СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ФОРМИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ К ДЕЗИНФИЦИРУЮЩЕМУ СРЕДСТВУ
METHOD OF SIMULATING BUILD-UP OF BACTERIAL RESISTANCE TO DISINFECTANT

Предлагаемый способ относится к биотехнологии, может быть использован для моделирования формирования устойчивости бактерий к дезинфицирующим средствам, а также для оценки бактерицидного действия дезинфицирующих средств.
Устойчивость микроорганизмов к применяемым дезинфектантам является одной из актуальнейших проблем, требующих решения, для предупреждения формирования и распространения устойчивых к дезинфицирующим средствам (ДС) штаммов микроорганизмов в учреждениях здравоохранения (1, 2, 3).
Преодоление устойчивости невозможно без понимания закономерностей ее формирования. К сожалению, существующие требования к разработке новых ДС не предусматривают проведение исследований возможностей и условий развития резистентных к ним вариантов микроорганизмов, в частности бактерий. Необходимость изучения формирования устойчивости бактерий к ДС и ее параметров вызвала потребность разработки предлагаемого.
Способы моделирования формирования устойчивости бактерий к дезинфицирующим средствам могут быть использованы как в научных целях, так и при производстве дезинфицирующих средств и в испытательных центрах.
В настоящий момент не известны способы, позволяющие формировать устойчивость бактерий к дезинфицирующим средствам.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего моделировать формирование устойчивости бактерий к дезинфицирующим средствам.
Поставленная задача решается предлагаемым способом моделирования формирования устойчивости бактерий к дезинфицирующему средству (ДС), включающим предварительный подбор концентрации раствора ДС, при которой бактерии проявляют неполную чувствительность к данному средству, воздействие на бактерии раствором ДС при данной концентрации, отбор выросших колоний бактерий после воздействия ДС и высев их на твердую питательную среду, после чего из выросших бактерий в количестве от 1 до 299 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) отбирают изолированные колонии бактерий, которые пересевают на питательную среду и выращивают их при условиях, необходимых для роста бактерий данного вида, на одну часть выращенных колоний бактерий воздействуют раствором ДС подобранной концентрации, на другую часть выращенных колоний бактерий воздействуют раствором ДС бактерицидной концентрации, и если при воздействии раствором ДС бактерицидной концентрации рост бактерий отсутствует или их рост составляет от 1 до 299 (КОЕ/мл), цикл отбора выращенных на предыдущем этапе бактерий, пересева бактерий на питательную среду, выращивания данных колоний бактерий при условиях, необходимых для роста данного вида бактерий, и воздействия на выращенные колонии бактерий раствором ДС подобранной бактерицидной концентрации повторяют столько раз, пока после воздействия на колонии бактерий раствором ДС бактерицидной концентрации рост бактерий на питательной среде не составит 300 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), по которому судят о формировании у бактерий устойчивости к данному дезинфицирующему средству.
Предпочтительно, что из выросших от 1 до 299 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) микроорганизма отбирают несколько изолированных колоний, а именно при росте единичных колоний - количеством от 1 до 5 - отбирают все колонии, при росте от 6 до 299 колоний отбирают от 5 до 10 колоний.
Предпочтительно, что пересев изолированных колоний микроорганизма осуществляют на твердую питательную среду, в частности на скошенный питательный агар.
Предлагаемый способ путем систематического воздействия ДС в заниженной концентрации позволяет смоделировать формирование устойчивости бактерий к действию ДС за счет адаптации бактерий к ДС.
Поэтому предлагаемый способ может быть использован для:
- объективной оценки формирования устойчивости бактерий к дезинфицирующим средствам с количественной оценкой полученных результатов;
- выявления механизма формирования устойчивости бактерий к различным дезинфицирующим средствам;
- оценки дозы и времени эффективного воздействия дезинфицирующего средства при формировании устойчивости у разных бактерий к различным дезинфицирующим средствам;
- тестировать дезинфицирующие средства на этапе их разработки для совершенствования бактерицидного потенциала;
- моделировать формирование устойчивости бактерий в лабораторных условиях для применения этих данных в условиях практического здравоохранения, в очагах инфекционных заболеваний, при проведении профилактической дезинфекции.
Предлагаемый способ реализуют следующим образом
Предварительно подбирают концентрацию ДС, при которой бактерии проявляют неполную чувствительность к данному средству и которая характеризуется ростом бактерий в количестве 1 - 299 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), для этого на основе бактерицидной концентрации данного дезинфицирующего средства готовят его серийные разведения и после этого действуют раствором данного ДС на взвесь испытуемых бактерий, при этом на стадии подбора концентрации ДС, при которой бактерии проявляет неполную чувствительность к данному средству, и на всех последующих стадиях используется экспозиция (время воздействия ДС на бактерии), предполагающая бактерицидный эффект для соответствующего дезинфицирующего средства, а дезинфицирующее средство может быть представлено любым дезинфицирующим средством с действующим веществом на основе разных химических групп, а бактерии - любой вид бактерий (патогенные, условно-патогенные), выделенные из клинического материала, объектов внешней среды, тест-бактерии), затем воздействуют на бактерии раствором ДС при данной концентрации и отбирают выросшие после воздействия ДС колонии бактерий, которые высевают на твердую питательную среду, после чего из выросших бактерий в количестве от 1 до 299 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) отбирают изолированные колонии бактерий, в частности при росте единичных колоний - количеством от 1 до 5 - отбирают все колонии, при росте от 6 до 299 колоний отбирают от 5 до 10 колоний, которые пересевают на питательную среду, в частности на скошенный питательный агар, и выращивают их, выдерживая при условиях, необходимых для роста бактерий данного вида, и далее на одну часть выращенных колоний воздействуют раствором ДС подобранной концентрацией, на другую часть выращенных колоний воздействуют раствором ДС бактерицидной концентрации, и если при воздействии раствором ДС бактерицидной концентрации отсутствует рост бактерий или их рост составляет от 1 до 299 КОЕ/мл, цикл отбора выращенного на предыдущем этапе бактерий, их пересева на питательную среду, выращивания колоний бактерий путем инкубирования их при условиях, необходимых для роста данного вида бактерий, и воздействия на обе части выращенных колоний раствором ДС повторяют столько раз, пока после воздействия на колонии раствором ДС в бактерицидной концентрации рост бактерий на питательной среде не составит 300 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), по которому судят о формировании у бактерий устойчивости к данному дезинфицирующему средству, поскольку общеизвестно, что штамм бактерий устойчив к воздействию дезинфицирующих средств при их росте 300 и более КОЕ/мл.
Пример конкретного исполнения предлагаемого способа
Предварительно осуществили подбор концентрации ДС на основе четвертичных аммониевых соединений (торговое название «Фрисепт»), при которой бактерии вида E.coli (тест - штамм М-17) проявили неполную чувствительность к данному средству, которая характеризуется ростом бактерий 1-299 КОЕ/мл, для этого на взвесь бактерии вида E.coli (мутностью 5 единиц по Макфарланду) воздействовали раствором ДС в концентрациях 0,5%; 0,1%; 0,05%; 0,02%; 0,01% в течение 60 минут с последующим высевом бактерий на твердую питательную среду (мясопептонный агар) и выдерживанием при 37°С в течение суток, а затем производили количественный учет роста бактерий, в результате учета было выявлено, что при концентрации ДС 0,02% бактерии данного вида проявили неполную чувствительность к данному ДС, и рост бактерий при этом составил от 30 до 160 КОЕ/мл в разных опытах, в то время как при концентрации ДС 0,5%, 0,1%, 0,05% роста бактерий не обнаружено, а при концентрации ДС 0,01% рост бактерий составил более 300 КОЕ/мл (данные приведены в таблице). При этом необходимо отметить, что на стадии подбора и на всех последующих стадиях использовалась экспозиция (время воздействия ДС на бактерии), предполагающая бактерицидный эффект для соответствующего дезинфицирующего средства, после того как была подобрана концентрация раствора ДС, при которой бактерии проявили неполную чувствительность к данному средству. Далее на взвесь бактерий воздействовали раствором ДС с концентрации 0,02% в течение 60 минут, после чего смесь, содержащую бактерии, раствор ДС, нейтрализатор ДС, была высеяна на твердую питательную среду (мясопептонный агар) и выдержана при 37°С в течение суток, а затем из выросших колоний бактерий в количестве от 60 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) были отобраны 10 изолированных колоний, которые пересеяли на твердую питательную среду (скошенный мясопептонный агар), и выращивали данные колонии, выдерживая их при 37°С в течение суток, далее из каждой выращенной колонии была приготовлена взвесь бактерий, при этом на одну часть полученной взвеси воздействовали раствором ДС в бактерицидной концентрации (0,5%) в течение 60 минут, а на другую часть взвеси бактерий воздействовали подобранной концентрацией (0,02%) также в течение 60 минут с последующим высевом смеси и ее выдерживанием, в результате при воздействии ДС в бактерицидной концентрации рост бактерий отсутствовал, в связи с этим цикл выращивания микроорганизма, отбора выращенных на предыдущем этапе колоний микроорганизма, воздействия бактерицидной концентрацией и подобранной концентрацией был повторен 6 раз, в результате чего после воздействия на колонии бактерий раствора ДС бактерицидной концентрации (0,5%) в течение 60 минут рост бактерий на питательной среде составил 300 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл), по которому судили о формировании у бактерий вида E.coli (штамм М-17) устойчивости к данному дезинфицирующему средству.
* концентрация ДС, рекомендованная методическими указаниями
** заниженная концентрация дезинфицирующего средства
*** применялась экспозиция 60 минут, рекомендованная методическими указаниями по применению ДС.
Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ позволяет моделировать формирование устойчивости бактерий к дезинфицирующему средству и может быть использован как в научных целях для оценки формирования резистентности госпитальных штаммов к дезинфицирующим средствам на этапе их практического применения, в условиях лаборатории с целью последующего ее преодоления при использовании, так и в практическом здравоохранении для совершенствования дезинфекционных мероприятий и обоснования ротации ДС в лечебно-профилактических учреждениях, в очагах инфекционных заболеваний, при проведении профилактической дезинфекции, а также при разработке дезинфицирующего средства для оценки его бактерицидного потенциала и подбора оптимальных режимов дезинфекции и производстве дезинфицирующих средств.
Источники информации
1. Соколова Н.Ф. Актуальные проблемы дезинфекции в целях профилактики внутрибольничных инфекций в ЛПУ. Внутрибольничные инфекции в стационарах различного профиля. Профилактика, лечение, осложнения. Тезисы доклада 3-й научно-практической конференции. М., 2005, с.21.
2. Chapman J.S. Disifectant resistance mechanisms, cross-resistance, co-resistance International Biodeterioration & Biodegradation. 2003, Vol.51, Is. 4, p.271.
3. Russel A.D. Bacterial adaptation and resistance to antiseptics, desinfectants and preservatives is not a new phenomenon J. Hosp. Infect. 2004, Vol.57, Is. 2, p.97.