ШТАММ БАКТЕРИЙ Paenibacillus sp. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ
STRAIN OF BACTERIA Paenibacillus sp. FOR OBTAINING BIOLOGICAL PRODUCT AGAINST DISEASES OF WHEAT CAUSED BY PHYTOPATHOGENIC FUNGI

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы корневыми гнилями и повышает урожайность пшеницы. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты от болезней и повышения урожайности злаковых культур.
Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.
Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2], и Pseudomonas putida ВКМ В-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатком известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.
Известен штамм Azotobacter chroococcum N В-3173, предназначенный для получения бактериального удобрения [4], повышающий урожайность злаковых культур. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам.
Известен штамм Azotobacter chroococcum 92 [5], обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность.
Наиболее близким к заявляемому является штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1 [6], обладающий способностью подавлять рост фитопатогенных грибов и повышающий урожайность пшеницы. Недостатком штамма является сравнительно высокая продолжительность культивирования и сравнительно невысокая антагонистическая активность.
Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающего высокой продуктивностью при невысокой продолжительности культивирования, нитрогеназной активностью, возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы.
Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Paenibacillus sp. ИБ-1, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В - 2823D.
1. Культурально-морфологические признаки
2
4
4
4
2
4
3
3
1.1. На агаризованной питательной среде, имеющий состав, г/л: KHPO - 0,3; CaHPO - 0,2; MgSO - 0,3; KSO - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl - 0,01; CaCO - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, pH 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24-м часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.
2
4
2
4
4
4
2
4
1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющей состав, г/л: KHPO - 0,8; KHPO - 0,2; MgSO - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO - 0,1; Fe(MoO) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; pH 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.
2
4
4
4
2
4
2
3
1.3. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: KHPO - 0,3; CaHPO - 0,2; MgSO - 0,3; KSO - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl - 0,01; CaCO - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; pH 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 36 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.
1.4. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24-м часу роста - мелкие подвижные палочки.
1.5. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-36 часу роста клетки - длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные.
2. Физиолого-биохимические признаки
Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.
Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.
10
Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·10 кл/мл. Не погибает при нагревании при 50°C в течение 15 мин.
Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.
Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.
Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.
2
4
4
3
2
4
Пример 1. Для сравнения продолжительности культивирования нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 с известным штаммом Azotobacter vinelandii ИБ-1 проводили выращивание в колбах на качалке при 180-200 об/мин, при температуре 28°C на жидкой питательной среде следующего состава, %: сахароза 3,0; KHPO 0,03; CaHPO 0,02; NaCl 0,05; CaCO 0,5; KSO 0,02. до достижения количества жизнеспособных клеток 80 млрд/мл. Результаты приведены в табл.1.
Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1
На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Paenibacillus sp. ИБ-1. Чашки инкубируют при 28°C в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.2 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.
4
9
Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5-10 КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10 КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 1 кг семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.3.
Пример 4. Определение ростстимулирующей активности заявляемого штамма.
Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие ростстимулирующей активности микроорганизма. Образование заявляемым штаммом цитокининов с концентрацией 330 нг/мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [7].
Пример 5. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает нитрогеназной активностью (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов рода Azotobacter (табл.4), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [8-11].
Пример 6. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 способен к переводу малорастворимых фосфатов в растворимые формы, используемые в метаболизме растений.
Дефосфорилирующую активность определяли на среде Муромцева, куда вносили фосфат кальция методом осаждения, предложенным Герретсеном, в модификации Муромцева [12]. Приготовленные питательные среды разливали по чашкам Петри, подсушивали в термостате и сажали уколом исследуемый штамм микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате при 28°C в течение семи суток. О растворении фосфатов судили по образованию вокруг колоний бактерий зон просветления питательной среды. В результате проведенных испытаний было установлено, что штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 способен к активному растворению трифосфата кальция, диаметр зоны просветления среды значительно превышает диаметр колонии бактерии
Таким образом, выделен новый штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающий высокой продуктивностью при невысокой продолжительности культивирования, нитрогеназной активностью, возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы.
Таблица 1
Продолжительность ферментации штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 для достижения числа жизнеспособных клеток (КОЕ) 80 млрд/мл
Штамм
Время ферментации, ч
Paenibacillus sp. ИБ-1
36
Azotobacter vinelandii ИБ 1 (по прототипу)
60
Таблица 2
Антагонистическое действие штаммов Paenibacillus sp. ИБ-1 и штамма по прототипу на грибные фитопатогены
Вид фитопатогенных грибов
Диаметр зоны подавления роста гриба, мм
Штаммы
Paenibacillus sp. ИБ-1
прототип
Fusarium culmorum
29
22
Fusarium gibbosum
28
21
Fusarium graminesrum
20
12
Fusarium nivale
15
8
Fusarium semitectum
24
16
Fusarium solani
18
12
Fusarium avenaceum
28
19
Fusarium moniliforme
28
18
Bipolaris sorokiniana
40
28
Penicillium funiculosum
18
11
Fusarium culmorum
30
22
Fusarium oxysporum
21
13
Alternaria alternata
48
33
Таблица 3
Эффективность нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 против корневых гнилей пшеницы
Варианты опытов
Развитие болезни проростков пшеницы, %
Проростки с дефектами, %
Alternaria + Penicillium
Bipolaris sorokiniana
Fusarium oxysporum
Контроль
28,0
11,0
15,5
8,0
Прототип
15,5
6,1
9,5
3,5
Paenibacillus sp. ИБ-1
12,0
4,5
7,2
3,1
Таблица 4
Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 и свободноживущих азотфиксаторов
Культура
Нитрогеназная активность, мкг N<sub>2</sub>/мл/час
Paenibacillus sp ИБ-1
0,77
Прототип
0,65
Azotobacter chroococcum В 35 [8]
0,26
Azotobacter chroococcum Ш 25 [9]
0,45
Azotobacter chroococcum Ц 40 [10]
0,11
Azotobacter chroococcum Б 1 [11]
0,22
Литература
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988.
2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.
3. Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993.
4. Авторское свидетельство СССР 1359272, кл. C05F 11/08, 1985.
5. Авторское свидетельство СССР 9221105, кл. C05F 11/08, 1982.
6. Патент RU 2224791, кл. C12N 1/20, 2004.
7. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.
8. Патент RU №2074159, кл. C05F 11/08, 1997.
9. Патент RU №2074158, кл. C05F 11/08, 1997.
10. Патент RU №2074157, кл. C05F 11/08, 1997.
11. Патент RU №2076088, кл. C05F 11/08, 1997.
12. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991 - 304 с.