ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ, СОДЕРЖАЩИЕ 9-ЦИС-РЕТИНИЛОВЫЕ СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ В ЛИПИДНОМ НАПОЛНИТЕЛЕ
PHARMACEUTICAL FORMULATIONS CONTAINING 9-CIS-RETINYL ESTERS IN LIPID EXCIPIENT

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Эта заявка испрашивает приоритет патентной заявки США No. 61/242,741, поданной 15 сентября 2009 г. в соответствии с 35 U.S.C. 119(e) Свода законов США, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая область
Данное описание относится к фармацевтическим составам, содержащим искусственные ретиноиды, в частности к стабильным составам и лекарственным дозированным составам, пригодным для хромофор-заместительной терапии зрения.
Предпосылки изобретения
цис
Annual review of biochemistry
транс
J Biol Chem
транс
транс
транс
цис-
транс
Зрительное восприятие является результатом биологического преобразования световой энергии в передачу электрических сигналов при помощи фоторецепторов сетчатки глаза, этот процесс называется фотопреобразованием. Процесс фотопреобразования инициируется зрительными пигментами, включающими хромофорный 11--ретиналь, связанный с рецепторными опсинами, соединенными с апопротеиновыми G-белками, для образования родопсина (Palczewski K. G protein-coupled receptor rhodopsin.  2006; 75:743-767). Хромофор поглощает фотоны, которые переводят фотоизомеризацию хромофора в его -форму и вызывают каскады преобразования сигналов (Palczewski K. выше; Ridge KD et al. Visual rhodopsin sees the light: structure and mechanism of G protein signaling.  2007; 282:9297-9301). Изомеризованный хромофор полностью -ретиналь затем редуцируется в полностью -ретинол, транспортируется к ретинальному пигментному эпителию (RPE) и преобразуется в полностью -ретиниловые эфиры жирных кислот при помощи лецитин:ретинолацилтрансферазы (LRAT). И, наконец, восстановление 11-ретиналя из полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот завершает этот ретиноидный цикл (цикл превращений родопсина) (см., например, опубликованные заявки США Nos. 2004/0242704, 2006/028182, 2006/0221208).
цис-
Annu Rev Pharmacol Toxicol
цис-
Nature genetics
Регенерация 11-ретиналя имеет важнейшее значение для поддержания зрения (Travis GH, et al. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents.  2007; 47:469-512). Дефекты образования 11-ретиналя связаны с целым рядом наследственных дегенеративных ретинопатий (Gu SM, et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.  1997; 17:194-197). Два примера представляют собой врожденную слепоту Лебера (LCA), начинающееся в детстве ретинальное заболевание, вызывающее тяжелое нарушение зрения; и пигментный ретинит (RP), другая ретинопатия, наступающая в более позднем, переходном возрасте.
Mol Genet Metab
Eur J Paediatr Neurol
Functional neurology
LCA представляет собой наследственную, тяжелую и в настоящее время неизлечимую ретинальную дегенерацию, которая является основной причиной слепоты в детстве. При рождении или вскоре после рождения у LCA-пациентов характерным образом проявляется серьезное нарушение зрения, о чем свидетельствуют странствующий нистагм, амавротические зрачки, пигментная ретинопатия с потерей колбочковой и палочковой чувствительности, отсутствие или сильное ослабление ответов на электроретинограмме (ЭРГ) и примерно 100-кратное снижение амплитуды колбочкового мерцания (Perrault I, et al. Leber congenital amaurosis. 1999; 68:200-208; Fazzi E, et al. Leber's congenital amaurosis: an update.  2003; 7:13-22; Fazzi E, et al. Response to pain in a group of healthy term newborns: behavioral and physiological aspects.  1996; 11:35-43).
транс
цис-
цис-
J Biol Chem
Cell
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Nature genetics
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
et al
Investigative ophthalmology & visual science
Investigative ophthalmology & visual science
Rpe65
цис-
транс
Nature genetics
Molecular vision
et al
Experimental eye research
Nature genetics
RPE65, белок массой 65кДа, специфический для и имеющийся в изобилии при RPE, который катализирует изомеризацию полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот в 11-ретинол, обычно рассматривается в качестве ретиноидной изомеразы, принимающей участие в регенерации 11-ретиналя (Hamel CP, et al. Molecular cloning and expression of RPE65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post- transcriptionally regulated in vitro.  1993; 268:15751 -15757; Jin M, et al. Rpe65 is the retinoid isomerase in bovine retinal pigment epithelium.  2005; 122:449-459; Moiseyev G, et al. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle.  2005; 102:12413-12418; Redmond TM, et al. Mutation of key residues of RPE65 abolishes its enzymatic role as isomerohydrolase in the visual cycle.  2005; 102:13658-13663)). Мутации в гене RPE65 являются причиной до 16% случаев LCA и 2% случаев аутосомно-рецессивной RP (Gu SM, выше; Marlhens F, et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.  1997;17:139-141 ; Morimura H, et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis  1998; 95:3088-3093; Thompson DA, . Genetics and phenotypes of RPE65 mutations in inherited retinal degeneration.  2000; 41:4293-4299; Lorenz B, et al. Early-onset severe rod-cone dystrophy in young children with RPE65 mutations.  2000; 41:2735-2742). Спонтанное или направленное делетирование  у мышей и собак приводит к 11-ретинальной недостаточности, начинающейся в раннем возрасте и медленно прогрессирующей ретинальной дегенерации с резким уменьшением ответов на электроретинограмме (ЭРГ) и типичной LCA-патологией, сопровождающейся накоплением полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот в RPE (Redmond TM, et al. Rpe65 is necessary for production of 11-цис-vitamin A in the retinal visual cycle.  1998; 20:344-351; Pang JJ, et al. Retinal degeneration 12 (rd12): a new, spontaneously arising mouse model for human Leber congenital amaurosis (LCA).  2005; 11:152-162; Wrigstad A, . Ultrastructural changes of the retina and the retinal pigment epithelium in Briard dogs with hereditary congenital night blindness and partial day blindness.  1992; 55:805-818; Acland GM, et al. Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness.  2001; 28:92-95; Imanishi Y, et al. Noninvasive two-photon imaging reveals retinyl ester storage structures in the eye. The Journal of cell biology 2004; 164:373-383).
RPE65
The New England journal of medicine
American journal of ophthalmology
Для лечения LCA исследуется несколько возможных терапий. Терапия, основанная на функциональном дополнении гена , и ретинальное протезирование продемонстрировали предварительные обнадеживающие признаки сохранения зрения на ранней стадии клинического определения (Bainbridge JW, et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis.  2008; 358:2231-2239; Maguire AM, et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. The New England journal of medicine 2008;358:2240-2248; Yanai D, et al. Visual performance using a retinal prosthesis in three subjects with retinitis pigmentosa.  2007; 143:820-827).
цис-
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
J Biol Chem
Investigative ophthalmology & visual science
PLoS Med
цис-
изо
цис-
изо
Rpe65
Lrat
цис-
Недавно, хромофор-заместительная терапия зрения 9-ретиналем была предложена в качестве нового фармакологического способа обхода нарушенного ретиноидного цикла (Van Hooser JP, et al. Rapid restoration of visual pigment and function with oral retinoid in a mouse model of childhood blindness.  2000;97:8623-8628; Van Hooser JP, et al. Recovery of visual functions in a mouse model of Leber congenital amaurosis.  2002; 277:19173-19182; Aleman TS, et al. Impairment of the transient pupillary light reflex in Rpe65(-/-) mice and humans with leber congenital amaurosis.  2004; 45:1259-1271; Batten ML, et al. Pharmacological and rAAV Gene Therapy Rescue of Visual Functions in a Blind Mouse Model of Leber Congenital Amaurosis.  2005; 2:e333). 9-ретиналь связывается с опсином, чтобы образовать пигмент палочковидной зрительной клетки, -родопсина, который инициирует фотопреобразование аналогично родопсину. Было показано, что пероральный прием 9-ретиналя или его предшественников восстанавливал в глазах опсин в качестве -родопсина, улучшал функцию сетчатки, оцениваемую по ЭРГ-ответам, и улучшал зрачковый рефлекс на свет у мышей с нокаутом генов  и , которые являются двумя генетическими моделями LCA. Существует необходимость в дальнейшей разработке синтетических 9-ретиноидов в составах для перорального, желудочного, местного (например, в стекловидное тело) или внутривенного введения для лечения различных форм наследственной ретинальной дегенерации, вызванной нарушениями в ретиноидном цикле.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
цис-
Описаны фармацевтические составы, содержащие искусственные ретиноиды в липидном наполнителе. Искусственные ретиноиды можно использовать для обхода критических блокад в ретиноидном цикле, таких как недостаток RPE65 или мутация, создавая посредством этого искусственный ретиноидный хромофор, который может функционально объединяться с опсином. Также описанными являются и лекарственные формы фармацевтических составов, в том числе для однократного, прерывистого и ежедневного режимов дозирования.
цис-
Итак, один вариант осуществления предоставляет фармацевтический состав, содержащий липидный наполнитель и один или более 9-ретинильных эфиров Формулы (I):
где R представляет собой алкильную группу или алкенильную группу; и липидный наполнитель содержит более чем 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
цис-
цис-
В конкретном варианте осуществления, 9-ретиниловый эфир Формулы (I) представляет собой 9-ретинилацетат.
В конкретном варианте осуществления, липидный наполнитель содержит соевое масло.
цис-
цис-
2
Дополнительный вариант осуществления предоставляет лекарственную форму, пригодную для ежедневного дозирования 9-ретинильного эфира нуждающемуся в этом субъекту,  включающую  примерно 1,25-20 мг/мл 9-цис-ретинилацетата в соевом масле, где лекарственная форма обеспечивает на площади поверхности тела субъекта примерно 1,25-20 мг/м 9-ретинилацетата в течение 24-часового периода.
цис-
цис-
Другой вариант осуществления предоставляет лекарственную форму, пригодную для однократного дозирования путем введения в стекловидное тело субъекта 9-ретинилацетата, включающую около 18-40% мг/мл 9-ретинилацетата в соевом масле.
Дополнительный вариант осуществления предоставляет способ лечения врожденной слепоты Лебера у человека, включающий: введение фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9-цис-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в липидном наполнителе, содержащем более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
цис-
В конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловый эфир формулы (I), используемый в способе, представляет собой 9-ретинилацетат.
В конкретном варианте осуществления, липидный наполнитель, используемый в способе, содержит соевое масло.
цис-
цис-
Дополнительный вариант осуществления предоставляет способ, включающий введение человеку, испытывающему недостаточность в 11-ретинале, фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9-ретиниловых эфиров с Формулой (I) в липидном наполнителе, содержащем более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
цис
цис-
В конкретном варианте осуществления, 9--ретиниловый эфир с Формулой (I), используемый в способе, представляет собой 9-ретинилацетат.
В конкретном варианте осуществления, липидный наполнитель, используемый в способе, содержит соевое масло.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ЧЕРТЕЖЕЙ
цис-
цис-
цис-
Фигура 1 (A-D) демонстрирует относительные поглощения 9-ретинилацетата в соевом масле и удержание в плазме его активных метаболитов, включая 9-ретиниловые эфиры жирных кислот и 9-ретинол.
цис-
Фигура 2 (A-C) демонстрирует дозозависимое увеличение амплитуд как а-волны, так и b-волны у мышей, подвергшихся лечению однократной дозой 9-ретинилацетата в соевом масле.
Фигура 3 демонстрирует режим дозирования в течение 14-дневного периода, при котором регистрировали ЭРГ от одной вспышки и определяли ретиноидные уровни в глазах.
Rpe65
-/-
Фигура 4 (A-D) демонстрирует ЭРГ при дозозависимом увеличении амплитуд как а-волны, так и b-волны при лечении, по сравнению с базовым уровнем 5-недельных мышей .
цис-
Фигура 5 демонстрирует режим дозирования и оценку ЭРГ и ретиноидные анализы после трех суточных доз 9-ретинилацетата в соевом масле.
цис-
Фигура 6 (A-F) демонстрирует дозозависимые амплитуды a- и b-волн ЭРГ-ответов, регистрируемых до 9 дня после трех суточных доз 9-ретинилацетата в соевом масле.
Фигура 7 демонстрирует прерывистый режим дозирования и ежедневный режим дозирования в течение 8-недельного периода.
Фигура 8 (A-D) демонстрирует дозозависимое увеличение амплитуды a- и b-волн в день 28 и день 56 при прерывистом режиме дозирования и ежедневном режиме дозирования.
цис-
Фигура 9 (A-I) демонстрирует последовавшее за долгосрочным введением 9-ретинилацетата дозозависимое защитное действие на сетчатку, оцененное по длинам внешних сегментов фоторецепторов.
цис-
Фигура 10 демонстрирует уровни ретиноидов в плазме, как определено при помощи ВЭЖХ, после введения 9-ретинилацетата.
цис-
Фигура 11(A-D) демонстрирует ретиноиды в глазах и печени после 14-дневного ежедневно лечения 9-ретинилацетатом.
цис-
цис-
Фигура 12 демонстрирует кинетику исчезновения 9-ретиналя из глаза после 3 суточных доз 9-ретинилацетата.
цис-
Фигура 13 (A-B) демонстрирует содержание ретиноидов в глазах мышей Rpe65-/- после прерывистого и ежедневного лечения 9-R-Ас в течение 8 недель.
цис-
Фигура 14 (A-C) демонстрирует анализ ретиноидов в печени мышей Rpe65-/- после 56-дневного прерывистого и ежедневного лечения 9-ретинилацетатом.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
цис-
цис-
Описаны фармацевтические составы 9-ретиниловых эфиров, пригодных для ретиноидной заместительной терапии. Конкретнее, фармацевтические составы содержат один или более 9-ретиниловых эфиров и липидный наполнитель.
транс
транс
транс
цис-
цис-
цис-
Как используется в настоящем документе, «ретиноиды» относятся к классу химических соединений, природных или искусственных, родственных витамину А. Структурно ретиноиды обладают общей структурой ядра, состоящей из циклической концевой группы, конъюгированной полиеновой боковой цепи и полярной концевой группы. Ретиноиды естественного происхождения включают, например, витамин A (11--ретинол), 11--ретиналь и 11--ретиноевую кислоту. Искусственные и синтетические ретиноиды, пригодные для ретиноидной заместительной терапии, включают, например, 9-ретиниловые эфиры, как определено в настоящем документе, 9-ретиналь и 9-ретинол.
цис-
цис-
Как отмечалось в настоящем документе, 9-ретиниловые эфиры могут выступать в качестве предшественников пролекарственной формы или пролекарства 9-ретиналя, который способен функционально объединяться с опсинами, таким образом, завершая ретиноидный цикл, несмотря, например, на недостаток RPE65 или мутацию.
цис-
цис-
Таким образом, один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, включающий: один или более 9-ретиниловых эфиров и липидный наполнитель, один или более 9- ретиниловых эфиров, суспендированных в липидном наполнителе.
цис-
9-ретиниловые эфиры
цис-
9-ретиниловые эфиры относятся к следующей характерной структуре Формулы (I):
где R представляет собой алкильную группу или алкенильную группу.
12-17
12-15
1-8
1-6
1-4
2
н
изо
н
н
трет
«Алкил» относится к радикалу с неразветвленной или разветвленной углеводородной цепью, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, не содержащему ненасыщенных углеводородов, содержащему до двадцати двух атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкил может содержать от двенадцати до семнадцати атомов углерода (также именуется как «С-алкил»). В некоторых вариантах осуществления, алкил может содержать от двенадцати до пятнадцати атомов углерода (также именуется как «С-алкил»). В некоторых вариантах осуществления, алкил может содержать от одного до восьми атомов углерода (также именуется как «С-алкил»). В других вариантах осуществления, алкил может содержать от одного до шести атомов углерода (также именуется как «С-алкил»). В дополнительных вариантах осуществления, алкил может содержать от одного до четырех атомов углерода (также именуется как «С-алкил»). Алкил присоединяется к остальной части молекулы при помощи простой связи, например метил, этил, -пропил, 1-метилэтил (-пропил), -бутил, -пентил, 1,1-диметилэтил (-бутил), 3-метилгексил, 2-метилгексил и тому подобное. Если в описании специально не указано иное, алкильная группа может быть необязательно заменена одной или несколькими из следующих заместителей: гало (в том числе -F, -Br, -Cl и -I), циано (-CN), нитро (-NO), оксо (=O) и гидроксилом (-OH).
12-17-
1-8
1-6
1-4
2
«Алкенил» относится к радикалу с неразветвленной или разветвленной углеводородной цепью, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, содержащему, по крайней мере, один ненасыщенный углеводород (т.е., C=C), имеющий от двух до двадцати атомов углерода. В различных вариантах осуществления, R представляет Салкенил, С-алкенил, С-алкенил или С-алкенил. Если в описании специально не указано иное, алкильная группа может быть необязательно замещена одной или несколькими из следующих замещающих групп: гало (в том числе -F, -Br, -Cl и -I), циано (-CN), нитро (-NO), оксо (=O) и гидроксилом (-OH).
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
В некоторых вариантах осуществления, 9-ретиниловые эфиры представляют собой искусственные ретиноиды, которые выступают в качестве предшественников (т.е., пре-лекарств) пролекарственной формы 9-ретиналя. Конкретнее, 9-ретиниловые эфиры могут преобразовываться печенью в метаболическую пролекарственную форму, а именно в 9-ретиниловые эфиры жирных кислот, которые хранятся в печени в печеночных липидных каплях. 9-ретиниловые эфиры жирных кислот и ретинол мобилизуются из печени и вводятся в кровообращение, где они перемещаются до глаза и RPE. Там они преобразуются в 9-ретиналь, который, в конечном счете, соединяется с опсинами фоторецепторов, чтобы образовать активные зрительные пигменты.
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
цис-
Предпочтительным 9-ретиниловым эфиром является 9-ретинилацетат (т.е., R представляет собой метил). Также упоминаемый как «9-R-Ac», 9-ретинилацетат является фармацевтическим пре-лекарством, которое метаболизируется в печени до 9-ретиниловых эфиров жирных кислот, таких как 9-ретинилпальмитат. 9-ретиниловые эфиры жирных кислот и ретинол затем преобразуются в 9-ретиналь в глазе и RPE, в качестве замены недостающих хромофоров, таких как 11-ретиналь.
цис-
транс
цис
транс
цис
транс
цис
транс
цис
цис
цис
9-R-Ас можно подготовить путем первоначального преобразования полностью -ретинилацетата (Sigma-Aldrich) в смесь 9--ретинилацетата и полностью -ретинилацетата в присутствии палладиевого катализатора (например, солей палладия, оксидов палладия). Смесь 9--ретинилацетата и полностью -ретинилацетата затем гидролизуют для образования смеси 9--ретинола и полностью -ретинола. Чистый 9--ретинол можно выделить посредством селективной перекристаллизации и последующей этерификации, чтобы очистить 9--R-Ac. Подробное описание процессов для подготовки и очистки 9--R-Ac можно найти, например, в патенте Великобритании GB No. 1452012.
цис
цис
цис
11-12
В других вариантах осуществления, ретиниловые эфиры являются пролекарствами (а не предшественниками пролекарств) и могут быть непосредственно преобразованы в 9--ретиналь в глазу и RPE. Пролекарственные формы 9--ретиниловых эфиров являются, как правило, 9--ретиниловыми эфирами жирных кислот, в которых R представляет собой С-алкил. В настоящем документе, «жирная кислота» относится к карбоновой кислоте, имеющей длинную алифатическую цепь, которая может являться насыщенной (алкиловой) или ненасыщенной (алкениленовой). Как правило, алифатическая цепь содержит, по крайней мере, 11 углеродов и может достигать 21 углерода в длину. Типичные жирные кислоты включают, в качестве неограничивающих примеров, лауриновую кислоту, пальмитиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту и линоленовую кислоту.
15
цис
цис
Таким образом, в одном варианте осуществления, R представляет собой C-алкил, и 9--ретиниловый сложный эфир Формулы (I) представляет собой 9--ретинилпальмитат.
17
цис
цис
В дополнительном варианте осуществления, R представляет собой C-алкил, и 9--ретиниловый эфир Формулы (I) представляет собой 9--ретинилстеарат.
17
цис
цис
В другом варианте осуществления, R представляет собой C-алкенил, и 9--ретиниловый эфир Формулы (I) представляет собой 9--ретинилолеат.
цис
цис
9--ретиниловые эфиры, описанные в настоящем документе, могут быть получены из 9--ретинола, используя соответствующие этерифицирующие агенты, способом, сходным со способом получения 9-цис-R-Ас, которые находятся в компетенции специалистов в данной области.
Rpe65
-/-
Как показано в настоящем документе, низкие дозы (1 и 4 мг/кг) типичного пре-лекарства, 9-цис-R-Ac, как было обнаружено, являются клинически безопасными и эффективными в поддержании зрительной функции у мышей , оцененной по ЭРГ-регистрациям, уровням ретиноидов в глазах, гистологии сетчатки и зависимым от зрения поведенческим исследованиям. Это соединение используется для лечения, например, людей с ретинопатиями, связанными с недостаточным образованием ретиноидного хромофора.
Липидные наполнители
цис
Как правило,  9--ретиниловые эфиры представляют собой маслянистые вещества и являются липофильными. Таким образом, описанный фармацевтический состав может дополнительно включать липидный наполнитель.
цис
цис
Поскольку 9--ретиниловые эфиры чувствительны к свету и кислороду, их стабильность имеет решающее значение для эффективности и срока годности состава. В связи с этим подходящий липидный наполнитель выбирают по его способности стабилизировать 9--ретиниловые эфиры, суспендированные или солюбилизированные в нем.
Как используется в настоящем документе, «липид» или «липидный наполнитель» относится к одному из или смеси сложных эфиров жирных кислот. В различных вариантах осуществления, липидный наполнитель состоит из одного или более триглицеридов, которые образуются, когда глицерин этерифицируется тремя жирными кислотами. Триглицериды включают как растительные масла, так и животные жиры.
В контексте описания липидных наполнителей, триглицериды часто называют просто по их соответствующим жирным кислотам. Жирные кислоты триглицеридов могут быть насыщенными, мононенасыщенными и полиненасыщенными, в зависимости от числа углерод-углеродных двойных связей (C=C) в алифатических цепях. Насыщенная жирная кислота не содержит углерод-углеродных двойных связей в алифатических цепях. Примеры насыщенных жирных кислот включают, например, пальмитиновую и стеариновую кислоты. Мононенасыщенная жирная кислота содержит только одну углерод-углеродную двойную связь (C=C) в алифатической цепи. К примерам мононенасыщенных жирных кислот относятся, например, олеиновая и пальмитолеиновая кислоты. Полиненасыщенная жирная кислота содержит, по крайней мере, две углерод-углеродные двойные связи в алифатической цепи. Примеры полиненасыщенных жирных кислот включают, например, линолевую кислоту (два C=C) и линоленовую кислоту (три C=C). Далее, полиненасыщенные жирные кислоты включают жирные кислоты Омега-3 и жирные кислоты Омега-6, в зависимости от расположения конечной C=C-связи в алифатической цепи. Например, линолевая является жирной кислотой Омега-6, тогда как линоленовая является жирной кислотой Омега-3.
цис
Как правило, липидный наполнитель представляет собой смесь жирных кислот, относительные содержания каждой из которых может влиять на общие характеристики липидного наполнителя, особенно на его способность препятствовать окислению и стабилизировать суспендируемый в нем 9--ретиниловый эфир.
В некоторых вариантах осуществления, липидный наполнитель составляет более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирные кислоты Омега-6 и жирные кислоты Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15. В конкретных вариантах осуществления, липидный наполнитель содержит триглицерид-линолеат и триглицерид-линоленат в соотношении (по массе) меньше чем 15, которые в совокупности составляют более чем 50% от общей массы липидного наполнителя.
В других вариантах осуществления, липидный наполнитель может представлять собой растительное масло или смесь масел, которая содержит более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирные кислоты Омега-6 и жирных кислоты Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
Таблица 1 показывает ряд растительных масел и их компонентов жирных кислот в массовых процентах (см., например, патентную публикацию США No. 2007071872).
Соевое масло является подходящим липидным наполнителем, поскольку оно содержит около 62% полиненасыщенной жирной кислоты (54% линолевой и 8% линоленовой), 25% мононенасыщенной жирной кислоты (олеиновой) и 16% насыщенной жирной кислоты (11% пальмитиновой кислоты и 5% стеариновая кислота).
цис
цис
Соевое масло является прозрачным маслом без запаха, которое смешивается с 9--ретиниловыми эфирами, описанными в настоящем документе. По сравнению с жирными кислотами, содержащими меньшую концентрацию полиненасыщенных жирных кислот (например, рапсовое масло и оливковое масло, которые содержат примерно 30% и менее 20% полиненасыщенных жирных кислот, соответственно), соевое масло неожиданно демонстрирует улучшенный стабилизирующий эффект, о чем свидетельствует увеличенное содержание чистого 9--ретинилацетата, сохранившегося в составах по прошествии двухнедельного периода.
Кроме того, при сравнении с жирными кислотами, которые имеют более высокое соотношение полиненасыщенных жирных кислот Омега-6 к Омега-3, соевое масло также демонстрирует превосходный стабилизирующий эффект. Например, подсолнечное масло, несмотря на общее количество полиненасыщенных жирных кислот (61%), сопоставимое с таковым для соевого масла, имеет гораздо более высокое соотношение полиненасыщенных жирных кислот Омега-6 к Омега-3 (более 600), чем соевое масло (около 7). Как показано в Таблице 2 (Пример 1), стабилизирующий эффект подсолнечного масла сопоставим с таковым для рапсового масла, для обоих намного ниже, чем для соевого масла (класса USP).
Существенно и то, что составы соевого масла являются наиболее стабильными по сравнению с составами других наполнителей при температурах, близких к физиологическим условиям (например, 40°C). Высоко рафинированное соевое масло, которое соответствует монограмме USP, является предпочтительным (например, как предусмотрено Ассортиментом химических веществ), поскольку отмечалось, что соевое масло класса USP обеспечивает более высокую стабилизацию, чем коммерческий сорт соевого масла (см. Пример 1).
цис
цис
цис
цис
Кроме того, наполнитель на основе соевого масла предоставляет самый высокий уровень в плазме метаболитов 9--ретиниловых эфиров. Фигура 1 показывает относительное поглощение 9--R-Ас и сохранение в плазме его активных метаболитов, 9--ретиниловых эфиров жирных кислот и 9--ретинола.
цис
Таким образом, показано, что соевое масло придает одновременно и стабильность 9--ретиниловых эфиров, и высокое сохранение в плазме активных метаболитов этого, тем самым обеспечивая составам синергетические преимущества.
В дополнительном варианте осуществления, липидным наполнителем является масло грецкого ореха, которое содержит 72% полиненасыщенных жирных кислот (62% линолевой и 12% линоленовой).
И еще в одном варианте осуществления, липидным наполнителем является масло зародышей пшеницы, которое содержит 62% полиненасыщенных жирных кислот (55% линолевой и 7% линоленовой).
Составы
:
цис
В большинстве случаев, фармацевтические составы могут включать любой из 9--ретиниловых сложных эфиров, описанных в настоящем документе, в сочетании с подходящим липидным наполнителем.
цис
Один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий один или более 9--ретиниловых эфиров в липидном наполнителе, где липидный наполнитель составляет более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
цис
Дополнительный вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9--ретинилацетат в липидном наполнителе, где липидный наполнитель составляет более 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
цис
Дополнительный вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9--ретинилацетат в липидном наполнителе, где липидный наполнитель содержит триглицерид-линолеат и триглицерид-линоленат в соотношении (по массе) меньше чем 15, что в совокупности составляет более чем 50% от общей массы липидного наполнителя.
цис
Дополнительный вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9--ретинилацетат в соевом масле.
цис
Еще один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9--ретинилацетат в масле грецкого ореха.
цис
Еще один вариант осуществления описывает фармацевтический состав, содержащий 9--ретинилацетат в масле зародышей пшеницы.
цис
цис
цис
цис
цис
В различных вариантах осуществления, фармацевтический состав содержит до 40% (по массе) 9--ретиниловых эфиров, до 30% (по массе) 9--ретиниловых эфиров, до 25% (по массе) 9--ретиниловых эфиров, до 10% (по массе) 9--ретиниловых эфиров, до 5% (по массе) 9--ретиниловых эфиров.
Необязательные компоненты
:
Фармацевтические составы, описанные в настоящем документе, могут необязательно включать дополнительные компоненты, которые повышают стабильность и вкусовые качества. Например, для придания дополнительного стабилизирующего эффекта может быть включен один или несколько стабилизаторов (например, антиоксидантов). Далее, для улучшения вкуса в составы для перорального введения могут быть добавлены вкусовые добавки.
трет
Антиоксидант, используемый в настоящем раскрытии, может представлять собой один или несколько из следующих: α-токоферола, бутилированного гидроксианизола (БГА), бутилированного гидрокситолуола (БГТ), аскорбилпальмитата и пропилгаллата, -бутилгидрохинона (TBHQ). Можно использовать комплексообразующие агенты, такие как динатрийэдетат и кальцийдинатрийэдетат.
Ароматизирующие вещества и интенсификаторы вкусоароматических свойств делают фармацевтические составы более приятными на вкус для пациента. К общеизвестным ароматизирующим веществам и интенсификаторам вкусоароматических свойств фармацевтической продукции, которые могут быть включены в композицию по настоящему изобретению, относятся мальтол, ванилин, этилванилин, ментол, лимонная кислота, фумаровая кислота, этилмальтол и винная кислота. Предпочтительны ароматизированные масла (например, лимонное масло), поскольку они смешиваемы с липидным наполнителем. Подслащивающие вещества, такие как сорбитол, сахарин, натрийсахарин, сахароза, аспартам, фруктоза, маннитол и инвертный сахар, можно добавлять для улучшения вкуса.
Воду, сурфактанты или эмульгаторы можно добавлять к составам на масляной основе для образования смеси, пригодной для перорального применения (например, в виде напитка) или внутривенной инъекции. Подходящие сурфактанты и эмульгаторы включают, например, соевый лецитин и дипальмитоилфосфатидилхолин. Напитки, такие как соевое молоко, также можно добавлять непосредственно к составам, описанным в настоящем документе.
цис
Таким образом, один вариант осуществления предоставляет напиток, содержащий один или более 9--ретиниловых эфиров и липидный наполнитель, где липидный наполнитель содержит более чем 50 масс./масс.% полиненасыщенных жирных кислот, включающих жирную кислоту Омега-6 и жирную кислоту Омега-3 в соотношении (по массе) меньше чем 15.
цис
Дополнительный вариант осуществления предоставляет рецепт напитка, эмульсию или напиток, содержащего 9--ретинилацетат, соевое масло и питьевую жидкую среду. В определенных вариантах осуществления, питьевая жидкая среда бывает в виде эмульсии типа «масло в воде» (например, молоко или соевое молоко). Также могут использоваться дополнительные эмульгаторы, как, например, акация, трагакантовая камедь и метилцеллюлоза.
цис
Дополнительный вариант осуществления предоставляет состав для перорального применения в виде капсул, содержащих 9--ретинилацетат, соевое масло. Могут быть включены дополнительные наполнители, такие как антиоксиданты, как определяется специалистом в рассматриваемой области.
Составы для введения и лекарственные формы
Фармацевтический состав, описанный в настоящем документе, можно вводить субъекту путем перорального, желудочного или местного введения, такого как инъекция в стекловидное тело и внутривенная инъекция.
цис
Пероральное введение может осуществляться перорально при помощи зонда или с помощью питьевого состава или напитка, который включает один или более 9--ретиниловых эфиров, липидного наполнителя и напитка, такого как соевое молоко.
Желудочное введение может осуществляться с помощью желудочного зонда (например, желудочной трубки).
Местное введение, такое как инъекция в стекловидное тело и внутривенная инъекция, осуществляют при помощи шприцев.
Как используется в настоящем документе, «субъект» относится к пациенту, который может относиться к любым видам млекопитающих, например приматов, в частности людей; грызунов, в том числе мышей, крыс и хомяков; кроликов; животных семейства лошадиных; крупного рогатого скота; собак; кошачьих и др. Животные модели, в частности генетически модифицированные животные, представляют интерес для экспериментальных исследований, предоставляя модели для лечения заболеваний человека, например LCA.
цис
цис
цис
Как правило, все дозы 9--R-Ac полностью смешиваются в липидных наполнителях, включая соевое масло, USP (Spectrum Chemicals). В различных вариантах осуществления описаны однократное, прерывистое и ежедневное введения. Далее, основываясь на уровнях фармакологически активных метаболитов 9--ретиниловых эфиров в плазме после поглощения, дозировку и соответствующую эффективность 9--ретиниловых эфиров можно оценить с помощью ЭРГ, остроты зрения, тестирование при стимулах полного возбуждения, анализа поля зрения, тестирования цветового зрения.
Rpe65
Lrat
Как показано в Примерах, дозозависимое повышение как уровня, так и длительности ретинальной функции наблюдалось у мышей с нокаутом  и , которые являются двумя генетическими моделями LCA. Важно, фармакологическая активность поддерживалась в течение достаточно длительного периода времени после дозирования, чтобы дать возможность составлять гибкую, прерывистую схему дозирования.
цис
цис
Конкретнее, однократные дозы 9--R-Ac (6,25 -50 мг/кг) приводили к значительному дозозависимому улучшению ЭРГ-ответов. Суточные дозы (1, 4 и по 12,5 мг/кг) в течение двух недель хорошо переносились и индуцировали замечательное улучшение ретинальной функции. Значительные дозозависимые улучшения ЭРГ-ответов наблюдались 6 дней после введения 9-цис-R-Ac ежедневно в течение 3 дней по 1, 4 и по 12,5 мг/кг. Мыши, получавшие ежедневно или периодически лечение 9--R-Ac с 1 и 4 мг/кг/день и оцененные через два месяца, демонстрировали дозозависимое улучшение ретинальной функции и морфологии 8 неделями позже, тогда как у сравниваемых 3-месячных контрольных животных ретинальная функция ухудшилась.
цис
цис
2
Таким образом, в одном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, представлена лекарственная форма, пригодная для 24 часового или ежедневного дозирования 9-цис-R-Ac нуждающемуся в этом субъекту, содержащая примерно 1,25-20 мг/мл 9--R-Ac в соевом масле, где лекарственная форма обеспечивает примерно 1,25-40 мг/м 9--R-Ac на площади поверхности тела субъекта в течение 24-часового периода.
цис
В другом варианте осуществления, лекарственная форма обеспечивает время до максимума или пика концентрации в плазме 9--ретиниловых эфиров около 3-6 ч после перорального или желудочного введения лекарственного состава. Как используется в настоящем документе, «пиковая концентрация в плазме крови» является фармакокинетической мерой для оценки биодоступности лекарственного продукта. Плазменная концентрация лекарственного препарата увеличивается с ростом степени поглощения; пик достигается, когда скорость элиминации лекарственного препарата становится равной скорости поглощения. В дополнение к максимальной (пиковой) концентрации лекарственного препарата в плазме, параметрами фармакокинетики также являются соответствующее время пика (когда имеет место максимальная концентрация лекарственного препарата в плазме) и площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени.
цис
цис
В дополнительном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, представлен лекарственный состав, пригодный для однократного дозирования введением в стекловидное тело 9--ретинилацетата субъекту, содержащий около 18-40% мг/мл 9--ретинилацетата в соевом масле. Было установлено, что однократная дозировка введением в стекловидное тело глаза субъекта может продолжаться в течение нескольких дней, даже недель, возможно, при помощи способа замедленного высвобождения.
цис
Применение 9--ретиниловых эфиров в качестве ретиноидной заместительной терапии
цис
Также описанными в настоящем документе являются способы применения 9--ретиниловых эфиров с Формулой (I) в качестве ретиноидной заместительной терапии дегенерации сетчатки у людей.
цис
Rpe65
-/-
Оценку эффективности и безопасности 9--ретиниловых эфиров, в качестве ретиноидной заместительной терапии, проводили с использованием соответствующих животных моделей (см. Примеры). Используемые животные модели представляют собой мышей , у которых отсутствует ретинальный пигментный эпителий-специфический белок массой 65 кДа (RPE65) и развивается ретинопатия и слепота, напоминающие LCA у людей.
Rpe65
цис
Rpe65
цис
цис
-/-
-/-
Фармакокинетические и фармакодинамические эффекты пре-лекарства показывают, что в модели на мышах пре-лекарство в печени преобразуется в пролекарство, т.е., в основном, в 9--ретинилпальмитат (см. Примеры). Далее, в модели на мышах  наблюдали, что 9--ретиноиды доставлялись к сетчатке двумя путями, то есть, прежде всего, быстро из циркулирующей крови и, во-вторых, более медленно, из запасов 9--ретиноидов в печени (см., например, 5).
Rpe65
цис
цис
-/-
С использованием нескольких различных режимов у мышей  для оценки эффективности действия препарата и безопасности, было показано, что 9--ретиниловые эфиры можно применять в качестве синтетических ретиноидов для лечения LCA-пациентов человека. Наблюдалось как дозозависимое, так и зависящее от периода введения сохранение зрительной функции, даже при самых низких испытанных дозах 1 и 4 мг/кг (Фигура 2, 4, 6, 8). Существенно, дозозависимое продление эффективности наблюдалась для пре-лекарства 9--R-Ac.
цис
Таким образом, один вариант осуществления предоставляет способ лечения врожденной слепоты Лебера у субъекта-человека, включающий введение фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9--ретиниловых эфиров с Формулой (I) в соевом масле. В более конкретном варианте осуществления, 9-цис-ретиниловые эфиры с Формулой (I) представляют собой 9-цис-ретинилацетат.
цис
цис
цис
Дополнительный вариант осуществления предоставляет способ, включающий: введение субъекту-человеку с недостатком 11--ретиналя фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более 9--ретиниловых эфиров с Формулой (I) в соевом масле. В более конкретном варианте осуществления, 9--ретиниловые эфиры с Формулой (I) представляют собой 9-цис-ретинилацетат.
Различные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, дополнительно иллюстрируются следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
Материалы, методология и анализ
Электроретинограмма (ЭРГ
et al
J Biol Chem
et al
Investigative ophthalmology & visual science
) - ЭРГ регистрировали для наркотизированных мышей, как описано, например, в Maeda A, . Role of photoreceptor- specific retinol dehydrogenase in the retinoid cycle in vivo.  2005; 280:18822-18832; и Maeda T, . A Critical Role of CaBP4 in the Cone Synapse.  2005; 46:4320-4327.
Вкратце, мышей сначала адаптировали к темноте в течение ночи перед регистрацией. Затем при безопасном свете мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 20 мкг/г массы тела 6 мг/мл кетамина и 0,44 мг/мл ксилазина, разбавленного раствором 10 мМ фосфата натрия, рН 7,2, содержащего 100 мМ NaCl. Зрачки расширяли 1%-ным тропикамидом. Контактную линзу-электрод помещали на глаз и контрольный электрод и электрод заземления располагали соответственно на ухе и хвосте. ЭРГ регистрировали с использованием универсальной тестирующей и электрофизиологической системы (UTAS) E-3000 (LKC Technologies, Inc.).
Регистрация после однократной вспышки
2
- Стимулирующие вспышки белого света применялись в диапазоне интенсивностей (от -3,7 до 2,8 log cd·s·m), и длительность вспышек корректировали в соответствии с интенсивностью (от 20 мкс до 1 мс). Было сделано от двух до пяти регистраций с достаточными интервалами между стимулирующими вспышками (от 10 с до 10 мин), чтобы дать возможность мышам восстановиться. Как правило, для регистрации каждой точки было использовано от четырех до восьми животных. Односторонний тест ANOVA использовали для статистического анализа ответов.
Гистология и иммуногистохимия
et al
- Гистологические процедуры использовали для анализа глаз, как описано в Maeda A, . выше.
Анализ ретиноевой кислоты и неполярных ретиноидов
et al
et al
транс
цис
- Все экспериментальные процедуры, связанные с экстракцией, получением ретиноидных производных и разделением ретиноидов, проводились под тусклым красным светом, обеспечиваемым светозащитным фильтром 1 от Kodak (коэффициент пропускания >560 нм). Экстракцию ретиноевой кислоты из печени проводили, как ранее описано, например, в Batten ML. . выше. Анализ полярных ретиноидов в плазме крови, глазе и печени проводили с использованием ВЭЖХ Agilent 1100 и двух тандемных колонок с нормальными фазами: Varian Microsorb Silica 3 мкм, 4,6×100 мм (Varian, Пало Альто, Калифорния) и колонки Ultrasphere-Si, 5 мкм, 4,6×250 мм (Aleman TS ., выше). Изократическая система нормальной фазы гексан:2-пропанол:ледяная уксусная кислота (1000:4,3:0,675; об./об./об.) была использована для элюции при скорости потока 1 мл/мин при 20°C с детектированием при 355 нм. Калибровку проводили со стандартами полностью -ретиноевой кислоты и 9--ретиноевой кислоты, приобретенными у Sigma-Aldrich. Анализ неполярных ретиноидов в плазме крови, глазу и печени проводили при помощи ВЭЖХ с нормальными фазами (Ultrasphere-Si, 5 мкм, 4,6×250 мм, Beckman, Фуллертон, Калифорния) с 10% этилацетата и 90% гексана при скорости потока 1,4 мл/мин, с детектированием при 325 нм путем ВЭЖХ HP1100 с диодно-матричным детектором и программным обеспечением HP Chemstation A.03.03.
ПРИМЕР 1
ТЕСТЫ НА СТАБИЛЬНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ СОСТАВОВ
цис
цис
цис
Несколько различных составов на основе липидов 9--R-Ac были подготовлены для проверки стабильности, предоставляемой различными липидными наполнителями. Поскольку 9--R-Ac рассматривался как чувствительный к свету, флаконы янтарного стекла использовались всегда, когда это было возможно, и с соединением обращались при золотистом свете флуоресцентной лампы. 9--R-Ac переместили из морозильника на -20°C и подогрели до комнатной температуре в течение 30 минут. Обращение с соединением выполняли в потоке газа аргона, поскольку соединение перемещали в предварительно взвешенный флакон янтарного стекла, и повторно взвешивали для расчета количества соединения, до того как флаконы заполнили аргоном и поместили на хранение при -20°C до использования.
цис
Смеси 9-цис-R-Ас (от 1,4 до 8 мг/мл) в различных носителях/наполнителях были подготовлены с использованием флаконов янтарного стекла, содержащих точно взвешенное соединение. Флаконы с образцами заполняли аргоном и смешивали путем интенсивного встряхивания. Образцы касторового масла с полиоксилом 35 нагревали до 60°С. Каждый образец разделяли на две части и хранили при 4°С или 40°С. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ на содержание 9--ретинилацетата сразу после получения (день 0) и в моменты времени до 2 недель после получения.
Образцы для ВЭЖХ-анализа разводили приблизительно до 0,1 мг/мл в тетрагидрофуране. Пробы сразу же анализировали или хранили при -20°С или - 70°С до 1 недели перед анализом. Процент извлечения рассчитывали относительно концентрации в составе в день 0, определенной путем ВЭЖХ.
цис
Неожиданно, соевое масло (USP), с присутствием и без присутствия БГЕ, обеспечивает наиболее стабильную суспензию для 9-цис-R-Ac, особенно при физиологической температуре (около 40°С), как показано процентным содержанием 9--R-Ac в составе в день 7 и день 14 (Таблица 2).
ПРИМЕР 2
ЦИС
СОХРАНЕНИЕ В ПЛАЗМЕ МЕТАБОЛИТОВ 9--РЕТИНИЛАЦЕТАТА
цис
Было подготовлено несколько различных препаратов на основе масла для определения уровней поглощения 9-цис-R-Ас в плазме. Конкретнее, однократную дозу 50 мг/кг 9--ретинилацетата (50 мг/кг), суспендированную в 4 различных наполнительных маслах, вводили при помощи желудочного зонда 5-недельным мышам C57/BI6 и после этого определяли ретиноидный уровень в плазме (n=5 в каждой временной точки на группу).
цис
цис
цис
цис
цис
транс
транс
цис
транс
Раствор 9--R-Ac в соевом или подсолнечном масле, по сравнению с маслом канолы и рапсовым маслом, обеспечивал лучшее поглощение 9-цис-R-Ac, о чем свидетельствуют самые высокие уровни 9--ретиниловых эфиров жирных кислот и 9--ретинола в плазме, обоих активных метаболитов 9--R-Ас (Фигура 1A, C, 11). Наивысшие уровни в плазме этих 9--ретиноидов были отмечены примерно в 3 ч. Плазменные уровни полностью -ретинола и полностью -ретиноловых эфиров жирных кислот существенно не отличаются, как среди тестируемых наполнителей, так и во время 23-часового периода тестирования, что позволяет предположить, что -ретиноиды не были преобразованы в полностью -ретиноиды (Фигура 1, B, D).
цис-
транс-
цис
транс
Фигура 10 показывает ретиноиды в плазме, как определено при помощи ВЭЖХ. Ретиниловые эфиры жирных кислот, детектированные ранее в фазе элюции (a, b, c), состояли из четырех пиков 9- (a, c) и двух пиков полностью  (b) изомеров. Как 9--ретинол (d), так и полностью -ретинол (e) элюировались позднее.
ПРИМЕР 3
ЦИС
Rpe65
-/-
ЭФФЕКТЫ ОДНОКРАТНЫХ ДОЗ 9--R-AC НА РЕТИНОВУЮ ФУНКЦИЮ МЫШЕЙ
цис
Rpe65Rpe65
цис
-/-
Однократные дозы (2-50 мг/кг) 9--R-Ас в соевом масле вводили 5-недельным мышам  для проверки того, было ли способно пре-пролекарство 9--R-Ac доставлять искусственный хромофор к глазу.
цис
Мыши не продемонстрировали никаких явных клинических побочных эффектов, даже после получения наивысшей дозы 50 мг/кг. После адаптации к темноте в течение 3 дней и зондового введения регистрировали скотопические ЭРГ от одиночных вспышек, и глаза собирали для оценки уровней 9--ретиналя.
цис
цис
транс
транс
Rpe65
-/-
Скотопические ЭРГ подвергнутых лечению мышей показали дозозависимое увеличение амплитуд как а-, так и b-волн (Фигура 2А, Б); наименьшая испытанная доза, которая обеспечивала значительное улучшение после высокоинтенсивного стимулирования, составляла 6,25 мг/кг. Аналогичным образом, дозозависимое накопление 9--ретиниля было обнаружено в глазах прошедших лечение мышей, что коррелировало с улучшением ретиновой функции (Фигура 2С). Ни в одном из исследованных глаз не было обнаружено никаких 9--ретиниловых эфиров жирных кислот, тогда как уровни полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот находились в диапазоне от примерно 1 до 1,6 нмоль/глаз и существенно не отличаются между четырьмя группами лечения. Кроме того, уровни полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот были сходны с 1,2 нмоль/глаз, сообщенным для не прошедших лечение 5-недельных мышей .
цис
транс
ис
9--ретинол (43 пмоль/глаз) был обнаружен только в глазах мышей, дозированных с 50 мг/кг, в то время как уровни полностью -ретинола, варьирующие от 14 до 22 пмоль/глаз, существенно не отличались между четырьмя группами лечения. Ни в одном из глаз 11-ц-ретиноиды обнаружены не были.
цис
цис
цис
Таким образом, полученные результаты указывают на то, что 9--ретиналь рекомбинирует с опсином с образованием изо-родопсина. Главное, уменьшенные дозы 9--R-Ac (2 и 4 мг/кг) вызывали положительные ЭРГ-эффекты, несмотря на то, что только следовые уровни 9--ретиналя детектировались в глазу (Фигура 2).
ПРИМЕР 4
цис
ЭФФЕКТЫ 9--R-AC, ВВОДИМОГО ЕЖЕДНЕВНО В ТЕЧЕНИЕ 14 ДНЕЙ
Rpe65
Rpe65
цис
-/-
-/-
Ретиновую функцию мышей  и C57BI/6 тестировали после неоднократного ежедневного дозирования 9-цис-R-Ac. Чтобы проверить это непосредственно, 5-недельным мышам  ежедневно через зонд вводили 9--R-Ac в соевом масле в дозах 1, 4 или 12,5 мг/кг в течение 14 дней. Мыши подвергались воздействию внешних условий с переменой темноты и флуоресцентного света (диапазон яркости 500-1500 люксов) во время последних 11 дней лечения. Скотопические ЭРГ от однократных вспышек регистрировали и определяли ретиноидные уровни в глазах (Фигура 3).
Rpe65
-/-
ЭРГ показали дозозависимое увеличение амплитуд a- и b-волн у прошедших лечение мышей по сравнению с базовым уровнем 5-недельных мышей  (Фигура 4A, B). Даже самая низкая ежедневная проверяемая доза 1 мг/кг вызывала значительные улучшения ретиновой функции по сравнению с контрольной группой.
цис
цис
цис
цис
Rpe65
цис
Rpe65
цис
цис
цис
транс
цис
транс
цис
-/-
-/-
9--ретиналь легко детектировался в глазах животных с нокаутом генов, но ни 9--ретиниловые эфиры жирных кислот, ни 9--ретинол не присутствовали (Фигура 11A-C). При этом 9--ретиниловые эфиры жирных кислот накапливались дозозависимым образом в печени как мышей C57BI/6, так и мышей  (Фигура 11D). Присутствие 9--ретиналя в глазах этих мышей предполагает улучшение ретиновой функции, как наблюдалось в исследованиях с однократными дозами на мышах . В глазах прошедших лечение мышей также было соответствующее дозозависимое накопление 9--ретиналя (Фигура 4C). В глазах контрольной группы и группы, прошедшей лечение 1 мг/кг, 9--ретиналь не был обнаружен, в то время как в группах с ежедневными дозами 4 и 12,5 мг/кг было определено соответственно 38±4 и 95±14 пмоль. Уровни 9--ретиниловых эфиров жирных кислот были низкими (1 пмоль/глаз) в группах с ежедневными 4 и 12,5 мг/кг и не обнаруживалось в глазах из других групп (Фигура 4D). Ни в какой группе не были обнаружены ни полностью -ретинол, ни 9--ретинол. Уровни полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот (в основном, пальмитата, стеарата и олеата) в глаза мышей, подвергшихся воздействию 9--R-Ac, находились в диапазоне от 1,2 до 1,4 нмоль/глаз и не значительно отличались от таковых в глазах контролей (1,2 нмоль/глаз в 5-недельном возрасте).
цис
Rpe65
цис
цис
изо
цис
цис
цис
изо
-/-
ЭРГ-ответы свидетельствуют об увеличении эффективности и улучшении кинетики 9--R-Ас дозозависимым образом. Самая низкая доза (1 мг/кг) значительно улучшала ЭРГ-ответы по сравнению с базовым уровнем 5-недельных мышей , несмотря на то, что 9-цис-ретиналь и 9-цис-ретиниловые эфиры жирных кислот не были обнаружены в глазе (Фигура 4). Это говорит о том, что 9--ретиналь исчезает при выдержке на свету (8 ч света/16 ч темноты) и что 9--ретиниловые эфиры жирных кислот вместо этого используются для регенерации -родопсина. Действительно, накопление 9--ретиниловых эфиров жирных кислот обнаруживалось дозозависимым образом в образцах печени, что дает основание предполагать, что запас 9--ретиниловых эфиров жирных кислот в печени может служить в качестве источника для образования 9--ретиналя и -родопсина в глазу.
Rpe65
цис
-/-
В этом 14-суточном исследовании каждая из суточных дозировок 1, 4, 12,5-50 мг/кг хорошо переносилась как 5-недельными мышами C57BI/6, так и 5-недельными мышами , что свидетельствует о безопасности 9--R-Ac.
ПРИМЕР 5
цис
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ УЛУЧШЕННОЙ РЕТИНОВОЙ ФУНКЦИИ ПОСЛЕ 3 СУТОЧНЫХ ДОЗ 9--R-AC
цис
цис
Rpe65
цис
-/-
9--ретинол в виде 9--ретиниловых эфиров жирных кислот накапливался в печени мышей, получавших повторные дозы 9--R-Ас по крайней мере 12,5 мг/кг в течение 2 недель (см. Фигуру 11D, Пример 4).
цис
цис
Rpe65
-/-
Для оценки способности мышей сохранять 9--ретиноиды и впоследствии использовать их в ретиноидном цикле, 9--R-Ac в соевом масле вводили через зонд один раз в день в течение трех дней подряд в дозе 1, 4 или 12,5 мг/кг/день в 5-недельных мышей, содержавшихся в темноте. Мышей затем подвергали воздействию циклов по 8 ч флуоресцентной лампы с яркостным диапазоном 500-1500 люкс, с последующими 16 ч в темноте.
цис
цис
цис
цис
Rpe65
-/-
ЭРГ и ретиноидный анализ проводились в конце первого (день 4), второго (день 5), четвертого (день 7) и шестого (день 9) дня выдержки на свету (Фигура 5). Амплитуды как a-, так и b-волн ЭРГ-ответов, зарегистрированных до дня 9 (Фигура 6A-F), были дозозависимыми в каждой временной точке и снижались с числом выдержек на свету. Самая высокая проверенная доза (12,5 мг/кг/день) существенно улучшала как a-, так и b-волну до дня 9 (Фигура 6A-B) при высокой интенсивности стимулов, в то время как дозы 4 мг/кг и 1 мг/кг показали увеличение амплитуд а-волны до дня 9 и дня 7 соответственно и амплитуд b-волны до дня 9 (Фигура 6C-F). Уровни 9--ретиналя в глазу также являлись дозозависимыми и уменьшилась с течением времени (Фигура 12). Это соединение было обнаружено в сетчатке всех прошедших лечение мышей в день 4 (Фигура 12), но только в сетчатке мышей, подвергшихся действию 4 и 12,5 мг/кг, в день 5 и только в группе 12,5 мг/кг на 7 день. В день 9 в сетчатках прошедших лечение или контрольных мышей 9--ретиналь не был обнаружен. Таким образом, не было необходимости в ежедневном введении 9--R-Ac, чтобы доставлять 9--R-Ac к глазу и поддерживать улучшение ретиновой функции у мышей.
цис
цис
цис
цис
цис
цис
Таким образом, показано, что ЭРГ-амплитуды улучшались, в основном, дозозависимым образом, и этот положительный эффект сохранялся в течение 4-6 дней после лечения. Кроме того, аналогичная картина была отмечена для уровней 9--ретиналя, обнаруженного в глазах этих животных. Главное, улучшение ЭРГ-ответов при дозовом уровне 4 мг/кг продолжалось в течение 4-6 дней после прекращения лечения, когда 9--ретиналь больше нельзя было обнаружить в глазах. Эти результаты показывают, что положительные эффекты от 9--R-Ac терапии сохраняются на следовых уровнях 9--ретиналя в сетчатке, что стабилизирует ROS, тогда как ЭРГ-ответы в контрольных группах ухудшились. Кинетику ретиноидных уровней в глазах затем проверяли во время адаптации к темноте после выдержки на свету. Важно, что восстановление 9--ретиниловых эфиров жирных кислот и 9--ретиналя в глазах происходило во время адаптации к темноте.
ПРИМЕР 6
Rpe65
цис
-/-
РЕТИНОВАЯ ФУНКЦИЯ У МЫШЕЙ  ПОСЛЕ ПРЕРЫВИСТОГО И ЕЖЕДНЕВНОГО ВВЕДЕНИЯ 9--R-Ас В ТЕЧЕНИЕ 8 НЕДЕЛЬ
цис
Из-за того что 3 низкие суточные дозы 9--R-Ac улучшали ЭРГ-ответы после 6 дней выдержки на свету (Фигура 6A-F), был проведен длительный 8-недельный прерывистый режим дозирования.
Rpe65
цис
-/-
Мыши были разделены на две группы (прерывистая группа и ежедневная группа), каждая из которых подвергалась лечению в общей сложности 8 недель с 1 или 4 мг/кг 9--R-Ac. Прерывистую группу дозировали ежедневно в течение 3 дней, с последующим 4-дневным перерывом в приеме лекарственного препарата, в течение каждой недели 8-недельного режима. Ежедневную группу дозировали ежедневно в течение всего 8-недельного периода. Режимы дозирования проиллюстрированы на Фигуре 7. Мышей подвергали воздействию ежедневного цикла - 8 ч флуоресцентного света с диапазоном яркости 500-1500 люкс, с последующими 16 ч в темноте. ЭРГ регистрировали в день 28 и еще раз в день 56, после чего ткани собирали для ретиноидного анализа глаза и печени и гистологии глаза.
цис
цис
транс
цис
цис
транс
цис
ЭРГ-ответы прошедших лечение мышей в прерывистой группе и ежедневной группы были значительно лучше, чем таковые контролей, как в день 28, так и в день 56, и умеренное снижение амплитуды между днем 28 и днем 56 отмечалось как у мышей, прошедших лечение 9-цис-R-Ac, так и у контрольных мышей. Как режим прерывистого дозирования, так и режим ежедневного дозирования вызывал дозозависимое увеличение амплитуды a- и b-волн в дни 28 и 56 (Фигура 8A-D). Ответы были более выраженными в группе ежедневного дозирования, чем в группе прерывистого дозирования. Пониженная доза (1 мг/кг) была достаточна, чтобы вызвать значительное улучшение ЭРГ-ответов в контрольной группе при высокой интенсивности стимулов, независимо от графика лечения. Кроме того, амплитуды a- и b-волн были сходными в день 28 и день 56, что дало основание предполагать, что может быть достигнуто равновесие между приемом и хранением 9-цис-ретинола, с одной стороны, и его мобилизацией в сетчатке для поддержания ретиноидного цикла, с другой. В согласии с этими результатами ЭРГ, 9--ретиналь детектировался дозозависимым образом в глазах, где уровни были выше у мышей, дозированных ежедневно (Фигура 13А). 9--ретиниловые эфиры жирных кислот на низких изменчивых уровнях также были обнаружены в глазах обеих групп прошедших лечение животных (Фигура 13B). Дозозависимое небольшое увеличение полностью -ретиниловых эфиров жирных кислот также было отмечено в глазах прошедших лечение мышей, независимо от режима. В печени 9--ретинол, по существу, сохранялся в виде 9--ретиниловых эфиров жирных кислот дозозависимым и режим-зависимым образом (Фигура 14А, B). Уровни жирных кислот полностью -ретиниловых эфиров, по существу, не зависели от этих режимов, несмотря на то, что могли быть немного увеличенными у мышей, получавших 4 мг/кг 9-цис-R-Ac. Долговременное введение 9--R-Ac обладало дозозависимым защитным действием на сетчатку, что оценивалось по длине внешних сегментов фоторецепторов (Фигура 9A, C) и числу ядер во внешнем ядерном слое (Фигура 9B, D). Эти эффекты были более выраженными во внешней, чем во внутренней области сетчатки. Изображения при более сильном увеличении поперечных срезов сетчатки показали улучшение морфологии палочкового наружного сегмента (ROS) и уменьшение структур, похожих на масляные капельки, в частях внешних и внутренних областей сетчаток мышей, прошедших лечение режимами либо 4 мг/кг ежедневно, либо 4 мг/кг прерывисто (Фигура 9E, F). При этом не наблюдалось существенного изменения в сетчатках мышей, получавших дозу 1 мг/кг 9-цис-R-Ac при помощи любой схемы (Фигура 9G, H), по сравнению с сетчатками контрольных мышей (Фигура 9).
цис
Rpe65
-/-
Важно, что ЭРГ-ответы мышей, прошедших прерывистое лечение 9--R-Ac, свидетельствовали об отсутствии существенных различий между группами доз 1 и 4 мг/кг в день 56, что позволяет предположить, что более низкая доза 1 мг/кг может обладать сходной эффективностью, если давать беспрерывно. Как показано на Фигуре 9, наблюдались морфологические улучшения ROS, такие что длины ROS были значительно больше у внешних областей сетчатки мышей, прошедших лечение 4 мг/кг, в то время как у животных, получавших дозу 1 мг/кг, существенных изменений не отмечалось. Эти наблюдения позволяют сделать обоснованное предположение, что режимы лечения с использованием как 1, так и 4 мг/кг поддерживали функцию сетчатки у мышей без существенной клинической токсичности или ненормального ретиноидного накопления в глазах и печени.
Все вышеприведенные патенты США, публикации патентных заявок США, патентные заявки США, иностранные патенты, иностранные патентные заявки и непатентные публикации, упомянутые в настоящей спецификации и/или перечисленные в инструкции по применению, включены в настоящем документе посредством ссылки в их полном объеме.
Из вышесказанного должно быть понятно, что, несмотря на то, что конкретные варианты осуществления изобретения были описаны в настоящем документе в иллюстративных целях, различные модификации могут быть сделаны без отступления от духа и границ изобретения. Соответственно, изобретение не ограничивается ничем, кроме как прилагаемыми пунктами формулы изобретения.