Способ прогнозирования качества гамет при лечении женского бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий на основании генотипа пациенток
METHOD FOR GAMETE QUALITY PREDICTION IN WOMEN INFERTILITY TREATMENT FOR AUXILIARY REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES PROGRAMS, BASED ON PATIENT'S GENOTYPE

Изобретение является частью области клинико-лабораторной диагностики. Цель - прогнозирование качества получаемых гамет (ооцитов, пригодных для оплодотворения) и персонализация лечения женского бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Несмотря на совершенство современных схем стимуляции суперовуляции при лечении бесплодия методами ВРТ, проблема получения незрелых ооцитов остается актуальной как с научной, так и с клинической точки зрения. В связи с низкой фертилизацией незрелых гамет (5-10%) зачастую происходит прерывание дальнейшей терапии методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), что влечет за собой как психологические травмы, так и экономические потери. Прогнозирование получения качества ооцитов может позволить проводить лечение и планировать эмбриологическую тактику еще на этапе подготовки пациентки к проведению программы ЭКО. Только такой подход может обеспечить достижение максимального результата лечения бесплодия - наступление клинической беременности и рождение здорового ребенка.
Предложены различные маркеры исходов программ ВРТ (возраст, овариальный резерв, гормональный статус и другие) [1; 2; 3]. При этом генетическая предрасположенность представляется важным фактором, детерминирующим процессы фолликуло-, оо- и эмбриогенеза в программе ЭКО [4; 5].
При интерпретации результатов исследования генома данные не меняются в течение жизни, не зависят от веса, от дня менструального цикла и так далее в отличие от гормональных маркеров. Исследование влияния генетических маркеров продолжает формировать научный и практический интерес современной медицины.
В литературе описаны созданные однофакторные модели, основанные на молекулярно-генетических предикторах, позволяющие прогнозировать овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции и качество полученных гамет и эмбрионов [1; 6; 7; 8]. Однако недостатками таких моделей являются относительно низкая предиктивная способность и противоречивость данных.
Задача настоящего изобретения - создать комплексную мультигенную математическую модель прогнозирования качества получаемых гамет в программах ВРТ путем предварительного генотипирования пациенток.
Поставленная цель и задача достигается генотипированием пациенток по следующим полиморфным локусам:
FSHR 2039 G>A (Ser680Asn)[rs6166];
SERPINE1 (PAI-1) -675(5G>4G)[rs1799889];
ESR2 G>A [RsaI][rs4986938];
VEGFA-634 G>C [rs2010963].
Определяют генотип по данным позициям с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) или аналогичного метода, позволяющего определить указанные генетические маркеры. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводят при помощи детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). ДНК для генотипирования выделяют из образцов периферической крови, взятой с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в качестве антикоагулянта, объемом 0,5 мл, смешивают в микроцентрифужных пробирках (объемом 1,5 мл) типа Эппендорф с лизирующим раствором (0,5 мл), состоящим из 10 мМ Трис-HCl pH 7,5, 0,32М сахарозы, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугируют. Центрифугирование проводится в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляется, осадки клеточных ядер двукратно отмывают соответствующим буфером. В последующем протеолиз проводят в буферном растворе (50 мкл), содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5 мМ MgCl, в течение 20 минут при 37°C. Инактивация протеиназы К производится в течение 20 минут при температурном режиме 98°C. Концентрация ДНК определяется на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США) и составляет около 50-100 мкг/мл. Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводят с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) с использованием оригинальных олигонуклеотидов [9; 10].
Определение полиморфизма генов сначала проводится ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК) и охлаждения (для обеспечения синтеза) синтезируются копии данной области гена [11]. Праймеры общие для обоих вариантов нуклеотидной последовательности, после чего температуру реакционной смеси для гибридизации матрицы с олигонуклеотидными пробами понижают. Для определения типа последовательности используют два варианта олигонуклеотидов. В первом случае олигонуклеотиды метят флуорофором, во втором - гасителем флуоресценции. Этот процесс протекает при помощи ферментов, способных соединять нуклеотидные основания и выдерживать необходимые для денатурации температурные режимы [11]. В качестве такого фермента используется Taq-полимераза, блокированная специфическими антителами, чтобы предотвратить неспецифический отжиг праймеров и повысить чувствительность тест-систем.
В режиме реального времени измеряют уровень флуоресценции в процессе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Генотип определяется путем анализа кривых плавления. В том случае, если анализируемый образец содержит только один тип нуклеотидной последовательности гена, т.е. гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс, выше, чем для пробы, образующей несовершенный дуплекс. В том случае, если анализировался гетерозиготный образец, содержащий два типа нуклеотидной последовательности, каждый из вариантов проб может образовать совершенный дуплекс, поэтому температуры плавления одинаковы [11].
Бинарная логистическая регрессия рассчитывает вероятность наступления события (в данном случае получение ооцитов, пригодных для оплодотворения), в зависимости от значений независимых переменных (в данном случае полиморфизма исследуемых генов).
Вероятность наступления события (получение ооцитов, пригодных для оплодотворения), (p) для некоторого случая рассчитывается по формуле, имеющий общий вид:
где p - искомая вероятность наступления события;
1
1
2
2
n
n;
z (классифицирующая дискриминантная функция) = а+b*X+b*X+…+b*X
1
1
a - некоторая константа; X - независимые переменные; b - коэффициенты, расчет которых является задачей бинарной логистической регрессии.
Если для p получается значение меньшее 0,5, то можно предположить, что событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.
В бинарной логистической регрессионной модели исходом считается факт получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, предикторами - полиморфизм генов FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166]; SERPINE1 (PAI-1) -675 (5G>4G) [rs1799889]; ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938]; VEGFA-634 G>C [rs2010963].
При построении бинарной логистической регрессионной модели используют метод обратной селекции. Качество приближения регрессионных моделей при каждом последующем шаге оценивают при помощи функции подобия. Мерой правдоподобия служит отрицательное удвоенное значение логарифма этой функции (-2LL). В качестве начального значения для -2LL применяется значение, которое получается для регрессионной модели, содержащей только константы. После добавления переменной влияния значение -2LL оказалось равным 67,05; разность между значением -2LL начальной и конечной модели составила 22,959 (р=0,003). Таким образом, после исключения всех незначимых переменных, произошло значительное улучшение начальной модели.
Мера определенности показывает ту часть дисперсии, которую можно объяснить с помощью логистической регрессии. Мера определенности по Коксу и Шелу имеет тот недостаток, что значение, равное 1, является теоретически недостижимым; этот недостаток устранен благодаря модификации данной меры по методу Найджелькеркеса. Часть дисперсии, объяснимая с помощью вышеперечисленных четырех генотипов, составляет 31,1% (вычислено по методу Найджелькеркеса).
Результаты рассчитанных коэффициентов в логистической регрессии и проверка их значимости приведены в таблице 1.
Проверка значимости отличия коэффициентов от нуля проводится при помощи статистики Вальда, использующей распределение хи-квадрат, которая представляет собой квадрат отношения соответствующего коэффициента к его стандартной ошибке.
Согласно полученной константе и согласно значимым коэффициентам для прогнозирования вероятности получения эмбрионов низкого качества (p) классифицирующая дискриминантная функция имеет вид:
A/G
G/G
5G/4G
5G/5G
A/G
A/A
G/C
G/G
Z=-0,21+2,518*FSHR+0,313*FSHR-0,899*PAI-1-2,607*PAI-1+2,544*ESR2+2,065*ESR2+2,027*VEGFA+0,568*VEGFA,
где -0,21 - константа;
A/G
FSHR - наличие у пациентки генотипа A/G гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] (1 - да, 0 - нет);
G/G
FSHR - наличие у пациентки генотипа G/G гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] (1 - да, 0 - нет);
5G/4G
PAI-1 - наличие у пациентки генотипа 5G/4G гена SERPINE1 (PAI-1) -675 (5G>4G) [rs1799889] (1 - да, 0 - нет);
5G
5G
PAI-1/ - наличие у пациентки генотипа 5G/5G гена SERPINE1 (PAI-1) -675 (5G>4G) [rs1799889] (1 - да, 0-нет);
A/G
ESR2 - наличие у пациентки генотипа A/G гена ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] (1 - да, 0 - нет);
A/A
ESR2 - наличие у пациентки генотипа А/А гена ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] (1 - да, 0 - нет);
G/C
VEGFA - наличие у пациентки генотипа G/C гена VEGFA -634 G>C [rs2010963] (1 - да, 0 - нет);
G/G
VEGFA - наличие у пациентки генотипа G/G гена VEGFA -634 G>C [rs2010963] (1 - да, 0 - нет);
2,518; 0,313; -0,899; -2,607; 2,544; 2,065; 2,027; 0,568 – коэффициенты,
-z
и вероятность получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, определяют по формуле p=1/(1+e), где в случае p меньше 0,5 предполагают, что событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.
Точность прогнозирования получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, с использованием полиморфизма генов FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166]; SERPINE1 (PAI-1) -675 (5G>4G) [rs1799889]; ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938]; VEGFA -634 G>C [rs2010963] составила 93,1%.
Был проведен ROC-анализ для валидации полученной модели (фиг. 1). Значение AUC для данной модели составило 0,827, 95% доверительный интервал от 0,7 до 0,955.
Пример 1
Прогнозирование получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, провели у пациентки К. 29 лет, обратившейся для проведения программы ЭКО по поводу мужского фактора бесплодия. Из анамнеза: беременностей 0, родов 0, абортов 0. Данная попытка ЭКО первая.
Кровь для генотипирования у пациентки К. брали натощак из локтевой вены в стерильную пробирку. Определяли замены однонуклеотидных последовательностей с применением ПЦР. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили при помощи детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Центрифугирование проводили в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удалялся, осадки клеточных ядер двукратно отмывали соответствующим буфером. В последующем протеолиз проводили в буферном растворе (50 мкл), содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5 мМ MgCl, в течение 20 минут при 37°C. Концентрацию ДНК определяли на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США). Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводили с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) с использованием оригинальных олигонуклеотидов.
Определение полиморфизма генов сначала проводили ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК) и охлаждения (для обеспечения синтеза) синтезируются копии данной области гена.
Результат генотипирования пациентки К.:
FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] - A/G
SERPINE1 (PAI-1) -675 (5G>4G) [rs1799889] - 5G/4G
ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] - A/G
VEGFA -634 G>C [rs2010963] - G/C
Значение дискриминантной функции составило: Z=-0,21+2,518*1+0,313*0-0,899*1-2,607*0+2,544*1+2,065*0+2,027*1+0,568*0=5,98.
Вероятность (p) получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, у данной пациентки расчитывали по формуле 1:
-5,98
p=1/(1+е)=0,99.
Рассчитанная вероятность p указывает на исполнение прогноза, в данном случае - на получение ооцитов, пригодных для оплодотворения, с вероятностью 99%.
В результате проведения программы ВРТ у пациентки всего было получено 5 зрелых пригодных для оплодотворения ооцитов.
Пример 2
Прогнозирование получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, провели у пациентки Л. 33 лет, обратившейся для проведения программы ЭКО по поводу трубно-перитонеального фактора бесплодия. Из анамнеза: беременностей 0, родов 0, абортов 0. В анамнезе хронический сальпингоофорит, проведена гистеросальпингография (ГСГ), диагностирована непроходимость обеих маточных труб. Данная попытка ЭКО первая.
Кровь для генотипирования у пациентки Л. брали натощак из локтевой вены в стерильную пробирку. Определяли замены однонуклеотидных последовательностей с применением ПЦР. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили при помощи детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Центрифугирование проводили в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удалялся, осадки клеточных ядер двукратно отмывали соответствующим буфером. В последующем протеолиз проводили в буферном растворе (50 мкл), содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 8,3, 50 мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5 мМ MgCl, в течение 20 минут при 37°C. Концентрация ДНК определяли на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США). Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводили с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) с использованием оригинальных олигонуклеотидов. Определение полиморфизма генов сначала проводили ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК) и охлаждения (для обеспечения синтеза) синтезируются копии данной области гена.
Результат генотипирования пациентки Л.:
FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) [rs6166] - G/G
SERPINE1 (PAI-1) -675 (5G>4G) [rs1799889] - 5G/5G
ESR2 G>A [RsaI] [rs4986938] - A/A
VEGFA -634 G>C [rs2010963] - G/G
Значение дискриминантной функции составило:
Z=-0,21+2,518*0+0,313*1-0,899*0-2,607*1+2,544*0+2,065*1+2,027*0+0,568*1=0,129.
Вероятность (p) получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, у данной пациентки рассчитывали по формуле 1:
-0,129
р=1/(1+е)=0,53.
Рассчитанная вероятность p указывает на исполнение прогноза, в данном случае - на получение ооцитов, пригодных для оплодотворения, с вероятностью 53%.
В результате проведения программы ВРТ у пациентки всего было получено 6 ооцитов, из них - 3 дегенеративных ооцита, 3 пригодных для оплодотворения.
Согласно полученным данным, предикция получения ооцитов, пригодных для оплодотворения, при проведении программ ВРТ на основании молекулярно-генетических маркеров носит статистически достоверный характер.
Полученный результат свидетельствует о независимой генетической детерминации процессов эмбриогенеза. Следовательно, способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток может быть использован в клинико-лабораторной практике с целью предикции исходов программы ЭКО.
Источники информации
1. Altmae S., Hovatta О., Stavreus-Evers A., Salumets A. Genetic predictors of controlled ovarian hyperstimulation: where do we stand today? // Human reproduction update. - 2011. - Vol. 17. - №6. - P. 813-828.
2. Сухих Г.Т., Сароян Т.Т., Корнеева И.Е. Иммунные аспекты патофизиологии синдрома гиперстимуляции яичников. // Акушерство и гинекология. 2009 - №3. С. 3-6.
3. O'Brien Т.J., Kalmin М.М., Harralson A.F., Clark А.М., Gindoff I., Simmens S.J., Frankfurter D., Gindoff P. Association between the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor (LHCGR) rs4073366 polymorphism and ovarian hyperstimulation syndrome during controlled ovarian hyperstimulation // Reproductive biology and endocrinology: RB&E. - 2013. - Vol. 11. - №1. - P. 71.
4. Twigt J.M., Hammiche F., Sinclair K.D., Beckers N.G., Visser J.A., Lindemans J., de Jong F.H., Laven J.S., Steegers-Theunissen R.P. Preconception folic acid use modulates estradiol and follicular responses to ovarian stimulation // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 2011. - Vol. 96. - №2. - P. E322-329.
5. Alviggi C., Humaidan P., Ezcurra D. Hormonal, functional and genetic biomarkers in controlled ovarian stimulation: tools for matching patients and protocols // Reproductive biology and endocrinology: RB&E. - 2012. - Vol. 10. - P. 9.
6. Desai S.S., Achrekar S.K., Paranjape S.R., Desai S.K., Mangoli V.S., Mahale S.D. Association of allelic combinations of FSHR gene polymorphisms with ovarian response // Reproductive biomedicine online. - 2013. - Vol. 27. - №4. - P. 400-406.
7. Lledo В., Ortiz J. A., Llacer J., Bernabeu R. Pharmacogenetics of ovarian response // Pharmacogenomics. - 2014. - Vol. 15. - №6. - P. 885-893.
8. Калинина E.А., Донников A.E., Владимирова И.В. Молекулярно-генетические предикторы овариального ответа, качества ооцитов и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий // Акушерство и гинекология. 2015 - №3. С. 21-25
9. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой // Генетика 2006 - Т. 42(1). С. 22-32
10. Lyon Е. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis // Expert Rev Mol Diagn. - 2001. - Vol. 1. - №1. - P. 92-101.
11. Элдер К., Дэйл Б. Экстракорпоральное оплодотворение / М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 276 с.