METHOD FOR SIMULATING DEGENERATIVE-DYSTROPHIC CHANGES IN THE INTERVERTEBRAL DISC
Способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, нейрохирургии, и может быть использовано для изучения механизмов развития и течения развития дегенеративного процесса в межпозвонковом диске после ламинэктомии.
Известны различные способы моделирования дегенеративно-дистрофических изменений в межпозвонковом диске, основанные на проколе межпозвонкового диска для изучения его дегенерации.
VII
VIII
VIII
IX
Так известен способ моделирования, включающий механическое повреждение межпозвонкового диска хвоста экспериментального животного путем прокола фиброзного кольца в пульпозное ядро Co/Co и Co/Co под ренгтен контолем (Kwon YJ. A minimally invasive rabbit model of progressive and reproducible disc degeneration confirmed by radiology, gene expression, and histolo-gy. J Korean Neurosurg Soc 2013; 53: 323-330). Данный способ стал широко используемой моделью in vivo, как для исследования дегенеративных изменений в межпозвонковом диске, так и для проверки эффективности новых методов лечения.
К недостаткам этого способа следует отнести:
- отсутствие возможности получения первичных и естественных дегенеративных изменений микроструктур пульпозного ядра и фиброзного кольца;
- механическое повреждение межпозвонкового диска сопровождается разрушением фиброзного кольца, что обуславливает миграцию фрагмента ткани пульпозного ядра, которая, являясь забарьерной, приводит к развитию системного воспалительного ответа;
- механическое повреждение межпозвонкового диска хвоста экспериментального животного так же не учитывает фактор нестабильности позвоночно-двигательного сегмента в механизме дегенеративно-дистрофических изменений в межпозвонковом диске, т.к. хвост не участвует в опорной функции.
IV
V
Наиболее близким к предлагаемому является способ моделирования дегенеративных изменений на уровне L/L (Kim, JS, Kroin, JS, Li, X., An, HS, Buvanendran, A., Yan, D., et al. (2011). A model of pain in the degeneration of rats of the intervertebral disc: the relationship between biological and structural changes and pain. Arthritis Res. Ther. 13: R165. Doi: 10.1186 / ar 3485).
IV
V
V
VI
Сущность известного способа заключается в доступе к вентральному отделу позвоночника через брюшинный разрез и механическому проколу микрохирургическим сверлом межпозвонковых дисков на уровне L/L и L/L на глубину 2 мм. Эксперимент был проведен на крысах линии Sprague Dawley.
К недостаткам этого способа, как и аналогичного, следует отнести невозможность получения дегенеративных изменений микроструктур пульпозного ядра и фиброзного кольца, которые происходят первично в естественных условиях, а также возможность развития системного воспалительного ответа, вызванного механическим повреждением межпозвонкового диска и фиброзного кольца, обуславливающего миграцию пульпозного ядра.
Задачей заявляемого технического решения является разработка способа моделирования первичных дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности получения физиологичной модели дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска с разрушением фиброзного кольца и формированием пролапса на фоне нестабильности межпозвонкового сегмента и нарушенной опорной функции позвоночника.
Технический результат заявляемого способа достигается тем, что способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска проводят путем хирургического доступа к позвоночнику экспериментального животного - крысы.
Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что в качестве экспериментальных животных используют самцов крыс линии Wistar в возрасте 4-5 месяцев, массой 250-300 г, которым проводят дорсальный доступ к остистым отросткам позвоночника на поясничном уровне.
VI
Основные отличия предлагаемого способа заключаются и в том, что выполняют расширенную ламинэктомию с фасетэктомией позвонка L после чего рану послойно ушивают.
Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».
Из проведенного анализа патентной и специальной литературы авторами установлено, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных областях медицины. В доступной литературе не выявлено способа моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска вышеприведенными приемами.
Взаимосвязь и взаимодействие существенных приемов предлагаемого способа обеспечивает достижение нового результата в решении поставленной задачи, а именно: получить модель дегенерации межпозвонкового диска, наиболее приближенную к патологии человека на фоне нарушенной опорной функции позвоночника.
VI
Так, выполнение расширенной ламинэктомии с фасетэктомией позвонка L, позволяет:
- получить развитие первичных дегенеративных изменений в межпозвонковом диске на уровне оперативного вмешательства на 16-ой неделе и формирование пролапса на 24-ой неделе эксперимента;
VI
I
- создать нестабильность и нарушение опорной функции в межпозвонковом двигательном сегменте L-S позвоночника без механического повреждения фиброзного кольца;
Следовательно, предлагаемый способ позволяет получить физиологичную модель дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска с разрушением фиброзного кольца и формированием пролапса на фоне нестабильности межпозвонкового сегмента и нарушенной опорной функции позвоночника.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в здравоохранении. Осуществление его возможностей подтверждено описанными в заявке приемами и средствами. Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
Сущность предлагаемого способа моделирования дегенеративно-дистрофических изменений поясняется фигурами 1-5.
VI
I
VI
I
На фиг. 1 представлен рентгеновский снимок позвоночника экспериментального животного (крысы линии Wistar) на 15-е сутки после операции; на уровне позвоночника - L-S; определен спондилолистез L относительно S.
VI
I
На фиг. 2-4 продемонстрирована морфология межпозвонкового диска L-S после ламинэктомии у крыс линии Wistar на 16 и 24 неделе эксперимента. Представленные серийные гистологические срезы произведены во фронтальной плоскости (поперек позвоночного столба); окраска гематоксилиномэозином, где: 1 - фиброзное кольцо; 2 - участок разрушения волокон в дорзальном отделе фиброзного кольца; 3 - пульпозное ядро; 4 - нотохордальные клетки; 5 - гиперплазия гиалинового хряща; 6 - очаг энхондрального окостенения; 7 - межпозвонковый нерв; 8 - очаг проникновения нотохордальных клеток и матрикса пульпозного ядра в разрушенные участки фиброзного кольца, с формированием пролапса; 9 - конский хвост.
На фиг. 2 показан срез межпозвонкового диска на 16-ой неделе эксперимента: в дорзальном отделе фиброзного кольца 1 выявлен участок разрушения волокон 2, что подтверждает развитие первичных дегенеративных изменений в межпозвонковом диске.
Фиг. 3 - 24 неделя эксперимента: боковой отдел межпозвонкового диска - гиперплазия гиалинового хряща 5 с очагом энхондрального окостенения 6, свидетельствует о выраженных дегенеративно-дистрофических изменениях в межпозвонковом диске.
Фиг. 4 - 24 неделя эксперимента. Фрагмент межпозвонкового диска, фиброзное кольцо 1 с участками разрушения волокон в дорзальном отделе 2, очаг проникновения нотохордальных клеток и матрикса пульпозного ядра в разрушенные участки фиброзного кольца с формированием пролапса 8.
Сущность предлагаемого «Способа моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска» поясняется примером конкретного выполнения.
Моделирование дегенеративно-дистрофических изменений в позвоночнике проведено на 6-ти на крысах самцах породы Wistar в возрасте 4-5 месяцев, с массой тела 250-300 г.
Оперативное вмешательство проводили в асептических условиях, под общей анестезией путем внутримышечной инъекции (атропин 0,1% - 50 мг/кг, дроперидол 1,5 мг/кг, кетамин 35 мг/кг массы тела).
Этапы операции:
V
I
V
I
VI
Подопытное животное (крысу) фиксировали на столике Сеченова в положении «лежа на животе». Операцию проводили при использовании операционной лупы с 3-кратным увеличением. Кожу на уровне поясничного отдела позвоночника экспериментального животного выбривали и дезинфицировали. Затем выполняли срединный разрез кожи над остистыми отростками от L до Sпозвоночника, после чего рассекали люмбо-сакральную фасцию и производили двухстороннее скелетирование дужек позвонков. Далее ранорасширителем раздвигали параспинальные мышцы, обнажая остистые отростки от L до S позвонков. С помощью высокооборотистой дрели, оснащенной алмазным буром (1 мм в диаметре), проводили выпиливание позвонковой дуги L с обеих сторон, тем самым образуя костный дефект размером 3×3 мм. После резекции желтой связки обнажали твердую мозговую оболочку. Площадь дефекта составляла 3×3 мм. Затем рану послойно ушивали (фасцию и подкожно-жировую клетчатку - кетгут 3.0, кожу - пролен 3.0).
Экспериментальные исследования выполнены в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием ФГБНУ «ИНЦХТ» при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа. При выполнении исследования выполнялись все биоэтические нормы работы с экспериментальными животными согласно приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N755, а также «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.1984 г.
VI
I
VI
I
Рентгенографию экспериментальным животным проводили на 15 сутки после операции (фиг. 1). На уровне позвоночника L-S определен спондилолистез L относительно S.
Животных выводили из опыта на 16-ой и 24-ой неделях эксперимента путем эвтаназии парами эфира. Органокомплекс вычленяли и проводили анатомическую препаровку позвоночника, выделяя зону дефекта с окружающими тканями на уровне проведенного оперативного вмешательства.
Фиксацию материала проводили в 10% нейтральном формалине, FineFix (Milestone, Италия) на 95%-ном этаноле; декальцинация в 7% муравьиной кислоте. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином.
На 16-ой неделе из эксперимента выведено 3-е животных. При гистологическом исследовании у всех этих крыс получены дегенеративно-дистрофические изменения в межпозвонковом диске и окружающих мягких тканях в виде разрушения волокнистых структур дорзального отдела фиброзного кольца в средней 2 и внутренней его частях на уровне оперативного вмешательства и с внешней стороны от фиброзного кольца; по боковым и абдоминальному отделам межпозвонкового диска находятся участки гиперплазии гиалинового хряща с редкими, небольшими очагами разрушения внеклеточного матрикса (Фиг. 2, позиция 2).
На срок 24 недели эксперимента эвтаназия проведена оставшимся 3-м крысам, у которых при морфологических исследованиях установлено:
- у всех крыс по боковым отделам межпозвонкового диска с внешней стороны фиброзного кольца 1 развивается гиперплазия гиалинового хряща (Фиг. 3, позиция 5) с очагом энхондрального окостенения (Фиг. 3, позиция 6);
- у 2-х крыс выявлены изменения в межпозвонковом диске в виде разрушения волокнистых структур дорзального отдела фиброзного кольца в средней и внутренней его частях на уровне оперативного вмешательства (Фиг. 4, позиция 2) и выявлено проникновения нотохордальных клеток и матрикса пульпозного ядра в разрушенные участки фиброзного кольца, формируя пролапс (Фиг. 4, позиция 8).
У третей крысы определено разрушение дорзального отдела фиброзного кольца, а пролапс еще не сформирован.
Из полученных результатов следует, что воспроизводимость модели дегенеративно-дистрофических изменений в межпозвонковом диске и окружающих тканях составила 100%. Установлено, что нарушение опорной функции позвоночника приводит к формированию признаков дегенерации диска на 24 неделе эксперимента и развитию признаков дегенеративного заболевания позвоночника с формированием пролапса пульпозного ядра в разрушенную ткань фиброзного кольца.
Стандартизация технологии моделирования дегенеративно-дистрофического заболевания позвоночника с поражением межпозвонкового диска достигнута за счет создания нестабильности и нарушения опорной функции позвоночника приемами ламинэктомии с фасетэктомией.
Таким образом, предлагаемый «Способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска» обеспечивает возможность получения первичных изменений в межпозвонковом диске без механического его повреждения и создание физиологичной модели дегенеративно-дистрофических изменений в нем с разрушением фиброзного кольца и формированием пролапса на фоне нестабильности межпозвонкового сегмента и нарушения опорной функции позвоночника.
Это свидетельствует о возможности использования предлагаемого способа моделирования для изучения механизмов развития и течения дегенеративных изменений в межпозвонковом диске на модели с нарушенной опорной функцией позвоночника после проведения ламинэктомии и фасетэктомии. Изучение гистологических изменений в области межпозвонкового диска и окружающих мягких тканях может быть использовано для разработки мероприятий по лечению и профилактике дегенеративного заболевания позвоночника у человека.