ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
PEPTIDE COMPOSITION

Область техники
Настоящее изобретение относится к пептидной композиции.
Предпосылки создания изобретения
В последние годы пептидная композиция использовалась в различных сферах применения. Например, известен пептидный гель с использованием пептида, обладающего способностью к самосборке. Пептидный гель обладает превосходной механической прочностью и прозрачностью и поэтому использовался в различных сферах применения (например, патентная литература 1).
Пептидная композиция содержит буферный агент в некоторых случаях для доведения до рН, подходящего для применения. Например, сообщается, что при приготовлении композиции для защиты и регенерации ткани сердца может использоваться приемлемый буферный раствор для доведения композиции до физиологически приемлемого рН (патентная литература 2).
Список противопоставленных документов
Патентная литература
[Патентная литература 1] JP 4620804 B2
[Патентная литература 2] JP 5558104 B2
Краткое изложение сущности настоящего изобретения
Техническая задача
Однако в результате исследования, проведенного авторами настоящего изобретения, было обнаружено, что в некоторых случаях пептидная композиция предшествующего уровня техники имеет проблему со стабильностью при хранении. В частности, во время хранения пептидной композиции с рН, доведенным с помощью буферного агента, такого как карбонат натрия, в некоторых случаях рН временно меняется. Было также обнаружено, что в пептидной композиции, содержащей пептид с амидированной С-концевой карбоксильной группой, в некоторых случаях происходит гидролиз амидной группы наряду с изменением рН, и такая тенденция является сильной, когда аминокислотный остаток на С-конце представляет собой основный аминокислотный остаток.
Амидная группа может функционировать в качестве защитной группы для С-конца пептида. Когда амидная группа, служащая в качестве защитной группы, удаляется и подвергается деградации в карбоксильную группу во время хранения, желаемые характеристики пептида в некоторых случаях ухудшаются. Кроме того, существует также риск того, что побочный продукт, образующийся в результате деградации, может служить примесью, которая снижает качество пептидной композиции. Кроме того, амидная группа, содержащаяся в пептиде, является важной функциональной группой также с точки зрения экспрессии физиологической активности и осуществления сборки молекул со специфической структурой. В частности, в пептиде, обладающем способностью к самосборке, (далее называемым самособирающимся пептидом) амидная группа является функциональной группой, важной для осуществления сборки молекул, т.е. для способности к самосборке. Число и расположение зарядов в молекуле пептида связаны со способностью к самосборке, и поэтому, например, на превращение амидной группы на С-конце в другую функциональную группу (например, карбоксильную группу) может влиять способность к самосборке. В частности, даже когда последовательность самособирающегося пептида является одинаковой, несмотря на получение прозрачной пептидной композиции в том случае, когда С-конец представляет собой амидную группу, прозрачность композиции может быть уменьшена в том случае, когда С-концом является карбоновая кислота.
Настоящее изобретение было создано для решения вышеупомянутой проблемы, и целью настоящего изобретения является предоставление пептидной композиции, которая может обеспечить как превосходную стабильность при хранении, так и желаемые в случае пептидной композиции характеристики (например, прозрачность).
Решение задачи
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения предоставляется пептидная композиция. Пептидная композиция включает: самособирающийся пептид; буферный агент, имеющий pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащий один или более атомов азота; и воду, и имеет рН от 4,5 до 6,6.
В одном варианте осуществления суммарный заряд аминокислотных остатков, содержащихся в самособирающемся пептиде, составляет между более 0 и +3 или менее в пептидной композиции.
В одном варианте осуществления С-конец самособирающегося пептида включает амидную группу.
В одном варианте осуществления аминокислота на С-конце самособирающегося пептида включает основную аминокислоту.
В одном варианте осуществления буферный агент включает гистидин, нитрат тиамина, пиридин, бис-трис, этилендиамин и/или N-метилморфолин.
В одном варианте осуществления концентрация буферного агента составляет от 1 мМ до 100 мМ.
В одном варианте осуществления пептидная композиция имеет коэффициент пропускания видимого света 70% или более.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предоставляется способ получения пептидной композиции. Способ получения включает перемешивание самособирающегося пептида, буферного агента, имеющего pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащего один или более атомов азота, и воды.
Полезные эффекты изобретения
Пептидная композиция настоящего изобретения содержит самособирающийся пептид, буферный агент, имеющий pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащий один или более атомов азота, и воду и имеет рН от 4,5 до 6,6. Пептидная композиция настоящего изобретения может обеспечить как отличную стабильность при хранении, так и желаемые характеристики (например, прозрачность). Соответственно, пептидная композиция настоящего изобретения может сохранять свое качество даже при хранении в течение определенного периода времени и может быть соответствующим образом использована в различных сферах применения.
Причина, по которой достигается вышеупомянутый эффект, еще не выяснена, но ей, по-видимому, является причина, описанная ниже. Т.е. в пептидной композиции предшествующего уровня техники содержание буферного агента постепенно уменьшается в результате испарения или т.п. с ослаблением его буферного действия в течение периода хранения. Предположительно, в результате этого рН композиции меняется с вызовом деградации пептида с низкой устойчивость к изменению рН (например, деградации С-концевой амидной группы). Напротив, в настоящем изобретении выбран специфический буферный агент, и поэтому временное изменение рН может быть подавлено. В результате рН композиции можно контролировать до определенного диапазона рН, в котором возникновение деградации пептида менее вероятно. Кроме того, специфический буферный агент может также обеспечивать, например, следующий эффект: могут сохраняться желаемые в случае композиции самособирающегося пептида характеристики (например, прозрачности).
Кроме того, когда буферный агент, который подвержен испарению, используется в пептидной композиции, также существует проблема в том, что ее получение при постоянном значении pH затруднено, что приводит к варьированию между партиями. Использование вышеупомянутого буферного агента облегчает контроль рН пептидной композиции и, следовательно, может подавлять также варьирование от партии к партии качества пептидной композиции.
Описание вариантов осуществления
Пептидная композиция настоящего изобретения включает пептид; буферный агент, имеющий pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащий один или более атомов азота; и воду, и имеет рН от 4,5 до 6,6. Благодаря использованию такого буферного агента предоставляется пептидная композиция, которая может обеспечивать как превосходную стабильность при хранении, так и желаемые характеристики (например, прозрачность).
Пептидная композиция имеет рН от 4,5 до 6,6, предпочтительно от 4,6 до 6,5, более предпочтительно от 5,0 до 6,0. Когда рН пептидной композиции находится в вышеуказанном диапазоне, стабильность при хранении пептидной композиции может быть дополнительно увеличена. Кроме того, даже когда используемый пептид содержит амидную группу в своей структуре, деградация амидной группы подавляется, и поэтому может быть достигнута отличная стабильность при хранении. Кроме того, эффект настоящего изобретения может особенно проявляться, когда используется пептид, в котором аминокислота на его С-конце является основной аминокислотой, и его С-конец является амидной группой. Это обусловлено тем, что, когда рН выходит за пределы вышеупомянутого диапазона, существует риск того, что может произойти реакция деградации С-концевой амидной группы с участием атома азота боковой цепи основной аминокислоты, с образованием пептида, имеющего С-концевую карбоновую кислоту.
Пептидная композиция имеет коэффициент пропускания видимого света, составляющий предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 85% или более, еще более предпочтительно 90% или более, особенно предпочтительно 95% или более. Когда коэффициент пропускания видимого света пептидной композиции находится в вышеупомянутом диапазоне, пептидная композиция может соответственно использоваться даже в случае применения, требующего прозрачности. При этом коэффициент пропускания видимого света представляет собой коэффициент пропускания света с длинами волн от 380 до 780 нм и может быть измерен с использованием, например, спектрофотометра (в частности, продукта, выпускаемого под названием Nano Drop 2000 фирмой Thermo Fisher Scientific).
А. Самособирающийся пептид
Пептид, содержащийся в пептидной композиции настоящего изобретения, представляет собой самособирающийся пептид. Ожидается, что самособирающийся пептид найдет применение в различных областях, таких как регенеративная медицина и культура клеток, в силу своих характеристик. В пептидной композиции настоящего изобретения самособирающийся пептид может удовлетворительно сохранять свою способность к самосборке. Соответственно, подходящая функция может сохраняться не только во время хранения, но также после применения в желаемой сфере.
-1
-1
Здесь «самособирающийся пептид» относится к пептиду, который самопроизвольно собирается в растворителе посредством взаимодействия между молекулами пептида. Взаимодействие особенно не ограничивается, и его примеры включают: электростатические взаимодействия, такие как водородная связь, межионное взаимодействие и взаимодействие Ван-дер-Ваальса; и гидрофобное взаимодействие. Из самособирающихся пептидов особенно предпочтительным является пептид, который подвергается самосборке через структуру β-листа. Структура β-листа, как правило, имеет поверхность с относительно высокой гидрофильностью и поверхность с относительно низкой гидрофильностью. В общем, когда композицию получают путем растворения самособирающегося пептида в растворителе, таком как вода, композиция часто превращается в гель благодаря вышеупомянутому взаимодействию между молекулами пептида. Образование структуры β-листа может быть подтверждено, например, путем измерения молярной эллиптичности пептидной композиции методом измерения кругового дихроизма и подтверждения того, что молярная эллиптичность при 216 нм имеет отрицательное значение. Кроме того, образование структуры β-листа также может быть подтверждено путем обнаружения появления около 1620 см пика, связанного с β-листом, и появление около 1690 см пика, связанного с антипараллельным β-листом, посредством использования Фурье-ИК-спектрального анализа.
В настоящем изобретении самособирающийся пептид и буферный агент используются вместе. Поэтому пептид предпочтительно имеет ион, который соединяется с используемым буферным агентом. Как описано ниже, соответственно использовать в качестве буферного агента буферный агент, проявляющий буферное действие на основе изменения между состоянием, в котором электронная пара атома азота, выполняющая буферное действие, не имеет добавленный к ней протон в молекуле буферного агента, (в этом случае формальный заряд атома азота равен ±0) и состоянием, в котором электронная пара атома азота имеет добавленный к ней протон, (в этом случае формальный заряд азота атом является положительным зарядом). Следовательно, предпочтительной является форма пептида, имеющая ион (анион), который соединяется с буферным агентом, в состоянии, в котором электронная пара азота имеет добавленный к ней протон, например, форма соли, такая как гидрохлорид пептида, трифторацетат пептида или метансульфонат пептида (предпочтительно соль с кислотой (например, сильной кислотой с рКа <3)). Пептид, имеющий ион, который соединяется с буферным агентом в состоянии, в котором электронная пара азота имеет добавленный к ней протон, может использоваться в комбинации с пептидом, не имеющим ион, который соединяется с буферным агентом.
Кроме того, обычно считается, что когда самособирающийся пептид объединяют с солью, заряд пептида экранируется зарядом (ионом), образуемым из соли, для приведения молекул пептида к сборке друг с другом. Таким образом, соль иногда добавляют для облегчения сборки пептида. Однако одновременно молекулы пептидов чрезмерно сближаются друг с другом случайным образом из-за соли, что часто приводит к агрегации пептида. Агрегация пептида может привести к снижению прозрачности из-за белой мути и снижению механической устойчивости в виде гелевой композиции (в частности, охрупчиванию или синерезису). Напротив, в настоящем изобретении особенно целесообразно использовать самособирающийся пептид, имеющий положительный суммарный заряд аминокислотных остатков, содержащихся в пептиде, при рН пептидной композиции. В случае использования пептида, имеющего положительный суммарный заряд, когда пептид объединяют с буферным агентом, содержащим один или более атомов азота, соответствующее электростатическое отталкивание поддерживается между молекулами пептида в композиции, и поэтому пептид менее подвержен агрегации. Буферный агент также образует заряд в воде, но композиция настоящего изобретения обладает желательным буферным действием и прозрачностью, а также имеет высокую устойчивость к механической обработке и поэтому может сохранять механическую устойчивость в виде гелевой композиции даже после подвергания обработке, такой как перемешивание и смешивание, множество раз.
Суммарный заряд аминокислотных остатков, содержащихся в самособирающемся пептиде, предпочтительно составляет между более 0 и +3 или менее, более предпочтительно от +1 до +3, в композиции, содержащей пептид (т.е. пептидной композиции настоящего изобретения). Это обусловлено тем, что когда положительный заряд и отрицательный заряд, которые происходят от боковых цепей аминокислотных остатков, не уравновешивают друг друга в композиции, описанной выше, соотношение между электростатическим притяжением и отталкиванием, подходящее для образования геля, сохраняется, и в результате может образовываться прозрачный и стабильный гель.
Заряд самособирающегося пептида можно рассчитать с помощью программы, доступной на веб-сайте PROTEIN CALCULATOR v3.4 (http://protcalc.sourceforge.net/).
Самособирающийся пептид, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно имеет амидную группу на своем С-конце (имея амидированную C-концевую карбоксильную группу). Амидная группа представляет собой функциональную группу, в которой электроны являются делокализованными, и поэтому является стабильной функциональной группой, которая относительно менее подвержена деградации. Поэтому амидная группа может использоваться в качестве защитной группы. Однако ее деградация может происходить в каждом кислотном состоянии и основном состоянии, и деградация может происходить даже при почти нейтральном рН. В настоящем изобретении используется буферный агент, имеющий pKa от 3,5 до 7,5 и содержащий один или более атомов азота, который описан в разделе B ниже, и композицию доводят до рН от 4,5 до 6,6. Соответственно, превосходная по стабильности при хранении пептидная композиция может быть получена даже с пептидом, имеющим амидную группу на своем С-конце.
В одном варианте осуществления аминокислота на С-конце самособирающегося пептида предпочтительно представляет собой основную аминокислоту, такую как аргинин, лизин или гистидин, более предпочтительно аргинин или лизин, еще более предпочтительно аргинин. Когда используется пептид, в котором аминокислота на его С-конце является основной аминокислотой, и его С-конец представляет собой амидную группу, может происходить реакция деградации С-концевой амидной группы с участием атома азота боковой цепи основной аминокислоты, с образованием пептида, имеющего С-концевую карбоновую кислоту. Соответственно, такой пептид может иметь проблему, в частности, со стабильностью при хранении. Однако в соответствии с настоящим изобретением может быть соответственно достигнут эффект достижения как стабильности при хранении, так и желаемых эффектов.
В качестве самособирающегося пептида, например, самособирающийся пептид, описанный в JP 2010-280719 А, может соответственно использоваться. Полное описание выложенной публикации включено сюда посредством ссылки. Этот самособирающийся пептид образован из аминокислотной последовательности из 13 остатков, имеющей основные аминокислотные остатки (в положениях 1, 5, 9 и 13) и кислотные аминокислотные остатки (в положениях 3 и 11), каждый второй остаток в симметричных положениях в N-концевом направлении и С-концевом направлении относительно гидрофобного аминокислотного остатка в положении 7 в центре. Т.е. одна особенность этого самособирающегося пептида заключается в том, что в самособирающемся пептиде нет чередующихся гидрофильных аминокислот и гидрофобных аминокислот попеременно. Кроме того, другая особенность этого самособирающегося пептида заключается в том, что в самособирающемся пептиде нет гидрофильных аминокислотных остатков и гидрофобных аминокислотных остатков в равных соотношениях. Кроме того, еще одна особенность этого самособирающегося пептида заключается в том, что самособирающийся пептид имеет четыре основных аминокислотных остатка и два кислотных аминокислотных остатка в заданных симметричных положениях относительно гидрофобного аминокислотного остатка в положении 7 в центре, и оба аминокислотных остатка на N-конце и С-конце являются основными аминокислотными остатками.
1
1
1
2
2
3
4
3
5
2
6
4
1
4
1
6
1
2
В частности, предоставляется самособирающийся пептид, образованный из следующей аминокислотной последовательности. Аминокислотная последовательность: abcbabdbabcba(В аминокислотной последовательности, каждый остаток a-a представляет собой основной аминокислотный остаток, каждый остаток b-b представляет собой незаряженный полярный аминокислотный остаток и/или гидрофобный аминокислотный остаток, при условии, что по крайней мере пять из них представляют собой гидрофобный аминокислотный остаток, каждый остаток c-c представляет собой кислотный аминокислотный остаток, а d представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток).
Самособирающийся пептид, представленный этой аминокислотной последовательностью, способен образовывать превосходный по прозрачности и механической прочности гель и поэтому может соответственно использоваться в различных сферах применения. Между тем, этот самособирающийся пептид имеет основные аминокислотные остатки на своих концах, как описано выше, и, следовательно, имеет коридор возможностей для увеличения стабильности при хранении. Когда этот самособирающийся пептид используется в качестве пептида, который будет содержаться в пептидной композиции настоящего изобретения, может быть предоставлена пептидная композиция, сохраняющая вышеупомянутые превосходные характеристики, а также являющаяся превосходной по стабильности при хранении.
Самособирающийся пептид, который может соответственно использоваться в настоящем изобретении, не ограничивается пептидом, приведенным выше в качестве примера. Конкретные примеры самособирающегося пептида, который может соответственно использоваться в настоящем изобретении, включают следующие, в том числе пептид, приведенный выше в качестве примера.
n-RLDLRLALRLDLR-c (SEQ ID NO:1)
n-RLDLRLSLRLDLR-c (SEQ ID NO:2)
n-RLALRLDLRLDLR-c (SEQ ID NO:3)
n-KRLDLNLRLDLRK-c (SEQ ID NO:4)
Самособирающийся пептид может быть получен любым подходящим способом получения. Их примеры включают: метод химического синтеза, такой как твердофазный метод, например, метод с использованием Fmoc, или жидкофазный метод; и молекулярно-биологический метод, такой как рекомбинантная экспрессия генов. Эти способы производства (в частности, метод химического синтеза) могут включать стадию очистки и/или стадию снятия защиты с использованием кислоты. В таком способе получения, поскольку трудно полностью отделить кислоту от пептида, получаемый пептид может содержать смешанное с ним очень небольшое количество кислоты и поэтому может иметь более низкий рН (например, pH≤4,0), чем теоретическое значение при его растворении в воде. Пептидная композиция с использованием такого пептида может быть обеспечена буферным действием одновременно с доведением до желаемого значения рН с помощью буферного агента, который будет описан ниже.
Каждая из аминокислот, составляющих самособирающийся пептид, может представлять собой L-аминокислоту или D-аминокислоту. Кроме того, каждая из аминокислот может представлять собой природную аминокислоту или неприродную аминокислоту. Природная аминокислота является предпочтительной, поскольку природная аминокислота доступна по низкой цене и облегчает синтез пептидов.
Самособирающимся пептидом, используемый в настоящем изобретении, может быть пептид, который подвергся любой соответствующей модификации, (далее называемый модифицированным пептидом). В модифицированном пептиде пептид может быть подвергнут любой соответствующей модификации до тех пор, пока пептид имеет желаемые характеристики (например, способность к самосборке), и эта модификация не влияет на стабильность при хранении пептидной композиции. Сайтом, в котором осуществлена модификация, может быть N-концевая аминогруппа пептида, его С-концевая карбоксильная группа или и та, и другая.
Примеры модификации включают: введение защитной группы, например, ацетилирование N-конца или амидирование С-конца; введение функциональной группы, например, алкилирование, этерификация или галогенирование; гидрирование; введение являющегося сахаридом соединения, такого как моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид; введение липидного соединения, такого как жирная кислота, фосфолипид или гликолипид; введение ДНК; и введение, например, любого другого соединения, обладающего физиологической активностью. Модификации могут осуществляться отдельно или в комбинации. Например, пептид может иметь ацетилированный N-конец и амидированный С-конец. Как описано выше, эффект настоящего изобретения может быть соответственно получен в пептидной композиции, содержащей самособирающийся пептид, имеющий амидную группу на своем С-конце, и поэтому модифицированный пептид, имеющий амидную группу, введенную в качестве защитной группы, на своем C-конце, может соответственно использоваться.
Модификация может быть осуществлена любым подходящим способом, в зависимости, например, от вида модификации.
Количество аминокислотных остатков, составляющих самособирающийся пептид, особенно не ограничивается. С точки зрения соответствующего проявления способности к самосборке количество аминокислотных остатков предпочтительно составляет от 2 до 200, более предпочтительно от 2 до 20, еще более предпочтительно от 6 до 20, особенно предпочтительно от 12 до 20, наиболее предпочтительно с 13 до 15.
Содержание самособирающегося пептида в пептидной композиции устанавливается на любое подходящее значение в зависимости, например, от целей. Пептидная композиция настоящего изобретения содержит самособирающийся пептид в концентрации, например, от 0,01 вес.% до 10 вес.%, предпочтительно от 0,1 вес.% до 3,0 вес.%, более предпочтительно от 0,5 вес.% до 3,0 вес.%, еще более предпочтительно от 0,5 вес.% до 2,5 вес.%, наиболее предпочтительно от 1,0 вес.% до 2,0 вес.%.
B. Буферный агент
В настоящем изобретении используют буферный агент, имеющий pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащий один или более атомов азота. Благодаря использованию такого буферного агента могут быть достигнуты как стабильность при хранении, так и желаемые характеристики (например, прозрачность) пептидной композиции. В частности, когда пептид, имеющий амидную группу на своем С-конце, используют в качестве самособирающегося пептида, эффект настоящего изобретения может дополнительно проявляться. Амидная группа может использоваться в качестве защитной группы для С-конца пептида. Известно, что амидная группа подвергается деградации в каждом кислотном состоянии и основном состоянии. Кроме того, даже в нейтральном состоянии трудно полностью подавить деградацию амидной группы. Соответственно, амидная группа, служащая в качестве защитной группы, удаляется и подвергается деградации в карбоксильную группу во время хранения, а желаемые характеристики пептида в некоторых случаях ухудшаются. Кроме того, существует также риск того, что побочный продукт, образующийся в результате деградации, может служить примесью, снижающей качество пептидной композиции. В случае пептидной композиции настоящего изобретения, благодаря использованию буферного агента, имеющего pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащего один или более атомов азота, пептидную композицию можно сохранять в течение длительного периода времени при рН, при котором деградация пептида может быть подавлена. Соответственно, можно получить пептидную композицию, которая может обеспечить как стабильность при хранении, так и желаемые характеристики. Кроме того, когда буферный агент используется в пептидной композиции, существует также проблема в том, что ее получение при постоянном значении рН затруднено из-за испарения буферного агента или т.п., что приводит к варьированию от партии к партии. В случае буферного агента, используемого в настоящем изобретении, его содержание в пептидной композиции менее подвержено уменьшению в результате испарения или т.п. Соответственно, пептидная композиция может поддерживать временно стабильный рН. Использование вышеупомянутого буферного агента облегчает контроль рН пептидной композиции и, следовательно, также может подавлять варьирование качества от партии к партии.
PKa буферного агента составляет 3,5 или более, но менее 7,5, предпочтительно от 3,8 до 7,2, более предпочтительно от 4,5 до 6,5. Когда pKa буферного агента находится в вышеупомянутом диапазоне, могут быть достигнуты как стабильность при хранении, так и желаемые характеристики получаемой пептидной композиции. Кроме того, использование такого буферного агента облегчает контроль рН пептидной композиции и, следовательно, может препятствовать варьированию качества от партии к партии. Буферный агент, который подвергается многоступенчатой диссоциации, имеет множество pKa. В случае использования такого буферного агента используется буферный агент, у которого по крайней мере один из множества pKa находится в пределах вышеупомянутого диапазона. Значение pKa может быть измерено при комнатной температуре (приблизительно 23°C) с использованием любого подходящего измерительного прибора, или может упоминаться и использоваться значение, описанное в литературе. Здесь приводятся ссылки на значения, описанные в следующих печатных материалах: Chemical Handbook Fundamentals II revised 3rd edition, edited by The Chemical Society of Japan, 1984 (этилендиамин и гистидин); Kiyoshi Sawada and Daijiro Ohmori, Buffers: Principle and Practice, 2009 (бис-трис); edited by the Society of Japanese Pharmacopoeia, Collection of Information on the Quality of Prescription Drugs No. 23, 2005 (тиамина нитрат); Brown, H.C. et al., in Braude, E.A. and F.C. Nachod, Determination of Organic Structures by Physical Methods, 1955 (пиридин); and Hall, H.K., Jr. J. A.m. Soc. 1957, 79, 5441 (N-метилморфолин).
Буферный агент содержит один или более атомов азота. Буферный агент является основным буферным агентом и, как правило, способен проявлять буферное действие на основе слабого основания и сопряженном с ним кислоты. Другими словами, буферный агент способен проявлять буферное действие на основе изменения между состоянием, в котором электронная пара атома азота не имеет добавленного к ней протона, (формальный заряд атома азота равен ±0) и состоянием, в котором электронная пара атома азота имеет добавленный к ней протон (формальный заряд атома азота представляет собой положительный заряд). Кроме того, когда буферный агент объединяют с его солью, может быть достигнуто более подходящее буферное действие. Здесь, что касается такого буферного агента, pKa состояния, в котором электронная пара атома азота имеет добавленный к ней протон, т.е. pKa сопряженной кислоты считается pKa буферного агента. Использование такого буферного агента предотвращает агрегацию пептида, и, следовательно, можно получить пептидную композицию с большей прозрачностью. Кроме того, с другой точки зрения, буферный агент предпочтительно является мономолекулярным. Кроме того, с другой точки зрения, буферный агент предпочтительно представляет собой вещество, не содержащее сульфокислотную группу.
2
В одном варианте осуществления буферный агент представляет собой соединение, имеющее одну или более основных функциональных групп, сопряженные с которыми кислоты имеют pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, предпочтительно от 3,8 до 7,2, более предпочтительно от 4,5 до 6,5. Примером основной функциональной группы является аминогруппа или азотсодержащий гетероцикл. Аминогруппа может быть любой из первичной аминогруппы (-NH), вторичной аминогруппы (-NHR) и третичной аминогруппы (-NRR'). Кроме того, количество основных функциональных групп в соединении может составлять, например, 4 или менее, предпочтительно 3 или менее. Соединение может, кроме того, содержать кислотную или основную функциональную группу с pKa, составляющей менее 3,5 или 7,5 или более, если эффект настоящего изобретения не уменьшается. Кроме того, молекулярная масса соединения может составлять, например, от 50 до 400, предпочтительно от 60 до 350.
Конкретные примеры буферного агента, подходящего в настоящем изобретении, включают этилендиамин (pKa: 7,1 (25°C)), гистидин (pKa: 6,0 (25°C)), бис-трис (pKa: 6,5 (20°C)), нитрат тиамина (pKa: 4,8), пиридин (pKa: 5,2 (20°C)), 1-метилимидазол (pKa: 7,1) и N-метилморфолин (pKa: 7,4) (описана только pKa, составляющая 3,5 или более, но менее 7.5). Из них предпочтительными являются гистидин и/или бис-трис. С любым из этих буферных агентов можно легко получить в высокой степени биосовместимую пептидную композицию. Буферные агенты могут использоваться отдельно или в комбинации.
Концентрация буферного агента в пептидной композиции лишь должна быть такой концентрации, чтобы пептидная композиция имела желаемый рН. С точки зрения соответствующего проявления буферного действия, концентрация буферного агента предпочтительно составляет от 1 мМ до 100 мМ, более предпочтительно от 5 мМ до 50 мМ, еще более предпочтительно от 15 мМ до 50 мМ, даже еще более предпочтительно от 20 мМ до 50 мМ, наиболее предпочтительно от 30 мМ до 50 мМ.
С. Вода
Любая подходящая вода может использоваться в качестве воды, которая содержится в пептидной композиции. Ее примеры включают дистиллированную воду (например, воду для инъекций) и деионизированную воду.
D. Добавка
Пептидная композиция настоящего изобретения может содержать любую подходящую добавку в дополнение к самособирающемуся пептиду, буферному агенту, имеющему pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащему один или более атомов азота, и воде, в зависимости, например, от сферы применения. Их примеры включают: агент для придания изотоничности; и сахариды, такие как моносахарид, дисахарид и олигосахарид. Добавки могут быть добавлены отдельно или в комбинации. Концентрация добавки может быть соответственно установлена в зависимости, например, от целей и сфер применения пептидной композиции.
Примеры агента для придания изотоничности включают: хлориды, такие как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и хлорид магния; моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза и галактоза; дисахариды, такие как сахароза, трегалоза, мальтоза и лактоза; и сахарные спирты, такие как маннит и сорбит.
Вдобавок, пептидная композиция настоящего изобретения может, кроме того, содержать компонент, имеющий ион для соединения с буферным агентом в состоянии, в котором электронная пара атома азота, содержащегося в буферном агенте, имеет добавленный к ней протон. Примером такого компонента является соль кислоты, такой как хлористоводородная кислота, трифторуксусная кислота или метансульфоновая кислота (например, сильная кислота с рКа<3), и неорганическое соединение или органическое соединение (например, натриевая соль или соль пептида, отличная от самособирающегося пептида).
E. Способ получения пептидной композиции
Пептидная композиция настоящего изобретения может быть получена любым подходящим способом получения. Способ получения предпочтительно включает перемешивание самособирающегося пептида, буферного агента, имеющего pKa, составляющую 3,5 или более, но менее 7,5, и содержащего один или более атомов азота, и воды. Например, самособирающийся пептид растворяют в воде, чтобы получить желаемую концентрацию, для получения водного раствора пептида, при необходимости, кроме того, добавляют любую подходящую добавку, а затем добавляют буферный агент, чтобы смесь имела рН от 4,5 до 6,6. Затем эти компоненты перемешивают по мере необходимости с использованием любого подходящего перемешивающего средства. Таким образом, может быть получена пептидная композиция. В одном варианте осуществления пептидная композиция сразу после получения может проявлять форму, имеющую текучесть, (например, жидкую форму или форму раствора), в зависимости, например, от концентрации пептида. Пептидная композиция в форме, которая потеряла текучесть, (например, гелеобразной форме) может быть получена, например, путем оставления пептидной композиции в форме, имеющей текучесть, в состоянии покоя для допуска самосборки самособирающегося пептида.
В качестве перемешивающего средства, например, движитель, палочка, магнитная мешалка, мешалка с вращением вращения (а также ее совместное использование с контейнером, имеющим неровность на внутренней поверхности), ультразвуковой гомогенизатор или ультразвуковой аппарат могут использоваться. В этом случае перемешивание охватывает операции, каждая из которых означает состояние, отличное от состояния покоя, такое как перемешивание, перемешивание по кругу, перемешивание, барботирование и вибрация.
Кроме того, буферный агент может быть отдельно растворен в воде для получения буферного раствора, и пептидная композиция может быть получена с использованием буферного раствора. Кроме того, пептид, буферный агент и любую подходящую добавку можно засыпать в воду, а затем перемешать. Засыпка может выполняться постепенно, может выполняться для каждого компонента или может выполняться сразу. Кроме того, вода может быть залита в пептид, буферный агент и любую подходящую добавку, а затем эти компоненты могут быть перемешаны.
Кроме того, пептидная композиция может быть подвергнута тепловой обработке, если требуется. В настоящем изобретении используется буферный агент, содержащий атом азота, и поэтому испарение и деградация буферного агента за счет нагрева могут быть подавлены. Соответственно, несмотря на достижении эффекта стерилизации или бактерицидного эффекта от нагревания, композицию можно сохранить при желаемом рН даже после нагревания, и, следовательно, существует преимущество, особенно в случае длительного хранения композиции. Температура обработки тепловой обработки составляет, например, 100°С или более, предпочтительно от 120°С до 130°С. Кроме того, время обработки составляет, например, 10 секунд или более, предпочтительно от 1 минуты до 30 минут, более предпочтительно от 15 минут до 25 минут. Тепловая обработка может выполняться при повышенном давлении. Конкретным примером тепловой обработки является автоклавирование (например, обработка при 121°С и 2 атм. в течение от 15 минут до 25 минут).
F. Применения пептидной композиции
Пептидная композиция настоящего изобретения может обеспечить как стабильность при хранении, так и желаемые характеристики. Соответственно, пептидная композиция настоящего изобретения может применяться в различных сферах с использованием характеристик пептидной композиции. Когда пептидная композиция настоящего изобретения содержит искусственно синтезированный пептид, пептидная композиция не подвержена риску инфицирования животного происхождения и поэтому может предпочтительно использоваться в сферах применения, предназначенных для людей. Конкретные примеры сфер применения, предназначенных для людей, включают: косметические средства, такие как изделие для ухода за кожей и изделие для ухода за волосами; субстрат для культуры клеток, используемый для скрининга при разработке лекарственного средства, регенеративную медицину или т.п., и лекарственные средства и медицинские инструменты, такие как препарат от пролежневых язв, заменитель костной ткани для инъекции, материал для инъекций для косметической хирургии, вспомогательный материал для глазной хирургия, синтетическое стекловидное тело, внутриглазные линзы, смазка для суставов, глазные капли, субстрат для системы доставки лекарственного средства (DDS), носитель для доставки клеток, гемостатический материал и окклюзионный агент; смазочный увлажнитель; десикант; агент для нанесения покрытия для медицинского инструмента или т.п.; и материал для предотвращения истечения жидкости, газа или т.п.
Когда пептидную композицию известного уровня техники перемешивают в состоянии содержания буферного агента, в некоторых случаях ее прозрачность уменьшается за счет агрегации и мути, и пептидная композиция в желаемой форме (например, в виде геля) не может быть приготовлена в некоторых случаях. Однако пептидная композиция настоящего изобретения, в которой такие проблемы были решены, может соответственно использоваться даже в сфере применения, требующей прозрачности или т.п.
Пептидная композиция настоящего изобретения имеет рН от 4,5 до 6,6. Можно использовать пептидную композицию при ее доведении во время использования до желаемого значения рН за пределами вышеупомянутого диапазона в зависимости от сфер ее применения.
Кроме того, текучесть пептидной композиции настоящего изобретения может быть временно увеличена при применении физической силы или подталкивания к ней. Кроме того, пептидная композиция настоящего изобретения может иметь особенность в том, что текучесть снова понижается через некоторое время, и ее прочность до применения физической силы или подталкивания к ней восстанавливается. Например, композиция, в которой используется самособирающийся пептид, описанный в JP 2010-280719 A, может иметь такие физические свойства. Следовательно, пептидная композиция настоящего изобретения может соответственно использоваться в сферах применения, требующих таких характеристик (например, в сфере применения, в которой пептидная композиция применяется посредством выталкивания шприцем или т.п.).
Теперь настоящее изобретение конкретно описывается в виде примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
[Пример 1]
3
2
Использовали гидрохлорид самособирающегося пептида А, представленного в SEQ ID NO: 1, синтезированного методом жидкофазного синтеза и имеющего ацетилированный N-конец и амидированный C-конец ([CHCO]-RLDLRLALRLDLR-[NH]).
Гидрохлорид пептида и воду для инъекций (производства Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd., название продукта: Вода для инъекций PL «Fuso») помещали в сосуд и перемешивали с получением водного раствора пептида. К полученному водному раствору пептида добавляли гистидин (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd., название продукта: L-гистидин, pKa: 6.0) в качестве буферного агента. Затем добавляли воду для инъекций до концентрации пептида 0,5 вес.% и концентрации гистидина 7 мМ, и содержимое дополнительно перемешивали с получением пептидной композиции 1. Полученная композиция имела рН 5,52. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
Таблица 1
Пептидная композиция
№
Пептид
Буферный агент
Вид
Концентрация [вес.%]
Вид
pKa
Пример 1
1
A
0,5
Гистидин
6,0
Сравнительный пример 1
C1
0,5
Карбонат натрия
6,4
Пример 2
2
1,5
Гистидин
6,0
Сравнительный пример 2
C2
1,5
Карбонат натрия
6,4
Пример 3
3
2,5
Гистидин
6,0
Сравнительный пример 3
C3
2,5
Карбонат натрия
6,4
Пример 4
4
1,5
Гистидин
6,0
Пример 5
5
1,5
Нитрат тиамина
4,8
Пример 6
6
1,5
Пиридин
5,2
Пример 7
7
1,5
Бис-Трис
6,5
Пример 8
8
1,5
Этилендиамин
7,1
Пример 9
9
1,5
N-метилморфолин
7,4
Сравнительный пример 4
C4
1,5
Трометамол (Трис)
8,3
Пример 10
10
B
1,5
Гистидин
6,0
Сравнительный пример 5
C5
1,5
Карбонат натрия
6,4
Пример 11
11
C
1,5
Гистидин
6,0
Сравнительный пример 6
C6
1,5
Карбонат натрия
6,4
Пример 12
12
D
1,5
Гистидин
6,0
Сравнительный пример 7
C7
Карбонат натрия
6,4
Пример 13
13
E
0,5
Гистидин
6,0
Пример 14
14
Нитрат тиамина
4,8
Сравнительный пример 8
C8
Карбонат натрия
6,4
Сравнительный пример 9
C9
A
1,5
Цитрат натрия
6,4
Сравнительный пример 10
C10
Малеиновая кислота
5,8
2
Пептид A: пептид, представленный в SEQ ID NO:1 (аминокислотная последовательность: Ac-RLDLRLALRLDLR-NH), полученный с помощью жидкофазного синтеза.
2
Пептид B: пептид, представленный в SEQ ID NO:1 (аминокислотная последовательность: Ac-RLDLRLALRLDLR-NH), полученный с помощью твердофазного синтеза.
2
Пептид C: пептид, представленный в SEQ ID NO:2 (аминокислотная последовательность: Ac-RLDLRLSLRLDLR-NH), полученный с помощью твердофазного синтеза.
2
Пептид D: пептид, представленный в SEQ ID NO:3 (аминокислотная последовательность: Ac-RLALRLDLRLDLR-NH), полученный с помощью твердофазного синтеза.
2
Пептид E: пептид, представленный в SEQ ID NO:4 (аминокислотная последовательность: Ac-KRLDLNLRLDLRK-NH), полученный с помощью твердофазного синтеза.
(Сравнительный пример 1)
Пептидную композицию С1 получали таким же образом, как и в примере 1, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали карбонат натрия (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd., название продукта: карбонат натрия, pKa: 6.4); и композицию готовили так, чтобы концентрация буферного агента в получаемой композиции составляла 5 мМ. Полученная композиция имела рН 7,42. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 2]
Пептидную композицию 2 получали таким же образом, как и в примере 1, за исключением того, что композицию готовили так, чтобы она имела концентрацию пептида 1,5 вес.% и концентрацию гистидина 31 мМ. Полученная композиция имела рН 6,14. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 2)
Пептидную композицию С2 получали таким же образом, как и в сравнительном примере 1, за исключением того, что композицию готовили так, чтобы она имела концентрацию пептида 1,5 вес.% и концентрацию карбоната натрия 13 мМ. Полученная композиция имела рН 7,12. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 3]
Пептидную композицию 3 получали таким же образом, как и в примере 1, за исключением того, что водный раствор пептида был приготовлен так, чтобы он имел концентрацию пептида 2,5 вес.% и концентрацию гистидина 38 мМ. Полученная композиция имела рН 5,91. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Сравнительный пример 3]
Пептидную композицию С3 получали таким же образом, как и в сравнительном примере 1, за исключением того, что композицию готовили так, чтобы она имела концентрацию пептида 2,5 вес.% и концентрацию карбоната натрия 23 мМ. Полученная композиция имела рН 7,65. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 4]
Пептидную композицию 4 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что композицию получали добавлением дигидрата трегалозы так, чтобы его концентрация в получаемой композиции составляла 7 вес.%. Полученная композиция имела рН 6,06. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 5]
Пептидную композицию 5 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали нитрат тиамина (производства Kanto Chemical Co., Inc., название продукта: нитрат тиамина, pKa: 4,8); и композицию готовили так, чтобы концентрация тиамина нитрата составляла 38 мМ. Полученная композиция имела рН 5,08. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 6]
Пептидную композицию 6 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали пиридин (производства Nacalai Tesque Inc., название продукта: пиридин, pKa: 5.2); и композицию готовили так, чтобы концентрация пиридина составляла 22 мМ. Полученная композиция имела рН 4,70. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 7]
Пептидную композицию 7 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали бис-трис (производства Dojindo Laboratories, название продукта: Bis-Tris, pKa: 6.5). Полученная композиция имела рН 6,51. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 8]
Пептидную композицию 8 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали этилендиамин (производства Kanto Chemical Co., Inc., название продукта: этилендиамин (безводный), pKa: 7.1); и композицию готовили так, чтобы концентрация этилендиамина составляла 9 мМ. Полученная композиция имела рН 5,85. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 9]
Пептидную композицию 9 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали N-метилморфолин (производства Kanto Chemical Co., Inc., название продукта: N-метилморфолин, pKa: 7.4); и композицию готовили так, чтобы концентрация N-метилморфолина составляла 17 мМ. Полученная композиция имела рН 6,10. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 4)
Пептидную композицию С4 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали трометамол (трисгидроксиметиламинометан) (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd., название продукта: Трометамол «Только для промышленного использования», pKa: 8,3); и композицию готовили так, чтобы концентрация трометамола составляла 30 мМ. Полученная композиция имела рН 8,13. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 10]
3
2
Использовали гидрохлорид самособирающегося пептида В, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, синтезированного методом твердофазного синтеза и имеющего ацетилированный N-конец и амидированный C-конец ([CHCO]-RLDLRLALRLDLR-[NH]).
Пептидную композицию 10 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что использовали гидрохлорид пептида В; и композицию готовили так, чтобы концентрация гистидина составляла 22 мМ. Полученная композиция имела рН 5,51. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 5)
Пептидную композицию С5 получали таким же образом, как и в сравнительном примере 2, за исключением того, что использовали гидрохлорид пептида В; и композицию готовили так, чтобы концентрация карбоната натрия составляла 14 мМ. Полученная композиция имела рН 6,94. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 11]
3
2
Использовали гидрохлорид самособирающегося пептида С, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, синтезированного методом твердофазного синтеза и имеющего ацетилированный N-конец и амидированный C-конец ([CHCO]-RLDLRLSLRLDLR-[NH]).
Пептидную композицию 11 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что использовали гидрохлорид пептида С; и композицию готовили так, чтобы концентрация гистидина составляла 22 мМ. Полученная композиция имела рН 5,54. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 6)
Пептидную композицию С6 получали таким же образом, как и в сравнительном примере 2, за исключением того, что использовали гидрохлорид пептида С; и композицию готовили так, чтобы концентрация карбоната натрия составляла 12 мМ. Полученная композиция имела рН 7,12. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 12]
3
2
Использовали гидрохлорид самособирающегося пептида D, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, синтезированного методом твердофазного синтеза и имеющего ацетилированный N-конец и амидированный C-конец ([CHCO]-RLALRLDLRLDLR-[NH]).
Пептидную композицию 12 получали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что использовали гидрохлорид пептида D; и композицию готовили так, чтобы концентрация гистидина составляла 22 мМ. Полученная композиция имела рН 5,73. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 7)
Пептидную композицию С7 получали таким же образом, как в сравнительном примере 2, за исключением того, что использовали гидрохлорид пептида D; и композицию готовили так, чтобы концентрация карбоната натрия составляла 12 мМ. Полученная композиция имела рН 7,22. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 13]
3
2
Использовали трифторацетат самособирающегося пептида E, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, синтезированного методом твердофазного синтеза и имеющего ацетилированный N-конец и амидированный C-конец ([CHCO]-KRLDLNLRLDLRK-[NH]).
Пептидную композицию 13 получали таким же образом, как и в примере 1, за исключением того, что использовали трифторацетат пептида Е; и композицию готовили так, чтобы концентрация гистидина составляла 43 мМ. Полученная композиция имела рН 5,51. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
[Пример 14]
Пептидную композицию 14 получали таким же образом, как и в примере 13, за исключением того, что в качестве буферного агента использовали нитрат тиамина (производства Kanto Chemical Co., Inc., название продукта: нитрат тиамина, pKa: 4,8); и композицию готовили так, чтобы концентрация тиамина нитрата составляла 5 мМ. Полученная композиция имела рН 4,56. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 8).
Пептидную композицию C8 получали таким же образом, как и в сравнительном примере 1, за исключением того, что использовали трифторацетат пептида E; и композицию готовили так, чтобы концентрация карбоната натрия составляла 3 мМ. Полученная композиция имела рН 7,42. Состав полученной пептидной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 9)
1
2
3
Пептидную композицию C9 получали таким же образом, как в сравнительном примере 2, за исключением того, что: цитрат натрия (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd., название продукта: цитрат натрия, pK: 3,1, pK: 4,8, pK: 6,4) использовали в качестве буферного агента; и композицию готовили так, чтобы концентрация буферного агента в получаемой композиции составляла 20 мМ, а концентрация дигидрата трегалозы в ней составляла 8 вес.%. Состав полученной композиции представлен в таблице 1.
(Сравнительный пример 10)
1
2
Пептидную композицию C10 получали таким же образом, как в сравнительном примере 2, за исключением того, что: малеиновую кислоту (производства Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., название продукта: Малеиновая кислота, pK: 1,84, pK: 5,83) использовали в качестве буферного агента; композицию готовили так, чтобы концентрация буферного агента в получаемой композиции составляла 19 мМ; в качестве нейтрализатора использовали трометамол (трисгидроксиметиламинометан) (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd., название продукта: трометамол «Только для промышленного использования», pKa: 8.3); и композицию готовили так, чтобы концентрация трометамола составляла 50 мМ. Состав полученной композиции представлен в таблице 1.
Следующее хранение и измерение осуществляли, используя полученные пептидные композиции 1-14 и C1-C10. Условия хранения представлены в таблице 2, а результаты измерений представлены в таблице 3 и таблице 4.
[Хранение пептидной композиции]
Каждая композиция хранилась в соответствии со следующим режимом.
Половину полученной пептидной композиции в сосуде отливали в чистый сосуд такого же типа, и каждый из двух сосудов был герметизирован.
Композицию, подвергнутую автоклавированию (АС-обработке), подвергали стерилизации в условиях 121°C и 20 минут.
Один из двух сосудов хранили в условиях, указанных в таблице 2. При хранении при 40°C (влажности: 75%) сосуд хранили в термогигростате LH21-13M (производства Nagano Science Co., Ltd.), а при хранении при 60°C (влажности: 75%) сосуд хранили в термогигростате CSH-210 (производства Tabai Espec Corporation).
Количество дней, в 6 раз превышающее количество дней хранения, и количество дней, в 50 раз превышающее количества дней хранения, определялось как значительный период хранения (эквивалентный хранению при комнатной температуре период) для сосуда, хранящегося при 40°C, и сосуда, хранящегося при 60°C, соответственно.
Другой сосуд был открытым и использовался в качестве образца перед хранением, и подвергался измерению ВЭЖХ и измерению коэффициента пропускания света. К тому же сосуд герметизировали, если это было необходимо, и хранили при комнатной температуре после измерения.
[Измерение рН]
Измерение проводили с использованием pH-метра (производства Horiba, Ltd., название продукта: B-712 (основной корпус), S010 (датчик)).
[Увеличение содержания продукта деградации]
Пептид, используемый для получения каждой композиции, (далее называемый «исходным материалом») и пептидную композицию после хранения анализировали с помощью хроматографии ВЭЖХ с обращенной фазой. Кроме того, также анализировали пептидную композицию после автоклавирования (перед хранением). Условия измерения представлены ниже. Как видно из следующих условий измерения, условия измерения представляют собой условия измерения оптического поглощения пептидной связи, а пептидный компонент композиции детектируется как пик в этих условиях.
ВЭЖХ: производства Waters, автодозатор 717, нанос для ВЭЖХ 515, встроенный дегазатор AF, модуль управления насосом II, детектор показателя преломления 2410 (используется для контроля температуры, а не для обнаружения), модуль нагревателя колонки
Колонка: YMC-Triart C18, 3 мм × 250 мм (производства YMC Co., Ltd.)
Подвижная фаза:
жидкость A: дистиллированная вода/ацетонитрил/TFA=750/250/1
жидкость B: дистиллированная вода/ацетонитрил/TFA=500/500/1
Детектор: производства Waters, детектор с фотодиодной матрицей 996
Скорость потока: 0,4 мл/мин
Объем инъекции: 10 мкл
Измеряемый диапазон длины волны: от 190 нм до 220 нм (используемый результат представлял собой данные при 205 нм)
Образец для анализа: водный раствор, содержащий приблизительно 120 частей на миллион пептида в качестве основного компонента (В случае исходного материала, образец для анализа получали путем растворения исходного материала в воде с получением водного раствора, имеющего указанную выше концентрацию пептида, а в случае композиции, образец для анализа получали путем разбавление композиции водой с получением водного раствора, имеющего указанную выше концентрацию пептида.)
Программное обеспечение: Empower™2 (производства Waters)
Время (мин)
А(%)
В(%)
0
100
0
35
60
40
65
0
100
70
0
100
70,01
100
0
При использовании программного обеспечения площадь и процент площади детектированного пика рассчитывали и использовали в качестве результатов анализа. В результате анализа процент площади представляли до сотой доли. На основании результата анализа установлено содержание (%) каждого из пептида в качестве основного компонента (пептида, который был целью синтеза), продукта с деградированным С-концом и другого компонента (отличного от являющегося основным компонентом пептида и продукта с деградированным С-концом). Продукт с деградированным С-концом относится к пептиду, имеющему карбоновую кислоту на своем С-конце, полученному в результате деградации амидной группы на С-конце являющегося основным компонента пептида. В вышеупомянутых условиях измерения продукт с деградированным С-концом, как правило, детектируется в несколько более позднее время удерживания, чем таковое пика, соответствующего являющемуся основным компонентом пептиду. Увеличение содержания (%) продукта с деградированным С-концом в композиции рассчитывали путем вычитания содержания (%) продукта с деградированным С-концом в исходном материале из содержания (%) продукта с деградированным С-концом деградированным С-концом в композиции после хранения (или после автоклавирования).
[Коэффициент пропускания видимого света]
Поглощение измеряли, используя Nano Drop 2000 (производства Thermo Fisher Scientific), и коэффициент пропускания видимого света рассчитывался на основе этого результата.
Таблица 2
№ композиции
Автоклавирование
Условия хранения
Значительный период хранения [день(дни)]
Температура
Период
[°С]
[день(дни)]
Пример 1-1
1
присутствует
Комнатная температура
105
105
Сравнительный пример 1-1
C1
присутствует
105
Пример 3-1
3
присутствует
105
Сравнительный пример 3-1
C3
присутствует
105
Пример 1-2
1
присутствует
40
29
174
Сравнительный пример 1-2
C1
присутствует
40
29
174
Пример 2
2
присутствует
40
29
174
Сравнительный пример 2
C2
присутствует
40
30
180
Пример 3-2
3
присутствует
40
29
174
Сравнительный пример 3-2
C3
присутствует
40
29
174
Пример 4
4
присутствует
40
29
174
Пример 5
5
присутствует
40
30
180
Пример 6
6
отсутствует
40
28
168
Пример 7
7
присутствует
40
29
174
Пример 8
8
отсутствует
40
28
168
Пример 9
9
присутствует
40
28
168
Сравнительный пример 4
C4
присутствует
40
29
174
Пример 10
10
отсутствует
40
41
246
Сравнительный пример 5
C5
отсутствует
40
41
246
Пример 11
11
присутствует
40
30
180
Сравнительный пример 6
C6
присутствует
40
30
180
Пример 12
12
присутствует
40
30
180
Сравнительный пример 7
C7
присутствует
40
30
180
Пример 13
13
отсутствует
40
21
155
60
0,6
Пример 14
14
отсутствует
40
21
155
60
0,6
Сравнительный пример 8
C8
отсутствует
40
21
155
60
0,6
Сравнительный пример 9
C9
отсутствует
-
-
-
Сравнительный пример 10
C10
отсутствует
-
-
-
Таблица 3-4
№ композиции
Значительный период хранения [день(дни)]
рН
Величина увеличения содержания (%) продукта с деградированным С-концом в пептиде
Коэффициент пропускания света
До автоклавирования
После автоклавирования
После хранения
Величина увеличения после хранения
Величина увеличения из-за автоклавирования
До хранения
После хранения
Пример 1-1
1
105
5,52
5,73
5,48
0,87
0,93
99
97
Сравнительный пример 1-1
C1
105
7,42
8,16
8,33
13,26
11,98
98
99
Пример 3-1
3
105
5,91
5,96
5,76
0,22
0,65
97
97
Сравнительный пример 3-1
C3
105
7,65
8,36
8,75
7,55
6,05
96
96
Пример 1-2
1
174
5,52
5,73
5,48
0,70
0,93
99
100
Сравнительный пример 1-2
C1
174
7,42
8,16
8,61
19,87
11,98
98
99
Пример 2
2
174
6,14
6,14
6,10
0,73
0,23
98
98
Сравнительный пример 2
C2
180
7,12
8,27
8,63
12,88
7,15
97
97
Пример 3-2
3
174
5,91
5,96
5,79
0,23
0,65
97
97
Сравнительный пример 3-2
C3
174
7,65
8,36
8,59
10,64
6,05
96
95
Пример 4
4
174
6,06
6,01
6,03
0,96
0,57
97
99
Пример 5
5
180
5,08
5,09
4,66
0,78
0,78
97
98
Пример 6
6
168
4,70
-
4,77
0,50
-
97
98
Пример 7
7
174
6,51
6,43
6,53
1,31
0,95
98
98
Пример 8
8
168
5,85
-
5,71
-0,07
-
97
97
Пример 9
9
168
6,10
6,28
5,99
0,00
0,05
97
98
Сравнительный пример 4
C4
174
8,13
7,98
8,07
3,17
1,41
99
99
Пример 10
10
246
5,51
-
5,53
0,25
-
99
99
Сравнительный пример 5
C5
246
6,94
-
8,71
5,71
-
99
98
Пример 11
11
180
5,54
-
5,59
1,33
0,82
99
98
Сравнительный пример 6
C6
180
7,12
-
8,59
8,82
7,79
96
95
Пример 12
12
180
5,73
-
5,70
0,43
0,04
96
96
Сравнительный пример 7
C7
180
7,22
-
8,53
11,64
7,40
97
97
Пример 13
13
155
5,51
-
5,99
0,14
-
98
99
Пример 14
14
155
4,56
-
4,78
0,35
-
99
99
Сравнительный пример 8
C8
155
7,42
-
8,41
13,87
-
98
98
Сравнительный пример 9
C9
-
5,29
-
-
-
-
19
-
Сравнительный пример 10
C10
-
5,39
-
-
-
-
69
-
В каждой из пептидных композиций примеров 1-14 сохранялись рН и прозрачность даже при хранении в течение длительного периода времени. Деградация пептида может происходить во время получения, например, во время автоклавирования композиции и во время периода хранения. В каждой из композиций примеров 1-14 образование продукта деградации подавлялось даже после хранения композиции. В каждой из композиций примеров 1-5, 7, 9, 11 и 12 образование продукта деградации подавлялось даже после автоклавирования композиции. В каждой из пептидных композиций примеров величина увеличения содержания продукта с деградированным С-концом составляла 1,4% или менее даже после хранения. Таким образом, каждая из композиций, полученных в примерах, считается способной к сохранению пептида в течение периода хранения продукта, в котором, как ожидается, композиция будет использоваться, (например, от 3 месяцев до 1 года).
С другой стороны, в композициях сравнительных примеров содержание продукта с деградированным С-концом после хранения продемонстрировало увеличение на 3% или более, в том числе даже увеличение на приблизительно 20%. Кроме того, в каждой из пептидных композиций сравнительных примеров 1-4, 6 и 7, несмотря на сохранение прозрачности, содержание продукта деградации увеличивалось даже после автоклавирования композиции. Кроме того, пептидные композиции сравнительного примера 9 и сравнительного примера 10 были хуже по прозрачности (сравнительный пример 9: 19%, сравнительный пример 10: 69%). Пептидные композиции сравнительных примеров 9 и 10 были хуже по прозрачности перед хранением, и поэтому их не хранили.
Кроме того, что касается свойств, каждый из примеров 1-14 представлял собой прозрачный гель и сохранял состояние прозрачного геля даже после хранения. Каждый из сравнительных примеров 1-8 представлял собой прозрачный гель и сохранял состояние прозрачного геля даже после хранения. Сравнительный пример 10 представляет собой гель, а сравнительный пример 9 представляет собой жидкую композицию без образования геля.
Промышленная применимость
Пептидная композиция настоящего изобретения может обеспечить как стабильность при хранении, так и желаемые характеристики. Таким образом, пептидная композиция настоящего изобретения может соответственно использоваться в медицинских сферах применения и т.п.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Menicon Co.Ltd.
<120>  Пептидная композиция
<130>  MNC14226PCT
<160>  4
<170>  Патент в версии 3.5
<210>  1
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  самособирающийся пептид, который может использоваться
в настоящем изобретении.
<400>  1
Arg Leu Asp Leu Arg Leu Ala Leu Arg Leu Asp Leu Arg
1               5                   10
<210>  2
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  самособирающийся пептид, который может использоваться
в настоящем изобретении.
<400>  2
Arg Leu Asp Leu Arg Leu Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg
1               5                   10
<210>  3
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  самособирающийся пептид, который может использоваться
в настоящем изобретении.
<400>  3
Arg Leu Ala Leu Arg Leu Asp Leu Arg Leu Asp Leu Arg
1               5                   10
<210>  4
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  самособирающийся пептид, который может использоваться
в настоящем изобретении.
<400>  4
Lys Arg Leu Asp Leu Asn Leu Arg Leu Asp Leu Arg Lys
1               5                   10
<---