Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи
METHOD OF PRODUCING CARBOXYPEPTIDASE IN THE PIG'S PANCREAS

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способу получения фермента карбоксипептидазы В (кВ) из свиной поджелудочной железы, и может быть использовано в производстве генно-инженерного инсулина.
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи, включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, получение ацетонового порошка из автолизата, экстракцию, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двумя последовательными хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе (А.с. №1551742, МКИ C12N 9/48, 1987).
Недостатком способа является использование на первом этапе органических растворителей (ацетон, диэтиловый эфир) и невысокая удельная активность конечного препарата (107-155 ед./мг белка).
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы млекопитающих, предлагающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 50-75°С и дробное осаждение сульфатом аммония 320-416 г/л и диализ (патент RU №1487817, МКИ C12N 9/48, 1989).
Недостатком способа является невысокий выход конечного препарата и сложность диализа с использованием целлюлозных трубок.
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы северных оленей (патент SU №1833427, МКИ C12N 9/64, 1991), включающий гомогенизацию, экстракцию, двухступенчатое подкисление до рН 5,2-5.5, затем до рН 3,8-4,2, осаждение ацетоном, повторное осаждение этанолом, лиофилизацию.
Недостатками способа являются сложность получения исходного сырья и использование органических растворителей.
Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи (патент RU №2177997, МПК C12N 9/14, 2002), включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 60°С, двухступенчатое осаждение сульфатом аммония, повторную термообработку, хроматографию на оксиапатите, повторное осаждение сульфатом аммония, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе.
Недостатком способа является сложность масштабирования стадий повторного осаждения сульфатом аммония и диализа с использованием диализных трубок.
Наиболее близким является способ получения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы (патент RU №2354696, 2007), включающий гомогенизацию, автолиз, экстракцию, осаждение сульфатом аммония, диализ и очистку целевого продукта двукратной хроматографией на Q-сефарозе.
Недостатком способа является сложность масштабирования диализа с использованием диализных трубок.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является масштабирование способа получения карбоксипептидазы В и повышение общего выхода ферментативной активности за один недельный производственный цикл при достижении уровня удельной активности соответствующей требованиям производства генно-инженерного инсулина.
2
4
2
2
2
Технический результат достигается тем, что предложен способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиней, предусматривающий гомогенизацию животного сырья, автолиз, экстракцию двойным объемом буферного раствора, содержащих 0,01 М KHPO и 0,001 М ZnCl при температуре 65°С, осаждение экстракта сульфатом аммония из расчета 350 г/л экстракта, центрифугирование, растворение осадка в 0,005 М трис-HCl-буфере, содержащем 0,001 М ZnCl, фильтрацию через стекловолоконный фильтр и картонный фильтр при температуре 4°С, разведение фильтрата в 0,005 М трис-HCl-буфере, содержащем 0,001 М ZnCl, с последующей ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле из полиэфирсульфона с пределом отсечения 20 кДа с последующей двукратной ионообменной хроматографией на колонке с UNO Sphere, уравновешенной 0,005 М трис-HCl-буфером, содержащем 0,1 М NaCl, и на колонке с Macro Prep Q, уравновешенной тем же буфером.
Отличием предлагаемого способа является определение условий эффективного освобождения от солей, пептидов и продуктов липолиза с помощью фильтрации через стекловолоконный и картонный фильтры и ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле при очистке препарата кВ в количествах до 4 г за один цикл до удельной активности 150-170 ед./мг.
Пример 1.
12 кг свиных желез дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют для автолиза в течение ночи на шейкере при 18°С.
2
4
2
К полученному автолизату добавляют 2 объема (24 л) 0,01 М KHPO, рН 6,5, 0,001 М ZnCl и инкубируют в водном термостате 15 минут при 65°С, перемешивая верхнеприводной механической мешалкой при 200 об/мин. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 4500 об/мин, 4°С, 60 минут.
2
К полученному центрифугату при перемешивании добавляют сульфат аммония (из расчета 350 г/л экстракта) и расчетное количество сухого карбоната натрия для поддержания рН около 6,5 и инкубируют при 4°С в течение ночи. Осаждают образовавшийся преципитат центрифугированием при 4500 об/мин, 40 минут и осадок растворяют в 3-4 л 0,005 М трис-HCl буфера, рН 7,6 содержащего 0,001 М ZnCl.
Полученный раствор фильтруют через стекловолоконный фильтр (ТУ 9471 001 00212038-00) под вакуумом 0,05 МПа и получают фильтрат 1.
2
2
2
3
Фильтрат 1 далее пропускают через «Картон фильтровальный для пищевых жидкостей, тип Т, сорт высший, ГОСТ 12290-89» под вакуумом 0,1 МПа и получают фильтрат 2. Фильтрат 2 разводят в 3 раза буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl, охлажденным до 4°С, и подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле в системе АСФ-009 «Владисарт», используя ультрафильтрационный кассетный модуль «Владисарт» из полиэфирсульфона МКМ 460020 01 У с пределом отсечения 20 кДа и площадью фильтрации 0,1 м. Разбавление буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl, охлажденным до 4°С, раствора на входе в модуль производят до тех пор, пока плотность не достигнет значения 0,960 кг/м по ареометру. Процесс проводят при 4°С. Хроматография на UNO Sphere Q.
2
Отдиализованный фильтрат наносят на колонку с UNO Sphere Q (BioRad) объемом 300 мл, предварительно уравновешенную буфером (ТБ) 0,005 М трис-HCl, рН 7,6, содержащим 0,001 М ZnCl. Колонку промывают 900 мл данного буфера, элюируют кВ 0,1 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 100 ед/мг белка, помещают в диализную трубку и диализуют в течение ночи против 10-кратного объема ТБ. Процесс проводят при 4°С.
Повторная хроматография на Macro Prep О (BioRad).
Отдиализованную фракцию кВ наносят на колонку объемом 150 мл, предварительно уравновешенную ТБ, промывают 450 мл данного буфера. Элюируют кВ 0,07 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 150 ед./мг. Процесс проводят при 4°С.
Готовый препарат хранят замороженным при -20°С.
Выход составляет 3,5 г препарата кВ с удельной активностью 167 ед./мг белка.
Пример 2.
12 кг свиных желез дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют для автолиза в течение ночи на шейкере при 18°С.
2
4
2
К полученному автолизату добавляют 2 объема (24 л) 0,01 М KHPO, рН 6,5, 0,001 М ZnCl и инкубируют при 65°С в водном термостате в течение 15 минут при перемешивании верхнеприводной механической мешалкой при 200 об/мин. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 4500 об/мин, 4°С, 60 минут.
2
К полученному центрифугату при перемешивании добавляют сульфат аммония (из расчета 350 г на литр экстракта) и расчетное количество сухого карбоната натрия для поддержания рН около 6,5 и инкубируют при 4°С в течение ночи. Осаждают образовавшийся преципитат центрифугированием при 4500 об/мин, 40 минут и осадок растворяют в 3-4 л 0,005 М трис-HCl буфера, рН 7,6, содержащего 0,001 М ZnCl.
Полученный раствор фильтруют через стекловолоконный фильтр (ТУ 9471 001 00212038-00) под вакуумом 0,05 МПа и получают фильтрат 1.
2
2
2
2
3
Фильтрат 1 далее пропускают через «Картон фильтровальный для пищевых жидкостей, тип Т, сорт высший, ГОСТ 12290-89» под вакуумом 0,1 МПа и получают фильтрат 2. Фильтрат 2 разводят в 3 раза буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl, охлажденным до 4°С, и подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле в системе АСФ-009 «Владисарт», используя ультрафильтрационный кассетный модуль «Владисарт» из полиэфирсульфона МКМ 460010 01 У с пределом отсечения 10 кДа и площадью фильтрации 0,1 м. Разбавление буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl, охлажденным до 4°С, раствора на входе в модуль производят до тех пор, пока плотность не достигнет значения 0,960 кг/м по ареометру. Процесс проводят при 4°С. Хроматография на UNO Sphere Q. Отдиализованный фильтрат наносят на колонку с UNO Sphere О (BioRad) объемом 300 мл, предварительно уравновешенную буфером (ТБ) 0,005 М трис-HCl буфером, рН 7,6, содержащим 0,001 М ZnCl. Колонку промывают 900 мл данного буфера, элюируют кВ 0,1 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 100 ед/мг белка, помещают в диализную трубку и диализуют в течение ночи против 10-кратного объема ТБ. Процесс проводят при 4°С.
Повторная хроматография на Macro Prep Q (BioRad). Отдиализованную фракцию кВ наносят на колонку объемом 150 мл, предварительно уравновешенную ТБ, промывают 450 мл данного буфера. Элюируют кВ 0,07 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 150 ед/мг. Процесс проводят при 4°С. Готовый препарат хранят замороженным при -20°С. Выход за один недельный производственный цикл составляет 6,0 г препарата кВ с удельной активностью 155 ед./мг белка.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет из 12 кг исходного сырья очистить 3-4 г препарата карбоксипептидазы В с удельной активностью 150-170 ед./мг или 450000-680000 единиц за один цикл. По сравнению с прототипом (патент RU №2354696, 2007) способ позволяет за один недельный производственный цикл получать в 30 раз больше общей активности фермента с удельной активностью, соответствующей требованиям производства генно-инженерного инсулина.