Влияние кормовой добавки на основе зернового мицелия вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) на окислительные процессы и активность антиоксидантных ферментов в плазме крови кролика европейского (Oryctolagus cuniculus)

УДК 591.13:636.92+577.11 DOI: 10.21685/2307-9150-2017-1-3

С. С. Тарасов

ВЛИЯНИЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ ЗЕРНОВОГО МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

Аннотация.

Актуальность и цели. Рассматривается возможность влияния зернового мицелия вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) на процессы окислительной модификации белков (ОМБ), перекисное окисление липидов (ПОЛ), а также на активность антиоксидантных ферментов каталазы и супероксиддисмута-зы (СОД) в плазме крови кролика европейского (Oryctolagus cuniculus). Целью исследования являлось изучение возможности влияния зернового мицелия вешенки обыкновенной на процессы окислительной деструкции биополимеров и активности антиоксидантных ферментов.

Материалы и методы. Мицелий вешенки поступал в организм животных путем его скармливания в составе корма. ОМБ определялась путем регистрации продуктов - 2,4-динитрофенилгидразонов в плазме крови, ПОЛ при регистрации малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК), определение СОД проводили методом, основанным на ее способности конкурировать с нитросиним тетрозолием за супероксидные анион-радикалы, регистрация каталазы осуществлялась за счет снижения количества пероксида в пробе.

Результаты. Выявлено влияние зернового мицелия вешенки обыкновенной на ОМБ, ПОЛ, активность СОД и каталазы. Зафиксировано снижение продуктов ОМБ в течение исследуемого периода, при этом можно выделить два пика снижения: краткосрочный в течение первых трех суток - незначительное изменение 2,4-денитрофенилгидразонов, долгосрочное - зафиксированный после семи суток с момента смены рациона. Схожая картина наблюдается и с ПОЛ. СОД увеличивает свою активность в первые сутки эксперимента с последующим снижением. Активность каталазы изменяется незначительно.

Выводы. Показана зависимость между уровнем ОМБ, ПОЛ и активностью соответствующих ферментов и количеством съеденного мицелия в сторону уменьшения концентрации продуктов ОМБ, ПОЛ и активности ферментов.

Ключевые слова: зерновой мицелий, окислительная модификация белков (ОМБ), перекисное окисление липидов (ПОЛ), динитрофенилгидразоны, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты, супероксиддисмутаза, каталаза.

S. S. Tarasov

INFLUENCE OF GRAIN MUCELIUM OF THE OYSTER MUSHROOM

Abstract.

Background. This work considers the influence of grain mucelium of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) on the oxidative modification of proteins (OMP),

lipid peroxidation (LPO), the activity of the dynamics of catalase and superoxide dismutase (SOD) in the blood plasma of the European rabbit (Orictolagus cunicu-lus). The aim of the study is to examine the activity of antioxidant enzymes and to explore the possibility of the influence of the grain mycelium oyster mushroom on the processes of oxidative degradation of biopolymers.

Materials and methods. The mucelium of the oyster mushroom entered the animals' organisms with food. OMP was determined by registration of 2,4-dinitro-phenylhydrazone products in the blood plasms; LPO - by registration of malon dial-dehyde (MDA) and diene conjugates (DC). SOD was determined through its ability to compete with nitroblue tetrozolem of superoxide anion radicals; catalase was determined by reducing the amount of peroxide in the sample.

Results. The author determined the influence of grain mycelium of the oyster mushroom on OMB, LPO, SOD and catalase. A decrease of OMP products was registered during the study period, which can be divided into 2 peaks: a short-term during the first 3 days - no significant change in 2,4-denitrofenilgidrazones, a long-term - recorded after 7 days from the date of the diet change. A similar pattern was observed with LPO. SOD increased its activity in the first day of the experiment, followed by a decrease. The catalase activity did not change significantly.

Conclusions. The author has shown a dependence between the level of OMP, LPO, catalase and SOD and the eaten grain mucelium, displaying a trend towards a decrease of the OMP and LPO concentration and the enzyme activity.

Key words: grain mucelium, oxidative modification of proteins (OMP), lipid peroxidation (LPO), malon dialdehyde, diene conjugates, superoxide dismutase, catalase.

Введение

Зерновой мицелий вешенки - типичный альтернативный кормовой компонент, его использование в кормлении животных представляется важным с нескольких позиций. Во-первых, в состав мицелия входят ценные вещества, которых нет в классических компонентах рациона, во-вторых, в процессе освоения мицелием зернового субстрата происходит ряд реакций, в частности, улучшающих усвоение зерна.

Известно, что рацион питания оказывает влияние на рост, развитие, физиологические и биохимические процессы организма, в частности на процессы биологического окисления [1]. Основными показателями окислительных процессов являются окислительная модификация белков (ОМБ), перекисное окисление липидов (ПОЛ), которые окисляются за счет реакций с активными формами кислорода (АФК) и образуют производные, а также активность антиоксидантных ферментов, в частности супероксиддисмутазы (СОД) и ка-талазы, осуществляющие утилизацию АФК и препятствующие процессам окислительной деструкции [2-4]. В связи с этим целью работы являлось: исследовать характер влияния мицелиальной добавки вешенки, выращенной на ячменном субстрате, на окисление белков и липидов, а также активность супероксиддисмутазы и каталазы в плазме крови кролика европейского. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) изучить характер влияния мицелия вешенки на процессы ОМБ в плазме крови кролика;

2) исследовать характер влияния мицелия вешенки на ПОЛ в плазме крови кролика;

3) установить динамику активности СОД и каталазы в зависимости от времени введения в рацион кормовой добавки на основе мицелия вешенки.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили на кроликах породы «Советская шиншилла» в возрасте от трех до пяти месяцев. Животных выращивали на кролиководческой ферме ООО «ВитаАс» в стандартных условиях. Рацион всех животных включал в себя: зерносмесь ячменя, овса и пшеницы, сено из лугового разнотравья, воду. Зерносмесь контрольной группы составляла следующее соотношение: 50 % ячменя, 25 % овса, 25 % пшеницы, а у экспериментальных животных ячмень был заменен на мицелий вешенки, выращенный на ячменном субстрате. Сформированные группы выделяли из общего стада и в течение двух недель вводили в их рацион корм, содержащий зерновой мицелий вешенки. Все животные имели в неограниченном количестве корма соответствующего рациона, т.е. могли потреблять столько корма, на сколько велика их физиологическая потребность. Всего в эксперименте было задействовано 15 животных, столько же кроликов было в контрольной группе. Забор крови проводили из ушной вены через 1, 3, 7 и 14 сут после смены рациона питания. Через такой же период времени забор крови проводили и у животных контрольной группы. Для получения плазмы кровь смешивали с антикоагулянтом и центрифугировали при 3000 g.

Определение содержания малонового диальдегида проводили методом, основанным на взаимодействии его с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [5]. Определение содержания диеновых конъюгатов в плазме крови проводили путем добавления к 0,2 мл плазмы 2 мл смеси изопропанол/гептан (1:1) [6]. Активность СОД определяли по методике Е. Е. Дубининой, Л. А. Салтыковой, Л. Ф. Ефимовой (1983). Активность каталазы определяли по методу, основанному на способности данного фермента разлагать перекись водорода с образованием воды [7]. Определение карбонильных производных в плазме крови кролика проводили по модифицированной методике Е. Е. Дубининой [8]. Общий белок определяли биуретовым методом (метод Кингслея -Вейксельбаума) [9]. Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью программы Microsoft Excel 2003 и Биостатистика вер. 4.03 методами параметрической статистики, включающей определение средней арифметической (М) и стандартного отклонения. Достоверность различий оценивали по ¿-критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони. Уровень значимости достоверности различий - 95 % [10].

Результаты и их обсуждение

При исследовании влияния зернового мицелия на процессы ОМБ установлено, что после введения в рацион данного компонента содержание продуктов ОМБ снижается (рис. 1). Зафиксированы два пика снижения: краткосрочный - зафиксированный в течение первых трех суток - незначительное изменение 2,4-денитрофенилгидразонов, долгосрочный - зафиксированный после семи суток с момента смены рациона, значительное снижение всех продуктов ОМБ (Р < 0,05).

Вероятно, это связано с особенностями биохимического состава мицелия [11, 12], так как он содержит в значительном количестве аскорбиновую кислоту, токоферолы, каратиноиды, являющиеся низкомолекулярными анти-оксидантами, способными в значительной степени улавливать АФК в плазме

крови и не давать им прореагировать с белковыми молекулами. Кроме этого, организм животных регулярно вырабатывает внеклеточные протеазы, расщепляющие окисленный белок плазмы крови, а низкомолекулярные антиок-сиданты препятствуют его новообразованию, поэтому через две недели наблюдается существенное снижение продуктов ОМБ. При применении обычных комбикормов данный эффект не наблюдается, так как они не содержат в своем составе низкомолекулярные антиоксиданты.

Рис. 1. Изменение уровня ОМБ в плазме крови кролика при добавлении в рацион

кормовой добавки на основе зернового мицелия вешенки обыкновенной: АН - алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны нейтрального характера; АО - алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны основного характера; КН - алифатические кетон-денитрофенилгидразоны нейтрального характера; КО - алифатические кетон-денитрофенилгидразоны основного характера

С введением в рацион кролика мицелия вешенки наблюдается отчетливая картина снижения продуктов ПОЛ уже на третьи сутки (рис. 2). При этом зафиксировано снижение ДК на третьи и седьмые сутки, а МДА - на третьи и четырнадцатые соответственно (Р < 0,05). Анализируя полученные данные, видим, что после проведения эксперимента концентрация продуктов ПОЛ становится существенно ниже по отношению к контролю. Это можно объяснить тем, что организм при наиболее рациональном питании имеет более крепкую иммунную систему, способен легче противостоять процессам ПОЛ, при этом в рационе имеется достаточное количество низкомолекулярных антиоксидантных веществ, что позволяет останавливать процессы ПОЛ, не затрачивая силы на синтез антиоксидантных ферментов. Полученные данные изменения уровня ОМБ и ПОЛ свидетельствуют о снижении процессов окислительной деструкции данных биополимеров в зависимости от наличия в рационе зернового мицелия вешенки обыкновенной.

Добавление зернового мицелия вешенки в рацион питания приводит к незначительному росту СОД на следующий день после смены рациона, при дальнейших наблюдениях за активностью данного фермента установлено статистически значимое снижение до уровня ниже контроля примерно на 20 %

(Р < 0,05) (рис. 3). Увеличение активности СОД в первый день, возможно, связано со сменой рациона питания, в связи с особым биохимическим составом мицелия, наличием в нем хитина и других свойственных для грибов веществ, не характерных для растений, которые являются рационом питания для кроликов в природе. Вероятно, некоторые соединения мицелия аналогичны таковым веществам патогенных микромицетов; возможно, вызывают специфические реакции иммунной системы и на короткое время активируют антигрибковый иммунитет, в связи с тем, что деятельность иммунной системы связана с респираторным взрывом, в результате чего образуются в большом количестве активные формы кислорода [13-15], на что организм вырабатывает антиоксидантные ферменты. Динамика каталазы статистически значимо не изменяется (Р > 0,05). Вероятно, это связано с тем, что утилизируемые ею АФК - Н2О2 - не генерируются клетками крови в большом количестве в нормальных условиях, а антиоксидантные вещества мицелия утилизируют АФК первого уровня, которые утилизирует СОД.

Рис. 2. Влияние кормовой добавки на основе зернового мицелия вешенки обыкновенной на ПОЛ в плазме крови кролика: ДК - диеновые конъюгаты; МДА - малоный диальдегид

Рис. 3. Влияние кормовой добавки на основе зернового мицелия вешенки обыкновенной на активность антиоксидантных ферментов: СОД - супероксиддисмутаза; кат - каталаза

Выводы

1. Установлено снижение уровня окислительной модификации белков в плазме крови кролика при добавлении в рацион зернового мицелия вешенки обыкновенной по сравнению с зерносмесью. Так, к четырнадцатым суткам кормления мицелием наблюдается снижение всех продуктов окислительной модификации не менее чем на 35 % по отношению к контролю.

2. Наблюдается снижение перекисного окисления липидов при добавлении в рацион зернового мицелия вешенки обыкновенной по сравнению с зерносмесью. Уровень продуктов перекисного окисления липидов снижается более чем на 50 % по отношению к контролю.

3. Зафиксировано небольшое увеличение активности супероксиддесму-тазы в первые сутки после смены рациона с последующим снижением примерно на 20 % по отношению к контролю.

4. Динамика активности каталазы статистически значимо не изменялась на протяжении всего времени эксперимента.

Библиографический список

1. Тарасов, С. С. Влияние разных типов питания на степень окислительной модификации белков плазмы крови кролика (Oryctolagus cuniculus) / С. С. Тарасов // Молодой ученый. - 2011. - Т. 1, № 12. - С. 116-120.

2. Дубинина, Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток / Е. Е. Дубинина. - СПб. : Медицинская пресса, 2006. - 396 с.

3. Bergendi, L. Chemistry, physiology and pathology of free radicals / L. Bergendi, L. Benes, Z. Duraskova, M. Ferensik // Life sci. - 1999. - Vol. 65, № 18/19. - P. 810-817.

4. Frey, P. A. Radical mechanisms of enzymatic catalysis / P. A. Frey // Anny. Rev. Biochem. - 2001. - Vol. 70. - P. 121-148.

5. Стальная, И. Д. Метод определения малонового диальдегида / И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / под ред. В. Н. Орехо-вича. - М. : Медицина, 1997. - C. 66-68.

6. Каган, В. Е. Проблемы анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов / В. Е. Каган, О. Н. Орлова, Л. Л. Прилипко - М. : Изд-во ВИНИТИ АН СССР, 1986. - 136 с.

7. Patterson, B. D. An inhibitor of catalase induced by cold in chilling-sensitive plants / B. D. Patterson, L. A. Paune, Chen Yi-Zhu, P. Graham // Plant Physiology. -1984. - Vol. 76, № 4. - P. 1014-1018.

8. Дубинина, Е. Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Е. Е. Дубинина, С. О. Бурмистров, Д. А. Ходов, И. Г. Поротов // Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41, вып. 1. - С. 24, 25.

9. Мельников, В. В. Лабораторные методы исследования в клинике / В. В. Мельников. - М. : Медицина, 1987. - 367 с.

10. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М. : Практика, 1999. - 459 с.

11. Морозов, А. И. Грибы: руководство по разведению / А. И. Морозов. - Донецк : Сталкер, 2000. - 304 с.

12. Иванов, А. И. Грибоводство / А. И. Иванов. - Пенза : РИО ПГСХА, 2015. - 96 с.

13. Петрова, М. Д. Открытие нейтрофильных внеклеточных ловушек - новый этап в изучении морфогенеза и функций нейтрофилов / М. Д. Петрова, М. Г. Шубин // Морфология. - 2011. - Т. 139, № 3. - С. 89-96.

14. Ванько, Л. В. Оксидативный стресс в генезе акушерских осложнений / Л. В. Ванько, В. Г. Сафронова, Н. К. Матвеева, Г. Т. Сухих. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 264 с.

15. Alghamdi, A. S. Seminal DNase frees spermatozoa entangled in neutrophil extracellular traps / A. S. Alghamdi, D. N. Foster // Biol. Reprod. - 2005. - Vol. 73. -P. 1174-1181.

References

1. Tarasov S. S. Molodoy uchenyy [The young scientist]. 2011, vol. 1, no. 12, pp. 116-120.

2. Dubinina E. E. Produkty metabolizma kisloroda v funktsional'noy aktivnosti kletok [Oxygen metabolism products in functional activity of cells]. Saint-Petersburg: Medi-tsinskaya pressa, 2006, 396 p.

3. Bergendi L., Benes L., Duraskova Z., Ferensik M. Life sci. 1999, vol. 65, no. 18/19, pp. 810-817.

4. Frey P. A. Anny. Rev. Biochem. 2001, vol. 70, pp. 121-148.

5. Stal'naya I. D., Garishvili T. G. Sovremennye metody v biokhimii [Modern methods in biochemistry]. Moscow: Meditsina, 1997, pp. 66-68.

6. Kagan V. E., Orlova O. N., Prilipko L. L. Problemy analiza endogennykh produktov perekisnogo okisleniya lipidov [Problems of analyzing endogenic products of lipid pe-roxidation]. Moscow: Izd-vo VINITI AN SSSR, 1986, 136 p.

7. Patterson B. D., Paune L. A., Yi-Zhu Chen, Graham P. Plant Physiology. 1984, vol. 76, no. 4, pp. 1014-1018.

8. Dubinina E. E., Burmistrov S. O., Khodov D. A., Porotov I. G. Voprosy meditsinskoy khimii [Problems of medical chemistry]. 1995, vol. 41, iss. 1, pp. 24, 25.

9. Mel'nikov V. V. Laboratornye metody issledovaniya v klinike [Laboratory research methods in clinics]. Moscow: Meditsina, 1987, 367 p.

10. Glants S. Mediko-biologicheskaya statistika [Biomedical statistics]. Moscow: Praktika, 1999, 459 p.

11. Morozov A. I. Griby: rukovodstvo po razvedeniyu [Fungi: cultivation guidance]. Donetsk: Stalker, 2000, 304 p.

12. Ivanov A. I. Gribovodstvo [Fungi cultivation]. Penza: RIO PGSKhA, 2015, 96 p.

13. Petrova M. D., Shubin M. G. Morfologiya [Morphology]. 2011, vol. 139, no. 3, pp. 89-96.

14. Van'ko L. V., Safronova V. G., Matveeva N. K., Sukhikh G. T. Oksidativnyy stress v geneze akusherskikh oslozhneniy [Oxidating stress in the genesis of obstetrical complications]. Moscow: GEOTAR-Media, 2010, 264 p.

15. Alghamdi A. S., Foster D. N. Biol. Reprod. 2005, vol. 73, pp. 1174-1181.

Тарасов Сергей Сергеевич ассистент, кафедра ботаники, физиологии и защиты растений, Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия

E-mail: Tarasov_ss@mail.ru

Tarasov Sergei Sergeevich Assistant, sub-department of botany, physiology and plant protection, Nizhny Novgorod State Agricultural Academy

УДК 591.13:636.92+577.11 Тарасов, С. С.

Влияние кормовой добавки на основе зернового мицелия вешенки обыкновенной (РкыгМ^ ostreatus) на окислительные процессы и активность антиоксидантных ферментов в плазме крови кролика европейского (Oryctolagus ситси1ш) / С. С. Тарасов // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2017. - № 1 (17). - С. 26-32. БОТ: 10.21685/2307-9150-2017-1-3