СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРИМЕНИМОСТИ БЕЛКОВ ИЛИ БЕЛКОВЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ
METHODS FOR PREDICTION OF APPLICABILITY OF PROTEINS OR PROTEIN FRAGMENTS FOR IMMUNOTHERAPY

Настоящее изобретение относится к способам предварительной оценки пригодности пептидов или полипептидов, таких как Т-клеточные эпитопы, для иммунотерапии, например, для вакцинации. В частности, настоящее изобретение относится к способам прогнозирования того, являются ли пептиды или полипептиды, такие как ассоциированные с опухолью антигены или эпитопы, в частности, ассоциированные с опухолью неоантигены или неоэпитопы, иммуногенными и, в частности, применимыми для иммунотерапии, например, для вакцинации. Способы в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы, в частности, для обеспечения вакцин, которые являются специфическими по отношению к опухоли больного, и, таким образом, в контексте персонализированных противораковых вакцин.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Эволюция иммунной системы привела к появлению у позвоночных высокоэффективной структуры, основанной на двух типах защиты: врожденном и адаптивном иммунитете. В отличие от эволюционно древней врожденной иммунной системы, которая основывается на инвариантных рецепторах, распознающих общие молекулярные паттерны, связанные с патогенами, адаптивный иммунитет основан на высокоспецифических антигенных рецепторах на В-клетках (В-лимфоцитах) и Т-клетках (Т-лимфоцитах), а также на клональном отборе. В то время как В-клетки индуцируют гуморальные иммунные реакции путем секреции антител, Т-клетки опосредуют клеточные иммунные реакции, приводящие к разрушению распознаваемых клеток.
Т-клетки играют центральную роль в клеточном иммунитете у людей и животных. Распознавание и связывание конкретного антигена опосредуются Т-клеточными рецепторами, экспрессированными на поверхности Т-клеток. Т-клеточный рецептор (TCR) Т-клеток способен взаимодействовать с иммуногенными пептидами (эпитопами), связанными с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) и презентироваться на поверхности целевых клеток. Специфическое связывание TCR запускает каскад передачи сигнала внутри Т-клетки, что приводит к пролиферации и дифференцировке в зрелые эффекторные Т-клетки. Чтобы быть способными нацеливаться на широкое разнообразие антигенов, Т-клеточные рецепторы должны быть очень разнообразными.
in vitro
Антиген-специфическая иммунотерапия направлена на усиление или индуцирование специфических иммунных реакций у больных для контролирования инфекционных или злокачественных заболеваний. Идентификация увеличивающегося числа ассоциированных с патогеном и опухолью антигенов, привела к обширному набору подходящих целей для иммунотерапии. Клетки, презентирующие иммуногенные пептиды (эпитопы), полученные из этих антигенов, могут быть специфически нацелены с помощью стратегий либо активной, либо пассивной иммунизации. Активная иммунизация, как правило, индуцирует и наращивает антиген-специфические Т-клетки у больного, которые способны специфически распознавать и уничтожать больные клетки. Напротив, пассивная иммунизация заключается в адоптивном переносе Т-клеток, которые были размножены и необязательно генетически сконструированы  (адоптивная Т-клеточная терапия; ACT).
in vivo
in vitro
Противоопухолевые вакцины направлены на индуцирование эндогенных специфических по отношению к опухоли иммунных реакций за счет активной иммунизации. Для противоопухолевой вакцинации могут быть использованы различные форматы антигенов, в том числе цельные больные клетки, белки, пептиды или иммунизирующие векторы, такие как векторы РНК, ДНК или вирусные, которые могут быть применены, либо непосредственно , либо , путем примирования DC после переноса больному.
ex vivo
ex vivo
Иммунотерапия на основе ACT в широком смысле может быть определена как форма пассивной иммунизации предварительно сенсибилизированными Т-клетками, которые переносят в неиммунных реципиентов или в аутологичного хозяина после  размножения из предшественников с низкой частотой встречаемости до клинически значимых количеств клеток. Подход, преодолевающий ограничения ACT, заключается в адоптивном переносе аутологичных Т-клеток, перепрограммированных для экспрессии реакционно активного в отношении опухоли TCR определенной специфичности на протяжении кратковременного  культивирования, с последующей реинфузией больному.
Открытие многочисленных ассоциированных с патогеном и опухолью антигенов послужило основой для концепций антиген-специфической иммунотерапии. Ассоциированные с опухолью антигены (TAA) являются необычными белками, экспрессированными на опухолевых клетках, которые из-за генетической нестабильности не экспрессируются или ограниченно экспрессируются в нормальных клетках. Эти TAA могут обеспечивать специфическое распознавание злокачественных клеток иммунной системой.
Злокачественные опухоли могут возникать из-за накопления геномных мутаций и эпигенетических изменений, часть которых может играть причинную роль. Кроме ассоциированных с опухолью антигенов злокачественные опухоли человека несут в среднем 100-120 несинонимичных мутаций, многие из которых являются целями для вакцин. Более чем 95% мутаций в опухоли являются уникальными и специфическими для больного. Число изменяющих белки соматических мутаций, которые могут приводить к специфическим по отношению к опухоли Т-клеточным эпитопам, находится в диапазоне от 30 до 400.
Мутации считают идеальными мишенями для противораковой иммунотерапии. Как неоэпитопы со строгим отсутствием экспрессии в какой-либо здоровой ткани они, как предполагают, являются безопасными и могут обходить механизмы центральной толерантности. Некоторое время назад авторы настоящего изобретения предложили подход персонализированной иммунотерапии, нацеленный на спектр отдельных мутаций (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)).
Несмотря на растущее число привлекательных целевых структур для иммунотерапевтических подходов, определение подходящих эпитопов для иммунотерапии остается проблемой. Таким образом, существует потребность в модели для прогнозирования того, будет ли эпитоп, в частности, неоэпитоп, индуцировать эффективный иммунитет и, таким образом, будет ли полезен в иммунотерапии.
В настоящем документе авторы настоящего изобретения показывают, что иммуногенные антигены и эпитопы в высокой степени представлены в некоторых субклеточных компартментах.
Известно, что иммунный ответ против опухолевых антигенов, в частности, мутированных опухолевых антигенов, не осуществляется самими опухолевыми клетками, а скорее антиген-презентирующими клетками, в частности дендритными клетками, получающими опухолевый антиген, высвобождаемый из опухолевых клеток. Также известно, что для достижения эффективного иммунного ответа высвобожденный опухолевый антиген, который поглощается антиген-презентирующими клетками, должен быть процессирован и презентирован либо MHC класса II для индуцирования CD4 иммунной реакции (экзогенная презентация), либо MHC класса I для индуцирования CD8 иммунной реакции (кросс-презентация). Для последней иммунной реакции требуется наличие CD4 иммунной реакции против такого же или другого опухолевого антигена, доставленного в ту же антиген-презентирующую клетку (Bennett et al., J. Exp. Med. 186, 65-70 (1997)).
Без углубления в конкретную теорию предполагают, что клеточная локализация антигена в больных клетках, таких как опухолевые клетки, определяет, будет ли антиген поглощаться и презентироваться антиген-презентирующими клетками. Экзосомы, высвобождаемые из больных клеток, таких как опухолевые клетки, содержат mRNA, белки, а также комплексы MHC-пептид и, таким образом, могут передавать эти компоненты в антиген-презентирующие клетки. Экзосомы продуцируются с помощью инвагинации и, таким образом, содержат помимо молекул эндоцитарной мембраны основные компоненты цитозоля. Таким образом, предполагают, что компоненты цитозоля, такие как белки, приумножаются в экзосомах и могут быть перенесены в антиген-презентирующие клетки. Экзосомы также могут продуктивно переносить mRNA, которая может быть транслирована в клетках, поглощающих РНК. Таким образом, без углубления в конкретную теорию предполагают, что пептиды или полипептиды, которые включены в экзосомы, в частности, цитозольные пептиды, или белки, или пептиды, или полипептиды, кодирующая РНК которых включена в экзосомы в соответствии с настоящим изобретением, являются особенно применимыми для иммунотерапии, поскольку экзосомы поглощаются антиген-презентирующими клетками, а пептиды и белки (необязательно после трансляции кодирующей РНК) презентируются антиген-презентирующими клетками. Экзосомы, таким образом, являются переносчиками пептидов, белков или РНК в антиген-презентирующие клетки и защищают пептиды, белки или РНК от разложения протеазами и рибонуклеазами. В качестве альтернативы, возможно поглощение пептидов и белков антиген-презентирующими клетками в виде комплексов с другими молекулами, такими как антитела, посредством зависимого от рецепторов механизма.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу прогнозирования применимости белка или его фрагмента, экспрессированного больными клетками, для иммунотерапии, при этом способ предусматривает установление распределения или локализации белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка.
in vivo
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает установление того, являются ли белок, или кодирующая его нуклеиновая кислота, или фрагмент белка локализованными или представленными в цитозоле и/или в экзосомах .
Согласно одному варианту осуществления локализация или представленность белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в цитозоле и/или в экзосомах указывает на то, что белок или его фрагмент является применимым для иммунотерапии.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу прогнозирования применимости белка или его фрагмента, экспрессированного больными клетками, для иммунотерапии, при этом способ предусматривает установление того, кросс-презентируется ли белок или его фрагмент антиген-презентирующими клетками, предпочтительно специализированными антиген-презентирующими клетками.
Согласно одному варианту осуществления кросс-презентация белка или его фрагмента антиген-презентирующими клетками указывает на то, что белок или его фрагмент является применимым для иммунотерапии.
in vivo
Согласно одному варианту осуществления установление того, кросс-презентируется ли белок или его фрагмент антиген-презентирующими клетками, предусматривает установление того, являются ли белок, или кодирующая его нуклеиновая кислота, или фрагмент белка локализованными или представленными в цитозоле и/или в экзосомах .
Согласно одному варианту осуществления локализация или представленность белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в цитозоле и/или в экзосомах указывает на то, что белок или его фрагмент кросс-презентируется антиген-презентирующими клетками.
Согласно одному варианту осуществления установление того, кросс-презентируется ли белок или его фрагмент антиген-презентирующими клетками, предусматривает установление наличия иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент.
Согласно одному варианту осуществления наличие иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент указывает на то, что белок или его фрагмент кросс-презентируется антиген-презентирующими клетками.
Согласно одному варианту осуществления установление того, кросс-презентируется ли белок или его фрагмент антиген-презентирующими клетками, предусматривает установление того, связывается ли белок или его фрагмент с F-актином.
Согласно одному варианту осуществления связывание белка или его фрагмента с F-актином указывает на то, что белок или его фрагмент кросс-презентируется антиген-презентирующими клетками.
Согласно одному варианту осуществления установление того, кросс-презентируется ли белок или его фрагмент антиген-презентирующими клетками, предусматривает установление того, связывается ли белок или его фрагмент с РНК.
Согласно одному варианту осуществления связывание белка или его фрагмента с РНК указывает на то, что белок или его фрагмент кросс-презентируется антиген-презентирующими клетками.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения белковый фрагмент присутствует в экзосомах в виде комплекса MHC-пептид, предпочтительно на поверхности экзосом.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения локализация или представленность белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в цитозоле указывает на процессирование и презентацию белка по пути MHC I, предпочтительно больных клеток. Согласно одному варианту осуществления процессирование и презентация белка по пути MHC I приводит к распознаванию комплексов, образованных MHC I и фрагментами белка, CD8+ Т-клетками.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения локализация или представленность белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в экзосомах указывает на накопление белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в антиген-презентирующих клетках, предпочтительно специализированных антиген-презентирующих клетках. Согласно одному варианту осуществления накопление белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в антиген-презентирующих клетках указывает на процессирование и презентацию белка по пути MHC I и/или MHC II, предпочтительно антиген-презентирующих клеток. Согласно одному варианту осуществления процессирование и презентация белка по пути MHC I приводит к распознаванию комплексов, образованных MHC I и фрагментами белка, CD8+ Т-клетками.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу прогнозирования применимости белка или его фрагмента, экспрессированного больными клетками, для иммунотерапии, при этом способ предусматривает установление одного или нескольких из следующего:
(a) установление наличия иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент,
(b) установление того, связывается ли белок или его фрагмент с F-актином, и/или
(c) установление того, связывается ли белок или его фрагмент с РНК.
Согласно одному варианту осуществления наличие иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент указывает на то, что белок или его фрагмент является применимым для иммунотерапии.
Согласно одному варианту осуществления связывание белка или его фрагмента с F-актином указывает на то, что белок или его фрагмент является применимым для иммунотерапии.
Согласно одному варианту осуществления связывание белка или его фрагмента с РНК указывает на то, что белок или его фрагмент является применимым для иммунотерапии.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения белок или его фрагмент содержит специфическую по отношению к заболеванию аминокислотную модификацию. Согласно одному варианту осуществления аминокислотная модификация обусловлена специфической по отношению к заболеванию соматической мутацией.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения заболеванием является злокачественная опухоль, а иммунотерапией является противораковая иммунотерапия.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения белковым фрагментом является связывающийся с MHC пептид или потенциальный связывающийся с MHC пептид.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу отбора и/или ранжирования специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций по их применимости для иммунотерапии, при этом способ предусматривает стадии:
(i) идентификации белков, экспрессированных больными клетками, при этом каждый белок содержит по меньшей мере одну специфическую по отношению к заболеванию аминокислотную модификацию, и
(ii) установления распределения или локализации белка, идентифицированного на стадии (i), или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка, и
(iii) повторения стадии (ii) по меньшей мере для одного дополнительного белка, идентифицированного на стадии (i).
in vivo
Согласно одному варианту осуществления стадия (ii) предусматривает установление того, являются ли белок, или кодирующая его нуклеиновая кислота, или фрагмент белка локализованными или представленными в цитозоле и/или в экзосомах .
Согласно одному варианту осуществления локализация или представленность белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка в цитозоле и/или в экзосомах указывает на то, что специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация является применимой для иммунотерапии.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу отбора и/или ранжирования специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций по их применимости для иммунотерапии, при этом способ предусматривает стадии:
(i) идентификации белков, экспрессированных больными клетками, при этом каждый белок содержит по меньшей мере одну специфическую по отношению к заболеванию аминокислотную модификацию, и
(ii) установление того, кросс-презентируется ли белок, идентифицированный на стадии (i), или фрагмент белка антиген-презентирующими клетками, предпочтительно специализированными антиген-презентирующими клетками, и
(iii) повторения стадии (ii) по меньшей мере для одного дополнительного белка, идентифицированного на стадии (i).
Согласно одному варианту осуществления кросс-презентация белка или его фрагмента антиген-презентирующими клетками указывает на то, что специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация является применимой для иммунотерапии.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу отбора и/или ранжирования специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций по их применимости для иммунотерапии, при этом способ предусматривает стадии:
(i) идентификации белков, экспрессированных больными клетками, при этом каждый белок содержит по меньшей мере одну специфическую по отношению к заболеванию аминокислотную модификацию, и
(ii) установления для белка, идентифицированного на стадии (i), или фрагмента белка одного или нескольких из следующего:
(a) установление наличия иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент,
(b) установление того, связывается ли белок или его фрагмент с F-актином, и/или
(c) установление того, связывается ли белок или его фрагмент с РНК, и
(iii) повторения стадии (ii) по меньшей мере для одного дополнительного белка, идентифицированного на стадии (i).
Согласно одному варианту осуществления наличие иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент указывает на то, что специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация является применимой для иммунотерапии.
Согласно одному варианту осуществления связывание белка или его фрагмента с F-актином указывает на то, что специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация является применимой для иммунотерапии.
Согласно одному варианту осуществления связывание белка или его фрагмента с РНК указывает на то, что специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация является применимой для иммунотерапии.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация состоит из белкового фрагмента, который представляет собой связывающийся с MHC пептид или потенциальный связывающийся с MHC пептид.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения способ используют в изготовлении вакцины. Согласно одному варианту осуществления вакцину получают из одного или нескольких белков, или их фрагментов, или одной или нескольких специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, которые, как прогнозируют, применимы для иммунотерапии.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу обеспечения вакцины, предусматривающему стадию идентификации одного или нескольких белков или их фрагментов или одной или нескольких специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, которые, как прогнозируют, применимы для иммунотерапии, с помощью способа в соответствии с любым из аспектов, описанных в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает стадию обеспечения вакцины, содержащей пептид или полипептид, содержащий один или несколько белков, или их фрагментов, или одну или нескольких специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, которые, как прогнозируют, применимы для иммунотерапии, или нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид или полипептид.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к вакцине, полученной по способу в соответствии с любым из аспектов, описанных в настоящем документе.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения признак применимости белка или его фрагмента, экспрессированного больными клетками для иммунотерапии, указывает на то, что белок или его фрагмент при введении (необязательно в формате кодирующей нуклеиновой кислоты) будет иммуногенным.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения белковым фрагментом, описанным в настоящем документе, является связывающийся с MHC пептид или потенциальный связывающийся с MHC пептид (например, прогноз связывания с MHC указывает на то, что белковый фрагмент будет связываться с MHC). Согласно одному варианту осуществления связывающимся с MHC пептидом является модифицированный пептид, который является фрагментом модифицированного белка.
Согласно одному варианту осуществления аминокислотные модификации в белках или пептидах идентифицируют путем идентификации несинонимичных мутаций в одной или нескольких кодирующих белок областях.
Согласно одному варианту осуществления аминокислотные модификации идентифицируют путем частичного или полного секвенирования генома или транскриптома одной или нескольких клеток, например, одной или нескольких раковых клеток и необязательно одной или нескольких нераковых клеток, и идентификации мутаций в одной или нескольких кодирующих белок областях. Согласно одному варианту осуществления указанные мутации являются соматическими мутациями. Согласно одному варианту осуществления указанные мутации являются канцерогенными мутациями.
Согласно одному варианту осуществления, в частности, для обеспечения персонализированной вакцины для больного, такого как раковый больной, модификация(ии) присутствует у указанного больного, и способы в соответствии с настоящим изобретением выполняют для указанного больного. Согласно другому аспекту настоящее изобретение представлена вакцина, которую получают с использованием способов в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительные варианты осуществления таких вакцин описаны в настоящем документе.
Вакцина, обеспеченная в соответствии с настоящим изобретением, может содержать фармацевтически приемлемый носитель и необязательно может содержать один или несколько адъювантов, стабилизаторов и т.д. Вакцина может иметь форму терапевтической или профилактической вакцины.
Другой аспект относится к способу индуцирования иммунной реакции у больного, предусматривающему введение больному вакцины, обеспеченной в соответствии с настоящим изобретением.
Другой аспект относится к способу лечения больного, предусматривающему стадии:
(a) обеспечения иммунотерапевтического средства, описанного в настоящем документе, такого как вакцина, с использованием способов в соответствии с настоящим изобретением; и
(b) введения указанного иммунотерапевтического средства больному.
Другой аспект относится к способу лечения больного, предусматривающему введение иммунотерапевтического средства, описанного в настоящем документе, такого как вакцина, больному.
Согласно одному варианту осуществления больным является раковый больной, а вакциной является противораковая вакцина, такая как вакцина, введение которой обеспечивает раковые специфические неоэпитопы.
Согласно следующим аспектам настоящее изобретение обеспечивает вакцины, описанные в настоящем документе, для применения в способах лечения, описанных в настоящем документе, в частности, для применения при лечении или предупреждении злокачественной опухоли.
Методы лечения злокачественной опухоли, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с хирургической резекцией и/или облучением, и/или традиционной химиотерапией.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания и формулы изобретения.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Хотя настоящее изобретение ниже описывается подробно, следует учитывать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными методами, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что терминология используется в настоящем документе исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена ограничивать объем настоящего изобретения, который ограничивается исключительно прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, что обычно известны рядовому специалисту в данной области.
Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы приводятся с конкретными вариантами осуществления, однако следует понимать, что они могут быть объединены любым способом и в любом количестве с созданием дополнительных вариантов осуществления. Различным образом описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны толковаться как ограничивающие настоящее изобретение только конкретно описанными вариантами осуществления. Настоящее описание следует понимать как поддерживающее и охватывающее варианты осуществления, которые объединяют конкретно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые пермутации и комбинации всех описанных элементов в настоящей заявке следует рассматривать как раскрытые описанием настоящей заявки, если в контексте не указано иное.
H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland
Предпочтительно термины, используемые в настоящем документе, определяют как описанные в «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», .
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
nd
.
При осуществлении настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, традиционные способы биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методик рекомбинантной ДНК, которые определяются в литературе данной области (см., например, , 2 Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)
По всему настоящему описанию и следующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и вариации, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумевать включение указанных представителя, целого числа или стадии, или группы представителей, целых чисел или стадий, но не исключение любых других представителя, целого числа или стадии, или группы представителей, целых чисел или стадий, хотя согласно некоторым вариантам осуществления такие другие представитель, целое число или стадия, или группа представителей, целых чисел или стадий могут быть исключены, т.e. объект изобретения заключается во включении указанных представителя, целого числа или стадии, или группы представителей, целых чисел или стадий. Термины в единственном числе, используемые в контексте описываемого настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), следует понимать как охватывающие и единственное, и множественное число, если в настоящем документе не указано иное или явно не противоречит контексту. Упоминание в настоящем документе диапазонов значений предназначено исключительно для использования в качестве сокращенного метода индивидуального упоминания каждого отдельного значения, попадающего в данный диапазон. Если в настоящем документе не указано иное, каждое отдельное значение включено в настоящее описание так, как если бы оно было индивидуально упомянуто в настоящем документе.
Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное, или иное явно не противоречит контексту. Применение любого и всех примеров или типичной формулировки (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено исключительно для более понятной иллюстрации настоящего изобретения, а не с целью ограничения объема настоящего изобретения, заявленного иным образом. Никакая формулировка в настоящем описании не должна истолковываться как указание какого-либо незаявленного элемента, необходимого для осуществления настоящего изобретения.
supra
infra
Некоторые документы цитируются по всему тексту настоящего описания. Каждый из таких документов, цитируемых в настоящем документе (в том числе все патенты, заявки на выдачу патентов, научные публикации, технические условия изготовителя, инструкции и т.д.) либо , либо , тем самым включены посредством ссылки во всей полноте. Никакая часть настоящего документа не должна быть истолкована как признание того, что настоящее изобретение не может быть датировано ранее такого раскрытия в силу предшествующего изобретения.
Настоящее изобретение относится к иммунотерапии заболеваний, в частности, злокачественных заболеваний, путем использования белка или белкового фрагмента, присутствующего в больных клетках в качестве метки, и нацеливания на больные клетки. В частности, на больные клетки может быть нацелен фрагмент белка, присутствующий на поверхности больных клеток в контексте MHC. Иммунотерапия в соответствии с настоящим изобретением подлежит осуществлению посредством активных и/или пассивных иммунотерапевтических подходов.
В частности, настоящее изобретение относится к определению белков или их фрагментов, подходящих для иммунотерапии. После идентификации подходящего белка этот белок или его фрагмент (необязательно как часть более крупного полипептида), или нуклеиновая кислота, кодирующая белок или фрагмент (необязательно как часть более крупного полипептида), могут быть использованы в качестве вакцины для усиления или индуцирования иммунной реакции против белка или его фрагмента, в частности, путем индуцирования и/или активизации соответствующих эффекторных клеток, таких как Т-клетки, которые распознают белок или его фрагмент (в частности, при представлении в контексте MHC) через соответствующий рецептор (такой как Т-клеточный рецептор или искусственный Т-клеточный рецептор). В качестве альтернативы или дополнения, можно вводить эффекторные клетки, такие как Т-клетки, которые распознают белок или его фрагмент (в частности, при представлении в контексте MHC) через соответствующий рецептор (такой как Т-клеточный рецептор или искусственный Т-клеточный рецептор). Без углубления в конкретную теорию предполагают, что белок или его фрагмент, который прогнозирован как применимый для иммунотерапии в соответствии с настоящим изобретением, имеет высокую степень вероятности быть поглощенным антиген-презентирующими клетками и быть презентированным антиген-презентирующими клетками, в частности, путем кросс-презентации, что таким образом в конечном итоге ведет к эффективной иммунной реакции против больных клеток, экспрессирующих белок или его фрагмент.
Белки, определяемые в соответствии с настоящим изобретением как применимые или подходящие для иммунотерапии, также в настоящем документе называют «антигенами». Фрагменты белков, определяемые в соответствии с настоящим изобретением как применимые или подходящие для иммунотерапии, также в настоящем документе называют «эпитопами».
Иммунотерапевтические подходы в соответствии с настоящим изобретением предусматривают иммунизацию i) белком или пептидом (нативным или модифицированным), ii) нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или пептид, iii) рекомбинантными клетками, кодирующими белок или пептид, iv) рекомбинантными вирусами, кодирующими белок или пептид, и v) антиген-презентирующими клетками, в которые ввели белок или пептид (нативный или модифицированный) или которые трансфицировали нуклеиновыми кислотами, кодирующими белок или пептид.
Иммунотерапевтические подходы в соответствии с настоящим изобретением также предусматривают перенос vi) Т-клеточных рецепторов, которые распознают белок или пептид, и vii) эффекторных клеток (таких как Т-клетки), кодирующих рецепторы, которые распознают белок или пептид, в частности, при представлении в контексте MHC.
Предпочтительные белки и фрагменты в соответствии с настоящим изобретением экспрессируются специфическим по отношению к заболеванию образом, например, они представляют собой ассоциированные с заболеванием антигены или эпитопы (например, наличие белка или клеток, экспрессирующих белок, является характеристикой заболевания) и/или содержат одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, например, они представляют собой ассоциированные с заболеванием неоантигены или неоэпитопы. Предпочтительно, специфическая по отношению к заболеванию аминокислотная модификация является результатом одной или нескольких специфических по отношению к заболеванию соматических мутаций. Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления специфической по отношению к заболеванию аминокислотной модификацией является специфическая по отношению к злокачественной опухоли аминокислотная модификация, а специфической по отношению к заболеванию соматической мутацией является специфическая по отношению к злокачественной опухоли соматическая мутация. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением вакцина предпочтительно отличается специфическими по отношению к заболеванию аминокислотными модификациями/специфическими по отношению к заболеванию соматическими мутациями больного и предпочтительно при введении обеспечивает один или несколько основанных на мутации неоэпитопов. Таким образом, вакцина может содержать пептид или полипептид, содержащий один или несколько основанных на мутации неоэпитопов, или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный пептид или полипептид. Согласно одному варианту осуществления специфические по отношению к заболеванию аминокислотные модификации идентифицируют путем идентификации специфических по отношению к заболеванию соматических мутаций, например, с помощью секвенирования геномной ДНК и/или РНК больной ткани или одной или нескольких больных клеток.
В соответствии с настоящим изобретением стадия идентификации специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций и/или идентификации специфических по отношению к заболеванию соматических мутаций может быть выполнена до или после способов в соответствии с настоящим изобретением прогнозирования применимости белка или его фрагмента, экспрессированного больными клетками, в иммунотерапии. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения специфические по отношению к заболеванию аминокислотные модификации и/или специфические по отношению к заболеванию соматические мутации сначала определяют в образце больного, и а затем прогнозируют применимость белка, содержащего одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, или его фрагмента, содержащего одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, для иммунотерапии согласно способам в соответствии с настоящим изобретением. После идентификации специфические по отношению к заболеванию аминокислотные модификации (соответственно, белки, содержащие одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, или их фрагменты, содержащие одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций) также могут быть отобраны и/или ранжированы по их применимости для иммунотерапии согласно способам в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «экзосомы» относится к полученным из клеток везикулам, которые присутствуют в биологических жидкостях, в том числе в крови, моче, и культуральной среде клеточных культур. Экзосомы либо высвобождаются из клетки при слиянии мультивезикулярных телец с плазматической мембраной, либо они высвобождаются непосредственно из плазматической мембраны. Экзосомы содержат различные молекулярные составляющие, происходящие из этой клетки, в том числе белки и РНК. Хотя композиция экзосомальных белков варьирует в клетке и ткани, из которых они происходят, большинство экзосом содержат эволюционно консервативный общий набор белковых молекул. Экзосомы могут переносить молекулы из одной клетки в другую за счет миграции мембранной везикулы, тем самым влияя на иммунную систему, такую как дендритные клетки и B-клетки, и могут играть функциональную роль в опосредовании адаптивных иммунных реакций на патогены и опухоли.
Используемый в настоящем документе термин «цитозоль» относится к части цитоплазмы в несвязанных с мембраной субструктурах клетки.
В соответствии с настоящим изобретением термин «пептид» относится к веществам, содержащим две или больше, предпочтительно 3 или больше, предпочтительно 4 или больше, предпочтительно 6 или больше, предпочтительно 8 или больше, предпочтительно 10 или больше, предпочтительно 13 или больше, предпочтительно 16 или больше, предпочтительно 21 или больше и предпочтительно до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности, 100, аминокислот, ковалентно соединенных пептидными связями. Термин «полипептид» или «белок» относится к крупным пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но, как правило, термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются в настоящем документе взаимозаменяемо.
В соответствии с настоящим изобретением термин «модификация» по отношению к пептидам, полипептидам или белкам относится к изменению последовательности в пептиде, полипептиде или белке по сравнению с исходной последовательностью, такой как последовательность пептида, полипептида или белка дикого типа. Термин включает в себя варианты аминокислотной вставки, варианты аминокислотного добавления, варианты аминокислотной делеции и варианты аминокислотной замены, предпочтительно варианты аминокислотной замены. Все такие изменения последовательности в соответствии с настоящим изобретением потенциально могут создавать новые эпитопы.
Варианты аминокислотной вставки предусматривают вставки одной, или двух, или больше аминокислот в конкретную аминокислотную последовательность.
Варианты аминокислотного добавления аминокислоты предусматривают амино- и/или карбокси-концевые слияния одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5, или больше аминокислот.
Варианты аминокислотной делеции характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности, например, удалением 1, 2, 3, 4 или 5, или больше аминокислот.
Варианты аминокислотной замены характеризуются тем, что по меньшей мере один остаток в последовательности удаляется, а на его место вставляется другой остаток.
В соответствии с настоящим изобретением модификация или модифицированный пептид могут быть получены из белка, содержащего модификацию.
Термин «полученный» в соответствии с настоящим изобретением означает, что конкретное соединение, в частности, конкретная пептидная последовательность, присутствует в объекте, из которого его получают. В случае аминокислотных последовательностей, особенно конкретных участков последовательностей, «полученный», в частности, означает, что соответствующую аминокислотную последовательность получают из аминокислотной последовательности, в которой она присутствует.
В соответствии с настоящим изобретением белки, описанные в настоящем документе, предпочтительно содержат одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций. Согласно одному варианту осуществления такие одна или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций располагаются в эпитопах или потенциальных эпитопах белка. Таким образом, предпочтительными белками, описанными в настоящем документе, являются неоантигены, предпочтительно содержащие один или несколько неоэпитопов. Подобным образом, предпочтительным белковым фрагментом, описанным в настоящем документе, является фрагмент белка, содержащего одну или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций, при этом предпочтительно одна или несколько специфических по отношению к заболеванию аминокислотных модификаций располагаются во фрагменте белка. Таким образом, предпочтительным белковым фрагментом, описанным в настоящем документе, является неоэпитоп.
В соответствии с настоящим изобретением термин «неоантиген» относится к пептиду или белку, включающему в себя одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с исходным пептидом или белком. Например, неоантигеном может быть ассоциированный с опухолью неоантиген, при этом термин «ассоциированный с опухолью неоантиген» включает в себя пептид или белок, включающие в себя аминокислотные модификации в связи со специфическими по отношению к опухоли мутациями.
В соответствии с настоящим изобретением термин «специфическая по отношению к заболеванию мутация» относится к соматической мутации, которая присутствует в нуклеиновой кислоте больной клетки, но отсутствует в нуклеиновой кислоте соответствующей нормальной, т.e. здоровой, клетки.
В соответствии с настоящим изобретением, термин «специфическая по отношению к опухоли мутация» или «специфическая по отношению к злокачественной опухоли мутация» относится к соматической мутации, которая присутствует в нуклеиновой кислоте опухоли или в раковой клетке, но отсутствует в нуклеиновой кислоте соответствующей нормальной, т.e. неопухолевой или нераковой, клетки. Термины «специфическая по отношению к опухоли мутация» и «опухолевая мутация», а также термины «специфическая по отношению к злокачественной опухоли мутация» и «канцерогенная мутация» используют в настоящем документе взаимозаменяемо.
Термин «иммунная реакция» относится к реакции иммунной системы, например, на иммуногенные организмы, такие как бактерии или вирусы, клетки или вещества. Термин «иммунная реакция» включает в себя врожденную иммунную реакцию и адаптивную иммунную реакцию. Предпочтительно, иммунная реакция относится к активации иммунных клеток, индуцированию биосинтеза цитокинов и/или продуцирования антител.
Предпочтительным является то, что иммунная реакция, индуцированная композициями, описанными в настоящем документе, предусматривает стадии активации антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки и/или макрофаги, презентации антигена или его фрагмента указанными антиген-презентирующими клетками и активации цитотоксических Т-клеток за счет такой презентации.
Термин «индуцирование иммунной реакции» может означать, что иммунная реакция отсутствовала до индуцирования, но также он может означать, что наблюдался некоторый уровень иммунной реакции до индуцирования, а после индуцирования указанная иммунная реакция усиливается. Таким образом, термин «индуцирование иммунной реакции» также включает в себя «усиление иммунной реакции». Предпочтительно, после индуцирования иммунной реакции у субъекта, указанный субъект является защищенным от развития заболевания, такого как злокачественное заболевание, или состояние заболевания облегчается индуцированием иммунной реакции. Например, иммунная реакция против экспрессированного опухолью антигена может быть индуцирована у больного, имеющего злокачественное заболевание, или у субъекта с риском развития злокачественного заболевания. Индуцирование иммунной реакции в этом случае может означать, что состояние заболевания субъекта облегчается, что у субъекта не развиваются метастазы, или что у субъекта с риском развития злокачественного заболевания не развивается злокачественное заболевание.
+
+
Термины «клеточная иммунная реакция» и «клеточная реакция» или подобные термины относятся к иммунной реакции, направленной на клетки, характеризующиеся презентацией антигена с MHC I класса или II класса, в том числе Т-клетки или T-лимфоциты, которые действуют либо как «хелперы», либо как «киллеры». Хелперные Т-клетки (также называемые CD4 Т-клетками) играют основную роль путем регуляции иммунной реакции, а клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-клетками, цитолитическими Т-клетками, CD8 Т-клетками или CTL) убивают больные клетки, такие как раковые клетки, предотвращая продуцирование большего количества больных клеток. Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к стимуляции реакции CTL против заболевания в отношении больных клеток, экспрессирующих один или несколько ассоциированных с заболеванием антигенов и предпочтительно презентирующих такие ассоциированные с заболеванием антигены с MHC I класса, в частности, противоопухолевой реакции CTL против опухолевых клеток, экспрессирующих один или несколько экспрессированных опухолью антигенов и предпочтительно презентирующих такие экспрессируемые опухолью антигены с MHC I класса.
В соответствии с настоящим изобретением термин «антиген» или «иммуноген» охватывает любое вещество, предпочтительно пептид или белок, которое является целью иммунной реакции и/или которое будет вызывать иммунную реакцию. В частности, термин «антиген» относится к любому веществу, которое специфически реагирует с антителами или T-лимфоцитами (T-клетками). В соответствии с настоящим изобретением термин «антиген» включает в себя любую молекулу, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, такой как Т-клеточный эпитоп. Предпочтительно, антиген в контексте настоящего изобретения представляет собой молекулу, которая, необязательно после процессирования, индуцирует иммунную реакцию, которая предпочтительно является специфической по отношению к антигену или клеткам, экспрессирующим антиген. В соответствии с настоящим изобретением может быть использован любой подходящий антиген, который является кандидатом для иммунной реакции, при этом иммунной реакцией предпочтительно является клеточная иммунная реакция. В контексте вариантов осуществления настоящего изобретения антиген предпочтительно презентируется клеткой, предпочтительно антиген-презентирующей клеткой, в контексте молекул MHC, что приводит к иммунной реакции против антигена. Антиген предпочтительно представляет собой продукт, который соответствует встречающемуся в природе антигену или получен из такового. Такие встречающиеся в природе антигены могут включать в себя аллергены, вирусы, бактерии, грибки, паразиты, другие инфекционные средства и патогены или могут быть получены из таковых, или антигеном также может быть опухолевый антиген. В соответствии с настоящим изобретением антиген может соответствовать встречающемуся в природе продукту, например, вирусному белку или его части. Согласно предпочтительным вариантам осуществления антигеном является поверхностный полипептид, т.e. полипептид, представленный в природе на поверхности клетки, патогена, бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли. Антиген может вызывать иммунную реакцию против клетки, патогена, бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли.
Термин «ассоциированный с заболеванием антиген» используют в его широком смысле по отношению к любому антигену, ассоциированному с заболеванием. Ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой молекулу, содержащую эпитопы, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина с получением клеточной антиген-специфической иммунной реакции и/или гуморальной иммунной реакции с образованием антител против заболевания. Ассоциированный с заболеванием антиген, поэтому, может быть использован для терапевтических целей. Ассоциированные с заболеванием антигены предпочтительно являются ассоциированными с инфекцией, вызываемой микробами, как правило, микробными антигенами, или ассоциированными со злокачественной опухолью, как правило, опухолевыми.
Термин «патоген» относится к патогенному биологическому материалу, способному вызывать заболевание в организме, предпочтительно, организме позвоночных. Патогены включают в себя микроорганизмы, такие как бактерии, одноклеточные эукариотические организмы (Protozoa), грибки, а также вирусы.
Термины «эпитоп», «антигенный пептид», «антигенный эпитоп», «иммуногенный пептид» и «связывающийся с MHC пептид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антигенной детерминанте в молекуле, такой как антиген, т.e. к части или фрагменту иммунологически активного соединения, которое распознается иммунной системой, например, которое распознается Т-клеткой, в частности, при представлении в контексте молекул MHC. Эпитоп белка предпочтительно содержит непрерывную или прерывистую часть указанного белка и составляет в длину предпочтительно от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот, например, эпитоп может составлять в длину предпочтительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот. В соответствии с настоящим изобретением эпитоп может связываться с молекулами MHC, такими как молекулы MHC на поверхности клетки, и, таким образом, может представлять собой «связывающийся с MHC пептид» или «антигенный пептид».
Термин «главный комплекс гистосовместимости» и сокращение «MHC» включают в себя молекулы MHC I класса и MHC II класса и относятся к комплексу генов, которые присутствуют у всех позвоночных. Белки или молекулы MHC важны для передачи сигнала между лимфоцитами и антиген-презентирующими клетками или больными клетками в иммунных реакциях, при этом белки или молекулы MHC связывают пептиды и презентируют их для распознавания Т-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые с MHC, экспрессируются на поверхности клеток и демонстрируют как собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и чужеродные антигены (например, фрагменты инвазивных микроорганизмов) Т-клетке. Такие предпочтительные иммуногенные части связываются с молекулой MHC I класса или MHC II класса. Как используется в настоящем документе, указывается, что иммуногенная часть «связывается с» молекулой MHC I класса или MHC II класса, если такое связывание выявляется с использованием любого анализа, известного в уровне техники. Термин «связывающийся с MHC пептид» относится к пептиду, который связывается с молекулой MHC I класса и/или MHC II класса. В случае комплексов MHC I класса/пептид связывающиеся пептиды, как правило, составляют в длину 8-10 аминокислот, хотя могут быть эффективными и более длинные или более короткие пептиды. В случае комплексов MHC II класса/пептид связывающиеся пептиды, как правило, составляют в длину 10-25 аминокислот и, в частности, 13-18 аминокислот, тогда как могут быть эффективными и более длинные, и более короткие пептиды. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения молекула MHC представляет собой молекулу HLA.
Если пептид является частью более крупного соединения, содержащего дополнительные последовательности, например, последовательности или полипептида вакцины, и подлежит представлению после процессирования, в частности, после расщепления, то пептид, полученный с помощью процессирования, имеет длину, которая подходит для связывания с молекулой MHC, в частности, с молекулой MHC I класса, и предпочтительно составляет в длину 7-30 аминокислот, например, 7-20 аминокислот в длину, более предпочтительно 7-12 аминокислот в длину, более предпочтительно 8-11 аминокислот в длину, в частности, 9 или 10 аминокислот в длину. Предпочтительно, последовательность пептида, подлежащую представлению после процессирования, получают из аминокислотной последовательности антигена или полипептида, используемого для вакцинации, т.e. его последовательность в значительной степени соответствует и, предпочтительно, полностью идентична фрагменту антигена или полипептида.
Таким образом, связывающийся с MHC пептид согласно одному варианту осуществления содержит последовательность, которая в значительной степени соответствует и, предпочтительно, полностью идентична фрагменту антигена.
Используемый в настоящем документе термин «неоэпитоп» относится к эпитопу, который не присутствует в эталоне, таком как нормальная здоровая (например, нераковая) или зародышевая клетка, но обнаруживается в больных клетках (например, раковых клетках). В частности, подразумеваются ситуации, при которых в нормальной здоровой или зародышевой клетке обнаруживается соответствующий эпитоп, однако из-за одной или нескольких мутаций в больной клетке последовательность эпитопа изменяется так, что приводит к неоэпитопу.
Используемый в настоящем документе термин «Т-клеточный эпитоп» относится к пептиду, который связывается с молекулой MHC в конфигурации, распознаваемой Т-клеточным рецептором. Как правило, Т-клеточные эпитопы представлены на поверхности антиген-презентирующей клетки.
Т-клеточный эпитоп в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно относится к части или фрагменту антигена, которые способны стимулировать иммунную реакцию, предпочтительно, клеточную реакцию против антигена или клеток, характеризующихся экспрессией антигена и, предпочтительно, презентацией антигена, такого как больные клетки, в частности, раковые клетки. Предпочтительно, Т-клеточный эпитоп способен стимулировать клеточную реакцию против клетки, характеризующейся презентацией антигена с MHC I класса, и, предпочтительно, способен стимулировать антиген-отвечающий цитотоксический T-лимфоцит (CTL).
Согласно одному варианту осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит эпитоп, подходящий для вакцинации целевого организма. Специалисту в данной области будет известен один из принципов иммунологии и вакцинации на основании того факта, что иммунопротективная реакция на заболевание вырабатывается путем иммунизации организма вакциной, которая является иммунологически значимой по отношению к заболеванию, подлежащему лечение. В соответствии с настоящим изобретением антиген выбирают из группы, содержащей собственный антиген и чужеродный антиген. Чужеродный антиген, предпочтительно, представляет собой бактериальный антиген, вирусный антиген, грибковый антиген, аллерген или паразитарный антиген. Предпочтительным является то, что антиген содержит эпитоп, который способен вызывать иммунную реакцию в целевом организме. Например, эпитоп может вызывать иммунную реакцию против бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли.
Согласно некоторым вариантам осуществления чужеродным антигеном является бактериальный антиген. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген вызывает иммунную реакцию против бактерии, которая инфицирует животных, в том числе птиц, рыб и млекопитающих, в том числе домашних животных. Предпочтительно, бактерией, против которой возникает иммунная реакция, является патогенная бактерия.
Согласно некоторым вариантам осуществления чужеродным антигеном является вирусный антиген. Вирусным антигеном может быть, например, пептид из белка вирусной поверхности, например, капсидный полипептид или полипептид шиповидных отростков. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген вызывает иммунную реакцию против вируса, который инфицирует животных, в том числе птиц, рыб и млекопитающих, в том числе домашних животных. Предпочтительно, вирусом, против которого возникает иммунная реакция, является патогенный вирус.
Согласно некоторым вариантам осуществления чужеродным антигеном является полипептид или белок из грибка. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген вызывает иммунную реакцию против грибка, который инфицирует животных, в том числе птиц, рыб и млекопитающих, в том числе домашних животных. Предпочтительно, грибком, против которого возникает иммунная реакция, является патогенный грибок.
Согласно некоторым вариантам осуществления чужеродный антиген представляет собой полипептид или белок от одноклеточного эукариотического паразита. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген вызывает иммунную реакцию против одноклеточного эукариотического паразита, предпочтительно, патогенного одноклеточного эукариотического паразита. Патогенные одноклеточные эукариотические паразиты могут быть, например, из рода Plasmodium, например, P. falciparum, P. vivax, P. malariae или P. ovale, из рода Leishmania или из рода Trypanosoma, например, T. cruzi или T. brucei.
Согласно некоторым вариантам осуществления чужеродный антиген представляет собой аллергенный полипептид или аллергенный белок. Аллергенный белок или аллергенный полипептид подходят для противоаллергенной иммунотерапии, также называемой гипосенсибилизацией.
Согласно некоторым вариантам осуществления антигеном является собственный антиген, в частности, опухолевый антиген. Опухолевые антигены и их определение известны специалисту.
В контексте настоящего изобретения термин «опухолевый антиген» или «ассоциированный с опухолью антиген» относится к белкам, которые при нормальных условиях специфически экспрессируются в ограниченном числе тканей и/или органов, или на определенных стадиях развития, например, опухолевый антиген может быть при нормальных условиях специфически экспрессирован в ткани желудка, предпочтительно, в слизистой оболочке желудка, в репродуктивных органах, например, в яичках, в трофобластической ткани, например, в плаценте, или в клетках зародышевой линии, и экспрессируются или аберрантно экспрессируются в одной или нескольких тканях или раковых тканях. В данном контексте «ограниченное число», предпочтительно, означает не более чем 3, более предпочтительно не более чем 2. Опухолевые антигены в контексте настоящего изобретения включают в себя, например, дифференцировочные антигены, предпочтительно, специфические по отношению к типу клеток дифференцировочные антигены, т.e. белки, которые при нормальных условиях специфически экспрессируются в определенном типе клеток на определенной стадии дифференцировки, раково-тестикулярные антигены, т.e. белки которые при нормальных условиях специфически экспрессируются в яичке и иногда в плаценте, а также специфические по отношению к зародышевой линии антигены. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген предпочтительно ассоциируется с клеточной поверхностью раковой клетки и предпочтительно не экспрессируется или исключительно редко экспрессируется в нормальных тканях. Предпочтительно, опухолевый антиген или аберрантная экспрессия опухолевого антигена идентифицируют раковые клетки. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген, который экспрессируется раковой клеткой у субъекта, например, больного, страдающего злокачественным заболеванием, предпочтительно представляет собой собственный белок указанного субъекта. Согласно предпочтительным вариантам осуществления опухолевый антиген в контексте настоящего изобретения экспрессируется при нормальных условиях специфически в ткани или органе, которые не являются главными, т.е. в тканях или органах, поражение которых иммунной система не приводит к смерти субъекта, или в органах или структурах организма, которые недоступны или исключительно сложно доступны иммунной системе. Предпочтительно, аминокислотная последовательность опухолевого антигена является идентичной у опухолевого антигена, который экспрессируется в нормальных тканях, и у опухолевого антигена, который экспрессируется в раковых тканях.
Примерами опухолевых антигенов, которые могут быть применимыми в соответствии с настоящим изобретением, являются p53, ART-4, BAGE, бета-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, белки клеточной поверхности семейства клаудинов, таких как CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 и CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 минорный BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, протеиназа 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE и WT. Особенно предпочтительные опухолевые антигены включают в себя CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) и CLAUDIN-6 (CLDN6).
Термин «иммуногенность» относится к относительной эффективности индуцирования иммунной реакции, которая предпочтительно ассоциирована с методами терапевтического лечения, такими как методы лечения злокачественные опухоли. Используемый в настоящем документе термин «иммуногенный» относится к свойству наличия иммуногенности. Например, термин «иммуногенная модификация» при использовании в контексте пептида, полипептида или белка относится к эффективности индуцирования указанным пептидом, полипептидом или белком иммунной реакции, которая обусловлена указанной модификацией и/или направлена против указанной модификации. Предпочтительно, немодифицированный пептид, полипептид или белок не индуцирует иммунную реакцию, индуцирует другую иммунную реакцию или индуцирует иммунную реакцию другого уровня, предпочтительно, более низкого уровня.
В соответствии с настоящим изобретением термин «иммуногенность» или «иммуногенный» предпочтительно относится к относительной эффективности индуцирования биологически значимой иммунной реакции, в частности, иммунной реакции, которая применима для вакцинации. Таким образом, согласно одному предпочтительному варианту осуществления аминокислотная модификация или модифицированный пептид являются иммуногенными, если они индуцируют иммунную реакцию против целевой модификации у субъекта, при этом иммунная реакция может быть полезной для терапевтических или профилактических целей.
Используемый в настоящем документе термин «прогнозирование применимости белка или его фрагмента для иммунотерапии» относится к прогнозирования того, будут ли белок или один или несколько его фрагментов, таких как эпитопы, в частности Т-клеточные эпитопы, применимы для индуцирования иммунной реакции или нацеленной иммунной реакции. Если по прогнозу белок, такой как ассоциированный с заболеванием антиген, является применимым для иммунотерапии, то, например, эпитопы указанного белка могут быть использованы для вакцинации, как описано в настоящем документе, или могут быть введены эффекторные клетки, нацеливающиеся на эпитоп указанного белка. Предпочтительно, белок, применимость которого в иммунотерапии подлежит прогнозированию в соответствии с настоящим изобретением, экспрессируется в больных клетках больного.
В соответствии с настоящим изобретением Т-клеточный эпитоп может быть представлен в вакцине как часть более крупного соединения, такого как вакцинная последовательность и/или полипептид, содержащий более чем один Т-клеточный эпитоп. Представленный пептид или Т-клеточный эпитоп получают после подходящего процессирования. Также Т-клеточные эпитопы могут быть модифицированы по одному или нескольким остаткам, которые не являются главными для распознавания TCR или для связывания с MHC. Такие модифицированные Т-клеточные эпитопы могут считаться иммунологически эквивалентными. Предпочтительно, Т-клеточный эпитоп при презентации с помощью MHC и распознавания Т-клеточным рецептором способен индуцировать в присутствии соответствующих костимуляторных сигналов клональное размножение Т-клетки, несущей Т-клеточный рецептор, специфически распознающей комплекс пептид/MHC. Предпочтительно, Т-клеточный эпитоп содержит аминокислотную последовательность, в значительной степени соответствующую аминокислотной последовательности фрагмента антигена. Предпочтительно, указанным фрагментом антигена является пептид, презентируемый MHC I класса и/или II класса.
Термин «процессирование антигена» или «процессирование» относится к разложению пептида, полипептида или белка на продукты процессирования, которые представляют собой фрагменты указанного пептида, полипептида или белка (например, разложение полипептида на пептиды), и ассоциации одного или нескольких из этих фрагментов (например, путем связывания) с молекулами MHC для презентации клетками, предпочтительно антиген-презентирующими клетками, специфическим Т-клеткам.
Рестриктированные II классом антигены преимущественно получают из экзогенных белков, которые попадают в антиген-презентирующие клетки эндоцитарным путем и процессируются в эндосомальном компартменте. Напротив, антигены, распознаваемые эффекторным CTL, рестриктированным по I классу, обычно получают из эндогенно синтезированных белков. Таким образом, экзогенные белки не могут обеспечивать антигенные детерминанты эффекторного CTL, рестриктированного I классом, если они вводятся непосредственно в цитоплазму целевых клеток.
Термин «кросс-презентация» относится к способности антиген-презентирующих клеток поглощать, процессировать и представлять внеклеточные антигены с молекулами MHC I класса CD8+ Т-клеткам (цитотоксическим Т-клеткам). Кросс-примирование описывает стимуляцию наивных цитотоксических CD8+ Т-клеток с помощью данного процесса. Антиген-презентирующие клетки, способные к кросс-презентации, главным образом представляют собой дендритными клетки, но было показано, что макрофаги, B-лимфоциты и синусоидальные эндотелиальные клетки также способны к этому.
Было показано кросс-примирование для вирусных белков и опухолевых антигенов. Это позволяет предположить, что кросс-примирование может обеспечивать иммунную систему механизмом, с помощью которого она может выявлять и реагировать на тканетропные вирусы, которые не инфицируют специализированные APC. При отсутствии такого механизма вирусы смогут избежать иммунологический надзор, ускользая от специализированных APC. Этот механизм также обеспечивает иммунную систему средством выживания неоантигенов, экспрессированных заново возникающими опухолевыми клетками. Подобно экзогенным чужеродным антигенам экзогенные собственные антигены могут проникать путем презентации с помощью I класса.
Термин «антиген-презентирующие клетки» (APC) означает клетки, которые представляют пептидные фрагменты белковых антигенов в ассоциации с молекулами MHC на своей клеточной поверхности. Некоторые APC могут активировать антиген-специфические Т-клетки.
Специализированные антиген-презентирующие клетки являются очень эффективными при интернализации антигена, либо с помощью фагоцитоза, либо с помощью опосредованного рецепторами эндоцитоза, с последующим представлением фрагмента антигена, связанного с молекулой MHC II класса, на своей мембране. Т-клетка распознает и взаимодействует с комплексом антиген-молекула MHC II класса на мембране антиген-презентирующей клетке. Затем производится дополнительный костимуляторный сигнал антиген-презентирующей клеткой, приводящий к активации Т-клетки. Экспрессия костимуляторных молекул является отличительной чертой специализированных антиген-презентирующих клеток.
in vitro
Основными типами специализированных антиген-презентирующих клеток являются дендритные клетки, которые характеризуются самым широким диапазоном презентации антигенов и, вероятно, являются наиболее важными антиген-презентирующими клетками, макрофаги, B-клетки и некоторые активированные эпителиальные клетки. Дендритные клетки (DC) представляют собой популяции лейкоцитов, которые представляют антигены, захваченными в периферические такни, Т-клеткам путями презентации антигена с помощью MHC как II класса, так и I класса. Хорошо известно, что дендритные клетки являются эффективными индукторами иммунных реакций, и активация этих клеток является важной стадией для индуцирования противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки условно классифицируют на «незрелые» и «зрелые» клетки, которые могут быть использованы в качестве простого пути различия двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако эта номенклатура не должна толковаться как исключающая все возможные промежуточные стадии дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуются как антиген-презентирующие клетки со способностью в высокой степени поглощать и процессировать антиген, что коррелирует с экспрессией в высокой степени Fcγ-рецептора и рецептора маннозы. Зрелый фенотип, как правило, характеризуется более низкой экспрессией этих маркеров, но экспрессией в высокой степени отвечающих за активацию Т-клеток молекул клеточной поверхности, таких как MHC I класса и II класса, адгезионных молекул (например, CD54 и CD11) и костимуляторных молекул (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 BB). Созревание дендритных клеток называют статусом активации дендритных клеток, при котором такие антиген-презентирующие дендритные клетки приводят к Т-клеточному примированию, тогда как презентация с помощью незрелых дендритных клеток приводит к толерантности. Созревание дендритных клеток главным образом вызывается биомолекулами с микробиальными признаками, выявляемыми врожденными рецепторами (бактериальной ДНК, вирусной РНК, эндотоксином и т.д.), провоспалительными цитокинами (TNF, IL-1, IFN), лигированием CD40 на поверхности дендритных клеток с помощью CD40L и веществами, высвобождаемыми из клеток, претерпевающих стрессогенную клеточную смерть. Дендритные клетки могут быть получены с помощью культивирования клеток костного мозга  с цитокинами, такими как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухолей альфа.
Неспециализированные антиген-презентирующие клетки конститутивно не экспрессируют белки MHC II класса, необходимые для взаимодействия с наивными Т-клетками; они экспрессируются только при стимуляции неспециализированных антиген-презентирующих клеток некоторыми цитокинами, такими как IFNγ.
Выражение «характеризуемая презентацией антигена клетка» или «презентирующая антиген клетка» или подобные выражения означают клетку, такую как больная клетка, например, раковая клетка, или антиген-презентирующая клетка, презентирующая антиген или фрагмент, полученный из указанного антигена, например, путем процессирования антигена, в контексте молекул MHC, в частности, молекул MHC I класса. Подобным образом, термины «характеризуемое презентацией антигена заболевание» означает заболевание, вовлекающее клетки, характеризуемые презентацией антигена, в частности, с MHC I класса. Презентация антигена клеткой может быть осуществлена с помощью трансфицирования клетки нуклеиновой кислотой, такой как РНК, кодирующая антиген.
Выражение «фрагмент антигена, который презентируется» или подобные выражения означают, что фрагмент может быть представлен с помощью MHC I класса или II класса, предпочтительно MHC I класса, например, при добавлении непосредственно к антиген-презентирующим клеткам. Согласно одному варианту осуществления фрагментом является фрагмент, который в естественных условиях презентируется клетками, экспрессирующими антиген.
Термин «целевая клетка» означает клетку, которая является целью для иммунной реакции, такой как клеточная иммунная реакция. Целевые клетки включают в себя клетки, которые представляют антиген, т.e. пептидный фрагмент, полученный из антигена, и включают в себя любую нежелательную клетку, такую как раковая клетка. Согласно предпочтительным вариантам осуществления целевой клеткой является клетка, экспрессирующая антиген, описанный в настоящем документе, и предпочтительно презентирующая указанный антиген с MHC I класса.
Термин «часть» относится к фракции. По отношению к конкретной структуре, такой как аминокислотная последовательность или белок, термин «часть» их может обозначать непрерывную или прерывистую фракцию указанной структуры. Предпочтительно, часть аминокислотной последовательности содержит по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислот указанной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, если часть представляет собой прерывистую фракцию, то указанная прерывистая фракция состоит из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше частей структуры, при этом каждая часть является непрерывным элементом структуры. Например, прерывистая фракция аминокислотной последовательности может состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше, предпочтительно не более 4 частей указанной аминокислотной последовательности, при этом каждая часть предпочтительно содержит по меньшей мере 5 непрерывных аминокислот, по меньшей мере 10 непрерывных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 20 непрерывных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 30 непрерывных аминокислот аминокислотной последовательности.
Термины «часть» и «фрагмент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к непрерывному элементу. Например, часть структуры, такой как аминокислотная последовательность или белок, относится к непрерывному элементу указанной структуры. Порция, часть или фрагмент структуры предпочтительно обладает одним или несколькими функциональными свойствами указанной структуры. Например, порция, часть или фрагмент эпитопа, пептида или белка являются предпочтительно иммунологически эквивалентными эпитопу, пептиду или белку, из которого они получены. В контексте настоящего изобретения «часть» структуры, такой как аминокислотная последовательность, предпочтительно составляет, предпочтительно состоит из по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% всей структуры или аминокислотной последовательности.
+
+
Термин «эффекторная клетка», «иммунная эффекторная клетка» или «иммунореактивная клетка» в контексте настоящего изобретения относится к клетке, которая проявляет эффекторные функции в ходе иммунной реакции. «Иммунореактивная клетка» предпочтительно способна связываться с антигеном или клеткой, характеризующейся презентацией антигена или его пептидного фрагмента (например, Т-клеточного эпитопа) и опосредованием иммунной реакции. Например, такие клетки секретируют цитокины и/или хемокины, секретируют антитела, распознают раковые клетки и необязательно элиминируют такие клетки. Например, иммунореактивные клетки содержат Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, инфильтрирующие опухоль Т-клетки), B-клетки, натуральные клетки-киллеры, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно, в контексте настоящего изобретения иммунореактивными клетками являются Т-клетки, предпочтительно CD4 и/или CD8 Т-клетки.
+
+
Предпочтительно, «иммунореактивная клетка» распознает антиген или его пептидный фрагмент с некоторой степенью специфичности, в частности, если представлена в контексте молекул MHC, например, на поверхности антиген-презентирующих клеток или больных клеток, таких как раковые клетки. Предпочтительно, указанное распознавание позволяет клетке, которая распознает антиген или его пептидный фрагмент, отвечать или реагировать. Если клеткой является хелперная Т-клетка (CD4 Т-клетка), несущая рецепторы, которые распознают антиген или его пептидный фрагмент в контексте молекул MHC II класса, такая отвечаемость или реактивность может включать в себя высвобождение цитокинов и/или активацию CD8 лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток. Если клеткой является CTL, то такая отвечаемость или реактивность может включать в себя элиминирование клеток, представленных в контексте молекул MHC I класса, т.е. клеток, характеризующихся презентацией антигена с MHC I класса, например, путем апоптоза или опосредованного перфорином клеточного лизиса. В соответствии с настоящим изобретением CTL отвечаемость может включать в себя постоянный поток кальция, клеточное деление, продуцирование цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, повышающую регуляцию маркеров активации, таких как CD44 и CD69, и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих целевых клеток. Отвечаемость CTL также может быть определена с использованием искусственного репортера, который точно указывает на отвечаемость CTL. Такие CTL, которые распознают антиген или фрагмент антигена и являются отвечающими или реактивными также называют в настоящем документе «антиген-отвечающими CTL». Если клеткой является B-клетка, то такая отвечаемость может включать в себя высвобождение иммуноглобулинов.
Термины «Т-клетка» и «T-лимфоцит» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и включают в себя T-хелперные клетки (CD4+ Т-клетки) и цитотоксические Т-клетки (CTL, CD8+ Т-клетки), которые включают в себя цитолитические Т-клетки.
Т-клетки принадлежат группе белых кровяных клеток, известных ка лимфоциты, и играют основную роль в клеточном иммунитете. Они могут отличаться от других типов лимфоцитов, таких как B-клетки и натуральные клетки-киллеры, наличием специального рецептора на их клеточной поверхности, называемого Т-клеточным рецептором (TCR). Тимус является основным органом, отвечающим за созревание Т-клеток. Были открыты несколько других подтипов Т-клеток, функция каждого из которых отличается.
T-хелперные клетки помогают другим белым кровяным клеткам в иммунологических процессах, в том числе в созревании B-клеток в плазматические клетки и в активации цитотоксических Т-клеток и макрофагов, среди прочих функций. Такие клетки также известны как CD4+ Т-клетки, поскольку они экспрессируют белок CD4 на своей поверхности. Хелперные Т-клетки становятся активированными при их презентации с пептидными антигенами с помощью молекул MHC II класса, которые экспрессируются на поверхности антиген-презентирующих клеток (APC). После активации они быстро делятся и секретируют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют активную иммунную реакцию или помогают ей.
Цитотоксические Т-клетки разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, а также участвуют в отторжении трансплантата. Эти клетки также известны как CD8+ Т-клетки, поскольку они экспрессируют гликопротеин CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои цели за счет связывания с антигеном, ассоциированным с MHC I класса, который присутствует на поверхности почти каждой клетки организма.
Большинство Т-клеток имеют Т-клеточный рецептор (TCR), представленный в виде комплекса некоторых белков. Данный Т-клеточный рецептор состоит из двух отдельных пептидных цепей, которые получены от независимых генов Т-клеточного рецептора альфа и бета (TCRα и TCRβ) и называются α- и β-TCR цепями. γδ Т-клетки (гамма дельта Т-клетки) представляют собой небольшую подгруппу Т-клеток, которые имеют отличающийся Т-клеточный рецептор (TCR) на своей поверхности. Однако в γδ Т-клетках TCR состоит из одной γ-цепи и одной δ-цепи. Эта группа Т-клеток является намного менее распространенной (2% от всех Т-клеток), чем αβ Т-клетки.
В соответствии с настоящим изобретением термин «антигенный рецептор» включает в себя встречающиеся в природе рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы, а также сконструированные рецепторы, которые обеспечивают условную специфичность, такую как специфичность моноклонального антитела в отношении эффекторной клетки, такой как Т-клетка. Следовательно, может быть создано большое число антиген-специфических Т-клеток для переноса адоптивных клеток. Таким образом, антигенный рецептор в соответствии с настоящим изобретением может присутствовать на Т-клетках, например, вместо собственного Т-клеточного рецептора или в дополнение к таковому. Такие Т-клетки не требуют обязательного процессирования и презентации антигена для распознавания целевой клетки, а скорее могут распознавать предпочтительно со специфичностью любой антиген, присутствующий на целевой клетке. Предпочтительно, указанный антигенный рецептор экспрессируется на поверхности клеток. Для целей настоящего изобретения Т-клетки, содержащие сконструированный антигенный рецептор, называют используемым в настоящем документе термином «Т-клетка». В частности, в соответствии с настоящим изобретением термин «антигенный рецептор» включает в себя искусственные рецепторы, содержащие одну молекулу или комплекс молекул, которые распознают, т.e. связывают, целевую структуру (например, антиген) на целевой клетке, такой как раковая клетка (например, с помощью связывания антиген-связывающего сайта или антиген-связывающего домена с антигеном, экспрессированным на поверхности целевой клетки), и могут обеспечивать специфичность в отношении эффекторной клетки, такой как Т-клетка, экспрессирующая указанный антигенный рецептор на клеточной поверхности. Предпочтительно, распознавание целевой структуры антигенным рецептором приводит в результате к активации эффекторной клетки, экспрессирующей указанный антигенный рецептор. В соответствии с настоящим изобретением «антигенным рецептором» может быть «химерный антигенный рецептор (CAR)», «химерный Т-клеточный рецептор» или «искусственный Т-клеточный рецептор».
В соответствии с настоящим изобретением антиген может быть распознан антигенным рецептором посредством любых доменов распознавания антигена (также называемых в настоящем документе просто «доменами»), способных образовывать антиген-связывающий сайт, например, через антиген-связывающие части антител и Т-клеточные рецепторы, которые могут находиться на одних и тех же или различных пептидных цепях. Согласно одному варианту осуществления два домена, формирующих антиген-связывающий сайт, получены из иммуноглобулина. Согласно другому варианту осуществления два домена, формирующих антиген-связывающий сайт, получены из Т-клеточного рецептора. Особенно предпочтительными являются вариабельные домены антител, такие как одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), полученные из моноклональных антител, и вариабельные домены Т-клеточного рецептора, в частности, отдельные цепи TCR альфа и бета. Фактически почти все, что связывает данную цель с высокой аффинностью, может быть использовано в качестве домена распознавания антигена.
Первый сигнал в активации Т-клеток обеспечивается за счет связывания Т-клеточного рецептора с коротким пептидом, представленным с помощью MHC на другой клетке. Это гарантирует, что активируется только Т-клетка с TCR, специфическим по отношению к этому пептиду. Клеткой-партнером обычно является антиген-презентирующая клетка, такая как специализированная антиген-презентирующая клетка, обычно дендритная клетка в случае наивных реакций, хотя важными APC могут быть B-клетки и макрофаги.
D
В соответствии с настоящим изобретением молекула способна связываться с целью, если она обладает значительной аффинностью в отношении указанной предварительно определенной цели и связывается с указанной предварительно определенной целью в стандартных анализах. «Аффинность» или «аффинность связывания» часто измеряют с помощью равновесной константы диссоциации (K). Молекула не способна (в значительной степени) связываться с целью, если она не обладает значительной аффинностью в отношении указанной цели и не связывается в значительной степени с указанной целью в стандартных анализах.
in vivo
in vivo
98
Цитотоксические T-лимфоциты могут быть созданы  путем включения антигена или его пептидного фрагмента в антиген-презентирующие клетки . Антиген или его пептидный фрагмент может быть представлен как белок, как ДНК (например, в векторе) или как РНК. Антиген может быть процессирован с получением пептидного партнера для молекулы MHC, тогда как его фрагмент может быть представлен без необходимости дополнительного процессирования. Последний, в частности, имеет место, если он может связываться с молекулами MHC. Как правило, возможно введение больному внутрикожной инъекцией. Однако инъекция также может быть выполнена внутрь лимфатического узла (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA :3299-303). Полученные в результате клетки представляют собой представляющий интерес комплекс и распознаются аутологичными цитотоксическими T-лимфоцитами, которые затем размножаются.
Специфическая активация CD4+ или CD8+ Т-клеток может быть выявлена рядом путей. Способы выявления специфической Т-клеточный активации предусматривают выявление пролиферации Т-клеток, продуцирование цитокинов (например, лимфокинов) или обеспечения цитолитической активности. Для CD4+ Т-клеток предпочтительный способ выявления специфической Т-клеточной активации заключается в выявлении пролиферации Т-клеток. Для CD8+ Т-клеток предпочтительный способ выявления специфической Т-клеточной активации заключается в выявлении обеспечения цитолитической активности.
Термин «иммунологически эквивалентный» означает, что иммунологически эквивалентная молекула, такая как иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность, проявляет такие же или по сути такие же иммунологические свойства и/или вызывает такие же или по сути такие же иммунологические эффекты, например, применительно к типу иммунологического эффекта, такого как индуцирование гуморальной и/или клеточной иммунной реакции, силы и/или длительности индуцированной иммунной реакции или специфичности индуцированной иммунной реакции. В контексте настоящего изобретения термин «иммунологически эквивалентный» предпочтительно используют по отношению к иммунологическим эффектам или свойствам пептида, используемого для иммунизации. Например, аминокислотная последовательность является иммунологически эквивалентной по отношению к эталонной аминокислотной последовательности, если указанная аминокислотная последовательность при воздействии иммунной системы субъекта индуцирует иммунную реакцию, характеризующуюся специфичностью реагирования с эталонной аминокислотной последовательностью.
+
+
Термин «иммунные эффекторные функции» в контексте настоящего изобретения включает в себя любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, которые приводят, например, к уничтожению опухолевых клеток или к ингибированию роста опухоли и/или к ингибированию развития опухоли, в том числе, к ингибированию распространения и метастазирования опухоли. Предпочтительно, иммунными эффекторными функциями в контексте настоящего изобретения являются опосредованные Т-клетками эффекторные функции. Такие функции включают в себя в случае хелперной Т-клетки (CD4 Т-клетки) распознавание антигена или фрагмента антигена в контексте молекул MHC II класса Т-клеточными рецепторами, высвобождение цитокинов и/или активацию CD8 лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток, а в случае CTL распознавание антигена или фрагмента антигена в контексте молекул MHC II класса Т-клеточными рецепторами, элиминирование клеток, представленных в контексте молекулы MHC I класса, т.е. клеток, характеризующихся презентацией антигена с MHC I класса, например, путем апоптоза или опосредованного перфорином клеточного лизиса, продуцирование цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих целевых клеток.
Как правило, в соответствии с настоящим изобретением белки, которые экспрессируются больными клетками, оценивают по отношению к их применимости для иммунотерапии. Белок с прогнозируемой применимостью в иммунотерапии может быть использован для обеспечения вакцины, содержащей белок или один или несколько его пептидных фрагментов, в частности, один или несколько (потенциальных) связывающихся с MHC пептидов белка.
in vivo
В соответствии с настоящим изобретением термин «распределение» относится к статусу локализации. Термин «установление распределения или локализации», в частности, включает в себя определение или прогнозирование статуса локализации, например, определение или прогнозирование субклеточной локализации или представленности пептида, белка или нуклеиновой кислоты, например, определение или прогнозирование того, являются или не являются пептид, белок или нуклеиновая кислота локализованными или представленными в цитозоле и/или в экзосомах .
Термины, такие как «прогнозировать», «прогнозирование» или «прогноз», относятся к определению вероятности.
in vivo
В соответствии с настоящим изобретением прогнозирование применимости белка или его фрагмента, экспрессированного больными клетками, в иммунотерапии может предусматривать одно или несколько из следующего: (i) установление распределения или локализации белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты, или фрагмента белка, например, установление того, являются ли белок, или кодирующая его нуклеиновая кислота, или фрагмент белка локализованными или представленными в цитозоле и/или в экзосомах , (ii) установление того, кросс-презентируется ли белок или его фрагмент антиген-презентирующими клетками, предпочтительно специализированными антиген-презентирующими клетками, (iii) установление наличия иммунной реакции с образованием антител на белок или его фрагмент, (iv) установление того, связывается ли белок или его фрагмент с F-актином, (v) установление того, связывается ли белок или его фрагмент с РНК.
in vivo
in vivo
Согласно одному варианту осуществления установление того, являются ли белок, или нуклеиновая кислота, кодирующая его, или фрагмент белка локализованными или представленным в экзосомах , выполняют путем получения образца внеклеточных жидкостей, выделения экзосом, например, с помощью дифференциального центрифугирования, выделения белков или нуклеиновых кислот, например, с помощью электрофореза в геле, и идентификации указанного белка или его фрагмента, например, посредством масс-спектрометрии, ELISA, проточной цитометрии, микромножеств антител или вестерн-блоттинга, или идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, например, посредством микроматрицы, РНК-секвенирования или RT-PCR. Согласно другому варианту осуществления установление того, являются ли белок, или нуклеиновая кислота, кодирующая его, или фрагмент белка локализованными или представленными в экзосомах , выполняют с помощью извлечения информации из базы данных, собирающей данные из экспериментов, описанных выше в данном разделе, например, ExoCarta (Keerthikumar, S, et al., J. Mol. Biol. 428, 688(2016)).
Согласно одному варианту осуществления установление наличия иммунной реакции с образованием антител может быть выполнено с использованием SEREX. SEREX означает серологическую идентификацию антигенов с помощью рекомбинантного экспрессионного клонирования и представляет собой способ идентификации опухолевых антигенов с помощью скринирования антител из сыворотки крови больного по распознаванию полученной из опухоли фаговой библиотеки трансдуцированной cDNA. В этой методике используют библиотеку фагового дисплея для экспрессии большой группы потенциальных антигенов больного. Антигены переносят на двухмерную поверхность, что позволяет их картирование в отношении специфических клонов. Поверхность инкубируют с аутологичной сывороткой крови больного. Иммунные реактивные клоны локализуют, культивируют и секвенируют (Sahin, U, et al., PNAS 92, 11810 (1995)).
Настоящее изобретение также может предусматривать разрушение белковых последовательностей на соответствующие фрагменты для связывания с MHC и установление баллов для связывания фрагментов с одной или несколькими молекулами MHC. Результаты могут быть ранжированы и могут состоять из перечня пептидов и их прогнозированных баллов, указывающих на вероятность связывания. Как правило, белки в соответствии с настоящим изобретением особенно применимы для иммунотерапии, если они содержат один или несколько (потенциальных) связывающихся с MHC пептидов.
Способы в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены для больного, такого как раковый больной, например, на образце опухоли больного, такого как раковый больной.
В соответствии с настоящим изобретением белок или белковый фрагмент, описанный в настоящем документе, предпочтительно содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию. Аминокислотные модификации, применимость в иммунотерапии которых подлежит определению в соответствии с настоящим изобретением или которые подлежат отбору и/или ранжированию согласно их прогнозированной иммуногенности в соответствии с настоящим изобретением, могут быть результатом мутаций в нуклеиновой кислоте клетки. Такие мутации могут быть идентифицированы известными методиками секвенирования.
Согласно одному варианту осуществления мутации являются специфическими по отношению к раковым соматическим мутациям в опухолевой пробе ракового больного, которые могут быть определены путем идентификации различий в последовательностях между геномом, экзомом и/или транскриптомом опухолевой пробы и геномом, экзомом и/или транскриптомом неонкогенной пробы.
В соответствии с настоящим изобретением опухолевая проба относится к любому образцу, такому как образец организма, полученному от больного, содержащему или предположительно содержащему опухолевые или раковые клетки. Образцом организма может быть образец любой ткани, такой как кровь, образец ткани, полученный из первичной опухоли или из опухолевого метастазиса, или любой другой образец, содержащий опухолевые или раковые клетки. Предпочтительно, образцом организма является кровь, а специфические по отношению к злокачественной опухоли соматические мутации или различия последовательностей определяют в одной или нескольких циркулирующих опухолевых клетках (CTC), содержащихся в крови. Согласно другому варианту осуществления опухолевая проба относится к одной или нескольким выделенным опухолевым или раковым клеткам, таким как циркулирующие опухолевые клетки (CTC), или к образцу, содержащему одну или несколько выделенных опухолевых или раковых клеток, таких как циркулирующие опухолевые клетки (CTC).
Не являющаяся опухолевой проба относится к любому образцу, такому как образец организма, полученный от больного или другого индивидуума, который предпочтительно принадлежит тому же виду, что и больной, предпочтительно от здорового индивидуума, не содержащий или предположительно не содержащий опухолевые или раковые клетки. Образцом организма может быть образец любой ткани, такой как кровь или образец из неонкогенной ткани.
Настоящее изобретение может относиться к определению сигнатуры канцерогенной мутации больного. Термин «сигнатура канцерогенной мутации» может относиться ко всем канцерогенным мутациям, присутствующим в одной или нескольких раковых клетках больного, или он может относиться только к части канцерогенных мутаций, присутствующих в одной или нескольких раковых клетках больного. Следовательно, настоящее изобретение может относиться к идентификации всех специфических по отношению к злокачественной опухоли мутаций, присутствующих в одной или нескольких раковых клетках больного, или оно может относиться к идентификации только части специфических по отношению к злокачественной опухоли мутаций, присутствующих в одной или нескольких раковых клетках больного. Как правило, способы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают идентификацию ряда мутаций, обеспечивающих значительное число модификаций или модифицированных белков, подлежащих включению в способы в соответствии с настоящим изобретением.
Предпочтительно, мутации, идентифицируемые в соответствии с настоящим изобретением, являются несинонимичными мутациями, предпочтительно несинонимичными мутациями белков, экспрессированных в опухолевой или раковой клетке.
Согласно одному варианту осуществления специфические по отношению к злокачественной опухоли соматические мутации или различия последовательностей определяют в геноме, предпочтительно целом геноме, опухолевой пробы. Таким образом, настоящее изобретение может относиться к идентификации сигнатуры канцерогенной мутации генома, предпочтительно целого генома, одной или нескольких раковых клеток. Согласно одному варианту осуществления стадия идентификации специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций в опухолевой пробе ракового больного предусматривает идентификацию профиля канцерогенной мутации по всему геному.
Согласно одному варианту осуществления специфические по отношению к злокачественной опухоли соматические мутации или различия последовательностей определяют в экзоме, предпочтительно во всем экзоме, опухолевой пробы. Таким образом, настоящее изобретение может относиться к идентификации сигнатуры канцерогенной мутации экзома, предпочтительно целого экзома, одной или нескольких раковых клеток. Согласно одному варианту осуществления стадия идентификации специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций в опухолевой пробе ракового больного предусматривает идентификацию профиля канцерогенной мутации по всему экзому.
Согласно одному варианту осуществления специфические по отношению к злокачественной опухоли соматические мутации или различия последовательностей определяют в транскриптоме, предпочтительно во всем транскриптоме, опухолевой пробы. Таким образом, настоящее изобретение может относиться к идентификации сигнатуры канцерогенной мутации транскриптома, предпочтительно целого транскриптома, одной или нескольких раковых клеток. Согласно одному варианту осуществления стадия идентификации специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций в опухолевой пробе ракового больного предусматривает идентификацию профиля канцерогенной мутации по всему транскриптому.
Согласно одному варианту осуществления стадия идентификации специфической по отношению к злокачественной опухоли соматической мутаций или идентификации различий последовательностей предусматривает одноклеточное секвенирование одной или нескольких, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже больше раковых клеток. Таким образом, настоящее изобретение может относиться к идентификации сигнатуры канцерогенной мутации указанных одной или нескольких раковых клеток. Согласно одному варианту осуществления раковыми клетками являются циркулирующие опухолевые клетки. Раковые клетки, такие как циркулирующие опухолевые клетки, могут быть выделены перед одноклеточным секвенированием.
Согласно одному варианту осуществления стадия идентификации специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций или идентификации различий последовательностей предусматривает использование секвенирования следующего поколения (NGS).
Согласно одному варианту осуществления стадия идентификации специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций или идентификации различий последовательностей предусматривает секвенирование геномной ДНК и/или РНК опухолевой пробы.
Для выявления специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций или различий последовательностей информацию о последовательностях, полученную из опухолевой пробы, предпочтительно сравнивают с эталоном, таким как информация о последовательностях, полученная при секвенировании нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК, нормальных не являющихся раковыми клеток, таких как зародышевые клетки, которые могут быть получены либо от больного, либо от другого индивидуума. Согласно одному варианту осуществления нормальную геномную ДНК зародышевой линии получают из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).
Термин «геном» относится к общему количеству генетической информации в хромосомах организма или клетки.
(Ng, PC et al., PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008)
Термин «экзом» относится к части генома организма, образованной экзонами, которые представляют собой кодирующие части экспрессированных генов. Экзом обеспечивает генетический схему, используемую в синтезе белков и других продуктов функциональных генов. Он представляет собой наиболее функционально значимую часть генома, и поэтому он скорее всего обуславливает фенотип организма. По оценкам, экзом человеческого генома составляет 1,5% всего генома .
Термин «транскриптом» относится к набору всех молекул РНК, в том числе mRNA, rRNA, tRNA, а также других некодирующих РНК, полученных в одной клетке или популяция клеток. В контексте настоящего изобретения транскриптом означает набор всех молекул РНК, полученных в одной клетке, популяции клеток, предпочтительно популяции раковых клеток, или во всех клетках данного индивидуума в определенный момент времени.
in vitro
in vitro
in vitro
Термин «нуклеиновая кислота» означает в настоящем изобретении предпочтительно дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), более предпочтительно РНК, наиболее предпочтительно  транскрибированную РНК (IVT РНК) или синтетическую РНК. Нуклеиновые кислоты включают в себя в соответствии с настоящим изобретением геномную ДНК, cDNA, mRNA, полученные рекомбинантным путем и химически синтезированные молекулы. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота может быть представлена как однонитевая или двухнитевая и линейная молекула или молекула с ковалентно замкнутым циклом. Нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть выделенной. Термин «выделенная нуклеиновая кислота» в соответствии с настоящим изобретением означает, что нуклеиновую кислоту (i) амплифицировали , например, с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), (ii) получили рекомбинантным путем с помощью клонирования, (iii) очистили, например, путем расщепления и разделения с помощью электрофореза в геле, или (iv) синтезировали, например, путем химического синтеза. Нуклеиновая кислота может быть использована для введения, т.e. трансфицирования, в клетки, в частности, в форме РНК, которая может быть получена с помощью  транскрипции из матрицы ДНК. Более того, РНК может быть модифицирована перед применением путем стабилизации последовательностей, кэппирования и полиаденилирования.
Термин «генетический материал» относится к выделенной нуклеиновой кислоте, либо ДНК, либо РНК, участку двойной спирали, участку хромосомы или полному геному организма или клетки, в частности, к его экзому или транскриптому.
Термин «мутация» относится к изменению или отличию в последовательности нуклеиновой кислоты (к нуклеотидным замене, добавлению или делеции) по сравнению с эталоном. «Соматическая мутация» может возникать в любой из клеток организма, за исключением зародышевых клеток (сперматозоида и яйцеклетки), и, поэтому, она не передается детям. Такие изменения могут вызывать (но не всегда) злокачественные или другие заболевания. Предпочтительно, мутация является несинонимичной мутацией. Термин «несинонимичная мутация» относится к мутации, предпочтительно к нуклеотидной замене, которая не приводит к аминокислотному изменению, такому как аминокислотная замена, в продукте трансляции.
В соответствии с настоящим изобретением термин «мутация» включает в себя точковые мутации, инделы, слияния, хромотрипсис и редактирования РНК.
В соответствии с настоящим изобретением термин «индел» описывает специальный класс мутаций, определяемых как мутации, приводящие к совместно локализованным вставке и делеции, а также суммарному увеличению или потери нуклеотидов. В кодирующих областях генома, если длина индела кратна 3, они продуцируют мутацию сдвига рамки. Инделы могут отличаться от точковой мутации; при этом индел вставляет и удаляет нуклеотиды из последовательности, а точковая мутация является формой замены, при которой заменяется один из нуклеотидов.
Слияния могут создавать гибридные гены, сформированные из двух ранее отдельных генов. Это может происходить в результате транслокации, интерстициальной делеции или инверсии сегмента хромосомы. Зачастую гены слияния являются онкогенами. Онкогенные гены слияния могут давать генный продукт с новой или другой функцией от двух партнеров слияния. В качестве альтернативы, протоонкоген сливается с сильным промотором, и, следовательно, онкогенная функция должна быть функцией с повышающей регуляцией, обусловленной сильным промотором вышележащего партнера слияния. Онкогенные транскрипты слияния также могут быть обусловлены событиями транс-сплайсинга или сквозного прочитывания.
В соответствии с настоящим изобретением термин «хромотрипсис» относится к генетическому явлению, при котором специфические области генома разбиваются, а затем объединяются посредством одного разрушающего события.
В соответствии с настоящим изобретением термин «редакция РНК» или «редактирование РНК» относится к молекулярному процессу, при котором информация, содержащаяся в молекуле РНК, изменяется посредством химического изменения в составе оснований. Редактирование РНК включает в себя нуклеозидные модификации, такие как дезаминирования цитидина (C) до уридина (U) и аденозина (A) до инозина (I), а также добавления и вставки внематричных нуклеотидов. Редактирование РНК в mRNA эффективно изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка так, что он отличается от предполагаемого по последовательности геномной ДНК.
Термин «сигнатура канцерогенной мутации» относится к набору мутаций, которые присутствуют в раковых клетках по сравнению с не являющимися раковыми эталонными клетками.
В соответствии с настоящим изобретением термин «эталон» может быть использован для корреляции и сравнения результатов из опухолевой пробы. Как правило, «эталон» может быть определен на основании одной или нескольких нормальных проб, в частности, проб, которые не поражены злокачественным заболеванием, полученных либо от больного, либо от одного или нескольких других индивидуумов, предпочтительно здоровых индивидуумов, в частности, индивидуумов того же вида. «Эталон» может быть определен эмпирически путем тестирования достаточно большого числа нормальных проб.
Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109
Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658
Любой подходящий способ секвенирования может быть использован в соответствии с настоящим изобретением для определения мутаций, при этом предпочтительными являются технологии секвенирования следующего поколения (NGS). Способы секвенирования третьего поколения могут заменить технологию NGS в будущем, чтобы ускорить стадию секвенирования в способе. С целью пояснения термины «секвенирование следующего поколения» или «NGS» в контексте настоящего изобретения означают все новые технологии высокопроизводительного секвенирования, которые в отличие от «обычной» методики секвенирования, известной как химия Сэнгера, рандомно считывают матрицы нуклеиновой кислоты параллельно по всему геному, разбивая весь геном на небольшие части. Такие технологии NGS (также известные как технологии массового параллельного секвенирования) способны доставлять информацию о последовательностях нуклеиновой кислоты целого генома, экзома, транскриптома (всех транскрибируемых последовательностей генома) или метилома (все метилированные последовательности генома) за очень короткие периоды времени, например, в течение 1-2 недель, предпочтительно в течение 1-7 суток или наиболее предпочтительно менее чем за 24 часа, и обеспечивают, в принципе, подходы одноклеточного секвенирования. Многочисленные платформы NGS, которые являются коммерчески доступными или которые упоминаются в литературе, могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, например, описываемые подробно в ; или в . Неограничивающими примерами таких технологий/платформ NGS являются следующие.
Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365
1) Технология секвенирования с помощью синтеза, известная как пиросеквенирование, реализуемая, например, в GS-FLX 454 Genome Sequencer™ ассоциированной с Roche компании 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), впервые описанная в . В этой технологии используют эмульсионную PCR, при которой связывающиеся с однонитевой ДНК гранулы инкапсулируют путем энергичного откручивания на вортексе в водные мицеллы, содержащие PCR-реактанты, окруженные маслом, для амплификации с помощью эмульсионной PCR. В ходе процесса пиросеквенирования регистрируют излучение, испускаемое из фосфатных молекул при включении нуклеотида, по мере того как полимераза синтезирует нить ДНК.
2) Подходы секвенирования с помощью синтеза, разработанные компанией Solexa (теперь часть Illumina Inc., San Diego, California), которые основываются на обратимо меченых терминаторах и реализуются, например, в Genome Analyzer™ от Illumina/Solexa и в HiSeq 2000 Genome Analyzer™ от Illumina. В этой технологии все четыре нуклеотида добавляют одновременно в олиго-примированные кластерные фрагменты в каналы проточной кюветы вместе с ДНК-полимеразой. Мостиковая амплификация удлиняет кластерные нити со всеми четырьмя флуоресцентно меченными нуклеотидами для секвенирования.
3) Подходы секвенирования с помощью лигирования, например, реализуемые на платформе SOLid™ от Applied Biosystems (теперь Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). В этой технологии пул всех возможных олигонуклеотидов фиксированной длины метят согласно секвенированному положению. Олигонуклеотиды отжигают и лигируют; предпочтительное лигирование с помощью ДНК-лигазы для совместимых последовательностей дает в результате информативный сигнал нуклеотида в этом положении. Перед секвенированием ДНК амплифицируют с помощью эмульсионной PCR. Полученные в результате гранулы, каждая из которых содержит копии исключительно одной и той же молекулы ДНК, размещают на предметном стекле. В качестве второго примера, на платформе Polonator™ G.007 от Dover Systems (Salem, New Hampshire) также используют подход секвенирования с помощью лигирования с использованием рандомно упорядоченной, на основе гранул эмульсионной PCR для амплификации фрагментов ДНК при параллельном секвенировании.
4) Технологии одномолекулярного секвенирования, такие как, например, реализуемые в системе PacBio RS от Pacific Biosciences (Menlo Park, California) или на платформе HeliScope™ от Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). Отличительной характеристикой этой технологии является ее способность секвенировать молекулы отдельной ДНК или РНК без амплификации, определяемая как одномолекулярное секвенирование ДНК в режиме реального времени (SMRT). Например, в HeliScope используют высокочувствительную систему выявления флуоресценции для непосредственного выявления каждого нуклеотида по мере его синтеза. Подобный подход на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) был разработан компанией Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Другие одномолекулярные методы на основе флуоресценции разработаны компаниями U.S. Genomics (GeneEngine™) и Genovoxx (AnyGene™).
5) Нанотехнологии для одномолекулярного секвенирования, в которых используют различные наноструктуры, которые, например, расположены на чипе, для наблюдения перемещения молекулы полимеразы по отдельной нити при репликации. Неограничивающими примерами подходов, основанных на нанотехнологиях, являются платформа GridON™ от Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), платформы выполняемого с помощью гибридизации нанопорового секвенирования (HANS™), разработанные Nabsys (Providence, Rhode Island), и специализированная платформа секвенирования ДНК на основе лигазы с технологией наносфер ДНК (DNB), называемой комбинаторным лигированием зонд-якорь (cPAL™).
6) Технологии на основе электронной микроскопии для одномолекулярного секвенирования, например, разработанные компаниями LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) и Halcyon Molecular (Redwood City, California).
7) Ионное полупроводниковое секвенирование, которое основывается на выявлении ионов водорода, высвобождающихся в ходе полимеризации ДНК. Например, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) использует высокоплотную решетку микромеханических лунок для осуществления этого биохимического процесса в массово-параллельным способом. В каждой лунке содержится разная матричная ДНК. Под лунками находится чувствительный к ионам слой, а под ним - специализированный ионный датчик.
Предпочтительно, препараты ДНК и РНК служат исходным материалом для NGS. Такие нуклеиновые кислоты могут быть легко получены из образцов, таких как биологический материал, например, из свежих, быстро замороженных или фиксированных формалином залитых парафином опухолевых тканей (FFPE), или из свежевыделенных клеток, или из CTC, которые присутствуют в периферической крови больных. Нормальная немутантная геномная ДНК или РНК может быть экстрагирована из нормальной соматической ткани, однако в контексте настоящего изобретения предпочтительными являются зародышевые клетки. ДНК или РНК зародышевой линии может быть экстрагирована из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) больных с негематологическими злокачественными новообразованиями. Хотя нуклеиновые кислоты, экстрагированные из FFPE тканей или свежевыделенных отдельных клеток, являются в высокой степени фрагментированными, они подходят для амплификаций NGS.
Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51
Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527
Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101
Некоторые способы направленного NGS для секвенирования экзома описаны в литературе (для обзора см., например, ), все из которых могут быть использованы в сочетании с настоящим изобретением. Во многих из этих способов (описанных, например, как фиксация генома, разделение генома, обогащение генома и т.д.) используются методики гибридизации и предусматриваются подходы гибридизации на основе чипа (например, ) и на основе жидкости (например, ). Также доступны коммерческие наборы для подготовки образцов ДНК и последующего фиксирования экзома, например, Illumina Inc. (San Diego, California) предлагает набор для подготовки образцов ДНК TruSeq™ и набор для обогащения экзома Exome Enrichment Kit TruSeq™.
Для снижения числа ложноположительных результатов при выявлении специфических по отношению к злокачественной опухоли соматических мутаций или различий последовательностей при сравнении, например, последовательности опухолевого образца с последовательностью эталонного образца, такой как последовательность образца зародышевой линии, предпочтительно определять последовательность в повторностях одного или обоих из этих типов образцов. Таким образом, предпочтительным является то, что последовательность эталонного образца, такую как последовательность образца зародышевой линии, определяют два раза, три раза или больше. В качестве альтернативы или дополнения, последовательность опухолевого образца определяют два раза, три раза или больше. Также может быть возможным определение последовательности эталонного образца, такой как последовательность образца зародышевой линии и/или последовательность опухолевого образца, более чем один раз путем определения по меньшей мере один раз последовательности в геномной ДНК и определения по меньшей мере один раз последовательности в РНК указанного эталонного образца и/или указанного опухолевого образца. Например, путем определения вариаций между повторностями эталонного образца, такого как образец зародышевой линии, может быть оценена предполагаемая степень ложноположительных (FDR) соматических мутаций как статистическая величина. Технические повторы образца должны генерировать идентичные результаты, и любая выявляемая мутация в таком «сравнении аналогичных» является ложноположительной. В частности, для определения степени ложных результатов для выявления соматических мутаций в опухолевом образце относительно эталонного образца может быть использован технический повтор эталонного образца в качестве эталона для оценки числа ложноположительных результатов. Кроме того, различные качественные критерии (например, охват или качество SNP) могут быть объединены в единый показатель качества с использованием подхода машинного обучения. Для данной соматической вариации могут учитываться все другие вариации с превышением показателя качества, что позволяет ранжировать все вариации в наборе данных.
В контексте настоящего изобретения термин «РНК» относится к молекуле, которая содержит по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток и предпочтительно полностью или в значительной степени состоит из рибонуклеотидных остатков. Термин «рибонуклеотид» относится к нуклеотиду с гидроксильной группой в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин «РНК» включает в себя двухнитевую РНК, однонитевую РНК, выделенную РНК, такую как частично или полностью очищенная РНК, практически чистую РНК, синтетическую РНК и полученную рекомбинантным путем РНК, такую как модифицированная РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать в себя добавление ненуклеотидного материала, например, к концу(ам) РНК или внутрь, например, к одному или нескольким нуклеотидам в РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК также могут содержать нестандартные нуклеотиды, такие как не встречающиеся в природе нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Такие измененные РНК могут быть названы аналогами или аналогами встречающейся в природе РНК.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
В соответствии с настоящим изобретением термин «РНК» включает в себя и предпочтительно относится к «mRNA». Термин «mRNA» означает «информационную РНК» и относится к «транскрипту», который образуется с использованием матричной ДНК и кодирует пептид или полипептид. Как правило, mRNA содержит 5'-UTR, кодирующую белок область, 3'-UTR и необязательно хвост поли(A). mRNA обладает исключительно ограниченным временем полужизни в клетках и . В контексте настоящего изобретения mRNA может быть образована путем  транскрипции из матричной ДНК. Метод  транскрипции известен специалисту. Например, имеется ряд коммерчески доступных наборов для  транскрипции.
В соответствии с настоящим изобретением стабильность и эффективность трансляции РНК могут быть модифицированы при необходимости. Например, РНК может быть стабилизирована, а ее трансляция усилена с помощью одной или нескольких модификаций, обладающих стабилизирующими эффектами и/или усиливающих эффективность трансляции РНК. Такие модификации описываются, например, в PCT/EP2006/009448, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Для усиления экспрессии РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, она может быть модифицирована по кодирующей области, т.е. последовательности, кодирующей экспрессированный пептид или белок, предпочтительно без изменения последовательности экспрессированного пептида или белка, так, чтобы повысить содержание GC для усиления стабильности mRNA и для осуществления оптимизации кодонов и, таким образом, усиления трансляции в клетках.
Термин «модификация» в контексте РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, включает в себя любую модификацию РНК, которая в природе не присутствует в указанной РНК.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения РНК, используемая в соответствии с настоящим изобретением, не имеет открытые 5'-трифосфаты. Удаление таких открытых 5'-трифосфатов может быть достигнуто с помощью обработки РНК фосфатазой.
РНК в соответствии с настоящим изобретением может иметь модифицированные рибонуклеотиды для усиления ее стабильности и/или снижения цитотоксичности. Например, согласно одному варианту осуществления в РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, 5-метилцитидин замещает частично или полностью, предпочтительно полностью, цитидин. В качестве альтернативы или дополнения, согласно одному варианту осуществления в РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, псевдоуридин замещает частично или полностью, предпочтительно полностью, уридин.
7
in vivo
Согласно одному варианту осуществления термин «модификация» относится к обеспечению РНК с 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа. Термин «5'-кэп» относится к кэп-структуре, находящейся на 5'-конце молекулы mRNA и, как правило, состоящей из гуанозинового нуклеотида, соединенного с mRNA посредством необычной 5'-5'-трифосфатной связи. Согласно одному варианту осуществления этот гуанозин является метилированным в 7-положении. Термин «обычный 5'-кэп» относится к встречающемуся в природе 5'-кэпу РНК, предпочтительно к 7-метилгуанозиновому кэпу (mG). В контексте настоящего изобретения термин «5'-кэп» включает в себя аналог 5'-кэпа, который напоминает кэп-структуру РНК и является модифицированным с приобретением способности стабилизировать РНК и/или усиливать трансляцию РНК, если прикреплен к ней, предпочтительно  и/или в клетке.
in vitro
in vitro
Обеспечение РНК с 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа может быть достигнуто с помощью  транскрипции матричной ДНК в присутствии указанного 5'-кэпа или аналога 5'-кэпа, при этом указанный 5'-кэп котранскрипционно включается в создаваемую нить РНК, или РНК может быть создана, например, с помощью  транскрипции, а 5'-кэп может быть присоединен к РНК после транскрипции с использованием ферментов кэппирования, например, ферментов кэппирования вируса осповакцины.
РНК может содержать дополнительные модификации. Например, дополнительной модификацией РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, может быть удлинение или усечение встречающегося в природе хвоста поли(A) или изменение 5'- или 3'-нетранслируемых областей (UTR), такое как введение UTR, которая не связана с кодирующей областью указанной РНК, например, обмен имеющейся 3'-UTR или вставка одной или нескольких, предпочтительно двух, копий 3'-UTR, полученной из гена глобина, такого как альфа2-глобин, альфа1-глобин, бета-глобин, предпочтительно бета-глобин, более предпочтительно человеческий бета-глобин.
РНК, имеющая незамаскированную последовательность поли-A, транслируется более эффективно, чем РНК, имеющая замаскированную последовательность поли-A. Термин «хвост поли(А)» или «последовательность поли-A» относится к последовательности остатков аденила (A), которые, как правило, локализуются на 3'-конце молекулы РНК, а термин «незамаскированная последовательность поли-A» означает, что последовательность поли-A на 3'-конце молекулы РНК, заканчивается на A последовательности поли-A и не сопровождается нуклеотидами, отличными от A, расположенными на 3'-конце, т.e. нижележащие, последовательности поли-A. Кроме того, длинная последовательность поли-A из приблизительно 120 пар оснований дает в результате оптимальную стабильность транскрипта и эффективность трансляции РНК.
Таким образом, для усиления стабильности и/или экспрессии РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, она может быть модифицирована так, чтобы присутствовать в сочетании с последовательностью поли-A, предпочтительно имеющей в длину 10-500, более предпочтительно 30-300, еще более предпочтительно 65-200 и особенно 100-150 аденозиновых остатков. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления последовательность поли-A имеет в длину около 120 аденозиновых остатков. Для дальнейшего усиления стабильности и/или экспрессии РНК, используемой в соответствии с настоящим изобретением, последовательность поли-A может быть замаскирована.
Кроме того, включение 3'-нетранслируемой области (UTR) в 3'-нетранслируемую область молекулы РНК может приводить к усилению эффективности трансляции. Синергетический эффект может быть достигнут путем включения двух или более таких 3'-нетранслируемых областей. 3'-нетранслируемые области могут быть аутологичными или гетерологичными по отношению к РНК, в которую их вводят. Согласно одному конкретному варианту осуществления 3'-нетранслируемую область получают из гена β-глобина человека.
Комбинация описанных выше модификаций, т.e. включение последовательности поли-A, снятие маскировки с последовательности поли-A и включение одной или нескольких 3'-нетранслируемых областей, оказывает синергетическое влияние на стабильность РНК и усиливает эффективность трансляции.
Термин «стабильность» РНК относится к «времени полужизни» РНК. Термин «время полужизни» относится к периоду времени, который необходим для элиминирования половины активности, количества или числа молекул. В контексте настоящего изобретения время полужизни РНК является показателем стабильности указанной РНК. Время полужизни РНК может влиять на «продолжительность экспрессии» РНК. Можно предположить, что РНК, имеющая длительное время полужизни, будет экспрессироваться в течение продолжительного периода времени.
Конечно, если в соответствии с настоящим изобретением желательно снизить стабильность и/или эффективность трансляции РНК, то можно модифицировать РНК так, чтобы препятствовать функции описанных выше элементов, усиливающих стабильность и/или эффективность трансляции РНК.
Термин «экспрессия» используется в соответствии с настоящим изобретением в его наиболее общем значении и включает в себя продуцирование РНК и/или пептидов, полипептидов или белков, например, путем транскрипции и/или трансляции. Что касается РНК, термин «экспрессия» или «трансляция» относится, в частности, к продуцированию пептидов, полипептидов или белков. Также он предусматривает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Более того, экспрессия может быть временной или стабильной.
В соответствии с настоящим изобретением термин «экспрессия» также включает в себя термин «аберрантная экспрессия» или «аномальная экспрессия». Термин «аберрантная экспрессия» или «аномальная экспрессия» означает в соответствии с настоящим изобретением, что экспрессия изменяется, предпочтительно усиливается, по сравнению с эталоном, например, состояние у субъекта, не имеющего заболевания, ассоциированного с аберрантной или аномальной экспрессией определенного белка, например, опухолевого антигена. Усиление экспрессии относится к усилению по меньшей мере на 10%, в частности, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100% или больше. Согласно одному варианту осуществления экспрессия обнаруживается только в больной ткани, тогда как экспрессия в здоровой ткани подавляется.
Термин «специфически экспрессированный» означает, что белок, по сути, экспрессируется только в определенных ткани или органе. Например, опухолевый антиген, специфически экспрессированный в слизистой оболочке желудка, означает, что указанный белок главным образом экспрессируется в слизистой оболочке желудка и не экспрессируется в других тканях или не экспрессируется в других типах ткани или органа в значительной степени. Таким образом, белок, который экспрессируется исключительно в клетках слизистой оболочки желудка и в значительно меньшей степени в любой другой ткани, такой как яичко, специфически экспрессируется в клетках слизистой оболочки желудка. Согласно некоторым вариантам осуществления, опухолевый антиген также может быть специфически экспрессирован при нормальных условиях в более чем одном типе ткани или органа, например, в 2 или 3 типах ткани или органа, но предпочтительно не более чем в 3 различных типах ткани или органа. В этом случае опухолевый антиген затем специфически экспрессируется в этих органах. Например, если опухолевый антиген экспрессируется при нормальных условиях предпочтительно в равной степени в легком и желудке, то указанные опухолевый антиген специфически экспрессируется в легком и желудке.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, при котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Затем РНК может быть транслирована в белок. В соответствии с настоящим изобретением термин «транскрипция» включает в себя « транскрипцию», при этом термин « транскрипция» относится к процессу, при котором РНК, в частности, mRNA,  синтезируется в бесклеточной системе, предпочтительно с использованием соответствующих клеточных экстрактов. Предпочтительно, для образования транскриптов применяются клонирующие векторы. Эти клонирующие векторы, как правило, называются транскрипционными векторами и в соответствии с настоящим изобретением охватываются термином «вектор». В соответствии с настоящим изобретением РНК, используемая в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представляет собой  транскрибированную РНК (IVT-RNA) и может быть получена путем  транскрипции соответствующей матричной ДНК. Промотором для контроля транскрипции может быть любой промотор для любой РНК-полимеразы. Конкретными примерами РНК-полимераз являются T7, T3 и SP6 РНК-полимеразы. Предпочтительно,  транскрипция в соответствии с настоящим изобретением контролируется промотором T7 или SP6. Матричная ДНК для  транскрипции может быть получена с помощью клонирования нуклеиновой кислоты, в частности, cDNA, и введения ее в соответствующий вектор для  транскрипции. cDNA может быть получена с помощью обратной транскрипции РНК.
Термин «трансляция» в соответствии с настоящим изобретением относится к процессу в рибосомах клетки, с помощью которого нить матричной РНК управляет сборкой последовательности аминокислот с получением пептида, полипептида или белка.
Последовательности контроля экспрессии или регуляторные последовательности, которые в соответствии с настоящим изобретением могут быть функционально связаны с нуклеиновой кислотой, могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность и регуляторная последовательность связываются вместе «функционально», если они связаны вместе ковалентно так, что транскрипция или трансляция кодирующей последовательности находится под контролем или под влиянием регуляторной последовательности. Если кодирующая последовательность подлежит трансляции в функциональный белок, с функциональной связью регуляторной последовательности с кодирующей последовательностью, то индуцирование регуляторной последовательности приводит к транскрипции кодирующей последовательности, не вызывая сдвига рамки считывания в кодирующей последовательности или неспособности кодирующей последовательности транслироваться в желаемый белок или пептид.
Термин «последовательность контроля экспрессии» или «регуляторная последовательность» включает в себя в соответствии с настоящим изобретением промоторы, связывающиеся с рибосомой последовательности и другие контрольные элементы, которые контролируют транскрипцию нуклеиновой кислоты или трансляцию желаемой РНК. Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения регуляторные последовательности могут быть контролируемыми. Точная структура регуляторных последовательностей может варьировать в зависимости от вида или в зависимости от клеточного типа, но, как правило, содержит 5'-нетранскрибируемые, а также 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые вовлекаются в инициацию транскрипции или трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэппирующая последовательность, CAAT-последовательность и т.п. В частности, 5'-нетранскрибируемые регуляторные последовательности содержат промоторную область, которая включает в себя промоторную последовательность для транскрипционного контроля функционально связанного гена. Регуляторные последовательности также могут содержать энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности.
in vitro
Предпочтительно, в соответствии с настоящим изобретением РНК, подлежащую экспрессии в клетке, вводят в указанную клетку. Согласно одному варианту осуществления способов в соответствии с настоящим изобретением РНК, которая подлежит введению в клетку, получают путем  транскрипции соответствующей матричной ДНК.
В соответствии с настоящим изобретением термины, такие как «способная к экспрессии РНК» и «кодирующая РНК», используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и по отношению к конкретному пептиду или полипептиду они означают, что РНК, если присутствует в соответствующем окружении, предпочтительно в клетке, может быть экспрессирована с получением указанного пептида или полипептида. Предпочтительно, РНК в соответствии с настоящим изобретением способна взаимодействовать с механизмом клеточной трансляции с обеспечением пептида или полипептида, который он способен экспрессировать.
Термины, такие как «перенос», «введение» или «трансфекция», используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к введению нуклеиновых кислот, в частности, экзогенных или гетерологичных нуклеиновых кислот, в частности, РНК, в клетку. В соответствии с настоящим изобретением клетка может формировать часть органа, ткани и/или организма. В соответствии с настоящим изобретением введение нуклеиновой кислоты достигается либо в виде свободной нуклеиновой кислоты, либо в комбинации с реагентом введения. Предпочтительно, введение нуклеиновой кислоты осуществляют в форме свободных нуклеиновых кислот. Предпочтительно, РНК вводят в комбинации со стабилизирующими веществами, такими как ингибиторы РНКазы. Настоящее изобретение также относится к повторному введению нуклеиновых кислот в клетки для обеспечения длительной экспрессии в течение продолжительных периодов времени.
Клетки могут быть трансфицированы с любыми носителями, с которыми РНК может быть ассоциирована, например, путем формирования комплексов с РНК или формирования везикул, в которых РНК заключается или инкапсулируется, с получением в результате повышенной стабильности РНК по сравнению со свободной РНК. Носители, применимые в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя, например, содержащие липид носители, такие как катионные липиды, липосомы, в частности, катионные липосомы, а также мицеллы и наночастицы. Катионные липиды могут формировать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. В соответствии с настоящим изобретением может быть использован любой катионный липид.
in vivo
Предпочтительно, введение РНК, которая кодирует пептид или полипептид, в клетку, в частности, в клетку, находящуюся , приводит в результате к экспрессии указанного пептида или полипептида в клетке. Согласно конкретным вариантам осуществления нацеливание нуклеиновых кислот на конкретные клетки является предпочтительным. Согласно таким вариантам осуществления носитель, который применяют для введения нуклеиновой кислоты в клетку (например, ретровирус или липосома), представляет собой нацеливающуюся молекулу. Например, молекула, такая как антитело, которая является специфической для поверхностного мембранного белка на целевой клетке, или лиганд для рецептора на целевой клетке могут быть включены в носитель нуклеиновой кислоты или могут быть связаны с ним. В случае введения нуклеиновой кислоты с помощью липосом белки, связанные с поверхностным мембранным белком, который ассоциируется с эндоцитозом, могут быть включены в состав липосомы для обеспечения нацеливания и/или поглощения. Такие белки охватывают капсидные белки или их фрагменты, которые являются специфическими для определенного типа клеток, антитела против белков, которые являются интернализированными, белки, которые нацеливаются на внутриклеточное расположение и т.д.
Термин «клетка» или «клетка-хозяин» предпочтительно означает интактную клетку, т.e. клетку с интактной мембраной, которая не высвобождает свои нормальные внутриклеточные компоненты, такие как ферменты, органеллы или генетический материал. Интактная клетка предпочтительно представляет собой жизнеспособную клетку, т.e. живую клетку, способную выполнять свои нормальные метаболические функции. Предпочтительно, указанный термин в соответствии с настоящим изобретением относится к любой клетке, которая может быть трансформирована или трансфицирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Термин «клетка» включает в себя в соответствии с настоящим изобретением прокариотические клетки (например, E. coli) или эукариотические клетки (например, дендритные клетки, B-клетки, клетки CHO, клетки COS, клетки K562, клетки HEK293, клетки HELA, дрожжевые клетки и клетки насекомых). Экзогенная нуклеиновая кислота может находиться внутри клетки (i) свободно диспергированной как есть, (ii) включенной в рекомбинантный вектор или (iii) встроенной в геном клетки-хозяина или митохондриальную ДНК. Особенно предпочтительными являются клетки млекопитающих, такие как клетки от людей, мышей, хомяков, свиней, коз и приматов. Клетки могут быть получены из большого числа типов ткани и включают в себя первичные клетки и клеточные линии. Конкретные примеры включают в себя кератиноциты, лейкоциты периферической крови, стволовые клетки костного мозга и эмбрионные стволовые клетки. Согласно следующим вариантам осуществления клетка является антиген-презентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой, моноцитом или макрофагом.
Клетка, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно экспрессирует пептид или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой.
Термин «клональное размножение» относится к процессу, при котором определенный объект приумножается. В контексте настоящего изобретения данный термин предпочтительно используют в контексте иммунологической реакции, при которой лимфоциты стимулируются антигеном, пролиферируют, и амплифицируется специфический лимфоцит, распознающий указанный антиген. Предпочтительно, клональное размножение ведет к дифференцировке лимфоцитов.
Термины, такие как «снижение» или «ингибирование», относятся к способности вызывать общее уменьшение уровня предпочтительно на 5% или больше, на 10% или больше, на 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше. Термин «ингибировать» или подобные фразы включают в себя полное или практически полное ингибирование, т.e. снижение до нуля или практически до нуля.
Термины, такие как «повышение», «усиление», «способствование» или «пролонгирование», предпочтительно относятся к повышению, усилению, способствованию или пролонгированию приблизительно по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 100%, предпочтительно по меньшей мере на 200% и, в частности, по меньшей мере на 300%. Данные термины также могут относиться к повышению, усилению, способствованию или пролонгированию от нуля, или неизмеряемого, или невыявляемого уровня до уровня больше нуля или до уровня, который измеряется или выявляется.
Настоящее изобретение обеспечивает вакцины, такие как противораковые вакцины, разработанные на основе предпочтительно модифицированных белков или белковых фрагментов, или аминокислотных модификаций, прогнозируемых как применимые в иммунотерапии с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с настоящим изобретением термин «вакцина» относится к фармацевтическому препарату (фармацевтической композиции) или продукту, который при введении индуцирует иммунную реакцию, в частности, клеточную иммунную реакцию, которая распознает и атакует патоген или больную клетку, такую как раковая клетка. Вакцина может быть использована для предупреждения или лечения заболевания. Термин «персонализированная противораковая вакцина» или «индивидуализированная противораковая вакцина» относится к конкретному раковому больному и означает, что противораковая вакцина адаптирована к потребностям или специальным обстоятельствам отдельного ракового больного.
Согласно одному варианту осуществления вакцина, обеспеченная в соответствии с настоящим изобретением, может содержать пептид или полипептид, содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций, или один или несколько модифицированных пептидов, прогнозированных как применимые в иммунотерапии с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением, или нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, кодирующую указанный пептид или полипептид.
Противораковые вакцины, обеспеченные в соответствии с настоящим изобретением, при введении больному предпочтительно обеспечивают один или несколько Т-клеточных эпитопов, подходящих для стимуляции, примирования и/или размножения Т-клеток, специфических по отношению к больным клеткам больного, например, к опухоли больного. Т-клетки предпочтительно направлены против клеток, экспрессирующих антигены, из которых получены Т-клеточные эпитопы. Вакцины, описанные в настоящем документе, предпочтительно способны индуцировать или стимулировать клеточную реакцию, предпочтительно цитотоксическую Т-клеточную активность, против злокачественного заболевания, характеризующегося презентацией одного или нескольких ассоциированных с опухолью неоантигенов с MHC I класса. Вакцина, нацеливающаяся на специфические по отношению к злокачественной опухоли мутации, будет специфической для опухоли больного.
Вакцина, обеспеченная в соответствии с настоящим изобретением, относится к вакцине, которая при введении больному предпочтительно обеспечивает один или несколько Т-клеточных эпитопов, например, 2 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше, 25 или больше, 30 или больше и предпочтительно до 60, до 55, до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 Т-клеточных эпитопов, включающих в себя аминокислотные модификации, или модифицированные пептиды, прогнозируемые как иммуногенные с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением. Такие Т-клеточные эпитопы также в настоящем документе называют «неоэпитопами». Презентация этих эпитопов клетками больного, в частности, антиген-презентирующими клетками, предпочтительно дает в результате Т-клетки, нацеливающиеся на эпитопы при связывании с MHC и, таким образом, на опухоль больного, предпочтительно на первичную опухоль, а также на метастазы опухоли, экспрессирующие антигены, из которых получены Т-клеточные эпитопы, и презентирующие те же эпитопы на поверхности опухолевых клеток.
in vitro
in silico
in vitro
Способы в соответствии с настоящим изобретением могут предусматривать дополнительную стадию определения пригодности идентифицированных аминокислотных модификаций или модифицированных пептидов для противораковой вакцинации. Таким образом, дополнительные стадии могут предусматривать одно или несколько из следующего: (i) оценивание того, располагаются ли модификации в известных или прогнозируемых презентируемых MHC эпитопах, (ii)  и/или  тестирование того, располагаются ли модификации в презентируемых MHC эпитопах, например, тестирование того, являются ли модификации частями пептидных последовательностей, которые процессированы до презентируемых MHC эпитопов и/или представлены в виде таковых, и (iii)  тестирование того, являются ли предусматриваемые модифицированные эпитопы, в частности, при присутствии в контексте их природной последовательности, например, при фланкировании аминокислотными последовательностями, также фланкирующими указанные эпитопы во встречающемся в природе белке, и при экспрессии в антиген-презентирующих клетках, способными стимулировать Т-клетки, такие как Т-клетки больного, обладающие желаемой специфичностью. Каждая из таких фланкирующих последовательностей может содержать 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше и предпочтительно до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот и может фланкировать эпитопную последовательность на N-конце и/или C-конце.
Модифицированные пептиды, определяемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть ранжированы по их пригодности в качестве эпитопов для противораковой вакцинации. Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к ручному или компьютеризированному аналитическому процессу, в котором идентифицированное модифицированные пептиды анализируют и отбирают по их пригодности в отношении обеспечиваемой вакцины. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный аналитический процесс представляет собой процесс на основе вычислительного алгоритма. Предпочтительно, указанный аналитический процесс предусматривает определение и/или ранжирование эпитопов согласно прогнозированию их способности быть иммуногенными.
Неоэпитопы, идентифицированные в соответствии с настоящим изобретением и обеспечиваемые с помощью вакцины в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представлены в форме полипептида, содержащего указанные неоэпитопы, такие как полиэпитопный полипептид или нуклеиновая кислота, в частности, РНК, кодирующая указанный полипептид. Кроме того, неоэпитопы могут быть представлены в полипептиде в форме вакцинной последовательности, т.e. представлены в контексте их природной последовательности, например, фланкированной аминокислотными последовательностями, также фланкирующими указанные эпитопы во встречающемся в природе белке. Каждая из таких фланкирующих последовательностей может содержать 5 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше и предпочтительно до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот и может фланкировать эпитопную последовательность на N-конце и/или C-конце. Таким образом, вакцинная последовательность может содержать 20 или больше, 25 или больше, 30 или больше, 35 или больше, 40 или больше и предпочтительно до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот. Согласно одному варианту осуществления неоэпитопы и/или вакцинные последовательности располагаются на одной линии с полипептидом от головы до хвоста.
Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006)
Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004)
(Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993)
Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005)
a
b
c
d
e
Согласно одному варианту осуществления неоэпитопы и/или вакцинные последовательности разделяются линкерами, в частности, нейтральными линкерами. Термин «линкер» в соответствии с настоящим изобретением относится к пептиду, добавленному между двумя пептидными доменами, такими как эпитопы или вакцинные последовательности, для соединения указанных пептидных доменов. Не существует конкретного ограничения в отношении линкерной последовательности. Однако предпочтительным является то, что линкерная последовательность уменьшает стерическое затруднение между двумя пептидными доменами, является хорошо транслируемой и поддерживает или позволяет процессирование эпитопов. Кроме того, линкер не должен содержать или содержать исключительно мало элементов иммуногенной последовательности. Линкеры предпочтительно не должны создавать неэндогенные неоэпитопы, подобные создаваемым из соединительного шва между соседними неоэпитопами, которые могут вызывать нежелательные иммунные реакции. Поэтому, полиэпитопная вакцина предпочтительно должна содержать линкерные последовательности, которые способны снижать число нежелательных связывающихся с MHC соединительных эпитопов.  и  показали, что богатые глицином последовательности нарушают протеасомное процессирование, и, таким образом, применение богатых глицином линкерных последовательностей действует с минимизацией числа содержащих линкеры пептидов, которые могут быть процессированы протеасомой. Кроме того, наблюдали, что глицин ингибирует сильное связывание в связывающих MHC положениях бороздки . обнаружили, что аминокислоты глицин и серин, включенные в аминокислотную последовательность, дают в результате более гибкий белок, который более эффективно транслируется и процессируется протеасомой, что обеспечивает лучший доступ к кодируемым неоэпитопам. Каждый линкер может содержать 3 или больше, 6 или больше, 9 или больше, 10 или больше, 15 или больше, 20 или больше и предпочтительно до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот. Предпочтительно линкер обогащен аминокислотами глицин и/или серин. Предпочтительно, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% аминокислот линкера составляют глицин и/или серин. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления линкер в значительной степени состоит из аминокислот глицин и серин. Согласно одному варианту осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (GGS)(GSS)(GGG)(SSG)(GSG), в которой a, b, c, d и e независимо представляют собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, и при этом a + b + c + d + e отличается от 0 и предпочтительно составляет 2 или больше, 3 или больше, 4 или больше, или 5 или больше. Согласно одному варианту осуществления линкер содержит последовательность, описанную в настоящем документе, в том числе линкерные последовательности, описанные в примерах, такие как последовательность GGSGGGGSG.
in vitro
in vitro
Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления полипептид, включающий в себя один или несколько неоэпитопов, такой как полиэпитопный полипептид в соответствии с настоящим изобретением, вводят больному в форме нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, такой как  транскрибированная или синтетическая РНК, которая может быть экспрессирована в клетках больного, таких как антиген-презентирующие клетки, для продуцирования полипептида. Настоящее изобретение также относится к введению одного или нескольких мультиэпитопных полипептидов, которые для цели настоящего изобретения, охватываются термином «полиэпитопный полипептид», предпочтительно в форме нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, такой как  транскрибированная или синтетическая РНК, которая может быть экспрессирована в клетках больного, таких как антиген-презентирующие клетки, для продуцирования одного или нескольких полипептидов. В случае введения более чем одного мультиэпитопного полипептида неоэпитопы, обеспечиваемые разными мультиэпитопными полипептидами могут быть разными или частично перекрывающимися. После представления в клетках больного, таких как антиген-презентирующие клетки, полипептид в соответствии с настоящим изобретением процессируется с продуцированием неоэпитопов, идентифицируемых в соответствии с настоящим изобретением. Введение вакцины, обеспеченной в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно обеспечивает презентируемые MHC I класса эпитопы, которые способны вызывать реакцию CD8+ хелперных Т-клеток против клеток, экспрессирующих антигены, из которых получены презентируемые MHC эпитопы. Введение вакцины, обеспеченной в соответствии с настоящим изобретением, также может обеспечивать презентируемые MHC II класса эпитопы, которые способны вызывать реакцию CD4+ Т-клеток против клеток, экспрессирующих антигены, из которых получены презентируемые MHC эпитопы. Кроме того, введение вакцины, обеспеченной в соответствии с настоящим изобретением, может обеспечивать один или несколько неоэпитопов (в том числе известных неоэпитопов и неоэпитопов, идентифицированных в соответствии с настоящим изобретением), а также один или несколько эпитопов, не содержащих специфические по отношению к злокачественной опухоли соматические мутации, но являющиеся экспрессированными раковыми клетками и предпочтительно индуцирующие иммунную реакцию против раковых клеток, предпочтительно специфическую по отношению к злокачественной опухоли иммунную реакцию.
Вакцина, обеспеченная в соответствии с настоящим изобретением, может быть рекомбинантной вакциной.
Термин «рекомбинантный» в контексте настоящего изобретения означает «полученный посредством генетической инженерии». Предпочтительно, «рекомбинантный объект», такой как рекомбинантный полипептид, в контексте настоящего изобретения не встречается в природе, и предпочтительно является результатом комбинации объектов, таких как последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот, которые в природе не объединяются. Например, рекомбинантный полипептид в контексте настоящего изобретения может содержать некоторые аминокислотные последовательности, такие как неоэпитопы или вакцинные последовательности, полученные из разных белков или разных частей одного и того же белка, слитые вместе, например, пептидными связями или соответствующими линкерами.
Используемый в настоящем документе термин «встречающийся в природе» относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (в том числе в вирусах) и могут быть выделены из природного источника, а также которые не могут быть целенаправленно модифицированы человеком в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Средства и композиции, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения субъекта с заболеванием, например, с заболеванием, характеризующимся наличием больных клеток, экспрессирующих антиген и презентирующих его фрагмент. Особенно предпочтительными заболеваниями являются злокачественные заболевания. Средства и композиции, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы в иммунизации или вакцинации для предупреждения заболевания, описанного в настоящем документе.
Термин «заболевание» относится к аномальному состоянию, которое поражает организм индивидуума. Заболевание зачастую расценивается как медицинское состояние, ассоциированное со специфическими симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими от внешнего источника, например, инфекционное заболевание, или оно может быть вызвано внутренними дисфункциями, например, аутоиммунные заболевания. В отношении людей термин «заболевание» часто используют более широко, чтобы ссылаться на любое состояние, которое вызывает боль, дисфункцию, дистресс, социальные проблемы или смерть пораженного индивидуума, или подобные проблемы для тех, кто контактирует с индивидуумом. В таком более широком смысле это иногда включает в себя повреждения, инвалидности, расстройства, синдромы, инфекции, изолированные симптомы, девиантное поведение и атипичные вариации структуры и функции, тогда как в других контекстах и для других целей они могут рассматриваться как отличимые категории. Заболевания обычно затрагивают людей не только физически, но и эмоционально, поскольку заражение и жизнь со многими заболеваниями могут изменить взгляд на жизнь и индивидуальные особенности личности.
Термин «нормальный» относится к здоровому состоянию или к состояниям у здорового субъекта или в здоровой ткани, т.е. к непатологическим состояниям, при этом термин «здоровый» предпочтительно означает не являющийся злокачественным.
Термин «ассоциированное с антигеном заболевание» или «вовлекающее антиген заболевание» относится к любому заболеванию, которое вовлекает антиген, например, заболевание, которое характеризуется наличием антигена или клеток, экспрессирующих антиген. Вовлекающее антиген заболевание может быть инфекционным заболеванием, аутоиммунным заболеванием или злокачественным заболеванием, или просто злокачественной опухолью. Как упоминалось выше, антиген может быть ассоциированным с заболеванием антигеном, таким как ассоциированный с опухолью антиген, вирусным антигеном или бактериальным антигеном.
Термин «вовлекающее экспрессирующие антиген клетки заболевание» в соответствии с настоящим изобретением означает, что выявляется экспрессия антигена в клетках больных ткани или органа. Экспрессия в клетках больных ткани или органа может быть усилена по сравнению с состоянием здоровых ткани или органа. Усиление относится к усилению по меньшей мере на 10%, в частности, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 10000% или даже больше. Согласно одному варианту осуществления экспрессию обнаруживают только в больной ткани, тогда как в здоровой ткани экспрессия подавляется. В соответствии с настоящим изобретением заболевания, вовлекающие или являющиеся ассоциированными с экспрессирующими антиген клетками, включают в себя злокачественные заболевания.
Термин «инфекционное заболевание» относится к любому заболеванию, которое может быть передано от индивидуума к индивидууму или от организма к организму и вызывается микробным агентом (например, вирусная инфекция верхних дыхательных путей). Инфекционные заболевания известны в уровне техники и включают в себя, например, вирусное заболевание, бактериальное заболевание или паразитарное заболевание, заболевания, которые вызываются вирусом, бактерией и паразитом, соответственно. В этом отношении инфекционным заболеванием может быть, например, гепатит, передающиеся половым путем заболевания (например, хламидиоз или гонорея), туберкулез, HIV/синдром приобретенного иммунного дефицита (AIDS), дифтерия, гепатит B, гепатит C, холера, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), птичий грипп и грипп.
Термин «аутоиммунное заболевание» относится к любому заболеванию, при котором возникает иммуногенная (т.e. иммунной системы) реакция на некоторый компонент своей собственной ткани. Другими словами, иммунная система утрачивает свою способность распознавать некоторую ткань или систему в организме как собственную, нацеливается на нее и атакует ее, как будто она является чужеродной. Аутоиммунные заболевания могут быть классифицированы на те, при которых поражается преимущественно один орган (например, гемолитическая анемия и аутоиммунный тиреоидит), и те, при которых процесс аутоиммунного заболевания распространяется на многие ткани (например, системная красная волчанка). Например, считается, что рассеянный склероз вызывается Т-клетками, атакующими оболочки, которые окружают нервные волокна головного мозга и спинного мозга. Это приводит в результате к потере координации, слабости и нечеткому зрению. Аутоиммунные заболевания известны в уровне техники и включают в себя, например, тиреоидит Хашимото, заболевание Грейвса, волчанку, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, гемолитическую анемию, аутоиммунный тиреоидит, системную красную волчанку, целиакию, болезнь Крона, колит, сахарный диабет, склеродермию, псориаз и т.п.
Термины «злокачественное заболевание» или «злокачественная опухоль» относятся к физиологическому состоянию у индивидуума или описывают таковое, которое, как правило, характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры злокачественных опухолей включают в себя без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретно, примеры таких злокачественных опухолей включают в себя злокачественную опухоль кости, злокачественную опухоль крови, злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль кожи, злокачественную опухоль головы или шеи, меланому кожи или внутриглазную меланому, злокачественную опухоль матки, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль прямой кишки, злокачественную опухоль анальной области, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль толстой кишки, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль матки, карциному половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль тонкого кишечника, злокачественную опухоль эндокринной системы, злокачественную опухоль щитовидной железы, злокачественную опухоль паращитовидной железы, злокачественную опухоль надпочечника, саркому мягкой ткани, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль почки, почечноклеточную карциному, карциному почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (CNS), нейроэктодермальную злокачественную опухоль, опухоли спинного мозга, глиому, менингиому и аденому гипофиза. Термин «злокачественная опухоль» в соответствии с настоящим изобретением также включает в себя метастазы злокачественной опухоли.
В соответствии с настоящим изобретением термин «опухоль» или «опухолевое заболевание» относится к аномально растущим клеткам (называемым неопластическими клетками, онкогенными клетками или опухолевыми клетками), предпочтительно образующим вздутие или повреждение. Термин «опухолевая клетка» означает аномальную клетку, которая растет за счет быстрой, неконтролируемой клеточной пролиферации и продолжает расти после прекращения действия стимулов, которые инициировали новообразование. Опухоли демонстрируют частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью и обычно формируют отдельную массу ткани, которая может быть или доброкачественной, предраковой или злокачественной.
Для целей настоящего изобретения термины «злокачественная опухоль» и «злокачественное заболевание» используют взаимозаменяемо с терминами «опухоль» и «опухолевое заболевание».
Термин «метастазис» означает распространение раковых клеток из их первоначального участка в другую часть организма. Формирование метастазиса является очень сложным процессом и зависит от отсоединения клеток злокачественного новообразования от первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проникновения через эндотелиальные базальные мембраны с попаданием в полость организма и сосуды, а затем после переноса кровью, инфильтрации целевых органов. Наконец, рост новой опухоли, т.e. вторичной опухоли или метастатической опухоли, на целевом участке зависит от ангиогенеза. Опухолевый метастазис часто возникает даже после удаления первичной опухоли, поскольку опухолевые клетки или компоненты могут оставаться и развивать метастатический потенциал. Согласно одному варианту осуществления термин «метастазис» в соответствии с настоящим изобретением относится к термину «отдаленный метастазис», означающему метастазис, который отдален от первичной опухоли и системы регионарных лимфатических узлов.
Клетки вторичной или метастатической опухоли подобны таковым в первоначальной опухоли. Это означает, что, например, если злокачественная опухоль яичника метастазирует в печень, то вторичная опухоль состоит из аномальных клеток яичника, а не аномальных клеток печени. Тогда опухоль в печени называют метастатической злокачественной опухолью яичника, а не злокачественной опухолью печени.
(Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904)
Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239
Термин «циркулирующие опухолевые клетки» или «CTC» относится к клеткам, которые отсоединились от первичной опухоли или опухолевых метастаз и циркулируют в кровотоке. CTC могут служить источником для последующего роста дополнительных опухолей (метастазиса) в различных тканях. Циркулирующие опухолевые клетки обнаруживаются с частотой порядка 1-10 CTC на мл цельной крови у больных метастатическим заболеванием. Были разработаны способы исследования для выделения CTC. В уровне техники описаны некоторые способы исследования для выделения CTC, например, методики, при которых используют тот факт, что эпителиальные клетки обычно экспрессируют белок клеточной адгезии EpCAM, который отсутствует в нормальных клетках крови. Иммуномагнитный захват на основе гранул предусматривает обработку проб крови антителом против EpCAM, который конъюгирован с магнитными частицами, с последующим отделением целевых клеток в магнитном поле. Выделенные клетки затем окрашивают антителом против другого эпителиального маркера - цитокератина, а также общего лейкоцитарного маркера CD45, чтобы отличить редкие CTC от загрязняющих белых кровяных клеток. Этот надежный и полуавтоматизированный подход идентифицирует CTC со средним выходом около 1 CTC/мл и чистотой 0,1% . Во втором способе выделения CTC применяют устройство для захвата CTC на основе микрожидкости, которое предусматривает протекание цельной крови через камеру с 80000 встроенных микростолбиков, которым придали функциональность путем покрытия антителом против EpCAM. Затем CTC окрашивают вторичными антителами либо против цитокератина, либо против специфических по отношению к ткани маркеров, таких как PSA в злокачественной опухоли предстательной железы или HER2 в злокачественной опухоли молочной железы, и визуализируют с помощью автоматизированного сканирования микростолбиков в нескольких плоскостях по трехмерным координатам. CTC-чипы способны идентифицировать цитокератин-позитивные циркулирующие опухолевые клетки у больных со средним выходом 50 клеток/мл и чистотой, варьирующей от 1 до 80% (). Другая возможность выделения CTC заключается в использовании теста циркулирующих опухолевых клеток (CTC) CellSearch™ от Veridex, LLC (Raritan, NJ), при котором захватывают, идентифицируют и подсчитывают CTC в пробирке с кровью. Система CellSearch™ является одобренным Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) методом для подсчета CTC в цельной крови, который основан на комбинации иммуномагнитного мечения и автоматизированной цифровой микроскопии. Существуют и другие способы для выделения CTC, описанные в литературе, все из которых могут быть использованы в сочетании с настоящим изобретением.
Рецидив или повторение происходит, когда человека снова поражает состояние, которое поражало его в прошлом. Например, если больной страдал от опухолевого заболевания, получил успешное лечение указанного заболевания, и у него снова развивается указанное заболевание, то указанное недавно развившееся заболевание можно рассматривать как рецидив или повторение. Однако в соответствии с настоящим изобретением рецидив или повторение опухолевого заболевания может, но не обязательно, возникать на участке исходного опухолевого заболевания. Таким образом, например, если больная страдала от опухоли яичника и получала успешное лечение, то рецидивом или повторением может быть появление опухоли яичника или появление опухоли на участке, отличном от яичника. Рецидив или повторение опухоли также включают в себя ситуации, при которых опухоль возникает на участке, отличном от участка первоначальной опухоли, а также на участке первоначальной опухоли. Предпочтительно, первоначальной опухолью, по поводу которой больной получал лечение, является первичная опухоль, а опухоль на участке, отличном от участка первоначальной опухоли, является вторичной или метастатической опухолью.
Термин «иммунотерапия» относится к лечению заболевания или состояния путем индуцирования, усиления или подавления иммунной реакции. Иммунотерапевтические методы, разработанные для индуцирования или амплификации иммунной реакции, классифицируют как активационные методы иммунотерапии, тогда как методы иммунотерапии, которые уменьшают или подавляют иммунную реакцию, классифицируют как подавляющие методы иммунотерапии. Термин «иммунотерапия» включает в себя антигенную иммунизацию, или антигенную вакцинацию, или противоопухолевую иммунизацию, или противоопухолевую вакцинацию. Термин «иммунотерапия» также относится к манипуляции с иммунными реакциями так, что несоответствующие иммунные реакции модулируют в более соответствующие в контексте аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, аллергии, сахарный диабет или рассеянный склероз.
Термины «иммунизация» или «вакцинация» описывают процесс введения антигена индивидууму с целью индуцирования иммунной реакции, например, по терапевтическим или профилактическим причинам.
Термин «терапевтическое лечение» или просто «лечение» относится к какому-либо лечению, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни индивидуума. Указанное лечение может устранять заболевание у индивидуума, останавливать или замедлять развитие заболевания у индивидуума, ингибировать или замедлять развитие заболевания у индивидуума, снижать частоту или тяжесть симптомов у индивидуума и/или снижать рецидив у индивидуума, который в настоящее время страдает заболеванием или который ранее страдал заболеванием.
Термин «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» относится к любому лечению, которое предназначено для предупреждения проявления заболевания у индивидуума. Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» используют в настоящем документе взаимозаменяемо.
Термины «защищать», «предупреждать», «профилактическое», «превентивное», или «защитное» относятся к предупреждению и/или лечению возникновения и/или развития заболевания, например, опухоли, у индивидуума. Например, профилактическое введение иммунотерапии, например, путем введения композиции, описанной в настоящем документе, может защищать получающего ее индивидуума от развития опухоли. Например, терапевтическое введение иммунотерапии, например, путем введения композиции, описанной в настоящем документе, может останавливать развитие заболевания, например, приводить к ингибированию прогрессирования/роста опухоли. Это предусматривает торможение прогрессирования/роста опухоли, в частности прерывает прогрессирование опухоли, что предпочтительно приводит к элиминированию опухоли. Терапевтическое введение иммунотерапии может защищать индивидуума, например, от распространения или метастазиса существующих опухолей.
Термин «индивидуум» или «субъект» относится к позвоночным, в частности, к млекопитающим. Например, млекопитающими в контексте настоящего изобретения являются люди, отличные от людей приматы, одомашненные млекопитающие, такие как собаки, кошки, овцы, крупный рогаты скот, козы, свиньи, лошади и т.д., лабораторные животные, такие как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.д., а также содержащиеся в неволе животные, такие как животные зоопарков. Термин «субъект» также относится к отличным от млекопитающих позвоночным, таким как птицы (в частности, одомашненные птицы, такие как куры, утки, гуси, индейки) и рыбы (в частности, искусственно выращенная рыба, например, лосось или сом). Используемый в настоящем документе термин «животное» также включает в себя людей. Предпочтительно, термин «больной» относится к больному индивидууму.
Средства, описанные в настоящем документе, могут быть введены в форме любой подходящей фармацевтической композиции. Термин «фармацевтическая композиция» относится к составу, содержащему терапевтически эффективное средство или его соль, предпочтительно вместе с фармацевтическими вспомогательными средствами, такими как буферы, консерванты и модификаторы тоничности. Указанная фармацевтическая композиция является применимой для лечения, предупреждения или снижения тяжести заболевания или нарушения путем введения указанной фармацевтической композиции индивидууму. Фармацевтическая композиция также известна в уровне техники как фармацевтический состав. Фармацевтическая композиция может быть введена локально или системно.
Термин «системное введение» относится к введению терапевтически эффективного средства так, что средство широко распределяется в организме индивидуума в значительных количествах и развивает биологический эффект. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным является то, что введение является парентеральным введением.
Термин «парентеральное введение» относится к введению терапевтически эффективного средства так, что средство не проходит кишечник. Термин «парентеральное введение» включает в себя внутривенное введение, подкожное введение, внутрикожное введение или внутриартериальное введение без ограничения.
Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят в мышечную ткань, такую как скелетная мышца. Внутримышечное введение, например, посредством внутримышечной инъекции, таким образом, является предпочтительным путем введения.
Введение может быть достигнуто различными путями. Согласно одному варианту осуществления композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят путем инъекции. Согласно предпочтительному варианту осуществления инъекцию осуществляют через иглу. В качестве альтернативы, может быть использована безыгольная инъекция.
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать по меньшей мере один адъювант. Термин «адъювант» относится к соединениям, которые при введении в комбинации с антигеном или антигенным пептидом индивидууму пролонгируют, или усиливают, или ускоряют иммунную реакцию. Предполагают, что адъюванты проявляют свою биологическую активность с помощью одного или нескольких механизмов, в том числе увеличение поверхности антигена, пролонгирование удержания антигена в организме, замедление высвобождения антигена, нацеливание на антиген макрофагов, усиление поглощения антигена, улучшение процессирования антигена, стимуляция высвобождения цитокина, стимуляция и активация иммунных клеток, таких как B-клетки, макрофаги, дендритные клетки, Т-клетки, и неспецифическая активация иммунных клеток. Адъюванты содержат разнородную группу соединений, таких как масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordetella pertussis) или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают в себя сапонины, неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, токоферол или квасцы без ограничения.
Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением, как правило, применяют в «фармацевтически эффективном количестве» и в «фармацевтически приемлемом препарате».
Термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, которое достигает желаемой реакции или желаемого эффекта отдельно или вместе со следующими дозами. В случае лечения конкретного заболевания желаемая реакция предпочтительно относится к ингибированию течения заболевания. Это предусматривает замедление прогрессирования заболевания и, в частности, прерывание или обращение прогрессирования заболевания. Желательной реакцией на лечение заболевания также может быть задержка проявления или предупреждение проявления указанного заболевания или указанного состояния. Эффективное количество композиций, описанных в настоящем документе, будет зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров больного, в том числе от возраста, физиологического состояния, размера и массы, длительности лечения, типа сопроводительной терапии (если имеется), конкретного пути введения и подобных факторов. Следовательно, вводимые дозы композиций, описанных в настоящем документе, могут зависеть от различий таких параметров. В случае, если реакция у больного не достаточна с начальной дозой, могут быть использованы более высокие дозы (или более эффективные дозы, достигаемые другим, более локализованным путем введения).
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичному материалу, который не влияет на действие активного компонента фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать соли, буферы, консерванты, носители и необязательно другие терапевтические средства. Предпочтительно, фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или вспомогательных средств.
Термин «вспомогательное средство» охватывает все вещества в фармацевтической композиции, которые не являются активными ингредиентами, такие как связующие, смазки, загустители, поверхностно-активные средства, консерванты, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители.
Термин «разбавитель» относится к разбавляющему и/или разжижающему средству. Более того, термин «разбавитель» включает в себя любую одну или несколько из среды, жидкости или твердой суспензии и/или среды смешивания.
Термин «носитель» относится к одному или нескольким совместимым твердым или жидким наполнителям или разбавителям, которые подходят для введения человеку. Термин «носитель» относится к натуральному или синтетическому, органическому или неорганическому компоненту, который объединяют с активным компонентом для облегчения применения активного компонента. Предпочтительно, компоненты-носители представляют собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, в том числе те, которые получают из минерального масла, животных или растений, такие как арахисовое масло, соевое масло, кунжутное масло, подсолнечное масло и т.д. Растворы солей и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве водных соединений-носителей.
Фармацевтически приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической отрасли и описываются, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Примеры подходящих носителей включают в себя, например, карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натрия карбоксиметилцеллюлозу, воск с низкой температурой плавления, масла какао и т.п. Примеры подходящих разбавителей включают в себя этанол, глицерин и воду.
Фармацевтические носители, вспомогательные средства или разбавители могут быть выбраны с позиции предназначенного пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать в качестве носителя(ей), вспомогательного средства(средств) или разбавителя(ей) или в дополнение к таковым любые подходящие связующее(ие), смазку(и), суспендирующее средство(а), покрывающее средство(а) и/или солюбилизирующее средство(а). Примеры подходящих связующих включают в себя крахмал, желатин, натуральные сахара, такие как глюкоза, безводная лактоза, свободно текучая лактоза, бета-лактоза, кукурузные подсластители, натуральные и синтетические смолы, такие как акациевая камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу и полиэтиленгликоль. Примеры подходящих смазок включают в себя олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. В фармацевтической композиции могут быть обеспечены консерванты, стабилизаторы, краски и даже ароматизаторы. Примеры консервантов включают в себя бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Также могут быть использованы антиоксиданты и суспендирующие средства.
Согласно одному варианту осуществления композицией является водная композиция. Водная композиция необязательно может содержать растворенные вещества, например, соли. Согласно одному варианту осуществления композиция имеет форму высушенной замораживанием композиции. Высушенную замораживанием композицию получают путем сушки замораживанием соответствующей водной композиции.
Средства и композиции, представленные в настоящем документе, могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими терапевтическими режимами, такими как хирургическое вмешательство, облучение, химиотерапия и/или трансплантация костного мозга (аутологичная, сингенная, аллогенная или неродственная).
Настоящее изобретение подробно описывается и иллюстрируется с помощью графических материалов и примеров, которые используются исключительно для иллюстративных целей и не являются ограничивающими. Благодаря настоящему описанию и примерам дополнительные варианты осуществления, которые также включены в настоящее изобретение, доступны квалифицированному специалисту.
Краткое описание графических материалов
фиг. 1
На белки опубликованных эпитопов в значительной степени обогащены в экзосомах и цитозоле по сравнению с рандомными пептидами (протеом).
фиг. 2
На гены опубликованных эпитопов значительно чаще обнаруживаются в базе данных SEREX по сравнению с рандомными пептидами.
ПРИМЕРЫ
nd
Методы и способы, используемые в настоящем документе, описываются в настоящем документе или выполняются путем, известным per se и описанным, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все способы, предусматривающие применение наборов и реагентов, осуществляются согласно информация изготовителя, если не указано иное.
Пример 1. Локализация белков, содержащих опубликованные эпитопы
Проверяли литературу для идентификации ограниченных MHC I класса мутантных неоэпитопов («опубликованные эпитопы», n = 129) и их локализацию сравнивали с рандомным образцом кодирующих белки генов («протеом», n = 500) (фиг. 1). Локализацию соответствующих генов определяли по базе данных генной онтологии (http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/). Более того, присутствие в экзосомах тестировали по базе данных ExoCarta (http://www.exocarta.org/). Как показано на фиг. 1, содержащие неоэпитопы гены в значительной степени обогащены в экзосомах, а также в цитозоле по сравнению с контрольными генами (точный критерий Фишера; p < 0,0001).
На второй стадии наличие генов опубликованных эпитопов в базе данных SEREX (V. Jongeneel, Cancer Immunity, Vol. 1, p. 3 (30 March 2001)) сравнивали с рандомными контрольными генами (фиг. 2). В базе данных SEREX перечисляются белки, которые, как известно, распознаются аутоантителами. Гены опубликованных эпитопов значительно чаще обнаруживались в базе данных SEREX по сравнению с рандомными пептидами (точный критерий Фишера; p < 0,0001).
Результаты, показанные на фиг. 1 и 2 указывают на то, что присутствие мутантных генов в экзосомах, цитозоле или в базе данных аутоантител является применимым параметром для прогнозирования значимых мутантных антигенов в иммунотерапии.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  БИОНТЭК РНА ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ГМБХ; ТРОН - ТРАНСЛАЦИОНАЛЕ ОНКОЛОГИ АН ДЕР
УНИФЕРЗИТЕТСМЕДИЦИН ДЕР ИОГАНН ГУТЕНБЕРГ-УНИФЕРЗИТЕТ МАЙНЦ
ГЕМАЙННЮТЦИГЕ ГМБХ
<120>  СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРИМЕНИМОСТИ БЕЛКОВ ИЛИ БЕЛКОВЫХ ФРАГМЕНТОВ
ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ
<130>  674-157 PCT2
<150>  PCT/EP2016/060897
<151>  2016-05-13
<160>  2
<170>  Патентная версия 3.5
<210>  1
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (1)..(3)
<223>  Часть последовательности, повторенная a раз, при этом a независимо
представляет собой   число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20
<220>
<221>  СМЕШ_ПРИЗНАК
<222>  (1)..(15)
<223>  a + b + c + d + e отличается от 0 и предпочтительно равняется 2 или
более, 3 или более, 4 или более, или 5 или более
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (4)..(6)
<223>  Часть последовательности, повторенная b раз, при этом b независимо
представляет собой  число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (7)..(9)
<223>  Часть последовательности, повторенная c раз, при этом c независимо
представляет собой   число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (10)..(12)
<223>  Часть последовательности, повторенная d раз, при этом d независимо
представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20
<220>
<221>  ПОВТОР
<222>  (13)..(15)
<223>  Часть последовательности, повторенная e раз, при этом e независимо
представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20
<400>  1
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
<210>  2
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  2
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5
<---