Средство для стимуляции роста бобовых, масличных и овощных культур и угнетения сорных растений в агроценозах
STRAIN OF CYANOBACTERIA NOSTOC LINCKIA ACSSI 271 FOR STIMULATION OF GROWTH OF CROPS AND OPPRESSION OF WEEDS IN AGROCENOSIS

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, растениеводству и земледелию, предназначено для стимуляции роста и развития сельскохозяйственных культур и ингибирования сорных растений в агроценозах.
Одной из распространенных биотехнологических задач с использованием цианобактерий (ЦБ) является разработка биоудобрений для питания растений, преобразующих питательные вещества (минеральные удобрения) в легкоусвояемую форму. Аналоги ростстимулирующей активности растений с использованием цианобактерий родов Nostoc, Anabaena и др. известны в отечественных и зарубежных исследованиях. Показано, что при бактеризации цианобактериями можно увеличить урожайность сельскохозяйственных культур на 5-20%. Известно использование цианобактерий при выращивании риса (Патент SU 1180366 A1, C05F 11/08, 23.09.1985; Андреева Н.А. Азотфиксирующие цианобактерий в ризосфере риса и их влияние на урожай растений: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.07. - Л., 1990. - 19 с.; Kaushik B.D. Developments in Cyanobacterial Biofertilizer // Proc. Indian. Natn. Sci. Acad. - 2014. - V. 80, no 2. - P. 379-388; Prasanna R. et al. Evaluating the potential of rhizo-cyanobacteria as inoculants for rice and wheat // Journal of Agri- cultural Technology. - 2012. - V. 8, iss. 1. - P. 157-171; Saadatnia H., Riahi H. Cyanobacteria from paddy fields in Iran as a biofertilizer in rice plants // Plant Soil Environ. - 2009. - V. 55, no 5. - P. 207-212), пшеницы (Karthikeyan N. et al. Evaluating the potential of plant growth promoting cyanobacteria as inoculants for wheat // European Journal of Soil Biology. - 2007. - V. 43, iss. 1. - P. 23-30; Fadl-Allah E.M. et al. In vitro creation of artificial nitrogen fixing Cyanobacterium (Nostoc muscorum) association with wheat // African Journal of Microbiology Research. - 2011. - V. 5, no 3. - P. 302-310), томата (Al-Khiat S.H. Effect of cyanobacteria as a soil conditioner and biofertilizer on growth and Some biochemical characteristics of tomato (Lycopersicon esculentum L.) seedlings // Tesis de M. Sc., Dept. Botany and Microbiology, King Saud Univ., Arabia Saudita. - 2006. - 191 p.), бобовых культур (Дiдович С. В., Мальцева I.A. Ефективнiть застосування альгобактериального консорциуму при вирощуваннi бобових культур // Биологический вестник Мелитопольского государственного педагогического университета им. Боглана Хмельницкого. - Т. 2, №2 (2012). - С. 58-66; Трефилова Л.В., Патрушева М.Н. Эффективность использования цианоризобиального консорциума при выращивании гороха посевного // Теоретическая и прикладная экология. - 2009, №3. - С. 67-75; Зяблых Р.Ю. Консорциумы микроорганизмов на основе почвенных азотфиксирующих цианобактерий и их агробиотехнологический потенциал: дисс. канд. биол. наук. - Киров, 2008. - 175 с.).
При этом в указанных исследованиях авторы преимущественно указывают на использование штаммов аксеничных цианобактерий для определенных сельскохозяйственных культур или предлагают использовать консорциумы цианобактериальных штаммов с различными агрономически полезными гетеротрофными микроорганизмами.
Примером более широкого использования свойств цианобактерий может служить способ стимуляции роста и развития растений, повышения урожайности и защиты от фитопатогенных грибов в аридной зоне с применением суспензии цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 (Патент RU 2634387 С2, A01N 63/02, опубл. 26.10.2017, бюл. №30). Согласно описанию способа культура цианобактерий Anabaena constricta IPPAS В-2020 проявляет ростстимулирующие свойства в отношении ряда сельскохозяйственных культур (кресс-салата, перца болгарского, томата), а также фунгицидную активность против фитопатогенных грибов.
Однако информации о препаратах на основе цианобактерий для ингибирования сорных растений в доступных нам поисковых научных базах литературы не обнаружено. Среди биопрепаратов - аналогов биогербицидного/ингибирующего использования микроорганизмов можно привести следующие: COLLEGO на основе Colletotrichum gloeosporioides f. sp.aeschynomene J.T. Daniel, G.E. Tempelton, R.J. Sm., W.T. Fox для контроля растений эшиномены {Aeschynomene virginica) в посевах риса и сои в США; DeVINE на осно- ве спор гриба Phytophthora palmivora (E.J. Butler) E.J. Butler для борьбы с моренией душистой (Morenia odorata) в цитрусовых садах; BIO MAL на основе Colletotrichum gloeosporioides f. sp.malvae для подавления просвирника при- земистого (Malva pusilla) в Канаде; STUMPOUT на основе Cylindrobasidium laeve (Pers.) Chamuris в ЮАР для предотвращения отрастания срубленных деревьев; ТЕНТОКСИН, на основе метаболитов Alternaria alternata (Fr.) Keissl. для подавления многих видов двудольных сорняков; микогербицид на основе гриба Curvularia lunata (Wakker) Boedijn (телеоморфа Cochliobolus lunatus) против куриного проса в Нидерландах и другие (Kremer R. J. The role of bioherbicides in weed management // Biopest. Int. - 2005 - Vol. 1, №3. - P. 127-141). В России ФГБНУ ВИЗР запатентованы штаммы грибов, обладающие микогербицидной активностью против мака снотворного, борщевика Сосновского, бодяка полевого, полыни обыкновенной (патент RU 2377774 С1, 10.01.2010; патент RU 2439141 С1, 10.01.2012; патент RU 2515899 С1, 20.05.2014; патент RU 2588470 С1, 27.06.2016).
Однако все данные гербициды разработаны на основе микроскопических грибов или их метаболитов, а также специфичности взаимодействия с растением-хозяином.
В основу изобретения поставлена задача расширения возможностей применения штамма цианобактерий Nostoc linckia IPPAS В-2044 с целью использования его в качестве средства, обладающего свойствами стимуляции роста в отношении широкого спектра сельскохозяйственных культур, а также гербицидной активностью.
Поставленная задача решена путем применения штамма цианобактерий Nostoc linckia IPPAS В-2044 для стимуляции роста бобовых, масличных и овощных культур и угнетения сорных растений.
Штамм Nostoc linckia IPPAS В-2044 выделен из почвы мокрого солончака побережья озера Сиваш (Семеновский Кут, 46°05'00.8''N 34°20'00.0''Е), где высшая растительность была представлена популяцией Salnicornietum prostratae Soo (1927), идентифицирован (Komarek J. Cyanoprokaryota 3: Heterocytous genera // Siisswasserflora von Mitteleuropa / Eds. Budel В., Gartner G., Schagerl M. Spectrum Akademischer Verlag, 2013. V. 19/3. ИЗО p.). В результате аналитической селекции определен как стимулятор/ингибитор растений в зависимости от физиологического возраста бактериальной культуры. Аксеничность штамма: альгологически чистая культура, проверен с использованием методов микроскопии и молекулярной биологии (ПЦР). Номер в GenBank: KY887478 (16S).
Штамм депонирован в коллекции микроводорослей ФГБУН «Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН» под регистрационным номером IPPAS В-2044.
Таксономия штамма: Филум: Cyanobacteria, класс Cyanophyceae, порядок Nostocales, семейство Nostocaceae, род Nostoc, вид linckia (Bornet ex Bornet et Flahault).
Штамм имеет следующую морфологическую характеристику: на твердой среде плоские распростертые зеленые колонии, клетки боченковидные размер 3,5x4 мкм. Имеет гетероцисты, акинеты, слизь бесцветная. На фиг. 1 представлена фотография штамма (микроскоп Carl Zeiss Axio Scope А1/ Германия), шкала 10 мкм.
Для хранения штамма используют агаризованную среду (1% агар) BG11 о (без азота), условия хранения штамма: температура 15°С, освещен- ность 30-40 мкмоль/м2/сек, пересев через 6 мес. (оптимум) - 12 мес. (максимум) согласно паспорту депонирования.
2
2
Для препаративной формы штамм культивируется на среде Громова №6 без азота и агара (Владимирова и др., 1991, http://www.cellreg.org/Catalog/Catalog%20NEW/media/N6_and%20variations.html), рН в начале культивирования 7,0; в конце культивирования 6,93; температура: 23-25°С, освещение: периодическое 12 ч свет / 12 ч темнота; освещенность: LED-освещение с плотностью фотосинтетического фотонного потока PPFD (ФАР) - 115 мкмоль/м/сек и энергетической освещенностью (ФАР) - 24,5 Вт/м с четырьмя зонами спектра: синим (400-500 нм), зеленым (500-600 нм), красным (600-700 нм), инфракрасным (700-780 нм).
Продуктивность в искусственных условиях культивирования (препаративная форма) с максимальным уровнем полезного свойства:
15 сут.- 0,598±0,02 10-3 мг абсолютно сухой биомассы / мл среды, рН 7,0;
7,5 мес.- 4,87±0,31 10-3 мг абсолютно сухой биомассы / мл среды, рН 6,93.
В таблице 1 представлены биохимические параметры при максимальной продуктивности штамма (7,5 месяцев культивирования).
Изобретение характеризуется следующими примерами:
1. Стимулирующая активность штамма Nostoc linckia IPPAS В-2044 (используется препаративная форма на основе 15 суточной культуры)
Пример 1.
Влияние бактеризации штаммом на посевные качества семян с/х культур определяли согласно ГОСТ 12038-84 в лабораторных опытах. Установлено повышение энергии прорастания на 22%, всхожести на 4% и дружности семян на 0,8%, а также фитомассы проростков нута на 14,8% в сравнении с контролем. Влияние бактеризации семян на посевные качества чечевицы имело позитивную тенденцию (таблица 2).
Пример 2.
Вегетационные опыты проводили на растениях, которые выращивали в сосудах с перфорированным дном, объемом 200 мл на стерильном субстрате - вермикулите (минерал класса алюмосиликатов, слюдяная крошка фракции 1-5 мм), удобренном питательной смесью Прянишникова Д.Н. (Волкогон В.В. i3 сшвавт., 2011), или на почвенном субстрате.
Мелко-деляночный опыт проводили в условиях суходола предгорной зоны Крыма на лугово-черноземной почве, пахотный слой которой (0-20 см) характеризовался средней обеспеченностью обменным калием и подвижным фосфором и низкой - легкогидролизуемым азотом. Нут выращивали по зональной технологии. Перед посевом проводили бактеризацию семян. Урожай собирали снопами и пересчитывали на 100% чистоту и 14% влажность.
Для нитрагинизации бобовых культур применяли препарат на основе клубеньковых бактерий Ризобофит, для обработки томатов препарат Азотобактерин.
Установлено, что бактеризация штаммом цианобактерии Nostoc linckia IPPAS В-2044 позволяет существенно повысить биологические показатели гороха, нута, рыжика посевного, кориандра, томата (таблицы 3-6).
Таким образом, в проведенных исследованиях штамм Nostoc linckia IPPAS В-2044 показал ростстимулирующий эффект на широком спектре культур: нуте, чечевице, кориандре, рыжике, томате и может быть использован в более широком диапазоне: как в аксеничной монокультуре, так и с агрономически полезными штаммами гетеротрофных бактерий для ростстимуляции растений в агроценозах Крыма.
2. Ингибирующая/биогербицидная активность штамма Nostoc linckia IPPAS В-2044 (используется препаративная форма на основе 7,5 месячной культуры)
Пример 3.
В вегетационном опыте на черноземе южном в растениях амброзии оценивали активность оксидоредуктаз при бактеризации штаммами Nostoc linckia IPPAS В-2044. Известно, что пероксидаза, обладая повышенной чувствительностью к внешним воздействиям, участвует в защитных реакциях растения, и ее можно считать стрессовым ферментом (Zhao, Sakai, 2003; Максимов, Черепанова, 2006). Бактеризация увеличила уровень пероксидаз в зеленой массе амброзии в 1,6-2,6 раза в сравнении с контролем (таблица 7).
Пероксидазы клеточных стенок ответственны за продукцию перекиси в ходе окислительного «взрыва» в ответ на патогенез, а защиту клеточных структур от разрушения перекисью водорода, обеспечивает фермент каталаза, активность которой увеличилась в 1,9 раза в сравнении с контролем. При бактеризации отмечена высокая активность фермента полифенолоксидазы - в 3,9 раза больше, чем в контроле, что свидетельствует о снижении интенсивности дыхания и торможения процессов роста и повышении стойкости растений к неблагоприятным стрессовым факторам, что отразилось на фитомассе растений, которая существенно снизилась в 1,4 раза.
Пример 4.
В полевом опыте на посеве озимого ячменя, где предшественником была фацелия, изучали эффективность бактеризации цианобактериальным штаммом на сорных растениях. В схему опыта были включены: контроль - обработка водой и вариант со штаммом цианобактерии Nostoc linckia IPPAS В-2044. Обработка составляла 5 л/га.
2
Перед обработкой проведен подсчет сорняков с определением их видового состава. Видовой и количественный состав сорняков перед внесением биогербицида был представлен одно-двулетними яровыми и зимующими сорняками в количестве 1-43,3 шт. /м, среди которых выявлены вероника плющелистная {Veronica hederifolia L.), ясколка стеблеобъемлющая {Caryophyllaceae Juss L.), яснотка стеблеобъемлющая {Lamium amplexicauleL.), пастушья сумка (Capsella bursa-pastoris), дискурейния Софии (Descurainia Sophia L.), хориспора нежная (Chorispora tenella (Pall.)), мак самосейка (Papaver rhoeas L.), воробейник полевой {Lithospermum arvense L.), двойчатка лучистая {Bifora radians Bieb.) (табл. 8).
2
По всем вариантам доминирующим видом сорняков была отмечена вероника плющелистная {Veronica hederifolia L.) - 41,0-^43,3 шт./м.
Учет через 10 дней после внесения биогербицида показал, что гибель сорных растений оставалась на уровне контроля, но состояние сорняков ухудшилось, т.е. растения находились в угнетенном состоянии, как в контрольном варианте, так и в вариантах с обработкой штаммом ЦБ, однако при бактеризации наблюдали увядание сорных растений и хлоротичные пятна на листьях. Через 20 дней после бактеризации учет сорняков показал, что по всем вариантам опыта все растения вероники плющелистной, пастушьей сумки высохли и погибли. В варианте с бактеризацией гибель мака самосейки составила 9,5% (контроль - 4,2%), хориспоры нежной - 100% (контроль - 66,7%), двойчатки лучистой 100% (контроль - 95%), ясколки стеблеобъемлющей - 100% (контроль - 57,1%), яснотки стеблеобъемлющей - 100% (контроль - 85%), дискурейнии Софии - 90% (контроль - 66,7%), воробейника полевого - 87,5% (контроль - 60%). На состоянии сорняков сказались и высокие температуры воздуха в период учета, однако выжившие сорные растения находились в полусухом состоянии с хлоротичными пятнами.
Предлагаемый штамм Nostoc linckia IPPAS В-2044 не имеет специфичности взаимодействия, а позволяет путем влияния на ферментативную систему ингибировать сорные растения.
Изобретение подготовлено в рамках государственных заданий 0834-2015-0001, 0834-2015-0005, гранта РФФИ 18-016-00184 «а».