СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭТИЛОВОГО СПИРТА И ДРУГИХ МЕТАБОЛИТОВ В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD OF DETERMINATION OF ETHANOL AND OTHER METABOLITES CONTENT IN HUMAN BLOOD

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике при изучении метаболических нарушений у человека, вызванных отравлением алкоголем, и в судебной медицинской деятельности для диагностирования степени опьянения живых лиц.
Общепринятым способом определения этилового спирта в крови человека является метод цветных реакций. Наибольшее распространение в 60-е годы получил так называемый «нитритный» метод и способ Видмарка. «Нитритный» метод очень трудоемок, требует быстрой обработки исследуемого материала двойной перегонкой с водяным паром, большого количества исследуемого материала (около 200-300 г). Кроме того, метод недостаточно специфичен. Способ Видмарка применяется с целью определения степени опьянения живых лиц. Метод также достаточно трудоемок, необходимо исследование 3-4 навесок исследуемого материала и параллельное проведение 3-4 холостых опытов, что указывает на плохую воспроизводимость метода.
Известен способ количественного определения содержания этилового алкоголя в крови и моче человека методом газожидкостной хроматографии [Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. №10-95/14-32]. Сущность метода заключается в превращении спиртов в алкилнитриты, которые затем подвергаются хроматографическому разделению. В основе детектирования лежит измерение различий в теплопроводности чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора по теплопроводности - катарометра, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, выходящей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора. Для проведения исследования применяется хроматограф лабораторный ХЛ-4.
Концентрацию этилового спирта определяют путем вычисления отношения высот пиков этилнитрита и изопропилнитрита (пропилнитрита) с последующей интерполяцией из калибровочного графика. Калибровочные графики строят, используя стандартные растворы этилового спирта в крови и моче.
Существенным недостатком способа является отсутствие возможности количественного определения этилового спирта при одновременном присутствии в исследуемом материале этилового, пропилового и изопропилового алкоголя. Кроме того, описанный выше способ не позволяет одновременно определять в крови этиловый спирт, диэтиловый эфир, ацетальдегид, ацетон, метилацетат, этилацетат, пропиловый спирт, изобутиловый спирт, бутиловый спирт, изоамиловый спирт и другие метаболиты.
Задачей изобретения является разработка способа одновременного количественного определения в крови человека этилового спирта, диэтилового эфира, ацетальдегида, ацетона, метилацетата, этилацетата, пропилового спирта, изобутилового спирта, бутилового спирта, изоамилового спирта и других метаболитов методом газожидкостной хроматографии.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения содержания этилового спирта и других метаболитов в крови человека методом газожидкостной хроматографии, включающем исследование компонентов крови, одновременно проводят количественное определение этилового спирта, диэтилового эфира, ацетальдегида, ацетона, метилацетата, этилацетата, пропилового спирта, изобутилового спирта, бутилового спирта, изоамилового спирта и других метаболитов в дистиллятах крови с использованием капиллярной хроматографической колонки, рассчитываем концентрацию компонентов крови по формуле:
3
где а - результат хроматографического исследования, мг/дм;
3
V - объем дистиллята, см;
m - масса навески цельной крови, г.
На фиг.1 представлена хроматограмма дистиллята цельной крови человека, на фиг.2 - хроматограмма модельной смеси.
Сущность метода заключается в получении дистиллятов крови методом прямой перегонки с водяным паром, которые затем подвергаются хроматографическому разделению. Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси поочередно поступают в пламенно-ионизационный детектор, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков. В основе детектирования лежит измерение различий электропроводности пламени чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, поступающей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора. Для проведения исследования применяют газовый хроматограф фирмы «Хьюлетт Паккард» (США), модель 5890, серия 2, с пламенно-ионизационным детектором и системой электронного регулирования потока газа-носителя, колонку хроматографическую капиллярную «HP-FFAP» (США) 50 м × 0,32 мм × 0,52 мкм, внутренний стандарт - 1,2-пропиленгликоль, газ-носитель - азот, температурная программа термостата колонки: начальная температура - 50 градусов Цельсия, 10 мин в изотерме, далее программирование температуры со скоростью 15 градусов в минуту до 220 градусов Цельсия, 10 мин в изотерме, температура инжектора - 150 градусов Цельсия, температура детектора - 230 градусов Цельсия, деление потока - 1:40.
3
3
3
3
3
3
Количественное определение этилового спирта и других метаболитов проводят следующим образом. Взвешивают от 10 до 50 г цельной крови в перегонную колбу вместимостью 500 см, затем добавляют 50 смдистиллированной воды. Смесь перемешивают. Колбу со смесью присоединяют к дефлегматору с каплеуловителем и холодильником с прямой трубкой. При осторожном нагревании (бурное вспенивание) смесь подвергают прямой дистилляции и собирают точно 25 см дистиллята в мерную колбу вместимостью 25 см. Приемную колбу необходимо дополнительно охлаждать. В 25 см полученного дистиллята вносят 2 мм внутреннего стандарта. Смесь тщательно перемешивают и подвергают хроматографическому исследованию. Капиллярная хроматографическая колонка позволяет надежно разделить компоненты дистиллята крови и одновременно определить этиловый спирт, диэтиловый эфир, ацетальдегид, ацетон, метилацетат, этилацетат, пропиловый спирт, изобутиловый спирт, бутиловый спирт, изоамиловый спирт и другие метаболиты.
3
Хроматограф предварительно калибруют по этиловому спирту и другим метаболитам, а также пропиленгликолю, используя не менее трех калибровочных смесей. Значения времени удерживания, калибровочных коэффициентов и концентрации внутреннего стандарта заносят в память компьютера. Расчетная концентрация внутреннего стандарта 83,2 мг/дм.
Исследования выполнялись на цельной крови человека (девять здоровых мужчин в возрасте от 25 до 39 лет).
Результаты исследований представлены в таблице.
Таблица
Содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови человека
№ п/п
Содержание этилового спирта, 10<sup>-3</sup>%
Содержание ацетальдегида, 10<sup>-3</sup>%
1
0,11
0,02
2
0,19
0,04
3
0,25
0,05
4
0,16
0,02
5
0,95
0,10
6
0,20
0,05
7
0,32
0,07
8
0,25
0,04
9
107,85
0,17
Полученные данные о содержании эндогенного этилового спирта в крови человека соответствуют литературным, согласно которым в норме, без введения извне, в крови человека может содержаться до 0,004% алкоголя. Кроме того, предлагаемый способ позволяет надежно диагностировать степень опьянения живых лиц (таблица, результат №9). Согласно литературным данным концентрация алкоголя от 0,02 до 0,20% вызывает в зависимости от индивидуальной чувствительности, состояния и типа нервной деятельности опьянение различной степени.
Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что предлагаемый способ определения содержания этилового спирта и других метаболитов в крови человека позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты.