МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ

Область техники, к которой относится полезная модель
Полезная модель относится к биотехнологии, а именно, к тканевой инженерии, и может быть использована для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей со статическим и/или динамическим движением ростовой среды.
В частности, заявляемая полезная модель может быть использована для формирования двухслойных клеточных моделей из различных типов клеток, например, модели плаценты, с последующим изучением процессов фетоплацентарного барьера in vitro. Устройство позволяет имитировать на микроуровне структуру и функцию плаценты и моделировать перенос питательных веществ от матери к плоду и от плода к матери.
Заявляемое решение также может быть использовано для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro, оценки транспорта ксенобиотиков через плацентарный барьер и их токсичности при разработке новых лекарственных средств.
Уровень техники
Плацента является высокоспециализированным органом, который играет важную роль в человеческом организме в ходе беременности. Известно, что по некоторым оценкам лишь 15% препаратов одобрены для применения во время беременности, т.к. у исследователей недостаточно информации о проницаемости плаценты для их препаратов и влиянии лекарств на развивающийся плод. Десятки выведенных с рынка препаратов, которые вызывали серьезные нарушения при беременности, привели к развитию новых in vitro методов тестирования безопасности. В этих исследованиях были выявлены серьезные недостатки существующих методов тестирования на животных: низкая релевантность относительно человека, высокая стоимость и сложность экспериментов.
На сегодняшний день известны подходы к созданию новых методик тестирования проницаемости плацентарного барьера. Стремительное развитие технологий «орган-на-чипе» привело к появлению работ по созданию клеточных моделей плацентарного барьера, культивируемых in vitro. В частности, в работах [Blundell С. и др. А microphysiological model of the human placental barrier. // Lab Chip. 2016. T. 16. №16. C. 3065-73; Lee J.S. и др. Placenta-on-a-chip: a novel platform to study the biology of the human placenta. // J. Matern. Fetal. Neonatal Med. 2016. T. 29. №7. C. 1046-54] была осуществлена попытка получения микрофизиологических моделей плацентарного барьера на чипе.
На данный момент в мировой литературе часто встречаются работы, посвященные исследованию токсического действия препаратов на плацентарный барьер. Эти работы основаны на базовых методах культивирования in vitro. Использование современных методов и моделей культивирования позволит получить больше достоверных результатов тестирования ксенобиотиков на токсичность. Наиболее перспективным подходом, обеспечивающим такие условия, считают культивирование клеток в условиях специальных устройств-микробиореакторов (или микрофлюидных чипов, микрофлюидных платформ), которые обеспечивают поддержание жизнеспособности, функциональной активности и стабильности клеточных культур в течение длительного времени, а также регистрацию изменения параметров, характеризующих их функциональный статус на молекулярном уровне [см., например, Peyton S.R. и др. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. // Biotechnol. Bioeng. 2011. T. 108. №5. C. 1181-93; Griffith L.G., Swartz M.A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. T. 7. №3. C. 211-24]. В динамических моделях микробиореакторов с помощью микронасосов обеспечивается циркуляция питательной среды в проточном и/или замкнутом режимах.
Из уровня техники известны микрофлюидные чипы (RU 2648444, RU 2584598), представляющие собой трехслойную структуру, включающую пластину из поликарбоната, в которой выполнены резьбовые отверстия, соответствующие расположению микрофлюидных элементов чипа (клеточных ячеек, микронасосов, клапанов и др.), а также служащие для подключения к нему различных емкостей (емкости с питательной средой, емкости сбора среды, емкости сбора фильтрата) и внешних модулей (например, средства создания постоянного давления); слой формовочного материала (например, полидиметилсилоксана), в котором выполнены микрофлюидные элементы чипа, включая ячейки для размещения/культивирования клеточных моделей, соединенные микрофлюидными каналами, и предметное стекло, герметизирующее микрофлюидную систему в слое формовочного материала. В частности, микрофлюидный чип по патенту RU 2648444 содержит объединенные микрофлюидными каналами, по крайней мере, шесть идентичных ячеек, предназначенных для одновременного сокультивирования клеточных моделей органов и тканей человека в проточном или замкнутом режимах. Ячейки сверху герметизированы пробками, закрепленными в пластине из поликарбоната с помощью резьбового соединения.
Известно также устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл (RU 2668157). Устройство включает пластину со сквозным отверстием для герметичного размещения в нем Трансвелла, где толщина пластины обеспечивает возможность размещения мембраны Трансвелла внутри отверстия с разделением полости отверстия на две части. Причем одна часть предназначена непосредственно для размещения Трансвелла, а вторая часть предназначена для размещения среды с клетками. Кроме того, вторая часть полости имеет входное отверстие с диаметром до 3 мм для подачи клеток и/или среды, что исключает за счет сил поверхностного натяжения выход среды наружу при переворачивании пластины.
Однако известные решения характеризуются нестабильностью жизнедеятельности клеток, находящихся в Трансвеллах, что приводит к искажению измерений. При установке мембранных вставок, как правило, под мембраной образуется пузырь воздуха, который ограничивает контакт питательной среды с клетками, нарушает процессы диффузии и транспорта питательных веществ и приводит к нарушению целостности монослоя и гибели клеток. Кроме того, при подключении к клеточной ячейке насоса и реализации потока среды через нее, пузырь может сместиться в микроканал и нарушить его гидродинамические характеристики: гидравлическое сопротивление, расход, что также может привести к деформации монослоя клеток.
Наиболее близкой к предлагаемому решению является конструкция микрофлюидного чипа для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей, известная из патента RU 184220. Микрофлюидный чип содержит основу, включающую клеточную ячейку, выполненную с возможностью размещения в ней культуральной вставки типа Трансвелл, и снабженную пробкой, а также размещенный на основе слой из формовочного материала со сформированной микрофлюидной системой заданной топологии. При этом чип содержит также уплотнительный слой из формовочного материала, размещенный на основе со стороны, противоположной размещению слоя с микрофлюидной системой, и со стороны внутренней поверхности клеточной ячейки. Внутренняя поверхность клеточной ячейки с уплотнительным слоем имеет ступенчатый профиль и рельеф, обеспечивающий центрирование Трансвелл и вывод пузырьков воздуха, образующихся со стороны нижней поверхности мембраны Трансвелла при его установке в ячейку.
Однако несмотря на наличие дополнительного уплотнительного слоя и выполнение клеточной ячейки со ступенчатым профилем, известное решение также не исключает возникновение пузырей воздуха в питательной среде под вставками Трансвелл в процессе их установки в отделение для клеток. Культивирование клеток с данными пузырьками может приводить к гибели части клеток на нижней стороне мембраны и, как следствие, снижению значений трансэпителиального электрического сопротивления (TEER). Кроме того, в известном решении отсутствует конструктивная возможность измерения TEER, являющегося важным параметром при исследовании клеточных моделей. Для измерения TEER необходимо извлечение вставки типа Трансвелл из устройства с размещением в отдельной подставке, что увеличивает риск контаминации и нарушения целостности слоев клеток за счет механических воздействий, а также не обеспечивает возможность контроля целостности и свойств слоев клеток в режиме реального времени.
Технической проблемой, на решение которой направлена предлагаемая полезная модель, является разработка конструкции микрофлюидного чипа с клеточной ячейкой для сокультивирования различных типов клеток, в т.ч. используемых в модели плацентарного барьера, в динамических и/или статических условиях ростовой среды, обеспечивающего получение качественных результатов при исследовании, а также возможность контроля целостности и свойств слоев клеток в режиме реального времени.
Техническим результатом является обеспечение возможности контроля целостности и свойств по меньшей мере двухслойных клеточных моделей, воспроизводящих модель плацентарного барьера в условиях in vitro, приближенных к in vivo, в режиме реального времени.
Полезная модель обеспечивает в т.ч. получение более точных результатов измерения трансэпителиального электрического сопротивления двухслойных клеточных моделей плацентарного барьера, за счет снижения риска повреждения или гибели клеток как в процессе их культивирования, так и в процессе самого исследования, исключающих образование пузырьков воздуха в питательной среде, негативно влияющих на результаты исследований.
Технический результат достигается за счет создания микрофлюидного чипа для культивирования и исследования клеточных моделей, включающего верхнюю и нижнюю пластины из твердого оптически прозрачного материала, и размещенный между пластинами слой формовочного оптически прозрачного материала с расположенной в нем микрофлюидной системой, при этом верхняя пластина, расположенная на слое формовочного материала, выполнена меньшей площади, а слой формовочного материала в области, свободной от верхней пластины, снабжен четырьмя элементами для подключения внешней среды, выполненными в виде углублений в слое формовочного материала, связанных с микрофлюидной системой; при этом микрофлюидная система образована клеточной ячейкой, выполненной в виде сквозного отверстия в слое формовочного материала, поперечно разделенного пористой мембраной, и двумя группами подводящих и отводящих микрофлюидных каналов, выполненных на поверхностях слоя формовочного материала, загерметизированными верхней и нижней пластинами; при этом подводящий и отводящий каналы первой группы выполнены в виде канавок Г-образной формы на нижней поверхности слоя формовочного материала, каждый из которых соединен одним концом - с клеточной ячейкой, а другим - с соответствующим углублением для доступа внешней среды к клеточной ячейке; подводящий и отводящий каналы второй группы образованы двумя прямолинейными сегментами, один из которых расположен на нижней поверхности слоя формовочного материала и соединен с соответствующим углублением для доступа внешней среды, а второй сегмент - расположен на верхней поверхности слоя формовочного материала и соединен с клеточной ячейкой; слой формовочного материала снабжен выемкой для подключения измерительного модуля с одной из торцевых сторон чипа, при этом каждая из пластин со стороны слоя формовочного материала снабжена двумя электродами, расположенными в области проекции клеточной ячейки, и двумя контактными площадками для подключения к измерительному модулю, расположенными в области выемки и соединенными с электродами.
При этом первый и второй сегменты подводящего и отводящего каналов второй группы расположены под прямым углом друг к другу и соединены между собой через дополнительное сквозное отверстие в слое формовочного материала.
Два электрода каждой из пластин расположены параллельно друг другу.
Слой формовочного материала в области расположения элементов для подключения внешней среды выполнен утолщенным, при этом элементы расположены симметрично относительно клеточной ячейки, по два на противоположных сторонах чипа.
Элементы для подключения внешней среды выполнены в виде углублений цилиндрической формы и снабжены сужениями в нижней части для обеспечения плотного контакта с устройством ввода внешней среды.
Подводящие и отводящие каналы выполнены прямоугольного сечения высотой от 0,5 мм до 2 мм и шириной от 0,2 до 1 мм, при этом диаметр клеточной ячейки составляет от 3 до 6 мм.
Верхняя и нижняя пластины выполнены толщиной от 0,16 до 2 мм, слой формовочного материала, расположенный между пластинами, выполнен толщиной от 1 до 4 мм, слой формовочного материала в области расположения элементов для подключения внешней среды выполнен толщиной от 5 до 10 мм.
Подводящие и отводящие каналы в области соединения с клеточной ячейкой имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 4 мм.
В качестве формовочного материала использован полидиметилсилоксан, верхняя и нижняя пластины выполнены из стекла.
Микрофлюидный чип может быть снабжен крышкой, выполненной с возможностью уплотнения в углублениях для доступа внешней среды к микрофлюидной системе.
5
8
2
Мембрана может быть выполнена из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена, диаметром от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью от 1×10 до 1×10 пор на 1 см.
В качестве измерительного модуля может быть использовано устройство измерения сопротивления монослоя клеток.
Микрофлюидный чип может быть выполнен с габаритными размерами, не превышающими 35-80 мм × 20-30 мм.
Таким образом, предлагаемая конструкция чипа за счет интегрированной внутри него клеточной ячейки с пористой мембраной и системой подводящих и отводящих каналов, а также системы электродов, позволяет производить необходимые исследования в режиме реального времени без предварительных операций установки Трансвелла с клетками в ячейку и его извлечения, что снижает риск повреждения или гибели клеток, и, как следствие, приводит к более точным результатам измерений. Конфигурация каналов обеспечивает исключение образования в них пузырей воздуха в процессе транспорта питательной среды, что позволяет сохранить целостность монослоя клеток. За счет интегрированной непосредственно в чип системы электродов, предлагаемое устройство позволяет контролировать изменение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) многослойной модели без нарушения целостности барьера, а также определять другие электрические свойства модели, такие как фоновое сопротивление, электрическая емкость и другие показатели, извлекаемые при импедансной спектрометрии.
Полезная модель поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен общий вид микрофлюидного чипа, на фиг. 2. представлено пространственное расположение микрофлюидной системы и электродов заявляемого чипа, на фиг. 3 представлен разрез чипа в сборе, на фиг. 4 - общий вид чипа с платой коммутации.
Позициями на чертежах обозначены: 1 - верхняя пластина; 2 - нижняя пластина; 3 -слой формовочного оптически прозрачного материала; 4-7 - элементы для подключения внешней среды; 8 - зона сужения в нижней части элементов для подключения внешней среды (например, для уплотнения носика пипетки, помогающее быстрому вводу среды); 9 - клеточная ячейка; 10 - пористая мембрана, 11, 12 - подводящие микрофлюидные каналы; 13, 14 - отводящие микрофлюидные каналы; 15 - сквозное отверстие в слое формовочного материала, соединяющее первый и второй сегменты каждого из каналов 12, 14; 16 - выемка для подключения измерительного модуля; 17 - плата коммутации; 18, 19 - электроды верхней пластины; 20, 21 - электроды нижней пластины; 22-25 - контактные площадки электродов для подключения к измерительному модулю; 26, 27 - контакты на плате коммутации для верхних электродов; 28, 29 - контакты на плате коммутации для нижних электродов; 30, 31 - сегменты подводящего канала 12; 32, 33 - сегменты отводящего канала 14.
Микрофлюидный чип для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей включает верхнюю 1 и нижнюю 2 пластины из твердого оптически прозрачного материала, преимущественно, стекла, и размещенный между пластинами слой 3 формовочного оптически прозрачного материала с расположенной в нем микрофлюидной системой. При этом верхняя пластина 1 выполнена меньшей площади по сравнению с пластиной 2 и расположена на слое 3 формовочного материала в центральной части. Слой формовочного материала в области, свободной от верхней пластины, снабжен четырьмя элементами 4-7 для подключения внешней среды (обеспечивающими доступ внешней среды к микрофлюидной системе), выполненными в виде углублений в слое формовочного материала, связанных с микрофлюидной системой. В качестве внешней среды могут выступать культуральные среды для клеток любого состава, в том числе среды с использованием сыворотки животных и бессывороточные среды, а также другие изотонические растворы, которые позволяют в течение необходимого времени поддерживать целостность клеток. Элементы 4-7 расположены симметрично относительно центра чипа, по два на его противоположных сторонах. При этом в области расположения данных элементов слой формовочного материала выполнен утолщенным. Углубления выполнены цилиндрической формы и снабжены сужениями 8 в нижней части, обеспечивающими плотный контакт с устройством ввода внешней среды (например, наконечником пипетки).
Микрофлюидная система, расположенная в слое 3 формовочного материала, образована клеточной ячейкой 9 и двумя группами подводящих 11, 12 и отводящих 13, 14 микрофлюидных каналов, связанных с клеточной ячейкой. При этом клеточная ячейка 9 расположена в центре чипа и выполнена в виде сквозного отверстия в слое формовочного материала, поперечно разделенного пористой мембраной 10, и загерметизирована сверху и снизу пластинами 1 и 2, соответственно. Подводящие 11, 12 и отводящие 13, 14 микрофлюидные каналы выполнены на нижней и верхней поверхностях слоя 3 формовочного материала и также загерметизированы верхней и нижней пластинами. При этом подводящий 11 и отводящий 13 каналы первой группы выполнены в виде канавок Г-образной формы на нижней поверхности слоя формовочного материала, и загерметизированы снизу пластиной 2, образующей нижние стенки каналов. Каждый из каналов 11, 13 соединен одним концом - с клеточной ячейкой 9, а другим - с соответствующим углублением 4, 5 для доступа внешней среды к клеточной ячейке. Подводящий 12 и отводящий 14 каналы второй группы образованы двумя прямолинейными сегментами 30, 31 и 32, 33, соответственно. Сегменты 30, 32 расположены на нижней поверхности слоя формовочного материала, загерметизированы снизу пластиной 2 и соединены с соответствующими элементами подключения внешней среды, а сегменты 31, 33 расположены под прямым углом к сегментам 30, 32 на верхней поверхности слоя формовочного материала, загерметизированы сверху пластиной 1 и соединены с клеточной ячейкой 9, при этом сегменты 30, 32 и 31, 33 каждого из каналов соединены между собой через сквозные отверстия 15 в слое формовочного материала. Таким образом, сегменты, образующие каналы 12, 14 расположены перпендикулярно друг другу и находятся в параллельных плоскостях, а пористая мембрана 10 разделяет каналы, расположенные на нижней и верхней поверхности слоя формовочного материала. Данная конфигурация позволяет осуществить бесперебойный транспорт жидкости, а также дает возможность дальнейшей мультипликации уровней и каналов микрофлюидной системы. Клеточная ячейка 9, являющаяся общей для подводящих и отводящих каналов, оказывается разделенной пористой мембраной 10, интегрированной в слой формовочного материала в средней плоскости, на две идентичные и независимые части - верхнюю и нижнюю, что позволяет проводить оценку транспорта ксенобиотиков через плацентарный барьер при разработке новых лекарственных средств. При этом подводящий и отводящий каналы 11,13 проходят под мембраной 10 и предназначены для циркуляции питательной среды, поступающей из элемента подключения внешней среды 5 через клеточную ячейку. За счет отсутствия выступов и перепада давления каналы заполняются равномерно без образования пузырей.
Подводящие и отводящие каналы могут быть выполнены прямоугольного сечения высотой от 0,5 мм до 2 мм и шириной от 0,2 до 1 мм, диаметр клеточной ячейки может составлять от 3 до 6 мм. В области соединения с клеточной ячейкой подводящие и отводящие каналы имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 4 мм. Верхняя 1 и нижняя 2 пластины могут быть выполнены толщиной от 0,16 до 2 мм. Слой 3 формовочного материала, расположенный между пластинами 1 и 2, может быть выполнен толщиной от 1 до 4 мм, а в области расположения элементов для подключения внешней среды - толщиной от 5 до 10 мм. Предлагаемый микрофлюидный чип выполнен с габаритными размерами, не превышающими 35-80 мм × 20-30 мм.
Слой 3 формовочного материала снабжен выемкой 16 для подключения измерительного модуля, например, устройства измерения сопротивления монослоя клеток, с одной из торцевых сторон чипа. Каждая из пластин 1, 2 со стороны слоя формовочного материала снабжена двумя электродами 18, 19 и 20, 21, соответственно, расположенными параллельно друг другу в области проекции клеточной ячейки, а также двумя контактными площадками 22, 23 и 24, 25 для подключения к измерительному модулю. Контактные площадки 22-25 расположены в области выемки и соединены с электродами 18-21, соответственно. При этом конфигурация электродов 18-21 выполнена таким образом, чтобы осуществить контакт с клеточной ячейкой и избежать контакта с каналами микрофлюидной системы. Коммутация электродов измерительного модуля может осуществляться посредством платы коммутации 17 с верхними 26, 27 и нижними 28, 29 контактными площадками, которая подключается к чипу через выемку 16. При этом плата коммутации снабжена разъемом для подключения внешнего измерительного модуля (устройства измерения TEER или импедансного спектра). Выемка 16 может быть выполнена в форме прямоугольника со скругленными углами в проекции на плоскость пластины. Размер и форму выемки выбирают в соответствии с размером и формой подключаемого устройства.
В качестве формовочного материала могут быть использованы эластичные термопласты или реактопласты, например, силоксаны, полиуретаны, полимеры OSTE+. В предпочтительном варианте осуществления полезной модели в качестве формовочного материала используют газопроницаемый эластичный органический материал -полидиметилсилоксан (ПДМС).
Элементы 4-7 могут служить, например, для герметичного подключения системы подачи воздуха к чипу и/или уплотнения размещаемых в углублениях крышек или пробок. Микрофлюидный чип может быть снабжен крышкой, выполненной с возможностью уплотнения в элементах 4-7 для доступа внешней среды к микрофлюидной системе. Данная крышка может представлять собой монолитную деталь, выполненную, например, из полистирола, и снабженную выступами, расположенными с возможностью одновременной герметизации всех углублений чипа, которая заменяет несколько отдельных резьбовых крышек и уплотнителей к ним, создающих избыточное давление при закручивании. При этом форма и взаимное расположение выступов соответствуют внутренней форме и взаимному расположению углублений 4-7. Крышка может быть выполнена с возможностью введения через нее различных растворов и отбора проб циркулирующей питательной среды или фильтрата, и снабжена встроенными трубками, сообщающимися с углубления 4-7.
2
5
8
2
Мембрана 10 может быть выполнена из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена, диаметром от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм (площадью от 0,143 до 4,67 см), с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×10 до 1×10 пор на 1 см.
Предлагаемый чип может быть изготовлен с использованием оснастки по патентам РФ №№2675998, 2658495. При этом в оснастке формируют слой формовочного материала с микрофлюидной системой заданной топологии (заготовку чипа). Внутренняя поверхность оснастки содержит рельеф, который в результате отливки на нем слоя формовочного материала формирует предлагаемую структуру микрофлюидной системы, в т.ч. траекторию транспорта питательной среды в чипе (конфигурацию микроканалов). При этом в процессе изготовления чипа в оснастку устанавливают мембрану, после чего производят отливку чипа, в результате чего мембрана оказывается интегрированной в чип.
На верхней и нижней поверхностях полученной заготовки чипа любым известным из уровня техники методом фиксируют пластины из оптически прозрачного материала (например, стекла), обеспечивающие герметизацию клеточной ячейки и микроканалов и формирующие верхний и нижний слои чипа.
Фиксация пластин на поверхностях заготовки может быть осуществлена в соответствии со способом, описанным в патенте RU 2658495.
Электроды 18-21 могут быть нанесены на стеклянные пластины 1, 2 ионно-вакуумным напылением. Напыление осуществляют через трафарет в два этапа: первым наносят титан, имеющий повышенную адгезию к стеклу, а сверху наносят золото, являющееся инертным материалом. Электроды могут быть изготовлены из золотой или из серебряной проволоки.
Работа устройства.
2
2
С помощью пипетки, размещаемой в углублении 5, через зону сужения 8, где происходит уплотнение носика пипетки, предотвращающее вытекание, осуществляют ввод клеток в клеточную ячейку 9 по каналу 11. Затем чип переворачивают и выдерживают в данном положении около двух часов, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться к поверхности мембраны 10 с формированием нижнего монослоя клеток (45 мкл). Далее с помощью пипетки, размещаемой в углублении 4, аналогичным образом осуществляют ввод клеток в клеточную ячейку 9 по каналу 12 для формирования верхнего монослоя клеток (45 мкл) и выдерживают в течение времени, обеспечивающем прикрепление клеток к мембране (около двух часов). При этом для создания плацентарного барьера нижний канал 11 заполняют суспензией клеток HUVEC (или аналогичными, имитирующими свойства эндотелия) в расчете от 10 до 50 тыс.клеток на 1 см мембраны, а верхний 12 - клетками BeWo b30 (или аналогичными, имитирующими свойства трофобласта) в расчете от 10 до 50 тыс. клеток на 1 см мембраны. Затем через элементы 4, 5 подключают поток внешней культуральной среды. За счет подводящего давления со стороны элемента 4 осуществляется транспорт питательной среды в верхний сегмент подводящего канала 12, и через клеточную ячейку 9 - в отводящий канал 14; и из элемента 5 - в подводящий канал 11 и через клеточную ячейку 9 - в отводящий канал 13. С помощью перистальтического насоса или насоса с постоянным давлением осуществляют движение питательной среды по указанным каналам и клетки культивируются в динамическом потоке. В случае отключения насоса среда останавливается и клетки культивируются в условиях статичной питательной среды. При этом динамический поток среды может иметь скорость от 2 до 100 мкл/мин.
В результате все клетки, размещенные со стороны нижней поверхности пористой мембраны 10, контактируют с культуральной средой, поступающей по каналу 11, а клетки, размещенные со стороны верхней поверхности пористой мембраны 10 - поступающей по каналу 12, что обеспечивает условия для дальнейшего роста и поддержания жизнеспособности клеток.
Клетки на верхней поверхности пористой мембраны находятся в условиях статичной культуральной среды, а клетки на нижней поверхности - в условиях динамического потока культуральной среды, создающего напряжение сдвига. Такие условия имитируют физиологические условия биологических барьеров в живом организме. Так, в плацентарном барьере клетки трофобласта окружены кровью матери, которая не имеет постоянного потока, а клетки эндотелия постоянно омываются движущейся по сосудам кровью плода. Подобным образом устроены и другие биологические барьеры в живом организме (гематоэнцефалический барьер, кишечный барьер и др.). Таким образом, получаемая с помощью разработанной ячейки модель биологического барьера in vitro имитирует реальные физиологические условия, позволяя изучать свойства данных барьеров в стандартизированном окружении.
С помощью платы коммутации к чипу подключают измерительный модуль, обеспечивающий измерение сопротивления и/или импедансного спектра монослоя клеток.
Таким образом, предлагаемый чип может быть использован для культивирования двухслойных клеточных моделей биологических барьеров, выращенных на пористой мембране, интегрированной внутри чипа, а также для исследования клеточной модели, сформированной на пористой мембране с противоположных ее сторон, имитирующей модель плаценты. При этом с помощью данного устройства возможны также изучение фетоплацентарного барьера в статическом или динамическом режиме ростовой среды, оценка целостности барьера, образованного слоем клеток, имитирующих эндотелий, и слоем клеток, имитирующих трофобласт, изучение газового обмена в плаценте и др. в условиях in vitro, приближенных к in vivo. Кроме того, заявляемое устройство может использоваться не только для формирования и исследования модели плаценты, но и моделей кишечного барьера, гематоэнцефалического барьера и других гемато-тканевых и многослойных барьеров.
Было проведено сокультивирование клеточных моделей плацентарного барьера в клеточной ячейке предлагаемого чипа и в клеточной ячейке чипа со ступенчатым профилем дна ячейки (прототип), с размещенной в ней вставкой Transwell. Сокультивирование осуществляли в течение 24 ч при скорости потока среды 25 мкл/мин. При этом определенная скорость питательной среды была достигнута благодаря подключению к чипу микронасоса. После периода культивирования осуществляли измерение трансэпителиального электрического сопротивления (см. таблицу) клеток в предлагаемом чипе путем его подключения к измерительному модулю (прибору EVOM-Epithelial Voltohmmeter, https://www.wpiinc.coni/var-2754-epithelial-volt-ohm-teer-meter), а также в чипе-прототипе, для чего вставку Transwell с клетками извлекали из клеточной ячейки чипа, а затем помещали в подставку с клеточной питательной средой для анализа трансэпителиального электрического сопротивления с помощью прибора EVOM. При этом процедура измерения EVOM включает в себя измерение сопротивления в пустой ячейке с полупроницаемой мембраной без клеток и измерение сопротивления через слой клеток на полупроницаемой мембране. Значение TEER определяется путем вычитания из второго значения первого значения. Эксперимент был проведен в 6 повторах, в каждом из которых использовался новый отдельный чип с клеточной ячейкой и моделью плацентарного барьера. Клеточные модели для каждого повтора выращивались параллельно и независимо в одинаковых условиях.
Проведенные исследования показали, что в процессе установки вставок в клеточные ячейки чипа-прототипа часто наблюдалось образование пузырей воздуха в питательной среде под вставками Transwell. Культивирование клеток с данными пузырями приводило к неоптимальным условиям для клеток на нижней стороне мембраны и, как следствие, снижению значений TEER. При использовании предлагаемого чипа образование пузырей воздуха не наблюдалось, измеренные значения TEER превышали значения TEER монослоя клеток, полученного в чипе-прототипе, в среднем на 15-20%, что свидетельствует о меньшем количестве поврежденных или погибших клеток как в процессе их культивирования, так и в процессе исследования.