СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ НАД-ЗАВИСИМОЙ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ
METHOD FOR EVALUATING THE EFFECT OF CYTOMEGALOVIRUS INFECTION ON THE ACTIVITY OF NAD-DEPENDENT ISOCITRATE DEHYDROGENASE IN VILLOUS SYNCYTIOTROPHOBLAST IN THIRD TRIMESTER OF PREGNANCY

1. Цель изобретения - выявить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в синцитиотрофобласте плаценты, приводящей к нарушению энергетических процессов в фетоплацентарном барьере.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке гистохимического способа диагностики снижения активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы, доказывающего нарушение процессов энергообмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.
3. Раскрытие изобретения
2
Изоцитратдегидрогеназа катализирует обратимое превращение изоцитрата в α-кетоглутарат и CO в двухстадийной реакции [3, 6]. Первый шаг реакции включает окисление изоцитрата в промежуточный оксалосукцинат. На втором этапе реакции происходит декарбоксилирование оксалосукцината в α-кетоглутарат. Существует три изоформы изоцитратдегидрогеназы. Две формы фермента являются НАДФ-зависимыми, одна из них находится в митохондриях, другая - в цитозоле. Окисление изоцитрата, связанное с работой цикла трикарбоновых кислот, осуществляется исключительно НАД-зависимой формой фермента, локализованного в митохондриях. В результате реакции, катализируемой изоцитратдегидрогеназой, производятся восстановительные эквиваленты - НАДН, при прохождении которых по дыхательной цепи генерируются три высокоэнергетические фосфатные связи посредством образования АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. Считается, что именно эта реакция лимитирует скорость всего цикла трикарбоновых кислот [4]. Снижение активности изоцитратдегидрогеназы указывает на уменьшение интенсивности работы цикла трикарбоновых кислот и, соответственно, аэробных энергетических процессов в плаценте, что, в свою очередь, влияет на формирование плода.
4. Новая техническая задача
Определить уровень активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью оценить характер состояния энергетического обмена в фетоплацентарном барьере, от чего зависит нормальное формирование плода.
5. В доступной литературе имеются упоминания об исследовании изоцитратдегидрогеназы в плаценте при осложненной беременности, однако данная работа касается изучения НАДФ-зависимой формы фермента [2]. Также известно изучение активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в плаценте при физиологической беременности [7], которое выполняется биохимическими методами. Кроме этого активность изоцитратдегидрогеназы изучается иммуногистохимическим методом в солидных опухолях человека [5], недостатком которого является необходимость дорогостоящих реактивов, оборудования и длительного времени исполнения.
В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Изменения активности изоцитратдегидрогеназы происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. 2. Использование данного метода позволяет судить о состоянии энергетического обмена в фетоплацентарном барьере, влияющего на развитие плода. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и лабораторной диагностики.
6. Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 36 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
+
6.3. Активность изоцитратдегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАД [1]. Субстратом служит 0,1 M раствор тринатриевой соли изолимонной кислоты «Sigma» (США). Инкубационный раствор готовится на основе 0,1 M фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 мМоль, НАД фирмы «Applichem» (Германия) - 1 мМоль.
Состав инкубационной среды:
- 0,1 M фосфатный буфер pH 7,2-7,4 - 1 мл;
- нитросиний тетразолий - 1 мг;
+
- НАД- 1 мг;
2
- тринатриевая соль изолимонной кислоты · HO - 27,6 мг.
6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°C в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора изоцитрата натрия адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).
1
2
6.5. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений M±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n+n-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.
7. Полученные данные
В процессе исследования получены следующие результаты. Гистохимическая реакция выявления активности НАД-изоцитратдегидрогеназы является достаточно специфичной, так как в отсутствие субстрата в инкубационной среде выпадение гранул формазана в тканевых структурах не наблюдается. На гистохимических препаратах плаценты беременных женщин, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности NAD-изоцитратдегидрогеназы до 21,6±1,91 усл. ед. (контроль - 35,5±2,28 усл. ед.) (фигура 1, 2).
Таким образом, снижение активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 указывает на нарушение энергообмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, влияющего на формирование плода в период гестации.
8. Литература
1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.
2. Назыров А.Т., Шафранова Н.Г., Алманиязова К.К. Изоцитратдегидрогеназа плаценты при осложненной беременности // Акушерство и гинекология. 1977. №5. С. 47-49.
3. Frey Р.А., Abies R.H., Hegeman A.D. Enzymatic Reaction Mechanisms. United Kingdom: Oxford University Press, 2006. 848p.
+
4. Kim Y.O., Koh H.J., Kim S.H., Jo S.H, Huh J.W., Jeong K.S., Lee I.J., Song B.J., Huh T.L. Identification and functional characterization of a novel, tissue-specific NAD dependent isocitrate dehydrogenase beta-subunit isoform. // J. Biochem. 1999. Vol, 274. P. 36866-36875.
5. Mauzo S.H., Lee M., Petros J., Hunter S., Chang С.М., Shu H.K., Bellail A.C., Hao C., Cohen C. Immunohistochemical demonstration of isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) mutation in a small subset of prostatic carcinomas. // Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 2014. Vol. 22, №4. P. 284-287.
6. Qi F., Chen X., Beard DA. Detailed kinetics and regulation of mammalian NAD-linked isocitrate dehydrogenase. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 1784, №11. P. 1641-1651.
7. Scislowski P.W., Zolnierowicz S., Zelewski L. Subcellular distribution of isocitrate dehydrogenase in early and term human placenta // Biochem. J. 1983. Vol. 214, №2. P. 339-343.