Получение плюрипотентных стволовых клеток из семенников взрослых мужчин

И I II II

^шлп

Новости клеточных технологий

Получение плюрипотентных стволовых клеток из семенников взрослых мужчин

Наиболее активно исследуемыми в настоящее время видами плюрипотентных клеток человека являются ЭСК и !РБ-клетки. Однако, несмотря на безусловный потенциал к дифференцировке, использование этих популяций клеток имеет свои ограничения — и в силу этических проблем, и в связи с особенностями получения (использование генных конструкций на основе ретровирусов). Поэтому проблема поиска подходящего источника плюрипотентных клеток для регенеративной медицины остается актуальной.

У взрослых млекопитающих мужские половые клетки включают популяцию стволовых сперматогенных клеток (ССпК), которые обеспечивают постоянный сперматогенез в течение всей жизни. ССпК происходят от первичных половых клеток (ППК) эмбриона, которые имеют внегонадное происхождение и вступают в процесс диф-ференцировки после миграции в гонады. При культивировании ППК мышей и человека в определенных условиях

формируются колонии плюрипотентных клеток, обладающих сходными с ЭСК характеристиками и получивших обозначение embryonic germ cells, EGCs [1, 2].

Могут ли из ССпК взрослых млекопитающих, аналогично ППК, формироваться колонии плюрипотентных клеток? Ответ на этот вопрос не был получен вплоть до недавнего времени, что, прежде всего, было обусловлено несовершенством методов селекции и культивирования сперматогенных клеток-предшественниц. Выделенные из протоков извитых семенных канальцев клетки даже на фидерном слое инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов быстро теряют пролиферативную активность [3]. Тем не менее, в 2003 г., используя специфический «коктейль» факторов роста, в состав которого входили нейротрофический глиальный фактор роста (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF), EGF, bFGF и LIF, японской научной группе T. Shinohara удалось выделить и культивировать

Схема экспериментов по выделению «герминальных стволовых клеток взрослого человека» и определению их потенциала к дифференцировке

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009

И I II II

тп

Новости клеточных технологий

сперматогенные клетки-предшественницы мыши в течение длительного времени [4]. В 2004 г., эти ученые описали субпопуляцию ЗСК-подобных клеток, формирующихся при длительном культивировании сперматогенных клеток-предшественниц и которые, возможно, являются аналогами EGCs [5]. Эти данные позднее были подтверждены в работах других научно-исследовательских групп [3, 6]. Тем не менее, возможность приобретения плюрипотентного статуса сперматогенными клетками-предшественницами человека в условиях длительного культивирования до настоящего времени оставалась неясной.

В журнале Nature опубликована работа европейских эмбриологов S. Conrad и соавт. (группа Т. Scutella), в которой сообщается об успешном получении плюрипотентных клеток при культивировании ССпК взрослых людей. В качестве источника сперматогенных клеток авторы использовали материал, полученный в ходе биопсии тестикул 22 пациентов. Суспензию клеток, полученную после механической и ферментативной обработки, культивировали в течение 4 сут. В среду для культивирования добавляли GDNF, критический фактор для культивирования ССпК, или сразу LIF, применяемый при культивировании ЗСК. В таких условиях клетки ад-гезировались ко дну чашки Петри. Затем с помощью магнитной селекции (MACS) выделялись CD49f+ (маркер ССпК) клетки. Последующую селекцию проводили на чашках, покрытых коллагеном и ламинином. В целом, использованные авторами подходы позволили избавиться от соматических клеток (VASA~/vimentin + ) и получить популяцию сперматогенных клеток-предшественниц (VASA+/vimentin~).

При дальнейшем культивировании полученной клеточной популяции формировались хорошо различимые колонии, которые по морфологии имели значительное сходство с колониями ЗСК человека. Они экспрессировали факторы 0ct4 и Sox2. В процессе культивирования данные колонии увеличивались в количестве и размерах.

Авторы доказали, что клетки каждой индивидуальной колонии ЗСК-подобных клеток экспрессируют маркеры чЗСК (Nanog, E-cad, 0ct4, CD133, SSEA4) одновременно с маркерами сперматогеннных клеток (VASA, DAZL, CD49f), что было показано при иммуноцитохимическом окрашивании полученных колоний и сравнении экспрессии описанных выше маркеров с их экспрессией в гистологических срезах семенников. Сперматогенные клетки

в ткани нормальных семенников экспрессировали CD133, SSEA4, VASA, DAZL, TSPYL2 и CD49f, однако были негативны по маркерам Nanog, e-cadherin, 0ct4 и Stella. Свежевыделенные сперматогенные клетки характеризовались тем же паттерном экспрессии, однако их отличием была слабая экспрессия 0ct4. Кроме того, авторы показали, что выраженная экспрессия 0ct4 и SSEA4 в культивируемых клетках появлялась только при добавлении в среду фактора LIF, но не GDNF или комбинации GDNF и FGF2. Таким образом, при культивировании с LIF ССпК приобретали подобный ЗСК профиль экспрессии маркерных молекул.

При индукции дифференцировки в культуре по протоколам, используемым для ЗСК человека, клетки ЗСК-подобных колоний давали начало нейрональным, мышечным, остеогенным потомкам, а также инсулин- и глюкагон-продуцирующим клеткам поджелудочной железы, фактически ничем не отличаясь в этом отношении от ЗСК линии Н1. После подкожной пересадки клеток ЗСК-подобных колоний от 8 доноров бестимусным мышам происходило формирование тератом, содержащих нейрональные, мышечные, эпидермальные и эктодермальные производные, что было показано путем имму-ногистохимического окрашивания.

Чтобы исключить вероятную контаминацию, проводилось определение микросателлитных маркеров ДНК в образцах нуклеиновых кислот всех полученных линий клеток после завершения экспериментов и сравнение с профилем маркеров в клетках ЗСК человека линии Н1. Во всех случаях контаминации не было обнаружено.

Для обозначения популяции полученных при длительном культивировании с фактором LIF сперматогенных клеток-предшественниц человека плюрипотентных ЗСК-подобных клеток авторы предлагают использовать термин «герминальные стволовые клетки взрослого человека» (human adult germline stem cells, human adult GSCs).

Появление способа получения плюрипотентных стволовых клеток из сперматогенных клеток может дать новые возможности для их потенциального терапевтического применения. Их преимущество перед iPS-клетками состоит в отсутствии использования вирусных методов доставки генов плюрипотентности. Однако если рассматривать перспективы аутогенной трансплантации таких клеток, то их использование возможно только у мужчин.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Matsui Y., Zsebo К., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 1992; 70: 841—7.

2. Shamblott М., Axelman J., Wang S. et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. PNAS 1998; 95: 13726-31.

3. Seandel М., James D., Shmelkov S.V. et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature 2007; 449: 346-50.

4. Kanatsu-Shinohara M., Ogonuki N.. Inoue K. et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 2003; 69: 612—16.

5. Kanatsu-Shinohara M., Inoue K., Lee J. et al. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 2004; 119: 1001-12.

6. Conrad S., Renninger M., Hennenlotter J., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature 2008; 456(72201: 344-9.

Подготовила B.C. Мелихова

По материалам: Conrad S., Renninger M„ Hennenlotter J. et al. Generation of pluripotent stem cells

from adult human testis. Nature 2008; 456: 344-9

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009