Способ диагностики воспалительного процесса в миокарде человека
METHOD FOR DIAGNOSING INFLAMMATORY PROCESS IN HUMAN MYOCARDIUM

Изобретение относится к области медицины, а именно, к лабораторной диагностике, кардиологии.
В основе таких часто встречающихся и неоднородных по своим проявлениям кардиологических синдромов, как идиопатическая аритмия (ИА), дилатационная кардиомиопатия - ДКМП (расширение камер сердца со снижением сократительной способности миокарда, которое является главной причиной трансплантации сердца у больных с хронической сердечной недостаточностью), некомпактный миокард во многих случаях лежит воспалительный процесс. Так, частота выявления признаков воспалительного процесса в миокарде по данным некоторых авторов, достигает 78% при ИА и 67% при ДКМП.
Следует отметить, что наиболее сложными для диагностики являются не столько острые формы, сколько хронический воспалительный процесс в миокарде, который нередко протекает латентно, без очевидной связи с перенесенной инфекцией и приводит к вышеназванным осложнениям.
Как можно более ранняя диагностика наличия воспалительного процесса и назначение адекватной терапии могут существенно улучшить прогноз и качество жизни пациента.
«Золотым стандартом» диагностики воспалительного процесса в миокарде на современном этапе признана эндомиокардиальная биопсия (Leone О, Veinot JP, Angelini A. et all Consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol 2012; 21:245-274). Однако выполнение биопсии нативного сердца не является рутинной процедурой. Эта инвазивная методика зачастую приводит к жизнеугрожающим осложнениям и выполняется в исключительных ситуациях. При этом не исключены ложноотрицательные результаты в том случае, если биоптат выполнен на достаточном удалении от зоны поражения миокарда. Чувствительность метода составляет лишь 50% при получении и последующем анализе 4-5 образцов (Chow L.H. et al. Insensitivity of right ventricular endomyocardial biopsy in the diagnosis of myocarditis // J. Am. Coll. Cardiol. 1989. Vol.14, №4. P. 915-920). В связи с вышеперечисленным, продолжается поиск неинвазивных или малоинвазивных диагностических методов выявления воспалительного процесса в миокарде.
Известен способ дифференциальной диагностики вариантов поражения проводящей системы миокарда при инфекционной кардиомиопатии у детей (Патент РФ 2510507, МПК G01N 33/50, публ. 2014), включающий проведение пациенту клинического осмотра и лабораторных исследований. Выполняют электрокардиографическое исследование. Проводят исследование крови, определяют антикардиальные антитела - АКАТ к антигенам отдельных структур сердца, по превышению титров которых относительно нормы определяют наличие воспалительного процесса в соответствующих структурах миокарда. При проведении исследования крови, в которой определяют АКАТ к антигенам отдельных структур сердца, производят забор 2-3 мл венозной крови. Приготовленный из цельной крови мазок исследуют методом твердофазовой непрямой иммунофлюоресценции с набором реактивов IMMCO Diagnostic / USA с помощью оптического микроскопа. Метод является полуколичественным. Антиген выделяют из сердечной ткани быка с помощью гель-хроматографии, а определение антикардиальных антител - по интенсивности развивающейся цветовой реакции. Полученную реакцию сравнивают с нормой.
Недостатком этого способа является невысокая точность, а также сложность в интерпретации полученных результатов при выявлении антикардиальных антител посредством исследования мазка из цельной крови. Кроме того, выделение антигена из сердечной ткани быка с помощью гель-хроматографии является крайне трудоемким процессом, особенно в части калибровки прибора, требует наличия дорогостоящего оборудования, специального обучения персонала, частого промывания колонок.
Наиболее близким является способ определения антител к антигенам тканей миокарда человека при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, сопровождающихся воспалительными процессами, включающий проведение исследования ткани миокарда быка непрямым методом иммунофлюоресценции, при этом предварительно эту ткань замораживают, затем готовят срезы ткани толщиной 4 мкм в криостате при -20°С, после этого срезы подсушивают при комнатной температуре и фиксируют ацетоном при +4°С, наносят на срезы сыворотку крови пациента в рабочем разведении и инкубируют 18 часов при +4°С, наслаивают люминесцирующие антитела, меченные ФИТЦ, и инкубируют в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Для промывания используют забуференный физиологический раствор с рН 7,0-7,4, окрашенные срезы заключают в 60% глицерин с рН 7,0-7,4. Учет результатов проводят под люминесцентным микроскопом. Оценивают свечение в зоне интерстициальной соединительной ткани, на территории клеточных мембран и цитоплазмы. (Данилова Т.А. и др. «Гетерофильные антитела к антигенам интерстициальной соединительной ткани и эндотелия сосудов миокарда при заболеваниях сердечно-сосудистой системы». Вестник трансплантологии и искусственных органов №3, 2004, с. 5-7).
К недостаткам этого способа относится высокая вероятность получения неточных результатов, поскольку, замораживание образца непосредственно в петролейном эфире при -70°С часто приводит к перераспределению внутриклеточной жидкости, образованию кристаллов льда и, как следствие, повреждению клеточных структур. При исследовании такой ткани под микроскопом создается картина ложного отека, а вариант заморозки непосредственно в жидком азоте приводит в значительном числе случаев к образованию в ткани трещин, раскалыванию кусочка, и, как следствие, к утрате необходимых для изучения структур, нарушению архитектоники изучаемой ткани, а также к неравномерному окрашиванию образца в дальнейшем. Кроме того, для выявления воспалительного процесса в миокарде, реакция в области интерстициальной соединительной ткани и клеточной мембраны считается неспецифичной. Другим существенным недостатком данного способа является длительность инкубации срезов миокарда быка с сывороткой крови пациента (18 часов), что не позволяет получить результат раньше, чем на вторые сутки после забора крови. Однако в ряде случаев при тяжелом состоянии пациента клиницистам необходим результат как можно быстрее для принятия решения о тактике лечения больного.
Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, повышение точности выявления воспалительного процесса в миокарде человека за счет более достоверного определения антител к антигенам тканей путем улучшения качества препарата для исследования; сокращение времени проведения исследования.
Для решения поставленной задачи при проведении диагностики воспалительного процесса в миокарде человека, включающей определение антител к антигенам тканей миокарда человека путем проведения исследования сыворотки крови пациента на ткани миокарда быка непрямым методом иммунофлюоресценции. При этом предварительно эту ткань замораживают, затем готовят срезы ткани толщиной 4 мкм в криостате, после этого срезы подсушивают при комнатной температуре и фиксируют ацетоном при +4°С. Наносят сыворотку крови пациента в рабочем разведении и инкубируют на срезах ткани миокарда быка, наслаивают люминесцирующие антитела, меченные ФИТЦ. Затем инкубируют в течение 30-40 минут при комнатной температуре, а для промывания используют забуференный физиологический раствор с рН 7,0-7,4, окрашенные срезы заключают в 60% глицерин с рН 7,0-7,4. Новым является то, что исследуют ткань миокарда быка, взятую из левого желудочка со стороны эндокарда, а предварительную заморозку осуществляют путем размещения ткани в емкости с изопентаном, охлажденным до температуры -145-159°С. При этом температуру изопентана поддерживают постоянной, время заморозки 10-40 с. Сыворотку крови пациента титруют до 1:160-1:320 и инкубируют на срезах в течение 1,5-2 часов при температуре +36°С-+37°С. Если при проведении исследования выявляют наличие реакции, по меньшей мере, в одной из зон, а именно, в широких анизотропных дисках кардиомиоцитов, в зоне эндотелия капилляров или волокон проводящей системы сердца, то диагностируют наличие воспалительного процесса.
Кроме того, предложено температуру изопентана поддерживать постоянной путем размещения емкости с тканью миокарда быка в емкости с жидким азотом.
Взятие ткани миокарда быка из предложенного нами сегмента сердца, а именно из левого желудочка со стороны эндокарда, обеспечивает попадание в срез всех интересующих структур и тканей сердца: эндотелия капилляров; кардиомиоцитов; гладкомышечных клеток сосудов; волокон проводящей систем сердца.
Экспериментальным путем нами установлены оптимальные параметрические значения температуры изопентана для реализации способа: от -145°С до -159°С. При температуре выше -145°С испарение реагента продолжается, что не позволяет качественно заморозить образец сердца быка. При температуре ниже -159°С вещество начинает быстро переходить в твердую фазу, что требует немедленного извлечения из жидкого азота и согревания при помешивании, чтобы не повредить замораживаемую ткань. Использование изопентана, охлажденного до -145°С -159°С в качестве протекторной среды для замораживания позволяет полностью сохранить архитектонику ткани; избежать растрескивания кусочка; предотвратить формирование картины ложного отека; обеспечить устранение артефактов, обусловливающих некорректное прокрашивание структур.
Предложенное время инкубации сыворотки крови пациента на срезах сердца быка в течение 1,5-2 часов при температуре +36°С-+37°С позволяет существенно сократить время исследования и получать результат в день взятия крови у пациента, что делает возможным использование данного способа диагностики воспалительного процесса в миокарде человека не только в плановых, но и в экстренных случаях.
При инкубации срезов с сывороткой крови пациента менее 1,5 часов резко возрастает количество ложноотрицательных результатов. Более длительная инкубация (> двух часов) полученный эффект не усиливает.
Инкубация срезов с сывороткой крови пациента при температуре ниже 36°С дает большое количество ложноотрицательных результатов. При повышении температуры более 37°С резко возрастает вероятность подсыхания срезов.
При исследовании окрашенных препаратов, в результате улучшения преаналитической подготовки субстрата, удается оценить не просто диффузную реакцию в обрасти цитоплазмы кардиомиоцитов, а дифференцировать свечение в зоне широких анизотропных дисков кардиомиоцитов, что важно, поскольку антитела, направленные против изоформ миозина являются органоспецифичными и считаются четким признаком наличия воспалительной реакции.
Способ осуществляется следующим образом.
Предварительно для заморозки ткани миокарда быка широкогорлый сосуд Дьюара или пенопластовую коробку заполняют жидким азотом. Криопробирку на две трети заполняют изопентаном, помещают в пенопластовый поплавок, плавающий в жидком азоте (в широкогорлом сосуде Дьюара, либо в пенопластовой коробке, в которую налит азот). Необходимо убедиться, что уровень изопентана в плавающей на поплавке пробирке хорошо виден. Изопентан охлаждают до температуры -145°С до -159°С по известной методике путем размещения емкости с тканью миокарда быка в емкости с жидким азотом.
Криопробирку с изопентаном помещают в жидкий азот. Охлаждение происходит в течение 2-5 минут, до тех пор, пока изопентан не перестанет испаряться из пробирки.
Образец ткани миокарда быка взятого из левого желудочка со стороны эндокарда, замораживают, погружая его в криопробирку с холодным изопентаном при помощи предварительно охлажденного пинцета на 10-40 секунд. Время выбирают в зависимости от размера образца. Образец ткани станет белесо-розового цвета, когда заморозится.
Затем, из одного замороженного в изопентане куска миокарда быка с использованием среды для заморозки О.СТ.™ Compound, готовят криостатный блок. Далее делают срезы ткани миокарда быка толщиной 4 мкм в криостате при -24-26°С. После этого срезы подсушивают при комнатной температуре и фиксируют ацетоном при +4°С, наносят на срезы сыворотку крови пациента в рабочем разведении (от 1:160 до 1:320) и инкубируют на срезах в течение 1,5- 2 часов при температуре +36°С-+37°С. После этого отмывают, наслаивают люминесцирующие антитела, меченные ФИТЦ, против иммуноглобулина класса G и инкубируют в течение 30-40 минут при комнатной температуре.
Для промывания используют забуференный физиологический раствор с рН 7,0-7,4, окрашенные срезы заключают в 60% глицерин с рН 7,0-7,4 и исследуют под люминесцентным микроскопом.
После этого препараты, полученные методом непрямой иммунофлюоресценции, исследуют под люминесцентным микроскопом. При этом оценивают реакцию (свечение) в зоне эндотелия капилляров, в обрасти широких анизотропных дисков кардиомиоцитов, волокон проводящей системы сердца. При выявлении реакции в разведении 1:160-1:320, по меньшей мере, в одной из указанных зон диагностируют наличие воспалительного процесса в миокарде.
Пример 1.
Пациент С, 1981 г.р., поступил в кардиореанимационное отделение с выраженной одышкой, перебоями в работе сердца, отеком нижних конечностей. При обследовании на ЭКГ - трепетание предсердий, 2:1, тахистолия. При эхокардиографическом исследовании выявлено увеличение объемных характеристик левого желудочка, снижение глобальной систолической функции миокарда левого желудочка (фракция выброса по Симпсону 28%), недостаточность митрального клапан 2+.
Проведено исследование по предлагаемому способу. Для этого из миокарда быка, предварительно замороженного в изопентане при -145°С в течение 40 с и залитого в криостатный блок с помощью среды для заморозки О.СТ.™ Compound, были изготовлены срезы толщиной 4 мкм. Далее срезы подсушивали при комнатной температуре, фиксировали ацетоном при +4°С, наносили на срезы сыворотку крови пациента в рабочем разведении и инкубировали 1,5 часа при +37°С. Затем срезы отмывали от сыворотки фосфатным буфером (троекратно по 3 мин), наслаивали люминесцирующие антитела (меченные изотиоцианатом флюоресцеина) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, для промывания использовали забуференный физиологический раствор с рН 7,0-7,4. Окрашенные срезы заключали в 60% глицерин с рН 7,0-7,4 и исследовали под люминесцентным микроскопом. Выявлено свечение в зоне широких анизотропных дисков кардиомиоцитов (титр 1:160) высокий титр антител к эндотелию (1:320) и волокнам проводящей системы сердца (1:320), что позволило диагостировать наличие воспалительного процесса.
Проведены дополнительные лабораторные исследования. Обнаружено повышение уровня NT-proBNP до 638 пг/мл, в остальном без особенностей. Функция и структура щитовидной железы - без патологии. На основании клинических данных, данных функционального и лабораторного обследования поставлен диагноз острый миокардит. Проведено лечение пентаглобин + пульс-гормональная терапия. В динамике улучшение по клиническим симптомам, нормосистолия за счет увеличения проведения при трепетании предсердий и повышение фракции выброса до 47% по Симпсону. Пациент выписан на терапии, включающей метипред. Месяц спустя при контрольном обследовании титр антител снизился до уровней: к широким анизотропным дискам - 1:20, к эндотелию и проводящей системе снизились до 1:80. Выписан с рекомендациями продолжения терапии метипредом, прошел полный курс. Синусовый ритм удерживается по настоящее время. В контрольных анализах на антитела титр 1:40. Фракция выброса миокарда левого желудочка 65%. Больной находится на динамическом наблюдении.
Пример 2.
Пациент К., 1955 г.р., поступил в кардиологическое отделение для обследования и лечения. История заболевания: С конца декабря 2017 г. после перенесенного бронхита стал отмечать частый пульс, а также нарастание одышки. АД до 140/90. Терапии не получал. Инфаркт миокарда не переносил. При эхокардиографическом исследовании выявлено наличие дилатации полостей сердца, снижение ФВЛЖ до 33%, отмечено наличие пароксизмальной ФП. При проведении коронарографии данных за ИБС не получено. Заподозрен острый миокардит.
Проведено исследование по предлагаемому способу. Для этого из миокарда быка, предварительно замороженного в изопентане (при -159°С) в течение 10 с и залитого в криостатный блок были изготовлены срезы толщиной 4 мкм. Далее срезы подсушивали при комнатной температуре, фиксировали ацетоном при +4°С, наносили на срезы сыворотку крови пациента в рабочем разведении и инкубировали 2 часа при +36°С. Далее обрабатывали по указанной выше методике и исследовали под люминесцентным микроскопом. Выявлено свечение в зоне широких анизотропных дисков кардиомиоцитов (титр 1:160), в зоне эндотелия капилляров (1:320) и волокон проводящей системы сердца (1:160), что было расценено как наличие воспалительного процесса.
Подтверждено наличие активного миокардита с аутоиммунными компонентом. При проведении дополнительных исследований выявлена персистенция вируса ВПГ 1-2 и HHV-6. Проводилась терапия с применением НПВС и стандартная терапия ХСН, начат курс противовирусной терапии с одновременным курсом Пентаглобина на фоне чего состояние улучшилось. Ритм синусовый. По данным эхоКГ: незначительная дилатация левого желудочка. ФВ по Симпсону = 54%. Умеренная легочная гипертензия. Перикард без особенностей. В динамике снижение титров антител, удержание синусового ритма. Пациент выписан под динамическое наблюдение.
Пример 3.
Пациентка К., 1965 г.р. поступила в кардиологическое отделение с клиникой одышки при минимальной физической нагрузке, загрудинными болями, подобными стенокардическим. История заболевания: с 2014 года страдает приступами болей за грудиной, одышкой, которые ранее расценивались как проявления ИБС. Однако при экстренной госпитализации с загрудинными болями и депрессией сегмента ST в грудных отведениях до 2 мм, после проведения коронарографии обнаружены «чистые» коронарные артерии и замедленный смыв контраста. Был заподозрен миокардит с явлениями коронариита.
Проведение исследования по предлагаемому способу. Для этого из миокарда быка, предварительно замороженного в изопентане (при -145°С) в течение 40 с и залитого в криостатный блок были изготовлены срезы толщиной 4 мкм. Далее срезы подсушивали при комнатной температуре, фиксировали ацетоном при +4°С, наносили на срезы сыворотку крови пациента в рабочем разведении и инкубировали 1,5 часа при +37°С. Далее обрабатывали по указанной выше методике и исследовали под люминесцентным микроскопом. Выявлены высокие титры антител, направленных к широким анизотропным дискам кардиомиоцитов (титр 1:320), а также к эндотелию капилляров (1:320). Было расценено как наличие воспалительного процесса в миокарде.
После проведения дополнительных исследований в крови обнаружен ВПГ-1 поставлен диагноз хронический персистирующий миокардит. Начато этиотропное лечение ацикловиром, пентаглобином. В результате проведенной терапии отмечен выраженный положительный эффект: одышка исчезла, боли в грудной клетки не рецидивировали. Пациентка выписана под динамическое наблюдение.
Пример 4
Пациент Л., 1966 г.р., поступил в кардиореанимационное отделение с клиникой перебоев в работе сердца, одышкой. Со слов больного ранее кардиологический анамнез отрицает. Около 2-х недель назад проходил лечение по поводу тонзиллита. Через 5-6 дней после лечения появилось ощущение заложенности в грудной клетке, перебои в работе сердца, при физической нагрузке - одышка. Приходилось останавливаться, в покое одышка исчезала. Обратился к терапевту по месту работы. Терапевт обратила внимание на высокую ЧСС, была выполнена ЭКГ, где зарегистрирован пароксизм фибрилляции предсердий. При поступлении в ОКР планировалось уточнение генеза аритмии, решение вопроса об ЭИТ-кардиоверсии. При обследовании выявлен массивный гидроторакс. При эхокардиографическом исследовании обнаружено расширение всех полостей сердца. Сократительная функция резко снижена (ФВЛЖ 31%), нарушения глобальной и локальной сократимости. Жидкость в перикарде. Аорта не расширена, уплотнена. Клапаны уплотнены. Митральная регургитация 2 степени. Трикуспидальная регургитация 2 степени. Легочная гипертензия 1 степени. Заподозрен острый миокардит. Проведение исследование по предлагаемому способу. Для этого из миокарда быка, предварительно замороженного в изопентане (при -159°С) в течение 10 с и залитого в криостатный блок были изготовлены срезы толщиной 4 мкм. Далее срезы подсушивали при комнатной температуре, фиксировали ацетоном при +4°С, наносили на срезы сыворотку крови пациента в рабочем разведении и инкубировали 2 часа при +36°С. Затем срезы отмывали от сыворотки фосфатным буфером (троекратно по 3 мин), наслаивали люминесцирующие антитела (меченные изотиоцианатом флюоресцеина) и инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре. Далее обрабатывали по указанной выше методике и исследовали под люминесцентным микроскопом. Выявлены высокие титры антител, направленных к широким анизотропным дискам кардиомиоцитов (титр 1:320), а также к эндотелию (1:320) и волокнам проводящей системы сердца (титр 1:320), что было расценено как наличие воспалительного процесса в миокарде.
По результатам анализов и клинического наблюдения принято решение о начале этиопатогенетической терапии: проведена терапия пентаглобином, пульс-гормональная терапия с переходом на таблетированные формы -метипред 80 мг/сутки, терапия ХСН. На фоне лечения отмечен положительный эффект: разрешились проявления ХСН, дыхательной недостаточности. Отмечена редукция отеков, одышки, ФВЛЖ 40%. Отмечена стойкая умеренная гипотензия, АД около 105…110/65…70. Выписан на амбулаторное лечение. При контрольных визитах отмечено повышение ФВ до 47%, анализ на антитела к структурам миокарда показал снижение титров до 1:80. В дальнейшем фракция выброса левого желудочка на прежнем уровне, признаки ХСН на уровне класса II.
По предлагаемому способу диагностика воспалительного процесса в миокарде, проведена у 120 больных. У 87 пациентов выявлена реакция хотя бы в одной из областей: в зоне широких анизотропных дисков, кардиомиоцитов, в зоне эндотелия капилляров и волокон проводящей системы сердца, что было расценено как наличие воспалительного процесса в миокарде.
В дальнейшем, при использовании дополнительных лабораторных и функциональных методов исследования, наличие или отсутствие воспалительного процесса было подтверждено в 100% случаев.
Кроме того, была набрана контрольная группа из 35 пациентов с невоспалительными заболеваниями сердца (пороки сердца, ИБС, ГКМП и пр.), которым дополнительно были проведены исследования по предлагаемому способу. Это позволило у 12 пациентов выявить наличие воспалительного процесса в миокарде. Были выполнены операции на открытом сердце и взяты образцы миокарда для гистологического исследования. Во всех 12 случаях обнаружены морфологические признаки миокардита в тканях биопсии.
Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность и точность определения воспалительного процесса в миокарде, сократить сроки диагностики, обеспечить дифференциальную диагностику заболеваний миокарда воспалительного генеза с другими кардиологическими заболеваниями невоспалительного генеза. Это обеспечивает возможность проведения своевременного адекватного лечения, в ряде случаев позволяющего избежать хирургического вмешательства, улучшить качество жизни данной категории пациентов и увеличить ее продолжительность.