СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРИ МИЕЛОСУПРЕССИИ
METHOD FOR PREPARING CELL TRANSPLANTATION MATERIAL IN MYELOSUPPRESSION

Изобретение относится к медицине, конкретно, к экспериментальной гематологии и клеточным технологиям, и касается способа получения клеточного материала для трансплантации.
Одним из самых распространенных способов получения клеточного материала, содержащего стволовые клетки (СК), для трансплантации при экспериментальной терапии различных заболеваний [1], а также для клинического использования в онкологии (при лечении осложнений, связанных с нарушением кроветворения при проведении химио- и лучевой терапии), является способ получения фракции мононуклеаров периферической крови после назначения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) [2, 3, 4].
Данный способ является наиболее близким к заявляемому по механизму действия и техническому результату и выбран в качестве прототипа.
Недостатком способа является недостаточная терапевтическая активность получаемого клеточного материала.
Задачей, решаемой данным изобретением, является увеличение терапевтической активности получаемого клеточного материала.
-8
Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ получения клеточного материала для терапии миелосупрессий, заключающийся в получении фракции мононуклеаров периферической крови после подкожного введения препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут в течение 3 дней и внутрибрюшинного введения препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут в течение 2 дней, с последующей инкубацией фракции мононуклеаров в сбалансированной питательной среде, содержащей 10 моль/мл D-глюкуроновой кислоты, в течение 2 часов.
Новым в предлагаемом изобретении является дополнительное введение гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут в течение 2 дней и инкубация фракции мононуклеаров в среде, содержащей 5 мкг/мл D-глюкуроновой кислоты, в течение 2 часов.
В настоящее время весьма перспективными для лечения различных заболеваний выглядят способы клеточной терапии [1]. В онкологической практике при получении трансплантанта, для лечения гематологических осложнений после проведения лучевой - и химиотерапии широко используют способ-прототип - получение фракции мононуклеаров периферической крови, обогащенной прогенеторными элементами за счет способности Г-КСФ вызывать выход СК, в том числе гемопоэтических, в циркуляцию [2, 3, 4].
Известна возможность увеличения доли содержания прогениторных элементов в клеточном материале из периферической крови, получаемом с помощью Г-КСФ, путем дополнительного назначения гиалуронидазы [5] - фермента, участвующего в метаболизме гиалуроновой кислоты (ГК). Однако, согласно данных литературы [6], а также собственных наблюдений применение данного фермента приводит к нарушению способности прогениторных клеток, полученных из периферической крови доноров, к их энграфтингу («оседанию» и «приживлению»). Данный феномен, очевидно, связан с тем, что ГК является не только одним из основных компонентов межклеточного матрикса тканей организма, в том числе и гемопоэтической ткани [7, 8], но и входит в состав гликокаликса клеток, их рецепторов к биологически активным веществам [7, 9], а также содержится во внуткиклеточных структурах (цитоплазме, ядре, ядрышках) [7]. Указанные обстоятельства определяют модифицирующее влияние данного фермента на структуру клеточной стенки, в том числе прогениторных элементов, уровни экспрессии рецепторов, а также активности их взаимодействия с лигандами, что в целом нарушает реализацию ростового потенциала СК материала, обработанного гиалуронидазой, при его трансплантации. В то же время известно, что одним из составных компонентов мономера ГК является D-глюкуроновая кислота, а также высокая скорость метаболизма данного гликозаминогликана [7]. В частности, период полураспада ГК в сыворотки крови составляет 2-5 минут [7]. Тем не менее, на сегодняшний день не известна возможность восстановления функциональной полноценности прогениторных клеток, подверженных воздействию гиалуронидазы, путем их инкубации перед трансплантацией в среде, содержащей D-глюкуроновую кислоту.
Факт дополнительного использования гиалуронидазы с дальнейшей инкубацией клеточного материала в среде, содержащей D-глюкуроновую кислоту, с целью повышения терапевтической активности получаемого трансплантанта для терапии миелосупрессии для специалиста не является очевидным и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют повысить терапевтическую активность трансплантанта. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных способов клеточной терапии. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
3
-8
Лабораторному интактному животному-донору (мыши) начинают одновременно вводить внутрибрюшинно препарат гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2-х дней и подкожно препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут в течение 3 дней. На 3-и сут после начала введения препаратов в стерильных условиях периферическую кровь животных собирают, гепаринизируют до конечной концентрации гепарина 40 Ед/мл. Затем с помощью специального раствора с плотностью 1077 кг/м путем центрифугирования и разделения клеток крови на разные фракции собирают фракцию мононуклеаров периферической крови. Клеточный материал разводят сбалансированной питательной средой, содержащей 10 моль/мл D-глюкуроновой кислоты, до концентрации 10-30 млн. клеток/мл и инкубируют в течение 2 часов.
Заявляемая доза и режим введения гиалуронидазы и Г-КСФ подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения гиалуронидазы отменяют получение заявленного технического результата. Уменьшение дозы гиалуронидазы и/или однократное введение препарата значительно снижают эффективность способа. Повышение дозы и кратности введения Г-КСФ (сопровождаемое увеличением ксенобиотической нагрузки на организм и развитием ряда побочных эффектов и осложнений) не приводит к возрастанию эффективности способа, а снижение указанных показателей режима введения Г-КСФ снижает его эффективность. Концентрация D-глюкуроновой кислоты в питательной среде и длительность инкубации также определены опытным путем и являются оптимальными. Опытным путем также показано, что инкубация трансплантанта, полученного с помощью только Г-КСФ, до использования в растворе, содержащем D-глюкуроновую кислоту, не влияет на его терапевтическую активность.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 250 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).
1
2
Оценку эффективности предлагаемого способа осуществляли по сравнению терапевтической активности трансплантантируемого материала, полученного по заявляемому способу и способу прототипу, при моделировании миелосупрессии. Миелосупресссию у животных-реципиентов моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения 5-фторурацила в дозе / от максимально переносимой дозы (МПД). Через сутки после введения цитостатика опытным животным однократно внутривенно вводили по 1,5 млн мононуклеаров. В одном случае, мононуклеары были получены по заявленному способу, в другом - по способу-прототипу. Контрольным животным в эквивалентном объеме вводили питательную среду.
На 5, 7 и 12-е сут после введения цитостатика с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) и стандартных гематологических методов определяли количество эритроцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, общее количество лейкоцитов и их различных морфологических форм в периферической крови и показатели костномозгового кроветворения [10]. Кроме того, изучали число эритроидных (КОЕ-Э), грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) и фибробластных (КОЕ-Ф) клеток-предшественников в костном мозге, а также пролиферативную активность и скорость дифференцировки кроветворных прекурсоров [11]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Пример 1.
Опытным мышам вводили внутрибрюшинно препарат гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2-х дней и подкожно препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут в течение 3 дней. Контрольным животным по соответствующей схеме (по способу-прототипу) подкожно вводили препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария).
-8
2
2
На 3-и сут после начала введения препаратов периферическую кровь животных обеих групп брали в стерильных условиях из шейных сосудов после частичной декапитации животного с помощью ножниц. Шерсть на шеи мышей предварительно выстригалась, и область будущего разреза обрабатывалась 70% спиртом. Кровь собирали в центрифужную пробирку с воронкой, гепариназировали (до 40 ЕД/мл гепарина ("Biochemie", Австрия)) и использовали для получения лейкоконцентрата (фракции мононуклеаров). Для этого гепаринизированную кровь наслаивали на 3 мл раствора «Histo-paque-1077» ("Sigma", США) и центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. При необходимости процедуру повторяли. После центрифугирования в пробирке над фракцией эритроцитов образовывалось «опалисцирующее кольцо», состоящее из мононуклеаров периферической крови, которые с помощью микропипетки собирали и переносили в препаровочную среду (95% RPMI-1640, 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) ("Sigma", США)). Полученный материал дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин. Затем клетки помещали в среду следующего состава: 90% RPMI-1640 ("Sigma", США), 10% инактивированной ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 40 Ед/мл гепарина ("Biochemie", Австрия), суспендировали, с помощью раствора трипанового синего подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Клеточный материал разводили до концентрации 15 млн. клеток/мл в среде, содержащей 10 моль/мл D-глюкуроновой кислоты. После чего клеточную взвесь инкубировали в CO инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°C, 5% CO и 100% влажности воздуха, в течение 2-х часов.
1
2
Изучение эффективности предлагаемого способа осуществляли по сравнению с терапевтической активностью трансплантанта, полученного по заявляемому способу и способу-прототипу при моделировании миелосупрессии. Миелосупресссию у животных-реципиентов моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения «5-фторурацил-Эбеве» (Эбеве Фарма ГмбХ, (Австрия)) в дозе / МПД (114 мг/кг).
-8
Через сутки после введения цитостатика животным внутривенно однократно вводили 1,5 млн мононуклеаров. Контрольным мышам вводили клеточный материал, полученный по способу-прототипу, а опытным животным - по заявленному способу. Мышам цитостатического контроля в эквивалентном объеме (0,1 мл) внутривенно вводили культуральную среду (90% RPMI-1640 ("Sigma", США), 10% инактивированной ЭТС ("Sigma", США), 280 мкг/мл L-глутамина ("Sigma", США), 40 Ед/мл гепарина ("Biochemie", Австрия), 10 моль/мл D-глюкуроновой кислоты ("Sigma", США).
Введение мононуклеаров периферической крови животным после моделирования миелосупрессии приводило к значительному ускорению регенерации кроветворной ткани. В обеих опытных группах наблюдалось значительное увеличение количества ретикулоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, а также общего количества лейкоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови. При этом существенно более выраженными изменения были в группе мышей, которым вводили клеточный материал, полученный после совместного использования Г-КСФ и гиалуронидазы (табл.1, 2).
Указанные изменения явились закономерным отражением костномозгового кроветворения. Клеточная терапия сопровождалась значительным возрастанием количества незрелых (ННГ) и зрелых (ЗНГ) нейтрофильных гранулоцитов, а также эритрокариоцитов в костном мозге мышей с подавленным цитостатиком кроветворением (табл.3). При этом число данных клеточных элементов в опытной группе достоверно превышало аналогичные показатели у контрольных животных. Максимальная разница регистрировалась: в отношении количества ННГ на 44,2% на 7-е сут, ЗНГ на 50,0% на 5-е сут, и содержания эритрокариоцитов на 45,3% на 7-е сут опыта.
Изучение механизмов ускорения регенерации кроветворной ткани выявило определяющую роль повышения содержания эритроидных и грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге, их пролиферативной активности и скорости созревания. Причем во всех случаях существенно более значимыми изменения были у животных опытной группы (табл.4). В частности, количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ на 7-е сут в опытной группе было выше, чем в контроле, на 90,9% и 61,5% соответственно. Кроме того, трансплантация мононуклеаров, содержащих СК [3, 4, 5], приводила к увеличению КОЕ-Ф в гемопоэтической ткани. Причем наиболее значительными данные изменения имели место при введении клеточных элементов животных, получавших оба препарата. Учитывая важную роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) [1], указанные изменения позволяют говорить о значительном участии стромальных клеточных элементов в восстановлении подавленного цитостатиком кроветворения. Особенно существенным представляется роль данного механизма компенсации при введении антиметаболита (5-фторурацила), который значительно нарушает функционирование элементов ГИМ и их кооперацию с кроветворными клетками, тем самым замедляя регенерацию гемопоэтической ткани при цитостатическом воздействии [12].
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о существенном повышении эффективности проведения клеточной терапии миелосупрессии трансплантатом, полученным из периферической крови при совместном использовании гиалуронидазы и Г-КСФ и обработанным D-глюкуроновой кислотой, чем при применении клеточного материала только после Г-КСФ.
Предлагаемый способ позволяет значительно повысить терапевтическую активность клеточного материала.
Литература
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - С.79-105.
2. Lionne-Huyghe P., Kuhnowski F., Coiteux V., Bauters F., Morschhauser F. Indications of G-CSF administration in hematologic disorders // Bull. Cancer. - 2006 - Vol.93. - N 5. - P.453-462.
3. Husebekk A., Kolstad A., Dahl I.M., Skogen В.. Decentralized high-dose cytostatic treatment with autologous stem cell support // Tidsskr. Nor. Laegeforen. - 1998. - Vol.118. - N 18. - P.2777-2780.
4. Borota R., Borota J., Belić A., Gebauer E., Stefanović N. Clinical use of granulocyte colony stimulating-factors (GM-CSF and G-CSF) // Med. Pregl. - 1997. - Vol.50. - N(3-4). - P.87-93.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Роль гиалуронидазы в регуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - №2. - С.115-119.
6. Hui Zhu, Noboru Mitsuhashi, Andrew Klein e.a. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. 2006 - Vol.24. - N.4. - P.928-935.
7. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Gly-cobiology. - 2003. - Vol.13. - №12. - P.105-115.
8. Noble P.W. Hyaluronan and its catabolic products in tissue injury and repair // Matrix Biol. - 2002. - №21. - P.25-29.
9. Henry C.B., Duling, B.R. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan // Am. J. Physiol. - 1999. - №277. - P.508-514.
10. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В.Меньшикова, М. - 1987. - 152 с.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.
12. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - 114 с.