Клонирование гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis

УДК 577.152.1

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ДРОЖЖЕЙ TRIGONOPSIS VARIABILIS

Е.Е. Давыдова*, В.И. Тишков

Оксидаза D-аминокислот (DAAO) является одним из двух ферментов, используемых при ферментативном получении из цефалоспорина С 7-аминоцефалоспорановой кислоты - исходного соединения для синтеза Р-лактамных антибиотиков нового поколения. Для создания высокоэффективного биокатализатора окисления цефалоспорина С, ген оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (daao) был клонирован в клетках Е. coli. Методика клонирования включала выделение суммарной мРНК, получение кДНК со специфического праймера и амплификацию гена с помощью ПЦР со специфическими праймерами. Продукт ПЦР был клонирован в векторной плазмиде Е. coli под контролем промотора фага Т7 . Показана экспрессия гена daao в клетках рекомбинантного штамма E. coli.

Оксидазы D-аминокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO) являются флавопротеинами, катализирующими окисление D-аминокислот до соответствующих а-кетонов и аммиака. Эти ферменты могут продуцироваться разнообразными микроогранизмами при определенных условиях (дрожжи Trigonopsis variabilis [I], Candida tropicalis [2], Rhodotorula gracilis [3], водоросли Chlorella vulgaris [4], грибы Neurospora crassa [5] и др.). Кодирующая оксидазы D-аминокислот кДНК была выделена также из млекопитающих (человек, свинья, кролики, мыши, крысы) [6].

Оксидазы D-аминокислот имеют большое биотехнологическое значение. Эти ферменты могут быть использованы в производстве L-аминокислот, а также для получения а-кето-кислот из D-аминокислот. Но наиболее важным является процесс получения 7-ами-ноцефалоспорановой кислоты из цефалоспорина С с помощью биферментной системы, состоящей из окси-дазы D-аминокислот и ацилазы 7-глутарилцефалоспо-рановой кислоты. Исходным соединением для получения полусинтетических Р-лактамных антибиотиков нового поколения является 7-аминоцефалоспорановая кислота [7].

Согласно литературным данным, наиболее привлекательным для этих целей является фермент из дрожжей Т. variabilis. Поскольку уровень синтеза DAAO в природном штамме очень низкий [8], то для его получения в больших количествах возникает необходимость создания генно-инженерного штамма - продуцента DAAO Т. variabilis. Цель данной работы состояла в клонировании гена daao из Т. variabilis и его экспрессии в клетках Е. coli.

Методы исследования

В работе использовали штамм дрожжей Trigonopsis variabilis 340A из коллекции Государственного научного центра по антибиотикам. Культуру дрожжей поддерживали на твердой среде Сабуро: солодовый экстракт (2 г/л), дрожжевой экстракт (1 г/л), D^-ме-тионин (0,2 г/л), агар (20 г/л). Для выделения хромосомной ДНК клетки выращивали в колбах для культивирования объемом В00 мл с 50 мл жидкой среды (4% кукурузного экстракта, 2% глюкозы, 0,3% D,L-метионина) при 28° в условиях интенсивной аэрации (200 об/мин) в течение 72 ч. Для выделения препарата мРНК использовали свежую культуру клеток, выращенную на небогатой среде (0,б7% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, 0,2% D,L-метионина, 50 мг/л ура-цила) в течение 24 ч.

В работе использовали также генно-инженерные штаммы Е. coli TG1 (supE hsdA5 thiA(lac-proAB) F'[traD36proAB+ lac4 lacZAM15]) и BL21 (DE3) pLysS (F - ompT hsdSe (r вт в) gal dcm(DE3) pLysS), кото -рые выращивали на стандартной 2YT среде (бактот-риптон 1б г/л, дрожжевой экстракт 10 г/л и хлорид натрия 5 г/л). Для идентификации экспрессии DAAO штамм BL21 (DE3 )/pLysS с исследуемой плазмидой pKDAOl выращивали при 25° в среде 2YT с аэрацией (200 об/мин) до достижения поглощения 0,б на б00 нм (Аб00 = 0,б). Далее в среду добавляли индуктор !ас-промотора изопропил-тио-а-галактозид (IPTG) до ко -нечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали клетки при 25° и 200 об/мин еще в течение 5 ч.

Для клонирования гена daao из хромосомы проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с общей

* Государственный научный центр по антибиотикам, Москва. 9 ВМУ, химия, № б

Рис. 1. Физическая карта гена daao из Т. variabilis. Кодирующая часть представлена темными прямоугольниками, светлый прямоугольник в начале гена - интрон

ДНК, выделенной из клеток Т. variabilis. Препарат хромосомной ДНК получали при использовании реагента DNAzol фирмы "Gibco" в соответствии с рекомендациями изготовителя. После предварительной денатурации матрицы при 95° в течение 5 мин проводили ПЦР, используя специфические праймеры Рг1 и Pr2 [9], комплементарные 5'- и З'-концам гена соответственно, на термоциклере РНС2 фирмы "Techne" с помощью Pfu Turbo полимеразы ( "Stratagene") в фирменном буфере.

Рг1 5'-GCTGGATCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGG-3' NcoI

Pr2 5'-CATGGATCCCTAAAGGTTTGGACGAGTAAGAGC-3' BamHI

Реакцию проводили в два этапа: 5 циклов (1 мин при 95°, 1 мин при 48° и 2 мин при 72°), затем 30 циклов (1 мин при 95°, 1 мин при 54° и 2 мин при 72°).

Для клонирования гена daao, не содержащего инт-рона, получали кДНК. Препарат суммарной РНК из клеток Т. variabilis выделяли с использованием набора NucleoSpin RNA II фирмы "Macherey-Nagel" в соответствии с рекомендациями изготовителя. Для получения кДНК гена daao проводили реакцию обратной транскрипции при 45° в течение 30 мин на свежевы-деленном препарате РНК с помощью AMV обратной транскриптазы ("Roche") и специфического праймера Pr2 [9], комплементарного 3'-концу мРНК гена daao. Реакцию останавливали прогреванием реакционной смеси при 95°.

После предварительной денатурации кДНК матрицы при 95° в течение 5 мин проводили ПЦР в условиях, аналогичных проведению ПЦР с хромосомной ДНК, выделенной из клеток Т. variabilis.

ПЦР-продукты обрабатывали рестриктазами NcoI и BamHI по фланкирующим ген рестриктным сайтам и клонировали в плазмиду pET23d ("Novagen"), обработанную теми же рестриктазами. Для анализа полученных рекомбинантных плазмид использовали не менее восьми клонов каждой плазмидной конструкции.

Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ДНК фирмы "Perkin Elmer Applied Biosystems" (модель 370 А) с помощью секвенирующего набора "ABI PRISM" DNA Sequencing

Kit с использованием Taq-полимеразы и флуоресцентно меченых терминаторов.

Результаты и их обсуждение

Анализ нуклеотидной последовательности гена daao из Т. variabilis показывает, что первичный транскрипт состоит из 1106 нуклеотидов и содержит один интрон из 38 нуклеотидов вблизи 5'-конца гена [8] (рис. 1). Так как ген daao содержит интрон, для осуществления экспрессии оксидазы D-аминокислот в Е. coli было необходимо использовать ген, полученный на основе кДНК. РНК выделяли из культуры клеток Т. variabilis, выращенных в оптимальных для продуцирования оксидазы D-аминокислот условиях, и содержащих поэтому относительно высокое количество мРНК гена daao. После транскрипции мРНК гена daao полученная кДНК была амплифицирована с помощью ПЦР По результатам электрофореза, приведенным на рис. 2 (трек 1), видно, что продуктом этой реакции является

12 3 4 5 6 тпн

4,117

- 3,05

- 2,03 ~ ],Ы

- 1,01

- (1,51

- 1Ы0

-

11,30

Рис. 2. Рестрикционный анализ плазмид рБЛО и рКБЛ01. Трек 1 -ген йаао, полученный в результате транскрипции мРНК и последующей амплификации с помощью ПЦР; треки 2 и 3 - плазмиды рБЛО и рКБЛ01, обработанные рестриктазами ЫеоГ и БатИ1; треки 4 и 5 -плазмиды рБЛО и рКБЛ01, обработанные рестриктазами ЫеоГ и ЕеоЯГ;. трек 6 - маркеры молекулярной массы ДНК

один фрагмент ДНК размером около 1,1 тпн, что соотвествует размерам гена daao (кДНК ген daao был клонирован в вектор pET23d по рестриктным сайтам NcoI и BamHI, в результате чего была создана рекомбинантная плазмида pKDAOl).

Для получения гена daao, содержащего интрон, проводили ПЦР на хромосомной ДНК Т. variabilis, и полученный продукт также клонировали в вектор pET23d по рестриктным сайтам Ncol и BamHI, в результате чего была создана рекомбинантная плазмида pDAO.

Для сравнительного анализа плазмид pDAO и pKDAOl, содержащих ген daao с интроном и без инт-рона соответственно, эти плазмиды расщепляли комбинацией двух рестриктаз - EcoRI (один сайт расположен внутри гена (рис. 1) и второй сайт в полилинкере pET23d со стороны 3'-конца гена daao) + NcoI (сайт по которому проводили клонирование гена daao). Расщепление этими рестриктазами должно приводить к получению трех фрагментов. Из результатов электрофореза в агарозном геле (рис. 2) хорошо видно, что фрагмент NcoI—EcoRI, соответствующий началу гена, в плазмиде

pKDAOl легче, чем в плазмиде pDAO. Полученные данные свидетельствуют о том, что в плазмиде pKDAOl ген daao не содержит интрона. Последующее секвенирование генов daao из плазмид pKDAOl и pDAO не выявило отличий от известной последовательности этих генов.

Для идентификации продукта гена daao в клетках Е. coli использовали систему экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7. По результатам предварительных опытов удалось установить, что рекомбинант-ный штамм продуцирует белок с молекулярной массой 39 кДа, что находится в соответствии с молекулярной массой, предсказанной для DAAO белка (39,3 кДа).

Таким образом, в результате проделанной работы был клонирован ген оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis и показана возможность его экспрессии в клетках Е. coli. Дальнейшим направлением наших исследований будет оптимизация экспрессии гена daao в клетках Е. coli и сравнение свойств рекомбинантного фермента с нативной оксидазой D-аминокислот.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sentheshanmuganathan S., Nickerson W.J. // J. Gen. Microbiol.

1962. 27. P. 465.

2. YoshizawaM., VedaM, Mozaffar S., Tanaka A. // Agric. Biol. Chem.

1986. 50. P. 2637.

3. Simonetta M. P., Vanoni M.A., Curti B. // FEMS Microbiol. Lett.

1982. 15. P. 27.

4. Pistorius E. К., Voss H. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. 481.

Р. 395.

5. Sikora L, Marzluf G. A. // Mol. Gen. Genet. 1982. 186. P. 186.

6. Le Hir M, Dubach U.C. // FEBS Lett. 1981. 127. P. 250.

7. Conlon H. D., Baqal J., Baker К. el al. // Biotechnol. Bioeng. 1995.

46. P. 510.

8. Gonzalez F. J., Monies J., Martin F., et al. // Yeast. 1997. 13.

P. 1399.

9. Lin L.L., Chien H. R., Wang W.C. et al. // Enzyme Microb. Technol.

2000. 27. P. 482.

Поступила в редакцию 25.10.02

10 ВМУ, химия, № 6