Влияние гормонов на реакцию фенотипирования лимфоцитов периферической крови людей, проживающих на Севере

первые часы после заражения эфирные масла бактерицидно действуют на капсульные бактерии и предотвращают развитие септицемии, что способствует резкому повышению выживаемости животных. Таким образом, масло монарды и лаванды оказывает выраженное бактерицидное действие не только in vitro но и in vivo. Необходимо отметить, что масло монарды оказывает более значительный терапевтический эффект.

Литература

1. Бескоровайная О. И. Лекарственные травы в медицине/О.И. Бескоровайная, И.И. Трещенко. Х.: Факт,2002. 479с.

2. Сейдахметова Р.Б. Противовоспалительные свойства эфирного масла ARTEMISIA GLABELLA KAR. ET RIR./ Р.Б. Сейдахметова, Р.Н. Пак, А.А.Бейсенбаева, К.Д. Рахимов // Растительные ресурсы. 2002. Т.38. Вып.1. С. 102.

3. Пак Р.Н. Ранозаживляющие свойства эфирного масла ARTEMISIA GLABELLA KAR. ET KIR./ Р.Н. Пак, А.А. Бейсеба-ева, Р.Б.Сейдахметова // Растительные ресурсы. 2004. Т.38. Вып.2. С. 101-106.

4. Казаринова Н.В. Компонентный состав и антибиотическая активность эфирного масла ORIGANUM VULGARE и,произростающей в некоторрых регионах Западной Сиби-ри/Н.В. Казаринова, К.Г. Ткаченко, Л.М. Музыченко // Растительные ресурсы. 2002. Т. 38. Вып.2. С. 99-103.

5. Богуцкий Б.В. Влияние эфирного масла монарды на мик-роорганизмы/Б.В. Богуцкий и др.//Фитонциды: Матер. УШ со-вещ. К.: Наукова думка, 1981. С. 252-254.

6. Харченко Г.И. Стратегия и тактика антибиотикотера-пии/Г.И. Харченко. Краснодар, 1966. С. 67-69.

7. Тютюнник В.И. Антимикробное действие эфирных масел, выделенных из растений / В.И. Тютюнник, Н.Г. Пономарева, Ю.С. Кривошеин // Выращивание и переработка эфиромасличных культур. Симферополь. 1980. С. 63-67.

8. Тринус Ф.П. Фармакологическая регуляция воспаления // Тринус Ф.П. и др. К.: Здоровье, 1987. 142с.

УДК [577.17:612.017.1:612.112.94:575.21]

ВЛИЯНИЕ ГОРМОНОВ НА РЕАКЦИЮ ФЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛЮДЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА СЕВЕРЕ

А. В. ПОЛЕТАЕВА, Л. К. ДОБРОДЕЕВА*

Анализируется влияние кортизола, тироксина, прогестерона и окси-тоцина in vitro на рецепторную активность лимфоцитов периферической крови практически здоровых людей. Доказано дифференцированное действие этих гормонов на активность сигнальных молекул.

Ключевые слова: иммунитет, гормоны, лимфоциты, рецепторы

Начиная с 80 годов, постепенно накапливаются сведения о молекулярной общности регуляторных систем функциями сигнальных молекул [1,2,3]. Так OD38 определяет незрелость клетки [4,5]. OD45 является общим маркером для всех лейкоцитов, OD123 определяют как общий антиген плазматических клеток. OD3, OD8, OD16 придают клетке возможность цитотоксического действия [6,7,8,9], OD19, CD20, CD21, CD23, CD24 обусловливают секреторную её функцию [10]. Антигены HLADR дают возможность клетке дифференцировать свое и чужое [11], 0D80, OD86 обеспечивают презентацию антигена, OD2 и OD58, по существу, являются молекулами адгезии, а CD95 (Fas -антиген) предопределяет программируемую гибель [12,13,14].

Таким образом, сигнальные молекулы вовлечены в процессы поддержания целостности тканей их клеточного обновления и локальных механизмов контроля межклеточных взаимодействий. Это предполагает, что сигнальные молекулы, в том числе и кластеры дифференциации, участвуют в этапах эмбриогенеза, влияют на процессы пролиферации, направляют специализацию и дифференцировку клеток, определяют фенотипическую изменчивость её. С другой стороны, экспрессия сигнальных молекул зависит от микроокружения, в том числе иммуноглобулинов, цитокинов, катехоламинов и гормонов. Представляет интерес изучить влияние гормонов на процесс клеточного фенотипирова-ния в условиях in vitro.

Цель исследования — выяснение иммуномодулирующего-действия некоторых гормонов на активность сигнальных молекул

Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, 163061 г. Архангельск, пр. Ломоносова, 249 тел. (8182)210242

в процессе фенотипирования лимфоцитов методом непрямой иммунопероксидазной реакции.

Материал и методы. Исследование проводилось с ноября 2007 по февраль 2009 гг. Обследовано 250 практически здоровых лиц трудоспособного возраста 40-57 лет, родившихся и проживающих на Севере. В периферической крови изучали содержание фенотипов способом иммунопероксидазной реакции с моноклональными сыворотками (г. Москва, «МедБиоСпектр»). Изучали следующие фенотипы лимфоцитов, отражающих процессы пролиферации (СЭ10+), активизации (СЭ25+, СЭ38+, СЭ71+, ^А DR+), дифференцировки (СЭ4+, СЭ8+, СЭ16+), апоптоза

(СЭ95+), антителообразования (CD22+) и экспрессии низкоаффинного рецептора к І§ Е (СD23+). В процессе фенотипирования лимфоцитов параллельно с обычной схемой постановки иммуно-пероксидазной реакции проводили реакцию с предварительной обработкой клеточной взвеси гормоном. Кроме того, использовали 2 дополнительные схемы контроля с добавлением гормона в реактивную клеточную взвесь после моноклональных антител и индикаторной ферментной системы, а в условиях реакции без моноклональных антител, но в присутствии индикаторной смеси.

Длительность контакта моноклональных антител с лимфоцитами и продолжительность иммунопероксидазной реакции были одинаковыми при фенотипировании лимфоцитов в обычных условиях и при контакте с гормонами. В работе использованы дипроспан, L-тироксин, актрапид НМ-инсулин растворимый (человеческий генно-инженерный), прогестерон, окситоцин. Гормоны вводили в реактивную взвесь в объеме 0,03 мл в дозах, соответствующих верхним границам их содержания в плазме крови человека (диспропан - 760 нмоль/л, L-тироксин - 160 нмоль/л, прогестерон - 78 нмоль/л, окситоцин - 1мкЕД/мл).

Статистическая обработку полученных результатов, оценку распределения показателей, определение границ нормального распределения проводили с помощью компьютерного пакета прикладных программ 8Р88 13.0. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался за 0,05.

В большинстве выборок выявлено нормальное распределение. Поэтому статобработка велась параметрическими методами. Учитывались средние значения (М) и стандартные ошибки (т). Для проверки статистической гипотезы разности средних значений использовали 1-критерий для независимых выборок.

Результаты. Введение в реактивную взвесь испытуемых гормонов статистически достоверно снижает уровень выявления экспрессированных кластеров дифференциации лимфоцитов на 25-50 % вне зависимости от варианта использованного гормона (рис.1,2,3,4,5); уровень депрессивного влияния определялся фенотипом. Так содержание CD3+ снижается с 0,79±0,06 до 0,40±0,04х109 кл/л; подобная закономерность наблюдается относительно CD5+ (0,81±0,09 и 0,43±0,06х109 кл/л), CD10+ (0,55±0,06 и 0,30±0,03х109 кл/л), CD4+ (0,73±0,06 и 0,40±0,04х109 кл/л), СD8+ (0,47±0,03 и 0,24±0,02х109 кл/л), CD16+ (0,37±0,03 и 0,20±0,02х109 кл/л), CD22+ (0,26±0,02 и 0,17±0,03х109 кл/л), CD25+ (0,28±0,03 и 0,18±0,02х109 кл/л), CD71+ (0,27±0,02 и 0,13±0,01х109 кл/л), ^А DR+ (0,38±0,04 до 0,20±0,02х109 кл/л), CD95+ (0,47±0,04 до 0,25±0,02х109 кл/л).

Рис.1. Влияние кортизола на активность сигнальных молекул. Примечание: І I — контрольная группа, - опыт; * - р<0,05;

** - р<0,01; *** - р<0,001

В основе взаимодействия антиген-антитело лежат те же законы термодинамики, что и в основе любой обратимой биомолеку-лярной реакции связывания. В заданных условиях отношение

концентрации комплекса к концентрациям реагентов в состоянии равновесия будет всегда постоянным. При изменении концентрации одного из реагентов (антитела, лиганда и т.д.) будет соответственно меняться концентрация комплекса при условии, что ни один из реагентов не лимитирован, т.е. их концентрация не достигла ещё насыщения и имеется достаточно времени для достижения равновесия. При увеличении концентрации антител или антигена, концентрация комплекса антиген-антитело увеличится во столько же раз. Поскольку в закон действующих масс входят концентрации, а не количества каждого из реагентов, то при переносе реагентов в меньший объем, количество комплекса увеличивается пропорционально кратности уменьшения, а при увеличении объема идет снижение количества комплекса [15,16].

10 100 ** ! |

о ©о

СИ> О«* CD

С D9» С i 10» С

D2> : кз* с с вз&» сон» к L*. си

Рис. 2. Влияние прогестерона на активно^^сигнальных молекул. Примечание: І I — контрольная группа, - опыт; * - р<0,05; *

р<0,01; *** - р<0,001 (достоверность различий).

Рис. 3. Влияние окситоцина на активно^^сигнальных молекул. Примечание: I I — контрольная группа, - опыт; * - р<0,05; ** -

р<0,01; *** - р<0,001 (достоверность различий).

Рис. 4. Влияние тироксина на активно^^сигнальных молекул.

Примечание: I I — контрольная группа, - опыт; * - р<0,05; ** -

р<0,01; *** - р<0,001 (достоверность различий).

Существует несколько причин (условий) торможения реакции антиген-антитело. Соединение между антителом и антигеном можно затормозить путем предварительной обработки малыми молекулами с такими же детерминантными группами, как и у антигена. В этом случае малые молекулы соединяются с антителами. К таким веществам можно отнести тетрапептиды, трисахара, вещества, содержащие ионизированные группы. Торможение может быть конкурентным, когда два различных антигена могут связываться с одним и тем же паратопом, два типа комплексов будут образовываться с тем единственным отличием, что две реакции имеют общий пул свободных паратопов. Стандартные конкурентные измерения предполагают избыток одного компонента, концентрация ингибитора является независимой переменной, при этом существуют две константы равновесия. Отношение обеих констант равнове-

сия всегда может быть определено по долям связывания независимо от концентрации свободных эпитопов [17].

Ингибитор может мешать образованию комплекса антиген-антитело, занимая паратоп (конкурентное торможение) или лишая его способности к связыванию вследствие аллостерического изменения (неконкурентное торможение) или же ни тем, ни другим способом, а просто оказываясь на пути взаимодействия. Такое стерическое ингибирование впервые было обнаружено при нейтрализации ферментов антителами, и в той же работе была представлена математическая модель этого явления. Оно может возникать, по-видимому, всякий раз, когда независимые реакции недостаточно разделены в пространстве, например, когда антитела нескольких специфичностей одновременно реагируют с мозаикой эпитопов, скажем, на клетке. Снижение функциональной аффинности возможно также из-за изменения конформации антигена [18].

В данной части работы не ставилась задача выяснения природы выявленной ингибиции диагностической реакции; основной интерес составляло выяснение специфичности влияния на указанный процесс используемых в работе гормонов. Установлено среди общего ингибирующего действия специфическое для каждого гормона влияние на иммунопероксидазную реакцию, заключающееся в отсутствии ингибиции соединения сигнальной молекулы (антигена) и моноклонального диагностического антитела (рис.14). Так синтетический аналог кортизола диспропан, которым обработали клетки до введения в реакцию диагностических моноклональных антител, не подавляет активность выявления антигенов HLADR (0,45±0,03 и 0,41±0,03х109кл/л).

Прогестерон, не оказывает действия на индикацию CD23+ (0,37±0,05 и 0,39±0,04х109 кл/л) и CD38+ (0,71±0,10 и 0,73±0,10х109 кл/л, рис.2). Известно, что CD23 обусловливает секреторную функцию клетки. Поскольку CD23 является рецептором для Ig E, а IL 4 стимулирует синтез иммуноглобулинов этого класса, то можно полагать, что прогестерон может инициировать. CD38 - мультифункциональный мембранный поверхностный гликопротеин, который экспрессируется различными клетками, включая Т- и В-лимфоциты на определенных этапах их развития и отражает активизацию незрелых лимфоцитов.

Окситоцин не влияет на концентрацию клеток с рецептором к IgE (0,30±0,02 и 0,37±0,02х109 кл/л, рис.3). Под влиянием окситоцина усиливается проницаемость клеточной мембраны для калия со снижением потенциала клетки и повышением её возбудимости. Соединение CD23 и IgE резко повышает проницаемость клеточной мембраны с высвобождением биологически активных веществ. Под влиянием окситоцина увеличивается проницаемость поверхностной мембраны клеток для ионов калия, снижается потенциал покоя и повышается их возбудимость.

В условиях in vitro тироксин повышает активность антите-лообразования. В наших исследованиях L-тироксин статистически достоверно не изменяет содержание CD22+ (0,44±0,03 и

0,50±0,03х109 кл/л, рис. 4). Учитывая, что CD22 экспрессируется В-клетками, является молекулой адгезии и может усиливать активационный сигнал В-лимфоцитов, то результаты этого исследования подтверждают известные факты иммуностимулирующего влияния тироксина на антителообразование.

Специфичность влияния гормонов на диагностическую реакцию антиген-антитело показана статистической значимостью разницы результатов в контролях и опытном варианте постановки диагностической реакции (p<0,01-0,001). Полученные результаты дают основание признать правомочность специфического взаимодействия гормона и его рецептора на клетке. Из этого следует, что на фенотипах HLA DR существуют рецепторы к кортизолу, на CD23+ - рецепторы к окситоцину, на CD23+ и CD38+ - рецепторы к прогестерону, на CD22+ - рецепторы к тироксину. Поскольку подобное специфическое влияние не установлено после моноклональной диагностической сыворотки надо признать, что взаимодействие гормона и рецептора обусловливает усиление активности взаимодействия молекулы кластера дифференциации и моноклонального антитела. Учитывая возможные варианты такого влияния, можно сделать предположение, что взаимодействие рецепторов клетки и гормона изменяют конфигурацию молекул дифференциации, обеспечивая более эффективное взаимодействие антигена и антитела в условиях конкурентной ингибиции реакции под влиянием дополнительного ингредиента, не предусмотренного технологией фенотипирования клеток моноклональными антителами.

Работа поддержана грантом Учреждения Российской академии наук научных проектов молодых ученых и аспирантов УрО РАН от 15 января 2009 г. № 1-6.

Литература

1. Wigzell H. Binz H. Lymphocyte receptors. Academic Press. 1980. 94 p.

2. A. Bevan, Burns G.F., Gray L. // J. Immunol. 1980, №11. P. 223-231.

3. U. Galili, Polliak A., Okon E. // J. Exp. Med. 1980, Vol.152. P. 796-812.

4. AlessioМ., S. Roggero, A. Funaro, L. B. De Monte, L.Peruzzi, M. Geuna, F. Malavasi // J. lmmunol. 1990. Vol. 145, N3. P.878-884.

5. Lund F.E., D. A. Cockayne, T. D. Randall, N. Solvason, F. Schuber, M. C., Howard // Immunol. Rev. 1998. №161. P. 79-93.

6. Control of effector CD8+ T cell function by transcription factor Eomesodermin / Pearce Erica L., Mullen Alan C. // Science. 2003, № 5647. P. 1041-1043.

7. Ma Ge, Zhu Li-ping, Zhang, Wei // Zhongguo yixue kexue-yuan xuebao //Acta Acad. Med. Sin. 2002. Vol. 24, №4. С. 439-442.

8. Inoue K., Wakao H., Ogonuki N. et al. // Curr. Biol. Vol.15.

2005. P. 1114-1118.

9. Р. М. Хаитов, Манько В. М., Ярилин А. А. // Успехи современной биологии. 2005. Т.125, № 5. С. 435-445.

10. И. С. Гущин Физиология иммуноглобулина Е (IgE) // Аллергология и иммунология. 2000. Т. 1, №1. С. 76-87.

11. М. Н. Болдырева, Л. П. Алексеев, Р. М. Хаитов // Иммунология. 2005. № 5. С. 260- 263.

12. А. А. Ярилин Апоптоз, роль в патологии, значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных / Ярилин А.А., Никонова М.Ф., Ярилина А.А. // Медицинская иммунология. 2000. Т.2. С. 7-16 .

13. Krueger Anderas / Krueger Anderas, Fas Stefanie C., Baumann Sven, Krammer Peter H. // Immunol. 2004. Vol. 173, №4. Р. 2542-2551.

14. Р.М. Хаитов Внутриклеточные сигнальные пути, активирующие или ингибирующие функции клеток иммунной системы. Внутриклеточные сигнальные пути при апоптозе / Хаитов Р. М., Манько В. М., Ярилин А. А. // Успехи современной биологии.

2006. Том 126, №1. С. 3-9.

15. Kochler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cell cekret-ing antibody predefined specifity. Natur. 1975. С. 495-497.

16. Bervzovski J.A. Properties of monoclonal antibodies specific fo determinants of a protein antigen, vyoglobin / Bervzovski J.A., HicksG., Minna J. // J.Biol. Chem. 1980, Vol.255. Р. 11188-11192.

17. P.G. Munson LIGAND: A versatile computerized approach of characterization of ligand-binding siytems / Munson P.G.,Rodbard D. // Anal. Biochem. 1980, Vol.107. P. 220-239.

18. A.K. Thakur Characterization of ligand-binding systems by continuous affinity istribusions of arbitrary shap. / Thakur A.K., Munson P.G.,Hungston D.L. Robard D. // Anal. Biochem. 1980, Vol.103. P. 240-254.

THE HORMONES INFLUENCE ON THE PERIPHERIC REACTION OF LYMPHOCYTES PHENOTYPING OF BLOOD IN PEOPLE LIVING IN THE NORTH

A. POLETAEVA, L. DOBRODEEVA Summary

The influence of corisol, thyroxin, progesterone, oxytocin in vitro to the receptor activity of lymphocyte of peripheral blood in the people, which are practically healthy, has been analyzed in this work. It is proved a varied effect of hormones under investigation to the activity of the signal molecules.

Key words: immunity, hormones, lymphocyte, receptor

УДК 577.352.3

ПАТОБИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ ХЛОРИДА НИКЕЛЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У КРЫС

Ф.С. ДЗУГКОЕВА, Е.А. ТАКОЕВА*

Ключевые слова: хлорид никеля, токсическое влияние

Цель исследования - изучение водо- и электролитовыделительной функции почек, активности Ка,К,АТФ-азы почечной ткани и сопряженных систем СРО в эритроцитах и почечной ткани, а также состояние АОС клеток, на фоне хронической интоксикации солями никеля в эксперименте у крыс.

Материалы и методы. Были проведены эксперименты на 60 белых крысах самцах линии Вистар одной возрастной группы, массой 180-210гр. Хроническую интоксикацию вызывали путем введения животным раствора хлорида никеля подкожно в дозе 0,3 мг/кг и 0,8 мг/кг веса животного в течение 1 месяца.

Исследовали основные процессы мочеобразования: клубочковую фильтрацию по клиренсу эндогенного Cr, рассчитывали канальцевую Rh2o, используя формулы Ю.В. Наточина (1974г.). Для анализа электролито-выделительной функции почек, определяли экскрецию Na и К с мочой, Фз ионов и рассчитывали канальцевую RNa в %. Для выяснения патогенетического механизма нарушений исследовали интенсивность перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов и в гомогенатах коркового и мозгового слоев почечной ткани по данным изменения концентрации малонового диальдегида по методу Osak^wa T., (1980). О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности ката-лазы в сыворотке крови, которую определяли методом М.А. Королюка и соавт., (1988) и СОД по методу аутоокисления адреналина. Изучали активность Na,K,АТФ-азы в корковом и мозговом слоях почечной ткани методом (Scou ТС, 1957). Весь полученный материал подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента на ПК типа IBM РС с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты. Анализ данных, вызванных подкожным введением 0,3 мг/кг и 0,8 мг/кг хлоридом никеля крысам линии «wistar» в течение 1 месяца, показали, что величина спонтанного диуреза достоверно снижается, что обусловлено угнетением клубочковой фильтрации при одновременном снижении канальцевой реабсорбции воды.

Таблица 1

Показатели водо- и электролитовыделительной функции почек на фоне интоксикации хлоридом никеля.

Изучаемый параметр Контроль 0,3 мг/кг NiCl, 1 мес 0,8 мг/кг NiCl, 1 мес

диурез 0,085±0,003 0,07±0,002 0,06±0,001

12,18±0,42 11,10±0,29 9,296±0,11

RH2O 99,41±0,038 99,37±0,024 99,35±0,015

9,38±0,26 10,16±0,18 10,74±0,18

F3Na 1658,16±52,93 1463,38±41,77 1305,37±24,13

99,49±0,07 99,30±0,023 99,17±0,026

Ek 6,32±0,36 7,09±0,14 7,75±0,12

F3k 53,85±1,47 47,14± 1,27 80,31±1,82

Наряду с водо-выделительной функцией почек нарушается и электролито-выделительная функция. Полученные данные свидетельствуют о достоверном повышении экскреции натрия и калия с мочой. Для выяснения механизма повышенной экскреции натрия нами рассчитывалась величина фильтрационного заряда натрия и относительная канальцевая реабсорбция данного катиона. Данные показали, что повышение экскреции натрия обусловлено снижением канальцевой реабсорбции иона, (р<0,01) на фоне достоверного снижения фильтрационного заряда, а повышение экскреции калия обусловлено повышением фильтрационного заряда на фоне интоксикации в дозе 0,8 мг/кг. Анализ содержания натрия и калия в плазме крови выявил, что происходит достоверное снижение концентрации натрия (р<0,001), и повышение содержания калия.

Поскольку одним из механизмов, по [1,4], повреждающим структуры нефрона, является ПОЛ, нами проводились исследования липопероксидации в эритроцитах универсальных аналогах тканевых клеток. Полученные данные свидетельствуют об активации процессов СРО по данным концентрации МДА как в эритроцитах (4,54±0,16 - 5,69±0,06), так и в корковом и мозговом веществах почечной ткани у крыс на фоне обеих дозировок хлорида никеля. Происходило достоверное повышение концентрации МДА в эритроцитах и слоях почечной ткани (р<0,001) (рис.1).

* г. Владикавказ,_ул. Пушкинская, 40, СОГМА, каф. Биохимии тел. (8672) 539349,(918)8237623 E-mail: elena_takoeva@mail.ru

Рис.1. Концентрация МДА в слоях почечной ткани на фоне экспозиции хлоридом никеля