КОМПОЗИЦИИ, СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ СОЕДИНИТЕЛЬНЫХ СТРУКТУР, ПРИКРЕПЛЕННЫХ К ПОЛИМЕРАЗАМ, РАСПОЛОЖЕННЫМ ВБЛИЗИ НАНОПОР

1. Композиция, включающая:
нанопору, имеющую первую сторону, вторую сторону и отверстие, проходящее через первую и вторую стороны;
множество нуклеотидов, где каждый из нуклеотидов включает удлиненный маркер;
первый и второй полинуклеотиды, где первый полинуклеотид комплементарен второму полинуклеотиду;
полимеразу, располагаемую вблизи первой стороны нанопоры, причем полимераза выполнена с возможностью присоединения нуклеотидов, взятых из множества нуклеотидов, к первому полинуклеотиду на основании последовательности второго полинуклеотида;
долговременную соединительную структуру, включающую головную область, хвостовую область и расположенное между ними удлиненное тело, где головная область закреплена на полимеразе, и удлиненное тело находится в отверстии нанопоры;
первый фрагмент, расположенный на удлиненном теле, где первый фрагмент выполнен с возможностью связывания с удлиненным маркером первого нуклеотида, на который воздействует полимераза; и
репортерную область, расположенную на удлиненном теле, где репортерная область способна указывать комплементарность или некомплементарность первого нуклеотида следующему нуклеотиду в последовательности второго полинуклеотида.
2. Композиция по п. 1, в которой первый фрагмент выполнен с возможностью формирования первого сигнального состояния в ответ на воздействие полимеразы на первый нуклеотид, и первый нуклеотид может быть идентифицирован на основании первого сигнального состояния.
3. Композиция по п. 2, в которой воздействие полимеразы на первый нуклеотид включает связывание полимеразой первого нуклеотида.
4. Композиция по п. 2, в которой первое сигнальное состояние включает генерацию электрического или оптического сигнала.
5. Композиция по п. 2, в которой репортерная область выполнена с возможностью формирования второго сигнального состояния, и на основании второго сигнального состояния может быть определена комплементарность или некомплементарность первого нуклеотида следующему нуклеотиду второго полинуклеотида.
6. Композиция по п. 5, в которой репортерная область выполнена с возможностью формирования второго сигнального состояния вследствие успешного встраивания первого нуклеотида в первый полинуклеотид под действием полимеразы.
7. Композиция по п. 6, в которой репортерная область выполнена с возможностью формирования второго сигнального состояния в ответ на высвобождение пирофосфата вследствие успешного встраивания первого нуклеотида в первый полинуклеотид под действием полимеразы.
8. Композиция по п. 7, в которой полимераза модифицирована для обеспечения задержки высвобождения пирофосфата вследствие встраивания первого нуклеотида в первый полинуклеотид.
9. Композиция по п. 8, в которой полимераза включает модифицированную рекомбинантную полимеразу Ф29, В103, GA-1, PZA, Ф15, BS32, M2Y, Nf, G1, Ср-1, PRD1, PZE, SF5, Ср-5, Ср-7, PR4, PR5, PR722 или L17.
10. Композиция по п. 8, в которой полимераза включает модифицированную рекомбинантную ДНК-полимеразу Ф29, имеющую по меньшей мере одно замещение аминокислоты или комбинацию замещений, выбранных из группы, состоящей из: замещения аминокислоты в положении 484, замещения аминокислоты в положении 198 и замещения аминокислоты в положении 381.
11. Композиция по п. 8, в которой полимераза включает модифицированную рекомбинантную ДНК-полимеразу Ф29, имеющую по меньшей мере одно замещение аминокислоты или комбинацию замещений, выбранных из группы, состоящей из E375Y, K512Y, T368F, А484Е, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W и L381A.
12. Композиция по п. 5, в которой репортерная область выполнена с возможностью формирования второго сигнального состояния в ответ на конформационное изменение полимеразы.
13. Композиция по п. 12, в которой величина или временная продолжительность конформационного изменения полимеразы чувствительна к комплементарности или некомплементарности первого нуклеотида следующему нуклеотиду второго полинуклеотида, и величина и/или временная продолжительность второго сигнального состояния зависит от конформационного изменения полимеразы.
14. Композиция по п. 5, в которой второе сигнальное состояние включает генерацию электрического сигнала.
15. Композиция по п. 5, в которой второе сигнальное состояние включает генерацию оптического сигнала.
16. Композиция по п. 1, в которой удлиненный маркер включает первую нуклеотидную последовательность, а первый фрагмент включает вторую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна первой нуклеотидной последовательности.
17. Система, включающая композицию по п. 16 и дополнительно включающая измерительную схему, выполненную с возможностью определения первого состояния электрического тока или потока, проходящего через отверстие.
18. Система по п. 17, в которой первое состояние электрического тока или потока зависит от удлиненного маркера, и первый нуклеотид может быть идентифицирован в соответствии с первым состоянием электрического тока или потока.
19. Композиция по п. 12, в которой измерительная схема дополнительно выполнена с возможностью определения второго состояния электрического тока или потока, проходящего через отверстие.
20. Композиция по п. 19, в которой второе состояние электрического тока или потока зависит от положения репортерной области внутри отверстия, и на основании второго состояния электрического тока или потока может быть определено комплементарен или не комплементарен первый нуклеотид следующему нуклеотиду во втором полинуклеотиде.
21. Композиция по п. 15, в которой первый фрагмент и второй фрагмент соединительной структуры способны гибридизоваться друг с другом с образованием шпилькообразной структуры.
22. Композиция по п. 21, дополнительно включающая источник напряжения, выполненный с возможностью создания напряжения между первой и второй сторонами.
23. Композиция по п. 22, в которой первый фрагмент и второй фрагмент соединительной структуры способны подвергаться дегибридизации с отщеплением друг от друга в ответ на воздействие напряжения в соответствии с двухэтапным механизмом.
24. Способ, включающий:
(a) предоставление нанопоры, имеющей первую сторону, вторую сторону и отверстие, проходящее через первую и вторую стороны;
(b) предоставление множества нуклеотидов, где каждый из нуклеотидов включает удлиненный маркер;
(c) предоставление первого и второго полинуклеотидов, где первый полинуклеотид комплементарен второму полинуклеотиду;
(d) предоставление полимеразы, располагаемой вблизи первой стороны нанопоры, причем полимераза выполнена с возможностью присоединения нуклеотидов, взятых из множества нуклеотидов, к первому полинуклеотиду на основании последовательности второго полинуклеотида, и полимераза прикреплена к долговременной соединительной структуре, включающей головную область, хвостовую область и расположенное между ними удлиненное тело, причем удлиненное тело находится в отверстии нанопоры;
(e) определение того, что на первый нуклеотид воздействует полимераза, на основании связывания удлиненного маркера с первым фрагментом, расположенным на удлиненном теле; и
(f) указание на комплементарность или некомплементарность первого нуклеотида следующему нуклеотиду в последовательности второго полинуклеотида с помощью репортерной области, расположенной на удлиненном теле.
25. Способ по п. 24, в котором определение включает формирование первого сигнального состояния в ответ на воздействие полимеразы на первый нуклеотид и идентификацию первого нуклеотида на основании первого сигнального состояния.
26. Способ по п. 25, в котором воздействие полимеразы на первый нуклеотид включает связывание полимеразой первого нуклеотида.
27. Способ по п. 26, в котором первое сигнальное состояние включает генерацию электрического или оптического сигнала.
28. Способ по п. 26, в котором указание включает обнаружение второго сигнального состояния и определение комплементарности или некомплементарности первого нуклеотида следующему нуклеотиду второго полинуклеотида на основании второго сигнального состояния.
29. Способ по п. 28, включающий формирование второго сигнального состояния в ответ на встраивание первого нуклеотида в первый полинуклеотид под действием полимеразы.
30. Способ по п. 29, включающий формирование второго сигнального состояния вследствие высвобождения пирофосфата в ответ на встраивание первого нуклеотида в первый полинуклеотид под действием полимеразы.
31. Способ по п. 30, в котором полимераза модифицирована для обеспечения задержки высвобождения пирофосфата вследствие встраивания первого нуклеотида в первый полинуклеотид.
32. Способ по п. 31, в котором полимераза включает модифицированную рекомбинантную полимеразу Ф29, В103, GA-1, PZA, Ф15, BS32, M2Y, Nf, G1, Ср-1, PRD1, PZE, SF5, Ср-5, Ср-7, PR4, PR5, PR722 или L17.
33. Способ по п. 31, в котором полимераза включает модифицированную рекомбинантную ДНК-полимеразу Ф29, имеющую по меньшей мере одно замещение аминокислоты или комбинацию замещений, выбранных из группы, состоящей из: замещения аминокислоты в положении 484, замещения аминокислоты в положении 198 и замещения аминокислоты в положении 381.
34. Способ по п. 33, в котором полимераза включает модифицированную рекомбинантную ДНК-полимеразу Ф29, имеющую по меньшей мере одно замещение аминокислоты или комбинацию замещений, выбранных из группы, состоящей из E375Y, K512Y, T368F, А484Е, A484Y, N387L, T372Q, T372L, K478Y, 1370W, F198W и L381A.
35. Способ по п. 28, включающий формирование второго сигнального состояния в ответ на конформационное изменение полимеразы.
36. Способ по п. 35, в котором величина или временная продолжительность конформационного изменения полимеразы чувствительная к комплементарности или некомплементарности первого нуклеотида следующему нуклеотиду полинуклеотида, причем величина и/или временная продолжительность второго сигнального состояния зависит от конформационного изменения полимеразы.
37. Способ по п. 29, в котором второе сигнальное состояние включает генерацию электрического сигнала.
38. Способ по п. 29, в котором второе сигнальное состояние включает генерацию оптического сигнала.
39. Способ по п. 24, в котором удлиненный маркер включает первую нуклеотидную последовательность, а первый фрагмент включает вторую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна первой нуклеотидной последовательности.
40. Способ по п. 39, в котором определение дополнительно включает определение первого состояния электрического тока или потока, проходящего через отверстие.
41. Способ по п. 40, в котором первое состояние электрического тока или потока зависит от удлиненного маркера, и определение дополнительно включает идентификацию первого нуклеотида на основании первого состояния электрического тока или потока.
42. Способ по п. 41, в котором указание включает перемещение репортерной области в отверстии в ответ на воздействие полимеразы на первый нуклеотид.
43. Способ по п. 42, в котором указание дополнительно включает определение второго состояния электрического тока или потока, проходящего через отверстие.
44. Способ по п. 43, в котором второе состояние электрического тока или потока зависит от положения репортерной области внутри отверстия, и указание дополнительно включает определение комплементарности или некомплементарности первого нуклеотида следующему нуклеотиду во втором полинуклеотиде на основании второго состояния электрического тока или потока.
45. Способ по п. 39, в котором первый фрагмент и второй фрагмент соединительной структуры гибридизуются друг с другом с образованием шпилькообразной структуры.
46. Способ по п. 45, дополнительно включающие создание напряжения между первой и второй стороной.
47. Способ по п. 46, в котором первый фрагмент и второй фрагмент соединительной структуры подвергаются дегибридизации с отщеплением друг от друга в ответ на воздействие напряжения в соответствии с двухэтапным механизмом.
48. Способ по п. 24, дополнительно включающий:
(g) определение того, что на следующий нуклеотид воздействует полимераза на основании связывания удлиненного маркера с первым фрагментом, расположенным на удлиненном теле; и
(h) указание на комплементарность или некомплементарность следующего нуклеотида нуклеотиду, который следует за следующим нуклеотидом в последовательности второго полинуклеотида с помощью репортерной области, расположенной на удлиненном теле.
49. Способ по п. 48, дополнительно включающий повторение этапов (g) и (h) при исследовании множества последующих нуклеотидов, которые комплементарны или некомплементарны множеству нуклеотидов, следующих за следующим нуклеотидом.