СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БРОМЕЛАЙНА, ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ
METHOD FOR OBTAINING A HETEROGENEOUS PREPARATION BASED ON BROMELAIN, IMMOBILIZED USING ION-EXCHANGE RESINS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности, а именно в хлебопекарной промышленности, при изготовлении сыра и творога, а также в пивоварении.
Бромелайн или бромелин (КФ 3.4.22.32) - протеолитический фермент, содержащийся в ананасе Ananas comosus, имеет высокий потенциал для применения в разных областях промышленности.
3+
2+
На активность бромелайна может влиять ряд факторов, а именно значения рН среды, температуры, концентрация субстрата, активаторов и ингибиторов. Известно, что ионы Fe и Cu могут значительно снизить его активность. Фермент стабилен при рН 3.0-7.0 и температуре 35-70°С.
Бромелайн широко применяют не только в медицине, фармацевтической и косметической промышленности, но и в пищевой отрасли. Он хорошо гидролизует белки, содержащиеся в молоке и мясе, в том числе коллаген. Бромелайн способствует свертыванию молока, что является одним из важных этапов производства сыра. Фермент можно использовать для получения творога, который имеет 10-13% белка, влажность 70.5-85.8% и рН 4.36-4.75. Бромелайн используется в хлебопекарной промышленности для гидролиза глютена с целью производства гипоаллергенной муки, для подавления процессов образования пены на пиве, в средствах для предотвращения потемнения фруктов и в процессах ферментативного получения кокосового масла первого отжима. Добавление бромелайна в продукты питания не ухудшает их вкусовые качества, что является основным критерием при выборе потребителем продукта. После обработки продуктов бромелайном горький вкус практически отсутствует по сравнению с гидролизом другими ферментами [A review: application of bromelain enzymes in animal food products / R.R. Nanda [et al.] // And. Int. J. Agric. Nat. Sci. - 2020. - V. 1(1). - P. 33-44].
Ферменты являются катализаторами с высокой активностью и специфичностью, но эффективно действуют лишь в «мягких» условиях реакции. Этим они отличаются от других катализаторов. Ферментативные процессы находят применение в разных отраслях промышленности. Существует несколько ограничений промышленного применения энзимов в свободной (растворимой) форме, включая их высокую стоимость, низкую стабильность, невозможность повторного использования и сложность разделения продуктов реакции. Технологии иммобилизации биокатализаторов далеко продвинулись в обеспечении надежных решений для преодоления этих ограничений.
Иммобилизация - распространенный метод стабилизации ферментов с широким спектром преимуществ, включая повышенную стабильность энзима, высокую скорость реакции и возможность адресной доставки биокатализатора. Использование подходящей полимерной матрицы в качестве носителя еще больше усиливает преимущества иммобилизованных ферментов.
Иммобилизация ферментов включает связывание растворимого биокатализатора с нерастворимым носителем, которое направлено на создание препарата с высокой каталитической активностью и высокой стабильностью в условиях среды, отличающихся от физиологических, таких как высокая температура, экстремальные значения рН и присутствие органических растворителей. Преимущества использования иммобилизованного фермента по сравнению со свободной формой включают: простоту разделения продуктов реакции и фермента (и, как следствие, отсутствие биокатализатора в потоке продукта), специфичность и селективность энзима, а также его более высокую стабильность, возможность повторного использования фермента [Ugwuodo C.J., Nwagu T.N., Stabilizing enzymes by immobilization on bacterial spores: A review of literature // International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - V. 166. - P. 238 -250].
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, A61K 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019. Бюл. № 2], включающий иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, отличающийся тем, что иммобилизацию бромелайна проводят на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.05 М глициновый буфер с рН 9.0-10.5 или 0.05 М боратный буфер с рН 8.0 без добавления KCl, а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.2 М ацетатный буфер с рН 5.0; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре; образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для получения иммобилизованного бромелайна. Применение с этой целью ионообменных смол КУ-2, КУ-2-8чС, IMAC-НР111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П позволит получить биокатализатор с более высокой активностью и сократить время процесса сорбции. Способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя, а иммобилизованный бромелайн сохраняет высокую активность и стабильность. В отличие от прототипа в заявляемом изобретении используются ионообменные смолы, что позволяет повысить содержание бромелайна в образцах до 30 мг/г, их общую протеазную активность до 115 ед/мл и удельную протеазную активность до 97 ед/мг. Кроме того, время сорбции сокращается с 24 до 2 часов, т.е. в 12 раз.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке простого в исполнении, не требующего предварительной активации носителя, способа получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на ионообменных смолах, позволяющего повысить содержание бромелайна в образцах до 30 мг/г, их общую протеазную активность до 115 ед/мл и удельную протеазную активность до 97 ед/мг при сокращении времени сорбционной иммобилизации до 2 часов, а также проводить ферментативные реакции с высокими скоростями и в условиях среды, отличающихся от физиологических, в том числе в так называемых «агрессивных» условиях.
В своей работе мы оптимизировали параметры для иммобилизации бромелайна адсорбционным методом на матрицах ионообменных смол с использованием различных буферов. После адсорбционной иммобилизации фермент более стабилен при варьировании значений рН среды и температуры, обладает пролонгированным действием.
Технический результат достигается тем что, в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на ионообменных смолах, включающем адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, согласно изобретению, иммобилизацию ведут в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г воздушно-сухого носителя; при этом иммобилизацию проводят на матрицу ионообменной смолы АВ-16-ГС, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М фосфатный буфер, рН 11.0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5.
Фиг. 1. Содержание белка (мг/г носителя) в препаратах бромелайна, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL c pH 12.0.
Фиг. 2. Протеазная активность (ед/мл раствора) в препаратах бромелайна, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 3. Удельная протеазная активность (ед/мг белка) в препаратах бромелайна, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 4. Эстеразная активность (ед/мл раствора) в препаратах бромелайна, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 5. Удельная эстеразная активность (ед/мг белка) в препаратах бромелайна, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Пример реализации способа
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн (Sigma, США), субстратами для гидролиза служили азоказеин и N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилид (BAPNA) (Sigma, США), носителями для иммобилизации - ионообменные смолы КУ-2, КУ-2-8чС, IMAC-HP111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П (Уральская химическая компания, Россия).
+
-
Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами HCl в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации (0.5-3.0 М) до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0.1-0.25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в требуемую ионную форму в той же колонке: для перевода катионита в Н - форму использовали раствор 0.5 М HCl, для перевода анионита в ОН - форму - раствор 0.1 М NaOH в количестве 5 объемов раствора на 1 объем смолы [Горбунов Н.В. О кондиционировании катионитов / Н.В. Горбунов, Н.Г. Полянский // Журнал физической химии. - 1978. - Т. 52, № 5. - С. 1259-1262; Полянский Н.Г. Методы исследования ионитов / Н.Г. Полянский, Н.В. Горбунов, Н.Л. Полянская. - М.: Химия, 1976. - 208 с.]. Подготовленный таким образом носитель высушивали при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. - 2012. - № 6. - С. 31-42].
Иммобилизацию бромелайна на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. К 1 г воздушно-сухой ионообменной смолы добавляли 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл, инкубировали в течение 2 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5 до отсутствия в промывных водах белка, контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм.
Содержание белка в иммобилизованных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].
Измерение протеазной активности бромелайна проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius II FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг иммобилизованного образца добавляли 200 мкл 0.05 М трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13 тыс об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество бромелайна, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/С,
где ПА - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Определение эстеразной активности бромелайна проводили на субстрате N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилиде (BAPNA) [Erlanger D.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - V. 95. - P. 271]. К 50 мг образца добавляли 400 мкл BAPNA (1 мг/мл) и 400 мкл 0.2 М фосфатного буфера с рН 7.4, содержащего 0.04 М раствор цистеина. Инкубировали раствор 2 часа при 37°С, останавливали реакцию 800 мкл 1 М HCl. Измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм. Контрольная проба содержала 400 мкл BAPNA, 400 мкл 1 М HCl, 50 мг образца и 400 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей эстеразной активности служило количество бромелайна, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилида за 1 минуту. Удельную эстеразную активность рассчитывали по формуле:
ЭА=D*1000/120/400/С,
где ЭА - эстеразная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
400 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
При иммобилизации бромелайна на ионообменных материалах необходимо учитывать такие важные показатели, как заряды носителя и фермента. Значение pI бромелайна составляет 9.55 [Холявка М.Г. Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 161 с.], поэтому в качестве иммобилизационной среды для его адсорбции на катионитах КУ-2, КУ-2-8чС и IMAC-HP111 мы использовали 0.05М фосфатный буфер с рН 6.5 и 0.05М глициновый буфер с рН 9.0, а для иммобилизации на анионитах АВ-17-2П, АВ-16-ГС, ЭДЭ-10П и PUROLITE А100 применяли 0.05М фосфатный буфер с рН 11.0 и 0.05М NaOH-KCL буфер с рН 12.0. Результаты отражены на фиг. 1-5.
Мы сравнили полученные результаты по определению содержания белка, протеазной и эстеразной активности для препаратов бромелайна, иммобилизованных на матрицах ионообменных смол КУ-2, КУ-2-8чС, IMAC-HP111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П.
Наибольшее количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя), максимальные значения общей протеазной и эстеразной (в ед на мл раствора), а также удельной протеазной (в ед на мг белка) активностей бромелайна наблюдались при его адсорбции на матрице АВ-16-ГС с фосфатным буфером с рН 11.0 в качестве иммобилизационной среды (фиг. 1-4). Наибольшую удельную эстеразную активность (в ед на мг белка) показали препараты бромелайна, иммобилизованного на матрице IMAC-HP111 с глициновым буфером, рН 9.0 (фиг. 5).
Из вышеизложенного материала следует, что среди апробированных нами вариантов иммобилизации для создания гетерогенных препаратов на основе бромелайна и ионообменных смол наиболее перспективным является адсорбция на анионите АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0.