Инсулин-продуцирующие клетки в лечении инсулинозависимого сахарного диабета

инсулин-продуцирующие клетки в лечении инсулинозависимого сахарного диабета

М.Е. Шереметьева, Т.Б. Бухарова, Д.В. Гольдштейн Медико-генетический научный центр, Москва, Россия

-dependent diabetes mellitus

Insulin-producing cells in the treatment of insulin

M.Y. Sheremetieva, T.B. Bukharova, D.V. Goldstein Research Centre of Medical Genetics, Moscow, Russia

Эффективным методом лечения инсулинозависимого сахарного диабета, альтернативным гормонозаместитель-ной терапии, является трансплантация инсулин-продуциру-ющих клеток (ИПК). Донорские ß-клетки трансплантируются как в составе поджелудочной железы целиком, так и в виде изолированных островков Лангерганса . Однако применение метода ограничено недостатком донорского материала и необходимостью проведения пожизненной иммуносупрес-сивной терапии, пагубно сказывающейся на состоянии ослабленного организма больных диабетом . Альтернативный способ получения ИПК — дифференцировка из стволовых или прогениторных клеток . Способность к панкреатической дифференцировке выявлена у различных типов стволовых клеток . В настоящее время в качестве наиболее перспективного источника ИПК рассматривают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), включая те, которые получены из специализированных клеток самих пациентов . Такие ИПК, во-первых, могут быть получены в неограниченном количестве, а во-вторых, в случае аутогенной трансплантации в наименьшей степени подвергаются иммунной атаке со стороны реципиентов, тем самым давая возможность полностью отказаться от иммуносупрес-сивной терапии Внедрению ИПСК в клиническую практику препятствует то, что они способны провоцировать образование тератом в организме реципиентов, причём сохраняют эту способность даже после дифференцировки за счёт отдельных недифференцированных клеток, сохранившихся в популяции

Данный обзор посвящён современным протоколам получения ИПК из ИПСК, воспроизводящим этапы формирования ß-клеток при эмбриональном развитии . Рассмотрено применение для трансплантации ИПК иммунноизолиру-ющих контейнеров, полупроницаемые стенки которых, с одной стороны, защищают трансплантат от воздействия иммунной системы реципиента, а с другой, обеспечивают безопасность трансплантата для реципиента с точки зрения образования опухолей Описано использование ИПК, полученных из ИПСК, в качестве модельного объекта для изучения процессов, происходящих в ß-клетках в норме и при сахарном диабете

Ключевые слова: сахарный диабет, ß-клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, иммуноизо-ляция, клеточная терапия

An effective treatment for insulin-dependent diabetes mellitus (DM), which provides an alternative to hormone replacement therapy, is transplantation of insulin-producing cells (iPCs). Donor p-cells are transplanted both in the form of a complete pancreas, or in the form of isolated islets of Langerhans . However, the application of this method is limited due to the lack of donor material and the need for lifelong immunosuppressive therapy that has a detrimental impact on the weakened DM patient's body .

An alternative method of obtaining iPCs is to differentiate stem or progenitor cells . Pancreatic differentiation capability has been demonstrated for various types of stem cells Currently, induced pluripotent stem cell (iPSC) are considered to be the most promising source of iPCs , including those obtained from mature cells of the patients themselves Firstly, such iPCs can be gained in unlimited quantities . Secondly, in the case of autologous transplantation they are least exposed to the recipient body's immune attack, thereby making it possible to completely discard immunosuppressive therapy . iPSCs introduction into clinical practice is hindered by the fact that they provoke the formation of teratomas in the recipient>s body . Moreover, they retain this ability even after differentiation because of a number of undifferentiated cells preserved in the population

This review focuses on contemporary protocols for obtaining iPCs from iPSCs These protocols mimic p-cells formation stages during embryonic development The review also covers the application of iPC immuno-isolating containers for transplantation Their semipermeable walls, on the one hand, protect the transplant from the recipient>s immune system, and on the other hand, they suppress the risk of the transplant causing tumor formation in addition, attention will be paid to the use of iPCs derived from iPSCs as a model object for studying the processes occurring in p-cells at normal circumstances as well as during DM

Keywords: diabetes mellitus, ß-cells, induced pluripotent stem cells, immunoisolation, cell therapy .

Введение

Распространение сахарного диабета (СД) в последние годы приобрело масштабы эпидемии . По данным Международной федерации диабета в 2014 г . в мире насчитывалось 387 млн больных, а к 2035 г . их количество возрастёт до 592 млн . В России зарегистрировано более 3,5 млн больных СД, однако реальное число, по некоторым оценкам, гораздо выше и может достигать 9 млн человек [1].

СД — тяжёлое заболевание, приводящее к резкому снижению качества жизни, развитию системных осложнений, инвалидизации и представляющее собой серьёзную медико-социальную проблему Выделяют два основных типа диабета СД 1 типа (СД-1) — заболевание, связанное с недостатком у

e-mail: m . e . sheremetieva@gmail . com

пациента р-кпеток поджелудочной железы вследствие разрушения последних, главным образом, за счет аутоиммунных механизмов . Инсулин перестаёт синтезироваться в достаточном количестве и требуется его искусственное введение . Чаще всего СД-1 развивается в детском, подростковом и молодом возрасте . Диабет 2 типа (СД-2) — хроническое заболевание неиммунной природы, которое чаще встречается у взрослых пациентов; с возрастом риск его возникновения увеличивается . Причина развития СД-2 — инсулинрезистентность периферических тканей организма. Выработка инсулина остаётся высокой на протяжении длительного времени, но не даёт необходимого физиологического эффекта, из-за чего происходит истощение

Р-клеток и также появляется потребность в искусственном введении инсулина [2].

Проблема лечения СД далека от решения . Поздняя диагностика и сложность физиологического контроля уровня глюкозы приводят к развитию отдаленных осложнений диабета, таких как нефропатия, ретинопатия, нейропатия, сердечно-сосудистые и другие заболевания. Применение препаратов инсулина кратковременного и пролонгированного действия, тщательный подбор режимов их введения и даже использование инсулиновой помпы далеко не всегда позволяют добиться адекватного контроля уровня глюкозы в крови, следствием чего являются повторяющиеся эпизоды острой гипергликемии [2].

Наиболее результативный метод лечения больных с тяжёлыми формами диабета — это трансплантация донорской поджелудочной железы, изолированных островков Лангерганса или выделенных из них р-клеток [3]. Трансплантация поджелудочной железы избавляет пациентов от искусственного введения инсулина на протяжении нескольких лет Однако такая операция представляет собой объёмное хирургическое вмешательство со смертностью от 1 до 3% и серьёзными осложнениями со стороны сердечно-сосудистой системы . Кроме того, в дальнейшем пациентам требуется пожизненная иммуносупрессивная терапия, поэтому трансплантация поджелудочной железы рекомендуется больным с тяжёлыми формами СД, такими как терминальная стадия диабетической нефропатии, лабильное течение заболевания, частые эпизоды тяжёлой гипогликемии и нарушение восприятия гипогликемии [4, 5].

трансплантация островков Лангерганса в настоящее время введена в клиническую практику в ряде стран Европы и Северной Америки. Данный способ хорошо зарекомендовал себя с точки зрения эффективности и безопасности для пациентов . Метод получения донорских островков Лангерганса отработан и стандартизирован [6]. Довольно продолжительного терапевтического эффекта при трансплантации изолированных островков удалось получить после того, как в клиническую практику был внедрён так называемый Эдмонтоновский протокол [7]. С помощью этого протокола достигнуты результаты, существенно превышающие предыдущие: возрастает уровень С-пептида, улучшаются показатели теста на толерантность к глюкозе, снижается уровень глико-зилированного гемоглобина и не повторяются эпизоды острой гликемии. Были предприняты попытки выделения р-клеток из островков Лангерганса с целью их дальнейшей экспансии in vitro, но они не увенчались успехом, поскольку эти клетки являются терминально дифференцированными таким образом использование р-кпеток для трансплантации наименее перспективно

Аллогенная пересадка островков Лангерганса или целой поджелудочной железы позволяет добиться заметного терапевтического эффекта, однако нехватка донорского материала так велика, что пациенты вынуждены ожидать операции на протяжении многих лет . Кроме того, для повышения эффективности трансплантации требуется оптимизация метода выделения донорских тканей, определение места трансплантации и выбора режима иммуносупрессии . Нельзя не учитывать и тот факт, что при аллогенных клеточных трансплантациях не исключена вероят-

ность контаминации вирусными и прионными возбудителями заболеваний [8]. Тем не менее, даже успешная трансплантация снимает потребность в инсулиновой терапии на ограниченное время: до 10 лет при трансплантации поджелудочной железы и до 5 лет при пересадке изолированных островков [9-11].

Таким образом, широкому распространению трансплантационных методов лечения СД мешают два обстоятельства: во-первых, ограниченное количество донорского материала, во-вторых, массивная иммуносупрессивная терапия, действующая губительно на ослабленный организм пациентов, но при этом не исключающая развития реакции отторжения организмом трансплантированных островков Лангерганса и поджелудочной железы [12].

Проблема, связанная с нехваткой донорского материала может быть решена, если использовать для трансплантации инсулин-продуцирующие клетки (ИПК), полученные в результате перепрограммирования стволовых/прогениторных клеток, количество которых неограниченно. В отличие от трансплантации аллогенных островков Лангерганса или р-кпеток, возможно получение ИПК из клеток самого пациента . Однако СД-1 имеет, как правило, аутоиммунную природу, поэтому время жизни трансплантированных аутогенных ИПК может быть недостаточным для эффективного применения . Выживаемость ИПК, также как и р-клеток без использования иммуносупрессии, можно обеспечить путем иммуноизоляции трансплантированных клеток с помощью полупроницаемых контейнеров (капсул).

Выделяют следующие способы получения ИПК [2, 11]:

1) дифференцировка стволовых клеток (СК), включая эмбриональные (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные (ИПСК);

2) трансдифференцировка клеток других типов, таких как гепатические, ацинарные и а-клетки;

3) дифференцировка панкреатических прогени-торных клеток;

4) экспансия собственных р-клеток пациента .

В настоящее время ИПСК рассматриваются как самый привлекательный объект для клеточной терапии, благодаря их высокой пластичности - способности формировать ткани всех трех зародышевых листков - и практически неограниченному пролифе-ративному потенциалу . При этом применение ИПСК свободно от этических ограничений, существующих для работы с ЭСК С тех пор, как впервые была показана возможность репрограммирования посредством активации экспрессии генов 0СТ4, SOX2, KLF4 и c-MYC [13, 14], ИПСК были получены из многих типов клеток [15]. ИПСК пригодны для ауто- и ал-логенных трансплантаций пациентам, а забор био-птата (например, небольшого фрагмента кожи) для их получения - малоинвазивная и безболезненная процедура [11]. В последнее время безопасность применения ИПСК в клинической практике была существенно повышена - разработаны методы получения ИПСК без инсерции транскрипционных факторов в геном — на основе вируса Сендай [16] и с использованием микроРНК [17, 18]. Кроме того, ведется разработка протоколов культивирования и дифференцировки ИПСК в «хепо-^ее»-условиях, что позволяет снизить иммуногенность трансплантата и риск контаминации (табл . 1) [19, 20].

Таблица 1. Культивирование ИПСК в «хепо^гее»-условиях

Компонент Стандартный протокол «Xeno-freex-протокол

Культуральная среда mTeSR-1 Essential 8, mTeSR-2

Подложка Матригель Рекомбинантный витронектин

Реагент для дезинтеграции Трипсин ЭДТА

Существует и другой аспект применения ИПСК — использование клеток на разных стадиях панкреатической дифференцировки для моделирования процессов, происходящих при развитии СД [11, 21]. Для этой цели подходят ИПСК, полученные как из клеток здоровых доноров, так и из клеток больных диабетом [22, 23].

Разработкой способов индукции дифференцировки ИПСК и СК других типов в ИПК занимаются ведущие лаборатории по всему миру. Однако большинство существующих протоколов не позволяют получить зрелые р-кпетки, способные к изменению уровня секреции инсулина в ответ на изменение уровня гликемии . В ряде случаев показано, что ИПК, прошедшие первичную панкреатическую дифферен-цировку, дозревают после трансплантации в организме реципиента [24]. В 2014 г . опубликованы две работы, в которых удалось дифференцировать ИПСК в ИПК, осуществляющие выброс инсулина при увеличении концентрации глюкозы в среде в нескольких последовательных циклах . Эти клетки весьма близки по своим свойствам к р-клеткам, выделенным из островков Лангерганса [25, 26]. Данные результаты дают надежду на скорое внедрение ИПК, полученных из ИПСК, в клиническую практику, и на прорыв в области лечения инсулинозависимого СД .

В данном обзоре рассматриваются методы получения ИПК путём дифференцировки ИПСК, а также макроинкапсуляция ИПК как способ повышения эффективности трансплантации ИПК для лечения больных СД .

Свойства р-клеток и панкреатическая

дифференцировка in vivo

Инсулин-продуцирующие р-клетки составляют основную массу эндокринной части поджелудочной железы и входят в состав островков Лангерганса

(60—70% от общего количества клеток в островках) . Единичные р-клетки могут быть расположены в составе ацинусов и протоков [27]. р-клетки поддерживают базальный уровень инсулина в крови, обеспечивают быстрое выделение накопленного инсулина и его синтез при повышении уровня глюкозы в крови Помимо инсулина, р-клетки выделяют в кровь в эк-вимолярном количестве С-пептид — полипептид, после отщепления которого от молекулы проинсулина образуется инсулин. Уровень С-пептида позволяет косвенно судить об инсулин-секретирующей способности р-клеток, поскольку не зависит от инсулина, вводимого извне [28].

В клетках протоков развивающейся поджелудочной железы человека ИПК можно обнаружить, начиная с 7-й нед . развития после оплодотворения [29]. Дифференцировка р-клеток — это сложный, тонко регулируемый процесс, в который вовлечено множество сигнальных путей и транскрипционных факторов (рис . 1) [30, 31]. Следует отметить, несмотря на то, что всеми авторами выделяются одни и те же этапы этого процесса, детальное его описание варьирует в разных источниках .

На первом этапе панкреатической дифференцировки вскоре после гаструляции и формирования из СК трёх зародышевых листков — эктодермы, мезодермы и энтодермы — происходит выделение дефинитивной энтодермы, клетки которой коэкспрес-сируют транскрипционные факторы FOXA1 и FOXA2 [30]. Отмечается также действие других факторов, например, WNT4, FGF4, NCAD, GOOSECOID [32]. Из клеток дефинитивной энтодермы затем формируются гастроинтестинальные органы: печень, лёгкие, тимус, дыхательный и пищеварительный тракты, поджелудочная железа

Второй важный этап дифференцировки — формирование примитивной кишечной трубки, дающей начало кишечнику В этом процессе участвуют

Рис. 1. Дифференцировка стволовых клеток в р-клетки (по [30] с изм . ):

ДЭ — дефинитивная эндодерма; ПКТ — первичная кишечная трубка; ЗПК — задняя передняя кишка; ПП — панкреатические прогениторные клетки

транскрипционные факторы PDX1 и PTFIa . Для клеток, экспрессирующих PDX1 (панкреатический дуоденальный гомеобокс 1), доказано их участие в формировании эндокринных и экзокринных компартментов [29]. Среди прочих факторов, влияющих на этот процесс, указывают FOXA4, SOX17, CXCR4, BMP2 и др . [32]. Клетки кишечной трубки при участии HNF1B и HNF4A дифференцируются в клетки передней кишки, которые и дают начало всем клеткам поджелудочной железы, включая инсулин-продуцирующие [32].

Панкреатические зачатки на ранних стадиях развития соседствуют с кардиальной мезенхимой и ното-хордом, синтезирующими морфогены, направляющие дальнейшие этапы дифференцировки клеток поджелудочной железы: активин А, факторы роста фибро-бластов и костные морфогенетические факторы [30].

В панкреатических зачатках формируются муль-типотентные прогениторные клетки, которые затем превращаются во все типы клеток поджелудочной железы Для клеток, которым предстоит стать эндокринными, отмечают экспрессию PDX1, PTF1A, CPA1 и c-MYC. Дифференцировка эндокринных клеток требует ингибирования сигнального пути Notch, что ведёт к усилению экспрессии транскрипционного фактора NGN3 (нейрогенин 3) с последующей активацией нескольких регуляторов, включая NKX2.2, NKX6.1, NEUROD1, PAX4, PAX6, ISL1 [30, 32]. Согласованное последовательное действие этих факторов приводит к получению ИПК .

Однако дифференцировка ß-клеток на этом не заканчивается . На следующих стадиях развития, должен сформироваться механизм, позволяющий клеткам изменять уровень секреции инсулина в соответствии с уровнем гликемии При созревании ß-клеток увеличивается экспрессия следующих ключевых факторов [30]:

1) INS1 (препроинсулин и инсулин, определяющие функцию ß-клеток);

2) GLUT2 и GK (транспортер глюкозы 2 и глюкоки-наза, участвующие в системе восприятия глюкозы);

3) PDX1, MAFA и NEUROD (транскрипционные факторы, участвующие в развитии ß-клеток и их функционировании);

4) CHGA, CHGB и IAPP (хромогранины и амилоидный полипептид, участвующие в формировании секреторных гранул инсулина);

5) SUR1 и KIR6.1 (гены каналов калия и кальция, участвующие в секреции инсулина);

6) гены пируваткарбоксилазы, митохондриальной глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и других ферментов, участвующих в формировании специфического фенотипа ß-клеток .

В организме взрослого человека ß-клетки de novo практически не образуются, что и приводит к их быстрой гибели при аутоиммунной атаке и развитию сахарного диабета 1 типа. Образование новых ß-клеток, как путём дифференцировки клеток-предшественников, так и путём деления имеющихся ß-клеток, продемонстрировано для взрослых мышей и для крыс [33].

Дифференцировка индуцированных

плюрипотентных стволовых клеток

в инсулин-продуцирующие клетки in vitro

Существует два основных подхода к репрограм-мированию СК: с помощью их генетической модификации и путём подбора селективных сред. Нередко при разработке протоколов дифференцировки используют комбинацию этих подходов, что справедливо и для получения ИПК из ИПСК и ЭСК .

В большинстве исследований превращение плюрипотентных СК в ИПК происходит в результате последовательного действия индукторов цитодиффе-ренцировки, которые добавляют в среду в различных комбинациях [34—44] (табл . 2, 3).

Таблица 2. Факторы, применяемые для дифференцировки ИПСК в ИПК in vitro (по [25, 31, 34-44]]

Название

Описание

Роль в дифференцировке ИПСК в ИПК

Активин А Цитокин, агонист рецепторов активина,

участвует во многих сигнальных путях

Дифференцировка дефинитивной энтодермы, усиление экспрессии PDX1

Бетацеллюлин Агонист рецепторов ERBB1 (EGFR) и ERBB4

Усиление экспрессии PDX1 и NKX6-1 в эндокринных клетках

Гепарин

Гликозаминогликан, участвует во многих сигнальных путях

Усиление экспрессии NKX6-1 в эндокринных клетках

Дорсоморфин

Ретиноевая кислота

Ингибитор, блокирующий BMP-сигналинг. Агонист рецепторов RAR

Увеличение выхода PDX1-позитивных клеток.

Индукция и усиление экспрессии PDX1 и NKX6-1

Форсколин

Активатор аденилатциклазы

Усиление дифференцировки PDX1-позитивных клеток в ИПК

Циклопамин Ингибитор сигнального пути Hedgehog Эксендин-4 Агонист рецептора GLP1R

Усиление экспрессии PDX1, NEUROD1 и NGN3 Усиление экспрессии PDX1

Окончание таблицы 2

Название

Описание

Роль в дифференцировке ИПСК в ИПК

Alk5i

DAPT

B27

CMRL

FGF

GLP-1 HGF

ILV

IGF-1 KGF

SANT1

SB431542

T3

XXI

Ингибитор А1к5-рецептора, ингибирует сигнальный путь TGFß/Активин

Ингибитор у-секретазы, ингибирует сигнальный путь Notch

Бессывороточная добавка в среду для культивирования

CHIR99021 Ингибитор киназы GSKa/ß, агонист

сигнального пути ß-катенин/Wnt

Среда для культивирования

Факторы роста фибробластов, агонисты тирозинкиназных рецепторов FGFR

Агонист рецептора GLP1R

Фактор роста гепатоцитов

( - )-Индолактам V

Инсулиноподобный фактор роста 1 Агонист рецептора FGFR2b

LDN193189 Ингибитор рецептора BMP1R

Noggin Полипептид, ингибитор сигнальных белков

семейства TGFp

PdbU Форбол-12,13-дибутират, активатор

протеинкиназы C

Ингибитор сигнального пути Hedgehog

Ингибитор рецептора TGFP-R1

Трийодотиронин,агонист тироидного рецептора

Ингибитор у-секретазы, ингибирует сигнальный путь Notch

Индукция эндокринной дифференцировки, усиление экспрессии NKX6-1, улучшение функции ИПК

Индукция эндокринной дифференцировки

Созревание панкреатических предшественников

Дифференцировка дефинитивной энтодермы

Усиление экспрессии инсулина, упаковка инсулина в секреторные гранулы, улучшение функции ИПК

Дифференцировка клеток первичной кишки, стимуляция панкреатической дифференцировки

Усиление экспрессии PDX1

Усиление продукции инсулина дифференцированными ИПК

Дифференцировка PDXI-позитивных панкреатических предшественников.

Улучшение функции ИПК

Улучшение выживания и пролиферации клеток, усиление экспрессии PDX1 и NKX6-1

Усиление экспрессии PDX1

Усиление экспрессии PDX1, FOXA2, HNF6, SOX9

Усиление экспрессии PDX1

Усиление экспрессии PDX1 и NKX6-1

Индукция экспрессии NGN3

Усиление экспрессии инсулина и улучшение функции ИПК

Индукция эндокринной дифференцировки

Wnt3A

Агонист сигнального пути ß-катенин/Wnt

Дифференцировка дефинитивной энтодермы

Таблица 3. Обзор существующих протоколов панкреатической дифференцировки ИПСК и ЭСК

Авторы Этап 1 Этап 2 Этап 3 Этап 4 Этап 5 Этап 6 Этап 7

K.A. Активин А 0,2% БСА 2% БСА 1% B27 1% B27 1% B27

D'Amour Wnt3A Активин А FGF10 РК ±Эксендин-4 ±Эксендин44

с соавт. (2006) Циклопамин Циклопамин ±DAPT ±IGF-1

FGF10 ±FGF

E. Kroon Активин А 0,2% БСА 2% БСА 1% B27 1% B27

c соавт. (2008) Wnt3A Активин А KGF РК Циклопамин Ноггин

S. Chen Активин А 0,2% БСА 2% БСА 1% B27 1% B27 1% B27 1% B27

с соавт. Wnt3A Активин А FGF10 РРК FGF10 Эксендин-4 HGF

(2009) Циклопамин FGF10 Циклопамин ILV DAPT IGF-1

T. Thatava Активин А 0,2% БСА 2% БСА B27 B27 B27 B27

с соавт. Wnt3A Активин А FGF10 FGF10 FGF10 DAPT HGF

(2011) Циклопамин Циклопамин РК ILV GLP-1 GLP-1 GLP-1 IGF-1

Y Kunisada 2% БСА 2% БСА 1% B27 1% B27

с соавт. (2012) Активин А CHIR99021 Активин А РК Дорсоморфин SB431542 Форсколин Alk5i

A. Rezania 2% БСА 2% БСА B27 B27 В27 B27

с соавт. Активин А FGF7 FGF7 Alk5i Alk5i

(2011) Wnt3A FGF2 Циклопамин Циклопамин Noggin РК DAPT Noggin РК

M.C. Nostro Активин А FGF10 B27 B27

с соавт. (2011) Noggin Циклопамин РК

БСА — бычий сывороточный альбумин . Активин А и ретиноевая кислота (РК) выделены жирным шрифтом; * Полные названия и функции факторов цитодифференцировки указаны в табл . 2 .

Детальное описание больших и малых молекул, направляющих процесс дифференцировки ИПСК в Р-клетки, представлено в обзоре S . Kumar с соавт . (2014) [31].

Общим для всех методов является использование активина А и ретиноевой кислоты [43]. Воздействие активина А на недифференцированные клетки приводит к дифференцировке энтодермы; последующая обработка ретиноевой кислотой — к индукции дифференцировки по панкреатическому пути [42]. Оба индуктора обладают системным действием, являются компонентами многих сигнальных путей, в том числе активируют экспрессию PDX1 .

В ряде случаев усиление специфических транскрипционных факторов проводят за счёт прямого введения в клетку белков или соответствующих им генов, что делает процесс более эффективным В первую очередь это касается фактора PDX1, который при дифференцировке in vivo играет важную роль как на стадии формирования панкреатических прогениторов, так и при созревании р-кпеток [45— 50]. Сверхэкспрессия генов Pdx1 и Ngn3 при акти-вин-индуцированной панкреатической дифференци-

ровке ЭСК мыши приводила к резкому увеличению количества полученных инсулин-продуцирующих клеток [46]. Трансдукция белком Р0Х1 ИПСК человека стимулировала их превращение в эндокринные панкреатические клетки-предшественники, усиливая экспрессию NGN3 [48]. Для эффективной диффе-ренцировки также применяли трансдукцию ЭСК и ИПСК мыши белками Pdx1, NeuroD и MafA [50]. В экспериментах с ЭСК человека было отмечено стимулирующее действие таких факторов роста, как ВМР4, bFGF [51] и FGF4 [52].

Опубликованы исследования, в которых для запуска панкреатической дифференцировки в ИПСК используют микроРНК . Лентивирусная трансдукция т^-375 позволила получить функционально активные ИПК, способные к глюкозо-зависимой секреции инсулина и демонстрирующие высокий уровень экспрессии маркеров панкреатической дифференциров-ки [53] Другая группа исследователей в качестве фактора дифференцировки применила комбинацию т^-375 и т^-186, что также привело к получению ИПК, способных изменять уровень секреции инсулина в ответ на изменение уровня гликемии [54]. В

качестве эффективного фактора панкреатической дифференцировки используют также miR-7, помещённую в клетки при помощи химической транс-фекции [55].

В качестве других факторов, которые влияют на эффективность формирования из ИПСК зрелых Р-кпеток, может быть, например, концентрация О2 [56]. Обнаружено, что культивирование клеток в дифференцировочной среде при повышенном содержании О2 приводит к подавлению гена Hes1, усилению Ngn3, активации сигнального пути Wnt — и, в конечном итоге, к увеличению количества ИПК, полученных по протоколу К . А . D'Amour (2006) [34].

Ряд авторов указывают на то, что эффективность панкреатической дифференцировки ИПСК повышается при культивировании в 3D-условиях [25, 57—59]. ИПК после трансплантации под капсулу почки мышам с диабетом, индуцированным стреп-тозотоцином, формировали васкуляризованный объёмный органоид, в котором сохранялась экспрессия инсулина [60]. В недавнем исследовании А . Shaer с соавт . (2015) из ИПСК были получены ИПК в виде островково-подобных кластеров; эти кластеры обнаружили способность увеличивать секрецию инсулина в ответ на повышение концентрации глюкозы в среде, и могут служить модельным объектом для изучения дифференцировки ИПСК в ИПК [61].

Для дифференцировки ИПСК в ИПК также имеют значение свойства исходных ИПСК . Отмечается, что при получении ИПСК из клеток больных СД-1 свойства ИПК, дифференцированных из этих клеток, различаются у разных пациентов; это касается как генов плюрипотентности, так и генов маркеров панкреатической дифференцировки Для успешной дифференцировки ИПСК в глюкозо-зависимые ИПК необходимо, чтобы гены плюрипотентности были полностью неактивны [23]. В исследовании по перепрограммированию р-клеток человека в ИПСК Р-клетки приобретали маркеры плюрипотентных клеток и могли быть дифференцированы во все три зародышевых листка . Такие ИПСК обладали более выраженной способностью дифференцироваться в ИПК по сравнению с ИПСК, полученными не из Р-клеток того же индивидуума [62], что указывает на наличие эпигенетической памяти у ИПСК, способствующей их дифференцировке в ИПК

Различные группы исследователей предпринимают попытки получить ИПК из ИПСК в «xeno-freeB-условиях, что обусловлено требованиями по безопасности применения клеточных продуктов в медицинской практике Однако в большинстве опубликованных работ при культивировании ИПСК всё же использовали мышиные фибробласты либо при-

меняли бычью сыворотку в ходе дифференцировки . Информация о том, что полученные таким образом клетки не просто способны к синтезу инсулина, а близки по своим свойствам к зрелым бета-клеткам, в настоящее время отсутствует [19, 63, 64].

Все разрабатываемые протоколы получения ИПК так или иначе направлены на воспроизведение ре-гуляторного каскада, определяющего формирование Р-клеток при эмбриональном развитии . Эффективность дифференцировки оценивают по уровню экспрессии маркерных генов, таких как PDX1, INS1, SOX17, NGN3 и др .

Ключевым моментом оценки функциональной активности ИПК является их способность синтезировать и секретировать инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в среде . ИПК, полученные с помощью большинства протоколов, обычно являются полигормональными, то есть синтезируют одновременно инсулин и глюкагон или инсулин, глюкагон и соматостатин . Зачастую анализ показывает, что эти клетки не способны демонстрировать секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой, то есть не функционируют как зрелые р-клетки [11]. Однако есть и такие исследования, в которых удалось наработать достаточное количество моногормональных клеток, проявляющих чувствительность к глюкозе [39, 41, 45]. В некоторых случаях продемонстрировано дозревание ИПК до функционально активных Р-клеток in vivo после трансплантации экспериментальным животным . Однако и оно не всегда бывает успешным . В исследовании S . Pellegrini с соавт . (2015) показано, что ИПК после трансплантации под капсулу почки иммунодефицитным мышам со временем, наоборот, утрачивали способность синтезировать инсулин. Гистологический анализ выявил, что популяции трансплантированных клеток, помимо зрелых панкреатических, содержат плюрипотентные и нейрональные клетки [65].

Трансплантация клеток, способных не только к синтезу и секреции инсулина, но и к регуляции этих процессов в зависимости от концентрации глюкозы в среде — вопрос, принципиально важный с точки зрения разработки медицинских технологий

В 2014 г . опубликован протокол получения ИПК, чрезвычайно близких по своим свойствам к зрелым Р-клеткам, как по уровню секреции инсулина, так и по способности изменять этот уровень в ответ на изменение концентрации глюкозы, причём для одних и тех же клеток фиксировалось несколько циклов глюкозо-зависимого выброса инсулина [25]. Превращение ИПСК в ИПК достигалось путём последовательного многостадийного воздействия на клетки факторов цитодифференцировки

SANTl SANT1 Бетацеллюлин CMRL

LDN193189 ТЗ

PdbU XXI

Гепарин Alk5i

Рис. 2. Дифференцировка ИПК из ИПСК по протоколу Е . W . РадНиса с соавт . (2014) (по [25] с изм . ):

ДЭ — дефинитивная эндодерма; ПКТ — первичная кишечная трубка; ПП1, ПП2 — панкреатические прогениторные

клетки, стадии 1 и 2; ЭК — эндокринные клетки; ИПК — инсулин-продуцирующие клетки .

Полные названия и функции факторов цитодифференцировки указаны в табл 2

В этих ИПК наблюдали экспрессию панкреатических генов PDX1 и NKX6-1. Эти клетки были способны выбрасывать кальций в ответ на добавление в среду глюкозы, упаковывали инсулин в секреторные гранулы, секретировали инсулин в количествах, сопоставимых с таковыми у зрелых р-клеток, в ответ на множественные эпизоды добавления глюкозы, и, наконец, хорошо показали себя в экспериментах in vivo: после трансплантации их диабетическим мышам у последних снижался уровень гипергликемии Сходные результаты были продемонстрированы и другой группой исследователей [26]

В 2015 г . была опубликована работа, авторы которой выполнили сравнительную характеристику ИПК, полученных из ИПСК по разным протоколам [66] Однако в экспериментах in vivo не удалось обнаружить столь же обнадёживающие результаты, как в оригинальных исследованиях, из чего следует, что и эти протоколы нуждаются в дальнейшей оптимизации

Использование иммуноизолирующих

контейнеров для трансплантации ИПК

Усилить защиту трансплантированных клеток, как аллогенных, так и аутогенных, от иммунной атаки организма можно путём их инкапсуляции . Полупроницаемые стенки иммуноизолирующей капсулы будут пропускать инсулин и низкомолекулярные продукты обмена, но не пропустят целые клетки — как трансплантированные ИПК, так и компоненты иммунной системы реципиента

Иммуноизолирующие «приспособления» привлекают внимание исследователей уже многие десятилетия. Главная задача, стоящая перед разработчиками — добиться того, чтобы клетки внутри капсулы были в достаточной мере обеспечены веществами, необходимыми для поддержания их жизнедеятельности . Наиболее простой, на первый взгляд, способ заключения клеток в микрокапсулы, которые затем помещаются в кровеносное русло, чреват закупоркой кровеносных сосудов, повышением риска образования тромбов и невозможностью локализовать микрокапсулы в области введения Поэтому в последние годы усилия направлены на разработку экстраваскулярных приспособлений — макрокапсул . Такие макрокапсулы, во-первых, должны иметь небольшие объём и (или) толщину, обеспечивая доступ к питательным веществам и кислороду для всех клеток . Во-вторых, вокруг них должна образовываться капиллярная сеть . И, в-третьих, необходимо предотвращать формирование вокруг имплантата фиброзной капсулы, которая сведёт к нулю обмен веществ между клетками и организмом реципиента [67].

Степень васкуляризации трансплантированной макрокапсулы имеет исключительное значение для ее функционирования . Поэтому разрабатываются методы, стимулирующие ангиогенез в тканях, окружающих трансплантат: добавление в состав капсулы ангиогенных биологически-активных веществ, таких, как VEGF, FGF1, FGF2 и др , противовоспалительных агентов, а также использование в качестве главного компонента капсулы полимерных материалов, состав и структура которых сами по себе обладают способностью индуцировать неоваскуляризацию [67]. В качестве одного из основных факторов, стимулирующих образование новых кровеносных сосу-

дов, указывают гипоксию . Васкуляризация трансплантированной макрокапсулы определяется в значительной степени также и структурой поверхности ее внешнего слоя: высокопористые материалы обеспечивают лучшее прорастание капилляров и сосудов

Дополнительный аспект, который необходимо учитывать при разработке иммуноизолирующих приспособлений — это наличие и состав матрикса внутри капсулы, имитирующего межклеточную среду для повышения выживаемости клеток . Таким ма-триксом может быть, например, коллаген, фибрин и полисахариды (хитозан, декстран, альгинаты, ага-роза). Наиболее перспективным, с точки зрения использования в качестве материала внутреннего слоя капсул, представляется коллаген, поскольку именно он является природным матриксом для адгезии клеток различных типов, в том числе стволовых клеток и фибробластов [68].

В ряде западных лабораторий проводятся исследования, посвящённые трансплантации панкреатических клеток в иммуноизолирующих изделиях (табл . 4) [69]. Обычно в экспериментах используются камеры на основе политетрафлуороэтилена TheraCyte™ (TheraCyte ^с . , США). Такая камера представляет собой плоскую систему тонких полимерных биосовместимых мембран (рис . 3) . Толщина внутренней мембраны 30 мкм, наружной — 15 мкм [70], объём камер 5—20 мкл . Наружная мембрана обладает свойством индуцировать васкуляризацию в прилегающих к ней тканях Внутренняя мембрана непроницаема для клеток, помещённых внутрь капсулы . Обе мембраны свободно пропускают питательные вещества и терапевтической продукт . Размер пор внутренней мембраны 0,4 мкм [71], наружной, ламинирующей внутреннюю — 5 мкм [70]. Внутрь приспособления помещается 1—10 млн клеток [72] либо около 1000 островков Лангерганса [73]. Клетки загружаются в капсулу через специальное отверстие, которое затем заклеивают кремниевым клеем медицинского качества [74]

В настоящее время TheraCyte™ считается «золотым стандартом» в технологии макроинкапсулирования ИПК . Однако размер макрокапсулы позволяет поместить в нее небольшое количество клеток, которых не достаточно для достижения нормоглике-мии у крупных лабораторных животных и человека, поэтому требуется трансплантация нескольких таких устройств, что ограничивает клиническое применение этой технологии

Трансплантированные внутри контейнера островки Лангерганса долгое время сохраняли жизнеспособность и секретировали инсулин глюкозо-зави-симым образом, уменьшая симптомы заболевания у животных с индуцированным диабетом [74—76]. Полигормональные ИПК, введенные таким же образом, дозревали и начинали эффективно регулировать уровень глюкозы только через 2—3 мес . после трансплантации [71, 74, 76].

Было показано, что иммуноизолирующие камеры с политетрафторэтиленовыми мембранами позволяют успешно осуществлять не только аллогенные [73, 75], но и ксеногенные трансплантации . Крысиные островки Лангерганса, помещённые в подобную камеру и трансплантированные свиньям Синклера с индуцированным диабетом, приводили к восстановлению нормогликемии при отсутствии иммуносу-прессивной терапии [77]

Таблица 4. Разработка приспособлений для инкапсуляции ИПК: исторический аспект

Тип приспособления Материал,технология изготовления Компании

Экстраваскулярные микрокапсулы Альгинат Diamon Biotech, Connaught Lab., Cell Biotech, Transcell

Интраваскулярные микрокапсулы Альгинат, полые волокна Biohybrid

Микрокапсулы Альгинат/полиэтиленгликоль VivoRx, AmCyte

Микрокапсулы Альгинат TransTech, Encelle, Metabolex, Islet Tech, LivingCell Tech, Microlslet, Isler Sciences

Микрокапсулы Гидрогель Encapsulife

Интраваскулярные макрокапсулы Полые волокна Grace Biomedical

Экстраваскулярные макрокапсулы Полые волокна Grace Biomedical, Amicon, W R Grace, Circe Medical, Cytotherapeutics

Экстраваскулярные макрокапсулы «С минимальной поддержкой» Islet Sheet Med, Cerro Medical

Экстраваскулярные макрокапсулы «Плоский лист с поддержкой», альгинат BaxterHealthcare

Экстраваскулярные макрокапсулы «Плоский лист с поддержкой» Neocrin, Theracyte, Viacyte, Betalogic

Экстраваскулярные макрокапсулы Смешанный тип Gore Medical

Экстраваскулярные макрокапсулы Механический тип Beta O2

Использование технологий макроинкапсуляции позволит безопасно и эффективно трансплантировать клетки различных типов . В случае СД это могут быть как донорские островки Лангерганса (алло- и ксеногенные), так и ИПК, полученные путем репро-граммирования, в том числе из собственных клеток пациента . Такой подход может привести к созданию радикального способа лечения СД-1 и других заболеваний, обусловленных нарушением синтеза гормонов, так как технология макроинкапсулирования обеспечивает условия для более длительного, возможно, пожизненного функционирования трансплантированных гормон-продуцирующих клеток .

Заключение

В 2014 г . были опубликованы протоколы, которые позволяют получать из ИПСК ИПК, приближенные по своим свойствам к зрелым р-кпеткам . Такие клетки в ответ на многократное стимулирование глюкозой высвобождают инсулин из секреторных гранул, тем самым в полной мере реализуя свою физиологическую функцию . Эксперименты in vivo показали способность этих ИПК регулировать уровень глюкозы в крови животных с индуцированным СД [26].

Интенсивно ведутся разработки макроконтейнера, обеспечивающего, с одной стороны, выживаемость трансплантированных клеток, с другой, защиту организма реципиента от их потенциально возможного туморогенного и канцерогенного действия Данный эффект достигается за счёт полупроницаемости

Рис. 3. Иммуноизолирующий макроконтейнер Theracyte™. Принцип устройства

стенок контейнера, способных пропускать кислород, питательные вещества и инсулин, но препятствующих перемещению клеток как внутрь контейнера, так и наружу

В настоящее время компанией ViaCyte™ уже начаты клинические исследования (1/2 фаза) по трансплантации клеток в контейнере [78]

Несмотря на ряд нерешённых проблем в этой области, имеющиеся к настоящему времени результаты и объём накопленных данных позволяют надеяться, что в ближайшие годы в медицинской практике появится эффективный и относительно недорогой метод лечения инсулинозависимого СД с использованием ИПК, полученных из собственных клеток пациентов

ЛИТЕРАТУРА:

I. International Diabetes Federation . http://www . idf . org .

2 . Дедов И . И ., Лисуков И .А ., Лаптев Д . Н . Современные возможности применения стволовых клеток при сахарном диабете . Сахарный диабет 2014; 2: 20-8 .

3 . Barton F., Rickels M ., Alejandro R . et al . Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010 . Diabetes Care 2012; 35(7): 1436-45 .

4 . Lauria M . W ., Figueir J . M . , Machado L . J . C . et al . Metabolic long-term follow-up of functioning simultaneous pancreas-kidney transplantation versus pancreas transplantation alone: insights and limitations . Transplantation 2010; 89(1): 83-7 .

5 . White S . A. , Shaw J . A., Sutherland D . E . R . Pancreas transplantation . Lancet 2009; 373(9677): 1808-17 .

6 Rickels M R Recovery of endocrine function after islet and pancreas transplantation . Curr . Diab . Rep . 2012; 12(5): 587-96 .

7 Shapiro A , Lakey J , Ryan E et al Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen . N . Engl . J . Med . 2000; 343(4): 230-8 .

8 Mason C , Dunnill P Assessing the value of autologous and allogeneic cells for regenerative medicine . Regen Med . 2009; 4(6): 835-53

9 . Shapiro A . M ., Ricordi C ., Hering B . J . et al . International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation N Engl J Med 2006; 355: 1318-30 .

10 Meloche R M Transplantation for the treatment of type 1 diabetes . World J . Gastroenterol . 2007; 13(47): 6347-55 .

II. Nostro M . C ., Keller G . Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: potential for regenerative medicine Semin Cell Dev. Biol . 2012; 23(6): 701-10 .

12 Ryan E , Bigam D , Shapiro A Current indications for pancreas or islet transplant . Diabetes Obes . Metab . 2006; 8(1): 1-7 .

13 . Takahashi K ., Yamanaka S . Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors Cell 2006; 126(4): 663-76 .

14 . Takahashi K ., Tanabe K ., Ohnuki M . et al . Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors Cell 2007; 131(5): 861-72 .

15 Stadtfeld M , Hochedlinger K Induced pluripotency: history, mechanisms and applications . Genes Dev . 2010; 24(20): 2239-63 .

16 . Lieu P . T ., Fontes A ., Vemuri M . C . et al . Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus . Methods Mol . Biol . 2013; 997: 45-56 .

17 . Anokye-Danso F ., Trivedi C . M ., Juhr D . et al . Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency . Cell Stem Cell 2011; 8(4): 376-88 .

18 . Qaglayan E . S, Güran § . Importance of Myc-related microRNAs in induced pluripotency . Cell Biol . Int . 2015; 39(9): 987-94 .

19 Shahjalal H M , Shiraki N , Sakano D et al Generation of insulin-producing b-like cells from human iPS cells in a defined and completely xeno-free culture system . J . Mol . Cell Biol . 2014; 6(5): 394-408

20 . Chen G ., Gulbranson D . R . , Hou Z . et al . Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture . Nat . Methods 2011; 8(5): 424-29

21 Abdelalim E M , Bonnefond A , Bennaceur-Griscelli A et al Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes . Stem Cell Rev . 2014; 10(3): 327-37 .

22 Stepniewski J , Kachamakova-Trojanowska N , Ogrocki D et al Induced pluripotent stem cells as a model for diabetes investigation Sci Rep 2015; 5: 8597

23 . Thatava T ., Kudva Y. C ., Edukulla R . et al . Intrapatient variations in type 1 diabetes-specific iPS cells differentiation into insulin-producing cells . Mol . Ther. 2013; 21(1): 228-39 .

24 Abdelalim E M , Emara M M Advances and challenges in the differentiation of pluripotent stem cells into pancreatic ß-cells . World J . Stem Cells 2015; 7(1): 174-81.

25 Pagliuca F W , Millman J R , Gürtler M et al Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro . Cell 2014; 159(2): 428-39

26 . Rezania A ., Bruin J . E . , Arora P . et al . Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells . Nat. Biotechnol . 2014; 32(11): 1121-33 .

27 . Прощина А . Е ., Савельев С . В . Иммуногистохимическое исследование распределения а- и ß-клеток в разных типах островков

Лангерганса поджелудочной железы человека . Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2013; 155(6): 763-7 .

28 . Hoogwerf В . J ., Goetz F . С . Urinary C-peptide: a simple measure of integrated insulin production with emphasis on the effects of body size, diet, and corticosteroids . J . Clin . Endocrinol . Metab . 1983; 56(1): 60-7 .

29 . Jeon J ., Correa-Medina M ., Ricordi С . et al . Endocrine cell clustering during human pancreas development . J . Histochem . Cytochem . 2009; 57(9): 811-24 .

30 . Márquez-Aguirre A. L ., Canales-Aguirre A .A ., Padilla-Camberos E . et al . Development of the endocrine pancreas and novel strategies for p-cell mass restoration and diabetes therapy . Braz . J . Med . Biol . Res . 2015; 48(9): 765-76 .

31. Kumar S . S ., Alarfaj A .A ., Munusamy M .A . Recent developments in p-cell differentiation of pluripotent stem cells induced by small and large molecules . int . J . Mol . Sci . 2014; 15(12): 23418-47 .

32 Liew Ch -G Generation of insulin-producing cells from pluripotent stem cells: from the selection of cell sources to the optimization of protocols . Rev . Diabet Stud . 2010; 7(2): 82-92 .

33 . Петеркова В .А ., Лаптев Д . Н . Перспективы терапии, направленной на восстановление пула р-клеток, при сахарном диабете . Сахарный диабет 2009; 3: 6-9 .

34 . D'Amour K.A., Bang A. G ., Eliazer S . et al . Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells . Nat . Biotechnol . 2006; 24(11): 1392-401.

35 Jiang J , Au M , Lu K et al Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells . Stem Cells 2007; 25(8): 1940-53 .

36 . Shim J . H ., Kim S . E ., Woo D . H . et al . Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate Diabetologia 2007; 50(6): 1228-38 .

37 Kroon E , Martinson L A , Kadoya K et al Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucoseresponsive insulin-secreting cells in vivo . Nat . Biotechnol . 2008; 26(4): 443-52 .

38 Chen S , Borowiak M , Fox J L et al A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage Nat Chem . Biol . 2009; 5(4): 258-65 .

39 . Kunisada Y., Tsubooka-Yamazoe N ., Shoji M . et al . Small molecules induce efficient differentiation into insulin-producing cells from human induced pluripotent stem cells . Stem Cell Res . 2012; 8(2): 274-84

40 . Nostro M . C . , Sarangi F ., Ogawa S . et al . Stage-specific signaling through TGFb family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells Development 2011; 138(5): 861-71.

41. Thatava T . , Nelson T . J . , Edukulla R . et al . indolactam V/GLP-1-mediated differentiation of human iPS cells into glucoseresponsive insulin-secreting progeny . Gene Ther . 2011; 18(3): 283-93 .

42 . Hosoya M . Preparation of pancreatic p-cells from human iPS cells with small molecules . islets 2012; 4(3): 249-52 .

43 Hosoya M , Kunisada Y , Kurisaki A et al induction of differentiation of undifferentiated cells into pancreatic beta cells in vertebrates . int . J . Dev . Biol . 2012; 56(5): 313-23 .

44 Rezania A , Riedel M , Wideman R D et al Production of functional glucagon-secreting a-cells from human embryonic stem cells . Diabetes 2011; 60(1): 239-47 .

45 . Федюнина И .А., Ржанинова А.А., Кириенко Е . Е . и соавт. Получение инсулинпродуцирующих клеток из разных популяций мультипотентных стромальных клеток пупочного канатика и жировой ткани человека Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; 1: 10-6 .

46 . Kubo A., Stull R ., Takeuchi M . et al . Pdx1 and Ngn3 overexpression enhances pancreatic differentiation of mouse ES cells derived endoderm population . PLoS One 2011; 6(9): e24058 .

47 . Xu H . , Tsang K . S ., Chan J . C . et al . The combined expression of Pdx1 and MafA with either Ngn3 of NeuroD improves the differentiation efficiency of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells Cell Transplant . 2013; 22(1): 147-58 .

48 Kaitsuka T , Noguchi H , Shiraki N et al Generation of functional insulin-producing cells from mouse embryonic stem cells through 804G cell-derived extracellular matrix and protein transduction of transcription factors . Stem Cells Transl . Med . 2014; 3(1): 114-27 .

49 . Qin Y ., Xiao L ., Zhan X . B . et al . Pdx1 and its role in activating Ngn3 and Pax6 to induce differentiation of iPSCs into islet p cells . Genet . Mol . Res . 2015; 14(3): 8892-900 .

50 . Wang L . , Huang Y . , Guo Q . et al . Differentiation of iPSCs into insulin-producing cells via adenoviral transfection of PDX-1, NeuroDI and MafA . Diabetes Res . Clin . Pract . 2014; 104(3): 383-92 .

51. Xu H ., Browning W ., Odorico J . Activin, BMB and FGF pathways cooperate to promote endoderm and pancreatic lineage cell differentiation from human embryonic stem cells . Mech . Dev . 2011; 128(7-10): 412-27 .

52 . Johannesson M ., Stählberg A., Ameri J . et al . FGF4 and retinoic acid direct differentiation of hESC into PDX1-expressing foregut endoderm in a time- and concentration-dependent manner PLoS One 2009; 4(3): e4794

53 Lahmy R , Soleimani M , Sanati M H et al miRNA-375 promotes beta pancreatic differentiation in human induced pluripotent stem (hiPS) cells . Mol . Biol . Rep . 2014; 41(4): 2055-66 .

54 . Shaer A ., Azarpira N ., Karimi M . H . Differentiation of human induced pluripotent stem cells into insulin-like cell clusters with miR-186 and miR-375 by using chemical transfection Appl Biochem Biotechnol . 2014; 174(1): 242-58 .

55 Shaer A , Azarpira N , Karimi M H et al Differentiation of human-induced pluripotent stem cells into insulin-producing clusters by microRNA-7 . Exp . Clin . Transplant . 2015; [Epub ahead of print].

56 Hakim F , Kaitsuka T , Raeed J M et al High oxygen condition facilitates the differentiation of mouse and human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors and insulin-producing cells J Biol Chem . 2014; 289(14): 9623-38 .

57 . Takeuchi H ., Nakatsuji N ., Suemori H . Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture . Sci . Rep . 2014; 4: 4488 .

58 . Bose B ., Shenoy S . P . In vitro differentiation of pluripotent stem cells into functional ß islets under 2D and 3D culture conditions and in vivo preclinical validation of 3D islets . Methods Mol . Biol . 2016; 1341: 257-84 .

59 Shim J H , Kim J , Han J et al Pancreatic islet-like three-dimensional aggregates derived from human embryonic stem cells ameliorate hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic mice Cell Transplant . 2015; 24(10): 2155-68 .

60 . Raikwar P . S . , Kim E . M . , Sivitz W . I . et al . Human iPS cell-derived insulin producing cells form vascularized organoids under the kidney capsules of diabetic mice . PLoS One 2015; 10(1): e0116582.

61. Shaer A ., Azarpira N ., Vahdati A . et al . Differentiation of human-induced pluripotent stem cells into insulin-producing clusters Exp . Clin . Transplant . 2015a; 13(1): 68-75 .

62 Bar-Nur O , Russ H A , Efrat S et al Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells Cell Stem Cell 2011; 9(1): 17-23 .

63 . Micallef S . J ., Li X ., Schiesser J . V . et al . INSGFP/w human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells . Diabetologia 2012; 55(3): 694-706 .

64 . Schulz T . C . , Young H .Y ., Agulnick A. D . et al . A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells . PLoS One 2012; 7(5): e37004 .

65 . Pellegrini S ., Ungaro F., Mercalli A. et al . Human induced pluripotent stem cells differentiate into insulin-producing cells able to engraft in vivo . Acta Diabetol . 2015; 52(6): 1025-35 .

66 . Rostovskaya M . , Bredenkamp N ., Smith A . Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells . Philos . Trans . R . Soc . Lond . B Biol Sci . 2015; 370(1680): 20140365

67 . Colton C . K . Oxygen supply to encapsulated therapeutic cells . Adv . Drug . Deliv . Rev . 2014; 67-68: 93-110 .

68 . de Vos P . , Lazarjani H .A ., Poncelet D . et al . Polymers in cell encapsulation from an enveloped cell perspective Adv Drug Deliv Rev . 2014; 67-68: 15-34 .

69 . Scharp D .W. , Marchetti P . Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution . Adv . Drug Deliv . Rev . 2014; 67-68: 35-73 .

70 Chen S H , Huang S C , Lui C C et al Effect of TheraCyte-encapsulated parathyroid cells on lumbar fusion in a rat model Eur Spine J . 2012; 21(9): 1734-9 .

71 Bruin J E , Rezania A , Xu J et al Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice . Diabetologia 2013; 56(9): 1987-98 .

72 Yakhnenko I , Wong W K , Katkov I I et al Cryopreservation of human insulin expressing cells macro-encapsulated in a durable therapeutic immunoisolating device theracyte Cryo Letters 2012; 33(6): 518-31.

73 Kumagai-Braesch M , Jacobson S , Mori H et al The TheraCyte™ device protects against islet allograft rejection in immunized hosts . Cell Transplant . 2013; 22(7): 1137-46 .

74 Kirk K , Hao E , Lahmy R et al Human embryonic stem cell derived islet progenitors mature inside an encapsulation device without evidence of increased biomass or cell escape Stem Cell Res 2014; 12(3): 807-14 .

75 . Sweet I . R ., Yanay O ., Waldron L . et al . Treatment of diabetic rats with encapsulated cells . J . Cell Mol . Med . 2008; 12(6B): 2644-50 .

76 . Lee S . H ., Hao E ., Savinov A . et al . Human ß-cell precursors mature into functional insulin-producing cells in an immunoisolation device: implications for diabetes cell therapies Transplantation 2009; 87(7): 983-91.

77 Neufeld T , Ludwig B , Barkai u et al The efficacy of an immunoisolating membrane system for islet xenotransplantation in minipigs . PLoS One 2013; 8(8): e70150 .

78 Viacyte, clinical trials http://viacyte com/clinical/clinical-trials

Поступила: 20.11.2015