Изучение длины теломер и колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови при криоконсервировании

Изучение длины теломер и колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови при криоконсервировании

Н.С. Карпова, К.М. Абдулкадыров, Е.А. Селиванов, В.А. Балашова

Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург

Investigation of telomere length and umbilical cord blood hematopoietic stem cells colony-forming potential in cryoconservation

N.S. Karpova, K.M. Abdulkadyrov, E.A. Selivanov, V.A. Balashova

Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology of the Russian Federal Bio-Medical Agency, Saint-Petersburg

Изучен пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) в зависимости от способа криоконсервирования. Определена длина теломер и колониеобразующая способность (КОС) ГСК ПК. Длина теломер измерена с использованием новейшего метода, сочетающего проточную цитометрию и флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH). Исследования выполнялись на проточном цитофлуориметре Cytomics FS-500 (Beckman Coulter, Швейцария). Для флуоресцентной гибридизации in situ использовался PNA-зонд, меченный FITC (DAKO, Дания). КОС ГСК ПК исследовалась в полной культуральной среде на основе метилцеллюлозы Н4435 MethoCult (StemCellTechnologies, Канада). Криоконсервирование образцов проводилось в программном замо-раживателе Planer и парах жидкого азота. Установлена корреляция между длиной теломер ГСК ПК и их КОС. При сравнении сохранности пролиферативных свойств ГСК ПК при криоконсервировании в программном замораживателе и парах жидкого азота доказано преимущество применения программного замораживателя для сохранения ГСК ПК. Таким образом, для криоконсервирования образцов ГСК ПК целесообразно использовать программный заморажи-ватель, так как при данном способе сохранения образцов клетки остаются жизнеспособными и функционально полноценными. Длина теломер может служить важным маркером сохранности пролиферативного потенциала ГСК ПК.

Ключевые слова: длина теломер, стволовые клетки, пуповинная кровь, криоконсервирование, колониеобразующая способность.

В клинической практике более двадцати лет используются трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), полученных из пуповинной крови (ПК) человека для лечения заболеваний системы крови и других заболеваний, при которых происходит угнетение гемопоэза [1].

В связи с увеличением количества трансплантаций ГСК пуповинной крови и расширением показаний к их клиническому применению проблема создания банков длительного хранения стволовых клеток является весьма актуальной [2—5]. Получение гемопо-этических клеток-предшественниц из костного мозга и периферической крови является сложной и дорогостоящей процедурой, связанной с вмешательством в здоровье донора, которое может приводить к нежелательным осложнениям. Процедура сбора пуповинной крови является безопасной и безболезненной, как для матери, так и для ребёнка, риск осложнений отсутствует. Широкомасштабный сбор клеток ПК и их хранение позволяет быстро осуществить подбор

e-mail: bloodscience@mail.ru

The study was focused on proliferative capacities of human hematopoietic cord blood stem cells at two different methods of cryopreservation. The proliferative potential was determined by measurement of telomere length and colony-forming cell assay. The telomere length was estimated by technique that combined flow cytometry and fluorescence in situ hybridization on Beckman Coulter Cytomics FS-500. We used the Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry for measuring telomeric sequences as well as MethoCult GF H4435 in colony-forming cell assays. The programmed Planer Cryo freezer and direct transfer into liquid nitrogen vapour were used for cryopreservation of samples. The correlation between telomere length and capacity of cells to forming colony after thawing were established. The programmed freezing showed advantage over freezing by direct transfer cells into liquid nitrogen vapour by better keeping of proliferative capacity hematopoietic cells.

Key words: telomere length, stem cells, cord blood, cryopreservation, colony-forming cell assays.

неродственного донора [6—9]. Вместе с тем, концентрация гемопоэтических стволовых и, возможно, примитивных стволовых клеток в одном образце ПК объемом 40—180 мл может обеспечить надёжную трансплантацию пациентам с массой тела, не превышающей 50 кг. Для пациентов, имеющих вес, превышающий 50 кг, приходится проводить трансплантацию двух и более образцов ПК, что может приводить к развитию осложнений в виде РТПХ или отторжения трансплантата. Поэтому вопросы о сохранности ГСК ПК на всех этапах их получения, сепарации, криоконсервирования и хранения, а также оценка их пролиферативного потенциала и способности к диффе-ренцировке in vivo требуют постоянного изучения и совершенствования.

Регенерация кроветворной системы у пациентов после трансплантации ГСК зависит не только от количественного содержания клеток, но и от их репликативного потенциала, снижение которого коррелирует с потерями теломерных повторов в хромосомах

[10, 11]. ГСК с фенотипом Сй34+ имеют различия в пролиферативной способности. Потенциал самовоспроизведения этих клеток также различен, что свидетельствует о гетерогенности их популяции, которая обусловлена различной степенью зрелости [12, 13]. Поэтому данные о количестве Сй 34+-ГСК пуповинной крови следует интерпретировать с осторожностью. При достаточном для восстановления гемопоэза количестве ГСК может быть недостаточен их пролиферативный потенциал, что приведёт к отсутствию ожидаемого результата от трансплантации. Это диктует необходимость определения терапевтической дозы ГСК, учитывая не только их количество, но и пролиферативный потенциал, зависящий, в том числе, от длины теломер [10, 12].

Криоконсервирование является неотъемлемой частью процедуры длительного хранения клеточных биоматериалов. В большинстве случаев клетки сохраняют свою морфологию после замораживания-размораживания, но может наблюдаться уменьшение их жизнеспособности и нарушение клеточных функций, приводящее к снижению пролиферативных свойств и нарушению биологической активности. Эти изменения обычно являются транзиторными, и клетки возобновляют свою первоначальную активность со временем, однако необратимые изменения всё равно наблюдаются. Криоконсервирование приводит

к повреждению белковых структур клеточной мембраны, ферментов и ДНК. Б. Нопс1а с соавт. (2001) изучили влияние криоконсервирования на эпителиальные клетки пигмента сетчатки глаза [14]. Ими было доказано, что криоконсервирование может служить потенциальным механизмом, вызывающим одиночные поломки терминальной теломерной ДНК и уменьшение длины теломер. Это приводит к снижению пролиферативных свойств деконсервирован-ных клеток.

Оценка пролиферативного потенциала ГСК ПК является дополнительным контролем качества клеток в образце ПК и важным прогностическим фактором успеха трансплантации.

Материал и методы

В исследовании использовалось 79 образцов пуповинной крови, полученных во время физиологических срочных родов. Информированное согласие рожениц на сбор пуповинной крови было получено. Сбор образцов пуповинной крови проводился в родильном доме № 13 г. Санкт-Петербурга.

Для исследований отбирались образцы, объем которых превышал 40 мл. Для получения концентрата ядросодержащих клеток из образцов пуповинной крови удаляли эритроциты и плазму путем осаждения с раствором полиглюкина в соотношении 1:1.

Рис. 1. Результат идентификации клеток культуры, находящихся в Б0/1-фазе клеточного цикла:

А, В - скетограммы, прямое светорассеяние, гейтирование области, в которой находятся клетки в фазе Б 0/1 клеточного цикла; Б, Г - гистограммы распределения клеток, интенсивность флуоресценции ЕИ.

А, Б - клетки перед криоконсервированием; В, Г - клетки после криоконсервирования

В качестве криозащитного средства к концентрату ядросодержащих клеток ПК добавляли высокоо-чищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в сочетании с полиглюкином. Конечная концентрация ДМСО в криоконсервируемой среде составляла 5%.

Для криоконсервирования концентрата клеток пуповинной крови использовались два способа замораживания: спонтанное замораживание в парах жидкого азота и замораживание в программном за-мораживателе Planer plc с визуальным контролем процесса охлаждения каждого образца клеток. Кри-консервирование производилось в криопробирках NUNC (Дания).

С целью изучения пролиферативного потенциала ГСК ПК определяли их длину теломер и колониеобразующую способность (КОС). Определение длины теломер проводилось с использование новейшего метода, объединяющего проточную цитометрию и флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH). Длина теломер вычислялась по экспрессируемому абсолютному значению флуоресценции теломер.

Для определения длины теломер использовался набор PNA Kit/FITC (DAKO, Дания). Гибридизация клеток с теломерным зондом проводилась в соответствии с рекомендациями фирмы DAKO. В образцах, гибридизированных с теломерным зондом, производилось определение длины теломер на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter FS-500 Cytomics (Beckman Coulter, Швейцария). Для исследования использовался световой фильтр с длиной волны 488 нм. Интенсивность флуоресценции выставляли при флуоресцентном сигнале в FL-1. Гейтировали клетки в G0/1 фазе клеточного цикла, где клетка имеет только одну копию своего генома (рис. 1).

КОС ГСК ПК исследовали в полной культуральной среде на основе метилцеллюлозы Н4435 MethoCult (StemCellTechnologies, Канада). Для культивирования клетки в количестве 1,0х105 трансплантировали в 1,5 мл полной среды H4435 MethoCult. Среду с клетками помещали в СО2-инкубатор при 37°С, 5% СО2 в воздухе и влажности более 95%. Проводилась оценка КОС ГСК ПК перед замораживанием и после размораживания. Клеточные агрегаты (колонии и кластеры) подсчитывали в световом микроскопе. Оценивали следующие виды колоний: бурстообразующие единицы эритроцитар-ные (БОЕ-Э), колониеобразующие единицы эритро-цитарные (КОЕ-Э), колониеобразующие единицы гра-нуломоноцитарные (КОЕ-ГМ), колониеобразующие единицы гранулоцитарно-эритроцитарно-макрофаго-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ), колониеобразующие единицы макрофагальные (КОЕ-М), колониеобразующие единицы гранулоцитарные (КОЕ-Г).

Для оценки значимости различий средних значений использовали t-критерий Стьюдента (и его модификации) при уровне значимости p < 0,05.

Таблица 1. Длина теломер ГСК ПК

Результаты и обсуждение

Влияние процессов криоконсервирования

на длину теломер ГСК ПК

Определение длины теломер ГСК ПК проводили с использованием новейшей методики сочетания флуоресцентной гибридизации in situ и проточной цитометрии. Для изучения влияния криоконсервирования на репликативный потенциал ГСК, зависящий от длины их теломер, нами было исследовано 79 образцов пуповинной крови. Исследование длины теломер проводилось в ГСК ПК перед криоконсервированием и в клетках тех же самых образцов после криоконсервирования в программном замораживателе (1 группа) и парах жидкого азота (2 группа). Сроки хранения образцов ГСК ПК составили от 6 до 12 мес. Выявлено достоверное уменьшение длины тело-мер в клетках после криоконсервирования. Средняя длина теломер клеток ГСК ПК перед криоконсервированием составила 15,35±3,85 kb (kilobase). При криоконсервировании клеток в программном замораживателе средняя длина теломер составила 13,36±1,87 kb, при замораживании в парах жидкого азота — 9,51±0,31 kb. (рис. 2, табл. 1). При криоконсервировании клеток в программном заморажи-вателе уменьшение длины теломер ГСК ПК менее выражено, чем при замораживании в парах жидкого азота. Как известно, охлаждение биологического объекта с любой скоростью всегда сопровождается образованием разнообразных кристаллов льда. При медленных скоростях замораживания — от 1 до 10°C в минуту, образуются гексагональные формы льда, которые локализуются в основном вне клетки. В процессе дегидратации клетки при дальнейшем снижении температуры такие кристаллы постепенно увеличиваются в размерах и оказывают механическое давление на клетки.

Рис. 2. Средняя длина теломер:

1 - в нативных клетках пуповинной крови;

2 - в клетках, замороженных по программе;

3 - в клетках, замороженных в парах жидкого азота

Средняя длина теломер нативных клеток, kb Средняя длина теломер клеток, замороженных в программном замораживателе, kb Средняя длина теломер клеток, замороженных в парах жидкого азота,№

15,35±3,85 13,36±1,87 9,51±0,31

При более быстрых скоростях замораживания — от 20 до 40°С в минуту, как в клетке, так и вне ее образуются смешанные формы льда — гексагональный и кубический, кристаллы которых оказывают более губительное действие на клетку. При сверхбыстрых скоростях замораживания — от 300 до 400°С в минуту, затвердевание воды в клетках происходит почти мгновенно и в большом количестве образуется аморфный стекловидный лед, в котором образуются быстроисчезающие сферуллиты. Такой внутриклеточный лед при отогреве вступает в процесс рекристаллизации, сопровождающийся увеличением размеров льда и необратимыми повреждениями клеточных структур. Поэтому медленная скорость замораживания является наиболее благоприятной для выживания клеток [17]. Медленное охлаждение от 1 до 2°С в мин вызывает образование в основном внеклеточных кристаллов, при более высокой скорости замораживания образуются внутриклеточные кристаллы, которые в дальнейшем приводят к повреждению клеточных структур и особенно мембран клетки. Вместе с тем, слишком медленное замораживание сопровождается дегидратацией клетки и образованием гиперконцентрированных растворов, которые тоже могут вызывать необратимые изменения в макромолекулах.

В момент перехода растворенной в клетке воды в кристаллическую форму — достижении точки эвтектики — происходит выделение дополнительного тепла за счет образования кристаллической решетки при переходе воды из жидкого состояния в твердое. Основные повреждения клетки наступают между точкой эвтектики и точкой замерзания, так как в этот период образуются концентрированные растворы солей, которые повреждают клеточные структуры. Этот период не должен длиться более 1,5 мин [12, 16, 17]. В проведенных нами исследованиях при замораживании в программном замораживателе время от наступления точки эвтектики и кристаллизации сокращено до 1,5 мин, а при замораживании в парах жидкого азота это время длилось более 5 мин.

При криоконсервировании клеток в программном замораживателе возможно индивидуальное прохождение точки кристаллизации для каждого образца, так как в момент кристаллизации происходит выброс тепла, оператор может следить за этим моментом по изменениям графика замораживания на мониторе и управлять данным процессом с помощью ручного снижения температуры охлаждения. Данный способ позволяет сохранить клетки лучше, так как программа охлаждения позволяет замораживать каждый образец индивидуально, с учетом разной концентрации клеток и соответственно разных сроков наступления кристаллизации в каждом образце. При замораживании в парах жидкого азота сглаживается плато кристаллизации, а следовательно удлиняется время между точкой эвтектики и наступлением момента кристаллизации. Этот процесс вызывает повреждение клеток. Чем дольше он длится по времени, тем повреждение клеток значительнее.

Таким образом, на основании статистически подтвержденных различий между длиной теломер в ГСК ПК в образцах перед криоконсервированием и после размораживания установлено, что процессы криоконсервирования вызывают уменьшение длины тело-мер ГСК ПК, а, следовательно, приводят к уменьшению их пролиферативного потенциала. Уменьшение

длины теломер клеток ПК является важным маркером повреждения клеточных структур в процессе криоконсервирования.

Корреляция длины теломер и колониеобразующей

способности

КОС ГСК является достоверным показателем их пролиферативного потенциала. Результаты исследований КОС ГСК коррелируют с данными об уменьшении длины теломер после криоконсервирования и лучшей сохранности пролиферативного потенциала клеток при замораживании в программном замора-живателе (табл. 2, рис. 3, 4).

При исследовании КОС ГСК (рис. 5) до замораживания среднее количество колоний на 1х105 ГСК ПК составило 411,75±46,51, КОС ГСК ПК, криокон-сервированных в программном замораживателе (1 группа), в среднем составила 403,75±15,84, при криоконсервировании в парах жидкого азота — 167,75±93,20 соответственно. Эти данные сопоставимы с данными о средней длине те-ломер в данных группах: в контрольной группе 15,35±3,85 кЬ, в 1 группе — 13,36±1,87 кЬ, и во 2 группе — 9,51 ±0,31 кЬ.

Исследование длины теломер в гемопоэтических клетках пуповинной крови

Длина теломер, кЬ

Рис. 3. Длина теломер ГСК ПК:

1 - длина теломер в нативных клетках;

2 - длина теломер в клетках, замороженных по программе; 3 - длина теломер в клетках, замороженных в парах жидкого азота

КОС гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

Рис. 4. КОС ГСК ПК:

1 - КОС в нативных клетках;

2 - КОС в клетках, замороженных по программе;

3 - КОС в клетках, замороженных в парах жидкого азота

Таблица 2. Влияние различных способов криоконсервирования на КОС ГСК ПК

Колонии

БОЭ 249,75±42,1 295,25±6,85 121,25±75,76

КОЭ-Г 83,25±17,35 55±2,94392 17,25±10,56

КОЭ-ГМ 63,75±14,89 41,5±9,99 21,5±7,94

КОЭ-М 8,5±1,29 6,75±1,26 4,5±0,58

Смешанные 6,5±1,29 5,25±1,26 3,25±1,26

Длина теломер, кЬ 15,35 ±3,85 13,36±1,87 9,51±0,31

КОС 411,75±46,51 403,75±15,84 167,75±93,20

Рис. 5. ГСК ПК. КОС клеток до (А, Б) и после (В, Г) криоконсервирования

Укорочение длины теломер при замораживании клеток ПК может быть связано с процессами повреждения ядерной мембраны. Так как теломеры участвуют в формировании скелета клеточного ядра и тесно связаны с внутренней поверхностью ядерной мембраны [10, 12, 13,], эти структуры повреждаются вместе с ядерной мембраной при криоконсервировании в первую очередь [12, 16]. Кроме того, в непосредственной близости к теломерной ДНК находятся участки ДНК, ответ-

ственные за сенесенс и апоптоз клетки [10, 12]. Процессы криоконсервирования клеток могут приводить к транзиторным или органическим поражениям этих структур, и таким образом индуцировать сенесенс и апоптоз клеток, что также скажется на их восстановлении после размораживания [14]. Уменьшение длины теломер и повреждения теломерных белков приводят к изменению экспрессии генов, что так же может сказаться на функции клетки [10, 12, 13].

Уменьшение длины теломер клеток ПК является важным маркером повреждения клеточных структур в процессе криоконсервирования. Таким образом, криоконсервирование индуцирует физиологическое старение клеток. Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что не подходящие условия криоконсервирования могут не только снижать жизнеспособность клеток, но и также индуцировать сенесенс и апоптоз. Полученные нами данные являются важными для областей медицины, которые используют замороженные клетки, у которых процессы криоконсервирования вызывает, начиная с сенесенса, множество повреждений. Изменение длины теломер может также вызывать изменения экспрессии генов, что так же сказывается на функции клетки [10].

Таким образом, при оценке пролиферативного потенциала ГСК ПК, зависящего от длины теломер и КОС клеток установлено, что замораживание в парах жидкого азота приводит к значительным поте-

рям клетками их пролиферативных свойств. Использовать такие клетки для трансплантации следует с большой осторожностью, так как при восстановлении гемопоэза из относительно малого количества ГСК ПК с низким пролиферативным потенциалом восстановление объема ниши стволовой клетки произойдет не полностью.

При криоконсервировании в программном замо-раживателе наблюдается лучшая сохранность пролиферативных свойств ГСК ПК, поэтому использование данного метода сохранения образцов клеток ПК для дальнейшего клинического применения предпочтительнее, так как позволяет сохранить клетки в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии. Длина теломер и КОС может служить важным маркером сохранности пролиферативного потенциала ГСК ПК. Дальнейшее изучение длины теломер ГСК ПК позволит расширить возможности применения ГСК ПК для трансплантации у онкогема-тологических пациентов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ballen K.K. New trends in umbilical cord blood transplantation. Blood 2005; 105(10): 3786-92.

2. Абдулкадыров К.М. Заготовка, хранение и лабораторное тестирование пуповинной крови. Гематология. Новейший справочник. М.: «Эксмо», 2004.

3. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови. Вопросы онкологии 2000; 46(5): 513-20.

4. Куртова А.В., Зуева Е.Е., Фрегатова Л.М. Методы банкирова-ния пуповинной крови. Иммунология 2005: 577-91.

5. Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А. и др. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М: «Медпрактика-М», 2005.

6. Ballen K. Cord blood banking review. Hematologist 2004.

7. Румянцев А.Г., Масчан. А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. Руководство для врачей. М.: МИА, 2003.

8. Гришина В.В., Тимохина Е.В., Андреева Л.Ю. Система сбора и фракционирования стволовых клеток пуповинной крови. Вопросы гинекологии, акушерства и перинаталогии 2004; 3(6): 50-4.

9. Ballen K., Barker J., Stewart S. et al. Collection and preservation of cord blood for personal use. Biol. Blood Marrow Transpl. 2008; 14: 356-63.

10. Blackburn E.H. Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and the effects of altering their functions. FEBS Lett. 2005; 579(4): 859-62.

11. Pipes L., Tsang T., Peng S. et al. Harris telomere length changes after umbilical cord blood transplant. Transfusion 2006; 46: 1038-43.

12. Lansdorp M. Telomeres, stem cells, and hematology. Blood 2008; 111: 1759-66.

13. Notaro R., Cimmeno A., Tabarini D. In vivo telomere dynamics of human hematopoietic stem cells. PNAS USA 1997; 94: 13782-5.

14. Honda S., Weigel A., Hjelmeland M. et al. Induction of telomere shortening and replicative senescence by cryopreservation. Biochem. Biophys. Research Comm. 2001; 282: 493-8

15. Hunt J., Armitage E., Pegg E. Cryopreservation of umbilical cord blood: 1. Osmotically inactive volume, hydraulic conductivity and permeability of CD34. cells to dimethyl sulphoxide. Cryobiology 2003; 46: 61-75.

16. Hunt J., Armitage E., Pegg E. Cryopreservation of umbilical cord blood: 2. Tolerance of CD34. cells to multimolar dimethyl sulphoxide and the effect of cooling rate on recovery after freezing and thawing. Cryobiology 2003; 46: 76-87.

17. Mazur P. Freezing of living cells: Mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 1984; 247: 125-42.

Поступила 26.05.2011