СПОСОБ ПРОГНОЗА ИСХОДА СКВОЗНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКИ
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL OUTCOME OF PENETRATING KERATOPLASTY

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в практической медицине для прогноза приживления роговичного трансплантата и профилактики развития осложнений - отторжения и гибели трансплантата.
Прототипом изобретения является способ прогнозирования отторжения роговичного трансплантата после кератопластики по поводу ожоговых бельм, заключающийся в том, что определяют в сыворотке крови и/или слезной жидкости содержание интерлейкина-1-бета (ИЛ-1β) и при его обнаружении в пред- или раннем послеоперационном периоде прогнозируют отторжение трансплантата, причем ИЛ-1β определяют с помощью иммуноферментного анализа (патент RU 2210774, 2003 г.).
Недостатком данного способа является невысокая точность прогноза, возможность использования при одном виде патологии - у больных, перенесших кератопластику по поводу ожоговых бельм.
Техническим результатом изобретения является повышение точности прогноза приживляемости роговичного трансплантата у пациентов с буллезной кератопатией, посттравматическими бельмами и помутнениями роговицы после перенесенных воспалительных процессов за счет определения достоверных численных критериев прогноза.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования приживления роговичного трансплантата, включающем определение в слезной жидкости содержание интерлейкина-1-бета (ИЛ-1β) в дооперационный период методом иммуноферментного анализа, согласно изобретению дополнительно определяют содержание ИЛ-10 в слезной жидкости, после чего определяют соотношение уровня ИЛ-1β к уровню ИЛ-10 и при его значении в пределах 0,15-0,20 прогнозируют благоприятный исход кератопластики с прозрачным приживлением донорской роговицы, при его значении 0,35 и выше - неблагоприятный результат, с последующим помутнением роговичного трансплантата.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Слезную жидкость забирают микропипеткой из нижнего свода конъюнктивы в количестве 1 мл. Определение уровня провоспалительного ИЛ-1β и противовоспалительного ИЛ-10 в слезной жидкости больных проводят твердофазным «сэндвич» вариантом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «ИЛ-1β (ИЛ-10) ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Новосибирск).
В микропланшет с иммобилизованными антителами вносят по 100 мкл раствора для разведения сывороток. В один ряд вносят по 100 мкл стандартов ИЛ-1β (соответственно ИЛ-10), в остальные - по 100 мкл исследуемых образцов слезной жидкости. Планшет инкубируют 2 часа при +37°С при непрерывном встряхивании, затем 5 раз промывают буфером. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.
В каждую ячейку микропланшета вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №1. Планшет инкубируют в течение 1 часа при +37°С при непрерывном встряхивании. Затем жидкость из ячеек удаляют и стрипы 5 раз промывают буфером. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.
В каждую лунку стрипов вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №2. Планшет инкубируют в течение 30 мин при +37°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляют и 5 раз промывают буфером. Полностью удаляют влагу из стрипов путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Общее время постановки исследования - 4,5 часа.
У 20 больных с патологией роговицы было изучено содержание цитокинов: провоспалительного ИЛ-1β и противоспалительного ИЛ-10 в слезной жидкости в дооперационный период. Слезную жидкость забирали микропипеткой из нижнего свода конъюнктивы в количестве 1 мл.
В микропланшет с иммобилизованными антителами вносили по 100 мкл раствора для разведения сывороток. В один ряд вносили по 100 мкл стандартов ИЛ-1β (ИЛ-10), в остальные - по 100 мкл исследуемых образцов слезной жидкости. Планшет инкубировали 2 часа при +37°С при непрерывном встряхивании, затем 5 раз промывали буфером. Проводили полную аспирацию оставшейся жидкости.
В каждую ячейку микропланшета вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №1. Планшет инкубировали в течение 1 часа при +37°С при непрерывном встряхивании. Затем жидкость из ячеек удаляли и стрипы 5 раз промывали буфером. Планшет сушили путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.
В каждую лунку стрипов вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №2. Планшет инкубировали в течение 30 мин при +37°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляли и 5 раз промывали буфером. Полностью удаляли влагу из стрипов путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.
Во все лунки планшета вносили по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку.
Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пг/мл.
У 8 (40%) из 20 больных содержание ИЛ-1β в слезной жидкости в дооперационном периоде в среднем составляло 24,15 пг/мл, IL-10- 120,9 пг/мл, соотношение ИЛ-1β ИЛ-10 составило 0,19.
В 7 случаях (35%) было отмечено благоприятное течение послеоперационного периода и прозрачное приживление роговичного трансплантата. У 1 пациента (5%) отмечалась умеренно выраженная воспалительная реакция и снижение прозрачности роговичного трансплантата.
У 6 (30%) больных послеоперационный период характеризовался как неблагоприятный, т.к. отмечено мутное приживление роговичного трансплантата с выраженной воспалительной реакцией. Содержание ИЛ-1β в слезной жидкости составляло в среднем 10,8 пг/мл, ИЛ-10 - 28,7 пг/мл, соотношение ИЛ-1β/ИЛ-10 - 0,38.
У 6 (30%) больных были следующие результаты: 4 случая (20%) полупрозрачное состояние трансплантата роговицы, 2 случая прозрачного приживления трансплантата роговицы.
Таким образом, предлагаемый способ прогноза сквозной кератопластики являлся правильным у 16 из 20 больных, что было достоверно в 80% случаев.
Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Больной Л. находился на стационарном лечении с диагнозом: левый глаз - посттравматическое помутнение роговицы, неполная осложненная катаракта; правый глаз - здоров. Определение интерлейкинов в слезной жидкости проводилось по вышеописанной методике. При поступлении (в дооперационный период) содержание ИЛ-1β в слезной жидкости составляло 9,2 пг/мл, ИЛ-10 - 62 пг/мл, соотношение ИЛ-1β/ИЛ-10 до операции составило 0,15, на основании чего прогнозировали благоприятный исход кератопластики. Действительно, в динамике исследования было отмечено стабильное прозрачное состояние роговичного трансплантата, что подтвердило сделанный нами прогноз.
Пример 2. Больной И. находился на стационарном лечении с диагнозом: левый глаз - центральное бельмо роговицы, краевая неоваскуляризация (исход вирусного кератита), осложненная катаракта; правый глаз - неполная осложненная катаракта. Перед проведением кератопластики содержание ИЛ-1β в слезной жидкости составляло 13,3 пг/мл, ИЛ-10 - 39,9 пг/мл, соотношение ИЛ-1β/ИЛ-10 до операции составило 0,33. Перед операцией мы предположили, что в послеоперационном периоде может развиться болезнь трансплантата и его помутнение. В последующем после проведения сквозной кератопластики через 2 недели начал развиваться отек роговичного трансплантата и, несмотря на увеличение доз противовоспалительных препаратов, было отмечено помутнение роговичного трансплантата через 3 месяца после операции.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет в дооперационный период на основании соотношения уровней ИЛ-1β и ИЛ-10 в слезной жидкости осуществить точный прогноз благоприятного или неблагоприятного результата сквозной кератопластики.