ТРЕХМЕРНАЯ МОДЕЛЬ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ЛЕГКОГО IN VITRO, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОЙ МОДЕЛИ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДСКАЗАНИЯ СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВДЫХАЕМЫХ ПРОДУКТОВ
THREE-DIMENSIONAL IN VITRO ALVEOLAR LUNG MODEL, METHOD OF OBTAINING THIS MODEL AND ITS APPLICATION FOR DETERMINING AND/OR PREDICTING THE SENSITIZING EFFECT OF INHALED PRODUCTS

Область техники
В настоящем изобретении предложена трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro и способ получения указанной модели.
Настоящее изобретение также относится к применению указанной модели и способу, включающему применение указанной модели, для оценки потенциальной способности вдыхаемых продуктов, таких как частицы или молекулы, вызывать раздражение аэрогематического барьера легких или оценки токсичности указанных продуктов для аэрогематического барьера легких, и также для определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия вдыхаемых продуктов, таких как частицы или молекулы, на аэрогематический барьер легких.
Уровень техники
Респираторная сенсибилизация как следствие воздействия химических продуктов возросла на протяжении последних десятилетий, приводя к повышению заболеваемости. Более широкое применение синтетических соединений, например, отдушек и промышленных растворителей, привело к экспоненциальному росту веществ, действию которых люди потенциально подвергаются ежедневно. Известно, что некоторые из данных веществ вызывают респираторную сенсибилизацию, что означает, что они могут со временем инициировать развитие аллергии, сопровождающейся потенциальными нежелательными системными эффектами.
Это может приводить к респираторным заболеваниям, таким как астма, аллергический ринит, риноконъюнктивит и синусит.
Для того чтобы охарактеризовать потенциальные риски данных химических веществ, необходимо полностью понимать механизмы, участвующие в сенсибилизации легкого.
Исследования на животных ранее обеспечивали получение результатов, которые можно применять для понимания механизмов, участвующих в развитии респираторных аллергий. Однако, понимание участвующих клеточных эффектов на уровне механизма все еще ограничено. Было предложено несколько способов дискриминации и идентификации функциональных и структурных признаков аллергена, но ни одно из данных исследований не привело к получению информативных результатов, главным образом из-за биогенных и экологических искажающих результаты совместно действующих факторов. Данный недостаток знаний мешает разработке моделей для прогнозирования в условиях in vitro, оставляя модели in vivo уникальным средством характеристики респираторных аллергенов. Однако, несмотря на недостаток утвержденных способов идентификации и характеристики респираторных сенсибилизаторов, регламент, такой как REACH (Регистрация, Оценка, Авторизация и Ограничение Химических Веществ), требует и поощряет применение неживотных моделей для токсикологической оценки.
В настоящее время не существует утвержденного способа в условиях in vitro, который можно было бы применять в качестве альтернативы тестированию в условиях in vivo, который мог бы обеспечить идентификацию и характеристику способности химических веществ выступать в качестве сенсибилизаторов.
В публикации 2013 г (Klein et al., Particle and Fibre Toxicology, 2013, 10:31) авторы предложили модель на основе тетракультуры, состоящей из линии альвеолоцитов II типа (А459), дифференцированных макрофагоподобных клеток (ТНР-1), тучных клеток (НМС-1) и эндотелиальных клеток (EA.hy 926), что обеспечило возможность воздействия на указанную модель в таком случае поверхности раздела воздушной и жидкостной сред (ALI). Однако, наблюдали, что клетки образовывали гетерогенные колонии в условиях погружения, что приводит к переоценке наблюдаемых эффектов в результатах, например, в отношении продукции ROS (активные формы кислорода) и секреции IL-8 (интерлейкин-8). Кроме того, модель Клейна нельзя применять для оценки сенсибилизирующих эффектов из-за недостатка релевантных компетентных клеток, и она не предусматривает возможность миграции клеток через мембрану вследствие уменьшенного размера пор. Обеспечение воздействия на ALI оказывает прайминг-эффект на культуру, которая представляет более высокие основные уровни окислительного стресса, по сравнению с термостатируемыми контролями. Это приводит к более физиологическому ответу на внешние провокации, что обеспечивает более реалистичную оценку токсикологических воздействий. Кроме того, подвергание воздействию на ALI делает возможным реалистичное воздействие экзогенных соединений без предварительного разведения в среде для клеточной культуры, которая содержит много биологических молекул, которые будут взаимодействовать с исследуемыми химическими веществами, таким образом, возможно изменяя считывание данных по биологическому действию, приводя к непредсказуемой недооценке и переоценке биологического действия.
Во всех предыдущих моделях, предложенных на настоящий момент в области респираторной токсикологии, обычно применяют линии клеток бронхов, не являющиеся релевантными в контексте респираторной сенсибилизации. Вследствие этого, существует потребность в релевантном средстве исследования респираторной сенсибилизации и предсказания респираторного потенциала вдыхаемых химических веществ и небольших частиц.
Цель изобретения
Первой задачей настоящего изобретения является обеспечение модели in vitro для имитации поверхности альвеол легких для оценки потенциальной способности вдыхаемых продуктов, химических веществ, а также частиц, вызывать респираторную сенсибилизацию.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении предложена трехмерна модель альвеолярного легкого in vitro, содержащая преимущественно следующие четыре типа клеток:
a) альвеолоциты II типа (выстилающие легкое), способные секретировать сурфактант,
b) эндотелиальные клетки, которые образуют внутреннюю оболочку капилляров, обеспечивая проницаемый барьер,
c) дендритоподобные клетки (объединяющие врожденный и приобретенный иммунитет),
d) макрофагоподобные клетки, способные принимать участие в защитных реакциях посредством поглощения чужеродных веществ путем фагоцитоза, при этом:
указанная трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro представлена в форме лунки для культивирования, оснащенной пористой мембраной, разделяющей указанную лунку на апикальный компартмент, контактирующий с поверхностью раздела воздушной и жидкостной сред, и базолатеральный компартмент, погруженный в культуральную среду, причем указанные эпителиальные клетки и указанные макрофаги находятся в апикальном компартменте, и указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки находится в базолатеральном компартменте и погружены в культуральную среду,
указанная пористая мембрана имеет поры в диапазоне от 2 до 10 мкм, что делает возможной миграцию дендритоподобных клеток из базолатерального компартмента в апикальный компартмент.
Под термином «преимущественно» в настоящей заявке подразумевается, что указанная модель альвеолярного легкого содержит по существу четыре описанных выше типа клеток, в частности указанная модель альвеолярного легкого не включает тучные клетки, которые могли бы приводить к получению ошибочных результатов.
Под термином «по существу» в частности подразумевается, что указанная модель не включает тучные клетки, которые могли бы приводить к получению ошибочных результатов при оценке токсического действия или сенсибилизирующего действия вдыхаемых продуктов.
Подробное описание изобретения
Более конкретно, макрофагоподобные клетки представляют собой клетки ТНР-1, дифференцированные с применением РМА (Форбол-12-миристат-13-ацетат) или с применением 1,25-дигидроксивитамина D3, предпочтительно дифференцированные с применением РМА. Данную дифференцировку предпочтительно осуществляют в течении нескольких суток: преимущественно от 3 до 10 суток, и предпочтительно 5 суток.
В модели согласно настоящему изобретению все клетки представляют собой иммортализованные линии клеток млекопитающих, которые представляют собой клетки, более стабильные, чем первичные клетки, и представляют собой предпочтительно иммортализованные линии клеток человека.
«Предпочтительно» указанные альвеолоциты II типа представляют собой клетки А549.
Также «предпочтительно» указанные эндотелиальные клетки представляют собой клетки EA.hy926.
И также «предпочтительно» указанные дендритоподобные клетки представляют собой недифференцированные клетки ТНР-1, которые представляют собой устойчивые модели для дендритных клеток человека.
Дендритные клетки крайне важны в процессе сенсибилизации, поскольку данные клетки уполномочены распознавать и захватывать антиген, который инициирует иммунный ответ.
Преимущественно, трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro согласно настоящему изобретению содержит:
a) клетки А549 в качестве альвеолоцитов II типа,
b) клетки EA.hy926 в качестве эндотелиальных клеток,
c) недифференцированные клетки ТНР-1 в качестве дендритоподобных клеток,
d) клетки ТНР-1, дифференцированные посредством РМА, в качестве макрофагоподобных клеток,
и не содержит тучные клетки.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro согласно настоящему изобретению исключительно состоит из следующей тетракультуры:
a) клетки А549 в качестве альвеолоцитов II типа,
b) клетки EA.hy926 в качестве эндотелиальных клеток,
c) недифференцированные клетки ТНР-1 в качестве дендритоподобных клеток,
d) клетки ТНР-1, дифференцированные с применением РМА, в качестве макрофагоподобных клеток.
По сравнению с моделью на основе тетракультуры Клейна 2013 г, настоящая модель не содержит тучные клетки, которые могли бы изменять локальную окружающую микросреду и влиять на ответ дендритоподобных клеток. Вследствие этого, настоящая модель более точно имитирует ситуацию in vivo, в которой тучные клетки только присутствуют во время стадии аллергического воспаления (фаза элиситации), а не во время фазы сенсибилизации, которая предшествует аллергическому воспалению. Тучные клетки отвечают на различные биологические стимулы, из которых наиболее важным является высвобождение иммуноглобулина Е (IgE) В-лимфоцитами. Так как В-лимфоциты не представлены в модели согласно настоящему изобретению и, кроме того, клетки НМС-1 не презентируют функциональный рецептор IgE, добавление тучных клеток в настоящую модель только бы добавило излишней сложности, не привнося какой-либо дополнительной ценности.
Пористая мембрана, разделяющая апикальный и базолатеральный компартменты, может представлять собой часть, например, вставки Transwell.
Преимущественно, пористая мембрана имеет поры, в диапазоне от 3 до 8 мкм, более предпочтительно от 4 до 6 мкм. В модели Клейна дендритные клетки отсутствовали в тетракультуре и, конечно, не могли находиться в апикальном компартменте. Отсутствие дендритных клеток в модели Клейна обеспечивало невозможность той модели предсказывать респираторную сенсибилизацию. Дендритные клетки играют важнейшую роль в индуктивной фазе процесса сенсибилизации, и при их отсутствии не может быть изучен полный процесс.
Способность дендритоподобных клеток мигрировать из базолатерального компартмента в апикальный компартмент также является важным признаком заявленной модели (что было невозможным в модели Клейна). Дендритные клетки в природе не присутствуют в альвеолах, в которые они привлекаются только вследствие внешних стимулов. Также, для достижения реалистичной оценки сенсибилизирующего потенциала, важно, чтобы дендритоподобные клетки напрямую не подвергались воздействию сенсибилизирующих агентов, которые должны сначала вступить в контакт с эпителием и резидентными макрофагами. Данный контакт может усиливать или снижать сенсибилизирующий потенциал вдыхаемых веществ вследствие метаболических процессов, происходящих в эпителиальных клетках или макрофагах.
Настоящее изобретение также относится к способу получения указанной выше трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro, включающему совместное культивирование клеток a)-d) во вставке, имеющей пористую мембрану, в следующей последовательности стадий:
5
5
2
i) посев на нижнюю сторону (которая станет базолатеральной стороной) мембранной вставки, имеющей поры в диапазоне от 2 до 10 мкм, 0,24 10 - 0,6 10 эндотелиальных клеток/см,
5
5
5
5
2
ii) спустя по меньшей мере четыре часа, посев на другую сторону (апикальная сторона) мембранной вставки альвеолоцитов II типа, в количестве предпочтительно 0,12 10 - 1,2 10, предпочтительно 0,5 10 - 1,0 10 клеток/см,
iii) спустя приблизительно 4 суток, добавление клеточной суспензии, содержащей от 0,1 до одного миллиона дендритоподобных клеток/мл, к базолатеральной стороне мембранной вставки, и затем
5
5
2
iv) добавление макрофагоподобных клеток поверх посева альвеолоцитов II типа, предпочтительно в количестве 0,12 10 - 1,2 10 макрофагоподобных клеток/см, и, наконец,
v) введение мембранной вставки в среду таким образом, чтобы указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки были (находясь в базолатеральном компартменте) погружены в среду для совместного культивирования, и указанные эпителиальные клетки и указанные макрофагоподобные клетки находились в апикальном компартменте, на поверхности раздела воздушной и водной сред (ALI).
Предпочтительно, в указанном выше способе указанные макрофагоподобные клетки представляют собой клетки ТНР-1, дифференцированные с помощью РМА (Форбол-12-миримтат-13-ацетат), и/или указанные альвеолоциты II типа представляют собой клетки А549, и/или указанные эндотелиальные клетки представляют собой клетки EA.hy926, и/или указанные дендритоподобные клетки представляют собой недифференцированные клетки ТНР-1.
Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro согласно настоящему изобретению находит интересные применения, в частности:
- применение для оценки потенциальной способности вдыхаемых продуктов, таких как частицы или молекулы, вызывать раздражение аэрогематического барьера легких или токсического действия вдыхаемых продуктов, таких как частицы или молекулы, на аэрогематический барьер легких;
- применение для определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия вдыхаемых продуктов, таких как частицы или молекулы, на аэрогематический барьер легких.
Настоящее изобретение также относится к способу определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия и/или потенциальной способности вызывать раздражающее действие или токсического действия вдыхаемых продуктов, таких как частицы или молекулы, на аэрогематический барьер легких, включающему следующие стадии:
A) стадия осуществления воздействия посредством пульверизации/распыления вдыхаемого продукта, подлежащего тестированию, над апикальным компартментом трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro по любому из пп. 1-8 в форме лунки для культивирования, оснащенной пористой мембраной, имеющей поры в диапазоне от 2 до 10 мкм, причем указанные эпителиальные клетки и указанные макрофаги находятся на апикальной стороне мембраны, и указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки находятся на базальной стороне мембраны, причем указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки погружены в среду для совместного культивирования, причем указанное осуществление воздействия приводит к активации дендритоподобных клеток,
B) стадия совместного культивирования указанных активированных дендритоподобных клеток с клеточной линией Т-лимфобластов.
Предпочтительно, Т-клетки должны презентировать профиль Т-хелперов типа 2 (ТН2), если продукт, подлежащий тестированию, представляет собой предполагаемый респираторный сенсибилизатор.
a
Маркеры для оценки потенциальной способности вызывать респираторную сенсибилизацию могут быть измерены посредством FACS (сортировка клеток с активированной флуоресценцией) (такие как, например, CD40, CD54, CD86, TSLPr (рецептор тимического стромального лимфопоэтина), IL-1ra (антагонист рецептора интерлейкина), OX40L) и/или посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) (TSLP (тимический стромальный лимфопоэтин), IL-33, IL-25, RANTES, МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1), MIP-3a (макрофагальный воспалительный белок 3), IL-6, IL-7, IL-10 и GM-CSF (Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор)).
Также можно измерять другие биологические конечные точки, такие как высвобождение интерлейкинов, генотоксичность, биомаркеры сенсибилизации, протеомика, транскриптомика, метаболическая активация.
Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro согласно настоящему изобретению имеет следующие основные преимущества:
- отсутствие тучных клеток, которые могли бы вызывать получение ошибочных результатов;
- возможность осуществления воздействия на поверхность раздела воздушной и водной сред (ALI) с применением газов, жидкостей или порошков в качестве материалов, подлежащих тестированию;
- возможность тестирования химических веществ и частиц в отношении обоих аспектов: их воспалительного или сенсибилизирующего потенциала, в отличие от модели Klein et al. 2013, которую можно применять только в отношении потенциальной способности вызывать раздражение;
- возможность измерения большого количества биологических конечных точек (например, высвобождение интерлейкинов, генотоксичность, биомаркеры сенсибилизации, протеомика, транскриптомика, метаболическая активация и т.д.).
Краткое описание чертежей
Другие преимущества и аспекты модели легкого согласно настоящему изобретению можно вывести из описания вариантов реализации, представленных ниже в разделе с примерами, со ссылкой на прилагаемые графические материалы, на которых:
- Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение вставки Transwell с тетракультурой согласно настоящему изобретению, представляющей модель легкого;
- Фиг. 2A-2E представляют собой гистограммы, показывающие экспрессию соответствующих маркеров клеточной поверхности CD86, CD40, IL7ra, CD54 и OX40L на клеточной поверхности клеток ТНР-1 в модели легкого на основе тетракультуры после 24 ч воздействия HDM;
- Фиг. 3A и 3B представляют собой диаграммы, отражающие жизнеспособность в %, после 24 ч и 48 ч воздействия разных концентраций химических респираторных сенсибилизаторов, соответственно, тримеллитового ангидрида (ТМА) и фталевого ангидрида (РА);
- Фиг. 4A, 4B и 4C представляют собой диаграммы, показывающие жизнеспособность в %, после 24 ч и 48 ч воздействия разных концентраций химических респираторных раздражителей, соответственно, додецилсульфата натрия (SDS), Акролеина (Acr) и метилсалицилата (MeSa);
- Фиг. 5A и 5B представляют собой диаграммы, показывающие экспрессию маркера клеточной поверхности CD54 на клетках ТНР-1 в модели легкого in vitro на основе тетракультуры согласно настоящему изобретению (А) и в модели на основе монокультуры, не являющейся частью настоящего изобретения (В), после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч (среднее +/- стандартная ошибка);
- Фиг. 6A и 6B представляют собой диаграммы, показывающие экспрессию маркера клеточной поверхности CD86 на клетках ТНР-1 в модели легкого in vitro на основе тетракультуры согласно настоящему изобретению (А) и в модели на основе монокультуры, не являющейся частью настоящего изобретения (В), после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч (среднее +/- стандартная ошибка);
- Фиг. 7 представляет собой диаграмму, показывающую экспрессию маркера клеточной поверхности ILra на клетках ТНР-1 в модели легкого in vitro на основе тетракультуры согласно настоящему изобретению после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч (среднее +/- стандартная ошибка);
- Фиг. 8 представляет собой диаграмму, показывающую экспрессию маркера клеточной поверхности OX40L на клетках ТНР-1 в модели легкого in vitro на основе тетракультуры согласно настоящему изобретению после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч (среднее +/- стандартная ошибка);
- Фиг. 9 представляет собой диаграмму, показывающую экспрессию маркера клеточной поверхности TSLPr на клетках ТНР-1 в модели легкого in vitro на основе тетракультуры согласно настоящему изобретению после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч (среднее +/- стандартная ошибка);
- Фиг. 10A и 10B представляют собой диаграммы, показывающие цитокины, высвобождаемые в модели легкого in vitro на основе тетракультуры согласно настоящему изобретению после воздействия химических сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч и 48 ч (А): основные уровни IL-7: основной уровень ДМСО (диметилсульфоксид) в течение 24 ч: 18,2±0,0 пкг/мл; в течение 48 ч: 19,5±1,2 пкг/мл; воды в течение 24 ч: 18,6±0,3 пкг/мл; в течение 48 ч: 18,2±0,0 пкг/мл (В) основные уровни GM-CSF: основной уровень ДМСО: ДМСО: в течение 24 ч: 32,4±6,0 пкг/мл; в течение 48 ч: 31,0±3,7 пкг/мл; воды: в течение 24 ч: 47,0±9,2 пкг/мл; в течение 48 ч: 43,1±5,4 пкг/мл (среднее +/- SE ((стандартная ошибка)) (Буквы иллюстрируют значимые различия (Factorial ANOVA (факторный дисперсионный анализ) плюс Fisher LSD (критерий наименьшей значимой разности Фишера) при уровне значимости Р меньше 0,05, n равен 6).
- Фиг. 11A и 11B представляют собой диаграммы, показывающие жизнеспособность клеток THP-1 после 24 ч воздействия РА (Фиг. 11A) и ТМА (Фиг. 11B) в монокультуре в условиях погружения. На данной фигуре наиболее высокие тестируемые концентрации представляют максимальную растворимость соединений в среде, содержащей 0,2% ДМСО.
Примеры
Пример 1
В данном примере применяют следующие клеточные линии: А549, EA.hy926, ТНР-1 и МФ-ТНР-1. Их соответствующие характеристики указаны ниже:
Клеточная линия А549 соответствует клеткам бронхиального эпителия человека со способностью продуцировать сурфактант;
Клеточная линия EA.hy926 представляет собой гибрид соматических клеток с эндотелиальными характеристиками;
ТНР-1 представляет собой моноцитарную лейкемическую клеточную линию; и
МФ-ТНР-1 представляют собой макрофаги, происходящие из клеток ТНР-1, дифференцированных с помощью РМА (Форбол-12-миристат-13-ацетат) или с помощью 1,25-дигидроксивитамина D3.
Получение различных сред
Применяемые протоколы являются следующими:
Среда EA.hy926:
- Удалить 60 мл среды DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) из новой бутыли (500 мл) и добавить 50 мл FBS (фетальная бычья сыворотка) (10%), затем 5 мл стокового раствора HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) (250 мМ; стерильный, фильтрованный) с получением среды, буферизованной HEPES (25 мМ),
- Консервация с 5 мл Pen/Strep (пенициллин/стрептомицин).
10% Среда для совместного культивирования:
- Удалить 5 мл сред DMEM из новой бутыли (500 мл) и добавить 5 мл стокового раствора HEPES (250 мМ; стерильный, фильтрованный) с получением среды, буферизованной HEPES (25 мМ),
- Смешать и удалить 125 мл,
- Добавить 50 мл IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по Искову), затем добавить 75 мл среды RPMI,
- Смешать и удалить 55 мл,
- Затем добавить в среду 50 мл FBS (10%) и 5 мл Pen/Strep.
1% Среда для совместного культивирования:
- Удалить 5 мл среды DMEM из новой бутыли и добавить 5 мл стокового раствора HEPES (250 мл; стерильный, фильтрованный) с получением среды, буферизованной HEPES (25 мМ),
- Смешать и удалить 125 мл,
- Добавить 50 мл IMDM, затем добавить 75 мл RPMI,
- Смешать и удалить 10 мл,
- Добавить в среду 5 мл FBS (1%) и 5 мл Pen/Strep.
Полная среда ТНР-1:
- Удалить 57,5 мл среды RPMI из новой бутыли (500 мл). Из этих 52,5 мл перенести 10 мл в пробирку типа Фалькон и удалить оставшуюся среду,
- Приготовить рабочий раствор 10 мМ β-меркаптоэтанола в среде RPMI путем добавления 7 мкл коммерческого раствора в 10 мл RPMI, перемешать, перенести 2,5 мл в бутыль со средой,
- Добавить в среду 50 мл FBS (10%), затем 5 мл Pen/Strep.
Получение трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro
В данном примере хронология различных стадий выглядела следующим образом.
1. Сутки -2
Дифференцировка клеток-макрофагов (в течение ночи):
- Клетки THP-1 дифференцируют с помощью РМА (Форбол-12-миристат-13-ацетат) или с помощью 1,25-дигидроксивитамина D3 (80 мкл РМА плюс 40 мл среды плюс 16 миллионов клеток на колбу T125) в течение ночи и затем хранят в колбе в течение 1-5 суток, причем среду обновляют в течение ночи.
2. Сутки 0: посев во вставку
Получение клеток EA.hy926:
5
5
2
5
2
- Добавить от 0,11 миллиона до 0,54 миллиона клеток на вставку (0,24 10 - 0,6 10 клеток/см, предпочтительно 0,24 10 клеток/см),
- Объем, необходимый для посева в вставке, в настоящей заявке составляет 700 мкл,
- Получить первую клеточную суспензию для всех вставок (плюс 2 дополнительные вставки для ошибок отмеривания пипеткой), перемешать для полной гомогенизации клеточной суспензии,
- Надлежащим образом поместить вставки внутрь лунки планшета,
- Повернуть планшет и осторожно поместить 700 мкл EA.hy926 под вставку,
- Затем поместить планшет в инкубатор.
Спустя по меньшей мере 4 часа:
Получение клеток А549:
- Объем, необходимый для посева во вставке, составляет в настоящей заявке 2 мл,
5
5
2
5
2
- Осадок клеток А549 ресуспендируют в среде EA.hy926: от 0,27 миллиона до 0,54 миллиона клеток на вставку (от 0,12 10 до 1,2 10 клеток/см, предпочтительно 0,6 10 клеток/см),
- Получить первую клеточную суспензию клеток А549 для всех вставок (в среде EA.hy926, принимая в расчет 2 дополнительные вставки для ошибок отмеривания пипеткой). Перемешать/полностью гомогенизировать клеточную суспензию.
Приготовить планшет со вставками для посева и гомогенизировать клеточную суспензию время от времени при осуществлении посева клеток на вставки для того, чтобы избежать оседания клеток в пробирке:
- Повернуть планшет и добавить в лунку 1,5 мл среды EA.hy926,
- Проверить слой эндотелиальных клеток под микроскопом,
- Добавить 2 мл клеток А549 во вставку.
3. Сутки 3:
Замена среды планшета вставок:
- Удалить старую среду вставки и добавить 2 мл 10% среды для совместного культивирования,
- Удалить старую среду лунки и добавить 2 мл 10% среды для совместного культивирования,
4. Сутки 4:
Получить DC-THP-1 в 6-луночном планшете:
- Получить клеточную суспензию с концентрацией 1 миллион клеток DC-THP-1/мл в настоящем примере (от 0,1 миллиона клеток до 1 миллиона клеток на мл).
- Взять новый планшет и добавить 1 мл (то есть объем, достаточный для выделения клеток EA.hy926) клеточной суспензии DC-THP-1 в 6 лунок нового планшета и перенести вставки из старого планшета в новый планшет.
Дифференцированные клетки ТНР-1 (МФ-ТНР-1):
- Промыть клетки ФБР (фосфатно-солевой буферный раствор),
- Добавить на дифференцированные клетки ТНР-1 аккутазу для разъединения клеток и поместить колбу в инкубатор на 15 минут,
- Центрифугировать 5 минут при 300 g, удалить супернатант,
- Растворить осадок в 1% среде для совместного культивирования,
5
2
5
2
- Подсчитать клетки и добавить в вставку 0,27-0,54 миллиона клеток МФ-ТНР-1 на вставку в настоящем примере (0,12-1,2 10 клеток/см, предпочтительно 0,6 10 клеток/см) в 700 мкл 1% среды для совместного культивирования.
Спустя по меньшей мере 4 часа: удалить среду из вставки для перехода на ALI. Инкубация в течение ночи.
Осуществление воздействия на вставку вдыхаемого продукта (частицы или молекулы), подлежащего тестированию на трехмерной модели согласно настоящему изобретению, полученной согласно приведенному выше протоколу, можно осуществлять после 10-12 часов (время, требуемое для продуцирования клетками сурфактанта) с моделью легкого in vitro, как представлено на Фиг. 1.
5. Сутки 5:
2
Пример воздействия на вставки осуществляют в устройстве Vitrocell Cloud (Waldkirch, Германия), ранее очищенном в стерильных условиях и поддерживаемом при 37°С. Вставки помещают в указанное устройство. Затем взвесь (от 200 до 500 мкл продукта, подлежащего тестированию) однородно распределяют внутри камеры, и она начинает оседать на поверхности. Спустя приблизительно 10-30 минут (в зависимости от инъекционно вводимого продукта), взвесь осаждают посредством осаждения единичных капель. Концентрация, которая осаждается на вставке, может быть рассчитана в г/см.
После осуществления воздействия вставки отодвигают обратно в их планшет, и после инкубации (обычно 24 ч или 48 ч, в зависимости от соединения, подлежащего тестированию), можно проводить следующие измерения.
6. Сутки 5, 6 или 7: измерения
Можно осуществлять биологические конечные точки от 0 до 48 ч после воздействия в зависимости от ожидаемых временных и конечных точек.
Возможные биологические конечные точки, подлежащие измерению, например, представляют собой: жизнеспособность клеток или цитотоксичность, секрецию цитокинов, миграцию DC (дендритные клетки), активацию DC, фагоцитоз макрофагов, активацию ЕС, фагоцитоз макрофагов, окрашивание на иммуноцитохимию или иммунофлуоресценцию, или выделение РНК. Данный список не является ограничивающим.
7. Сутки 5: пример выделения DC и совместного культивирования с Т-клетками
Выделение DC с применением следующего:
- Сортировка клеток с применением FACS (например, BD FACS Aria) посредством применения различных маркеров, требуемых для активации Т-клеток, таких как MHCII, CD86, CD54 (для выделения активированных клеток ТНР-1) и CD11a (для выделения клеток из клеток EA.hy.926). Может быть необходимым объединить разные лунки для того, чтобы иметь достаточно клеток для совместного культивирования с Т-клетками.
- Магнитные частицы (например, Dynabeads) с позитивным или негативным выделением с разными маркерами поверхности, такими как MHCII, CD86, CD54 и CD11a.
Совместное культивирование активированных DC с Т-клетками:
- Т-клетки должны презентировать маркеры поверхности, делая возможной активацию клеток (TCR и CD4), выживаемость (CD28 связывающие В7.1 или CD80 и В7.2 или CD86) и дифференцировку,
- Совместное культивирование в средах:
• совместное культивирование с 1% FBS (применяемым для подвергания воздействию тетракультуры-DC)
• или RPMI 1640 с 10% FBS (применяемым для линии ТНР-1 и Т-клеток)
• нужно рассматривать добавление нескольких соединений (таких как цитокины, необходимые для дифференцировки Т-клеток) для имитации среды тканей из нескольких видов клеток лимфоидного вторичного органа.
6
- Соотношение клеток: тестировали несколько соотношений клеток, так как только несколько интактных Т-клеток способны распознавать любой данный эпитоп (1 из 10). DC должны взаимодействовать с многими Т-клетками в надежде на обнаружение Т-клеткой, которые распознают антиген на своей поверхности:
• 0,01 миллиона DC на 0,1 миллиона Т-клеток (1/10)
• 0,01 миллиона DC на 1 миллион Т-клеток (1/100)
• 0,01 миллиона DC на 10 миллионов Т-клеток (1/1000)
- В зависимости от выбранной линии Т-клеток, среду нужно обновлять или пополнять посредством добавления свежей среды (20% - 30% объема каждые 2 или 3 суток), следуя рекомендациям по субкультивированию от поставщика/ATCC.
Измерения конечных точек:
Секрецию цитокинов (IL-4, IL-5 и IL-13) и экспрессию маркеров поверхности следует измерять каждые 24 ч, от 24 ч (1 сутки) совместного культивирования до 120 ч (5 суток) совместного культивирования. Т-клетки должны презентировать профиль клеток-хелперов типа 2 (ТН2), если соединения представляют собой респираторный сенсибилизатор.
Пример 2
Вставки, полученные в соответствии с Примером 1, подвергали воздействию химических соединений и положительных контролей, применяя систему Vitrocell Cloud (Vitrocell, Waldkirch, Германия). Все соединения разводили в 1/1 (об./об.) растворе стерильного физиологического раствора и ФБР.
Воздействие HDM (Клещ домашней пыли)
2
2
Клещ домашней пыли представляет собой очень распространенный аллерген, который ассоциирован с астмой и аллергическим ринитом. Поскольку не обнаружено данных в отношении воздействия in vitro, концентрацию, воздействию которой подвергали клетки модели легкого согласно настоящему изобретению, определяли на основе исследований in vivo. In vivo, мышей обычно подвергают воздействию 1 мкг Der p1 (основной белковый аллерген HDM) интраназально. Учитывая, что поверхность альвеол мышей составляет 82,2 см, рассчитывали концентрацию 0,01 мкг/см для подвергания вставки воздействию (что составляет 45 мкг/вставка).
Воздействие химических веществ
Вставки подвергали воздействию целого ряда концентраций химических респираторных раздражителей и сенсибилизаторов для определения, прежде всего, жизнеспособности ткани, применяя анализ на основе аламарового синего. Резазурин, активный ингредиент анализа на основе аламарового синего, представляет собой проникающее в клетку синее нефлуоресцирующее соединение. Поступая в клетки, резазурин восстанавливается до розового сильно флуоресцирующего резоруфина. Жизнеспособные клетки непрерывно превращают резазурин в резоруфин. Флуоресценция пропорциональна жизнеспособности клеток.
После 24 ч и 48 ч воздействия соединений посредством Vitrocell cloud клетки инкубировали в течение 1 ч с 400 мкМ аламарового синего, разбавленного 1% средой для совместного культивирования.
Сразу после определения жизнеспособности клеток в отношении каждого соединения, концентрацию, соответствующую приблизительно 75% жизнеспособности, выбирали для измерения экспрессии маркеров клеточной поверхности на ТНР-1 DC.
Модель легкого на основе тетракультуры подвергали воздействию нескольких концентраций двух известных химических респираторных сенсибилизаторов: фталевого ангидрида (РА) или тримеллитового ангидрида (ТМА), и двух известных респираторных раздражителей: акролеина (Acr), метилсалицилата (MeSa) или додецилсульфата натрия (SDS).
Измерения путем проточной цитометрии:
Спустя 24 ч и 48 ч после воздействия в Vitrocell Cloud, ТНР-1 DC выделяли в среде в лунке. После центрифугирования в течение 5 минут при 300 g клетки промывали ФБР и осуществляли окрашивание, применяя антитела, перечисленные ниже в Таблице 1 (в соответствии с разведениями, рекомендованными производителем), и соответствующий изотипический контроль для определения неспецифического связывания антитела и обеспечения того, чтобы наблюдаемое окрашивание было обусловлено специфичным связыванием, а не артефактом.
В отношении цитотоксичности:
В случае красителя SYTOX синий длина волны возбуждения составляет 444 нм и длина волны испускания составляет 480.
Относительную интенсивность флуоресценции (RFI) применяли в качестве показателя экспрессии OX40L, IL7ra, CD40 и CD86 и CD54 и рассчитывали по следующей формуле I:
На Фиг. 2A-2E показана относительная экспрессия маркеров клеточной поверхности CD86, CD40, IL7ra, CD54 и OX40L на клеточной поверхности клеток ТНР-1 в модели легкого на основе тетракультуры после 24 ч воздействия HDM. Экспрессию маркеров клеточной поверхности на жизнеспособных клетках измеряли посредством проточной цитометрии.
Очевидно, что осуществляется повышающая регуляция всех маркеров после 24 ч воздействия HDM, по сравнению с контролем. Таким образом, маркеры IL7ra, OX40L, CD86, CD40, и CD54 на клеточной поверхности клеток ТНР-1 в модели легкого на основе тетракультуры можно было бы применять для определения потенциальной способности химических соединений вызывать респираторную сенсибилизацию.
На диаграммах Фиг. 3A и 3B показана жизнеспособность после 24 ч и 48 ч воздействия разных концентраций химических респираторных сенсибилизаторов, соответственно тримеллитового ангидрида (ТМА) и фталевого ангидрида (РА).
Дозозависимый ответ наблюдают в отношении жизнеспособности клеток модели альвеолярной ткани.
На диаграммах Фиг. 4A, 4B и 4C показана жизнеспособность после 24 ч и 48 ч воздействия разных концентраций химических респираторных раздражителей, соответственно додецилсульфата натрия (SDS) и акролеина (Acr) и метилсалицилата (MeSa).
Дозозависимый ответ также наблюдают в отношении жизнеспособности клеток модели альвеолярной ткани.
Пример 3
Систему Vitrocell Cloud (Vitrocell, Waldkirch, Германия) применяли для доставки и воздействия на клетки распыления соединений, разведенных в ФБР и, в зависимости от контроля-носителя, в стерильной воде или стерильной воде плюс ДМСО.
Клеща домашней пыли (HDM), белок Bet v1 (дополнительный известный белок-сенсибилизатор) и акролеин (Acr) разводили в стерильной воде. Фталевый ангидрид (РА), тримеллитовый ангидрид (ТМА) и метилсалицилат (MeSa) разводили в ДМСО.
Жизнеспособность оценивали, применяя анализ на основе аламарового синего, спустя 24 ч и 48 ч после воздействия в соответствии с протоколом, подробно описанным выше в Примере 2.
Концентрацию, приводящую к 25% относительной цитотоксичности (что подразумевает 75% жизнеспособности: CV75), по сравнению с контролем-носителем, определяли, применяя графики, представленные в Примере 2.
Для измерения экспрессии маркеров клеточной поверхности и высвобождения разных цитокинов клетки вставок, полученные в соответствии с описанным выше Примером 1, подвергали воздействию CV75 или, когда было невозможно достичь 75% жизнеспособности, клетки подвергали воздействию концентрации, представляющей собой максимальную растворимость соединений.
Воздействие Bet v1
2
2
Поскольку данные по воздействию in vitro не были обнаружены, концентрацию, воздействию которой подвергали клетки модели легкого согласно настоящему изобретению, определяли на основе исследований in vivo. In vivo, мышей подвергали воздействию 2 мкг bet v1 (важный белковый аллерген пыльцы). Учитывая, что поверхность альвеол мышей составляет 82,2 см, рассчитывали концентрацию 0,024 мкг/см.
Спустя 24 ч и 48 ч, клетки ТНР-1 выделяли, окрашивали и анализировали, применяя проточный цитометр в соответствии с протоколом, подробно описанным выше в Примере 2. Супернатанты выделяли для измерения цитокинов.
После воздействия HDM и Bet v1 эффекта, оказываемого на жизнеспособность, не наблюдали.
Воздействие Bet v1 приводило к относительной жизнеспособности, по сравнению с контролем, 100,7% +/- 1,2% при 24 ч и 89,5% +/- 4,2% при 48 ч. Воздействие HDM приводило к относительной жизнеспособности, по сравнению с контролем, 100,0% +/- 0,03% при 24 ч и 95,7% +/- 0,03% при 48 ч.
Одновременно, клетки ТНР-1 подвергали воздействию в условиях погружения в монокультуре для воспроизведения данных, полученных с применением h-CLAT анализа (тестирование активации линии клеток человека). Анализ h-CLAT основан на свойстве химических веществ активировать дендритные клетки, свойстве, которое является общим для кожных и респираторных сенсибилизаторов. h-CLAT представляет собой модель in vitro, подтвержденную на Европейском уровне (подтверждение ECVAM (Европейский центр валидации альтернативных методов)).
С целью сравнения экспрессию маркеров клеточной поверхности CD86 и CD54 также оценивали в h-CLAT. В настоящее время рекомендуют применять h-CLAT для оценки потенциальной способности химических веществ вызывать кожную сенсибилизацию. Поскольку кожа и легкое имеют общее свойство активации DC, h-CLAT можно рассматривать для применения для оценки также потенциальной способности химических веществ вызывать респираторную сенсибилизацию. В качестве напоминания, еще не существует утвержденных имеющихся в продаже моделей для оценки респираторной сенсибилизации.
Когда для измерения экспрессии CD применяли разные антитела, флуорохромы и оборудование, пороговый уровень, полученный в литературе на h-CLAT, нельзя было сравнивать с пороговыми уровнями, измеренными в данном примере.
Однако на Фиг. 5 показана экспрессия CD54 на клетках ТНР-1 в тетракультуре (А) и в монокультуре (В). Наблюдали увеличения после воздействия химических респираторных раздражителей (РА и ТМА), тогда как для контролей-носителей (вода и ДМСО) и химического раздражителя (акролеин) увеличения не наблюдали (Фиг. 5А). Напротив, на Фиг. 5B в монокультуре после воздействия респираторных сенсибилизаторов увеличения не наблюдали, и увеличение экспрессии CD54 измеряли после воздействия раздражителя при неправильном отнесении химического вещества-раздражителя акролеин к сенсибилизатору.
На Фиг. 6 показана экспрессия CD86 на клетках ТНР-1 в тетракультуре (А) и в монокультуре (В). Увеличения наблюдали после воздействия химических респираторных раздражителей (РА и ТМА), тогда как для контролей-носителей (вода и ДМСО) и химического раздражителя (акролеин) увеличения не наблюдали (Фиг. 6А). Напротив, в монокультуре после воздействия респираторных сенсибилизаторов увеличения не наблюдали, и уровень экспрессии CD86 после воздействия ТМА даже ниже, чем в контроле-носителе (Фиг. 6B).
Таким образом, трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro согласно настоящему изобретению (тетракультура) демонстрирует улучшение в отношении дискриминации химических респираторных сенсибилизаторов и раздражителей. Для усиления дискриминирующей способности системы применяли дополнительные маркеры и респираторные белковые сенсибилизаторы также добавляли к набору тестируемых соединений.
На Фиг. 7 показана экспрессия маркера клеточной поверхности IL7ra на клетках ТНР-1 в тетракультуре после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч. Уменьшение экспрессии IL7ra после воздействия акролеина можно было бы использовать в качестве дискриминирующего маркера среди раздражителей и сенсибилизаторов (независимо от типов, химические или белковые).
На Фиг. 8 показана экспрессия маркера клеточной поверхности OX40L на клетках ТНР-1 в тетракультуре после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч. Увеличение экспрессии OX40L после воздействия белковых сенсибилизаторов можно было бы применять в качестве дискриминирующего маркера среди белковых сенсибилизаторов и химических раздражителей/сенсибилизаторов.
На Фиг. 9 показана экспрессия маркера клеточной поверхности TSLPr на клетках ТНР-1 в тетракультуре после воздействия сенсибилизаторов и раздражителей в течение 24 ч. Увеличение экспрессии TSLPr после воздействия химических сенсибилизаторов можно было бы применять в качестве дискриминирующего маркера среди химических сенсибилизаторов и химических раздражителей/белковых сенсибилизаторов.
Другие параметры оценивали в системе после подвергания воздействию акролеина и обоих химических респираторных сенсибилизаторов РА и ТМА.
Ниже в Таблице 2 приведен краткий обзор результатов, полученных для всех измеренных цитокинов, где  указывает на уменьшение высвобождения цитокинов, по сравнению с контролем-носителем,  указывает на увеличение высвобождения цитокинов, по сравнению с контролем-носителем, и = указывает на то, что не наблюдали изменения, проводя сравнение между воздействием и контролем-носителем:
Данные результаты также проиллюстрированы на Фиг. 10, которая дает лучшее представление об относительных концентрациях IL-7 (Фиг. 10A) и GM-CSF (Фиг. 10B), по сравнению с контролями-носителями. Увеличение высвобождения МСР-1, MIP-3a, IL-6 RANTES, GM-CSF и IL-10 можно применять в качестве маркеров для респираторных сенсибилизаторов. Уменьшение высвобождения МСР-1, MIP-3a, IL-6, GM-CSF и IL-10 можно применять в качестве маркеров для респираторных раздражителей наряду с увеличением высвобождения цитокина IL-7.
Наконец, и как показано на Фиг. 11, следует отметить, что вследствие низкой растворимости ТМА и РА, невозможно достичь какой-либо цитотоксичности клеток ТНР-1 в монокультуре в условиях погружения (Фиг. 11A и 11B), в то время как в системе тетракультуры после воздействия данных соединений наблюдают уменьшение жизнеспособности (Фиг. 3A и 3B).
Несмотря на то, что в настоящей заявке были проиллюстрированы и описаны только определенные признаки настоящего изобретения, многие модификации, замены, изменения или эквиваленты будут понятны специалистам в данной области техники. Вследствие этого, следует понимать, что подразумевается, что данная заявка охватывает все такие модификации и изменения, которые входят в истинный объем сущности заявленного изобретения.