Роль протеаиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты

2010 г.

ИММУНИТЕТ НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ К ПОЛИОМИЕЛИТУ

Ермолович М.А., Свирчевская Е.Ю., Самойлович Е.О., Игнатьев Г.М.

Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Республика Беларусь

Дикие полиовирусы (ПВ) не циркулируют в Беларуси уже более 40 лет, и популяционный иммунитет формируется исключительно благодаря плановой иммунизации детей. До 2000 г. в стране использовалась оральная поли-овакцина (ОПВ), с 2000г. применяется комбинированная схема вакцинации, предусматривающая первичную иммунизацию (с 2000 - 1 доза, с 2004 - 2 дозы, с 2008 - 3 дозы) инактивированной полиовакциной (ИПВ) с последующей ревакцинацией ОПВ. В настоящее время дети получают ИПВ в возрасте 3, 4 и 5 мес., и затем ОПВ в 18, 24 мес. и 7 лет. Необходимость оценки популяционного иммунитета была вызвана обострением ситуации по полиомиелиту в Европейском регионе в 2010 г. и внесенными изменениями в национальный календарь прививок.

Сыворотки крови 315 лиц в возрасте 1 - 39 лет из всех 7 регионов Беларуси, собранные методом случайной выборки в мае-июне 2010 г., были исследованы в реакции нейтрализации с референс-штаммами вакцинных ПВ серотипов 1, 2 и 3 согласно методике, рекомендованной ВОЗ. Исследовали двукратные последовательные разведения сывороток от 1:4 до 1:512 (ПВ1 и ПВ2) или 1:256 (ПВ3). Минимальным защитным титром антител считали 1:4; титры 1:4 - 1:16 расценивали как низкие,

1:32-1:128 - как средние, 1:256 и выше - как высокие.

Согласно полученным данным в Беларуси популяционный иммунитет к ПВ1 и ПВ2 является высоким (более 97%) и характеризуется равномерным распределением иммунной прослойки во всех возрастных группах населения на всей территории страны. Более 80% обследованных имели вируснейтрализующие антитела в средних и высоких титрах.

Иммунитет к ПВ3 являлся достоверно более низким (88%) и отличался меньшей напряженностью и быстрым падением в возрастных группах старше 6 лет. Наиболее низкая иммунная прослойка к ПВ3 выявлена у лиц 21 - 30 лет (82%). Значительная доля (15 - 20%) обследованных в возрасте 7 - 39 лет имели минимальный защитный уровень антител к ПВ3, в то время как аналогичный показатель к ПВ1 и ПВ2 в этой возрастной группе составлял 1 - 2%.

Предыдущее исследование популяционного иммунитета, проведенное в 2000 г., указывало на достоверное снижение числа иммунных к ПВ3 в группе детей старше 3 лет. Вероятно, наблюдаемое в настоящее время стойкое сохранение уровня и напряженности иммунитета к ПВ3 у детей 4-6 лет обусловлено использованием для их вакцинации ИПВ, которая вызывает формирование более выраженного гуморального иммунного ответа.

РОЛЬ ПРОТЕАИНАЗ КРОВИ И ИХ ИНГИБИТОРОВ В МЕХАНИЗМАХ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ЗАЩИТЫ

Михальчук В.Н., Гоженко А.И., Дивоча В.А.

ГП «Украинский НИИ медицины транспорта

Цель работы. Обосновать и разработать биотехнологию получения противовирусного препарата для человека с класса ингибиторов трипсиноподобных протеи-наз по результатам исследований взаимодействия ферментной системы клетки с вирусом гриппа.

Работа посвящена изучению наличия протеолити-ческих ферментов и их ингибиторов в донорской крови человека, в промышленных отходах получения гамма-глобулина, коммерческих отечественных препаратах (иммуноглобулин, интерферон, герпетическая и туля-ремийная вакцины), в зарубежных препаратах (гриппозные вакцины - «Инфлувак», «Ваксигрип», «Флюа-рикс», вакцина против гепатита А - «Аваксим»; препараты из крови - «Фраксипарин» и «Солкосерил»). Из промышленных отходов получения гамма-глобулина выделена изоформа ингибитора трипсиноподобных протеиназ, которая обладает защитным действием при

заражении экспериментальных животных смертельной дозой вируса гриппа А/=^/8/34 (А/Н1Ж).

Наибольшее количество трипсиноподобной протеи-назы и ее ингибитора содержалось в свежей донорской крови. Следует отметить, что наибольшая активность протеиназы установлена в донорской крови 11-й группы, а активность ингибитора трипсиноподобной протеина-зы была наиболее высокой и практически одинаковой в донорской кровь 1-й и !У-й групп. Сыворотка донорской крови содержала большее количество ингибитора по сравнению с плазмой и эритроцитарной массой. При длительном хранении активность ингибитора трипсиноподобной протеиназы сохранялась лучше в лиофильно высушенных препаратах, чем в растворенных. Биоматериалом для получения противовирусного препарата для человека служили промышленные отходы получения гамма-глобулина и альбумина, так как наибольшее ко-

э

.ПРЕПАРАТЫ

личество ингибитора трипсиноподобных протеиназ содержалось в отходах первой и второй стадии получения гамма-глобулина, которые идут на утилизацию. Коммерческие отечественные препараты: иммуноглобулин человеческий, интерферон и герпетическая вакцина содержали в своем составе трипсиноподобную протеина-зу и ее ингибитор, что свидетельствует об их недостаточной очистке. Гоновакцина не содержала ни протеиназы, ни ее ингибитора, а туляремийная вакцина содержала только следы ингибитора. Иммуноглобулин человека содержал в четыре раза больше ингибитора трипсиноподобных протеиназ, чем интерферон человеческий. Зарубежные гриппозные вакцины «Инфлувак», «Ваксигрип», «Флюарикс»; вакцина против гепатита А -«Аваксим»; препараты из крови - «Фраксипарин» и «Солкосерил» содержали в своем составе трипсиноподобную протеиназу и ее ингибитор. Меньше всего ингибитора и трипсиноподобной протеиназы содержалось в вакцине «Аваксим», а больше всего ингибитора содержалось в препарате «Фраксипарин». Определение активности трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора может служить маркером чистоты препарата при изготовлении вакцин (особенно противогриппозных) и препаратов из крови человека. Методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из отходов 1-й и !У-й стадий получения гамма-глобулина промышленным способом было выделено по девять изоформ ингибитора трипсиноподобных протеиназ. Игибиторы трипсиноподобных протеиназ были очищены от балластных белков в среднем на 99,6 %. Наибольший процент выхода ингибитора трипсиноподобных протеиназ установлено

к девятой изоформе ингибитора, а удельная активность к четвертой изоформе ингибитора. Выделенные изо-формы ингибитора трипсиноподобных протеиназ были гетерогенны по молекулярной массе с преобладанием высокомолекулярных компонентов (480 кДа). В первой, второй и девятой изоформах ингибитора трипсиноподобных протеиназ был обнаружен и белок гаммаглобу-лина (160 кДа). Пятая изоформа ингибитора трипсино-подобных протеиназ, выделенная из отходов первой стадии получения гамма-глобулина, защитила от смерти 80 % белах мышей, зараженных смертельной дозой вируса гриппа А/^/8/34 (А/Н1Ж). Ингибиторы трипсиноподобных протеиназ, выделенных из отходов четвертой стадии получения гаммаглобулина, не обладали защитными свойствами при экспериментальном гриппе.

На основании результатов проведенных исследований предложено использовать:

1. Биоматериал для производства ингибитора трипсиноподобных протеиназ в качестве противовирусного препарата для человека.

2. Способ получения ингибитора трипсиноподобных протеиназ из промышленных отходов получения гамма-глобулина.

3. Пятую изоформу ингибитора трипсиноподобных протеиназ в качестве противовирусного препарата. 4. Способ лечения гриппа путем введения ингибитора трипсиноподобных протеиназ.

5. Способы определения активности трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора в донорской крови человека.

ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА (ШТАММ ВНУКОВО-32) НА РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕЛЬ-ХРОМА-ТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА ЕГО ОЧИСТКИ

1Якин О.Г., 2Сергеев А.Н., 1Хафизова Л.Г., 2Глазатов В.В., Алсынбаев Р.М., 2Красильников И.В.

1 Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Уфа «Иммунопрепарат», г. Уфа, Россия

2 ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Москва, Россия

Представлены результаты изучения динамик накопления антигена вируса бешенства (штамм Внуково-32) при стационарном монослойном культивировании на первичной и перевиваемых клеточных культурах: клетках почек сирийских хомяков (ПСХ), Vero, Vero B, соответственно. При культивировании вируса бешенства на перевиваемых культурах клеток Vero B в присутствии поддерживающей среды, содержащей 2,5% сыворотки крови плодов коровы (КПК), отмечено 2 пика (большой и малый) накопления антигена в культуральных жидкостях. Независимо от видов используемой добавки в сос-

таве поддерживающей среды (2,5% сыворотки КПК, 2% сыворотки крупного рогатого скота и 5% аминопептида) более высокие концентрации антигена вируса бешенства были получены при культивировании на культуре клеток Vero B, чем на Vero и клетках ПСХ. При этом перевиваемые культуры клеток существенно дольше сохраняли свою жизнеспособность в процессе культивирования вируса, по сравнению с таковой культур клеток ПСХ.

Из трех испытанных клеточных культур (ПСХ, Vero и Vero B) с точки зрения продукции вируса бешенства

€