Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ
STRAIN OF YEAST SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE, PRODUCING L-LACTIC ACID, CONTAINING GENES OF THREE DIFFERENT HETEROLOGOUS LACTATE DEHYDROGENASES IN CHROMOSOME

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается рекомбинантного штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe - продуцента L-молочной кислоты.
Молочная кислота является платформой для производства различных химических соединений. Последнее десятилетие возрос интерес к получению биоразлагаемого полимера молочной кислоты полилактида, занимающего лидирующее положение по объемам выпуска среди биопластиков. В настоящее время полилактид находит все большее применение, в частности, для производства экологически чистых упаковочных изделий и биодеградируемых имплантатов, в том числе с помощью 3D-принтера.
В связи с этим разработка эффективных способов производства молочной кислоты является актуальной задачей.
Традиционно для получения молочной кислоты используют микробиологические способы, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий.
Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты в культуральной жидкости (КЖ), что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.
В качестве альтернативы бактериальным штаммам широко используют штаммы дрожжей, способные к росту и брожению в условиях повышенной кислотности.
Дрожжевые штаммы-продуценты L-молочной кислоты получают путем экспрессии в дрожжевых клетках гетерологичных генов L-лактатдегидрогеназы (L-LDH), в основном из молочнокислых бактерий. При этом в качестве реципиента используют разные виды дрожжей.
Дрожжевые штаммы, продуцирующие L-молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем, получены на дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
Штамм Saccharomyces cerevisiae SP7 [Biotechnol. Bioeng. 2015; 112: 751-758], в котором гены PDC1, CYB2 и GPD1 заменены на гены лактатдегидрогеназы из Pelodiscus sinensis, а гены NDE1 и NDE2, отвечающие за внеклеточный редокс-баланс, делетированы, продуцирует L-молочную кислоту в количестве 117 г/л КЖ в ферментере на среде с дрожжевым экстрактом и пептоном, при поддержании рН на уровне 3.5 на протяжении всего процесса культивирования.
Известен кислотоустойчивый штамм Saccharomyces cerevisiae [Metab. Eng. 2016;35: 38-45], содержащий гетерологичные гены лактатдегидрогеназ из Pelodiscus sinensis japonicas и Bos taurus, который продуцирует L-молочную кислоту в количестве 142 г/л за 40 ч культивирования в ферментере. Недостатком этого штамма - ауксотрофа по урацилу, триптофану, лейцину и гистидину, является необходимость культивирования его на среде, содержащей дрожжевой экстракт, смесь аминокислот и витаминов, что приводит к значительному увеличению себестоимости конечного продукта.
Высокой устойчивостью к низким значениям рН среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают также дрожжи Schizosaccharomyces pombe [RU 2268304].
Известен [RU 2650669] штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224, полученный путем последовательного трехкратного введения гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы дрожжей S. pombe с инактивированным геном алкогольдегидрогеназы, продуцирующий L-молочную кислоту в количестве 100 г/л за 96 ч культивирования в аэробных условиях.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих L-молочную кислоту.
Техническим результатом заявляемого изобретения является рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 ВКПМ Y-4822 с делетированным геном пируватдекарбоксилазы PDC1, несущий в составе хромосомы гетерологичные гены лактатдегидрогеназ из Lactobacillus pentosus, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus helveticus - продуцента L-молочной кислоты.
Штамм Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 ВКПМ Y-4822 получен путем введения в родительский штамм S. pombe ММ-11, содержащий ген L-LDH из Lactobacillus pentosus и ген KanMX, обеспечивающий устойчивость к генетицину (G418) следующих модификаций:
- последовательное делетирование из хромосомной ДНК штамма S. pombe ММ-11 генов KanMX, URA4 и PDC1;
- интеграция в состав хромосомной ДНК кассеты, содержащей ген URA4 и ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus acidophilus;
- интеграция в состав хромосомной ДНК кассеты, содержащей ген KanMX и ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus;
- делетирование из хромосомной ДНК гена KanMX.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:
Фиг. 1. Кассета для трансформации, содержащая ген URA4 и ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus acidophilus.
Фиг. 2. Кассета для трансформации, содержащая ген KanMX и ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus.
Пример 1. Конструирование заявляемого штамма
1.1. Делетирование селективного маркера KanMX по lox-сайтам из хромосомной ДНК штамма S. pombe ММ-11
Делетирование селективного маркера KanMX из хромосомной ДНК штамма S. pombe ММ-11 осуществляют в результате рекомбинации по lox-сайтам с использованием Cre-рекомбиназы. [Biosci Biotechnol Biochem 2004;68(3): 545-550; Yeast 2006;23(11): 813-823].
Штамм ММ-11 трансформируют плазмидой, содержащей ген cre-рекомбиназы под контролем промотора nmt1 с селективным маркером Hph, обеспечивающим устойчивость к гигромицину. Трансформанты отбирают на среде YES состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0.5; глюкоза - 3.0; остальное - вода, с гигромицином (50 мкг/мл). Отдельную колонию засевают в пробирку с минеральной средой PMG, не содержащей тиамин [Pombe Glutamate medium, https://domsife.usc.edu/pombenet/media/]. Пробирку инкубируют на качалке (250 об/мин) при температуре 30° в течение 24 ч. Культуру рассевают до отдельных колоний на чашку со средой YES. Отельные колонии с помощью репликатора переносят на среды YES, YES с генетицином (100 мкг/мл) и YES с гигромицином (50 мкг/мл). В результате отбирают колонию, чувствительную к генетицину и гигромицину, и называют ее Sp-MK1.
1.2. Делетирование гена URA4 из хромосомы штамма S. pombe Sp-MK1
Готовят компетентные клетки штамма S. pombe Sp-MK1, которые трансформируют методом электропорации линейной плазмидой, содержащей дрожжевой селективный маркер KanMX и объединенные методом ПЦР последовательности Up- и Dn-, расположенные выше и ниже гена URA4 с регуляторными элементами.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YES с генетицином (100 мкг/мл) в течение 5 суток при температуре 30°С.
Отбирают трансформант T1 c заданным местом инсерции линейной плазмиды в Uр-плечо гена URA4.
Делетирование генов URA4 и KanMX ws хромосомной ДНК трансформанта Т1 проводят на минеральной среде PMG с урацилом (200 мкг/мл) с добавлением 5-фтороротовой кислоты (1 мас. %) по методу [https://domsife.usc.edu/pombenet/drugs/]. Делетирование гена URA4 и селективного маркера KanMX происходит по прямым повторам, образовавшимся в результате встраивания плазмиды, по механизму гомологичной рекомбинации. Из отдельных колоний выделяют хромосомную ДНК и анализируют на наличие делеции генов URA4 и KanMX методом ПЦР. Отбирают штамм S. pombe Sp-MK2, который содержит конструкцию pCMV-LDHpent Δura4.
1.3. Делетирование гена PDC1 из хромосомной ДНК штамма S. pombe Sp-MK2
Компетентные клетки штамма S. pombe Sp-MK2 трансформируют методом электропорации линейной плазмидой, содержащей дрожжевой селективный маркер URA4 и объединенные методом ПЦР последовательности Up- и Dn-, расположенные выше и ниже структурной части гена PDC1.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде PMG в течение 5 суток при температуре 30°С.
Отбирают трансформант Т2 с заданным местом инсерции линейной плазмиды в Up-плечо гена PDC1.
Далее проводят делетирование генов URA4 и PDC1 из хромосомной ДНК трансформанта Т2 как описано в п. 1.2. Из отдельных колоний выделяют хромосомную ДНК и анализируют на наличие делеции генов URA4 и PDC1 методом ПЦР. Отбирают штамм S. pombe Sp-MK3, который содержит конструкцию pCMV-LDHpent Δura4 Δpdc1.
1.4. Введение гена L-LDH лактатдегидрогеназы из Lactobacillus acidophilus в состав хромосомной ДНК штамма S. pombe Sp-MK3
Введение гена L-LDH лактатдегидрогеназы из Lactobacillus acidophilus в состав хромосомной ДНК штамма Sp-MK3 осуществляют путем трансформации кассетой (Фиг. 1), содержащей ген L-LDH из Lactobacillus acidophilus, транскрипция которого находится под контролем промотора pHsp9 и терминатора транскрипции tbGH, и дрожжевой селективный маркер - ген урацила URA4, фланкированный прямыми повторами dr и обеспечивающий прототрофность по урацилу.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде PMG в течение 5 суток при температуре 30°С.
Отбирают трансформанты с инсерцией кассеты, содержащей ген L-LDH из Lactobacillus acidophilus, в хромосомную ДНК S. pombe.
Трансформанты культивируют в жидкой питательной среде для определения продукции L-молочной кислоты.
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 3 мл жидкой питательной среды YPD состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1.0; пептон - 1.5; глюкоза - 2.0; остальное - вода, при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посевной материал вносят в ферментационную среду в соотношении 1/10 об. Культивирование проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в ферментационной среде ФС состава (мас. %): кукурузный экстракт - 2, калий-фосфатный буфер с рН 6.0 - 5, остальное - вода, с добавлением глюкозы (20 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Ферментацию продолжают в течение 72 часов. Концентрацию L-молочной кислоты в КЖ определяют согласно методу ВЭЖХ [Acta Biotechnol. 1990; 10(5): 459-468]. По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный штамм S. pombe Sp-MK4, который содержит конструкцию pCMV-LDHpent Δpdc1 pHsp9-LDHaci URA4.
1.5. Введение гена L-LDH лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus в состав хромосомной ДНК штамма S. pombe Sp-MK4
Введение гена L-LDH лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus в состав хромосомной ДНК штамма S. pombe Sp-MK4 осуществляют путем трансформации кассетой (Фиг. 2), содержащей ген L-LDH из Lactobacillus helveticus, транскрипция которого находится под контролем промотора pHsp9 и терминатора транскрипции tbGH. В качестве селективного маркера используют фланкированный сайтами lox66 и lox71 ген устойчивости к генетицину KanMX, транскрипция которого находится под контролем промотора pTEF и терминатора транскрипции tTEF.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YES с генетицином (G418) в количестве 100 мкг/мл в течение 5 суток при температуре 30°С.
Отбирают трансформанты с инсерцией кассеты, содержащей ген L-LDH из Lactobacillus helveticus, в хромосомную ДНК S. pombe.
Трансформанты культивируют в жидкой питательной среде для определения продукции L-молочной кислоты, как описано в п. 1.4, и выбирают наиболее продуктивный трансформант Sp-MK5, который содержит конструкцию pCMV-LDHpent Δpdc1 pHsp9-LDHaci URA4 pHsp9-LDHhelv KanMX.
1.6. Получение заявляемого штамма путем делетирования селективного маркера KanMX по lox-сайтам из хромосомной ДНК штамма S. pombe Sp-MK5
Делетирование селективного маркера KanMX по lox-сайтам из хромосомной ДНК штамма S. pombe Sp-MK5 осуществляют, как описано в п. 1.1.
Отбирают колонию, чувствительную к генетицину и гигромицину. Штамм назван S. pombe Sp-MK6 и содержит конструкцию pCMV-LDHpent Δpdc1 pHsp9-LDHaci URA4 pHsp9-LDHhelv.
В результате получают штамм, в котором делетирован ген пируватдекарбоксилазы PDC1, а в хромосомную ДНК интегрированы гены лактатдегидрогеназ L-LDH из Lactobacillus pentosus, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus helveticus. Штамм способен продуцировать L-молочную кислоту.
Штамм депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1) как Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4822.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
При культивировании при температуре 30°С в течение 72 ч на агаризованной среде PMG культура образует колонии белого или слегка кремоватого оттенка, округлые, выпуклые, с ровным краем.
При культивировании в жидкой среде YES в течение 2-х суток клетки имеют палочковидную форму и размеры 3-4 мкм в диаметре и 7-14 мкм в длину. Осадок формируется.
Вегетативное размножение - деление клетки пополам.
Физиолого-биохимические признаки
Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит. Культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.
Оптимальные условия для поддержания штамма
Температура 30°С, рН 6, полная дрожжевая среда YES.
Штамм хранится в лиофилизированном виде или в жидкой среде YES с глицерином (2 мас. %) при -70°С.
Заявляемый штамм Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 ВКПМ Y-4822 сохраняет способность к образованию L-молочной кислоты после 10 последовательных пересевов на полноценной среде.
Пример 2. Уровень продукции L-молочной кислоты при культивировании заявляемого штамма в пробирке
Штамм Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 культивируют в жидкой питательной среде для определения уровня продукции L-молочной кислоты. В качестве контроля используют исходный штамм Schizosaccharomyces pombe ММ-11.
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 3 мл жидкой питательной среды YPD в течение 24 ч на качалке (250 об/мин) при 30°С. Посевной материал вносят в ферментационную среду в соотношении 1/10 об. Культивирование проводят в среде ФС при 30°С на качалке (250 об/мин) в пробирках 50 мл с рабочим объемом 5 мл в течение 72 часов. Концентрацию L-молочной кислоты в КЖ определяют согласно методу ВЭЖХ.
Продукция L-молочной кислоты у штамма Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 составляет 102 г/л, у контрольного штамма Schizosaccharomyces pombe ММ-11 - 60 г/л.
Пример 3. Уровень продукции L-молочной кислоты при культивировании заявляемого штамма в ферментере
600
Культуру клеток штамма Sp-MK6 выращивают на чашках с агаризованной средой YPD в течение 48 часов при 30°С. Полученную биомассу ресуспендируют в стерильной дистиллированной воде. Для приготовления инокулята в качалочных колбах используют жидкую посевную среду YPD. В две качалочные колбы объемом 750 мл с рабочим объемом 50 мл жидкой посевной среды YPD вносят суспензию клеток до получения оптической плотности (OD) равной 0.1. Колбы инкубируют на качалке при 220 об/мин и температуре 30°С до достижения культурой оптической плотности равной 8.0.
2
4
2
4
Для проведения основного процесса биосинтеза в ферментере КФ-103 (ООО-фирма «Проинтех») используют среду следующего состава (мас. %): KНРО - 0.57; KНРО - 0.34; кукурузный экстракт - 2.0; глюкоза - 19.0; пеногаситель Бреокс - 0.1; вода - остальное.
2
В ферментер вносят культуру, выращенную в качалочных колбах, до стартового значения оптической плотности равной 2.0. Культивирование проводят в ферментере объемом Зле начальным рабочим объемом 1 л при 29°С; начальном перемешивании 300 об/мин и аэрации - 1.0 л/мин. Значение рО поддерживают на уровне 20.0% (от насыщения среды воздухом) с использованием каскадной регулировки скорости вращения мешалки. рН=5.0 поддерживают титрованием 25%-м водным раствором аммиака в течение первых 24 часов культивирования, далее титрование отключают.
Через 24 ч культивирования в КЖ стерильно вносят глюкозу до начальной концентрации и продолжают культивирование до 72 ч.
Штамм Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 ВКПМ Y-4822 продуцирует L-молочную кислоту в количестве 125 г/л за 72 часа культивирования в ферментере в аэробных условиях. Конверсия 56%, скорость синтеза 1.7 г/л/ч, конечный рН=2.7.
Таким образом, сконструирован высокопродуктивный прототрофный штамм Schizosaccharomyces pombe Sp-MK6 ВКПМ Y-4822, способный продуцировать L-молочную кислоту при кислых значениях рН на небогатой среде с кукурузным экстрактом (отходе крахмало-паточного и глюкозного производства). Полученный штамм не обладает антибиотикорезистентностью.