НОВЫЕ МЕДИЦИНСКИЕ АГЕНТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW MEDICAL AGENTS AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к новому соединению TMZ-CD154 и способу лечения заболеваний, в котором используется новая молекула TMZ-CD154. В частности, TMZ-CD154 используется для модификации иммунных ответов у пациентов с заболеваниями, связанными с иммунитетом, такими как рак и инфекционные заболевания. Данное изобретение также относится к способу активации клеток in vitro с помощью TMZ-CD154 либо до использования активированных клеток в терапии, либо для диагностических целей.
Уровень техники в области изобретения
В течение последних десятилетий технология переноса генов широко исследовалась в лечении, например, рака. В 2012 г. Glybera стала первым способом лечения генной терапией, утвержденной для клинического использования. Glybera компенсирует дефицит липазы липопротеинов путем предоставления интактной копии гена липазы липопротеинов человека (LPL), инкорпорированного в вирусный вектор аденоассоциированного вируса серотипа 1 (AAV1).
Целью генной терапии является введение функционального/терапевтического гена в клетку-мишень, такую как клетка опухоли.
WO 2012/038607 описывает способ продуцирования CD40L в клетке и увеличения специфического иммунного ответа опухоли и апоптоза у объекта. CD40L (также обозначаемый как лиганд CD40, CD154 или gp39) представляет собой трансмембранный белок типа II, принадлежащий к семейству факторов некроза опухолей.
WO 02/36769 описывает химеру CD40L-CD40. В отличие от нуклеотидной последовательности по данному изобретению химера содержит внутриклеточный сигнальный участок другого белка, тогда как по данному изобретению отсутствует способность к внутриклеточной сигнализации.
Blaser et al (Clin. Immunology 2005, 117, 231-237) и Hsu et al. (Journal of Biological Chemistry, 1997, 272, 911-915) описывают встречающийся в природе CD40L, который в случае Blaser et al. демонстрирует, что мутация ведет к дисфункциональному белку. Hsu et al. описывают, что природный CD40L может быть расщеплен с выделением внеклеточного домена. Однако выделившийся CD40L не стабилен как тример.
WO 94/10308 и WO 2007/120368 отсылают к растворимым мультимерным молекулам CD40L, которые не удерживаются в плазматической мембране, но выделяются из клетки или используются как рекомбинантно продуцированные молекулы для системного использования у пациента. Сравнение этих растворимых молекул с TMZ-CD154 по данному изобретению показывает, что TMZ-CD154 дает более сильный сигнал активации, вероятно, поскольку он удерживается в плазматической мембране.
CD154 представляет собой трансмембранную молекулу, которая может тримеризоваться при связывании с рецептором CD40. Связывание приводит к реципрокной стимуляции CD154 позитивных и CD40 позитивных клеток. CD154 также может быть расщеплен и секретирован, но затем действует, как растворимый CD154 (sCD154) мономер. Мембранное связывание или sCD154 активируют дендритные клетки (DCs), чтобы они стали эффективными клетками, предоставляющими антиген, и активировали так называемые иммунные ответы типа Th1 в эффекторных клетках, таких как Т-клетки и естественные клетки-киллеры (NK). Иммунный ответ типа Th1 играет ключевую роль в иммунитете опухоли и является, следовательно, сутью активной иммунотерапии опухоли. CD154 может индуцировать апоптоз в CD40-позитивных опухолевых клетках пока не полностью установленным образом. Однако, некоторые сообщения относят это за счет активации каспазы-9 TRAF3-JNK-зависимым путем, тогда как другие исследования привлекают ауто- или паракринную продукцию лигандов смерти, которая может индуцировать активацию каспазы-8 (Loskog и Eliopoulos, Semin Immunol 2009). CD40 не имеет доменов смерти в своем хвосте, что оставляет простор для многочисленных объяснений. Показано, что индукция апоптоза более сильна, если CD154 мембранно связан, что может происходить вследствие тримеризации этой системы рецептор/лиганд при связывании. CD154 был использован как растворимая молекула в клинических исследованиях, включающих пациентов, страдающих раком, однако системное применение может приводить к повышенным печеночным ферментам, что не отмечалось, когда CD154 доставлялся локально в метастазы опухоли, например, с использованием переноса генов аденовирусного серотипа 5 (Vonderheide JCO, 2001; Malmström et al CCR 2010). Полноразмерный CD154 был использован также в онколитических вирусах (Fernandes et al CCR 2009; Gomes et al CCR 2009; Terada et al GT 2006; Diaconu et al CR 2012) и протестирован на безопасность для пациентов (Pesonen et al CR 2012). Экспрессия с помощью генной инженерии молекулы CD154 в T-клетках может приводить к лимфопролиферативному заболеванию (Brown et al Nat Med 1998). Следовательно, векторы, переносящие полноразмерный ген CD154, и таковые, способные инфицировать клетки, которые могут реагировать таким образом, могут вызывать неожиданную нежелательную токсичность.
Следовательно, существует необходимость в развитии производных CD154, которые сохраняют свои полезные свойства в отношении апоптоза и подавления опухоли, не имеющих нежелательной неблагоприятной токсичности.
Краткое описание данного изобретения
Авторы данного изобретения разработали мембранно-связанное тримеризованное производное CD154, не имеющее внутриклеточных сигнальных доменов. Производное является более сильным иммуномодулятором, чем соответствующий мономер CD154, оно не приводит к внутренней сигнализации CD154 и не приводит к системной токсичности, опосредованной CD154.
Описание TMZ-CD154
Данное изобретение относится к генно-инженерной форме CD154, в которой внеклеточный и трансмембранный домен CD154 слиты с доменом олигомеризации (Фиг. 1). Генно-инженерный CD154 сохраняет мембранно-связанную форму с функциональным внеклеточным доменом, но не содержащую внутриклеточных сигнальных доменов. Напротив, домен олигомеризации олигомеризует транслированный генно-инженерный CD154, и белковый комплекс остается мембранно-связанным.
В качестве примера авторы данного изобретения продуцировали тримеризованную мембранно-связанную, содержащую изолейциновую «молнию» молекулу CD154, именующуюся TMZ-CD154. TMZ-CD154 образует олигомеризованные, предпочтительно тримеризованные, молекулы CD154, не имеющие внутриклеточного домена, и локализованные на клеточной мембране. Экспрессия TMZ-CD154 в клетках приводит к сильному проявлению молекулы на клеточной поверхности и минимальной секреции молекулы по сравнению с CD154 дикого типа. TMZ-CD154-экспрессирующие клетки активируют дендритные клетки (DCs), что показывает униформная экспрессия CD83 и высокая продукция IL12. Продукция IL12 так же высока, как у CD154 дикого типа и выше, чем, если DCs стимулируются растворимыми мультимерными молекулами CD154, демонстрируя пользу трансмембранного участка, который удерживает TMZ-CD154 в мембране. Далее, сигнализация CD154 в клетках, экспрессирующих CD154, после лигирования с CD40 плохо определяется, но может индуцировать пролиферативные условия в экспрессирующих CD154 Т-клетках. Следовательно, TMZ-CD154 имеет полезные свойства стимуляции CD154 CD40-позитивными клетками без активации нисходящих сигнальных путей в клетках, экспрессирующих TMZ-CD154, что могло бы вызвать неконтролируемый рост, например, в генно-инженерных T-клетках или другие неизвестные события, в зависимости от типа генно-инженерной клетки. Это особенно важно, если молекула доставляется в клетки, такие как T-клетки, на которые может повлиять внутренняя сигнализация CD154.
Как описано в данном документе, данное изобретение не ограничено TMZ-CD154, но другие нуклеотиды/белки, имеющие существенные строительные блоки, также находятся в сфере данного изобретения. Для иллюстративных целей TMZ-CD154 использован как пример различных аспектов данного изобретения:
i) TMZ-CD154 в нуклеотидной или белковой форме,
ii) TMZ-CD154 для применения в медицине,
iii) TMZ-CD154, встроенный в генетические носители, клетки, искусственные клетки или естественные или искусственные носители,
iv) TMZ-CD154, встроенный в генетические носители, клетки, искусственные клетки или естественные или искусственные носители для применения в медицине,
v) TMZ-CD154 или TMZ-CD154, встроенный в генетические носители генетические носители, клетки, искусственные клетки искусственные клетки или естественные или искусственные носители для применения в лечении заболеваний, включая в себя, но, не ограничиваясь ими, рак, инфекционное заболевание, лимфопролиферативное заболевание, воспаление, хроническое воспаление, аутоиммунную реакцию или аллергию у человека и (или) в ветеринарной медицине,
vi) фармацевтическая композиция, содержащая TMZ-CD154,
vii) фармацевтическая композиция, содержащая TMZ-CD154, встроенный в генетические носители, клетки, искусственные клетки или естественные или искусственные носители,
viii) способ продуцирования TMZ-CD154 в клетке.
Описание изобретения
Основываясь на наблюдениях, сообщенных в данном документе, особенно с точки зрения результатов, касающихся TMZ-CD154, данное изобретение относится к нуклеотидной последовательности, содержащей структуру
OD-(L)- TD-ED (5' - 3')
в которой OD представляет собой домен олигомеризации,
L представляет собой линкер, который присутствует, если необходимо,
TD представляет собой трансмембранный домен, и
ED представляет собой внеклеточный домен CD154,
при том условии, что нуклеотидная последовательность не содержит внутриклеточного участка CD154, соответствующего эквивалентной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 16.
Трансмембранный домен может происходить из CD154 или из какого-либо трансмембранного белка типа II.
Внеклеточный домен может быть выбран из:
i) SEQ ID NO: 11, т.е. остатков 199-846 в SEQ ID NO: 1,
ii) SEQ ID NO: 11, т.е. остатков 199-846 в SEQ ID NO: 1, но в которой один или более остатков нуклеиновой кислоты 397-420 в SEQ ID NO: 1 делетированы или заменены другой аминокислотой, чтобы устранить расщепление молекулы,
iii) SEQ ID NO 12, т.е. остатков 127-846 в SEQ ID NO: 3,
iv) SEQ ID NO: 13, т.е. остатков 127-844 в SEQ ID NO: 4,
v) SEQ ID NO: 14, т.е. остатков 127-844 в SEQ ID NO: 5,
vi) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью, определенной в каком-либо из пп. i)-v), или
vii)соответствующего внеклеточного домена CD154 млекопитающих.
Нуклеотидная последовательность по данному изобретению содержит три обязательных признака, которые в направлении от 5'-конца к 3' образуют структуру OD-TD-ED, и в то же самое время в ней отсутствует внутриклеточная передача сигнала. Внеклеточный домен CD40L сливают с трансмембранным участком, чтобы он остался на клеточной поверхности для улучшения сигнализации и с доменом тримеризации для максимальной сигнализации. Линкер может быть встроен между OD и TD.
Назначение TMZ-CD154 состоит в тримеризации CD40L и удержании в плазматической мембране без предоставления внутриклеточной сигнализации в клетках, несущих TMZ-CD154, при взаимодействии с CD40+ клетками. Цель состоит в передаче сигналов, но без достижения реципрокных сигналов.
in vivo
Естественно встречающийся CD40L не поддерживает тримеризованную структуру  в растворимой форме, что ослабляет сигнализацию.
in vivo
in vivo
Нуклеотидная последовательность по данному изобретению может быть использована, например, в генной терапии  - как описано в примерах в данном документе - путем внутриопухолевой инъекции вируса, несущего нуклеотидную последовательность (например, ген TMZ-CD154); важно удалить [его] внутриклеточный участок (например, CD40L). Инъекция приводит к экспрессии нуклеотидной последовательности во всех инфицированных клетках, включая в себя инфильтрирующие опухоль T-клетки - клетки, которые естественным образом экспрессируют CD40L в короткое время в ходе активации. Оверэкспрессия CD40L дикого типа в T-клетках приводит к неконтролируемой пролиферации T-клеток и, следовательно, лимфопролиферативным заболеваниям у мышей. Удаление внутриклеточного участка важно с точки зрения аспектов безопасности. TMZ-CD154 не индуцирует ни неконтролируемой пролиферации T-клеток в Т-клетках человека, ни таких неблагоприятных реакций, которые отмечались в мышах, обработанных CD40L.
В частности, данное изобретение относится к производным CD40L или CD154, которые имеют нижеследующую структуру:
OD-(L)-TD-ED, в котором OD представляет собой домен олигомеризации, L представляет собой линкер, который присутствует, если требуется, TD представляет собой трансмембранный домен, а ED представляет собой внеклеточный домен. Таким образом, по сравнению с CD40L (CD154) нуклеотидная последовательность по данному изобретению не имеет внутриклеточного домена, но обладает доменом олигомеризации, который предшествует трансмембранному и внеклеточному доменам. Таким образом, внутриклеточный домен CD40L (CD154) не представлен.
В таблице ниже дан обзор последовательностей, упомянутых в данном документе.
Список последовательностей SEQ ID NO:
1
TMZ-CD154
Нуклеотид
2
TMZ-CD154
Белок
3
TMZ-CD154 (лошадь)
Нуклеотид
4
TMZ-CD154 (собака)
Нуклеотид
5
TMZ-CD154 (кошка)
Нуклеотид
6
Ген TMZ-CD154/4-1BBL
Нуклеотид
7
Ген TMZ-CD154/4-1BBL
Белок
8
Ген TMZ-CD154/aIL6R scFv
Нуклеотид
9
Ген TMZ-CD154/aIL6R scFv
Белок
10
Полноразмерный CD154 дикого типа
Белок
11
ED-остатки 199-846 в SEQ ID NO: 1
Нуклеотид
12
ED-остатки 127-846 в SEQ ID NO: 3
Нуклеотид
13
ED-остатки 127-844 в SEQ ID NO: 4
Нуклеотид
14
ED-остатки 127-844 в SEQ ID NO: 5
Нуклеотид
15
ID-остатки 1-22 в SEQ ID 10
Белок
16
ID, соответствующий аминокислотным остаткам 1-22 в SEQ ID 10
Нуклеотид
17
TD остатки 127-198 в SEQ ID NO: 1
Нуклеотид
18
TD, соответствующий остаткам нуклеиновой кислоты 127-198 в SEQ ID NO: 1
Белок
19
TD, происходящий из лиганда Ox40 человека
Белок
20
TD, происходящий из лиганда Ox40 человека
Нуклеотид
21
TD, происходящий из CD70 человека
Белок
22
TD, происходящий из CD70 человека
Нуклеотид
23
OD-изолейциновая «молния» - остатки 10-108 SEQ ID NO: 1
Нуклеотид
24
ED - белок, соответствующий SEQ ID NO: 11, т.е. остатки 199-846 в SEQ ID NO: 1
Белок
25
Линкер-белок, соответствующий SEQ ID NO: 17, т.е. остатки 109-126 в SEQ ID NO: 1
Белок
26
Полноразмерный aa CD40L человека со сдвигом в aa для предупреждения расщепления молекулыQ K (№№ 114,115) и D Q N P (№№ 117-120) заменены на P R и E E D S
Белок
27
TMZ-CD154 (лошадь)
Белок
28
TMZ-CD154 (собака)
Белок
29
TMZ-CD154 (кошка)
Белок
В целом, нуклеотидная последовательность представляет собой CD154, в котором отсутствует внутриклеточный участок, и, как следует из изложенного выше, CD154 может происходить от млекопитающих, включая в себя человека, лошадь, собаку, кошку и т.д. Предпочтителен CD154 человека. Предусматривается, что один или более остатков CD154 могут быть делетированы или замещены. В нижеследующей таблице и в виде иллюстрации с CD154 человека (представленным в виде белка) указывается, какие остатки могут быть замещены другими остатками. Какая-либо комбинация паттерна замещений/делеций находится в сфере данной заявки. Таким образом, одна или более аминокислота в CD154 (с отсутствующим внутриклеточным участком), указанная ниже в таблице, может быть замещена/делетирована в соответствии с конкретным указанным изменением.
Некоторые из аминокислот CD154 (белка) могут также быть замещены, чтобы предотвратить расщепление молекулы. SEQ ID NO: 26 дает пример такой последовательности, в которой сделаны следующие изменения (основываясь на полноразмерном CD150 человека): Q114P, K115R, D117E, Q118E, N119D и P120S. Нуклеотидная последовательность, соответствующая белку SEQ ID NO: 26, но с отсутствующим внутриклеточным участком, также находится в сфере данного изобретения.
Естественные вариации аминокислотной последовательности CD154 человека
Ссылка: UniProtKB/Swiss-Prot/P29965 (CD40L_HUMAN)
<b>Положение (aa)</b>
<b>Изменение</b>
<b>Домен</b>
36
M на R
TD
38
G на R
TD
116
G на R
ED
116
G на S
ED
123
A на E
ED
125
H на R
ED
126
V на A
ED
126
V на D
ED
128-129
SE на RG
ED
140
W на C
ED
140
W на G
ED
140
W на R
ED
143
K на T
ED
144
G на E
ED
147
T на N
ED
155
L на P
ED
170
Y на C
ED
173
A на D
ED
174
Q на R
ED
176
T на I
ED
195
L на P
ED
208
A на D
ED
211
T на N
ED
219
G на R
ED
224
H на Y
ED
226
G на A
ED
227
G на V
ED
227
отсутствует
ED
231
L на S
ED
235
A на P
ED
237
V на E
ED
254
T на M
ED
257
G на D
ED
257
G на S
ED
258
L на S
ED
Как упоминалось выше, трансмембранный домен может быть каким-либо трансмембранным белком, в особенности, происходящим от CD154, лиганда OX40 человека или CD70 человека.
Таким образом, трансмембранный домен может иметь, по меньшей мере, 90% последовательности, идентичной:
i) SEQ ID NO: 17, т.е. остаткам 127-198 из SEQ ID NO 1,
ii) SEQ ID NO: 20, т.е. трансмембранному домену OX40 человека, или
iii) SEQ ID NO: 22, т.е. трансмембранному домену CD70 человека,
или он может иметь, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 22.
В качестве примера, трансмембранный домен имеет SEQ ID NO: 17, т.е. остатки 127-198 в SEQ ID NO: 1 (TMZ-CD154).
Домен олигомеризации обычно представляет собой изолейциновую «молнию» или домен тримеризации T4-фибрина. В качестве примера, домен олигомеризации представляет собой изолейциновую «молнию», имеющую SEQ ID NO: 23, т.е. остатки 10-108 в SEQ ID NO: 1.
Нуклеотидная последовательность может также содержать последовательность Козака, например, соответствующую остаткам 1-9 в SEQ ID NO: 1.
Последовательность Козака представляет собой короткую нуклеотидную последовательность, которая встречается в эукариотической мРНК для стимуляции запуска процесса трансляции. Чтобы стимулировать трансляцию TMZ-CD154, когда это используется в условиях генной терапии, последовательности гена TMZ-CD154 предшествует последовательность Козака. Последовательность Козака присутствует, если TMZ-CD154 экспрессируется сам по себе или как первый ген в транскрипте, содержащем дополнительные гены иммуномодуляторов или другие молекулы. Таким образом, в данном контексте полинуклеотид по данному изобретению может иметь или не иметь последовательность Козака. Обе формы находятся в сфере данного изобретения.
Как пример, нуклеотидная последовательность по данному изобретению может иметь, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% последовательности, идентичной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Конкретно, нуклеотидная последовательность по данному изобретению может иметь, по меньшей мере, 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4 или EQ ID NO: 5, или быть идентичным нуклеотидам SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
Нуклеотидная последовательность по данному изобретению может также быть скомбинирована с иммуномодулятором. Примерами подходящих иммуномодуляторов являются ген лиганда 4-1BB или ген для анти-IL6R scFv.
Аналогично, нуклеотидная последовательность по данному изобретению может быть скомбинирована с модулятором сигнального пути, таким как анти-IL6R scFv; или она может быть скомбинирована с* блокатором сигнального пути. Таким образом, нуклеотидная последовательность по данному изобретению может иметь, по меньшей мере, 95%, 98% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 (ген TMZ-CD154/4-1BBL и ген TMZ-CD154/alL6R scFv, соответственно).
Применение нуклеотидной последовательности по данному изобретению описано в данном документе подробно. Нуклеотидная последовательность целиком может быть использована в медицине и (или) в качестве диагностического инструмента.
Данное изобретение также относится к белку, кодируемому нуклеотидной последовательностью, определенной в данном документе.
По аналогии с определением нуклеотидной последовательности по данному изобретению, белок по данному изобретению может быть определен как белок, содержащий структуру
OD-(L)-TD-ED,
в которой OD представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую домену олигомеризации,
L представляет собой линкер, который присутствует, если требуется,
TD представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую трансмембранному домену, и
ED представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену CD154,
с тем условием, что белок не содержит аминокислотной последовательности, соответствующей внутриклеточному участку CD154, соответствующему аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15.
Внеклеточный домен CD154 может быть выбран из:
i) SEQ ID NO: 24,
ii) SEQ ID NO: 24, но в которой одна или более аминокислот аминокислотной последовательности MQKGDQNP, соответствующей нуклеотидным остаткам 397-420 в SEQ ID NO: 1, делетирована или заменена другой аминокислотой, чтобы устранить расщепление молекулы,
iii) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидным остаткам в SEQ ID NO 12, т.е. остатков 127-846 в SEQ ID NO: 3,
iv) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидным остаткам SEQ ID NO: 13, т.е. остатков 127-844 в SEQ ID NO: 4,
v) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидным остаткам SEQ ID NO: 14, т.е. остатков 127-844 в SEQ ID NO: 5,
vi) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью, определенной в каком-либо из пп. i)-v), или
vi) соответствующего внеклеточного домена CD154 млекопитающих.
Трансмембранный домен может происходить из CD154 или какого-либо трансмембранного белка типа II. Он может иметь идентичность последовательности, по меньшей мере, 90%, 95%, 98% или 100% с SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21, предпочтительно SEQ ID NO: 18.
В белке по данному изобретению отсутствует внутриклеточный участок, такой как внутриклеточный участок CD154 или CD40.
Детали и подробности, описанные в аспекте нуклеотидов касаются также аспекта белка, однако, что касается аспекта белка, соответствующие части молекул представляют собой аминокислотные последовательности, соответствующие описанным нуклеотидам или аминокислотным последовательностям, кодируемым нуклеотидами, описанными в данном документе.
Как пример, белок по данному изобретению может содержать ED, имеющий, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 24. Далее, в вышеприведенной таблице дан обзор возможных изменений в ED. Как описано выше, какие-либо такие изменения и комбинация изменений предполагаются как находящиеся в сфере данного изобретения.
Более конкретно, домен олигомеризации может представлять собой домен изолейциновой «молнии» или домен тримеризации T4-фибрина.
Как упоминалось выше, трансмембранный домен может происходить из трансмембранного домена CD154 или какого-либо трансмембранного белка типа II. Конкретно, аминокислотная последовательность, соответствующая трансмембранному домену, имеет, по меньшей мере, 90%, 95%, 98% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 (TD, происходящий из лиганда OX40) или SEQ ID NO: 21 (TD, происходящий от CD70). Как пример, трансмембранный домен белка по данному изобретению может представлять собой SEQ ID NO: 18 или белок, в котором один или более остатков SEQ ID NO: 18 могут быть делетированы или замещены другой аминокислотой. Примерами таких остатков являются aa14 и (или) aa16, например, c M14R и (или) G15R (соответствующими M36R и G38R в полноразмерном CD154).
В частности, белок по данному изобретению может иметь, по меньшей мере, 90%, 95% или 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2, такую как 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.
Применение белка по данному изобретению описано подробно в данном документе. В целом, белок может быть использован в медицине и (или) как диагностический инструмент.
TMZ-CD154 представляет интерес и в нуклеотидной, и в белковой форме.
Детали, относящиеся к связи TMZ-CD154 со структурой и последовательностями
Ген TMZ-CD154 содержит внеклеточный и трансмембранный домены CD154, слитые с доменом олигомеризации, но без внутриклеточного участка CD154. Более конкретно, ген TMZ-CD154 имеет, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с одним из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В частности, ген TMZ-CD154 имеет, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с одним из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В частности, ген TMZ-CD154 представляет собой одну из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 2 соответствует аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Белок TMZ-CD154, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с соответствующей белковой последовательностью одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, также охватывается данным изобретением. В частности, белок TMZ-CD154 имеет, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с соответствующей белковой последовательностью одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В частности, белок TMZ-CD154 соответствует соответствующей белковой последовательности нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В частности, белок имеет, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2. В частности, белок TMZ-CD154 имеет белковую последовательность SEQ ID NO: 2.
Домены TMZ-CD154 могут быть человеческого происхождения, но также могут происходить от других видов, включая в себя, но, не ограничиваясь ими, собаку, кошку и лошадь. Трансген может быть использован в аутологической, аллогенной или ксеногенной форме. Например, TMZ-CD154 человека может быть использован для лечения заболеваний у человека, кошки, собаки и (или) лошади.
Домен олигомеризации может представлять собой домен изолейциновой «молнии», но может также представлять собой другие домены, которые олигомеризуют молекулу TMZ-CD154, не нарушая мембранной локализации. Многие белки олигомеризуются или специфически тримеризуются и содержат последовательности, которые могут быть использованы. Например, могут быть использованы домен тримеризации фибритина T4 или других молекул, которые тримеризуются естественным путем.
Трансмембранный домен может происходить из молекулы CD154 или из других молекул, которые демонстрируют один или более трансмембранных участков, или из сконструированного участка для усиления удержания CD154 в мембране. Трансмембранные участки могут быть одиночными или множественными трансмембранными α-спиралями, β-баррелем/баррелями, β-спиралью грамицидина A, но также быть другими структурами.
Носители
Данное изобретение также относится к носителям, содержащим нуклеотидную последовательность, как определено в данном документе. Носитель может представлять собой какой-либо подходящий носитель, включая в себя плазмиды, вирусные векторы, транспозоны, клетки, искусственные клетки и искусственные носители.
Когда TMZ-CD154 используется в нижеследующем, это охватывает TMZ-CD154 как таковой, так же как другие нуклеотиды (и белки, в соответствующем случае) по данному изобретению.
Носитель для переноса TMZ-CD154 может представлять собой, но, не ограничиваясь этим, плазмиду, вирусный вектор, дефектный по репликации; вирус, компетентный по репликации; транспозон, клетку, искусственную клетку или искусственный носитель.
TMZ-CD154, как это определено в данном документе, может быть доставлен в носители, описанные в данном документе, как ДНК, кДНК, РНК, мРНК, олигонуклеотид или белок.
Плазмиды
Носитель для переноса нуклеотидных последовательностей по данному изобретению, в частности TMZ-CD154, может представлять собой плазмиду, миникольцевое производное плазмиды или самореплицирующуюся плазмиду или миникольцо.
Плазмидный вектор может представлять собой, но, не ограничиваясь этим, основную плазмиду, состоящую из кольцевой последовательности ДНК с сайтами ORI, ферментом/ферментами рестрикции, промотором/промоторами и нуклеотидной последовательности по данному изобретению, в частности последовательности TMZ-CD154, со старт- и стоп-кодонами.
Плазмида может также представлять собой, так называемое производное миникольцевой плазмиды с ограниченными или неограниченными прокариотическими частями вектора, но содержащие нуклеотидную последовательность по данному изобретению, в частности последовательность TMZ-CD154.
Плазмида, содержащая нуклеотид по данному изобретению, в частности последовательность TMZ-CD154, может представлять собой, так называемую самореплицирующуюся плазмиду или миникольцо, содержащее элемент S/MAR или другую часть, которая делает возможной саморепликацию плазмиды или миникольца в клетках.
Вирусные векторы
Вектор может представлять собой дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, содержащий нуклеотидную последовательность по данному изобретению, например TMZ-CD154.
Под дефектным по репликации вирусным вектором авторы данного изобретения понимают вирус, который не способен к репликации собственными средствами, вследствие делеции генов, вовлеченных в вирусную репликацию. Например, ранний ген 1 (E1) может быть делетирован у семейства вирусов Adenoviridae, чтобы сгенерировать дефектный по репликации вирусный вектор. Чтобы поддержать рост репликации вируса, должны быть обеспечены отсутствующие гены/соответствующие белки, которые не ограничиваются встраиванием гена E1 в клеточные линии-продуценты (такие как 293, 293T, 911, C6 (Crucell) клеточные линии-продуценты). Отсутствующие гены/соответствующие белки могут также быть предоставлены отдельно в клеточную линию, продуцирующую вирус. Например, плазмида дефектного по репликации вектора, происходящего от Retroviridae, может быть трансфецирована вместе с генами/белками, содержащими отсутствующие гены, в клетки-продуценты.
Под вирусом, компетентным по репликации, авторы данного изобретения понимают вирус, который способен к репликации собственными средствами в какой-либо клетке, которую он инфицировал, или в клетке специфического происхождения. Последний может представлять собой условно репликативный вирус, в котором репликация управляется промотором, который активен только в определенных клетках или при определенных обстоятельствах. Такая клетка может представлять собой опухолевую клетку или органоспецифическую клетку, а такие условия могут представлять собой повышение активности промотора вследствие пролиферации, такого как промотор теломеразы (TERT) или нарушение Rb-пути ретинобластомы.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как упомянуто выше, может иметь другие делеции в вирусном геноме, чтобы предоставить больше места для трансгенов, таких как TMZ-CD154, или устраненные участки генов, которые в противном случае негативно сказываются на лечебном эффекте или экспрессии трансгена. Например, ранний ген 3 (E3) может быть частично или полностью делетирован у семейства вирусов Adenoviridae по вышеупомянутым причинам.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как упомянуто выше, может иметь дополнения промоторов для управления репликацией или экспрессией трансгена, и инсуляторы или сходную защиту промотора или трансгена от ингибирующих эффектов, чтобы улучшить трансляцию трансгена, или повысить или улучшить специфичность онколитической функции онколитического вируса. Например, вирусные векторы могут содержать промоторы, происходящие от цитомегаловируса (CMV), вируса саркомы Рауса (RSV), вируса стволовых клеток мыши (MSCV) и (или) промотора фактора элонгации-1a (EF-1a) человека, но не ограничивающиеся ими.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано выше, может представлять собой члена семейств вирусов Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, Anelloviridae, Retroviridae, Reoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Arenaviridae, Flaviviridae, Orthomycoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Coronaviridae, Astroviridae, Bornaviridae, Arteriviridae, Hepeviridae, но не ограничиваясь ими.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано выше может представлять собой представителя ДНК-вирусов, таких как Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, Anelloviridae, но не ограничиваясь ими.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано выше, может представлять собой представителя РНК-вирусов, таких как Retroviridae, Reoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Arenaviridae, Flaviviridae, Orthomycoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Coronaviridae, Astroviridae, Bornaviridae, Arteriviridae, Hepeviridae, но не ограничиваясь ими.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано выше, может представлять собой представителя Adenoviridae, Parvoviridae, Poxviridae, Retroviridae, Togaviridae.
Как проиллюстрировано в Примерах данного документа, дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано в данном документе, представляет собой члена семейства Adenoviridae.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано в данном документе, может представлять собой химерный вирус. Под химерным вирусом авторы данного изобретения понимают вирус, как описано выше, состоящий из: a) двух или более различных вирусных частей из семейств вирусов, описанных в данном документе, b) двух или более различных вирусных частей из различных вирусов, или c) смесь «a» и «b» или d) вирусный вектор может иметь гены других видов. Например, промотор, происходящий из вируса CMV, может быть встроен в вирусный вектор из другого семейства вирусов, или вирусный вектор может демонстрировать гены или промоторы человека.
Дефектный по репликации вирусный вектор или вирус, компетентный по репликации, как описано в данном документе, может представлять собой химерный вирус, как описано выше, особенно химерный вирус, состоящий из скелета аденовируса серотипа 5, в котором ножка и глобулярный наконечник (shaft и knob) происходят из аденовирусного серотипа 35.
Таким образом, носитель по данному изобретению может быть вирусом, который представляет собой вирус аденовирусного серотипа 5/35. Аденовирус 5/35 может иметь промоторный участок E2F/сайты связывания, вышележащие по отношению к гену E1A, он может содержать сайт Sp-1, вышележащий по отношению к гену E1A, делецию E1A Δ24, E3 Δ6.7K/gp19K и группу трансгенов, включающую в себя pCMV и трансген/трансгены, встроенные после участка гена L5.
Транспозоны
Генетический носитель может также представлять собой транспозон. Под транспозоном авторы данного изобретения понимают вектор, происходящий из мобильного элемента (TE, транспозон или ретротранспозон). Например, но, не ограничиваясь этим, система транспозона «спящая красавица» (Sleeping Beauty transposon) или система транспозона PiggyBac.
Клетки, искусственные клетки или искусственные носители
Нуклеотидная последовательность, включая в себя TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть встроена и воспроизведена в клетках, искусственных клетках или искусственных носителях. Эти клетки/носители могут быть использованы как простые носители для доставки нуклеотидной последовательности или транслированного белка, например, TMZ-CD154, к месту заболевания, такому как опухоль. Если клетки непосредственно подвергаются действию нуклеотидных последовательностей/транслированного белка, например, TMZ-CD154, клетки-носители могут быть использованы и для доставки нуклеотидной последовательности/транслированного белка, например, TMZ-CD154, и как клеточная терапия вследствие новых свойств клетки, проявляющихся благодаря нуклеотидной последовательности/транслированному белку, например, TMZ-CD154.
Генно-инженерные клетки TMZ-CD154 могут представлять собой опухолевые клетки (например, вакцины опухолевых клеток), клетки иммунной системы, такие как T-клетки, дендритные клетки, моноциты и макрофаги и другие типы клеток, такие как фибробласты, стромальные мезенхимные клетки, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, но не ограничиваясь ими.
Генно-инженерные клетки TMZ-CD154 могут представлять собой опухолевые клетки, аутологические или аллогенные для пациента. Такие генно-инженерные клетки могут быть использованы как клеточная вакцина для пациентов, страдающих раком.
Генно-инженерные клетки TMZ-CD154 являются аутологическими или аллогенными клетками, происходящими из иммунной системы, как описано в данном документе, для использования в лечении пациентов. Например, клетки могут быть лимфоидного происхождения, такие как нормальные клетки-киллеры (клетки NK) или направленные на антиген T-клетки, полученные либо селекцией и выращиванием природных антиген-распознающих T-клеток, либо генно-инженерные T-клетки (например, T-клетки, экспрессирующие химерные рецепторы антигенов, направленные на антиген рецепторы T-клеток или их эквиваленты).
Под «антигеном» авторы данного изобретения понимают мишень, распознаваемую T-клетками через рецептор T-клеток, химерный антигенный рецептор или эквивалент, такой как, опухоль-специфический или ассоциированный антиген для лечения рака или микробный антиген для лечения инфекционной болезни или раковые клетки, которые также предоставляют микробный антиген но, не ограничиваясь ими. Например, вирус Эпштейна-Барр (EBV) может быть экспрессирован в раковых опухолях, происходящих из B-клеток, и поэтому антигены EBV могут быть использованы в качестве раковых клеток-мишеней. Аналогичным образом, вирус папилломы и CMV ассоциировали с раком.
ex vivo
Нуклеотидная последовательность, например, TMZ-CD154, в генно-инженерных клетках также может быть миелоидного происхождения, такого как, но, не ограничиваясь ими, моноциты, дендритные клетки и макрофаги. Эти клетки могут быть селектированными природными клетками, клетками, полученными от прогениторных клеток  и (или) генно-инженерными клетками для получения улучшенных или новых свойств. Например, клетки могут быть культивированы с цитокинами или другими стимуляторами, такими как другие клетки, антигены, белки, антитела, пептиды, нуклеотиды, РНК, ДНК и т.д. или сконструированные с генными носителями для достижения новых свойств.
ex vivo
Генно-инженерные клетки с нуклеотидной последовательностью, например, TMZ-CD154, могут быть аутологическими или аллогенными клетками, иными, чем опухолевые клетки и иммунные клетки, такие как стволовые клетки, фибробласты, стромальные мезенхимные клетки, эндотелиальные клетки и эпителиальные клетки, но, не ограничиваясь ими. Клетки могут быть встречающимися в природе клетками или полученными путем культивирования прогениторных клеток. Клетки могут быть культивированы  и (или) стимулированными цитокинами или другими стимуляторами, такими как другие клетки, антигены, белки, антитела, пептиды, нуклеотиды, РНК, ДНК и т.д. или сконструированные с генным носителем для достижения новых свойств.
in vitro
Нуклеотидная последовательность по данному изобретению, например, TMZ-CD154, может проявляться или доставляться искусственными клетками. Под искусственными клетками авторы данного изобретения понимают сущность, которая обладает некоторыми важными биологическими признаками определенной биологической функции. Это может быть везикула, покрытая липидной мембраной, плазматической мембраной или искусственной мембраной, которая: 1) содержит TMZ-CD154, как описано в данном документе, для транспортировки и выделения в месте заболевания, таком как опухоль, 2) содержит на мембране нуклеотидную последовательность по данномуизобретению, например, TMZ-CD154, для достижения активации CD40 позитивных клеток в месте заболевания или .
Нуклеотидная последовательность по данному изобретению, например, TMZ-CD154, может также проявляться или доставляться естественными или искусственными носителями. Под естественными или искусственными носителями авторы данного изобретения понимают различные композиции липосом, шариков, наночастиц или везикул, например, нагруженных TMZ-CD154 на поверхности или во внутренней сердцевине для быстрого или медленного выделения, например, TMZ-CD154. Везикулы могут быть, например, очищенными экзосомами из нуклеотидной последовательности, например, TMZ-CD154, экспрессирующих клеток.
Применение генетических носителей, содержащих нуклеотидную последовательность по данному изобретению, например, TMZ-CD154
in vitro
Генетические носители, клетки, искусственные клетки, естественные или искусственные носители, сконструированные с нуклеотидной последовательностью по данному изобретению, например, TMZ-CD154, как определено в данном документе, могут быть использованы для стимуляции  клеток, которые затем используются в качестве клеточной терапии или в качестве стимуляторов для клеток, которые позже будут использованы для клеточной терапии. Например, TMZ-CD154 генно-инженерные дендритные клетки, активированные опухолевыми или вирусными пептидами, могут быть использованы в качестве клеточной терапии рака или инфекционного заболевания.
in vitro
in vitro
Генетические носители, клетки, искусственные клетки, искусственные носители, сконструированные с нуклеотидной последовательностью, например, TMZ-CD154, как определено в данном документе, могут быть использованы для стимуляции клеток , которые затем используются для клеточной терапии. Например, TMZ-CD154 генно-инженерные дендритные клетки могут быть использованы для стимуляции  и размножения Т-клеток, направленных на опухоль или вирус перед T-клеточной терапией рака или инфекционного заболевания.
in vitro
in vitro
in vitro
Далее, генетические носители, клетки, искусственные клетки, искусственные носители, сконструированные с нуклеотидной последовательностью, например, TMZ-CD154, как определено в данном документе, используются для стимуляции  клеток, которые используются для анализов  здоровых пациентов. Например, дендритные клетки, сконструированные с TMZ-CD154, могут быть использованы для наращивания  опухоль- или вирус-специфических T-клеток, чтобы оценить наличие и функцию таких клеточных популяций в крови или в биопсиях.
TMZ-CD154 и другие последовательности, как определено в данном документе, могут быть использованы в качестве терапевтического агента в форме ДНК, кДНК, РНК, мРНК, олигонуклеотида или белка. Далее использование проиллюстрировано на TMZ-CD154 в качестве примера, но другие нуклеотиды и белки по данному изобретению также могут быть использованы для описанных применений.
TMZ-CD154 для применения в медицине
TMZ-CD154 может быть использован в медицине. В особенности TMZ-CD154 может быть использован в лечении раковых заболеваний.
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть использован для лечения рака, такого как происходящий из эпителиальных клеток (карцинома), соединительной ткани (саркома), генеративных клеток (семинома и дисгерминома), предшественников или эмбриональных клеток (бластома) или гемопоэтических клеток (лимфома или лейкемия).
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может также быть использован для лечения:
i) не гемопоэтических раковых заболеваний, таких как происходящие из эпителиальных клеток (карцинома), соединительной ткани (саркома), генеративных клеток (семинома и дисгерминома), предшественников или эмбриональных клеток (бластома),
ii) раковых заболеваний, происходящих от эпителиальных клеток (карцинома), таких как аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома, железисто-плоскоклеточный рак, анапластическая карцинома, крупноклеточная карцинома или мелкоклеточная карцинома,
iii) карцином, происходящих из клеток в поджелудочной железе, таких как, но не ограничиваясь ею, протоковая аденокарцинома,
iv) карцином, происходящих из яичников, таких как карцинома яичника,
v) карцином, происходящих из мочевого пузыря,
vi) карцином, происходящих из легких,
vii) карцином, происходящих из печени,
viii) карцином, происходящих из почек, таких как почечно-клеточная карцинома,
ix) карцином, происходящих из кишечника,
x) карцином, происходящих из молочной железы,
xi) карцином, происходящих из кожи,
xii) нейроэндокринных опухолей, независимо от их локализации,
xiii) рака, происходящего из простаты,
xiv) рака, происходящего из мозга, такого как глиобластома,
xv) раковых заболеваний, которые происходят из клеток мезенхимного происхождения, таких как кости, хрящ, жир, мышцы и сосудистые или гемопоэтические ткани (саркома),
xvi) сарком, происходящих из кости, таких как остеосаркома, или хряща, таких как хондросаркома,
xvii) сарком, происходящих из жира, таких как липосаркома, или гладких мышц, таких как лейомиосаркома,
xviii) сарком мягких тканей, включая в себя альвеолярную саркому мягких тканей, ангиосаркому, листовидную цистосаркому, возвышающуюся дерматофибросаркому, десмоидную опухоль, десмопластическую мелкокруглоклеточную опухоль, десмопластическую мелкокруглоклеточную опухоль, эпителиоидную саркому, внескелетную хондросаркому, внескелетную остеосаркому, фибросаркому, гемангиоперицитому, гемангиосаркому, саркому Капоши, лейомиосаркому, лимфосаркому, недифференцированную плейоморфную саркому, злокачественную опухоль оболочек периферических нервов, нейрофибросаркому, рабдомиосаркому и синовиальную саркому,
xix) саркомы Юинга,
xx) гемопоэтических раковых заболеваний, таких как таковые, происходящие из гемопоэтических клеток (лимфома и лейкемия),
xxi) гемопоэтических раковых заболеваний, таких как таковые, происходящие из гемопоэтических клеток лимфоидных линий, таких как, но не ограничиваясь ими, лимфома Ходжкина или неходжкинская лимфома или T-клеточная лимфома,
xxii) гемопоэтических раковых заболеваний, таких как таковые, происходящие из гемопоэтических клеток лимфоидных линий, таких как, но не ограничиваясь ею, неходжкинская лимфома,
xxiii) гемопоэтических раковых заболеваний, таких как таковые, происходящие из гемопоэтических клеток лимфоидных линий, таких как, но не ограничиваясь ею, B-клеточная лейкемия, такая как хроническая миелоидная лейкемия и острый лимфобластный лейкоз предшественников В-клеток,
xxiv) гемопоэтических раковых заболеваний, таких как таковые, происходящие из гемопоэтических клеток лимфоидных линий, таких как, но не ограничиваясь ею, острая миелоидная лейкемия или хроническая миелоидная лейкемия,
xxv) рака неизвестной первичной локализации,
xxvi) локального первичного рака,
xxvii) местнораспространенного рака,
xxviii) одиночных метастазов,
xxix) распространенного диссеминированного ракового заболевания,
xxx) инфекционного заболевания,
xxxi) вирусных инфекций, таких как, но не ограничиваясь ими, цитомегаловирусная (CMV) инфекция, инфекция вирусом Эпштейна-Барр (EBV) или аденовирусная инфекция,
xxxii) вирусных инфекций, таких как, но не ограничиваясь ими, инфекция вирусом иммунодефицита человека (HIV),
xxxiii) вирусных инфекций, таких как, но не ограничиваясь ими, вирус гриппа или RS вирус,
xxxiv) лимфопролиферативных заболеваний, таких как, но не ограничиваясь ею, макроглобулинемия (болезнь Вальденстрема).
xxxv) иммунных дисфункций, таких как гипер-IgМ-синдром,
xxxvi) иммунных дисфункций, в которых протекающие иммунные реакции должны быть отнесены к типу иммунитета Th1,
xxxvii) заболеваний, как определено в данном документе, медицины человека,
xxxviii) заболеваний, как определено в данном документе, пациентов - взрослых людей,
xxxix) заболеваний, как определено в данном документе, пациентов - детей,
xxxx) лечения заболеваний, как определено в данном документе, ветеринарной медицины,
xxxxi) заболеваний, как определено в данном документе, у собак,
xxxxii) заболеваний, как определено в данном документе, у кошек.
xxxxiii) заболеваний, как определено в данном документе, у лошадей.
Применение TMZ-CD154 в комбинации с иммуномодуляторами
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть скомбинирован с одной или более активных молекул. Молекулы могут быть использованы без или с одними и теми же или разными векторными системами.
Подходящие активные молекулы упомянуты ниже.
Активные молекулы могут быть другими иммуномодуляторными генами в форме ДНК, кДНК, РНК, мРНК, нуклеотидов или белка. Другой активный агент может представлять собой один или более иммуномодуляторов дикого типа, таких как, например, иммуномодуляторы дикого типа, принадлежащие к суперсемейству факторов некроза опухолей (TNF)/рецепторов факторов некроза опухолей (TNFR).
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может также быть использован в комбинации с лигандом 4-1BB дикого типа, и (или) в комбинации с цитокином дикого типа или рецепторами цитокина.
Дополнительно или в качестве альтернативы TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть скомбинирован с одним или более интерлейкинами. Интерлейкины могут представлять собой интерлейкин-2, 7, 15 и (или) 21. Таким образом, активный агент, который комбинируется с TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть интерлейкином-2, интерлейкином-7, интерлейкином-15 или интерлейкином-21.
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может также быть скомбинирован с одним или более факторов роста дикого типа или одним или более рецептором фактора роста. Такие рецепторы могут представлять собой рецепторы трансформированного фактора роста β дикого типа (TGFβ), рецептор-ловушку TGFβ или доминантно-негативный рецептор TGFβ.
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может также быть скомбинирован с молекулами, как определено выше, но которые модифицированы по сравнению с формой дикого типа. Например, нуклеотиды или аминокислоты могут быть изменены, но они продолжают демонстрировать ту же или улучшенную иммуностимуляторную функцию, или молекула может быть изменена и (или) слита с другими доменами, образуя химерные белки. Например, внеклеточный домен лиганда 4-1BB и трансмембранный домен могут быть слиты с доменом TMZ с образованием мембранно-связанного тримеризованного лиганда 4-1BB.
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть скомбинирован с внеклеточным доменом лиганда 4-1BB, а трансмембранный домен может быть слит с доменом TMZ, образуя мембранно-связанный тримеризованный лиганд 4-1BB.
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может также быть скомбинирован с молекулами-ловушками, чтобы блокировать, изменять или активировать сигнальные пути. Молекула-ловушка может представлять собой антитело, одноцепочечный фрагмент, происходящий из антитела, рецептор, лиганд или часть таковых.
Молекула-ловушка, как определено выше, может представлять собой молекулу-ловушку, которая блокирует или изменяет лигирование рецептора интерлейкина-6 (IL6)/IL6.
Таким образом, молекула-ловушка может представлять собой scFv, направленный на рецептор IL6 или scFv, направленный на молекулу IL6.
В качестве альтернативы или дополнительно, молекула-ловушка, определенная выше, может представлять собой молекулу-ловушку, которая блокирует путь STAT3, гремлин-1, лигирование IL10/рецептор IL10 или аргиназы-I.
TMZ-CD154, как определено в данном документе, может быть скомбинирован с каким-либо из модуляторов, определенных выше, в той же самой системе носителя (генетической, в клетках или искусственных носителей), как определено в данном документе. Например, нуклеотидная последовательность TMZ-CD154 может быть лигирована конец в конец с нуклеотидной последовательностью лиганда 4-1BB в генетическом векторе.
Комбинация TMZ-CD154 и другого модулятора может быть лигирована конец в конец в векторной системе и разделены последовательностью IRES или подобной, чтобы позволить экспрессию обоих генов, или комбинация TMZ-CD154 и другого модулятора может быть помещена один за другим в векторной системе, разделенной последовательностью пептида 2A или сходной, что позволяет транскрипцию одиночного гена двум модуляторам, которые разделены на два участка после трансляции.
Комбинация TMZ-CD154 с одним или более иммуномодуляторами для применения в медицине
Нуклеотиды или белки по данному изобретению, в частности, TMZ-CD154, как определено в данном документе, могут быть скомбинированы с каким-либо из модуляторов, как определено в данном документе, в различные системы носителей (генетическая, клетки или искусственные носители), как определено в данном документе, но использоваться вместе в лечении заболеваний. Например, два носителя, несущие TMZ-CD154 и лиганд 4-1BB, соответственно, могут быть использованы одновременно или в различные моменты времени в ходе лечения рака или инфекционного заболевания, но, не ограничиваясь этим.
Носители могут представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154, а другой носитель может представлять собой аденовирусный вектор, снабженный лигандом 4-1BB.
Один из носителей может также представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154, а другой носитель может представлять собой аденовирусный вектор, снабженный анти-IL6 рецептором scFv.
В качестве альтернативы, один из носителей может представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154, а другой носитель может представлять собой еще одну векторную систему, снабженную лигандом 4-1BB, или один из носителей может представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154, а другой носитель может представлять собой еще одну векторную систему, снабженную анти-IL6 рецептором scFv.
Носитель может также представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154, в комбинации с белком лиганда 4-1BB, или носитель может представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154 в комбинации с антителом или scFv, блокирующим рецептор IL6, или носитель может представлять собой аденовирусный вектор, снабженный TMZ-CD154 в комбинации с антителом или scFv, блокирующим IL6.
TMZ-CD154 для применения в комбинации с терапиями, допущенными к применению в клинической практике
Нуклеотиды и белки по данному изобретению, например, TMZ-CD154, как определено в данном документе, могут также быть скомбинированы с такими видами лечения болезней, которые допущены к применению в клинической практике, как различные медикаменты, радиотерапия или хирургия.
Таким образом, нуклеотиды и белки по данному изобретению, например, TMZ-CD154, как определено в данном документе, могут быть скомбинированы, например, с:
i) допущенными к применению в клинической практике иммуномодуляторными терапиями,
ii) допущенными к применению в клинической практике терапевтическими средствами, основанными на антитело-антигене, такие как, но не ограничиваясь ими, трастузумаб (анти-Her2), ритуксимаб (анти-CD20), тоцилизумаб (анти-IL6R), ипилимумаб (анти-CTLA-4), ниволумаб (анти-PD1) и пембролизумаб (анти-PD1).
iii) допущенными к применению в клинической практике клеточными терапиями, связанными с иммунной системой, такими как, но не ограничиваясь ими, T-клеточная терапия (естественная, направленная на опухоль, такая как размноженными проникающими в опухоль лимфоцитами, или генно-инженерными, такими как CAR T-клетки или TcR генно-инженерные T-клетки), клеточные терапии NK или вакцина дендритных клеток,
iv) допущенной к применению в клинической практике T-клеточной терапией (естественными, направленными на опухоль T-клетками, такими как размноженные проникающие в опухоль лимфоциты, или генно-инженерные, такие как CAR T-клетки или TcR генно-инженерные T-клетки),
v) допущенной к применению в клинической практике клеточной терапией NK,
vi) допущенной к применению в клинической практике вакциной дендритных клеток,
vii) допущенными к применению в клинической практике вакцинами, такими как вакцины опухолевых клеток, опухолевые или вирусные антигенные пептиды или другие вирусные или бактериальные антигены, но не ограничиваясь ими,
viii) допущенными к применению в клинической практике вакцинами опухолевых клеток,
ix) допущенными к применению в клинической практике опухолевыми или вирусными антигенными пептидами,
x) допущенными к применению в клинической практике вирусными или бактериальными антигенами, такими как, но не ограничиваясь ими, пептид pp65 CMV или полноразмерный белок, бацилла Кальметта-Герена (BCG) или неметилированные нуклеотиды CpG,
xi) допущенными к применению в клинической практике иммуномодуляторами, включая в себя, но, не ограничиваясь ими, имиквимод, интерфероны (такие как человеческий лейкоцитарный интерферон-γ (IFN-γ), IFN-α), интерлейкины/цитокины (такие как IL2) и факторы роста (такие как GM-CSF),
xii) допущенными к применению в клинической практике противораковыми терапевтическими средствами, включая в себя алкилирующие агенты, антиметаболиты, агенты, оказывающий воздействие на микротрубочки, ингибиторы топоизомеразы и цитотоксические антибиотики,
xiii) допущенной к применению в клинической практике химиотерапией рака, такой как, но не ограничиваясь ими, алкилирующие агенты, включая в себя хлорметин, бендамустин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид, бусульфан, N-нитрозо-N-метилмочевина, кармустин, ломустин, семустин, фотемустин, стрпетозотоцин, дакарбазин, метазоламид, темозоламид, тиотепа, митомицин, диазиквон, цисплатин, карбоплатин,оксаплатин, прокарбоксин и гексаметилмеламин,
xiv) циклофосфамидом,
xv) бендамустином,
xvi) темозоломидом,
xvii) цисплатином, карбоплатином или оксалиплатином,
xviii) допущенной к применению в клинической практике химиотерапией рака, такой как, но не ограничиваясь ими, антиметаболитами, такими как антифолаты, фторпиримидины, аналоги дезоксинуклеозидов и тиопурины,
xix) антифолатами, такими как метотрексат или пеметрексед,
xx) фторпиримидином, таком как фторурацил или капецитабин,
xxi) аналогом дезоксинуклеозидов, таким как цитарабин, гемцитабин, децитабин, вайдаза (азацитидин), флударабин, неларабин, кладрибин, клофарабин или пентостатин,
xxii) гемцитабином,
xxiii) тиопурином, такой как тиогуанин или меркаптопурин,
xxiv) допущенной к применению в клинической практике химиотерапией рака, такой как, но не ограничиваясь ею, агентами, оказывающими воздействие на микротрубочки, такими как алкалоиды барвинка, таксаны или другие лекарственные препараты, которые блокируют образование микротрубочек или стабилизируют микротрубочки,
xxv) винкристином, винбластином, винорелбином, виндезином или винфлюнином,
xxvi) паклитакселом или доцетакселом,
xxv) этопозидом, тенипозидом или другим агентом, который блокирует формирование микротрубочек или который стабилизирует микротрубочки,
xxvi) допущенной к применению в клинической практике химиотерапией рака, такой как, но не ограничиваясь ею, ингибиторами топоизомеразы,
xxvii) иринотеканом, топотеканом или камптотецином,
xxviii) допущенной к применению в клинической практике химиотерапией рака, такой как, но не ограничиваясь ею, цитотоксическими антибиотиками,
xxix) доксорубицином, даунорубицином, пирарубицином, акларубицином, митоксантроном,
xxx) допущенными к применению в клинической практике терапиями рака, включая в себя радиотерапию, такую как наружная дистанционная лучевая терапия, близкофокусная лучевая терапия и радиоизотопная терапия,
xxxi) наружной дистанционной лучевой терапией, такой как общепринятая наружная дистанционная лучевая терапия, стереотаксическое облучение, виртуальная имитация, трехмерная конформная лучевая терапия/лучевая терапия с модулированной интенсивностью, лучевая терапия заряженными частицами и терапия Оже,
xxxii) близкофокусной лучевой терапией,
xxxiii) радиоизотопной терапией,
xxxiv) допущенными к применению в клинической практике терапиями рака, включая в себя ингибиторы ангиогенеза,
xxxv) бевацизумабом или афиберцептом,
xxxvi) допущенными к применению в клинической практике терапиями рака, включая в себя ингибиторы [сигнальных] путей,
xxxvii) ингибиторами EGFR, RET, мутированного BRAF, тирозин киназ, mTOR, Hedgehog, Smo, PI3K, MEK, AKT, RAF, Rac1, PARP, PIM, cMET, STAT3, JAK2, p38MAPK, NOTCH, BCL-2, IAP, p53, GSK2, Chk1, CDK4/6, PDGFR, IGF-1R, DKK1, CF-1R или TWEAK:Fn14,
xxxviii) ингибиторами мутировавшего BRAF, включая в себя V600E, такой как вемурафениб,
xxxix) ингибиторами тирозин киназ, такими как, но не ограничиваясь ими, иматиниб, дазатиниб, нилотиниб и сунитиниб,
xxxx) ингибиторами STAT3,
xxxxi) ингибиторами Rac-1,
xxxxii) ингибиторами BCL-2,
xxxxiii) ингибиторами ингибиторов апоптоза, такими как, но не ограничиваясь ими, ABT-737 или навитоклакс,
xxxxv) допущенными к применению в клинической практике противовирусными терапевтическими средствами,
xxxxvi) допущенными к применению в клинической практике противовирусными средствами, включая в себя, но не ограничиваясь ими, абакавир, ацикловир (acyclovir), ацикловир (acyclovir), адефовир, атазанавир, боцепревир, цидофовир, дарунавир, делавирдин, эфавиренз, энтекавир, фоскарнет, ганцикловир, ламивудин, оселтамивир, валакловир, валганцикловир,
xxxxvii) ацикловиром (acyclovir), ацикловиром (acyclovir), фоскарнетом, ганцикловиром или валганцикловиром,
xxxxviii) фоскарнетом, ганциуловиром и валганцикловиром.
Пути введения
В принципе, любые пути введения могут быть использованы, при условии, если достигнут ожидаемый эффект. В целом, предполагается парентеральное введение.
.
Таким образом, нуклеотидная последовательность по данному изобретению может быть введена путем парентерального введения, таким как внутривенная инъекция, чрескожная инъекция, инъекция непосредственно в пораженный болезнью орган или ткань, или внутриопухолевая инъекция. В последнем случае введение может иметь место путем инъекции в опухоль под визуальным контролем
Фармацевтические композиции
Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям для использования в лечении заболеваний, связанных с иммунитетом, таких как рак и инфекционные заболевания. Примеры таких заболеваний приведены в данном документе. Фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит TMZ-CD154, как определено в данном документе, в генетическом носителе, как определено в данном документе.
♣
Композиция может быть построена для перорального, парентерального введения или через слизистую. Таким образом, введение может быть пероральным, подъязычным, аппликацией на слизистую рта или может быть внутривенным, подкожным, внутримышечным, интраперитонеальным, интратекальным, внутриопухолевым и т.д., или оно может быть нанесением на кожу или поверхность слизистой, включая в себя слизистую глаз, рта, носа, влагалища и прямой кишки. Однако, предполагается, что парентеральный путь введения является наиболее эффективным, в частности инъекция непосредственно в область, пораженную заболеванием, такая как инъекция непосредственно в опухоль или в метастаз.
Композиция может иметь твердую, полутвердую или жидкую форму.
Подходящие твердые композиции включают порошки, гранулы, пеллеты, капсулы, таблетки (включая в себя таблетки с покрытием), порошки для приготовления раствора, принимаемого внутрь, импланты, устройства для доставки лекарственных средств, пленки и т.д.
Подходящие полутвердые композиции включают гели, пасты, кремы, мази, вагинальные свечи, суппозитории и т.д.
Подходящие жидкие или текучие композиции включают растворы, взвеси, эмульсии, суспензии, лосьоны, спреи, аэрозоли.
Фармацевтические композиции, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или взвеси. Они могут также иметь жидкую форму, которая отвердевает при локальном введении, например, в опухоль. Она также может иметь форму импланта, вставки или устройства для доставки [лекарственного средства].
Для парентерального применения композиция может иметь, например, жидкую форму, содержащую TMZ-CD154 на генетическом носителе в растворителе или дисперсионной среде, такой как вода, этанол, пропиленгликоль, изопропанол, глицерин, растительное масло, как, например, кунжутное масло, арахисовое масло или подобное. Могут быть добавлены дополнительные вещества, как, например, буферные агенты, агенты, регулирующие рН, солюбилизирующие агенты, стабилизирующие агенты, консерванты и т.д. Далее, она может содержать наполнители, которые фармацевтически приемлемы для инъецируемых композиций. Это могут быть, в частности, изотонические, стерильные солевые растворы (фосфата, хлористого натрия) или сухие, особенно - лиофилизированные композиции, которые при добавлении, в зависимости от случая, стерильной воды или физиологического раствора или другого растворителя или дисперсионной среды восстанавливаются до готовой к использованию композиции.
Предпочтительно такие добавки могут быть растворены в растворителе. Чтобы улучшить стабильность, композиция может быть заморожена после заполнения во флакон, а вода устранена под вакуумом. Высушенный лиофилизированный порошок затем запечатывают во флаконе, а дополнительный флакон с водой для инъекции может быть поставлен для восстановления жидкости перед применением.
Композиция может также быть представлена как замороженная композиция, которая размораживается перед терапией. Это может быть, например, композиция, содержащая вирусный вектор. Такая композиция может быть использована как таковая или могут быть внесены добавки, такие как водная среда, содержащая, например, буферные вещества, агенты, регулирующие рН, агенты, устанавливающие тоничность и т.д.
Композиции может для удобства быть представлена в виде единичных лекарственных форм и может быть изготовлена каким-либо из способов, известных в области фармации. Такие способы включают в себя стадию ассоциации активной молекулы (TMZ-CD154, связанной с носителем) с носителем, который образован из одного или более вспомогательных ингредиентов. В целом, композиции готовят стандартным образом и тщательно проводят ассоциацию активного ингредиента с жидкими носителями или мелкодисперсными твердыми носителями или теми и другими, а затем, если необходимо, придают продукту нужную форму.
Как упоминалось выше, нуклеотидная последовательность или белок по данному изобретению, например, TMZ-CD154, содержащиеся в генетическом носителе, могут быть введены перорально в форме фармацевтической композиции. В зависимости от заболевания и подвергающегося лечению пациента, а также пути введения, композиции могут быть введены в варьирующих дозах.
Например, соединения по данному изобретению могут быть введены перорально, трансбуккально или подъязычно в форме таблеток, капсул, суппозиториев, элексиров, растворов или суспензий, которые могут содержать вкусовые или красящие агенты для немедленного, отсроченного или контролируемого нанесения.
Такие таблетки могут содержать наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двузамещенный фосфат кальция и глицин, разрыхлители, такие как крахмал (предпочтительно, кукурузный, картофельный или маниоковый крахмал), гликоляткрахмал натрия, кроскармеллоза натрия и определенные комплексные силикаты, и связующие гранулирования, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), гидроксипропилцеллюлоза (HPC), сахароза, желатин и гуммиарабик. Дополнительно, могут быть включены смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерил бегенат и тальк.
Твердые композиции сходного типа могут также быть применены как заполнение желатиновых капсул. Предпочтительные наполнители в этом отношении включают в себя лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Для водных суспензий и (или) элексиров соединения по данному изобретению могут быть скомбинированы с различными подсластителями или вкусовыми агентами, окрашивающим материалом или красителями, с эмульгирующими и (или) суспендирующими агентами и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, и их комбинации.
Таблетки могут быть изготовлены путем прессования или формовки, если требуется - с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены прессованием в подходящей машине активного ингредиента в текучем состоянии, таком как порошок или гранулы, если требуется, смешанным со связующим веществом (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметил целлюлозой), смазкой, инертным разбавителем, консервантом, разрыхлителем (например, гликоляткрахмалом натрия, поперечно-сшитым повидоном, поперечно-сшитой карбоксиметилцеллюлозой), поверхностно активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены формовкой в соответствующей машине смеси порошкообразного соединения, увлаженного инертным жидком разбавителем. Таблетки могут быть, если требуется, покрыты или иметь риску, и могут быть изготовлены так, чтобы обеспечить медленное или контролируемое выделение активного ингредиента на месте с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в варьирующих пропорциях для обеспечения желаемого профиля выделения.
Композиции для применения в соответствии с данным изобретением, подходящие для перорального введения, могут быть представлены как отдельные единицы, такие как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или в неводной жидкой эмульсии или в жидкой эмульсии «вода в масле». Активный ингредиент может также быть представлен в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.
Следует понимать, что в дополнение к ингредиентами, конкретно упомянутым выше, формы по данному изобретению могут включать в себя другие агенты, общепринятые в данной области техники, имеющей отношение к типу форм, о которых идет речь, например, таковые, пригодные для перорального введения, могут включать в себя вкусовые агенты.
Как показано в примерах в данном документе, нуклеотидная последовательность по данному изобретению может быть использована в композиции, которая имеет форму водной композиции, в которой водная среда представляет собой физиологически приемлемую среду, обычно используемую для инъекций. Такая водная среда может представлять собой 0,9% хлористый натрий, раствор Рингера или Трис/глицериновый буферный раствор.
Когда TMZ-CD154 доставляется через вирус (такой как представлен в примерах в данном документе), вирус, содержащий нуклеотид по данному изобретению, может быть очищен ультрацентрифугированием (с помощью, например, хлористого цезия), и сконцентрированный вирус диализуется в трис/глицериновый буферный раствор (содержащий 20 мМ Триса, 25 мМ хлористого натрия, 2,5% вес/объем глицерина, pH установлен на pH 8,0). Таким образом, нуклеотид вводится в буфере и, если требуется, буфер может быть разбавлен таким же трис/глицериновым буферным раствором или подходящим раствором для введения in vivo, например, одним или другим из растворов, упомянутых выше.
th
Специалисты в данной области техники могут изготовить композицию, которая пригодна для применения в соответствии с данным изобретением, основываясь на его раскрытии в данном документе и (или) на основе руководства Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed,. Mack Publishing Company, 1990 или более поздних редакций.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может также содержать TMZ-CD154 в комбинации с одним или более иммуномодуляторами, упомянутыми в данному документе или в комбинации с одним или более других терапевтических активных агентов, упомянутых в данном документе. Такая композиция может либо содержать все активные элементы в той же самой форме (например, в форме единой дозы, в которой единая доза содержит все активные молекулы), либо она может иметь форму упаковки, содержащей набор форм, каждая из которых содержит одну или более активных молекул (например, в форме упаковки, содержащей две различных формы, одна из которых содержит TMZ-CD154 на носителе, а другая содержит другую активную молекулу; или в форме упаковки, содержащей, например, две различные формы, одна из которых содержит TMZ-CD154 на носителе и иммуномодулятор, а другая содержит другую активную молекулу).
Дозировка вводимой молекулы TMZ-CD154 варьирует в соответствии с конкретной молекулой, носителем, содержащим молекулу, заболевания, которое подвергается лечению, объекта, и природы и жестокости заболевания, а также физического состояния объекта и избранного пути введения [лекарства].
Подходящая дозировка может быть легко определена специалистом в данной области техники.
6
14
9
13
Композиции могут содержать от 0,1% по весу, предпочтительно - от 5-95%, более предпочтительно - от 10-60% по весу соединения по данному изобретению, в зависимости от способа введения и формы TMZ-CD154 (например, использования его как белка или как генной терапии). Аденовирусные векторы могут иметь концентрации в диапазоне от 1×10 до 1×10 вирусных частиц на мл. Предлагаемая доза для лечения может предпочтительно быть в диапазоне от 1×10 до 1×10 вирусных частиц на мл при введении путем внутриопухолевой инъекции или внутривенного вливания.
Специалистам в данной области техники понятно, что оптимальное количество и промежутки между индивидуальными дозами соединения по данному изобретению определяются природой и глубиной состояния, подвергающегося лечению, формой, путем и местом введения, а также возрастом и состоянием конкретного объекта, подвергающегося лечению, и тем, что медик должен окончательно определить подходящую дозировку, которая должна быть использована. Эта дозировка может быть повторена настолько часто, насколько это уместно. Если развиваются побочные эффекты, количество и (или) частота дозировок может быть изменено или уменьшено в соответствии с обычной клинической практикой.
Ниже иллюстрируется применение TMZ-CD40L в медицине, в частности, в иммунотерапии рака.
Иммунотерапия рака
Иммунология опухолей и иммунотерапия рака
Иммунная система может распознать и уничтожить клетки опухоли теми же механизмами, которыми распознает и уничтожает вирусно инфицированные клетки, чтобы уберечь организм-хозяин от летальных инфекций. Как и вирусно инфицированные клетки, клетки опухоли являются аутологическими клетками, и ассоциированные с вирусами или опухолями эпитопы представлены в главном комплексе гистосовместимости I (MHC-I) на клетках для CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов (CTLs). И вирусно инфицированные клетки, и опухолевые клетки могут предупреждать распознавание CTL за счет понижающего регулирования молекул MHC, делающих клетки мишенями для натуральных клеток-киллеров (NK). Однако, вирусы первоначально активируют врожденный ответ иммунной защиты, активирующий антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки (DCs), чтобы активировать противовирусный иммунитет, тогда как опухолевые клетки не индуцируют такой же степени стимуляции. Действительно, в ходе развития раковая опухоль и ее строма продуцируют вещества, которые ингибируют иммунные клетки. Опухолевый иммунитет ограничен блокадой созревания DC и запуска дифференцировки и привлечения иммуносупрессорных клеток в окружении опухоли. Эти супрессорные клетки обычно представляют собой макрофаги М2, множество незрелых миелоидных клеток, объединяемых под названием миелоидные супрессорные клетки (MDSCs) и T-регуляторные клетки (Tregs). Такие клетки продуцируют супрессорный цитокин и факторы роста, такие как IL10, TGFβ, простагландин 2, аргиназа I и миелоидная пероксидаза. В окружении опухоли активированные CTLs быстро подавляются этими факторами и становятся клетками с подавленным иммунитетом, входят в состояние иммунологической неотвечаемости или погибают.
Суть иммунотерапии рака состоит в нарушении толерантности опухоли (например, нарушение подавления иммунитета) и реверсии возникающих иммунных ответов типа 2 в иммунные ответы типа 1. Тип 1 характеризуется активацией T-хелпер 1 (Th1) лимфоцитов, CTLs, клеток NK и макрофагов М, так же как пула цитокинов, таких как IFNγ, IL12, IL21 и TNF.
Недавний успех в блокаде иммунных контрольных точек CTLA4 и PD1/PDL1 для меланомы и других солидных злокачественных опухолей, так же как химерных антиген-рецепторов (CAR) T-клеток для B-клеток злокачественных опухолей значительно усилит иммунотерапию рака. Исследуются новые концепции лечения рака стимуляцией иммунной системы. Одна из этих концепций - это иммуностимуляторная генная терапия, использующая онколитические вирусы как носители доставляемых генов.
Иммуностимуляторная генная терапия
Иммуностимуляторная генная терапия направлена на перенос генов, кодирующих иммуностимуляторные белки в область опухоли. Первые исследования с применением иммуностимуляторной генной терапии на экспериментальных моделях были опубликованы в конце 90-х голов (ХХ века) с многообещающими результатами. Были использованы различные подходы в клинических испытаниях, но многие из них не показали эффективности. Однако, эти исследования были выполнены до того, как были расширены знания о супрессорных иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль, и о возможности поддержать иммунные ответы с использованием прекондиционирования или поддерживающей химиотерапии, которые уменьшают уровень этих иммуносупрессорных клеток. Далее, ответы на иммунотерапию протекают иначе по сравнению с традиционной химиотерапией или облучением. Первоначальное увеличение опухоли вследствие воспаления может быть ошибочно интерпретировано как ее развитие, что приводит к преждевременному прекращению лечения. Комбинация прекондиционирования/поддерживающей химиотерапии вместе с осведомленностью о том, как следует интерпретировать данные, вероятно проложит путь иммуностимуляторной генной терапии, такой же, как для других [видов] иммунотерапий. По сравнению с системной доставкой растворимых иммуностимуляторных цитокинов, факторов роста и антител, генная терапия может доставлять в различные места в течение дней - до недели экспрессируемые иммуностимуляторные трансгены в зависимости от используемого вектора. Это приводит к высокой концентрации иммуностимуляторных белков в опухоли, уменьшая токсичность благодаря отсутствию необходимости устранения толерантности к аутологическим клеткам, которую можно наблюдать при системной иммунной активации.
Терапевтические иммуностимуляторные гены доставляются к опухоли с использованием огромного разнообразия носителей. Обычно использовались дефектные по репликации аденовирусы, поскольку они в состоянии нести большие наборы трансгенов. К сожалению, экспрессия трансгена имеет ограниченную длительность, поскольку аденовирусы не интегрируются в геном клетки-хозяина. Отсутствие интеграции повышает безопасность, поскольку риск мутагенеза клетки-хозяина не вероятен. Далее, люди хорошо адаптированы, чтобы справляться с аденовирусными инфекциями. Например, большинство индивидов имело аденовирусные инфекции верхних дыхательных путей и наработало антитела против нескольких серотипов, и T-клетки кросс-реактивны на все [серотипы]. Для иммуностимуляторной генной терапии иммуностимуляторный эффект вируса может подкрепить формирование противоопухолевых ответов путем активации TLRs на опухолевые нагруженные антигеном DCs. Тем не менее, при внутриопухолевой доставке, вирус инфицирует клетки по ходу иглы, и существует необходимость в увеличении вирусной инфекции для продления экспрессии трансгена. Этого можно достичь путем применения онколитических вирусов, например, в качестве носителей доставки генов.
Онколитическая вирусная (OV) терапия
Способность определенных вирусов инфицировать клетки, размножаться и убивать их путем лизиса в ходе выделения новых вирионов означает, что она может быть использована в качестве терапии рака. Чтобы ограничить онколизис опухолевыми клетками, экспрессия вирусных реплицируемых генов ограничена добавлением промоторов, которые предпочтительно активны в опухоли. Для максимальной эффективности OVs должны инфицировать все клетки опухоли, что может быть затруднительно, если опухоль метастазировала. Поскольку системное распространение вируса в дистальную опухоль может быть ограничено иммунной системой, были сделаны попытки разработать менее иммуногенные OVs.
Вместо снижения иммуногенности OVs, другой подход состоит в применении и усилении естественных иммуностимулирующих способностей вируса путем добавления иммуностимуляторных генов в геном OV. Онколитические аденовирусы, снабженные иммуностимуляторными трансгенами, успешно доставляют их в опухоль и придают системный противоопухолевый иммунный ответ, активный против метастатического процесса. Полную эффективность комбинированного онколизиса и иммунной стимуляции трудно определить на моделях мышей, поскольку в клетках мышей онколизис ограничен, и иммуностимуляторный эффект не может быть оценен на моделях ксенотрансплантата на иммунодефицитных мышах. Имеется, по меньшей мере, одно опубликованное исследование с использованием онколитического аденовируса, несущего полноразмерный ген CD40L человека, на пациентах с терминальной стадией рака, продемонстрировавшее практическую осуществимость и безопасность. Существует другое исследование находящегося в процессе разработки использования онколитических вирусов, снабженных GM-CSF, и вируса герпеса (herpes simplex), снабженного GM-CSF (talimogene laherparepvec), которые завершили Фазу III предрегистрационного исследования на пациентах, страдающих меланомой.
Прекондиционирование и поддерживающая химиотерапия
Прекондиционирование или поддерживающая химиотерапия часто даются пациентам, получающим иммунотерапию, чтобы уменьшить ингибиторные клетки стромы опухоли, такие как Tregs и MDSCs, которые в противном случае могут препятствовать предполагаемой иммунной активации. Далее, лимфоциты, индуцированные химиотерапией, или истощение миелоидных клеток могут индуцировать продукцию цитокинов костного мозга, что восстанавливает популяцию иммунных клеток (т.е. путем гомеостатической репликации), и способствует активации противоопухолевых ответов. В зависимости от диагноза и типа химиотерапии также может быть затронут рост опухоли. Метрономная терапия циклофосфамидом давалась пациентам, проходящим иммунотерапию, в попытке контролировать супрессорные иммунные клетки. Такие протоколы поддерживающей химиотерапии могут иметь большое значение, если они не препятствуют желательным противоопухолевым ответам. Одной из таких поддерживающих химиотерапий, представляющих интерес, может быть таковая гемцитабином.
Гемцитабин представляет собой нуклеозидный аналог, который замещает цитидин при репликации ДНК, и приводит к остановке роста и апоптозу. Гемцитабин также влияет на рибонуклеотидредуктазу, блокируя, таким образом, функцию этого фермента. В настоящее время это - стандарт лечения рака поджелудочной железы и как вспомогательное лечение после хирургического, и как самостоятельное лечение опухолей на поздних стадиях. Хотя лечение гемцитабином метастазирующих опухолей на поздних стадиях является только паллиативным, несколько исследований, включая в себя собственное исследование авторов данного изобретения, показали, что пациенты, леченные гемцитабином, имели существенно более низкий уровень иммуносупрессорной молекулы TGFβ, Tregs и MDSCs, но увеличенное количество DCs, моноцитов и активированных T-клеток. Недавно было показано, что гемцитабин уменьшает накопление MDSC в опухоли и ускоряет развитие противоопухолевых ответов T-клеток, которые способствуют комбинированной терапии онколитическим реовирусом. У мышей гемцитабин уменьшает MDSCs и усиливает эффективность иммунотерапии.
Следовательно, комбинация стандартного лечения гемцитабином с иммунотерапией может быть полезным для таких пациентов.
Исследуемый препарат LOAd703, содержащий TMZ-CD40L
LOAd703 представляет собой новую иммунотерапию рака. Это - онколитический аденовирус серотипа 5 с файбер-протеином (ножка и глобулярное утолщение) серотипа 35 (Ad5/35) для увеличения связывания с клетками и, таким образом, его инфекционности. Репликация вируса и онколизис ограничены клетками с дисфункциональным путем ретинобластомы (Rb), благодаря E1Ad24 и множественным E2F доменам связывания, расположенным против хода транскрипции от E1A. Rb в нормальных клетках связывается с транскрипционным фактором E2F, и таким образом блокирует присущую ему способность индуцировать транскрипцию генов, которые активируют переход от стадии G1 на стадию S клеточного цикла. После фосфорилирования Rb, E2F выделяется, чтобы стимулировать клеточную пролиферацию. Опухоли человека имеют широкий спектр мутаций, которые изменяют Rb белок и (или) факторы, которые ведут к гиперфосфорилированию Rb. Следовательно, в раковых клетках E2F может запускать транскрипцию вируса. Вирус инфицирует и убивает опухолевые клетки через онколизис благодаря избыточной репликации вируса, тогда как здоровые немалигнизированные клетки могут быть инфицированы, но в них не продуцируется новых вирусных частиц. Поэтому LOAd703 не убивает здоровые клетки. LOAd703 имеет трансгенный набор с двумя иммуностимуляторными генами (TMZ-CD40L и 4-1BBL), управляемыми промотором CMV. Промотор CMV не ограничен тканью, и иммуностимуляторные гены могут быть экспрессированы во всех клетках, которые инфицированы LOAd703. Следовательно, LOAd703 направлен и на опухоль, и на ее строму. Поскольку вирус вводится внутриопухолевой инъекцией, экспрессия трансгенов локализована в области опухоли.
Схема генного конструкта
Репликация LOAd703 контролируется через E1AΔ24, который ограничивает репликацию вируса в клетках с поврежденным (гиперфосфорилированным) белком ретинобластомы, обычно наблюдающихся в злокачественных клетках. Далее, участок промотора E2F и сайт Sp-1 были встроены перед E1A. Такие ограничения репликации приводят к промотированию репликации вируса в опухолевых клетках и, в конечном счете, приводят опухоль к онколизису и гибели. Вирусы LOAd703 могут инфицировать нормальные клетки, но ни реплицируются в нормальных клетках, ни убивают их. Дальнейшие модификации включают в себя делеции 6,7K и gp19K в участке E3. 6,7K ингибирует TRAIL рецептор 1 и 2 в клетках, тогда как gp19K улавливает MHC в эндоплазматическом ретикулуме (ER). Вместе эти два фактора уменьшают способность T-клеток к распознаванию и уничтожению клеток, инфицированных вирусом. Поскольку цель LOAd703 состоит в усилении иммуногенности, эти участки были удалены из генома аденовируса. Участок ножки и глобулярного наконечника (shaft и knob) файбер-протеина серотипа 5, расположенный в участке L5, был изменен на участок ножки и глобулярного наконечника серотипа 35 вируса, что усиливает трансдукцию вируса, поскольку файбер-протеин 35 связывается с рецептором CD46, избыточно экспрессирующимся и на нормальных, и на злокачественных клетках человека, тогда как файбер-протеин Ad5 ограничен клетками, позитивными по аденовирусному рецептору Коксаки. После участка L5 был встроен набор трансгенов с генами TMZ-CD40L и 4-1BBL, управляемыми промотором цитомегаловируса (pCMV). После инфицирования клеток вирус LOAd703, следовательно, индуцирует экспрессию TMZ-CD40L и 4-1BBL. Экспрессия управляется промотором CMV и не зависит от репликации вируса. Какая-либо клетка, инфицированная в опухоли, после внутриопухолевой инъекции может экспрессировать трансгены.
int/low
high
Трансген TMZ-CD40L представляет собой модифицированный лиганд CD40 человека (CD40L; CD154), у которого отсутствует внутриклеточный сигнальный домен, а вместо него присоединены внеклеточный и трансмембранный домены с доменом изолейциновой «молнии». Это создает мембранно-связанную тримеризованную молекулу CD40L, у которой отсутствует внутриклеточная сигнализация в клетках, экспрессирующих TMZ-CD40L, но все еще связывается и передает сигналы другим клеткам, которые экспрессируют его рецептор CD40. CD40L в норме экспрессируется на многих типах клеток в патологических условиях, т.е. когда клетки находятся в состоянии напряжения или активированы. Стимуляция CD40L клеток CD40+ приводит к различным действиям, в зависимости от идентификации CD40+ клеток. Незрелые DCs экспрессируют CD40, и после CD40L-стимуляции DCs дифференцируются в зрелый фенотип, который экспрессирует повышенный уровень молекул комплекса тканевой совместимости (MHC), костимулирующих молекул и цитокинов. Такие зрелые DCs являются превосходными стимуляторами T-клеток (Th1 и CTLs), NK-клеток и M1 макрофагов. CD40+ эндотелиальные клетки усиливают экспрессию молекул, важных для присоединения T-клетки, и диапедез, промотирующий рекрутинг T-клеток. Однако CD40+ опухолевые клетки имеют нарушенный внутриклеточный сигнальный путь CD40, и после стимуляции CD40L рост большинства опухолевых клеток ингибируется, и они входят в апоптоз. Далее, CD40L-опосредованная сигнализация в микроокружении опухоли может косвенно уменьшать уровень Tregs у пациентов с раком мочевого пузыря, леченных генной терапией CD40L (AdCD40L). На моделях мышей популяция миелоидных клеток сдвигается с супрессорных CD11b+Gr1и M2 клеток к CD11b+Gr1 и M1 миелоидным клеткам.
in vitro
in vivo
Трансген лиганда 4-1BB (4-1BBL; CD137L) представляет собой полноразмерный ген 4-1BBL человека. Он связывается с его рецептором 4-1BB (CD137), экспрессирующимся на активированных T-клетках и NK-клетках. Стимуляция 4-1BBL T-клеток и NK-клеток защищает клетки от индуцированной активацией клеточной смерти (AICD) через активацию ингибиторов апоптоза, таких как BCL-xL. Стимуляция 4-1BBL также промотирует эффективную пролиферацию лимфоцитов. 41BBL является хорошим стимулятором  и CTLs, и NK-клеток, но для эффективности на моделях опухоли комбинация 41BBL с другими иммунными энхансерами кажется ключевой. Комбинация стимуляции CD40L и 4-1BBL, так же как и стимуляция каркасом аденовируса Toll-подобных рецепторов (TLRs), значительно стимулирует DCs, T-клетки и NK-клетки в предклинических экспериментальных условиях авторов данного изобретения, описанных ниже.
Таким образом, LOAd703 экспрессирует CD40L и 4-1BBL, и, следовательно, имеет два главных эффекторных механизма: 1) индукцию клеточной смерти через либо онколизис, либо CD40-опосредованный апоптоз, и 2) активацию иммунной системы через CD40L, 41BBL и каркас аденовируса. Основным эффекторным средством, вероятно, является иммунная активация, но индукция клеточной смерти онколизисом дополнительно усиливает противоопухолевые ответы благодаря выделению опухолевых антигенов, приводящие к опухолевой антиген-специфичной иммунной стимуляции.
Сокращения
aCTLA4
антиген 4 антицитотоксического Т-лимфоцита
Ad
Аденовирус
AICD
Клеточная смерть, индуцируемая активацией
CD
кластер дифференцировки
CD40L
Лиганд CD40, CD154
CMV
Цитомегаловирус
CTL
Цитотоксический T-лимфоцит
DC
Дендритная клетка
GM-CSF
гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор
IFNg
γ-интерферон
IL
Интерлейкин
LOAd
Онколитический аденовирус (фирмы) Lokon
MDSC
Супрессорная клетка миелоидного происхождения
NK
Натуральный киллер
PCR
Полимеразная цепная реакция
PDAC
протоковая аденокарцинома поджелудочной железы
PD1
Рецептор программируемой смерти 1
PDL1
Лиганд рецептора 1 программируемой смерти
Rb
Ретинобластома
TCR
Рецептор T-клетки
TGFb
Трансформирующий ростовой фактор β
Th
T-хелпер
TLR
толл-подобный рецептор
TMZ-CD40L
Тримеризованный мембранно-связанный CD40L
TNFa
Фактор некроза опухолей α
Treg
T-регуляторная клетка
VP
Вирусные частицы
4-1BBL
лиганд 4-1BB, лиганд CD137
Определения
Ad5/35: термин «Ad5/35» означает аденовирусный вектор онколитического серотипа 5, в котором ножка и глобулярный наконечник выроста принадлежат Ad серотипу 35.
Антиген: термин «антиген» представляет собой мишень, которую распознают T-клетки через рецептор T-клеток, химерный рецептор антигена или их эквивалент.
кДНК: термин «кДНК» означает молекулу ДНК, которая может быть изготовлена обратной транскрипцией из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из клетки. В кДНК отсутствуют интронные последовательности, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный транскрипт РНК представляет собой предшественник мРНК, который процессируется в ходе серии стадий, включая в себя сплайсинг, перед возникновением зрелой сплайсированной мРНК.
Кодирующая последовательность: термин «кодирующая последовательность» означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность TMZ-CD154 или ее вариант. Границы кодирующей последовательности в целом определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может быть геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или их комбинацией.
Экспрессия: термин «экспрессия» включает какую-либо стадию, вовлеченную в продукцию TMZ-CD154, включая в себя, но, не ограничиваясь этим, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.
Клетка-хозяин: термин «клетка-хозяин» означает какой-либо тип клетки, который допускает трансформацию, трансфекцию, трансдукцию или подобное для конструкта нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид, как описано в данном документе.
Функционально связанный: термин « функционально связанный» означает конфигурацию, в которой контролирующая последовательность помещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида, так что контролирующая последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.
Начало репликации: термин «начало репликации» означает конкретную последовательность в геноме, с которой инициируется репликация. Это может вовлекать репликацию ДНК в живых организмах, таких как прокариоты и эукариоты, или таковой ДНК или РНК в вирусах, таких как вирусы с двухцепочечной РНК.
Компетентный по репликации вирусный вектор: термин «компетентный по репликации вирусный вектор» означает вирус, который способен к репликации собственными средствами в какой-либо клетке, которую он инфицировал или в клетках специфического происхождения.
Дефектный по репликации вирусный вектор: термин ʺдефектный по репликации вирусный векторʺ означает вирус, который не способен к репликации собственными средствами вследствие делеции генов, вовлеченных в репликацию вируса.
Идентичность последовательности: термин «идентичность последовательности» означает связь между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями. Алгоритмы для сравнения нуклеотидов: blastn, megablst, discontiguous megablast. Алгоритмы для сравнения белков: blastp, psi-blast, phi-blast, delta-blast.
Вирусный вектор: термин «вирусный вектор» означает инструмент доставки генетического материала в клетки.
The термин «содержащий» следует понимать в широком смысле, как охватывающий термины «содержащий», «состоящий из», а в связи с молекулярной структурой, структура может соответствовать приведенным иллюстрациям, т.е. не иметь каких-либо других элементов.
Подписи к чертежам
Фиг. 1: A) Схема, демонстрирующая молекулу TMZ-CD154. B) Схема, демонстрирующая тримеризованную молекулу TMZ-CD154 на плазматической мембране (PM) клетки с или без взаимодействия с рецептором CD40 на соседней клетке-мишени.
Фиг. 2: клетки 293 были трансфецированы плазмидой, содержащей TMZ-CD154, или контрольной («пустой») плазмидой. A) Через два дня культивирования клетки были лизированы, и белковая суспензия анализировалась гель-электрофорезом и вестерн-блоттингом, чтобы детектировать TMZ-CD154. Образцы разделяли на две группы, из которых первую группу кипятили в ослабляющем буфере для образца (R), а другую не кипятили и смешивали с неослабляющим буфером для образца перед гель-электрофорезом. B) Через два дня культивирования часть клеток анализировали проточной цитометрией, чтобы продемонстрировать экспрессию TMZ-CD154. C) Супернатанты клеток Panc01, BxPc3, MiaPaca2 и PaCa3, трансдуцированных вирусом Ad5/35, экспрессирующим TMZ-CD154, CD154 дикого типа или без трансгенов (Mock) были проанализированы на выделение CD154 в супернатанты с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). D) Аденовирус серотипа 5/35 был использован для трансдукции T-клеток молекулой TMZ-CD154. Контроли не были трандуцированы или были трансдуцированы пустым (Mock) вирусом. Клетки культивировались в течение 48 часов с или без IL2.
Фиг. 3:Дендритные клетки (A) и клетки MiaPaCa2 (B) были трансдуцированы 100 MOI вируса Ad5/35-TMZ-CD154 (красная линия), вирусом Mock (зеленая линия) или были оставлены нетрансдуцированными (серая линия). DCs были трансдуцированы двумя версиями вируса Ad5/35-TMZ-CD154, комбинированного с 4-1BBL (оранжевая линия) или scFv aIL6R (синяя линия). Через 24 часа клетки анализировались на экспрессию TMZ-CD154 проточной цитометрией. Нетрансдуцированные или Mock-трансдуцированные [клетки] не экспрессировали TMZ-CD154, тогда как клетки, трансдуцированные Ad5/35-TMZ-CD154, демонстрировали сильную экспрессию, которая была выражена более сильно в опухолевых клетках по сравнению с DCs.
Фиг. 4: Клеточные линии раковой опухоли поджелудочной железы были трансдуцированы условно компетентным по репликации (онколитическим) вирусом Ad5/35-TMZ-CD154 (CRC), онколитическим вирусом Mock (CRC), дефектным по репликации вирусом Mock (RD) или оставлены нетрансдуцированными. Трансдуцированные клетки были высеяны в 96-гнездный планшет и проанализированы на выживаемость с помощью анализа жизнеспособности клеток MTS, чтобы определить уровень клеточной смерти по онколизису: A) Panc01, B) MiaPaCa2 или C) BxPC3. D) Такой же анализ был выполнен на клеточной линии лимфомы (Karpas 422).
Фиг. 5: Незрелые дендритные клетки были культивированы совместно с клетками 293, трансфецированными TMZ-CD154, растворимым тримеризованным (st) CD154 (CD40L), мультимерным растворимым CD154 (CD40L) или Mock плазмидами, или оставлены нетрансфецированными. Через два дня совместного культивирования клетки были проанализированы проточной цитометрией на экспрессию CD83 (A). Супернатанты собирали и анализировали на экспрессию IL-12 с помощью ELISA (B).
Фиг. 6: Незрелые дендритные клетки были трандуцированы вирусом Ad5/35-TMZ-CD154 или вирусом Mock, или оставлены нетрансдуцированными (только DC). Через два дня культивирования клетки были проанализированы проточной цитометрией на экспрессию HLA-DR, CD86, CD70 ad CD83 (A). Супернатанты собирали и анализировали на экспрессию IL-12 с помощью ELISA (B).
Фиг. 7: Одноядерные клетки CD14 из CMV+-донора культивировались с дендритными клетками, трансдуцированными вирусом Ad5/35-TMZ-CD154 и нагруженными пептидами CMV pp65 в течение 11 дней. На 11-й день клетки анализировались на присутствие CD3+CD8+тетрамер+ CMV-специфических T-клеток по проточной цитометрии. Только 0,5% T-клеток было CMV-специфическим до культивирования, а после культивирования более чем 60% T-клеток было CMV-специфическим.
Фиг. 8: Одноядерные клетки лошади были трансдуцированы аденовирусным вектором с геном CD154 человека и культивировались. Через неделю популяция лимфоцитов размножалась (A, справа) по сравнению с клетками, трансдуцированными Mock (слева). Супернатанты собирали и анализировали с помощью ELISA с антителами к лошадиному MCP-1. Вирус Mock активирует MCP-1, но вирус CD154 дает более сильную экспрессию.
9
Фиг. 9: Клеточная линия Panc01 выращивалась подкожно в мышах Nu/Nu, у которых отсутствует функциональная иммунная система. В опухоли инъецировали однократно в количестве 1×10 вирусных частиц (VP) онколитического аденовируса, экспрессирующего TMZ-CD154, или фосфатно-солевой буфер (PBS). Процент роста опухоли показан во времени с момента инъекции вируса.
Фиг. 10: Клетки 293 были трансфецированы плазмидами, содержащими TMZ-CD154 в комбинации с 4-1BBL (A, B) или aIL6R scFv (C,D) и анализировались на экспрессию CD154 (A, C) или 4-1BBL (B) проточной цитометрией. Супернатант от клеток, экспрессирующих aIL6R scFv с myk-Tag, анализировали с помощью ELISA, чтобы определить экспрессию aIL6R (D).
Фиг. 11: DCs трансдуцировали вирусом Ad5/35 с TMZ-CD154 в комбинации с 4-1BBL или клетки оставляли нетрансдуцированными, или трансдуцировали «пустым» вирусом Mock. Через два дня совместного культивирования клетки анализировались на экспрессию TMZ-CD154 и 4-1BBL проточной цитометрией.
Фиг. 12: Незрелые дендритные клетки человека трансдуцировали вирусом Ad5/35 только с TMZ-CD154 или в комбинации с 4-1BBL или aIL6R scFv, или клетки оставляли нетрансдуцированными или трансдуцировали «пустым» вирусом Mock. Через два дня совместного культивирования клетки анализировались на экспрессию CD83 проточной цитометрией.
Фиг. 13: Незрелые дендритные клетки человека трансдуцировались вирусом Ad5/35 только с TMZ-CD154 или в комбинации с 4-1BBL, или aIL6R scFv, или клетки оставлялись нетрансдуцированными, либо трансдуцировались «пустым» вирусом Mock. Через два дня совместного культивирования клетки анализировались на экспрессию CD70 проточной цитометрией.
Фиг. 14: Незрелые дендритные клетки человека трансдуцировались вирусом Ad5/35 только с TMZ-CD154 или в комбинации с 4-1BBL или aIL6R scFv, или клетки оставлялись нетрансдуцированными. Через два дня совместного культивирования супернатанты анализировались с помощью прибора фирмы Luminex, чтобы сравнить уровни IFN-γ (A), IL12 (B), TNFa (C) и IL21 (D) между группами.
Фиг. 15: CMV-специфические T-клетки размножали из одноядерных клеток, приготовленных от CMV-положительного донора крови путем размножения клеток CD14с трансдуцированными дендритными клетками, нагруженными пептидами CMV pp65. Дендритные клетки трансдуцировались вирусом Mock, вирусом Ad5/35 только с TMZ-CD154 или в комбинации с 4-1BBL, или aIL6R. На 11-й день клетки собирали и анализировали на процент тетрамер-положительных (CMV-специфических) T-клеток с помощью проточной цитометрии и сравнивали со значением до размножения в A. В «B» показано общее число размноженных клеток в разных группах. Вирус Ad5/35, который содержит и TMZ-CD154, и 4-1BBL (LOAd703), мог также размножать NK-клетки в культуре (C).
Фиг. 16: Клеточная линия PaCa3 поджелудочной железы сама по себе или с 100 мкМ гемцитабина (G). Клетки PaCa3 были также трансдуцированы вирусами Ad5/35, экспрессирующими только TMZ-CD154, или в комбинации с лигандом 4-1BB, или aIL6R scFv. Наконец, трансдуцированные клетки культивировались с 100 мкМ гемцитабина. Клетки высевали в 96-гнездные планшеты и анализировались на выживание с помощью теста на выживаемость MTS, чтобы определить уровень клеточной смерти вследствие онколизис, от гемцитабина или комбинации онколизис и гемцитабин. * обозначает p<0,05 разности.B) Клетки опухоли поджелудочной железы мыши Panc02 выращивали в мышах C57BL6 и воздействовали на них онколитическим аденовирусом, несущим TMZ-CD154+4-1BBL, дважды в неделю 6 раз +/- еженедельно (3 раза) гемцитабин (25 мг/кг). Показан рост опухоли. C) Клетки поджелудочной железы человека Panc01 были трансдуцированы, как в (A), изложенном выше, и культивировались с или без паклитаксела (2 мкМ). * показывает p<0,05 [достоверности] разности.
Фиг. 17: Клетки мыши [линии] C57BL/6 с растущей опухолью мочевого пузыря MB49 подверглись воздействию 1 внутриопухолевого вливания аденовирусного вектора, несущего ген CD154 мыши. Через 24 часа были взяты биопсии для иммуногистохимического детектирования CD11b и GR-1 клеток с помощью конфокальной микроскопии (A) и для проточной цитометрии после механического разрушения на суспензию одиночных клеток, определяющей инфильтрирующие CD3+CD107a+ опухоль T-клетки.
Фиг. 18: Эндотелиальные клетки (HUVEC) человека были трансдуцированы вирусами Ad5/35, содержащими TMZ-CD154 с или без либо 4-1BBL, либо aIL6R, либо вирусом без трансгенов (Mock), или оставлены без трансдукции. Через 48 часов культивирования клетки были проанализированы проточной цитометрией на экспрессию E-селектина и ICAM-I, что важно для присоединения лимфоцита и диапедеза через эндотелий в воспаленные ткани.
Фиг. 19: Онколизис ограничивается клетками опухоли. Опухолевые клетки (на Фиг. 19 показаны клетки Panc01) и здоровые контрольные экзокринные клетки поджелудочной железы были трансдуцированы LOAd703, LOAd (-) вирусом, у которого отсутствуют трансгены, и Mock-вирусом Ad5/35, у которого отсутствует способность реплицироваться из-за делеции E1/E3, или оставленные не трансдуцированными. Клетки культивировались в параллельных анализах в 96-гнездных планшетах и анализировались на выживаемость с использованием теста MTS. Низкая жизнеспособность приводила к низкому поглощению.
8
7
8
Фиг. 20: Тест токсичности на модели кровяной петли. Кровь от 5 здоровых доноров была протестирована на реактивность на LOAd703. Кровь циркулировала в гепаринизированных петлях (2 мл/петля), что не влияло на комплемент в течение четырех часов. Образцы плазмы брали перед анализом и через 4 часа после добавления LOAd703 в большой дозе (1×10 VP) или в низкой дозе (1×10 VP). В качестве негативного контроля в петлю добавляли PBS, а антитела к CD28 использовались как позитивный контроль. AdCD40L - это вирус, сходный с LOAd703, который был использован в клинике и был протестирован в высокой дозе (1×10 VP).
Фиг. 21: Опухоли B16, растущие подкожно в мышах [линии] C57BL6, были подвергнуты действию AdCD40L, где после pmel (Potentially Malignant Epithelial Lesion - потенциально малигнизирующее повреждение эпителия (?)), вливаются T-клетки, распознающие опухоли B16. Опухоли затем анализировались проточной цитометрией на присутствие T-клеток. A) pmel T-клетки могут инфильтрировать опухоль, однако, если опухоль предварительно обработана AdCD40L (combo) инфильтрация pmel T-клеток была резко увеличена. B) В опухолях, обработанных AdCD40L, [количество] и естественных, и pmel T-клеток было увеличено по сравнению с опухолями, которые не являются предобработанными AdCD40L, и они экспрессировали маркер активации CD107a.
11
11
Фиг. 22:Расписание воздействий для терапии единственной дозой с помощью Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL (LOAd703) при первом уровне дозы 1×10 VP и втором уровне дозы 5×10 VP. Синие и белые квадратики представляют 1 неделю.
11
Фиг. 23: Расписание воздействий для терапии повторными дозами с использованием Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL (LOAd703) при уровне дозы 5×10 VP. Синие и белые квадратики представляют 1 неделю.
Данное изобретение проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими его примерами.
Примеры
Материалы и способы
Генные последовательности TMZ-CD154
Чтобы проиллюстрировать генную последовательность молекулы TMZ-CD154, как определено в данном документе, авторы данного изобретения сконструировали такие генные последовательности TMZ-CD154 для человека, лошади, собаки и кошки.
SEQ ID NO: 1 (ДНК), SEQ ID NO: 2 (белок)
Человек
Тримеризованный мембранно-связанный CD154 человека
1-9
Последовательность Козака
10-108
Изолейциновая «молния»
109-126
Линкер
127-198
Трансмембранный домен CD154 человека
199-846
Внеклеточный домен CD154 человека
Аминокислотная последовательность tm и ec доменов CD154 помечена серым [цветом]
1 GCCACCATGA GAATGAAGCA GATCGAGGAC AAGATCGAGG AGATCCTGAG
M R M K Q I E D K I E E I L S Рамка 1
51 CAAGATCTAC CACATCGAGA ACGAGATCGC CAGAATCAAG AAGCTGATCG
K I Y H I E N E I A R I K K L I G Рамка 1
101 GCGAGAGAGG CGGCCGGGGC GGCGGCATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT
E R G G R G G G I F M Y L L T V Рамка 1
151 TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA CTTTTTGCTG TGTATCTTCA
F L I T Q M I G S A L F A V Y L H Рамка 1
201 TAGAAGGTTG GACAAGATAG AAGATGAAAG GAATCTTCAT GAAGATTTTG
R R L D K I E D E R N L H E D F V Рамка 1
251 TATTCATGAA AACGATACAG AGATGCAACA CAGGAGAAAG ATCCTTATCC
F M K T I Q R C N T G E R S L S Рамка 1
301 TTACTGAACT GTGAGGAGAT TAAAAGCCAG TTTGAAGGCT TTGTGAAGGA
L L N C E E I K S Q F E G F V K D Рамка 1
351 TATAATGTTA AACAAAGAGG AGACGAAGAA AGAAAACAGC TTTGAAATGC
I M L N K E E T K K E N S F E M Q Рамка 1
401 AAAAAGGTGA TCAGAATCCT CAAATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC
K G D Q N P Q I A A H V I S E A Рамка 1
451 AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG GCTGAAAAAG GATACTACAC
S S K T T S V L Q W A E K G Y Y T Рамка 1
501 CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG CTGACCGTTA
M S N N L V T L E N G K Q L T V K Рамка 1
551 AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT
R Q G L Y Y I Y A Q V T F C S N Рамка 1
601 CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC
R E A S S Q A P F I A S L C L K S Рамка 1
651 CCCCGGTAGA TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT
P G R F E R I L L R A A N T H S S Рамка 1
701 CCGCCAAACC TTGCGGGCAA CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA
A K P C G Q Q S I H L G G V F E Рамка 1
751 TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT GTGACTGATC CAAGCCAAGT
L Q P G A S V F V N V T D P S Q V Рамка 1
801 GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA CTCTGA
S H G T G F T S F G L L K L * Рамка 1
SEQ ID NO: 3
Лошадь TZM-CD154 (жирным шрифтом - домен CD154)
atttttatgtatttgcttactgtttttcttatcacccagatgattgtgtcagcactttttgctgtgtatcttcacagaagattggacaagatagaagatgaaaggaatcttcatgaagattttgtgttcatgaaaacgatacagagatgcaacaaaggagaggggcctttatcattactgaactgtgaggaaattagaagccagttcgaaggcttcgtcaaggatataatgctaaatgaagaagtgaagaagaaaggagaaaactttgaaatgcaaaaaggcgatcaggagcctcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaaaacagcatctgttctacagtgggcccaaaaaggatactacaccataagcaacaacttggtaaccctcgaaaatgggaaacagctggccgttaaaagacaaggactctattatatctatgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgggtcaagctccatttatagccagcctctgcctgaggtccgtgagtggatctgagagaatcttacttagagcggcaaatacccacagttcctccaaaccttgcgggcagcaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaaccaggtgcttcggtgtttgtcaacgtgactgatccaagccaagtgagccatgggaccggcttcacatcttttggtttactcaaactctga
gccaccatgagaatgaagcagatcgaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgccagaatcaagaagctgatcggcgagagaggcggccggggcggcggc
Аминокислотная последовательность TMZ-CD154 лошади
A T M R M K Q I E D K I E E I L S K I Y H I E N E I A R I K K L I G E R G G R G G G I F M Y L L T V F L I T Q M I V S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N L H E D F V F M K T I Q R C N K G E G P L S L L N C E E I R S Q F E G F V K D I M L N E E V K K K G E N F E M Q K G D Q E P Q I A A H V I S E A S S K T A S V L Q W A Q K G Y Y T I S N N L V T L E N G K Q L A V K R Q G L Y Y I Y A Q V T F C S N R E A S G Q A P F I A S L C L R S V S G S E R I L L R A A N T H S S S K P C G Q Q S I H L G G V F E L Q P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L
SEQ ID NO: 4
Собака TZM-CD154 (жирным шрифтом - домен CD154)
atttttatgtatttgcttactgtttttctcatcacccagatgattggatcggcactctttgctgtatatcttcacagaagattggacaagatagaagatgaaaggaatctttatgaagattttgtgttcatgaaaacgttacagaaatgcaacaaaggggaggggtccttgtccttactgaactgtgaggaaattaaaagccaatttgaagcctttctcaaggagataatgctaaacaacgaaatgaagaaagaagaaaacattgcaatgcaaaaaggtgatcaggatcctcgaattgcagcccatgtcataagtgaggctagtagtaacccagcgtccgttctgcggtgggcgccaaaagggtactacaccataagcagcaacctggtgagcctcgagaatgggaaacagttggccgtgaaaagacaaggactctattacgtctatgcccaagtcaccttctgctccaatcgggcagcttcgagtcaagctccgttcgtcgccagcctatgcctccattccccgagtggaacggagagagtcttactccgcgccgcgagctcccgcggctcgtccaaaccttgcggccaacagtccatccacttgggaggagtatttgaattgcatccaggtgcttcggtgttcgtcaacgtgactgatccaagccaagtgagccacgggaccggcttcacgtcttttggcttactcaaactctgaa
gccaccatgagaatgaagcagatcgaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgccagaatcaagaagctgatcggcgagagaggcggccggggcggcggc
Аминокислотная последовательность TMZ-CD154 собаки
A T M R M K Q I E D K I E E I L S K I Y H I E N E I A R I K K L I G E R G G R G G G I F M Y L L T V F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N L Y E D F V F M K T L Q K C N K G E G S L S L L N C E E I K S Q F E A F L K E I M L N N E M K K E E N I A M Q K G D Q D P R I A A H V I S E A S S N P A S V L R W A P K G Y Y T I S S N L V S L E N G K Q L A V K R Q G L Y Y V Y A Q V T F C S N R A A S S Q A P F V A S L C L H S P S G T E R V L L R A A S S R G S S K P C G Q Q S I H L G G V F E L H P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L
SEQ ID NO: 5
Кошка TZM-CD154 (жирным шрифтом - домен CD154)
atttttatgtatttacttactgtgtttctcatcacccagatgattgggtcagcactctttgctgtgtatcttcacagaagactggacaagatagaagatgaaaggaatctttatgaagattttgtgttcatgaaaacattacagaaatgcaacaaaggagagggggccttatccttactgaactgtgaggaaattaaaagccggtttgaagcctttctcaaggagataatgctaaacaaagaaacgaagaaagaaaaaaatgttgcaatgcaaaaaggcgaccaggatcctcgagttgcagcacatgtcataagtgaggccagcagtagcacagcgtctgttctccagtgggcccccaaaggctactacaccataagcagcaacttggtgaccctcgagaacgggaagcagctggccgttaaaagacaaggactctattatatctacgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccgttcatagccagcctctgcctgcattccccgagtggatccgagagagtcttactcagagctgcaaatgcccgcagttcctccaaaccctgtgggcagcaatccattcacttgggaggagtcttcgaactgcatccaggtgcttcggtgttcgtgaacgtgactgatccgagccaagtgagccacgggacgggcttcacgtcttttggcttactcaaactctgaa
gccaccatgagaatgaagcagatcgaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgccagaatcaagaagctgatcggcgagagaggcggccggggcggcggc
Аминокислотная последовательность TMZ-CD154 кошки
A T M R M K Q I E D K I E E I L S K I Y H I E N E I A R I K K L I G E R G G R G G G I F M Y L L T V F L I T Q M I G S A L F A V Y L H R R L D K I E D E R N L Y E D F V F M K T L Q K C N K G E G A L S L L N C E E I K S R F E A F L K E I M L N K E T K K E K N V A M Q K G D Q D P R V A A H V I S E A S S S T A S V L Q W A P K G Y Y T I S S N L V T L E N G K Q L A V K R Q G L Y Y I Y A Q V T F C S N R E A S S Q A P F I A S L C L H S P S G S E R V L L R A A N A R S S S K P C G Q Q S I H L G G V F E L H P G A S V F V N V T D P S Q V S H G T G F T S F G L L K L
Конструкция плазмиды
Генные последовательности были сконструированы с использованием бесплатного программного обеспечения pDraw32 фирмы AcaClone, а затем синтезировались с промотором CMV перед 5' концом гена и фланкирующими областями аденовируса (также содержащими сайты рестрикции 5'SspI и 3'ScaI) для гомологической рекомбинации в аденовирусные векторы на обоих концах. После 3' Ad фланкирующей области сайт поли A был синтезирован, когда экспрессия гена была достигнута плазмидной трансфекцией. Фрагменты гена были синтезированы и субклонированы в плазмиду pUC57-Kan фирмы GenScript Inc.
Конструкция аденовирусного вектора
Плазмиды pUC57 с набором трансгенов переваривались с ферментами SspI и ScaI, и полосу выделяли стандартным гель-электрофорезом и очисткой. Набор генов встраивался в каркас плазмиды путем гомологической рекомбинации. Колонии с корректной вставкой размножались и генные последовательности подтверждались паттерном рестрикционного анализа и сиквенированием. Аденоплазмиды с набором генов трансфецировались в клетки 293 для производства вирусов. Анализ бляшкообразования был выполнен на клетках A549, чтобы получить клоны одиночного вируса. Вирусы далее амплифицировались на клетках A549 и очищались центрифугированием в градиенте CsCl. Финальные вирусные частицы образовывали форму в 20 мМ TRIS, 25 мМ NaCl и 2,5% глицерина. Были определены физический (O.D) титр и функциональный титр (антигексонное окрашивание).
Клеточные линии
Клеточные линии HEK 293, B16 и A549 были приобретены на фирме ATCC, тогда как Karpas 422, PancO1, MiaPaCa2, PaCa3 и BxPC3 являются любезным подарком Karolinska Institute (Швеция). Клеточная линия MB49 является подарком Национального университетского госпиталя Сингапура. Клетки 293 культивировались в среде на основе минимальной эссенциальной среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% Pest Streptomycin, 0,1% пирувата натрия) фирмы Life Technologies. A549 были выращены в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium GlutaMAX™ Supplement с 10% FBS, 1% PeSt, 1% HEPES и 0,1% пирувата натрия. MiaPaca2 и PanC01 выращивали в DMEM с 10% FBS и 1% PeSt. BxPC3 выращивали в RPMI 1640 Medium GlutaMAX™ Supplement с 1% FBS и 1% Pest. Все компоненты среды для клеточного роста получены с фирмы Life Technologies.
Изготовление лейкоцитарной пленки
Лейкоцитарные пленки были приобретены в Банке крови госпиталя университета Упсалы (Uppsala University Hospital Blood Bank). Одноядерные клетки были изготовлены путем центрифугирования в фиколе. Кратко, лейкоциты разбавляли 1:1 фосфатным буферным раствором (PBS) и осторожно доводили до 50 мл в пробирках фирмы Falcon, содержащих 10 мл фикола без смешивания двух слоев. Пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин без взбалтывания. Слой клеток белой крови затем переносили пипетированием в чистые пробирки и отмывали центрифугированием в PBS. Приготовленные клетки были использованы свежеполученными или замороженными в емкостях с жидким азотом в содержащей диметилсульфоксид (DMSO) среде для замораживания для использования в будущем.
Приготовление незрелых дендритных клеток
6
Моноциты CD14+ были отсортированы от одноядерных клеток из препаратов лейкоцитарной пленки с помощью системы шариков MACS CD14 MicroBeads в соответствии с протоколом производителя (фирма Miltenyi Biothech). Клетки CD14 (включая в себя T-клетки) были заморожены. Клетки CD14+ были затем разбавлены культуральной средой RPMI (10% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин) до концентрации 1×10 клеток/мл. GM-CSF и IL-4 добавляли до финальной концентрации 50 нг/мл и 25 нг/мл, соответственно. Свежую среду с GM-CSF и IL-4 добавляли через день в течение одной недели. Через одну неделю культивирования моноциты дифференцировались в незрелые CD14-CD1a+ дендритные клетки.
Стимуляция T-клеток
Одноядерные клетки периферической крови стимулировались OKT-3 (анти-CD3) антителами (1 мкг/мл) и IL2 (100 единиц/мл). На 3-й день T-клетки размножались и были трансдуцированы аденовирусными векторами, как описано ниже, и клетки культивировались с или без свежего IL2 в течение 48 часов.
Трансфекция с использованием плазмид
6
Клетки 293 отмывали центрифугированием в PBS (1500 об/мин, 5 мин). Клетки (0,75×10/группа) были ресуспендированы в среде и высеяны в 6-гнездный планшет и культивировались в течение ночи. На следующий день 5 мкг плазмид смешивали в суспензию 8 мкл полиэтиленимина в 100 мкл OptiMEM (фирма Life Technologies) и инкубировали в течение 20 мин. Плазмидную суспензию затем раскапывали в гнезда с клетками 293. Клетки культивировали до разных точек времени для анализа FACS, сбора супернатанта и для совместной культуры с незрелыми дендритными клетками.
Трансдукция с использованием аденовирусных векторов
6
2
Клетки, которые должны трансдуцироваться аденовирусными векторами, отмывали в бессывороточной среде. 1×10 клеток добавляли на одну коническую пробирку на 10 мл и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливали, и клетки ресуспендировали в оставшейся среде - приблизительно 150 мкл на пробирку. Аденовирусы в диапазоне от 25-100 ffu/клетка добавляли в пробирки, где затем они инкубировались в течение 2 часов в клеточном инкубаторе при 37°С с 5% CO. Добавляли среду культуры клеток с сывороткой, и клетки затем инкубировались и использовались в различных анализах (проточная цитометрия в различных точках времени, гель-электрофорез/вестерн блоттинг, совместное культивирование с незрелыми дендритными клетками и т.д.).
Проточная цитометрия
Клетки, которые анализировались проточной цитометрией, отмывались в PBS и центрифугировались в пробирках для проточной цитометрии (фирма BD Biosciences). Супернатанты удаляли, и оставшиеся клетки ресуспендировались перемешиванием вихревым способом. Антители или тетрамеры, разбавленные в 1% бычьем сывороточном альбумине (BSA) в PBS, добавляли к клеточным суспензиям и инкубировали 5 мин при комнатной температуре или 30 мин при 4°С. Антитела, детектирующие CD154, CD83, HLA-DR, CD86, CD70, CD14, CD1a, CD3, CD8, CD107a и лиганд 4-1BB человека, так же как Gr-1, и CD11b мыши, приобретались на фирме BioLegend как нерелевантные изотипически сходные контроли. Тетрамеры CMV pp65 приобретались на фирме Nordic BioSite. Окрашенные клетки отмывались 1% BSA в PBS и фиксировались с помощью 1% параформальдегида (PFA) в PBS в общем объеме 300 мкл/пробирка. Клетки анализировались с помощью FACS Canto II фирмы BD Biosciences.Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo фирмы Treestar Inc.
Анализы
упернатантов
с
Супернатанты из клеточных культур анализировались на выделение растворимого CD154 человека, IL-12 человека, MCP1 лошади и scFv в IL-6R человека из нетрансдуцированных, трансдуцированных или трансфецированных клеток. sCD154 был проанализирован с помощью ELISA с использованием sCD40L набора Platinum фирмы eBioScience Inc. MCP1 лошади был проанализирован с помощью набора MCP1 Kit фирмы BioLegend. IL-12p70 был детектирован с помощью самодельного ELISA. Кратко, 96-гнездные планшеты были покрыты 1 мкг/мл очищенных антител против IL-12 (p70) человека от фирмы Biolegend в течение ночи при 4°C. Блокирование выполняли путем добавления PBS с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (фирма Sigma-Aldrich) на 1 час при 37°С. Затем образцы инкубировались в гнездах с покрытием в течение 2 часов при 37°С, после чего добавляли биотинилированные антитела против IL-12/IL-23 p40 человека (фирма Biolegend) в концентрации 1 мкг/мл на 1 час при 37°С. Конъюгированную с авидином пероксидазу хрена (фирма Dako A/S) разбавляли 1:4000 и добавляли в планшет на 1 час при 37°С в темноте. Анализ выполняли с помощью TMB (фирма Dako) и считывания поглощения на [длине волны] 450 нм в высокоточном считывателе планшетов Emax (фирма Molecular Devices). scFv к IL-6R человека анализировали с помощью самодельной ELISA, детектирующего Myk-Tag, встроенного в scFv. Кратко, планшеты покрывали рекомбинантным IL-6R человека и затем инкубировали образцы. После отмывки 1% BSA-PBS планшеты инкубировали с антителами против myk-HRP, которые затем могли детектироваться добавлением субстрата и фермента пероксидазы (фирма Dako). Цветовой сдвиг анализировали с помощью спектрофотометрии. Далее, супернатанты анализировались на множественные цитокины с помощью Luminex в соответствии с протоколом компании. Использовался набор для детектирования следующих анализируемых веществ: IFNγ, Il12, TNFα и IL21.
Гель-электрофорез и вестерн-блоттинг
Лизаты готовили из клеток, трансфецированных плазмидами, как описано выше. Клетки отмывали в ледяном 1×PBS и ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем M-PER реагент для экстракции белка млекопитающих с добавлением 1% коктейля ингибиторов фосфатаз Halt и 1% коктейля ингибиторов протеаз (фирма Thermo Scientific). Концентрация белка в клеточных лизатах измеряли с помощью набора реагентов для определения белкового спектра Coomassie plus в соответствии с протоколом производителя. 10 мкг образца нагружали в гель фирмы BioRad. Образцы смешивали либо с буфером образца, содержащим меркаптоэтанол (восстановленный) или не содержащим (не восстановленный).Восстановленные образцы также кипятили в течение 5min при 95°С перед загрузкой. Гель прогоняли в течение 50 мин при 110 В и переносили на мембрану с помощью стеков для переноса гелей в устройство iBlot maschine (фирма Life Technologies). Мембраны блокировались в течение 1 часа при комнатной температуре (RT) и затем разбавленные 1:500 антитела CD154 (H215) (фирма Santa Cruz Biotechnology Inc) добавлялись к мембране и инкубировались в течение ночи при 4°С. В качестве вторых антител использовались антикроличьи IgG-HRP коз (фирма Life Technologies) в разбавлении 1:2000 и инкубировались в течение 1 часа при RT. Мембрана проявлялась при добавлении раствора ECL Clarity Western ECL Substrate (фирма BioRad) и экспонировалась в V3 Western Workflow™ (фирма BioRad).
Анализ жизнеспособности
490
Онколитическая способность вирусов, содержащих трансген TMZ-CD154, определялась с помощью анализа CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) от фирмы Promega. Анализ использовали в соответствии с протоколом производителя. Кратко, опухолевые клетки были трансдуцированы вирусами и затем высеяны в 96-гнездные планшеты в четырех параллелях/группа, 10 000 клеток/гнездо. Экзокринные клетки здорового донора были получены из неиспользованного материала препаратов островковых клеток госпиталя университета Упсалы и использовались как контроль ограниченной репликации опухолевых клеток. Планшеты культивировались и анализировались в различных точках времени: 24, 48 и 72 часа после трансдукции. Добавляли 20 мкл реагента из набора, и планшет инкубировали в течение 1,5 часа. Поглощение на A измеряли с помощью спектрофотометрии.
Активация и размножение T-клеток
5
6
Незрелые DCs от CMV-позитивных доноров были трансдуцированы различными вирусными векторами в соответствии с протоколом вирусной трансдукции, либо оставлялись нетрансдуцированными или стимулировались TNFα (40 нг/мл) и поли IC (30 мкг/мл). На следующий день клетки собирали и переносили в пробирки и отмывали центрифугированием в PBS (1500 об/мин, 5 мин). Супернатанты сливали и добавляли пептиды CMV pp65 (10 мкг), а также β2-микроглобулин (1 мкг), в которых затем клетки инкубировались при 37°С в течение 4 часов. Клетки дважды отмывались PBS, а затем разбавлялись в культуральной среде до концентрации 1×10 клеток/мл. Параллельно, одноядерные клетки CD14 от того же самого донора оттаивали и отмывали центрифугированием в PBS (1500 об/мин, 5 мин). Клетки были разбавлены в культуральной среде до концентрации 1×10 клеток/мл. Приготовленные незрелые DCs и одноядерные клетки CD14 (включая в себя T-клетки) культивировались совместно в соотношении 1:10 в культуральных матрасах T-25 (5-10 мл/матрас) в течение 11 дней. На 11-й день размножившиеся T-клетки анализировали проточной цитометрией на маркеры T-клеток и реактивность на CMV pp65 тетрамеры.
Эксперименты на животных
9
9
Самок мышей C57BL/6 дикого типа или Nu/Nu получали на фирме Taconic M&B. Опухолевые клетки Panc01 человека инъецировали иммунодефицитным мышам Nu/Nu. Когда опухоли становились обнаружимыми, опухоли инъецировались однократно 1×10 VP вируса с TMZ-CD154 на одну мышь. Объем опухоли измеряли в различных точках времени. Опухолевые клетки мыши Panc02 инъецировали мышам дикого типа. Мыши дважды в неделю получали аденовирус, несущий TMZ-CD154+4-1BBL мыши (1×10 VP/мышь). Гемцитабин (25 мг/кг) давали 1 раз в неделю. Размер опухоли контролировали.
Ортотопическая модель
5
8
+
+
: мыши анестезировались и катетеризовались (INSYTE.w24Gx3/4; фирма BD Biosciences). Мочевые пузыри преинкубировались с 100 мкл 0,1 мкг/мл поли-L-лизина (фирма PLL, молекулярный вес 70000-150000) (фирма Sigma-Aldrich), чтобы увеличить адгезивность опухолевых клеток. Клетки MB49 (2,5×10/мышь) были имплантированы в мочевой пузырь. Мышь получала локально внутрипузырное введение дефектного по репликации Ad5-CD154 мыши или Ad5-Mock (1×10 ffu). Перед инстилляцией вектора мочевые пузыри предварительно отмывались три раза с энхансером трансдукции Clorpactin WCS-90 (0,1% раствор) (фирма United-Guardian) и один раз отмывались с PBS. Для определения количества миелоидных клеток и T-клеток в опухоли мочевого пузыря, через 24 часа после воздействия брали опухоль, мгновенно замораживали в жидком азоте, а затем окрашивали и оценивали на присутствие CD11bGr-1 клеток по иммуногистохимии. Часть опухоли механически разрушали до отдельных клеток и анализировали проточной цитометрией, чтобы определить число инфильтрированных T-клеток. Модель pmel: клетки опухоли B16 выращивали подкожно в мышах C57BL6. Мышей делили на четыре группы. Первая группа получала только PBS ка негативный контроль. Вторая группа обрабатывалась AdCD40L, третья группа с pmel T-клетками клетки, а четвертую группу обрабатывали сначала AdCD40L как праймером для pmel T-клеточной терапии. Региональный комитет по [био]этике в Упсала, Швеция, Dnr, утвердил все эксперименты на животных: [решения] C86/10 и C54/13.
Иммуногистохимия
b
↑
+
+
6 мкм срезы мгновенно замороженных тканей, погруженные в OCT (фирма Tissue-Tek Sakura), фиксировали в ледяном ацетоне (фирма Sigma-Aldrich) в течение 10 минут и уравновешивали в PBS. Срезы заливали в 10% нормальную сыворотку коз (фирма Dako) в PBS и неспецифический IgG2 крысы (фирма BD Biosciences, 5 мкг/мл) на 2 часа перед инкубацией с первыми антителами (2 мкг/мл, PE- конъюгированные антитела [крысы] к мышиному CD11b (Clone M1/70, фирма BD Biosciences), флуоресцеин изотиоцианат(FITC)-конъюгированными [антителами крысы] к мышиному Gr-1 (Clone RB6-8C5, фирма BD Biosciences), разбавленными в заливочном растворе на 1 ч при RT. Ядра докрашивались с помощью 2 мкг/мл Hoechst 33342 (фирма Sigma-Aldrich), за чем следовала интенсивная отмывка в PBS и помещение в Fluoromount G (фирма Southern Biotech). Микрофотографии, охватывающие целиком один срез опухоли на образец, получали с помощью микроскопа Nikon Eclipse E100, снабженного камерой Nikon DXM 1200 (фирма Nikon Instruments Europe) с использованием объектива PlanApochromat 20x/0,75 (фирма Nikon). Изображения анализировались с помощью [программного обеспечения] ImageJ (Национальный институт здравоохранения США, NIH). Чтобы определить количество клеток CD11bGr-1, дважды положительная область определялась установлением порога вручную, и подсчитывались ядра в этой области и в участке, представляющем интерес (ROI). Число клеток выражали в отношении к общему в ROI.
Модель кровяной петли
Цельная кровь циркулировала в гепаринизированных трубках (2 мл/трубка). Вирусы инъецировались, и через 4 часа инкубации отбирались образцы для анализа комплемента и активации цитокинов. Образцы до инкубации использовали как контрольные. В контрольные петли инъецировали PBS или антителозависимо активированные антитела к CD28.
Пример1
Перенос генов и экспрессия TMZ-CD154 с помощью плазмиды-носителя генов
6
Чтобы проиллюстрировать, что система переноса генов плазмидой может быть использована для переноса гена TMZ-CD154, приводящего к экспрессии TMZ-CD154 в трансфецированных клетках, авторы данного изобретения сконструировали плазмиду-носитель гена TMZ-CD154 и протестировали его способность доставлять TMZ-CD154 в клетки. Плазмида-TMZ-CD154 была сконструирована путем встраивания гена TMZ-CD154 человека в плазмиду экспрессии pUC57-Kan, как описано в разделе «Материалы и способы». Плазмида (5 мкг) затем трансфецировалась в клетки 293 (1×10), и экспрессия TMZ-CD154 определялась на трансфецированных клетках на второй день после трансфекции. Во-первых, часть клеток была лизирована стандартным буфером RIPA и анализировалась гель-электрофорезом и вестерн-блоттингом (Фиг. 2A). Клетки 293 трансфецированные либо TMZ-CD154, либо плазмидами Mock были разделены на две группы каждая. Одну из каждой группы не кипятили в восстанавливающем буфере образца, тогда как другую кипятили, и она содержала восстанавливающий буфер образцы. Таким образом, TMZ-CD154 может быть идентифицирован как мономер (восстановленный) или олигомер (невосстановленный). Обе группы с Mock-трансфецированными клетками были негативны по CD154. В группах TMZ-CD154 мономерный TMZ-CD154 мог быть детектирован в обеих восстановленных и невосстановленных группах, как и ожидалось. Однако, количество было меньше, чем в восстановленной группе. Только в невосстановленной группе могли быть детектированы олигомеры TMZ-CD154. Интересно, что CD154 дикого типа могут быть детектированы в форме мономеров в обеих группах, что предполагает, что экспрессия TMZ-CD154 также запускает экспрессию CD154 дикого типа. Во-вторых, оставшиеся клетки анализировались проточной цитометрией. Трансфекция клеток 293 с помощью плазмиды-TMZ-CD154 приводила к сильной экспрессия TMZ-CD154 на клеточной поверхности, тогда как контрольная плазмида Mock не приводила к экспрессии TMZ-CD154 (Фиг. 2B). В-третьих, супернатанты нетрансдуцированных или трансдуцированных вирусами, экспрессирующими TMZ-CD154, CD154 дикого типа или без трансгенов (Mock) были проанализированы с помощью ELISA, чтобы определить выделение CD154 в среду. Результаты показывают, что TMZ-CD154 не выделяется в больших количествах в клеточные супернатанты по сравнению с CD154 дикого типа (Фиг. 2C). CD154 в норме управляют активацией T-клеток и пролиферацией. У TMZ-CD154 отсутствует внутриклеточный сигнальный домен, и, чтобы продемонстрировать, что TMZ-CD154 не вызывает неконтролируемой аутопролиферации в T-клетках, экспрессирующих TMZ-C154, T-клетки активировались OKT-3 и IL2 перед трансдукцией Ad5/35-TMZ-CD154, Ad5/35-Mock или оставлены без трансдукции. Клетки культивировались с или без IL2 в течение 48 часов, и определялось количество клеток. На Фиг. 2D показано, что IL2 управляет размножением T-клеток, а добавление TMZ-CD154 не индуцирует дополнительной пролиферации. T-клетки не пролиферируют без добавления IL2, независимо от присутствия TMZ-CD154.
Пример 2
Перенос генов и экспрессия TMZ-CD154с помощью вирусного носителя генов
Чтобы проиллюстрировать, что транспортная система вирусного носителя генов может быть использована для переноса гена TMZ-CD154, ведущего к его экспрессии в клетках, авторы данного изобретения сконструировали носитель гена, основанный на аденовирусах (Ad5/35-TMZ-CD154). Ad5/35-TMZ-CD154 был использован, чтобы трансдуцировать клетки 293, и после этого экспрессия гена TMZ-CD154 ярко детектируется на клеточной поверхности этих клеток, тогда как контрольный вирус Mock не мог индуцировать экспрессию TMZ-CD154 (Фиг. 3A).
Пример3
Перенос генов и экспрессия TMZ-CD154 на опухолевых клетках
in vitro
Чтобы проиллюстрировать, что опухолевые клетки могут быть сконструированы так, чтобы экспрессировать TMZ-CD40L, авторы данного изобретения перенесли TMZ-CD154 в опухолевую клеточную линию, происходящую из рака поджелудочной железы (Panc01), с помощью вектора Ad5/35-TMZ-CD154. Трансдуцированная клеточная линия, экспрессировала TMZ-CD154 после трансдукции Ad5/35-TMZ-CD154, но не контрольным вектором Mock (Фиг. 3B). Как показано ранее, опухолевые клетки, экспрессирующие CD154, могут быть эффективно использованы как вакцины из опухолевых клеток на экспериментальных моделях (Loskog A et al JU 2001), и использовались для стимуляции активации DC  и размножения T-клеток (Loskog A et al CGT 2002; Loskog et al JI 2004; Loskog et al CII 2006).
Пример 4
Оценка эффективности онколитического вектора Ad5/35-TMZ-CD154 в уничтожении клеток
Чтобы проиллюстрировать, что опухолевые клетки могут быть лизированы онколитическим вектором Ad5/35-TMZ-CD154, опухолевые клетки (A) Panc01, B) MiaPaCa2, C) BxPC3) D) Karpas-422 были трансдуцированы Ad5/35-TMZ-CD154 (MOI 100 ffu/клетка). На третий день анализировали жизнеспособность клеток в тесте жизнеспособности клеток, описанном в «Способы и материалы», и результаты ясно продемонстрировали, что онколитический вектор Ad5/35-TMZ-CD154 лучше уничтожает опухолевые клетки, чем при использовании дефектных по репликации вирусов или по сравнению с нетрансдуцированными клетками (Фиг. 4). Компетентная по репликации группа Ad5/35-TMZ-CD154 демонстрирует улучшенную цитотоксичность по сравнению с соответствующим компетентным к репликации вектором Ad5/35-Mock с использованием клеточной линии Panc01, и другие две клеточные линии также демонстрируют эту повышенную цитотоксичность групп с TMZ-CD154, но разница не достигает [уровня] достоверной. Вирус был равно эффективен на клеточной линии лимфомы Karpas-422.
Пример 5
Перенос генов и экспрессия TMZ-CD154 на дендритных клетках
Чтобы проиллюстрировать, что антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут быть активированы TMZ-CD154, авторы данного изобретения провели исследования активации на клетках человека. Моноциты отделялись от одноядерных клеток периферической крови, приготовленной из лейкоцитарной пленки, как описано в разделе «Способы и материалы» с использованием шариков с CD14 MACS. Моноциты затем культивировали в течение семи дней с IL-4 и GM-CSF, чтобы дифференцировать их в незрелые дендритные клетки. Незрелые дендритные клетки культивировались совместно с клетками 293, трансфецированными плазмидой-TMZ-CD154 или контролем Mock. Через 2 дня клетки и супернатанты собирали и анализировали на статус активации дендритных клеток проточной цитометрией (маркер активации CD83) и ELISA (маркер активации IL-12). Результаты показывают, что дендритные клетки, подвергнувшиеся стимуляции TMZ-CD154, созревали в активированный фенотип, что повышало экспрессию CD83 и давало высокий уровень IL-12 (Фиг. 5A, B). Результаты также демонстрируют, что мембранно-связанный CD154, включая в себя TMZ-CD154, индуцирует высокую степень активации дендритных клеток, поскольку TMZ-CD154 стимулирует дендритные клетки экспрессировать существенно более высокое количество IL-12, чем тримеризованной растворимой (stCD40L) или мультимерной формами CD154 (мультмер sCD40L).
Пример 6
Трансдукция дендритных клеток Ad5/35-TMZ-CD154
A. Чтобы проиллюстрировать, что антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут быть трансдуцированы вектором Ad5/35-TMZ-CD154, незрелые дендритные клетки были трансдуцированы этим вектором или контрольным Mock. Результаты демонстрируют, что дендритные клетки, трансдуцированные Ad5/35-TMZ-CD154, созревали в CD83-экспрессирующие активированные дендритные клетки, продуцирующие IL-12 (Фиг. 6A, B). Ad5/35-TMZ-CD154-активированные DCs имели также повышенную экспрессию HLA-DR, CD86 и CD70 (Фиг. 6A).
B. Чтобы проиллюстрировать, что антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, активированные TMZ-CD154, могут индуцировать ответы антиген-специфических T-клеток, таких как антивирусные CMV-специфические T-клетки, дендритные клетки, трансдуцированные Ad5/35-TMZ-CD154 или контролем Mock, культивировались с пептидами pp65 CMV и совместно культивировались с аутологическими T-клеткам, как описано в разделе «Способы и материалы». Через 11 дней размножения уровень pp65-специфических T-клеток был определен по открашиванию тетрамеров и проточной цитометрии. Результаты показывают, что TMZ-CD154-активировaнные дендритные клетки были способны активировать и размножать pp65-специфические T-клетки (Фиг. 7).
Пример 7
Ранее было показано, что CD154-экспрессирующий аденовирус человека может индуцировать активацию происходящих от собаки иммунных клеток (von Euler et al JIT 2008), а PBMCs лошадей также демонстрирует активацию аденовирусом, экспрессирующим CD154, поскольку популяция лимфоцитов увеличивает послевирусную трансдукцию PBMCs (см. «Способы и материалы») (Фиг. 8A). Далее, MCP-1 увеличен в супернатантах трансдуцированных PBMCs (Фиг. 8B).
Пример 8
Контроль роста опухоли in vivo
in vivo
in vivo
Чтобы проиллюстрировать, что Ad5/35-TMZ-CD154 может контролировать рост опухоли , мыши с ксенотрансплантатной опухолью человека Panc01 были подвергнуты действию Ad5/35-TMZ-CD154 или PBS однократно. На 7-й день объем опухоли измеряли. Результаты демонстрируют, что Ad5/35-TMZ-CD154 может ингибировать прогрессию опухоли  благодаря онколитической способности вируса (Фиг. 9). Иммунологические эффекты вируса не могут быть оценены на моделях мышей, поскольку TMZ-CD154 человека не дает перекрестной реакции с CD40 мыши. Далее, вирус не реплицируется в мышиных опухолях, следовательно, ксенотрансплантатные модели должны быть использованы на иммунодефицитных мышах.
Пример 9
Комбинация TMZ-CD154 с другими иммуномодуляторами в векторных системах
Чтобы проиллюстрировать, что TMZ-CD154 может быть скомбинирован с другими иммуномодуляторами, генный конструкт TMZ-CD154 был сконструирован вместе с геном лиганда 4-1BB или геном анти-IL6R scFv в плазмиде и аденовирусных векторных системах.
SEQ ID NO: 6 (DNA), SEQ ID NO: 7 (белок)
Ген TMZ-CD154/4-1BBL
1-6: последовательность Козака
7-768: 4-1BBL
769-831: пептид T2A
832-1668: TMZ-CD154
1 GCCACCATGG AATACGCCTC TGACGCTTCA CTGGACCCCG AAGCCCCGTG
M E Y A S D A S L D P E A P W Рамка 1
51 GCCTCCCGCG CCCCGCGCTC GCGCCTGCCG CGTACTGCCT TGGGCCCTGG
P P A P R A R A C R V L P W A L V Рамка 1
101 TCGCGGGGCT GCTGCTGCTG CTGCTGCTCG CTGCCGCCTG CGCCGTCTTC
A G L L L L L L L A A A C A V F Рамка 1
151 CTCGCCTGCC CCTGGGCCGT GTCCGGGGCT CGCGCCTCGC CCGGCTCCGC
L A C P W A V S G A R A S P G S A Рамка 1
201 GGCCAGCCCG AGACTCCGCG AGGGTCCCGA GCTTTCGCCC GACGATCCCG
A S P R L R E G P E L S P D D P A Рамка 1
251 CCGGCCTCTT GGACCTGCGG CAGGGCATGT TTGCGCAGCT GGTGGCCCAA
G L L D L R Q G M F A Q L V A Q Рамка 1
301 AATGTTCTGC TGATCGATGG GCCCCTGAGC TGGTACAGTG ACCCAGGCCT
N V L L I D G P L S W Y S D P G L Рамка 1
351 GGCAGGCGTG TCCCTGACGG GGGGCCTGAG CTACAAAGAG GACACGAAGG
A G V S L T G G L S Y K E D T K E Рамка 1
401 AGCTGGTGGT GGCCAAGGCT GGAGTCTACT ATGTCTTCTT TCAACTAGAG
L V V A K A G V Y Y V F F Q L E Рамка 1
451 CTGCGGCGCG TGGTGGCCGG CGAGGGCTCA GGCTCCGTTT CACTTGCGCT
L R R V V A G E G S G S V S L A L Рамка 1
501 GCACCTGCAG CCACTGCGCT CTGCTGCTGG GGCCGCCGCC CTGGCTTTGA
H L Q P L R S A A G A A A L A L T Рамка 1
551 CCGTGGACCT GCCACCCGCC TCCTCCGAGG CTCGGAACTC GGCCTTCGGT
V D L P P A S S E A R N S A F G Рамка 1
601 TTCCAGGGCC GCTTGCTGCA CCTGAGTGCC GGCCAGCGCC TGGGCGTCCA
F Q G R L L H L S A G Q R L G V H Рамка 1
651 TCTTCACACT GAGGCCAGGG CACGCCATGC CTGGCAGCTT ACCCAGGGCG
L H T E A R A R H A W Q L T Q G A Рамка 1
701 CCACAGTCTT GGGACTCTTC CGGGTGACCC CCGAAATCCC AGCCGGACTC
T V L G L F R V T P E I P A G L Рамка 1
751 CCTTCACCGA GGTCGGAAGG CTCCGGGGAG GGCAGAGGAA GTCTGCTAAC
P S P R S E G S G E G R G S L L T Рамка 1
801 ATGCGGTGAC GTCGAGGAGA ATCCTGGGCC CAGAATGAAG CAGATCGAGG
C G D V E E N P G P R M K Q I E D Рамка 1
851 ACAAGATCGA GGAGATCCTG AGCAAGATCT ACCACATCGA GAACGAGATC
K I E E I L S K I Y H I E N E I Рамка 1
901 GCCAGAATCA AGAAGCTGAT CGGCGAGAGA GGCGGCCGGG GCGGCGGCAT
A R I K K L I G E R G G R G G G I Рамка 1
951 TTTTATGTAT TTACTTACTG TTTTTCTTAT CACCCAGATG ATTGGGTCAG
F M Y L L T V F L I T Q M I G S A Рамка 1
1001 CACTTTTTGC TGTGTATCTT кошка AGAAGGT TGGACAAGAT AGAAGATGAA
L F A V Y L H R R L D K I E D E Рамка 1
1051 AGGAATCTTC ATGAAGATTT TGTATTCATG AAAACGATAC AGAGATGCAA
R N L H E D F V F M K T I Q R C N Рамка 1
1101 CACAGGAGAA AGATCCTTAT CCTTACTGAA CTGTGAGGAG ATTAAAAGCC
T G E R S L S L L N C E E I K S Q Рамка 1
1151 AGTTTGAAGG CTTTGTGAAG GATATAATGT TAAACAAAGA GGAGACGAAG
F E G F V K D I M L N K E E T K Рамка 1
1201 AAAGAAAACA GCTTTGAAAT GCAAAAAGGT GATCAGAATC CTCAAATTGC
K E N S F E M Q K G D Q N P Q I A Рамка 1
1251 GGCACATGTC ATAAGTGAGG CCAGCAGTAA AACAACATCT GTGTTACAGT
A H V I S E A S S K T T S V L Q W Рамка 1
1301 GGGCTGAAAA AGGATACTAC ACCATGAGCA ACAACTTGGT AACCCTGGAA
A E K G Y Y T M S N N L V T L E Рамка 1
1351 AATGGGAAAC AGCTGACCGT TAAAAGACAA GGACTCTATT ATATCTATGC
N G K Q L T V K R Q G L Y Y I Y A Рамка 1
1401 CCAAGTCACC TTCTGTTCCA ATCGGGAAGC TTCGAGTCAA GCTCCATTTA
Q V T F C S N R E A S S Q A P F I Рамка 1
1451 TAGCCAGCCT CTGCCTAAAG TCCCCCGGTA GATTCGAGAG AATCTTACTC
A S L C L K S P G R F E R I L L Рамка 1
1501 AGAGCTGCAA ATACCCACAG TTCCGCCAAA CCTTGCGGGC AACAATCCAT
R A A N T H S S A K P C G Q Q S I Рамка 1
1551 TCACTTGGGA GGAGTATTTG AATTGCAACC AGGTGCTTCG GTGTTTGTCA
H L G G V F E L Q P G A S V F V N Рамка 1
1601 ATGTGACTGA TCCAAGCCAA GTGAGCCATG GCACTGGCTT CACGTCCTTT
V T D P S Q V S H G T G F T S F Рамка 1
1651 GGCTTACTCA AACTCTGA
G L L K L * Рамка 1
SEQ ID NO: 8 (ДНК), SEQ ID NO: 9 (белок)
Ген TMZ-CD154/aIL6R scFv
1-6: последовательность Козака
7-59: SigPep
60-798: aIL6R scFv
799-861: пептид T2A
862-1698: TMZ-CD154
1 GCCACCATGC ACAGCTCAGC ACTGCTCTGT TGCCTGGTCC TCCTGACTGG
M H S S A L L C C L V L L T G Рамка 1
51 GGTGAGGGCC CAGGTCCAAC TGCAGGAGAG CGGTCCAGGT CTTGTGAGAC
V R A Q V Q L Q E S G P G L V R P Рамка 1
101 CTAGCCAGAC CCTGAGCCTG ACCTGCACCG TGTCTGGCTA CTCAATTACC
S Q T L S L T C T V S G Y S I T Рамка 1
151 AGCGATCATG CCTGGAGCTG GGTTCGCCAG CCACCTGGAC GAGGTCTTGA
S D H A W S W V R Q P P G R G L E Рамка 1
201 GTGGATTGGA TACATTAGTT ATAGTGGAAT CACAACCTAT AATCCATCTC
W I G Y I S Y S G I T T Y N P S L Рамка 1
251 TCAAATCCAG AGTGACAATG CTGAGAGACA CCAGCAAGAA CCAGTTCAGC
K S R V T M L R D T S K N Q F S Рамка 1
301 CTGAGACTCA GCAGCGTGAC AGCCGCCGAC ACCGCGGTTT ATTATTGTGC
L R L S S V T A A D T A V Y Y C A Рамка 1
351 AAGATCCCTA GCTCGGACTA CGGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGCAGCC
R S L A R T T A M D Y W G Q G S L Рамка 1
401 TCGTCACAGT CTCCTCAGGT GGCGGTGGCT CGGGTGGCGG TGGCTCGGGC
V T V S S G G G G S G G G G S G Рамка 1
451 GGTGGTGGGT CGGGTGGCGG CGGATCAGAC ATCCAGATGA CCCAGAGCCC
G G G S G G G G S D I Q M T Q S P Рамка 1
501 AAGCAGCCTG AGCGCCAGCG TGGGTGACAG GGTGACCATC ACCTGTCGAG
S S L S A S V G D R V T I T C R A Рамка 1
551 CCAGCCAGGA кошка CAGCAGT TACCTGAATT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA
S Q D I S S Y L N W Y Q Q K P G Рамка 1
601 AAGGCTCCAA AGCTGCTGAT CTACTACACC TCCCGCCTGC ACTCTGGTGT
K A P K L L I Y Y T S R L H S G V Рамка 1
651 GCCAAGCAGA TTCAGCGGTA GCGGTAGCGG TACCGACTTC ACCTTCACCA
P S R F S G S G S G T D F T F T I Рамка 1
701 TCAGCAGCCT CCAGCCAGAG GACATCGCTA CCTACTACTG CCAGCAGGGT
S S L Q P E D I A T Y Y C Q Q G Рамка 1
751 AACACGCTTC кошка ACACGTT CGGCCAAGGG ACCAAGGTGG AAATCAAAGG
N T L P Y T F G Q G T K V E I K G Рамка 1
801 CTCCGGGGAG GGCAGAGGAA GTCTGCTAAC ATGCGGTGAC GTCGAGGAGA
S G E G R G S L L T C G D V E E N Рамка 1
851 ATCCTGGGCC CAGAATGAAG CAGATCGAGG ACAAGATCGA GGAGATCCTG
P G P R M K Q I E D K I E E I L Рамка 1
901 AGCAAGATCT ACCACATCGA GAACGAGATC GCCAGAATCA AGAAGCTGAT
S K I Y H I E N E I A R I K K L I Рамка 1
951 CGGCGAGAGA GGCGGCCGGG GCGGCGGCAT TTTTATGTAT TTACTTACTG
G E R G G R G G G I F M Y L L T V Рамка 1
1001 TTTTTCTTAT CACCCAGATG ATTGGGTCAG CACTTTTTGC TGTGTATCTT
F L I T Q M I G S A L F A V Y L Рамка 1
1051 кошка AGAAGGT TGGACAAGAT AGAAGATGAA AGGAATCTTC ATGAAGATTT
H R R L D K I E D E R N L H E D F Рамка 1
1101 TGTATTCATG AAAACGATAC AGAGATGCAA CACAGGAGAA AGATCCTTAT
V F M K T I Q R C N T G E R S L S Рамка 1
1151 CCTTACTGAA CTGTGAGGAG ATTAAAAGCC AGTTTGAAGG CTTTGTGAAG
L L N C E E I K S Q F E G F V K Рамка 1
1201 GATATAATGT TAAACAAAGA GGAGACGAAG AAAGAAAACA GCTTTGAAAT
D I M L N K E E T K K E N S F E M Рамка 1
1251 GCAAAAAGGT GATCAGAATC CTCAAATTGC GGCACATGTC ATAAGTGAGG
Q K G D Q N P Q I A A H V I S E A Рамка 1
1301 CCAGCAGTAA AACAACATCT GTGTTACAGT GGGCTGAAAA AGGATACTAC
S S K T T S V L Q W A E K G Y Y Рамка 1
1351 ACCATGAGCA ACAACTTGGT AACCCTGGAA AATGGGAAAC AGCTGACCGT
T M S N N L V T L E N G K Q L T V Рамка 1
1401 TAAAAGACAA GGACTCTATT ATATCTATGC CCAAGTCACC TTCTGTTCCA
K R Q G L Y Y I Y A Q V T F C S N Рамка 1
1451 ATCGGGAAGC TTCGAGTCAA GCTCCATTTA TAGCCAGCCT CTGCCTAAAG
R E A S S Q A P F I A S L C L K Рамка 1
1501 TCCCCCGGTA GATTCGAGAG AATCTTACTC AGAGCTGCAA ATACCCACAG
S P G R F E R I L L R A A N T H S Рамка 1
1551 TTCCGCCAAA CCTTGCGGGC AACAATCCAT TCACTTGGGA GGAGTATTTG
S A K P C G Q Q S I H L G G V F E Рамка 1
1601 AATTGCAACC AGGTGCTTCG GTGTTTGTCA ATGTGACTGA TCCAAGCCAA
L Q P G A S V F V N V T D P S Q Рамка 1
1651 GTGAGCCATG GCACTGGCTT CACGTCCTTT GGCTTACTCA AACTCTGA
V S H G T G F T S F G L L K L * Рамка 1
Пример 10
Экспрессия генов TMZ-CD154/4-1BBL/aIL6R scFv в клетках
A. Чтобы проиллюстрировать, что плазмида-TMZ-CD154/4-1BBL и плазмида-aIL6R scFv могут быть использованы для переноса генов TMZ-CD154/4-1BBL/aIL6R scFv и индукции их экспрессии в клетках, плазмида-TMZ-CD154/4-1BBL и плазмида-aIL6R scFv были использованы для трансфекции клеток 293. Результаты показывают, что все трансгены могут быть экспрессированы после трансфекции этими плазмидами (Фиг. 10). См. «Способы и материалы».
B. Чтобы проиллюстрировать, что TMZ-CD154 может быть экспрессирован вместе с другим геном, отделенным пептидом 2A, Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL был использован для трансдукции дендритных клеток. Результаты демонстрируют, что оба трансгена могут быть экспрессированы после трансдукции этими вирусными векторами (Фиг. 11). См. «Способы и материалы».
Пример 11
Активация дендритных клеток комбинацией TMZ-CD154 с лигандом 4-1BB или aIL6R scFv
Чтобы продемонстрировать, что комбинация TMZ-CD154 и лиганда 4-1BB может активировать антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, незрелые дендритные клетки трансдуцировались векторами Ad5/35-TMZ-CD154, Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL или Ad5/35-TMZ-CD154/aIL6R scFv, вектором Mock или оставались нетрансдуцированными. Результаты демонстрируют, что трансдуцированные дендритные клетки созревали и были активированы при экспрессии трансгенов, как показано их экспрессией CD83 (Фиг. 12). Далее, эти комбинации вирусов приводили к активации CD70 на дендритных клетках по сравнению только с TMZ-CD154, даже если TMZ-CD154-содержащий вирус приводил к повышению экспрессии CD70, чем, если дендритные клетки были стимулированы «пустым» вирусом Mock (Фиг. 13). Далее, трансдуцированные дендритные клетки экспрессировали высокий уровень IFNγ и IL12 в группе Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL (Фиг. 14). См. «Способы и материалы».
Пример 12
Активация антиген-специфических T-клеток
Чтобы проиллюстрировать, что дендритные клетки, стимулированные либо комбинацией TMZ-CD154/4-1BBL, либо комбинацией TMZ-CD154/aIL6R, могут активировать антиген-специфические T-клетки, дендритные клетки, загруженные пептидами pp65 CMV, трансдуцированные либо вектором Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL, либо вектором Ad5/35-TMZ-CD154/aIL6R scFv, совместно культивировались с аутологическими T-клетками. Через 11 дней размножения определяли число активированных pp65-специфических T-клеток. Результаты показывают, что дендритные клетки, стимулированные либо Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL, либо Ad5/35-TMZ-CD154/aIL6R scFv, могли активировать и размножать антиген-специфические T-клетки по сравнению с числом антиген-специфических T-клеток среди одноядерных клеток определенного донора (Фиг. 15A). Дендритные клетки, трансдуцированные вирусами, содержащими и TMZ-CD154, и лиганд 4-1BB или aIL6R scFv, индуцировали большее число клеток после размножения, чем дендритные клетки, трансдуцированные вирусами, содержащими только TMZ-CD154 (Фиг. 15B). Вирус и с TMZ-CD154, и с лигандом 4-1BB вызывал размножение также клеток NK в культурах (Фиг. 15C). См. «Способы и материалы».
Пример 13
TMZ-CD154, скомбинированный с другими видами лечения
Чтобы проиллюстрировать, что TMZ-CD154 может быть скомбинирован с другими терапиями, опухолевые клетки подвергали воздействию Ad5/35-TMZ-CD154, Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL или A5/35-TMZ-CD154/aIL6R по отдельности и в комбинации с гемцитабином (100 мкМ). Результаты демонстрируют, что Ad5/35-TMZ-CD154 может быть скомбинирован с другими видами лечения без потери его способности убивать раковые клетки, и что комбинация с другими видами лечения увеличивает клеточную смерть в опухоли (Фиг. 16A). Клетки опухоли поджелудочной железы мыши Panc02 выращивали в мышах C57BL6, обрабатывали онколитическим аденовирусом, несущим TMZ-CD154+4-1BBL, дважды в неделю 6 раз +/- еженедельно (3 раза) гемцитабином (25 мг/кг). Рост опухоли оценивали во времени. C) клетки поджелудочной железы человека Panc01 трансдуцировали, как в (A) выше, и культивировали с или без паклитакселом (2 мкМ). * показывает p<0,05 разности.
См. «Способы и материалы».
Пример 14
in vivo
TMZ-CD154 человека не может активировать CD40 мыши. Поэтому мышиный CD154 был встроен в вектор Ad5, чтобы продемонстрировать, что Ad-CD154-опосредованная иммунная активация могла быть использована для предварительной сенситизации опухоли к T-клеточной терапии путем уменьшения присутствия супрессорных клеток миелоидного происхождения, что позволяет инфильтрацию T-клеток и выживание в окружении опухоли. Результаты показывают, что обработанные Ad-CD154 опухоли уменьшают число супрессорных клеток миелоидного происхождения (Фиг. 17A) и увеличивает их способность привлекать и активировать Т-клетки, инфильтрирующие опухоль (Фиг. 17B). См. «Способы и материалы». Фактически TMZ-CD154 может сам по себе или вместе с 4-1BBL повышать E-селектин и ICAM-I на поверхности эндотелиальных клеток. E-селектин и ICAM-I важны для рекрутинга лимфоцитов путем повышения их привлечения и диапедеза (Фиг. 18).
Пример 15 - Резюме предклинических данных, касающихся LOAd703
Онколитическая способность
Способность LOAd703 индуцировать онколизис опухолевых клеток была оценена на наборе клеточных линий рака поджелудочной железы. Все клеточные линии, трансдуцированные LOAd703, экспрессировали трансгены TMZ-CD40L и 41BBL, и во времени наблюдалась доза-зависимая клеточная смерть. Клетки погибали, главным образом, от апоптоза, что показано путем детектирования аннексина V проточной цитометрией. Однако, иммунные клетки здорового донора, такие как DCs, T-клетки или NK-клетки не погибали от LOAd703-опосредованного онколизиса, даже если детектировалась экспрессия трансгена (DCs, T-клетки). Далее, LOAd703 не реплицировался в нормальных экзокринных клетках поджелудочной железы и демонстрировал регулируемую репликацию этого OV (Фиг. 19). Репликация LOAd703 не ограничивалась раковыми клетками поджелудочной железы, другие опухоли могут быть также затронуты, поскольку большинство опухолей имеет разрегулированный Rb-сигнальный путь. Следовательно, LOAd703 мог эффективно индуцировать онколизис других опухолевых клеточных линий, происходящих от B-клеток лимфомы или аденокарциномы легких. Далее, клеточная смерть в опухоли в результате LOAd703-опосредованного онколизис может быть усилена химиотерапиями, такими как гемцитабин или паклитаксел, обычно используемые для пациентов, страдающих раком поджелудочной железы (Фиг. 16).
LOAd703 использовался как одноразовая доза или множественные (до 6 раз) околоопухолевые инъекции в ксенотрансплантатных мышей с установленными подкожными раковыми опухолями поджелудочной железы человека. LOAd703 мог индуцировать регрессию опухоли в зависимости только от онколизиса, поскольку ксенотрансплантатные модели используют иммунодефицитных мышей. В агрессивных моделях (крупные опухоли), гемцитабин мог существенно увеличить эффективность LOAd703. Эти данные предоставляют разумное объяснение того, что LOAd703 может быть использован в комбинации со стандартными лечением гемцитабином для пациентов с раком поджелудочной железы (Фиг. 16).
Иммуностимуляторный эффект
in vitro
Трансдукция LOAd703 дендритных клеток, происходящих от моноцитов человека, индуцировали их созревание, как показано усилением экспрессии маркеров клеточной поверхности, таких как CD83 и CD70 (Фиг. 12 и 13). Зрелые DCs также экспрессировали и выделяли Th1-промотирующие цитокины IL12, TNFα, IL21 и IFNγ (Фиг. 14). Активированные DCs могут, в свою очередь индуцировать специфические ответы T-клеток и индуцировать размножение и T-клеток, и NK-клеток (Фиг. 15). Следовательно, LOAd703 может мощно индуцировать Th1-опосредованный иммунитет против опухолевой клетки. Немедленные ответы на LOAd703 в цельной крови были продемонстрированы на моделях кровяных петель у здоровых доноров, в которых вирус добавляли к циркулирующей цельной крови . Результат демонстрирует, что LOAd703 вирусного серотипа 5/35 не индуцировал немедленной активации комплемента или выделения цитокинов и был сравним с аденовирусным серотипом 5, кодирующим CD40L, который был использован на пациентах (Фиг. 20).
in vitro
in vivo
in vitro
К сожалению, LOAd703 не может быть исследован на его иммуностимуляторный эффект на моделях животных, поскольку мышиные клетки не имеют CD46, рецептора вирусного захвата. Даже если трансдукция  может быть усилена высоким соотношением вирусов на клетку, трудно достичь высокой дозы вируса на клетку, необходимой для эффективной трансдукции . Тем не менее, мышиная версия LOAd703 (mLOAd703), экспрессирующая TMZ-CD40L и 41BBL мыши была использована в мышиной модели рака поджелудочной железы. Клетки опухоли мыши были трансдуцированы , чтобы экспрессировать два трансгена мыши TMZ-CD40L и 4-1BBL. Трансдуцированные опухолевые клетки были затем инъецированы мышам, и мыши контролировались на рост опухоли. Опухолевые клетки CD40L+4-1BBL+ активировали противоопухолевый иммунитет и образовывали опухоли. Контрольные опухоли, у которых отсутствуют CD40L и 4-1BBL, образовывали опухоли в течение 14 дней.
in vivo
in vivo
Поскольку эндотелиальные клетки экспрессируют CD40, они могут реагировать на сигнализацию CD40L. На моделях, использующих эндотелиальные клетки человека (HUVEC), авторы данного изобретения продемонстрировали, что клетки HUVEC активируют рецепторы присоединения T-клеток, роллинг и диапедез после трансдукции LOAd703 (Фиг. 18). Следовательно, LOAd703 может усилить инфильтрацию T-клеток в паренхиму опухоли, предупреждая таким образом локализацию инфильтрирующих опухоль лимфоцитов в строму, общую проблему опухоль-специфической T-клеточной активности. LOAd703 не трансдуцирует клетки мыши , поскольку мышиные клетки не имеют CD46, как указано выше. Аденовирусы серотипа 5 лучше для трансдукции клеток мыши. Поэтому, авторы данного изобретения использовали вирус Ad5, несущий CD40L мыши, чтобы продемонстрировать, что клетки HUVEC экспрессировали критических важные рецепторы присоединения T-клеток, роллинга и диапедеза после трансдукции, и что перенос генов в опухоль , действительно индуцировали массивную инфильтрацию активированных T-клеток, показывающую, что LOAd703 может так же быть эффективен в отношении первичной опухоли перед T-клеточной терапией (Фиг. 21).
Резюме данных по токсичности in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
Полную эффективность и возможную токсичность, основанных на аденовирусах онколитических вирусов, снабженных иммуностимуляторными генами человека, трудно оценить, используя модели животных. Во-первых, аденовирусы существенно не реплицируются в клетках мышей. В результате, требуется, чтобы онколизис был определен в ксенотрансплантатных моделях с помощью опухолевых клеток человека в иммунодефицитных мышах. Побочная токсичность, например распространение вируса, ведущее к трансдукции и возможному онколизису здоровых клеток не может быть определена на мышах. Тем не менее, данные  показывают, что LOAd703 не реплицируется в нормальных клетках, включая в себя экзокринные клетки поджелудочной железы. Токсичность вследствие экспрессии трансгена также ослабляется, поскольку CD40L человека не реактивен в клетках мыши. Далее, поскольку клетки опухоли мыши не экспрессируют CD46, трансдукция вируса ограничена до  параметров, при которых [число] вирусных частиц на клетку может быть увеличено, чтобы обойти потребность в CD46. Трансдуцированные  раковые клетки поджелудочной железы мыши, экспрессирующие TMZ-CD40L и 4-1BBL мыши, были, поэтому подкожно инъецированы мышам, чтобы определить возможную токсичность экспрессии трансгена. Каких-либо неблагоприятных реакций не наблюдалось после повторных (трехкратных) инъекций.
LOAd703 был также инъецирован повторно (4 раза) в несущих опухоль сирийских хомяков. Аденовирусы показали некоторую онколитическую активность на сирийских хомяках, тем не менее, трансгены человека не функционировали оптимально, и имеется немного инструментов для измерения ясно выраженных противоопухолевых иммунных реакций у хомяков. Тем не менее, не было отмечено никаких неблагоприятных реакций у подвергшихся воздействию хомяков.
Пример 16 - Проверка концепции TMZ-CD154+4-1BBL (LOAd703)
11
11
11
Был разработан протокол клинических испытаний, чтобы получить подтверждение концепции эффективности TMZ-CD154+4-1BBL. Онколитический вирус Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL был получен в соответствии с условиями правил организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP) и будет использоваться как исследовательский медицинский продукт для лечения пациентов с раком поджелудочной железы, диагностированным с 1-3 метастазами, начиная с первого стандартного лечебного применения гемцитабина. В данном исследовании вирус (500 мкл) доставляется под визуальным контролем внутриопухолевой инъекцией, тогда как в других исследованиях с более распространенным заболеванием, может рассматриваться и системная доставка. Эта фаза I/IIa испытаний оценит максимум 17-26 пациентов в зависимости от профиля безопасности. Вкратце, первая группа пациентов получит одиночную дозу Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL (1×10 VP) в дополнение к их стандартному лечению гемцитабин ом. Следующая группа получит повышенную дозу 5×10 VP Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL (Фиг. 22). Если одиночная доза окажется безопасной, следующая группа получит повторные дозы (6 раз) Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL (5×10 VP/воздействие) в дополнение к стандартному лечению (Фиг. 23). Будут контролироваться безопасность пациентов, эффективность [воздействия] на опухоль, фармакокинетика вируса и формирование противовирусных антител, так же как и контроль иммунной активации, включая в себя фенотипирование иммунных клеток и измерения сыворотки или плазмы и биопсии на белковые маркеры, такие как цитокины. Успешная фаза I/IIa испытаний приведет к рандомизированной фазе IIb исследования, сравнивающей [действие] гемцитабина самого по себе с комбинацией гемцитабина и Ad5/35-TMZ-CD154/4-1BBL.
В нижеследующем исследование описано дополнительно.
Исследовательский продукт: LOAd703
Активное вещество: модифицированный аденовирус серотипа 5/35, содержащий управляемый промотором CMV набор трансгенов с трансгенами человека для мембранно-связанного лиганда CD40 (TMZ-CD40L) и полноразмерного 4-1BBL.
Производитель: Медицинский колледж Бэйлор (Baylor College of Medicine), Хьюстон, Техас.
11
Доза: 1-5×10 вирусных частиц (VP) в 500 мкл суспензии на одну инъекцию. Более высокая концентрация вирусных частиц в 500 мкл суспензии может вызывать агрегацию вирусных частиц и не рекомендуется.
12
11
Форма дозы: аденовирусные частицы LOAd703 в суспензии, 650 мкл на флакон, 1×10VP/мл, (малая доза; 2×10 VP/мл).
Введение
LOAd703 будет доставляться внутриопухолевой инъекцией 500 мкл вируса LOAd703 в суспензии под визуальным контролем. В зависимости от локализации опухоли могут быть использованы различные технологии визуального контроля по выбору исследователя.
Для опухолей, легко доступных чрескожной инъекцией [введение] LOAd703 может быть выполнено предпочтительно путем абдоминальной чрескожной инъекцией под контролем ультразвукового исследования метастазов опухоли. Другие опухоли могут быть лучше доступны для эндоскопической инъекции под контролем ультразвукового исследования. Другие технологии визуального контроля, такие как инъекция под контролем компьютерной томографии (CT) могут также быть использованы по выбору исследователя.
Обоснование доз в фазе I/IIa
11
11
11
Первоначальная доза может быть разовой инъекцией 1×10 VP LOAd703 в 500 мкл суспензии за одно применение. Объяснение основывается на предшествующем опыте внутриопухолевых инъекций предшественника AdCD40L, который безопасно инъецировался повторно (4-8 раз) в дозе 2,5×10 VP в 500 мкл суспензии. Более низкая первоначальная доза была выбрана, поскольку LOAd703, в отличие от AdCD40L, представляет собой онколитический вирус. Если эта доза является безопасной для двух включенных пациентов, то следующий уровень дозы составит единичную дозу в 5×10 VP в 500 мкл суспензии, которая будет дана двум дополнительным пациентам. Следующие три пациента получат шесть внутриопухолевых инъекций выбранной дозы LOAd703 каждую вторую неделю. Если это окажется безопасным, множественная доза будет использована на десяти пациентах в фазе IIa части исследования, чтобы подтвердить безопасность в большей группе.
Поскольку иммунная система усиливает реактивность при повторной стимуляции, авторы данного изобретения не ожидали длительной эффективности или токсичности у пациентов, получивших разовую дозу. Поэтому был выбран вариант 2+2 при повышении дозы при использовании разовой дозы, а для множественных доз использовали стандартных 3 пациента, чтобы подтвердить безопасность перед переходом к фазе IIa.
Если дозо-лимитирующая токсичность (DLT) определена, может быть выполнен подбор дозы.
Популяция пациентов
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одной из наиболее агрессивных раковых [опухолей] и имеет высочайший уровень смертности среди всех основных раков. Даже если рак поджелудочной железы являеся орфанным показанием, он занимает четвертое место по смертности в США. Первоначально присутствует небольшое количество симптомов, и поэтому пациентам ставился диагноз, когда опухоль уже метастазировала. Она имеет высокорезистентный к лекарствам профиль, и немногие лекарственные препараты демонстрируют существенное полезное влияние на выживаемость. Стандартным лечением является в настоящее время гемцитабин, но недавно была утверждена для пациентов с метастазировавшим раком поджелудочной железы комбинированная терапия с другими лекарственными препаратами, такими как паклитаксел. 10-20% диагностированных пациентов имели локализованную раковую опухоль, но лишь 20% из них подвергаются хирургическому вмешательству с дополнительной химиотерапией. Выживаемость в течение 1 года составляет для рака поджелудочной железы около 20%, а через 5 лет только 6% остаются в живых. Однако, если рассматривать только подгруппу пациентов, подходящих для хирургического вмешательства, средняя выживаемость через 5 лет составляет 20%.
В данное исследование будут включены пациенты с местнораспространенным заболеванием (единичной локализацией) и таковые с распространенной, но малочисленной (2-3) локализацией заболевания.
Цели исследования и ожидаемые результаты
У пациентов с диагнозом PDAC имеется ограниченный выбор способов лечения и неблагоприятный прогноз, даже если опухоль все еще локализована только в поджелудочной железе или метастазировала только в небольшое количество мест. Локальная иммуностимуляторная генная терапия может иметь ценность для пациентов с единственной или немногочисленными локализациями, однако связана с большим риском. Эти пациенты получают стандартную терапию (гемцитабин), которая не только направлена на опухоль, но также уменьшает уровень супрессорных иммунных клеток. LOAd703 вводится в единственное место поражения. Аденовирусные частицы сами по себе взаимодействуют с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMPs), такими как TLR2 и TLR9, которые приводят к воспалительным реакциям. Онколизис способствует захвату антигена антиген-презентирующими клетками, такими как DCs, и позволяет новым вирионам инфицировать близлежащие клетки, продлевая экспрессию иммуностимуляторных трансгенов. Тогда как TMZ-CD40L может активировать DCs, которые захватывают опухолевые антигены, что стимулирует de novo ответы CTL, NK-клеток и M1- макрофагов и активирует эндотелиальные клетки к увеличению входа лимфоцитов в паренхиму опухоли, 4-1BBL может повторно стимулировать предсуществующие Т-клетки, инфильтрирующие опухоль и NK-клетки, чтобы способствовать уничтожению опухолевых клеток, так же как продление выживания de novo стимулированных иммунных клеток, входящих в опухоль. Вызванный иммунитет может также затем действовать на удаленные опухолевые клетки, чтобы уменьшить скорость роста опухоли или даже предупредить формирование новых метастазных поражений.
Цели
Фаза I
Целью Фазы I является определение осуществимости и безопасности внутриопухолевой инъекции LOAd703, проводящейся под визуальным контролем, в двух уровнях дозы, по два пациента на дозу, и шести повторных инъекций выбранной дозы трем пациентам в ходе лечения согласно стандарту оказания медицинской помощи.
Фаза IIa
Целью Фазы IIa является определение безопасности и эффекта повторной терапии LOAd703, скомбинированной с лечением согласно стандарту оказания медицинской помощи.
Ожидаемые результаты
Фаза I
Компонентом ожидаемого результата Фазы I является оценка токсичности.
1. Токсичность согласно стандартным критериям с использованием медицинского осмотра, гематологического и клинического химического анализа.
2. Копии вируса LOAd703 в крови и биопсиях (только при множественных дозах) с использованием количественного ПЦР реального времени.
3. Антиаденовирусные антитела в крови, с помощью ELISA.
4. Иммунологический белковый профиль в крови и лизатах опухоли (только при множественных дозах) с помощью ELISA и (или) способы, основанные на мультиплексе, такие как ProSeek
5. Иммунологический клеточный профиль в крови по проточной цитометрии и ELISPOT.
6. Эффект на опухоль с помощью подходящей визуализации в зависимости от локализации опухоли и путем контроля маркера опухоли CA 19-9.
Фаза IIa
Предполагаемыми результатами части Фазы IIa являются эффекты на опухоль и безопасность.
1. Токсичность согласно стандартным критериям с использованием медицинского осмотра, гематологического и клинического химического анализа.
2. Копии вируса LOAd703 в крови и биопсиях с использованием количественного ПЦР реального времени..
3. Антиаденовирусные антитела в крови, с помощью ELISA.
4. Иммунологический белковый профиль в крови и лизатах опухоли с помощью ELISA и (или) способы, основанные на мультиплексе, такие как ProSeek.
5. Иммунологический клеточный профиль в крови по проточной цитометрии и ELISPOT.
6. Эффект на опухоль с помощью подходящей визуализации в зависимости от локализации опухоли и путем контроля маркера опухоли CA 19-9.
Организация испытаний
Резюме организации испытаний
Испытания состоят из Фазы I с повышением дозы в единичной или множественной дозах, и подтверждение в Фазе IIa множественными дозами на уровне доз, выбранном в Фазе I. 7 пациентов будут включены в Фазу I, если дозолимитирующая токсичность (DLT) не потребует подбора дозы и дополнительной группы перед началом Фазы IIa. В результате, в Фазе I максимально могут подвергнуться воздействию 7-16 пациентов. Максимум 10 пациентов включаются в компонент Фазы IIa. Путем применения методологии Гехана риск, что будет некорректно признано отсутствие эффекта LOAd703 (OR) на 10 пациентах на Фазе IIa у, по меньшей мере, одного пациента, несмотря на тот факт, что лечение в реальности дает до 30% OR, составляет менее 5%. В целом, предполагается, что в исследовании будет задействовано максимум 17-26 пациентов.
Фаза I
2
11
11
Пациенты должны быть проинформированы об исследовании и подписать информированное согласие, чтобы войти в фазу скрининга для определения соответствия установленным требованиям, включая в себя проверку состояния здоровья и радиологию. Пациенты начинают первый трехнедельный цикл стандартного лечения гемцитабином (1000 мг/м), после чего следовала неделя отдыха. Во время недели отдыха первые два пациента получают одну дозу внутриопухолевой инъекции 1×10 VP LOAd703 под визуальным контролем, а следующие два пациента - одну дозу 5×10 VP LOAd703 (Фиг. 22). Воздействие на вторую пару пациентов может начинаться, когда первые два пациента пройдут заключительный контроль без дозолимитирующей токсичности (DLT). Пациентов оставляют [в больничных условиях] на ночь после воздействия вирусом для наблюдения. Пациенты после этого продолжают другой трехнедельный цикл гемцитабина и однонедельный отдых. Образцы крови берутся для оценки токсичности, фармакокинетики вируса (например, распространение в кровь) и иммунных реакций, как показано на Фиг 22. В ходе скрининга исследования и на заключительном контроле пациенты проходят радиологию, после которой они выходят из исследования.
Если режим единственной дозы оказывается безопасным, следующие три пациента получают множественные (6-ти кратные) внутриопухолевые инъекции каждую вторую неделю в параллель с их стандартным лечением гемцитабиновой терапией (Фиг. 23). Если немедленные реакции после инъекции LOAd703 при повышении дозы у пациентов отсутствуют при первых четырех единичных дозах, пациенты, получающие множественные дозы, не нуждаются в оставлении на ночь [в больничных условиях], но наблюдаются в течение, по меньшей мере, 4 часов после инъекции вируса, на усмотрение исследователя, а затем отпущены из госпиталя.
Биопсии берутся перед первой инъекцией LOAd703 и через неделю после последней инъекции. Образцы крови берутся в различные моменты времени для оценки токсичности, вирусной фармакокинетики (например, распространения в кровь) и иммунных реакций, как показано на Фиг. 23. Каждый второй месяц проводится визуализация размера опухоли. Через шесть месяцев пациенты проходят заключительные контрольные анализы, а затем пациенты выходят из исследования. После участия в испытаниях пациенты продолжают стандартный режим лечения в соответствии с клиническим порядком госпиталя.
Когда три пациента получают воздействие множественных инъекций безопасными дозами, о чем судят, когда у всех эти пациентов проходит, по меньшей мере, две недели после заключительной дозы вируса, может быть начата часть Фазы IIa испытаний.
Если DLTs наблюдается при повышении дозы или множественных дозах, доза должна быть отрегулирована.
Фаза IIa
2
Пациенты должны быть проинформированы об исследовании и подписать информированное согласие, после чего они входят в фазу скрининга, чтобы определить пригодность [к испытаниям], включая в себя определение состояния здоровья и визуализацию [опухоли]. Пациенты начинали свой трехнедельный цикл стандартного лечения гемцитабином (1000 мг/м), после чего следовала неделя отдыха. В течение недели отдыха пациенты начинали получение LOAd703 в виде визуально контролируемой внутриопухолевой инъекции выбранной дозы LOAd703. Инъекции LOAd703 даются каждую вторую неделю в параллель со стандартным лечением гемцитабином. Дается шесть доз вируса.
Биопсии берут перед первой инъекцией и через неделю после последней инъекции LOAd703. Образцы крови берут в различные моменты времени, чтобы оценить токсичность, фармакокинетику вируса (например, распространение в кровь) и иммунные реакции, как показано на Фиг. 23. Каждый второй месяц определяли размер опухоли с помощью радиологии. Через шесть месяцев пациенты проходят заключительные контрольные анализы, и после этого пациенты покидают исследование. После участия в испытаниях пациенты продолжают свой стандартный режим лечения в соответствии с клиническим порядком госпиталя. В целом, 10 пациентов подвергаются воздействию на Фазе IIa.
Длительность исследования
Пациенты будут участвовать в исследовании в течение от двух (при разовой дозе) до шести месяцев (при множественных дозах). В целом, в исследование будет включено 17-26 пациентов. Рассчитывается, что исследование будет завершено за 2 года.
Окончание исследования
Окончание исследования определяется как дата последнего посещения последнего пациента, проходящего испытания.
Конкретные варианты осуществления
1. Нуклеотидная последовательность, содержащая структуру
OD - (L) -TD - ED
в которой
OD представляет собой домен олигомеризации,
L представляет собой линкер, который присутствует, если требуется,
TD представляет собой трансмембранный домен, происходящий из CD154 или из какого-либо трансмембранного белка типа II, и
ED представляет собой внеклеточный домен CD154, выбранный из:
i) SEQ ID NO: 11, т.е. остатков 199-846 в SEQ ID NO: 1,
ii) SEQ ID NO: 11, т.е. остатков 199-846 в SEQ ID NO: 1, но в которой в нуклеиновой кислоте один или более из остатков 397-420 в SEQ ID NO: 1 были делетированы или заменены другой нуклеиновой кислотой, чтобы устранить расщепление молекулы,
iii) SEQ ID NO 12, т.е. остатков 127-846 в SEQ ID NO: 3,
iv) SEQ ID NO: 13, т.е. остатков 127-844 в SEQ ID NO: 4,
v) SEQ ID NO: 14, т.е. остатков 127-844 в SEQ ID NO: 5,
vi) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью определенной в каком-либо из пп. i)-v), или
vii) соответствующего внеклеточного домена CD154 млекопитающих при условии, что нуклеотидная последовательность не содержит внутриклеточного участка CD154, соответствующего эквивалентной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 16.
2. Нуклеотидная последовательность по п. 1, в которой трансмембранный домен происходит из CD154, лиганда OX40 человека или CD70 человека.
3. Нуклеотидная последовательность по п. 2, в которой трансмембранный домен имеет, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с:
i) SEQ ID NO: 17, т.е. остатками 127-198 of SEQ ID NO 1,
ii) SEQ ID NO: 20, т.е. трансмембранным доменом лиганда OX40 человека, или
iii) SEQ ID NO: 22, т.е. трансмембранным доменом CD70 человека.
4. Нуклеотидная последовательность по п. 3, в которой трансмембранный домен имеет, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 22.
5. Нуклеотидная последовательность по п. 4, в которой трансмембранный домен имеет SEQ ID NO: 17.
6. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., в которой домен олигомеризации представляет собой изолейциновую «молнию» или домен тримеризации T4-фибрина.
7. Нуклеотидная последовательность по п. 6, в которой домен олигомеризации представляет собой изолейциновую «молнию», имеющую SEQ ID NO: 23, т.е. остатки 10-108 SEQ ID NO: 1.
8. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., также содержащая последовательность Козака.
9. Нуклеотидная последовательность по п. 8, в которой последовательности Козака соответствуют остатки 1-9 SEQ ID NO: 1.
10. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., имеющая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
11. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., имеющая, по меньшей мере, 95% или 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
12. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., имеющая 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
13. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., в комбинации с иммуномодулятором.
14. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., в которой иммуномодулятор представляет собой ген лиганда 4-1BB или ген анти-IL6R scFv.
15. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп. в комбинации с модулятором сигнального пути.
16. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп., в которой модулятор сигнального пути представляет собой анти-IL6R scFv.
17. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из пп. 1-14 в комбинации с блокатором сигнального пути.
18. Нуклеотидная последовательность по п. 14, имеющая, по меньшей мере, 95%, 98% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8.
19. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп. для использования в медицине.
20. Нуклеотидная последовательность по какому-либо из предшествующих пп. для использования в качестве диагностического инструмента.
21. Белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, как определено в каком-либо из пп. 1-20.
22. Белок, содержащий структуру
OD-(L)-TD-ED,
в которой
OD представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую домену олигомеризации,
L представляет собой линкер, который присутствует, если необходимо,
TD представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую трансмембранному домену, и
ED представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену CD154, выбранная из:
i) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидам SEQ ID NO: 11, т.е. остаткам 199-846 SEQ ID NO: 1,
ii) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидам SEQ ID NO: 11, т.е. остаткам 199-846 SEQ ID NO: 1, но в которых один или более аминокислотных остатков соответствующих нуклеотидам 397-420 SEQ ID NO: 1, делетированы или заменены другой аминокислотой, чтобы устранить расщепление молекулы,
iii) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидам SEQ ID NO 12, т.е. остаткам 127-846 SEQ ID NO: 3,
iv) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидам SEQ ID NO: 13, т.е. остаткам 127-844 SEQ ID NO: 4,
v) аминокислотных остатков, соответствующих нуклеотидам SEQ ID NO: 14, т.е. остаткам 127-844 SEQ ID NO: 5,
vi) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью, определенной в каком-либо из пп. i)-v), или
vii)соответствующего внеклеточного домена CD154 млекопитающих, при том условии, что белок не содержит аминокислотной последовательности, соответствующей внутриклеточному участку CD154, соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15.
23. Белок по п. 22, в котором ED имеет, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности SEQ ID NO: 24.
24. Белок по какому-либо из пп. 21-23, в котором домен олигомеризации представляет собой домен изолейциновой «молнии» или домен тримеризации T4-фибрина.
25. Белок по какому-либо из пп. 21-24, в котором трансмембранный домен происходит из трансмембранного домена CD154 или какого-либо трансмембранного белка типа II.
26. Белок по какому-либо из пп. 22-25, в котором аминокислотная последовательность, соответствующая трансмембранному домену имеет, по меньшей мере, 90%, 95%, 98% или 100% идентичности последовательности SEQ ID NO: 18.
27. Белок по какому-либо из пп. 22-26, в котором один или более остатков SEQ ID NO: 18 может быть делетирован или замещен другой аминокислотой.
28. Белок по п. 27, в котором представляют собой aa14 и (или) aa16.
29. Белок по какому-либо из пп. 21-28, имеющий, по меньшей мере, 90%, 95% или 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.
30. Белок по какому-либо из пп. 21-29, имеющий 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2.
31. Белок по какому-либо из пп. 21-30 для использования в медицине.
32. Белок по какому-либо из пп. 21-31 для использования в лечении заболеваний, определенных в данном документе.
33. Белок, как определено в каком-либо из пп. 21-32 в комбинации с лекарственным веществом, выбранным из противораковых агентов, иммуномодуляторов и других лекарственных веществ, как определено в данном документе, для использования в медицине.
34. Носитель, содержащий нуклеотидную последовательность, как определено в каком-либо из пп. 1-20.
35. Носитель по п. 34, выбранный из плазмид, вирусных векторов, транспозонов, клеток, искусственных клеток и искусственных носителей.
36. Носитель по п. 34 или 35 в форме вируса.
37. Носитель по п. 36, в котором вирус представляет собой вирус аденовирусного серотипа 5/35.
38. Носитель по п. 37, в котором аденовирусный 5/35 вирус имеет промоторный участок/сайт связывания E2F против хода транскрипции от гена E1A, может иметь сайт Sp1 против хода транскрипции от E1A, делецию E1A Δ24, E3 Δ6,7K/gp19K, и набор трансгенов, включая в себя pCMV, и трансген/трансгены встроены после участка гена L5.
39. Носитель по какому-либо из пп. 34-38, содержащий нуклеотид TMZ-CD154, как определено в SEQ ID NO: 1.
40. Носитель по какому-либо из пп. 34-39, также содержащий ген лиганда 4-1BB или ген анти-IL6R scFv.
41. Комбинация двух или более носителей, как определено в каком-либо из пп. 34-40.
42. Комбинация двух носителей, в которой первый носитель определен в каком-либо из пп. 34-41, а второй носитель содержит иммуномодулятор, такой как ген лиганда 4-1BB или ген анти-IL6R scFv.
43. Носитель по какому-либо из пп. 34-42 для использования в медицине.
44. Носитель по какому-либо из пп. 34-43 для использования в лечении заболеваний, определенных в данном документе.
45. Носитель по какому-либо из пп. 34-43 для использования в лечении рака.
46. Носитель по какому-либо из пп. 34-43 для использования в лечении солидных опухолей.
47. Носитель по какому-либо из пп. 34-43 для использования в лечении рака поджелудочной железы.
48. Носитель, как определено в каком-либо из пп. 34-44, в комбинации с лекарственным веществом, выбранным из противораковых агентов, иммуномодуляторов и других лекарственных веществ, как определено в данном документе для использования в медицине.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Lokon Pharma AB
<120> Новые медицинские агенты и их использование
<130> P013660PCT1
<160> 29
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 846
<212> ДНК
<213> Человек Homo sapiens
<220>
<223> TMZ-CD154
<400> 1
gccaccatga gaatgaagca gatcgaggac aagatcgagg agatcctgag caagatctac      60
cacatcgaga acgagatcgc cagaatcaag aagctgatcg gcgagagagg cggccggggc     120
ggcggcattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca     180
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat     240
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc     300
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta     360
aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct     420
caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg     480
gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag     540
ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat     600
cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga     660
ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa     720
caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat     780
gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa     840
ctctga                                                                846
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> Человек Homo sapiens
<220>
<223> TMZ-CD154
<400> 2
Met Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys
1               5                   10                  15
Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly
20                  25                  30
Glu Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val
35                  40                  45
Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu
50                  55                  60
His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp
65                  70                  75                  80
Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser
85                  90                  95
Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe
100                 105                 110
Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser
115                 120                 125
Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
130                 135                 140
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
145                 150                 155                 160
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
165                 170                 175
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
180                 185                 190
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
195                 200                 205
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
210                 215                 220
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
225                 230                 235                 240
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
245                 250                 255
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
260                 265                 270
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
275
<210> 3
<211> 846
<212> ДНК
<213> Лошадь Equus caballus
<220>
<223> TMZ-CD154
<400> 3
gccaccatga gaatgaagca gatcgaggac aagatcgagg agatcctgag caagatctac      60
cacatcgaga acgagatcgc cagaatcaag aagctgatcg gcgagagagg cggccggggc     120
ggcggcattt ttatgtattt gcttactgtt tttcttatca cccagatgat tgtgtcagca     180
ctttttgctg tgtatcttca cagaagattg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat     240
gaagattttg tgttcatgaa aacgatacag agatgcaaca aaggagaggg gcctttatca     300
ttactgaact gtgaggaaat tagaagccag ttcgaaggct tcgtcaagga tataatgcta     360
aatgaagaag tgaagaagaa aggagaaaac tttgaaatgc aaaaaggcga tcaggagcct     420
caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa cagcatctgt tctacagtgg     480
gcccaaaaag gatactacac cataagcaac aacttggtaa ccctcgaaaa tgggaaacag     540
ctggccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat     600
cgggaagctt cgggtcaagc tccatttata gccagcctct gcctgaggtc cgtgagtgga     660
tctgagagaa tcttacttag agcggcaaat acccacagtt cctccaaacc ttgcgggcag     720
caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaac     780
gtgactgatc caagccaagt gagccatggg accggcttca catcttttgg tttactcaaa     840
ctctga                                                                846
<210> 4
<211> 844
<212> ДНК
<213> Собака Canis lupus familiaris
<220>
<223> TMZ-CD154
<400> 4
gccaccatga gaatgaagca gatcgaggac aagatcgagg agatcctgag caagatctac      60
cacatcgaga acgagatcgc cagaatcaag aagctgatcg gcgagagagg cggccggggc     120
ggcggcattt ttatgtattt gcttactgtt tttctcatca cccagatgat tggatcggca     180
ctctttgctg tatatcttca cagaagattg gacaagatag aagatgaaag gaatctttat     240
gaagattttg tgttcatgaa aacgttacag aaatgcaaca aaggggaggg gtccttgtcc     300
ttactgaact gtgaggaaat taaaagccaa tttgaagcct ttctcaagga gataatgcta     360
aacaacgaaa tgaagaaaga agaaaacatt gcaatgcaaa aaggtgatca ggatcctcga     420
attgcagccc atgtcataag tgaggctagt agtaacccag cgtccgttct gcggtgggcg     480
ccaaaagggt actacaccat aagcagcaac ctggtgagcc tcgagaatgg gaaacagttg     540
gccgtgaaaa gacaaggact ctattacgtc tatgcccaag tcaccttctg ctccaatcgg     600
gcagcttcga gtcaagctcc gttcgtcgcc agcctatgcc tccattcccc gagtggaacg     660
gagagagtct tactccgcgc cgcgagctcc cgcggctcgt ccaaaccttg cggccaacag     720
tccatccact tgggaggagt atttgaattg catccaggtg cttcggtgtt cgtcaacgtg     780
actgatccaa gccaagtgag ccacgggacc ggcttcacgt cttttggctt actcaaactc     840
tgaa                                                                  844
<210> 5
<211> 844
<212> ДНК
<213> Кошка Felis catus
<220>
<223> TMZ-CD154
<400> 5
gccaccatga gaatgaagca gatcgaggac aagatcgagg agatcctgag caagatctac      60
cacatcgaga acgagatcgc cagaatcaag aagctgatcg gcgagagagg cggccggggc     120
ggcggcattt ttatgtattt acttactgtg tttctcatca cccagatgat tgggtcagca     180
ctctttgctg tgtatcttca cagaagactg gacaagatag aagatgaaag gaatctttat     240
gaagattttg tgttcatgaa aacattacag aaatgcaaca aaggagaggg ggccttatcc     300
ttactgaact gtgaggaaat taaaagccgg tttgaagcct ttctcaagga gataatgcta     360
aacaaagaaa cgaagaaaga aaaaaatgtt gcaatgcaaa aaggcgacca ggatcctcga     420
gttgcagcac atgtcataag tgaggccagc agtagcacag cgtctgttct ccagtgggcc     480
cccaaaggct actacaccat aagcagcaac ttggtgaccc tcgagaacgg gaagcagctg     540
gccgttaaaa gacaaggact ctattatatc tacgcccaag tcaccttctg ttccaatcgg     600
gaagcttcga gtcaagctcc gttcatagcc agcctctgcc tgcattcccc gagtggatcc     660
gagagagtct tactcagagc tgcaaatgcc cgcagttcct ccaaaccctg tgggcagcaa     720
tccattcact tgggaggagt cttcgaactg catccaggtg cttcggtgtt cgtgaacgtg     780
actgatccga gccaagtgag ccacgggacg ggcttcacgt cttttggctt actcaaactc     840
tgaa                                                                  844
<210> 6
<211> 1668
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TMZ-CD154/4-1BBL
<400> 6
gccaccatgg aatacgcctc tgacgcttca ctggaccccg aagccccgtg gcctcccgcg      60
ccccgcgctc gcgcctgccg cgtactgcct tgggccctgg tcgcggggct gctgctgctg     120
ctgctgctcg ctgccgcctg cgccgtcttc ctcgcctgcc cctgggccgt gtccggggct     180
cgcgcctcgc ccggctccgc ggccagcccg agactccgcg agggtcccga gctttcgccc     240
gacgatcccg ccggcctctt ggacctgcgg cagggcatgt ttgcgcagct ggtggcccaa     300
aatgttctgc tgatcgatgg gcccctgagc tggtacagtg acccaggcct ggcaggcgtg     360
tccctgacgg ggggcctgag ctacaaagag gacacgaagg agctggtggt ggccaaggct     420
ggagtctact atgtcttctt tcaactagag ctgcggcgcg tggtggccgg cgagggctca     480
ggctccgttt cacttgcgct gcacctgcag ccactgcgct ctgctgctgg ggccgccgcc     540
ctggctttga ccgtggacct gccacccgcc tcctccgagg ctcggaactc ggccttcggt     600
ttccagggcc gcttgctgca cctgagtgcc ggccagcgcc tgggcgtcca tcttcacact     660
gaggccaggg cacgccatgc ctggcagctt acccagggcg ccacagtctt gggactcttc     720
cgggtgaccc ccgaaatccc agccggactc ccttcaccga ggtcggaagg ctccggggag     780
ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga atcctgggcc cagaatgaag     840
cagatcgagg acaagatcga ggagatcctg agcaagatct accacatcga gaacgagatc     900
gccagaatca agaagctgat cggcgagaga ggcggccggg gcggcggcat ttttatgtat     960
ttacttactg tttttcttat cacccagatg attgggtcag cactttttgc tgtgtatctt    1020
catagaaggt tggacaagat agaagatgaa aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg    1080
aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag    1140
attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag    1200
aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc    1260
ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac    1320
accatgagca acaacttggt aaccctggaa aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa    1380
ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa    1440
gctccattta tagccagcct ctgcctaaag tcccccggta gattcgagag aatcttactc    1500
agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga    1560
ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa    1620
gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt ggcttactca aactctga                 1668
<210> 7
<211> 551
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TMZ-CD154/4-1BBL
<400> 7
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1               5                   10                  15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20                  25                  30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35                  40                  45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50                  55                  60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85                  90                  95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100                 105                 110
Pro Gly Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
115                 120                 125
Thr Lys Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
130                 135                 140
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
165                 170                 175
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
180                 185                 190
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
195                 200                 205
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
210                 215                 220
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
225                 230                 235                 240
Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Ser Gly Glu
245                 250                 255
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
260                 265                 270
Pro Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys
275                 280                 285
Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly
290                 295                 300
Glu Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu
325                 330                 335
His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp
340                 345                 350
Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser
355                 360                 365
Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe
370                 375                 380
Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser
385                 390                 395                 400
Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
405                 410                 415
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
420                 425                 430
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
435                 440                 445
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
450                 455                 460
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
465                 470                 475                 480
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
485                 490                 495
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
500                 505                 510
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
515                 520                 525
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
530                 535                 540
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
545                 550
<210> 8
<211> 1698
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TMZ-CD154/aLL6R scFv
<400> 8
gccaccatgc acagctcagc actgctctgt tgcctggtcc tcctgactgg ggtgagggcc      60
caggtccaac tgcaggagag cggtccaggt cttgtgagac ctagccagac cctgagcctg     120
acctgcaccg tgtctggcta ctcaattacc agcgatcatg cctggagctg ggttcgccag     180
ccacctggac gaggtcttga gtggattgga tacattagtt atagtggaat cacaacctat     240
aatccatctc tcaaatccag agtgacaatg ctgagagaca ccagcaagaa ccagttcagc     300
ctgagactca gcagcgtgac agccgccgac accgcggttt attattgtgc aagatcccta     360
gctcggacta cggctatgga ctactggggt caaggcagcc tcgtcacagt ctcctcaggt     420
ggcggtggct cgggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgggtggcgg cggatcagac     480
atccagatga cccagagccc aagcagcctg agcgccagcg tgggtgacag ggtgaccatc     540
acctgtcgag ccagccagga catcagcagt tacctgaatt ggtaccagca gaagccagga     600
aaggctccaa agctgctgat ctactacacc tcccgcctgc actctggtgt gccaagcaga     660
ttcagcggta gcggtagcgg taccgacttc accttcacca tcagcagcct ccagccagag     720
gacatcgcta cctactactg ccagcagggt aacacgcttc catacacgtt cggccaaggg     780
accaaggtgg aaatcaaagg ctccggggag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac     840
gtcgaggaga atcctgggcc cagaatgaag cagatcgagg acaagatcga ggagatcctg     900
agcaagatct accacatcga gaacgagatc gccagaatca agaagctgat cggcgagaga     960
ggcggccggg gcggcggcat ttttatgtat ttacttactg tttttcttat cacccagatg    1020
attgggtcag cactttttgc tgtgtatctt catagaaggt tggacaagat agaagatgaa    1080
aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa    1140
agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag    1200
gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt    1260
gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct    1320
gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa    1380
aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc    1440
ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag    1500
tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa    1560
ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg    1620
gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt    1680
ggcttactca aactctga                                                  1698
<210> 9
<211> 563
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TMZ-CD154/aIL6R scFv
<400> 9
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1               5                   10                  15
Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro
20                  25                  30
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
35                  40                  45
Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85                  90                  95
Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
145                 150                 155                 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
165                 170                 175
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
180                 185                 190
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr
195                 200                 205
Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210                 215                 220
Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile
225                 230                 235                 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
245                 250                 255
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser
260                 265                 270
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Lys
275                 280                 285
Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile
290                 295                 300
Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly Gly
305                 310                 315                 320
Arg Gly Gly Gly Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr
325                 330                 335
Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu
340                 345                 350
Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met
355                 360                 365
Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu
370                 375                 380
Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile
385                 390                 395                 400
Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln
405                 410                 415
Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala
420                 425                 430
Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr
435                 440                 445
Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr
450                 455                 460
Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys
465                 470                 475                 480
Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys
485                 490                 495
Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn
500                 505                 510
Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly
515                 520                 525
Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr
530                 535                 540
Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu
545                 550                 555                 560
Leu Lys Leu
<210> 10
<211> 261
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Полноразмерный CD154
<400> 10
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20                  25                  30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35                  40                  45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50                  55                  60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85                  90                  95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100                 105                 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115                 120                 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130                 135                 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145                 150                 155                 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165                 170                 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180                 185                 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195                 200                 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210                 215                 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225                 230                 235                 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245                 250                 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 11
<211> 648
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки 199-846 Seq_1
<400> 11
catagaaggt tggacaagat agaagatgaa aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg      60
aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag     120
attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag     180
aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc     240
ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac     300
accatgagca acaacttggt aaccctggaa aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa     360
ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa     420
gctccattta tagccagcct ctgcctaaag tcccccggta gattcgagag aatcttactc     480
agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga     540
ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa     600
gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt ggcttactca aactctga                  648
<210> 12
<211> 720
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки 127-846 Seq_3
<400> 12
atttttatgt atttgcttac tgtttttctt atcacccaga tgattgtgtc agcacttttt      60
gctgtgtatc ttcacagaag attggacaag atagaagatg aaaggaatct tcatgaagat     120
tttgtgttca tgaaaacgat acagagatgc aacaaaggag aggggccttt atcattactg     180
aactgtgagg aaattagaag ccagttcgaa ggcttcgtca aggatataat gctaaatgaa     240
gaagtgaaga agaaaggaga aaactttgaa atgcaaaaag gcgatcagga gcctcaaatt     300
gcggcacatg tcataagtga ggccagcagt aaaacagcat ctgttctaca gtgggcccaa     360
aaaggatact acaccataag caacaacttg gtaaccctcg aaaatgggaa acagctggcc     420
gttaaaagac aaggactcta ttatatctat gcccaagtca ccttctgttc caatcgggaa     480
gcttcgggtc aagctccatt tatagccagc ctctgcctga ggtccgtgag tggatctgag     540
agaatcttac ttagagcggc aaatacccac agttcctcca aaccttgcgg gcagcaatcc     600
attcacttgg gaggagtatt tgaattgcaa ccaggtgctt cggtgtttgt caacgtgact     660
gatccaagcc aagtgagcca tgggaccggc ttcacatctt ttggtttact caaactctga     720
<210> 13
<211> 718
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки 127-844 Seq_4
<400> 13
atttttatgt atttgcttac tgtttttctc atcacccaga tgattggatc ggcactcttt      60
gctgtatatc ttcacagaag attggacaag atagaagatg aaaggaatct ttatgaagat     120
tttgtgttca tgaaaacgtt acagaaatgc aacaaagggg aggggtcctt gtccttactg     180
aactgtgagg aaattaaaag ccaatttgaa gcctttctca aggagataat gctaaacaac     240
gaaatgaaga aagaagaaaa cattgcaatg caaaaaggtg atcaggatcc tcgaattgca     300
gcccatgtca taagtgaggc tagtagtaac ccagcgtccg ttctgcggtg ggcgccaaaa     360
gggtactaca ccataagcag caacctggtg agcctcgaga atgggaaaca gttggccgtg     420
aaaagacaag gactctatta cgtctatgcc caagtcacct tctgctccaa tcgggcagct     480
tcgagtcaag ctccgttcgt cgccagccta tgcctccatt ccccgagtgg aacggagaga     540
gtcttactcc gcgccgcgag ctcccgcggc tcgtccaaac cttgcggcca acagtccatc     600
cacttgggag gagtatttga attgcatcca ggtgcttcgg tgttcgtcaa cgtgactgat     660
ccaagccaag tgagccacgg gaccggcttc acgtcttttg gcttactcaa actctgaa       718
<210> 14
<211> 718
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки 127-844 Seq_5
<400> 14
atttttatgt atttacttac tgtgtttctc atcacccaga tgattgggtc agcactcttt      60
gctgtgtatc ttcacagaag actggacaag atagaagatg aaaggaatct ttatgaagat     120
tttgtgttca tgaaaacatt acagaaatgc aacaaaggag agggggcctt atccttactg     180
aactgtgagg aaattaaaag ccggtttgaa gcctttctca aggagataat gctaaacaaa     240
gaaacgaaga aagaaaaaaa tgttgcaatg caaaaaggcg accaggatcc tcgagttgca     300
gcacatgtca taagtgaggc cagcagtagc acagcgtctg ttctccagtg ggcccccaaa     360
ggctactaca ccataagcag caacttggtg accctcgaga acgggaagca gctggccgtt     420
aaaagacaag gactctatta tatctacgcc caagtcacct tctgttccaa tcgggaagct     480
tcgagtcaag ctccgttcat agccagcctc tgcctgcatt ccccgagtgg atccgagaga     540
gtcttactca gagctgcaaa tgcccgcagt tcctccaaac cctgtgggca gcaatccatt     600
cacttgggag gagtcttcga actgcatcca ggtgcttcgg tgttcgtgaa cgtgactgat     660
ccgagccaag tgagccacgg gacgggcttc acgtcttttg gcttactcaa actctgaa       718
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки 1-22 SEQ ID NO: 10
<400> 15
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Ile Ser Met Lys
20
<210> 16
<211> 66
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ID остатки 1-22 SEQ ID 10
<400> 16
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc     60
atgaaa                                                                66
<210> 17
<211> 78
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки 127-198 SEQ ID NO: 1
<400> 17
ggcggcattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca     60
ctttttgctg tgtatctt                                                   78
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TD остатки 127-198 SEQ ID 1
<400> 18
Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu
20
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Трансмембранный домен OX40 человека
<400> 19
Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys
1               5                   10                  15
Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser Ala Leu
20                  25
<210> 20
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TD, происходящий из лиганда Ox40 человека
<400> 20
ctattgctgg tggcctctgt aattcaggga ctggggctgc tcctgtgctt cacctacatc     60
tgcctgcact tctctgctct t                                               81
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Трансмембранный домен CD70 человека
<400> 21
Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Cys Leu
1               5                   10                  15
Val Val Cys Ile
20
<210> 22
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TD, происходящий из CD70 человека (aa 18-38)
<400> 22
ctgcgggctg ctttggtccc attggtcgcg ggcttggtga tctgcctcgt ggtgtgcatc     60
<210> 23
<211> 99
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Изолейциновая "молния" - остатки 10-108 Seq_1
<400> 23
agaatgaagc agatcgagga caagatcgag gagatcctga gcaagatcta ccacatcgag     60
aacgagatcg ccagaatcaa gaagctgatc ggcgagaga                            99
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ED - белок, соответствующий Seq_11
<400> 24
His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp
1               5                   10                  15
Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser
20                  25                  30
Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe
35                  40                  45
Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser
50                  55                  60
Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
65                  70                  75                  80
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
85                  90                  95
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
100                 105                 110
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
115                 120                 125
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
130                 135                 140
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
145                 150                 155                 160
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
165                 170                 175
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val
180                 185                 190
Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser
195                 200                 205
Phe Gly Leu Leu Lys Leu
210
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TD белок, соответствующий Seq_17
<400> 25
Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu
20
<210> 26
<211> 261
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD40L человека с измененными 114, 115, 117-120
<400> 26
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20                  25                  30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35                  40                  45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50                  55                  60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85                  90                  95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100                 105                 110
Met Pro Arg Gly Glu Glu Asp Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115                 120                 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130                 135                 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145                 150                 155                 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165                 170                 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180                 185                 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195                 200                 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210                 215                 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225                 230                 235                 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245                 250                 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 27
<211> 281
<212> PRT
<213> Лошадь Equus
<220>
<223> TMZ-CD154 лошади
<400> 27
Ala Thr Met Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu
20                  25                  30
Ile Gly Glu Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ile Phe Met Tyr Leu Leu
35                  40                  45
Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Val Ser Ala Leu Phe Ala Val
50                  55                  60
Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Lys Gly Glu
85                  90                  95
Gly Pro Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Arg Ser Gln Phe Glu
100                 105                 110
Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Glu Glu Val Lys Lys Lys Gly
115                 120                 125
Glu Asn Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Glu Pro Gln Ile Ala Ala
130                 135                 140
His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp
145                 150                 155                 160
Ala Gln Lys Gly Tyr Tyr Thr Ile Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu
165                 170                 175
Asn Gly Lys Gln Leu Ala Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr
180                 185                 190
Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Gly Gln Ala Pro
195                 200                 205
Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Arg Ser Val Ser Gly Ser Glu Arg Ile
210                 215                 220
Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln
225                 230                 235                 240
Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser
245                 250                 255
Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly
260                 265                 270
Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
275                 280
<210> 28
<211> 280
<212> PRT
<213> Собака Canis lupus familiaris
<220>
<223> TMZ-CD154 собаки
<400> 28
Ala Thr Met Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu
20                  25                  30
Ile Gly Glu Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ile Phe Met Tyr Leu Leu
35                  40                  45
Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val
50                  55                  60
Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Leu Gln Lys Cys Asn Lys Gly Glu
85                  90                  95
Gly Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu
100                 105                 110
Ala Phe Leu Lys Glu Ile Met Leu Asn Asn Glu Met Lys Lys Glu Glu
115                 120                 125
Asn Ile Ala Met Gln Lys Gly Asp Gln Asp Pro Arg Ile Ala Ala His
130                 135                 140
Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Asn Pro Ala Ser Val Leu Arg Trp Ala
145                 150                 155                 160
Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Ile Ser Ser Asn Leu Val Ser Leu Glu Asn
165                 170                 175
Gly Lys Gln Leu Ala Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Ala
180                 185                 190
Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Ala Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe
195                 200                 205
Val Ala Ser Leu Cys Leu His Ser Pro Ser Gly Thr Glu Arg Val Leu
210                 215                 220
Leu Arg Ala Ala Ser Ser Arg Gly Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu His Pro Gly Ala Ser Val
245                 250                 255
Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe
260                 265                 270
Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
275                 280
<210> 29
<211> 280
<212> PRT
<213> Кошка Felis catus
<220>
<223> TMZ-CD154 кошки
<400> 29
Ala Thr Met Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu
20                  25                  30
Ile Gly Glu Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ile Phe Met Tyr Leu Leu
35                  40                  45
Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val
50                  55                  60
Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Leu Gln Lys Cys Asn Lys Gly Glu
85                  90                  95
Gly Ala Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Arg Phe Glu
100                 105                 110
Ala Phe Leu Lys Glu Ile Met Leu Asn Lys Glu Thr Lys Lys Glu Lys
115                 120                 125
Asn Val Ala Met Gln Lys Gly Asp Gln Asp Pro Arg Val Ala Ala His
130                 135                 140
Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala
145                 150                 155                 160
Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Ile Ser Ser Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn
165                 170                 175
Gly Lys Gln Leu Ala Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala
180                 185                 190
Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe
195                 200                 205
Ile Ala Ser Leu Cys Leu His Ser Pro Ser Gly Ser Glu Arg Val Leu
210                 215                 220
Leu Arg Ala Ala Asn Ala Arg Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln
225                 230                 235                 240
Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu His Pro Gly Ala Ser Val
245                 250                 255
Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe
260                 265                 270
Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
275                 280
<---