МОЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ
DETERGENT COMPOSITION

Ссылка на перечень последовательностей
Данная заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение касается моющей и фармацевтической композиции, содержащей дезоксирибонуклеазу (ДНКаза), при этом ДНКазу получают из источника, относящегося к грибам. Оно дополнительно касается способа стирки и применения ДНКазы. Настоящее изобретение дополнительно относится к полипептидам, обладающим активность ДНКазы, нуклеотидам, кодирующим полипептид, а также способам получения полипептидов.
Предпосылки изобретения
Микроорганизмы, как правило, существуют прикрепленными к поверхностям во многих природных, промышленных и медицинских средах, инкапсулированными внеклеточными веществами, в том числе биополимерами и макромолекулами. Полученный в результате слой инкапсулированного в слизи микроорганизма называют биопленкой. Биопленки представляют собой преобладающий механизм роста бактерий в природной среде, и бактерии, растущие в биопленках, проявляют отличающиеся физиологические свойства. По сравнению с их планктонно растущими эквивалентами, бактерии в биопленке являются более устойчивыми к воздействию антибиотиков, УФ-облучению, моющим средствам и иммунному ответу хозяина.
Биопленка может включать один или несколько микроорганизмов, в том числе грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, водорослей, простейших, и/или дрожжей, или нитчатых грибов и вирусов, и/или бактериофагов. Примерами спорных биопленок являются зубной налет, инфекции на медицинских имплантантах, но также исходное загрязнение на корпусах судов. Биопленки приписываются патогенезу многих инфекций человека и представляют собой существенную проблему в промышленности с точки зрения биозагрязнения открытых поверхностей, где колонизация биопленки может образовывать основной компонент локализованной экосистемы, который может разрушать и препятствовать промышленным процессам и компонентам.
Если применяют такие изделия, подлежащие стирке, как футболки или спортивная одежда, они подвергаются воздействию бактерий тела пользователя и остальной окружающей среды, в которой их применяют. Некоторые из данных бактерий способны налипать на изделие, подлежащее стирке, и образовывать биопленку на данном изделии. Присутствие бактерий подразумевает, что изделия, подлежащие стирке, становятся липкими и, следовательно, грязь налипает на липкие области. Данная грязь является сложной в устранении с помощью коммерчески доступных моющих композиций. Кроме того, если сильно загрязненные изделия, подлежащие стирке, стирают вместе с менее загрязненными изделиями, подлежащими стирке, загрязнение, присутствующее в моющем растворе, стремится налипать на биопленку. В результате этого изделие, подлежащее стирке, является более "загрязненным" после, чем перед стиркой. Кроме того, данные бактерии являются источником плохого запаха, который развивается после применения изделия, подлежащего стирке. Плохой запах сложно устранить и он может оставаться даже после стирки. Причиной данного плохого запаха является налипание бактерий на текстильную поверхность. По причине налипания на текстиль бактерии могут оставаться даже после стирки и продолжать быть источником плохого запаха.
Международная заявка на патент WO 2011/098579 касается бактериологических соединений дезоксирибонуклеазы и способов разрушения и предотвращения образования биопленки.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение касается моющей композиции, содержащей дезоксирибонуклеазу (ДНКаза) и вспомогательный ингредиент моющего средства, где ДНКазу получают из источника, относящегося к грибам.
Настоящее изобретение дополнительно касается способа очищения или стирки для очищения или стирки изделия, включающего следующие стадии:
a. воздействие на изделие моющим раствором, содержащим ДНКазу, относящуюся к грибам, или моющей композицией, содержащей ДНКазу, относящуюся к грибам;
b. завершение по меньшей мере одного цикла стирки и
c. необязательно полоскание изделия,
где изделие представляет собой текстильное.
Кроме того, заявляется применение ДНКазы для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки изделия.
Настоящее изобретение дополнительно относится к полипептидам, обладающим активностью ДНКазы, нуклеотидам, кодирующим полипептид, и способам получения полипептида.
Определения
Аллельный вариант.
Выражение "аллельный вариант" означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в естественных условиях вследствие мутации и может приводить в результате к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть в неструктурном гене (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.
Биопленка:
Биопленкой является любая группа микроорганизмов, в которой клетки прилипают друг к другу на поверхности, такой как текстиль, предметы посуды или твердая поверхность. Данные налипшие клетки часто встроены внутрь образованной ими матрицы внеклеточного полимерного вещества (EPS). Биопленка EPS представляет собой полимерную конгломерацию, как правило, состоящую из внеклеточной ДНК, белков и полисахариды. Биопленки могут образовываться на живых или неживых поверхностях. Рост микробных клеток в биопленке физиологически отличается от планктонных клеток того же организма, которые, в отличие от этого, представляют собой отдельные клетки, которые могут держаться на поверхности или плавать в жидкой среде.
Бактерии, живущие в биопленке, обычно имеют значительно отличающиеся свойства от свободно плавающих бактерий того же вида, поскольку густая и защищенная среда пленки позволяет им объединяться и взаимодействовать различными способами. Одним преимуществом данной среды является повышенная устойчивость к моющим средствам и антибиотикам, поскольку плотная внеклеточная матрица и наружный слой клеток защищают внутреннюю часть сообщества.
На изделиях, подлежащих стирке, образующие биопленку бактерии могут быть обнаружены в числе следующих видов: Acinetobacter sp., Aeromicrobium sp., Brevundimonas sp., Microbacterium sp., Micrococcus luteus, Pseudomonas sp., Staphylococcus epidermidis и Stenotrophomonas sp.
кДНК
:
Выражение "кДНК" означает молекулу ДНК, которую можно получить посредством обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической или прокариотической клетки. В кДНК отсутствуют последовательности интронов, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который подвергается процессингу в течение ряда стадий, в том числе сплайсинга, до того, как станет зрелой сплайсированной мРНК.
Кодирующая последовательность.
Выражение "кодирующая последовательность" означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность полипептида. Границы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК или их сочетание.
Цветовое различие (
):
L-значение Цветовое пространство Lab представляет собой цветоппонентное пространство с величиной L для яркости. L-значение, L* обозначает самый темный черный при L*=0, и самый светлый белый при L*=100. В контексте настоящего изобретения L-значение также называют цветовым различием.
Регуляторные последовательности
.
Выражение "регуляторные последовательности" означает последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего зрелый полипептид по настоящему изобретению. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной (т.е. из того же гена) или чужеродной (т.е. из другого гена) по отношению к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, или нативной или чужеродной по отношению к другой таковой. Такие регуляторные последовательности включают в себя без ограничения лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, регуляторные последовательности включают в себя промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. В регуляторных последовательностях могут быть предусмотрены линкеры с целью введения специфических сайтов рестрикции, способствующих лигированию регуляторных последовательностей с кодирующим участком полинуклеотида, кодирующего полипептид.
Под термином "глубокое очищение" подразумевают разрушение или устранения биопленки или компонентов биопленки, таких как полисахариды, белки, ДНК, грязь или другие компоненты, присутствующие в биопленке.
Вспомогательный ингредиент моющего средства.
Вспомогательный ингредиент моющего средства отличается от ДНКазы по настоящему изобретению. Точная природа данных дополнительных вспомогательных ингредиентов моющего средства и количества, в которых их включают, будут зависеть от физической формы композиции и природы процесса, для которого ее применяют. Подходящие вспомогательные материалы включают без ограничения компоненты, описанные ниже, такие как поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, флокулирующая добавка, хелатирующие средства, ингибиторы переноса красителя, ферменты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для устранения/средства против переосаждения глинистой грязи, осветлители, подавители образования мыльной пены, красители, отдушки, средства, обеспечивающие эластичность структуры, мягчители тканей, носители, гидротропы, моющие компоненты и дополнительные моющие компоненты, окрашивающие средства для тканей, противовспенивающие средства, диспергирующие средства, технологические добавки и/или пигменты.
Моющая композиция
Термин "моющая композиция" относится к композициям, которые находят применение в устранении нежелательных соединений с изделий, подлежащих очистке, таких как текстильные изделия. Моющую композицию можно применять, например, для очищения текстильных изделий как для очистки в домашних условиях, так и промышленной очистки. Термины охватывают любые материалы/соединения, выбранные для конкретного типа желаемой композиции для очистки и формы продукта (например, жидкость, гель, порошок, гранулят, паста или композиции для распыления) и включает без ограничения моющие композиции (например, жидкие и/или твердые моющие средства для стирки и моющие средства для тонких тканей; освежители тканей; мягчители тканей; и пятновыводители для текстильных изделий и стирки/средства для предварительной обработки). В дополнение к содержанию фермента по настоящему изобретению, состав моющего средства может содержать один или несколько дополнительных ферментов (например, протеазы, амилазы, липазы, кутиназы, целлюлазы, эндоглюканазы, ксилоглюканазы, пектиназы, пектин-лиазы, ксантаназы, пероксидазы, галогенпероксигеназы, каталазы и маннаназы или любую их смесь) и/или дополнительных ингредиентов моющего средства, таких как поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, комплексообразователи или хелатирующие средства, отбеливающую систему или отбеливающие компоненты, полимеры, кондиционирующие средства для тканей, пенообразователи, подавители образования мыльной пены, красители, отдушку, ингибиторы потускнения, оптические осветлители, бактерициды, фунгициды, средства, суспендирующие грязь, антикоррозионные средства, ингибиторы или стабилизаторы ферментов, активаторы ферментов, трансферазу(трансферазы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, виды синьки и флуоресцентные красители, антиоксиданты и солюбилизаторы.
ДНКаза (дезоксирибонуклеаза):
Термин "ДНКаза" означает полипептид с активностью ДНКазы, который катализирует гидролитическое расщепление связей сложного фосфодиэфира в основе ДНК, разрушая таким образом ДНК. В целях настоящего изобретения активность ДНКазы определяют в соответствии с процедурой, описанной в анализе I. В одном аспекте полипептиды по настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% активности ДНКазы зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению обладают улучшенной активностью ДНКазы, например, таким образом, что активность ДНКазы полипептида составляет по меньшей мере 105%, например, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120%, по меньшей мере 130%, по меньшей мере 140%, по меньшей мере 160%, по меньшей мере 170%, по меньшей мере 180%, или по меньшей мере 200% относительно активности ДНКазы зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2.
Преимущество моющей способности под действием фермента
. Термин "преимущество моющей способности под действием фермента" в данном документе определяют как полезный эффект, который фермент может придать моющем средству по сравнению с таким же моющим средством без фермента. Важными преимуществами моющей способности под действием фермента, которые могут быть обеспечены ферментами, являются устранение пятен без видимых загрязнений или с очень небольшим их количеством после стирки и/или очистки, предотвращение или уменьшение переосаждения грязи, высвобожденных в процессе мытья (эффект, который также называется препятствованием переосаждению), полное или частичное восстановление белизны текстильных изделий, которые изначально были белыми, но после многократного использования и стирки приобрели сероватый или желтоватый внешний вид (эффект, который также называется отбеливанием). Преимущества, связанные с уходом за текстильными изделиями, которые непосредственно не относятся к каталитическому устранению пятен или предотвращению переосаждения грязи, также являются важными преимуществами моющей способности под действием фермента. Примерами таких преимуществ, связанных с уходом за текстильными изделиями, являются предотвращение или уменьшение переноса красителя с одной ткани на другую ткань или другую часть той же ткани (эффект, который также называется ингибированием переноса красителя или препятствованием переотложению красителя), устранение выступающих или порванных волокон с поверхности ткани для уменьшения склонности к скатыванию волокна в узелки или устранения уже существующих узелков или распушки (эффект, который также называется препятствованием скатыванию волокна в узелки), улучшение мягкости ткани, осветление цвета ткани и устранение грязи в форме мелких частиц, захваченных волокнами ткани или предмета одежды. Отбеливание при помощи ферментов представляет собой дополнительное преимущество моющей способности под действием фермента, причем каталитическая активность, как правило, используется для катализа образования отбеливающих компонентов, таких как пероксид водорода или другие пероксиды.
Экспрессия.
Выражение "экспрессия" предусматривает любую стадию, связанную с образованием полипептида, в том числе без ограничения, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.
Вектор экспрессии.
Выражение "вектор экспрессии" означает линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, и функционально связана с регуляторными последовательностями, которые обеспечивают ее экспрессию.
Фрагмент.
например
например
например
например
Термин "фрагмент" означает полипептид, у которого отсутствуют один или несколько (, некоторое число) аминокислот с амино и/или карбоксильного конца зрелого полипептида или домена; где фрагмент обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 206 аминокислотных остатков (, аминокислоты с 1 по 206 в SEQ ID NO: 2), по меньшей мере 205 аминокислотных остатков (, аминокислоты с 2 по 206 в SEQ ID NO: 2) или по меньшей мере 204 аминокислотных остатков (, аминокислоты с 3 по 206 в SEQ ID NO: 2).
Относящийся к грибам:
В контексте настоящего изобретения термин "относящийся к грибам" относительно полипептида (такого как фермент, например ДНКаза) относится к полипептиду, кодируемому и, таким образом, непосредственно получаемому из генома гриба, при этом такой гриб не был генетически модифицирован для кодирования указанного полипептида, например, посредством введения кодирующей последовательности в геном посредством методики рекомбинантной ДНК. В контексте настоящего изобретения термин "ДНКаза, относящаяся к грибам" или "полипептид, обладающий активностью ДНКазы, полученной из источника, относящегося к грибам", таким образом, относится к ДНКазе, кодируемой и, таким образом, непосредственно получаемой из генома видов грибов, где виды грибов не подвергались генетической модификации, вводящей рекомбинантную ДНК, кодирующую указанную ДНКазу. Таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, относящийся к грибам, обладающий активностью ДНКазы, представляет собой последовательность, в естественных условиях находящуюся в генетическом окружении видов грибов. Полипептид, относящийся к грибам, обладающий активностью ДНКазы, кодируемый такой последовательностью, также может относится к ДНКазе дикого типа (исходной ДНКазе). В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает полипептиды, обладающие активностью ДНКазы, где указанные полипептиды по сути гомологичны ДНКазе, относящейся к грибам. В контексте настоящего изобретения термин "по сути гомологичный" обозначает полипептид, обладающий активностью ДНКазы, который по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичен аминокислотной последовательности выбранной ДНКазы, относящейся к грибам. Полипептиды, по сути гомологичные ДНКазе, относящейся к грибам, могут быть включены в моющее средство по настоящему изобретению и/или могуть быть использованы в способах по настоящему изобретению.
Клетка-хозяин.
Термин «клетка-хозяин» означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин "клетка-хозяин" охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, происходящих в течение репликации.
Улучшенная эффективность смывания
Термин "улучшенная эффективность смывания" в данном документе относится к ферменту, проявляющему увеличенную эффективность смывания в моющей композиции относительно эффективности смывания той же моющей композиции без фермента, например, посредством увеличенного устранения пятен или меньшего переосаждения. Термин "улучшенная эффективность смывания" включает эффективность смывания при стирке.
Выделенный.
например
Термин "выделенный" означает вещество в форме или среде, которое не встречается в естественных условиях. Неограничивающие примеры выделенных веществ предусматривают (1) любое не встречающееся в естественных условиях вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично отделены от одного или нескольких, или всех, встречающихся в естественных условиях, составляющих, с которыми они связаны в естественных условиях; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с таким веществом, встречающимся в природе или (4) любое вещество, модифицированное посредством увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в естественных условиях (, рекомбинантное получение в клетке-хозяине; несколько копий гена, кодирующего вещество; и применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в естественных условиях с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментативного бульона; например клетка-хозяин может быть генетически модифицирована для экспрессии полипептида по настоящему изобретению. Ферментативный бульон из такой клетки-хозяина будет содержать выделенный полипептид.
Стирка.
Термин "стирка" относится как к стирке в домашних условиях, так и к промышленной стирке и означает способ обработки текстильных изделий раствором, содержащим очищающую или моющую композицию по настоящему изобретению. Процесс стирки, например, можно осуществлять с применением, например, домашней или промышленной стиральной машины или можно осуществлять вручную.
Под термином "неприятный запах" понимают запах, который не является желательным на чистых изделиях. Очищенное изделие должно иметь свежий и чистый запах без неприятных запахов, оставшихся на изделии. Одним примером неприятного запаха являются соединения с неприятным запахом, которые могут быть образованы микроорганизмами. Другой пример представляет собой неприятные запахи, которые могут представлять собой запах пота или запах тела, оставшиеся на изделии, которое контактировало с телом человека или животного. Другим примером неприятного запаха может быть запах пряностей, который остается на изделиях, например, карри или другие экзотические пряности, которые сильно пахнут. Одним способом измерения способности изделия поглощать неприятный запах является применение анализа II, раскрытого в данном документе.
Зрелый полипептид.
например
например
Термин "зрелый полипептид" означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. В одном аспекте зрелый полипептид образован аминокислотами 1-206 в SEQ ID NO: 2 и аминокислоты с -37 по -16 в SEQ ID NO: 2 представляют собой сигнальный полипептид и аминокислоты с -15 по -1 в SEQ ID NO: 2 представляют собой пропептид. Из уровня техники известно, что клетка-хозяин может вырабатывать смесь из двух или более различных зрелых полипептидов (т.е. с другой C-концевой и/или N-концевой аминокислотой), экспрессируемых одним и тем же полинуклеотидом. Из уровня техники также известно, что в различных клетках-хозяевах процессинг полипептидов осуществляется различным образом, и, таким образом, одна клетка-хозяин, экспрессирующая полинуклеотид, может вырабатывать другой зрелый полипептид (например, с другой C-концевой и/или N-концевой аминокислотой) по сравнению с другой клеткой-хозяином, экспрессирующей один и тот же полинуклеотид. В одном аспекте зрелые полипептиды содержат до 206 аминокислотных остатков и в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 9 (, аминокислоты 1-206 в SEQ ID NO: 2), или до 204 аминокислотных остатков (, аминокислоты 3-206 в SEQ ID NO: 2).
Последовательность, кодирующая зрелый полипептид.
Термин "последовательность, кодирующая зрелый полипептид" означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий активностью ДНКазы. В одном аспекте последовательность, кодирующая зрелый полипептид, представляет собой объединенные нуклеотиды 1-242, 309-494, 556-714 и 766-907 в SEQ ID NO: 1.
Конструкция нуклеиновой кислоты
.
Выражение "конструкция нуклеиновой кислоты" означает одно- или двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из встречающегося в естественных условиях гена, или модифицированную с тем, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот в таком порядке, который в иных случаях не может существовать в естественных условиях, или являющуюся синтетической, которая содержит одну или несколько регуляторных последовательностей.
Функционально связанный.
Выражение "функционально связанный" означает конфигурацию, при которой регуляторная последовательность размещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что регуляторная последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.
Фармацевтический вспомогательный ингредиент
означает любое фармацевтическое вспомогательное вещество, подходящее для составления фармацевтического соединения.
Такие вспомогательные вещества, носители, среды-носители и т.д. хорошо известны специалисту в данной области и описаны в пособиях, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые подходят для применения в таблетированных составах, включают, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактозу, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и разрыхляющие средства, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие средства, например крахмал, желатин или камедь, и смазывающие средства, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми или они могут быть покрыты с помощью известных методик для задержки разрушения и поглощения в желудочно-кишечном тракте и обеспечивать таким образом замедленное действие в течение более длительного периода. Например, можно использовать материал для задержки времени действия, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.
Для составов в форме твердых желатиновых капсул активный ингредиент можно смешивать с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином. Для составов в форме мягких желатиновых капсул активный ингредиент можно смешивать с водной или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Наполнители, подходящие для производства водных суспензий, включают суспендирующие средства, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие средства могут представлять собой встречающийся в природе фосфатид, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиэтиленсорбитанмоноолеат.
Водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например бензоатов, таких как этил или н-пропил п-гидроксибензоат, один или несколько красящих средств, один или несколько ароматизирующих средств и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Масляные суспензии могут быть составлены посредством суспендирования активных ингредиентов в растительном масле, например, в арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Можно добавлять подсластители и ароматизирующие средства. Данные композиции могжно хранить посредством добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Значение отражения
: Эффективность смывания выражают в виде значения отражения окрашенных образцов. После стирки и прополаскивания образцы раскладывали плашмя и обеспечивали возможность высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение ночи. Все образцы для стирки оценивали на следующий день после стирки. Оценки отражения света образцов осуществляли с использованием отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000 с очень маленькой апертурой. Измерения проводили без использования УФ-излучения в отраженном свете и получали значения отражения при 460 нм.
Идентичность последовательностей.
Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром "идентичность последовательностей". В целях настоящего изобретения идентичность последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, помеченные как "наиболее длинный идентичный участок" (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:
(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).
В контексте настоящего изобретения идентичность последовательности для двух последовательностей дезоксирибонуклеотидов определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EM-BOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, помеченные как "наиболее длинный идентичный участок" (полученные с применением опции -  nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:
(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).
Текстильное изделие
. Выражение ʺтекстильное изделиеʺ означает любой текстильный материал, в том числе пряжу, промежуточные продукты из пряжи, волокна, нетканые материалы, природные материалы, синтетические материалы и любой другой текстильный материал, ткани, изготовленные из этих материалов, и продукты, изготовленные из тканей (например, предметы одежды, и другие изделия). Текстильное изделие или ткань может быть в форме трикотажных изделий, тканых изделий, изделий из грубой хлопчатобумажной ткани, нетканых изделий, войлочных изделий, пряжи и ткани для полотенец. Текстильное изделие может быть на основе целлюлозы, например, природные целлюлозные полимеры, в том числе хлопок, волокна льна/льняное полотно, джутовое изделие, волокна рами, сизаль или кокосовые волокна, или созданные человеком целлюлозные полимеры (например, полученные из древесной пульпы), в том числе вискоза/искусственный шелк, волокна из ацетата целлюлозы (триацетатные), лиоцелл, или их смеси. Текстильное изделие или ткань также могут быть отличными от целлюлозных, например, природные полиамиды, в том числе шерсть, верблюжья шерсть, кашемир, мохер, кроличья шерсть и шелк, или синтетический полимер, например, нейлон, арамид, сложный полиэфир, полимер на основе акрилонитрила, полипропилен и спандекс/эластан, или их смеси, а также смесь волокон на основе целлюлозы и волокон, отличных от целлюлозных. Примерами смесей являются смеси хлопка и/или искусственного шелка/вискозы с одним или несколькими дополнительными материалами, такими как шерсть, синтетическое волокно (например, полиамидное волокно, акриловое волокно, полиэфирное волокно, поливинилхлоридное волокно, полиуретановое волокно, полимочевинное волокно, арамидное волокно) и/или целлюлозосодержащее волокно (например, искусственный шелк/вискоза, волокна рами, волокна льна/льняное полотно, джутовая ткань, волокно из ацетата целлюлозы, лиоцелл). Ткань может представлять собой белье, пригодное для обычной стирки, например, испачканное домашнее белье. При использовании выражения ткань или предмет одежды предусматривается, что оно также включает более общее выражение текстильные изделия. В контексте настоящего изобретения термин "текстильное изделие" также охватывает ткани.
Условия жесткости
.Выражение "условия очень низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 45°C.
Выражение "условия низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 50°C.
Выражение "условия умеренной жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 55°C.
Выражение "условия умеренно высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.
Выражение "условия высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 65°C.
Выражение "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 70°C.
Подпоследовательность.
например
например
например
например
Выражение "подпоследовательность" означает полинуклеотид, у которого отсутствуют один или несколько (, некоторое количество) нуклеотидов с 5' и/или 3' конца кодирующей последовательности зрелого полипептида; причем подпоследовательность кодирует фрагмент, обладающий активностью ДНКазы. В одном аспекте подпоследовательность содержит по меньшей мере 796 нуклеотидов (, нуклеотиды 112-907 в SEQ ID NO: 1), по меньшей мере 793 нуклеотидов (, нуклеотиды 115-907 в SEQ ID NO: 1), по меньшей мере 790 нуклеотидов (, нуклеотиды 118-907 в SEQ ID NO: 1).
Текстильное изделие
. Выражение ʺтекстильное изделиеʺ означает любой текстильный материал, в том числе пряжу, промежуточные продукты из пряжи, волокна, нетканые материалы, природные материалы, синтетические материалы и любой другой текстильный материал, ткани, изготовленные из этих материалов, и продукты, изготовленные из тканей (например, предметы одежды, и другие изделия). Текстильное изделие или ткань может быть в форме трикотажных изделий, тканых изделий, изделий из грубой хлопчатобумажной ткани, нетканых изделий, войлочных изделий, пряжи и ткани для полотенец. Текстильное изделие может быть на основе целлюлозы, например, природные целлюлозные полимеры, в том числе хлопок, волокна льна/льняное полотно, джутовая ткань, волокна рами, сизаль или кокосовые волокна, или созданные человеком целлюлозные полимеры (например, полученные из древесной пульпы), в том числе вискоза/искусственный шелк, волокна из ацетата целлюлозы (триацетатные), лиоцелл, или их смеси. Текстильное изделие или ткань также могут быть отличными от целлюлозных, например, природные полиамиды, в том числе шерсть, верблюжья шерсть, кашемир, мохер, кроличья шерсть и шелк, или синтетические полимеры, например, нейлон, арамид, сложный полиэфир, полимер на основе акрилонитрила, полипропилен и спандекс/эластан, или их смеси, а также смеси волокон на основе целлюлозы и волокон, отличных от целлюлозных. Примерами смесей являются смеси хлопка и/или искусственного шелка/вискозы с одним или несколькими дополнительными материалами, такими как шерсть, синтетическое волокно (например, полиамидное волокно, акриловое волокно, полиэфирное волокно, поливинилхлоридное волокно, полиуретановое волокно, полимочевинное волокно, арамидное волокно) и/или целлюлозосодержащее волокно (например, искусственный шелк/вискоза, волокна рами, волокна льна/льняное полотно, джутовая ткань, волокно из ацетата целлюлозы, лиоцелл). Ткань может представлять собой белье, пригодное для обычной стирки, например, испачканное домашнее белье. При использовании выражения ткань или предмет одежды предусматривается, что оно также включает более общее выражение текстильные изделия. В контексте настоящего изобретения термин "текстильное изделие" также охватывает ткани.
Вариант.
т. е.
например
т.е.
Выражение "вариант" означает полипептид, обладающий той же активностью, что и исходный фермент, содержащий изменение, замену, вставку и/или делецию в одном или нескольких (, некоторых) положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей определенное положение, другой аминокислотой; делеция означает устранение аминокислоты, занимающей определенное положение; а вставка означает добавление аминокислоты рядом с и непосредственно после аминокислоты, занимающей определенное положение. В контексте настоящего изобретения вариант идентифицированная ДНКаза обладает ферментативной активностью исходного, способностью катализировать гидролитическое расщепление связей сложного фосфодиэфира в основе ДНК (активность дезоксирибонуклеазы). В одном варианте осуществления активность дезоксирибонуклеазы варианта является повышенной относительно исходной ДНКазы, например зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2.
Цикл стирки:
Термин "цикл стирки" в данном документе определяют как моющую операцию, где текстильные изделия погружают в моющий раствор, к текстильному изделию применяют механическое воздействие некоторого вида с целью высвобождения загрязнений и облегчения течения моющего раствора внутрь и наружу из текстильного изделия и конечного устранения избыточного моющего раствора. После одного или нескольких циклов стирки текстильное изделие, как правило, прополаскивают и высушивают.
Моющий раствор:
Термин "моющий раствор" в данном документе определяют как раствор или смесь воды и моющих компонентов, необязательно содержащие фермент по настоящему изобретению.
Время стирки
:
Термин "время стирки" в данном документе определяют как время, которое занимает весь процесс стирки; т.е. время цикла стирки(циклов стирки) и цикла полоскания(циклов полоскания) вместе.
Белизна
: Термин "белизна" в данном документе определяют как широкий термин с различными значениями в разных областях и для разных потребителей. Потеря белизны может быть обусловлена, например, изменением окраски на серую или изменением окраски на желтую, или устранением оптически осветляющих/окрашивающих средств. Изменение окраски на серую и изменение окраски на желтую может быть обусловлено переосаждением грязи, загрязнениями вследствие контакта с телом, окрашиванием, например, ионами железа и меди, или переносом красителя. С белизной могут быть связаны одна или несколько проблем из списка, представленного ниже: эффекты, связанные с красящим веществом или красителем; неполное устранение пятен (например, загрязнения вследствие контакта с телом, секретом сальных желез и т. д.); переосаждение (изменение окраски на серую, изменение окраски на желтую или другие изменения цвета объекта) (устраненная грязь повторно связывается с другими частями текстильного изделия, загрязненной или незагрязненной); химические изменения в текстильном изделии при его использовании и осветление цвета или увеличение яркости цвета.
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что полипептиды, обладающие активностью дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) и которые получены из источника, относящегося к грибам, можно применять для предотвращения или устнанения биопленки с изделий, таких как текстильные изделия и/или ткани. Биопленка может развиваться на текстильном изделии, если микроорганизмы присутствуют на изделии и прилипают к изделию. Некоторые микроорганизмы стремятся налипать на поверхность изделий, таких как текстильные изделия. Некоторые микроорганизмы налипают на такие поверхности и образуют биопленку поверхности. Биопленка может быть липкой и налипшие микроорганизмы и/или биопленку может быть трудно устранить. Более того, на биопленку налипает грязь в связи с липкой природой биопленки. Коммерческие моющие композиции для стирки, доступные на рынке, не устраняют такие налипшие микроорганизмы или биопленку.
Настоящее изобретение касается применения полипептида, обладающего активностью ДНКазы, для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия, где полипептид, обладающий активностью ДНКазы, получают из источника, относящегося к грибам, и где изделие представляет собой текстильное изделие. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий активностью ДНКазы, применяют для предотвращения, уменьшения или устранения липкости изделия. Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, можно дополнительно применять для предварительной обработки загрязнений на текстильном изделии, таком как текстильное изделие с выраженным количеством биопленки, налипшей на текстильное изделие.
Кроме того, настоящее изобретение касается применения полипептида, обладающего активностью ДНКазы, для предотвращения, уменьшения или устранения переосаждения грязи в течение цикла стирки. Если полипептид применяют, например, для стирки текстильного изделия, полипептид препятствует осаждению грязи, присутствующей в моющем растворе, против осаждения на текстильное изделие.
Кроме того, настоящее изобретение касается применения полипептида, обладающего активностью ДНКазы, для предотвращения, уменьшения или устранения налипания грязи на изделие. В одном варианте осуществления изделие представляет собой текстильное изделие. Если грязь не налипает на изделие, изделие становится более чистым. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно касается полипептида, обладающего активностью ДНКазы, для поддержания или улучшения белизны изделия.
Если применяют такие изделия, как футболки или спортивная одежда, они подвергаются воздействию бактерий тела пользователя и остальной окружающей среды, в которой их применяют. Это может вызывать неприятный запах на изделии даже после стирки изделия. Следовательно, настоящее изобретение также касается устранения или уменьшения неприятного запаха по отношению к текстильному изделию. Неприятный запах может быть вызван бактериями, вырабатывающими соединения с неприятным запахом. Одним примером таких неприятно пахнущих соединений является E-2-ноненал. Неприятный запах может присутствовать на только что постиранном текстильном изделии, которое все еще является влажным. Либо неприятный запах может присутствовать на только что постиранном текстильном изделии, которое затем высушили. Неприятный запах также может присутствовать на текстильном изделии, которое хранилось в течение некоторого времени после стирки. Настоящее изобретение касается уменьшения или устранения неприятного запаха, такого как E-2-ноненал, с влажного или сухого текстильного изделия.
Настоящее изобретение дополнительно касается моющей композиции, содержащей полипептид, обладающий активностью ДНКазы, и вспомогательный ингредиент моющего средства, где ДНКазу получают из источника, относящегося к грибам. Моющую композицию по настоящему изобретению можно применять для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия, для предотвращения, уменьшения или устранения липкости изделия, для предварительной обработки загрязнений на изделии, для предотвращения, уменьшения или устранения переосаждения грязи в течение цикла стирки, для уменьшения или устранения налипания грязи на изделие, для поддержания или улучшения белизны изделия и для предотвращения, уменьшения или устранения неприятного запаха с изделия, такого E-2-ноненал (см. пример 10, 13 и 14). Моющая композиция по настоящему изобретению преодолевает проблемы предыдущего уровня техники.
Aspergillus
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что полипептиды, обладающие активностью ДНКазы, полученные из источника, относящегося к грибам, являются более стабильными, чем бактериологические полипептиды, обладающие активностью ДНКазы, при составлении с другими моющими ферментами. В частности, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что составление ДНКазы, полученной из источника, относящегося к грибам, в композицию, содержащую протеазу ДНКазы, относящейся к грибам, является более стабильным, чем бактериологическая ДНКаза, полученная из бактериологического источника. Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, может быть получен из , например из . Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, полученной из , оказался более стабильным при составлении с протеазой, чем комбинация бактериологической ДНКазы и протеазы (см. пример 11 и 12).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения моющая композиция содержит полипептид, обладающий активностью ДНКазы, как заявляется в данном документе.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения вспомогательный ингредиент моющего средства выбран из группы, состоящей из поверхностно-активных веществ, моющих компонентов, флокулирующей добавки, хелатирующих средств, ингибиторов переноса красителя, ферментов, стабилизаторов ферментов, ингибиторов ферментов, каталитических материалов, активаторов отбеливания, пероксида водорода, источников пероксида водорода, предварительно образованных перкислот, полимерных диспергирующих средств, средств для устранения/средств против переосаждения глинистой грязи, осветлителей, подавителей образования мыльной пены, красителей, отдушек, средств, обеспечивающих эластичность структуры, мягчителей тканей, носителей, гидротропов, моющих компонентов и дополнительных моющих компонентов, окрашивающих средств для ткани, противовспенивающих средств, диспергирующих средств, технологических добавок и/или пигментов.
Вспомогательный ингредиент моющего средства может представлять собой поверхностно-активное вещество. Преимуществом включения поверхностно-активного вещества в моющую композицию, содержащую ДНКазу, относящуюся к грибам, является то, что эффективность смывания улучшается. В одном варианте осуществления вспомогательный ингредиент моющего средства представляет собой моющий компонент или средство для устранения/средство против переосаждения глинистой грязи.
В одном варианте осуществления вспомогательный ингредиент моющего средства представляет собой фермент. Моющая композиция может содержать один или несколько ферментов. Один или несколько ферментов могут быть выбраны из группы, состоящей из протеаз, липаз, кутиназ, амилаз, карбогидраз, целлюлаз, пектиназ, маннаназ, арабиназ, галактаназ, ксиланаз и окисдаз.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что ДНКаза, полученная из источника, относящегося к грибам, демонстрирует хорошую стабильность при составлении с другими ферментами. ДНКаза, полученная из бактериологического источника, продемонстрировала низкую стабильность, если бактериологическая ДНКаза составлена с другими ферментами, такими как протеазы. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что ДНКаза, полученная из источника, относящегося к грибам, имеет увеличенную стабильность по сравнению с ДНКазой, полученной из бактериологического источника.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения моющая композиция по настоящему изобретению составлена с протеазой, которая является протеазой животного, растительного или микробного происхождения. Протеаза химически модифицирована или получена с помощью белковой инженерии. Протеаза может представлять собой сериновую протеазу или металлопротеазу, предпочтительно щелочную микробную протеазу или трипсин-подобную протеазу.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения протеаза выбрана из группы, состоящей из Bacillus, например, субтилизина Novo, субтилизина Carlsberg, субтилизина 309, субтилизина 147, субтилизина 168, трипсина бычьего происхождения, трипсина свиного происхождения и протеазы Fusarium. Протеаза может характеризоваться по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95%, идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления протеаза характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 10 или ее варианту с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 и 274, предпочтительно вариант представляет собой щелочную протеазу, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 10 со следующей заменой: M222S или заменами N76D+G195E.
Acinetobacter
Aeromicrobium
Brevundimonas
Microbacterium
Micrococcus luteus
Pseudomonas
Staphylococcus epidermidis
Stenotrophomonas
В одном варианте осуществления моющая композиция способна уменьшать адгезию бактерий, выбранных из группы, состоящей из sp., sp., sp., sp., , sp., , и sp. к поверхности, или высвобождение бактерий с поверхности, на которую они налипают.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения поверхность представляет собой поверхность текстильного изделия. Текстильное изделие может быть выполнено из хлопка, хлопка/сложного полиэфира, сложного полиэфира, полиамида, полиакрила и/или шелка.
Моющая композиция может быть составлена в виде бруска, гомогенной таблетки, таблетки, имеющей два или более слоев, пакета, имеющего один или несколько отделений, обычного или уплотненного порошка, гранулы, пасты, геля или обычной, уплотненной или концентрированной жидкости. Моющая композиция может представлять собой жидкое моющее средство, моющее средство в виде порошка или моющее средство в виде гранул.
Настоящее изобретение дополнительно касается жидкой моющей композиции, содержащей поверхностно-активное вещество и моющий компонент моющего средства с общей концентрацией по меньшей мере 3% по весу, и микрокапсулу, содержащую моющий фермент, где мембрана микрокапсулы получена посредством сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 1 кДа. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что при инкапсулировании ферментов в микрокапсуле с полупроницаемой мембраной по настоящему изобретению, и при наличии более высокой активности воды внутри данных капсул (перед добавлением в жидкое моющее средство), чем в жидком моющем средстве, капсулы будут подвергаться (частично) разрушению при добавлении в моющее средство (вода вытекает наружу), при этом более концентрированный и более вязкий фермент остается внутри капсул. Разрушение мембраны также может приводить к уменьшенной проницаемости. Это также может быть использовано посредством добавления стабилизаторов/полимеров, в частности, таких, которые не проникают через мембрану. Разрушение и полученное в результате повышение вязкости будет уменьшать/препятствовать диффузии неблагоприятных компонентов (например, поверхностно-активных веществ или комплексообразователей) в капсулы, и, таким образом, повышать стабильность при хранении фермента в жидком моющем средстве. Компоненты в жидком моющем средстве, которые чувствительны к действию фермента (например, компоненты, которые выступают в качестве субстрата для фермента) также защищены ферментом против распада. В течение стирки жидкое моющее средство разводят водой, повышая таким образом активность воды. После этого вода диффундирует внутрь капсул (осмос). Капсулы будут набухать и мембрана будет либо становится проницаемой для фермента, так что он будет вытекать из капсул, либо просто прорываться и таким способом высвобождать фермент. Концепция является очень эффективной для стабилизации ферментов против нежелательных компонентов в жидком моющем средстве, и наоборот, также защищает чувствительные к действию фермента компоненты в жидком моющем средстве от воздействия ферментов.
Примеры моющих компонентов, которые чувствительны к действию и могут распадаться под действием ферментов, включают (используемый фермент в скобках): ксантановую камедь (ксантаназа), полимеры со сложноэфирными связями (липаза), гидрогенизированное касторовое масло (липаза), отдушку (липаза), поверхностно-активные вещества на основе сульфонатов сложных метиловых эфиров (липаза), целлюлозу и производные целлюлозы (например CMC) (целлюлаза) и декстрин и циклодекстрин (амилаза).
Кроме того, чувствительные моющие ингредиенты могут быть инкапсулированы и, таким образом, стабилизированы, в микрокапсулах по настоящему изобретению. Чувствительные моющие ингредиенты склонны к распаду при хранении. Такие моющие ингредиенты включают соединения для отбеливания, активаторы отбеливания, отдушки, полимеры, моющие компоненты, поверхностно-активные вещества и т.д.
Как правило, микрокапсулы по настоящему изобретению можно использовать для разделения несовместимых компонентов/соединений в моющих средствах.
Добавление микрокапсул в моющие средства можно применять для воздействия на внешний вид моющего продукта, такого как эффект непрозрачности (небольшие микрокапсулы) или эффект отчетливо видимых частиц (крупные микрокапсулы). Микрокапсулы также могут быть окрашены.
Микрокапсулы можно применять для уменьшения уровней ферментной пыли в течение обработки и переработки ферментных продуктов.
Если не указано иное, все процентные содержания приведены в виде процента по весу (% вес/вес) по всей данной заявке.
Микрокапсула: Микрокапсулы обычно получают посредством образования капель воды в сплошной среде, которая является несмешиваемой с водой - т.е. обычно посредством получения эмульсии вода-в-масле - и последующего образования мембраны посредством межфазной полимеризации путем добавления сшивающего средства. После возможного отверждения капсулы можно собирать и далее прополаскивать и составлять с помощью способов, известных из данного уровня техники. Состав капсул затем добавляют в моющее средство.
Нагрузка, основные составляющие мембраны и возможный дополнительный компонент, которые подлежат инкапсулированию, обнаружены в водной фазе. В сплошной среде обнаружены компоненты, которые стабилизируют капли воды против коалесценции (эмульгаторы, стабилизаторы эмульсий, поверхностно-активные вещества и т.д.) и сшивающее средство также добавляют через сплошную среду.
Эмульсию можно получать с помощью любых способов, известных из уровня техники, например, посредством механического перемешивания, способов стекания каплями, эмульгирования мембраны, микроструйной методики, обработки ультразвуком и т.д. В некоторых случаях простое смешивание фаз автоматически будет обеспечивать в результате эмульсию, часто называемое самоэмульгированием. Применение способов, обеспечивающих получение в результате узкого распределения размеров частиц, является преимуществом.
Сшивающее средство(средства) обычно затем добавляют в эмульсию, либо непосредственно, либо, более часто, посредством получения раствора сшивающего средства в растворителе, который растворим в непрерывной фазе. Эмульсию и сшивающее средство или его раствор можно смешивать посредством обычных способов, применяемых в данной области, например, посредством простого смешивания или посредством тщательного контроля потоков эмульсии и раствора сшивающего средства через встроенный смеситель.
В некоторых случаях отверждение капсул необходимо для завершения образования мембраны. Отверждение зачастую представляет собой простое перемешивание капсул в течение некоторого времени для обеспечения завершения реакции межфазной полимеризации. В других случаях образование мембраны можно остановить посредством добавления гасителя реакции.
Капсулы могут быть модифицированы впоследствии, например, посредством осуществления реакции компонентов на мембране для препятствования или устранения слипания частиц в моющем средстве, как описано в WO 99/01534.
Полученные капсулы могут быть выделены или концентрированы посредством способов, известных в данной области, например, посредством фильтрации, центрифугирования, дистилляции или отстаивания дисперсии капсул.
Полученные в результате капсулы могут быть дополнительно составлены, например, посредством добавления поверхностно-активных веществ с получением продукта с необходимыми свойствами для хранения, транспортировки и последующей обработки и добавления в моющее средство. Другие средства для состава микрокапсул включают модифицирующие реологические свойства средства, биоциды (например, Proxel), кислоту/основание для регулирования pH (которые также будут регулировать внутреннюю часть микрокапсул) и воду для регулирования активности воды.
Способ образования капсул может включать следующие стадии:
- получение исходной воды и масляной фазы(фаз),
- образование эмульсии вода-в-масле,
- образование мембраны посредством межфазной полимеризации,
- необязательная модификация после реакции,
- необязательное выделение и/или составление,
- добавление в моющее средство.
Способ может быть либо периодическим способом, либо непрерывным или полунепрерывным способом.
Микрокапсула по настоящему изобретению представляет собой небольшую водную сферу с однородной мембраной вокруг нее. Материал внутри микрокапсулы называют ядром, внутренней фазой или наполнением, тогда как мембрану иногда называют оболочкой, покрытием или стенкой. Микрокапсулы по настоящему изобретению имеют диаметры от 0,5 мкм до 2 миллиметров. Предпочтительно, средний диаметр микрокапсул находится в диапазоне от 1 мкм до 1000 мкм, более предпочтительно в диапазоне от 5 мкм до 500 мкм, еще более предпочтительно в диапазоне от 10 мкм до 500 мкм, еще более предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 500 мкм, и наиболее предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 200 мкм. В качестве альтернативы, диаметр микрокапсул находится в диапазоне от 0,5 мкм до 30 мкм; или в диапазоне от 1 мкм до 25 мкм. Диаметр микрокапсулы измеряют в масляной фазе после завершения полимеризации. Диаметр капсулы может изменяться в зависимости от активности воды окружающей химической среды.
Микроинкапсулирование ферментов, применяемое в настоящем изобретении, можно осуществлять посредством межфазной полимеризации, где два реагента в реакции полимеризации контактируют на межфазной границе и быстро реагируют. Основой данного способа является реакция полиамина с производным кислоты, обычно с галогенангидридом, которое выступает в качестве сшивающего средства. Полиамин предпочтительно по сути растворим в воде (если находится в форме свободного основания). В соответствующих условиях на поверхности быстро образуются тонкие гибкие мембраны. Одним способом осуществления полимеризации является применение водного раствора фермента и полиамина, которые эмульгируются неводным растворителем (и эмульгатором), и добавление раствора, содержащего производное кислоты. Щелочное средство может присутствовать в растворе фермента для нейтрализации кислоты, образованной в ходе реакции. Полимерные (полиамидные) мембраны мгновенно образуются на поверхности капель эмульсии. Полимерная мембрана микрокапсулы обычно имеет катионную природу и, таким образом, связывается/образует комплекс с соединениями анионной природы.
Диаметр микрокапсул определяют посредством размера капель эмульсии, который контролируют, например, посредством скорости перемешивания.
Эмульсия: Эмульсия представляет собой временную или постоянную дисперсию одной жидкой фазы во второй жидкой фазе. Вторую жидкость обычно называют непрерывной фазой. Поверхностно-активные вещества обычно применяют для облегчения образования и стабилизации эмульсий. Не все поверхностно-активные вещества в равной степени способны стабилизировать эмульсию. Тип и количество поверхностно-активного вещества необходимо выбирать из оптимального применения эмульсии, в частности, относительно получения и физической стабильности эмульсии и стабильности при разбавлении и дальнейшей переработке. Физическая стабильность относится к поддержанию эмульсией формы дисперсии. Процессы, такие как коалесценция, агрегация, поглощение стенками контейнера, осаждение и отстаивание, представляют собой формы физической нестабильности, и их следует избегать. Примеры подходящих поверхностно-активных веществ описаны в WO 97/24177, стр. 19-21; и в WO 99/01534.
Эмульсии могут быть дополнительно классифицированы либо как простые эмульсии, где диспергированная жидкая фаза представляет собой гомогенную жидкость, либо более сложная эмульсия, где диспергированная жидкая фаза представляет собой гетерогенную комбинацию жидких или твердых фаз, например, двойная эмульсия или множественная эмульсия. Например, могут быть образованы двойная эмульсия вода-в-масле или множественная эмульсия, где водная фаза сама по себе дополнительно содержит эмульгированную масляную фазу; данный тип эмульсии может быть определен как эмульсия масло-в-воде-в масле (o/w/o). В качестве альтернативы, может быть образована эмульсия вода-в-масле, где водная фаза содержит диспергированную твердую фазу, которую часто называют суспензия-эмульсия. Могут быть описаны более сложные эмульсии. Вследствие характерной сложности описания таких систем, термин эмульсия применяют для описания как простых, так и более сложных эмульсий без необходимого ограничения формы эмульсии или типа и числа присутствующих фаз.
Полиамин: Жесткость/гибкость и проницаемость мембраны в основном зависит от выбора полиамина. Полиамин по настоящему изобретению представляет собой полиразветвленный полиамин. Каждая ветвь, предпочтительно заканчивающаяся группой первичного амина, выступает в качестве точки связывания в сетке мембраны, обеспечивая таким образом благоприятные свойства настоящего изобретения. Полиразветвленный полиамин по настоящему изобретению представляет собой полиамин, имеющий более двух точек разветвления и более двух реактивных амино-групп (способных вступать в реакцию со связывающим средством, т.е., группами первичного и вторичного амина). Полиразветвленный полиамин применяют в качестве исходного материал, если получают эмульсию - ее не образовывают in situ из других исходных материалов. Для получения приемлемых свойств настоящего изобретения полиразветвленная структура полиамина должна присутствовать в качестве исходного материала.
Существует тесная связь между числом точек разветвления и числом первичных аминов, поскольку первичные амины всегда будут располагаться на конце ветви: Линейный амин может содержать только два первичных амина. Для каждой точки разветвления, гипотетически введенной в такой линейный диамин, будет обеспечиваться один или несколько первичных амин(аминов) для введения в конец введенной ветви(ветвей). В данном контексте понимают группу первичного амина как часть ветви, т.е., конечную часть ветви. Например, авторами настоящего изобретения как трис(2-аминоэтил)амин, так и 1,2,3-пропантриамин считаются молекулами с одной точкой разветвления. Для настоящего изобретения полиамин имеет по меньшей мере четыре первичных амина. Точки разветвления могут быть введены из цепи алифатического углеводорода, как в ранее приведенных примерах, или из ненасыщенных углеродных связей, как например, в 3,3'-диаминобензидине, или из групп третичного амина, как в N,N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)этилендиамин.
Помимо числа точек разветвления, было обнаружено, что компактность реактивных амино-групп имеет большое значение. Такое вещество, как например, N,N,N',N'-тетракис-(12-аминододецил)этилендиамин, не является приемлемым. Также для образования мембраны не является приемлемым пептид или белок, такой как фермент. Таким образом, полиразветвленный полиамин не является пептидом или белком.
В одном варианте осуществления реактивные амино-группы составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса полиразветвленного полиамина, например, более 20% или более 25%. Предпочтительно, молекулярный вес полиразветвленного полиамина составляет по меньшей мере 1 кДа; более предпочтительно молекулярный вес полиразветвленного полиамина составляет по меньшей мере 1,3 кДа.
В предпочтительном варианте осуществления полиразветвленный полиамин представляет собой полиэтиленимин (PEI) и его модификации, имеющие более двух точек разветвления и более двух реактивных амино-групп; где реактивные амино-группы составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса PEI, например, более 20% или более 25%. Предпочтительно молекулярный вес PEI составляет по меньшей мере 1 кДа.
Комбинации различных полиразветвленных полиаминов можно применять для получения микрокапсулы по настоящему изобретению.
Полезные свойства (например, стабильность фермента при хранении, уменьшение вытекания фермента, уменьшение притока моющих ингредиентов) микрокапсулы по настоящему изобретению могут быть улучшены посредством добавления одного или нескольких низкомолекулярных аминов с молекулярным весом менее 1 кДа. Низкомолекулярный амин предпочтительно по сути растворим в воде (если находится в форме свободного основания) и может представлять собой материал, такой как этилендиамин, гексаметилендиамин, гександиамин, диэтилентетрамин, этилентетрамин, диаминобензол, пиперазин, тетраметиленпентамин или, предпочтительно, диэтилентриамин (DETA). Низкомолекулярные амины можно добавлять в количестве до 50%, предпочтительно до 40%, до 30%, до 20%, до 10% или до 5% по весу общего содержания низкомолекулярного амина и полиразветвленного полиамина при получении микрокапсулы по настоящему изобретению.
Сшивающее средство: Сшивающее средство, применяемое в настоящем изобретении, представляет собой молекулу, имеющую по меньшей мере две группы/области, способные вступать в реакцию с аминами с образованием ковалентных связей.
Сшивающее средство предпочтительно растворимо в масле и может находиться в форме ангидрида кислоты или галогенангидрида, предпочтительно хлорангидрида. Например, он может представлять собой адипоил хлорид, себакоил хлорид, хлорид додекандиовой кислоты, фталоил хлорид, терфталоил хлорид, изофталоил хлорид, или тримесоил хлорид; но предпочтительно сшивающее средство представляет собой терфталоил хлорид или тримесоил хлорид.
Настоящее изобретение дополнительно касается способа стирки изделия, при этом способ включает следующие стадии:
a. воздействие на изделие моющим раствором, содержащим полипептид по настоящему изобретению, обладающий активностью ДНКазы, или моющей композиции, содержащей полипептид;
b. завершение по меньшей мере одного цикла стирки и
c. необязательно полоскание изделия,
где изделие представляет собой текстильное.
pH жидкого раствора находится в диапазоне от 1 до 11, например, в диапазоне от 5,5 до 11, например, в диапазоне от 7 до 9, в диапазоне от 7 до 8 или в диапазоне от 7 до 8,5.
Моющий раствор может иметь температуру в диапазоне от 5°C до 95°C, или в диапазоне от 10°C до 80°C, в диапазоне от 10°C до 70°C, в диапазоне от 10°C до 60°C, в диапазоне от 10°C до 50°C, в диапазоне от 15°C до 40°C или в диапазоне от 20°C до 30°C. В одном варианте осуществления температура моющего раствора составляет 30°C.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ стирки изделия дополнительно включает сливание моющего раствора или части моющего раствора после завершения цикла стирки. Моющий раствор затем может быть использован повторно в последующем цикле стирки или последующем цикле полоскания. На изделие можно воздействовать моющим раствором в течение первого и необязательно второго или третьего цикла промывания. В одном варианте осуществления изделие прополаскивают после воздействия моющим раствором. Изделие можно полоскать водой или водой, содержащей кондиционер.
Настоящее изобретение дополнительно касается изделия, которое стирают в соответствии со способом по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно касается фармацевтической композиции, содержащей полипептид, обладающий активностью ДНКазы, и фармацевтический вспомогательный ингредиент, где полипептид, обладающий активностью ДНКазы, получают из источника, относящегося к грибам. Композицию можно применять для высвобождения или устранения биопленки или предотвращения образования биопленки.
Противопаразитарное соединение может представлять собой один или несколько из бензазола, такого как альбендазол, мебендазол и тиабендазол; азола, такого как метронидазол и тинидазол; макроцикла, такого как амфотерицин B, рифампин и ивермектин; пирантел памоат; диэтилкарбамазин; никлозамин; празиквантел; меларспорол; и эфлорнитина.
Противовирусное соединение может представлять собой один или несколько из ингибитора обратной транскриптазы нуклеозидного аналога, такого как ацикловир, диданозин, ставудин, зидовудин, ламивудин, абакавир, эмтрицитабин и энтекавир; непокрывающего ингибитора, такого как амантадин, римантадин и плеконарил; ингибитора протеазы, такого как саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир и ампренавир; занамивира; оселтамивира; и рифампина. Бактерицидное соединение может представлять собой один или несколько из аминогликозида, такого как гентамицин, канамицин и стрептомицин; бета-лактама, такого как пенициллин, ампициллин и имипенем; цефалоспорина, такого как цефтазимид, квинолона, такого как ципрофлоксацин; макролида, такого как азитромицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин и телитромицин; оксазолидинона, такого как линезолид; ансамицина, такого как рифамицин; сульфонамида; тетрациклина, такого как доксициклин; гликопептида, такого как ванкомицин; сульфизоксазол, триметоприм, новобиоцин, даптомицин и линезолид.
Противогрибковое соединение может представлять собой один или несколько из азола, такого как миконазол, кетоконазол, клотримазол, эконазол, омоконазол, бифоназол, бутоконазол, фентиконазол, изоконазол, сертаконазол, сулконазол, тиоконазол, флуконазол, итраконазол, изавуконазол, равуконазол, позаконазол, вориконазол, терконазол и абафунгин; макроцикла, такого как натамицин, римоцидин, филипин, нистатин, амфотерицин B, кандицин, гамицин; аллиламина, такого как тербинафин, нафтифин и бутенафин; эхинокандина, такого как андидулафунгин, каспофунгин и микафунгин; или других, таких как полигодиал, циклопирокс, толнафтат, бензойная кислота, ундециленовая кислота, флуцитозин и грисеофулфин.
Настоящее изобретение также касается постоянно присутствующего медицинского устройства, характеризующегося тем, что по меньшей мере часть контактирующей с телом пациента поверхности указанного устройства покрыта фармацевтической композицией.
Устройство может представлять собой катетер, такой как центральный венозный катетер, сосудистый катетер, мочевой катетер, катетер Хикмана, катетер для брюшинного диализа, эндотрахеальный катетер, или где устройство представляет собой механический клапан сердца, кардиостимулятор, артериовенозный шунт, склеральный зажим, соединение протеза, тимпаностомическую трубку, трахеостомическую трубку, голосовой протез, протез полового члена, искусственный сфинктер мочевого пузыря, синтетическая лонно-вагинальная петля, хирургическую нить, костный фиксатор, костный винт, внутриглазную линзу, контактную линзу, внутриматочное устройство, аортобедренный трансплантат, сосудистый трансплантат, иглу, соединитель люер-лок, соединитель без иглы или хирургический инструмент.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в виде жидкости, лосьона, крема, состава для распыления, геля или мази.
Фармацевтическая композиция может быть предназначена для введения пациенту-животному. Пациент-животное может быть пациентом-млекопитающим. Пациент-млекопитающее может являться человеком.
Aspergillus
Aspergillus oryzae
Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, может быть получен из , например из . В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий активностью ДНКазы, представляет собой заявленный полипептид.
Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте полипептиды отличаются не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2.
В варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте полипептиды отличаются не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенным полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности SEQ ID NO: 8 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте полипептиды отличаются не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 8.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 60%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 60%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 65%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 65%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 70%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 70%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 75%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 75%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 80%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 80%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 85%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 85%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 90%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 90%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 91%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 91%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 92%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 92%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 93%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 93%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 94%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 94%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 95%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 95%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 96%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 96%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 97%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 97%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 98%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 98%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 99%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 99%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 на 100%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 на 100%, который обладает активностью ДНКазы, и полипептид применяют для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия.
В одном варианте осуществления полипептид был выделен. Полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 или его аллельного варианта; или его фрагмент, обладающий активностью ДНКазы. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из аминокислот от 1 до 206 в SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления полипептид был выделен. Полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 9 или его аллельного варианта; или его фрагмент, обладающий активностью ДНКазы. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из аминокислот от 1 до 204 в SEQ ID NO: 9. Один аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей или по сути состоящей из полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 8, и полипептида по настоящему изобретению, состоящего из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 9.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или с (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренно низкой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренной жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренно высокой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях высокой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях очень высокой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
32
3
35
Полинуклеотид с SEQ ID NO: 1 или его подпоследовательность, а также полипептид с SEQ ID NO: 2 или его фрагмент или полипептид с SEQ ID NO: 9 или его фрагмент можно применять для конструирования зондов на основе нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептид, обладающий активностью ДНКазы, у штаммов разных родов или видов, в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. В частности, такие зонды можно применять для гибридизации с геномной ДНК или кДНК представляющей интерес клетки после стандартных процедур Саузерн-блоттинга с целью идентификации и выделения их соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, но должны иметь в длину по меньшей мере 15, например, по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Зонд на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет в длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, например, имеет в длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно применять как ДНК-, так и РНК-зонды. Зонды, как правило, метят для выявления соответствующего гена (например, P, H, S, биотином или авидином). Настоящее изобретение охватывает такие зонды.
Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из таких других штаммов можно подвергнуть скринингу в отношении ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и кодирует полипептид, обладающий активностью ДНКазы. Геномную или другую ДНК из таких других штаммов можно разделить посредством электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или других методик разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести и иммобилизировать на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале-носителе. С целью идентификации клона или ДНК, которые гибридизуются с SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательностью, материал-носитель применяется в Саузерн-блоттинге.
В контексте настоящего изобретения гибридизация указывает на то, что полинуклеотид гибридизуется с меченым зондом на основе нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 1; (ii) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1; (iii) ее последовательности кДНК; (iv) его комплементарной последовательности полной длины; или (v) ее подпоследовательности; в условиях очень низкой, низкой жесткости, в условиях умеренно низкой жесткости, в условиях умеренной жесткости, в условиях умеренно высокой жесткости, в условиях высокой жесткости до условий очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми в этих условиях гибридизируется зонд на основе нуклеиновой кислоты, можно выявить с помощью, например, пленки для рентгенографии или любых других средств для выявления, известных из уровня техники.
например
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, характеризующимся идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1 или ее последовательности кДНК по меньшей мере на 60%, , по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%. В следующем варианте осуществления полипептид был выделен.
например
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или более (например, некоторых) положениях. В варианте осуществления количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок, введенных в зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2, составляет не более 10, , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на фолдинг и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку посредством изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.
например
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или более (например, некоторых) положениях. В варианте осуществления количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок, введенных в зрелый полипептид с SEQ ID NO: 9, составляет не более 10, , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на фолдинг и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку посредством изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.
в The Proteins
Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Замены аминокислот, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, , Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.
Альтернативно, изменения аминокислот имеют такой характер, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термоустойчивость полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять оптимальное значение pH и т.п.
Science
et al.,
J. Biol. Chem.
et al.,
Science
et al.,
J. Mol. Biol.
et al.,
FEBS Lett.
Незаменимые аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными из уровня техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят в каждый остаток в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении активности ДНКазы для идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также, Hilton 1996, 271: 4699-4708. Активный центр для ферментативного или другого биологического взаимодействия можно также определить с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего центра. См., например, de Vos 1992, 255: 306-312; Smith 1992, 224: 899-904; Wlodaver 1992, 309: 59-64. Об идентичности незаменимых аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом.
Science
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.,
Biochemistry
et al.,
Gene
Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществить и исследовать при помощи известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей соответствующей процедурой скрининга, как, например, таковых, раскрытых в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, 86: 2152-2156; WO 95/17413 или WO 95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР с использованием неточной полимеразы, фаговый дисплей (например, Lowman 1991, 30: 10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204) и направленный на участок мутагенез (Derbyshire 1986, 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
et al.,
Nature Biotechnology
Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединить с автоматизированными способами скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness 1999, 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлечь из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов из данной области техники. Эти способы обеспечивают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.
Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором участок одного полипептида слит с N-концом или C-концом участка другого полипептида.
EMBO J.
Science
Полипептид может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида по настоящему изобретению. Слитый полипептид получают посредством слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Методики получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, с тем, чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем одного и того же промотора(промоторов) и терминатора. Слитые полипептиды можно также конструировать с применением интеиновой технологии, в которой слитые полипептиды создаются посттрансляционно (Cooper et al., 1993, 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, 266: 776-779).
J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
et al.,
Appl. Environ. Microbiol.
et al.,
Biotechnology
et al.,
Biotechnology
et al.,
Biochemistry
et al.,
Biotechnology
et al.,
Proteins: Structure, Function, и Genetics
Drug Discovery World
Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка сайт расщепляется с высвобождением двух полипептидов. Примеры сайтов расщепления включают без ограничения сайты, раскрытые в Martin et al., 2003, 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson 1997, 63: 3488-3493; Ward 1995, 13: 498-503; и Contreras 1991, 9: 378-381; Eaton 1986, 25: 505-512; Collins-Racie 1995, 13: 982-987; Carter 1989, 6: 240-248; и Stevens, 2003, 4: 35-48.
Полинуклеотиды
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептид, как описано в данном документе. В одном варианте осуществления был выделен полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, содержит или состоит из полинуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 12.
et al.,
PCR: A Guide to Methods and Application
Aspergillus
Методики, применяемые для выделения или клонирования полинуклеотида, известны из уровня техники и включают выделение из геномной ДНК или кДНК или их комбинации. Клонирование полинуклеотидов из геномной ДНК можно осуществлять, например, посредством применения хорошо известной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или скрининга экспрессионных библиотек с помощью антител для выявления клонированных фрагментов ДНК с общими структурными особенностями. См., например, Innis 1990, , Academic Press, New York. Можно применять другие процедуры амплификации нуклеиновой кислоты, такие как лигазная цепная реакция (LCR), активированная лигированием транскрипция (LAT) и реакция транскрипционной амплификации (NASBA). Полинуклеотиды можно клонировать из штамма или родственного организма, и, следовательно, может, например, присутствовать аллельный или видовой вариант участка полинуклеотида, кодирующего полипептид.
например
например
et al.,
Protein Expression and Purification
Модификация полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению, может быть необходимой для синтеза полипептидов, по сути аналогичных указанному полипептиду. Термин ʺпо сути аналогичныйʺ в отношении полипептида относится к не встречающимся в естественных условиях формам полипептида. Эти полипептиды могут отличаться некоторыми особенностями, обусловленными их конструированием, от полипептида, выделенного из его нативного источника, например, как варианты, которые отличаются специфической активностью, термостабильностью, оптимальным значением pH и т.п. Варианты можно сконструировать на основе полинуклеотида, присутствующего в виде кодирующей зрелый полипептид последовательности с SEQ ID NO: 1 или последовательности их кДНК, , их подпоследовательности, и/или посредством введения нуклеотидных замен, которые не приводят в результате к изменению аминокислотной последовательности полипептида, но которые соответствуют использованию кодона у организма-хозяина, предполагаемого для выработки фермента, или посредством введения нуклеотидных замен, которые могут быть источником различных аминокислотных последовательностей. В отношении общего описания нуклеотидных замен см., , Ford 1991, 2: 95-107. Таким образом, в одном варианте осуществления полинуклеотид содержит или состоит из полинуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 12, где кодоны были модифицированы нуклеотидными заменами для соответствия использования кодона организма-хозяина, предназначенного для получения полипептида по настоящему изобретению.
Конструкции нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, соответствующих регуляторным последовательностям.
С полинуклеотидом можно производить действия при помощи ряда способов для обеспечения экспрессии полипептида. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой в зависимости от вектора экспрессии. Методики модификации полинуклеотидов, в которых применяют способы с рекомбинантной ДНК, хорошо известны из уровня техники.
Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который распознается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Промотор содержит последовательности, регулирующие транскрипцию, которые опосредуют экспрессию полипептида. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, в том числе мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.
Bacillus amyloliquefaciens
amyQ
Bacillus licheniformis
amyL
Bacillus licheniformis
penP
Bacillus stearothermophilus
amyM
Bacillus subtilis
sacB
xylA
xylB Bacillus subtilis
cryIIIA Bacillus thuringiensis
Molecular Microbiology
lac-
E. coli
trc
E. coli
et al
Gene
Streptomyces coelicolor
dagA
et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
tac
et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.,
Scientific American
et al.,
supra
Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в бактериальной клетке-хозяине являются промоторы, полученные из гена альфа-амилазы (), гена альфа-амилазы (), гена пенициллиназы (), гена мальтогенной амилазы (), гена левансахаразы (), генов и , гена (Agaisse and Lereclus, 1994, 13: 97-107), оперон , -промотор (Egon ., 1988, 69: 301-315), ген агаразы () и ген прокариотической бета-лактамазы (Villa-Kamaroff 1978, 75: 3727-3731), а также -промотор (DeBoer 1983, 80: 21-25). Дополнительные промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" в Gilbert 1980, 242: 74-94; и в Sambrook 1989, . Примеры тандемных промоторов раскрыты в WO 99/43835.
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus awamori
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Fusarium oxysporum
Fusarium venenatum
Fusarium venenatum
Fusarium venenatum
Rhizomucor miehei
Rhizomucor miehei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus niger
Aspergillus nidulans
Aspergillus oryzae
Примеры подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в клетке-хозяине, относящейся к нитчатому грибу, представляют собой промоторы, полученные из генов ацетамидазы , нейтральной альфа-амилазы , устойчивой к кислоте альфа-амилазы , глюкоамилазы или (glaA), TAKA амилазы , щелочной протеазы , триозофосфат-изомеразы , трипсин-подобной протеазы (WO 96/00787), амилоглюкозидазы (WO 00/56900), Daria (WO 00/56900), Quinn (WO 00/56900), липазы , аспартат-протеиназы , бета-глюкозидазы , целлобиогидролазы I , целлобиогидролазы II , эндоглюканазы I , эндоглюканазы II , эндоглюканазы III , эндоглюканазы V , ксиланазы I , ксиланазы II , ксиланазы III Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы , фактор элонгации трансляции , а также промотор NA2-tpi (модифицированный промотор из гена нейтральной альфа-амилазы , в котором нетранслируемая лидерная последовательность была заменена на нетранслируемую лидерную последовательность из гена триозофосфат-изомеразы ; неограничивающие примеры включают модифицированные промоторы из гена нейтральной альфа-амилазы , в которых нетранслируемая лидерная последовательность была заменена на нетранслируемую лидерную последовательность из гена триозофосфтат-изомеразы или ); а также мутантные, усеченные и гибридные промоторы из них. Другие промоторы описаны Патенте США № 6011147.
et al.,
Yeast
В хозяине, относящемся к дрожжам, пригодные промоторы получают из генов енолазы (ENO-1) Saccharomyces cerevisiae, галактокиназы (GAL1) Saccharomyces cerevisiae, алкоголь-дегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ADH1, ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae, триозофосфат-изомеразы (TPI) Saccharomyces cerevisiae, металлотионеина (CUP1) Saccharomyces cerevisiae и 3-фосфоглицерат-киназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные промоторы для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам описаны в Romanos 1992, 8: 423-488.
Регуляторная последовательность может также представлять собой терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином с терминацией транскрипции. Терминатор функционально связан с 3ʹ-концом полинуклеотида, кодирующего полипептид. В настоящем изобретении можно применять любой терминатор, функционирующий в клетке-хозяине.
Bacillus clausii (aprH),
Bacillus licheniformis (amyL)
Escherichia coli (rrnB).
Предпочтительные терминаторы для бактериальных клеток-хозяев получают из генов щелочной протеазы альфа-амилазы и рибосомной РНК
Aspergillus nidulans
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
niger
Aspergillus oryzae
Fusarium oxysporum
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Предпочтительными терминаторами для клеток-хозяев, относящихся к нитчатым грибам, являются полученные из генов для ацетамидазы , антранилатсинтазы , глюкоамилазы , альфа-глюкозидазы Aspergillus , ТАКА-амилазы , трипсин-подобной протеазы , бета-глюкозидазы , целлобиогидролазы I , целлобиогидролазы II , эндоглюканазы I , эндоглюканазы II , эндоглюканазы III , эндоглюканазы V , ксиланазы I , ксиланазы II , ксиланазы III , бета-ксилозидазы и фактора элонгации трансляции .
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
et al.,
supra
Предпочтительные терминаторы для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, получают из генов енолазы , цитохрома C (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы . Другие пригодные терминаторы для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, описаны в Romanos 1992, .
Регуляторная последовательность может также представлять собой участок, стабилизирующий мРНК, расположенный ниже промотора и выше кодирующей последовательности гена, который повышает экспрессию гена.
Bacillus thuringiensis
Bacillus subtilis
et al.,
Journal of Bacteriology
Примеры подходящих участков-стабилизаторов мРНК получены из гена cryIIIA (WO 94/25612) и гена SP82 (Hue 1995, 177: 3465-3471).
Регуляторная последовательность может также представлять собой лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, важный для трансляции в клетке-хозяине. Лидерная последовательность функционально связана с 5ʹ-концом полинуклеотида, кодирующего полипептид. Можно применять любую лидерную последовательность, функционирующую в клетке-хозяине.
Предпочтительные лидерные последовательности для клеток-хозяев, относящихся к нитчатым грибам, получены из генов TAKA-амилазы Aspergillus oryzae и триозофосфат-изомеразы Aspergillus nidulans.
Подходящие лидерные последовательности для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, получены из генов енолазы (ENO-1) Saccharomyces cerevisiae, 3-фосфоглицерат-киназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкоголь-дегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae.
Регуляторная последовательность может также представлять собой последовательность полиаденилирования, последовательность, функционально связанную с 3ʹ-концом полинуклеотида, которая при транскрипции распознается клеткой-хозяином как сигнал для добавления полиаденозиновых остатков к транскрибируемой мРНК. Можно применять любую последовательность полиаденилирования, функционирующую в клетке-хозяине.
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Fusarium oxysporum
Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев, относящихся к нитчатым грибам, получают из генов антранилатсинтазы , глюкоамилазы , альфа-глюкозидазы , амилазы TAKA и трипсиноподобной протеазы .
Mol. Cellular Biol.
Пригодные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, описаны в Guo and Sherman, 1995, 15: 5983-5990.
Регуляторная последовательность может также представлять собой участок, кодирующий сигнальный пептид, который кодирует сигнальный пептид, связанный с N-концом полипептида, и направляет полипептид по клеточному секреторному пути. 5ʹ-конец кодирующей последовательности полинуклеотида может по своей природе содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, связанную в естественных условиях в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей последовательности, которая кодирует полипептид. В качестве альтернативы, 5ʹ-конец кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной по отношению к кодирующей последовательности. Чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может быть необходимой в тех случаях, когда кодирующая последовательность в естественных условиях не содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид. В качестве альтернативы, чужеродной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, можно просто заменить естественную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, с целью повышения секреции полипептида. Тем не менее, можно применять любую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессируемый полипептид по секреторному пути в клетке-хозяине.
Bacillus
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus stearothermophilus
Bacillus stearothermophilus
nprT
nprS
nprM
prsA Bacillus subtilis
Microbiological Reviews
Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы NCIB 11837, субтилизина , бета-лактамазы , альфа-амилазы , нейтральных протеаз (, , ) и . Дополнительные сигнальные пептиды описаны в Simonen and Palva, 1993, 57: 109-137.
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Humicola insolens
Humicola insolens
Humicola lanuginosa
Rhizomucor miehei
Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для клеток-хозяев, относящихся к нитчатым грибам, представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов нейтральной амилазы , глюкоамилазы , амилазы TAKA , целлюлазы , эндоглюканазы V , липазы и аспартатпротеиназы .
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
et al.,
supra
Пригодные сигнальные пептиды для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, получают из генов альфа-фактора и инвертазы . Другие пригодные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, описаны в Romanos 1992, .
Регуляторная последовательность может также представлять собой последовательность, кодирующую пропептид, которая кодирует пропептид, расположенный на N-конце полипептида. Получаемый в результате полипептид известен как профермент или прополипептид (или, в некоторых случаях, зимоген). Прополипептид обычно неактивен и может быть превращен в активный полипептид посредством каталитического или автокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Последовательность, кодирующую пропептид, можно получить из генов щелочной протеазы (aprE) Bacillus subtilis, нейтральной протеазы (nprT) Bacillus subtilis, лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), аспартат-протеиназы Rhizomucor miehei и альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.
В случае, если присутствуют последовательности как сигнального пептида, так и пропептида, последовательность пропептида расположена возле N-конца полипептида, а последовательность сигнального пептида расположена возле N-конца последовательности пропептида.
lac
tac
trp
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Также может быть желательным добавление регулирующих последовательностей, которые регулируют экспрессию полипептида в связи с ростом клетки-хозяина. Примерами регулирующих последовательностей являются таковые, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, в том числе на наличие соединения, осуществляющего регуляцию. Регуляторные последовательности в прокариотических системах включают системы операторов , и . У дрожжей можно применять систему ADH2 или систему GAL1. У нитчатых грибов можно применять промотор гена глюкоамилазы , промотор гена ТАКА-амилазы и промотор гена глюкоамилазы , промотор гена целлобиогидролазы I и промотор гена целлобиогидролазы II . Другими примерами регулирующих последовательностей являются таковые, которые обеспечивают возможность амплификации гена. В эукариотических системах эти регулирующие последовательности предусматривают ген дигидрофолатредуктазы, амплифицируемый в присутствии метотрексата, и гены металлотионеинов, амплифицируемые в присутствии тяжелых металлов. В этих случаях полинуклеотид, кодирующий полипептид, будет функционально связан с регулирующей последовательностью.
Векторы экспрессии
например
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и регуляторные последовательности можно соединить вместе с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может содержать один или несколько подходящих сайтов рестрикции для обеспечения возможности вставки или замены в таких сайтах полинуклеотида, кодирующего полипептид. Альтернативно, полинуклеотид можно экспрессировать посредством вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор для экспрессии. При создании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими регуляторными последовательностями для экспрессии. В одном варианте осуществления вектор экспрессии состоит из полинуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 12, при этом он функционально связан с соответствующими регуляторными последовательностями для экспрессии. В следующем варианте осуществления кодоны полинуклеотидной последовательности были модифицированы нуклеотидными заменами для соответствия использованию кодона организма-хозяина, предназначенного для получения полипептида по настоящему изобретению. Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (, плазмиду или вирус), который может быть удобным образом подвержен процедурам с применением рекомбинантной ДНК и может обеспечивать экспрессию полинуклеотида. Выбор вектора, как правило, будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.
Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т. е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно, при введении в клетку-хозяина вектор может интегрироваться в геном и реплицироваться вместе с хромосомой (хромосомами), в которые он был интегрирован. Более того, можно применять один вектор или плазмиду или два или более векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина или транспозон.
Вектор предпочтительно содержит один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т. п.
dal Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis
adeA
adeB
amdS
argB
bar
hph
niaD
pyrG
sC
trpC
Aspergillus
amdS
pyrG Aspergillus nidulans
Aspergillus oryzae
bar Streptomyces hygroscopicus
Trichoderma
adeA
adeB
amdS
hph
pyrG
Примеры бактериальных селектируемых маркеров представляют собой гены или или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, канамицину, неомицину, спектиномицину или тетрациклину. Подходящие маркеры для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, включают в себя, без ограничения, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры для применения в клетке-хозяине, относящейся к нитчатым грибам, включают без ограничения, (фосфорибозиламиноимидазол-сукцинокарбоксамидсинтазу), (фосфорибозил-аминоимидазолсинтазу), (ацетамидазу), (орнитинкарбамоилтрансферазу), (фосфинотрицинацетилтрансферазу), (гигромицинфосфотрансферазу), (нитратредуктазу), (оротидин-5'-фосфатдекакарбоксилазу), (сульфатаденилтрансферазу) и (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты. Для применения в клетке предпочтительными являются гены и или и ген . Предпочтительными для применения в клетке являются гены , , , и .
hph
tk
Селектируемый маркер может представлять собой систему двойного селектируемого маркера, описанную в WO 2010/039889. В одном аспекте двойной селектируемый маркер представляет собой систему двойного селектируемого маркера -.
Вектор предпочтительно содержит элемент(ы), которые обеспечивают интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.
Интеграция вектора в геном клетки-хозяина может зависеть от последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид или любого другого элемента вектора для интеграции в геном посредством гомологичной или негомологичной рекомбинации. Альтернативно, вектор может содержать дополнительные полинуклеотиды для управления интеграцией в геном клетки-хозяина в точном местоположении(местоположениях) в хромосоме(хромосомах) посредством гомологичной рекомбинации. Для повышения возможности интеграции в точном местоположении интегрируемые элементы должны содержать достаточное количество нуклеиновых кислот, как например, от 100 до 10000 пар оснований, от 400 до 10000 пар оснований и от 800 до 10000 пар оснований, последовательность которых в высокой степени обладает идентичностью соответствующей последовательности-мишени для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. Интегрируемые элементы могут представлять собой любую последовательность, гомологичную последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интегрируемые элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие полинуклеотиды. С другой стороны, вектор можно интегрировать в геном клетки-хозяина посредством негомологичной рекомбинации.
in vivo
Для автономной репликации вектор может дополнительно содержать точку начала репликации, что обеспечивает возможность автономной репликации вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Точка начала репликации может представлять собой любой репликатор плазмиды, опосредующий автономную репликацию, который функционирует в клетке. Выражение "точка начала репликации" или "репликатор плазмиды" означает полинуклеотид, который обеспечивает возможность репликации плазмиды или вектора .
E. coli
Bacillus
Примерами бактериальных точек начала репликации являются точки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177, и pACYC184, обеспечивающие возможность репликации в , и pUB110, pE194, pTA1060, и pAMß1, обеспечивающие возможность репликации в .
Примеры точек начала репликации для применения в клетке-хозяине, относящейся к дрожжам, представляют собой точки начала репликации 2-микронной плазмиды ARS1, ARS4, комбинацию ARS1 и CEN3 и комбинацию ARS4 и CEN6.
et al.,
Gene
et al.,
Nucleic Acids Res.
Примерами точек начала репликации, пригодных в клетке нитчатого гриба, являются AMA1 и ANS1 (Gems 1991, 98: 61-67; Cullen 1987, 15: 9163-9175; WO 00/24883). Выделение гена AMA1 и конструирование плазмид или векторов, содержащих ген, можно проводить в соответствии со способами, раскрытыми в WO 00/24883.
В клетку-хозяина для повышения выработки полипептида можно ввести более одной копии полинуклеотида по настоящему изобретению. Увеличения числа копий полинуклеотида можно достичь посредством интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или посредством внедрения амплифицируемого селектируемого маркерного гена с полинуклеотидом, причем клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого маркерного гена и, следовательно, дополнительные копии полинуклеотида, можно отбирать посредством культивирования клеток в присутствии подходящего средства для отбора.
et al.,
Методики, применяемые для лигирования описанных выше элементов для конструирования рекомбинантных векторов экспрессии по настоящему изобретению, хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook 1989, выше).
Клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют выработкой полипептида по настоящему изобретению. Конструкция или вектор, содержащие полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкция или вектор сохранялись в виде интегрированного в хромосому элемента или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Термин "клетка-хозяин" охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, происходящих в течение репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего полипептид, и его источника.
Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, пригодную для рекомбинантного получения полипептида согласно настоящему изобретению, например, прокариотическую или эукариотическую.
Bacillus
Clostridium
Enterococcus
Geobacillus
Lactobacillus
Lactococcus
Oceanobacillus
Staphylococcus
Streptococcus
Streptomyces
Campylobacter
E. coli
Flavobacterium
Fusobacterium
Helicobacter
Ilyobacter
Neisseria
Pseudomonas
Salmonella
Ureaplasma
Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой клетку любой грамположительной или грамотрицательной бактерии. Грамположительные бактерии включают без ограничения , , , , , , , , и . Грам-отрицательные бактерии включают без ограничения , , , , , , , , и .
Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку Bacillus, в том числе без ограничения клетки Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.
Streptococcus
Streptococcus equisimilis
Streptococcus pyogenes
Streptococcus uberis
Streptococcus equi
Zooepidemicus
Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку , в том числе без ограничения клетки , , и подвида .
Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptomyces, в том числе без ограничения клетки Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus и Streptomyces lividans.
Bacillus
например
Mol. Gen. Genet.
J. Bacteriol
J. Mol. Biol.
Biotechniques
J. Bacteriol.
E. coli
J. Mol. Biol.
et al.,
Nucleic Acids Res.
Streptomyces
et al.,
Folia Microbiol.
Praha
et al.,
J. Bacteriol
et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Pseudomonas
et al.,
J. Microbiol. Methods
Appl. Environ. Microbiol.
Streptococcus
Infect. Immun.
et al.,
Appl. Environ. Microbiol.
Microbiol. Rev.
Введение ДНК в клетку можно осуществлять посредством трансформации протопластов (см., , Chang and Cohen, 1979, 168: 111-115), трансформации компетентных клеток (см., например, Young and Spizizen, 1961, . 81: 823-829 или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, 56: 209-221), электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, 6: 742-751) или конъюгации (см., например, Koehler and Thorne, 1987, 169: 5271-5278). Введение ДНК в клетку можно осуществлять посредством трансформации протопластов (см., например, Hanahan, 1983, 166: 557-580) или электропорации (см., например, Dower 1988, 16: 6127-6145). Введение ДНК в клетку можно осуществлять посредством трансформации протопластов, электропорации (см., например, Gong 2004, () 49: 399-405), конъюгации (см., например, Mazodier 1989, . 171: 3583-3585) или трансдукции (см., например, Burke 2001, 98: 6289-6294). Введение ДНК в клетку можно осуществлять посредством электропорации (см., например, Choi 2006, 64: 391-397) или конъюгации (см., например, Pinedo and Smets, 2005, 71: 51-57). Введение ДНК в клетку можно осуществлять посредством естественной компетентности (см., например, Perry and Kuramitsu, 1981, 32: 1295-1297), трансформации протопластов (см., например, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), электропорации (см., например, Buckley 1999, 65: 3800-3804) или конъюгации (см., например, Clewell, 1981, 45: 409-436). Тем не менее можно применять любой известный из уровня техники способ введения ДНК в клетку-хозяина.
Клетка-хозяин может также быть эукариотической клеткой, такой как клетка млекопитающего, насекомого, растительная или клетка, относящаяся к грибам.
.
Ainsworth and Bisbyʹs Dictionary of The Fungi
Клетка-хозяин может представлять собой клетку, относящуюся к грибам. "Грибы", как применяется в данном документе, включают отделы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota, а также Oomycota и все митоспоровые грибы (как определено Hawksworth и соавтв , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).
Biology and Activities of Yeast
Soc. App. Bacteriol. Symposium Series
Клетка-хозяин,относящаяся к грибам, может представлять собой клетку, относящуюся к дрожжам. ʺДрожжиʺ в контексте данного документа включают аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (бластомицетам). Поскольку классификация дрожжей в будущем может измениться, в контексте настоящего изобретения дрожжи следует определять согласно описанному в (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, No. 9, 1980).
Candida
Hansenula
Kluyveromyces
Pichia
Saccharomyces
Schizosaccharomyces
Yarrowia
Kluyveromyces lactis
Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces diastaticus
Saccharomyces douglasii
Saccharomyces kluyveri
Saccharomyces norbensis
Saccharomyces oviformis
Yarrowia lipolytica
Клетка-хозяин, относящаяся к дрожжам, может представлять собой клетку , , , , , или , как например, клетку , , , , , , , или .
et al.,
выше
Saccharomyces cerevisiae
Клетка-хозяин, относящаяся к грибам, может представлять собой клетку нитчатого гриба. "Нитчатые грибы" включают все нитчатые формы подотделов Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth 1995, ). Нитчатые грибы, как правило, характеризуются клеточной стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит посредством удлинения гиф, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным. Напротив, вегетативный рост дрожжей, таких как , происходит посредством почкования одноклеточного таллома, а катаболизм углерода может быть ферментативным.
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Bjerkandera
Ceriporiopsis
Chrysosporium
Coprinus
Coriolus
Cryptococcus
Filibasidium
Fusarium
Humicola
Magnaporthe
Mucor
Myceliophthora
Neocallimastix
Neurospora
Paecilomyces
Penicillium
Phanerochaete
Phlebia
Piromyces
Pleurotus
Schizophyllum
Talaromyces
Thermoascus
Thielavia
Tolypocladium
Trametes
Trichoderma
Клетка-хозяин, относящаяся к нитчатым грибам, может представлять собой клетку , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или .
Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei
Trichoderma viride
Например, клетка-хозяин, яотносящаяся к нитчатым грибам, может представлять собой клетку или .
per se
Aspergillus
Trichoderma
et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.,
Bio/Technology
Fusarium
et al.,
Gene
Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology
Methods in Enzymology
et al.,
J. Bacteriol.
et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Клетки, относящиеся к грибам можно трансформировать с помощью способа, предусматривающего образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки способом, известным . Подходящие процедуры для трансформации клеток-хозяев и описаны в EP 238023, Yelton 1984, 81: 1470-1474, и Christensen 1988, 6: 1419-1422. Подходящие способы трансформации видов описаны в Malardier 1989, 78: 147-156, и WO 96/00787. Дрожжи можно трансформировать с применением методик, описанных Becker and Guarente в Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, , , Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito 1983, 153: 163; и Hinnen 1978, 75: 1920.
Способы получения
Aspergillus
Aspergillus oryzae
Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида согласно настоящему изобретению, включающим (a) культивирование клетки, которая в своей форме дикого типа вырабатывает полипептид, в условиях, благоприятных для выработки полипептида и необязательно (b) извлечение полипептида. В одном аспекте клетка является клеткой . В другом аспекте клетка является клеткой .
Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида согласно настоящему изобретению, включающим (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению в условиях, благоприятных для выработки полипептида и необязательно (b) извлечение полипептида.
Клетки-хозяев культивируют в питательной среде, подходящей для выработки полипептида, с применением способов, известных из уровня техники. Например, клетки можно культивировать посредством культивирования во встряхиваемой колбе или при мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (в том числе непрерывной, периодической, периодической с подпиткой или твердофазной ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии и/или выделения полипептида. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных из уровня техники. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах американской коллекции типовых культур). Если полипептид секретируется в питательную среду, то полипептид можно извлечь непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, его можно извлечь из клеточных лизатов.
Полипептид можно выявить с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфическими по отношению к полипептидам. Эти способы выявления включают без ограничения применение специфичных антител, образование продукта ферментативной реакции или исчезновение субстрата фермента. Например, анализ ферментативной активности можно применять для определения активности полипептида.
Полипептид можно извлечь с применением способов, известных из уровня техники. Например, полипептид можно извлечь из питательной среды с помощью общепринятых методик, в том числе без ограничения сбора, центрифугирования, фильтрации, экстракции, распылительной сушки, выпаривания или осаждения. В одном аспекте извлекают ферментативный бульон, содержащий полипептид.
Protein Purification
Полипептид можно очистить с помощью ряда методик, известных из уровня техники, в том числе без ограничения хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографии, хроматофокусирования и эксклюзионной хроматографии), электрофоретических методик (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), дифференциальной растворимости (например, осаждения сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракции (см., например, , Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением практически чистых полипептидов.
В альтернативном аспекте полипептид не извлекают, а вместо этого в качестве источника полипептида используют клетку-хозяина согласно настоящему изобретению, экспрессирующую полипептид.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно включает получение полипептида посредством культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, дополнительно содержащей полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, представляющий интерес; предпочтительно фермент, представляющий интерес; более предпочтительно секретируемый фермент, представляющий интерес; еще более предпочтительно гидролазу, изомеразу, лигазу, лиазу, оксидоредуктазу или трансферазу; и наиболее предпочтительно секретируемый фермент представляет собой альфа-галактозидазу, альфа-глюколзидазу, аминопептидазу, амилазу, аспарагиназу, бета-галактозидазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлобиогидролазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, циклодекстрингликозилтрансферазу, дезоксирибонуклеазу, эндоглюканазу, эстеразу, зеленый флуоресцентный белок, глюкано-трансфразу, глюкоамилазу, инвертазу, лакказу, липазу, маннозидазу, мутаназу, оксидазу, пектинолитический фермент, пероксидазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглютаминазу или ксиланазу.
В одном варианте осуществления второй полипептид, представляющий интерес, является гетерологичным или гомологичным по отношению к клетке-хозяину.
В одном варианте осуществления рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина, относящуюся к грибам; предпочтительно клетку-хозяина, относящуюся к нитчатым грибам; более предпочтительно клетку Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, или Trichoderma; наиболее предпочтительно клеткой Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, или Trichoderma viride.
В одном варианте осуществления рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку-хозяина; предпочтительно прокариотическую клетку-хозяина; более предпочтительно грам-положительную клетку-хозяина; еще более предпочтительно клетку-хозяина Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus или Streptomyces; и наиболее предпочтительно клетку-хозяина Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.
В одном варианте осуществления способ получения второго полипептида, представляющего интерес, включает культивирование клетки-хозяина в условиях, благоприятных для получения второго полипептида, представляющего интерес.
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает извлечение второго полипептида, представляющего интерес.
Составы ферментативного бульона или композиции клеток
Настоящее изобретение также относится к составу ферментативного бульона или композиции клеток, содержащим полипептид по настоящему изобретению. Продукт в виде ферментативного бульона дополнительно содержит дополнительные ингредиенты, применяемые в способе ферментации, такие как, например, клетки (в том числе клетки-хозяева, содержащие ген, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, которые применяют для получения полипептида, представляющего интерес), клеточный дебрис, биомассу, ферментативную среду и/или продукты ферментации. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой цельный бульон с погибшими клетками, содержащий органическую кислоту(кислоты), погибшие клетки и/или клеточный дебрис и среду культуры.
например
например
например
Термин "ферментативный бульон", применяемый в данном документе, относится к препарату, получаемому посредством клеточной ферментации, который не подвергается или подвергается минимальному извлечению и/или очистке. Например, ферментативные бульоны получают, когда микробные культуры выращивают до насыщения, инкубируют в углерод-ограничивающих условиях для обеспечения синтеза белка (, экспрессия ферментов клетками-хозяевами) и секрецию в среду культуры клеток. Ферментативный бульон может содержать нефракционированные или фракционированные составляющие ферментативных материалов, образованных в конце ферментации. Как правило, ферментативный бульон является нефракционированным и содержит истощенную среду культуры и клеточный дебрис, присутствующий после удаления микробных клеток (, клеток нитчатых грибов), , посредством центрифугирования. В некоторых вариантах осуществления ферментативный бульон содержит истощенную средукультуры клеток, внеклеточные ферменты и жизнеспособные и/или нежизнеспособные микробные клетки.
В одном варианте осуществления состав ферментативного бульона и композиции клеток содержат компонент первой органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту с 1-5 атомами углерода и/или ее соль и компонент второй органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту с 6 или более атомами углерода и/или ее соль. В конкретном варианте осуществления компонент первой органической кислоты представляет собой уксусную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, ее соль или смесь двух или более из приведенных выше кислот и компонент второй органической кислоты представляет собой бензойную кислоту, циклогексанкарбоновую кислоту, 4-метилвалериановую кислоту, фенилуксусную кислоту, ее соль или смесь двух или более из приведенных выше кислот.
В одном аспекте композиция содержит органическую кислоту(кислоты) и необязательно дополнительно содержит погибшие клетки и/или клеточный дебрис. В одном варианте осуществления погибшие клетки и/или клеточный дебрис удаляют из цельного бульона с погибшими клетками с получением композиции, которая не содержит данные компоненты.
например
Составы ферментативного бульона или композиции клеток могут дополнительно содержать консервант и/или противомикробное средство (, бактериостатическое средство), в том числе, без ограничения, сорбит, хлорид натрия, сорбат калия и другие, известные из уровня техники.
например
Цельный бульон с погибшими клетками или композиция могут содержать нефракционированные составляющие ферментативных материалов, образованных в конце ферментации. Как правило, цельный бульон с погибшими клетками или композиция содержат истощенную среду культуры и клеточный дебрис, присутствующие после выращивания до насыщения микробных клеток (, клеток нитчатых грибов), инкубированных в углерод-ограничивающих условиях с обеспечением синтеза белка. В некоторых вариантах осуществления цельный бульон с погибшими клетками или композиции содержат истощенную среду культуры клеток, внеклеточные ферменты и погибшие клетки нитчатых грибов. В некоторых вариантах осуществления микробные клетки, присутствующие в цельном бульоне с погибшими клетками или композиции, могут быть пермеабилизированы и/или лизированы с использованием способов, известных из уровня техники.
Цельный бульон или композиция клеток, описанные в данном документе, обычно представляют собой жидкость, но могут содержать нерастворимые компоненты, такие как погибшие клетки, клеточный дебрис, компоненты среды культуры и/или нерастворимый фермент(ы). В некоторых вариантах осуществления нерастворимые компоненты можно устранять с получением осветленной жидкой композиции.
Составы на основе цельного бульона и композиций на основе клеток по настоящему изобретению могут быть получены посредством способа, описанного в WO 90/15861 или WO 2010/096673.
Сигнальный пептид
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему сигнальный пептид, содержащий аминокислоты с -37 по -16 в SEQ ID NO: 2. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему пропептид, содержащий аминокислоты с -15 по -1 в SEQ ID NO: 2. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему сигнальный пептиди пропептид, содержащий аминокислоты с -37 по -1 в SEQ ID NO: 2.
Полинуклеотиды могут дополнительно содержать ген, кодирующий белок, который функционально связан с сигнальным пептидом и/или пропептидом. Белок предпочтительно является чужеродным по отношению к сигнальному пептиду и/или пропептиду. В одном аспекте полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид, представляет собой нуклеотиды 1-66 в SEQ ID NO: 1. В другом аспекте полинуклеотид, кодирующий пропептид, представляет собой нуклеотиды 67-111 в SEQ ID NO: 1. В другом аспекте полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид, и пропептид представляют собой нуклеотиды 1-111 в SEQ ID NO: 1.
Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, векторам экспрессии и рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды.
Настоящее изобретение также относится к способам получения белка, включающим (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей такой полинуклеотид; и (b) извлечение белка.
Белок может быть нативным или гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. Выражение "белок" в данном документе не относится к конкретной длине кодируемого продукта и, следовательно, охватывает пептиды, олигопептиды и полипептиды. Выражение "белок" также охватывает два или более полипептидов, объединенных с образованием кодируемого продукта. Белки также включают гибридные полипептиды и слитые полипептиды.
например
Предпочтительно, белок представляет собой гормон, фермент, рецептор или их часть, антитело или его часть или репортер. Например, белок может представлять собой гидролазу, изомеразу, лигазу, лиазу, оксидоредуктазу или трансферазу, , альфа-галактозидазу, альфа-глюкозидазу, аминопептидазу, амилазу, бета-галактозидазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлобиогидролазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, циклодекстрингликозилтрансферазу, дезоксирибонуклеазу, эндоглюканазу, эстеразу, глюкоамилазу, инвертазу, лакказу, липазу, маннозидазу, мутаназу, оксидазу, пектинолитический фермент, пероксидазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглютаминазу или ксиланазу.
Ген может быть получен из любого прокариотического, эукариотического или другого источника.
Фермент по настоящему изобретению - дезоксирибонуклеаза (ДНКаза)
Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, или дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) представляет собой любой фермент, который катализирует гидролитическое расщепление связей сложного фосфодиэфира в основной цепи ДНК, разрушая таким образом ДНК. Два термина - полипептид, обладающий активностью ДНКазы, и ДНКаза - применяют взаимозаменяемо.
Aspergillus,
Aspergillus oryzae,
Aspergillus oryzae.
В соответствии с настоящим изобретением, ДНКазу можно получать из гриба; в частности, ДНКаза, которую можно получать из является предпочтительной; в частности, ДНКаза, которую можно получать из является предпочтительной. В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий активностью дезоксирибонуклеазы, не является S1 нуклеазой из
Aspergillus oryzae
ДНКаза, применяемая в настоящем изобретении, включает зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2, показанный аминокислотами 1-206 в SEQ ID NO: 2, которую можно получать из .
Aspergillus
Aspergillus oryzae
Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, может быть получен из , например из . В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий активностью ДНКазы, представляет собой заявленный полипептид.
Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте полипептиды отличаются не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2.
В варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте полипептиды отличаются не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенным полипептидам, характеризующимся идентичностью последовательности SEQ ID NO: 8 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%, который обладает активностью ДНКазы. В одном аспекте полипептиды отличаются не более 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 8.
Полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 или его аллельного варианта; или его фрагмент, обладающий активностью ДНКазы. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из аминокислот от 1 до 206 в SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления полипептид был выделен. Полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 9 или его аллельного варианта; или его фрагмент, обладающий активностью ДНКазы. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9. В другом аспекте полипептид содержит или состоит из аминокислот от 1 до 204 в SEQ ID NO: 9. Один аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей или по сути состоящей из полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 8, и полипептида по настоящему изобретению, состоящего из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 9.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или с (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренно низкой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренной жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренно высокой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях высокой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях очень высокой жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1, с (ii) ее последовательностью кДНК или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii). В одном варианте осуществления полипептид был выделен.
32
3
35
Полинуклеотид с SEQ ID NO: 1 или его подпоследовательность, а также полипептид с SEQ ID NO: 2 или его фрагмент или полипептид с SEQ ID NO: 9 или его фрагмент можно применять для конструирования зондов на основе нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептид, обладающий активностью ДНКазы, у штаммов разных родов или видов, в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. В частности, такие зонды можно применять для гибридизации с геномной ДНК или кДНК представляющей интерес клетки после стандартных процедур Саузерн-блоттинга с целью идентификации и выделения их соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, но должны иметь в длину по меньшей мере 15, например, по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Зонд на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет в длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, например, имеет в длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно применять как ДНК-, так и РНК-зонды. Зонды, как правило, метят для выявления соответствующего гена (например, P, H, S, биотином или авидином). Настоящее изобретение охватывает такие зонды.
Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из таких других штаммов можно подвергнуть скринингу в отношении ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и кодирует полипептид, обладающий активностью ДНКазы. Геномную или другую ДНК из таких других штаммов можно разделить посредством электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или других методик разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести и иммобилизировать на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале-носителе. С целью идентификации клона или ДНК, которые гибридизуются с SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательностью, материал-носитель применяется в Саузерн-блоттинге.
В контексте настоящего изобретения гибридизация указывает на то, что полинуклеотид гибридизуется с меченым зондом на основе нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 1; (ii) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1; (iii) ее последовательности кДНК; (iv) его комплементарной последовательности полной длины; или (v) ее подпоследовательности; в условиях очень низкой, низкой жесткости, в условиях умеренно низкой жесткости, в условиях умеренной жесткости, в условиях умеренно высокой жесткости, в условиях высокой жесткости до условий очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми в этих условиях гибридизируется зонд на основе нуклеиновой кислоты, можно выявить с помощью, например, пленки для рентгенографии или любых других средств для выявления, известных из уровня техники.
например
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью ДНКазы, кодируемому полинуклеотидом, характеризующимся идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1 или ее последовательности кДНК по меньшей мере на 60%, , по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%. В следующем варианте осуществления полипептид был выделен.
например
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или более (например, некоторых) положениях. В варианте осуществления количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок, введенных в зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2, составляет не более 10, , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на фолдинг и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку посредством изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.
например
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или более (например, некоторых) положениях. В варианте осуществления количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок, введенных в зрелый полипептид с SEQ ID NO: 9, составляет не более 10, , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на фолдинг и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку посредством изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.
Фермент ДНКазы может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, показанной аминокислотами с -37 по 206 в SEQ ID NO: 2 или ее фрагмент, который обладает активностью ДНКазы, такой как зрелый полипептид. Либо фермент ДНКазы может содержать или состоять из фрагмента аминокислоты с -37 по 206 в SEQ ID NO: 2 или аминокислот 1-206 в SEQ ID NO: 2, для которых фрагмент одной или нескольких аминокислот устраняют из амино- и/или карбоксильного конца SEQ ID NO: 2.
Фермент ДНКазы может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, показанной аминокислотами с 1 по 204 в SEQ ID NO: 9 или ее фрагмент, который обладает активностью ДНКазы, такой как зрелый полипептид. Либо фермент ДНКазы может содержать или состоять из фрагмента аминокислоты с 1 по 204 в SEQ ID NO: 9 или аминокислоты 1-204 в SEQ ID NO: 9, для которых фрагмент одной или нескольких аминокислот устраняют из амино- и/или карбоксильного конца SEQ ID NO: 9.
В настоящем изобретении также представлены полипептиды ДНКазы, которые по сути гомологичны полипептидам, приведенным выше, и их гомологам видов (паралогам или ортологам). Термин "по сути гомологичный" в данном документе применяют для обозначения полипептидов, которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентичны, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% или более идентичны аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 или аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 9, или ее фрагменту, который обладает активностью ДНКазы, или его ортологов или паралогов.
например
например
В другом варианте осуществления ДНКаза в SEQ ID NO: 2 содержит замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких (, некоторых) положениях. В другом варианте осуществления ДНКаза в SEQ ID NO: 9 содержит замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких (, некоторых) положениях. В варианте осуществления количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок, введенных в зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2 или в зрелый полипептид с SEQ ID NO: 9, составляет не более 10, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на фолдинг и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку посредством изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.
в The Proteins
Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Замены аминокислот, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, , Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.
Альтернативно, изменения аминокислот имеют такой характер, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термоустойчивость полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять оптимальное значение pH и т.п.
Science
et al.,
J. Biol. Chem.
et al.,
Science
et al.,
J. Mol. Biol.
et al.,
FEBS Lett.
Незаменимые аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными из уровня техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят в каждый остаток в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении активности ДНКазы для идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также, Hilton 1996, 271: 4699-4708. Активный центр для ферментативного или другого биологического взаимодействия можно также определить с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего центра. См., например, de Vos 1992, 255: 306-312; Smith 1992, 224: 899-904; Wlodaver 1992, 309: 59-64. Об идентичности незаменимых аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом.
Science
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.,
Biochemistry
et al.,
Gene
Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществить и исследовать при помощи известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей соответствующей процедурой скрининга, как, например, таковых, раскрытых в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, 86: 2152-2156; WO 95/17413 или WO 95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР с использованием неточной полимеразы, фаговый дисплей (например, Lowman 1991, 30: 10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204) и направленный на участок мутагенез (Derbyshire 1986, 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
et al.,
Nature Biotechnology
Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединить с автоматизированными способами скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness 1999, 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлечь из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов из данной области техники. Эти способы обеспечивают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.
Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором участок одного полипептида слит с N-концом или C-концом участка другого полипептида.
EMBO J.
Science
Полипептид может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида по настоящему изобретению. Слитый полипептид получают посредством слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Методики получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, с тем, чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем одного и того же промотора(промоторов) и терминатора. Слитые полипептиды можно также конструировать с применением интеиновой технологии, в которой слитые полипептиды создаются посттрансляционно (Cooper et al., 1993, 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, 266: 776-779).
J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
et al.,
Appl. Environ. Microbiol.
et al.,
Biotechnology
et al.,
Biotechnology
et al.,
Biochemistry
et al.,
Biotechnology
et al.,
Proteins: Structure, Function, и Genetics
Drug Discovery World
Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка сайт расщепляется с высвобождением двух полипептидов. Примеры сайтов расщепления включают без ограничения сайты, раскрытые в Martin et al., 2003, 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson 1997, 63: 3488-3493; Ward 1995, 13: 498-503; и Contreras 1991, 9: 378-381; Eaton 1986, 25: 505-512; Collins-Racie 1995, 13: 982-987; Carter 1989, 6: 240-248; и Stevens, 2003, 4: 35-48.
Концентрация ДНКазы в моющем растворе обычно находится в диапазоне от 0,00004 до 100 ppm белка-фермента, например, в диапазоне от 0,00008 до 100, в диапазоне от 0,0001 до 100, в диапазоне от 0,0002 до 100, в диапазоне от 0,0004 до 100, в диапазоне от 0,0008 до 100, в диапазоне от 0,001 до 100 ppm белка-фермент, 0,01-100 ppm белка-фермента, предпочтительно 0,05-50 ppm белка-фермента, более предпочтительно 0,1-50 ppm белка-фермента, более предпочтительно 0,1-30 ppm белка-фермента, более предпочтительно 0,5-20 ppm белка-фермента и наиболее предпочтительно 0,5-10 ppm белка-фермента.
ДНКазу по настоящему изобретению можно добавлять в моющую композицию в количестве, соответствующем по меньшей мере 0,002 мг белка ДНКазы, наример, по меньшей мере 0,004 мг белка ДНКазы, по меньшей мере 0,006 мг белка ДНКазы, по меньшей мере 0,008 мг белка ДНКазы, по меньшей мере 0,01 мг белка ДНКазы, по меньшей мере 0,1 мг белка, предпочтительно по меньшей мере 1 мг белка, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг белка, еще более предпочтительно по меньшей мере 15 мг белка, наиболее предпочтительно по меньшей мере 20 мг белка и еще более предпочтительно по меньшей мере 25 мг белка. Таким образом, моющая композиция может содержать по меньшей мере 0,00008% белка ДНКазы, предпочтительно по меньшей мере 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,008%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1,0% белка ДНКазы.
ДНКазу в моющей композиции по настоящему изобретению можно стабилизировать с применением общепринятых стабилизирующих средств, например, полиола, такого как пропиленгликоль или глицерин, сахара или сахароспирта, молочной кислоты, борной кислоты или производного борной кислоты, например, ароматического сложного эфира борной кислоты, или производного фенилбороновой кислоты, например, 4-формилфенилбороновой кислоты, и при этом композицию можно составить, как описано, например, в WO 92/19709 и WO 92/19708.
Полипептид по настоящему изобретению также может быть включен в составы моющих средств, раскрытых в WO 97/07202, которая включена в данный документ посредством ссылки.
Моющие композиции
В одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на моющие композиции, содержащие фермент по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими дополнительными чистящими компонентами композиции. В одном варианте осуществления моющая композиция содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 9. В другом варианте осуществления моющее средство содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 8, и полипептида по настоящему изобретению, состоящего из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления моющая композиция находится в твердой форме. В другом варианте осуществления моющая композиция находится в жидкой форме. Выбор дополнительных компонентов находится в компетенции специалиста в данной области и предусматривает общепринятые ингредиенты, в том числе иллюстративные неограничивающие компоненты, изложенные ниже.
Жидкая моющая композиция
Жидкая моющая композиция может содержать микрокапсулу по настоящему изобретению, и таким образом образовывать любую моющую композицию в любой форме, такой как жидкая форма, и моющие средства в форме порошка, и бруски мыла и моющего средства.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на жидкие моющие композиции, содержащие микрокапсулу, как описано выше, в комбинации с одним или несколькими дополнительными чистящими компонентами композиции.
Микрокапсулу, как описано выше, можно добавлять в жидкую моющую композицию в количестве, соответствующем 0,0001%-5% (вес/вес) активного белка-фермент(AEP); предпочтительно 0,001%-5%, более предпочтительно 0,005%-5%, более предпочтительно 0,005%-4%, более предпочтительно 0,005%-3%, более предпочтительно 0,005%-2%, еще более предпочтительно 0,01%-2% и наиболее предпочтительно 0,01%-1% (вес/вес) активного белка-фермента.
Жидкая моющая композиция имеет физическую форму, которая не является твердой (или газообразной). Она может представлять собой текучую жидкость, пасту, текучий гель или нетекучий гель. Она может быть либо изотропной, либо структурированной, предпочтительно изотропной. Она может представлять собой состав, пригодный для стирки в автоматических стиральных машинах или для ручной стирки. Она также может представлять собой продукт для личной гигиены, такой как шампунь, зубная паста или мыло для рук.
Жидкая моющая композиция может быть водной, обычно содержащей по меньшей мере 20% по весу и не более 95% воды, например, не более 70% воды, не более 50% воды, не более 40% воды, не более 30% воды или не более 20% воды. Другие типы жидкостей, в том числе, без ограничения, алканолы, амины, диолы, эфиры и полиолы, могут быть включены в водное жидкое моющее средство. Водное жидкое моющее средство может содержать 0-30% органического растворителя. Жидкое моющее средство также может быть неводным, при этом содержание воды составляет менее 10%, предпочтительно менее 5%.
Ингредиенты моющего средства могут быть отделены физически один от другого с помощью отделений в водорастворимых пакетах. Таким образом можно избежать отрицательного взаимодействия между компонентами при хранении. Различные профили растворимости каждой из отделений также могут обеспечивать задержку растворения выбранных компонентов в моющем растворе.
например
Моющая композиция может принимать форму единичной дозы продукта. Единичная доза продукта представляет собой упаковку с одной дозой в одноразовом контейнере. Она все чаще используется в моющих средствах для стирки. Единичная доза моющего продукта представляет собой упаковку (, в пакете, изготовленном из водорастворимой пленки) с количеством моющего средства, применяемым для одной стирки.
например
например
Пакеты могут иметь любую форму, вид и из любого материала, который является пригодным для удерживания композиции, , без обеспечения высвобождения композиции из пакета до контакта с водой. Пакет изготовлен из водорастворимой пленки, которая охватывает внутренний объем. Указанный внутренний объем может быть разделен на отделения пакета. Предпочтительными пленками являются полимерные материалы, предпочтительно полимеры, которые имеют форму пленки или листа. Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные выбраны из полиакрилатов и водорастворимых coполимеров акрилата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, декстрина натрия, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, наиболее предпочтительно coполимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC). Предпочтительно, количество полимера в пленке, например PVA, составляет по меньшей мере примерно 60%. Предпочтительный средний молекулярный вес обычно составляет от примерно 20000 до примерно 150000. Пленки могут также представлять собой смесь композиций, которая содержит гидролитически разлагаемые и водорастворимые полимерные смеси, такие как полиактид и поливиниловый спирт (известный под торговым названием M8630, продаваемый Chris Craft In. Prod. Of Gary, Индиана, США) а также пластификаторы, такие как глицерин, этиленглицерин, пропиленгликоль, сорбит и их смеси. Пакеты могут содержать твердую чистящую композицию для стирки или часть компонентов и/или жидкую чистящую композицию или часть компонентов, разделенные водорастворимой пленкой. Отделение для жидких компонентов может отличаться по составу от отделений, содержащих твердые вещества (см., , US 2009/0011970).
При уходе за текстильным изделием, выбор моющих компонентов может включать учет типа текстильного изделия, которое необходимо очистить, тип и/или степень загрязнения, температуру, при которой должна осуществляться очистка, и состав моющего продукта. Хотя компоненты, упомянутые ниже, разделены на категории согласно общему названию в соответствии с конкретной функциональной возможностью, это не должно быть истолковано как ограничение, так как компонент может включать дополнительные функциональные возможности, что будет понятно специалисту в данной области.
Выбор дополнительных компонентов находится в компетенции специалиста в данной области и предусматривает общепринятые ингредиенты, в том числе иллюстративные неограничивающие компоненты, изложенные ниже.
Поверхностно-активные вещества
Моющая композиция может содержать одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут быть анионными, и/или катионными, и/или неионными, и/или полуполярными, и/или цвиттер-ионными, или их смесью. В конкретном варианте осуществления моющая композиция включает смесь одного или нескольких неионных поверхностно-активных веществ и одного или нескольких анионных поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активное вещество(вещества) обычно присутствует в количестве от приблизительно 0,1% до 60% по весу, например, от приблизительно 1% до приблизительно 40%, или от приблизительно 3% до приблизительно 20%, или от приблизительно 3% до приблизительно 10%. Поверхностно-активное вещество(вещества) выбирают исходя из необходимого применения для очистки, и при этом может предусматриваться любое общепринятое поверхностно-активное вещество(вещества), известное из уровня техники.
При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу анионного поверхностно-активного вещества, например, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, включая от приблизительно 5% до приблизительно 15%, или от приблизительно 15% до приблизительно 20%, или от приблизительно 20% до приблизительно 25% анионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают сульфаты и сульфонаты, в частности, линейные алкилбензолсульфонаты (LAS), изомеры LAS, разветвленные алкилбензолсульфонаты (BABS), фенилалкансульфонаты, альфа-олефинсульфонаты (AOS), олефинсульфонаты, алкенсульфонаты, алкан-2,3-диилбис(сульфаты), гидроксиалкансульфонаты и дисульфонаты, алкилсульфаты (AS), такие как додецилсульфат натрия (SDS), сульфаты жирных спиртов (FAS), сульфаты первичных спиртов (PAS), эфирсульфаты спиртов (AES, или AEOS, или FES, также известные как этоксисульфаты спиртов или эфирсульфаты жирных спиртов); вторичные алкансульфонаты (SAS), сульфонаты парафина (PS), сульфонаты сложных эфиров, сложные эфиры глицерина и сульфонированных жирных кислот, метиловые сложные эфиры жирных альфа-сульфокислот (альфа-SFMe или SES), включая сульфонат сложного метилового эфира (MES), алкил- или алкенилянтарную кислоту, додеценил/тетрадеценил янтарную кислоту (DTSA), жирнокислотные производные аминокислот, сложные диэфиры и моноэфиры сульфоянтарной кислоты или соль жирной кислоты (мыло) и их комбинации.
При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу катионного поверхностно-активного вещества, например, от приблизительно 0,5% до приблизительно 30%, в частности, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 3% до приблизительно 10%, например, от приблизительно 3% до приблизительно 5%, от приблизительно 8% до приблизительно 12%, или от приблизительно 10% до приблизительно 12%. Неограничивающие примеры катионных поверхностно-активных веществ включают четвертичный алкилдиметилэтаноламин (ADMEAQ), цетилтриметиламмония бромид (CTAB), диметилдистеариламмония хлорид (DSDMAC) и алкилбензилдиметиламмоний, алкильные соединения четвертичного аммония, соединения алкоксилированного четвертичного аммония (AQA), сложный эфир четвертичных аммониевых соединений и их комбинации.
N
N
При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% по весу неионного поверхностно-активного вещества, например, от приблизительно 0,5% до приблизительно 30%, в частности, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 3% до приблизительно 10%, например, от приблизительно 3% до приблизительно 5%, от приблизительно 8% до приблизительно 12%, или от приблизительно 10% до приблизительно 12%. Неограничивающие примеры неионогенных поверхностно-активных веществ включают этоксилаты спирта (AE или AEO), пропоксилаты спирта, пропоксилированные жирные спирты (PFA), алкоксилированные алкиловые сложные эфиры жирной кислоты, например этоксилированные и/или пропоксилированные алкиловые сложные эфиры жирной кислоты, алкилфенолэтоксилаты (APE), нонилфенолэтоксилаты (NPE), алкилполигликозиды (APG), алкоксилированные амины, моноэтаноламиды жирной кислоты (FAM), диэтаноламиды жирной кислоты (FADA), этоксилированные моноэтаноламиды жирной кислоты (EFAM), пропоксилированные моноэтаноламиды жирной кислоты (PFAM), амиды жирной полигидроксиалкилкислоты или -ацил--алкил-производные глюкозамина (глюкамиды, GA или глюкамиды жирной кислоты, FAGA), а также продукты, доступные под торговыми названиями SPAN и TWEEN, и их комбинации.
N
N,N
N
N,N
При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0% до приблизительно 40% по весу полуполярного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры полуполярных поверхностно-активных веществ включают аминоксиды (AO), такие как алкилдиметиламиноксид, -(кокоалкил)--диметиламиноксид и -(таллоу-алкил)--бис(2-гидроксиэтил)аминоксид и их комбинации.
При их включении моющее средство обычно будет содержать от примерно 0% до примерно 40% по весу цвиттерионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры цвиттерионных поверхностно-активных веществ включают бетаины, такие как алкилдиметилбетаины, сульфобетаины и их комбинации.
Гидротропы
Гидротроп представляет собой соединение, которое солюбилизирует гидрофобные соединения в водных растворах (или, в противоположном случае, полярные соединения в неполярной среде). Как правило, гидротропы имеют как гидрофобный, так и гидрофильный характер (так называемые амфифильные свойства, которые известны у поверхностно-активных веществ), тем не менее, молекулярная структура гидротропов обычно не способствует спонтанной аутоагрегации, см., например, обзор Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Гидротропы не проявляют критическую концентрацию, выше которой происходит аутоагрегация, что обнаруживается у поверхностно-активных веществ и липидов, образующих мицеллярные, ламеллярные или другие хорошо определенные мезофазы. Между тем, у многих гидротропов наблюдают процесс агрегации непрерывного типа, при этом размеры агрегатов растут по мере увеличения концентрации. Тем не менее, многие гидротропы изменяют фазовое поведение, устойчивость и коллоидные свойства систем, содержащих вещества полярного и неполярного характера, в том числе смеси воды, масла, поверхностно-активных веществ и полимеров. Гидротропы обычно применяют в отраслях, начиная от фармацевтики, личной гигиены, пищевой промышленности и заканчивая применениями в технике. Применение гидротропов в моющих композициях дает, например, более концентрированные составы поверхностно-активных веществ (например, в процессе компактизации жидких моющих средств посредством устранения воды), не вызывая нежелательные явления, такие как разделение фаз или высокая вязкость.
Моющее средство может содержать 0-10% по весу, например, 0-5% по весу, например, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5%, или от приблизительно 3% до приблизительно 5% гидротропа. Что касается применения в моющих средствах можно применять любой гидротроп, известный из уровня техники. Неограничивающие примеры гидротропов включают бензолсульфонат натрия, п-толуолсульфонат натрия (STS), ксилолсульфонат натрия (SXS), кумолсульфонат натрия (SCS), цимолсульфонат натрия, аминоксиды, спирты и полигликолевые эфиры, гидроксинафтоат натрия, гидроксинафталинсульфонат натрия, этилгексилсульфат натрия и их комбинации.
Моющие компоненты и дополнительные моющие компоненты
например
Моющая композиция может содержать примерно 0-65% по весу, например, от примерно 5% до примерно 50% моющего компонента или дополнительного моющего компонента или их смеси в моющем средстве. Моющий компонент и/или дополнительный моющий компонент могут представлять собой, в частности, хелатирующее средство, которое образует растворимые в воде комплексы с Ca и Mg. Можно применять любой моющий компонент и/или дополнительный моющий компонент, известные из уровня техники для применения в моющих средствах. Неограничивающие примеры структурообразователей включают цеолиты, дифосфаты (пирофосфаты), трифосфаты, такие как трифосфат натрия (STP или STPP), карбонаты, такие как карбонат натрия, растворимые силикаты, такие как метасиликат натрия, слоистые силикаты (, SKS-6 от Hoechst), этаноламины, такие как 2-аминоэтан-1-ол (MEA), диэтаноламин (DEA, также известный как 2,2'-иминодиэтан-1-ол), триэтаноламин (TEA, также известный как 2,2',2"-нитрилoтриэтан-1-ол), и (карбоксиметил)инулин (CMI), и их комбинации.
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N', N'
Моющая композиция также может содержать 0-50% по весу, например, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, дополнительного моющего компонента моющего средства. Композиция моющего средства может включать дополнительный моющий компонент сам по себе, или в сочетании с моющим компонентом например, моющим компонентом на основе цеолита. Неограничивающие примеры дополнительных моющих компонентов включают гомополимеры полиакрилатов или их сополимеры, такие как поли(акриловая кислота) (PAA) или сополимер акриловой кислоты/малеиновой кислоты (PAA/PMA). Дополнительные неограничивающие примеры включают цитрат, комплексообразователи, такие как аминокарбоксилаты, аминополикарбоксилаты, а также фосфонаты и алкил- или алкенилянтарную кислоту. Дополнительные конкретные примеры включают 2,2',2"-нитрилотриуксусную кислоту (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), иминодиянтарную кислоту (IDS), этилендиамин-,ʹ-диянтарную кислоту (EDDS), метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), глутаминовую кислоту-,-диуксусную кислоту (GLDA), 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновую кислоту (HEDP), этилендиаминтетра-(метиленфосфоновую кислоту) (EDTMPA), диэтилентриаминпентакис(метиленфосфоновую кислоту) (DTMPA или DTPMPA), -(2-гидроксиэтил)иминодиуксусную кислоту (EDG), аспарагиновую кислоту--моноуксусную кислоту (ASMA), аспарагиновую кислоту-,-диуксусную кислоту (ASDA), аспарагиновую кислоту--монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), -(2-сульфометил)-аспарагиновую кислоту (SMAS), -(2-сульфоэтил)-аспарагиновую кислоту (SEAS), -(2-сульфометил)-глутаминовую кислоту (SMGL), -(2-сульфоэтил)-глутаминовую кислоту (SEGL), -метилиминодиуксусную кислоту (MIDA), α-аланин-, -диуксусную кислоту (α-ALDA), серин-, -диуксусную кислоту (SEDA), изосерин-, -диуксусную кислоту (ISDA), фенилаланин-, -диуксусную кислоту (PHDA), антраниловую кислоту-, -диуксусную кислоту (ANDA), сульфаниловую кислоту-, -диуксусную кислоту (SLDA), таурин-, -диуксусную кислоту (TUDA) и сульфометил-, -диуксусную кислоту (SMDA), -(2-гидроксиэтил)-этилендиамин-, -триуксусную кислоту (HEDTA), диэтанолглицин (DEG), диэтилентриамин-пента(метиленфосфоновую кислоту) (DTPMP), аминотрис(метиленфосфоновую кислоту) (ATMP) и их комбинации и соли. Дополнительные иллюстративные моющие компоненты и/или дополнительные моющие компоненты описаны, например, в WO 09/102854, US 5977053.
Отбеливающие системы
Моющее средство может содержать 0-30% по весу, как например, от примерно 1% до примерно 20% отбеливающей системы. Можно применять любую отбеливающую систему, известную из уровня техники, для использования в моющих средствах. Компоненты подходящей отбеливающей системы включают катилизаторы отбеливания, фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, источники пероксида водорода, такие как перкарбонат натрия, пербораты натрия и пероксид водорода-мочевина (1:1), предварительно образованные перкислоты и их смеси. Подходящие предварительно образованные перкислоты включают без ограничения, пероксикарбоновые кислоты и соли, дипероксидикарбоновые кислоты, перимидные кислоты и соли, пероксимоносерные кислоты и соли, например, Oxone (R), и их смеси. Неограничивающие примеры отбеливающих систем включают отбеливающие системы на основе пероксида, которые могут содержать, например, неорганическую соль, в том числе соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетрагидраты), перкарбонаты, персульфаты, перфосфаты, персиликатные соли в комбинации с активатором отбеливания, образующим перкислоту. Под выражением "активатор отбеливания" в данном документе понимают соединение, которое реагирует с пероксидом водорода с образованием перкислоты посредством пергидролиза. Перкислота, полученная таким образом, представляет собой активированный отбеливатель. Подходящие активаторы отбеливания для применения согласно данному документу включают активаторы, принадлежащие к классу сложных эфиров, амидов, имидов или ангидридов. Подходящие примеры представляют собой тетраацетилэтилендиамин (TAED), натрия 4-[(3,5,5-триметилгексаноил)окси]бензол-1-сульфонат (ISONOBS), 4-(додеканоилокси)бензол-1-сульфонат (LOBS), 4-(деканоилокси)бензол-1-сульфонат, 4-(деканоилокси)бензоат (DOBS или DOBA), 4-(нонаноилокси)бензол-1-сульфонат (NOBS), и/или таковые, раскрытые в WO98/17767. Конкретное семейство активаторов отбеливания, которое представляет интерес, раскрыто в EP624154 и наиболее предпочтительным в этом семействе является ацетилтриэтилцитрат (ATC). ATC или короткоцепочечный триглицерид, такой как триацетин, имеет преимущество, которое заключается в том, он является экологически безопасным. Кроме того, ацетилтриэтилцитрат и триацетин обладают хорошей гидролитической стабильностью в продукте при хранении и являются эффективными активаторами отбеливания. Наконец, ATC является многофункциональным, поскольку цитрат, высвобождаемый в течение реакции пергидролиза, может действовать в качестве моющего компонента. Альтернативно, отбеливающая система может содержать пероксикислоты, например, амидного, имидного или сульфонового типа. Отбеливающая система может дополнительно содержать перкислоты, такие как 6-(фталимидо)пероксигексановая кислота (PAP). Отбеливающая система может дополнительно включать катализатор отбеливания. В некоторых вариантах осуществления отбеливающий компонент может представлять собой органический катализатор, выбранный из группы, состоящей из органических катализаторов со следующими формулами:
(iii) и их смесей;
1
1
1
где каждый R независимо представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от 9 до 24 атомов углерода, или линейную алкильную группу, содержащую от 11 до 24 атомов углерода, предпочтительно каждый R независимо представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от 9 до 18 атомов углерода, или линейную алкильную группу, содержащую от 11 до 18 атомов углерода, более предпочтительно каждый R независимо выбран из группы, включающей 2-пропилгептил, 2-бутилоктил, 2-пентилнонил, 2-гексилдецил, додецил, тетрадецил, гексадецил, октадецил, изононил, изодецил, изотридецил и изопентадецил. Другие иллюстративные отбеливающие системы описаны, например, в WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259, EP1867708 (витамин K) и WO2007/087242. Подходящие фотоотбеливатели могут, например, представлять собой сульфонированный цинк или фталоцианины алюминия.
Предпочтительно отбеливающий компонент содержит источник перкислоты в дополнение к катализатору отбеливания, в частности, органическому катализатору отбеливания. Источник перкислоты может быть выбран из (a) предварительно образованной перкислоты; (b) перкарбонатной, перборатной или персульфатной соли (источника пероксида водорода) предпочтительно в комбинации с активатором отбеливания и (c) фермента пергидролазы и сложного эфира для образования перкислоты in situ в присутствии воды на стадии обработки текстиля или твердых поверхностей.
Полимеры
N
Моющее средство может содержать 0-10% по весу, как например, 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% или 0,2-1% полимера. Для применения в моющих средствах можно использовать любой полимер, известный из уровня техники. Полимер может выполнять функцию дополнительного моющего компонента, который упомянут выше, или может препятствовать переосаждению, обеспечивать защиту волокон, отталкивание грязи, ингибирование переноса красителя, очистку от жира и/или антивспенивающие свойства. Некоторые полимеры могут иметь более чем одно из вышеупомянутых свойств и/или более чем один из нижеприведенных мотивов. Иллюстративные полимеры включают (карбоксиметил)целлюлозу (CMC), поли(виниловый спирт) (PVA), поли(винилпирролидон) (PVP), поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) (PEG), этоксилированный поли(этиленимин), карбоксиметилинулин (CMI) и поликарбоксилаты, такие как PAA, PAA/PMA, полиаспарагиновую кислоту и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты, гидрофобно модифицированную CMC (HM-CMC) и кремнийогранические соединения, сополимеры терефталевой кислоты и олигомерные гликоли, сополимеры поли(этилентерефталата) и поли(оксиэтилентерефталата) (PET-POET), PVP, поли(винилимидазол) (PVI), поли(винилпиридин--оксид) (PVPO или PVPNO) и поливинилпирролидон-винилимидазол (PVPVI). Дополнительные иллюстративные полимеры включают сульфированные поликарбоксилаты, полиэтиленоксид и полипропиленоксид (PEO-PPO) и этоксисульфат дикватерния. Другие иллюстративные полимеры раскрыты, например, в WO 2006/130575. Также предусматриваются соли вышеупомянутых полимеров.
Окрашивающие средства для тканей
Композиции моющего средства по настоящему изобретению могут также включать окрашивающие средства для тканей, такие как красители или пигменты, которые при введении в состав композиции моющего средства могут откладываться на ткани, при контакте указанной ткани с моющим раствором, содержащим указанные композиции моющего средства, и, следовательно, они изменяют тон указанной ткани посредством поглощения/отражения видимого света. Флуоресцентные отбеливающие средства излучают по меньшей мере некоторое количество видимого света. Напротив, окрашивающие средства для тканей изменяют тон поверхности, поскольку они поглощают по меньшей мере часть видимой части спектра. Подходящие окрашивающие средства для тканей включают красители и конъюгаты краситель-глина, а также они могут включать пигменты. Подходящие красители включают низкомолекулярные красители и полимерные красители. Подходящие красители-малые молекулы включают красители-малые молекулы, выбранные из группы, состоящей из красителей, попадающих при классификации по цветовому индексу (C.I.) в Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet и Basic Red или их смеси, например, как описано в WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 и EP1876226 (включены в данный документ посредством ссылки). Моющая композиция предпочтительно содержит от примерно 0,00003 вес. % до примерно 0,2 вес. %, от примерно 0,00008 вес. % до примерно 0,05 вес. % или даже от примерно 0,0001 вес. % до примерно 0,04 вес. % окрашивающего средства для тканей. Композиция может содержать от 0,0001 вес. % до 0,2 вес. % окрашивающего средства для тканей, причем может быть особенно предпочтительным, если композиция присутствует в форме пакета с единичной дозой. Подходящие окрашивающие средства также раскрыты, например, в WO 2007/087257 и WO 2007/087243.
Ферменты
например
Моющая добавка, а также моющая композиция могут содержать один или несколько дополнительных ферментов, таких как протеаза, липаза, кутиназа, амилаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, манназа, арабиназа, галактаназа, ксиланаза, оксидаза, , лакказа и/или пероксидаза.
В целом, свойства выбранного фермента(ферментов) должны быть совместимыми с выбранным моющим средством (т. е. оптимум pH, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т. д.), при этом фермент(ферменты) должен присутствовать в эффективных количествах. В предпочтительном варианте осуществления моющая добавка или моющая композиция содержит протеазу. В следующем варианте осуществления указанная протеаза обладает по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95%, например, 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10
Целлюлазы
Bacillus
Pseudomonas
Humicola
Fusarium
Thielavia
Acremonium
Humicola insolens
Myceliophthora thermophila
Fusarium oxysporum
Подходящие целлюлазы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из рода , , , , , , например, целлюлазы, относящиеся к грибам, полученные из , и , раскрытые в US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 и WO 89/09259.
Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие положительными эффектами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются такие варианты целлюлаз, как описанные в WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 и WO99/001544.
Другими целлюлазами являются фермент ендо-бета-1,4-глюканаза, обладает по меньшей мере 97% идентичностью аминокислотной последовательности от положения 1 до положения 773 с SEQ ID NO:2 из WO 2002/099091, или семейство 44 ксилоглюканаз, в котором ксилоглюканазные ферменты обладают по меньшей мере 60% идентичностью последовательностям 40-559 с SEQ ID NO: 2 из WO 2001/062903.
Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme™, и Carezyme™ (Novozymes A/S) Carezyme Premium™ (Novozymes A/S), Celluclean ™ (Novozymes A/S), Celluclean Classic™ (Novozymes A/S), Cellusoft™ (Novozymes A/S), Whitezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, и Puradax HA™ (Genencor International Inc.), и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Протеазы
Подходящие протеазы включают протеазы бактериального, грибкового, растительного, вирусного или животного происхождения, например, растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение является предпочтительным. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Это может быть щелочная протеаза, например, серин-протеаза или металлопротеаза. Серин-протеаза может быть, например, представителем семейства S1, таким как трипсин, или семейства S8, таким как субтилизин. Протеазы, относящиеся к металлопротеазам, могут, например, представлять собой термолизин, например из семейства M4, или другую металлопротеазу, например из семейств M5, M7 или M8.
Выражение "субтилазы" относится к подгруппе серин-протеазы в соответствии с Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Серин-протеазы представляют собой подгруппу протеаз, которая характеризуется наличием серина в активном центре, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Субтилазы могут быть разделены на 6 подразделов, т. е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство пептидазы-лантибиотика, семейство кексина и семейство пиролизина.
Bacillus
Bacillus lentus
B. alkalophilus
B. subtilis
B. amyloliquefaciens
Bacillus pumilus
Bacillus gibsonii
субтилизин lentus
субтилизин Novo
субтилизин Carlsberg
Bacillus licheniformis
субтилизин BPN'
субтилизин 309
субтилизин 147
субтилизин 168
Fusarium
Cellumonas
Примерами субтилаз являются субтилазы, полученные из , например, , , , , и , описанные в US7262042 и WO09/021867, и , , , , , , и , описанные в WO89/06279, и протеаза PD138, описанная в (WO93/18140). Другими подходящими протеазами могут быть протеазы, описанные в WO 92/175177, WO 01/016285, WO 02/026024 и WO 02/016547. Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза , описанная в WO 89/06270, WO 94/25583 и WO 05/040372, и химотрипсиновые протеазы, полученные из , описанные в WO 05/052161 и WO 05/052146.
Bacillus lentus
Следующей предпочтительной протеазой является щелочная протеаза из DSM 5483, описанная, например, в WO 95/23221, и ее варианты, которые описаны в WO 92/21760, WO 95/23221, EP 1921147 и EP 1921148.
Bacillus amyloliquefaciens
Примерами металлопротеаз являются нейтральная металлопротеаза, описанная в WO 07/044993 (Genencor Int.), например, металлопротеазы, полученные из .
Примерами пригодных протеаз являются варианты, описанные в WO 92/19729, WO 96/034946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/011768, WO 01/44452, WO 03/006602, WO 04/03186, WO 04/041979, WO 07/006305, WO 11/036263, WO 11/036264, в частности, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274, при использовании BPN'-нумерации. Более предпочтительно варианты субтилазы могут содержать следующие мутации: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (при использовании BPN'-нумерации).
Tm
Tm
Tm
Tm
TM
Bacillus alkalophilus
Подходящие коммерчески доступные ферменты-протеазы включают продаваемые под торговыми названиями Alcalase, Duralase, Durazym, Relase, Relase Ultra, Savinase, Savinase Ultra, Primase, Polarzyme, Kannase, Liquanase, Liquanase Ultra, Ovozyme, Coronase, Coronase Ultra, Neutrase, Everlase и Esperase (Novozymes A/S), продаваемые под торговым названием Maxatase, Maxacal, Maxapem, Purafect, Purafect Prime, Preferenz, Purafect MA, Purafect Ox, Purafect OxP, Puramax, Properase, Effectenz, FN2, FN3, FN4, Excellase, Opticlean и Optimase (Danisco/DuPont), Axapem (Gist-Brocases N.V.), BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 в US5352604) и их варианты (Henkel AG) и KAP (субтилизин ) от Kao.
Липазы и кутиназы
Thermomyces
T. lanuginosus
Humicola lanuginosa
Humicola
H. insolens
Pseudomonas
Burkholderia
P. alcaligenes
P. pseudoalcaligenes
P. cepacia
P. sp.
P. wisconsinensis
Streptomyces
Magnaporthe grisea
Pseudomonas mendocina
Thermobifida fusca
Geobacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Streptomyces griseus
S. pristinaespiralis
Подходящие липазы и кутиназы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные с применением белковой инженерии мутантные ферменты. Примеры включают липазу из , например, из (ранее называемый ), которая описана в EP 258068 и EP 305216, кутиназу из , например, (WO 96/13580), липазу из штаммов (некоторые из них сейчас переименованы в ), например, или (EP 218272), (EP 331376), штамм SD705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), (WO 96/12012), липазы GDSL-типа (WO 10/065455), кутиназу из (WO 10/107560), кутиназу из (US 5389536), липазу из (WO 11/084412), липазу (WO 11/084417), липазу из (WO 11/084599) и липазу из (WO 11/150157) и (WO 12/137147).
Другими примерами являются варианты липаз, такие как описанные в EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 и WO 09/109500.
TM
TM
TM
Предпочтительные коммерческие продукты на основе липаз включают Lipolase, Lipex™; Lipolex и Lipoclean (Novozymes A/S), Lumafast (первоначально от Genencor) и Lipomax (первоначально от Gist-Brocades).
Candida antarctica
Mycobacterium smegmatis
M. smegmatis
Другими примерами являются липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы с гомологией с липазой А (WO 10/111143), ацилтрансферазы из (WO 05/56782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO 09/67279) и варианты пергидролазы , в частности, вариант S54V, используемый в коммерческом продукте Gentle Power Bleach от Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028).
Амилазы
Bacillus
Bacillus licheniformis
Подходящие амилазы, которые можно применять совместно с ферментом по настоящему изобретению, могут представлять собой альфа-амилазу или глюкоамилазу и могут быть бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Амилазы предусматривают, например, альфа-амилазы, полученные из , например, специального штамма , описанного более детально в GB 1296839.
Подходящие амилазы включают амилазы с SEQ ID NO: 2 в WO 95/10603, или их варианты, обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты описаны в WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 и SEQ ID NO: 4 из WO 99/019467, например, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.
Различные подходящие амилазы включают амилазы с SEQ ID NO: 6 из WO 02/010355 или их варианты, обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 и замену в положении 193.
B. amyloliquefaciens
B. licheniformis
B. amyloliquefaciens
Другие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из , приведенные в SEQ ID NO: 6 в WO 2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы , приведенные в SEQ ID NO: 4 из WO 2006/066594, или варианты, обладающие 90% идентичностью их последовательности. Предпочтительными вариантами данной гибридной альфа-амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительными вариантами гибридной альфа-амилазы, содержащими остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из , приведенными в SEQ ID NO: 6 из WO 2006/066594, и остатки 36-483 в SEQ ID NO: 4 являются варианты, имеющие следующие замены:
M197T;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S или
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
Следующие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой амилазы с SEQ ID NO: 6 из WO 99/019467 или их варианты, обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются амилазы, имеющие делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.
Дополнительными амилазами, которые можно применять, являются амилазы с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 из WO 96/023873 или их варианты, обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476, применяя SEQ ID 2 из WO 96/023873 для нумерации. Более предпочтительными являются варианты которые имеют делецию в двух положениях, выбранных из 181, 182, 183 и 184, такие как 181 и 182, 182 и 183, или положения 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие делецию в положениях 183 и 184 и замену в одном или нескольких из положений 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.
Другие амилазы, которые можно применять, представляют собой амилазы с SEQ ID NO: 2 из WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712 или их варианты, обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 из WO 08/153815 или обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10 в WO 01/66712. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.
Следующими подходящими амилазами являются амилазы из SEQ ID NO: 2 из WO 09/061380 или их варианты, обладающие 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие усечение C-конца и/или замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180, и/или S181, или T182, и/или G183. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие следующие замены:
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K или
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, где варианты усечены по C-концу и необязательно дополнительно содержат замену в положении 243 и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.
Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу с SEQ ID NO: 12 в WO 01/66712 или вариант, обладающий 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений SEQ ID NO: 12 из WO 01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Особенно предпочтительные амилазы включают варианты, имеющие делецию в D183 и G184 и имеющие замены в R118K, N195F, R320K и R458K, и вариант, дополнительно имеющий замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы следующих: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339, причем наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех данных положениях.
Другими примерами являются варианты амилазы, например, варианты, описанные в WO 2011/098531, WO 2013/001078 и WO 2013/001087.
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
Имеющиеся в продаже амилазы представляют собой Duramyl, Termamyl, Fungamyl, Stainzyme , Stainzyme Plus, Natalase, Liquozyme X, и BAN (от Novozymes A/S), и Rapidase, Purastar/Effectenz, Powerase и Preferenz S100 (от Genencor International Inc./DuPont).
Пероксидазы/оксидазы
Пероксидаза по настоящему изобретению представляет собой фермент пероксидазу, включенный в классификацию ферментов EC 1.11.1.7, как изложено Номенклатурным комитетом Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB), или любой фрагмент, полученный из него, проявляющий пероксидазную активность.
Coprinopsis
например
C. cinerea
Подходящие пероксидазы включают пероксидазы растительного, бактериологического или грибного происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Примеры пригодных пероксидаз включают пероксидазы из , , из (EP 179,486), и их варианты, описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.
Пероксидаза по настоящему изобретению также включает фермент галогенпероксидазу, например, хлорпероксидазу, бромпероксидазу и соединения, проявляющие хлорпероксидазную или бромпероксидазную активность. Галогенпероксидазы классифицируют в соответствии с их специфичностью относительно ионов галогена. Хлорпероксидазы (E.C. 1.11.1.10) катализируют образование гипохлорита из хлорид-ионов.
т.е.,
В одном варианте осуществления галогенпероксидаза по настоящему изобретению представляет собой хлорпероксидазу. Предпочтительно галогенпероксидаза представляет собой ванадиевую галогенпероксидазу, содержащую ванадат галогенпероксидазу. В предпочтительном способе по настоящему изобретению содержащая ванадат галогенпероксидаза объединена с источником хлорид-иона.
Caldariomyces
например
C. fumago
Alternaria
Curvularia
например
C. verruculosa
C. inaequalis
Drechslera
Ulocladium
Botrytis
Галогенпероксидазы были выделены из множества различных грибов, в частности, из группы грибов гифомицетов, таких как , , , , , , , и , , , и .
Pseudomonas
например
P. pyrrocinia
Streptomyces
например
S. aureofaciens
Галогенпероксидазы также были выделены из бактерий, таких как , , и , , .
Curvularia
Curvularia verruculosa
Curvularia inaequalis
C. inaequalis
C. verruculosa
C. verruculosa
Drechslera hartlebii
Dendryphiella salina
Phaeotrichoconis crotalarie
Geniculosporium
В предпочтительном варианте осуществления галогенпероксидазу можно получить из sp., в частности, или , например, CBS 102.42, как описано в WO 95/27046; или CBS 147.63 или CBS 444.70, как описано в WO 97/04102; или из , как описано в WO 01/79459, , как описано в WO 01/79458, , как описано в WO 01/79461, или sp., как описано в WO 01/79460.
Оксидаза по настоящему изобретению включает, в частности, любой фермент лакказу, включенный в классификацию ферментов EC 1.10.3.2, или любой фрагмент, полученный из него, проявляющий лакказную активность, или соединение, проявляющее подобную активность, например, катехолоксидазу (EC 1.10.3.1), o-аминофенолоксидазу (EC 1.10.3.4), или билирубиноксидазу (EC 1.3.3.5).
Предпочтительные ферменты лакказы представляют собой ферменты микробного происхождения. Ферменты могут быть получены из растений, бактерий или грибов (в том числе нитчатых грибов и дрожжей).
Aspergillus, Neurospora
например
N. crassa
Podospora
Botrytis
Collybia
Fomes
Lentinus
Pleurotus
Trametes
например
T. villosa
T. versicolor
Rhizoctonia
например
R. solani
Coprinopsis
например
C. cinerea
C. comatus
C. friesii
C. plicatilis
Psathyrella
например
P. condelleana
Panaeolus
например
P. papilionaceus
Myceliophthora
например
M. thermophila
Schytalidium
например
S. thermophilum
Polyporus
например
P. pinsitus
Phlebia
например
P. radiata
Coriolus
например
C. hirsutus
Подходящие примеры ферментов из грибов включают лакказу, которую можно получить из штамма , , , , , , , , , , , и , , , , , , , , , и , , , , , , , , , , , , , , , , , , (WO 92/01046), или , , (JP 2238885).
Bacillus
Подходящие примеры ферментов из бактерий включают лакказу, которую можно получить из штамма .
Coprinopsis
Myceliophthora
Coprinopsis cinerea
Myceliophthora thermophila
Лакказа, полученная из или является предпочтительной; в частности, лакказа, полученная из , как раскрыто в WO 97/08325; или из , как раскрыто в WO 95/33836.
Фермент(ы) в моющем средстве может быть включен в моющую композицию посредством добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или посредством добавления комбинированной добавки, содержащей все эти ферменты. Моющую добавку по данному изобретению, т.е. отдельную добавку или комбинированную добавку, можно составить, например, в виде гранулята, жидкости, взвеси и т.д. Предпочтительные составы моющих добавок представляют собой грануляты, в частности, непылящие грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости, или взвеси.
Непылящие грануляты можно получать, например, как раскрыто в US 4106991 и 4661452, и на них можно наносить покрытие с применением способов, известных из уровня техники. Примерами восковидных покрывающих материалов являются поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, PEG) со средним молярным весом 1000-20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие 16-50 этиленоксидных звеньев; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых присутствует от 15 до 80 этиленоксидных звеньев; жирные спирты; жирные кислоты; а также моно-, и ди-, и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для нанесения с помощью методик с применением псевдоожиженного слоя, приведены в GB 1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать посредством добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахароспирта, молочной кислоты или борной кислоты в соответствии с общепризнанными способами. Защищенные ферменты можно получать в соответствии со способом, раскрытым в EP 238216.
Другие материалы
Также можно применять любые компоненты моющего средства, известные из уровня техники, в моющих средствах. Другие необязательные компоненты моющего средства включают антикоррозионные средства, средства, препятствующие усадке, средства, препятствующие повторному осаждению грязи, средства, препятствующие сминанию, бактерициды, связующие, ингибиторы коррозии, разрыхлители/разрыхляющие средства, красители, стабилизаторы ферментов (в том числе борная кислота, бораты, CMC и/или полиолы, например, пропиленгликоль), кондиционеры для тканей, в том числе глины, наполнители/технологические добавки, флуоресцентные отбеливающие средства/оптические отбеливатели, пенообразователи, регуляторы пенообразования (образования мыльной пены), отдушки, средства, суспендирующие грязь, смягчители, подавители образования мыльной пены, ингибиторы потускнения и средства, способствующие впитыванию влаги, либо отдельно, либо в комбинации. Можно применять любой ингредиент, известный из уровня техники, в моющих средствах. Выбор таких ингредиентов находится в компетенции специалиста в данной области.
Диспергирующие средства.
Композиции моющего средства по настоящему изобретению могут также содержать диспергирующие средства. В частности, порошкообразные моющие средства могут содержать диспергирующие средства. Подходящие растворимые в воде органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода. Подходящими диспергирующими средствами являются, например, описанные в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.
Средства, ингибирующие перенос красителя
Композиции моющего средства по настоящему изобретению могут также включать одно или несколько средств, ингибирующих перенос красителя. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителя, включают без ограничения полимеры поливинилпирролидона, полимеры полиамин-N-оксида, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Если они присутствуют в представленной композиции, средства, ингибирующие перенос красителя, могут присутствовать при уровнях от примерно 0,0001% до примерно 10%, от примерно 0,01% до примерно 5% или даже от примерно 0,1% до примерно 3% по весу композиции.
Флуоресцентное отбеливающее средство
N
N
d
E
Моющая композиция по настоящему изобретению предпочтительно будут также содержать дополнительные компоненты, которые могут придавать очищаемому изделию цветовой оттенок, такие как флуоресцентное отбеливающее средство или оптические осветлители. Если он присутствует, то содержание оптического осветлителя предпочтительно составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%. В композиции по настоящему изобретению может применяться любое флуоресцентное отбеливающее средство, подходящее для применения в композиции моющего средства для стирки. Наиболее часто применяемые флуоресцентные отбеливающие средства представляют собой таковые, относящиеся к классам производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты, диарилпиразолиновых производных и бисфенилдистириловых производных. Примеры флуоресцентных отбеливающих средств типа производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты включают натриевые соли 4,4'-бис-(2-диэтаноламино-4-анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфонат, 4,4'-бис-(2,4-дианилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2.2'-дисульфонат, 4,4'-бис-(2-анилино-4-(-метил--2-гидрокси-этиламино)-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфонат, 4,4'-бис-(4-фенил-1,2,3-триазол-2-ил)стильбен-2,2'-дисульфонат и натрия 5-(2H-нафто[1,2-][1,2,3]триазол-2-ил)-2-[()-2-фенилвинил]бензолсульфонат. Предпочтительные флуоресцентные отбеливающие средства представляют собой Tinopal DMS и Tinopal CBS, поставляемые компанией Ciba-Geigy AG, Базель, Швейцария. Tinopal DMS представляет собой динатриевую соль 4,4'-бис-(2-морфолино-4 анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната. Tinopal CBS представляет собой динатриевую соль 2,2'-бис-(фенил-стирил)дисульфоната. Предпочтительными также являются флуоресцентные отбеливающие средства, коммерчески доступные в виде Parawhite KX, поставляемого Paramount Minerals and Chemicals, Мумбай, Индия. Tinopal CBS-X представляет собой динатриевую соль 4.4'-бис-(сульфостирил)-бифенила, также известную как динатрия дистирилбифенилдисульфонат. Другие флуоресцентные вещества, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают 1-3-диарилпиразолины и 7-алкиламинокумарины.
Количества подходящего флуоресцентного осветлителя включают нижние значения количества от приблизительно 0,01, от 0,05, от приблизительно 0,1 или даже от приблизительно 0,2 вес. % до верхних значений количества 0,5 или даже 0,75 вес. %.
Грязеотталкивающие полимеры
Моющие композиции настоящего изобретения также могут включать один или несколько грязеотталкивающих полимеров, которые способствуют устранению грязи с тканей, таких как хлопок и ткани на основе сложного полиэфира, в частности, для устранения гидрофобной грязи с тканей на основе сложного полиэфира. Грязеотталкивающими полимерами могут, например, являться неионные или анионные полимеры на основе терефталата, поливинилкапролактам и родственные сополимеры, виниловые привитые сополимеры, сложный полиэфир-полиамиды, см., например, главу 7 в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Другим типом грязеотталкивающих полимеров являются амфифильные алкоксилированные полимеры для очистки от жира, содержащие сердцевинную структуру и множество алкоксилатных групп, прикрепленных к этой сердцевинной структуре. Сердцевинная структура может содержать полиалкилениминную структуру или полиалканоламинную структуру, которые подробно описаны в WO 2009/087523 (тем самым включены с помощью ссылки). Более того, случайные привитые сополимеры являются подходящими грязеотталкивающими полимерами. Подходящие привитые сополимеры более подробно описаны в WO 2007/138054, WO 2006/108856 и WO 2006/113314 (включенный в данный документ посредством ссылки). Другими грязеотталкивающими полимерами являются замещенные полисахаридные структуры, особенно замещенные целлюлозные производные, такие как модифицированные производные целлюлозы, такие как описанные в EP 1867808 или WO 2003/040279 (обе из которых включены в данный документ посредством ссылки). Подходящие целлюлозные полимеры включают целлюлозу, эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, амиды целлюлозы и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают анионно-модифицированную целлюлозу, неионно-модифицированную целлюлозу, катионно-модифицированную целлюлозу, цвиттерионно-модифицированную целлюлозу и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, сложный эфир карбоксиметилцеллюлозы и их смеси.
Средства против переосаждения
Моющие композиции по настоящему изобретению могут также включать одно или несколько средств против переосаждения, таких как карбоксиметилцеллюлоза (CMC), поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (PVP), полиоксиэтилен и/или полиэтиленгликоль (PEG), гомополимеры акриловой кислоты, сополимеры акриловой кислоты и малеиновой кислоты и этоксилированные полиэтиленимины. Полимеры на основе целлюлозы, описанные как грязеотталкивающие полимеры выше, могут также функционировать в качестве средств против переосаждения.
Средства, модифицирующие реологические свойства
Моющие композиции по настоящему изобретению также могут включать один или несколько средств, модифицирующих реологические свойства, структурообразующих средств или загустителей, в отличие от средств, уменьшающих вязкость. Средства, модифицирующие реологические свойства, выбраны из группы, состоящей из неполимерного кристаллического материала, гидрокси-функционализированных материалов, полимерных средств, модифицирующих реологические свойства, которые обеспечивают характеристики истончения сдвига для водной жидкой матрицы жидкой моющей композиции. Реологические свойства и вязкость моющего средства можно модифицировать и регулировать посредством способов, известных из предыдущего уровня техники, например, как показано в EP 2169040.
Другие подходящие вспомогательные материалы включают без ограничения средства, препятствующие усадке, средства, препятствующие сминанию, бактерициды, связующие средства, носители, красители, стабилизаторы ферментов, мягчители тканей, наполнители, регуляторы пенообразования, гидротропы, отдушки, пигменты, подавители образования мыльной пены, растворители и структурообразующие средства для жидких моющих средств и/или средства, обеспечивающие эластичность структуры.
Состав продуктов моющего средства
Моющая композиция по данному изобретению может быть в любой удобной форме, например, бруска, гомогенной таблетки, таблетки с двумя или более слоями, пакета с одной или несколькими отделениями, обычного или уплотненного порошка, гранулы, пасты, геля или обычной, плотной или концентрированной жидкости.
Пакеты могут быть сконфигурированы как с одной, так и с множеством отделений. Они могут иметь любую форму, вид и материал, который является подходящим для удерживания композиции, например, без возможности высвобождения композиции из пакета до контакта с водой. Пакет изготовлен из водорастворимой пленки, которая охватывает внутренний объем. Указанный внутренний объем может быть разделен на отделения пакета. Предпочтительными пленками являются полимерные материалы, предпочтительно полимеры, которые имеют форму пленки или листа. Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные выбраны из полиакрилатов и водорастворимых coполимеров акрилата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, декстрина натрия, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, наиболее предпочтительно coполимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC). Предпочтительно, количество полимера в пленке, например PVA, составляет по меньшей мере примерно 60%. Предпочтительный средний молекулярный вес обычно составляет от примерно 20000 до примерно 150000. Пленки также могут состоять из смешанных композиций, содержащих гидролитически разлагаемые и водорастворимые смеси полимеров, например полилактида и поливинилового спирта (известных под торговым названием M8630, продаваемых MonoSol LLC, Индиана, США), с пластификаторами, такими как глицерин, этиленглицерин, пропиленгликоль, сорбит и их смеси. Пакеты могут содержать твердую чистящую композицию для стирки или часть компонентов и/или жидкую чистящую композицию или часть компонентов, разделенные водорастворимой пленкой. Отделение для жидких компонентов может отличаться по составу от отделений, содержащих твердые вещества: (US 2009/0011970 A1).
Ингредиенты моющего средства могут быть отделены физически один от другого с помощью отделений в водорастворимых пакетах или в различных слоях таблеток. Таким образом можно избежать отрицательного взаимодействия между компонентами при хранении. Различные профили растворимости каждой из отделений также могут обеспечивать задержку растворения выбранных компонентов в моющем растворе.
Моющее средство в виде жидкости или геля, которое не является единичной дозой, может быть водным, как правило, содержащим от по меньшей мере 20% по весу и до 95% воды, например, до приблизительно 70% воды, до приблизительно 65% воды, до приблизительно 55% воды, до приблизительно 45% воды, до приблизительно 35% воды. Другие типы жидкостей, в том числе без ограничения алканолы, амины, диолы, эфиры и полиолы, могут быть включены в водную жидкость или гель. Моющее средство в виде водной жидкости или геля может содержать 0-30% органического растворителя.
Моющее средство в виде жидкости или геля может быть отличным от водного.
Бруски мыла для стирки
ДНКазу по настоящему изобретению можно добавлять в бруски мыла для стирки и их можно применять для ручной стирки белья, тканей и/или текстильных изделий. Выражение брусок мыла для стирки охватывает бруски средства для стирки, бруски мыла, бруски c комбинацией средств, бруски синтетического моющего средства и бруски моющего средства. Типы бруска обычно отличаются по типу поверхностно-активного вещества, которое они содержат, и при этом выражение брусок мыла для стирки охватывает бруски, содержащие мыла из жирных кислот и/или синтетические мыла. Брусок мыла для стирки характеризуется физической формой, которая при комнатной температуре. представляет собой твердое вещество, а не жидкость, гель или порошок. Выражение твердое вещество определено как физическая форма, которая со временем не подвергается значительным изменениям, т.е. если твердый объект (например, брусок мыла для стирки) поместить в контейнер, этот твердый объект не изменяет форму с тем, чтобы заполнить контейнер, в который он помещен. Брусок представляет собой твердое вещество, как правило, в форме прямоугольного бруска, но может представлять собой твердое вещество другой формы, например, круглой или овальной.
+
+
+
4
Брусок мыла для стирки может содержать один или несколько дополнительных ферментов, ингибиторы протеазы, например, пептиды, содержащие альдегидные группы (или гидросульфитный аддукт, или полуацетальный аддукт), борную кислоту, борат, буру и/или производные фенилбороновой кислоты, например, 4-формилфенилбороновую кислоту, одно или несколько мыл или синтетических поверхностно-активных веществ, полиолы, например, глицерин, соединения для регулирования pH, например, жирные кислоты, лимонную кислоту, уксусную кислоту, и/или муравьиную кислоту, и/или соль одновалентного катиона и органического аниона, где одновалентный катион может представлять собой, например, Na, K или NH, и при этом органический анион может представлять собой, например, формиат, ацетат, цитрат или лактат, таким образом, соль одновалентного катиона и органического аниона может представлять собой, например, формиат натрия.
Брусок мыла для стирки также может содержать комплексообразующие вещества, такие как EDTA и HEDP, отдушки и/или другой тип наполнителей, поверхностно-активные вещества, например, анионные синтетические поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, полимерные грязеотталкивающие средства, комплексообразователи моющего средства, стабилизирующие средства, наполнители, красители, красящие вещества, ингибиторы переноса красителя, алкоксилированные поликарбонаты, подавители образования мыльной пены, структурообразующие средства, связующие средства, средства для выщелачивания, активаторы отбеливания, средства для устранения глинистой грязи, средства против переосаждения, полимерные диспергирующие средства, осветлители, мягчители тканей, отдушки и/или другие соединения, известные из уровня техники.
Брусок мыла для стирки можно обрабатывать при помощи обычного оборудования для изготовления брусков мыла для стирки, например, без ограничения мешалок, шнек-прессов, например, двухступенчатого вакуумного шнек-пресса, экструдеров, устройств для резки, устройств для клеймения, туннельных охладителей и упаковочных устройств. Настоящее изобретение не ограничивается получением брусков мыла для стирки при помощи какого-либо одного способа. Предварительно полученную смесь по настоящему изобретению можно добавлять к мылу на различных стадиях способа. Например, можно получать предварительно полученную смесь, содержащую мыло, ДНКазу, необязательно один или несколько дополнительных ферментов, ингибитор протеазы и соль одновалентного катиона и органического аниона, и затем смесь обрабатывать при помощи шнек-пресса. ДНКазу и необязательные дополнительные ферменты можно добавлять одновременно с ингибитором протеазы, например, в жидкой форме. Кроме стадии смешивания и стадии обработки при помощи шнек-пресса, способ дополнительно может включать стадии размалывания, экструдирования, разрезания, измельчения, охлаждения и/или упаковывания.
Состав фермента в комбинированной грануле
ДНКаза может быть составлена в виде гранулы, например, в виде комбинированной гранулы, которая объединяет один или несколько ферментов. Тогда каждый фермент будет присутствовать в большем количестве гранул, обеспечивая более однородное распределение ферментов в моющем средстве. Это также уменьшает физическое разделение различных ферментов в связи с различными размерами частиц. Способы получения комбинированных гранулятов с несколькими ферментами для производства моющих средств раскрыты в раскрытии IP.com IPCOM000200739D.
Другие примеры состава ферментов для применения в комбинированных гранулятах раскрыты в WO 2013/188331, которая относится к моющей композиции, содержащей (a) комбинированную гранулу с несколькими ферментами; (b) менее 10 вес. % цеолита (безводное основание); и (c) менее 10 вес. % фосфатной соли (безводное основание), где указанная комбинированная гранула с ферментом содержит от 10 до 98 вес. % увлажняющего компонента и композиция дополнительно содержит от 20 до 80 вес. % моющего увлажняющего компонента. WO 2013/188331 также относится к способу обработки и/или очищения поверхности, предпочтительно тканевой поверхности, включающему стадии (i) приведения поверхности в контакт с моющей композицией, как заявляется и описано в данном документе в водном моющем растворе, (ii) полоскание и/или высушивание поверхности.
Комбинированная гранула с несколькими ферментами может содержать ДНКазу и (a) один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из липаз для первой стирки, очищающих целлюлаз, ксилоглюканазы, пергидролаз, пероксидаз, липоксигеназ, лакказ и из смесей; и (b) один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из гемицеллюлаз, протеаз, целлюлаз для ухода, целлобиоздегидрогеназ, ксиланаз, фосфолипаз, эстераз, кутиназ, пектиназ, манназ, пектитлиаз, кератиназ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, лигниназ, пуллуланаз, танназ, пентозаназ, лихеназ, глюканаз, арабинозидаз, гиалуронидаз, хондроитиназ, амилаз и их смесей.
Настоящее изобретение дополнительно кратко изложено в следующих пунктах:
1. Применение полипептида, обладающего активностью ДНКазы, для предотвращения, уменьшения или устранения биопленки с изделия, где полипептид получен из источника, относящегося к грибам, а изделие представляет собой текстильное изделие.
2. Применение по пункту 1 для предотвращения, уменьшения или устранения липкости с изделия.
3. Применение по любому из пунктов 1 или 2 для предварительной обработки загрязнений на изделии.
4. Применение по любому из пунктов 1-3 для предотвращения, уменьшения или устранения переосаждения грязи в течение цикла стирки.
5. Применение по любому из пунктов 1-4 для предотвращения, уменьшения или устранения налипания грязи на изделие.
6. Применение по любому из предыдущих пунктов, относящихся к поддержанию или улучшению белизны изделия.
7. Применение по любому из предыдущих пунктов, где полипептид представляет собой полипептид по пунктам 47-56.
8. Применение по любому из предыдущих пунктов, где по отношению к изделию уменьшается или устраняется неприятный запах.
9. Применение по любому из предыдущих пунктов, где неприятный запах вызван E-2-ноненалом.
10. Применение по любому из предыдущих пунктов, где количество E-2-ноненала, присутствующего на влажном текстильном изделии, уменьшают или устраняют.
11. Применение по любому из предыдущих пунктов, где количество E-2-ноненала, присутствующего на сухом текстильном изделии, уменьшают или устраняют.
12. Моющая композиция, содержащая полипептид, обладающий активностью дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), и вспомогательный ингредиент моющего средства, где полипептид получен из источника, относящегося к грибам.
Aspergillus
13. Моющая композиция по пункту 12, где полипептид получен из .
Aspergillus oryzae
14. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где полипептид получен из .
15. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, где полипептид представляет собой полипептид по пунктам 47-56.
16. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где вспомогательный ингредиент моющего средства выбран из группы, состоящей из поверхностно-активных веществ, моющих компонентов, флоккулирующей добавки, хелатирующих средств, ингибиторовов переноса красителя, ферментов, стабилизаторов ферментов, ингибиторов ферментов, каталитических материалов, активаторов отбеливания, пероксида водорода, источников пероксида водорода, предварительно образованных перкислот, полимерных диспергирующих средств, средств для устранения/средств против переосаждения глинистой грязи, осветлителей, подавителей образования мыльной пены, красителей, отдушек, средств, обеспечивающих эластичность структуры, мягчителей тканей, носителей, гидротропов, моющих компонентов и дополнительных моющих компонентов, окрашивающих средств для ткани, противовспенивающих средств, диспергирующих средств, технологических добавок и/или пигментов.
17. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где композиция дополнительно содержит один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из протеаз, липаз, кутиназ, амилаз, карбогидраз, целлюлаз, пектиназ, манназ, арабиназ, галактаназ, ксиланаз и оксидаз.
18. Моющая композиция по по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где фермент представляет собой протеазу, которая является протеазой животного, растительного или микробного происхождения.
19. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где протеаза химически модифицирована или получена с помощью белковой инженерии.
20. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где протеаза представляет собой серинпротеазу или металлопротеазу, предпочтительно щелочную микробную протеазу или трипсин-подобную протеазу.
Bacillus
например
Fusarium
21. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где протеаза выбрана из группы, состоящей из , , субтилизина Novo, субтилизина Carlsberg, субтилизина 309, субтилизина 147, субтилизина 168, трипсина бычьего происхождения, трипсина свиного происхождения и протеазы .
22. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где протеаза обладает по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 10.
23. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, где протеаза обладает по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 10 или ее варианту с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 и 274, предпочтительно вариант представляет собой щелочную протеазу, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 10 со следующей заменой: M222S или заменами N76D+G195E.
Acinetobacter
Aeromicrobium
Brevundimonas
Microbacterium
Micrococcus luteus
Pseudomonas
Staphylococcus epidermidis
Stenotrophomonas
24. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где моющая композиция способна уменьшать адгезию бактерий, выбранных из группы, состоящей из sp., sp., sp., sp., , sp., и sp., к поверхности, или высвобождать бактерии с поверхности, на которую они налипают.
25. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где поверхность представляет собой поверхность текстильного изделия.
26. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где текстильное изделие изготовлено из хлопка, хлопка/сложного полиэфира, сложного полиэфира, полиамида, полиакрила и/или шелка.
27. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где композиция представляет собой брусок, гомогенную таблетку, таблетку с двумя или более слоев, пакет с одним или несколькими отделениями, обычный или уплотненный порошок, гранулу, пасту, гель или обычную, уплотненную или концентрированную жидкость.
28. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где композиция представляет собой жидкое моющее средство, моющее средство в форме порошка или моющее средство в форме гранул.
29. Способ стирки для стирки изделия, включающий следующие стадии:
a. воздействие на изделие моющим раствором, содержащим полипептид по пунктам 47-56 или моющую композицию по любому из пунктов 12-28
b. завершение по меньшей мере одного цикла стирки и
c. необязательно полоскание изделия,
где изделие представляет собой текстильное.
30. Способ по пункту 28, где pH моющего раствора находится в диапазоне от 1 до 11.
31. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где pH моющего раствора находится в диапазоне от 5,5 до 11, например, в диапазоне от 7 до 9, в диапазоне от 7 до 8 или в диапазоне от 7 до 8,5.
32. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где температура моющего раствора находится в диапазоне от 5°C до 95°C, или в диапазоне от 10°C до 80°C, в диапазоне от 10°C до 70°C, в диапазоне от 10°C до 60°C, в диапазоне от 10°C до 50°C, в диапазоне от 15°C до 40°C или в диапазоне от 20°C до 30°C.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где температура моющего раствора оставляет 30°C.
34. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где способ дополнительно включает сливание моющего раствора или части моющего раствора после завершения цикла стирки.
35. Способ по любому из предыдущих ппунктов, относящихся к способу, где на изделие воздействуют моющим раствором в течение первого и необязательно второго или третьего цикла стирки.
36. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где изделие прополаскивают после воздействия моющим раствором.
37. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где изделие прополаскивают водой или водой, содержащей кондиционер.
38. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где липкость изделия уменьшена.
39. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где загрязнения присутствующие на изделии, предварительно обрабатывают полипептидом по пунктам 47-56 или моющей композицией по любому из пунктов 12-28.
40. Способ по любому из предыдущих ппунктов, относящихся к способу, где переосаждение грязи уменьшено.
41. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где налипание грязи на изделие уменьшают или устраняют.
42. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где белизну изделия поддерживают или повышают.
43. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где по отношению к изделию уменьшается или устраняется неприятный запах.
44. Способ по любому из предыдущихпунктов, относящихся к способу, где неприятный запах вызван E-2-ноненалом.
45. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где количество E-2-ноненала, присутствующего на влажном или сухом текстильном изделии, уменьшают или устраняют.
46. Способ по любому из предыдущих пунктов, относящихся к способу, где концентрация полипептида в моющем растворе составляет по меньшей мере 1 мг белка ДНКазы, например, по меньшей мере 5 мг белка, предпочтительно по меньшей мере 10 мг белка, более предпочтительно по меньшей мере 15 мг белка, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 мг белка, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 мг белка, и даже наиболее предпочтительно по меньшей мере 40 мг белка на литр моющего раствора.
47. Полипептид, обладающий активностью ДНКазы, выбранный из группы, состоящей из
a. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2, или полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 9;
b. полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости с
i. последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1,
ii. ее последовательностью кДНК или
iii. последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii);
c. полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 60% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1 или его последовательности кДНК;
d. варианта зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2, содержащего замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях, или варианта зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9, содержащего замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях; и
e. фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает активностью ДНКазы;
48. Полипептид по пункту 47, характеризующийся по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 или зрелому полипептиду с SEQ ID NO: 9.
49. Полипептид по пунктам 47 или 48, кодируемый полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости, в условиях умеренно низкой жесткости, в условиях средней жесткости, в условиях умеренно высокой жесткости, в условиях высокой жесткости или в условиях очень высокой жесткости с
i. последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1,
ii. ее последовательностью кДНК или
iii. последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii).
50. Полипептид по любому из пунктов 47-49, кодируемый полинуклеотидом, характеризующийся по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, с SEQ ID NO: 1 или последовательность ее кДНК.
51. Полипептид по любому из пунктов 47-50, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 2, или зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2.
52. Полипептид по любому из пунктов 47-50, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 9, или зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9.
53. Полипептид по пункту 51, где зрелый полипептид образован аминокислотами 1-206 SEQ ID NO: 2.
54. Полипептид по пункту 52, где зрелый полипептид образован аминокислотами 1-204 SEQ ID NO: 9.
55. Полипептид по пунктам 47-56, который представляет собой вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 2, содержащего замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях, или варианта зрелого полипептида с SEQ ID NO: 9, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях.
56. Полипептид по пунктам 55, который представляет собой фрагмент SEQ ID NO: 2, где фрагмент обладает активностью ДНКазы, или фрагмент SEQ ID NO: 9, где фрагмент обладает активностью ДНКазы.
57. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пунктов 47-56.
58. Конструкция нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по пункту. 57, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют выработкой полипептида у экспрессирующего хозяина.
59. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по пунктам 57-58, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют выработкой полипептида.
60. Способ получения полипептида по любому из пунктов 47-56, включающий культивирование клетки, которая в своей форме дикого типа вырабатывает полипептид, в условиях, благоприятных для выработки полипептида.
61. Способ по пункту 60, дополнительно включающий выделение полипептида.
62. Способ получения полипептида, обладающего активностью ДНКазы, включающий культивирование клетки-хозяина по пункту 59 в условиях, благоприятных для выработки полипептида.
63. Способ по пункту 62, дополнительно включающий выделение полипептида.
64. Полинуклеотид, кодирующий сигнальный пептид, содержащий или состоящий из аминокислот с -37 по -1 в SEQ ID NO: 2.
65. Полинуклеотид по пункту 64, дополнительно содержащий полинуклеотид, кодирующий пропептид, содержащий или состоящий из аминокислот с -15 по -1 в SEQ ID NO: 2
66. Конструкция нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащие ген, кодирующий белок, функционально связанный с полинуклеотидом по пункту 65, где ген является чужеродным по отношению к полинуклеотиду, кодирующему сигнальный пептид.
67. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая ген, кодирующий белок, функционально связанный с полинуклеотидом по пункту 65, где ген является чужеродным по отношению к полинуклеотиду, кодирующему сигнальный пептид.
68. Способ получения белка, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей ген, кодирующий белок, функционально связанный с полинуклеотидом по пункту 64, где ген является чужеродным по отношению к полинуклеотиду, кодирующему сигнальный пептид, в условиях, благоприятных для выработки белка.
69. Способ по пункту 67, дополнительно включающий выделение белка.
70. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пропептид, содержащий или состоящий из аминокислот с -15 по -1 в SEQ ID NO: 2.
71. Конструкция нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащие ген, кодирующий белок, функционально связанный с полинуклеотидом по пункту 64, где ген является чужеродным по отношению к полинуклеотиду, кодирующему пропептид.
72. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая ген, кодирующий белок, функционально связанный с полинуклеотидом по пункту 64, где ген является чужеродным по отношению к полинуклеотиду, кодирующему пропептид.
73. Способ получения белка, включающий культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей ген, кодирующий белок, функционально связанный с полинуклеотидом по пункту 62, где ген является чужеродным по отношению к полинуклеотиду, кодирующему пропептид, в условиях, благоприятных для выработки белка.
74. Способ по пункту 73, дополнительно включающий выделение белка.
75. Состав на основе цельного бульона или композиция на основе культуры клеток, содержащие полипептид по любому из пунктов 47-56.
76. Изделие, постиранное в соответствии со способом по любому из пунктов 29-46.
77. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, обладающий активностью ДНКазы, и фармацевтический вспомогательный ингредиент, где полипептид получен из источника, относящегося к грибам.
Aspergillus
78. Фармацевтическая композиция по пункту 77, где полипептид, обладающий активностью ДНКазы, получают из .
Aspergillus oryzae
79. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 77-78, где полипептид, обладающий активностью ДНКазы, получают из .
80. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 77-79, где полипептид представляет собой полипептид по пп. 47-56.
81. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 77-80, где композиция составлена в виде зубной пасты, жидкого средства для чистки зубов, ополаскивателя для рта, пастилки или мази для массажа десен.
82. Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 77-81, дополнительно содержащая один или несколько противомикробных соединений, таких как противобактериальное соединение, противопаразитическое соединение, противогрибковое соединение и противовирусное соединение.
83. Постоянно присутствующее медицинское устройство, характеризующееся тем, что по меньшей мере часть контактирующей с телом пациента поверхности указанного устройства покрыта фармацевтической композицией по любому из пунктов 77-83.
84. Устройство по пункту 83, где указанное устройство представляет собой катетер, такой как центральный венозный катетер, сосудистый катетер, мочевой катетер, катетер Хикмана, катетер для брюшинного диализа, эндотрахеальный катетер, или где устройство представляет собой механический клапан сердца, кардиостимулятор, артериовенозный шунт, склеральный зажим, соединение протеза, тимпаностомическую трубку, трахеостомическую трубку, голосовой протез, протез полового члена, искусственный сфинктер мочевого пузыря, синтетическую лонно-вагинальную петлю, хирургическую нить, костный фиксатор, костный винт, внутриглазную линзу, контактную линзу, внутриматочное устройство, аортобедренный трансплантат, сосудистый трансплантат, иглу, соединитель люер-лок, соединитель без иглы или хирургический инструмент.
85. Способ получения полипептида по любому из пунктов 47-56, включающий культивирование клетки-хозяина по пункту 59 в условиях, благоприятных для выработки полипептида.
86. Способ по пункту 85, дополнительно включающий выделение полипептида.
87. Рекомбинантная клетка-хозяин по пункту 59, дополнительно содержащая полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, представляющий интерес; предпочтительно фермент, представляющий интерес; более предпочтительно секретируемый фермент, представляющий интерес; еще более предпочтительно гидролазу, изомеразу, лигазу, лиазу, оксидоредуктазу или трансферазу; и наиболее предпочтительно секретируемый фермент представляет собой альфа-галактозидазу, альфа-глюкозидазу, аминопептидазу, амилазу, аспарагиназу, бета-галактозидазу, бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлобиогидролазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, циклодекстрин гликозилтрансферазу, дезоксирибонуклеазу, эндоглюканазу, эстеразу, зеленый флуоресцентный белок, глюкано-трансферазу, глюкоамилазу, инвертазу, лакказу, липазу, маннозидазу, мутаназу, оксидазу, пектинолитический фермент, пероксидазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглютаминазу или ксиланазу.
88. Рекомбинантная клетка-хозяин по пунтку 87, где второй полипептид, представляющий интерес, является гетерологичным или гомологичным к клетке-хозяину.
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Bjerkandera
Ceriporiopsis
Chrysosporium
Coprinus
Coriolus
Cryptococcus
Filibasidium
Fusarium
Humicola
Magnaporthe
Mucor
Myceliophthora
Neocallimastix
Neurospora
Paecilomyces
Penicillium
Phanerochaete
Phlebia
Piromyces
Pleurotus
Schizophyllum
Talaromyces
Thermoascus
Thielavia
Tolypocladium
Trametes
Trichoderma
Aspergillus awamori
Aspergillus foetidus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus japonicus
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Bjerkandera adusta
Ceriporiopsis aneirina
Ceriporiopsis caregiea
Ceriporiopsis gilvescens
Ceriporiopsis pannocinta
Ceriporiopsis rivulosa
Ceriporiopsis subrufa
Ceriporiopsis subvermispora
Chrysosporium inops
Chrysosporium keratinophilum
Chrysosporium lucknowense
Chrysosporium merdarium
Chrysosporium pannicola
Chrysosporium queenslandicum
Chrysosporium tropicum
Chrysosporium zonatum
Coprinus cinereus
Coriolus hirsutus
Fusarium bactridioides
Fusarium cerealis
Fusarium crookwellense
Fusarium culmorum
Fusarium graminearum
Fusarium graminum
Fusarium heterosporum
Fusarium negundi
Fusarium oxysporum
Fusarium reticulatum
Fusarium roseum
Fusarium sambucinum
Fusarium sarcochroum
Fusarium sporotrichioides
Fusarium sulphureum
Fusarium torulosum
Fusarium trichothecioides
Fusarium venenatum
Humicola insolens
Humicola lanuginosa
Mucor miehei
Myceliophthora thermophila
Neurospora crassa
Penicillium purpurogenum
Phanerochaete chrysosporium
Phlebia radiata
Pleurotus eryngii
Thielavia terrestris
Trametes villosa
Trametes versicolor
Trichoderma harzianum
Trichoderma koningii
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma reesei
Trichoderma viride
89. Рекомбинантная клетка-хозяин по пунктам 87 или 88, которая представляет собой клетку-хозяина,, относящуюся к грибам; предпочтительно клетку-хозяина,, относящуюся к нитчатым грибам; более предпочтительно клеткой , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или ; наиболее предпочтительно клеткой , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или .
Bacillus
Clostridium
Enterococcus
Geobacillus
Lactobacillus
Lactococcus
Oceanobacillus
Staphylococcus
Streptococcus
Streptomyces
Bacillus alkalophilus
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus brevis
Bacillus circulans
Bacillus clausii
Bacillus coagulans
Bacillus firmus
Bacillus lautus
Bacillus lentus
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Bacillus pumilus
Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis
90. Рекомбинантная клетка-хозяин по пунктам 87 или 88, которая представляет собой бактериальную клетку-хозяина; предпочтительно прокариотическую клетку-хозяина; более предпочтительно грам-положительную клетку-хозяина; еще более предпочтительно клетку-хозяина , , , , , , , , , или ; и наиболее предпочтительно клетку-хозяина , , , , , , , , , , , , , и .
91. Способ получения второго полипептида, представляющего интерес, как указано в любом из пунктов 87-88, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пунктов 87-90 в условиях, благоприятных для выработки второго полипептида, представляющего интерес.
92. Способ по пункту 91, дополнительно включающий выделение второго полипептида, представляющего интерес.
93. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где вспомогательный ингредиент моющего средства представляет собой поверхностно-активное вещество.
94. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где вспомогательный ингредиент моющего средства представляет собой моющий компонент.
95. Моющая композиция по любому из предыдущих пунктов, относящихся к композиции, где вспомогательный ингредиент моющего средства представляет собой средства для устранения/средства против переосаждения глинистой грязи.
96. Моющая композиция по пункту 28, где композиция представляет собой жидкую моющую композицию, содержащую поверхностно-активное вещество и моющий компонент моющего средства, в общей концентрации по меньшей мере 3% по весу, и моющий фермент, содержащий микрокапсулу, где мембрана микрокапсулы получена путем сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 1 кДа.
97. Моющая композиция по пункту 96, где реактивные амино-группы полиразветвленного полиамина составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса.
98. Моющая композиция по любому из пунктов 96-97, где микрокапсулу получают при использовании хлорангидрида в качестве сшивающего средства.
99. Моющая композиция по любому из пунктов 96-98, где диаметр микрокапсулы составляет по меньшей мере 50 микрометров или выше.
100. Моющая композиция по любому из пунктов 96-99, где микрокапсула содержит по меньшей мере 1% по весу активного фермента.
101. Моющая композиция по любому из пунктов 96-100, которая дополнительно включает спирт, такой как полиол.
102. Моющая композиция по любому из пунктов 96-101, где поверхностно-активное вещество представляет собой анионное поверхностно-активное вещество.
103. Моющая композиция по любому из пунктов 96-102, которая представляет собой жидкую композицию для стирки.
104. Моющая композиция по любому из пунктов 96-103, которая содержит менее 90% по весу воды.
105. Моющая композиция по любому из пунктов 96-104, где моющий фермент представляет собой полипептид, обладающий активностью ДНКазы, протеазы, амилазы, липазы, целлюлазы, манназы, пектиназы или оксидоредуктазы.
106. Моющая композиция по любому из пунктов 96-105, где протеаза представляет собой металлопротеазу или щелочную серин-протеазу, такую как субтилизин.
107. Моющая композиция по любому из пунктов 96-105, где полипептид, обладающий активностью ДНКазы, представляет собой полипептид по любому из пунктов 47-54.
108. Моющая композиция по любому из пунктов 96-107, где микрокапсулу получают путем поверхностной полимеризации с использованием хлорангидрида в качестве сшивающего средства.
109. Моющая композиция по любому из пунктов 96-108, где полиразветвленный полиамин представляет собой полиэтиленимин.
110. Моющая композиция по любому из пунктов 96-109, где микрокапсула содержит источник ионов Mg2+, Ca2+ или Zn2+, такой как слаборастворимая соль Mg2+, Ca2+ или Zn2+.
Анализы и моющие композиции
Моющие композиции
Упомянутую ниже моющую композицию можно применять в комбинации с ферментом по настоящему изобретению.
Biotex Black (жидкость)
5-15% анионного поверхностно-активного вещества, <5% неионного поверхностно-активного вещества, отдушка, ферменты, DMDM и гидрантоин.
Композиция Ariel Sensitive White & Color, жидкая моющая композиция
Вода, этоксисульфат спирта, этоксилат спирта, аминоксид, лимонная кислота, C12-18 усеченная жирная пальмоядровая кислота, протеаза, гликозидаза, амилаза, этанол, 1,2-пропандиол, формиат натрия, хлорид кальция, гидроксид натрия, эмульсия на основе силикона, транс-сульфатированый EHDQ (ингредиенты перечислены в порядке убывания).
Композиция моющего средства-модели WFK IEC-A (порошок)
Ингредиенты: Линейный алкилбензолсульфонат натрия 8,8%, этоксилированный жирный спирт C12-18 (7 EO) 4,7%, натриевое мыло 3,2%, противовспенивающее средство DC2-4248S 3,9%, алюмосиликат натрия - цеолит 4A 28,3%, карбонат натрия 11,6%, натриевая соль сополимера акриловой и малеиновой кислоты (Sokalan CP5) 2,4%, силикат натрия 3,0%, карбоксиметилцеллюлоза 1,2%, Dequest 2066 2,8%, оптический отбеливатель 0,2%, сульфат натрия 6,5%, протеаза 0,4%.
Композиция моющего средства-модели A (жидкость)
Ингредиенты: 12% LAS, 11% AEO Biosoft N25-7 (NI), 7% AEOS (SLES), 6% MPG (монопропиленгликоля), 3% этанола, 3% TEA, 2,75% кокосового мыла, 2,75% соевого мыла, 2% глицерина, 2% гидроксида натрия, 2% цитрата натрия, 1% формиата натрия, 0,2% DTMPA и 0,2% PCA (все процентные содержания приведены в вес/вес).
Композиция Ariel Actilift (жидкость)
Ингредиенты: 5-15% анионных поверхностно-активных веществ; <5% неионных поверхностно-активных веществ, фосфонаты, мыло; ферменты, оптические осветлители, бензизотиазолинон, метилизотиазолинон, отдушки, альфа-изометил ионон, цитронеллол, гераниол, линаноол.
Композиция Ariel Actilift Colour&Style (жидкость)
Ингредиенты: 5-15% анионных поверхностно-активных веществ; <5% неионных поверхностно-активных веществ, фосфонаты, мыло; ферменты, отдушки, бензизотиазолинон, метилизотиазолинон, альфа-изометил ионон, бутилфенил метилпропионал, цитронеллол, гераниол, линалоол.
Композиция Persil Small & Mighty (жидкость)
Ингредиенты: 15-30% анионных поверхностно-активных веществ, неионные поверхностно-активные вещества, 5-15% мыла, < 5% поликарбоксилатов, отдушка, фосфаты, оптические осветлители.
Persil 2 in1 with Comfort Passion Flower Powder
Сульфат натрия, карбонат натрия, додецилбензолсульфонат натрия, бентонит, перкарбонат натрия, силикат натрия, цеолит, вода, лимонная кислота, TAED, C12-15 парет-7, стеариновая кислота, отдушка, натриевая соль акриловой кислоты/сополимер MA, целлюлозная камедь, модифицированный кукурузный крахмал, хлорид натрия, тетранатрия этидронат, кальция-натрия EDTMP, динатрия анилиноморфолинотриазинил-аминостильбенсульфонат, бикарбонат натрия, фенилпропилэтилметикон, бутилфенил метилпропионал, глицерилстеараты, карбонат кальция, полиакрилат натрия, альфа-изометил ионон, дистиролбифенилдисульфонат динатрия, целлюлоза, протеаза, лимонен, PEG-75, диоксид титана, декстрин, сахароза, полиарилсульфонат натрия, CI 12490, CI 45100, CI 42090, тиосульфат натрия, CI 61585.
Persil Biological Powder
Сахароза, сорбит, силикат алюминия, полиоксиметилен меламин, полиарилсульфонат натрия, CI 61585, CI 45100, липаза, амилаза, ксантановая камедь, гидроксипропилметилцеллюлоза, CI 12490, дистирилбифенилдисульфонат динатрия, тиосульфат натрия, CI 42090, манназа, CI 11680, этидроновая кислота, тетранатрия EDTA.
Persil Biological Tablets
Карбонат натрия, перкарбонат натрия, бикарбонат натрия, цеолит, вода, силикат натрия, лаурилсульфат натрия, целлюлоза, TAED, додецилбензолсульфонат натрия, гемицеллюлоза, лигнин, лаурилглюкозид, натриевая соль акриловой кислоты/сополимер MA, бентонит, хлорид натрия, отдушка, тетранатрия этидронат, сульфат натрия, полиакрилат натрия, диметикон, анилиноморфолинотриазиниламиностильбенсульфонат динатрия, додецилбензолсульфоновая кислота, триметилсилоксисиликат, карбонат кальция, целлюлоза, PEG-75, диоксид титана, декстрин, протеаза, модиифцированный кукурузный крахмал, сахароза, CI 12490, полиарилсульфонат натрия, тиосульфат натрия, амилаза, каолин.
Persil Colour Care Biological Powder
Субтилизин, имидазолинон, гексил циннамал, сахароза, сорбит, силикат алюминия, полиоксиметилен меламин, CI 61585, CI 45100, липаза, амилаза, ксантановая камедь, гидроксипропилметилцеллюлоза, CI 12490, дистирилбифенилдисульфонат динатрия, тиосульфат натрия, CI 42090, манназа, CI 11680, этидроновая кислота, тетранатрия EDTA.
Persil Colour Care Biological Tablets
Бикарбонат натрия, карбонат натрия, цеолит, вода, силикат натрия, лаурилсульфат натрия, целлюлозная камедь, додецилбензолсульфонат натрия, лаурилглюкозид, хлорид натрия, натриевая соль акриловой кислоты/сополимер MA, отдушка, тиогликолат натрия, PVP, сульфат натрия, тетранатрия этидронат, полиакрилат натрия, диметикон, бентонит, додецилбензолсульфоновая кислота, триметилсилоксисиликат, карбонат кальция, целлюлоза, PEG-75, диоксид титана, декстрин, протеаза, модифицированный кукурузный крахмал, сахароза, тиосульфат натрия, амилаза, CI 74160, каолин.
Persil Dual Action Capsules Bio
MEA-додецилбензолсульфонат, MEA-гидрогенизированный кокоат, C12-15 парет-7, дипропиленгликоль, вода, тетранатрия этидронат, поливиниловый спирт, глицерин, азиридин, этоксилированный гомополимер, пропиленгликоль, отдушка, диэтилентриаминпентаметиленфосфонат натрия, сорбит, MEA-сульфат, этаноламин, субтилизин, гликоль, бутилфенилметилпропионал, бориновая кислота, (4-формилфенил), гексил циннамал, лимонен, линалоол, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, альфа-изометил ионон, гераниол, амилаза, полимерный синий краситель, полимерный желтый краситель, тальк, хлорид натрия, бензизотиазолинон, манназа, денатониум бензоат.
Persil 2 in1 with Comfort Sunshiny Days Powder
Сульфат натрия, карбонат натрия, додецилбензолсульфонат натрия, бентонит, перкарбонат натрия, силикат натрия, цеолит, вода, лимонная кислота, TAED, C12-15 парет-7, отдушка, стеариновая кислота, натриевая кислота акриловой кислоты/сополимер MA, целлюлозная камедь, модифицированный кукурузный крахмал, хлорид натрия, тетранатрия этидронат, кальция-натрия EDTMP, динатрия анилиноморфолинотриазинил-аминостильбенсульфонат, бикарбонат натрия, фенилпропилэтилметикон, бутилфенил метилпропионал, глицерилстеараты, карбонат кальция, полиакрилат натрия, гераниол, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, целлюлоза, протеаза, PEG-75, диоксид титана, декстрин, сахароза, полиарилсульфонат натрия, CI 12490, CI 45100, CI 42090, тиосульфат натрия, CI 61585.
Persil Small & Mighty 2in1 with Comfort Sunshiny Days
Вода, C12-15 парет-7, додецилбензолсульфонат натрия, пропиленгликоль, гидрогенизированный кокоат натрия, триэтаноламин, глицерин, TEA-гидрогенизированный кокоат, отдушка, хлорид натрия, поликватерний-10, PVP, полимерный розовый краситель, сульфат натрия, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, бутилфенил метилпропионал, сополимер стирола/акрилатов, гексил циннамал, цитронеллол, евгенол, поливиниловый спирт, ацетат натрия, изопропиловый спирт, полимерный желтый краситель, лаурилсульфат натрия.
Persil Small & Mighty Bio
Вода, MEA-додецилбензолсульфонат, пропиленгликоль, лауретсульфат натрия, C12-15 парет-7, TEA-гидрогенизированный кокоат, MEA-цитрат, этоксилированный гомополимер азиридина, MEA-этидронат, триэтаноламин, отдушка, сополимер акилатов, сорбит, MEA-сульфат, сульфит натрия, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, бутилфенил метилпропионал, сополимер стирола/акрилатов, цитронеллол, сульфат натрия, пептиды, соли, сахара из (процесса) ферментации, субтилизин, глицерин, бориновая кислота, (4-формилфенил), гераниол, пектат-лиаза, амилаза, лаурилсульфат натрия, манназа, CI 42051.
Persil Small & Mighty Capsules Biological
MEA-додецилбензолсульфонат, MEA-гидрогенизированный кокоат, C12-15 парет-7, дипропиленгликоль, вода, глицерин, поливиниловый спирт, отдушка, этоксилированный гомополимер азиридина, натрия диэтилентриамин пентаметилен фосфонат, пропиленгликоль, сорбит, MEA-сульфат, этаноламин, субтилизин, гликоль, бутилфенил метилпропионал, гексил циннамал, крахмал, бориновая кислота, (4-формилфенил), лимонен, линалоол, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, альфа-изометил ионон, гераниол, амилаза, тальк, полимерный синий краситель, хлорид натрия, бензизотиазолинон, денатониум бензоат, полимерный желтый краситель, манназа.
Persil Small & Mighty Capsules Colour Care
MEA-додецилбензолсульфонат, MEA-гидрогенизированный кокоат, C12-15 парет-7, дипропиленгликоль, вода, глицерин, поливиниловый спирт, отдушка, этоксилированный гомополимер азиридина, натрия диэтилентриамин пентаметилен фосфонат, пропиленгликоль, MEA-сульфат, этаноламин, PVP, сорбит, бутилфенил метилпропионал, субтилизин, гексил циннамал, крахмал, лимонен, линалоол, бориновая кислота, (4-формилфенил), альфа-изометил ионон, гераниол, тальк, полимерный синий краситель, денатониум бензоат, полимерный желтый краситель.
Persil Small & Mighty Colour Care
Вода, MEA-додецилбензолсульфонат, пропиленгликоль, лауретсульфат натрия, C12-15 парет-7, TEA-гидрогенизированный кокоат, MEA-цитрат, этоксилированный гомополимер азиридина, MEA-этидронат, триэтаноламин, отдушка, сополимер, сорбит, MEA-сульфат, сульфит натрия, глицерин, бутилфенил метилпропионал, цитронеллол, сульфат натрия, пептиды, соли, сахара из (процесса) ферментации,сополимер стирола/акрилатов, субтилизин, бориновая кислота, (4-формилфенил), гераниол, пектат-лиаза, амилаза, лаурилсульфат натрия, манназа, CI 61585, CI 45100.
Композиция Fairy Non Bio (жидкость)
Ингредиенты: 15-30% анионных поверхностно-активных веществ, 5-15% неионных поверхностно-активных веществ, мыло, бензизотиазолинон, метилизотиазолинон, отдушки.
Композиция моющего средства-модели T (порошок)
Ингредиенты: 11% LAS, 2% AS/AEOS, 2% мыла, 3% AEO, 15,15% карбоната натрия, 3% силиката натрия, 18,75% цеолит, 0,15% хелатирующего средства, 2% цитрат натрия, 1,65% сополимера AA/MA, 2,5% CMC и 0,5% SRP (все процентные содержания приведены в вес/вес).
Композиция моющего средства-модели X (порошок)
Ингредиенты: 16,5% LAS, 15% цеолит, 12% дисиликата натрия, 20% карбоната натрия, 1% Sokalan, 35,5% сульфата натрия (все процентные содержания приведены в вес/вес).
Композиция Ariel Actilift Colour&Style (порошок)
Ингредиенты: 15-30% анионных поверхностно-активных веществ, <5% неионных поверхностно-активных веществ, фосфонаты, поликарбоксилаты, цеолиты; ферменты, отдушки, гексил циннамал.
Композиция Ariel Actilift (порошок)
Ингредиенты: 5-15% анионных поверхностно-активных веществ, отбеливающие средства на основе кислорода, <5% неионных поверхностно-активных веществ, фосфонатов, поликарбоксилатов, цеолиты, оптические осветлители, ферменты, отдушки, бутилфенил метилпропионал, кумарин, гексил циннамал
Композиция Persil Megaperls (порошок)
Ингредиенты: 15-30% следующего: анионные поверхностно-активные вещества, отбеливающее средство на основе кислорода и цеолиты, менее 5% следующего: неионные поверхностно-активные вещества, фосфонаты, поликарбоксилаты, мыло, следующие ингредиенты: отдушки, гексил циннамал, бензилсалицилат, линалоол, оптические осветлители, ферменты и цитронеллол.
Gain Liquid, Original:
Ингредиенты: вода, этоксисульфат спирта, диэтиленгликоль, этоксилат спирта, этаноламин, линейный алкилбензолсульфонат, натриевые соли жирных кислот, полиэтиленимин этоксилат, лимонная кислота, бура, натрия куменсульфонат, пропиленгликоль, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, дипропилэтил тетрамин, гидроксид натрия, формиат натрия, формиат кальция, диметикон, амилаза, протеаза, Liquitint™, гидрогенизированное касторовое масло, ароматизатор.
Tide Liquid, Original:
Ингредиенты: Линейный алкилбензолсульфонат, пропиленгликоль, лимонная кислота, гидроксид натрия, бура, этаноламин, этанол, сульфатный спирт, полиэтилениминэтоксилат, натриевые соли жирных кислот, дикватерний этоксисульфат, протеаза, диэтиленгликоль, лаурет-9, алкилдиметиламин оксид, ароматизатор, амилаза, динатрия диаминостильбен дисульфонат, DTPA, формиат натрия, формиат кальция, полиэтиленгликоль 4000, манназа, Liquitint™ синий, диметикон.
Liquid Tide, Free and Gentle:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, пропиленгликоль, бура, этанол, линейный алкилбензолсульфонат натрия, соль, полиэтиленимин этоксилат, диэтиленгликоль, транс-сульфатированный & этоксилированный гексаметилендиамин, этоксилат спирта, линейный алкилбензолсульфонат, соль MEA, формиат натрия, натрия алкилсульфат, DTPA, аминоксид, формиат кальция, динатрия диаминостильбен, дисульфонат, амилаза, протеаза, диметикон, бензизотиазолинон.
Tide Coldwater Liquid, Fresh Scent:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, линейный алкилбензолсульфонат, диэтиленгликоль, пропиленгликоль, этаноламин, лимонная кислота, бура, сульфат спирта, гидроксид натрия, полиэтиленимин, этоксилат, натриевые соли жирных кислот, этанол, протеаза, лаурет-9, дикватерний этоксисульфат, лаураминоксид, кумен натрия, сульфонат, ароматизатор, DTPA, амилаза, динатрия диаминостильбен, дисульфонат, формиат натрия, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, формиат кальция, полиэтиленгликоль 4000, манназа, пектиназа, Liquitint™ синий, диметикон.
Tide TOTALCARE™ Liquid, Cool Cotton:
Вода, этоксисульфат спирта, пропиленгликоль, натриевые соли жирных кислот, лауртримонийхлорид, этанол, гидроксид натрия, натрия куменсульфонат, лимонная кислота, этаноламин, диэтиленгликоль, силиконовый полиэфир, бура, ароматизатор, полиэтиленимин этоксилат, протеаза, лаурет-9,
DTPA, полиакриламид кватернийхлорид, динатрия диаминостильбен дисульфонат, формиат натрия, Liquitint™ оранжевый, дипропилэтилтетраамин, диметикон, целлюлаза.
Liquid Tide Plus Bleach Alternative™, Vivid White and Bright, Original and Clean Breeze:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, алкилсульфат натрия, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат, соль MEA, пропиленгликоль, диэтиленгликоль, полиэтиленимин этоксилат, этанол, натриевые соли жирных кислот, этаноламин, лаураминоксид, бура, лаурет-9, DTPA, натрия куменсульфонат, формиат натрия, формиат кальция, линейный алкилбензолсульфонат, натриевая соль, сульфат спирта, гидроксид натрия, дикватерний этоксисульфат, ароматизатор, амилаза, протеаза, манназа, пектиназа, динатрия диаминостильбен дисульфонат, бензизотиазолинон, Liquitint™ синий, диметикон, дипропилэтилтетраамин.
Liquid Tide HE, Original Scent:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, алкилсульфат натрия, этоксилат спирта, линейный алкилбензолсульфонат, соль MEA, натриевые соли жирных кислот, полиэтилениминэтоксилат, диэтиленгликоль, пропиленгликоль, дикватерний этоксисульфат, бура, полиэтиленимин, этоксилат пропоксилат, этанол, натрия куменсульфонат, ароматизатор, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, манназа, целлюлаза, амилаза, формиат натрия, формиат кальция, лаурамин оксид, Liquitint™ синий, диметикон/полидиметилсиликон.
Tide TOTALCARE HE Liquid, renewing Rain:
Вода, этоксисульфат спирта, линейный алкилбензолсульфонат, этоксилат спирта, лимонная кислота, этаноламин, натриевые соли жирных кислот, диэтиленгликоль, пропиленгликоль, гидроксид натрия, бура, полиэтиленимин этоксилат, силиконовый полиэфир, этанол, протеаза, натрия куменсульфонат, дикватерний этоксисульфат, лаурет-9, ароматизатор, амилаза, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, формиат натрия, формиат кальция, манназа, Liquitint™ оранжевый, диметикон, полиакриламид кватернийхлорид, целлюлаза, дипропилэтилтетраамин.
Tide liquid HE Free:
Вода, этоксисульфат спирта, диэтиленгликоль, моноэтаноламинцитрат, формиат натрия, пропиленгликоль, линейные алкилбензолсульфонаты, этаноламин, этанол, полиэтиленимин этоксилат, амилаза, бензизотиазолин, бура, формиат кальция, лимонная кислота, диэтилентриамин пентаацетат натрия, диметикон, дикватерний этоксисульфат, динатрия диаминостильбен дисульфонат, лаурет-9, манназа, протеаза, натрия куменсульфонат, натриевые соли жирных кислот.
Tide Coldwater HE Liquid, Fresh Scent:
Вода, этоксисульфат спирта, цитрат MEA, сульфат спирта, этоксилат спирта, линейный алкилбензол сульфонат MEA, натриевые соли жирных кислот, полиэтиленимин этоксилат, диэтиленгликоль, пропиленгликоль, дикватерний этоксисульфат, бура, полиэтиленимин этоксилат пропоксилат, этанол, натрия куменсульфонат, ароматизатор, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, протеаза, манназа, целлюлаза, амилаза, формиат натрия, формиат кальция, лаураминоксид, Liquitint™ синий, диметикон.
Tide for Coldwater HE Free Liquid:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат: натриевая соль, этоксилат спирта, линейный алкилбензолсульфонат: Соль MEA, натриевые соли жирных кислот, полиэтиленимин этоксилат, диэтиленгликоль, пропиленгликоль, дикватерний этоксисульфат, бура, протеаза, полиэтиленимин этоксилат пропоксилат, этанол, натрия куменсульфонат, амилаза, лимонная кислота, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, формиат натрия, формиат кальция, диметикон.
Tide Simply Clean & Fresh:
Вода, этоксилатсульфат спирта, линейный алкилбензол сульфонат натрия/соли Mea, пропиленгликоль, диэтиленгликоль, формиат натрия, этанол, бура, натриевые соли жирных кислот, ароматизатор, лаураминоксид, DTPA, полиэтилен амин этоксилат, формиат кальция, динатрия диаминостильбен дисульфонат, диметикон, тетрамин, Liquitint™ синий.
Tide Pods, Ocean Mist, Mystic Forest, Spring Meadow:
Линейные алкилбензолсульфонаты, C12-16 парет-9, пропиленгликоль, этоксисульфат спирта, вода, полиэтиленимин этоксилат, глицерин, соли жирных кислот, PEG-136 поливинилацетат, этилендиаминдиянтарная соль, моноэтаноламин цитрат, бисульфит натрия, диэтилентриамин пентаацетат натрия, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, формиат кальция, манназа, эксилоглюканаза, формиат натрия, гидрогенизированное касторовое масло, Natalase, красители, Termamyl, субтилизин, бензизотиазолин, отдушка.
Tide to Go:
Деионизованная вода, бутиловый эфир дипропиленгликоль, алкилсульфат натрия, пероксид водорода, єтанол, сульфат магния, алкил диметиламинооксид, лимонная кислота, гидроксид натрия, триметоксибензойная кислота, отдушка.
Tide Stain Release Liquid:
Вода, алкилэтоксилат, линейный алкилбензолсульфонат, пероксид водорода, дикватерний этоксисульфат, этаноламин, динатрия дистирилбифенил дисульфонат, тетрабутил этилиденбисфенол, F&DC желтый 3, ароматизатор.
Tide Stain Release Powder:
Натрия перкарбонат, сульфат натрия, карбонат натрия, алюмосиликат натрия, нонаноилокси бензолсульфонат, полиакрилат натрия, вода, натрия алкилбензолсульфонат, DTPA, полиэтиленгликоль, пальмитат натрия, амилаза, протеаза, модифицированный крахмал, FD&C синий 1, ароматизатор.
Tide Stain Release, Pre Treater Spray:
Вода, алкилэтоксилат, борат MEA, линейный алкилбензолсульфонат, пропиленгликоль, дикватерний этоксисульфат, кальция хлоридфермент, протеаза, этаноламин, бензoизотиазолинон, амилаза, цитрат натрия, гидроксид натрия, ароматизатор.
Tide to Go Stain Eraser:
Вода, алкиламиноксид, фениловый эфир дипропиленгликоль, пероксид водорода, лимонная кислота, натриевая соль этилендиаминдиянтарной кислоты, алкилсульфат натрия, ароматизатор.
Tide boost with Oxi:
Бикарбонат натрия, карбонат натрия, перкарбонат натрия, этоксилат спирта, хлорид натрия, малеиновый/акриловый сополимер, нонаноилоксибензолсульфонат, сульфат натрия, красящее вещество, натриевая соль диэтилентриаминпентаацетата, гидратированный алюмосиликат (цеолит), полиэтиленгликоль, натрия алкилбензолсульфонат, пальмитат натрия, крахмал, вода, ароматизатор.
Tide Stain Release boost Duo Pac:
Пленка для пакета на основе поливинилового спирта, в которую упакована жидкая часть и порошкообразная часть.
Жидкие ингредиенты:
Порошкообразные ингредиенты:
Дипропиленгликоль, дикватерний этоксисульфат, вода, глицерин, LiquitintTM оранжевый. Перкарбонат натрия, нонаноилоксибензолсульфонат, карбонат натрия, сульфат натрия, алюмосиликат натрия, полиакрилат натрия, алкилбензолсульфонат натрия, малеиновый/акриловый сополимер, вода, амилаза, полиэтиленгликоль, пальмитат натрия, модифицированный крахмал, протеаза, глицерин, DTPA, ароматизатор.
Tide Ultra Stain Release:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, линейный алкилбензолсульфонат, соли натрия/MEA, цитрат MEA, пропиленгликоль, полиэтилениминэтоксилат, этанол, диэтиленгликоль, полиэтиленимин пропоксиэтоксилат, натриевые соли жирных кислот, протеаза, бура, натрия куменсульфонат, DTPA, ароматизатор, амилаза, динатрия диаминостильбен дисульфонат, формиат кальция, формиат натрия, глюконаза, диметикон, Liquitint™ синий, манназа.
Ultra Tide with a Touch of Downy
Powdered Detergent, April Fresh/Clean Breeze/April Essence:

Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, линейный алкилбензолсульфонат, бентонит, вода, перкарбонат натрия, полиакрилат натрия, силикат, алкилсульфат, нонаноилоксибензолсульфонат, DTPA, полиэтиленгликоль 4000, силикон, этоксилат, ароматизатор, полиэтиленоксид, пальмитиновая кислота, динатрия диаминостильбен дисульфонат, протеаза, Liquitint™ красный, FD&C синий 1, целлюлаза.
Ultra Tide with a Touch of Downy Clean Breeze:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат: соли натрия/MEA, пропиленгликоль, полиэтилениминэтоксилат, этанол, диэтиленгликоль, полиэтиленимин, пропоксиэтоксилат, дикватерний этоксисульфат, сульфат спирта, диметикон, ароматизатор, бура, натриевые соли жирных кислот, DTPA, протеаза, бисульфит натрия, динатрия диаминостильбен дисульфонат, амилаза, глюконаза, касторовое масло, формиат кальция, MEA, стирол акрилат сополимер, формиат натрия, Liquitint™ синий.
Ultra Tide with Downy Sun Blossom:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат: соли натрия/MEA, пропиленгликоль, этанол, диэтиленгликоль, полиэтиленимин пропоксиэтоксилат, полиэтиленимин этоксилат, сульфат спирта, диметикон, ароматизатор, бура, натриевые соли жирных кислот, DTPA, протеаза, бисульфит натрия, динатрия диаминостильбен дисульфонат, амилаза, касторовое масло, формиат кальция, MEA, стирол акрилат сополимер, пропанаминия пропанамид, глюконаза, формиат натрия, Liquitint™ синий.
Ultra Tide with Downy April Fresh/Sweet Dreams:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат: соли натрия/MEA, пропиленгликоль, полиэтиленимин этоксилат, этанол, диэтиленгликоль, полиэтиленимин пропоксиэтоксилат, дикватерний этоксисульфат, сульфат спирта, диметикон, ароматизатор, бура, натриевые соли жирных кислот, DTPA, протеаза, бисульфит натрия, динатрия диаминостильбен дисульфонат, амилаза, глюконаза, касторовое масло, формиат кальция, MEA, стирол акрилат сополимер, пропанаминия пропанамид, формиат натрия, Liquitint™ синий.
Ultra Tide Free Powdered Detergent:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, алкилсульфат, сульфат натрия, линейный алкилбензол сульфонат, вода, полиакрилат натрия, силикат, этоксилат, перкарбонат натрия, полиэтиленгликоль 4000, протеаза, динатрия диаминостильбен дисульфонат, силикон, целлюлаза.
Ultra Tide Powdered Detergent, Clean Breeze/Spring Lavender/mountain Spring:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, линейный алкилбензолсульфонат, алкилсульфат, перкарбонат натрия, вода, полиакрилат натрия, силикат, нонаноилоксибензолсульфонат, этоксилат, полиэтиленгликоль 4000, ароматизатор, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, пальмитиновая кислота, протеаза, силикон, целлюлаза.
Ultra Tide HE (high Efficiency) Pwdered Detergent, Clean Breeze:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, линейный алкилбензолсульфонат, вода, нонаноилоксибензолсульфонат, алкилсульфат, полиакрилат натрия, силикат, перкарбонат натрия, этоксилат, полиэтиленгликоль 4000, ароматизатор, DTPA, пальмитиновая кислота, динатрия диаминостильбен дисульфонат, протеаза, силикон, целлюлаза.
Ultra Tide Coldwater Powdered Detergent, Fresh Scent:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, перкарбонат натрия, алкилсульфат, линейный алкилбензол сульфонат, вода, нонаноилоксибензолсульфонат, полиакрилат натрия, силикат, этоксилат, полиэтиленгликоль 4000, DTPA, ароматизатор, Natalase, пальмитиновая кислота, протеаза, динатрия, диаминостильбен дисульфонат, FD&C синий 1, силикон, целлюлаза, алкилэфирсульфат.
Ultra Tide with bleach Powdered Detergent, Clean Breeze:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, линейный алкилбензол сульфонат, перкарбонат натрия, нонаноилоксибензолсульфонат, алкил сульфат, вода, силикат, полиакрилат натрия, этоксилат, полиэтиленгликоль 4000, ароматизатор, DTPA, пальмитиновая кислота, протеаза, динатрия диаминостильбен дисульфонат, силикон, FD&C синий 1, целлюлаза, алкилэфирсульфат.
Ultra Tide with Febreeze Freshness™ Powdered Detergent, Spring Renewal:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, линейный алкилбензол сульфонат, перкарбонат натрия, алкил сульфат, вода, полиакрилат натрия, силикат, нонаноилоксибензолсульфонат, этоксилат, полиэтиленгликоль 4000, DTPA, ароматизатор, целлюлаза, протеаза, динатрия диаминостильбен дисульфонат, силикон, FD&C синий 1.
Жидкость Tide Plus with Febreeze Freshness - Sport HE Active Fresh:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат, натриевая соль, линейный алкилбензолсульфонат: соль MEA, этоксилат спирта, натриевые соли жирных кислот, пропиленгликоль, диэтиленгликоль, полиэтиленимин этоксилат пропоксилат, дикватерний этоксисульфат, этанол, натрия куменсульфонат, бура, ароматизатор, DTPA, бисульфат натрия, динатрия диаминостильбен дисульфонат, манназа, целлюлаза, амилаза, формиат натрия, формиат кальция, лаураминоксид, Liquitint™ синий, диметикон/полидиметилсиликон.
Tide Plus Febreeze Freshness Spring & Renewal:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, линейный алкилбензолсульфонат: соли натрия/MEA, цитрат MEA, пропиленгликоль, полиэтилениминэтоксилат, ароматизатор, этанол, диэтиленгликоль, полиэтиленимин пропоксиэтоксилат, протеаза, сульфат спирта, бура, натриевые соли жирных кислот, DTPA, динатрия диаминостильбен дисульфонат, MEA, манназа, глюконаза, формиат натрия, диметикон, Liquitint™ синий, тетрамин.
Liquid Tide Plus with Febreeze Freshness, Sport HE Victory Fresh:
Вода, этоксисульфат натрия на основе спирта, цитрат MEA, линейный алкилбензолсульфонат, натриевая соль, линейный алкилбензолсульфонат: соль MEA, этоксилат спирта, натриевые соли жирных кислот, пропиленгликоль, диэтиленгликоль, полиэтиленимин этоксилат пропоксилат, дикватерний этоксисульфат, этанол, натрия куменсульфонат, бура, ароматизатор, DTPA, бисульфат натрия, динатрия диаминостильбен дисульфонат, манназа, целлюлаза, амилаза, формиат натрия, формиат кальция,
лаураминоксид, Liquitint™ синий, диметикон/полидиметилсиликон.
Tide Vivid White+Bright Powder, Original:
Карбонат натрия, алюмосиликат натрия, сульфат натрия, линейный алкилбензолсульфонат, перкарбонат натрия, нонаноилоксибензолсульфонат, алкил сульфат, вода, силикат, полиакрилат натрия этоксилат, полиэтиленгликоль 4000, ароматизатор, DTPA, пальмитиновая кислота, протеаза, динатрия диаминостильбен дисульфонат, силикон, FD&C синий 1, целлюлаза, алкилэфирсульфат.
HEY SPORT TEX WASH Detergent
Вода, додецилбензолсульфокислота, лаурет-11, пег-75 ланолин, пропиленгликоль, денат. спирт, соят калия, гидроксид калия, динатрия кокоамфодиацетат, этилендиаминтриацетат кокосалкилацетамид, отдушка, рицинолеат цинка, хлорид натрия, бензизотиазолинон, метилизотиазолинон, ci 16255, бензиловый спирт.
Продукты под названиями Tide, Ariel, Gain и Fairy являются коммерчески доступными продуктами, поставляемыми Procter & Gamble. Продукты под названием Persil являются коммерчески доступными продуктами, поставляемыми Unilever и Henkel. Продукты под названием Hey Sport являются коммерчески доступными продуктами, поставляемыми Hey Sport.
Ингредиент
Количество (в вес. %)
Анионное моющее поверхностно-активное вещество (такое как алкилбензолсульфонат, алкилэтоксилированный сульфат и их смеси
от 8 вес. % до 15 вес. %)
Неионное моющее поверхностно-активное вещество (такое как алкилэтоксилированный спирт)
от 0,5 вес. % до 4 вес. %
Катионное моющее поверхностно-активное вещество (такое как соединения четвертичного аммония)
от 0 до 4 вес. %
Другое моющее поверхностно-активное вещество (такое как цвиттерионные моющие поверхностно-активные вещества, амфотерные поверхностно-активные вещества и их смеси)
от 0 вес. % до 4 вес. %
Карбоксилатный полимер (такой как сополимеры малеиновой кислоты и акриловой кислоты)
от 1 вес. % до 4 вес. %
Полимер полиэтиленгликоль (такой как полимер полиэтиленгликоль, содержащий боковые цепи поливинилацетата)
от 0,5 вес. % до 4 вес. %
Полимер на основе сложного полиэфира, способствующий высвобождению грязи (такой как полимеры Repel-o-tex от, и/или Texcare)
от 0,1 до 2 вес. %
Целлюлозный полимер (такой как карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза и их комбинации)
от 0,5 вес. % до 2 вес. %
Другой полимер (такой как аминные полимеры, полимеры, ингибирующие перенос красителя, полимеры-производные гексаметилендиамина и их смеси)
от 0 вес. % до 4 вес. %
Цеолитный моющий компонент, и фосфатный моющий компонент (такой как цеолит 4A и/или триполифосфат натрия)
от 0 вес. % до 4 вес. %
Другой моющий компонент (такое как цитрат натрия и/или лимонная кислота)
от 0 вес. % до 3 вес. %
Карбонатная соль (такая как карбонат натрия и/или бикарбонат натрия)
от 15 вес. % до 30 вес. %
Силикатная соль (такая как силикат натрия)
от 0 вес. % до 10 вес. %
Наполнитель (такой как сульфат натрия и/или био-наполнители)
от 10 вес. % до 40 вес. %
Источник доступного кислорода (такой как перкарбонат натрия)
от 10 вес. % до 20 вес. %
Активатор отбеливания (такой как тетраацетилэтилендиамин (TAED) и/или нонаноилоксибензолсульфонат (NOBS)
от 2 вес. % до 8 вес. %
Катализатор отбеливания (такой как катализатор отбеливания на основе оксазиридиния и/или катализатор отбеливания на основе переходного металла)
от 0 вес. % до 0,1 вес. %
Другое отбеливающее средство (такое как восстанавливающее отбеливающее средство и/или предварительно образованная перкислота)
от 0 вес. % до 10 вес. %
Хелатирующее средство (такое как этилендиамин-N'N'-диянтарная кислота (EDDS) и/или гидроксиэтандифосфоновая кислота (HEDP)
от 0,2 вес. % до 1 вес. %
Фотоотбеливатель (такой как сульфонированный фталоцианин цинка и/или алюминия)
от 0 вес. % до 0,1 вес. %
Окрашивающее средство (такое как Direct Violet 99, Acid Red 52, Acid Blue 80, Direct Violet 9, Solvent Violet 13 и любые их комбинации)
от 0 вес. % до 1 вес. %
Осветлитель (такой как осветлитель 15 и/или осветлитель 49)
от 0,1 вес. % до 0,4 вес. %
Протеаза (такая как Savinase, Savinase Ultra, Purafect, FN3, FN4 и любая их комбинация)
от 0,1 вес. % до 0,4 вес. %
Амилаза (такая как Termamyl, Termamyl ultra, Natalase, Optisize, Stainzyme, Stainzyme Plus и любая их комбинация)
от 0,05 вес. % до 0,2 вес. %
Целлюлаза (такая как Carezyme и/или Celluclean)
от 0,05 вес. % до 0,2 вес. %
Липаза (такая как Lipex, Lipolex, Lipoclean и любая их комбинация)
от 0,2 до 1 вес. %
Другой фермент (такой как ксилоглюканаза, кутиназа, пектат-лиаза, манназа, отбеливающий фермент)
от 0 вес. % до 2 вес. %
Мягчитель ткани (такой как мотмориллонитная глина и/или полидиметилсилоксан (PDMS)
от 0 вес. % до 4 вес. %
Флоккулирующее средство (такое как полиэтиленоксид)
от 0 вес. % до 1 вес. %
Подавитель запаха пота (такой как силикон и/или жирна кислота)
от 0 вес. % до 0,1 вес. %
Отдушка (такая как микрокапсула с отдушкой, отдушка для распыления, инкапсулированные в крахмале сочетания отдушек, цеолит, вмещающий отдушку, и любая их комбинация)
от 0,1 вес. % до 1 вес. %
Средства для улучшения эстетических характеристик (такие как окрашенные мыльные кольца и/или окрашенные вкрапления/нити)
от 0 вес. % до 1 вес. %
Прочее
Баланс
Ингредиент
Количество
Содержащий карбоксильную группу полимер (содержащий от приблизительно 60% до приблизительно 70% по массе акрилового мономера на основе кислоты (A); и от приблизительно 30% до приблизительно 40%) по массе содержащего группу сульфовой кисоты мономера (B); и где средний молекуляный вес составляет от приблизительно 23000 до приблизительно 50000, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 25000 до приблизительно 38000, как описано в WO2014032269.
От приблизительно 0,5 вес. % до приблизительно 1,5 вес. %
Амилаза (Stainzyme Plus(R), обладающая ферментной активностью 14 мг активного фермента/г)
от приблизительно 0,1 вес. % до приблизительно 0,5 вес. %
Анионное моющее поверхностно-активное вещество (такое как алкилбензолсульфонат, алкилэтоксилированный сульфат и их смеси)
От приблизительно 8 вес. % до приблизительно 15 вес. %
Неионное моющее поверхностно-активное вещество (такое как алкилэтоксилированный спирт)
от приблизительно 0,5 вес. % до 4 вес. %
Катионное моющее поверхностно-активное вещество (такое как соединения четвертичного аммония)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 4 вес. %
Другое моющее поверхностно-активное вещество (такое как цвиттерионные моющие поверхностно-активные вещества, амфотерные поверхностно-активные вещества и их смеси)
от приблизительно 0 вес. % до 4 вес. %
Карбоксилатный полимер (такой как сополимеры малеиновой кислоты и акриловой кислоты)
От приблизительно 1 вес. % до приблизительно 4 вес. %
Полимер полиэтиленгликоль (такой как полимер полиэтиленгликоль, содержащий боковые цепи поливинилацетата)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 4 вес. %
Полимер на основе сложного полиэфира, способствующий высвобождению грязи (такой как полимеры Repel-O- Tex(R) и/или Texcare(R))
От приблизительно 0,1 вес. % до приблизительно 2 вес. %
Целлюлозный полимер (такой как карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза и их комбинации)
от приблизительно 0,5 вес. % до приблизительно 2 вес. %
Другой полимер (такой как аминные полимеры, полимеры, ингибирующие перенос красителя, полимеры-производные гексаметилендиамина и их смеси)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 4 вес. %
Цеолитный моющий компонент, и фосфатный моющий компонент (такой как цеолит 4A и/или триполифосфат натрия)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 4 вес. %
Другой моющий компонент (такое как цитрат натрия и/или лимонная кислота)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 3 вес. %
Карбонатная соль (такая как карбонат натрия и/или бикарбонат натрия)
от приблизительно 15 вес. % до приблизительно 30 вес. %
Силикатная соль (такая как силикат натрия)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 10 вес. %
Наполнитель (такой как сульфат натрия и/или био-наполнители)
от приблизительно 10 вес. % до приблизительно40 вес. %
Источник доступного кислорода (такой как перкарбонат натрия)
от приблизительно 10 вес. % до приблизительно 20 вес. %
Активатор отбеливания (такой как тетраацетилэтилендиамин (TAED) и/или нонаноилоксибензолсульфонат (NOBS)
От приблизительно 2 вес. % до приблизительно 8 вес. %
Катализатор отбеливания (такой как катализатор отбеливания на основе оксазиридиния и/или катализатор отбеливания на основе переходного металла)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 0,1 вес. %
Другое отбеливающее средство (такое как восстанавливающее отбеливающее средство и/или предварительно образованная перкислота)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 10 вес. %
Хелатирующее средство (такое как этилендиамин-N'N'-диянтарная кислота (EDDS) и/или гидроксиэтандифосфоновая кислота (HEDP)
от приблизительно 0,2 вес. % до приблизительно 1 вес %
Фотоотбеливатель (такой как сульфонированный фталоцианин цинка и/или алюминия)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 0,1 вес. %
Окрашивающее средство (такое как Direct Violet 99, Acid Red 52, Acid Blue 80, Direct Violet 9, Solvent Violet 13 и любые их комбинации)
От приблизительно 0 вес. % до приблизительно 0,5 вес. %
Осветлитель (такой как осветлитель 15 и/или осветлитель 49)
от приблизительно 0,1 вес. % до приблизительно 0,4 вес. %
Протеаза (такая как Savinase, Polarzyme, Purafect, FN3, FN4 и любая их комбинация, обычно обладающая ферментной активностью от приблизительно 20 мг до приблизительно 100 мг активного фермента/г)
от приблизительно 0,1 вес. % до приблизительно 1,5 вес. %
Амилаза (такая как Termamyl(R), Termamyl Ultra(R), Natalase(R), Optisize HT Plus(R), Powerase(R), Stainzyme(R) и любая их комбинация, обычнообладающая ферментной активностью от приблизительно 10 мг до приблизительно 50 мг активного фермента/г)
От приблизительно 0,05 вес. % до приблизительно 0,2 вес. %
Целлюлаза (такая как Carezyme(R), Celluzyme(R) и/или Celluclean(R), обладающая ферментной активность приблизительно от 10 до 50 мг активного фермента/г)
от приблизительно 0,05 вес. % до 0,5 вес. %
Липаза (такая как Lipex(R), Lipolex(R), Lipoclean(R) и любая их комбинация, обычно обладающая ферментной активностью от приблизительно 10 мг до приблизительно 50 мг активного фермента/г)
От приблизительно 0,2 вес. % до приблизительно 1 вес. %
Другой фермент (такой как ксилоглюканаза (например, Whitezyme(R)), кутиназа, пектат-лиаза, манназа, отбеливающий фермент, обычно обладающий ферментной активностьюот приблизительно 10 мг до приблизительно 50 мг активного фермента/г)
от 0 вес.% до 2 вес.%
Мягчитель ткани (такой как мотмориллонитная глина и/или полидиметилсилоксан (PDMS))
от 0 вес.% до 15 вес.%
Флоккулирующее средство (такое как полиэтиленоксид)
от 0 вес.% до 1 вес.%
Подавитель запаха пота (такой как силикон и/или жирна кислота)
от 0 вес.% до 0,1 вес.%
Отдушка (такая как микрокапсула с отдушкой, отдушка для распыления, инкапсулированные в крахмале сочетания отдушек,содержащий отдушку цеолит и любая их комбинация)
от 0,1 вес.% до 1 вес.%
Средства для улучшения эстетических характеристик (такие как окрашенные мыльные кольца и/или окрашенные вкрапления/нити)
от 0 вес.% до 1 вес.%
Прочее
Баланс
Все уровни ферментов выражены в виде приблизительное количество активного белка-фермента на 100 г моющей композиции. Ингредиенты, выступающие в качестве поверхностно-активных веществ могут быть получены из BASF, Людвигсхафен, Германия (Lutensol(R)); Shell Chemicals, Лондон, Великобритания; Stepan, Норфилд, III, США; Huntsman, Huntsman, Солт-Лейк-Сити, Юта, США; Clariant, Зульцбах, Германия (Praepagen(R)).
Натрия триполифосфат может быть получен от Rhodia, Париж, Франция. Цеолит может быть получен от Industrial Zeolite (Великобритания) Ltd, Грейс, Эссекс, Великобритания. Лимонная кислота и цитрат натрия могут быть получены от Jungbunzlauer, Базель, Швейцария.
NOBS означает натрия нонаноилоксибензолсульфонат, поставляемый Eastman, Бейтсвил, Арканзас, США.
TAED означает тетраацетилэтилендиамин, поставляемый под торговым названием Peractive(R) от Clariant GmbH, Зульцбах, Германия.
Карбонат натрия и бикарбонат натрия могут быть получены от Solvay, Брюссель, Бельгия.
Полиакрилат, сополимеры полиакрилата/малеата могут быть получены от BASF, Людвигсхафен, Германия.
Repel-O-Tex(R) могут быть получены от Rhodia, Париж, Франция.
Texcare(R) может быть получен от Clariant, Зульцбах, Германия. Перкарбонат натрия и карбонат натрия могут быть получены от Solvay, Хьюстон, Техас, США.
Соль Na изомера этилендиамин-N,N'-диянтарной кислоты, (S,S) (EDDS) поставляется Octel, Элсмир-Порт, Великобритания.
Гидроксиэтандифосфонат (HEDP) поставляется Dow Chemical, Мидланд, Мичиган,
США.
Ферменты Savinase(R), Savinase(R) Ultra, Stainzyme(R) Plus, Lipex(R), Lipolex(R), Lipoclean(R), Celluclean(R), Carezyme(R), Natalase(R), Stainzyme(R), Stainzyme(R) Plus, Termamyl(R), Termamyl(R) ultra и Mannaway(R) могут быть получены от Novozymes, Багсверд, Дания.
Ферменты Purafect(R), FN3, FN4 и Optisize могут быть получены от Genencor International Inc., Пало-Альто, Калифорния, США.
Красители Direct violet 9 и 99 могут быть получены от BASF DE, Людвигсхафен, Германия. Краситель Solvent violet 13 может быть получен от Ningbo Lixing Chemical Co., Ltd. Нинбо, Чжэцзян, Китай. Осветлители могут быть получены от Ciba Specialty Chemicals, Базель, Швейцария.
Все процентные содержания и отношения рассчитаны по весу, если не указано иное. Все процентные содержания и отношения рассчитаны на основании общей композиции, если не указано иное. Следует понимать, что каждое максимальное количественное ограничение, приведенное по всему данному описанию, включает каждое более низкое количественное ограничение, как если бы такие более низкие количественные ограничения были явно описаны в данном документе. Каждое минимальное количественное ограничение, приведенное по всему данному описанию, будет включать каждое более высокое количественное ограничение, как если бы такие более высокие количественные ограничения были явно описаны в данном документе. Каждая область числовых значений, приведенная по всему данному описанию, будет включать каждую более узкую область числовых значений, которая входит в данную более широкую область числовых значений, как если бы такие более узкие области числовых значений были явно описаны в данном документе.
Анализы стирки
Система-модель для стирки Launder-O-Meter (LOM)
Launder-O-Meter (LOM) представляет собой систему-модель для стирки среднего масштаба, которую можно применять для исследования не более 20 различных условий стирки одновременно. LOM по сути представляет собой большую терморегулируемую водяную баню с 20 закрытыми металлическими лабораторными стаканами, вращающимися внутри нее. Каждый лабораторный стакан представляет собой одну малую машину для стирки, и при этом в ходе эксперимента каждая из них содержит раствор конкретной системы моющее средство/фермент, исследование которой предусматривается, вместе с загрязненными и незагрязненными тканями, с использованием которых проводится ее исследование. Механическое воздействие достигается за счет вращения лабораторных стаканов на водяной бане и помещения металлических шариков в лабораторный стакан.
Система-модель для стирки LOM главным образом используется для исследования моющих средств и ферментов в среднем масштабе при условиях стирки, характерных для Европы. В эксперименте с LOM такие факторы, как отношение балласта к грязи и отношение ткани к моющему раствору могут варьироваться. Следовательно, LOM обеспечивает связь между экспериментами малого масштаба, такими как AMSA и стирка в малом масштабе, и более затратными по времени полномасштабными экспериментами в стиральных машинах с фронтальной загрузкой.
Система-модель для стирки Mini Launder-O-Meter (MiniLOM)
MiniLOM представляет собой модифицированную систему стирки в малом масштабе Launder-O-Meter (LOM), которая представляет собой систему-модель для стирки среднего масштаба, которую можно применять для исследования не более 20 различных условий стирки одновременно. LOM по сути представляет собой большую терморегулируемую водяную баню с 20 закрытыми металлическими лабораторными стаканами, вращающимися внутри нее. Каждый лабораторный стакан представляет собой одну малую машину для стирки, и при этом в ходе эксперимента каждая из них содержит раствор конкретной системы моющее средство/фермент, исследование которой предусматривается, вместе с загрязненными и незагрязненными тканями, с использованием которых проводится ее исследование. Механическое воздействие достигается за счет вращения лабораторных стаканов на водяной бане и помещения металлических шариков в лабораторный стакан.
Система-модель для стирки LOM главным образом используется для исследования моющих средств и ферментов в среднем масштабе при условиях стирки, характерных для Европы. В эксперименте с LOM такие факторы, как отношение балласта к грязи и отношение ткани к моющему раствору могут варьироваться. Следовательно, LOM обеспечивает связь между экспериментами малого масштаба, такими как AMSA и стирка в малом масштабе, и более затратными по времени полномасштабными экспериментами в стиральных машинах с фронтальной загрузкой.
В системе MiniLOM все стирки осуществляли в 50 мл тестовых пробирках, помещенных в ротатор Stuart.
Анализ стирки Terg-O-tometer (TOM)
Tergo-To-Meter (TOM) представляет собой систему-модель для стирки среднего масштаба, которую можно применять для исследования 12 различных условий стирки одновременно. TOM, по существу, представляет собой большую терморегулируемую водяную баню с не более чем 12 открытых металлических лабораторных стаканов, погруженных в нее. Каждый лабораторный стакан представляет собой одну малую стиральную машину с вертикальной загрузкой, и при этом в течение эксперимента каждая из них содержит раствор конкретной системы моющее средство/фермент и загрязненные и незагрязненные ткани, с использованием которых проводится исследование ее эффективности. Механическое воздействие достигается за счет вращения лопасти мешалки, которая перемешивает жидкость в каждом лабораторном стакане. Поскольку у лабораторных стаканов в TOM нет крышки, возможно извлекать образцы в течение эксперимента и анализа TOM для оперативного получения информации в процессе стирки.
Система-модель для стирки TOM главным образом используется для исследования моющих средств и ферментов в среднем масштабе при условиях стирки, характерных для США или LA/AP. В эксперименте TOM такие факторы, как отношение балласта к грязи и отношение ткани к моющему раствору, могут варьироваться. Следовательно, TOM обеспечивает связь между экспериментами малого масштаба, такими как AMSA и стирка в малом масштабе, и более затратными по времени полномасштабными экспериментами в стиральных машинах с вертикальной загрузкой.
Оборудование: Водяная баня с 12 стальными лабораторными стаканами и 1 вращающейся лопастью на лабораторный стакан с вместимостью 500 или 1200 мл моющего раствора. Температура варьируется от 5 до 80°C. Водяную баню следует заполнять деионизированной водой. Скорость вращения может быть установлена на 70-120 об./мин.
Устанавливают температуру на Terg-O-Tometer и начинают вращение на водяной бане. Ожидали до выравнивания температуры (допустимое отклонение составляет +/- 0,5°C). Все лабораторные стаканы были очищены и не содержали следов предыдущего тестового материала.
Моющий раствор с необходимым количеством моющего средства, температурой и жесткостью воды готовили в сосуде. Обеспечивали возможность растворения моющего средства в течение магнитного перемешивания в течение 10 мин. Моющий раствор применяли в течение 30-60 мин. после получения.
800 мл моющего раствора добавляли в лабораторный стакан TOM. Моющий раствор перемешивали со скоростью 120 об./мин. и в лабораторный стакан добавляли необязательно один или несколько ферментов. В лабораторный стакан высыпали образцы, а затем балластную загрузку. Измерение времени начинали, когда образцы и балласт добавляли в лабораторный стакан. Образцы промывали в течение 20 минут после чего перемешивание завершали. Моющую загрузку затем переносили из лабораторного стакана TOM на сито и прополаскивали холодной водопроводной водой. Твердые образцы отделяли от балластной загрузки. Образцы грязи переносили в 5-л лабораторный стакан с холодной водопроводной водой под проточной водой в течение 5 минут. Балластную загрузку выдерживают отдельно для следующей инактивации. Воду бережно выжимали из образцов рукой и их помещали в поддон, покрытый бумагой. Другой лист бумаги помещали поверх образцов. Обеспечивали высушивание образцов в течение ночи перед проведением анализа образцов, такого как измерение интенсивности цвета с использованием Color Eye, как описано в данном документе.
Ферментные анализы
Анализ I: тестирование активности ДНКазы
Активность ДНКазы определяли на тестовом планшете для ДНКазы с агаровой средой с метиловым зеленым (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), который готовили в соответствии с инструкцией производителя. Вкратце, 21 г агара растворяли в 500 мл воды и затем автоклавировали в течение 15 мин. при 121°C. Температуру автоклавированного агара доводили до 48°C на водяной бане, и 20 мл агара выливали в чашки Петри и обеспечивали отверждение при инкубировании в течение ночи при комнатной температуре. В планшеты с отвержденным агаром добавляли 5 мкл растворов фермента, и активность ДНКазы наблюдали в виде бесцветных зон вокруг точечных растворов фермента.
Анализ II
Анализ E-2-ноненала на текстильном изделии с использованием электронного анализатора запахов.
Один из способов тестирования в отношении присутствия неприятного запаха на текстильных изделиях состоит в использовании E-2-ноненала в качестве маркера для неприятного запаха, поскольку данное соединение вызывает неприятный запах при стирке.
Раствор E-2-ноненала добавляли на 5 см x 5 см текстильный образец и образец помещали в 20 мл стеклянную виалу для анализа GC, и закупоривали виалу. Анализировали 5 мл свободное пространство над образцом из закупоренных виал в электронном анализаторе запахов Heracles II от Alpha M.O.S., Франция (хроматографический газовый анализатор с двойной колонкой с 2 FID, колонка 1: MXT5 и колонка 2: MXT1701) через 20 минут инкубирования при 40°C.
Примеры
Способы
Общие способы ПЦР, клонирования, лигирование нуклеотидов и т.д. хорошо известны специалисту в данной области и их можно найти, например, в "Molecular cloning: A laboratory manual", Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.); "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, (1995); Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.); "DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II", D.N. Glover ed. (1985); "Oligonucleotide Synthesis", M.J. Gait ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization", B.D. Hames & S.J. Higgins eds (1985); "A Practical Guide To Molecular Cloning", B. Perbal, (1984).
Пример 1
ПЦР-амплификация
Все ПЦР-амплификации осуществляли в объеме 100 мкл, содержащем 2,5 частей Taq полимеразы, 100 нг pSO2, 250 нМ каждого dNTP, и 10 пмоль каждого из двух праймеров, описанных выше, в реакционном буфере 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl pH 8,0, 1,5 мМ MgCl2.
Амплификацию осуществляли в Cetus DNA Termal 480 от Perkin-Elmer, и она состояла из одного цикла 3 минуты при 94°C, с последующими 25 циклами по 1 минуте при 94°C, 30 секунд при 55°C и 1 минуте при 72°C.
Трансформация Aspergillus
Aspergillus oryzae
NBRC4177: доступен от Института Ферментации, Осака; 17-25 Juso, Hammachi 2-Chome Yodogawa-Ku, Осака, Япония.
A.oryzae

4
2
Трансформацию Aspergillus осуществляли, как описано Christensen et al.; Biotechnology 1988 6 1419-1422. Вкратце, мицелий  выращивали в обогащенном питательном бульоне. Мицелий отделяли от бульона посредством фильтрации. Препарат фермента Novozyme (Novozymes) добавляли к мицелию в осмотически стабилизирующем буфере, таком как 1,2 M MgSO, забуференном до pH 5,0 фосфатом натрия. Суспензию инкубировали в течение 60 минут при 37 градусах C при перемешивании. Протопласт фильтровали через Miracloth для устранения дебриса мицелия. Протопласт собирали и дважды промывали STC (1,2 M сорбита, 10 мМ CaCl, 10 мМ трис-HCl pH 7,5). Протопласты окончательно повторно суспендировали в 200-1000 мкл STC.
2
Для трансформации, 5 мкг ДНК добавляли в 100 мкл суспензии протопластов и затем добавляли 200 мкл раствора PEG (60% PEG 4000, 10 мМ CaCl, 10 мМ трис-HCl pH 7,5) и смесь инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Протопласт собирали и дважды промывали 1,2 M сорбита. Протопласт окончательно повторно суспендировали в 200 мкл 1,2 M сорбита. Трансформанты, содержащие ген amdS, выбирали относительно их способности применять ацетамид в качестве единственного источника азота на минимальных планшетах (Cove D.J. 1966. Biochem. Biophys. Acta. 113:51-56), содержащих 1,0 M сахарозы в качестве источника углерода, 10 мМ ацетамида в качестве источника азота. Через 4-5 дней выращивания при 37 градусах C, оказалось, что стабильные трансформанты энергично растут и образуют колонии. Трансформанты очищали дважды через конидиоспоры на выбранных выше планшетах.
Пример 2
Конструкция кассеты экспрессии pJaL1368 для Aspergillus
Для экспрессии гена A. oryzae (SEQ ID NO: 1), кодирующего предполагаемую нуклеазу SEQ ID NO: 2), кодирующую область, содержащую интроны (SEQ ID NO: 1) амплифицировали как фрагмент ПЦР на 931 п.о. с помощью набора праймеров oJaL316 (SEQ ID NO: 3) и oJaL317 (SEQ ID NO: 4) с использованием геномной ДНК A. oryzae NBRC4177 в качестве матрицы. Фрагмент ПЦР 931 п.о. расщепляли посредством BamHI и XhoI, полученных в результате в 919 п.о. фрагменте (SEQ ID NO: 5). Фрагмент 919 BamHI-XhoI клонировали в соответствующие области в pJaL1262 с получением плазмиды pJaL1368.
Пример 3
Экспрессия гена предполагаемой нуклеазы A. oryzae
в штамме
MT3568
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Экспрессионную плазмиду Aspergillus pJaL1368 трансформировали в штаммы  MT3568, как описано Christensen et al.; Biotechnology 1988 6 1419-1422. Двенадцать случайным образом выбранных трансформантов очищали и инокулировали в пробирки, содержащие 10 мл среды YPM (2 г/л экстракта дрожжей, 2 г/л пептона и 2% мальтозы), которые инкубировали при 30 C при встряхивании (200 об./мин.) в течение 4 дней. Трансформанты, которые вырабатывали белок A. oryzae AO090701000540, идентифицировали по внешнему виду неустойчивой зоны примерно на 25 кДа (рассчитанный молекулярный вес 23893 Да) по сравнению с надосадочной жидкостью от нетрансформированного исходного штамма. Идентичности зоны подтверждали путем 1) определения N-концевого конца посредством расщепления Эдмана и 2) расщепления InGel и MS/MS. N-концевое определение обеспечивало две доминантные N-концевые последовательности ALKTGSG (SEQ ID NO: 6) и KTGSGDS (SEQ ID NO: 7). Данные MS/MS дополнительно подтверждали, что предполагаемый ген (SEQ ID NO:1) кодирует зрелые белки SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, которые являются частью белка в SEQ ID NO: 2. В следующих примерах применяют ДНКазу , полученную из приведенных выше штаммов  MT3568, трансформированных с помощью pJaL1368.
Пример 4
Эффективность ДНКазы
Aspergillus oryzae
(SEQ ID NO: 2) в моющих средствах-моделях и коммерческих моющих средствах
Выделение специфичных для белья, подлежащего стирке, бактериальных штаммов
Brevundimonas
Один штамм sp., выделенный из белья, подлежащего стирке, применяли в настоящем примере.
Brevundimonas
sp. выделяли в ходе исследования, где исследовали различия бактерий в белье, подлежащем стирке, после стирки при 15, 40 и 60°C, соответственно. Исследование проводили на белье, подлежащем стирке, собранном у датских семей. Для каждой стирки применяли 20 г изделий, подлежащих стирке, (чайное полотенце, полотенце, кухонное полотенце, детский нагрудник, подмышечные области на футболках, воротники футболок, носки) в диапазоне 4:3:2:2:1:1:1. Стирку осуществляли в Laundr-O-Meter (LOM) при 15, 40 или 60°C. Для стирки при 15 и 40°C, применяли Ariel Sensitive White & Color, тогда как моющее средство-модель WFK IEC-A* применяли для стирки при 60°C. Ariel Sensitive White & Color готовили путем отвешивания 5,1 г и добавления водопроводной воды не более 1000 мл с последующим перемешиванием в течение 5 минут. Моющее средство-модель WFK IEC-A* (которое доступно от WFK Testgewebe GmbH) готовили путем отвешивания 5 г и добавления водопроводной воды не более 1300 мл с последующим перемешиванием в течение 15 мин. Стирку осуществляли в течение 1 часа при 15, 40 и 60°C, соответственно, с последующими 2 полосканиями водопроводной водой в течение 20 мин. при 15°C.
Образцы белья, подлежащего стирке, отбирали сразу после стирки при 15, 40 и 60°C, соответственно. К двадцати граммам белья, подлежащего стирке, добавляли 0,9% (вес/об.) NaCl (1,06404; Merck, Дармштадт, Германия) с 0,5% (вес/вес) Tween 80 с получением разбавления 1:10 в пакете Stomacher. Смесь гомогенизировали с использованием Stomacher в течение 2 минут на средней скорости. После гомогенизации готовили десятикратное разбавление в 0,9% (вес/об.) NaCl. Бактерии подсчитывали в соевой среде с агаром Tryptone (TSA) (CM0129, Oxoid, Бейзингстоук, Гемпшир, Великобритания), инкубированной аэробно при 30°C в течение 5-7 дней. Для подавления роста дрожжей и плесневых грибов добавляли 0,2% сорбиновой кислоты (359769, Sigma) и 0,1% циклогексимида (18079; Sigma). Колонии бактерий выбирали из исчисляемых планшетов и очищали путем пересева дважды на TSA. Для длительного хранения очищенные изоляты хранили при -80°C в TSB, содержащем 20% (вес/об.) глицерина (49779; Sigma).
Получение образцов-доноров с биопленкой
Brevundimonas
Brevundimonas
600
sp. предварительно выращивали в соевой среде с агаром Tryptone (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Бейзингстоук, Великобритания) в течение 2-5 дней при 30°C. Из одной колонии целые петли переносили в 10 мл TSB и инкубировали в течение 1 дня при 30°C при встряхивании (240 об./мин.). После культивирования sp. пеллетировали посредством центрифугирования (Sigma Laboratory Centrifuge 6K15) (3000 г при 21°C в течение 7 мин.) и повторно суспендировали в 10 мл TSB, дважды разбавленном водой. Оптическую плотность (OD) при 600 нм измеряли с использованием спектрофотометра (POLARstar Omega (BMG Labtech, Ортенберг, Германия). Свежеполученный TSB, дважды разбавленный водой, инокулировали до OD нм 0,03, и 1,6 мл добавляли в каждую лунку 12-луночного полистиролового микропланшета с плоским дном (3512; Corning Incorporated, Корнинг, Нью-Йорк, США), в который помещали круглый образец (диаметр 2 см) стерильного сложного полиэфира WFK30A. После инкубирования (24 ч. при 15°C при встряхивании (100 об./мин.) образцы дважды прополаскивали 0,9% (вес./об.) NaCl.
Эксперимент стирки
Aspergillus oryzae
A
oryzae
Пять прополосканных образцов Brevundimonas sp. смешивали с пятью образцами стерильного сложного полиэфира WFK30A в 50 мл тестовой пробирке и добавляли 10 мл моющего раствора для стирки, содержащего следующую моющую композицию в приведенных концентрациях: моющее средство-модель A (EU, 3,3 г/л), Ariel Actilift (EU, 6,9 г/л), Persil Small & Mighty (EU, 4 г/л), Fairy (EU, 5,6 г/л) и Tide Original (US, 3,2 г/л), моющее средство-модель T (EU, 5,3 г/л), моющее средство-модель X (D&E, 1,8 г/л), Ariel (EU, 5,3 г/л) и Persil Megaperls (EU, 4,0 г/л) добавляли вместе с 0,7 г/л грязи (Pigmentschmutz, 09V, wfk, Крефельд, Германия), и ДНКаза (0,04 ppm) оказалась положительной относительно активности ДНКазы на тестовом агаре ДНКазы с метиловым зеленым (анализ I). Тестовые пробирки помещали в ротатор Stuart (Mini LOM) на 1 час при 30°C. Образцы дважды прополаскивали водопроводной водой и высушивали на фильтровальной бумаге в течение ночи. В качестве контролей параллельно выполняли стирки с упомянутыми моющими средствами и без добавления ДНКазы . . Цветовое отличие (L-значения) измеряли с использованием Color Eye (отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000). Измерения осуществляли без УФ-излучения в отраженном свете и выделяли L-значение от цветового пространства CIE Lab.
3
3
3
Ссылаясь на условия EU, приведенные выше, например, (EU, 3,3 г/л) применяли воду с жесткостью 15°dH (Ca:Mg:NaHCO4:1:1,5). Для US моющих средств (US, 3,2 г/л) применяли воду с жесткостью 6°dH (Ca:Mg:NaHCO2:1:1,5). Для моющих средств D&E (возникающих и развивающихся рынков) (D&E, 1,8 г/л) применяли воду с жесткостью 14°dH (Ca:Mg:NaHCO2:1:1,5).
A
oryzae
A
Oryzae
A
Оryzae
Настоящий пример демонстрирует, что ДНКаза . ДНКаза предотвращает осаждение грязи (действие против переосаждения) на образцах сложного полиэфира с предварительно выращенными бактериями (донорами), а также на образцах стерильного полиэфира (меченными объектами), добавленных к стирке. Предотвращение осаждения грязи наблюдалось как в жидких моющих средствах с pH 8,0, так и в порошкообразных моющих средствах с pH 10 и в капсулах Tide. Наблюдаемый эффект связан с эффектами глубокого очищения ДНКазы . (SEQ ID NO: 2). Наиболее важно, что настоящий пример демонстрирует, что ДНКаза . будет препятствовать переносу грязи между различными текстильными изделиями при стирке и, таким образом, обеспечивает то, что загрязненное белье, подлежащее стирке, может быть выстирано с меньшим количеством загрязненного белья, подлежащего стирке. Это обеспечивает то, что белизна текстильного изделия улучшается.
Таблица 1
Моющее средство
Область
pH
Цветовое различие (ΔL)
Образец-донор
Меченный образец
<i>Жидкости:</i>
Моющее средство-модель A
EU
7,7
5,6
5,1
Ariel Actilift
EU
8,3
6,9
3,5
OMO Small & Mighty
EU
7,9
5,8
3,2
Fairy
EU
8,1
5,6
3,5
Tide Original
US
8,3
5,2
4,8
Gain
US
nd
3,8
0,11
<i>Порошки:</i>
Моющее средство-модель T
EU
10,4
8,9
2,6
Моющее средство-модель X
D&E
10,2
7,0
4,5
Ariel Actilift
EU
10,2
5,6
1,2
Persil Megaperls
EU
8,7
4,0
0,4
<i>Капсулы:</i>
Капсулы Tide
US
nd
5,7
1,0
Nd: не определено
Пример 5
Эффективность ДНКазы
Aspergillus oryzae
(SEQ ID NO: 2) на различных типах тканей
A
oryzae
Brevundimonas
С целью исследования эффектов глубокого очищения и отбеливания ДНКазы . на различных типах тканей, sp. выращивали на круглых образцах (диаметр 2 см) хлопка (WFK10A), сложного полиэфира/хлопка (WKF20A), сложного полиэфира (WFK30A), полиамида (WFK40A), полиакрила (WFK50A) и шелка (WFK70) в течение 1 дня (см. пример 4 - получение образцов-доноров).
Brevundimonas
Aspergillus oryzae
A
oryzae
A
oryzae
A
oryzae
Пять прополосканных образцов с sp. смешивали с пятью стерильными образцами в 50 мл тестовой пробирке и добавляли 10 мл моющего раствора моющего средства-модели A моющего средства-модели A (EU, 3,3 г/л), содержащего 0,7 г/л грязи (Pigmentschmutz, 09V, wfk, Крефельд, Германия) и ДНКазу (0,04 ppm). Тестовые пробирки помещали в ротатор Stuart (MiniLOM) на 1 час при 30°C. Образцы дважды прополаскивали водопроводной водой и высушивали на фильтровальной бумаге в течение ночи. В качестве контролей параллельно проводили стирки без добавления . . Цветовое отличие (L-значения) измеряли с использованием Color Eye (отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000). Измерения осуществляли без УФ-излучения в отраженном свете и выделяли L-значение от цветового пространства CIE Lab. Настоящий пример демонстрирует, что ДНКаза . препятствует осаждению грязи (действие против переосаждения) на различные типы тканей, и что белизна текстильного изделия улучшается, если присутствует ДНКаза . .
Таблица 2
Тип ткани
Цветовое различие (ΔL)
Хлопок (WFK10A)
3,5
Хлопок/сложный полиэфир (WFK20A)
5,4
Сложный полиэфир (WFK30A)
7,5
Полиамид (WFK40A)
3,3
Полиакрил (WFK50A)
7,2
Шелк (WFK70A)
4,5
Пример 6
Aspergillus oryzae
Стабильность ДНКазы в моющем средстве-модели A
A
oryzae
С целью исследования стабильности моющего средства и протеазы ДНКазы . , 20 г моющего средства-модели A отвешивали в 50 мл тестовую пробирку и добавляли 1,35% (вес./вес.) протеазы 1 и протеазы 2, соответственно. Кроме того, добавляли 2 г/л и 4 г/л системы ингибиторов протеазы 1 или 2 г/л системы ингибиторов протеазы 2.
Brevundimonas
A
oryzae
A
oryzae
После инкубирования при -18°C и 37°C, соответственно, эффекты глубокого очищения исследовали на образцах sp. В качестве контролей перед стиркой применяли моющее средство-модель A с добавлением и без добавления ДНКазы . . Цветовое отличие (L-значения) измеряли с использованием Color Eye (отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000). Измерения осуществляли без УФ-излучения в отраженном свете и выделяли L-значение от цветового пространства CIE Lab. Настоящий пример демонстрирует, что ДНКаза . является стабильной в жидком моющем средстве, а также в жидком моющем средстве с добавлением различных протеаз и систем ингибиторов протеаз.
Протеаза 1, применяемая в данном эксперименте, представлена SEQ ID NO: 10 со следующей модификацией M222S. Протеаза 2 представлена SEQ ID NO: 10 со следующей модификацией: N76D+G195E. Система ингибиторов протеазы 1 представляет собой 4-формил-фенил-бориновую кислоту, как описано в заявке на патент WO 1996/041859. Система ингибиторов протеазы 2 представляет собой соединение Cbz-Gly-Ala-Tyr-H, как описано в заявке на патент WO 2009/118375.
Таблица 3
Моющая композиция со смесью ферментов
Цветовое различие (L-значение)
-18°C
37°C
Контроль
Моющее средство и отсутствие ДНКазы, и отсутствие протеазы
84,7
Моющее средство и ДНКаза, и отсутствие протеазы
90,3
Моющее средство и ДНКаза, и отсутствие протеазы
89,5
89,2
Моющее средство и ДНКаза, и протеаза 1 и 2 г/л системы ингибиторов протеазы 1
91,0
90,7
Моющее средство и ДНКаза, и протеаза 1 и 4 г/л системы ингибиторов протеазы 1
89,5
88,7
Моющее средство и ДНКаза, и протеаза 1 и 2 г/л системы ингибиторов протеазы 2
89,7
90,3
Моющее средство и ДНКаза, и протеаза 2 и 2 г/л системы ингибиторов протеазы 1
91,5
90,8
Моющее средство, и ДНКаза, и протеаза 2 и 2 г/л системы ингибиторов протеазы 2
90,3
89,7
Пример 7
Дополнительный эффект ДНКазы
A
oryzae
Brevundimonas
С целью исследования того, являются ли наблюдаемые эффекты глубокого очищения и отбеливания ДНКазы . уникальными для ДНКазы A. oryzae по сравнению с существующим ферментом для стирки, осуществляли сравнительное исследование. sp. выращивали на круглых образцах (диаметр 2 см) сложного полиэфира (WFK30A) в течение 1 дня (см. пример 4 - получение образцов-доноров).
Brevundimonas
Aspergillus oryzae
Пять прополасканных образцов с sp. смешивали с пятью стерильными образцами в 50 мл тестовой пробирке и добавляли 10 мл моющего раствора моющего средства-модели A (для композиции см. пример 4), содержащего 0,7 г/л грязи (Pigmentschmutz, 09V, wfk, Крефельд, Германия) и фермент. Применяли следующие ферменты: ДНКаза (0,04 ppm) (SEQ ID NO: 2), Celluclean™ 5000L (0,002 ppm), Celluclean™ 5.0T (0,001 ppm), Carezyme™ (0,2 ppm), Savinase™ (2,7 ppm), Lipex™ (0,06 ppm) и Stainzyme™ (0,2 ppm) (все ферменты поставляются Novozymes A/S). Концентрация в ppm обозначает концентрацию фермента в моющем растворе. Параллельно, был изготовлен контроль без добавления фермента.
A
oryzae
Тестовые пробирки помещали в ротатор Stuart (MiniLOM) на 1 час при 30°C. Образцы дважды прополаскивали водопроводной водой и высушивали на фильтровальной бумаге в течение ночи. Цветовое отличие (L-значение) измеряли с использованием Color Eye (отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000). Измерения осуществляли без УФ-излучения в отраженном свете и выделяли L-значение от цветового пространства CIE Lab. Настоящий пример демонстрирует, что ДНКаза . препятствует осаждению грязи (действие против переосаждения) и улучшает белизну, поскольку только один из ферментов для стирки указывал на то, что эффект глубокого очищения и отбеливания ДНКазы A. oryzae является дополнительным эффектом по сравнению с существующими ферментами для стирки.
Таблица 4
Фермент
Моющее средство
Моющее средство-модель A
Моющее средство-модель T
ДНКаза
89,6
89,6
Celluclean™ 5000L
83,6
-
Celluclean™ 5.0T
-
83,9
Carezyme™
83,2
83,1
Savinase™
83,8
84,9
Lipex™
82,4
84,4
Stainzyme™
82,2
83,6
Без фермента
82,6
84,3
Пример 8
Определение запаха пота на футболках для бега
Две белые футболки для бега, изготовленные из 100% сложного полиэфира, предварительно стирали в стиральной машине с использованием 3,33 г/л моющего средства-модели A.
Две футболки носились испытуемым (мужчиной), одна футболка за раз. Испытуемый носил каждую из футболок во время физической активности в течение одного часа. После ношения одну футболку стирали в стиральной машине с использованием 3,33 г/л моющего средства-модели A с ДНКазой SEQ ID NO: 2 (1 ppm), тогда как вторую футболку стирали в стиральной машине с использованием 3,33 г/л моющего средства-модели A без ДНКазы (0 ppm). Футболки стирали, как описано для стирки в полном масштабе, описанной выше и для стирки применяли 15 л водопроводной воды. Обе футболки носили во время физической активности, а затем стирали. Этот цикл ношения и стирки повторяли 10 раз.
Для оценки запаха тренированный испытуемый перед применением исследовал футболки в отношении запаха пота (неприятного запаха) путем оценки запаха футболок. Если обнаруживался запах пота, то в таблице ниже добавляли отметку (X). Наблюдения ниже демонстрируют, что стирка с ДНКазой в ходе 10 стирок препятствует накоплению запаха.
Таблица 5
Номер применения
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Футболка, выстиранная без ДНКазы
-
-
-
-
-
x
x
x
x
x
Футболка, выстираннаяс ДНКазой
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Пример 9
Данный пример демонстрирует, что устранение пятен с помощью таких ферментов, как протеаза, амилаза, липаза, манназа, пектат-лиаза и целлюлаза во время стирки не уменьшается с присутствием ДНКазы.
Устранение пятен было продемонстрировано на следующих пятнах (эффективный фермент в скобках): C-S-10 жир сливочного масла (липаза), C-S-03 шоколадное молоко/сажа (протеаза), C-S-28 рисовый крахмал, обладающий цветом (амилаза), C-S-73 камедь бобов рожкового дерева с пигметом (манназа), C-S-54 овсянка/шоколад (целлюлаза), все от Center For Testmaterials BV, Нидерланды, и 013KC свежий банан (пектат-лиаза) от Warwick Equest Ltd., Великобритания.
Все пятна вырезали на образцах 4×9 см, за исключением пятен C-S-10 жира сливочного масла, которые вырезали на образцах 5×5 см, и пятно 013KC, которое представляло собой Ø5 см круглое пятно на 10×10 см образце. Два образца каждого пятна прикрепляли к чайному полотенцу (100% хлопка) посредством степлера. Одно чайное полотенце с прикрепленными образцами пятен добавляли в каждую машину с 3 кг балласта, состоящего из 3 футболок (100% хлопок), 10 рубашек с короткими рукавами (55% хлопка, 45% сложного полиэфира), 4 наволочек (35% хлопка, 65% сложного полиэфира) (11×75 см), 1 небольшой простыни (100% хлопка) (10×75 см) и 4 чайных полотенец (100% хлопка).
Стирки осуществляли в стиральных машинах Miele Softtronic W2445 при 30°C с использованием стандартной программы стирки с 12-13 литрами вода на 3 кг ткани. Стирки осуществляли с 3,33 г/л моющего средства-модели A, как описано выше, в водопроводной воде города Багсверда, и кондуктометр HI 9635 от Hanna Instruments, Канада, применяли для измерения электропроводности воды до 919 мкСм при 21°C.
Ферменты добавляли в 4 стирки в количествах, описанных в таблице ниже:
Таблица 6
Машина
1
2
3
4
ДНКаза (SEQ ID NO: 2)
-
0,04 ppm
-
0,04 ppm
Протеаза (Liquanase 2,5 л)Амилаза (Amplify 12 л)Липаза (Lipex 100 л)Манназа (Mannaway 4 л)Пектат-лиаза (Xpect 1000 л)Целлюлаза (Celluclean 5000 л)
------
------
874 мкл151 мкл98 мкл100 мкл50 мкл821 мкл
874 мкл151 мкл98 мкл100 мкл50 мкл821 мкл
Ферменты добавляли в стиральные машины в отдельных пластмассовых лабораторных стаканах, разбавленными в 100 мл 15°dH воды (вода с жесткостью 15°dH: 3,00 мл 0,713 моль/л CaCl2, 1,50 мл 0,357 моль/л MgCl2 и 0,3371 г NaHCO3 в 1 л измерительном цилиндре, наполненном до 1 л водой MilliQ). Отдельный пластмассовый лабораторный стакан привода с жесткостью применяли для ДНКазы, другой пластмассовый лабораторный стакан применяли для протеазы, а оставшиеся ферменты (амилазу, липазу, манназу, пектат-лиазу и целлюлозу) растворяли в третьем пластмассовом лабораторном стакане. Лабораторные стаканы помещали внутрь барабана стиральной машины перед началом стирки.
После стирки образцы высушивали в течение ночи на фильтровальной бумаге и отражение измеряли при 460 нм, как описано выше. Образцы C-S-10 жира сливочного масла измеряли через 22 часа после окончания стирки.
Среднее значение отражения при 460 нм образцов с пятнами после стирки показаны в таблице ниже. Чем выше значение отражения, тем чище образец после стирки.
Таблица 7
Машина
1
2
3
4
Добавленные ферменты:
Отсутствие
ДНКаза
P, A, L, M, PL, C
P, A, L, M, PL, C+ДНКаза
Значение отражения при 460 нм
Овсянка/шоколад
40,35
39,64
57,22
58,30
Свежий банан
52,50
47,61
68,37
73,97
Шоколадное молоко
36,55
36,61
56,11
55,66
Камедь бобов рожкового дерева
42,63
44,05
55,11
54,65
Рисовый крахмал
51,57
47,09
69,17
73,97
Жир сливочного масла
52,48
52,06
56,44
56,58
P= протеаза, A= амилаза, L= липаза, M= манназа, PL= пектат-лиаза, C= целлюлаза
На основании двухстороннего критерия Стьюдента (с неравным отклонением) средние значения отражения для каждого типа пятен в стирке 3 статистически значительно не отличались от стирки 4 на значимом уровне 5%. Результаты демонстрируют, что устранение пятен с помощью таких ферментов, как протеаза, амилаза, липаза, манназа, пектат-лиаза и целлюлаза, не уменьшается с присутствием ДНКазы во время стирки.
Пример 10
Эксперимент стирки осуществляли на собранной одежде для бега (свитера и футболки для бега), которые носили во время тренировочных упражнений в течение по меньшей мере 50 раз и стирали промежуточно. Во время тренировочных упражнений одежда для бега становилась сырой от пота, но в целом не загрязнялась. Одежду для бега предварительно стирали в Miele Softtronic W5825 при 30°C (низкое заполнение машины) с использованием BioTex Black (Unilever) в рекомендованной стандартной дозе.
Перед проведением настоящего эксперимента свитер и футболку для бега (100% сложного полиэфира) оценивались обученным участником группы оценки запаха, который обнаружил выраженный запах кислого пота (неприятный запах), в частности, присутствующий в подмышечных областях на одежде. Неприятный запах присутствовал после стирки одежды с использованием BioTex Black и неприятный запах накапливался с числом применений одежды для бега.
A. oryzae
Одежду для бега стирали в Miele Softtronic W5825 при 30°C (низкое заполнение машины) с использованием стандартной дозы BioTex Black и дозы ДНКазы (0,4 ppm) в моющем растворе.
A. oryzae
A. oryzae
A. oryzae
Между каждым тренировочным упражнением одежду для бега подвергали другому кругу оценивания участником группы оценки запаха. Участник группы оценки запаха обнаружил, что неприятный запах был значительно уменьшен и его было трудно определить после 1-3 циклов стирки в присутствии ДНКазы по настоящему изобретению. В расширенном исследовании одежду для бега стирали в присутствии ДНКазы по настоящему изобретению каждый раз, когда одежду стирали. Участник группы оценки запаха обнаружил, что если одежду для бега стирали в присутствии ДНКазы , ее можно носить по меньшей мере два тренировочных упражнения (обеспечивая высыхание одежды без стирки одежды между тренировочными упражнениями) до того, как неприятный запах становился четко определяемым.
Пример 11
Aspergillus oryzae
Стабильность ДНКазы , сравнительное исследование
Получение образца моющего средства
Образец моющего средства получали в соответствии с описаниями в таблице ниже (таблица 8) и хранили в течение четырех недель при постоянной температуре (-18°C, 30°C и 37°C, соответственно).
Таблица 8
Название моющего средства
ДНКаза в моющем средстве
Savinase в моющем средстве
ДНКаза в моющем растворе
Savinase в моющем растворе
Моющее средство-модель A
Bl ДНКаза: 120 ppm
0 ppm
Bl ДНКаза: 0,4 ppm
0 ppm
Моющее средство-модель A
Bl ДНКаза: 120 ppm
440 ppm
Bl ДНКаза: 0,4 ppm
1,5 ppm
Моющее средство-модель A
Ao ДНКаза: 120 ppm
0 ppm
Ao ДНКаза: 0,4 ppm
0 ppm
Моющее средство-модель A
Ao ДНКаза: 120 ppm
440 ppm
Ao ДНКаза: 0,4 ppm
1,5 ppm
Ariel Actilift Color&Style
Bl ДНКаза: 120 ppm
NA
Bl ДНКаза: 0,4 ppm
NA
Ariel Actilift Color&Style
Ao ДНКаза: 120 ppm
NA
Ao ДНКаза: 0,4 ppm
NA
Bacillus licheniformis
Apergillus oryzae
Bl ДНКаза: ДНКаза (зрелый пептид последовательности, изложенной в SEQ ID NO 11); Ao ДНКаза: ДНКаза ; Savinase (протеаза, последовательность, изложенная в SEQ ID NO: 10), NA: Нет доступной информации.
Получение образцов-доноров с биопленкой
Brevundimonas
Brevundimonas
sp. предварительно выращивали в соевой среде с агаром Tryptone (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Бейзингстоук, Великобритания) в течение 2-5 дней при 30°C. Из одной колонии целые петли переносили в 10 мл TSB и инкубировали в течение 1 дня при 30°C при встряхивании (240 об./мин.). После культивирования sp. пеллетировали посредством центрифугирования (Sigma Laboratory Centrifuge 6K15) (3000 г при 21°C в течение 7 мин.) и повторно суспендировали в 10 мл TSB, дважды разбавленном водой. Оптическую плотность (OD) при 600 нм измеряли с использованием спектрофотометра (POLARstar Omega (BMG Labtech, Ортенберг, Германия). Свежеприготовленный TSB, дважды разбавленный водой, инокулировали до OD 600 нм 0,03, и добавляли 20 мл в чашку Петри, в которую помещали 5 см x 5 см образец стерильного сложного полиэфира WFK30A. После инкубирования (24 ч. при 15°C при встряхивании (100 об./мин.) образцы дважды прополаскивали 0,9% (вес./об.) NaCl. Затем круглые образцы (1 см в диаметре) вырезали из 5 см x 5 см образцов-доноров. Круглые образцы применяли для эксперимента стирки.
Стирка
т.е.
Моющий раствор готовили посредством отвешивания количества моющего средства, необходимого для анализа, в колбу, моющее средство-модель A 3,3 г/л; Ariel Actilift Color & Style 6,9 г/л, растворенные в воде MilliQ с жесткостью 15°dH. Грязь готовили путем повторного суспендирования грязи (Pigmentschmutz, 09V, wfk, Крефельд, Германия) в водопроводной воде и перемешивания суспензии в течение 30 мин. перед применением. Затем грязь добавляли в каждую колбу до достижения концентрации загрязнения 0,35 г грязи/л (Pigmentschmutz, 09V, wfk, Крефельд, Германия) и колбы заполняли водопроводной водой до конечного объема (4 мл).
Круглые образцы посещали в планшет 24-луночного формата (два круглых образца, полученные от того же образца-донора на каждую лунку). Объект механического стресса (MSO) в форме удлиненного металлического объекта (1 см), покрытого пластмассой, помещали в каждую лунку. Лунку помещали в автоматический манипулятор Hamilton и подвергали программе симуляции стирки с использованием следующих условий: Длительность цикла стирки: 30 минут при встряхивании (1000 об./мин.); температура 30°C; объем моющего раствора (общий): 4 мл на лунку. В течение периода стирки планшет встряхивали круговым способом для обеспечения контакта тестового раствора с текстильным изделием и применения механического стресса постоянным периодическим колебательным способом. После завершения цикла симуляции стирки образцы устраняли из моющего раствора и оставляли для высыхания на фильтровальной бумаге. Высушенные образцы закрепляли на листе белой бумаги для сканирования.
Эффективность смывания измеряли по яркости цвета постиранного текстильного материала. Яркость также можно выражать как интенсивность света, отраженного от образца, при освещении белым светом. Если образец загрязнен, то интенсивность отраженного света ниже, чем у чистого образца. Следовательно интенсивность отраженного света можно использовать для измерения эффективности смывания. Измерения цвета проводили с помощью планшетного сканера (EPSON V750 PRO), который применяли для фиксации изображения постиранного текстильного изделия. Для получения значения интенсивности света со сканированных изображений, значения 24-битного пиксельного изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего цвета (RGB). Значение интенсивности (Int) рассчитывали сложением всех значений RGB в качестве векторов, а затем - учетом длины результирующего вектора:
Таблица 9
Моющее средство
Фермент(ы)
Интенсивность(-18˚C)
Интенсивность(30˚C)
Интенсивность(37˚C)
ΔИнтенсивность(-18˚C - 30˚C)
ΔИнтенсивность(-18˚C - 37˚C)
Моющее средство-модель A
Bl ДНКаза
439
439
438
< 5
< 5
Моющее средство-модель A
Bl ДНКаза+Savinase
436
430
416
5
20
Моющее средство-модель A
Ao ДНКаза
439
438
437
< 5
< 5
Моющее средство-модель A
Ao ДНКаза+Savinase
439
439
438
< 5
< 5
Ariel Actilift Colour & Style
Bl ДНКаза
439
438
439
65
26
Ariel Actilift Colour & Style
Ao ДНКаза
439
438
439
< 5
< 5
Моющее средство-модель A
-
350
Ariel Actilift Colour & Style
-
392
Bacillus licheniformis
Apergillus oryzae
Bl ДНКаза: ДНКаза (зрелый пептид последовательности, изложенной в SEQ ID NO 11); Ao ДНКаза: ДНКаза ; Savinase (протеаза, последовательность, изложенная в SEQ ID NO: 10).
Aspergillus oryzae
Bacillus licheniformis
Выводы: Данное сравнительное исследование демонстрирует, что ДНКаза по настоящему изобретению обладает лучшей стабильностью в сравнении с протеазами по сравнению с ДНКазой (зрелый пептид последовательности, изложенной в SEQ ID NO 11).
Пример 12
Aspergillus oryzae
Bacillus licheniformis
Стабильность ДНКазы и ДНКазы , сравнительное исследование в анализе miniLOM.
Bacillus licheniformis
Aspergillus oryzae
Brevundimonas
С целью сравнения стабильности при хранении ДНКазы и ДНКазы по настоящему изобретению стабильность при хранении двух данных типов ДНКаз устанавливали для моющего средства-модели A и Ariel Actilift Colour&Style. Образец моющего средства готовили, как описано в примере 11, и хранили в течение двух и четырех недель при постоянной температуре (-18°C, 35°C). Доза ДНКазы в моющем растворе составляла 0,4 ppm. Доза протеазы (Savinase, последовательность изложена в SEQ ID NO: 10)) в моющем растворе составляла 0,15 ppm. После хранения моющую способность тестировали в анализе miniLOM (описанном в данном документе) с использованием образцов сложного полиэфира с биопленкой sp. (полученные как описано в примере 11). Эффективность смывания измеряли по яркости цвета постиранного текстильного материала. Цветовое различие (L-значения) измеряли с использованием Color Eye (отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000). Измерения осуществляли без УФ-излучения в отраженном свете и выделяли L-значение от цветового пространства CIE Lab.
Таблица 10
Моющее средство
Время инкубации
Ферменты
L (-18°C)
L (35°C)
ΔL
Моющее средство-модель A
2 недели
Bl ДНКаза
90,6
90,5
< 0,5
Моющее средство-модель A
2 недели
Bl ДНКаза+Savinase
91,5
84,6
6,9
Моющее средство-модель A
2 недели
Ao ДНКаза
90,4
90,5
< 0,5
Моющее средство-модель A
2 недели
Ao ДНКаза+Savinase
90,5
91,1
< 0,5
Bacillus licheniformis
Apergillus oryzae
Свежеприготовленное моющее средство-модель A без ферментов обеспечивала цветовое различие (L) 82,6. Цветовое различие (L), разница цветового различия (ΔL). Bl ДНКаза: ДНКаза  (зрелый пептид последовательности, изложенной в SEQ ID NO 11); Ao ДНКаза: ДНКаза .
Таблица 11
Моющее средство
Время инкубации
Ферменты
L (-18°C)
L (35°C)
ΔL
Ariel Actilift Colour&Style
2 недели
Bl ДНКаза
92,3
87,0
5,3
Ariel Actilift Colour&Style
2 недели
Ao ДНКаза
92,1
92,4
< 0,5
Моющее средство
Время инкубации
Ферменты
L (-18°C)
L (37°C)
ΔL
Ariel Actilift Colour&Style
4 недели
Bl ДНКаза
93,2
87,0
6,2
Ariel Actilift Color&Style
4 недели
Ao ДНКаза
93,2
93,0
< 0,5
Bacillus licheniformis
Apergillus oryzae
Свежеприготовленное моющее средство-модель A без ферментов обеспечивала цветовое различие (L) 86,9. Цветовое различие (L), разница цветового различия (ΔL). Bl ДНКаза: ДНКаза  (зрелый пептид последовательности, изложенной в SEQ ID NO 11); Ao ДНКаза: ДНКаза
Aspergillus oryzae
Bacillus licheniformis
Выводы: Данное сравнительное исследование демонстрирует, что ДНКаза обладает лучшей стабильностью в сравнении с протеазами по сравнению с ДНКазой (зрелый пептид последовательности, изложенной в SEQ ID NO 11).
Пример 13
Устранение запаха ДНКазой (E-nose)
Получение образцов ДНК с E-2-ноненалом
Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp.,
Хромосомная ДНК из выделяли посредством QIAamp DNA Blood Mini Kit, следуя инструкциям производителя (Qiagen, Хильден, Германия). Образцы сложного полиэфира (WFK30A) (2 см в диаметре) стерилизовали в автоклаве Holm & Halby Systec DB-23 в течение 60 минут при 121°C. 100 мкл очищенной ДНК разбавленной до конечной концентрации 1 нг/мкл добавляли к каждому из автоклавированных образцов и образцы высушивали в стеллаже с постоянным ламинарным потоком воздуха в течение 2 часов. После высушивания 10 образцов с ДНК помещали в стерильную 25 мл пробирку NUNC (364238; Thermo Scientific) и добавляли 10 мл 0,2 мМ E-2-ноненала (255653; Sigma-Aldrich). Пробирку помещали в ротатор Stuart (20 об./мин. при комнатной температуре на 20 мин.). 10 образцов переносили в центрифужную побирку 50.000 MWCO (VS203, Vivaspin 20, Satorius). Пробирки центрифугировали с 3000 г при 21°C в течение 1 мин., и 10 образцов разделяли между 2 стерильными пробирками NUNC (364238; Thermo Scientific) по 5 образцов в каждой пробирке. Кроме того, 5 стерильных образцов сложного полиэфира (WFK30A) (2 см в диаметре) без ДНК и E-2-ноненала добавляли в каждую из данных пробирок. Образцы без ДНК отмечали, обеспечивая возможность отличия от образцов с ДНК/E-2-ноненалом.
Процедура стирки образцов ДНК с E-2-ноненалом
Моющий раствор порошка Ariel Actilift Colour&Style и порошка Ariel Actilift готовили путем растворения 5,0 г моющего средства в 1000 мл стерильной воды MilliQ с жесткостью 15°dH (условия EU). Моющий раствор капсул Tide готовили путем растворения 1,8 г белой фазы моющего средства в 1000 мл стерильной воды milliQ с жесткостью 6°dH. Моющие растворы оставляли на магнитной мешалке на 20 мин. перед применением.
Apergillus oryzae
Моющий раствор (10 мл) добавляли в каждую из двух идентичных пробирок с 5 образцами ДНК с E-2-ноненалом и в одну из пробирок добавляли 5 стерильных образцов, 10 мкл ДНКазы по настоящему изобретению, полученной в результате в конечной концентрации 5 ppm. Пробирки помещали в ротатор Stuart (20 об./мин. при 30°C на 60 мин.). Моющий раствор выливали и образцы дважды прополаскивали 20 мл стерильной воды milliQ с жесткостью 15°dH. Образцы из каждой пробирки переносили в центрифужную пробирку 50.000 MWCO (VS203, Vivaspin 20, Satorius) и центрифугировали с 3000 г при 21°C в течение 1 мин. Каждый образец с E-2-ноненалом затем переносили в 20 мл GC виалу для парофазного анализа с использованием чистых стерильных пинцетов для помещения каждого образца в каждую виалу. Затем их анализировали в электронный анализатор запахов Alpha MOS HERACLES Flash Gas Chromatography, оснащенный капиллярной колонкой Restek MXT-5 с автоматическим пробоотборником HS100 и детектором FID.
Таблица 12. Интенсивность E-2-ноненала, измеренная с помощью E-nose.
Моющее средство
Пиковая область(без ДНКазы)
Пиковая область(с ДНКазой)
% уменьшения
Порошок Ariel Actilift
108325
83177
23%
Порошок Ariel Actilift Colour&Style
167288
122868
27%
Капсулы Tide
128945
80895
37%
Apergillus oryzae
Вывод: Захваченный ДНК запах на текстильном изделии может быть устранен посредством ДНКазы , таким образом, обеспечивая в результате уменьшение запаха.
Пример 14
Устранение запаха посредством ДНКазы (сенсорный анализ)
Pseudomonas
Apergillus oryzae
Образцы сложного полиэфира и хлопка (2 см в диаметре) загрязняли ДНК sp. и 0,5 мМ E-2-ноненала (255653; Sigma Aldrich) (см. пример 13 относительно подробностей получения образцов ДНК) и стирали в ротаторе Stuart в течение 60 мин. при 30°C в моющем средстве-модели A (полученном путем растворения 3,33 г в 1 литре воды milliQ с жесткостью 15°dH) в присутствии или в отсутствие ДНКазы по настоящему изобретению (5 ppm). После стирки образцы дважды прополаскивали в 20 мл воды MilliQ с жесткостью 15°dH. Образцы оценивали в отношении предполагаемой интенсивности E-2-ноненала четверо обученных участников группы оценки запаха (образцы были замаскированы). Для оценки предполагаемой интенсивности применяли шкалу от 0 до 9. 0 обозначал отсутствие предполагаемой интенсивности E-2-ноненала, тогда как 9 указывало на наивысшую предполагаемую интенсивность E-2-ноненала. Результаты продемонстрировали согласованность между всеми четырьмя участниками группы оценки запаха.
Таблица 13
Тип ткани
Добавление ДНКазы
Средняя оценка четырех участников группы оценки запаха
Хлопчатник
-
5,0
Хлопчатник
+
1,3
Сложный полиэфир
-
6,3
Сложный полиэфир
+
2,8
Apergillus oryzae
Захваченный ДНК запах на текстильном изделии может быть устранен посредством ДНКазы , таким образом, обеспечивая в результате уменьшение запаха.
Пример 15
Анализ визуального определения устранения запаха
Brevundimonas
Brevundimonas
sp. предварительно выращивали в соевой среде с агаром Tryptone (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Бейзингстоук, Великобритания) в течение 2-5 дней при 30°C. Из одной колонии целые петли переносили в 10 мл TSB и инкубировали в течение 20 часов при 30°C со встряхиванием (240 об./мин.). После культивирования sp. пеллетировали посредством центрифугирования (Sigma Laboratory Centrifuge 6K15) (3000 г при 21°C в течение 7 мин.) и повторно суспендировали в 10 мл TSB, дважды разбавленном водой. Оптическую плотность (OD) при 600 нм измеряли с использованием спектрофотометра (POLARstar Omega (BMG Labtech, Ортенберг, Германия). Свежеприготовленный TSB, дважды разбавленный водой, инокулировали до OD 600 нм 0,03, и добавляли 20 мл в чашку Петри, в которую помещали 5 см x 5 см образец стерильного сложного полиэфира WFK30A. После инкубирования (24 ч. при 15°C при встряхивании (75 об./мин.) образцы дважды прополаскивали 0,9% (вес./об.) NaCl. Образцы стирали в TOM либо непосредственно после полоскания, либо после высушивания в течение 24 часов в стеллаже LAF.
Средство для визуального определения феноловый красный в растворе получали путем растворения 0,1 г в 100 мл 99% этанола. Индикаторный раствор (50 мкл) добавляли на фильтровальную бумагу (диаметр 2 см) и высушивали в течение ночи в вытяжном шкафу с образованием захватывающего запах средства, содержащего средство для визуального определения (феноловый красный). Четыре постиранных образца помещали на дно стеклянного контейнера (один контейнер на каждый образец) и добавляли 500 мкл 17% TSB. В качестве контроля постиранное чистое текстильное изделие из сложного полиэфира помещали на дно другого стеклянного контейнера и добавляли 500 мкл 17% TSB. Контейнеры с образцами инкубировали при 37°C. Контейнеры изучали до 48 часов для определения изменения цвета меченного феноловым красным образца.
Таблица 14. Результаты инкубирования
Моющее средство
Без фермента
ДНКаза Apergillus oryzae (10 ppm)
Tide Original
Красный (24 ч.)
Желтый (24 ч.)
Ariel sensitive White&Color
Красный (48 ч.)
Желтый (48 ч.)
Моющее средство-модель T
Красный (24 ч.)
Желтый (24 ч.)
Часы в таблице указывают на моменты времени для обнаруженного изменения цвета.
Пример 16
Эффект присутствия ДНКазы в моющем средстве относительно биопленки
Pseudomonas aeruginosa
на текстильном изделии
Pseudomonas
P. aeruginosa
Один штамм aeruginosa, выделенный из белья, подлежащего стирке, применяли в настоящем примере. Штамм предварительно выращивали в соевой среде с агаром Tryptone (TSA) (pH 7,3) (CM0131; Oxoid Ltd, Бейзингстоук, Великобритания) в течение 3 дней при 30°C. Из одной колонии целые петли переносили в 10 мл TSB и инкубировали в течение ночи при 30°C при встряхивании (200 об./мин.). После культивирования в течение ночи культуру разбавляли 1000-кратно свежеполученной средой TSB и 1,62 мл данного разбавления культурой добавляли в каждую лунку 12-луночного полистиролового микропланшета с плоским дном (3512; Corning Incorporated, Корнинг, Нью-Йорк, США), в который помещали круглые образцы (диаметр 2 см) стерильного сложного полиэфира (WFK30A). Через 48 ч. при 30°C при встряхивании (70 об./мин.) питательную среду удаляли и образцы дважды прополаскивали 3 мл 0,9% (вес./об.) NaCl.
P. aeruginosa
Aspergillus oryzae
Пять прополосканных образцов с помещали в 50 мл тестовую пробирку и добавляли 10 мл модели жидкого моющего средства A, полученного в воде с жесткостью 15°dH с 0,7 г/л пигментированной грязи (Pigmentschmutz 09V, wfk, Крефельд, Германия), и ДНКазу по настоящему изобретению (0,1 ppm в моющем растворе). В качестве контроля параллельно осуществляли стирку без ДНКазы. Стирку осуществляли в ротаторе Stuart в течение 1 часа при 30°C (анализ MiniLOM, описанный в данном документе). Моющий раствор удаляли и образцы дважды прополаскивали водопроводной водой и высушивали на фильтровальной бумаге в течение ночи.
Цветовое различие (L-значение в цветовом пространстве L*a*b) измеряли с использованием измерительной головки Minolta CR-300 Chroma Meter и устройства для обработки данных Minolta DP-301. Цветовое различие (L-значение, L*) обозначает самый темный черный при L*=0 и самый яркий белый при L*=100.
P. aeruginosa
Результаты демонстрируют, что ДНКаза способна уменьшать липкость и/или уменьшать количество биопленки на текстильном изделии.
Pseudomonas aeruginosa
Таблица 15. Эффект ДНКазы в моющем средстве относительно биопленки на текстильном изделии.
Концентрация ДНКазы (ppm)
L-значение
L-значение (с ДНКазой) - L-значение (без ДНКазы)
0
84,6
0,1
87,3
2,7
Пример 17
Моющая способность ДНКазы в присутствии оптического осветлителя
Материалы и методы
Получение образцов биопленки
Brevundimonas
Круглые образцы (диаметр 2 см) стерильного сложного полиэфира WFK30A с биопленкой  sp. получали, как описано в примере 4.
Эксперимент стирки
Brevundimonas
Brevundimonas
Моющий раствор порошка моющего средства-модели T без отбеливающего средства получали путем растворения моющего средства (5,33 г/л) в воде с жесткостью 15°dH. Раздельно добавляли компонент моющего средства-модели Т AEO Biosoft N25-7 (NI) (0,16 г/л). Пигментированая грязь (Pigmentschmutz, 09V, wfk, Крефельд, Германия) (0,7 г/л) добавляли в моющий раствор. Моющий раствор (10 мл) добавляли в 50 мл пробирку с пятью прополасканными образцами с sp. и пятью образцами стерильного сложного полиэфира (WFK30A). В стирки, в которые была включена ДНКаза, добавляли ДНКазу (0,5 ppm). В стирки, в которые был включен оптический осветлитель, в моющий раствор добавляли Tinopal CBS-X (0,1 г/л). Стирку осуществляли в ротаторе Stuart в течение 1 часа при 30°C (анализ MiniLOM, описанный в данном документе). После стирки образцы с sp. дважды прополаскивали в водопроводной воде и высушивали на фильтровальной бумаге в течение ночи. Цветовое отличие (L-значения) измеряли с использованием Color Eye (отражательного спектрофотометра Macbeth Color Eye 7000). Измерения осуществляли без УФ-излучения в отраженном свете и выделяли L-значение от цветового пространства CIE Lab.
Таблица 16. Моющая способность ДНКазы в присутствии оптического осветлителя.
Моющее средство-модель T (г/л)+NI (г/л)
CBS-X (g/l)
<i>A. oryzae </i>ДНКаза(ppm)
L-значение
Разница L-значения(L-значение - L-значение (без оптического осветлителя, без ДНКазы)
5,33+0,16
0
0
85,4
5,33+0,16
0
0,5
89,3
3,9
5,33+0,16
0,1
0
83,9
<0
5,33+0,16
0,1
0,5
89,3
0
A. oryzae
Данные, представленные в таблице 16, демонстрируют, что на моющую способность ДНКазы по настоящему изобретению не влияет присутствие оптического осветлителя.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Novozymes A/S
<120>  Моющая композиция
<130>  12785-WO-PCT
<160>  12
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  910
<212>  ДНК
<213>  Aspergillus oryzae
<220>
<221>  экзон
<222>  (1)..(242)
<220>
<221>  Интрон
<222>  (243)..(308)
<220>
<221>  экзон
<222>  (309)..(494)
<220>
<221>  Интрон
<222>  (495)..(555)
<220>
<221>  экзон
<222>  (556)..(714)
<220>
<221>  Интрон
<222>  (715)..(765)
<220>
<221>  экзон
<222>  (766)..(907)
<220>
<221>  Интрон
<222>  (908)..(910)
<400>  1
atg cag ctt act aag tcc ctc ctg gta ttc gcg ctt tac atg ttt ggc         48
Met Gln Leu Thr Lys Ser Leu Leu Val Phe Ala Leu Tyr Met Phe Gly
1               5                   10                  15
act cag cac gtt cta gct gtg cct gtc aat ccc gag cct gat gct acg         96
Thr Gln His Val Leu Ala Val Pro Val Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr
20                  25                  30
agc gtc gaa aat gtt gcc ctt aaa aca ggc agc ggt gat agc cag agc        144
Ser Val Glu Asn Val Ala Leu Lys Thr Gly Ser Gly Asp Ser Gln Ser
35                  40                  45
gat ccc atc aag gcg gac ttg gag gtc aaa ggc caa agt gct ttg cct        192
Asp Pro Ile Lys Ala Asp Leu Glu Val Lys Gly Gln Ser Ala Leu Pro
50                  55                  60
ttc gac gtc gac tgc tgg gct atc ctg tgc aag ggc gcc ccg aat gtc        240
Phe Asp Val Asp Cys Trp Ala Ile Leu Cys Lys Gly Ala Pro Asn Val
65                  70                  75                  80
ct  gtatgtcttc ctttattgaa gctcttgatg tggcttgtat gtttgactaa             292
Leu
tatatcgcac ccttag g cag cgc gtg aat gaa aag acg aaa aat agt aat        342
Gln Arg Val Asn Glu Lys Thr Lys Asn Ser Asn
85                  90
cgc gat cgg agc ggt gcg aac aaa ggg cct ttc aaa gat cct cag aaa        390
Arg Asp Arg Ser Gly Ala Asn Lys Gly Pro Phe Lys Asp Pro Gln Lys
95                  100                 105
tgg ggc atc aaa gcc ctt cca cct aag aat cca tcc tgg agc gca caa        438
Trp Gly Ile Lys Ala Leu Pro Pro Lys Asn Pro Ser Trp Ser Ala Gln
110                 115                 120
gac ttc aaa tca ccc gaa gaa tac gca ttt gcg tct tcc ctt caa ggc        486
Asp Phe Lys Ser Pro Glu Glu Tyr Ala Phe Ala Ser Ser Leu Gln Gly
125                 130                 135                 140
gga acc aa  gtatgctaag atcatcactg cttcaatcaa tgtgttgtta                534
Gly Thr Asn
gctgactccg atgtgaccaa g t gcc atc cta gcg ccc gtc aac ctc gct tct      586
Ala Ile Leu Ala Pro Val Asn Leu Ala Ser
145                 150
cag aac tcc caa ggc ggc gtc ttg aac ggt ttc tac tcg gcg aac aaa        634
Gln Asn Ser Gln Gly Gly Val Leu Asn Gly Phe Tyr Ser Ala Asn Lys
155                 160                 165
gta gca caa ttt gat cct agc aag ccc caa cag aca aag gga aca tgg        682
Val Ala Gln Phe Asp Pro Ser Lys Pro Gln Gln Thr Lys Gly Thr Trp
170                 175                 180                 185
ttt cag atc act aag ttc aca ggt gca gct gg  gtaagaactt ccagtaccat      734
Phe Gln Ile Thr Lys Phe Thr Gly Ala Ala Gly
190                 195
ggtcatatgc aatttactaa gaaaatacta g t cct tac tgc aag gct ctg ggg       787
Pro Tyr Cys Lys Ala Leu Gly
200
agt aat gat aag agt gtg tgc gat aag aac aag aat att gca ggg gac        835
Ser Asn Asp Lys Ser Val Cys Asp Lys Asn Lys Asn Ile Ala Gly Asp
205                 210                 215
tgg ggc ttc gac ccg gcg aaa tgg gca tat cag tat gat gag aag aat        883
Trp Gly Phe Asp Pro Ala Lys Trp Ala Tyr Gln Tyr Asp Glu Lys Asn
220                 225                 230                 235
aac aag ttc aac tat gtt ggt aag taa                                    910
Asn Lys Phe Asn Tyr Val Gly Lys
240
<210>  2
<211>  243
<212>  Белок
<213>  Aspergillus oryzae
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(22)
<220>
<221>  ПРОПЕПТИД
<222>  (23)..(37)
<220>
<221>  ЦЕПЬ
<222>  (38)..(243)
<223>  зрелый полипептид
<400>  2
Met Gln Leu Thr Lys Ser Leu Leu Val Phe Ala Leu Tyr Met Phe Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln His Val Leu Ala Val Pro Val Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr
20                  25                  30
Ser Val Glu Asn Val Ala Leu Lys Thr Gly Ser Gly Asp Ser Gln Ser
35                  40                  45
Asp Pro Ile Lys Ala Asp Leu Glu Val Lys Gly Gln Ser Ala Leu Pro
50                  55                  60
Phe Asp Val Asp Cys Trp Ala Ile Leu Cys Lys Gly Ala Pro Asn Val
65                  70                  75                  80
Leu Gln Arg Val Asn Glu Lys Thr Lys Asn Ser Asn Arg Asp Arg Ser
85                  90                  95
Gly Ala Asn Lys Gly Pro Phe Lys Asp Pro Gln Lys Trp Gly Ile Lys
100                 105                 110
Ala Leu Pro Pro Lys Asn Pro Ser Trp Ser Ala Gln Asp Phe Lys Ser
115                 120                 125
Pro Glu Glu Tyr Ala Phe Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Thr Asn Ala
130                 135                 140
Ile Leu Ala Pro Val Asn Leu Ala Ser Gln Asn Ser Gln Gly Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Asn Gly Phe Tyr Ser Ala Asn Lys Val Ala Gln Phe Asp Pro Ser
165                 170                 175
Lys Pro Gln Gln Thr Lys Gly Thr Trp Phe Gln Ile Thr Lys Phe Thr
180                 185                 190
Gly Ala Ala Gly Pro Tyr Cys Lys Ala Leu Gly Ser Asn Asp Lys Ser
195                 200                 205
Val Cys Asp Lys Asn Lys Asn Ile Ala Gly Asp Trp Gly Phe Asp Pro
210                 215                 220
Ala Lys Trp Ala Tyr Gln Tyr Asp Glu Lys Asn Asn Lys Phe Asn Tyr
225                 230                 235                 240
Val Gly Lys
<210>  3
<211>  32
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер oJAL316
<400>  3
gacggatcca ccatgcagct tactaagtcc ct                                     32
<210>  4
<211>  31
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер oJAL317
<400>  4
gacctcgagt tacttaccaa catagttgaa c                                      31
<210>  5
<211>  931
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Фрагмент ПЦР
<400>  5
gacggatcca ccatgcagct tactaagtcc ctcctggtat tcgcgcttta catgtttggc       60
actcagcacg ttctagctgt gcctgtcaat cccgagcctg atgctacgag cgtcgaaaat      120
gttgccctta aaacaggcag cggtgatagc cagagcgatc ccatcaaggc ggacttggag      180
gtcaaaggcc aaagtgcttt gcctttcgac gtcgactgct gggctatcct gtgcaagggc      240
gccccgaatg tcctgtatgt cttcctttat tgaagctctt gatgtggctt gtatgtttga      300
ctaatatatc gcacccttag gcagcgcgtg aatgaaaaga cgaaaaatag taatcgcgat      360
cggagcggtg cgaacaaagg gcctttcaaa gatcctcaga aatggggcat caaagccctt      420
ccacctaaga atccatcctg gagcgcacaa gacttcaaat cacccgaaga atacgcattt      480
gcgtcttccc ttcaaggcgg aaccaagtat gctaagatca tcactgcttc aatcaatgtg      540
ttgttagctg actccgatgt gaccaagtgc catcctagcg cccgtcaacc tcgcttctca      600
gaactcccaa ggcggcgtct tgaacggttt ctactcggcg aacaaagtag cacaatttga      660
tcctagcaag ccccaacaga caaagggaac atggtttcag atcactaagt tcacaggtgc      720
agctgggtaa gaacttccag taccatggtc atatgcaatt tactaagaaa atactagtcc      780
ttactgcaag gctctgggga gtaatgataa gagtgtgtgc gataagaaca agaatattgc      840
aggggactgg ggcttcgacc cggcgaaatg ggcatatcag tatgatgaga agaataacaa      900
gttcaactat gttggtaagt aactcgaggt c                                     931
<210>  6
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Aspergillus oryzae
<400>  6
Ala Leu Lys Thr Gly Ser Gly
1               5
<210>  7
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  аминокислоты
<400>  7
Lys Thr Gly Ser Gly Asp Ser
1               5
<210>  8
<211>  206
<212>  Белок
<213>  Aspergillus oryzae
<220>
<221>  ЦЕПЬ
<222>  (1)..(206)
<223>  зрелый полипептид
<400>  8
Ala Leu Lys Thr Gly Ser Gly Asp Ser Gln Ser Asp Pro Ile Lys Ala
1               5                   10                  15
Asp Leu Glu Val Lys Gly Gln Ser Ala Leu Pro Phe Asp Val Asp Cys
20                  25                  30
Trp Ala Ile Leu Cys Lys Gly Ala Pro Asn Val Leu Gln Arg Val Asn
35                  40                  45
Glu Lys Thr Lys Asn Ser Asn Arg Asp Arg Ser Gly Ala Asn Lys Gly
50                  55                  60
Pro Phe Lys Asp Pro Gln Lys Trp Gly Ile Lys Ala Leu Pro Pro Lys
65                  70                  75                  80
Asn Pro Ser Trp Ser Ala Gln Asp Phe Lys Ser Pro Glu Glu Tyr Ala
85                  90                  95
Phe Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Thr Asn Ala Ile Leu Ala Pro Val
100                 105                 110
Asn Leu Ala Ser Gln Asn Ser Gln Gly Gly Val Leu Asn Gly Phe Tyr
115                 120                 125
Ser Ala Asn Lys Val Ala Gln Phe Asp Pro Ser Lys Pro Gln Gln Thr
130                 135                 140
Lys Gly Thr Trp Phe Gln Ile Thr Lys Phe Thr Gly Ala Ala Gly Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Cys Lys Ala Leu Gly Ser Asn Asp Lys Ser Val Cys Asp Lys Asn
165                 170                 175
Lys Asn Ile Ala Gly Asp Trp Gly Phe Asp Pro Ala Lys Trp Ala Tyr
180                 185                 190
Gln Tyr Asp Glu Lys Asn Asn Lys Phe Asn Tyr Val Gly Lys
195                 200                 205
<210>  9
<211>  204
<212>  Белок
<213>  Aspergillus oryzae
<220>
<221>  ЦЕПЬ
<222>  (1)..(204)
<223>  зрелый полипептид
<400>  9
Lys Thr Gly Ser Gly Asp Ser Gln Ser Asp Pro Ile Lys Ala Asp Leu
1               5                   10                  15
Glu Val Lys Gly Gln Ser Ala Leu Pro Phe Asp Val Asp Cys Trp Ala
20                  25                  30
Ile Leu Cys Lys Gly Ala Pro Asn Val Leu Gln Arg Val Asn Glu Lys
35                  40                  45
Thr Lys Asn Ser Asn Arg Asp Arg Ser Gly Ala Asn Lys Gly Pro Phe
50                  55                  60
Lys Asp Pro Gln Lys Trp Gly Ile Lys Ala Leu Pro Pro Lys Asn Pro
65                  70                  75                  80
Ser Trp Ser Ala Gln Asp Phe Lys Ser Pro Glu Glu Tyr Ala Phe Ala
85                  90                  95
Ser Ser Leu Gln Gly Gly Thr Asn Ala Ile Leu Ala Pro Val Asn Leu
100                 105                 110
Ala Ser Gln Asn Ser Gln Gly Gly Val Leu Asn Gly Phe Tyr Ser Ala
115                 120                 125
Asn Lys Val Ala Gln Phe Asp Pro Ser Lys Pro Gln Gln Thr Lys Gly
130                 135                 140
Thr Trp Phe Gln Ile Thr Lys Phe Thr Gly Ala Ala Gly Pro Tyr Cys
145                 150                 155                 160
Lys Ala Leu Gly Ser Asn Asp Lys Ser Val Cys Asp Lys Asn Lys Asn
165                 170                 175
Ile Ala Gly Asp Trp Gly Phe Asp Pro Ala Lys Trp Ala Tyr Gln Tyr
180                 185                 190
Asp Glu Lys Asn Asn Lys Phe Asn Tyr Val Gly Lys
195                 200
<210>  10
<211>  269
<212>  Белок
<213>  Bacillus lentus
<400>  10
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1               5                   10                  15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20                  25                  30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35                  40                  45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50                  55                  60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65                  70                  75                  80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85                  90                  95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100                 105                 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115                 120                 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130                 135                 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165                 170                 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180                 185                 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195                 200                 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210                 215                 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225                 230                 235                 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245                 250                 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260                 265
<210>  11
<211>  142
<212>  Белок
<213>  Bacillus licheniformis
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(33)
<220>
<221>  ЦЕПЬ
<222>  (34)..(142)
<223>  зрелый полипептид
<400>  11
Met Ile Lys Lys Trp Ala Val His Leu Leu Phe Ser Ala Leu Val Leu
1               5                   10                  15
Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Ser Pro Gln His Ala Glu Gly
20                  25                  30
Ala Ala Arg Tyr Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Pro Ala Ser Arg Tyr Pro
35                  40                  45
Glu Thr Gly Ala His Ile Ser Asp Ala Ile Lys Ala Gly His Ser Asp
50                  55                  60
Val Cys Thr Ile Glu Arg Ser Gly Ala Asp Lys Arg Arg Gln Glu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Gly Ile Pro Thr Lys Pro Gly Phe Asp Arg Asp Glu Trp Pro
85                  90                  95
Met Ala Met Cys Glu Glu Gly Gly Lys Gly Ala Ser Val Arg Tyr Val
100                 105                 110
Ser Ser Ser Asp Asn Arg Gly Ala Gly Ser Trp Val Gly Asn Arg Leu
115                 120                 125
Ser Gly Phe Ala Asp Gly Thr Arg Ile Leu Phe Ile Val Gln
130                 135                 140
<210>  12
<211>  732
<212>  ДНК
<213>  Aspergillus oryzae
<400>  12
atgcagctta ctaagtccct cctggtattc gcgctttaca tgtttggcac tcagcacgtt       60
ctagctgtgc ctgtcaatcc cgagcctgat gctacgagcg tcgaaaatgt tgcccttaaa      120
acaggcagcg gtgatagcca gagcgatccc atcaaggcgg acttggaggt caaaggccaa      180
agtgctttgc ctttcgacgt cgactgctgg gctatcctgt gcaagggcgc cccgaatgtc      240
ctgcagcgcg tgaatgaaaa gacgaaaaat agtaatcgcg atcggagcgg tgcgaacaaa      300
gggcctttca aagatcctca gaaatggggc atcaaagccc ttccacctaa gaatccatcc      360
tggagcgcac aagacttcaa atcacccgaa gaatacgcat ttgcgtcttc ccttcaaggc      420
ggaaccaatg ccatcctagc gcccgtcaac ctcgcttctc agaactccca aggcggcgtc      480
ttgaacggtt tctactcggc gaacaaagta gcacaatttg atcctagcaa gccccaacag      540
acaaagggaa catggtttca gatcactaag ttcacaggtg cagctggtcc ttactgcaag      600
gctctgggga gtaatgataa gagtgtgtgc gataagaaca agaatattgc aggggactgg      660
ggcttcgacc cggcgaaatg ggcatatcag tatgatgaga agaataacaa gttcaactat      720
gttggtaagt aa                                                          732
<---