СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR ASSESSMENT OF IMMUNOMODULATORS

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к технике оценки свойств препаратов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность, и может быть использовано в научных лабораториях для изучения иммуномодулирующих свойств известных и вновь синтезируемых препаратов.
Известно, что иммунная система является первой мишенью при воздействии на организм вредных факторов физического, химического, биологического генеза. В отличие от этого патогенные микроорганизмы, условно-патогенная микрофлора, обладая уникальной способностью к изменчивости и адаптации, могут повышать свою вирулентность, способность преодоления естественных защитных барьеров. Указанные факторы влияют на становление иммунной системы на ранних этапах онтогенеза, обусловливая у плода и новорожденного нарушение в ней, сопровождающееся снижением иммунного ответа, развитием толерантности, иммунодефицитных состояний (Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский. Иммунодефициты домашних животных. М., 1996. - 96 с.).
В научной литературе описаны факторы, вызывающие утрату иммунологической толерантности (ареактивности), которые в основном относятся к двум группам: 1-я группа - неспецифические факторы, стимулирующие иммунный ответ толерантных животных; 2-я группа - специфические по отношению к антигену, вызвавшему толерантность (Л.Н.Фонталин, Л.А.Певницкий. Иммунологическая толерантность. М.: Медицина. - 1978. - С.165-176).
Иммуномодулирующие свойства известных и вновь синтезируемых средств определяют оценкой иммунного статуса как гуморального, так и клеточного у человека или животных до и после их применения: в крови определяют общее количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций; количество В-лимфоцитов; количество иммуноглобулинов основных изотипов G, М, А (патент РФ RU №2034542, кл. А61К 31/305, 1995). Определяют относительное содержание Т-лимфоцитов и их субпопуляций; пролиферативную активность Т-лимфоцитов на ФГА в реакции бластной трансформации (РБТ); соотношение Т-хелперов/ Т-супрессоров и другие иммунологические показатели (патент РФ RU №2112543, кл. А61К 39/04, А61К 47/48, 1998); К.А.Лебедев, И.Д.Понякина. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). М.: Медицинская книга. Н. Новгород. - 2003. - С.230-347.
Однако составление иммунограммы для определения иммунного статуса и оценки эффективности иммуномодулирующих средств является трудоемким и дорогостоящим исследованием.
Также при оценке иммунного статуса нельзя не учитывать, что одно и то же состояние организма или любой его системы может быть достигнуто множеством вариантов сочетаний параметров отдельных компонентов. Какой вариант будет реализован в каждом конкретном случае, зависит не только от генетических особенностей индивида, но и от набора внешних факторов - закономерных и случайных, благоприятных и неблагоприятных. Это положение также затрудняет более объективную оценку иммуномодулирующей эффективности изучаемых препаратов.
Задачей изобретения является повышение точности оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на их способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность, снижение материальных затрат.
Задача достигается путем индуцирования иммунологической толерантности аллергеном (ППД-туберкулин для млекопитающих) у морских свинок подкожно в дозе 1,3-1,8 мл на животное, через 3-5 дней парентерально вводят изучаемый иммуномодулирующий препарат для восстановления утраченной иммунологической реактивности в расчете на 1 кг массы животного в 0,2-1 мл физиологического раствора, через 7-10 дней морских свинок иммунизируют вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора, через 30 дней заражают вирулентной культурой микобактерий M.bovis подкожно в дозе 0,0001 мг, через 30 дней проводят убой морских свинок и по результатам патологоанатомического исследования оценивают иммуномодулирующие свойства изучаемых препаратов по индексу защиты - от 100% до 67% - высокая способность иммуномодулирующего средства, 66-43% - средняя, от 42% - низкая.
Отличительными признаками предложенного способа являются: экспериментальное индуцирование у морских свинок иммунологической толерантности путем введения ППД-туберкулина для млекопитающих в дозе 1,3-1,8 мл на животное и восстановление утраченной реактивности с помощью изучаемых иммуномодулирующих средств в расчете на 1 кг массы животного в 0,2-1 мл физиологического раствора. Оценивают степень восстановления иммунологической реактивности у морских свинок. Иммунизируют вакциной БЦЖ на способность противостоять экспериментальному заражению вирулентной культурой микобактерий. Проводят убой морских свинок и патологоанатомическое исследование убитых животных, по индексу защиты оценивают: от 100% до 67% - высокая способность иммуномодулирующего средства, 66-43% - средняя, от 42% - низкая.
Предложенный способ повышает точность, снижает трудоемкость и материальные затраты. На одно исследование 30 морских свинок предлагаемым способом материальные затраты без учета стоимости лабораторных животных и их содержания составили 1200 рублей, в то время как материальные затраты на изучение иммуномодулирующих свойств препаратов с оценкой иммунного статуса: подсчет общего числа лейкоцитов, выведение лейкоцитарной формулы крови, определение общего количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций, определение общего числа В-лимфоцитов составляют в расчете на одно исследование 30 лабораторных животных 12000 руб., что в 10 раз выше предлагаемого способа (по ценам практических лабораторий иммунологических исследований).
Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.
Пример 1. Опыт проводят на 25 морских свинках. С целью индукции у морских свинок иммунологической толерантности 20-ти животным вводят аллерген - ППД-туберкулин для млекопитающих подкожно в дозе 1,5 мл. Толерагенные свойства туберкулопротеидов (туберкулезных аллергенов) были установлены рядом исследователей (Под ред. М.М.Авербаха / Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М.: Медицина. - 1976. - С.73-88). Затем 20 морских свинок разделяют на 5 групп по 4 в каждой. Животных 1-й группы иммунизируют вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора через 3 дня после толерогенной обработки; 2-ой - через 7 дней; 3-ей - через 14 дней; 4-ой - через 21 день; 5-ой - через 28 дней. Морских свинок 6-ой группы (5 животных) иммунизируют вакциной БЦЖ без предварительной толерогенной обработки. Всех морских свинок исследуют ППД-туберкулином через 30 дней после вакцинации.
Результаты кожной аллергической реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих показаны в таблице 1.
Таблица 1
Кожная аллергическая реакция у морских свинок на вакцину БЦЖ после толерогенной обработки
Группы животных
Количество животных
Сроки введения БЦЖ животным после толерогенной обработки
Кожная реакция на ППД-туберкулин через 30 дней после вакцинации, мм
Реагирующих животных
M±m
1
4
через 3
-
2
4
7
-
3
4
14
-
4
4
21
2
6,25±3,66
5
4
28
3
10,0±3,56
6
5
за 30 дней до исследования ППД-туберкулином
5
16,4±3,47
Из таблицы видно, что у морских свинок восстановление утраченной иммунологической реактивности начинается с 21 дня после толерогенной обработки. В течение первых двух недель после толерогенной обработки морские свинки не отвечают на вакцину БЦЖ кожной аллергической реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих. Следовательно, в эти сроки можно испытывать препараты на способность устранять у животных толерантное состояние. Таким образом, оптимальным сроком введения вакцины БЦЖ являются 14-16 дни после введения ППД-туберкулина или 7-10 дни после введения иммуномодулятора.
Пример 2. Испытание иммуномодулирующих средств и их оценка.
Проводят сравнительную оценку иммуномодулирующих препаратов известным способом, оценивая иммунологические реакции, и предлагаемым. Для проведения эксперимента использовали: ронколейкин, полиоксидоний, поливинилпирролидон. Ронколейкин - рекомбинантный интерлейкин-2 человека (ИЛ-2), который способен усиливать пролиферацию Т-лимфоцитов и последующий синтез ИЛ-2, дифференцировку и активацию В-лимфоцитов и макрофагов. Полиоксидоний - иммуномодулятор химического синтеза. Препарат способен взаимодействовать с клеточными структурами на мембране клетки и является эффективным средством при различных формах вторичных иммунодефицитов, стимулирует продукцию цитокинов, усиливает реакции гуморального и клеточного иммунитета. Поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 12600±2700 - синтетический неприродный полиэлектролит, модулирующий иммуногенез, обладает митогенными свойствами, стимулирует миграцию стволовых клеток.
15-ти морским свинкам вводят толероген (как в примере 1) и разделяют на 3 группы: 1-я группа - 5-ти морским свинкам через 3 дня после толерогенной обработки подкожно вводят ронколейкин трижды с интервалом 24 часа в дозе по 3,5 тыс.БД 0,2 мл физиологического раствора (общая доза на животное - 10,5 тыс.ЕД); 2-ая - 5 животным вводят внутримышечно полиоксидоний трижды по 0,06 мг 0,2 мл физиологического раствора (общая доза на животное 0,18 мг); 3-я - 5-ти животным вводят поливинилпирролидон (ПВП) по 5 мг на животное в 1 мл физиологического раствора (кратность и дозы препаратов соответствуют инструкции по их применению). Через 10 дней после введения иммуномодуляторов морских свинок иммунизируют вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг 0,1 мл физиологического раствора; 4-я группа - 5 здоровых интактных морских свинок также были привиты вакциной БЦЖ; 5-я - 4 интактные морские свинки, которых инфицируют вирулентной культурой М.bovis подкожно в дозе 0,0001 мг в 1 мл физиологического раствора. Одновременно инфицируют морских свинок всех опытных групп.
Иммуномодулирующие свойства препаратов изучают с помощью оценки иммунного статуса по определению в крови морских свинок наиболее активных иммунокомпетентных клеток: определение количества в тесте Е-рок - Т-лимфоцитов; ЕАС-рок - В-лимфоцитов; ЕА-рок - лимфоцитов-киллеров; ЕТ-рок (туберкулиновые) - антигенреактивных лимфоцитов и нейтрофилов. Отбор проб крови проводят через 30 дней после иммунизации и 30 дней после экспериментального заражения. Число иммунокомпетентных клеток определяют в абсолютном содержании (тыс./мкл). Результаты по изучению числа иммунокомпетентных клеток у морских свинок после вакцинации и заражения вирулентной культуры микобактерий показаны в таблице 2.
Иммунологическая перестройка в организме морских свинок через 30 дней после вакцинации сопровождается увеличением числа иммунокомпетентных клеток, при этом высокой степени достоверности достигает увеличение числа Т-лимфоцитов у животных всех групп, кроме 4-й группы.
Через 30 дней после инфицирования также отмечают увеличение у морских свинок числа Т-лимфоцитов, однако достоверных различий оно достигает у животных, которым вводили ронколейкин и вакцину БЦЖ.
Таблица 2
Результаты оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на толерантных морских свинках
№ группы
Сроки исследования
Препарат
Символы статистики
Иммунокомпетентные клетки
Е-рок
ЕАС-рок
ЕА-рок
ЕТ-рок
нейтрофилы
1
через 30 дней после иммунизации
Ронколейкин
М=
2,95
2,60
1,83
1,61
1,98
m±
0,62
0,30
0,28
0,28
0,77
Р
0,04
0,22
0,57
0,68
0,18
2
Полиоксидоний
М=
4,55
3,66
2,49
1,73
2,05
m±
0,81
0,79
0,38
0,29
0,55
Р
0,008
0,09
0,09
0,54
0,07
3
ПВП
М=
2,61
2,70
1,67
1,94
1,94
m±
0,40
0,38
0,22
0,49
0.84
Р
0,03
0,21
0,88
0,44
0,23
4
БЦЖ
М=
1,91
2,95
2,58
1,68
3,81
m±
0,36
0,92
0,69
0,34
1,06
Р
0,19
0,36
0,23
0,61
0,02
5
контроль
М=
1,33
1,99
1,62
1,38
0,82
m±
0,17
0,32
0,22
0,45
0,08
1
через 30 дней после инфицирования
Ронколейкин
М=
4,39
3,41
3,49
1,46
1,17
m±
0,82
0,22
0,80
0,28
0,28
Р
0,04
0,43
0,97
0,09
0,06
2
Полиоксидоний
М=
3,45
3,73
4,55
1,23
1,26
m±
0,66
1,39
0,97
0,20
0,41
Р
0,13
0,73
0,41
0,15
0,10
3
ПВП
М=
2,39
3,15
2,46
0,94
1,23
m±
0,40
0,39
0,39
0,16
0.23
Р
0,64
0,34
0,28
0,72
0,07
4
БЦЖ
М=
3,77
3,49
2,62
1,99
2,02
m±
0,30
1,09
0,30
0,38
0,76
Р
0,01
0,59
0,34
0,02
0,44
5
контроль
М=
2,12
4,38
3,45
0,87
2,87
m±
0,38
1,13
0,76
0,09
0.73
Из таблицы видно, что оценку иммуномодулирующих препаратов возможно провести, определяя наиболее активные в иммунном ответе иммунокомпетентные клетки, это затрудняет проводить оценку эффективности каждого иммуномодулирующего средства в сравнительном аспекте. Затраты на одно исследование 30 морских свинок составили 12000 руб., что в 10 раз дороже предлагаемого нами способа.
Для проведения исследования использовали этих же морских свинок, которых через 30 дней после инфицирования убивают, проводят патологоанатомические исследования и оценивают степень пораженности внутренних органов животных и индекс защиты по схеме Г.И.Гельберга и Е.А.Финкеля (Гельберг С.И. К методике экспериментального изучения иммуногенных свойств противотуберкулезных вакцин и эффективность методов их применения / С.И.Гельберг, Е.А.Финкель // Пробл. туберкулеза. - 1959. - №2. - С.80-84.): сначала определяли в количественных показателях интенсивность распространения поражения туберкулезного характера каждой опытной и контрольной морской свинки. Показатель поражений оценивали от 0 до 9. Так, показатель поражений в 1-й группе составил: 3, 0, 0, 3, 0; во 2-й - 3, 3, 3, 4; в 3-й группе - 4, 4, 4, 3, 0; в 4-й группе - 0, 0, 5, 3, 3 и в 5-й группе - 4, 4, 8, 7.
Затем устанавливали средний показатель поражения для каждой опытной группы животных путем вычисления средних арифметических величин из индивидуальных показателей по формуле:
где В - показатель интенсивности поражений группы животных;
А - показатель поражения каждой морской свинки в группе;
n - количество животных в группе.
Например, показатель интенсивности поражений 1-й группы составил:
Подставив значения исследуемых групп в формулу, аналогично определили показатель интенсивности поражений остальных опытных групп (соответственно: 3,25; 3,0; 2,2; 5,75).
Для оценки напряженности иммунитета применяли индекс защиты, предложенный А.И.Тогуновой (1948). Из среднего показателя интенсивности поражения контрольной группы вычитали такой же показатель, установленный для опытной группы. Затем полученный остаток, взятый в процентах, делили на средний показатель интенсивности поражения контрольной группы по формуле:
где С - индекс защиты;
К
В - показатель интенсивности поражений в контрольной группе;
О
В - показатель интенсивности поражений в опытной группе.
Например, индекс защиты в 1-й группе составил:
индекс защиты в во 2-й группе составил:
Из таблицы 3 видно, что ронколейкин является наиболее эффективным препаратом для восстановления иммунологической реактивности (индекс защиты 79%), ПВП и полиоксидоний (соответственно: 48 и 43%).
Результаты показывают, что предлагаемый способ оценки иммуномодулирующих свойств препаратов предпочтительно использовать как экономически выгодный и более точный.
Таблица 3
Результаты оценки иммуномодулирующих свойств препаратов на толерантных морских свинках
Группа животных
Кожная аллергическая реакция через 30 дней после вакцинации, мм
Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм
Степень пораженности органов, в баллах M±m
Индекс защиты, %
n
Реагировало
M±m
n
Реагировало
M±m
Ронколейкин-2
5
5
10,4±1,03
5
5
13,2±1,02
1,2±0,73
79
Полиоксидоний
4
3
6,0±2,48
4
4
13,0±1,78
3,25±0,25
43
ПВП
5
3
6,0±2,59
5
5
10,6±1,12
3,0±0,77
48
Вакцина БЦЖ
5
5
16,4±3,47
5
5
12,0±0,63
2,2±0,97
67
Контроль
4
-
-
4
3
12,25±4,11
5,75±1,03
0