СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ МИКРОПОБЕГОВ HYSSOPUS OFFICINALIS L. В УСЛОВИЯХ IN VITRO
METHOD OF REGENERATION OF MICROSHOOTS HYSSOPUS OFFICINALIS L UNDER CONDITIONS IN VITRO

(Hyssopus officinalis
Изобретение относится к биотехнологии получения посадочного материала и может быть использовано для быстрого размножения, селекции и генетических манипуляций иссопа L.) в условиях in vitro.
H.officinalis
in vitro
(Hyssopus officinalis
Известен способ получения микропобегов в культуре с использованием вегетативных почек Lt C.L. Multiplication in vitro de I'Husope L.) // Revue Suisse de Vitic. Arboric. Hortic. - 1987.-V.19, №6. - P. 363-367. Вегетативные почки иссопа, отобранные от материнских растений, после стерилизации гипохлоритом кальция помещают на питательную среду, которая содержит макро- и микроэлементы на основе Мурасиге и Скуга (1962) - МС, дополнена 3% сахарозой, 0,7 % агаром (Difco Bacto-Agar, Germany), 1,0 мг/л тиамином, 0,5 мг/л пиридоксином, 0,5 мг/л никотиновой кислотой, и используют 100 мг/л раствора: 4,44 мкМ 6-бензиламинопурина (БАП), 1 мкМ 3-индолилмасляной кислоты (ИМК) и 0,57 мкМ гибереловой кислоты (ГК). Среднее количество микропобегов на эксплант достигает 6±1,5 (при концентрации БАП - 4,44 мкМ и ИМК - 0,49 мкМ).
Недостатком способа является низкий коэффициент размножения микропобегов, использование  морфогенетических  потенций только  одного  экспланта (вегетативная почка).
Actinidia deliciosa
in vitro
in vitro,
Известен способ регенерации микропобегов из листовых эксплантов в культуре , который использовали как прототип (Заявка № 2002120668 от 27.12.2002 г.). Метод включает в себя отбор листовых эксплантов от растений, полученных в культуре и культивирование высечек листа на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины МС, дополненной фитогормонами - БАП и индолилуксусной кислотой (ИУК). Через 4 недели культивирования на листовых эксплантах формируются адвентивные почки и микропобеги. Культивирование происходит при температуре 25°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивном освещении 2-3 клк.
При использовании данного способа, с целью получения микропобегов из листовой ткани иссопа, культивируя их на питательной среде с БАП и ИУК, не удавалось добиться массового образования адвентивных почек из листовых эксплантов.
in vitro
H.officinalis
В основу изобретения поставлена задача: усовершенствовать способ регенерации растений из листовой ткани в условиях за счет подбора условий культивирования листовых дисков с целью максимального выхода генетически однородного растительного материала.
H.officinalis,
in vitro,
in vitro
Поставленная задача решается тем, что в способе прямой регенерации микропобегов которая состоит из отделения листовых эксплантов от растений, полученных в культуре и культивирования эксплантов на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины на основе МС и фитогормоны, в соответствии с изобретением на питательную среду в качестве фитогормона вводят вещество цитокининового типа действия, листовые экспланты иссопа отделяют от микропобегов после 4-5 пассажа в культуре и их культивирование проводят при низкой интенсивности освещения.
in vitro
Существенные признаки заявленного способа имеют причинно-следственную связь с достигнутым результатом. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа, после первых трех субкультивирований на листовых эксплантах формировался каллус или единичные адвентивные почки, которые в дальнейшем не образовывали микропобеги. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 4-5 пассажей в культуре интенсивность образования адвентивных почек и регенерация микропобегов достигали 90%. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 6-8 пассажей наблюдали массовую регенерацию микропобегов, однако основная их часть была витрифицирована (обезвожена) и не способна для дальнейшего размножения.
Частота побегообразования увеличивалась при снижении интенсивности освещения до 1-1,5 клк и достигала 90%. Повышение интенсивности освещения до 2-3 клк (стандартные параметры для большинства растительных объектов) снижало частоту регенерации микропобегов до 50-60%.
9
8
4
В качестве вещества цитокининового типа действия, которое индуцирует образование и развитие меристем, а также регенерацию микропобегов в питательной среде, использовали тидиазурон (TDZ) - CHNOS.
Предложенный способ выполняется таким образом: приготавливают питательную среду согласно существующей методике. Состав питательных сред представлен в таблице 1.
Состав питательной среды для размножения растений иссопа
Таблица 1
Компоненты
Питательные среды для разных этапов размножения
1
2
3
Культура вегетативных почек
Культура листовых дисков
Укоренение <i>in vitro</i>
Макроэлементы, мг/л:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
825,0
825,0
412,5
KNO<sub>3</sub>
950,0
950,0
475,0
СаС1<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>О
220,0
220,0
110,0
MgSO<sub>4</sub> <sup>.</sup>7H<sub>2</sub>O
185,0
185,0
92,5
КН<sub>2</sub>РО<sub>4</sub>
85,0
85,0
42,5
Na<sub>2</sub>EDTA
37,3
37,3
37,3
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
27,8
27,8
27,8
Микроэлементы, мг/л:
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
6,2
6,2
3,1
MgSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
22,3
22,3
11,15
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
8,6
8,6
4,3
KJ
0,83
0,83
0,415
Na<sub>2</sub>M<sub>0</sub>O<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,25
0,25
0,125
CuSO<sub>4</sub>·6H<sub>2</sub>O
0,025
0,025
0,0125
Органические вещества:
Глицин, мг/л
2,0
2,0
2,0
Мезоинозит, мг/л
50,0
50,0
25,0
Никотиновая кислота, мг/л
0,5
0,5
0,5
Пиридоксин - НСl,мг/л
0,5
0,5
0,5
Тиамин - НСl, мг/л
0,1
0,1
0,1
Зеатин, мкМ
2,28
-
-
Тидиазурон, мкМ
-
4,0-7,0
-
Кинетин, мкМ
4,6
-
-
ИМК, мкМ
0,49
-
8,0-11,0
Сахароза, мг/л
30000,0
30000,0
15000,0
Агар, мг/л
6000,0
6000,0
6000,0
рН
5,6
5,6
5,6
Сегмент микропобега иссопа с латеральной почкой помещают на питательную среду для культивирования вегетативных почек. Интенсивность освещения составляет 2,5-3 клк, температура 25±1°С, фотопериод 16 часов. Через пять суток наблюдают образование микропобегов. Нормально сформированные микропобеги без морфологических изменений через 2 недели культивирования удлиняются до 3-4 см. Их микрочеренкуют на сегменты с латеральной почкой и снова помещают на исходную среду №1 (табл.1). Микрочеренкование производят через 2-3 недели культивирования. Вначале коэффициент размножения не превышает 1:2, но после 4-5 пассажа достигает 1:4. У листьев микропобегов после 4-5 субкультивирования вырезают диски, которые помещают на питательную среду №2 (табл.1), которая содержит половинную концентрацию макроэлементов, полный набор микроэлементов и витаминов по МС, дополненную цитокинином - тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ (табл.2). Из данных таблицы видно, что максимальное количество адвентивных почек и микропобегов образуется на листовых эксплантатах после 8 недель при оптимальной концентратции тидиазурона. Через 8 недель культивирования листовых эксплантов происходит активное формирование адвентивных почек (16-20 шт./эксплант), при концентрации тидиазурона 9,0 мкМ листовые экспланты формируют каллус.
in vitro,
in vitro.
Влияние количества пассажей микропобегов на регенеративную способность листовых дисков подтверждается данными таблицы 3. Из данных таблицы видно, что листовые экспланты, взятые с микропобегов иссопа после 3-х субкультивирований в условиях  образуют каллус; адвентивные почки и микропобеги отсутствуют. Максимальное количество адвентивных почек и побегов образуется на эксплантах, отобранных с листовых микропобегов иссопа, после 4-5 субкультивирований в условиях После 6-8 пассажей на листовых эксплантах образуется масса обезвоженных и в дальнейшем нежизнеспособных микропобегов иссопа.
Таблица 2
in vitro
Влияние концентрации тидиазурона на частоту регенерации микропобегов иссопа из листовых эксплантов условиях
Концентрация тидиазурона, мкМ
Количество листовых эксплантов с микропобегами, % (*)
Форма 80882
Форма 38285
4 недели
8 недель
4 недели
8 недель
0,5
1,2±0,1
8,0±1,4
1,5±0,1
9,0±1,2
1,0
1,5±0,1
8,0±1,4
2,0±0,2
10,0±3,5
3,0
10,0±2,0
20,0±2,5
20,0±3,0
40,0±7,9
6,0
25,0±3,0
55,0±3,0
45,0±5,0
90,0±4,0
9,0
5,0±0,5
9,0±1,6
10,0±2,0
20,0±2,5
(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.
Таблица 3
Влияние количества субкультивирований микропобегов на регенерационную
in vitro
способность листовых эксплантов иссопа в условиях
№ пассажа
Регенерационная способность листовых дисков
Морфогенетические процессы
Коэффициент размножения
1-3
Образование каллуса
0
4-5
Адвентивное побегообразование
1:16-1:20
6-8
Образование обезвоженных микропобегов
1:10
in vitro.
Снижение интенсивности освещения до 1-1,5 клк стимулирует образование микропобегов иссопа в условиях Это подтверждается данными таблицы 4.
Таблица 4
in vitro
Влияние интенсивности освещения на частоту регенерации микропобегов иссопа у листовых эксплантов в условиях
Интенсивность освещения, клк
Количество листовых эксплантатов с микропатогенами, % (*)
Форма 80882
Форма 38285
0
0,0
0,0
1
80,0±5,0
35,0±11,0
1,5
90,0±4,0
50,0±4,3
2
75,0±5,0
40,0±7,9
2,5
55,0±3,0
27,0±3,0
3
35,0±5,0
16,0±6,1
(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.
Из данных таблицы видно, что при отсутствии освещения не происходит образование адвентивных почек и побегов. Оптимальный уровень интенсивности освещения для инициации побегообразования и пролиферации микропобегов иссопа составил 1,5 клк. Частота регенерации и количество микропобегов на листовой диск значительно уменьшились при интенсивности освещения 2 клк, а при интенсивности освещения 3 клк только низкий процент листовых дисков был способен к регенерации и чаще всего экспланты погибали.
Следует отметить, что адаксиальное размещение листовых дисков иссопа на питательной среде повышает частоту регенерации микропобегов иссопа до 90%. В течение года из листовых дисков от одного растения иссопа можно получить около 10000 микропобегов, которые отделяют и в дальнейшем укореняют.
in vitro
in vivo.
Укоренение микропобегов проводят на питательной среде №3 (табл.1), которая содержит 8,0-11,0 мкМ ИМК. Культуральные сосуды выставляют на стеллажи. Интенсивность освещения составляет около 2 клк, температура 21±1°С, фотопериод 14 часов. Через 2-2,5 недели наблюдается образование максимального количества корешков длиной 5-6 см. Число укорененных побегов иссопа в условиях составляет 63-72 % (в зависимости от формы иссопа). Полученные растения готовы к высадке в субстрат и адаптации