СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНЫХ СВОЙСТВ СЫВОРОТКИ КРОВИ
METHOD TO DETERMINE BACTERICIDE PROPERTIES OF BLOOD SERUM

Изобретение относится к области биомедицинских измерительных технологий, а именно к способам определения бактерицидных свойств сыворотки крови. Необходимость проведения подобных исследований закреплена в «Номенклатуре клинических лабораторных исследований, применяемых в целях диагностики болезней и слежения за состоянием пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации» (п.6.3.2 - Определение общих бактерицидных свойств сыворотки крови), утвержденной Приказом Министерства здравоохранения РФ №64 от 21.02.2000 г.
В частности, изобретение предназначено для определения бактерицидных свойств сыворотки крови, связанных с присутствием в ней бета-лизина (тромбоцитарного катионного белка).
Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биологического, медицинского и ветеринарного профиля, решающих вопросы оценки системы естественного (врожденного) иммунитета человека и животных с целью выявления их возможных нарушений и контроля эффективности соответствующих коррекционных мероприятий.
Известные из уровня техники способы оценки бактерицидных начал сыворотки крови ориентированы на выявление двух основных систем, первоначально обозначенных Эмилем фон Берингом (Emil von Behring) как термолабильный «альфа-лизин» и термостабильный) «бета-лизин» (Бухарин О.В., Васильев Н.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине. - Томск. Изд-во ТГУ. - 1977. - С.19). Позднее «альфа-лизин» был идентифицирован как система комплемента, активация которого ведет к эффективному лизису грамотрицательных микроорганизмов, а бета-лизин, проявляющий наибольшую активность в отношении грамположительных спорообразующих микроорганизмов, все чаще стал ассоциироваться с действием тромбоцитарного катионного белка (Бухарин О.В., Сулейманов К.Г. Свойства и функции тромбоцитарного катионного белка // Успехи современной биологии. - 1998. - N 2. - С.194-204).
По совокупности существенных признаков наиболее общим методическим подходом к определению активности системы комплемента и бета-лизина в экспериментальных и клинико-диагностических целях является проведение бактериологических исследований на специально отобранных бактериальных культурах, проявляющих высокую чувствительность к повреждающему действию названных факторов. При этом различия в строении поверхностных структур подобных грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов позволяют относительно специфично оценивать каждую из исследуемых бактерицидных систем.
В частности, целый ряд существующих методов определения комплемент-зависимой бактерицидности основаны на одном и том же принципе - воздействии сыворотки крови на популяцию жизнеспособных серочувствительных грамотрицательных микроорганизмов с последующей оценкой доли клонов, выживших после подобного контакта, по сравнению с контролем - теми же микроорганизмами, инкубированными вне контакта с сывороткой крови. При этом в качестве серочувствительных микроорганизмов обычно используются различные штаммы Escherichia coli: 0111 (Бухарин О.В., Созыкин В.Л. Фотонефелометрический метод определения бактерицидной активности сыворотки крови // Факторы естественного иммунитета. - Оренбург, 1979. - С.43-45), 675 (Красильников А.П., Титов Л.П. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом реплик // Лаб. дело. - 1981. - N 4. - С.245-247), что определяется особенностями строения их клеточной стенки, эффективно разрушаемой под действием комплекса сывороточных факторов.
В свою очередь для оценки бета-лизин-зависимой бактерицидности сыворотки крови традиционно используются штаммы Bacillus subtilis, в силу особенностей организации своих характерных для грамположительных микроорганизмов поверхностных структур, проявляющих преимущественную чувствительность к данной группе веществ с одновременной относительной устойчивостью к литическому действию прочих гуморальных бактерицидных факторов (Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., Царин П.Г. Метод определения бета-литической активности крови сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология. - 2007. - N4. - С.123-125).
Вычисление значений бактерицидности в обоих случаях производится на основании сходных и имеющих одинаковый биологический смысл формул, оценивающих соотношение микроорганизмов, выросших в опыте и контроле, и выражающих итоговые значения в процентах достигнутого бактерицидного эффекта.
Однако несмотря на многочисленные попытки уменьшения трудоемкости подобных методов снижения расхода питательных сред (Евтушенко А.Д., Тимохина Т.Х., Аргунова Г.А. Модифицированный способ бактериологического определения бактерицидной активности сыворотки крови // Лаб. дело. - 1982. - N 12. - С.41-42; Слоним А.А., Толчеев Ю.Д. Определение бактерицидной активности сыворотки крови и лимфы // Лаб. дело. - 1989. - N 7. - С.65-66) говорить об их использовании в настоящее время можно только в историческом аспекте. Сказанное определяется несоответствием требованиям, предъявляемым к медико-биологическим технологиям XXI века и оговоренным в «Концепции развития службы клинической лабораторной диагностики Российской Федерации».
Одна их перспектив совершенствования способов оценки бактерицидных систем естественного иммунитета связана с использованием в качестве объектов воздействия люминесцирующих микроорганизмов, изменение (подавление) свечения которых является следствием их разрушения с пространственной дезорганизацией ферментных систем, в результате чего остаточная интенсивность биолюминесценции оказывается пропорциональной числу сохранивших свою жизнеспособность бактериальных клеток-мишеней.
Впервые возможность оценки активности гуморальных и клеточных бактерицидных систем по их влиянию на уровень светимости люминесцирующих бактерий была продемонстрирована еще в 80-х годах XX века (Barak M., Ulitzur S., Merzbach D. Determination of serum bactericidal activity with the aid of luminous bacteria // J.Clin.Microbiol. - 1983. - Vol.18. - N 2. - P.248-253). При этом в качестве тестерного штамма для проведения подобных исследований использован природный изолят Vibrio cholerae biovar albensis, демонстрирующий высокую чувствительность к повреждающему действию молекулярных и клеточных систем, присутствующих в крови человека и животных. Однако, принадлежность данного микроорганизма к патогенному виду с соответствующим несоответствием требованиям биологической безопасности явилась существенным ограничением для широкого распространения предложенной биолюминесцентной технологии.
Найденное решение этого вопроса заключалось в клонировании генов биолюминесценции (lux-генов) в непатогенных лабораторных микроорганизмах, исходно проявляющих высокую чувствительность к бактерицидным факторам сыворотки крови. В частности, использование рекомбинантного люминесцирующего штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-тенами природного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi было положено в основу способа оценки бактерицидной активности сыворотки крови, значимыми преимуществами которого стали сокращение длительности исследования, общее снижение трудоемкости с одновременным формированием возможности анализа большого количества проб (Патент РФ №2247987. Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови. Опубл. 10.03.2005, Бюл. №7).
Подтверждением актуальности подобного подхода также является опыт аналогичного использования рекомбинантного люминесцирующего штамма Klebsiella pneumoniae Xen39, конститутивно экспрессирующий полную кассету luxCDABE-генов природного почвенного микроорганизма Photorhabdus luminescence (Nypaver C.M., Thornton M.M., Yin S.M., Bracho D.O., Nelson P.W., Jones A.E., Bortz D.M., Younger J.G. Dynamics of human complement-mediated killing of Klebsiella pneumoniae // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2010. - Vol.43. - N 5. - P.585-590). В свою очередь принадлежность данного штамма к числу грамотрицательных микроорганизмов, как и в случае Escherichia coli, также обусловила его наибольшую чувствительность к комплемент-зависимой бактерицидной системе сыворотки крови.
На этом фоне нерешенной является задача оценки бета-лизин-зависимой бактерицидности, формирующей вторую важнейшую антимикробную систему сыворотки крови человека и животных. При этом попытки ее решения с использованием описанных выше лабораторных люминесцирующих штаммов, как и еще одной генно-инженерной конструкции Pseudomonas aeruginosa H1001 (fliC:luxCDABE}, ранее использованной для оценки артифициалыю синтезированных катионных антимикробных пептидов (Hilpert К., Hancock R.E. Use of luminescent bacteria for rapid screening and characterization of short cationic antimicrobial peptides synthesized on cellulose using peptide array technology // Nature Protocols. - 2007. - Vol.2. - P.1652-1660), не могут быть признаны адекватными в связи с возможностью их реагирования на широкий спектр присутствующих в биологических жидкостях сложного компонентного состава бактерицидных факторов и, в первую очередь, систему комплемента.
Значительно более специфичный отклик следует ожидать при использовании представителей рода Bacillus, традиционно используемых для исследования бета-литической активности крови человека и животных (Бухарин О.В., Васильев Н.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине. - Томск. Изд-во ТГУ. - 1977. - С.20; Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., Царим П.Г. Метод определения бета-литической активности крови сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология. - 2007. - N 4. - С.123-125).
Известный опыт подобной оценки бактерицидных свойств сыворотки крови связан с использованием рекомбинантных люминесцирующих штаммов Bacillus subtilis BR151, также как и Escherichia coli JM109, несущих плазмиду pCSS962 с клонированными в ней генами люциферазы насекомого Pyrophorus plagiophthalamus (Virta M., Karp M., Runnemaa S., Lilius E.-M. Kinetic measurement of the membranolytic activity of serum complement using bioluminescent bacteria // J. Immunol. Meth. - 1997. - Vol.201. - N 2. - P.215-221; Virta M., Lineri S., Kankaanpaa P. at al. Determination of complement-mediated killing of bacteria by viability staining and bioluminescence // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol.64. - N 2. - P.515-519). Однако, природа зафиксированной с их использованием бактерицидности однозначно связывалась авторами с активностью комплемента, хотя какой-либо параллельной оценки данной системы проведено не было. Кроме того, в цитируемых работах дана сравнительная реакция штаммов В.subtilis BR151 и E.coli JM109 лишь на пул сывороток от пяти доноров, что делало невозможным выявление особенностей люминесцентного отклика каждого из них на отдельные присутствующие в данной биологической жидкости бактерицидные системы. Дополнительной технологической сложностью при использовании данных штаммов также являлась необходимость дополнительного внесения субстрата для светлячковой люциферазы (D-люциферина), при значениях pH=7,0 слабо диффундирующего через цитоплазматическую мембрану.
В целом анализ научной и научно-технической литературы позволяет констатировать, что по совокупности признаков наиболее близким к заявляемому, и в этой связи характеризуемым как способ-прототип, является нефелометрический метод оценки бета-лизина (Бухарин О.В., Васильев Н.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине. - Томск. Изд-во ТГУ. - 1977. - С.52-53), основанный на изменении оптической плотности мясо-пептонного бульона при росте в нем штамма Bacillus subtilis 83 (ГКИ им. Тарасовича) с добавлением и без добавления испытуемой сыворотки. Соответственно, степень задержки роста штамма Bacillus subtilis 83 при контакте с сывороткой крови после 18 часов инкубации при 37°C по сравнению с контролем позволяет осуществить расчет активности бета-лизина по формуле:
<mrow><mi>А</mi><mi>Б</mi><mi>Л</mi><mo>=</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>18</mn></mrow></msubsup><mo>−</mo><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>18</mn></mrow></msubsup><mo>−</mo><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100,</mn><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>1</mn><mo>)</mo></mrow></mrow>
<mrow><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
где
- оптическая плотность опытной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>18</mn></mrow></msubsup></mrow>
- оптическая плотность опытной пробы после 18 часов контакта;
<mrow><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
- оптическая плотность контрольной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><mi>O</mi><msubsup><mi>D</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>18</mn></mrow></msubsup></mrow>
- оптическая плотность контрольной пробы после 18 часов контакта.
Основной причиной, препятствующей получению требуемого результата при использовании способа-прототипа, является существенная длительность этапа подращивания (18 часов), лимитируемая скоростью роста индикаторного микроорганизма после контакта с сывороткой крови до значений оптической плотности, доступных для фотонефелометрической регистрации.
Таким образом, основной причиной, препятствующей получению требуемого результата, является отсутствие лабораторного люминесцирующего штамма Bacillus, для которого продемонстрирована избирательная чувствительность к бактерицидному действию сыворотки крови, определяемому присутствием в ней системы бета-лизина (тромбоцитарного катионного белка).
Альтернативные подходы, ведущие к устранению данного недостатка, в доступной заявителям литературе не описаны.
Сказанное позволяет утверждать, что заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.
Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является экспрессное определение бактерицидных свойств сыворотки крови, определяемой присутствием в ней бета-лизина (тромбоцитарного катионного белка). Дополнительной задачей, решаемой при осуществлении заявляемого способа, является снижение трудоемкости и повышение технологичности его выполнения данного лабораторного исследования.
Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: при воздействии сыворотки крови человека или животных выраженность подавления свечения лабораторного штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, эффективно экспрессирующего luxAB-гены грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi, пропорциональна уровню развивающегося в отношении него бактерицидного эффекта, определяемого присутствием бета-лизина (тромбоцитарного катионного белка).
Соответственно, при реализации заявляемого способа определения бактерицидных свойств сыворотки крови, характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления в сравнении со способом-прототипом представляются следующим образом.
На первом (подготовительном) этапе выращивают штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 на LB-агаре в присутствии канамицина (селективного фактора для клонированной плазмиды pLF14ABlei с luxAB генами и генами устойчивости к канамицину) в конечной концентрации 40 мкг/мл при 37°C в течение 24 часов. Полученную биомассу смывают стерильным LB-бульоном, после чего полученную суспензию стандартизуют до оптической плотности 1,2 отн. ед. при 540 им, измеренных в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Особенностями этапа, отличающими его от такового по способу-прототипу, являются: 1) использование в качестве тест-объекта люминесцирующего штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 с клонированными luxAB-генами грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi для которого показана количественная зависимость снижения уровня биолюминесценции от выраженности бактерицидного эффекта (см. ниже); 2) выращивание штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 на питательной среде, содержащей селективный маркер (канамицин, 40 мкг/мл), что позволяет исключить рост не люминесцирующих штаммов.
-6
На втором (основном) этапе смешивают суспензию бактериальных клеток и исследуемого образца сыворотки крови в соотношении 1:1, инкубируют при 37°C в течение 0,5 часа. На 0 и 0,5 часах существования реакционной смеси производят отбор аликвот по 250 мкл в кюветы для биолюминометра, дополнительно вносят в них по 2 мкл деканаля в конечной концентрации 7×10 М.
Особенностями данного этапа, отличающего его от способа-прототипа, являются: 1) создание соотношения 1:1 в реакционной смеси бактерии: сыворотка крови; 2) контакт бактериальных клеток с исследуемыми образцами сыворотки крови в течение 0,5 часа, что значительно сокращает время проведения анализа; 3) свечение тест-штамма в присутствии экзогенного субстрата (деканаля), окисляемого в присутствии молекулярного кислорода ферментом люциферазой, синтез которой обеспечивается экспрессией клонированных luxAB-генов грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi
На завершающем этапе осуществляют регистрацию уровня свечения в пробах в видимой сине-зеленой области спектра (420-600 им). В качестве измерительного прибора при реализации заявляемого способа могут использоваться биохемилюминометр Биотоке-10М, а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, работающие в обозначенной области спектра и обеспечивающие соответствующую чувствительность измерений.
Итоговый расчет бактерицидных свойств сыворотки крови, определяемых присутствием в ней бета-лизина, проводят по формуле:
<mrow><mi>Б</mi><mi>С</mi><mi>С</mi><msub><mi>К</mi><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Б</mi><mi>Л</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></msub><mo>=</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup><mo>×</mo><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup><mo>×</mo><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100,</mn><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>2</mn><mo>)</mo></mrow></mrow>
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
где
- уровень биолюминесценции опытной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции опытной пробы после 0,5 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции контрольной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции контрольной пробы после 0,5 часов контакта.
Основным отличием данного этапа от такового в способе-прототипе является использование люминометров, обеспечивающих детекцию уровня свечения в анализируемых пробах.
Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей:
1) использование для заявленных целей именно Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, во-первых, определяется тем, что, в отличие от известных рекомбинантных люминесцирующих штаммов рода Bacillus он характеризуется высоким уровнем экспрессии (транскрипции и трансляции) luxAB-генов бактериальной люциферазы.
Для достижения этого фрагменты ДИК, содержащие гены luxA и luxB, кодирующие альфа- и бета-субъединицы люциферазы Photobacterium leiognathi - ключевого фермента бактериальной биолюминесценции, были амплифицированы с использованием праймеров:
luxA
LuxADir5' -
CGTCTC
GAAGGTGG
GAGATCGAAGAAATAATGAAAATTAGTAATATC - 3'
CGTCTC
LuxARev 5' - GGACGTCATAGTTTAAAAAGAACAGCTTACTGAGG - 3'
luxB
LuxBDir5'-
CGTCTC
GAAGGTGG
GGACGTCAATAAAATATGAATTTCGGGTTATTTTTC - 3'
CGTCTC
LuxBRev 5' - GCAATTGCCGTAATTAAATTATTTAATAAGGTTATC - 3'
важной особенностью которых являлось присутствие рибосом-связывающего сайта грамположительных бактерий (подчеркнут). Кроме того, к 5' концам всех праймеров была добавлена последовательность сайта эндонуклеазы рестрикции BsmBI (помечена жирным шрифтом), обеспечивающая возможность последующего лигирования продуктов амплификации.
Очищенные при помощи элюции из геля фрагменты ДНК были рестрицированы и лигированы, после чего из полученной лигазной смеси амплифицированы фрагменты ДНК, содержащие искомые гены в последовательности luxAB. В свою очередь клонирование полученных ПЦР-продуктов в Т-векторе на основе рлазмиды pTZ57R (Fermentas, Литва) привело к созданию первичной плазмиды pTZ ABlei, трансформация которой штамма E.coli MC1061 сообщала последнему способность к выраженной биолюминесценции при добавлении субстрата данной реакции - длинноцепочечного альдегида n-деканаля.
-6
С целью интеграции luxAB-геноъ в клетки В. subtilis они по сайгам PstI и EcoRI были переклонированы из pTZ ABlei в челночный вектор pLF14. В свою очередь перенос сформированной гибридной плазмиды pLF14ABlei в клетки В. subtilis 168 с последующим высевом бактериальной биомассы на LB-агар с 25 мкг/мл канамицина позволил получить рекомбинантный штамм В. subtilis DO 0002 pLF14ABlei с высоким уровнем трансляции конститутивно транскрибируемых luxAB-генов, интенсивность свечения которого при добавлении деканаля в концентрации 7×10 М не менее чем в 10 раз превышала таковую у известного штамма В.subtilis ВКПМ В-10191 с немодифицированными luxAB-генами V. fischeri (Каримов И.О., Манухов И.В., Котова В.Ю., Омельченко Д.О., Дерябин Д.Г. Особенности люминесцентного отклика рекомбинантного штамма Bacillus subtilis с клонированными luxAB-генами Vibrio fisheri при воздействии термостабильиых компонентов сыворотки крови /// Биотехнология. - 2010. - №2 - С.25-30).
Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика, Москва) под № В-10548.
2) Важным обоснованием использования для заявленных целей Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 является выявленная в эксперименте прямая достоверная (Р<0,05) корреляция между подавлением интенсивности его биолюминесценции при воздействии сыворотки крови и выраженностью развивающегося в данных условиях бактерицидного эффекта, зафиксированного с использованием классических бактериологических техник.
Сказанное является ключевым условием использования показателя интенсивности биолюминесценции Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 для тестирования бактерицидных свойств сыворотки крови.
3) Другим обоснованием использования для заявленных целей для заявленных целей Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 является выявленная в эксперименте избирательная чувствительность данного штамма к бета-лизину (тромбоцитарному катионному белку) в отсутствие таковой к иным присутствующим в сыворотке крови бактерицидным факторам.
Так, сравнение люминесцентного отклика данного штамма с таковым у Escherichia coli с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi, использование которого для определения бактерицидной активности сыворотки крови закреплено патентом РФ на изобретение №2247987 [9], при общей сонаправленности эффектов исследуемых сывороток крови свидетельствовало о том, что значения подавления биолюминесценции двух сравниваемых микроорганизмов являлись корреляционно независимыми (Р>0,05). В свою очередь сопоставление полученных значений с компонентным составом воздействующих сывороток крови, предварительно оцененным с использованием представительного ряда иммунохимических методов, позволило установить причины подобного различного реагирования использованных рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов.
В частности, интенсивность подавления свечения Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 достоверно коррелировала только с количественным присутствием в исследуемых сыворотках бета-лизина (r=-0,481; Р<0,01).
50
В свою очередь для сравниваемого штамма Escherichia coli с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi наиболее значимые коэффициенты корреляции были зафиксированы между остаточной биолюминесценцией и характеризуемой значениями СН общей активностью комплемента (r=-0,427; Р<0,01), а также активностью бактериологического фермента лизоцима (r=-0,395; Р<0,01). При этом существование подобной зависимости могло определяться как собственной биологической активностью лизоцима, вовлекаемого в процесс разрушения бактериальных клеток после формирования мембраноповреждающих комплексов из «поздних» белков системы комплемента, так и особенностями исследуемой выборки сывороток крови, в которых присутствие данного фактора положительно коррелировало с активностью названной системы (r=0,308; Р<0,05) и количественным содержанием входящих в нее С3- и С5-компонентов (r=0,309 и r=0,295; Р<0,05). Наконец сами названные компоненты, а также вовлекаемый в альтернативный путь активации системы комплемента фактор Н, также объединялись между собой положительными корреляционными связями (r=0,339; Р<0,05 и r=0,516; Р<0,01), формируя единую «корреляционную плеяду», значимую для развития бактерицидного эффекта сыворотки крови в отношении Escherichia coli.
Таким образом, сказанное позволяет утверждать, что клонирование одних и тех же генов биолюминесценции Photobacterium leiognathi в клетках Bacillus subtilis и Escherichia coli ведет к созданию двух различных сенсорных систем, селективная чувствительность которых к присутствующим в сыворотке крови бактерицидным факторам предположительно определяется особенностями организации поверхностных структур клеток-реципиентов. Тем самым выявленный комплекс причинно-следственных связей является ключевым условием использования показателя интенсивности биолюминесценции Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 для тестирования бактерицидных свойств сыворотки крови, определяемых именно присутствием в ней бета-лизина (тромбоцитарного катионного белка).
-6
4) Использование бактериальной суспензии с оптической плотностью 1,2 отн. ед. определяется необходимостью достижения уровня свечения пробы, которое возможно зафиксировать с помощью аппаратных средств регистрации люминесценции. При этом использование субстрата реакции - длинноцепочечного альдегида (деканаля) - оптимально в конечной концентрации 7×10 М для достижения высокого и стабильного уровня биолюминесценции клеток Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, так как дальнейшее уменьшение концентрации деканаля ухудшало стабильность свечения и было недостаточным для формирования аппаратно-регистрируемого уровня свечения, а увеличение уже не вело к дальнейшему росту значений биолюминесценции.
5) Обоснованием времени контакта люминесцируюшего штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 с образцом сыворотки крови в течение 0,5 часа является выход к данному времени уровня свечения на «плато эффекта» без дальнейшего изменения уровня люминесценции бактериальных клеток при увеличении времени воздействия.
В целом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условия осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию «изобретательский уровень».
Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.
Пример
1) Изучено изменение иммунного статуса у крупно рогатого скота при использовании комплексного препарата X, основными действующими веществами которого являются плацента денатурированная эмульгированная и нуклеинат натрия. Для проведения исследований было создано две группы стельных коров по 10 голов в каждой. Пря этом коровам опытной группы внутримышечно вводили препарат Х в дозе 0,025 мл/кг массы тела за 60, 30 и 7 дней отела, а животным контрольной группы препарат не применяли.
-6
Кровь для анализа бета-литической активности за два, один месяц и 7 дней до отела и через 10 дней после родов, у полученных от них телят в суточном и 30-дневном возрасте. При этом 1 мл сыворотки крови смешивали с аналогичным объемом суспензии бактериальных клеток и отбирали аликвоты по 250 мкл на 0 и 30 минуте существования смеси в кюветы, вносили 2 мкл деканаля в конечной концентрации 7×10 М и измеряли уровень свечения на биолюминометре Биотоке-10М. В контрольных пробах вместо сыворотки крови использовали физиологический раствор. Итоговый расчет бактерицидных свойств сыворотки крови, определяемых присутствием в ней бета-лизина, проводят по формуле:
<mrow><mi>Б</mi><mi>С</mi><mi>С</mi><msub><mi>К</mi><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Б</mi><mi>Л</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></msub><mo>=</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup><mo>×</mo><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup><mo>×</mo><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn></mrow>
,
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
где
- уровень биолюминесценции опытной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции опытной пробы после 0,5 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции контрольной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции контрольной пробы после 0,5 часов контакта.
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup><mo>=</mo><mn>8200</mn><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mo>.</mo><mi>е</mi><mi>д</mi><mo>.</mo></mrow>
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup><mo>=</mo><mn>7050</mn><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mo>.</mo><mi>е</mi><mi>д</mi><mo>.</mo></mrow>
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup><mo>=</mo><mn>8120</mn><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mo>.</mo><mi>е</mi><mi>д</mi><mo>.</mo></mrow>
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup><mo>=</mo><mn>7800</mn><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mo>.</mo><mi>е</mi><mi>д</mi></mrow>
К примеру, были получены значения
,
,
,
. При этом получаем:
<mrow><mi>Б</mi><mi>С</mi><mi>С</mi><msub><mi>К</mi><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Б</mi><mi>Л</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></msub><mo>=</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>7050</mn><mo>×</mo><mn>8120</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>8200</mn><mo>×</mo><mn>7800</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mo>=</mo><mn>10,50</mn><mi>%</mi></mrow>
Было установлено, что бета-литическая активность крови коров и новорожденных телят под действием иммуностимулятора изменялась незначительно. Однако у молодняка тридцатидневного возраста показатель был выше, чем у телят контрольной группы на 6,89% (p<0,05).
Бактерицидные свойства сыворотки крови, определяемые присутствием в ней бета-лизина коров при применении препарата X
Группа животных
бактерицидные свойства сыворотки крови
контрольная, %
опытная, %
Коровы за 60 дней до отела
10,52±0,85
1,0,84±0,41
Коровы за 30 дней до отела
10,72±0,54
10,82±0,36
Коровы за 7 дней до отела
10,25±0,35
10,69±0,39
Коровы после 10 дней после отела
11,98±0,66
11,00±0,36
Суточные телята
9,33±0,87
9,98±0,97
Тридцатидневные телята
9,76±0,23
10,44±0,34
Наблюдалась тесная взаимосвязь между интенсивностью роста и сохранностью телят контрольной и опытной групп. Из 10 телят опытной группы заболело четыре. Первые признаки желудочно-кишечного заболевания регистрировались на 5-7 день жизни, а у контрольных животных - на 2-4 день. Тяжелая степень заболевания отмечалась у 5 телят контрольной группы, в опытной все животные переболели в легкой форме.
Таким образом, положительный результат, полученный при использовании заявляемого способа, выступает в виде сокращения трудоемкости процедуры определения бактерицидной активности сыворотки крови, определяемое активностью бета-лизина.
2) В инфекционное отделение городской клинической больницы №1 г.Оренбург 2.06.11 в 17 часов поступил больной А с диагнозом «пневмония». Для определения бактерицидных свойств сыворотки крови, определяемых присутствием в ней бета-лизина, было отобрано 10 мл крови. Однако ввиду значительной длительности определения активности бета-лизина фотонефелометрическим методом (18 часов), было проведено экспрессное изучения данного параметра с использованием биолюминесцентного метода.
-6
При выполнении данного исследования этом 1 мл сыворотки крови смешивали с аналогичным объемом суспензии бактериальных клеток и отбирали аликвоты по 250 мкл на 0 и 0,5 часе существования смеси в кюветы, вносили 2 мкл деканаля в конечной концентрации 7×10 М и измеряли уровень свечения на биолюминометре Биотоке-10М. В контрольных пробах вместо сыворотки крови использовали физиологический раствор. Итоговый расчет бактерицидных свойств сыворотки крови, определяемых присутствием в ней бета-лизина, проводят по формуле:
<mrow><mi>Б</mi><mi>С</mi><mi>С</mi><msub><mi>К</mi><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Б</mi><mi>Л</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></msub><mo>=</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup><mo>×</mo><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup><mo>×</mo><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn></mrow>
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
где
- уровень биолюминесценции опытной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции опытной пробы после 0,5 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mn>0</mn></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции контрольной пробы после 0 часов контакта;
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mrow><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow><mrow><mn>0,5</mn></mrow></msubsup></mrow>
- уровень биолюминесценции контрольной пробы после 0,5 часов контакта.
Результаты изучения бактерицидных свойств сыворотки крови люминесцентным методом показали, что активность бета-лизина составляет 15% и характеризуется как «низкий». В связи с этим было принято решение осуществить переливание 200 мл плазмы с целью повышения уровня бактерицидных свойств крови, что было проведено уже через час после поступления пациента в отделение. Полученные на следующий день результаты нефелометрического анализа активности бета-лизина подтвердили результаты, полученные при биолюминометрии (уровень активности бета-лизина 13%).
Таким образом, положительный результат, полученный при использовании заявляемого способа, выступает в виде сокращения длительности выполнения процедуры определения бактерицидной активности сыворотки крови, определяемое активностью бета-лизина, и уменьшения его трудоемкости.