Интерферон человека модулирует функцию инфицированного эндотелия сосудов

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОЛОГИИ

О.Н. Щегловитова, Н.Н. Склянкина, Н.В. Болдырева, А.А. Бабаянц, И.С. Фролова, М.Р. Капкаева

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва, Российская Федерация

Интерферон человека модулирует функцию инфицированного эндотелия сосудов

Цель исследования: изучить влияние интерфероное а, р и у на функциональную активность инфицированных вирусом простого герпеса 1-го типа клеток эндотелия сосудов человека, связанную с участием в развитии воспаления. Материалы и методы: в работе использовали эндотелиальные клетки, выделенные из пупочной вены. Интактные и инфицированные культуры обрабатывали интерфероном, и в динамике культивирования тестировали медиаторы в культуральной среде. Результаты: все исследованные интерфероны активировали продукцию интерлейкина 6. Интерфероны а и р активировали продукцию интерлейкина 8, тогда как интерферон у ингибировал ее. Интерфероны а и у увеличивали синтез оксида азота и уменьшали синтез эндотелина-1, тогда как интерферон р активировал продукцию эндотелина-1. Выводы: инфекция вирусом простого герпеса 1-го типа эндотелиальных клеток, выделенных из пупочной вены, не изменяет способность интерферона модулировать синтез провоспалительных цитокинов, оксида азота и эндотелина-1. Очевидно, в организме модуляция проявлений врожденного иммунитета под влиянием экзогенного интерферона реализуется как интактным, так и инфицированным вирусом простого герпеса 1-го типа эндотелием сосудов, а характер модуляции определяется типом интерферона.

Ключевые слова: эндотелиальные клетки, выделенные из пупочной вены, интерферон, вирус простого герпеса 1-го типа, цитокины, оксид азота, эндотелин-1.

Ф

31

Введение

Попадание инфекционного агента в организм приводит к активации врожденного иммунитета, действие которого направлено на элиминацию патогена. Эндотелий сосудов (ЭС), наряду с иммунокомпетентными клетками, принимает участие в функционировании врожденного иммунитета, синтезирует факторы, поддерживающие антивоспалительный фенотип эндотелия [1]. На интервенцию патогена клетки ЭС вместе с лейкоцитами крови реагируют цепью событий, приводящих к развитию воспалительного процесса: активации продукции провоспалительных цитокинов, экспрессии молекул клеточной адгезии (МКА), что сопровождается повышением интенсивности рекрутирования и трансмиграции лейкоцитов через слой эндотелия в субэндотелиальное пространство и очаг воспаления [2, 3]. ЭС синтезирует множество других факторов с плейотропными свойствами, связанных с воспалительным процессом. Так, вазодилататор оксид азота

(ОА) вместе с антипатогенным также оказывает антивоспалительное действие, тогда как вазоконстриктор эндотелин-1 (ЭТ-1) обладает провоспалительным эффектом [1].

Эндотелиотропные потенции характерны для вируса простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1), широко распространенного в человеческой популяции. ВПГ-1 обнаруживается в эндотелии кровеносных сосудов биоптатов органов человека, а его нуклеиновая кислота идентифицирована в образцах нормальной и атеросклеротически измененной аорты [4, 5]. Кроме того, культивируемые клетки ЭС экспрессируют рецепторы для ВПГ-1 [2].

Для профилактики и лечения вирусных заболеваний, в т.ч вызванных ВПГ-1, используют препараты интерферона (ИФН) [6]. Лечебный эффект ИФН связан как с антивирусной, так и с иммуномодулирующей активностью [6].

Цель исследования: изучить действие ИФН на функциональное состояние инфицированных ВПГ-1 клеток ЭС, связанное с их участием в развитии воспаления.

#

O.N. Scheglovitova, N.N. Sklyankina, N.V. Boldyreva, A.A. Babayants, I.S. Frolova, M.R. Kapkaeva

N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russian Federation

Human Interferon Modulates Infected Vascular Endothelium Function

Background: To study impact of interferon (IFN) a, p and у on the Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infected endothelial cells functional activity related with participation in the inflammation development. Materials and methods: In the work endothelial cells isolated from umbilical vein were used. Intact and infected cultures were treated by interferon and in the dynamics of cultivation tested mediators in the cultural medium. Results: All investigated interferons activated the production of IL-6. IFN a, p activated the production of IL-8, while IFN у inhibited her. IFN a and Y increased synthesis of nitrogen oxides and reduced the synthesis of endothelin-1, while IFN p activated the production of endothelin-1. Conclusion: Infection of endothelial cells isolated from umbilical vein with HSV-1 does not alter the ability of interferon in modulating of proinflammatory cytokines, nitric oxide and endothelin-1 synthesis. It is obvious in the body modulation manifestations of innate immunity under the influence of exogenous interferon is implemented both intact and infected with HSV-1-vascular endothelium and nature modulation is determined by the type of IFN. Key words: endothelial cells isolated from umbilical vein, interferon, Herpes simplex virus type 1, cytokines, nitric oxide, endothelin-1.

#

32

ВЕСТНИК РАМН /2014/ № 3-4

Влияние рекомбинантных ИФН I (ИФН аир) и II (ИФН у) типа человека оценивали на культурах клеток ЭС человека, интактных и инфицированных ВПГ-1, по продукции провоспалительных цитокинов и синтезу ОА и ЭТ-1.

Материалы и методы

Материал для исследования

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ЭКПВЧ) выделяли из вен пупочных канатиков, полученных от здоровых женщин после нормальных родов [7]. ЭКПВЧ культивировали в среде 199 (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (HyClone, США), эндотелиального фактора роста, гепарина (100 мкг/мл) и гентамицина (50 мкг/мл) при 37 °C в 5% СО2. После образования монослоя клетки ресуспен-дировали раствором трипсина с EDTA (Gibco, США) и засевали с плотностью 105 клеток/см2 в 24-луночные планшеты. Для работы использовали культуры только первого пассажа на 4-е сут культивирования после образования монослоя.

Культуры ЭКПВЧ инфицировались ВПГ-1 (штамм R39, полученный из Банка ВОЗ) из расчета 0,0001 ТЦД50 на клетку. Среду роста декантировали, и в лунки вносили по 200 мкл вируссодержащей среды. После 1 ч адсорбции монослой отмывали от неадсорбировавшегося вируса и продолжали культивировать в свежей среде.

Методы исследования

При постановке экспериментов использовали ИФН a2b (Иммунофарм, Россия) с активностью 3х108 Ед/мл и концентрацией 0,5 мг/мл согласно международному стандарту NIBSC 95/576 (Великобритания). ИФН р- 1b (Schering AG, Германия) был предоставлен фирмой-производителем, его удельная активность составила 9,6х106 Ед/мл, концентрация — 0,3 мг. ИФН у (Иммунофарм, Россия): активность — 1,4х107 ЕД/мл, концентрация — 1,4 мг/мл (согласно международному стандарту NIBSC tade:82/587).

Влияние ИФН (концентрации 104 Ед/мл) на культуры ЭКПВЧ, инфицированные ВПГ-1, исследовали в трех модификациях. Обработка культуры ИФН составляла 24 ч, затем их инфицировали ВПГ-1 и продолжали культивировать в отсутствии ИФН. В других двух модификациях экспериментов культуры инфицировали ВПГ-1, затем сразу или через 6 ч в среду вносили ИФН, и культивирование продолжалось. Пробы культуральной среды отбирали через 24 ч после внесения вируса и хранили при -20 ° до момента тестирования. Контрольные культуры обрабатывали ИФН и одновременно с опытными образцами отбирали пробы среды.

Тестирование растворимых факторов проводили методом иммуноферментного анализа. Использовали тест-системы фирм Biosource (Австрия) — ELISA IL-1p, ELISA IL-6, ELISA IL8/NAP, ELISA TNF a; R&D Systems (Великобритания) — Total NO Nitrite/Nitrate Assay; IBL Biomedica Gruppe (Германия) — Endothelin-1 Assay Kit.

Статистическая обработка данных

Результаты выражали в относительных (процентное выражение) показателях. Статистическую обработку данных выполняли по методу Стьюдента и оценивали в соответствии с ^-критерием Стьюдента.

Результаты

В динамике исследовали влияние ИФН а, р и у на продукцию культурами ЭКПВЧ провоспалительных цитокинов (рис. 1). Все три ИФН не оказывали существенного воздействия на продукцию ИЛ 1р, но продемонстрировали себя активными индукторами синтеза ИЛ 6. При воздействии ИФН а и р максимальные показатели ИЛ 6 в культуральной среде определялись в более ранние сроки (3 и 6 ч, соответственно), тогда как после воздействия ИФН у максимальные показатели были наибольшими к 24 ч. Возможно, разница во времени проявления эффекта связана с более длительным внутриклеточным сигналингом после воздействия ИФН у, что характерно и для развития антивирусного состояния под влиянием ИФН у по сравнению с ИФН I типа [6]. Среди ИФН I типа ИФН р активировал более высокий уровень продукции ИЛ 6 в ЭКПВЧ: более 2500% продукции ИЛ 6 в клетках, не обработанных ИФН. Возможно, это связано как с более выраженной тканевой специфичностью ИФН р по сравнению с ИФН а, так и с особенностями механизмов сигналинга [7]. При воздействии ИФН а и р было отмечено увеличение продукции ИЛ 8 культурой ЭКПВЧ, тогда как ИФН у подавлял синтез этого цитокина. Разница в действии ИФН I и II типа на продукцию культурой ЭКПВЧ ИЛ 8, по-видимому, определяется разницей в их воздействиях на все этапы процесса: от разницы в структуре рецепторов до различия в механизмах трансдукции [6]. Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) а культурой была увеличена через 3 ч только после воздействия ИФН у, но не ИФН а и р.

При всех использованных модификациях экспериментов ИФН снижал уровень репродукции ВПГ-1 в культурах ЭКПВЧ [8]. Также при всех модификациях экспериментов — при предобработке ИФН р или у, применении ИФН а, р или ИФН-у сразу или через 6 ч после инфицирования ВПГ-1, когда механизм репликации вируса уже запущен, — происходила активации синтеза ИЛ 6 (рис. 2). Необходимо отметить, что уровень продукции ИЛ 6 достоверно отличался от такового в контрольных интактных и контрольных инфицированных (но не обработанных ИФН) культурах, но достоверно не отличался от уровня продукции в контрольных культурах, культивированных в присутствии ИФН. Отсутствие продукции ИЛ 6 при предобработке ЭКПВЧ ИФН а и последующем инфицировании ВПГ-1, очевидно, связано с тем, что результат оценивали через 48 ч от начала воздействия ИФН а, именно в то время, когда, как было показано в данной работе, действие на продукцию данного цитокина интактными культурами уже не выявлялось. Культуры ЭКПВЧ, инфицированные ВПГ-1, при воздействии ИФН а, р и у не продуцировали ИЛ 1р и ФНО а в количествах, значительно отличающихся от таковых при продукции интактными культурами. Возможно, это связано с тем, что ИФН а, р и у не оказывали выраженного воздействия на продукцию данных цитокинов и интактными неинфицированными культурами ЭКПВЧ.

Только ИФН у (но не ИФН аир), примененный до инфицирования, оказывал модулирующее воздействие на продукцию ИЛ 8 культурами ЭКПВЧ, инфицированными ВПГ-1. Эффект ИФН у был установлен при раздельной статистической обработке результатов, полученных на культурах спонтанно продуцирующих ИЛ 8 в высоких (254,13+18,1 пг/мл) или низких (51,62+6,67 пг/мл) концентрациях (рис. 3). Ранее нами уже была показана способность культур ЭКПВЧ спонтанно продуцировать достоверно различающиеся количества

#

#

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОЛОГИИ

Ф

_о

с:

о

о.

ИФН а 400 300 200 100 0

3 6 24 48 3 6 24 48 3 6 24 48 3 6 24 48

Время,ч

ИЛ 1р «ИЛ 6 иИЛ 8 иФНО а

* *

Рис. 1. Влияние ИФН а, р и у на продукцию цитокинов культурами эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Примечание. * — p относительно контроля клеток (* — p <0,05,

** p <0,01, *** — p <0,001).

ИФН-а

300

200

^ 100

0 ' А ' В ' С  Контроль ВПГ-1 «Контроль ИФН иВПГ-1 + ИФН

Рис. 2. Продукция ИЛ 6 культурами эндотелиальных клеток пупочной вены человека, обработанными ИФН а, р и у и инфицированными ВПГ-1.

Примечание (здесь и на рис. 3, 4). * — p относительно контроля клеток (* — p <0,05, ** p <0,01); + — p относительно контроля вируса (+— p <0,05, ++— p <0,01); А — обработка ИФН за 24 ч до инфицирования ВПГ-1; В — обработка ИФН сразу после инфицирования ВПГ-1; С — обработка ИФН через 6 ч после инфицирования ВПГ-1.

ИФН р

2500

2000

1500

1000

500

0

3 6 2448 3 6 24 48 3 6 24 48 3 6 24 48

Время, ч

|ИЛ 1р «ИЛ 6 «ИЛ 8 «ФНО а

ИФН Y

250

200

150

100

50

0

3 6 24 48 3 6 24 48 3 6 24 48 3 6 2448

Время, ч

ИЛ 1р «ИЛ 6 «ИЛ 8 иФНО а

ИФН-р

400

300

200

100

* * ,

* * +

ihFf

0 . . .

А В С

Контроль ВПГ-1 «Контроль ИФН «ВПГ-1 + ИФН

ИФН-у 400

300

200

100

J i J

0

А В С

| Контроль ВПГ-1 «Контроль ИФН  ВПГ-1 + ИФН

+

33

#

#

ВЕСТНИК РАМН /2014/ № 3-4

160

120

80

40

0 А  В

Контроль ВПГ-1 «Контроль ИФН «ВПГ-1 + ИФН

Рис. 3. Влияние ИФН у на продукцию ИЛ 8 высоко- (A) и низкопродуцирующими (B) культурами эндотелиальных клеток пупочной вены человека, инфицированными ВПГ-1.

150

100

50

А

В

С

Контроль ВПГ-1 «Контроль ИФН «ВПГ-1 + ИФН

Рис. 4. Влияние ИФН у на продукцию ЭТ-1 культурами эндотелиальных клеток пупочной вены человека, инфицированными ВПГ-1.

0

ф

цитокинов [9]. Обработка ИФН у высокопродуцирующих культур и последующее инфицирование ВПГ-1 приводили к ингибированию продукции ИЛ 8, тогда как 34 следствием предобработки низкопродуцирующих инфицированных культур была активация продукции ИЛ 8. При этом в обоих случаях не обнаружено статистически значимых отличий от его продукции после действия ИФН на интактные неинфицированные культуры.

ИФН а, р и у оказывали статистически достоверное воздействие на синтез ОА и ЭТ-1 культурами ЭКПВЧ, инфицированными ВПГ-1. ИФН а и у активировали продукцию ОА в том случае, когда культуры были обработаны сразу после инфицирования. Активация продукции этого медиатора происходила при использовании ИФН р как до инфицирования культур, так и после него. Использованные препараты различались по влиянию на синтез ЭТ-1 инфицированными культурами. При всех модификациях обработки инфицированных культур ИФН а снижал интенсивность синтеза ЭТ-1, тогда как ИФН р активировал его продукцию. Наиболее активным ингибитором синтеза ЭТ-1 оказался ИФН у (рис. 4). Максимально выраженное подавление продукции ЭТ-1 происходило при использовании ИФН у сразу после инфицирования культур или через 6 ч после инфицирования.

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что противовирусные препараты ИФН а, р и у, ингибируя репродукцию ВПГ-1 в культуре ЭКПВЧ, одновременно оказывают регулирующее воздействие на продукцию инфицированным эндотелием факторов врожденного иммунитета: провоспалительных цитокинов, ОА и ЭТ-1. Очевидно, свойства всех исследованных ИФН во многом определяются активацией продукции ЭС ИЛ 6, являющегося одним из наиболее активных цитокинов-факторов врожденного иммунитета, участвующих в воспалительной реакции — реализации адаптивного иммунного ответа и, по-видимому, также в переключении врожденного ответа организма на адаптивный иммунный ответ [10]. ИЛ 8 определяет хемотаксис лейкоцитов, влияет на трансмиграцию нейтрофильных лейкоцитов через слой эндотелия сосудов и при помощи этого механизма регулирует развитие воспаления [11]. По всей вероятности,

ИФН I и II типа путем воздействия на синтез эндотелием ИЛ 8 могут активировать (ИФН аир) или подавлять (ИФН у) этот процесс в интактном эндотелии сосудов или же модулировать его (ИФН у) в эндотелии сосудов, инфицированном ВПГ-1. ИФН а, р и у регулируют функциональное состояние эндотелия также и путем воздействия на синтез ОА и ЭТ-1. Увеличение под влиянием ИФН а и у продукции ОА и уменьшение продукции ЭТ-1 интактными и инфицированными ВПГ-1 ЭКПВЧ характеризует их антивоспалительную направленность. Активация ИФН р продукции ЭТ-1 в инфицированном эндотелии, возможно, направлена на синтез ОА, т.к. ЭТ-1 по принципу обратной связи, воздействуя на специфические рецепторы ЭК, активирует синтез ОА [1].

Активация механизмов врожденного иммунитета в ответ на попадание инфекционных патогенов реализуется на уровне клеточных рецепторов TLR, NLR и RLR [12]. В ЭК функционируют TLR1 6, TLR 9, NOD 1, NLRP 1, RIG-1 и MDA 5, из которых могут распознавать структурные белки ВПГ-1 TLR 2/TLR 2, TLR 2/TLR 1, TLR 2/TLR 6 и внутриклеточный рецептор TLR 9 [13]. Однако инфекция ВПГ-1 вызывает в культуре ЭС развитие продуктивной инфекции и запускает механизмы, сдерживающие активацию синтеза клеточных медиаторов врожденного иммунитета, тогда как чувствительность к действию экзогенного ИФН сохраняется [8, 14, 15]. Вероятно, именно этим объясняется синтез медиаторов культурами инфицированных эндотелиальных клеток на уровне их синтеза неинфицированными культурами под влиянием ИФН. При этом эффект ИФН сохраняется и при их использовании через 6 ч после инфицирования культур ВПГ-1, в то время как вирус уже проник в ядра клеток, и начался процесс его репликации [14].

Заключение

Экстраполируя полученные данные, можно предположить, что в организме модуляция проявлений врожденного иммунитета под влиянием экзогенного ИФН реализуется как интактным, так и инфицированным ВПГ-1 эндотелием сосудов, а характер модуляции определяется типом ИФН.

Работа частично поддержана грантом МНТЦ № 3505.

#

#

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОЛОГИИ

ЛИТЕРАТУРА

1. Biederman B.C. Vascular endothelium: checkpoint for inflammation and immunity. New Physiol. Sci. 2001; 16: 84—88.

2. Щегловитова О.Н., Склянкина Н.Н., Болдырева Н.В., Баба-янц А.А., Фролова И.С., Беляев Д.Л., Ершов Ф.И. Молекулв1 адгезии, экспрессируемые клетками сосудистого эндотелия в естественном иммунитете при вирусных инфекциях. Вестник РАМН. 2011; 10: 54-60.

3. Wallez Y, Huber P Endothelial adherens and tight junction in vascular homeostasis, inflammation and angiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 2008; 3: 794-809.

4. Herzum M., Schaefer J.R., Hufnagel G., Maisch B. Cytomegalovirus and herpes simplex virus in pathogenesis and progression of native arteriosclerosis and recurrent stenosis after intervention. Herz. 1998; 23: 193-196.

5. Holbach L.M., Assano N., Naumann G.O. Infection of the corneal endothelium in herpes simplex keratitis. Am. J. Ophtalmol. 1998; 126: 592-594.

6. Pestka S. The interferons: 50 years after their discovery, there is much more to learn. J. Biol. Chem. 2007; 282: 20047-20051.

7. Da Silva A.J., Brickelmaier M., Majeau G.R. Comparison of gene expression patterns induced by treatment of human umbilical vein endothelial cells with IFN-alpha 2b vs. IFN-beta 1a: understanding the function relationship between distinct type 1 interferons that act through a common receptor. Interferon Cytokine Res. 2002; 22: 173-188.

8. Щегловитова О.Н Склянкина Н.Н., Болдырева Н.В., Баба-янц А.А., Фролова И.С. Модуляция фенотипических проявле-

ний кулътивируемвши клетками эндотелия кровеносных сосудов человека в результате инфицирования вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1). Клеточн. технол. в биол. и медицине.

2013; 1: 34-41.

9. Щегловитова О.Н., Склянкина Н.Н., Болдырева Н.Н. Различия в функциональной активности культивируемых клеток эндотелия кровеносных сосудов человека, полученных от разных доноров. Цитология. 2011; 53: 341-346.

10. Jones S. Directing transition from innate to acquired immunity: defining a role for IL-6. J. Immunol. 2005; 175: 3463-3468.

11. Mukaida N. Interleukin-8: an expanding universe beyond neutrophil chemotaxis and activation. Int. J. Hemaol. 2000; 72: 391-398.

12. Opitz B., Eitel J., Meixenberger K., Suttorp N. Role of Tolllike receptors, NOD-like receptors and RIG-like receptors in endothelial cells and systemic infections. Thromb Haemost. 2009;

102: 1103-1109.

13. Gill N., Deacon PM., Lichty B., Mossman K.L., Ashkar A.A.

Induction of innate immunity against herpes simplex virus type 2 infection via local delivery of Tall-like receptor ligand correlates with beta interferon production. J. Virol. 2006; 80: 9943-9950.

14. Mossman K.L. Activation and inhibition of virus and interferons: the herpes virus story. Viral Immunol. 2002; 15: 3-15.

15. Scheglovitova O.N., Romanov Yu.A., Maksianina E.V. Kabaeva N.V Pronin A.G. Herpes simplex type I virus infection of cultured

human vascular endothelial cells: expression of cell adhesion 35 molecules and induction of interferon and cytokine production by blood mononuclear cells. Rus. J. Immunol. 2001; 6: 367-376.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Щегловитова Ольга Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией противовирусного иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-61-43, e-mail: scheglovitova@rambler.ru

Склянкина Надежда Николаевна, научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ

Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-55-62, e-mail: scheglovitova@rambler.ru

Болдырева Наталья Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-55-62, e-mail: scheglovitova@rambler.ru

Бабаянц Алла Артемовна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-63-68, e-mail: scheglovitova@rambler.ru

Фролова Ирина Сергеевна, старший научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ

Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-63-68, e-mail: scheglovitova@rambler.ru

Капкаева Марина Рафаиловна, младший научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ

Адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18, тел.: (499) 193-55-62, e-mail: scheglovitova@rambler.ru

#

#