Композиция и способ лечения и профилактики кишечной инфекции и воспаления
COMPOSITION AND METHOD OF TREATING AND PREVENTING INTESTINAL INFECTION AND INFLAMMATION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащей по меньшей мере один штамм Lactobacillus. В частности, штамм Lactobacillus может представлять собой штамм L. salivarius, штамм L. plantarum и/или штамм L. brevis, и желудочно-кишечное расстройство может представлять собой бактериальную инфекцию, вызываемую Clostridium difficile, Salmonella или Escherichia coli.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
По разным оценкам, кишечник млекопитающих колонизирован 100 триллионами бактерий, которые эволюционировали вместе с организмом-хозяином в симбиотических отношениях. Эту совокупность микробных популяций в организме-хозяине называют микробиотой. Микробиота может эффективно защищать кишечник от колонизации экзогенными патогенами и потенциально вредными собственными микроорганизмами (патобионтами). Иммунные ответы на нормальные кишечные бактерии в слизистых оболочках также важны для развития и физиологии организма-хозяина. Нарушение иммунологической толерантности к микробиоте приводит к неправильным местным и системным иммунным ответам на кишечные бактериальные сообщества, что может способствовать развитию ряда болезненных состояний, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и синдром раздраженного кишечника (СРК). Предполагается, что на рост распространенности этих хронических расстройств влияют факторы, включающие бактериальные инфекции, применение антибиотиков, а также пищевые факторы, стресс и уровень гигиены.
Нарушения баланса кишечной микробиоты приводят к нарушению кишечного гомеостаза, что повышает риск инфицирования патогенами и избыточного роста патобионтов, особенно при иммунодефиците у организма-хозяина. Патобионты обычно являются колитогенными, то есть они могут вызывать воспаление кишечника. Псевдомембранозный колит, приводящий к тяжелой диарее, лихорадке и боли в животе, является результатом избыточного роста Clostridium difficile (CD), грамположительной анаэробной бактерии, после длительного лечения антибиотиками широкого спектра действия.
Длительная госпитализация, лечение антибиотиками, иммунодефицит, злокачественные новообразования, химиотерапия и лечение стероидами являются основными причинами нозокомиальных диарейных инфекций, возбудителями которых обычно выступают CD, а также другие кишечные бактериальные патогены, такие как Salmonella, Shigella, Camphylobacter и Yersinia.
CD стала одним из наиболее серьезных возбудителей антибиотико-ассоциированной диареи. Обычное лечение включает ванкомицин и метронидазол на протяжении десяти дней. Тем не менее, частота рецидивов (возникают в 10-25% случаев) неуклонно растет, что является наиболее значимой проблемой, связанной с инфекциями, вызываемыми CD (CD infections, CDI).
Согласно сообщениям, в Канаде и Соединенных Штатах CDI развиваются все чаще, при этом растет доля тяжелых и рецидивирующих инфекций. В США количество выписных эпикризов с CDI в качестве любого диагноза выросло с 3,82 на 1000 эпикризов в 2000 г. до 8,75 на 1000 эпикризов в 2008 г.; рост был особенно заметен у пациентов старше 65 лет. Предварительные данные показывают, что в США число свидетельств о смерти с энтероколитом, обусловленным CDI, выросло с 793 в 1999 г. до 7483 в 2008 г. У детей частота госпитализаций, связанных с CDI, также выросла в период с 1997 г по 2006 г., с 0,724 до 1,28 на 1000 госпитализаций. Наибольшая распространенность отмечена у детей в возрасте 1-4 лет. Рост распространенности и вирулентности CDI совпал с распространением гипервирулентной CD, называемой NAP1/027, также известной как CD BI/NAP1/027 (группа BI по рестрикционному анализу, тип NAP1 по гель-электрофорезу в пульсирующем поле и риботип 027 по полимеразной цепной реакции). Штамм NAP1/027 продуцирует бинарный токсин и до 16 раз больше токсинов, чем большинство других штаммов, связанных с госпитальными вспышками. Впоследствии эпидемии CDI, вызванные CD NAP1/027, были выявлены в больницах европейских стран, например, Великобритании, Нидерландов, Бельгии, Австрии и Швеции. Ввиду этих существенных изменений в эпидемиологии CDI, произошедших за последние годы, и повышения частоты и тяжести заболевания CDI стали глобальной медицинской проблемой.
Единственными препаратами, используемыми для лечения CDI, являются антибиотики, такие как метронидазол, ванкомицин и утвержденный недавно дифицид (Dificid). Несмотря на высокие показатели клинической эффективности этих препаратов, у 15-30% пациентов все равно возникают рецидивы, при этом каждый рецидив повышает риск последующих инфекций. Как правильное, так и неправильное применение антибиотиков также связано с ростом резистентности к антибиотикам, появлением новых биотипов Clostridium difficile, резистентных к ванкомицину, и ростом распространенности хронических воспалительных расстройств.
Частота тяжелых случаев CDI за последние годы выросла, и недавние вспышки по всему миру были связаны с гипервирулентной CD NAP1/027. По данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний (European Centre for Disease Prevention and Control, ECDC) распространенность CD NAP1/027 в 34 европейских странах (в 2011 г.) составила 5%. Также сообщалось о крупных вспышках тяжелого, часто летального колита в Северной Америке и Европе. При такой инфекции можно, в качестве последнего варианта при неэффективности всех других видов лечения, проводить трансплантацию фекалий от здорового индивида. Такая трансплантация, помимо возможного психологического дискомфорта, может также нести риск трансплантации потенциально вредных микроорганизмов от донора. Поэтому, несмотря на то, что трансплантация фекальной микробиоты продемонстрировала многообещающие результаты при лечении CDI, врачи высказывают опасения по поводу потенциальных инфекционных рисков и долгосрочной безопасности. На наличие рисков и проблем с долгосрочной безопасностью указывают недавние сообщения о развитии ожирения после трансплантации фекалий. Кроме того, обременительные процедуры, связанные с этой методикой, ограничивают ее рутинное применение. Отсутствуют стандартные протоколы и процедуры скрининга/отбора доноров, подготовки фекалий, санитарного контроля, подготовки реципиента и пути введения.
Таким образом, существует потребность в более эффективных вариантах терапевтического лечения, а также в превентивном лечении CDI.
Изменение состава микробиоты нарушает нормальные функции кишечника на различных уровнях. Помимо стимуляции иммунной системы и провоспалительных цитокинов, оно может также приводить к высвобождению микробных метаболитов, активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) с повышением кортизола, что ведет к изменению моторики и чувствительности кишечника, нарушению кишечного барьера и неправильной продукции нейромедиаторов с усилением ответа на стрессовые события. Эти осложнения могут приводить к СРК, представляющему собой хроническое функциональное расстройство желудочно-кишечного тракта и одну из наиболее распространенных причин заболеваемости и отсутствия на рабочем месте.
Существующие препараты и методы не обеспечивают излечения, и пациенты с СРК вынуждены полагаться на лечение, облегчающее симптомы, такие как боль, диарея и запор, но связанное с побочными эффектами. Причина СРК неизвестна, но все больше данных о том, что состав просветной и пристеночной микробиоты у пациентов с СРК изменен по сравнению с микробиотой здоровых индивидов. Примерами этих изменений у пациентов с СРК являются уменьшение количества лактобацилл и бифидобактерий и увеличение количества клостридий. Исследования кишечной микробиоты детей с диагностированным СРК также указывают на дисбиоз с преобладанием, главным образом, клостридий.
Поэтому терапевтические вмешательства с использованием лактобацилл при СРК выглядят привлекательными. Был проведен ряд исследований, позволивших сделать вывод о том, что лактобациллы, в целом, полезны для пациентов с СРК, однако определение относительной пользы различных бактериальных штаммов было затруднено. Слабая эффективность и противоречивые результаты обусловлены, в первую очередь, отсутствием надлежащего отбора бактериальных штаммов и часто низким качеством исследований.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Указанные выше и иные задачи изобретения решаются, полностью или по меньшей мере частично, композицией, содержащей по меньшей мере один штамм Lactobacillus, выбранный из группы, состоящей из одного штамма L. salivarius, трех штаммов L. plantarum и одного штамма L. brevis, где штамм L. salivarius может представлять собой L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), штаммы L. plantarum могут быть выбраны из группы, включающей L. plantarum SH1313 (LMG Р-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), и штамм L. brevis может представлять собой L. brevis SH111 (LMG P-28888). Предпочтительно, композиция содержит все из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
Настоящий документ также направлен на пробиотическую композицию, содержащую L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885). Настоящий документ также направлен на композицию, содержащую L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis SH111 (LMG P-28888). Бактерии в композиции могут состоять из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMGP-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis SH111 (LMG P-28888) в комбинации, но композиция может также содержать дополнительные бактериальные штаммы.
Настоящий документ также направлен на пробиотическую композицию, содержащую смесь равных количеств бактерий штаммов L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. salivarius CW30 (LMG P-28887) и L. brevis SH111 (LMG P-28888). Следует понимать, что в контексте настоящего документа под термином «равный» и подобными, в связи с количеством бактерий, подразумевают, что бактериальные клетки различных бактериальных штаммов присутствуют в таком количестве друг относительно друга, что ни один бактериальный штамм не присутствует в количестве, более чем в 10 раз превышающем количество другого, и, предпочтительно, количество одного штамма превышает количество других менее чем в 9 раз, 8 раз, 7 раз, 6 раз, 5 раз, 4 раза, 3 раза или 2 раза. Предпочтительно, когда бактерии присутствуют в равных количествах, каждый бактериальный штамм присутствует в таком количестве, что его отношение к каждому другому бактериальному штамму составляет приблизительно 1:1.
Настоящий документ также направлен на композицию для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащую по меньшей мере один штамм Lactobacillus, выбранный из группы, состоящей из одного штамма L. salivarius, трех штаммов L. plantarum и одного штамма L. brevis, где штамм L. salivarius представляет собой L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), штаммы L. plantarum представляют собой L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и штамм L. brevis представляет собой L. brevis SH111 (LMG P-28888).
Лечение может представлять собой радикальное лечение, то есть лечение, приводящее к восстановлению здоровья субъекта. В процессе радикального лечения композицию можно вводить в форме клизмы. При введении в форме клизмы число возможных введений композиции ограничено, составляя обычно от одного до пяти раз на протяжении короткого периода времени, например, на протяжении курса продолжительностью от одних суток до пяти недель. При пероральном введении композицию можно вводить ежедневно на протяжении, например, от 1 до 6 недель.
При определенных условиях или у определенных пациентов лечение может иметь более вспомогательный характер, когда композицию вводят несколько раз на протяжении более длительного периода времени, иногда в течение всей жизни. Композицию можно вводить с интервалом от одних суток до двух недель.
Композиция может также быть использована в качестве профилактического (превентивного) лечения, например, на протяжении более продолжительных периодов приема антибиотиков для поддержания, и/или сохранения, и/или восстановления здоровой бактериальной флоры желудочно-кишечного тракта.
Композиция может содержать по меньшей мере один штамм L, salivarius, который может представлять собой L. salivarius CW30 (LMG Р-28887). Преимущество этого штамма состоит в том, что L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) обладает потенциальным антимикробным действием. Таким образом, настоящий документ также направлен на композицию, бактериальная часть которой содержит или состоит из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887).
Кроме того, композиция может содержать по меньшей мере L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и по меньшей мере один из штаммов L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis SH111 (LMG P-28888). Таким образом, настоящий документ также направлен на композицию, бактериальная часть которой содержит или состоит из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и по меньшей мере одного из штаммов L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis SH111 (LMG P-28888). Преимущество штаммов L. plantarum L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SU1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) состоит в том, что эти штаммы обладают противовоспалительными свойствами. Кроме того, эти штаммы позволяют предупреждать и/или лечить воспаление кишечника и улучшать функционирование кишечного барьера. Кроме того, эти штаммы L. plantarum могут действовать синергетически с L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. brevis SH111 (LMG Р-28888) в ингибирующей активности против более широкого спектра патогенных бактерий, связанных с желудочно-кишечными осложнениями. Это приводит к терапевтической коррекции дисбиоза кишечной микробиоты, способствуя восстановлению гомеостаза иммунной системы. Преимущество L. brevis SH111 (LMG Р-28888) состоит в том, что он обладает синергетическим антибактериальным потенциалом. Было продемонстрировано, что этот штамм обладает широкой антимикробной активностью против различных грамположительных патогенных бактерий, таких как Staphylococcus aureus, и грамотрицательных, таких как Escherichia coli.
Альтернативно, композиция может содержать по меньшей мере L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L.plantarum KS11 (LMGP-28885). Таким образом, настоящий документ также направлен на композицию, бактериальная часть которой содержит или состоит из L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L.plantarum KS11 (LMG P-28885). Эта композиция может дополнительно содержать L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
Желудочно-кишечное расстройство может представлять собой диарею, антибиотико-ассоциированную диарею (ААД), гастроэнтерит, острый гастроэнтерит и/или инфекционную диарею.
Кроме того, желудочно-кишечное расстройство может представлять собой бактериальную инфекцию, вызываемую Clostridium difficile, Salmonella и/или Escherichia coli. Желудочно-кишечное расстройство может также быть вызвано диарейным заболеванием, обусловленным такими бактериями, как Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, энтеропатогенная E, coli (EPEC), энтерогеморрагическая E.coli (EHEC), Shigella spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus и Bacillus cereus. Желудочно-кишечное расстройство может также быть обусловлено вирусной инфекцией, например, диарея, связанная с ротавирусами. Желудочно-кишечное расстройство может также представлять собой постинфекционную диарею.
В частности, желудочно-кишечное расстройство может представлять собой инфекцию, вызываемую Clostridium difficile NAP1/027. Одно преимущество настоящего изобретения состоит в том, что оно приводит к быстрому разрешению заболевания, оказывая направленное действие на патогенные бактерии и на восстановление иммунологической толерантности и кишечного гомеостаза. Второе преимущество состоит в том, что использование очищенных штаммов Lactobacillus, полезные эффекты которых на здоровье хорошо известны, позволяет избежать использования фекалий или других композиций с критическими проблемами безопасности для здоровья.
Желудочно-кишечное расстройство может представлять собой синдром раздраженного кишечника (СРК) или воспалительное заболевание кишечника (ВЗК). Термин "воспалительное заболевание кишечника" (ВЗК) включает, среди прочего, болезнь Крона и язвенный колит.
Желудочно-кишечное расстройство может также представлять собой резервуарный илеит или постинфекционный колит.
Композиция может быть введена перорально, например, в напитке или пищевом продукте. Композицию можно принимать в форме напитка, в случае чего штамм (штаммы) Lactobacillus суспендирован(ы) в жидкости. Жидкость может представлять собой, например, воду, молоко, сахарно-солевой раствор или жидкую кашу. Альтернативно, композицию можно принимать в форме каши или пудинга. Композиция может быть включена в пилюлю, которая может быть проглочена пациентом. Преимущество этих путей введения состоит в том, что они не требуют сложного медицинского оборудования. Другое преимущество введения композиции в форме напитка, каши, пудинга или пилюли состоит в том, что пациент может контролировать время приема напитка, каши, пудинга или пилюли.
Композиция может быть введена в форме клизмы. Преимущество этого пути введения состоит в том, что оно может быть проведено с использованием оборудования, обычно используемого в больницах. Преимущество этого пути введения состоит в том, что композиция может быть введена в тот отдел желудочно-кишечного тракта, где она наиболее эффективна. Другое преимущество состоит в том, что введение проводят профессиональные медицинские работники; пациентам может быть достаточно нескольких введений, и те, кто оказывает им медицинскую помощь, будут регулярно оценивать их состояние.
Композиция может быть введена инфузией в верхние отделы желудочно-кишечного тракта. Композиция может быть введена через медицинское устройство, такое как назодуоденальный зонд. Преимущество этого пути введения состоит в том, что оно может быть проведено с использованием оборудования, обычно используемого в больницах. Другое преимущество этого пути введения состоит в том, что композиция может быть введена в тот отдел желудочно-кишечного тракта, где она наиболее эффективна. Другое преимущество состоит в том, что бактериальная композиция минует желудок и его кислую среду, попадая непосредственно в кишечник.
Композиция может быть введена через медицинское устройство, такое как назогастральный зонд. Композиция может быть введена при колоноскопии.
9
13
9
10
11
12
13
Общее количество лактобацилл может составлять от 10 до 10колониеобразующих единиц (КОЕ) на одно введение, например, 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ на одно введение. В случае назодуоденальной инфузии введение можно повторять через одни сутки, через несколько суток или через неделю по меньшей мере два раза.
Композиция может быть лиофилизированной. Преимущество этого состоит в возможности длительного хранения бактерий и отсутствии необходимости в сложных системах хранения для бактерий.
Лиофилизированная композиция может быть помещена в пакет, флакон, капсулу или контейнер другого типа, такой как пилюля. Лиофилизированная композиция может быть одним из нескольких компонентов в смеси. Кроме того, лиофилизированная композиция может также быть одним из нескольких компонентов пилюли. Конечно, в лиофилизированные композиции или в любые другие упомянутые композиции, раскрытые здесь, могут быть добавлены другие обычные добавки для обеспечения стабильности композиций и приемлемого срока хранения. Такие обычные добавки и их количества для использования в композициях будут известны специалисту в данной области.
Композиция может дополнительно содержать клетчаточный компонент.
Клетчаточный компонент может быть выбран из группы, состоящей из овсяной клетчатки, пшеничной клетчатки, ржаной клетчатки, клетчатки чиа, кукурузной клетчатки, ячменной клетчатки, картофельной клетчатки, клетчатки фруктов, клетчатки овощей, клетчатки злаков и клетчатки водорослей.
Другие примеры подходящей клетчатки включают различные типы растворимой и нерастворимой клетчатки. Например, может быть использована клетчатка семян (например, семян льна и семян подорожника) или орехов (например, грецких орехов, кокосовых орехов, миндальных орехов). Могут быть использованы пищевые волокна, такие как инулин. В композиции, содержащие клетчатку, могут быть добавлены другие обычные добавки.
Бактерии могут быть суспендированы в жидкой каше, пюре, каше или пудинге.
Жидкая каша может представлять собой жидкую овсяную кашу. Другие жидкие каши, которые могут быть использованы, включают жидкую пшеничную кашу, жидкую ячменную кашу, жидкую ржаную кашу или жидкую кукурузную или маисовую кашу.
Перед введением композиции по настоящему изобретению свежая или лиофилизированная бактериальная композиция может быть суспендирована в подходящей жидкости. Жидкость может представлять собой фармацевтически приемлемый жидкий компонент или подходящую среду любого типа, например, одну из сред, описанных выше. Предпочтительно, используют дистиллированную воду или забуференные водные среды, содержащие фармацевтически приемлемые соли и буферы. Подходящими солевыми растворами являются PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), GBSS (сбалансированный солевой раствор Гея), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла), HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса) и SBF (синтетическая/имитированная биологическая жидкость). В зависимости от применения, жидкий компонент может также иметь более гидрофобную природу.
В случае перорального введения могут быть добавлены различные корригенты для придания смеси, содержащей композицию, более приятного вкуса.
После реактивации в подходящей среде композиция может быть пригодна для применения в течение 24 ч при комнатной температуре или до одной недели при 4°С. Тем не менее, следует отметить, что этот период времени и температура могут варьировать в зависимости, например, от используемой среды.
Композиция может дополнительно содержать один или более чем один терапевтический агент, такой как агент против бактериальной инфекции и/или воспалительного расстройства.
Композиция может содержать указанные выше пять штаммов или даже большее количество штаммов при условии присутствия по меньшей мере одного из указанных выше бактериальных штаммов.
Композиция, описанная выше, может быть помещена в клизму. Преимущество такой клизмы состоит в том, что введение может быть проведено с использованием оборудования, обычно используемого в больницах. Другое преимущество этого пути введения состоит в том, что композиция может быть введена в тот отдел желудочно-кишечного тракта, где она наиболее эффективна, то есть в толстую кишку.
Вводимый объем композиции будет изменяться в зависимости от возраста и биометрических данных субъекта, которому вводят клизму. Тем не менее, согласно общим инструкциям: дети дошкольного возраста - 250 мл или менее; дети школьного возраста - 200-500 мл; взрослые - 200-1000 мл.
Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию.
Согласно настоящему документу также предложен выделенный штамм, выбранный из группы, состоящей из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis (LMG P-28888). Бактериальные штаммы являются биологически чистыми.
Согласно настоящему документу также предложен выделенный штамм L. salivarius для использования в лечении и/или предупреждении инфекции, вызываемой Clostridium difficile NAP1/027, представляющий собой L. salivarius CW30 (LMG Р-28887).
Настоящий документ также направлен на способ лечения и/или предупреждения желудочно-кишечного расстройства, включающий стадию введения фармацевтически эффективного количества композиции, содержащей один или более чем один бактериальный штамм, выбранный из группы, состоящей из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMGP-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis (LMG P-28888), клизмы, содержащей одну или более чем одну из этих бактерий, или одного или более чем одного выделенного бактериального штамма, выбранного из группы, состоящей из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMGP-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis (LMG P-28888), субъекту, нуждающемуся в этом. Указанное желудочно-кишечное расстройство представляет собой желудочно-кишечное расстройство, раскрытое в других разделах настоящего документа.
Применение композиции, содержащей один или более чем один бактериальный штамм, выбранный из группы, состоящей из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L.plantarum SH1313 (LMG P-28884), L.plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis (LMG P-28888), клизмы, содержащей одну или более чем одну из этих бактерий, или одного или более чем одного выделенного бактериального штамма, выбранного из группы, состоящей из L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. brevis (LMG P-28888), для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения желудочно-кишечного расстройства. Указанное желудочно-кишечное расстройство представляет собой желудочно-кишечное расстройство, раскрытое в других разделах настоящего документа.
Другие задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, приложенной формулы изобретения, а также графических материалов. Следует отметить, что изобретение относится ко всем возможным комбинациям признаков.
Обычно, если здесь прямо не определено иное, все термины, используемые в формуле изобретения, следует интерпретировать в соответствии с их обычным значением в рассматриваемой области. Если прямо не указано иное, все ссылки на единственное число (элемент, устройство, компонент, средство, стадия и так далее) следует интерпретировать как по меньшей мере один указанный элемент, устройство, компонент, средство, стадию и так далее. Стадии любого способа, раскрытого здесь, не подразумевают обязательного проведения в том конкретном порядке, в котором они раскрыты, если необходимость такого порядка не указана прямо.
При использовании здесь термин «содержащий/включающий» и варианты данного термина не подразумевают исключения других добавок, компонентов, целых или стадий.
Определение штаммов
Все штаммы были депонированы в BCCM/LMG (Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (Бельгийские Координационные Коллекции Микроорганизмов) / Laboratorium voor Microbiologic, Universiteit Gent (UGent) (лаборатория микробиологии Гентского университета)), Гент, Бельгия, 19 мая 2015 г. Депозитором является Лундский университет в лице Shahram Aghaibeik-Lavasani, кафедра биологии (Department of Biology), 223 62, Швеция, Лунд, Солвегатан, 35, строение С (Solvegatan 35, Building С, 223 62 Lund, Sweden).
Депозитарные номера представлены ниже.
L. plantarum SH1313 LMG P-28884
L. plantarum KS11 LMG P-28885
L. plantarum Y1An734 LMG P-28886
L. salivarius CW30 LMG P-28887
L. brevis SH111 LMG P-28888
Штаммы являются биологически чистыми.
Определение штаммов и терминов
КОЕ - колониеобразующие единицы.
ОПИСАНИЕ ТАБЛИЦ И ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
+
+
6
На Фиг. 1 показан процент CD4 Foxp3 Т-клеток после совместной инкубации лактобацилл со свежевыделенными иммунными клетками лимфоидных тканей кишечника мыши. 1×10 иммунных клеток инкубировали с одним видом Lactobacillus или в комбинации с двумя или несколькими видами. * указывает на р-значение <0,05, ** - р-значение <0,01, и *** - р-значение <0,001, по сравнению с контролем.
+
+
6
На Фиг. 2 показан процент CD4Foxp3 Т-клеток после совместной инкубации лактобацилл с иммунными клетками лимфоидных тканей кишечника мыши, как описано выше. 1×10 иммунных клеток инкубировали с одним видом Lactobacillus, включая пять штаммов лактобацилл LMG Р-28884 - Р-28888 и четыре штамма лактобацилл, выделенных из различных пищевых продуктов, имеющихся в продаже (L. paracasei CNCM I-1518, L. plantarum DSM 9843, L. acidophilus DSM 13241 и L. rhamnosus ATCC 53103). * указывает на р-значение <0,05, ** - р-значение <0,01, и *** - р-значение <0,001, по сравнению с L. plantarum SH1313 (LMG P-28884).
На Фиг. 3 в Таблице 1 показана антагонистическая активность различных видов лактобацилл против Clostridium difficile, включая гипервирулентные штаммы NAP1/027; - указывает на отсутствие ингибирования, + указывает на ингибирование или отсутствие роста вокруг штрихов лактобацилл.
На Фиг. 4 в Таблице 2 показано исследование межвидового ингибирования у пяти различных штаммов Lactobacillus методом перпендикулярных штрихов. Для каждой группы штаммы, указанные в таблице сверху, были тестерными штаммами (наносились первым штрихом); - указывает на отсутствие ингибирования, + указывает на ингибирование или отсутствие роста в зоне пересечения штрихов лактобацилл.
На Фиг. 5 в Таблице 3 показан анализ чувствительности штаммов Lactobacillus к антибиотикам.
8
На Фиг. 6 показана способность штаммов лактобацилл к адгезии на клетках колоректального эпителия человека. Для сравнения использовали виды Lactobacillus, включая пять штаммов лактобацилл LMG Р-28884 - Р-28888 и четыре штамма лактобацилл, выделенных из различных пищевых продуктов, имеющихся в продаже (L.paracasei CNCM I-1518, L. plantarum DSM 9843, L. acidophilus DSM 13241 и L.rhamnosus ATCC 53103). Одинаковое количество клеток каждого штамма (5×10) независимо инкубировали (1 ч при 37°С) с монослоем полностью дифференцированных клеток Сасо-2. Клетки промывали и окрашивали раствором красителя Гимза. Проводили подсчет количества прикрепленных бактерий в выбранных случайным образом микроскопических полях зрения и определяли средние значения. * указывает на р-значение <0,05, ** - р-значение <0,01, и *** - р-значение <0,001, по сравнению с L. plantarum SH1313 (LMG P-28884).
На Фиг. 7 в Таблице 4 показана антагонистическая активность комбинации пяти различных штаммов Lactobacillus против штаммов Salmonella и Escherichia coli; +++ указывает на хорошее ингибирование (зона ингибирования более 5-10 мм); ++++ указывает на сильное ингибирование (зона ингибирования более 10 мм).
Фиг. 8. Расписка в получении и заявление о жизнеспособности Lactobacillus salivarius CW30 (LMG Р-28887).
Фиг. 9. Расписка в получении и заявление о жизнеспособности Lactobacillus brevis SH111 (LMG P-28888).
Фиг. 10. Расписка в получении и заявление о жизнеспособности Lactobacillus plantarum SH1313 (LMG P-28884).
Фиг. 11. Расписка в получении и заявление о жизнеспособности Lactobacillus plantarum KS11 (LMG P-28885).
Фиг. 12. Расписка в получении и заявление о жизнеспособности Lactobacillus plantarum Y1An734 (LMG P-28886).
Фиг. 13. Определение углеводного профиля Lactobacillus salivarius CW30 (LMG P-28887), Lactobacillus brevis SH111 (LMG P-28888), Lactobacillus plantarum SH1313 (LMG P-28884), Lactobacillus plantarum KS11 (LMG P-28885) и Lactobacillus plantarum Y1An734 (LMG P-28886), соответственно. Показатели относятся к интенсивности окраски. На положительный результат указывает изменение окраски с фиолетовой на желтую (1-3) из-за образования кислоты в анаэробных условиях (-соответствует отсутствию изменений). 24 h означает 24 часа, 48 h означает 48 часов, 72 h означает 72 часа.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В контексте настоящего изобретения действует следующее определение. Под термином «кишечная инфекция и воспаление» подразумевают гастроэнтерит, усиленное воспаление желудочно-кишечного тракта, вызванное вирусной, бактериальной или паразитарной инфекцией. Он может также означать другое желудочно-кишечное расстройство, например, синдром раздраженного кишечника (СРК), воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), резервуарный илеит или постинфекционный колит. Под термином антибиотико-ассоциированная диарея (ААД) подразумевают диарею, развивающуюся у человека, принимающего или недавно принимавшего антибиотики. Одной из наиболее серьезных причин ААД является инфекция, вызываемая грамположительной анаэробной бактерией Clostridium difficile (CD). Кроме того, CD является основным возбудителем нозокомиальных диарейных инфекций, наряду с другими кишечными бактериальными патогенами, такими как Salmonella, Shigella, Camphylobacter и Yersinia.
Согласно настоящему изобретению предложена симбиотическая композиция, содержащая эффективное количество бактерий Lactobacillus, выбранных из группы, включающей или состоящей из одного или более из Lactobacillus salivarius CW30 (LMG Р-28887), Lactobacillus brevis SH111 (LMG P-28888), Lactobacillus plantarum SH1313 (LMG P-28884), Lactobacillus plantarum KS11 (LMG P-28885) и Lactobacillus plantarum Y1An734 (LMG P-28886). Эти бактериальные штаммы выбраны из новых штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из различных растительных источников. Образцы различных овощных растений, необработанные и после ферментации, высевали на агар Рогоза и инкубировали в течение 24-72 ч при 35-42°С в анаэробных условиях. Случайным образом отбирали отдельные клоны. Все клоны с бактериями в форме грамположительных палочек проверяли на предмет пробиотических свойств, таких как резистентность к кислому рН (рН менее или равному 3) и солям желчных кислот. Выделенные бактерии идентифицировали определением профиля ферментации углеводов (см. Таблицу 5 на Фиг. 13) и секвенированием 16S рибосомальной РНК (рРНК). Проводили дополнительный отбор штаммов молочнокислых бактерий на предмет способности к адгезии в кишечнике и ингибированию роста желудочно-кишечных патогенов, но не роста друг друга. Обычно, когда композиция содержит более одного из этих бактериальных штаммов, количества бактериальных клеток разных бактериальных штаммов приблизительно равны (то есть бактериальные клетки присутствуют в приблизительно одинаковых количествах, например, как определено измерением числа КОЕ или микроскопическим подсчетом количества бактерий). Композиция, содержащая один или более чем один из этих бактериальных штаммов, может быть названа пробиотической.
Согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один штамм по изобретению, то есть по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, состоящей из Lactobacillus salivarius CW30 (LMG Р-28887), Lactobacillus brevis SH111 (LMG P-28888), Lactobacillus plantarum SH1313 (LMG P-28884), Lactobacillus plantarum KS11 (LMG P-28885) и Lactobacillus plantarum Y1An734 (LMG P-28886). Настоящее изобретение также направлено на культуру, композицию или продукт, содержащие один или более чем один указанный бактериальный штамм, для использования в предупреждении и/или лечении желудочно-кишечного расстройства, такого как расстройство, вызванное CD.
В настоящем исследовании был проведен скрининг более 18 различных новых штаммов лактобацилл с описанием их свойств относительно антимикробной активности против 21 патогенного штамма CD. Интересно, что было обнаружено, что эти свойства штаммоспецифичны и не являются общими для всех штаммов рода. Терапевтическая композиция по изобретению, содержащая бактерии всех штаммов Lactobacillus salivarius CW30 (LMG Р-28887), Lactobacillus brevis SH111 (LMG P-28888), Lactobacillus plantarum SH313 (LMG P-28884), Lactobacillus plantarum KS11 (LMG P-28885) и Lactobacillus plantarum Y1An734 (LMG P-28886), продемонстрировала способность к ингибированию роста всех штаммов CD, но не роста друг друга. Это демонстрирует синергизм штаммов, входящих в композицию по настоящему изобретению.
Как показывают экспериментальные данные, представленные в настоящем документе, L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. brevis SH111 (LMG P-28888) и L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) обладают большей способностью к колонизации (как продемонстрировано связыванием с клетками Сасо-2), чем L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886), хотя последние также демонстрируют хорошую способность к колонизации. С другой стороны, было показано, что L. plantarum SH1313, KS11 и Y1An734 оказывают больший противовоспалительный эффект (как измерено по способности индуцировать регуляторные Т-клетки (Treg-клетки)). Поэтому композиция, содержащая L. plantarum SH1313, KS11 и Y1An734, может быть особенно полезной в лечении и/или предупреждении хронического воспалительного расстройства, такого как, без ограничения, ВЗК, включая, среди прочего, болезнь Крона и язвенный колит, резервуарный илеит или постинфекционный колит. L. brevis SH111 (LMG Р-28888) и L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) демонстрируют наиболее сильный антимиробный эффект из пяти выделенных штаммов лактобацилл. Поэтому композиция, содержащая L. brevis SH111 (LMG Р-28888) и L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), может быть особенно полезной для использования в лечении и/или предупреждении микробной желудочно-кишечной инфекции, такой как инфекция, вызываемая Clostridium difficile, Salmonella, Escherichia coli, Campylobacter, Shigella, Yersinia, Staphylococcus, Listeria, Vibrio и/или Bacillus cereus. Желудочно-кишечная инфекция может быть обусловлена вирусной инфекцией, такой как ротавирусная инфекция.
Ввиду ингибирующих свойств выбранных штаммов лактобацилл в отношении патогенных штаммов CD и/или других кишечных патогенов и терапевтического эффекта у пациентов с антибиотико-ассоциированной диареей (ААД), настоящее изобретение относится к медицинскому применению симбиотических комбинаций лактобацилл для изготовления фармацевтических композиций для предупреждения, лечения или облегчения симптомов желудочно-кишечного расстройства, выбранного, без ограничения, из ААД, гастроэнтерита, острого гастроэнтерита или инфекционной диареи. Желудочно-кишечное расстройство может представлять собой бактериальную инфекцию, вызываемую, без ограничения, Clostridium difficile, Salmonella, Escherichia coli, Campylobacter, Shigella, Yersinia, Staphylococcus, Listeria, Vibrio или Bacillus cereus. Желудочно-кишечное расстройство может быть обусловлено вирусной инфекцией, например, диарея, связанная с ротавирусами, или постинфекционная диарея.
Композиции по настоящему документу могут также быть эффективно использованы для лечения гастроэнтерита, вызываемого Salmonella или Escherichia coli. Salmonella spp.являются возбудителями одной из наиболее распространенных форм пищевого отравления по всему миру. Эксперименты ясно продемонстрировали, что симбиотическая композиция по данному изобретению сильно ингибирует рост патогенных штаммов Salmonella (S. enteritidis и S. typhimurium) и Escherichia coli.
Настоящее изобретение также относится к профилактическому (превентивному) применению против инфекций, вызываемых CD. Пациентов с инфекциями, вызываемыми CD, обычно лечат антибиотиками, такими как метронидазол и ванкомицин. Дальнейший экспериментальный анализ композиции по данному изобретению не выявил чувствительности к метронидазолу и ванкомицину, продемонстрировав возможность ее использования в качестве профилактического (превентивного) лечения, например, на протяжении более продолжительных периодов приема антибиотиков для поддержания, и/или сохранения, и/или восстановления здоровой бактериальной флоры желудочно-кишечного тракта. Она может также быть использована для подавления рецидивов, являющихся распространенной и наиболее значимой проблемой, связанной с инфекциями, вызываемыми CD.
Настоящее изобретение также относится к лечению инфекций, вызываемых гипервирулентной CD, называемой NAP1/027. Рост распространенности и вирулентности инфекций, вызываемых CD, совпал с распространением CD NAP1/027. Скрининг новых лактобацилл выявил, что лишь немногие штаммы Lactobacillus могли ингибировать рост 2 разных гипервирулентных штаммов CD NAP1/027. Эти терапевтические штаммы были включены в симбиотическую композицию, представленную в данном изобретении.
+
Настоящий документ также направлен на применение симбиотической композиции, заявленной в данном изобретении, для профилактического или терапевтического лечения хронических воспалительных расстройств, таких как, без ограничения, ВЗК, включая, среди прочего, болезнь Крона и язвенный колит, резервуарный илеит или постинфекционный колит.Взаимодействие бактериальных патогенов с клетками кишечного эпителия запускает каскад воспалительных процессов, способствующих развитию желудочно-кишечного расстройства. Изменения в кишечной микробиоте и воспаление приводят к нарушению функционирования кишечного барьера, создавая условия для дальнейшего размножения патогенов и колонизации ими кишечника. Foxp3 регуляторные Т-клетки (Treg-клетки) необходимы для поддержания иммунной толерантности в кишечнике и подавления вредных воспалительных ответов. Исходя из собственного опыта, авторы изобретения провели дополнительный скрининг комбинаций лактобацилл на предмет возможности стимуляции Treg-клеток. Терапевтическая композиция по изобретению продемонстрировала наибольшую способность к стимуляции этих противовоспалительных клеток по сравнению с другими проанализированными комбинациями. Это еще раз продемонстрировало синергизм штаммов, входящих в композицию по настоящему изобретению.
Настоящий документ также направлен на применение симбиотической композиции, заявленной в данном изобретении, для профилактического или терапевтического лечения кишечных расстройств, связанных с дискомфортом или болью в животе, таких как, без ограничения, синдром раздраженного кишечника (СРК). Согласно предположениям, ключевую роль в развитии СРК играют кишечная микробиота и стрессовые воздействия. Терапевтическая композиция, представленная в настоящем изобретении, продемонстрировала высокую эффективность в лечении СРК.
Композиция может быть введена перорально. Все штаммы композиции по настоящему изобретению отобраны по их уникальной и выраженной способности к выживанию при низком рН в желудке и при высоком содержании желчных кислот в тонкой кишке и способности к прикреплению к слизистой оболочке толстой кишки и временной колонизации толстой кишки. Композицию можно принимать в форме напитка, в случае чего бактериальный(е) штамм (штаммы) суспендирован(ы) в жидкости. Жидкость может представлять собой воду, молоко, сахарно-солевой раствор или жидкую кашу. Альтернативно, композицию можно принимать в форме каши или пудинга. Композиция может быть включена в пилюлю, которая может быть проглочена пациентом.
Композиция может быть введена в форме клизмы. Преимущество этого пути введения состоит в том, что композиция может быть введена в тот отдел желудочно-кишечного тракта, где она наиболее эффективна. Для лечения пациентов применяли трансплантацию фекальной микробиоты, вводимой клизмой. Несмотря на то, что применение клизмы признано безопасным и методика продемонстрировала многообещающие результаты при лечении инфекций, вызываемых CD, врачи высказывают опасения по поводу потенциальных инфекционных рисков и долгосрочной безопасности такой терапии фекальными бактериями доноров-добровольцев. Однако терапевтическая композиция, представленная в данном изобретении, состоит из штаммов Lactobacillus, выбранных по результатам многочисленных исследований и успешно прошедших тестирование на пациентах. Другое преимущество этого метода состоит в том, что введение проводят профессиональные медицинские работники; пациентам может быть достаточно нескольких введений, и те, кто оказывает им медицинскую помощь, будут регулярно оценивать их состояние.
Композиция может быть введена инфузией в верхние отделы желудочно-кишечного тракта. Композиция может быть введена через медицинское устройство, такое как назодуоденальный зонд. Преимущество этого пути введения состоит в том, что композиция может быть введена при желудочно-кишечных расстройствах в тот отдел желудочно-кишечного тракта, где она наиболее эффективна.
9
13
Комбинация бактерий может быть введена вместе с фармацевтически приемлемым жидким компонентом, а также в форме порошка. Предпочтительно, используют дистиллированную воду или забуференные водные среды, содержащие фармацевтически приемлемые соли и буферы. Бактериальные штаммы могут присутствовать таким образом, что общая концентрация бактерий, вводимых за одно введение, будет составлять по меньшей мере 10-10 КОЕ. При введении более чем одного бактериального штамма все эти разные штаммы обычно вводят в одинаковом количестве.
Композиция может дополнительно содержать клетчаточный компонент. Польза пищевых волокон для здоровья известна давно. Также известно, что некоторые из них селективно стимулируют рост и/или активность одних или определенного числа комменсальных бактерий в толстой кишке, улучшая посредством этого здоровье организма-хозяина.
Может быть необходим один или более чем один фармацевтически приемлемый жидкий компонент. Такие компоненты хорошо известны специалистам в данной области.
Композиция может дополнительно содержать клетчаточный компонент. Клетчаточный компонент может быть выбран из группы, состоящей из, без ограничения, овсяной клетчатки, пшеничной клетчатки, ржаной клетчатки, клетчатки чиа, кукурузной клетчатки, ячменной клетчатки, картофельной клетчатки, клетчатки фруктов, клетчатки овощей, клетчатки злаков и клетчатки водорослей. Комбинация бактерий может также быть суспендирована в жидкой каше, пюре, каше или пудинге.
Для изготовления композиции по настоящему документу бактериальные штаммы для включения в композицию могут быть выращены по отдельности или в комбинации с одним или более чем одним штаммом. В случае раздельного выращивания и предполагаемого введения более чем одного бактериального штамма разные бактериальные штаммы обычно смешивают таким образом, что полученная композиция содержит одинаковое количество (равное количество) этих бактерий (КОЕ). Штаммы лактобацилл, раскрытые здесь, можно выращивать в любых средах, обычно используемых для выращивания лактобацилл, таких как жидкая среда или агар Мана-Рогоза-Шарпа (Man-Rogosa-Sharpe, MRS) и агар Рогоза. Бактерии обычно выращивают при температуре приблизительно от 25 до 42°С, например от 30 до 37°С, в частности при 37°С. Бактерии можно выращивать в жидкой культуре с покачиванием или без него или на твердых средах. Обычно бактерии выращивают на протяжении периода времени продолжительностью 24-72 часа. Как известно специалисту в данной области, время выращивания будет зависеть от различных факторов, таких как температура, количество внесенных бактерий, содержание питательных веществ в среде и так далее. Обычно бактерии выращивают до стационарной фазы. Перед введением бактерий субъекту, нуждающемуся в этом, бактерий обычно выделяют из использованной для них питательной среды, например, центрифугированием или фильтрацией бактериальной культуры. Бактерии могут быть промыты один или более чем один раз, например, в буфере или солевом растворе, таком как PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) или 0,9% NaCl. Затем, перед применением, бактерии могут быть ресуспендированы в среде, используемой для введения. Бактерии могут также быть лиофилизированы для повышения их стабильности при хранении. Лиофилизированные бактерии могут быть введены в сухом состоянии или могут быть растворены в жидкости или среде, содержащей жидкость, перед введением. Также возможна реактивация лиофилизированных бактерий в подходящей среде на 24 ч при комнатной температуре или до одной недели при 4°С. Тем не менее, следует отметить, что этот период времени и температура для такой реактивации могут варьировать в зависимости, например, от используемой среды. Также возможно непосредственное использование бактериальных культур без их выделения из использованной для них питательной среды. Также возможно выделение бактерий из использованной для них питательной среды и введение использованной питательной среды вместо самих бактерий.
Изобретение будет теперь описано более подробно в последующих разделах. Тем не менее, примеры приведены исключительно для пояснения и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Эксперименты
Оценка взаимодействия лактобацилл и Clostridium difficile. Для оценки взаимодействия лактобацилл и Clostridium difficile in vitro определяли антагонистическую активность 18 штаммов Lactobacillus против 21 патогенного штамма С. difficile, включая два гипервирулентных CD NAP1/027 (также известных как CD BI/NAP1/027 или CD NAP1/027). Штаммы CD принадлежали к различным генотипам и были ранее выделены из кала пациентов, госпитализированных в Швеции, главным образом в университетской клинике Сконе (Skane University Hospital) в Мальме, с включением случайно отобранных случаев антибиотико-ассоциированной диареи. Антагонистическую активность лактобацилл определяли на чашках с агаром как ингибирование роста С. difficile. Результаты представлены в Таблице 1. Штаммы Lactobacillus культивировали в течение 48 ч в жидкой среде Мана-Рогоза-Шарпа (MRS) при 37°С. Штаммы С.difficile культивировали в течение 24 ч в жидкой среде с сердечно-мозговым экстрактом (brain heart infusion, BHI) при 37°C в анаэробной среде. Все бактериальные штаммы центрифугировали при 4°С и осадок суспендировали в 0,9% растворе NaCl с получением концентрации 0,5 по шкале мутности МакФарланда. 100 мкл суспензии С. difficile высевали и распределяли по чашкам с кровяным агаром Уилкинса-Чалгрена (Wilkins-Chalgren). Раздельными штрихами (приблизительно 2 см) наносили по 10 мкл каждой суспензии лактобацилл. Чашки инкубировали в анаэробной среде при 37°С в течение 48 ч и анализировали зоны ингибирования роста лактобациллами на штрихе С. difficile.
Результаты ясно демонстрируют, что штаммы L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), KS11 (LMG P-28885) и Y1An734 (LMG P-28886), а также S. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. brevis SH111 (LMG P-28888) ингибируют рост нескольких анализируемых штаммов С. difficile. В частности, смесь этих пяти штаммов ингибировала рост всех анализируемых штаммов С. difficile. Кроме того, S. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. brevis SH111 (LMG Р-28888), а также L. plantarum KS11 (LMG Р-28885) ингибировали рост штаммов CD NAP1/027. В частности, смесь этих пяти штаммов ингибировала рост обоих анализируемых штаммов CD NAP1/027. Следует отметить, что другие протестированные штаммы лактобацилл не ингибировали рост С. difficile в такой же степени.
+
6
7
7
+
+
2
Взаимодействие лактобацилл и иммунных клеток. Было показано, что непосредственное взаимодействие С. difficile с клетками кишечного эпителия запускает каскад воспалительных процессов, способствующих развитию заболеваний кишечника, таких как диарея и псевдомембранозный колит. Изменения состава кишечной микробиоты и воспаление приводят к нарушению функционирования кишечного барьера, создавая условия для дальнейшего размножения и колонизации кишечника С.difficile. CD4 Т-клетки, экспрессирующие Foxp3 (регуляторные Т-клетки, Treg-клетки), необходимы для поддержания иммунной толерантности в кишечнике и подавления вредных воспалительных ответов. Исходя из предыдущего опыта, авторы изобретения выделили лимфоидные ткани кишечника (пейеровы бляшки и брыжеечные лимфатические узлы) мышей. Они были объединены, и были получены отдельные суспензии иммунных клеток in vitro. Затем клетки инкубировали совместно с пятью разными лактобациллами, L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L.plantarum Y1An734 (LMG P-28886), по отдельности или в комбинациях. В 96-луночный планшет высевали в общей сложности 1×10 иммунных клеток на лунку (в среде для культивирования клеток RPMI 1640). К клеткам добавляли 1×10 КОЕ/мл (100 мкл) бактерий (суспендированных в RPMI 1640) и совместную культуру инкубировали в течение 20 ч (37°С, увлажненная атмосфера с 5% СО). На следующие сутки клетки промывали и анализировали присутствие Treg-клеток с применением проточной цитометрии. Были обнаружены Treg-клетки, экспрессирующие рецептор CD4, транскрипционный фактор (forkhead box Р3; Foxp3) и внутриклеточный цитокин IL-10. Бактерии использовали либо по отдельности, либо в комбинациях по два, три, четыре или пять штаммов. Комбинации содержали равные количества каждого штамма (которые добавляли на одни и те же сутки эксперимента), все в конечной концентрации 1×10 КОЕ/мл. Контрольные образцы содержали только среду для культивирования клеток. Результаты показаны на Фиг. 1. Данные представлены как частота CD4 Foxp3 Т-клеток в процентах.
По результатам ясно видно, что в качестве отдельных штаммов только выбранные штаммы L. plantarum (SH1313, KS11 или Y1An734) могут индуцировать противовоспалительный профиль и активировать Treg-клетки среди клеток свежевыделенных лимфоидных тканей кишечника. L. salivarius CW30, L. brevis SH111 могут стимулировать Treg-клетки только в комбинации с тщательно выбранными штаммами L. plantarum. Результаты также продемонстрировали, что L. plantarum SH1313, L. plantarum KS11, L. plantarum Y1An734, L. salivarius CW30 и L. brevis SH111 действуют синергетически, активируя Treg-клетки и увеличивая их количество. Наиболее существенный и выраженный противовоспалительный эффект достигается с использованием комбинации всех пяти штаммов.
7
+
+
С применением такого же анализа авторы изобретения сравнили также способность различных лактобацилл индуцировать Treg-клетки. Авторы изобретения использовали L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. brevis SH111 (LMG Р-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и четыре штамма лактобацилл, выделенных из различных пищевых продуктов, имеющихся в продаже, L. paracasei CNCM I-1518 (Actimel), L. plantarum DSM 9843 (ProViva), L. acidophilus DSM 13241 (Arla A-fil) и L. rhamnosus ATCC 53103 (йогурт Valio). 1×10 КОЕ/мл (100 мкл) каждого штамма культивировали вместе с иммунными клетками в течение 20 ч при 37°С. Результаты показаны на Фиг. 2. Данные представлены как частота CD4 Foxp3 Т-клеток в процентах.
Результаты выявили, что L. plantarum (SH1313, KS11 и Y1An734) способны индуцировать Treg-клетки значительно сильнее, чем другие штаммы, включая L. paracasei CNCM I-1518, L. plantarum DSM 9843, L, acidophilus DSM 13241 и L. rhamnosus ATCC 53103, то есть эти штаммы L. plantarum (L. plantarum SH1313, KS11 и Y1An734) оказывают выраженный противовоспалительный эффект.
Весь статистический анализ проводили с использованием StatView и данные анализировали с применением непараметрического критерия Манна-Уитни.
Межвидовое ингибирование пяти различных штаммов Lactobacillus. Все больше данных демонстрируют, что определенные смеси видов Lactobacillus оказывают более полезные эффекты, чем составляющие их штаммы. Согласно предположениям, на различные синергетические или аддитивные эффекты in vivo влияет возможное взаимное ингибирование штаммов, составляющих смесь. Авторы изобретения изучали возможное взаимное ингибирование роста пяти разных лактобацилл L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) in vitro. С этой целью был использован анализ перпендикулярных штрихов. Каждый штамм высевали штрихом на MRS-агар с использованием 1 мл петли (3 параллельные линии). После высыхания этих линий высевали другие штаммы штрихами, перпендикулярными первым штаммам, создавая по 3 зоны возможного ингибирования для каждой комбинации штаммов. Если тестерный штамм сдерживал рост штамма, нанесенного вторым, это указывало на ингибирование. Результаты показаны в Таблице 2.
Результаты ясно показали, что L. salivarius CW30 и L. brevis SH111 обладают очень незначительной способностью ингибировать рост других выбранных бактериальных штаммов, а штаммы L. plantarum SH1313, L. plantarum KS11, L. plantarum Y1An734 не обладают такой способностью. Несмотря на то, что предложенный препарат из нескольких штаммов лактобацилл (состоящий из L. salivarius CW30 и L. brevis SH111, L. plantarum SH1313, L. plantarum KS11 и L. plantarum Y1An734) может поддерживать ингибирование ряда патогенных С. difficile, нет взаимного ингибирования отдельных штаммов, которое могло бы повлиять на терапевтическую эффективность этой бактериальной смеси.
Чувствительность штаммов Lactobacillus к антибиотикам. Было показано, что чувствительность лактобацилл к антибиотикам зависит от вида и штамма. Поэтому была проведена оценка чувствительности пяти разных лактобацилл L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) к антибиотикам с применением дискового диффузионного теста. Чашки с агаром Рогоза засевали бактериями из свежеприготовленных культур штаммов Lactobacillus. Проводили дисковые диффузионные тесты с эритромицином (15 мкг на диск), ванкомицином (30 мкг на диск) и метронидазолом (5 мкг на диск). Результаты показаны в Таблице 3. S обозначает чувствительность, и R обозначает резистентность.
Данные профиля антибиотиков показывают, что все L. salivarius CW30 и L. brevis SH111, L. plantarum SH1313, L. plantarum KS11 и L. plantarum Y1An734 чувствительны к эритромицину, лекарственному средству, известному как макролидный антибиотик, и ни один из штаммов не чувствителен к ванкомицину или метронидазолу.
Адгезия штаммов лактобацилл на человеческих энтероцитоподобных клетках Сасо-2. Адгезия штаммов лактобацилл на слизистой оболочке кишечника является одним из необходимых свойств для колонизации ими кишечного тракта, где они конкурируют с другими бактериями. Линия клеток кишечника человека Сасо-2 (из аденокарциномы толстой кишки) является хорошо охарактеризованной клеточной моделью и при полной дифференцировке приобретает свойства зрелых энтероцитов с функциональными микроворсинками щеточной каемки. Клеточная линия Сасо-2 широко используется для изучения бактериальной адгезии и инвазии.
5
8
В настоящем исследовании сравнивали адгезию различных штаммов Lactobacillus на клетках Сасо-2. Клетки Сасо-2 выращивали в пластиковых чашках Петри диаметром 100 мм. Клетки высевали в чашки диаметром 35 мм в количестве 5×10 и использовали через две недели после смыкания монослоя (полностью дифференцированные клетки). К отмытым клеточным монослоям добавляли бактериальные клетки (5×10) и проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С. Авторы изобретения использовали L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и четыре штамма лактобацилл, выделенных из различных пищевых продуктов, имеющихся в продаже, L. paracasei CNCM I-1518, L. plantarum DSM 9843, L. acidophilus DSM 13241 и L. rhamnosus ATCC 53103.
Затем все монослои промывали 3 раза PBS для отмывки несвязанных бактерий и окрашивали раствором красителя Гимза. Затем чашки промывали, сушили в течение 1 ч и исследовали под микроскопом (увеличение ×100) с масляной иммерсией. Проводили подсчет штаммов Lactobacillus в 20 выбранных случайным образом микроскопических полях зрения и определяли средние значения.
Как показано на Фиг. 6, были существенные различия в адгезии разных штаммов лактобацилл на клетках Сасо-2, указывающие на то, что адгезионные свойства не являются универсальным свойством лактобацилл. Наибольшую эффективность адгезии на клетках Сасо-2 продемонстрировали L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. brevis SH111 (LMG P-28888) и L. salivarius CW30 (LMG P-28887). Несмотря на то, что адгезионные свойства L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. paracasei CNCM I-1518 несколько слабее, их адгезия на клетках Сасо-2 все равно представляется более существенной, чем адгезионные свойства L. plantarum DSM 9843, L. acidophilus DSM 13241 и L. rhamnosus ATCC 53103.
7
2
Антагонистическая активность комбинации штаммов Lactobacillus против штаммов Salmonella и Escherichia coli. Авторы изобретения также оценили способность комбинации пяти лактобацилл L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMGP-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) ингибировать рост Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium и Escherichia coli in vitro. Штаммы Lactobacillus культивировали в течение 48 ч в жидкой среде Мана-Рогоза-Шарпа (MRS) при 37°С. Штаммы Salmonella и Е. coli культивировали в течение 24 ч в жидкой среде с сердечно-мозговым экстрактом (BHI) при 37°С. Все бактериальные культуры центрифугировали при 4°С и осадок суспендировали в 0,9% растворе NaCl с получением концентрации 0,5 по шкале мутности МакФарланда. 100 мкл клеточные суспензии штаммов Salmonella или Е. coli высевали и распределяли по чашкам с кровяным агаром Уилкинса-Чалгрена. Готовили смесь, содержащую равные количества каждого из пяти штаммов Lactobacillus (которые добавляли на одни и те же сутки эксперимента) в конечной концентрации 1×10 КОЕ/мл. Раздельными штрихами (приблизительно 2 см) наносили по 10 мкл суспензии лактобацилл. Чашки инкубировали в течение 48 ч при 37°С (с 5% СО). Затем проводили оценку зон ингибирования роста.
Как показано в Таблице 4, результаты ясно демонстрируют, что комбинация L. salivarius CW30 и L. brevis SH111, L. plantarum SH1313, L. plantarum KS11 и L. plantarum Y1An734 способна сильно ингибировать рост Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium и Escherichia coli. Эти данные еще раз демонстрируют антимикробный потенциал смеси лактобацилл против желудочно-кишечных патогенных бактерий.
Клинические случаи
Настоящее исследование продемонстрировано следующими примерами клинических исследований, проведенных в отделении инфекционных заболеваний университетской клиники Сконе в Мальме, Швеция (в 2013-2014 гг.). Приведенные примеры, материалы и методики следует понимать широко в соответствии с объемом изобретения, описанного здесь.
Случай 1. Инфекция, вызываемая Clostridium difficile, является частым осложнением антибиотикотерапии у госпитализированных пациентов. Пациентке в возрасте 70 лет с активным раком прямой кишки после наложения стомы были проведены несколько курсов антибиотиков по поводу проблем с заживлением ран. В течение года у нее развился рецидивирующий колит, вызванный С. difficile, по поводу которого несколько раз проводили терапию метронидазолом и затем ванкомицином по методу деэскалации в течение шести недель. У нее снова развился рецидив инфекции, вызванной С. difficile (CDI).
12
Метод. Была предоставлена комбинация из пяти лактобацилл L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) (равные количества каждого штамма). 1×10 КОЕ были смешаны со стерильной жидкой кашей с высоким содержанием клетчатки. Затем композиция была примешана к клизменному раствору и была проведена инфузия в толстую кишку через ректальный зонд. Процедура была повторена пять раз с интервалом 3-5 суток.
Результат. Через 3 месяца у пациентки наступило клиническое и бактериологическое выздоровление без признаков рецидива инфекции в течение одного года после последней процедуры.
Случай 2. Пациент в возрасте 75 лет с несколькими заболеваниями. У него развился рецидивирующий колит, вызванный С. difficile, после длительного лечения далацином, содержащим антибиотик, называемый гидрохлоридом клиндамицина, годом ранее. Ему было проведено два курса метронидазола с последующим введением ванкомицина на протяжении 10 суток. После шести недель деэскалации у него развился рецидив CDI. Ему была проведена трансплантация фекальной микробиоты в форме фекалий здоровых доноров, подготовленных клиническими исследователями в клинике. После нового курса лечения антибиотиками у него снова развился рецидив CDI.
Метод. Была предоставлена композиция пяти лактобацилл, как описано выше, и проведена инфузия раствора клизмой. Процедура была повторена три раза с интервалом 7 суток.
Результат. Через несколько дней у пациента наступило клиническое выздоровление без признаков рецидива инфекции в течение одного года после последней процедуры.
Случай 3. У пациентки в возрасте 55 лет был рецидивирующий колит, вызванный С. difficile, развившийся после длительных курсов лечения антибиотиками. Ей было проведено два курса метронидазола с последующим введением ванкомицина на протяжении 10 суток. После шести недель деэскалации у нее развился рецидив CDI.
Метод. Была предоставлена композиция пяти лактобацилл, как описано выше, и проведена инфузия раствора клизмой. Процедура была повторена три раза с интервалом 7 суток.
Результат. Через несколько дней у пациентки наступило клиническое выздоровление без признаков рецидива инфекции в течение одного года после последней процедуры.
Случай 4. У молодого человека в возрасте 20 лет развился синдром раздраженного кишечника (СРК) после перенесенного ранее гастроэнтерита. Ему была дважды проведена трансплантация фекальной микробиоты в форме фекалий здоровых доноров (подготовленных клиническими исследователями в клинике) без признаков улучшения состояния.
Метод. Была предоставлена композиция пяти лактобацилл, как описано выше, и проведена инфузия раствора клизмой. Процедура была повторена три раза с интервалом 7 суток.
Результат. У пациента было отмечено существенное уменьшение симптомов СРК. У него не было никаких признаков клинического ухудшения в течение одного года после последней процедуры.
Результаты клинических исследований демонстрируют, что бактериальная композиция, состоящая из L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. salivarius CW30 (LMG P-28887), L. brevis SH111 (LMG P-28888), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), эффективна и относительно безопасна для лечения пациентов с тяжелыми желудочно-кишечными расстройствами.
Конкретные воплощения
1. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887).
2. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886).
3. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. plantarum SH1313 (LMG P-28884).
4. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
5. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. brevis SH111 (LMG Р-28888).
6. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. plantarum SH313 (LMG-28884).
7. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
8. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
9. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG Р-28884) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
10. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) and L. brevis SH111 (LMG P-28888).
11. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
12. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. brevis SH111 (LMG P-28888).
13. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
14. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
15. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMGP-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
16. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887), L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
17. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum Y1An734 (LMG P-28886).
18. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886) и L. plantarum SH1313 (LMG P-28884).
19. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
20. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) и L. brevis SH111 (LMG Р-28888).
21. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
22. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
23. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum YlAn734 (LMG Р-28886), L. plantarum KS11 (LMG P-28885), L. brevis SH111 (LMG P-28888).
24. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886), L. plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
25. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum SH1313 (LMG P-28884).
26. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
27. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L.plantarum SH1313 (LMG P-28884) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
28. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L.plantarum SH1313 (LMG P-28884), L. plantarum KS11 (LMG P-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
29. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
30. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. plantarum KS11 (LMG Р-28885) и L. brevis SH111 (LMG P-28888).
31. Композиция для использования в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства, содержащая L. brevis SH111 (LMG Р-28888).
32. Композиция для использования по любому из воплощений 1-31, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой диарею, антибиотико-ассоциированную диарею (ААД), гастроэнтерит, острый гастроэнтерит и инфекционную диарею.
33. Композиция для использования по любому из воплощений 1-32, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой бактериальную инфекцию, вызываемую Clostridium difficile, Salmonella или Escherichia coli.
34. Композиция для использования по любому из воплощений 1-33, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой инфекцию, вызываемую Clostridium difficile NAP1/027.
35. Композиция для использования по любому из воплощений 1-32, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой синдром раздраженного кишечника (СРК) или воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).
36. Композиция для использования по любому из воплощений 1-35, вводимая перорально.
37. Композиция для использования по любому из воплощений 1-36, вводимая в форме клизмы.
38. Композиция для использования по любому из воплощений 1-37, вводимая инфузией в верхние отделы желудочно-кишечного тракта.
9
13
39. Композиция для использования по любому из воплощений 1-38, где общее количество лактобацилл составляет от 10 до 10 КОЕ на одно введение и введение повторяют один раз в неделю по меньшей мере два раза.
40. Композиция для использования по любому из воплощений 1-39, представляющая собой лиофилизированную композицию.
41. Композиция для использования по воплощению 40, дополнительно содержащая клетчаточный компонент.
42. Композиция для использования по воплощению 41, где клетчаточный компонент выбран из группы, состоящей из овсяной клетчатки, пшеничной клетчатки, ржаной клетчатки, клетчатки чиа, кукурузной клетчатки, ячменной клетчатки, картофельной клетчатки, клетчатки фруктов, клетчатки овощей, клетчатки злаков и клетчатки водорослей.
43. Композиция для использования по любому из воплощений 40-42, где бактерии суспендированы в жидкой каше, пюре, каше или пудинге.
44. Композиция для использования по воплощению 43, где жидкая каша представляет собой жидкую овсяную кашу.
45. Клизма, содержащая композицию по любому из воплощений 1-44.
46. Выделенный штамм L. salivarius CW30 (LMG Р-28887).
47. Выделенный штамм L. plantarum Y1An734 (LMG Р-28886).
48. Выделенный штамм L. plantarum SH1313 (LMG P-28884).
49. Выделенный штамм L. plantarum KS11 (LMG P-28885).
50. Выделенный штамм L. brevis SH111 (LMG P-28888).
51. Выделенный штамм L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) для использования в лечении и/или предупреждении инфекции, вызываемой Clostridium difficile NAP1/027.
52. Выделенный штамм по любому из воплощений 47-50 для применения в лечении и/или предупреждении инфекции, вызываемой Clostridium difficile NAP1/027.
53. Способ лечения и/или предупреждения желудочно-кишечного расстройства путем введения композиции по любому из воплощений 1-44, или клизмы по воплощению 45, или выделенного штамма по любому из воплощений 46-50.
54. Способ лечения и/или предупреждения по воплощению 53, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой диарею, антибиотико-ассоциированную диарею (ААД), гастроэнтерит, острый гастроэнтерит и инфекционную диарею.
55. Способ лечения и/или предупреждения по воплощению 53 или 54, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой бактериальную инфекцию, вызываемую Clostridium difficile, Salmonella или Escherichia coli.
56. Способ лечения и/или предупреждения по любому из воплощений 53-55, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой инфекцию, вызываемую Clostridium difficile NAP1/027.
57. Способ лечения и/или предупреждения по любому из воплощений 53-56, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой синдром раздраженного кишечника (СРК) или воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).
58. Способ лечения и/или предупреждения по любому из воплощений 53-57, где композицию вводят перорально.
59. Способ лечения и/или предупреждения по любому из воплощений 53-58, где композицию вводят в форме клизмы.
60. Способ лечения и/или предупреждения по любому из воплощений 53-59, где композицию вводят инфузией в верхние отделы желудочно-кишечного тракта.
9
13
61. Способ лечения и/или предупреждения по любому из воплощений 53-60, где общее количество лактобацилл составляет от 10 до 10 КОЕ на одно введение и введение повторяют один раз в неделю по меньшей мере два раза.
62. Применение композиции по любому из воплощений 1-44, или клизмы по воплощению 45, или выделенного штамма по любому из воплощений 46-50 в лечении и/или предупреждении желудочно-кишечного расстройства.
63. Применение по воплощению 62, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой диарею, антибиотико-ассоциированную диарею (ААД), гастроэнтерит, острый гастроэнтерит и инфекционную диарею.
64. Применение по воплощению 62 или 63, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой бактериальную инфекцию, вызываемую Clostridium difficile, Salmonella или Escherichia coli.
65. Применение по любому из воплощений 62-64, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой инфекцию, вызываемую Clostridium difficile NAP1/027.
66. Применение по любому из воплощений 62-64, где желудочно-кишечное расстройство представляет собой синдром раздраженного кишечника (СРК) или воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).
67. Применение по любому из воплощений 62-66, где композицию вводят перорально.
68. Применение по любому из воплощений 62-66, где композицию вводят в форме клизмы.
69. Применение по любому из воплощений 62-68, где композицию вводят инфузией в верхние отделы желудочно-кишечного тракта.
9
13
70. Применение по любому из воплощений 62-69, где общее количество лактобацилл составляет от 10 до 10 КОЕ на одно введение и введение повторяют один раз в неделю по меньшей мере два раза.
71. Применение выделенного штамма L. salivarius CW30 (LMG Р-28887) в лечении и/или предупреждении инфекции, вызываемой Clostridium difficile NAP1/027.
72. Применение выделенного штамма по любому из воплощений 47-50 для лечения и/или предупреждения инфекции, вызываемой Clostridium difficile NAP1/027.