RSV-СПЕЦИФИЧНЫЕ АНТИТЕЛА И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЧАСТИ
RSV-SPECIFIC ANTIBODIES AND THEIR FUNCTIONAL PARTS

[001] Настоящая заявка является §371 национальной стадии международной заявки США № PCT/US2015/011391, поданной 14 января 2015, которая испрашивает преимущество предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 61/927819, поданной 15 января 2014 г., которые включены в данный документ посредством ссылки.
Область техники
[002] Настоящая заявка относится к области биотехнологии и медицины.
Предпосылки изобретения
[003] Респираторный синцитиальный вирус (RSV) является вирусом простуды, принадлежащим к семейству парамиксовирусов. RSV является вирулентным, легко передающимся и наиболее распространенной причиной заболевания нижних дыхательных путей у детей в возрасте менее 2 лет. До 98% детей, посещающих детский сад, будут инфицированы за один сезон распространения RSV. От 0,5% до 3,2% детей с RSV-инфекцией требуют госпитализации. В США регистрировали примерно 90000 случаев поступления в лечебные заведения и 4500 случаев смерти в год. Основными факторами риска госпитализации в связи с RSV являются преждевременные роды, хроническое заболевание легких, врожденный порок сердца, ослабленный иммунитет и возраст менее 6 недель у в остальном здоровых детей. Существует необходимость в дополнительном лечении RSV-положительного бронхиолита помимо поддерживающей терапии в виде надлежащщего питания и кислородной терапии. Для противовирусных терапевтических средств, таких как рибавирин, не была подтверждена эффективность в отношении RSV-инфекции. Одно моноклональное антитело, паливизумаб (также называемое Synagis), зарегистрировано как профилактическое средство против RSV-инфекции. Паливизумаб представляет собой генно-инженерное (гуманизированное) моноклональное антитело к белку RSV, отвечающему за слияние. Хотя паливизумаб был весьма эффективным профилактическим средством, преимущественными являлись бы альтернативные антитела и терапевтические средства, обеспечивающие дополнительную защиту от RSV.
[004] Целью является получение средств и способов для противодействия и/или предупреждения RSV-инфекции. Дополнительной целью является получение альтернативных и/или улучшенных антител к RSV или функциональных эквивалентов таких антител, а также получение стабильных клеток, способных к образованию антител к RSV или их функциональных эквивалентов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[005] В соответствии с описанием синтетическое, рекомбинантное или выделенное антитело или его функциональная часть, способные к специфичному связыванию с респираторным синцитиальным вирусом, содержат
a. последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9), и
b. последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 75% идентичную последовательности GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), и
c. последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), и
d. последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), и
e. последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности VASNLET (SEQ ID NO: 5), и
f. последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности QQYDNLP (SEQ ID NO: 6),
и где по меньшей мере одна аминокислота в тяжелой цепи отличается от SEQ ID NO: 7, и указанная по меньшей мере одна аминокислота выбрана из следующих:
Положение относительно SEQ ID NO: 1
Аминокислота
19
K
23
K
28
T или L
29
F
30
S или E
37
V
45
L
77
S
81
M
82
E или H
84
S
98
R
[006] В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат
a. последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9),
b. последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10),
c. последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11),
d. последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4),
e. последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или
f. последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[007] В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат
a. последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9),
b. последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10),
c. последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11),
d. последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4),
e. последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую VASNLET (SEQ ID NO: 5), и
f. последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[008] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
82
E
84
S
[009] В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи отличаются от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
37
V
81
M
82
E
84
S
[010] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
37
V
45
L
81
M
82
E
84
S
[011] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
[012]
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
T
29
F
30
S
37
V
45
L
81
M
82
E
84
S
[013] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
82
E
84
S
[014] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
82
E
84
S
109
R
[015] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
[016]
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
77
S
81
M
84
S
98
R
[017] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
84
S
[018] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
77
S
81
M
82
E
84
S
[019] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
77
S
81
M
84
S
[020] В дополнительном варианте осуществления последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), и/или последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).
[021] В дополнительном варианте осуществления последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[022] В дополнительном варианте осуществления последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), и/или последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).
[023] В дополнительном варианте осуществления последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[024] В одном варианте осуществления синтетическое, рекомбинантное или выделенное антитело или его функциональная часть, способные к специфичному связыванию с F-антигеном RSV, содержат
a. последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность DYIIN (SEQ ID NO: 9), и
b. последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), и
c. последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), и
d. последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), и
e. последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность VASNLET (SEQ ID NO: 5), и
f. CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[025] В другом варианте осуществления синтетическое, рекомбинантное или выделенное антитело или его функциональная часть, способные к специфичному связыванию с F-антигеном RSV, содержат
a. последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность DYIIN (SEQ ID NO: 9), и
b. последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), и
c. последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), и
d. последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), и
e. последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность VASNLET (SEQ ID NO: 5), и
f. CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[026] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат Fc-область с Y в положении 252Y, T в положении 254T и E в положении 256, где нумерация соответствует EU-индексу у Кэбота.
[027] В еще одном дополнительном варианте осуществления способ ингибирования RSV-инфекции у субъекта включает введение субъекту антитела или его функциональной части, описанных в данном документе.
[028] В еще одном дополнительном варианте осуществления синтетическая, рекомбинантная или выделенная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его функциональную часть, описанные в данном документе.
[029] Дополнительные цели и преимущества частично будут изложены в следующем описании и частично будут очевидны из описания или могут быть изучены на практике. Цели и преимущества будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.
[030] Следует понимать, что как вышеприведенное общее описание, так и нижеследующее подробное описание являются лишь иллюстративными и пояснительными и не ограничивают формулу изобретения.
[031] Сопроводительные графические материалы, включенные в настоящее описание и образующие его часть, иллюстрируют один (несколько) вариант(вариантов) осуществления и вместе с описанием служат для пояснения принципов, описанных в данном документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[032] На фигурах 1A и B представлены последовательности тяжелой цепи D25 и некоторых вариантов тяжелой цепи (J, L и LA).
[033] На фигуре 2 представлены последовательности тяжелой цепи некоторых оптимизированных вариантов (1G7, 1F5, 2D10).
[034] На фигурах 3A и B представлены последовательности тяжелой цепи четырех дополнительных вариантов оптимизированного варианта 1G7. Варианты (1G7-GLM, B12-1, E3-5 и E9-2) получали для изменения pI путем внедрения остатков, свойственных зародышевому типу.
[035] На фигурах 4A и B показана активность D25 и некоторых его вариантов in vitro в анализе микронейтрализации.
[036] На фигурах 5A и B показано, что D25 и некоторые его варианты обеспечивают защиту от заражения подтипами A2 RSV и B RSV.
[037] На фигуре 6 показаны результаты заражения RSV A2 хлопковых хомяков у животных, обработанных 1G7, 1F5, D25 (обозначенным на фигуре как D25wt) или никаким из антител.
[038] На фигурах 7A и B показано, что 1G7 защищает как от RSV A2, так и от RSV B9320. Легочные титры RSV отложены на графике в зависимости от концентрации IgG человека в сыворотке крови в момент сбора.
[039] На фигурах 8A и B показана нейтрализация как RSV A2, так и RSV B9320 различными антителами.
[040] На фигурах 9A и B показан эпитоп для связывания с 1G7, как определено у мутантов, устойчивых к моноклональным антителам.
[041] На фигуре 10 показаны результаты анализа нейтрализации клинических изолятов RSV.
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[042] В таблице 1 представлен перечень определенных последовательностей, упоминаемых в вариантах осуществления настоящего изобретения.
Таблица 1
Описание
Последовательность
SEQ ID NO
CDR1 HC D25
NYIIN
1
CDR2 HC D25
GIIPVLGTVHYAPKFQG
2
CDR3 HC D25
ETALVVSTTYLPHYFDN
3
CDR1 LC D25
QASQDIVNYLN
4
CDR2 LC D25
VASNLET
5
CDR3 LC D25
QQYDNLP
6
D25,вариабельная область тяжелой цепи
10 20 30 40 50QVQLVQSGAE VKKPGSSVMV SCQASGGPLR NYIINWLRQA PGQGPEWMGG60 70 80 90 100IIPVLGTVHY APKFQGRVTI TADESTDTAY IHLISLRSED TAMYYCATET110 120 126ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
7
D25,вариабельная область легкой цепи
DIQMTQSPSS LSAAVGDRVT ITCQASQDIV NYLNWYQQKP GKAPKLLIYV ASNLETGVPS RFSGSGSGTD FSLTISSLQP EDVATYYCQQ YDNLPLTFGG GTKVEIKRTV
8
АльтернативнаяCDR1 HC
DYIIN
9
АльтернативнаяCDR2 HC
GIIPVLGTVHYGPKFQG
10
АльтернативнаяCDR3 HC
ETALVVSTTYRPHYFDN
11
J-вариант,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVMV SCQASGGPLR NYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY APKFQGRVTI TADESTDTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
12
L-вариант,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVMV SCQASGGPLR NYIINWVRQA PGQGLEWMGG IIPVLGTVHY APKFQGRVTI TADESTDTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
13
LA-вариант,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS NYIINWVRQA PGQGLEWMGG IIPVLGTVHY APKFQGRVTI TADESTDTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
14
1G7,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVMV SCQASGGLLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTDTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
15
1F5,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVMV SCQASGGPLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTDTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
16
2D10,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVMV SCQASGGPLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTDTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYRP HYFDNWGQGT LVTVSS
17
1G7-GLM,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGLLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTSTAY MHLSSLRSED TAMYYCARET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
18
B12-1,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGLLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTDTAY MHLSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
19
E3-5,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGLLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
20
E9-2,вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGLLE DYIINWVRQA PGQGPEWMGG IIPVLGTVHY GPKFQGRVTI TADESTSTAY MHLSSLRSED TAMYYCATET ALVVSTTYLP HYFDNWGQGT LVTVSS
21
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
I. Антитела или их функциональные части
[043] Представлены улучшенные RSV-специфичные антитела или их функциональные части, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с другими антителами. [0092] Антитела или их функциональные части, например, антитела или их антиген-связывающие фрагменты, варианты или производные, включают, без ограничений, поликлональные, моноклональные, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, Fv, образованные за счет дисульфидных связей (sdFv), фрагменты, содержащие VL- либо VH-домен, фрагменты, получаемые при помощи экспрессионной библиотеки Fab. Молекулы scFv известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США № 5892019. Молекулы иммуноглобулинов или антител, охватываемые настоящим раскрытием, могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекул иммуноглобулинов.
[044] Например, авторы настоящего изобретения добились успеха в получении RSV-специфичных антител с улучшенными свойствами по сравнению с прежними RSV-специфичными антителами, включающими улучшенную защиту от подтипов A RSV и подтипов B RSV, улучшенную нейтрализацию и более низкие значения IC50. Такие антитела обладают особенно высокой или сильной аффинностью к RSV и поэтому особенно подходят для противодействия RSV-инфекции и/или неблагоприятным эффектам RSV-инфекции и/или по меньшей мере частичного их предупреждения. Антитела и их функциональные части синонимичны RSV-специфичным связывающим молекулам и включают в себя любые антитела полной длины или части антител, способные к специфичному связыванию с RSV.
A. Антитела или их функциональные части с остатками, не свойственными зародышевому типу, измененными на остатки, свойственные зародышевому типу
[045] В одном варианте осуществления по меньшей мере один остаток, не свойственный зародышевому типу, вариабельной области тяжелой цепи D25 (SEQ ID NO: 7) изменен на остаток, свойственный зародышевому типу. В другом варианте осуществления по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков, не свойственных зародышевому типу, из остатков вариабельной области тяжелой цепи D25 заменены обратно на остаток, свойственный зародышевому типу. В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере один остаток, не свойственный зародышевому типу, может быть изменен на остаток, свойственный зародышевому типу, и по меньшей мере одно положение в CDR может быть модифицировано по сравнению с SEQ ID NO: 7.
[046] Один вариант осуществления включает выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональную часть, способные к специфичному связыванию с респираторным синцитиальным вирусом и содержащие
a) последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 94% идентичную последовательности NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9),
b) последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 94% идентичную последовательности GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10),
c) последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 94% идентичную последовательности ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11),
d) последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 94% идентичную последовательности QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4),
e) последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 94% идентичную последовательности VASNLET (SEQ ID NO: 5), и
f) последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 94% идентичную последовательности QQYDNLP (SEQ ID NO: 6),
и где по меньшей мере одна аминокислота в тяжелой цепи отличается от SEQ ID NO: 7, и указанная по меньшей мере одна аминокислота выбрана из следующих:
Таблица 2
Положение относительноSEQ ID NO: 7
Тип изменения
Аминокислота
19
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
K
23
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
K
28
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
T или L
29
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
F
30
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
S или E
37
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
V
45
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
L
77
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
S
81
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу, изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
M
82
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу, изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
E или H
84
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
S
98
Остаток каркасной области, не свойственный зародышевому типу,изменен на остаток, свойственный зародышевому типу
R
[047] ʺПо меньшей мере одна аминокислота в вариабельной области тяжелой цепи отличается от SEQ ID NO: 7ʺ означает, что антитело или его функциональная часть должны содержать по меньшей мере одно аминокислотное различие по сравнению с SEQ ID NO: 7, хотя в некоторых вариантах осуществления они могут содержать более одного различия по сравнению с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления оно включает в себя замены, указанные в таблице 2, делеции или альтернативные аминокислоты в положениях, указанных в таблице 2, или различия (в том числе делеции, замены или добавления) в положениях, не перечисленных в таблице 2. Номера положений в таблице 2 приведены относительно SEQ ID NO: 7, и номер положения в итоге может не совпадать с номером положения согласно последовательной нумерации аминокислот в антителе или его функциональной части, представляющих интерес. Вместо этого, номера положений присваивают на основании выравнивания с SEQ ID NO: 7.
[048] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат тяжелую цепь и/или легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15, и где вариабельная область легкой цепи по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 8. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 8.
[049] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9).
[050] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10).
[051] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).
[052] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4).
[053] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от VASNLET (SEQ ID NO: 5).
[054] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[055] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[056] В некоторых вариантах осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере одну или вплоть до всех из CDR, идентичных SEQ ID NO: 7 (тяжелая цепь) и/или SEQ ID NO: 8 (легкая цепь).
[057] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9).
[058] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10).
[059] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).
[060] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), и/или последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).
[061] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4).
[062] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую VASNLET (SEQ ID NO: 5).
[063] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[064] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[065] В дополнительном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую NYIIN (SEQ ID NO: 1) или DYIIN (SEQ ID NO: 9), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2) или GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3) или ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[066] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, в каркасных областях на 95% идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 12-21.
[067] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, в каркасных областях идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 12-21.
[068] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 3. J-вариант
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
37
V
81
M
82
E
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 3, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 3, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[069] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 4. L-вариант
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
37
V
45
L
81
M
82
E
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 4, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 4, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[070] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
[071]
Таблица 5. LA-вариант
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
T
29
F
30
S
37
V
45
L
81
M
82
E
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 5, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 5, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[072] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 6. IG7
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
82
E
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 6, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 6, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[073] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 7. 1F5
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
82
E
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 7, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 7, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[074] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 8. 2D10
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
82
E
84
S
109
R
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 8, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 8, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[075] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 9. 1G7-GLM
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
77
S
81
M
84
S
98
R
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 9, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 9, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[076] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 10. B12-1
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
81
M
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 10, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 10, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[077] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 11. E3-5
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
77
S
81
M
82
E
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 11, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 11, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[078] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат по меньшей мере следующие аминокислоты в вариабельной области тяжелой цепи, отличающиеся от SEQ ID NO: 7:
Таблица 12. E9-2
Положение относительно SEQ ID NO: 7
Аминокислота
19
K
23
K
28
L
30
E
31
D
37
V
61
G
77
S
81
M
84
S
В другом варианте осуществления различия, приведенные в таблице 12, являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления различия, приведенные в таблице 12, не являются единственными различиями по сравнению с SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи содержит SEQ ID NO: 8.
[079] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21. В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности каркасной области (т.е. отличной от CDR) из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.
[080] В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV (SEQ ID NO: 8).
[081] В других вариантах осуществления применяют консервативную аминокислотную замену. Консервативная аминокислотная замена включает замену одной аминокислоты на другую, имеющую в целом аналогичные свойства (размер, гидрофобность и т.д.), так что общее функционирование, по всей видимости, не должно подвергаться серьезному воздействию.
B. Антитела или их функциональные части с улучшенными CDR
[082] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть могут содержать по меньшей мере одну мутацию CDR по сравнению с CDR, присутствующими в SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть могут содержать по меньшей мере одно из изменений согласно таблице 13. В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть могут содержать одно, два или все три изменения согласно таблице 13.
Таблица 13
Положение относительноSEQ ID NO: 7
Тип изменения
Аминокислота
31
Модификация CDR
D
61
Модификация CDR
G
109
Модификация CDR
R
[083] Другой вариант осуществления включает выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональную часть, способные к специфичному связыванию с F-антигеном RSV и содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность DYIIN (SEQ ID NO: 9), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность VASNLET (SEQ ID NO: 5), и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[084] Другой вариант осуществления включает выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональную часть, способные к специфичному связыванию с F-антигеном RSV и содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность NYIIN (SEQ ID NO: 1), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10), последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность VASNLET (SEQ ID NO: 5), и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[085] Другой вариант осуществления включает выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональную часть, способные к специфичному связыванию с F-антигеном RSV и содержащие последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность NYIIN (SEQ ID NO: 1), последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11), последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность VASNLET (SEQ ID NO: 5), и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QQYDNLP (SEQ ID NO: 6).
[086] В другом варианте осуществления выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело или его функциональная часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где по меньшей мере одна, две или все три CDR тяжелой цепи выбраны из столбца A, остальные CDR тяжелой цепи (при наличии таковых) выбраны из столбца B, а CDR легкой цепи содержат таковые из столбца C таблицы 14. Таким образом, в одном варианте осуществления CDR легкой цепи приведены в столбце C таблицы 14, а CDR тяжелой цепи могут быть скомбинированы из столбцов A и B при условии, что тяжелая цепь содержит по одной из каждой CDR1, CDR2 и CDR3.
Таблица 14. Альтернативные CDR одной группы вариантов осуществления
AАльтернативные CDR
BCDR D25
CCDR легкой цепи
CDR1
DYIIN(SEQ ID NO: 9)
NYIIN(SEQ ID NO: 1)
QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4)
CDR2
GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10)
GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2)
VASNLET(SEQ ID NO: 5)
CDR3
ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11)
ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3)
QQYDNLP(SEQ ID NO: 6)
[087] Различные альтернативные варианты осуществления CDR не обязательно содержат какую-либо из мутаций замены остатков, не свойственных зародышевому типу, на остатки, свойственные зародышевому типу, обсуждаемых выше в разделе I.A, но любая из них или все они могут необязательно присутствовать.
[088] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть могут содержать по меньшей мере одну альтернативную CDR тяжелой цепи из таблицы 14 и могут иметь по меньшей мере одну другую модификацию CDR. В частности, в еще одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть могут содержать последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от NYIIN (SEQ ID NO: 1), последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от GIIPVLGTVHYAPKFQG (SEQ ID NO: 2), последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной или двумя аминокислотами от ETALVVSTTYLPHYFDN (SEQ ID NO: 3), последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QASQDIVNYLN (SEQ ID NO: 4), последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от VASNLET (SEQ ID NO: 5), и/или последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, отличающуюся одной аминокислотой от QQYDNLP (SEQ ID NO: 6), где по меньшей мере одна CDR1 тяжелой цепи представляет собой DYIIN SEQ ID NO: 9), CDR2 тяжелой цепи представляет собой GIIPVLGTVHYGPKFQG (SEQ ID NO: 10) или CDR3 тяжелой цепи представляет собой ETALVVSTTYRPHYFDN (SEQ ID NO: 11).
C. Антитела или их функциональные части с улучшенным временем полужизни
[089] В одном варианте осуществления в антителах или их функциональных частях, описанных в данном документе, могут быть произведены дополнительные модификации для улучшения их времени полужизни. В одном варианте осуществления в антителах или их функциональных частях могут быть произведены мутации, такие как мутации по типу делеции, добавления или замены, для улучшения их времени полужизни. В одном варианте осуществления Fc-область можно подвергнуть мутации с включением одной, двух или всех трех следующих замен: M252Y, S254T и T256E, где нумерация соответствует EU-индексу у Кэбота. В одном варианте осуществления Fc-область можно подвергнуть мутации с включением всех следующих замен: M252Y, S254T и T256E, где нумерация соответствует EU-индексу у Кэбота. DallʹAcqua et al., Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn), J Biol Chem 281(33):23514-23524 (2006). Вариант осуществления со всеми тремя заменами обозначается как YTE-вариант. Иными словами, в одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть содержат Fc-область с Y в положении 252Y, T в положении 254T и E в положении 256, где нумерация соответствует EU-индексу у Кэбота.
D. Другие характеристики антител и их функциональных частей
[090] В определенном варианте осуществления антитело или его функциональная часть характеризуются значением IC50, составляющим менее 10 нг/мл, в анализе нейтрализации in vitro, где клетки HEp-2 инфицированы RSV и антителом или его функциональной частью. В другом варианте осуществления IC50 составляет 9 нг/мл, 8 нг/мл, 7 нг/мл, 6 нг/мл, 5 нг/мл, 4 нг/мл, 3 нг/мл или 2 нг/мл или менее для подтипа A RSV и/или подтипа B RSV. В одном варианте осуществления IC50 измеряют в анализе нейтрализации in vitro, описанном в примерах, необязательно для RSV A2 и/или RSV B9320.
[091] В одном варианте осуществления антитела и их функциональные части являются эффективными в нейтрализации штаммов RSV подтипа A. В одном варианте осуществления антитела и их функциональные части являются эффективными в нейтрализации штаммов RSV подтипа B. В другом варианте осуществления антитела и их функциональные части являются эффективными в нейтрализации штаммов RSV как подтипа A, так и подтипа B.
2
2
[092] Используемое в данном документе выражение "антитело или его функциональная часть" используется в самом широком смысле. Они могут быть искусственными, такими как моноклональные антитела (mAb), получаемые с помощью традиционной гибридомной технологии, рекомбинантной технологии, и/или их функциональный фрагмент. Они могут включать в себя как интактные молекулы иммуноглобулинов, например, поликлональное антитело, моноклональное антитело (mAb), моноспецифическое антитело, биспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, антитело животного (например, антитело верблюда), химерные антитела, так и части, фрагменты, области, пептиды и их производные (получаемые с помощью любой известной методики, такой как, без ограничений, ферментативное расщепление, синтез пептидов или рекомбинантные методики), такие как, например, иммуноглобулин, лишенный легких цепей, Fab, Fab', F (ab'), Fv, scFv, фрагмент антитела, диатело, Fd, CDR-области или любая часть или пептидная последовательность антитела, способная к связыванию с антигеном или эпитопом. В одном варианте осуществления функциональная часть представляет собой одноцепочечное антитело, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), Fab-фрагмент или F(ab')-фрагмент.
2
[093] Указывают, что антитело или его функциональная часть ʺспособны к связываниюʺ с молекулой, если они способны к специфичной реакции с молекулой с последующим связыванием молекулы с антителом. Фрагменты или части антител могут не содержать Fc-фрагмента интактного антитела, быстрее выводятся из кровотока и могут характеризоваться меньшим неспецифичным связыванием в ткани, чем интактное антитело. Примеры антитела могут быть получены из интактных антител с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, например, путем протеолитического расщепления ферментами, такими как папаин (с получением Fab-фрагментов) или пепсин (с получением F(ab')-фрагментов). Части антител могут быть получены с помощью любого из вышеупомянутых способов или могут быть получены путем экспрессии части рекомбинантной молекулы. Например, CDR-область(области) рекомбинантного антитела можно выделить и субклонировать в соответствующий вектор экспрессии.
[094] В одном варианте осуществления антитело или его функциональная часть представляют собой антитело человека. Применение антител человека для терапии человека может уменьшить вероятность появления побочных эффектов, обусловленных иммунной реакцией отдельного человека на последовательности, отличные от человеческих. В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть являются гуманизированными. В другом варианте осуществления антитело или его функциональная часть представляют собой химерное антитело. Таким образом, последовательности, представляющие интерес, такие как, например, участок связывания, представляющий интерес, могут быть включены в антитело или его функциональную часть.
[095] В одном варианте осуществления антитело может иметь изотип IgG, IgA, IgM или IgE. В одном варианте осуществления антитело представляет собой IgG.
II. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их функциональные части
[096] В вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно представлена выделенная, синтетическая или рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая любое из антител или их функциональных частей, описанных в разделе I.A или I.B выше. Такую нуклеиновую кислоту выделяют, например, из B-клетки, способной к образованию антитела или его функциональной части. Такие нуклеиновые кислоты кодируют последовательности тяжелой и легкой цепей, приведенные в данном документе. Альтернативно, такие нуклеиновые кислоты кодируют последовательности тяжелой и легкой цепей, соответственно содержащие CDR тяжелой и легкой цепей, приведенные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты будут кодировать функциональные части антител, описанных в данном документе. По причине вырожденности кода нуклеиновых кислот несколько нуклеиновых кислот будут кодировать одну и ту же аминокислоту, и все они охватываются данным документом.
III. Способы применения
A. Способы применения антител или их функциональных частей
[097] В одном варианте осуществления антитело или его функциональную часть можно применять в способе лечения или в качестве лекарственного препарата. Способ можно применять для противодействия RSV-инфекции или по меньшей мере частичного ее предупреждения, или для противодействия неблагоприятным эффектам RSV-инфекции или по меньшей мере частичного их предупреждения. Способ также включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его функциональной части, описанных в данном документе. В одном варианте осуществления индивидуумом, нуждающимся в этом, является пациент-человек.
[098] В одном варианте осуществления в целях противодействия RSV антитело или его функциональную часть можно вводить индивидууму до того, как произошло инфицирование RSV, иными словами, в качестве профилактического средства. Альтернативно, антитело или его функциональную часть можно вводить, когда индивидуум уже инфицирован RSV. Указанное антитело или его функциональную часть можно вводить индивидуумам с повышенным риском развития RSV-инфекции, таким как, например, преждевременно родившиеся дети, индивидуумы с хроническим заболеванием легких, врожденным пороком сердца и/или ослабленным иммунитетом, дети в возрасте менее 6 недель. Преждевременно родившиеся дети включают как младенцев в их первый год жизни, так и детей в их второй год жизни, а также старших детей, у которых сохраняется риск развития RSV-инфекции. Люди пожилого возраста также имеют повышенный риск развития RSV-инфекции, и поэтому, с учетом риска, для них может предназначаться введение. Антитела или их функциональные части также можно вводить индивидуумам, у которых ранее была RSV-инфекция.
[099] Для терапевтического применения антитела или их функциональные части обычно объединяют с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом, разбавителем и/или наполнителем. В одном варианте осуществления антитела или их функциональные части объединяют с водой для инъекций, в другом варианте осуществления их получают в стерильном, не содержащем консервантов жидком растворе с гистидином, глицином и хлоридом. В другом варианте осуществления примеры подходящих носителей включают, например, гемоцианин фиссуреллы (KLH), сывороточный альбумин (например, BSA или RSA) и овальбумин. В другом варианте осуществления указанный подходящий носитель включает раствор, такой как, например, солевой раствор. В других вариантах осуществления антитела или их функциональные части представлены в лиофилизированной форме и смешиваются с водой для инъекций перед введением.
B. Способы применения нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их функциональные части
[0100] В еще одном варианте осуществления можно вводить нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его функциональную часть. После введения такой нуклеиновой кислоты антитела или их функциональные части образуются с помощью аппарата клетки-хозяина. Образующиеся антитела или их функциональные части способны к предупреждению RSV-инфекции и/или неблагоприятных эффектов RSV-инфекции и/или противодействию им.
[0101] Нуклеиновая кислота, кодирующая функциональную часть антитела, относится к нуклеиновой кислоте длиной по меньшей мере 30 пар оснований, длиной по меньшей мере 50 пар оснований или длиной по меньшей мере 100 пар оснований, обладающей по меньшей мере одной экспрессионной характеристикой (по характеру, не обязательно относящемся к количественной характеристике) нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая функциональную часть антитела, кодирует по меньшей мере аминокислотную последовательность, содержащую две или необязательно три CDR антител, описанных в данном документе.
IV. Способы получения антител и их функциональных частей
[0102] Также представлена выделенная антителообразующая клетка, способная к образованию антитела или его функциональной части. Антитела или их функциональные части, описанные в данном документе, можно получить из гибридомы, секретирующей антитело, или из полученной рекомбинантным путем клетки, которая была трансформирована или трансфицирована с геном или генами, кодирующими антитело или его функциональную часть.
[0103] Один вариант осуществления включает способ получения антитела или его функциональной части путем культивирования клеток-хозяев в условиях, в которых нуклеиновая кислота экспрессируется с получением антитела, с последующим извлечением антитела. Для экспрессии антитела или его функциональной части можно применять ряд линий клеток, в том числе, без ограничений, линии клеток млекопитающих. В одном варианте осуществления линии клеток могут быть человеческими. В другом варианте осуществления можно применять линии клеток бактерий или насекомых. В одном варианте осуществления линии клеток включают клетки яичника китайского хомячка (CHO), варианты клеток CHO (например, DG44), клетки 293 и клетки NSO. В другом варианте осуществления линии клеток включают клетки VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293F, 293T, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, а также T47D, CRL7030 и HsS78Bst.
[0104] В рекомбинантной экспрессии используется конструкция вектора экспрессии, содержащая полинуклеотид, который кодирует антитело или его функциональную часть. Непосредственно после получения полинуклеотида вектор для получения антитела может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известной из уровня техники. Векторы экспрессии могут содержать соответствующие сигналы контроля транскрипции и трансляции. Этого можно достичь с помощью методик рекомбинантных ДНК in vitro, методик синтеза и генетической рекомбинации in vivo. В одном варианте осуществления реплицируемый вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или его функциональную часть, функционально связанную с гетерологичным промотором.
[0105] Для экспрессии антител или их функциональных частей можно использовать ряд векторных систем экспрессии в хозяине, как описано в патенте США № 5807715. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (CHO), совместно с вектором, таким как промоторный элемент главного предраннего гена цитомегаловируса человека, являются эффективной системой экспрессии для антител (Foecking et al., Gene, 45:101 (1986); и Cockett et al., Bio/Technology, 8:2 (1990)). В дополнение, можно выбрать такой штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и осуществляет процессинг продукта гена определенным желаемым способом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка. Разные клетки-хозяева имеют характерные и конкретные механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков, а также продуктов генов. Можно выбирать подходящие линии клеток или системы экспрессии в хозяине для обеспечения правильной модификации и процессинга белка по настоящему изобретению. В связи с этим можно применять эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена.
[0106] В бактериальных системах количество векторов экспрессии можно выбирать в зависимости от предполагаемого применения экспрессируемых антитела или его функциональной части. Например, если необходимо получить большое количество такого антитела или его функциональной части для создания фармацевтических композиций, содержащих антитело или его функциональную часть, желательными могут быть векторы, управляющие высокими уровнями экспрессии продуктов на основе белка слияния, которые легко очищаются. Такие векторы включают, без ограничений, вектор экспрессии pUR278 в E. coli (Ruther et al., EMBO J. 12:1791 (1983)), в котором кодирующая последовательность может быть отдельно лигирована в вектор внутри рамки с кодирующей областью lacZ таким образом, что вырабатывается белок слияния; векторы pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) и т.п. Также можно применять векторы pGEX для экспрессии чужеродных полипептидов в виде белков слияния с глутатион-S-трансферазой (GST). Как правило, такие белки слияния являются растворимыми, и их можно легко очищать из лизированных клеток посредством адсорбции и связывания с аффинной матрицей на основе глутатион-агарoзы с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX разработаны таким образом, что в экспрессируемый полипептид внедряются сайты протеазного расщепления тромбином и/или фактором Xa, так что клонируемый целевой продукт гена можно освободить от GST-фрагмента.
[0107] В системе на основе клеток насекомых в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов применяют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Последовательность, кодирующую белок, можно отдельно клонировать в несущественные области генома вируса (например, ген полиэдрина) и помещать под контроль промотора AcNPV (например, промотора гена полиэдрина).
[0108] В клетках-хозяевах, являющихся клетками млекопитающих, можно использовать множество вирусных систем экспрессии. В случаях, когда в качестве вектора экспрессии применяют аденовирус, кодирующую последовательность, представляющую интерес, можно лигировать с комплексом контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например, содержащим поздний промотор и лидерную последовательность из трех частей. Данный химерный ген можно затем вставлять в геном аденовируса путем рекомбинации in vitro или in vivo. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область E1 или E3) будет приводить к получению рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен к экспрессии антитела или его функциональной части у инфицированных хозяев (например, см., Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)). Для эффективной трансляции вставленных последовательностей, кодирующих антитело или его функциональную часть, также могут быть необходимы конкретные сигналы инициации. Эти сигналы включают в себя инициирующий кодон ATG и прилежащие последовательности. Кроме того, инициирующий кодон, как правило, должен находиться внутри рамки по отношению к рамке считывания желаемой кодирующей последовательности для обеспечения трансляции всей вставки. Эти экзогенные сигналы контроля трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения соответствующих транскрипционных энхансерных элементов, терминаторов транскрипции и т.п. (см., например, Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)).
[0109] Стабильную экспрессию можно применять для длительного высокопродуктивного получения рекомбинантных белков. Например, можно создать линии клеток, стабильно экспрессирующих молекулу белка. Клетки-хозяева можно трансформировать подходящим образом сконструированным вектором, содержащим элементы контроля экспрессии (например, промотор, энхансер, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.п.) и ген селектируемого маркера. После внедрения чужеродной ДНК клеткам можно позволить расти в течение 1-2 суток на обогащенной среде, и затем их переводят на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам со стабильно интегрированной в их хромосомы плазмидой расти и образовывать фокусы, которые, в свою очередь, можно клонировать и наращивать с получением линий клеток. Плазмиды, которые кодируют антитело или его функциональную часть, можно применять для внедрения гена/кДНК в любую линию клеток, подходящую для выработке в культуре.
[0110] Можно применять ряд систем отбора, в том числе, без ограничений, можно использовать гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22:8-17 1980) в tk-, hgprt- или aprT- клетках, соответственно. Также можно применять устойчивость к антиметаболитам в качестве основы для отбора по следующим генам: dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); и Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):155-2 15 (1993)); и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантных ДНК, можно применять обычным путем для выбора желаемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); и в главах 12 и 13 Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150:1.
[0111] Непосредственно после получения антитела или его функциональной части путем рекомбинантной экспрессии их можно очистить любым известным из уровня техники способом очистки молекулы иммуноглобулина, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности, по аффинности к специфическим антигенам белку A или белку G, и колоночной хроматографии размеров), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной методики очистки белков. Дополнительно, белки по настоящему изобретению или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом известными из уровня техники, для облегчения очистки.
[0112] В некоторых вариантах осуществления получают клетки, образующие RSV-специфичные антитела, стабильные в течение по меньшей мере шести месяцев. В другом варианте осуществления клетка, образующая RSV-специфичные антитела, является стабильной в течение по меньшей мере девяти недель, по меньшей мере трех месяцев или по меньшей мере шести месяцев. В другом варианте осуществления представлены альтернативные способы получения антител и их функциональных частей, хорошо известные из уровня техники и описанные по меньшей мере в патенте США № 8562996.
[0113] Теперь подробно обратимся к иллюстративным вариантам осуществления настоящего изобретения, примеры которых проиллюстрированы в прилагаемых графических материалах. Там, где это возможно, одни и те же ссылочные номера будут применяться во всех графических материалах для обозначения одних и тех же или подобных частей. Специалистам в данной области будут очевидны другие варианты осуществления после рассмотрения описания и практического применения, раскрытых в данном документе. Варианты осуществления дополнительно поясняются в следующих примерах. Эти примеры не ограничивают объем формулы изобретения, а служат лишь для разъяснения определенных вариантов осуществления. Предполагается, что описание и примеры будут рассматриваться лишь как иллюстративные, при этом истинные объем и сущность указаны в следующей формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение и экспрессия моноклональных антител
TM
2
[0114] Фрагменты ДНК, кодирующие вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина 1G7, каждый из которых содержит желаемые мутации, улучшающие эффективность антитела, вставляли в вектор экспрессии IgG1 человека, содержащий константную область легкой каппа-цепи и константную область CH1-шарнирный участок-CH2-CH3 тяжелой цепи IgG1. Для экспрессии антитела 1G7 человеческие эмбриональные клетки почек 293-F транзиентно трансфицировали вектором, содержащим 1G7, с помощью реагента 293Fectin (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Клетки выращивали при 37°C, 120 об./мин. при 5% CO и 80% влажности. Культуральную среду подавали на второй день путем добавления равного объема среды и собирали через 10 дней после трансфекции. Надосадочную жидкость подвергали стерилизующей фильтрации для удаления клеток и дебриса. IgG очищали с применением колонки с белком A (колонка HiTrap с белком A, Sigma) и элюированный белок подвергали диализу против PBS в течение ночи при 4°C. Концентрацию IgG определяли путем количественной оценки белка на NanoDrop (Thermo Scientific).
[0115] Такой же подход использовали для получения других антител.
Пример 2. In vitro анализ микронейтрализации
2
2
5
[0116] Анализы микронейтрализации проводили следующим образом. Вкратце, 2-кратные серийные разведения mAb вносили в 384-луночные микротитрационные планшеты в среду для культуры клеток HEp-2 при объеме 15 мкл/лунка. Затем 15 мкл вируса RSV A2 либо RSV B 9320 разбавляли в среде для культуры клеток HEp-2 до концентрации, варьирующей в диапазоне от 80 до 150 PFU/лунка, и добавляли в каждую лунку, в том числе в контрольные лунки, содержащие только среду для культуры клеток HEp-2, и планшеты инкубировали в течение 1,5 часов при 37°C с 5% CO. В каждую лунку добавляли клетки HEp-2 при 2,5×10 клеток/мл в 30 мкл и планшеты инкубировали при 37°C с 5% CO. Спустя 3 дня для RSV A2 или 4 дня для RSV B9320 удаляли среду и добавляли 30 мкл ледяной смеси 80% ацетона/20% PBS для фиксации клеток.
2
4
[0117] Репликацию вируса измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с применением конъюгированных с пероксидазой хрена mAb к F-белку RSV, нацеливающегихся на участок C белка F RSV (1331H) (Beeler and van Wyke Coelingh, J Virol. 63(7):2941-2950 (1989). MAb 1331H разбавляли PBS в соотношении 1:6000 и в каждую лунку добавляли 30 мкл. Через два часа инкубирования при 37°C планшеты трижды промывали с помощью PBS-T. В каждую лунку добавляли 30 мкл TMB для пероксидазы и планшеты инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. Реакцию останавливали путем добавления 15 мкл 2 н. HSO в каждую лунку. Метаболизм субстрата измеряли путем отслеживания поглощения при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов. Значения IC50 рассчитывали с помощью нелинейного алгоритма аппроксимации в GraphPad Prism с использованием зависимости ответа от логарифма концентрации (ингибитора) с аппроксимацией кривой с переменным наклоном, и они представляют концентрацию mAb, необходимую для 50% снижения поглощения, измеряемого при 450 нм.
[0118] Результаты представлены на фигуре 4, на которой показано, что каждое из 1G7, 1F5, 2D10 и D25 ингибировало репликацию RSV A2 и RSV B9320 при микронейтрализации. Наиболее эффективным было 1G7, за которым следовали 1F5, 2D10, а затем D25.
Пример 3. Модель заражения RSV на хлопковых хомяках
A) Сравнение способности D25 и J,- L- и LA-вариантов к обеспечению защиты от заражения RSV
6
[0119] Животным вводили дозы 0,1 мл антитела путем внутримышечной инъекции при различных уровнях доз, указанных на фигуре. Через двадцать четыре часа животных анестезировали с использованием изофлурановой камеры и инфицировали путем закапывания в нос 1×10 PFU/животное RSV штамма A2. Четыре дня спустя животных умерщвляли путем удушения диоксидом углерода; их легкие удаляли хирургическим путем, разрезали пополам и замораживали в жидком азоте или обрабатывали незамедлительно. Образцы крови получали путем пункции сердца в момент умерщвления.
5
2
2
[0120] Для оценки эффекта введения mAb в отношении репликации RSV в легких хлопковых хомяков в каждой дозовой группе определяли титр вируса для RSV в гомогенатах легких хлопковых хомяков. Для этой цели собранные легкие по отдельности гомогенизировали в 10 частях (вес/объем) сбалансированного солевого раствора Хэнкса с добавлением сахарозофосфата с использованием гомогенизатора тканей FastPrep 24 в течение 20 секунд с пробирками с лизирующей матрицей TeenA при комнатной температуре. Полученные в результате суспензии центрифугировали при 930 ×g в течение 10 мин. при 4°C и образцы надосадочной жидкости собирали и хранили при -80°C до проведения анализа. Гомогенизированные образцы легких разбавляли 1:10 и 1:100 в культуральной среде и 50 мкл неразбавленных гомогенизированных образцов легких либо разбавленных гомогенизированных образцов легких добавляли в дублирующие лунки с клетками HEp-2, которые были высеяны при плотности клеток 2,5 × 10 клеток/лунка в 24-луночные планшеты за 24 часа до инокуляции. Через 1 час инкубирования при 37°C с 5% CO инокулят заменяли на культуральную среду, содержащую 0,8% метилцеллюлозу, и клетки инкубировали при 37°C с 5% CO. Спустя пять дней удаляли верхний слой и клетки фиксировали и подвергали иммунному окрашиванию с помощью поликлонального антитела козы к RSV, а затем вторичного антитела к иммуноглобулинам козы, конъюгированного с HRP. Бляшки визуализировали посредством реакции с реагентом AEC. Бляшки оценивали количественно под микроскопом с использованием объектива с 10-кратным увеличением. Предел обнаружения для данного анализа составляет 200 PFU/г ткани. Образцы с титром вируса ниже предела обнаружения (< 200 PFU/г) обозначали как 100 PFU/г (половина нижнего предела обнаружения) для целей статистического анализа. Результаты, представленные на фигуре 5, демонстрируют, что все из J-, L- и LA-вариантов являются более эффективными, чем D25, в защите от заражения RSV A, но что L- и LA-варианты были менее эффективными в защите от подтипов RSV B (при этом L в отношении одного штамма B функционировал лучше по сравнению с другим). На основании этих данных J был выбран в качестве исходной точки для дальнейшей оптимизации.
B) Сравнение способности вариантов 1G7, 1F5 и D25 к обеспечению защиты от заражения RSV
[0121] Модель, обсуждаемую выше в части (A) данного примера, применяли для сравнения способности 1G7, 1F5 и D25 к обеспечению защиты от заражения RSV. Животным вводили дозы 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг и 0,25 мг/кг. Результаты показаны на фигуре 6. Данные показывают, что 1G7 функционировало лучше, чем 1F5, в защите от заражения RSV, хотя оба из них были способны снижать титр вируса до предела обнаружения. Как 1G7, так и 1F5 функционировали лучше, чем D25.
C) Подробная оценка варианта 1G7
[0122] На хлопковых хомяках применяли ту же модель, которая описана в разделе (A) выше. Каждое животное получало 0,1 мл антитела при наличии различных концентраций антитела, как представлено на фигуре 7. 1G7 демонстрирует зависимость "доза-эффект" в отношении легочного титра RSV как для RSV A2, так и для RSV B9320.
D) Сравнение способности вариантов к нейтрализации RSV A2 и RSV B9320
[0123] На хлопковых хомяках применяли ту же модель, которая описана в разделе (A) выше.
[0124] Значения концентрации IgG человека в образцах сыворотки крови хлопковых хомяков в день сбора легких определяли с помощью способа ELISA. В этом анализе антитела человека захватывали с помощью антитела козы к иммуноглобулинам человека, связанного с микротитрационными планшетами. Антителом козы к IgG человека (H+L) (0,5 мкг/мл в 1× PBS) покрывали 384-луночные микротитрационные планшеты Nunc MaxiSorp на ночь при 4°C в объеме 30 мкл. Планшеты промывали, затем блокировали 60 мкл раствора PBS+3% термоинактивированной козьей сыворотки крови в течение 1 часа при комнатной температуре. Блокирующий буфер удаляли и образцы применяли следующим образом. Двукратное серийное разведение стандартного антитела человека, разбавленного в аналитическом буфере, применяли для построения калибровочной кривой с диапазоном концентраций от 500 нг/мл до 0,488 нг/мл. Калибровочные кривые аппроксимировали с помощью 4-параметрической аппроксимации кривой.
[0125] Результаты, представленные на фигуре 8, показывают, что варианты, описанные в данном документе, характеризуются более низкими значениями IC50, чем D25, при нейтрализации как RSV A2, так и RSV B9320. Это также демонстрирует, что в отношении вируса A2 или B9320 не наблюдали утрату активности, при этом наблюдали повышение активности для E9-2 и B12-1 и лишь незначительную утрату активности в отношении вируса B9320 для 1G7-GLM и E3-5.
Пример 4. Эпитоп, определяемый у мутантов, устойчивых к моноклональным антителам
[0126] Мутантные вирусы RSV A и RSV B выделяли тремя пассажами в присутствии 250 нг/мл 1G7-YTE. 1G7-YTE представляет собой антитело 1G7 с мутацией YTE, описанной выше в вышеприведенном разделе I.C. После последнего пассажа определяли последовательность F-белка RSV. Мутации соответствуют областям, ранее определенным в совместной кристаллической структуре F-белка RSV и исходного антитела D25. Все устойчивые мутанты содержали изменения в области F-белка RSV, в области F1, среди аминокислот 200-213. Не было показано, что вторичные мутации в положении 294 повышают устойчивость, и их носители не были более устойчивыми, чем таковые с одиночной мутацией в области 200-213. Вторичные мутации в области F2 в окружении мутации N208S приводили к повышению устойчивости. Результаты представлены на фигуре 9.
Пример 5. Нейтрализация клинических изолятов RSV
[0127] Анализ нейтрализации проводили путем предварительного инкубирования размножаемых клинических изолятов вирусов c серией разведений антител перед инфицированием клеток HEp2. Инфицирование клеток измеряли в зависимости от экспрессии F-белка на поверхности клеток. Значения IC50 рассчитывали путем нелинейной аппроксимации кривых нейтрализации. Репликацию вируса измеряли согласно примеру 2 (анализ микронейтрализации in vitro).
[0128] Результаты представлены на фигуре 10. IC50 как для 1G7, так и для 1F5 были более низкими, чем для D25, при нейтрализации изолятов A или изолятов B RSV в клетках HEp2.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[0129] Все литературные источники, цитируемые в данном документе, в том числе патенты, заявки на патенты, статьи, учебники и т.п., и литературные источники, цитируемые в данном документе, до той степени, в которой они уже не являются таковыми, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
[0130] Изложенное выше письменное описание считается достаточным, чтобы дать возможность специалисту в данной области реализовать на практике варианты осуществления. В изложенных выше описании и примерах подробно определены некоторые варианты осуществления и описан лучший способ осуществления, предполагаемый авторами настоящего изобретения. Будет понятно, однако, что, независимо от того, насколько подробно вышеизложенное может быть представлено в тексте, варианты осуществления можно реализовать на практике множеством способов, и формула изобретения включает любые их эквиваленты.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  МЕДИММЬЮН, ЭЛ.ЭЛ.СИ
<120>  RSV-СПЕЦИФИЧНЫЕ АНТИТЕЛА И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЧАСТИ
<130>  RSVNG-103WO1
<150>  61/927819
<151>  2014-01-15
<160>  21
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR1 тяжелой цепи D25
<400>  1
Asn Tyr Ile Ile Asn
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR2 тяжелой цепи D25
<400>  2
Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR3 тяжелой цепи D25
<400>  3
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr Phe Asp
1               5                   10                  15
Asn
<210>  4
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR1 легкой цепи D25
<400>  4
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  5
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR2 легкой цепи D25
<400>  5
Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1               5
<210>  6
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR3 легкой цепи D25
<400>  6
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
1               5
<210>  7
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи D25
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (19)..(19)
<223>  M также может представлять собой K
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (23)..(23)
<223>  Q также может представлять собой K
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (28)..(28)
<223>  P также может представлять собой T или L
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (29)..(29)
<223>  L также может представлять собой F
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (30)..(30)
<223>  R также может представлять собой S или E
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (31)..(31)
<223>  N также может представлять собой D
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (37)..(37)
<223>  L также может представлять собой V
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (45)..(45)
<223>  P также может представлять собой L
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (61)..(61)
<223>  A также может представлять собой G
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (77)..(77)
<223>  D также может представлять собой S
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (81)..(81)
<223>  I также может представлять собой M
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (82)..(82)
<223>  H также может представлять собой E или H
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (84)..(84)
<223>  I также может представлять собой S
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (98)..(98)
<223>  T также может представлять собой R
<220>
<221>  ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222>  (109)..(109)
<223>  L также может представлять собой R
<400>  7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  8
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область легкой цепи D25
<400>  8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100                 105                 110
<210>  9
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Альтернативная CDR1 тяжелой цепи
<400>  9
Asp Tyr Ile Ile Asn
1               5
<210>  10
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Альтернативная CDR2 тяжелой цепи
<400>  10
Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  11
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Альтернативная CDR3 тяжелой цепи
<400>  11
Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Arg Pro His Tyr Phe Asp
1               5                   10                  15
Asn
<210>  12
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  J-вариант вариабельной области тяжелой цепи
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  13
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  L-вариант вариабельной области тяжелой цепи
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  14
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  LA-вариант вариабельной области тяжелой цепи
<400>  14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  15
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи 1G7
<400>  15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  16
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи 1F5
<400>  16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  17
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи 2D10
<400>  17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Arg Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  18
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи 1G7-GLM
<400>  18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  19
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи B12-1
<400>  19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  20
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи E3-5
<400>  20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  21
<211>  126
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи E9-2
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Leu Leu Glu Asp Tyr
20                  25                  30
Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Gly Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<---