Влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик на радиочувствительность лебеды раскидистой (Atriplexpatula L. ) разных экоформ

УДК 577.11:577.345:582.6/.9

Влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик на радиочувствительность лебеды раскидистой (Atriplex patula L.) разных экоформ

И.В. Воронов, А.Н. Журавская

Исследовано влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик (выживаемость проростков, коэффициенты общей антиоксидантной защиты и общей активности генома клеток) на радиочувствительность лебеды раскидистой (Atriplex patula L.) нерюнгринской, центрально-якутской и уральской экоформ. Установлено, что нгрюнгринская и центрально-якутская экоформы лебеды раскидистой имеют высокий адаптивный потенциал, в отличие от уральской, что отразилось на их радиочувствительности к острому радиационному облучению.

Influence of variability of physiology-biochemical characteristics (a survival rate of sprouts, quotients of the general antioxidant protection and the general genome activity of cells) on a radiosensitiveness of an orach sprawling (Atriplex patula L.), Nerungrian, Central yakutian and Ural ecoforms is investigated. It is established, that Nerungrian and Central yakutian ecoforms an orach sprawling have high adaptive potential, as against Ural, that was reflected in their radiosensitiveness to a sharp radiating irradiating.

Радиочувствительность растений зависит от многих факторов, как эндогенных, так и экзогенных [4, 13]. Механизмы формирования радиочувствительности неспецифичны, и физиолого-биохи-мические адаптации вида к среде обитания могут существенно изменять ее уровень [7].

Исследований, посвященных изучению влияния внутривидовой изменчивости растительных популяций (на уровне физиологических, биохимических и других характеристик), существующих в условиях экстремальных факторов среды, на их радиочувствительность, очень мало. Ранее нами было установлено, что. радиочувствительность индивидуума определяется прежде всего цитолого-биохи-мическими параметрами клеток (антиоксидантной защитой, репарацией и др.), которые в совокупности и определяют лучевую реакцию выборки (популяции) [8]. Цель данного исследования - выявить влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик на радиочувствительность лебеды раскидистой, произрастающей в разных климатических условиях (Южная Якутия, Центральная Якутия, Средний Урал).

Материал и методики. Семена лебеды раскидистой, произрастающей в разных регионах России (Южная Якутия, Центральная Якутия, Средний Урал), были собраны в 2002 году, индивидуально с каждого растения. В окрестностях г. Якутска - с 20, г. Нерюнгри - с 19 и г. Екатеринбурга -с 10 растений.

ВОРОНОВ Иван Васильевич, аспирант ИБПК СО РАН; ЖУРАВСКАЯ Алла Николаевна, зав. группой радиобиологии ИБПК СО РАН, д.б.н.

Семена проращивали в чашках Петри, на фильтрах при комнатной температуре (20-24° С) с длиной дня - 16 ч. и ночи - 8 ч., по 50 штук в 4-х повторностях. Критериями оценки физиологических и цитолого-биохимических параметров лебеды раскидистой явились: выживаемость проростков на 30 день наблюдения (%). Стадия настоящего листа, когда начинают активно функционировать меристемы, дает возможность прогнозировать дальнейшую судьбу растения. Также определялась митотическая активность меристематических клеток корней проростков (%), содержание низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО, мкгэквкв/гпр), активность ферментов супероксиддисмутазы (СОД, мкмоль/гшин) и пероксидазы (мкмоль/ г*мин), включение 3Н-тимидина (фмоль/гпр-Чсут) и ,4С-лейцина (пмоль/гпрЧсут) в клетки проростков. Определение активности пероксидазы проводили по стандартной методике [5], активность СОД -по методу Constantine et al. [16], суммарное содержание НМАО - по Асатиани [2]. Активность функционирования белоксинтезирующих, ДНК-репли-цирующих и репарирующих систем определяли с применением радиоиндикаторного метода [12]. Устойчивость генома клеток проростков устанавливали, применяя цитолого-биохимическую методику, где были использованы цитологический и биохимический подходы [7].

Воздушно-сухие семена облучали у-квантами S0Co на установке типа «Исследователь» при мощности дозы 9,4 рад/с, в диапазоне доз от 10 до 500 Грей (Гр) на биофизической станции г. Заречный Института экологии растений и животных УрО РАН (г. Екатеринбург). Для сравнения радиоустой-

чивости как у индивидуальных растений, так и у экоформ была применена нормированная оценка натурально-логарифмических анаморфоз дозовых кривых выживаемости проростков, которая дала возможность установить значения квазипороговой дозы (Dq, Гр) и угла наклона кривой «доза-эффект» (1§а)[6].

Построение вариационных кривых, их анализ и оценку достоверности результатов проводили по [ 10].

Результаты и обсуждение. На рис. 1А представлены вариационные кривые выживаемости 30-дневных проростков лебеды раскидистой исследованных нами трёх экоформ. Известно, что фенотипы, признаки которых близки к среднему значению для данной популяции (или выборки), обладают высокой приспособленностью, чем фено-

типы, у которых признаки выражены в крайней степени [14]. Формы изображенных кривых позволяют утверждать, что среда обитания в год сбора семян южно-якутской и центрально-якутской экоформ характеризовались одинаковыми и стабильными для лебеды условиями произрастания. Куполообразные формы вариационных кривых этих экоформ говорят об их высоком приспособительном потенциале, в отличие от уральской экоформы. Все три кривые смещены вправо от центра, что является признаком действия направленного (не установленного нами) отбора на эти экоформы. Вычисленный коэффициент вариации выживаемости проростков показал сходство нерюнгринской и якутской экоформ лебеды (Увыж= 11%), у уральской этот показатель равен 9,2% (табл. 1).

Таблица 1

Значения квазипороговой дозы фя, Гр), тангенса угла наклона кривых «доза-эффект» О^а) лебеды раскидистой разных экоформ в зависимости от вариабельностей выживаемости проростков

Регион Увы*,% Укоаз, /0 Укоаг,% ОЯ, Гр *8а

Южная Якутия 11,0 8,3 27,0 155,0±15,0 1,4

Центральная Якутия 11,0 19,7 26,4 227,0±30,0 1,7

Средний Урал 9,2 7,5 19,2 128,4±13,0 1,2

В природной среде на дикорастущие растения оказывает влияние большое число экологических факторов. Наиболее важные из них: температура, осадки и влажность, интенсивность и режим солнечной инсоляции, тип почвы, наличие доступных минеральных и органических веществ, биотическое влияние, подстилающая многолетняя мерзлота (в условиях Севера), а также антропогенные загрязнения тяжелыми металлами, газообразными веществами, радионуклидами и т.д. Условиями сбора семян влияние антропогенных загрязнений было сведено к минимуму.

Ранее было выявлено, что наиболее важными факторами, способствующими накоплению биологически активных веществ, являются высокая температура и малое количество осадков в период активной вегетации (июль) [15]. Поэтому из гидротермических показателей регионов нами были взяты средняя температура и количество выпавших осадков в июле (2002 г.). Для удобства сравнения температурно-влажностных условий произрастания разных экоформ лебеды в июле был вычислен коэффициент экстремальности (кэкстр - отношение среднего значения температуры июля к количеству осадков этого месяца; табл. 2).

Таблица 2

Средняя температура, количество выпавших осадков и значения коэффициентов экстремальности

исследованных регионов в июле 2002 года

Показатели Центральная Якутия

Средняя 1, °С 19,7 17,6 16,0

Количество осадков, мм 44,7 55,2 70,0

*У?КСТГ> 0,44 0,32 0,23

Установлено, что самые экстремальные условия произрастания в 2002 году были в г. Якутске (0,44) и г. Нерюнгри (0,32). Наиболее «мягкие» условия среды обитания - в г. Екатеринбурге (0,23). Важную роль в формировании адаптаций к экологическим условиям обитания у растений играют эво-люционно сформированные антиоксидантные и геномные защитные системы клеток, формирующие общую устойчивость организмов [4]. Результатом адаптации к экстремальным условиям Севера у якутских экоформ растений являются повышенное содержание антиоксидантов (ферментативной и низкомолекулярной природы) и увеличение функциональной активности генома.

Диспергированность конформации хроматина в ядрах клеток делает геном более уязвимым при облучении, одновременно это облегчает включение ферментативных ДНК-репарационных систем клеток, восстанавливающих целостность хромосом. Обогащённость же биологически активными веществами и низкомолекулярными антиоксидантами, включая флавоноиды, низкомолекулярные алифатические спирты, как известно, ведет к увеличению радиоустойчивости [4]. Можно считать, что величина квазипороговой дозы (Оц), в первую очередь, связана с концентрацией всей совокупности антиоксидантов в клетке, а тангенс угла наклона дозо-вой кривой ^а) прямо пропорционален степени диспергированности конформации хроматина.

Антиоксиданты - вещества, способные предотвращать биологическое окисление за счет инактивации свободных радикалов или перекисей, в том числе активированных кислородных метаболитов, образующихся в повышенных количествах при воздействии стресс-факторов среды [3]. Тем самым антиоксиданты являются одной из неспецифических защитных систем клетки и организма в целом. На рис. 1Б показаны вариационные кривые значений коэффициента антиоксидантной защиты (коаз) меристематических клеток корней проростков лебеды обыкновенной разных экоформ. Установлено, что нерюнгринская и центрально-якутская экоформы исследуемого растения имеют близкие по форме вариационные кривые, в отличие от уральской. Следует отметить, что коэффициент вариации (Укою) центрально-якутской экоформы в 2,4-2,6 раза выше, чем у растений, выросших в окрестностях гг.Нерюнгри и Екатеринбурга. Поэтому и значения квазипороговых доз (Бц) у последних двух экоформ также близки по значению: 155,0±15,0 и 128,4±13,0 Гр (табл. 1).

Функциональная активность генома клеток организма также формируется в зависимости от тех экологических условий, к которым он адаптирован. Рядом исследователей ЯНЦ СО РАН было показано, что адаптация к своеобразным климатическим условиям Якутии выражается в изменении функциональной активности генома [1, 9]. При сравнении вариабельности общей активности генома (Укоаг) клеток проростков нерюнгринской, центрально-якутской и уральской популяций была также установлена сниженная (на 30%) диспергированность конформации хроматина последних (рис. 1В). Поэтому угол наклона кривой «доза-эффект» уральской экоформы более пологий, чем у нерюнгринской и центрально-якутской (табл. 1). Ранее проведенные исследования общей функциональной активности генома у проростков растений также показали, что у большинства исследованных центрально- и южно-якутских видов растений повышенная функциональная активность генома приводит к снижению радиоустойчивости, по сравнению с уральскими экоформами [7].

На рис. 2 показаны вариационные кривые выживаемости проростков лебеды разных экоформ, выросших из семян, получивших дозы острого у-облучения. Видно, что кривые исследованных экоформ имеют две вершины. То есть после действия острого стресса появляются две группы индивидуумов, имеющих крайние значения по выживаемости. Известно, что подобная ситуация складывается в случае, когда создается среда, благоприятствующая крайним значениям для вида, что приводит к появлению дизруптивного отбора, способствующего образованию двух и более модальных фенотипов и происходящего в гетерогенной среде [14].

Следует подчеркнуть, что в качестве фактора, благоприятствующего появлению крайних значений, в нашем эксперименте являлось острое радиационное у-облучение семян, которое может вызывать радиационно-индуцированную нестабильность генома, способную возникать в клеточных системах в ответ на действие любых факторов определенной силы, при генетической предрасположенности или даже спонтанно. Механизмы ее формирования до сих пор не изучены [11].

Рассчитанные коэффициенты вариабельности кривых распределения выживаемости проростков нерюнгринской, центрально-якутской и уральской экоформ статистически достоверно не отличаются друг от друга: 13,0; 13,7 и 12,1% соответственно. Подобные формы кривых появились у иссле-

дованных нами экоформ при разных дозах провокационного облучения. Для нерюнгринской и центрально-якутской экоформ - 100, а для уральской -250 Гр. Можно предположить, что однократное радиационное воздействие вызвало перестройку геномов индивидуумов, которое проявилось в снижении и повышении выживаемости проростков, отличном от нормального распределения (рис, 1 А). Это еще один аргумент, позволяющий утверждать, что адаптационным механизмом для растений, су-

А

ю т

ществующих в условиях экстремального климата, является увеличение функциональной активности генома клеток, который, с одной стороны, позволяет быстро проходить стадии развития растений, а с другой, - приводит к большей уязвимости генома. Поэтому проростки лебеды нерюнгринской и центрально-якутской экоформ, семена которых получили дозу 100 Гр, уже изменяют характер реакции, отличной от нормы, когда как у уральской эта доза в 2,5 раза выше.

Б

Рис. 1. Вариационные кривые выживаемости проростков (А), значений коэффициента антиоксидантной защиты (Б) и коэффициента общей активности генома клеток (В) лебеды раскидистой исследованных экоформ:

-----нерюнгринская;.......якутская;------уральская.

По оси абсцисс — категории (нормировано относительно среднего значения по выборке); по оси ординат - частота встречаемости категории

Рис. 2. Вариационные кривые выживаемости проростков лебеды раскидистой исследованных экоформ, семена которых получили дозы острого у-облучения:

----- нерюнгринская (100 Гр);

----- якутская (100 Гр);

-----уральская (250 Гр).

По оси абсцисс — категории (нормировано относительно среднего значения по выборке);

по оси ординат - частота встречаемости категории

Выводы

Таким образом, было установлено, что высокие значения коэффициентов вариации выживаемости проростков и куполообразные формы вариационных кривых нерюнгринской и центрально-якутской экоформ лебеды раскидистой (в отличие от уральской) позволяют предполагать: а) эти экофор-

мы имеют высокий приспособительный потенциал; б) в год сбора семян они произрастали приблизительно в одинаковых погодных условиях. Высокая вариабельность коэффициента антиоксидантной защиты клеток центрально-якутской экоформы лебеды определяет ее высокую радиоустойчивость (по Эц). А у уральской популяции была

выявлена сниженная диспергированность конформации хроматина, что привело к повышению устойчивости к облучению в диапазоне высоких доз (выше 250 Гр).

Дополнительное острое облучение привело к появлению двувершинных вариационных кривых распределения выживаемости проростков. Подобные формы кривых появились при облучении дозами 100 Гр (нерюнгринская и центрально-якутская) и 250 Гр (уральская). Предположено, что однократное радиационное воздействие вызвало перестройку геномов индивидуумов, которая проявилась в снижении и повышении выживаемости проростков, отличном от нормального распределения. Это позволяет говорить о возникновении радиационно-индуцированной нестабильности геномов клеток исследованных экоформ лебеды, способной возникать в ответ на действие любых факторов определенной силы (в данном случае - острое радиационное воздействие).

Литература

1. Алексеев В.Г. Устойчивость растений в условиях Севера: эколого-биохимические аспекты. - Новосибирск: ВО Наука, 1994. - 152 с.

2. Асатиани В.С.Ферментные методы анализа. - М.: Наука, 1969. - 740 с.

3. Барабой В.А.,Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. - СПб, 1992.

- 148 с.

4. Гродзинский Д.М. Радиобиология растений.

- Киев: Наук, думка, 1989. - 380 с.

5. Ермаков А.И., Арасимович В.В. Методы биохимического исследования растений. - Л.: Колос, 1987. -456 с.

6. ЖуравскаяА.Н., ПазстотинаВ.Н., Кершенголъц Б.М. Радиочувствительность семян растений Якутии // Экология. - 1997.-№1.-С. 111-117.

7. Журавская А.Н. Адаптация к экстремальным условиям среды и радиочувствительность растений (радиоэкологические исследования) // Автореф. дис... д-ра биол. наук. - М., 2001. - 45 с.

8. Журавская А.Н., Воронов И.В., Шадрина Е.Г.Вт-яние внутривидового разнообразия ряда физиологических, биохимических и морфологических показателей на радиочувствительность березы растопыренной // Наука и образование. - 2003. - №1 (29). - С. 29-33.

9. Кершенголъц Б.М. Неспецифические биохимические механизмы адаптации организмов к экстремальным условиям среды // Наука и образование. - 1996. - Т.З, -С. 130-138.

10.ЛакинГ.Ф. Биометрия.-М.: Высш. школа, 1980, -293 с.

11. Мазурик В.К, Михайлов В.Ф. Радиационно-ин-дуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Ради-ац. биология. Радиоэкология. - 2001. - Т.41. - № 3.

- С. 272-289.

12. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. - М.: Наука, 1983.-304 с.

13. Преображенская Е.И. Радиоустойчивость семяи растений. - М.: Атомиздат, 1971. - 232 с.

14. Солбриг О., Солбриг Д. Популяционная биология и эволюция. - М.: Мир, 1982. - 488 с.

15. Филиппова Г.В. Роль экологических факторов в накоплении биологически активных веществ растениями Якутии // Автореф. дис... канд. биол. наук. - Якутск, 2003,- 18 с.

16.Constantine N.G., Stanley K.R. Superoxide Dismutases in hanger plants // Plant Physiol. -1977. - V.59. -P. 565-569.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований,

проект № 03-04-96044 «р2003арктика_а»