Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О
INACTIVATED EMULSION VACCINE AGAINST FOOT-AND-MOUTH DISEASE TYPE O

По классификации Всемирной организации здравоохранения животных (МЭБ) и Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАО) ящур относится к группе «трансграничных инфекций», имеющих большую экономическую значимость для торговли и продовольственной безопасности всех стран. Вирус ящура может легко распространяться и приобретать размах эпизоотий. В Российской Федерации разработана система мер борьбы и профилактики ящура, предусматривающая предупреждение занесения вируса в страну, систематическую вакцинацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне и проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса гомологичного полевым изолятам [1].
В 2014 году в Забайкальском и Приморском крае Российской Федерации, а также в сопредельных странах были зарегистрированы вспышки ящура типа О. Нуклеотидное секвенирование полевых изолятов вируса, выделенных в Забайкальском крае, позволило отнести их к генетической линии PanAsia топотипа ME-SA [2]. Вирус этой же линии циркулировал в 2014 году в Монголии. Вспышка ящура в Приморском крае вызвана изолятом вируса, который принадлежит генетической линии Mya-98 топотипа SEA и имеет высокую степень нуклеотидного родства (96,87%) с изолятом, выделенным в 2014 году в Южной Корее [2].
Профилактическая эффективность вакцин, определяемая по эпидемиологическим показателям, устанавливается в группах привитых животных при угрозе возникновения и распространения болезни. Вакцины должны обеспечивать создание массовой невосприимчивости и препятствовать распространению эпизоотических штаммов вируса ящура.
Для успешного проведения профилактической иммунизации необходима информация об антигеном соответствии вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов, циркулирующих в зоне профилактической вакцинации. При возникновении эпизоотий именно путем определения нуклеотидного и аминокислотного соответствия полевого изолята производственному штамму можно наиболее оперативно подобрать подходящий штамм для производства вакцин, применяемых в зонах риска [3].
Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики ящура используют необходимые типы вируса, подбирают штаммы с богатым набором антигенных вариаций внутри типа и с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм, имеющий широкий спектр иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона, выбирают с помощью его исследования в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса для получения иммуногенной вакцины.
Производственному штамму предъявляются высокие требования по стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также по сохранению антигена во время инактивации и при длительном хранении [4].
Важной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, возникающая в различные временные промежутки на разных территориях, и зависящая от видового состава восприимчивого поголовья животных, его иммунного статуса и множества других факторов. Преимущественно замены в аминокислотных последовательностях имеют место в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Возникающие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики вызываемой болезни [1, 5].
Изменения антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого изолята, могут варьировать от незначительных, детектируемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью поликлональных иммуноглобулинов. Существенные генетические изменения природного изолята вызывают ослабление специфического иммунитета против ящура, индуцированного гетерологичным антигеном. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики ящура.
1
1
Известны штаммы возбудителя ящура типа О, которые долгое время применяли в качестве производственных на территории России в течение последних 50 лет. Среди них выделяют штамм O №1618 Чечено-Ингушский/66, выделенный в 1966 году, а также штамм O №194, выделенный в 1957 году в Волгоградской области. Данные штаммы использовали для получения диагностикумов и противояшурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны, в настоящее время их поддерживают Коллекции штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных».
В Гальском районе Абхазии от КРС выделен штамм О 1736/Абхазия/2000 вируса ящура, который применяли для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.
1
1
13 апреля 2000 года на территории РФ в ОПХ «Степное» села Элитное Уссурийского района Приморского края от свиней выделен изолят О №1734/Приморский/2000 вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штамма О №1734/Приморский/2000, показал, что данный вирус относится к генетической линии PanAsia типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе в Японии, Корее, Вьетнаме, Монголии, а также Армении и Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 году была также вызвана вирусом данной генетической линии. Штамм О №1734/Приморский/2000 имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О Вьетнам/99 и О Тайвань/99. При этом по антигенным характеристикам он отличается от всех выделенных ранее штаммов O №194 и O №1618/Чечено-Ингушский/1966, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики [7].
Производственный штамм О №1734/Приморский/2000 вируса ящура применяется в Российской Федерации в качестве производственного при разработке средств диагностики и специфической профилактики, используемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.
В Восточно-Гобийском аймаке Монголии в феврале 2004 года от КРС выделили штамм О 1964/Монголия/2004, который используется для производства диагностических и вакцинных препаратов [6].
1
В странах Юго-Восточной Азии (Бутан, Монголия, Непал, Китай и др.) за 2015-2017 гг. по квартальным данным WRLFMD неоднократно выделяли изоляты вируса ящура, которые по результатам молекулярно-биологического анализа гена VP, относятся к генетической линии О/ME-SA/Ind-01d. Следует отметить, что вирус ящура генетической линии О Ind-2001 был выделен на территории Российской Федерации впервые.
3
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №1734/Приморский/2000, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта в соотношении, мкг/см:
В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъювантов служат Montanide ISA-70 и Montanide ISA-206. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ).
А вирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №1734/Приморский/2000 представляет собой суспензию, состоящую преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Появился новый изолят вируса ящура, новой линии отсюда следует, что имеющиеся вакцины против вируса ящура не будут создавать иммунитет от эпизоотического изолята типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.
Существенный недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоит в их недостаточной иммуногенной активности, что объясняется невысокой степенью защиты восприимчивых животных от эпизоотических изолятов вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.
Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины, обеспечивающей эффективную защиту восприимчивых животных против полевых изолятов вируса ящура типа О, распространенных на территории Центральной и Юго-Восточной Азии.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных эмульсионных против ящура типа О.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа О, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
3
Разработанная вакцина в 1 см препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17, в количестве не менее 3,0 мкг и адъюванты: масляные адъюванты Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 предпочтительно в количестве 600000,0-700000,0 или 500000,0-575000,0 мкг, соответственно.
Изолят вируса ящура, послуживший источником для создания штамма О №2311/Забайкальский/2016, выделен 28 ноября 2016 года в пади Широкая возле поселка Молодежный Приаргунского района в Забайкальском крае в восточной части РФ на границе с Монголией и Китаем (экспертиза №2311/2016). Производственный штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О получен путем последовательных пассажей в чувствительных гомо- и гетерологичных культурах клеток.
Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/2-17), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без внесения сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Инактивацию вируса проводят с использованием АЭЭИ с концентрацией 0,025-0,050% от объема вируссодержащей суспензии. По окончании процесса АЭЭИ. нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [8]. Инактивированный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005-0,007% от общего объема [9].
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2311/Забайкальский/2016 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура.
3
Содержание компонентов в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [10]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см не менее 0,5 мкг 146S иммуногенных компонентов вируса ящура. Необходимую концентрацию 146S иммуногенных компонентов в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена методом проточной ультрафильтрации.
Эмульсионную инативированную вакцину против ящура типа О получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта в соотношении 4:6 или 1:1 по массе, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют масляный адъювант производства фирмы «Seppic» марки Montanide ISA-70 и Montanide ISA-206.
Полученная вакцина представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана.
1. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма О №2311/Забайкальский/2016 в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма
О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура в эффективном количестве.
3
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см готового препарата.
3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант.
4. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206.
3
5. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве 500000,0-575000,0 мкг в 1 см готового препарата.
6. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант.
7. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-70.
3
8. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 600000,0-700000,0 мкг в 1 см готового препарата.
3
9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве, мкг/см готового препарата:
3
10. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве, мкг/см препарата:
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.
Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антигенный материал из штамма О №2311/Забайкальский/2016, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа О, вызывающего в последние годы вспышки заболевания в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.
Изолят вируса ящура, послуживший источником для получения штамма ВЯ типа О №2311/Забайкальский/2016, был выделен в декабре 2016 года от больных ящуром КРС, находящихся на территории падь «Широкая», сельского поселения «Молодежнинское» Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2311). Производственный штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток и депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов (КШМ) ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 депонирован 08 августа 2017 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/ 2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ).
1
Сущность изобретения представлена на дендрограмме, которая отражает филогенетическое взаимоотношение штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура с эпизоотическими изолятами и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP.
Сущность изобретения изложена в перечне последовательностей, в котором:
1
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена VP штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О;
1
SEQ ID NO: 2 отражает последовательность аминокислот белка VP штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О.
Штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки:
Штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) принадлежит к генетической линии Ind-2001 топотипа Ближний Восток-Южная Азия.
1
Антигенное родство штамма ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) с производственными штаммами вируса ящура О Manisa, О №1734/Приморский/2000, О PanAsia2, О/Тайвань 3/97, О №2222/Тайвань/2012, О №2102/Забайкальский/2010, О №2147/Приморский/2012 и О №2212/Приморский/2014 изучено в РМН.
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r) составило для O1 Manisa - 0,41; О PanAsia2 - 0,85; О №2102/Забайкальский/2010 - 0,44; О №2147/Приморский/2012 - 0,47; О/Тайвань 3/97 - 0,07; О №2222/Тайвань/2012 - 0,12 и О №2212/Приморский/2014 - 0,33.
1
1
При значении r>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются родственными, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма.
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) репродуцируется в первичной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21/2-17). В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 5,78 до 6,45 lg ТЦД/см. При высокой множественности заражения (1-5 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 3 пассажей (срок наблюдения).
Гено и хемотаксономическая характеристики
6
Штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10Д.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP, VP, VP и VP. Липопротеидная оболочка отсутствует.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 3 пассажей на перевиваемой культуре клеток IBRS-2 (срок наблюдения).
При испытании было проведено 3 последовательных пассажей штамма ВЯ О №2311/Забайкальский/2016 (производственный), (контрольный КРС - К-КРС), (контрольный свиной - К-СВ) в перевиваемой культуре клеток IBRS-2. Для определения биологической активности проводили титрование вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IBRS-2.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм О №2311/Забайкальский/2016 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.
Для снижения эпизоотической опасности ящура типа О и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.
Получена высокоиммуногенная инактивированная эмульсионная вакцина против ящура типа О из штамма О №2311/Забайкальский/2016.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение и исследование биологических свойств штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура.
Штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О был изолирован из полевого материала, поступившего в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в виде эпителия афт от свиней, подозреваемых в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. С целью проведения изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов.
2
3
50
Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса в культуре первично-трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией в течение 3 последовательных пассажей. Для постановки биопробы в первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД/клетка), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После инкубации при температуре 37°С в течение 0,5 часа во флаконы вносили по 5 см поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37°С до появления ЦПД вируса, характеризующегося округлением клеток, дегенерацией и отделением клеток от стекла, повышение оптической плотности суспензии. После развития ЦПД флаконы подвергали процессу замораживания-оттаивания, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 об/мин (1200 g) в течение 0,25 ч. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК для детекции вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Возбудитель ящура считали адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов клеточный монослой деструктировал под влиянием вируса на 90-100%.
Вирус, адаптированный к культуре клеток IB-RS-2 использовали для получения антигена для РСК.
Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21/2-17 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.
Результаты исследований представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной активности штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.
Пример 2. Сравнительный анализ биологических свойств штамма О №2311/Забайкальский/2016 с производственными штамма вируса ящура типа О.
При изучении свойств штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура выявлены значительные преимущества в сравнении с другими используемыми производственными штаммами.
В таблицах 3 и 4 приведены результаты культивирования штаммов О №2311/Забайкальский/2016 и О №1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О, из которых следует:
1) штаммы О №2311/Забайкальский/2016 и О №1734/Приморский/2000 имеют разное время репродукции - 10,67±0,36 и 12,33±0,25 часов, соответственно;
3
2) накопление иммуногенных компонентов при культивировании вируса ящура О №2311/Забайкальский/2016 выше, чем у штамма О №1734/Приморский/2000 - 1,53±0,07 и 1,11±0,08 мкг/см, соответственно.
Пример 3. Получение инактивированного антигена и исследование влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S) компоненты вируса ящура штаммов О №2311/Забайкальский/2016 и О №1734/Приморский/2000.
50
Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О готовят из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, выращенного в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,200 ТЦД/клетка.
3
Культивирование вируса осуществляют при температуре 35-37°С. Через 6-7 часов инкубирования оценивают концентрацию живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то экспозицию с вирусом продолжают еще 2-4 часа. При достижении цитопатического действия около 90-95% репродукцию вируса ящура прекращают, а полученную суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S компонентов. Концентрация 146S компонентов вируса ящура в суспензии должна составлять не менее 0,5 мкг/см. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая процесса термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна составлять 0,025-0,050%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток аминоэтилэтиленимина нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия. Для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов в теплую суспензию вносят 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007%. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
Результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S) компоненты штаммов О №2311/Забайкальский/2014 и О №1734/Приморский/2000 вируса ящура отражены в таблице 5.
Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства штамму О №1734/Приморский/2000. Особенно важным является тот факт, что при этом использование штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура по сравнению с вакцинным штаммом О №1734/Приморский/2000 не приводит к снижению концентрации 146S компонента.
Пример 4. Концентрирование антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 для получения вакцины.
Необходимую концентрацию 146S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины из штамма О №2311/Забайкальский/2016 получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией с применением ультрафильтров БТУ 0,5/2-А1 при давлением 1,5 атм. Полученный концентрат антигена хранят при температуре 4-6°С до момента использования. Получаемую вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль стерильности продукции в соответствии с ГОСТ 28085-89.
Пример 5. Процесс диспергирования антигена и адъюванта для получения инактивированной эмульсионной вакцины против ящура из штамма О №2311/Забайкальский/2016.
Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта. В качестве адъювантов применяют продукты марок Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).
При изготовлении эмульсионной вакцины на основе Montanide ISA-206 адъювант и антиген подогревают до температуры 25-30°С и на коллоидных мельницах проводят их диспергирование в соотношении 1:1.
Эмульсионную вакцину на основе Montanide ISA-70 изготавливают путем диспергирования антигена и адъюванта в соотношении 4:6 при их температуре 18-25°С.
3
3
В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против ящура из производственного штамма О №2311/Забайкальский/2016, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде повышения температуры. Обладает выраженной иммуногенной активностью для свиней в прививной дозе 2 см через 21 день после введения. В 1 см должно содержаться не менее 3 мкг 146S компонента вируса ящура. Оптимальный компонентный состав полученной вакцины представлен в таблицах 6 и 7.
Пример 6. Оценка авирулентности и безвредности инактивированной эмульсионной вакцины против ящура из штамма О №2311/Забайкальский/2016.
3
Для определения авирулентности вакцины на свиньях отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см в две точки венчика на каждой конечности. В исследовании использовали свиней массой 35-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.
3
Контроль безвредности продукта на свиньях проводили путем внутримышечного введения вакцины в область верхней трети шеи в дозе 6 см. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после инокуляции температура тела животного может повышаться до 41°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-3 суток.
По результатам исследований вакцина была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.
Пример 7. Оценка гуморального иммунитета у свиней при использовании противоящурной вакцины из штамма О №1734/Приморский/2000 против гомологичного штамма и гетерологичного штамма О №2311/Забайкальский/2016.
Проведена оценка гуморального иммунитета у свиней, привитых инактивированной противоящурной эмульсионной вакциной из штамма О №1734/Приморский/2000, против гетерологичного штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура. Уровень гуморального иммунитета оценивали против производственных штаммов О №1734/Приморский/2000 и О №2311/Забайкальский/2016.
3
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примерах 4, 5, 6 и содержащей, мкг в 2 см:
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
О №1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О
6,9
масляный адъювант ISА-70
1200000,0.
3
2
2
2
Испытание провели на 10 головах свиней. Эмульсионную вакцину вводили внутримышечно в дозе 2,0 см. Результаты исследований представлены в таблице 8, из данных которой видно, что эмульсионная вакцина стимулировала у свиней выработку вируснейтрализующих антител (ВНА) против гомологичного штамма О №1734/Приморский/2000 в количестве 5,19±0,21 log, против гетерологичного штамма О №2311/Забайкальский/2016 - 2,46±0,28 log. Разница в титрах вируснейтрализующих антител является существенной и достоверной. Из этого следует, что вакцина, изготовленная из производственного штамма О №1734/Приморский/2000 не создает гуморальный иммунитет для защиты животных от заражения гетерологичным вирусом ящура О №2311/Забайкальский/2016. По рекомендациям МЭБ (OIE) титр вируснейтрализующих антител должен составлять не менее 5,00 log [1].
Пример 8. Оценка антигенной и протективной активности инактивированной эмульсионной вакцины из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура.
Проведена оценка антигенной и протективной активности инактивированной эмульсионной противоящурной вакциной из штамма О №2311/Забайкальский/2016, против гомологичного штамма вируса ящура.
3
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примерах 4, 5, 6 и содержащей, мкг в 2 см:
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О
6,2
масляный адъювант ISA-70
1400000,0.
3
50
2
2
2
2
Трем группам свиней по 5 голов вводили по 2,0 см цельного препарата, а также в разведениях 1:5 и 1:25, соответственно. 2 головы свиней, взятые в качестве контроля, не прививали. Через 21 день после иммунизации всем животным интрадермолингвально в две точки вводили 10000 ИД контрольного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016, полученного как описано выше. Результаты исследования отражены в таблице 9, из которой следует, что свиньи, привитые цельным препаратом, на 21 день после инокуляции имели титр вируснейтрализующих антител (ВНА), равный 6,35±0,52 log, свиньи, иммунизированные вакциной в разведениях 1:5 и 1:25 - 4,85±0,55 log и 2,35±0,80 log, соответственно. Клинические признаки, характерные для ящура, у животных, иммунизированных цельной вакциной и в разведении 1:5 не развивались. У 4 из 5 свиней, инокулированных вакцинным препаратом в разведении 1:25, наблюдалось развитие генерализованной формы заболевания. Два контрольных животных без вакцинации заболели ящуром при титре ВНА≤0,5 log.
50
Инактивированная эмульсионная противоящурная вакцина из штамма О №2311/Забайкальский/2016 содержала 15 PD (протективных доз с вероятностью 50%), что соответствует требованиям МЭБ (OIE).
Пример 9. Оценка иммуногенной и протективной активности инактивированной эмульсионной вакцины из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура.
Проведено исследование иммуногенной и протективной активности инактивированной эмульсионной противоящурной вакциной из штамма О №2311/Забайкальский/2016, против гомологичного штамма вируса ящура.
3
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примерах 4, 5, 6 и содержащей, мкг в 2 см:
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О
6,2
масляный адъювант ISA-70
1000000,0.
2
2
2
2
2
Результаты исследования представлены в таблице 10, из которой видно, что животные, привитые цельным препаратом, на 21 день после иммунизации имели титр ВНА, равный 6,80±0,33 log, головы КРС, инокулированные вакциной в разведениях 1:4 и 1:16 - 5,05±0,11 log и 3,20±0,31 log, соответственно. Титр ВНА у контрольных животных составлял ≤0,5 log. Развития клинических признаков ящура у КРС, иммунизированного цельной вакциной и в разведении 1:4 не наблюдалось. У 1 из 5 голов, иммунизированных вакцинным препаратом в разведении 1:16, отмечали развитие генерализованной формы заболевания. Генерализация процесса также развивалась у двух контрольных животных с титром ВНА≤0,5 log.
50
Инактивированная эмульсионная противоящурная вакцина из штамма О №2311/Забайкальский/2016 содержала 22 PD (протективных доз с вероятностью 50%), что соответствует требованиям МЭБ (OIE).
50
По рекомендациям МЭБ (OIE) вакцина против ящура должна содержать не менее 6 PD в прививном объеме [1]. Следовательно, изготовленная инактивированная эмульсионная вакцина из штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура проявляет высокую иммуногенную активность.
Пример 10. Оценка антигенной активности при использовании противоящурной вакцины из штамма О №1734/Приморский/2000 против гетерологичного штамма О №2311/Забайкальский/2016
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
О №1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О
6,1
масляный адъювант ISA-206
1100000,0.
2
2
Результаты исследования представлены в таблице 11, из которой видно, что животные, привитые вакциной, на 21 сутки после иммунизации имели титр ВНА против гомологичного штамма О №1734/Приморский/2000 5,50±0,43 log, а против гетерологичного штамма О №2311/Забайкальский/2016 3,10±0,23 log.
Титры антител против гетерологичного штамма ниже в 5 раз, чем против гомологичного вируса.
У одной головы из пяти отмечали развитие генерализованной формы заболевания.
2
Генерализация процесса также развивалась у двух контрольных животных с титром ВНА≤0,5 log.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма О №2311/Забайкальский/2016 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина эмульсионная инактивированная против ящура типа О»:
1. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed.-, Paris, 2016 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
2. Официальный сайт Пербрайт - URL: http://www.wrlfmd.org/fmd_genotyping/fmd_genotyping.htm (дата обращения 02.08.2017 г.).
3. Дудников А.И., Борисов В.В., Дудников С.А. Противоящурный иммунитет и практические достижения в области противоящурной защиты // Пробл. зооiнженерii та вет. Медицини: зб. наук. прац. - Харькiв, 2007. - Вип. 15(40). - Ч. 2, - т. 1. - С. 116-120.
4. Ререр X. Ящур / Перевод с нем. Г.А. Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур / Под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - С. 231-250.
6. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 / Т.А. Фомина, В.К. Спирин, А.И. Егорова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 94-104.
7. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 Приморский/2000 / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-58.
8. Патент РФ №2054039, С12N 7/02, А61К 39/135, 10.02.1996 г.
9. Патент РФ №594771, А61К 39/12, 07.07.1993 г.
10. Бондаренко А.Ф. Методика определения содержания вирусоспецифического белка и компонентного состава вируса ящура с помощью количественной РСК: утв. директором ВНИИЯИ. - Владимир, 1987.
11. Archetti, J. Persistent antigenic variation of influenza A viruses after incomplete neutralization in ovo with heterologus immune serum / J. Archetti, F.L. Horsfall // J. Exp. Med. - 1950. - Vol. 92, №5. - P. 441-462.
Примечание: РМН - реакция микронейтрализации
* ВСБ - вирусспецифический белок
* ВСБ - вирусспецифический белок
Примечание: * ВСБ - вирусспецифический белок