МОЛЕКУЛЫ ИСКУССТВЕННОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты, включающая
a. по меньшей мере одну открытую рамку считывания (ORF); и
b. по меньшей мере один элемент 3′-нетранслируемой области (элемент 3′-UTR), включающий последовательность нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина, или от варианта 3′-UTR гена альбумина,
где открытая рамка считывания предпочтительно не кодирует бета-глобин, в частности, в том случае, когда элемент 3′-UTR происходит от 3′-UTR гена альбумина крысы, и
где открытая рамка считывания предпочтительно не кодирует фактор IX человека, в частности, в том случае, когда элемент 3′-UTR происходит от 3′-UTR гена альбумина человека.
2. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1, дополнительно включающая стебель-петлю гистона.
3. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где по меньшей мере один элемент 3′-UTR включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина позвоночных или от его варианта, предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина млекопитающих, например, от гена альбумина мыши или от его варианта, более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина приматов, особенно от гена альбумина человека или гена альбумина бабуина анубис или от их вариантов, еще более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина человека в соответствии с регистрационным номером GenBank NM_000477.5 или от его варианта.
4. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где по меньшей мере один элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, или где по меньшей мере один элемент 3′-UTR включает или состоит из фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, который идентичен по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.
5. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 4, где фрагмент имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
6. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где по меньшей мере один элемент 3′-UTR имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
7. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, дополнительно включающая
с. поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования.
8. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 7, где сигнал полиаденилирования локализован в пределах элемента 3′-UTR.
9. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 7 или 8, где сигнал полиаденилирования включает консенсусную последовательность NN(U/T)ANA, с N=A или U, предпочтительно АА(U/T)AAA или A(U/T)(U/T)AAA.
10. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 7 или 8, где сигнал полиаденилирования, предпочтительно консенсусная последовательность NNUANA, локализован менее чем приблизительно на 50 нуклеотидов выше 3′-конца 3′-UTR.
11. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 7 или 8, где поли(А)-последовательность имеет длину от приблизительно 20 до приблизительно 300 адениновых нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 200 адениновых нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 100 адениновых нуклеотидов, даже более предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 70 адениновых нуклеотидов.
12. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где открытая рамка считывания не кодирует альбумин, предпочтительно не кодирует альбумин человека.
13. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, дополнительно включающая структуру 5′-кэпа, поли(С)-последовательность, стебель-петлю гистона и/или мотив IRES.
14. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где нуклеиновая кислота включает дополнительный 5′-элемент, предпочтительно 5′-UTR, промотор или 5′-UTR и последовательность, содержащую промотор.
15. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где молекула искусственной нуклеиновой кислоты, предпочтительно открытая рамка считывания, является, по меньшей мере, частично G/C модифицированной, предпочтительно, где содержание G/C открытой рамки считывания повышено по сравнению с открытой рамкой считывания дикого типа.
16. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где открытая рамка считывания включает кодон-оптимизированную область, предпочтительно, где открытая рамка считывания является кодон-оптимизированной.
17. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, которая представляет собой РНК, предпочтительно молекулу мРНК.
18. Вектор, включающий
a. открытую рамку считывания и/или сайт клонирования; и
b. по меньшей мере один элемент 3′-нетранслируемой области (элемент 3′-UTR), включающий последовательность нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина или от варианта 3′-UTR гена альбумина,
где открытая рамка считывания предпочтительно не кодирует бета-глобин, в частности, в том случае, когда элемент 3′-UTR происходит от 3′-UTR гена альбумина крысы, и
где открытая рамка считывания предпочтительно не кодирует фактор IX человека, в частности, в том случае, когда элемент 3′-UTR происходит от 3′-UTR гена альбумина человека.
19. Вектор по п. 18, дополнительно включающий стебель-петлю гистона.
20. Вектор по п. 18, где по меньшей мере один элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина позвоночных или от его варианта, предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина млекопитающих, например, от гена альбумина мыши или от его варианта, более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина приматов, особенно от гена альбумина человека или от гена альбумина бабуина анубис или от их вариантов, еще более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина человека в соответствии с регистрационным номером GenBank NM_000477.5 или от его варианта.
21. Вектор по п. 18 или 19, где по меньшей мере один элемент 3'-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, или где по меньшей мере один элемент 3′-UTR включает или состоит из фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, который идентичен по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.
22. Вектор по п. 21, где фрагмент имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
23. Вектор по п. 18 или 19, где по меньшей мере один элемент 3′-UTR имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
24. Вектор по п. 18, дополнительно включающий
с. поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования.
25. Вектор по п. 24, где сигнал полиаденилирования локализован в пределах элемента 3′-UTR.
26. Вектор по п. 24 или 25, где сигнал полиаденилирования включает консенсусную последовательность NN(U/T)ANA, с N=A или U, предпочтительно АА(U/T)AAA или A(U/T)(U/T)AAA.
27. Вектор по п. 24 или 25, где сигнал полиаденилирования, предпочтительно консенсусная последовательность NNUANA, локализован менее чем приблизительно на 50 нуклеотидов выше 3′-конца элемента 3′-UTR.
28. Вектор по п. 24 или 25, где поли(А)-последовательность имеет длину от приблизительно 20 до приблизительно 300 адениновых нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 40 до приблизительно 200 адениновых нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 100 адениновых нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 70 адениновых нуклеотидов.
29. Вектор по п. 18 или 19, где открытая рамка считывания не кодирует альбумин человека, предпочтительно не кодирует альбумин.
30. Вектор по п. 18 или 19, где открытая рамка считывания не кодирует фактор IX человека или репортерный белок, предпочтительно не кодирует белок GFP, белок люциферазы или белок глобина, или их варианты.
31. Вектор по п. 18 или 19, дополнительно включающий поли(С)-последовательность и/или мотив IRES.
32. Вектор по п. 18 или 19, дополнительно включающий 5′-элемент, предпочтительно 5′-UTR, промотор или 5′-UTR и последовательность, содержащую промотор.
33. Вектор по п. 18 или 19, который является, по меньшей мере, частично G/C модифицированным, предпочтительно, где открытая рамка считывания является, по меньшей мере, частично G/C модифицированной, предпочтительно, где содержание G/C открытой рамки считывания повышено по сравнению с открытой рамкой считывания дикого типа.
34. Вектор по п. 18 или 19, где открытая рамка считывания включает кодон-оптимизированную область, предпочтительно, где открытая рамка считывания является кодон-оптимизированной.
35. Вектор по п. 18 или 19, который представляет собой ДНК-вектор.
36. Вектор по п. 18 или 19, который представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор, предпочтительно плазмидный вектор.
37. Вектор по п. 18 или 19, который включает молекулу искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17.
38. Вектор по п. 18 или 19, который представляет собой кольцевую молекулу.
39. Вектор по п. 38, где за поли(А)-последовательностью или элементом 3′-UTR кодирующей цепи следует в направлении 5′→3′ сайт рестрикции для линеаризации кольцевой молекулы вектора.
40. Клетка, включающая молекулу искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17 или вектор по любому из пп. 18-39.
41. Клетка по п. 40, которая представляет собой клетку млекопитающего.
42. Клетка по п. 40 или 41, которая представляет собой клетку индивидуума-млекопитающего, предпочтительно выделенную клетку индивидуума-млекопитающего, предпочтительно человека.
43. Фармацевтическая композиция, включающая молекулу искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17, вектор по любому из пп. 18-39 или клетку по любому из пп. 40-42.
44. Фармацевтическая композиция по п. 43, дополнительно включающая один или более фармацевтически приемлемых разбавителей и/или наполнителей, и/или один или более адъювантов.
45. Применение молекулы искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17 или вектора по любому из пп. 18-39 в генной терапии и/или генетической вакцинации.
46. Применение клетки по любому из пп. 40-42 в генной терапии и/или генетической вакцинации.
47. Применение фармацевтическая композиция по п. 43 или 44 в генной терапии и/или генетической вакцинации.
48. Способ лечения или профилактики нарушения, включающий введение молекулы искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17, вектора по любому из пп. 18-39, клетки по любому из пп. 40-42 или фармацевтической композиции по п. 43 или 44 нуждающемуся в этом индивидууму.
49. Способ лечения или профилактики нарушения, включающий трансфекцию клетки молекулой искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17 или вектором по любому из пп. 18-39.
50. Способ по п. 49, где трансфекция клетки осуществляется in vitro/ex vivo, и трансфицированная клетка вводится нуждающемуся в этом индивидууму, предпочтительно больному человеку.
51. Способ по п. 50, где клетка, подлежащая трансфекции in vitro, представляет собой выделенную клетку индивидуума, предпочтительно больного человека.
52. Способ по любому из пп. 48-51, который представляет собой способ вакцинации или способ генной терапии.
53. Способ стабилизации и/или продления продукции белка с молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно с молекулы мРНК или вектора, причем способ включает стадию связывания молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы мРНК или вектора, с элементом 3′-UTR, где элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина или от варианта 3′-UTR гена альбумина.
54. Способ по п. 53, где элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина позвоночных или от его варианта, предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина млекопитающих, например, от гена альбумина мыши или от его варианта, более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина приматов, особенно от гена альбумина человека или от гена альбумина бабуина анубис или от их вариантов, еще более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина человека в соответствии с регистрационным номером GenBank NM_000477.5 или от его варианта.
55. Способ по п. 53, где элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, или где элемент 3′-UTR включает или состоит из фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, который идентичен по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.
56. Способ по п. 55, где фрагмент имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
57. Способ по п. 53, где элемент 3′-UTR имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
58. Применение элемента 3′-UTR для стабилизации и/или продления продукции белка с молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно с молекулы мРНК или вектора, где элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина или от варианта 3′-UTR гена альбумина.
59. Применение по п. 58, где элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая происходит от 3′-UTR гена альбумина позвоночных или от его варианта, предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина млекопитающих, например, от гена альбумина мыши или от его варианта, более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина приматов, особенно от гена альбумина человека или от гена альбумина бабуина анубис или от их вариантов, еще более предпочтительно от 3′-UTR гена альбумина человека в соответствии с регистрационным номером GenBank NM_000477.5 или от его варианта.
60. Применение по п. 58, где элемент 3′-UTR включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентична по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, или где элемент 3′-UTR включает или состоит из фрагмента последовательности нуклеиновой кислоты, который идентичен по меньшей мере приблизительно на 40%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 50%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 60%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 90%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 99% последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.
61. Применение по п. 60, где фрагмент имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
62. Применение по п. 58, где элемент 3′-UTR имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 125 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 150 нуклеотидов.
63. Набор или набор из частей, включающий молекулу искусственной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-17, вектор по любому из пп. 18-39, клетку по любому из пп. 40-42 и/или фармацевтическую композицию по п. 43 или 44.
64. Набор по п. 63, дополнительно включающий инструкции по применению, клетки для трансфекции, адъювант, средство для введения фармацевтической композиции, фармацевтически приемлемый носитель и/или фармацевтически приемлемый раствор для растворения или разбавления молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, ДНК-вектора или фармацевтической композиции.