СОСТАВЫ ВАКЦИН ПРОТИВ НЕОПЛАЗИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
COMPOSITIONS OF VACCINES AGAINST NEOPLASIA AND METHODS FOR OBTAINING THEREOF

Родственные заявки и включение с помощью ссылки
Данная заявка испрашивает приоритет и преимущество предварительной заявки США под серийным номером 62/172890, поданной 9 июня 2015 года.
Ссылка делается на международную заявку на патент под серийным номером PCT/US2014/068893, поданную 5 декабря 2014 года, и которая испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США под серийным номером 61/913172, поданной 6 декабря 2013 года.
Вышеприведенные заявки, и все документы, цитируемые в них или в ходе их рассмотрения ("документы, цитируемые в заявке"), и все документы, цитируемые или упомянутые в документах, цитируемых в заявке, и все документы, цитируемые или упомянутые в данном документе ("документы, цитируемые в данном документе"), и все документы, цитируемые или упомянутые в документах, цитируемых в данном документе, вместе с любыми инструкциями изготовителя, описаниями, характеристиками продукта и технологическими картами для любых продуктов, упомянутыми в данном документе или в любом документе, включенном в данный документ с помощью ссылки, настоящим включены в данный документ с помощью ссылки и могут быть использованы в практике осуществлении настоящего изобретения. Более конкретно, все документы, приводимые в качестве ссылки, включены с помощью ссылки в такой же мере, как если бы конкретно и отдельно было указано, что каждый отдельный документ включен с помощью ссылки.
Сведения о финансировании из федерального бюджета
Настоящее изобретение было выполнено при поддержке правительства в рамках грантов под номерами CA155010 и HL103532, выданных Национальными институтами здоровья. Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.
Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к составам для лечения неоплазии и способам их получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к составам противоопухолевых вакцин для лечения неоплазии у субъекта и способам их получения.
Предпосылки изобретения
Ежегодно у примерно 1,6 миллиона американцев диагностируют неоплазию, и ожидается, что в 2013 г. примерно 580000 человек в Соединенных Штатах будут умирать от этого заболевания. За последние несколько десятилетий произошли значительные улучшения в выявлении, диагностике и лечении неоплазии, которые значительно повысили выживаемость при многих типах неоплазии. Тем не менее, лишь приблизительно 60% людей с диагнозом неоплазия все еще живы через 5 лет после начала лечения, что делает неоплазию второй ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах.
В настоящее время существует множество различных методов терапии рака, в том числе методы абляции (например, хирургические процедуры, криогенную/термо-, ультразвуковую, высокочастотную и радиационную обработку) и химические методы (например, фармацевтические средства, цитотоксические/химиотерапевтические средства, моноклональные антитела и различные их комбинации). К сожалению, такие методы терапии часто связаны с серьезным риском, токсическими побочными эффектами и чрезвычайно высокими затратами, а также неопределенной эффективностью.
Растет интерес к методам терапии рака, которые направлены на то, чтобы нацелить на раковые клетки собственную иммунную систему пациента (например, противораковые вакцины), поскольку такие методы терапии могут смягчать/устранять некоторые из описанных в данном документе недостатков. Противораковые вакцины обычно состоят из опухолевых антигенов и иммуностимулирующих молекул (например, цитокинов или TLR-лигандов), которые работают вместе, чтобы индуцировать антигенспецифичные цитотоксические Т-клетки, которые нацеливаются на опухолевые клетки и разрушают их. Современные противораковые вакцины обычно содержат общие опухолевые антигены, которые представляют собой нативные белки (т.е. белки, кодируемые ДНК всех нормальных клеток у индивидуума), которые избирательно экспрессируются или сверхэкспрессируются в опухолях, обнаруженных у многих индивидуумов. Хотя данные общие опухолевые антигены полезны для идентифицирования конкретных типов опухолей, они не являются идеальными в качестве иммуногенов для нацеливания ответа Т-клеток на конкретный тип опухоли, поскольку они подвержены эффектам иммунного ослабления при аутотолерантности. Вакцины, содержащие опухолеспецифичные и пациент-специфичные неоантигены, способны преодолеть некоторые из недостатков вакцин, содержащих общие опухолевые антигены.
В целом, любая вакцина должна иметь достаточно долгий срок хранения, чтобы гарантировать, что вакцина не будет распадаться или портиться до использования. Для стабильности при хранении также требуется, чтобы компоненты вакцины не осаждались из раствора во время хранения. Однако достижение надлежащей стабильности при хранении может быть трудным. Соответственно, необходимы новые составы для вакцин.
Цитирование или идентификация любого документа в данной заявке не является признанием того, что такой документ доступен в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к вакцинам против неоплазии или иммуногенным композициям для лечения неоплазии и, более конкретно, к составам вакцин, содержащим пул опухолеспецифичных и пациент-специфичных неоантигенов для лечения опухолей у субъекта.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ выбора пептида, предусматривающий: определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) по меньшей мере одного пептида; и выбор пептида, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5. В некоторых вариантах осуществления способ включает определение Pi и HYDRO по меньшей мере двух пептидов и выбор пептида, в случае если его Pi и HYDRO ограничены или близки к значениям Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0. В некоторых близких вариантах осуществления выбранный пептид используют в способах, описанных в данном документе (например, способах получения водных растворов, фармацевтических композиций, иммуногенных композиций, вакцинных композиций и т.п.).
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ оценки растворимости пептида в водном растворе, предусматривающий определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) пептида, где пептид является растворимым в водном растворе, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения водного раствора пептида, предусматривающий: определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) по меньшей мере одного пептида; выбор пептида, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5; и получения водного раствора, содержащего пептид.
В одном варианте осуществления пептид или по меньшей мере один пептид представляет собой неоантигенный пептид. В одном варианте осуществления пептид или по меньшей мере один пептид, длина которого находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В одном варианте осуществления пептид или по меньшей мере один пептид, длина которого находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 35 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет приблизительно 15 аминокислот или меньше. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 8 до приблизительно 11 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет 9 или 10 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет приблизительно 30 аминокислот или меньше. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 6 до приблизительно 25 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 15 до приблизительно 24 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 9 до приблизительно 15 аминокислот.
В одном варианте осуществления водный раствор содержит модификатор рН. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой основание. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой соль дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой цитрат. В другом варианте осуществления модификатор рН представляет собой сукцинат. В одном варианте осуществления сукцинат предусматривает сукцинат натрия. В одном варианте осуществления сукцинат присутствует в водном растворе в концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В одном варианте осуществления сукцинат присутствует в водном растворе в концентрации, составляющей от приблизительно 2 мМ до приблизительно 5 мМ.
В одном варианте осуществления водный раствор дополнительно содержит декстрозу, трегалозу или сахарозу. В одном варианте осуществления водный раствор дополнительно содержит диметилсульфоксид.
В одном варианте осуществления водный раствор дополнительно содержит иммуномодулятор или адъювант.
В одном варианте осуществления водный раствор представляет собой фармацевтическую композицию. В одном варианте осуществления водный раствор представляет собой иммуногенную композицию. В одном варианте осуществления водный раствор представляет собой вакцинную композицию.
В одном варианте осуществления водный раствор является лиофилизируемым.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения водного раствора неоантигенных пептида, при этом способ включает: определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) по меньшей мере одного неоантигенного пептида; выбор по меньшей мере одного неоантигенного пептида, если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5; получения раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль; и объединение раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль, с раствором, содержащим янтарную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, с получением таким образом раствора пептида для вакцины против неоплазии. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает фильтрацию раствора. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает лиофилизацию профильтрованного раствора неоантигенных пептидов.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 неоантигенных пептидов, каждый из которых был выбран на основании того, что он характеризуется Pi и HYDRO, ограниченными Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5. В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит по меньшей мере два неоантигенных пептида, которые были выбраны на основании того, что они характеризуются Pi и HYDRO, ограниченными Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если их Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5. В одном варианте осуществления раствор заявленного неоантигенного пептидов содержит по меньшей мере три неоантигенных пептида, которые были выбраны на основании того, что они характеризуются Pi и HYDRO, ограниченными Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если их Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5. В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит по меньшей мере четыре неоантигенных пептида, которые были выбраны на основании того, что они характеризуются Pi и HYDRO, ограниченными Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если их Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5. В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит по меньшей мере пять неоантигенных пептидов, которые были выбраны на основании того, что они характеризуются Pi и HYDRO, ограниченными Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если их Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5.
В одном варианте осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В одном варианте осуществления длина по меньшей мере одного неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 35 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет приблизительно 15 аминокислот или меньше. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 8 до приблизительно 11 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет 9 или 10 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет приблизительно 30 аминокислот или меньше. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 6 до приблизительно 25 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 15 до приблизительно 24 аминокислот. В одном варианте осуществления длина пептида или по меньшей мере одного пептида составляет от приблизительно 9 до приблизительно 15 аминокислот.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит модификатор рН. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой основание. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой соль дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой цитрат. В одном варианте осуществления модификатор рН представляет собой сукцинат. В одном варианте осуществления сукцинат предусматривает сукцинат натрия. В одном варианте осуществления сукцинат присутствует в составе в концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В одном варианте осуществления сукцинат присутствует в составе в концентрации, составляющей от приблизительно 2 мМ до приблизительно 5 мМ.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель содержит декстрозу. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель содержит трегалозу. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель содержит сахарозу. В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит диметилсульфоксид. В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов является лиофилизируемым.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов дополнительно содержит иммуномодулятор или адъювант. В одном варианте осуществления иммуномодулятор или адъювант выбраны из группы, состоящей из поли-ICLC, 1018 ISS, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel, векторной системы, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys и QS21 stimulon от Aquila. В одном варианте осуществления иммуномодулятор или адъювант содержат поли-ICLC.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит: от одного до пяти неоантигенных пептидов или их фармацевтически приемлемых солей, где каждый неоантигенный пептид был выбран на основании того, что он характеризуется Pi и HYDRO, ограниченными Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5; 1-3% диметилсульфоксида; 3,6-3,7% декстрозы; 3,6-3,7 мМ янтарной кислоты или ее соли; 0,5 мг/мл поли-I:поли-C; 0,375 мг/мл поли-L-лизина; 1,25 мг/мл натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и 0,225% хлорида натрия.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов содержит каждый из неоантигенных пептидов в концентрации, составляющей приблизительно 300 мкг/мл.
В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов представляет собой фармацевтическую композицию. В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов представляет собой иммуногенную композицию. В одном варианте осуществления раствор неоантигенных пептидов представляет собой вакцинную композицию.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ, описанный в данном документе, предусматривающий введение раствора неоантигенных пептидов, описанного в данном документе, субъекту, у которого диагностировано наличие неоплазии, за счет чего осуществляется лечение неоплазии.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает вакцину против неоплазии, полученную способом, описанным в данном документе, включающим определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) по меньшей мере одного пептида и выбор пептида, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 или Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, необязательно в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi >7 и значением HYDRO ≥ -5,5.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую: по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль; модификатор рН и фармацевтически приемлемый носитель.
i
i
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает в себя по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль, которая является растворимой. Растворимые пептиды можно идентифицировать экспериментально. Растворимые пептиды можно идентифицировать на основании аминокислотной последовательности каждого пептида. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает в себя по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль с определенной изоэлектрической точкой (P). В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает в себя по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль с определенной гидрофобностью. Гидрофобность может быть выражена как значение HYDRO. Значение HYDRO можно определить с использованием известных значений гидрофобности или гидрофильности боковой цепи каждой аминокислоты. Значение HYDRO можно определить с помощью идентифицирования непрерывных участков гидрофобных аминокислот в пептиде. Значение HYDRO можно определить с помощью добавления гидрофобности каждой аминокислоты в непрерывном участке гидрофобных аминокислот. Значение HYDRO может быть суммой значений в непрерывном участке гидрофобных аминокислот с наивысшей степенью гидрофобности. В одном варианте осуществления пептид является растворимым на основании комбинации значений P и HYDRO. Пептид может быть ограничен значениями Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 и Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0. В предпочтительных вариантах осуществления пептид находится в любом из этих диапазонов значений.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой вакцинную композицию.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере два неоантигенных пептида. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере три неоантигенных пептида. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере четыре неоантигенных пептида. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере пять неоантигенных пептидов. Вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии преимущественно содержат по меньшей мере четыре разных неоантигена (и под разными антигенами подразумевается, что каждый антиген имеет другой неоэпитоп), например, по меньшей мере 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12, или 13, или 14, или 15, или 16, или 17, или 18, или 19, или 20, или 21, или 22, или 23, или 24, или 25, или 26, или 27, или 28, или 29, или 30, или 31, или 32, или 33, или 34, или 35, или 36, или 37, или 38, или 39, или 40 или больше разных неоантигенов могут находиться в вакцинной или иммуногенной композициях против неоплазии.
В определенных вариантах осуществления длина неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В другом близком варианте осуществления длина неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 35 аминокислот. Как правило, длина составляет более чем приблизительно 15 или 20 аминокислот, например, от 15 до 50 или приблизительно 75 аминокислот.
В одном варианте осуществления вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии дополнительно содержат модификатор рН и фармацевтически приемлемый носитель.
В определенных вариантах осуществления модификатор pH представляет собой основание. В определенных вариантах осуществления модификатор pH представляет собой соль дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты. В определенных вариантах осуществления модификатор pH представляет собой сукцинат. В определенных вариантах осуществления модификатор pH представляет собой цитрат.
В определенных вариантах осуществления янтарная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль содержат дизамещенный сукцинат натрия.
В определенных вариантах осуществления сукцинат присутствует в составе в концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В определенных вариантах осуществления сукцинат присутствует в составе в концентрации, составляющей от приблизительно 2 мМ до приблизительно 5 мМ.
В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель содержит воду.
В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит декстрозу.
В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит трегалозу.
В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит сахарозу.
В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит диметилсульфоксид.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммуномодулятор или адъювант. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение иммуномодулятора или адъюванта. В другом близком варианте осуществления иммуномодулятор или адъювант выбраны из группы, состоящей из поли-ICLC, 1018 ISS, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL, векторной системы, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys и QS21 stimulon от Aquila. В другом дополнительном варианте осуществления иммуномодулятор или адъювант представляют собой поли-ICLC.
-
Растворение этих полимеров в воде приводит к кислому раствору, который нейтрализуют предпочтительно до физиологического значения рН для того, чтобы получить раствор адъюванта, в который включают вакцинную или иммуногенную композиции или их антиген(-ы) или вектор(-ы). Затем карбоксильные группы полимера частично находятся в виде COO.
Предпочтительно, раствор адъюванта в соответствии с настоящим изобретением, особенно карбомера, получают в дистиллированной воде, предпочтительно в присутствии хлорида натрия, причем полученный раствор находится при кислом значении рН. Этот исходный раствор разбавляют с помощью добавления к необходимому количеству (для получения требуемой конечной концентрации) или его фактической части воды, насыщенной солью, такой как NaCl, предпочтительно физиологического раствора (NaCl 9 г/л), все сразу или несколькими порциями с сопутствующей или последующей нейтрализацией (рН 7,3-7,4), предпочтительно с использованием основания, такого как NaOH. Этот раствор при физиологическом рН используют также и для восстановления вакцины, особенно хранящейся в лиофилизированной форме.
Концентрация полимера в конечной композиции вакцины составляет от 0,01% до 2% вес/об., более предпочтительно от 0,06 до 1% вес/об., предпочтительно от 0,1 до 0,6% вес/об.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая представляет собой вакцину против неоплазии, содержащую: от одного до пяти неоантигенных пептидов или их фармацевтически приемлемых солей; 1-3% диметилсульфоксида; 3,6-3,7% декстрозы в воде; 3,6-3,7 мМ янтарной кислоты или ее соли; 0,5 мг/мл поли-I:поли-C; 0,375 мг/мл поли-L-лизина; 1,25 мг/мл натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и 0,225% хлорида натрия. В определенных вариантах осуществления каждый из одного-пяти неоантигенных пептидов или их фармацевтически приемлемых солей присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 300 мкг/мл.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения раствора неоантигенного пептида для вакцины против неоплазии, при этом способ включает: получение раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль; и объединение раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль, с раствором, содержащим янтарную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, с получением таким образом раствора пептида для вакцины против неоплазии.
i
В определенных вариантах осуществления способ включает получение по меньшей мере одного неоантигенного пептида или его фармацевтически приемлемой соли, которая является растворимой. Растворимые пептиды можно определить экспериментально. Пептиды можно определить на основании аминокислотной последовательности каждого пептида. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает в себя по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль с определенной изоэлектрической точкой (P). В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает в себя по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль с определенной гидрофобностью. Гидрофобность может быть выражена как значение HYDRO. Значение HYDRO можно определить с использованием известных значений гидрофобности или гидрофильности боковой цепи каждой аминокислоты. Значение HYDRO можно определить с помощью идентифицирования непрерывных участков гидрофобных аминокислот в пептиде. Значение HYDRO можно определить с помощью добавления гидрофобности каждой аминокислоты в непрерывном участке гидрофобных аминокислот. Значение HYDRO может быть суммой значений в непрерывном участке гидрофобных аминокислот с наивысшей степенью гидрофобности. Пептид может быть ограничен значениями Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 и Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0. В предпочтительных вариантах осуществления пептид находится в любом из этих диапазонов значений.
В определенных вариантах осуществления раствор, содержащий по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль, содержит по меньшей мере два (или 3, или 4, или 5) неоантигенных пептида. В определенных вариантах осуществления раствор пептидов для вакцины против неоплазии содержит воду, декстрозу или трегалозу или сахарозу, сукцинат и диметилсульфоксид. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает после стадии объединения фильтрацию раствора пептидов для вакцины против неоплазии.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения вакцины против неоплазии, при этом способ включает: получение раствора пептидов для вакцины против неоплазии и объединение раствора пептидов с раствором иммунодулятора или адъюванта с получением таким образом вакцины против неоплазии.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает вакцину против неоплазии, полученную любым способом, описанным в данном документе (например, вышеописанным способом).
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает раствор неоантигенных пептидов для вакцины против неоплазии, содержащий: по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль и янтарную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента с диагнозом неоплазии, при этом способ включает: введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту, за счет чего осуществляется лечение неоплазии.
В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту второй фармацевтической композиции по настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, описанной в данном документе).
В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту третьей фармацевтической композиции по настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, описанной в данном документе).
В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту четвертой фармацевтической композиции по настоящему изобретению (например, фармацевтической композиции, описанной в данном документе).
Введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии может происходить по схеме разовых введений, например, еженедельно, раз в две недели, каждые три недели, ежемесячно, раз в два месяца, ежеквартально (каждые три месяца), каждую треть года (каждые четыре месяца), каждые пять месяцев, два раза в год (каждые шесть месяцев), каждые семь месяцев, каждые восемь месяцев, каждые девять месяцев, каждые десять месяцев, каждые одиннадцать месяцев, ежегодно или т.п.
Вакцинную или иммуногенную композиции против неоплазии можно вводить посредством подкомпозиций, каждая из которых содержит часть неоантигенов, и подкомпозиции можно вводить в разные места у субъекта или пациента; к примеру, композицию, содержащую 20 различных неоантигенов, можно вводить в четырех (4) подкомпозициях, каждая из которых содержит 5 из 20 различных неоантигенов, и четыре (4) подкомпозиции можно вводить так, чтобы попытаться доставить каждую подкомпозицию в дренирующий лимфатический узел пациента или вблизи него, например в каждую из рук и ног (например, в бедро или верхнюю часть бедра или вблизи ягодиц или нижней части спины на каждом боку пациента) так, чтобы попытаться доставить каждую подкомпозицию в дренирующий лимфатический узел пациента или субъекта, или вблизи него. Разумеется, количество мест, а, следовательно, количество подкомпозиций, могут варьироваться, например, квалифицированный специалист-практик в данной области может рассмотреть возможность введения в селезенку или вблизи нее, чтобы иметь пятую точку введения, и квалифицированный практик в данной области может изменять такие места так, чтобы использовать только одно, два или три (например, каждую руку и ногу, каждую из ног и одну руку, каждую из ног и ни одну руку или только обе руки).
Вакцинная или иммуногенная композиции, вводимые с вышеупомянутыми различными интервалами, могут представлять собой различные составы, и подкомпозиции, вводимые в разных местах субъекту или пациенту в течение одного введения, могут представлять собой различные композиции. Например, первое введение может представлять собой вакцинную или иммуногенную композиции на основе полного антигена, а следующее или более позднее введение может представлять собой вектор (например, вирусный вектор или плазмиду), который характеризуется экспрессией антигена(-ов) in vivo. Аналогично, при введении различных подкомпозиций в разные места пациенту или субъекту некоторые из подкомпозиций могут содержать полный антиген и некоторые из подкомпозиций могут содержать вектор (например, вирусный вектор или плазмиду), который характеризуется экспрессией антигена(-ов) in vivo. И некоторые композиции и подкомпозиции могут содержать как вектор(-ы) (например, вирусный вектор или плазмиду), который характеризуется экспрессией антигена(-ов) in vivo, так и полные антигены. Некоторые векторы (например, поксвирус), которые характеризуются экспрессией антигена(-ов) in vivo, могут обладать иммуностимулирующим или адъювантным эффектами, и, следовательно, композиции или подкомпозиции, которые содержат такие векторы, могут быть самоадъювантными. Кроме того, при изменении характера того, как антигены презентируются иммунной системе, введения могут "примировать", а затем "стимулировать" иммунную систему. И в данном тексте, в случае если упоминается "вакцина", предполагается, что настоящее изобретение охватывает иммуногенные композиции, а в случае если упоминается пациент или субъект предполагается, что такой индивидуум является пациентом или субъектом, нуждающимся в раскрытых в данном документе методах лечения, введениях, композициях и в настоящем изобретении в целом.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению любого типа вектора экспрессии, такого как вектор экспрессии на основе вируса, например, поксвируса (например, ортопоксвируса или авипоксвируса, такого как вирус коровьей оспы, в том числе модифицированный вирус коровьей оспы Анкара или MVA, MVA-BN, NYVAC в соответствии с WO-A-92/15672, вирус оспы кур, например TROVAX, вирус оспы канареек, например ALVAC (WO-A-95/27780 и WO-A-92/15672), вирус оспы голубей, вирус свиной оспы и т.п.), аденовируса, AAV, вируса герпеса и лентивируса; или плазмиды, или вектора на основе ДНК или молекулы нуклеиновой кислоты. Некоторые векторы, которые являются цитоплазматическими, такие как векторы на основе поксвируса, могут обладать преимуществом. Однако аденовирус, AAV и лентивирус также могут быть полезны для использования в практике осуществления настоящего изобретения.
В готовых к употреблению, особенно восстановленных, вакцинной или иммуногенной композициях, вектор, например, вирусный вектор, присутствует в количествах, находящихся в пределах компетенции специалиста в данной области из данного раскрытия и знания в данной области техники (такого как в патенте и научной литературе, приведенных в данном документе).
Полный антиген или вектор, например, рекомбинантные живые вакцины, как правило, существуют в лиофилизированной форме, что позволяет их хранить и восстанавливать непосредственно перед применением в растворителе или вспомогательном веществе, которое может включать в себя адъювант, обсуждаемый в данном документе.
Таким образом, предметом настоящего изобретения является также комплект или набор для вакцинации или иммунизации, содержащий отдельно упакованную лиофилизированную вакцину и раствор, преимущественно включающий в себя адъювантное соединение, обсуждаемое в данном документе, для восстановления лиофилизированной вакцины.
Предметом настоящего изобретения является также способ вакцинации или иммунизации, включающий или практически заключающийся или заключающийся во введении, например, парентеральном, предпочтительно подкожном, внутримышечном, или внутрикожном, или мукозальном, вакцинной или иммуногенной композиций в соответствии с настоящим изобретением в количестве одного или нескольких введений. Необязательно данный способ включает в себя предварительную стадию восстановления лиофилизированных вакцинной или иммуногенной композиций (например, лиофилизированных полного антигена или вектора) в растворе, преимущественно также включающем в себя адъювант.
В одном варианте осуществления субъект страдает от неоплазии, выбранной из группы, состоящей из: неходжкинской лимфомы (NHL), светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (ccRCC), меланомы, саркомы, лейкоза или рака мочевого пузыря, толстой кишки, головного мозга, молочной железы, головы и шеи, эндометрия, легкого, яичника, поджелудочной железы или предстательной железы. В другом варианте осуществления неоплазия является метастатической. В дополнительном варианте осуществления субъект не имеет выявляемой неоплазии, однако подвергается высокому риску рецидива заболевания. В дополнительном близком варианте осуществления субъект ранее подвергался аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (AHSCT).
В одном варианте осуществления введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии проводят согласно режиму дозирования примирование/стимулирование. В другом варианте осуществления введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии проводят в 1, 2, 3 или 4 недели в качестве примирования. В другом дополнительном варианте осуществления введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии проводят на 2, 3, 4 или 5 месяц в качестве стимулирования.
В одном варианте осуществления вакцинную или иммуногенную композиции вводят в дозе, составляющей от приблизительно 10 мкг до 1 мг на 70 кг веса тела индивидуума по каждому неоантигенному пептиду. В другом варианте осуществления вакцинную или иммуногенную композиции вводят при средней недельной дозе, составляющей от приблизительно 10 мкг до 2000 мкг на 70 кг веса тела индивидуума по каждому неоантигенному пептиду.
В одном варианте осуществления вакцинную или иммуногенную композиции вводят внутривенно или подкожно.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает раствор неоантигенных пептидов для вакцины против неоплазии, содержащий: по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль и янтарную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.
Настоящее изобретение охватывает способы выполнения, описанные в заявке на патент США № 2011/0293637, включенной в данный документ с помощью ссылки, например способ идентифицирования множества из по меньшей мере 4 специфичных для субъекта пептидов и получения специфичной для субъекта иммуногенной композиции, которая при введении предоставляет множество из по меньшей мере 4 специфичных для субъекта пептидов иммунной системе субъекта, где у субъекта имеется опухоль и специфичные для субъекта пептиды являются специфичными для субъекта и опухоли субъекта, при этом указанный способ включает:
(i) идентифицирование, в том числе посредством
секвенирования нуклеиновой кислоты образца опухоли субъекта и
секвенирования нуклеиновой кислоты неопухолевого образца субъекта,
множества из по меньшей мере 4 опухолеспецифичных немолчащих мутаций, не присутствующих в неопухолевом образце; и
(ii) выбор из идентифицированных немолчащих мутаций множества из по меньшей мере 4 специфичных для субъекта пептидов, каждый из которых имеет другой неоэпитоп опухоли, который является эпитопом, специфичным для опухоли субъекта, из идентифицированного множества опухолеспецифичных мутаций,
где каждый неоэпитоп представляет собой продукт экспрессии опухолеспецифичной немолчащей мутации, не присутствующей в неопухолевом образце, при этом каждый неоэпитоп связывается с белком HLA субъекта и выбор предусматривает
определение связывания специфичных для субъекта пептидов с белком HLA,
и
(iii) составление специфичной для субъекта иммуногенной композиции для введения субъекту, так что при введении множество из по меньшей мере 4 специфичных для субъекта пептидов презентируют иммунной системе субъекта,
где осуществление выбора или составление предусматривает по меньшей мере одно из следующего:
включение в специфичную для субъекта иммуногенную композицию специфичного для субъекта пептида, который включает в себя продукт экспрессии идентифицированной neoORF, где neoORF представляет собой опухолеспецифичную немолчащую мутацию, не присутствующую в неопухолевом образце, которая создает новую открытую рамку считывания, и
включение в специфичную для субъекта иммуногенную композицию специфичного для субъекта пептида, который включает в себя продукт экспрессии идентифицированной точечной мутации и характеризуется определенным связыванием с белком HLA субъекта с IC50 менее 500 нМ,
в результате чего идентифицируют множество из по меньшей мере 4 специфичных для субъекта пептидов и получают специфичную для субъекта иммуногенную композицию, которая при введении презентирует множество из по меньшей мере 4 специфичных для субъекта пептидов иммунной системе субъекта, где специфичные для субъекта пептиды являются специфичными для субъекта и опухоли субъекта; или способ идентифицирования неоантигена, предусматривающий:
a. идентифицирование опухолеспецифичной мутации в экспрессируемом гене субъекта, у которого имеется рак;
b. где указанная мутация, идентифицированная на стадии (а), представляет собой точечную мутацию:
i. идентифицирование мутантного пептида, имеющего мутацию, идентифицированную на стадии (а), где указанный мутантный пептид связывается с белком HLA класса I с большей аффинностью, чем пептид дикого типа; и характеризуется IC50 менее 500 нМ;
c. где указанная мутация, идентифицированная на стадии (а), представляет собой мутацию сайта сплайсинга, сдвига рамки считывания, сквозного прочитывания или слияния генов:
i. идентифицирование мутантного полипептида, кодируемого мутацией, идентифицированной на стадии (а), где указанный мутантный полипептид связывается с белком HLA класса I; или способ индуцирования опухолеспецифичного иммунного ответа у субъекта, предусматривающий введение одного или нескольких идентифицированных пептидов или полипептидов и адъюванта; или способ вакцинации или лечения субъекта от рака, предусматривающий:
a. идентифицирование множества опухолеспецифичных мутаций в экспрессируемом гене субъекта, где, в случае если указанная идентифицированная мутация представляет собой:
i. точечную мутацию, дополнительно идентифицируют мутантный пептид, имеющий точечную мутацию; и/или
ii. мутацию сайта сплайсинга, сдвига рамки считывания, сквозного прочитывания или слияния генов, дополнительно идентифицируют мутантный пептид, кодируемый данной мутацией;
b. выбор одного или нескольких мутантных пептидов или полипептидов, идентифицированных на стадии (а), которые связываются с белком HLA класса I;
c. выбор одного или нескольких мутантных пептидов или полипептидов, идентифицированных на стадии (b), которые способны активировать противоопухолевые CD8 Т-клетки; и
d. введение субъекту одного или нескольких пептидов или полипептидов, аутологичных дендритных клеток или антигенпрезентирующих клеток, в которые вводили один или несколько пептидов или полипептидов, выбранных на стадии (с); или получение фармацевтической композиции, содержащей один идентифицированный пептид(-ы), и выполнение способа(-ов), описываемого в данном документе. Таким образом, вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии в данном документе могут быть такими же, как в заявке на патент США № 2011/0293637.
Соответственно, целью настоящего изобретения не является охват в пределах настоящего изобретения любого ранее известного продукта, способа получения продукта или способа применения продукта, так что заявители сохраняют за собой право и настоящим объявляют об отказе от прав на любой ранее известный продукт, процесс или способ. Следует дополнительно отметить, что настоящее изобретение не предназначено охватывать в пределах объема настоящего изобретения любой продукт, способ получения продукта или способ применения продукта, который не соответствует письменному описанию и требованиям достаточного раскрытия сути изобретения USPTO (первый пункт § 112 статьи 35 USC) или EPO (статья 83 EPC), так что заявители сохраняют за собой право и настоящим объявляют об отказе от прав на любой ранее описанный продукт, способ получения продукта или способ применения продукта.
Следует отметить, что в данном раскрытии и, в частности, в формуле изобретения и/или параграфах такие термины как "содержит", "содержащийся", "содержащий" и т.п. могут иметь значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они могут означать "включает в себя", "включенный", "включающий в себя" и т.п., и что такие термины как "практически состоящий из" и "практически состоит из" имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например они допускают не указанные в явной форме элементы, однако исключают элементы, которые встречаются в известном уровне техники или которые влияют на основные или новые характерные признаки настоящего изобретения.
Эти и другие варианты осуществления раскрыты или являются очевидными, исходя из следующего подробного описания, а также охвачены им.
Краткое описание графических материалов
Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии публикации данного патента или патентной заявки с цветным чертежом(-ами) предоставляются Управлением по запросу и с оплатой необходимой пошлины.
Нижеследующее подробное описание, приведенное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения настоящего изобретения исключительно конкретными описанными вариантами осуществления, лучше всего можно понять в сочетании с прилагаемыми чертежами, включенными в данный документ с помощью ссылки, где:
на фиг. 1 показан технологический процесс изготовления персонализированных противораковых вакцинной или иммуногенной композиций;
на фиг. 2 показан технологический процесс для стадий предварительной обработки при создании противораковых вакцинной или иммуногенной композиций для пациента, у которого имеется рак;
на фиг. 3 проиллюстрирована схема иммунизации на основе схемы примирование/стимулирование в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения. Многократная иммунизация может иметь место в течение первых 3 недель с целью поддержания раннего высокоантигенного воздействия во время фазы примирования иммунного ответа. Затем пациенты могут отдыхать в течение восьми недель, чтобы дать возможность Т-клеткам памяти развиваться, и потом эти Т-клетки будут стимулироваться для того, чтобы поддержать сильный непрерывный ответ;
на фиг. 4 показан линия времени, указывающая первичную иммунологическую конечную точку в соответствии с иллюстративным аспектом настоящего изобретения;
на фиг. 5 показана схема, изображающая обработку лекарственного продукта из отдельных неоантигенных пептидов в пулы 4 подгрупп в соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения;
на фиг. 6 показаны результаты количественной ПЦР с оценкой уровней индукции нескольких ключевых иммунных маркеров после стимуляции дендритных клеток мыши с использованием неоантигенного состава;
на фиг. 7 показан MDSC-анализ 5% декстрозы и 0,8% DMSO;
на фиг. 8 показан MDSC-анализ 10% трегалозы и 0,8% DMSO;
на фиг. 9 показан MDSC-анализ 10% сахарозы и 0,8% DMSO;
на фиг. 10 показан профиль давления иллюстративной лиофилизации;
на фиг. 11 показан температурный профиль иллюстративной лиофилизации;
на фиг. 12 показан физический вид лиофилизированного осадка с использованием иллюстративных составов по настоящему изобретению;
на фиг. 13 показан пример того, как определяют значение HYDRO для данного пептида с аминокислотной последовательностью KYNDFDSEPMFLFIVFSHGILVNHMLIVVM (SEQ ID NO:1);
i
на фиг. 14 показана диаграмма, изображающая HYDRO в зависимости от P для набора пептидов;
i
на фиг. 15 показана диаграмма, изображающая HYDRO в зависимости от P для большего набора пептидов, в том числе пептидов на фиг. 14.
Подробное описание изобретения
Определения
Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, в данном документе определен ряд терминов и фраз:
Если конкретно не указано или не очевидно из контекста, то используемый в данном документе термин "приблизительно" понимается как в пределах диапазона нормального допуска в данной области техники, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. Термин "приблизительно" можно понять, как находящийся в пределах 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанной величины. Если иное не ясно из контекста, то все числовые значения, представленные в данном документе, модифицированы с помощью термина приблизительно.
Если специально не указано или не очевидно из контекста, то используемый в данном документе термин "или" понимается как включительный. Если специально не указано или не очевидно из контекста, то используемые в данном документе термины в единственном числе понимаются в форме единственного или множественного числа.
Под "средством" подразумевается любое низкомолекулярное химическое соединение, антитело, молекула нуклеиновой кислоты или полипептид или их фрагменты.
Под термином "улучшение" подразумевается снижение, подавление, ослабление, уменьшение, остановка или стабилизация развития или прогрессирования заболевания (например, неоплазии, опухоли и т.д.).
Под термином "изменение" подразумевается изменение (повышение или снижение) уровней экспрессии или активности гена или полипептида, обнаруженных стандартными способами, известными из уровня техники, такими как описанные в данном документе. Изменение, используемое в данном документе, включает изменение уровней экспрессии на 10%, предпочтительно изменение на 25%, более предпочтительно изменение на 40% и наиболее предпочтительно изменение уровней экспрессии на 50% или больше.
Под термином "аналог" подразумевается молекула, которая не идентична, однако характеризуется аналогичными функциональными или структурными особенностями. Например, аналог опухолеспецифичного неоантигенного полипептида сохраняет биологическую активность соответствующего встречающегося в природе опухолеспецифичного неоантигенного полипептида, имея в тоже время определенные биохимические модификации, которые улучшают функцию аналога относительно встречающегося в природе полипептида. Эти биохимические модификации могут повышать устойчивость аналога к протеазам, мембранную проницаемость или время полужизни, без изменения, например, связывания лиганда. Аналог может включать в себя неприродную аминокислоту.
Термин "неоантиген" или "неоантигенный" означает класс опухолевых антигенов, который возникает из-за опухолеспецифичной мутации(-ий), которая изменяет аминокислотную последовательность белков, кодируемых геномом.
Под "неоплазией" подразумевается любое заболевание, которое вызвано или приводит к неадекватно высоким уровням клеточного деления, несоответственно низким уровням апоптоза или к обоим. Например, рак является примером неоплазии. Примеры рака включают без ограничения лейкемию (например, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, острый эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз), истинную полицитемию, лимфому (например, заболевание Ходжкина, неходжкинское заболевание), макроглобулинемию Вальденстрема, заболевание тяжелых цепей и солидные опухоли, такие как саркомы и карциномы (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовой железы, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак матки, рак яичка, карцинома легкого, мелкоклеточный рак легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, акустическая неврома, олигодендроглиома, шваннома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома). Лимфопролиферативные нарушения также считаются пролиферативными заболеваниями.
Термин "вакцина против неоплазии" предназначен для обозначения объединенного образца специфичных для неоплазии/опухоли неоантигенов, например, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти или больше неоантигенных пептидов. Под "вакциной" следует понимать композицию для создания иммунитета для профилактики и/или лечения заболеваний (например, неоплазии/опухоли). Соответственно, вакцины представляют собой медикаменты, которые содержат антигены и предназначены для использования на людях или животных для создания специфичного защитного и профилактического вещества с помощью вакцинации. "Композиция вакцины против неоплазии" может включать в себя фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или разбавитель.
Термин "фармацевтически приемлемый" относится к утвержденному или одобренному регулирующим органом Федерального правительства или правительства штата или указанному в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, в том числе людях.
Термин "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или разбавитель" относится к вспомогательному веществу, носителю или разбавителю, которые можно вводить субъекту вместе со средством, и которые не разрушают его фармакологическую активность и нетоксичны при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества средства.
"Фармацевтически приемлемая соль" объединенных опухолеспецифичных неоантигенов, как указано в данном документе, может представлять собой кислую или основную соль, которая, как правило, считается в данной области техники пригодной для применения в контакте с тканями людей или животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа или другой проблемы или осложнения. Такие соли включают минеральные и органические кислые соли основных остатков, таких как амины, а также щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты. Конкретные фармацевтические соли включают без ограничения соли кислот, таких как хлористоводородная, фосфорная, бромистоводородная, яблочная, гликолевая, фумаровая, серная, сульфаминовая, сульфанильная, муравьиная, толуолсульфоновая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, этандисульфоновая, 2-гидроксиэтилсульфоновая, азотная, бензойная, 2-ацетоксибензойная, лимонная, винная, молочная, стеариновая, салициловая, глутаминовая, аскорбиновая, памоевая, янтарная, фумаровая, малеиновая, пропионовая, гидроксималеиновая, йодистоводородная, фенилуксусная, алкановая, такая как уксусная, HOOC-(CH2)n-COOH, где n равно 0-4, и т.п. Аналогично, фармацевтически приемлемые катионы включают без ограничения натрий, калий, кальций, алюминий, литий и аммоний. Специалисты в данной области техники поймут из настоящего раскрытия и знаний в данной области техники, что дополнительные фармацевтически приемлемые соли для объединенных опухолеспецифичных неоантигенов, представленных в данном документе, включают в себя те, которые перечислены в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985). Как правило, фармацевтически приемлемая соль кислоты или основания может быть синтезирована из исходного соединения, которое содержит основной или кислотный фрагмент, любым общепринятым химическим способом. Вкратце, такие соли могут быть получены с помощью взаимодействия свободной кислой или основной форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в подходящем растворителе.
Под "полипептидом" или "пептидом" подразумевается полипептид, который был отделен от компонентов, сопровождающих его в природе. Как правило, полипептид является выделенным, если он составляет по меньшей мере 60% по весу, свободен от белков и природных органических молекул, с которыми он ассоциирован в природе. Предпочтительно, чтобы препарат имел по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% по весу полипептида. Выделенный полипептид можно получить, например, с помощью экстракции из природного источника, с помощью экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид; или с помощью химического синтеза белка. Чистоту можно измерить любым подходящим способом, например, колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или анализом с помощью метода HPLC.
Термины "предупреждать", "предупреждая", "предупреждение", "профилактическое лечение" и т.д., используемые в данном документе, относятся к уменьшению вероятности развития заболевания или состояния у субъекта, у которого не имеется, однако он подвержен риску или восприимчив к развитию заболевания или состояния.
Термин "примирование/стимулирование" или "режим дозирования примирование/стимулирование" предназначен для обозначения последовательных введений вакцинной, или иммуногенной, или иммунологической композиций. Примирующее введение (примирование) представляет собой введение первого типа вакцинной, или иммуногенной, или иммунологической композиций и может включать одно, два или больше введений. Стимулирующее введение представляет собой введение второго типа вакцинной, или иммуногенной, или иммунологической композиций и может включать одно, два или больше введений и, например, может включать или заключаться практически в ежегодных введениях. В определенных вариантах осуществления введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии проводят согласно режиму дозирования примирование/стимулирование.
Диапазоны, представленные в данном документе, понимаются как сокращенная запись для всех значений в пределах диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 понимается с включением любого числа, комбинации чисел или поддиапазона из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50, а также все промежуточные десятичные значения между вышеуказанными целыми числами, такие как, например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и 1,9. В отношении поддиапазонов специально рассматриваются "вложенные поддиапазоны", которые простираются от любой конечной точки диапазона. Например, вложенный поддиапазон иллюстративного диапазона от 1 до 50 может содержать от 1 до 10, от 1 до 20, от 1 до 30 и от 1 до 40 в одном направлении или от 50 до 40, от 50 до 30, от 50 до 20 и от 50 до 10 в другом направлении.
Термин "рецептор" следует понимать как означающий биологическую молекулу или группу молекул, способную связывать лиганд. Рецептор может служить для передачи информации в клетку, клеточное образование или организм. Рецептор содержит по меньшей мере один рецепторный блок и часто содержит два или больше рецепторных блока, где каждый рецепторный блок может состоять из белковой молекулы, в частности молекулы гликопротеина. Рецептор имеет структуру, которая дополняет структуру лиганда и может образовывать комплекс с лигандом в качестве партнера по связыванию. Сигнальная информация может передаваться с помощью конформационных изменений рецептора после связывания с лигандом на поверхности клетки. В соответствии с настоящим изобретением, рецептор может относиться к конкретным белкам МНС классов I и II, способным образовывать комплекс рецептор/лиганд с лигандом, в частности пептидом или пептидным фрагментом подходящей длины.
Термин "комплекс рецептор/лиганд" также следует понимать как означающий "комплекс рецептор/пептид" или "комплекс рецептор/фрагмент пептида", в частности презентирующую пептид или пептидный фрагмент молекулу MHC класса I или класса II.
Под "уменьшением" подразумевается отрицательное изменение по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 75% или 100%.
Под "эталоном" подразумевается стандартное или контрольное условие.
"Эталонная последовательность" представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой подмножество или цельность указанной последовательности; например, сегмент полноразмерной кДНК или геномной последовательности, или полную кДНК или геномную последовательность. Для полипептидов длина эталонной полипептидной последовательности, как правило, составляет по меньшей мере приблизительно 10-2000, 10-1500, 10-1000, 10-500 или 10-100 аминокислот. Предпочтительно длина эталонной полипептидной последовательности может составлять по меньшей мере приблизительно 10-50 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10-40 аминокислот и еще более предпочтительно приблизительно 10-30 аминокислот, приблизительно 10-20 аминокислот, приблизительно 15-25 аминокислот или приблизительно 20 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина эталонной последовательности нуклеиновой кислоты, как правило, составляет по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 60 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов и еще более предпочтительно приблизительно 100 нуклеотидов или приблизительно 300 нуклеотидов, или любое целое число около или между ними.
Под термином "специфически связывает" понимается соединение или антитело, которые распознают и связывают полипептид, однако которые фактически не распознают и не связывают другие молекулы в образце, например биологическом образце.
Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в способах по настоящему изобретению, включают любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по настоящему изобретению или его фрагмент. Такие молекулы нуклеиновой кислоты не должны быть на 100% идентичными эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, однако, как правило, проявляют фактическую идентичность. Полинуклеотиды, характеризующиеся "фактической идентичностью" эндогенной последовательности, как правило, способны гибридизироваться по меньшей мере с одной нитью двухнитевой молекулы нуклеиновой кислоты. Под "гибридизацией" подразумевается спаривание с образованием двухнитевой молекулы между комплементарными полинуклеотидными последовательностями (например, описанным в данном документе геном) или их частями в условиях различной жесткости. (См., например, Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).
Например, жесткая концентрация соли обычно будет составлять менее чем приблизительно 750 мМ NaCl и 75 мМ цитрата натрия трехзамещенного, предпочтительно менее чем приблизительно 500 мМ NaCl и 50 мМ цитрата натрия трехзамещенного и более предпочтительно менее чем приблизительно 250 мМ NaCl и 25 мМ цитрата натрия трехзамещенного. Гибридизацию в условиях сниженной жесткости можно получить в отсутствие органического растворителя, например формамида, в то время как гибридизацию в условиях повышенной жесткости можно получить в присутствии по меньшей мере приблизительно 35% формамида и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50% формамида. Жесткие температурные условия обычно включают температуры по меньшей мере приблизительно 30°С, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 37°С и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 42°С. Специалистам в данной области техники хорошо известны дополнительные параметры, такие как время гибридизации, концентрация детергента, например додецилсульфата натрия (SDS), и включение или исключение носителя ДНК. Различные уровни жесткости достигаются с помощью комбинирования этих разных условий по мере необходимости. В предпочтительном варианте осуществления гибридизация будет проходить при 30°С в 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления гибридизация будет проходить при 37°С в 500 мМ NaCl, 50 мМ цитрата натрия трехзамещенного, 1% SDS, 35% формамида и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (ssDNA). В наиболее предпочтительном варианте осуществления гибридизация будет проходить при 42°С в 250 мМ NaCl, 25 мМ цитрата натрия трехзамещенного, 1% SDS, 50% формамида и 200 мкг/мл ssDNA. Полезные варианты этих условий будут очевидны специалистам в данной области техники.
Для большинства применений стадии промывки, которые следуют за гибридизацией, также будут варьироваться по жесткости. Условия жесткости промывки могут определяться концентрацией соли и температурой. Как указано выше, жесткость промывки можно повысить за счет снижения концентрации соли или повышения температуры. Например, жесткая концентрация соли для стадий промывки будет предпочтительно составлять менее чем приблизительно 30 мМ NaCl и 3 мМ цитрата натрия трехзамещенного и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 15 мМ NaCl и 1,5 мМ цитрата натрия трехзамещенного. Жесткие температурные условия для стадий промывки обычно включают температуру по меньшей мере приблизительно 25°С, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 42°С и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 68°С. В предпочтительном варианте осуществления стадии промывки будут проходить при 25°С в 30 мМ NaCl, 3 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 0,1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления стадии промывки будут проходить при 42°С в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 0,1% SDS. В более предпочтительном варианте осуществления стадии промывки будут проходить при 68°С в 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрата натрия трехзамещенного и 0,1% SDS. Дополнительные варианты этих условий будут очевидны специалистам в данной области техники. Методы гибридизации хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York) и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Термин "субъект" относится к животному, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Только в качестве примера субъект включает без ограничения млекопитающее, в том числе без ограничения человека или млекопитающее, не относящееся к человеку, такое как примат, не относящийся к человеку, представитель бычьих, лошадиных, собачьих, овечьих или кошачьих.
Под "фактически идентичным" подразумевается полипептид или молекула нуклеиновой кислоты, обладающие по меньшей мере 50% идентичностью эталонной аминокислотной последовательности (например, любая из аминокислотных последовательностей, описанных в данном документе) или последовательности нуклеиновой кислоты (например, любая из последовательностей нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе). Предпочтительно, такая последовательность по меньшей мере на 60%, более предпочтительно на 80% или 85% и более предпочтительно на 90%, 95% или даже 99% идентична на уровне аминокислот или нуклеиновой кислоты последовательности, используемой для сравнения.
-3
-100
Идентичность последовательности обычно измеряют с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей (например, пакет программного обеспечения Sequence Analysis от Genetics Computer Group, университет Висконсинский биотехнологический центр, 1710 University Avenue, Мэдисон, Wis. 53705, программы BLAST, BESTFIT, GAP или PILEUP/PRETTYBOX). Такое программное обеспечение подбирает идентичные или сходные последовательности, определяя степени гомологии различных замен, делеций и/или других модификаций. Консервативные замены обычно включают в себя замены в следующих группах: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин и фенилаланин, тирозин. В иллюстративном подходе к определению степени идентичности можно использовать программу BLAST с балльной оценкой вероятности между e и e, указывающей на близкородственную последовательность.
Термин "Т-клеточный эпитоп" следует понимать как означающий пептидную последовательность, которая может быть связана молекулами МНС класса I или II в форме пептидпрезентирующей молекулы MHC или комплекса MHC, и затем в этой форме распознаваться и связываться не подвергавшимися воздействию Т-клетками, цитотоксическими Т-лимфоцитами или Т-хелперными клетками.
Термины "лечить", "получивший лечение", "проведение лечения", "лечение" и т.д. предназначены для обозначения снижения или ослабления нарушения и/или связанных с ним симптомов (например, неоплазии или опухоли). Термин "лечение" включает понятия "облегчения", которые относятся к уменьшению частоты появления или рецидива, или тяжести любых симптомов или других побочных эффектов, связанных с раком, и/или побочных эффектов, связанных с противораковой терапией. Термин "лечение" также охватывает понятие "контроль", которое относится к снижению тяжести конкретного заболевания или нарушения у пациента или отсрочке его рецидива, например, продлению периода ремиссии у пациента, который страдал от данного заболевания. Понятно, что, хотя это и не исключено, лечение нарушения или состояния не требует полного устранения нарушения, состояния или симптомов, связанных с ними.
Термин "терапевтический эффект" относится к некоторой степени облегчения одного или нескольких симптомов нарушения (например, неоплазии или опухоли) или связанной с ними патологии. Термин "терапевтически эффективное количество", используемый в данном документе, относится к количеству средства, которое эффективно при однократном или многократном введении дозы в клетку или субъекту для продления выживаемости пациента с таким нарушением, снижения одного или нескольких признаков или симптомов нарушения, предупреждения или отсрочки и т.п. относительно того, что ожидается в отсутствие такого лечения. "Терапевтически эффективное количество" предназначено для определения количества, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Врач или ветеринар, являющийся специалистом в данной области техники, может легко определить и предписать "терапевтически эффективное количество" (например, ED50) необходимой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар мог бы начинать вводить дозы соединений по настоящему изобретению, применяемых в фармацевтической композиции, при уровнях ниже, чем это необходимо для достижения требуемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения требуемого эффекта.
Фармацевтические композиции обычно должны обеспечивать дозу от приблизительно 0,0001 мг до приблизительно 200 мг соединения на килограмм веса тела в день. Например, дозы для системного введения человеку могут находиться в диапазоне 0,01-10 мкг/кг, 20-80 мкг/кг, 5-50 мкг/кг, 75-150 мкг/кг, 100-500 мкг/кг, 250-750 мкг/кг, 500-1000 мкг/кг, 1-10 мг/кг, 5-50 мг/кг, 25-75 мг/кг, 50-100 мг/кг, 100-250 мг/кг, 50-100 мг/кг, 250-500 мг/кг, 500-750 мг/кг, 750-1000 мг/кг, 1000-1500 мг/кг, 1500-2000 мг/кг, 5 мг/кг, 20 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг. Фармацевтические единичные дозированные формы готовят с получением от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 5000 мг, например, от приблизительно 100 до приблизительно 2500 мг соединения или комбинации основных ингредиентов на единичную дозированную форму.
Под "вакциной" следует понимать композицию для создания иммунитета для профилактики и/или лечения заболеваний (например, неоплазии/опухоли). Соответственно, вакцины представляют собой медикаменты, которые содержат антигены и предназначены для использования на людях или животных для создания специфичного защитного и профилактического вещества с помощью вакцинации.
Раскрытие перечня химических групп в любом определении переменной в данном документе включает определения этой переменной в виде любой отдельной группы или комбинации перечисленных групп. Раскрытие варианта осуществления для переменной или аспекта в данном документе включает этот вариант осуществления в виде любого одного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
Любые композиции или способы, представленные в данном документе, можно комбинировать с одним или несколькими из любых других композиций и способов, представленных в данном документе.
Настоящее изобретение относится к вакцинам и способам лечения неоплазии, а более конкретно опухолей, с помощью введения субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции (например, противораковой вакцины), содержащей множество специфичных для неоплазии/опухоли неоантигенов (например, млекопитающему, такому как человек). Как описано более подробно в данном документе, полное секвенирование генома/экзома можно использовать для идентификации всех или почти всех мутантных неоантигенов, которые уникально присутствуют в неоплазии/опухоли отдельного пациента, и при этом эту коллекцию мутантных неоантигенов можно анализировать для идентификации конкретного оптимизированного подмножества неоантигенов для использования в качестве персонализированных противораковых вакцинной или иммуногенной композиций для лечения неоплазии/опухоли пациента. Например, популяцию специфичных для неоплазии/опухоли неоантигенов можно идентифицировать с помощью секвенирования ДНК неоплазии/опухоли и нормальной ДНК каждого пациента для идентификации опухолеспецифичных мутаций, и при этом можно идентифицировать аллотип HLA пациента. Затем популяцию специфичных для неоплазии/опухоли неоантигенов и их когнатных нативных антигенов можно подвергнуть биоинформационному анализу с использованием валидированных алгоритмов для прогнозирования того, какие опухолеспецифичные мутации создают эпитопы, которые могут связываться с аллотипом HLA пациента. На основании этого анализа множество пептидов, соответствующих подмножеству этих мутаций, можно сконструировать и синтезировать для каждого пациента и объединить вместе для использования в качестве противораковых вакцинной или иммуногенной композиций для иммунизации пациента. Неоантигенные пептиды можно комбинировать с адъювантом (например, поли-ICLC) или другим противоопухолевым средством. Не ограничиваясь теорией, полагают, что эти неоантигены обходят центральную толерантность тимуса (обеспечивая таким образом более сильный противоопухолевый ответ Т-клеток), в то же время снижая потенциал аутоиммунитета (например, избегая нацеливания на нормальные аутоантигены).
Иммунную систему можно классифицировать на две функциональные подсистемы: врожденную и приобретенную иммунные системы. Врожденная иммунная система является первой линией защиты от инфекций, и большинство потенциальных патогенов быстро нейтрализуются этой системой, прежде чем они смогут вызвать, например, заметную инфекцию. Приобретенная иммунная система реагирует на молекулярные структуры вторгающегося организма, называемые антигенами. Существует два типа приобретенных иммунных реакций, которые включают в себя гуморальную иммунную реакцию и клеточно-опосредованную иммунную реакцию. При гуморальной иммунной реакции антитела, секретируемые В-клетками в жидкости организма, связываются с антигенами, происходящими от патогенов, что приводит к устранению патогена с помощью нескольких механизмов, например лизиса, опосредованного комплементом. При клеточно-опосредованной иммунной реакции активируются Т-клетки, способные разрушать другие клетки. Например, если связанные с заболеванием белки присутствуют в клетке, то их протеолитически фрагментируют до пептидов внутри клетки. Затем специфические клеточные белки присоединяются к образуемому таким образом антигену или пептиду и транспортируют их на поверхность клетки, где презентируют их механизмам молекулярной защиты организма, в частности Т-клеткам. Цитотоксические Т-клетки распознают эти антигены и убивают клетки, которые несут антигены.
Молекулы, которые транспортируют и презентируют пептиды на клеточной поверхности, называются белками главного комплекса гистосовместимости (MHC). Белки MHC подразделяют на два типа, называемые MHC класса I и MHC класса II. Структуры белков двух классов МНС очень похожи; однако они имеют очень разные функции. Белки MHC класса I присутствуют на поверхности почти всех клеток организма, в том числе большинства опухолевых клеток. Белки MHC класса I загружаются антигенами, которые обычно происходят из эндогенных белков или из патогенов, присутствующих внутри клеток, и затем презентируются не подвергавшимся воздействию или цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL). Белки MHC класса II присутствуют на дендритных клетках, B-лимфоцитах, макрофагах и других антигенпрезентирующих клетках. В основном они презентируют пептиды, которые обрабатываются из внешних источников антигенов, т.е. снаружи клеток, Т-хелперным (Th) клеткам. Большинство пептидов, связанных белками МНС класса I, происходят из цитоплазматических белков, продуцируемых в здоровых клетках-хозяевах самого организма, и обычно не стимулируют иммунную реакцию. Соответственно, цитотоксические Т-лимфоциты, которые распознают эти презентирующие свой пептид молекулы MHC класса I, удаляются в тимусе (центральная толерантность) или после их высвобождения из тимуса удаляются или инактивируются, т.е. лишаются иммуногенности (периферическая толерантность). Молекулы МНС способны стимулировать иммунную реакцию, в случае если они презентируют пептиды не лишенным иммуногенности Т-лимфоцитам. Цитотоксические Т-лимфоциты имеют на своей поверхности как Т-клеточные рецепторы (TCR), так и молекулы CD8. Т-клеточные рецепторы способны распознавать и связывать пептиды в комплексе с молекулами МНС класса I. Каждый цитотоксический Т-лимфоцит экспрессирует уникальный Т-клеточный рецептор, который способен связывать специфические комплексы МНС/пептид.
Пептидные антигены присоединяются к молекулам МНС класса I с помощью конкурентного аффинного связывания в эндоплазматическом ретикулуме, прежде чем они будут презентированы на поверхности клетки. В данном случае аффинность отдельного пептидного антигена непосредственно связана с его аминокислотной последовательностью и наличием специфичных связывающих мотивов в определенных положениях в аминокислотной последовательности. Если последовательность такого пептида известна, то можно направить иммунную систему против пораженных клеток, используя, например, пептидные вакцины.
Одним из критических барьеров для развития лечебной и опухолеспецифичной иммунотерапии является идентификация и выбор высокоспецифичных и ограниченных опухолевых антигенов, чтобы избежать аутоиммунитета. Опухолевые неоантигены, возникающие в результате генетических изменений (например, инверсий, транслокаций, делеций, миссенс-мутаций, мутаций сайта сплайсинга и т.д.) в злокачественных клетках, представляют собой наиболее опухолеспецифичный класс антигенов. Неоантигены редко использовались в противораковых вакцинной или иммуногенной композициях из-за технических трудностей в их идентифицировании, выборе оптимизированных неоантигенов и получении неоантигенов для использования в вакцинной или иммуногенной композициях. К этим проблемам можно отнести:
• идентифицирование всех или почти всех мутаций в неоплазии/опухоли на уровне ДНК с использованием полного генома, полного экзома (например, только захваченных экзонов) или секвенирования РНК опухоли по сравнению с соответствующими образцами зародышевой линии от каждого пациента;
• анализ идентифицированных мутаций с одним или несколькими алгоритмами предсказания связывания пептид-MHC для создания множества T-клеточных эпитопов неоантигена-кандидата, которые экспрессируются в неоплазии/опухоли и могут связываться с аллелями HLA пациента; и
• синтезирование множества неоантигенных пептидов-кандидатов, выбранных из наборов всех neoORF-пептидов и предсказанных связывающих пептидов для использования в противораковых вакцинной или иммуногенной композициях.
Например, преобразование информации секвенирования в терапевтическую вакцину может включать следующее.
(1) Прогнозирование индивидуальных мутантных пептидов, которые способны связываться с молекулами HLA индивидуума. Для эффективного выбора тех конкретных мутаций, которые нужно использовать в качестве иммуногена, необходима идентификация типа HLA пациента и способность предсказать, какие мутантные пептиды будут эффективно связываться с аллелями HLA пациента. В последнее время подходы, основанные на нейронных сетях, с валидированными связывающими и несвязывающими пептидами, повысили точность алгоритмов прогнозирования для основных аллелей HLA-A и -B.
(2) Составление лекарственного средства в виде мультиэпитопной вакцины из длинных пептидов. Нацеливание на такое количество мутантных эпитопов, какое практически возможно, дает преимущество огромной емкости иммунной системы, предотвращает возможность избежать иммунологического надзора при понижающей модуляции определенного нацеленного иммунной системой продукта гена и компенсирует известную неточность подходов к прогнозированию эпитопов. Синтетические пептиды обеспечивают особенно полезные средства для эффективного получения множества иммуногенов и для быстрого преобразования идентификации мутантных эпитопов в эффективную вакцину. Пептиды можно легко синтезировать химически и легко очистить с использованием реагентов, свободных от загрязняющих бактерий или животных веществ. Небольшой размер позволяет четко сосредоточиться на мутированной области белка, а также снижает нерелевантную антигенную конкуренцию со стороны других компонентов (антигенов немутированного белка или вирусного вектора).
(3) Комбинирование с сильным вакцинным адъювантом. Эффективные вакцины требуют сильного адъюванта для инициации иммунного ответа. Как описано ниже, поли-ICLC, агонист TLR3 и РНК геликазных доменов MDA5 и RIG3 продемонстрировал несколько требуемых свойств для вакцинного адъюванта. Эти свойства включают индукцию локальной и системной активаций иммунных клеток in vivo, выработку стимулирующих хемокинов и цитокинов и стимуляцию антигенпрезентации DC. Более того, поли-ICLC может индуцировать длительные ответы CD4+ и CD8+ у людей. Важно отметить, что поразительное сходство в положительной регуляции транскрипционных путей и путей сигнальной трансдукции наблюдали у субъектов, вакцинированных поли-ICLC, и у добровольцев, получивших высокоэффективную, способную к репликации вакцину против желтой лихорадки. Более того, >90% пациентов с раком яичников, иммунизованных поли-ICLC в комбинации с пептидной вакциной NY-ES0-1 (в дополнение к Montanide), продемонстрировали индукцию CD4+ и CD8+ T-клеток, а также гуморальный иммунный ответ на пептид в недавнем исследовании фазы 1. В то же время поли-ICLC на сегодняшний день был широко протестирован в более чем 25 клинических испытаниях и показал относительно безопасный профиль токсичности. Преимущества настоящего изобретения описаны в данном документе дополнительно.
Как описано в данном документе, существуют многочисленные данные как от животных, так и от людей о том, что мутантные эпитопы являются эффективными в индуцировании иммунного ответа, и что случаи спонтанной регрессии опухоли или длительного выживания коррелируют с ответами CD8+ T-клеток на мутантные эпитопы (Buckwalter and Srivastava PK. "It is the antigen(s), stupid" and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296-300 (2008); Karanikas et al., High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 61:3718-3724 (2001); Lennerz et al, The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci U S A.102:16013 (2005)), и что "иммуноредактирование" может быть сопряжено с изменениями в экспрессии антигенов с доминантной мутацией у мышей и человека (Matsushita et al, Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); и Sampson et al, Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)). В одном варианте осуществления определяют мутантные эпитопы у больного, у которого имеется рак.
В одном варианте осуществления мутантные эпитопы определяют с помощью секвенирования генома и/или экзома опухолевой ткани и здоровой ткани больного, у которого имеется рак, с использованием технологий секвенирования нового поколения. В другом варианте осуществления гены, которые выбирают на основании их частоты мутаций и способности действовать в качестве неоантигена, секвенируют с использованием технологии секвенирования нового поколения. Секвенирование нового поколения применяют для секвенирования генома, ресеквенирования генома, профилирования транскриптома (РНК-секв.), характеристики взаимодействий ДНК-белок (ChIP-секвенирование) и эпигенома (de Magalhães JP, Finch CE, Janssens G (2010). "Next-generation sequencing in aging research: emerging applications, problems, pitfalls and possible solutions". Ageing Research Reviews 9 (3): 315-323; Hall N (May 2007). "Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology". J. Exp. Biol. 209 (Pt 9): 1518-1525; Church GM (January 2006). "Genomes for all". Sci. Am. 294 (1): 46-54; ten Bosch JR, Grody WW (2008). "Keeping Up with the Next Generation". The Journal of Molecular Diagnostics 10 (6): 484-492; Tucker T, Marra M, Friedman JM (2009). "Massively Parallel Sequencing: The Next Big Thing in Genetic Medicine". The American Journal of Human Genetics 85 (2): 142-154). С помощью секвенирования нового поколения в настоящее время можно быстро выявить наличие дискретных мутаций, таких как кодирующие мутации в отдельных опухолях, наиболее часто единичные аминокислотные изменения (например, миссенс-мутации) и менее часто новые фрагменты из аминокислот, образуемые посредством вставок/делеций/слияний генов со сдвигом рамки считывания, мутации сквозного прочитывания в стоп-кодонах и трансляция неправильно сплайсированных интронов (например, neoORF). НеоORF являются особенно ценными в качестве иммуногенов, поскольку вся их последовательность является совершенно новой для иммунной системы, и, следовательно, они являются аналогичными вирусному или бактериальному чужеродным антигенам. Таким образом, neoORF: (1) являются высокоспецифичными для опухоли (т.е. их экспрессия отсутствует в каких-либо нормальных клетках); и (2) способны обходить механизмы центральной толерантности с увеличением таким образом частоты встречаемости предшественников неоантигенспецифичных CTL. Например, эффективность использования аналогичных чужеродных последовательностей в терапевтических противораковых вакцинной или иммуногенной композициях недавно была продемонстрирована с пептидами, полученными из вируса папилломы человека (HPV). У ~50% из 19 пациентов с предраковым заболеванием, индуцированным вирусом, которые получали 3-4 вакцинации смесью пептидов HPV, полученных из вирусных онкогенов E6 и E7, сохранялся полный ответ в течение ≥24 месяцев (Kenter et al, Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia NEJM 361:1838 (2009)).
С помощью технологии секвенирования было выявлено, что каждая опухоль содержит несколько пациент-специфичных мутаций, которые изменяют белок-кодирующую часть гена. Такие мутации создают измененные белки в диапазоне от единичных аминокислотных изменений (вызываемых миссенс-мутациями) до добавления длинных областей с новыми аминокислотными последовательностями вследствие сдвигов рамки считывания, сквозного прочитывания терминирующих кодонов или трансляции интронных областей (мутации образования новой открытой рамки считывания; neoORF). Эти мутантные белки являются ценными мишенями для иммунного ответа организма-хозяина на опухоль, поскольку, в отличие от нативных белков, они не подвергаются эффектам иммунного ослабления аутотолерантности. Таким образом, мутантные белки с большей долей вероятности являются иммуногенными, а также являются более специфичными к опухолевым клеткам по сравнению с нормальными клетками пациента.
Альтернативным способом идентифицирования опухолеспецифичных неоантигенов является прямое секвенирование белка. Для идентификации неоантигенов по настоящему изобретению можно также использовать секвенирование белка продуктов ферментативного расщепления с использованием многомерных методов MS (MSn), в том числе тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Эти протеомные подходы обеспечивают быстрый, высокоавтоматизированный анализ (см., например, K. Gevaert and J. Vandekerckhove, Electrophoresis 21:1145-1154 (2000)). Кроме того, в рамках настоящего изобретения предполагается, что высокопроизводительные способы de novo секвенирования неизвестных белков можно использовать для анализа протеома опухоли пациента с целью идентификации экспрессированных неоантигенов. Например, мета-панорамное секвенирование белка можно использовать для идентификации экспрессированных неоантигенов (см., например, Guthals et al. (2012) Shotgun Protein Sequencing with Meta-contig Assembly, Molecular and Cellular Proteomics 11(10):1084-96).
Опухолеспецифичные неоантигены также можно идентифицировать с использованием мультимеров MHC для идентификации неоантигенспецифичных ответов Т-клеток. Например, высокопроизводительный анализ неоантигенспецифичных ответов Т-клеток в образцах пациентов можно выполнять с использованием методов скрининга на основе тетрамера МНС (см., например, Hombrink et al. (2011) High-Throughput Identification of Potential Minor Histocompatibility Antigens by MHC Tetramer-Based Screening: Feasibility and Limitations 6(8):1-11; Hadrup et al. (2009) Parallel detection of antigen-specific T-cell responses by multidimensional encoding of MHC multimers, Nature Methods, 6(7):520-26; van Rooij et al. (2013) Tumor exome analysis reveals neoantigen-specific T-cell reactivity in an Ipilimumab-responsive melanoma, Journal of Clinical Oncology, 31:1-4 и Heemskerk et al. (2013) The cancer antigenome, EMBO Journal, 32(2):194-203). Такие методы скрининга на основе тетрамера можно использовать для первоначальной идентификации опухолеспецифичных неоантигенов или, альтернативно, в качестве протокола вторичного скрининга для оценки того, какие неоантигены уже могли повлиять на пациента, облегчая таким образом выбор неоантигенов-кандидатов для настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления данные секвенирования, полученные при определении наличия мутаций у больного, у которого имеется рак, анализируют для прогнозирования индивидуальных мутантных пептидов, которые способны связываться с молекулами HLA индивидуума. В одном варианте осуществления данные анализируют с использованием компьютера. В другом варианте осуществления данные секвенирования анализируют на присутствие неоантигенов. В одном варианте осуществления неоантигены определяют по их аффинности к молекулам МНС. Для эффективного выбора тех конкретных мутаций, которые нужно использовать в качестве иммуногена, необходима идентификация типа HLA пациента и способность предсказать, какие мутантные пептиды будут эффективно связываться с аллелями HLA пациента. В последнее время подходы, основанные на нейронных сетях, с валидированными связывающими и несвязывающими пептидами, повысили точность алгоритмов прогнозирования для основных аллелей HLA-A и -B. Используя недавно усовершенствованные алгоритмы предсказания того, какие миссенс-мутации создают пептиды, характеризующиеся сильным связыванием с когнатными молекулами MHC пациента, можно идентифицировать и расставить приоритеты для набора пептидов, представляющих оптимальные мутантные эпитопы (как с neoORF, так и с миссенс-мутациями) для каждого пациента (Zhang et al., Machine learning competition in immunology - Prediction of HLA class I binding peptides J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)).
Нацеливание на такое количество мутантных эпитопов, какое практически возможно, дает преимущество огромной емкости иммунной системы, предотвращает возможность избежать иммунологического надзора при понижающей модуляции определенного нацеленного иммунной системой продукта гена и компенсирует известную неточность подходов к прогнозированию эпитопов. Синтетические пептиды обеспечивают особенно полезные средства для эффективного получения множества иммуногенов и для быстрого преобразования идентификации мутантных эпитопов в эффективные вакцинную или иммуногенную композиции. Пептиды можно легко синтезировать химически и легко очистить с использованием реагентов, свободных от загрязняющих бактерий или животных веществ. Небольшой размер позволяет четко сосредоточиться на мутированной области белка, а также снижает нерелевантную антигенную конкуренцию со стороны других компонентов (антигенов немутированного белка или вирусного вектора).
В одном варианте осуществления состав лекарственного средства представляет собой мультиэпитопные вакцинную или иммуногенную композиции из длинных пептидов. Эти "длинные" пептиды подвергаются эффективной интернализации, процессингу и перекрестной презентации в "профессиональных" антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, и, как было показано, индуцируют ответы CTL у людей (Melief and van der Burg, Immunotherapy of established (pre) malignant disease by synthetic long peptide vaccines Nature Rev Cancer 8:351 (2008)). В одном варианте осуществления для иммунизации готовят по меньшей мере 1 пептид. В предпочтительном варианте осуществления для иммунизации готовят 20 или больше пептидов. В одном варианте осуществления длина неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В другом варианте осуществления синтезируют пептиды длиной от приблизительно 15 до приблизительно 35 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления длина неоантигенного пептида находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 35 аминокислот.
Получение опухолеспецифичных неоантигенов
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на возможности презентировать иммунной системе пациента пул опухолеспецифичных неоантигенов. Специалисту в данной области техники будет понятно из настоящего раскрытия и знаний в данной области техники, что существует множество способов получения этих опухолеспецифичных неоантигенов. В целом, эти опухолеспецифичные неоантигены можно получить in vitro или in vivo. Опухолеспецифичные неоантигены можно получить in vitro в виде пептидов или полипептидов, которые затем можно составить в персонализированные вакцинную или иммуногенную композиции против неоплазии и ввести субъекту. Как описано более подробно в данном документе, такое получение in vitro может происходить различными способами, известными специалисту в данной области техники, например, такими как пептидный синтез или экспрессия пептида/полипептида из молекулы ДНК или РНК в любой из множества бактериальных, эукариотических или вирусных рекомбинантные систем экспрессии, с последующей очисткой экспрессированного пептида/полипептида. В качестве альтернативы, опухолеспецифичные неоантигены можно получить in vivo с помощью введения субъекту молекул (например, ДНК, РНК, вирусных систем экспрессии и т.п.), которые кодируют опухолеспецифичные неоантигены, после чего экспрессируются кодируемые опухолеспецифичные неоантигены. Способы получения неоантигенов in vitro и in vivo также дополнительно описаны в данном документе, поскольку они относятся к фармацевтическим композициям и способам доставки.
Выбор пептидов, растворимых в водном растворе
Способы, раскрытые в данном документе, основаны, по меньшей мере частично, на возможности выбирать пептиды, которые растворимы в водном растворе. Растворимость пептидов можно определить экспериментально. Растворимость пептидов в водном растворе также можно определить на основании аминокислотной последовательности каждого пептида. В одном варианте растворимость пептида определяют с использованием двух расчетных параметров, которые относятся к гидрофобности и изоэлектрической точке (Pi) пептида. Изоэлектрическую точку и гидрофобность можно оценить с использованием любого из способов, известных специалисту, например способов, описанных в примере 14. В одном варианте осуществления гидрофобность пептида оценивают с помощью идентифицирования областей внутри пептида, которые состоят из последовательных гидрофобных аминокислот, расчета индекса степени гидрофобности каждой области последовательных гидрофобных аминокислот и идентифицирования области с наивысшей степенью гидрофобности. Этот параметр может быть обозначен как HYDRO. Данный расчет можно легко выполнить с использованием опубликованных значений гидрофобности (или гидрофильности) для каждой боковой цепи аминокислот, идентифицируя непрерывные участки гидрофобных аминокислот в пептиде и суммируя гидрофобность каждой аминокислоты в каждой области. Пример оценки гидрофобности пептида описан в примере 14.
В одном варианте осуществления способ выбора растворимого пептида, описанного в данном документе, включает определение значений Pi и HYDRO пептида и выбор пептида, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 и Pi ≥9 и значением HYDRO ≤ -8,0.
В одном варианте осуществления способ оценки растворимости пептида в водном растворе, описанном в данном документе, включает определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) пептида, где пептид является растворимым в водном растворе, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 и Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0.
В одном варианте осуществления способ получения водного раствора пептида, описанного в данном документе, включает определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) по меньшей мере одного пептида, выбор пептида, в случае если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 и Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, и получения водного раствора, содержащего пептид.
В одном варианте осуществления способ получения водного раствора пептида, описанного в данном документе, включает определение изоэлектрической точки (Pi) и гидрофобности (HYDRO) по меньшей мере одного неоантигенного пептида, выбор по меньшей мере одного неоантигенного пептида, если его Pi и HYDRO ограничены Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0, Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5 и Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0, получение раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль; и объединение раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль, с раствором, содержащим янтарную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, с получением таким образом раствора пептида для вакцины против неоплазии.
In vitro синтез пептида/полипептида
Белки или пептиды можно получить с помощью любого метода, известного специалистам в данной области техники, в том числе экспрессии белков, полипептидов или пептидов посредством стандартных молекулярно-биологических методов, выделение белков или пептидов из природных источников, трансляцию in vitro или химический синтез белков или пептидов. Нуклеотидные и белковые, полипептидные и пептидные последовательности, соответствующие различным генам, были ранее раскрыты и могут быть найдены в компьютеризированных базах данных, известных специалистам в данной области техники. Одной из таких баз данных являются базы данных Genbank и GenPept Национального центра биотехнологической информации, расположенные на веб-сайте Национальных институтов здравоохранения Кодирующие области для известных генов можно амплифицировать и/или экспрессировать с использованием методов, раскрытых в данном документе, или как известно специалистам в данной области техники. В качестве альтернативы, различные коммерческие препараты белков, полипептидов и пептидов известны специалистам в данной области техники.
Пептиды можно легко синтезировать химически с использованием реагентов, свободных от загрязняющих бактериальных или животных веществ (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963). В определенных вариантах осуществления неоантигенные пептиды получают с помощью (1) параллельного твердофазного синтеза на многоканальных приборах с использованием однородных условий синтеза и отщепления; (2) очистки на колонке RP-HPLC со снятием с колонки; и повторной промывкой, но не заменой пептидов; с последующим (3) анализом с использованием ограниченного набора наиболее информативных испытаний. Зону присутствия надлежащей производственной практики (GMP) можно определить вокруг набора пептидов для отдельного пациента, что требует изменения набора процедур только между синтезами пептидов для разных пациентов.
В качестве альтернативы, для получения неоантигенного пептида in vitro можно использовать нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую неоантигенный пептид по настоящему изобретению. Полинуклеотид может представлять собой, например, ДНК, кДНК, PNA, CNA, РНК, либо одно- и/или двухнитевые, либо нативные или стабилизированные формы полинуклеотидов, например, такие как полинуклеотиды с тиофосфатным каркасом или их комбинации, и он может содержать или не содержать интроны до тех пор, пока кодирует пептид. В одном варианте осуществления для получения пептида используют трансляцию in vitro. Существует множество иллюстративных систем, которые могут быть использованы специалистом в данной области техники (например, набор Retic Lysate IVT, Life Technologies, Уолтем, Массачусетс).
Можно также получить вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид. Векторы экспрессии для разных типов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без чрезмерного экспериментирования. Как правило, ДНК вставляют в вектор экспрессии, такой как плазмида, в правильной ориентации и в правильную рамку считывания для экспрессии. При необходимости, ДНК может быть связана с соответствующими контрольными нуклеотидными последовательностями для регуляции транскрипции и трансляции, распознаваемыми требуемым хозяином (например, бактериями), хотя такие средства контроля, как правило, доступны в векторе экспрессии. Затем вектор вводят в бактерии-хозяева для клонирования с использованием стандартных методов (см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Рассматриваются также векторы экспрессии, содержащие выделенные полинуклеотиды, а также клетки-хозяева, содержащие векторы экспрессии. Неоантигенные пептиды могут быть представлены в форме молекул РНК или кДНК, кодирующих требуемые неоантигенные пептиды. Один или несколько неоантигенных пептидов по настоящему изобретению могут кодироваться одним вектором экспрессии.
Термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид" охватывает полинуклеотид, который включает в себя только кодирующие последовательности для полипептида, а также полинуклеотид, который включает в себя дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности. Полинуклеотиды могут быть в форме РНК или в форме ДНК. ДНК предусматривает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК и может быть двухнитевой или однонитевой, и в случае однонитевой может представлять собой кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую) нить.
В вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для опухолеспецифичного неоантигенного пептида, слитого в одной рамке считывания с полинуклеотидом, который помогает, например, при экспрессии и/или секреции полипептида из клетки-хозяина (например, лидерная последовательность, которая функционирует как секреторная последовательность для управления транспортом полипептида из клетки). Полипептид, имеющий лидерную последовательность, представляет собой белок-предшественник, и лидерная последовательность может отщепляться клеткой-хозяином с образованием зрелой формы полипептида.
В вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для опухолеспецифичного неоантигенного пептида, слитую в одной раме считывания с маркерной последовательностью, которая позволяет, например, очищать кодируемый полипептид, который затем можно включить в персонализированные вакцинную или иммуногенную композиции против неоплазии. Например, маркерная последовательность может быть гексагистидиновой меткой, поставляемой вектором pQE-9, чтобы обеспечить очистку зрелого полипептида, слитого с маркером, в случае бактериального хозяина, или маркерная последовательность может представлять собой гемагглютининовую (HA) метку, полученную из белка гемагглютинина гриппа, в случае если используют хозяина-млекопитающего (например, клетки COS-7). Дополнительные метки включают без ограничения кальмодулиновые метки, FLAG-метки, Myc-метки, S-метки, SBP-метки, Softag 1, Softag 3, V5-метку, Xpress-метку, Isopeptag, SpyTag, метки с белком-переносчиком карбоксибиотина (BCCP), GST-метки, метки с флуоресцентными белками (например, метки с зеленым флуоресцентным белком), метки с мальтоза-связывающим белком, Nus-метки, Strep-метка, тиоредоксиновая метка, TC-метка, Ty-метка и т.п.
В вариантах осуществления полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для одного или нескольких опухолеспецифичных неоантигенных пептидов, слитых в одной рамке считывания, для создания одной конкатемеризированной конструкции неоантигенного пептида, способной продуцировать несколько неоантигенных пептидов.
В определенных вариантах осуществления могут быть предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную, по меньшей мере на 65% идентичную, по меньшей мере на 70% идентичную, по меньшей мере на 75% идентичную, по меньшей мере на 80% идентичную, по меньшей мере на 85% идентичную, по меньшей мере 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентичную полинуклеотиду, кодирующему опухолеспецифичный неоантигенный пептид по настоящему изобретению.
Под полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% "идентичную" эталонной нуклеотидной последовательности, подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может содержать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, чтобы получить полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную эталонной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности можно удалить или заменить другим нуклеотидом, или несколько нуклеотидов, вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности, можно вставить в эталонную последовательность. Эти мутации эталонной последовательности могут происходить в амино- или карбокси-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или где-либо между этими концевыми положениями, перемежаясь либо индивидуально среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в эталонной последовательности.
С практической точки зрения то, является ли какая-либо конкретная молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80% идентичной, по меньшей мере на 85% идентичной, по меньшей мере на 90% идентичной и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной эталонной последовательности, можно определить общепринятым способом, с использованием известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). В Bestfit используется алгоритм поиска локальной гомологии Смита-Уотермана, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), для обнаружения лучшего сегмента гомологии между двумя последовательностями. При использовании Bestfit или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают так, что процент идентичности вычисляется по всей длине эталонной нуклеотидной последовательности, и что гэпы разрешены в гомологии до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности.
Выделенные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды, описанные в данном документе, можно получить in vitro (например, в лаборатории) любым подходящим способом, известным в данной области техники. Такие способы варьируются от прямых способов синтеза белков до конструирования последовательности ДНК, кодирующей выделенные полипептидные последовательности, и экспрессии этих последовательностей в подходящем трансформированном хозяине. В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК конструируют с использованием рекомбинантной технологии с помощью выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей белок дикого типа, представляющий интерес. Необязательно, последовательность можно мутировать с помощью сайт-специфического мутагенеза с получением функциональных аналогов. См., например, Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) и патент США № 4588585.
В вариантах осуществления последовательность ДНК, кодирующая полипептид, представляющий интерес, будет сконструирована с помощью химического синтеза с использованием автоматического синтезатора ДНК. Такие олигонуклеотиды можно сконструировать на основе аминокислотной последовательности требуемого полипептида и выбора тех кодонов, которые предпочтительны в клетке-хозяине, в которой продуцируется рекомбинантный полипептид, представляющий интерес. Для синтеза выделенной полинуклеотидной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, представляющий интерес, можно использовать стандартные способы. Например, полную аминокислотную последовательность можно использовать для конструирования восстановленного по полипептиду гена. Кроме того, можно синтезировать олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный выделенный полипептид. Например, несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части требуемого полипептида, можно синтезировать и затем лигировать. Отдельные олигонуклеотиды обычно содержат "липкие" 5'- или 3'-концы для комплементарной сборки.
После сборки (например, с помощью синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный выделенный полипептид, представляющий интерес, вставляют в вектор экспрессии и необязательно функционально связывают с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии белка в требуемом хозяине. Надлежащую сборку можно подтвердить секвенированием нуклеотидов, рестрикционным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно в данной области техники, для получения высоких уровней экспрессии трансфицированного гена в хозяине ген можно функционально связать с последовательностями транскрипционного и трансляционного контроля экспрессии, которые являются функциональными в выбранном хозяине экспрессии.
Рекомбинантные векторы экспрессии можно использовать для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей опухолеспецифичные неоантигенные пептиды. Рекомбинантные векторы экспрессии представляют собой реплицируемые ДНК-конструкции, которые имеют синтетические или полученные из кДНК фрагменты ДНК, кодирующие опухолеспецифичный неоантигенный пептид или биоэквивалентный аналог, функционально связанные с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, полученными из генов млекопитающих, микробов, вирусов или насекомых. Как правило, единица транскрипции содержит набор из (1) генетического элемента или элементов, имеющих регуляторную роль в экспрессии генов, например, транскрипционных промоторов или энхансеров, (2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в mRNA и транслируется в белок, и (3) соответствующих последовательностей инициации и терминации транскрипции и трансляции, как подробно описано в данном документе. Эти регуляторные элементы могут включать в себя последовательность операторов для контроля транскрипции. Могут быть также включены возможность репликации в хозяине, обычно предоставляемая началом репликации, и выбор гена для облегчения распознавания трансформантов. Области ДНК являются функционально связанными, в случае если они функционально связаны друг с другом. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторного лидера) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы обеспечивать трансляцию. Как правило, функционально связанный означает смежный, а в случае секреторных лидеров означает смежный и в рамке считывания. Структурные элементы, предназначенные для использования в системах экспрессии дрожжей, включают в себя лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслированного белка клеткой-хозяином. В качестве альтернативы, в случае если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать в себя N-концевой остаток метионина. Этот остаток необязательно можно впоследствии отщепить от экспрессированного рекомбинантного белка с получением конечного продукта.
Полезные векторы экспрессии для эукариотических хозяев, особенно млекопитающих или людей, включают в себя, например, векторы, содержащие последовательности контроля экспрессии из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Полезные векторы экспрессии для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Escherichia coli, в том числе pCR 1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды из более широкого диапазона хозяев, такие как M13 и нитевидные фаги с однонитевой ДНК.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии полипептида включают прокариот, дрожжи, клетки насекомых или высших эукариот под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например, E. coli или бациллы. Клетки высших эукариот включают в себя общепринятые клеточные линии млекопитающих. Также можно использовать бесклеточные системы трансляции. Соответствующие векторы клонирования и экспрессии для использования с клетками-хозяевами, происходящими из бактериальных, грибных, дрожжевых и клеток млекопитающих, хорошо известны в данной области техники (см. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).
Для экспрессии рекомбинантного белка также выгодно использовать различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых. Экспрессию рекомбинантных белков в клетках млекопитающих можно выполнять, поскольку такие белки, как правило, правильно сворачиваются, соответствующим образом модифицируются и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают линии COS-7 клеток почки обезьяны, описанные Gluzman (Cell 23:175, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать соответствующий вектор, в том числе, например, клеточные линии L-клеток, C127, 3T3, клеток яичника китайского хомяка (CHO), 293, HeLa и BHK. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как начало репликации, подходящий промотор и энхансер, связанные с экспрессируемым геном, и другие 5'- или 3'-концевые фланкирующие нетранскрибируемые последовательности и 5' или 3'-концевые нетранслируемые последовательности, такие как необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для продуцирования гетерологичных белков в клетках насекомых рассмотрены Luckow и Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Белки, полученные трансформированным хозяином, можно очистить в соответствии с любым подходящим способом. Эти стандартные способы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную и колоночную хроматографию с разделением по размерам и т.п.), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любой другой стандартный метод очистки белка. К белку можно присоединить аффинные метки, такие как гексагистидин, мальтоза-связывающий домен, последовательность оболочки вируса гриппа, глутатион-S-трансфераза и т.п., для обеспечения легкой очистки с помощью прохождения через подходящую аффинную колонку. Выделенные белки также можно физически охарактеризовать с использованием таких методов, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.
Например, супернатанты из систем, которые секретируют рекомбинантный белок в культуральную среду, можно сперва концентрировать с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат можно нанести на подходящую матрицу для очистки. В качестве альтернативы можно использовать анионообменную смолу, например, матрицу или субстрат, имеющий боковые диэтиламиноэтильные (DEAE) группы. Матрицы могут представлять собой акриламид, агарозу, декстран, целлюлозу или другие типы, обычно используемые для очистки белка. В качестве альтернативы можно использовать стадию обмена катионов. Подходящие катионообменники включают в себя различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Наконец, для дополнительной очистки композиции на основе Fc-белка раковых стволовых клеток можно использовать одну или несколько стадий высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC) с использованием гидрофобной среды RP-HPLC, например силикагеля, имеющего боковые метильные или другие алифатические группы. Для получения гомогенного рекомбинантного белка также можно использовать некоторые или все вышеуказанные стадии очистки в различных комбинациях.
Рекомбинантный белок, продуцируемый в бактериальной культуре, можно выделить, например, с помощью первоначальной экстракции из клеточного осадка с последующим проведением одной или нескольких стадий концентрирования, высаливания, ионообменной или эксклюзионной хроматографии в водной среде. Для конечных стадий очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC). Микробные клетки, используемые для экспрессии рекомбинантного белка, можно разрушить любым удобным способом, в том числе циклами замораживания-оттаивания, ультразвуковой обработкой, механическим разрушением или применением средств, лизирующих клетки.
In vivo синтез пептида/полипептида
В настоящем изобретении также рассматривается использование молекул нуклеиновых кислот в качестве несущих сред для доставки неоантигенных пептидов/полипептидов in vivo субъекту, нуждающемуся в этом, в форме, например, ДНК/РНК-вакцин (см., например, WO 2012/159643 и WO 2012/159754, включенные в данный документ в полном объеме с помощью ссылки).
В одном варианте осуществления неоантигены можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, с использованием плазмиды. Это плазмиды, которые обычно состоят из сильного вирусного промотора для управления in vivo транскрипцией и трансляцией гена (или комплементарной ДНК), представляющего интерес (Mor, et al., (1995). The Journal of Immunology 155 (4): 2039-2046). Интрон А иногда может быть включен для улучшения стабильности mRNA и, следовательно, повышения экспрессии белка (Leitner et al. (1997). The Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119). Плазмиды также включают в себя сильный сигнал полиаденилирования/терминации транскрипции, такой как из гена бычьего гормона роста, или последовательность полиаденилирования гена бета-глобулина кролика (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Robinson et al., (2000). Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74; Böhmet al., (1996). Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40.). Иногда конструируют мультицистронные векторы для экспрессии более чем одного иммуногена или для экспрессии иммуногена и иммуностимулирующего белка (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
Because the plasmid is the "vehicle" from which the immunogen is expressed, optimising vector design for maximal protein expression is essential (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Одним из способов усиления экспрессии белка является оптимизация использования кодонов патогенных mRNA для эукариотических клеток. Другим важным моментом является выбор промотера. Такими промоторами могут быть промотор SV40 или вируса саркомы Рауса (RSV).
Плазмиды можно вводить в ткани животных несколькими различными способами. Двумя наиболее популярными подходами являются инъекция ДНК в физиологическом растворе с использованием стандартной иглы для подкожных инъекций и доставка с помощью генной пушки. Схематический план конструкции плазмиды ДНК-вакцины и ее последующая доставка этими двумя способами в хозяина проиллюстрированы в Scientific American (Weiner et al., (1999) Scientific American 281 (1): 34-41). Инъекция в физиологическом растворе обычно проводится внутримышечно (IM) в скелетную мышцу или внутрикожно (ID), причем ДНК доставляется во внеклеточные пространства. Этому может способствовать электропорация путем временного повреждения мышечных волокон миотоксинами, такими как бупивакаин; или с использованием гипертонических растворов солевого раствора или сахарозы (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). На иммунные ответы на этот способ доставки могут влиять многие факторы, в том числе тип иглы, выравнивание иглы, скорость инъекции, объем инъекции, тип мышц и возраст, пол и физиологическое состояние животного, которому проводят инъекцию (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).
Доставка с помощью генной пушки, другой широко используемый способ доставки, баллистически ускоряет доставку плазмидной ДНК (pDNA), которая была адсорбирована на микрочастицы золота или вольфрама, в клетки-мишени, с использованием сжатого гелия в качестве ускорителя (Alarcon et al., (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
Альтернативные способы доставки могут включать инстилляцию аэрозолей голой ДНК на поверхности слизистой оболочки, такой как слизистая оболочка носа и легких (Lewis et al., (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88), и местное введение pDNA в слизистую глаза и влагалища (Lewis et al., (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Доставку на поверхность слизистой оболочки также можно осуществить с использованием препаратов катионных липосом с ДНК, биоразлагаемых микросфер, ослабленных векторов на основе Shigella или Listeria для перорального введения в слизистую оболочку кишечника и векторов на основе рекомбинантного аденовируса.
Способ доставки определяет дозу ДНК, необходимую для появления эффективного иммунного ответа. Для инъекций с физиологическим раствором, для появления эффективного иммунного ответа требуются различные количества ДНК от 10 мкг до 1 мг, тогда как при доставке с помощью генной пушки требуется в 100-1000 раз меньше ДНК, чем при внутримышечной инъекции с физиологическим раствором. Как правило, требуется 0,2 мкг - 20 мкг, хотя сообщалось о количествах до 16 нг. Эти величины варьируются от видов к видам, например, мышам требуется примерно в 10 раз меньше ДНК, чем приматам. Для инъекций с физиологическим раствором требуется больше ДНК, поскольку ДНК доставляется во внеклеточное пространство ткани-мишени (обычно мышцы), где ей приходится преодолевать физические барьеры (к примеру, в частности такие как базальная мембрана и большое количество соединительной ткани) до поглощения клетками, в то время как методы доставки с помощью генной пушки забрасывают ДНК непосредственно в клетки, что приводит к меньшим "потерям" (см., например, Sedegah et al., (1994). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91 (21): 9866-9870; Daheshiaet al., (1997). The Journal of Immunology 159 (4): 1945-1952; Chen et al., (1998). The Journal of Immunology 160 (5): 2425-2432; Sizemore (1995) Science 270 (5234): 299-302; Fynan et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (24): 11478-82).
В одном варианте осуществления вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии могут включать в себя отдельные ДНК-плазмиды, кодирующие, например, один или несколько неоантигенных пептидов/полипептидов, идентифицируемых в соответствии с настоящим изобретением. Как обсуждалось в данном документе, точный выбор векторов экспрессии может зависеть от пептида/полипептида, подлежащих экспрессии, и находится в пределах компетенции обычного специалиста в данной области. Предполагается, что ожидаемая устойчивость конструкций ДНК (например, в эписомальной, нереплицирующейся, неинтегрированной формах в мышечных клетках) обеспечит увеличенную продолжительность защиты.
Один или несколько неоантигенных пептидов по настоящему изобретению могут кодироваться и экспрессироваться in vivo с использованием системы на основе вирусов (например, аденовирусной системы, вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), поксвируса или лентивируса). В одном варианте осуществления вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии могут включать в себя вектор на основе вируса для использования у нуждающегося в ней пациента, например, такой как аденовирус (см., например, Baden et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis. 2013 Jan 15;207(2):240-7, включенную в данный документ в полном их объеме с помощью ссылки). Плазмиды, которые можно использовать для доставки аденоассоциированных вирусов, аденовирусов и лентивирусов, были описаны ранее (см., например, патенты США №№ 6955808 и 6943019 и заявку на патент США № 2008/0254008, включенные в данный документ с помощью ссылки).
9
Среди векторов, которые можно использовать в практике осуществления настоящего изобретения, интеграция в геном хозяина клетки возможна с помощью способов переноса генов с ретровирусом, что часто приводит к длительной экспрессии введенного трансгена. В предпочтительном варианте осуществления ретровирус представляет собой лентивирус. Кроме того, высокие показатели эффективности трансдукции наблюдали у многих различных типов клеток и целевых тканей. Тропизм ретровируса можно изменить путем включения чужеродных белков оболочки с расширением возможной целевой популяции клеток-мишеней. Ретровирус также можно спроектировать для обеспечения условной экспрессии введенного трансгена, так что только определенные типы клеток заражаются лентивирусом. Для нацеливания экспрессии в конкретных типах клеток можно использовать специфичные для типа клеток промоторы. Лентивирусные векторы представляют собой ретровирусные векторы (и, следовательно, в практике осуществления настоящего изобретения могут использоваться как лентивирусный, так и ретровирусный векторы). Лентивирусные векторы являются ретровирусными векторами, которые способны трансдуцировать или инфицировать неделящиеся клетки и обычно дают высокие вирусные титры. Таким образом, выбор системы переноса генов на основе ретровирусов может зависеть от целевой ткани. Ретровирусные векторы состоят из действующих в цис-положении длинных концевых повторов с упаковывающей способностью до 6-10 т.о. чужеродной последовательности. Минимальных действующих в цис-положении LTR достаточно для репликации и упаковки векторов, которые затем используют для интеграции требуемой нуклеиновой кислоты в клетку-мишень с получением постоянной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы, которые можно использовать в практике осуществления настоящего изобретения, предусматривают векторы на основе вируса лейкоза мышей (MuLV), вируса лейкоза гиббонов (GaLV), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита человека (HIV) и их комбинаций (см., например, Buchscher et al., (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann et al., (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommnerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson et al., (1998) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., (1991) J. Virol. 65:2220-2224; PCT/US94/05700). Zou et al. вводили приблизительно 10 мкл рекомбинантного лентивируса с титром 1 x 10 трансдуцирующих единиц (TU)/мл с помощью интратекального катетера. Эту разновидность доз можно адаптировать или экстраполировать для использования ретровирусного или лентивирусного вектора в настоящем изобретении.
Также полезным в практике осуществления настоящего изобретения является минимальный лентивирусный вектор, не связанный с приматом, такой как лентивирусный вектор на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) (см., например, Balagaan, (2006) J Gene Med; 8: 275-285, опубликованную в Интернете 21 ноября 2005 г. в Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Векторы могут иметь промотор цитомегаловируса (CMV), управляющий экспрессией целевого гена. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает среди векторов, пригодных в практике осуществления настоящего изобретения, вирусные векторы, в том числе ретровирусные векторы и лентивирусные векторы.
Также полезным в практике осуществления настоящего изобретения является вектор на основе аденовируса. Одним из преимуществ является способность рекомбинантных аденовирусов эффективно переносить и экспрессировать рекомбинантные гены в различных клетках и тканях млекопитающих in vitro и in vivo, что приводит к высокой экспрессии перенесенных нуклеиновых кислот. Кроме того, способность продуктивно инфицировать покоящиеся клетки расширяет функциональность векторов на основе рекомбинантных аденовирусов. В дополнение, высокие уровни экспрессии гарантируют, что продукты нуклеиновых кислот будут экспрессироваться на достаточных уровнях для создания иммунного ответа (см., например, патент США № 7029848, включенный в данный документ с помощью ссылки).
5
6
6
12
7
8
8
11
8
12
9
9
10
9
12
10
10
12
14
13
12
11
10
9
6
6
6
7
7
7
8
8
8
9
9
9
10
10
10
11
11
11
12
12
12
В одном варианте осуществления в данном документе доставку осуществляют посредством аденовируса, который может находиться в однократной дозе стимулирования, содержащей по меньшей мере 1 x 10 частиц (также называемых единицами частиц, pu) аденовирусного вектора. В одном варианте осуществления в данном документе доза предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 1 x 10 частиц (например, приблизительно 1 x 10 - 1 x 10 частиц), более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1 x 10 частиц, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1 x 10 частиц (например, приблизительно 1 x 10 - 1 x 10 частиц или приблизительно 1 x 10 - 1 x 10 частиц) и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1 x 10 частиц (например, приблизительно 1 x 10 - 1 x 10 частиц или приблизительно 1 x 10 - 1 x 10 частиц) или даже по меньшей мере приблизительно 1 x 10 частиц (например, приблизительно 1 x 10 - 1 x 10 частиц) аденовирусного вектора. В качестве альтернативы доза содержит не более чем приблизительно 1 x 10 частиц, предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10 частиц, еще более предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10 частиц, еще более предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10 частиц и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10 частиц (например, не более чем приблизительно 1 x 10 частиц). Таким образом, доза может включать в себя однократную дозу аденовирусного вектора, например, с приблизительно 1 x 10 единиц частиц (pu), приблизительно 2 x 10 pu, приблизительно 4 x 10 pu, приблизительно 1 x 10 pu, приблизительно 2 x 10 pu, приблизительно 4 x 10 pu, приблизительно 1 x 10 pu, приблизительно 2 x 10 pu, приблизительно 4 x 10 pu, приблизительно 1 x 10 pu, приблизительно 2 x 10 pu, приблизительно 4 x 10 pu, приблизительно 1 x 10 pu, приблизительно 2 x 10 pu, приблизительно 4 x 10 pu, приблизительно 1 x 10 pu, приблизительно 2 x 10 pu, приблизительно 4 x 10 pu, приблизительно 1 x 10 pu, приблизительно 2 x 10 pu или приблизительно 4 x 10 pu аденовирусного вектора. См., например, аденовирусные векторы в патенте США № 8454972 B2 Nabel, et. al., выданном 4 июня 2013 г.; включенном в данный документ с помощью ссылки, и дозы в столб. 29, строках 36-58 данного патента. В варианте осуществления в данном документе аденовирус доставляют посредством многократных доз.
Что касается доставки in vivo, то AAV выгоден по сравнению с другими вирусными векторами из-за низкой токсичности и низкой вероятности возникновения инсерционного мутагенеза, поскольку он не интегрируется в геном хозяина. AAV имеет предел упаковки, составляющий 4,5 или 4,75 т.о. Конструкции, размер которых превышает 4,5 или 4,75 т.о., приводят к значительному снижению продуцирования вируса. Существует много промоторов, которые можно использовать для управления экспрессией молекулы нуклеиновой кислоты. ITR AAV может служить в качестве промотора и является преимуществом при устранении необходимости в дополнительном промоторном элементе. Для повсеместной экспрессии можно использовать следующие промоторы: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, гена тяжелой или легкой цепей ферритина и т.д. Для экспрессии в головном мозге можно использовать следующие промоторы: гена синапсина I для всех нейронов, гена CaMKII-альфа для возбуждающих нейронов, GAD67, или GAD65, или VGAT для GABA-эргических нейронов и т.д. Промоторы для управления синтезом РНК могут включать в себя: промоторы Pol III, такие как U6 или H1. Использование промотора Pol II и интронных кассет можно использовать для экспрессии направляющей РНК (gRNA).
Что касается AAV, то AAV может представлять собой AAV1, AAV2, AAV5 или любую их комбинацию. Можно выбрать AAV с учетом клеток, подлежащих целенаправленному воздействию; например, можно выбрать AAV серотипов 1, 2, 5 или гибридный капсид AAV1, AAV2, AAV5 или любую их комбинацию для нацеливания на головной мозг или нейроны; и можно выбрать AAV4 для нацеливания на сердечную ткань. AAV8 применим для доставки в печень. Вышеуказанные промоторы и векторы являются предпочтительными по отдельности.
10
50
5
50
8
20
10
16
11
16
13
13
В варианте осуществления в данном документе доставку осуществляют посредством AAV. Полагают, что терапевтически эффективная доза для in vivo доставки AAV человеку находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 50 мл физиологического раствора, содержащего от приблизительно 1 x 10 до приблизительно 1 x 10 функциональных частиц AAV/мл раствора. Дозу можно скорректировать для уравновешивания терапевтической пользы и любых побочных эффектов. В одном варианте осуществления в данном документе доза AAV, как правило, находится в диапазоне концентраций от приблизительно 1 x 10 до 1 x 10 геномов AAV, от приблизительно 1 x 10 до 1 x 10 геномов AAV, от приблизительно 1 x 10 до приблизительно 1 x 10 геномов или от приблизительно 1 x 10 до приблизительно 1 x 10 геномов AAV. Доза для человека может составлять приблизительно 1 x 10 геномов AAV. Такие концентрации можно доставлять в дозе, составляющей от приблизительно 0,001 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мл или от приблизительно 10 до приблизительно 25 мл раствора-носителя. В предпочтительном варианте осуществления AAV используют с титром приблизительно 2 × 10 вирусных геномов/мл, и каждое из стриарных полушарий мыши получает одну инъекцию объемом 500 нл. Другие эффективные дозы может без труда установить один из специалистов в данной области техники посредством стандартных испытаний с построением кривых зависимости "доза-эффект". См., например, патент США № 8404658 B2 Hajjar, et al., выданный 26 марта 2013 г., в столб. 27, строках 45-60.
В другом варианте осуществления эффективной активации клеточного иммунного ответа на вакцинную или иммуногенную композиции против неоплазии можно достичь с помощью экспрессии соответствующих неоантигенов в вакцинной или иммуногенной композициях в непатогенном микроорганизме. Известными примерами таких микроорганизмов являются Mycobacterium bovis BCG, Salmonella и Pseudomona (см. патент США № 6991797, включенный в данный документ в полном их объеме с помощью ссылки).
В другом варианте осуществления поксвирус используют в вакцинной или иммуногенной композициях против неоплазии. К ним относятся ортопоксвирус, авипоксвирус, вирус коровьей оспы, MVA, NYVAC, вирус оспы канареек, ALVAC, вирус оспы кур, TROVAC и т.д. (см., например, Verardiet al., Hum Vaccin Immunother. 2012 Jul;8(7):961-70; и Moss, Vaccine. 2013; 31(39): 4220-4222). Векторы экспрессии на основе поксвируса были описаны в 1982 году и быстро нашли широкое применение для создания вакцин, а также для исследований во многих областях. Преимущества этих векторов включают простую конструкцию, способность вмещать большие количества чужеродной ДНК и высокие уровни экспрессии.
В другом варианте осуществления вирус коровьей оспы используют в вакцинной или иммуногенной композициях против неоплазии для экспрессии неоантигена. (Rolph et al., Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997). Рекомбинантный вирус коровьей оспы способен к репликации в цитоплазме инфицированной клетки-хозяина, и поэтому полипептид, представляющий интерес, может индуцировать иммунный ответ. Более того, поксвирусы широко использовались в качестве векторов для вакцинной или иммуногенной композиций из-за их способности нацеливать кодируемые антигены для процессинга с помощью пути главного комплекса гистосовместимости класса I путем прямого инфицирования иммунных клеток, в частности антигенпрезентирующих клеток, а также из-за их способности к само-адъювантности.
В другом варианте осуществления ALVAC используют в качестве вектора в вакцинной или иммуногенной композициях против неоплазии. ALVAC является вирусом оспы канареек, который может быть модифицирован для экспрессии чужеродных трансгенов и был использован в качестве способа вакцинации против прокариотических и эукариотических антигенов (Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol Immunother 2000; 49:504-14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin Cancer Res 2000; 6:2219-28; Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals. J Immunol 2003; 171:1094-101; Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:11349-53; патент США № 7255862). В клиническом испытании фазы I вирус ALVAC, экспрессирующий опухолевый антиген CEA, продемонстрировал превосходный профиль безопасности и привел к усилению СЕА-специфичных ответов Т-клеток у выбранных пациентов; однако объективных клинических ответов не наблюдалось (Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J Clin Oncol 1999; 17:332-7).
В другом варианте осуществления модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA) можно использовать в качестве вирусного вектора для неоантигенной вакцинной или иммуногенной композиций. MVA является представителем рода Orthopoxvirus и был получен в результате приблизительно 570 последовательных пассажей штамма Анкара вируса коровьей оспы (CVA) на фибробластах куриного эмбриона (для обзора см. Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14, 1975). Вследствие этих пассажей полученный вирус MVA содержит на 31 тысячу пар оснований меньше геномной информации по сравнению с CVA и сильно ограничен в отношении клетки-хозяина (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). MVA характеризуется своим чрезвычайным ослаблением, а именно уменьшенной вирулентностью или инфекционной способностью, но при этом обладает превосходной иммуногенностью. При тестировании на различных животных моделях MVA оказался авирулентным даже у иммуносупрессированных индивидуумов. Кроме того, MVA-BN-HER2 представляет собой кандидатную иммунотерапию, предназначенную для лечения HER-2-положительного рака молочной железы, и в настоящее время проходит клинические испытания. (Mandl et al., Cancer Immunol Immunother. Jan 2012; 61(1): 19-29). Способы получения и применения рекомбинантного MVA описаны (например, см. патенты США №№ 8309098 и 5185146, включенные в данный документ в полном их объеме).
В другом варианте осуществления в качестве вектора используют варианты NYVAC и NYVAC модифицированного штамма Копенгаген вируса коровьей оспы (см. патент США № 7255862, PCT WO 95/30018, патенты США №№ 5364773 и 5494807, включенные в данный документ в полном их объеме с помощью ссылки).
3,5
4
6
8
7
9
В одном варианте осуществления рекомбинантные вирусные частицы вакцинной или иммуногенной композиций вводят пациентам, нуждающимся в этом. Дозировки экспрессированного неоантигена могут варьироваться от нескольких до нескольких сотен микрограмм, например, от 5 до 500 мкг. Для достижения экспрессии при этих уровнях доз вакцинную или иммуногенную композиции можно вводить в любом подходящем количестве. Вирусные частицы можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, или трансфицировать клетки в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 10 БОЕ; таким образом, вирусные частицы предпочтительно вводят пациенту, нуждающемуся в этом, или инфицируют или трансфицируют клетки в количестве, составляющем по меньшей мере от приблизительно 10 БОЕ до приблизительно 10 БОЕ; однако пациенту, нуждающемуся в этом, можно вводить по меньшей мере приблизительно 10 БОЕ, так что более предпочтительное количество для введения может составлять по меньшей мере от приблизительно 10 БОЕ до приблизительно 10 БОЕ. Дозы для NYVAC применимы в отношении ALVAC, MVA, MVA-BN и авипоксвирусов, таких как вирус оспы канареек и вирус оспы кур.
Адъювант вакцинной или иммуногенной композиций
Эффективные вакцинная или иммуногенная композиции преимущественно включают в себя сильный адъювант для инициации иммунного ответа. Как описано ниже, поли-ICLC, агонист TLR3 и РНК геликазных доменов MDA5 и RIG3, продемонстрировал несколько требуемых свойств для адъюванта вакцинной или иммуногенной композиций. Эти свойства включают индукцию локальной и системной активации иммунных клеток in vivo, выработку стимулирующих хемокинов и цитокинов и стимуляцию антигенпрезентации DC. Более того, поли-ICLC может индуцировать длительные ответы CD4+ и CD8+ у людей. Важно отметить, что поразительное сходство в положительной регуляции транскрипционных путей и путей сигнальной трансдукции наблюдали у субъектов, вакцинированных поли-ICLC, и у добровольцев, получивших высокоэффективную, способную к репликации вакцину против желтой лихорадки. Более того, >90% пациентов с раком яичников, иммунизованных поли-ICLC в комбинации с пептидной вакциной NY-ESО-1 (в дополнение к Montanide), продемонстрировали индукцию CD4+ и CD8+ T-клеток, а также гуморальный иммунный ответ на пептид в недавнем исследовании фазы 1. В то же время поли-ICLC на сегодняшний день был широко протестирован в более чем 25 клинических испытаниях и продемонстрировал относительно безопасный профиль токсичности. В дополнение к мощному и специфическому иммуногену неоантигенные пептиды можно комбинировать с адъювантом (например, поли-ICLC) или другим противоопухолевым средством. Не ограничиваясь теорией, полагают, что эти неоантигены обходят центральную толерантность тимуса (обеспечивая таким образом более сильный противоопухолевый ответ Т-клеток), в то же время снижая потенциал аутоиммунитета (например, избегая нацеливания на нормальные аутоантигены). Эффективный иммунный ответ преимущественно подразумевает применение сильного адъюванта для активации иммунной системы (Speiser and Romero, Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy, and protective T cell immunity Seminars in Immunol 22:144 (2010)). Например, Toll-подобные рецепторы (TLR) оказались мощными датчиками "сигналов опасности" от микробных и вирусных патогенов, эффективно индуцируя ответ врожденной иммунной системы и, в свою очередь, адаптивной иммунной системы (Bhardwaj and Gnjatic, TLR AGONISTS: Are They Good Adjuvants? Cancer J. 16:382-391 (2010)). Среди агонистов TLR поли-ICLC (синтетический миметик двухнитевой РНК) является одним из наиболее действенных активаторов дендритных клеток миелоидного происхождения. В исследовании с участием людей-добровольцев было продемонстрировано, что поли-ICLC является безопасным и индуцирует экспрессию генов в клетках периферической крови, профиль которой сравним с таковым при индукции с помощью одной из наиболее действенных живых аттенуированных вирусных вакцин, вакцины YF-17D на основе вируса желтой лихорадки (Caskey et al, Synthetic double-stranded RNA induces innate immune responses similar to a live viral vaccine in humans J Exp Med 208:2357 (2011)). В предпочтительном варианте осуществления в качестве адъюванта используют Hiltonol, GMP-препарат поли-ICLC, производимый Oncovir, Inc. В других вариантах осуществления предусматриваются другие адъюванты, описанные в данном документе. Например, эмульсии типа масло-в-воде, вода-в-масле или многофазные вода/масло/вода (W/O/W); см., например, патент США № 7608279 и Aucouturier et al, Vaccine 19 (2001), 2666-2672, а также документы, упомянутые в них.
Показания
Примеры форм рака и раковых состояний, которые можно лечить иммуногенной композицией или вакциной в соответствии с данным документом, включают без ограничения пациента, нуждающегося в этом, у которого был диагностирован рак или он подвергается риску развития рака. У субъекта может быть солидная опухоль, такая как рак молочной железы, яичников, предстательной железы, легкого, почки, желудка, толстой кишки, яичка, головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланома и другие опухоли тканевых органов и гематологические опухоли, такие как лимфомы и лейкозы, в том числе острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфоцитарный Т-клеточный лейкоз и лимфомы В-клеток, опухоли головного мозга и центральной нервной системы (например, опухоли мозговых оболочек, головного мозга, спинного мозга, черепных нервов и других частей ЦНС, такие как глиобластомы или медуллобластомы); рак головы и/или шеи, опухоли молочной железы, опухоли системы кровообращения (например, сердца, средостения и плевры, а также других внутригрудных органов, опухоли сосудов и опухолеассоциированной сосудистой ткани); опухоли крови и лимфатической системы (например, заболевание Ходжкина, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, лимфомы, связанные со СПИДом, злокачественные иммунопролиферативные заболевания, множественная миелома и злокачественные новообразования плазматических клеток, лимфоидный лейкоз, миелоидный лейкоз, острый или хронический лимфоцитарный лейкоз, моноцитарный лейкоз, другие лейкозы клеток специфического типа, лейкоз клеток неуточненного типа, неуточненные злокачественные новообразования лимфоидной, гемопоэтической и родственных тканей, такие как диффузная крупноклеточная лимфома, Т-клеточная лимфома или кожная Т-клеточная лимфома); опухоли экскреторной системы (например, почки, почечной лоханки, мочеточника, мочевого пузыря и других органов мочевой системы); опухоли желудочно-кишечного тракта (например, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, колоректальные, ректосигмоидного соединения, прямой кишки, ануса и анального канала); опухоли с участием печени и внутрипеченочных желчных протоков, желчного пузыря и других частей желчного тракта, поджелудочной железы и других органов пищеварения; опухоли полости рта (например, губ, языка, десен, полости рта, неба, околоушной железы, слюнных желез, миндалин, ротоглотки, носоглотки, грушевидного синуса, гортаноглотки и других участков полости рта); опухоли репродуктивной системы (например, вульвы, влагалища, шейки матки, матки, яичника и других участков, связанных с женскими половыми органами, плаценты, пениса, предстательной железы, яичек и других участков, связанных с мужскими половыми органами); опухоли дыхательных путей (например, полости носа, среднего уха, придаточных пазух носа, гортани, трахеи, бронха и легкого, такие как рак легкого и немелкоклеточный рак легких); опухоли скелетной системы (например, кости и суставного хряща конечностей, костного суставного хряща и других участков); опухоли кожи (например, злокачественная меланома кожи, немеланомный рак кожи, базальноклеточная карцинома кожи, плоскоклеточная карцинома кожи, мезотелиома, саркома Капоши); и опухоли с участием других тканей, в том числе периферических нервов и вегетативной нервной системы, соединительных и мягких тканей, забрюшинного пространства и брюшины, глаз, щитовидной железы, надпочечника и других эндокринных желез и связанных с ними структур, вторичные и неуточненные злокачественные новообразования лимфатических узлов, вторичное злокачественное новообразование респираторной и пищеварительной систем и вторичное злокачественное новообразование других участков.
Особый интерес представляет лечение неходжкинской лимфомы (NHL), светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (ccRCC), меланомы, саркомы, лейкоза или рака мочевого пузыря, толстой кишки, головного мозга, молочной железы, головы и шеи, эндометрия, легкого, яичника, поджелудочной железы или предстательной железы. В определенных вариантах осуществления меланома представляет собой меланому высокого риска.
Формы рака, которые можно лечить с использованием этой иммуногенной композиции или вакцины, могут включать, среди прочего случаи, которые не поддаются лечению другими химиотерапевтическими средствами. Термин "не поддающийся лечению", используемый в данном документе, относится к раку (и/или его метастазам), который не проявляет или проявляет лишь слабый антипролиферативный ответ (например, отсутствие или только слабое ингибирование роста опухоли) после лечения другим химиотерапевтическим средством. Это формы рака, которые нельзя удовлетворительно лечить другими химиотерапевтическими средствами. Формы рака, не поддающиеся лечению, охватывают не только (i) формы рака, при которых одно или несколько химиотерапевтических средств уже перестали действовать в ходе лечения пациента, но также (ii) формы рака, которые могут быть показаны как не поддающиеся лечению другими способами, например, с помощью биопсии и культивирования в присутствии химиотерапевтического средства.
Иммуногенная композиция или вакцина, описанные в данном документе, также применимы для лечения пациентов, нуждающихся в этом, которые ранее не получали лечения.
Иммуногенная композиция или вакцина, описанные в данном документе, также применимы там, где субъект не имеет выявляемой неоплазии, однако подвергается высокому риску рецидива заболевания.
Также особый интерес представляет лечение пациентов, нуждающихся в этом, которые подверглись аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (AHSCT) и, в частности, пациентов, которые демонстрируют остаточное заболевание после прохождения AHSCT. Состояние после AHSCT характеризуется низким объемом остаточного заболевания, инфузией иммунных клеток до ситуации гомеостатического распространения и отсутствием какой-либо стандартной терапии, замедляющей рецидив. Эти особенности предоставляют уникальную возможность для применения описанной вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии для замедления рецидива заболевания.
Фармацевтические композиции/способы доставки
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество одного или нескольких соединений в соответствии с настоящим изобретением (в том числе его фармацевтически приемлемой соли), необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или добавкой.
Хотя опухолеспецифичные неоантигенные пептиды можно вводить в качестве единственного активного фармацевтического средства, их также можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими средствами и/или адъювантами. При введении в виде комбинации терапевтические средства могут быть составлены в виде отдельных композиций, которые назначают в одно и то же время или в разные моменты времени, или терапевтические средства могут назначать в виде единой композиции.
Композиции можно вводить один раз в день, два раза в день, один раз каждые два дня, один раз каждые три дня, один раз каждые четыре дня, один раз каждых пять дней, один раз каждых шесть дней, один раз каждых семь дней, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз каждые два месяца, один раз один раз каждые шесть месяцев или один раз в год. Интервал введения доз можно регулировать в соответствии с потребностями отдельных пациентов. Для более длительных интервалов введения можно использовать составы с пролонгированным высвобождением или депо.
Композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения заболеваний и болезненных состояний, которые являются острыми, и можно также использовать для лечения хронических состояний. В частности, композиции по настоящему изобретению используют в способах лечения или предупреждения неоплазии. В определенных вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению вводят в течение периодов времени, превышающих две недели, три недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, один год, два года, три года, четыре года или пять лет, десять лет или пятнадцать лет; или например любой временной диапазон в днях, месяцах или годах, в котором нижний предел диапазона представляет собой любой период времени от 14 дней до 15 лет и верхний предел диапазона составляет от 15 дней до 20 лет (например, от 4 недель до 15 лет, от 6 месяцев до 20 лет). В некоторых случаях введение соединений по настоящему изобретению может быть целесообразным в течение всей оставшейся жизни пациента. В предпочтительных вариантах осуществления пациента контролируют для проверки прогрессирования заболевания или нарушения, и соответствующим образом корректируют дозу. В предпочтительных вариантах осуществления лечение в соответствии с настоящим изобретением является эффективным в течение по меньшей мере двух недель, трех недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, одного года, двух лет, трех лет, четырех лет или пять лет, десяти лет, пятнадцати лет, двадцати лет или на протяжении всей оставшейся жизни субъекта.
Опухолеспецифичные неоантигенные пептиды можно вводить с помощью инъекций, перорально, парентерально, с помощью ингаляционного спрея, ректально, вагинально или местно в единичных дозированных составах, содержащих общепринятые фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и несущие среды. Термин "парентеральный", используемый в данном документе, включает введение в лимфатический узел или узлы, подкожное, внутривенное, внутримышечное, внутрисуставное, инфузионные методы, внутрибрюшинное, глазное или офтальмологическое, интравитреальное, интрабуккальное, трансдермальное, интраназальное, в головной мозг, в том числе внутричерепное и интрадуральное, в суставы, в том числе лодыжки, колени, бедра, плечи, локти, запястья, непосредственно в опухоли и т.п., а также в форме суппозитория.
При хирургической резекции используют хирургическую операцию для удаления аномальной ткани при раке, таком как медиастинальные, нейрогенные или эмбрионально-клеточные опухоли, или тимома. В определенных вариантах осуществления введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии начинают через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше недель после резекции опухоли. Предпочтительно введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии начинают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель после резекции опухоли.
Режимы примирование/стимулирование относятся к последовательным введениям вакцинной, или иммуногенной, или иммунологической композиций. В определенных вариантах осуществления введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии проводят согласно режиму дозирования примирование/стимулирование, например, введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии в недели 1, 2, 3 или 4 в виде примирования и введение вакцинной или иммуногенной композиций против неоплазии в месяцы 2, 3 или 4 в виде стимулирования. В другом варианте осуществления гетерологичные стратегии примирование/стимулирование используют для получения большего цитотоксичного ответа Т-клеток (см. Schneider et al., Induction of CD8+ T cells using heterologous prime-boost immunisation strategies, Immunological Reviews Volume 170, Issue 1, pages 29-38, August 1999). В другом варианте осуществления ДНК, кодирующую неоантигены, используют для примирования с последующим стимулированием белком. В другом варианте осуществления белок используют для примирования с последующим стимулированием с помощью вируса, кодирующего неоантиген. В другом варианте осуществления вирус, кодирующий неоантиген, используют для примирования, и другой вирус используют для стимулирования. В другом варианте осуществления белок используют для примирования, и ДНК используют для стимулирования. В предпочтительном варианте осуществления ДНК-вакцину или иммуногенную композицию используют для примирования ответа Т-клеток, и рекомбинантную вирусную вакцину или иммуногенную композицию используют для стимулирования ответа. В другом предпочтительном варианте осуществления вирусные вакцинную или иммуногенную композиции вводят совместно с белковой или ДНК-вакциной или иммуногенной композицией для действия в качестве адъюванта белковой или ДНК-вакцины или иммуногенной композиции. Затем пациенту можно провести стимулирование либо вирусной вакцинной или иммуногенной композициями, либо белковой или ДНК-вакциной или иммуногенной композицией (см. Hutchings et al., Combination of protein and viral vaccines induces potent cellular and humoral immune responses and enhanced protection from murine malaria challenge. Infect Immun. 2007 Dec;75(12):5819-26. Epub 2007 Oct 1).
Фармацевтические композиции можно обработать в соответствии с общепринятыми фармацевтическими способами получения лекарственных средств для введения пациентам, нуждающимся в этом, в том числе людям и другим млекопитающим.
Модификации неоантигенных пептидов могут влиять на растворимость, биодоступность и скорость метаболизма пептидов, обеспечивая таким образом контроль за доставкой активных видов. Растворимость можно оценить с помощью получения неоантигенного пептида и тестирования в соответствии с хорошо известными способами в пределах навыков обычного специалиста-практика в данной области техники.
Неожиданно было обнаружено, что фармацевтическая композиция, содержащая янтарную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль (сукцинат), способна обеспечить улучшенную растворимость для неоантигенных пептидов. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает: фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один неоантигенный пептид или его фармацевтически приемлемую соль; модификатор рН (такой как основание, такое как соль дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты, например, фармацевтически приемлемая соль янтарной кислоты или лимонной кислоты) и фармацевтически приемлемый носитель. Эти фармацевтические композиции можно получить путем объединения раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид, с основанием, таким как соль дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты, такая как фармацевтически приемлемая соль янтарной кислоты или лимонной кислоты (такая как сукцинат натрия), или путем объединения раствора, содержащего по меньшей мере один неоантигенный пептид, с раствором, содержащим основание, такое как соль дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты, такая как фармацевтически приемлемая соль янтарной кислоты или лимонной кислоты (в том числе, например, сукцинатный буферный раствор). В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит сукцинат натрия. В определенных вариантах осуществления модификатор рН (такой как цитрат или сукцинат) присутствует в композиции в концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ и в определенных вариантах осуществления в концентрации, составляющей от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 7,5 мМ, или от приблизительно 2,0 до приблизительно 6,0 мМ, или от приблизительно 3,75 до приблизительно 5,0 мМ.
В определенных вариантах осуществления фармацевтической композиции фармацевтически приемлемый носитель содержит воду. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит декстрозу. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель дополнительно содержит диметилсульфоксид. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммуномодулятор или адъювант. В определенных вариантах осуществления иммуномодулятор или адъювант выбраны из группы, состоящей из поли-ICLC, 1018 ISS, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL, векторной системы, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys и QS21 stimulon от Aquila. В определенных вариантах осуществления иммуномодулятор или адъювант содержат поли-ICLC.
Производные ксантенона, например, такие как Vadimezan или AsA404 (также известные как 5,6-диметилаксантенон-4-уксусная кислота (DMXAA)), также можно использовать в качестве адъювантов в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. В качестве альтернативы такие производные можно также вводить одновременно с вакцинной или иммуногенной композициями по настоящему изобретению, например, посредством системной или внутриопухолевой доставки для стимуляции иммунитета в месте опухоли. Не ограничиваясь теорией, полагают, что такие производные ксантенона действуют путем стимуляции выработки интерферона (IFN) через рецептор стимулятора гена IFN (ISTING) (см., например, Conlon et al. (2013) Mouse, but not Human STING, Binds and Signals in Response to the Vascular Disrupting Agent 5,6-Dimethylxanthenone-4-Acetic Acid, Journal of Immunology, 190:5216-25 и Kim et al. (2013) Anticancer Flavonoids are Mouse-Selective STING Agonists, 8:1396-1401).
Вакцинная или иммунологическая композиции могут также включать адъювантное соединение, выбранное из акриловых или метакриловых полимеров и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Это, в частности, полимер акриловой или метакриловой кислот, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта (карбомера), в частности сшитый с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Оно может также представлять собой сополимер малеинового ангидрида и этилена, сшитый, например, с дивиниловым эфиром (см. патент США № 6713068, который включен в данный документ в полном объеме с помощью ссылки).
В определенных вариантах осуществления модификатор рН может стабилизировать адъювант или иммуномодулятор, как описано в данном документе.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит от одного до пяти пептидов, диметилсульфоксид (DMSO), декстрозу (или трегалозу или сахарозу), воду, сукцинат, поли-I: поли-С, поли-L-лизин, карбоксиметилцеллюлозу и хлорид. В определенных вариантах осуществления каждый из одного-пяти пептидов присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 300 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит ≤3% DMSO по объему. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 3,6-3,7% декстрозы в воде. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 3,6-3,7 мМ сукцината (например, в виде динатрия сукцината) или его соли. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 0,5 мг/мл поли-I: поли-С. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 0,375 мг/мл поли-L-лизина. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 1,25 мг/мл натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 0,225% хлорида натрия.
Фармацевтические композиции содержат описанные в данном документе опухолеспецифичные неоантигенные пептиды в терапевтически эффективном количестве для лечения заболеваний и состояний (например, неоплазии/опухоли), которые были описаны в данном документе, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемой добавкой, носителем и/или вспомогательным веществом. Специалисту в данной области техники из настоящего раскрытия и знаний в данной области техники будет понятно, что терапевтически эффективное количество одного или нескольких соединений в соответствии с настоящим изобретением может варьироваться в зависимости от состояния, подлежащего лечению, его тяжести, режима лечения, который необходимо применить, фармакокинетики используемого средства, а также пациента (животного или человека), получающего лечение.
Для получения фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением терапевтически эффективное количество одного или нескольких соединений по настоящему изобретению предпочтительно тщательно смешивают с фармацевтически приемлемым носителем в соответствии с общепринятыми фармацевтическими методами составления смесей с получением дозы. Носитель может принимать самые разнообразные формы в зависимости от формы препарата, требуемой для введения, например, офтальмологической, пероральной, местной или парентеральной, в том числе гели, кремы, мази, лосьоны и имплантируемые препараты с замедленным высвобождением среди множества других. При приготовлении фармацевтических композиций в пероральной лекарственной форме можно использовать любую из обычных фармацевтических сред. Таким образом, для жидких пероральных препаратов, таких как суспензии, эликсиры и растворы, можно использовать подходящие носители и добавки, в том числе воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты, красящие средства и т.п. Для твердых пероральных препаратов, таких как порошки, таблетки, капсулы, и для твердых препаратов, таких как суппозитории, можно использовать подходящие носители и добавки, в том числе крахмалы, носители-сахара, такие как декстроза, маннит, лактоза и родственные носители, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связывающие вещества, средства для улучшения распадаемости и т.п. При необходимости, таблетки или капсулы могут быть выполнены с энтеросолюбильным покрытием или замедленного высвобождения с помощью стандартных методов.
Активное соединение включают в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества для требуемого показателя, не вызывая серьезных токсических эффектов у пациента, получающего лечение.
Пероральные композиции обычно включают в себя инертный разбавитель или съедобный носитель. Их можно заключать в желатиновые капсулы или спрессовать в таблетки. Для перорального терапевтического введения активное соединение или его производное-пролекарство можно вводить со вспомогательными веществами и использовать в форме таблеток, пастилок или капсул. В состав композиции можно включать фармацевтически совместимые связывающие средства и/или адъювантные материалы.
Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичного характера: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, диспергирующее средство, такое как альгиновая кислота или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. В случае если единичная дозированная форма представляет собой капсулу, - она может содержать в дополнение к обсуждаемому в данном документе материалу жидкий носитель, такой как жирное масло. Кроме того, единичные дозированные формы могут содержать различные другие материалы, которые изменяют физическую форму единицы дозирования, например покрытия из сахара, шеллака или кишечнорастворимых средств.
Композиции по настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде отдельных единиц, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит заданное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии типа масло-в-воде или эмульсии типа вода-в-масле, а также в виде болюса и т.д.
Таблетку можно получить путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получить прессованием в подходящей машине активного ингредиента в свободно сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связывающим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим средствами. Формованные таблетки можно получить формованием в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно можно покрыть или нанести риску и можно составить таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента, находящегося в них.
Способы составления композиций фармацевтически активных ингредиентов с этим медленным или контролируемым высвобождением известны из уровня техники и описаны в нескольких опубликованных патентах США, некоторые из которых включают без ограничения патенты США №№ 3870790; 4226859; 4369172; 4842866 и 5705190, раскрытие которых включено в данный документ в полном объеме с помощью ссылки. Покрытия можно использовать для доставки соединений в кишечник (см., например, патенты США №№ 6638534, 5541171, 5217720 и 6569457 и ссылки, упоминаемые в них).
Активное соединение или его фармацевтически приемлемую соль также можно вводить в виде компонента эликсира, суспензии, сиропа, облатки, жевательной резинки или т.п. Сироп может содержать, помимо активных соединений, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителя и определенные консерванты, красители и красящие вещества и ароматизаторы.
Растворы или суспензии, используемые для офтальмологического, парентерального, внутрикожного, подкожного или местного введений, могут включать в себя следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; комплексообразующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетатные, цитратные или фосфатные; и средства для регулировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза.
В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой водный растворитель, т.е. растворитель, содержащий воду, необязательно с дополнительными сорастворителями. Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители включают в себя воду, буферные растворы в воде (такие как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и 5% декстроза в воде (D5W), или 10% трегалоза, или 10% сахароза). В определенных вариантах осуществления водный растворитель дополнительно содержит диметилсульфоксид (DMSO), например в количестве приблизительно 1-4% или 1-3%. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель является изотоническим (т.е. имеет практически такое же осмотическое давление, как и жидкость организма, такая как плазма).
В одном варианте осуществления активные соединения получают с носителями, которые защищают соединение от быстрого удаления из организма, такими как состав с контролируемым высвобождением, в том числе имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры, полимолочная кислота и сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA). Способы получения таких составов находятся в пределах компетенции квалифицированного специалиста с учетом настоящего раскрытия и знаний в данной области техники.
Квалифицированному специалисту будет понятно из настоящего раскрытия и знаний в данной области техники, что в дополнение к таблеткам можно составить другие лекарственные формы для обеспечения медленного или контролируемого высвобождения активного ингредиента. Эти лекарственные формы включают без ограничения капсулы, грануляты и гелевые капсулы.
Липосомальные суспензии также могут быть фармацевтически приемлемыми носителями. Их можно получить в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники. Например, липосомальные составы можно получить путем растворения соответствующего липида(-ов) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают, оставляя тонкую пленку высушенного липида на поверхности контейнера. Затем в контейнер вводят водный раствор активного соединения. Затем контейнер вращают вручную, чтобы высвободить липидный материал со стенок контейнера и диспергировать липидные агрегаты, образуя таким образом липосомальную суспензию. Другие способы получения, хорошо известные обычным специалистам в данной области техники, также можно использовать в данном аспекте настоящего изобретения.
Составы в целях удобства можно представить в единичной лекарственной форме и получить с помощью общепринятых фармацевтических методов. Такие методы включают стадию объединения активного ингредиента и фармацевтического носителя(-ей) или вспомогательного вещества(-ств). В целом, составы получают путем равномерного и тщательного объединения активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, или обоими, а затем, при необходимости, формованием продукта.
Составы и композиции, подходящие для местного введения во рту, включают в себя лепешки, содержащие ингредиенты в ароматизированной основе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь; и средства для полоскания рта, содержащие ингредиент для введения в подходящем жидком носителе.
Составы, подходящие для местного введения в кожу, могут быть представлены в виде мазей, кремов, гелей и паст, содержащих ингредиент, подлежащий введению, в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительной системой для местной доставки является трансдермальный пластырь, содержащий ингредиент, подлежащий введению.
Составы для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящей основой, включающей, например, масло какао или салицилат.
Составы, подходящие для назального введения, где носитель представляет собой твердое вещество, включают в себя крупнодисперсный порошок, имеющий размер частиц, например, в диапазоне от 20 до 500 микрон, который вводят способом для введения нюхательного табака, т.е. путем быстрого вдыхания через носовой проход из контейнера с порошком, удерживаемого близко к носу. Подходящие составы для введения, в которых носитель представляет собой жидкость, как например назальный спрей или назальные капли, включают в себя водные или масляные растворы активного ингредиента.
Составы, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или аэрозольных составов, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие допустимые носители, которые известны в данной области техники.
Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократного приема, выполненные из стекла или пластика. При внутривенном введении предпочтительные носители включают, например, физиологический раствор или физиологический раствор, забуференный фосфатом (PBS).
Для парентеральных составов носитель обычно содержит стерильную воду или водный раствор хлорида натрия, хотя могут быть включены другие ингредиенты, в том числе те, которые помогают дисперсии. Конечно, в случае если стерильная вода должна использоваться и поддерживаться как стерильная, то композиции и носители также стерилизуют. Могут быть также приготовлены суспензии для инъекций, - в этом случае можно использовать подходящие жидкие носители, суспендирующие средства и т.п.
Составы, подходящие для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным с кровью предполагаемого реципиента; а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства и загустители. Составы могут быть представлены в виде контейнеров, содержащих единичную дозу или несколько доз, например, запаянных ампул и флаконов, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требуя лишь добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных ранее.
Введение активного соединения может варьироваться от непрерывного (внутривенное капельное) до нескольких пероральных введений в день (например, Q.I.D.) и может включать в себя пероральное, местное, глазное или офтальмологическое, парентеральное, внутримышечное, внутривенное, подкожное, трансдермальное (которое может включать в себя средство, повышающее проникновение), буккальное введение и введение суппозиториев среди прочих путей введения, в том числе глазной или офтальмологический пути.
Вакцинную или иммуногенную композиции против неоплазии можно вводить с помощью инъекции, перорально, парентерально, с помощью ингаляционного спрея, ректально, вагинально или местно в единичных дозированных составах, содержащих общепринятые фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и несущие среды. Термин "парентеральный", используемый в данном документе, включает введение в лимфатический узел или узлы, подкожное, внутривенное, внутримышечное, внутрисуставное, инфузионные методы, внутрибрюшинное, глазное или офтальмологическое, интравитреальное, интрабуккальное, трансдермальное, интраназальное, в головной мозг, в том числе внутричерепное и интрадуральное, в суставы, в том числе лодыжки, колени, бедра, плечи, локти, запястья, непосредственно в опухоли и т.п., а также в форме суппозитория.
Для доставки рассматриваемой композиции в место, представляющее интерес, можно использовать различные методы, такие как инъекция, применение катетеров, троакаров, снарядов, плюронилового геля, стентов, полимеров для замедленного высвобождения лекарственного средства или другого устройства, которое обеспечивает внутренний доступ. Когда орган или ткань доступны из-за удаления у пациента, то такой орган или ткань можно омыть в среде, содержащей рассматриваемые композиции, рассматриваемыми композициями можно смазать орган или их можно нанести любым удобным способом.
Опухолеспецифичные неоантигенные пептиды можно вводить через устройство, подходящее для контролируемого и замедленного высвобождения композиции, эффективной для получения требуемого местного или системного физиологического или фармакологического эффекта. Способ включает в себя размещение системы доставки с замедленным высвобождением лекарственного средства в участки, где требуется высвобождение средства, и обеспечение возможности прохождения средства через устройство к требуемой зоне лечения.
Опухолеспецифичные неоантигенные пептиды можно использовать в комбинации с по меньшей мере одним другим известным терапевтическим средством или фармацевтически приемлемой солью указанного средства. Примеры известных терапевтических средств, которые можно использовать, включают без ограничения кортикостероиды (например, кортизон, преднизон, дексаметазон), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDS) (например, ибупрофен, целекоксиб, аспирин, индометацин, напроксен), алкилирующие средства, такие как бусульфан, цисплатин, митомицин С и карбоплатин; антимитотические средства, такие как колхицин, винбластин, паклитаксел и доцетаксел; ингибиторы топоизомеразы I, такие как камптотецин и топотекан; ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин и этопозид; и/или антиметаболиты РНК/ДНК, такие как 5-азацитидин, 5-фторурацил и метотрексат; ДНК-антиметаболиты, такие как 5-фтор-2'-дезоксиуридин, ара-С, гидроксимочевина и тиогуанин; антитела, такие как герцептин (HERCEPTIN) и ритуксан (RITUXAN).
Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, конкретно указанным в данном документе, составы по настоящему изобретению могут включать в себя другие средства, общепринятые в данной области техники, имеющие отношение к типу рассматриваемого состава, например, те, которые подходят для перорального введения, могут включать в себя ароматизаторы.
Фармацевтически приемлемые солевые формы могут быть предпочтительной химической формой соединений в соответствии с настоящим изобретением для включения в фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящие соединения или их производные, в том числе пролекарственные формы этих средств, могут быть представлены в форме фармацевтически приемлемых солей. Термин "фармацевтически приемлемые соли или комплексы", используемый в данном документе, относится к соответствующим солям или комплексам активных соединений в соответствии с настоящим изобретением, которые сохраняют требуемую биологическую активность исходного соединения и проявляют ограниченное токсическое действие на нормальные клетки. Неограничивающими примерами таких солей являются (a) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами (например, соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.д.) и солями, образованными органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памоевая кислота, альгиновая кислота и полиглутаминовая кислота, среди других; (b) соли присоединения основания, образованные с катионами металлов, такими как цинк, кальций, натрий, калий и т.п., среди многих других.
Соединения в данном документе являются коммерчески доступными или могут быть синтезированы. Как может быть понятно квалифицированному специалисту, дополнительные способы синтеза соединений согласно формулам в данном документе очевидны обычным специалистам в данной области техники. Кроме того, различные стадии синтеза могут выполняться в альтернативной последовательности или порядке с получением требуемых соединений. Синтетические химические превращения и методики защитных групп (защита и удаление защиты), полезные при синтезе соединений, описанных в данном документе, известны в данной области техники и включают, например, те, которые описаны в R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2nd. Ed., Wiley-VCH Publishers (1999); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1999); и L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) и последующие их издания.
Дополнительные средства, которые могут быть включены в опухолеспецифичные неоантигенные пептиды по настоящему изобретению, могут содержать один или несколько асимметричных центров и, таким образом, встречаться в виде рацематов и рацемических смесей, одиночных энантиомеров, индивидуальных диастереомеров и диастереомерных смесей. Все такие изомерные формы этих соединений в явной форме включены в настоящее изобретение. Соединения по настоящему изобретению также могут быть представлены в нескольких таутомерных формах, в таких случаях данное изобретение в явной форме включает все таутомерные формы соединений, описанных в данном документе (например, алкилирование кольцевой системы может приводить к алкилированию в нескольких местах, причем данное изобретение в явной форме включает все такие продукты реакции). Все такие изомерные формы подобных соединений в явной форме включены в настоящее изобретение. Все кристаллические формы соединений, описанных в данном документе, в явной форме включены в настоящее изобретение.
Дозирование
В случае если средства, описанные в данном документе, вводят в виде фармацевтических препаратов людям или животным, то их можно давать per se или в виде фармацевтической композиции, содержащей активный ингредиент в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным средством или разбавителем.
Фактические уровни доз и динамику введения активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно варьировать так, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и режима введения, не являясь токсичным для пациента. В целом, средства или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводят в количестве, достаточном для снижения или устранения симптомов, связанных с вирусной инфекцией и/или аутоиммунным заболеванием.
Предпочтительная доза средства представляет собой максимум, который пациент может переносить без развития серьезных или неприемлемых побочных эффектов. Иллюстративные диапазоны доз включают от 0,01 мг до 250 мг в день, от 0,01 мг до 100 мг в день, от 1 мг до 100 мг в день, от 10 мг до 100 мг в день, от 1 мг до 10 мг в день и от 0,01 мг до 10 мг в день. Предпочтительная доза средства представляет собой максимум, который пациент может переносить без развития серьезных или неприемлемых побочных эффектов. В вариантах осуществления средство вводят в концентрации, составляющей от приблизительно 10 микрограмм до приблизительно 100 мг на килограмм веса тела в день, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/кг в день или от приблизительно 1,0 мг до приблизительно 10 мг/кг веса тела в день.
В вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит средство в количестве от 1 до 10 мг, как например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг.
В вариантах осуществления терапевтически эффективная доза дает концентрацию средства в сыворотке от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 50-100 мг/мл. Фармацевтические композиции 5 обычно должны обеспечивать дозу от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 2000 мг соединения на килограмм веса тела в день. Например, дозы для системного введения человеку могут находиться в диапазоне 1-10 мг/кг, 20-80 мг/кг, 5-50 мг/кг, 75-150 мг/кг, 100-500 мг/кг, 250-750 мг/кг, 500-1000 мг/кг, 1-10 мг/кг, 5-50 мг/кг, 25-75 мг/кг, 50-100 мг/кг, 100-250 мг/кг, 50-100 мг/кг, 250-500 мг/кг, 500-750 мг/кг, 750-1000 мг/кг, 1000-1500 мг/кг, 1500-2000 мг/кг, 5 мг/кг, 20 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 500 мг/кг, 1000 мг/кг, 1500 мг/кг или 2000 мг/кг. Фармацевтические единичные дозированные формы готовят с получением от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг, например, от приблизительно 100 до приблизительно 2500 мг соединения или комбинации основных ингредиентов на единичную дозированную форму.
В вариантах осуществления субъекту вводят от приблизительно 50 нМ до приблизительно 1 мкМ средства. В сходных вариантах осуществления субъекту вводят приблизительно 50-100 нМ, 50-250 нМ, 100-500 нМ, 250-500 нМ, 250-750 нМ, 500-750 нМ, от 500 нМ до 1 мкМ или от 750 нМ до 1 мкМ средства.
Определение эффективного количества находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного раскрытия, представленного в данном документе. Как правило, обеспечивающее нужный эффект или эффективное количество средства определяют сначала путем введения низкой дозы средства(-ств), а затем постепенно увеличивают вводимую дозу или дозы до обнаружения требуемого эффекта (например, снижения или устранения симптомов, связанных с вирусной инфекцией или аутоиммунным заболеванием) у получающего лечение субъекта с минимальными или приемлемыми токсическими побочными эффектами. Применимые способы определения соответствующей дозы и схемы дозирования для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению описаны, например, у Goodman и Gilman в The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005 и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 и 2005), каждый из которых включен в настоящее описание с помощью ссылки.
Предпочтительными единичными лекарственными составами являются композиции, содержащие суточную дозу или единицу, суточную часть дозы, как обсуждалось в данном документе, или ее соответствующую фракцию вводимого ингредиента.
Режим приема для лечения нарушения или заболевания опухолеспецифичными неоантигенными пептидами по настоящему изобретению и/или композициями по настоящему изобретению основана на множестве факторов, в том числе типе заболевания, возрасте, весе, поле, состоянии здоровья пациента, тяжести состояния, пути введения и конкретном используемом соединении. Таким образом, режим приема может широко варьироваться, но может определяться обычным образом с использованием стандартных способов.
Количества и режимы приема при введении субъекту могут зависеть от ряда факторов, таких как режим введения, характер состояния, подлежащего лечению, вес тела субъекта, подлежащего лечению, и решение лечащего врача; все такие факторы находятся в пределах компетенции квалифицированного специалиста с учетом данного раскрытия и знаний в данной области техники.
Количество соединения, включенного в терапевтически активные составы в соответствии с настоящим изобретением, является эффективным количеством для лечения заболевания или состояния. Как правило, терапевтически эффективное количество данного предпочтительного соединения в лекарственной форме обычно составляет от чуть менее чем приблизительно 0,025 мг/кг/сутки до приблизительно 2,5 г/кг/сутки, предпочтительно от приблизительно 0,1 мг/кг/сутки до приблизительно 100 мг/кг/сутки по весу тела пациента или значительно больше, в зависимости от используемого соединения, состояния, подвергаемого лечению, или инфекции и пути введения, хотя исключения из данного диапазона доз могут рассматриваться в настоящем изобретении. В наиболее предпочтительной форме соединения по настоящему изобретению вводят в количествах от приблизительно 1 мг/кг/сутки до приблизительно 100 мг/кг/сутки. Дозы соединения могут зависеть от состояния, подлежащего лечению, конкретного соединения и других клинических факторов, таких как масса и состояние пациента, а также путь введения соединения. Следует понимать, что настоящее изобретение применимо как для человека, так и для ветеринарного использования.
Для перорального введения человеку обычно достаточно дозы от приблизительно 0,1 до 100 мг/кг/сутки, предпочтительно от приблизительно 1 до 100 мг/кг/сутки.
3
В тех случаях, когда доставка лекарственного средства является системной, а не местной, этот диапазон доз, как правило, обеспечивает эффективные концентрации активного соединения в крови на уровне от менее чем приблизительно 0,04 до приблизительно 400 микрограмм/см крови пациента или больше. Соединение удобно вводить в любой подходящей единичной лекарственной форме, в том числе без ограничения форме, содержащей от 0,001 до 3000 мг, предпочтительно от 0,05 до 500 мг активного ингредиента на единичную лекарственную форму. Обычно удобной является пероральная доза 10-250 мг.
В соответствии с определенным иллюстративным вариантам осуществления вакцинную или иммуногенную композиции вводят в дозе, составляющей от приблизительно 10 мкг до 1 мг в расчете на неоантигенный пептид. В соответствии с определенными иллюстративными вариантами осуществления вакцинную или иммуногенную композиции вводят при средней недельной дозе, составляющей от приблизительно 10 мкг до 2000 мкг в расчете на неоантигенный пептид.
Концентрация активного соединения в композиции лекарственного средства будет зависеть от абсорбции, распределения, инактивации и скорости экскреции лекарственного средства, а также других факторов, известных специалистам в данной области техники. Следует отметить, что значения дозы также будут варьироваться в зависимости от тяжести состояния, которое необходимо облегчить. Следует также понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы приема должны корректироваться во времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным суждением лица, осуществляющего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны концентрации, указанные в данном документе, являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или практического применения заявленной композиции. Активный ингредиент можно вводить сразу или его можно разделить на несколько меньших доз, вводимых с различными интервалами времени.
Настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один опухолеспецифичный неоантиген, описанный в данном документе. В вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель, который включает в себя любое фармацевтическое средство, само по себе не индуцирующее выработку иммунного ответа, вредного для субъекта, получающего композицию, и который можно вводить без чрезмерной токсичности. Термин "фармацевтически приемлемый", используемый в данном документе, означает, что он утвержден регулирующим органом Федерального правительства или правительства штата или указан в Фармакопее США, Европейской фармакопее или другой общепризнанной фармакопее для применения у млекопитающих и, более конкретно, у людей. Эти композиции могут быть полезны для лечения и/или предупреждения вирусной инфекции и/или аутоиммунного заболевания.
Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и других вспомогательных веществ представлено в Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed., Mack Publishing Company) и Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Lippincott Williams & Wilkins), которые включены в данный документ с помощью ссылки. Состав фармацевтической композиции должен соответствовать режиму введения. В вариантах осуществления фармацевтическая композиция подходит для введения человеку и может быть стерильной, не содержащей частиц и/или апирогенной.
Фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или разбавители включают без ограничения физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол, стерильный изотонический водный буфер и их комбинации.
В композициях также могут присутствовать смачивающие средства, эмульгаторы и смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красящие средства, противоадгезивные средства, средства для покрытия, подсластители, ароматизаторы и отдушки, консерванты и антиоксиданты.
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают без ограничения: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) металл-комплексообразующие средства, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, ортофосфорная кислота и т.п.
В вариантах осуществления фармацевтическая композиция предоставляется в твердой форме, такой как лиофилизированный порошок, пригодный для восстановления, жидкий раствор, суспензия, эмульсия, таблетка, пилюля, капсула, композиция с замедленным высвобождением или порошок.
В вариантах осуществления фармацевтическая композиция поставляется в жидкой форме, например, в герметичном контейнере, указывающем количество и концентрацию активного ингредиента в фармацевтической композиции. В сходных вариантах осуществления жидкая форма фармацевтической композиции поставляется в герметично закрытом контейнере.
Способы составления фармацевтических композиций по настоящему изобретению являются общепринятыми и хорошо известны в данной области техники (см. Remington и Remington's). Специалист в данной области техники легко может составить фармацевтическую композицию, имеющую требуемые характеристики (например, путь введения, биобезопасность и профиль высвобождения).
Способы получения фармацевтических композиций включают стадию объединения активного ингредиента с фармацевтически приемлемым носителем и, необязательно, одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Фармацевтические композиции можно получить путем равномерного и тщательного объединения активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, или обоими, а затем, при необходимости, формованием продукта. Дополнительная методика получения фармацевтических композиций, в том числе получение многослойных лекарственных форм, описана у Ansel в Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9th ed., Lippincott Williams & Wilkins), которая включена в данный документ с помощью ссылки.
Фармацевтические композиции, пригодные для перорального введения, могут находиться в форме капсул, облаток, пилюль, таблеток, лепешек (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и аравийской камеди или трагаканта), порошков, гранул или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкостях, или в виде жидкой эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин, сахароза и аравийская камедь), и/или в виде полоскания для рта и т.п., каждый из которых содержит заданное количество соединения(-й), описанного в данном документе, его производного или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства в качестве активного ингредиента(-ов). Активный ингредиент можно также вводить в виде болюса, электуария или пасты.
В твердых лекарственных формах для перорального введения (например, капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.) активный ингредиент смешан с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или разбавителями, такими как цитрат натрия или дикальция фосфат, и/или любым из следующего: (1) наполнители или добавки для увеличения объема, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связывающие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие средства, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные силикаты и карбонат натрия; (5) замедлители схватывания раствора, такие как парафин; (6) ускорители поглощения, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие средства, например такие как ацетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; а также (10) красящие средства. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции также могут содержать буферные средства. Твердые композиции аналогичного типа также можно получить с использованием наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах и вспомогательных веществ, таких как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Таблетку можно изготовить путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получить с использованием связывающих веществ (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), смазывающих веществ, инертных разбавителей, консервантов, дезинтегрирующих средств (например, крахмалгликолята натрия или сшитой натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы), поверхностно-активных веществ и/или диспергирующих средств. Формованные таблетки можно изготовить формованием в подходящей машине смеси порошкообразного активного ингредиента, смоченного инертным жидким разбавителем.
Таблетки и другие твердые лекарственные формы, такие как драже, капсулы, пилюли и гранулы, можно необязательно выполнить с риской или получить с покрытиями и оболочками, такими как кишечнорастворимое покрытия и другие покрытия, хорошо известные из уровня техники.
В некоторых вариантах осуществления, чтобы продлить действие активного ингредиента, желательно замедлить поглощение соединения из подкожной или внутримышечной инъекции. Этого можно достичь путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала, характеризующегося низкой растворимостью в воде. Затем скорость поглощения активного ингредиента зависит от скорости его растворения, которая в свою очередь может зависеть от размера кристалла и кристаллической формы. В качестве альтернативы, замедленное поглощение парентерально вводимого активного ингредиента осуществляется путем растворения или суспендирования соединения в масляной несущей среде. Кроме того, длительное поглощение фармацевтической формы для инъекций можно вызвать включением в состав средств, которые замедляют поглощение, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Парентеральные композиции с контролируемым высвобождением могут находиться в виде водных суспензий, микросфер, микрокапсул, магнитных микросфер, масляных растворов, масляных суспензий, эмульсий, или активный ингредиент может быть включен в биосовместимый носитель(-и), липосомы, наночастицы, имплантаты или инфузионные устройства.
Материалы для применения в получении микросфер и/или микрокапсул включают в себя биоразлагаемые/биоразрушаемые полимеры, такие как полиглактин, поли(изобутилцианоакрилат), поли(2-гидроксиэтил-L-глутамин) и поли(молочная кислота).
Биосовместимые носители, которые можно использовать при составлении парентерального состава с контролируемым высвобождением, включают в себя углеводы, такие как декстраны, белки, такие как альбумин, липопротеины или антитела.
Материалы для применения в имплантатах могут быть бионеразлагаемыми, например полидиметилсилоксан, или биоразлагаемыми, такими как, например, поли(капролактон), поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) или сложные поли(ортоэфиры).
В вариантах осуществления активный ингредиент(-ы) вводят с помощью аэрозоля. Это достигается путем приготовления водного аэрозоля, липосомального препарата или твердых частиц, содержащих соединение. Можно использовать неводную (например, фторуглеродный пропеллент) суспензию. Фармацевтическую композицию можно также вводить с использованием ультразвукового распылителя, что сводит к минимуму воздействие деформирующего усилия на средство, которое способно привести к разложению соединения.
Обычно водный аэрозоль получают путем составления водного раствора или суспензии активного ингредиента(-ов) вместе с общепринятыми фармацевтически приемлемыми носителями и стабилизаторами. Носители и стабилизаторы варьируются в зависимости от требований конкретного соединения, однако обычно включают в себя неионные поверхностно-активные вещества (Tweens, Pluronics или полиэтиленгликоль), безвредные белки, такие как сывороточный альбумин, сложные эфиры сорбита, олеиновую кислоту, лецитин, аминокислоты, такие как глицин, буферы, соли, сахара или сахарные спирты. Аэрозоли обычно получают из изотонических растворов.
Лекарственные формы для местного или трансдермального введения активного ингредиента(-ов) включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и средства для ингаляции. Активный ингредиент(-ы) можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, если это необходимо.
Трансдермальные пластыри, подходящие для применения в настоящем изобретении, раскрыты в Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives (Marcel Dekker Inc., 1989) и патентах США №№ 4743249, 4906169, 5198223, 4816540, 5422119, 5023084, включенных в данный документ с помощью ссылки. Трансдермальный пластырь также может быть любым трансдермальным пластырем, хорошо известным из уровня техники, в том числе трансскротальные пластыри. Фармацевтические композиции в этих трансдермальных пластырях могут содержать один или несколько усилителей поглощения или усилителей проницаемости кожи, хорошо известных в данной области (см., например, патенты США №№ 4379454 и 4973468, которые включены в данный документ с помощью ссылки). Трансдермальные терапевтические системы для применения в настоящем изобретении могут быть на основе ионтофореза, диффузии или комбинации этих двух эффектов.
Трансдермальные пластыри имеют дополнительное преимущество в обеспечении контролируемой доставки активного ингредиента(-ов) в организм. Эти лекарственные формы можно получить путем растворения или диспергирования активного ингредиента(-ов) в соответствующей среде. Усилители поглощения также можно использовать для увеличения потока активного ингредиента через кожу. Скорость такого потока можно регулировать либо обеспечением наличия мембраны, контролирующей скорость, либо диспергированием активного ингредиента(-ов) в полимерной матрице или геле.
Эти фармацевтические композиции могут быть в виде кремов, мазей, лосьонов, линиментов, гелей, гидрогелей, растворов, суспензий, полосок, спреев, паст, пластырей и других видов трансдермальных систем доставки лекарственных средств. Композиции также могут включать в себя фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества, такие как эмульгирующие средства, антиоксиданты, буферные средства, консерванты, увлажнители, усилители проникновения, комплексообразующие средства, гелеобразующие средства, мазевые основы, отдушки и защитные средства для кожи.
Примеры эмульгирующих средств включают без ограничения природные смолы, например, аравийскую камедь или трагакантовую камедь, природные фосфатиды, например, соевый лецитин и производные сорбитанмоноолеата.
Примеры антиоксидантов включают без ограничения бутилированный гидроксианизол (BHA), аскорбиновую кислоту и ее производные, токоферол и его производные и цистеин.
Примеры консервантов включают без ограничения парабены, такие как метил- или пропил-п-гидроксибензоат и хлорид бензалкония.
Примеры увлажнителей включают без ограничения глицерин, пропиленгликоль, сорбит и мочевину.
Примеры усилителей проникновения включают без ограничения пропиленгликоль, DMSO, триэтаноламин, N,N-диметилацетамид, N,N-диметилформамид, 2-пирролидон и их производные, тетрагидрофурфуриловый спирт, пропиленгликоль, моноэтиловый или монометиловый эфиры диэтиленгликоля с монолауратом или метилауратом пропиленгликоля, эвкалиптол, лецитин, TRANSCUTOL и AZONE.
Примеры комплексообразующих средств включают без ограничения натрия EDTA, лимонную кислоту и ортофосфорную кислоту.
Примеры гелеобразующих средств включают без ограничения карбопол, производные целлюлозы, бентонит, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон.
Кроме активного ингредиента(-ов), мази, пасты, кремы и гели по настоящему изобретению могут содержать вспомогательные вещества, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, кремнийорганические соединения, бентониты, кремниевая кислота, тальк и оксид цинка или их смеси.
Порошки и спреи могут содержать вспомогательные вещества, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и порошок полиамида или смеси этих веществ. Спреи могут дополнительно содержать обычные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.
Формы для инъекционных депо получают путем формирования заключенных в микрокапсулы матриц соединения(-й) по настоящему изобретению в биоразлагаемых полимерах, таких как сополимер лактида и гликолида. В зависимости от соотношения соединения с полимером и природы конкретного используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения соединения. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Составы инъекционных депо также получают путем захвата лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканью тела.
Подкожные имплантаты хорошо известны из уровня техники и пригодны для применения в настоящем изобретении. Способы подкожной имплантации предпочтительно являются не раздражающими и конструктивно эластичными. Имплантаты могут быть матричного типа, резервуарного типа или их гибридами. В устройствах матричного типа материал-носитель может быть пористым или непористым, твердым или полутвердым и проницаемым или непроницаемым для активного соединения или соединений. Материал-носитель может быть биоразлагаемым или может медленно разрушаться после введения. В некоторых случаях матрица является неразлагаемой, а вместо этого основана на диффузии активного соединения через матрицу для разрушения материала-носителя. В альтернативных способах подкожной имплантации используют резервуарные устройства, в которых активное соединение или соединения окружены мембраной, контролирующей скорость, например, мембраной, не зависящей от концентрации компонента (обладающей кинетикой нулевого порядка). Устройства, состоящие из матрицы, окруженной мембраной, контролирующей скорость, также пригодны для применения.
Устройства как резервуарного, так и матричного типа могут содержать такие материалы, как полидиметилсилоксан, такой как SILASTIC, или другие кремнийорганические каучуки. Материалами матрицы могут быть нерастворимый полипропилен, полиэтилен, поливинилхлорид, этилвинилацетат, полистирол и полиметакрилат, а также сложные эфиры глицерина глицеринпальмитостеаратного, глицеринстеаратного и глицеринбегенатного типов. Материалы могут представлять собой гидрофобные или гидрофильные полимеры и необязательно содержать солюбилизирующие средства.
Устройства для подкожной имплантации могут представлять собой капсулы с медленным высвобождением, изготовленные с использованием любого подходящего полимера, например, как описано в патентах США №№ 5035891 и 4210644, включенных в данный документ с помощью ссылки.
В целом, для обеспечения контроля скорости высвобождения и трансдермального проникновения лекарственного соединения применимы по меньшей мере четыре разных подхода. Этими подходами являются: мембранные системы замедления, адгезивные системы с контролируемой диффузией, матричные системы дисперсионного типа и микрорезервуарные системы. Понятно, что чрескожную и/или местную композиции с контролируемым высвобождением можно получить с использованием подходящей комбинации этих подходов.
В мембранной системе замедления активный ингредиент присутствует в резервуаре, который полностью инкапсулирован в неглубокий отсек, сформованный из непроницаемого для лекарственного средства слоистого материала, такого как металлопластиковый слоистый материал, и полимерной мембраны, контролирующей скорость, такой как микропористая или непористая полимерная мембрана, например, сополимер этилена и винилацетата. Активный ингредиент высвобождается через полимерную мембрану, контролирующую скорость. В резервуаре для лекарственного средства активный ингредиент может быть либо диспергирован в твердой полимерной матрице, либо суспендирован в невымываемой вязкой жидкой среде, такой как кремнийорганическая жидкость. На внешнюю поверхность полимерной мембраны наносят тонкий слой адгезивного полимера для достижения плотного контакта трансдермальной системы с поверхностью кожи. Адгезивный полимер предпочтительно представляет собой полимер, который является гипоаллергенным и совместимым с активным лекарственным веществом.
В адгезивной системе с контролируемой диффузией резервуар активного ингредиента образуется путем прямого диспергирования активного ингредиента в адгезивном полимере, а затем, например, путем формования окунанием в раствор, распределения адгезива, содержащего активный ингредиент, на плоский лист практически непроницаемой для лекарственного средства металлопластиковой подложки с образованием тонкого резервуарного слоя лекарственного средства.
Матричная система дисперсионного типа характеризуется тем, что резервуар активного ингредиента образован с помощью практически гомогенного диспергирования активного ингредиента в гидрофильной или липофильной полимерных матрицах. Затем полимер, содержащий лекарственное средство, формуют в диск с практически четко определенной площадью поверхности и контролируемой толщиной. Адгезивный полимер распределяют по окружности, образуя полосу адгезива вокруг диска.
Микрорезервуарную систему можно рассматривать как комбинацию систем резервуарного и матричного типов. В этом случае резервуар активного вещества образуется сначала суспендированием твердых веществ лекарственного средства в водном растворе водорастворимого полимера, а затем диспергированием суспензии лекарственного средства в липофильном полимере с образованием множества невымываемых микроскопических сфер резервуаров лекарственного средства.
Любые из описанных в данном документе композиций с контролируемым высвобождением, пролонгированным высвобождением и замедленным высвобождения можно составлять с высвобождением активного ингредиента в течение от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, в течение от приблизительно 30 минут до приблизительно 72 часов, в течение от приблизительно 30 минут до 24 часов, в течение от приблизительно 30 минут до 12 часов, в течение от приблизительно 30 минут до 6 часов, в течение от приблизительно 30 минут до 4 часов и в течение от приблизительно 3 часов до 10 часов. В вариантах осуществления эффективная концентрация активного ингредиента(-ов) поддерживается у субъекта в течение 4 часов, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов или больше после введения фармацевтических композиций субъекту.
Вакцинная или иммуногенная композиции
Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, например, к вакцинной или иммуногенной композициям против неоплазии, способных вызывать специфичный ответ Т-клеток. Вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии содержат неоантигенные пептиды и/или неоантигенные полипептиды, соответствующие опухолеспецифичным неоантигенам, идентифицированным способами, описанными в данном документе.
Подходящие вакцинная или иммуногенная композиции против неоплазии могут предпочтительно содержать множество опухолеспецифичных неоантигенных пептидов. В одном варианте осуществления вакцинная или иммуногенная композиции могут включать в себя от 1 до 100 наборов пептидов, более предпочтительно от 1 до 50 таких пептидов, еще более предпочтительно от 10 до 30 наборов пептидов, еще более предпочтительно от 15 до 25 пептидов. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления вакцинная или иммуногенная композиции могут включать в себя по меньшей мере один пептид, более предпочтительно 2, 3, 4 или 5 пептидов. В определенных вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиции могут содержать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 различных пептидов.
Оптимальное количество каждого пептида, которое должно быть включено в вакцинную или иммуногенную композиции, а также оптимальный режим дозирования, способен определить специалист в данной области техники без излишнего экспериментирования. Например, пептид или его вариант могут быть получены для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.c.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшинной (i.p.) инъекции, внутримышечной (i.m.) инъекции. Предпочтительные способы инъекции пептидов включают s.c., i.d., i.p., i.m. и i.v. Предпочтительные способы инъекции ДНК включают i.d., i.m., s.c., i.p. и i.v. Например, могут быть назначены дозы от 1 до 500 мг, от 50 мкг до 1,5 мг, предпочтительно от 10 мкг до 500 мкг пептида или ДНК, и они будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы данного диапазона были успешно использованы в предыдущих испытаниях (Brunsvig P. F., et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12): 1553-1564; M. Staehler, et al., ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Другие способы введения вакцинной или иммуногенной композиций известны специалистам в данной области техники.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения различные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды и/или полипептиды выбирают для использования в вакцинной или иммуногенной композициях против неоплазии, чтобы увеличить до максимума вероятность возникновения иммунной атаки против неоплазии/опухоли пациента. Не ограничиваясь теорией, полагают, что включение разнообразных опухолеспецифичных неоантигенных пептидов может создавать широкомасштабную иммунную атаку против неоплазии/опухоли. В одном варианте осуществления выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются миссенс-мутациями. Во втором варианте осуществления выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются комбинацией миссенс-мутаций и мутаций neoORF. В третьем варианте осуществления выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются мутациями neoORF.
В одном варианте осуществления, в котором выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются миссенс-мутациями, пептиды и/или полипептиды выбирают на основе их способности связываться с конкретными молекулами МНС пациента. Пептиды/полипептиды, полученные из мутаций neoORF, также можно выбрать на основе их способности связываться с конкретными молекулами MHC пациента, однако также можно выбрать, даже если не предсказана связь с конкретными молекулами MHC пациента.
Вакцинная или иммуногенная композиции способны вызывать специфичный ответ цитотоксичных Т-клеток и/или специфичный ответ Т-клеток хелперов.
Вакцинная или иммуногенная композиции могут дополнительно содержать адъювант и/или носитель. Примеры пригодных адъювантов и носителей приведены в данном документе. Пептиды и/или полипептиды в композиции могут быть ассоциированы с носителем, например, таким как белок или антигенпрезентирующая клетка, например, такая как дендритная клетка (DC), способная презентировать пептид Т-клетке.
Адъюванты представляют собой любое вещество, подмешивание которого в вакцинную или иммуногенную композиции увеличивает или иным образом модифицирует иммунный ответ на мутантный пептид. Носителями являются каркасные структуры, например, полипептид или полисахарид, с которыми могут ассоциироваться неоантигенные пептиды. Необязательно, адъюванты конъюгируют ковалентно или нековалентно с пептидами или полипептидами по настоящему изобретению.
Способность адъюванта усиливать иммунный ответ на антиген обычно проявляется в значительном увеличении иммуноопосредованной реакции или уменьшении симптомов заболевания. Например, увеличение гуморального иммунитета обычно проявляется в значительном увеличении титра антител, появившихся к антигену, а увеличение активности Т-клеток обычно проявляется в увеличении клеточной пролиферации или клеточной цитотоксичности или секреции цитокинов. Адъювант может также изменять иммунный ответ, например, путем изменения преимущественно гуморального или Th2-ответа на преимущественно клеточный или Th1-ответ.
Подходящие адъюванты включают в себя без ограничения 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимод, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипид A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL, векторную систему, микрочастицы PLGA, резиквимод, SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкан, Pam3Cys, QS21 stimulon от Aquila (Aquila Biotech, Уорчестер, Массачусетс, США), который получен из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические миметики бактериальной клеточной стенки и другие патентованные адъюванты, такие как Ribi's Detox. Quil или Superfos. Несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфичных для дендритных клеток и их препаратов, были описаны ранее (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1): 18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Кроме того, можно использовать цитокины. Некоторые цитокины непосредственно связаны с влиянием на миграцию дендритных клеток в лимфоидные ткани (например, TNF-альфа), ускорением созревания дендритных клеток в эффективные антигенпрезентирующие клетки для Т-лимфоцитов (например, GM-CSF, IL-1 и IL-4) (патент США № 5849589, специально включенный в данный документ в полном объеме с помощью ссылки) и действием в качестве иммуноадъювантов (например, IL-12) (Gabrilovich D. I., et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
Toll-подобные рецепторы (TLR) также могут использоваться в качестве адъювантов и являются важными представителями семейства патерн-распознающих рецепторов (PRR), которые распознают консервативные мотивы, общие для многих микроорганизмов, называемые "патоген-ассоциированными молекулярными паттернами" (PAMP). Распознавание этих "сигналов опасности" активирует множество элементов врожденной и адаптивной иммунной систем. TLR экспрессируются клетками врожденной и адаптивной иммунной систем, такими как дендритные клетки (DC), макрофаги, T- и B-клетки, тучные клетки и гранулоциты, и локализуются в различных клеточных компартментах, таких как плазматическая мембрана, лизосомы, эндосомы и эндолизосомы. Различные TLR распознают различные PAMP. Например, TLR4 активируется LPS, содержащимся в клеточных стенках бактерий, TLR9 активируется неметилированной бактериальной или вирусной ДНК CpG, а TLR3 активируется двухнитевой РНК. Связывание TLR-лиганда приводит к активации одного или нескольких внутриклеточных сигнальных путей, что в конечном итоге приводит к продуцированию многих ключевых молекул, связанных с воспалением и иммунитетом (в частности, транскрипционного фактора NF-κB и интерферонов I типа). TLR-опосредованная активация DC приводит к усиленной активации DC, фагоцитозу, положительной регуляции маркеров активации и костимуляции, таких как CD80, CD83 и CD86, экспрессии CCR7, обеспечивающей возможность миграции DC в дренирующие лимфатические узлы и облегчающей презентацию антигена Т-клеткам, а также к повышенной секреции цитокинов, таких как интерфероны I типа, IL-12 и IL-6. Все эти последующие события имеют решающее значение для индукции адаптивного иммунного ответа.
Среди наиболее перспективных адъювантов для противораковых вакцинной или иммуногенной композиций, которые в настоящее время находятся в клинической разработке, известен TLR9-агонист CpG и синтетический TLR3-лиганд из двухнитевой РНК (dsRNA) поли-ICLC. В доклинических исследованиях поли-ICLC представляется наиболее эффективным TLR-адъювантом по сравнению с LPS и CpG из-за индукции провоспалительных цитокинов и отсутствия стимуляции IL-10, а также поддержания высоких уровней костимулирующих молекул в DCs1. Кроме того, поли-ICLC недавно непосредственно сравнивали с CpG у приматов, не относящихся к человеку (макак резусов), в качестве адъюванта для белковых вакцинной или иммуногенной композиций, состоящих из капсомеров папилломавируса человека (HPV) 16 (Stahl-Hennig C, Eisenblatter M, Jasny E, et al. Synthetic double-stranded RNAs are adjuvants for the induction of T helper 1 and humoral immune responses to human papillomavirus in rhesus macaques. PLoS pathogens. Apr 2009;5(4)).
Также сообщалось, что CpG-иммуностимулирующие олигонуклеотиды усиливают действия адъювантов в условиях вакцинной или иммуногенной композиций. Не ограничиваясь теорией, олигонуклеотиды CpG действуют путем активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы посредством Toll-подобных рецепторов (TLR), в основном TLR9. CpG-опосредованная активация TLR9 усиливает антигенспецифичные гуморальный и клеточный ответы на широкий спектр антигенов, в том числе пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, дендритные клеточные вакцины, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и в терапевтических вакцинах. Что еще более важно, она усиливает созревание и дифференцировку дендритных клеток, что приводит к усиленной активации Th1-клеток и мощной генерации цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL) даже в отсутствие помощи CD4 T-клеток. Смещение в сторону Th1, индуцированное стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют смещению в сторону Th2. Олигонуклеотиды CpG проявляют еще большую адъювантную активность при составлении или совместном введении с другими адъювантами или в составах, таких как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или аналогичные составы, которые особенно необходимы для индуцирования сильного ответа тогда, в случае если антиген является относительно слабым. Они также ускоряют иммунный ответ и дают возможность снизить дозы антигена примерно на два порядка по сравнению с ответами антител, сопоставимыми с полной дозой вакцины без CpG в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, Jun. 2006, 471-484). В патенте США № 6406705 В1 описывается совместное применение олигонуклеотидов CpG, адъювантов, не содержащих нуклеиновых кислот, и антигена для индуцирования антигенспецифичного иммунного ответа. Коммерчески доступный TLR9-антагонист CpG представляет собой dSLIM (иммуномодулятор, имеющий структуру с двухнитевым стеблем и однонитевыми петлями) от Mologen (Берлин, ГЕРМАНИЯ), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Можно также использовать другие TLR-связывающие молекулы, такие как РНК, связывающая TLR 7, TLR 8 и/или TLR 9.
Другие примеры пригодных адъювантов включают без ограничения химически модифицированные CpG (например, CpR, Idera), поли(I:C) (например, поли:CI2U), бактериальную ДНК или РНК кроме CpG, а также иммуноактивные небольшие молекулы и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафиниб, XL-999, CP-547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, ипилимумаб, тремелимумаб и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или в качестве адъюванта. Количество и концентрацию адъювантов и добавок, пригодных в контексте настоящего изобретения, может легко определить квалифицированный специалист без излишнего экспериментирования. Дополнительные адъюванты включают колониестимулирующие факторы, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, сарграмостим).
Поли-ICLC представляет собой синтетически полученную двухнитевую РНК, состоящую из цепей поли-I и поли-C со средней длиной приблизительно 5000 нуклеотидов, которую стабилизировали относительно термической денатурации и гидролиза сывороточными нуклеазами путем добавления полилизина и карбоксиметилцеллюлозы. Соединение активирует TLR3 и РНК-геликазный домен MDA5, оба представителя семейства PAMP, приводящие к активации DC и клеток природных киллеров (NK) и выработке "природной смеси" интерферонов I типа, цитокинов и хемокинов. Кроме того, поли-ICLC обладает более непосредственным, направленным на широкий спектр организмов антиинфекционным и, возможно, противоопухолевым эффектом, опосредуемым двумя IFN-индуцибельными ядерными ферментными системами, 2'5'-OAS и киназой P1/eIF2a, также известной как PKR (4-6), а также геликазой RIG-I и MDA5.
Было показано, что у грызунов и приматов, не относящихся к человеку, поли-ICLC усиливает ответы Т-клеток на вирусные антигены, примирование перекрестнореагирующим антигеном и индукцию опухоле-, вирусо- и аутоантигенспецифичных CD8+ Т-клеток. В недавнем исследовании на приматах, не относящихся к человеку, было установлено, что поли-ICLC имеет важное значение для генерации ответов антител и Т-клеточного иммунитета к нацеленному или ненацеленному на DC белку Gag p24 HIV, подчеркивая его эффективность в качестве вакцинного адъюванта.
У людей транскрипционный анализ серийных образцов цельной крови выявил сходные профили экспрессии генов среди 8 здоровых добровольцев, получавших одно единственное s.c. введение поли-ICLC, и дифференциальную экспрессию до 212 генов среди этих 8 субъектов по сравнению с 4 субъектами, получившими плацебо. Примечательно, что сравнение данных по экспрессии генов при поли-ICLC с предыдущими данными добровольцев, иммунизованных высокоэффективной вакциной против желтой лихорадки YF17D, показало, что большое количество канонических транскрипционных путей и путей сигнальной трансдукции, в том числе врожденной иммунной системы, было аналогичным образом активировано в пиковые моменты времени.
Совсем недавно сообщалось об иммунологическом анализе пациентов с раком яичника, фаллопиевой трубы и первичным перитонеальным раком во второй или третьей полных клинических ремиссиях, которые получали лечение в фазе 1 исследования подкожной вакцинации синтетическими перекрывающимися длинными пептидами (OLP) из антигена рака яичек NY-ESO-1 отдельно или с Montanide-ISA-51, или с 1,4 мг поли-ICLC и Montanide. Выработка NY-ESO-1-специфичных CD4+ и CD8+ Т-клеток и ответы антител заметно усиливались при добавлении поли-ICLC и Montanide по сравнению с OLP отдельно или OLP и Montanide.
Вакцинная или иммуногенная композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать более чем один отличающийся адъювант. Кроме того, настоящее изобретение охватывает терапевтическую композицию, содержащую любое адъювантное вещество, в том числе любое из обсуждаемых в данном документе. Также предполагается, что пептид или полипептид и адъювант можно вводить отдельно в любой подходящей последовательности.
Носитель может присутствовать независимо от адъюванта. Носитель может быть ковалентно связан с антигеном. Носитель также может быть добавлен к антигену путем вставки ДНК, кодирующей носитель, в рамку считывания с ДНК, кодирующей антиген. Функцией носителя может быть, например, обеспечение стабильности, увеличение биологической активности или увеличение времени полужизни в сыворотке. Продление времени полужизни может помочь уменьшить количество введений и снизить дозы, что полезно как по терапевтическим, так и по экономическим причинам. Кроме того, носитель может способствовать презентации пептидов Т-клеткам. Носитель может представлять собой любой подходящий носитель, известный специалисту в данной области техники, например, белок или антигенпрезентирующую клетку. Белок-носитель может представлять собой без ограничения гемоцианин лимфы улитки, белки сыворотки, такие как трансферрин, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека, тиреоглобулин или овальбумин, иммуноглобулины или гормоны, такие как инсулин или пальмитиновая кислота. Для иммунизации человека носитель может представлять собой физиологически приемлемый носитель, приемлемый для человека и безопасный. Тем не менее, в одном варианте осуществления настоящего изобретения столбнячный анатоксин и/или дифтерийный анатоксин являются подходящими носителями. В качестве альтернативы, носитель может представлять собой декстраны, например сефарозу.
Цитотоксические Т-клетки (CTL) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС, а не сам интактный чужеродный антиген. Сама молекула МНС располагается на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Таким образом, активация CTL возможна только в том случае, если присутствует тримерный комплекс пептидного антигена, молекула MHC и APC. Соответственно, можно усилить иммунный ответ, если для активации CTL использовать не только пептид, но если дополнительно добавить APC с соответствующей молекулой МНС. Поэтому в некоторых вариантах осуществления вакцинная или иммуногенная композиции в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку.
Антигенпрезентирующая клетка (или стимулирующая клетка) обычно имеет молекулу МНС класса I или II на своей поверхности и в одном варианте осуществления практически не способна сама загрузить молекулу МНС класса I или II выбранным антигеном. Как описано более подробно в данном документе, молекулу МНС класса I или II можно легко загрузить выбранным антигеном in vitro.
Активность CD8+ клеток можно увеличить с помощью использования CD4+ клеток. Идентификация эпитопов опухолевых антигенов для CD4+ T-клеток вызвала интерес, поскольку многие методы лечения рака, основанные на иммунитете, могут быть более эффективными, если одновременно использовать CD8+ и CD4+ T-лимфоциты для нацеливания на опухоль пациента. CD4+ клетки способны усиливать ответ CD8 Т-клеток. Многие исследования на животных моделях ясно продемонстрировали лучшие результаты, в случае если в противоопухолевых ответах одновременно участвуют CD4+ и CD8+ Т-клетки (см., например, Nishimura et al. (1999) Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (TH1) and Th2 cells in tumor eradication in vivo. J Ex Med 190:617-27). Были идентифицированы универсальные эпитопы для CD4+ Т-клеток, которые применимы в разработке методов лечения различных типов рака (см., например, Kobayashi et al. (2008) Current Opinion in Immunology 20:221-27). Например, HLA-DR-ограниченный хелперный пептид из столбнячного анатоксина использовали в вакцинах против меланомы для неспецифичной активации CD4+ T-клеток (см., например, Slingluff et al. (2007) Immunologic and Clinical Outcomes of a Randomized Phase II Trial of Two Multipeptide Vaccines for Melanoma in the Adjuvant Setting, Clinical Cancer Research 13(21):6386-95). В рамках настоящего изобретения предполагается, что такие CD4+ клетки могут использоваться на трех уровнях, которые различаются по своей опухолеспецифичности: 1) широкий уровень, на котором универсальные CD4+ эпитопы (например, столбнячный анатоксин) можно использовать для наращивания клеток CD8+; 2) промежуточный уровень, на котором нативные опухолеассоциированные CD4+ эпитопы можно использовать для наращивания CD8+ клеток; и 3) специфичный для пациента уровень, на котором неоантигенные CD4+ эпитопы можно использовать для наращивания CD8+ клеток специфичным для пациента образом.
Иммунитет, опосредованный CD8+ клетками, также можно выработать с помощью вакцины из дендритных клеток (DC), загруженных неоантигеном. DC являются действенными антигенпрезентирующими клетками, которые инициируют Т-клеточный иммунитет и могут быть использованы в качестве противораковых вакцин при загрузке одним или несколькими пептидами, представляющими интерес, например, путем непосредственной инъекции пептидов. Например, было показано, что пациенты с впервые диагностированной метастатической меланомой были иммунизированы против 3 HLA-A*0201-ограниченных пептидов gp100, полученных из антигена меланомы, с помощью аутологичного пептида, введенного в CD40L/IFN-g-активированные зрелые DC-клетки посредством вакцины из IL-12p70-продуцирующих DC пациента (см., например, Carreno et al (2013) L-12p70-producing patient DC vaccine elicits Tc1-polarized immunity, Journal of Clinical Investigation, 123(8):3383-94 и Ali et al. (2009) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy, 1(8):1-10). В объеме настоящего изобретения предполагается, что DC, загруженные неоантигеном, можно получить с использованием синтетического TLR3-агониста полиинозиновой-полицитидиловой кислот-поли-L-лизина карбоксиметилцеллюлозы (поли-ICLC) для стимуляции DC. Поли-ICLC является мощным стимулятором индивидуального созревания для DC человека, как оценено по положительной регуляции CD83 и CD86, индукции интерлейкина-12 (IL-12), фактора некроза опухоли (TNF), индуцированного интерфероном-гамма белка 10 (IP-10), интерлейкина 1 (IL-1) и интерферонов I типа (IFN), а также минимальной выработке интерлейкина 10 (IL-10). DC могут дифференцироваться из замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных лейкаферезом, тогда как РВМС можно выделить центрифугированием в градиенте Ficoll и заморозить в аликвотах.
6
В качестве примера можно использовать следующий 7-дневный протокол активации. День 1 - РВМС оттаивают и помещают в колбы для культивирования тканей для отбора моноцитов, которые прилипают к пластиковой поверхности через 1-2 ч. инкубации при 37°С в инкубаторе для тканевых культур. После инкубации лимфоциты смывают и прилипшие моноциты культивируют в течение 5 дней в присутствии интерлейкина-4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) для дифференцировки в незрелые DC. В день 6 в незрелые DC вводят белок гемоцианин лимфы улитки (KLH), который служит как контроль качества вакцины и может стимулировать иммуногенность вакцины. DC стимулируют для созревания, загружают пептидными антигенами и инкубируют в течение ночи. В день 7 клетки промывают и замораживают в аликвотах объемом 1 мл, содержащих 4-20 × 10 клеток, с использованием морозильной камеры с контролируемой скоростью. Тестирование выпуска партий на соответствие минимальным требованиям для партий DC можно выполнить до того, как DC будут введены пациентам (см., например, Sabado et al. (2013) Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy, J. Vis Exp. Aug 1;(78). doi: 10.3791/50085).
DC-вакцину можно заключить в каркасную систему для облегчения доставки пациенту. При терапевтическом лечении неоплазии у пациентов с помощью DC-вакцины можно использовать систему биоматериалов, высвобождающую факторы, которые привлекают дендритные клетки хозяина в устройство, дифференцируют резидентные незрелые DC с помощью локально презентирующих адъювантов (например, сигналы опасности) при высвобождении антигена и стимулируют высвобождение активированных DC, загруженных антигеном, в лимфатические узлы (или требуемое место действия), где DC могут взаимодействовать с Т-клетками для выработки действенного ответа цитотоксичных Т-лимфоцитов на неоантигены рака. Имплантируемые биоматериалы можно использовать для выработки действенного ответа цитотоксичных Т-лимфоцитов против неоплазии специфичным для пациента способом. Затем дендритные клетки, резидентные для биоматериала, можно активировать путем воздействия на них сигналов опасности, имитирующих инфекцию, в сочетании с высвобождением антигена из биоматериала. Затем активированные дендритные клетки мигрируют из биоматериалов в лимфатические узлы для индукции ответа цитотоксичных Т-эффекторов. Ранее было продемонстрировано, что данный подход приводил к регрессии подтвержденной меланомы в доклинических исследованиях с использованием лизата, полученного из биопсий опухоли (см., например, Ali et al. (2209) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy 1(8):1-10; Ali et al. (2009) Infection-mimicking materials to program dendritic cells in situ. Nat Mater 8:151-8), и подобная вакцина в настоящее время тестируется в фазе I клинических испытаний, недавно начатых в Институте рака Dana-Farber. Было также показано, что данный подход приводит к регрессии глиобластомы, а также к индукции действенного ответа клеток памяти для предотвращения рецидива с использованием модели.24 глиомы крыс C6 в текущем проекте. Способность этого имплантируемого биоматричного каркаса для доставки вакцины усиливать и поддерживать опухолеспецифичную активацию дендритных клеток может приводить к более устойчивой противоопухолевой иммуносенситизации, чем это может быть достигнуто традиционными подкожными или внутриузловыми введениями вакцин.
Предпочтительно, антигенпрезентирующие клетки представляют собой дендритные клетки. Соответственно, дендритные клетки представляют собой аутологичные дендритные клетки, в которые вводили неоантигенный пептид. Пептид может представлять собой любой подходящий пептид, который вызывает соответствующий Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток, в которые вводили пептиды из опухолеассоциированного антигена, раскрыта в Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 и Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения в вакцинную или иммуногенную композиции, содержащие по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку, вводят или загружают один или несколько пептидов по настоящему изобретению. В качестве альтернативы мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные у пациента, можно загрузить пептидами ex vivo и ввести обратно пациенту. В качестве альтернативы антигенпрезентирующая клетка содержит конструкцию для экспрессии, кодирующую пептид по настоящему изобретению. Полинуклеотид может представлять собой любой подходящий полинуклеотид, и предпочтительно, чтобы он был способен трансдуцировать дендритную клетку, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена таким образом, чтобы выбор, число и/или количество пептидов, присутствующих в композиции, были специфичными для ткани, рака и/или пациента. Например, точный выбор пептидов может определяться паттернами экспрессии исходных белков в данной ткани, чтобы избежать побочных эффектов. Выбор может зависеть от конкретного типа рака, статуса заболевания, более ранних режимов лечения, иммунного статуса пациента и, конечно же, HLA-гаплотипа пациента. Кроме того, вакцинная или иммуногенная композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать индивидуализированные компоненты в соответствии с личными потребностями конкретного пациента. Примеры включают изменение количества пептидов в зависимости от экспрессии родственного неоантигена у конкретного пациента, нежелательных побочных эффектов из-за индивидуальной аллергии или других методов лечения и корректировок для вторичных методов лечения после первого цикла или схемы лечения.
Фармацевтические композиции, содержащие пептид по настоящему изобретению, можно вводить индивидууму, уже страдающему от рака. В терапевтических применениях композиции вводят пациенту в достаточном количестве, чтобы вызвать эффективный ответ CTL на опухолевый антиген и вылечить или по меньшей мере частично остановить симптомы и/или осложнения. Количество, достаточное для достижения подобного, определяется как "терапевтически эффективная доза". Количество, эффективное для данного использования, может зависеть, например, от пептидной композиции, способа введения, стадии и степени тяжести заболевания, подлежащего лечению, веса и общего состояния здоровья пациента, а также от решения лечащего врача, однако как правило диапазон для начальной иммунизации (т.е. для терапевтического или профилактического введений) составляет от приблизительно 1,0 мкг до приблизительно 50000 мкг пептида для пациента с весом 70 кг с последующими стимулирующими дозами, или от приблизительно 1,0 мкг до приблизительно 10000 мкг пептида в соответствии с режимом стимулирования в течение недель и месяцев в зависимости от ответа и состояния пациента и, возможно, при измерении специфической активности CTL в крови пациента. Следует иметь в виду, что пептид и композиции по настоящему изобретению, как правило, могут использоваться при серьезных болезненных состояниях, т.е. в опасных для жизни или потенциально опасных для жизни ситуациях, особенно при метастазировании рака. Для терапевтического применения введение должно начинаться как можно скорее после обнаружения или хирургического удаления опухолей. Затем следуют стимулирующие дозы до тех пор, пока симптомы по меньшей мере существенно не уменьшатся, и в течение последующего периода.
Фармацевтические композиции (например, вакцинные композиции) для терапевтического лечения предназначены для парентерального, местного, назального, перорального или местного введений. Предпочтительно, фармацевтические композиции вводят парентерально, например, внутривенно, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. Композиции можно вводить в месте хирургического удаления, чтобы индуцировать локальный иммунный ответ на опухоль. Настоящее изобретение предусматривает композиции для парентерального введения, которые содержат раствор пептидов и вакцинные или иммуногенные композиции, растворенные или суспендированные в приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе. Можно использовать различные водные носители, например, воду, буферную воду, 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Эти композиции можно стерилизовать общепринятыми, хорошо известными методами стерилизации, или можно стерильно отфильтровать. Полученные водные растворы можно упаковать для использования как есть, или лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат объединяют со стерильным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для аппроксимации физиологических условий, такие как регулирующие рН и буферные средства, средства для регулирования тоничности, смачивающие средства и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, монолаурат сорбитана, олеат триэтаноламина и т.д.
Липосомальную суспензию, содержащую пептид, можно вводить внутривенно, локально, местно и т.д. в дозе, которая варьируется в зависимости, inter alia, от способа введения, пептида, подлежащего доставке, и стадии заболевания, подлежащего лечению. Для нацеливания на иммунные клетки в липосому можно включить лиганд, например, такой как антитела или их фрагменты, специфичные для детерминант клеточной поверхности требуемых клеток иммунной системы.
Для твердых композиций можно использовать общепринятые нетоксичные твердые носители или наночастицы, которые включают, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и т.п. фармацевтических степеней чистоты. Для перорального введения фармацевтически приемлемую нетоксичную композицию образуют путем введения любого из обычно применяемых вспомогательных веществ, таких как вышеперечисленные носители, и как правило 10-95% активного ингредиента, т.е. одного или нескольких пептидов по настоящему изобретению, и более предпочтительно в концентрации 25% - 75%.
Для введения с аэрозолем иммуногенные пептиды предпочтительно поставляют в тонкоизмельченной форме вместе с поверхностно-активным веществом и пропеллентом. Типичное процентное содержание пептидов составляет 0,01% - 20% по весу, предпочтительно 1% - 10%. Разумеется, поверхностно-активное вещество может быть нетоксичным и предпочтительно растворимым в пропелленте. Типичными представителями таких средств являются сложные эфиры или неполные сложные эфиры жирных кислот, содержащих от 6 до 22 атомов углерода, таких как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая, олестериновая и олеиновая кислоты, с алифатическим многоатомным спиртом или его циклическим ангидридом. Можно использовать смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Поверхностно-активное вещество может составлять 0,1% - 20% по весу композиции, предпочтительно 0,25 - 5%. Остальной частью композиции обычно является пропеллент. Если требуется, то можно включить также носитель, как в случае, например, лецитина для интраназальной доставки.
Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению можно легко синтезировать химическим путем с использованием реагентов, свободных от загрязняющих бактериальных или животных веществ (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963).
Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению также можно экспрессировать с помощью вектора, например, молекулы нуклеиновой кислоты, обсуждаемой в данном документе, например, РНК- или ДНК-плазмиды, вирусного вектора, такого как поксвирус, например, ортопоксвирус, авипоксвирус или аденовирус, AAV или лентивирус. Данный подход включает применение вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют пептид по настоящему изобретению. При введении в остро или хронически инфицированного хозяина или в неинфицированного хозяина вектор экспрессирует иммуногенный пептид и таким образом вызывает ответ CTL хозяина.
Для целей лечения или иммунизации пациенту также можно вводить нуклеиновые кислоты, кодирующие пептид по настоящему изобретению, и необязательно один или несколько пептидов, описанных в данном документе. Для доставки нуклеиновых кислот пациенту удобно использовать ряд способов. Например, нуклеиновую кислоту можно доставить непосредственно в виде "голой ДНК". Данный подход описан, например, в Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990), а также в патентах США №№ 5580859 и 5589466. Нуклеиновые кислоты также можно вводить с использованием баллистической доставки, как описано, например, в патенте США № 5204253. Можно вводить частицы, состоящие исключительно из ДНК. В качестве альтернативы, ДНК можно прикрепить к частицам, таким как частицы золота. Как правило, плазмида для вакцинной или иммунологической композиций может содержать ДНК, кодирующую антиген (например, один или несколько неоантигенов), функционально связанную с регуляторными последовательностями, которые контролируют экспрессию или экспрессию и секрецию антигена из клетки-хозяина, например клетки млекопитающего; например, от выше расположенного к ниже расположенному, ДНК для промотора, такого как промотор вируса млекопитающего (например, промотор CMV, такой как промотор hCMV или mCMV, например ранне-средний промотор или промотор SV40, - см. документы, упомянутые или включенные в данный документ для пригодных промоторов), ДНК для эукариотического лидерного пептида для секреции (например, тканевого активатора плазминогена), ДНК для неоантигена(-ов) и ДНК, кодирующая терминатор (например, 3'-концевой UTR терминатор транскрипции из гена, кодирующего бычий гормон роста, или polyA bGH). Композиция может содержать более одной плазмиды или вектора, при этом каждый вектор содержит и экспрессирует другой неоантиген. Упоминается также Wasmoen, патент США № 5849303, и Dale, патент США № 5811104, тексты которых могут быть полезны. Составы с ДНК или ДНК-плазмидами можно составлять с катионными липидами или внутри них; и что касается катионных липидов, а также адъювантов, то упоминание также относится к заявке на патент США № 2003/0104008 от Loosmore. Кроме того, на сведения Audonnet в патентах США №№ 6228846 и 6159477 можно полагаться для получения сведений о ДНК-плазмидах, которые можно использовать при конструировании и использовании ДНК-плазмид, содержащихся и экспрессирующихся in vivo.
Нуклеиновые кислоты также можно доставлять в комплексе с катионными соединениями, такими как катионные липиды. Способы доставки гена, опосредованные липидом, описаны, например, в WO 1996/18372; WO 1993/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (7): 682-691 (1988); патенте США № 5279833; WO 1991/06309 и Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987).
РНК, кодирующую пептид, представляющий интерес (например, mRNA), также можно использовать для доставки (см., например, Kiken et al., 2011; Su et al., 2011; см. также US 8278036; Halabi et al. J Clin Oncol (2003) 21:1232-1237; Petsch et al., Nature Biotechnology 2012 Dec 7;30(12):1210-6).
Информацию, касающуюся поксвирусов, которые можно использовать в практике осуществления настоящего изобретения, таких как поксвирусы подсемейства Chordopoxvirinae (поксвирусы позвоночных), например ортопоксвирусы и авипоксвирусы, например вирус коровьей оспы (например, штамм Wyeth, WR (например, ATCC VR-1354), штамм Copenhagen, NYVAC, NYVAC.1, NYVAC.2, MVA, MVA-BN), вирус оспы канареек (например, штамм Wheatley C93, ALVAC), вирус оспы кур (например, штамм FP9, штамм Webster, TROVAC), оспы белого голубя, оспы голубя, оспы перепелов и оспы енота, inter alia их синтетические или неприродные рекомбинанты, пути их применения и способы получения и применения таких рекомбинантов можно найти в научной и патентной литературе, такой как:
 патенты США №№ 4603112, 4769330, 5110587, 5174993, 5364773, 5762938, 5494807, 5766597, 7767449, 6780407, 6537594, 6265189, 6214353, 6130066, 6004777, 5990091, 5942235, 5833975, 5766597, 5756101, 7045313, 6780417, 8470598, 8372622, 8268329, 8268325, 8236560, 8163293, 7964398, 7964396, 7964395, 7939086, 7923017, 7897156, 7892533, 7628980, 7459270, 7445924, 7384644, 7335364, 7189536, 7097842, 6913752, 6761893, 6682743, 5770212, 5766882 и 5989562, а также
 Panicali, D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982; 79; 4927-493, Panicali D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983; 80(17): 5364-8, Mackett, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982; 79: 7415-7419, Smith GL. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983; 80(23): 7155-9, Smith GL. Nature 1983; 302: 490-5, Sullivan VJ. Gen. Vir. 1987; 68: 2587-98, Perkus M Journal of Leukocyte Biology 1995; 58:1-13, Yilma TD. Vaccine 1989; 7: 484-485, Brochier B. Nature 1991; 354: 520-22, Wiktor, TJ. Proc. Natl Acd. Sci. 1984; 81: 7194-8, Rupprecht, CE. Proc. Natl Acd. Sci. 1986; 83: 7947-50, Poulet, H Vaccine 2007; 25(Jul): 5606-12, Weyer J. Vaccine 2009; 27(Nov): 7198-201, Buller, RM Nature 1985; 317(6040): 813-5, Buller RM. J. Virol. 1988; 62(3):866-74, Flexner, C. Nature 1987; 330(6145): 259-62, Shida, H. J. Virol. 1988; 62(12): 4474-80, Kotwal, GJ. J. Virol. 1989; 63(2): 600-6, Child, SJ. Virology 1990; 174(2): 625-9, Mayr A. Zentralbl Bakteriol 1978; 167(5,6): 375-9, Antoine G. Virology. 1998; 244(2): 365-96, Wyatt, LS. Virology 1998; 251(2): 334-42, Sancho, MC. J. Virol. 2002; 76(16); 8313-34, Gallego-Gomez, JC. J. Virol. 2003; 77(19); 10606-22), Goebel SJ. Virology 1990; (a,b) 179: 247-66, Tartaglia, J. Virol. 1992; 188(1): 217-32, Najera JL. J. Virol. 2006; 80(12): 6033-47, Najera, JL. J. Virol. 2006; 80: 6033-6047, Gomez, CE. J. Gen. Virol. 2007; 88: 2473-78, Mooij, P. Jour. Of Virol. 2008; 82: 2975-2988, Gomez, CE. Curr. Gene Ther. 2011; 11: 189-217, Cox,W. Virology 1993; 195: 845-50, Perkus, M. Jour. Of Leukocyte Biology 1995; 58: 1-13, Blanchard TJ. J Gen Virology 1998; 79(5): 1159-67, Amara R. Science 2001; 292: 69-74, Hel, Z., J. Immunol. 2001; 167: 7180-9, Gherardi MM. J. Virol. 2003; 77: 7048-57, Didierlaurent, A. Vaccine 2004; 22: 3395-3403, Bissht H. Proc. Nat. Aca. Sci. 2004; 101: 6641-46, McCurdy LH. Clin. Inf. Dis 2004; 38: 1749-53, Earl PL. Nature 2004; 428: 182-85, Chen Z. J. Virol. 2005; 79: 2678-2688, Najera JL. J. Virol. 2006; 80(12): 6033-47, Nam JH. Acta. Virol. 2007; 51: 125-30, Antonis AF. Vaccine 2007; 25: 4818-4827,B Weyer J. Vaccine 2007; 25: 4213-22, Ferrier-Rembert A. Vaccine 2008; 26(14): 1794-804, Corbett M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105(6): 2046-51, Kaufman HL., J. Clin. Oncol. 2004; 22: 2122-32, Amato, RJ. Clin. Cancer Res. 2008; 14(22): 7504-10, Dreicer R. Invest New Drugs 2009; 27(4): 379-86, Kantoff PW.J. Clin. Oncol. 2010, 28, 1099-1105, Amato RJ. J. Clin. Can. Res. 2010; 16(22): 5539-47, Kim, DW. Hum. Vaccine. 2010; 6: 784-791, Oudard, S. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60: 261-71, Wyatt, LS. Aids Res. Hum. Retroviruses. 2004; 20: 645-53, Gomez, CE. Virus Research 2004; 105: 11-22, Webster, DP. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005; 102: 4836-4, Huang, X. Vaccine 2007; 25: 8874-84, Gomez, CE. Vaccine 2007a; 25: 2863-85, Esteban M. Hum. Vaccine 2009; 5: 867-871, Gomez, CE. Curr. Gene therapy 2008; 8(2): 97-120, Whelan, KT. Plos one 2009; 4(6): 5934, Scriba, TJ. Eur. Jour. Immuno. 2010; 40(1): 279-90, Corbett, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008; 105: 2046-2051, Midgley, CM. J. Gen. Virol. 2008; 89: 2992-97, Von Krempelhuber, A. Vaccine 2010; 28: 1209-16, Perreau, M. J. Of Virol. 2011; Oct: 9854-62, Pantaleo, G. Curr Opin HIV-AIDS. 2010; 5: 391-396,
каждый из которых включен в данный документ с помощью ссылки.
Что касается векторов на основе аденовируса, пригодных в практике осуществления настоящего изобретения, то упоминается патент США № 6955808. Используемый вектор на основе аденовируса можно выбрать из группы, состоящей из векторов на основе Ad5, Ad35, Ad11, C6 и C7. Опубликована последовательность генома аденовируса 5 ("Ad5") (Chroboczek, J., Bieber, F., and Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285; содержание которой включено в данный документ с помощью ссылки). Векторы на основе Ad35 описаны в патентах США №№ 6974695, 6913922 и 6869794. Векторы Ad11 описаны в патенте США № 6913922. Векторы на основе аденовируса C6 описаны в патентах США №№ 6780407; 6537594; 6309647; 6265189; 6156567; 6090393; 5942235 и 5833975. Векторы на основе C7 описаны в патенте США № 6277558. Также можно использовать векторы на основе аденовируса, которые являются дефектными по E1 или с удалением такового, дефектными по E3 или с удалением такового и/или дефектными по E4 или с удалением такового. Определенные аденовирусы, имеющие мутации в области E1, характеризуются улучшенным пределом безопасности, поскольку мутанты аденовируса с дефектом по E1 являются дефектными по репликации в непермиссивных клетках или по крайней мере сильно ослаблены. Аденовирусы, имеющие мутации в области Е3, могут характеризоваться усиленной иммуногенностью с нарушением механизма, посредством которого аденовирус угнетает молекулы МНС класса I. Аденовирусы, имеющие мутации в E4, могут характеризоваться сниженной иммуногенностью вектора на основе аденовируса из-за подавления экспрессии "поздних" генов. Такие векторы могут быть особенно полезными, в случае если требуется повторная ревакцинация с использованием того же самого вектора. Векторы на основе аденовирусов, у которых удалены или мутированы E1, E3, E4, E1 и E3, E1 и E4, можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением можно также использовать векторы на основе "выпотрошенного" аденовируса, в котором удалены все вирусные гены. Такие векторы нуждаются в вирусе-помощнике для своей репликации и для них требуется специальная линия клеток человека 293, экспрессирующая как E1a, так и Cre, условие, которое не существует в природной среде. Эти "выпотрошенные" векторы являются неиммуногенными, а, следовательно, эти векторы можно многократно инокулировать для ревакцинации. Векторы на основе "выпотрошенного" аденовируса можно использовать для введения гетерологичных вставок/генов, таких как трансгены по настоящему изобретению, и можно даже использовать для совместной доставки большого количества гетерологичных вставок/генов.
Что касается векторных систем на основе лентивирусов, пригодных в практике осуществления настоящего изобретения, то упоминаются патенты США №№ 6428953, 6165782, 6013516, 5994136, 6312682 и 7198784, а также документы, цитируемые в них.
Что касается векторов на основе AAV, пригодных в практике осуществления настоящего изобретения, то упоминаются патенты США №№5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 и 6258595, а также документы, цитируемые в них.
Другим вектором является BCG (Bacille Calmette Guerin; бацилла Кальмета-Герена). Векторы на основе BCG описаны в Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Широкий спектр других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации пептидов по настоящему изобретению, например, векторов на основе Salmonella typhi и т.п., является очевидным специалисту в данной области техники из описания в данном документе.
Векторы можно вводить так, чтобы иметь экспрессию и ответ in vivo, сходные с дозами и/или ответами, вызванными введением антигена.
В предпочтительных средствах для введения нуклеиновых кислот, кодирующих пептид по настоящему изобретению, используют минигенные конструкции, кодирующие несколько эпитопов. Для создания последовательности ДНК, кодирующей выбранные CTL-эпитопы (миниген) для экспрессии в клетках человека, аминокислотные последовательности эпитопов подвергают обратной трансляции. Таблицу использования кодонов человека применяют для руководства при выборе кодонов для каждой аминокислоты. Эти последовательности ДНК, кодирующие эпитоп, непосредственно соприкасаются, создавая непрерывную полипептидную последовательность. Для оптимизации экспрессии и/или иммуногенности, в дизайн минигенов можно включать дополнительные элементы. Примеры аминокислотной последовательности, которую можно подвергнуть обратной трансляции и включить в последовательность минигенов, включают: хелперный Т-лимфоцит, эпитопы, лидерную (сигнальную) последовательность и сигнал удержания в эндоплазматическом ретикулуме. Кроме того, MHC-презентацию эпитопов CTL можно улучшить путем включения синтетических (например, полиаланиновых) или природных фланкирующих последовательностей, смежных с эпитопами CTL.
Последовательность минигена превращают в ДНК путем сборки олигонуклеотидов, которые кодируют плюс- и минус-нити минигена. Перекрывающиеся олигонуклеотиды (длиной 30-100 оснований) синтезируют, фосфорилируют, очищают и отжигают в подходящих условиях с использованием хорошо известных методов. Концы олигонуклеотидов соединяют с использованием ДНК-лигазы T4. Затем этот синтетический миниген, кодирующий полипептид эпитопа CTL, можно клонировать в требуемый вектор экспрессии.
Стандартные регуляторные последовательности, хорошо известные специалистам в данной области техники, включают в вектор для обеспечения экспрессии в клетках-мишенях. Требуется несколько элементов вектора: промотор с нижерасположенным сайтом клонирования для вставки минигена; сигнал полиаденилирования для эффективной терминации транскрипции; начало репликации E. coli и селектируемый маркер E. coli (например, резистентность к ампициллину или канамицину). Для этой цели можно использовать множество промоторов, например, промотор цитомегаловируса (hCMV) человека. Для других подходящих промоторных последовательностей см. патенты США №№ 5580859 и 5589466.
Для оптимизации экспрессии и иммуногенности минигена могут потребоваться дополнительные модификации вектора. В некоторых случаях для эффективной экспрессии генов необходимы интроны, и при этом один или несколько синтетических или встречающихся в природе интронов можно включить в транскрибируемую область минигена. Для увеличения экспрессии минигена также можно рассматривать включение последовательностей для стабилизации mRNA. Недавно было высказано предположение, что иммуностимулирующие последовательности (ISS или CpG) выполняют роль в иммуногенности ДНК-вакцин. Эти последовательности можно включить в вектор за пределами кодирующей последовательности минигена, если обнаружено, что они усиливают иммуногенность.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать бицистронный вектор экспрессии, дающий возможность продуцировать кодируемые минигеном эпитопы и второй белок, включенный для усиления или уменьшения иммуногенности. Примеры белков или полипептидов, которые могут благотворно усиливать иммунный ответ при совместной экспрессии, включают цитокины (например, IL2, IL12, GM-CSF), цитокин-индуцирующие молекулы (например, LeIF) или костимулирующие молекулы. Эпитопы хелперов (HTL) можно соединить с сигналами внутриклеточного нацеливания и экспрессировать отдельно от эпитопов CTL. Это позволило бы направлять эпитопы HTL в клеточный компартмент, отличный от эпитопов CTL. При необходимости, это может способствовать более эффективному вхождению эпитопов HTL на путь MHC класса II, улучшая таким образом индукцию CTL. В отличие от индукции CTL, специфическое снижение иммунного ответа путем совместной экспрессии иммуносупрессивных молекул (например, TGF-β) может быть полезным при определенных заболеваниях.
Когда вектор экспрессии выбран, миниген клонируют в область полилинкера ниже промотора. Эту плазмиду трансформируют в соответствующий штамм E. coli и получают ДНК с использованием стандартных методов. Ориентацию и последовательность ДНК минигена, а также всех других элементов, включенных в вектор, подтверждают с использованием рестрикционного картирования и анализа последовательности ДНК. Бактериальные клетки, несущие правильную плазмиду, можно хранить в виде главного банка клеток и рабочего банка клеток.
Для инъекции с использованием различных составов можно получить очищенную плазмидную ДНК. Простейшим из них является восстановление лиофилизированной ДНК в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Были описаны различные способы, и новые методы могут стать доступными. Как отмечено в данном документе, нуклеиновые кислоты обычно составляют с катионными липидами. Кроме того, гликолипиды, фузогенные липосомы, пептиды и соединения, вместе называемые защитными, интерактивными, неконденсирующимися (PINC), также можно объединять с очищенной плазмидной ДНК для воздействия на такие переменные, как стабильность, внутримышечная дисперсия или перемещение в определенные органы или типы клеток.
Сенсибилизацию клетки-мишени можно использовать в качестве функционального анализа экспрессии и презентации MHC класса I эпитопов CTL, кодируемых минигеном. Плазмидную ДНК вводят в клеточную линию млекопитающих, которая пригодна в качестве мишени для стандартных анализов CTL с высвобождением хрома. Используемый способ трансфекции зависит от конечного состава. Электропорацию можно использовать для "голой" ДНК, тогда как катионные липиды допускают прямую трансфекцию in vitro. Плазмиду, экспрессирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP), можно котрансфицировать для обогащения трансфицированных клеток с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Затем эти клетки метят хромом-51 и используют в качестве клеток-мишеней для эпитоп-специфичных линий CTL. Цитолиз, обнаруженный по высвобождению 51 Cr, указывает на продуцирование презентации MHC эпитопов CTL, кодируемых минигеном.
Иммуногенность in vivo является вторым подходом к функциональному тестированию составов на основе ДНК минигенов. Трансгенных мышей, экспрессирующих соответствующие молекулы МНС человека, иммунизируют ДНК-продуктом. Доза и путь введения зависят от состава (например, IM для ДНК в PBS, IP для ДНК в комплексе с липидами). Спустя двадцать один день после иммунизации спленоциты собирают и рестимулируют в течение 1 недели в присутствии пептидов, кодирующих каждый тестируемый эпитоп. Эти эффекторные клетки (CTL) анализируют на цитолиз нагруженных пептидом клеток-мишеней, меченых хромом-51, с использованием стандартных методов. Лизис клеток-мишеней, сенсибилизированных загрузкой MHC пептидов, соответствующих эпитопам, которые кодируются минигеном, демонстрирует работу ДНК-вакцины по индукции CTL in vivo.
Пептиды можно также использовать для выявления CTL ex vivo. Полученные CTL можно использовать для лечения хронических опухолей у пациентов, нуждающихся в этом, у которых нет ответа на другие общепринятые формы терапии или нет ответа на подход к терапии с помощью пептидной вакцины. Ответы CTL ex vivo на конкретный опухолевый антиген индуцируют инкубацией в тканевой культуре клеток-предшественников CTL (CTLp) пациента вместе с источником антигенпрезентирующих клеток (APC) и соответствующего пептида. После соответствующего времени инкубации (обычно 1-4 недели), за которое CTLp активируются и созревают, а также размножаются в эффекторные CTL, клетки вводят обратно пациенту, где они разрушают свою специфичную клетку-мишень (т.е. опухолевую клетку) Чтобы оптимизировать условия in vitro для выработки специфичных цитотоксичных Т-клеток, культуру клеток-стимуляторов поддерживают в соответствующей бессывороточной среде.
Перед инкубацией клеток-стимуляторов с активируемыми клетками, например клетками-предшественниками CD8+, в культуру клеток-стимуляторов добавляют некоторое количество антигенного пептида, достаточное для загрузки на молекулы класса I человека, которые должны экспрессироваться на поверхности клеток-стимуляторов. В настоящем изобретении достаточное количество пептида представляет собой количество, которое обеспечивает возможность приблизительно 200, а предпочтительно 200 или больше молекулам МНС класса I человека, нагруженных пептидом, экспрессироваться на поверхности каждой клетки-стимулятора. Предпочтительно клетки-стимуляторы инкубируют с >2 мкг/мл пептида. Например, клетки-стимуляторы инкубируют с > 3, 4, 5, 10, 15 или больше мкг/мл пептида.
Затем покоящиеся клетки CD8+ или их предшественников инкубируют в культуре с соответствующими клетками-стимуляторами в течение периода времени, достаточного для активации CD8+ клеток. Предпочтительно, CD8+ клетки активируют антигенспецифичным образом. Отношение покоящихся CD8+ (эффекторных) клеток или их предшественников к клеткам-стимуляторам может варьироваться от индивидуума к индивидууму и может дополнительно зависеть от таких переменных, как восприимчивость лимфоцитов индивидуума к условиям культивирования, а также характер и тяжесть болезненного состояния или другого состояния, для которого используют процедуру лечения в рамках описанной. Однако предпочтительно, в случае если соотношение лимфоциты : клетки-стимуляторы находится в диапазоне от приблизительно 30: 1 до 300: 1. Культуру эффектора/стимулятора можно поддерживать в течение длительного времени, которое необходимо для стимуляции терапевтически пригодного или эффективного количества CD8+ клеток.
Индукция CTL in vitro требует специфического распознавания пептидов, которые связаны с аллельспецифичными молекулами МНС класса I на APC. Количество специфичных комплексов MHC/пептид на APC имеет решающее значение для стимуляции CTL, особенно при первичных иммунных ответах. Хотя небольшие количества комплексов пептид/МНС на клетку достаточны для того, чтобы сделать клетку восприимчивой к лизису с помощью CTL или стимулировать вторичный ответ CTL, успешная активация предшественника CTL (pCTL) во время первичного ответа требует значительно большего числа комплексов МНС/пептид. Загрузка пептидами пустых молекул главного комплекса гистосовместимости на клетках обеспечивает возможность индукции первичных ответов цитотоксичных Т-лимфоцитов.
Поскольку мутантных клеточных линий для каждого аллеля человеческого MHC не существует, то целесообразно применять метод удаления эндогенных МНС-ассоциированных пептидов с поверхности APC с последующей загрузкой полученных пустых молекул MHC иммуногенными пептидами, представляющими интерес. Применение нетрансформированных (неонкогенных), неинфицированных клеток и, предпочтительно, аутологичных клеток пациентов в качестве APC является желательным для составления протоколов индукции CTL, направленных на разработку терапии с CTL ex vivo. В настоящей заявке раскрыты способы снятия эндогенных МНС-ассоциированных пептидов с поверхности APC с последующей загрузкой требуемых пептидов.
Стабильная молекула МНС класса I представляет собой тримерный комплекс, состоящий из следующих элементов: 1) пептид, обычно из 8-10 остатков, 2) трансмембранная тяжелая полиморфная белковая цепь, которая несет сайт связывания пептида в своих доменах a1 и a2, и 3) нековалентно связанная неполиморфная легкая цепь, p2-микроглобулин. Удаление связанных пептидов и/или диссоциация р2-микроглобулина из комплекса делает молекулы МНС класса I нефункциональными и нестабильными, что приводит к быстрому разложению. Все молекулы МНС класса I, выделенные из РВМС, имеют связанные с ними эндогенные пептиды. Поэтому первым стадией является удаление всех эндогенных пептидов, связанных с молекулами МНС класса I, на APC без их разложения до того, как к ним смогут присоединиться экзогенные пептиды.
Два возможных способа освобождения молекул MHC класса I от связанных пептидов включают снижение температуры культивирования с 37°C до 26°C в течение ночи для дестабилизации р2-микроглобулина и снятие эндогенных пептидов с клетки с использованием мягкой кислотной обработки. В этих способах высвобождают ранее связанные пептиды во внеклеточную среду, давая возможность новым экзогенным пептидам связываться с пустыми молекулами класса I. Способ низкотемпературной инкубации дает возможность экзогенным пептидам эффективно связываться с комплексом МНС, однако требует инкубации в течение ночи при 26°С, что может замедлить скорость метаболизма клеток. Также вероятно, что клетки, не активно синтезирующие молекулы МНС (например, покоящиеся РВМС), не будут приводить к образованию больших количеств пустых поверхностных молекул МНС низкотемпературным методом.
Грубое кислотное снятие включает экстракцию пептидов трифторуксусной кислотой, рН 2, или кислотную денатурацию иммуноаффинно очищенных комплексов класс I-пептид. Эти способы нецелесообразны для индукции CTL, так как важно удалить эндогенные пептиды, сохраняя жизнеспособность APC и оптимальное метаболическое состояние, которое имеет решающее значение для презентации антигена. Для идентификации эндогенных пептидов и идентификации опухолеассоциированных Т-клеточных эпитопов использовали мягкие кислотные растворы с рН 3, такие как глициновый или цитратно-фосфатный буферы. Обработка является особенно эффективной, поскольку дестабилизируются только молекулы МНС класса I (и высвобождаются ассоциированные пептиды), тогда как другие поверхностные антигены остаются интактными, в том числе молекулы МНС класса II. Самое главное, что обработка клеток мягкими кислотными растворами не влияет на жизнеспособность или метаболическое состояние клетки. Мягкая кислотная обработка является быстрой, так как снятие эндогенных пептидов происходит за две минуты при 4°C, и APC готова выполнять свою функцию после загрузки соответствующих пептидов. В данном документе методику используют для получения пептидспецифичных APC для создания первичных антигенспецифичных CTL. Полученные APC эффективны для индукции пептидспецифичных CD8+ CTL.
Активированные CD8+ клетки можно эффективно отделять от клеток-стимуляторов с использованием одного из множества известных способов. Например, моноклональные антитела, специфичные для клеток-стимуляторов, для пептидов, загружаемых на клетки-стимуляторы, или для клеток CD8+ (или их части), можно использовать для связывания их подходящего комплементарного лиганда. Затем меченые антителом молекулы можно экстрагировать из смеси стимулятор-эффекторная клетка с помощью соответствующих средств, например, с помощью известных способов иммунопреципитации или иммуноанализа.
6
12
8
11
9
10
6
7
Эффективные цитотоксические количества активированных CD8+ клеток могут варьироваться между применениями in vitro и in vivo, а также количеством и типом клеток, которые являются конечной целью этих клеток-киллеров. Количество может также варьироваться в зависимости от состояния пациента и должно определяться с учетом всех соответствующих факторов практикующим специалистом-практиком. Однако, предпочтительно для взрослых людей используют от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10, более предпочтительно от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 и еще более предпочтительно от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 активированных CD8+ клеток по сравнению с приблизительно 5 × 10 - 5 × 10 клеток, используемых у мышей.
Предпочтительно, как обсуждалось в данном документе, активированные CD8+ клетки собирают из культуры клеток перед введением CD8+ клеток индивидууму, получающему лечение. Однако важно отметить, что в отличие от других существующих и предлагаемых способов лечения, в настоящем способе используют систему клеточной культуры, которая не является онкогенной. Поэтому, если не достигается полное разделение клеток-стимуляторов и активированных CD8+ клеток, то нет никакой присущей опасности, которая, как известно, связана с введением небольшого количества клеток-стимуляторов, тогда как введение клеток млекопитающего, способствующих опухоли, может быть чрезвычайно опасным.
Способы повторного введения клеточных компонентов известны из уровня техники и включают такие процедуры, как представленные в патенте США № 4844893, выданном Honsik et al., и в патенте США № 4690915, выданном Rosenberg. Например, подходящим является введение активированных CD8+ клеток путем внутривенной инфузии.
Практическое осуществление настоящего изобретения предусматривает, если не указано иное, общепринятые методики молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации квалифицированного специалиста. Такие методы полностью объясняются в литературе, например, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Wei, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Эти методы применимы к получению полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению и, как таковые, могут быть рассмотрены при изготовлении и осуществлении настоящего изобретения. Особенно полезные методы для конкретных вариантов осуществления обсуждаются в следующих разделах.
Терапевтические способы
Настоящее изобретение предусматривает способы индуцирования специфического иммунного ответа против неоплазии/опухоли у субъекта, вакцинации против неоплазии/опухоли, лечения и/или облегчения симптома рака у субъекта путем введения субъекту вакцины против неоплазии, или неоантигенного пептида, или композиции по настоящему изобретению.
В соответствии с настоящим изобретением описанные в данном документе вакцинную или иммуногенную композиции против неоплазии можно применять в отношении пациента, у которого был диагностирован рак или он подвергается риску развития рака. В одном варианте осуществления у пациента может быть солидная опухоль, такая как рак молочной железы, яичника, предстательной железы, легкого, почки, желудка, толстой кишки, яичка, головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланома и другие опухоли органов и тканей, а также гематологические опухоли, такие как лимфомы и лейкозы, в том числе острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфоцитарный Т-клеточный лейкоз и лимфомы В-клеток.
Пептид или композицию по настоящему изобретению вводят в количестве, достаточном для индуцирования ответа CTL.
Композиции и способы, описанные в данном документе, можно использовать для пациентов, нуждающихся в этом, с любой формой рака в соответствии с общим технологическим процессом, показанным на фиг. 2. Пациенты, нуждающиеся в этом, могут получить серию примирующих вакцинаций со смесью персонализированных опухолеспецифичных пептидов. Кроме того, примирование в течение 4-недельного периода может сопровождаться двумя стимулированиями на протяжении поддерживающей фазы. Все вакцины доставляют подкожно. Вакцину или иммуногенную композиции оценивают в отношении безопасности, переносимости, иммунного ответа и клинического эффекта у пациентов, а также в отношении осуществимости получения вакцины или иммуногенной композиции и успешного начала вакцинации в соответствующих временных рамках. Первая когорта может состоять из 5 пациентов, и после того как будет надлежащим образом продемонстрирована безопасность, в исследование может быть включена дополнительная когорта из 10 пациентов. Периферическую кровь подвергают всестороннему мониторингу в отношении пептидспецифичных T-клеточных ответов, и пациентов отслеживают в течение периода до двух лет для оценки рецидива заболевания.
Наборы или совместная упаковка вакцинной или иммуногенной композиций
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает наборы, содержащие любой один или несколько из элементов, обсуждаемых в данном документе, для обеспечения введения иммуногенной композиции или вакцины. Элементы могут быть предоставлены отдельно или в комбинациях и могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере, как например, ампуле, флаконе или пробирке. В некоторых вариантах осуществления набор включает инструкции на одном или нескольких языках, например, на нескольких языках. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько реагентов для применения в способе, в котором используется один или несколько элементов, описанных в данном документе. Реагенты могут быть предоставлены в любом подходящем контейнере. Например, набор может предусматривать один или несколько буферов для доставки или буферов для хранения. Реагенты могут быть предоставлены в форме, которая применима в конкретном процессе, или в форме, которая предусматривает добавление одного или нескольких других компонентов перед применением (например, в форме концентрата или лиофилизированной форме). Буфер может быть любым буфером, в том числе без ограничения буфером с карбонатом натрия, буфером с бикарбонатом натрия, боратным буфером, Трис-буфером, буфером MOPS, буфером HEPES и их комбинациями. В некоторых вариантах осуществления буфер является щелочным. В некоторых вариантах осуществления буфер характеризуется значением pH от приблизительно 7 до приблизительно 10. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько векторов, белков и/или один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе. Преимущественно набор может обеспечивать наличие всех элементов систем по настоящему изобретению. Наборы могут включать в себя вектор(-ы) и/или частицу(-ы) и/или наночастицу(-ы), содержащие или кодирующие РНК для 1-50 или больше неоантигенных мутаций, которые должны вводиться животному, млекопитающему, примату, грызуну и т.д. с помощью такого набора, включающего в себя инструкции по введению такому эукариоту, а также инструкции для применения с любым из способов по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления набор содержит по меньшей мере один флакон с иммуногенной композицией или вакциной. В одном варианте осуществления наборы могут содержать готовые к применению компоненты, которые смешиваются и готовы к применению. Готовая к применению иммуногенная или вакцинная композиции могут содержать отдельные флаконы, содержащие различные пулы иммуногенных композиций. Иммуногенные композиции могут содержать один флакон, содержащий вирусный вектор или ДНК-плазмиду, а другой флакон может содержать иммуногенный белок. В другом варианте осуществления набор может содержать иммуногенную композицию или вакцину в готовой к восстановлению форме. Иммуногенную или вакцинную композиции можно лиофилизировать. Набор может содержать отдельный флакон с буфером для восстановления, который можно добавить в лиофилизированную композицию, чтобы она была готова к введению. Буфер может преимущественно содержать адъювант или эмульсию в соответствии с настоящим изобретением. В другом варианте осуществления набор может содержать отдельные флаконы, содержащие дозу иммуногенной композиции. В другом аспекте несколько флаконов включены таким образом, что один флакон вводят в соответствии с графиком лечения. В дополнительном варианте осуществления флаконы помечены для их правильного введения пациенту, нуждающемуся в этом. Иммуноген может быть в лиофилизированной форме, в высушенной форме или в водном растворе, как описано в данном документе. Иммуноген может представлять собой живой аттенуированный вирус, белок или нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе.
В другом варианте осуществления набор может содержать отдельные флаконы иммуногенной композиции для использования в примировании иммунного ответа и другую иммуногенную композицию, которая должна применяться для стимулирования. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для примирования может представлять собой ДНК или вирусный вектор, а иммуногенная композиция для стимулирования может представлять собой белок. Любая композиция может быть лиофилизированной или готовой к введению.
Хотя настоящее изобретение и его преимущества были описаны подробно, следует понимать, что в данном документе могут быть сделаны различные изменения, замены и переделки без отхода от сущности и объема настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах, которые приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом.
Примеры
Пример 1
Протокол тестирования противораковой вакцины
Композиции и способы, описанные в данном документе, можно тестировать на 15 пациентах с меланомой с высоким риском рецидива (полностью резецированной на стадиях IIIB, IIIC и IVM1a, b) в соответствии с общим технологическим процессом, показанным на фиг. 2. Пациенты могут получать серии примирующих вакцинаций смесью индивидуальных опухолеспецифичных пептидов и поли-ICLC в течение периода 4 недели с последующими двумя стимулирующими иммунизациями на протяжении поддерживающей фазы. Все вакцины доставляли подкожно. Вакцинную или иммуногенную композиции оценивали в отношении безопасности, переносимости, иммунного ответа и клинического эффекта у пациентов, а также в отношении осуществимости получения вакцины или иммуногенной композиции и успешного начала вакцинации в соответствующих временных рамках. Первая когорта могла состоять из 5 пациентов, и после того как была надлежащим образом продемонстрирована безопасность, в исследование могла быть включена дополнительная когорта из 10 пациентов. Периферическую кровь подвергали всестороннему мониторингу в отношении пептидспецифичных T-клеточных ответов, и пациентов отслеживали в течение периода до двух лет для оценки рецидива заболевания.
Как описано в данном документе, существуют многочисленные данные как от животных, так и от людей о том, что мутантные эпитопы являются эффективными в индуцировании иммунного ответа, и что случаи спонтанной регрессии опухоли или длительного выживания коррелируют с ответами CD8+ T-клеток на мутантные эпитопы (Buckwalter and Srivastava PK. "It is the antigen(s), stupid" and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296-300 (2008); Karanikas et al, High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 61:3718-3724 (2001); Lennerz et al, The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci U S A.102:16013 (2005)), и что "иммуноредактирование" может быть сопряжено с изменениями в экспрессии антигенов с доминантной мутацией у мышей и человека (Matsushita et al, Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); и Sampson et al, Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)).
С помощью секвенирования нового поколения в настоящее время можно быстро выявить наличие дискретных мутаций, таких как кодирующие мутации в отдельных опухолях, наиболее часто единичные аминокислотные изменения (например, миссенс-мутации) и менее часто новые фрагменты из аминокислот, образуемые посредством вставок/делеций/слияний генов со сдвигом рамки считывания, мутации сквозного прочитывания в стоп-кодонах и трансляция неправильно сплайсированных интронов (например, neoORF). НеоORF являются особенно ценными в качестве иммуногенов, поскольку вся их последовательность является совершенно новой для иммунной системы, и, следовательно, они являются аналогичными вирусному или бактериальному чужеродным антигенам. Таким образом, neoORF: (1) являются высокоспецифичными для опухоли (т.е. их экспрессия отсутствует в каких-либо нормальных клетках); (2) способны обходить механизмы центральной толерантности с увеличением таким образом частоты встречаемости предшественников неоантигенспецифичных CTL. Например, эффективность использования аналогичных чужеродных последовательностей в терапевтической противораковой вакцине недавно была продемонстрирована с пептидами, полученными из вируса папилломы человека (HPV). У ~50% из 19 пациентов с предраковым заболеванием, индуцированным вирусом, которые получали 3-4 вакцинации смесью пептидов HPV, полученных из вирусных онкогенов E6 и E7, сохранялся полный ответ в течение ≥24 месяцев (Kenter et al, Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia NEJM 361:1838 (2009)).
С помощью технологии секвенирования было выявлено, что каждая опухоль содержала несколько пациент-специфичных мутаций, которые изменяют белок-кодирующую часть гена. Такие мутации создают измененные белки в диапазоне от единичных аминокислотных изменений (вызываемых миссенс-мутациями) до добавления длинных областей с новыми аминокислотными последовательностями вследствие сдвигов рамки считывания, сквозного прочитывания терминирующих кодонов или трансляции интронных областей (мутации образования новой открытой рамки считывания; neoORF). Эти мутантные белки являются ценными мишенями для иммунного ответа организма-хозяина на опухоль, поскольку, в отличие от нативных белков, они не подвергаются эффектам иммунного ослабления аутотолерантности. Таким образом, мутантные белки с большей долей вероятности являются иммуногенными, а также являются более специфичными к опухолевым клеткам по сравнению с нормальными клетками пациента.
С использованием недавно усовершенствованных алгоритмов предсказания того, какие миссенс-мутации создают пептиды, характеризующиеся сильным связыванием с когнатными молекулами MHC пациента, проводили идентификацию и расстановку приоритетов для набора пептидов, представляющих оптимальные мутантные эпитопы (как с neoORF, так и с миссенс) для каждого пациента, и получали до 20 или больше пептидов для иммунизации (Zhang et al, Machine learning competition in immunology - Prediction of HLA class I binding peptides J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)). Синтезировали пептиды длиной ~20-35 аминокислот, поскольку эти "длинные" пептиды подвергаются эффективной интернализации, процессингу и перекрестной презентации в "профессиональных" антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, и, как было показано, индуцируют ответы CTL у людей (Melief and van der Burg, Immunotherapy of established (pre) malignant disease by synthetic long peptide vaccines Nature Rev Cancer 8:351 (2008)).
В дополнение к сильнодействующему и специфичному иммуногену, эффективный иммунный ответ преимущественно подразумевает использование сильного адъюванта для активации иммунной системы (Speiser and Romero, Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy, and protective T cell immunity Seminars in Immunol 22:144 (2010)). Например, Toll-подобные рецепторы (TLR) оказались мощными датчиками "сигналов опасности" от микробных и вирусных патогенов, эффективно индуцируя ответ врожденной иммунной системы и, в свою очередь, адаптивной иммунной системы (Bhardwaj and Gnjatic, TLR AGONISTS: Are They Good Adjuvants? Cancer J. 16:382-391 (2010)). Среди агонистов TLR поли-ICLC (синтетический миметик двухнитевой РНК) является одним из наиболее действенных активаторов дендритных клеток миелоидного происхождения. В исследовании с участием людей-добровольцев было продемонстрировано, что поли-ICLC является безопасным и индуцирует экспрессию генов в клетках периферической крови, профиль которой сравним с таковым при индукции с помощью одной из наиболее действенных живых аттенуированных вирусных вакцин, вакцины YF-17D на основе вируса желтой лихорадки (Caskey et al, Synthetic double-stranded RNA induces innate immune responses similar to a live viral vaccine in humans J Exp Med 208:2357 (2011)). В качестве адъюванта используют Hiltonol, GMP-препарат поли-ICLC, производимый Oncovir, Inc.
Пример 2
Целевая популяция пациентов
Пациенты с меланомой на стадии IIIB, IIIC и IVM1a, b имеют значительный риск рецидива заболевания и смерти даже при полной хирургической резекции заболевания (Balch et al, Final Version of 2009 AJCC Melanoma Staging and Classification J Clin Oncol 27:6199 - 6206 (2009)). Доступным средством системной адъювантной терапии для данной популяции пациентов является интерферон-α (IFNα), который обеспечивает измеримый, но несущественный благоприятный эффект и связан со значительной и часто дозолимитирующей токсичностью (Kirkwood et al, Interferon alfa-2b Adjuvant Therapy of High-Risk Resected Cutaneous Melanoma: The Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684 J Clin Oncol 14:7-17 (1996); Kirkwood et al, High- and Low-dose Interferon Alpha-2b in High-Risk Melanoma: First Analysis of Intergroup Trial E1690/S9111/C9190 J Clin Oncol 18:2444 - 2458 (2000)). У этих пациентов не был ослаблен иммунитет предшествующей терапией, направленной на рак, или активной формой рака, и таким образом они являлись превосходной популяцией пациентов, в которой надлежало оценить безопасность и иммунологическое влияние вакцины. Наконец, существующий стандарт оказания медицинской помощи для этих пациентов не предписывал какого-либо лечения после хирургического вмешательства, что обеспечивало таким образом 8-10-недельное окно для получения вакцины.
Целевой популяцией являлись пациенты с меланомой кожи, имеющие клинически выявляемые гистологически подтвержденные узловые (местные или отдаленные) или перемещающиеся метастазы, которые были подвергнуты полной резекции и не имели заболевания (большинство на стадии IIIB (ввиду необходимости в наличии надлежащей опухолевой ткани для секвенирования и создания линий клеток пациентов с изъязвленной первичной опухолью и в то же время с микрометастазами в лимфатических узлах (T1-4b, N1a или N2a) исключают), все на стадии IIIC и на стадии IVM1a, b). Это могли быть пациенты с впервые установленным диагнозом или с рецидивом заболевания после предшествующего диагностирования меланомы на ранней стадии.
Сбор опухоли: пациентов можно подвергать полной резекции их первичной меланомы (если она уже не была удалена) и всех регионарных метастазов заболевания для того, чтобы избавить их от меланомы. После сбора надлежащего количества опухоли для патологической оценки оставшуюся ткань опухоли помещали в стерильную среду в стерильном контейнере и подготавливали для дезагрегации. Части ткани опухоли использовали для полноэкзомного и транскриптомного секвенирований и образования линий клеток, и любую оставшуюся часть опухоли замораживали.
Сбор нормальной ткани: образец нормальной ткани (образец крови или мокроты) отбирали для полноэкзомного секвенирования.
Пациентов с клинически очевидными местно-регионарными метастазами заболевания или доступными для полной резекции отдаленными узловыми, кожными или легочными метастазами заболевания (но при отсутствии нерезектабельных отдаленных или висцеральных метастазов заболевания) идентифицировали и включали в исследование. Зачисление пациентов до хирургического вмешательства необходимо для получения свежей ткани опухоли для создания линии клеток меланомы (с целью образования целевых клеток для анализов цитотоксичности in vitro в качестве части плана иммунологического мониторинга).
Пример 3
Доза и схема
Для пациентов, удовлетворяющих всем предлечебным критериям, введение вакцины могло начинаться в как можно более короткие сроки после поступления исследуемого лекарственного средства и удовлетворения его входным характеристикам. Для каждого пациента имелось четыре отдельных исследуемых лекарственных средства, каждое из которых содержит 5 из 20 пациент-специфичных пептидов. Иммунизации в целом могли происходить согласно схеме, показанной на фиг. 3.
Пациенты получали лечение в поликлинике. Иммунизация в каждый день лечения могла состоять из четырех подкожных инъекций объемом 1 мл, каждую из которых вводили в отдельную конечность для нацеливания на разные участки лимфатической системы с целью снижения антигенной конкуренции. Если пациент был подвергнут полному иссечению подмышечных или паховых лимфатических узлов, то вакцины в качестве альтернативы вводили в правую или левую верхнюю часть живота. Каждая инъекция могла состоять из 1 из 4 исследуемых лекарственных средств для данного пациента, и в каждом цикле одно и то же исследуемое лекарственное средство инъецировали в одну и ту же конечность. Состав для каждой инъекции объемом 1 мл являлся следующим:
0,75 мл исследуемого лекарственного средства, содержащего 300 мкг каждого из 5 пациент-специфичных пептидов;
0,25 мл (0,5 мг) 2 мг/мл поли-ICLC (Hiltonol).
Во время фазы индукции/примирования пациентов иммунизировали в дни 1, 4, 8, 15 и 22. В поддерживающей фазе пациенты могли получать стимулирующие дозы в недели 12 и 24.
Образцы крови можно было получать в несколько моментов времени: до вакцинации (исходный уровень; два образца в разные дни); в день 15 в ходе примирующей вакцинации; через четыре недели после индукционной/примирующей вакцинации (неделя 8); до (неделя 12) и после (неделя 16) первой стимулирующей; до (неделя 24) и после (неделя 28) второй стимулирующей; для каждого образца собирали 50-150 мл крови (за исключением недели 16). Первичную иммунологическую конечную точку определяли в неделю 16, и с этого момента пациентов можно было подвергать лейкаферезу (если не указано иное на основании оценки пациента и врача).
Пример 4
Иммунологический мониторинг
Стратегия иммунизации представляет собой подход "примирование/стимулирование", включающий начальную серию иммунизаций с коротким интервалом между ними для индукции иммунного ответа с последующим периодом отдыха для обеспечения возможности формирования T-клеток памяти. За этим следовала бустерная иммунизация, и согласно ожиданиям T-клеточный ответ через 4 недели после этой стимулирующей иммунизации порождал наиболее сильный ответ и являлся первичной иммунологической конечной точкой. Мониторинг глобального иммунного ответа изначально проводили с использованием мононуклеарных клеток периферической крови, полученных в данный момент времени, в 18-часовом анализе ELISPOT ex vivo со стимуляцией пулом перекрывающихся 15-мерных пептидов (перекрывание в 11 аминокислот), содержащих все иммунизирующие эпитопы. Образцы до вакцинации оценивали для установления исходного уровня ответа на этот пул пептидов. При необходимости, дополнительные образцы PBMC оценивали для изучения кинетики иммунного ответа на общую смесь пептидов. Для пациентов, демонстрирующих ответы, значительно превышающие исходный уровень, пул всех 15-мерных пептидов разворачивали для определения того, какой конкретный иммунизирующий пептид(-ы) были иммуногенными. В дополнение, для соответствующих образцов проводили ряд дополнительных анализов в зависимости от конкретного случая.
• Полный пул или подпулы 15-мерных пептидов применяли в качестве стимулирующих пептидов для анализов внутриклеточного окрашивания цитокинов с целью идентификации и количественной оценки популяций антигенспецифичных CD4+, CD8+, центральных клеток памяти и эффекторных клеток памяти.
• Аналогичным образом, эти пулы применяются для оценки профиля цитокинов, секретируемых этими клетками, для определения TH1 в зависимости от фенотипа TH2.
• Внеклеточное окрашивание цитокинов и проточную цитометрию нестимулированных клеток применяли для количественной оценки Treg и супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC).
• Если линия клеток миеломы была успешно получена от пациента, отвечающего на лечение, и можно было идентифицировать активирующий эпитоп, то проводили анализы в отношении T-клеточной цитотоксичности с использованием мутантного пептида и соответствующего пептида дикого типа.
• PBMC из первичной иммунологической конечной точки оценивали в отношении "распространения эпитопа" путем использования известных опухолеассоциированных антигенов меланомы в качестве стимуляторов и путем использования нескольких дополнительных идентифицированных мутантных эпитопов, которые не были выбраны как принадлежащие к иммуногенам, как показано на фиг. 4.
Иммуногистохимическое исследование образца опухоли осуществляли для количественной оценки инфильтрирующих популяций CD4+, CD8+, MDSC и Treg.
Пример 5
Получение неоантигена
После хирургической резекции опухоли часть ткани опухоли и образец крови незамедлительно переносили в помещение, в котором им присваивали уникальный идентификационный код для дальнейшего отслеживания. Ткань опухоли подвергали дезагрегации коллагеназой, и отдельные части замораживали для экстракции нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Образец крови незамедлительно переносили в помещение для экстракции нуклеиновых кислот. ДНК и/или РНК, экстрагированные из ткани опухоли, использовали для полноэкзомного секвенирования (например, путем использования платформы Illumina HiSeq) и для определения информации о типировании HLA. В пределах объема настоящего изобретения предполагается, что неоантигенные пептиды с миссенс-мутацией или neoORF можно непосредственно идентифицировать с помощью методик на основе белков (например, масс-спектрометрии).
Биоинформационные анализы проводили следующим образом. При анализе последовательностей экзома и РНК в файлах SEQ и FASTQ эффективно использовали существующие биоинформационные конвейеры, которые обширно применялись и подтверждались в крупномасштабных проектах, таких как TCGA, для множества образцов от пациентов (например, Chapman et al, 2011, Stransky et al, 2011, Berger et al, 2012). Существуют две последовательные категории анализов: обработка данных и анализ ракового генома.
Конвейер обработки данных. Конвейер обработки данных Picard (picard.sourceforge.net/) был разработан Sequencing Platform. Необработанные данные для каждого образца опухоли и нормального образца извлекали из секвенаторов (например, Illumina) и подвергали следующим процессам с использованием разнообразных модулей конвейера Picard.
(i) Преобразование данных: необработанные данные Illumina преобразовывали в стандартный формат BAM, и генерировали основные метрические показатели QC, относящиеся к распределению оснований, превышающие различные пороговые показатели качества.
(ii) Выравнивание: инструмент выравнивания Барроуза-Уилера (BWA) применяли для выравнивания пар ридов с геномом человека (hg19).
(iii) Маркировка дубликатов: ПЦР-дубликаты и оптические дубликаты идентифицировали по картированным положениям пар ридов и маркировали в конечном BAM-файле.
(iv) Повторное выравнивание со вставками/делециями: изучали риды, выровненные с известными полиморфными сайтами вставок и делеций в геноме, и осуществляли корректировку по тем сайтам, в которых показатель логарифма отношения шансов (LOD) для улучшения после повторного выравнивания составлял по меньшей мере 0,4.
(v) Пересмотр качества: исходные показатели качества распознавания оснований согласно данным конвейера Illumina пересматривали, исходя из количества циклов для рида, дорожки, ячейки проточной кюветы, рассматриваемого основания и предыдущего основания. Пересмотр предполагал, что все несовпадения в положениях, отличных от представленных в dbSNP, обусловлены ошибками, которые создавали условия для проведения пересмотра вероятности ошибки в каждой категории, представляющей интерес, в виде доли несовпадений среди общего количества наблюдений.
(vi) Контроль качества: конечный BAM-файл обрабатывали с генерированием исчерпывающих метрических показателей QC, включающих качество рида в зависимости от цикла, распределение показателей качества, обобщенные показатели выравнивания и распределение вставок по размеру. Данные, не прошедшие QC по качеству, заносили в список блокировок.
(vii) Подтверждение идентичности: для подтверждения идентичности образца, независимо друг от друга собранные данные о генотипе образца по ~100 известным положениям SNP сверяли с данными о последовательности. Для подтверждения идентичности показатель LOD ≥10 использовали в качестве порогового значения. Данные, не прошедшие QC по идентичности, заносили в список блокировок.
(viii) Агрегирование данных: все данные от одного и того же образца объединяли, и стадию маркировки дубликатов повторяли. Идентифицировали новые целевые области, содержащие предполагаемые короткие области вставок и делеций, и по этим локусам осуществляли стадию повторного выравнивания со вставками/делециями.
(ix) Повторное локальное выравнивание по предполагаемым вставкам/делециям в агрегированных данных: идентифицировали новые целевые области, содержащие предполагаемые короткие вставки и делеции, и осуществляли стадию повторного локального выравнивания по этим локусам (например, с помощью модулей GATK RealignerTargetCreator и IndelRealigner) для обеспечения согласованности и корректности распознавания вставок/делеций.
(x) Контроль качества в отношении агрегированных данных: метрические показатели QC, такие как обобщенные показатели выравнивания и распределение вставок по размеру, пересчитывали. Дополнительно генерировали набор метрических показателей, которые оценивали скорость образования окислительного повреждения на ранних стадиях процесса конструирования библиотеки, вызываемого акустической фрагментацией ДНК в присутствии реакционноспособных загрязнителей из процесса экстракции.
Выходным результатом работы Picard являлся BAM-файл (Li et al, 2009) (см., например, http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf), в котором хранятся последовательности оснований, показатели качества и подробности выравнивания для всех ридов по данному образцу.
Конвейер выявления мутаций, связанных с раком. Анализировали BAM-файлы для образцов опухолей и соответствующих нормальных образцов из конвейера Picard согласно описанному в данном документе.
1. Контроль качества
(i). В отношении экзомов из образцов опухолей и экзомов соответствующих нормальных образцов применяли программу CapSeg для получения профилей числа копий. Инструмент CopyNumberQC можно затем применять для изучения сгенерированных профилей в ручном режиме и оценки смесей образцов опухолей/нормальных образцов. Нормальные образцы, имеющие зашумленные профили, а также случаи, в которых образец опухоли характеризовался меньшей изменчивостью числа копий, чем соответствующий нормальный образец, помечали и отслеживали посредством конвейеров генерирования и анализа данных для проверки на наличие смесей.
(ii). Чистоту и плоидность опухолей оценивали с помощью инструмента ABSOLUTE 15 на основе профилей числа копий, генерируемых CapSeg. Очень зашумленные профили могли получаться в результате секвенирования образцов с высокой степенью разрушения. В таких случаях оценки чистоты и плоидности опухолей не были возможными, и соответствующий образец помечали.
(iii). ContEst (Cibulskis et al, 2011) использовали для определения уровня перекрестного загрязнения образцов в образцах. Образцы с более чем 4% загрязнением исключали.
2. Идентификация соматических однонуклеотидных вариаций (SSNV)
Соматические замены пар оснований идентифицировали с помощью анализа BAM для образцов опухолей и соответствующих нормальных образцов от пациента с помощью байесовской базовой статистической системы, называемой muTect (Cibulskis et al, 2013). На стадии предварительной обработки риды с преобладанием оснований с низким качеством распознавания или несовпадений с геномом отфильтровывали. Затем с помощью MuTect рассчитывали два показателя логарифма отношения шансов (LOD), которые отражали достоверность присутствия и отсутствия варианта соответственно в образцах опухолей и нормальных образцах. На стадии постобработки кандидатные мутации фильтровали с помощью шести фильтров для учета артефактов захвата, секвенирования и выравнивания.
(i) Проксимальный гэп: удалял ложноположительные результаты, проистекающие из наличия невыровненных вставок/делеций вблизи объекта. Образцы с ≥3 ридами со вставками или делециями в окне на 11 п. о. вблизи места кандидатной мутации-кандидата отклоняли.
(ii) Низкокачественное картирование: исключали ложноположительные результаты, проистекающие из неопределенного размещения ридов в геноме. Исключали кандидатов, если ≥50% ридов в образцах опухолей и нормальных образцах характеризовались нулевым качеством картирования или если отсутствовали риды, несущие мутантный аллель с качеством картирования ≥20.
(iii) Трехаллельные сайты: исключали сайты, которые являлись гетерозиготными в нормальном образце, поскольку они склонны давать множество ложноположительных результатов.
(iv) Смещение нити: удаляли ложноположительные результаты, обусловленные ошибками секвенирования в конкретной ситуации, где большая доля ридов, несущих мутацию, имела одну и ту же ориентацию. Отклоняли кандидатов, у которых специфичный для нити LOD составлял <2, где чувствительность к прохождению этого порога составляла ≥90%.
(v) Кластеризация в положениях: отклоняли ложноположительные результаты, обусловленные ошибками выравнивания, которые характеризовались наличием альтернативного аллеля на фиксированном расстоянии от начала или конца выравнивания ридов. Отклоняли, если медианное расстояние от начала и конца ридов составляло ≤10, что означает, что мутация находится в начале или в конце выравнивания, или если медианное абсолютное отклонение расстояний составляло ≤3, что означает, что мутации кластеризованы.
(vi) Наблюдали в контрольном образце: исключали ложноположительные результаты в опухоли, если существовали свидетельства наличия альтернативного аллеля в нормальном образце за рамками секвенирования, ожидаемого в результате случайных ошибок. Отклоняли, если существовало ≥2 ридов, содержащих альтернативный аллель в нормальном образце, или если они составляли ≥3% от ридов, и если сумма их показателей качества составляла >20.
В дополнение к этим 6 фильтрам, кандидатов сравнивали с панелью нормальных образцов, и тех из них, наличие которых в качестве генеративных вариантов было обнаружено в двух или больше нормальных образцах, отклоняли. Конечный набор мутаций можно затем аннотировать с помощью инструмента Oncotator по нескольким полям, включающим участок генома, кодон, кДНК и изменения белка.
3. Идентификация небольших соматических вставок и делеций
Выходной результат повторного локального выравнивания, описанный в данном документе (см. выше "Повторное локальное выравнивание по предполагаемым вставкам/делециям в агрегированных данных"), использовали для предсказания соматических и генеративных кандидатных вставок/делеций на основании оценки ридов, поддерживающих вариант, из BAM исключительно в образцах опухолей или, соответственно, как в образцах опухолей, так и в нормальных образцах. Осуществляли дополнительную фильтрацию по количеству и распределению несовпадений и показателей качества распознавания оснований (McKenna et al, 2010, DePristo et al, 2011). Для обеспечения высокой точности распознавания все вставки/делеции изучали в ручном режиме с помощью Integrated Genomics Viewer (Robinson et al, 2011) (www.broadinstitute.org/igv).
4. Выявление слияния генов
Первой стадией в конвейере выявления слияния генов являлось выравнивание ридов из секвенирования РНК образцов опухолей с библиотекой известных последовательностей генов с последующим картированием этого выравнивания по геномным координатам. Картирование генома способствовало объединению нескольких пар ридов, картированных в различные варианты транскриптов, обладающие общими экзонами в одних и тех же местоположениях в геноме. В BAM-файле с выровненными ДНК делали запрос на пары ридов, в которых два парных элемента картированы на две различные кодирующие области, располагающихся в разных хромосомах или на расстоянии по меньшей мере 1 млн. п. о. друг от друга в случае, если они находятся в одной и той же хромосоме. Также может потребоваться, чтобы спаренные концы, выровненные по их соответствующим генам, располагались в направлении, соответствующем направлению кодирования 5'- > 3'-конец (предполагаемого) слитого mRNA-транскрипта. Перечень пар генов, в которых существует по меньшей мере две таких "химерных" пары ридов, пронумерован в виде первоначального перечня предполагаемых объектов, подлежащего дополнительному улучшению. Затем все невыровненные риды извлекали из исходного BAM-файла с дополнительным ограничением, заключающимся в том, что их парные элементы должны были быть изначально выровнены и картированы на один из генов в парах генов, полученных как описано в данном документе. Затем можно предпринять попытку выравнивания всех этих изначально невыровненных ридов со специально разработанной "эталонной" последовательностью, составленной из всех возможных экзон-экзонных сочленений (полной длины, граница к границе, в направлении кодирования 5'- > 3'-конец) среди обнаруженных пар генов. Если один такой изначально невыровненный рид картирован (уникальным образом) на сочленение между экзоном гена X и экзоном гена Y, а парный ему элемент был в действительности картирован на один из генов X или Y, то такой рид маркировали как "слитый" рид. Объекты слитых генов распознавали в тех случаях, если существовал по меньшей мере один слитый рид в правильной ориентации относительно парного ему элемента без избыточного количества несовпадений около сочленения экзон:экзон и с охватом по меньшей мере 10 п. о. в любом гене. Слияния генов между высокогомологичными генами (за исключением семейства HLA) вероятно являлись ложными, и их отфильтровывали.
5. Оценка клональности
Биоинформационный анализ можно применять для оценки клональности мутаций. Например, алгоритм ABSOLUTE (Carter et al, 2012, Landau et al, 2013) можно применять для оценки чистоты, плоидности опухолей, абсолютного числа копий и клональности мутаций. Генерировали плотность распределения вероятностей аллельных фракций для каждой мутации с последующим преобразованием в доли раковых клеток (CCF) с мутациями. Мутации классифицировали как клональные или субклональные, исходя из того, составляет ли апостериорная вероятность того, что их CCF превышает 0,95, больше или меньше 0,5, соответственно.
6. Количественная оценка экспрессии
Пакет программ TopHat (Langmead et al, 2009) применяли для выравнивания ридов из секвенирования РНК для BAM опухолей и соответствующих нормальных образцов с геномом hg19. Качество данных секвенирования РНК оценивали с помощью пакета программного обеспечения RNA-SeQC (DeLuca et al., 2012). Затем инструмент RSEM (Li et al., 2011) можно применять для оценки уровней экспрессии генов и изоформ. Сгенерированные риды на тысячу пар оснований на миллион и оценки тау-коэффициентов использовали для расстановки приоритетов для неоантигенов, идентифицированных у каждого пациента, как описано в другом месте данного документа.
7. Подтверждение мутаций в секвенировании РНК
8. Подтверждение соматических мутаций, идентифицированных с помощью анализа данных полноэкзомного секвенирования, как описано в данном документе (в том числе однонуклеотидных вариаций, небольших вставок, а также делеций и слияний генов), оценивали путем изучения соответствующего BAM-файла пациента с секвенированием РНК опухолей. Для каждого варианта локуса выполняли расчет мощности на основе бета-биномиального распределения для обеспечения по меньшей мере 95% мощности для его выявления в данных секвенирования РНК. Идентифицированная путем захвата мутация считалась подтвержденной, если существовали по меньшей мере 2 рида, несущих мутацию в сайтах с надлеждащим образом подсчитанной мощностью.
Отбор опухолеспецифичных эпитопов, содержащих мутации: все образцы с миссенс-мутациями и neoORF анализировали на наличие эпитопов, содержащих мутации, с помощью алгоритма нейронной сети NetMHC, предоставляемого и поддерживаемого Центром анализа биологических последовательностей, Датский технический университет, Нидерланды. Это семейство алгоритмов получило наиболее высокий рейтинг алгоритмов предсказания эпитопов на основании недавно завершившегося соревнования среди ряда родственных подходов (см.). Алгоритмы изучали с применением подхода на основе искусственной нейронной сети на 69 различных аллелях HLA A и B человека, охватывающих 99% аллелей HLA-A и 87% аллелей HLA-B, обнаруживаемых в популяции европеоидной расы, наиболее крупной этнической группе в целевой популяции пациентов в местной зоне. Использовали самую последнюю версию (v2.4).
Точность алгоритмов оценивали с помощью проведения предсказаний по мутациям, обнаруживаемым у пациентов с CLL, для которых известны аллотипы HLA. Были включены аллотипы A0101, A0201, A0310, A1101, A2402, A6801, B0702, B0801, B1501. Предсказания были сделаны для всех 9-мерных и 10-мерных пептидов, охватывающих каждую мутацию, с помощью NetMHCpan в середине 2011 г. На основании этих предсказаний синтезировали семьдесят четыре (74) 9-мерных пептида и шестьдесят три (63) 10-мерных пептида, большинство из которых характеризовались предсказанными значениями аффинности ниже 500 нМ, и аффинность связывания измеряли с помощью анализа конкурентного связывания (Sette).
Предсказания для этих пептидов повторяли в марте 2013 г. с использованием каждой из самых последних версий серверов NetMHC (NetMHCpan, NetMHC и NetMHCcons). Эти три алгоритма были наиболее высокорейтинговыми алгоритмами среди группы из 20 используемых в соревновании в 2012 г. (Zhang et al). Затем наблюдаемые значения аффинности связывания оценивали относительно каждого из новых предсказаний. Для каждого набора предсказанных и наблюдаемых значений приводился % правильных предсказаний для каждого диапазона, а также количество образцов. Определения для каждого диапазона являлись следующими.
0-150: наличие предсказанной аффинности, равной 150 нМ или более низкой, и наличие измеренной аффинности, равной 150 нМ или более низкой.
0-150*: наличие предсказанной аффинности, равной 150 нМ или более низкой, и наличие измеренной аффинности, равной 500 нМ или более низкой.
151-500 нМ: наличие предсказанной аффинности, превышающей 150 нМ, однако равной 500 нМ или более низкой, и наличие измеренной аффинности, равной 500 нМ или более низкой.
FN (>500 нМ): ложноотрицательные результаты - наличие предсказанной аффинности, превышающей 500 нМ, однако наличие измеренной аффинности, равной 500 нМ или более низкой.
Для 9-мерных пептидов (таблица 1) наблюдалось небольшое различие между алгоритмами, при этом незначительно более высокое значение для диапазона 151-500 нМ в случае с NetMHCcons не считалось значимым ввиду малого количества образцов.
Таблица 1
Диапазон (nM)
9-мерный PAN
9-мерный netMHC
9-мерный CONS
0-150
76%(33)
78%(37)
76%(34)
0-150*
91%(33)
89%(37)
88%(34)
151-500
50%(28)
50%(14)
62%(13)
FN (>500)
38%(13)
39%(23)
41%(27)
Для 10-мерных пептидов (таблица 2) вновь наблюдалось небольшое различие между алгоритмами, за исключением того, что NetMHC давал значительно больше ложноположительных результатов, чем NetMHCpan или NetMHCcons. Тем не менее, точность предсказаний для 10-мерных пептидов являлась незначительно более низкой в диапазонах 0-150 нМ и 0-150* нМ и значительно более низкой в диапазоне 151-500 нМ по сравнению с 9-мерными.
Таблица 2
Диапазон (nM)
10-мерный PAN
10-мерный netMHC
10-мерный CONS
0-150
53%(19)
50%(16)
59%(17)
0-150*
68%(19)
69%(16)
76%(17)
151-500
35%(26)
42%(12)
35%(23)
FN (>500)
11%(18)
23%(35)
13%(23)
Для 10-мерных пептидов использовали только предсказания в диапазоне 0-150 нМ ввиду менее чем 50% точности для связывающих веществ в диапазоне 151-500 нМ.
Количество образцов для любого отдельного аллеля HLA было слишком маленьким, чтобы сделать какие-либо выводы относительно точности алгоритма предсказания для различных аллелей. Данные из наибольшей доступной подгруппы (0-150* нМ; 9-мерные) показаны в таблице 3 в качестве примера.
Таблица 3
Аллель
Доля правильных предсказаний
A0101
2/2
A0201
9/11
A0301
5/5
A1101
4/4
A2402
0/0
A6801
3/4
B0702
4/4
B0801
1/2
B1501
2/2
Использовали только предсказания для аллелей HLA A и B, поскольку имелось мало доступных данных для того, чтобы на их основании судить о точности предсказаний для аллелей HLA C (Zhang et al).
Оценку информации о меланомной последовательности и предсказаний в отношении связывания пептидов проводили с использованием информации из базы данных TCGA. На основании информации о 220 образцах меланомы от различных пациентов было выявлено, что в среднем на пациента приходилось примерно 450 образцов с миссенс-мутациями и 5 образцов с neoORF. Случайным образом отбирали 20 пациентов, и рассчитывали предсказанные значения аффинности связывания для всех образцов с миссенс-мутациями и neoORF с помощью NetMHC (Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)). Поскольку аллотипы HLA для этих пациентов были неизвестными, то количество предсказанных связывающих пептидов на аллотип корректировали по частоте встречаемости этого аллотипа (согласно набору данных из реестра доноров костного мозга для ожидаемой пораженной доминирующей популяции в данной географической зоне [европеоидная раса для меланомы]) с генерированием предсказанного количества функционирующих мутантных эпитопов на пациента. Для каждого из этих мутантных эпитопов (MUT) также предсказывали связывание с соответствующим нативным (NAT) эпитопом.
Использование расстановки приоритетов, описанное в данном документе:
• у 90% (18 из 20) пациентов было предсказано наличие по меньшей мере 20 пептидов, подходящих для вакцинации;
• примерно у четверти пациентов пептиды, полученные из neoORF, могли составлять от половины до всех 20 пептидов;
• у немного больше половины пациентов могли использоваться только пептиды из категорий 1 и 2;
• у 80% пациентов могли использоваться только пептиды из категорий 1, 2 и 3.
Таким образом, существовало достаточное количество мутаций в меланоме, чтобы ожидать высокой доли пациентов, у которых образовывалось достаточное количество иммуногенных пептидов.
Пример 6
Получение и составление пептидов
Неоантигенные GMP-пептиды для иммунизации получали с помощью химического синтеза (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963) в соответствии с предписаниями FDA. Были проведены три прогона разработки по 20 ~20-30-мерных пептидов в каждом. Каждый прогон проводили в том же помещении и с использованием того же оборудования, которое применяли для прогонов GMP с использованием черновой GMP-документации на партию. В каждом прогоне успешно получали >50 мг каждого пептида, которые тестировали с использованием всех планируемых в настоящее время тестов при выпуске (например, проверка внешнего вида, идентификация с помощью MS, определение чистоты с помощью RP-HPLC, анализ содержания с помощью элементарного азота и анализ содержания TFA с помощью RP-HPLC), и при необходимости обеспечивали удовлетворение целевым характеристикам. Продукты также получали в пределах временных рамок, предполагаемых для этой части процесса (примерно 4 недели). Лиофилизированные пептиды в объеме отправляли на долгосрочное исследование стабильности и оценивали в разнообразные моменты времени в течение периода до 12 месяцев.
Материал из этих прогонов применяли для тестирования запланированного подхода с растворением и смешиванием. Вкратце, каждый пептид растворяли при высокой концентрации (50 мг/мл) в 100% DMSO и разбавляли до 2 мг/мл в водном растворителе. Изначально предполагалось, что в качестве разбавителя будет применяться PBS, однако высаливание большого количества пептидов вызывало видимое помутнение. Было показано, что D5W (5% декстроза в воде) является намного более эффективной; 37 из 40 пептидов успешно разбавлялись до прозрачного раствора. 10% сахароза или 10% трегалоза в воде также являлись эффективными. Состав, содержащий 10% сахарозу или 10% трегалозу, являлся лиофилизируемым, в отличие от состава, содержащего 5% декстрозу. Проблемными пептидами являлись лишь очень гидрофобные пептиды.
В таблице 4 показаны результаты оценки растворимости 60 потенциальных неоантигенных пептидов, отсортированных на основании расчетной доли гидрофобных аминокислот. Как показано, практически все пептиды с долей гидрофобных аминокислот ниже 0,4 являлись растворимыми в DMSO/D5W, однако ряд пептидов с долей гидрофобных аминокислот, превышающей или равной 0,4, не были растворимыми в DMSO/D5W (что указано знаком "+" в столбце, помеченном как "Растворимость в DMSO/D5W"). Несколько их можно солюбилизировать путем добавления сукцината (что указано знаком "++" в столбце "Растворимость в DMSO/D5W/сукцинате"). 3 из 4 этих пептидов имели долю гидрофобных аминокислот от 0,4 до 0,43. Четыре пептида становились менее растворимыми при добавлении сукцината; 3 из 4 этих пептидов имели долю гидрофобных аминокислот, превышающую или равную 0,45.
Оценивали предсказанные биохимические свойства запланированных для иммунизации пептидов, и планы синтеза могли быть соответствующим образом изменены (использование более короткого пептида, смещение участка, подлежащего синтезу, в N- или C-концевых направлениях вблизи предсказанного эпитопа или возможное использование альтернативного пептида) в целях ограничения количества пептидов с высокой долей гидрофобных аминокислот.
o
o
Десять отдельных пептидов в DMSO/D5W подвергали двум циклам замораживания/размораживания, и они продемонстрировали полное извлечение. Два отдельных пептида растворяли в DMSO/D5W и отправляли на исследование стабильности при двух значениях температуры (-20C и -80C). Эти пептиды оценивали (RP-HPLC, а также pH и визуальный осмотр) в течение периода до 24 недель. Оба пептида являлись стабильными в течение периода до 24 недель; процентная доля примесей, выявляемых с помощью анализа по методу RP-HPLC, значительно не изменялась для какого-либо пептида при хранении при -20°C либо -80°C. Любые небольшие изменения, по-видимому, обусловлены вариативностью анализа, поскольку не было отмечено никаких подлежащих оценке тенденций.
Как показано на фиг. 5, план процесса получения лекарственных форм заключался в получении 4 пулов пациент-специфичных пептидов, каждый из которых содержал 5 пептидов. Для оценки этих смесей пептидов подготавливали и сертифицировали анализ по методу RP-HPLC. В данном анализе достигалось хорошее разделение нескольких пептидов в одной смеси, и его можно применять также для количественного определения отдельных пептидов.
Мембранную фильтрацию (размер пор 0,2 мкм) применяли для снижения бионагрузки и проведения заключительной стерилизующей фильтрации. Изначально оценивали четыре различных типа фильтров соответствующего размера, и был выбран фильтр Pall из PES (№ 4612). К тому времени были получены 4 различных смеси с 5 различными пептидами в каждой и по отдельности последовательно профильтрованы через два фильтра из PES. Извлечение каждого отдельного пептида оценивали с использованием анализа по методу RP-HPLC. Для 18 из 20 пептидов извлечение после двух фильтраций составляло >90%. Для двух высокогидрофобных пептидов извлечение составляло менее 60% при оценке в малом масштабе, однако они практически полностью извлекались (87% и 97%) в требуемом масштабе. Как указано в данном документе, предпринимались подходы для ограничения гидрофобной природы выбранных последовательностей.
Пул пептидов (пул 4), состоящий из пяти пептидов, получали путем растворения в DMSO, разбавления D5W/сукцинатом (5 мМ) до 2 мг/мл и объединения в пул до конечной концентрации пептидов, составляющей 400 мкг на мл, и конечной концентрации DMSO, составляющей 4%. После получения пептиды фильтровали через фильтр Pall из PES диаметром 25 мм (№ по кат. 4612) и отмеряли во флаконы Nunc Cryo (№ 375418) аликвотами по одному мл. Образцы анализировали в нулевой момент времени и через 2 и 4 недели до данной даты. Дополнительные образцы анализировали через 8 и 24 недели. При -80ºC не наблюдалось каких-либо значительных изменений в HPLC-профилях или профиле примесей для пула пептидов 4 в момент времени четыре недели. Вплоть до момента времени 4 недели при визуальном наблюдении и в отношении pH пула пептидов изменений не происходило.
Пример 7
Синтез пептидов
GMP-пептиды синтезировали с помощью стандартных химических средств твердофазного синтеза пептидов (например, с использованием синтезаторов пептидов CS 536 XT) и очищали с помощью RP-HPLC. Каждый отдельный пептид анализировали с помощью разнообразных сертифицированных анализов для оценки внешнего вида (визуальной), чистоты (с помощью RP-HPLC), идентичности (с помощью масс-спектрометрии), количества (с помощью элементарного азота) и противоиона трифторацетата (с помощью RP-HPLC) и высвобождали.
Индивидуальные неоантигенные пептиды могли состоять из отдельных пептидов, уникальных для каждого пациента, в количестве до 20. Каждый пептид мог представлять собой линейный полимер из ~20 - ~30 L-аминокислот, соединенных стандартными пептидными связями. Амино-конец мог представлять собой первичный амин (NH2-), а карбокси-конец представлять собой карбонильную группу (-COOH). Использовали 20 стандартных аминокислот, обычно обнаруживаемых в клетках млекопитающих (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин). Молекулярный вес каждого пептида варьировался в зависимости от его длины и последовательности и рассчитывался для каждого пептида.
Во всех реакциях синтеза использовали аминокислоты с N-концевой защитной Fmoc- (9-флуоренилметилоксикарбонильной) группой. Боковые цепи аминокислот при необходимости имеют защитные 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильную (Pbf), трифенилметильную (Trt), трет-бутилоксикарбонильную (Boc) или трет-бутилэфирную (tBu) группы. Все аминокислоты в объеме растворяли в диметилформамиде (DMF). При конденсации использовали следующие две комбинации катализаторов в отдельных реакциях:
Диизопропилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазол (DIC/HOBT)
Диизопропилэтиламин/2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (DIEA/HBTU)
Каждую аминокислоту подвергали двум реакциям связывания для обеспечения высокого уровня включения. В первой реакции связывания использовали DIC/HOBT в течение 2-6 часов, а во второй реакции связывания использовали DIEA/HBTU в течение 1-2 часов. Мониторинг каждой из двух реакций связывания осуществляли по поглощению UV-излучения, и между циклами связывания смолу тщательно промывали с помощью DMF для улучшения эффективности. После двух циклов связывания расчетная эффективность связывания должна составлять по меньшей мере 95% для продолжения в следующем цикле. Дополнительный синтез любых пептидов, который не удовлетворял этому минимальному значению эффективности связывания, останавливали.
После связывания всех аминокислот смолу дважды промывали DMF и затем три раза метанолом. Затем смолу подвергали непродолжительному вакуумному высушиванию, в ходе которого она по-прежнему находилась в реакционном сосуде, и затем переносили в новый тарированный сосуд для вакуумного высушивания (в течение более 12 часов) до тех пор, пока она не становилась свободнотекучей. Массу синтезированного неочищенного пептида определяли с помощью взвешивания сосуда, содержащего высушенную смолу, вычитания массы тарированного сосуда и корректировки по массе смолы. Ожидаемые значения выхода массы находился в диапазоне 60% - 90%. Любой синтез, в ходе которого не удавалось получить по меньшей мере 200 мг неочищенного пептида, прекращали. Высушенную смолу можно было хранить при 4°C в течение периода до 28 дней до начала отщепления.
Реакцию отщепления осуществляли в отдельной комнате. Перед переносом набора пациент-специфичных высушенных смол из камеры для синтеза в комнату для отщепления проводили полную сертификацию комнаты для отщепления службой по QA для синтеза нового GMP-продукта. Сертификация предусматривала осмотр производственной линии на предмет чистоты, проверку очистки GMP-комплекса, подготовку всех необходимых материалов и лабораторной посуды, проверку пригодности и маркировки оборудования и проверку того, что весь необходимый персонал надлежащим образом обучен и сертифицирован для проведения работы, а также надлежащим образом переодет и не имеет видимых признаков болезни.
Операции проверки подготовленности комнаты начинали с проверки оборудования, подлежащего использованию (ротационного испарителя, вакуумного насоса, весов), и осмотра документации, в которой указано, что оборудование было надлежащим образом очищено и откалибровано (при необходимости). Полный перечень всех необходимых исходных материалов (TFA, триизопропилсилан (TIS) и 1,2-этандитиол) выдался службой по QA при изготовлении, и в нем указывался номер серии, подлежащей использованию, дата повторного теста или срок годности и количество материала, отмеряемого для ежедневных реакций.
Отщепление пептидной цепи от смолы и отщепление защитных групп боковых цепей осуществляли в кислых условиях (95% TFA) в присутствии 2% триизопропилсилана (TIS) и 1% 1,2-этандитиола в качестве улавливателей свободных радикалов, образуемых кислотами, в течение 3-4 часов при комнатной температуре.
Смолу отделяли от свободного неочищенного пептида с помощью фильтрации. Конечный раствор высвобожденного и лишенного защитных групп пептида подвергали осаждению эфиром, и осадок подвергали сублимационному высушиванию в течение 12 часов. Выход высвобожденного неочищенного пептида определяли с помощью взвешивания порошка, подвергнутого сублимационному высушиванию, и расчета соотношения высвобожденный неочищенный пептид/пептид, связанный со смолой. Ожидаемые значения выхода неочищенного пептида составляли от 200 мг до 1000 мг. Любую реакцию отщепления, в ходе которой не удавалось получить по меньшей мере 200 мг неочищенного пептида, прекращали. Затем неочищенный пептид переносили в комплекс для очистки.
Очистку осуществляли в отдельной комнате. Перед переносом набора высушенных неочищенных пептидов из комнаты для отщепления в комнату для очистки проводили полную сертификацию комнаты для очистки службой по контролю качества для синтеза нового GMP-продукта. Сертификация предусматривала осмотр производственной линии на предмет чистоты, проверку очистки GMP-комплекса, подготовку всех необходимых материалов и лабораторной посуды, проверку пригодности и маркировки оборудования и проверку того, что весь необходимый персонал надлежащим образом обучен и сертифицирован для проведения работы, а также надлежащим образом переодет и не имеет видимых признаков болезни.
Операции проверки подготовленности комнаты начинали с проверки оборудования, подлежащего использованию (прибора для препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [RP-HPLC], весов, прибора для аналитической жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS), лиофилизатора, весов), и осмотра документации, в которой указано, что оборудование было надлежащим образом очищено и откалибровано (при необходимости). Полный перечень всех необходимых исходных материалов (трифторуксусная кислота [TFA], ацетонитрил [ACN], вода) выдавался службой по QA при изготовлении, и в нем указывался номер серии, подлежащей использованию, дата повторного теста или срок годности и количество материала, отмеряемого для ежедневных реакций.
Очистку начинали, растворяя не более 200 мг высвобожденного пептида, подвергнутого сублимационному высушиванию, в ACN. Затем образец дополнительно разбавляли водой до 5% - 10% ACN. Добавляли TFA до конечной концентрации, составляющей 0,1%. Перед началом работы с каждым набором пациент-специфичных пептидов заново упаковывали одну колонку C-18 для RP-HPLC (10 см x 250 см). Перед загрузкой пептида пациента колонки тщательно промывали 5% ацетонитрилом, содержащим 0,1% TFA. Максимальное количество пептида, загружаемого в одну колонку, составляло 200 мг. Мониторинг работы колонок осуществляли по поглощению UV-излучения при 220 нм. После загрузки одного пептида, обеспечивали возможность образцу поступить в колонку, и колонку промывали 5% ацетонитрилом/0,1% TFA. Для элюирования пептида использовали градиент 10% - 50% ацетонитрила в 0,1% TFA. Фракции собирали (по 50 мл в каждой), начиная с момента, в который наблюдаемое поглощение UV-излучения на 20% превышало исходный уровень. Фракции продолжали собирать до тех пор, пока UV-поглощающий материал не переставал элюироваться из колонки или градиент не завершался. Как правило, главный элюируемый пик разделяли на 4-8 фракций.
Каждую отдельную фракцию оценивали с помощью аналитической LC/MS. Условия анализа выбирали, исходя из процентной концентрации ацетонитрила, связанной с пиком элюируемого продукта. Фракции с ожидаемой массой и чистотой, превышающей или равной 95%, объединяли в пул в качестве пептидного продукта. Как правило, этому требованию к объединению в пул удовлетворяли 2-4 фракции. Объединенный в пул пептид помещали в тарированную банку для сублимационного высушивания и подвергали сублимационному высушиванию в течение 24-72 часов. Массу лиофилизированного пептида определяли с помощью определения массы банки, содержащей пептид, подвергнутый сублимационному высушиванию, и вычитания массы тарированной банки.
Части пептида, подвергнутого сублимационному высушиванию, передавали на контроль качества для анализа и распределения. Оставшуюся часть хранили при -20°C до дальнейшей обработки.
Любые пептиды, для которых ни одна из фракций не удовлетворяла требованию 95% чистоты, исключали. При этом могла иметь место повторная обработка фракций, полученных с помощью RP-HPLC. Если имелось достаточное количество неочищенного пептида, подвергнутого сублимационному высушиванию и отщеплению, то на колонке можно было очистить второй образец пептида, корректируя условия градиента для улучшения чистоты элюируемого пептида.
Затем колонку можно было очистить от какого-либо оставшегося пептида с помощью тщательного промывания 4 объемами колонки 100% ACN/0,1% TFA и затем повторно уравновесить 5% ACN/0,1% TFA перед загрузкой следующего пептида.
Пептиды для отдельного пациента последовательно обрабатывали на той же колонке. На одной колонке обрабатывали не более 25 пептидов.
Таким образом, элементарными операциями для изготовления лекарственного вещества являлись следующие.
Синтез
Конденсация, промывка и повторная конденсация для каждой аминокислоты
Промывание и вакуумное высушивание смолы
Перенос в комплекс для отщепления
Отщепление
Кислотное отщепление от смолы
Отделение высвобожденного пептида от смолы и осаждение пептида
Перенос в комплекс для очистки
Очистка
Растворение в ацетонитриле и очистка с помощью RP-HPLC
Сублимационное высушивание пиковых фракций в течение 24-72 часов
Выбор аликвот для QC-тестирования и хранение оставшегося лиофилизированного продукта
Индивидуальные неоантигенные пептиды могли поставляться в коробке, содержащей флаконы Nunc Cryo объемом 2 мл с цветокодированными колпачками, при этом каждый флакон содержал примерно 1,5 мл замороженного раствора DMSO/D5W, содержащего до 5 пептидов в концентрации, составляющей 400 мкг/мл. Для каждой из четырех групп пептидов могло предусматриваться 10-15 флаконов. Флаконы подлежали хранению при -80ºC до использования. Текущие исследования стабильности подтвердили температуру и время хранения.
Хранение и стабильность: индивидуальные неоантигенные пептиды хранили замороженными при -80ºC. Размороженные внутрипроизводственные промежуточные продукты, подвергнутые стерилизующей фильтрации, и конечную смесь индивидуальных неоантигенных пептидов и поли-ICLC можно было выдерживать при комнатной температуре, однако следовало использовать течение периода 4 часов.
Совместимость: индивидуальные неоантигенные пептиды смешивали с 1/3 объема поли-ICLC непосредственно перед использованием.
Пример 8
Тестирование составов
В растворе пула пептидов для определенных пептидов в некоторых условиях наблюдали помутнение или осаждение. В связи с этим оценивали эффект слабых буферов в отношении растворимости и стабильности пептидов.
Было обнаружено, что смешивание поли-ICLC и пула пептидов (в D5W с DMSO) иногда приводило к помутнению или осаждению, возможно вследствие низкого pH раствора поли-ICLC, в частности в случае с гидрофобными пептидами. В целях повышения pH раствора пептидов тестировали буферы и оценивали эффект в отношении растворимости пептидов. На основании результатов первоначального тестирования тестировали цитратный и сукцинатный буферы.
Было обнаружено, что улучшенная растворимость наблюдалась для 3 из 4 пептидов, в отдельности имевших проблемы с растворимостью в D5W. На основании этого первоначального наблюдения оценивали 19 дополнительных пептидов с цитратом или сукцинатом и 4 дополнительных пептида с сукцинатом в отдельности. Было обнаружено, что растворы 18 из 19 тестируемых пептидов были прозрачными в случае использования либо цитрата натрия (при тестировании), либо сукцината натрия в качестве буфера (ни один из четырех пептидов, оцениваемых в сукцинате в отдельности, не демонстрировал помутнение).
Было обнаружено, что концентрации сукцината от 2 мМ до 5 мМ являются эффективными. Извлечение пептида было улучшенным для одного пептида в сукцинатном буфере, но не в цитратном буфере. В зависимости от пула пептидов и применяемой концентрации сукцинатного буфера значение pH растворов пептидов в D5W/сукцинате находилось в диапазоне от приблизительно 4,64 до приблизительно 6,96.
После оценки в общей сложности 27 пептидов (в том числе изначально группы из 4 пептидов, трудно поддающейся солюбилизированию) было обнаружено, что один пептид воспроизводимо демонстрировал помутнение во всех условиях, и один дополнительный пептид демонстрировал незначительное помутнение, однако поддавался полному извлечению при фильтрации. Оба из этих двух пептидов характеризовались высокой гидрофобностью.
В целом было обнаружено, что пептиды, которые являются прозрачными при разбавлении до 2 мг/мл в D5W с сукцинатным буфером, сохраняют прозрачность при смешивании с другими пептидами (это обычно справедливо для пептидов в D5W в отдельности).
В ходе репрезентативной процедуры пептиды взвешивали с введением поправки на % содержания пептида, а затем растворяли в DMSO до концентрации 50 мг/мл. Затем раствор пептиды/DMSO разбавляли с помощью 5 мМ сукцината натрия в D5W до концентрации пептидов, составляющей 2 мг/мл.
Тестировали дополнительные условия растворимости пептидов. Каждый из пептидов CS6709, CS6712, CS6720, CS6726 и CS6783 весил примерно 10 мг. Затем пептиды растворяли примерно в 200 мкл чистого согласно требованиям USP DMSO с получением 50 мг/мл концентрации каждого пептида. Заявители наблюдали, что пептид CS6709 при 10,02 мг не полностью растворялся в DMSO в количестве 200 мкл, рассчитанном для получения 50 мг/мл. Образец оказался мутным. К пептиду CS6709 добавляли дополнительные добавки по 50 мкл DMSO в количестве до 400 мкл с получением в общей сложности 600 мкл DMSO. CS6709 переходил в раствор (прозрачный), в случае если количество DMSO достигало 600 мкл, а концентрация составляла 16,67 мг/мл.
Для разбавления пептидов до 400 мкг получали раствор PBS с pH 7,4 без калия. Все 5 образцов пептидов в DMSO (50 мг/мл) помещали в один флакон для разбавления до 400 мкг/мл. Каждый пептид в DMSO добавляли во флакон при 40 мкл, за исключением CS6709, концентрация которого составляла 16,67 мг/мл. Объем CS6709, добавляемого в один флакон, составлял 120 мкл. Образцы разбавляли до 400 мкг путем добавления 4,72 мл PBS с pH 7,4. При добавлении PBS с pH 7,4 наблюдали, что один или несколько пептидов выпадали в осадок.
Для определения того, какие из пептидов осаждались, заявители руководствовались матрицей, представленной в таблице 5 ниже, применяя очень небольшие количества (10-20 мкл) пептидов, растворенных в DMSO, и добавляя эти пептиды к разнообразным жидкостям.
Таблица 5. Матрица разбавителей для пептидов
Пептид
Липосома
PBS pH 7,4
Вода
10% сахароза
D5W (5% декстрозадля инъекций, чистая согласно требованиям USP)
CS6709
NP
NP
NP
NP
NP
CS6712
NP
NP
NP
NP
NP
CS6720
NP
NP
NP
NP
NP
CS6726
NP
NP
NP
NP
NP
CS6783
P
P
NP
NP
NP
P = осаждение; NP = отсутствие осаждения
Было обнаружено, что CS6783 осаждался в тех случаях, когда в качестве разбавителя к смеси пептидов добавляли PBS с pH 7,4. D5W для инъекций, чистая согласно требованиям USP, представляет собой разбавитель, используемый вместо PBS с pH 7,4.
В дополнение, заявители тестировали небольшое количество каждого пептида (<1 мг), чтобы увидеть, можно ли какой-либо из 5 пептидов растворить в D5W без использования DMSO. Пептиды CS6709, CS6712, CS6720 и CS6726 можно было растворять непосредственно в D5W. CS6783 нельзя растворить с использованием D5W.
Пример 9
Составление
Составы для каждого пациента содержали до 20 пептидов, получаемых по отдельности в качестве иммуногенов. Для вакцинации получали четыре пула (до 5 пептидов в каждом) для инъекции в отдельные участки с нацеливанием на различные части лимфатической системы, как обсуждается в данном документе. Отдельные пептиды взвешивали, растворяли в DMSO при высокой концентрации, разбавляли с помощью 5% декстрозы в воде (D5W) и сукцината натрия (4,8-5 мМ) и смешивали в четыре пула. Отдельные пулы фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для снижения бионагрузки, отбирали аликвотами во флаконы и замораживали. Замороженные флаконы хранили замороженными до использования.
Как описано в данном документе, набор пациент-специфичных пептидов, составляющих лекарственные вещества, по отдельности получали, лиофилизировали, тестировали и высвобождали, а также хранили после изготовления. Для получения этих пептидов для инъекции, четыре группы, в каждой из которых содержались до 5 различных пептидов, идентифицировали для объединения в пул.
Пример 10
Получение вакцин
Взвешивание и растворение: исходя из веса брутто и содержания пептида, взвешивали 15 мг (чистый вес) или чуть больше каждого отдельного пептида и добавляли 100% чистого согласно требованиям USP DMSO (2:250 мкл) для достижения конечной концентрации пептида, составляющей 50 мг/мл. Согласно исследованиям по технической разработке >95% растворенных пептидов демонстрировали прозрачность на данном этапе.
Разбавление и смешивание: D5W, чистую согласно требованиям USP, содержащую 5 мМ сукцината натрия (D5W/Succ), получали и фильтровали (0,2 мкм) для использования в качестве разбавителя. 250 мкл каждого растворенного пептида разбавляюли с помощью D5W/Succ для снижения концентрации пептидов до 2 мг пептида/мл и доведения pH до примерно ~6,0. Любые пептиды, которые не демонстрировали прозрачности раствора, заменяли другими пептидами (или, если только дополнительные пептиды не имелись в наличии, раствором D5W/сукцината). Затем по 5,5 мл каждого разбавленного раствора пептидов объединяли в один пул, содержащий 5 пептидов, в котором концентрация каждого пептида составляла 400 мкг пептида/мл. Затем осуществляли первую из двух стадий фильтрации через мембрану с размером пор 0,2 мкм. Каждый пул втягивали в шприц Becton Dickinson (или эквивалентный) объемом 60 мл, оснащенный наконечником Luer-Lock и тупоконечной иглой 18 калибра. Иглу снимали и заменяли мембранным фильтром PALL из PES (полиэфирсульфона) диаметром 25 мм с размером пор 0,2 мкм (№ по каталогу PALL HP1002). Содержимое шприца переносили через фильтр в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл (Falcon № 352070 или эквивалентную). Отбирали аликвоту каждого пула для тестирования, и оставшуюся часть замораживали при -80°C. Оставшуюся часть каждого отдельного разбавленного пептида хранили при -20°C до завершения всего анализа.
Перевозка: замороженные пулы пептидов перевозили с использованием утвержденных контейнеров для перевозки и круглосуточного авиатранспорта.
Фильтрация и хранение: замороженные пулы размораживали и переносили в бокс биологической безопасности. Образец объемом 2 мл из размороженного пула тестировали в отношении стерильности и подвергали тестированию на наличие эндотоксинов. Оставшуюся часть основного объема раствора обрабатывали на второй из двух стадий фильтрации через мембрану с размером пор 0,2 мкм. Пептиды в объеме, объединенные в пул, втягивали в шприц Becton Dickinson (или эквивалентный) объемом 60 мл, оснащенный наконечником Luer-Lock и тупоконечной иглой 18 калибра. Иглу снимали и заменяли мембранным фильтром PALL из PES (полиэфирсульфон) диаметром 25 мм с размером пор 0,2 мкм (№ по каталогу PALL HP1002). Содержимое шприца переносили через фильтр в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл (Falcon № 352070 или эквивалентную). Затем аликвоты по 1,5 мл раствора пептидов переносили в асептических условиях в пятнадцать предварительно маркированных стерильных флаконов Nunc Cryo объемом 1,8 мл (№ по каталогу 375418). Флаконы закрывали одним из 4 цветокодированных колпачков. Для содействия идентификации для каждого из 4 пулов пептидов для одного пациента использовали свой цветокодированный колпачок. Флаконы маркировали именем пациента, номером медицинской карты, номером исследования, оригинальным буквенно-цифровым идентификатором продукта/образца и уникальным буквенно-цифровым идентификатором (A-D). Все флаконы замораживали при -80°C. Оставшиеся замороженные флаконы хранили до тех пор, пока во всех тестах при выпуске не достигались критерии приемлемости. Для пациентов не планировали иммунизацию до тех пор, пока все тесты при выпуске не завершались и продукт не был выпущен для продажи в аптеки.
В качестве альтернативы, в каждый день иммунизации один набор флаконов (четыре), которые еще не были подвергнуты стерилизующей фильтрации в боксе биологической безопасности, как описано в данном документе, размораживали и переносили в бокс биологической безопасности. Содержимое каждого флакона набирали в отдельные шприцы. Прикрепляли стерилизующий фильтр с размером пор 0,2 мкм, и содержимое переносили через фильтр в стерильный флакон. Фильтр снимали и проверяли на целостность. Затем 0,75 мл смеси пептидов набирали с помощью стерильного шприца и смешивали путем переноса из шприца в шприц с 0,25 мл поли-ICLC (Hiltonol).
Анализ: три теста (на внешний вид, идентичность и на содержание остаточных растворителей) проводили в качестве внутрипроизводственных тестов с аликвотой объединенных в пул пептидов. Тест на наличие эндотоксинов проводили с аликвотой размороженного пула пептидов перед заключительной фильтрацией. Стерильность анализировали в объединенных образцах конечного продукта из двух флаконов. Данный подход предпринимали для обеспечения доступности ключевой биохимической информации (о растворимости пептидов, идентичности каждого пика в каждом пуле и уровнях каких-либо остаточных растворителей) до проведения заключительной фильтрации. После получения пулов пептидов в объеме, объединенных в пул и профильтрованных, выполняли тестирование на наличие эндотоксинов и культивирование для выявления микроорганизмов для оценки микробиологической чистоты. Для применения продукта необходимо, чтобы он удовлетворял характеристикам в отношении наличия эндотоксинов. Любые положительные результаты в тесте с культивированием микробов исследовали в отношении влияния на применение продукта. Ключевой тест на безопасность, тест на стерильность, проводили с образцами во флаконах после заключительной фильтрации и помещения во флаконы, при этом образцы являлись наиболее близкими для применения пациентом.
Пример 11
Введение
После смешивания с индивидуальными неоантигенными пептидами/полипептидами, вакцину (например, пептиды + поли-ICLC) следует вводить подкожно.
Получение пулов индивидуальных неоантигенных пептидов/полипептидов: пептиды смешивали друг с другом в 4 пула, каждый из которых содержал до 5 пептидов. В основе критериев отбора для каждого пула лежал конкретный аллель MHC, связывание с которым предсказывалось для пептида.
Состав пулов: состав пулов выбирали с учетом конкретного аллеля HLA, связывание с которым предсказывалось для пептида. Четыре пула инъецировали в анатомические участки, из которых они перетекали в отдельные лимфатические коллекторы. Данный подход был выбран в целях потенциального снижения антигенной конкуренции между пептидами, связывающимися с одним и тем же аллелем HLA, насколько это возможно, и вовлекания широкого подмножества элементов иммунной системы пациента в развитие иммунного ответа. Для каждого пациента идентифициовали пептиды, для которых предсказывалось связывание с различными аллелями HLA A и B в количестве до четырех. Некоторые пептиды, полученные из neoORF, не были ассоциированы с каким-либо конкретным аллелем HLA. Подход к распределению пептидов в различные пулы заключался в разнесении каждого набора пептидов, ассоциированных с конкретным аллелем HLA, по как можно большему количеству пулов из четырех. С высокой долей вероятности имели место ситуации, в которых данному аллелю соответствовали более чем 4 предсказанных пептида, и в этих случаях необходимо определить несколько пептидов, ассоциированных с конкретным аллелем, в один и тот же пул. Те пептиды, полученные из neoORF, которые не были ассоциированы с каким-либо конкретным аллелем, случайным образом относили к оставшимся позициям. Пример показан ниже.
A1
HLAA0101
3 пептида
A2
HLA A1101
5 пептидов
B1
HLA B0702
2 пептида
B2
HLA B6801
7 пептидов
X
НИ ОДИН (neoORF)
3 пептида
№ пула
1
2
3
4
B2
B2
B2
B2
B2
B2
B2
A2
A2
A2
A2
A2
A1
A1
A1
B1
B1
X
X
X
Пептиды, для которых было предсказано связывание с одним и тем же аллелем MHC, по возможности помещали в отдельные пулы. Для некоторых пептидов, полученных из neoORF, могло не быть предсказано связывание с каким-либо аллелем MHC пациента. Тем не менее, эти пептиды по-прежнему использовались, главным образом потому, что они являлись совершенно новыми и поэтому не подвергались эффектам иммунного ослабления центральной толерантности и, таким образом, характеризовались высокой вероятностью иммуногенности. Пептиды, полученные из neoORF, также обладали существенно сниженным потенциалом аутоиммунности, поскольку в какой-либо нормальной клетке эквивалентной им молекулы не существует. В дополнение, могли иметь место ложноотрицательные результаты, проистекающие из алгоритма предсказания, и существовала возможность, что пептид содержал эпитоп для HLA II класса (надежное предсказание эпитопов для HLA II класса на основании существующих алгоритмов не обеспечивалось). Все пептиды, не идентифицированные по соответствию конкретному аллелю HLA, случайным образом относили к отдельным пулам. Количество каждого пептида определяли на основании конечной дозы 300 мкг каждого пептида на инъекцию.
Для каждого пациента четыре отдельных пула (помеченные как "A", "B", "C" и "D") по 5 синтетических пептидов в каждом получали у производителя и хранили при -80°C. В день иммунизации в исследовательском фармацевтическом учреждении получали полную вакцину, состоящую из пептидного компонента(-ов) и поли-ICLC. По одному флакону в каждом случае (A, B, C и D) размораживали при комнатной температуре и перемещали в бокс биологической безопасности для осуществления оставшихся стадий. Набирали 0,75 мл каждого пула пептидов из флакона в отдельные шприцы. Помимо этого, в отдельные шприцы набирали четыре аликвоты по 0,25 мл (0,5 мг) поли-ICLC. Затем содержимое каждого шприца, содержащего пул пептидов, осторожно смешивали с 0,25 мл аликвоты поли-ICLC путем переноса из шприца в шприц. Для инъекции использовали весь один мл смеси. Эти 4 препарата помечали как "исследуемое лекарственное средство A", "исследуемое лекарственное средство B", "исследуемое лекарственное средство C" и "исследуемое лекарственное средство D".
В каждый день иммунизации пациентам подкожно инъецировали до четырех пулов индивидуальных неоантигенных пептидов, смешанных с поли-ICLC (Hiltonol).
Объем инъекции для каждой смеси пептидов и Hiltonol составлял 1 мл.
Каждый пул пептидов состоял из пептидов в количестве до 5, каждый из которых имел концентрацию, составляющую 400 мкг/мл.
Состав пула пептидов являлся следующим:
до пяти пептидов, каждый из которых имел концентрацию 400 мкг/мл;
4% DMSO;
4,8-5% декстрозы в воде;
4,8-5 мМ сукцината натрия.
Hiltonol состоял из:
2 мг/мл поли-I:поли-C;
1,5 мг/мл поли-L-лизина;
5 мг/мл натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы;
0,9% хлорида натрия.
Каждый объем инъекции 1 мл состоял из 0,75 мл одного из четырех пулов пептидов, смешанных с 0,25 мл Hiltonol. После смешивания состав являлся следующим:
до пяти пептидов, каждый из которых имел концентрацию 300 мкг/мл;
≤3% DMSO;
3,6-3,7% декстрозы в воде;
3,6-3,7 мМ сукцината натрия;
0,5 мг/мл поли-I:поли-C;
0,375 мг/мл поли-L-лизина;
1,25 мг/мл натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы;
0,225% хлорида натрия.
Инъекции: при каждой иммунизации каждое из 4 исследуемых лекарственных средств инъецировали подкожно в одну конечность. Каждое отдельное исследуемое лекарственное средство вводили в одну и ту же конечность при каждой иммунизации в течение всей продолжительности лечения (т.е. исследуемое лекарственное средство A было инъецировано в левую руку в дни 1, 4, 8 и т.д., исследуемое лекарственное средство B было инъецировано в правую руку в дни 1, 4, 8 и т.д.). Альтернативными анатомическими местоположениями для пациентов в состоянии после полного иссечения подмышечных или паховых лимфатических узлов являлись соответственно левая и правая верхняя части живота.
Вакцину вводили согласно схеме "примирование/стимулирование". Примирующие дозы вакцины вводили в дни 1, 4, 8, 15 и 22, как показано в данном документе. В фазе стимулирующей иммунизации вакцину вводили в дни 85 (неделя 13) и 169 (неделя 25).
Всех пациентов, получающих по меньшей мере одну дозу вакцины, оценивали в отношении токсичности. Пациентов оценивали в отношении иммунологической активности, если они получали все вакцинации в ходе фазы индукции и первую вакцинацию (стимулирующую) на протяжении поддерживающей фазы.
Пример 12
Краткосрочная стабильность конечной лекарственной формы при комнатной температуре
Стабильность пептидов: пул пептидов (пул 3), состоящий из пяти пептидов, показанных в таблице 6 ниже, получали путем растворения в DMSO и разбавления D5W/сукцинатом (2 мМ) до 2 мг/мл, а также объединения в пул до конечной концентрации пептидов, составляющей 400 мкг на мл, и конечной концентрации DMSO 4%. После получения пептиды фильтровали через фильтр Pall из PES диаметром 25 мм (№ по кат. 4612) и отмеряли во флаконы Nunc Cryo (№ 375418) аликвотами по одному мл.
Таблица 6. Пептиды и последовательности из пула 3
Пептид
Последо-вательность
% содержания пептида
Общее количество аминокислот
Гидрофобные аминокислоты
Доля гидрофобных аминокислот
1
CS6919
KLAWRGRISSSGCPSMTSPPSPMFGMTLHT
30
9
0,30
2
CS6931
VAGLAASGLHGSAWLVPGEQPVSGPHHGKQ
30
11
0,37
3
CS6934
SKRGVGAKTLLLPDPFLFWPCLEGTRRSL
29
11
0,38
4
CS6941
AHRQGEKQHLLPVFSRLALRLPWRHSVQL
29
12
0,41
5
CS7416
AESAQRQGPNGGGEQSANEF
20
4
0,20
Три образца получали путем смешивания 0,75 мл пула 3 с 0,25 мл Hiltonol в соответствии с запланированным с целью получения лекарственной формы. Затем образцы оставляли при комнатной температуре на 0, 4 и 6 часов и анализировали с помощью RP-HPLC (таблица 7). Для 4 из 5 пептидов изменений не отмечали. Отмечали незначительное увеличение второго пика, ассоциированного с пептидом CS6919, с увеличением от 14% до 17% и 18% соответственно через 4 и 6 часов. Как отмечается в исследовании стабильности при -20°C, пептиды CS6919 и CS6934 (оба из которых представлены в пуле 4) могут образовывать гетеродимер (как показано с помощью масс-спектрометрии), который элюируется в положении этой примеси. Извлечение всех пептидов превышало 90%, что указывало на отсутствие разрушения и утраты каких-либо пептидов в конечной лекарственной форме после 6-часового инкубирования при комнатной температуре.
Таблица 7. Обобщенные данные в отношении стабильности пула 3 после смешивания с Hiltonol и инкубирования при комнатной температуре
Пул 3 + Hiltonol, T0
Главный пик
Общее количество примесей
Суммарныйпик
%чистоты
%примеси
CS6919
7786,28
1256,72
9043
86,1
13,9
CS6931
9014,82
198,6
9213,42
97,84
2,16
CS6934
6147,14
244,49
6391,63
96,17
3,83
CS7416
5988,42
143,98
6132,4
97,65
2,35
CS6941
7140,91
0
7140,91
100
0
Пул 3 + Hiltonol, T0
Главный пик
Общее количество примесей
Суммарныйпик
%чистоты
%примеси
Извлечение
4 часа при к. т.
Главный пик
Общее количество AUP
CS6919
7238,56
1492,4
8730,96
82,91
17,09
93%
97%
CS6931
8523,53
265,54
8789,07
96,98
3,02
95%
95%
CS6934
5842,22
184,46
6026,68
96,94
3,06
95%
94%
CS7416
5669,85
148,82
5818,67
97,44
2,56
95%
95%
CS6941
6676,54
0
6676,54
100
0
93%
93%
Пул 3 + Hiltonol, T0
Главный пик
Общее количество примесей
Суммарныйпик
%чистоты
%примеси
Извлечение
6 часов при к. т.
Главный пик
Общее количество AUP
CS6919
7688,89
1703,9
9392,79
81,86
18,14
106%
108%
CS6931
9387,81
311,37
9699,18
96,79
3,21
110%
110%
CS6934
6268,16
221,46
6489,62
96,59
3,41
107%
108%
CS7416
6197,48
132,83
6330,31
97,9
2,1
109%
109%
CS6941
7158,29
0
7158,29
100
0
107%
107%
Стабильность поли-ICLC: во втором исследовании использовали другой пул пептидов (пул 4), который смешивали с Hiltonol (0,75 мл пула пептидов + 0,25 мл Hiltonol) и хранили при комнатной температуре в течение 6 часов. Смесь пептид + Hiltonol, инкубируемую при комнатной температуре, и Hiltonol в отдельности (который хранили при постоянной температуре 4°C) затем разбавляли до 20 мкг/мл поли-ICLC и анализировали в отношении стимуляции TLR с использованием дендритных клеток мыши в соответствии с опубликованными способами. После 24-часовой стимуляции, для оценки уровней индукции ключевых иммунных маркеров, показанных на фиг. 6, применяли количественную ПЦР. Каких-либо изменений стимулирующей способности поли-ICLC через 6 часов при комнатной температуре с пулом пептидов в конечном составе не наблюдалось, что указывало на то, что Hiltonol не был подвержен влиянию каких-либо компонентов состава (DMSO [4%], D5W, 5 мМ сукцинат, пептиды) и был стабильным в конечной лекарственной форме в течение периода до 6 часов при комнатной температуре.
Пример 13
Лиофилизация конечной формы состава
Состав для пептидов являлся следующим: каждый пул пептидов состоял из пептидов в количестве до 5, каждый из которых имел концентрацию, составляющую 400 мкг/мл. Состав пула пептидов являлся следующим:
до пяти пептидов, каждый из которых имел концентрацию, составляющую 400 мкг/мл;
4-8% DMSO;
4,6-4,8% декстрозы в воде;
5 мМ сукцината натрия.
Объемообразующим средством, используемым для стабилизации, являлась декстроза в воде (D5W). В основе конечного состава лежат температурные свойства матрицы состава. Данные модулированной дифференциальной сканирующей калориметрии (MDSC) позволили предположить наличие двух температур стеклования (Tg'), составляющих соответственно -24°C и -56°C, и экзотермической реакции при -67°C в связи с плавлением в DMSO. Согласно литературным источникам, температура стеклования в D5W составляет -43°C. Данные MDSC позволили предположить, что в случае наличия DMSO температура стеклования дополнительно снижается. На основании этой информации проверяли осуществимость лиофилизации пептидов с использованием двух дополнительных объемообразующих средств - сахарозы и трегалозы. Следующие составы оценивали с помощью анализа по методу MDSC (фиг. 7-9):
1. 5% D5W и 0,8% DMSO
2. 10% сахарозы и 0,8% DMSO
3. 10% трегалозы и 0,8% DMSO
Вышеуказанные составы лиофилизировали с использованием цикла традиционной лиофилизации путем замораживания при -50°C в течение 3 ч., первичного высушивания при -35°C и 75 мторр в течение 30 ч. и при -30°C в течение 30 ч. (фиг. 10 и 11). Состав, содержащий D5W-DMSO, подвергался полному коллапсу, хотя для состава, содержащего D5W в отдельности, наблюдали частичное образование брикета. Результаты лиофилизации позволили предположить, что в присутствии 0,8% DMSO состав, содержащий трегалозу или сахарозу, в большей степени подходил для лиофилизации, чем состав, содержащий декстрозу (фиг. 12).
Образцы (25 мкл) анализировали с помощью MDSC с использованием следующей программы. Для мониторинга температурных событий использовали следующие параметры.
1. Уравновешивание при 20,00°C
2. Изотермические условия в течение 5,00 мин
3. Модулирование +/- 1,00°C каждые 60 секунд
4. Сохранение данных: ВКЛЮЧЕНО
5. Линейное изменение на 1,00°C/мин до -70°C
6. Уравновешивание при -70°C
7. Изотермические условия в течение 5,00 мин
8. Линейное изменение на 1,00°C/мин до 20,00°C
9. Уравновешивание при 20,00°C
10. Сохранение данных: ОТКЛЮЧЕНО
11. Изотермические условия в течение 5 минут
12. Завершение способа
g
Лиофилизация: MDSC применяли для определения температуры стеклования (T), которую использовали для выбора температуры первичного высушивания и замораживания продуктов (таблица 8 и фиг. 7-9). Данные указывали на то, что плавление в DMSO имело место при температуре около -68°C во всех составах. Все 3 состава имели две температуры стеклования. Состав, содержащий декстрозу, трегалозу или сахарозу, имел наиболее низкую температуру стеклования в тепловом потоке, составляющую соответственно -59°C, -42°C и -50°C, что позволило предположить, что лиофилизировать состав, содержащий D5W-DMSO, без коллапса/плавления является затруднительным.
Таблица 8. Анализ 10% сахарозы и 0,8% DMSO по методу MDSC
Составы
Температура замораживания (°C)
Температура плавления (°C)
Температура плавления в DMSO (°C)
Tg’1 (°C)
Tg’2 (°C)
5% D5W - 0,8% DMSO в тепловом потоке
-18,2
-0,38
-67,86
-24,27
-59,17
5% D5W - 0,8% DMSO в обратном тепловом потоке
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
-33,31
-62,86
10% трегалоза - 0,8% DMSO в тепловом потоке
-12,64
-1,25
-68,06
-24,4
-42,55
10% трегалоза - 0,8% DMSO в обратном тепловом потоке
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
-24,4
-39,2
10% сахароза - 0,8% DMSO в тепловом потоке
-11,36
-0,26
-67,87
-23,53
-50,31
10% сахароза - 0,8% DMSO в обратном тепловом потоке
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
-31,21
Данные отсутствуют
Вначале лиофилизацию попытались провести с флаконами Nunc, и было обнаружено, что конфигурация флаконов Nunc была недостаточной для лиофилизации матрицы состава. Один мл состава с 5% D5W и 0,8% DMSO в четырех стерильных флаконах Nunc объемом 1,8 мл (Thermo Scientific) лиофилизировали с использованием цикла лиофилизации (замораживание до -50°C и выдерживание в течение 2 ч., первичное высушивание при -15°C в течение 20 ч. при 75 мторр и вторичное высушивание при 20°C в течение 8 ч. при давлении 75 мторр). Наблюдали, что во флаконах отсутствовал брикет, и на дне флаконов Nunc были замечены остаточные жидкие DMSO и D5W в виде небольших капель жидкости.
Для определения осуществимости лиофилизации лидерного состава был выбран флакон из бесцветного нейтрального стекла, подходящий для лиофилизации. Содержимым пяти флаконов, содержащих по 1,5 мл каждого состава, заполняли флаконы из бесцветного стекла объемом 3 мл с диаметром горловины 13 мм, которые неплотно закрывали лиофилизационной пробкой диаметром 13 мм и выдерживали на средней полке Lyostar II для лиофилизации.
Лиофилизация состава, имеющего температуру стеклования ниже -50°C, являлась затруднительной. Для проведения лиофилизации на основании температуры стеклования устанавливали следующие параметры традиционной лиофилизации (таблица 9). Полученные результаты в отношении профиля давлений и температурных профилей представлены соответственно на фиг. 10 и 11. Давление, измеряемое с помощью датчика Пирани, достигало более низкого уровня, чем давление, установленное на полке, в ходе первичного и вторичного высушиваний, что позволило предположить отсутствие влаги в камере (фиг. 10) и завершение цикла лиофилизации.
Таблица 9. Параметры лиофилизации состава-плацебо с пептидами, содержащего DMSO и трегалозу, сахарозу или D5W.
Стадия
Температура
Давление
Время выдерживания(минуты)
Скорость линейногоИзменения
Линейное изменение/времявыдерживания (мин или ч.)
Загрузка
Атмосферное
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
Замораживание
Данные отсутствуют
Данные отсутствуют
1°C/мин
70 (линейное изменение)
Замораживание
Данные отсутствуют
120
Данные отсутствуют
180 (выдерживание)
Первичное высушивание
75 мторр
1800
1°C/мин
15 (линейное изменение)
Первичное высушивание
75 мторр
Пока давление, измеряемое с помощью датчика Пирани, не достигало 75 мторр (1800 мин)
1°C/мин
5 (линейное изменение)
Вторичное высушивание
75 мторр
Данные отсутствуют
1°C/мин
50 (линейное изменение)
Вторичное высушивание
75 мторр
Пока давление, измеряемое с помощью датчика Пирани, не достигало 75 мторр (1800 мин)
Данные отсутствуют
Пока давление, измеряемое с помощью датчика Пирани, не достигало 75 мторр (220 мин)
Обратное заполнение до 600 торр в атмосфере азота и с закрытой пробкой, доведение до 760 (атмосферное давление), обжатие и герметичное закрывание.
Физический внешний вид брикета. Состав, содержащий D5W и DMSO, подвергали полному коллапсу и плавлению, тогда как состав, содержащий трегалозу-DMSO или сахарозу-DMSO, характеризовался наличием белого аморфного брикета с незначительным коллапсом (фиг. 12).
Пример 14
Алгоритм получения растворимых пептидов в D5W/сукцинат или других водных буферах
Заявители разработали алгоритм точного предсказания растворимости пептидов в разнообразных водных растворах. Общеизвестно, что растворимость любого данного пептида в водных растворах затруднительно предсказать только на основании информации о последовательности, и зачастую для этого требуется эмпирическое определение. Используя два рассчитываемых параметра, которые относятся к гидрофобности и изоэлектрической точке, заявители определили, что пептиды с определенными рассчитываемыми комбинациями этих параметров проявляют высокую или низкую растворимость, что обеспечивает таким образом решение проблемы предсказания растворимости пептидов.
i
Изоэлектрическую точку (P)можно оценить с помощью калькуляторов, общедоступных в Интернете (например, см. www.geneinfinity.org/sms/sms_proteiniep.html), или можно легко рассчитать с помощью известных формул pH/заряд для всех возможных заряженных аминокислот. Известны значения pKa боковых цепей заряженных аминокислот (H, R, K, D, E, C, Y) и амино- и карбокси-концов пептидов (таблица 10).
Таблица 10
(NH2-)
9,69
(-COOH)
2,34
K (лизин)
10,5
D (аспарагиновая кислота)
3,86
R (аргинин)
12,4
E (глутаминовая кислота)
4,25
H (гистидин)
6,00
C (цистеин)
8,33
Y (тирозин)
10,0
Lehninger, Biochemistry
Фактический заряд каждой аминокислоты будет зависеть от pH раствора согласно следующим формулам:
Суммарный заряд пептида при любом данном pH представляет собой сумму зарядов каждых отдельных аминокислоты или конца. Изоэлектрическая точка представляет собой значение pH, при котором суммарный заряд равен 0.
Гидрофобность можно рассчитать различными способами. Одним из способов расчета гидрофобности является поиск в каждом пептиде областей, являющихся гидрофобными, расчет индекса степени гидрофобности каждой области и нахождение области с наиболее высокой степенью гидрофобности. Этот параметр может быть обозначен как HYDRO. Данный расчет можно легко выполнить с использованием опубликованных значений гидрофобности (или гидрофильности) для каждой боковой цепи аминокислот, идентифицируя непрерывные участки гидрофобных аминокислот в пептиде и суммируя гидрофобность каждой аминокислоты в каждой области. В качестве примера приведена следующая таблица значений гидрофильности для каждой аминокислоты (таблица 11).
Таблица 11
Аланин
-0,5
Цистеин
-1
Аспарагиновая кислота
3
Глутаминовая кислота
3
Фенилаланин
-2,5
Глицин
0
Гистидин
-0,5
Изолейцин
-1,8
Лизин
3
Лейцин
-1,8
Метионин
-1,3
Аспарагин
0,2
Пролин
0
Глутамин
0,2
Аргинин
3
Серин
0,3
Треонин
-0,4
Валин
-1,5
Триптофан
-3,4
Тирозин
-2,3
Гидрофобные аминокислоты имеют отрицательные значения.
Каждой аминокислоте присваивали ее значение гидрофильности, и для каждого сплошного фрагмента из аминокислот, все из которых имели значения ниже 0, эти значения суммировали друг с другом, и эта сумма представляла собой индекс гидрофобности для данного сплошного фрагмента. Наиболее гидрофобным фрагментом являлся фрагмент с наименьшим отрицательным значением. Это значение определяло параметр HYDRO. Показан пример этих значений для пептида, приводимого в качестве примера (фиг. 13). Значения, показанные синим цветом, представляют собой значение гидрофильности (таким образом, отрицательные значения представляют гидрофобные остатки) для каждой аминокислоты, а значения, показанные красным цветом, указывают на сумму значений гидрофобности по всему гидрофобному фрагменту.
i
При совместном изучении этих двух параметров (P и HYDRO) обнаруживалось, что пептиды с определенными комбинированными характеристиками чаще являются растворимыми, тогда как с другими комбинированными характеристиками являются нерастворимыми. Таким образом, эти комбинированные характеристики можно применять в ходе процесса проектирования пептида для синтеза, с тем чтобы вероятность того, что пептид будет растворимым в буфере для состава после синтеза, увеличивалась.
i
В таблице 12 отображены расчетные значения P и HYDRO для 221 пептида, а также то, является ли пептид растворимым (S) или нерастворимым (I) в составе с 5% декстрозой в воде (D5W)/5 мМ сукцинатом, описанном в данном документе.
i
На фиг. 15 эти параметры для данного набора пептидов отложены на графике по осям x (P) и y (HYDRO). В соответствии с наблюдениями, нерастворимые пептиды распределены по всему пространству, задаваемому осями x и y, тогда как растворимые пептиды наблюдаются в более дискретных областях. Таким образом, растворимость определяется балансом суммарного заряда и гидрофобности и может быть предсказана по аминокислотной последовательности.
% пептидов, являющихся растворимыми, различается в зависимости от области. На фиг. 15 участок A ограничен Pi ≥5 и HYDRO ≥ -6,0 и Pi ≥8 и HYDRO ≥ -8,0, участок B ограничен Pi ≤5 и HYDRO ≥ -5, и область C ограничена Pi ≥9 и HYDRO ≤ -8,0. В предпочтительных областях (A, B и C) % изученных пептидов, которые были растворимыми, указан в таблице 13 и находится в диапазоне от 64% до 89%. В непредпочтительных областях ("прочих") только приблизительно 42,5% пептидов были растворимыми.
Таблица 13
A
B
C
Прочие
Количество растворимых
115
25
9
17
Количество нерастворимых
15
3
4
23
% растворимых
88%
89%
64%
42,5%
Можно построить электронную таблицу Excel, в которой допускаются изменения длины или конкретной последовательности области пептида и немедленный пересчет этих значений для выбранного пептида. Данный подход способен облегчать проектирование пептида с более высокой предсказанной растворимостью или отклонение потенциальных пептидов как характеризующихся маловероятной растворимостью. Такой подход может принести значительный благоприятный результат для производителей пептидов, желающих получать растворимые пептиды.
i
Данный подход был разработан для конкретного водного состава (D5W/5 мМ сукцинат), однако без труда может быть адаптирован для любого другого водного состава для идентификации подходящей комбинации P и гидрофобности.
* * *
Имея таким образом подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение, определяемое в вышеприведенных разделах, не должно ограничиваться конкретными деталями, изложенными в вышеприведенном описании, поскольку возможны их многочисленные очевидные варианты без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> THE BROAD INSTITUTE INC.
<120> СОСТАВЫ ВАКЦИН ПРОТИВ НЕОПЛАЗИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
<130> 47608.99.2011
<140> PCT/US2016/036605
<141> 2016-06-09
<150> 62/172,890
<151> 2015-06-09
<160> 287
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 1
Lys Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Glu Pro Met Phe Leu Phe Ile Val Phe
1 5 10 15
Ser His Gly Ile Leu Val Asn His Met Leu Ile Val Val Met
20 25 30
<210> 2
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 2
Pro Pro Tyr Pro Tyr Ser Ser Pro Ser Leu Val Leu Pro Thr Glu Pro
1 5 10 15
His Thr Pro Lys Ser Leu Gln Gln Pro Gly Leu Pro Ser
20 25
<210> 3
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 3
Asn Pro Glu Lys Tyr Lys Ala Lys Ser Arg Ser Pro Gly Ser Pro Val
1 5 10 15
Val Glu Gly Thr Gly Ser Pro Pro Lys Trp Gln Ile Gly Glu Gln Glu
20 25 30
Phe
<210> 4
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 4
Gly Thr Tyr Leu Gln Gly Thr Ala Ser Ala Leu Ser Gln Ser Gln Glu
1 5 10 15
Arg Pro Pro Ser Val Asn Arg Val Pro Pro Ser Ser Pro Ser Ser Gln
20 25 30
Glu
<210> 5
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 5
Ala Glu Ser Ala Gln Arg Gln Gly Pro Asn Gly Gly Gly Glu Gln Ser
1 5 10 15
Ala Asn Glu Phe
20
<210> 6
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 6
Glu Pro Asp Gln Glu Ala Val Gln Ser Ser Thr Tyr Lys Asp Cys Asn
1 5 10 15
Thr Leu His Leu Pro Thr Glu Arg Phe Ser Pro Val Arg
20 25
<210> 7
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 7
Leu Lys Asp Ser Asn Ser Trp Pro Pro Ser Asn Lys Arg Gly Phe Asp
1 5 10 15
Thr Glu Asp Ala His Lys Ser Asn Ala Thr Pro Val Pro
20 25
<210> 8
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 8
Gly Ala Ser Arg Arg Ser Ser Ala Ser Gln Gly Ala Gly Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Ser Glu Glu Lys Thr Leu Arg Ser Gly Gly Gly Pro
20 25
<210> 9
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 9
Lys Lys Glu Lys Ala Glu Lys Leu Glu Lys Glu Arg Gln Arg His Ile
1 5 10 15
Ser Lys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Phe Ser Leu Thr Thr His Thr Gly
20 25 30
Glu
<210> 10
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 10
Ser Pro Thr Glu Pro Ser Thr Lys Leu Pro Gly Phe Asp Ser Cys Gly
1 5 10 15
Asn Thr Glu Ile Ala Glu Arg Lys Ile Lys Arg Ile Tyr Gly Gly Phe
20 25 30
Lys
<210> 11
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 11
Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Arg Gly Ser Gln Leu Thr Gln His Gln
1 5 10 15
Gly Ile His Ile Ser Glu Lys Ser Phe Glu Tyr Lys Glu Cys Gly Ile
20 25 30
Asp
<210> 12
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 12
Ser His Val Glu Lys Ala His Ile Thr Ala Glu Ser Ala Gln Arg Gln
1 5 10 15
Gly Pro Asn Gly Gly Gly Glu Gln Ser Ala Asn Glu Phe
20 25
<210> 13
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 13
Pro Ile Glu Arg Val Lys Lys Asn Leu Leu Lys Lys Glu Tyr Asn Val
1 5 10 15
Ser Asp Asp Ser Met Lys Leu Gly Gly Asn Asn Thr Ser Glu Lys Ala
20 25 30
Asp
<210> 14
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 14
His Lys Ser Ile Gly Gln Pro Lys Leu Ser Thr His Pro Phe Leu Cys
1 5 10 15
Pro Lys Pro Gln Lys Met Asn Thr Ser Leu Gly Gln His Leu Thr Leu
20 25 30
<210> 15
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 15
Ala Glu Ser Ala Gln Arg Gln Gly Pro Leu Gly Gly Gly Glu Gln Ser
1 5 10 15
Ala Asn Glu Phe
20
<210> 16
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 16
Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys
1 5 10 15
Arg Thr Pro Lys Lys Val Lys Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys
20 25 30
Lys
<210> 17
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 17
Ser Lys Leu Pro Tyr Pro Val Ala Lys Ser Gly Lys Arg Ala Leu Ala
1 5 10 15
Arg Gly Pro Ala Pro Thr Glu Lys Thr Pro His Ser Gly Ala Gln Leu
20 25 30
Gly
<210> 18
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 18
Glu Gln Gly Pro Trp Gln Ser Glu Gly Gln Thr Trp Arg Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Pro Val Pro Cys Pro Ala Ala Gly Pro Gly
20 25
<210> 19
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 19
Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ala Pro Pro Pro His Ala Thr Ala Thr Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Phe Met Pro Gly Thr Trp Gly Arg Glu Asp Leu
20 25 30
<210> 20
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 20
Lys Leu Ala Trp Arg Gly Arg Ile Ser Ser Ser Gly Cys Pro Ser Met
1 5 10 15
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Met Phe Gly Met Thr Leu His Thr
20 25 30
<210> 21
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 21
Asp Ser Ala Val Asp Lys Gly His Pro Asn Arg Ser Ala Leu Ser Leu
1 5 10 15
Thr Pro Gly Leu Arg Ile Gly Pro Ser Gly Ile Pro Gln Ala Gly Leu
20 25 30
Gly
<210> 22
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 22
Leu Leu Thr Asp Arg Asn Thr Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Pro Glu Leu Gln Val Pro
20 25
<210> 23
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 23
Leu Thr Asp Leu Pro Gly Arg Ile Arg Val Ala Pro Gln Gln Asn Asp
1 5 10 15
Leu Asp Ser Pro Gln Gln Ile Ser Ile Ser Asn Ala Glu
20 25
<210> 24
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 24
Lys Gly Ala Ser Leu Asp Ala Gly Trp Gly Ser Pro Arg Trp Thr Thr
1 5 10 15
Thr Arg Met Thr Ser Ala Ser Ala Gly Arg Ser Thr Arg Ala
20 25 30
<210> 25
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 25
Phe Arg Leu Ile Trp Arg Ser Val Lys Asn Gly Lys Ser Ser Arg Glu
1 5 10 15
Gln Glu Leu Ser Trp Asn Cys Ser His Gln Val Pro Ser Leu Gly Ala
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 26
Gly Lys Ser Arg Gly Gln Gln Ala Gln Asp Arg Ala Arg His Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ala Pro Ala Arg Pro Leu Gly Ala Leu Arg Glu Gln
20 25 30
<210> 27
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 27
Leu Leu Thr Asp Arg Asn Thr Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Pro Glu Leu Gln Val Pro Ile Pro Gln Ala Gly Leu
20 25 30
Gly
<210> 28
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 28
Arg Gly Leu His Ser Gln Gly Leu Gly Arg Gly Arg Ile Ala Met Ala
1 5 10 15
Gln Thr Ala Gly Val Leu Arg Ser Leu Glu Gln Glu Glu
20 25
<210> 29
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 29
Pro Gln Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Gly Glu His Pro
1 5 10 15
Leu Leu Pro Gly Gly Ala Pro Leu Pro Ala Gly Leu Phe
20 25
<210> 30
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 30
Thr Trp Ala Gly His Val Ser Thr Ala Leu Ala Arg Pro Leu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Trp Ala Glu Pro Gly Ser Cys Gly Pro Gly Thr Asn
20 25
<210> 31
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 31
Lys Lys Asn Ile Thr Asn Leu Ser Arg Leu Val Val Arg Pro Asp Thr
1 5 10 15
Asp Ala Val Tyr
20
<210> 32
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 32
Trp Asp Gly Pro Pro Glu Asn Asp Met Leu Leu Lys Glu Ile Cys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ile Pro
20
<210> 33
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 33
Leu Ala Ala Ser Gly Leu His Gly Ser Ala Trp Leu Val Pro Gly Glu
1 5 10 15
Gln Pro Val Ser Gly Pro His His Gly Lys Gln Pro Ala Gly Val
20 25 30
<210> 34
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 34
Pro Ile Gln Val Phe Tyr Thr Lys Gln Pro Gln Asn Asp Tyr Leu His
1 5 10 15
Val Ala Leu Val Ser Val Phe Gln Ile His Gln Glu Ala Pro Ser Ser
20 25 30
Gln
<210> 35
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 35
Val Ala Gly Leu Ala Ala Ser Gly Leu His Gly Ser Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Pro Gly Glu Gln Pro Val Ser Gly Pro His His Gly Lys Gln
20 25 30
<210> 36
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 36
Ser Lys Arg Gly Val Gly Ala Lys Thr Leu Leu Leu Pro Asp Pro Phe
1 5 10 15
Leu Phe Trp Pro Cys Leu Glu Gly Thr Arg Arg Ser Leu
20 25
<210> 37
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 37
Ser Tyr Lys Lys Leu Pro Leu Leu Ile Phe Pro Ser His Arg Arg Ala
1 5 10 15
Pro Leu Leu Ser Ala Thr Gly Asp Arg Gly Phe Ser Val
20 25
<210> 38
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 38
Gly Leu Leu Ser Asp Gly Ser Gly Leu Gly Gln Ile Thr Trp Ala Ser
1 5 10 15
Ala Glu His Leu Gln Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu Leu Ala
20 25 30
<210> 39
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 39
Asp Leu Cys Ile Cys Pro Arg Ser His Arg Gly Ala Phe Gln Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ser Ala Leu Leu Val Arg Val Leu Glu Gly Ser Asp Ser
20 25 30
<210> 40
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 40
Asp Ala Ser Asp Phe Leu Pro Asp Thr Gln Leu Phe Pro His Phe Thr
1 5 10 15
Glu Leu Leu Leu Pro Leu Asp Pro Leu Glu Gly Ser Ser Val
20 25 30
<210> 41
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 41
Asp Met Ala Trp Arg Arg Asn Ser Arg Leu Tyr Trp Leu Ile Lys Met
1 5 10 15
Val Glu Gln Trp Gln Glu Gln His Leu Pro Ser Leu Ser Ser
20 25 30
<210> 42
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 42
Leu Ser Val Pro Phe Thr Cys Gly Val Asn Phe Gly Asp Ser Ile Glu
1 5 10 15
Asp Leu Glu Ile
20
<210> 43
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 43
Pro Leu Met Gln Thr Glu Leu His Gln Leu Val Pro Glu Ala Asp Pro
1 5 10 15
Glu Glu Met Ala
20
<210> 44
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 44
Glu Asp Leu His Leu Leu Ser Val Pro Cys Pro Ser Tyr Lys Lys Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Ile Phe Pro Ser His Arg Arg Ala Pro Leu Leu Ser Ala
20 25 30
<210> 45
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 45
Ala His Arg Gln Gly Glu Lys Gln His Leu Leu Pro Val Phe Ser Arg
1 5 10 15
Leu Ala Leu Arg Leu Pro Trp Arg His Ser Val Gln Leu
20 25
<210> 46
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 46
Ala Leu Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Ile Gly Pro Ser Gly Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Phe Leu Ala Glu Ser Ala Val Asp Lys Gly His Pro Asn Arg
20 25 30
Ser
<210> 47
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 47
Asp Ser Ala Val Asp Lys Gly His Pro Asn Arg Ser Ala Leu Ser Leu
1 5 10 15
Thr Pro Gly Leu Arg Ile Gly Pro Ser Gly Leu Phe Leu Val Phe Leu
20 25 30
Ala
<210> 48
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 48
Leu Arg Val Phe Ile Gly Asn Ile Ala Val Asn His Ala Pro Val Ser
1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly Thr Val
20 25 30
Pro
<210> 49
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 49
Leu Pro Val Phe Ile Gly Asn Ile Ala Val Asn His Ala Pro Val Ser
1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly Thr Val
20 25 30
Pro
<210> 50
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 50
Val Ser Trp Gly Lys Lys Val Gln Pro Ile Asp Ser Ile Leu Ala Asp
1 5 10 15
Trp Asn Glu Asp Ile Glu Ala Phe Glu Met Met Glu Lys Asp
20 25 30
<210> 51
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 51
Gly Thr Lys Ala Leu Gln Leu His Ser Ile Ala Gly Arg Trp Pro Arg
1 5 10 15
Met Glu Pro Trp Val Val Glu Ser Met Ser Leu Gly Val Pro
20 25 30
<210> 52
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 52
Ser Gly Gln Pro Ala Pro Glu Glu Thr Val Leu Phe Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
His Gly Leu Leu Leu Ile Leu Arg Arg Leu Arg Gly Gly
20 25
<210> 53
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 53
Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Ala Val Val Leu Arg Cys Pro Ala Leu Arg
1 5 10 15
Val Arg Lys Pro
20
<210> 54
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 54
Ile Gly Ala Leu Asn Pro Lys Arg Ala Ala Phe Phe Ala Glu His Tyr
1 5 10 15
Glu Ser Trp Glu
20
<210> 55
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 55
Ser Tyr Asp Ser Val Ile Arg Glu Leu Leu Gln Lys Pro Asn Val Arg
1 5 10 15
Val Val Val Leu
20
<210> 56
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 56
Val Glu Gln Gly His Val Arg Val Gly Pro Asp Val Val Thr His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Val
20
<210> 57
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 57
Ala Pro Ala Leu Gly Pro Gly Ala Ala Ser Val Ala Ser Arg Cys Gly
1 5 10 15
Leu Asp Pro Ala Leu Ala Pro Gly Gly Ser His Met Leu Arg Ala
20 25 30
<210> 58
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 58
Leu Leu Thr Asp Arg Asn Thr Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Pro Glu Leu Gln Val Pro Leu Phe Leu Val Phe Leu
20 25 30
Ala
<210> 59
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 59
Glu Glu Gly Leu Leu Pro Glu Val Phe Gly Ala Gly Val Pro Leu Ala
1 5 10 15
Leu Cys Pro Ala Val Pro Ser Ala Ala Lys Pro His Arg Pro Arg Val
20 25 30
Leu
<210> 60
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 60
Val Gln Leu Ser Ile Gln Asp Val Ile Arg Arg Ala Arg Leu Ser Thr
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Gln Arg Val Ala Leu Arg Ser Gly Trp Ile
20 25 30
<210> 61
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 61
Leu Pro Val Phe Ile Gly Asn Ile Ala Val Asn His Ala Pro Val Ser
1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Leu Val Val
20 25 30
Pro
<210> 62
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 62
Lys Leu Ala Trp Arg Gly Arg Ile Ser Ser Ser Gly Cys Pro Ser Met
1 5 10 15
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Met Phe Gly Met Thr Leu His Thr
20 25 30
<210> 63
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 63
Val Ala Gly Leu Ala Ala Ser Gly Leu His Gly Ser Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Pro Gly Glu Gln Pro Val Ser Gly Pro His His Gly Lys Gln
20 25 30
<210> 64
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 64
Ser Lys Arg Gly Val Gly Ala Lys Thr Leu Leu Leu Pro Asp Pro Phe
1 5 10 15
Leu Phe Trp Pro Cys Leu Glu Gly Thr Arg Arg Ser Leu
20 25
<210> 65
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 65
Ala His Arg Gln Gly Glu Lys Gln His Leu Leu Pro Val Phe Ser Arg
1 5 10 15
Leu Ala Leu Arg Leu Pro Trp Arg His Ser Val Gln Leu
20 25
<210> 66
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 66
Ala Glu Ser Ala Gln Arg Gln Gly Pro Asn Gly Gly Gly Glu Gln Ser
1 5 10 15
Ala Asn Glu Phe
20
<210> 67
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 67
Thr Ser Gly Ser Ser Thr Ala Leu Pro Gly Ser Asn Pro Ser Thr Met
1 5 10 15
Asp Ser Gly Ser Gly Asp
20
<210> 68
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 68
Asp Gly Val Ser Glu Glu Phe Trp Leu Val Asp Leu Leu Pro Ser Thr
1 5 10 15
His Tyr Thr
<210> 69
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 69
Asp Val Thr Tyr Asp Gly His Pro Val Leu Gly Ser Pro Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Ala Ser Leu
20
<210> 70
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 70
Glu Tyr Trp Lys Val Leu Asp Gly Glu Leu Glu Val Ala Pro Glu Tyr
1 5 10 15
Pro Gln Ser Thr Ala Arg Asp Trp Leu
20 25
<210> 71
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 71
Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu
1 5 10 15
Trp Thr Ser Ser
20
<210> 72
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 72
Ser Glu Arg Tyr Ile Gly Thr Glu Gly Gly Gly Met Asp Gln Ser Ile
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ala Glu Glu Gly Thr Ala Lys
20 25
<210> 73
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 73
Thr Thr Thr Ser Val Lys Lys Glu Glu Leu Val Leu Ser Glu Glu Asp
1 5 10 15
Phe Gln Gly Ile Thr Pro Gly Ala Gln
20 25
<210> 74
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 74
Glu Glu Phe Asn Arg Arg Val Arg Glu Asn Pro Trp Asp Thr Gln Leu
1 5 10 15
Trp Met Ala Phe Val Ala Phe Gln Asp Glu
20 25
<210> 75
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 75
Glu Asp Ser Lys Tyr Gln Asn Leu Leu Pro Phe Phe Val Gly His Asn
1 5 10 15
Met Leu Leu Val Ser Glu Glu
20
<210> 76
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 76
Thr Thr Ser Gly Asp Glu Arg Leu Tyr Pro Ser Pro Thr Phe Tyr Ile
1 5 10 15
His Glu Asn Tyr Leu Gln Leu Phe Glu
20 25
<210> 77
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 77
Glu Ser Lys Leu Phe Gly Asp Pro Asp Glu Phe Ser Leu Ala His Leu
1 5 10 15
Leu Glu Pro Phe Arg Gln Tyr Tyr Leu
20 25
<210> 78
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 78
Thr Ile Ser Leu Leu Leu Ile Phe Tyr Asn Thr Lys Glu Ile Ala Arg
1 5 10 15
Thr Glu Glu His Gln Glu
20
<210> 79
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 79
Glu Thr Tyr Ser Arg Ser Phe Tyr Pro Glu His Ser Ile Lys Glu Trp
1 5 10 15
Leu Ile Gly Met Glu Leu Val Phe Val
20 25
<210> 80
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 80
Thr Leu Asp Asp Ile Lys Glu Trp Leu Glu Asp Glu Gly Gln Val Leu
1 5 10 15
Asn Ile Gln Met Arg Arg Thr Leu His Lys
20 25
<210> 81
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 81
Asn His Ser Ala Lys Phe Leu Lys Glu Leu Thr Leu Ala Met Asp Glu
1 5 10 15
Leu Glu Glu Asn Phe Arg Gly
20
<210> 82
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 82
Lys Ala His Val Glu Gly Asp Gly Val Val Glu Glu Ile Ile Arg Tyr
1 5 10 15
His Pro Phe Leu Tyr Asp Arg Glu Thr
20 25
<210> 83
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 83
Glu Ala Ala Phe Ser Val Gly Ala Thr Gly Ile Ile Thr Asp Tyr Pro
1 5 10 15
Thr Ala Leu Arg His Tyr Leu Asp Asn His Gly
20 25
<210> 84
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 84
Ile Gly Ala Leu Asn Pro Lys Arg Ala Ala Phe Phe Ala Glu His Tyr
1 5 10 15
Glu Ser Trp Glu
20
<210> 85
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 85
Glu Arg Leu Ser Ile Gln Asn Phe Ser Lys Leu Leu Asn Asp Asn Ile
1 5 10 15
Phe Tyr Met Ser
20
<210> 86
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 86
Leu Asp Val Leu Gln Arg Pro Leu Ser Pro Gly Asn Ser Glu Phe Leu
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ala Asn Tyr Ser Lys
20
<210> 87
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 87
Ser Ala Val Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ala Met His Ile Asn Gln Ala
1 5 10 15
Thr Asn Gly Gly Gly Ser
20
<210> 88
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 88
Ile Ser Ser Leu Phe Val Ser Tyr Phe Leu Tyr Arg Val Val Phe His
1 5 10 15
Phe Glu
<210> 89
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 89
Leu Val Asp Gln Trp Arg Trp Gly Val Phe Ser Gly His Thr Pro Pro
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Asn Phe Asp Trp Trp Tyr
20 25
<210> 90
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 90
Asp His Ala Pro Glu Phe Pro Ala Arg Glu Met Leu Leu Lys Tyr Gln
1 5 10 15
Lys Leu Leu Cys Gln Glu Arg Tyr Phe Leu
20 25
<210> 91
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 91
Ser Val Leu Arg Glu Asp Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Lys Tyr Gln Tyr
1 5 10 15
Ala Tyr Phe Arg Met Gly Ile Lys His Pro Asp
20 25
<210> 92
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 92
Ala Asp Arg Arg Arg Gln Arg Ser Thr Phe Arg Ala Val Leu His Phe
1 5 10 15
Val Glu Gly Gly Glu Ser Glu Glu
20
<210> 93
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 93
Ala Ile Tyr His Lys Tyr Tyr His Tyr Leu Tyr Ser Tyr Tyr Leu Pro
1 5 10 15
Ala Ser Leu Lys Asn Met Val Asp
20
<210> 94
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 94
Lys Gln Gly Trp Thr Thr Glu Gly Ile Trp Lys Asp Val Tyr Ile Ile
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 95
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 95
Ala Ile Ile Ser Ser Leu Phe Val Ser Tyr Phe Leu Tyr Arg
1 5 10
<210> 96
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 96
Ser Gly Gln Pro Ala Pro Glu Glu Thr Val Leu Phe Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
His Gly Leu Leu Leu Ile Leu Arg Arg Leu Arg Gly Gly
20 25
<210> 97
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 97
Lys Gln Tyr Leu Asp His Ser Gly Asn Leu Met Ser Met His Asn Ile
1 5 10 15
Lys Ile Phe Met Phe Gln Leu Leu Arg Gly
20 25
<210> 98
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 98
Ser Met Trp Lys Gly Glu Leu Tyr Arg Gln Asn Arg Phe Ala Ser Ser
1 5 10 15
Lys Glu Ser Ala Lys Leu Tyr Gly Ser
20 25
<210> 99
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 99
Leu Arg Val Phe Ile Gly Asn Ile Ala Val Asn His Ala Pro Val Ser
1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly Thr Val
20 25 30
Pro
<210> 100
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 100
Asp Val Gly Val Asn Ser Leu Gln Gln Tyr Tyr Leu Ser Pro Asp Leu
1 5 10 15
His Phe Ser Leu Ile Gln Lys Glu Asn Leu Asp
20 25
<210> 101
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 101
Asp His Val Ser Ile Ile Leu Leu Ser Ala Thr Ile Pro Asn Ala Leu
1 5 10 15
Glu Phe Ala Asp Trp Ile Gly
20
<210> 102
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 102
Asp Pro Asp Val Gly Val Asn Ser Leu Gln Gln Tyr Tyr Leu Ser Pro
1 5 10 15
Asp Leu His Phe Ser Leu Ile
20
<210> 103
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 103
Leu His Phe Ile Met Pro Glu Lys Phe Ser Phe Trp Glu Asp Phe Glu
1 5 10 15
Glu
<210> 104
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 104
Asp Pro Leu Met Thr Cys Ser Glu Pro Glu Arg Leu Thr Glu Ile Leu
1 5 10 15
Phe Gln Arg Ala Glu Leu Glu
20
<210> 105
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 105
Thr Leu Lys Glu Glu Val Asn Glu Leu Gln Tyr Arg Gln Lys Gln Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ile Thr Asn Leu Met Arg Gln Val Asp
20 25
<210> 106
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 106
Leu Lys Glu Met Asn Glu Lys Val Ser Phe Ile Lys Asn Ser Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Ser Gln Val Gly His Leu Gln Asp
20 25
<210> 107
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 107
Tyr Phe Asp Val Val Glu Arg Ser Thr Glu Lys Ile Val Asp Thr Ser
1 5 10 15
Leu Ile Phe Asn Ile
20
<210> 108
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 108
Val Ala Arg Asn Tyr Leu Arg Glu Ala Val Ser His Asn Ala Ser Leu
1 5 10 15
Glu Val Ala Ile Leu Arg Asp
20
<210> 109
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 109
Ala Ala Ala Phe Pro Ser Gln Arg Thr Ser Trp Glu Phe Leu Gln Ser
1 5 10 15
Leu Val Ser Ile Lys Gln Glu Lys Pro Ala
20 25
<210> 110
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 110
Asn Asn Gly Pro Val Thr Ile Leu Gln Arg Ile His His Met Ala Ala
1 5 10 15
Ser His Val Asn Ile Thr Ser
20
<210> 111
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 111
Leu Met Ser Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Arg Met Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 112
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 112
Tyr Arg Met Tyr Gln Lys Gly Gln Glu Thr Ser Thr Asn Leu Ile Ala
1 5 10 15
Ser Ile Phe Ala
20
<210> 113
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 113
Pro Ala Ala Gly Asp Phe Ile Arg Phe Arg Phe Phe Gln Leu Leu Arg
1 5 10 15
Leu Glu Arg Phe Phe
20
<210> 114
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 114
Leu Asn Tyr Leu Arg Thr Ala Lys Phe Leu Glu Met Tyr Gly Val Asp
1 5 10 15
Leu His Pro Val Tyr Gly
20
<210> 115
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 115
Phe Lys Met Asp Arg Gln Gly Val Thr Gln Val Leu Ser Cys Leu Ser
1 5 10 15
Tyr Ile Ser Ala Leu Gly Met Met Thr
20 25
<210> 116
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 116
Leu Thr Lys Leu Lys Phe Ser Leu Lys Lys Ser Phe Asn Phe Phe Asp
1 5 10 15
Glu Tyr Phe
<210> 117
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 117
Leu Leu Thr Asp Arg Asn Thr Ser Gly Thr Thr Phe Thr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Pro Glu Leu Gln Val Pro Leu Phe Leu Val Phe Leu
20 25 30
Ala
<210> 118
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 118
Asp Ser Ala Val Asp Lys Gly His Pro Asn Arg Ser Ala Leu Ser Leu
1 5 10 15
Thr Pro Gly Leu Arg Ile Gly Pro Ser Gly Leu Phe Leu Val Phe Leu
20 25 30
Ala
<210> 119
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 119
Ala Leu Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Ile Gly Pro Ser Gly Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Phe Leu Ala Glu Ser Ala Val Asp Lys Gly His Pro Asn Arg
20 25 30
Ser
<210> 120
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 120
Pro Ile Asp Thr Ser Lys Thr Asp Pro Thr Val Leu Leu Phe Met Glu
1 5 10 15
Ser Gln Tyr Ser Gln Leu Gly Gln Asp
20 25
<210> 121
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 121
Asn Asn Ser Lys Lys Lys Trp Phe Leu Phe Gln Asp Ser Lys Lys Ile
1 5 10 15
Gln Val Glu Gln Pro Gln
20
<210> 122
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 122
Ser Lys Arg Gly Val Gly Ala Lys Thr Leu Leu Leu Pro Asp Pro Phe
1 5 10 15
Leu Phe Trp Pro Cys Leu Glu Gly Thr Arg Arg Ser Leu
20 25
<210> 123
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 123
Ser Leu Pro Lys Ser Phe Lys Arg Lys Ile Phe Val Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Lys Gly Val Pro Ala Gly Asn Ser Asp
20 25
<210> 124
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 124
Asp Asn His Leu Arg Arg Asn Arg Leu Ile Val Val Asp Leu Phe His
1 5 10 15
Gly Gln Leu
<210> 125
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 125
Thr Lys Arg Gln Val Ile Leu Leu His Thr Glu Leu Glu Arg Phe Leu
1 5 10 15
Glu Tyr Leu Pro Leu Arg Phe
20
<210> 126
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 126
Thr Lys Asp Arg Asp Leu Leu Val Val Ala His Asp Leu Ile Trp Lys
1 5 10 15
Met Ser Pro Arg Thr Gly Asp Ala Lys Pro Ser
20 25
<210> 127
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 127
His Arg Pro Arg Pro Phe Ser Pro Gly Lys Gln Val Ser Ser Ala Pro
1 5 10 15
Leu Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn
20
<210> 128
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 128
Pro Glu Asn Asp Asp Leu Phe Met Met Pro Arg Ile Val Asp Val Thr
1 5 10 15
Ser Leu Ala Thr Glu Gly Gly
20
<210> 129
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 129
Arg Pro Ala Gly Arg Thr Gln Leu Leu Trp Thr Pro Ala Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ala Met Ala Glu Val Gly Pro Gly His Thr Pro
20 25
<210> 130
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 130
Asp Pro Asn Lys Tyr Pro Val Pro Glu Asn Trp Leu Tyr Lys Glu Ala
1 5 10 15
His Gln Leu Phe Leu Glu
20
<210> 131
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 131
Ser His Thr Gln Thr Thr Leu Phe His Thr Phe Tyr Glu Leu Leu Ile
1 5 10 15
Gln Lys Asn Lys His Lys
20
<210> 132
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 132
Asp Gly Gly Arg Gln His Ser Gly Pro Arg Arg His Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Pro Lys Pro Ser Ser Ser Glu Trp Ala Val Cys Trp Ala Pro
20 25 30
<210> 133
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 133
Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp Ser Thr Thr Lys Arg Arg Trp Ser
1 5 10 15
Ala Leu Val Ile Gly Leu
20
<210> 134
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 134
Gly Ser Tyr Leu Val Ala Leu Gly Ala His Thr Gly Glu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 135
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 135
Arg Ala Arg Gln Ile Leu Ile Ala Ser His Leu Pro Phe Tyr Glu Leu
1 5 10 15
Arg His Asn Gln Val Glu Ser
20
<210> 136
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 136
Leu Pro Val Phe Ile Gly Asn Ile Ala Val Asn His Ala Pro Val Ser
1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly Thr Val
20 25 30
Pro
<210> 137
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 137
Val Ala Gly Leu Ala Ala Ser Gly Leu His Gly Ser Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Pro Gly Glu Gln Pro Val Ser Gly Pro His His Gly Lys Gln
20 25 30
<210> 138
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 138
Asp Ala Ser Asp Phe Leu Pro Asp Thr Gln Leu Phe Pro His Phe Thr
1 5 10 15
Glu Leu Leu Leu Pro Leu Asp Pro Leu Glu Gly Ser Ser Val
20 25 30
<210> 139
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 139
Asp Arg Ser Val Leu Ala Lys Lys Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe
1 5 10 15
Arg His Gly Asp Arg Ser Pro Ile Asp
20 25
<210> 140
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 140
Val Glu Gln Gly His Val Arg Val Gly Pro Asp Val Val Thr His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Val
20
<210> 141
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 141
Ser Gln Ser Ser Thr Pro Ala Met Leu Phe Pro Ala Pro Ala Ala His
1 5 10 15
Arg Thr Leu Thr Tyr Leu Ser Gln
20
<210> 142
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 142
Gly Thr Lys Ala Leu Gln Leu His Ser Ile Ala Gly Arg Trp Pro Arg
1 5 10 15
Met Glu Pro Trp Val Val Glu Ser Met Ser Leu Gly Val Pro
20 25 30
<210> 143
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 143
Thr Ile Lys Asn Ser Asp Lys Asn Val Val Leu Glu His Phe Gly
1 5 10 15
<210> 144
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 144
Arg Leu Val Leu Gly Lys Phe Gly Asp Leu Thr Asn Asn Phe Ser Ser
1 5 10 15
Pro His Ala Arg
20
<210> 145
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 145
Tyr Leu Leu Pro Lys Thr Ala Val Val Leu Arg Cys Pro Ala Leu Arg
1 5 10 15
Val Arg Lys Pro
20
<210> 146
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 146
Leu Glu Asn Asn Ala Asn His Asp Glu Thr Ser Phe Leu Leu Pro Arg
1 5 10 15
Lys Glu Ser Asn Ile Val Asp
20
<210> 147
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 147
Lys Lys Asn Ile Thr Asn Leu Ser Arg Leu Val Val Arg Pro Asp Thr
1 5 10 15
Asp Ala Val Tyr
20
<210> 148
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 148
Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys Val Arg Thr Ala Pro Leu
1 5 10 15
Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly
20
<210> 149
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 149
Lys Met Gln Arg Arg Asn Asp Asp Lys Ser Ile Leu Met His Gly Leu
1 5 10 15
Val Ser Leu Arg Glu Ser Ser Arg Gly
20 25
<210> 150
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 150
His Lys Ser Ile Gly Gln Pro Lys Leu Ser Thr His Pro Phe Leu Cys
1 5 10 15
Pro Lys Pro Gln Lys Met Asn Thr Ser Leu Gly Gln His Leu Thr Leu
20 25 30
<210> 151
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 151
Asn Thr Asp Lys Gly Asn Asn Pro Lys Gly Tyr Leu Pro Ser His Tyr
1 5 10 15
Lys Arg Val Gln Met Leu Leu Ser Asp Arg Phe Leu
20 25
<210> 152
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 152
Trp Asp Gly Pro Pro Glu Asn Asp Met Leu Leu Lys Glu Ile Cys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ile Pro
20
<210> 153
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 153
Pro Arg Val Asp Leu Gln Gly Ala Glu Leu Trp Lys Arg Leu His Glu
1 5 10 15
Ile Gly Thr Glu Met Ile Ile Thr Lys
20 25
<210> 154
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 154
Asp His Ala Pro Glu Phe Pro Ala Arg Glu Met Leu Leu Lys Tyr Gln
1 5 10 15
Lys Leu Leu Ser Gln Glu Arg
20
<210> 155
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 155
Ser Ser Glu Leu Thr Ala Val Asn Phe Pro Ser Phe His Val Thr Ser
1 5 10 15
Leu Lys Leu Met Val Ser Pro Thr Ser
20 25
<210> 156
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 156
Glu Val Val Gly Gly Tyr Thr Trp Pro Ser Gly Asn Ile Tyr Gln Gly
1 5 10 15
Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Arg
20
<210> 157
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 157
Gly Ser Thr Leu Ser Pro Val Pro Trp Leu Pro Ser Glu Glu Phe Thr
1 5 10 15
Leu Trp Ser Ser Leu Ser Pro Pro Gly
20 25
<210> 158
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 158
Gly Ser Gly Ala Leu Gly Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn
1 5 10 15
Gln Asp Trp Leu
20
<210> 159
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 159
Gly Asp Gln Tyr Lys Ala Thr Asp Phe Val Ala Asp Trp Ala Gly Thr
1 5 10 15
Phe Lys Met Val Phe Thr Pro Lys Asp Gly Ser Gly
20 25
<210> 160
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 160
Leu Ser Pro Arg Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Ile Met Met
1 5 10 15
Arg Ser Ile Gln
20
<210> 161
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 161
Gly Ala Leu Gly Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp
1 5 10 15
Trp Leu Gly Val Ser Arg Gln Leu Arg Thr Lys Ala
20 25
<210> 162
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 162
Val Gln Leu Ser Ile Gln Asp Val Ile Arg Arg Ala Arg Leu Ser Thr
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Gln Arg Val Ala Leu Arg Ser Gly Trp Ile
20 25 30
<210> 163
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 163
Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Arg Gln Leu
20
<210> 164
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 164
Gly Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5 10 15
<210> 165
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 165
Glu Gly Pro Met His Gln Trp Val Ser Tyr Gln Gly Arg Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Pro Arg Pro Gly Met Cys Pro Ser Lys Thr
20 25
<210> 166
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 166
Ala His Arg Gln Gly Glu Lys Gln His Leu Leu Pro Val Phe Ser Arg
1 5 10 15
Leu Ala Leu Arg Leu Pro Trp Arg His Ser Val Gln Leu
20 25
<210> 167
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 167
Lys Leu Ala Trp Arg Gly Arg Ile Ser Ser Ser Gly Cys Pro Ser Met
1 5 10 15
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Met Phe Gly Met Thr Leu His Thr
20 25 30
<210> 168
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 168
Ser Leu Thr Glu Glu Ser Gly Gly Ala Val Ala Phe Phe Pro Gly Asn
1 5 10 15
Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ala
20
<210> 169
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 169
Ala Gln Arg Lys Leu Tyr Gln Asp Val Met His Glu Asn Phe Thr Asn
1 5 10 15
Leu Leu Ser Val Gly His Gln Pro
20
<210> 170
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 170
Asp Asp Ser Leu His Ile Gln Ala Thr Tyr Ile Ser Gly Pro Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Asp
20
<210> 171
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 171
Ser Arg Asn Thr Gly His Leu His Pro Thr Pro Arg Phe Pro Leu Leu
1 5 10 15
Arg Trp Thr Gln Glu Pro Gln Pro Leu Glu
20 25
<210> 172
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 172
Ser His Asn Glu Leu Ala Asp Ser Gly Ile Pro Glu Asn Ser Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Leu Val Glu
20
<210> 173
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 173
Val Pro Arg Ile Ala Glu Leu Met Asn Lys Lys Leu Pro Ser Phe Gly
1 5 10 15
Pro Tyr Leu Glu
20
<210> 174
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 174
Lys His Leu Pro Gly Val Asn Phe Pro Gly Asn Gln Trp Asn Pro Val
1 5 10 15
Glu Gly Ile Leu Pro Ser
20
<210> 175
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 175
Gly Arg Met Ser Pro Ser Gln Phe Ala Arg Val Pro Gly Tyr Val Gly
1 5 10 15
Ser Pro Leu Ala Ala Met Asn Pro Lys
20 25
<210> 176
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 176
Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn
1 5 10 15
Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu
20 25 30
<210> 177
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 177
Asp Ala Thr Phe Ser Asp Gly Ser Leu Gly Gln Leu Val Lys Asn Thr
1 5 10 15
Ser Ala Thr Tyr Ala Leu Ser
20
<210> 178
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 178
Asp Glu Gln Gly Arg Glu Ala Glu Leu Ala Arg Ser Gly Pro Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gly Pro Val Arg Leu Lys Pro Gly Leu Val Pro Gly Leu
20 25 30
<210> 179
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 179
Arg Arg Gly Gly Ala Leu Phe Ala Ser Arg Pro Arg Phe Thr Pro Leu
1 5 10 15
<210> 180
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 180
Ser Ala Ala Glu Ala Leu Glu Leu Asn Leu Asp Glu Glu Ser Ile Ile
1 5 10 15
Lys Pro Val His Ser Ser Ile Leu Gly Gln Glu
20 25
<210> 181
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 181
Pro Gly Gly Asp Ser Gly Glu Leu Ile Thr Asp Ala His Glu Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala His Pro Pro Gly Tyr
20
<210> 182
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 182
Pro Glu Thr Gly Glu Ile Gln Val Lys Thr Phe Leu Asp Arg Glu Gln
1 5 10 15
Arg Glu Ser Tyr Glu Leu Lys Val
20
<210> 183
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 183
Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5 10 15
<210> 184
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 184
Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5 10
<210> 185
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 185
Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn
1 5 10 15
Phe Glu Lys Leu
20
<210> 186
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 186
Thr Thr Val Thr His Glu Arg Lys Gln Ala Lys Val Val Asn Pro Pro
1 5 10 15
Ile Gln Glu Val Gly Lys Gly Ala Arg Lys
20 25
<210> 187
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 187
Arg Tyr Asn Ser Thr Ala Ala Thr Asn Glu Val Ser Glu Val Thr Val
1 5 10 15
Phe Ser Lys Ser Pro Val Thr
20
<210> 188
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 188
Lys Gly Glu Lys Asn Gly Met Thr Phe Ser Ser Thr Lys Asp Tyr Val
1 5 10 15
Asn Asn Val
<210> 189
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 189
Val Ser Trp Gly Lys Lys Val Gln Pro Ile Asp Ser Ile Leu Ala Asp
1 5 10 15
Trp Asn Glu Asp Ile Glu Ala Phe Glu Met Met Glu Lys Asp
20 25 30
<210> 190
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 190
Gly His Gln Lys Leu Pro Gly Lys Ile His Leu Phe Glu Ala Glu Phe
1 5 10 15
Thr Gln Val Ala Lys Lys Glu Pro Asp Gly
20 25
<210> 191
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 191
Thr Ser Arg Arg Leu Thr Gly Leu Leu Asp His Glu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gln
<210> 192
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 192
Ser Pro Ile Lys Leu Val Gln Lys Val Ala Ser Lys Ile Pro Phe Pro
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Glu Glu Ser Val
20
<210> 193
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 193
Arg Gly Gln Ile Lys Leu Ala Asp Phe Arg Leu Ala Arg Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Ser Glu Glu Ser Arg
20
<210> 194
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 194
Pro Leu Met Gln Thr Glu Leu His Gln Leu Val Pro Glu Ala Asp Pro
1 5 10 15
Glu Glu Met Ala
20
<210> 195
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 195
Thr Phe Pro Lys Lys Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu
1 5 10 15
Tyr
<210> 196
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 196
Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met
1 5 10 15
Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr
20
<210> 197
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 197
Asn Ile Leu His Gln Glu Glu Leu Ile Ala Gln Lys Lys Trp Glu Ile
1 5 10 15
Glu Ala Lys Met Glu Gln Lys
20
<210> 198
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 198
Val Pro Asp Ile Asn Met Glu Lys Lys Leu Arg Lys Ile Arg Ala Gln
1 5 10 15
Thr Gln Lys His Leu Asp Leu Tyr Ala Arg Asp Gly
20 25
<210> 199
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 199
His Pro Glu Phe Ala Asn Pro Asp Ser Met Glu Tyr Ile Ser Asp Val
1 5 10 15
Val Asp Glu Val Ile Gln Asn
20
<210> 200
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 200
Ser Glu Ile Asp Phe Pro Met Ala Arg Ser Lys Leu Leu Lys Lys Lys
1 5 10 15
Leu Pro Ser Lys Asp Leu
20
<210> 201
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 201
Glu Asp Ser Asp Lys Leu Phe Glu Ser Lys Ala Glu Leu Ala Asp His
1 5 10 15
Gln Lys Phe
<210> 202
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 202
Met Pro Pro Pro Gly Ala Leu Met Gly Leu Ala Leu Lys Lys Lys Ser
1 5 10 15
Ile Pro Gln Pro Thr Asn
20
<210> 203
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 203
Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ala Pro Pro Pro His Ala Thr Ala Thr Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Phe Met Pro Gly Thr Trp Gly Arg Glu Asp Leu
20 25 30
<210> 204
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 204
Leu Gly Glu Thr Met Gly Gln Val Thr Glu Lys Leu Gln Pro Thr Tyr
1 5 10 15
Met Glu Glu Thr
20
<210> 205
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 205
Thr Trp Ala Gly His Val Ser Thr Ala Leu Ala Arg Pro Leu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Trp Ala Glu Pro Gly Ser Cys Gly Pro Gly Thr Asn
20 25
<210> 206
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 206
Trp Thr Pro Ala Ala Pro Thr Ala Met Ala Glu Val Gly Pro Gly His
1 5 10 15
Thr Pro Ala His Pro Ser Gln Gly Ala Val Pro Pro
20 25
<210> 207
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 207
Glu Gln Gly Pro Trp Gln Ser Glu Gly Gln Thr Trp Arg Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Pro Val Pro Cys Pro Ala Ala Gly Pro Gly
20 25
<210> 208
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 208
Leu Ala Arg Asp Ile Pro Pro Ala Val Thr Gly Lys Trp Lys Leu Ser
1 5 10 15
Asp Leu Arg Arg Tyr Gly Ala Val Pro Ser Gly
20 25
<210> 209
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 209
Lys Gly Ala Ser Leu Asp Ala Gly Trp Gly Ser Pro Arg Trp Thr Thr
1 5 10 15
Thr Arg Met Thr Ser Ala Ser Ala Gly Arg Ser Thr Arg Ala
20 25 30
<210> 210
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 210
Leu Ser Val Pro Phe Thr Cys Gly Val Asn Phe Gly Asp Ser Ile Glu
1 5 10 15
Asp Leu Glu Ile
20
<210> 211
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 211
Val Thr Ser Pro Lys Ala Ser Pro Val Thr Phe Pro Ala Ala Ala Phe
1 5 10 15
Pro Thr Ala Ser Pro Ala Asn Lys Asp
20 25
<210> 212
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 212
Asp Ser Pro Ala Gly Pro Arg Arg Lys Glu Cys Thr Met Ala Leu Ala
1 5 10 15
Pro Asn Phe Thr Ala Asn Asn Arg
20
<210> 213
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 213
Pro Ser Thr Ala Asn Tyr Asn Ser Phe Ser Ser Ala Pro Met Pro Gln
1 5 10 15
Ile Pro Val Ala Ser Val Thr Pro Thr
20 25
<210> 214
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 214
Ser Ala Val Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ala Glu His Ile Asn Gln Ala
1 5 10 15
Thr Asn Gly Gly Gly Ser
20
<210> 215
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 215
Asn Asn Gln Thr Asn Ser Pro Thr Thr Pro Asn Phe Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Ser Phe Asn Leu Pro Asn Ser Gly Asp
20 25
<210> 216
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 216
Gly Thr Glu Pro Glu Pro Ala Phe Gln Asp Asp Ala Val Asn Ala Pro
1 5 10 15
Leu Glu Phe Lys Met Ala Ala Gly Ser Ser Gly
20 25
<210> 217
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 217
Thr Asn Gly Pro Glu Lys Asn Ser Ser Ser Phe Pro Ser Ser Val Asp
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Ser Gly Pro Arg Lys Leu
20 25
<210> 218
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 218
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Val Pro Lys Glu His Pro Ala Pro Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Pro Ala Ser Ala Pro Thr Pro
20 25
<210> 219
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 219
Met Ser Gln Asp Ile Lys Lys Ala Asp Glu Gln Ile Glu Ser Met Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Glu Arg Lys Thr
20
<210> 220
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 220
Pro Ala His Pro Ser Gln Gly Ala Val Pro Pro Ser Arg Ala Ala Ala
1 5 10 15
Glu Pro His Leu Lys Pro Ser Pro Ser Glu Leu Gln Thr Ala
20 25 30
<210> 221
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 221
Ser Gly Ser Pro Pro Leu Arg Val Ser Val Gly Asp Phe Ser Gln Glu
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ile Gln Glu Ala Gln Gln Asp
20 25
<210> 222
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 222
Arg Gln Arg Arg Gly Arg Leu Gly Leu Pro Gly Glu Ala Gly Leu Glu
1 5 10 15
Gly Phe Glu Pro Ser Asp Ala Leu Gly Pro Asp
20 25
<210> 223
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 223
Ala Glu Ser Ala Gln Arg Gln Gly Pro Asn Gly Gly Gly Glu Gln Ser
1 5 10 15
Ala Asn Glu Phe
20
<210> 224
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 224
Ala Ala Val Arg Pro Glu Gln Arg Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Val
1 5 10 15
<210> 225
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 225
Phe Tyr Ser Asn Ser Thr Val Ser Glu Thr Gln Trp Lys Val Thr Val
1 5 10 15
Thr Pro Arg
<210> 226
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 226
Leu Met Gly Arg Leu Gln His Thr Phe Lys Gln Lys Met Thr Gly Val
1 5 10 15
Gly Ala Ser Leu Glu Lys Arg
20
<210> 227
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 227
Val Asp Lys Asn Gly Arg Arg Arg Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 228
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 228
Val Asp Lys Asn Gly Arg Arg Arg Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser
20
<210> 229
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 229
Phe Leu Leu Gln Val Pro Gly Ser Pro Val Val Ser Pro Ser Ala
1 5 10 15
<210> 230
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 230
Phe Val Gly Lys Leu Gln Arg His Pro Val Ala Val Asp Val Leu Leu
1 5 10 15
<210> 231
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 231
Tyr Pro Glu Pro Gln Asn Lys Glu Ala Phe Val His Ser Gln Met Tyr
1 5 10 15
Ser Thr Asp Tyr Asp Gln Ile
20
<210> 232
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 232
Asp Asp Asn Gly Asn Ile Leu Asp Pro Asp Lys Thr Ser Thr Ile Ala
1 5 10 15
Leu Phe Lys Ala His Glu Val
20
<210> 233
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 233
Leu Val Gly Gln Leu Lys Arg Val Pro Arg Thr Gly Arg Val Tyr Arg
1 5 10 15
Asn Val Gln Arg Pro Glu Ser Val Ser
20 25
<210> 234
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 234
Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr
1 5 10 15
Asp His Gly Ser Cys Val
20
<210> 235
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 235
Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val
1 5 10 15
Val Thr Asp His Gly Ser
20
<210> 236
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 236
Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser
1 5 10 15
Cys Val
<210> 237
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 237
Ile Ala Met Gly Phe Pro Gln Lys Asp Leu Lys Ala Tyr Thr Gly Thr
1 5 10 15
Ile Leu
<210> 238
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 238
Ala Ala Val Asp Ser Val Thr Ile Pro Pro Ala Gln Cys Tyr Leu Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Leu Gln Gln Arg Arg Met Gln Ser Ala
20 25
<210> 239
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 239
Pro Ala Ala Val Asp Ser Val Thr Ile Pro Pro Ala Gln Cys Tyr Leu
1 5 10 15
Ser Leu Leu His Leu
20
<210> 240
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 240
Asp Leu Ser Tyr Val Ser Asp Gln Asn Gly Gly Val Pro Asp Gln Ile
1 5 10 15
Leu Leu His Leu Arg Pro Thr Glu Asp
20 25
<210> 241
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 241
Ala Val Arg Ser Pro Gly Ser Pro Leu Ile Leu Glu Val Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ile Ser
20
<210> 242
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 242
Leu Glu Glu Val Ala Gln Arg Ser His Ala Val Arg Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Pro Leu Ile Leu Glu Val Gly
20
<210> 243
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 243
Leu Ala Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly
1 5 10 15
Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser
20 25
<210> 244
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 244
Leu Ala Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly
1 5 10 15
Asn Tyr Val Val Thr Asp His
20
<210> 245
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 245
Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp
1 5 10 15
His Gly Ser Cys Val Arg Ala
20
<210> 246
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 246
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr
1 5 10 15
Val Val
<210> 247
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 247
Ala Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn
1 5 10 15
Tyr Val
<210> 248
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 248
Ser His His Thr His Ser Tyr Gln Arg Tyr Ser His Pro Leu Phe Leu
1 5 10 15
Pro Gly His Arg Leu Asp Pro Pro Ile
20 25
<210> 249
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 249
Ser His Gln Ile His Ser Tyr Gln Leu Tyr Thr His Pro Leu Leu His
1 5 10 15
Pro Trp Asp His Arg Asp
20
<210> 250
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 250
Asp Lys Gly His Gln Phe His Val His Pro Leu Leu His Ser Gly Asp
1 5 10 15
Asp Leu Asp Pro
20
<210> 251
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 251
Lys Leu Arg Thr Ile Pro Leu Ser Asp Asn Thr Ile Phe Arg Arg Ile
1 5 10 15
Cys Thr Ile Ala Lys His Leu Glu
20
<210> 252
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 252
Ala Ser Ala Thr Glu Pro Ala Asn Asp Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ala Asn Leu Phe Ser Thr Tyr Leu Ala Arg
20 25
<210> 253
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 253
Phe Pro Val Val Gln Ser Thr Glu Asp Val Phe Pro Gln Gly Leu Pro
1 5 10 15
Asn Glu Tyr Ala Phe Val Thr
20
<210> 254
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 254
Ala Ala Ser Ala Ala Ala Phe Pro Ser Gln Arg Thr Ser Trp Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gln Ser Leu Val Ser Ile Lys Gln Glu Lys
20 25
<210> 255
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 255
Gly Ser Val Leu Gln Phe Met Pro Phe Thr Thr Val Ser Glu Leu Met
1 5 10 15
Lys Val Ser Ala Met Ser Ser Pro Lys Val
20 25
<210> 256
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 256
Asn Gln Val Leu Ala Ser Arg Tyr Gly Ile Arg Gly Phe Ser Thr Ile
1 5 10 15
Lys Ile Phe Gln Lys Gly Glu Ser Pro Val
20 25
<210> 257
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 257
Ala Arg Leu Gln Ser Lys Glu Tyr Pro Val Ile Phe Lys Ser Ile Met
1 5 10 15
Arg Gln Arg Leu Ile Ser Pro Gln Leu
20 25
<210> 258
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 258
Asp Val Thr Gly Pro His Leu Tyr Ser Ile Tyr Leu His Gly Ser Thr
1 5 10 15
Asp Lys Leu Pro Tyr Val Thr Met Gly Ser
20 25
<210> 259
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 259
Ser His Leu Ala Ser Leu Lys Asn Asn Val Ser Pro Val Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Ser Phe Ser Asp Pro Ser Pro Lys Phe Ala
20 25
<210> 260
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 260
Thr Ala Gln Phe Ala Pro Ser Pro Gly Gln Pro Pro Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Gly His Arg Leu Pro Leu Gln Gln Gly
20 25
<210> 261
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 261
Pro Ala Ser Ala Lys Ser Arg Arg Glu Phe Asp Lys Ile Glu Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Arg
<210> 262
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 262
Met Ala Gly Pro Lys Gly Phe Gln Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Phe Arg
1 5 10 15
Arg Glu Arg
<210> 263
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 263
Ser Asp Ala Phe Ser Gly Leu Thr Ala Leu Pro Gln Ser Ile Leu Leu
1 5 10 15
Phe Gly Pro
<210> 264
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 264
Ser Thr Gln His Ala Asp Leu Thr Ile Ile Asp Asn Ile Lys Glu Met
1 5 10 15
Asn Phe Leu Arg Arg Tyr Lys
20
<210> 265
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 265
Leu His Thr His Tyr Asp Tyr Val Ser Ala Leu His Pro Val Ser Thr
1 5 10 15
Pro Ser Lys Glu Tyr Thr Ser Ala
20
<210> 266
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 266
Ser Ser Pro Leu Gly Arg Ala Asn Gly Arg Arg Phe Ala Asn Pro Arg
1 5 10 15
Asp Ser Phe Ser Ala Met Gly Phe Gln Arg
20 25
<210> 267
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 267
Glu Ile His Gly Lys Cys Glu Asn Met Thr Ile Thr Ser Arg Gly Thr
1 5 10 15
Thr Val Thr Pro Thr Lys Glu Thr Val Ser Leu Gly
20 25
<210> 268
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 268
Leu Asn Thr Gly Leu Phe Arg Ile Lys Phe Lys Glu Pro Leu Glu Asn
1 5 10 15
Leu Ile
<210> 269
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 269
Ser Pro Gln Ser Gly Gly Ala Ala Thr Leu Ala Ala Gln Ala Arg Leu
1 5 10 15
Gln Pro Val His Leu Asp Val Trp Gly Glu His Glu Arg Gly
20 25 30
<210> 270
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 270
Gly Ser Gly Ser Gln Met Pro Ala Trp Arg Thr Arg Gly Ala Ile Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ser Thr Gln Lys Thr Pro Thr Thr Arg Leu
20 25
<210> 271
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 271
Gly Leu Thr Arg Ile Ser Ile Gln Arg Ala Gln Pro Leu Pro Pro Cys
1 5 10 15
Leu Pro Ser Phe Arg Pro Pro Thr Ala Leu Gln Gly Leu Ser
20 25 30
<210> 272
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 272
Ser Arg Leu Gln Thr Arg Lys Asn Lys Lys Leu Ala Leu Ser Ser Thr
1 5 10 15
Pro Ser Asn Ile Ala Pro Ser Asp
20
<210> 273
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 273
Trp Cys Thr Glu Met Lys Arg Val Phe Gly Phe Pro Val His Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Val Ser Asn Met Ser
20
<210> 274
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 274
Gly Pro Leu Gln Leu Pro Val Thr Arg Lys Asn Met Pro Leu Pro Gly
1 5 10 15
Val Val Lys Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ser
20 25
<210> 275
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 275
Ala Leu Leu Gln Asn Val Glu Leu Arg Arg Asn Val Leu Val Ser Pro
1 5 10 15
Thr Pro Leu Ala Asn
20
<210> 276
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 276
Val Asn Gly Ile Ser Ser Gln Pro Gln Val Pro Phe Tyr Pro Asn Leu
1 5 10 15
Gln Lys Ser Gln Tyr Tyr Ser Thr Val
20 25
<210> 277
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 277
Tyr Leu Ser His Thr Leu Gly Ala Ala Ser Ser Phe Met Arg Pro Thr
1 5 10 15
Val Pro Pro Pro Gln Phe
20
<210> 278
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 278
Ser Leu Arg Asn Asn Met Phe Glu Ile Ser Asp Arg Phe Ile Gly Ile
1 5 10 15
Tyr Lys Thr Tyr Asn Ile Thr Lys
20
<210> 279
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 279
Val Thr Leu Asn Asp Met Lys Ala Arg Gln Lys Ala Leu Val Arg Glu
1 5 10 15
Arg Glu Arg Gln Leu Ala
20
<210> 280
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 280
Val Lys Gln Leu Glu Arg Gly Glu Ala Ser Val Val Asp Phe Lys Lys
1 5 10 15
Asn Leu Glu Tyr Ala Ala Thr
20
<210> 281
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 281
Thr Lys Leu Lys Ser Lys Ala Pro His Trp Thr Asn Cys Ile Leu His
1 5 10 15
Glu Tyr Lys Asn Leu Ser Thr Ser
20
<210> 282
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 282
Phe Ala Lys Gly Phe Arg Glu Ser Asp Leu Asn Ser Trp Pro Val Ala
1 5 10 15
Pro Arg Pro Leu Leu Ser Val
20
<210> 283
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 283
His Leu Leu Gln Lys Gln Thr Ser Ile Gln Ser Pro Ser Leu Tyr Gly
1 5 10 15
Asn Ser Ser Pro Pro Leu Asn Lys
20
<210> 284
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 284
Ser Thr Glu Val Glu Pro Lys Glu Ser Pro His Leu Ala Arg His Arg
1 5 10 15
His Leu Met Lys Thr Leu Val Lys Ser Leu Ser Thr
20 25
<210> 285
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 285
Asp Gly Ala Trp Pro Val Leu Leu Asp Lys Phe Val Glu Trp Tyr Lys
1 5 10 15
Asp Lys Gln Met Ser
20
<210> 286
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 286
Ser His Lys Leu Glu Ser Ile Lys Glu Ile Thr Asn Phe Lys Asp Ala
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu
20
<210> 287
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетическая последовательность пептидного антигена"
<400> 287
Thr Gly Lys Pro Glu Met Asp Phe Val Arg Leu Ala Gln Leu Phe Ala
1 5 10 15
Arg Ala Arg Pro Met Gly Leu Phe Asn Glu Trp Tyr Arg Lys
20 25 30
<---