СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ЭНТЕРИТА ИНДЕЕК
METHOD TO DETECT SPECIFIC ANTIBODIES TO VIRUS OF HAEMORRAGIC ENTERITIS OF TURKEYS

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, эпизоотологии, а именно к способам выявления специфических антител [AT] к вирусу геморрагического энтерита индеек [ГЭИ].
Известен способ выявления специфических AT к ГЭИ в сыворотке крови птицы с использованием реакции иммуноферментного анализа [ИФА] (Domeruth, C.H., W.B. Gross and F.W.Pierson. Hemorrhagic enteritis of turkeys. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. 3rd ed. H.G. Purchase et al. eds. Kendall/Hunt Publishing Co. Dubuque, IA. pp.82-84. 1989), который является аналогом предлагаемого способа. Однако данный тест не позволяет проводить обнаружение AT к ГЭИ без использования коммерческих тест-систем, связанных с видовой принадлежностью исследуемых образцов, а также требует использования технически сложного и дорогостоящего оборудования для регистрации результатов реакции.
Наиболее близким в техническом отношении и принятым за прототип является способ обнаружения AT к вирусу Ньюкаслской болезни птиц в сыворотке крови птицы с использованием реакции задержки гемагглютинации [РЗГА]. (Czifra G, M Nilsson, D.J.Alexander, R.Manvell, S.Kecskemeti, B.E.Engstrom. Detection of PMV-1 specific antibodies with a monoclonal antibody blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4): 691-703). Однако данный тест не позволяет выявлять AT к вирусу ГЭИ.
Задачей заявляемого решения является расширение арсенала диагностических методов для выявления специфических антител к вирусу ГЭИ. Поставленная задача решается тем, что предложен способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек в сыворотке крови или плазме крови птицы с использованием реакции непрямой гемагглютинации [РНГА], отличающийся тем, что при приготовлении эритроцитарного диагностикума для РНГА необходимо использовать эритроциты кролика, с осажденным на них антигеном вируса ГЭИ, а при постановке реакции - указанный эритроцитарный диагностикум, 96-луночные микропланшеты с V-образным дном и гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм.
Способ осуществляют следующим образом.
Материалы и оборудование: вакцина против геморрагического энтерита индеек «Dindoral», фосфатно-солевой буфер [PBS] рН 7,2-7,4, 1М водный раствор аланина, забуференный 10% раствор формалина, центрифуга, шейкер.
Протокол получения диагностикума.
1. Отмыть эритроциты из 2 мл крови кролика PBS в соотношении 1:5 двукратно, центрифугируя суспензию при 2000 об/мин 1 минуту.
2. Ресуспендировать полученную эритроцитарную массу PBS до 12 мл.
3. Добавить к 12 мл суспензии 1,2 мл 10% формалина.
4. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 2 часа.
5. Осадить центрифугированием при 2000 об/мин в течение 1 минуты.
6. Ресуспендировать осадок PBS, доведя до объема 6 мл.
7. Добавить 100 мкл предварительно разведенной, в соответствии с инструкцией и осветленной центрифугированием при 10000 об/мин 2 минуты, вакцины против геморрагического энтерита «Dindoral».
8. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 1 час.
9. Добавить 600 мкл 1М раствора аланина.
10. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 10 мин.
11. Осадить центрифугированием при 2000 об/мин в течение 1 минуты.
12. Отмыть осадок PBS в соотношении 1:5 однократно, центрифугируя суспензию при 2000 об/мин 1 минуту.
13. Ресуспендировать осадок PBS, доведя объем до 40 мл.
Полученной суспензии эритроцитов достаточно для проведения исследования 400 проб. Срок хранения диагностикума при +4°С - 1 месяц.
Образцы для исследования: пробы сыворотки крови, плазмы крови.
РНГА проводят по следующему протоколу:
1. Подготовить гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм (коммерческий препарат - Sefadex G25): ресуспендировать их в PBS 1:2; инкубировать для набухания при 22-24°С 2 часа. Использовать осадок гранул.
2. Приготовить серийные двукратные разведения исследуемых сывороток начиная с разведения 1:4 в микропланшетах с V-образным дном в объеме 100 мкл в PBS.
3. Внести в лунки 96-луночного микропланшета с V-образным дном по 50 мкл приготовленных по п.1 гранул Sefadex G25.
4. Внести в лунки микропланшета по 100 мкл эритроцитарного диагностикума.
5. Инкубировать при температуре 22-24°С до формирования зонтиков 2-5 часов, можно на ночь.
В случае положительной реакции в толще гранул сефадекса формируется зонтик, в случае отрицательной реакции эритроциты с иммобилизированным на них вирусным антигеном беспрепятственно просачиваются между гранулами и оседают на дне V-образных лунок в виде пуговки.
Для иллюстрации способа приведены примеры.
Пример 1
Результаты РНГА с сывороткой крови индейки разных возрастов. Отражена динамика прироста титров антител к вирусу ГЭИ у птицы с птицефабрики, неблагополучной по геморрагическому энтериту индеек.
Таблица 1
возраст
Всего проб
отр.
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1 дн.
12
8
2
2
6 дн.
12
2
4
4
1
1
10 дн.
12
4
6
2
13 дн.
12
6
4
2
18 дн.
12
2
2
2
2
4
19 дн.
12
2
2
4
2
2
25 дн.
12
2
2
6
2
57 дн.
12
12
122 дн.
12
12
Примечание: вакцинация живой вакциной против геморрагического энтерита индеек проводилась в возрасте 22 дней.
Как следует из таблицы, уровень антител к дате вакцинации (22 дня) не снижается за счет естественного распада трансовариальных антител, а растет. Таким образом, одной из ведущих проблем на стационарно неблагополучных по ГЭИ птицефабриках является наличие антител до вакцинации, что способно снизить эффективность вакцинации.
Пример 2
Титры антител в РНГА к вирусу ГЭИ на пике заболевания у реконвалесцентов.
Таблица 2
Титры антител к вирусу ГЭИ
Возраст 19 дн. на пике падежа, кол-во проб
Возраст 36 дн. на спаде падежа, кол-во проб
0
9
1:2
1:4
1:8
1
1
1:16
1:32
9
% реагирующих (за положительные принимаем 1:8 и выше)
10%
100%
Как следует из таблицы 2, защитными титрами антител в РНГА в очаге заболевания можно считать значение 1:32.