СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОБЛУЧЕНИЯ ДОНОРСКОЙ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНОМ
METHOD OF CONTROLLING IRRADIATION EFFICIENCY OF DONOR BLOOD BY LYMPHOCYTE ACTIVATION REACTION ASSAY

Изобретение относится к иммунологическим методам исследования крови и может использоваться для определения пригодности донорской крови для переливания пациенту.
Известно, что наиболее грозным осложнением гемотрансфузий с 90% летальностью является реакция трансплантат против хозяина (РТПХ). Решающую роль в развитии данной реакции играют цитотоксические лимфоциты донора CD3+CD8+ в присутствии Т-хелперов (CD3+CD4+). Описан случай развития РТПХ после переливания фильтрованной крови. Единственным надежным способом профилактики данного осложнения гемотрансфузий является облучение донорской крови. В результате облучения число и соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов принципиально не изменяется. Эффективность облучения контролируется биологическими детекторами доз облучения. Иммунологических способов контроля эффективности облучения, аналогичных предложенному, неизвестно.
Известен способ бластной трансформации лимфоцитов крови и лимфоидных органов свиней (см. «Методические рекомендации по изучению клеточного иммунитета у свиней при вирусных инфекциях» Сост.: А.А. Коломыцев, В.В. Макаров, В.И. Попов. - Покров, 1988. - С. 65-69).
6
В известном способе лимфоциты из лимфоидных органов выделяют методом измельчения их в питательной среде с последующим ресуспендированием клеток и подсчетом их концентрации. Из периферической крови лимфоциты выделяют с помощью дифференциального центрифугирования форменных элементов в градиенте плотности 17% верографина. После отмывания лимфоцитов крови и лимфоидных органов центрифугированием в питательной среде доводят концентрацию клеток до рабочей - 2×10 кл/мл питательной среды. При постановке реакции в четыре контрольные пробирки вносят по 0,5 мл рабочей суспензии лимфоцитов, 0,2 мл сыворотки свиней и по 0,3 мл питательной среды. В четыре опытные пробирки вносят по 0,5 мл суспензии лимфоцитов, 0,2 мл сыворотки свиней, 0,2 мл питательной среды и по 0,1 мл раствора митогена фитогемагглютинина в разведении 1:100. Опытные и контрольные пробирки инкубируют в термостате при 37-38°C в течение 72 часов.
Учет результатов реакции бластной трансформации лимфоцитов проводят радиометрическим способом в жидкостном сцинтиляционном β-счетчике. Включение радиоактивной метки в лимфоцитах, трансформирующихся в бласты, выражают в импульсах в минуту. Подсчитывают среднее количество импульсов радиоактивной метки с лимфоцитов в опытных и контрольных пробирках с последующим определением индекса стимуляции по формуле:
Известный метод не обладает достаточной чувствительностью для оценки иммунного статуса других животных, в частности норок.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является «Способ определения индекса стимуляции лимфоцитов для оценки иммунного статуса норок», описанный в з. №2003114790 по кл. G01N 30/48, з. 19.05.03, оп. 27.10.05 и выбранный в качестве прототипа.
6
Известный способ определения индекса стимуляции лимфоцитов для оценки иммунного статуса норок включает выделение лимфоцитов из периферической крови и лимфоидных органов, доведение их концентрации до рабочей, постановку реакции бласттрансформации с митогеном фитогемагглютинином, инкубацию лимфоцитов и учет результатов реакции радиометрическим способом и отличается тем, что концентрацию лимфоцитов доводят до рабочей концентрации 10-15×10 кл/мл, а инкубацию лимфоцитов осуществляют в течение 48-54 часов при температуре 37,5-40,0°C, индекс стимуляции лимфоцитов определяют по формуле:
6
Недостатком известного способа является его сложность, обусловленная определением учета результатов радиометрическим способом, достаточно непростым для широкого внедрения его в лабораторную практику, а также необходимостью получения весьма высокой концентрации лимфоцитов (10-15×10 кл/мл). Кроме того, его эксплуатационные возможности ограничены, т.к. он предназначен только для оценки иммунного статуса животных (норок), т.е. состояния их здоровья.
Задачей является обеспечение возможности использования способа для контроля качества донорской крови при упрощении способа.
Поставленная задача решается тем, что в способе контроля эффективности облучения донорской крови с помощью реакции активации лимфоцитов фитогеммагглютинином, включающем постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином и учет результатов реакции путем определения индекса стимуляции лимфоцитов, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ постановку реакции проводят в отношении облученной донорской крови, учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, при этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови, после чего определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как:
Эоб.=Сднтло-Сднтлк, где
Эоб- эффективность облучения,
Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8 - в опыте (в проверяемой облученной крови),
Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8 - в контроле (в необлученном образце той же крови),
и при разнице с контрольной более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.
Постановка в заявляемом способе реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином в отношении облученной донорской крови в совокупности с выполнением учета результатов реакции с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, использованием при этом в качестве контроля необлученного образца той же крови и последующей оценкой эффективности облучения крови как разности процентного содержания в ней дубль-негативных Т-лимфоцитов в сравнении с необлученной позволяет достаточно просто и надежно определять качество облученной донорской крови.
Технический результат - возможность простой и надежной оценки качества донорской крови.
Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками, как проведение постановки реакции в отношении облученной донорской крови, выполнение учета результатов с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-, использование в качестве контроля необлученного образца той же крови, определение эффективности облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови по приведенной выше формуле и последующая оценка эффективности облучения крови как разности процентного содержания в ней дубль-негативных Т-лимфоцитов в сравнении с необлученной, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата.
Хотя отдельные операции предлагаемого способа, такие как использование для учета результатов проточного цитофлюориметра, проведение гейтирования лейкоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 (см. книгу Луговская М.Е. и др. «Иммунофенотипирование в диагностике гемобластов», 2005 г. ), определение дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD+CD4-CD8 (см. книгк Ярилин А.А. «Основы иммунологии», Москва, 1999 г. ) известны, однако совокупное использование указанных отличительных признаков, позволяющее достаточно просто и надежно оценить качество переливаемой крови с точки зрения безопасности ее использования для пациента, неочевидно для специалиста среднего уровня, поэтому заявитель считает, что его техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ может найти широкое применение в медицине для исследования донорской крови, поэтому он соответствует критерию «промышленная применимость».
Заявляемый способ заключается в следующем.
Проводят постановку реакции бласттрансформации клеток крови с митогеном фитогемагглютинином в отношении облученной донорской крови. Учет результатов выполняют с помощью проточного цитофлюориметра с использованием моноклональных антител, меченных разными флюорохромами, проведением гейтирования активированных лимфоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определением среди них процента дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-. При этом в качестве контроля берут необлученный образец той же крови. После этого определяют эффективность облучения по соотношению содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в проверяемой облученной и той же необлученной контрольной крови как:
Эоб.=Сднтло-Сднтлк, где
Эоб - эффективность облучения,
Сднтло - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в опыте (в проверяемой облученной крови),
Сднтлк - процент содержания дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8- в контроле (в необлученном образце той же крови),
При разнице с контрольной более чем в 50% делают вывод о функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.
На практике заявляемый способ осуществляется следующим образом.
Облученную донорскую кровь для исследования в стерильных условиях вносят в вакуэт с гепарином.
Для выделения лейкоцитов крови в ламинарном шкафу готовят культуральную смесь из расчета на 1 исследование: культуральная среда RPMI-1640 - 5 мл; эмбриональная телячья сыворотка - 1 мл; глютамин - 0,1 мл; антибиотик и антимикотик - 0,1 мл, ФГА - 0,5 мл.
В стерильный культуральный флакон с подогретой до 37°C культуральной смесью вносят 0,5 мл исследуемой крови и инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 48 часов.
Надосадочную жидкость удаляют из флакона водоструйным насосом, осадок ресуспендируют и используют для исследования на проточном цитофлюориметре BD CANTO II.
В качестве негативного контроля исследуют необлученный образец той же крови, с которым проведена аналогичная пробоподготовка (культивирование с ФГА 48 часов).
9
Доводят концентрацию лейкоцитов в исследуемых образцах до 5-6 кл. * 10/л с помощью разводящего раствора BD.
В реакционные пробирки BD вносят по 50 мкл исследуемых образцов крови и по 5 мкл 6-цветного реагента BD, содержащего моноклональные антитела, меченные разными флюорохромами, к следующим рецепторам: CD45; CD3; CD4; CD8; CD19: CD16+56. Инкубируют в темноте при комнатной температуре 15 минут. Добавляют лизирующий раствор, инкубируют 10 минут.
Результат определяют с помощью проточного цитофлюориметра BD CANTO II, программы DIVA, регистрируя стандартные 10000 событий.
Для оценки результатов исследования проводят гейтирование активированных лейкоцитов со сниженной экспрессией общелейкоцитарного маркера CD45 и определяют среди них процент дубль-негативных Т-лимфоцитов с иммунофенотипом CD3+CD4-CD8-. Разница с контролем более чем в 50% является доказательством функциональной неполноценности Т-лимфоцитов в облученной крови и показателем иммунологической безопасности данного препарата крови для реципиента.
В сравнении прототипом заявляемый способ может использоваться для контроля качества донорской крови и является более простым.