СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АСИММЕТРИЧНЫХ АДАПТОРОВ НА КОНЦАХ ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫХ МАТРИЦ, СОДЕРЖАЩИХ ПЕТЛИ ШПИЛЬКИ, И СЕКВЕНИРОВАНИЯ ИЗ НИХ

1. Способ получения асимметричной двухнитевой матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами из двухнитевой матрицы нуклеиновой кислоты, имеющей свободные 5' и 3'-концы, включающий:
(A) присоединение первого адаптора типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты к 3'-концам двухнитевой матрицы нуклеиновой кислоты, имеющей свободные 5' и 3'-концы;
(B) продолжение с каждого 3'-конца шпильки или гантели нуклеиновой кислоты последовательности, комплементарной двухнитевой матрице нуклеиновой кислоты, с использованием процессивной полимеразы для получения двух длинных шпилечных дуплексных матриц, причем один конец дуплексной матрицы содержит закрытую шпильку («шпилечный конец»), а второй конец дуплекса содержит свободный 3'-конец нити и свободный 5'-конец нити («свободный конец»); и
(C) закрытие свободного конца каждой длинной шпилечной дуплексной матрицы с образованием асимметричной двухнитевой матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами путем:
(i) лигирования второго адаптора типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты к свободному концу дуплексной матрицы; или
(ii) использования TelN протеломеразы для закрытия свободного конца дуплексной матрицы, при этом свободный конец дуплексной матрицы выполнен с возможностью включения последовательности узнавания TelN.
2. Способ по п. 1, в котором двухнитевая матрица нуклеиновой кислоты представляет собой матрицу двухнитевой ДНК.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором 5' и 3'-концы двухнитевой матрицы нуклеиновой кислоты представляют собой дефосфорилированные и прошедшие восстановление концы.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором двухнитевая матрица нуклеиновой кислоты имеет тупые 5' и 3'-концы.
5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором двухнитевая матрица нуклеиновой кислоты имеет 3'-концы с А-хвостом.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты лигируют к 3'-концам двухнитевой матрицы нуклеиновой кислоты с использованием лигазы.
7. Способ по п. 6, в котором лигаза представляет собой T4 ДНК лигазу или T3 ДНК лигазу.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты содержит тупые концы или концы с T-хвостом.
9. Способ по любому из пп. 1-7, в котором первый адаптор типа шпильки на основе нуклеиновой кислоты представляет собой адаптор Y-типа.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором димеры, образующиеся из двух связавшихся друг с другом первых адапторов типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты, удаляют путем применения методик с отбором по размеру или исключением по размеру.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором процессивная полимераза представляет собой Phi29 полимеразу.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором второй адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты содержит тупые концы или концы с T-хвостом.
13. Способ по любому из пп. 1-11, в котором перед этапом (C) длинные шпилечные дуплексные матрицы расщепляют рестрикционным ферментом, который создает висящий 5'-конец.
14. Способ по любому из пп. 1-11, в котором перед этапом (C) длинные шпилечные дуплексные матрицы расщепляют рестрикционным ферментом, который создает висящий 3'-конец.
15. Способ по п. 13 или 14, в котором второй адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты содержит висящую последовательность, которая комплементарна висящей последовательности расщепленных длинных шпилечных дуплексных матриц.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором второй адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты лигируют к свободному концу дуплексной матрицы с использованием полинуклеотидкиназы и лигазы.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором димеры, образующиеся из двух связавшихся друг с другом вторых адапторов типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты, удаляют путем применения методик с отбором по размеру или исключением по размеру.
18. Способ по любому из пп. 1-11, в котором TelN протеломераза выделена из фага N15 и TelN протеломераза разрезает длинные шпилечные дуплексные матрицы по последовательности узнавания TelN и оставляет ковалентно закрытые концы на сайте расщепления.
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий этап:
(C') получения наносферических комплексов, содержащих полицистронно амплифицированные асимметричные двухнитевые матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами с использованием репликации по типу катящегося кольца.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий этап:
(D) секвенирования асимметричной двухнитевой матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами или наносферических комплексов с использованием праймера для секвенирования и полимеразы.
21. Способ по п. 20, в котором этап (B), этап (C)(ii) и этап (D) можно объединять в виде одной реакции, проводимой без выделения промежуточных продуктов.
22. Способ по п. 20, в котором этап (B), этап (C)(ii) и этап (D) выполняют в лунке автоматизированной платформы секвенирования.
23. Способ получения асимметричной двухнитевой матрицы нуклеиновых кислот из тагментированной ДНК, содержащей комплементарные петли шпильки, включающий:
(I) получение тагментированной ДНК, содержащей комплементарные петли шпильки на 5'-концах каждой нити, причем петли шпильки содержат последовательность узнавания транспозазы со спаренными основаниями, и при этом имеется гэп из одноцепочечной последовательности между 5'-концами и 3'-концами тагментированной ДНК;
(II) заполнение гэпов между 5'-концами и 3'-концами тагментированной ДНК с использованием реакции лигирования с заполнением гэпа для получения тагментированной ДНК с закрытыми концами;
(III) создание разрыва в верхней нити в каждой шпилечной области тагментированной ДНК с закрытыми концами;
(IV) продолжение с каждого разрыва последовательности, комплементарной двухнитевой матрице нуклеиновой кислоты, с использованием процессивной полимеразы для получения двух длинных шпилечных дуплексных матриц, причем один конец дуплексной матрицы содержит закрытую шпильку («шпилечный конец»), а второй конец дуплекса содержит 3'-конец нити и 5'-конец нити («свободный конец»); и
(V) закрытие свободного конца каждой длинной шпилечной дуплексной матрицы с получением асимметричной двухнитевой матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами путем:
(a) лигирования адаптора типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты к свободному концу дуплексной матрицы; или
(b) использования TelN протеломеразы для закрытия свободного конца дуплексной матрицы, при этом свободный конец дуплексной матрицы выполнен с возможностью включения последовательности узнавания TelN.
24. Способ по п. 23, в котором последовательность узнавания транспозазы представляет собой последовательность мозаичного конца из 19 пар оснований.
25. Способ по п. 24, в котором гэп имеет длину 9 пар оснований.
26. Способ по любому из пп. 23-25, в котором реакция лигирования с заполнением гэпа включает фрагмент Кленова.
27. Способ по любому из пп. 23-25, в котором реакция лигирования с заполнением гэпа включает T4 ДНК полимеразу и амплигазу.
28. Способ по любому из пп. 23-27, в котором разрыв получают с использованием сайт-специфичной эндонуклеазы.
29. Способ по любому из пп. 23-28, в котором процессивная полимераза представляет собой Phi29 полимеразу.
30. Способ по любому из пп. 23-29, в котором адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты содержит тупые концы или концы с T-хвостом.
31. Способ по любому из пп. 23-29, в котором перед этапом (V) длинные шпилечные дуплексные матрицы расщепляют рестрикционным ферментом, который создает висящий 5'-конец.
32. Способ по любому из пп. 23-29, в котором перед этапом (V) длинные шпилечные дуплексные матрицы расщепляют рестрикционным ферментом, который создает висящий 3'-конец.
33. Способ по п. 31 или 32, в котором адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты содержит висящую последовательность, которая комплементарна висящей последовательности расщепленных длинных шпилечных дуплексных матриц.
34. Способ по любому из пп. 23-33, в котором адаптор типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты лигируют к свободным концам дуплексной матрицы с использованием полинуклеотидкиназы и лигазы.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором димеры, образующиеся из двух связавшихся друг с другом адапторов типа шпильки или гантели на основе нуклеиновой кислоты, удаляют путем применения методик с отбором по размеру или исключением по размеру.
36. Способ по любому из пп. 23-29, в котором TelN протеломераза выделена из фага N15 и TelN протеломераза разрезает длинные шпилечные дуплексные матрицы по последовательности узнавания TelN и оставляет ковалентно закрытые концы на сайте расщепления.
37. Способ по любому из пп. 23-36, дополнительно включающий этап:
(V') получения наносферических комплексов, содержащих полицистронно амплифицированные асимметричные двухнитевые матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами с использованием репликации по типу катящегося кольца.
38. Способ по любому из пп. 23-37, дополнительно включающий этап:
(VI) секвенирования асимметричной двухнитевой матрицы нуклеиновых кислот с закрытыми концами или наносферических комплексов с использованием праймера для секвенирования и полимеразы.
39. Способ по п. 38, в котором этап (V)(ii) и этап (VI) можно объединять в один этап.
40. Способ по п. 39, в котором этап (V)(ii) и этап (VI) выполняют в лунке автоматизированной платформы секвенирования.
41. Способ секвенирования тагментированной ДНК, содержащей комплементарные петли шпильки, включающий:
(I) получение тагментированной ДНК, содержащей комплементарные петли шпильки на 5'-концах каждой нити, причем петли шпильки содержат последовательность узнавания транспозазы со спаренными основаниями, и при этом имеется гэп из одноцепочечной последовательности между 5'-концами и 3'-концами тагментированной ДНК;
(II) формирование двух продолженных нитей тагментированной ДНК, содержащих последовательность узнавания транспозазы и комплементарную последовательность узнавания транспозазы на 5' и 3'-концах каждой из продолженных нитей тагментированной ДНК с использованием полимеразы;
(III) разделение продолженных нитей тагментированной ДНК и регибридизацию последовательности узнавания транспозазы и комплементарной последовательности узнавания транспозазы на концах каждой из продолженных нитей тагментированной ДНК с образованием двух комплементарных петель шпилек; и
(IV) секвенирование продолженной нити тагментированной ДНК, содержащей комплементарные петли шпильки, с использованием секвенирующей полимеразы.
42. Способ по п. 41, в котором этап (IV) выполняют в лунке автоматизированной платформы секвенирования.
43. Способ по п. 41, в котором перед секвенированием на этапе (IV):
(III') получают наносферические комплексы, содержащие полицистронно амплифицированные продолженные нити тагментированной ДНК.