СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА
METHOD FOR PRODUCING IMMUNE STIMULANT

Изобретение относится к области пищевой и медицинской промышленности, в частности к способу получения иммуностимулятора из морских животных и гидробионтов, и может применяться как биологически активная добавка к пище (перорально) и как лечебное инъекционное средство для людей и животных.
Известен способ получения иммуностимулятора из гидробионтов, например моллюска дрейссены (Патент РФ №2374891 от 16.07.2008, МПК А23J 1/04). При этом иммуностимулятор получают путем ферментолиза. Сырье измельчают вместе со створками и подвергают гидролизу ферментным препаратом, взятым в количестве 0,1-0,2% к массе фаршевой смеси, процесс ведут в течение 360-480 мин, при рН среды 3-11 и температуре 54-56°С, далее фермент инактивируют путем нагрева массы до 70-75°С в течение 10 мин, упаривают и фильтруют с отделением гидролизата от осадка, в качестве ферментного препарата используют ферменты растительного, животного или микробиального происхождения.
Известен способ получения иммуностимулятора из морских гидробионтов (патент РФ №2468593 от 29.09.2011, МПК А23L 1/33). При этом в качестве сырья используют мидии, которые измельчают, сушат и смешивают с ферментным препаратом. В качестве ферментного препарата используют препарат "Протозим" с активностью не менее 490 ПЕ/г протеолитического действия. Проводят гидролиз. В смесь добавляют воду, при этом сырье, ферментный препарат и воду берут в соотношении 20:1:400. Полученный гомогенат нагревают в течение 30-40 мин до температуры 50°С и выдерживают при данной температуре и постоянном перемешивании в течение 10 ч. Отделяют жидкую фракцию и концентрируют ее до содержания влаги не более 20%. При этом получают продукт, обладающий высоким содержанием низкомолекулярных пептидов.
Известен способ получения иммуностимулятора из кукумарии (Патент РФ №2147239, МКИ 7 А61К 35/56 "Общеукрепляющее неспецифическое иммуномодулирующее средство»). Измельченную мышечную ткань кукумарии смешивают с водой, добавляют протеолитический фермент, поваренную соль и 0,1% бензойнокислого натрия, смесь нагревают и термостатируют, затем фермент инактивируют нагреванием, фильтруют и консервируют 96%-ным этиловым спиртом или спиртовой вытяжкой из внутренностей кукумарии.
Недостатком вышеуказанных аналогов является то, что в качестве сырья использовали мышечную ткань или гидробионы целиком, в которых, как известно, содержание пептидов не превышает 1%, а биологическая активность обусловлена присутствием в ткани тритерпеновых гликозидов или других компонентов. К недостаткам относится также длительность и многостадийность процесса получения, низкий уровень иммуностимулирующей активности.
Имунностимулятор, полученный из нервной ткани морских гидробионтов, рыб и морских млекопитающих, содержит комплекс низкомолекулярных пептидов и аминокислот, обладающих иммностимулирующей активностью, стимуляцией мозгового крообращения, повышенной стойкостью к инфекционным заболеваниям.
Известен способ получения иммуностимулятора из нервной ткани морских гидробионтов, обладающих иммуностимулирующим действием (Патент РФ №2091072 от 10.03.1993, МПК А61К 35/50). В данном способе ганглии кальмара или каракатицы гомогенизируют в воде, подкисленной уксусной кислотой до рН 3,5-4,5 0,1% хлористого цинка. Смесь выдерживают 28-48 ч. После отделения надосадочной жидкости ее подвергают стерилизующей фильтрации. Стерильный фильтрат концентрируют в 5,5 раз методом ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 1000-5000 Д и подвергают очистке в трехкратном объеме подщелоченной до рН 9,0-10,0 воды. Очищенный концентрат снова концентрируют в 2 раза на том же пористом материале и подвергают стерилизующей фильтрации. Затем проводят стерильный розлив препарата и лиофильно высушивают.
Известен способ получения биологически активного вещества, обладающего иммуностимулирующим действием (Патент РФ №2105504 от 05.06.1996, МПК А61К 35/50). Иммуностимулятор получен из нервной ткани кальмара или каракатицы. Ганглии (нервную ткань) промывают водой и ацетоном, затем помещают в ацетон и выдерживают в ацетоне при температуре 4-10°С, гомогенизируют в воде, подкисляют до рН 3,5-4,5 0,1%-ным раствором хлористого цинка, выдерживают 24-48 ч, отделяют надосадочную жидкость, которую обрабатывают ацетоном при соотношении надосадочной жидкости и ацетона 1:6 по объему, при температуре 3-5°С, отделяют осадок, высушивают его, растворяют в воде с рН 6,0-7,0 и фильтруют.
Наиболее близким по достигаемому результату является способ получения биологически активного вещества, обладающего иммуностимулирующим действием (Патент РФ №2222337 от 03.07. 2002, МПК А61К 35/50). При этом иммуностимулятор получают из нервной ткани головоногих моллюсков: кальмаров, каракатиц, осьминогов; мозг морских млекопитающих: белух, кашалотов, китов, моржей, ларги, нерпы, лахтака, акибы; мозг рыб: лососевых, осетровых, сельдевых, тресковых, камбаловых, окуневыхи т.п. Сырье размораживают, измельчают, экстрагируют 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и выделяют целевой продукт путем ультрафильтрации и диафильтрации, которые проводят в две стадии на двух мембранах с различным пределом разделения по молекулярной массе. Иммуностимулятор, полученный по предлагаемому способу, имеет четко ограниченные пределы молекулярной массы 1000 -10000-15000 Да. Концентрированный раствор с целевым веществом молекулярной массой 1000-10000 Да стерильно фильтруют на мембранах с размером пор 0,22 мкм, разливают в стерильных условиях во флаконы с последующей лиофильной сушкой.
Недостатками перечисленных способов является:
- использование уксусной кислоты;
- использование хлористого цинка;
- использование ацетона;
- отделение осадка и процесс ультрафильтрации;
- длительность процесса;
- низкий выход конечного продукта (менее 1%).
Задача, решаемая изобретением, - упрощение способа получения иммуностимулятора из нервной ткани морских гидробионтов и млекопитающих и повышение выхода конечного продукта за счет использования экзогенных протеолитических ферментов.
Поставленная задача решается следующим образом.
Способ получения иммуностимулятора, включающий размораживание сырья, измельчение его, получение надосадочной жидкости, отделение ее и высушивание конечного продукта, при этом измельченное сырье ферментируют при гидромодуле 1:1-5, рН 5.5-7,5, температуре 22-45°С, в течение 1,5-3,5 ч под действием протеолитических ферментов в количестве 15-45 ед. активности на 1 г сырья, а надосадочную жидкость отделяют путем фильтрации.
В качестве сырья используют нервную ткань головоногих моллюсков: кальмаров, каракатиц, осьминогов; мозг морских млекопитающих: белух, кашалотов, китов, моржей, ларги, нерпы, лахтака, акибы; мозг рыб: лососевых, осетровых, тресковых, сельдевых, камбаловых, окуневых и т.п.).
В качестве протеолитических ферментов используют протеолитические ферменты (например, протамекс, коллагеназу, мегатерии, трипсин, химотрипсин, пилорин), а конечный продукт либо сублимируют, либо сушат на вакуум-сушильном аппарате барабанного типа. При этом выход конечного продукта составляет 5-10% от массы исходного сырья.
Новым в заявляемом техническом решении является то, что иммуностимулятор получают путем ферментирования сырья (нервной ткани морских гидробионтов и млекопитающих) протеолитическими ферментами, при этом сохраняется биологическая активность конечного продукта, а выход от массы исходного сырья составляет 5-10% в зависимости от вида сырья, в то время как в прототипе он менее 1%.
Использование ферментов протеолитического действия способствует образованию дополнительного количества низкомолекулярных пептидов, оказывающих стимулирующее действие.
Повышение выхода конечного продукта за счет использования протеолитических ферментов определено экспериментальным путем. Достигаемый результат иллюстрируется данными.
Таблицы 1Выход конечного продукта, в % от массы исходного сырья
Сырье
Иммуностимулятор прототип
Заявляемый иммуностимулятор (ЗИ)
головоногие
0,97
10,0
рыбы
0,88
7,0
млекопитающие
0,54
5,0
Биологическую активность заявляемого иммуностимулятора определяли путем исследования фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови
Гепаринизированную венозную кровь помещали в термостат на 20-30 мин для оседания эритроцитов. С помощью пипетки отбирали верхнюю (светлую) фракцию, содержащую лейкомассу, трижды отмывали 0,85% NaCl (по 10 мин при 1000 об/мин). Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в растворе Хэнкса, доводили до концентрации 2×106/мл по нейтрофилам и исследовали их фагоцитарную активность.
Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по отношению к латексу. Вначале нейтрофилы крови здоровых доноров инкубировали с исследуемыми БАВ в течение 60 минут при 37°С в конечной концентрации - 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,01 мкг/мл. Затем взвесь клеток в объеме 100 мкл соединяли в центрифужных пробирках со 100 мкл латекса (размер частиц латекса 1,5-2 мкм) в соотношении 1:20 и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем пробирки центрифугировали при 1000 об/мин 5 минут и сливали надосадочную жидкость. Из осадка готовили мазки, фиксировали метанолом, окрашивали азур-II-эозином и микроскопировали, определяя фагоцитарный показатель (ФП %) - процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и фагоцитарное число (ФЧ) - среднее число частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом.
Таблица 2Процент клеток, участвующих в фагоцитозе (ФП %)
ФТ
Среднее значение
Стандартное отклонение
p
Контроль
49,0
5,97
Тинростим 1 мкг/мл
47,0
3,06
0,89
Тинростим 0,1 мкг/мл
51,0
4,98
0,11
Тинростим 0,01 мкг/мл
53,5
0,88
0,01
ЗИ 1 м кг/мл
47,5
5,41
0,50
ЗИ 0,1 мкг/мл
50,0
14,68
0,26
ЗИ 0,01 мкг/мл
53,50
3,63
0,05
По ФП - Статистически значимые различия с контролем - Тинростим 0,01 мкг/мл и Заявляемый иммуностимулятор (ЗИ) 0,01 мкг/мл; мкг - микрограмм; 1 мг - 1000 мкг
Таблица 3Значения величин фагоцитарного числа (ФЧ) - среднее число частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом
Среднее
Стандартное
значение
отклонение
р
Контроль
1,75
0,13
Тинростим 1 мкг/мл
2,00
0,37
0,563
Тинростим 0,1 мкг/мл
2,05
0,18
0,056
Тинростим 0,01 мкг/мл
2,30
0,25
0,020
ЗИ 0,1 мкг/мл
2,15
0,20
0,036
ЗИ 0,01 мкг/мл
2,05
0,48
0,023
ЗИ 0,001 мкг/мл
2,50
0,47
0,003
По ФЧ - Статистически значимые различия с контролем - Тинростим 0,01 мг/кг и 0,01 мкг/мл; Заявляемый иммуностимулятор (ЗИ) - 0,01 мкг/мл и 0,01 мкг/мл.
Результаты, представленные в таблице 2 и 3, свидетельствуют, что достоверных различий в иммуностимулирующей активности препаратов тинростим и заявляемого иммуностимулятора нет. Таким образом, активность препарата, полученного методом ферментативного гидролиза, совпадает с активностью препарата, полученного по способу прототипа.
Пример 1
10 кг замороженных ганглий кальмара размораживают до температуры минус 4°С в центре брикета и измельчают на электромясорубке. Измельченное сырье помещают в реактор и добавляют воду в соотношении 1:2, рН 7,5. Смесь перемешивают и добавляют раствор фермента протамекс из расчета 25 ед. на 1 г сырья. Доводят температуру до 25°С и ферментируют в течение 1,5 ч. После окончания процесса ферментолиза смесь фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Жидкую фракцию направляют на сублимационную сушку. Выход конечного продукта составляет 1 кг, что равняется 10% от веса исходного сырья.
Полученный конечный продукт представляет собой порошок светлосерого цвета, хорошо растворимый в воде и нерастворимый в органических растворителях и содержит 45% свободных аминокислот и 35% пептидов с молекулярной массой менее 15 кДа.
Таблица 4Состав свободных аминокислот из нервных тканей
Аминокислота
ЗИ, моль%
прототип, %
Таурин
9,67
1,56
Аспарагиновая кислота
22,86
3,69
Треонин
1,67
0,27
Серии
2,66
0,43
Глутаминовая кислота
18,59
3,0
Глицин
2,66
0,43
Алании
2,85
0,46
Валин
2,17
0,35
Метионин
1,30
0,21
Изолейцин
1,24
0,20
Лейцин
3,66
0,59
Гистидин
2,11
0,34
Лизин
28,56
4,61
Таблица 5Выход фракций тинростима и ЗИ при ультрафильтрации
Образец, № фракции
Тинростим
ЗИ
Выход фракций, г
Выход фракций, г
Центрифугат/фильтрат
85,0±2,5
1000±5,0
более 100 кД
26,6±0,2
220±4,0
от 10 до 100 кД
21,8±0,1
310±4,0
от 1 до 10 кД
36,6±0,2
375±3,5
менее 1 кД
-
95±1,7,0
Выход тинростима из 10 кг сырья приведен в таблице 1.
Пример 2
10 кг мороженой нервной ткани мозга морских млекопитающих размораживают до температуры минус 4°С в центре брикета и измельчают на электромясорубке. Измельченное сырье помещают в реактор и добавляют воду в соотношении 1:5. Смесь перемешивают и добавляют раствор фермента коллагеназы из расчета 15 ед. на 1 г сырья. Доводят температуру до 45°С и ферментируют в течение 3,5 ч при рН 5.5. После окончания процесса ферментолиза смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Сушку жидкой фракции проводят на вакуум-сушильном аппарате барабанного типа. Выход конечного продукта составляет 0,5 кг, что равняется 5% от веса исходного сырья.
Пример 3
10 кг мороженой нервной ткани мозга рыб размораживают до температуры минус 4°С в центре брикета и измельчают на электромясорубке. Измельченное сырье помещают в реактор и добавляют воду в соотношении 1:3. Смесь перемешивают и добавляют раствор фермента трипсин из расчета 45 ед. на 1 г сырья. Смесь ферментируют в течение 2,5 ч при температуре 22°С и рН 7.5. После окончания процесса ферментолиза смесь фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Жидкую фракцию лиофилизируют. Выход конечного продукта составляет 0,7 кг, что равняется 7% от веса исходного сырья.