Оценка генотоксичности тетрахлорметана и защитного действия силибинина и хаурантина с помощью метода ДНК-комет в печени крыс

методов оказались сопоставимы (табл. 2). Сапонины надземной части патринии скабиозолистной ранее не исследовались. Обнаружено, что сырье травы содержит эти соединения, количество которых, определенное методом осаждения, близко к таковому в корнях (3,4 и 4,5 % соответственно). Надземная часть растения содержит 1,3 % олеаноловой кислоты.

Дубильные вещества в сырье патринии скабиозолистной обнаружены в надземной части в количестве 5,4 % (от абсолютно сухой массы). В корнях дубильных веществ не обнаружено.

Проведенные исследования показали, что основными экстрактивными веществами как надземной, так и корневой частей патринии скабиозолистной являются эфирные масла, фенолкарбоновые кислоты, сапонины и полисахариды.

Литература

1. Бабаш Т.А., Перельсон М.Е. Количественное определение агликона суммы патринозидов в корнях патринии средней // Химия природ. соед. 1982. № 5. С. 612-624.

2. Бухаров В.Г., Карлин В.В., Сидорович Т.Н. Тритерпеновые гликозиды РаМша БсаБюзИШа // Химия природных соединений. 1970. № 1. С. 69-74.

3. Зорикова О.Г., Хасина Э.И. Седативная и стресс-протектив-ная активность настоек РаШта БсаБюзИШа (Уа1ег1апасеае) //

Растительные ресурсы. 2006. Т.42, вып.3. C.150-155.

4. Ушкалова А.В., Илларионова Т.С. Эффективность и безопасность антидепрессивных и седативных средств растительного происхождения // Фармация. 2008. № 20. С. 10-14.

5. Фурса Н.С., Доля В.С., Литвиненко В.И. Зайцев В.Г. Фиохишч-не досл1женнянасшня валер1ани высоко! та патрши скабюзо-листно1 // Фармац. журн. 1984. № 3. С. 69-70.

6. Harborne J.B. Nature, distribution and function of plant flavonoids // Progress in clinical and biological res. 1986. Vol. 213. P. 15-24.

Поступила в редакцию 18.12.2012.

CHEMICAL ANALYSIS OF pATRINIA ScABKSIFoLIA

O.G. Zorikova1, L.V. Yakimenko2

The V. L. Komarov Mountain-Taiga Station, FEB RAS (26 1 Solnechnaya St. Gorno-Tayozhnoye village Primorsky Krai 692533 Russian Federation), 2 Interdepartmental Research and Educational Centre “Plant Resources” (The V. L. Komarov Mountain-Taiga Station, FEB RAS - Vladivostok State University of Economics and Service, 41 Gogolya St. Vladivostok 690014 Russian Federation) Summary - The paper provides studies on chemical composition of root and above-ground parts of Patrinia scabiosifolia. The plant samples have been collected and prepared during blossom time, then treated with solvents with increasing polarity. As reported, the main extractive substances from both above-ground and root parts of the plant are essential oils, phenolcarbonic acids, saponins, and polysaccharides. Key words: Patriniascabiosifolia, essential oils, phenolcarbonic acids, saponins.

Pacific Medical Journal, 2013, No. 2, p. 61-63.

УДК 611.36:577.213/.217:546.26:615.244/.3

ОЦЕНКА генотоксичности тетрахлорметана и защитного действия силибинина и хаурантина с помощью метода днк-комет в ПЕЧЕНИ КРЫС

А.В. Кропотов1, В.П. Челомин2, В.В. Слободскова2, Е.Е. Солодова1, А.О. Михайлов1

1 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690050, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),

2 Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН

Ключевые слова: четыреххлористый углерод, токсический

С помощью метода ДНК-комет (микроэлектрофорез ДНК единичной клетки) исследовали индуцированную тетрахлорме-таном деградацию ДНК в клетках печени крыс. Показано, что гепатотоксичность, которую оценивали по профилю комет, обусловлена повреждением генома гепатоцитов. Препарат силибинин, полученный из растения расторопши пятнистой -БИуЬит ma.ria.num (Ь.) ОаеЛп. - и экстракт из туники асцидии пурпурной - ИаОсупШа аитапЫит - хаурантин, оказывали генопротективное действие. Рассматриваются основные механизмы деструктивного действия тетрахлорметана.

В соответствии с современными принципами лечения заболеваний печени программа комплексной терапии этой патологии включает два основных направления. Первое представляет собой этиотропную терапию, направленную на элиминацию возбудителя и санацию организма; второе направление соответствует патогенетической терапии, имеющей целью фармакологическую коррекцию универсальных, мультифакторных

Кропотов Александр Валентинович - д-р мед. наук, профессор кафедры общей и клинической фармакологии ТГМУ, e-mail: pharmakolog@ yandex.ru

гепатит, генотоксичность, гепатопротекция.

и разнесенных во времени звеньев патогенеза [2, 10]. Среди патогенетических средств лечения заболеваний печени традиционно выделяют группу гепатопротек-торов, преимущественно растительного происхождения, обладающих антиоксидантными свойствами, среди которых нашли широкое применение в клинической гепатологии препараты, созданные на основе расторопши пятнистой (силибинин, силибор, легалон), солянки холмовой (лохеин) и др. [8, 10, 11]. В последние годы на моделях токсического гепатита получены обнадеживающие данные о защитном действии экстрактивных веществ, выделенных из гидробионтов: трепанга японского, карбикулы японской, асцидии пурпурной и др. [4-7]. Прослеживается закономерность: препараты, обладающие стресс-протективной и антиокислительной активностью, как правило, оказывают и гепатозащитное действие [1, 4-7].

Асцидия пурпурная (ИаЪсупШа аитпйит) - один из пяти объектов, отобранных в процессе скрининга на стресс-модулирующую активность из спиртовых экстрактов 70 видов морских беспозвоночных,

обитающих в заливе Петра Великого Японского моря [3], и, как было установлено в дальнейшем, препараты из асцидии (хаурантин) оказывали мебранопротек-тивное и антистрессовое действие, в том числе при С04-индуцированном и алкогольном гепатите [4, 5, 7]. Несмотря на обширные токсикологические исследования [5], отсутствуют данные о генотоксичности по отношению к печени как CCl4, так и хаурантина.

Цель нашего исследования состояла в экспериментальной оценке влияния четыреххлористого углерода и его комбинаций с силибинином или хаурантином на степень повреждения ДНК (по интенсивности миграции ДНК и длине формирующихся ДНК-комет в индивидуальных клетках) в печени крыс.

Материал и методы. Для эксперимента была выбрана тетрахлорметановая модель острого токсического гепатита, рекомендованная Фармакологическим комитетом РФ как основной тест при скрининге потенциальных гепатозащитных средств [1]. Четыреххлористый углерод является политропным химическим агентом, способным взаимодействовать с различными макромолекулами и структурами клетки, инициировать в печени оксидативный стресс, вызывать колликвационный некроз, белковую и жировую дистрофию гепатоцитов [1, 11]. Опыты были выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 280-320 г. В качестве гепатозащитных средств были изучены: препарат из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.), содержащий силибинин (суспензия, полученная из карсила, Pharmachim Holding EAD, Болгария) и жидкий экстракт из туники асцидии пурпурной (Halocynthia aurantium), имеющий товарный знак «Хаурантин» (патент № 1522497, приоритет от 08.08.1985, свидетельство на товарный знак № 236689 от 24.05.2001).

Крысы были разделены на четыре группы по 6 особей в каждой:

1-я группа - контрольная; животным в течение 5 дней один раз в сутки подкожно вводили 0,4 мл оливкового масла;

2-я группа - животные, которым в течение 5 дней подкожно вводили 50 % масляный раствор четыреххлористого углерода в дозе 0,4 мл/кг/сут.;

3-я группа - животные, которым наряду с тетрахлор-метаном вводили внутрибрюшинно силибинин в дозе 100 мг/кг/сут.;

4-я группа - животные, которым наряду с тетрахлор-метаном вводили внутрибрюшинно хаурантин в дозе 0,4 мл/кг/сут.

Обе субстанции вводили крысам за 1 час до применения гепатотоксина. Моделирование С04-инду-цированного гепатита и дозирование гепатозащитных средств осуществляли в соответствии с существующими рекомендациями [1, 4, 5, 11]. Для контроля состояния перекисного окисления липидов в гомогенатах печени с помощью реакции с 2-тиобарбиту-ровой кислотой измеряли концентрацию малонового

диальдегида (МДА) - водорастворимого продукта окислительной деградации жирных кислот [13].

Экспериментальную работу по изучению CCl4-индуцированных повреждений структуры молекулы ДНК выполняли на клетках печени крыс. Животных выводили из опыта в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, применяемых для экспериментальных и других научных целей (86/609 ЕЕС) и указом Минздрава СССР от 12.08.1974 г. № 755 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Печень для удаления крови трижды промывали холодным (4 °С) изотоническим раствором, не содержащим Са2+ и Mg2+ (500 мМ NaCl, 12,5 мМ КО, 5 мМ ЭДТА-№2 и 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4), затем аккуратно разрезали ножницами на небольшие фрагменты и помещали в 4-5 мл изотонического раствора. Через 30-40 мин инкубации выделившиеся клетки отделяли от фрагментов печени фильтрованием через мельничный газ с диаметром ячеи 40 мкм. Клетки, находящиеся в фильтрате, осаждали центрифугированием и доводили в изотоническом растворе до концентрации 105/мл.

Для оценки влияния CCl4 на структуру ДНК применяли метод электрофореза единичной клетки (Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE), известный в литературе как метод ДНК-комет (Comet Assay). В настоящее время этот метод получил широкое признание и является быстрым и чувствительным инструментом для демонстрации повреждающего действия химических веществ и физических факторов на ДНК на уровне клетки [9, 14]. Образующиеся при повреждении цепей ДНК фрагменты, активно мигрирующие в постоянном электрическом поле от ядра, образуют «хвост», напоминающий комету. По существу комета представляет собой клеточный геном, поскольку в щелочных условиях (при рН более 13) РНК распадается и флуоресцирует только комплекс «ДНК-краситель». В нашем эксперименте длина миграции указывала на присутствие клеток с одноцепочными разрывами в молекуле ДНК.

В работе использовали щелочной вариант кометного анализа [15]. Для этого 50 мкл суспензии клеток добавляли к 100 мкл 1 % легкоплавкой агарозы (LKB, Швеция) в 0,04 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 37 °С, тщательно перемешивали, наносили на предметное стекло, предварительно покрытое для улучшения прилипания 1 % раствором агарозы, и накрывали покровным стеклом. Образец на 3 мин помещали в холодильник для образования геля. Покровное стекло осторожно снимали, каждый слайд погружали на 1 час в лизирующий раствор (2,5 М NaCl; 0,1 М ЭДТА-№2; 1 % Тритон Х-100; 10 % ДМСО; 0,02 М трис, рН 10) и помещали в темное холодное место. После промывания холодной дистиллированной водой слайды переносили в электрофорезный буфер (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА-№2) и выдерживали 40 мин. Электрофорез проводили при напряжении 2 В/см в течение 15 мин.

После нейтрализации (0,4 М трис-HCl, рН 7,4) слайды окрашивали этидиум бромидом (2 мкг/мл).

Визуализацию и регистрацию ДНК-комет осуществляли с помощью сканирующего флуоресцентного микроскопа (Zeiss, AxioImager Al), оснащенного цифровой фотокамерой AxioCam MRc. Для обработки цифровых изображений использовали компьютерную программу CometScore Freeware v. 1.З (http:/www. autocomet.com/products_cometscore.php), которая позволяет вычислить параметры комет, указывающие на степень повреждения клеточной ДНК. В каждой комете определяли три параметра: 1) долю ДНК в хвосте кометы ( %DNAt); 2) длину хвоста кометы (Lt) и 3) момент хвоста кометы, который представляет собой произведение длины хвоста кометы (Lt) на долю ДНК в нем ( %DNAt).

Во всех группах крыс анализировали по З слайдов на животное, на каждом из которых регистрировали не менее 30 комет. Статистическую оценку результатов проводили путем сравнения среднегрупповых показателей поврежденности ДНК с использованием непараметрического критерия Даннета.

Результаты исследования. При анализе картины, образуемой клетками печени после электрофореза, видно, что молекула ДНК клеток печени контрольных крыс формировала симметричное яркое ядро (полость в агарозе, заполненную ДНК) и окружавшего его «гало», представленное вышедшими в агарозу петлями высокополимерной ДНК (рис. 1, а). В то же время в клетках печени экспериментальных крыс, подвергшихся воздействию тетрахлорметана, молекула ДНК образовывала хорошо выраженные кометы, что, очевидно, обусловлено глубокой деградацией генома и миграцией низкополимерных фрагментов ДНК (рис. 1, б). Исходя из классификации, предложенной A.R. Collins et al. в 1993 г., клетки печени контрольных животных формировали кометы, которые можно отнести к двум классам: С0 и С1. Иногда визуально трудно различить кометы этих классов, поэтому их объединяют в одну группу (С0/С1)-комет,

Таблица

Влияние силимарина и хаурантина на СС14-индуцируемую генотоксичность в печени крыс

Показатель Группа животных

1-я 2-я 3-я 4-я

НАК*, % 7,0 60,0 48,3 47,3

Lt, px 75,4±16,4 232,9±45,4 164,1±49,1 160,2±43,1

%DNAt, % 26,2±11,3 74,8±16,7 60,4±20,7 53,3±18,5

* Некрозоапоптотические клетки.

Рис. 1. Микрофотографии «комет», формируемых клетками печени в контрольных (а) и экспериментальных (б) условиях под воздействием СС14.

Рис. 2. Корреляция между долей мигрирующей ДНК и длиной хвоста у комет, формируемых клетками печени интактных (контрольных) и экспериментальных крыс, получавших СС14.

характерных для неповрежденных и жизнеспособных клеток. При воздействии СС14 у крыс формировались кометы, относящиеся преимущественно к классу С3, что свидетельствовало о высоком уровне фрагментации ДНК.

Расчет параметров комет, отражающих степень повреждения ДНК клеток печени показал, что в клетках экспериментальной группы, которой вводили четыреххлористый углерод, все значения параметров были существенно выше, чем в контроле (табл.). Для наглядности полученные экспериментальные данные, из которых были рассчитаны усредненные значения, представлены в виде зависимости между процентом ДНК и длиной «хвоста» кометы (рис. 2).

В группах животных, которым в сочетании с СС14 вводили силибинин или хаурантин (табл. 1), по сравнению с контролем имело место снижение в печени на 16 % доли некрозоапоптических клеток, уменьшение длины «хвоста кометы» на 71 % и ДНК в «хвосте кометы» на 18 и 28 % соответственно. Все это свидетельствует о генопротективных свойствах исследованных субстанций. Полученные результаты могут быть объяснены с трех позиций: 1) либо силимарин и хаурантин активируют токсикокинетику СС14; 2) либо индуктируют или защищают биохимические системы репарации ДНК, на подавление которых в группе крыс, получавших СС14, указывает увеличение длины миграции ДНК как отражение числа одноцепочных разрывов; 3) или, что вызывает наибольший интерес,

защитное действие изученных природных соединений связано с их антиоксидантными свойствами.

Обсуждение полученных данных. Сопоставляя полученные результаты, можно говорить о высокой гетерогенности структуры ДНК клеток печени крыс, подвергнутых интоксикации тетрахлорметаном. Таким образом, полученные с помощью метода ДНК-комет экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при воздействии CCl4 на организм молекула ДНК печени является одной из основных его мишеней.

При объяснении причин генотоксичности тет-рахлорметана следует обратить внимание на его способность запускать процессы перекисного окисления липидов и снижать интегральную антирадикальную активность в печени [1, 6, 11]. По мнению некоторых исследователей, именно высокореакционные оксирадикалы являются одной из основных причин окислительного повреждения ДНК, вызывая разрывы цепей и модифицируя основания [12]. Так, гидроксильный радикал (-ОН) способен замещать атомы водорода из остатков сахаров предпочтительно у 4-го углеродного атома.

Образующиеся радикалы нестабильны и в большинстве случаев конвертируются в разрывы цепей с помощью механизмов, хорошо описанных в литературе [14]. Силибинин и другие флаволигнаны обладают достаточно высокой активностью при экспериментальных отравлениях, которая объясняется их антиоксидантным эффектом и подавлением пе-рекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов мембран [1, 10, 11]. Так, в нашем опыте под воздействием CCl4 в печени концентрация МДА увеличивалась по сравнению с контролем на 69 %, при этом силибинин и хаурантин проявляли по этому показателю антиоксидантные свойства, снижая МДА в сравнении с моделью на 34 и 30 % соответственно. Известно также, что хау-рантин усиливает активность глутатионзависимых механизмов антиоксидантной защиты, которые при токсическом гепатите снижены [5, 6]. Полученные результаты дают основание полагать, что одним из ведущих механизмов генотоксичности CCl4 является окислительный стресс, а выявленные повреждения ДНК следует отнести к наиболее важным проявлениям токсичности.

Метод ДНК-комет позволяет количественно оценивать степень повреждения генома и эффективность гепатозащитных средств. Сравнение фармакологического действия силимарина и биологически активной добавки хаурантина позволяет отнести их к слабым гепатозащитным средствам, оказывающим сходную генопротективную активность.

Литература

1. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости

Фармакологического комитета. 1999. № 2. С. 9-12.

2. Гепатиты. Рациональная диагностика и терапия / под ред. Михаэля Фукса. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 240 с.

3. Добряков Ю.И., Брехман И.И. Поиск природных источников физиологически активных веществ из морских организмов // Валеология: диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. Владивосток: Дальнаука, 1996. Вып. 3. С. 83-89.

4. Добряков Ю.И., Пономарева Т.И., Добряков Е.Ю. К фармакологии хаурантина // Там же, 2000. Вып. 4. С. 140-151.

5. Добряков Е.Ю. Фармакологические эффекты экстракта из туники асцидии Halocynthia aurantium: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Владивосток, 2004. 23 с.

6. Кропотов А.В., Челомин В.П., Плаксен Н.В. и др. Антипере-кисные эффекты экстракта из трепанга Stichopus japonicas // Тихоокеанский медицинский журнал. 2004. № 3. С. 18-20.

7. Кушнерова Н.Ф., Лесникова Л.Н. Влияние хаурантина на процессы восстановления липидной составляющей мембран эритроцитов после поражения этиловым спиртом // Наркология. 2003. № 5. С. 25-28.

8. Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е. Фармакотерапия с основами фитотерапии. Часть II. СПб.: СПбХФИ, 1995. 250 с.

9. Тронов В.А., Полевина Т. А. Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Принцип и применение метода // Цитология. 1996. Т. 38, № 4/5. С. 427-439.

10. Скакун Н.П., Саратиков А.С., Охримович Л.М. Клиническая фармакология гепатопротекторов. Тернополь: Збруч, 1995. 272 с.

11. Шабанов П.Д., Султанов В.С., Лебедев В.А. и др. Эффекты полипропинольного препарата ропрен при токсическом поражении печени и головного мозга у крыс: изучение функционального состояния печени, поведения и метаболизма моноаминов в мозге // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2010. Т. 8, № 3. С. 7-30.

12. Almeida E.A., Bainy A.C.D.,Loureiro A.P.M. et al. Oxidative stress in Perna perna and other bivalves as indicators of environmental stress in the Brazilian marine environment: antioxidants, lipid peroxidation and DNA damage // Comp. Biochem. Physiol. A. 2007. Vol. 146. P. 588-600.

13. Buege J.L., Aust S.D. Microsomal lipid peroxidation // Methods in Enxymology. Academic Press, 1978. P. 302-310.

14. Cadet J., Berger M., Douki T., Ravanat J.L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biological significance // Rev. Phisiol. Biochem. Pharmakol. 1997. Vol. 131. P. 1-87.

15. Jha A.N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay // Mitagenesis, 2008. Vol. 23, No. 3. P. 207-221.

Поступила в редакцию 19.04.2011.

estimating carbon tetrachloride toxicity AND protective ACTION OF siLIBININ AND HAURANTIN using dna-comet assay in rat liver

A.V Kropotov1, V.P. Chelomin2, V.V. Slobodskova2, E.E. Solodova1, A.O. Mikhailov1

1 Pacific State Medical University (2 Ostryakova Av. Vladivostok 690950 Russian Federation), 2 Pacific Oceanological Institute, FEB RAS (43 Baltiyskaya St. Vladivostok 690041 Russian Federation) Summary - The authors have studied the carbon tetrachloride-induced DNA degradation in liver of rats with DNA-comet assay (microelectrophoresis of DNA in a single cell). As reported, the hepatotoxicity estimated by the comet profile arose from hepato-cyte genome damage. Medication Silibinin derived from Silibium marianum (L.) Gaertn. and extraction of tunic of Halocynthia aurantium - Haurantin exhibited genoprotective action. The paper considers major mechanisms of destructive action of carbon tetrachloride.

Key words: carbon tetrachloride, toxic hepatitis, genotoxicity, liver protection.

Pacific Medical Journal, 2013, No. 2, p. 63-66.