Особенности воспалительного процесса у больных муковисцидозом

Краткие сообщения

© 2000, СПб РО РААКИ____________________________________

ОСОБЕННОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ

Булгакова Т.В., Сесь Т.П., Суркова Е.А., Доценко Е.К., Желенина JI.A., Гембицкая Т.Е.

Научно-исследовательский институт пульмонологии

при Санкт- Петербургском университете имени И.П. Павлова

Резюме. В работе исследовали состояние системы протеазы-антипротеазы и уровни провоспалительных ци-токинов IL-8 и TNFa в мокроте у больных муковисцидозом (MB) при обострении и минимальной активности заболевания. Нами было показано, что активность эластазы коррелировала с активностью воспалительного процесса и увеличивалась при обострении заболевания более чем в 10 раз. При этом концентрация a 1-PI - основного ингибитора протеаз увеличилась в 3-5 раз, что свидетельствует о выраженном дисбалансе в системе протеазы-ингибиторы. Концентрация провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa, которые играют важную роль в привлечении нейтрофилов в очаг воспаления, также значительно возрастала при обострении заболевания.

Ключевые слова: муковисцидоз, TNFa, IL-8, а - ингибитор протеиназ, эластаза.

Bulgakova T.V., Ses Т.P., Surkova Е.А., Docenko E.K., Jelenina L.A., Guembitskaia T.E.

FEATURES OF INFLAMMATORY PROCESS IN PATIENTS WITH CYSTIC FIBROSIS

Abstract. The protease-antiprotease system and the levels of proinflammatory cytokines IL-8 and TNFa were investigated in the sputum of patients with cystic fibrosis both in remission and in exacerbation of the disease. It was shown that elastase activity correlated with the degree of inflammatory process and was more than 10 times higher in the sputum of patients with the exacerbation of the disease. At the same time al-PI

Муковисцидоз (MB) - часто встречающееся мо- ного белка (МВТР) в бронхолегочном эпителии спо-

ногенное заболевание, обусловленное мутацией гена, собствует продукции большого количества вязкого

кодирующего трансмембранный регуляторный бе- слизистого секрета, скапливающегося в дыхательных

лок, который в организме выполняет роль ионселек- путях больных MB. Это обеспечивает благоприят-

тивного хлоридного канала [3]. Мутации гена MB ные условия для колонизации грамотрицательных

приводят к нарушению водно-электролитного обме- бактерий - в частности, синегнойной палочки

на в эпителиальных клетках бронхолегочной систе- (Pseudomonos aeruginosa) [3, 9]. Формирующиеся в

мы, поджелудочной железы, печени, репродуктивной легочной ткани больных микроколонии Ps.

системы, потовых желез и развитию воспалительных aeruginosa, окружают себя слизистым экзополисаха-

процессов в жизненно важных органах и системах ридом - алгинатом, который является важнейшим

организма [3]. Тип мутации гена MB и, следователь- фактором защиты микроорганизмов от фагоцитиру-

но, степень нарушения синтеза трансмембранного ющих клеток организма-хозяина и антибиотиков,

регуляторного белка, определяют тяжесть течения что способствует успешному росту бактерий, несмот-

заболевания и его прогноз. Причиной почти всех рянапроводимуюантибактериальнуютерапию[13].

случаев летальных исходов при MB является про- Длительная персистенция синегнойной инфекции

грессирующее поражение легких [4, 9]. Отсутствие стимулирует бронхоальвеолярный эпителий и дру-

или недостаточность трансмембранного регулятор- гие эффекторные клетки к синтезу и освобождению

—-------------------------------------------------- целого ряда медиаторов воспаления, включая и про-

Аорес для переписки: /тт , 0 ™тт, тт г™

„ „ , г, воспалительные цитокины (IL-1B, TNF-a, IL-8) [9].

Санкт-Петербург, ул. Рентгена 12, D тт о

r z/r j > Важную роль в патогенезе MB играет IL-o - кото-

лаборатория молекулярной пульмонологии, , /с^г

Тел (812 ) 234 19 24 ^ЫИ паРяд^ с ДРУГИМИ факторами (С5а компонентом

^ комплемента, LTB., бактериальными продуктами)яв-

Факс:(812)234-90-46. u , rm

v 7 ляется мощным хемоаттрактантом для неитрофилов [9].

IL-8 стимулирует движение нейтрофилов из периферической крови в легкие, активируя адгезионные свойства нейтрофилов, их способность к экзо-цитозу протеолитических ферментов и выработке кислородных радикалов [9]. Эластаза, выделяемая активированными нейтрофилами в межклеточное пространство, способна повреждать практически все соединительнотканные структуры легочной ткани [5]. Ее основным ингибитором в легких является а 1 -ингибитор протеиназ (al-PI) [7,16]. В условиях хронического воспаления при MB активированные ней-трофилы не способны к эффективному клиренсу Ps. aeruginosa вследствие наличия защитного алгинан-тного экрана, окружающего микроколонии. Объектом для повреждающего действия оксидантов и протеолитических ферментов нейтрофилов и альвеолярных макрофагов становятся клетки организма-хозяина - бронхоальвеолярный эпителий, эндотелий легочных капилляров, а также структурные белки -эластин и коллаген. Повреждение легочной ткани приводит к формированию бронхоэктазов и способствует прогрессированию воспалительного процесса [9].

Целью нашей работы была оценка таких важных аспектов хронического воспалительного процесса, развивающегося в легочной ткани больных MB, как характеристика протеазо-антипротеазного баланса и определение уровней провоспалительных цитокинов TNFa и IL-8.

Поскольку по результатам исследования периферической крови трудно оценить особенности воспалительного процесса, протекающего в бронхолегочной системе больных MB, материалом исследования была выбрана мокрота.

Материалы и методы

Обследовано 17 детей, в возрасте 4,5-14 лет, страдающих муковисцидозом, (мутация A F 508), находившихся на лечении в больнице св. Ольги в течение 1997-1998г. У всех обследуемых больных отмечалась смешанная форма MB с тяжелым и среднетяжелым течением заболевания. Согласно клиниколабораторным критериям оценки активности заболевания, больные составили 2 группы: у 10 детей на момент обследования отмечалось выраженное обострение, у 7 - минимальная активность заболевания. Мокроту собирали в стерильные флаконы, измеряли ее объем и разводили физиологическим раствором в соотношении 1: 3 , гомогенизировали, затем центрифугировали 30 минут при 20 ООО g и t° +4°С. Образцы супернатантов хранили при -20° С.

Определение al- ингибитора протеиназ проводили методом количественного иммуноэлектрофореза в агарозном геле. В качестве стандарта использовали al-PI фирмы “SEVAC “ (Чехия) [1]. Количество al-PI выражали в мкг/мл.

Определение активности эластазы проводили спектрофотометрическим методом с использованием в качестве субстрата N- тетра-бутилоксикарбонил-1-аланин-паранитрофенилового эфира (BANPE). Активность эластазы выражали в ЕД/мл [2].

Уровни провоспалительных цитокинов IL-8 и TNFa в образцах мокроты больных MB определяли с помощью метода твердофазного иммунофермен-тного анализа (ИФА), используя наборы ТОО “Ци-токин” ГНЦ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург. Величину оптической плотности образцов определяли при длине волны 495 нм с помощью спектрофотометра “ELIZA -3000 “(DRG, США) с компьютерной обработкой полученных данных. Результаты выражали в пг/мл.

Результаты и обсуждение

При определении активности эластазы в мокроте больных MB установлено достоверное повышение величины этого показателя (Р< 0,001) при обострении заболевания (207,8 ±23,2 ЕД / мл) по сравнению с минимальной активностью воспалительного процесса (17,8±5,0 ЕД /мл) (рис.1).

Как известно, основным ингибитором сериновой эластазы нейтрофилов в легочной ткани является al - ингибитор протеиназ. Наличие антипротеазно-го экрана в микроокружении эпителиальных клеток можно рассматривать как один из наиболее важных механизмов защиты легочной ткани от повреждающего действия протеолитических ферментов. При определении количества al-PI в мокроте больных MB наблюдалось его достоверное (Р< 0,001) повышение (142,2±21,3 мкг / мл) по сравнению с величиной этого параметра при минимальной активности заболевания (28,1 ±5,9 мкг/мл) (рис.2).

Из представленных результатов видно, что обострение заболевания сопровождается увеличением активности эластазы и компенсаторным повышением уровня al-PI в мокроте больных MB. Однако количество al-PI при обострении заболевания увеличивалось в 3-5 раз, по сравнению с минимальной активностью, в то время как активность эластазы возрастала более, чем в10 раз.

Таким образом, эти результаты, а также данные ряда зарубежных авторов о повышении активности эластазы в мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных MB при обострении заболевания [4,12] свидетельствуют о выраженности местного дисбаланса в системе протеазы-антипротеазы и недостаточности компенсаторных защитных механизмов.

Приток нейтрофилов в легкие осуществляется при участии целого ряда хемоаттрактантов - С5а компонента комплемента, лейкотриена В4 и IL-8. Потенциальным источником IL-8 у больных MB слу-

жат клетки альвеолярного эпителия и макрофаги [9]. Бактериальные компоненты - такие, как липополи-сахарид (ЬРБ) и мукоидный экзополисахарид (МЕР) стимулируют макрофаги к освобождению Т№а и 1Ь-8. Важнейший провоспалительный цитокин-Т№а также способен стимулировать освобождение ТЬ-8 [4].

При определении уровня 1Ь-8 и ТОТа в мокроте больных МВ нами установлено достоверное (р<0,05) увеличение концентрации этих провоспалительных цитокинов при обострении заболевания по сравнению с минимальной активностью (рис.З).

Концентрация 1Ь-8 в мокроте больных МВ при обострении заболевания составила 11460±1200 иг/ мл, а ТИРа- 145,6±20,4 пг/мл. При минимальной активности величина этих показателей была достоверно (р<0,05) ниже и составила, соответственно - для 1Ь-8- 6450±1 ООО пг/мл, а для ТИБа- 54,7± 12,4 пг/мл.

Аналогичные данные были получены рядом других авторов, изучавших содержание провоспалительных цитокинов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) и мокроте больных МВ [8,9].

В литературе дискутируется вопрос о целесообразности определения уровней провоспалительных цитокинов для оценки активности заболевания при муковисцидозе. В работе Р. вгеаПу е[ а1. показано, что уровни Т№а и ЬТВ коррелируют с активностью воспаления при МВ [ 6]. Другие авторы -С. КтопЬег§ е! а1., Р.5а1уа et.al.He обнаружили значимой корреляции между уровнем провоспалительных цитокинов

- Т№сс и 1Ь-8 в крови и мокроте больных МВ с числом нейтрофилов в мокроте, объемом форсированного выдоха за 1 секунду (ЕЕУ^ и рядом других клиническо-лабораторных показателей [10,15 ].

Наши данные свидетельствуют о том, что концентрация ТТМЕа и 1Е-8 в мокроте может служить дополнительным критерием оценки активности воспалительного процесса, протекающего в бронхолегочной системе больных муковисцидозом.

Известно, что дисбаланс в системе протеазы-ингибиторы, развивающейся вследствие недоста-

250

200

150

100

50

0

Условные обозначения к рис. 1-3

Минимальная активность заболевания

0] Обострение заболевания

2

Рис. 1. Активность эластазы в мокроте больных муковисцидозом.

Рис. 2. Содержание а1 - ингибитора протеиназ в мокроте больных муковисцидозом.

12000

10000

8000

2

= 6000 4000 2000 0

А Б

Рис. 3. Концентрации провоспалительных цитокинов И-8 (А) и ТИРсх (Б) в мокроте больных муковисцидозом.

точности al-PI, может приводить к развитию эмфиземы легких [4]. Несмотря на увеличение содержания al-PI в мокроте пациентов с MB при обострении заболевания существенно повышается активность свободной, не связанной с al-PI элас-тазы [11]. Следовательно, у больных MB в очаге поражения возникает относительная недостаточность al-PI, что и приводит к развитию эмфизематозных изменений в легких. Наличие большого количества свободной эластазы может быть связано как с резким увеличением в очаге воспаления эндогенной эластазы активированных нейтрофи-лов, так и с наличием экзогенной эластазы бактериального происхождения и, прежде всего Ps. aeruginosa. Нельзя исключить также инактивацию al-PI оксидантами, генерируемыми эффекторны-ми клетками воспаления [11,14]. Вместе с тем, в ряде работ показано, что увеличение активности эластазы в мокроте связано именно с увеличением ее количества, а не с окислительной инактивацией al-PI [4,12].

Полученные нами данные подтверждают следующую схему воспалительного процесса при MB: значительное увеличение провоспалительных цитоки-нов IL-8 и TNFa в очаге воспаления приводит к массивному притоку нейтрофилов, активация которых сопровождается освобождением эластазы во внеклеточное пространство [9]. Несмотря на то, что TNFa усиливает также и синтез al-PI [7], наблюдается выраженный дисбаланс в системе протеазы - ингибиторы. Свободная эластаза вызывает прямое повреждение бронхоальвеолярного эпителия, разрушает эластин и другие структурные белки, что приводит к развитию бронхоэктазов. Наконец, эластаза способствует продукции провоспалительных цитоки-нов, в частности, IL-8 и TNFa эпителиальными клетками дыхательных путей и альвеолярными макро-фагами[ 9 ]. IL-8 и TNFa привлекают в очаг воспаления еще большее число нейтрофилов, дополняя порочный круг воспаления, ведущего к поражению легких.

Список литературы

1. Аксельсен Н„ Крель И., Вееке Б. //Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. М. Мир. - 1977. -С.120

2. Каминская Г.О., Жукова Н.Л., Степанов И.Э. Сравнение двух методов определения и оценки полученных результатов при исследовании эластоли-тической активности мокроты // Лабораторное дело.

- 1984. -№2. -С.110- ИЗ.

3. Капранов Н.И., Рачинский С.В. // Муковисци-доз. - М. - 1995. - С.188.

4. Allen E.D. Opprtunities for the use of aerosolied a -antitripsin for the treatment of cystic fibrosis. // Chest. -1996. - Vol.110. - P.256 - 260.

5. Bieth I.G., // In R. Mecham. editor. Regulation of Matrix Accumulation. Academic Press. New York. - 1986.

- P.217 - 320.

6.Grally P., Hussein М., Cook A., Samson A., PiperP., Price J. Sputum tumor necrosis factor-а and leukotriene concentrations in cystic fibrosis //Arch.Dis.Child.-1993.-Vol.68.-P.389-392

7. Knoell D.L., Ralston D.R., Coulter K.R., Wewers M.D. Alphal-antitripsin and Protease complexation is induced by lypopolysaccharide, interleukin-1(3, and tumor necrosis factor-а in monocytes // Am. J. Crit. Care. Med. -1998.-Vol.157.-P.246-255.

8. Koller D.Y., Nething I., Otto J., Urbaner R., Eichler I. Cytokine concentration in sputum from patients with cystic fibrosis and their relation to eosinophil activity // Am. I. Respir. Care Med. - 1997. - Vol.155. - P.1050 -1054.

9. Konstan M.W., Berger M. Current understanding of the inflammatory process in cysic fibrosis: onset and etiology // Pediatric Pulmonology. - 1997. - Vol.24. - P.137 -142

10. Kronberg G., Fomsgaard A., Shand G. et al.TNF-a and immune complexes in sputum and serum from patients with cystic fibrosis and chronic Ps. aeruginosa lung infection // Immunol. Infect. Dis. - 1992. - Vol.2. - P. 171 -177.

11. Meyer K.C., Lewandoski J.R., Zimmerman I.I.,Nunley D., Calhoun J., Dopico G. Human neutrophil elastase and elastase /a - antiprotease complex in cystic fibrosis// Am. Rev. Respir. Dis. - 1991. - Vol. 144.-P.580

- 585.

12. O’Connor C.M., Gaffney K., Keane J.,Southey A., Byrne N., O’Mahoney S., Fitzerald X. a, - Proteinase inhibitor, elastase activity, and lung disease severity in cystic fibrosis // Am. Rev. Respir. Dis. -1993. - Vol. 148. - P. 1665

- 1670.

13. Perdersen S.S., Hoiby N., Espersen F., Koch C. Role of alginate in infection with mucoid Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis // Thorax. - 1992. - Vol.47. - P.6 -13.

14. Regelmann W.E., Siefferman C.M., Herron I.М., Elliott G.R., Clawson C.C., Gray B.H. Sputum peroxidase activity correlates with the severity of lung disease in cystic fibrosis // Pediatric Pulmonology. - 1995. - Vol.19. -P.l -9.

15. Salva P.S., Doyle N.A., Graham L., Eigen H., Doer-schur C.M. TNF-a, IL-8, soluble ICAM-1, and neutrophils in sputum of cystic fibrosis patients // Pediatric Pulmonology. - 1996. - Vol.21. - P.l 1 - 19.

16. Travis I., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors // Annu. Rev. Biochem. - 1983. - Vol.52. - P.655 -709.

поступила в редакцию 20.04.2000 принята к печати 08.06.2000