o
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80 C с раствором Гекмолит
METHOD FOR UNSTRUCTURED FREEZING PERIPHERAL BLOOD PRECURSOR CELLS AT MINUS 80 °C WITH A HEMICOLITE SOLUTION

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) до температуры минус 80°С без контроля скорости охлаждения с криоконсервантом Гекмолит. Гекмолит содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (ГМБТОЭМ) и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при следующих соотношениях компонентов, мас.%: ГМБТОЭМ 30,0-50; ЭДТА 0,08-0,18, Бидистиллированная вода - Остальное. Коррегируют рН раствора до 7,0-7,2 с помощью 2 н. раствора х.ч. соляной кислоты (см. патент РФ №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995).
А
А
50
Способ замораживания КППК с криоконсервантом Гекмолит включает смешивание раствора Гекмолит с нативной стабилизированной миеловзвесью (НСМ) в соотношении 1:1 в пластиковом криопакете, его герметизацию, маркировку, эквилибрацию взвеси ядросодержащих клеток (ЯК) с криоконсервантом при температуре плюс 4°С в течение 20÷30 мин, укладку в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры изотермической холодовой адаптации клеток (Т) по ступенчатой программе, причем на первом этапе криопакет с миеловзвесью помещают на 10 мин в электрический холодильник с температурой плюс 4°С, на втором этапе переносят в электроморозильник с Т минус 28±2°С, выдерживают их в этих условиях в течение 10÷25 мин, после чего переносят в морозильник-хранилище с температурой минус 80±2°С для полного замораживания клеточной взвеси и длительной криоконсервации, после чего проводят отогревание криопакета в водной среде до температуры клеточной взвеси плюс 2÷4°С. Присутствие в растворе криоконсерванта Гекмолит базового криопротектора ГМБТОЭМ со среднелетальной дозой - ЛД, равной 15,5±0,6 г/кг массы мыши, минимизирует токсичность рабочего раствора криоконсерванта на клеточном и организменном уровнях, не требует отмывания перед трансплантацией криоконсервированных КППК, способствует сохранности ЯК.
Способ замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С с раствором Гекмолит относится к медицине, в частности к трансфузиологии.
Важными составляющими в повышении эффективности клеточных технологий на основе применения криоконсервиованных КППК с ГСК для клинических целей являются обеспечение морфофункциональной сохранности большого процента ГСК, доступности лечебным учреждениям, простота выполнения, безопасность и экономичность.
В технологии замораживания КППК известны способы их длительной консервации, которые включают добавление криоконсерванта на основе ГМБТОЭМ в НСМ, поэтапное замораживание смеси в жидкоазотном программном замораживателе, длительное хранение при температуре минус 80÷ минус 196°С и последующее отогревание. Подбор значений температур и скоростей охлаждения произведены эмпирически лабораторным способом (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. - Киев, Наук. Думка, - 1994. - С. 68-69; Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - С. 44-45 (Коми научный центр УрО РАН).
Недостатками такого решения способа замораживания КППК являются: высокая затратность, потребность в дефицитном жидком азоте, сложности при работе с криогенной техникой и риск посттрансфузионных осложнений.
В качестве прототипа нами использован способ замораживания ЯК костного мозга с криоконсервантом на основе ГМБТОЭМ, включающего смешивание ГМБТОЭМ с НСМ в равных пропорциях, замораживание в жидком азоте в аппарате УОП 000 000 по двух- и трехэтапной программам. В образцах ЯК, замороженных с раствором Гекмолит по описанному методу, после отогревания сохраняется в среднем 86,4±1,5% миелокариоцитов, 70,7±3,7% мононуклеаров, 73,2±3,1% эозинорезистентных и 83,3±2,7% стволовых кроветворных клеток (Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - С. 44-45 (Коми научный центр УрО РАН), патент 2049391 «Средство для криоконсервирования костного мозга».
Недостатками прототипа являются высокая затратность, потребность в запасах дефицитного жидкого азота, опасность инфекционных, простудных заболеваний и ожоговых травм, потребность в высококвалифицированном обслуживающем персонале и негативный человеческий фактор.
Поэтому поставленной задачей было устранение указанных недостатков, а также разработать доступный для широкой сети лечебных учреждений безазотный способ эффективного замораживания КППК.
Цель изобретения - повысить сохраннность ЯК и экономичность их криоконсервирования.
Поставленная цель достигается тем, что в вышеописанном способе при замораживании КППК в качестве хладоагента используют холод рефрижераторов.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - заготовка концентрата НСМ с ГСК; Б - смешивание криоконсерванта Гекмолит с НСМ в равных пропорциях; В - эквилибрацию НСМ с криоконсервантом Гекмолит при температуре плюс 4°С в течение 20-30 мин, герметизацию, маркировку и укладку пластикового криопакета с ЯК в металлический пенал-холдер; Г - замораживание клеточной взвеси от температуры плюс 4°С до минус 80±2°С в режиме многоступенчатой программы; Д - размораживание биообъекта в водной среде с температурой плюс 39°С до температуры плюс 2÷4°С в клеточной взвеси.
А
Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК с криоконсервантом Гекмолит являются: Е - в известном способе взвесь ЯК в растворе Гекмолит замораживали по 3-х ступенчатой программе с помощью жидкоазотного программного замораживателя клеточных суспензий УОП 000 000, требующего постоянного обеспечения жидким азотом, высококвалифицированного технического обслуживания, несущего риск человеческого фактора и микробной контаминации биообъекта при контакте с инфицированным жидким азотом; И - в предлагаемом изобретении замораживание клеточной взвеси осуществляют от плюс 4°С до минус 80°С в экономичных, простых в обслуживании и доступных широкой сети лечебных учреждений электрических рефрижераторах, например, марки Sanyo, с заранее установленной Т.
Предлагаемый способ обеспечивает прогнозируемые показатели сохранности ЯК после замораживания-отогревания. В том числе: количество морфологически сохранных клеток в пределах 90,71±6,79%, количество эозинорезистентных клеток - 85,7±1,47%, количество мононуклеаров -75,57±16,0%, количество CD34+ клеток - 77,63±16,70%.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Пример выполнения
Криоконсервант Гекмолит готовят заблаговременно согласно рецепта по патенту РФ №1772911 от 17.06.1993. Опубл. 10.04.1995. Фасуют в полимерные криопакеты и длительно охлаждают в электрическом холодильнике при температуре плюс 4°С.
А
А
Производят смешивание раствора Гекмолит с нативной стабилизированной миеловзвесью и концентратом ядросодержащих клеток (ЯК) в соотношении 1:1 в пластиковом криопакете, его герметизацию, маркировку, эквилибрацию взвеси ядросодержащих клеток (ЯК) с криоконсервантом при температуре плюс 4°С в течение 20÷30 мин, укладку в металлический пенал-холдер, поэтапное замораживание в электрических рефрижераторах с регулируемой установкой температуры изотермической холодовой адаптации клеток (Т) по ступенчатой программе, на первом этапе биообъект помещают на 10 мин в электрический холодильник марки Sanyo MDF-U5411 с температурой плюс 4±1°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник марки Sanyo MDF-U333 с Т минус 22±1°С и выдерживают в этих условиях 10 мин, на третьем этапе контейнер с ЯК переносят в электроморозильник марки Sanyo MDF-U5411 с установленной температурой минус 28±1°С, выдерживают в этих условиях в течение 25 мин, после чего на четвертом этапе биообъект быстро переносят в морозильник-хранилище марки Sanyo MDF-U53 с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной (до 7 мес) криоконсервации ядерных клеток. Замороженные КППК с ГСК отогревают интенсивным покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 39°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 ÷ плюс 4°С. Берут пробу размороженного клеточного материала одноразовым шприцем для контрольных морфологических и функциональных тестов.
Сравнительный анализ результатов криоконсервирования КППК, замороженных известным и заявляемым способами предоставлен в табл. 1.
Результаты исследований, представленные в табл. 1, показывают, с одной стороны, высокий уровень контрольных морфологических и функциональных тестов известного и заявляемого способов замораживания КППК с раствором Гекмолит, с другой стороны, отмечают повышенный класс опасности для жизни человека, осуществляющего замораживание КППК известным способом.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа замораживания КППК.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.
Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».