КОМПОЗИЦИЯ БИОЧЕРНИЛ ДЛЯ ЛИСТА ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ДЕРМЫ, СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННОГО ЛИСТА ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ДЕРМЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОЗИЦИИ И ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННЫЙ ЛИСТ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ДЕРМЫ, ИЗГОТОВЛЕННЫЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПОСОБА ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЧЕРНИЛ
BIO-INK COMPOSITION FOR SHEET FOR DERMA REGENERATION, METHOD FOR MANUFACTURE OF INDIVIDUALIZED SHEET FOR DERMA REGENERATION, USING BIO-INK COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество на основании патентной заявки Кореи №10-2018-0012220, поданной в ведомство по интеллектуальной собственности Кореи 31 января 2018 г., все содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к композиции биочернил для листа для регенерации дермы, способу изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с ее использованием и индивидуализированному листу для регенерации дермы, изготовленному с использованием указанного способа производства.
Уровень техники
Кожа - самый большой орган, который покрывает всю поверхность человеческого тела, и функционирует, чтобы предотвратить потерю жидкостей организма, предотвратить приток вредных материалов и микроорганизмов извне и защитить наш организм от физического раздражения, радиации, ультрафиолетовых лучей, и тому подобное. Кожа имеет различные вспомогательные органы, такие как волосяные фолликулы, волосы, потовые и сальные железы, и, таким образом, является важным сложным органом, выполняющим различные функции в дополнение к функции защитной пленки. Кожа примерно делится на эпидермис, дерму и подкожную ткань (гиподерму).
Дерма - это слой под эпидермисом, который обеспечивает субстрат, поддерживающий различные структуры, такие как кровеносные сосуды и нервы, и состоит из коллагена, эластичных волокон и внеклеточного матрикса. Дерма в основном состоит из сосочкового слоя, в верхней части которого много фибробластов и распределены микрососуды, а также из ретикулярной соединительной ткани, в которой много коллагеновых волокон.
Часть ткани кожи может быть повреждена в результате ожогов, травмы, кожных заболеваний, и в этом случае используют метод аутотрансплантации для имплантации ткани кожи человека с целью заживления поврежденной ткани или для реконструктивной хирургии, метод гомотрансплантации или аллотрансплантации для имплантации кожи другого человека, а также метод гетеротрансплантации или ксенотрансплантации для имплантации кожи животного. Среди этих методов метод аутотрансплантации является наиболее идеальным, но имеет недостатки, заключающиеся в том, что, когда участок лечения широкий, участок, на котором можно закрепить ткань, ограничен, а участок сбора остается новым участком раны. Гомотрансплантат или аллотрансплантат служит для содействия миграции и заживлению клеток вокруг раны.
Искусственная кожа - это трехмерно реконструированная кожа с использованием клеток кожи и компонентов кожи, таких как коллаген и эластин, и называется кожным эквивалентом или реконструированной кожей, поскольку искусственная кожа состоит из живых фибробластов и кератиноцитов, которые имеют морфологические и физиологические характеристики, аналогичные характеристикам реальной кожи. Искусственная кожа была разработана в 1980-х годах для лечения пациентов, которым требуется имплантация кожи из-за сильных ожогов, но их собственная кожа не может быть имплантирована из-за слишком большой тяжести ожога или слишком широкой пораженной области, и в ходе постоянного улучшения и исследования, искусственная кожа в настоящее время используется в различных областях, таких как исследования физиологии кожи, оценка раздражения кожи и оценка эффективности кожи. Однако существующая искусственная кожа имеет проблему, заключающуюся в том, что происходит явление, при котором дерма постепенно сокращается во время культивирования ткани в способе изготовления, и когда дерма резко сокращается, искусственная кожа полностью деформируется.
В случае существующих клеточных терапевтических агентов используют способ имплантации аллогенных клеток с использованием аллогенных клеток или способ трансплантации аутологичных клеток. Имплантация аллогенных клеток обладает паракринным эффектом, но имеет проблему, заключающуюся в том, что организм рассматривает аллогенные клетки как инородное тело, и аллогенные клетки в конечном итоге исчезают. Кроме того, когда аутологичные клетки имплантируются методом инъекции, весьма вероятно, что клетки исчезнут, когда нет среды (например, каркаса) для роста клеток, и в конечном итоге трудно увидеть вызванный эффект введенными клетками.
Кроме того, аутологичная имплантация, при которой часть аутологической ткани изолируется, культивируется и размножается, имеет такие проблемы, как возможность рубцевания донорского участка и отсутствие донорского участка, когда участок для имплантации широк, и аллотрансплантат и ксенотрансплантат имеют такие проблемы, как иммунные реакции отторжения или индукция воспаления. Следовательно, существует потребность в разработке способа, способного заменить или регенерировать поврежденную кожу и минимизировать побочные эффекты, как описано выше.
Документы предшествующего уровня техники Патентный документ Кореи №10-1710615.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Настоящее изобретение было создано при решении задачи предоставления композиции биочернил для листа для регенерации дермы, способного минимизировать реакцию отторжения имплантата и изготовления индивидуализированного для пациента листа для регенерации дермы, способа изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с его использованием и листа регенерации дермы.
Техническое решение
Один из примеров осуществления настоящего изобретения обеспечивает композицию биочернил для листа для регенерации дермы, при этом композиция биочернил включает первую жидкость, содержащую стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; и вторую жидкость, содержащую тромбин.
Другой пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы, включающий: а) получение трехмерных данных участка дефекта дермы с использованием 3D-сканера; b) формирование первого слоя, соответствующего форме полученных трехмерных данных, с использованием первой жидкости, содержащей стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; с) формирование второго слоя путем нанесения второй жидкости, содержащей тромбин, на первый слой; и d) формирование листа для регенерации дермы, позволяя первому слою и второму слою взаимодействовать друг с другом.
Еще один пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает индивидуализированный лист для регенерации дермы, полученный с использованием указанного способа изготовления.
Преимущества изобретения
Композиция биочернил для листа для регенерации дермы согласно настоящему изобретению и способ изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с его использованием имеют преимущество в том, что может быть изготовлен лист для регенерации дермы, подходящий для поврежденной ткани кожи пациента. В частности, способом изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением может изготавливать лист для регенерации дермы, имеющий форму, соответствующую пораженной области, с помощью трехмерного сканирования точной формы пораженной области.
Лист для регенерации дермы согласно настоящему изобретению имеет преимущество в том, что имплантацию можно проводить без реакции иммунного отторжения, а также в том, что здоровые клетки могут быть имплантированы в пораженный участок, поскольку лист для регенерации дермы может быть изготовлен в пределах короткого промежутка времени.
Описание чертежей
На фиг. 1 показан способ соответственно изготовления первой жидкости и второй жидкости для изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 2 показаны фотографии, подтверждающие жизнеспособность клеток индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 1.
На фиг. 3 показана фотография, на которой кожа удалена в эксперименте на животных для экспериментального примера 2.
На фиг. 4 показан контроль, полученный в соответствии с экспериментальным примером 2, и индивидуализированный лист для регенерации дермы согласно этому примеру.
На фиг. 5 показан прогресс имплантированных индивидуализированных листов для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 2.
На фиг. 6 показаны результаты окрашивания трихромом Массона в эксперименте на животных в соответствии с экспериментальным примером 2.
На фиг. 7 показано наличие или отсутствие ангиогенеза в месте имплантации в результате эксперимента на животных в соответствии с экспериментальным примером 2 с использованием окрашивания CD31.
Осуществление изобретения
Когда в настоящем описании один элемент расположен «на» другом элементе, это включает не только случай, когда один элемент приводится в контакт с другим элементом, но также случай, когда еще один элемент присутствует между двумя элементами.
Когда одна часть «включает» один составной элемент в настоящем описании, если иное специально не описано, это не означает, что другой составной элемент исключен, но означает, что еще один составной элемент может быть дополнительно включен.
Далее настоящее изобретение далее будет описано подробно.
Один из примеров осуществления настоящего изобретения обеспечивает композицию биочернил для листа для регенерации дермы, при этом композиция биочернил включает первую жидкость, содержащую стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; и вторую жидкость, содержащую тромбин.
Композиция биочернил для листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением является двухжидкостной, и первая жидкость и вторая жидкость могут наноситься последовательно, а затем вступать в реакцию с образованием листа для регенерации дермы. В частности, тромбин во второй жидкости может реагировать с фибриногеном в первой жидкости с образованием фибриновой сети, которая может служить для достаточной фиксации стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, и внеклеточного матрикса.
Стромально-васкулярная фракция жировой ткани включает стволовые клетки, полученные из жировой ткани. Предпочтительно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может по существу не включать клетки (например, адипоциты, эритроциты, другие стромальные клетки и т.п.), кроме стволовых клеток, полученных из жировой ткани, и материалов внеклеточного матрикса, и, более предпочтительно, может полностью не включать другие клетки и материалы внеклеточного матрикса.
Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена из жировой ткани аллогенного животного или гетерологичного животного. Предпочтительно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена из аутологичной жировой ткани. Более конкретно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена с использованием жировой ткани пациента или животного, подлежащего лечению. Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена путем выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани (SVF), внеклеточного матрикса (ЕСМ) и т.п. в форме микро- или нанокластера SVF/ECM из жировой ткани, а также чистые стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани (SVF), и внеклеточный матрикс (ЕСМ) также можно отделить друг от друга и использовать. Например, стромальная сосудистая фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена из жировой ткани с использованием набора Lipocell от Tiss'you. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим, и стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена с использованием способа, набора для экстракции и тому подобного, известных в данной области.
5
7
Согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения концентрация стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, в первой жидкости может составлять от 10 клеток/мл до 10 клеток/мл. Когда концентрация стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, находится в пределах описанного выше диапазона, изготавливаемый индивидуализированный лист для регенерации дермы может эффективно дифференцировать стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, в клетки дермы в месте имплантации.
Чем выше содержание стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, тем сильнее эффект, но когда ее содержание чрезвычайно велико, эффект может быть менее выражен из-за влияния внеклеточного матрикса, фибриногена и т.п. Следовательно, содержание стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, может уравновешивать содержание других компонентов в первой жидкости.
Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может использоваться с внеклеточным матриксом, полученным из жировой ткани, для стимулирования дифференцировки в клетки дермы. В частности, внеклеточный матрикс, полученный из жировой ткани, имеет биохимические факторы, необходимые для роста и дифференцировки клеток, необходимых для заживления раны в пораженной области, и может обеспечивать физическую среду, в которой стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может дифференцироваться в клетки дермы и способствовать заживлению раны.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения внеклеточный матрикс может быть выделен из жировой ткани (или клеток) аллогенного или гетерологичного животного. Более того, внеклеточный матрикс может быть выделен из фиброзной ткани (или клеток) аллогенного или гетерологичного животного. В частности, внеклеточный матрикс может быть выделен из аутологичной жировой ткани (или клеток) или аутологичной фиброзной ткани (или клеток). Более конкретно, внеклеточный матрикс может быть выделен с использованием адипоцитов пациента или животного, подлежащего лечению.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения внеклеточный матрикс может быть очищен от клеток.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения внеклеточный матрикс может представлять собой частицы, имеющие диаметр от 5 мкм до 100 мкм. В частности, внеклеточный матрикс можно очистить от клеток и измельчить физическим способом и приготовить в форме частиц. Кроме того, внеклеточный матрикс может быть получен с использованием способов, известных в данной области.
Фибриновый матрикс посредством реакции фибриногена первой жидкости и тромбина второй жидкости может служить для фиксации стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, и внеклеточного матрикса.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения содержание внеклеточного матрикса в первой жидкости может составлять от 20 до 60 мас. %. В частности, содержание внеклеточного матрикса в первой жидкости может составлять от 20 до 50 мас. %. Когда содержание внеклеточного матрикса находится в пределах указанного выше диапазона, жизнеспособность клеток, дифференцирующихся в клетки дермы, может быть улучшена для эффективного достижения регенерации участка дефекта дермы. Когда содержание внеклеточного матрикса слишком велико, содержание фибриногена и тромбина для изготовления листа для регенерации дермы относительно снижено, так что может возникнуть проблема, состоящая в том, что трудно поддерживать форму полученного листа для регенерации дермы. Кроме того, когда содержание внеклеточного матрикса слишком низкое, содержание фибриногена и тромбина для изготовления листа для регенерации дермы сильно увеличивается, и в результате изготовленный лист для регенерации дермы становится слишком твердым, так что может возникнуть проблема, состоящая в том, что трудно ожидать эффекта, обусловленного внеклеточным матриксом. Следовательно, предпочтительно повышать жизнеспособность клеток, дифференцирующихся в клетки дермы, путем регулирования содержания внеклеточного матрикса до указанного выше диапазона и, кроме того, для облегчения сохранения формы листа для регенерации дермы.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения концентрация фибриногена в первой жидкости может составлять 4-50 мг/мл. Кроме того, концентрация фибриногена в первой жидкости может составлять 5-40 мг/мл или 7-30 мг/мл.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения концентрация тромбина во второй жидкости может составлять 30-250 МЕ/мл. Кроме того, концентрация тромбина во второй жидкости может составлять 40-250 МЕ/мл, 40-100 МЕ/мл или 45-80 МЕ/мл.
Когда концентрация фибриногена и тромбина находится в пределах вышеуказанных диапазонов, скорость отверждения может быть обеспечена надлежащим образом и может поддерживаться равномерное распределение стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани. Посредством этого может поддерживаться равномерное распределение клеток в индивидуализированном листе для регенерации дермы, который будет изготовлен, и может быть эффективно реализована способность клеток к дифференцировке после имплантации индивидуализированного листа для регенерации дермы. Более того, когда концентрации фибриногена и фибриногена ае находятся в пределах вышеуказанных диапазонов, это обеспечивает преимущества, заключающиеся в том, что форма изготовленного листа для регенерации дермы может сохраняться в хорошем состоянии, и лист может быть соответствующим образом имплантирован в пораженный участок, поддерживая соответствующую твердость.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения первая жидкость может дополнительно включать апротинин. Апротинин является ингибитором протеолитических ферментов, секретируемых поджелудочной железой, и представляет собой полипептид, состоящий в общей сложности из 58 аминокислот. Апротинин обычно получают из легких крупного рогатого скота и, как известно, обладает кровоостанавливающим действием, подавляя разложение фибрина в крови.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения апротинин может быть включен в количестве от 900 кининоген инактивирующих единиц (KIU) до 1,1000 KIU, в частности 1,000 KIU, на мл первой жидкости.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения вторая жидкость может представлять собой тромбин, растворенный в растворе хлорида кальция. В частности, вторая жидкость может включать от 40 до 250 ME тромбина и от 5 до 6,5 мг хлорида кальция на мл второй жидкости.
Растворителем первой жидкости и второй жидкости может быть вода, в частности физиологический раствор. Кроме того, фибриноген в первой жидкости и тромбин во второй жидкости могут быть получены с помощью коммерчески доступного набора фибринового клея.
Поскольку реакция первой жидкости и второй жидкости завершается в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут, композиция биочернил для листа для регенерации дермы имеет преимущество в том, что лист для регенерации дермы может быть немедленно изготовлен с использованием 3D-принтера в месте лечения.
В настоящем изобретении в качестве адгезива используется фибриновый клей, включающий фибриноген и тромбин, который может обеспечить более высокую вязкость, чем вязкость адгезива на основе гиалуроновой кислоты или коллагенового адгезива, так что индивидуализированный лист для регенерации дермы имеет превосходную силу связывания с пораженной областью, и, кроме того, может сохранять высокую прочность.
Другой пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы, включающий: а) получение трехмерных данных участка дефекта дермы с использованием 3D-сканера; b) формирование первого слоя, соответствующего форме полученных трехмерных данных, с использованием первой жидкости, содержащей стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; с) формирование второго слоя путем нанесения второй жидкости, содержащей тромбин, на первый слой; и d) формирование листа для регенерации дермы путем обеспечения взаимодействия первого слоя со вторым слоем.
Кроме того, согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, способ дополнительно включает: этап a1) изготовление формы, соответствующей форме трехмерных данных, полученных с использованием 3D-принтера, где на этапе b) первая жидкость наносится в форму.
На этапе а) может быть использовано оборудование для 3D-сканирования или оборудование для 3D-печати, известное в данной области техники. Кроме того, на этапе a1) может быть использовано оборудование для 3D-печати, известное в данной области техники. Форма может служить для фиксации трехмерной формы при нанесении первой и второй жидкости. Форму можно удалить после формирования индивидуализированного листа для регенерации дермы. Форма может быть сформирована с использованием биосовместимого полимера, обычно используемого в данной области.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этапы b) и с) могут выполняться с использованием струйной печати или 3D-печати. В частности, на этапах b) и с) может использоваться печатающее устройство, имеющее два или более сопел, известное в данной области техники, и трехмерная форма может быть создана путем выпуска первой жидкости и второй жидкости из соответствующих сопел. Кроме того, когда формируется первый слой, равномерное распределение клеток может быть получено с использованием 3D-принтера или струйного принтера, тем самым предотвращая явление агрегации клеток и т.п. в индивидуализированном листе для регенерации дермы.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этапы b) и с) могут повторяться поочередно. В частности, когда необходимо сформировать лист для регенерации дермы большого объема, этапы b) и с) поочередно выполняются для ламинирования слоев, а именно: "первый слой / второй слой / первый слой / второй слой", и затем слои могут быть коагулированы, чтобы сформировать каркас для регенерации хряща.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этап d) может быть завершен в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут. В частности, на этапе d) реакция может проводиться в течение от 3 до 7 минут, и первый слой и второй слой могут вступать в реакцию с образованием индивидуализированного листа для регенерации дермы.
В способе изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы согласно настоящему изобретению стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, и внеклеточный матрикс могут быть выделены из жировой ткани пациента или животного и получены без отдельной стадии культивирования. После того, как первая жидкость приготовлена с использованием того же самого, индивидуализированный лист для регенерации дермы может быть изготовлен в течение короткого периода времени и имплантирован в пораженный участок, так что активность клеток может быть максимальной.
Кроме того, поскольку лист для регенерации дермы может быть изготовлен такой же формы, как и форма пораженной области, с помощью способа изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы, естественное состояние после восстановления может быть реализовано путем минимизации зазора между местом имплантации и листом регенерации дермы.
Еще один пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает индивидуализированный лист для регенерации дермы, изготовленный с использованием указанного способа изготовления.
Как описано выше, индивидуализированный лист для регенерации дермы может быть имплантирован после изготовления в форме, подходящей для пораженной области, в течение короткого периода времени с использованием жировой ткани пациента или животного. Может быть запланировано восстановление поврежденной кожи путем имплантации регенерирующего слоя дермы в пораженный участок и защиты пораженного участка повязкой. После имплантации индивидуализированного листа регенерации дермы, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, дифференцируется в клетки дермы; дифференцированные клетки дермы могут быть зафиксированы во внеклеточном матриксе, полученном из жировой ткани, и фибриновом матриксе для восстановления поврежденной кожи.
Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры для конкретного описания настоящего изобретения. Однако примеры согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы в различные формы, и не следует понимать, что объем настоящего изобретения ограничен примерами, которые будут описаны ниже. Примеры настоящего описания предоставлены для более полного объяснения настоящего изобретения специалистам в данной области техники.
Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани (SVF) Клетки стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани (SVF), получали с помощью следующих этапов.
3
1. Приблизительно 60 см жировой ткани выделяли путем липосакции под руководством врача в стерильной операционной, добавляли в том же объеме 0,075% коллагеназы к ткани, и полученная смесь вступала в реакцию путем инкубации при встряхивании при 230 об/мин при температуре 37°С в течение 30 минут.
2. После описанной выше реакции продукт реакции центрифугировали со скоростью 420 g (относительная центробежная сила (RCF)) при 25°С в течение 10 минут, и в результате центрифугирования продукт реакции разделяли на три слоя гранул SVF, слой коллагеназы и масляный слой.
3. После удаления верхнего раствора за исключением слоя гранул SVF и ресуспендирования слоя гранул SVF в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), волокнистые материалы и оставшиеся примеси ресуспендированного слоя SVF были удалены с использованием 100 мкм нейлонового фильтра (сетчатый фильтр).
6
6
4. После ресуспендирования раствора, содержащего отфильтрованный SVF, и трехкратного центрифугирования все оставшиеся материалы были удалены за исключением осадка в нижнем слое, и затем в результате подсчета ядерных клеток с использованием счетчика клеток можно было подтвердить, что было получено от 0,26×10 до 2,2×10 клеток SVF.
Внеклеточный матрикс (ЕСМ)
После того, как жировая ткань была выделена путем липосакции под руководством врача в стерильной операционной, жировая ткань была смешана с физиологическим раствором. Кроме того, после механического выделения ЕСМ из жировой ткани с использованием гомогенизатора в условиях 12000-20000 об/мин выделенный ЕСМ центрифугировали. После центрифугирования осадка процесс центрифугирования повторяли 3-5 раз, в конечном итоге получали ЕСМ.
Экспериментальный пример 1 эксперимент in vitro для подтверждения жизнеспособности клеток в индивидуализированном листе для регенерации дермы
На фиг. 1 показан способ соответственно получения первой жидкости и второй жидкости для изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением. В частности, после того как полученные SVF и ЕСМ были смешаны с использованием шприца для смешивания, первая жидкость была приготовлена путем смешивания 1 мл жидкости апротинина, в которой 4,5 мг/мл фибриногена были смешаны со смесью SVF/ECM с использованием шприца для смешивания. В этом случае содержание ЕСМ в первой жидкости было доведено до 10-20 мас.%, как показано на фиг. 2.
Далее был приготовлен раствор хлорида кальция, в котором был растворен тромбин, имеющий тот же объем, что и приготовленная первая жидкость. В этом случае концентрация тромбина во второй жидкости была доведена до 7,8-250 МЕ/мл как показано на фиг. 2.
После того, как первый слой был сформирован путем нанесения полученной первой жидкости, был изготовлен индивидуализированный лист для регенерации дермы путем нанесения полученной второй жидкости на первый слой.
На фиг. 2 показаны фотографии, подтверждающие жизнеспособность клеток индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 1. В частности, на фиг. 2 подтверждена жизнеспособность клеток индивидуализированного листа для регенерации дермы с использованием конфокального микроскопа (Leica, TCS SP5) после окрашивания зеленым флуоресцентным кальцеином-АМ для подтверждения наличия живых клеток и окрашивания красным флуоресцентным гомодимером-1 этидия для подтверждения того, что плазматическая мембрана была потеряна. Согласно фиг. 2, когда содержание ЕСМ составляло 20 мас. %, взаимодействие между SVF и ЕСМ было улучшенным, так что была активирована пролиферация клеток, и также, когда концентрация тромбина составляла 50 МЕ/мл или более, это могло подтверждать, что пролиферация клеток дополнительно активируется.
Экспериментальный пример 2 эксперимент на животных (эксперимент in vivo) для подтверждения эффективности индивидуализированного листа для регенерации дермы
Чтобы проверить эффективность листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением, был удален кусок кожи четырехмесячной свиньи размером 2,5×2,5 см, а затем были получены SVF и ЕСМ из жировой ткани свиньи таким же образом, как описано выше. На фиг. 3 показана фотография, на которой кожа удалена в эксперименте на животных для экспериментального примера 2.
6
Далее, после того как полученные SVF и ЕСМ были смешаны с использованием шприца для смешивания, первая жидкость была приготовлена путем смешивания 1 мл жидкости апротинина, в которой 9 мг/мл фибриногена были смешаны со смесью SVF/ECM с использованием шприца для смешивания. В этом случае содержание ЕСМ в первой жидкости составляло 20 мас.%, а концентрация SVF составляла 6,25×10 клеток/мл. Далее была приготовлена вторая жидкость, содержащая тромбин в концентрации 50 МЕ/мл.
Более того, после сканирования удаленной области кожи с помощью 3D-сканера подготовленная первая жидкость и вторая жидкость были последовательно нанесены с использованием 3D-принтера 3D Bio (INVIVO, ROKIT), а затем изготовлен индивидуализированный лист для регенерации дермы путем отверждения первой жидкости и второй жидкости в течение 5 минут. После того как лист для регенерации дермы, изготовленный, как описано выше, был имплантирован в область удаленной кожи и подвергнут обработке повязкой, степень восстановления кожи наблюдалась в течение 14 дней.
В качестве контроля индивидуализированный лист для регенерации дермы был изготовлен таким же образом, как описано выше, но без включения ЕСМ в первую жидкость, и имплантирован в удаленный участок кожи и подвергнут обработке повязкой, а затем наблюдали степень восстановления кожи в течение 14 дней.
На фиг. 4 показан контроль, полученный в соответствии с экспериментальным примером 2, и индивидуализированный лист для регенерации дермы согласно этому примеру.
На фиг. 5 показан прогресс имплантированных индивидуализированных листов для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 2. В частности, фиг. 5 показаны фотографии, на которых имплантированы индивидуализированные листы регенерации дермы в соответствии с контролем (только SVF) и примером (SVF+ЕСМ), и показан прогресс от даты имплантации (0 дней) до 14 дня после имплантации.
На фиг. 6 показаны результаты окрашивания трихромом Массона в эксперименте на животных в соответствии с экспериментальным примером 2. В частности, на фиг. 6 показана область неповрежденной кожи (нормальной), область удаленной кожи (только дефект) и область (SVF+ЕСМ), в которой индивидуализированный лист для регенерации дермы в соответствии с примером имплантирован в область удаленного кожного покрова, которая была окрашена трихромом Массона и наблюдалась через 14 дней после удаления кожи. Согласно фиг. 6, можно подтвердить, что, когда кожу удаляют, а затем оставляют на 14 дней (только дефект), в дерме образуется коллагеновый комплекс с очень низкой концентрацией. Напротив, можно подтвердить, что при имплантации индивидуализированного листа для регенерации дермы согласно примеру (SVF+ЕСМ) дерма четко окрашивается в синий цвет, что говорит о том, что в дерме образуется комплекс коллагена с высокой плотностью, и также подтверждает, что дерма четко окрашена в красный цвет, что говорит об образовании кератина, который является составным компонентом эпидермиса, цитоплазмы и т.п.
На фиг. 7 показано наличие или отсутствие ангиогенеза в месте имплантации в результате эксперимента на животных в соответствии с экспериментальным примером 2 с использованием окрашивания CD31. В частности, на фиг. 7 наблюдают, регенерируются ли кровеносные сосуды путем окрашивания CD31 на каждой из областей неповрежденной кожи (нормальной), удаленной кожи (только дефект) и области (SVF+ЕСМ), в которой индивидуализированный лист для регенерации дермы согласно примеру имплантируют в удаленную область через 14 дней после удаления кожи. Согласно фиг. 7, можно подтвердить, что, когда кожу удаляют, а затем оставляют на 14 дней (только дефект), ангиогенные области, окрашенные в коричневый цвет, появляются очень спорадически и узко. Напротив, можно подтвердить, что при имплантации индивидуализированного листа для регенерации дермы согласно примеру (SVF+ЕСМ) имеется большое количество ангиогенных областей, окрашенных в коричневый цвет.
Основываясь на различных экспериментальных результатах в экспериментальном примере 2, можно увидеть, что когда индивидуализированный лист для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением имплантируется в кожу, регенерация кожи ускоряется, и более того, также стимулируется ангиогенез в коже, так что область, в которой кожа удалена, может быть восстановлена аналогично исходной коже.