СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ МАНИФЕСТАЦИИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ
METHOD FOR PREDICTION OF MANIFESTATION OF FOETAL HERPES VIRAL INFECTION IN NEWBORNS

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности.
Герпесвирусная инфекция является важнейшей медико-социальной проблемой современной перинатологии, что обусловлено тяжестью течения заболевания, высокой частотой поражения ЦНС и последующей инвалидизацией детей (Бочарова И.И., Аксенов А.Н. и соавт. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме внутриутробной инфекции новорожденных // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2007. - Т.7, №5. - С.60-63); В.В.Иванова, М.В.Иванова, А.С.Левина и соавт. Современные принципы диагностики и лечения перинатальных герпесвирусных инфекций // Рос. вестник перинатологии и педиатрии. - 2008. - №1. - С.10-18). К росту частоты инфицирования плода и новорожденного приводит значительное распространение герпесвирусных инфекций в урогенитальной сфере у женщин во время беременности (Л.В.Ганковская, Л.В.Ковальчук, И.В.Бахарева. Внутриутробная инфекция: роль TLR-опосредованной активации врожденного иммунитета // Russian Journal of Immunology. - 2007. - Vol.9, №4. - P.35-40; R.Pusztai, A.Lukacsi, I.Kovacs Mother-to-fetus transmission of cytomegalovirus // Acta Microbiol. Immunol. Hung. - 2004. - Vol.51, N4 - P.385-401).
Несмотря на широкий арсенал современных методов диагностики, выявление конкретной этиопатогенетической причины является сложной задачей. Клиническая диагностика инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, в настоящее время является чрезвычайно трудной из-за отсутствия четко выраженных клинических симптомов, а поздняя диагностика и, как следствие, позднее начало терапии значительно ухудшает прогноз.
В настоящее время доказано, что отрицательный результат обследования крови и мочи методом ПЦР, полученный в первые дни жизни новорожденного ребенка, не исключает возможности отсроченной реализации герпесвирусной инфекции (Ю.H.Воронцова, Н.Н.Володин, Д.Н.Дегтярев и др. Сравнительный анализ клинических и лабораторных характеристик врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей // Российский вестник перинатологии. - 2004. - №2. - С.60. - 65). Кроме того, наличие инфекции у матери не всегда приводит к инфицированию и развитию заболевания новорожденного.
Все вышеизложенное определяет необходимость разработки прогностических критериев манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, у новорожденных детей от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности, что позволит снизить тяжесть течения врожденной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, у детей на основании ранней диагностики и своевременного назначения патогенетической терапии.
На сегодняшний день ранней диагностике и прогнозированию манифестации внутриутробной инфекции посвящено значительное количество работ.
Известен способ диагностики инфекций у новорожденных путем определения продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами, определяемой методом люминолзависимой хемилюминесценции (Л.В.Ганковская и соавт. // International Journal on Immunorehabilitation. - 2000. - V.2. - №1. - p.175-185).
Недостатками способа являются техническая сложность выполнения, а также невозможность дифференцировать вид метаболических нарушений для проведения специфических методов лечения.
Известен способ диагностики внутриутробной инфекции новорожденных путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке пуповинной крови определяют уровень гликозаминогликанов (ГАГ) и уроновых кислот (УК) и при их значениях 225,1-286,1 мкмоль/л и 282,0-518,6 мкмоль/л соответственно ребенка признают инфицированным, а при значении ГАГ ниже 225,1 мкмоль/л и УК ниже 282,0 мкмоль/л ребенка признают больным (2231791, 27.06.2004).
Известен способ прогнозирования внутриутробной инфекции путем определения в пуповинной крови новорожденных β2-микроглобулина (Ю.А.Павлютенкова, О.А.Пустотина, Е.В.Екимова с соавт. Прогностическое значение определения концентрации β2-микроглобулина в сыворотке крови беременных группы высокого инфекционного риска // «Мать и дитя»: материалы VIII всероссийского форума. - Москва. - 2006. - С.191-192).
Недостатком этих способов является невозможность осуществить прогнозирование развития или же отсутствия у новорожденного конкретной нозологической патологии, т.е. отсутствует специфичность способа.
3
1-2
Известен способ диагностики внутриутробных вирусных инфекции у детей (патент РФ №2310851, 2007.11.20) путем морфологического исследования плаценты, определения IgM и IgG антител в реакции мPCK в ретроплацентарной крови, крови ребенка и матери, определения вирусных антигенов, специфических иммунных комплексов специфических низкоавидных антител IgG, IgG.
К недостаткам способа можно отнести необходимость проведения комплексного вирусологического исследования ретроплацентарной крови, крови новорожденного и матери, так как обследование только одного из вышеперечисленных объектов не дает полной картины инфицирования плода.
Известен способ диагностики генерализованной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни путем выявления повышения уровней IgM, IgA в сыворотке крови (Н.А.Яценко. Клинико-иммунологические аспекты врожденной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни, 2000, дисс. канд. мед. наук).
К недостаткам способа можно отнести то, что диагностическая ценность лабораторных методов, основанных на оценке гуморального иммунитета (специфические антитела IgG и IgM класса), является низкой, в связи с особенностями антителогенеза в период ранней неонатальной адаптации, Отсутствие специфических антител нередко не означает отсутствия инфекционного процесса, т.к. исследование могло проводиться в фазе формирования иммунного ответа.
Известен способ диагностики тяжелой рецидивирующей герпетической инфекции, представленный в автореферате канд. диссертации А.Ю.Одокиенко. Основные закономерности иммунных нарушений у больных герпетической инфекцией и возможности иммунотропной фармакотерапии, Пермь, 2005. Сущность способа состоит в том, что при тяжелой рецидивирующей герпетической инфекции выявляют сниженный уровень индуцированного интерферона-Y при нормальной продукции спонтанного и повышенный уровень интерлейкина 4.
Недостатком является то, что способ предполагается использовать у взрослых в возрасте от 27 до 32 лет и он не апробирован у детей первых месяцев жизни.
Известен способ прогнозирования генерализованной формы герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпесвирусами, путем исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке периферической крови определяют уровень субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+СД40 и при выявлении повышения субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+СД40 выше 14,8% прогнозируют развитие генерализованной формы герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни (Патент РФ№2341797, 20.12.2008).
Способ обладает рядом несовершенств:
1) Исследование уровня В-лимфоцитов с рецепторами CD20+CD40+ отражает их участие в развитии адаптивного иммунного ответа, сопровождающегося выработкой и накоплением противовирусных антител, что происходит значительно позднее, чем развитие врожденного иммунного ответа на распознавание вирусных патогенов.
2) Способ предполагает использование только для прогнозирования генерализованной формы герпесвирусной инфекции и не затрагивает реализации других форм внутриутробной герпесвирусной инфекции, что сужает функциональные возможности.
3) Способ является инвазивным.
4) Объектом исследования является периферическая кровь, однако при внутриутробной инфекции особо значимыми являются показатели пуповинной крови.
5) Не позволяет проводить дифференциальный диагноз между внутриутробной инфекцией и инфицированием.
Данный способ выбран нами за прототип.
Недостатки прототипа устраняются в заявляемом способе.
Задачей изобретения является разработка неинвазивного, высокочувствительного способа прогнозирования манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом герпеса 1 и 2 типа, который может быть осуществлен на этапе доклинической диагностики.
Поставленная задача решается тем, что в пуповинной крови новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности определяют количество моноцитов, экспрессирующих TLR-2, и при значениях 64,5% и ниже, прогнозируют высокий риск манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей.
Технический результат - способ позволяет сократить время исследования и повысить точность индивидуального прогноза, упрощение способа, информативность.
Нами доказано, что данный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью. В доступной литературе не выявлено использование определения TLR-2 в пуповинной крови в качестве скринингового маркера для доклинического прогнозирования манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа.
TLR-рецепторы экспрессируются классическими иммунными клетками моноцитами и играют решающую роль в ранней защите организма от патогенов. Основной функцией TLR-рецепторов в рамках развития врожденного иммунного ответа является быстрое распознавание инфекционных патогенов и сигнализация об их проникновении через анатомические барьеры. После взаимодействия клеток врожденной иммунной системы, несущих TLR-рецепторы, с патогеном происходит передача сигнала внутрь клетки и последовательная активация дополнительных молекул MyD88, TIRAP/Mal и TRIF, результатом чего является воспалительный ответ, опосредованный продукцией провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12, IFN-α), что в дальнейшем определяет характер, направление и интенсивность адаптивного иммунного ответа (Akira S., Takeda K. Toll-like receptors in innate immunity // Immunology. - 2005. - №17 (1). - p.1-14). Таким образом, TLR-рецепторы регулируют активацию врожденного иммунитета и обеспечивают взаимосвязь с приобретенным иммунитетом через антиген-презентирующие клетки.
Нарушение функционирования в TLR-системе может быть одной из причин повышенной чувствительности к инфекционным заболеваниям, особенно в период раннего постнатального развития, когда механизмы приобретенного иммунитета еще не являются достаточно эффективными. Известно, что герпесвирусная инфекция может приводить к снижению TLR2-опосредованной воспалительной реакции, в частности, синтеза интерферона альфа (van Lint AL, Murawski MR, Goodbody RE et al. Herpes simplex virus immediateearly ICPO protein inhibits TLR2-dependent inflammatory responses and NF-kappa В signaling // J Virol. - 2004. - №78. - p.20-92).
В этой связи все вышеуказанное явилось основанием к исследованию изменений количества моноцитов, экспрессирующих TLR-2, в пуповинной крови новорожденных для прогноза манифестации внутриутробной герпесвирусной инфекции. Наши исследования позволили установить очень важные количественные величины TLR-2, которые являются определяющими для отбора новорожденных в группу риска, а именно то, что при значениях 64,5% и ниже, прогнозируют манифестацию внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей.
Способ осуществляют следующим образом:
У новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности исследуют пуповинную кровь, собранную в количестве 0,5 мл в пробирки с гепарином натрия. К 20 мкл моноклональных антител CD14(PE) и 20 мкл TLR-2(CD282-FITC), (НВТ, Нидерланды) добавляют 100 мкл гепаринизированной крови, перемешивают на шейкере (1000 об/мин) в течении 3 секунд и инкубируют при комнатной температуре 20 минут. Затем добавляют 500 мкл лизирующего раствора и инкубируют до полного лизиса эритроцитов. Далее дважды отмывают в 1 мл РВС (фосфатно-солевой буфер) при 1500 об/мин по 3 минуты. К осадку добавляют 1 мл РВС и ресуспендируют. Учет реакции проводят на проточном цитофлюориметре "Beckman Coulter XL"(США). При выявлении в пуповинной крови количества моноцитов, экспрессирующих TLR-2, 64,5% и ниже прогнозируют манифестацию внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, что позволяет неонатологу своевременно назначить адекватную терапию.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1
Ребенок П-н Б., родился 26.11.2010 г. (история болезни №7808) от женщины 22 лет с отягощенным акушерским анамнезом (первая беременность - мед. аборт). Беременность протекала на фоне кольпита, эндоцервицита, эрозии шейки матки, ОРВИ, частых рецидивов генитального герпеса. При ДНК-диагностике в мазке из цервикального канала в III триместре были обнаружены ВПГ 1 типа, ЦМВ. Роды I, в срок. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, с массой 3400 г, длиной 52 см, оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. В пуповинной крови проведено исследование количества моноцитов, экспрессирующих TLR-2. Уровень TLR-2 составил 64,3%, т.е. по нашим данным ребенок угрожаем по развитию инфекции в неонатальном периоде. В первые 5 суток, когда ребенок находился в роддоме, клинических проявлений заболевания не было. После выписки из роддома у ребенка стала нарастать иктеричность кожных покровов, появилось отделяемое из глаз, явления омфалита, повысилась температура до субфебрильных цифр, ребенок плохо прибавлял в массе, отмечались симптомы интоксикации в виде вялости, адинамии, срыгиваний, плохого аппетита, имела место неврологическая симптоматика в виде снижения рефлексов новорожденного, тремора конечностей, запрокидывания головы, болезненного плача. На 20 сутки жизни ребенок был госпитализирован в отделение патологии новорожденных РНИИАП. Во время нахождения в стационаре ребенку был проведен общий анализ крови, в котором определялся лимфоцитоз, моноцитоз. УЗИ печени выявило увеличение ее размеров и изменения паренхимы. При исследовании уровня билирубина в сыворотке крови выявлено его повышение до 180 мкмоль/л за счет непрямой фракции. В анализе крови на стерильность, посевах отделяемого из зева, носа рост микрофлоры не определялся. При ПЦР-диагностике мочи обнаружен ВПГ 1, при ИФА-диагностике выявлены IgM антитела к ВПГ. При НСГ-исследовании отмечалось повышение эхогенности мозгового вещества и перивентрикулярной области, наличие псевдокистозных образований в каудо-таламической области. Ребенку был поставлен диагноз: Внутриутробная инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 1 типа, конъюктивит, катаральный омфалит, конъюгационная желтуха, гипотрофия. Церебральная ишемия 2 ст, синдром угнетения, гипертензионный синдром. Назначена противовирусная, антибактериальная, дезинтоксикационная терапия, интерферонотерапия. Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2
Ребенок Г-ев Т., родился 10.10.2010 г. (история болезни №6431) от женщины 27 лет с отягощенным акушерским анамнезом (1 неразвивающаяся беременность, 3 самоаборта). Беременность протекала на фоне цервицита, угрозы прерывания, фетоплацентарной недостаточности. Во время беременности у женщины отмечалась ОРВИ в III триместре. При ДНК-диагностике в цервикальном канале был обнаружен вирус простого герпеса 2 типа. Роды I, в сроке 37-38 недель. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, с массой 2400 г, длиной 48 см, оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. В пуповинной крови проведено исследование количества моноцитов, экспрессирующих TLR-2. Уровень TLR-2 составил 64,5%, т.е. по нашим данным ребенок угрожаем по развитию инфекции в неонатальном периоде. В первые 6 суток, когда ребенок находился в роддоме, клинических проявлений заболевания не было. После выписки из роддома на 10 сутки у ребенка появились симптомы дыхательной недостаточноти (одышка, хрипы в легких, периоральный, акроцианоз), везикулярная сыпь на коже туловища, неврологическая симптоматика в виде тремора конечностей, запрокидывания головы, судорожного синдрома, пирамидного синдрома), ребенок плохо прибавлял в массе, отмечались симптомы интоксикации в виде вялости, адинамии, срыгиваний. Принимая во внимание тяжесть общего состояния, для дальнейшей интенсивной терапии ребенок был переведен в ОПН РНИИАП. Ребенку во время нахождения в стационаре проведен общий анализ крови, в котором определялся лимфоцитоз, моноцитоз. При УЗИ выявлено увеличение размеров печени. На рентгенограмме органов грудной клетки определялось усиление легочного рисунка. В анализе крови на стерильность, посевах отделяемого из зева, носа, глаз рост микрофлоры не определялся. При ПЦР-диагностике крови обнаружен вирус простого герпеса 2 типа. При НСГ-исследовании отмечалось повышение эхогенности мозгового вещества и перивентрикулярной области, наличие псевдокистозных образований в области боковых желудочков области. На МРТ-головного мозга выявлено внутричерепное кровоизлияние I степени, на ЭЭГ - определялась эпиактивность. Ребенку был поставлен диагноз: Внутриутробная инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 2 типа, двусторонняя пневмония, ДН 2, тяжелое течение. Церебральная ишемия III ст, синдром угнетения, гипертензионный синдром, судорожный синдром. Назначена противовирусная, антибактериальная, дезинтоксикационная терапия, интерферонотерапия.
Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 3
Ребенок Сид-ко В., родился 22.04.2010 г. (история родов №4567) у женщины 30 лет с отягощенным акушерским анамнезом (1 беременность - роды, 2 - мед. аборт), беременность которой протекала на фоне кольпита, эрозии шейки матки. При ДНК-диагностике в мазке из цервикального канала обнаружена уреаплазма, ВПГ 1 типа. Роды 2, в срок. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии массой 3450, длиной 50 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. В пуповинной крови проведено исследование количества моноцитов, экспрессирующих TLR-2. Уровень TLR-2 составил 64,8%. По нашим данным период новорожденности должен протекать благоприятно. При обследовании ребенка в возрасте 1 месяца выявлено, что ребенок здоров и на первом месяце жизни ничем не болел.
Достоверность предлагаемого способа подтверждена клинико-лабораторными исследованиями. По заявляемому способу было обследовано 38 новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности.
У 20 из них (1 группа) количество моноцитов, экспрессирующих TLR-2, было 64,5% и ниже, что свидетельствовало о риске манифестации внутриутробной герпесвирусной инфекции и было подтверждено в процессе дальнейшего клинико-лабораторного наблюдения.
У 18 новорожденных (II группа) данные показатели были выше, что предполагало благоприятное течение неонатального периода.
В первой группе процент реализации инфекции, вызванной вирусом герпеса 1,2 типа составил 95%, в сравнении с 5,5% во 2-й группе.
Результаты статистического анализа в среде пакета прикладных программ STATISTIKA 6 позволили разработать прогностическое правило формирования групп риска среди новорожденных детей от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности с использованием метода логистической регрессии (Ребров 0.10. "Статистический анализ медицинских данных", Москва. - Медиа сфера. - 2003). Полученное правило обеспечивает высокую точность, чувствительность и специфичность метода.
ТОЧНОСТЬ (ИП+ИО)/(ИП+ИО+ЛП+ЛО)
81,08%
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ИП/(ИП+ЛО)
95,00%
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ИО/(ИО+ЛП)
64,71%
ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ ДОЛЯ ДИАГНОЗОВ ЛП/[ЛП+ИО)
35,29%
ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНАЯ ДОЛЯ ДИАГНОЗОВ ЛО/(ИП+ЛО)
5,00%
ТОЧНОСТЬ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИП/(ИП+ЛП)
76,00%
Таким образом, по количеству моноцитов, экспрессирующих TLR-2, в крови пуповины было возможно прогнозировать манифестацию инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа в периоде новорожденности. Предложенный нами способ достаточно прост, не травматичен, так как используется пуповинная кровь, позволяет на доклинической стадии диагностировать риск манифестации инфекции, на основании этого назначать противовирусную терапию не всем новорожденным из группы риска, а дифференцированно. Способ апробирован в родильном доме и отделении патологии новорожденных РНИИАП.
Преимущество заявляемого метода состоит в том, что на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится прогнозирование риска манифестации внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, с целью раннего назначения патогенетической терапии. В клинической практике это позволит снизить процент инвалидизации за счет своевременного формирования новорожденных группы риска и начала адекватных лечебных мероприятий. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что заявляемый способ неинвазивен, обладает быстротой исполнения с использованием стандартных тест-систем, может быть рекомендован для широкого клинического применения в практическом здравоохранении.