавляли корректирующее значение к A.R.V. для определения конечного порогового значения. A.R.V. получали для 310 парафинированных образцов опухолевой ткани и 108 парафинированных образцов нормальной ткани, при этом и образцы нормальные ткани, и образцы ткани рака желудка описывали количественно и нормализовали. Получали значения, вычисленные для образцов нормальной ткани и ткани рака желудка для гена с использованием метода адаптивной регрессии, конечные пороговые значения, соответствующие приведенным ниже стандартам, определяли путем применения вышеупомянутых корректирующих значений к ранее полученным значениям. Кроме того, если значение Cq гена определяли как N/A или неустановленное, то соответствующий ген из этого образца устраняли из значений адаптивной регрессии. Конечные пороговые значения маркерных генов, вычисленных согласно описанному выше способу, показаны в приведенной ниже таблице 3 (см. фиг. 2).
Основанную на бинарном сигнале двухуровневую систему классифицировали с использованием четырех маркерных генов следующим образом.
Сначала на стадии первого уровня классифицировали группу хорошего прогноза (прогностический кластер I, область, выделенная жирной линией на фиг. 3) и группу неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R, область, выделенная жирной линией на фиг. 4) с помощью двух маркерных генов (WARS, GZMB) с использованием бинарного логического элемента. В настоящем документе маркерные гены WARS и GZMB называли иммунной осью.
Затем на стадии второго уровня классифицировали другие группы больных раком желудка, которые не были классифицированы на стадии первого уровня, и в данном случае для классификации использовали два других маркерный гена CDX1 и SFRP4.
В данном случае исходя из прогностической разницы с помощью маркерного гена (SFRP4), представляющего ось клеток, подобных стволовым, группу с низким уровнем экспрессии классифицировали как группу с промежуточным прогнозом (прогностический кластер II, левая область, выделенная жирной линией на фиг. 5), а группу с высоким уровнем экспрессии называли группой с плохим прогнозом (прогностический кластер III, правая область, выделенная жирной линией на фиг. 5).
Затем исходя из отвечаемости на химиотерапию с помощью маркерного гена (CDX1), представляющего эпителиальную ось, группу с высоким уровнем экспрессии классифицировали как группу отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S, верхняя область, выделенная жирной линией на фиг. 6), группу с низким уровнем экспрессии, а также группы, классифицированные на стадии первого уровня (область, выделенная жирной линией на фиг. 4), классифицировали как группы неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R, нижняя область, выделенная жирной линией на фиг. 6).
Такой алгоритм классификации показан на фиг. 7.
Пример 2. Проверка алгоритма для предсказания прогноза и вероятности отвечаемости на химиотерапию прогрессирующего рака желудка
Значимость прогноза и отвечаемости на химиотерапию согласно алгоритму предсказания, полученному в примере 1, проверяли с использованием кривой Каплана-Мейера и однофакторного/многофакторного анализа Кокса (n=307, три образца не выдержали QC).
Как показано на кривой Каплана-Мейера фиг. 8, имелось прогностическое различие между тремя прогностическими группами (прогностический кластер I, II и III). Общая 5-летняя выживаемость в трех группах составляла 83,3, 71,8 и 58,2%, соответственно, что указывает на то, что прогностический кластер I имел лучший прогноз среди трех групп, а прогностический кластер III имел худший прогноз среди них.
Как показано в таблице 4, выяснили, что классификация прогностических групп (прогностических кластеров) была не только эффективной в классификации прогноза однофакторного/многофакторного анализа Кокса, выполняемого в прогностических группах в соответствии с настоящим изобретением, но также и то, что каждая прогностическая группа служила в качестве независимого фактора предсказания прогноза. В частности, имелось прогностическое различие между прогностическим кластером I и прогностическим кластером III, и прогностический кластер II определяли как буферную зону.
Результат прогноза подтверждали в отношении выживаемости без признаков заболевания. Как показано на кривой Каплана-Мейера фиг. 9, имелось различие в выживаемости без признаков заболевания между тремя группами (прогностический кластер I, прогностический кластер II, прогностический кластер III), сходное с результатом общей выживаемости. 5-летняя выживаемость без признаков заболевания трех групп составляла 75,8%, 66,9% и 48,2%, соответственно, что указывает на то, что прогностический кластер I имел лучший прогноз среди трех групп, а прогностический кластер III имел худший прогноз.
Кроме того, как показано в таблице 5, можно видеть, что классификация прогностических групп (прогностических кластеров) была не только эффективной в классификации прогноза в отношении выживаемости без признаков заболевания однофакторного/многофакторного анализа Кокса, выполненного в прогностических группах в соответствии с настоящим изобретением, но также каждая прогностическая группа служила в качестве независимого фактора предсказания прогноза.
Затем, когда прогнозы сравнивали для всех проб (n=307) в отношении общей выживаемости больных, которые не получали химиотерапию (только хирургическое вмешательство), и больных, которые получали вспомогательную химиотерапию (СТХ), после получения гастрэктомии, не наблюдали значимое различие между группами, как показано на кривой Каплана-Мейера фиг. 10. По-видимому, такой результат возникает, поскольку пробы отбирали как ретроспективные выборки, и определение того, применялась ли вспомогательная химиотерапия или не применялась больному, было неправильным. Поэтому, данные анализировали путем выполнения многофакторного анализа Кокса с использованием таких параметров, как пол, возраст, стадия TNM и химиотерапевтическое лечение в примере 2.
В результате сравнения прогнозов пациентов, которые получали или не получали химиотерапию, в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S; n=145) в соответствии с настоящим изобретением, как показано на фиг. 11, не было никакого существенного различия между группой, которая получала химиотерапию, и группой, которая не получала химиотерапию, в однофакторном анализе Кокса, что, как считается, было вызвано погрешностью в группах выборки. Однако согласно многофакторному анализу Кокса с использованием таких параметров, как пол, возраст, стадия TNM показан статистически значимый результат, при котором группа, которая получала химиотерапию, показала более высокую эффективность химиотерапии, чем группа, которая не получала химиотерапию (см. таблицу 6 и фиг. 11).
Как проверено в отношении выживаемости без признаков заболевания, прогноз показал тот же результат, что и в отношении общей выживаемости. В предиктивном кластере S (n=145) в соответствии с настоящим изобретением при сравнении прогнозов больных, которые получали или не получали химиотерапию, в отношении выживаемости без признаков заболевания, как показано на фиг. 12, не было никакого существенного различия между группами, которые получали или не получали химиотерапию, согласно однофакторному анализу Кокса, тогда как согласно многофакторному анализу Кокса с использованием таких параметров, как пол, возраст, стадия TNM, группа, которая получала химиотерапию, показала более высокую эффективность химиотерапии, чем группа, которая не получала химиотерапию, которая была однако маргинальной. Выживаемость без признаков заболевания дополнительно проверяли в примере 4 (см. таблицу 7 и фиг. 12).
Затем в предиктивном кластере R (n=162) в результате сравнения прогнозов больных, которые получали и которые не получали химиотерапию, в отношении общей выживаемости, как показано на фиг. 13, группы, которые получали и которые не получали химиотерапию, показывали незначительное различие в выживаемости в соответствии с однофакторным/многофакторным анализом Кокса (см. таблицу 8 и фиг. 13).
Наконец, в результате сравнения прогнозов больных, которые получали и которые не получали химиотерапию, в предиктивный кластере R (n=162) в отношении выживаемости без признаков заболевания, как показано на фиг. 14, группы, которые получали и которые не получали химиотерапию, показывали незначительное различие в выживаемости в соответствии с однофакторным/многофакторным анализом Кокса (см. таблицу 9 и фиг. 14).
Пример 3. Проверка взаимосвязи между классификацией групп отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S и R) и химиотерапией
При сравнении взаимосвязи между отвечаемостью на химиотерапию (предиктивные кластеры) и химиотерапией выяснили, что не было прямого взаимосвязи между группами, достигающими полезных эффектов от химиотерапии, но было видно, что была взаимосвязь между отвечаемостью на химиотерапию (предиктивные кластеры) и химиотерапией, когда многофакторный анализ Кокса выполняли в отношении смещения ретроспективной выборки. Этот результат указывает на то, что, как видно из многофакторного анализа Кокса с параметрами возраст, пол и стадия TNM, пользу от химиотерапии ожидали в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), но не в группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R) (см. таблицу 10, р-значение = 0,039 многофакторного анализа Кокса предиктивных кластеров).
Как также проверено в отношении выживаемости без признаков заболевания, результат был таким же, как и для общей выживаемости. Это указывает на тот факт, что пользу химиотерапии ожидали в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), но не в группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R) (см. таблицу 11, р-значение = 0,048 многофакторного анализа Кокса предиктивных кластеров).
Поскольку прогнозы группы с хорошим прогнозом (прогностический кластер I) и группы с плохим прогнозом (прогностический кластер III), которые классифицировали согласно алгоритму в соответствии с настоящим изобретением, предсказывали из приведенного выше результата, было видно, что существовали значимые различия в общей 5-летней выживаемости и выживаемости без признаков заболевания. В результате сравнения общей 5-летней выживаемости польза хирургическое вмешательства и химиотерапии являются статистически значимыми в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), но не в группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R). Кроме того, этот результат статистически показывает, что существует взаимосвязь между классификацией групп отвечающих на химиотерапию и химиотерапией.
Пример 4. Проверка взаимосвязи пользы вспомогательной химиотерапии XELOX между прогностическими группами (прогностический кластер I, II, III) с использованием выборки клинического испытания CLASSIC и групп отвечающих на стандартную терапию кселода + оксалиплатин (XELOX) (предиктивный кластер R и S)
Клиническое испытание CLASSIC (исследование вспомогательных лекарственных средств капецитабина и оксалиплатина при раке желудка) представляет собой рандомное международное клиническое испытание 3 фазы, выполняемое в каждой из 37 больниц в Корее, Японии и Китае, для проверки химиотерапии кселода + оксалиплатин (XELOX) после хирургического вмешательства (иссечения D2) среди больных II и III стадии на основании 6-го издания AJCC. Всего в этом исследовании участвовали 1037 больных, из которых 515 больных только наблюдали после хирургического вмешательства, а 520 больным вводили кселоду и оксалиплатин (затем XELOX), и, таким образом, наконец, сообщили, что получавшая введение XELOX группа показала 15% эффект улучшения прогноза по сравнению с наблюдаемой группой. Таким образом, клиническое испытание CLASSIC использовали в качестве стандартного режима химиотерапии для больных II и III стадии.
Согласно типичному варианту осуществления эффекты в отношении прогноза и отвечаемости на химиотерапию проверяли на 629 образцах от больных, участвующих в клиническом испытание CLASSIC, с использованием набора nProfiler I, показанного в таблице 1.
Экстрагировали РНК из 629 образцов, как показано в примере 1 и подвергали 1 PCR с использованием набора nProfiler I анализа рака желудка. Контроль качества осуществляли, как описано в наборе nProfiler I, и, таким образом, четыре образца устраняли.
Значения Cq от общей сложностью 9 генов измеряли с помощью набора nProfiler I и значения ΔCq вычисляли согласно уравнению 1. Вычисленные значения ΔCq классифицировали на группы, как показано на фиг. 7 примера 1, путем применения эталонной точки для классификации согласно предварительно определенным значениям, как показано в таблице 3 примера 1.
Перед классификацией групп прогнозы группы, получавшие введение XELOX (XELOX) после хирургического вмешательства, и группы, получившие только хирургическое вмешательство, показаны на фиг. 15.
При сравнении прогнозов между группой больных, только наблюдаемых после хирургического вмешательства (только хирургическое вмешательство), и группой больных, получавших введение XELOX после получения гастрэктомии, можно увидеть, что существует значимое различие между группами во всех пробах (n=625) как показано на кривой Каплана-Мейера фиг. 15. В отличие от примеров 1, 2 и 3 в примере 4, поскольку пробы были собраны из образцов больных в рандомном клиническом испытании 3 фазы, установили, что не было погрешности в выборе лечения XELOX, и, поэтому, в примере 4 выполняли однофакторный/многофакторный анализ. В результате данного анализа в однофакторном анализе Кокса и на графике Каплана-Мейера наблюдали существенное различие в прогнозах между группой, получающей введение XELOX (СТХ), и группой только с наблюдением (только хирургическое вмешательство), что совпадает с результатом ранее опубликованной литературы (см. фиг. 15). Этот результат был таким же в отношении выживаемости без признаков заболевания (см. фиг. 17).
Значимость прогноза и отвечаемость на химиотерапию проверяли согласно алгоритму предсказания, показанному в примере 1 с использованием кривых Каплана-Мейера и однофакторных/многофакторных анализов Кокса.
Как показано на кривой Каплана-Мейера фиг. 16, можно наблюдать различие в прогнозах между тремя группами (прогностический кластер I, прогностический кластер II и прогностический кластер III). Общая 5-летняя выживаемость в трех группах составляла 83,2, 74,8 и 66,0%, соответственно, что указывает на тот факт, что среди трех групп прогностический кластер I имел наилучший прогноз, а прогностический кластер III имел худший прогноз.
Кроме того, как показано в таблице 12, в однофакторном/многофакторном анализе Кокса каждый подтип идентифицировали как независимый предиктивный фактор прогноза. В частности, существовало прогностическое различие между прогностическим кластером I и прогностическим кластером III, и прогностический кластер II определяли как буферную зону.
Такой результат проверяли в отношении выживаемости без признаков заболевания следующим образом. Подобно результату в отношении общей выживаемость можно видеть, что в отношении выживаемости без признаков заболевания существовало прогностическое различие между тремя группами (прогностический кластер I, прогностический кластер II и прогностический кластер III), как показано на кривой Каплана-Мейера фиг. 18. 5-летняя выживаемость без признаков заболевания в трех группах составляла 76,9, 65,0 и 55,3%, соответственно, что указывает на тот факт, что прогностический кластер I имел наилучший прогноз, а прогностический кластер III имел худший прогноз среди трех групп.
Кроме того, как показано в таблице 13, в результате проверки в отношении выживаемости без признаков заболевания в однофакторном/многофакторном анализе Кокса каждый подтип идентифицировали как независимый предиктивный фактор прогноза. В частности, существовало прогностическое различие между прогностическим кластером I и прогностическим кластером III, и прогностический кластер II определяли как буферную зону.
В предиктивном кластере S (n=281) при сравнении прогнозов группы больных, которые получали химиотерапевтическое лечение кселода + оксалиплатин (XELOX) (СТХ), и группой больных, получавших только наблюдение (только хирургическое вмешательство), в отношении общей выживаемости, как показано на фиг. 19, в однофакторном анализе Кокса наблюдали значимое различие между группой, которая получала химиотерапевтическое лечение XELOX, и группой, которая не получала химиотерапию. В многофакторном анализе Кокса с поправкой на пол, возраст и стадию TNM группа, которая получала химиотерапевтическое лечение XELOX, показывала статистически значимый результат, то есть хороший прогноз, который совпадал с таковым в однофакторном анализе, по сравнению с группой, которая получала только хирургическое вмешательство (см. таблицу 14 и фиг. 19).
Также при проверке упомянутого выше результата в отношении выживаемости без признаков заболевания, если в предиктивном кластере S (n=281) сравнивали прогнозы между группой больных, которые получали химиотерапевтическое лечение XELOX, и группой больных, которые получали только наблюдение, как показано на фиг.20, при этом наблюдали существенное различие между группой, которая получала химиотерапевтическое лечение XELOX, и группой, получившей только хирургическое вмешательство, в однофакторном анализе Кокса. В многофакторном анализе Кокса с поправкой на пол, возраст и стадию TNM группа, которая получала химиотерапевтическое лечение XELOX, показывала статистически значимый результат, то есть хороший прогноз, который совпадал с таковым в однофакторном анализе, по сравнению с группой, которая получала только хирургическое вмешательство (см. таблицу 15 и фиг. 20).
Затем в предиктивном кластере R (n=344) при сравнении прогнозов между группой больных, которые получали химиотерапевтическое лечение XELOX, и группой больных, которые получали только наблюдение, как показано на фиг. 21, не наблюдали значимого различия в выживаемости между двумя группами. Этот результат совпадал с таковым в однофакторном/многофакторном анализе Кокса (см. таблицу 16 и фиг. 21).
Затем при проверке прогнозов в отношении выживаемости без признаков заболевания наблюдали тот же результат, что и для общей выживаемости. В предиктивном кластере R (n=344) при сравнении прогнозов между группой больных, которые получали химиотерапевтическое лечение XELOX, и группой больных, которые получали только наблюдение, как показано на фиг. 22, не наблюдали значимого различия в выживаемости между двумя группами. Этот результат совпадал с таковым в однофакторном/многофакторном анализе Кокса (см. таблицу 17 и фиг. 22).
После этого при проверке прогноза в отношении общей выживаемости можно было увидеть, что существовала прямая взаимосвязь между отвечаемостью на химиотерапию (предиктивный кластер) и химиотерапевтическим лечением XELOX (таблица 18).
При проверке прогнозов в отношении выживаемости без признаков заболевания можно было увидеть, что существовала прямая взаимосвязь между отвечаемостью на химиотерапию (предиктивный кластер), такой как общая выживаемость, и химиотерапевтическим лечением XELOX, как подтверждено в отношении общей выживаемости (таблица 19).
Данный результат получен путем проверки результата примера 3 и показывает, что преимущество химиотерапии XELOX наблюдается в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), но не наблюдается в группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R).
В результате предсказания прогнозов в группе с хорошим прогнозом (прогностический кластер I) и группе с плохим прогнозом (прогностический кластер III), которые классифицируют с помощью алгоритма в соответствии с настоящим изобретением по описанному выше результату, можно видеть, что существует значимое различие в 5-летней выживаемости. Кроме того, эффект химиотерапии XELOX после хирургического вмешательства в значительной степени проявлялся в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер S), но терапевтический эффект не наблюдали в группе неотвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R), что указывает на значимую взаимосвязь отвечаемости на химиотерапию и лечения XELOX.
Пример 5. Оценивание клинической эффективности в прогностических группах (прогностические кластеры I, II и III) с использованием остальных FFPE проб после хирургического вмешательства у больных прогрессирующим раком желудка II и III стадии
Для проверки оценивания клинической эффективности алгоритма предсказания прогноза у больных рака желудка, полученного в примере 1 (с помощью медицинского устройства nProfiler I для анализа рака желудка), измеряли значение ΔCq гена с помощью PCR в режиме реального времени, выполняемой на остальных FFPE пробах после хирургического вмешательства для больных с раком желудка II и III стадии (на основании 6-го издания AJCC), и тестировали клиническую эффективность алгоритма, который предсказывает прогноз больного, на новой группе субъектов. В частности, 1) эффективность предсказания с помощью алгоритма оценивали путем идентификации 5-летней выживаемости двух прогностических групп (прогностический кластер I, прогностический кластер III), выведенной из ряда проверок по кривой Каплана-Мейера; 2) стабильность прогностического различия между группами оценивали с помощью сравнительного теста на прогностическое различие между прогностическими группами со статистической значимостью с использованием теста логарифмических рангов, чтобы определить, что среди трех групп прогностический кластер I является лучшей прогностической группой, а прогностический кластер III является худшей прогностической группой; и 3) отношение рисков в прогностической группе анализировали с использованием многофакторной модели пропорциональных рисков Кокса, чтобы определить то, что прогностическая группа является независимым прогностическим фактором.
Для клинического испытания использовали общей сложностью 684 проб и на стадии скрининга проб 18 проб исключили из-а недостаточного количества и качества РНК. За исключением 18 проб, исключенных при скрининге, 666 проб приняли в качестве проб для клинического испытания. На первой стадии теста и анализа 126 проб из общей сложностью 666 проб не соответствовали критериям QC, так что выполняли единоразовое повторное тестирование, что привело к исключению 12 проб из общей сложностью 126 проб из-за не соответствия критериям QC. В результате, за исключением общей сложностью 30 проб, таких как 18 проб, отклоненных при скрининге и 12 проб, исключенных из-за критериев повторного тестирования, 654 пробы из 684 целевых проб отобрали в качестве группы анализа оценивания эффективности.
В данном клиническом испытании не проводили оценивание отвечаемости на химиотерапию (предиктивный кластер R, S), потому что, поскольку 97,7% больных из больных, от которых были получены 654 пробы, получали химиотерапию, не хватало больных, которые не получали химиотерапию, для сравнения прогностического различия между больными, которые получали химиотерапию, и больными, которые не получали химиотерапию, которых классифицировали как подгруппы в группе отвечающих на химиотерапию (предиктивный кластер R или S).
Сначала, чтобы измерить эффективность предсказания 5-летней выживаемости в прогностических группах, прогностические группы классифицировали путем применения значения ΔCq образца в алгоритме, а затем выживаемость в прогностической группе вычисляли с помощью кривых Каплана-Мейера (см. фиг. 23 и таблицу 20).
Кроме того, в результате проверки перекрывания между 95% доверительными интервалами двух прогностических групп, таких как прогностическая группа I и прогностическая группа III, подтвердили, что перекрывание отсутствовало, как показано в приведенной ниже таблице 21.
2
Для подтверждения стабильности в различии между прогностическими группами прогностические группы I, II и III подвергали тесту логарифмических рангов для идентификации статистически значимого различия и для статистического вычисления, р-значение вычисляли путем вычисления хи-квадрата с 2 степенями свободы. Если не было различия в эффекте сравнения прогностических групп, то проявление события (смерти) во всех разделах должно происходить с частотой, пропорциональной количеству наблюдаемых субъектов (О) в трех прогностических группах в каждом разделе. В тесте логарифмических рангов весь кластер, который суммирует три прогностические группы, был упорядочен по времени наблюдения, и исходя из этого цензурированная запись была исключена, чтобы оставить только раздел, в котором произошло событие (смерть). Кроме того, вычисляли ожидаемую частоту (Е) смерти для каждой прогностической группы. Поскольку взаимосвязь между общей частотой наблюдения (О) и ожидаемой частотой (Е) в отношении смерти для каждой прогностической группы показала распределение хи-квадрат с двумя степенями свободы, если значение (X) было больше 5,99 (р-значение <0,05), считали, что три прогностические группы показывают значимое различие. Нулевая гипотеза в тесте логарифмических рангов была следующей:
0
Н: отсутствие различия между прогностическими кластерами I, II и III.
Способ вычисления ожидаемой частоты (ожидаемой смертности)
(E1j: ожидаемая смертность j переменной в группа 1; Oj: ожидаемая смертность j переменных во всех группах; N1j: число субъектов наблюдения j переменной в группе 1; Nj: число субъектов наблюдения j переменных во всех группах).
2
-1
t
Статистические показатели теста логарифмических рангов между двумя или более группами: хи-квадрат X=Z(Σ)Z (Σ: матрица вариаций и ковариаций, Z: k-1 статистический вектор).
Если р-значения по отношению к статистическим показателям теста логарифмических рангов было меньше 0,05, это интерпретировали как наличие прогностического различия между прогностическими группами, и наоборот, если р-значения по отношению к статистическому показателю превышало 0,05, это интерпретировали как отсутствие прогностического различия между прогностическими группами.
2
В результате, если хи-квадрат (X) с 2 степенями свободы был рассчитан как 24,7 (р-значение = 4,39е-06), то было указано статистически значимое различие (см. таблицу 22). Таким образом, можно видеть, что существовало прогностическое различие между этими тремя группами (прогностические кластеры I, II и III).
Чтобы выяснить, где происходит различие между тремя прогностическими группами в результате выполнения апостериорного теста, имеющего распределение хи-квадрат с двумя степенями свободы, с использованием теста логарифмических рангов, можно наблюдать различие в прогнозе при вычислении всех значимых р-значений. То есть, поскольку различие между тремя прогностическими группами было очевидным, было решено, что этот результат отвечает стабильности в различие между прогностическими группами.
Чтобы подтвердить степень рисков и независимость прогностических групп, влияние других факторов риска (возраста, пола, стадии TNM и химиотерапии) рака желудка корректировали, чтобы оценить, было ли различие в выживаемости согласно фактору риска, то есть самой прогностической группе, с помощью анализа соотношения рисков. С помощью способа анализа с использованием модели пропорциональных рисков Кокса выполняли многофакторный анализ с использованием уже имеющегося фактора прогноза в качестве ковариации, чтобы выяснить, была ли прогностическая группа согласно алгоритму независимым прогностическим фактором, который повлиял на прогноз рака желудка.
Нулевой анализ с использованием модели пропорциональных рисков Кокса был следующим.
0
j
Н: β=0 означает, что два индивидуума с разными факторами риска пропорционально связаны независимо от времени (t).
0
1
1
k
k
h(t)=h(t)exp(βχ+ … +βχ).
1
k
0
[χ, …, χ: независимые переменные (факторы риска), h(t): исходный риск на момент времени t, то есть указывающий на риск для индивидуума со значением «0» для всех независимых переменных].
Соотношение рисков
Вычисление статистических показателей и р-значения
α/2
1-α/2
0
α/2
1-α/2
0
Если Z<Z или Z<Z, Н отклоняется, и если Z≤Z≤Z, Н принимается, р-значение = 2×[1-Ф(Z)], если Z≥0,
2×Ф(Z), если Z<0.
Затем из 654 образцов, отобранных в качестве группы анализа оценивания эффективности, 22 образца, которые были неопределенными в отношении того, была ли получена химиотерапия, исключали из анализа, а оставшиеся 632 образца анализировали с использованием многофакторной модели пропорциональных рисков Кокса для вычисления соотношения рисков, а также его 95% доверительного интервала и р-значения.
В результате многофакторного анализа с использованием модели пропорциональных рисков Кокса, если соотношение рисков между двумя прогностическими кластерами (прогностический кластер I по сравнению с прогностическим кластером III) было статистически значимым (р-значение < 0,05), делали вывод о том, что прогностическая группа согласно алгоритму представляла собой независимый прогностический фактор.
В результате анализа с использованием модели пропорциональных рисков Кокса показали, что в качестве факторов риска (независимых переменных), влияющих на прогноз рака желудка, возраст (значение р=0,000112), стадия TNM (значение р=1,67е-08) и прогностическая группа были статистически значимыми.
В случае прогностической группы (прогностический кластер), которая является переменной оценивания для клинического испытания, соотношение рисков прогностических кластеров II и III вычисляли с использованием прогностического кластера I эталона соответствующей независимой переменной. Таким образом, при диагностике по сравнению с прогностическим кластером I прогностический кластер II (р-значение = 0,001475) был в 2,04 раза опаснее, а прогностический кластер III (р-значение = 1,40е-05) был в 2,58 раза опаснее, что было статистически значимым.
Следовательно, хотя модель пропорциональных рисков Кокса скорректировали с учетом факторов риска (возраста, пола, стадии TNM и химиотерапии), было видно, что классификация прогностических кластеров согласно алгоритму является независимым прогностическим фактором при раке желудка.
В результате оценивания безопасности клинического испытания в течение соответствующего периода тестер хранил и обрабатывал образец в соответствии с указаниями биологической безопасности лаборатории. Согласно наблюдениям в течение периода клинического испытания, не возникали никакие проблемы безопасности, связанные с побочными эффектами, такими как аномальные случаи и инфекции от образцов, для тестера, работающего с образцом.
Результат оценивания клинической эффективности прогноза проверяли с использованием алгоритма предсказания, полученного в примере 1, посредством клинического испытания и порогового значения алгоритма. 5-летнюю выживаемость в прогностическом кластере I и прогностическом кластере III в качестве переменных оценивания эффективности подтверждали как 81,98% (95% CI, 74,12-90,67%) и 55,74 (95% CI, 50,52-61,49%), соответственно, что отвечало критериям оценивания в плане клинического испытания, и подтвердили, что 95% CI 5-летней выживаемости в прогностическое группе I и прогностической группе III не перекрывались друг с другом.
Кроме того, в соответствии с тестом логарифмических рангов, проведенным для оценивания наличия прогностического различия между тремя классифицированными прогностическими группами, подтвердили, что между этими тремя группами существовало значимое различие. Кроме того, в соответствии с апостериорным анализом вычисляли значимые р-значения для всех трех групп, что указывает на существование прогностического различия между группами. То есть, поскольку между тремя прогностическими группами различие было очевидным, то результат отвечает стабильности в различии между прогностическими группами.
Наконец, при оценке соотношения рисков путем выполнения многофакторного анализа с использованием модели пропорциональных рисков Кокса с использованием возраста, пола, химиотерапии, стадии и т.д. в качестве ковариат, по сравнению с прогностическим кластером I прогностический кластер II (р-значение = 0,001475) по сравнению с прогностическим кластером I прогностический кластер II, и по сравнению с прогностическим кластером I прогностический кластер III (р-значение = 1,40е-05) был в 2,58 раза опаснее, что было статистически значимым. То есть подтвердили, что прогностический кластер I имел наилучший прогноз, а прогностический кластер III имел худший прогноз. То есть, хотя модель пропорциональных рисков Кокса скорректировали с учетом факторов риска (например, возраста, пола, стадии TNM и химиотерапии), было видно, что классификация прогностических кластеров согласно алгоритму является независимым прогностическим фактором при раке желудка.
Следовательно, как показано результатом оценивания для клинического испытания, алгоритм предсказания прогноза для больного раком желудка, который получали в примере 1, и клиническая эффективность медицинского устройства для анализа рака желудка nProfiler I были признаны успешно оцененными.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение может быть использовано в качестве дополнительной информации для определения способа лечения больного раком желудка.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  Novomics Co., Ltd.
<120>  System for predicting prognosis and benefit from adjuvant
chemotherapy for patients with stage II and III gastric cancer
<130>  G19C30C0369P/RU
<150>  KR 10-2017-0032027
<151>  2017-03-14
<160>  27
<170>  PatentIn version 3.2
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  SFRP4 forward primer
<400>  1
ggagacttcc gacttcctta ca                                              22
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  SFRP4 reverse primer
<400>  2
tggccttaca taggctgtcc                                                 20
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  GZMB forward primer
<400>  3
cggtggcttc ctgatacaag                                                 20
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  GZMB reverse primer
<400>  4
ttatggagct tccccaacag                                                 20
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  WARS forward primer
<400>  5
ttgtggaccc atggacagta                                                 20
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  WARS reverse primer
<400>  6
ccaaaccgaa caatgagctt                                                 20
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDX1 forward primer
<400>  7
agggaggaac gtggtcaact                                                 20
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDX1 reverse primer
<400>  8
tatgatgggg gcaggtagaa                                                 20
<210>  9
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ACTB forward primer
<400>  9
tcaccctgaa gtaccccatc                                                 20
<210>  10
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ACTB reverse primer
<400>  10
tgtggtgcca gattttctcc                                                 20
<210>  11
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ATP5E forward primer
<400>  11
atggtggcct actggagaca                                                 20
<210>  12
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ATP5E reverse primer
<400>  12
ctctcactgc ttttgcacag a                                               21
<210>  13
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  HPRT1 forward primer
<400>  13
tggtcaggca gtataatcca a                                               21
<210>  14
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  HPRT1 reverse primer
<400>  14
cttcgtgggg tccttttcac                                                 20
<210>  15
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  GPX1 forward primer
<400>  15
cccgtgcaac cagtttgg                                                   18
<210>  16
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  GPX1 reverse primer
<400>  16
ggacgtactt gagggaattc aga                                             23
<210>  17
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  UBB forward primer
<400>  17
tgggtgagct tgtttgtgtc                                                 20
<210>  18
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  UBB reverse primer
<400>  18
tttgacctgt tagcggatac c                                               21
<210>  19
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  SFRP4 probe
<400>  19
aggcaatgcc cagcctcatc                                                 20
<210>  20
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  GZMB probe
<400>  20
cgacttcgtg ctgacagctg c                                               21
<210>  21
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  WARS probe
<400>  21
tgccttttgc actgcttgtc tg                                              22
<210>  22
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDX1 probe
<400>  22
tgcctcttcc tgcagcctca                                                 20
<210>  23
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ACTB probe
<400>  23
cggcatcgtc accaactggg                                                 20
<210>  24
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ATP5E probe
<400>  24
tggactcagc tacatccgat actccca                                         27
<210>  25
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  HPRT1 probe
<400>  25
tgcaagcttg cgaccttgac c                                               21
<210>  26
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  GPX1 probe
<400>  26
ctcttcgttc ttggcgttct cctgatg                                         27
<210>  27
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  UBB probe
<400>  27
caccaaccac gtccacccac                                                 20
<---