ШТАММ КЛЕТОК CHO-SE-9/4 - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЭРИТРОПОЭТИНА ЧЕЛОВЕКА И ХИМЕРНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ДАННЫМ ШТАММОМ
CHO-SE-9/4 CELL STRAIN, PRODUCER OF CHIMERIC HUMAN ERYTHROPOIETIN ANTIBODY AND CHIMERIC ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению антител к эритропоэтину человека. Изобретение может быть использовано для выделения и/или очистки рекомбинантного эритропоэтина человека из культуральной жидкости методом иммуноаффинной хроматографии.
Продукция красных кровяных клеток, эритроцитов, необходимых для транспорта кислорода, постоянно происходит в клетках костного мозга и регулируется специфическим гормоном - эритропоэтином. Эритропоэтин представляет собой кислый гликопротеин с молекулярным весом около 34000 Да, синтезируемый в почках. Функцией эритропоэтина является стимулирование пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников эритроцитарного ряда [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины, С-Пб, 2008].
В обычных условиях, когда ткани здорового организма получают достаточное количество кислорода, эритропоэтин содержится в плазме крови в очень низких концентрациях (10-15 мМЕ/мл). Эта низкая концентрация достаточна для поддержания воспроизводства красных кровяных телец взамен выбывающих в процессе старения.
Однако концентрация эритропоэтина в крови многократно возрастает в условиях гипоксии, когда снижается перенос кислорода кровяными клетками. Гипоксия может быть вызвана, например, потерей большого количества крови при кровотечениях, разрушением эритроцитов вследствие радиоактивного облучения, снижением потребления кислорода при нахождении в высоких слоях атмосферы, а также при анемиях [Симбирцев А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека С-Пб, 2018].
В медицинской практике рекомбинантный эритропоэтин, полученный с использованием генно-инженерных технологий, применяют при анемиях, патологиях почек, кровопотерях и на поздних стадиях онкологических заболеваний. Рекомбинантный эритропоэтин получают путем культивирования клеток-продуцентов эритропоэтина с его последующей очисткой. Очистка эритропоэтина производится хроматографическими методами, которые могут включать стадию иммуноаффинной хроматографии с применением иммобилизованных моноклональных антител к эритропоэтину.
Известны моноклональные антитела к эритропоэтину (US 4558005 А, 10.12.1985; ЕР 0116446 В1, 22.08.1990; RU 2151184 С1, 20.06.2000; RU 2145610 С1, 20.02.2000, RU 2451071 С1, 02.05.2012). Описанные антитела могут применяться при очистке эритропоэтина, однако все они являются мышиными. Применение для очистки эритропоэтина мышиных моноклональных антител нежелательно из-за возможности развития иммунного ответа на мышиные антитела или их фрагменты, которые могут контаминировать препарат эритропоэтина вследствие протеолиза используемых для его очистки иммобилизованных антител.
Этого недостатка в значительной степени можно избежать за счет использования для очистки эритропоэтина химерного (мышь-человек) антитела к эритропоэтину, в котором константные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела мыши заменены на аналогичные области антитела человека.
Из патента RU 2513689 известно химерное антитело 6-4A3him. В примере 4 упомянутого патента представлено конструирование последовательностей ДНК (генов), кодирующих тяжелую и легкую цепи химерного антитела 6-4A3him, вставка полученных генов в экспрессионные векторы, трансфекция данными векторами клеток СНО линии DG-44, культивирование трансфицированных клеток в течение 7 дней с очисткой и определением свойств полученного химерного антитела. Известно, что в течение 1-2 недель трансфицированные плазмидными ДНК клетки продуцируют рекомбинантные белки, но данная продукция в дальнейшем многократно снижается вследствие генетической нестабильности трансфицированных клеток и так называемого «замолкания» промотора [Jia J., Hou C., Hughes В.S., Smede M., Leung K.M., Levine K., Rigby S., Gray P.P., Munro T.P. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system // New Biotechnology, 2014, 31(3): 214-220]. Однако внедрение химерного антитела в производственную практику требует создания штамма клеток - стабильных продуцентов такого антитела. В RU 2513689 такая задача не была решена.
Для выделения из пулов первично трансфицированных клеток стабильных штаммов-продуцентов применяют генетические и селекционные методы [там же; Nair A.R., Xie Jinger X., Hermiston Т.W. Effect of different UCOE-promoter combinations in creation of engineered cell lines for the production of Factor VIII // BMC Research Notes, 2011, 4:178].
Для удовлетворения растущих потребностей медицины в препаратах эритропоэтина существует необходимость в совершенствовании технологии его получения, в том числе в создании штамма клеток - стабильных продуцентов химерного антитела к эритропоэтину.
Задачей настоящего изобретения является создание штамма культивируемых клеток - стабильных продуцентов химерного антитела к эритропоэтину.
Поставленная задача решается тем, что предложен штамм культивируемых клеток яичников китайского хомячка CHO-SE-9/4 - продуцент химерного антитела SE-9/4 к эритропоэтину человека.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Штамм клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus (авторское наименование штамма - CHO-SE-9/4) - продуцент рекомбинантного химерного антитела против эритропоэтина человека.
dhfr-
Родословная штамма: Родительская клеточная линия CHO. Котрансфекция плазмидами pTVK4g/hybEpo-H и pTVK4d/hybEpo-L с последовательным отбором стабильного высокопродуктивного клона на среде без гипоксантина/тимидина с метотрексатом и на среде с генетицином. Плазмида pTVK4g/hybEpo-H несет последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, ген устойчивости к генетицину и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК тяжелой цепи химерного антитела к эритропоэтину и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина. Плазмида pTVK4d/hybEpo-L несет последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, ген устойчивости к метотрексату и служебные последовательности, обеспечивающие транскрипцию мРНК легкой цепи химерного антитела против эритропоэтина человека и интеграцию плазмиды в транскрипционно активные участки хроматина.
6
6
Культуральные свойства: Суспензионное культивирование в пробирках, колбах или 6-луночных планшетах на орбитальном шейкере с частотой вращения 130-180 об/мин, либо в биореакторе (ферментере). Посевная доза 0,3⋅10-0,5⋅10 клеток/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 24-26 часов. Устойчив к 5 мкг/мл метотрексата и к 0,2 мг/мл генетицина.
2
Стандартные условия выращивания: Среда CDM4 СНО (HyClone) без гипоксантина/тимидина с 6 мМ глутамина, 5 нМ метотрексата, 37°С, 5% CO.
Характеристика культивирования в организме животного: культивирование в организме животного не применяется.
Характеристики полезного вещества, продуцируемого штаммом: Рекомбинантное химерное (мышь-человек) антитело (изотип IgG1, каппа) к эритропоэтину человека (оценка с помощью иммуноферментного анализа, вестерн-блота).
Характеристика биосинтеза полезных продуктов: Рекомбинантное химерное антитело к эритропоэтину человека, секретируется в культуральную среду в количестве не менее 20 пг на клетку в сутки. Стабильность продукции антитела сохраняется после 30 пассажей в неселективных условиях.
6
6
Способ криоконсервирования: 45% свежей среды CDM4 СНО, 45% кондиционной среды, 10% DMSO, 3⋅10-5⋅10 клеток/мл, заморозка до -70°C со скоростью 1°C/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта составила 90% (с трипановым синим).
Продуцируемое химерное антитело характеризуется наличием следующих отличительных признаков:
а) аминокислотная последовательность тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12;
б) аминокислотная последовательность легкой цепи по SEQ ID NO: 14;
в) аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность антитела:
CDRH-1 по SEQ ID NO: 5, CDRH-2 по SEQ ID NO: 6, CDRH-3 по SEQ ID NO: 7;
CDRL-1 по SEQ ID NO: 8, CDRL-2 no SEQ ID NO: 9, CDRL-3 по SEQ ID NO: 10;
d
-8
г) константа диссоциации с рекомбинантным эритропоэтином K=6,3-10 M;
д) изоэлектрическая точка в диапазоне pI от 7,86 до 8,53;
е) молекулярный вес 160 кД.
Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.
На Фиг. 1 представлены схемы плазмид pTVK4d/hybEpo-L (А) и pTVK4g/hybEpo-H (Б), где
CMV Promoter - промотор предранних белков цитомегаловируса;
hybEpo-L - последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела к эритропоэтину человека (SEQ ID NO: 13);
hybEpo-H - последовательность ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела к эритропоэтину человека (SEQ ID NO: 11);
TKpolyA - сайт полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;
SV40 Promoter - промотор ранних белков вируса SV40;
DHFR - ген дигидрофолатредуктазы;
Neo - ген устойчивости к неомицину;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;
pUC Ori - точка начала репликации;
Amp - ген бактериального фермента β-лактамазы;
UCOE - регуляторный элемент, усиливающий экспрессию целевого гена.
На Фиг. 2 представлена динамика накопления химерного антитела SE-9/4 (мкг/мл) и числа жизнеспособных клеток (млн/мл) штамма-продуцента CHO-SE-9/4.
На Фиг. 3 представлены результаты электрофореза антитела SE-9/4 в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. 1 - восстанавливающие условия, 2 - маркеры молекулярной массы, 3 - невосстанавливающие условия.
На Фиг. 4 представлено изофокусирование антитела SE-9/4. Фракция в - pI 8,53; фракция г - pI 8,49; фракция д - pI 8,37; фракция е - pI 8,17; фракция ж - pI 8,00; фракция з - pI 7,91 и фракция и - pI 7,86.
На Фиг. 5 представлен анализ связывания антитела SE-9/4 с эритропоэтином методом поверхностного плазмонного резонанса. Концентрация эритропоэтина: к - 200 нМ, л - 100 нМ, м - 50 нМ, н - 25 нМ, о - 12,5 нМ.
На Фиг. 6 представлены результаты аффинной хроматографии рекомбинантного эритропоэтина человека на колонке с иммобилизованным антителом SE-9/4. 4 - элюция посторонних белков 1 М раствором NaCl, 5 - элюция рекомбинантного эритропоэтина человека 0,1 М раствором лимонной кислоты, 6 - очистка колонки от загрязнений.
Подробное описание изобретения
-8
Для создания химерного антитела против эритропоэтина человека первоначально была получена мышиная гибридома, секретирующая моноклональное антитело к эритропоэтину человека. Из клеток данной гибридомы была выделена РНК, на матрице которой была синтезирована кДНК, которая, в свою очередь, была использована в качестве матрицы для синтеза ДНК, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела. Данные ДНК были слиты с последовательностями, кодирующими, соответственно, константные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина G человека с получением генов тяжелой и легкой цепей химерного (мышь-человек) антитела SE-9/4. Было показано, что экспрессия химерных цепей антитела в клетках СНО приводит к секреции антитела, эффективно связывающего эритропоэтин человека. Рекомбинантное антитело по настоящему изобретению имеет аффинность к эритропоэтину с константой диссоциации Кd=6,3⋅10 М, вычисленной по результатам связывания SE-9/4 с эритропоэтином, установленным методом поверхностного плазмонного резонанса, и может быть использовано для аффинной хроматографии эритропоэтина.
На основе химерного антитела SE-9/4 могут быть также получены одноцепочечные и гуманизированные антитела к эритропоэтину человека.
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение гибридомы мыши, продуцирующей моноклональное антитело против эритропоэтина человека.
Мышей линии Balb/c иммунизировали рекомбинантным эритропоэтином человека в полном адъюванте Фрейнда в концентрации 10 мкг/мышь в апоневроз задних конечностей. На 28 день мышам повторно вводили антиген в неполном адъюванте Фрейнда в дозе 5 мкг/мышь. Еще через 21 день мышей иммунизировали в дозе 10 мкг/мышь внутривенно. Далее проводили выделение клеток селезенки и их слияние с клетками миеломы SP2/0 по стандартной процедуре [Pandey S. Hybridoma Technology For Production Of Monoclonal Antibodies // International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 2010, 1(2): 017]. После отбора на селективной НАТ-среде в образцах культуральной жидкости определяли наличие антител к эритропоэтину методом твердофазного иммуноферментного анализа. Позитивные клоны подвергали дальнейшему клонированию и скринингу. В результате был отобран клон гибридных клеток, стабильно продуцирующих моноклональное антитело к эритропоэтину человека. С помощью иммуноферментного набора ISO-2 kit 072K4849 (Sigma, США) был установлен изотип тяжелой цепи продуцируемого антитела (G1) и легкой цепи (каппа). С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что данное антитело не связывается с белками сыворотки крови и селезенки мышей, а также с белками сыворотки крови человека и растворимыми белками гомогената культивируемых клеток яичников китайского хомячка (СНО).
Пример 2. Выделение кДНК и секвенирование вариабельных областей легкой и тяжелой цепей.
Из клеток полученной гибридомы была выделена тотальная РНК. 100 нг полученной РНК подвергали обратной транскрипции с набором случайных гексануклеотидных праймеров.
На матрице полученной кДНК с помощью наборов синтетических праймеров были амплифицированы фрагменты генов, кодирующие вариабельные области тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей антитела. Полученные фрагменты генов были вставлены в вектор pAL-TA (Евроген, Москва) и секвенированы со стандартных праймеров M13F и M13R. Последовательности ДНК, кодирующие VH и VL, представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, вычисленные аминокислотные последовательности VH и VL представлены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Анализ последовательностей аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела производили с помощью программы IMGTACQUEST (Immunogenetics Information System, http://www.imgt.org). Это позволило выделить участки мышиного моноклонального антитела, определяющие комплементарность к антигену для тяжелой цепи: CDR-H1, CDR-Н2 и CDR-H3, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, и легкой цепи: CDRL-1, CDRL-2 и CDRL-3, представленные в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно.
Пример 3. Конструирование химерного антитела SE-9/4 к эритропоэтину.
С помощью полимеразной цепной реакции последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела, были состыкованы с последовательностями ДНК, кодирующими константную область тяжелой цепи IgG1 человека и константную область легкой каппа цепи иммуноглобулина G человека соответственно.
Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая тяжелую цепь химерного (мышь-человек) антитела, представлена в SEQ ID NO: 11, последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела - в SEQ ID NO: 12.
Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая легкую цепь химерного антитела, представлена в SEQ ID NO: 13, последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела - в SEQ ID NO: 14. Сконструированное химерное антитело получило название SE-9/4.
Пример 4. Создание штамма-продуцента химерного антитела SE-9/4 против эритропоэтина человека.
Полученные в примере 3 ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи химерного антитела, удлиняли путем постановки ПЦР с праймерами, содержавшими сайты рестрикции XbaI и NotI, обрабатывали данными рестриктазами и лигировали с рестрицированными XbaI и NotI плазмидными векторами серии pTVK4. В результате были получены плазмиды pTVK4g/hybEpo-H (Фиг. 1Б) и pTVK4d/hybEpo-L (Фиг. 1А). Плазмида pTVK4g/hybEpo-H несет последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, промотор цитомегаловируса, сайт полиаденилирования, ген устойчивости к генетицину и элемент UCOE из генома мыши, длиной 2990 нуклеотидов, обеспечивающий преимущественную интеграцию вектора в транскрипционно активные участки хроматина [Jia J. Hou C., Hughes В.S., Smede M., Leung K.M., Levine K., Rigby S., Gray P.P., Munro T.P. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system // New Biotechnology, 2014, 31(3): 214-220; Nair A. R., Xie Jinger X., Hermiston T.W. Effect of different UCOE-promoter combinations in creation of engineered cell lines for the production of Factor VIII // BMC Research Notes, 2011, 4:178]. Плазмида pTVK4d/hybEpo-L несет последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь химерного антитела против эритропоэтина человека, промотор цитомегаловируса, сайт полиаденилирования, ген дигидрофолатредуктазы, обеспечивающий устойчивость к метотрексату, и элемент UCOE из 5'-нетранслируемой области гена RPS3 мыши, длиной 2990 нуклеотидов.
dhfr-
Для постоянной трансфекции использовали клетки линии яичников китайского хомячка, дефицитные по гену дигидрофолатредуктазы (CHO), ранее адаптированные к суспензионному росту в бессывороточных условиях (Biaggio R.T., Abreu-Neto M.S., Covas D.T., Swiech K. Serum-free suspension culturing of human cells: adaptation, growth, and cryo-preservation // Bioprocess Biosyst Eng., 2015, 38(8): 1495-1507).
2
2
Клетки культивировали в среде CDM4CHO (HyClone, США) с добавлением 4 мМ аланилглутамина, 0,1 мМ гипоксантина, 0,016 мМ тимидина и 0,1% Pluronic F-68 (Sigma, США) в микробиореакторах типа TubeSpin 50 (ТРР, Швейцария) на орбитальном шейкере Sanyo MIR-S100C (200 об/мин), который был помещен в СО-инкубатор, обеспечивающий содержание в воздухе 5% СО и температуру 37°С.
6
Трансфекцию проводили с помощью липосомального реагента «Free-style» (Life Technologies, США) по инструкции производителя, используя смесь из 3,6 мкг плазмиды pTVK4g/hybEpo-H и 2,4 мкг плазмиды pTVK4d/hybEpo-L на 5-10 клеток. Через 48 часов после трансфекции клетки переводили на среду без гипоксантина/тимидина с добавлением 5 мкг/мл метотрексата. В последующие дни среду меняли с интервалом 3 суток. Выросшие клетки затем пересевали на среду, содержавшую 0,2 мг/мл генетицина. Через 15 суток клетки переносили в колбы Эрленмейера в культуральную среду для последующего наращивания, после чего производили клонирование путем высева клеток в плотности одна клетка на лунку 96-луночного планшета. Таким образом было засеяно 20 планшетов по 96 лунок в каждом. Через 12 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон. Всего было идентифицировано 500 клонов. Через 3 суток культивирования с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) оценивали содержание иммуноглобулинов человека в образцах культуральной среды индивидуальных клонов.
6
Для дальнейшей работы было отобрано 18 клонов, обеспечивших накопление иммуноглобулинов человека в концентрации более 1200 нг/мл. Отобранные клоны были целиком перенесены в 48-луночные планшеты. Через 48 часов культивирования был проведен повторный анализ концентрации иммуноглобулинов в образцах культуральной среды. По результатам второго анализа было отобрано 9 клонов с максимальной волюметрической продукцией рекомбинантных антител, концентрация иммуноглобулинов в культуральной среде которых была более 6000 нг/мл. Далее клетки каждого клона высевали в 12-луночные планшеты по 0,5⋅10 клеток на лунку в 2 мл среды и культивировали в тех же условиях. Продукцию антител оценивали на 5 сутки после посева. В результате были отобраны 7 клонов с максимальной продукцией антитела на 5 сутки.
6
6
Полученные клоны культивировали на шейкере в микробиореакторах типа TubeSpin 50 в 5 мл культуральной среды. Начальная плотность культуры составляла 0,5⋅10 клеток/мл, пересев проводили с интервалом 3 суток. После третьего пассажа клетки высевали в плотности 0,5⋅10 клеток/мл в 5 мл среды без метотрексата и генетицина и анализировали продукцию антител и динамику роста клеток. На основании полученных данных рассчитывали удельную продуктивность клеток клонов, которая оказалась наилучшей у клона 41.
6
Далее клетки клона 41 последовательно адаптировали к росту на среде с 5 нМ метотрексата (МТХ). После 7 пассажей в среде с МТХ клетки субклонировали в 96-луночные планшеты в среде с 5 нМ МТХ, при этом был получен 61 субклон. В результате анализа их продуктивности было показано, что субклон 9/4 обладает наилучшими ростовыми характеристиками и продуктивностью: на 6 сутки культивирования плотность жизнеспособных клеток составила 4,3⋅10 клеток/мл при жизнеспособности 90%, а максимальная волюметрическая продукция рекомбинантных антител - 20 мкг/мл. Субклон 9/4 был помещен в клеточный банк ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» под названием CHO-SE-9/4.

6
6
2
Клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 рассевали в мини-биореакторы, содержавшие по 5 мл среды CDM4CHO (HyClone, США), в которую добавляли 4 мМ аланил-глутамина (Applichem, Германия), 0,1% Plutonic F-68 (Sigma, США) и 5% EX-CELL CD Hydrolysate Fusion (HyClone, США). Исходная концентрация клеток составляла 0,6⋅10 клеток/мл. Культивирование проводили на шейкере-инкубаторе LT-X (Kuhner, Швейцария), со скоростью вращения 200 об/мин и амплитудой 50 мм при 5% СО. В первые трое суток культивирования поддерживали температуру 37 С, затем ее понижали до 32 С. Дальнейшее культивирование проводили при 32 С. Начиная с четвертых суток, в мини-биореакторы ежедневно добавляли питательные добавки Cell Boost 7а и Cell Boost 7b (HyClone, США) по 2% и 0,2% от первоначального объема культуры соответственно. Культивирование продолжали до 14 суток, достигнув максимальной плотности клеток более 9⋅10/мл и концентрации химерного антитела 1200 мкг/мл (Фиг. 2). Удельная продукция целевого антитела, рассчитанная по методике, описанной в статье Chusainow J., Yuan Sheng Yang Y.S., J.H.M. Yeo, Toh C.P., Asvadi P., Wong N.S.C, Yap M.S.G. A Study of Monoclonal Antibody-Producing CHO Cell Lines: What Makes a Stable High Producer? // Biotechnol. Bioeng., 2009, 102:1182-1196, составила 20 пг антитела SE-9/4 на клетку в сутки. Для оценки стабильности продукции химерного антитела клетки штамма CHO-SE-9/4 последовательно культивировали в 5 мл среды CDM4CHO без добавления метотрексата и генетицина в течение 3 суток, после чего пересевали в 5 мл аналогичной среды. Данную процедуру повторяли 30 раз, после чего вновь культивировали клетки в мини-биореакторе с добавлением питательных добавок и понижением температуры до 32°С на 4-е сутки культивирования. Концентрация химерного антитела в культуральной среде на 14 сутки культивирования составила 1150±100 мкг/мл. Таким образом, клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 сохранили первоначальную продуктивность после 30 пассажей в неселективных условиях культивирования, что говорит о стабильности полученного штамма-продуцента.
Пример 5. Очистка химерного антитела SE9/4 и определение его свойств.
Клетки штамма-продуцента CHO-SE-9/4 культивировали в 5 колбах Эрленмейера емкостью 1 л, заполненных 50 мл среды. Состав среды, питательные добавки и режим культивирования использовали, как в примере 4. Накопление в среде культивирования химерного моноклонального антитела SE-9/4 определяли методом иммуноферментного анализа. В результате на 12 сутки культивирования было получено 200 мл культуральной среды, которую наносили на колонку, содержавшую 5 мл сефарозы с иммобилизованным белком A (GE Healthcare Life Sciences, США), промывку колонки и элюирование антитела проводили по инструкции изготовителя. В результате был получен лабораторный образец очищенного рекомбинантного химерного антитела SE-9/4 против эритропоэтина человека в количестве 80 мг.
Анализ химерного антитела SE-9/4 методом электрофореза в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия показал, что оно имеет молекулярный вес примерно 160 кД в невосстанавливающих условиях, в восстанавливающих условиях антитело диссоциирует на белки с молекулярной массой 49 и 24 кДа, что соответствует ожидаемым показателям для тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (Фиг. 3). Изоэлектрическое фокусирование антитела SE-9/4 в мочевине при 20 С проводили с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» (Люмэкс, Россия), в нейтральном капилляре длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм, используя амфолиты «Pharmalyte 3-10» (GE, США) и пептидные маркеры с известными изоэлектрическими точками («Beckman Coulter», США). Результаты регистрировали по светопоглощению при длине волны 280 нм с последующей обработкой в программе «Эльфоран» (Фиг. 4). Антитело SE-9/4 имеет изоэлектрические точки в диапазоне pI от 7,86 до 8,53, что может быть связано с гетерологичным гликозилированием. Основная фракция (фракция е), содержащая 74,89% материала, соответствует изоточке с pI=8,17, кроме того, наблюдаются другие фракции: фракция в имеет pI 8,53; фракция г - pI 8,49; фракция д - pI 8,37; фракция ж - pI 8,00; фракция з - pI 7,91 и фракция и - pI 7,86. (Фиг. 4).
2
d
Для определения аффинности антитела SE-9/4 к рекомбинантному эритропоэтину человека был использован метод поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора «Biacore X100» с двойной проточной ячейкой (GE-Healthcare, США). После иммобилизации антитела против IgG человека (Abeam, США) в ячейке прибора (4,9 нг на 1 мм поверхности ячейки) в ячейку добавляли раствор антитела SE-9/4 (50 нМ), промывали от несвязавшегося антитела, вводили раствор эритропоэтина человека в концентрации от 12,5 нМ до 200 нМ, после чего диссоциацию комплекса антиген-антитело проводили путем промывки ячейки буферным раствором (Фиг. 5). Равновесная константа диссоциации K комплекса SE-9/4-эритропоэтин была определена по зависимости установившегося значения ответа (RU) от концентраций эритропоэтина (ЕРО), при этом полученные данные соответствовали уравнению Ленгмюра для модели одноцентрового связывания:
eq
max
d
d
где R - ответ (RU) при достижении равновесия, R - ответ (RU) при насыщении поверхности антителом SE-9/4. K - равновесная константа диссоциации комплекса антитела SE-9/4 с эритропоэтином, [ЕРО] -концентрация эритропоэтина. Было получено значение K=63 нМ.
Пример 6. Применение химерного антитела SE-9/4 для очистки рекомбинантного эритропоэтина человека.
5
Химерное антитело SE-9/4 очищали из среды культивирования с помощью хроматографии на белок А-сефарозе. Выделенное антитело в количестве 5 мг иммобилизовывали на 2 мл CNBr-активированной матрицы Sepharose FF (GE Healthcare, США) по методике изготовителя и помещали в хроматографическую колонку. На колонку, предварительно уравновешенную фосфатным буфером, наносили 20 мл кондиционной культуральной среды, содержащей рекомбинантный эритропоэтин человека (Фиг. 6). После промывки колонки фосфатным буфером, содержащим 1 М хлористого натрия и 0,02% неионного детергента (пик 4 на Фиг. 6), сорбированный эритропоэтин человека элюировали 0,1 М раствором лимонной кислоты (пик 5 на Фиг. 6). рН полученного раствора эритропоэтина человека доводили до значения 7,5 дробным добавлением 0,1 М раствора NaOH, после чего анализировали свойства эритропоэтина. По данным электрофореза в полиакриламидном геле чистота эритропоэтина, очищенного с помощью иммобилизованного антитела SE-9/4, составила 95%, выход не менее 80%. Биологическая активность полученного эритропоэтина, определяемая по приросту ретикулоцитов в крови мышей после подкожного введения, составила 1,2⋅10 МЕ/мг белка.
Штамм-продуцент CHO-SE-9/4 был помещен на хранение в музей ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России. Удельная продуктивность клеток штамма CHO-SE-9/4 составляет не менее 20 пг антитела SE-9/4 на клетку в сутки, время удвоения от 24 до 26 часов.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Штамм клеток CHO-SE-9/4 - продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.
--->
Перечень последовательностей нуклеотидов
<110> Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства
Federal State Unitary Enterprise «State Research Institute of Ultra Pure Biologicals» of the Federal Medical and Biological Agency
<120> Штамм клеток СНО SE-9/4 — продуцент химерного антитела против эритропоэтина человека и химерное антитело, продуцируемое данным штаммом
<130>
<160> 14
<210> 1
<211> 358
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела мыши к эритропоэтину человека
<400> 1
<b>CAG</b>
<b>GTT</b>
<b>CAG</b>
<b>CTG</b>
<b>CAA</b>
<b>CAA</b>
<b>TCT</b>
<b>GGG</b>
<b>GCT</b>
<b>GAG</b>
<b>CTG</b>
<b>GTG</b>
<b>AGG</b>
<b>39</b>
<b>Gln</b>
<b>Val</b>
<b>Gln</b>
<b>Leu</b>
<b>Gln</b>
<b>Gln</b>
<b>Ser</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Glu</b>
<b>Leu</b>
<b>Val</b>
<b>Arg</b>
<b>1</b>
<b>5</b>
<b>10</b>
<b>CCT</b>
<b>GGG</b>
<b>GCT</b>
<b>TCA</b>
<b>GTG</b>
<b>AAG</b>
<b>CTG</b>
<b>TCC</b>
<b>TGC</b>
<b>AAG</b>
<b>GCT</b>
<b>TTG</b>
<b>GGC</b>
<b>78</b>
<b>Pro</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Ser</b>
<b>Val</b>
<b>Lys</b>
<b>Leu</b>
<b>Ser</b>
<b>Cys</b>
<b>Lys</b>
<b>Ala</b>
<b>Leu</b>
<b>Gly</b>
<b>15</b>
<b>20</b>
<b>25</b>
<b>TAC</b>
<b>ACT</b>
<b>TTT</b>
<b>ACT</b>
<b>GAC</b>
<b>TAT</b>
<b>GAA</b>
<b>ATG</b>
<b>CAC</b>
<b>TGG</b>
<b>GTG</b>
<b>AAG</b>
<b>CAG</b>
<b>117</b>
<b>Tyr</b>
<b>Thr</b>
<b>Phe</b>
<b>Thr</b>
<b>Asp</b>
<b>Tyr</b>
<b>Glu</b>
<b>Met</b>
<b>His</b>
<b>Trp</b>
<b>Val</b>
<b>Lys</b>
<b>Gln</b>
<b>30</b>
<b>35</b>
<b>ACA</b>
<b>CCT</b>
<b>GTG</b>
<b>CAT</b>
<b>GGC</b>
<b>CTG</b>
<b>GAA</b>
<b>TGG</b>
<b>ATT</b>
<b>GGA</b>
<b>GCT</b>
<b>ATT</b>
<b>TAT</b>
<b>156</b>
<b>Thr</b>
<b>Pro</b>
<b>Val</b>
<b>His</b>
<b>Gly</b>
<b>Leu</b>
<b>Glu</b>
<b>Trp</b>
<b>Ile</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Ile</b>
<b>Tyr</b>
<b>40</b>
<b>45</b>
<b>50</b>
<b>CCA</b>
<b>GGA</b>
<b>AGT</b>
<b>GGT</b>
<b>GGT</b>
<b>ACT</b>
<b>GTC</b>
<b>TAC</b>
<b>AAT</b>
<b>CAG</b>
<b>AAG</b>
<b>TTC</b>
<b>AAG</b>
<b>195</b>
<b>Pro</b>
<b>Gly</b>
<b>Ser</b>
<b>Gly</b>
<b>Gly</b>
<b>Thr</b>
<b>Val</b>
<b>Tyr</b>
<b>Asn</b>
<b>Gln</b>
<b>Lys</b>
<b>Phe</b>
<b>Lys</b>
<b>55</b>
<b>60</b>
<b>65</b>
<b>GGC</b>
<b>AAG</b>
<b>GCC</b>
<b>ACA</b>
<b>CTG</b>
<b>ACT</b>
<b>GCA</b>
<b>GAC</b>
<b>AAA</b>
<b>TCC</b>
<b>TCC</b>
<b>AGC</b>
<b>ACA</b>
<b>234</b>
<b>Ala</b>
<b>Thr</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Ala</b>
<b>Asp</b>
<b>Lys</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>Thr</b>
<b>Ala</b>
<b>Tyr</b>
<b>70</b>
<b>75</b>
GCC
TAC
ATG
GAG
CTC
AGC
AGC
CTG
ACA
TCT
GAG
GAC
TCT
273
<b>Gly</b>
<b>Lys</b>
<b>Met</b>
<b>Glu</b>
<b>Leu</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Ser</b>
<b>Glu</b>
<b>Asp</b>
<b>Ser</b>
<b>80</b>
<b>85</b>
<b>90</b>
<b>GCT</b>
<b>GTC</b>
<b>TAT</b>
<b>TAC</b>
<b>TGT</b>
<b>ACA</b>
<b>AGA</b>
<b>ATA</b>
<b>GGG</b>
<b>ATT</b>
<b>ATG</b>
<b>ACA</b>
<b>GGG</b>
<b>312</b>
<b>Ala</b>
<b>Val</b>
<b>Tyr</b>
<b>Tyr</b>
<b>Cys</b>
<b>Thr</b>
<b>Arg</b>
<b>Ile</b>
<b>Gly</b>
<b>Ile</b>
<b>Met</b>
<b>Thr</b>
<b>Gly</b>
<b>95</b>
<b>100</b>
<b>TAC</b>
<b>TTC</b>
<b>GAT</b>
<b>GTC</b>
<b>TGG</b>
<b>GGC</b>
<b>GCA</b>
<b>GGG</b>
<b>ACC</b>
<b>ACG</b>
<b>GTC</b>
<b>ACC</b>
<b>GTC</b>
<b>351</b>
<b>Tyr</b>
<b>Phe</b>
<b>Asp</b>
<b>Val</b>
<b>Trp</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Gly</b>
<b>Thr</b>
<b>Thr</b>
<b>Val</b>
<b>Thr</b>
<b>Val</b>
<b>105</b>
<b>110</b>
<b>115</b>
<b>TCG</b>
<b>AGC</b>
<b>G</b>
<b>358</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>119</b>
<210> 2
<211> 336
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(336)
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела мыши к эритропоэтину человека
<400> 2
GAT
GTT
TTG
ATG
ACC
CAA
AGT
CCA
CTC
TCC
CTG
CCT
GTC
39
Asp
Val
Leu
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Leu
Ser
Leu
Pro
Val
1
5
10
AGT
CTT
GGA
GAT
CAA
GCC
TCC
ATC
TCT
TGC
AGA
TCT
AGT
78
Ser
Leu
Gly
Asp
Gln
Ala
Ser
Ile
Ser
Cys
Arg
Ser
Ser
15
20
25
CAG
AGC
ATT
GTA
TAT
AGT
AAT
GGA
AAC
ACC
TAT
TTA
GAA
117
Gln
Ser
Ile
Val
Tyr
Ser
Asn
Gly
Asn
Thr
Tyr
Leu
Glu
30
35
TGG
TAC
CTG
CAG
AAA
CCA
GGC
CAG
TCT
CCA
AAG
CTC
CTG
156
Trp
Tyr
Leu
Gln
Lys
Pro
Gly
Gln
Ser
Pro
Lys
Leu
Leu
40
45
50
ATC
TAC
AAA
GTT
TCC
AAC
CGA
TTT
TCT
GGG
GTC
CCA
GAC
195
Ile
Tyr
Lys
Val
Ser
Asn
Arg
Phe
Ser
Gly
Val
Pro
Asp
55
60
65
AGG
TTC
AGT
GGC
AGT
GGA
TCA
GGG
ACA
GAT
TTC
ACA
CTC
234
Arg
Phe
Ser
Gly
Ser
Gly
Ser
Gly
Thr
Asp
Phe
Thr
Leu
70
75
AAG
ATC
AGC
AGA
GTG
GAG
GCT
GAG
GAT
CTG
GGA
GTT
TAT
273
Lys
Ile
Ser
Arg
Val
Glu
Ala
Glu
Asp
Leu
Gly
Val
Tyr
80
85
90
TAC
TGT
TTT
CAA
GGT
TCA
CAT
GTT
CCG
TAC
ACG
TTC
GGA
312
Tyr
Cys
Phe
Gln
Gly
Ser
His
Val
Pro
Tyr
Thr
Phe
Gly
95
100
GGG
GGG
ACC
AAG
CTG
GAG
CTG
AAA
336
Gly
Gly
Thr
Lys
Leu
Glu
Leu
Lys
105
110
112
<210> 3
<211> 119
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(119)
<223> Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 3
<b>Gln</b>
<b>Val</b>
<b>Gln</b>
<b>Leu</b>
<b>Gln</b>
<b>Gln</b>
<b>Ser</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Glu</b>
<b>Leu</b>
<b>Val</b>
<b>Arg</b>
<b>1</b>
<b>5</b>
<b>10</b>
<b>Pro</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Ser</b>
<b>Val</b>
<b>Lys</b>
<b>Leu</b>
<b>Ser</b>
<b>Cys</b>
<b>Lys</b>
<b>Ala</b>
<b>Leu</b>
<b>Gly</b>
<b>15</b>
<b>20</b>
<b>25</b>
<b>Tyr</b>
<b>Thr</b>
<b>Phe</b>
<b>Thr</b>
<b>Asp</b>
<b>Tyr</b>
<b>Glu</b>
<b>Met</b>
<b>His</b>
<b>Trp</b>
<b>Val</b>
<b>Lys</b>
<b>Gln</b>
<b>30</b>
<b>35</b>
<b>Thr</b>
<b>Pro</b>
<b>Val</b>
<b>His</b>
<b>Gly</b>
<b>Leu</b>
<b>Glu</b>
<b>Trp</b>
<b>Ile</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Ile</b>
<b>Tyr</b>
<b>40</b>
<b>45</b>
<b>50</b>
<b>Pro</b>
<b>Gly</b>
<b>Ser</b>
<b>Gly</b>
<b>Gly</b>
<b>Thr</b>
<b>Val</b>
<b>Tyr</b>
<b>Asn</b>
<b>Gln</b>
<b>Lys</b>
<b>Phe</b>
<b>Lys</b>
<b>55</b>
<b>60</b>
<b>65</b>
<b>Ala</b>
<b>Thr</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Ala</b>
<b>Asp</b>
<b>Lys</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>Thr</b>
<b>Ala</b>
<b>Tyr</b>
<b>70</b>
<b>75</b>
<b>Gly</b>
<b>Lys</b>
<b>Met</b>
<b>Glu</b>
<b>Leu</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Ser</b>
<b>Glu</b>
<b>Asp</b>
<b>Ser</b>
<b>80</b>
<b>85</b>
<b>90</b>
<b>Ala</b>
<b>Val</b>
<b>Tyr</b>
<b>Tyr</b>
<b>Cys</b>
<b>Thr</b>
<b>Arg</b>
<b>Ile</b>
<b>Gly</b>
<b>Ile</b>
<b>Met</b>
<b>Thr</b>
<b>Gly</b>
<b>95</b>
<b>100</b>
<b>Tyr</b>
<b>Phe</b>
<b>Asp</b>
<b>Val</b>
<b>Trp</b>
<b>Gly</b>
<b>Ala</b>
<b>Gly</b>
<b>Thr</b>
<b>Thr</b>
<b>Val</b>
<b>Thr</b>
<b>Val</b>
<b>105</b>
<b>110</b>
<b>115</b>
<b>Ser</b>
<b>Ser</b>
<b>119</b>
<210> 4
<211> 112
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(112)
<223> Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 4
Asp
Val
Leu
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Leu
Ser
Leu
Pro
Val
1
5
10
Ser
Leu
Gly
Asp
Gln
Ala
Ser
Ile
Ser
Cys
Arg
Ser
Ser
15
20
25
Gln
Ser
Ile
Val
Tyr
Ser
Asn
Gly
Asn
Thr
Tyr
Leu
Glu
30
35
Trp
Tyr
Leu
Gln
Lys
Pro
Gly
Gln
Ser
Pro
Lys
Leu
Leu
40
45
50
Ile
Tyr
Lys
Val
Ser
Asn
Arg
Phe
Ser
Gly
Val
Pro
Asp
55
60
65
Arg
Phe
Ser
Gly
Ser
Gly
Ser
Gly
Thr
Asp
Phe
Thr
Leu
70
75
Lys
Ile
Ser
Arg
Val
Glu
Ala
Glu
Asp
Leu
Gly
Val
Tyr
80
85
90
Tyr
Cys
Phe
Gln
Gly
Ser
His
Val
Pro
Tyr
Thr
Phe
Gly
95
100
Gly
Gly
Thr
Lys
Leu
Glu
Leu
Lys
105
110
112
<210> 5
<211> 8
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(8)
<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-1 моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 5
Gly
Tyr
Thr
Phe
Thr
Asp
Tyr
Glu
1
5
8
<210> 6
<211> 8
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(8)
<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-2 моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 6
<b>Ile</b>
<b>Tyr</b>
<b>Pro</b>
<b>Gly</b>
<b>Ser</b>
<b>Gly</b>
<b>Gly</b>
<b>Thr</b>
<b>1</b>
<b>5</b>
<b>8</b>
<210> 7
<211> 12
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(12)
<223> Последовательность аминокислот участка CDRH-3 моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 7
Thr
Arg
Ile
Gly
Ile
Met
Thr
Gly
Tyr
Phe
Asp
Val
1
5
10
12
<210> 8
<211> 11
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(11)
<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-1 моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 8
Gln
Ser
Ile
Val
Tyr
Ser
Asn
Gly
Asn
Thr
Tyr
1
5
10
11
<210> 9
<211> 3
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(3)
<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-2 моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 9
Lys
Val
Ser
1
3
<210> 10
<211> 9
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<222> (1)…(9)
<223> Последовательность аминокислот участка CDRL-3 моноклонального антитела к эритропоэтину человека
<400> 10
Phe
Gln
Gly
Ser
His
Val
Pro
Tyr
Thr
1
5
9
<210> 11
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(1347)
<223> ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела SE-9/4
<400> 11
CAG
GTT
CAG
CTG
CAA
CAA
TCT
GGG
GCT
GAG
CTG
GTG
AGG
39
Gln
Val
Gln
Leu
Gln
Gln
Ser
Gly
Ala
Glu
Leu
Val
Arg
1
5
10
CCT
GGG
GCT
TCA
GTG
AAG
CTG
TCC
TGC
AAG
GCT
TTG
GGC
78
Pro
Gly
Ala
Ser
Val
Lys
Leu
Ser
Cys
Lys
Ala
Leu
Gly
15
20
25
TAC
ACT
TTT
ACT
GAC
TAT
GAA
ATG
CAC
TGG
GTG
AAG
CAG
117
Tyr
Thr
Phe
Thr
Asp
Tyr
Glu
Met
His
Trp
Val
Lys
Gln
30
35
ACA
CCT
GTG
CAT
GGC
CTG
GAA
TGG
ATT
GGA
GCT
ATT
TAT
156
Thr
Pro
Val
His
Gly
Leu
Glu
Trp
Ile
Gly
Ala
Ile
Tyr
40
45
50
CCA
GGA
AGT
GGT
GGT
ACT
GTC
TAC
AAT
CAG
AAG
TTC
AAG
195
Pro
Gly
Ser
Gly
Gly
Thr
Val
Tyr
Asn
Gln
Lys
Phe
Lys
55
60
65
GGC
AAG
GCC
ACA
CTG
ACT
GCA
GAC
AAA
TCC
TCC
AGC
ACA
234
Gly
Lys
Ala
Thr
Leu
Thr
Ala
Asp
Lys
Ser
Ser
Ser
Thr
70
75
GCC
TAC
ATG
GAG
CTC
AGC
AGC
CTG
ACA
TCT
GAG
GAC
TCT
273
Ala
Tyr
Met
Glu
Leu
Ser
Ser
Leu
Thr
Ser
Glu
Asp
Ser
80
85
90
GCT
GTC
TAT
TAC
TGT
ACA
AGA
ATA
GGG
ATT
ATG
ACA
GGG
312
Ala
Val
Tyr
Tyr
Cys
Thr
Arg
Ile
Gly
Ile
Met
Thr
Gly
95
100
TAC
TTC
GAT
GTC
TGG
GGC
GCA
GGG
ACC
ACG
GTC
ACC
GTC
351
Tyr
Phe
Asp
Val
Trp
Gly
Ala
Gly
Thr
Thr
Val
Thr
Val
105
110
115
TCG
AGC
GCT
TCT
ACC
AAG
GGC
CCC
TCC
GTG
TTC
CCT
CTG
390
Ser
Ser
Ala
Ser
Thr
Lys
Gly
Pro
Ser
Val
Phe
Pro
Leu
120
125
130
GCC
CCT
TCC
AGC
AAG
TCT
ACC
TCT
GGC
GGC
ACA
GCC
GCT
429
Ala
Pro
Ser
Ser
Lys
Ser
Thr
Ser
Gly
Gly
Thr
Ala
Ala
135
140
CTG
GGC
TGC
CTC
GTG
AAG
GAC
TAC
TTC
CCC
GAG
CCC
GTG
468
Leu
Gly
Cys
Leu
Val
Lys
Asp
Tyr
Phe
Pro
Glu
Pro
Val
145
150
155
ACA
GTG
TCC
TGG
AAC
TCT
GGC
GCT
CTG
ACC
TCC
GGC
GTG
507
Thr
Val
Ser
Trp
Asn
Ser
Gly
Ala
Leu
Thr
Ser
Gly
Val
160
165
CAC
ACC
TTC
CCG
GCG
GTG
CTG
CAG
AGC
AGC
GGC
CTG
TAT
546
His
Thr
Phe
Pro
Ala
Val
Leu
Gln
Ser
Ser
Gly
Leu
Tyr
170
175
180
AGC
CTG
AGC
AGC
GTG
GTG
ACC
GTG
CCG
AGC
AGC
AGC
CTG
585
Ser
Leu
Ser
Ser
Val
Val
Thr
Val
Pro
Ser
Ser
Ser
Leu
185
190
195
GGC
ACC
CAG
ACC
TAT
ATT
TGC
AAC
GTG
AAC
CAT
AAA
CCG
624
Gly
Thr
Gln
Thr
Tyr
Ile
Cys
Asn
Val
Asn
His
Lys
Pro
200
205
AGC
AAC
ACC
AAA
GTG
GAT
AAA
AAA
GTG
GAA
CCG
AAA
AGC
663
Ser
Asn
Thr
Lys
Val
Asp
Lys
Lys
Val
Glu
Pro
Lys
Ser
210
215
220
TGC
GAT
AAA
ACC
CAT
ACC
TGC
CCG
CCG
TGC
CCG
GCG
CCG
702
Cys
Asp
Lys Thr
His
Thr
Cys
Pro
Pro
Cys
Pro
Ala
Pro
225
230
GAA
CTG
CTG
GGC
GGC
CCG
AGC
GTG
TTT
CTG
TTT
CCG
CCG
741
Glu
Leu
Leu
Gly
Gly
Pro
Ser
Val
Phe
Leu
Phe
Pro
Pro
235
240
245
AAA
CCG
AAA
GAT
ACC
CTG
ATG
ATT
AGC
CGT
ACC
CCG
GAA
780
Lys
Pro
Lys
Asp
Thr
Leu
Met
Ile
Ser
Arg
Thr
Pro
Glu
250
255
260
GTG
ACC
TGC
GTG
GTG
GTG
GAT
GTG
AGC
CAT
GAA
GAT
CCG
819
Val
Thr
Cys
Val
Val
Val
Asp
Val
Ser
His
Glu
Asp
Pro
265
270
GAA
GTG
AAA
TTT
AAC
TGG
TAT
GTG
GAT
GGC
GTG
GAA
GTG
858
Glu
Val
Lys
Phe
Asn
Trp
Tyr
Val
Asp
Gly
Val
Glu
Val
275
280
285
CAT
AAC
GCG
AAA
ACC
AAA
CCG
CGT
GAA
GAA
CAG
TAT
AAC
897
His
Asn
Ala
Lys
Thr
Lys
Pro
Arg
Glu
Glu
Gln
Tyr
Asn
290
295
AGC
ACC
TAT
CGT
GTG
GTG
AGC
GTG
CTG
ACC
GTG
CTG
CAT
936
Ser
Thr
Tyr
Arg
Val
Val
Ser
Val
Leu
Thr
Val
Leu
His
300
305
310
CAG
GAT
TGG
CTG
AAC
GGC
AAA
GAA
TAT
AAA
TGC
AAA
GTG
975
Gln
Asp
Trp
Leu
Asn
Gly
Lys
Glu
Tyr
Lys
Cys
Lys
Val
315
320
325
AGC
AAC
AAA
GCG
CTG
CCG
GCG
CCG
ATT
GAA
AAA
ACC
ATT
1014
Ser
Asn
Lys
Ala
Leu
Pro
Ala
Pro
Ile
Glu
Lys
Thr
Ile
330
335
AGC
AAA
GCG
AAA
GGC
CAG
CCG
CGT
GAA
CCG
CAG
GTG
TAT
1053
Ser
Lys
Ala
Lys
Gly
Gln
Pro
Arg
Glu
Pro
Gln
Val
Tyr
340
345
350
ACC
CTG
CCG
CCG
AGC
CGT
GAT
GAA
CTG
ACC
AAA
AAC
CAG
1092
Thr
Leu
Pro
Pro
Ser
Arg
Asp
Glu
Leu
Thr
Lys
Asn
Gln
355
360
GTG
AGC
CTG
ACC
TGC
CTG
GTG
AAA
GGC
TTT
TAT
CCG
AGC
1131
Val
Ser
Leu
Thr
Cys
Leu
Val
Lys
Gly
Phe
Tyr
Pro
Ser
365
370
375
GAT
ATT
GCG
GTG
GAA
TGG
GAA
AGC
AAC
GGC
CAG
CCG
GAA
1170
Asp
Ile
Ala
Val
Glu
Trp
Glu
Ser
Asn
Gly
Gln
Pro
Glu
380
385
390
AAC
AAC
TAT
AAA
ACC
ACC
CCG
CCG
GTG
CTG
GAT
AGC
GAT
1209
Asn
Asn
Tyr
Lys
Thr
Thr
Pro
Pro
Val
Leu
Asp
Ser
Asp
395
400
GGC
AGC
TTT
TTT
CTG
TAT
AGC
AAA
CTG
ACC
GTG
GAT
AAA
1248
Gly
Ser
Phe
Phe
Leu
Tyr
Ser
Lys
Leu
Thr
Val
Asp
Lys
405
410
415
AGC
CGT
TGG
CAG
CAG
GGC
AAC
GTG
TTT
AGC
TGC
AGC
GTG
1287
Ser
Arg
Trp
Gln
Gln
Gly
Asn
Val
Phe
Ser
Cys
Ser
Val
420
425
ATG
CAT
GAA
GCG
CTG
CAT
AAC
CAT
TAT
ACC
CAG
AAA
AGC
1326
Met
His
Glu
Ala
Leu
His
Asn
His
Tyr
Thr
Gln
Lys
Ser
430
435
440
CTG
AGC
CTG
AGC
CCG
GGC
AAA
1347
Leu
Ser
Leu
Ser
Pro
Gly
Lys
445
449
<210> 12
<211> 449
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(449)
<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела SE-9/4
<400> 12
Gln
Val
Gln
Leu
Gln
Gln
Ser
Gly
Ala
Glu
Leu
Val
Arg
1
5
10
Pro
Gly
Ala
Ser
Val
Lys
Leu
Ser
Cys
Lys
Ala
Leu
Gly
15
20
25
Tyr
Thr
Phe
Thr
Asp
Tyr
Glu
Met
His
Trp
Val
Lys
Gln
30
35
Thr
Pro
Val
His
Gly
Leu
Glu
Trp
Ile
Gly
Ala
Ile
Tyr
40
45
50
Pro
Gly
Ser
Gly
Gly
Thr
Val
Tyr
Asn
Gln
Lys
Phe
Lys
55
60
65
Gly
Lys
Ala
Thr
Leu
Thr
Ala
Asp
Lys
Ser
Ser
Ser
Thr
70
75
Ala
Tyr
Met
Glu
Leu
Ser
Ser
Leu
Thr
Ser
Glu
Asp
Ser
80
85
90
Ala
Val
Tyr
Tyr
Cys
Thr
Arg
Ile
Gly
Ile
Met
Thr
Gly
95
100
Tyr
Phe
Asp
Val
Trp
Gly
Ala
Gly
Thr
Thr
Val
Thr
Val
105
110
115
Ser
Ser
Ala
Ser
Thr
Lys
Gly
Pro
Ser
Val
Phe
Pro
Leu
120
125
130
Ala
Pro
Ser
Ser
Lys
Ser
Thr
Ser
Gly
Gly
Thr
Ala
Ala
135
140
Leu
Gly
Cys
Leu
Val
Lys
Asp
Tyr
Phe
Pro
Glu
Pro
Val
145
150
155
Thr
Val
Ser
Trp
Asn
Ser
Gly
Ala
Leu
Thr
Ser
Gly
Val
160
165
His
Thr
Phe
Pro
Ala
Val
Leu
Gln
Ser
Ser
Gly
Leu
Tyr
170
175
180
Ser
Leu
Ser
Ser
Val
Val
Thr
Val
Pro
Ser
Ser
Ser
Leu
185
190
195
Gly
Thr
Gln
Thr
Tyr
Ile
Cys
Asn
Val
Asn
His
Lys
Pro
200
205
Ser
Asn
Thr
Lys
Val
Asp
Lys
Lys
Val
Glu
Pro
Lys
Ser
210
215
220
Cys
Asp
Lys Thr
His
Thr
Cys
Pro
Pro
Cys
Pro
Ala
Pro
225
230
Glu
Leu
Leu
Gly
Gly
Pro
Ser
Val
Phe
Leu
Phe
Pro
Pro
235
240
245
Lys
Pro
Lys
Asp
Thr
Leu
Met
Ile
Ser
Arg
Thr
Pro
Glu
250
255
260
Val
Thr
Cys
Val
Val
Val
Asp
Val
Ser
His
Glu
Asp
Pro
265
270
Glu
Val
Lys
Phe
Asn
Trp
Tyr
Val
Asp
Gly
Val
Glu
Val
275
280
285
His
Asn
Ala
Lys
Thr
Lys
Pro
Arg
Glu
Glu
Gln
Tyr
Asn
290
295
Ser
Thr
Tyr
Arg
Val
Val
Ser
Val
Leu
Thr
Val
Leu
His
300
305
310
Gln
Asp
Trp
Leu
Asn
Gly
Lys
Glu
Tyr
Lys
Cys
Lys
Val
315
320
325
Ser
Asn
Lys
Ala
Leu
Pro
Ala
Pro
Ile
Glu
Lys
Thr
Ile
330
335
Ser
Lys
Ala
Lys
Gly
Gln
Pro
Arg
Glu
Pro
Gln
Val
Tyr
340
345
350
Thr
Leu
Pro
Pro
Ser
Arg
Asp
Glu
Leu
Thr
Lys
Asn
Gln
355
360
Val
Ser
Leu
Thr
Cys
Leu
Val
Lys
Gly
Phe
Tyr
Pro
Ser
365
370
375
Asp
Ile
Ala
Val
Glu
Trp
Glu
Ser
Asn
Gly
Gln
Pro
Glu
380
385
390
Asn
Asn
Tyr
Lys
Thr
Thr
Pro
Pro
Val
Leu
Asp
Ser
Asp
395
400
Gly
Ser
Phe
Phe
Leu
Tyr
Ser
Lys
Leu
Thr
Val
Asp
Lys
405
410
415
Ser
Arg
Trp
Gln
Gln
Gly
Asn
Val
Phe
Ser
Cys
Ser
Val
420
425
Met
His
Glu
Ala
Leu
His
Asn
His
Tyr
Thr
Gln
Lys
Ser
430
435
440
Leu
Ser
Leu
Ser
Pro
Gly
Lys
445
449
<210> 13
<211> 660
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(660)
<223> ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела SE-9/4
<400> 13
GAT
GTT
TTG
ATG
ACC
CAA
AGT
CCA
CTC
TCC
CTG
CCT
GTC
39
Asp
Val
Leu
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Leu
Ser
Leu
Pro
Val
1
5
10
AGT
CTT
GGA
GAT
CAA
GCC
TCC
ATC
TCT
TGC
AGA
TCT
AGT
78
Ser
Leu
Gly
Asp
Gln
Ala
Ser
Ile
Ser
Cys
Arg
Ser
Ser
15
20
25
CAG
AGC
ATT
GTA
TAT
AGT
AAT
GGA
AAC
ACC
TAT
TTA
GAA
117
Gln
Ser
Ile
Val
Tyr
Ser
Asn
Gly
Asn
Thr
Tyr
Leu
Glu
30
35
TGG
TAC
CTG
CAG
AAA
CCA
GGC
CAG
TCT
CCA
AAG
CTC
CTG
156
Trp
Tyr
Leu
Gln
Lys
Pro
Gly
Gln
Ser
Pro
Lys
Leu
Leu
40
45
50
ATC
TAC
AAA
GTT
TCC
AAC
CGA
TTT
TCT
GGG
GTC
CCA
GAC
195
Ile
Tyr
Lys
Val
Ser
Asn
Arg
Phe
Ser
Gly
Val
Pro
Asp
55
60
65
AGG
TTC
AGT
GGC
AGT
GGA
TCA
GGG
ACA
GAT
TTC
ACA
CTC
234
Arg
Phe
Ser
Gly
Ser
Gly
Ser
Gly
Thr
Asp
Phe
Thr
Leu
70
75
AAG
ATC
AGC
AGA
GTG
GAG
GCT
GAG
GAT
CTG
GGA
GTT
TAT
273
Lys
Ile
Ser
Arg
Val
Glu
Ala
Glu
Asp
Leu
Gly
Val
Tyr
80
85
90
TAC
TGT
TTT
CAA
GGT
TCA
CAT
GTT
CCG
TAC
ACG
TTC
GGA
312
Tyr
Cys
Phe
Gln
Gly
Ser
His
Val
Pro
Tyr
Thr
Phe
Gly
95
100
GGG
GGG
ACC
AAG
CTG
GAG
CTG
AAA
CGA
ACT
GTG
GCT
GCA
351
Gly
Gly
Thr
Lys
Leu
Glu
Leu
Lys
Arg
Thr
Val
Ala
Ala
105
110
115
CCA
TCT
GTC
TTC
ATC
TTC
CCG
CCA
TCT
GAT
GAG
CAG
TTG
390
Pro
Ser
Val
Phe
Ile
Phe
Pro
Pro
Ser
Asp
Glu
Gln
Leu
120
125
130
AAA
TCT
GGA
ACT
GCC
TCT
GTT
GTG
TGC
CTG
CTG
AAT
AAC
429
Lys
Ser
Gly
Thr
Ala
Ser
Val
Val
Cys
Leu
Leu
Asn
Asn
135
140
TTC
TAT
CCC
AGA
GAG
GCC
AAA
GTA
CAG
TGG
AAG
GTG
GAT
468
Phe
Tyr
Pro
Arg
Glu
Ala
Lys
Val
Gln
Trp
Lys
Val
Asp
145
150
155
AAC
GCC
CTC
CAA
TCG
GGT
AAC
TCC
CAG
GAG
AGT
GTC
ACA
507
Asn
Ala
Leu
Gln
Ser
Gly
Asn
Ser
Gln
Glu
Ser
Val
Thr
160
165
GAG
CAG
GAC
AGC
AAG
GAC
AGC
ACC
TAC
AGC
CTC
AGC
AGC
546
Glu
Gln
Asp
Ser
Lys
Asp
Ser
Thr
Tyr
Ser
Leu
Ser
Ser
170
175
180
ACC
CTG
ACG
CTG
AGC
AAA
GCA
GAC
TAC
GAG
AAA
CAC
AAA
585
Thr
Leu
Thr
Leu
Ser
Lys
Ala
Asp
Tyr
Glu
Lys
His
Lys
185
190
195
GTC
TAC
GCC
TGC
GAA
GTC
ACC
CAT
CAG
GGC
CTG
AGC
TCG
624
Val
Tyr
Ala
Cys
Glu
Val
Thr
His
Gln
Gly
Leu
Ser
Ser
200
205
CCC
GTC
ACA
AAG
AGC
TTC
AAC
AGG
GGA
GAG
TGT
TAG
660
Pro
Val
Thr
Lys
Ser
Phe
Asn
Arg
Gly
Glu
Cys
***
210
215
219
220
<210> 14
<211> 219
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(219)
<223> Последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела SE-9/4
<400> 14
Asp
Val
Leu
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Leu
Ser
Leu
Pro
Val
1
5
10
Ser
Leu
Gly
Asp
Gln
Ala
Ser
Ile
Ser
Cys
Arg
Ser
Ser
15
20
25
Gln
Ser
Ile
Val
Tyr
Ser
Asn
Gly
Asn
Thr
Tyr
Leu
Glu
30
35
Trp
Tyr
Leu
Gln
Lys
Pro
Gly
Gln
Ser
Pro
Lys
Leu
Leu
40
45
50
Ile
Tyr
Lys
Val
Ser
Asn
Arg
Phe
Ser
Gly
Val
Pro
Asp
55
60
65
Arg
Phe
Ser
Gly
Ser
Gly
Ser
Gly
Thr
Asp
Phe
Thr
Leu
70
75
Lys
Ile
Ser
Arg
Val
Glu
Ala
Glu
Asp
Leu
Gly
Val
Tyr
80
85
90
Tyr
Cys
Phe
Gln
Gly
Ser
His
Val
Pro
Tyr
Thr
Phe
Gly
95
100
Gly
Gly
Thr
Lys
Leu
Glu
Leu
Lys
Arg
Thr
Val
Ala
Ala
105
110
115
Pro
Ser
Val
Phe
Ile
Phe
Pro
Pro
Ser
Asp
Glu
Gln
Leu
120
125
130
Lys
Ser
Gly
Thr
Ala
Ser
Val
Val
Cys
Leu
Leu
Asn
Asn
135
140
Phe
Tyr
Pro
Arg
Glu
Ala
Lys
Val
Gln
Trp
Lys
Val
Asp
145
150
155
Asn
Ala
Leu
Gln
Ser
Gly
Asn
Ser
Gln
Glu
Ser
Val
Thr
160
165
Glu
Gln
Asp
Ser
Lys
Asp
Ser
Thr
Tyr
Ser
Leu
Ser
Ser
170
175
180
Thr
Leu
Thr
Leu
Ser
Lys
Ala
Asp
Tyr
Glu
Lys
His
Lys
185
190
195
Val
Tyr
Ala
Cys
Glu
Val
Thr
His
Gln
Gly
Leu
Ser
Ser
200
205
Pro
Val
Thr
Lys
Ser
Phe
Asn
Arg
Gly
Glu
Cys
***
210
215
219
<---