СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОГРИБКОВОГО АНТИБИОТИКА ЭМЕРИЦИЛЛИПСИНА А
METHOD OF PRODUCING AN ANTIFIBIC ANTIBACTERIAL EMERICILLIPSIN A

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения противогрибкового антибиотика путем культивирования штамма алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina F -1428 на жидкой питательной среде и нового пептидного антибиотика эмерициллипсина А. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности при производстве противогрибкового антибиотика, эффективного при лечении бронхолегочных инвазивных микозов, вызываемых плесневыми грибами и дрожжами.
Поражения условно-патогенными грибами бронхов, легких и плевры относятся к вероятным инфекционным осложнениям туберкулеза, что обусловлено наличием тяжелого первичного заболевания легких (его течением и прогрессированием) и рядом предрасполагающих факторов: формированием полостных изменений и бронхоэктазов в легких; различными иммуносупрессивными состояниями, включая случаи туберкулеза, сочетанного с ВИЧ-инфекцией; длительным применением нескольких антибактериальных препаратов широкого спектра действия; наличием распространенной колонизации нижних дыхательных путей условно-патогенными грибами; проведением инвазивных процедур и другими факторами риска, связанными с пребыванием во фтизиатрическом стационаре [Климко Н.Н. Васильева Н.В., 2016; Нозокомиальная пневмония у взрослых: Российские национальные рекомендации, 2016]. Заселение и последующая колонизация нижних отделов дыхательных путей грибами родов Aspergillus или Candida может приводить к развитию аллергических форм заболеваний, способных осложнять течение туберкулезного процесса [Климко Н.Н. Васильева Н.В. Микозы легких. // В кн.: Пульмонология: Национальное руководство. Под ред. А.Г. Чучалина. - Москва: ГЭОТАР-Media. - 2016. - с. 236-249. У значительного числа пациентов наблюдаются два и более фактора, предрасполагающих к развитию микоза; особенно опасно их сочетание с наличием спор Aspergillus spp.и других мицелиальных грибов в воздухе лечебного стационара [Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Ви Джи Групп, 2008. - 336 с.].
Природные антимикробные пептиды грибов являются одним из важнейших источников новых эффективных антибиотиков за счет широкого спектра действия в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов, низкой токсичности и отсутствия формирования резистентности. Только грибы продуцируют пептаиболы - антибиотические пептиды, активные в отношении грамположительных микроорганизмов и паразитов, некоторые из них также обладают противоопухолевой активностью.
Грибы рода Emericellopsis давно известны как продуценты антимикробных пептидов группы пептаиболов. Наиболее изученными являются 4 гомолога зервамицина, проявляющих фунгицидную и цитотоксическую активность [Balashova, Т.А., Shenkarev, Z.O., Tagev, А.А., Ovchinnikova, T.V., Raap, J. and Arseniev, A.S. (2000). “NMR structure of the channel-former zervamicin IIB in isotrop solvents”. FEBS Letters, 466: 333 -336], выделены и описаны эмеримицины II, III, IV (продуцент Emericellopsis microspora). Известны бергофунгины А и В из Emericellopsis donezkii HKI 0059 [Berg, A., Schlegel, В., Ihn, W., Demuth, U. and  (1999). “Isolation and Structural Elucidation of New Peptaibols, Bergofungins В, С and D, from Emericellopsis donezkii HKI 0059”. The Journal of Antibiotics, 52(7): 666 -669]. Их гомологи, бергофунгины С и D, были обнаружены и у вида Е. salmosynnemata [Gessmann R., Axford D.,  Berg A., Petratos K. A natural, single-residue substitution yields a less active peptaibiotic: the structure of bergofungin A at atomic resolution/ Acta Cryst. - 2017. - P. 1-6].
Новый вид Emericellopsis alkalina впервые описан в 2013 г., его изоляты выделены из содовых солончаков Кулундинской степи и Забайкалья (Россия). Известно, что алкалофильные грибы вида Emericellopsis alkalina способны к синтезу биологически активных пептидных соединений, которые содержатся в культуральной жидкости и вегетативном мицелии [Баранова А.А., Рогожин Е. А., Георгиева М. Л., Биланенко Е. Н., Кулько А. Б., Якушев А. В., Алферова В. А., Садыкова В. С.Антимикробные пептиды алкалофильных грибов Emericellopsis alkalina: Биосинтез и биологическая активность в отношении патогенных грибов с множественной резистентности/ Прикл. биохимия и микробиология.2019. - том 55. №2. -с.151-157].
1;
Известны способы получения пептидов и фармацевтических композиций на их основе химическим синтезом или химической модификацией антибиотиков полимиксина и октапептина, включая циркулин А, полимиксин А, полимиксин В, полимиксин D, октапептин В, октапептин С и полимиксин B обладающих антибактериальными свойствами [Патент WO 2006/083317(10.08.2006)].
Известны способы получения природных пептидов из органов и тканей сельскохозяйственных животных [патенты РФ №№2075944, 2104702, 2161501, 2043364]. Недостатком этого способа является дефицит этого вида природного сырья.
Известен способ получения природных комплексов пептидов с противогрибковой активностью, предназначенных для лечения бактериальных и грибковых инфекций человека и животных, включая устойчивые к антибиотикам формы из жирового тела насекомых [Патент РФ №2552157].
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения противогрибкового пептида ареницина микробиологическим синтезом из генно-модифицированного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 [Патент РФ №2316595].
Недостатком этого способа является дорогостоящая очистка рекомбинатного пептида и отсутствие противогрибковой активности в отношении резистентных патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов -возбудителей системных и инвазивных микозов.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента природных пептидов и получение пептида с противогрибковой активностью.
Техническим результатом описываемого изобретения является получение из штамма Emericellopsis alkalina F -1428 микробиологическим синтезом нового противогрибкового пептида эмерициллипсина А, подавляющего возбудителей инвазивных бронхолегочных микозов, резистентных к используемым в клинической практике антибиотикам - азолам.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение.
Пример 1. Культивирование штамма Emericellopsis alkalina F -1428
Штамм F -1428 галофильного микромицета Emericellopsis alkalina относится к митоспоровым грибам - анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Hypocrea, семейства Bionectriaceae, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota [Grum-Grzhimaylo A.A., Georgieva M.L., Debets A.J.M., Bilanenko E.N. Are alkalotolerant fungi of the Emericellopsis lineage {Bionectriaceae) of marine origin? // IMA Fungus. Vol. 4. N. 2. 2013. P. 211-226. DOI: 10.5598/imafungus.2013.04.02.07
http://www.imafungus.org/Issue/42/17.pdfl.
В качестве посевного материала используют споровую суспензию 5-суточной культуры гриба, полученной на сусло-агаре.
2
3
3
3
2
4
2
4
Культивирование штамма F -1428 Emericellopsis alkalina осуществляют в аэробных условиях стационарным способом на специализированной щелочной среде (г/л): минеральная основа: NaCO - 24, NaHCO - 6, NaCl - 6, KNO - 1, KHPO - 1; солодовый экстракт (15°Б) - 200 мл, дрожжевой экстракт - 1, агар - 20; HO дистиллированная 800 мл. Для приготовления отдельно стерилизуют минеральную основу и остальные компоненты в течение 30 мин при избыточном давлении 0.5 атм. Все компоненты среды объединяют при 50°С. Данную среду разливают в колбы, стерилизуют и засевают споровой суспензией гриба из расчета 1×10 КОЕ мл среды. Стационарное культивирование продуцента проводят в течение 14 суток, затем биомассу мицелия и спор отделяют центрифугированием на центрифуге. Для получения целевого пептидного противогрибкового антибиотика эмерициллипсина А используют культуральную жидкость.
Пример 2. Выделение пептидного антибиотика эмерициллипсина А
Культуральную жидкость продуцента экстрагируют этилацетатом в соотношении органический растворитель - культуральная жидкость 5:1. Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе  (Швейцария) при 42°С досуха, остаток растворяют в водном 70%-ном этаноле и получают спиртовые концентраты антибиотика.
Для фракционирования антибиотического комплекса фракции разделяют с помощью прямофазной флеш-хроматографии последовательно в системах: хлороформ-метанол (50:1→20:1→10:1→3:1), 96% этанол и этанол-вода (7:3).
Дальнейшее разделение активной фракции после флэш-хроматографии проводят путем аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием колонки XBridge 5 мкм 100А размером 250×4.6 мм в растущем линейном градиенте концентрации ацетонитрила в качестве подвижной фазы (элюент А - 0.1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ) в воде MQ, элюентом В - 80%-ный ацетонитрил с 0.1%-ной водной ТФУ) при скорости потока 950 мкл/мин. Для ОФ-ВЭЖХ используют ультраградиентный ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания) и ТФУ производства «Sigma-Aldrich» (США). С целью получения индивидуального антибиотика эмерициллипсина А проводят разделение методом полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ на колонке XBridge 10 мкм 100А (250×10 мм). Поглощение определяют при длине волны 214 нм и скорости потока подвижной фазы 4 мл/мин (рисунок 1). Выход антибиотика эмерициллипсина А составляет 0,25 г/л.
Пример 3. Определение структуры эмерициллипсина А
Масс-спектрометрический анализ эмерицеллипсина А проводят с использованием установки для хроматомасс-спектрометрии LC-MS/MS (Agilent Technologies, США). Раствор пептида объемом 40 мкл и концентрацией 1 мг/мл наносят с помощью системы автоматического ввода образцов на колонку ОФ-ВЭЖХ Zorbax 300SB-C18, 5 μм, размерами 0.75×150 мм и разделяют в системе «подвижная фаза», содержащей смесь 96.9% воды MQ, 3% ацетонитрила и 0.1% муравьиной кислоты (v/v) (буфер А) и 99,9% ацетонитрила в присутствии 0.1% муравьиной кислоты (v/v) (буфер Б), скорость потока 300 нл/мин, линейный градиент: 15-85% буфера Б в течение 30 минут.
1
13
1
13
Запись спектров ЯМР осуществляют на приборе Avance Bruker 800 МГц (Bruker Biospin, Германия). Концентрация пептида составляет примерно 3 мг/мл DMSO. Структуру эмерицеллипсина А расшифровывают путем анализа гомоядерных (2D COSY, 2D Н-С HSQC, 2D 1H-15N HSQC, 2D Н-С НМВС, 2D 1H-15N НМВС) и гетероядерных (2D 1Н-13С HSQC-TOCSY) спектров. Дополнительно записывают спектр 2D ROESY с целью выявления конфигурации стереоцентров данной молекулы.
1
13
Сигналы в спектрах ЯМР Н и С представлены в Таблице 4. Структура соединения представлена на рисунке 2.
54
99
9
11
В соответствии с ЯМР-спектрами эмерициллипсин А представляет собой линейный полипептид, с 2-метилдекановой кислотой (2MDA) на N-конце и N-(2-гидроксиэтил) -1,2-пропандиамина на С-конце. Пептид образует альфа-спираль и содержит 8 карбоксильных и кетоновых групп. Из 7 аминокислотных остатков два представлены аланином и изолейцином, а остальные - 3-метилпролином (3МП), 2-амино-4-метил-6-гидрокси-8-оксодекановой кислотой (AHMOD), 2-аминоизобутиратом (AIB), изовалином и β-аланином. ЯМР-спектры показывают молекулярную формулу CHNO с изотопной молекулярной массой 1049,746.
Эмерициллипсин А является типичным представителем липоаминопептидов. Эти пептиды характеризуются присутствием альфа-метилразветвленной жирной кислоты на N-конце, с последующим производным пролина в положении 2 и AHMOD в положении 3.
Для оценки противогрибковых свойств полученного вышеописанным способом пептидного антибиотика эмерициллипсина А проводят тесты на условно-патогенных и патогенных клинических грибах, оценивающих активность противогрибкового антибиотика.
Пример 4. Оценка фунгицидной активности эмерициллипсина А в отношении штаммов условно-патогенных и токсигенных мицелиальных и дрожжевых грибов
Тест-объектами берут коллекционные штаммы условно - патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A.terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8К. Контролем служат стандартные диски с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 5-7 сутки. Чашки Петри с дрожжами инкубируют при 37°С на среде Сабуро, с патогенными и условно-патогенными микроскопическими грибами при 28°С на среде Чапека. Эмерициллипсин А обладает широким спектром фунгицидной активности в отношении условно-патогенных грибов (таблица 2).
* - ошибка измерения зоны подавления 1-2 мм.
Антибиотик ингибирует рост всех условно-патогенных и токсигенных тест-культур мицелиальных грибов, особенно эффективен против A. fumigatus 4K, A.niger INA 00760, P.chrysogenum VKM F-4499. Активность антибиотика в большинстве случаев превышает активность амфотерицина В.
Пример 5. Оценка фунгицидной активности эмерициллипсина А в отношении клинических изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов, резистентных к азолам.
-
Опыт проводят согласно примеру 4, но в качестве тест-объектов используют клинические изоляты дрожжевых грибов, возбудителей инвазивных кандидозов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Candida albicans 1582м 2016 - возбудитель кандидоза пищевода на фоне туберкулеза, туберкулезом селезенки и ВИЧ, Candida glabrata 1402м 2016 - возбудитель кандидоза легких, Candida krusei 1447м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, Saccharomyces cerevisiae 775м 2017 - туберкулезный плеврит, Cryptococcus laurentii 801м 2017 - туберкулез легких. Также используют изоляты мицелиальных грибов - возбудителей инвазивных аспергиллезов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Aspergillus fumigatus 163м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Aspergillus flavus 905м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Aspergillus terreus 1133м 2011 - туберкулез легких; Aspergillus ochraceus 497м 2015 - туберкулез легких; Aspergillus niger 2192016 фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких.
Эмерициллипсин А эффективен против С.glabrata 1402м, Aspergillus ochraceus 497м 2015, обладающих природной резистентностью ко всем применяемым в химиотерапии антибиотикам - азолам, а также Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 к Aspergillus terreus 1133м 2011 (таблица 3 и 4).
* - ошибка измерения зоны подавления 1-2 мм.
Приведенные в таблицах результаты позволяют сделать вывод о наличии достаточно высокой противогрибковой активности нового пептидного антибиотика эмерициллипсина А, полученного описываемым способом.