ПРЕДОПЕРАЦИОННЫЙ СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОСТНОГО ИМПЛАНТАТА
PRE-OPERATION METHOD OF ESTIMATING BONE IMPLANT QUALITY

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, хирургии, клеточной биологии, и предназначено для экстракорпорального определения качества имплантируемых материалов in vitro, например для оценки остеокондуктивных свойств имплантатов из деминерализованного костного матрикса (ДКМ), выявления негативного влияния на репаративные процессы свободных химических реагентов у имплантатов.
Материал, из которого произведен имплантат для целей травматологии и ортопедии (восполнение крупных костных, хрящевых дефектов), должен обладать необходимьм набором свойств, главными из которых являются: низкая антигенная активность; материал должен быть хондро- и остеокондуктором, хондро- и остеоиндуктором; иметь способность к постепенной и желательно управляемой биодеградации. Некоторые из этих свойств присутствуют у материалов, из которых производятся имплантаты, другие проявляются в процессе обработки, третьи привносятся с дополнительными веществами, например стимуляторами, факторами роста, стромальными ауто- или аллоклетками, культивированными для трансплантации.
В то же время известно, что большинство имплантируемых материалов (кроме нативных биологического происхождения) в процессе обработки подвергаются глубоким изменениям структуры, химического состава, формы, пористости и шероховатости поверхности. В глубине материала (например, синтетического небиологического происхождения) могут остаться продукты неполного синтеза (керамика, гидроксиапатиты), активные химические реагенты (например, соляная кислота в ДКМ), элементы клеток (аллогенный нативный костный матрикс, матрикс хряща).
Применяемые в настоящее время способы стерилизации и консервации имплантатов также способны изменить их свойства и не всегда в лучшую сторону. Так, например, стерилизация гамма-лучами в значительной степени изменяет структуру и остеоиндуктивные свойства имплантатов из ДКМ, быстрые электронные пучки имеют низкую проникающую способность, окись этилена - клеточный яд, требующий полного удаления его паров из глубины имплантата. В то же время имплантаты из ДКМ при лиофилизации могут деформироваться со значительной потерей остеокондуктивных свойств (при несоблюдении технологических правил).
Все сказанное выше требует тщательного контроля, что достигается часто большим количеством экспериментальных исследований с целью определения, как и в какой степени влияет то или иное изменение производственного процесса при изготовлении имплантатов. Тем более эта проблема актуальная в массовом лабораторно-промышленном производстве имплантатов. Однако не всегда результаты экспериментальной проверки (в острых опытах на животных) соответствуют реальной ситуации при имплантации материала человеку (реакция человеческого организма, в первую очередь его клеток в зоне повреждения, может отличаться от эксперимента).
Известны способы определения остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов небиологической природы, в качестве которых использовали титан и его сплавы с различными покрытиями /патент РФ 2159094/. Опыты проводились на самцах мышей линии Balb/c, находящихся в стандартных условиях и на диете. Мышей предварительно выдерживали в течение 2-3 недель в карантине, больные и нестандартные животные выбраковывались. Каждому животному после дачи эфирного наркоза подкожно вводили по 4 диска. Для определения остеокондуктивных свойств на диск предварительно наносили столбик костного мозга, выделенного из бедренной кости путем вымывания 1-2 мл среды Д-МЕМ с 5%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Остеоиндуктивность исследовали без нанесения на диски костного мозга. Через 1 месяц животных забивали, определяли физическими методами силу сцепления дисков с окружающей тканью. Предварительную оценку размеров очагов костеобразования осуществляли с помощью бинокулярного микроскопа МБС-2, после чего делали гистологический, цитологический и цитохимический анализ для определения качественного состава костных и других клеток на поверхности имплантанта и реакции на него окружающей ткани. Результаты обрабатывали методом непараметрической статистики.
Известен способ определения остеоинтегративных свойств материалов в зубных имплантатах, заключающийся в определении поверхности перехода имплантата, помещенного 4 собакам. По истечении 15, 30, 60 и 120 дней после помещения имплантата в челюстную кость животных проводили гистологическую оценку тканей, окружающих имплантат. Определяли также рост костной ткани через отверстия имплантата по направлению к внутреннему костному столбику. При микроскопическом исследовании образцов, полученных от собак, выведенных из эксперемента на 60-й день, определяли поверхность перехода кость/металл /Lum. L.B., Beirne O.R. Viability of the retained bone core in the core-vent dental implant. J. Oral ImplantoL, 1987, 13, №3, 402-408/.
Известны способы определения остеоинтегративных свойств материалов для костных имплантантов и трасплантатов биологической и небиологической природы, заключающиеся в непосредственном вживлении испытуемых материалов в кость экспериментальных животных /Diert E., Fischer-Brandies E., Bagambisa F. REM-Untersuchungen an den Grenzschichtstrukturen Hydroxylapatik. Knochen. Dtsch. Zahnarztl. Z., 1988, 43, №1, 22-25/.
Недостатками известных способов являются: крайне затрудненное определение количественной оценки костной интеграции (отношение площади участков прямого контакта костных культур с поверхностью имплантанта к общей площади имплантата); для достоверного суждения требуются значительно большие группы животных; необходимы более длительные эксперименты; нет прямой зависимости от техники выполнения операции на животном.
2
Известен способ определения остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов, заключающийся в определении биосовместимости путем помещения культуры остеобластов человека, которая являлась тест-объектом, на фрагменты размером 1-3 мм из исследуемого материала и количественной оценки роста остеобластов на исследуемом материале через 15 дней. Рост остеобластов изучали методом сканирующей электронной микроскопии. /A comparison of the biocompatibility of bone graft substitutes for human osteoblasts. Begley C.T.. J. Anat. 1993, 183, №1, с 176/. Оценка остеоинтегративных свойств материалов проводилась по возможному размножению культуры. Отбраковывался материал, на котором клетки не приживались. Недостатком известного способа является невозможность количественной оценки остеоинтегративных свойств материалов, а также невозможность прямого перенесения полученных результатов на целый организм, так как поведение изолированных клеток значительно отличается от реакции in vivo.
Известен способ определения in vitro остеоинтегративных свойств пластических материалов для инплантатов, заключающийся в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью культивирования тест-объекта, который помещают на поверхность испытуемого материала. В качестве тест-объекта используют мезенхимальные стволовые клетки, при этом вначале определяют цитотоксичность образцов по жизнеспособности клеток, затем определяют эффективность прикрепления клеток к поверхности образцов путем заселения клеток на поверхность образца, последующей промывки образца культуральной средой через 120 минут и стандартного подсчета оставшихся на образце клеток, после этого определяют влияние образцов на эффективность пролиферации мезенхимальных стволовых клеток по количеству выращенных на поверхности образца клеток на 7 и 14 сутки и их стандартному подсчету, затем осуществляют индукцию остеогенной дифференцировки и оценивают ее по наличию минерализации, а также с помощью окраски на щелочную фосфатазу (пат. РФ 2259851). Способ очень сложен и не пригоден для экспресс-метода при подготовке операции по имплантации.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ (пат. РФ №2182018) определения in vitro остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов заключающийся в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью тест-объекта, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют лишенной надкостницы фрагмент теменной или лобной кости крысенка-сосунка в возрасте до 1 недели, на который помещают образец испытуемого материала из ДМК и определяют отношение площади заселенной остеобластподобными клетками поверхности к площади верхней поверхности образца и толщину отложенного клетками слоя коллагена известным методом. Недостатком прототипа является недостаточная эффективность способа, невозможность оперативного прогнозирования возможности дальнейшего использования костного имплантата.
Цель данного изобретения - упрощение способа качественной оценки костного имплантата, подготовленного к пересадке, получение качественных и количественных показателей поведения мезенхимальных стволовых клеток на исследуемом имплантате, что позволит оперативно прогнозировать возможность дальнейшего использования костного имплантата.
Поставленная цель достигается за счет использования предоперационного способа оценки качества костного имплантата, заключающегося в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью тест-объекта клеточного происхождения путем заселения клетками образца, помещенного в стандартную питательную среду. В качестве тест-объекта используют стволовые клетки костного мозга пациента и через 48 часов определяют количество заселенных клеток на поверхности образца, при увеличении количества клеток в 2-2,5 раза делают вывод о пригодности данного образца к имплантации.
Пример реализации способа
6
Способ осуществляется следующим образом: 1. Операционным (или пункционным) путем производится забор части костного мозга пациента (для сравнения отбирается часть клеток из клеточного банка лаборатории конкретно клетки от животных и человека-донора). 2. Выделенные трипсином стромальные клетки культивируются в стандартной питательной среде, состоящей из DMEM с телячьей сывороткой 10%, с добавлением глутамина, пенициллина, стрептомицина в среде углекислого газа (5%) до третьего пассажа. Концентрация клеток 2-5×10 клеток/мл. 3. Фрагмент имплантируемого материала (прошедший полный технологический цикл, включая стерилизацию, консервацию) помещают в ячеи стандартного планшета для культивирования и заполняют питательной средой. Далее планшет переносят в термостат и при 37°С и содержании углекислоты в воздухе 5% проводят культивирование. В первые часы культивирования остеобластподобные клетки поднимаются на боковые и верхнюю поверхности образца, заселяя их на несколько миллиметров от края. В процессе перемещения клетки распластаны по поверхности образца и контурируют его рельеф. В клетках, наиболее удаленных от края образца, активность синтеза коллагена меньше, чем в клетках у его края, где определяется сеть вновь отложенных коллагеновых фибрилл, среди которых обнаруживаются многочисленные клеточные отростки.
Через 48 часов флаконы с фрагментом имплантата и без него исследуются в инвертирующем и электронном сканирующем микроскопах (или, как вариант, количество клеток на образцах оценивали методом фотометрии и с помощью прямого подсчета в камере Горяева после снятия раствором трипсина).
Быстрота заселения поверхностей образца клетками (% покрытой ими поверхности) и толщина синтезированного клетками коллагена являются количественными критериями выраженности остеоинтегративных свойств испытуемого материала. Оптимальным сроком для оценки этих показателей является 48 часов культивирования для определения % покрытой остеобластподобными клетками поверхности образца и для оценки толщины синтезируемого клетками слоя коллагена.
В эксперименте в качестве заменителей костной ткани для имплантатов использовали как биологические композиты, так и материал небиологической природы.
1. По литературным данным оптимальным с точки зрения остоинтегративных свойств материалов для имплантации в кость является деминерализованный костный матрикс (ДКМ) - объект №1 и 2 (таблица).
2. Другим часто используемым в ортопедической и травматологической практике биологическим имплантируемым материалом являются фрагменты фиксированной лиофизированной или консервированной кости - объект №3 (таблица).
3. Использование в ортопедической и травматологической практике в качестве имплантируемых материалов трасплантатов небиологической природы используют гидроксиапатиты - образец №4 (таблица) /Перечень полимерных материалов, рекомендуемых для изделий медицинского назначения. М., 1987 г, ВНИИМТ и ВНИИФ/.
Для исследуемых материалов (образец №1 и №2) по заявляемому способу определяли их остеоинтегративные свойства через 48 часов культивирования. Стромальные клетки заселили 90-100% верхней поверхности аутогенного ДКМ и 50-80% гетерогенного ДКМ. Через 48 часов толщина отложенного клетками слоя коллагена была достаточно равномерна и составляла 0,4-0,7 мкм.
Для исследуемых материалов (образец №3) по заявляемому способу определяли их остеоинтегративные свойства через 48 часов культивирования. Стромальные клетки заселили 25% верхней поверхности образца. Через 48 часов толщина отложенного клетками слоя коллагена неравномерна: в участках у края образца она была 0,1-0,2 мкм, а в его центральных отделах выявлялась сеть разрозненных коллагеновых волокон.
Для исследуемых материалов (образец №4) по заявляемому способу определяли их остеоинтегративные свойства через 48 часов культивирования. Стромальные клетки заселили 5% верхней поверхности образца. Через 48 часов слой отложенного клетками коллагена на поверхности образца не выявляется, а по его краям обнаруживается лишь сеть разрозненных коллагеновых волокон.
Результаты проведенных исследований по определению остеоинтегративных свойств материалов костных имплантатов сведены в таблицу.
№№
Клетки
Материал образца
Толщина слоя коллагена через 48 час, мкм
Количество заселяемых клеток через 48 час, клеток/мл
Качественная хар-ка остеоинтегративных свойств материалов
1
пациента
Аутогенный ДКМ
0,7
4-7,5×10<sup>6</sup>
++++
2
Чел. донора
Гетерогенный ДКМ
0,4
3-4×10<sup>6</sup>
+++
3
Животного
Лиофизированная кость
0,2
2,5-3×10<sup>6</sup>
++
4
Чел. донора
Гидроксиапатит
Разрозненная сеть колл. волокон
2,5×10<sup>6</sup>
+
В качестве клеток использовали стромальные клетки костного мозга пациента, для сравнения отбирается часть клеток из клеточного банка лаборатории - конкретно клетки от животных и человека-донора.
6
Начальное количество заселяемых клеток (содержание в питательной среде) составляло 2-3×10 клеток/мл.
Как видно из таблицы, образец №1 может быть рекомендован для дальнейшей пересадки. Образцы №2, 3, 4 не могут использоваться в качестве имплантата, поскольку клетки очень слабо заселяют поверхность образцов и синтез коллагена практически не выражен.
Через 24 часа на образцах поверхность, заселенная клетками, составляла не более 30%, что не позволяло сделать выводы для дальнейшего использования в операции имплантатов. Количество часов в способе контроля более 48 не дает дополнительного результата, а менее 24 еще не дает качества.
Предложенный способ был испытан в условиях лаборатории соединительной ткани с группой клинической генетики и отделения экспериментальной травматологии и ортопедии ФГУ «ЦИТО им. Н.Н.Приорова Росмедтехнологий» на культурах стромальных клеток человека, выделенных из костного мозга пациента в нескольких сериях с фрагментами имплантатов из деминерализованного костного матрикса ксеногенного происхождения (кости телят), и с контрольными группами. Наблюдался благоприятный процесс заживления, имплантат воспринимался организмом пациента и интегрировался организмом.