СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОЗА ПОЧЕК
MEANS FOR KIDNEY FIBROSIS TREATMENT

Область техники
Настоящее изобретение относится к носителю для доставки вещества в продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке и к композиции для лечения фиброза почек, и к способу лечения фиброза почек, в котором применяется вышеуказанный носитель.
Уровень техники
В последние годы, из-за больших изменений в образе жизни, главным образом касающихся предпочтений в еде, увеличилось распространение связанных с образом жизни болезней, таких как повышенное кровяное давление и диабет, и сопровождающий эти явления риск заболевания почек и, следовательно, почечной недостаточности увеличивался.
Почка является важным органом для поддержания гомеостаза внутренней среды посредством экскреции продуктов жизнедеятельности или регуляции жидкостей тела/электролитов/кислотно-основного баланса и т.д. Почка контролирует концентрации различных соединений в крови, таких как водород, натрий, калий и кремний и выделяет продукты жизнедеятельности в виде мочи. Любое ухудшение почечной функции формирует возможность вмешательства в способность организма в достаточном объеме удалять метаболиты из крови и также возможность нарушения баланса электролита тела. В наиболее тяжелой форме ухудшение или отказ функции почек могут быть фатальными.
Кроме того, помимо вышеупомянутых функций почка обладает такими функциями как опосредованный клетками иммунитет, эндокринная секреция и метаболизм. Почка в качестве эндокринного органа производит эритропоэтин, который регулирует продукцию эритроцитов, или 1,25-дигидроксивитамин D3, который является активной формой витамина D3, секрецию ренина и эритропоэтина, которые являются факторами регуляции кровяного давления, и секрецию кинина, калликреина, простагландина и т.д.
Хроническая почечная недостаточность означает состояние, при котором вышеупомянутые почечные функции постепенно ухудшаются необратимо, и гомеостаз живого организма не может поддерживаться. Известно, что хроническая почечная недостаточность вызывается диабетической нефропатией, хроническим гломерулонефритом, злокачественным нефросклерозом, поликистозным заболеванием почек и т.д. Все почечные заболевания сопровождаются фиброзом почки и, в конечном счете, приводят к неизлечимой почечной недостаточности. В частности, так как хроническое ухудшение почечной функции зависит в большой степени от прогрессирования фиброза почки, считается, что ингибирование прогрессирования фиброза может привести к подавлению прогрессирования хронической почечной недостаточности.
Как правило, фиброз почек сопровождается воспалительным ответом вследствие дисфункции эндотелиальных клеток и внеклеточного матрикса, который, в конечном счете, продуцируется в избытке, являются причиной фиброза. Например, при громелуросклерозе из-за клубочковой дисфункции эндотелиальных клеток секретируется цитокин, такой как хемокин или фактор роста, и моноциты или макрофаги мигрируют для того, чтобы воспалительный ответ развивался. Впоследствии происходят активация, пролиферация и трансформация мезангиальных клеток, продуцируется избыточное количество внеклеточного матрикса из продуцирующих внеклеточный матрикс клеток, таких как мезангиальные клетки, появляется фиброз, и это приводит к громелуросклерозу.
В частности диабетическая нефропатия является самым важным фактором, приводящим к хронической почечной недостаточности, и одному из осложнений диабета. Диабетическая нефропатия характеризуется гиперплазией и расширением гломерулярного мезангия, и это происходит главным образом из-за увеличения накопления белка ЕСМ, такого как коллаген I типа или IV типа, фибронектина или ламинина.
Как только достигается опасная степень хронической почечной недостаточности, восстановление становится невозможным, и случается уремия, если не будет осуществлено лечение, такое как диализ. В качестве терапии хронической почечной недостаточности применяется диета, такая как низкобелковая диета или диета с ограничением соли, введение гипотензивного препарата, чтобы облегчить нагрузку на клубочки и т.д.
Кроме того, для хронической почечной недостаточности, по мере необходимости, проводится лечение для компенсации 1,25-дигидроксивитамина D3 или эритропоэтина, которые секретируются почкой, или лечение для поддержания надлежащей регуляции кровяного давления, что является важной функцией почки.
В качестве химиотерапии, чтобы подавить прогрессирование почечной недостаточности, используются ингибитор ангиотензин-превращающего фермента или антагонист рецептора ангиотензина II. Предполагается, что они имеют защитный эффект по отношению к почкам сами по себе в дополнение к подавлению прогрессирования почечной недостаточности посредством уменьшения кровяного давления в клубочках. Однако необходимо соблюдать осторожность при введении, так как, когда клубочковое кровяное давление уменьшается слишком резко, интенсивность клубочкового кровотока на самом деле уменьшается, и случается преренальная почечная недостаточность.
В качестве ингибитора ангиотензин-превращающего фермента известны: каптоприл, эналаприл, делаприл, имидаприл, квинаприл, темокаприл, периндоприла эрбумин, лизиноприл и т.д., а в качестве антагонистов рецептора ангиотензина II известны: лозартан, валсартан, кандесартан цилексетил, телмисартан, олмесартана медоксомил, ирбесартан и т.д.
Кроме вышеупомянутого, для того чтобы нормализовать симптомы уремии и задержать немного начало диализа, используется Kremezin в качестве адсорбирующего угля, который адсорбирует вредные вещества в кишечнике. Кроме того, чтобы предотвратить одышку, онемение в конечностях, аритмию и т.д. вследствие увеличения калия в крови, используется полистиролсульфонат кальция в качестве ионообменной смолы, которая адсорбирует калий в кишечнике и выводит в виде экскрементов.
Когда концентрация в сыворотке креатинина, который является метаболитом, образующимся в скелетных мышцах, превышает 5-7 мг/дл, следует рассматривать искусственную диализную терапию, такую как перитонеальный диализ, гемофильтрацию или диализ крови или пересадку почек. Однако диализ крови оказывается очень обременительным для человека из-за необходимости посещать больницу три раза в неделю и быть заключенным там в течение 4-5 часов для лечения, и относительно пересадки почек: так как доноров почек немного, среди пациентов, которые желают пересадки, только очень небольшое число может получить трансплантат почки. Кроме того, ожидаемая средняя продолжительность жизни больных почечной недостаточностью после начала диализа приблизительно вдвое меньше, чем продолжительность жизни у нормальной популяции.
При этих обстоятельствах большая научно-исследовательская работа была проведена для разработки средства для лечения фиброза почек. В результате было сообщено, что имеют определенную степень успеха на животной модели с фиброзом почек или в клинических испытаниях (непатентный документ 1) например, лекарственное средство, действующее на систему ренин-ангиотензин-альдостерон, такие как ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, антагонист рецептора ангиотензина II AT1, антагонист альдостерона или ингибитора ренина, лекарственное средство, действующее на систему окиси азота, такой как антагонист эндотелиннового рецептора, α-блокатор, β-блокатор, иммуносупрессор, ингибитор метаболизма внеклеточного матрикса, ингибитор системы комплемента, ингибитор хемокина или ингибитор фосфодиэстеразы 5 и лекарственное средство, такое как ингибитор NFκB, ингибитор Rho, ингибитор р38 МАРК, ингибитор PI3Kγ, ингибитор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), калликреин, релаксин, антагонист рецептора интерлейкина 1, костный морфогенетический фактор 7 (ВМР-7), антитело против фактора некроза опухоли-α (антитело Anti-TNFα), или антитело против тромбоцитарного фактора роста D (Антитело Anti-PDGF-D).
Кроме того, было много заявок на патент и, например, патенты, касающиеся ингибитора ангиотензин-превращающего фермента (патентный документ 1), антагонистов рецептора ангиотензина II (патентный документ 2), ингибитор трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) (патентный документ 3), ингибитор продуцирования ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1) (патентный документ 4), селективный агонист простагландинового рецептора 4 (патентный документ 5), ингибитор синтеза коллагена типа I (патентный документ 6), ингибитор сульфотрансферазы протеогликана хондроитинсульфата (патентный документ 7), ингибитор эпоксидредуктазы витамина К (патентный документ 8), ингибитор образования конечного продукта гликирования (патентный документ 9), 2A агонист аденозинового рецептора A2A (патентный документ 10), антагонист рецептора эндотелина (патентный документ 11), ингибитор VEGF (патентный документ 12) и т.д., которые применялись в качестве лекарственных средств против фиброза почек. Однако ни одно из этих лекарственных средств не является удовлетворительным, и необходимо дальнейшее развитие препаратов для лечения фиброза почек.
Документы, использованные при экспертизе заявки
Патентные документы
Патентный документ 1 патент США. №5238924
Патентный документ 2 JP, А, 07-002667
Патентный документ 3 JP, А, 2004-043459
Патентный документ 4 JP, А, 2009-007258
Патентный документ 5 JP, А, 2001-233792
Патентный документ 6 JP, (РСТ) 2004-534760
Патентный документ 7 JP, А, 2009-292725
Патентный документ 8 JP, А, 2010-077101
Патентный документ 9 JP, А, 2009-029750
Патентный документ 10 JP, (РСТ) 2007-536241
Патентный документ 11 JP, (РСТ) 2006-519817
Патентный документ 12 JP, А, 2007-099641
Патентный документ 13 международная заявка на патент WO 2006/068232
Патентный документ 14 JP, А, 2009-221164
Патентный документ 15 JP, А, 2010-59124
Непатентные Документы
Непатентный документ 1 Nephrology, dialysis, transplantation 2007; 22 (12): 3391-407
Сущность изобретения
Проблемы, решаемые настоящим изобретением
Целью настоящего изобретения является обеспечение носителя, который может специфически доставлять вещество, такое как лекарственное средство, к клеткам, продуцирующим внеклеточный матрикс в почке, и средства для лечения фиброза почек, и способа лечения фиброза почек, в котором применяется указанный носитель.
Средства для решения проблем
Авторы настоящего изобретения обнаружили во время исследования нового средства для лечения фиброза почек, что фиброз почек можно эффективно лечить посредством введения композиции, в которой ингибитор продуцирования внеклеточного матрикса переносится носителем, который включает ретиноид в качестве нацеливающего агента, таким образом, осуществляя настоящее изобретение.
Известно, что носитель, который включает витамин А, может доставлять лекарственное средство к звездчатым клеткам, которые хранят витамин А (патентный документ 13), и что композиция, в которой миРНК для HSP47 зафиксирована на вышеупомянутом носителе, может нормализовать печеночный фиброз (патентный документ 13), легочный фиброз (патентный документ 14), и миелофиброз (патентный документ 15), но никакая взаимосвязь между почечным фиброзом, интерстициальной ткани почек или мезангии до сих пор совершенно неизвестна.
Таким образом, настоящее изобретение касается следующего:
(1) Носитель для доставки вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке, включающий ретиноид в качестве агента, нацеливающего на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки.
(2) Носитель по п.(1), приведенному выше, в котором ретиноид включает ретинол.
(3) Носитель в соответствии с пп.(1) или (2), указанных выше, в котором носитель имеет форму липосомы, и мольное отношение ретиноида и липида, содержащегося в липосоме, составляет от 8:1 до 1:4.
(4) Фармацевтическая композиция для лечения фиброза почек, включающая носитель по любому из пп.(1) - (3), приведенных выше, и лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке.
(5) Фармацевтическая композиция по п.(4), приведенному выше, в которой лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, выбирается из группы, состоящей из ингибитора активности или продуцирования PAI-1, ингибитора клеточной активности, ингибитора роста, индуктора апоптоза и молекулы РНКи, рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты или химерного полинуклеотида ДНК/РНК, которые нацелены по меньшей мере на одно из молекул, составляющих внеклеточный матрикс, или молекул, вовлеченных в продуцирование или секрецию молекул, составляющих внеклеточный матрикс, или вектора, экспрессирующего их.
(6) Фармацевтическая композиция по п.(4), приведенному выше, в которой лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток, представляет собой ингибитор HSP47.
(7) Фармацевтическая композиция по любому из пп.(4) - (6), приведенных выше, в которой лекарственное средство и носитель смешиваются в месте лечения или поблизости от него.
(8) Набор для получения фармацевтической композиции по любому из пп.(4) - (7), описанных выше, включающий один или более контейнеров, которые содержат либо по отдельности, либо в комбинации лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, ретиноид и при необходимости составляющее носитель вещество, отличное от ретиноида.
(9) Способ получения носителя для доставки вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке, включающий стадию введения ретиноида в качестве агента, нацеливающего на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке.
(10) Способ получения фармацевтической композиции для лечения фиброза почек, включающий стадию введения ретиноида в качестве агента, нацеливающего на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, и лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, в качестве активного ингредиента.
Эффекты изобретения
Хотя точный способ действия композиции для лечения фиброза почек в соответствии с настоящим изобретением еще не был полностью выяснен, считается, что ретиноид функционирует в качестве агента, который нацеливает на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, такие как фибробласты или миофибробласты, и доставляет активный ингредиент, такой как лекарственное средство, которое контролирует активность или рост продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, к таким клеткам, таким образом демонстрируя эффект против фиброза почек.
Поэтому, так как активный ингредиент может быть эффективно доставлен к месту действия, и затем к клеткам-мишеням при помощи носителя в соответствии с настоящим изобретением, лечение, подавление прогрессирования и предотвращение наступления фиброза почек и т.д., в особенности диабетического нефрита, чье лечение было трудным до настоящего времени, стало возможным, и настоящий носитель таким образом вносит значительный вклад в медицину человека и ветеринарию.
Кроме того носитель в соответствии с настоящим изобретением может быть объединен с любым лекарственным средством (например, существующим лекарственным средством для лечения фиброза почек), чтобы увеличить эффективность его действия; поэтому это также является выгодным для всего широкого спектра применения с точки зрения технологии приготовления лекарственного средства, что облегчает производство эффективных лекарственных средств.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет собой микроскопическое изображение клубочка при окрашивании с помощью красителя сириус красный среза коркового вещества почки мыши каждой группы. Изображения получали при увеличении 800× с использованием масляно-иммерсионной линзы.
Фиг.2 представляет собой график, показывающий долю фиброзной области коркового вещества почки, количественно определенной с помощью окрашивания красителем сириус красный. 20 полей зрения были случайным образом выбраны в области коркового вещества почки для каждой мыши и были вычислены доли фиброзной области (Площадь фиброза (%)) (*Р<0,05, **Р<0,01).
Фиг.3 представляет собой график, показывающий нокдаун гена посредством липосомы, VA-связывающей, содержащей миРНК, в мышиных почечные клетках, продуцирующих внеклеточный матрикс. Уровень экспрессии гена HSP47 в клетках, продуцирующих внеклеточный матрикс, собранных из почки мыши, был скорректирован с уровнем экспрессии GAPDH, который является геном внутреннего контроля, и была построена доля экспрессии гена HSP47 (экспрессия гена HSP47 (%)), определяя «Никакого лечения» (нелеченные) как 100%. VA-lip обозначает VA-липосома-миРНК Hsp47C, lip обозначает липосома-миРНК Hsp47C, VA + миРНК обозначает VA + миРНК Hsp47C, и NT обозначает отсутствие лечения.
Варианты выполнения настоящего изобретения
В настоящем изобретении продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, не являются особенно ограниченными, до тех пор пока они являются клетками, существующими в почке, обладающие способностью продуцировать внеклеточный матрикс, и примеры этого, присутствующие в почке, включают мезангиальные клетки, тубулоинтерстициальные клетки, перициты, фибробласты, фиброциты, которые являются клетками предшественниками фибробластов и миофибробластов. Клетки, продуцирующие матрикс, существующие в почке, могут включать не только клетки, полученные из клеток, существующих в почке, но также и клетки, полученные из фиброцитов в циркулирующей крови и клеток, трансформированных из эндотелиальных клеток путем эндотелиально-мезенхимальной трансдифференцировки. Миофибробласты характеризуются экспрессией α-SMA (альфа-актина гладких мышц). Миофибробласты в настоящем изобретении являются миофибробластами, идентифицированными, например, с помощью иммуноокрашивания с использованием детектируемо-меченных анти α-SMA антител. Кроме того, так как фибробласты экспрессируют виментин, который характерен для мезенхимальных клеток, но не экспрессируют αSMA, они могут быть идентифицированы двойным окрашиванием виментина и αSMA и т.д. Кроме того продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, могут быть получены обработкой почечной ткани коллагеназой и протеазой и затем осуществлением выделения посредством центрифугирования в градиенте плотности (например, в Nycodenz, имеющем конечную концентрацию 8%).
Ретиноид в соответствии с настоящим изобретением функционирует в качестве нацеливающего агента (нацеливающий агент) к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке, и способствует специфической доставке вещества к этим клеткам. Механизм способствования доставке вещества посредством ретиноида еще не полностью ясен; однако, например, считается, что ретиноид, которой специфически связывается с ретинол-связывающим белком (RBP), поглощается клетками, продуцирующими внеклеточный матрикс в почке, через определенный рецептор, представленный на поверхности указанной клетки.
Ретиноид является членом класса соединений, имеющих скелет, в котором четыре изопреноидные единицы соединены голова-к-хвосту (см. G. P. Moss, «Biochemical Nomenclature and Related Documents)), 2nd Ed. Portland Press, pp.247-251 (1992)). Термин витамин А является родовым названием для ретиноида, которое качественно указывает биологическую активность ретинола. Ретиноид, который может использоваться в настоящем изобретении in vitro, не особенно ограничивается, и примеры его включают ретинол (включая all-транс-ретинол), ретиналь, ретиноевую кислоту (включая третиноин), ретиноидные производные, такие как сложный эфир ретинола и жирной кислоты, сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты, этретинат, изотретиноин, адапален, ацитретин, тазаротен и ретинил пальмитат и аналоги витамина А, такие как (4-HPR) фенретидин и бексаротен.
Из них ретинол, ретиналь, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирной кислоты (такой как ретинил ацетат, ретинил пальмитат, ретинил стеарат и ретинил лаурат) и сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты (такой как этил ретиноат) предпочтительны с точки зрения эффективности специфической доставки вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке.
Все изомеры ретиноида, включая цис-транс изомеры, включены в объем настоящего изобретения. Ретиноид может быть замещенным одним или более заместителями. Ретиноид в настоящем изобретении включает ретиноид как в чистом виде, так и в форме раствора или смеси со средой, которая может растворять или сохранять ретиноид.
Носитель в соответствии с настоящим изобретением может состоять только из ретиноида или может быть создан путем связывания ретиноида с составной частью компонента носителя, отличного от ретиноида, или путем включения его туда. Поэтому, носитель в соответствии с настоящим изобретением может включать компонент составной части носителя, отличного от ретиноида. Такой компонент in vitro не особенно ограничивается, и любой компонент, известный в лекарственной и фармацевтической областях, может использоваться, но те из них, которые могут включать ретиноид или могут связаться с ретиноидом, предпочтительны.
Примеры такого компонента включают липид, например, фосфолипид, такой как глицерофосфолипид, сфинголипид, такой как сфингомиелин, стерол, такой как холестерин, растительное масло, такое как соевое масло или маковое масло, минеральное масло, лецитин, такой как лецитин яичного желтка, и полимер, но примеры не ограничены вышеперечисленным. Среди них те, которые могут образовывать липосому, например, природный фосфолипид, такой как лецитин, полусинтетический фосфолипид, такой как димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), или дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дилауроилфосфатидилхолин (DLPC), холестерин и т.д., предпочтительны.
Особенно предпочтительным компонентом является компонент, который может избежать захвата ретикулоэндотелиальной системой, примеры этого включают катионные липиды, такие как N-(α-триметиламмониоацетил)-дидоде-цил-D-глутамат хлорид (TMAG), N,N’,N’’,N’’’-тетраметил-N,N’,N’’,N’’’-тетрапальми-тилспермин (TMTPS), 2,3-диолеилокси-N-[2-(сперминкарбоксами-до)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминиум трифторацетат (DOSPA), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмониум хлорид (DOTMA), диоктадецилдиметиламмониум хлорид (DODAC), дидодециламмониум бромид (DDAB), 1,2-диолеилокси-3-триметиламмониопропан (DOTAP), 3β-[N-(N’,N’’-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol), 1,2 димиристо-илоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмониум (DMRIE) и O,O’-дитетра-деканоил-N-(α-триметиламмониоацетил)диэтаноламин хлорид (DC-6-14).
Носитель в настоящем изобретении может иметь специфическую пространственную структуру. Такая структура не имеет ограничений, и примеры этому включают неразветвленную или разветвленную линейную структуру, слоистую структуру и сферическую структуру. Поэтому, носитель может иметь без ограничения любую трехмерную структуру, такую как мицелла, липосома, эмульсия, микросфера или наносфера.
Связывание ретиноида с носителем в соответствии с настоящим изобретением или его включение в носитель также делается возможным путем связывания ретиноида с или включением его в компоненты носителя, отличные от ретиноида, химическим и/или физическим методом. Альтернативно, ретиноид может быть связан с или включен в носитель в соответствии с настоящим изобретением посредством смешения ретиноида и компонентами носителя, отличного от ретиноида, в процессе получения носителя. Количество ретиноида в носителе в соответствии с настоящим изобретением может быть, например, 0,01 к 1000 нмоль/мкл и предпочтительно 0,1 к 100 нмоль/мкл. Ретиноид может быть связан с или включен в носитель прежде, чем лекарственное средство будет загружено на носитель; или носитель, ретиноид и лекарственное средство могут быть смешаны одновременно; или ретиноид может быть смешан с носителем, уже содержащим лекарственное средство и т.д. Поэтому настоящее изобретение также касается способа получения состава, специфичного к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почках, включающий стадию связывания ретиноида с любым существующим носителем, связывающим лекарственное средство, или носителем, способным к инкапсуляции лекарственного средства, например, липосомальной композицией, таким как DaunoXome, Doxil, Caelyx или Myocet.
Носитель в соответствии с настоящим изобретением может быть в любой форме пока требуемое вещество или предмет может быть транспортирован к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почках, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: полимерная мицелла, липосома, эмульсия, микросферы и наносферы. В настоящем изобретении липосомальная форма является предпочтительной перед остальными с точки зрения высокой эффективности доставки, широкого выбора веществ, которые могут быть доставлены, и простоты технологии получения и т.д., и катионная липосома, содержащая катионный липид, особенно предпочтительна. В случае, когда носитель находится в форме липосомы, мольное отношение ретиноида к другим компонентам липосомы предпочтительно составляет от 8:1 до 1:4, и более предпочтительно от 4:1 до 1:2, с точки зрения эффективности связывания ретиноида с носителем или инкапсулирования в него.
Носитель в соответствии с настоящим изобретением может содержать вещество, для транспортировки в своем внутреннем объеме, он может присоединять к внешней поверхности вещество, которое должно транспортироваться, или он может быть смешан с веществом, которое должно транспортироваться, необходимо лишь, чтобы он содержал ретиноид в такой форме, чтобы ретиноид был в состоянии функционировать в качестве нацеливающего агента. «Функционирует в качестве нацеливающего агента» в настоящем изобретении означает, что носитель, который включает ретиноид, достигает и/или поглощается клетками-мишенями, то есть клетками, производящими внеклеточный матрикс в почке, быстрее и/или в большем количестве, чем с носителем, не включающим ретиноид, и это может легко быть подтверждено, например, добавлением меченого носителя или носителя, содержащего метку, к культуре клеток-мишеней, и анализируя распределение метки после предварительно определенного промежутка времени. Структурно это требование может быть удовлетворено, например, если ретиноид, по меньшей мере частично экспонируется на внешней поверхности лекарственной формы, содержащей носитель, самое позднее к тому времени, когда он достигает клеток-мишеней. «Лекарственная форма», упомянутая в настоящем изобретении, является понятием, которое включает композицию в соответствии с настоящим изобретением, которая описывается ниже, и которая дополнительно имеет форму. Будет ли или не будет ретиноид экспонироваться на внешней поверхности лекарственной формы, может быть оценено посредством контактирования лекарственной формы с веществом, которое специфически связывается с ретиноидом, таким как, например ретинол-связывающий белок (RBP), и исследуя его связывание с лекарственной формой.
Экспозиция ретиноида по меньшей мере частично на поверхности лекарственной формы не позже того времени, когда она достигнет клеток-мишеней, может быть достигнута, например, посредством регуляции отношения ретиноида и компонентов, составляющих носитель, отличных от ретиноида. Кроме того, когда носитель имеет форму липидной структуры, такую как липосома, например, когда например, образование комплекса из ретиноида и компонента, составляющего носитель, отличного от ретиноида, может использоваться способ, в котором сначала липидную структуру, сформированную из компонента, составляющего носитель, отличного от ретиноида, разбавляют в водном растворе, и затем она приводится в контакт и смешивается с ретиноидом и т.п. В этом случае ретиноид может быть в состоянии, в котором растворяется в растворителе, например, органическом растворителе, таком как ДМСО. Липидная структура, упоминаемая в настоящем изобретении, означает структуру, содержащую липид как составной компонент и имеющую любую пространственную структуру, например, форму, такую как линейная форма, форма пленки или сферическая форма, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: липосома, мицелла, липидная микросфера, липидная наносфера и липидная эмульсия. Применение других носителей лекарственного средства для того же самого нацеливающего агента, который используется с липосомой для нацеливания описано например в Zhao and Lee, Adv Drug Deliv Rev. 2004; 56(8): 1193-204, Temming et al., Drug Resist Updat. 2005; 8(6): 381-402 и т.д.
Липидная структура может быть стабилизирована, например, с посредством регулирования осмотического давления при помощи регулирующего осмотическое давление вещества, такого как соль, сахарид, такой как сахароза, глюкоза или мальтоза или многоатомный спирт, такой как глицерин или пропиленгликоль, и предпочтительно сахароза или глюкоза. Кроме того, pH может быть отрегулирован, прибавлением соответствующего количества корректирующего вещества, такого как соль или буферный раствор. Поэтому возможно осуществить продуцирование, хранение и т.д. липидной структуры в среде, содержащей вышеупомянутые вещества. В этом случае концентрация регулирующего осмотическое давление агента предпочтительно такова, чтобы стать изотонической с кровью. Например, в случае сахарозы концентрация ее в среде составляет, хотя не ограничена этим: 3-15 мас.%, предпочтительно 5-12 мас.%, более предпочтительно 8-10 мас.% и особенно 9 мас.%, а в случае глюкозы концентрация ее в среде составляет, хотя не ограничена этим: 1 - 10 мас.%, предпочтительно 3-8 мас.%, более предпочтительно 4-6 мас.% и особенно 5 мас.%.
Настоящее изобретение также касается способа получения носителя для доставки вещества к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке, включающий стадию введения ретиноида в качестве агента, нацеливающего на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке. Способ введения ретиноида не ограничивается до тех пор, пока в носителе, в котором он введен, ретиноид может функционировать в качестве агента, нацеливающий на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почках, и например, могут использоваться различные способы, описанные в настоящем описании. Поэтому, введение ретиноида может быть осуществлена посредством, связывания ретиноида с или включением его в другой компонент, составляющий носитель, химическим и/или физическим способом или смешением ретиноида с другим компонентом, составляющим носитель, при приготовлении носителя. Количество введенного ретиноида и др. представлено, как описано выше, относительно носителя в соответствии с настоящим изобретением.
Вещество или предмет, который доставляется настоящим носителем, не ограничивается до тех пор, пока и он предпочтительно имеет размер такой, что он может физически перемещаться в внутри тела организма от места введения к месту повреждения, где присутствуют клетки-мишени. Поэтому носитель в соответствии с настоящим изобретением может транспортировать не только субстанцию, такое как атом, молекула, соединение, белок или нуклеиновая кислота, но также и объект, такой как вектор, вирусная частица, клетка, система для высвобождения лекарственного средства, которая включает один или больше элементов или микромашину. Вещество или предмет предпочтительно обладают свойством иметь некоторый эффект на клетки-мишени, и примеры включают такие, которые метят клетки-мишени или контролируют (например, увеличивают или подавляют) активность или рост клеток-мишеней.
Поэтому, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, он является «лекарственным средством для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке», который доставляется носителем. Активность продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, в настоящем изобретении относится к различным активностям, таким как секреция, поглощение или миграция, демонстрируемое клетками, продуцирующими внеклеточный матрикс в почках, и в настоящем изобретении, в частности среди тех, которые, как правило, означает активность, вовлеченную в начало, прогрессию и/или рецидив фиброза почек. Примеры такой активности включают, но не ограничиваются этим: продуцирование/секреция биологически активного вещества, такого как PAI-1, и внеклеточного матриксного компонента, такого как коллаген, протеогликан, тенасцин, фибронектин, тромбоспондин, остеопонтин, остеонектин или эластин и подавление активности разложения этих внеклеточных матриксных компонентов.
Поэтому, лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, упоминаемый в настоящем описании, может быть любым лекарственным средством, которое прямо или косвенно подавляет физические, химические и/или физиологические и др. действия указанных клеток, связанных с началом, прогрессией и/или рецидивом фиброза почек, и примеры вышеперечисленного включают, но не ограничиваются этим: лекарственное средство, которое ингибирует активность или продуцирование биологически активных веществ, перечисленных выше, антитела и фрагменты антител, которые нейтрализуют биологически активных веществ, перечисленных выше, вещество, которое подавляет экспрессию биологически активных веществ, перечисленных выше, таких как молекула РНКи (например, миРНК, кшРНК (короткая шпилечная РНК), ddRNA, микроРНК, piRNA, rasiRNA и т.д.) рибозим, антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, ПНК или композицию вышеперечисленного) или вещество, имеющее доминантный негативный эффект, такой как доминантный негативный мутант или вектор, экспрессирующий их, или лекарственное средство, которое ингибирует продуцирование и секрецию внеклеточного матриксного компонента, упомянутого выше, например, вещество, которое подавляет экспрессию внеклеточного матриксного компонента, такого как молекула РНКи (например, миРНК, кшРНК, ddRNA, микроРНК, piRNA, rasiRNA и т.д.) рибозим, антисмысловая нуклеиновая кислота (включая РНК, ДНК, ПНК или композицию вышеперечисленного) или вещество, имеющее доминантный негативный эффект, такой как доминантный негативный мутант или вектор, экспрессирующий их ингибитор клеточной активности, такой как блокатор натриевого канала, ингибитор роста клеток, такой как алкилирующий агент (такой как ифосфамид, нимустин, циклофосфамид, дакарбазин, мелфалан или ранимустин), противоопухолевый антибиотик (такой как идарубицин, эпирубицин, даунорубицин, доксорубицин, пирарубицин, блеомицин, пепломицин, митоксантрон или митомицин C), антиметаболит (такой как гемцитарабин, эноцитабин, цитарабин, тегафур/урацил, смесь тегафур/гимерацил/отерацил калия, доксифлуридин, гидроксикарбамид, фтороурацил, метотрексат или меркаптопурин), алкалоид, такой как этопозид, иринотекан, винорелбин, доцетаксел, паклитаксел, винкристин, виндезин, или винбластин и платиновый комплекс, такой как карбоплатин, цисплатин, или недаплатин, так же как индуктор апоптоза, такой как циклоспорин.
Примеры лекарственного средства для ингибирования продуцирования/секреции внеклеточного матриксного компонента включают, но не ограничиваются этим: HSP47, который является специфичным для коллагена молекулярным шапероном, важным для внутриклеточного транспорта и созревания молекулы, которые характерны для синтетических процессов различных типов коллагена.
Кроме того, «лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке» в настоящем изобретении может быть любым лекарственным средством, которое прямо или косвенно способствует физическим, химическим и/или физиологическим действиям продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, прямо или косвенно связанный с подавлением начала, прогрессии и/или рецидива фиброза почек, например, продуцирования/секрецией ММР (включая ММР1, MMP2, и т.д.), активатор плазминогена (РА) и т.д. Примеры такого средства включают, но не ограничиваются этим: активатор или энхансер экспрессии для этих веществ. Носитель в соответствии с настоящим изобретением может доставлять один или более типов вышеупомянутых лекарственных средств.
миРНК (малая интерферирующая РНК), которая может использоваться в настоящем изобретении, включает, в дополнение к миРНК в строгом значении, двухцепочечные РНК и их модифицированные формы, такие как миRNA (микро РНК), кшRNA (короткая шпилечная РНК), piRNA (РНК, взаимодействующая с Piwi), и rasiRNA (ассоциированная с повторами миРНК). миРНК как функциональная малая РНК в широком смысле и вектор, экспрессирующий миРНК, могут использоваться, например, в соответствии с инструкциями в стандартном тексте (Experimental Medicine Special Edition, Revised RNAi Experimental Protocol 2004, Yodosha, RNAi Experimental Frequently Asked Questions 2006, Yodosha).
Дизайн этих миРНК может быть осуществлен соответствующим образом специалистом в данной области техники в соответствии с инструкциями в стандартном тексте (Experimental Medicine Special Edition, Revised RNAi Experimental Protocol 2004, Yodosha, RNAi Experimental Frequently Asked Questions 2006, Yodosha) в соответствии с последовательностью информационной РНК целевого гена-мишени и известной последовательности миРНК.
Вещество, которое должно быть доставлено носителем в соответствии с настоящим изобретением, может быть, но не ограничивается этим: лекарственным средством для подавления начала, прогрессии и/или рецидива фиброза почек, отличным от вышеупомянутых лекарственных средств, и его примеры включают, но не ограничивается этим: лекарственное средство, действующее на систему окиси азота, такую как ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, антагонист рецептора ангиотензина II AT1, антагонист альдостерона, антагонист рецептора эндотелина, α-блокатор, β-блокатор, иммунодепрессивный препарат, ингибитор метаболизма внеклеточного матрикса, ингибитор системы комплемента, ингибитор хемокина, ингибитор TGF-β или ингибитор фосфодиэстеразы 5, ингибитор NFκB, ингибитор Rho, ингибитор р38 МАРК, ингибитор PI3Kγ, калликреин, антагонист рецептора интерлейкина 1, ВМР-7, антитело против фактора некроза опухоли-α, антитело против тромбоцитарного фактора роста D, ингибитор продуцирования активатора плазминогена 1, селективный антогонист рецептора-4 простагландина, ингибитор синтеза коллагена типа I, ингибитор сульфотрансферазы протеогликана хондроитинсульфата, ингибитор редуктазы эпоксида витамина K, ингибитор образования конечного продукта гликирования, 2А агонист аденозинового рецептора А2А, антагонист рецептора эндотелина, ингибитор VEGF, активатор или энхансер экспрессии для ADAM (дезинтегрин и металлопротеиназный домен) протеиназы, активатор или энхансер экспрессии для ADAMTS (дезинтегрин и металлпротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами) протеиназа, и релаксин или энхансер экспрессии для вышеперечисленного. В настоящем описании примеры энхансера экспрессии включают, но не ограничиваются этим: агент генотерапии, такой как вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, который является мишенью для усиления экспрессии. Эти лекарственные средства могут использоваться в сочетании с композициями в соответствии с настоящим изобретением, которое описано ниже. «Используемый в комбинации» включает одновременное по существу введение композиции в соответствии с настоящим изобретением и вышеупомянутого лекарственного средства, и введение его с разнесением во времени в пределах того же самого периода лечения. В последнем случае композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить либо до, либо после лекарственного средства.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве лекарственного средства для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, например ингибитор HSP47, миРНК соответствующая каждому из них может быть подобрана.
Вещество или предмет, доставленный носителем в соответствии с настоящим изобретением, могут мечеными или могут быть немеченными. Введение метки позволяет контролировать успех или неудачу доставки к клеткам-мишеням, или увеличение и уменьшение клеток-мишеней и т.д., и особенно полезность не только на уровне тестирования/исследования, но также и на клиническом уровне. Метка может быть выбрана из любых меток, известных специалисту в данной области техники такие как, например, любой радиоизотоп, магнитный материал, вещество, которое связывается с меченным веществом (например, антитело и т.д.), флуоресцентное вещество, флуорофор, хемилюминесцентное вещество, фермент и т.д. Метка может быть прикреплена к компоненту, составляющего носитель, или может быть присоединена к носителю как независимое вещество, которое должно быть доставлено.
В данном изобретении «для продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке» или «для доставки к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке» означает, что это подходит для использования для продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почках, как клеток-мишеней, и это включает, например, что можно доставлять вещество к этим клеткам, быстрее, более эффективно и/или в большем количестве, чем к другим клеткам, например, нормальным клеткам. Например, носитель в соответствии с настоящим изобретением может доставлять вещество к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке на уровне и/или эффективности в 1,1 раз или больше, в 1,2 раза или больше, в 1,3 раза или больше, в 1,5 раза или больше, в 2 раза или больше, или даже в 3 раза или больше по сравнению с другими клетками.
Настоящее изобретение также касается композиции для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, или для лечения фиброза почек, композиции включающей вышеуказанный носитель и вышеупомянутое лекарственное средство для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, и настоящее изобретение также имеет отношение к применению носителя при получении указанной композиции.
Фиброз почек, упоминаемый в настоящем изобретении, включает любой интерстициальный нефрит, например, стрептококковый нефрит, стафилококковый нефрит, пневмококковый нефрит, ветряную оспу, гепатит В, гепатит С, вирусный нефрит, связанный с ВИЧ, и т.д., нефрит вследствие паразитарной инфекции, такой как малярия, инфекционный интерстициальный нефрит, связанный с грибковым нефритом, микоплазмозный нефрит и т.д., системная красная волчанка (волчаночный нефрит), системная склеродермия (коллагеновая болезнь почек), интерстициальный нефрит, ассоциированный с коллагеновой болезнью, такой как синдром Шегрена, нефрит, ассоциированный с иммунными заболеваниями кровеносных сосудов, такой как геморрагический нефрит, множественный артериит или быстропрогрессирующий гломерулонефрит, интерстициальный нефрит, связанный с радиационным облучением, лекарственно-индуцированный интерстициальный нефрит вследствие применения препарата золота, НПВП, пенициллинамина, противоопухолевых препаратов, таких как блеомицин, антибиотиков, Параквата и т.д., аллергический нефрит вследствие укуса насекомого, пыльцы, растения семейства Anacardiaceae и т.д., амилоидный нефроз, диабетическая нефропатия, хронический гломерулонефрит, нефрит, ассоциированный со злокачественным нефросклерозом, поликистозным заболеванием почек, и т.д., тубулоинтерстициальный нефрит, нефрит, ассоциированный с токсикозом беременности или раком, мембранопролиферативный гломерулонефрит, IgA-нефропатия, смешанный криоглобулинемический нефрит, нефрит синдрома Гудпасчера, нефрит гранулематоза Вегенера и хроническая форма интерстициального нефрита, вызванного идиопатическим интерстициальным нефритом, таким как острый интерстициальный нефрит. Предпочтительные примеры фиброза почек в настоящем изобретении включают диабетический нефрит, лекарственно-индуцированный интерстициальный нефрит и хроническая форма идиопатического интерстициального нефрита.
В композиции в соответствии с настоящим изобретением пока ретиноид, содержащийся в носителе, присутствует таким образом, что он функционирует в качестве нацеливающего агента, носитель может содержать вещество, которое должно быть доставлено внутри его объема, он может быть присоединен к внешней части субстанции, которая должна быть доставлена, или может быть смешан с субстанцией, которая должна быть доставлена. Поэтому, в зависимости от способа введения и способа, которым лекарственное средство высвобождается, и т.д., композиция может быть покрыта соответствующим материалом таким как, например, кишечнорастворимая оболочка или материал постепенного разрушения, или может быть включен в подходящую систему высвобождения лекарственного средства. Кроме того, композиция в соответствии с настоящим изобретением может существовать в форме комплекса активного ингредиента с липосомой, связывающей ретиноид, такой как липоплекс. Кроме того, когда носитель состоит только из ретиноида, композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть в форме комплекса ретиноида и лекарственного средства для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может применяться в качестве лекарственного средства (то есть, фармацевтической композиции) и может вводиться различными способами, включая как пероральный, так и парентеральные способы, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрилегочный, трахеобронхиальный, интратрахеальный, внутрибронхиальный, назальный, интраректальный, внутриартериальный, внутрипортальный, интравентрикулярный, интрамедуллярный, внутрь лимфатического узла, внутрилимфатический, внутрицеребральный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, чрескожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный способы, и она может быть составлен в лекарственной форме, подходящей для каждого способа введения. Такая лекарственная форма и метод составления могут быть выбраны как соответствующие любой известной лекарственной формы и способа (см., например, Hyojun Yakuzaigaku (Standard Pharmaceutics), Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003).
Примеры лекарственных форм, подходящих для перорального приема, включают, но не ограничиваются этим: порошок, гранула, таблетка, капсула, жидкость, суспензия, эмульсия, гель и сироп, и примеры лекарственных форм, подходящих для парентерального введения, включают инъекции, такие как раствор для инъекции, суспензия для инъекции, эмульсия для инъекции и инъекция, которая должна быть приготовлена непосредственно перед использованием. Композиции для парентерального введения могут быть в форме, такой как водный или неводный изотонический стерильный раствор или суспензия.
Настоящее изобретение также касается способа получения фармацевтической композиции для лечения фиброза почек, включающий стадию введения ретиноида в качестве агента, нацеливающего на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, и лекарственного средства для контроля активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, в качестве активного ингредиента. Способ технологии введения ретиноида не ограничивается до тех пор, пока ретиноид может функционировать в качестве нацеливающего агента на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почках, в композиции, в которую он введен, и например могут использоваться различные способы, описанные в настоящем описании. Кроме того, способ введения активного ингредиента не ограничивается до тех пор, пока активный ингредиент может показывать предварительно определенный эффект, и может использоваться любой известный способ. Введение активного ингредиента может быть осуществлено в то же самое время как введение ретиноида или может быть выполнено до или после введения ретиноида. Например, когда композиция содержит компонент, составляющий носитель, отличный от ретиноида, введение активного ингредиента может быть осуществлено посредством смешения активного ингредиента с носителем, в который ретиноид был уже введен в качестве нацеливающего агента, это может быть осуществлено, посредством смешения ретиноида, компонента, составляющего носитель, отличного от ретиноида, и активного ингредиента одновременно, или это может быть осуществлено, введением активного ингредиента с компонентом, составляющим носитель, отличным от ретиноида, и затем посредством смешения его с ретиноидом.
Количество введенного ретиноида и др., должно быть таким, как описано выше относительно носителя в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, количество активного ингредиента является таким количеством, которое при введении в качестве композиции, может подавить начало или рецидив фиброза почек, улучшить клиническое состояние, облегчить его симптомы или задержать или приостановить его прогрессию, и предпочтительно может быть количеством, которое может предотвратить начало или рецидив фиброза почек или вылечить его. Также предпочтительно количество, которое не вызывает побочного эффекта, который бы превышал полезный эффект от введения. Такое количество может быть известно или надлежащим образом определено исследованием in vitro с использованием культивируемых клеток или исследованием на животных моделях, таких как мышь, крыса, собака или свинья, и такие методы исследований известны специалисту в данной области техники. Примеры животной модели с почечным фиброзом включают модель, описанную в JP, А, 2009-178143. Количество введенного активного ингредиента может изменяться в соответствии со способом введения композиции. Например, когда множество частей композиции используется при одном введении, количество активного ингредиента, введенного в одной единице композиции, может быть таким, которое получается при делении количества активного ингредиента, требуемого для одного введения, на число единиц. Такое регулирование вводимого количества может быть осуществлено соответствующим образом специалистом в данной области техники.
Носитель или композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечена в любой форме, но с точки зрения стабильности при хранении предпочтительно может обеспечиваться в форме, которая может быть приготовлена непосредственно перед применением, например в форме такой, что они могут быть приготовлены в месте лечения или поблизости от него доктором и/или фармацевтом, медсестрой или другим медицинским работником. В этом случае носитель или композиция в соответствии с настоящим изобретением снабжаются одним или большим количеством контейнеров, содержащих по меньшей мере одну составляющую часть для этого, и он приготавливается перед применением, например, в течение 24 часов перед применением, предпочтительно в течение 3 часов перед применением, и более предпочтительно, непосредственно перед применением. При осуществлении приготовления реактив, растворитель, оборудование для приготовления и т.д., которые обычно являются доступными в месте приготовления, могут использоваться в случае необходимости.
Соответственно, настоящее изобретение также касается набора для получения носителя или композиции, включающего один или больше контейнеров, которые содержат по отдельности или в комбинации ретиноид и/или вещество, которое должно быть доставлено, и/или вещество, составляющее носитель, отличный от ретиноида, а также компонент, который необходим для носителя или композиции, обеспеченной в форме такого набора. Набор в соответствии с настоящим изобретением может содержать, в дополнение к вышеупомянутому, инструкции такие как, например, письменное объяснение или запись на электронном носителе, такие как CD или DVD относительно способов получения или введения носителя и композиции в соответствии с настоящим изобретением и т.д. Кроме того, набор в соответствии с настоящим изобретением может содержать все составляющие для комплектации носителя или композиции в соответствии с настоящим изобретением, но не обязательно должен содержать все составляющие. Соответственно, набор в соответствии с настоящим изобретением не обязан содержать реактив или растворитель, которые обычно доступны в месте лечения, экспериментальную установку и т.д., такие как, например, стерильная вода, физиологический раствор или раствор глюкозы.
Настоящее изобретение дополнительно касается способа контролирования активности или роста продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в почке, или лечения фиброза почек, включающий введение эффективного количества вышеупомянутой композиции нуждающемуся в этом субъекту. В настоящем изобретении эффективное количество, например, в способе лечения фиброза почек является количеством, которое подавляет начало или рецидив фиброза почек, улучшает клиническое состояние, облегчает его симптомы или задерживает или приводит к приостановке его прогрессии и является предпочтительно количеством, которое предотвращает начало или рецидив фиброза почек или вылечивает его. Также предпочтительно количество, которое не вызывает побочный эффект, который бы превышал полезный эффект от введения. Такое количество может быть соответствующим образом определено с помощью эксперимента in vitro с использованием культивируемых клеток или исследованием на животной модели, такой как мышь, крыса, собака или свинья, и такие методы исследования известны специалисту в данной области техники. Кроме того доза ретиноида, содержавшегося в носителе, и доза лекарственного средства, используемого в способе в соответствии с настоящим изобретением, известна специалисту в данной области техники, или может быть соответствующим образом определена с помощью вышеупомянутого исследования и т.д. Примеры животной модели с почечным фиброзом включают модель, описанную в JP, А, 2009-178143.
Определенная доза композиции, которую вводят в способе в соответствии с настоящим изобретением, может быть определена, принимая во внимание различные условия, касающиеся субъекта, нуждающегося в лечении, такие как серьезность симптомов, общее состояние здоровья субъекта, возраст, масса тела и пол субъекта, диета, способ введения, выбор времени и частоты введения, сопутствующее лечение, восприимчивость к лечению, соблюдение режима лечения, и т.д.
Способ введения включает различные способы, включающие как пероральный, так парентеральные способы такие как, например, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрилегочный, трахеобронхиальный, интратрахеальный, внутрибронхиальный, назальный, интраректальный, внутриартериальный, внутрипортальный, интравентрикулярный, интрамедуллярный, внутрь лимфатического узла, внутрилимфатический, внутрицеребральный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, чрескожный, интраназальный, внутрибрюшинный и внутриматочный способы.
Частота введения изменяется в зависимости от свойств композиции, которая будет использоваться, и вышеупомянутых свойств субъекта и может быть, например, несколько раз в день (конкретней 2, 3,4, 5 или больше раз в день), один раз в день, раз в несколько дней (конкретней каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, и т.д.), несколько раз в неделю (например, 2, 3, 4 раза и т.д. в неделю), один раз в неделю или раз в несколько недель (конкретней каждые 2, 3, 4 недели и т.д.).
В методе в соответствии с настоящим изобретением термин «субъект» означает любого живого индивидуума, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее, и еще более предпочтительно человеческий индивидуум. В настоящем изобретении субъект может быть здоровым или страдающим от некоторых расстройств и, если предписано лечение фиброза почек, это как правило, означает, что субъект страдает диабетическим нефритом или почечным фиброзом или существует опасность быть пораженным вышеперечисленным. Если предписана профилактика фиброза почек, например, типичные примеры включают, но не ограничиваются этим: субъект, пораженный диабетическим нефритом, в особенности диабетическим нефритом вследствие диабета типа II.
Кроме того, термин «лечение» включает все типы приемлемого с медицинской точки зрения профилактического и/или терапевтического вмешательства с целью лечения, временной ремиссии или профилактики расстройства. Например, термин «лечение» включает приемлемое с медицинской точки зрения вмешательство в различных целях, включая отсрочку или задержку прогрессии фиброза почек, регрессии или исчезновения повреждения, и предотвращение возникновения и профилактика рецидивов фиброза почек.
Настоящее изобретение также касается способа, использующего вышеупомянутый носитель для доставки лекарственного средства к продуцирующим внеклеточный матрикс клеткам в почке. Этот способ включает, но не ограничиваются этим: например, стадию закрепления вещества, которое должно быть доставлено, на носитель и стадию введения или добавления носителя, содержащего вещество, которое должно быть доставлено в организм или среду, например питательную среда, которая содержит продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке. Эти стадии могут соответствующим образом быть достигнуты в соответствии с любым известным способом или способом, описанным в настоящем описании. Способ доставки может быть объединен с другим способом доставки, например, другим способом доставки для нацеливания на почки. Кроме того метод включает вариант осуществления, выполняемый in vitro, и вариант осуществления, в котором мишенью являются продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке внутри тела.
Примеры
Настоящее изобретение объясняется ниже в дополнительных деталях в соответствии с Примерами, но они являются только Примерами и нисколько не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1. Приготовление миРНК-содержащих VA-связывающих липосом.
В качестве миРНК использовали РНК, имеющую следующую последовательность.
Наименование последовательности: Hsp47-C
5’ GGACAGGCCUGUACAACUA dTdT 3’ (смысловая, SEQ ID NO: 1)
5’ UAGUUGUACAGGCCUGUCC dTdT 3’ (антисмысловая, SEQ ID NO: 2)
Приготовили в качестве растворов перед смешиванием, 10 мМ витамин А (ретинол, Sigma; в дальнейшем также называемый VA, растворенный в диметилсульфоксиде), 1 мМ Lipotrust SR (Hokkaido System Science Co., Ltd.; в дальнейшем также называемый липосомой или составляющим липосому липидом, растворенный в воде, свободной от нуклеаз), и 10 мкг/мкл миРНК (Hsp47-C растворяли в воде, свободной от нуклеаз). Впоследствии, VA, растворенный в диметилсульфоксиде, добавляли к Lipotrust SR, растворенному воде, свободной от нуклеаз, приготовленному, как описано выше, в отношении 1:1 (моль/моль), и смесь перемешивали с помощью вортекса в течение 15 секунд и затем оставляли при комнатной температуре в течение 5 минут в защищенном от света месте, таким образом формируя комплекс. Этот комплекс смешивали с миРНК, таким образом получая «VA Липосома-миРНК Hsp47C» раствор для введения. Этот раствор для введения содержал на 100 мкл 75 нмоль VA, 75 нмоль составляющего липосому липида и 112,5 мкг миРНК, что соответствовало 3,00 мкмоль на кг массы тела VA, 3,00 мкмоль на кг массы тела составляющего липосому липида и миРНК 4,5 мг на кг массы тела миРНК. VA экспонировался на поверхности липосомы.
Пример 2. Исследование терапевтического эффекта на мышиной модели фиброза почек.
(1) Получение мышиной модели фиброза почек.
Получение мышиной модели фиброза почек было введено в практику Stelic Institute & Co. Конкретно, самцам мыши двухдневного возраста C57BL6J/JcL (CLEA Japan, Inc.) после рождения давали ингибитор N-ацетил-β-D-глюкозаминидазы, выращивая на корме СЕ-2 (CLEA Japan, Inc.) и стерильной воде до 4 недель, были отняты от груди, когда они достигли возраста 4 недель, и затем выращивали на корме High Fat Diet 32 (CLEA Japan, Inc.), который имеет более высокое содержание неочищенного жира, чем корм нормальной диеты, и стерильной воде до 12 недель, таким образом получая мышей STAM. Известно, что такие модельные мыши будут поражены диабетическим нефритом (см. JP, А, 2009-178143), и может быть исследован фиброз почек вследствие диабетического нефрита.
Вышеупомянутых модельных мышей разделяли на четыре группы, описанные ниже, с 10 животными в группе в возрасте 12 недель и 3 дня.
(Первая группа) STAM-мыши без какого-либо лечения, контрольная группа перед лечением (в дальнейшем, NT-STAM (Предгруппа).
(Вторая группа) группа STAM-мышей без какого-либо лечения (в дальнейшем, группа NT-STAM).
(Третья группа) группа, леченная 5% глюкозой (в дальнейшем, группа, получающая основу).
(Четвертая группа), группа, леченная «VA-Липосома-миРНК Hsp47C» (в дальнейшем, группа VL-Hsp47C).
(2) Введение раствора для введения
Для NT-STAM (Предгруппа) после разделения на группы мышей умерщвляли прежде, чем начать лечение, и проверяли клиническое состояние. Для вышеупомянутых двух групп, отличных от группы NT-STAM, соответствующие растворы введения, описанные ниже, вводили посредством инъекции в хвостовую вену в общей сложности 10 раз через день от возраста 12 недель и 5 дней.
(Третья группа) В качестве контроля растворителя, использовали раствор для введения (5%-ая глюкоза или основа), в котором смешивали 0,75 мл на кг массы тела воды, свободной от нуклеаз, и 3,250 мл на кг массы тела 5%-ой глюкозы (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
(Четвертая группа) Использовали раствор для введения («VA-Липосома-миРНК Hsp47C» или VL-Hsp47C), в котором смешивали 75 нмоль VA, 75 нмоль составляющего липосому липида и 112,5 мкг миРНК на 100 мкл раствора для введения, и окончательную корректировку выполняли, используя 5%-ую глюкозу.
Массу тела на дату, когда начинали введение, определяли в качестве стандартной массы тела, и 4 мл на кг массы тела каждого раствора для введения вводили в хвостовую вену, когда процент изменения массы тела на дату введения был в пределах 20% стандартной массы тела. Когда он превышал 20%, такую массы тела после этого определяли в качестве новой стандартной масса тела, и дозу определяли заново.
(3) Изучение положительной динамики на фиброз почек
На 2-ой день после того, как было завершено заключительное введение (15 недель 4 дня), мышей умерщвляли, забирая кровь из сердца под анестезией диэтиловым эфиром, и почки удаляли.
Удаленные почки фиксировали, используя 4%-ый параформальдегид в фосфорнокислом буферном растворе, и заливали парафином, и получали образцы тонкого среза. Чтобы исследовать терапевтический эффект на фиброз почек, проводили окрашивание красителем сириус красный (окрашивающий волокна, который специфически окрашивает коллаген в красный цвет), и получали изображение, используя многофункциональный флуоресцентный микроскоп BZ-9000 (Keyence Corporation) в 80 х. Анализ выполняли с помощью случайно выбранных изображений 20 полей обзора в области коркового вещества почки и определили количественно с использованием аналитического программного обеспечения, которое пришло с BZ-9000.
Фиг.1 показывает репрезентативное микроскопическое изображение клубочка области коркового вещества почки в каждой экспериментальной группе. Окрашивание красителем сириус красный является специфичным для коллагеновых волокон окрашиванием, и место фиброза, окрашивается от красного до розового. Из результатов микроскопии никаких различий не было замечено между любыми из групп относительно утолщения клубочковой базальной мембраны, степень фиброза в мезангиальной области (строма) и окружающей среды тубулярных клеток были незначительными для группы, обработанных VL-Hsp47C, по сравнению с другими тремя группами, и наблюдалось улучшение фиброза почек (расширение мезангиальной области, показанное стрелкой). Кроме того, 20 полей обзора случайно выбирали в области коркового вещества почки на отдельную мышь, и вычисляли долю фиброзной области. Из результатов, показанных на Фиг.2, в группе, обработанных VL-Hsp47C, доля области, окрашенной красителем сириус красный, была значительно ниже, чем в группах NT-STAM и основы, и наблюдалось улучшение фиброза почек. Оценку статистически значимых различий осуществляли при помощи t-теста.
Как следует из результата, описанного выше, наблюдалась тенденция к улучшению фиброза в группе, обработанной VL-Hsp47C. Исходя из предположения, что миРНК в основном действует внутри цитоплазмы, этот результат подтверждает, что ретиноид функционирует в качестве агента, нацеливающего на продуцирующие внеклеточный матрикс клетки, эффективно доставляет лекарственное средство к этим клеткам, и таким образом может подавить прогрессирование фиброза почек.
Пример 3. Нокдаун гена в клетках, продуцирующих внеклеточный матрикс в почке, посредством миРНК-содержащих VA-связывающих липосом.
(1) Выделение и сбор клеток
Продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, имеющие свойства, подобные звездчатые эндотелиоцитам печени, выделяли и собирали следующим образом.
Во-первых, пять типов растворов, описанных ниже, готовили заранее. Все растворы хранили при 4°C.
Раствор EGTA: 1,19 г HEPES и 0,1 г EGTA прибавляли к 500 мл HBSS (Invitrogen 14170) и перемешивали.
Раствор коллагеназы (0,02%): 1,19 г HEPES, 0,235 г CaCl2 2H2O и 0,1 г коллагеназы (Yakult YK-102) прибавляли к 500 мл HBSS (Invitrogen 24020) и перемешивали.
Коллагеназа (0,02%)+0.1% раствор протеазы: 40 мг протеазы (Sigma P6911-1G) прибавляли к 40 мл 0,02% коллагеназы и перемешивали.
Раствор Хэнкса: 0,05 г MgSO4 прибавляли к 500 мл HBSS (Invitrogen 24020) и перемешивали.
Раствор 10% Nycodenz (Axis-Shield Prod. No 1114542-1): 50 г Nycodenz прибавляли к 500 мл дистиллированной воды и перемешивали и растворяли.
Мышь (самец C57BL 6/J, 20 - 30 г, 6 - 8 недель) анестезировали, область брюшной полости выбривали, и делали разрез вдоль средней линии, и почки вынимали. Почки, вынутые таким образом, промывали 30 мл раствора EGTA три раза, удаляя таким образом кровь. Почки помещали в 5 мл раствора EGTA, и точно разрезали, используя ножницы. Раствор EGTA добавляли к разрезанным почкам, чтобы суммарный объем довести до 30 мл, и осуществляли центрифугирование при 1300 об/мин в течение 5 минут.После центрифугирования супернатант удаляли, добавляли 30 мл 0,02% коллагеназы + 0,1% раствора протеазы, и смесь переносили в колбу Эрленмейера и перемешивали при 37°C в течение 20 минут. Смешанный раствор фильтровали, используя сотовый фильтр (Cell Strainer) (Falcon 352360), и фильтрат центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Осадок суспендировали в растворе Хэнкса, и 10% раствор Nycodenz смешивали с раствором Хэнкса, чтобы получить конечную концентрацию 8% Nycodenz.
Раствор смеси центрифугировали при 1400×g в течение 20 минут.Супернатант собирали и затем центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляли, образец ресуспендировали в 10% FBS DMEM (Sigma D6546) и высевали в колбе Т-75 (BD 353136).
(2) Эксперимент по сайленсингу гена (по снижению экспрессии гена)
1. Приготовление миРНК-содержащих VA-связывающих липосом
В качестве siRNA, использовали ее со следующей последовательностью.
Наименование последовательности: Hsp47-C
5’ GGACAGGCCUGUACAACUA dTdT 3’ (смысловая, SEQ ID NO: 1)
5’ UAGUUGUACAGGCCUGUCC dTdT 3’ (антисмысловая, SEQ ID NO: 2)
В качестве растворов перед смешиванием приготовили: 10 мМ витамин A (R7632, ретинол, Sigma; в дальнейшем сокращаемый до VA, растворенный в диметилсульфоксиде), 1 мМ Lipotrust SR (N301, Hokkaido System Science Co., Ltd.; в дальнейшем также называемый липосомой или составляющим липосому липидом, растворенный в воде, свободной от нуклеаз) и 10 мг/мл миРНК (Hsp47-C, растворенной в воде, свободной от нуклеаз). Затем добавляли VA, растворенный в диметилсульфоксиде, к Lipotrusta SR, растворенному в воде, свободной от нуклеаз, приготовленному, как описывалось выше, в отношении 1:1 (моль:моль), и смесь затем перемешивали с помощью вортекса в течение 15 секунд и оставляли при комнатной температуре в течение 5 минут в защищенном от света месте, таким образом формируя комплекс.Этот комплекс смешивали с 10 мг/мл миРНК, что давало VA-Липосома-миРНK Hsp47C. Когда VA не использовали, добавляли равное количество диметилсульфоксида вместо VA. Приготовление осуществляли таким образом, что когда проводили трансфекцию клеток, конечная концентрация Lipotrust SR/VA составляла 7,7 мкМ и концентрация миРНК составляла 869 нМ.
2. Эксперимент по трансфекции
В качестве клеток для эксперимента, продуцирующие внеклеточный матрикс клетки, собранные из почек мыши в вышеупомянутом методе сбора, высевали заранее на 6-луночные планшеты с 0,2×105 клеток/лунку и культивировали в 10% FBS DMEM при 37°C в течение 2 дней.
После 2 дней культивирования весь 10% FBS DMEM из каждой лунки удаляли перед трансфекцией, добавляли 900 мкл свежего 10% FBS DMEM и культивирование выполняли при 37°C в течение приблизительно 15 минут.
100 мкл VA-Липосома-миРНК Hsp47C или Липосома-миРНК Hsp47C приготовили по п.«1», описанному выше, аккуратно добавляли в каждую лунку, и инкубацию осуществляли при 37°C в течение 30 минут, весь культуральный супернатант из каждой лунки затем удаляли, добавляли 2 мл свежего 10% FBS DMEM и культивирование выполняли при 37°C в течение 2 дней. Через 2 дня РНК выделяли из клеток, используя RNeasy Mini Kit (QIAGEN 74104), и ОТ-ПЦР выполняли с помощью High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Applied Biosystems 4390779), таким образом получая кДНК. Количественный ПЦР выполняли с помощью Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems 4368708), используя кДНК таким образом полученную, и исследовали эффект сайленсинга гена. Результаты показаны на Фиг.3.
Приведенные выше результаты показывают, что миРНК для гена HSP47, используемого в Примере 2, подавляет экспрессию гена HSP47 в клетках почки, продуцирующих внеклеточный матрикс, подтверждая, что миРНК, содержавшаяся в средстве для лечения в соответствии с настоящим изобретением, специфически включается в клетки почки, продуцирующие внеклеточный матрикс, и подавляет экспрессию гена-мишень в клетках, таким образом, подавляя прогрессирование фиброза почек.