Изучение invitro-воздействия L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз изолированно и на фоне оксидативного стресса

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Фомина М.А., Кудлаева А.М., 2016 УДК 577.1+547.495.9+615.45-001.1/.3

ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO-ВОЗДЕЙСТВИЯ L-КАРНИТИНА НА ЛИЗОСОМАЛЬНЫЙ ЦИСТЕИНОВЫЙ ПРОТЕОЛИЗ ИЗОЛИРОВАННО И НА ФОНЕ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА

М.А.ФОМИНА, А.М. КУДЛАЕВА

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань

IN VITRO STUDIES OF L^ARN^INE ACTION ON LYSOSOMAL CYSTEINE PROTEOLYSIS ALONE AND IN OXIDATIVE STRESS

M.A. FOMINA, A.M. KUDLAEVA

Ryazan State Medical University, Ryazan

Изучены показатели активности лизосомальных цистеиновых протеиназ и стабильность лизосомальной мембраны. Выделенные лизосомы in vitro инкубировали в растворе L-карнитина изолированно, а также при стимуляции оксидативного стресса. В контрольных группах проводили in vitro-инкубацию в среде выделения и с добавлением оксиданта соответственно. Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектрофлуориметрическим методом по Barrett&Kirschke в двух фракциях - лизосомальной и внелизосомальной. В качестве основного маркера лабилизации мембран использовали активность кислой фосфатазы. Было обнаружено, что in vitro воздействие 5 мМ Н2О2 в течение 60 мин не вызывает изменений активности катепсинов В, L и Н и стабильности лизосомальной мембраны. L-Карнитин в концентрации 5 мМ при in vitro инкубации 60 мин вызывает снижение активности катепсина Н, повышение активности катепсина В и не влияет на активность катепсинаL, при этом стабилизирует лизосомальную мембрану как изолированно, так и на фоне оксидативного стресса. 5 м МL-карнитина повышает избирательную проницаемость мембраны для катепсина Н.

Ключевые слова: катепсины В, L, Н; L-карнитин, стабильность лизосомальной мембраны.

The parameters of the lysosomalcysteine proteinase activity and stability of lysosomal membrane were studied. Isolated lysosomes were incubated in vitro in a solution of L-carnitine alone, as well as in stimulation of oxidative stress. In vitro incubation in a medium of isolating solution and with addition of oxidant was carried out in the control groups respectively. The activity of cathepsins B, L and H was investigated by spectrofluo-rimetric method of Barrett &Kirschke in two fractions - lysosomal and outside of lyso-

somes. The activity of acid phosphatase used as the main marker of a membrane labiliza-tion. It has been found that in vitro action of 5 мМН2О2 60 min does not change the activity of cathepsins B,L and H and stability of lysosomal membrane, wherein L- earnitinein a concentration of 5 mM at 60 min in vitro incubation causes decrease in the activity of ca-thepsin H, increase in the activity of cathepsinBwithout affecting the activity of cathepsin L and also causes stabilization of lysosomal membrane both alone and in oxidative stress. Besides it was observed selective permeability of the membrane for cathepsin H after the action of 5 mML-earnitine.

Keywords: cathepsins B,Land H, L- carnitine, lysosomal membrane stability.

Лизосомальные цистеиновые про-теиназы (ЛЦП) относятся к семейству па-паиноподобных протеолитических ферментов, локализованных в основном в ли-зосомах и поздних эндосомах клетки. Поскольку они обладают сильным гидролитическим потенциалом и широким спектром действия, это опосредует их участие в ряде важных клеточных процессов. Среди них можно выделить участие в антиген-презентации, ремоделирование костной ткани, активация предшественников многих белков, дифференцирование кера-тиноцитови др. Нарушение секреции ка-тепсинов ведёт к таким заболеваниям как ревматоидный артрит и остеоартрит, атеросклероз, мышечная дистрофия, болезнь Альцгеймера. ЛЦП принимают участие в процессах, связанных с раковой прогрессией, таких как апоптоз, метастазирование, опухолевый рост, инвазия и ангиогенез. Повышение активности катепсинов В и L по сравнению с нормальной тканью наблюдается в цитозольной фракции многих опухолей человека: рака легкого, желуд-ка,прямой кишки, карциномы груди, мела-номы. У больных раком легких наблюдается повышение активности катепсина Н в опухолевой ткани [1, 5]. Активно изучается участие ЛЦП в процессах опосредуемой клеточной гибели. Так, во многих работах по моделированию апоптоза обнаружена ранняя утечка катепсинов В, Б и Ь в цито-золь, где они активируют каспазы 3 и 9, запуская данный процесс. Также имеются данные о каспазонезависимом пути клеточной гибели, сигналом которого служит пермеабилизация лизосомальной мембраны (ПЛМ). Наряду с достижением избира-

тельной проницаемости лизосомальной мембраны, одним из факторов выхода катепсинов в цитозоль является лабилизация мембраны, которую может вызвать окислительный стресс [2, 6].

В связи с этим актуальным является поиск соединений, обладающих антиок-сидантными свойствами и способными стабилизировать лизосомальную мембрану. В этом отношении особый интерес представляет L-карнитин. Так, в ряде исследований были обнаружены его антиок-сидантные эффекты [9, 10, 13]. Кроме того, L-карнитин в физиологических концентрациях способен повышать стабильность мембраны эритроцитов [8]. Также 5 м ML-карнитин оказывает защитное действие при апоптозе, что обусловлено ин-гибированием синтеза церамидов и активности каспаз 3,7 и 8[12]. Было показано, что на фоне гипергомоцистеинемии L-карнитин приводит к снижению активности катепсинов L и Н и оказывает стабилизирующее влияние на лизосомальные мембраны клеток сердечной мышцы [3]. Таким образом, актуальным является изучение влияния L-карнитина на лизосо-мальный цистеиновый протеолиз и состояние лизосомальной мембраны.

Целью нашего исследования явилось изучение прямого влияния L-карнитинана лизосомальный цистеиновый протеолиз in vitro, как изолированно, так и при стимуляции оксидативного стресса.

Материалы и методы

Выделение лизосом. За 12 часов до забоя животных лишали пищи для стандартизации условий опытов. Эвтаназия животных осуществлялась методом обес-

кровливания под эфирным рауш-наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении. Печень извлекали немедленно после обескровливания, помещая орган в охлажденный 0.25 М раствор сахарозы (среда выделения). Печень промывали от остатков крови средой выделения, после чего готовили точные навески участков печени в пределах 740-760 мг на электронных весах (AJH-220 CE, Япония). Полученный материал предварительно измельчали ножницами и помещали в стеклянный стакан гомогенизатора «Potter S» (Sartorius, Германия), добавляя холодный 0.25 М раствор сахарозы в соотношении 1:9 и гомогенизировали в течение 35 секунд тефлоновым пестиком 900 об/мин и зазоре в пределах 0.16-0.24 мм. Описанные процедуры проводили при температуре не выше 4 °С. Полученные гомогена-ты центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия) для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой в отдельные гильзы и центрифугировали 15 мин при 13000 об/мин для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант - дополнительно при 15500 об/мин в течение 30 мин (центрифуга рефрижераторная К 24 Д, ГДР). Осадок, представляющий собой грубую фракцию лизосом, ресуспендиро-вали в 2 мл 0.25 М сахарозы и использовали для in vitro исследования.

Инкубация. Полученные суспензии лизосом печени в 0.25 М сахарозе разделяли на серии по 6 проб в каждой:

Серия 1(серия сравнения): 2 мл 0.25 М сахароза.

Серия 2: 1,9 мл 0.25 М сахарозы с добавлением раствора 0.1 мл карнитина с конечной концентрацией 5 мМ.

Серия 3(серия сравнения): 2 мл раствора перекиси водорода в сахарозе с конечной концентрацией 5мМ.

Серия 4: 1,9 мл раствора перекиси водорода в сахарозе с конечной концентрацией 5мМ с добавлением раствора 0.1 мл карнитина с конечной концентрацией 5 мМ.

Пробы всех серий инкубировались в течение часа при t=37 градусов в водяной бане. После инкубации лизосомы повторно осаждали центрифугированием при 15500 об/мин в течение 30 мин. Затем отбирали надосадочную жидкость (неседименти-руемая фракция, НСФ), а осадок (седимен-тируемая фракция, СФ) ресуспендировали в 0.25 М сахарозе с добавлением Тритона Х-100 в конечной концентрации 0.1%. Полученные аликвоты замораживали и хранили до момента исследования при температуре -20 °С не более 1 месяца.

Определение активности лизосо-мальных цистеиновых протеиназ. Активность катепсинов В, L и Н изучалась спек-трофлуориметрическим методом (System 3 Scanning Spectrofluorometr, Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523) по Barrett & Kirschke [7]. Удельную активность катепсинов выражали в нмоль амидометилкумарина/сек.-г. белка. Содержание белка определяли по методу Лоури коммерческим набором НПЦ «Эко-сервис» (Санкт-Петербург). Описанное измерение активности ферментов осуществлялось раздельно для седиментируемой и неседи-ментируемой фракции и обозначалось для каждого катепсина как седиментируемая и неседиментируемая активность (СА и НСА) соответственно.

Оценка стабильности лизосомальной мембраны. Для оценки стабильности лизосомальной мембраны традиционно используется коэффициент лабильности (Клаб), рассчитываемый как соотношение активности лизосомального фермента во внелизосомальной (неседиментируемой) фракции к общей активности (ОА), представляющей собой сумму НСА и СА для данного фермента [4]. Поскольку для ли-зосомальных цистеиновых протеиназ описан механизм секреции [14], в качестве основного маркера лабилизации мембран использовали активность кислой фосфата-зы (КФ) [11]. Активность фермента измеряли унифицированным методом по «конечной точке», используя коммерческий набор «Витал Диагностикс СПб» (Санкт-Петербург).

Для каждой выборки определяли значение медианы и верхнего и нижнего квартилей. Результаты представляли в формате Me [Q1; Q3]. Для проверки статистической значимости отличий значений в контрольной и опытной группах использовали непараметрическийЦ-критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Обнаружено, что in vitro - провокация оксидативного стресса, моделируемая путем введения в среду инкубации 5 мМ Н2О2, не привела к статистически значимым изменениям изучаемых показателей.

Одновременно оказалось, что прямое воздействие карнитина в конечной концентрации 5 ммоль/л в течение 60 минут приводит к отчетливым изменениям как активности лизосомальных цистеино-вых протеиназ, так и стабильности лизо-сомальной мембраны.

Так, введение карнитина в среду инкубации приводило к статистически значимому росту общей активности катепси-на B (1,38 [1,26; 1,67] против 0,37 [0,21; 0,6])за счет роста активности в неседиме-нтируемой фракции (1,12 [0,91; 1,33] против 0,26 [0; 0,28]). На фоне введения в среду инкубации перекиси водорода на-блюдалосьзначительное снижение активности данного фермента в седиментируе-мой фракции (0,085 [0,07; 0,12] против 0,348 [0,24; 0,43]) и падение общей активности (0,919 [0,75; 1,18] против 1,38 [1,26; 1,67]). Также отмечалось повышение Клаб для катепсина В (87,38 [84,69; 90,52] против 74,87 [70,76; 78,00]).

При этом в отношении катепсина Н наблюдалась другая картина: прямое воздействие 5 мМ карнитина приводило к падению активности фермента в седимен-тируемой фракции относительно серии сравнения (0,17 [0,04; 0,23] против 1,31 [1,19; 1,82]) и снижению общей активности (1,13 [1,09; 1,29] против 2,26 [1,89; 2,33]). Также наблюдалось статистически значимое повышение значения Клаб относительно серии сравнения (86,24 [79,46; 97,45] против 37,35 [22,20; 37,38]). Анало-

гичные изменения наблюдались на фоне введения в среду инкубации 5 мМ Н2О2.

Для катепсинаL статистически значимых изменений активности выявлено не было.

В отношении кислой фосфатазы наблюдалось падение значения коэффициента лабильности лизосомальной мембраны (Клаб кислой фосфатазы) как для серии 2, так и для серии 4 относительно соответствующих серий сравнения (9,52 [7,18; 12,03] и 23,54 [16,23; 27,02] против 7,93 [5,31; 9,79] и 19,67 [18,66; 23,88] соответственно). Этот факт свидетельствует о стабилизации лизосомальной мембраны.

Можно предположить, что разнонаправленное действие карнитина на активность катепсинов B и Н и отсутствие статистически значимых изменений показателей в отношении катепсина L объясняется различиями в первичной структуре указанных протеиназ.

Выводы

1) In vitro воздействие 5 мМ Н2О2 в течение 60 мин не вызывает изменений активности катепсина В, L и Н и стабильности лизосомальной мембраны.

2) Карнитин в концентрации 5 мМ при in vitro инкубации 60 мин вызывает снижение активности катепсина Н, повышение активности катепсина В и не влияет на активность катепсина L.

3) 5 мМ карнитин in vitro стабилизирует лизосомальную мембрану как изолированно, так и на фоне оксидативного стресса. При этом увеличивается избирательная проницаемость мембраны для ка-тепсина Н.

Литература

1. Абаленихина Ю.В. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсина L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина, С.А. Исаков // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2013. - №1. - С.45-49.

2. Арапова А.И. Аутокаталитические эффекты лизосомальных цистеиновых протеиназ гладкой мышцы аорты крыс /

А.И. Арапова, М.А. Фомина // Наука молодых (Eruditio Juvenium). - 2015. - №4. -С. 27-33.

3. Ильичёва А.С. Влияние L-аргинина и карнитина на активность ка-тепсинов L и H и проницаемость лизосо-мальной мембраны в сердечной мышце при выраженной гипергомоцистеинемии / А.С. Ильичёва, М.А. Фомина // Казанский медицинский журнал. - 2015. - Вып. 5. -С. 819-824.

4. Покровский А.А. Лизосомы / А.А. Покровский, В.А. Тутельян. - М.: Наука, 1976. - 378 с.

5. Потеряева О.Н. Участие цистеи-новых протеиназ и их ингибиторов в развитии злокачественных опухолей (обзор литературы) / О.Н. Потеряева // Медицина и образование в Сибири. - 2009. - № 1. -Электрон. дан. - Режим доступа: http://ngmu.ru/cozo/mos/article/abauthors.ph p?id=327

6. Пупышев А.Б. Пермеабилизация лизосомных мембран как апоптогенный фактор / А.Б. Пупышев // Цитология. -2011. - Т. 53, №4. - С. 313-324.

7. Barrett A.J. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett, H. Kirschke // Methods in Enzymol. - 1981. - Vol. 80. -P. 535-561.

8. Effect of L-carnitine and acetyl-L-carnitine on the human erythrocyte membrane stability and deformability / Arduino Arduini [et al.] // Life Sciences. - 1990. -Vol. 47, Issue 26. - P. 2395-2400.

9. Effects of L-carnitine on high glucose-induced oxidative stress in retinal ganglion cells / Y. Cao [et al.] // Pharmacology. - 2014. - Vol. 94, № 3-4. - P. 123-130.

10. Effects of carnitine on oxidative stress response to intravenous iron administration to patients with CKD: impact of haptoglobin phenotype / Z. Armaly [et al.] // BMC Nephrology. - 2015. - Vol. 16. - P. 135.

11. Lysosomal Labilization / A. Ter-man [et al.] // IUBMB Life. - 2006. - Vol. 58, № 9. - P. 531-539.

12. Regulation of the activity of cas-pases by L-carnitine and palmitoylcarnitine / M.C. Mutomba [et al.] // FEBS Letters. -2000. - Vol. 478, № 1-2. - P. 19-25.

13. Ribas G.S. L-carnitine supplementation as a potential antioxidant therapy for inherited neurometabolic disorders / G.S. Ribas, C.R. Vargas, R.M. Wajne // Niger J Clin Pract. - 2014. - Vol. 533, № 2. - P. 469-476.

14. Secreted cathepsin L generates en-dostatin from collagen XVIII / U. Felbor [et al.] // EMBO J. - 2000. - Vol. 19, №6. -P. 1187-1194.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Фомина Мария Алексеевна - к.м.н., доц. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail:marya.fom@yandex.ru

Кудлаева Анна Михайловна - ассист. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: anyakudlaeva@mail.ru