Идентификация гермоплазмы пшеницы, устойчивой к ржавчине с использованием генетических и молекулярных маркеров

8. Рокицкий П.Ф. Введение в статистическую генетику. - Минск: Вышэйш.школа, 1974. - 448

с.

9. Российский солнечный цветок / Калайджян А.А., Хлевной Л.В., Нещадим Н.Н. и др.; Рос. акад. с.-х. наук. Куб. нар. акад. - Краснодар: Совет. Кубань, 2007. - 352 с.

10. Ростова Н.С., Анащенко А.В., Рожкова В.Т. Сравнительный анализ корреляций признаков продуктивности у гибридов подсолнечника // С.-х. биология. - 1984. - № 12. - C. 64-72.

11. Сербай Р.М. Зависимость масличности и лузжистости семянок подсолнечника от генотипа зародыша // Науч.-техн. бюл. ВСГИ. - 1988. - № 1. - С. 27-30.

12. Фурсова А.К. Биология семяобразования подсолнечника. - Харьков: Харьк. гос. аграрн. ун-т., 1993. - 199 с.

13. Tang S., Leon A., Bridges W.C., Knapp S.J. Quantitative Trait Loci for Genetically Correlated Seed Traits are Tightly linked to Branching and Pericarp Pigment Loci in Sunflower // Crop Science. - 2006. - V. 46. - P. 721-734.

Рекомендовано к печати к.б.н. Хлыпенко Л.А.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕРМОПЛАЗМЫ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВОЙ К РЖАВЧИНЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

А.М. КОХМЕТОВА, доктор биологических наук;

А.И. СЕДЛОВСКИИ, доктор биологических наук;

Л.Н. ТЮПИНА, кандидат биологических наук; Г.Т. ЕСЕНБЕКОВА Институт биологии и биотехнологии растений Национального центра биотехнологии

Республики Казахстан, Алматы, Казахстан

Введение

Несмотря на определенные успехи в селекции пшеницы, основной проблемой для ее возделывания являются грибные болезни, которые не только снижают урожай в годы эпифитотий до 50-70%, но и значительно ухудшают технологические и хлебопекарные качества зерна. Вредоносность ржавчины заключается в нарушении физиологических процессов, включающих снижение ассимиляционной деятельности растений, а также ухудшение зимостойкости озимых культур. Возбудители ржавчины препятствуют также образованию в зерне глютениновых компонентов, подавляют процессы синтеза и отложения крахмала, а также протеина в эндосперме [1]. В Казахстане в последние годы значительное распространение получила бурая ржавчина Puccinia recóndita Rob ex Desm f. sp. tritici Eriks., которая наносит серьезный экономический ущерб, снижая урожай и качество зерна пшеницы. Создание генетически устойчивых сортов растений является наиболее эффективным, экономически и экологически надежным методом контроля болезней. Количество эффективных Lr-генов устойчивости к возбудителю бурой листовой ржавчины с каждым годом сокращается, поэтому необходим постоянный поиск новых источников генов. Особая опасность болезни обусловлена способностью патогена к мутации и быстрой смене генераций, что ускоряет расообразовательный процесс. Использование генетических и молекулярно-генетических маркеров, сопряженных с признаком устойчивости к ржавчине, позволяет проводить направленный отбор конкретных носителей длительной устойчивости, что значительно повышает эффективность и надежность селекционных программ. С целью поиска эффективных генов устойчивости проведен скрининг и идентификация генетического материала, устойчивого к бурой ржавчине пшеницы.

Объекты и методы исследования

Фитопатологическая оценка полевой устойчивости на естественном фоне к ржавчине пшеницы проведена по методике [2], согласно которой полевую устойчивость определяли по проценту распространения инфекции и инфекционному типу болезни (0 - иммунный, R -устойчивый, MR - умеренно устойчивый, MS - умеренно восприимчивый, S - восприимчивый). Инфекционный тип устойчивости на стадии проростков определяли по пятибальной шкале [3]. Для оценки ювенильной устойчивости к популяции и расе № 77 патогена бурой ржавчины (Puccinia recóndita Rob ex Desm f. sp. tritici.) изучено 38 образцов озимой мягкой пшеницы отечественной и зарубежной селекции. Фитопатологические тесты проводились на отрезках листьев проростков

пшеницы, помещенных в 0,004% водный раствор бензимидазола [4]. Для идентификации молекулярных маркеров, сцепленных с генами устойчивости, использован метод BSA - Bulked Segregant Analysis [5]. Выделение ДНК из листьев проростков проведено на основе СТАБ метода [6]. Амплификация проводилась по методу [7]. Амплифицированные фрагменты ДНК разделялись в 5%-ном денатурирующем полиакриламидном геле (398 mm x 338 mm x 0.4 mm). После электрофореза продукты ПЦР визуализировали путем окрашивания нитратом серебра.

Результаты и обсуждение

Результаты фитопатологической оценки образцов пшеницы из питомника-ловушки CWARTN, включающего дифференциаторы ржавчинных болезней, показали устойчивость большинства образцов пшеницы к бурой ржавчине. Умеренный тип устойчивости 5 MR отмечен у носителя гена Lr3 и изогенной линии сорта Thatcher - TC*6/DEMOCRAT (RL6002). Умеренно-восприимчивыми носителями (5MS-10MS) оказались гены Lr 2A (TC*6/WEBSTER), Lr 2B (TC*6/CARINA) и Lr 12 (EXCHANGE/6*TC). Высокий уровень устойчивости (0-R тип) - выявлен у образцов с генами Lr1, Lr2C, Lr3KA, Lr3BG, Lr9, Lr10, Lr13, Lr14A, Lr14B, Lr15, Lr16, Lr17, Lr18, Lr19, Lr20, Lr23, Lr24, Lr25, Lr26, Lr10, Lr27+Lr31, Lr29, Lr30 и Lr32. Носители указанных Lr-генов могут быть вовлечены в скрещивания в селекции на устойчивость к бурой ржавчине.

В табл. 1 представлены результаты оценки проростков 38 образцов озимой мягкой пшеницы при заражении их расой № 77 популяции спор Puccinia recóndita, а также данные оценки устойчивости материала к популяции патогена на стадии взрослого растения. Установлено, что при заражении образцов пшеницы расой № 77 один генотип пшеницы Г-152 характеризовался полной иммунностью (IT 0). Выявлено 22 образца с высоким уровнем ювенильной устойчивости (IT 1). Среди них сорта Купава, Бермет, Княжна, Октябрина, Алмалы, Уманка, Наири, Карлыгаш, Арап, Адир, Сапалы, Анза, Моро, BWKLDN-33, МК- 3832. Восприимчивыми к расе № 77 оказались сортообразцы Стекловидная-24 и МК-3732.

Анализ реакции проростков к популяции патогена Puccinia recóndita показал, что 11 сортообразцов пшеницы (Купава, Бермет, Княжна, Наз, Алмалы, МК-3732, МК-3796, МК-3797, МК-3732, МК-3750) проявили высокий уровень устойчивости к бурой ржавчине (табл. 1). Умеренно-устойчивый и умеренно-восприимчивый типы реакции (IT 2-3) наблюдали у сортов Улугбек-600, Купава, Безостая-1, Октябрина и Анза. Последующий анализ устойчивости этих 38 образцов на естественном фоне к популяции патогена на стадии взрослого растения показал, что сорта Улугбек-600 и Безостая-1, характеризовавшиеся как умеренно-устойчивые к ржавчине на стадии проростков показали высокую восприимчивость на стадии взрослого растения (30-60S). Сорт Анза, носитель APR-гена, характеризовался расоспецифической устойчивостью (IT 1), а на стадии взрослого растения отличался умеренно-восприимчивой реакцией. Сорта Бермет, Княжна, Алмалы, МК-3750, BWKLDN-33, Арап и Шарора проявили высокий уровень устойчивости.

Таблица 1

Устойчивость образцов пшеницы к бурой ржавчине

Наименование образца Устойчивость к бурой р интенсивность поражения/ин( »жавчине, юкционный тип

Раса патогена № 77, стадия проростков Популяция патогена, стадия проростков Популяция, стадия взрослого растения

1 2 3 4

Купава 1 1 5MS

Бермет 1 1 0

Княжна 1 1 0

Стекловидная-24 3 4 60S

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4

Жетысу 2 3 - 4 10MS

Улугбек-600 2 2 30S

Безостая-1 2 2 - 3 60S

Октябрина 1 2 - 3 10MS

МК-3732 3 1 20MS

Наз 2 1 10MS

Алмалы 1 1 0

Красноводопадская-25 2 3 15MS

Уманка 1 2 5MR

Наири 1 3 5R

Санзар 8 2 2 15MS

Морокко 2 4 80S

Карлыгаш 1 3 5MR

МК-3796 2 1 - 2 20MS

МК-3797 2 1 5MR

МК- 3732-1 2 1 5R

МК- 3750 2 1 0

Моро 1 3 50S

Южная-12 2 1 10MR

BWKLDN-33 1 0 0

МК- 3832 1 1 20MS

Арап 1 2 0

Шарора 2 0

Адир 1 2 15MS

Сапалы 1 3 20MS

Анза 1 2 - 3 20MR-40MS

Таза 1 4 10MS

Прогресс 1 3 5MS

Г-152 2 15MS

Г-153 1 3 10MR

Г-157 1 2 - 3 20MS

5fth FAWWON-35 1 2 15MS

Известно, что ген Lr34 относится к генам с длительным развитием ржавчины, "slow rusting genes", которые обеспечивают длительную и неспецифическую устойчивость взрослого растения. Этот эффективный ген расположен на коротком плече хромосомы 7D [8]. Проведено генетическое и фитопатологическое изучение популяции рекомбинантных инбреных линий пшеницы RILs F6 комбинаций Адир х Анза и RILs F6 Прогрес х Анза, где в качестве носителя гена Lr34 задействован сорт Анза. Результаты исследований показали, что ряд растений RILs характеризуется значениями умеренной устойчивости. По-видимому, эта устойчивость передана от сорта Анза, как носителя гена Lr34. Фенологические и фитопатологические наблюдения показали, что из изученных 113 RILs F6 комбинации Прогресс х Анза ряд линий является носителями признака «Leaf-tip necrosis» -«Некроза кончиков флаговых листьев» (Ltn), который, как известно, тесно сцеплен с геном Lr34 [8]. Скрининг сегрегирующей популяции с помощью морфологического генетического маркера Ltn позволил выявить 57 линий - потенциальных носителей Lr34.

Молекулярно-генетический анализ проведен в сегрегирующей популяции RILs F6

комбинации Прогресс х Анза с использованием ПЦР-метода. ДНК, выделенные из родительских форм и 113 линий - потомство сегрегирующей популяции ЫЬ8 были протестированы с 26 парами ЯОЛР праймеров и с тремя микросателлитными маркерами: Xgwm 130, Xgwm 295, Xgwm 1220. В табл. 2 представлены результаты идентификации устойчивых к бурой ржавчине линий популяции ЫЬ8 на основе последовательного использования морфологического маркера ЬШ и молекулярного маркера Xgwm 130 (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика линий ШЬ8 Е6 Прогресс х Анза по устойчивости к бурой ржавчине и

наличию маркерных генов

Характеристика образцов и групп по устойчивости к бурой ржавчине Количество линий Устойчивость к бурой ржавчине Количество линий с наличием маркеров

Морфологический маркер Ltn Амплифици-рованный фрагмент маркера Xgwm 130

Прогресс 10 40S 0 0

Анза 10 20MR-30MS 10 10

Устойчивые 26 5R-10MR 0 0

Умеренно-устойчивые 57 30MR-30MS 57 49

Восприимчивые 30 50MS-60S 0 0

Примечание: Ltn - морфологический маркер «Leaf-tip necrosis», «Некроз кончиков флаговых листьев», сцепленный с геном устойчивости Lr34

Указанный маркер показал полиморфизм между контрастными по восприимчивости к ржавчине родительскими сортами Прогресс и Анза. Установлено, что из 57 умеренно-устойчивых линий RILs Прогресс х Анза, характеризующихся наличием гена Ltn, у 49 линий обнаружены продукты амплификации. Таким образом, для 49 линий пшеницы доказано наличие гена Lr34 с помощью комплекса генетических маркеров: морфологического маркера Ltn (Leaf Tip Necrosis) и молекулярного маркера Xgwm130. В настоящее время линии - носители эффективного гена Lr 34 испытываются на последующих этапах селекционного процесса.

Выводы

В результате проведенных исследований установлены особенности формирования признака устойчивости к бурой ржавчине пшеницы. Это позволило эффективно применить полученные знания для идентификации гермоплазмы пшеницы, устойчивой к бурой ржавчине. Для надежного поиска эффективных генов устойчивости разработана система бензимидазольной и ПЦР идентификации носителей генов устойчивости к бурой ржавчине пшеницы. Выделено 11 образцов пшеницы с высоким уровнем ювенильной устойчивости к бурой ржавчине. Из 57 линий RILs Прогресс х Анза, характеризующихся наличием гена Ltn, у 49 линий обнаружены продукты амплификации. Устойчивые к бурой ржавчине линии характеризовались наличием молекулярного маркера. Взаимосвязь между этими признаками была положительной и высокодостоверной: R2 = 0.877. Линии-носители эффективного гена Lr 34 испытываются на последующих этапах селекционного процесса.

Список литературы

1. Животков Л.А., Бирюков С.В., Степаненко А.Я. Пшеница. - К.: Урожай, 1989. - 319 с.

2. McIntosh R.A., Wellings C.R., Park R.F. Wheat Rusts: An atlas of Resistance Genes. - Australia: CSIRO, 1995. - 121 p.

3. Chen X.M., Line R.F. Identification of stripe rust resistance genes in wheat genotypes used to differentiate North American races of Puccinia striiformis // Phytopathology. - 1992. - V. 82. - P. 14281434.

4. Михайлова Л.А., Квитко К.В. Лабораторные методы культивирования возбудителя бурой ржавчины пшеницы Puccinia recóndita Rob ex Desm. // Микология и фитопатология. - 1970. - Т. 4, Вып. 3. - С. 56-63.

5. Michelmore R.W. Paran I., Kesseli R.V. A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating population // Proc. Natl. Acad Sci. USA. - 1991. - V. 88. - P. 9828-9832.

6. Riede C.R., Anderson J.A. Linkage of RFLP markers to an aluminum tolerance gene in wheat // Crop Sci. - 1996. - V. 36. - P. 905-909.

7. Chen X.M., Line R.F., Leung H. Genome scanning for resistance gene analogs in rice, barley and wheat by high resolution electrophoresis // Theor. Appl. Genet. - 1998. - V. 97. - P. 345-355.

8. Singh R.P., Huerta-Espino J., William M. Genetics and Breeding for durable resistance to leaf and stripe rust of wheat // Proc. 1-st Central Asia Wheat conf., Kazakhstan, 10-13 June 2003. - P. 127-132.

Рекомендовано к печати д.б.н. Шевченко С.В.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЛЕКТИНОВ И ЛЕКТИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ В ПРОРОСТКАХ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ PSEUDOCERCOSPORELLA HERPOTRICHOIDES (FRON) DEIGHTON

В Н. БЕЛАВА1; С Б. ЗЕЛЁНЫЙ2; О.А. ПАНЮТА1, кандидат биологических наук;

Н.Ю. ТАРАН1, доктор биологических наук;

П.В. ПОГРЕБНОЙ2, доктор биологических наук 'Киевский национальный университет им. Т. Шевченко 2Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН

Украины, Киев

Введение

Одной из исследуемых функций лектинов в растительном организме, которая базируется на способности распознавать малейшие отличия структуры углеводов и специфичности к мономеру и олигомерам хитина, является защита от фитопатогенов. Гипотезы о возможности участия лектинов в защите растений от патогенных микроорганизмов подкреплены данными о способности лектинов специфически взаимодействовать с поверхностью бактериальных клеток, спор и гиф грибов [6, 11, 12]. Исследования лектиновой активности (ЛА) при инфицировании растений на разных этапах онтогенеза показали её значительное возрастание по сравнению с контролем [4, 8, 9]. Эти данные свидетельствуют об участии лектинов в формировании стрессового состояния или неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы [3]. Изменения ЛА могут быть обусловлены, с одной стороны, конформационными перестройками белковых молекул, в ходе которых изменяется достижимость углеводсвязывающих центров, а с другой, - увеличением содержания этого белка, что, в свою очередь, может обеспечиваться на уровне транскрипции и/или трансляции. По данным литературы, при прорастании семян на ранних стадиях развития проростка синтезируется значительное количество лектинов [5]. Кроме того, с использованием ингибитора транскрипции мРНК было доказано существование в зародышах пшеницы пула запасных форм лектиновых мРНК [13], что обеспечивает быстрое возрастание ЛА за счет синтеза белка de novo. Логично предположить, что еще до начала возможного инфицирования включается механизм предадаптации растений на уровне транскрипции. Таким образом, целью нашей работы было определение уровня ЛА и лектиновой мРНК на ранних стадиях развития проростка при инфицировании и определить степень зависимости между этими показателями у различных по устойчивости сортов.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили проростки озимой пшеницы (Triticum aestivum L.), восприимчивого к церкоспореллёзу сорта Мироновская 808 (украинской селекции), и относительно резистентного сорта Roazon (французской селекции).

В качестве фитопатогенного стрессора использовали гриб-возбудитель церкоспореллёза -Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton (высоковирулентный штамм 543 7/1, любезно предоставленный лабораторией иммунитета сельскохозяйственных растений к болезням Института защиты растений УААН).

Инфицирование семян проводили на стадии их прорастания суспензией конидий, исходный титр 5-7х104 КОЕ/см3 [1]. Начальный уровень ЛА и транскриптов определяли через 24 часа с