Оптическое картирование волн возбуждения в светочувствительной иммортализованной культуре кардиомиоцитов

УДК 577.345

О. В. Галайдыч1, И. С. Ерофеев1, К. И. Агладзе1,2

1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Научно-образовательный центр «Вионанофизика» institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, Киото, Япония

Оптическое картирование волн возбуждения в светочувствительной иммортализованной культуре

кардиомиоцитов

В работе методом оптического картирования было проведено исследование свойств спиральных волн, возникающих в возбудимой культуре клеток HL-1, трансфецирован-ных светочувствительным ионным каналом ChR2-YFP. В результате с помощью модуляции возбудимости культуры светом удалось продемонстрировать индуцированное смещение центра спиральной волны и разрыв фронта спиральной волны с последующим образованием пары спиральных волн. Кроме того, с помощью стимуляции культуры внешними электрическими импульсами было показано вытеснение спиральных волн серией круговых волн большей частоты на границу образца. Этим же методом был продемонстрирован разрыв фронтов круговых волн на однородном участке монослоя клеток при превышении критической частоты.

Ключевые слова: оптическое картирование, спиральные волны, клеточная культура, канальный родопсин-2.

1. Введение

Исследования механизмов распространения возбуждения в сердце лежат в основе разработки методов борьбы с сердечными аритмиями. С одной стороны, наиболее ценными являются данные, получаемые непосредственно на препаратах сердца, таких как пер-фузируемые полоски желудочковой стенки или целые сердца (препарат Лангендорфа), индивидуально-анатомические особенности реального сердца затрудняют установление общих фундаментальных закономерностей, не зависящих от индивидуальных особенностей, и даже видоспецифичности сердца. С другой стороны, компьютерное моделирование позволяет фундаментально идеализировать модель сердца, но, к сожалению, не может принять в расчет целый ряд параметров, оказывающих влияние на распространение возбуждения в реальной ткани, например, в силу недостаточной изученности функционирования многих ионных каналов. Культура сердечной ткани служит моделью, позволяющей упростить систему, избавив ее от ненужных индивидуальных особенностей, в то же время сохраняющей в качестве основы генерации возбуждения функционирование реальных клеточных систем.

В последние 10-15 лет первичная культура кардиомиоцитов ярко продемонстрировала свой потенциал при исследовании процессов, приводящих к различного рода нарушениям сердечного ритма [1-9]. Однако динамическое интерактивное управление параметрами возбудимой среды на основе монослоя сердечных клеток, особенно необходимое при исследовании нестационарных процессов, стало возможным только с развитием методов фотоконтроля сердечной ткани [10,11].

В настоящей работе демонстрируется фотоуправление монослоями кардиомиоцитов иммортализованной клеточной линии HL-1, трансфецированных светочувствительным ионным каналом ChR2-RFP [12,13].

2. Материалы и методы Клеточная культура HL-1

Для культивирования клеточной линии HL-1 использовалась среда Клейкомба [14]. Среда приготовлялась из следующих реагентов без дальнейшей очистки: L-Glu L-Glutamine

(глутамин), Invitrogen; FBS Fetal bovine serum (сыворотка из крупного рогатого скота), Sigma Aldrich; PBS Phosphate buffer standard (стандартный фосфатный буфер), Invitrogen; HF Human Fibronectin (человеческий фибронектин), Invitrogen; Trvpsin/EDTA Trypsin (трипсин 0,25%, EDTA 0,2%), Invitrogen; PS Penicilin/Streptomvcin (пеници-лин/стрептомицин, 1 мл PS содержит 100 ед/мл пеницилина, 100 ед/мл стрептомицина) Invirogen. Клетки выращивались во флаконах Т25 (площадь дна 25 см2) в CO-2-инкубаторе при 37 °С. Поскольку используемые среды содержали фенолред, то можно было наблюдать за кислотным состоянием клеток, следя за окраской среды.

Приготовление образцов для оптического картирования

Покровные стекла (Corning, квадратные с длиной ребра 22 мм) обрабатывались этиловым спиртом, обжигались на огне и помещались в шестилуночный культуральный планшет. Клеточная суспензия наносилась на покровные стекла по 700 тыс. клеток на образец. Клетки культивировались при стандартных условиях [14,15]. На третьи сутки клетки образовывали 100% монослой (конфлюэнтный монослой). На этой стадии образцы были готовы к покраске и последующему оптическому картированию. Для наблюдения и регистрации волн возбуждения использовался кальциевый индикатор Fluo-4, согласно стандартной методике [16].

Оптическое картирование

Для оптического картирования использовалась установка, состоящая из следующих компонентов:

1) Высокочувствительная скоростная видеокамера (Andor IXon3, Andor Technologies) на основе ПЗС-матрицы для наблюдения волн в реальном времени и записи видеоряда.

2) Ртутная лампа (Olympus U-RFL-T), служащая источником света для возбуждения флуоресценции.

3) Оптический микроскоп (Olympus MVX10).

4) Фильтровый куб (Olympus U-M49002XL): фильтр возбуждения вырезал спектр излучения ртутной лампы в диапазоне поглощения флуоресцентного красителя; фильтр излучения пропускал свет в диапазоне длин волн излучения флуоресцентного красителя.

Лазерный модуль стимуляции

Для того чтобы осуществить стимуляцию светом, установка по оптическому картированию была оснащена дополнительно лазерным модулем:

1) Ионный лазер (Melles Griot 35-LAP-321-230) с регулируемой длиной волны излучения.

2) Оптический чопер (Avesta Project, OCV-4800FD) позволял подавать свет импульсами. Контролирующий блок оптического чоппера позволял регулировать частоту и длительность импульсов.

3) Оптоволоконный кабель с оптическими конденсорами на обоих концах для сфокусированного подведения импульсов в плоскость образца.

На рис. 1 изображены фотография и схема комплекса, на котором проводились исследования по зарождению, распространению и взаимодействию волн возбуждения на культуре ткани.

Рис. 1. Комплекс по оптическому картированию: установка для наблюдения волн возбуждения на культуре ткани с возможностью ее стимуляции световыми и электрическими сигналами. 1 - лазер; 2 оптический чопер с блоком для контроля; 3, 5 оптические конденсоры; 4 оптоволоконный кабель; 6 - стойка под образец; 7 - микроскоп; 8 - видеокамера на базе ПЗС-матрицы; 9 - генератор электрических сигналов; 10 осциллограф

Обработка данных

Обработка данных производилась при помощи программы ImageJ и плагинов к данной программе, полученых с сайта http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Определение скорости распространения волны в среде, пространственновременная развертка

Данные, полученные при оптическом картировании волн возбуждения, представляют собой последовательность изображений, снятых с определенной частотой, фактически образующих видеоряд. При этом каждая фотография представляет собой совокупность пикселей, каждому из которых сопоставлено определенное число, градация серого. Для определения скорости волны в среде по данной серии изображениях используется так называемая пространственно-временная развертка: на всех изображениях серии снимков выбирается фиксированная линия (например, см. рис. 2а вертикальная линия У). Потом строится зависимость значения для пикселя, принадлежащего данной линии, от номера кадра. Фактически получается новая фотография размера длина линии хколичество кадров (рис. 26), светлая полоска на данной картинке отображает положения фронта волны возбуждения в различные моменты времени, построив касательную к данной полоске, можно определить скорость волны в каждой точке выбранной линии.

Рис. 2. Метод пространственно-временной развертки для определения скорости распространения фронта волны возбуждения; (а) снимок фронта волны возбуждения, на котором отмечены линии X и У, по пикселям которых строится пространственно-временная развертка; (б) пространственновременная развертка для линии У (показано изменение значений пикселей с течением времени); (в) пространственно-временная развертка для линии X

Левый край данной линии на рис. 26 представляет собой зависимость (у,Ь). В данном случае рис. 26 называется пространственно-временной разверткой рис. 2а по линии У.

3. Результаты

Генерация волн возбуждения на культуре ткани НЬ-1 С11112 при помощи лазера

На культуре клеток НЬ-1 СЫ12 наблюдалась контролируемая 1'енерация волн возбуждения внешним источником излучения (рис. 3). На образец подавалась серия импульсов заданной частоты и длительности. В месте взаимодействия импульса с образцом происходила стимуляция культуры, вызывая распространение круговой волны вплоть до границы, где распространение прекращалось. В клетках, освещаемых лазерным лучом, происходила стимуляция возбуждения, вызывая распространение круговой волны вплоть до границы, где распространение прекращалось. На рис. 3 представлена серия кадров, фиксирующих активность после двух последующих импульсов длительностью 33 ме и частотой 1,1 Гц. Плотность потока энергии излучения в фокусе: 130 мВт/см2. Скорость волны в направлении, перпендикулярном фронту, составила 9,04 мм/с.

¡а»,

>

0,0 с 0,2 С 0,4 С 0,6 с 0,8 с

0,9 с 1,0 с 1,2 с 1,4 с 1,6 с

Рис. 3. Стимуляция монослоя культуры клеток НЬ-1 СЫ12. Последовательность двух круговых волн, вызванных двумя соседними световыми импульсами. Ярко-светлые точки на кадрах отображают место попадания импульсов на образец (0.0 с и 0.9 с). Границы раздела между светлыми и темными точками изображают фронты волн

Возбуждение волн лазером на смешанной культуре ткани кардиомиоцитов НЬ-1 СЫ12 и фибробластов ЗТЗ

Аналогично предыдущему эксперименту (см. выше) были получены волны возбуждения в смешанной культуре клеток кардиомиоцитов НГ-1 СЫ12 и фибробластов ЗТЗ, с частотой внешних) периодического воздействия лазерных импульсов. В отличие от случая с культурой НГ-1 СЫ12, волновые фронты были менее четкими и округлыми. Это объясняется более неоднородной структурой монослоя, вызванной присутствием невозбудимых клеток фибробластов, что в свою очередь приближает данный модельный объект к нативной форме сердечной ткани. Соотношение концентраций клеток кардиомиоцитов и фибробластов в момент пассажа составляло 9:1 соответственно. На рис. 4 представлено зарождение и распространение круговой волны в промежутке между двумя соседними световыми импульсами. Скорость волны в направлении, перпендикулярном фронту, составила 4,68 мм/с. Длительность импульсов: 33 с; частота: 0.4 Гц. Плотность потока энергии излучения в фо-2

0,0 с 0,5 с 1,1 с 1,9 с 2,5 с

Рис. 4. Стимуляция светом монослоя смешанной культуры клеточных линий: кардиомиоцитов НГ-1 СЫ12 и фибробластов ЗТЗ. Видна генерация и распространение круговой волны в промежутке между двумя соседними световыми импульсами. Ярко-синие точки на кадрах отображают место попадания импульсов на образец (0.0 с и 2.5 с). Резкие границы раздела между светлыми и темными точками изображают фронты волн

3.1. Инициация спиральных волн

Однорукавная спиральная волна

На культуре клеток НГ-1 СЫ12 были получены две волновые структуры, относящихся к классу реентри. Первой из них является однорукавная спиральная волна. На рис. 5 показана серия кадров видеоряда, детектирующих) один период спиральной волны. В течение однохх) периода фронт волны в виде спирали делает один оборот вокруг организующих) центра. Частота обращения, измеренная при помощи метода псевдокардиограммы, составила 1,14 Гц.

0,0 с 0,25 с 0,50 с 0,75 с 1,0 с

Рис. 5. Однорукавная спиральная волна на культуре клеток НГ-1 СЫ12. Частота: 1.14 Гц. Серия кадров отображает один период распространения волны. В течение одного периода фронт волны в виде спирали делает один оборот вокруг организующего центра

Получение спиральной волны. Высокая спонтанная активность культуры приводила к наличию нескольких спиральных волн на образце. Одиночная спиральная волна была получена за счет подавления организующих центров всех спиральных волн, кроме наблюдаемой. При помощи модулирования возбудимости образца светом можно было добиться либо полного исчезновения центра спиральной волны, либо его вытеснения на границу культуры, после чего вся волна исчезала.

Двурукавная спиральная волна

Второй полученной волновой структурой, относящейся к ре-ентри, была двурукавная спиральная волна. Фронт такой волны представляет собой объединение двух спиралей, закрученных в одну сторону и повернутых относительно друг друга вокруг середины отрезка, соединяющих) их центры. По мере вращения центры спиралей могут сближаться, образуя в некоторый момент общий организующий центр всей структуры. На рис. 6 показана последовательность кадров, изображающих половину периода обращения двурукавной спиральной волны вокруг центра. В течение половины периода две образующих спирали меняются местами, а центры успевают объедсниться и разойтись.

0,75 с 0,9 с 1,05 с 1,2 с 1,25 е

Рис. 6. Двурукавная спиральная волна. Половина периода. Частота: 0.4 Гц

Подобная волновая структура была устойчива и наблюдалась в течение длительноі'о времени (порядка десяти минут). Стоит отметить, что две составных спирали ефазированы. Об этом можно судить исходя из пространственно-временной развертки (рис. 7).

Рис. 7. Пространственно-временная развертка видеоряда, отображающего двурукавную спиральную волну. Параллельные прямые участки на развертках отвечают разным составляющим спиралям. Цветами отмечены фазы волны. Видно, что в точках слияния центров фазы одинаковы.

Спиральная волна на смешанной культуре ткани кардиомиоцитов НЬ-1 СЫ12 и фибробластов ЗТЗ

Аналогично предыдущему, была получена однорукавная спиральная волна на смешанной культуре клеток кардиомиоцитов НЬ-1 СЫ12 и фибробластов ЗТЗ. На рис. 8 показана серия кадров из видео, детектирующих) один период спиральной волны. Частота обращения составила 0,34 Гц. Стоит подчеркнуть, что при очень близких условиях приготовления образцов и проведения экспериментов в данном случае частоты спиральных волн оказались уменьшенными более чем в три раза. По-видимому, это объясняется присутствием невозбудимых клеток фибробластов: наличие непроводящих участков уменьшает площадь контактов между кардиомиоцитами, за счет чего скорость распространения надает.

0,0 с 0,75 с 1,5 с 2,25 с 3,0 е

Рис. 8. Однорукавная спиральная волна на смешанной культуре двух линий: кардиомиоцитов НЬ-1 СЫ12 и фибробластов ЗТЗ. Частота: 0.34 Гц

3.2. Эксперименты по модулированию возбудимости светом

Управление положением спиральной волны

Метод модулирования возбудимости образца светом позволил направленно смещать центр спиральной волны. Так, локальный участок клеточши'о монослоя культуры НЬ-1 СЫ12 вблизи центра спиральной волны был приведен в возбужденное состояние. Будучи временно невозбудимым, данный участок послужил препятствием в распространении центра спиральной ВОЛНЫ внутрь возбужденной области, ЧТО привело К С1'0 смещению в плоскости образца (рис. 9).

4,6 с 5,75 с 6,4 с

Рис. 9. Индуцированное смещение центра спиральной волны. В промежутках между первыми пятью кадрами применялось модулирование возбудимости участка образца вблизи центра спиральной волны. Желтыми точками отмечено начальное положение центра до воздействия. Впоследствии установилось стационарное вращение спиральной волны

Разрыв фронта спиральной волны

Наблюдалась стационарно вращающаяся спиральная волна на культуре НЬ-1 СЫ12. Вдали от центра спирали (за первым витком) методом модулирования возбудимости был локально возбужден участок образца, послуживший препятствием для распространения витка спиральной волны. Образовавшийся на данном участке разрыв витка дал начало двум свободным концам, приведших к образованию двух сосуществующих (’фазированных спиральных волн, вращающихся в противоположных направлениях и с одинаковой частотой. На рис. 10 (нижний ряд) показана дальнейшая аннигиляция нары спиральных волн с последующим стационарным вращением начальной спиральной волны со смещенным центром.

А ¿уяУ71 *• F - .у. . • • . і . 7- ' • . ШВг 1 1 lip 1 . - • -7'-.7 ' і кШЙЙ?' А'

0,0 с 1,2 с 1,35 с 1,5 с 1,65 с

В? '¡й&ґ "'аК.’ 1 иг ?'" 1' ' ,*& »vShB JBk і УНИ і .у-** р . 1  ¿¿S • яВ ШЗ м - I , ЩГ . 1 і '•> А ? і91 ЭяЯНншИМКг ! Я ВВ ЇЇШГ fjy

1,8 с 1,95 с 2,1 с 2,25 с 2,4 с

т/Г- іцГ ’їй І' Ж Я' Щ- і ;>ч ' Jjfe. Г. ' 'й Ж» I - % Шьа Щж ' . ' І і В 'Ч’!. ' %2p . • ,* . ШтЫМШк1 U *.у ' 1  • , : ШН !  ЗкЯИНМнНя

2,55 с 4,05 с 4,2 с 5,5 с 7,75 с

Рис. 10. Разрыв фронта спиральной волны с образованном двух сфазированных спиральных волн, вращающихся в противоположных направлениях с одинаковой частотой, и их последующая аннигиляция

4. Выводы

В настоящей работе методом онтическоі'о картирования волн возбуждения на культуре иммортализованных мышиных кардиомиоцитов, экспрессирующих светочувствительный белок канальный родопсин тина 2, была осуществлена контролируемая і'енерация круї'о-вых и спиральных волн возбуждения. Было показано, что чувствительность культуры кардиомиоцитов к свету позволяет локально модулировать их возбудимость. При изменении возбудимости культуры вблизи центра спиральной волны наблюдалось еі'о смещение. Это может представлять собой основу для метода управления положением спиральной волны. Изменение же возбудимости кардиомиоцитов вдали от центра спиральной волны приводило к разрыву фронта с последующим образованием нары спиральных волн. Таким образом, полученные данные моїут быть использованы при моделировании поведения вращающихся волн (реентри) в сердечной ткани.

Данная работа была поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.

Литература

1. Rohr SScholly D. М., Kleber A. G. Patterned growth of neonatal rat heart cells in culture. Morphological and electrophysiological characterization /7 Circulation Research. 1991.

V. 68(1). P. 114 130.

2. Fast V.G., Ideker R.E. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures /7 .Journal of cardiovascular electrophysiology. 2000. V. 11(5). P. 547 556.

3. Kucera J. P., Kleber A. G., Rohr S. Slow conduction in cardiac tissue: Insights from optical mapping at the cellular level // J. of Electrocardiology. — Oct 2001. — V. 34. — P. 57-64.

4. Bursae N., Aguel F., Tung L. Multiarm spirals in a two-dimensional cardiac substrate // Proc. of the National Academy of Sciences of the United States of America. — V. 101(43). — 2004. - 15530-4.

5. Entcheva E., Lu S.N., Troppman R.H., Sharma V., Tung L. Contact fluorescence imaging of reentry in monolayers of cultured neonatal rat ventricular myocytes // J. of cardiovascular electrophysiology. - Jun. 2000. - V. 11(6). - P. 665-676.

6. Agladze K.I., Kay M.W., Krinsky V.I., Sarvazyan N. Interaction between spiral and paced waves in cardiac tissue // American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. - 2007. - V. 293(1). - P. 503-513.

7. Fast V. G., Rohr S., Gillis A. M., Kleber A. G. Activation of Cardiac Tissue by Extracellular Electrical Shocks : Formation of ‘Secondary Sources’ at Intercellular Clefts in Monolayers of Cultured Myocytes // Circulation Research. — 1998. — V. 82. — P. 375-385.

8. Arutunyan A., Pumir A., Krinsky V., Swift L., Sarvazyan N. Behavior of ectopic surface: effects of beta-adrenergic stimulation and uncoupling // American journal of physiology. — Dec. 2003. - V. 285. - P. 2531-2542.

9. Pumir A., Arutunyan A., Krinsky V., Sarvazyan N. Genesis of ectopic waves: role of coupling, automaticitv, and heterogeneity // Biophysical journal. — Oct. 2005. — V. 89. — P. 2332-2349.

10. Magome N., Kanaporis G., Moisan N., Tanaka K., Agladze K. Photo-control of excitation waves in cardiomvocvte tissue culture // Tissue engineering. Part A. — 2011. — V. 17. —

I. 21-22. - P. 2703-2711.

11. Erofeev I., Magome N., Agladze K. Digital photocontrol of the network of live excitable cells 11 JETP Letters. - Nov. 2011. - V. 94. - P. 477-480.

12. Hoffman B., Maybeck V., Eick S., Meffert S., Ingebrandt S., Wood P., Bam,berg E., Offenhausser A. Light induced stimulation and delay of cardiac activity // Lab on a Chip. — Oct. 2010. - V. 10. - P. 2588-2596.

13. Nagel G., Szellas T., Hunn W., Kateriya S., Adeishvili N., Berthold P., Ollig D.

Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // Proc. of the National Academy of Sciences of the United States of America. — V. 100(24). — P. 1394013945.

14. Clay comb W.C., Lanson N.A., Stallworth B.S., Egeland D.B., Delcarpio J.B.,

Bahinski A., Izzo N. J. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomvocvte // Proc. of the National Academy of Sciences of the United States of America. — Mar. 1998. — V. 95. — P. 2979-84.

15. Sartiani L., Bochet P., Cerbai E., Mugelli A., Fischmeister R. Functional expression

of the hvperpolarization-activated, non-selective cation current If in immortalized HL-1 cardiomvocvtes // J. of Physiology. — Sept. 2002. — V. 545. — P. 81-92.

16. Entcheva E., Bien H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks

with ultra-high spatiotemporal resolution // Progress in Biophysics and Molecular Biology. - Oct. 2006. - V. 92(2). - P. 232-257.

Поступила в редакцию 29.08.2012.