Способ определения подвидов Francisella tularensis методом мультипраймерной ПЦР
METHOD FOR THE DETERMINATION OF FRANCISELLA TULARENSIS SUBSPECIES BY MULTI-PRIMER PCR

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов F.tularensis, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации.
Francisella tularensis, этиологический агент туляремии, относится к факультативным внутриклеточным патогенам, вызывающим тяжелое заболевание у многих видов животных и человека [1], и является агентом биотерроризма категории А [2]. В настоящее время F. tularensis делится на четыре подвида: F. tularensis subsp.tularensis (nearctica), F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp. novicida, которые различаются по своей патогенности и географическому распределению [3]. Исторически такое разделение было обусловлено различным ареалом циркуляции штаммов, их отличиями в биохимической активности и патогенностью для разных хозяев [4, 5]. F. novicida, официально признанная четвертым подвидом вида F. tularensis, обладает высокой гомологией ДНК с другими подвидами F, tularensis, но не является возбудителем типичной туляремийной инфекции [3].
Дифференциация штаммов F. tularensis проводилась с помощью многих молекулярно-генетических методов, включая полногеномный анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) [3], мультилокусное секвенирование-типирование (MLST) [6], риботипирование [7], анализ регионов различия (RD) [8], пульс-гель электрофорез [7, 9], AFLP [10], анализ канонических INDEL-маркеров [11], и мультилокусный УШТ1-анализ (MLVA) [12, 13]. Однако практическое использование многих из них ограничивается как сложностью методического характера, так и проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов [14].
Известен способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба [15], заключающийся в ПЦР амплификации с использованием специфических для гена ig1C и регионов хромосомы, содержащих Chi-последовательности, подобные Е. coli, праймеров Fig1C: AAGGATAAGACCTGTCTG, Rig1C:TTGAAACCATACCGGGTA и Chi1f:CTAGG-GCTGGTGG-G, с последующим электрофорезом продуктов амплификации и с последующей дифференциацией путем сравнения электрофоретической подвижности полученных ампликонов с подвижностью маркерных фрагментов ДНК, причем при наличии специфической светящейся полосы на уровне 986 п.о. данные штаммы регистрируют как бактерии рода Francisella, а характер распределения полос в диапазоне 190-830 п.о. позволяет дифференцировать исследуемые образцы на уровне подвидов туляремийного микроба: 190 п.о. для subsp. novicida, 500-570 п.о. для subsp. mediasiatica, 570 п.о. для subsp. holarctica, тогда как для subsp. tularensis характерен фрагмент размером 500 п.о.
Однако используемый при проведении данного способа праймер Chi1f не является специфичным (более десяти фрагментов в электрофорезе), что исключает получение традиционного специфического ампликона строго определенного размера. Поэтому амплифицированные фрагменты, полученные с представителями даже одного подвида туляремийного микроба, характеризуют значительный разброс молекулярной массы. Например, для subsp. mediasiatica размер ампликона может варьировать от 500 до 570 п.о., а для subsp. holarctica характерен ампликон массой около 570 п.о., а для представителя другого подвида- subsp. tularensis характерен фрагмент размером 500 п.о. Столь высокая вариация размеров ампликонов при осуществлении данного способа может приводить к появлению ампликонов одинакового размера в случае анализа штаммов разных подвидов туляремийного микроба, что делает маловероятным надежное определение подвидов туляремийного микроба с помощью данного способа.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica [16], который включает стадии выделения ДНК микроорганизма из исследуемого материала и проведение с полученной ДНК двух реакций амплификации, при этом используют набор сконструированных специфических праймеров к вариабельным участкам области RD6 туляремийного микроба, где набор состоит из трех праймеров:
RD6-comATACTAGCTTCAATCTCTGTGGCTTT,
RD6-holATGCACTGGTTGGAATACAAATC,
RD6-tulCACATAGCAAATTAGTTGGATATGGA и второй из двух праймеров:
RD6-del1AACAATACCAACACTATTGAGTAAAA,
RD6-del2AGCCATGCAATTATTAAAGC.
Подвид возбудителя туляремии определяют по размеру специфического амплификата, в случае первой реакции амплификации если он составляет 212 п.о., а во второй 85 п.о, то регистрируют Francisella tularensis subsp. holarctica, если соответственно 425-91 п.о., то Francisella tularensis subsp. tularensis и 419-85 п.о. определяют как Francisella tularensis subsp. mediasiatica.
Недостатком данного способа является использование двух наборов праймеров и, соответственно, необходимость проведения двух реакций амплификации, что увеличивает длительность идентификации. Кроме того, способ не предусматривает определения вида F. novicida.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа позволяющего достоверно, быстро и с невысокой себестоимостью осуществлять дифференциацию подвидов штаммов F. tularensis, выделенных в различных регионах, областях и странах.
Поставленная задача достигается тем, что в способе дифференциации штаммов F. tularensis путем молекулярно-генетического типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма F. tularensis, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличие заключается в том, что на ДНК F. tularensis выявляют два общих INDEL-гена, имеющих делеции определенного размера, а именно ft1779 и ft426, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфическихпраймеров:
к гену ft1779 - праймеры GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT и TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG,
с длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 950 п.н.,
к гену ft426 - праймеры GATAGACGCTGCATCGACAC и ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA,
с длиной амплифицированного фрагмента 174 п.н. или 196 п.н., при этом учет результатов определения подвидов F. tularensis проводят визуально после электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по двум INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают подвид исследуемых штаммов F. tularensis.
При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:2 мММg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси всех праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед.ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК, объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов F.tularensis.
Кроме того, ПЦР проводят с соблюдением режимов:
1 этап - денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл);
2 этап - денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с (35 циклов);
3 этап - досинтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).
Обоснование выбора праймеров
С помощью программного обеспечения, разработанного авторами (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора) было проанализировано более 2500 генов F. tularensis в базе данных GenBank. В процессе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей штаммов F. tularensis в базе данных GenBank авторы идентифицировали ряд INDEL-генов, отличающихся по размеру у штаммов F. tularensis различных подвидов. В результате было выделено 2 общих гена, имеющих делеции определенного размера, а именно: ft1779 и ft426 (см. идентификационную таблицу).
Примечание - nov-novicida, hol-holarctica, medi-mediasiatica, tul-tularensis
С помощью программного обеспечения Primer3Plus и BLASTNCBI к варьирующим участкам указанных генов ft1779 и ft426 были сконструированы специфические праймеры.
к гену ft1779 - праймеры GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT и TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG;
к гену ft426 - праймеры GATAGACGCTGCATCGACAC и ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA.
Набор значений размера фрагментов для каждого штамма по каждому из двух INDEL-генов являются его индивидуальной характеристикой и позволяют определять его подвид.
Способ осуществляется следующим образом
Перед постановкой способа дифференциации штаммов F. tularensis выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию исследуемого штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Затем методом мультипраймерной ПЦР проводят амплификацию выделенной ДНК со специфическими праймерами:
к гену ft1779 - праймеры GCCTTTTCAGTTCTTGAAATTGT и TTTGAGATTCGTGTAGTGTACTTGTG, c длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 950 п.н.,
к гену ft426 -
ACTAGAGTTAACCCATTCAACAAGA, c длиной амплифицированного фрагмента 174 п.н. или 196 п.н.
Условия проведения реакции амлификации.
Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).
Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 2 мMMg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси всех праймеров (по 0, 5. мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов F. tularensis. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.
При этом учет результатов типирования проводят визуально после электрофореза, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по двум генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов с идентификационной таблицей определяют подвид исследуемого штамма F. tularensis.
В случае подвида Francisella tularensis subsp. tularensis в мультипраймерной ПЦР к генам ft1779 и ft426 регистрируют появление двух ампликонов 98 и 196 п.н. соответственно. При анализе представителей подвидов Francisella tularensis subsp. holarctica специфические ампликоны имеют размеры 950 и 196 п.н., для Francisella tularensis subsp. mediasiatica 98 и 174 п.н., а для Francisella novicida - 107 и 196 п.н. (см. таблицу).
Проведенные исследования доказывают, что использование разработанного способа определения подвидов Francisella tularensis методом мультипраймерной ПЦР по структуре INDEL-генов позволяет выявлять штаммы различных подвидов.
Пример 1.
В эксперименте используют штаммы F. tularensis из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis (вакцинный штамм 15/10 (holarctica) и 503 (holarctica) (лунки 1,2) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft1779 и ft426. Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).
Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 2мMMg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси всех праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов F. tularensis. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (см. фото).
На фото видим электрофорез продуктов амплификации INDEL-генов ft779 и ft426. М-маркерная ДНК, стрелки указывают позиции аллелей 950 п.н. для гена ft1779 и 196 п.н. для гена ft426. Проводят сравнительный анализ выявленных аллелей INDEL - генов с идентификационной таблицей.
Вывод: в лунках 1 и 2 обнаружены фрагменты 960 и 196 п.н. (см. фото), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду holarctica (табл.).
Пример 2.
В эксперименте используют штаммы F. tularensism коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis Schu (tularensis) и 261 (tularensis) (лунки 3,4) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводят выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft1779 и ft426. Условия проведения ПЦР как в примере 1. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.
Вывод: в лунках 3 и 4 обнаружены фрагменты 196 и 98 п.н. (фото), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду tularensis (см. идентификационную табл.).
Пример 3.
В эксперименте используют штаммы F. tularensis из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis 543 (mediasiatica) и 240 (mediasiatica) (лунки 6,7) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft779 и ft426. Условия проведения ПЦР как в примере 1. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.
Вывод: в лунках 6 и 7 обнаружены фрагменты 98 и 174 п.н. (фото 1), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду mediasiatica (табл. 1).
Пример 4.
В эксперименте использованы штаммы F. novicidam коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. novicida Utah (novicida) и U112 (novicida) (лунки 8, 10) суспендировали в 150 мклдеионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к генам ft1779 и ft426. Условия проведения ПЦР как в примере 1. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.
Вывод: в лунках 8 и 10 обнаружены фрагменты 107 и 196 п.н. (фото 1), что свидетельствует о принадлежности исследуемых штаммов к подвиду novicida (см. таблицу).
Стрелки указывают позиции аллелей 98,107 и 950 п.н. для гена ft779 и аллелей 174 и 196 п.н. для гена ft426. Лунки 5 и 9 маркерная ДНК.
Использование предлагаемого изобретения позволяет достоверно и быстро за счет подбора праймеров для мультипраймерной ПЦР в одной реакции в течение (2-3) часов определять подвид исследуемых бактерий рода Francisella, а именно: holarctica, tularensis, mediasiatica и novicida.
Источники информации
1. Hopla, С.Е., and А. K. Hopla. 1994. Tularemia, p. 113-126. In G. W. Beran(ed.), Handbook of zoonoses, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL.
2. Centers for Disease Control and Prevention, Office of Inspector General, Department of Health and Human Services (HHS).2005. Possession, use, and transfer of select agents and toxins. Final rule. Fed. Regist. 70:13293-13325.
3. Keim, P., A. Johansson, and D. M. Wagner.2007. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1105:30-66.
4. Олсуфьев Н.Г. Внутривидоваятаксономиявозбудителятуляремии Francisellatularensis / Н.Г. Олсуфьев, И.С. Мещерякова // Ж. ГигиеныЭпидемиол. Микробиол. Иммунол. - 1982. - №26. - С. 291-299.
5. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев - М.: Медицина, 1975. - 192 с.
6. Svensson, K., P. Larsson, D. Johansson, М. Bystrom, М. Forsman, and А. Johansson. 2005. Evolution of subspecies of Francisellatularensis. J. Bacteriol. 187:3903-3908.
7. Fey, P. D., M. M. Dempsey, M. E. Olson, M. S. Chrustowski, J. L. Engle, J. J. Jay, M. E. Dobson, K. S. Kalasinsky, A. A. Shea, P. C. Iwen, R. C. Wickert, S. C. Francesconi, R. M. Crawford, and S. H. Hinrichs. 2007. Molecular analysis of Francisellatularensissubspeciec tularensisand holarctica. Am. J. Clin. Pathol. 128:926-935.
8. Dempsey, M. P., J. Nietfeldt, J. Ravel, S. Hinrichs, R. Crawford, and A. K. Benson. 2006. Paired-end sequence mapping detects extensive genomic rearrangement and translocation during divergence of Francisellatularensissuhsp. tularensisand Francisellatularensissuhsp. holarcticapopulations. J. Bacteriol. 188:5904-5914.
9. Staples, J. E., K. A. Kubota, L. G. Chalcraft, P. S. Mead, and J. M. Petersen. 2006. Epidemiologic and molecular analysis of human tularemia, United States, 1964-2004. Emerg. Infect. Dis. 12:1113-1118.
10. Garcia Del Blanco, N., M. E. Dobson, A. I. Vela, V. A. De La Puente, C. B.Gutie 'rrez, T. L. Hadfield, P. Kuhnert, J. Frey, L. Dominguez, and E. F.RodriguezFerri. 2002. Genotyping of Francisellatularensis strains by pulsed field gel electrophoresis, amplified fragment length polymorphism fingerprinting, and 16S rRNA gene sequencing. J. Clin. Microbiol. 40:2964-2972.
11. Larsson, P., K. Svensson, L. Karlsson, D. Guala, M. Granberg, M. Forsman, and A. Johansson. 2007. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisellatularensis. Emerg. Infect. Dis. 13:1725-1732.
12. Johansson, A., J. Farlow, P. Larsson, M. Dukerich, E. Chambers, M. , J. Fox, M. Chu, M. Forsman, A.  and P. Keim. 2004. Worldwide genetic relationships among FrancisellatularensisisolatQs determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 186:5808-5818.
13. Farlow, J., Smith, K. L., Wong, J., Abrams, M., Lytle, M., and Keim, P. (2001). Francisellatularensis strain typing using multiple-locus, variable number tandem repeat analysis. J. Clin. Microbiol. 39, 3186-3192. doi: 10.1128/JCM.39.9.3186-3192.2001.
14. Farlow, J., D. M. Wagner, M. Dukerich, M. Stanley, M. Chu, K. Kubota, J. Petersen, and P. Keim. 2005. Francisellatularensis in the United States. Emerg. Infect. Dis. 11:1835-1841.
15. Способ дифференцирования подвидов туляремийного микроба. RU, патент №2478717, кл. C12Q 1/68,опубл. 10.04.13 г., Бюл. № 10.
16. Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica, Francisella tularensis subsp. holarctica. RU, пат. №2612137, кл. C12Q 1/04, опубл. 02.03.2017. Бюл. № 2.
17. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.