Молекулярные механизмы супрессии иммунного ответа при туберкулезе легких

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Иммунология туберкулеза Immunology of tuberculosis

цитометрии определяли содержание Mtb-специфичных лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy, IL-17, и одновременно IFNy и IL-17, экспрессию на них рецепторов CXCR3, CCR6, CD161, отличающих популяции лимфоцитов Th1, Th17 и Th1/Th17, экспрессию маркеров диффе-ренцировки и функционального истощения клеток. Аналогичный подход был использован для определения содержания популяций Th1, Th17, Th1/Th17 в очаге инфекции в легочной ткани.

Результаты. Показано, что в крови больных ТБ и «контактов» среди лимфоцитов CD4+, экспрессирующих хемо-киновые рецепторы, преобладают лимфоциты с фенотипом CXCR3+CCR6+, характерным для популяции Th1/Th17. Среди Mtb-специфичных лимфоцитов CD4+, у больных ТБ и «контактов» преобладают лимфоциты IFNy+IL-17-; содержание лимфоцитов IL-17+ существенно ниже, содержание лимфоцитов IFNy+IL-17+ незначительно. Несмотря на функциональную принадлежность лимфоцитов IFNy+IL-17- к популяции Th1, их фенотип отличается от фенотипа «классических» лимфоцитов Th1 и характеризуется коэкспрессией рецепторов CXCR3, CCR6, CD161 («гибридный» фенотип, характерный для популяции Th1/Th17). Проведен сравнительный анализ фенотипа, степени диф-ференцировки, содержания лимфоцитов Th1, Th17, Th1/ Th17 в крови больных ТБ и «контактов», в крови больных ТБ с различным течением ТБ процесса, в крови и легких больных ТБ. Полученные результаты позволяют предположить, что популяция Mtb-специфичных лимфоцитов IFNy+IL-17-, экспрессирующих фенотип CXCR3+CCR6+, является менее дифференцированной по сравнению с популяцией «классических» лимфоцитов Th1, а увеличение содержания последних ассоциировано с большей активностью и тяжестью инфекционного процесса.

Заключение. Полученные результаты выявляют специфические характеристики ответа Th1 при ТБ, к которым относится преобладание среди Mtb-специфичных лимфоцитов CD4+ клеток-продуцентов IFNy и экспрессия данными клетками «гибридного» фенотипа CXCR3+CCR6+/ CD161+. Увеличение содержания лимфоцитов Th1 в популяции CXCR3+CCR6- отмечается при активном ТБ.

Работа поддержана грантом РНФ 15-15-00136.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СУПРЕССИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

Уразова О.И., Есимова И.Е., Кононова Т.Е., Захарова П.В., Колобовникова Ю.В., Чурина Е.Г.

Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия

Многие инфекционные возбудители (в том числе Mycobacterium tuberculosis) способны вызывать супрессию иммунного ответа. Немаловажная роль в ее развитии отводится Т-регуляторным лимфоцитам (Treg), реализующим свое иммуносупрессорное действие посредством экспрессии поверхностных (CD25, CTLA-4) и внутриклеточных (транскрипционный фактор FoxP3) молекул, гранзим-опосредованного цитолиза и секреции ингибиторных ци-токинов (IL-10 и TGF-ß). Однако остаются дискуссионными вопросы о том, какие конкретные патогенетические факторы и механизмы лежат в основе Treg-опосредованной иммуносупрессии при туберкулезе легких.

Цель. Определить роль и молекулярные механизмы Treg-опосредованной иммуносупрессии в иммунопатоге-незе туберкулеза легких.

Материалы и методы. Обследованы 217 больных (149 мужчин и 68 женщин 41,94±10,63 лет) с впервые выявленным инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких (ИТЛ, ДТЛ) до лечения. Материал исследования: выделенные из крови лимфоциты и эо-зинофилы, ДНК, РНК. Методы исследования: иммуно-фенотипирование Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD25+, CD28+, CTLA-4+, FoxP3+, IL-2+), оценка in vitro секреции IL-2, IL-10, TGF-Р и содержания активных форм транскрипционных факторов внутриклеточной трансдукции сигнала (NF-kB, AP-1 и NFAT2) в Т-лимфоцитах при моделировании in vitro их рецептор-зависимой активации с применением методов иммуноферментного анализа и проточной цитометрии, определение полиморфизмов генов цитокинов IL-10, TGF-Р и мРНК гена FoxP3 с использованием ПЦР.

Результаты. У больных ТЛ увеличение количества CD3+CD4+CD25high, CD4+CD25+FoxP3+, CD4+CD25-FoxP3+ Treg в крови сочеталось с повышением экспрессии мРНК гена FoxP3 в лимфоцитах и гиперсекрецией in vitro ингибиторных Treg-цитокинов IL-10, TGF-p с наибольшей выраженностью при ДТЛ (соответственно, 1,12%, 4,88%, 7,25%, 27,72 отн.ед., 30,93 пг/мл, 1227,71 пг/мл; p < 0,01-0,001). Выявлены ассоциации между базальной и BCG-индуцированной in vitro гиперсекрецией IL-10, TGF-P и носительством полиморфных вариантов генов С-592А гена IL10 (аллель А и генотипы СА, АА) и C-509T гена TGFe (аллель Т и генотипы СТ, ТТ), что свидетельствует о генетически детерминированной предрасположенности к иммуносупрессии у больных ТЛ. Однако Treg реализуют свое иммуносупрессорное действие не только посредством цитокинов, но и контактным способом — через экспрессию ингибиторной молекулы CTLA4 (инактивирует молекулы костимуляции на антигенпре-зентирующих клетках (АРС) и Т-лимфоцитах). При этом блокируются не только внеклеточный этап активации Т-лимфоцитов (посредством костимуляции при контакте с АРС), но и внутриклеточный — проведение сигнала активации от поверхности клетки к генам синтеза IL-2 и его рецептора при участии транскрипционных факторов NF-kB, AP-1 и NFAT2, на что указывают результаты моделирования in vitro CD3/CD28-зависимой активации Т-лимфоцитов у больных ТЛ — снижение численности NF-kB+, AP-1+, NFAT2+ и (до 9,80%) CD28+IL-2+ активированных Т-клеток при повышении количества Treg с фенотипом CD3+CTLA4+ (более 20%) (р < 0,001). У 18% больных ТЛ увеличение числа и цитокинсекреторной активности FoxР3+Treg ассоциировалось с эозинофиль-ным лейкоцитозом до лечения (до [0,97±0,11] х 109/л, более выраженным при ДТЛ, чем при ИТЛ) во взаимосвязи с деструктивными изменениями и замедлением темпов рассасывания инфильтратов в легких. Обнаружены корреляции между количеством иммуносупрес-сорных Treg в крови и показателями пролиферации (отрицательные) и апоптоза (положительные) лимфоцитов, снижением базальной и BCG-индуцированной in vitro секреции IL-2 мононуклеарными лейкоцитами (10,59 и 33,85 пг/мл, р < 0,05) при повышении базальной и BCG-индуцированной in vitro секреции IL-2 эозинофильными гранулоцитами (666,23 и 670,45 пг/мл, р < 0,05) у больных ДТЛ. Ввиду того, что IL-2 — медиатор, в комбинации с TGF-Р активирующий конверсию и функции Treg, гиперсекрецию IL-2 эозинофильными гранулоцитами в сочетании с эозинофильной реакцией крови можно рас-

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

ценивать как фактор, потенцирующий механизмы Treg-опосредованной иммуносупрессии при ДТЛ.

Заключение. Патогенетическими факторами Treg-опосредованной иммуносупрессии при ТЛ является повышение секреции ингибиторных цитокинов (IL-10, TGF-P) и экспрессии маркерных молекул (FoxP3, CTLA-4) с подавлением внеклеточного и внутриклеточного этапов рецептор-зависимой активации T-лимфоцитов. Факторами, предрасполагающими к иммуносупрессии при ТЛ, являются полиморфизм генов IL10 (С-592А), TGFe (C-509T) и эозинофильная реакция крови (эозинофилия) до лечения.

IL-18 И МАРКЕРЫ ДЕСТРУКЦИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ФОРМАМИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

Эсмедляева Д.С., Дьякова М.Е., Перова Т.Л., Васильев И.В., Кирюхина Л.Д.

ФГБУ«Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия.

Введение. Степень поражения легочной ткани напрямую зависит от состояния иммунной системы организма. IL-18, провоспалительный цитокин, экспрессируемый многими типами клеток, обладает широким спектром биологических эффектов: сдвигает баланс цитокинов в пользу клеточного иммунитета, стимулируя продукцию IFNy, IL-2 и др., регулирует Fas-ligand опосредованный апоптоз. Наряду с TNFa, IL-17 и др. цитокинами участвует в стимуляции матриксных металлопротеиназ (ММР) — семейства внеклеточных цинк-зависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного ма-трикса и к выбросу апоптозных лигандов (Fas).

Цель. Определить закономерности изменений IL-18 и системы ММР/ингибиторы в зависимости от хронической формы туберкулеза легких (ТЛ).

Материалы и методы. Обследовано 43 пациента ТЛ с длительностью заболевания более 2-х лет, с наличием распада, выделяющих лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий. Среди них — 24 с туберкулемами (ТУБ) и 19 с фиброзно-кавернозным (ФКТ) ТЛ. В супернатан-тах мононуклеаров периферической крови определяли спонтанную и индуцированную фитогемагглютинином (РНА) и туберкулином (PPD) продукцию цитокинов (IL-18 и IFNy) с использованием ИФА наборов ЗАО «Вектор Бест». Оценку внешнего пути активации апоптоза лимфоцитов проводили по экспрессии поверхностного фенотипа Fas (CD95+) и по окрашиванию коньюгатом аннексин-V (AnnV) с флуорохромом (FITC) и йодистым пропидием (PI) (Becton Dickinson, USA) на проточным цитофлюориметре. В исследовании уровней коллаге-наз (ММР-1,-8), желатиназы (ММР-9) и их ингибитора TIMP-1 в сыворотке крови использовали ИФА наборы (Biosiurce, USA). Расчет объемов деструкции проводили согласно результатам компьютерно-томографического обследования.

Результаты. Установлено, что ТУБ и ФКТ характеризуются значимым ростом абсолютного числа лимфоцитов, экспрессирующих СD95+, возрастанием числа АпУ+ положительных клеток, не стимулированной продукцией цитокинов, не только относительно контроля, но и между собой. Индукция PPD вызывала увеличение продукции обоих цитокинов только при ТУБ. При ФКТ она была ниже контрольного уровня. Установлены связи Ш-18 и как между собой (г = 0,69, р < 0,03; г = 0,87, р < 0,004), так и с маркерами апоптоза, различающиеся в зависимости от характера стимуляции и объема поражения. При ТУБ активация ГЬ-18 на PPD была связана с маркерами позднего апоптоза (АппУ+/ Р1+) (г = 0,45, р < 0,03), при ФКТ — с ранним апоптозом АппУ+/ Р1-наряду с продукцией ^N7 на PPD (г = 0,48, р < 0,03; (г = 0,43, р < 0,03).

При обеих хронических формах ТЛ наблюдалось повышение уровней коллагеназ и желатиназы, не сопровождавшееся компенсированным повышением концентрации их ингибитора относительно контрольного уровня (р < 0,05), приобретающее значимые различия по мере увеличения объема деструкции. С учетом того, что основными источниками ММР-8 и -9 являются нейтрофилы и что по мере увеличения тяжести процесса наблюдается увеличение казеозно-некротических масс, полученная закономерность кажется логичной.

Продукция №N7 была связана только с одной из коллагеназ (ММР-8) и Т1МР-1 и определялась объемом поражения. При ТУБ изменения ММР-8 были противоположны продукции цитокина стимулированной PPD (г = -0,41, р < 0,03), при ФКТ — оставались на уровне контроля (г = -0,52, р < 0,03). Связи Ш-18 с уровнями ММР и Т1МР-1 установлено не было.

Участие цитокинов в активации апоптоза было установлено при анализе изменений липидного состава поверхности мембраны клетки, тогда как показатели системы ММР/ингибиторы были связаны с уровнем экспрессии Fas-рецептора, характеризующего потенциальную готовность клеток к рецепции апоптотического сигнала. При этом в случае ТУБ объем деструкции определялся взаимосвязью CD95+ с ММР-9 (г = 0,55, р < 0,03), при ФКТ — с уровнем желатиназы и ее ингибитора (г = 0,45, р < 0,03; г = 0,48, р < 0,03).

Заключение. Показана зависимость изменений ГЬ-18 с ^N7 и маркерами апоптоза при хронических формах ТЛ. При ТУБ отмечался рост спонтанной и PPD стимулированной продукции обоих цитокинов. При ФКТ установлено увеличение спонтанной продукции ГЬ-18 и №N7 по сравнению с ТУБ, тогда как при стимуляции PPD наблюдалось их снижение ниже контрольного уровня, свидетельствующее о низком функциональном состоянии иммунокомпетентных клеток. Нарушение соотношения уровня ММР/ингибитора в сторону протеаз, в большей степени выраженное при ФКТ, в сочетании с отрицательной связью с ^N7, по-видимому, вызвано влиянием противовоспалительных цитокинов (ГЬ-10, TGF-P), способствующих хронизации процесса и увеличению объема распада.