Влияние карбоната кальция на ацидофицирующую активность микромицетов

К. В. Баринова, С'. М. Щипарев, А. Л. Шаварда, Д. Ю. Власов

ВЛИЯНИЕ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ

НА АЦИДОФИЦИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ

МИКРОМИЦЕТОВ*

Введение

Продуцирование органических кислот — весьма распространенное явление, встречающееся у грибов различных систематических и экологических групп. В природных условиях образование и выделение кислот играет определенную роль во взаимодействии грибов с другими организмами, а также оказывает существенное воздействие на субстрат [10, 11, 12]. Среди активных продуцентов органических кислот насчитывается большое количество видов микроскопических грибов (микромицетов), обитающих на каменистых поверхностях. Ацидофицирующая активность грибов данной группы заметно отражается на кальцийсодержащих субстратах (мрамор и известняк), основу которых составляет минерал кальцит химического состава СаСОз. По мнению ряда авторов, способность к выделению органических кислот является одним из ведущих факторов повреждения грибами различных сооружений из мрамора и известняка [5, 8, 13]. Еще в ранних работах, касающихся исследования способности грибов продуцировать органические кислоты [2, 3, 4], отмечалось, что карбонат кальция, в свою очередь, существенным образом влияет на образование грибами органических кислот, и, в особенности щавелевой кислоты.

Основным способом синтеза щавелевой кислоты грибами считается гидролиз с помощью фермента оксалоацетатгидролазы щавелевоуксусной кислоты, образующейся в цитоплазме [16, 18, 22]. Биосинтез оксалоацетата осуществляется в результате работы фермента цитоплазматической пируваткарбоксилазы. Для реализации данного процесса необходима нейтрализация образующихся кислот и наличие углекислоты в среде [12, 16, 20]. Связывание углекислоты пируваткарбоксилазой имеет значение и при образовании других органических кислот грибами. Синтезированная в цитоплазме щавелевоуксусная кислота может быть преобразована в яблочную цитоплазматической малатдегидрогеназой [17, 18]. Яблочная же кислота, в свою очередь, может транспортироваться в митохондрии, окисляться НАД-зависимой малатдегидрогеназой до оксалоацетата, который далее конденсируется с ацетил-СоА с образованием лимонной кислоты [19]. Возможно также образование из яблочной кислоты фумаровой под действием фермента фумаратгидратазы, присутствующей в цитоплазме [21].

Необходимо отметить, что активность фермента оксалоацетатгидролазы, осуществляющей гидролиз щавелевоуксусной кислоты, ингибируется щавелевой [22] и яблочной кислотами [15], но ацетат не является ингибитором этого фермента [22].

Очевидно, что добавление карбоната кальция в среду приводит к ее подщелачи-ванию. Между тем относительное выделение органических кислот грибами в значительной степени зависит от кислотности экстраклеточного раствора. В кислой среде активность оксалоацетатгидролазы подавляется [16, 22]. Считается, что высокая кис-

* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №09-05-01062-а).

© К. В. Баринова, С. М. Щипарев, А. Л. Шаварда, Д. Ю. Власов, 2010

лотность индуцирует образование лимонной кислоты [4, 6, 9, 23]. Однако, по некоторым данным, мутанты Aspergillus niger с отсутствием глюкозооксидазы и оксалоаце-татгидролазы продуцируют лимонную кислоту в больших количествах в нейтральной и слабощелочной средах, а снижение кислотности среды важно главным образом для предотвращения образования щавелевой и глюконовой кислот [22]. Оптимальным для биосинтеза глюконовой кислоты является рН 6,5. При рН питательного раствора менее 3,5 работа фермента глюкозооксидазы полностью инактивируется [7].

Таким образом, литературные данные показывают, что влияние карбоната кальция на образование кислот у грибов осуществляется вследствие действия нескольких факторов. Эффект, оказываемый СаСОз, может быть связан с наличием ионов Са2+, осуществляющего нейтрализацию образующихся кислот, с повышением содержания углекислоты в среде, а также с подщелачиванием экстраклеточного раствора. Оценка значимости каждого из этих факторов для биосинтеза органических кислот у грибов, обитающих на СаСОз-содержащем субстрате, не нашла достаточного отражения в опубликованных ранее работах.

Цель данной работы состояла в оценке влияния Са2+, СО3- и рН среды на образование кислот микромицетами, обитающими на каменистых субстратах.

Материал и методы исследования

В изучение были включены следующие микромицеты: Aspergillus niger Ch 4/07, Penicillium brevicompactum 65/07, P. oxalicum 15/02 и P. vitale L 5/1. Грибы были выделены с поврежденного каменистого субстрата и отобраны на основании результатов предварительных экспериментов как активные продуценты органических кислот [1].

Микромицеты культивировали на жидких питательных средах: среда Чапека-Док-са (NaNO3 -3,0 г; КН2РО4 -1,0 г; MgSO4 -0,5 г; КС1-0,5 г; FeSO4 -0,015 г; глюкоза—30,0 г; вода-1000 мл) (рН 5,8)-среда I; среда Чапека-Докса + 0,2% СаСО3 (рН 6,8)—среда II; среда Чапека-Докса + NaOH (pH 6,8)—среда III; среда Чапека-Докса + ^2СОз (рН 5,8) — среда IV. Среды были подобраны так, чтобы создать варианты присутствия ионов Са2+, СО|- (раздельно или вместе), а также их отсутствия в среде. Микромицеты культивировали поверхностным способом в колбах объемом 100 мл. Объем среды составлял 20 мл. Время культивирования 25 суток. Инокулиро-вание осуществляли спорами. Посевной материал выращивали на агаризованной (1,5% агара) среде Чапека-Докса в течение 10 суток. Эксперимент проводили в пятикратной повторности. Статистическую обработку результатов проводили методами непараметрической статистики с использованием t-критерия. Бары на рисунках соответствуют стандартному отклонению.

Органические кислоты выделяли из культуральной жидкости с помощью ионообменных смол: катионит КУ — 2-84 С и анионит АН-2ФН. Предварительно культуральную жидкость подкисляли 0,1н HC1 до рН 1,0, что дало возможность вытеснить щавелевую кислоту из нерастворимой соли оксалата кальция. Кислоты анализировали в виде триметилсилилпроизводных [14]. ГХ-МС анализ проводили на приборе Agilent с масс-селективным детектором MSD5975 и колонкой HP-5MS размером 30 м х 0,25 мм. Толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мм. Газ-носитель — гелий, скорость потока

1,3 мл/мин, при сбросе 1:20. Температура испарителя 320°С. Хроматографирование велось в режиме постоянства скорости потока газа через колонку. Анализ проводился при линейном программировании температуры от 70 до 320°C со скоростью 4°С/мин.

Сбор данных осуществлялся с помощью программного обеспечения Agilent Chem-Station. Обработка и интерпретация масс-спектрометрической информации проводились с использованием программы AMDIS (URL:http://www.admis.net/index.html) и стандартных библиотек NIST2005 и Wiley6. Количественная интерпретация хроматограмм проводилась методом внутренней стандартизации по углеводороду Ci8 с помощью программы UniChrom (URL:http://www.unichrom.com/unichrome.shtml). Хроматографические параметры представлялись в шкале арифметических индексов удерживания.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного исследования установлено, что при культивировании грибов на экспериментальных питательных средах (I, II, III, IV) количество продуцируемых органических кислот значительно различается (рисунок). Зафиксировано, что кальций оказывает стимулирующее действие на выделение щавелевой кислоты всеми изученными штаммами грибов. Содержание щавелевой кислоты в культуральных фильтратах P. brevicompactum 65/07 и P. vitale L5/1, выращенных на среде Чапека-Докса с добавлением СаСОз, было более чем на 90% выше, чем на остальных средах. Количество щавелевой кислоты, выделенной P. oxalicum 15/02 на среде с карбонатом кальция, на 64% выше, чем на стандартной среде Чапека-Докса. Содержание щавелевой кислоты у A. niger Ch 4/07 на среде II было на 35% выше, чем на среде III, и на 40% выше, чем на среде IV. Интересно отметить, что из всех изученных видов мик-ромицетов, A. niger Ch 4/07 не развивался на стандартной среде Чапека-Докса, а рост P. oxalicum 15/02 не наблюдался на средах с добавлением Na2CÜ3 и NaOH.

При сравнении количественных показателей щавелевой кислоты, выделенной P. brevicompactum 65/07 и P. vitale L 5/1 на средах III и IV, были получены данные, косвенно подтверждающие значение углекислоты для биосинтеза оксалата грибами рода Penicillium. Ее количество в культуральных жидкостях P. brevicompactum 65/07 и P. vitale L 5/1 на среде IV более чем на 40% превышало количество щавелевой кислоты, образованной этими же грибами на среде III. В случае же A. niger Ch 407, напротив, количество щавелевой кислоты, образованной на среде IV, было на 38% меньше, чем на среде III.

Достоверных различий в количестве щавелевой кислоты, выделенной P. brevicom-pactum 65/07 и P. vitale L 5/1 на стандартной среде Чапека-Докса и на среде Чапека-Докса с добавлением NaOH не было выявлено.

Что касается лимонной кислоты, то у всех грибов, успешно культивируемых на стандартной среде Чапека-Докса (рН 5,8), ее количественные показатели были ниже, чем на других средах (рН 6,8). Достоверных различий в содержании цитрата на средах с СаСОз и Na2CO3 у P. brevicompactum 65/07 зафиксировано не было. Количество же лимонной кислоты выделенной культурой P. brevicompactum 65/07 на среде III было на 41% меньше, чем на средах II и IV, но на 54% больше, чем на среде I. В отличие от P. brevicompactum 65/07 у P. vitale L5/1 наибольшее содержание лимонной кислоты было обнаружено при его культивировании на среде Чапека-Докса с добавлением NaOH. На этой среде гриб продуцировал на 84% больше лимонной кислоты, чем на среде c Na2CO3, на 21 % больше, чем на среде с СаСОз, и на 91% больше, чем на стандартной среде Чапека-Докса. В культуральной жидкости P. oxalicum 15/02 количество лимонной кислоты на среде II было на 39% больше, чем на среде I. Самое большое количество

Среда Среда

Щавелевая кислота Н Лимонная кислота  Глюконовая кислота

Соотношения органических кислот в культуральной жидкости грибов на различных питательных средах:

А — Aspergillus niger Ch 4/07; Б — Penicillium brevicompactum 65/07; В — P. oxalicum 15/02; Г — P. vitale L5/1

лимонной кислоты у гриба A. niger Ch 4/07 обнаружено на среде IV. В данном случае количество цитрата было на 65% больше, чем на среде III, и на 80% больше, чем на среде II.

Различия по количеству продуцируемой грибами глюконовой кислоты оказались весьма существенными. Наибольшее содержание глюконата зафиксировано в культуральных фильтратах грибов P. brevicompactum 65/07 и P. vitale L5/1, выращенных на среде с добавлением NaOH, тогда как A. niger Ch 4/07 очень активно продуцировал глюконовую кислоту на среде с Na2CO3. В целом для видов рода Penicillium было характерно более высокое содержание глюконовой кислоты (по сравнению с лимонной и щавелевой) на стандартной среде Чапека-Докса (рН 5,8).

На основании вышеизложенных данных можно сделать предположение, что стимулирующее действие карбоната кальция на выделение грибами щавелевой кислоты обусловлено в первую очередь наличием в среде ионов Са2+. Из литературных данных известно, что активность оксалоацетатгидролазы ингибируется щавелевой кисло-

той [22]. В связи с этим одна из возможных причин положительного влияния Са2+, на наш взгляд, может зависеть от образования нерастворимой соли (оксалата кальция), устраняющей данный ингибирующий эффект.

Как отмечалось выше, у A. niger Ch 4/07 образование щавелевой кислоты на среде с кальцием происходило менее интенсивно, чем у грибов рода Penicillium. На наш взгляд, это связано с тем, что у культуральной жидкости A. niger Ch 4/07 в момент снятия опыта были низкие значения рН, тогда как культуральные фильтраты грибов рода Penicillium имели нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Поскольку при низких значениях рН активность оксалоацетазы подавляется [16, 22], можно предположить, что именно благодаря этому фактору стимуляция кальцием выделения щавелевой кислоты у A. niger Ch 4/07 происходила менее эффективно. При отсутствии же кальция в среде углекислота, вероятно, связывается пируваткарбоксилазой и образованная таким образом щавелевоуксусная кислота не гидролизуется оксалоацетазой, а транспортируется в митохондрии и конденсируется с ацетил-CoA с образованием лимонной кислоты.

В отношении оптимальных значений рН для биосинтеза глюконовой кислоты наши результаты согласуются с литературными данными, согласно которым оптимальным для ее образования является рН около 6,5 [7]. Что касается лимонной кислоты, то полученные нами данные показали, что в более щелочной среде (рН 6,8) ее выделение происходит более интенсивно, чем на стандартной среде Чапека-Докса (рН 5,8).

Проведенные эксперименты показывают существенную значимость факторов среды для процесса биосинтеза органических кислот у грибов и позволяют лучше понять особенности взаимодействия грибов с СаСОз-содержащим субстратом.

Литература

1. Баринова К. В., Власов Д. Ю., Щипарев С. М. Выделение органических кислот микро-мицетами — биодеструкторами in vitro // Проблемы медицинской микологии. 2009. Т. 11, №2. С. 55.

2. Берннет-Кларк Т. А. Роль органических кислот в обмене веществ растений. Л.: Государственное изд-во биологической и медицинской литературы, 1938. 130 с.

3. Буткевич В. С. Избранные труды. М.: Изд-во Академии наук СССР, 1957. Т. 1. 632 с.

4. Фостер Д. Химическая деятельность грибов. М.: Изд-во иностранной литературы, 1950. 642 с.

5. Abin L., Goto O., Gomez Y., Bosecker K. Screening of fungi with capacity for organic acid production // Revista Biol. 2002. Vol. 16, N1. Р. 69-73.

6. AH S., Haq J., Iqbal I. The role of Mn++ ions for high and consistent yield of citric acid in recycling fed-batch bioreactor system and its novelty on kinetic basis // Electronic J. Biotechnol. 2002. Vol. 5, N2.

7. Anastassiadis S., Rehm H.-J. Continuous gluconic acid production by Aureobasidium pullu-lans with and without biomass retention // Electronic J. Biotechnol. 2006. Vol. 9, N 5.

8. Braams J. Ecological studies on the fungal microflora inhabiting historical sandstone monuments: thesis ... dr. rer. nat. Oldenburg: University of Oldenburg, 1992. 104 p.

9. Garlile M. J., Watkinson S. G., Gooday G. W. The Fungi. London: Academic press, 2001. 588 p.

10. Dutton M. V., Evans G. S. Oxalate production by fungi: Its role in pathogenicity and ecology in the soil environment // Can. J. Microbiol. 1996. N42. Р. 881-895.

11. Fomina M., Hillier S., Gharnock J. M., Melville K., Alexander I. J., Gadd G. M. Role of oxalic acid overexcretion in transformations of toxic metal minerals by Beauveria caledonica // Appl Environ Microbiol. 2005. Vol. 71, N 1. Р. 371-381.

12. Gadd G. M. Fungal production of citric and oxalic acid: Importance in metal speciation, physiology and biogeochemical processes // Adv. Microb. Physiol. 1999. Vol. 41. P. 47-91.

13. Gadd G. M. Geomycology: biogeochemical transformations of rocks, minerals, metals and radionuclides by fungi, bioweathering and bioremediation // Mycol. Res. 2007. Vol. 111. P. 3-49.

14. Halket J. M., Waterman D., Przyborowska A. M., Patel R. K. P., Fraser P. D., Bram-ley P. M. Chemical derivatization and mass spectral libraries in metabolic profiling by GC/MS and LC/MS/MS // J. Experiment. Botany. 2004. Vol. 56, N. 410. P. 219-243.

15. Han Y., Joosten H.-J., Niu W., Zhao Z., Mariano P. S., Caiman M., van Kan J., Schaap P. J., Dunaway-Mariano D. Oxaloacetate hydrolase, the C-C bond lyase of oxalate secreting fungi // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282, N13. P. 9581-9590.

16. Kubicek C. P., Schreferl-Kunar G., Wohrer W., Rohr M. Evidence for a cytoplasmic pathway of oxalate biosynthesis in Aspergillus niger // Appl Environ Microbiol. 1988. N 54. P. 633-637.

17. Ma H., Kubicek C. P., Rohr M. Malate dehydrogenase isoenzymes from Aspergillus niger // FEMS Microbiol. Lett. 1981. N12. P. 147-151.

18. Magnuson J. K., Lasure L. L. Organic acid production by filamentous fungi // Advances in fungal biotechnology for industry, agriculture, and medicine / Ed. by J. S. Tkacz, L. Lange. Springer, 2004. P. 307-340.

19. Papagianni M. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: Biochemical aspects, membrane transport and modeling // Biotechnol. Advanc. 2007. N 25. P. 244-263.

20. Pedersen H., Hjort C., Nielsen, J. Cloning and characterization of oah, the gene encoding oxaloacetate hydrolase in Aspergillus niger // Mol. Gen. Genet. 2000. N 263. P. 281-286.

21. Roa Engel C.A., Straathof A.J.J., Zijlmans T.W., van Gulik W.M., van der Wielen L. A. M. Fumaric acid production by fermentation // Appl. Microbiol. and Biotechnol. 2008. Vol. 78, N 3. P. 379-389.

22. Ruijter G. J., van de Vondervoort P. J.I., Visser J. Oxalic acid production by Aspergillus niger: an oxalate-non-producing mutant produces citric acid at pH 5 and in the presence of manganese // Microbiology. 1999. N 145. P. 2569-2576.

23. Zhang A., Rohr M. Citric acid fermentation and heavy metal ions: II. The action of elevated manganese ion concentrations // Acta Biotechnol. 2002. N 22. P. 375-382.

Статья поступила в редакцию 5 апреля 2010 г.