Роль NO-системы в морфогенезе заживления кожных ран при сахарном диабете

МОРФОЛОГИЯ

А. В. Смирнов, Н. Г. Паньшин, А. А. Слиецанс, Е. М. Ломкина

Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ, кафедра патологической анатомии, ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

РОЛЬ NO-СИСТЕМЫ В МОРФОГЕНЕЗЕ ЗАЖИВЛЕНИЯ КОЖНЫХ РАН ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

УДК 661.98+616.379-008.64-092.4:616-001.4-003.9

Проанализирована морфология раневого процесса у крыс с сахарным диабетом и моделированными плоскостными ранами на фоне блокады NO-системы. Показано влияние блокады конститутивной и индуцибельной NO-синтаз на морфогенез раневого процесса. (В чем это выразилось?) Определена роль NO-системы в механизмах заживления ран у крыс при экспериментальном сахарном диабете.

Ключевые слова: сахарный диабет, раны, оксид азота, аминогуанидин, L-NAME.

A. V. Smirnov, N. G. Panshin, A. A. Slietsans, E. V. Lomkina

THE ROLE OF THE NO-SYSTEM IN THE MORPHOGENESIS OF SKIN WOUND HEALING IN DIABETES MELLITUS

The morphology of wound healing in rats with diabetes mellitus and simulated wounds induced by NO-system blockade was analyzed. The study demonstrated the effects of the blockade of constitutive and inducible NO-synthases on the histomorphological features of wound healing process. The role of NO-system in mechanisms of wound healing processes in rats with experimental diabetes was identified.

Key words: diabetes, wounds, nitric oxide, aminoguanidine, L-NAME.

Оксид азота играет ключевую роль в процессе заживления ран [7, 8]. Известны положительные эффекты на данный процесс не только эндогенного оксида азота, но и экзогенного ^О-содержащие газовые потоки [11], аппликация NO-доноров на область поражения -NO-высвобождающие полимеры, такие как поли-этил-энеимин-целлюлозо-NONO полимеры и поли-гидро-гели [6, 12]).

Оксид азота выполняет регулирующую роль во всех фазах раневого процесса [5, 8]. В стадии воспаления оксид азота регулирует процессы воспаления, иммуномодуляции и оксидации. Во время репарации влияет на процессы дифференциации фибробластов [5], коллагеновый синтез [4], повышает васкуляри-зацию тканей [5, 6], что, в свою очередь, ускоряет завершающую стадию эпителизации. Ряд авторов считает, что во всех этих фазах в области локализации раны клетки продуцируют NO, и эти процессы NO-зависимы [5, 7].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

В настоящем исследовании показать роль NO-системы в процессе заживления ран крыс с сахарным диабетом путем блокады индуцибельной и эндотелиальной NOs.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было выполнено на 90 крысах-самцах Wistar, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН, (Московская обл.). Животные содержались в стандартных условиях вивария, согласно правилам GLP при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.396 и 51000.4-96), Международным рекомендациям по защите позвоночных животных (1997).

Животные были разделены на следующие группы: Рана - группа животных с моделированными ранами, которой вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме; Рана +

L-NAME, Рана + аминогуанидин - группы животных с моделированными ранами, которым вводили L-NAME, аминогуанидин; Рана + СД -группы крыс с экспериментальным сахарным диабетом и моделированными ранами, которым вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме; Рана + СД + L-NAME, Рана + СД + аминогуанидин - группы крыс с экспериментальным сахарным диабетом и моделированными ранами, которым вводили L-NAME, аминогуанидин. Сахарный диабет вызывался введением стрептозотоцина (45 мг/кг, однократно, в/в). Через 72 часа производили количественное определение глюкозы в крови глюко-зооксидазным методом на спектрофотометре (ПЭ-5400В, ЭКРОС). В дальнейший эксперимент отбирали животных с уровнем глюкозы крови 12 ммоль/л и выше.

После подтверждения развития сахарного диабета моделировались плоскостные раны у наркотизированных животных на предварительно дэпиллированной коже спины, в межлопаточной области по специальному трафарету, скальпелем, путем иссечения кожи размером 20 х 30 мм [600 мм2 по методике Л. И. Слуцкого (1969)]. В работе были использованы блокато-ры NOs: ^нитро^-аргинин метиловый эфир (L-NAME) фирмы SIGMA-ALDRICH (блокатор eNOs), в дозе 25 мг/кг, аминогуанидин фирмы SIGMA-ALDRICH (блокатор iNOs), в дозе 50 мг/кг, которые вводились в течение 14 дней внутри-брюшинно с целью заблокировать синтез, и выделение эндогенного оксида азота.

Для морфологических исследований проводили забор материала на 7-, 14-, 21-е сутки (фрагменты кожи и подлежащих тканей), фиксировали 10%-м раствором нейтрального забуфе-ренного формалина (рН 7,4) в течение 24 часов, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков [7]. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм. В дальнейшем для выявления общепатологических процессов производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате морфологического исследования препаратов кожных ран крыс группы животных с моделированными ранами в исходном состоянии было обнаружено наличие линейной раневой поверхности кожи с некротизирован-ными тканями, выраженный фиброзно-гнойный экссудат, состоящий из непрофильных лейкоцитов. В краях раны определяется непрофильная инфильтрация лейкоцитами. В дерме и подкожной жировой клетчатке определялась выраженная полиморфно-клеточная инфильтрация.

В группе крыс без сахарного диабета на 7-е сутки не было обнаружено значимых изменений раневой поверхности по сравнению

с исходным состоянием. Незначительно уменьшилась зона некроза. В дне раны определялись полнокровные сосуды, очаговые кровоизлияния. В краях раны обнаруживалась гранулядионная ткань с фибробластами и гастаоцитами. В эпидермисе отмечалась начинающаяся эпителиза-ция. На 14-е сутки в данной группе не обнаружено выраженных признаков некроза, дистрофических изменений и экссудативного воспаления. Отмечалось незначительное разрастание грануляционной ткани с образованием новых кровеносных сосудов, коллагеновых волокон, а также почти полная эпителизация поверхности грануляционной ткани. На 21-е сутки полностью отсутствовали признаки некроза и воспаления. Обнаруживалась полная эпителизация раневой поверхности, образование волосяных фоликулов и формирование мышечных трубочек в скелетной мышечной ткани.

У крыс без сахарного диабета, принимавших L-NAME, на 7-е сутки зона некроза оставалась прежней. Отмечалась более выраженная непрофильная инфильтрация лейкоцитами по сравнению с интактной группой. На 14-е сутки по сравнению с интактной группой оставались признаки некроза и экссудативного воспаления. Было менее выражено появление грануляционной ткани. На 21-е сутки раневая поверхность почти полностью покрылась толстым гипертрофированным эпидермисом, но без формирования волосяных фолликулов и желез, отмечалась меньшая интенсивность фиброза.

У крыс без сахарного диабета, принимавших аминогуанидин, на 7-е сутки морфологические изменения почти полностью соответствовали интактной группе. Однако в эпидермисе определялись хорошо выраженные участки разрастания и регенерации эпителия по краям раны, т. е. более выраженные процессы эпителизации по сравнению с группой животных, получавших L-NAME. На 14-е сутки в данной группе признаки некроза и экссудативного воспаления полностью отсутствовали. Отмечалось менее выраженное разрастание грануляционной ткани и активность ангиогенеза по сравнению с интактной группой. На 21-е сутки было обнаружено, что раневая поверхность кожи была полностью покрыта эпидермисом, отмечалось образование новых волосяных фолликулов. Образовывалась фиброзная соединительная ткань с большим количеством фибробластов и гистиоцитов.

В группе животных с индуцированным сахарным диабетом на 7-е сутки обнаруживалась раневая поверхность с умеренно выраженным некрозом в виде детрита и струпа. Определялся выраженный гнойный экссудат, состоящий из непрофильных лейкоцитов. Формировалось незначительное количество грануляционной ткани, фибробластов и гистиоцитов. Отмечалось незначительное образование эпителиальных клеток на краях раны. На 14-е сутки

в данной группе животных уменьшалась выраженность некроза лейкоцитарной инфильтрации. В грануляционной ткани увеличивалось количество фибробластов и гистиоцитов. К 21-м суткам раневая поверхность с некротическими изменениями и воспалительной инфильтрацией сохранялась. Количество фибробластов оставалось на прежнем уровне. Отмечалось образование коллагеновых волокон и волосяных фолликулов.

У крыс с сахарным диабетом, принимавших L-NAME, на 7-е сутки обнаруживалась раневая поверхность с выраженным некрозом и лейкоцитарной инфильтрацией. Отмечалось формирование грануляционной ткани. Появлялись участки разрастания и регенерации эпителия по краям раны, однако менее выраженное по сравнению и интактной группой. На 14-е сутки у животных сохранялась раневая поверхность с некрозом и лейкоцитарной инфильтрацией. Количество грануляций оставалось прежним. Незначительно увеличилась по объему эпите-лизация краев раны. На 21-е сутки обнаружено наличие раневой поверхности кожи в виде струпа, под которым имеется небольшое количество воспалительного экссудата и небольшая зона некротизированной ткани. Отмечалось резкое увеличение объема грануляционной ткани по сравнению с деабедическими животными, не принимавших препараты. Обнаруживалось появление коллагеновых волокон. У некоторых животных появлялось умеренное венозное полнокровие и очаговые кровоизлияния в дерме.

У крыс с сахарным диабетом, принимавших аминогуанидин, на 7-е сутки был менее выражен некроз и лейкоцитарная инфильтрация на раневой поверхности по сравнению с диабетическими животными, принимавших L-NAME. Отмечалось формирование грануляционной ткани с фибробластами и гистиоцитами. По краям раны определялись разрастания эпителиальных клеток, но менее выраженное по сравнению с интактной группой. На 14-е сутки у животных сохранялась раневая поверхность с небольшими участками нектротизированных тканей в виде детрита. Грануляционная ткань хорошо выражена со значительным количеством фибробла-стов и гистиоцитов. Воспаление практически отсутствует. В эпидермисе имеются участи разрастания и регенерации эпителия по краям раны, а также усиленный ангиогенез. На 21-е сутки у животных сохранялась небольшая раневая поверхность с наличием серозного экссудата. Воспаление практически отсутствовало. Отмечалось резкое увеличение объема грануляционной ткани по сравнению с деабедическими животными, не принимавших препараты. В большей степени были выражены процессы эпителизации раны и формирование коллагеновых волокон по сравнению с группой диабетических животных, принимавших L-NAME.

Сахарный диабет замедляет заживление ран, которые приобретают длительный, рецидивирующий характер [2]. Кроме того, наблюдается значительное замедление и нарушение созревания грануляционной ткани, ее нагноение, снижение численной плотности сосудов. По литературным данным при изучении заживления ран у лабораторных животных с диабетом обнаружено снижение числа полиморфноядерных лейкоцитов, увеличение отека, снижение количества фибробластов, коллагенового синтеза, прочности ран, а также уменьшение образования грануляционной ткани [1, 2]. Анализ проведенных нами морфологических исследований также свидетельствует о снижении скорости репарации ран в группе с сахарным диабетом. Полученные нами результаты о процессе заживления ран при сахарном диабете согласуются с данными многих авторов. Данные процессы объяснимы метаболическими и обменными нарушениями, сопровождаемыми сахарный диабет, снижением тканевого кровообращения, развитием местной гипоксии, ацидоза тканей, микробной контаминации [2, 13].

В свою очередь, система оксида азота играет важную роль в процессе репарации ран [6, 7, 8]. Так, в своих исследованиях мы наблюдали более медленное заживление ран у групп, получавших блокатор eNOs L-NAME. Возможно, это объяснимо тем, что NO эндотелиального происхождения в норме обеспечивает адекватную вазодилатацию сосудов [9], обладает анти-агрегационным действием [15] и вследствие этого улучшает микроциркуляцию и трофику тканей в ране и прилегающей области. Положительная роль NO, продуцируемого eNOs, на процессы ранозаживления может быть также связана с его функциональным влиянием на активацию ангио-генеза, модуляцию цитокинового каскада, клеточную пролиферацию [5]. NO действует как хемотаксический фактор на фибробласты и активирует фиброплазию, проявляет антимикробную активность за счет активации фагоцитоза, тормозит развитие радикальных окислительных реакций в первой фазе ранозаживления [5, 17]. В фазе пролиферации NO принимает участие в синтезе и сборке молекул коллагена [4].

При регенерации соединительной ткани основными клетками, обеспечивающими создание структурной основы для формирования тканей, являются фибробласты. Зрелые фибробласты - самые активные в функциональном отношении, выполняют регуляторную, синтетическую функции при ремоделировании тканей [1]. NO стимулирует миграцию фибробластов и макрофагов, повышает васкуляризацию, коллагено-вую регенерацию и эпителизацию [5]. Таким образом, блокада eNOs L-NAME вызывает более выраженные патологические процессы в ране, длительную репарацию и отрицательную динамику ранозаживления.

Известна роль активации индуцибельной iNOs в процессе заживления ран [16]. Оксид азота, продуцируемый в большом количестве при наличии воспалительного процесса, в том числе и при наличии диабетических ран, связываясь со свободными радикалами кислорода, превращается в цитотоксичный пероксинитрит (ОNОО-). Пероксинитрит анион (ОNОО-) подавляет активность митохондриальных ферментов, вызывает повреждение клеточных и других белков (ДНК, РНК др.) и вызывает энергетическую дестабилизацию, мутации и гибель клетки. Следствием таких модификаций является инги-бирование ферментов дыхательной цепи, цикла Кребса, синтеза ДНК, усиление окислительного стресса и окисления липидов [10, 14], что приводит к еще более выраженным сосудистым нарушениям и ухудшает заживление диабетических ран. Аминогуанидин является блокато-ром NOs, в большей степени индуцибельной изоформы ферменты (iNOs). На различных экспериментальных моделях на животных ами-ногуанидин уменьшает тяжесть протекания болезни при развитии воспаления, септическом шоке, повышает выживаемость при введении эндотоксинов [16]. При блокаде iNOs снижается интенсивность продукции пероксинитрита, оказываемого цитотоксическое действие. Соответственно, в наших исследованиях мы наблюдали не только укорочение времени репарации кожных ран, но и более положительную динамику ранозаживления в группах животных, получавших аминогуанидин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, сахарный диабет сопровождается удлинением времени репарации кожных ран, снижением скорости ранозаживле-ния по сравнению с группой животных без экспериментального сахарного диабета.

Блокатор eNOs L-NAME вызывает утяжеление процесса репарации кожных ран крыс с сахарным диабетом, наличие интенсивных признаков повреждения кожи и имеющихся патологических процессов, которые носят более

выраженный характер по сравнению с группой контроля с сахарным диабетом.

Применение аминогуанидина (блокатора iNOs) в группе животных с сахарным диабетом приводило к появлению более ранних сроков репаративных процессов, более положительной динамике ранозаживления по сравнению с группой с сахарным диабетом без применения блокаторов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алексеева Н. Т., Гпухов А. Л., Остроушко А. П. // Вестник эксперим. и клинич. хирургии. - 2012. - Т. V, № 3. - С. 601-608.

2. Прошин А. В. // Вестник Новг. гос. ун-та. Сер.: Медицинские науки. - 2010. - № 59. - С. 63-66.

3. Саркисов Д. С., Перов Ю. Я. Микроскопическая техника: руководство для врачей и лаборантов. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.

4. Abramson S. B. // J. Arthritis Res. - 2008. -Vol. 10. - Р. 159-172.

5. Akram Jamshidzadeh, Near Azarpira // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2011. - № 7 (1). - P. 43-48.

6. Amadeu T. P., Amedea B. S., Deoliveira M. G. // J. Surg. Res. - 2007. - Vol. 10. - Р. 5.

7. Bernatchez S. F., Menon V, Stoffel J., et al. // Wound Repair Regen. - 2013. - Vol. 21 (3). - Р. 410-417.

8. Boykin J. V. // J. Wound Ostomy Continence Nurs. -2010. - Vol. 37 (1). - Р. 25-34.

9. Cacanyiova S., Dovinova I., Kristek F. // Physiol Pharmacol. - 2013. - Vol. 64. - Р. 241-247.

10. Fermor B., Gurumurthy A, Diekman B. O. // Osteoarthritis Cartilage. - 2010. - Vol. 18. - Р. 1167-1173.

11. Ferrari C. K., Eduardo Luzia Franca E. L., Honorio-Franca A. C. // J. Applied Biomedicine. - 2009. - Vol. 7. -P. 163-173.

12. Jen M. C., Serrano M. C., Lith R., et al. // Advanced Functional Materials. - 2012. - Vol. 22. -Р. 239-260.

13. Masha, S. Dinatale, S. Allasia, V. Martin. // Curr. Pharm. Biotechnol. - 2011. - Vol. 12 (9). - Р. 1354-1363.

14. Pacher P., Beckman J. S., Liaudet L. // Physiol. Rev. - 2009. - Vol. 87. - Р. 315-324.

15. Radomski W. W., Palm er R. M. J., Moncada S. // B r. J. Pharmacol. - 2009. - Vol. 92. - P. 639-646.

16. Rigamonti E., Touvier T., Clementi E., et al. // The J. Immunol. - 2013. - Vol. 190 (4). - P. 1767-1777.

17. Weller R. B. // J. Invest. Dermatol. - 2009. -Vol. 129 (10). - Р. 2335-2337.