Лабораторные исследования деградации полигидроксиалканоатов различной химической структуры в почве

Journal of Siberian Federal University. Biology 2 (2015 8) 210-219

УДК 504.53:579.26

Laboratory Research of Degradation of Polyhydroxyalkanoates of Different Chemical Structure in Soil

Olga N. Vinogradova* and Daria A. Syrvacheva

Institute of Biophysics of SB RAS 50/50 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russia

Received 14.01.2015, received in revised form 16.02.2015, accepted 22.04.2015 Degradation of three types ofpolyhydroxyalkanoates (PHAs) was studied in the laboratory conditions in the field soil at two temperature regimes during 35 days. It was shown that composition of PHA and the degree of crystallinity have a significant effect on degradation of PHA films. The order of biodegradability of film samples was: poly-3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate (P3HB-co-4HB) > poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (P3HB-co-3HV) > poly-3-hydroxybutyrate (P3HB). Samples of P3HB-co-4HB copolymers with the lowest degree of crystallinity were destroyed most actively; a significant decrease of molecular weight of P3HB-co-4HB during destruction was found. The initial molecular weight of the samples did not affect the process ofPHA destruction. A significant effect of the medium temperature on the rate of PHA degradation was found; PHA samples were destroyed 1.5-2 times more actively at 28 °С compared to 21 °C.

Keywords: degradable biopolymers, polyhydroxyalkanoates (PHAs), copolymers, 3-hydroxybutyrate, 4-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, biodegradation in the soil.

DOI: 10.17516/1997-1389-2015-8-2-210-219.

© Siberian Federal University. All rights reserved

* Corresponding author E-mail address: olgav88@mail.ru

Лабораторные исследования деградации полигидроксиалканоатов различной химической структуры в почве

О.Н. Виноградова, Д.А. Сырвачева

Институт биофизики СО РАН Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50

Исследована деградация трех типов полигидроксиалканоатов (ПГА) в лабораторных условиях в полевой почве при двух температурных режимах в течение 35 суток. Показано существенное влияние состава мономеров и степени кристалличности ПГА на разрушаемость в лабораторных почвенных микроэкосистемах. Пленочные образцы поли-3-гидроксибутирата (П3ГБ), поли-3-гидроксибутирата/4-гидроксибутирата (П3ГБ/4ГБ), поли-3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата (П3ГБ/3ГВ) по активности разрушения в почве расположены в ряду: П3ГБ/4ГБ > П3ГБ/3ГВ > П3ГБ. Наиболее активно разрушаются образцы сополимеров П3ГБ/4ГБ, имеющие самую низкую степень кристалличности, для которых зарегистрировано значительное падение молекулярной массы по мере разрушения. Влияния исходной величины молекулярной массы образцов на процесс разрушения ПГА не обнаружено. Подтверждено существенное влияние температуры среды на активность разрушения ПГА; при 28 °С образцы ПГА разрушаются в 1,5-2 раза активнее, чем при 21 °С.

Ключевые слова: разрушаемые биополимеры, полигидроксиалканоаты (ПГА), сополимеры, 3-гидроксибутират, 4-гидроксибутират, 3-гидроксивалерат, биодеградация в почве.

Введение

Наращивание объемов производства и применение микробных биопластиков -разрушаемых полигидроксиалканоатов (ПГА) - делает необходимым активизацию исследований закономерностей их разрушения в природных средах с учетом различий географических и погодно-климатических условий. К настоящему времени исследована разрушаемость в основном двух представителей этого класса биополимеров -гомогенного поли-3 -гидроксибутирата (П3ГБ) и сополимеров 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом (П3ГБ/3ГВ) (Doi et а1., 1992; Ме^аеП et а1., 1995; Tomasi et а1., 1996).

Большой вклад в изучение разрушаемо-сти ПГА внесли исследования, проводимые в Институте биофизики СО РАН и Сибирском федеральном университете. В течение ряда лет изучались закономерности биоразрушения П3ГБ и П3ГБ/3ГВ в виде пленок и прессованных 3D-форм в реальных природных условиях - в водных и почвенных экосистемах, различающихся структурой микробиоценозов. Исследования проведены в пресноводных водоемах (Уо^а et а1., 2004; 2006; 2007) и почвах сибирского региона (Прудникова и др., 2012; ВоуаМш et а1., 2012а), солоновод-ном лечебном озере Шира (Жила и др., 2012), в тропических условиях: в Южно-Китайском море (Уо^а et а1., 2010; 2011; ВоуаМш et а1.,

2013), материковых и прибрежных почвах (Прудникова и др., 2012; Boyandin et al., 2013). Обобщением этих исследований стало издание монографии «Экологическая роль поли-гидроксиалканоатов: закономерности биоразрушения в природной среде и взаимодействия с микроорганизмами» (Прудникова, Волова, 2012).

Полигидроксиалканоаты - это семейство полимеров различной химической структуры, свойства которых значительно варьируют (Laycock et al., 2013; Chen et al., 2001). Вариабельность химической структуры и вытекающая из этого вариабельность физико-химических свойств оказывает влияние также и на процессы биоразрушения этих полимеров (Steinbüchel, 2001; Williams et al., 1999; Freier et al., 2002; Na et al., 2003; Janigova et al., 2002; Aoyagi et al., 2002; Tsuji, Suzuyoshi, 2002; He et al., 2001).

Особо перспективными, но трудносин-тезируемыми ПГА являются сополимеры, обладающие свойствами эластомеров, содержащие в своем составе помимо 3-гидроксибу-тирата (3ГБ) мономеры 4-гидроксибутирата (4ГБ). Сополимеры 3ГБ/4ГБ характеризуются более низкими значениями степени кристалличности, температуры плавления и термической деградации (Volova et al., 2014). В литературе известны лишь единичные работы по изучению деградации сополимеров этих типов (Wen, Lu, 2012; Weng et al., 2011; Salim et al., 2012), показавшие, что скорости разрушения П3ГБ/4ГБ существенно превосходят таковые у П3ГБ и П3ГБ/3ГВ (Weng et al., 2011; Salim et al., 2012).

В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте исследована кинетика биоразрушения трех представителей ПГА, различающихся химическим строением и базовыми физико-химическими свойствами, в лабораторных почвенных микроэкосистемах.

Материалы и методы

Исследованы образцы полигидрокси-алканоатов, синтезированные в культуре бактерий Cupriavidus eutrophus B10646 в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН по авторской технологии (Volova et al., 2013, 2014): гомо-полимер поли-3 -гидроксибутират (П3ГБ) и сополимеры поли(3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата) (П3ГБ/3ГВ) с включением 3-гидроксивалерата 32 мол. % и поли(3-гидроксибутирата/4-гидроксибутирата) (П3ГБ/4ГБ) с включением 4-гидроксибутира-та 35 мол. %. Различия химической структуры образцов ПГА показаны на рис. 1.

Исследованы образцы в виде пленок, полученных методом полива из растворов полимеров в хлороформе. Гомогенные растворы, содержащие 40 г/л полимера, нагретые до 35 °С, выливали на обезжиренную поверхность чашек Петри и высушивали в течение 2-3 суток при комнатной температуре в ламинарном боксе (Labconco, США) и досушивали до постоянного веса в десикаторе. Для экспериментов из пленок высекали диски диаметром 30 мм, толщиной 0,045±0,005 мм, которые взвешивали на аналитических весах 1-го класса точности Discovery (Ohaus, Швейцария).

Взвешенные образцы ПГА помещали в нейлоновые сетки и размещали по 3 штуки в пластиковых контейнерах объемом 250 см3 с полевой почвой (200 г) на глубину 2 см. Полевая почва (Красноярский край, пос. Минино) - агрочернозем криогенно-мицеллярный, характеризуется высоким содержанием гумуса, слабощелочной реакцией среды (рН 7,1-7,8). Плотность почвы имеет рыхлое и нормальное сложение пахотного слоя (0,85-1,11 г/см3). Общий титр органотрофных бактерий составил 16,3±5,1 млн КОЕ в 1 г.

Рис. 1. Структурные формулы исследованных представителей ПГА

Длительность экспозиции полимерных пленок в почве составила 35 суток при двух температурных режимах - 21 и 28 °С; абсолютной влажности почвы - 50 %. Уменьшение массы образцов определяли в динамике с периодичностью в 7 дней, для этого образцы ПГА (по 3 шт.) изымали из почвы. Одновременно с отбором проб ПГА регистрировали рН и влажность почвы с использованием стандартных физико-химических методов (Звягинцев, 1990). Образцы после изъятия из почвы отмывали от земли дистиллированной водой, помещали в термостат при 40 °С на 24 ч для высушивания до постоянного веса, далее пленки взвешивали.

Показателями биодеградации ПГА служили: убыль массы образцов, изменение молекулярно-массовых характеристик, степени кристалличности; морфология и свойства поверхности.

Молекулярно-массовые характеристики образцов ПГА исследовали методом гель-проникающей хроматографии (модель 1260 Infinity, «Agilent Technologies», США) с детектором показателя преломления, используя колонку Agilent PLgel Mixed-C. Определяли средневесовую (Мв) и средне-числовую молекулярную массу (Мч) и полидисперсность (В), позволяющую оценить соотношение в полимере фрагментов с различной степенью полимеризуемости. Определение степени кристалличности образцов проводили на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE (Bruker, Германия). Степень

кристалличности (Сх) вычисляли как соотношение общей площади кристаллических пиков к общей площади радиограммы (кри-сталличные + аморфные компоненты). Термический анализ проведен с использованием дифференциально-сканирующего калориметра DSC-1 (METTLER TOLEDO, Швейцария). Температуру плавления и термической деградации определяли по экзотермическим пикам на термограммах. Термограммы анализировали с помощью программного обеспечения STARe v11.0 (METTLER TOLEDO, Швейцария).

Статистическую обработку результатов осуществляли общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением.

Результаты и обсуждение

Исследованные образцы ПГА отличались по физико-химическим свойствам (табл. 1). Наиболее существенные отличия исследованных образцов - различия степени кристалличности. Самая высокая степень кристалличности (76 %) характерна для гомополимера П3ГБ; у сополимера 3ГБ/3ГВ - существенно ниже (51 %), а у сополимера 3ГБ/4ГБ - еще ниже (39 %). Самые высокие и близкие значения молекулярно-массовых характеристик были у П3ГБ и сополимера 3ГБ/3ГВ (Мв 920 и 1120 кДа); у сополимера 3ГБ/4ГБ - ниже практически в 2 раза (597 кДа). Полидисперсность

Таблица 1. Состав и физико-химические свойства полимерных образцов ПГА, экспонированных в почве

Номер п/п Состав ПГА, мол. % Мч, кДа Мв, кДа В Сх, % Т °С 1 пл ^ Т °С ^дегр, ^

3ГБ 4ГБ 3ГВ

1 100 0 0 365 920 2,52 76 178 295

2 65 35 0 149 597 4,00 39 167 280

3 68 0 32 460 1120 2,00 51 177 284

Примечание: Мч - среднечисловая молекулярная масса, Мв - средневесовая молекулярная масса, В - полидисперсность, Сх - степень кристалличности, Тпл - температура плавления, Тдегр - температура термической деградации.

3 ГЬ 3 ГВ-32 моп. % <1ГБ-35 моп. %

О 7 14 21 2« 35

Время эксг оз ицин. сутки

Рис. 2. Динамика уменьшения массы образцов пленок, полученных из ПГА различного химического состава, в почве при 28 °С

исследуемых образцов также менялась от 2,0 до 4,0 в зависимости от состава ПГА.

Различия химической структуры и свойств оказывали влияние на кинетику разрушения ПГА (рис. 2). При 28 °С (эта температура выбрана с учетом известных данных о том, что она является оптимальной для максимальной разрушаемости ПГА) (Волова и др., 1998) в течение первых 7 суток отмечена убыль массы всех пленочных образцов; наиболее выражено на 30 % от исходной у П3ГБ/4ГБ, в меньшей степени (на 10 %) - у П3ГБ.

Далее наступала фаза интенсивной деструкции, в ходе которой масса образцов убывала более активно. Установлено, что

наиболее подвержены разрушению пленки из сополимера 3ГБ/4ГБ, масса которых на 21-е сутки экспозиции была разрушена на 97 % от исходной. В эти сроки масса гомополимера уменьшилась на 60 %, и только на 35-е сутки зафиксировано разрушение П3ГБ на 93 %. Разрушаемость сополимера 3ГБ/3ГВ была сопоставимой и занимала промежуточное положение между быстро разрушаемым П3ГБ/4ГБ и медленно разрушаемым П3ГБ. Таким образом, три исследованных типа ПГА по скорости разрушаемости при 28 °С в почве можно расположить следующим образом: П3ГБ/4ГБ > П3ГБ/3ГВ > П3ГБ.

Внешний вид пленок гомополимера П3ГБ и сополимеров 3ГБ/3ГВ и 3ГБ/4ГБ в ходе раз-

Рис. 3. Внешний вид пленок из ПГА в ходе разрушения в почве при 28 °С: а - П3ГБ/4ГБ; б - П3ГБ/3ГВ; в - П3ГБ

3ГБ ЗГВ-Э2 ноя. % 4ГБ-35 мол. %

ti Н-,-,-т-т-

fl 7 И 21 2ft 35

Время экспозиции, сутки

Рис. 4. Динамика уменьшения массы образцов пленок, полученных из ПГА различного химического состава, в почве при 21 °С

рушения при температуре 28 °С показан на рис. 3.

При снижении температуры почвы до 21 °С разрушение всех образцов происходило менее активно (рис. 4 и 5).

За первые 7 суток зафиксировано разрушение всех образцов, но убыль массы была практически в 2 раза ниже, чем при 28 °С. При этом влияние состава ПГА на интенсивность биодеградации была аналогичной.

Пленки из П3ГБ/4ГБ разрушились к 28-м суткам практически на 90 %; из П3ГБ/3ГВ на 75 % от исходной массы. И только пленки из гомополимера П3ГБ разрушались медленно. Эти образцы разрушились только на 60 % на 35-е сутки эксперимента.

Вычисленные значения скорости разрушения ПГА дали следующие показатели: при 21 °С в среднем убыль массы образцов гомополимера П3ГБ составляла 1,57 мг/сут, у

0 7 14 21 28 35 сутки

Рис. 5. Внешний вид пленок из ПГА в ходе разрушения в почве при 21 °С: а - П3ГБ/4ГБ; б - П3ГБ/3ГВ; в - П3ГБ

сополимера 3ГБ/3ГВ - 2,46 мг/сут, 3ГБ/4ГБ -3,15 мг/сут. При 28 °С убыль массы образцов ПГА была на 40 % выше и составила у П3ГБ 2,58 мг/сут, у П3ГБ/3ГВ - 4,08 мг/сут и у П3ГБ/4ГБ - 4,5 мг/сут.

Как известно, на скорость деградации ПГА влияет степень кристалличности, чем она ниже, т.е. выше объем неупорядоченной (аморфной) фазы в полимере, тем активнее разрушается полимер (Кипюка et а1., 1989). Полученные результаты согласуются с этим положением. Наиболее активно разрушаемые образцы П3ГБ/4ГБ исходно имели самую низкую кристалличность; и, напротив, наиболее кристалличные образцы гомополимера П3ГБ разрушались менее активно. Образцы П3ГБ/3ГВ, имеющие кристалличность выше, чем у П3ГБ/4ГБ, и ниже, чем у П3ГБ, по активности разрушения занимали промежуточное положение.

Результаты исследования степени кристалличности разрушенных образцов ПГА представлены на рис. 6. Степень кристалличности наименее разрушенных образцов П3ГБ через 35 суток экспозиции в почве практически не изменилась. Это позволяет

говорить о том, что в процессе разрушения этого типа ПГА обе фазы (кристаллическая и аморфная) разрушались равномерно. Степень кристалличности образцов сополимера 3ГБ/3ГВ возрастала от исходной 51 %, при этом более отчетливо при 21 °С до 63 %, т.е. в данном случае более активно разрушалась аморфная фаза. Еще более выражен этот эффект для сополимера 3ГБ/4ГБ, степень кристалличности которых от исходной (39 %) возросла до 50 % при 28 °С и до 54 % при 21 °С.

Прямой связи между разрушаемостью образцов ПГА и исходными значениями молекулярной массы не выявлено. Однако обнаружено, что изменение этой величины в ходе разрушения пленок было различным. Величина средневесовой молекулярной массы медленно разрушаемого гомополимера П3ГБ, а также сополимера 3ГБ/3ГВ практически не изменялись, несмотря на значительную убыль массы. Однако у наиболее активно разрушаемого сополимера 3ГБ/3ГВ уже через 7 суток отмечено резкое снижение значений молекулярной массы и возрастание полидисперсности, однако далее продолжалось не-

Рис. 6. Изменение степени кристалличности образцов ПГА в ходе разрушения в почве при различных температурных режимах

значительное снижение массы. Так, при экспонировании образцов при температуре 21 °С за первую неделю среднечисловая и средне-весовая молекулярные массы снизились в 4 и 1,88 раза соответственно, а В возросла в 2,2 раза. К концу эксперимента эти значения составили 26 и 255 кДа соответственно. При 28 °С также за первую неделю происходило значительное снижение молекулярной массы, в 2 и 1,5 раза соответственно, и возрастание величины В в 1,4 раза.

Заключение

Таким образом, в ходе сравнительного исследования трех типов ПГА различной химической структуры в лабораторных по-

чвенных микроэкосистемах показано существенное влияние состава мономеров и степени кристалличности ПГА на их раз-рушаемость. Наиболее активно разрушаются образцы сополимера 3ГБ/4ГБ, имеющие самую низкую степень кристалличности, для которых зарегистрировано значительное падение молекулярной массы по мере разрушения. По активности разрушения ПГА в почве образцы расположены в ряду: П3ГБ/4ГБ > П3ГБ/3ГВ > П3ГБ. Влияния исходной величины молекулярной массы образцов на процесс разрушения ПГА не обнаружено. Подтверждено существенное влияние температуры среды на активность разрушения ПГА.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 14-26-00039.

Список литературы

1. Волова Т.Г., Беляева О.Г., Плотников В.Ф., Пузырь А.П. (1998) Исследование биодеградации микробных полигидроксиалканоатов. Прикладная биохимия и микробиология 34 (5): 539-543 [Volova T.G., Belyaeva O.G., Plotnikov V.F., Puzyr' A.P. (1998) Study of microbial biodegradable polyhydroxyalkanoates. Applied Biochemistry and Microbiology 34 (5): 539-543].

2. Жила Н.О., Прудникова С.В., Задереев Е.С., Рогозин Д.Ю. (2012) Деградация пленок из полигидроксиалканоатов в солоноватоводном озере Шира. Журнал СФУ 5 (2): 210-215 [Zhila

- 217 -

N.O., Prudnikova S.V., Zadereev E.S., Rogozin D.Y. (2012) Degradation of polyhydroxyalkanoate films in brackish lake Shira. Journal of Siberian Federal University, Biology 5 (2): 210-215 (In Russian)].

3. Звягинцев Д.Г. (1990) Методы почвенной микробиологии и биохимии. М: МГУ, 303 с. [Zvyagintsev D.G. (1990) Methods of soil microbiology and biochemistry. M: MSU, 303 p.].

4. Прудникова С.В., Коробихина К.И., Бояндин А.Н., Волова Т.Г. (2012) Закономерности биоразрушения полигидроксиалканоатов на территории Вьетнама и Центральной Сибири. Журнал СФУ, Биология 5 (3): 311-321 [Prudnikova S.V., Korobikhina K.I., Boyandin A.N., Volova T.G. (2012) Biodegradation behavior of polyhydroxyalkanoates on the territory of Vietnam and Central Siberia. Journal of Siberian Federal University, Biology 5 (3): 311-321 (In Russian)].

5. Aoyagi Y., Yamashita K., Doi Y. (2002) Thermal degradation of poly[(R)-3-hydroxybutyrate], poly[epsilon-caprolactone], and poly [(S )-lactide]. Polym Degrad Stabil 76 (1): 53-59.

6. Boyandin A.N., Prudnikova S.V., Filipenko M.L., Khrapov E.A., Vasil'ev A.D., Volova T.G. (2012а) Biodegradation of polyhydroxyalkanoates by soil microbial communities of different structures and detection of PHA degrading microorganisms. Applied Biochemistry and Microbiology 48 (1): 28-36.

7. Boyandin A.N., Prudnikova S.V., Karpov V.A., Ivonin V.N., Korobohina K., Filipenko M.L., Volova T.G., Sinskey A.J. (2012b) Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates in tropical soils. Macromol. Symposium 320: 38-42.

8. Boyandin A.N., Prudnikova S.V., Karpov V. A., Ivonin V.N., Do Ngoc Lanh, Nguyen Thi Hoai, Le Thi My Hiep, Filipenko M.L., Volova T.G., Gitelson I.I. (2013) Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates in tropical soils. International Biodeterioration & Biodegradation 83: 77-84.

9. Chen G.Q., Wu Q., Chen J.C. (2001) Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate. Tsinghua J Sci Technol 6: 193-199.

10. Doi K., Kanesawa Y., Tanahashi N. (1992) Biodegradation of microbial polyesters in the marine environments. Polym Degrad Stab 36: 173-177.

11. Freier T., Kunze C., Nischan C., Kramer S., Sternberg K., Sass M. (2002) In vitro and in vivo degradation studies for development of a biodegradable patch based on poly (3-hydroxybutyrate). Biomaterials 23 (13): 2649-2657.

12. He Y., Shuai X.T., Cao A., Kasuya K., Doi Y., Inoue Y. (2001) Enzymatic biodegradation of synthetic atactic poly(R, S-3-hydroxybutyrate) enhanced by an amorphous nonbiodegradable polymer. Polym Degrad Stabil 73 (2):193-199.

13. Janigova I., Lacik I., Chodak I. (2002) Thermal degradation of plasticized poly(3-hydroxybutyrate) investigated by DSC. Polym Degrad Stabil 77 (1): 35-41..

14. Kunioka M., Kawaguchi Y., Doi Y. (1989) Production of biodegradable copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 4-hydroxybutyrate by Alcaligenes eutrophus. Appl Microbiol Biotechnol 30 (6): 569-573.

15. Mergaert J., Wouters A., Swings J., Anderson C. (1995) In situ biodegradation of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in natural waters. Can J Microbiol 41 (1):154-159.

16. Na Y.H., He Y., Nishiwaki T., Inagawa Y., Osanai Y., Matsumura S. (2003) Phase-separation enhanced enzymatic degradation of atactic poly(R, S-3-hydroxybutyrate) in the blends with poly(methyl methacrylate). Polym Degrad Stabil 79 (3): 535-545.

17. Steinbüchel A. (1991) Polyhydroxyalkanoic acids. In: Byrom D. (ed) Biomaterials: novel materials from biological sources. New York: Stockton, p. 124-213.

18. Tomasi G., Scandola M., Briese B.H., Jendrossek D. (1996) Enzymatic degradation of bacterial poly(3-hydroxybutyrate) by a depolymerase from Pseudomonas lemoignei. Macromolecules 29 (2): 507-513.

19. Tsuji H., Suzuyoshi K. (2002) Environmental degradation of biodegradable polyesters 2. Poly(epsilon-caprolactone), poly [(R)-3-hydroxybutyrate], and poly(L-lactide) films in natural dynamic seawater. Polym Degrad Stabil 75 (2): 357-365.

20. Voinova O.N., Gladyshev M.I., Volova T.G. (2008) Comparative study of PHA degradation in natural reservoirs having various types of ecosystems. Macromol Symposia 269: 34-37.

21. Volova T.G., Belyaeva O.G., Plotnikov V.F., Puzyr' A.P. (1996) Study of biodegradation of microbial polyhydroxylalkanoates. Doklady Biological Sciences 350: 504-508.

22. Volova T.G., Gladyshev M.I., Trusova M.Y., Zhila N.O., Kartushinskaya M.V. (2004) Degradation of bioplastics in natural environment. Doklady Biological Sciences 397: 330-332..

23. Volova T.G.,Gladyshev M.I., TrusovaM.Y., ZhilaN.O. (2006) Degradationofpolyhydroxyalkanoates and the composition of microbial destructors under natural conditions. Microbiology 80 (5): 593598.

24. Volova T.G., Gladyshev M.I., TrusovaM.Y.,ZhilaN.O. (2007) Degradationofpolyhydroxyalkanoates in eutrophic reservoir. Polym Degrad Stab 92: 580-586.

25. Volova T.G., Boyandin A.N., Vasiliev A.D (2010) Biodegradation of polyhydroxyalkanoates (PHAs) in tropical coastal waters and identification of PHA-degrading bacteria. Polym Degrad Stab 95: 2350-2359.

26. Volova T.G., Boyandin A.N., Vasil'ev A.D., Karpov V.A., Kozhevnikov I.V., Prudnikova S.V., Rudnev V.P., Büi Ba Xuän, V~uViet D~ung, Gitel'zon I.I. (2011) Biodegradation of polyhydroxyalkanoates (PHAs) in the South China Sea and identification of PHA-degrading bacteria. Microbiology 80 (2): 252-260.

27. Volova T., Kiselev E., Shishatskaya E., Zhila N., Boyandin A., Syrvacheva D., Vinogradova O., Kalacheva G., Vasiliev A., Peterson I. (2013) Cell growth and PHA accumulation from CO2 and H2 of a hydrogen-oxidizing bacterium, Cupriavidus eutrophus B-10646. Bioresource Technology 146: 215-222.

28. Volova T.G., Kiselev E.G., Vinogradova O.N., Nikolaeva E.D., Chistyakov A.A., Sukovatyi A.G., Shishatskaya E.I. (2014) A glucose-utilizing strain, Cupriavidus eutrophus B-10646: growth kinetics, characterization and synthesis of multicomponent PHAs. Plos One 9 (2): 1-15 - e87551..

29. Wen X., Lu X. (2012) Microbial degradation of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) in soil. J Polym Environ 20: 381-387.

30. Weng Y.-X., Wang X.-L., Wang Y.-Z. (2011) Biodegradation behavior of PHAs with different chemical structures under controlled composting conditions. Polymer Testing 30: 372-380.

31. Williams S.F., Martin D.P., Horowitz D.M., Peoples O.P. (1999) PHA applications: addressing the price performance issue I. Tissue engineering. Int J Biol Macromol 25(1-3): 111-121.