СРЕДСТВА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ получения вирусного вектора на основе AAV, включающий:
a. культивирование адгезивных клеток;
b. трансфекцию адгезивных клеток плазмидой(-ами) с обеспечением продуцирования вирусного вектора на основе AAV;
c. лизис адгезивных клеток с выделением вирусного вектора на основе AAV;
d. подкисление и осветление клеточного лизата из (c);
e. очистку продукта из (d) с применением катионообменной хроматографии (CEX);
f. фильтрование продукта из (e) с применением фильтрации в тангенциальном потоке (TFF);
g. ультрацентрифугирование продукта из (f) в буфере с хлоридом цезия (CsCl); и
h. сбор вирусных векторов на основе AAV из продукта из (g).
2. Способ по п. 1, где AAV представляет собой AAV9.
3. Способ по п. 1 или 2, где AAV является самокомплементарным (scAAV).
4. Способ по любому из пп. 1-3, где адгезивные клетки представляют собой клетки HEK293.
5. Способ по п. 4, где стадия (а) включает посев клеток в крупномасштабный биореактор, который может обеспечивать непрерывную циркуляцию среды для культивирования клеток.
2
6. Способ по п. 5, где плотность посева составляет приблизительно 8000-12000 клеток/см.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где стадия трансфекции (b) включает приведение в контакт адгезивной клетки с хелперной плазмидой (pHELP) для аденовируса, и с плазмидой, кодирующей гены rep AAV и cap AAV.
8. Способ по п. 7, где ген rep AAV представляет собой rep2, и ген cap AAV представляет собой cap9.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где стадия трансфекции (b) включает приведение в контакт адгезивных клеток с плазмидой, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости мотонейронов (SMN), полинуклеотид, кодирующий MeCP2, или полинуклеотид, кодирующий SOD1 shRNA.
10. Способ по п. 9, где плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующий белок SMN1, содержит модифицированный ITR AAV2, промотор бета-актина курицы (CB), немедленно-ранний энхансер цитомегаловируса (CMV), модифицированный интрон поздней 16s SV40, сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH) и немодифицированный ITR AAV2.
11. Способ по п. 9 или 10, где полинуклеотид кодирует белок SMN под SEQ ID NO: 2.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит SEQ ID NO: 1.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где стадия трансфекции включает приведение в контакт адгезивной клетки со средством для трансфекции, представляющим собой полиэтиленимин (PEI).
14. Способ по любому из пп. 1-13, где стадия трансфекции включает приведение в контакт адгезивной клетки со средой для трансфекции, которая не содержит сыворотку, кальций или глутамин.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где стадия лизиса включает применение буфера для лизиса с добавлением бензоназы и TWEEN.
16. Способ по любому из пп. 1-15, дополнительно включающий замораживание клеточного лизата из стадии (c) до стадии подкисления (d).
17. Способ очистки вирусного вектора на основе AAV от лизата культуры клеток, включающий стадии:
a. подкисления и осветления клеточного лизата;
b. очистки продукта из (a) с применением катионообменной хроматографии (CEX);
c. фильтрования продукта из (b) посредством фильтрации в тангенциальном потоке;
d. ультрацентрифугирования продукта из (c) с применением 2 - 4 М буфера с хлоридом цезия (CsCl);
e. сбора вирусных векторов на основе AAV из продукта из (d);
f. фильтрования продукта из (e) посредством фильтрации в тангенциальном потоке.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где стадия подкисления включает подкисление клеточного лизата до значения pH, составляющего приблизительно 3,0 - 4,0.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где ультрацентрифугирование проводят при 40000 - 50000 об/мин.
2
20. Способ по любому из пп. 1-19, где буфер с CsCl содержит приблизительно 3 M CsCl, Tris, MgCl и полоксамер 188, и pH составляет приблизительно рН от 7,5 до 8,5.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где клеточный лизат инкубируют с Tween до стадии подкисления.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где стадия осветления предусматривает фильтрование клеточного лизата посредством глубинного фильтра.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где CEX предусматривает смолу с сульфонильными группами.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где по меньшей мере одна стадия TFF предусматривает применение целлюлозных мембран с порогом отсечения по молекулярной массе, представляющим собой MW приблизительно 300 кДа.
25. Способ по любому из пп. 1-24, где количество пустых вирусных капсидов составляет менее 7%, менее 5%, менее 3% или менее 1% от общего количества вирусных капсидов после сбора вирусных векторов на основе AAV из клеточного лизата, подвергнутого ультрацентрифугированию.
2
26. Способ по любому из пп. 17-25, где вирусные векторы на основе AAV, собранные после стадии второй TFF, хранят в растворе, содержащем Tris, MgCl, NaCl и полоксамер 188, и pH составляет приблизительно рН от 7,5 до 8,5.
27. Способ по любому из пп. 17-26, где вирусные векторы на основе AAV, собранные после второй TFF, содержат менее приблизительно 30 мкг/г или менее приблизительно 20 мкг/г CsCl.
13
28. Способ по любому из пп. 17-27, где концентрация вирусных векторов на основе AAV, собранных после второй TFF, составляет приблизительно 3×10 г. в./мл или больше.
15
15
16
29. Способ по любому из пп. 1-28, где получаемый выход AAV составляет более 5×10 г. в., или более 8×10 г. в., или более 1×10 г. в. на одну производственную партию.
30. Способ по любому из пп. 1-29, где вирусный вектор на основе AAV содержит полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости мотонейронов (SMN), полинуклеотид, кодирующий белок MeCP2, или полинуклеотид, кодирующий SOD1 shRNA.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая вирусный вектор на основе AAV9, полученный в соответствии со способом по любому из пп. 1-30.
32. Фармацевтическая композиция по п. 31, содержащая по меньшей мере одно из следующего:
13
a. менее приблизительно 0,09 нг бензоназы на 1,0×10 г. в.,
b. менее приблизительно 30 мкг/г (ppm) цезия,
c. приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188,
13
d. менее приблизительно 0,22 нг BSA на 1,0×10 г. в.,
5
13
e. менее приблизительно 6,8×10 пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10 г. в.,
5
13
f. менее приблизительно 1,1×10 пг остаточной hcDNA на 1,0×10 г. в.,
13
g. менее приблизительно 4 нг rHCP на 1,0×10 г. в.,
h. значение pH приблизительно 7,7-8,3,
i. приблизительно 390-430 мОсм/кг,
j. менее приблизительно 600 частиц размером ≥ 25 мкм на контейнер,
k. менее приблизительно 6000 частиц размером ≥ 10 мкм на контейнер,
13
13
l. геномный титр, составляющий приблизительно 1,7×10 - 2,3×10 г. в./мл,
8
10
13
m. инфекционный титр, составляющий приблизительно 3,9×10 - 8,4×10 МЕ на 1,0×10 г. в.,
13
n. общий белок, составляющий приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10 г. в.,
o. относительную активность, составляющую приблизительно 70-130%, и
p. менее приблизительно 5% пустых капсидов.
33. Фармацевтическая композиция, содержащая:
13
а. от 1 до 8×10 геномов вирусного вектора на основе AAV9/мл (г. в./мл);
b. менее чем приблизительно 7% пустых вирусных капсидов;
13
c. менее чем приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10 г. в./мл;
6
13
d. менее чем приблизительно 5×10 пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина на 1×10 г. в./мл;
13
и при этом по меньшей мере приблизительно 80% из 1 - 8×10 геномов вирусного вектора на основе AAV9/мл являются функциональными.
34. Композиция по п. 33, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости мотонейронов (SMN), полинуклеотид, кодирующий белок MeCP2, или полинуклеотид, кодирующий SOD1 shRNA.
35. Композиция по п. 33 или 34, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит модифицированный ITR AAV2, промотор бета-актина курицы (CB), немедленно-ранний энхансер цитомегаловируса (CMV), модифицированный интрон поздней 16s SV40, сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH) и немодифицированный ITR AAV2.
36. Композиция по п. 34 или 37, где полинуклеотид кодирует белок SMN под SEQ ID NO: 2.
37. Композиция по любому из пп. 33-36, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит SEQ ID NO: 1.
13
38. Композиция по любому из пп. 33-37, содержащая 1,7-2,3×10 г. в. на основе AAV9/мл.
39. Композиция по любому из пп. 33-38, где композиция представляет водный фармацевтический состав.
2
40. Композиция по п. 39, где водный фармацевтический состав содержит Tris-буфер, MgCl, NaCl и полаксамер 188.
41. Композиция по п. 39 или 40, где водный фармацевтический состав не содержит консерванта.
42. Композиция по п. 40 или 41, где:
(i) концентрация Tris-буфера составляет приблизительно 10-30 нМ;
(ii) pH состава составляет от приблизительно 7,7 до приблизительно 8,3;
2
(iii) концентрация MgCl составляет приблизительно 0,5-1,5 мМ;
(iv) концентрация NaCl составляет приблизительно 100-300 мМ;
(v) состав содержит приблизительно 0,005% вес./об. полоксамера 188;
(vi) водный фармацевтический состав имеет осмоляльность, составляющую 390-430 мОсм/кг.
43. Способ лечения спинальной мышечной атрофии (SMA) типа I у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение композиции по любому из пп. 34-42 пациенту, где пациент:
a. характеризуется возрастом, составляющим девять месяцев или меньше;
b. имеет массу тела по меньшей мере приблизительно 2,6 кг;
SMN1
c. имеет биаллельные нулевые мутации или делеции в  и
SMN2
d. имеет по меньшей мере одну функциональную копию .
14
44. Способ по п. 43, где вирусный вектор вводят в дозе, составляющей приблизительно 1-2,5×10 г. в./кг.
45. Способ по любому из пп. 43 или 44, где вес тела пациента составляет не более приблизительно 8,5 кг.
SMN2
46. Способ по любому из пп. 43-45, где у пациента нет замены c.859G> C в экзоне 7 по меньшей мере одной копии гена .
47. Способ по любому из пп. 43-46, где средство для лечения вводят пациенту до возраста 6 месяцев или до появления одного или нескольких симптомов SMA, выбранных из гипотонии, задержки развития двигательных навыков, слабого удержания головы, сутулой осанки и гипермобильности суставов.
48. Способ по любому из пп. 43-47, где вирусный вектор вводят в приблизительно 5-20 мл/кг, приблизительно 10-20 мл/кг или приблизительно 5,5-6,5 мл/кг солевого раствора, забуференного с помощью Tris.
49. Способ по любому из пп. 43-48, где эффективность определяют с применением шкалы CHOP-INTEND.
50. Способ по пп. 43-49, включающий введение объема дозы, выбранного из группы, состоящей из дозы 16,5 мл для пациента с весом тела 2,6-3,0 кг, дозы 19,3 мл для пациента с весом тела 3,1-3,5 кг, дозы 22,0 мл для пациента с весом тела 3,6-4,0 кг, дозы 24,8 мл для пациента с весом тела 4,1-4,5 кг, дозы 27,5 мл для пациента с весом тела 4,6-5,0 кг, дозы 30,3 мл для пациента с весом тела 5,1-5,5 кг, дозы 33,0 мл для пациента с весом тела 5,6-6,0 кг, дозы 35,8 мл для пациента с весом тела 6,1-6,5 кг, дозы 38,5 мл для пациента с весом тела 6,6-7,0 кг, дозы 41,3 мл для пациента с весом тела 7,1-7,5 кг, дозы 44,0 мл для пациента с весом тела 7,6-8,0 кг и дозы 46,8 мл для пациента с весом тела 8,1-8,5 кг.
51. Способ по любому из пп. 43-50, где композицию вводят внутривенной или интратекальной инфузией пациенту, нуждающемуся в этом.
52. Способ по п. 51, где инфузию вирусного вектора осуществляют в течение приблизительно 45 - 75 мин.
13
2
53. Набор, содержащий флаконы, содержащие приблизительно 5,5 мл или приблизительно 8,3 мл вирусного вектора на основе AAV9, содержащего полинуклеотид, кодирующий белок выживаемости мотонейронов (SMN), и составленного в концентрации, составляющей приблизительно 2,0×10 г. в./мл, в 20 мМ Tris, 1 мМ MgCl, 200 мМ NaCl, 0,005% вес/об. полоксамера 188 при pH 7,7-8,3.