Способ прогнозирования риска развития задержки роста плода с учетом эпистатических взаимодействий полиморфных локусов менархе
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF FETAL GROWTH RETARDATION, TAKING INTO ACCOUNT EPISTATIC INTERACTIONS OF POLYMORPHIC MENARCHE LOCI

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития задержки роста плода.
Плацентарная недостаточность с задержкой роста плода является гетерогенным нарушением беременности и включают широкий спектр факторов риска. Основными факторами риска развития ЗРП являются: материнские факторы (возраст, вес, курение, паритет, артериальная гипертензия в предыдущую беременность, семейная история ЗРП, ЗРП и/или преэклампсия в предыдущую беременность, внутриутробная гибель плода, унаследованная или приобретенная тромбофилия, анемия, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет, пороки развития матки); плодовые факторы (многоплодная беременность, врожденные инфекции, анеуплоидии, генетические синдромы).
Значительно повышают риск развития плацентарной недостаточности и ЗРП: возраст матери больше 35 лет, курение и употребление алкоголя во время беременности, низкий материнский рост, низкий показатель массы тела до беременности и низкий прирост массы во время беременности, плохое питание матери, низкий социально-экономический статус, инфекции матери, плаценты и плода (Different risk factors for very low birth weight, term-small-for-gestational-age, or preterm birth in Japan / N. Tamura, T. Hanaoka, K. Ito [et al.]. – DOI: 10.3390/ijerph15020369 // Int. J. Environ. Res. Public. Health. – 2018. – Vol. 15, № 2. – Art. 369. – URL: https://www.mdpi.com/1660-4601/15/2/369).
Наличие соматической патологии и отягощенный акушерско-гинекологический анамнез значительно повышают риск возникновения плацентарной недостаточности и развитие ЗРП при последующих беременностях (Risk of stillbirth, preterm delivery, and fetal growth restriction following exposure in a previous birth: systematic review and meta-analysis / E. Malacova, A. Regan, N. Nassar [et al.] // BJOG. – 2018. – Vol. 125, № 2. – P. 183-192).
Проведенный метаанализ показал, что наличие мертворождений в предыдущих беременностях значительно увеличивало риск рождения детей весом ниже 10-го процентиля с учетом гестационного возраста (маленьких для своего гестационного возраста (Risk of stillbirth, preterm delivery, and fetal growth restriction following exposure in a previous birth: systematic review and meta-analysis / E. Malacova, A. Regan, N. Nassar [et al.] // BJOG. – 2018. – Vol. 125, № 2. – P. 183-192).
Наличие ЗРП, гестационной гипертензии, преэклампсии в анамнезе также способствовало развитию ЗРП в следующую беременность (Recurrence of small-for-gestational-age pregnancy: analysis of first and subsequent singleton pregnancies in The Netherlands / B. J. Voskamp, B. M. Kazemier, A. C. Ravelli [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2013. – Vol. 208, № 5. – P. 374.e1-374.e6).
Наиболее частыми осложнениями беременности, связанными с метаболическими и гемодинамическими расстройствами в системе «мать-плацента-плод», являются плацентарная недостаточность и преэклампсия (ПЭ) (ACOG Practice Bulletin No. 202: gestational hypertension and preeclampsia // Obstet. Gynecol. – 2019. – Vol. 133, № 1. – Art. 1. – URL: https://journals.lww.com/greenjournal/Fulltext/2019/01000/ACOG.49.aspx). Одним из серьезных последствий плацентарной недостаточности является возникновение задержки роста плода (ЗРП) (Wardinger, J. E. Placental Insufficiency / J. E. Wardinger, S. Ambati // StatPearls / B. Abai, A. Abu-Ghosh, A. B. Acharya [et al.]; StatPearls Publishing, LLC. – Treasure Island (Fl), 2021. – URL: https://www.statpearls.com/ArticleLibrary/viewarticle/27266). ПЭ занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной заболеваемости и смертности (Early-onset fetal growth restriction: a systematic review on mortality and morbidity / A. Pels, I. M. Beune, A. G. van Wassenaer-Leemhuis [et al.] // Acta Obstet. Gynecol. Scand. – 2020. – Vol. 99, № 2. – P. 153-166.), а также обусловливает в дальнейшем у детей отставание в физическом развитии, его дисгармоничность, задержку темпов психомоторного развития (Ярыгина, Т. А. Задержка (замедление) роста плода: все, что необходимо знать практикующему врачу / Т. А. Ярыгина, А. И. Гус // Акушерство и гинекология. – 2020. – № 12. – С. 14-24.). На территории РФ в настоящее время данная патология встречается в 5-18% случаев (Darendeliler, F. IUGR: genetic influences, metabolic problems, environmental associations/triggers, current and future management / F. Darendeliler // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. – 2019. – Vol. 33, № 3. – Art. 101260. – URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1521690X1930003X).
Преэклампсия и задержка роста плода являются коморбидными осложнениями беременности, так как их развитие связано с аномальной плацентацией, развитием окислительного стресса, воспалительного процесса и формированием эндотелиальной дисфункции (Диагностическая значимость определения уровня внеклеточной фетальной ДНК у беременных с преэклампсией и задержкой роста плода / А. А. Садекова, З. В. Хачатрян, А. М. Красный [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2019. – № 8. – С. 144-149.). Считается, что ранняя форма ЗРП регистрируется в 20-30% случаев и в том числе в 50% она связана с ранней ПЭ, тяжелой плацентарной недостаточностью и хронической гипоксией плода. На долю поздней формы приходится 70-80% всех случаев ЗРП и она значительно реже (лишь в 10% случаев) сочетается с ПЭ (Maršál, K. Preeclampsia and intrauterine growth restriction: placental disorders still not fully understood / K. Maršál // J. Perinat. Med. – 2017. – Vol. 45, № 7. – P. 775-777).
Низкий вес до беременности и низкий прирост веса во время беременности также приводят к увеличению риска развития ЗРП (The effect of pre-pregnancy weight and the increase of gestational weight on fetal growth restriction: a cohort study / M. Y. Shi, Y. F. Wang, K. Huang [et al.] // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. – 2017. – Vol. 51, № 12. – P. 1074-1078.).
Результаты многочисленных исследований указывают на мультифакторность в происхождении ПЭ и ЗРП, со значимым вкладом наследственных факторов в их развитии (Family history of pre-eclampsia and cardiovascular disease as risk factors for pre-eclampsia: the GenPE case-control study / N. C. Serrano, D. C. Quintero-Lesmes, F. Dudbridge [et al.] // Hypertens. Pregnancy. – 2020. – Vol. 39, № 1. – P. 56-63.). Близнецовые исследования свидетельствуют о высоких показателях наследуемости ПЭ (50-55%).
Работы по изучению молекулярно-генетических основ ПЭ, ЗРП, веса новорожденного активно проводится различными отечественными и зарубежными научными коллективами как на уровне полногеномных исследований (GWAS) (Genome-wide association study of offspring birth weight in 86 577 women identifies five novel loci and highlights maternal genetic effects that are independent of fetal genetics / R. N. Beaumont, N. M. Warrington, A. Cavadino [et al.] // Hum. Mol. Genet. – 2018. – Vol. 27, № 4. – P. 742-756.) так и на основе изучения ассоциаций однонуклеотидного полиморфизма (SNP) генов-кандидатов с данными фенотипами (Functionally significant polymorphisms of ESR1 and PGR and risk of intrauterine growth restriction in population of Central Russia / O. Golovchenko, M. Abramova, I. Ponomarenko [et al.] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. – 2020. – Vol. 253. – P. 52-57.).
Согласно материалам некоторых исследований, одним из факторов риска развития осложнений беременности может являться возраст менархе (Age at menarche, menstrual characteristics, and risk of preeclampsia / D.F. Abetew, D.A. Enquobahrie, M. Dishi [et al.]. – DOI: 10.5402/2011/472083 // ISRN Obstet. Gynecol. – 2011. – Vol. 2011. – Art. 472083. – URL: https://www.hindawi.com/journals/isrn/2011/472083/). Следует отметить, что возраст появления первых месячных, характеризуя функционирование гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы в организме женщины (Plant, T.M. 60 years of Neuroendocrinology: the hypothalamo-pituitary-gonadal axis / T.M. Plant // J. Endocrinol. – 2015. – Vol. 226, № 2. – P. T41-T54.), является одним из ключевых показателей как его пубертатного этапа развития, так и важным маркером фертильности женщины и возможных проблем с ее здоровьем в дальнейшей жизни (Пономаренко И.В. Менархе как этап пубертатного развития и его генетические детерминанты / И.В. Пономаренко, М.И. Чурносов // Акушерство и гинекология. – 2018. – № 12. – С. 18-22.). Считается, что девочки с ранним менархе, как правило, характеризуются повышенным индексом массы тела (ИМТ) или ожирением, которые в свою очередь обусловливают 2-4-кратное увеличение риска развития преэклампсии (Poorolajal, J. The association between body mass index and preeclampsia: a meta-analysis / J. Poorolajal, E. Jenabi // J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. – 2016. – Vol. 29, № 22. – P. 3670-3776.). Наряду с этим, низкий ИМТ (характерен для девочек с поздним менархе) уменьшает риск развития задержки роста плода (Different risk factors for very low birth weight, term-small-for-gestational-age, or preterm birth in Japan / N. Tamura, T. Hanaoka, K. Ito [et al.]. – DOI: 10.3390/ijerph15020369 // Int. J. Environ. Res. Public. Health. – 2018. – Vol. 15, № 2. – Art. 369. – URL: https://www.mdpi.com/1660-4601/15/2/369). Обращает на себя внимание тот факт, что несмотря на очевидную связь возраста менархе с ПЭ и ЗРП, исследований, направленных на изучение роли полиморфизма генов-кандидатов менархе в формировании осложнений беременности до настоящего времени не проведено как в России, так и в мире.
Ген KISS1 кодирует белок кисспептин (КР), состоящий из 145 аминокислот, который расщепляется на более короткие, биологически активные молекулы, известные как KP-54, KP-14, KP-13 и KP-10 (число указывает на количество аминокислот), при этом KP-10 имеет С-концевую декапептидную последовательность, общую для всех видов кисспептинов (https://www.genecards.org/). Данные белки реализуют свои эффекты через связывание со специфическим белком-рецептором 54, ассоциированным с G-белком (GPR54), также известным как рецептор KISS1 (KISS1R). Система KP/GPR54, посредством воздействия на гипоталамо-гипофизарно-гонадную ось, влияет на беременность, имплантацию, регулирует различные этапы менструального цикла (Clarke, H. Comprehensive review on kisspeptin and its role in reproductive disorders / H. Clarke, W. S. Dhillo, C. N. Jayasena // Endocrinol. Metab. (Seoul). – 2015. – Vol. 30, № 2. – P. 124-141.). Более низкая концентрация KISS1 в крови у женщин в начале второго триместра беременности приводит к развитию задержки роста плода и преэклампсии.
Ген NKX2-1 кодирует фактор транскрипции, который связывает и активирует промоторы генов тиреоглобулина, тиреопероксидазы и рецептора тиреотропного гормона (https://www.genecards.org/). Также данный белок подавляет экспрессию фактора транскрипции NR1D1, который, в свою очередь, ингибирует транскрипцию генов, участвующих в метаболизме липидов и желчных кислот, процессах адипогенеза, глюконеогенеза и воспалительных реакций макрофагов.
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития ЗРП на основании исследованных полиморфных вариантов генов менархе KISS1 и NKX2-1, а так же других возможных факторов риска с целью выявления беременных с развитием задержки роста плода.
В Российской Федерации исследования о вовлеченности модели эпистатических взаимодействий полиморфных локусов менархе, включающие следующие генотипы: rs7538038 AA KISS1 и rs999460 AA NKX2-1 в формирование предрасположенности к риску развития задержки роста плода у женщин отсутствуют.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития задержки развития плода в зависимости от полиморфных маркеров генов менархе KISS1 и NKX2-1. Источник информации: сайт Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ЗРП на основе данных о полиморфных локусах генов менархе  KISS1 и NKX2-1.
Известен способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода (патент РФ №2526178, от 20.08.2014), отличающийся тем, что с ранних сроков беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровень С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в венозной крови женщины, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле:
PI=-0,8911X1-0,0321X2-2,3669X3+11,0779,
где X1 - относительное содержание CD3+CD16+CD56+-лимфоцитов, %;
Х2 - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;
Х3 - концентрация sTNF-R, нг/мл
и при PI менее 0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI более 0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния. К недостаткам данного способа можно отнести многокомпонентность, сложный расчет, затрудняющий получение заключения о прогнозе, отсутствие сведений о точности и особенно специфичности способа, поскольку изменение многих иммунологических параметров, в том числе используемых CD+-лимфоцитов, имеет место и при преэклампсии, не учитываются генетические факторы.
Известен патент № 2677335 от 16.01.2019 «Способ прогнозирования риска формирования суб- и декомпенсированной плацентарной недостаточности с исходом в синдром задержки роста плода на основе генетических особенностей энергетического обмена матери» по заявке № 2017138891, от 2017.11.08. Сущность способа: проводят определение наиболее информативных сочетаний патологических полиморфизмов генов энергетического обмена PPARD(-87C>T), PPARGC 1A(S482G G>A) и AMPD(Q12X G>A), а также исследование уровня липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и холестерина у матери. Затем вычисляют прогностический индекс D по формуле: D=0,19*Х1+0,39*Х2-0,71*Х3-1,04*Х4-0,68*Х5-1,86, где D - прогностический индекс, Х1 - уровень холестерина в ммоль/л в крови у женщины, Х2 - уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в ммоль/л в крови женщины, Х3 - наличие у женщины генотипов, содержащих вариантный аллель - 87_Т полиморфного ДНК-локуса PPARD(-87C>T) в гомо- и гетерозиготном состоянии: если есть - 1, если нет - 0, Х4 - наличие у женщины генотипов, содержащих вариантный аллель S482 А полиморфного ДНК-локуса PPARGC 1 A(S482G G>A) в гомо- и гетерозиготном состоянии: если есть -1, если нет - 0, Х5 - наличие у женщины генотипов, содержащих вариантный аллель Q12X_A полиморфного ДНК-локуса AMPD(Q12X G>A) в гомо- и гетерозиготном состоянии: если есть - 1, если нет - 0, - 1,86 - CONST. Риск развития суб- и декомпенсированной плацентарной недостаточности с исходом в синдром задержки роста, оценивается в зависимости от величины показателя D: D<0 соответствует высокому риску, D≥0 - низкому. Недостатком данного способа является низкий уровень специфичности решения: изменение данных показателей может наблюдаться у женщин с ожирением, нарушением липидного обмена, атеросклерозом, данный способ ограничен в применении ввиду сложности и длительности его выполнения, а также не учитываются другие генетические детерминанты.
9
Известен способ прогнозирования СЗРП у женщин во втором триместре беременности, осложненной гестозом (патент № 2221253 от 10.01.2004). Для этого в периферической венозной крови определяют число тромбоцитов, активированное парциальное тромбопластиновое время, уровень фибриногена и вычисляют прогностический индекс S по формуле: S=AK1+BK2+CK3+const, где А - число тромбоцитов в 10/л; В - активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ): С - уровень фибриногена, г/л; K1, K2, К3 - коэффициенты, равные соответственно 0,02; 0,046; -0,06; const=-4.39, и если значение индекса S менее 0, то прогнозируют угрозу СЗРП, если значение S более 0, то прогнозируют пропорциональное развития плода. Недостатками способа являются:
- способ отличается трудоемкостью, так как требует определения трех показателей для вычисления прогностического критерия; в изобретении не указывается точный срок беременности, в котором следует проводить исследование и срок гестации, в котором прогнозируется развитие СЗРП;  сложность математической обработки результата по формуле;  не учитываются генетические факторы.
За прототип выбран способ прогнозирования риска развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных (патент РФ №2540928, от 10.02.2015), включающий забор периферической венозной крови, отличающийся тем, что после выделения ДНК проводят анализ полиморфизмов генов факторов коагуляции 20210G/A FII, 1691G/A FV, 10976G/A FVII и прогнозируют повышенный риск развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных в случае выявления аллеля 10976G FVII и генотипа 10976GG FVII, а низкий риск прогнозируют при наличии следующих комбинаций: генотипа 20210GG FII и аллеля 10976А FVII; аллелей 20210G FII, 10976А FVII с генотипом 1691GG FV; аллелей 20210G FII и 10976А FVII. Недостатком данного способа является то, что в нем не учитываются другие генетические полиморфизмы.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития задержки роста плода на основе данных о модели эпистатических взаимодействий полиморфных локусов менархе, включающие следующие генотипы: rs7538038 AA KISS1 × rs999460 AA NKX2-1.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития задержки роста плода у беременных русской национальности, уроженок Центрального Черноземья РФ, на основе данных о полиморфных локусах менархе rs7538038 KISS1 и rs999460 NKX2-1, включающий:
- забор периферической венозной крови;
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов rs7538038 KISS1 и rs999460 NKX2-1;
- прогнозирование высокого риска развития ЗРП у беременных при выявлении модели эпистатических взаимодействий полиморфных локусов менархе, включающие следующие генотипы: rs7538038 AA KISS1 × rs999460 AA NKX2-1.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития ЗРП у беременных на основе данных о модели эпистатических взаимодействий полиморфных локусов менархе, включающие следующие генотипы: rs7538038 AA KISS1 × rs999460 AA NKX2-1.
Способ осуществляют следующим образом:
2
Производится забор периферической венозной крови. Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Miller, S. A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S. A. Miller, D. D. Dykes, H. F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. – 1988. – Vol. 16, № 3. – P. 1215) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
0
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20С.
Генотипирование образцов ДНК было выполнено в Центре коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского национального исследовательского медицинского центра РАН на базе НИИ медицинской генетики (использовался метод MALDI и масс-спектрометр MassARRAY Analyzer 4 (фирма производитель “Seqeunom”, страна производства США). Для генотипирования использовали образцы ДНК в концентрации 10-20 нг в микролитре общим обьемом 10 мкл. В процессе экспериментального анализа образцов выполняли следующие этапы: проведение мультиплексной ПЦР; осуществление SAP-реакции; выполнение iPLEX реакции с последующим обессоливанием и нанесением на SpectroCHIP; процедуры ионизации и анализа спектров с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Степанов, В. А. Мультиплексное генотипирование однонуклеотидных полиморфных маркеров методом масс-спектрометрии MALDI-TOF: частоты 56 SNP в генах иммунного ответа в популяциях человека / В. А. Степанов, Е. А. Трифонова // Молекулярная биология. – 2013. – Т. 47, № 6. – С. 976-986).
Для изучения SNP×SNP взаимодействий, ассоциированных с развитием осложнений беременности и веса новорожденного, использовалась модификация метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) – MB-MDR (Mbmdr: an R package for exploring gene-gene interactions associated with binary or quantitative traits / M. L. Calle, V. Urrea, N. Malats, K. van Steen // Bioinformatics. – 2010. – Vol. 26, № 17. – P. 2198-2199.). Для кодирования генотипов SNPs применялась кодоминантная схема (Lower-order effects adjustment in quantitative traits model-based multifactor dimensionality reduction / J. J. Mahachie, T. Cattaert, F. Van Lishout [et al.]. – DOI: 10.1371/journal.pone.0029594 // PLoS One. – 2012. – Vol. 7, № 1. – Art. e29594. – URL: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0029594). В работе рассматривались наиболее значимые (имеют максимальные статистики Вальда) модели SNP×SNP взаимодействий (в среднем по 2-3 модели 2-х, 3-х и 4-х локусных взаимодействий). Коррекция на множественные сравнения выполнялась пермутационными процедурами (проводилось не менее 1000 пермутаций). При pperm<0,01 результаты считались статистически значимыми. Выполнение MB-MDR и пермутационного теста проводилось в одноименной программе (версия 2.6) в среде R.
Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития ЗРП у беременных подтверждает анализ результатов наблюдений 904 пациенток, из них  женщины с изолированной задержкой роста плода (n=194) и беременные с сочетанием задержки роста плода с преэклампсией (n=79) и 631 женщин контрольной группы. Основные медико-биологические и клинико-анамнестические характеристики беременных с задержкой роста плода и женщин группы контроля отражены в таблице 1.
В выборку для исследования вошли женщины с преэклампсией и/или задержкой роста плода и женщины контрольной группы (с физиологическим течением беременности), давшие свое информированное согласие на участие в данной исследовательской работе и соответствующие ряду критериев: русский этнос, место рождения и проживания – регион Центрального Черноземья России. Основаниями для исключения женщин из исследовательской выборки были отказ от участия в данной работе, наличие родства между ними различной степени, выявление тяжелых хранических заболеваний, проводящих к декомпенсации, нерусский этнос и иные (нежели Центральное Черноземье России) места рождения и/или проживания.
Клиническое, клинико-лабораторное, клинико-инструментальное обследование беременных и новорожденных детей, верификация диагноза осложнений беременности – ПЭ, ЗРП (или их отсутствие), сбор медико-биологической информации, результатов клинического, клинико-лабораторного, клинико-инструментального обследования беременных и новорожденных детей в специально разработанные анкеты и формирование электронной базы данных проводилось сертифицированными врачами профильных отделений перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
При расчете частот генотипов и анализе их ассоциаций у индивидуумов установлена значимая модель эпистатических взаимодействий полиморфных локусов менархе с формированием задержки роста плода: rs7538038 AA KISS1 × rs999460 AA NKX2-1.  Комбинация генотипов, включающие следующие локусы менархе: rs7538038 AA KISS1 × rs999460 AA NKX2-1 является фактором повышенного риска развития ЗРП у женщин (beta=0,98, p=0,0004).
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациенток, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственницами между собой:  проведено генетическое исследование по локусам менархе rs7538038 KISS1 и rs999460  NKX2-1.
У пациентки В., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация генотипов, включающие следующие локусы менархе: rs7538038 GG KISS1 × rs999460 AG NKX2-1, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков ЗРП.
У пациентки Л., при прегравидарной подготовке, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была определена комбинация генотипов, включающие следующие локусы менархе: rs7538038 AA KISS1 × rs999460 AA NKX2-1, что позволило отнести ее в группу беременных с повышенным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. При возникновении беременности у нее на сроке 27 недель был диагностирован синдром задержки роста плода.
У пациентки Е., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация генотипов, включающие следующие локусы менархе: rs7538038 GA KISS1 × rs999460 GG NKX2-1, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков ЗРП.
У пациентки И., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, при прегравидарной подготовке была взята венозная кровь. При генотипировании ДНК-маркеров была выявлена комбинация   генотипов, включающие следующие локусы менархе: rs7538038 GA KISS × rs999460 AG NKX2-1, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков ЗРП.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациенток группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ЗРП.