Моноклональное антитело, специфичное к вирусу Эбола
MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR EBOLA VIRUS

Изобретение относится к моноклональным антителам, а именно к моноклональному антителу, применяемому в иммуноферментном анализе для идентификации вируса Эбола.
Вирусные инфекции занимают одно из первых мест среди причин заболеваемости и смертности населения. Опасность представляют как хорошо известные длительное время присутствующие в популяции человека вирусы, такие как вирусы гриппа, так и новые вирусы, вызывающие инфекции с чрезвычайно высоким уровнем летальности, такие как вирус Эбола.
Геморрагическая лихорадка Эбола (далее по тексту – «ГЛЭ») – острая вирусная высококонтагиозная инфекция, вызываемая вирусом Эбола. Вирус был впервые идентифицирован в качестве этиологического агента ГЛЭ в 1976 году. С этого времени было зафиксировано 23 спорадические вспышки заболевания, каждая из которых характеризовалась высочайшей смертностью (до 80%). Вирус Эбола обладает исключительно высокой контагиозностью. Стремительное распространение вируса Эбола среди населения может произойти даже в результате единичного случая преодоления вирусом межвидового барьера [1]. Такие свойства позволили отнести вирус Эбола к патогенам группы А, являющимися потенциальными агентами биотерроризма. Вирус ГЛЭ относится к наиболее патогенным представителям рода Ebolavirus. Вирус Эбола делится на пять подтипов: суданский, заирский, кот-д’ивуарский, рестонский, а также бундибугио. По своим морфологическим свойствам вирус Эбола близок к вирусу Марбург, который относится к роду Marburgvirus, но отличается по антигенным свойствам. Оба рода вирусов относятся к семейству Filoviridae, отряд Mononegavirales.
Крупнейшей из всех ранее известных эпидемией ГЛЭ считалась вспышка 1976 года (318 подтвержденных случаев заболевания, из них 280 смертельных). Однако последняя к настоящему времени эпидемия, начавшаяся в 2013 году, превосходит ее на порядки. По данным на начало 2015 года официальное число инфицированных составило более 20000 человек, при этом число смертельных исходов – около 8000 [2]. Вспышка ГЛЭ преимущественно затронула страны Западной Африки. Случаи заболевания в США и Европейских странах относятся только к медицинскому персоналу и миссионерам. Нераспространение эпидемии за пределы Африки объясняется, в том числе, применением комплексных противоэпидемических мероприятий.
Расширение технических возможностей общества повышает опасность распространения инфекционных заболеваний. В частности, по данным доклада управления верховного комиссара ООН по делам беженцев, в 2014 году, число зарегистрированных беженцев превысило 51 миллион человек, что является самым высоким числом беженцев в мире после окончания Второй мировой войны. При этом по оценке ООН, в России находится более 13 миллионов мигрантов, что составляет приблизительно 9% населения Российской Федерации. Прогнозы, публикуемые в средствах массовой информации в отношении вероятности переноса ГЛЭ в другие страны, включая Россию и Финляндию, основаны на статистических расчетах пассажиропотоков из неблагополучных по заболеваемости африканских стран. Очевидно, что скорость распространения ГЛЭ по миру в первую очередь определяется жесткостью карантинных мер в первичных очагах распространения заболевания и контролем на транспортных узлах. Однако эпидемиологическая практика свидетельствует, что для высококонтагиозных инфекций с длительным инкубационным периодом эти меры имеют только временный успех.
При появлении новой инфекции или возвращении ранее известной остро встает вопрос о диагностическом мониторинге. Быстрая лабораторная диагностика является одним из основных условий обеспечения инфекционной безопасности, выявления групп инфицированных лиц, проведения карантинных мероприятий и, главное, принятия быстрых решений по предписанию эффективной и своевременной терапии.
Для диагностики ГЛЭ можно использовать общепринятые методы выявления вирусных инфекций (Таблица 1): выделение вируса в клеточных культурах, электронную микроскопию, иммуноферментный анализ (далее по тексту – «ИФА»), методы на основе полимеразной цепной реакции (далее по тексту – «ПЦР»).
Таблица 1 – Общепринятые методики выявления вирусных инфекций
Однако на диагностику ГЛЭ накладывается ряд ограничений, связанных с медико-биологическими и социально-экономическими особенностями протекания заболевания. Прежде всего, образцы, взятые у пациентов с подозрением на ГЛЭ, представляют чрезвычайно высокую биологическую опасность, и работа с неинактивированным материалом должна проводиться в лабораториях 4 уровня биобезопасности (BSL-4) [3]. Методы диагностики ГЛЭ значительно отличаются на ранней и поздней стадиях заболевания и зависят от того, имеет ли ГЛЭ единичный или эпидемический характер распространения. Кроме того методы диагностики ГЛЭ будут различны в странах, отличающихся уровнем развития систем здравоохранения.
Классическим способом вирусологической диагностики ГЛЭ является метод выделения вируса в клеточной культуре Vero или Vero E6 [4, 5].
Метод является одним из самых точных и чувствительных, так как позволяет восстановить даже следовые количества вируса. Однако процесс выделения занимает несколько дней и может быть осуществлен только в лабораториях, соответствующих уровню BSL-4, что делает невозможным его использование в рутинной диагностике.
На ранних стадиях ГЛЭ в крови и тканях пациентов присутствуют высокие титры вирусных частиц, поэтому основными рекомендуемыми подходами к диагностике ГЛЭ являются выявление вирусных РНК методами ПЦР и/или вирусных антигенов методами ИФА [6]. ПЦР является быстрой, простой и высокочувствительной методикой молекулярной диагностики, позволяющей выявить в анализируемой пробе даже следовые количества вирусной РНК. В литературе представлен целый ряд методов диагностики ГЛЭ, основанных как на традиционных методах ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени, так и их различных модификациях [4]. Следует отметить, что большинство из немногих имеющихся в настоящее время валидированных систем in vitro диагностики ГЛЭ основано именно на методе ПЦР в режиме реального времени [6].
Методы ИФА, рекомендованные для диагностики ГЛЭ, хотя и уступают методам ПЦР в чувствительности, являются более простыми в реализации. В научной литературе описаны различные варианты ИФА для чувствительной и специфической детекции вирусных антигенов с использованием поли- и моноклональных антител (далее по тексту – «МКА»), полученных против рекомбинантных белков вируса Эбола [4]. Были также разработаны системы ИФА для выявления вирус-специфических IgG и IgM, которые могут быть использованы преимущественно на поздних стадиях заболевания.
Помимо традиционных методов ПЦР и ИФА для выявления вирусных РНК и антигенов и вирус-специфических антител в перспективе можно также использовать современные высокопроизводительные методы анализа, такие как олигонуклеотидные и белковые микрочипы [7] и высокопроизводительное секвенирование (NGS) [8]. Однако все эти методы были разработаны в рамках научно-исследовательских работ и не были реализованы на практике.
Также известны МКА 4А2, продуцируемые гибридомой 4А2 (субкласс иммуноглобулинов IgG1) и МКА 1C1, продуцируемые гибридомой 1C1 (субкласс иммуноглобулинов IgG1) [9]. МКА 4A2, продуцируемое штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 4A2 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), и МКА 1C1, продуцируемое штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 1C1 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), совместно используются в иммуноферментной системе формата «сэндвич» для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).
–9
Известно МКА, связывающееся с гликопротеином вируса Эбола [11]. Данное МКАселективно связывает гликопротеин вируса Эбола с константой диссоциации комплекса 2,6×10 М. Специфичность МКА к гликопротеину вируса Эбола подтверждена методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга, а также установлены аминокислотная и нуклеотидная последовательности вариабельных доменов МКА.
Известны МКА 1B2, продуцируемые штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 1B2, и МКА 7В11, продуцируемые штаммом гибридных клеток животного Rattus Norvegicus 7B11 [12]. МКА 1B2, продуцируемое штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 1B2 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), а также МКА 7В11, продуцируемое штаммом гибридных клеток животного Rattus Norvegicus 7B11 (субкласс иммуноглобулинов IgG), используются совместно в иммуноферментной системе формата «сэндвич» для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). В качестве прототипа выбрано МКА 1B2.
Недостатком вышеприведенных технических решений и прототипа является относительно низкая специфичность к рекомбинантному белку eGP вируса Эбола.
Технический результат заключается в получении моноклонального антитела с высокой специфичностью к рекомбинантному белку eGP вируса Эбола.
–8
Технический результат достигается путем получения МКА, специфичного к вирусу Эбола и продуцируемого гибридомой 1B1, штамм которой депонирован в специальной коллекции культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ФБГУН Институт цитологии РАН под № РККК(П) 788Д, полученного иммунизацией мыши рекомбинантным фьюжн-белком rBs с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, связывающегося с рекомбинантным белком eGP вируса Эбола с равновесной константой диссоциации (KD) 4,4×10 М, применяемого в иммуноферментном анализе для идентификации вируса Эбола.
Заявляемое МКАполучено следующим образом.
Мыши линии BALB/c были проиммунизированы рекомбинантным фьюжн-белком rBs (SEQ ID NO:1), состоящим из фрагмента NS1-124 вируса гриппа А/PR8, фрагментов GP1/GP2 вируса Эбола и гистидинового тега. Мышей иммунизировали двукратно, с интервалом 3 недели, белок вводили внутримышечно в дозе 40 мкг с адъювантом гидроксидом алюминия 500 мкг. Через 3 недели после 2-й иммунизации была проведена внутрибрюшинно бустер-иммунизация рекомбинантным фьюжн-белком rBs, растворённым в PBS, в дозе 30 мкг/мышь (за три дня до слияния).
–4
–7
–5
Гибридомы получали по методике Гальфре и Мильстейна. Культуру мышиной миеломы Х63Аg8.653 поддерживали в логарифмической фазе роста путём ежедневных рассевов в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой крупного рогатого скота (далее по тексту «СКРС»). Гибридизацию спленоцитов гипериммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы осуществляли в суспензии в соотношении 10:1 в присутствии 50% ПЭГ-1000 (“Sigma-Aldrich”, США). Затем клетки переносили в селективную ГАТ-среду, приготовленную на основе RPMI-1640 и 20% СКРС с добавлением гипоксантина (10 М), аминоптерина (4×10 М) и тимидина (1,6×10 М) производства “Sigma-Aldrich” (США), а также 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия (“Sigma-Aldrich”, США), 1 мг/л амфотерицина В и 50 мг/л гентамицина. Суспензию распределяли по ячейкам 96-луночных планшетов, содержащих трёхсуточную культуру мышиных макрофагов. После 10 суток культивирования ГАТ-среду заменяли на более щадящую ГТ-среду, а после 20 суток культуры поддерживали на среде RPMI-1640 с СКРС. Для удаления Ig, секретированных не слившимися спленоцитами мышей, культуральную жидкость из ячеек с растущими гибридами отбирали на 5–6, затем на 10–12 и на 16–17 дни после слияния.
2
Культивирование всех клеток осуществляли в пластиковых культуральных планшетах или во флаконах производства Sarstedt или Nunc. Клетки содержали при +37°С и 100% влажности в атмосфере с 6–7% СО. Базовая культуральная среда содержала 90% RPMI-1640 и 10% СКРС производства фирмы «Биолот» (Санкт-Петербург).
Основным приёмом тестирования культуральных жидкостей был твердофазный ИФА с очищенными рекомбинантными белками rBs, rNS и eGP, в качестве отрицательного контроля использовали лизат бактериальных клеток E. coli. Часть клеток первичных (до этапа клонирования) позитивных культур временно замораживали, а часть клонировали 3–4 раза методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на фидерном слое из мышиных перитонеальных макрофагов. После каждого клонирования гибридомы тестировали методом ИФА и положительные культуры закладывали на хранение в криобанк. Клонированные гомогенные гибридомные штаммы наращивали в культуре, собирали надосадочную жидкость для изучения свойств МКА, а клетки криоконсервировали. Для криоконсервирования клеток использовали среду, состоящую из 90% СКРС и 10% ДМСО (“Sigma-Aldrich”, США). Предварительно охлажденные до –80°С в парах азота криопробирки с клетками помещали в жидкий азот (для многолетнего хранения). Криоконсервированию подвергали культуры гибридомных клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, образующие сплошной монослой. Перед замораживанием клетки подвергали микроскопическому исследованию на отсутствие контаминации микрофлорой. Количество живых клеток оценивали по эксклюзии трипанового синего.
Для пассирования гибридом мышам-реципиентам линии BALB/c за 10–14 дней до прививки внутрибрюшинно вводили 0,5 мл пристана (“Sigma-Aldrich”, США). Клетки в количестве 5–10 млн инокулировали в брюшную полость. После образования асцита делали прокол брюшной стенки и собирали оттекающую жидкость. После центрифугирования асцитов надосадочная жидкость служила источником МКА, а клетки гибридом, прошедшие пассирование на мышах, криоконсервировали.
-2
-6
2
2
2
4
450
Антигенами, разведёнными карбонатно-бикарбонатным буфером до концентрации 1 мкг/мл, сенсибилизировали планшеты в течение 18 часов при 4°С. После отмывания несвязавшегося антигенного материала 0,01 М PBS с добавлением 0,05% Tween 20 (PBS-T), рН 7.2 вносили МКА в PBS-Т в разведениях 10–10 и инкубировали 1 час при 37°С. Связавшиеся с антигеном МКА детектировали с помощью пероксидазных конъюгатов антител к IgG мыши (“Sigma-Aldrich”, США) в PBS-Т в течение 1 часа при 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина и 0,03% НО в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции 2N HSO оптическую плотность измеряли на фотометре Anthos-2010 при длине волны 450 нм (ОП). Специфическая активность препаратов МКА (eGP) была определена в ИФА. Результаты непрямого неконкурентного ИФА представлены на Фиг. 1, где по оси ординат представлены относительные единицы значения поглощения (OD) при длине волны 450 нм, а по оси абсцисс представлены значения соответствующих концентраций сорбированного белка eGP (рекомбинантного белка eGP) в нг/мл. По результатам данного ИФА была составлена таблица 2.
Таблица 2 – Зависимость значений относительных единиц поглощения (OD) при длине волны 450 нм от концентрации сорбированного белка eGP (рекомбинантного белка eGP) в нг/мл.
Из данных таблицы следует, что наиболее специфичным является МКА 1B1, которое было выбрано для дальнейшей работы.
Препараты мышиных МКА перед очисткой представляли собой асцитные жидкости мышей, содержащие МКА, секретируемые клетками отобранной гибридомы. Асцитную жидкость, содержащую МКА, размораживали на ледяной бане и фильтровали через шприцевой фильтр-насадку с диаметром пор 0,45 мкм, материал мембраны PES (“Sartorius”, Германия). Полученный фильтрат переводили методом обессаливания на хроматографическом картридже Bio-Scale Mini Bio-Gel P6 в буферный раствор для хроматографии А (20 мМ Трис гидрохлорид, 50 мМ натрия хлорид, pH 7.3, 0,01% натрия азид) и хранили при +4°С не более суток.
На первой стадии хроматографической очистки был использован сорбент Affi-Gel DEAE Blue (“Bio-Rad”, США), который представляет собой иммобилизованную на агарозной матрице смешанную фазу на основе красителя Cibacron blue F3GA и диэтиламиноэтиловой группы. Хроматографию проводили на приборе AKTA start (“GE Healthcare”, США). Две хроматографические колонки Bio-Scale Mini Affi-Gel DEAE Blue (“Bio-Rad”, США) объёмом 5 мл каждая соединяли тандемно, предварительно регенерировали согласно инструкции производителя. Далее колонки уравновешивали 30 мл буфера А на скорости потока 2 мл/мин. Фильтрат асцитной жидкости вносили в колонку на скорости 2 мл/мин из расчёта 1 мл фильтрата на 1 мл сорбента. Далее колонку отмывали 10 мл буфера А. Несвязавшийся материал, содержащий МКА чистотой около 80–90% (по данным электрофореза), собирали и хранили при +4°С. Колонку регенерировали согласно инструкции производителя.
На второй стадии выделения был использован сорбент CHT I, представляющий собой синтетические макропористые гранулы фосфата кальция (гидроксиапатита) и позволяющий разделять белки в широком диапазоне их поверхностных зарядов и изоэлектрических точек. Данный сорбент используется для удаления из раствора остатков белков асцитной жидкости и неактивных форм IgG (димеров, агрегатов и фрагментов лёгких и тяжёлых цепей). Хроматографию проводили на приборе AKTA start (“GE Healthcare”, США). Хроматографическую колонку Bio-Scale Mini CHT Type I Cartridge (“Bio-Rad”, США) объёмом 5 мл уравновешивали 25 мл буферного раствора для хроматографии Б (10 мМ натрия фосфат, 50 мМ натрия хлорид, pH 7.3, 0,01% натрия азид) на скорости потока 5 мл/мин.
К раствору МКА, полученному на первой стадии очистки, добавляли 500 мМ раствор натрия фосфата, pH 7.3, до конечной концентрации 10 мМ, перемешивали и вносили в колонку на скорости потока 5 мл/мин. Далее колонку отмывали 5 объёмами буфера Б и элюировали IgG линейным градиентом буфера В (10 мМ натрия фосфат, 1 М натрия хлорид, pH 7.3, 0,01% натрия азид). Объём градиента составил 75 мл, скорость элюции — 5 мл/мин. Основной пик, содержащий мономерную форму IgG, отбирали и хранили при +4°С. Хроматографическую колонку регенерировали, последовательно промывая 25 мл 500 мМ раствора натрия фосфата, pH 7.3 и 25 мл 1 М раствора натрия хлорида.
Концентрацию белка в полученном растворе МКАопределяли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (“Thermo Scientific”, США), полагая значение А280 для 0,1% раствора белка равным 14,5. Далее раствор концентрировали на центрифужном концентраторе VivaSpin Turbo 15, Cut-off 30 кДа, материал фильтра PES (“Sartorius”, Германия), до конечной концентрации 5 мг/мл и переводили в буфер PBS, содержащий 0,01% азид натрия, методом обессаливания на хроматографическом картридже Bio-Scale Mini Bio-Gel P6 (“Bio-Rad”, США). Полученный препарат представлял собой раствор активной формы IgG чистотой 98–99% по данным электрофореза и аналитической гель-фильтрации.
Электрофореграмма конечного препарата представлена на фиг. 2, где на дорожке 1 нанесены маркеры молекулярного веса, а на дорожке 2 нанесён очищенный препарат МКА. Идентификацию конечных препаратов МКА проводили методом электрофореза в ПААГ по методу Лэммли с добавлением восстанавливающего агента (2-меркаптоэтанол). К 10-мкл аликвотам препаратов в нужной концентрации добавляли по 4 мкл 4-кратного буфера Лэммли и 2 мкл PBS, прогревали 15 мин в твердотельном термостате при 99°С, затем по 15 мкл готовой смеси вносили в лунки геля. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 200 В в течение 40 минут. Гель окрашивали коллоидным раствором Кумасси G-250 и визуализировали при помощи системы гель-документации ChemiDoc MP System (“Bio-Rad”, США) с последующим денситометрическим анализом. Денситограмма представлена на фиг. 3. На денситограмме присутствуют бэнды молекулярной массой 51,8 и 21,4 кДа, что соответствует тяжёлой и лёгкой цепям молекулы IgG.
Аналитическую хроматографию проводили на приборе AKTA pure на колонке Superdex 200 Increase 10/300 GL (“GE Healthcare”, США). Для этого в колонку, предварительно уравновешенную 50 мл буфера PBS, вносили 100 мкл препарата и элюировали буфером PBS на скорости потока 0,75 мл/мин. Мониторинг проводили по оптической плотности на длине волны 280 нм. Полученные данные сравнивали с хроматограммой стандартных растворов для гель-фильтрации и анализировали при помощи программного обеспечения Unicorn 6.0 (“GE Healthcare”, США). В данном конкретном примере пик №5 имеет объём элюции 11,63 мин, что соответствует нативной форме молекулы IgG. Содержание нативной формы IgG в препарате составила 98,41% по результатам аналитической гель-фильтрации, которая представлена на фиг. 4.Заявляемое изобретение поясняется примером.
–8
Исследование взаимодействия рекомбинантного белка eGP вируса Эбола и МКА1B1 было проведено с использованием оптического биосенсора Biacore на основе поверхностного плазмонного резонанса. Наличие шести гистидиновых остатков у лиганда (eGP) являлись идеальным фрагментом для иммобилизации в силу высокой связываемости с иммобилизированной нитрилоуксусной кислотой на поверхности используемого сенсорного чипа NTA. Связывание лиганда с анализируемой парой МКА было изучено путем мониторинга изменения значений резонансной единицы (RU) в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Сенсограмма взаимодействия рекомбинантного белка eGP с парой МКА 1B1 представлена на Фиг. 5. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore. Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра и получены константы ассоциации и диссоциации полученного комплекса антиген-антитело. Так, рассчитанная по данному приближению равновесная константа диссоциации составила KD = 4,4Ч10 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии рекомбинантного белка eGP с парой МКА 1B1.
Список источников
1. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Gire S.K., Goba A., Andersen K.G. et al. Science. 2014 Sep; 12;345(6202):1369-72. doi: 10.1126/science.1259657. Epub 2014 Aug 28.
2. Global status report on noncommunicable diseases 2014. WHO. 2014; ISBN: 978 92 4 156485 4.
3. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. Krisztina Janosko, Michael R. Holbrook, Ricky Adams et al. J Vis Exp. 2016; (116): 52317. doi:  10.3791/52317.
4. Laboratory Diagnostic Systems for Ebola and Marburg Hemorrhagic Fevers Developed with Recombinant Proteins. Masayuki Saijo, Masahiro Niikura, Tetsuro Ikegami, Ichiro Kurane, Takeshi Kurata, Shigeru Morikawa. Clin Vaccine Immunol. 2006 Apr; 13(4): 444–451. doi: 10.1128/CVI.13.4.444-451.2006.
5. Towards Detection and Diagnosis of Ebola Virus Disease at Point-of-Care. Ajeet Kaushik,a, Sneham Tiwari, Rahul Dev Jayant, Aileen Marty, Madhavan Nair. Biosens Bioelectron. 2016 Jan 15; 75: 254–272; doi: 10.1016/j.bios.2015.08.040.
6. U.S. FDA, «2014 Ebola Virus Emergency UseAuthorizations»; Vogel, 2014.
7. Laboratory guidance for the diagnosis of Ebola virus disease : interim recommendations: September 2014/ World Health Organization, URL: http://www.who.int/iris/handle/10665/134009#sthash.5HKgzZSc.dpuf; дата обращения – 26.09.2018.
8. Kamata K, et al. (2014) The N-terminus and Tudor domains of Sgf29 are important for its heterochromatin boundary formation function. J Biochem 155(3):159-71.
9. Köhler O., Benros M.E., Nordentoft M., Farkouh M.E., Iyengar R.L., Mors O., Krogh J., Effect of anti-inflammatory treatment on depression, depressive symptoms, and adverse effects: a systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials. JAMA Psychiatry. 2014 Dec 1;71(12):1381-91. doi: 10.1001/jamapsychiatry.2014.1611.
10. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), и набор для иммуноферментной тест-системы формата "сэндвич" для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga): патент № 2395577, Российская Федерация, заявка № RU2008150265, заявл. 18.12.2008, опубл. 27.07.2010.
11. Моноклональное антитело, связывающееся с гликопротеином вируса эбола, фрагменты днк, кодирующие указанное антитело, и антигенсвязывающий фрагмент: патент № 2630304, Российская Федерация, RU2015157142, заявл. 31.12.2015, опубл. 06.09.2017.
12. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L.1B2 - продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной тест-системы формата "сэндвич" для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga): патент № 2395576, Российская Федерация, заявка № RU2008149653, заявл. 16.12.2008, опубл. 27.07.2010.