СПОСОБЫ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПОМПЕ

1. Выделенный молекулярный комплекс, обладающий активностью кислой альфа-глюкозидазы (GAA) и включающий, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1 в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74; при этом указанный молекулярный комплекс включает, по меньшей мере, одну модификацию, которая приводит к увеличению способности указанного молекулярного комплекса транспортироваться внутрь клетки млекопитающего.
2. Молекулярный комплекс по п. 1, отличающийся тем, что каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 60 и аминокислотой 65.
3. Молекулярный комплекс по п. 1, отличающийся тем, что указанный комплекс включает, по меньшей мере, три полипептида.
4. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что протеолиз аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, также включает расщепление в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 719 и аминокислотой 746 или расщепление в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 137 и аминокислотой 151 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1.
5. Молекулярный комплекс по пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный комплекс включает, по меньшей мере, четыре полипептида.
6. Молекулярный комплекс по п. 5, отличающийся тем, что протеолиз также включает расщепление в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 719 и аминокислотой 746 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, и расщепление в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 137 и аминокислотой 151 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1.
7. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один из указанных полипептидов включает один или несколько фосфорилированных N-гликанов, при этом указанная модификация включает декэпирование и деманнозилирование, по меньшей мере, одного фосфорилированного N-гликана.
8. Молекулярный комплекс по п. 5, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 40% N-гликанов на указанном полипептиде являются декэпированными и деманнозилированными.
9. Молекулярный комплекс по п. 8, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 60% N-гликанов на указанном полипептиде являются декэпированными и деманнозилированными.
10. Молекулярный комплекс по п. 8, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 80% N-гликанов на указанном полипептиде являются декэпированными и деманнозилированными.
11. Молекулярный комплекс по п. 8, отличающийся тем, что, по меньшей мере, 90% N-гликанов на указанном полипептиде являются декэпированными и деманнозилированными.
12. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1.
13. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 95% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1.
14. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что для одного из указанных, по меньшей мере, двух полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 22 до 57 SEQ ID NO:1, при этом для одного из указанных, по меньшей мере, двух полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 66 до 896 SEQ ID NO:1.
15. Молекулярный комплекс по любому из пп. 3, 6, 8-11, отличающийся тем, что для одного из указанных, по меньшей мере, трех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 22 до 57 SEQ ID NO:1, при этом для одного из указанных, по меньшей мере, трех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 66 до 726 SEQ ID NO:1, при этом для одного из указанных, по меньшей мере, трех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 736 до 896 SEQ ID NO:1.
16. Молекулярный комплекс по любому из пп. 6, 8-11, отличающийся тем, что для одного из указанных, по меньшей мере, четырех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 22 до 57 SEQ ID NO:1, при этом для одного из указанных, по меньшей мере, четырех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 66 до 143 SEQ ID NO:1, при этом для одного из указанных, по меньшей мере, четырех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 158 до 726 SEQ ID NO:1, при этом для одного из указанных, по меньшей мере, четырех полипептидов указанный сегмент включает аминокислоты от 736 до 896 SEQ ID NO:1.
17. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает лиганд для внеклеточного рецептора, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
18. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает таргетирующий домен, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов, при этом указанный таргетирующий домен связывает внеклеточный домен рецептора на поверхности клетки-мишени.
19. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает плазминогенный рецептор урокиназного типа, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
20. Молекулярный комплекс по любому из пп. 1-3, 6, 8-11, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает распознающий домен инсулинподобного фактора роста II человека, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
21. Композиция, содержащая молекулярный комплекс по любому из пп. 1-20, в которой указанный молекулярный комплекс является лиофилизированным.
22. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что указанная композиция упакована во флакон для одноразового применения.
23. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулярный комплекс по любому из пп. 1-20 и фармацевтически приемлемый носитель.
24. Композиция по п. 23, отличающаяся тем, что указанная композиция составлена для внутривенного или подкожного введения.
25. Композиция по п. 23, отличающаяся тем, что указанная композиция составлена для внутривенной инфузии.
26. Способ лечения болезни Помпе, включающий введение указанной композиции по любому из пп. 23-25 пациенту с диагностированной болезнью Помпе.
27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что указанному пациенту диагностирована инфантильная форма болезни Помпе.
28. Способ по п. 26, отличающийся тем, что указанному пациенту диагностирована взрослая форма болезни Помпе.
29. Способ получения молекулярного комплекса, включающий контактирование полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1, с протеазой, обладающей, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8, при этом указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанное контактирование осуществляют in vitro.
31. Способ по п. 29 или 30, отличающийся тем, что указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 60 и аминокислотой 65.
32. Способ получения молекулярного комплекса, включающего декэпированные и деманнозилированные фосфорилированные N-гликаны, при этом указанный способ включает контактирование молекулярного комплекса с маннозидазой, способной (i) гидролизовать маннозо-1-фосфо-6-маннозный остаток с образованием маннозо-6-фосфата и (ii) гидролизовать терминальные связи с альфа-1,2-маннозой, альфа-1,3-маннозой и/или альфа-1,6-маннозой, при этом указанный молекулярный комплекс обладает GAA активностью и включает, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74, при этом, по меньшей мере, один из указанных полипептидов включает фосфорилированные N-гликаны, содержащие один или несколько маннозо-1-фосфо-6-маннозных остатков.
33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой гликозилгидролазу семейства 38.
34. Способ по п. 32 или 33, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой маннозидазу Canavalia ensiformis.
35. Способ по п. 32 или 33, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой маннозидазу Yarrowia lipolytica.
36. Способ по любому из пп. 32-33, отличающийся тем, что указанное контактирование осуществляют в рекомбинантной грибковой клетке, при этом указанная грибковая клетка экспрессирует указанную маннозидазу.
37. Способ по любому из пп. 32-33, отличающийся тем, что указанный способ также включает контактирование клетки млекопитающего с указанным молекулярным комплексом, включающим, по меньшей мере, один полипептид, включающий указанные декэпированные и деманнозилированные N-гликаны, при этом после указанного контактирования указанный молекулярный комплекс транспортируется внутрь указанной клетки млекопитающего с повышенной эффективностью.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека.
39. Способ получения молекулярного комплекса, включающего декэпированные и деманнозилированные фосфорилированные N-гликаны, при этом указанный способ включает контактирование молекулярного комплекса с маннозидазой, способной гидролизовать терминальные связи с альфа-1,2-маннозой, альфа-1,3-маннозой и/или альфа-1,6-маннозой, при этом указанный молекулярный комплекс обладает GAA активностью и включает, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74, при этом до контактирования, по меньшей мере, один из указанных полипептидов включает фосфорилированные N-гликаны, включающие декэпированные маннозо-6-фосфатные остатки.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой гликозилгидролазу семейства 47.
41. Способ по п. 39 или 40, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой маннозидазу Aspergillus satoi.
42. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой гликозилгидролазу семейства 92.
43. Способ по п. 39 или 42, отличающийся тем, что маннозидаза представляет собой маннозидазу Cellulosimicrobium cellulans.
44. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой гликозилгидролазу семейства 38.
45. Способ по п. 39 или 44, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой маннозидазу Canavalia ensiformis.
46. Способ по любому из пп. 39, 40, 42, 44, отличающийся тем, что указанное контактирование осуществляют в рекомбинантной грибковой клетке, при этом указанная грибковая клетка экспрессирует указанную маннозидазу.
47. Способ по любому из пп. 39, 40, 42, 44, отличающийся тем, что указанный способ также включает контактирование клетки млекопитающего с указанным молекулярным комплексом, включающим, по меньшей мере, один полипептид, включающий указанные декэпированные и деманнозилированные N-гликаны, при этом после указанного контактирования указанный молекулярный комплекс транспортируется внутрь указанной клетки млекопитающего с повышенной эффективностью.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека.
49. Способ получения молекулярного комплекса, включающего декэпированные и деманнозилированные фосфорилированные N-гликаны, при этом указанный способ включает контактирование молекулярного комплекса с маннозидазой, способной гидролизовать маннозо-1-фосфо-6-маннозный остаток с образованием маннозо-6-фосфата, при этом указанный молекулярный комплекс обладает GAA активностью и включает, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74, при этом до контактирования, по меньшей мере, один из указанных полипептидов включает маннозо-1-фосфо-6-маннозные остатки.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой гликозилгидролазу семейства 38.
51. Способ по п. 49 или 50, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой маннозидазу Canavalia ensiformis.
52. Способ по п. 49 или 50, отличающийся тем, что указанная маннозидаза представляет собой маннозидазу Yarrowia lipolytica.
53. Способ по любому из пп. 49-50, отличающийся тем, что указанный способ также включает контактирование клетки млекопитающего с указанным молекулярным комплексом, включающим, по меньшей мере, один полипептид, включающий указанные декэпированные и деманнозилированные N-гликаны, при этом после указанного контактирования указанный молекулярный комплекс транспортируется внутрь указанной клетки млекопитающего с повышенной эффективностью.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека.
55. Способ получения молекулярного комплекса, включающего декэпированные и деманнозилированные фосфорилированные N-гликаны, при этом указанный способ включает
а) контактирование молекулярного комплекса с маннозидазой, способной гидролизовать маннозо-1-фосфо-6-маннозный остаток с образованием маннозо-6-фосфата для декэпирования маннозо-6-фосфатных остатков в, по меньшей мере, одном полипептиде в указанном молекулярном комплексе, при этом молекулярный комплекс обладает GAA активностью и включает, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно аминокислотного сегмента, указанного в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1 в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74; и
b) контактирование указанного молекулярного комплекса с маннозидазой, способной гидролизовать терминальные связи с альфа-1,2-маннозой, альфа-1,3-маннозой и/или альфа-1,6-маннозой.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что этап (а) и этап (b) катализируются двумя различными ферментами.
57. Способ по п. 55, отличающийся тем, что этап (а) и этап (b) катализируются одним ферментом.
58. Способ по п. 55 или 56, отличающийся тем, что контактирование осуществляют в рекомбинантной грибковой клетке-хозяине, при этом указанная грибковая клетка-хозяин экспрессирует маннозидазу, способную катализировать этап (а), и маннозидазу, способную катализировать этап (b).
59. Способ по п. 55 или 57, отличающийся тем, что контактирование осуществляют в рекомбинантной грибковой клетке-хозяине, при этом указанная грибковая клетка-хозяин экспрессирует маннозидазу, способную катализировать этапы (а) и (b).
60. Способ по любому из пп. 55-57, отличающийся тем, что указанный способ также включает контактирование клетки млекопитающего с указанным молекулярным комплексом, включающим, по меньшей мере, один полипептид, включающий указанные декэпированные и деманнозилированные N-гликаны, при этом после указанного контактирования указанный молекулярный комплекс транспортируется внутрь указанной клетки млекопитающего с повышенной эффективностью.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека.
62. Способ транспортирования молекулярного комплекса, обладающего GAA активностью, внутрь клетки, при этом указанный способ включает контактирование клетки млекопитающего с указанным молекулярным комплексом, при этом указанный молекулярный комплекс включает, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74; при этом фосфорилированные N-гликаны на, по меньшей мере, одном из указанных полипептидов были декэпированы и деманнозилированы как указано в способах по любому из пп. 32-62.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку in vitro.
64. Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего находится в субъекте, представляющем собой млекопитающее.
65. Способ по любому из пп. 63 и 64, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека.
66. Способ по любому из пп. 62-64, отличающийся тем, что указанная модификация включает таргетирующий домен, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов, при этом указанный таргетирующий домен связывает внеклеточный домен рецептора на поверхности клетки-мишени.
67. Способ по любому из пп. 62-64, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает плазминогенный рецептор урокиназного типа, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
68. Способ по любому из пп. 62-64, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает распознающий домен инсулинподобного фактора роста II человека, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
69. Способ транспортирования молекулярного комплекса, обладающего GAA активностью, внутрь клетки, при этом указанный способ включает контактирование клетки млекопитающего с указанным молекулярным комплексом, при этом указанный молекулярный комплекс включает, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74, при этом указанный молекулярный комплекс включает, по меньшей мере, одну модификацию, которая приводит к увеличению способности указанного молекулярного комплекса транспортироваться внутрь клетки млекопитающего.
70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку in vitro.
71. Способ по п. 69, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего находится в субъекте, представляющем собой млекопитающее.
72. Способ по любому из пп. 70 и 71, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека.
73. Способ по любому из пп. 69-71, отличающийся тем, что указанная модификация включает таргетирующий домен, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов, при этом указанный таргетирующий домен связывает внеклеточный домен рецептора на поверхности клетки-мишени.
74. Способ по любому из пп. 69-71, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает плазминогенный рецептор урокиназного типа, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
75. Способ по любому из пп. 69-71, отличающийся тем, что указанная, по меньшей мере, одна модификация включает распознающий домен инсулинподобного фактора роста II человека, слитый, по меньшей мере, с одним из указанных полипептидов.
76. Выделенная грибковая клетка, включающая нуклеиновую кислоту, кодирующую GAA аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, и нуклеиновую кислоту, кодирующую щелочную протеазу, обладающую, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8, при этом указанная грибковая клетка продуцирует молекулярный комплекс, обладающий GAA активностью и включающий, по меньшей мере, два полипептида, при этом каждый полипептид обладает, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно сегмента аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, при этом каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74 указанной щелочной протеазой.
77. Выделенная грибковая клетка по п. 76, отличающаяся тем, что каждый сегмент получен протеолизом аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, в одном или нескольких сайтах между аминокислотой 60 и аминокислотой 65 указанной щелочной протеазой.
78. Грибковая клетка по п. 76 или 77, отличающаяся тем, что указанная грибковая клетка включает также нуклеиновую кислоту, кодирующую маннозидазу, при этом указанная маннозидаза способна (i) гидролизовать маннозо-1-фосфо-6-маннозный остаток с образованием маннозо-6-фосфата и (ii) гидролизовать терминальную связь с альфа-1,2-маннозой, альфа-1,3-маннозой и/или альфа-1,6-маннозой.
79. Грибковая клетка по п. 76 или 77, отличающаяся тем, что указанная грибковая клетка включает также нуклеиновую кислоту, кодирующую маннозидазу, при этом указанная маннозидаза способна гидролизовать маннозо-1-фосфо-6-маннозный остаток с образованием маннозо-6-фосфата.
80. Грибковая клетка по п. 76 или 77, отличающаяся тем, что указанная грибковая клетка включает также нуклеиновую кислоту, кодирующую маннозидазу, при этом указанная маннозидаза способна гидролизовать терминальную связь с альфа-1,2-маннозой, альфа-1,3-маннозой и/или альфа-1,6-маннозой.
81. Грибковая клетка по п. 77, отличающаяся тем, что указанная грибковая клетка также включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, способный промотировать маннозил-фосфорилирование.
82. Грибковая клетка по любому из пп. 76, 77, 81, отличающаяся тем, что указанная грибковая клетка является генетически модифицированной для устранения ОСН1 активности.
83. Выделенная грибковая клетка, включающая экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую щелочную протеазу, обладающую, по меньшей мере, 85% идентичностью последовательности относительно аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:8.