Гистохимический способ выявления белков на основе Кумасси и способ подготовки и хранения гистологических препаратов
HISTOCHEMICAL METHOD FOR DETECTING PROTEINS BASED ON COOMASSIE AND METHOD FOR PREPARING AND STORING HISTOLOGICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к гистохимическим методам (молекулярно-биологическим методам) и может быть использовано в гистохимических исследованиях на срезах  микропрепаратов.
Аналог описан в учебном пособии «Основы гистохимии» автор Буданцев А.Ю. (с.7).
Известный способ окрашивания белков при помощи бромфенолового синего проводится в присутствии сулемы. Для окрашивания необходимо блокирование сульфгидрильных групп белков. Окраска срезов бромфеноловым синим возможна после фиксации материала в 10% растворе формалина, жидкости Карнуа, но при этом используют и срезы из свежей ткани, а также образцов, залитых в парафин.
Способы окрашивания гистологических препаратов приведены https://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/histology/histology/r1/t1.html, где в разделе приведены типы красителей.
Недостатком использования  бромфенолового синего красителя является то, что он выявляет суммарные белки, предлагаемый нами способ   выявляет кислые белки.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является  – оценка эффективности действия ангтигельминтных препаратов путем  выявления кислых белков как наиболее показательных при аналогичных исследованиях.
В настоящее время кислые белки не выявляются гистохимическими методами, выявляются суммарные белки. Как показали наши исследования именно анализ кислых белков наиболее демонстративно для выявления механизма действия антигельминтиков.
Предлагается гистохимический способ выявления белков на основе Кумасси включающий приготовление буферного раствора, приготовление раствора Кумасси, подготовка гистологических препаратов  и окрашивание гистологических препаратов.
Отличием является то,  буферный раствор получают путем смешения 0,2 молярного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 молярного раствора  лимонной кислоты с рН 2,2, рН 4,0, рН 8,0, краситель Кумасси бриллиантовый синий R-250 в количестве 0,25 г растворяют в приготовленном буферном растворе используя поочередно разный уровень рН, фильтруют, выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре,  гистологические парафиновые срезы помещают на лоточек по 2-3 стекла со срезами, депарафинируют и капельницей наносят раствор красителя Кумасси бриллиантовый синий R-250 на поверхность срезов на 10 мин.
3
Для осуществления гистохимического способа выявления белков на основе Кумасси предлагается способ подготовки и хранения гистологических препаратов включающий взятие материала не более 1см, фиксацию путем  помещения в 10% нейтральный раствор формалина,  промывку в воде, обезвоживание и пропитку гистологических материалов.
Отличием является то, что для этапа пропитки готовят смесь из парафина, воска и стеарина в соотношении 6:2:2.
Предлагаемый способ осуществляется без использования электрофореза.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
Техника способа окрашивания:
Приготовление красителя  Кумасси бриллиантовый синий R-250 на форфатно-цитратном буфере:
Этап 1. Приготовление растворов буферного и красителя
1). Приготовление фосфатно-цитратного буфера:
2
4
2
В своих исследованиях, соблюдая общие принципы приготовления буферных растворов, мы готовили фосфатно-цитратный буферный раствор путем смешения 0,2 молярного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия, содержащего 35,61 г NаНР0-2Н0 в 1 л и 0,1 молярного раствора лимонной кислоты. Мы использовали растворы с рН 2,2-4,0 и 8,0. (Цитратно-фосфатных буферах  по Мак-Ильвейну в  пределах рН=2,2-8).
Использование растворов с добавлением фосфорнокислого натрия  в том, что фосфат хорошо растворим в воде, и обладает чрезвычайно высокой буферной способностью.
Готовим не сразу растворы с разными рН, а по очередности окрашивания. Буферы не хранили, всегда применяли свежеприготовленный буфер.
1.1  Фосфатно-цитратный буфер с рН-2,2.
1.2  Фосфатно-цитратный буфер с рН-4,0
1.3  Фосфатно-цитратный буфер с рН-8,0
Этап 2. Приготовление раствора красителя Кумасси бриллиантового синегоR-250.
2.1. 0,25 г этого красителя  Кумасси бриллиантовый синий R-250 растворяли  в мерной колбе, вместимостью 250 мл, используя для этого приготовленный буфер, взбалтывали несколько раз, затем фильтровали и оставляли на 20-30 мин при комнатной температуре.
Этап 3. Техника окрашивания гистологических препаратов, то есть проведение гистохимических реакций взаимодействия ткани (срезы паразита) с красителем.
З.1. Для пропитки готовят смесь из парафина, воска и стеарина в соотношении 6:2:2.
3.2. Материал заливали в подготовленную смесь, изготавливая  блоки, из которых готовили  срезы путем нарезки их на микротоме. Приготовленные гистологические срезы, проводили через систему депарафинирования общепринятым способом, то есть доводили их до окрашивания. Гистологические  помещали на лоточек по 2-3 стекла со срезами, и капельницей наносили раствор красителя Кумасси бриллиантовый синий R-250 на поверхность срезов на 10 мин. Время фиксировали песочными часами.
3.3. После покраски промывали дистиллированной водой несколько раз таким же капельным  способом (можно посмотреть плотность окрашивания под микроскопом, но, как правило, в этом нет необходимости, так как последующие действия удаляют перекрашивание).
3.4. Весь процесс, до момента заключения срезов, проводили, используя  капельный способ, а именно: по каплям наносили воду на срезы за 1 мин, затем слили воду со стекол в лоток, наносили на 2-3 сек капли 40°спирта на срезы, затем использовали спирты восходящей концентрации 50°, 60°, 70°, 90°, 96°(по 2-3 сек. в каждом), спирт-ксилол (1:1) – 20 сек, ксилол, заключение в полистирол (срезы с каплей полистирола закрывают покровным стеклом).
3.4. Готовые окрашенные гистологические препараты оставляли на 15-20 минут, затем удаляли лишний полистирол с боков покровного стекла. Гистохимический анализ проводили в световом микроскопе.
При приготовлении раствор красителя  Кумасси бриллиантовый синий R-250 становится красным, но затем, когда будет происходить окрашивание, то проявляется синий цвет.
У паразитов ткани, содержащих кислые белки,  хорошо окрашиваются все структуры. При действии антигельминтиков на паразита, картина окрашивания меняется и распределение кислых белков может быть снижаться в разной степени или полностью отсутствовать. Таким образом, можно дифференцировать распределение их скопления, как в норме, так и патологии, а также использовать как критерий оценки эффективности действия антигельминтиков. Значение кислых белков для паразитов.
Применение в качестве раствора красителя Кумасси бриллиантового синего позволяет получить заявленный технический результат, а именно оценить эффективность действия ангтигельминтных препаратов путем  выявления кислых белков как наиболее показательных при аналогичных исследованиях. Как показали исследования, на практике использование заявленного способа дает наибольшую достоверность при исследовании ангтигельминтных препаратов.
Для того, чтобы наиболее качественно подготовить для заявленного способа гистологические материалы, предлагается способ подготовки и хранения гистологических материалов.
Предлагаемая смесь из парафина, воска и стеарина в соотношении 6:2:2. Предлагаемая смесь наиболее практична в данном случае. Наличие воска в смеси в предлагаемом соотношении позволяет достичь пластичности за более короткое время при этапе депарафинирования, а присутствие стеарина делает более прочным блоки содержащие материал для исследований. Разница температур плавления позволяет достичь результата.
Кроме того, полученный путем смешения парафина, воска и стеарина в соотношении 6:2:2 препарат в целом более пластичен при срезе, в отличие от парафина, который при нарезании может крошиться. Улучшается хранение гистологических материалов.
Процесс подготовки и хранения  гистологических материалов для исследования влияет на качественные результаты проводимых гистологических исследований.
Признаки предлагаемых способов находятся в причинно-следственной связи с заявленным техническим результатом и являются существенными.