Создание рекомбинантных аденовирусов, кодирующих гены нейральных молекул клеточной адгезии ncaml, ncam2 и l1cam

142

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

Создание рекомбинантных аденовирусов, кодирующих гены нейральных молекул клеточной адгезии ncaml, ncam2 и l1cam

В.Ю. Федотова 1, Е.Е. Черенкова 1, Р.Р. Исламов 2, А.А. Ризванов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань

Generation of recombinant adenoviral vectors encoding neural cell adhesion molecules ncam1, ncam2 and l1cam

V.Y. Fedotova 1, E.E. Cherenkova 1, R.R. Islamov2, A.A. Rizvanov1

1 Kazan Federal University, Kazan, Russia

2 Kazan State Medical university, Kazan, Russia

Для проведения успешной генной терапии необходимо соблюдение основных условий, таких как адресная доставка терапевтического гена в орган-мишень и его эффективная экспрессия. На сегодняшний день, адресность доставки терапевтических генов является одной из важных проблем генной терапии. Доставка рекомбинантных генов на клеточных носителях, экспрессирующих тканеспецифические молекулы клеточной адгезии, позволяет нас приблизить к поставленной цели.

С помощью технологии клонирования Gateway (Invitrogen) нами были получены рекомбинантные экспрессионные конструкции pAd-NCAM1, pAd-NCAM2 и pAd-L1CAM, кодирующие гены молекул адгезии клеток нервной ткани. Экспрессия рекомбинантных генов была подтвеждена с помощью иммунофлуоресцентного анализа. На основе данных кострукций были созданы и оттитрованы рекомбинантные аденовирусы 5 серотипа. Полученные вирусные векторы, кодирующие нейрональные молекулы клеточной адгезии, в дальнейшем могут быть использованы для модификации клеток, несущих терапевтические гены, с целью повышения эффективности доставки генно-клеточного препарата в орган-мишень.

Ключевые слова: нейральные молекулы клеточной адгезии, рекомбинантный аденовирус, генная терапия, генно-клеточный препарат.

От нейродегенеративных заболеваний страдает более 36 млн. человек по всему миру. Только количество пациентов с болезнью Альцгеймера составляет около 26 млн человек и предполагается, что эта цифра увеличится более чем в 4 раза к 2050 году. Подавляющее большинство нейродегенеративных заболеваний развиваются у пациентов пожилого возраста. Так, например, у пациентов в возрасте 70—75 лет распространенность нейродегенеративных заболеваний составляет около 5%, а в возрасте старше 80 лет — достигает 15%. По данным Всемирной организации здравоохранения средняя продолжительность жизни за последние 60 лет значительно увеличилась, что в свою очередь увеличивает частоту встречаемости нейродегенеративных заболеваний. Однако самой большой проблемой в этой сфере является отсутствие эффективного лечения, так как существующие методы являются лишь симптоматическими и не способны устранить самой проблемы. Одним из перспективных направлений считается генная терапия. Важным

e-mail: rizvanov@gmail.ru

To succed in gene therapy it is necessary to observe few basic conditions, such as targeted delivery of the therapeutic gene into the target organ and its effective expression. Nowadays targeted delivery of therapeutic genes is one of the critical problems of gene therapy. Delivery of recombinant genes using cell carriers (vectors), expressing tissue-specific cell adhesion molecules, allows us to move toward solving this problem.

Using Gateway cloning technology (Invitrogen) we have created recombinant expression constructs pAd-NCAM1, pAd-NCAM2 and pAd-L1CAM, encoding neural cell adhesion molecules. Expression of recombinant proteins has been confirmed by immunofluorescent analysis. Based on these genetic constructs recombinant adenoviruses (serotype 5) were generated and titered. Obtained viral vectors encoding neural cell adhesion molecules may be subsequently used to modify cells carrying additional therapeutic genes to increase the efficiency of gene-cell therapeutics delivery to target organ.

Key words: neural cell adhesion molecules, recombinant adenovirus, gene therapy, gene-cell therapeutics.

условием для проведения успешной генной терапии является адресная доставка рекомбинантного гена в клетки-мишени и обеспечение его эффективной экспрессии [1]. В то же время на сегодняшний день адресная доставка генов является серьезной проблемой. Для генной терапии применяют векторы на основе вирусов, в частности аденовирусов, обеспечивающие эффективную трансдукцию и относительно длительную экспрессию рекомбинантных генов в клетках различных тканей и органов человека.

Аденовирус человека — безоболочечный вирус с икосаэдрическим вирионом, содержащий линейную двухцепочечную молекулу ДНК размером от 26 до 48 т.п.н. [2]. Векторы на их основе широко применяются в генной терапии [3, 4]. Всего насчитывается около 50 серотипов аденовирусов, однако для генной терапии наиболее часто применяются вирусы 2 и 5 серотипов. Важным является тот факт, что аденовирус может инфицировать широкий спектр клеточных типов статической, растущей, или обновляющейся популяции и обеспечивать высокий уровень

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

143

экспрессии трансгена. Кроме того, аденовирусные векторы не встраиваются в геном клетки-хозяина и тем самым не вызывают инсерционного мутагенеза и онкологической трансформации клетки [5]. Титр аденовируса может достигать 1012 инфекционных частиц на миллилитр культуральной среды [3].

Нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM (neural cell adhesion molecule) экспрессируются на поверхности нервных клеток, клеток нейроглии, скелетных мышечных волокон, НК-клеток. Межклеточные взаимодействия NCAM в нейроонтогенезе и посттравматической регенерации обеспечивают выживание и миграцию нейронов, направленный рост нейритов, синаптогенез. Через цитозольный домен NCAM участвует в разных внутриклеточных сигнальных каскадах [6—9].

NCAM1 — гомофильно связывающийся гликопротеин, экспрессируется на поверхности нервных клеток, клеток нейроглии, скелетных мышечных волокон. Гомофильное связывание происходит между NCAM молекулами соседних клеток (trans-) и молекулами NCAM одной клетки (cis-). Механизм го-мофильного связывания NCAM в trans- и cis- еще недостаточно исследован. NCAM1 играет решающую роль в развитии нейронов, синаптической пластичности и регенерации [10].

Нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM2 и L1CAM могут обеспечивать как гомо-, так и гетерофильные взаимодействия. NCAM2 экспрессируется в различных тканях [11], но преимущественно в головном мозге, а также на поверхности НК-клеток [12], стимулирует рост нейритов и фасцикуляцию, играет важную роль в организации аксонов и дендри-тов в обонятельной системе [13].

L1CAM — это гликопротеин, опосредующий клеточную адгезию как путем гомофильного взаимодействия с L1CAM молекулами, экспрессируемыми соседними клетками, так и гетерофильного связывания. Лигандами могут выступать интегрины, CD24, нейроканы, нейропилин-1 и другие представители семейства молекул нейральной клеточной адгезии. Сайты связывания для большинства лигандов

Нуклеотидные последовательности праймеров

L1CAM определены. L1 экспрессируется на нейронах и нейролеммоцитах периферической нервной системы, не экспрессируется на незрелых нейронах. В зрелых нейронах продуцируется преимущественно на нейритах при образовании нервных волокон. В развивающемся мозге его находят в области клеточных контактов, на миелинизированных нейронах отсутствует [14, 15].

Целью нашей работы стало создание и определение титра рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM1, NCAM2 и L1CAM.

Материал и методы

В работе использовались плазмидные векторы: pCMV-SPORT6-NCAM1, pBluescriptR-NCAM2

(Harvard Medical School) и полученная нами ранее pcDNA-hL1CAM [16], несущие кДНК генов ncaml, ncam2 и llcam, соответственно. Для последующих этапов клонирования, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК вышеуказанных генов была амплифицирована с добавлением фланкирующих сайтов attB. Присоединение сайтов проводили в два этапа с помощью высокоточной полимеразы Phusion High fidelity DNA Polimerase (Finnzymes), способной синтезировать длинные последовательности генов с высокой точностью и скоростью. На первом этапе для фланкирования последовательностей использовали геноспецифичные праймеры (табл. 1, комбинации 1—3), на втором — адаптерные (табл. 1, комбинация 4) для увеличения длины attB сайтов.

После окончания второго раунда ПЦР амплификации реакционную смесь очищали от компонентов реакции с помощью набора EZ-10 Spin Column PCR products purification kit (BIO BASIC), согласно инструкции производителя.

Реакцию рекомбинации между очищенным ПЦР-продуктом и вектором-донором pDONR221 (Invitrogen) проводили по технологии BP-рекомбинации Gateway (Invitrogen), по стандартному протоколу, предложенному производителем. На следующий день полученной рекомбинационной смесью трансформировали клетки E.coli, штамм TOP10, после чего

Праймеры Нуклеотидная последовательность 5’^3’

1 hNCAM1-attB1 AAAAAGCAGGCTCACCATGCTGCAAACTAAG

hNCAM1-attB2 AGAAAGCTGGGTTCATGCTTTGTTCTCGTTCTC

2 hNCAM2-attB1 AAAAAGCAGGCTCACCATGAGCCTCCTCCTCT

hNCAM2-attB2 AGAAAGCTGGGTGTTATGCTTTGCT GTCGT CTT

3 hL1CAM-attB1 AAAAAGCAGGCTCACCATGGAGCCGCTTTTAC

hL1CAM-attB2 AGAAAGCTGGGTTTATGCCCGAAGGGGAA

4 GW-attB1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT

GW-attB2 GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGT

5 hNCAM1-R-Stop-XhoI CT CGAGT CATGCTTT GTTCTCGTTCTC

hNCAM1-F-Kozak-BamHI GGATCCACCATGCTGCAAACTAAG

6 hNCAM2-R-Stop-XhoI CT CGAGTTATGCTTTGCT GTCGTCTTC

hNCAM2-F-Kozak-BamHI GGATCCACCAT GAGCCT CCT CCT CT

7 hL1CAM-R-Stop-XhoI CTCGAGTTATGCCCGAAGGGGAA

hL1CAM-F-Kozak-EcoRI GAATTCACCATGGAGCCGCTTTTAC

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

144

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

клетки рассевали на агаризованную селективную среду, а выросшие колонии анализировали методом ПЦР-скрининга с использованием геноспецифичных праймеров (табл. 1, комбинации 5—7). Позитивные клоны использовали для выделения плазмидной ДНК, необходимой для следующего этапа клонирования. Выделение производили с помощью набора GeneJET Miniprep Plasmid Kit (Fermentas), по методике производителя.

Полученные плазмидные конструкции pDONR221-NCAM1, pDONR221-NCAM2, pDONR221-L1CAM использовали для следующего этапа LR-рекомбинации по технологии Gateway (Invitrogen) и создания экспрессионных конструкций на основе pAd/CMW5-DEST (Invitrogen) (далее pAd). Реакции проводили согласно инструкции производителя. После чего по описанной выше методике трансформировали клетки E.coli, штамм TOP10, и анализировали выросшие колонии методом ПЦР с использованием геноспецифичных праймеров (табл. 1, комбинации 5—7). Позитивные клоны также использовали для выделения плазмидной ДНК с помощью набора GeneJET Miniprep Plasmid Kit (Fermentas).

Все полученные конструкции были проанализированы секвенированием, результаты обрабатывали с помощью программы SeqScanner (Applied Biosystems).

Для подтверждения экспрессии генов нейральных молекул клеточной адгезии использовали клеточную линию HEK293A (Invitrogen). В данной клеточной линии экспрессируются гены, кодируемые Е1 (E1a и E1b) регионом аденовируса, необходимые для его репликации [17, 18]. Клетки данной линии трансфицировали экспрессионными плазмидными векторами pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM по стандартной методике с помощью трансфицирующего агента TurboFect Transfection Reagent (Fermentas). Иммунофлюоресцентный анализ проводили 1) с использованием моноклональных антител мыши к NCAM1 (Сорбент, 2423000), конъюгированных с фикоэритрином (РЕ); 2) первичных поликлональных антител кролика к NCAM2 (Santa Cruse, 134876) и вторичных антител осла к иммуноглобулину G кролика, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa 488 (Invitrogen, A21206); 3) первичных поликлональных антител кролика к L1CAM (Santa Cruse, 15326) и вторичных антител осла к иммуноглобулину G кролика, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa 555 (Invitrogen, А31572). Результаты анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioObserver Z1 (Carl Zeiss).

После подтверждения экспрессии целевых генов (ncaml, ncam2, llcam) полученные аденовирусные плазмидные векторы pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM подвергли ферментативному гидролизу рестриктазой PacI (Fermentas) для освобождения концевых инвертированных повторов, необходимых для сборки и репликации вируса. Линейными конструкциями, очищенными с применением набора EZ-10 Spin Column PCR products purification kit (BIO BASIC), трансфицировали клетки линии НЕК293А (Invitrogen) c помощью TurboFect Transfection Reagent (Fermentas). Через 10 сут. после трансфекции культуральную среду вместе с клетками подвергали криолизу с последующим центрифугированием для удаления остатков клеток. Таким образом, были получены первичные вирусные стоки

Ad5-NCAM1, Ad5-NCAM2 и Ad5-L1CAM. Затем для получения более высоких вирусных титров вирусный сток амплифицировали, повторно заражая клетки линии НЕК293А первичными стоками.

Для обеспечения в последующем воспроизводимых и достоверных результатов определяли титр полученного рекомбинантного аденовируса. Для этого приготовили 10-кратные серийные разведения вируса в диапазоне от 10-4—10-8 и инфицировали клетки линии НЕК293А. Затем клетки покрывали 0,4% агарозой, а на 8 сут. подсчитывали количество вирусных бляшек и определяли титр БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы/мл) по следующей формуле: БОЕ/мл = количество бляшек / объем вирусного инокулята (мл) / степень разведения.

Результаты и обсуждение

На сегодняшний день при терапии больных с нейродегенеративными заболеваниями, а также с ишемическими и травматическими повреждениями мозга, основной задачей является стимулирование регенерации нервных клеток. Поддержание жизни нейронов и восстановление утраченных межклеточных связей может значительно повысить продолжительность и уровень жизни пациентов с нейротравмами или нейродегенеративными заболеваниями, затрагивающими разные типы нервных клеток и разные структуры ЦНС [19].

Многочисленные опыты по трансплантации клеток пуповинной крови животным с экспериментальными ишемическими и дегенеративными поражениями мозга, подтвердили эффективность клеточной терапии [20]. Однако для повышения эффективности терапии с применением клеток пуповинной крови (поддержание выживаемости клеток реципиента, стимулирование клеточной пролиферации, восстановления межклеточных контактов и образования утраченных тканевых структур), активно исследуются возможности их генетической модификации с помощью плазмидных и вирусных векторов, экспрессирующих факторы роста и молекулы адгезии [21].

Генетическая модификация мононуклеарных клеток пуповинной крови с помощью векторов, экспрессирующих, помимо терапевтического гена, и ген молекулы адгезии нервных клеток, повышает их способность к хоумингу и выживаемости в нервной ткани реципиента, а, следовательно, увеличивает продолжительность действия терапевтического гена на нервные клетки [22, 23].

В предыдущих экспериментах было показано, что при трансфекции плазмидами, содержащими ген l1cam, эмбриональных стволовых клеток мыши происходило не только встраивание этой молекулы в клеточную мембрану клеток, но и секреция её растворимой формы [24]. Затем после трансплантации в травмированный спинной мозг данные клетки формировали отростки и оставались жизнеспособными в течение месяца, в то время как нетрансфицированные клетки выживали лишь в течение 7 сут. В опытах по введению трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, экспрессирующих рекомбинантный L1CAM, генетически модифицированные клетки обнаруживались в спинном мозге через 3 мес. после введения. Предположительно, выживаемость пуповинных клеток была обусловлена специфичным

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

145

взаимодействием рекомбинантного белка L1CAM на мембране генетически модифицированных клеток с нервной тканью реципиента [19].

Таким образом, экспрессия генов ncaml, ncam2, llcam с последующим встраиванием белков в клеточную мембрану мононуклеарных клеток крови пуповины может иметь важное стимулирующее влияние на нейрорегенерацию за счёт образования гомофильных и гетерофильных взаимодействий с клетками ЦНС, что в свою очередь усиливает адресную миграцию клеток, повышает их выживаемость и продолжительность экспрессии терапевтического гена.

В настоящем исследовании в результате двух раундов амплификации были получены ПЦР-продукты генов ncaml, ncam2 и llcam ожидаемого размера, фланкированные attB-сайтами (рис. 1), которые затем использовались для получения рекомбинантных вирусных векторов путем BP-рекомбинации с вектором-донором pDONR221 (Invitrogen). Рекомбинационной смесью трансформировали клетки E.coli, штамм TOP10. Позитивные клоны, несущие рекомбинантные плазмиды с интересующими нас генами, определялись с помощью ПЦР-скрининга. После этого часть клонов использовали для выделения плазмидной ДНК рекомбинантных векторов pDONR221-NCAM1, pDONR221-NCAM2, pDONR221-NCAML. На следующем этапе после проведения

ncaml псат2 Исат

А М Б М В М

Рис. 1. Продукты ПЦР-амплификации кДНК генов ncaml, ncam2 и llcam:

M - 1 kb DNA Ladder (Fermentas);

А - ncaml (2576 п.н.);

Б - ncam2

LR-рекомбинации с последующей трансформацией, также проводили ПЦР-скрининг, а позитивные клоны были использованы для выделения плазмидной ДНК экспрессионных конструкций pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM. На всех этапах ПЦР-скрининга отбирались только те клоны, размер вставки в которых соответствовал ожидаемому.

Далее для подтверждения экспрессии рекомбинантных белков был проведен иммунофлюоресцентный анализ клеток линии НЕК293А, модифицированных полученными экспрессионными конструкциями pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM. Показана положительная реакция со специфичными к нейральным молекулам антителами (рис. 2). После подтверждения экспрессии рекомбинантного белка полученные конструкции были линеаризованы и использованы для продукции рекомбинантных аденовирусов 5 серотипа.

Были получены аденовирусные векторы, экспрессирующие нейральные молекулы клеточной адгезии. Титр полученных вирусов составил: Ad5-NCAM1 (2,64х108 БОЕ/мл), Ad5-NCAM2 (1,97х109 БОЕ/мл), Ad5-L1CAM (1,5х108 БОЕ/мл).

Согласно данным, полученным нами ранее, модификация мононуклеарной фракции пуповинной крови человека плазмидными конструкциями, кодирующими ген молекулы L1CAM, повышала хоуминг, а также пролиферацию и выживаемость модифицированных клеток [25, 26].

Однако по сравнению с плазмидными векторами, при применении вирусных экспрессионных векторов увеличивается продолжительность и уровень экспрессии клонированных генов, а, следовательно, и продолжительность действия терапевтических молекул на клетки-мишени. Кроме того вирусная трансдукция более эффективна и не требуют каких-либо дополнительных травмирующих клетку физических или химических воздействий.

В заключение, полученные нами аденовирусные векторы, экспрессирующие нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM1, NCAM2 и L1CAM, в дальнейшем будут использованы для генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови. Использование нейральных молекул клеточной адгезии предположительно должно повысить выживаемость и адресную доставку модифицированных клеток к месту нейродегенерации, и таким образом усилить эффект трансплантированных клеток, экспрессирующих терапевтический ген, на нейрорегенерацию.

Рис. 2. Клетки линии НЕК293А, трансфицированные рекомбинантными плазмидами: A - плазмидой pAd-NCAM1; Б - плазмидой pAd-NcAM2; В -плазмидой pAd-L1CAM. Иммуноцитохимическая реакция. Визуализация ядер DAPI

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

146

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

Благодарности

Работа финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований 13-04-12035 и 11-04-00902, грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых докторов наук

ЛИТЕРАТУРА:

1. Borroni B., Pilotto A., Bonvicini C. et al. Atypical presentation of a novel Presenilin 1 R377W mutation: sporadic, late-onset Alzheimer disease with epilepsy and frontotemporal atrophy. Neurol. Sci. 2012; 33(2): 375-8.

2. Davison A.J., Benko M., Harrach B. Genetic content and evolution of adenoviruses. J. Gen. Virol. 2003; 84(Pt 11): 2895-908.

3. Russell W.C. Update on adenovirus and its vectors. J. Gen. Virol. 2000; 81(Pt 11): 2573-604.

4. Wang I.I., Huang I.I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discov. Today. 2000; 5(1): 10-6.

5. Segerman A., Arnberg N., Erikson A. et al. There are two different species B adenovirus receptors: sBAR, common to species B1 and B2 adenoviruses, and sB2AR, exclusively used by species B2 adenoviruses. J. Virol. 2003; 77(2): 1157-62.

6. Povlsen G.K., Ditlevsen D.K., Berezin V. et al. Intracellular signaling by the neural cell adhesion molecule. Neurochem. Res. 2003; 28(1): 127-41.

7. Walmod P.S., Kolkova K., Berezin V. et al. Zippers make signals: NCAM-mediated molecular interactions and signal transduction. Neurochem. Res. 2004; 29(11): 2015-35.

8. Buttner B., Kannicht C., Reutter W., Horstkorte R. The neural cell adhesion molecule is associated with major components of the cytoskeleton. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 310(3): 967-71.

9. Buttner B., Kannicht C., Reutter W. et al. Novel cytosolic binding partners of the neural cell adhesion molecule: mapping the binding domains of PLC gamma, LANP, TOAD-64, syndapin, PP1, and PP2A. Biochemistry 2005; 44(18): 6938-47.

10. Stoenica L., Senkov O., Gerardy-Schahn R. et al. In vivo synaptic plasticity in the dentate gyrus of mice deficient in the neural cell adhesion molecule NCAM or its polysialic acid. Eur .J. Neurosci. 2006; 23(9): 2255-64.

11. Paoloni-Giacobino A., Chen H., Antonarakis S.E. Cloning of a novel human neural cell adhesion molecule gene (NCAM2) that maps to chromosome region 21q21 and is potentially involved in Down syndrome. Genomics 1997; 43(1): 43-51.

12. Nelson E.A., Walker S.R., Li W. et al. Identification of human STAT5-dependent gene regulatory elements based on interspecies homology. J. Biol. Chem. 2006; 281(36): 26216-24.

13. Walz A., Mombaerts P., Greer C.A. et al. Disrupted compartmental organization of axons and dendrites within olfactory glomeruli of mice deficient in the olfactory cell adhesion molecule, OCAM. Mol. Cell Neurosci. 2006; 32(1-2): 1-14.

14. Maretzky T., Schulte M., Ludwig A. et al. L1 is sequentially processed by two differently activated metalloproteases and presenilin/gamma-secretase and regulates neural cell adhesion, cell migration, and neurite outgrowth. Mol. Cell Biol. 2005; 25(20): 9040-53.

МД-433.2013.4. Работа частично выполнена на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

15. Mechtersheimer S., Gutwein P., Agmon-Levin N. et al. Ectodomain shedding of L1 adhesion molecule promotes cell migration by autocrine binding to integrins. J. Cell Biol. 2001; 155(4): 661-73.

16. Кудряшова Н.В., Гусева Д.С., Салафутдинов И.И. и др. Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные двухкассетными плазмидами (vegf + нейротрофический фактор) для терапии бокового амиотрофического склероза. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2012; 7(3): 92-7.

17. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C. et al. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 1977; 36(1): 59-74.

18. Harrison T., Graham F., Williams J. Host-range mutants of adenovirus type 5 defective for growth in HeLa cells. Virology 1977; 77(1): 319-29.

19. Rizvanov A.A., Guseva D.S., Salafutdinov I.I. et al. Genetically modified human umbilical cord blood cells expressing vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 differentiate into glial cells after transplantation into amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice. Exp. Biol .Med. 2011; 236(1): 91-8.

20. Chen J., Sanberg P.R., Li Y. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32(11): 2682-8.

21. Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Гусева Д.С. и др. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2(3): 21-37.

22. Ризванов А.А., Гусева Д.С., Салафутдинов И.И. и др. Доклинические исследования терапии бокового амиотрофического склероза с помощью генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(2): 56-63.

23. Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Киясов А.П. Боковой амиотрофический склероз: стратегия генно-клеточной терапи. Неврологический вестник 2008; 40(4): 91-101.

24. Chen J., Bernreuther C., Dihne M. et al. Cell adhesion molecule l1-transfected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury. Neurotrauma 2005; 22(8): 896-906.

25. Rizvanov A.A., Kiyasov A.P., Gaziziov I.M. et al. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and L(1)CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis-a novel approach in stem cell therapy. Neurochem. Int. 2008; 53(6-8): 389-94.

26. Ризванов А.А., Гусева Д.С., Салафутдинов И.И. и др. Генноклеточная терапия бокового амиотрофического склероза монону-клеарными клетками пуповинной крови человека, трансфицированными генами нейронной молекулы адгезии L1CAM и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 5(4): 55-65.

Поступила 0409.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013