НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ФРАКЦИЮ НА ОСНОВЕ ЗЛАКОВ И ПРОБИОТИК, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
UNFERMENTED COMPOSITIONS CONTAINING CEREAL FRACTION AND PROBIOTIC, AND USING THEM

Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к неферментированной композиции, способной увеличивать образование масляной кислоты в толстом кишечнике, а также к различному применению указанной неферментированной композиции, как, например, для поддержания здоровой слизистой оболочки кишечника путем обеспечения усиленной барьерной функции.
Предпосылки изобретения
Предположили, что масляная кислота и глутамин важны для здоровья толстого кишечника. Было показано, что чистые β-глюканы ячменя дают сравнительно высокие количества масляной кислоты, и пищевые продукты из проросшего ячменя, полученные из пивной дробины (BSG), содержащие большие количества β-глюканов и глутамина, как было показано, снижают воспалительную реакцию в толстом кишечнике пациентов с неспецифическим язвенным колитом.
В настоящее время вызывает большой интерес отношение между пищевыми волокнами, бактериями, способствующими укреплению здоровья, и предупреждением воспалительных заболеваний кишечника, в том числе болезни Крона и неспецифического язвенного колита.
Пищевое волокно устойчиво к перевариванию в тонком кишечнике и поэтому доступно для ферментации микробной флорой в толстом кишечнике, формируя короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), наряду с газами и теплом. Основые формируемые SCFA представляют собой уксусную, пропионовую и масляную кислоты, в то время как валериановая, капроновая, гептановая кислоты и разветвленные изо-масляная и изо-валериановая кислоты образуются в меньших количествах. SCFA абсорбируются и транспортируются через воротную вену в печень, а неабсорбированная фракция выделяется с фекалиями. Пропионовая кислота является субстратом для глюконеогенеза в печени и, как было показано, ингибирует синтез холестерина, в то время, как было показано, что уксусная кислота стимулирует глюконеогенез и образование холестерина с помощью ацетил-СоА. Масляная кислота является основным источником энергии для колоноцитов, и предположили, что она снижает риск рака толстого кишечника и облегчает IBD. Недавно предположили, что масляная кислота имеет метаболические эффекты.
Помимо пищевых волокон небольшие количества белка также достигают толстого кишечника. В этом смысле, глутамин представляют собой аминокислоту особого интереса. Глутамин вместе с масляной кислотой является важным субстратом для эпителиальных клеток толстого кишечника. Это представляет интерес, поскольку присутствие высокого количества масляной кислоты в толстом кишечнике снизит потребность эпителиальных клеток в глутамине, и таким образом, увеличит уровни глутамина в крови. Было обнаружено, что положительным является факт наличия высоких уровней глутамина в циркуляционной системе, так как это улучшает иммунную защиту.
Продукты на основе злаков используются очень долгое время, а зерна злаков содержат белки, жиры и углеводы, необходимые людям для роста и поддержания. Ферментация ячменя может привести к высоким количествам масляной кислоты благодаря высокому содержанию β-глюканов, и было показано, что пищевые продукты из проросшего ячменя (GBF) содержат большие количества глутамина. Было показано, что глутамин в GBF связан с пищевыми волокнами и достигает толстого кишечника, где он может быть освобожден во время ферментации и быть субстратом для слизистой оболочки толстого кишечника. В исследованиях, где был использован GBF, симптомы и воспаления были улучшены у крыс, индуцированных колитом посредством декстрана сульфата натрия (DSS). Тот же эффект наблюдался у людей с неспецифическим язвенным колитом.
Пробиотические бактерии определяются как живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах, благотворно влияют на хозяина. Lactobacilli и bifidobacteria - наиболее часто используемые бактерии в пробиотических продуктах. Эти бактерии, как правило, безопасны, как и пробиотики на основе этих организмов. Отсутствие патогенности распространяется на все возрастные группы, а также на лица с ослабленным иммунитетом. Было показано, что прием различных пробиотических бактерий имеет клиническую пользу в различных физиологических и патологических ситуациях. Наиболее ярковыраженные эффекты были показаны при диарее, вызванной терапией с применением антибиотиков и ротавирусной инфекцией Существуют также исследования, показывающие положительный клинический эффект при воспалительных заболеваниях кишечника, атопических дерматитах и гиперхолестеринемии после приема пробиотических бактерий. Механизм, с помощью которого бактерии-пробиотики способствуют этим клиническим улучшениям, не ясен. Lactobacillus rhamnosus является одной из самых больших групп бактерий, представленной в кишечнике здоровых людей. Высокое количество пробиотических бактерий может мешать распространению патогенных бактерий. Сочетание пре- и пробиотиков может не только влиять на микрофлору, но также и оптимизировать образование СА.
WO2007036230 раскрывает готовый к использованию продукт, содержащий ферментированные злаки и непатогенные микроорганизмы, где ферментированный злак преимущественно представляет собой овсянку. Настоящее изобретение отличается от WO2007036230 тем фактом, что настоящие композиции являются неферментированными.
Существует потребность в новых подходах, как сохранить слизистую оболочку кишечника здоровой, обеспечивая повышение барьерной функции.
Целью настоящего изобретения является исследование потенциальной роли нескольких фракций на основе злаков как, например, различные фракции ячменя, как преобиотического продукта относительно образования СА в слепой кишке, уровней SCFA и аминокислот в крови и состава бактериальной флоры слепой кишки (молочнокислые бактерии, бифидобактерии, Enterobactehacece), и будет ли давать добавление пробиотического штамма любые дополнительные эффекты.
Краткое описание настоящего изобретения
Таким образом, настоящее изобретение относится в одном аспекте к неферментированной композиции, способной увеличивать образование масляной кислоты в толстом кишечнике и включающей по меньшей мере одну фракцию на основе злаков и по меньшей мере один изолированный пробиотический штамм Lactobacillus.
Настоящее изобретение относится в другом аспекте к использованию указанной неферментированной композиции в качестве синбиотика.
Настоящее изобретение относится в еще одном аспекте к указанной неферментированной композиции для использования в лечении метаболического синдрома, неспецифического язвенного колита, болезни Крона, синдрома раздраженного кишечника (IBS) или воспалительного заболевания кишечника (IBD).
Настоящее изобретение относится в еще одном аспекте к указанной неферментированной композиции для использования в поддержании здоровой слизистой оболочки кишечника и/или для обеспечения повышения барьерной функции слизистой оболочки кишечника.
Краткое описание фигур
Фигура 1 показывает количество бактерий Lactobacillus (белые полосы), Bifidobacterium (черные полосы) и Enterobacteriaceae (штрихованные полосы) в содержимом слепой кишки крыс, питающихся цельнозерновым ячменем (WGB), солодом (Malt) или пивной дробиной (BSG), и теми же рационами, дополненными L rhamnosus (Lr). Значения являются средними, и эти значения WGB, Malt и BSG, т.е. те, которые без добавления пробиотиков, с разными надстрочными буквами, были достоверно различными, Р<0,05. Средние значения достоверно отличались от значений для крыс, питавшихся рационами без бактерий, *Р<0,05.
Детальное описание вариантов осуществления настоящегое изобретения
Настоящее изобретение относится к неферментированной композиции, способной увеличивать образование масляной кислоты в толстом кишечнике, и включающей по меньшей мере одну фракцию на основе злаков и по меньшей мере один изолированный пробиотический штамм Lactobacillus. Значение фразы "способная увеличивать образование масляной кислоты в толстом кишечнике" означает, что настоящая неферментированная композиция, включающая, как пробиотик, так и фракцию на основе злаков, будет увеличивать образование масляной кислоты в толстом кишечнике и в крови, см. таблицу 4 и 5, по сравнению с тем, когда фракция на основе злаков дается без пробиотика. В таблице 4 образование масляной кислоты в толстом кишечнике увеличилось на 157% (от 7 до 18 мкмоль/г) для цельнозернового ячменя, на 50% (от 12 до 18 мкмоль/г) для осоложенного ячменя и на 33% (от 9 до 12 мкмоль/г) для пивной дробины. Таким образом, увеличение образования масляной кислоты находится в диапазоне 30-200%, преимущественно в диапазоне 40-180%, более преимущественно в диапазоне 50-160%. С другой стороны, другими словами, содержание масляной кислоты, образованной в толстом кишечнике, варьирует в пределах 14-20 мкмоль/г или > 14 мкмоль/г.
В настоящем контексте фразу "неферментированная композиция" следует интерпретировать как еще не израсходованную композицию. Предполагается, что ферментация должна происходить в желудочно-кишечном тракте после расходования композиции. Органические кислоты, сформированные в ходе ферментации в желудочно-кишечном тракте, измеряют в крови и содержимом слепой кишки. В высушенных продуктах настоящего изобретения, таких как злаки, мюсли, хлеб, печенье, питательные батончики или пасты, органические кислоты не присутствуют в композиции из-за неферментирования. Во влажных продуктах бактерии могут присутствовать в инкапсулированной форме, предотвращающей их от ферментации композиции до входа в желудочно-кишечный тракт. Другой подход к предотвращению ферментирования представляет собой хранение композиции при низкой температуре, т.е. хранение композиции охлажденной или замороженной при подходящей температуре и времени хранения. Неферментированные композиции настоящего изобретения могут быть высушенной композицией или жидкой композицией.
В таблице 5 было измерено содержание масляной кислоты, образованной в крови воротной вены. Увеличение для WGB - 133% (46 до 107 мкмоль/л), для осоложенного ячменя 117% (от 96 до 208 мкмоль/л) и для BSG 56% (53 до 83 мкмоль/л). Таким образом, для всех трех ячменных фракций содержание масляной кислоты >80 мкмоль/л.
Фракция на основе злаков присутствует в неферментированной композиции в пределах 40-100% от веса. Остальное содержимое композиции очевидно для специалиста в данном уровне техники разработки синбиотических композиций.
Результаты настоящего изобретения являются очень неожиданными, и наблюдаемое увеличение образования масляной кислоты было удвоено, когда давалась композиция, соответствующая настоящему изобретению, по сравнению с тем, когда давалась только фракция на основе злаков см. таблицу 4 и 5.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна фракция композиции на основе злаков это цельнозерновая фракция злака, такая как цельнозерновой ячмень, цельнозерновой овес, цельнозерновая пшеница, цельнозерновая рожь или их комбинации. По меньшей мере одна фракция на основе злаков используемая в композиции настоящего изобретения, может быть обработана различными путями перед добавлением в настоящую композицию, например фракция на основе злаков может быть смолотой и/или обработанной теплом фракцией на основе злаков или экструдированной, разрыхленной фракцией на основе злаков или высушенной в барабане фракцией на основе злаков или хлопьевидной фракцией на основе злаков или приготовленной на пару фракцией на основе злаков.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одну фракцию на основе злаков выбирали из группы фракции ячменя, фракции овса, фракции пшеницы, фракции ржи и любой их комбинации. По меньшей мере одна фракция на основе злаков может быть дополнительно осоложена, и в одном варианте осуществления настоящего изобретения солодовая фракция на основе злаков представляет собой солод или пивную дробину (BSG), что является побочным продуктом процесса пивоварения. На первом этапе пивоварения ячмень проращивают и затем поджаривают. Солод дробят и смешивают с водой, и смесь нагревают. BSG - это побочный продукт, когда смесь фильтруют, и фильтрат переходит на следующий этап процесса пивоварения. BSG часто используют в качестве корма для скота, но результаты более ранних исследований демонстрируют, что представляет большой интерес для исследования, могут ли BSG быть использованы в качестве пребиотиков в питании человека.
В варианте осуществления настоящего изобретения фракция на основе злаков была измельчена, чтобы иметь подходящий размер в композиции, где размер по меньшей мере одной фракции на основе злаков находится в диапазоне приблизительно 0,1 мм - 10 мм, предпочтительно 0,5 мм до 5 мм.
6
14
8
12
9
11
По меньшей мере один изолированный штамм Lactobacillus присутствует в количестве 10-10 КОЕ/день, предпочтительно 10-10 КОЕ/день, более предпочтительно 10-10 КОЕ/день. КОЕ означает колониеобразующие единицы и является хорошо известной единицей для специалистов в уровне техники пробиотиков.
В варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один изолированный пробиотический штамм выбирают из группы Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus fermentum.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одним изолированным пробиотическим штаммом является Lactobacillus rhamnosus 271 (DSM 6594). В другом варианте осуществления по меньшей мере один пробиотический штамм выбирают из группы Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 и Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.
Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 и Lactobacillus rhamnosus 271 (DSM 6594) были депонированы 2 июля 1991 в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, были депонированы 16 марта 1995 в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 и Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 были депонированы 27 ноября 2002 в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. По меньшей мере один пробиотик может присутствовать в композиции в качестве лиофилизированного компонента, в форме пробиотика в масле, в форме пробиотика в водном растворе или суспензии, в форме высушенного распылением пробиотика или в форме пробиотика в твердом состоянии.
В варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция имеет жидкий состав или твердый состав. При приготовлении композиций настоящего изобретения или в жидком, или в твердом состоянии, обычные добавки, которые используют в технической области, могут быть использованы и реализованы специалистами в технической области.
В другом варианте осуществления указанная композиция является медицинским питанием, функциональным питанием, диетической добавкой, пищевым продуктом, продуктом питания или пищевой добавкой. Пищевая добавка может быть, например, добавлена в злаковые, мюсли, хлеб, печенье, крупы, питательные батончики или распространяться в качестве композиции в виде смешанного порошка или каждого компонента в отдельности. Примером последнего является, например, распространение фракции на основе злаков в соответствующие продукты, такие как мюсли, и последующее добавление соответствующего пробиотического штамма. Положительные эффекты настоящего изобретения достигаются, когда фракция на основе злаков и пробиотические штаммы взяты вместе. Следует понимать, что не обязательно, чтобы комбинация давалась как композиция. Например, возможно смешивание компонентов непосредственно перед приемом.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения продуктом питания является питье, напиток, йогурт, сок или мороженое. Таким образом, понятно, что композиция легко может приниматься в форме продукта питания ежедневно. Таким образом, общее состояние здоровья человечества может стать лучше за счет использования композиции, соответствующей настоящему изобретению.
Композиция настоящего изобретения может быть использована как синбиотик. Синбиотик представляет собой вспомогательное средство, которое включает, как пребиотик, так и пробиотик, которые работают совместно, чтобы улучшать "дружественную флору" кишечника человека.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию композиции для лечения метаболического синдрома, неспецифического язвенного колита, болезни Крона, синдрома раздраженного кишечника (IBS) или воспалительного заболевания кишечника (IBD).
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, как описано здесь, для использования в поддержании здоровой слизистой оболочки кишечника и/или для обеспечения повышения барьерной функции слизистой оболочки кишечника. Экспериментальная часть Материалы и способы Состав исследуемых материалов Используемым сырьевым материалом был цельнозерновой ячмень (Viking Malt АВ, Halmstad, Sweden), солод и пивную дробину (Carlsberg, Falkenberg, Sweden). Цельнозерновой ячмень, солод и пивную дробину были из одной партии муки. Сырьевые материалы были измельчены перед включением в рационы до размера частицы в диапазоне приблизительно 1 мм. Бактериальным штаммом, включенным в эксперимент, был L. rhamnosus 271 (Probi АВ, Lund Sweden) и он был доставлен лиофилизированным.
Животные и планирование эксперимента
8
Шесть тестовых рационов были приготовлены в соотвеетствии с таблицей 1: один контрольный рацион, содержащий цельнозерновой ячмень (WGB), и 5 тестовых рационов, включающих цельнозерновой ячмень и L. rhamnosus 271 (WGB+Lr), солод (Malt), солод и L rhamnosus 271 (Malt+Lr), пивную дробину (BSG) или пивную дробину и L. rhamnosus 271 (BSG+Lr). Сырьевой материал добавляли на уровне 80 г пищевых волокон/кг пищи (dwb, сухого веса). Пшеничный крахмал был использован для регулировки содержания сухих веществ, и ранее было показано, что этот тип крахмала полностью переваривается и поэтому не формирует никакие СА. Пробиотический штамм был включен ежедневно в рацион во время кормления каждой крысы в количестве 2××10 колониеобразующих единиц (CFU)/сут.
Таблица 1 показывает состав тестовых рационов, которые давались крысам в следующих группах: цельнозерновой ячмень (WGB), солод (Malt) или пивная дробина (BSG) с или без добавления L. rhamnosus (Lr) (Таблица 1).
Таблица 1
Ингредиенты рациона<sup>1</sup>
WGB
WGB+Lr
Malt
Malt+Lr
BSG
BSG+Lr
Цельнозерновой
519.5<sup>3</sup>
519.5<sup>3</sup>
0
0
0
0
ячмень,<sup>2</sup> г
Солод,<sup>4</sup> г
0
0
661,2<sup>3</sup>
661,2<sup>3</sup>
0
0
Пивная дробина,<sup>4</sup> г
0
0
0
0
135,8<sup>3</sup>
135,8<sup>3</sup>
Казеин, г
120
120
120
120
120
120
DL-Метионин, г
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
Кукрузное масло, г
50
50
50
50
50
50
Минеральная смесь,<sup>5</sup> г
48
48
48
48
48
48
Витаминная смесь,<sup>6</sup> г
8
8
8
8
8
8
Холинхлорид, г
2
2
2
2
2
2
Сахароза, г
100
100
100
100
100
100
Пшеничный крахмал,<sup>7</sup> г
151,3
151,3
9,6
9,6
535,0
535,0
<sup>1</sup>Ингредиенты рациона всего 1000 г.
<sup>2</sup>Viking Malt АВ (Halmstad, Sweden).
<sup>3</sup>Соответствует 80 г пищевых волокон/кг рациона (dwb).
<sup>4</sup>Carlsberg (Falkenberg, Sweden).
<sup>5</sup>Содержащая (г/кг): 0,37 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O, 1,4 ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O, 332,1 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, 171,8 NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O, 324,4 CaCO<sub>3</sub>, 0,068 KI, 57,2 MgSO<sub>4</sub>, 7,7 FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O, 3,4 MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O, 0,02 CoCI·6H<sub>2</sub>O, 101,7 NaCl (Bie & Berntsen A-S, R⌀dovre, Denmark).
<sup>6</sup>Содержащая (г/кг): 0,62 витамина К, 2,5 тиамингидрохлорида, 2,5 рибофлавина, 1,25 пиридоксингидрохлорида, 6,25 пантотената кальция, 6,25 никотиновой кислоты, 0,25 фолиевой кислоты, 12,5 инозитола, 1,25 р-аминобензоевой кислоты, 0,05 биотина, 0,00375 цианкобаламина, 0,187 ретинолпальмитата, 0,00613 кальциферола, 25 d-α-токоферилацетата, 941,25 кукурузного крахмала (Apoteket, Malmö, Sweden).
<sup>7</sup>Пшеничный крахмал (Cerestar, Krefeld, Germany).
Самцы крыс линии Wistar (начальный вес, 134±1 г) были получены из, Scanbur (Sollentuna, Sweden). Они были случайным образом разделены на шесть групп, по семь крыс в каждой, и размещены отдельно в метаболических клетках в комнате с поддерживаемой температурой 22°С с 12-часовыми свет/темнота циклами. Потребление корма было ограничено до 12 г/сут (dwb), и крысам был дан свободный доступ к воде. Животным позволили адаптироваться к рациону в течение 7 дней и затем последовал 5-дневный длительный экспериментальный период, в течение которого фекалии и остатки корма собирали ежедневно. Образцы фекалий хранили при -20°С и затем лиофилизировали и измельчали перед анализами пищевых волокон. В конце эксперимента животных анестезированы подкожной инъекцией смеси (1:1:2) Hypnorm (Division of Janssen-Cilag Ltd., Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium), Dormicum (F. Hoffman-La Roche AG, Basel, Switzerland) и стерильной воды в дозе 0,15 мл/100 г, и собирали кровь, ткань и содержимое слепой кишки. Образцы крови брали из воротной вены и разделяли на две пробирки: одна для плазмы, содержащая EDTA, и одна для сыворотки. Образцы плазмы и сыворотки центрифугировали 15 мин (2500g) и затем хранили при -40°С до анализа аминокислот и SCFA. Вес слепой кишки, содержимое и рН измеряли непосредственно. Содержимое слепой кишки делили на одну стерильную пробирку, содержащую замороженную среду, и сразу же замораживали в жидком азоте для анализа микрофлоры, и другую часть содержимого замораживали и хранили при -40°С до анализа на СА, что также выполнялась для различных частей кишки.
Анализы
Пищевые волокна. Для определения количества растворимых и нерастворимых пищевых волокон в сырых материалах использовали гравиметрический способ. Композицию изолированных остатков волокон анализировали с использованием газо-жидкостной хроматографии (GLC) нейтральных сахаров как их альдитацетатов, и содержание уроновых кислот анализировали с помощью спектрофотометрического способа. Мономеры волокон в фекалиях характеризовали напрямую без предварительного выделения пищевых волокон.
СА в фекалиях. GLC способ был использован для анализа SCFA (уксусная, пропионовая, изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая, капроновая и гептановая кислоты) в содержимом кишечника (слепой кишке, проксимальном и дистальном толстом кишечнике). Разбавленный раствор (2,5М HCl) и 2-этилмасляную кислоту (внутренний стандарт, 1 мМ) добавляли к образцам перед гомогенизацией. Образцы затем центрифугировали перед инъекцией в капиллярную колонку из плавленого кварца.
Янтарная и молочная кислоты количественно определялись спектрофотометрически с коммерчески доступным ферментным набором (Cat. Nos. 10176281035 и 1112821, соответственно; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Процедуры проводились в соответствии с инструкциями производителя.
SCFA в сыворотке. SCFA в сыворотке анализировали GLC способом. Воду и 2-этил масляную кислоту (внутренний стандарт, 1 мМ) вместе с соляной кислотой добавляли к образцам, и затем полое волокно погружали в раствор сыворотки для экстрагирования SCFA. После эктракции SCFA вымывали из полости волкна и затем вводили в капиллярную колонку из плавленого кварца (DB-FFAP 125-3237, J&W Scientific, Agilent Technologies Inc., Folsom, CA USA). Для анализа использовали программное обеспечение GC ChemStation (Agilent Technologies Inc., Wilmington, DE, USA).
Содержание аминокислот в плазме крови
Сульфосалициловую кислоту добавляли в образцы плазмы для очищения свободных аминокислот путем осаждения белков с высокой молекулярной массой. Аминокислотный анализатор (Biochrom 30, Biochrom Ltd, Cambridge, England), основанный на ионообменной хроматографии, использовали для количественного определения количества аминокислот. Для анализа использовали пакет программного обеспечения EZChrom Elite (Scientific Software Inc., Pleasanton, CA, USA).
Кишечная микрофлора
Образцы слепой кишки размораживали, и после гомогенизации была выполнена серия общепринятых процедур разведения и соответствующие разведения были распределены в агаровые пластины. Жизнеспособные единицы были получены из агара Rogosa (Oxoid, Unipath Ltd., Basingstoke, UK), инкубированного анаэробно при 37°C в течение 72 ч (Lactobacilli единицы), из агара Modified Wilkins-Chalgren (Oxoid), инкубированного анаэробно при 37°С в течение 72 ч (bifidobacteria единицы) и из глюкозо-желчного агара с кристаллвиолетом и нейтральным красным VRBG (Oxoid), инкубированного анаэробно при 37°С в течение 24 ч (Enterobacteriaceae единицы). Число колоний, сформированных на каждой пластине, было подсчитано и скорректировано на вес оригинальных образцов. Расчеты и статистические анализы
Концентрация каждой СА (мкмоль/г) была умножена на количество содержимого слепой кишки для получения пулов слепой кишки (мкмоль). Для коррекции для небольших количеств остатков пищи величины пулов экстраполировали на полное потребление пищевых волокон (4,8 г). Увеличение массы тела в течение экспериментального периода было рассчитано на грамм потребляемой пищи.
Для определения эффектов пищевых волокон (Fiber), пробиотиков (Pro) и их взаимодействий (Fiber×Pro) был испльзован двухфакторный анализ ANOVA (Таблицы 3-5 и 7). Однофакторный анализ ANOVA был использован для индивидуальных значений для оценки эффекта пищевых волокон или эффекта пробиотика с использованием процедуры Тьюки. Когда дисперсия ошибки оказалась гетерогенной, данные были преобразованы ВохСох-преобразованием перед анализом ANOVA. Значения представлены как среднее ± SEM, и полученные различия в значениях Р, меньше 0,05, считались значимыми. Все вычисления были выполнены со статистическим программным обеспечением Minitab (Выпуск 14).
Результаты
Фекальная экскреция пищевых волокон
Содержание пищевых волокон было схожим в цельнозерновом ячмене и солоде (15,4 и 12,1 г/100 г, dwb, соответственно), в то время как пивная дробина содержала в 4-5 раз больше пищевых волокон (58,2 г/100 г, dwb). Основными компонентами полисахаридов пищевых волокон были глюкоза (35-49%), ксилоза (29-35%) и арабиноза (16-22%). В толстом кишечнике крыс были более ферментированы полисахариды пищевых волокон цельнозернового ячменя и пивной дробины, чем солода (Таблица 2). Пятьдесят шесть процентов волокон в солоде было экскретировано в фекалии, в то время, как в цельнозерновом ячмене и пивной дробине было экскретировано 38% и 49% волокон соответственно (Р<0,001). Из основных компонентов ксилоза была таким же образом ферментирована 45±4%, в то время как арабиноза и прежде всего вся глюкоза были ферментированы в различной степени (Р<0,01 и Р<0,001 соответственно). Глюкозосодержащие полимеры были наиболее устойчивы к ферментированию в солоде (72% было экскретировано в фекалии) и наиболее ферментированы в цельнозерновом ячмене (36% было экскретировано в фекалии). Никаких различий в степени ферментации видно не было, когда был добавлен в рацион Lr, исключение составляет присутствие небольших количеств уроновых кислот, которые были более ферментированы с Lr в рационе, чем только с цельнозерновым ячменем (Р=0,040).
Таблица 2
WGB
WGB
WGB+Lr
Malt
Malt
Malt+Lr
BSG
BSG
BSG+Lr
г/100 г
% поглощения
г/100 г
% поглощения
г/100 г
% поглощения
Рамноза
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
tr<sup>1</sup>
Арабиноза
2,0
33<sup>а</sup>
35
1,7
40<sup>b</sup>
37
7,7
36<sup>a,b</sup>
36
Ксилоза
3,5
43
41
2,7
49
48
12,1
45
45
Манноза
0,3
19<sup>а</sup>
18
0,2
34<sup>b</sup>
33
0,5
37<sup>b</sup>
40
Галактоза
0,2
66<sup>а</sup>
72
0,2
68<sup>a</sup>
67
1,1
51<sup>b</sup>
54
Глюкоза
5,9
36<sup>а</sup>
35
2,7
72<sup>b</sup>
68
13,8
57<sup>c</sup>
58
Уроновая
0,3
64
56<sup>*</sup>
0,3
56
55
1,3
59
60
кислота
Полисахариды
пищевых
12,2
38<sup>а</sup>
38
7,8
56<sup>b</sup>
54
36,7
49<sup>c</sup>
49
волокон
Лигнин
3,2
nd<sup>2</sup>
nd<sup>2</sup>
4,3
nd<sup>2</sup>
nd<sup>2</sup>
21,5
nd<sup>2</sup>
nd<sup>2</sup>
Всего
15,4
nd<sup>2</sup>
nd<sup>2</sup>
12,1
nd<sup>2</sup>
nd<sup>2</sup>
58,2
nd<sup>2</sup>
nd<sup>2</sup>
<sup>1</sup>tr=следы, менее 0,05г/100г.
<sup>2</sup>nd=не определено.
Поглощение пищи и увеличение массы тела
Крысы в различных группах съедали большую часть предложенного рациона (56,6-59,3 г/5д). Кроме того, увеличение массы тела и содержимого слепой кишки, вес ткани и рН были довольно сходными между тремя группами (Таблица 3). Когда в рацион были добавлены пробиотики, были видны некоторые различия. Наблюдался более высокий рост массы тела у крыс с BSG (Р=0,044) и более высокий вес содержимого слепой кишки и ткани совместно с WGB (Р=0,019 и Р=0,004 соответственно). Более низкий рН слепой кишки можно было увидеть с WGB (Р=0,011) и с Malt (Р=0,032). Способность к увеличению объема была выше у крыс, питавшихся Malt, по сравнению с другими продуктами (Р<0,001).
Таблица 3
WGB
WGB+Lr
Malt
Malt+Lr
BSG
BSG+Lr
Р-значение
Волокно
Pro
Волокно×Pro
BWG
0,21
0,25
0,17
0,21
0,18
0,25<sup>*</sup>
NS
0,006
NS
СС
1,8±0,1
2,3±0,1*
2,2±0,1
2,2±0,1
1,8±0,1
1,7±0,1
0,002
NS
NS
CTW
0,56±0,01
0,63±0,01<sup>**</sup>
0,57±0,02
0,58±0,03
0,53±0,02
0,54±0,02
0,011
NS
NS
РН слепой кишки
7,1
6,7<sup>*</sup>
7,0
6,8<sup>*</sup>
7,1
7,0
NS
0,001
NS
ВС
0,8±0,0<sup>а</sup>
0,8±0,0
1,0±0,0<sup>b</sup>
0,9±0,0*
0,8±0,0<sup>а</sup>
0,8±0,0
<0,001
NS
NS
BWG - увеличение массы тела г/г
СС - содержимое слепой кишки, г
CTW- вес ткани слепой кишки, г
ВС - способность к увеличению объема, г/г поглощенного волокна
<sup>1</sup>3начения являются средними±SEM, n=7. Malt+Lr, n=6.
<sup>2</sup>Средние значения WGB, Malt и BSG, т.е. без добавления пробиотиков, с разными надстрочными буквами достоверно различались (Р<0,05).
<sup>3</sup>Средние значения достоверно отличались от значений для крыс, питавшихся рационами без бактерий: <sup>*</sup>Р<0,05, <sup>**</sup>Р<0,01.
Образование СА в кишечнике крыс
Крысы, питавшиеся Malt, имели более высокий уровень и пул СА, чем крысы, питавшиеся WGB (79 против 62 мкмоль/г, Р=0,027 и 173 против 116 мкмоль, Р=0,037, соответственно), в то время как две другие ячменные фракции имели сходные уровни (62-66 мкмоль/г) и пулы (123-173 мкмоль) СА слепой кишки (Таблица 4). В общем, пробиотический штамм влиял на уровни СА слепой кишки более индивидуально, чем различные фракции волокон. Однако индивидуальные значимые различия между рационами, содержащими L. rhamnosus, и аналогичными им рационами без этого пробиотического штамма были заметны только у крыс, питавшихся WGB. Основной кислотой, образованной в слепой кишке крыс, получавших шесть тестовых рационов, была уксусная кислота (62±3%), затем масляная кислота (15±4%) и пропионовая кислота (14±1%).
Таблица 4:
WGB
WGB+Lr
Malt
Malt+Lr
BSG
BSG+Lr
Р-значение
Волокно
Pro
Волокно* Pro
Уровень в слепой кишке
Уксусная
39±1<sup>а</sup>
55±7*
49±3<sup>b</sup>
61±6
41±4<sup>а,b</sup>
51+3
NS
0,001
NS
Пропионовая
9±1
13±1*
11±0
13±1
9±1
11±1
0,021
<0,001
NS
Масляная
7±0<sup>а</sup>
18±5*
12±1<sup>b</sup>
18±3
9±1<sup> а,b</sup>
12±2
NS
0,001
NS
Молочная
0,1±0,0<sup>а</sup>
0,2±0,1
0,3±0,1<sup>b</sup>
0,2±0,0
0,4±0,1<sup>b</sup>
0,4+0,1
0,013
NS
NS
Янтарная
2±0
2±0
2±0
1±0
2±0
1+0
NS
NS
NS
Минорные
4±0
6±1*
5±0
5±0
5±0
5±0
NS
0,010
0,026
Всего
62±2<sup>а</sup>
94±13*
79±4<sup>b</sup>
99±10
66±6<sup>a,b</sup>
80±5
NS
0,001
NS
Общий пул
116±11<sup>a</sup>
228±41*
173±10<sup>b</sup>
225±34
123±20<sup> а,b</sup>
141+6
0,009
0,002
NS
Детальный уровень
Уксусная
37±1
39±3
38±2
46+2<sup>*</sup>
37±5
29±2
0,004
NS
0,013
Пропионовая
8±0
10±1*
10±1
13±1<sup>*</sup>
8±1
7±0
<0,001
NS
0,015
Масляная
6±0<sup>а</sup>
8±1
9±1<sup>b</sup>
10±1
6±1<sup>а,b</sup>
6±0
<0,001
NS
NS
Минорные
4±0
4±0
4±0
4±0
4±0
3±0
0,044
NS
NS
Всего
55±1
61±4
62±3
73±4*
55±6
44±3
<0,001
NS
0,016
<sup>1</sup>Значения являются средними ± SEM, n=7. Malt+Lr, n=6. Дистальный: Malt+Lr, n=6; WGB, BSG, n=5.
<sup>2</sup>Средние значения WGB, Malt и BSG, т.е. без добавления пробиотиков, с разными надстрочными буквами достоверно различались (Р<0,05).
<sup>3</sup>Средние значения достоверно отличались от значений для крыс, питавшихся рационами без бактерий: *Р<0,05, **Р<0,01.
Уровень в слепой кишке дан в мкмоль/г.
Уровень уксусной кислоты в слепой кишке крыс, питавшихся Malt, был выше, чем у крыс, получавших WGB (Р=0,035), что также видно с масляной (Р=0,016) и молочной кислотой (Р=0,024). Кроме того, крысы, получавшие BSG, имели более высокий уровень молочной кислоты, чем WGB группа (Р=0,003). Уровни всех кислот, за исключением уровней молочной и янтарной кислоты, были выше, когда добавляли пробиотики в WGB группу (Р=0,011-0,033).
Уровни в проксимальных и дистальных частях толстого кишечника (данные не представлены) были очень сходны в различных тестовых рационах (46-56 мкмоль/г и 44-73 мкмоль/г, соответственно). В дистальной части толстого кишечника фракция волокон, в основном, имела большее влияние на уровни СА, чем L. rhamnosus. Однако было только одно индивидуально различие между тестовыми материалами, касающееся уровней масляной кислоты, т.е. крысы, питавшиеся WGB, имели более низкий уровень масляной кислоты, чем крысы, питавшиеся Malt (Р=0,025). Уровни уксусной и пропионовой кислоты и общий дистальный уровень был выше у крыс, питавшихся Malt дополнительно с L. rhamnosus, по сравнению с только Malt (Р=0,02, Р=0,048 и Р=0,038, соответственно). Более высокий уровень пропионовой кислоты был также обнаружен у крыс, получавших WGB+Lr, чем у крыс, питавшихся только WGB (Р=0,047).
Уровень SCFA в крови воротной вены
Уксусная кислота (976-1596 мкмоль/л), пропионовая кислота (72-195 мкмоль/л) и масляная кислота (46-208 мкмоль/л) были основными кислотами в крови воротной вены (Таблица 5). Крысы, питавшиеся Malt, имели более высокий уровень пропионовой кислоты и масляной кислоты в крови воротной вены, чем крысы, получавшие WGB (Р=0,039 и Р=0,011, соответственно) и BSG (Р=0,020 и Р=0,032, соответственно). Крысы, получавшие Malt+Lr, имели очень высокий уровень масляной кислоты в крови воротной вены по сравнению с группой Malt. Различие в уровне масляной кислоты было не достоверным, но очень близко к нему (Р=0,055). Минорных кислот (изо-масляная, изо-валериановая и валериановая кислоты) было больше в крови воротной вены крыс, питавшихся WGB+Lr, чем крыс, питавшихся только WGB (Р=0,040).
Таблица 5
WGB
WGB+L r
Malt
Ma+L r
BSG
BSG+Lr
Р-значение
мкмоль/л
Волокно
Pro
Волокно ×Pro
Уксусная
1193±95
1223+156
1175+94
1596±307
976±35
1185±215
NS
NS
NS
Пропи-оновая
77±10<sup>а</sup>
131±24
131±18<sup>b</sup>
195±56
72±7<sup>а</sup>
102±23
0,028
0,043
NS
Масляная
46±5<sup>а</sup>
107+27
96+14b
208±84
53±7<sup>а</sup>
83±22
0,023
0,009
NS
i-Масляная
15±1<sup>а,b</sup>
22±3
21±3<sup>b</sup>
32±5
13±1<sup>а</sup>
17±2
0,003
0,006
NS
i-Валери-ановая
16±1
25±3
21±2
25±3
16±3
19±2
NS
0,016
NS
Валериановая
6±1<sup>а,b</sup>
13±3
11±2<sup>b</sup>
16±4
5±1<sup>а</sup>
8±2
NS
0,026
NS
Минорные
37±2
60±9
53±6
73±7
35±5
45±6
0,004
0,002
NS
Всего
1354±100
1520±186
1454±130
2071±451
1136±45
1414±263
NS
NS
NS
<sup>1</sup>Значения являются средними ±SEM, Malt, n=6; WGB, WGB+Lr, Malt+Lr, BSG, n=5; BSG+Lr n=4.
<sup>2</sup>Средние значения WGB, Malt и BSG, т.е. без добавления пробиотиков, с разными надстрочными буквами достоверно различались (Р<0,05).
<sup>3</sup>Средние значения достоверно различались от значений для крыс, питавшихся рационами без бактерий: *Р<0,05.
Композиция аминокислот в ячменных продуктах
Общие количества аминокислот были практически одинаковыми в цельнозерновом ячмене и солоде (9,7 г/100 г и 9,5 г/100 г), в то время, как пивная дробина содержала значительно больше (24,3 г/100 г) (Таблица 6). Аминокислотный паттерн ячменных продуктов был сходен с самым высоким процентом глутаминовой кислоты, затем пролина, лейцина и аспарагиновой кислоты.
Таблица 6
Цельнозерновой ячмень
Солод
Пивная дробина
Аспарагиновая кислота, %
6
7
7
Треонин, %
3
4
4
Серин, %
5
4
4
Глутаминовая кислота, %
23
20
20
Пролин, %
12
11
10
Глицин, %
4
4
4
Аланин, %
4
5
5
Валин, %
5
6
6
Цистеин, %
3
3
2
Метионин, %
2
2
2
Изолейцин,%
4
4
4
Лейцин, %
7
7
8
Тирозин, %
3
3
4
Фенилаланин,%
5
5
6
Лизин, %
4
4
4
Гистидин,%
2
3
2
Аргинин, %
5
5
5
NH<sub>4</sub>, %
3
3
2
Всего, г/100 г
9,7
9,5
24,3
Общее поглощение, г/5д
3,0
3,8
2,0
Распределение аминокислот в крови воротной вены
Были обнаружены количества 19 аминокислот во всех группах, но только аминокислоты с достоверными отличиями показаны в Таблице 7. Фракции волокон влияли на аминокислоты сходным образом с пробиотическим штаммом, хотя они не влияли на те же аминокислоты.
Таблица 7
WGB
WGB+L г
Malt
Ma+L г
BSG
BSG+Lr
Р-значение
Волокно
Pro
Волокно×Pro
Серии, %
6,3±0,2
5,9±0,2
6,2±0,2
6,0±0,2
7,0±0,2
6,5±0,3
0,008
NS
NS
Глутаминовая кислота, %
2,7±0,2
2,8±0,1
2,6±0,2
3,0±0,3
2,5±0,2
2,9±0,1*
NS
0,037
NS
Глутамин, %
14,0±0,4<sup>а</sup>
11,8±0,3<sup>**</sup>
11,6±0,3b
11,4±0,6
12,±0,7<sup>а,b</sup>
13,0±0,7
0,030
NS
NS
Тирозин, %
1,6±0,1<sup>а</sup>
1,6±0,1
1,5±0,0<sup>а,b</sup>
1,6±0,1
1,3±0,1<sup>b</sup>
1,6±0,1<sup>*</sup>
NS
0,038
NS
Лизин, %
11,3±0,3<sup>а,b</sup>
10,7±0,5
10,4±0,3<sup>а</sup>
10,5±0,3
11+0,4b
10,9±0,6
NS
NS
NS
Гистидин, %
1,9±0,2<sup>а</sup>
2,3±0,2
2,3±0,1<sup>а,b</sup>
2,3±0,1
2,6±0,1<sup>b</sup>
2,1±0,2
NS
NS
0,024
NH<sub>4</sub>, %
8,2±0,3<sup>а</sup>
10,7±0,8*
11,4±0,9<sup>b</sup>
12,5±0,5
8,1±0,2<sup>а</sup>
10,1±1,1
0,001
0,004
NS
Всего, м моль/л
5,0±0,5
5,6±0,6
4,8±0,5
4,3±0,4
5,5±0,6
5,4±0,7
NS
NS
NS
<sup>1</sup>Значения являются средними ± SEM, n=7; Malt, Malt+Lr, n=6; BSG, n=5.
<sup>2</sup>Средние значения WGB, Malt and BSG, т.е. без добавления пробиотиков, с разными надстрочными буквами достоверно различались (Р<0,05).
<sup>3</sup>Средние значения достоверно отличались от значений для крыс, питавшихся рационами без бактерий: *Р<0,05, "Р<0,01.
4
Крысы, получавшие WGB, имели самый высокий процент глутамина (Р=0,01, по сравнению с группой, которой давали Malt) и тирозина (Р=0,027, по сравнению с группой, которой давали BSG), в то время как процент гистидина и NH был самый низкий из трех фракций (Р=0,01, по сравнению с крысами, которым давали BSG, и Р=0,01, по сравнению с Malt и BSG, соответственно). Соотношение глутамина и тирозина был выше в группе BSG+Lr, чем в BSG группе (Р=0,046 и Р=0,025, соответственно). В целом, доля серина в крови воротной вены была выше у крыс, питавшихся BSG, чем другими тестовыми рационами, хотя никаких индивидуальных различий между крысами, питавшимися различными фракциями волокон, обнаружено не было.
Бактериология
В общем, на жизнеспособное количество как бифидобактерий, так и Enterobacteiaceae слепой кишки влияли фракции волокон, и на количество бифидобактерий также влияли L. rhamnosus (Фигура 1). Крысы, питавшиеся Malt, имели более низкое число бифидобактерий, чем крысы, которые получали WGB или BSG (6,3±0,2 logKOE/г содержимого слепой кишки в сравнении со средним 7,0±0,1 logKOE/г содержимого слепой кишки, Р<0,006), и когда L. rhamnosus добавляли к рациону WGB, число бифидобактерий было ниже, чем у крыс, питавшихся только WGB (6,3±0,2 logKOE/г содержимого слепой кишки в сравнении с 6,9±0,1 logKOE/г содержимого слепой кишки, Р=0,021). Хотя жизнеспособные количества Enterobacteriaceae в Malt группе были значительно ниже, чем в WGB группе, P-величина была очень близка к достоверной (Р=0,059).
Было предположено, что масляная кислота важна для здоровья толстого кишечника, например, благодаря снижению риска воспалительных заболеваний кишечника и рака толстого кишечника. Эти эффекты могут быть связаны с ее функцией в качестве основного энергетического источника для эпителиальных клеток и ее основной ролью в регуляции клеточной пролиферации и дифференциации. Сообщалось, что глутамин также является важным энергитическим источником эпителиальных клеток слизистой оболочки и как таковой может восстанавливать и сохранять слизистую оболочку кишечника и предупреждать бактериальную транслокацию. GBF, как известно, содержит высокие количества β-глюканов и глутамина, как сообщалось, они уменьшают воспалительный ответ в эпителии как у пациентов с неспецифическим язвенным колитом, так и у мышей с DSS-индуцированными колитами. Ранее было показано, что β-глюканы чистого ячменя дают сравнительно высокие количества масляной кислоты у крыс, и предположили, что глутамин в GBF является субстратом для слизистой, так как он связан с волокнами ячменя. В этом эксперименте три различные фракции ячменя отдельно или в комбинации с пробиотическим штаммом L.rhamnosus были использованы для оценки потенциальной роли пивной дробины (BSG) в качестве пребиотического продукта в отношении образования СА в слепой кишке, уровней SCFA и аминокислот в крови и состава бактериальной флоры слепой кишки (лактобактерии, бифидобактерии, Enterobacteriaceаe) у крыс в сравнении с измельченным ячменем (WGB) и солодом (Malt), и дает ли добавление L. rhamnosus дополнительные эффекты.
Солод дал более высокие уровни масляной кислоты в слепой кишке, дистальной части толстого кишечника и крови воротной вены крыс, по сравнению с WGB, и в крови воротной вены также по сравнению с BSG. Уровень пропионовой кислоты был также выше в крови воротной вены. Увеличение циркулирующих уровней как масляной, так и пропионовой кислоты было связано с метаболическими эффектами. Недавно было высказано предположение, что эти кислоты могут модулировать провоспалительные маркеры и таким образом влиять на параметры, связанные с метаболическими нарушениями. Также сообщалось, что увеличение потребления пищевых волокон из ячменя вечером улучшает толерантность к глюкозе в последующий стандартизированный завтрак, что может быть связано с увеличением уровня SCFA в плазме. Можно было предположить, облегчала ли измененная микрофлора слепой кишки у крыс, питавшихся Malt, транспортирование SCFA через слизистую оболочку, по сравнению с WBG и BSG. Важность состава микрофлоры, в этом отношении, была далее установлена тем фактом, что пробиотический штамм L. rhamnosus 271 в целом влиял на уровень и паттерн формирующихся SCFA. Так, уровни масляной кислоты, как в слепой кишке, так и в крови воротной вены были выше, когда штамм добавляли к рационам. Хотя было обнаружено довольно много индивидуальных различий между группами, особенно в крови, добавление пробиотика четко имело эффект и повышало уровни SCFA, что было показано абсолютно достоверно в Таблицах 4 и 5 (Pro). Р-значение различий в масляной кислоте между Malt и Malt+Lr было очень близко к достоверному (Р=0,055), и можно предположить, что дополнительные крысы в группах или удлиненный экспериментальный период приведет к достоверных отличиям. Более высокий уровень SCFA в крови был показан ранее, когда пробиотики добавляли к рационам, богатым волокнами. Однако следует отметить, что уровни, особенно масляной кислоты, но также и пропионовой кислоты в слепой кишке и крови воротной вены, были значительно выше у крыс, питавшихся фракциями ячменя, по сравнению с более ранним экспериментом, в котором крысы питались шелухой черники. Увеличение степени ферментации также отразилось на рН посредством пробиотиков и оно было ниже в тех группах, которые получали L.rhamnosus 271. В связи с этим стоит отметить, что при низком рН рост потенциальных патогенов, таких как Clostridia, снижается, и, таким образом, кажется, что L.rhamnosus 271 может противодействовать патогенной флоре.
Крысы, питающиеся Malt, имели самый высокий уровень масляной кислоты в дистальной части толстого кишечника (Р<0,05, по сравнению с WBG). Большое значение имеет то, что пищевые волокна способны достичь не только проксимального толстого кишечника, но также и дистальную часть, потому что такие заболевания толстого кишечника, как неспецифический язвенный колит и рак толстого кишечника обычно происходят в этой части толстого кишечника. Пациенты с неспецифическим язвенным колитом увеличивали уровни масляной кислоты в фекалиях через 4 недели на диете с овсяными отрубями, обогащенными β-глюканом, и, в отличие от контроля, жалобы при поступлении были уменьшены при этом лечении. Сходные результаты были получены Kanauchi и соавторами с продуктами питания из проросшего ячменя.
Пулы и уровни СА в слепой кишке были выше у крыс, питавшихся Malt, по сравнению с WGB, демонстрируя высокую степень ферментации волокна. Однако волокна, включающие глюкозосодержащие полисахаридные пищевые волокна, в солоде были наименее ферментированы из трех изученных фракций ячменя. Вероятным объяснением может быть то, что волокна в цельнозерновом ячмене деградируют в процессе соложения и не осаждаются в этаноле во время анализа пищевых волокон. Это означает, что пищевых волокон, взятых для крыс, питавшихся Malt, по факту было больше, чем в других препаратах ячменя, что приводит к более высокому формированию СА. Значения в Таблице 2 основаны на анализе волокон, т.е. измерялись только полисахариды, имеющие более высокую степень полимеризации (около 20), что приводит к очевидно более низкой степени ферментации. Тем не менее это является проблемой не только этого способа, а и всех имеющихся методик, использущих пищевые волокна. Включение неперевариваемых углеводов с более низкой степенью полимеризации в расчет ферментации будет уменьшать фекальную экскрецию до приблизительно 36%. BSG был наименее ферментирован (Р<0,05, по сравнению с WGB), возможно, из-за обогащения целлюлозосодержащими полисахаридами, как известно, плохо подвергающимися ферментации.
Число количеств бифидобактерий было ниже с Malt, чем с другими фракциями ячменя. Хотя бактерии, подсчитанные в этом эксперименте, не составляют всю микрофлору, это может означать, что микрофлора была изменена. Измененная микрофлора может также приводить к другим путям для ферментации и измененному образованию продуктов распада, как можно полагать из более высоких уровней масляной кислоты в слепой кишке и дистальной части толстого кишечника у крыс, питавшихся Malt, по сравнению с другими ячменными продуктами.
Общее содержание белка, измерянного как аминокислоты, было почти в три раза выше в пивной дробине, чем в солоде и цельнозерновом ячмене, в то время как состав белка был очень схож в трех ячменных фракциях. Вклад белка из ячменных фракций в рационах, однако, был самым высоким в Malt (Таблица 6). Тем не менее не было никаких различий в общем объеме аминокислот в крови воротной вены. Однако некоторые различия были обнаружены в распределении аминокислот, и крысы, питавшиеся WGB, имели более высокий процент глутамина в плазме, чем группа, питавшаяся Malt. В этом эксперименте не было определено, содержит ли цельнозерновой ячмень неперевариваемые белки, включая глутамин, который может достигать толстого кишечника для ферментации. Было высказано предположение, что повышенное образование масляной кислоты может снизить потребность в глутамине, повышая таким образом уровни циркулирующего глутамина. Солод, дающий высокие количества масляной кислоты, не показывал никаких более высоких уровней глутамина в плазме крыс, чем другие ячменные фракции, свидетельствуя о том, что глутамин не достигает толстого кишечника в какой-либо значительно степени и поэтому не абсорбируется там. На самом деле шелуха черники в рационе, содержащем казеин в качестве источника белка, продемонстрировала сходные уровни глутамина в плазме, как и в данном эксперименте, используя ту же модель животных (данные не опубликованы). Это может означать, что ни одна из фракций ячменя, используемых в настоящем эксперименте, не увеличивает плазменные уровни глутамина больше, чем казеин. Благотворное влияние GFB у людей с неспецифическим язвенным колитом и у крыс с DSS-индуцированным колитом отчасти приписывают глутамину.
Существуют некоторые трудности при анализе глутамина в тестовых материалах. В ходе кислотного гидролиза глутамин превращается в глутаминовую кислоту, и количество глутаминовой кислоты, следовательно, включает в себя количество глутамина. Однако только следы глутаминовой кислоты могут быть найдены в продуктах питания из проросшего ячменя и, следовательно, большая часть измеряемого количества должна быть глутамином. Кроме того, как сообщалось, глутамин в ячмене связан с пищевыми волокнами, достигающими толстого кишечника, и после ферментирования волокон является субстратом для слизистой толстого кишечника. Однако глутамин известен как очень непрочная аминокислота, и большая часть глутамина, не связанная с пищевыми волокнами, разрушается пищевыми кислотами. Malt группа имела более низкие уровни глутамина в плазме и можно предположить, что это связано с процессом соложения в какой-то степени. Как говорилось выше, похоже, что пищевые волокна деградируют во время соложения, что может приводить к меньшим количествам связанного глутамина.
Уровень аммиака в плазме в Malt группе был выше, чем у крыс, питавшихся WGB и BSG. Происхождение аммиака в воротной вене является сложным, но часть возникает из метаболизма глутамина. Это может быть другой причиной более низкого соотношения глутамина в Malt группе. Предыдущие исследования на людях показали, что увеличение числа фекальных бифидобактерий было связано со снижением уровня аммиака в фекалиях и крови. Bifidobacterium spp., как известно, использует аммиак в качестве источника азота для роста. Крысы, питавшиеся Malt, имели более низкое количество жизнеспособных бифидобактерий в слепой кишке, указывая, что этим можно объяснить более высокий процент аммиака, найденный в крови воротной вены. Было показано, что аммиак является токсичным для клеток и изменяет синтез ДНК, и таким образом было предложено, что он является промотером канцерогенеза у людей. Одним способом снижения уровня аммиака у крыс, питавшихся Malt, может быть добавление бифидобактерий L. rhamnosus, используемых в данном эксперименте, которые не уменьшили, а увеличили уровень аммиака в крови.
В заключение, в экспериментах, выполненных в соответствии с настоящим изобретением, ячмень в виде цельнозернового ячменя, пивной дробины или солодового ячменя в комбинации с пробиотическим штаммом приводил к значительному увеличению образования масляной кислоты в толстом кишечнике, см. таблицу 4, и крови, см. таблицу 5, по сравнению с ситуацией, когда давали только фракции ячменя. Как видно из таблицы 5, увеличение более чем в два раза для WGB и Malt, и почти в два раза для BSG в крови. Коммерческий интерес композиции, включающей эти компоненты, реализуется с учетом многих полезных эффектов, связанных с масляной кислотой. Таким образом, образование СА, а не только масляной кислоты, увеличивалось, когда к ячменным фракциям добавляли пробиотический штамм L. rhamnosus, хотя большинство эффектов было показано вместе с WBG, например, увеличенные уровни масляной кислоты в слепой кишке и крови воротной вены. В связи со сходностью злаков ячменя, овса и ржи ожидается, что сходные результаты будут получены также с другими злаками.