СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ НА ОСНОВЕ ФРАКЦИЙ ПОЛИ-1-ВИНИЛИМИДАЗОЛА
METHOD FOR PRODUCING ANTI-POLY-1-VINYLIMIDAZOLE FRACTION ANTIBODIES

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения защитных антител к бактериям C.Diphteriae при вакцинопрофилактике и в производстве гипериммунных сывороток, необходимых для диагностических и лечебных целей.
Известные методы получения антител основаны на введении в организм животных или человека антигенов, являющихся, как правило, белками или полисахаридами, входящими в структуру бактериальных клеток, вирусов и других микроорганизмов. Использование чистых антигенов не всегда приводит к должному ответу иммунной системы организма из-за различных факторов: низкая активность иммунокомпетентных клеток, быстрое выведение антигена из организма или их нейтрализация имеющимися антителами при наличии пассивного иммунитета, например, у новорожденных. В этой связи добиться необходимой концентрации антител удается увеличением дозы антигена и повторными вакцинациями, что экономически нецелесообразно из-за высокой стоимости антигенов и может приводить к осложнениям из-за использования больших доз чужеродного белка. Альтернативным подходом к усилению иммунной реакции в ответ на антиген является использование адъювантов - веществ, замедляющих выведение антигена из организма, стимулирующих иммунную систему и облегчающих распознавание ею антигена. Известные адъюванты относятся к нескольким основным классам: неорганические наночастицы гидроксида или фосфата алюминия [1], масляные композиции [2], водорастворимые синтетические [3-6] или биополимеры [5]. Необходимость работ по совершенствованию существующих адъювантов и разработке новых отмечается в публикациях [7], в частности, в связи с проблемой ликвидации полиомиелита [8].
7
50
Известен способ получения защитных антител к бактериям С. Diphtehriae с использование поли-1-винилимидазола в форме растворов концентрацией 0.01-0.6 мг/мл в качестве адъюванта [Патент №2205408 РФ, МПК G01N 33/569, А61K 31/787. Иммуноадъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе / С.И.Лещук и др.; Иркутский институт химии им. А.Е.Фаворского СО РАН. - №2001128413/14; заявл. 18.10.2001; опубл. 27.05.2003] [9]. Преимуществами данного препарата являются низкая токсичность (LD>1000 мг/мл); возможность формирования иммунноактивного комплекса при смешении растворов адъюванта и антигена без их ковалентного связывания; низкая вязкость раствора адъюванта, исключающая проблемы при работе с тонкими иглами в случае мелких животных.
Недостатком известного адъюванта является использование полидисперсных образцов полимера, содержащих фракции различной молекулярной массы. Как известно, физиологическая активность полимеров существенно зависит от их молекулярной массы [10]. По этой причине полидисперсные образцы могут содержать существенную долю неактивных фракций, понижающих общую активность препарата, увеличивающих токсичность вводимой дозы и возможность побочных эффектов.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение активности полимерного адъюванта для снижения его действующей концентрации и уменьшения количества чужеродных веществ, вводимых в организм при иммунизации.
Технический результат достигают тем, что используют узкие фракции поли-1-винилимидазола молекулярной массы 8800-32000, полученные дробным осаждением из раствора нефракционированного образца поли-1-винилимидазола.
Фракционирование поли-1-винилимидазола проводят из этанольного раствора используя в качестве осадителей ацетон и гексан.
Для получения антител в качестве антигена используют клеточные стенки коринебактерий дифтерии (вакцинный препарат «Кодивак»).
Фракции поли-1-винилимидазола используют в виде растворов концентрации 0,001 мг/мл.
Адъювантную активность фракций определяют для растворов поли-1-винилимидазола с указанной минимально активной концентрацией, равной 0.001 мг/мл. Это в 10 раз ниже минимально активной концентрации для нефракционированного полимера [9]. В качестве антигена применяют препарат «Кодивак», представляющий собой клеточные стенки коринебактерий дифтерии [11] и использованный ранее в экспериментах с поли-1-винилимидазолом [9].
Возможность осуществления способа иллюстрируют приведенные ниже примеры его проведения в лабораторных условиях. В примере 1 описано получение фракций поли-1-винилимидазола, в примере 2 сопоставлена адъювантная активность нефракционированного поли-1-винилимидазола и его фракций с молекулярными массами 8800, 14500 и 32000. Полученные данные указывают на выраженную активность полимерных фракций, которая проявляется при их концентрации 0,001 мг/мл. Нефракционированный образец при этой концентрации неактивен, что связано с малым содержанием в нем активных фракций, суммарная доля которых составляет 12%.
Пример 1.
Для получения фракций поли-1-винилимидазола используют полимер, полученный радикальной полимеризацией 1-винилимидазола в соответствии с изложенным в источнике [12] методом. При этом поли-1-винилимидазол растворяют в этаноле в количестве 17 г на 400 мл. К полученному раствору при 20°C и интенсивном перемешивании добавляют вначале 1500 мл ацетона, далее порциями по 35 мл. После добавления каждой порции смесь выдерживают 20-22 ч, выпавший осадок отделяют декантацией и центрифугированием (10 мин, 3000 g) и добавляют новую порцию осадителя. После добавления 1700 мл ацетона осаждение продолжают гексаном. Собирают фракции, осаждаемые при добавлении 1550, 1800, 2100, 2200 и 2400 мл осадителя. Фракции сушат в вакууме до постоянной массы. Молекулярную массу определяют вискозиметрически используя константы в уравнении Марка-Куна-Хаувинка из [13].
Выход и молекулярные массы фракций составляют:
0,70 г (65000), 0.68 г (32000), 0,624 г (14500), 0,72 г (8800) и 0,16 г (6000).
Пример 2.
Исследование адъювантной активности фракций поли-1-винилимидазола проводят на линейных мышах (BALB) весом 18-20 г. Формируют 14 групп, по 10 мышей в каждой группе, из которых 12 групп опытные, 2 группы - контрольные. Иммунизацию проводят один раз в неделю, в течение 4-х недель смесью раствора вакцины «Кодивак» с равным объемом водного раствора поли-1-винилимидазола и его фракций. Вакцинацию проводят внутрибрюшинно по 0,4 мл и в подушечки лап по 0,1 мл, всего на одну мышь 0,5 мл смеси. Смесь для иммунизации готовят из 0.25 мл раствора вакцины «Кодивак» с концентрацией антигена 0.0002 мг/мл и по 0.25 мл растворов поли-1-винилимидазола с концентрацией 0,001 мг/мл и с концентрацией 0,01 мг/мл. В контрольных опытах раствор поли-1-винилимидазола заменяют на физиологический раствор или полный адъювант Фрейнда.
Через семь дней после последней иммунизации проводят забор крови. Кровь от каждой группы собирают в одну пробирку. Сыворотку для исследования готовят общепринятым методом: образцы крови центрифугируют в течение 10 мин при 1500 g, затем определяют титры специфических антител в пуле сывороток методом реакции пассивной гемагглютинации (РИГА) с эритроцитарным диагностикумом.
Для выявления специфических антител в РПГА используют антигенный эритроцитарный диагностикум, содержащий антиген (белок 64 кД) вакцины «Кодивак», приготовленный в соответствии с описанием к патенту [14]. Сыворотку титруют в иммунологических планшетах на 8 лунок кратно двум в физиологическом растворе. Затем добавляют в каждую лунку по 25 мкл диагностикума, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Предварительный учет результатов проводят через 1,5-2 часа, а окончательный - через 20 часов. При положительном результате реакции эритроциты оседают на дне лунки в виде зонтика, оседание эритроцитов в виде точки свидетельствует об отрицательном результате. Результаты определения титров антител после иммунизации представлены в Таблице. В Таблице приведены показатели адъювантной активности поли-1-винилимидазола и его фракций при иммунизации мышей вакциной «Кодивак».
Можно отметить, что адъювантная активность наблюдается только для фракций с молекулярными массами в диапазоне 8800-32000. Понижение концентрации поли-1-винилимидазола с 0.01 мг/мл до 0.001 мг/мл приводит к повышению активности фракций в отличие от нефракционированного полимера.
Этот эффект согласуется с отмеченным ранее [6, 9, 15, 16] понижением адъювантной активности водорастворимых полимерных адъювантов при превышении концентрации над неким оптимальным значением. По-видимому, адъювантное действие поли-1-винилимидазола и родственных полимеров обусловлено образованием комплекса полимер-антиген за счет множественных водородных и/или ионных связей. Данное комплексообразование не является специфическим и при значительном количестве полимера может приводить к блокированию гаптенных участков антигена понижая иммунный ответ.
В результате осуществления способа оказалось возможным понизить концентрацию органического полимера (поли-1-винилимидазол) в адъюванте в 10 раз по сравнению с известным способом [9] при сохранении его высокой активности, особенно в случае образца с молекулярной массой 14500. Преимуществом способа является отсутствие в адъюванте малоактивных высоко- и низкомолекулярных полимерных фракций, потенциально способных увеличивать риск побочных эффектов при использовании адъюванта.
Источники информации
0. А. Ройт, Дж. Брюсстофф, Д. Мейл. Иммунология. Пер. с англ. - М.: Мир, 2000, 592 с.
1. Stephanie М. Noe, Mark A. Green, Harm HogenEsch, Stanley L. Hem Mechanism of immunopotentiation by aluminum-containing adjuvants elucidated by the relationship between antigen retention at the inoculation site and the immune response // Vaccine 28 (2010) 3588-3594.
2. Aldo Tagliabue, and Rino Rappuoli Vaccine adjuvants // Human Vaccines 2008, 4:5, 347-349.
3. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на биологические свойства микроорганизмов / Д.А. Кириллов, И.В. Чайникова, Н.Б. Перунова, О.Е. Челпаченко, А.С. Панков, А.И. Смолягин, А.В. Валышев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003. - N 4. - С.74-78.
4. А.с. 1578143 (СССР). Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Ананьев В.А., Ветрова М.М., Аксаментов И.В. // Заявл. 18.07.88, опубл. 15.07.90, бюл. №26.
5. Патент РФ №2111013. Способ получения антител к арбовирусам комплекса Калифорнийского энцефалита и Батаи / Анненков В.В., Круглова В.А., Феоктистов А.З., Чапоргина Е.А. // Заявл. 22.12.92, опубл. 20.05.98, бюл. №14.
6. Патент РФ №2129014. Способ получения антител к коринебактериям дифтерии / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Е.А. Шмелева, С.М. Попкова // Заявл. 31.03.95, опубл. 20.04.99, бюл. №11.
7. Alexander К. Andrianov, Daniel P. DeCollibus, Helice A. Gillis, Henry H. Kha, Alexander Marin, Mark R. Prausnitz, Lome A. Babiuk, Hugh Townsend, and George Mutwiri Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene] is a potent adjuvant for intradermal immunization // PNAS 2009 vol. 106 no.45 18936-18941.
8. Hsin-Ming Liu, Sally E. Newbrough, Sudershan K. Bhatia, Christopher E. Dahle, Arthur M. Krieg, and George J. Weiner Immunostimulatory CpG Oligodeoxynucleotides Enhance the Immune Response to Vaccine Strategies Involving Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor // Blood, Vol. 92, No 10, 1998: pp. 3730-3736.
7
9. Патент №2205408 РФ, МПК G01N 33/569, А61K 31/787. Иммуноадъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе / С.И. Лещук и др.; Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН. - №2001128413/14; заявл. 18.10.2001; опубл. 27.05.2003.
10. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры М.: Химия, 1986, 296 с.
11. Патент №2150958 РФ, МПК А61K 39/05. Способ лечения детей с затяжным и длительным бактерионосительством токсигенных коринебактерий дифтерии (ткд) / В.В. Иванова, Е.А. Шмелева и др.; НИИ детских инфекций. - №96113873/14; заявл. 10.07.1996; опубл. 20.06.2000.
12. N. Pekel, О. Guven Investigation of complex formation between poly(N-vinyl imidazole) and various metal ions using the molar ratio method // Colloid Polym Sci. - 1999. V.277. - P.570.
13. Эскин В.Б., Магарик С.Я., Кураев У.Б., Рудковская Г.Д. // Высокомол. Соединения. 1978. Том (А) XX №10, 2219-2223.
7
14. Патент №2202801 РФ, МПК G01N 33/556; G01N 33/531. Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Н.Л. Мазяр, С.М. Попкова, Е.А. Шмелева; Иркутский госуд. ун-т; Ин-т эпидем. и микробиол. ВСНЦ СО РАМН. - №98106367/14; заявл. 07.04.1998; опубл. 20.04.2003.
15. А.с. 1578143 (СССР). Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Ананьев В.А., Ветрова М.М., Аксаментов И.В.; Иркутский государственный университет, Институт эпидемиологии и микробиологии Вост. - Сиб. филиала СО АМН СССР // Заявл. 18.07.88; опубл. 15.07.90, бюл. №26.
16. Патент №2111013 РФ. Способ получения антител к арбовирусам комплекса Калифорнийского энцефалита и Батаи / Анненков В.В., Круглова В.А. и др. Иркутский государственный ун-т; Иркутский науч.-иссл. противочумный ин-т Сибири и Дальнего Востока // Заявл. 22.12.92, опубл. 20.05.98, бюл. №14.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФРАКЦИЙ ПОЛИ-1-ВИНИЛИМИДАЗОЛА В КАЧЕСТВЕ ИММУНОАДЪЮВАНТА
Таблица
Адъювант (молекулярная масса)
Титры антител в РПГА (log<sub>2</sub>)
0,001 мг/мл поли-1-винилимидазола
0,01 мг/мл поли-1-винилимидазола
Поли-1-винилимидазол нефракционированный
1:8(3)
1:16(4)
Поли-1-винилимидазол (65000)
1:8(3)
1:16(4)
Поли-1-винилимидазол (32000)
1:32(5)
1:32(5)
Поли-1-винилимидазол (14500)
1:64(6)
1:32(5)
Поли-1-винилимидазол (8800)
1:16(4)
1:16(4)
Поли-1-винилимидазол (6000)
1:8(3)
1:8(3)
Адъювант Фрейнда
1:8(3)
1:8(3)
Физиологический раствор (контроль)
1:8(3)
1:8(3)