РАСТЕНИЯ С ИЗМЕНЕННЫМ РОСТОМ И/ИЛИ РАЗВИТИЕМ И СПОСОБ ИХ СОЗДАНИЯ
PLANTS WITH MODIFIED GROWTH AND/OR DEVELOPMENT AND METHOD OF CREATING THEREOF

Данное изобретение относится, в целом, к области молекулярной биологии и касается способа изменения различных аспектов роста и/или развития растения путем модулирования в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей Убиквитин-Специфичную Протеазу (UBiquitin-Specific Protease (UBP)) из подсемейства UBP15 или ее гомолог. Данное изобретение также касается растений с модулированной экспрессией нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, такие растения изменили рост и/или развитие по сравнению с соответствующими растениями дикого типа или другими контрольными растениями. Изобретение также описывает конструкции, применимые в способах по изобретению.
Постоянно растущая мировая популяция и сокращение запасов пахотных земель, пригодных для сельскохозяйственных культур, заставляют ученых искать пути улучшения эффективности сельского хозяйства. Обычными способами улучшения сельскохозяйственных и садовых культур является использование методов селективного разведения для идентификации растений, имеющих желаемые характеристики. Однако такие методы селективного разведения имеют несколько недостатков, а именно такие методы являются, как правило, трудоемкими, а полученные в результате растения часто содержат гетерогенные генетические компоненты, которые при передаче от родительских растений могут не всегда приводить к желаемым признакам. Достижения в молекулярной биологии позволили человечеству изменять идиоплазму животных и растений. Генная инженерия растений включает выделение и манипуляции генетическим материалом (как правило, в виде ДНК или РНК) и последующее введение этого генетического материала в растение. Такая технология способна произвести сельскохозяйственные культуры или растения, имеющие различные улучшенные экономические, агрономические и садоводческие признаки.
Обнаружили, что рост и/или развитие растения могут быть изменены путем модулирования в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог.
Уровень техники
Убиквитин-Специфичные Протеазы (UBPs) являются консервативным семейством белков эукариот, которые играют важнейшие роли в деубиквитинилировании белков. Ковалентная модификация белков убиквитином играет центральную роль в различных клеточных процессах, таких как прогрессия клеточного цикла, сигнальная трансдукция, регуляция транскрипции, репарация ДНК, реакции на стресс, эндоцитоз и апоптоз (Hochstrasser, 1996; Varshavsky, 1997; Hershko and Ciechanover, 1998; Weissman, 2001; Pickart, 2004). Убиквитинилирование белков катализирует каскад из трех ферментов. Сначала убиквитин активируется с помощью убиквитин-активирующего фермента (Е1), который образует тиоэфирную связь с С-концом убиквитина. Затем убиквитин переносится на транспортный фермент (Е2) (убиквитин-связывающий фермент). Несмотря на то что некоторые Е2 ферменты могут катализировать связывание С-конца убиквитина с лизиновым остатком белков-мишеней с помощью убиквитинлигаз (Е3), другие ферменты Е2 переносят конъюгированный с ними убиквитин на ферменты Е3 перед связыванием с субстратами. Субстратный белок-мишень может быть моноубиквитинилирован или мультиубиквитинилирован путем последовательного конъюгирования С-конца убиквитина с лизиновым остатком предыдущего убиквитина посредством нескольких возможных связываний. Судьба убиквитинилированных субстратных белков зависит отчасти от количества конъюгированных убиквитинов и от способа связи в цепочке убиквитинов. Наиболее часто убиквитинилирование представлено мультиубиквитиновой цепочкой (количество убиквитинов >=4), связанной через Lys48, действующей как сигнал для деградации белка в 26S протеосоме.
Отщепление убиквитина от белков с помощью деубиквитинилирующих ферментов (DUBs) также может влиять на активность и судьбу убиквитинилированных субстратных белков (Wilkinson, 1997; Amerik and Hochstrasser, 2004; Crosas et al., 2006; Hanna et al., 2006). Эти DUBs являются протеазами, специфически расщепляющими пептидные связи между убиквитинами или между С-концом убиквитина и ковалентно связанными полипептидами. В настоящее время известно, что DUBs одновременно выполняют четыре типа основных биохимических функций: во-первых, они образуют зрелый убиквитин из предшественников убиквитина (пришитых к рибосомному белку) и полиубиквитиновых продуктов гена; во-вторых, они спасают белки, которые были ошибочно убиквитинилированы; в-третьих, они отщепляют убиквитин (цепочки) от связанных субстратных белков; и, в-четвертых, высвобождают мономеры убиквитина из мультиубиквитиновых цепочек. Последние три роли сопровождаются расщеплением изопептидных связей между Gly С-конца убиквитина и аминокислотным остатком Lys белка-мишени.
Цистеиновые протеазы и металлопротеазы представляют две большие группы суперсемейства DUB, вместе с цистеиновыми протеазами являются наиболее многочисленными в эукариотах (Nijman et al., 2005). Все известные металлопротеазы для каталитической активности имеют домен JAMM (Verma et al., 2002). Цистеиновые протеазы из семейства DUB могут быть разделены на четыре группы на основе организации структуры каталитического центра убиквитин-протеазы и организации (Wilkinson, 1997; Amerik and Hochstrasser, 2004; Nijman et al., 2005). Убиквитин-Специфичные Протеазы (UBP или USPs, как они были названы у млекопитающих) содержат каталитическую триаду остатков в высоко консервативном цистеиновом боксе и гистидиновом боксе (Ни et al., 2002). С-концевые Убиквитин Гидралазы (UCHs), со сходной каталитической триадой остатков в двух консервативных цистеиновых и гистидиновых боксах (Johnston et al., 1997; Johnston et al., 1999), имеют меньший размер, а также структурные ограничения каталитической поверхности, которые ограничивают их способность к гидролизу только небольшими амидами и эфирами на С-конце убиквитина (Amerik and Hochstrasser, 2004). Протеазы из опухолей яичек (OTUs) имеют каталитическую триаду, аналогичную вышеуказанным двум группам в Цистеиновом и Гистединовом боксах, но содержат OTU-родственный мотив и рассматриваются как часть UBP семейства (Balakirev et al., 2003; Nanao et al., 2004). Наконец, Протеин Доменные Протеазы болезни Мачадо-Джозефа (MJDs) содержат домены, похожие на гистидиновый и цистеиновый боксы, но с довольно низким сходством последовательностей с остальными тремя группами (Burnett et al., 2003; Scheel et al., 2003). Семейство UBP составляет основную часть цистеиновых протеаз. Все четыре типа упомянутых выше биохимических функций DUB найдены в семействе UBPs, в то время как UCHs выполняют свои функции только на маленьких белках и предшественнике убиквитина.
На модели растения Арабидопсис Таля (Arabidopsis Thaliana) анализ in silico полной последовательности генома, основанный на наличии консервативных Cys и His боксов, выявил в общей сложности 27 UBPs; эти 27 UBPs были затем разделены на 14 подсемейств (Yan et al., 2000). Предыдущие сообщения показали, что UBP3 и UBP4 составляют одно подсемейство, обладают UBP активностью in vitro и присутствуют в ядре (Chandler et al., 1997; Rao-Naik et al., 2000). Было показано, что другой член, UBP5, также обладает деубиквитинилирующей активностью in vitro (Rao-Naik et al., 2000). Сообщалось, что генетический анализ UBP1 и UBP2, членов другого подсемейства, показал их необходимость для устойчивости к аналогу аминокислоты канаванину (Yan et al., 2000). Кроме того, было показано, что мутация, вызывающая потерю функции UBP14, приводит к летальному исходу на стадии раннего эмбриогенеза (Doelling et al., 2001).
Краткое описание изобретения
Удивительно, но в настоящее время было установлено, что модулирование экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, дает растениям измененный рост и/или развитие по сравнению с контрольными растениями.
В соответствии с одним вариантом выполнения изобретения, в данном изобретении описан способ изменения роста и/или развития растения по сравнению с контрольными растениями, содержащий модулирование в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог.
Определение
Полипетид(ы)/Белок (белки)
Термины "полипептид" и "белок" используются в этом документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотам в полимерной форме любой длины, соединенным пептидными связями.
Полинуклеотид(ы)/Нуклеиновая кислота(ы)/Последовательность(и) нуклеиновых кислот/последовательность(и) нуклеотидов
Термины "полинуклеотид(ы)", "последовательность(и) нуклеиновых кислот", "последовательность(и) нуклеотидов", "нуклеиновая кислота(ы)", "молекула нуклеиновой кислоты" используются в этом документе взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидам, либо рибонуклеотидам, или дезоксирибонуклеотидам, или к комбинации обоих в неразветвленной полимерной форме любой длины.
Контрольное(ые) растение(я)
Выбор подходящих контрольных растений является обычной частью постановки эксперимента и может включать соответствующие растения дикого типа или соответствующие растения без гена, представляющего интерес. Контрольное растение является, как правило, растением того же вида или даже того же сорта, как и опытное растение. Контрольное растение также может быть нулевой гомозиготой (нульзиготой) опытного растения. Нульзиготами являются особи, потерявшие трансген путем сегрегации. "Контрольное растение", как используется в этом документе, относиться не только к целым растениям, но также к частям растения, включая семена и части семян.
Гомолог(и)
"Гомолог(и)" белка охватывает(ют) пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и ферменты, имеющие аминокислотные замены, делеции и/или вставки, по сравнению с немодифицированным исследуемым белком, и имеющие сходную с немодифицированным белком, из которого они получены, биологическую и функциональную активность.
Делеция относится к удалению из белка одной или более аминокислот.

Вставка относится к внедрению одной или нескольких аминокислот в заданный участок белка. Вставки могут содержать N-концевые и/или С-концевые слияния, также как вставки одной или нескольких аминокислот внутри последовательности. Как правило, вставки внутри последовательности аминокислот будут меньше, чем N- или С-концевые слияния, примерно от 1 до 10 остатков. Примеры N- или С-концевых слитых белков или пептидов включают связывающий домен или активирующий домен активатора транскрипции, как используют в двухгибридной системе в дрожжах, белки оболочки фага, гистидин-6 метку, глутатион-8-трансферазную метку, А белок, мальтоз-связывающий белок, дигидрофолатредуктазу, эпитоп Tag·100, эпитоп с-myc, FLAG-эпитоп, lacZ, CMP (кальмодулин-связывающий пептид), НА эпитоп, эпитоп С-белка и VSV эпитоп.
Замена относится к замещению аминокислот белка другими аминокислотами, имеющими схожие свойства (такие как сходную гидрофобность, гидрофильность, антигенность, склонность к образованию или разрыванию α-спиральных структур или структур β-листа). Обычно замещают один аминокислотный остаток, но могут быть кластерные замены, в зависимости от функциональных ограничений, наложенных на полипептид; обычно вставки будут примерно от 1 до 10 аминокислотных остатков. Вставки аминокислот являются предпочтительно заменами консервативных аминокислот. Таблицы консервативных замен общеизвестны в данной области техники (см., например, Creighton (1984) Proteins. W.H.Freeman and Company (Eds) и Таблицу А ниже).
Таблица А
Примеры замен консервативных аминокислот
Остаток
Консервативные замены
Остаток
Консервативные замены
Ala
Ser
Leu
lie; Val
Arg
Lys
Lys
Arg; Gin
Asn
Gln; His
Met
Leu; Ile
Asp
Glu
Phe
Met; Leu; Tyr
Gln
Asn
Ser
Thr; Gly
Cys
Ser
Thr
Ser; Val
Glu
Asp
Trp
Tyr
Gly
Pro
Туг
Trp; Phe
His
Asn; Gin
Val
Ile; Leu
lie
Leu, Val
Аминокислотные замены, делеции и/или вставки могут быть легко сделаны с помощью методики пептидного синтеза, общеизвестной в данной области техники, такой как твердофазный пептидный синтез и тому подобное, или манипуляциями с рекомбинантной ДНК. Способы манипуляции последовательностями ДНК для производства вариантов белка с заменой, вставкой или делецией общеизвестны в данной области техники. Например, методы получения мутаций с помощью замены в заданных участках ДНК общеизвестны специалистам в данной области техники и включают мутагенез с использованием фага М13, мутагенез in vitro с помощью T7-Gen (USB, Cleveland, ОН), QuickChange сайт-направленный мутагенез (Stratagene, San Diego, СА), сайт-направленный мутагенез методом ПЦР или другие протоколы сайт-направленного мутагенеза.
Производные
"Производные" включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые могут содержать замены аминокислот на аминокислотные остатки, не встречающиеся в природе (искусственного происхождения), или добавление аминокислотных остатков, не встречающихся в природе, по сравнению с аминокислотной последовательностью, встречающейся в природе формы белка, такой как белок, представляющий интерес. "Производные" белка также охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые содержат встречающиеся в природе измененные (гликозилированные, ацилированные, пренилированные, фосфорилированные, миристоилированные, сульфатированные и т.д.) или не встречающиеся в природе измененные аминокислотные остатки по сравнению с аминокислотной последовательностью встречающейся в природе формы полипептида. Производные также могут содержать один или более не аминокислотных заменителей или присоединений по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой они получены, например репортерная молекула или другой лиганд, ковалентно или нековалентно связанные с аминокислотной последовательностью, такие как репортерная молекула, которую присоединяют для облегчения ее обнаружения, и не встречающиеся в природе аминокислотные остатки по сравнению с аминокислотной последовательностью встречающегося в природе белка. Кроме того, "производные" также включают слияния встречающейся в природе формы белка с мечеными пептидами, такими как FLAG, HIS6 или тиоредоксин (для обзора меченых пептидов см. Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).
Ортолог(и)/Паралог(и)
Ортологи или паралоги охватывают эволюционные концепции, используемые для описания родственных отношений генов. Паралоги являются генами в пределах одного вида, которые возникли путем дублирования генов-предшественников, ортологи являются генами из разных видов организмов, которые возникли путем видообразования, и также происходят из общего гена-предшественника.
Домен
Термин "домен" относится к набору аминокислот, сохраняющихся на определенной позиции при сравнении линейной последовательности эволюционно родственных белков. Хотя аминокислоты в других позициях могут варьировать между гомологами, высоко консервативные аминокислоты в определенных позициях указывают на аминокислоты, которые, вероятно, являются необходимыми для структуры, стабильности или функции белка. Выявленные по их высокой степени консервативности в линейных последовательностях семейства гомологов белков, они могут быть использованы в качестве маркеров для определения принадлежности исследуемого полипептида к ранее определенному семейству полипептидов.
Мотив/Консенсусная последовательность/Сигнатура
Термины "мотив", или "консенсусная последовательность", или "сигнатура" относятся к короткому консервативному участку последовательности эволюционно родственных белков. Мотивы часто являются высоко консервативными частями доменов, но могут также включать только часть домена, или быть расположены вне консервативного домена (если все аминокислоты мотива расположены вне определенного домена).
Гибридизация
Термин "гибридизация", как определено в этом документе, является процессом, где в значительной степени гомологичные комплементарные нуклеотидные последовательности отжигаются друг на друга. Процесс гибридизации может происходить полностью в растворе, т.е. обе комплементарные нуклеиновые кислоты находятся в растворе. Процесс гибридизации также может происходить, когда одна из комплементарных нуклеиновых кислот иммобилизована на матриксе, таком как магнитные шарики, гранулы Сефарозы или любой другой смолы. Кроме того, процесс гибридизации может происходить, когда одна из комплементарных нуклеиновых кислот иммобилизована на твердом носителе, таком как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана, или иммобилизована, например, методом фотолитографии на, например, подложке из силиконового стекла (последние известны как матрицы нуклеиновых кислот или микропанели или как чипы нуклеиновых кислот). Для того чтобы гибридизация произошла, молекулы нуклеиновых кислот, как правило, термически или химически денатурируют для плавления двухцепочечной ДНК на две отдельные цепи и/или для удаления шпилек или других вторичных структур на одноцепочечных нуклеиновых кислотах.
m
m
m
Термин "жесткость" относится к условиям, при которых происходит гибридизация. Жесткость гибридизации зависит от таких условий, как температура, концентрация соли, ионной силы и состава буфера для гибридизации. Как правило, условия низкой жесткости выбираются так, чтобы температура была ниже, чем температура плавления (T) конкретной последовательности при определенной ионной силе и рН, примерно на 30°С. Условия средней жесткости, когда температура ниже T на 20°С, и условия высокой жесткости, когда температура ниже T на 10°С. Условия гибридизации высокой жесткости используют, как правило, для выделения гибридизуемых последовательностей, которые имеют высокую степень сродства последовательности с изучаемой последовательностью нуклеиновых кислот. Однако из-за вырожденности генетического кода нуклеиновые кислоты могут варьировать в последовательности и при этом кодировать в значительной степени одинаковый полипептид, поэтому иногда могут быть необходимы условия гибридизации средней жесткости для выявления таких молекул нуклеиновых кислот.
m
m
m
m
m
T - это температура, при определенной ионной силе и рН, при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с идеально подходящим зондом. T зависит от условий раствора, и нуклеотидного состава, и длины зонда. Например, более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Максимальная степень гибридизации достигается от около 16°С до 32°С ниже Т. Присутствие моновалентных катионов в растворе для гибридизации уменьшает электростатическое отталкивание двух цепей нуклеиновых кислот, тем самым способствуя образованию гибрида; этот эффект виден при концентрации натрия выше 0,4 М (при более высоких концентрациях этим эффектом можно пренебречь). Формамид уменьшает температуру плавления ДНК-ДНК и ДНК-РНК дуплексов на 0,6-0,7°С на каждый процент формамида, и добавление 50% формамида позволяет проводить гибридизацию от 30 до 45°С, хотя степень гибридизации будет ниже. Ошибки спаривания оснований (мисматчи оснований) уменьшают степень гибридизации и температурную стабильность дуплекса. В среднем и для больших зондов T уменьшается на примерно 1°С на % ошибок спаривания оснований. T может быть рассчитана с помощью следующего уравнения, в зависимости от типа гибридов:
1) ДНК-ДНК гибриды (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
m
10
+
a
b
c
-1
T=81.5°C+16.6×log[Na]+0.41×%[G/C]-500×[L]-0.61×% формамида
2) ДНК-РНК или РНК-РНК гибриды:
m
10
+
a
b
b
2
c
T=79.8+18.5(log[Na])+0.58(%G/C)+11.8(%G/C)-820/L
d
3) Олиго-ДНК или олиго-PHK гибриды:
m
n
Для <20 нуклеотидов: T=2 (l)
m
n
Для 20-35 нуклеотидов: T=22+1.46 (l)
а
или для других моновалентных катионов, но только точно в диапазоне 0,01-0,4 М.
b
только точно для %GC в 30%-75% диапазоне.
с
L=длина дуплекса в парах оснований.
d
n
олиго, олигонуклеотид; l,=эффективная длина праймера=2×(кол-во G/С)+(кол-во А/T).
Неспецифическое связывание можно контролировать, используя любой из ряда известных методов, таких как, например, блокирование мембраны раствором, содержащим белок, добавление гетерологичной РНК, ДНК и СДС в буфер для гибридизации, и обработка РНКазой. Для негомологичных проб может быть выполнена серия гибридизаций путем изменения одного из (i) постепенное снижение температуры отжига (например, с 68°С до 42°С) или (ii) постепенное снижение концентрации формамида (например, с 50% до 0%). Специалистам в данной области известны различные параметры, которые могут быть изменены в процессе гибридизации и которые либо поддержат, либо изменят условия жесткости.
Кроме условий гибридизации, специфичность гибридизации, как правило, также зависит от этапа постгибридизационных отмывок. Для удаления фона, являющегося результатом неспецифической гибридизации, образцы отмывают в разбавленными солевыми растворами. Критическими факторами таких отмывок являются ионная сила и температура последнего промывающего раствора: чем ниже концентрация соли и выше температура отмывки, тем выше жесткость отмывки. Как правило, отмывку осуществляют в условиях на уровне или ниже гибридизационной жесткости. Положительная гибридизация дает сигнал, по меньшей мере, в два раза сильнее фона. Как правило, для гибридизации нуклеиновых кислот или выявления амплификации генов подходящими условиями жесткости являются вышеизложенные условия. Также могут быть выбраны более или менее жесткие условия. Специалистам в данной области известны различные параметры, которые могут быть изменены в процессе отмывки и которые либо поддержат, либо изменят условия жесткости.
Например, типичные условия гибридизации высокой жесткости для гибридов ДНК длиной более 50 нуклеотидов охватывают гибридизацию при 65°С в 1×SSC или при 42°С в 1×SSC и 50% формамида с последующей отмывкой при 65°С в 0,3×SSC. Примеры условий гибридизации средней жесткости для гибридов ДНК длиной более 50 нуклеотидов охватывают гибридизацию при 50°С в 4×SSC или при 40°С в 6×SSC и 50% формамида с последующей отмывкой при 50°С в 2×SSC. Длина гибрида является ожидаемой длиной гибридизации нуклеиновых кислот. Когда гибридизуются известные последовательности нуклеиновых кислот, длина гибрида может быть определена путем сравнения последовательностей и выявления консервативных участков, описанных в этом документе. 1×SSC в 0,15М NaCl и 15 мМ цитрате натрия; раствор для гибридизации и отмывающий раствор могут дополнительно содержать 5× раствор Денхардта, 0,5-1,0% СДС, 100 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК из спермы лосося, 0,5% фосфат натрия.
Для целей определения уровней жесткости можно сослаться на Молекулярное клонирование Sambrook и др. (2001): лабораторный справочник, 3-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, или на Современные протоколы в Молекулярной биологии, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 и ежегодные обновления).
Варианты сплайсинга
Термин "варианты сплайсинга", как применяется в этом документе, охватывает варианты последовательностей нуклеиновых кислот, в которых выявленные интроны или экзоны были вырезаны, заменены, перемещены или добавлены или в которых интроны были укорочены или удлинены. Такими вариантами будут те, в которых в значительной степени сохранилась биологическая активность белка; это может быть достигнуто путем выборочного сохранения функциональных сегментов белка. Такие варианты сплайсинга могут быть найдены в природе или могут быть сделаны человеком. Способы прогнозирования и выделения таких вариантов сплайсинга хорошо известны в данной области техники (см., например, Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6:25).
Аллельный вариант
Аллели или аллельные варианты это альтернативные формы данного гена, расположенные в одинаковой хромосомной позиции. Аллельные варианты охватывают полиморфизмы Одного Нуклеотида (SNPs), так же как Полиморфизм Маленьких Вставок/Делеций (INDELs). Размер INDELs обычно меньше чем 100 п.о. SNPs и INDELs формируют большой набор вариантов последовательностей в полиморфных штаммах большинства организмов, встречающихся в природе.
Перестановка генов/Направленная эволюция
Перестановка генов или направленная эволюция состоит из повторов перестановок генов с последующим скринингом и/или селекцией с целью создания вариантов нуклеиновых кислот или их участков, кодирующих белки, имеющие измененную биологическую активность (Castle et al., (2004) Science 304 (5674): 1151-4; US patents 5,811,238 and 6,395,547).
Регуляторные элементы/Управляющая последовательность/Промотор
Все термины "регуляторный элемент", "управляющая последовательность" и "промотор" используются в этом документе взаимозаменяемо и должны быть приняты в широком контексте для обозначения нуклеиновых последовательностей, способных влиять на экспрессию последовательностей, к которым они привязаны. Термин "промотор" обычно относится к управляющей последовательности, расположенной перед началом транскрипции гена, которая вовлечена в узнавание и связывание РНК полимеразы и других белков, тем самым направляя транскрипцию функционально связанной нуклеиновой кислоты. Элементы, охваченные вышеупомянутыми терминами, являются транскрипционными регуляторными последовательностями, происходящими из классических геномных генов эукариот (включая ТАТА бокс, который необходим для точной инициации транскрипции, с или без последовательности ССААТ), и дополнительными регуляторными элементами (т.е. вышестоящими активирующими последовательностями, энхансерами и сайленсерами), которые изменяют экспрессию генов в ответ на стимуляцию развития и/или внешнее воздействие, или тканеспецифичным образом. Также включена в этот термин транскрипционная регуляторная последовательность классического прокариотического гена, которая в этом случае может содержать "-35нп" бокс и/или "-10нп" бокс транскрипционных регуляторных последовательностей. Термин "регуляторный элемент" также охватывает синтетическую слитую молекулу или производное, которое передает, активирует или усиливает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в клетке, ткани или органе.
"Растительный промотор" содержит регуляторные элементы, которые опосредуют экспрессию части кодирующей последовательности в клетках растений. Соответственно, растительный промотор не должен быть растительного происхождения, но может происходить из вирусов или микроорганизмов, например из вирусов, которые поражают растительные клетки. "Растительный промотор" также может происходить из растительной клетки, например из растения, трансформированного последовательностью нуклеиновой кислоты, которая будет представлена в процессе изобретения и описана в этом документе. Это также относится к другим "растительным" регуляторным сигналам, таким как "растительные" терминаторы. Промоторы, перед нуклеотидными последовательностями, которые применимы в способах по данному изобретению, могут быть изменены одной или более нуклеотидными заменой(ами), вставкой(ами) и/или делецией(ями) без вмешательства в функциональные свойства или активность либо промоторов, открытых рамок считывания (ОРС), или 3'-регуляторных участков, таких как терминаторы или другие 3'-регуляторные участки, расположенные на расстоянии от ОРС. Кроме того, возможно, что активность промоторов увеличена изменением их последовательности или что они полностью заменены более активными промоторами, даже промоторами из гетерологичных организмов. Для экспрессии в растениях, как описано выше, молекула нуклеиновой кислоты должна быть функционально связана с или содержать подходящий промотор, который приводит к экспрессии гена в нужный момент времени и с требуемым пространственным паттерном экспрессии.
Для идентификации функционально эквивалентных промоторов сила промотора и/или паттерн экспрессии кандидата в промоторы могут быть проанализированы, например, путем функционального связывания промотора с репортерным геном и оценки уровня экспрессии и паттерна репортерного гена в различных тканях растения. Подходящие, хорошо известные, репортерные гены включают, например, бета-глюкуронидазу или бета-галактозидазу. Активность промотора оценивают измерением ферментативной активности бета-глюкуронидазы или бета-галактозидазы. Сила промотора и/или паттерн экспрессии могут быть затем сравнены с таковыми референсного промотора (такого, как используется в способах по данному изобретению). Кроме того, сила промотора может быть оценена путем количественного определения уровней мРНК или сравнения уровней мРНК нуклеиновой кислоты, используемой в способах по данному изобретению, с уровнями мРНК конститутивных генов, таких как 18S рРНК, с применением способов, известных в данной области техники, таких как нозерн-блот с денситометрическим анализом ауторадиограмм, количественный ПЦР в реальном времени или ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией, RT-PCR) (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Как правило, под "слабым промотором" подразумевают промотор, который вызывает низкий уровень экспрессии кодируемой последовательности. Под "низким уровнем" подразумевают уровни от около 1/10.000 транскриптов до около 1/100.000 транскриптов, до около 1/500.000 транскриптов на клетку. И наоборот, "сильный промотор" вызывает высокий уровень экспрессии кодируемой последовательности, или от около 1/10 транскриптов до около 1/100 транскриптов, до около 1/1000 транскриптов на клетку.
Функционально связанный
Термин "функционально связанный", как применяется в этом документе, относится к функциональной связи между промоторной последовательностью и геном, представляющим интерес, такой, что промоторная последовательность способна инициировать транскрипцию гена, представляющего интерес.
Конститутивный промотор
"Конститутивный промотор" относится к промотору, который является транскрипционно активным в течение большинства, но не обязательно всех, фаз роста и развития и в большинстве условий окружающей среды в по меньшей мере одной клетке, ткани или органе. Таблица В ниже приводит примеры конститутивных промоторов.
Таблица В
Примеры конститутивных промоторов
Ген источник
Ссылка
Актин
McElroy et al., Plant Cell, 2: 163-171, 1990
HMGP
WO 2004/070039
CAMV 35S
Odell et al., Nature, 313: 810-812, 1985
CaMV 19S
Nilsson et al., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997
GOS2
de Pater et al., Plant J Nov; 2 (6): 837-44, 1992, WO 2004/065596
Убиквитин
Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992
Циклофилин риса
Buchholz et al., Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994
НЗ гистон кукурузы
Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992
НЗ гистон люцерны
Wuetal. Plant Mol. Biol. 11: 641-649, 1988
Актин 2
An et al., Plant J. 10 (1); 107-121, 1996
34S FMV
Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443
малая субъединица холофермента Rubisco
US 4,962,028
OCS
Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553
SAD1
Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2
Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999:
1696
Nos
Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831-7846
V-АТФаза
WO 01/14572
Суперпромотор
WO 95/14098
Белки G-box
WO 94/12015
Универсальный промотор
Универсальный промотор является активным практически во всех тканях и клетках организма.
Промотор, регулируемый развитием
Промотор, регулируемый развитием (developmentally-regulated promoter), активен в течение определенных стадий развития или в частях растений, которые подвергаются изменениям в развитии.
Индуцибельный промотор
Индуцибельный промотор индуцирует или увеличивает транскрипцию в ответ на химические (для обзора см. Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), окружающие или физические стимулы, или могут быть "стресс-индуцируемые", т.е. активируемые, когда растение подвергается воздействию различных стрессовых условий, или "патоген-индуцируемые", т.е. активируемые, когда растение подвергается воздействию различных патогенов.
Органспецифичный/Тканеспецифичный промотор
Органспецифичный или тканеспецифичный промотор это промотор, который способен предпочтительно инициировать транскрипцию в определенных органах или тканях, таких как листья, корни, ткани семени и др. Например, "кореньспецифичный промотор" это промотор, который транскрипционно активен преимущественно в корнях растения, практически исключая любые другие части растения, хотя все же допуская некоторую утечку экспрессии в этих других частях растения. Промоторы, способные инициировать транскрипцию только в определенных клетках, относятся к "клеточно-специфичным" в этом документе.
Семяспецифичный промотор транскрипционно активен преимущественно в тканях семени, но не обязательно исключительно в тканях семени (в случаях утечки экспрессии). Семяспецифичный промотор может быть активен в течение развития семени и/или в течение прорастания. Семяспецифичный промотор может быть эндосперм, и/или алейрон, и/или эмбрионспецифичным.
Терминатор
Термин "терминатор" охватывает управляющую последовательность, которая является последовательностью ДНК в конце единицы транскрипции, которая дает сигнал к 3' процессингу, и полиаденилированию первичного транскрипта, и окончанию транскрипции. Терминатор может быть получен из природного гена из ряда других растительных генов или из Т-ДНК. Терминатор, который необходимо добавить, может быть получен из, например, генов нопалин синтазы, или октопин синтазы, или же из другого гена растения, или менее предпочтительно из любого другого эукариотического гена.
Модуляция
Термин "модуляция" означает, в отношении экспрессии или экспрессии гена, процесс, в котором уровень экспрессии изменен указанной экспрессией гена, в сравнении с контрольным растением, уровень экспрессии может быть увеличен или уменьшен. Исходная, немодулированная экспрессия может быть любого рода экспрессией структурной РНК (рРНК, тРНК) или мРНК с последующей трансляцией.
Экспрессия
Термин "экспрессия" или "экспрессия гена" означает транскрипцию определенного гена, или определенных генов, или определенных генных конструкций. Термин "экспрессия" или "экспрессия гена", в частности, означает транскрипцию гена, или генов, или генных конструкций в структурную РНК (рРНК, тРНК) или мРНК с или без последующей трансляцией последнего в белок. Процесс включает транскрипцию ДНК и процессинг полученного в результате продукта мРНК.
Увеличенная экспрессия/сверхэкспрессия
Термин "увеличенная экспрессия" или "сверхэкспрессия", как применяется в этом документе, означает любую форму экспрессии, дополнительную к исходному уровню экспрессии дикого типа.
Способы увеличения экспрессии генов или продуктов генов хорошо задокументированы в данной области техники и включают, например, сверхэкспрессию, запускаемую соответствующими промоторами, применение энхансеров транскрипции или энхансеров трансляции. Изолированные нуклеиновые кислоты, которые служат промоторными или энхансерными элементами, могут быть введены в соответствующее положение (как правило, перед) в негетерологичную форму полинуклеотида так, чтобы активировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, представляющий интерес. Например, эндогенные промоторы могут быть изменены in vivo с помощью мутации, делеции и/или замены (см. Kmiec, US 5,565,350; Zarling et al., WO 9322443), или в растительную клетку могут быть введены изолированные промоторы в надлежащем положении и расстоянии от гена по данному изобретению так, чтобы управлять экспрессией гена.
Если экспрессия полипептида желательна, то в большинстве случаев желательно включить полиаденилированный участок на 3' конце полинуклеотидного кодирующего участка. Полиаденилированный участок может быть получен из природного гена, из ряда других растительных генов или из Т-ДНК. 3' концевая последовательность, которую добавляют, может быть получена, например, из генов нопалин синтетазы, или октопин синтетазы, или же из другого растительного гена, или менее предпочтительно из любого другого эукариотического гена.
Последовательность интрона также может быть добавлена к 5' нетранслируемому участку (UTR) или к кодирующей последовательности частично кодирующей последовательности для увеличения количества зрелой мРНК, которая накапливается в цитозоле. Было показано, что включение сплайсируемого интрона в транскрипционную единицу в обеих растительных и животных экспрессионных конструкциях увеличивает экспрессию гена и на уровне мРНК, и на уровне белка до 1000 раз (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183-1200). Такое интронное усиление экспрессии гена, как правило, наибольшее, когда расположено около 5' конца транскрибируемой единицы. Применение интронов кукурузы интрон Adh1-S 1, 2, и 6, интрон Bronze-1 хорошо известно в данной области техники. Для получения общей информации смотри: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
Эндогенный ген
В данном документе ссылка на "эндогенный ген" относится не только к исследуемому гену, как обнаруженному в растении в его естественной форме (то есть без какого-либо вмешательства человека), но также относится к тому же гену (или в значительной степени гомологичной нуклеиновой кислоте/гену) в изолированной форме, в дальнейшем введенному (повторно) в растение (трансген). Например, трансгенное растение, содержащее такой трансген, может столкнуться с существенным уменьшением экспрессии трансгена и/или существенным уменьшением экспрессии эндогенного гена. Изолированный ген может быть получен из организма или может быть искусственно сделан, например методом химического синтеза.
Уменьшенная экспрессия
В данном документе ссылка на "уменьшенная экспрессия" или "снижение или существенная элиминация" экспрессии означает уменьшение экспрессии эндогенного гена, и/или уровней полипептида, и/или активности полипептида относительно контрольных растений. Снижение или существенная элиминация составляет в порядке возрастания предпочтения по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большее сокращение в сравнении с таковым контрольных растений.
Для снижения или существенной элиминации экспрессии эндогенного гена в растении требуется последовательность нуклеиновой кислоты достаточной длины и высокой степени комплементарности. С целью достижения молчания гена это могут быть всего 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 или менее нуклеотидов, альтернативно это может быть такой же длины нуклеотид, как целый ген (включая 5' и/или 3' UTR, частично либо полностью). Отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности может быть получен из нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, представляющий интерес (ген-мишень), или из любой нуклеиновой кислоты, способной кодировать ортолог, паралог или гомолог белка, представляющего интерес. Предпочтительно, отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности способен формировать водородные связи с геном-мишенью (либо со смысловой, либо с антисмысловой цепью), более предпочтительно, отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности имеет, в порядке возрастания предпочтения, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичность последовательности с последовательностью гена-мишени (либо со смысловой, либо с антисмысловой цепи). Кодирование последовательностью нуклеиновой кислоты (функционального) полипептида не является обязательным требованием для различных способов, обсуждаемых в этом документе, снижения или существенной элиминации экспрессии эндогенного гена.
Это снижение или существенная элиминация экспрессии может достигаться с помощью применения обычных инструментов и методов. Предпочтительным способом снижения или существенной элиминации экспрессии эндогенного гена являются введение и экспрессия в растении генетической конструкции, в которой нуклеиновая кислота (в этом случае отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности, полученный из гена, представляющего интерес, или из любой нуклеиновой кислоты, способной кодировать ортолог, паралог или гомолог любого белка, представляющего интерес) клонирована в виде инвертированного повтора (частично или полностью) разделенного спейсером (некодирующая ДНК).
В таком предпочтительном способе, экспрессия эндогенного гена снижается или существенно элиминируется через РНК-опосредованное выключение, с применением инвертированного повтора, нуклеиновой кислоты или ее части (в этом случае отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности получен из гена, представляющего интерес, или из любой нуклеиновой кислоты, способной кодировать ортолог, паралог или гомолог белка, представляющего интерес), предпочтительно способного формировать шпилечные структуры. Инвертированный повтор клонирован в вектор экспрессии, содержащий управляющие последовательности. Некодирующая ДНК последовательность нуклеиновых кислот (спейсер, например, фрагмент участка прикрепления к матриксу (MAR), интрон, полилинкер, и т.д.) расположена между двумя инвертированными нуклеиновыми кислотами, формирующими инвертированный повтор. После транскрипции инвертированного повтора формируется химерная РНК с самокомплементарной структурой (частично или полностью). Эта двухцепочечная структура РНК называется РНК-шпилькой (hpRNA). РНК-шпилька перерабатывается растением в миРНК (малые интерферирующие РНК, siRNAs), которые включены в РНК-индуцируемый комплекс выключения гена (комплекс сайленсинга) (RNA-induced silencing complex, RISC). RISC далее расщепляет транскрипты мРНК, таким образом существенно снижая количество транскриптов мРНК, транслируемых в полипептиды. Для дальнейшего ознакомления с основными деталями смотри, например, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050.
Выполнение способов по данному изобретению не зависит от введения или экспрессии в растении генетической конструкции, в которой нуклеиновая кислота клонирована в виде инвертированного повтора, но любой один или более из нескольких хорошо известных способов "молчания генов" ("gene silencing") могут быть использованы для достижения тех же эффектов.
Один из таких способов снижения экспрессии эндогенного гена является РНК-опосредованным выключением экспрессии гена (отрицательная регуляция). Выключение гена в растении в этом случае вызвано последовательностью двухцепочечной РНК (dsRNA) , которая обладает большим сходством с эндогенным геном-мишенью. Эта двухцепочечная РНК далее перерабатывается растением в около 20 до около 26 нуклеотидов, называемых короткие (малые) интерферирующие РНК (short/small interfering RNAs, siRNA) (миРНК). миРНК включены в РНК-индуцируемый комплекс выключения гена (комплекс сайленсинга) (RISC), который расщепляет транскрипты мРНК эндогенного гена-мишени, тем самым существенно снижая количество транскриптов мРНК, транслируемых в полипептиды. Предпочтительно, двухцепочечная последовательность РНК соответствует гену-мишени.
Другой пример способа РНК-опосредованного выключения гена включает в себя введение последовательности нуклеиновой кислоты или ее части в смысловой ориентации в растение (в этом случае отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности получен из гена, представляющего интерес, или из любой нуклеиновой кислоты, способной кодировать ортолог, паралог или гомолог белка, представляющего интерес). "Смысловая ориентация" относится к последовательности ДНК, гомологичной транскрипту его мРНК. В растение должна быть введена по меньшей мере одна копия нуклеиновой кислоты. Дополнительная последовательность нуклеиновой кислоты снизит экспрессию эндогенного гена, давая толчок к развитию феномена, известного как ко-супрессия. Снижение экспрессии гена будет более явным, если в растение введены несколько дополнительных копий последовательности нуклеиновой кислоты, поскольку есть положительная корреляция между высоким уровнем транскриптов и запуском косупрессии.
Другой пример способа РНК-опосредованного выключения гена включает в себя применение антисмысловых последовательностей нуклеиновой кислоты. Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которые комплементарны "смысловой" последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, т.е. комплементарна кодирующей цепи двухцепочечной молекулы кДНК или комплементарна последовательности транскрипта мРНК. Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно комплементарна эндогенному гену, который должен молчать. Комплементарность может быть расположена в "кодирующем участке" и/или в "некодирующем участке" гена. Термин "кодирующий участок" относиться к 5' и 3' последовательностям, которые примыкают по бокам (фланкируют) к кодирующему участку, которые транскрибируются, но не транслируются в аминокислоты (также относятся к 5' и 3' нетранслируемым участкам).
Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты может быть рассчитана в соответствии с комплементарностью пар оснований Уотсона и Крика. Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты может быть комплементарна всей последовательности нуклеиновой кислоты (в этом случае отрезок нуклеотидов высокой степени комплементарности получен из гена, представляющего интерес, или из любой нуклеиновой кислоты, способной кодировать ортолог, паралог или гомолог белка, представляющего интерес), но также может быть олигонуклеотид, который является анстисмысловым только к части последовательности нуклеиновой кислоты (включая мРНК 5' и 3' UTR). Например, антисмысловая олигонуклеотидная последовательность может быть комплементарна участку, окружающему стартовый кодон трансляции в транскрипте мРНК, кодирующей полипептид. Длина подходящей антисмысловой последовательности олигонуклеотида известна в данной области техники и может начинаться с около 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 или 10 нуклеотидов в длину или менее. Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты, в соответствии с данным изобретением, может быть синтезирована путем химического синтеза и ферментными реакциями лигирования, с использованием способов, известных в данной области техники. Например, антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты (например, антисмысловая последовательность олигонуклеотида) может быть химически синтезирована с использованием встречающихся в природе нуклеотидов или разным образом модифицированных нуклеотидов, сконструированных для увеличения биологической стабильности молекул или для увеличения физической стабильности дуплексов, формируемых между антисмысловой и смысловой последовательностями нуклеиновой кислоты, например, могут быть использованы производные фосфотиоата и акридин замещенные нуклеотиды. В данной области техники хорошо известны примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для синтеза антисмысловой последовательности нуклеиновой кислоты. Известные модификации нуклеотидов включают метилирование, циклизацию, кеппирование и замену одного или более встречающихся в природе нуклеотидов аналогами, такими как инозин. Другие модификации нуклеотидов хорошо известны в данной области техники.
Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты может быть получена биологическим путем, используя вектор экспрессии, в который была клонирована последовательность нуклеиновой кислоты в антисмысловой ориентации (т.е. РНК, транскрибируемая с клонированной нуклеиновой кислоты, будет в антисмысловой ориентации к заданной нуклеиновой кислоте, представляющей интерес). Предпочтительно, производство антисмысловых последовательностей нуклеиновой кислоты в растении происходит посредством стабильно интегрированной конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей промотор, функционально связанный антисмысловой олигонуклеотид и терминатор.
Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для выключения гена в способах по изобретению (или введенные в растение, или синтезированные in situ), гибридизуются с или связываются с транскриптом мРНК и/или геномной ДНК, кодирующей полипептид, чтобы таким образом ингибировать экспрессию белка, например, ингибированием транскрипции или трансляции. Гибридизация может быть обусловлена обычной способностью комплементарных нуклеотидов формировать стабильный дуплекс, или, например, в случае антисмысловой последовательности нуклеиновой кислоты, которая связывается с ДНК дуплексом, посредством специфичного связывания с большой бороздкой двойной спирали. Антисмысловые последовательности нуклеиновой кислоты могут быть введены в растение путем трансформации или прямой инъекцией в определенный участок ткани. Кроме того, антисмысловые последовательности нуклеиновой кислоты могут быть изменены для поражения выбранных клеток и затем введены системно. Например, для системного введения, антисмысловые последовательности нуклеиновой кислоты могут быть изменены так, что они специфически связываются с рецепторами или антигенами, экспрессированными на поверхности выбранных клеток, например, путем соединения антисмысловой последовательности нуклеиновой кислоты с пептидами или антителами, которые связываются с поверхностными клеточными рецепторами или антигенами. Антисмысловые последовательности нуклеиновой кислоты также могут быть доставлены в клетку с помощью вектора, как описано в этом документе.
Согласно следующему объекту, антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты является а-аномерной последовательностью нуклеиновой кислоты. А-аномерная последовательность нуклеиновой кислоты формирует специфичные двуцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которой, в отличие от обычных b-единиц, цепи идут параллельно друг другу (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625-6641). Антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты может также содержать 2'-о-метилрибонуклеотид (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131-6148) или химерный РНК-ДНК аналог (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).
Снижение или существенная элиминация экспрессии эндогенного гена также может быть выполнена с использованием рибозимов. Рибозимы являются каталитическими молекулами РНК с рибонуклеазной активностью, которые способны расщеплять одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты, такую как мРНК, к которой у них есть комплементарный участок. Так, рибозимы (например, рибозимы акулы-молота, описанные в Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) могут быть использованы для каталитического расщепления транскриптов мРНК, кодирующих полипептид, тем самым, существенно снижая количество транскриптов мРНК, транслируемых в полипептиды. Могут быть созданы специфичные к последовательности нуклеиновой кислоты рибозимы (см., например: Cech et al. U.S. Patent No.4,987,071; and Cech et al. U.S. Patent No.5,116,742). Кроме того, для отбора каталитических РНК, имеющих специфичную рибонуклеазную активность, из пула молекул РНК, могут быть использованы транскрипты мРНК, соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). Использование рибозимов для выключения генов в растениях известно в данной области техники art (e.g., Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 and Scott et al. (1997) WO 97/38116).
Выключение генов также может быть достигнуто с помощью инсерционного мутагенеза (например, вставка Т-ДНК или транспозона) или с применением стратегий, как описано, среди других, Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083), или Baulcombe (WO 99/15682).
Выключение генов также может произойти, если есть мутация в эндогенном гене и/или мутация в выделенном гене/последовательности нуклеиновой кислоты, введенном в клетку. Снижение или существенная элиминация может быть вызвана нефункциональным полипептидом. Например, полипептид может связываться с различными взаимодействующими белками; одна или более мутация(й) и/или усечение(й) могут, следовательно, обеспечить полипептид, который все еще способен связывать взаимодействующие белки (такие как рецепторные белки), но не может выполнять свою обычную функцию (такую как сигнальный лиганд).
Следующий подход к выключению гена состоит в направленном воздействии комплементарными последовательностями нуклеиновой кислоты на регуляторный участок гена (например, на промотор и/или энхансеры) с формированием структуры тройной спирали, которая предотвращает транскрипцию гена в клетках-мишенях. See Helene, С., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; and Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.
Другие методы, такие как применение антител, направленных на эндогенный полипептид, для ингибирования его функции in planta (в полевых условиях), или вмешательство в пути передачи сигнала, в которые вовлечен полипептид, будут хорошо известны специалистам в данной области техники. В особенности, можно предвидеть, что искусственно сделанные молекулы могут быть применены для ингибирования биологической функции полипептида-мишени или для вмешательства в пути передачи сигнала, в которые вовлечен полипептид-мишень.
Кроме того, программа скрининга может быть настроена на выявление в популяции растений природных вариантов гена, которые кодируют полипептиды со сниженной активностью. Такие природные варианты также могут быть применены, например, для выполнения гомологичной рекомбинации.
Искусственные и/или природные микроРНК (miRNAs) могут быть использованы для нокаута экспрессии гена и/или трансляции мРНК. Эндогенные микроРНК являются одноцепочечными маленькими РНК, обычно длиной 19-24 нуклеотида. Их функция главным образом в регуляции экспрессии генов и/или трансляции мРНК. Большинство растительных микроРНК (miRNAs) полностью или почти полностью комплементарны последовательности, с которой они связываются. Однако есть природные мишени, содержащие до пяти некомплементарных оснований. Они процессируются из более длинных некодирующих РНК с характерными структурами обращенных повторов с помощью РНКаз из Дайсер семейства, специфичных к двухцепочечной РНК. После процессинга они встраиваются в РНК-индуцируемый комплекс выключения гена (RISC) путем связывания с его основным компонентом, белком Argonaute. МикроРНК служат компонентом RISC, обеспечивающим специфичность его действия, так как они комплементарны нуклеиновым кислотам-мишеням, в основном мРНК, в цитоплазме. Последующие этапы регуляции включают расщепление и уничтожение мРНК-мишени и/или ингибирование трансляции. Эффект сверхэкспрессии микроРНК, таким образом, часто выражается в уменьшении уровня мРНК генов-мишеней.
Искусственные микроРНК (amiRNAs), которые обычно 21 нуклеотид в длину, могут быть созданы генетически специально для обратной регуляции экспрессии одного или нескольких генов, представляющих интерес. Факторы, определяющие направленный выбор растительных микроРНК хорошо известны в данной области техники. Были определены эмпирические параметры направленного распознавания, которые могут использоваться как помощь в конструировании специфичных искусственных микроРНК (amiRNAs) (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Удобные инструменты для конструирования и создания искусственных микроРНК и их предшественников также доступны для общего пользования (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).
Для оптимальной работы, методы выключения генов, используемые для снижения экспрессии эндогенных генов в растении, требуют использование последовательностей нуклеиновой кислоты из однодольных растений для трансформации однодольных растений и из двудольных растений для трансформации двудольных растений. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты из любого данного вида растений вводится в растение того же вида. Например, последовательность нуклеиновой кислоты из риса вводится в растение риса. Тем не менее, не является абсолютно необходимым условием, чтобы вводимая последовательность нуклеиновой кислоты происходила из того же вида растения, что и растение, в которое будет введена. Достаточно того, что есть существенная гомология между эндогенным геном-мишенью и вводимой нуклеиновой кислотой.
Вышеописанное является примерами различных способов снижения или существенной элиминации экспрессии эндогенных генов в растении. Специалисты в данной области техники легко смогут адаптировать вышеуказанные способы выключения генов для достижения снижения экспрессии эндогенных генов в целом растении или его части, например, с помощью использования соответствующего промотора.
Селективный маркер (ген)/Репортерный ген

"Селективный маркер", "селективный маркерный ген" или " репортерный ген" включают любой ген, который придает клетке, в которой он экспрессируется, фенотип для облегчения идентификации и/или селекции клеток, трансфицированных или трансформированных конструкцией нуклеиновой кислоты по изобретению. Эти маркерные гены дают возможность идентифицировать успешную передачу молекулы нуклеиновой кислоты через серию различных характеристик. Подходящие маркеры могут быть выбраны из маркеров, которые придают устойчивость к антибиотикам или гербицидам, которые вводят новый метаболический признак или позволяют визуальную селекцию. Примеры селективных маркерных генов включают гены, придающие устойчивость к антибиотикам (таким как nptll, который фосфорилирует неомицин и канамицин, или hpt, фосфорилирование гигромицина, или гены, придающие устойчивость, например, к блеомицину, стрептомицину, тетрациклину, хлорамфениколу, ампицилину, гентамицину, генетицину (G418), спектиномицину или бластицидину), к гербицидам (например, бар (bar), который обеспечивает устойчивость к Basta; aroA или gox, обеспечивая устойчивость к глифосату, или гены, придающие устойчивость, например, к имидазолинону, фосфинотрицину или сульфонилмочевине) или гены, которые обеспечивают метаболический признак (такой как manА, который позволяет растениям использовать маннозу, как единственный источник углерода, или ксилозизомеразу для утилизации ксилозы, или антипитательные маркеры, такой как устойчивость к 2-дезоксиглюкозе). Экспрессия визуального гена маркера проявляется в окраске (например, β-глюкоронидаза, GUS или β-галактозидаза с их окрашенными субстратами, например, X-Gal), люминесценции (такой как система люциферин/люцефераза) или флуоресценции (зеленый флуоресцентный белок GFP и его производные). Этот перечень представляет только малую часть возможных маркеров. Квалифицированный специалист хорошо знаком с такими маркерами. Различные маркеры являются предпочтительными в зависимости от организма и методов селекции.
Известно, что при стабильной или временной интеграции нуклеиновой кислоты в растительные клетки только меньшая часть клеток захватывает чужеродную ДНК и, при желании, интегрирует ее в свой геном, в зависимости от использованного вектора экспрессии и использованного метода трансфекции. Для идентификации и селекции этих интегрантов, ген, кодирующий селективный маркер (такой как один из описанных выше), обычно вводится в клетки хозяина вместе с геном, представляющим интерес. Такие маркеры могут, например, использоваться в мутантах, в которых эти гены не функциональны, например из-за делеции, обычными способами. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие селективный маркер, могут быть введены в клетку хозяина в том же векторе, что содержит последовательность, кодирующую полипептиды по изобретению, или использован в способах по изобретению, или в другом векторе. Клетки, которые были стабильно трансфицированы введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы, например, селекцией (например, клетки, которые интегрировали селективный маркер, выживают, в то время как другие клетки погибают).
Так как маркерные гены, в частности гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, более не нужны или не желательны в трансгенной клетке хозяина, как только нуклеиновые кислоты были успешно введены, процесс введения нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением преимущественно использует методы, которые дают возможность удаление или вырезание этих маркерных генов. Один такой способ известен как ко-трансформация. Способ ко-трансформации использует два вектора одновременно для трансформации, один вектор несет нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением и второй несет маркерный ген(ы). Большая часть трансформантов получает или, в случае растений, содержит оба вектора (до 40% или более трансформантов). В случае трансформации с агробактерией (Agrobacteria), трансформанты обычно получают только часть вектора, то есть последовательность, фланкированную Т-ДНК, которая обычно представлена в кассете для экспрессии. Маркерные гены могут быть успешно удалены из трансформированных растений путем скрещиваний. В другом способе, маркерные гены, интегрированные в транспозон, использовались для трансформации вместе с желаемой нуклеиновой кислотой (известный как метод Ac/Ds). Трансформанты могут быть скрещены с источником транспозазы или трансформанты трансформируют конструкцией нуклеиновой кислоты, обеспечивающей временную или постоянную экспрессию транспозазы. В некоторых случаях (примерно 10%), транспозоны, как только трансформация прошла успешно, выпрыгивают из генома клетки хозяина и теряются. В следующих случаях, транспозон прыгает в разные места. В этих случаях маркерный ген должен быть удален путем скрещивания. В микробиологии были разработаны методы, которые делают возможным, или облегчают, обнаружение таких событий. Следующий предпочтительный способ основан на том, что известно как система рекомбинации; чье преимущество состоит в том, что можно обойтись без элиминации путем скрещивания. Наиболее известной системой этого типа является система, известная как Cre/lox. Cre1 является рекомбиназой, которая удаляет последовательности, расположенные между последовательностями loxP. Если маркерный ген вставлен между последовательностями loxP, он удаляется, как только трансформация успешно произошла, путем экспрессии рекомбиназы. Дополнительными системами рекомбинации являются HIN/HIX, FLP/FRT и REP/STB система (Tribble et al., J. Biol. Chem, 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). В соответствии сданным изобретением возможна сайт-специфическая интеграция в геном растения последовательностей нуклеиновой кислоты. Естественно, эти способы могут также быть применены к микроорганизмам, таким как дрожжи, грибы или бактерии.
Трансгенный/Трансген/Рекомбинантный
В целях изобретения, "трансгенный", "трансген" или "рекомбинантный" означают в отношении, например, последовательности нуклеиновой кислоты, кассету для экспрессии, генную конструкцию или вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, или организм, трансформированный последовательностями нуклеиновой кислоты, кассетами для экспрессии или векторами в соответствии с данным изобретением, все эти конструкции получены рекомбинантными способами, в которых либо
(а) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, применимый в способах по изобретению, или
(b) генетические управляющие последовательности(ь), которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты в соответствии сданным изобретением, например, промотором, или
(c) а) и b)
не находятся в их естественном генетическом окружении или были модифицированы рекомбинантными способами, возможно модификация состояла, например, в замене, добавлении, делеции, инверсии или вставке одного или более нуклеотидных остатков. Естественное генетическое окружение понимается как обозначение естественного геномного или хромосомного локуса в исходном растении или нахождение в геномной библиотеке. В случае геномной библиотеки, естественное генетическое окружение последовательности нуклеиновой кислоты предпочтительно сохранено, по меньшей мере, частично. Естественное окружение примыкает к последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере с одной стороны и имеет последовательность длиной по меньшей мере 50 п.о., предпочтительно по меньшей мере 500 п.о., особенно предпочтительно по меньшей мере 1000 п.о., наиболее предпочтительно по меньшей мере 5000 п.р. Встречающиеся в природе кассеты для экспрессии, например, встречающееся в природе сочетание естественного промотора последовательностей нуклеиновой кислоты с соответствующей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, применимый в способах по изобретению, как определено выше, становятся трансгенными кассетами для экспрессии, когда эта кассета для экспрессии изменена неестественными, синтетическими ("искусственными") способами, такими как, например, обработка мутагенами. Подходящие способы описаны в патентах US 5,565,350 или WO 00/15815.
Таким образом, трансгенное растение в целях данного изобретения понимается, как и выше, в том значении, что использованные в способах по изобретению нуклеиновые кислоты не находятся в их природном локусе в геноме указанного растения, при этом нуклеиновые кислоты могут быть экспрессированы гомологично или гетерологично. Однако, как упомянуто, трансгенное также означает, что хотя нуклеиновые кислоты в соответствии с данным изобретением или использованные в способах изобретения находятся в их природном положении в геноме растения, последовательность была изменена по сравнению с природной последовательностью и/или что регуляторные последовательности природной последовательности были изменены. Трансгенное, в соответствии с данным изобретением, предпочтительно понимается в значении экспрессии нуклеиновых кислот в природном локусе генома, т.е. имеет место гомологичная или, предпочтительно, гетерологичная экспрессия нуклеиновых кислот. В данном документе упомянуты предпочтительные трансгенные растения.
Трансформация
Термин "введение" или "трансформация", как изложено в данном документе, охватывает перенос экзогенного полинуклеотида в клетку хозяина, независимо от примененного метода переноса. Ткань растения, способная к последующему развитию клона, либо органогенезу, либо эмбриогенезу, может быть трансформирована генетической конструкцией по данному изобретению и из нее регенерировано целое растение. Выбор конкретной ткани будет меняться, в зависимости от имеющихся в наличии систем развития клона и, среди них, наиболее пригодных для трансформации конкретных видов. Типичные ткани-мишени включают листовые диски, пыльцу, эмбрион, семядоли, гипокотиль, мегагаметофиты, каллюсную ткань, существующую меристематическую ткань (например, меристема семядоли и меристема гипокотиля). Полинуклеотид может быть временно или постоянно введен в клетку хозяина и может сохраняться в неинтегрированном виде, как плазмида. Или же он может быть интегрирован в геном хозяина. Полученная в результате трансформированная растительная клетка затем может быть использована для регенерирования трансформированного растения способом, известным специалистам в данной области.
Перенос чужеродных генов в геном растения называется трансформацией. Трансформация видов растений теперь достаточно стандартная методика. Преимущественно, любой из ряда способов трансформации может быть использован для введения гена, представляющего интерес, в подходящую первичную клетку. Способы, описанные для трансформации и регенерации растений из растительных тканей или растительных клеток, могут быть использованы для временной или постоянной трансформации. Способы трансформации включают использование липосом, электропорации, химических реагентов, которые увеличивают захват свободной ДНК, прямую инъекцию ДНК в растение, биобаллистическую пушку, трансформацию с применением вирусов или пыльцы и микроинъекций. Способы могут быть выбраны из кальций-полиэтиленгликолевого способа для протопластов (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); электропорации протопластов (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); микроинъекций в растительный материал (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); бомбардировки ДНК или РНК-несущими частицами (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) инъекции с (интегрирующимися) вирусами и тому подобное. Трансгенные растения, включая трансгенные сельскохозяйственные культуры, предпочтительно получают путем трансформации, с помощью агробактерий. Предпочтительным способом трансформации является трансформация in planta. Для этого возможно, например, позволить агробактерии воздействовать на семена растения или инокулировать меристему растения агробактериями. Особенно целесообразным в соответствии с изобретением оказалось позволить суспензии агробактерии воздействовать на целое растение или, по меньшей мере, на завязь цветка. Растение далее растет до тех пор, пока не получены семена обработанных растений (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Способы трансформации риса с помощью агробактерий включают хорошо известные способы трансформации риса, такие как описанные в любом из последующих документов: European patent application ЕР 1198985 А1, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), раскрытая в них информация приведена в виде ссылки, как будто она полностью изложена в данном документе. В случае трансформации кукурузы, предпочтительным способом является способ, описанный либо в Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14 (6): 745-50, 1996) или Frame et al. (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002), раскрытая в них информация приведена в виде ссылки, как будто она полностью изложена в данном документе. Указанные способы далее описаны в виде примера в В.Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D.Kung and R.Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Нуклеиновые кислоты или конструкции, которые должны быть экспрессированы, предпочтительно клонированы в вектор, пригодный для трансформации Agrobacterium tumefaciens, например pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Агробактерия, трансформированная таким вектором, затем может быть использована известным способом для трансформации растений, таких как растения, использованные в качестве модели, как Арабидопсис (Arabidopsis) (Арабидопсис Таля или Резуховидка Таля в рамках данного изобретения не рассматривается как сельскохозяйственная культура), или сельскохозяйственные культуры, такие как, в качестве примера, растения табака, например погружением мятых листьев или рубленных листьев в раствор агробактерий и затем культивированием их в подходящих условиях. Трансформация растений с помощью Agrobacterium tumefaciens описана, например, Hofgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 и известна inter alia из F.F.White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, eds. S.D.Kung and R.Wu, Academic Press, 1993, pp.15-38.
В дополнение к трансформации соматических клеток, которые затем должны быть регенерированы в целое растение, также возможно трансформировать клетки меристемы растений и особенно клетки, которые развиваются в гаметы. В этом случае, трансформированные гаметы следуют пути развития природного растения, давая начало трансгенным растениям. Так, например, семена Арабидопсис, обработанные агробактериями, и семена, полученные из развивающихся растений, среди которых определенная доля является трансформированными, и таким образом трансгенными Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann К (1992). In: С Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp.274-289]. Другие способы основаны на повторяющихся удалениях соцветий и инкубации места среза в центре розетки с трансформированными агробактериями, посредством чего могут быть аналогично получены трансформированные семена в более поздний период времени time (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Однако особенно эффективным является метод вакуумной инфильтрации с его модификациями, такими как способ "floral dip" (погружение цветка). В случае вакуумной инфильтрации Арабидопсис, целые растения в условиях пониженного давления обрабатывают суспензией агробактерий [Bechthold, N (1993). С R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], в то время как в случае способа "floral dip" развивающаяся ткань цветка быстро инкубируется с суспензией агробактерий, обработанных сурфактантом [Clough, SJ and BentAF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. Определенные пропорции трансгенных семян собирают в обоих случаях, и эти семена можно отличить от нетрансгенных семян по росту в ранее описанных селективных условиях. Кроме того, стабильная трансформация плазмид имеет преимущество, так как плазмиды наследуются по материнской линии в большинстве сельскохозяйственных культур, уменьшая и элиминируя риск потока трансгенов через пыльцу. Трансформация генома хлоропластов в целом достигается процессом, который был схематично показан Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Коротко, последовательности, которые должны быть трансформированы, клонируются вместе с селективным геном-маркером между фланкирующими последовательностями, гомологичными геному хлоропластов. Эти гомологичные фланкирующие последовательности направляют сайт специфичную интеграцию в пластом. Пластидная трансформация была описана для многих различных видов растений и обзор дан в Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3): 425-38 or Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Недавно были опубликованы новые достижения в биотехнологии, в форме пластидных трансформантов без маркера, которые могут быть получены путем временной коинтеграцией маркерного гена (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229).
Мечение активацией Т-ДНК
Мечение активацией Т-ДНК (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) включает вставку Т-ДНК, обычно содержащую промотор (также может быть энхансер трансляции или интрон), в участок генома, где расположен ген, представляющий интерес, или на 10 kb выше или ниже кодирующего участка гена в такой конфигурации, что промотор управляет экспрессией целевого гена. Обычно, регуляция экспрессии целевого гена его природным промотором нарушена, и ген попадает под контроль вновь введенного промотора. Промотор, как правило, включен в Т-ДНК. Эта Т-ДНК случайным образом вставляется в геном растения, например, через заражение агробактерией и ведет к изменению экспрессии генов, расположенных рядом со вставкой Т-ДНК. Получаемое в результате трансгенное растение обладает доминантным фенотипом благодаря измененной экспрессии генов, близких к введенному промотору.
ТИЛЛИНГ (TILLING)
Термин ТИЛЛИНГ (TILLING) является аббревиатурой "Направленные Индуцированные Местные Повреждения в Геноме" ("Targeted Induced Local Lesions In Genomes") и относится к технологии мутагенеза, применимой для генерирования и/или идентификации нуклеиновых кислот, кодирующих белки с измененной экспрессией и/или активностью. ТИЛЛИНГ также позволяет выбирать растения, несущие такие мутантные варианты. Эти варианты мутаций могут проявлять измененную экспрессию, или по силе, или по месту, или по времени (если мутация затрагивает, например, промотор). Эти варианты мутаций могут проявлять высокую активность, чем та, которую проявляет ген в его природной форме. ТИЛЛИНГ сочетает в себе высокую плотность мутагенеза с высокой пропускной способностью методов скрининга. Обычная последовательность шагов в ТИЛЛИНГе составляет: (a) EMS мутагенез Redei GP and Koncz С (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp.16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar Т (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol.82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) подготовку ДНК и объединение объектов; (с) амплификацию, методом ПЦР, участка, представляющего интерес; (d) денатурацию и отжиг для образования гетеродуплексов; (е) ДВЭЖХ (DHPLC), где определяется присутствие гетеродуплекса в пуле в виде дополнительного пика на хроматографии; (f) идентификацию мутантных объектов; и (g) секвенирование мутантного ПЦР продукта. Способы, применяемые в ТИЛЛИНГе, хорошо известны в данной области техники (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; reviewed by Stemple (2004) Nat Rev Genet 5 (2): 145-50).
Гомологичная рекомбинация
Гомологичная рекомбинация позволяет вводить в геном выбранные нуклеиновые кислоты в определенную выбранную позицию. Гомологичная рекомбинация является стандартной технологией, используемой рутинно в биологических науках для низших организмов, таких как дрожжи или мох Physcomitrella. Способы выполнения гомологичной рекомбинации в растениях были описаны не только для модели растений (Offringa et al. (1990) EMBO J 9 (10): 3077-84), но также для сельскохозяйственных культур, например риса (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20 (10): 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2): 132-8), и существуют подходы, которые, в целом, применяются не зависимо от выбранного организма (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).
Увеличение/Улучшение/Усиление
Термины "увеличение", "улучшение" или "усиление" взаимозаменяемы и должны означать в смысле применения, по меньшей мере, на 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 15% или 20%, более предпочтительно на 25%, 30%, 35% или 40% больше рассматриваемого фактора по сравнению с любым контролем.
Растение
Термин "растение", как используется в этом документе, охватывает целые растения, предков и потомков растений и части растений, включая семена, побеги, ствол, листья, корни (в том числе клубни), цветы, и ткани, и органы, где каждый вышеупомянутый включает ген/нуклеиновую кислоту, представляющую интерес. Термин "растение" также охватывает растительные клетки, суспензию культур, каллюсную ткань, эмбрионы, меристематические участки, гаметофиты, спорофиты, пыльцу и микроспоры, где снова каждый вышеупомянутый включает ген/нуклеиновую кислоту, представляющую интерес.
Растения, особенно применимые в способах по изобретению, включают все растения, которые относятся к надсемейству Viridiplantae, особенно однодольные и двудольные растения, включая кормовые растения и кормовые бобовые растения, декоративные растения, сельскохозяйственные растения, деревья и кустарники, выбранные из перечня, содержащего Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranth us spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (например, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (например, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [канола, масличный рапс, масличная репа]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (например, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragan'a spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (например, Glycine max, Soja hispida or Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (например, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (например, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (например, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (например, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solarium spp. (например, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium or Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Tiiticum spp. (например, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybemum, Triticum macha, Triticum sativum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., среди других.
Подробное описание изобретения
Удивительно, но в настоящее время было обнаружено, что моделирование в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, дает растения с измененным ростом и/или развитием относительно контрольных растений. В соответствии с первым вариантом выполнения изобретения, настоящее изобретение описывает способ изменения роста и/или развития растения относительно контрольных растений, содержащий модулирование экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, в растении.
Предпочтительным способом модулирования (желательно, увеличения) экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, является введение и экспрессия в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог.
Любая ссылка в дальнейшем в этом документе на "белок, применимый в способах по изобретению" означает UBP полипептид подсемейства UBP15 или его гомолог, как определено в этом документе. Любая ссылка в дальнейшем в этом документе на "нуклеиновую кислоту, применимую в способах по изобретению" означает нуклеиновую кислоту, способную кодировать такой UBP полипептид. Нуклеиновая кислота для введения в растение (и поэтому применимая в выполнении способов по изобретению) является любой нуклеиновой кислотой, кодирующей тип белка, который теперь будет описан, в дальнейшем в этом документе также именуемый "нуклеиновая кислота UBP15" или "ген UBP15".
"Полипептид UBP15", как определено в этом документе, относится к любому полипептиду, содержащему любое из последующего:
(i) Цистеиновый бокс Cys box; и
(ii) Гистидиновый бокс His box; и
(iii) ZnMYND домен "цинковый палец".
Cys и His боксы два высококонсервативных мотива найдены в консервативном каталитическом домене, называемом UBP домен (см. Фиг.1). Cys и His боксы содержат каталитическую триаду остатков (Cys в Cys боксе, His и Asp/Asn в His боксе) (Amerik and Hochstrasser, 2004). Длина UBP домена варьирует от 300 до 900 аминокислот в длину, и, несмотря на иногда низкую консервативность всей последовательности, они обычно демонстрируют консервативную трехмерную структуру. В пределах UBP доменов, Цистеин в Cys боксе играет существенную роль в каталитической активности, и специфичная мутация по Цистеину может прекратить деубиквитинилирующую активность UBP доменов (Papa and Hochstrasser, 1993; Chandler et al., 1997; Rao-Naik et al., 2000; Yan et al., 2000; Baek et al., 2001; Doelling et al., 2001; Hanna et al., 2006).
Подсемейство UBP15 включает UBP15, UBP16, UBP17, UBP18 и UBP19. Члены этого подсемейства и их гомологи содержат характерный признак MYND тип домена "цинковый палец", который, как сообщалось, является доменом белок-белкового взаимодействия у млекопитающих (Gross and McGinnis, 1996; Lutterbach et al., 1998a; Lutterbach et al., 1998b; Masselink and Bernards, 2000).
Генетический анализ взаимодействий между членами подсемейства UBP15 выявил, что UBP15 и UBP16, но не UBP17, обладают функциональной избыточностью, даже если UBP16 и UBP17 одинаково взаимодействуют с UBP15. Мутация в другом члене подсемейства, UBP19, приводит к эмбриональной летальности, в то время как потеря активности самого близкого члена их подсемейства, UBP18, не приводит к видимым дефектам.
Последовательности UBP, применимые в выполнении способов по изобретению, также могут быть идентифицированы путем включения запрашиваемой последовательности в филогенетическое дерево UBP, такое, как описанное в Фиг.1. Полипептиды UBP15 или их гомологи будут группироваться с подсемейством UBP15, а не с любым другим подсемейством.
Кроме того, полипептиды UBP15 и их гомологи, как правило, имеют UBP активность In vitro.
Полипептиды UBP15 или их гомологи, применимые в способах по изобретению, как правило, имеют, в порядке возрастания предпочтения, по меньшей мере, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности всей последовательности к любому из UBP15 (SEQ ID NO:2), UBP16 (SEQ ID NO:4), UBP17 (SEQ ID NO:6), UBP18 (SEQ ID NO:8) или UBP19 (SEQ ID NO:10) из Арабидопсиса Таля. Идентичность всей последовательности может быть определена с использованием глобального алгоритма выравнивания, такого как алгоритм Needleman Wunsch в программе GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), предпочтительно с параметрами по умолчанию. В сравнении с идентичностью всей последовательности, идентичность последовательности, как правило, бывает выше, когда рассматривают только консервативные домены или мотивы.
Термин "домен" или "мотив" определен в разделе "определения" в этом документе. Для идентификации доменов существуют специальные базы данных, например SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp 53-61, AAAI Press, Menio Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)), или Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30 (1): 276-280 (2002)). Набор инструментов для анализа белковых последовательностей in silico доступен на сервере протеомики ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)). Домены и мотивы также могут быть идентифицированы с помощью стандартных методов, таких как выравнивание последовательности (сравнительный анализ линейных последовательностей).
Способы сравнения (выравнивания) линейных последовательностей хорошо известны в данной области техники, такие способы включают GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA. GAP использует алгоритм Needleman and Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) для обнаружения глобальной (т.е. охватывающей полные последовательности) линейной последовательности в двух последовательностях, которая максимизирует количество совпадений и минимизирует количество расхождений. Алгоритм BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) вычисляет процент идентичности последовательности и выполняет статистический анализ подобия между двумя последовательностями. Программное обеспечение для выполнения BLAST анализа публично доступно через Национальный Центр Биотехнологической Информации (NCBI). Гомологи могут быть легко идентифицированы с использованием, например, алгоритма множественного сравнения (выравнивания) и парных совпадений по умолчанию и способа оценки в процентах. Общий процент подобия и идентичности может быть также определен с использованием одного из методов, доступного в пакете программного обеспечения MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4: 29. MatGAT: приложение, которое создает матрицу подобия/идентичности, используя последовательности белков или ДНК). Незначительное ручное редактирование может быть выполнено для оптимизации выравнивания (линейного сравнения) между консервативными мотивами, с точки зрения специалиста в данной области техники. Более того, вместо того чтобы использовать последовательности полной длины для идентификации гомологов, могут быть также использованы специфичные домены. Степень идентичности последовательностей может быть определена по полной последовательности нуклеиновой кислоты или полной аминокислотной последовательности или по выбранным доменам или по консервативному мотиву(ам), с использованием вышеупомянутых программ с использованием параметров по умолчанию. Для частичных сравнений линейных последовательностей особенно применим алгоритм Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147 (1); 195-7).
Примеры нуклеиновых последовательностей, кодирующих членов подсемейства UBP15, представлены последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 и 44. Такие нуклеиновые кислоты применимы в выполнении способов по изобретению. Нуклеотидная последовательность, представленная последовательностью SEQ ID NO:11, кодирует полипептидную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO:12, UBP из риса (Nipponbare strain), который очень близок к AtUBP15, и имеет 53% идентичности на нуклеотидном уровне, 40% идентичности на белковом уровне и 54% подобия на белковом уровне. Нуклеотидная последовательность, представленная последовательностью SEQ ID NO:13, кодирует полипептидную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO:14, UBP из риса (Nipponbare strain), который очень близок к AtUBP16, и имеет 44% идентичности cAtUBP16 на нуклеотидном уровне, 30% идентичности на белковом уровне и 44% подобия на белковом уровне с АtUВР16. Нуклеотидная последовательность, представленная последовательностью SEQ ID NO:15, кодирует полипептидную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO:16, UBP из риса (Nipponbare strain), который очень близок AtUBP17, и имеет 40% идентичности AtUBP17 на нуклеотидном уровне, 33% идентичности на белковом уровне и 45% подобия на белковом уровне с AtUBP17. Нуклеотидная последовательность, представленная последовательностью SEQ ID NO:17, кодирует полипептидную последовательность, представленную последовательностью SEQ ID NO:18, UBP из риса (Nipponbare strain), который очень близок к AtUBP18, и имеет 34% идентичности с AtUBP17 на нуклеотидном уровне, 30% идентичности на белковом уровне и 39% подобия на белковом уровне с AtUBP18. SEQ ID NO:19 является нуклеотидной последовательностью из кукурузы (Zea mays), демонстрирующей некоторое подобие последовательности SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:19 является самой длинной последовательностью кДНК кукурузы, полученной путем сборки экспрессируемых ярлыков (ESTs= Expressed Sequence Tags) последовательностей SEQ ID NOs 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38. Последовательность SEQ ID NO:39 была собрана из экспрессируемых ярлыков (ESTs) последовательностей SEQ ID NOs 40, 41, 42 и 43. SEQ ID NO:44 является другой нуклеотидной последовательностью из кукурузы, демонстрирующей некоторое подобие последовательности SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:44 была собрана из экспрессируемых ярлыков (ESTs) последовательностей SEQ ID NOs 45, 46, 47, 48, 49, 50 и 51.
Последовательности SEQ ID NOs 12, 14, 16 и 18 являются примерами ортологов полипептидов UBP, представленных последовательностями SEQ ID NOs: 2, 4, 6 и 8 соответственно. Термин "ортолог" и "паралог" такие, как определено в данном документе. Следующие ортологи и паралоги могут быть легко идентифицированы путем выполнения так называемого реципрокного бласт-поиска. Как правило, он включает первый BLAST, включающий бластинг (BLASTing) изучаемой последовательности (запрос) (например, использование любой из последовательностей (SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 или 10), против любой последовательности базы данных, такой как доступная публично база данных NCBI. BLASTN или TBLASTX (с использованием стандартных параметров по умолчанию) обычно используются, когда начинают с нуклеотидной последовательности, и BLASTP или TBLASTN (с использованием стандартных параметров по умолчанию), когда начинают с белковой последовательности. Результаты BLAST могут быть необязательно отфильтрованы. Последовательности полной длины из отфильтрованных результатов или нефильтрованных результатов затем обратно бластируются (BLASTed back) (второй BLAST) против последовательностей из организма, из которого получена изучаемая последовательность (где изучаемая последовательность является SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:10, поэтому второй BLAST будет против последовательностей Arabidopsis). Затем сравнивают результаты первого и второго blastob. Паралог определяется, если последовательность с высоким уровнем совпадений из первого бласта происходит из того же вида, что и изучаемая последовательность, и затем обратный BLAST выдает изучаемую последовательность среди самых больших совпадений; ортолог определяется, если последовательность с высоким уровнем совпадений в первом BLAST (бласте) происходит не из того же вида, что и исследуемая последовательность, и предпочтительно при обратном BLAST выдает исследуемую последовательность среди самых больших совпадений.
Последовательность с высоким уровнем совпадений имеет низкую величину Е. Чем ниже величина Е, тем более достоверно выравнивание (сравнение) (или другими словами тем меньше шанс, что совпадение случайно). Вычисление величины Е хорошо известно в данной области техники. Дополнительно к величине Е, сравнения также оцениваются по проценту идентичности. Процент идентичности относится к числу идентичных нуклеотидов (или аминокислот) между двумя сравниваемыми нуклеотидными (или полипептидными) последовательностями по фиксированной длине. В случае больших семейств, может быть использован ClustalW, с последующим построением филогенетического дерева, для помощи в визуализации кластеров родственных генов и идентификации ортологов и паралогов.
Варианты нуклеиновых кислот также могут быть пригодны в применении на практике способов по изобретению. Примеры таких вариантов включают нуклеиновые кислоты, кодирующие гомологи и производные любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 или 10, где термины "гомолог" и "производное" определяются, как описано в этом документе. Также применимы в способах по изобретению нуклеиновые кислоты, кодирующие гомологи и производные ортологов и паралогов любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 или 10. Гомологи и производные, применимые в способах по данному изобретению, имеют по существу такую же биологическую и функциональную активность, как и немодифицированный белок, из которого они происходят.
Следующие варианты нуклеиновых кислот, пригодные для применении на практике способов по изобретению, включают участки нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды UBP15 или их гомологи, нуклеиновые кислоты, гибридизующиеся с нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды UBP 15 или их гомологи, варианты сплайсинга нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды UBP 15 или их гомологи, аллельные варианты нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды UBP 15 или их гомологи, и варианты нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды UBP 15, полученные перестановкой генов. Термины гибридизующиеся последовательности, варианты сплайсинга, аллельные варианты и перестановка генов определяются, как описано в данном документе.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды UBP15 или их гомологи, не должны быть полноразмерными нуклеиновыми кислотами, поскольку выполнение способов по изобретению не зависит от использования полноразмерных последовательностей нуклеиновых кислот. В соответствии с настоящим изобретением, здесь представлен способ изменения роста и развития растения, содержащий введение и экспрессию в растениях участка любой из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или участка нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог, паралог или гомолог любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18.
Участок нуклеиновой кислоты может быть подготовлен, например, выполнением одной или более делеций в нуклеиновой кислоте. Участки могут быть использованы в изолированном виде, или они могут быть слиты с другими кодирующими (или некодирующими) последовательностями, например, с целью получения белка, который сочетает несколько активностей. В случае сшивания с другой кодирующей последовательностью, конечный полипептид, полученный после трансляции, может быть больше, чем предполагаемый для участка белка.
Участки, применимые в способах по изобретению, кодируют полипептид UBP15 или его гомолог, как определено в этом документе, и имеют по существу такую же биологическую активность, как и последовательности аминокислот, представленные последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Предпочтительно, участок является участком любой из перечисленных нуклеиновых кислот, представленных последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или является участком нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог или паралог любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Предпочтительно участок имеет в длину, по меньшей мере, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 1200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150 или более последовательных нуклеотидов, последовательные нуклеотиды, являющиеся любой из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или нуклеиновой кислотой, кодирующей ортолог или паралог любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Наиболее предпочтительно, участок является фрагментом нуклеиновой кислоты любой из последовательностей SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 или 9. Предпочтительно, участок кодирует фрагмент аминокислотной последовательности, которая при использовании в построении филогенетического дерева, такого как описано в Фиг.1, группируется с подсемейством белков UBP15 более, чем с любым другим подсемейством UBP.
Другой вариант нуклеиновой кислоты, применимый в способах по изобретению, является нуклеиновой кислотой, способной гибридизоваться в условиях пониженной жесткости, предпочтительно в жестких условиях, с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, как определено в данном документе, или с его участком, как определено в данном документе.
В соответствии с настоящим изобретением, здесь представлен способ изменения роста и/или развития растения, содержащий введение и экспрессию в растении нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться с любой из нуклеиновых кислот, представленных последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или содержащий введение и экспрессию в растении нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, кодирующей ортолог, паралог или гомолог любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18.
Гибридизуемые последовательности, применимые в способах по изобретению, кодируют полипептид UBP15, как определено в этом документе, имея по существу такую же биологическую активность, как и аминокислотные последовательности, представленные любой из последовательностей SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Предпочтительно, гибридизуемая последовательность способна гибридизоваться с любой из нуклеиновых кислот, представленных последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или с участком любой из этих последовательностей, где участок определяется, как указано выше, или гибридизуемая последовательность способна гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог или паралог любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Наиболее предпочтительно, гибридизуемая последовательность способна гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, представленной последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17 или их участком.
Предпочтительно, гибридизуемая последовательность кодирует полипептид с аминокислотной последовательностью, который при полной длине в построении филогенетического дерева UBP, такого как показан на Фиг.1, группируется с подсемейством полипептидов UBP15 более, чем с любым другим подсемейством UBP.
Другой вариант нуклеиновой кислоты, применимый в способах по изобретению, является вариантом сплайсинга, кодирующим полипептид UBP15 или его гомолог, как определено выше в этом документе, где вариант сплайсинга определяется, как указано в этом документе.
В соответствии с настоящим изобретением, здесь представлен способ изменения роста и/или развития растения, содержащий введение и экспрессию в растении варианта сплайсинга любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, представленной последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или вариантом сплайсинга нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог, паралог или гомолог любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18.
Предпочтительные варианты сплайсинга являются вариантами сплайсинга нуклеиновой кислоты, представленной любой из последовательностей SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17, или вариантом сплайсинга нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог или паралог последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Предпочтительно, аминокислотная последовательность, кодируемая вариантом сплайсинга, при построении филогенетического дерева UBP, такого, как показан на Фиг.1, группируется с подсемейством полипептидов UBP15 более, чем с любым другим подсемейством UBP.
Другой вариант нуклеиновой кислоты, применимый в исполнении способов по изобретению, является аллельным вариантом нуклеиновой кислоты, колирующим полипептид UBP15 или его гомолог, как определено выше в этом документе, где аллельный вариант определяется, как указано в этом документе.
В соответствии с настоящим изобретением, здесь представлен способ изменения роста и/или развития растения, содержащий введение и экспрессию в растении аллельного варианта любой из нуклеиновых кислот, представленных последовательностями SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или содержащий введение и экспрессию в растении аллельного варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог, паралог или гомолог любой из аминокислотных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18.
Аллельные варианты, применимые в способах по изобретению, имеют по существу такую же биологическую активность, как и любой полипептид подсемейства UBP15, представленный последовательностями SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Аллельные варианты существуют в природе и, охваченные в пределах способов по данному изобретению, являются применением этих природных аллелей. Предпочтительно, аллельный вариант является аллельным вариантом любой их последовательностей SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или аллельным вариантом нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог или паралог последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18. Предпочтительно, аминокислотная последовательность, кодируемая аллельным вариантом, при построении филогенетического дерева UBP, такого, как показано на Фиг.1, группируется с подсемейством UBP15 более, чем с любым другим подсемейством UBP.
Перестановка генов или направленная эволюция также могут быть использованы для создания вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды UBP15 или их гомологи, как определено выше; термин "перестановка генов" определяется, как указано в этом документе.
В соответствии с настоящим изобретением, здесь представлен способ изменения роста и/или развития растения в растениях, содержащий введение и экспрессию в растении варианта любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, представленных любой последовательностью SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 39 или 44, или содержащий введение и экспрессию в растении варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей ортолог, паралог или гомолог любой из аминокислотных последовательностей, представленных любой из последовательностей SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18, где вариант нуклеиновой кислоты получен перестановкой генов.
Предпочтительно, аминокислотная последовательность, кодируемая вариантом нуклеиновой кислоты, полученным перестановкой генов, при построении филогенетического дерева UBP, такого, как показано на Фиг.1, группируется с подсемейством UBP15 более, чем с любым другим подсемейством UBP.
Кроме того, варианты нуклеиновой кислоты могут также быть получены с помощью сайт-специфического мутагенеза. Несколько способов доступны для достижения сайт-специфического мутагенеза, наиболее распространенным является способ, основанный на ПЦР (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды UBP15, могут происходить из любого природного или искусственного источника. Нативная форма нуклеиновой кислоты может быть изменена по составу и/или генетическому окружению преднамеренными манипуляциями человека. Предпочтительно, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид UBP, происходит из растения, далее предпочтительно из двудольного растения, более предпочтительно из семейства Brassicaceae, наиболее предпочтительно нуклеиновая кислота из Арабидопсиса Таля.
Выполнение способов по изобретению создает растения, имеющие измененный рост и/или развитие.
Измененное развитие может присутствовать в любой части растения, в любой клетке, ткани или органе, особенно в листьях. Измененное развитие может быть измененным репродуктивным развитием. Измененное развитие может являться причиной измененного фенотипа растения, такого как измененная форма листа (особенно более узкие, и/или зубчатые, и/или плоские листья); и измененные фенотипы (такие как измененное цветение, и/или изменения в апикальном доминировании, и/или измененная урожайность). Измененное развитие или фенотип могут являться причиной изменений в пролиферации клеток.
Настоящее изобретение охватывает растения или их части (включая семена), которые можно получить способами в соответствии с настоящим изобретением. Растения или их части содержат трансгены нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид UBP15 или его гомологи, как описано выше.
В изобретении также описаны генетические конструкции и вектора для упрощения введения и/или экспрессии в растении нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид UBP15 или его гомологи. Генетические конструкции могут быть введены в вектора, которые могут быть коммерчески доступны, пригодны для трансформации в растениях и для экспрессии гена, представляющего интерес, в трансформированных клетках. В изобретении также описано использование генетических конструкций, как определено в этом документе, в способах по изобретению.
Более конкретно, в данном изобретении описаны конструкции, содержащие:
(а) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который является членом подсемейства UBP15 или его гомолога, как определено выше;
(б) одну или более управляющие последовательности, способные запускать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты по (а); и необязательно
(с) последовательность терминации трансляции.
Предпочтительно, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид UBP15 или его гомолог, такова, как определено выше. Термин "управляющая последовательность" и "последовательность терминации" такие, как определено выше.
Растения трансформированы вектором, содержащим любую из нуклеиновых кислот, описанных выше. Специалисту в данной области хорошо известны генетические элементы, которые должны присутствовать в векторе для успешных трансформации, отбора и размножения клеток хозяина, содержащих последовательность, представляющую интерес. Последовательность, представляющая интерес, функционально связана с одной или более управляющими последовательностями (по меньшей мере, с промотором).
Преимущественно, любой тип промотора или естественный, или синтетический, может быть использован для запуска экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Конститутивный промотор является особенно применимым в способах. Предпочтительно конститутивный промотор является универсальным промотором. Смотри раздел "Подробное описание изобретения" в этом документе для определения различных типов промоторов.
Конститутивный промотор является предпочтительно промотором CaMV35S. Далее предпочтительно конститутивный промотор представлен последовательностью нуклеиновой кислоты, в значительной степени сходной с последовательностью SEQ ID NO:52, наиболее предпочтительно конститутивный промотор является таковым, как представлено в последовательности SEQ ID NO:52. Для дополнительных примеров конститутивных промоторов смотри Таблицу В в "Подробном описании изобретения" в этом документе.
Необязательно, одна или более терминирующих последовательностей могут быть использованы в конструкции, введенной в растение. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные, так же как и трансляционные, энхансеры. Специалистам в данной области техники хорошо известны терминирующие и энхансерные последовательности, которые могут быть пригодны к применению для выполнения изобретения. Также могут быть добавлены последовательности интронов в 5' нетранслируемом регионе (UTR) или в кодирующую последовательность для увеличения количества зрелых мРНК, накапливаемых в цитозоле, как описано в разделе "подробное описание изобретения". Другие регулирующие последовательности (кроме промотора, энхансера, сайленсера, последовательностей интронов, 3'UTR и/или 5'UTR участков) могут быть элементами, стабилизирующими белок и/или РНК. Такие последовательности должны быть хорошо известны или могут быть легко получены специалистом в данной области техники.
Генетические конструкции по изобретению могут кроме того включать последовательность инициации репликации, которая необходима для сохранения и/или репликации в определенном типе клетки. Один из примеров, когда генетическая конструкция нуждается в эписомальном генетическом элементе (например, плазмиде или космиде) для сохранения в бактериальной клетке. Предпочтительные инициаторы репликации включают, но не ограничиваются, f1-ori и colE1.
Для определения успешного переноса последовательностей нуклеиновой кислоты, как используется в способах по изобретению, и/или выбора трансгенных растений, содержащих эти нуклеиновые кислоты, удобно использовать гены-маркеры (или репортерные гены). Поэтому генетические конструкции могут необязательно содержать селективные гены-маркеры. Селективные маркеры более подробно описаны в разделе "Подробное описание изобретения" в этом документе. Гены-маркеры могут быть удалены или вырезаны из трансгенной клетки как только они перестают быть нужны. Методы удаления маркеров известны в данной области техники, применимые методы описаны выше в разделе "Подробное описание изобретения".
В изобретении также описан способ получения трансгенных растений, имеющих измененный рост и/или развитие по сравнению с контрольными растениями, содержащий введение и экспрессию в растении любой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, как определено выше в этом документе.
Более конкретно, в настоящем изобретении описан способ получения трансгенных растений, имеющих измененный рост и/или развитие, который содержит:
(i) введение и экспрессию в растении или в растительной клетке нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15; и
(ii) культивирование растительной клетки в условиях стимулирования роста и развития растения.
Нуклеиновая кислота (i) может быть любой нуклеиновой кислотой, способной кодировать полипептид UBP15 или его гомолог, как определено в этом документе.
Нуклеиновая кислота может быть введена непосредственно в растительную клетку, или в само растение, или, включая введение в ткань, орган, или любую другую часть растения. В соответствии с предпочтительным признаком настоящего изобретения, нуклеиновая кислота, предпочтительно вводится в растение путем трансформации. Термин "трансформация" детально описан в разделе "Подробное описание изобретения" в этом документе.
Генетически измененные растительные клетки могут быть созданы всеми способами, с которыми знаком специалист в данной области техники. Подходящие способы могут быть найдены в вышеуказанных публикациях S.D.Kung and R.Wu, Potrykus or Hofgen and Willmitzer.
Как правило, после трансформации, растительные клетки или группировки клеток отбирают по факту наличия одного или более маркеров, которые кодируются экспрессирующимися в растении генами, ко-трансфицированными совместно с геном, представляющим интерес, после чего из трансформированного материала регенерируют целое растение. Для отбора трансформированных растений, растительный материал, полученный в процессе трансформации, как правило, подвергают воздействию селективных условий так, чтобы трансформированные растения можно было отличить от не трансформированных растений. Например, семена, полученные вышеописанным способом, могут быть высажены и, после начального периода роста, подвергнуты подходящему отбору путем распыления. Дополнительная возможность состоит в выращивании семян, при необходимости после стерилизации, на чашках с агаром с использованием подходящего селективного агента, так что только трансформированные семена могут вырасти в растения. Кроме того, трансформированные растения скринируются на наличие селективного маркера, такого, как описан выше.
После переноса ДНК и регенерации, предположительно трансформированные растения могут быть охарактеризованы, например, с помощью Саузерн-Блотт анализа на наличие гена, представляющего интерес, количество копий и/или геномную организацию. Альтернативно или дополнительно, уровни экспрессии недавно введенной ДНК могут быть измерены с помощью Нозерн- и/или Вестерн-Блотт анализов, оба метода хорошо известны специалистам в данной области техники.
Полученные трансформированные растения могут быть размножены рядом способов, таких как развитие клона или классические методы разведения. Например, первое поколение (или Т1) трансформированного растения может быть самоопылено и отобраны гомозиготные трансформанты второго поколения (или Т2), и затем Т2 растения могут быть далее размножены с помощью классических методов разведения. Полученные трансформированные организмы могут принимать различные формы. Например, они могут быть химерами трансформированных клеток и нетрансформированных клеток; кленовыми трансформантами (например, все клетки трансформированы и содержат кассету для экспрессии); привоями трансформированных и нетрансформированных тканей (например, в растениях, трансформированный подвой привит на нетрансформированный привой).
Настоящее изобретение, безусловно, распространяется на любую растительную клетку или растение, полученное любым описанным с этом документе способом, и на все части растений и их пропагулы. Настоящее изобретение распространяется далее, охватывая потомство первично трансформированной или трансфицированной клетки, ткани, органа или целого растения, которое было получено любым из ранее упомянутых методов, единственное требование состоит в том, что потомство проявляет ту же генотипическую и/или фенотипическую характеристику(и), что и родитель, в способах по данному изобретению.
Изобретение также включает клетки хозяина, содержащие изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид UBP15 или его гомолог, как определено выше в этом документе. Предпочтительные клетки хозяина по изобретению являются растительными клетками. Теоретически, предпочтительно все растения, которые способны синтезировать полипептиды, используемые в методах изобретения, являются растениями-хозяевами для нуклеиновых кислот или вектора, используемого в способах по изобретению, кассеты для экспрессии, или конструкции, или вектора.
Способы по изобретению предпочтительно применимы к любому растению. Растения, которые особенно применимы в способах по изобретению, включают все растения, которые относятся к суперсемейству Зеленые растения (Viridiplantae), в особенности однодольные и двудольные растения, включая кормовые или кормовые бобовые растения, декоративные растения, продовольственные культуры, деревья и кустарники. По предпочтительному варианту выполнения настоящего изобретения, растение является сельскохозяйственным растением. Примеры сельскохозяйственных растений включают соевые бобы, подсолнечник, канолу, люцерну, рапс, хлопок, томаты, картофель и табак. Далее предпочтительно растение является однодольным растением. Примеры однодольных растений включают сахарный тростник. Более предпочтительно, растение является злаком. Примеры злаков включают рис, маис, пшеницу, ячмень, просо, рожь, тритикале, сорго и овес.
Изобретение также распространяется на части растений, собираемые в виде урожая, такие как, но не ограничиваясь, семена, листья, фрукты, цветы, стебли, корни, подземные побеги, клубни и луковицы. Более того, изобретение относится к продуктам, происходящим, предпочтительно непосредственно происходящим, из собираемых в виде урожая частей таких растений, как сухие кормовые гранулы или порошки, масло, жир и жирные кислоты, крахмал или белки.
В соответствии с предпочтительным признаком изобретения, модулированная экспрессия является увеличенной экспрессией. Способы увеличения экспрессии нуклеиновых кислот, или генов, или продуктов генов хорошо задокументированы в данной области техники, и примеры представлены в разделе "Подробное описание изобретения".
Как упомянуто выше, предпочтительным способом модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог, является введение и экспрессия в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15 или его гомолог; однако результат исполнения способа, то есть измененный рост и/или развитие растения, может быть также достигнут использованием других хорошо известных методов, включая, но не ограничиваясь, мечение активацией Т-ДНК, ТИЛЛИНГ, гомологичную рекомбинацию. Описания этих методов представлены в разделе "Подробное описание изобретения".
Настоящее изобретение также охватывает использование нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид UBP15 или его гомологи, как описано в этом документе, и использование этих UBP15 полипептидов в изменении роста и/или развития растений.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид UBP15, описанные в этом документе, или сам полипептид UBP15 могут найти применение в программах разведения, в которых определен ДНК маркер, который может быть генетически связан с геном, кодирующим полипептид UBP15. Нуклеиновые кислоты/гены или сам полипептид UBP15 могут быть использованы для установления молекулярного маркера. Этот ДНК или белковый маркер может затем быть использован в программах разведения для селекции растений, имеющих измененный рост и/или развитие, как определено выше в этом документе в способах по изобретению.
Аллельные варианты нуклеиновой кислоты/гена, кодирующей полипептид UBP15, также могут найти применение в программах разведения с помощью маркеров. Такие программы разведения иногда требуют введения аллельных вариаций с помощью мутагенной обработки растений с использованием, например, ЕМС мутагенеза; кроме того, программы могут начинаться с создания коллекции аллельных вариантов так называемого "природного" происхождения, полученных непреднамеренно. Затем осуществляют идентификацию аллельных вариантов, например, с помощью ПЦР. Следующий шаг состоит в отборе лучших аллельных вариантов изучаемой последовательности и которые дают измененный рост и/или развитие. Отбор обычно заключается в измерении характеристик роста растений, содержащих различные аллельные варианты изучаемой последовательности. Характеристики роста могут измеряться в оранжерее или в поле. Следующие необязательные стадии включают скрещивание растений, в которых был идентифицирован лучший аллельный вариант, с другим растением. Это может быть использовано, например, для получения комбинаций интересных фенотипических особенностей.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды UBP15 или их гомологи, могут также быть использованы в качестве зондов для генетического и физического картирования генов, частью которых они являются, и как маркеры признаков, сцепленных с этими генами. Такая информация может быть полезна в разведении растений с целью создания линий с желаемыми фенотипами. Такое применение нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид UBP15, требует только последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, в 15 нуклеотидов в длину. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид UBP15, могут быть использованы как маркеры полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Саузерн-Блотты (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis Т (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) рестрикционных фрагментов геномной ДНК растения могут быть обработаны зондами нуклеиновых кислот, кодирующих UBP15. Полученные в результате отпечатки связывания могут быть подвергнуты генетическому анализу с помощью таких компьютерных программ, как MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181), для построения генетической карты. Дополнительно, нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве зондов в Саузерн-Блоттах, содержащих эндонуклеазные рестрикционные фрагменты геномной ДНК ряда особей, представляющих родителей и потомство заданного генетического скрещивания. Сегрегация полиморфизмов ДНК описана и использована для вычисления положения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид UBP15, на ранее полученной генетической карте этой популяции (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331).
Производство и использование зондов из генов растений для применения в генетическом картировании описано в Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41. Многочисленные публикации описывают генетическое картирование специфичных клонов кДНК с использованием метода, описанного в общих чертах выше, или его вариантов. Например, F2 популяции перекрестного скрещивания, популяция реципрокного скрещивания, свободно скрещенная популяция, близкие изогенные линии и другие множества особей могут быть использованы для картирования. Такие методики хорошо известны специалистам в данной области техники.
Зонды нуклеиновых кислот также могут быть использованы для физического картирования (т.е. положение последовательности на физических картах, см. Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp.319-346 и приведенный в документе список ссылок).
В другом варианте выполнения изобретения, зонды нуклеиновых кислот могут быть использованы в картировании с помощью прямой флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Хотя современные методы FISH картирования поддерживают использование больших зондов (от нескольких kb до нескольких сотен kb; смотри Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13-20), улучшение чувствительности может допустить выполнение FISH картирования с применением более коротких зондов.
Ряд способов, основанных на амплификации нуклеиновой кислоты, для генетического и физического картирования могут быть выполнены с использованием нуклеиновых кислот. Примеры включают аллель-специфичную амплификацию (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96), полиморфизм амплифицированных с помощью ПЦР фрагментов (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325-332), аллель-специфичное лигирование (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080), реакции нуклеотидной элонгации (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), картирование с помощью облученных гибридов (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22-28) и картирование HAPPY (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Для этих способов последовательность нуклеиновой кислоты используется для конструирования и производства пар праймеров для применения в реакции амплификации или в реакциях элонгации праймера. Конструирование таких праймеров хорошо известно специалистам в данной области техники. В способах, использующих генетическое картирование, основанное на ПЦР, может быть необходимо определить различия в последовательностях ДНК у родителей, которых использовали в скрещивании для картирования, в участке, соответствующем рассматриваемой в данный момент последовательности нуклеиновой кислоты. Это, тем не менее, не является необходимым для способов картирования.
Способы по настоящему изобретению дают в результате растения с измененным ростом и/или развитием, описанными ранее в данном документе. Эти признаки также могут быть объединены с другими экономически выгодными признаками, такими как признаки повышения урожайности, устойчивости к абиотическим и биотическим факторам, признаки изменения различных декоративных особенностей и/или биохимических и/или физиологических особенностей.
Примеры
Теперь настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые являются только иллюстрацией. Следующие примеры не предназначены для полного определения или иного ограничения области изобретения.
1. Растительный материал и условия роста
UBP15
UBP15
UBP15
UBP15
UBP19
UBP19
Растения дикого типа Арабидопсиса Таля, использованные в этом исследовании, были Columbia-0 экотипа. Инсерционные линии 38 Т-ДНК (включая ubp15-1, ubp15-2 и ubp19-1 эти три линии с наблюдаемыми фенотипами), приведенные в Таблице 1, были получены из коллекции SALK. UBP15 (или UBP15C447A/S)-сверхэкспрессирующие трансгенные растения были получены путем трансформации P:UBP15 (или P:UBP15C447A/S) в генетическое окружение дикого типа. UBP15 комплементарные (или UBP15C447A/S) трансгенные растения были получены путем трансформации P:UBP15 (или P:UBP15C447A/S) в ubp15-1 генетическое окружение. P:GUS трансгенные растения были получены путем трансформации P:GUS конструкции в генетическое окружение дикого типа. ubp15 ubp16, ubp15 ubp17 и ubp16 ubp17 двойные мутанты были получены путем скрещивания ubp15-1 (или ubp15-2) с ubp16-1 или ubp17-1, или путем скрещивания ubp16-1 с ubp17-1; гомозиготы поколения F2 были подтверждены ПЦР анализом. Тройные мутанты ubp15 ubp16 ubp17 были получены путем скрещивания ubp15 с двойными мутантами ubp16 ubp17; гомозиготы поколения F2 были подтверждены ПЦР анализом.
Семена были поверхностно стерилизованы 15% (об./об.) NaOCl. После 48 часов при 4°С яровизации семена были помещены на чашки с 1× кратной средой Мурасиге-Скуга (MS) (содержащие 1% сахарозу и 0,3% Phytagel) и помещены в инкубатор при 22°С в условиях непрерывного освещения на 7 дней перед переносом в грунт. Затем растения росли в условиях стандартного дня (16 часов света/8 часов темноты) в вегетационных домиках. Семена, выращенные в условиях короткого дня (78 часов света/16 часов темноты), были высеяны в грунт и выращены в вегетационных домиках в условиях короткого дня.
2. Выравнивание линейных последовательностей и филогенетический анализ
Поиск общих доменов среди 27 белков UBP был выполнен с помощью TAIR и NCBI CDART. Консервативные домены в каждом белке были объединены путем удаления вариабельных участков и выравниванием фрагментов с использованием ClustalW (Thompson et al., 1994) с последующим выравниванием вручную.
Филогенетическое дерево строилось с помощью программы MAGA версия 3.1 (Kumar et al., 2004) на основе консервативных позиций в линейной последовательности с использованием алгоритма объединения соседей с "bootstrap" анализом 1000 репликантов.
3. Измерение длины саженцев, корней, стручка и ширины и длины листьев розетки
Для получения длины корней рассады дикий тип, ubp15-1 и ubp15-2 были выращены вертикально на чашках. Была измерена длина корней 20 случайно выбранных саженцев либо дикого типа, либо мутантов. Были измерены 20 случайно выбранных зрелых стручков (старше 8 дней после опыления) дикого типа или мутантов. Зрелые листья розетки дикого типа или ubp15-1 с первого до последнего настоящего листа были отрезаны и измерена ширина и длина листьев.
4. Измерение времени цветения и количество листьев в розетке
Время цветения дикого типа, ubp15-1, UBP15-сверхэкспрессирующие линии измеряли как число дней от прорастания семени до раскрытия первого цветка. Количество листьев в розетке считали во время стрелкования.
5. Выделение РНК и ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР
-
РНК выделяли с помощью тризола (Invitrogen). Перед выполнением ОТ-ПЦР, 4 мкг РНК обработали РНК-свободной ДНКазой (Premega) для предотвращения контаминации ДНК, с последующей экстракцией хлороформ:фенолом (1:1) для предотвращения влияния ионов. Часть РНК затем использовали для ПЦР с At3g04120/GAPDH праймерами для подтверждения отсутствия ДНК. Оставшийся образец был подвергнут реакции обратной транскрипции с использованием набора Superscript™ II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen) и случайных праймеров. Реакционную смесь развели в 10 раз и 1 мкл был подвергнут ПЦР с использованием rTaq ДНК полимеразы (TaKaRa). At3g04120/G4PDH использовали как внутренний контроль. Линейность ПЦР реакции контролировали путем сравнения относительных количеств продуктов ПЦР через 22, 30 и 35 циклов. Последовательности прямых и обратных праймеров, использованных для определения транскриптов генов, были следующие At3g04120/GAPDH, 5'-CACTTGAAGGGTGGTGCCAAG-3' и 5'-CCTGTTGTCGCCAACGAAGTC-3'; UBP15, 5'-TCGAGAGGCAACAGTTATGCTG-3' и 5'-CTCAGGCCTCCAGTAACTGTAAGTTCTATCCTG-3'.
6. Блотт-анализ РНК в геле
+
Блотт РНК выполняли, как описано ранее (Yang et al., 2005). Выделяли общую РНК из различных участков листьев, и 20 мкг общей РНК каждого выделения разделяли на агарозном геле, переносили на мембрану Hybond-N (Amersham Biosciences) и гибридизовали с UBP15-специфичным зондом. В качестве контроля нагрузки использовали 18S рРНК. Праймеры были следующие: UBP15, 5'-TCGAGAGGCAACAGTTATGCTG-3' и 5'-CTCAGGCCTCCAGTAACTGTAAGTTCTATCCTG-3'.
7. Временная экспрессия в эпидермальных клетках лука
Процедуру временной экспрессии в эпидермальных клетках живого лука (Allium сера) с использованием бомбардировки частицами выполняли, как описано (Ang et al., 1998). После бомбардировки слои клеток лука инкубировали 24 часа при 22°С на свету. Слои клеток затем исследовали с помощью конфокальной микроскопии.
8. Создание трансгенных линий
UEP15
UBP15
Для получения растений с UBP15-сверхэкпрессией и UBP15 комплементарных растений фрагмент промотора UBP15, полученный HindIII/Xbal-расщеплением (1,8 kb выше ATG), и фрагмент XbaI/StuI UBP15 CDS (2,8 kb) были вставлены в бинарный вектор pCAMBIA1300. Полученная в результате конструкция была затем трансформирована в дикий тип и ubp15-1 посредством трансформации, с помощью агробактерий. Конструкции с мутацией по Cys сайту P:UBP15C447A и P:UBP15C447S были получены аналогичным путем и трансформированы в дикий тип и ubp15-1. Трансгенные растения отбирали с помощью гидромицина (20 мкг/мл; Roche) на MS чашках.
Для создания 35S:GFP-UBP15 (или 35S:UBP15-GFP) конструкций, 35S, так же как GFP-сшитый полноразмерный UBP15 CDS (или полноразмерный UBP15 CDS сшитый с GFP), были субклонированы в XbaI/SphI сайты вектора pCAMBIA1300.
Для определения тканевого паттерна экспрессии UBP19 использовали окрашивание GUS, BamHI/KpnI фрагменты промотора UBP19 (1,2 kb) были вставлены в pCAMBIA1381Z и трансформированы в окружение дикого типа посредством трансформации с помощью агробактерий. Трансгенные линии отбирали с помощью гидромицина (20 мкг/мл; Roche).
9. Тест активности DUB In vitro
Способность UBP15 расщеплять убиквитин, связанный через α-амино связь, был выполнен в E. coli, с использованием his-меченных субстратов полиубиквитина UBQ10 и убиквитинилированным белком UBQ1. Каждый из двух α-амино субстратов (UBQ1 в рЕТ28а и UBQ10 в pACYCDuet-1) были ко-экспрессированы либо с GST, либо с GST-UBP15, либо с GST-UBP15C447A/S в pGEX4T-3 в линии Е. coll. NovaBlue (DE3) при стандартных условиях (индукция при 22°С) (Novagen). Лизаты анализировали Вестерн-блоттом с антиубиквитин антителами (Sigma) или анти-his антителами (Sigma). Для определения использовали ECL хемилюминесцентную систему (Amersham).
10. Фиксация ткани и парафинирование для гистологических срезов
2
2
Для наблюдения поперечной структуры образцы были зафиксированы более чем на 24 часа в FAA (50% этанол, 5% уксусная кислота и 5% формальдегид) при комнатной температуре, обезвоженные в ступенчатых сериях смеси HO:95% спирта:третбутиловый спирт (4:5:1, 3:5:2, 1.5:5:3.5, 0:5:5, 0:2.5:7.5, 100% третбутиловый спирт дважды) с 2-часовой инкубацией в каждом растворе и затем пропитывали, постепенно добавляя парафин (третбутиловый спирт:парафин как 3:1, 2:2, 1:3, 0:4, 0:4). Парафинированные ткани были разрезаны на 8 мкм срезы с помощью цитохрома (Leica RM2255). Срезы поместили на покрытые поли-L лизином предметные стекла, депарафинированы и регидратированы с помощью этаноловых серий (этанол:NO как 1:0, 1:0, 9.5:0.5, 9:1, 8:2, 7:3, и 1:1) с 5-минутной инкубацией в каждом растворе. Срезы затем были окрашены 1% сафранином О и 0,02% зеленым прочным. Покровные стекла были прикреплены на предметные стекла смолой. Количество адаксиальных эпидермальных и столбчатых клеток подсчитывали под микроскопом.
11. Анализ на микропанелях и количественная ОТ-ПЦР
3
Процедуры, использованные в экспериментах на микропанелях, и анализ данных были описаны ранее (Ма et al., 2002). Рано появившиеся 9-е листья розетки дикого типа и ubp15-1 были использованы в качестве образцов. Общую РНК выделяли с помощью реагента RNAwiz (Ambion) и очищали набором RNeasy (Qiagen). Для каждого образца, 50 мкг общей РНК метили аминоаллил-dUTP (aa-dUTP, Sigma-Aldrich) с помощью обратной транскрипции. кДНК, меченные аминоаллил-dUTP, были очищены с помощью фильтра Microcon YM-30 (Millipore) и ресуспендированы в 0,1 М NaHCO. Очищенные кДНК затем были флуоресцентно мечены путем конъюгирования монофункциональных красителей Cy3 или Cy5 (Amersham) с аминоаллил функциональными группами. Попарное комбинирование двух выбранных образцов использовали для одновременного исследования одного предметного стекла, и были выполнены четыре независимых биологических повтора (два повтора со сменой красок). Гибридизированные покровные стекла сканировали сканером GenePix 4000B (Axon), и независимые TIFF изображения для Cy3 и Cy5 каналов использовали для последующего анализа программным обеспечением GenePix Pro 5.0.
Для подтверждения результатов на микропанелях, была проведена ПЦР в реальном времени с использованием мастер смеси ABI SYBR Green PCR в объеме 20 мкл на системе ABI 7900. ПЦР смесь состояла из 0,3 мкл кДНК, 0,6 мкл праймеров и 4-кратной мастер смеси. В каждой ПЦР в реальном времени в качестве внутреннего контроля использовали At1g42970/GAPDH для нормализации разбросов в количестве матрицы кДНК. Результаты теста подтвердили, что это конститутивно экспрессированный ген.
Последовательности праймеров были следующие: At1g42970/GAPDH, 5'-TCTTTCCCTGCTCAATGCTCCTC-3' и 5'-TTTCGCCACTGTCTCTC СТСТААС-3'. 7 подавленных генов и 2 активированных гена были отобраны с помощью теста количественной ОТ-ПЦР. Праймеры, использованные для определения количества этих генов, были At1g71030/MYB, 5'-CATTTGCCTGACCTAAACATTG-3' и 5'-AAGCGTTTCTTGACCTGTTGA-3'; At5g57660/TRANSCRIPT FACTOR, 5'-GGCTCATCCACCACCGTT-3' и 5'-GGGAGAGGCTCTGTTTTCGTC-3'; At5g67030/ABA1, 5'-GGGCTTGGTCCTCTGTCTT-3' и 5-GTGAGTCTGCAACTAGGTGGC3'; M5g35970/HELICASE-LIKE, 5'-CCACAGGGCTCGGAGGTAT-3' и 5'-TCGTAAGTAAGGGCATCGGC-3'; At3g49160/PYRWATE KINASE FAMILY PROTEIN, 5'-TCCAGCAGGTCTCACATAAACAA-3' и 5'-CTGCTGCTAAGAGATGTGACCG-3'; WQ73480/HYDROLASE, 5'-AATGGCGGTGGAAACAATG-3' и 5'-ACGACGCGAAACGGAAGGAG-3'; At5g24470MPW?5, 5-TACCCTACGCCAACCCCTAT-3' и 5'-ATGTGATTGCCTATTGCACTATGT-3'; At3g20810/TRANSCRIPTION FACTOR, 5'-CCTCAATGCTGTTGCTGGTAA-3' и 5'-TGGGCAAGATAAGTAGGCTCC-3'; At4g21990MPR3, 5'-CTGTCAACACGCTTCACGC-3' и 5'-TCTTTCCGGTTCTCTAACTTCATC-3'. Для определения специфичности этих праймеров, амплифицированные продукты были подвергнуты анализу кривой плавления с использованием стандартного машинного метода. Условия циклов были следующие: 2 мин 50°С, 10 мин 95°С, 40 циклов по 15 с при 95°С, 30 с 60°С и 1 мин 72°С. Полученные значения были средними из шести независимых опытов (два биологических повтора и три технических повтора). Относительные уровни экспрессии были вычислены следующим образом. Уровни транскрипции этих генов были нормализованы относительно Стандарта (GAPDH) с помощью формулы
T
T(ген X) посредством технических повторов
T(GAPDH) посредством технических повторов
ΔC=C-C или в диком типе, или в ubp15-1. Затем были получены ΔCt (дикий тип) и ΔCt (ubp15-1) каждого гена. Дикий тип использовали в качестве стандарта для сравнения уровней экспрессии. Относительный уровень экспрессии затем был подсчитан с помощью уравнения 2
[ΔCT (ubp 15-1)
ΔСТ
(дикий тип)]
-.
Т
Далее было подсчитано среднее значение С 2-х биологических повторов.
12. Определение активности GUS
UBP19
P:GUS трансгенные линии были выращены на MS чашках. Рассаду осторожно промыли 100 мМ натрий фосфатным буфером, рН 7,0, и затем красили 4 часа при 37°С в 2 мМ Х-глюкорониде, разведенном в 0,1 мМ ферроцианиде калия, 0,1 мМ ферроцианиде калия, 10% Тритон Х-100, 100 мкг/мл хлорамфеникола и 500 мМ натрий фосфатном буфере, рН 7,0 (Weigel and GIazebrook, 2002; Byrne et al., 2003). Затем ткани отмывали в 100 мМ натрий фосфатном буфере с последующей обработкой 95% и 70% этанолом при комнатной температуре. Микроскопию осуществляли на диссекционном микроскопе (Leica MZFLIII) с 10х объективом, и изображения были сняты цифровой камерой Canon (Power Shot S70).
13. Номера образцов
Идентификаторы инициативных локусов генома Арабидопсис (Arabidopsis Genome Initiative locus) для генов, упомянутых в этой статье, перечислены в Таблице 1.
14. Гены UBP проявили не одинаковые профили экспрессии
Для получения паттернов экспрессии генов UBP было изучено покрытие ранее описанным тестом на микропанелях 18 различных органов Арабидопсис, включая стеблевые листья, листья розетки, пестик за день до опыления, пестик через день после опыления, стручок через 3 дня после опыления, стручок через 8 дней после опыления, стебель, чашелистик, тычинка, лепесток, семя, культивированная клетка, темный корень, светлый корень, гипокотиль темный, гипокотиль светлый, семядоля темная и семядоля светлая (Ма et al., 2005; Дополнительная Таблица 1). В этом описанном исследовании, 24 из 27 генов UBP были покрыты использованной микропанелью, и экспрессия всех 24 генов была определена в одной или более тканях. Среди этих 24 генов UBP9 и UBP10 оказались, по сути, идентичны, и их олигонуклеотидные зонды перекрестно гибридизовались друг с другом, таким образом, непозволяя окончательно определить экспрессию обоих генов. Экспрессия трех генов, не покрытых этой микропанелью, UBP13, UBP14 и UBP20, была описана в предварительном исследовании (Yan et al., 2000). Как типовой случай, профили тканеспецифичной экспрессии для 5 генов подсемейства UBP15 представлены в Дополнительной Фиг.2. 5 генов имеют разные профили экспрессии.
15. Выделение полного генома и анализ Т-ДНК инсерционных мутантов генов UBP
В качестве первого шага функционального анализа семейства генов была проанализирована база данных Ресурсного Центра Арабидопсис Северной Америки (the North America Arabidopsis Resource Center database) на все доступные Т-ДНК инсерционные линии для членов семейства генов UBP. Всего 38 Т-ДНК инсерционных линий, соответствующих 25 генам UBP, были получены и проверены, как суммарно показано в Таблице 1, с локализацией места вставки Т-ДНК для каждой линии. После генотипирования с помощью ПЦР, были сконструированы прямой и обратные праймеры (Дополнительная Таблица 2). Изучение возможных фенотипов этих отдельных гомозиготных мутантных линий показало, что только 5 мутантных линий с потерей функции в 3 генах из 2 подсемейств проявляют видимые фенотипы (Таблица 1). Два независимых Т-ДНК аллелей UBP14 проявляли рецессивную летальность эмбриона, похожую на ранее описанную (Doelling et al., 2001). Другие три мутантные линии, принадлежащие подсемейству UBP15, с двумя аллелями UBP15, проявляли фенотип морфологии листа, и один аллель UBP19 проявлял летальность эмбриона. 5 генов в этом подсемействе были ранее охарактеризованы и поэтому были отобраны для детального анализа.
Был проведен поиск гомологичных генов подсемейства АtUР15 в рисе (priza Sativa) для выяснения, имеют ли они аналогичные функции. Были найдены четыре гена с высоким уровнем сходства, и были сравнены их первичные последовательности с 5 генами подсемейства AtUBP15. Полученное в результате филогенетическое дерево показано на Дополнительной Фиг.3. Один из генов риса был даже более схож с AtUBP15, чем другие гены Арабидопсис.
16. Два мутантных аллеля ubp15 проявляются в схожих дефектах развития листа
Две Т-ДНК инсерционные линий для UBP15, Salk_018601 и Salk_015611, названные ubp15-1 и ubp15-2, были идентифицированы в коллекции Salk и имели вставки Т-ДНК в 12-й и 8-й экзоны гена UBP15 соответственно (Фиг.2А). Полуколичественный ОТ-ПЦР показал, что ни в одном из двух мутантов не может быть определен уровень экспрессии мРНК (Фиг.2В), что означает, что оба аллеля нулевые. Обе линии при расщеплении давали единственный, рецессивный признак по Менделю (описанный ниже), схожий друг с другом, ко-расщепляемый с Т-ДНК, что указывает на то, что признак был вызван единичной вставкой в UBP15. По сравнению с диким типом, оба мутанта давали более мелкие растения и узкие, зубчатые листья с более выраженным фенотипом листа в поздних листьях розетки (Фиг.2С). Мутанты также проявляли более короткие корни на стадии рассады (Фиг.2D), более мелкие цветы (Фиг.2Е), более короткие стручки (Фиг.2F), так же как и более короткие и тонкие стебли. Эти морфометрические изменения (длина стручка, длина корня, длина основного стебля и диаметр основного стебля) суммированы в Таблице 2. Далее была проанализирована морфология листьев розетки с использованием ubp15-1. Листья розетки дикого типа Арабидопсис, выращенные в условиях длинного дня (16 ч света/8 ч темноты), постепенно изменяют свой общий рисунок, начиная с круглых и плоских настоящих листьев, постепенно становятся более овальной формы и немного закрученными вниз, в итоге становясь длинными и с выраженным закрученным вниз краем. В то время как листья розетки у мутантов ubp15-1 более плоские даже в более поздней стадии, и постоянно образуется меньше листьев в розетке (10,8 против 12,6 дикого типа) до стрелкования (Фиг.2С). Соотношение длины и ширины ubp15-1 и дикого типа было отображено на графике, и определено как значение индекса листа (Tsukaya, 2006), и выявило значительно более сильное уменьшение ширины, чем длины листовой пластинки листьев розетки у мутантов (Фиг.2G). Напротив, стеблевые листья ubp15-1 не показали какой-либо видимой разницы в сравнении с диким типом.
В соответствии с уменьшением количества вегетативных листьев, ubp15-1 также проявляет фенотип раннего цветения, с средним сроком цветения 39,1 (±2,02) дней против 41,5 (±3,79) дней дикого типа (Таблица 2). Даже в условиях короткого дня (8 ч света/16 ч темноты), ubp15-1 также цвел немного раньше (Таблица 2). Также было отмечено, что листья розетки ubp15-1 имели меньший вес (Таблица 2) и были тоньше, предполагая изменение клеточной структуры.
17. UBP15 имеет высокий уровень экспрессии в листьях розетки и репродуктивных тканях и локализован и в цитозоле, и в ядре
Наличие дефектов в листьях розетки и цветках у ubp15-1 предполагает вовлеченность UBP15 в регуляцию вегетативного и репродуктивного развития. Для подтверждения этого и для проверки ранее проведенного анализа на микропанелях, был использован полуколичественный ОТ-ПЦР для изучения тканеспецифичной экспрессии UBP15. Как показано на Фиг.3А, уровень мРНК UBP15 был сильно аккумулирован в листьях розетки и соцветиях, в то время как мало было в корнях, стручках и семядолях, средний уровень в стебле и стеблевых листьях. Этот паттерн экспрессии в значительной степени согласуется с данными анализа на микропанели (Дополнительная Таблица 1 и Дополнительная Фиг.2).
Далее был исследован пространственный паттерн экспрессии UBP15 в листьях розетки. Как на Фиг.3В, были выбраны листья розетки на ранних, средних и поздних стадиях и разрезаны в областях центра и края для выделения РНК отдельно из каждой области (Фиг.3В верхняя часть, показано черными линиями) и проведения Блотт-анализа (Фиг.3В, низ). Уровень мРНК UBP15 увеличивается от ранних листьев к поздним листьям, вместе с более очевидным высоким уровнем экспрессии в краях листа в поздней стадии. Этот паттерн экспрессии в листьях в процессе развития согласуется с ролью UBP15 в определении формы листа и очертаний краев, таких как зазубренность и закрученность.
Для изучения внутриклеточного распределения UBP15, конструкции, содержащие либо 35S:GFP-UBP15, или 35S:UBP15-GFP, были трансформированы в эпидермальные клетки лука. Временная экспрессия показала, что слитый белок присутствует повсеместно и в цитозоле, и в ядре, и результат экспрессии 35S:GFP-UBP15 показан на Фиг.3С.
18. UBP15 обладает деубиквитинилирущей активностью in vitro и эта биохимическая активность необходима для функции in vivo
447
447
Для проверки того, является ли UBP15 настоящим деубиквитинилирующим ферментом, UBP15, так же как две мутантные формы (изменен остаток Цистеина в консервативном каталитическом центре на Аланин или Серин), были ко-экспрессированы как GST слитые белки в Е. coli. His меченные полиубиквитинилированные белки UBQ1 или UBQ10 были использованы в качестве субстратов для теста in vitro на деубиквитинилирующую (DUB) активность рекомбинантного GST-UBP15 белка дикого типа или мутантной формы белков. Иммуноблотт-анализ с антителами к убиквитину показал, что UBP15 способен расщеплять два субстрата и что Цистеине необходим для DUB активности (Фиг.4А и 4В соответственно).
447
Чтобы проверить степень необходимости DUB активности UBP15 в развитии растения, мы ввели дикий тип UBP15 и две его Цистеинмутантные формы под контроль нативного промотора UBP15 в дикий тип Арабидопсис и в генетическое окружение ubp15-1 посредством трансформации с помощью агробактерий. Для трансгенных линий с генетическим окружением дикого типа мы получили всего 36 независимых растений То поколения для трансгенов UBP15 дикого типа. Половина линий (18 из 36) не проявили никаких фенотипических изменений, в то время как другая половина показала интересные отличия от дикого типа, противоположные фенотипам мутантов ubp15 (Фиг.4С, слева посередине). Для тех линий с трансгенами дикого типа в генетическом окружении ubp15-1, 5 независимых линий показали фенотип дикого типа (Фиг.4С, справа посередине), таким образом, функционально компенсировав мутантный дефект. Блот-анализ РНК в геле двух репрезентативных линий из каждой группы (Фиг.4D) показал, что высокий уровень экспрессии трансгена в генетическом окружении дикого типа отвечал за ненормальный фенотип, противоположный мутанту ubp15-1, в то время как уровень экспрессии, схожий с экспрессией эндогенного гена, приводит к удалению мутантного фенотипа в ubp15-1 и не приводит к изменению фенотипа в генетическом окружении дикого типа. Там, где трансген дикого типа не смог удалить мутантный фенотип ubp15-1, в этих трансгенных линиях экспрессировался только усеченный вариант мРНК ubp15 и не экспрессировалась мРНК дикого типа.
Введение UBP15C447A или UBP15C447S мутантных трансгенов под контроль нативного промотора UBP15 в диком типе и ubp15-1 не вызвало сверхпроявления фенотипа в генетическом окружении дикого типа и комплементации мутантного фенотипа в генетическом окружении ubp15-1, в то время как блотт-анализ РНК в геле показал нормальный или даже повышенный уровень экспрессии мутантных генов (Фиг.4С и 4Е). Напротив, некоторые линии с UBP15C447A в диком типе показали фенотип, схожий с мутантом ubp15-1 (Фиг.4С, слева внизу, и 4Е), который был противоположен UPB15-сверхэекспрессии в генетическом окружении дикого типа, как произошло в трансгенных линиях дикого типа со сверхэкспрессией UBP15C447S (данные не приведены). Те линии, которые имели тенденцию к высокому уровню экспрессии мутантного трансгена, вероятно вызвали доминантную негативную интерференцию функции эндогенного белка. Эти результаты означают, что активность DUB является необходимой для функционирования UBP15 in vivo.
19. Сверхэкспрессия UBP15 демонстрирует фенотипы, противоположные мутантам ubp15-1
Далее мы исследовали фенотипы линий со сверхэкспрессией UBP15 (трансгены дикого типа в генетическом окружении дикого типа), описанных выше. Один очевидный фенотип это большой общий статус растений, так же как каждого листа розетки. Листья розетки этих линий со сверхэкспрессией были более круглые, чем дикого типа, начиная с очень ранних стадий, и были сильно закручены вниз в середине поздней стадии (Фиг.4С, слева и посередине). Листья розетки позднего развития, такие как девятый лист розетки, были не только закручены вниз, но также иногда демонстрировали утолщение в области верхушки листа (стрелка на Фиг.5В, сравнение 5А и 5В), возможно вызванное неравномерной пролиферацией клеток в различных областях листа. Кроме того, линии со сверхэкспрессией UBP15 были также поздноцветущими с большим количеством листьев в розетке (16,2) до стрелкования, чем в диком типе, и с задержкой во времени цветения при условии длинного светового дня (Таблица 2). В линиях со сверхэкспрессией UBP15 был также увеличен вес свежих листьев розетки на единицу площади по сравнению с диким типом (Таблица 2).
У линий со сверхэкспрессией UBP15 был также выраженный фенотип цветов. В сравнении с диким типом линии со сверхэкспрессией UBP15 проявляли более крупные цветки (сравните Фиг.5I и 5J) с высокой долей аномального количества лепестков и тычинок (91,3%, 40 из 46 в одном растении) в ранних цветах (Фиг.5С и 5D, 5Е, 5К). Однако это аномальный паттерн цветков был менее частый в поздних цветах. Также линии со сверхэкспрессией имели более крупные стручки, чем у дикого типа (Фиг.5L), в противоположность мутантам ubp15-1. Аномальности цветка и стручка не влияли на фертильность, не считая крайних случаев, когда повреждения органов размножения предотвращали опыление (Фиг.5Н и 5М). Было видно усиление апикального доминирования в линиях со сверхэкспрессией по сравнению с уменьшением апикального доминирования в мутантах ubp15 (Таблица 2 и Дополнительная Фиг.4). В некоторых крайних случаях растений со сверхэкспрессией UBP15, позиции ожидаемых вторичных стрелок только в главной стрелке переродились в цветки, но не в стручки (Фиг.5G) в отличие от дикого типа (Фиг.5Р).
ubp15
20. Мутанты с потерей функции  и растения со сверхэкспрессией UBP15 проявляли противоположные аномалии в пролиферации клеток листа
Для продолжения оценки роли UBP15 в развитии листьев в Арабидопсис, сравнили морфогенетический паттерн всех листьев, от семядолей, настоящих листьев, до стеблевых листьев из мутантов с потерей функции, растений со сверхэкспрессией и дикого типа. Как показано на Фиг.6А, растения дикого типа имеют около 11 листьев в розетке, в то время как оба мутанта ubp15 имеют около 9 листьев в розетке. Напротив, линии со сверхэкспрессией UBP15 производят около 14 листьев в розетке. Листья в розетке обоих мутантов были узкие, зазубренные и плоские, но в растениях со сверхэкспрессией UBP15 были более круглые в ранних листьях и более закрученные вниз в поздних листьях. Среди оцененных линий не проявлялось видимой разницы в стеблевых листьях, за исключением двух мутантов, имевших слегка более узкие листья.
Для изучения причин малых размеров растении и узкой листовой пластины мутантов ubp15 на клеточном уровне, были сравнены поперечные сечения листьев мутантов, так же как линий со сверхэкспрессией UBP15 с растениями дикого типа. Рисунок справа на Фиг.6В иллюстрирует места типичных разрезов, сделанных и проанализированных по стандартной методике, которые были в середине листа. Рисунок слева на Фиг.5В модель разреза в середине листа дикого типа. Шесть листьев (листья с нечетными номерами на Фиг.6А) были выбраны для измерений от первой семядоли до первого, третьего, пятого, девятого настоящего листа и первого выросшего стеблевого листа. Настоящие листья после девятого листа не включали для достижения единообразия, потому что два мутанта образовывали только 9~10 настоящих листьев. Было подсчитано под микроскопом количество адаксиальных эпидермальных клеток и столбчатых клеток в серии разрезов в каждой линии (3~4).
Для адаксиальных эпидермальных клеток количество клеток в каждом листе для каждой линии показано на Фиг.6С. На начальном этапе развития листьев, количество адаксиальных эпидермальных клеток поперек листовой пластины было схоже среди этих линий и составляло ~30 клеток в семядоле каждой линии, но различие увеличилось с развитием листьев, и серьезное различие было в девятом листе розетки, где количество клеток поперек листовой пластины составило ~290 в диком типе, ~180 в двух мутантах (уменьшено на ~40%) и ~400 в линии со сверхэкспрессией UBP15 (увеличено на ~40%). Это согласуется с наблюдаемым фенотипом, где различия становятся заметны на поздних стадиях развития. Количество адаксиальных эпидермальных клеток стеблевого листа было выше, чем в любых листьях розетки. Это возможно может быть вызвано более высокой плотностью в количестве адаксиальных эпидермальных клеток поперек стеблевого листа. Схожие результаты были получены при измерении количества столбчатых клеток (Дополнительная Фиг.5). Мутация в UBP15 дает уменьшение в количестве адаксиальных эпидермальных и столбчатых клеток в латеральном направлении, в то время как сверхэкспрессия UBP15 приводит к обратному.
21. UBP15 в Арабидопсис вовлечен в организацию клеточных слоев листа
Для расширения сведений о изменении количества клеток были изучены структуры клеток листьев этих линий. Основываясь на результатах того, что листья розетки позднего развития проявляют выраженный фенотип, полностью раскрывшийся девятый лист розетки был выбран для сравнения клеточной структуры поперечного сечения в срединной части листа разных линий (Фиг.6В). На Фиг.7А слева первым показан дикий тип, лист имеет организованную внутреннюю структуру, содержащую слой вертикально упакованных столбчатых клеток под адаксиальной поверхностью, и ~4 слоя клеток губчатой паренхимы, вперемежку с воздушным пространством, были свободно расположены ниже слоя столбчатых клеток. ubp15-1 и ubp15-2 также проявляли схожую структуру, но количество слоев губчатых клеток в мутантах было меньше, чем в диком типе, тогда как их было больше в линиях со сверхэкспрессией UBP15 (Фиг.7А слева со второго по четвертый). В диком типе было в среднем ~4 слоя губчатых клеток, но в двух мутантах было ~3 слоя губчатых клеток, тогда как в линиях со сверхэкспрессией UBP15 количество слоев губчатых клеток достигало ~5. Дефекты в структуре слоев клеток в ubp15-1 были компенсированы экспрессией соответствующим ему диким типом UBP15, подтверждая этим, что фенотип ubp15-1 был вызван прямым нарушением гена UBP15 (данные не приведены). Эти результаты согласуются с результатами измерения веса свежих листьев, где меньший вес соответствует меньшему количеству клеточных слоев (Таблица 2), больший вес результат большего количества слоев (смотри выше). Было обнаружено небольшое увеличение размера клеток у мутантов, предполагая частичную компенсацию в потере количества клеток.
Также были сравнены структура срединной жилки и периферийная структура этих линий. Сосудистый пучок дикого типа был составлен из нескольких слоев ксилемы и флоэмы, окруженных слоями паренхимальных клеток (Фиг.7В, первый слева). Напротив, два мутанта показали уменьшение толщины. Сосудистый пучок двух мутантов был тоньше, чем в диком типе, за счет уменьшения количества клеток в ксилеме и флоэме. Кроме того, количество паренхимальных клеток вокруг сосудистых пучков двух мутантов было также уменьшено. В линии со сверхэкспрессией UBP15 были получены противоположные результаты, показывая развитый сосудистый пучок, сильный и в ксилеме, и в флоэме (Фиг.7В, слева со второго по четвертый).
22. Анализ транскриптоном показал влияние UBP15 на уровень экспрессии 804 генов (достоверность Р<0,15)
Для изучения влияния на клеточные циклы в ubp15-1 и изучения возможной роли UBP15 в регуляции транскрипции других генов, мы выполнили тест на микропанелях для широкого геномного анализа экспрессии в только что появившемся девятом листе розетки. Анализ на микропанелях также подтвердил отсутствие экспрессии мРНК UBP15 в ubp15-1 (Дополнительная Таблица 3). Статистический анализ показал, что всего 804 из 20000 генов экспрессировались по-разному в ubp15-1 в сравнении с диким типом с достоверностью Р<0,15 (4% экспрессируемых генов), среди которых 406 (50,5%) были активированы и 398 (49,5%) были ингибированы с разбросом кратности изменения экспрессии от 1,72 до 8,35 и 0,09 до 0,56 соответственно (Дополнительная Таблица 3). Для подтверждения тренда, полученного при анализе транскриптомов, мы выбрали случайным образом 9 генов, из которых 7 ингибировались и 2 активировались, и провели ПЦР в реальном времени. Уровни экспрессии этих генов соответствовали результатам, полученным при анализе на микропанелях, на 100% (Фиг.8), что свидетельствует, что тест на микропанелях был достоверным. At1g42970/GAPDH служил внутренним контролем.
Для изучения вовлеченных биологических процессов, типичные представители тех генов, которые находятся под влиянием мутанта ubp15, были проанализированы с точки зрения онтологии генов (GO) (Maere et al., 2005) (Таблица 3). Два гена, относящихся к клеточному циклу, были экспрессированы по-разному в ubp15-1 (Таблица 3). Так как время цветения также было изменено в ubp15-1, то гены, контролирующие цветение, тоже были в поле внимания. Гомеотический ген цветка CAL, позитивно регулирующий развитие цветка, был активирован в 1,98 раза в генетическом окружении ubp15-1, в то время как другой ген, MAF5, негативно регулирующий развитие цветка, был ингибирован в 0,31 раза (Таблица 3).
Другие категории генов, находящихся под влиянием мутанта ubp15, содержали гены, вовлеченные в биосинтетический метаболизм, биосинтез хлорофилла, фотосинтез, сигнальную трансдукцию, и также содержали большое количество факторов транскрипции (Таблица 3). Таким образов, кроме влияния на некоторые гены, связанные с фенотипом, такие как контролирующие клеточный цикл и цветение, мутант ubp15-1 был в целом дефектным по различным путям метаболизма на уровне транскрипции, что предполагает вторичное и не только первичное влияние на наблюдаемые дефекты роста.
23. UBP15 и UBP16 частично избыточны, но не по отношению к UBP17
UBP16 и UBP17 два близко родственных белка (Фиг.1), что предполагает, что они могут иметь функциональную избыточность. Нокаутные линии этих двух генов (ubp16-1, ubp17-1 и ubp17-2) (Фиг.9А) не проявили выраженного фенотипа. ubp16-1 был скрещен с ubp17-1 или ubp17-2 для изучения возможных дефектов в двойных мутантах. Гомозиготы F2 поколения скрещенных линий не показали заметного фенотипа, указывая на то, что возможно наличие других избыточных белков. В дальнейшем были скрещены мутанты ubp15 с двойными мутантами ubp16 ubp17. В F2 поколении, были получены три генетических типа двойных мутантов ubp15 ubp16, ubp15 ubp17 и ubp16 ubp17, так же как тройные мутанты ubp15 ubp16 ubp17 (Фиг.9В и 9С, ubp16 ubp17 не показаны). Двойные мутанты ubp15 ubp16 проявили схожий, но более выраженный фенотип с мутантом ubp15, указывая, что может быть функциональная избыточность этих двух генов, ubp15 ubp16 проявлялись в карликовости растений и абортивных стручках, листьях розетки, которые были уже, чем у мутантов ubp15 (Фиг.9С). Было также заметно изменение на клеточном уровне, только 2 слоя губчатых клеток (Фиг.7А, первый справа) и удивительно вырожденный сосудистый пучок (Фиг.7В, первый справа). В случае девятого листа, количество адаксиальных эпидермальных клеток в разрезе листовой пластины уменьшилось на 60% по сравнению с диким типом (Дополнительная Фиг.6), так же как количество столбчатых клеток (данные не показаны). Напротив, ubp15 ubp17 усилил дефекты мутантов ubp15, предполагая, что эти два гена могут быть задействованы в двух различных путях регуляции клеточных функций. Тройной мутант ubp15 ubp16 ubp17 был похож на двойной мутант ubp15 ubp16, дополнительно подтверждая, что UBP17 вовлечен в другой путь регуляции, чем UBP15 и UBP16, не смотря на высокий уровень гомологии с последовательностью UBP16.
Данные свидетельствуют о том, что мутация в UBP15 нарушает развитие листьев розетки, и этот эффект был более заметным в сочетании с UBP16. Влияние UBP16 было заметно только в присутствии UBP15. Не наблюдалось заметного эффекта мутации UBP17 на этот процесс. Эти результаты показывают, что UBP15 является основным регулятором формы листьев розетки и развития в целом растений. UBP16 также вовлечен в эти процессы, хотя его вклад менее значителен, чем вклад UBP15.
24. UBP19 может быть вовлечен в развитие эмбриона, в то время как функция UBP18 не известна
На Фиг.9А показана структура генов UBP18 и UBP19 в двух Т-ДНК мутантах каждая. ubp19-1, со вставкой Т-ДНК в 5'UTR участке 195 п.о. выше ATG, проявлял рецессивную летальность эмбриона, с ~1/4 (13/47) абортивных эмбрионов в одном гетерозиготном стручке (Фиг.9В, стрелка указывает на желтые эмбрионы). Дальнейший статистический анализ в среднем 10 стручков в каждой гетерозиготной линии показал, что соотношение нормальный:аномальный было ~3:1 (372/136), подтверждая, что это была линия с рецессивной летальностью эмбрионов. Было изучено развитие эмбриона в конкретном гетерозиготном стручке от стадии зрелости обратно до глобулярной стадии. Было установлено, что ubp19-1 останавливает развитие на глобулярной стадии (Фиг.10С).
Поэтому было предположено, что UBP19 вовлечен в раннюю стадию развития эмбриона. Была создана конструкция GUS под управлением 1,2kb промотора UBP19 для трансформации дикого типа и изучения тканевого паттерна экспрессии. Было установлено, что UBP19 экспрессирован повсеместно, включая в целом молодые саженцы, за исключением меристемной области корня (Фиг.11А) (увеличение на Фиг.11А - детальная демонстрация концевого участка корня), в тканях сосудистого пучка и в устьицах зрелых листьев розетке (Фиг.11В), так же как и в соцветиях. Детальное изучение установило, что GUS экспрессируется в чашелистиках и сосудистых тканях чашелистика, также в пыльниках и рыльцах пестика (Фиг.11С). GUS был обнаружен в концевом и базальном участках стручков, но едва в эмбрионах (Фиг.11D).
Другой мутант ubp19, 205bp выше ATG, не показал видимого фенотипа, указывая, что участок между 195bp и 205bp выше ATG является необходимым для функции UBP19.
Ни один из двух мутантов, полученных вставкой в экзон и интрон UBP18, не проявил никакого видимого фенотипа, указывая на возможную функциональную избыточность между UBP18 и другими белками этого семейства.
25. UBP15 вовлечен в развитие листьев розетки
Фенотип ubp15 мутантов и линий со сверхэкспрессией UBP15 предоставил основание для дальнейшего изучения роли этих генов в развитии листьев растения. Оба мутанта ubp15 показали более узкие, зазубренные и плоские листья розетки, в то время как линии со сверхэкспрессией UBP15 воспроизводили противоположный фенотип с круглыми (ранняя стадия развития) и закрученными вниз (поздняя стадия развития) листьями в розетке (Фиг.2А и Фиг.5В). Количество клеток в поперечном сечении (и столбчатых, и адаксиальных эпидермальных клеток поперек листовой пластины) мутантов ubp15 уменьшено, в то время как таковое в линиях со сверхэкспрессией UBP15 сильно увеличено в сравнении с диким типом. Это показывает, что UBP15 изменяет форму листьев за счет пролиферации клеток, возможно путем регулирования белков клеточного цикла. Недавно было установлено, что hub1 проявляется в узких листьях розетки, причиной чего является уменьшение количества клеток, и тест на микропанелях показал, что количество генов, связанных с клеточным циклом и цитокинезом, было изменено (Fleury et al., 2007). В этом исследовании, хотя результаты теста на микропанелях показали, что было только два гена, связанных с измененным клеточным циклом (ICK1 и белок, содержащий Циклин-подобный F бокс домен), их уровень экспрессии согласовывался с уменьшением количества клеток. Листья розетки в мутантах стали плоскими, в то время как они были закручены вниз в линиях со сверхэкспрессией UBP15. Уровень экспрессии UBP15 в листьях розетки увеличивается по краям с развитием растений (Фиг.3В), предполагая, что UBP15 специфично (по меньшей мере, частично) определяет край листьев розетки. Это схоже с iamt1-D, который демонстрирует существенно искривленные фенотипы листьев, вызванные увеличенным уровнем экспрессии гена IAMT1, и, как было установлено тестом на GUS экспрессию, специфически экспрессирован в краях листьев розетки (Qin et al., 2005).
Индекс листа увеличен в мутантах ubp15-1 из-за более узких листьев розетки (хотя длина листа была короче, но менее измененная, что привело к большому показателю индекса листа). Поляризованный рост листовой пластины в направлении ширины листа определяется полярной элонгацией клеток листа или полярной пролиферацией клеток (Tsukaya, 2006). Генами, изменяющими пролиферацию клеток в направлении ширины листа, до настоящего времени являются GIF1 (также называемый AN3) (Kim and Kende, 2004), GRF5 (Horiguchi et al., 2005), и HUB1 (Kim and Kende, 2004; Horiguchi et al., 2005; Fleury et al., 2007). Они все важны для позитивного контроля количества клеток в направлении ширины листа. Мутанты ubp15 имеют измененное количество адаксиальных эпидермальных и столбчатых клеток в направлении ширины листа, но тест на микропанелях не показал никаких изменений в уровне экспрессии GIF1 (AN3), GRF5 или HUB1 в генетическом окружении ubp15-1. Это может быть обусловлено тем, что UBP15 и эти гены вовлечены в разные пути передачи сигнала.
26. Аминокислота цистеин является критически важной для функции UBP15 in vitro и in vivo
447
Тест на ко-экспрессию in vitro показал, что UBP15 является истинной убиквитин специфической протеазой и Cys является критически важным для этой активности. Было установлено, что UBP15 может расщеплять только α-связанные пептиды (полиубиквитин и убиквитинилированный ген) (Фиг.5А), но не ε-связанный изопептид (мультиубиквитиновая цепь, связанная через изопептидную связь) (данные не показаны), предполагая, что это может работать только на α-связанных пептидах или может узнавать только сайт на проксимальном конце цепи субстрата. Сообщалось, что белки UBP3, 4 и 5 содержат сигнал ядерной локализации и был сделан вывод, что они работают только на субстратах, связанных изопептидной связью (Chandler et al., 1997; Rao-Naik et al., 2000). Внутриклеточная локализация UBP15, экспрессированного повсеместно в клетке, позволяет предположить, что этот фермент может узнавать более одного субстрата для выполнения своих разнообразных функций; или он выполняет другие функции в дополнение к деубиквитинилированию.
447
447
447
В этом исследовании мы сначала доказали in vivo функцию Cys UBP15 в развитии листа. В то время как экспрессия конструкции дикого типа UBP15 в ubp15-1 может удалить мутантный фенотип, ни сверхэкспрессия UBP15C447A, ни UBP15C447S не продемонстрировали комплементацию мутантной недостаточности. Это подразумевает, что Цистеин является функциональным остатком UBP15. С другой стороны, трансгенные линии дикого типа, содержащие конструкции с диким типом UBP15, проявлялись закрученными вниз зрелыми листьями розетки, в то время как таковые с конструкциями, содержащими мутацию Cys447Ala или Cys447Ser, продемонстрировали мутантный фенотип ubp15-1. Эти результаты подтверждают, что фенотип листьев розетки был обусловлен сверхэкспрессией UBP15 и что Cys играет критическую роль в этой функции. Это также означает, что именно деубиквитинилирующая активность, а не другие домены (такие как цинковый палец MYND), является причиной анормальности. Недавно установлено, что ген HUB1 (Fleury et al., 2007), Е3 лигаза моноубиквитинилированного Н2В, со схожим с мутантным ubp15 фенотипом, возможно, участвует в том же сигнальном пути, что и UBP15.
Существует также другой результат, трансгенные линии с конструкцией, содержащей UBP15 под 35S промотором в генетическом окружении дикого типа, не показали никакого фенотипа и не могут компенсировать мутантный фенотип (данные не показаны). Это предполагает, что нативный промотор может обеспечивать лучшую пространственную структуру для лучшего выполнения функций эндогенными белками.
27. UBP15 регулирует транскрипцию многих генов
Тест на микропанелях был выполнен для изучения возможной роли UBP15 в регуляции других генов на уровне транскрипции. Было установлено, что два гена, связанных с клеточным циклом, были изменены, что могут быть прямой причиной изменения в количестве клеток в ubp15-1, хотя и не так как HUB1, который изменяет белки клеточного цикла по всему геному (24 гена).
Мы также установили, что два гена, контролирующие цветение, были изменены, и это изменение вызвало наблюдаемый нами фенотип. MAF5 и гомеотический ген цветка CAL противоположно регулируют цветение, оба продемонстрировали изменения в ubp15-1 и стали причиной фенотипа раннего цветения.
Хотя множество других генов было активировано и ингибировано в ubp15-1, кажется, что они являются вторично измененными, а не прямыми целями воздействия.
28. Функциональная избыточность среди членов подсемейства UBP15
Члены подсемейства UBP15 кодируют белки, содержащие домен цинкового пальца MYND. Далее они могут быть разделены на три группы на основе сходства последовательностей. UBP16 и UBP17 имеют 50% аминокислотную идентичность в их двух консервативных доменах, в то время как UBP18 и UBP19 имеют 68% идентичности по всей длине. Но UBP15 менее схож с другими четырьмя (UBP15 с UBP16 имеет 37% сходства в UBP домене и с UBP18 45% сходства по всей длине), и это объясняет ubp15 мутантный фенотип. Чтобы убедиться, что UBP16 и UBP17 имеют функциональную избыточность, два мутанта двух генов были скрещены для получения двойных мутантов. Гомозиготы двойных мутантов не показали никакого фенотипа, что предполагает, что они могут работать в различных сигнальных путях. В дальнейшем, двойной мутант был скрещен с мутантом ubp15, чтобы проверить, будет ли какое-либо изменение. В F2 поколении, только ubp15 ubp16, но не другие, усилил фенотип ubp15 мутантов. Это показывает, что UBP15 и UBP16 могут иметь функциональную избыточность. Тройной мутант ubp15 ubp16 ubp17 проявил схожий с ubp15 ubp16 фенотип. Что предполагает, что UBP17 не вовлечен в функцию, разделяемую другими двумя. С другой стороны, ubp16 мутант не показал никакого видимого фенотипа, но усилил фенотип ubp15 мутантов, что предполагает, что в Арабидопсис UBP15 является основным регулятором этого сигнального пути. Функциональная избыточность также наблюдалась в другом подсемействе UBP1 и UBP2, чьи двойные мутанты, но не мутант каждого гена, были чувствительны к Канаванину (Yan et al., 2000).
Гомология последовательностей UBP18 и UBP19 также подразумевает функциональную избыточность. Тем не менее, только один мутант из четырех (ubp19-1) показал рецессивную летальность эмбриона. Более того, вставка в 195bp выше UBP19 5'UTR вызывает фенотип, в то время как вставка в 205bp выше UBP19 5'UTR не показывает никакого фенотипа. Это предполагает, что участок от 195bp до 205bp выше UBP19 5'UTR является критичным для функции UBP19.
С другой стороны, хотя UBP16 и UBP17 более близки друг к другу, чем к UBP15 по белковой последовательности, проявленный фенотип ubp15 ubp16 близок к мутанту ubp15, предполагая, что UBP16 более близок по функции к UBP15, а не к UBP17. Это также относится к группе UBP18 и UBP19, так как фенотип мог быть определен только в мутанте ubp19, но не в мутантах ubp18. Это показывает, что белки, близкородственные на уровне последовательности, не всегда функционально дублируют друг друга.
Описание фигур
Настоящее изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие Фигуры, на которых:
Фиг.1 - филогенетиечский анализ 27 семейств UBP из Арабидопсис.
Филогенетическое дерево 27 UBP. Длина ветвей дерева пропорциональна дивергенции. 0,1 шкалы представляет 10% изменения. Значения анализа Bootstrap показаны в процентах от ветвлений. 27 белков могут быть разделены на 14 подсемейств, окрашенных в различные цвета, на основании сходства доменов. Множественное выравнивание, примененное для анализа, показано на Дополнительной Фиг.1
Белки с консервативными доменами нанесены на схематическую шкалу. Каждый окрашенный блок представляет домен. Черные линии представляют длину UBP белков, в то время как длина доменов может быть оценена по связывающим черным линиям, аа, аминокислоты; UBP, убиквитинспецифичная протеаза; ZnF, цинковый палец; MYND, миелоидный, Nervy, и DEAF-1; DUSP, домен убиквитинспецифичных протеаз; UBQ, гомологи убиквитина; MATH, меприн и TRAF гомология; UBA, убиквитинсвязанные.
Фиг.2. - характеристика гена убиквитинспецифичной протеазы UBP15.
(A) Структура гена UBP15. Есть 14 экзонов, распределенных в пределах участка генома, размером 4,37 kb. Черные блоки представляют экзоны, в то время как линии между этими экзонами являются интронами. Белые блоки на двух концах обозначают 5' и 3' UTRы. Две Т-ДНК нокаутные линии со вставками с 8 м и 12 м экзонах соответственно, в каждом случае разрушен UBP домен.
(B) Экспрессия UBP15 в диком типе и в гомозиготных линиях ubp15-1 и ubp15-2 с помощью ОТ-ПЦР с праймерами UBP15FP и UBP15RP. At3g04120/GAPDH служит внутренним контролем.
(C)1-месячные растения дикого типа, гомозиготное по ubp15-1 и гомозиготное по ubp15-2. Черта = 1 см.
(D)12-дневные саженцы дикого типа, гомозиготные по ubp15-1 и гомозиготные по ubp15-2. Черта = 1 см.
(Е) Цветы дикого типа, гомозиготные по ubp15-1 и гомозиготные по ubp15-2. Черта = 1 мм.
(F) Стручки дикого типа, гомозиготные по ubp15-1 и гомозиготные по ubp15-2. Черта = 1 см. Все приведенные растения растут в условиях 16 ч свет/8 ч темнота.
(G) Соотношение длины и ширины листьев розетки дикого типа и ubp15-1 в условиях короткого дня (8 ч свет/16 ч темнота). Планки погрешностей представляют стандартные отклонения 7 повторов.
Фиг.3. - тканевый и связанный с развитием паттерн экспрессии UBP15 и внутриклеточная локализация UBP15 в эпидермальных клетках лука.
(А) Анализ с помощью ОТ-ПЦР паттерна экспрессии UBP15. At3g04120/GAPDH в качестве внутреннего контроля.
(A) Нозерн-блотт анализ паттерна экспрессии UBP15 в центральных и краевых участках листа в трех стадиях развития, Р1, Р2 и Р3. Листья были разделены на две части: центр и края, как показано линиями на рисунке. Использовали равные количества общей РНК из различных образцов, и блотт в геле гибридизовали и метили с пробами, специфичными к гену UBP15. Маркеры рРНК использовали для демонстрации равной нагрузки. С, центральный участок; М, участок края. Черта = 1 см.
(B) Внутриклеточная локализация UBP15 в эпидермальных клетках лука. Черта = 100 мкм.
Cys
447
Фиг.4. - UBP15 кодирует функциональный деубиквитинилирующий фермент, способный расщеплять полипептиды, и его  необходим для выполнения функции in vitro и in vivo.
(А) UBP15 может расщеплять субстрат UBQ1 (убиквитинилированный белок). Коэкспрессия плазмид в Е. coli. Novablue (DE3) штамм (Novagen) был UBQ1 с вектором GST (линия 1), GST-UBP15 (линия 2), GST-UBP15C447A (линия 3) и GST-UBP15C447S (линия 4). Продукты расщепления определяли методом иммуноблотта с антителами к убиквитину.
(B) UBP15 может расщеплять субстрат UBQ10 (гексамерный полиубиквитин). Коэкспрессия плазмид в Е. coli. Novablue (DE3) штамм (Novagen) был UBQ10 с вектором GST (линия 1), GST-UBP15 (линия 2), GST-UBP15C447A (линия 3) и GST-UBP15C447S (линия 4). Продукты расщепления определяли методом иммуноблотта с антителами к убиквитину. Продукты расщепления показаны белыми стрелками.
(C) Экспрессия UBP15 в ubp15-1 повторяет его функцию дикого типа, в то время как сверхэкспрессия UBP15, но не UBP15C447A или UBP15C447S, вызывает фенотип с круглыми (раннее развитие) и закрученными вниз (зрелые) листьями розетки, что противоположно мутантам ubp15-1. Образцы, возрастом 1 месяц, слева направо и сверху вниз: дикий тип, ubp15-1, линия со сверхэкспрессией UBP15, UBP15-комплементированная линия, линия со сверхэкспрессией UBP15C447A и сверхэкспрессия UBP15C447A в линии ubp15-1. Черта = 1 см.
(D) Блотт-анализ РНК в геле для определения экспрессии гена UBP15 в трансгенных линиях. Был проанализирован уровень РНК в растениям дикого типа (1), ubp15-1 (2), дикого типа с трансгеном UBP15 (3-6) и ubp15-1 с трансгеном UBP15 (7-9). Из листьев розетки, возрастом 4 недели, выделяли общую РНК. Использовали равные количества общей РНК из различных образцов растений, и блотт в геле гибридизовали и метили с пробами, специфичными к гену UBP15. Маркеры рРНК использовали для демонстрации равной нагрузки. Верхняя полоса (верхняя стрелка) была мРНК UBP15 полной длины, в то время как нижняя полоса (нижняя стрелка) представляла усеченную мРНК. Линии 3, 4 были образцами фенотипа со сверхэкспрессией UBP15, тогда как линии 5, 6 были похожи на дикий тип, очевидно без фенотипа со сверхэкспрессией UBP15. Линии 7, 8, но не 9, были компенсированными образцами, так как они не показывали мутантный фенотип, а нормальный, как дикий тип. Линия 9 - образец показал мутантный ubp15-1 фенотип.
(Е) Блотт-анализ РНК в геле для определения экспрессии гена UBP15C447A в трансгенных линиях.
Фиг.5. - сравнение дикого типа и линии со сверхэкспрессией UBP15.
(A) Девятый лист розетки дикого типа. Черта = 1мм.
(B) Девятый лист розетки линии со сверхэкспрессией UBP15. Черта = 1 мм.
(C) Вид сверху на цветок дикого типа. Черта = 1 мм.
(D) (Е) (К) Эктопические цветки линии со сверхэкспрессией UBP15. Черта = 1 мм.
(I) Вид сбоку на цветок дикого типа.Черта=1мм.
(J) Вид сбоку на цветок линии со сверхэкспрессией UBP15. Черта = 1 мм.
(F) Вторичный стебель дикого типа. Черта = 1 см.
(G) Вырожденный вторичный стебель линии со сверхэкспрессией UBP15. Черта = 1 см.
(Н) Стручки дикого типа. Черта = 1 см.
(М) Анормальные стручки линии со сверхэкспрессией UBP15. Черта = 1 см.
(L) Сравнение нормальных стручков дикого типа (слева) и линии со сверхэкспрессией UBP15 (справа). Черта = 1 см.
Фиг.6. - сравнение поперечного сечения через листовую пластину листьев розетки в четырех линиях.
(A) Сверху вниз: дикий тип, ubp15-1, ubp15-2 и линия со сверхэкспрессией UBP15. В каждой панели, две семядоли листья розетки от первого до последнего, так же как два первых стеблевых листа расположены слева направо. Стрелки показывают положение стеблевых листьев. Черта = 1 см.
(B) Модели показывают положение поперечного сечения.
(Н) Сравнение количества адаксиальных эпидермальных клеток в поперечном сечении через листовую пластину листьев розетки. Планки погрешностей представляют стандартные отклонения трех биологических повторов.
Фиг.7. - гистологическое сравнение поперечного сечения серединного участка девятого листа розетки.
(A) Сравнение слоев клеток в поперечном сечении дикого типа, ubp15-1, ubp15-2, линии со сверхэкспрессией UBP15 и ubp15 ubp16. ad, адаксиальные; ра, столбчатые; sm, губчатый мезофил; ab, абаксиальный; х, ксилема; р, флоэма. Черта = 0,1 мм.
(B) Сравнение структуры срединной жилки в поперечных сечениях дикого типа, ubp15-1, ubp15-2, линии со сверхэкспрессией UBP15 и ubp15 ubp16. Черта = 0,1 мм.
Фиг.8. - ПЦР в реальном времени подтверждает результаты теста на микропанелях.
7 ингибированных генов и 2 активированных гена были выбраны случайным образом для анализа с помощью ПЦР в реальном времени, которая подтверждает результаты теста на микропанелях.
Фиг.9. - характеристика UBP16 и UBP17.
(A) Структура гена UBP16 (слева) и UBP17 (справа).
(B) 12-дневные саженцы дикого типа, ubp15-1, ubp15 ubp17, ubp15 ubp16 и ubp15 ubp16 ubp17. Черта = 1 см.
(C) 2-месячные растения дикого типа, ubp15-1, ubp15 ubp17, ubp15 ubp16 и ubp15 ubp16 ubp17. Черта = 1 см.
Фиг.10. - характеристика UBP18 и UBP19.
(A) Структура гена UBP18 (верхняя панель) и UBP19 (нижняя панель).
(B) ubp19 проявляет рецессивную летальность эмбриона. Верхний стручок является гетерозиготой ubp19 и нижний является диким типом. Стрелки указывают на анормальные гомозиготные эмбрионы. Черта=1мм.
(C) Изучение под микроскопом эмбрионов дикого типа (слева) и гомозиготы ubp19 (справа). bup19 гомозигота останавливается в развитии на стадии глобулы. Черта = 20 мкм.
UBP19
Фиг.11. - тканевый паттерн экспрессии UBP19. Паттерн экспрессии UBP19 определяли с использованием P:GUS трансгенных линий.
UBP19
(A) 12-дневные саженцы линии P:GUS. Черта = 1 мм. Изображение справа внизу 6х кратное увеличение концевого участка корня.
UBP19
(B) Зрелые листья розетки линии P:GUS. Черта = 1 мм.
UBP19
(C) Соцветие линии P:GUS line. Изображение слева внизу 2-кратное увеличение цветка. Черта = 1 мм.
UBP19
(D) Стручок линии P:GUS line. Черта = 1 мм.
Талица 1
Анализ Т-ДНК инсерционных линий по генам UBP
ID Генома Арабидопсис
Белок
Мутантный аллель
Т-ДНК линия
Место вставки
Фенотип
At2g32780
UBP1
ubp1-2
SALK_086190
Промотор
ND
At1g04860
UBP2
ubp2-2
SALK_064103
1<sup>й</sup> экзон
ND
ubp2-3
SALK_059858
1<sup>и</sup> экзон
ND
At4g39910
UBP3
ubp3-1
SALK_112950
3<sup>й</sup> экзон
ND
At2g22310
UBP4
ubp4-1
SALK_043210
4<sup>й</sup> экзон
ND
At2g40930
UBP5
ubp5-1
SALK_08839
5'UTR
ND
At1g51710
UBP6
ubp6-1
SALK_108832
14<sup>й</sup> интрон
ND
At3g21280
UBP7
ubp7-1
SALK_014223
ND
ND
At5g22030
UBP8
ubp8-1
SALK_034744
5<sup>й</sup> интрон
ND
ubp8-2
SALK_149329
6<sup>й</sup> интрон
ND
ubp8-3
SALK_088692
7<sup>й</sup> экзон
ND
At4g 10570
UBP9
ubp9-1
SALK_141485
5'UTR
ND
At4g 10590
UBP10
ubp10-1
SALK_093503
9<sup>й</sup> экзон
ND
At1g32850
UBP11
ubp11-1
SALK_043515
8<sup>й</sup> интрон
ND
At5g06600
UBP12
NONE
At3g11910
UBP13
ubp13-1
SALK_128312
5<sup>й</sup> экзон
ND
ubp13-2
SALK_024054
6<sup>й</sup> экзон
ND
ubp13-3
SALK_130784
17<sup>й</sup> экзон
ND
ubp13-4
SALK_132368
21<sup>й</sup> интрон
ND
At3g20630
UBP14
ubp14-3
SALK_050151
9<sup>й</sup> экзон
Рецессивная летальность
эмбриона
ubp14-4
SALK_012863
19<sup>й</sup> экзон
Рецессивная летальность эмбриона
At1g17110
UBP15
ubp15-1
SALK_018601
12<sup>й</sup> экзон
Рецессив узкой и зазубренной розетки листьев
ubp15-2
SALK_015611
8<sup>й</sup> экзон
Рецессив узкой и зазубренной розетки листьев
At4g24560
UBP16
ubp16-1
SALK_023552
5<sup>й</sup> экзон
ND
At5g65450
UBP17
ubp17-1
SALK_087726
9<sup>й</sup> экзон
ND
ubp17-2
SALK_113300
12<sup>й</sup> экзон
ND
ubp17-3
SALK_009641
8<sup>й</sup> интрон
ND
At4g31670
UBP18
ubp18-1
SALK_101685
2<sup>й</sup> интрон
ND
ubp18-2
SALK_126252
4<sup>й</sup> экзон
ND
At2g24640
UBP19
ubp19-1
SALK_084566
5'UTR
Рецессивная летальность эмбриона
ubp19-2
SALK_117787
5'UTR
ND
At4g17890
UBP20
NONE
At5g46740
UBP21
ubp21-1
SALK_079015
1 экзон
ND
At5g10790
UBP22
NONE
At5g57990
UBP23
ubp23-1
SALK_121772
10<sup>й</sup> экзон
ND
At4g30890
UBP24
ubp24-1
SALK_001531
3<sup>й</sup> экзон
ND
At3g14400
UBP25
ubp25-1
SALK_088458
5'UTR
ND
ubp25-2
SALK_111336
2<sup>й</sup> экзон
ND
At3g49600
UBP26
ubp26-1
SALK_024392
4<sup>й</sup> интрон
ND
At4g39370
UBP27
ubp27-1
SALK_067020
5'UTR
ND
ubp27-2
SALK_027968
1<sup>и</sup> экзон
ND
38 Т-ДНК нокаутных линий, соответствующих 24 из 27 генов UB, были разделены по фенотипам. Только 5 линий, принадлежащих 3 генам, проявляют видимый фенотип.
Таблица 2
Морфометрический анализ растений дикого типа, мутанта ubp15-1, и ее сверхэкспрессией UBP15
Параметры растения
Дикий тип
ubp15-1
Растения ее сверхэкспрессией UBP15
Количество листьев розетки (LD)<sup>a</sup>
12,58±0,95 (n=26)
10,82±1,36 (n=18)
16,21±1,63 (n=26)
Время цветения (LD) (дни)<sup>a</sup>
41,54±3,79 (n=26)
39,13±2,02 (n=46)
46,07±2,37 (n=26)
Количество листьев розетки (SD)<sup>b</sup>
15,92±2,11 (n=7)
13,08±1,77 (n=7)
20,22±2,66 (n=7)
Время цветения (SD) (дни)<sup>b</sup>
69,04±1,41 (n=8)
65,69±4,66 (n=21)
75,45±4,87 (n=8)
Свежий вес листьев розетки (мг/см<sup>2</sup>)<sup>b</sup>
13,24±0,48 (n=24)
10,74±0,29 (n=40)
15,6±0,46 (n=24)
Длина стручка (см)<sup>c</sup>
1,36±0,08 (n=50)
1,09±0,08 (n=50)
1,42±0,07(n=40)
Длина корня (см)<sup>d</sup>
5,87±0,75 (n=22)
4,64±0,74 (n=22)
6,84±0,69 (n=26)
Длина первичного стебля (см)<sup>c</sup>
26,09±2,68 (n=11)
23,77±2,98 (n=15)
29,25±4,44 (n=6)
Диаметр первичного стебля (мм)<sup>c</sup>
0,80±0,08 (n=14)
0,65±0,09 (n=18)
0,98±0,07 (n=8)
а. Измерения проводились на растениях со стрелками. Растения росли при 16 часах света/8 часах темноты.
b. Измерения проводились на растениях со стрелками. Растения росли при 8 часах света/16 часах темноты.
с. Измерения проводились на растениях через 60 дней после посева. Растения росли при 16 часах света/8 часах темноты.
d. Измерения проводились на растениях через 14 дней после посева. Растения росли при 16 часах света/8 часах темноты.
Таблица 3
Данные теста на микропанелях для выбора генов с различными функциями
Код AGI
Кратность изменений
Описание гена и предполагаемые функции
Категории GO
Белки, связанные с клеточным циклом
At2g23430
1,72
ICK1
Негативная регуляция деления клеток и промотор
эндоредупликации
At1g77880
0,3
Белок, содержащий Циклин-подобный F бокс домен
Белки, регулирующие цветение
At1g26310
1,98
Гомеотический ген цветка CAL
Позитивная регуляция развития цветка
At5g65080
0,31
MAF5
Негативная регуляция развития цветка, яровизационный ответ
Факторы транскрипции
At1g74080
4,26
MYB122
Кодирует предполагаемый фактор транскрипции
At3g07650
2,39
Семейство генов CONSTANS
Негативная регуляция фотопериодизма длинного дня, цветения
At4g 17980
2,32
Семейство белков без апикальных меристем (NAM)
Активность фактора транскрипции
At3g20810
2,05
Фактор транскрипции,
Активность фактора
содержащий jmjC домен
транскрипции
At3g23250
2,03
MYB15
Активность фактора транскрипции, ответ на виды гормонов
At1g21910
1,92
Фактор транскрипции ERF/AP2
Активность фактора транскрипции, TINY-подобный белок
At2a31220
1,86
Стандартный белок семейства петля-спираль-петля (bHLH)
Активность фактора транскрипции
At2g 19810
0,56
Белок семейства с Цинкового пальца (СССН-тип)
Активность фактора транскрипции
At5g57660
0,51
Белок семейства цинкового пальца типа В-бокс
Активность фактора транскрипции
At1d71030
0,42
Фактор транскрипции семейства MYB
Активность фактора транскрипции, ответ на виды гормонов, в основном в листьях
At4g 16780
0,42
Белок 4 гомеобокслецитиновая застежка
Активность фактора транскрипции, ответ на стимул цитокинином
At3g04070
0,45
Семейство белков без апикальных меристем (NAM)
Активность фактора транскрипции
Биосинтетический метаболизм
At5g38710
4,81
Пролин оксидаза
Биосинтез глутамата, катаболический процесс пролина, локализован в МТ
At4g21990
3,31
APS REDUCTASE 3
Ассимиляция сульфата, расположен в хлоропластах
At3g12430
3,24
3'-5' экзонуклеаза
Связывание нуклеиновых кислот, 3'-5' экзонуклеазная активность
At5g06290
2,53
2-cys пероксиредоксин
Локализован в хлоропластах, антиоксидантная активность
At3g24420
2,48
Гидролаза, белок семейства альфа/бета складки
Локализован в эндомембранной системе
At5g61440
2,04
Белок семейства тиоредоксина
Активность посредника тиол-дисульфидного обмена, локализован в хлоропластах
At1g51760
1,96
IAA-аминокислотная гибролаза 3
Активность IAA-Ala конъюгирующей гидролазы
At1g76130
1,92
Альфа-амилаза
Процесс углеводного обмена, локализован во внеклеточной области
At4g19170
0,54
Предполагаемая 9-цис-эпоксикаротиноидная диоксигеназа
Локализован в пластоглобуле
At5g35970
0,48
ДНК хеликаза-подобный
ДНК связывающий белок, локализован в хлоропластах
At1g73480
0,47
Гидролаза, белок семейства альфа/бета складки
Метаболизм ароматических соединений, локализован в хлоропластах
At1g77760
0,47
Нитрат редуктаза 1 (NR1)
At3g49160
0,43
Пируват киназа-подобный белок
Пируваткиназная активность, вовлечен в гликолиз
At1g77760
0,43
Нитрат редуктаза
Отвечает за стимуляцию светом, процесс биосинтеза оксида азота
At5g24470
0,42
APRR5
Суточный ритм, фотоморфогенез
At5g11330
0,41
Белок семейства монооксигеназ
Перенос электронов, метаболический процесс, локализован в эндомембранной системе
At1g32900
0,39
Синтез крахмала
Трансферазная активность, перенос гликозильных групп, локализован в хлоропластах
At5g48490
0,28
Белок семейства липид переносящих белков (LTP)
Связывание и перенос липидов, локализованных в эндомембранной системе
Метаболизм полисахаридов
At5g25980
4,53
Семейство гликозил гидролаз 1
Гидролазная активность, гидролиз O-гликозил соединений
At1g55850
3,57
Белок семейства целлюлозсинтазы
Процесс биосинтеза полисахаридов, процесс биосинтеза клеточной стенки
At3g44990
2,52
Ксилоглюкан: ксилоглюкозил трансфераза
Гидролазная активность, действует на гликозильные связи, локализован в хлоропластах
At2g32290
2,3
Предполагаемая 1,4-альфа-О-глюкан мальтогидролаза
Катаболический процесс полисахаридов
At3g21750
2,17
Семейство белков UDP-гликозилтрансферазы
Перенос гликозильных групп
Сигнальная трансдукция
At5g39670
3,03
Белок семейства Calcium-binding EF hand
At1g14320
2,52
Белок, связанный с супрессией опухоли Вильмса
Вовлечен в трансляцию
At5g35735
2,04
Семейство Ауксин-чувствительных белков
Допамин бета-монооксигеназная активность, локализован в мембране
At1g61370
2,1
Семейство белков S-локус лектин протеинкиназы
Фосфорилирование аминокислот белков, локализован в эндомембранной системе
At1g51760
1,96
IAA amino acid hydrolase (IAR3)
Протеолиз, локализован в эндомембранной системе
At5g67030
0,55
Зеаксантин эпоксидаза
Процесс биосинтеза абсцизовой кислоты
At5g45830
0,52
Подобный опухоль-связанным белкам
At4g12980
0,51
Семейство Ауксин-чувствительных белков, предположительно
Допамин бета-монооксигеназная активность, локализован в мембране
At4g28950
0,47
Белок семейства генов ROP GTPase
Транспорт белков, сигнальная трансдукция, опосредованная малой GТРазой
At5g45820
0,26
CBL-взаимодействующая протеинкиназа 20 (CIPK20)
Киназная активность
Фотосинтез
At3g17040
0,5
Белок, содержащий тетратрикопептидный повтор (TPR)
Предшественник хлоропластов
At3g59400
0,37
GUN4
Процесс биоситеза хлорофила, локализован в хлоропласте
At1g44446
0,34
Хлорофил а оксигеназа/хлорофил b синтаза
Процесс биоситеза хлорофила
Дополнительная Фиг.1. - сравнение (выравнивание) последовательностей 27 UBP белков.
Высоконсервативные аминокислоты закрашены черным цветом, а менее консервативные закрашены серым цветом. Цифры над последовательностью указывают на позицию аминокислоты в последовательности.
Дополнительная Фиг.2. - паттерн экспрессии генов подсемейства UBP15.
Элементы с 1 по 18 стеблевые листья, листья розетки, пестик один день до опыления, пестик один день после опыления, стручок 3 дня после опыления, стручок 8 дней после опыления, стебель, чашелистик, тычинка, лепесток, семя, культивируемая клетка, темный корень, светлый корень, темный гипокотиль, светлый гипокотиль, темная семядоля и светлая семядоля.
Дополнительная Фиг.3. - филогенетический анализ подсемейства AIUBP15 и их гомологов в Рисе.
Филогенетическое дерево 9 UBPs в Арабидопсис или рисе. Значения анализа Bootstrap показаны в процентах от ветвлений.
Дополнительная Фиг.4. - двухмесячные линии дикого типа, два мутанта ubp15 и линия со сверхэкспрессией UBP15.
Двухмесячный дикий тип, ubp15-1, ubp15-2, линия со сверхэкспрессией UBP15 и компенсированная линия. Мутанты слабые, с ранним временем цветения и большим количеством вторичных стеблей, тогда как линии со сверхэкспрессией UBP15 демонстрируют противоположный фенотип с поздним цветением и сильным апикальным доминированием. Черта = 1 см.
Дополнительная Фиг.5. - сравнение количества столбчатых клеток в поперечном сечении через листовую пластину листьев розетки.
Планки погрешностей представляют стандартные отклонения трех биологических повторов.
Дополнительная Фиг.6. - сравнение девятого листа розетки дикого типа и мутантов, а также трансгенных линий.
(A) Зрелые девятые листья розетки дикого типа, ubp15-1, ubp15-2, линии со сверхэкспрессией UBP15 и ubp15 ubp16. Черта = 1 см.
(B) Сравнение количества адаксиальных эпидермальных клеток в поперечном сечении трех участков девятого листа розетки.
Дополнительные Таблицы
Дополнительная таблица 1. Данные теста на микропанелях экспрессии 27 UBP генов в разных органах
Код гена
Имя гена
Стеблевой лист
Лист розетки
Пестик на следующий день, после опыления
Пестик за один день до опыления
Стручок, 3 дня после опыления
Стручок, 8 дней после опыления
At4g10590
UBP10
253.2371134
538
318.9969539
178.5757576
209.7058824
69
At4g10570
UBP9
253.2371134
538
318.9969539
178.5757576
209.7058824
69
At1g32850
UBP11
14.17808219
19
10.58646617
12.07272727
38.05147059
14.80555556
At2g40930
UBP5
114.5257732
497.5804196
350.327381
404.625
337.3897059
70
At5g22030
UBP8
123.0618557
309.4912281
218.0594178
315.5220588
311
89.97222222
At4g30890
UBP24
248
584.2237762
655.5600733
568
736.5073529
168.5555556
At4g39910
UBP3
172.9726027
350.6993007
302.4974359
372.8897059
208.8602941
130.9722222
At2g22310
UBP4
38.41237113
66.24561404
63.11683054
48
28
22
At5g06600
UBP12
1141
1519.146853
1139.097744
599.6121212
1186.024096
247.1388889
At3g49600
UBP26
190
480.2807018
330.575188
343.5955882
313.1325301
219
At1g51710
UBP6
621
1231.754386
891.3714671
781.1764706
754.2647059
574
At3g21280
UBP7
71
292.9370629
145.1863505
160.5073529
136.1397059
107
At2g32780
UBP1
7
8.251748252
51.91666667
29.67878788
15.22058824
35
At1g04860
UBP2
211.2680412
381.2307692
367.7518797
222.8424242
306.9485294
149
At4g39370
UBP27
46.94845361
74.52631579
127.5
61.02941176
57
77.9
At5g10790
UBP22
379.1443299
600.3508772
273.7743975
238.0147059
289.1911765
91
At5g46740
UBP21
120.9278351
158.4335664
383.9718913
241.4545455
222.3897059
124.1388889
At5g57990
UBP23
491
1614.736842
1162.335897
1227.911765
1056
726.6111111
At3g14400
UBP25
407.5979381
719.3859649
611.4935415
376.2666667
496.0240964
315.4722222
At4g24560
UBP16
152.2268041
443.9440559
509.277381
546.8235294
367.1686747
142.3611111
At5g65450
UBP17
59.04123711
193.0909091
134.8794872
150.9090909
152.2058824
85
At1g17110
UBP15
711.3402062
1031.982456
1031.665293
758.0666667
845
514.7777778
At4g31670
UBP18
142
404.3356643
203,3615577
209.3308824
181.8014706
188
At2g24640
UBP19
56
222
205.9252747
238.0147059
203
84.27777778
Код гена
Имя гена
Стебель
Чашелистик
Тычинка
Лепесток
Семя
Культивированная клетка
At4g10590
UBP10
266
504.8139535
661.641791
290
95.75543478
963.8555417
At4g10570
UBP9
266
504.8139535
661.641791
290
95.75543478
963.8555417
At1g32850
UBP11
52
91.84883721
64.74129353
134
-3.02173913
34.26132223
At2g40930
UBP5
315.9270073
246.3023256
270
798
67.02173913
1217.020979
At5g22030
UBP8
444
29.51162791
451.2704918
886.7755102
116.8865489
417.7322314
At4g30890
UBP24
646.8076923
562.5348837
707
1767.030612
191.9293478
1559.865613
At4g39910
UBP3
524.2627737
458.3953488
750.5721393
1617
68.875
1084.045697
At2g22310
UBP4
143.0192308
90.53488372
101
160
10.30366848
65.2861244
At5g06600
UBP12
1903.386861
204.5813953
1246
2006
401.0923913
2426.601399
At3g49600
UBP26
551.4615385
195.755814
215.6721311
465.122449
213.3043478
560.5384615
At1g51710
UBP6
1669.846154
406.5465116
901
1469
394.9476902
6227.830303
At3g21280
UBP7
263.1094891
138.7674419
125
294.505102
71.46195652
274.6139657
At2g32780
UBP1
21
67.65116279
39.12935323
118
30.04415761
28.70312881
At1g04860
UBP2
324
590.1046512
639.5870647
256.4693878
261.9293478
819.7538462
At4g39370
UBP27
43
114.4302326
122.3681592
116
248.3913043
64.60289855
At5g10790
UBP22
289
409.6046512
407
834
139.798913
371.109589
At5g46740
UBP21
243.5192308
135.1860465
118.0995025
146.7091837
72.24456522
93.65178979
At5g57990
UBP23
2079.445255
431.5581395
346
929.1581633
534.28125
3446.150487
At3g14400
UBP25
697.0576923
277.3837209
758
214.0867347
207.9673913
1548.92372
At4g24560
UBP16
351.75
318.744186
454
542
93.54076087
1062.276923
At5g65450
UBP17
98.78832117
178.4767442
108.8507463
455
276.5108696
88.66155158
At1g17110
UBP15
851.6730769
379.5930233
534.2935323
207.5663265
210.125
641.6596737
At4g31670
UBP18
398.0875912
309.0348837
322
880
130.9728261
574.4164103
At2g24640
UBP19
331
172.5348837
269.6368159
547.7142857
112.7391304
556.7737557
Код гена
Имя гена
Корень темный
Корень светлый
Гипокотиль темный
Гипокотиль светлый
Семядоля темная
Семядоля светлая
At4g10590
UBP10
424.8228346
438.28125
173.40625
131.5095238
393.2027027
370.7176157
At4g10570
UBP9
424.8228346
438.28125
173.40625
131.5095238
393.2027027
370.7176157
At1g32850
UBP11
51.77382175
85.8125
17.91666667
36.67142857
44.11560694
39.55357143
At2g40930
UBP5
325.4406923
344.65625
97.63541667
123.1904762
353.9322034
313.0154762
At5g22030
UBP8
279.9637111
408.21875
129.2604167
143.8857143
419.0860927
422.2265816
At4g30890
UBP24
414.0984252
531.8125
188.71875
313.3857143
467.1186441
429.1309524
At4g39910
UBP3
462.4347826
666.46875
311.2708333
294.1071429
540.1788079
598.1203056
At2g22310
UBP4
128.5507246
111.09375
20.54166667
46.95714286
62.12582781
101.2047619
At5g06600
UBP12
1517.831793
2085.65625
416.6458333
406.9738095
1479
1652.075033
At3g49600
UBP26
425.0354331
616.53125
202.71875
183.6095238
397.9595376
378.8214286
At1g51710
UBP6
1981.102362
3926.3125
569.9583333
668.4071429
889
1159.790698
At3g21280
UBP7
105.6540784
209.125
42.21875
91.56428571
131.4277457
177.4428571
At2g32780
UBP1
62.84468789
34.8125
20.13541667
28.72619048
26.65317919
26.14784053
At1g04860
UBP2
502.2960018
594.59375
183.71875
200.4095238
438.0397351
410.7517483
At4g39370
UBP27
92.94123017
106.28125
28.96875
47.19047619
109
73.32009044
At5g10790
UBP22
410.9566929
420.59375
106.6354167
127.0714286
470.7118644
562.8515873
At5g46740
UBP21
146.8093119
215.71875
63.33333333
84.58809524
145.2138728
122.7753913
At5g57990
UBP23
832,6963369
1380.65625
540.7708333
948.9547619
817.1125828
1300.761526
At3g14400
UBP25
730.0184868
1210.8125
323.5520833
322.2595238
837.2774566
704.6364653
At4g24560
UBP16
345.6990291
359.90625
148.8854167
179.4928571
431.9653179
379.5714286
At5g65450
UBP17
171.0468619
137.28125
48.69791667
90.40714286
195.8543046
184.5927003
At1g17110
UBP15
787.4924113
1596.84375
409.7291667
498.3833333
1680.243243
1613.125
At4g31670
UBP18
388.7701246
783.5625
268.8229167
230.0404762
196.7288136
236.5464286
At2g24640
UBP19
216.5870136
405.65625
110.78125
162.3714286
315.8513514
298.2021164
Дополнительная Таблица 2
Праймеры, синтезированные для идентификации генотипа линий с Т-ДНК вставкой
Т-ДНК вставка
Прямой (FP) и обратный (RP) праймеры
SALK_086190
FP: 5'-TGCGTGAAGGAATTCAGATCCA-3'
RP: 5'-TTCAGCGTTATATCTAAAAGAATTG-3'
SALK_064103
FP: 5'-GCTTCGCTTACGTTATACCACGC-3'
RP: 5'-CTGAAGCCTCGGGAGTTGGTT-3'
SALK_059858
FP: 5'-CGGGTCTTCTCCGCTACACCT-3'
RP: 5'-CCTTTGGTGGTTGCAGATTCG-3'
SALK_112950
FP: 5'-TGTGCACAACACCATTTGCCT-3'
RP: 5'-TCTCTCCCTTGTGCAGGCTCTT-3'
SALK_043210
FP: 5'-TGTGATTGGGTTTGGTTTGGG-3'
RP: 5'-TCTCTTGACCTGCTTGGCTGA-3'
SALK_088398
FP: 5'-GTGCTGCTACTGCTGCTTCCC-3'
RP: 5'-CAACAGCAGCTAAATCAAAAAGG -3'
SALK_108832
FP: 5'-AAAATGTGGTCCAAGTGGATGG-3'
RP: 5'-TGAGAAGGAAACTCACATGACTGGA-3'
SALK_014223
FP: 5'-CCAATTACAGTGCGTTCCAAGC-3'
RP: 5'-TGGCCAACTTTGTTAGATGTTTCA-3'
SALK_034744
FP: 5'-GACCAAGGGGATTCCAAATGC-3'
RP: 5'-TTTCTGGTTGCAGGGCCAATA-3'
SALK_149329
FP: 5'-AGCGGGAAATCCACATATGCC-3'
RP: 5'-CCTTTCCAATGGTTTTCAGGC-3'
SALK_088692
FP: 5'-CGTAAGCAGCCGAGGTCTTGA-3'
RP: 5'-TCCAAGCGGTTGAATGTGCTT-3'
SALK_141485
FP: 5'-TGCAATGATGCTAATTGGATCAAGA -3'
RP: 5'-TTTTATTATGCTTCTGTTCCTTTTT-3'
SALK_093503
FP: 5'-AGCATCAGGAAGGTGGCCATT-3'
RP: S'-TCGGTTACCATTTCCTTCCATTG-3'
SALK_043515
FP: 5'-CACTAGGAAACCAGTGCCTTCG-3'
RP: 5'- ACACTTTGGGCCCCTGTCACT-3'
SALK_128312
FP: 5'-CCCTCCACAACAGTTCCCTTG-3'
RP: 5'-TTGGAATGGAGTCAAGTTACCGC-3'
SALK_024054
FP: 5'-CGCACTATGAACCCCAACACC-3'
RP: S'-GAAAGGTTGGATGCTTGTTTTG-3'
SALK_130784
FP: 5'-GCTTTTGTTGGAACAGATGTCAA-3'
RP: 5'-TCCTCATGTAGGAAGAGGTAGCCA-3'
SALK_132368
FP: 5'-CCAAGCTTCTCAGCCACCCTT-3'
RP: 5'-TGTTGGCAGGCTAATGGTGAAA-3'
SALK_050151
FP: 5'-GCCGAAAAGGAGTATCGTTCCA-3'
RP: 5'-CAAGGTAGATGCCATTGCCCA-3'
SALK_012863
FP: 5'-GGAGGCAAATTAAAAAGACAGCGA-3'
RP: 5'-ATGCACCAATCTCCCACCAGA-3'
SALK_018601
FP: 5'-ATGGTGAACCGGAGCTTTTCC-3'
RP: 5'-CCAGGTTAAATGCCTGAGGTGTG-3'
SALK_015611
FP: 5'-TCACACCTCAGGCATTTAACC-3'
RP: 5'-TTGTGGAAACAGGTATTGTCTC-3'
SALK_023552
FP: 5'-TACGCAAATGAAAGACCATGA-3'
RP: 5'- TGGGTTTGAGAAGCTGGTCGT-3'
SALK_087726
FP: 5'-GGTGAATCATATGGGTTTTGCTTT-3'
RP: 5'- TTTGAACCAATCTCCATCAAGGG-3'
SALK_113300
FP: 5'-TGCTTCTTTATGCAAGGTGAATGA-3'
RP: 5'-CATACTCCCTCCGTTTTCACAA-3'
SALK_009641
FP: 5'-AAAGGCAAGGGGAGGAGAATC-3'
RP: 5'-GAAGCTCGGGAAAATGGATGG-3'
SALK_101685
FP: 5'-TGAGCATCCTCCTGTCTTCCA-3'
RP: 5'-TTTTTCAGATTGTTACCCAAAAA-3'
SALK_126252
FP: 5'-TGAGCATCCTCCTGTCTTCCA-3'
RP: 5'-TTTTTCACATTGTTACCCAAAAA-3'
SALK_084566
FP: 5'-TCGGCGATGGTCTCTATCGAA-3'
RP: 5'-GGTTGATAACAATTTACCAAAGTCG-3'
SALK_117787
FP: 5'-TGCGTGAAGGAATTCAGATCCA-3'
RP: 5'-TTCAGCGTTATATCTAAAAGAATTG-3'
SALK_079015
FP: 5'-TTTAAGTTTTCTAGACACTATTTTT-3'
RP: 5'-GGGAGAAAGCCGAGAGTCTGTG-3'
SALK_121772
FP: 5'-TGTAACCTCGATCCCTCAGCATC-3'
RP: 5'-TTGCCAAATGGGATGAGGAAA-3'
SALK_001531
FP: 5'-CCTTCCCAGTAACCGAGGCTCT-3'
RP: 5'-CCTTTTGTGCAGCTCCTCCAG-3'
SALK_088458
FP: 5'-CGGAGAAAACCAACCAAGCAA -3'
RP: 5'-ACAGCTATTGCCGGTGTAGCG-3'
SALK_111336
FP: 5'-TGAACGTTGCAAATTCATTCGAT-3'
RP: 5'-CCGATGCGCCTAACAAGATTTC-3'
SALK_024392
FP: 5'-TTGTGGAAACACCCCACAAAA-3'
RP: 5'-TTGGCTTCGTCTATGGGCTGA-3'
SALK_067020
FP: 5'-TTCTCAAAACATTCGCAGTGGC-3'
RP: 5'-AATAGACCGTGCTGTTGGGCA-3'
SALK_027968
FP: 5'-TTTCAAATCAAATAAGCTAAAAAG-3'
RP: 5'-TGGCTTGTCAAATTGAAATTTTTG-3'
Дополнительная Таблица 3
Анализ транскриптомов ubp15-1
Код Гена
ID
M
W
M/W
At1g17110
AF302665
110
1959
0.06
At1g28375
AC010155
21
221
0.09
At4g01525
AC069551
25
236
0.11
At1g14550
AC010657
32
204
0.16
At3g59970
FF181966
39
239
0.16
At5g05820.a
15569
45
270
0.17
At3g29000
AB025615
37
209
0.18
At4g12900
AL079349
47
247
0.19
At1g38450
AC006918
50
233
0.22
At1g41720
AC006918
50
233
0.22
At2g06330
AC006918
50
233
0.22
At1g42360
AC006918
50
233
0.22
At1g42370
AC006918
50
233
0.22
At1g37160
AC006918
50
233
0.22
At5g39890
AB010077
57
256
0.22
At1g63530
AC008047
56
253
0.22
At1g71150
AG016972
55
244
0.22
At1g32060
AC074309
517
2159
0.24
At5g66990
AB026640
73
302
0.24
At1g35690
AC007887
81
322
0.25
At5g41315
AB006707
60
230
0.26
At3g02120
AC011664
76
290
0.26
At4g02240
AL096882
64
244
0.26
At5g65330
AL096882
64
244
0.26
At5g45820
AB016870
495
1874
0.26
At2g06410
AC006918
69
244
0.28
At5g48490
AB020745
2248
7953
0.28
At4g28440
AV557403
62
217
0.29
At1g62710
AF367254
85
281
0.3
At1g77880
AC009243
83
276
0.3
At1g48980
AC016041
61
203
0.3
At3g60500
AL138646
62
206
0.3
At3g01650
AC009325
71
241
0.3
At5g01600
AF326869
5374
17383
0.31
At5g16580
AB008270
72
231
0.31
At1g14500
AC012188
71
228
0.31
At5g65080
AF214485
114
363
0.31
At4g07938
AC006423
63
200
0.31
At5g02720
AL162973
66
212
0.31
At5g58830
AB016885
120
386
0.31
At1g43830
AC006423
63
200
0.31
At2g38690
AC005499
90
287
0.31
At2g02690
AC002521
64
201
0.32
At1g51960
AC006216
160
502
0.32
At1g48660
AC073555
116
364
0.32
At5g19840
AB024038
71
218
0.33
At1g65920
AC009513
123
376
0.33
At4g24080
AC002343
94
282
0.33
At3g55240
AL132954
508
1545
0.33
At1g44446
AB021316
3029
8868
0.34
At4g39090
AL035679
2180
6320
0.34
At4g38590
AL035540
74
220
0.34
At4g12440
AL049730
80
231
0.34
At4g20450
AL080253
104
308
0.34
At2g29670
AF375460
6906
19504
0.35
At4g31360
AL021633
190
547
0.35
At1g53930
AC006577
112
318
0.35
At3g63160
BE039458
1963
5579
0.35
At2g34940
AC004238
113
320
0.35
At3g26210
AB024038
515
1421
0.36
At5g44510
AB017065
73
202
0.36
At1g32810
AC006424
153
421
0.36
At4g13490.a
AA404812
4980
13728
0.36
At3g58650
AL137082
87
244
0.36
At5g62080
AB016880
81
217
0.37
At4g09930
AL049481
110
297
0.37
At1g47730
AC007519
110
296
0.37
At2g22240
U30250
235
626
0.37
At3g59400
AL356014
6379
17232
0.37
At3g01080
AC008261
102
276
0.37
At2g46590
AC006418
145
386
0.38
At4g20970
AL080282
95
248
0.39
At3g27500
AB025626
78
200
0.39
At1g17740
AB010407
105
267
0.39
At4g26460
AL022223
100
256
0.39
At5g54190
U29699
880
2255
0.39
At3g56790
AL390921
111
287
0.39
At3g46760
AL096859
80
207
0.39
At1g32900
AC006424
158
406
0.39
At5g49140
AB023028
107
268
0.4
At4g36195
AL022141
97
242
0.4
At4g35960
AL022373
96
242
0.4
At3g30130
AY046045
221
555
0.4
At1g74980
AY045856
476
1195
0.4
At1g77410
AC078898
85
214
0.4
At1g49800
AC079674
112
280
0.4
At1g28470
AV567286
152
381
0.4
At1g56350
AY046045
221
555
0.4
At2g18150
AC007212
152
383
0.4
At1g05700
AC007153
108
273
0.4
At4g29230
AL161574
126
313
0.4
At3g52040
AL049711
94
236
0.4
At1g63570
AC008047
151
378
0.4
At5g11330
AL360314
1143
2805
0.41
At3g13760
AP001307
151
368
0.41
At1g27220
AC004557
85
207
0.41
At1g04710
AC002376
144
356
0.41
At5g51670
AB025607
198
477
0.41
At1g63840
H77052
242
585
0.41
At2g31670
AV540982
214
519
0.41
At4g20380
U87834
101
247
0.41
At3g18780
U41998
687
1650
0.42
At3g03590
AC009327
190
450
0.42
At3g27160
AY039901
6880
16566
0.42
At4g16780
X68146
1165
2800
0.42
At1g56080
AC009894
115
272
0.42
At3g25080
AB026647
163
389
0.42
At3g10440
AG011560
231
555
0.42
At2g11010
AB028615
133
315
0.42
At2g46570
AC006418
84
200
0.42
At1g71030
Z68157
3598
8496
0.42
At1g41630
AC006250
238
572
0.42
At1g41600
AC006250
238
572
0.42
At1g41660
AC006250
238
572
0.42
At4g23700
AL035394
142
336
0.42
At4g10220
AF096373
89
211
0.42
At5g37230
AB017069
104
245
0.42
At5g37250
AB017069
104
245
0.42
At5g37270
AB017069
104
245
0.42
At5g03350
AL162751
2212
5268
0.42
At5g24470
AF027408
407
972
0.42
At1g79910
AC011717
104
247
0.42
At1g62690
AC007190
137
317
0.43
At5g06980
AY042849
657
1544
0.43
At1g75100
AC013258
117
271
0.43
At1g30080
AC022455
108
251
0.43
At2g35310
AC004667
171
397
0.43
At1g44542
AC084807
133
312
0.43
At1g50720
AC079027
120
276
0.43
At2g47150
AC004411
103
238
0.43
At2g46140
AC005397
112
259
0.43
At3g51150
AL132980
93
218
0.43
At3g42230
AL138645
168
390
0.43
At3g49160
AL132956
485
1128
0.43
At4g36470
AL161589
146
340
0.43
At1g36960
AC051631
86
202
0.43
At1g66100
AF380652
6908
15905
0.43
At2g47860
AC005309
117
275
0.43
At3g60570
AL138646
116
260
0.44
At1g08630
AC003981
93
213
0.44
At3g04360
AC016829
89
201
0.44
At5g26700
AF058914
111
255
0.44
At1g04570
AC002376
117
263
0.44
At2g19070
AC002392
92
206
0.44
At2g04440
AC006951
113
256
0.44
At2g41300
AC005662
107
245
0.44
At4g23970
AL078468
114
254
0.45
At1g43880
AC006423
147
331
0.45
At1g27490
AC004557
116
260
0.45
At1g65300
AC004512
106
236
0.45
At3g04070
AC011698
152
335
0.45
At1g38196
AC006423
147
331
0.45
At3g58350
AL137081
180
401
0.45
At1g80640
AC018849
96
214
0.45
At3g45390
AL132953
115
254
0.45
At1g14390
AC012188
188
407
0.46
At1g37130
AF367272
4767
10361
0.46
At5g51760
AB010074
132
289
0.46
At2g11760
AC074109
217
468
0.46
At2g12010
AC074109
217
468
0.46
At2g34980
AC004238
100
215
0.46
At5g39330
AB009054
171
370
0.46
At4g12210
AL080318
103
224
0.46
At4g12220
AL080318
103
224
0.46
At3g45650
AL138657
239
519
0.46
At5g62130
AB016880
343
745
0.46
At3g59060
AL163527
2960
6497
0.46
At1g38340
AC074109
217
468
0.46
At5g27700
AV534288
124
271
0.46
At1g38149
AC074109
217
468
0.46
At4g07733
AC074109
217
468
0.46
At3g16320
AC001645
119
260
0.46
At1g09150
AC003114
104
227
0.46
At1g20030
AC022472
330
699
0.47
At1g19010
AF360209
217
458
0.47
At2g36050
AY044326
179
381
0.47
At3g48800
AL132963
186
397
0.47
At4g00320
AL161471
202
429
0.47
At3g19050
AP000735
149
315
0.47
At5g46330
AB010698
101
216
0.47
At1g73480
AY045929
1324
2806
0.47
At1g77760
AC012193
1190
2545
0.47
At5g08480
AB006697
120
255
0.47
At3g51830
U72504
886
1904
0.47
At4g28950
AF079484
112
237
0.47
At4g18250
AL021713
116
249
0.47
At3g19700
AP000417
186
400
0.47
At3g48940
AL132967
98
207
0.47
At5g42250
AB023032
935
1961
0.48
At5g35970
AB026643
2449
5056
0.48
At1g06210
AC025290
265
546
0.48
At4g17460
U09332
2470
5158
0.48
At1g44860
AC007264
125
259
0.48
At2g10370
AC007264
125
259
0.48
At1g43740
AC009526
126
262
0.48
At1g43750
AC009526
126
262
0.48
At5g41040
AY034954
221
456
0.48
At5g04950
AB005245
161
338
0.48
At4g35820
AL031986
162
338
0.48
At5g02810
AY039943
2587
5372
0.48
At1g42400
AC007264
125
259
0.48
At2g31900
AC006533
127
261
0.48
At3g02380
AF370149
221
459
0.48
At4g27310
AL030978
621
1281
0.49
At1g76310
AC012394
245
504
0.49
At4g23520
AL031326
121
245
0.49
At3g50900
AL049862
116
238
0.49
At3g15353
AF013959
11215
22738
0.49
At1g12490
AC025416
138
282
0.49
At4g17000
AL161545
195
396
0.49
At2g15730
AC006248
139
283
0.49
At5g16190
AL391148
141
287
0.49
At3g59580
AL138659
145
298
0.49
At3g61190
AL137898
119
243
0.49
At5g53040
AB018116
108
221
0.49
At5g64170
AB008266
736
1512
0.49
At1g13650
AC027656
1432
2937
0.49
At5g10660
AL392144
125
255
0.49
At1g52300
AF370216
3677
7323
0.5
At4g29650
AL079344
247
497
0.5
At1g31300
AI995950
108
214
0.5
At4g29960
AL050352
120
238
0.5
At1g63420
AF372939
221
441
0.5
At1g61220
AV565744
174
352
0.5
At3g26610
X98130
167
337
0.5
At4g38970
AV440437
123
249
0.5
At5g42160
AB017067
129
257
0.5
At3g60380
AL138646
115
230
0.5
At4g36050
AL022373
127
251
0.5
At5g65380
AB011479
545
1080
0.5
At5g03090
AL163002
472
950
0.5
At1g80310
ACO18848
740
1489
0.5
At3g17040
AB026636
1749
3490
0.5
At3g44530
AL353818
170
339
0.5
At1g17990
AF344314
1752
3437
0.51
At5g64840
AB019236
3117
6109
0.51
At1g64740
M21414
1506
2968
0.51
At2g43040
AC006224
188
371
0.51
At5g57660
AB018118
6011
11797
0.51
At3g20540
AP000410
219
432
0.51
At5g39865
AB010077
136
268
0.51
At5g17300
AB005238
211
412
0.51
At1g18020
AF344314
1752
3437
0.51
At1g50910
AC079284
261
513
0.51
At5g51440
AB025621
184
363
0.51
At2g06880.a
AF147259
117
230
0.51
At3g32020.b
AF147259
117
230
0.51
At4g07730.a
AF147259
117
230
0.51
At2g03200
AC005313
159
312
0.51
At3g60870
AL162295
234
458
0.51
At3g50800
AL049862
131
259
0.51
At5g41830
AB016871
339
668
0.51
At5g53310
AF361603
583
1145
0.51
At4g 12980
AL079349
2345
4580
0.51
At2g30730
AC002340
178
350
0.51
At3g52270
AL132972
135
265
0.51
At3g21080
AP000604
172
336
0.51
At2g30510
AF181683
3085
6075
0.51
NoAnno
AA585895
189
364
0.52
At2g34480
AY042803
2958
5666
0.52
At1g06450
AC007592
229
437
0.52
At5g52020
AB015478
104
200
0.52
At1g62060
X91954
145
279
0.52
At2g13690
AC006436
107
205
0.52
At1g20780
AC069251
379
729
0.52
At3g17930
AY039550
1550
2953
0.52
At3g54590
AP002543
190
364
0.52
At4g08410
AP002543
190
364
0.52
At5g06640
AP002543
190
364
0.52
At2g44470
AC004521
114
219
0.52
At1g34740
AC007894
113
219
0.52
At1g52020
AC007894
113
219
0.52
At2g14770
AC007894
113
219
0.52
At3g24390
AC007894
113
219
0.52
At3g42730
AC007894
113
219
0.52
At4g05280
AC007894
113
219
0.52
At5g36860
AC007894
113
219
0.52
At1g21940
ACO13482
128
248
0.52
At1g34290
AC007454
110
213
0.52
At1g62000
X91954
145
279
0.52
At1g62080
X91954
145
279
0.52
At3g06020
AC013454
171
328
0.52
At1g17390
AC007843
254
492
0.52
At2g05560
AC007894
113
219
0.52
At1g68850
AC011914
144
276
0.52
At1g73600
AC079676
6072
11568
0.52
At2g05130
ABO15477
113
217
0.52
At1g04380
AC000104
119
227
0.52
At4g04710
ABO15477
113
217
0.52
At1g25886
AC007894
113
219
0.52
At4g03300
AC007894
113
219
0.52
At4g08880
AC007894
113
219
0.52
At4g08400
AP002543
190
364
0.52
At4g10710
AF080119
208
402
0.52
At3g43990
AB015477
113
217
0.52
At5g34940
AA586196
211
403
0.52
At3g54500
AL138656
183
350
0.52
At3g27560
X92728
167
323
0.52
At5g16030
AL391145
7145
13777
0.52
At3g25960
AB023041
434
835
0.52
At2g16980
AC002354
204
389
0.52
At4g10670
AF080119
208
402
0.52
At1g61500
AC005850
247
475
0.52
At5g45830
AB016870
306
590
0.52
At5g35520
AB015477
113
217
0.52
At3g54860
AL049655
130
247
0.52
At1g31710
AC074360
240
449
0.53
At2g21110
AC006264
117
219
0.53
At5g60390
AF360167
7372
13840
0.53
At5g44220
AB005239
225
423
0.53
At3g57160
AL138655
194
362
0.53
At1g11620
AC007296
128
239
0.53
At4g14450
AF067468
114
213
0.53
At2g42340
AC005956
162
304
0.53
At3g21670
AF372959
748
1399
0.53
At1g54300.a
AC005287
174
327
0.53
At2g02850
AC004138
129
246
0.53
At2g26690
AC003105
2529
4731
0.53
At4g17910
AP002057
118
222
0.53
At3g58340
AL137081
131
248
0.53
At4g24480
AL078637
191
362
0.53
At2g29000
AC005315
124
236
0.53
At5g45810
AB016870
272
514
0.53
At2g18000
AC006201
123
233
0.53
At2g25260
AC007070
232
437
0.53
NoAnno
AI099709
159
295
0.54
At4g19170
AL021687
1362
2532
0.54
At1g10610
AC007067
221
412
0.54
At5g05690
X87368
2014
3720
0.54
At1g51480
AB026651
186
343
0.54
At5g43730
AB026651
186
343
0.54
At1g37040
AC020646
158
292
0.54
At2g04770
AC020646
158
292
0.54
At2g38320
AF370310
200
371
0.54
At4g37550
AY045895
1113
2075
0.54
At1g49090
AC020646
158
292
0.54
At5g03415
AJ294532
249
458
0.54
At5g16700
AL391147
182
337
0.54
At1g20390
AC027665
185
340
0.54
At1g77150
AV544954
127
236
0.54
At1g77170
AV544954
127
236
0.54
At1g68870
AC011914
438
804
0.54
At3g43210
AL353871
174
326
0.54
At3g05880
AG012393
7580
14042
0.54
At5g20410
AJ000331
111
205
0.54
At2g24430
AC006403
157
292
0.54
At1g26800.a
AC006535
155
288
0.54
At1g73660.a
BE037745
371
684
0.54
At1g64860
AB004821
2996
5515
0.54
At5g34810
AL161499
222
411
0.54
At5g30480
AC020646
158
292
0.54
At3g01120
AF039206
227
417
0.54
At5g53260
AB013388
128
236
0.54
At4g04130
AL161499
222
411
0.54
At5g62780
AB009053
150
278
0.54
At3g22060
AY034900
1041
1922
0.54
At1g62070
AC000375
336
620
0.54
At1g06570
AF000228
713
1301
0.55
At4g01740
AL161492
182
333
0.55
At5g18620
U95990
188
344
0.55
At3g26190
AB024038
218
394
0.55
At3g61580
AJ224161
139
250
0.55
At4g12010
AL049638
199
360
0.55
At2g37640
AC004684
134
245
0.55
At1g26390
AC013427
174
317
0.55
At1g26400
AC013427
174
317
0.55
At1g26420
AC013427
174
317
0.55
At2g28440
AC006283
190
345
0.55
At4g18110
AL110123
143
262
0.55
At1g70260
AC002062
176
319
0.55
At1g58310
AC008051
117
212
0.55
At3g13229
AB024034
190
345
0.55
At3g12440
AC069474
145
263
0.55
At3g31930
AP001301
217
394
0.55
At2g20740
AC006234
150
272
0.55
At1g26810
AC006535
166
302
0.55
At1g47790
ACO12463
302
545
0.55
At1g47560
AC007519
149
273
0.55
At4g14790.a
АЛ 32843
250
453
0.55
At3g62260
AL138651
180
327
0.55
At3g32091
BE521910
134
244
0.55
At3g44720
AC002534
126
227
0.55
At2g34320
AC004481
156
284
0.55
At4g34840
AL079347
109
201
0.55
At3g61750
AL132959
176
318
0.55
At5g39530
AA395409
5835
10560
0.55
At5g26840
AL132976
5258
9555
0.55
At2g23330
AC002391
284
519
0.55
At2g11680
AC007187
165
298
0.55
At3g54210
AL132957
5028
9190
0.55
At5g49050
AB017061
151
273
0.55
At5g67030
AB030296
3968
7179
0.55
At1g28300
AC021044
127
229
0.56
At1g07180
AC067971
774
1388
0.56
At2g28580
AC007171
178
319
0.56
At5g16440
AF188067
218
390
0.56
At2g19810
AC005169
516
927
0.56
At5g44690
AB016874
140
251
0.56
At4g17720
AL161547
639
1148
0.56
At5g10220
AY014798
487
272
1.79
At4g20990
AL080282
306
171
1.79
At4g12290
AL080318
1516
845
1.79
At3g04640
AC011437
1081
604
1.79
At3g19280
AP000419
835
465
1.79
At1g11170
AC007259
370
207
1.79
At1g55550
AC005223
319
178
1.79
At2g30400
U93215
311
174
1.79
At3g56400
AY039933
14429
8054
1.79
At1g76960
AF370567
591
328
1.8
At2g22790
AC005617
228
127
1.8
At1g52620
AC008016
678
377
1.8
At1g68570
AC008075
857
475
1.8
At3g43250
AL353871
211
117
1.8
At4g27900
AL035524
1215
676
1.8
At2g17190
AF360159
250
139
1.8
At4g23240
AL022347
415
231
1.8
At4g23320
AL022347
415
231
1.8
At4g23290
AL022347
415
231
1.8
At3g13010
AC024128
230
127
1.81
At4g10340
AF134129
6930
3820
1.81
At4g31630
AL031004
213
118
1.81
At5g56840
AB013392
502
278
1.81
At1g55490
AF386945
22830
12641
1.81
At3g02470
AY042824
24562
13607
1.81
At1g74310
U13949
663
365
1.82
At2g36980
AC006922
398
219
1.82
At3g17360
AB022216
296
163
1.82
At1g17150
AC007651
210
115
1.82
At4g30500
AL161577
708
388
1.82
At5g62690
M84701
554
304
1.82
At5g62700
M84701
554
304
1.82
At3g17790
AJ133747
537
294
1.83
At3g23690
АР000377
17759
9687
1.83
At3g12500
АС069474
264
144
1.83
At4g38970
AL035679
11816
6462
1.83
At1g71250
АС016162
263
144
1.83
At5g53420
АВ020754
563
307
1.83
At1g70760
АС011663
236
129
1.83
At1g29600
АС068667
226
123
1.83
At5g37770
AB016873
7766
4226
1.84
At1g75950
AF059294
514
280
1.84
At1g78980
AC002986
231
126
1.84
At2g28040
AC005851
292
158
1.84
At3g01350
AG010676
345
187
1.84
At3g59630
AL138659
309
168
1.84
At1g09340
AY035050
18319
9954
1.84
At4g18100
AL110123
25024
13606
1.84
At4g23310
AL022347
225
123
1.84
At2g26840
AC005168
678
369
1.84
NoAnno
F15338
312
169
1.85
At1g02400
AC064879
297
161
1.85
At2g48090
AC006072
258
140
1.85
At5g39610
AB012243
263
142
1.85
At2g31220
AC006593
477
257
1.86
At2g24300
AC006403
205
110
1.86
At5g42500
AB016888
256
137
1.86
At3g01570
AC009325
426
229
1.86
At3g05710
AJ245408
257
139
1.86
At1g07470
X98861
13725
7392
1.86
At1g07480
X98861
13725
7392
1.86
At3g14620
AB023038
519
277
1.87
At1g67920
AC012563
291
156
1.87
At1g68590
AC008075
19955
10683
1.87
At5g45850
AB016870
8826
4711
1.87
At3g62550
AY035146
23437
12503
1.87
At5g67250
AF263378
17304
9265
1.87
At2g43670
AC002333
203
108
1.88
At1g56040
AC009894
492
261
1.88
At4g05180
AF372897
5948
3170
1.88
At3g08940
AF134127
17812
9497
1.88
At5g35340
AF058826
232
123
1.88
At4g20370
AB027506
233
124
1.88
NoAnno
M63234
207
110
1.89
At4g20950
AL080282
277
147
1.89
At1g31630
AC074360
573
302
1.89
At1g33070
AC074360
573
302
1.89
At4g12800
AJ245867
5393
2859
1.89
At5g14840
AL080282
277
147
1.89
At5g15240
AL353993
474
251
1.89
At4g34190
AF133716
18097
9574
1.89
At4g32260
AY042873
15062
7907
1.9
At2g43790
AV558477
440
232
1.9
At3g01440
AC010870
5091
2683
1.9
At1g02200
U40489
5410
2841
1.9
At3g22120
AF104328
22876
12056
1.9
At2g20880
AC006234
332
174
1.91
At1g31940
AC079041
207
108
1.91
At1g32470
AF385740
18411
9658
1.91
At4g08730
AL161512
403
211
1.91
At3g44320
X63445
22225
11646
1.91
At3g44300
X63445
22225
11646
1.91
At3g44310
X63445
22225
11646
1.91
At5g24210
AB006701
2109
1105
1.91
At3g16640
AY045802
1511
792
1.91
At1g76130
AC009978
868
451
1.92
At1g51140
AY034941
891
463
1.92
At1g74980
AY045856
17627
9200
1.92
At1g27270
AC004557
224
117
1.92
At1g05880
AC009999
279
146
1.92
At4g02770
AF389290
8820
4595
1.92
At1g27980
AF360166
961
499
1.92
At1g21910
AC013482
2917
1523
1.92
At5g58570
AY045817
656
339
1.93
At4g36510
AL161589
207
107
1.93
At3g58380
AL137081
266
138
1.93
At3g12810
AB024033
207
107
1.93
At2g28340
AC006283
417
215
1.94
At4g03890
AL161498
298
153
1.94
At4g02250
AL161494
201
104
1.94
NoAnno
F15136
271
139
1.95
At5g02260
AL162874
306
157
1.95
At1g30060
AC022455
303
156
1.95
At2g38140
AC003028
12398
6316
1.96
At1g25988
AC084221
235
120
1.96
At1g51760
Y13577
208
106
1.96
At2g14990
AL161509
252
129
1.96
At2g46870
AC004411
19086
9748
1.96
At2g14970
AF262043
16604
8412
1.97
At1g58290
AC008051
15587
7898
1.97
At4g16080
AL161543
703
357
1.97
At5g02520
AL162971
202
103
1.97
At4g08060
AF262043
16604
8412
1.97
At3g27860
AP000371
270
137
1.97
At1g64670
AC009519
239
121
1.98
At1g26310
AF061410
275
139
1.98
At5g38730
AB011478
307
155
1.98
At1g23205
AC002311
2171
1098
1.98
At4g04640
M61741
8213
4124
1.99
At1g52220
AC022354
21605
10842
1.99
At4g02870
AL161495
273
137
1.99
At1g34740
AF104920
212
107
1.99
At2g05560
AF104920
212
107
1.99
At2g14770
AF104920
212
107
1.99
At3g24390
AF104920
212
107
1.99
At3g42730
AF104920
212
107
1.99
At4g08880
AF104920
212
107
1.99
At5g36860
AF104920
212
107
1.99
At4g24570
AY042859
3564
1794
1.99
At1g52020
AF104920
212
107
1.99
At3g15720
AB017071
423
212
1.99
At1g25886
AF104920
212
107
1.99
At3g43390
AF104920
212
107
1.99
At4g03300
AF104920
212
107
1.99
At4g05280
AF104920
212
107
1.99
At3g28610
AP000420
205
103
1.99
At3g09440
Y17053
3577
1784
2
At1g30250
AC073506
6659
3331
2
At5g36960
AB016877
271
135
2.01
At2g37220
AY048251
14320
7098
2.02
At1g71691
ACO12654
288
142
2.02
At2g31980
AC006223
211
105
2.02
At2g27400
AC006233
313
154
2.03
At1g11260
X55350
17446
8597
2.03
At3g23250
Y14207
215
106
2.03
At5g53490
AF370552
19631
9694
2.03
At2g33830
AB050786
14290
7021
2.04
At4g14950
AV537413
254
124
2.04
At1g22270
AC068562
290
142
2.04
At5g35735
AF372955
4539
2220
2.04
At2g15960
AC006438
23165
11339
2.04
At2g36800
AC006282
584
287
2.04
At5g61440
AF144389
6829
3348
2.04
At1g10040
AC004122
352
173
2.04
At3g20810
AB025629
4866
2370
2.05
At2g42730
AC006931
248
121
2.05
At3g47960
AF370202
5950
2905
2.05
At2g01600
AV541295
265
129
2.06
At3g07480
AF386949
267
130
2.06
At1g56070
AC009894
26599
12925
2.06
At2g43940
AC004005
607
294
2.06
At4g04610
U53864
1154
559
2.07
At3g13340
AY048298
1955
945
2.07
At5g59220
AB016890
282
137
2.07
At2g28960
AC005315
231
112
2.07
At2g19350
AC003058
210
101
2.08
At1g21960
ACO13482
298
144
2.08
At2g30860
AF372905
25890
12409
2.09
At2g45350
AC002387
585
280
2.09
At5g37640
L05363
11449
5488
2.09
At4g05320
L05363
11449
5488
2.09
At4g05050
L05363
11449
5488
2.09
At5g20620
L05363
11449
5488
2.09
At5g03240
L05363
11449
5488
2.09
At3g09790
L05363
11449
5488
2.09
At1g65350
L05363
11449
5488
2.09
At1g55060
L05363
11449
5488
2.09
At3g62250
L05363
11449
5488
2.09
At4g02890
L05363
11449
5488
2.09
At4g16690
AL161544
1258
601
2.1
At1g08640
AF370182
372
178
2.1
At2g02815
AF175994
283
134
2.1
At3g62150
AL138651
293
140
2.1
At1g56430
AC058785
641
306
2.1
At1g61370
AC004255
444
211
2.1
At3g24100
AF370331
463
220
2.1
At4g02140
AL161493
252
119
2.11
At3g46190
AL355775
210
100
2.11
At3g56260
AL163763
349
166
2.11
At2g21170
AF247559
20479
9650
2.12
At1g80280
AV547254
221
104
2.12
At3g21760
AF372973
1223
575
2.13
At1g14600
AC010657
413
193
2.14
At3g15650
AB017071
416
194
2.14
At2g25510
AC006300
14882
6928
2.15
At4g11440
AL050399
402
187
2.15
At5g03000
AL163002
249
116
2.15
At1g50560
AC012561
241
111
2.16
At3g04120
AC016829
19007
8803
2.16
At5g26000
AY045681
4323
1999
2.16
At1g15620
ACO13453
277
128
2.16
At1g65400
AF325110
2725
1260
2.16
At1g55290
AC027034
243
112
2.16
At1g50540
AC012561
241
111
2.16
At3g46890
AL096859
16966
7863
2.16
At1g61400
AC004255
248
115
2.16
At1g61430
AC004255
248
115
2.16
At1g61440
AC004255
248
115
2.16
NoAnno
AF003102
550
254
2.17
At3g47470
M63931
5758
2649
2.17
At4g01530
AL161492
212
98
2.17
At3g21750
AB025634
825
381
2.17
At2g18120
AC007212
258
119
2.17
At4g22020
AJ002892
3194
1468
2.18
At1g21310
AB031821
278
128
2.18
At1g49490
AJ002892
3194
1468
2.18
At4g27440
AY042883
279
128
2.18
At3g46250
AL355775
207
95
2.18
At2g40200
AF085279
212
97
2.19
At4g01310
AL161491
15461
7075
2.19
At5g65980
AB011474
204
93
2.19
At3g63290
AV543251
247
113
2.19
At5g27280
AF007271
303
139
2.19
At4g35100
AY049238
16586
7554
2.2
At2g22760
AC005617
203
92
2.2
At2g45960
AY049238
16586
7554
2.2
At2g16850
AY049238
16586
7554
2.2
At2g39310
AC004697
205
93
2.2
At3g61430
AY049238
16586
7554
2.2
At4g19700
AL024486
975
443
2.2
At2g14800
AC004705
483
219
2.21
At2g03020
AC004138
362
164
2.21
At3g60810
AL162295
261
118
2.21
At3g52145
AI995315
206
93
2.22
At2g16600
U40399
24863
11149
2.23
At2g30570
U93215
8840
3958
2.23
At3g53420
AY039579
20978
9407
2.23
At5g13510
AL391710
21808
9770
2.23
At4g35450
U70425
19189
8562
2.24
At3g61700
AV557897
238
106
2.24
At5g66570
AF372898
8498
3775
2.25
At2g46330
AC006526
18763
8298
2.26
At5g06540
AP002543
307
136
2.26
At3g15530
AC024081
1342
592
2.27
At1g20300
AC026234
653
286
2.28
At2g27385
AV531683
327
144
2.28
NoAnno
AF360265
27827
12129
2.29
At1g75350
AF370226
16420
7163
2.29
At1g30260
AC073506
4248
1858
2.29
At2g32290
AC005700
434
189
2.3
At3g46430
AL133298
19794
8588
2.3
At4g16370
AL161543
3197
1382
2.31
At1g44810
AY042861
277
120
2.32
At4g17980
AL021889
357
154
2.32
At5g52050
ABO15478
478
205
2.33
At3g50820
AJ145957
16012
6873
2.33
At5g42900
AB008264
7894
3370
2.34
At4g30750
AY037251
209
89
2.36
At2g31920
AC006533
210
89
2.36
At2g01300
AC006200
1094
461
2.37
At5g08280
X73535
25523
10707
2.38
At5g62300
AF370460
27616
11598
2.38
At5g50610
AB025619
222
93
2.38
At5g50710
AB025619
222
93
2.38
At3g07650
AC009176
4686
1965
2.39
At5g11780
AL163814
274
114
2.39
At4g32430
AL034567
394
164
2.4
At5g02500
X74604
20275
8429
2.41
At3g54890
AF326866
9157
3789
2.42
At3g59340
AF370505
692
284
2.43
At1g79850
Z11151
830
339
2.45
At2g21660
AY042826
613
250
2.45
At2g39320
AC004697
773
316
2.45
At2g21420
AC006841
260
106
2.45
At4g36010
AF360165
958
388
2.47
At4g13940
AF325037
26706
10790
2.48
At1g32080
AC084165
20969
8468
2.48
At4g01260
AL161491
227
91
2.48
At4g31830
AL049607
292
118
2.48
At3g24420
AP000382
8999
3623
2.48
At2g28900
AY045593
21483
8645
2.49
At1g63820
ACO10852
214
86
2.5
At5g16400
AF144386
19378
7696
2.52
At1g14320
AY045866
22985
9128
2.52
At1g27710
AC012375
213
85
2.52
At1g75690
AC006434
24943
9882
2.52
At3g44990
X92975
865
343
2.52
At5g06290
AF326871
22183
8782
2.53
At3g15630
AB017071
22541
8902
2.53
At5g01100
AL137189
595
235
2.53
At1g73810
AC012679
279
110
2.54
At5g14610
AL163792
30717
12004
2.56
At5g42530
AB016888
7812
3054
2.56
At2g28800
U89272
22626
8809
2.57
At2g36970
AC006922
308
120
2.57
At1g77110
AC002291
255
99
2.58
At1g28410
AC010155
257
99
2.6
At1g32990
AF325023
20190
7763
2.6
At5g63580
AB005234
209
80
2.62
At2g21800
AC007019
204
78
2.63
At2g33450
AC002332
25052
9518
2.63
At2g23910
AC005170
699
266
2.63
At2g19150
AC002392
206
78
2.64
At5g23660
AF095641
2931
1106
2.65
At3g21470
AB019232
401
151
2.66
At5g13630
Z68495
21783
8155
2.67
At2g42220
AY045616
20113
7535
2.67
At2g03190
AC005313
206
77
2.68
At1g44880
AC020576
245
91
2.68
At2g10350
AC020576
245
91
2.68
At4g03970
AC020576
245
91
2.68
At3g42530
AC020576
245
91
2.68
At3g01310
ACO10676
212
79
2.68
At3g45680
AL157735
258
95
2.72
At3g45690
AL157735
258
95
2.72
At2g10940
AC006429
8529
3119
2.73
At5g46110
AY037211
7130
2614
2.73
At2g41430
AC004625
8374
3041
2.75
At1g48300
AC007932
2604
935
2.78
At1g28760
AC007508
310
111
2.8
At1g44040
AC022314
360
129
2.8
At1g08790
AC003981
277
99
2.81
At5g63090
AB008265
223
80
2.81
At3g49910
AF370158
22291
7877
2.83
At3g12840
AB024033
220
77
2.84
At2g29280
AC004561
496
175
2.84
At1g12610
AC025417
293
103
2.85
At2g28460
AC006587
256
89
2.86
At2g38240
AC003028
282
98
2.87
At2g05070
AY045787
20173
6958
2.9
At2g05100
AY045787
20173
6958
2.9
At4g25050
T45818
15045
5121
2.94
At4g10260
AL049488
309
105
2.94
At1g49500
AF370563
22168
7513
2.95
At5g58310
ABO19228
1438
487
2.95
At3g45520
AL161500
215
72
2.97
At4g04380
AL161500
215
72
2.97
At3g25290
AB026647
307
103
2.99
At3g01500
AC009325
616
205
3
At4g24420
AL078637
202
67
3
At3g43600
AB005805
19762
6576
3.01
At5g11370
AL360314
236
78
3.01
At2g28000
AC006929
27972
9297
3.01
At5g39670
AB012243
291
96
3.03
At5g24780
AF386930
375
123
3.05
At1g23310
AF360195
31336
10247
3.06
At2g34420
X64460
7379
2403
3.07
At3g21640
AJ224640
20590
6686
3.08
At5g15960
X55053
22316
7183
3.11
At5g15970
X55053
22316
7183
3.11
At3g01600
AC009325
233
75
3.11
At4g32540
AL050398
303
97
3.12
At2g11820
AB047398
207
66
3.12
At4g17350
AL161546
215
69
3.13
At1g04270
AY048221
22066
7025
3.14
At2g17180
AC007127
345
109
3.15
At4g21280
AL021960
7348
2313
3.18
At3g53290
AL132958
228
71
3.2
At5g44980
AB010693
210
65
3.22
At2g30950
AF135189
29571
9161
3.23
At3g12430
AC069474
270
83
3.24
At4g32490
AL034567
261
81
3.25
At1g69990
AC002062
249
76
3.26
At5g05250
AB010692
1176
358
3.28
At3g56360
AL163972
1291
391
3.3
At1g72150
AY045913
24133
7291
3.31
At4g21990
U53865
1684
509
3.31
At2g30840
AC004669
308
93
3.32
At1g41810
AC022456
240
71
3.37
At5g29090
AC022456
240
71
3.37
At5g32610
AC022456
240
71
3.37
At3g59170
AL356014
217
64
3.41
At5g37470
AP000607
223
65
3.45
At2g25040.a
AV558611
287
83
3.46
At3g32370.a
AV558611
287
83
3.46
At5g37300
AB017069
753
217
3.48
At4g22214
AL021712
256
73
3.51
At1g48700
AC073555
275
78
3.52
At1g55850
AC002304
267
75
3.57
At1g04920
AC004809
362
99
3.64
At4g03280
AJ243702
1486
400
3.71
At1g35660.a
AC007887
203
55
3.73
At4g27110
AL035680
201
51
3.9
At2g04820
AC006955
341
85
4.01
At1g75910
AC007396
205
51
4.04
At3g21980
AB028622
215
52
4.15
At3g27830
AP000371
25310
6009
4.21
At1g74080
AC016662
352
83
4.26
At2g17850
AC003952
277
65
4.29
At2g45570
AC003680
251
58
4.33
At3g56040
AV548493
280
62
4.49
At5g25980
AF360348
28538
6306
4.53
At3g43580
AL391734
222
48
4.61
At5g38710
AB011478
376
78
4.81
At3g12760
AB024033
271
50
5.41
At1g32920.a
BE522104
235
28
8.35
W, дикий тип; М, мутант.
Ссылки
Amerik, A.Y., and Hochstrasser, M. (2004). Mechanism and function of deubiquitinating enzymes. BBA 1695, 189-207.
Ang, L.H., Chattopadhyay, S., Wei, N., Oyama, Т., Okada, K., Batschauer, A., and Deng, X.W. (1998). Molecular interaction between COP1 and HY5 defines a regulatory switch for light control of Arabidopsis development. Mol Cell 1,213-222.
Baek, K.H., Mondoux, M.A., Jaster, R., Fire-Levin, E., and D'Andrea, A.D. (2001). DUB-2A, a new member of the DUB subfamily of hematopoietic deubiquitinating enzymes. Blood 98, 636-642.z767
Balakirev, M.Y., Tcherniuk, S.O., Jaquinod, M., and Chroboczek, J. (2003). Otubains: a new family of cysteine proteases in the ubiquitin pathway. EMBO Rep 4, 517-522.
Burnett, В., Li, F., and Pittman, R.N. (2003). The polyglutamine neurodegenerative protein ataxin-3 binds polyubiquitylated proteins and has ubiquitin protease activity. Hum Mol Genet 12, 3195-3205.
Byrne, M.E., Groover, A.T., Fontana, J.R., and Martienssen, R.A. (2003). Phyllotactic pattern and stem cell fate are determined by the Arabidopsis homeoboxgene BELLRINGER. Development 130, 3941-3950.
Chandler, J.S., McArdle, В., and Callis, J. (1997). AtUBP3 and AtUBP4 are two closely related Arabidopsis thaliana ubiquitin-specific proteases present in the nucleus. Mol Gen Genet 255, 302-310.
Crosas, В., Hanna, J., Kirkpatrick, D.S., Zhang, D.P., Tone, Y., Hathaway, N.A., Buecker, C., Leggett, D.S., Schmidt, M., King, R.W., Gygi, S.P., and Finley, D. (2006). Ubiquitin chains are remodeled at the proteasome by opposing ubiquitin ligase and deubiquitinating activities. Cell 127, 1401-1413.
Doelling, J.H., Yan, N., Kurepa, J, Walker, J, and Vierstra, R.D. (2001). The ubiquitin-specific protease UBP14 is essential for early embryo development in Arabidopsis thaliana. Plant J 27, 393-405.
Fleury, D., Himanen, K., Cnops, G., Nelissen, H., Boccardi, T.M., Maere, S., Beemster, G.T, Neyt, P., Anami, S., Robles, P., Micol, J.L, Inze, D., and Van Lijsebettens, M. (2007). The Arabidopsis thaliana Homolog of Yeast BRE1 Has a Function in Cell Cycle Regulation during Early Leaf and Root Growth. Plant Cell.
Gross, C.T., and McGinnis, W. (1996).,DEAF-1, a novel protein that binds an essential region in a Deformed response element. EMBO J. 15, 1961-1970.
Hanna, J., Hathaway, N.A., Tone, Y., Crosas, В., Elsasser, S., Kirkpatrick, D.S., Leggett, D.S., Gygi, S.P., King, R.W., and Finley, D. (2006). Deubiquitinating enzyme Ubp6 functions noncatalytically to delay proteasomal degradation. Cell 127,99-111.
Hershko, A., and Ciechanover, A. (1998). The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479.
Hochstrasser, M. (1996). Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Genet. 30, 405-439.
Hofmann, К., and Bucher, P. (1996). The DBA domain: a sequence motif present in multiple enzyme classes of the ubiquitination pathway. Trends Biochem Sci 21, 172-173.
Horiguchi, G., Kirn, G.T., and Tsukaya, H. (2005). The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana. Plant J 43, 68-78.
Hu, M., Li, P., Li, M., Li, W, Yao, Т., Wu, J.W., Gu, W., Cohen, R.E-, and Shi, Y. (2002). Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell 111, 1041-1054.
Johnston, S.C., Riddle, S.M., Cohen, R.E., and Hill, C.P. (1999). Structural basis for the specificity of ubiquitin C-terminal hydrolases. Embo J 18, 3877-3887.
Johnston, S.C., Larsen, C.N., Cook, W.J, Wilkinson, K.D., and Hill, C.P. (1997). Crystal structure of a deubiquitinating enzyme (human UCH-L3) at 1.8 A resolution. Embo J 16, 3787-3796.
Kim, J.H., and Kende, H. (2004). A transcriptional coactivator, AtGIFI, is involved in regulating leaf growth and morphology in Arabidopsis. Proc NatI Acad Sci U S A 101, 13374-13379.
Kumar, S., Tamura, K., and Nei, M. (2004). MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform5, 150-163.
Lutterbach, В., Sun, D, Schuetz, J., and Hiebert, S.W. (1998a). The MYND motif is required for repression of basal transcription from the multidrug resistance 1 promoter by the t (8; 21) fusion protein. Mol. Cell. Biol. 18, 3604-3611.
Lutterbach, В., Westendorf, J.J., Linggi, В., Patten, A., Moniwa, M., Davie, J.R., Huynh, K.D., Bardwell, V.J., Lavinsky, R.M., Rosenfeld, M.G., Glass, C., Seto, E., and Hiebert, S.W. (1998b). ETO, a target of t (8; 21) in acute leukemia, interacts with the N-CoR and mSin3 corepressors. Mol. Cell Biol. 18, 7176-7184.
Ma, L., Sun, N, Liu, X., Jiao, Y., Zhao, H., and Deng, X.W. (2005). Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol 138,80-91.
Ma, L., Gao, Y., Qu, L, Chen, Z., Li, J., Zhao, H., and Deng, X.W. (2002). Genomic evidence for COP1 as a represser of light-regulated gene expression and development in Arabidopsis. Plant Cell 14, 2383-2398.
Maere, S., Heymans, K., and Kuiper, M. (2005). BiNGO: a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks. Bioinformatics21, 3448-3449.
Masselink, H., and Bernards, R. (2000). The adenovirus E1A binding protein BS69 is a corepressor of transcription through recruitment of N-CoR. Oncogene 19, 1538-1546.
Mueller, T.D., and Feigon, J. (2002). Solution structures of UBA domains reveal a conserved hydrophobic surface for protein-protein interactions. J Mol Biol 319, 1243-1255.
Nanao, M.H., Tcherniuk, S.O., Chroboczek, J., Dideberg, O., Dessen, A., and Balakirev, M.Y. (2004). Crystal structure of human otubain 2. EMBO Rep 5, 783-788.
Nijman, S.M., Luna-Vargas, M.P., Velds, A., BruMMelkamp, T.R., Dirac, A.M., Sixma, Т.К., and Bernards, R. (2005). A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell 123, 773-786.
Papa, F.R., and Hochstrasser, M. (1993). The yeast DOA4 gene encodes a deubiquitinating enzyme related to a product of the human tre-2 oncogene. Nature 366, 313-319.
Park, Y.C., Burkitt, V., Villa, A.R., Tong, L., and Wu, H. (1999). Structural basis for self-association and receptor recognition of human TRAF2. Nature 398, 533-538.
Pickart, C.M. (2004). Back to the future with ubiquitin. Cell 116, 181-190.
Qin, G., Gu, H., Zhao, Y., Ma, Z., Shi, G., Yang, Y., Pichersky, E., Chen, H., Liu, M., Chen, Z., and Qu, L.J. (2005). An indole-3-acetic acid carboxyl methyltransferase regulates Arabidopsis leaf development. Plant Cell 17, 2693-2704.
Rao-Naik, С., Chandler, J.S., McArdle, В., and Callis, J. (2000). Ubiquitin-specific proteases from Arabidopsis thaliana: cloning of AtUBP5 and analysis of substrate specificity ofAtUBP3, AtUBP4, and AtUBP5 using Escherichia coli in vivo and in vitro assays. Arch Biochem Biophys 379, 198-208.
Scheel, H., Tomiuk, S., and Hofmann, K. (2003). Elucidation of ataxin-3 and ataxin-7 function by integrative bioinformatics. Hum Mol Genet 12, 2845-2852.
Sunnerhagen, M., Pursglove, S., and Fladvad, M. (2002). The new MATH: homology suggests shared binding surfaces in meprin tetramers and TRAF trimers. FEBS Lett 530, 1-3.
Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson, T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22, 4673-4680.
Tsukaya, H. (2006). Mechanism of leaf-shape determination. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 477-496.
Varshavsky, A. (1997). The ubiquitin system. TIBS 22, 383-387.
Verma, R., Aravind, L, Oania, R., McDonald, W.H., Yates, J.R., 3rd, Koonin, E.V., and Deshaies, R.J. (2002). Role of Rpn11 metalloprotease in deubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Science 298, 611-615.
Weigel, D., and Glazebrook, J. (2002). Arabidopsis A laboratory Manual. (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Weissman, A.M. (2001). Themes and variations on ubiquitylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 169-177.
Wilkinson, K.D. (1997). Regulation of ubiquitin-dependent processes by deubiquitinating enzymes. FASEB J. 11, 1245-1256.
Wilkinson, K.D. (1999). Ubiquitin-dependent signaling: the role of ubiquitination in the response of cells to their environment. J Nutr 129, 1933-1936.
Yan, N, Doelling, J.H, Falbel, T.G., Durski, A.M., and Vierstra, R.D. (2000). The ubiquitin-specific protease family from Arabidopsis. AtUBPI and 2 are required for the resistance to the amino acid analog canavanine. Plant Physiol 124, 1828-1843.
Yang, J., Lin, R., Sullivan, J-, Hoecker, U., Liu, В., Xu, L., Deng, X.W., and Wang, H. (2005). Light regulates COP1-mediated degradation of HFR1, a transcription factor essential for light signaling in Arabidopsis. Plant Cell 17, 804-821.
Ye, H., Park, Y.C, Kreishman, M., Kieff, E., and Wu, H. (1999). The structural basis for the recognition of diverse receptor sequences by TRAF2. Mol Cell 4, 321-330.