АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ СЕКРЕТОМОВ

1. Способ определения активности супернатанта культуры клеток млекопитающих для применения в лечении воспалительного состояния, включающий стадии
a) инкубации эукариотических клеток в культуральной среде, содержащей или состоящей из указанного супернатанта,
b) измерения промоторной активности промотора активирующего белка 1 (AP-1) и/или промотора ядерного фактора энхансера гена легкой цепи каппа в активированных В-клетках (NF-κB), и необязательно, измерения количества фосфорилированного белка теплового шока 27 (HSP27) высвобожденного эукариотическими клетками в культуральную среду со стадии a),
где супернатант культуры клеток млекопитающих имеет потенциал для применения в лечении воспалительного состояния, если промоторная активность по меньшей мере одного промотора по меньшей мере на 50% выше, по сравнению с промоторной активностью, измеренной когда эукариотические клетки культивируют в культуральной среде, не содержащей указанного супернатанта и если, необязательно, количество фосфорилированного HSP27, высвобожденного в культуральную среду со стадии a), по меньшей мере на 20% выше по сравнению с количеством фосфорилированного HSP27, высвобожденного в культуральную среду, когда эукариотические клетки культивируют в культуральной среде, не содержащей указанного супернатанта.
2. Способ по п. 1, где измеряют промоторную активность по меньшей мере одного дополнительного промотора, выбранного из группы, состоящей из промотора бокса 2 области определения пола Y (Sox2), промотора передатчика сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3), промотора белка 1 ответа роста на ранних стадиях (EGR-1) и промотора элемента ответа на сыворотку (SRE).
3. Способ определения активности супернатанта культуры клеток млекопитающих для применения в лечении воспалительного состояния, включающий стадии
a) инкубации эукариотических клеток в культуральной среде, содержащей или состоящей из указанного супернатанта,
b) измерения промоторной активности промотора активирующего белка 1 (AP-1) и/или промотора ядерного фактора энхансера гена легкой цепи каппа в активированных В-клетках (NF-xB), и необязательно, измерения количества фосфорилированного белка теплового шока 27 (HSP27), высвобожденного эукариотическими клетками в культуральную среду со стадии a),
где супернатант культуры клеток млекопитающих имеет потенциал для применения в лечении воспалительного состояния, если промоторная активность по меньшей мере одного промотора на вплоть до 25% выше или ниже, по сравнению с промоторной активностью, измеренной, когда эукариотические клетки культивируют в культуральной среде, содержащей эталонный супернатант клеток млекопитающих, который можно применять в лечении воспалительного состояния, и если, необязательно, количество фосфорилированного HSP27, высвобожденного в культуральную среду со стадии a), на вплоть до 25% выше или ниже по сравнению с количеством фосфорилированного HSP27, высвобожденного в культуральную среду со стадии a), содержащую эталонный супернатант клеток млекопитающих, который можно применять в лечении воспалительного состояния.
4. Способ по п. 4, где измеряют промоторную активность по меньшей мере одного дополнительного промотора, выбранного из группы, состоящей из промотора бокса 2 области определения пола Y (Sox2), промотора передатчика сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3), промотора белка 1 ответа роста на ранних стадиях (EGR-1) и промотора элемента ответа на сыворотку (SRE).
5. Способ по любому из пп. 1-4, где супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).
6. Способ по любому из пп. 1-5, где воспалительное состояние представляет собой состояние, ассоциированное с ишемией, предпочтительно, состояние кожи или внутреннее воспалительное состояние.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где эукариотические клетки со стадии a) выбраны из группы, состоящей из базальных эпителиальных клеток пораженных аденокарциномой альвеол человека, предпочтительно, клеток A549, анеуплоидных иммортализованных клеток кератиноцитов (Ha-CaT), клеток эмбриональной почки человека (клетки HEK), предпочтительно, клеток HEK293, и клеток нейробластомы, предпочтительно, клеток SH-SY5Y.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где эукариотические клетки со стадии a) инкубируют в среде для культивирования клеток в течение по меньшей мере 2 часов, предпочтительно, по меньшей мере 4 часов, более предпочтительно, по меньшей мере 6 часов, более предпочтительно, по меньшей мере 12 часов, более предпочтительно, по меньшей мере 18 часов, более предпочтительно, по меньшей мере 24 часов.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где культуральная среда содержит по меньшей мере 20%, предпочтительно, по меньшей мере 50%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, указанного супернатанта.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где среда для культивирования клеток со стадии a) представляет собой среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM), среду Хэма F12 (F12), минимальную эссенциальную среду или комбинацию одной или нескольких из этих сред.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где среда для культивирования клеток со стадии a) содержит 2-20%, предпочтительно, 5-15%, эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и/или L-аланил-L-глутамина.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где эукариотические клетки содержат по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, содержащую промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора AP-1, промотора NF-κB, промотора Sox2, промотора STAT3, промотора EGR-1 и промотора SRE, функционально связанный по меньшей мере с одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей репортерный белок.
13. Способ по п. 12, где репортерный белок выбран из группы, состоящей из люциферазы, предпочтительно, люциферазы светляка, и флуоресцентного белка, предпочтительно, зеленого флуоресцентного белка.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где количество белка, высвобожденного клетками в культуральную среду, определяют посредством иммунологического способа, предпочтительно посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), посредством фотометрического способа или посредством флуоресцентного способа.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где эукариотические клетки со стадии a) представляют собой базальные эпителиальные клетки пораженных аденокарциномой альвеол человека, предпочтительно, клетки A549, HaCaT или клетки HEK, предпочтительно, клетки HEK293, и определяют количество фосфорилированного HSP27.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где промоторная активность по меньшей мере одного промотора по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 100%, более предпочтительно, по меньшей мере на 150%, более предпочтительно, по меньшей мере на 200% выше, по сравнению с промоторной активностью, измеренной, когда эукариотические клетки культивируют в культуральной среде, не содержащей указанного супернатанта.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где эукариотические клетки со стадии a) представляют собой базальные эпителиальные клетки пораженных аденокарциномой альвеол человека, предпочтительно, клетки A549, клетки HaCaT или клетки HEK, предпочтительно, клетки HEK293, когда измеряют количество фосфорилированного HSP27, высвобожденного в культуральную среду.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где эукариотические клетки со стадии a) представляют собой клетки нейробластомы, предпочтительно, клетки SH-SYSY, или клетки HaCaT, содержащие по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, содержащую промотор AP-1, функционально связанный по меньшей мере с одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей репортерный белок.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где эукариотические клетки со стадии a) представляют собой базальные эпителиальные клетки пораженных аденокарциномой альвеол человека, предпочтительно, клетки A549, содержащие по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, содержащую промотор NF-κB или Sox2, функционально связанный по меньшей мере с одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей репортерный белок.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где эукариотические клетки со стадии a) представляют собой клетки HEK, предпочтительно, клетки HEK293, содержащие по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, содержащую промотор EGR-1, SRE, AP-1 или STAT3, функционально связанный по меньшей мере с одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей репортерный белок.