СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ
METHOD FOR PREPARING ANTICANCER AGENT FOR TREATING SOLID TUMOURS

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и предназначено для лечения солидных опухолей.
Одной из главных причин, тормозящих внедрение иммунологических методов лечения злокачественных опухолей в практическую онкологию, является низкая иммуногенность большинства опухолеспецифичных антигенов-маркеров (ОСМ). Это является труднопреодолимым препятствием для получения противоопухолевых антисывороток и антител, пригодных для деструкции первичных опухолей и их метастазов в условиях in vivo. При росте злокачественной опухоли в организме, иммунная система опухоленосителя начинает синтезировать опухолеспецифичные антитела [Агеенко, Лицо рака, М., Медицина, 1995; Xiaoju Wang, et al., Autoantibody Signatures in Prostate Cancer, N. Eng. J. Med., 2005; 353: 1224-35.]. Понятно, что индукция синтеза антител осуществляется в отношении наиболее иммуногенных ОСМ. Однако уровни продукции таких антител и/или их аффинность обычно бывают недостаточными для реверсии опухолевого роста. Тем не менее, имеются основания полагать, что разработка способов качественного повышения уровня продукции специфических высокоаффнных антител в организме опухоленосителя, как и цитотоксических лимфоцитов, специфических для ОСМ, может стать основой получения эффективных лечебных вакцинных противораковых препаратов.
В настоящее время в качестве специфических противораковых вакцин используют отдельные антигены опухолевых клеток, либо ОСМ-содержащие фракции - например, нативные или модифицированные мембранные фракции опухолей [Munck-Wilkland et al., Anticancer Res., 1990, 10, 3, p.703]. Подобные подходы, основанные на случайно выбранных ОСМ (из тысяч возможных), не гарантируют выделения антигенов, эффективных с точки зрения индукции противоопухолевого иммунного ответа. К тому же подходы, базирующиеся на применении любого одного-двух опухолевых антигенов, принципиально не позволяет надеяться на успех вакцитотерапии, т.к. не учитывают высокую антигенную гетерогенность клеток злокачественных опухолей: В этих условиях даже очень эффективная индукция эффекторного ответа на отдельные ОСМ позволяет, в лучшем случае, надеяться на элиминацию лишь части опухолевых клеток, экспрессирующих соответствующий антиген. Тогда как не экспрессирующие выбранные антигены злокачественные клетки сохранятся и обеспечат дальнейшую опухолевую прогрессию.
Прототипом предлагаемого изобретения может служить способ "противораковой вакцинации", достигаемый с помощью иммунизации опухоленосителя отдельными специфическими антиидиотипическими антителами АТ2, с целью индукции в его организме антител, направленных к тому же опухолевому антигену, которые, в свою очередь, способны ингибировать рост опухолевых клеток [Hellstrom and Hellstrom, Rev. Int. Immunol., 1989, v.4, N 4, p.337]. Согласно данным авторов, применение такого подхода в ряде случаев приводит к регрессии опухоли и метастазов.
Описанный в аналоге способ позволял создать определенный противоопухолевый иммунитет, однако он не был лишен ряда существенных недостатков.
Во-первых, применяемые антитела являются структурными подобиями лишь единичных, произвольно выбранных (случайных) ОСМ, что не гарантирует их достаточно высокой иммуногенности и доступности соответствующих ОСМ для иммунной атаки организма-хозяина.
Во-вторых, практическое использование индивидуальных антител не учитывает антигенной гетерогенности разных клеток даже одного опухолевого узла. В силу чего, даже при индукции выраженной иммунной атаки организма хозяина на клетки опухоли, та часть из них, которая не экспрессирует соответствующий ОСМ, останется незатронутой и может обеспечить дальнейший злокачественный рост.
Мы полагаем, что для индукции эффективного противоопухолевого иммунного ответа, направленного на максимальное число злокачественно трансформированных клеток, должен быть предложен принципиально иной подход, базирующийся на двух основных положениях. Во-первых, для создания эффективных противоопухолевых препаратов представляется целесообразным заменить малоиммуногенные нативные опухолевые антигены на их суррогатные «антигенные копии», т.е. на антиидиотипические аналоги ОСМ. При этом важно, чтобы антиидиотипические аналоги ОСМ были получены от животных другого вида, что повысит их иммуногенность. Во-вторых, для индукции иммунного ответа на самые разные субпопуляции опухолевых клеток необходимо использовать мультикомпонентные вакцины. Иными словами при создании вакцин необходимо использовать аналоги не одного-двух ОСМ, а их максимально возможного числа. Это позволит рассчитывать на элиминацию большого числа гетерогенных злокачественно трансформированных клеток, экспрессирующих разные ОСМ.
Для решения обеих задач предлагается использовать следующие приемы. А) Из массива злокачественных солидных опухолей выделяют гетерогенные наборы антител к ОСМ (AT1), специфически связанных с самыми разными антигенами опухолевых клеток. Б) Fab-фрагменты (Fab2-фрагменты) полученных AT1, используются в качестве антигена для иммунизации животных-продуцентов антисывороток (кроликов, коз и т.п.), у которых индуцируется иммунный ответ на антиген-связывающие сайты самих AT1. В результате в организме животных-продуцентов запускается синтез антиидиотипических АТ2-мимикрирующих под множество опухолевых антигенов. Вышеизложенные соображения явились основанием для разработки предлагаемого способа получения специфических антиидиотипических АТ2, являющихся иммунохимическими аналогами множества иммуногенных антигенов разных субпопуляций клеток злокачественных опухолей человека. Такие АТ2 предполагается использовать в качестве вакцинных препаратов для индукции противоопухолевого ответа у вакцинируемых пациентов.
Задача изобретения - повысить эффективность противоопухолевых вакцинных препаратов, посредством заявляемого нами способа их получения.
Предлагаемый способ позволяет добиться следующего технического результата:
- получать АТ2, являющиеся структурными подобиями не произвольных отдельно выбранных, а множества иммуногенных и доступных для распознавания иммунной системой онкологических больных.
- получать поликлональные АТ2, являющиеся аналогами широкого набора наиболее иммуногенных ОСМ, экспрессируемых разными популяциями клеток опухоли и, таким образом, обеспечить возможность воздействия на большое число злокачественных клеток опухоли.
Поставленная задача решается способом достигается путем реализации существенных признаков предлагаемого способа, а именно:
I. Отбор первоначального опухолевого материала, получение тканей опухолей (хирургический материал), их смешение и гомогенизация для выделения антител к опухолевым антигенам.
II. Обогащении и очистке их от примесных белков с помощью комбинации солевого осаждения и хроматографии на иммобилизованном протеине А или G;
III. Истощении (устранение перекресно реагирующих антител) полученных AT1 на иммобилизованных белках нормальных (неопухолевых) тканей, в качестве которых выступают, например иммуноглобулин человека нормальный, экстракт белков плаценты человека.
2
IV. Протеолитическом расщеплении истощенных AT1 с целью выделения их антиген-связывающих фрагментов (F(ab) или F(ab));
V. Иммунизации животных антигенсвязывающими-фрагментами антител AT1, направленных к ОСМ;
VI. Получении гипериммунных сывороток, содержащих антиидиотипические АТ2;
VII. Выделении из гипериммунных сывороток АТ2 для их последующего использования в качестве противоопухолевого вакцинного препарата.
Практически способ осуществляют следующим образом.
1. В качестве исходного сырья для получения гетерогенной популяции антител AT1 к ОСМ, использовали гомогенаты злокачественных солидных опухолей разного гистологического типа, полученных от разных пациентов, с подтвержденным диагнозом рака 2-3 клинической группы.
2. В целях стандартизации сырья производили гомогенизацию наборов опухолей разной локализации (по 3-5 образцов каждого типа, полученных, соответственно, от 3-5 пациентов), а именно умеренно дифференцированные и низкодифференцированные карциномы, аденокарциномы, взятые в равных количествах от пациентов, имеющих опухоли желудка, толстого кишечника, яичника, легких, молочной железы.
3. Свежеполученный хирургический материал хранили до использования при -40°С от 1 до 3 месяцев. Перед гомогенизацией 3-5 образцов каждого типа опухолей (по 10-15 г каждого типа) объединяли в стакане бленд ора и одномоментно гомогенизировали в 5-10 объемах буферного раствора при 0…+4°С.
II. Опухолевую ткань гомогенизируют в нейтральном буферном растворе с любым неионным детергентом (например, в фосфатном буфере с 0,1-0,5 М NaCl рН 6-8 с 0,01-0,1% тритона Х-100). Центрифугируют 20 или более минут при ускорении 20000 g или более; супернатант, содержащий экстрагируемые белки, в том числе иммуноглобулины (антитела) не связанные с ОСМ, отбрасывают. Полученный осадок 2-4 раза дополнительно отмывают тем же буферным раствором, каждый раз отбрасывая супернатант.
Полученный в результате осадок, отмытый от несвязанных и непрочно связанных белков, суспендируют в 5-10 объемах кислого буфера (например, 0,1 М глицин-HCl рН 2,5), перемешивают в течение 1-3 мин., защелачивают полученную суспензию до слабо кислых значений (рН 4-5,5), ингибирующих формирование антиген-антительных комплексов, осаждают осадок центрифугированием, а супернатант, собирают и используют для дополнительной очистки AT1.
3. Выделение и очистку опухолеассоциированных антитела AT1 от примесных белков производят с помощью сочетания методов солевого осаждения и аффинной хроматографии на протеине А или протеине G.
III. Истощение полученных AT1 на иммобилизованых белках нормальных тканей.
В силу того, что среди диссоциированных от ОСМ антител присутствуют антитела как к ОСМ, так и к антигенам, экспрессируемым нормальными клетками, для получения специфических анти-ОСМ антител, суммарную фракцию антител истощают (адсорбируют) на колонках с сорбентами, содержащими антигены нормальных (немалигнизированных) тканей. Для этого, полученный пул антител AT1, экстрагированных в кислой среде из гомогенатов опухолей, подщелачивают до рН 7-8 и пропускают сначала через колонки, содержащие иммобилизованные белки разных немалигнизированных тканей человека. А именно а) через колонку с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса IgG (100-500 мг белка/колонку), полученными путем иммобилизации иммуноглобулина человеческого нормального (содержит 90-95% IgG), б) через колонку с иммобилизованными суммарными белками плаценты человека (100-500 мг белка/колонку), для этого свежую плаценту гомогенизировали в любом нейтральном буфере, центрифугировали, супернатант отбрасывали, полученный осадок гомогенизировали в 0,1% тритона Х-100 и белки полученного экстракта иммобилизовали на любом инертном носителе. Собирают белковый материал, свободно прошедший через колонки, содержащий очищенные противоопухолевые антитела (AT1), направленные к ОСМ и концентрируют их ультрафильтрацией.
2
IV. Получение антиген-связывающих Fab- или F(ab)-фрагментов AT1.
Для иммунизации животных полученными AT1 и индукции у них антиидиотипического ответа на антиген-связывающие сайты молекул антител AT1, последние подвергают протеолитическому расщеплению, позволяющему устранить высокоиммуногенные, но не связывающие антигены Fc-фрагменты молекул AT1. Для этого AT1 к ОСМ подвергали гидролизу пепсином, трипсином или папаином по общепринятым методам (см. Антитела. Методы, Том 1., М., Мир, 1991).
2
V. Иммунизация животных Fab- или F(ab) - фрагментами антител AT1 к ОСМ.
2
Для получения гипериммунных сывороток, содержащих поликлональные АТ2 (антиидиотипические антитела - аналоги ОСМ), производят иммунизацию лабораторных животных, используя общепринятые схемы. Например, проводят иммунизацию кроликов, вводя им через каждые 2-3 недели подкожно по 0.1-1 мг Fab- или F(ab)-фрагментов AT1 в смеси с полным адъювантом Фрейнда.
2
После получения иммунизируемыми животными 4-6 или более инъекций Fab- или F(ab)-фрагментов AT1, используемых в качестве антигена, от них собирают кровь, отделяют сыворотку и выделяют из нее суммарную фракцию иммуноглобулинов, используя общепринятые методы (например, осаждение 40% раствором сульфата аммония).
2
VI. Полученную фракцию суммарных иммуноглобулинов пропускали через колонки с иммобилизованными на любом инертном носителе (например, на CNBr-сефарозе, Аффи-Геле и т.п.) иммуноглобулинами здоровых людей (в качестве иммуноглобулинов использовали коммерческие препараты пулированных нормальных донорских иммуноглобулинов человека например, производства НПО «Микроген» - иммуноглобулин человека нормальный) для устранения примесных антител, направленных к иным (не к антигенсвязывающим сайтам) участкам молекул иммуноглобулинов, а затем - через колонки с иммобилизованными белками плаценты человека, полученные вышеуказанным способом. Эти процедуры позволяли устранить кроличьи антитела, полученные к возможным примесям, потенциально присутствующим в препаратах Fab- или F(ab) - фрагментов AT1, использованным для иммунизации животных, а также антитела к эпитопам ОСМ, имеющимся также в структуре неопухолевых антигенов и определяющих перекрестную реактивность с антигенами здоровых клеток человека.
Выделение антиидиотипических АТ2-аналогов наиболее иммуногенных ОСМ опухолей.
Из полученных истощенных иммунных сывороток животных выделяли АТ2, используя стандартные процедуры иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных AT1, ранее полученных из экстрактов опухолей.
Контроль специфичности полученных АТ2.
Специфичность полученных АТ2 контролируют с помощью стандартных процедур твердофазного иммуноферментного анализа.
1. Для контроля специфичности полученных АТ2 в лунки планшета для иммуноферментного анализа предварительно сорбируют AT1, выделенные из экстрактов опухолей человека, после чего к ним приливают возрастающие разведения полученных от иммунизированных животных АТ2. В результате проведения иммуноферментной реакции демонстрируется наличие существенно более высоких титров (более интенсивного сигнала) АТ2 на лунках с сорбированными AT1 экстрактов опухолей, в сравнении с лунками, содержащими иммуноглобулины здоровых лиц.
VII. Приготовление вакцинных препаратов на основе поликлональных антиидиотипических АТ2-аналогов наиболее иммуногенных ОСМ опухолей.
Полученные АТ2 или их антигенсвязывающие фрагменты переводили в нейтральный физиологический буферный раствор, например, в 0,05 М фосфатный буфер рН 7, с 0,15 М хлорида натрия (диализом или гель-фильтрацией), стерилизовали фильтрацией через безмикробные фильтры, фасовали в стерильные флаконы и хранили до использования при -20°С или ниже. Непосредственно перед использованием раствор АТ2 или их антигенсвязывающие фрагментов размораживали и смешивали с адъювантом (например, с суспензией гидроокиси алюминия).
Примеры применения вакцины для лечения больных с 3-4 стадиями злокачественных опухолевых процессов.
Под нашим наблюдением находилось 12 пациентов с далеко зашедшим (инкурабельным) злокачественным опухолевым процессом и ожидаемой продолжительностью жизни не превышающей 1-2 мес. У всех больных имелись распространенные формы прогрессирующих солидных злокачественных опухолей с множественными метастазами. Все больные ранее подвергались различным видам специального лечения (оперативного, лучевого, гормонального, химиотерапевтического) возможности которого к моменту проведения вакцинации оказались исчерпанными. К началу вакцинации все пациенты получали только симптоматическую терапию. Перед началом вакцинации пациенты получали подробную информацию об экспериментальном характере предполагаемого лечения, его сути, планируемых процедурах, и возможных побочных эффектах. Включенные в работу лица предварительно давали информированное согласие на проведение вакцинации и регулярное наблюдение за их состоянием. На любом этапе пациент имел право отказаться от дальнейшего участия в работе.
Вакцинация. Пациенты получали по 3 инъекции вакцины, подкожно, в 4-6 точек, с 1-2 - недельными интервалами и, 1-2 мес. спустя, четвертую инъекцию. Однократно каждый получал по 0,5-1 мг АТ2 или их фрагментов (по 2-4 мг на курс).
Из всей группы (n=12) наблюдавшихся вакцинированных пациентов с инкурабельным раковым процессом, разной локализации, в течение 1-го года наблюдения погибло 6 пациентов. Оставались в живых при наблюдении 3 и более лет 4 пациента. Причем, ни у кого из них не имелось признаков активно развивающегося злокачественного процесса.
Пример - 1. (Больной 63 лет, м.) Диагноз и краткое описание: рак нижней трети пищевода 4 клинической группы (T4N2M2); ранее безуспешно лечился различными химиопрепаратами. При росте 179 см масса тела составляла 62 кг. Не встает с постели. Аппетит резко снижен. Имеется почти полная непроходимость пищевода (проходит лишь жидкая пища с сильными болями при глотании на месте ракового поражения). Стоял вопрос о наложении гастростомы или постановке пищеводного стента. Прогноз неудовлетворительный. После проведения 4-кратной вакцинации больной самостоятельно принимает жидкую и твердую пищу, стал самостоятельно передвигаться по квартире и гулять на улице. Улучшилось настроение, нормализовался сон. Масса тела через 10 месяцев составляет 75 кг. Размеры опухоли уменьшились приблизительно втрое; резко уменьшились количество и размеры метастазов - приблизительно втрое; резко уменьшились количество и размеры метастатических очагов. Живет более 10 мес. Наблюдение продолжается.
Пример - 2. (Больная 43 года, ж.,). Диагноз и краткое описание: первичный иноперабельный рак печени 4 клинической группы (T4N2M2); опухоль без четких границ размером около 10-15 см в левой доли печени с субтотальной деструкцией левой доли, множественные метастазы с распространением по брюшине, в легкие, в позвоночник, в головной мозг. Непереносимость к химиотерапии. Ожидаемая продолжительность жизни к моменту начала вакцинации - менее 1 месяца. В процессе вакцинации состояние больной существенно улучшилось. Уменьшились размеры первичной опухоли и численность метастазов (некоторые очаги - с признаками кальцификации). Живет более 1 года с удовлетворительным качеством жизни. Наблюдение продолжается.
Как следует из вышеприведенных лабораторных и испытаний на больных, способ по изобретению позволяет получать противоопухолевые вакцинные препараты, обладающие высокой активностью.