Стандартизация диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии с помощью проточной цитометрии

deficient anemia in infants in a prospective study in Jordan. Eur. J. Haematol. 2000; 64(4): 231-6.

9. GamblingL., DanzeisenR., GairS., LeaR.G., CharaniaZ., Solanky N., Joory K.D., Srai S.K., McArdle H.J. Effect of iron deficiency on placental transfer of iron and expression of iron transport proteins in vivo and in vitro. Biochem. J. 2001; 15 (356, Pt 3): 883-9.

10. Harthoorn-Lasthuizen E.J., Lmdemans J., Langenhuysen M.M. Does iron-deficient erythropoiesis in pregnancy influence fetal iron supply? Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2001; 80 (5): 392-6.

11. Alen LH. Biological mechanisms that might underlie iron's effects on fetal growth and preterm birth. J. Nutr. 2001; 131(28-2): 581-9.

12. Gambling L., Charania Z., Hannah L., Antipatis C., Lea R.G., McArdle H.J. Effect of iron deficiency on placental cytokine expression and fetal growth in the pregnant rat. Biol. Reprod. 2002; 66 (2): 516-23.

13. Козинец Г.И., Левина А.А., Шмаров Д.А. и др. Железодефицит -реальная опасность. Русский медицинский журнал. 2003; 11(8): 464-7.

14. Макаров И.О. Анемия и беременность. Мед. Журнал SonoAce-International. 2007.

REFERENCES

1. Blbulyan A.K. Blood indicators at the time of delivery at patients with iron deficiency anemia and healthy women // YI congress of Hematology and Blood Transfusion Republic of Belarus. Collection of the works «Aktual'nye problemy gematologii i transfuziologii». Minsk, on May 24-25, 2007; 148-9.

2. Shmarov D. A. Kozineс G. I. Laboratory and clinical value of the flowing and cytometric analysis of blood. M., Medical news agency. 2004; 128 (in Russian).

3. Rumyantsev S. A., PlyasunovaS. L., РunkovD.D. etc. Cellular structure of an umbilical blood depending on a floor and the weight of a body of newborns//the Russian pediatric magazine: scientific and practical magazine. 2006; 6: 39-46 (in Russian).

4. Shmarov D. A., Blbulyan A.K., Kozineс G. I. Studying of cellular structure of a peripheral and umbilical blood at the first and repeated childbirth at healthy women the Collection «Novoe v gematologii i transfuziologii». Kiev. 2006; 4: 216-20.

5. Kozineс G. I., Pogorelov V. M., Kotelnikov V. M. etc. About stability of a krovetvoreniye and its laboratory indicators (the literature review). Laboratornoe delo. 1988; 7: 3-7 (in Russian).

6. Garkavi L.H., Kvakina E.B., Kuzmenko T.S. Antistressornye reactions and activation therapy. M., 1998 (in Russian).

7. Matyushichev V. B., Shamratova V. G. Change of indicators of platelets of peripheral blood at iron deficiency anemia. Gematologija i transfuziologija. 2005; 50(2): 29-32 (in Russian).

8. Kilbnde J, Baker TG, Parapia L.A, Khoury S.A. Incidence of iron-deficient anemia in infants in a prospective study in Jordan. Eur. J. Haematol. 2000; 64(4): 231-6.

9. GamblingL., DanzeisenR., GairS., LeaR.G., Charania Z., Solanky N., Joory K.D., Srai S.K., McArdle H.J. Effect of iron deficiency on placental transfer of iron and expression of iron transport proteins in vivo and in vitro. Biochem. J. 2001; 15 (356, Pt 3): 883-9.

10. Harthoorn-Lasthuizen E.J., Lmdemans J., Langenhuysen M.M. Does iron-deficient erythropoiesis in pregnancy influence fetal iron supply? Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2001; 80 (5): 392-6.

11. Alen L.H. Biological mechanisms that might underlie iron's effects on fetal growth and preterm birth. J. Nutr. 2001; 131(28-2): 581-9.

12. GamblingL., Charania Z., HannahL., Antipatis C., LeaR.G., McAr-dle H.J. Effect of iron deficiency on placental cytokine expression and fetal growth in the pregnant rat. Biol. Reprod. 2002; 66 (2): 516-23.

13. Kozineс G. I., LevinaA.A., ShmarovD. A. etc. Zhelezodefitsit - real danger //Russkij medicinskij zhurnal. 2003; 11(8): 464-7 (in Russian).

14. Makarov I.O. Anemia and pregnancy. Medical. SonoAce-Interna-tional magazine. 2007.

Поступила 05.03.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 удК 616.633.963.42-07:576.08

Е.В. Наумова1, М.Е. Почтарь1, Д.Г. Кисиличина1, О.С. Плеханова1, А.А. Сипол2, Е.В. Бабенко2, Е.В. Боякова3, Т.В. Глазанова4, Ж.В. Чубукина4, Н.В. Пронкина5, А.М. Попов6, Л.И Савельев6, В.И. Борисов8 , С.А. Луговская1

стандартизация диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии с помощью проточной цитометрии

1Кафедра клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава РФ,123995, Москва; 2НИИ Детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой, Санкт-Петербург; 3ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, 117997, Москва; 4Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России, 191024, Санкт-Петербург; 5ФГБУ НИИ клинической иммунологии СОРАМН, 630099, Новосибирск; 6 ОДКБ №1 Центр детской гематологии и онкологии, Екатеринбург; 7ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия, 620028 Екатеринбург; 8ООО Алексион Фарма, 123317, Москва

Проточная цитометрия становится все более широко используемым методом, однако достаточная новизна методики не имеет четко отработанных стандартов диагностики многих заболеваний. Отсутствие внешнего контроля качества способствует появлению большого разнообразия подходов к диагностике заболеваний и невозможности сопоставления результатов исследований, полученных в разных лабораториях. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) является приобретенным клональным заболеванием, характеризующимся пролиферацией стволовых клеток с частичной или полной потерей экспрессии гликозилфосфатидилиннозитолового якоря, необходимого для связи целого ряда поверхностных белков. Проточная цитометрия является основным методом выявления и мониторинга ПНГ-клона. В данной статье приводятся результаты ПНГ-тестирования 8 пациентов в 6 независимых лабораториях с помощью проточной цитометрии по стандартному протоколу, рекомендованному Международным обществом клинических цитометристов

Ключевые слова: проточная цитометрия, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, моноклональные антитела

гематология

E.V. Naumova, M.E. Potchtar, D.G. Kisilitchina, O.S. Plekhanova, A.A. Sipol, E.V. Babenko, E.V. Boyakova, T.V. Glazanova, J.V. Tchubukina, N.V. Pronkina, A.M. Popov, L.I. Saveliyev, V.I. Borisov, S.A. Lugovskaya

THE STANDARDIZATION OF DIAGNOSTIC OF PAROXYSMAL NIGHT HEMOGLOBINURIA USING FLOW CYTOMETRY

The Russian medical academy of post-graduate education of Minzdrav of Russia, 123995 Moscow, Russia; The R.M. Gorbacheva institute of children hematology and transplantology, St. Petersburg, Russia; The Dmitri Rogatchev research clinical center of children hematology, oncology and immunology, 117997 Moscow, Russia; The Russian research institute of hematology and transfusiology of the Federal medical biological agency, 191024 St. Peterburg, Russia; The research institute of clinical immunology of the Siberian branch of Russian academy of medical sciences, 630099 Novosibirsk, Russia; The center of children oncology and hematology of oblast children clinical hospital №1, 620149 Yekaterinburg, Russia; The Ural state medical academy, 620028 Yekaterinburg, Russia; Alexion Pharma, 123317 Moscow, Russia

The flow cytometry becomes a more and more largely applied technique. However, the sufficient novelty of technique has no worked-out standards of diagnostic of many diseases. The lacking of external control of quality promotes development of large variety of approaches to diagnostic of diseases and impossibility to compare the study results from different laboratories. The paroxysmal night hemoglobinuria is an acquired clonal disease characterized by proliferation of stem cells with partial or total loss of expression of glykosylphosphosphatidyl inositol anchor needed to conjugate a number of surface proteins. The flow cytometry is a basic technique of detection and monitoring of clone ofparoxysmal night hemoglobinuria. The article presents the results ofparoxysmal night hemoglobinuria testing of 8 patients in 6 independent laboratories using flow cytometry by standard protocol recommended by the International society of clinical cytometrists (ICCS).

Key words: flow cytometry, paroxysmal night hemoglobinuria, monoclonal antibody

Введение. Пароксизмальная ночная гемоглобину-рия (ПНГ) - это уникальная клональная патология ге-мопоэтических стволовых клеток, характеризующаяся частичной или абсолютной потерей всех белков, которые связываются с мембраной через гликозил-фосфатидилиннозитоловый (ГФИ) якорь. В основе нарушения экспрессии ГФИ лежит мутация гена PIG-A [1, 2]. Патогенез клинических проявлений заболевания связан с гемолизом эритроцитов в результате атаки комплементом через образование мембраноатакующе-го комплекса (МАК), который в норме инактивируется присутствием на эритроцитах ГФИ-связанного белка CD59. CD59 является основным блокатором постоянной активации системы комплемента и защищает клетки от образования на их поверхности МАК [3].Первы-ми методами диагностики ПНГ были сахарозная проба Хартмана-Дженкинса и кислотный метод Хэма (1936), когда в слабом растворе сахарозы или при понижении рН сыворотки происходят активация комплемента и видимый глазом гемолиз эритроцитов. Недостатками этих методов являются невозможность количественной оценки результата и слабая чувствительность. С развитием проточной цитометрии и пониманием патогенеза заболевания был разработан протокол по диагностике ПНГ на основе определения дефицита экспрессии CD55 и CD59 на эритроцитах [4, 5]. В дальнейшем стало очевидно, что оценка содержания эритроцитов с недостаточным количеством белков CD55 и CD59 не позволяет судить об истинных размерах ПНГ-клона, поскольку эритроциты подвергаются гемолизу, кроме того, после переливания крови изменяется соотношение содержания нормальных и ПНГ-эритроцитов. Более адекватным является оценка наличия ПНГ-клеток в популяции лейкоцитов. Одновременно показано, что определение экспрессии CD55 не позволяет эффективно выявить эритроциты 2-го и 3-го типа (частично лишенные GPI-якоря и полностью лишенные). В настоящее время оценка экспрессии CD55 не является обязательной для диагностики ПНГ [6]. После создания FLAER (Fluorescence AERolysin) - бакте-

Для корреспонденции:

Луговская Светлана Алексеевна, д-р мед. наук, проф. Адрес: 123995, Москва, ул. Баррикадная, 2/1 E-mail: slugovskay@mail.ru

риальный белок, который связывается непосредственно с ОР1-якорем, выявление ПНГ-клона стало рутинным тестом. Результаты сравнения различных клонов антител разных фирм-производителей позволило определить наиболее эффективные, был создан протокол, который в настоящее время рекомендован Международным обществом клинических цитометристов (ICCS) как основной протокол диагностики ПНГ [7, 8]. Руководствуясь данным протоколом, провели работу по определению сходимости результатов тестирования образцов крови для выявления ПНГ-клона в нескольких лабораториях на приборах разных фирм-производителей.

Материалы и методы. Характеристика пациентов. Протестировали 7 пациентов с заранее известным наличием ПНГ-клеток в популяции гранулоцитов: у 1 пациента менее 1%, у 3 - 1 до 10%, у 3 - более 50%. Дополнительно предложили 1 образец крови здорового донора в качестве негативного контроля (табл. 1). Средний возраст больных 36 лет. Получили информированное согласие от всех пациентов, а также разрешение локального этического комитета для проведения данного протокола с помощью проточной цитометрии.

Лаборатории, принимавшие участие в исследовании. В тестировании участвовали 6 независимых цитометри-ческих лабораторий: лаборатория кафедры клиниче-

Таблица 1

Характеристика больных

Пациент Первичный диагноз Возраст, годы ПНГ-клон на гранулоцитах, %

1-й АА 28 1-10

2-й АА/ПНГ 32 > 50

3-й ПНГ 55 > 50

4-й АА 23 1-10

5-й АА 36 1-10

6-й АА 27 < 1

7-й АА 62 > 50

8-й Негативный контроль 32 0%

Примечание. Здесь и в табл. 2: АА - апластическая анемия.

Рис. 1. Выявление ПНГ-клона на гранулоцитах (пациент № 7) на основании отсутствия флюоресценции по FLAER-Alexa 488 (FL1) и CD24-PE (FL2) через 2 ч (FACS AriaII, BD) после взятия крови (а) и через 4 сут (FACS Calibur, BD) этого же образца крови в другой лаборатории (б).

ской лабораторной диагностики РМАПО, Москва, (руководитель - д-р мед. наук проф. Долгов В.В.), прибор CytomicsFC500, Beckman Coulter, США (BC); лаборатория биологии трансплантации ГСК ФНКЦ им. Д. Рога-чева, (руководитель - канд. мед. наук Боякова Е.В.), прибор FACSCantoII, Becton Dickinson, США (BD); лаборатория трансплантационной иммунологии НИИ детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой, Санкт-Петербург (руководитель - канд. мед. наук Сипол А.А.), прибор FACSAriaII, BD; лаборатория иммуноге-матологии ФГУ Российский НИИ гематологии и транс-фузиологии, Санкт-Петербург (руководитель - д-р мед.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

I

2 3 б

♦

д

Лаборатория 1 Лаборатория 2 Лаборатория 3  Лаборатория 4 * Лаборатория 5 О Лаборатория 6

1

Рис. 2. Распределение (в %) по количеству ПНГ-клеток в популяциях эритроцитов (2-й и 3-й тип), гранулоцитов и моноцитов у пациентов с ПНГ-клоном до 10% (пациент № 4, а) и с ПНГ-клоном более 50% (пациент № 1, б).

1 - эритроциты 2-го типа; 2 - эритроциты 3-го типа; 3 - гранулоциты; 4 - моноциты.

наук Глазанова Т.В.), прибор CytomicsFC500, BC; лаборатория иммунофенотипирования опухолей ОДКБ №1 Центр детской гематологии и онкологии, Екатеринбург (руководитель - канд. мед. наук Савельев Л.И.), прибор FACSCantoII, BD; лаборатория клинической иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СОРАМН, Новосибирск ( руководитель - канд. мед. наук Пронкина Н.В.), прибор FACSCalibur, BD.

Характеристика панели антител. Набор антител по характеру выявляемых антигенов был идентичен для цитометров различных фирм-производителей, но отличался по флюорохромам и клонам антител с сохранением 4-цветной комбинации.

Для приборов фирмы Beckman Coulter набор реагентов был следующим: для выявления ПНГ-клеток на эритроцитах (1-я пробирка): CD235a (гликофорин)-FITC, клон KC16 (BC), CD59-PE, клон МЕМ-43 (Invitrogen); на гранулоцитах (2-я пробирка): CD45-PC7, клон J33 (BC), CD15-PC5, клон 80H5 (BC), CD24-PE, клон ALB9 (BC), FLAER-Alexa 488 (CEDARLANE); на моноцитах (3-я пробирка): CD45-PC7 (BC), CD64-PC5, клон 22 (BC), CD14-PE, клон RMO52 (BC), FLAER-Alexa 488 (CEDARLANE).

Для приборов фирмы Becton Dickinson использовали следующую комбинацию: на эритроцитах (1-я пробирка) CD235a (гликофорин)^ТГС, клон (BC), CD59-PE (In-vitrogen); на гранулоцитах (2-я пробирка): CD45-perCp, клон D2 (BD), CD15-APC, клон H198 (BD), CD24-PE (BC), FLAER-Alexa 488 (CEDARLANE); на моноцитах (3-я пробирка): CD45-PerCP (BD), CD64-APC, клон 10.1 (BD), CD14-PE (BC), FLAER-Alexa 488 (CEDAR-LANE).

Методика гейтирования. Протокол гейтирования был следующий: (1-я пробирка) определение содержания ПНГ-клеток на эритроцитах: SSC (log) vs. FSC (log), далее SSC (log) vs. CD235a-FITC, последний дотплот CD235a-FITCvs. CD59-pE; Отдельным гейтированием CD235a-FITCvs. FSC (log) смотрели количество агрегированных клеток, которых не должно быть больше 1,5% общего количества событий; (2-я пробирка) определение уровня ПНГ-клеток на гранулоцитах: SSC (lin) vs. FSC (lin), далее SSC (lin) vs. CD45, затем SSC (lin) vs. CD15, последний дотплот CD24 vs. FLAER; (3-я пробирка) определение уровня ПНГ-клеток на моноцитах аналогичное, вместо CD15 и CD24 использовали CD64 и CD14 соответственно.

Методика иммунофенотипирования. Окрашивание лейкоцитов проводили по стандартной методике имму-

Рис. 3. Распределение эритроцитов по уровню экспрессии CD59: 1-й тип - нормальные эритроциты; 2-й тип - частично лишенные ОР1-якоря; 3-й тип - полностью лишенные ОРТ-якоря, не содержащие на своей поверхности протеина CD59 (пациент № 4).

ГЕмАТОЛОГИЯ

Таблица 2

результаты тестирования 8 пациентов на наличие пнг-клона в популяциях эритроцитов, моноцитов и гранулоцитов

Пациент Эритроциты 2-го типа Эритроциты 3-го типа Гранулоциты Моноциты Первичный диагноз

M (%) SD M (%) SD M (%) SD M (%) SD

1-й 0,30 0,064 1,38 0,177 6,83 0,386 7,23 0,597 AA

2-й 19,46 0,523 30,59 0,864 94,84 0,514 93,61 0,687 AA/ПНГ

3-й 13,95 0,598 34,00 0,744 97,79 0,266 98,17 0,885 ПНГ

4-й 0,36 0,163 1,85 0,040 5,57 0,360 4,66 0,230 AA

5-й 0,09 0,085 0,51 0,056 2,69 0,253 4,73 0,399 AA

6-й 0,03 0,017 0,29 0,028 0,12 0,037 2,51 0,209 AA

7-й 1,11 0,075 11,54 0,998 62,77 1,472 66,43 0,939 AA

8-й 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,002 0,003 Контроль

Примечание. M - среднее значение; SD - стандартное отклонение.

нофенотипирования для цельной крови, для моноцитов и гранулоцитов в разных пробирках: после добавления к образцу цельной крови антител в объеме, предлагаемом фирмой-производителем, и 20-минутной инкубации в темноте проводили лизирование эритроцитов с последующей отмывкой. Для выявления ПНГ-эритроцитов цельную кровь предварительно разбавляли в 100 раз, затем инкубировали с антителами в отдельной пробирке с последующей обязательной двойной отмывкой. Тестирование образцов крови проводили в разных лабораториях в разные промежутки времени после взятия крови: минимальный промежуток 2 ч, максимальный - 4 дня. Транспортировку образцов крови осуществляли при температуре 4/8°С.

Результаты и обсуждение. Поскольку лаборатории, участвовавшие в тестировании, находились в разных городах, то максимальное время между первым тестированием и последним составило 4 дня. Тем не менее во всех лабораториях было получено четкое распределение популяций на двухмерном графике (рис. 1).

Всего протестировали 8 образцов крови. В независимости от уровня ПНГ-клона все 6 лабораторий получили результаты с минимальным различием (рис. 2).

Считается, что истинный и максимальный уровень ПНГ-клона отражает исследование популяции гранулоци-тов, тогда как среди моноцитов ПНГ-клон обычно больше или равен гранулоцитарному. Разница по количеству ПНГ-клеток между популяциями гранулоцитов и эритроцитов дает информацию о степени разрушения последних, что должно подтверждаться уровнем ЛДГ [9]. Однако при наличии предшествовавших переливаний крови картина не позволяет судить об уровне гемолиза из-за изменения соотношения содержания нормальных и ПНГ-эритроцитов. Считается, что тестирование необходимо делать не ранее чем через 2 нед после последнего переливания крови.

Разделение эритроцитов на 2-й и 3-й тип дает косвенную информацию о большей склонности к тромбозам или гемолизу: 3-й тип - это эритроциты, полностью лишенные CD59, а следовательно, и защиты от комплемента, т.е. клетки склонны к разрушению, 2-й тип - устойчивы к гемолизу, но имеют поврежденную мембрану, что способствует большей их агрегации и тром-бообразованию (рис. 3).

У всех 7 пациентов выявили ПНГ-клон во всех исследуемых популяциях. Несмотря на то что у 5 пациентов количество ПНГ-клеток было максимально среди моноцитов, истинный уровень ПНГ-клона определили в популяции гранулоцитов (табл. 2). До сих пор не уста-

новили биологическую причину такого различия между уровнем клона моноцитов и гранулоцитов, но наиболее часто это встречается у пациентов с апластической анемией и миелодиспластическим синдромом.

Заключение. Метод, предложенный ICCS, является эффективным в определении содержания ПНГ-клона как большого размера, так и минорного клона меньше 1%, что особо важно при тестировании пациентов из групп риска, где высока частота встречаемости и его наличие является благоприятным для течения заболевания и может повлиять на выбор тактики лечения. Этот метод имеет высокую воспроизводимость в независимости от типа прибора и фирмы-производителя, позволяет точно определять размер клона в течение длительного периода хранения образцов крови при 4-8°С до 4 дней как среди эритроцитов, так и среди популяций лейкоцитов. Данный протокол определения содержания ПНГ-клона является оптимальным и подходит как для скрининга пациентов из групп риска, так и для проведения высокочувствительного исследования ПНГ-клона. Благодарности

Д^оры данной статьи благодарят компанию ООО "Aлексиoн Фарма" за организацию данного исследования и предоставленную возможность принять в нем участие. Личная благодарность д-ру A^. Кулагину, НИИ Детской гематологи и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой (Санкт-Петербург) за организацию и предоставление образцов крови пациентов.

ЛИТЕ PAТУPA

1. Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Козлов В.А. Aпластическая анемия. Иммунопатогенез, клиника, диагностика, лечение. Новосибирск, Наука, 2008, 232 с.

2. Takeda J., Miyata T., Kawagoe K., Iida Y., Endo Y., Fujita T., Taka-hashiM., Kitani T., Kinoshita T. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the pIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 1993 May 21; 73(4):703-11.

3. Kinoshita T, Inoue N. Relationship between aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Int J Hematol 2002; 75: 11722.

4. Cui W., Lin Q., Zhang Z. phenotypicanalysisofaffectedperipheral-erythroidforCD59 inparoxysmalnocturnalhaemoglobinuria. 2002 Chin. Med. J. 115: 206-8.

5. Oelschlaegel U., Besson I., Arnoulet C., Sainty D., NowakR., Naumann R., Bux Y., Ehninger G. Astandardizedflowcytometricmethod-forscreeningparoxysmalnocturnalhaemoglobinuria (PNH) measur-ingCD55 andCD59 expressiononerythrocytesandgranulocytes. Clin. Lab. Haematol. 2001; 23: 81-90.

6. Hernandez-Campo P.M., Martin-Ayuso M., Almeida J., Lopez A.,

Orfao A. Comparative analysis of different flow cytometry- based immunophenotypic methods for the analysis of CD59 and CD55 expression on major peripheral blood cell subsets. Cytometry. 2002; 50: 191-201.

7. Brodsky R.A., Mukhina G.L., Li S., Nelson K.L., Chiurazzi P.L., Buckley J.T., Borowitz M.J. Improved detection and characterization of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria using fluorescent aerolysin. Am. J. Clin. Pathol. 2000; Sep; 114(3): 459-66.

8. SutherlandD.R., KeeneyM., Illingworth A. Practical Guidelines for

the high-sensitivity detection and monitoring of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) clones by flow cytometry. Cytometry Part B. 2012; 82B: 195-208.

9. Yeongsic Kim, Jihyang Lim, Myungshin Kim, Yonggoo Kim, Jong-Wook Lee, Kyungja Han. QuantitationofCD55 andCD59 Expression-on Reticulocytes andMature Erythrocytesin Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria, Aplastic Anemia, and Healthy Control-Subjects. Annalsof Clinical & Laboratory Science, 2010; 40(3).

Поступила 05.03.13

коагулология

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 удК 616.155.25-091-073.537

В.Б. Хватов, М.С. Макаров, Н.В. Боровкова

морфологическая оценка адгезивной активности тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания

НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, 129010, Москва

Предложена морфологическая оценка адгезивной активности тромбоцитов (ААТ) человека, основанная на витальном окрашивании клеток и регистрации процесса адгезии с помощью флюоресцентного микроскопа. Установлена регрессионная зависимость (R2 = 0,916) между ААТ и морфофункциональной и агрегационной активностью тромбоцитов. Исследована кровь 100 доноров крови, 100 гематологических больных, 110 пациентов травматологического и хирургического профиля, 50 пациентов с острыми экзогенными отравлениями, 20 пациентов с хроническими трофическими язвами. Выявлено резкое снижение ААТ и количества адгезивно активных тромбоцитов (КААТ) в циркулирующей крови у больных с кровотечениями различной этиологии, у гематологических больных и заметное повышение ААТ и КААТ у больных с тромбозами. Морфологическая оценка качества тромбоцитов эффективна для определения биологической полноценности всей популяции циркулирующих клеток.

Ключевые слова: тромбоциты, витальное окрашивание, гранулы, адгезия V.B. Khvatov, M.S. Makarov, ТюМю Borovkova

THE MORPHOLOGIC EVALUATION OF ADHESIVE ACTIVITY OF HUMAN THROMBOCYTES USING VITAL DYE The N.V. Sklifosofskiy research institute of emergency medical care, 129010 Moscow, Russia

The morphologic evaluation of adhesive activity of human thrombocytes using both vital dye of cells and registration of adhesion process with fluorescent microscope is proposed. The regression dependence between adhesive activity of human thrombocytes and morpho-functional and aggregative activity of thrombocytes is established. The blood samples of 100 blood donors, 100 patients with hematologic pathology, 110 patients of traumatology, 50 patients with acute exogenous intoxications and 20 patients with chronic trophic ulcers were analyzed. The drastic decrease of adhesive activity of human thrombocytes and number of adhesively active thrombocytes was established in circulating blood ofpatients with bleedings of various etiology and hematologic patients. The significant increase of adhesive activity of human thrombocytes and number of adhesively active thrombocytes in patients with thrombosis is established. The morphologic evaluation of quality of thrombocytes is effective in case of analysis of biologic value of all population of circulating cells.

Key words: thrombocytes, vital dye, granule, adhesion

Оценка биологической полноценности тромбоцитов человека имеет важное значение в клинико-лабораторной практике [4], гематологии, трансфузиологии, реаниматологии [2, 3, 5]. Существует множество методов анализа свойств тромбоцитов [3-5, 14], однако до сих пор не выработано четких критериев биологической полноценности этих клеток. Уста-

Для корреспонденции:

Хватов Валерий Борисович, д-р мед. наук, проф., зав. лаб. трансфузиологии, консервирования тканей и искусственного питания Адрес: 123056, Москва, ул. Васильевская, 9/36 Телефон: 8-495-903-260-39-69 E-mail: khvatov@yandex.ru

новлено, что адгезивная активность является неотъемлемым свойством функционально полноценных тромбоцитов, играющих определенную роль в клеточном звене гемостаза человека [1, 2, 5]. Исследование адгезивной активности тромбоцитов (ААТ) проводят путем простого пропускания крови или плазмы через колонку, заполненную стеклянными бусинами диаметром 1-2 мм, с дальнейшим подсчетом числа оставшихся клеток в пробе [12]. При этом полученные данные существенно варьируют в зависимости от концентрации тромбоцитов в анализируемом образце. Такой метод исследования не отражает динамических изменений морфологии исследуемых тромбоцитов, что снижает достоверность анализа. Более эффективной является оценка содержания адгезировавших тромбоцитов с помощью методов