СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОЛИНЕВРОПАТИИ ТОНКИХ ВОЛОКОН У ПАЦИЕНТОВ С ЦЕЛИАКИЕЙ

1. Способ диагностики полиневропатии тонких волокон у пациентов с целиакией, включающийся забор трех образцов кожи с дистального участка нижней конечности (на 100 мм выше латеральной лодыжки), после чего биоптаты фиксируют в растворе для фиксации, при этом в качестве раствора для фиксации препаратов используют 2%-ный параформальдегид-лизинпериодат или 2%-ный парафармальдегид, пикриновая кислота (раствор Замбони) в 3 мл в течение 2 дней при температуре 4°С, после чего биоптаты промывают 10 мин в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М, затем выдерживают в криопротективном растворе, который приготавливают из расчета 20 мл глицерина, 2 мл DMSO и 78 мл раствора Соренсен, при температуре 4°С в течение 12 ч, замороженные биоптаты нарезают по 50 мкм, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М 2 раза по 10 мин, добавляют первичные антитела в нужном разведении (1:100, 1:200 или 1:500), выдерживают 12 ч при комнатной температуре во влажной камере, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М 2 раза по 10 мин, после чего добавляют вторичные антитела в разведении 1:100, оставляют на столе при комнатной температуре на 1 ч, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М 2 раза по 10 мин, выдерживают в 30%-ном растворе метанола в натрий-фосфатном буфере в течение 30 мин при комнатной температуре, промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М 2 раза по 5 мин, затем выдерживают биоптаты в АВ-смеси, приготовленной из расчета 1А : 1В : 100 PBS, в течение 1 ч при комнатной температуре, промывают в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М 2 раза по 10 мин, после чего к биоптатам добавляют смесь, приготовленную путем перемешивания 5 мл раствора натрий-фосфатного буфера 0,08 М, 3 капель SG-хромогена и 3 капель гидрогенпероксидазы, через 5 с после этого промывают биоптаты в растворе натрий-фосфатного буфера 0,08 М 3 раза по 10 мин, затем погружают биоптаты в эозин на 5-8 с, вслед за этим проводят дегидратацию в 70%-ном этаноле 3 раза по 1 мин и в 96%-ном этаноле 3 раза по 1 мин, затем опускают биоптаты в ксилол-I на 1 мин, затем в ксилол-II на 1 мин, закрепляют покровным стеклом, дожидаются высыхания полученных препаратов и проводят исследование препаратов методом световой микроскопии, в ходе которого определяют линейную плотность интраэпидермальных тонких нервных волокон, их диаметр, и при значении линейной плотности менее 11 волокон в 1 мм у пациентов с целиакией диагностируют полиневропатию тонких волокон, при значении линейной плотности, большем или равном 11 волокон в 1 мм, диагностируют отсутствие у обследуемого полиневропатии тонких волокон.