Влияние клеточных препаратов кордовой крови на морфологию кожи крыс

2. Bernal J. Action of thyroid hormone in brain / Bernal J. // Journal of endocrinology investigations.- 2002-Vol. 25, № 3.- P. 268-288.

3. Ройтбак А. И. Глия и ее роль в нервной деятельности / Ройтбак А. И. - СПб.: Наука, 1993.- 352 с.

4. Flavia R. S. Lima, Annie Gervais et all. Regulation of microglial development: a novel role for thyroid hormone / Flavia R. S. // Journal of Neuroscience.-2001.-V.21 ,P2028-2038.

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОК ГЛИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ТИРЕОИДЭКТОМИРОВАННЫХ КРЫС Петренко В.А. , Стеченко Л. О., Куфтирева Т.П.

Исследованы участки коры головного мозга крыс в динамике послеоперационного гипотиреоза. Первыми реагируют на дефицит гормонов щитовидной железы периваскулярные астроциты, для которых характерно нарастание отечных процессов в динамике эксперимента. Признаки внутриклеточного отека и угнетения белоксин-тетической активности в отдаленных от капилляров астроцитах появляются лишь к 100 суткам после операции. Первичная реакция олигодендроцитов заключается в активации белкового синтеза и формируется через 35 суток после тиреоидэктомии вместе с активацией клеток микроглии на фоне развития процесов демиелинизации нервных волокон. К 100 суткам происходит угнетение олигодендоцитов и микроглиапьных клеток.

Ключові слова: клетки глии головного мозга, тиреоидэктомированные крысы.

ULTRASTRUCTURAL PECULIARITIES OF GLIAL CELLS IN THYROIDECTOMIZED RATS’ BRAIN CORTEX Petrenko V.A., Stechenko L.A., Kuftireva T.P.

Brain cotrex of thyroidectomized rats investigated in dynamic of hypothyroidism. Astrocites, located near blood vessels, are most changeable in thyroid gland hormones deficiency condition and react with cytoplasm swelling increasing from 14 days after operation. Astrocites, located fare from capillaries, react with cytoplasm swelling and biosynthetic hypoactivity only on 100 days of the experiment. The primary oligodendrocite reaction starts on 35 days after operation as well as microglial cells activation and myelinolyses process initiation. Oligodendrocites and microglial cells depression were found on 100 days after operation.

Key words: glial cells of brain cortex, thyroidectomized rat.

УДК 615.361:612.649;612.118.7:57.085.2

ВЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ КОРДОВОЙ КРОВИ НА МОРФОЛОГИЮ КОЖИ

КРЫС

Кожа, как самый крупный орган в организме человека и животных, является не только «ареной борьбы» с различными микроорганизмами и вредными воздействиями, но и зеркалом, отражающим общее состояние здоровья организма. Эндокринная система играет ведущую роль в регуляции функционирования кожи, обеспечивая обмен веществ в этом органе, его репарацию и восстановление утрачиваемых элементов, функционирование желез и рост волос. Наиболее важным влиянием на функционирование кожи обладают гормоны щитовидной железы [2, 3].

Тиреоидные гормоны играют главную роль в обеспечении метаболизма и необходимы для нормального роста и развития кожи. Основным механизмом действия тиреоидных гормонов является стимуляция синтеза белков в цитоплазме клеток и повышение уровня потребления тканями кислорода. Развивающиеся при хроническом гипотиреозе нарушения структуры дермы проявляются изменениями волосяного покрова, функциональными изменениями потовых и сальных желез, сухостью кожи, повышенным слущиванием эпидермиса, нарушениями основных способностей кожных покровов в осуществлении физиологических, иммунных и биохимических функций [3].

В настоящее время гипотиреоз различного генеза перестает быть только эндокринологической проблемой, клинические его проявления затрагивают, помимо кожи, практически все органы и функциональные системы организма. Эффективной терапии, охватывающей весь спектр развивающихся при гипотиреозе поражений, практически не существует, поэтому на фоне применения традиционных препаратов, направленных на восстановление гормонального гомеостаза организма, требуется

назначение лекарственных средств для коррекции поражений различных органов и систем. При этом не существует универсальных средств, позволяющих в минимальные сроки и при минимальных затратах достичь высоких терапевтических результатов. Особенно актуальным является вопрос коррекции изменений структуры дермы, развивающихся в процессе гипотиреоза.

Известно, что для стимуляции процессов репарации поврежденной или регенерации стареющей, утратившей тургор и эластичность кожи в последнее время все чаще используют биологически активные препараты - плаценту, ее экстракты, клеточные суспензии [7-10]. Однако механизм действия этих препаратов изучен недостаточно. Клетки кордовой крови (КК) изначально использовали для лечения заболеваний системы крови, однако в последнее время в связи с открытием в кордовой крови плюрипотентных стволовых клеток (СК) и стволовых мезенхимальных клеток, кордовая кровь рассматривается как потенциальный источник для клеточной терапии при широком спектре заболеваний [9]. В этой связи возникают теоретические предпосылки для использования препаратов КК в процессах регенерации кожи крыс как в системе in vitro, так и при дерматопатологии, вызванной экспериментальным гипотиреозом (ЭГт).

Целью работы было изучение влияния криоконсервированных ядерных клеток кордовой крови человека на морфологию кожи крыс in vitro и in vivo.

Материал и методы исследования. Объектом исследования в экспериментах in vitro являлись образцы кожи крыс. Фрагменты кожи размером 0,3 х 0,3 см помещали на твердый агар, затем покрывали стандартной культуральной ростовой средой в объеме

0,5 мл. При постановке эксперимента материал распределяли на следующие группы: 1я группа - интактная кожа; 2-я - (контрольная) - образцы кожи, помещенные на поверхность агара с культуральной средой; 3-я - (опыт) - образцы кожи, помещенные на поверхность агара с культуральной средой, в которую добавляли 10% препарата кордовой крови. Препарат кордовой крови «Стемкорд» представлял собой криоконсервированную взвесь стволовых клеток (СК) в концентрации (1 -3)105 в 1 мл плазмы КК, богатой биологически активными веществами, факторами роста, гормонами, цитокинами, микроэлементами [1]. Исследования ядросодержащих клеток (СD45+) кордовой крови, в том числе и гемопоэтических ^D34+), проведены до и после криоконсервирования методом проточной цитометрии по международному ISHAGE протоколу [1]. Культивирование кожи выполняли in vitro в условиях термостата при температуре 37°С и pH среды 7,2. Фрагменты кожи исследовали на 5, 15 и 25 сутки культивирования. Материалом исследования в экспериментах in vivo служили самки беспородных белых крыс 4-месячного возраста массой тела 110-120 г. Работа с животными осуществлялась с соблюдением положения Европейской конвенции по охране позвоночных животных и национального законодательства по гуманному обращению с животными. Субтотальную тиреоидэктомию (100%-ное удаление щитовидной железы) выполняли по методу [5]. В эксперименте были задействованы животные, подвергшиеся тиреоидэктомии и последующему введению препарата КК в хвостовую вену [8]. Все эксперименты проводились в течении первых 40 дней с момента тиреоидэктомии, учитывая динамику восстановления тиреоидных гормонов в крови подопытных животных [3,8].

Животные составили следующие экспериментальные группы:

• группа 1 -ЭГт - тиреоидэктомированные животные;

• группа 2-ЭГт - тиреоидэктомированные животные, которым вводили препарат КК.

Каждая группа состояла из 10 животных. Контролем служили интактные животные. Для изготовления гистологических препаратов иссеченные на всю толщину участки кожи из области спины и культивируемые фрагменты кожи фиксировали в 10% -ном формалине, промывали проточной водой, подвергали обезвоживанию в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин-целлоидин. Полученные из парафин-целлоидиновых блоков микротомные срезы толщиной 5-7 микрон окрашивали гематоксилином и эозином для получения обзорных гистологических препаратов, а также - пикрофуксином по методу Ван Гизон для изучения соединительной ткани [6]. Дифференцировку препаратов проводили под

световым микроскопом «Биолам» при увеличении *400. Статистическую обработку полученных данных проводили по методу Стьюдента-Фишера [4].

Результаты исследования и их обсуждение. В первой серии экспериментов в культуре in vitro на гистологических препаратах структура интактной кожи соответствовала норме и была представлена хорошо дифференцируемыми слоями - эпидермисом и дермой. После 5 суток культивирования фрагментов кожи контрольной группы на агаризованной ростовой среде наблюдалось уменьшение толщины эпидермиса за счет снижения количества клеток в его слоях (кератинизация и миграция клеток). Отмечалась сглаженность дермоэпидермальной границы, расширялись эпидермальные выросты. В сосочковом слое дермы наблюдалась пролиферация фибробластов, их количество увеличивалось по сравнению с интактной кожей. В сетчатом слое дермы появлялись молодые коллагеновые волокна, которые интенсивно окрашивались, увеличивалось количество клеток в волосяных фолликулах и железистых структурах (рис. 1, а).

Во фрагментах кожи, выращенных на агаризованной питательной среде, в которую был добавлен препарат «Стемкорд» (группа 3), на 5-е сутки культивирования структура эпидермиса была сравнима с интактной. Базальный слой содержал один ряд клеток. Дермоэпидермальная граница в основном контурировалась хорошо, однако местами наблюдалось отслоение эпидермиса от дермы в области базальной мембраны. Коллагеновые волокна образовывали плотную сеть, количество фибробластов увеличивалось по сравнению с группами 1 и 2 (рис. 1, б).

Рис. 1. Кожа в культуре in vitro на 5 сутки. а - на агаризованной питательной среде; б - на агаризованной питательной среде с добавлением препарата «Стемкорд». Окраска г.-э. Ув. х400.

А Б

Рис. 2. Кожа в культуре in vitro на 15 сутки. а - на агаризованной питательной среде; б - на агаризованной питательной среде с добавлением препарата «Стемкорд» Окраска г.-э. Ув. *400.

На 15-е сутки культивирования фрагментов кожи без препарата уменьшалась толщина эпидермиса по сравнению с интактной кожей. Дермоэпидермальная граница

контурировалась нечетко. Структура соединительнотканных волокон дермы соответствовала интактной коже. Количество фибробластов увеличивалось. В волосяных фолликулах и сальных железах наблюдалась пролиферация эпителиальных клеток, размеры которых были увеличены (рис. 2, а). В присутствии препарата «Стемкорд» на 15-е сутки культивирования кожи толщина эпидермиса по сравнению с группой 2 увеличивалась, однако дифференциация его клеточных слоев была затруднена, в базальном слое обнаруживались клетки в состоянии митоза. Клетки базального слоя эпидермиса имели выраженную базофилию (ядра гиперхромные, занимающие почти всю клетку, цитоплазма - ацидофильная). Дермоэпидермальная граница контури-ровалась. В дерме, непосредственно в сосочковом слое, увеличивалось количество фибробластов по сравнению с их содержанием в коже групп 1 и 2. Соединительная ткань была представлена плотно упакованными пучками коллагеновых волокон, фибробласты гиперхромные (рис. 2, б).

Рис. 3. Кожа в культуре in vitro на 25 сутки. а - на агаризованной питательной среде; б - на агаризованной питательной среде с добавлением препарата «Стемкорд» Окраска г.-э. Ув. х400.

Рис. 4. Кожа крыс экспериментальных групп: а - интактные животные; б - животные с моделированным гипотиреозом через 1 мес; в - тиреоидэктомированные животные, которым вводили препарат КК. Окраска г.-э. Ув. *400.

На 25-е сутки культивирования на агаризованной среде без препарата в коже появлялись очаги микронекроза. В эпидермисе увеличивались межклеточные пространства, плохо дифференцировались слои клеток. Ядра эпителиальных клеток были пикнотичны, цитоплазма - вакуолизирована. Отмечалась стертость границы между эпидермисом и дермой, наблюдались очаги клеточного детрита. В дерме происходила дезорганизация соединительной ткани в виде гомогенизации и глыбчатого распада коллагеновых и эластиновых волокон. Количество фибробластов уменьшалось. Наблюдались отечность и деструкция железистых структур и волосяных фолликулов (рис. 3, а). При культивировании фрагментов кожи в среде с добавлением препарата «Стемкорд» на 25-е сутки некротические процессы как в эпидермисе, так и в дерме не отмечались. Толщина эпидермиса сохранялась на уровне 15-х суток, причем базальный слой оставался активным, отмечалось увеличение количества слущивающихся роговых чешуек.

Граница между эпидермисом и дермой была четко выражена. В дерме сохранялась высокая клеточность, хотя количество фибробластов уменьшалось по сравнению с 15 сутками культивирования. В сетчатом слое четко контурировались коллагеновые и эластиновые волокна, которые формируют сетчатую структуру соединительной ткани, однако их плотность уменьшалась по сравнению с 15 сутками культивирования, а в некоторых участках кожных фрагментов сохранялась плотная структура соединительной ткани. Дериваты кожи - волосяные фолликулы и сальные железы - сохраняли свою структуру, хорошо контурировались. В отдельных участках кожных фрагментов отмечались отслоение эпидермиса и микроочаги клеточного детрита (рис. 3, б).Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат КК «Стемкорд» стимулирует пролиферативную активность клеток дермы и эпидермиса in vitro.

В экспериментах in vivo при гистологическом исследовании кожи тиреоидэктомированных животных (группа 1-ЭГт) через 1 месяц после моделирования гипотиреоза обнаруживалось, что эпидермис очень истончен, уплощен, отсутствует его нормальная складчатость. Слои эпидермиса не дифференцируются, некоторые клетки имеют пикнотичные ядра. В собственно дерме сосочковый и сетчатый слои также не дифференцируются. Соединительнотканная часть дермы представляет собой разрыхленные, фрагментированные и контурно измененные пучки коллагеновых и эластических волокон, среди которых находится уменьшенное, по сравнению с нормой, количество фибробластических клеток с плотными ядрами. Дериваты кожи - сальные железы и волосяные фолликулы - встречаются редко, они уменьшены в размерах, ядра их клеток пикнотичны (рис. 4б).

Кожа тиреоидэктомированных животных, которым через 1 месяц после операции вводили препарат КК (группа 2-ЭГт), иссекалась у животных под эфирным наркозом спустя 7 суток. При гистологическом исследовании обнаруживался новообразованный эпидермис, который был утолщен по сравнению с нормой. В нем обнаруживалась складчатость и дифференцировка клеток с формированием характерных слоев. Клетки фибробластического ряда, количество которых было увеличено по сравнению с нормой, в большинстве случаев располагались параллельно новообразованным пучкам коллагеновых волокон, формирующих дерму, трещин и щелей между ними не обнаружено (рис. 4в). В собственно дерме, особенно в глубоких ее отделах, обнаруживались растущие волосяные фолликулы. На границе дермы и подкожной ткани наблюдалось разрастание мелких кровеносных сосудов и капилляров, а также -фибробластических клеточных элементов, вероятно произошедших из перицитов (периваскулярных клеток мезенхимального происхождения, служащих главными предшественниками фибробластов).

Результаты гистологического исследования в эксперименте in vivo показывают, что характер восстановительных процессов в коже животных с экспериментальным гипотиреозом при введении препарата КК имеет выраженную тенденцию к полной регенерации утраченных морфофункциональных свойств кожи. По нашему мнению, основным механизмом, обеспечивающим восстановительные процессы в коже как in vitro, так и in vivo, является введение биогенных стимуляторов, присутствующих в плазме КК, которые участвуют в нормализации метаболизма в организме, и определенного количества стволовых, в том числе и мезенхимальных, клеток, стимулирующих рост капилляров и фибробластов.

Препарат КК «Стемкорд», добавленный в агаризованную питательную среду культивирования, стимулирует пролиферативную активность клеток дермы и эпидермиса in vitro. В эксперименте in vivo характер восстановительных процессов в коже животных с экспериментальным гипотиреозом при введении препарата КК «Стемкорд» имеет выраженную тенденцию к полной регенерации утраченных кожей морфофункциональных свойств. Применение препаратов кордовой крови как при культивировании фрагментов кожи in vitro, так и в условиях экспериментального гипотиреоза можно рассматривать как перспективный фактор воздействия на течение и последствия эндокринных нарушений всего организма и кожи в частности.

1. Бабийчук Л. А. Новые перспективы в криоконсервировании ядросодержащих клеток кордовой крови / Л. А. Бабийчук, О. В. Кудокоцева, В. В. Рязанцев // Гематологія і переливання крові. - 2008. - № 34. -С. 17-21.

2. Калюжная Л., Дзюбак В. Старение кожи: патогенетические и лечебные аспекты I Л. Калюжная,

В. Дзюбак II Укр. мед. часопис. - 2002. - № 2 (28). - С. 68-72.

3. Кандрор В. Физиологические эффекты тиреоидных гормонов и механизм их действия II Руководство по клинической эндокринологии: статья I В. Кандрор. - Питер, 1996. - С. 120-124.

4. Лакин Г. Ф. Биометрия I Лакин Г. Ф.- М. : Высш. школа, 1990. - З52 с.

б. Легач Е. И. Ретроградный способ тиреоидэктомии крыс как адекватная модель гипотиреоза I Е.

И. Легач II Трансплантологія. - 2005. - Т. 8, № 2. - С. 92-94.

6. Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники I Меркулов Г. А. - Ленинград, 1961. - З40 с.

7. Озерская О. Экспериментальные подходы к обоснованию применения клеточных композиций на основе фибробластов в дерматокосметологии! О. Озерская, В. Щеголев II Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2008. - Т. З, № 2. - С. 66-67.

8. Применение препаратов кордовой крови и общей экстремальной аэрокриотерапии для восстановления нарушений дермы, вызванных хроническим гипотиреозом I В. Ю. Пурышева, И.

И. Ломакин, О. В. Кудокоцева [и др.] II Трансплантологія. - 2008. - Т. 10, № 1. - С. 100-103.

9. Стволовые клетки. Биология и потенциальное клиническое использование I Н. Я. Спивак, Г. Т. Сухих, В. В. Малайцев [ и др.] II Трансплантологія. - 2005. - Т.8, №З. - С. 6-14.

10. Scott D. W. Miller and Kirk’s small animal dermatology I Scott D. W., Miller W. H., Griffin C. E. - 5th

ed. - Philadelphia etc.: WIBISaunders Company, 1995. - 1213 p.

ВЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ КОРДОВОЙ КРОВИ НА МОРФОЛОГИЮ КОЖИ КРЫС Пурышева В.Ю., Волина В.В., Кудокоцева О.В., Бабийчук Л.А.

В роботі вивчали характер впливу кріоконсервованих ядровмісних клітин кордової крові на морфологію шкіри в різні строки культивування in vitro та характер впливу стовбурових клітин на морфофункціональний стан дерми в умовах експериментального гіпотіреоза in vivo. Показано перспективність застосування стволових клітин кордової крові у якості терапевтичного впливу на процеси регенерації дерми.

Ключові слова: кордова кров, шкіра щурів.

INFLUENCE OF CELLULAR PREPARATIONS OF CORD BLOOD ON MORPHOLOGY OF SKIN OF RATS Purysheva V.Yu., Volina V.V., Kudokoceva O.V., Babiychuk l.A.

In work studied character of the influence of the cryopreserved nucleated cells of cord blood on the skin morphology was investigated on the different stages of skin cultivation in vitro and character of the influence stem cells of cord blood on morphofunctinal condition of a derma in conditions of an experimental hypothyroidism in vivo. The application of cord blood stem cells is perspectives as therapeutic treatment of derma.

Key words: cord blood, skin of the rats.

УДК 546.815/89:591.481.2 591.147.6 591.463.2:615.099.083

МОРФОЛОГИЯ АДЕНОГИПОФИЗА И КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ ПРИ СВИНЦОВОЙ

ИНТОКСИКАЦИИ И ЕЁ КОРРЕКЦИИ

*&№¥///////////////;

В Украине в последние годы проблема охраны здоровья населения стоит особо остро, что связано с высоким уровнем заболеваемости, тенденцией к снижению продолжительности жизни. Антропогенное загрязнение окружающей природной среды во многом связано с микроэлементами из группы тяжелых металлов, среди которых ведущими загрязнителями являются соединения свинца. Они отличаются высокой токсичностью, способностью проникать в организм с пищей, водой, воздухом и накапливаться, оказывая политропное действие. Характерно, что заболевания принимают длительный и вялотекущий характер, а иногда и хроническую форму. В настоящее время выделен отдельный класс

13б