Получение моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки на основе термоэкстракта из бруцелл в S-форме

Пробл. особо опасных инф. 2017; 2:78-80. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-78-80

УДК 616.98:579.841.93

Л.М.Михайлов, Н.Л.Баранникова, Л.Е.Токарева, Н.М.Андреевская, В.А.Михайлова, В.И.Кузнецов,

К.Ю.Ястремская, С.В.Балахонов

получение моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки на основе термоэкстракта из бруцелл в s-форме

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего востока», Иркутск,

Российская Федерация

Цель работы. Получение кроличьей моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки к термоэкстракту из бруцелл в S-форме, оценка ее активности и специфичности. Материалы и методы. В работе использовали поливалентную гипериммунную бруцеллезную сыворотку, полученную к термоэкстракту, которую адсорбировали штаммом гетерологичного вида Brucella melitensis 16M. Для оценки активности и специфичности полученной сыворотки использовали референтные, вакцинные и полевые штаммы бруцелл. Результаты и выводы. Полученная сыворотка обладала высокой активностью (титр 1:160, 1:320) и специфичностью, а результаты полностью совпадают с данными, указанными в таблице дифференциальных свойств, представленными в МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей». Предложенный способ приготовления моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки позволяет значительно снизить биологическую опасность для персонала при проведении технологических операций.

Ключевые слова: бруцеллы, термоэкстракт, S-форма, моноспецифическая сыворотка.

Корреспондирующий автор: Михайлов Леонид Михайлович, e-mail: E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.

L^^ikhailov, N.L.Barannikova, L.E.Tokareva, N.M.Andreevskaya, V.A.Мikhailova, V.I.Kuznetsov, K.Yu.Yastremskaya, S.V.Balakhonov

Preparation of Monospecific Brucella Anti-Abortus Serum Based on Thermoextract From S-Form Brucella

Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russian Federation

Objective of the study is to prepare rabbit monospecific anti-abortus serum to a Brucella S-form thermoextract, as well as to evaluate its activity and specificity. Materials and methods. Utilized was polyvalent hyperimmune serum obtained to Brucella thermoextract. It was adsorbed by a strain of heterologous species Brucella melitensis 16 N. Reference, vaccinal and field Brucella strains were used to estimate the activity and specificity of the serum produced. Results and conclusions. This serum possesses high activity (1:160, 1:320 titer) and specificity, and the results completely coincide with the data specified in the table of differential properties presented in MR 3.1.7.1189-03 "Prophylaxis and laboratory diagnostics of human brucellosis». The outlined method for manufacturing monospecific Brucella anti-abortus serum permits for a considerable decrease in biological hazard for personnel involved in the technological operations.

Key words: Brucella, thermoextract, S-form, monospecific serum.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Leonid M. Mikhailov, e-mail: E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.

Citation: Mikhailov L.M., Barannikova N.L., Tokareva L.E., Andreevskaya N.M., Mikhailova V.A., Kuznetsov V.I., Yastremskaya K.Yu., Balakhonov S.V. Preparation of Monospecific Brucella Anti-Abortus Serum Based on Thermoextract From S-Form Brucella. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 2:78-80. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-78-80

Моноспецифическая бруцеллезная сыворотка anti-abortus используется при дифференциации видов бруцелл [4]. Известно, что моноспецифическую бруцеллезную anti-abortus сыворотку готовят с использованием эталонного штамма ФАО/ВОЗ - Brucella abortus 544 или вакцинного - B. abortus 19BA, живыми культурами которых иммунизируют кроликов (внутривенно однократно суспензией клеток в разных концентрациях). Полученную антисыворотку адсорбируют штаммом B. melitensis 16M, B. melitensis 28 или B. melitensis 548. Титры специфических антител в полученных моноспецифических бруцеллезных anti-abortus сывороток при этом составляли 1:160-1:640 [1, 2]. Основным недостатком этих методов является использование для получения бруцеллезной антисыворотки живой культуры вирулентного штамма возбу-

дителя, что требует соблюдения на разных этапах работы специальных мер для обеспечения требований биобезопасности персонала. Все бруцеллы, в том числе и вакцинный штамм, который обладал остаточной вирулентностью, способны вызывать иммуноаллер-гические реакции. Поэтому поиск слабовирулентных штаммов или специфических бруцеллезных антигенов для получения высокотитражной антисыворотки, пригодной для получения после ее адсорбции моноспецифических сывороток, а также снижение биологической опасности при проведении технологических приемов работ являются актуальными.

Цель исследования - получение кроличьей моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки к термоэкстракту из бруцелл в S-форме, оценка ее активности и специфичности.

БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ

Материалы и методы

Донорами гипериммунной сыворотки служили кролики породы шиншилла из лаборатории подопытных животных Иркутского научно-исследовательского противочумного института. Термоэкстракт готовили в соответствии с патентом [3].

Иммунизацию животных осуществляли по двух-цикловой схеме, что позволило получить антисыворотку с высоким титром специфических антител 1:1600-1:3200. По отработанной ранее в лаборатории методике для получения моноспецифической anti-abortus сыворотки гипериммунную сыворотку адсорбировали штаммом гетерологичного вида B. melitensis 16M. Трехсуточную культуру штамма смывали ЗФР (рН 7,2±0,1) и добавляли до 2,5 % формалина, взвесь оставляли при (20±2) °С в течение 24 ч. Проводили контроль на специфическую стерильность. Бактериальную массу центрифугировали при 3000 об./мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливали, и ЗФР (рН 7,2±0,1) доводили концентрацию бактериальной взвеси до 5-1011 м.к./мл. Полученную бактериальную взвесь в количестве 0,25 мл однократно добавляли в 2,5 мл сыворотки и оставляли на два часа при 37 °с, помешивая через каждые 15 мин, после чего выдерживали 15 ч при (20±2) °С. Затем сыворотку центрифугировали при 6000 об./мин в течение 20 мин и удаляли осадок. После адсорбции проверяли тиры специфических антител в объемной реакции агглютинации (РА).

В качестве контроля моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки использовали референтные, вакцинные и полевые штаммы бру-целл из музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института и выделенные от людей.

Результаты и обсуждение

Для поиска однократного оптимального количества адсорбента, приготовленного из B. melitensis 16М и добавляемого в 2,5 мл адсорбируемой бруцеллезной сыворотки для получения моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки, испытали три серии сывороток и четыре дозы адсорбента.

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что полная адсорбция антисывороток во всех трех сериях получена при дозах адсорбента, составляющих от 0,15 до 0,25 мл. При дозе адсорбента 0,1 мл отмечены положительные реакции на один-два креста в разведении 1:20. Наибольшие титры специфических anti-abortus антител зарегистрированы при добавлении 0,15 мл адсорбента: серия 1 - 1:320, серия 2 - 1:640, серия 3 - 1:160. В наших, ранее проведенных опытах показано, что полное истощение бруцеллезной антисыворотки, полученной иммунизацией кроликов живыми клетками бруцелл вида аbortus, адсорбентом из штамма B. melitensis 16M происходило при использовании дозы не менее 0,25 мл на 2,5 мл сыворотки. Поэтому следует отметить, что при получении бруцеллезной кроличьей сыворотки иммунизацией инактивированным антигеном - термоэкстрактом из B. abortus 544, для полной адсорбции требуется меньшее количество (0,15 мл) адсорбента, при этом моноспецифическая бруцеллезная anti-abortus сыворотка имеет высокую специфичность и активность.

Полученная моноспецифическая бруцеллезная anti-abortus сыворотка испытана с 11 штаммами бру-целл трех основных видов (melitensis, abortus, suis) и некоторых их биоваров, а также с 9 культурами, выделенными от больных бруцеллезом людей.

Таблица 1

Активность моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки после адсорбции гетерологичным штаммом B. melitensis 16М

Сыворотка бруцеллезная кроличья (anti-abortus) серия, титр Доза абсорбента B. melitensis 16М, мл Активность моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки в РА

B. melitensis 16М B. abortus 544

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 КС КА 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 КС КА

Серия 1, 1:1600 0,25 ++++ ++++ ++++ ++ + - - -

0,2 ++++ ++++ ++++ +++ - - -

0,15 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + -

0,1 ++ + ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ -

Серия 2, 1:1600 0,25 ++++ ++++ + - - - -

0,2 ++++ ++++ +++ +++ ++ + -

0,15 ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ -

0,1 + ++++ ++++ +++ ++ + + -

Серия 3, 1:1600 0,25 ++ ++ + ± - - -

0,2 ++++ +++ ++ ++ + + -

0,15 ++++ +++ +++ ++ + + -

0,1 + ++++ +++ +++ ++ + + -

Примечания: «++++», «+++», «++», «+», «±» - выраженность реакции в крестах, «-» - результат отрицательный.

2017, issue 2 79

Таблица 2

Специфичность моноспецифической бруцеллезной сыворотки anti-abortus в РА

Моноспецифи-

Наименование штамма Биовар ческая бруцеллезная сыворотка anti-abortus Контроль сыворотки Контроль антигена

. melitensis 16M* . melitensis REV-1* . melitensis Ether* . abortus 19 BA* . abortus Tulya* . abortus 793* . abortus 86/8159* . abortus 292* . suis 1330* . suis 686*

. suis (rangiferi) 181*

. melitensis 239** . melitensis 240** . melitensis 241** . melitensis 9** . melitensis 17** . melitensis 19** . melitensis 33** . melitensis 34** . melitensis 349**

1

Вакцина 3

вакцина 3

3 2

4 1

3

4

3

Отр. Отр. 1:80 1:160 1:160 1:160 1:160 1:160 1:80 1:80 1:80 Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. 1:80

Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.

Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.

*Штаммы из музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института; **Штаммы, выделенные от людей.

Примечание: Отр. - реакция отрицательная.

Полученные при испытании результаты, представленные в табл. 2, говорят о том, что моноспецифическая бруцеллезная anti-abortus сыворотка взаимодействовала с бруцеллами в соответствии с требованиями МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» и полностью совпадают с данными, указанными в таблице, отражающей дифференциальные свойства, определяемые этим методом.

таким образом, получение моноспецифической бруцеллезной anti-abortus сыворотки путем адсорбции антисыворотки, приготовленной с использованием для иммунизации кроликов инактивированного

термоэкстракта из бруцелл в S-форме, позволяет значительно снизить биологическую опасность для персонала при проведении технологических операций.

Моноспецифическая бруцеллезная anti-abortus сыворотка, полученная по предлагаемой методике, обладает высокой специфичностью и активностью и может быть использована для внутривидовой дифференциации бруцелл.

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вилинская С.В., Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В., Русанова Д.В. Способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus. Патент РФ 2375074, опубл. 10.12.2009. Бюл. № 34.

2. Дальвадянц В.Г., Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Луканина Л.М. Способ получения моноспецифических сывороток для дифференциации возбудителя бруцеллеза. Патент РФ 2104031, опубл. 10.02.1998.

3. Михайлов Л.М., Калиновский А.И., Баранникова Н.Л., Балахонов С.В., Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Козулина К.Ю., Шестопалов М.Ю., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Татарникова О.Г., Кузнецов В.И. Способ получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме. Патент РФ 2416429, опубл. 20.04.2011. Бюл. № 11.

4. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.

References

1. Vilinskaya S.V., Lyamkin G.I., Lyapustina L.V., Rusanova D.V. [Method for the production of brucellosis monospecific anti-abortus serum]. RF Patent 2375074, 10.12.2009.

2. Dal'vadyants V.G., Lyamkin G.I., Lyapustina L.V., Taran I.F., Lukanina L.M. [Method for the production of monospecific sera for differentiation of brucellosis agent]. RF Patent 2104031, 10.02.1998.

3. Mikhailov L.M., Kalinovsky A.I., Barannikova N.L., Balakhonov S.V., Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Kozulina K.Yu., Shestopalov M.Yu., Andreevskaya N.M., Mikhailova V.A., Tatarnikova O.G., Kuznetsov V.I. [Method for the production of antigen preparation from L-form brucella]. RF Patent 2416429, 20.04.2011.

4. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases. Practice Guidelines]. 2nd Edition, revised and enlarged. M.: CJSC "Shiko"; 2013. 560 p.

Authors:

Мikhailov L.M., Barannikova N.L., Tokareva L.E., Andreevskaya N.M., Мikhailova V.A., Kuznetsov V.l., Yastremskaya K.Yu., Balakhonov S.V. Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East. 78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.

Об авторах:

Михайлов Л.М., Баранникова Н.Л., Токарева Л.Е., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Кузнецов В.И., Ястремская К.Ю., Балахонов С.В. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.

Поступила 19.07.16.