Направленное регулирование устойчивости суспензии клеток полимерным реагентом - катионным полиакриламидом

Вестник Казанского технологического университета. 2015. Т.18, №3 УДК 541.18.041.2:661.185

Е. М. Кулагина, Р. И. Юсупова, М. В. Потапова

НАПРАВЛЕННОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК ПОЛИМЕРНЫМ РЕАГЕНТОМ - КАТИОННЫМ ПОЛИАКРИЛАМИДОМ

Ключевые слова: флокуляция, полиакриламидные флокулянты, устойчивость бактериальной суспензии.

Рассмотрено действие модифицированного полиакриламида на устойчивость суспензий грамположительных и грамотрицательных бактерий, проведено сравнение с анионным ПАА. Определен оптимальный диапазон концентраций флокулянта. Флокуляция под действием КПАА является перспективным способом интенсификации процесса выделения клеточной биомассы.

Key words: flocculation, polyacrylamide flocculants, the stability of the bacterial suspension.

Considered the effect of the modified polyacrylamide on the stability of suspensions of gram-positive and gramnegative bacteria, compared with anionic PAA. The optimal range of concentration of the flocculant. Flocculation under the action of CPAA is a promising way to intensify the process of isolation of cell biomass.

В мире современных технологий для решения многих задач все чаще используют полимеры на основе акриламида. Акриламид широко используется в производстве высокоэффективного флокулянта полиакриламида (ПАА) [1], который легко поддается модификации введением различных заместителей и функциональных групп [2]. ПАА и его производные применяются для обеспечения высокой степени очистки природных и сточных вод, в технологических процессах, связанных с разделением твердых и жидких фаз [3], в нефтедобывающей промышленности, медицине, косметологии [4-6], а также в биотехнологии для интенсификации стадии выделения биомассы из культуральной жидкости [7].

В литературе приведено значительное количество экспериментальных данных по способам агрегации микробных клеток. Нарушение агрегативной устойчивости и, как следствие этого, флокуляция биосуспензий могут быть вызваны различными причинами. Наиболее перспективным направлением интенсификации выделения биомассы признается флокуляция клеток под действием полимерных флокулянтов [3, 8]. Для флокуляционных процессов характерна быстрота образования агрегатов при введении сравнительно небольших доз полимеров.

Ранее было показана возможность флокуляции суспензии дрожжей катионным производным ПАА [9]. Однако проведенные исследования по изучению механизма флокуляции биосуспензии не дают пока полного представления о данном процессе и о возможности управления им. Трудность заключается в том, что следует учитывать конкретный вид микроорганизмов, стадию их культивирования, физиологическое состояние и среду, на которой происходит их рост. В ряде работ [7,10] показано влияние состава и строения клеточной поверхности на агрегативную устойчивость биосуспензий. С химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий связывают способность клеток удерживать красящий комплекс. По отношению к различным красителям, прежде всего к окраске по Граму, все

микроорганизмы делятся на две группы: бактерии, сохраняющие окраску после обработки растворителями - грамположительные (Гр+) - и бактерии, обесцвечивающиеся или -грамотрицательные (Гр-). Гр+ бактерии отличаются от Гр- рядом биологических свойств и особенностей. В оболочках Гр+ бактерий содержится гликопептид муреин, полисахариды и тейхоевые кислоты и они имеют достаточно плотную многослойную структуру. Оболочки грамотрицательных бактерий однослойные, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопротеидов и липополисахаридов. Большинство Гр+ видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивности и другим типам излучения. В тоже время Гр- бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков [11]. В наружной мембране Гр-бактерий, отсутствующей у бактерий Гр+, содержатся порины - белки, пронизывающие наружную мембрану насквозь, функционирующие подобно порам для определенных молекул. Это, возможно, и создает определенные (необходимые) условия при флокуляции.

Целью работы явилось исследование влияния добавок модифицированного ПАА на устойчивость суспензии грамотрицательных и грамположительных бактерий.

В работе использовали грамположительные бактерии рода Bacillus subtilis B917 и грамотрицательные - рода Esherichia coli K12 из коллекции промышленных микроорганизмов Казанского института биохимии и биофизики. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах с жидкой питательной средой (мясопептонный бульон) при Т =370C в течении 36 часов. Посевным материалом служила 18 часовая культура, выращенная на мясопептонном агаре.

В качестве флокулянтов использовали модифицированные полиакриламидные флокулянты фирмы BASF:

a) катионный полиакриламид Sedipur CF-803 (КПАА), ß = 56% - содержание ионогенных звеньев, ММ = 2700000.

Вестник Казанского технологического университета. 2015. Т.18, №3

б) анионный полиакриламид Sedipur AF-404 (АПАА), ß = 37% - содержание ионогенных звеньев, ММ =2900000.

Флокулирующее действие полимерных добавок на биосуспензию оценивали в условиях реальной культуральной жидкости. Контроль за процессом флокуляции осуществляли по изменению оптической плотности (Dorrr.) бактериальной суспензии во времени. Измерения проводили на спектрофотометре «APPEL AP-101» с использованием кварцевых кювет с толщиной слоя жидкости l = 3 см. В качестве раствора сравнения использовали супернатант культуральной жидкости. Каждое измерение повторялось не менее трех раз, разброс значений DonT. не превышал 5%.

Получены кинетические зависимости оптической плотности изучаемых систем при дозированном введении флокулянта, рис. 1 и 2. Наблюдали резкое просветление системы (Бопт. падает практически до DonT. = 0), происходило оседание клеток при введении добавки КПАА.

Рис. 1 - Изменение оптической плотности суспензии клеток Esherichia coli K12 под действием КПАА и АПАА при концентрациях С103, %: 1 - 0,075; 2 - 0,1; 3 - 0,125; 4 - 0,175; 5 -0,15; 6 - АПАА 0,2

Можно рассуждать следующим образом, необходимым условием агрегации клеток в модельных системах является снижение их потенциала [12]. В кислой области рН это происходит за счет диссоциации аминогрупп, входящих в состав белков клеточной поверхности, а на макромолекулах КПАА, рН < 3,0, преобладает положительный заряд. В работе [13] при исследовании поверхностных свойств дрожжевых клеток Torulopsis (Candida) kefir var kumis и Saccharomyces cerevisiaе было показано, что при варьировании рН в интервале от 2 до 8 электрофоретический потенциал изменяется незначительно, т.е. в этом интервале поверхность клеток имеет отрицательный заряд, что подтверждается величиной электрокинетического потенциала 4 = -3 ^ -6 мВ [14]. За счет проявления сил электростатического взаимодействия система теряет устойчивость. Таким образом, введение КПАА в биосуспензию приводит к флокуляции.

Введение в исследованные системы анионного полиакриламида практически не вызывает седиментацию микробных клеток, рис. 1, кр. 1, Бош,сохраняется в диапазоне значений 1.2 -1.1. По-видимому, это можно объяснить тем, что происходит электростатическое отталкивание одноименно заряженных поверхностей «клетка -макромолекула АПАА», поверхность клеток сохраняет отрицательный заряд [12].

12 1?

20

24

28

?2

МИН

Рис. 2 - Изменение оптической плотности суспензии клеток Bacillus subtilis B917 под действием КПАА и АПАА при концентрациях С103, %: 1 - 0,15; 2 - 0,75; 3 - 0,20; 4 - 0,25; 5 -0,225; 6 - АПАА 0,20

Аналогичную картину наблюдали для суспензии клеток Bacillus subtilis B917.

Определен оптимальный диапазон концентраций КПАА, вызывающие флокуляцию суспензий клеток Esherichia coli K12 и Bacillus subtilis B917 в культуральной жидкости. Для грамотрицательных бактерий он составил С-103, % = 0.125 - 0.15, потеря устойчивости в системе наступает за время т = 8-12 минут и время т = 4-10 минут при С-103, % = 0.2 - 0.25 - для грамположительных бактерий, то есть можно предположить зависимость флокуляции от строения клеточной стенки изучаемых микроорганизмов.

Исследованиями, проведенными ранее [15], было отмечено, что при различном порядке ввода флокулирующих агентов в клеточную суспензию дрожжей родов Saccharomyces cerevisiae и Candida lambica возникала необходимость дополнительного введения анионного ПАВ для снижения заряда клеточной поверхности. Это приводило к нейтрализации заряда и способствовало процессу агрегации и снижению устойчивости биосуспензии. При этом увеличивалась вероятность «мостикообразования». Согласно современным представлениям [8], макромолекула флокулянта при одновременной адсорбции на двух или нескольких частицах дисперсии связывает их в агрегаты полимерными «мостиками». Это возможно при изменении конформации макромолекулы с образованием длинных «петель и хвостов», что способствует ее закреплению на поверхности клеток и захвату частиц.

Вестник Казанского технологического университета. 2015. Т.18, №3

Таким образом, в результате выполненного эксперимента установлен оптимальный интервал концентраций флокулянта КПАА для изученных бактериальных суспензий в предположении «мостичного» и нейтрализационного механизмов флокуляции, а также влияния сложного строения клеточной поверхности.

Использование полиэлектролитных флокулянтов может служить перспективным направлением интенсификации процесса выделения биомассы.

Литература

1. В.Ф. Куренков, Полиакриламидные флокулянты. Химия, Москва, 1997. 208 с.

2. В.А. Мягченков, В.Е. Проскурина, Сополимеры акриламида с функцией флокулянтов. КГТУ, Казань, 2011. 296 с.

3. А.К. Запольский, А. А. Баран, Коагулянты и флокулянты в процессах очистки воды. Химия, Ленингр. отд., Ленинград, 1987. 205 с.

4. Ж.Н. Малышева, С.С. Дрябина, А.В. Навроцкий, А.В. Купцов, Ю.С. Зубрева, И.А. Новаков, Журнал прикладной химии, 82, 11, 1881-1886

5. В.Ф. Куренков, С.В. Снигирев, Ф.И. Чуриков, Журнал прикладной химии, 73, 6, 1346-1349,

6. В.И. Комаров, Пищевая промышленность, 2, 27-29,

7. Я.Я. Шкоп, Н.В. Фомченко, Агрегация клеток микроорганизмов в процессе разделения микробных суспензий. ИНТИТЕЙ микробпром, Москва, 2002. 60 с.

8. В.Ф. Куренков, Соровский образовательный журнал, 7, 57-59,

9. Е.М. Кулагина, Р.И. Юсупова, М.В. Потапова, Вестник Казанского технологического университета, 17, 16, 167-170

10. S. Barany, A. Szepesszentgyorgyi, Advances in Colloid and Interface Science, 111, 1-2, 117-129

11. М.В. Гусев, Л.А. Минеева, Микробиология. Академия, Москва, 2003. 464 с.

12. M. Stratford, FEMS Microbiology Letters, 136, 13-18

13. С.М. Тажибаева, К.Б. Мусабеков, А.Б. Оразымбетова, А.А. Жубанова, Коллоидный журнал, 65, 1, 132-135

14. Л.Б. Свердлов. Автореф. дисс. канд. хим. наук, -Казанский хим.технол. ин-т, Казань, 1985. 20с.

15. Р. И. Юсупова, М. В. Потапова, А. И. Курмаева, В. П. Барабанов, Вестник Казанского технологического университета, 1, 244-249

© Е. М. Кулагина - к.х.н., доцент кафедры физической и коллоидной химии КНИТУ, kyllen@mail.ru; Р. И. Юсупова - к.х.н., зав. лаб. той же кафедры; М. В. Потапова - к.х.н., доцент той же кафедры.

© E. M. Kiilagina - associate Professor of physical and colloid chemistry, KNRTU kyllen@mail.ru; R. I. Yusupova - head. lab. the same Department; M. V. Potapova - associate Professor of the same Department.