СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ НЕЙРОГЕНЕЗ ПРИ ИШЕМИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА
AGENT STIMULATING NEUROGENESIS IN ISCHEMIC CEREBRAL INJURIES

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, обладающего способностью стимулировать нейрогенез при ишемических повреждениях головного мозга.
Известны вещества, стимулирующие нейрогенез при ишемических повреждениях мозга. К ним относятся эндогенные ростовые факторы [1] и ряд антидепрессантов, в том числе флуоксетин [2].
Наиболее близким (прототипом) является лекарственное средство - флуоксетин, обладающее свойством стимулировать нейрогенез при ишемических повреждениях головного мозга [2].
Задачей изобретения является расширение номенклатуры средств, стимулирующих репаративный нейрогенез при ишемических повреждениях головного мозга.
Поставленная задача решается применением 4-(2-гидроксиэтил)-фенола (п-тирозола) в качестве противоишемического средства.
Известно, что п-тирозол обладает антиоксидантными, гемореологическими, антигипоксическими и антитромбоцитарными свойствами [3-10]. Кроме того, п-тирозол является адаптогеном широкого спектра действия, используется как стимулятор активности при химическом, биологическом и физическом воздействии на организм, в качестве профилактики вирусных заболеваний, при физической или нервной перегрузке, как лекарственное средство для лечения больных шизофренией, неврозами, онкологическими заболеваниями, болезнями кожи, нарушениями функций щитовидной железы, надпочечников, вилочковой железы, половых желез [11].
Использование п-тирозола как средства, стимулирующего репаративный нейрогенез при ишемических повреждениях головного мозга, в литературе не описано.
Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве средства, стимулирующего нейрогенез, используется п-тирозол. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. п-Тирозол можно использовать для лечения больных с ишемическим инсультом.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".
Исследование проводили на половозрелых крысах самцах Wistar (n=20, по 5 крыс в группе) массой 250-300 г, полученных из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга. Эксперименты на животных проведены в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.
Животные были разделены на 4 экспериментальные группы: 1) ложнооперированные животные (ЛО), 2) ишемия (И), 3) ишемия+флуоксетин (И+Ф) 4) ишемия+п-тирозол (И+Т). Все группы были сформированы таким образом, чтобы количество животных в каждой группе и средняя масса животных между группами были примерно одинаковыми.
Для проведения хирургического вмешательства животных наркотизировали хлоралгидратом (450 мг/кг внутрибрюшинно). Тотальную транзиторную ишемию головного мозга моделировали методом окклюзии трех сосудов, подробно описанным в [11]. ЛО животные подвергались аналогичным манипуляциям без наложения микрохирургических зажимов. В первый час после операции и последующие 9 дней крысам группы И+Т внутрибрюшинно вводили п-тирозол в дозе 20 мг/кг, крысам группы И+Ф внутрибрюшинно вводили флуоксетин в дозе 20 мг/кг, крысам групп ЛО и И - физиологический раствор.
2
На 31-й день после операции осуществляли транскардиальную перфузию 4% параформальдегидом под эфирным наркозом, мозг извлекали и помещали в раствор формальдегида, через 24 ч выполняли криопротекцию в сахарозе для сохранности детектируемых белков, затем замораживали мозг в парах жидкого азота и хранили при t=-80°C. Коронарные срезы мозга толщиной 10 мкм (-2,64 мм -3,60 мм от брегмы) изготавливали с помощью криотома HM525 (Thermo Scientific, Германия) и окрашивали иммуногистохимически на даблкортин (DCX, маркер молодых нейронов) и нейрональный белок (NeuN, маркер зрелых нейронов) с использованием первичных (Doublecortin (C-18): sc-8066, Santa Cruz; NeuN (ABN78): Merck Millipore) и вторичных (Donkey anti goat AlexaFlour 488 (705-545-147), Jackson Immunoresearch) антител, покрывали средой с DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Для каждого животного были получены микрофотографии с 10-22 срезов мозга, как с левого, так и с правого полушария. Фотографирование осуществляли с помощью микроскопа Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения AxioVision 4.8 (Carl Zeiss, Германия) c модулем MozaiX, позволяющим получать снимки размером ~11 мм совмещением 20-28 изображений меньшего размера, в зависимости от размеров гиппокампа. Число DCX-позитивных (DCX+) клеток подсчитывали визуально в гранулярном слое зубчатой извилины гиппокампа (DG, dentate gyrus).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Statistica 6.0. Для анализа различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, сравнение проводили по сумме клеток в зубчатой извилине гиппокампа, взвешенной по числу исследуемых срезов.
Результаты исследований представлены в примерах 1-3.
Пример 1. В зубчатой извилине гиппокампа животных группы ЛО молодые нейроны демонстрируют хорошо развитые аксоны, формирующие разветвленные сети (рис. 1).
Пример 2. Для группы И молодых нейронов в зубчатой извилине гиппокампа значительно меньше, чем для группы ЛО, кроме того, заметного роста аксонов у молодых нейронов не наблюдается (рис. 1). Статистический анализ показал, что тотальная транзиторная ишемия в ~1.3 раза снижала количество DCX+клеток в зубчатой извилине по сравнению с ЛО животными (p<0.01) (рис. 2).
Пример 3. При ведении флуоксетина в течение 10 суток после ишемии у молодых нейронов так же, как и для группы ЛО, наблюдается рост аксонов (рис. 1). Статистический анализ показал, что введение флуоксетина увеличивало количество молодых нейронов в ~1.5 раза по сравнению с группой И (p<0.001), восстанавливая нейрогенез в зубчатой извилине до контрольного уровня: различия с группой ЛО не значимы (рис. 2).
Пример 4. Введение п-тирозола в течение 10 суток после тотальной ищемии оказывает сходное с флуоксетином действие на нейрогенез в зубчатой извилине гиппокампа. У животных группы И+Т, как и групп ЛО и И+Ф, молодые нейроны показывают хорошо развитые аксоны (рис.1). Статистический анализ показывает значимое увеличение количества молодых нейронов в ~1.5 раза по сравнению с группой И (p<0.001), в то же время различия с группой ЛО не значимы (рис. 2).
Таким образом, получено стимулирующее действие п-тирозола на восстановление исходного уровня нейрогенеза в гиппокампе в условиях тотальной ишемии головного мозга у крыс.
Источники информации
1. Wiltrout C., Lang B., Yan Y., Dempsey R.J., Vemuganti R. Repairing brain after stroke: A review on post-ischemic neurogenesis //Neurochem. Int. - 2007. - Vol.50. - P. 1028-1041.
2. Malberg JE, Eisch AJ, Nestler EJ, Duman RS. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus //J. Neurosci.- 2000. - Vol.20. - P. 9104-9110.
3. Патент РФ №2384327 «Противоишемическое средство».
4. Патент РФ №2239423 «Гемореологическое и антитромбоцитарное средство».
5. Гуреева Н.В., Дарюхина Е.Н., Крысин А.П., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г., Бурлякова Е.Б. О взаимосвязи строения и активности природных и синтетических антиоксидантов //Цитология. - 1999. - №9. - С. 814-815.
6. Плотников М.Б., Чернышева Г.А., Смольякова В.И., Маслов М.Ю., Черкашина И.В., Крысин А.П., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Влияние п-тирозола на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов //Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2007. - Т. 143, №1. - С. 67-69.
7. Черкашина И.В., Смольякова В.И., Чернышева Г.А., Плотников М.Б. Влияние п-тирозола на тромбообразование у крыс с моделью артериального тромбоза //Химия и технология растительных веществ: Тез. докл. IV Всеросийской научной конференции. - Сыктывкар, 2006. - C. 295.
8. Плотников М.Б., Чернышева Г.А., Смольякова В.И., Маслов М.Ю., Черкашина И.В., Крысин А.П., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Влияние п-тирозола на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов //Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2007. - Т. 143, №1. - С. 67-69.
9. Смольякова В.И., Плотников М.Б., Чернышева Г.А., Голубева И.В., Краснов Е.А.Антигипоксическая активность п-тирозола //Фармакология - практическому здравоохранению: Матер. III Съезда фармакологов России. Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7, спец. вып. - С. 1955.
10. Патент РФ №2385858 «Способ получения 4-(2-гидроксиэтил)фенола высокой степени чистоты».
11. Chernysheva G.A., Smol'yakova V.I., Osipenko A.N., Plotnikov M.B. Evaluation of survival and neurological deficit in rats in the new model of global transient cerebral ischemia //Bull. Exp. Biol. Med. - 2014. - Vol.158, No 2. - P. 197-119.