Способ определения функционального фибриногена
METHOD FOR DETERMINATION OF FUNCTIONAL FIBRINOGEN

Изобретение относится к медицине, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза, интенсивной терапии.
На сегодняшний день известны различные методы определения функционального фибриногена.
Так известно определение концентрации фибриногена по Клауссу, основанное на исследовании времени образования сгустка при добавлении высокой концентрации тромбина к разбавленной в 10-20 раз плазме. Тест выполняется на коагулометрах, при этом логарифм времени образования сгустка обратно пропорционален логарифму концентрации функционального фибриногена. Калибровочная кривая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена. (Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада» 2005. - 227 с,). Основными ограничениями метода определения фибриногена по Клауссу является чувствительность результатов к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, а также к продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров и могут быть причиной ложно низких результатов. Метод выполняется только в лабораторных условиях на специальном оборудовании (центрифуга, коагулометр).
FF
Известно также определение функционального фибриногена (Functional Fibrinogen Level - FLEV)c помощью тромбоэластографии. Метод тромбоэластографии не требует центрифугирования крови, является прикроватным, широко используется в интенсивной терапии. Определение уровня функционального фибриногена с помощью тромбоэластографии заключается в регистрации максимальной амплитуды тромбоэластограммы после добавления к цитратной крови ингибитора тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIIa (абциксимаба) и активатора вешнего пути свертывания (лиофилизированного тканевого фактора). Максимальная амплитуда (MA), регистрируемая при этом на тромбоэластограмме, отражает уровень функционального фибриногена (FLEV) (Rossaint R, Bouillon В, Cerny V, Coats TJ, Duranteau J,  E, et al. The European guideline on management of major bleeding and coagulopathy following trauma: fourth edition. Critical Care. Critical Care; 2016;20:100). Определенный таким образом функциональный фибриноген коррелирует с концентрацией фибриногена, определенной по Клауссу. В то же время известно, что функциональный фибриноген, определенный с помощью тромбоэластографии, может переоценивать концентрацию фибриногена (Agren A, Wikman AT, Ostlund A, Edgren G. TEG functional fibrinogen analysis may overestimate fibrinogen levels. Anesthesia and analgesia. 2014;118:933-5). Возможной причиной переоценки фибриногена является то, что при этом методе не всегда удается полностью ингибировать тромбоциты, что было показано при сравнении его с методом тромбоэластометрии, использующим другой ингибитор тромбоцитов. Существенным недостатком является также дороговизна метода, ограничивающая его широкое использование, а возможное присутствие в пробе гепарина, который может получать обследуемый, требует выполнения теста с гепариназой.
2
Известен также способ определения функционального фибриногена в тесте FIBTEM ротационной тромбоэластометрии. В этом тесте к цитратной крови добавляются ингибитор тромбоцитов цитохалазин D, рекомбинантный тканевой фактор и ингибитор гепарина, после чего определяется максимальная плотность сгустка (показатель MCF - maximum clot firmness) по данным тромбоэластометрии. Функциональный фибриноген, определенный с помощью теста FIBTEM, коррелирует с концентрацией фибриногена по Клауссу (R = 0.671, р<0.001) ( F,  A, Preininger A, Raggam RB, Grinschgl Y, Krumnikl J, et al. Comparison of functional fibrinogen (FF/CFF) and FIBTEM in surgical patients - a retrospective study. Clinical chemistry and laboratory medicine. 2016;54:453-8). По уровню фибриногена, определенного с помощью теста FIBTEM, рекомендуется принимать решение о коррекции гипофибриногенемии у больных с травмой. Однако и этот метод не позволяет полностью ингибировать функцию тромбоцитов и, следовательно, может завышать уровень функционального фибриногена. Причем это завышение тем выше, чем больше тромбоцитов в крови. Поэтому была предложена модификация теста FIBTEM, которая называется FIBTEM Plus (Solomon С, Baryshnikova Е, Schlimp CJ,  H, Asmis LM, Ranucci M. FIBTEM PLUS Provides an Improved Thromboelastometry Test for Measurement of Fibrin-Based Clot Quality in Cardiac Surgery Patients. Anesthesia & Analgesia. 2013;117:1054-62). В данном тесте FIBTEM Plus для лучшего подавления функции тромбоцитов наряду с цитохалазином D добавляется ингибитор тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIIa - препарат тирофибан. Существенными недостатками является дороговизна метода, ограничивающая его широкое использование, неполное ингибирование функции тромбоцитов, что может привести к переоценке концентрации функционального фибриногена.
Наиболее близким техническим решением к заявленному, является способ определения фибриногена, в котором предлагается оценивать уровень фибриногена по величине максимальной амплитуды тромбоэластограммы, выполненной с обедненной тромбоцитами плазмой (RU 2517116 от 27.05.2014). Недостатками данного метода является то, что для получения обедненной тромбоцитами плазмы необходимо центрифугировать кровь в определенных режимах. Кроме того, полученная после центрифугирования обедненная тромбоцитами плазма никогда не является полностью свободной от тромбоцитов, а их количество в ней может варьировать. Следовательно, и максимальная амплитуда тромбоэластограммы обедненной тромбоцитами плазмы будет варьировать и зависеть от количества оставшихся в ней тромбоцитов и не всегда точно отражать уровень функционального фибриногена.
Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении точности определения функционального фибриногена по максимальной амплитуде тромбоэластограммы гепаринизированной крови, в котором образование фибринового сгустка индуцируется добавлением фермента, выделенного из яда гремучей змеи Bothrops atrox, батроксобина с активностью 5 МЕ/мл.
Батрокс
Батрокс
батрокс
батрокс
батрокс
Батрокс
Технический результат достигается тем, что определение функционального фибриногена, проводят посредством исследования цельной пробы крови путем тромбоэластографии, при этом гепаринизированную кровь и батроксобин с активностью 5 МЕ/мл вносят в кювету для тромбоэластографии в соотношении 34:1 соответственно, после чего выполняют тромбоэластографию, оценивают параметр максимальной амплитуды (МА) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена (ФФ) рассчитывают по формуле: ФФ = 0.1153 МА + 0.5903, где ФФ - расчетная концентрация функционального фибриногена (г/л) в тесте с батроксобином, МА - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты пересчета.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является определение функционального фибриногена, по образованию фибринового сгустка, индуцируемого добавлением батроксобина. Особенностью метода является использование батроксобина - фермента из яда гремучей змеи Bothrops atrox, обитающей в Южной и Центральной Америке. Батроксобин - тромбиноподобная протеаза, способная вызывать переход фибриногена в фибрин. Батроксобин отщепляет от фибриногена только фибринопептид А, что отличает ее от действия тромбина, который, кроме фибринопептида А, отщепляет от фибриногена еще и фибринопептид В. Батроксобин не подавляется антитромбином и гепарином, поэтому может использоваться для оценки полимеризации мономеров фибрина в присутствии гепарина. Поскольку на определение концентрации функционального фибриногена в цельной крови оказывает влияние возможная активация тромбоцитов, одной из задач исследования было получить тромбиноподобный фермент из яда Bothrops atrox venom, который одновременно не активировал бы тромбоциты. С этой целью были подобраны условия хроматографии, которые заключались в следующем: 50 мг яда растворяли в буферном растворе состава 50 мМ трис-HCl, рН 7.4 и наносили на колонну с анионообменным сорбентом DEAE-Sepharose Fast Flow. Сорбент промывали стартовым буфером и затем связанный с сорбентом белок элюировали градиентом ионной силы натрий хлорида. В выходящих фракциях (по 5 мл) автоматически записывалась концентрация белка, а также определяли время свертывания с раствором фибриногена. Чем короче было время свертывания, тем выше активность тромбиноподобного фермента в выходящих с колонны фракциях. Тромбиноподобная активность распределялась по двум фракциям, первая элюировалась с колонны при низкой концентрации соли, а вторая - при более высокой концентрации. Обе фракции фермента собирали отдельно, стабилизировали, добавляя бычий сывороточный альбумин до концентрации 5 мг/мл, разливали по флаконам и лиофилизировали. Исследовали влияние обеих фракций батрокобсина на тромбоциты, в тесте тромбоэластографии. Для этого из пробы цельной гепаринизированной крови получали обедненную тромбоцитами и обогащенную тромбоцитами плазму, согласно общепринятым методам (Perez AG, Lana JF, Rodrigues AA, Luzo AC, Belangero WD, Santana MH. Relevant Aspects of Centrifugation Step in the Preparation of Platelet-Rich Plasma. ISRN Hematology. 2014, article ID 176060). С полученными образцами обедненной тромбоцитами плазмы и обогащенной тромбоцитами плазмы выполняли тромбоэластографию, для чего к 340 мкл каждого образца плазмы добавляли по 10 мкл раствора батроксобина с активностью 5 МЕ/мл, из первой фракции, затем так же выполняли тромбоэластографию с батроксобином из второй фракции. Оценивали максимальную амплитуду на каждой из 4 тромбоэластограмм. Установлено, что первая фракция батроксобина не активировала тромбоциты, что проявилось в одинаковой максимальной амплитуде на тромбоэластограммах с обедненной и обогащенной тромбоцитами плазме (фиг. 1А и 1В). Вторая фракция, напротив, активировала тромбоциты, что проявилось большей максимальной амплитудой на тромбоэластограмме с обогащенной тромбоцитами плазмой, чем с обедненной тромбоцитами плазмой (фиг. 1Б и 1Г), т.е. в ней содержались ферменты, способные кроме расщепления фибриногена еще и активировать тромбоциты. Для определения функционального фибриногена использовали только первую фракцию батроксобина, не активирующую тромбоциты. Выход тромбиноподобного фермента, не активирующего тромбоциты (первая фракция), составил 20 МЕ/мг яда Bathrops atrox venom.
Определение функционального фибриногена осуществляют следующим образом: набирают кровь в пробирку, содержащую гепарин. Затем в кювету для тромбоэластографии вносят цельную гепаринизированную кровь и батроксобин с активностью 5 МЕ/мл в соотношении 34:1 соответственно. После чего выполняют тромбоэластографию, оценивают параметр максимальной амплитуды (МАбатрокс) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена рассчитывают по формуле линейной регрессии:
батрокс
батрокс
ФФ = 0.1153 МА + 0.5903,
батрокс
батрокс
где ФФ - это расчетная концентрация функционального фибриногена (г/л) в тесте с батроксобином с активностью 5 МЕ/мл, МА - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты уравнения регрессии (коэффициенты пересчета).
Примеры осуществления способа.
Пример 1. Определение зависимости между концентрацией функционального фибриногена, определенной по методу Клаусса, и максимальной амплитудой на тромбоэластограмме с батроксобином активностью 5 МЕ/мл.
Исследовано 30 образцов крови, полученных у 17 онкогематологических больных. Кровь получали путем венепункции одной из периферических вен и помещали в пробирки S-Monovette с 3.2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови) и пробирки S-Monovette с литий гепарином (концентрация гепарина 10-30 ед/мл крови).
Концентрацию функционального фибриногена в плазме цитратной крови определяли по методу Клаусса на коагулометре Sysmex СА-620 с помощью реактивов компании Siemens (Германия).
Батрокс
Тромбоэластографию цельной гепаринизированной крови выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Для этого 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлены 10 мкл раствора батроксобина, полученному по описанному выше способу, с активностью 5 МЕ/мл. Определяли максимальную амплитуду (МА) на тромбоэластограмме.
Батрокс
Батрокс
Концентрация фибриногена в плазме цитратной крови, определенная по методу Клаусса, колебалась в пределах от 0,5 г/л до 8,7 г/л. Величина МА на тромбоэластограмме в пробе с батроксобином активностью 5 МЕ/мл и гепаринизированной кровью колебалась в пределах от 2,3 мм до 62,5 мм. Корреляция между концентрацией фибриногена в плазме, определенной по методу Клаусса, и МА показана на фиг. 2. Эта зависимость представляет собой прямую линию, с коэффициентом корреляции 0,83 (р<0.001), что позволяет связать концентрацию функционального фибриногена с максимальной амплитудой уравнением:
Батрокс
Батрокс
ФФ = 0.1153 × МА + 0.5903, где
Батрокс
Батрокс
где ФФ - расчетная концентрация функционального фибриногена (г/л) в тесте с батроксобином активностью 5 МЕ/мл, МА - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты уравнения регрессии (коэффициенты пересчета).
Концентрация функционального фибриногена в пробах с батроксобином активностью 5 МЕ/мл, рассчитанная согласно уравнению, колебалась от 0,8 г/л до 7,8 г/л, т.е. значения были близки к концентрации фибриногена по Клауссу.
Пример 2. Сравнение методов определения функционального фибриногена по тромбоэластографии с использованием абциксимаба и батроксобина активностью 5 МЕ/мл.
Исследовано 29 образцов крови, полученных у 17 онкогематологических больных. Кровь для исследования у больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette с 3.2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови) и пробирки S-Monovette с литий гепарином (концентрация гепарина 10-30 ед/мл крови).
Тромбоэластографию выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Использовали два канала тромбоэластографа.
Батрокс
FF
На одном канале 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлено 10 мкл раствора батроксобина, полученного по описанному выше методу, с активностью 5 МЕ/мл. Выполняли тромбоэластографию. Определяли максимальную амплитуду (МА) на тромбоэластограмме. На втором канале выполняли тест функционального фибриногена, как предписано инструкцией к тромбоэластографу TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Для этого в кювету для тромбоэластографии вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реагентом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000). Этот реагент содержит ингибитор абциксимаб и лиофилизированный тканевой фактор. После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли тромбоэластографию. По окончанию теста определяли максимальную амплитуду стандартного метода определения функционального фибриногена (MA).
Батрокс
FF
FF
Батрокс
Величина максимальной амплитуды (МА) колебалась от 2,3 мм до 62,5 мм. Величина максимальной амплитуды (MA) колебалась от 7,6 мм до 54,5 мм. На фиг. 3 показана корреляция между MA и МА
FF
Батрокс
Коэффициент корреляции между M и МА составил 0,88 (р<0.001).
FF
Батрокс
FF
Батрокс
По методу Бленд-Альтмана оба показателя также соответствовали друг другу (фиг. 4). На фиг. 4 показано сравнение MA и МА методом Бленд-Альтмана. Видно, что данные, полученные обоими методами, согласуются между собой. Пунктирными линиями представлены средняя разница MA и МА, а также среднее разницы ± 1,96 стандартного отклонения.
Пример 3. Исследование функционального фибриногена двумя методами с помощью тромбоэластографии у больной с гипофибриногенемией до и после коррекции содержания фибриногена в плазме с помощью криопреципитата.
Больная З., 29 лет, госпитализирована в связи с впервые выявленным острым промиелоцитарным лейкозом. У больной имелся выраженный геморрагический синдром в виде гематом после инъекций, спонтанных гематом на коже груди, нижних конечностей. При поступлении плазменная концентрация фибриногена, определенная по методу Клаусса, составила 1,1 г/л.
FF
Батрокс
Батрокс
Выполнена тромбоэластография на тромбоэластографе TEG 5000 реактивом Haemonetics для исследования функционального фибриногена. В кювету для тромбоэластографии вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реагентом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000). После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли тромбоэластографию. По окончанию теста определяли максимальную амплитуду (MA), которая составила 13,5 мм, что соответствовало уровню функционального фибриногена (FLEV) 2,5 г/л (фиг. 5). Одновременно выполняли тест с батроксобином, полученным по описанному выше методу с активностью 5 МЕ/мл: 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлены 10 мкл раствора батроксобина с активностью 5 МЕ/мл. Выполняли тромбоэластографию. Определяли максимальную амплитуду (МА) на тромбоэластограмме, которая составила 3,6 мм (фиг. 6), что, согласно полученной нами формуле, соответствовало концентрации функционального фибриногена (ФФ) 1,0 г/л.
Больной была выполнена коррекция гипофибриногенемии трансфузиями 40 доз криопреципитата. При повторном исследовании крови плазменная концентрация фибриногена, определенная по методу Клаусса, составила 3,7 г/л.
FF
При выполнении пробы на функциональный фибриноген реактивом Haemonetics, как описано выше, максимальная амплитуда (MA) составила 28,8 мм, что соответствовала концентрации функционального фибриногена (FLEV) 5,53 г/л (фиг. 7).
FF
На фиг. 7 показана тромбоэластограмма с реактивом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000) больной 3. после переливания 40 доз криопреципитата. MA 28,8 мм, расчетный уровень функционального фибриногена (FLEV) 5,5 3 г/л
Батрокс
Батрокс
При выполнении тромбоэластографии с гепаринизированной кровью и раствором батроксибина активностью 5 МЕ/мл, как описано выше, максимальная амплитуда составила 22,1 мм (фиг. 8), что, согласно разработанной нами формуле, соответствовала концентрации функционального фибриногена 3,1 г/л. На фиг. 8 показана тромбоэластограмма с гепаринизированной кровью и батроксобином активностью 5 МЕ/мл больной 3. после переливания 40 доз криопреципитата. МА 22,1 мм, расчетная концентрация функционального фибриногена (ФФ) 3,1 г/л.
Пример 4. Сравнение определения концентрации функционального фибриногена по методу Клаусса и функционального фибриногена двумя методами с помощью тромбоэластографии у больной с тромбоцитозом.
9
9
Больная А. 21 года страдает талассемией. В 2013 г. была выполнена спленэктомия. С 2013 г. в клиническом анализе крови у больной выявляется тромбоцитоз. На момент исследования функционального фибриногена концентрация тромбоцитов в периферической крови составила 1333×10/л (норма 180-320×10/л), плазменная концентрация фибриногена, определенная по методу Клаусса, составила 1,1 г/л.
FF
Батрокс
Батрокс
Батрокс
Батрокс
FF
Батрокс
Была выполнена тромбоэластография на тромбоэластографе TEG 5000 с реактивом Haemonetics для исследования функционального фибриногена. В кювету для тромбоэластографии вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реагентом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000). После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли тромбоэластографию. По окончанию теста определяли максимальную амплитуду стандартным методом определения функционального фибриногена (MA), которая составила 34 мм, что соответствовало концентрации функционального фибриногена (FLEV) 6,3 г/л (фиг. 9). На фиг. 9 показана тромбоэластограмма с реактивом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000) больной А с тромбоцитозом 1333×109/л. MAFF 34,4 мм, что соответствовало уровню функционального фибриногена (FLEV) 6,3 г/л. Одновременно выполняли тест с батроксобином активностью 5 МЕ/мл, полученным по описанному выше методу: 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлены 10 мкл раствора батроксобина с активностью 5 МЕ/мл. Выполняли тромбоэластографию. Определяли максимальную амплитуду (МА) на тромбоэластограмме, которая составила 6,3 мм (фиг. 10), что, согласно полученной нами формуле, соответствовало концентрации функционального фибриногена (ФФ) 1,3 г/л, это оказалось значительно ближе к концентрации фибриногена, определенного по методу Клаусса, чем с реактивом Haemonetics. На фиг 10 показана тромбоэластограмма с гепаринизированной кровью и батроксобином с активностью 5 МЕ/мл больной А. с тромбоцитозом 1333×109/л. МА 6,2 мм, расчетная концентрация функционального фибриногена (ФФ) 1,3 г/л. Большую величину MA, чем МА, а, следовательно, и большую концентрацию функционального фибриногена можно объяснить различиями в методологических подходах. В тесте Haemonetics максимальная амплитуда, которая должна бы соответствовать уровню фибриногена, достигается добавлением абциксимаба, ингибирующего тромбоциты, однако при тромбоцитозе, при котором количество тромбоцитов крови значительно превышает их нормальное значение, стандартная доза абциксимаба может не полностью ингибировать тромбоциты (Schlimp CJ., Solomon С, Ranucci М, Hochleitner G, Redl H,  Ню The Effectiveness of Different Functional Fibrinogen Polymerization Assays in Eliminating Platelet Contribution to Clot Strength in Thromboelastometry. Anesth Analg 2014; 118: 269-76) и, следовательно, сохраняется их вклад в максимальную амплитуду тромбоэластограммы, поэтому ее величина будет завышенной. При определении функционального фибриногена в гепаринизированной крови в тесте с батроксобином активностью 5 МЕ/мл тромбоциты вообще не участвуют в формирования сгустка и максимальной амплитуды, следовательно, их количество в крови не влияет на определяемую концентрацию функционального фибриногена.
Таким образом, максимальная амплитуда тромбоэластограммы, выполненной с гепаринизированной кровью с добавлением батроксобином с активностью 5 МЕ/мл, хорошо коррелирует с плазменной концентрацией фибриногена, измеренной по методу Клауссса, с максимальной амплитудой тромбоэластограммы, выполненной с реактивом Haemonetics для исследования функционального фибриногена (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000), отражает концентрацию функционального фибриногена у больных с гипофибриногенемией, нормальным содержанием фибриногена, при тромбоцитозе.