2
2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА BOC-THZ-PHE-D-TRP-LYS(BOC)-THR-NHCHCHNH-DOTA, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ ПРЕКУРСОРОМ ДЛЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ РАДИОФАРМПРЕПАРАТОВ
2
2
METHOD FOR PRODUCING BOC-THZ-PHE-D-TRP-LYS(BOC)-THR-NHCHCHNH-DOTA CONJUGATE BEING A PRECURSOR FOR ANTI-TUMOR RADIOPHARMACEUTICS

Область техники
2
2
Изобретение относится к области пептидной химии и касается получения конъюгата Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHCHCHNH-DOTA, имеющего в качестве вектора пентапептид, являющийся аналогом соматостатина. Данный конъюгат перспективен как адресный носитель медицинских радионуклидов для использования в радионуклидной диагностике и терапии, посредством специфичного взаимодействия с соматостатиновыми рецепторами опухолевых клеток.
Уровень техники
Радионуклидная терапия - метод лечения опухолевой и неопухолевых патологий, в основе которого лежит использование радиоактивных изотопов. Суть терапии заключается в введении в организм радиофармпрепарата (РФП) - лечебного изотопа в комбинации с биологической молекулой, который избирательно накапливается в пораженном органе или ткани. Таргетный принцип действия радионуклидной терапии обуславливает чрезвычайно высокую эффективность, специфичность и безопасность такого вида лечения. Пептидные аналоги соматостатина играют важную роль в терапии нейроэндокринных опухолей, специфично связываясь с рецепторами соматостатина на поверхности раковых клеток. Таким образом, аналоги соматостатина перспективны для использования в радионуклидной терапии опухолей, которая осуществляется доставкой радионуклида к опухоли, Аналоги соматостатина обладают высоким сродством и специфичностью по отношению к соматостатиновым рецепторам подтипа SSTR 1-5, а небольшой размер и относительно низкая молекулярная масса пептидов способствуют быстрому проникновению в ткань-мишень по сравнению с белками и антителами.
Цитотоксические свойства пентапептида H-Thz-Phe-D-Trp-Lys-Thr-OMe и условия синтеза его предшественника - Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОМе были изучены нами ранее (патент RU 2648357). Показано, что пептиды, имеющие Вос-защитные группы, более активны, вероятно из-за их повышенной липофильности и устойчивости к протеолитическому расщеплению, что дает больше шансов попасть к опухолевой клетке.
2
2
Ранее был синтезирован конъгат на основе незамещенного пентапептида Thz-Phe-D-Trp-Lys-Thr-NHCHCHNH-DOTA (DOTA-P4) и исследованы его свойства. Была найдена высокая аффинность этого конъюгата к рецепторам соматостатина на клетках (Fedotova АО, Egorova BV, Posypanova GA, et al// J. Pep.Sci. 2021; e3361). Ди-Вос-защищенный аналог DOTA-P4 представляется более перспективным для использования для радионуклидной терапии благодаря очевидно более высокой устойчивостью к протоолетическому расщеплению.
2
2
3+
44
3+
152
3+
207
3+
В этой же работе были проанализированы рецептор-связывающее сродство и стабильность in vitro конъюгата H-Thz-Phe-D-Trp-Lys-Thr-NHCHCHNH-DOTA (DOTA-P4). Конъюгат DOTA-P4 был успешно помечен радиоактивной меткой 90Y, Sc, Euи Bi. Все комплексы не демонстрировали высвобождения катионов in vitro в течение 4-24 часов.
В этой же публикации описан метод синтеза конъюгата, исходящий из пяти стадий по следующей схеме:
Метод основан на получении N-(2-аминоэтил)амида пентапептида, с последующим ацилированием его хлорацетилхлоридом. Основными недостатками данного метода являются: во-первых, использование неэкологичного, агрессивного реагента - хлорацетил хлорида, во-вторых, низкий выход ключевой последней стадии удаления трет-бутильных групп действием раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, составляющий всего 6%, что делает процесс неэкономичным и промышленно вряд ли осуществимым. Также этим методом невозможно получить ди-Вос-защищенный целевой продукт, так как при обработке трифторуксусной кислотой удаляются и Вос-группы.
Технической проблемой, на решение которой направлено предлагаемое изобретение является повышение технологичности процесса, получения конъюгатов, являющихся прекурсорами для противоопухолевых радиофармпрепаратов.
Раскрытие сущности изобретения
2
2
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение с высоким выходом до 46% конъюгата Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHCHCHNH-DOTA в отличие 6% выхода по известной схеме.
2
2
3
3
2
2
2
3
2
2
2
2
2
Для достижения технического результата предложен способ получения Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-NHCHCHNH-DOTA, включающий алкилирование DO3A(OBu-t) в смеси ацетонитрила с ДМФА в присутствии основания, такого как поташ, с использованием этилового эфира бромуксусной кислоты с образованием тетраэфира (EtO)DOTA(OBu-t) (I), амидирование этилового эфира (I) действием избытка этилендиамина приводящее к амину NHCHCHNH-DOTA(OBu-t) (II), гидролиз третбутильных групп амина II в растворе соляной кислоты с образованием NHCHCHNH-DOTA (DOTA-EDA) (III), конденсацию Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OH (IV) в присутствии EDC⋅HCl с гидроксисукцинимидом в растворе ацетонитрила приводящее in situ к промежуточному активированному сукцинимидиому эфиру кислоты IV с последующей реакцией с амином III, приводящее к целевому конъюгату Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHCHCHNH-DOTA (V).
Осуществление изобретения
Предлагается простой и удобный способ синтеза целевого соединения. Сущность способа заключается в том, что конъюгат получают в результате 4-х стадийного синтеза, включающего следующие стадии:
3
3
1. Алкилирование DO3A(OBu-t) в смеси ацетонитрила с ДМФА в присутствии основания, например, как поташ с использованием этилового эфира бромуксусной кислоты с образованием тетраэфира (EtO)DOTA(OBu-t) (I);
2
2
2
3
2. Реакция амидирования этилового эфира (I) действием избытка этилендиамина приводит к амину NHCHCHNH-DOTA(OBu-t) (II);
2
2
2
3. Гидролиз третбутильных групп амина II в растворе соляной кислоты с образованием NHCHCHNH-DOTA (DOTA-EDA) (III);
2
2
4. Конденсация кислоты IV в присутствии EDC⋅HCl с гидроксисукцинимидом в растворе ацетонитрила приводит in situ к промежуточному активированному сукцинимидному эфиру кислоты IV с последующей реакцией с амином III, что приводит к целевому конъюгату Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHCHCHNH-DOTA (V).
Для получения амина III и конъюгата V нами использованы адаптированные условия методик, приведенных в публикации (L. Adriaenssens, et al. Chem. Med. Chem. 2014, 9, 1567 - 1573). Способ получения пентапептида Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОМе и кислоты IV описаны соответственно в статье (Балаев А.Н., Осипов В.Н., Охманович К.А., Барышникова Μ. Α., Хачатрян Д.С. Пентапептидные аналоги соматостатина, содержащие тиазолидиновый фрагмент: синтез и цитотоксическая активность // Известия АН. Серия химическая. - 2016, №12. - С. 2948-2951) и патенте (Хачатрян Д.С. и др., Патент РФ 2648357, 30.03.2016, A61K 38/08)
Используемые выше и ниже сокращения обозначают:
Boc - трет-бутилоксикарбонил
EDA - этилендиамин
3
DO3A(OBu-t) - тритретбутил 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триил)триацетат
DOTA - 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраил)тетрауксусная кислота
EDC⋅HCl - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид
HOSu - гидроксисукцинимид
Схема получения:
Ниже предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Экспериментальная часть
Чистоту полученных соединений определяли при помощи аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Agilent LC/MS 1200 (колонка - ReproSil-Pur Basic C185 мкм размером 250×4,6 мм с предколонкой SecurityGuard Cartridges Widepore C184×2 мм; подвижная фаза: градиент с 95% вода +5% ацетонитрил до 100% ацетонитрил с буферизацией 0,01% трифторуксусной кислотой за 20 минут). Детектирование на УФ-детекторе с длиной волны 220 нм.
Содержание основного вещества в образце определяли по относительной величине площади пика на хроматограмме.
Спектры ESI-MS регистрировались на MS детекторе Agilent Ion Trap 6310. Ионизация пробы с помощью электроспрея, регистрация в режиме положительных ионов, в некоторых случаях в режиме отрицательных ионов.
Настройки масс-детектора:
- давление на нибулайзере 40 psi;
- напряжение на нибулайзере 3500 вольт;
- поток шторного газа 7 л в минуту;
- температура газа носителя 360°С;
- детекция масс в диапазоне от 70 до 1500 атомных единиц массы.
Параметром, характеризующим анализируемое вещество, является молекулярный вес иона, определенный МС детектором.
3
Пример 1. Синтез этилового эфира (EtO)DOTA(OBu-t) (соединение I)
3
2
Смесь 2.00 г (3.36 ммоль) гидробромида DO3A(OBu-t), 0.415 мл (3.70 ммоль) этил бромацетата и 1.39 г (10.08 ммоль) прокаленного поташа в смеси безводных 32 мл ацетонитрила и 8 мл ДМФА кипятят в атмосфере аргона в течение 12 часов. По окончании реакции (контроль по ТСХ) упаривают ацетонитрил, полученное масло разбавляют 30 мл хлористого метилена, органический слой промывают водой 2 раза по 10 мл, 10 мл 10% раствором хлористого натрия и сушат над сульфатом натрия. После удаления осушителя и отгонки растворителя получают жидкий остаток, который очищают флэш-хроматографией (SiO, хлористый метилен/метанол). Получают 2.01 г (99%) светло-желтого вещества.
2
2
2
3
Пример 2. Синтез NHCHCHNH-DOTA(OBu-t) (соединение II)
3
3
Этиловый эфир (EtO)DOTA(OBu-t) (2.00 г, 3.30 ммоль) растворяют в 5 мл этилендиамина, и выдерживают полученный раствор на 3-4 дня при комнатной температуре. Реакционную массу упаривают досуха в вакууме, к полученному остатку добавляют 10 мл воды и экстрагируют хлористым метиленом 2 раза по 25 мл. Экстракт промывают водой 2 раза по 10 мл и сушат над сульфатом натрия. После удаления осушителя и отгонки растворителя получают 1.91 г (94%) этилендиамин-моноамида EDA-DOTA(OBu-t).
2
2
2
Пример 3. Синтез NHCHCHNH-DOTA (соединение III)
3
2
4
2
2
2
Этилендиамин-моноамид EDA-DOTA(OBu-t) (320 мг, 0.52 ммоль) растворяют в 3.3 мл концентрированной соляной кислоты, перемешивают 30 минут при комнатной температуре и упаривают досуха в вакууме, получают твердый остаток продукта в виде гидрохлорида, который очищают флэш-хроматографией (SiO, MeOH/NHOH=8/1-4/1) предварительно растворив в 0.53 мл водного аммиака. Получают этилендиамин-моноамид NHCHCHNH-DOTA в виде светло-желтого твердого вещества (228 мг, выход 99%).
2
2
Пример 4. Синтез конъюгата Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHCHCHNH-DOTA (соединение V)
2
2
2
2
3
4
2
2
К охлажденному до 0-3°С раствору Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-ОН (90 мг, 0.10 ммоль) в 2 мл сухого ацетонитрила последовательно прибавляют EDC⋅HCl (21 мг, 0.11 ммоль), триэтиламин (30 мкл, 0.22 ммоль), HOSu (13 мг, 0.11 ммоль), перемешивают 16 часов при комнатной температуре. Добавляют NHCHCHNH-DOTA (45 мг, 0.10 ммоль), полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 24 часа, упаривают досуха при пониженном давлении, получают твердый остаток продукта, который очищают хроматографированием на колонке (SiO, CHCl/МеОН/NHOH - 6/3/1). Получают Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NHCHCHNH-DOTA в виде белых кристаллов 61 мг (46%).
R
2+
+
Содержание основного вещества 96.2% (ВЭЖХ), t=12.9 мин. Масс-спектр (ESI-MS), m/z: 663.1 [М+2Н], 1324.6 [М+Н].
Таким образом, описанный способ отличается простотой, отсутствием агрессивных реагентов и использует более экономичный процесс, использующий более короткий путь синтеза. Целевой конъюгат на ключевой стадии получают с 46% выходом.