ПОДЛОЖКА ДЛЯ БИОЧИПА

Заявляемая полезная модель относится к медицине, а именно к средствам для иммунологических исследований биологических материалов, и может найти применение в клинических и биологических лабораториях.
Белковые биочипы применяются в таких областях исследований, как фундаментальные биологические научные исследования, характеристика ассоциированных с заболеваниями белковых каскадов, оценка токсичности лекарственных препаратов и медицинская диагностика, что значительно повышает производительность и биологическую значимость экспериментов по анализу экспрессии белков [Hall E.A.H. In Handbook of Biosensors and Biochips. Eds. Wiley, Chichester, 2007, v.2, ch.72, p.1111-1129]. Для клинической медицинской диагностики большой интерес представляют биочипы с иммобилизованными аффинными захватывающими агентами (антителами, антигенами, аптамерами).
Для иммобилизации захватывающих агентов используется субстрат с нанесенной на него подложкой. К подложке предъявляется ряд требований, выполнение которых необходимо для корректного выполнения иммунологических исследований. Подложка должна иметь высокую связывающую способность и способность сохранять функциональную активность антител, а также высокое соотношение сигнал-шум при последующем сканировании связанных материалов.
В качестве субстрата могут применяться стекло, силиконовые материалы, а также синтетические полимеры, такие как полистирол, нитроцеллюлоза, поливинилиденфторид. В качестве подложки используется широкий спектр материалов, способных образовывать со связываемыми белками химические связи; это могут быть гидрогель на основе декстрана, агароза, пористый акриламидный гидрогель, гидрофильные полимеры или полиаминокислоты, тонкие полоски металлов и т.п.
Известна подложка для биочипа, у которой область, предназначенная для иммобилизации антител, ограничена по периметру бортиком, который может быть выполнен съемным или отламывающимся [RU полезная модель №86091, МПК А61В 10/00, 2009]. Указанное устройство сокращает непроизводительный расход исследуемого материала и реактивов, но сложно в исполнении и не достигает оптимального соотношения сигнал-шум, так как не исключает перетекания антител через бортики и связывания их с субстратом подложки.
Также известна подложка для биочипа, имеющая, по крайней мере, один контрольный участок, «обеспечивающий прочность связывания клеток, заведомо, меньшую, чем прочность их специфического связывания в области любого из участков с иммобилизованными антителами, но заведомо большую, чем прочность неспецифического связывания клеток с подложкой» [RU полезная модель №86090, МПК А61В 10/00, 2009]. Полезная модель позволяет повысить точность анализа за счет контроля качества отмывки биочипа, однако это решение не влияет на соотношение сигнал-шум, свойственное используемой подложке
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемой является подложка для биочипа, представляющая собой стеклянную пластину с включенными в матрицу наночастицами благородных металлов, таких как Au, Ag, Pt [RU №2411180, МПК В82В 1/00, 2011]. Пластина выполнена из фотохромного или фототермореактивного стекла и содержит матрицу сквозных каналов, перпендикулярных поверхности или направленных под другим углом к ней, сформированных импульсно-периодическим лазерным излучением, причем торцы каналов, выходящие на рабочую поверхность подложки, имеют углубления, содержащие приповерхностный слой наночастиц металла толщиной 10-50 нм. Тем самым достигается повышение чувствительности биочипа и уменьшение искажения получаемой информации за счет «оптической изоляции потоков излучения, идущих из каждого пикселя матричного биочипа».
Указанная подложка сложна в изготовлении и требует прецизионного высокотехнологичного оборудования, как для изготовления, так и для нанесения енотов (пятен) исследуемого биологического материала.
Технический результат, достигаемый в заявляемой полезной модели, заключается в удешевлении подложки для биочипа и в упрощении проводимых с ее использованием исследований.
Указанный технический результат достигается тем, что подложка для биочипа на стеклянной основе с функциональным покрытием из неорганического материала в качестве неорганического покрытия содержит слой халькогенидного стекла толщиной не более 2 мкм
В качестве неорганического материала берут халькогениды, выбранные из группы, включающей сульфиды мышьяка, галлия и германия, сплавы сульфидов галлия и германия и селенид меди и индия.
В качестве стеклянной основы использовали покровные стекла для микроскопических исследований фирмы «Chemints», выполненные из боросиликатного стекла, обладающего гидролитической устойчивостью и высокой устойчивостью к химически агрессивным средам. Указанные стекла наиболее подходят для флуоресцентной микроскопии, так как падающие УФ лучи с длинной волны не менее 320 нм не вызывают автофлуоресценцию стекол.
Заявленная полезная модель испытана в лабораторных условиях в ФБГУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ, г.Санкт-Петербург, в режиме реального времени.
Халькогенидные соединения получали кристаллизацией соответствующих расплавов. Исходными веществами служили галлий, германий медь, индий, мышьяк, сера и селен чистоты выше 99.999%.
2
-3
Например, соединение CuInSe, получали кристаллизацией расплава меди, индия и селена. Взятые в стехиометрических соотношениях элементарные компоненты в количестве ~15 г загружали в кварцевые ампулы с оттянутым в виде конуса дном. Ампулы вакуумировали до остаточного давления ~10 Па и помещали в качающуюся печь. В начальный период температуру в печи повышали со скоростью ~50 К/ч до 1000-1020°К. При указанных температурах проводилась изотермическая выдержка в течение 2 ч. Затем с той же скоростью температуру повышали до 1220-1230°К и снова выдерживали 2 ч. После этого проводили направленную кристаллизацию расплава, понижая температуру печи со скоростью ~2 К/ч до полного затвердевания расплава. Для гомогенизации полученных слитков их отжигали при 1020°К в течение 150 ч. Выращенные образцы имели диаметр ~12 мм и длину ~20 мм. Образцы подвергались рентгеновскому исследованию. Полученные рентгенограммы сравнивали с литературными данными (база ASTM).
2
3
2
2
15
85
40
60
Аналогичным образом были получены и исследованы соединения: AsS, GeS, GaS и сплавы GaGeS и GaGeS.
Халькогенидное стекло (соединения или сплавы) наносили на стеклянную основу следующим образом.
Покровные стекла мыли мыльным раствором, после чего выдерживали в растворе перманганата калия в течение 15 мин, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.
-5
Напыление халькогенидного стекла производилось в вакуумной камере при базовом давлении 10 мм рт.ст. Образец халькогенидного стекла облучался XeCl эксимерным лазером, генерирующим 20 нс импульсы на длине волны 308 нм с энергией импульса 10-40 мДж. Лазерный луч фокусировали на мишени (образце халькогенидного стекла) под углом 45°. Поток формирующейся плазмы направляли на предметное стекло, где происходило формирование пленки.
Способность полученной подложки к адсорбции белка определяли с помощью зеленого флуоресцирующего белка. Печать проводилась на споттере SpotArray 24 при 50% влажности и температуре 25°C с использованием одной иглы SMP3 (Telechem, USA). Данная игла при установленных по умолчанию параметрах забирает 250 nl образца за один раз и наносит по 0.6 nl на каждый спот. После печати слайды были оставлены на 1 час при комнатной температуре.
Сканирование биочипов проводилось путем рассеивающего сканирования на длине волны 633 нм на сканере ScanArray Express (PerkinElmer, USA) с разрешением 10 µm и РМТ=70 по задаваемому протоколу сканирования.
Обработка получаемых изображений проводилась с использованием программного обеспечения ScanArray и QuantArray 3.0. Microanalysis SoftWare (Perkin Elmer, USA).
2
3
На Фиг. представлены результаты сканирования напечатанного на подложку состава AsS зеленого флуоресцирующего белка после отмывки (кипячение в воде в течении 10 мин). Ряды соответствуют концентрации белка:
1 - abGFP 0,01 mg/ml
2 - abGFP 0,1 mg/ml
3 - abGFP 1 mg/ml
На Фиг. видно, что белок превосходно адсорбировался даже при низких концентрациях.
Технико-экономическая эффективность заявленной полезной модели состоит в том, что наряду с высокой адсорбирующей способностью, преимуществом данной подложки является возможность избирательного травления поверхности, что позволяет формировать заданную геометрию распределения активного слоя на поверхности подложки. Это дает возможность использовать более простую аппаратуру для изготовления биочипа и считывания с него информации, а также увеличить соотношение сигнал/шум при сканировании. Новая полезная модель может стать эффективной основой для изготовления диагностических систем, доступных для широкого использования стандартно оснащенными лабораториями, в частности, биохимическими, иммунологическими, микробиологическими и др.