Способ получения наноразмерных систем низкомолекулярных биологически активных соединений на основе амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами разветвленного строения для космецевтических приложений
METHOD FOR OBTAINING NANOSCALE SYSTEMS OF LOW MOLECULAR WEIGHT BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS BASED ON AMPHIPHILIC COPOLYMERS OF N-VINYLPYRROLIDONE WITH BRANCHED STRUCTURE DIMETHACRYLATES FOR COSMECEUTICAL APPLICATIONS

Изобретение относится к области нанотехнологии и косметологии, а именно к способам получения наноразмерных систем низкомолекулярных биологически активных соединений (БАС) на основе амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами разветвленного строения, в которые введены растворимые, низкорастворимые или нерастворимые в воде низкомолекулярные БАС. Изобретение призвано обеспечить наноразмерную форму и повышенную растворимость в воде БАС и связанное с этим повышение биодоступности БАС.
Из уровня техники известно, что для повышения биодоступности и эффективности действия БАС их вводят в состав полимерных наноматериалов, например, наночастиц биосовместимых линейных полимеров (полиэтиленгликоль, полимолочная кислота и др.), ветвящихся полимеров (дендримеров), а также липосом [Rajesh S. et al. Nanoparticle-based targeted drug delivery // Experimental and Molecular Pathology. - 2009. - Vol. 86. - No. 3. -Р. 215-223].
В патенте [US 6322805 B1] описана лекарственная композиция, содержащая гидрофобное лекарственное средство (ЛС) с носителем, представляющим собой полимерные мицеллы на основе амфифильного блок-сополимера структуры БА, АБА или БАБ, где Б - гидрофильный полиалкиленоксидный компонент, А - биоразлагаемый гидрофобный полимерный компонент из ряда: поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота), сополимер молочной и гликолевой кислот, поликапролактон.
В патенте [RU 2166934] описана композиция, включающая противоопухолевое ЛС и полиэфирный блок-сополимер, включающий множество линейных полимерных сегментов, повторяющиеся единицы которых имеют молекулярные массы в диапазоне от 30 до 500 дальтон, в которых не менее 80 процентов связей, соединяющих повторяющиеся единицы каждого из полимерных сегментов, включают простую эфирную связь.
Из патента [RU 2501570] известна группа трифункциональных сополимеров этиленоксида и пропиленоксида для внутриклеточной доставки БАВ. Указанный полимерный носитель представляет собой сополимеры на основе глицерина с числом мономерных единиц этиленоксида от 1 до 10, пропиленоксида от 1 до 30, и конъюгаты сополимеров с янтарной кислотой.
Ближайшим аналогом представляемого изобретения является техническое решение, предложенное в патенте [RU 2325151 С2], а именно: способ получения систем доставки низкорастворимых и водонерастворимых БАС путем их солюбилизации амфифильными полимерами, включающими как минимум один фрагмент водорастворимого карбоцепного полимера, например поливинилпирролидона, и как минимум одну концевую гидрофобную группу, представляющую собой один или два алифатических радикала, методом самоассоциации дифильных веществ в водных средах с образованием сферических частиц размером от 5 до 1500 нм.
Изобретение направлено на создание наноразмерных систем низкомолекулярных (с молекулярной массой менее 1 кДа) БАС различной структуры, примеры которых приведены на фиг. 1. Наноразмерные системы создаются на основе наночастиц амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами, структуры которых приведены на фиг. 2. Эти сополимеры характеризуются особой топологической структурой, схематично изображенной на фиг. 3.
Способ получения наноразмерных систем низкомолекулярных БАС включает введение БАС в наночастицы амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами при концентрациях, близких к их критической концентрации агрегатообразования, в изопропиловом спирте и последующем растворении полимерных пленок с введенным БАС в водных средах. Молекулы БАС захватываются полимерными частицами, как схематично показано на фиг. 4: гидрофобные БАС находятся во внутренних полостях - малополярном ядре полимерной частицы (фиг. 4, а), а гидрофильные - в ее полярной оболочке (фиг. 4, б), состоящей из звеньев N-винилпирролидона. В первом случае БАС удерживаются полимерной частицей за счет гидрофобных взаимодействий, а во втором - посредством водородной связи, образованной их функциональными группами с С=O группами лактамного цикла звеньев N-винилпирролидона.
Полимерные наночастицы амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с диметакрилатом триэтиленгликоля (разветвитель) и их сополимеров, модифицированных звеньями различных метакрилатов - олигоэтиленгликоль метакрилата (ОЭГМ), гексилметакрилата (ГМА), циклогексилметакрилата (ЦГМА), изоборнилметакрилата (ИБМА) и метакриловой кислоты (МАК), - получены радикальной сополимеризацией в толуоле в присутствии инициатора - азо-бис-изобутиронитрила при различных мольных соотношениях реагентов ВП/М/ДМТЭГ/П, где ВП - N-винилпирролидон, М - метакриловый сомономер (0-5 мол.%), ДМТЭГ - разветвитель диметакрилат триэтиленгликоля, П - передатчик цепи 1-декантиол (ДТ) или меркаптоэтанол (МЭ). Передатчик цепи берется в количествах, эквимолярных по отношению к разветвителю, чтобы ограничить длину полимерных цепей и избежать образования нерастворимого продукта. Сополимеры ВП-МАК-ДМТЭГ получали в этаноле, поскольку в толуоле сополимеризация мономеров носит гетерогенный характер и сопровождается фазовым разделением. Полученные наночастицы имеют сферическую форму, как показано на электронном изображении частиц ВП-ДМТЭГ, полученном с помощью просвечивающей электронной микроскопии (фиг. 5). Составы реакционных смесей, сополимеров и их физико-химические характеристики приведены в таблице 1. Мономерные составы рассчитаны из данных элементного анализа, молекулярные массы и размерность в воде определены методом динамического рассеяния света.
Содержание (ди)метакрилатных звеньев в сополимерах варьируется от ~3 до 18 мол.% Абсолютная средневесовая молекулярная масса сополимеров, определенная по методу Дебая динамическим рассеянием света, составляет в воде -10-100 кДа. В спиртовых, водных и водно-спиртовых растворах сополимеры существуют в виде изолированных макромолекул с гидродинамическим радиусом около 3-5 нм, а выше критической концентрации агрегатообразования (0,3-5 мг/мл) - в виде их агрегатов с гидродинамическим радиусом менее 100 нм, способных реагировать на изменение температуры и рН среды в зависимости от мономерного состава.
Наноразмерные системы низкомолекулярных БАС готовятся простым и эффективным методом прямого растворения в два этапа. Во всех случаях на первом этапе использовали раствор полимерных частиц в изопропиловом спирте (1-3 мг/мл), чтобы обеспечить гомогенность среды при введении БАС, растворимых только в органических растворителях. На втором этапе сухие пленки сополимеров с активным соединением вновь растворяли в водных буферных растворах при комнатной температуре и получали прозрачные или опалесцирующие растворы полимерных частиц с разными БАС.
Пример 1. Дигидрокверцетин (ДГ) (растворимость в воде 0.1%, М=304.25 г/моль) растворяли в изопропиловом спирте (1 мг/мл) и вводили в предварительно выдержанный при комнатной температуре (2 суток) раствор сополимера 1, 2, 14 или 15 в изопропиловом спирте (3 мг/мл). Содержание дигидрокверцетина варьировали от 1 до 15% на сополимер. После испарения изопропилового спирта сухие пленки полностью растворялись в водных буферных растворах с рН в диапазоне 5.0-9.5.
В спектрах поглощения водных буферных растворов полимерных частиц с различным содержанием ДГ наблюдали полосу поглощения ДГ с максимумом при длине волны 325 нм и плечом - 291 нм. Таким образом, в составе полимерной частицы он находится в нативной форме. Оптическая плотность в максимуме полосы поглощения при длине волны 325 нм ДГ в полимерных частицах была ниже, чем у свободного и зависела от мономерного состава сополимера. Гидродинамический радиус полимерных частиц, загруженных ДГ, находился в интервале 10-100 нм в зависимости от его содержания, состава, молекулярной массы и концентрации исходного сополимера и рН среды.
Пример 2. Токоферол (ТФ) (нерастворим в воде, М=430.7 г/моль) растворяли в изопропиловом спирте (1 и 6 мг/мл). К раствору сополимера 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 добавляли по каплям раствор ТФ при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. После высушивания полимерные пленки растворяли в 8 мл водных буферных растворов с различным значением рН. Водные растворы полимерных наночастиц с высокой загрузкой ТФ (~28%) были малопрозрачными и нестабильными. Водные растворы полимерных частиц с загрузкой до 10 мас. % опалесцировали и были достаточно стабильными. В водных буферных растворах наноразмерных систем на основе сополимеров 9, 11, 12 и 13 имело место частичное растворение, в этом случае нерастворенная часть отфильтровывалась.
В спектрах поглощения водных буферных растворов наноразмерной системы ТФ-сополимер 14 наблюдается полоса поглощения инкапсулированного ТФ при длине волны около 290 нм (фиг. 6), при этом интенсивность поглощения зависит как от содержания ТФ в системе (фиг. 6, а), так и от рН среды (фиг. 6, б).
На фиг. 7 показаны кривые распределения по размерам частиц интенсивности рассеяния света водными буферными растворами наноразмерных систем ТФ-сополимер 1 (фиг. 7, а), ТФ-сополимер 2 (фиг. 7, б), ТФ-сополимер 7 (фиг. 7, в) при их концентрации 0.4 мг/мл при температуре 25°С. Из приведенных данных видно, что данное распределение близко к унимодальному.
Гидродинамический радиус полимерных частиц, загруженных ТФ, зависел от его содержания в системе, а также от состава, молекулярной массы, концентрации сополимера и температуры среды. С увеличением температуры до 40°С гидродинамический радиус снижался от ~100 до 70-80 нм.
Пример 3. Полимерные частицы, загруженные ТФ, в смеси глицерин-вода.
С применением растворов сополимера 5 (3 мг/мл) и токоферола (1 мг/мл) в изопропиловом спирте получали наноразмерную систему ТФ-сополимер 5 по методу, описанному в Примере 2. Сухую полимерную пленку с 5% содержанием ТФ в расчете на сополимер растворяли в 8 мл воды. К 3 мл глицерина по каплям и постоянном перемешивании добавляли 1 мл водного раствора полимерных частиц, загруженных ТФ. Получали стабильные наноразмерные системы токоферола на глицериновой основе.
Пример 4. Фолиевую кислоту (ФК) (нерастворима в воде, М=441.4 г/моль) растворяли в ДМСО. К раствору сополимера 14 добавляли по каплям раствор ФК при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Максимальное содержание ФК составляло 10% в расчете на сополимер. Раствор высушивали на воздухе и под вакуумом до полного испарения растворителей. Полимерные пленки растворяли в 4 мл водного буферного раствора с рН=6.8.
В спектре поглощения водных буферных растворов наноразмерных систем ФК-сополимер 14 имеются типичные для ФК полосы поглощения. Оптическая плотность полосы поглощения при длине волны 285 нм растет нелинейно с повышением концентрации ФК, что указывает на ее взаимодействие с сополимером. Гидродинамический радиус полимерных частиц, загруженных 5 и 10% ФК, составляет около 70 нм при 25°С и существенно не изменяется с ростом температуры. Значения дзета-потенциала этих наноразмерных систем в водном буферном растворе, равные +76 и +106 мВ, свидетельствуют об их высокой стабильности.
Пример 5. Полимерные частицы, загруженные ФК, в смеси глицерин-вода.
Готовили водный раствор полимерных частиц с ФК аналогично Примеру 4. Для этого использовали растворы сополимера 5 (3 мг/мл) в изопропиловом спирте и ФК в ДМСО (2 мг/мл). Сухую полимерную пленку с 5% содержанием ФК в расчете на сополимер растворяли в 8 мл воды. К 3 мл глицерина по каплям и постоянном перемешивании добавляли 1 мл водного раствора полимерных частиц, загруженных ФК. Получали стабильные наноразмерные системы ФК на глицериновой основе.
Пример 6. 5, 10, 15, 20-тетра-фенил-21H,23H-порфиринат цинка (ZnTФП) (нерастворим в воде, М=678.1 г/моль) растворяли в толуоле (0.7 мг/мл). В спиртовый раствор сополимеров 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 14 или 15 с концентрацией 3 мг/мл вводили раствор ZnTФП при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Максимальное содержание ZnTФП в расчете на сополимер составляло около 1.8%. Растворы сушили от органических растворителей на воздухе и в вакууме. Полимерные пленки, содержащие ZnТФП, растворяли в 8 мл свежеприготовленного буфера с рН=6.8. Концентрация сополимеров в водном буферном растворе составляла от 1.5 до 2.5 мг/мл.
На фиг. 8 представлены спектры поглощения водных буферных растворов наноразмерных систем, включающих ZnТФП (1.75%) и сополимеры 1-6 (фиг. 8, а) и водных буферных наноразмерной системы ZnТФП-сополимер 2 при разном содержании ZnТФП (фиг. 8, б). В спектрах поглощения всех водных растворов наноразмерных систем имеется характерная полоса поглощения красителя с максимумом при длине волны 425 нм, т.е. в полимерных частицах ZnТФП находится в нативном состоянии и его структура не изменяется. Вместе с тем, включение ZnТФП в полимерные частицы различного типа отражается на величине оптической плотности полосы Соре. Ее значение является максимальным для ZnТФП, инкапсулированного в сополимер 3. Значение оптической плотности полосы Соре снижалось в ряду наноразмерных систем ZnТФП-сополимер 3 > ZnТФП-сополимер 5 > ZnТФП-сополимер 1 > ZnТФП-сополимер 4. Минимальные значения оптической плотности полосы поглощения Соре показывали водные растворы систем ZnТФП-сополимер 2 и ZnТФП-сополимер 6. Инкапсулированный краситель в водных растворах флуоресцировал в области 600-650 нм.
h
Кривые динамического рассеяния света водных буферных растворов наноразмерных систем ZnТФП-сополимер 7 и исходного сополимера носят унимодальный характер. Для унимодальных полимерных частиц 7 рассчитаны массовое и числовое распределение частиц по размерам при температуре 30 и 34°С. Гидродинамический радиус R в максимуме пика составляет 88 нм.
На фиг. 9 представлены кривые распределения интенсивности рассеяния света водными буферными растворами системы ZnТФП-сополимер 14 и исходного сополимера 14 при 25 и 37°С и концентрации сополимера 1.5 мг/мл. Видно, что при обеих температурах распределение интенсивности рассеяния света по размерам частиц системы ZnTФП-сополимер 14 является практически унимодальным в отличие от исходного сополимера. С увеличением температуры положение пика на кривой динамического рассеяния света системы ZnTФП-сополимер 14 практически не изменяется, т.е. в растворе присутствуют стабильные структуры.
Пример 7. Полимерные частицы, загруженные красителем, в смеси глицерин-вода.
В 8 мл раствора сополимера 5 в изопропиловом спирте (4 мг/мл) добавляли по каплям 0.4 мл раствора ZnТФП в толуоле (0.7 мг/мл). Сушили от органических растворителей в вакууме и добавляли к полимерной пленке 8 мл бидистиллята. К 5 мл глицерина добавляли 1.6 мл раствора ZnТФП-сополимер 5 при постоянном перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре. Полученные растворы были прозрачными, имели желтоватый цвет и показывали высокую стабильность во времени, в спектрах поглощения наблюдали характерную для красителя полосу поглощения Соре при 425 нм, растворы флуоресцировали в области 600-650 нм.
Пример 6. Биотин (БТ) (растворим в воде, М=244.3 г/моль) и сополимеры 1, 2, 3, 4, 5, 7, или 14 растворяли в изопропиловом спирте (3 мг/мл). К спиртовому раствору сополимера при перемешивании магнитной мешалкой добавляли по каплям коллоидный раствор БТ (0.8 мг/мл) в изопропиловом спирте при различных объемных соотношениях растворов. Сушили от органических растворителей на воздухе и в вакууме. Полученные пленки растворяли в 4 мл водного буферного раствора с рН=6.8. Максимальная загрузка БТ в расчете на сополимер - 12.5%. С увеличением содержания БТ в полимерных частицах БТ-сополимер 7 возрастала опалесценция водных буферных растворов. Растворы полимерных частиц БТ-сополимер 14, содержащие от 1 до 12% БТ, оставались прозрачными. Для обеих систем с ростом концентрации БТ в полимерных частицах нарастала вязкость растворов.
h
h
На фиг. 10 представлена зависимость значения R рассеивающих центров водных буферных растворов БТ-сополимер 7 (0.2 мг/мл) и БТ-сополимер 14 (3 мг/мл) от концентрации БТ, измеренные при 25°С (фиг.10, а) и зависимость R исследованных систем от температуры (фиг. 10, б). Видно, что в случае системы БТ-сополимер 7 с ростом температуры заметно снижается размер рассеивающих центров во всем исследованном температурном диапазоне. Для системы БТ-сополимер 14 вначале наблюдается резкое снижение размера частиц, а затем их размер остается постоянным. В области физиологически важных температур (36-40°С) обе системы имеют близкие размеры частиц -около 80 нм.
Значение рН оказывает сильное влияние на распределение частиц по размерам в водных растворах системы БТ-сополимер 14. В бидистилляте оно близко к унимодальному, первый пик, соответствующий частицам малого размера, практически исчезает. При рН 6.8 интенсивность первого пика соизмерима со вторым. Гидродинамический радиус рассеивающих центров зависит от рН среды и снижается от 120 (рН 5.0) до 100 нм (рН 9.5).
Таким образом, на основе амифифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами получены стабильные в водных растворах наноразмерные системы низкомолекулярных БАС разной структуры (жиро- и водорастворимые витамины, антиоксиданты) с размером частиц менее 100 нм. Полученные данные по свойствам наноразмерных систем показывают, что они позволяют повысить стабильность водонерастворимых БАС в водных растворах. Размерные диапазоны полученных наноразмерных систем и повышенная стабильность в водных растворах, в свою очередь, связаны с повышением биодоступности. В этой связи, полученные наноразмерные системы БАС могут применяться в качестве ингредиентов в составе космецевтических средств различного назначения.