Способ получения клеток пигментного эпителия сетчатки

1. Способ получения клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE), включающий стадии:
(а) культивирования плюрипотентных клеток в присутствии первого ингибитора SMAD (Similar to Mothers Against Decapentaplegic) и второго ингибитора SMAD;
(б) культивирования клеток со стадии (а) в присутствии активатора пути BMP (костного морфогенетического белка) и в отсутствии первого и второго ингибиторов SMAD; и
(в) пересева клеток со стадии (б).
2. Способ по п. 1, где на стадии (а) клетки культивируют в виде монослоя или в суспензионной культуре, и где на стадии (б) клетки культивируют в виде монослоя или в суспензионной культуре.
3. Способ по п. 1, где плюрипотентные клетки выбраны из эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
4. Способ по п. 1, где первый ингибитор SMAD выбран из группы, состоящей из ингибитора рецептора ALK2 и/или ALK3 BMP типа 1, производного дорсоморфина, ноггина, хордина и 4-(6-(4-(пиперазин-1-ил)фенил)пиразол[1,5-а]пиридин-3-ил)хинолина (LDN193189) или его соли или гидрата.
5. Способ по п. 1, где на стадии (а) концентрация первого ингибитора SMAD составляет от 0,5 нм до 10 мкМ.
6. Способ по п. 1, где второй ингибитор SMAD выбран из группы, состоящей из
ингибитора ALK5, и/или ALK4, и/или ALK7,
4-(4-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-5-(пиридин-2-ил)-1Н-имидазол-2-ил)бензамида;
2-метил-5-(6-(мета-толил)-1Н-имидазо[1,2-а]имидазол-5-ил)-2Н-бензо[d][1,2,3]триазола;
2-(6-метилпиридин-2-ил)-N-(пиридин-4-ил)хиназолин-4-амина;
2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1Н-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридина;
4-(2-(6-метилпиридин-2-ил)-5,6-дигидро-4Н-пирроло[1,2-b]пиридин-3-ил)фенола;
2-(4-метил-1-(6-метилпиридин-2-ил)-1Н-пиразол-5-ил)тиено[3,2-с]пиридина;
4-(5-(3,4-дигидроксифенил)-1-(2-гидроксифенил)-1Н-пиразол-3-ил)бензамида;
2-(5-хлор-2-фторфенил)-N-(пиридин-4-ил)птеридин-4-амина;
6-метил-2-фенилтиено[2,3-d]пиримидин-4(3Н)-она;
3-(6-метил-2-пиридинил)-N-фенил-4-(4-хинолинил)-1Н-пиразол-1-карботиоамида (А 83-01);
2-(5-бензо[1,3]диоксол-5-ил-2-трет-бутил-3Н-имидазол-4-ил)-6-метилпиридина (SB-505124);
7-(2-морфолиноэтокси)-4-(2-(пиридин-2-ил)-5,6-дигидро-4Н-пирроло[1,2-b]пиразол-3-ил)хинолина (LY2109761);
4-[3-(2-пиридинил)-1Н-пиразол-4-ил]-хинолина (LY364947); и
4-(4-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-5-(пиридин-2-ил)-1Н-имидазол-2-ил)бензамида (SB-431542)
или их соли или гидрата.
7. Способ по п. 1, где на стадии (а) концентрация второго ингибитора SMAD составляет от 0,5 нм до 100 мкМ.
8. Способ по п. 1, где на стадии (а) плюрипотентные клетки культивируют в течение по меньшей мере 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 суток.
2
2
9. Способ по п. 1, где до стадии (а) клетки культивируют в виде монослоя с исходной плотностью по меньшей мере 1000 клеток/см или с исходной плотностью от 100000 до 500000 клеток/см.
10. Способ по п. 1, где активатор пути BMP содержит BMP.
11. Способ по п. 1, где на стадии (б) концентрация активатора пути BMP составляет от 1 нг/мл до 10 мкг/мл.
12. Способ по п. 1, где на стадии (б) указанные клетки культивируют в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 суток.
2
13. Способ по п. 1, где на стадии (в) указанные клетки пересевают с плотностью по меньшей мере 1000 клеток/см.
14. Способ по п. 1, где на стадии (в) указанные клетки пересевают на Матригель, фибронектин или Cellstart.
15. Способ по п. 1, где указанный способ дополнительно включает:
(г) культивирование пересеянных клеток со стадии (в) в присутствии активатора активинового пути;
(д) пересев клеток со стадии (г); и
(е) культивирование пересеянных клеток со стадии (д).
16. Способ по п. 15, где на стадии (г) концентрация активатора активинового пути составляет от 1 нг/мл до 10 мкг/мл.
17. Способ по п. 15, где на стадии (г) клетки культивируют в присутствии цАМФ.
18. Способ по п. 1, где стадия (б) дополнительно включает, после культивирования клеток в присутствии активатора пути BMP, культивирование клеток в течение по меньшей мере 10 суток в отсутствии активатора пути BMP; стадия (в) включает пересев клеток со стадии (б), имеющих морфологию «булыжной мостовой»; и указанный способ дополнительно включает стадию:
(г) культивирования пересеянных клеток со стадии (в).
19. Способ по п. 18, включающий следующие дополнительные стадии:
(д) пересев клеток со стадии (г);
(е) культивирование пересеянных клеток со стадии (д).
2
20. Способ по п. 19, где на стадии (д) клетки пересевают с плотностью по меньшей мере 1000 клеток/см.
21. Способ по п. 20, где на стадии (е) клетки культивируют в течение по меньшей мере 10 суток.
22. Способ по п. 1, где указанный способ дополнительно включает стадию сбора клеток RPE.
23. Способ по п. 1, где указанный способ дополнительно включает стадию очистки клеток RPE.
24. Способ по п. 1, который дополнительно включает стадию очистки клеток RPE посредством сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или сортировки магнитно-активированных клеток (MACS).
25. Способ по п. 1, где клетки RPE размножают способом, включающим:
пересев клеток RPE; и
культивирование пересеянных клеток RPE.
2
26. Способ по п. 25, где клетки пересевают с плотностью от 1000 до 100000 клеток/см.
27. Способ по п. 25, где клетки культивируют в течение по меньшей мере 7 суток, по меньшей мере 14 суток, по меньшей мере 28 суток или по меньшей мере 42 суток.
28. Способ размножения клеток RPE, включающий следующие стадии:
2
(а) посев клеток RPE с плотностью по меньшей мере 1000 клеток/см, и
(б) культивирование указанных клеток RPE в присутствии ингибитора SMAD, цАМФ или агента, который увеличивает внутриклеточную концентрацию цАМФ.
29. Клетки RPE, полученные способом получения клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE), включающим стадии:
(а) культивирования плюрипотентных клеток в присутствии первого ингибитора SMAD и второго ингибитора SMAD;
(б) культивирования клеток со стадии (а) в присутствии активатора пути BMP и в отсутствии первого и второго ингибиторов SMAD; и
(в) пересева клеток со стадии (б).
30. Фармацевтическая композиция, содержащая клетки RPE по п. 29.
31. Способ лечения заболевания сетчатки у субъекта, включающий введение клеток RPE по п. 29 или фармацевтической композиции, содержащей указанные клетки RPE, указанному субъекту.
32. Способ очистки клеток RPE, включающий:
а) получение клеточной популяции, содержащей клетки RPE и клетки, не являющиеся RPE;
б) увеличение процента клеток RPE в этой клеточной популяции путем обогащения клеточной популяции клетками, экспрессирующими CD59.
33. Способ по п. 32, где на стадии (б) клеточную популяцию клеток, экспрессирующих CD59, обогащают, используя FACS или MACS.
34. Способ по п. 33, где клетки, не являющиеся RPE, представляют собой плюрипотентные клетки или клетки-предшественники RPE.