Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus 1383 clone 3)
STRAIN OF SINDBIS FEVER VIRUS 1383 CLONE 3

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3), зарегистрированного в Государственной коллекции вирусов (ГКВ №1273), обладающего высокой репродуктивной активностью, с охарактеризованной полной первичной структурой белков оболочки (envelop 1 - E1 и envelop 2 - Е2) и нуклеокапсида (core - С) вириона. Изобретение может быть использовано для разработки методов диагностики и средств биологической защиты.
Предшествующий уровень техники.
Вирусы лихорадки Синдбис (SV) - род Alphavirus, серокомплекс вирусов западного энцефаломиелита (Western encephalomyelitis - WEE-ЗЭЛ) и лихорадки Синдбис (WEE-SV) - являются возбудителями лихорадочных заболеваний человека и теплокровных животных [1, 2, 3, 4]. Объединение вирусов Синдбис - и Западного энцефаломиелита лошадей - WEE - подобных вирусов в один серокомплекс внутри рода Alphavirus основано на антигенном сходстве белков оболочки вириона (белки Е1 и Е2) SV- и WEE, определяемом в реакциях иммунофлюоресценции - РИФ, реакции нейтрализации инфекционной активности - РН, реакции торможения гемагглютинации - РТГА [5], иммуноферментном анализе - ИФА, иммуноблоте) [1; 6].
Вирусы WEE являются особо опасными вирусами с рекомбинантной структурой генома вируса Сидбис (SV) и вируса восточного энцефаломиелита. SV относятся к группе новых и возвращающихся инфекций (2-ая группа патогенности). Вирус лихорадки Сидбис передается кровососущими членистоногими (комарами Aedes communis, Culex, Culisetta [1; 3] и может переноситься на большие расстояния во время сезонной миграции птиц [7]. Описаны случаи эпидемических вспышек лихорадки Синдбис разной интенсивности и выделение SV в северных и южных широтах Африки, в Центральной Европе, Западной Украине, Фенноскандии, Российской Федерации (северо-западные регионы РФ, Южное Поволжье, Северный Кавказ, Татария, Тюмень), Индии, Китае (КНР). SV распространены в Евразии, Африке, Юго-Восточной Азии и Океании [4]. SV были выделены в основном от комаров и на основании антигенного сходства и определения первичной структуры гена Е2 вирионов (аа-последовательностей гликопротеина Е2) распределены в пять генотипов, коррелирующих с их географическим распространением и путями миграции птиц [7]. Заболевания человека с характерными симптомами встречаются наиболее часто в странах Северной Европы [8; 9]. Эпидемии с тысячами серологически подтвержденных случаев возникают примерно через каждые 5-7 лет. В Финляндии заболевание было названо болезнь Погоста [10, 11], в Швеции - болезнь Окельбо [12], в России -Карельская лихорадка [13].
Характерными симптомами заболевания человека являются лихорадка, выраженная головная боль, артралгии и миалгии. В течение первых дней болезни может появляться сыпь везикулярного или геморрагического характера, которая может сохраняться от 7 до 20 дней. У человека описаны случаи длительного сохранения хронических артралгий крупных суставов и снижения иммунитета [8, 9, 14]. Как возбудители заболеваний человека с указанными симптомами наиболее известны штаммы вируса лихорадки Синдбис, циркулирующие в северо-западных регионах России и в прилежащих европейских странах [15].
В структуру вирионов SV входят три белка: гликопротеин оболочки вириона Е1 (envelop 1), гликопротеин Е2 (envelop 2) и белок С нуклеокапсида (core - С).
Альфавирусы относятся к РНК-содержащим вирусам с геномом положительной полярности и имеют липидную оболочку. Геном альфавирусов (49S РНК) представлен одноцепочечной РНК положительной полярности (геномная РНК вируса инфекционна), кодирует неструктурные (nsP) белки (nsP1 - nsP2 - nsP3 - nsP4) полимеразного комплекса и структурные (str) белки (белок нуклеокапсида С - [core] -Е3 - Е2 - 6к - E1 вириона. Str белки транслируются с 26 S - субгеномной РНК в виде полипротеина.
Белок С обладает протеазной активностью и разрезает полипротеин в участке С -Е3 (триптофан-серин), сайты Е3 - Е2 - 6К - Е1 разрезаются клеточными протеазами. Белок Е3 не включается в структуру вириона SV. Белок нуклеокапсида ("кор"-core-белок, С-белок) выполняет разнообразные функции в процессе морфогенеза вируса: способствует депротеинизации геномной РНК, участвует в формировании вирусного рибонуклеопротеина путем связывания (1-98 N-концевых аа остатков) с дочерней геномной РНК, участвует в формировании сферического нуклеокапсида вириона, взаимодействуя с эндодоменами встроенных в клеточную стенку структурных гликопротеинов Е2 и Е1 [2].
Белки Е1 и Е2 включены в липидную оболочку вириона и формируют на поверхности вириона шипы, индуцирующие в инфицированном организме образование нейтрализующих антител и анти-гемагглютинирующих антител. Обработка альфавирусов липид-экстрагирующими соединениями (нейонными детергентами, например, NP40, этиловым эфиром, хлороформом) в течение 30 мин. приводит к инактивации вирусных частиц и диссоциации вирионов. Диаметр зрелого вириона около 50-55 нм. Антитела к этим белкам или же сами белки в сыворотке иммунного (или больного) организма или в инфицированных клетках выявляются с помощью иммунологических реакций и вирусологических методов.
Особенности строения генома SV и способ формирование вирионов обеспечивают возможность использования SV и других альфавирусов в качестве генных векторов для прикладных генно-инженерных разработок [16, 17].
Задача создания методов экспресс-диагностики (в особенности для дифференциации от других, близких по антигенной структуре альфавирусов или «комариных» вирусов других семейств (например, вируса Зика) остается весьма актуальной. Отсутствие коммерческих экспресс-диагностических (для SV) тест-систем сдерживает проведение плановых экологических исследований в приграничных к территории России регионах, где описано выделение вариантов SV (Швеция, Финляндия, страны Прибалтики, Западная Украина, Армения, Азербайджан и др.) и в районах с потенциальным распространением вирусных инфекций, сходных по клинической картине заболевания. Первичная структура геномов штаммов SV, выделенных в России: в Южном Поволжье, Северном Кавказе, Казани и Тюмени определена нами и размещена в Ген-банке (MG679373, MG679374, MG679375, MG679376, MG679377, MG679378, MG679380, MG679381).
Коммерческие диагностические тест-системы, основанные на использовании очищенных вирусных антигенов и антител к ним (методы иммуноферментного анализа - ИФА, иммунофлюоресценции - ИФ, латекс агглютинации - ЛА, иммуноблота -ИФБ), а также на выявлении генетического материала этого вируса (например, метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции - ОТ-ПЦР) не известны.
Раскрытие изобретения
Технической задачей изобретения является создание штамма вируса лихорадки Синдбис, эффективно репродуцирующегося в клеточной культуре (первичной или перевиваемой), пригодного для использования в производственных целях.
Заявленный штамм - «штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3)» был получен из клеток головного мозга больных птиц -Somateria mollissima в культуре клеток Vero-Е6 путем заражения клеток 10%-ной суспензией головного мозга и последовательного генетического клонирования вируса.
Полученный штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) депонирован в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ №1273) под названием «штамм SV-1383/клон 3, род Alfavirurus, семейство Togaviridae» и зарегистрирован в международном ген-банке: № MG679379, 2018 г. Представленный штамм хорошо хранится при минус 70°С.
Предлагаемый штамм содержит три структурных белка: гликопротеины Е1 и Е2 и белок С нуклеокапсида.
Технический результат: получен оригинальный штамм вируса лихорадки Синдбис, эффективно репродуцирующийся в клеточной культуре (например, в фибробластах эмбрионов кур - ФЭК или в перевиваемых линиях клеток почек зеленой мартышки VERO-E6), с высокими титрами при использовании производственных методов культивирования (роллерное или суспензионное), обладающего выраженной иммуногенной активностью и широкими антигенными связями с другими известными штаммами вируса Синдбис, с охарактеризованной первичной структурой белков вириона.
Полученные сведения о первичной структуре вирусных белков данного штамма (E1, Е2, С) позволяют контролировать фенотип вируса при генетическом клонировании и могут быть использованы для создания генно-инженерных препаратов. Актуальна возможность прикладного использования генетически охарактеризованного штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 в качестве генетического вектора, эффективно экспрессирующего полезные гены для адресной доставки сконструированного белка в клеточное ядро.
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 приведена аминокислотная последовательность белка Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (SEQ ID NO: 1).
На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность белка Е2 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (SEQ ID NO: 2), у штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 выявлена замена (глютамин Q55->K лизин) в сайте вирулентности. Данный штамм также имеет уникальную замену (apr.R114 -> S серии) в сайте проникновения вируса в клетку (на фиг. 2 замены в позициях 55 и 114 выделены курсивом и подчеркиванием).
На фиг. 3 приведена аминокислотная последовательность белка С нуклеокапсида штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (SEQ ID NO: 3).
Примеры осуществления заявленного изобретения.
Все исследования данного штамма, как и других изолятов SV, взятых для сравнения, проводились по стандартным (классическим) методикам [18].
Пример 1. Культуральные свойства штамма вируса лихорадки
Синдбис 1383 клон 3
Вирус SV-1383 нами выделен из клеток головного мозга больных птенцов. Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 отличается способностью эффективно размножаться в клеточных линиях, широко используемых в производственных целях; имеет короткий цикл репродукции, эффективно индуцирует специфические антитела, перекрестно реагирующие с другими SV из разных регионов РФ.
Предложенный штамм хорошо размножается в клетках зеленой мартышки -VERO-E6, фибробластах эмбриона человека - ФЭЧ, легких эмбриона человека - ЛЭЧ, клетках почек хомячка ВНК-21, клетках почек свиньи - СПЭВ при разных условиях культивирования (монослойная культура на пластиковых матрацах или в роллерных бутылях).
Для сравнения проведены исследования с другими штаммами SV, выделенными в разных регионах мира:
EgAR-339 выделен в Египте от комаров Culex univittatus;
Ф-720 выделен в Армении от комаров Aedes sp.;
штамм Pogosta (Финляндия) выделен от человека;
штамм Ставрополь выделен от комаров Aedes sp.;
штамм Астрахань выделен от комаров Aedes sp.
Инфекционный титр вируса определяют путем титрования в монослойной 2-х суточной культуре клеток VERO-E6 в пластиковых микропланшетах по развитию цитопатического эффекта (ЦПЭ, единиц ЦПЭ/мл) или при титровании в пластиковых флаконах - подсчетом бляшек под агаровым покрытием (число бляшек БОЕ\мл). Через 16-24 ч. после заражения инфекционный титр штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) достигает максимальных значений:
8
9
8-9×10 - 1-5×10 БОЕ/мл, данные по другим вирусам представлены в таблице (Таблица 1). Продукция инфекционного вируса на 1 клетку может превышать 1000 ед. БОЕ (бляшкообразующих единиц). Роллерное выращивание вируса позволяет получить наибольшее (по массе) количество вируса.
6
7
Одновременно с инфекционной активностью в культуральной жидкости накапливаются вирусные гемагглютинины (ГА) до титров 1:128-1:256, которые определяют в реакции агглютинации (РГА) с эритроцитами гуся [18]. Реакция происходит в зоне рН 5,6-6.2 с оптимумом рН 5,8-6,0. Соотношение БОЕ/ГАЕ (гемагглютинирующие единицы) равное 10-10 свидетельствует о высоком содержании зрелых вирионов и может использоваться как простой ориентировочный показатель на стадиях концентрации и очистки вируса.
* EgAR-339 выделен в Египте от комаров Culex univittatus
** Ф-720 выделен в Армении от комаров Aedes sp.
*** штамм Pogosta (Финляндия) выделен от человека
+ штамм Ставрополь выделен от комаров Aedes sp.
++ штамм Астрахань выделен от комаров Aedes sp.
8
9
11
12
Вирус можно сконцентрировать методами дифференциального центрифугирования и очистить в градиенте плотности сахарозы: (до концентрации и очистки 10-10 БОЕ/мл, после очистки 10-10 БОЕ/мл). В отличие от других штаммов SV, штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 эффективно размножается в первичных и перевиваемых клеточных линиях, используемых для производственных целей.
В этом исследовании отмечено, что продукция штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 в клеточной культуре Vero Е6 по сравнению с данными об отечественных и зарубежных изолятах вирусов Синдбис выше на 2-4 порядка, что подчеркивает его высокую продуктивность. Подобная закономерность прослеживается и при заражении других клеточных линий (ФЭЧ, ЛЭЧ, ВНК-21, СПЭВ) при сходных условиях культивирования как в монослойной культуре, так и на пластиковых матрацах или в роллерных бутылях.
Пример 2. Антигенные свойства штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3.
Структурные белки вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 можно выявить методами РИФ или ИФА в зараженных SV клеточных культурах (использовались классические методики, так как коммерческие тест-системы отсутствуют). Использование специфических антител в реакции непрямой РИФ позволяет выявить белки Е1 и Е2 в виде свечения в цитоплазме зараженных клеток. Белок С через 1-4 ч. после заражения штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 определяется специфическим антителами сначала в цитоплазме, а затем транспортируется в ядро клетки.
Антисыворотка к цельному или разрушенному штамму вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 нейтрализует инфекционную активность в организме и/или «in vitro». Заболевание лихорадкой Синдбис или иммунизация лабораторных животных (мышей и кроликов) препаратами очищенного вируса или разрушенного вируса приводит к развитию специфического иммунного ответа, эффективность которого определяется уровнем нарастания специфических антител в организме при изучении в реакции нейтрализации, при этом в основном участвуют антитела к белку Е2. Все работы выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ №755 от 12.08.1977 г.). В исследовании использованы 4 группы мышей линии Balb/c (самки), 6-7 недель (массой 18-20 гр.) по 5 особей в каждой, а также в некоторых опытах использованы кролики. Антисыворотка к цельному или разрушенному вирусу, главным образом к белку Е1, вызывает торможение реакции агглютинации эритроцитов (гуся или человека с 1-ой группой крови), в зоне рН 6,7-7,2. Для сравнения в исследовании использовали штамм Ф-720, который выделен на Северном Кавказе, штамм SV - EgAR-339, который выделен в северных районах Египта, а также штамм WEE 163-А вирус западного энцефаломиелита, аттенуированный штамм, прототипный вариант которого выделен в западных регионах США и является природным рекомбинантом между SV и восточным энцефаломиелитом лошадей [19].
Приведенные в Таблице 2 данные показывают высокую нейтрализующую активность гипериммунных антител к гомологичному штамму вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 и одновременно положительные перекрестные реакции с изолятами SV из разных географических регионов. Это свойство обеспечивает возможность использования антител к штамму вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 для выявления иммунохимическими методами генетических вариантов SV из разных географических регионов. Моноклональные антитела также позволяют дифференцировать вирусы Синдбис в серологических реакциях [5, 19]. Одновременно, такие антитела реагируют в реакции нейтрализации с вирусом западного энцефаломиелита (WEE 163-А).
Предлагаемый штамм содержит три структурных белка: гликопротеины Е1 и Е2 и белок С нуклеокапсида, аминокислотная последовательность которых определяли на основании первичной структуры вирусного генома путем секвенирования.
Пример 3. Анализ аминокислотной последовательности белка гликопротеина оболочки вириона Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3.
Штамм зарегистрирован в ген-банке (№ MG 679379) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, обозначенную как envelop 1 (белок Е1), представленную на фиг. 1.
Белок Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 имеет аминокислотную (аа) последовательность, сходную с белками Е1 «северных» изолятов SV, выделенных в Фенноскандии (ВКЛ, Окельбо, Погоста и др.), (96,1-98,9%) независимо от источника выделения, биологического вида хозяина (комар, птица, человек) и времени выделения вируса, что свидетельствует о сформировавшемся очаге лихорадки Синдбис в Северо-Европейской части Европы. Дивергенция (%) аа-последовательности белка Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 с белком Е1 изолятов SV из Южного Поволжья, Северного Кавказа, Юго-восточной Азии наиболее высока (в зоне 18,2-24,3%).
Пример 4. Анализ аминокислотной последовательности белка Е2 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3
Штамм зарегистрирован в ген-банке (№ MG 679379) и имеет следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, обозначенную как envelop 2 (белок Е2), представленную на фиг. 2.
Белок Е2 оболочки вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 выполняет важные функции в морфогенезе и проявлении биологических свойств вириона: как и у других изолятов SV.
Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 содержит частично перекрывающиеся участки проникновения вируса в клетку (область ~55 - 110аа), сайты связывания с клеткой (нейтрализуемые эпитопы, область ~ 62 - 209 аа), сайт вирулентности вируса (область ~3 - 170 аа), трансмембранный домен (~350 - 394 аа), С-концевой-эндогенный домен связывания с нуклеокапсидом (~395 - 423аа). Замены в этих участках могут приводить к изменению фенотипических свойств вириона: влиять на эффективность связывания вируса с клеткой (адсорбция), скорость проникновения вируса в клетку, компактность вириона при формировании зрелой частицы.
Белок Е2 оболочки вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 наиболее сходен с «северными» вариантами SV. Для вирусов ВКЛ, Окельбо, Погоста различия в пределах 3,2% с представленным штаммом, что также указывает на сформировавшийся очаг лихорадки Синдбис в Северо-Западном регионе Европы. В отличие от других «северных» изолятов SV у штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 выявлена замена (глютамин Q55->K лизин) в сайте вирулентности. Данный штамм также имеет уникальную замену (арг. R114 -> S серии) в сайте проникновения вируса в клетку (замены в позициях 55 и 114 выделены на фиг. 2 курсивом и подчеркиванием). Указанные аа-замены можно использовать на этапах культивирования как маркерные.
Пример 5. Анализ аминокислотной последовательности белка нуклеокапсида (Core - С) штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3.
Штамм зарегистрирован в ген-банке (№ MG 679379) и имеет следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, обозначенную как Core-C (белок С) нуклеокапсида, представленную на фиг. 3.
В N-концевой 1\2части белка С содержится мотив транслокации (nuclear location signal - NLS) этого белка в клеточное ядро (выделен курсивом (фиг. 3)). Это свойство можно рассматривать как перспективный элемент для разработки генно-инженерных конструкций и адресного транспорта полезных белков в клеточное ядро.
Т.о., выявленная первичная структура белков вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Е2, Е1 и С) имеет высокое сходство с другими изолятами вируса Синдбис (SV), выделенными от человека, птиц и комаров в разных регионах мира и России. Белок Е1 штамма SV 1383 clone 3 обладает высоким сходством с аналогичными белками «северных» изолятов SV Окельбо, Погоста, карельской лихорадки (процент гомологии 96,1-98,9%), независимо от биологического источника и времени выделения вируса (комар, птица, человек). В то же время дивергенция (%) аа-последовательности белка Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 с белком Е1 изолятов SV из Южного Поволжья, Северного Кавказа, Юго-восточной Азии наиболее высока (в зоне 18,2-24,3%).
Промышленная применимость
Полученный штамм может быть использован для разработки средств диагностики и методов биологической защиты (вакцины и противовирусные препараты), включая испытания «in vitro» новых лекарственных препаратов против других, более патогенных для человека альфавирусов, чем SV, например, вирусов венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ-VEE), восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ-ЕЕЕ) и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ-WEE). А также для дифференцирования с другими видами альфавирусов, вызывающих заболевания со сходными клиническими проявлениями (например, вирус лихорадки Чикунгунья, вирус лихорадки Росс Ривер и др.).
Полученный штамм вируса лихорадки Синдбис (вирус Синдбис 1383-клон 3 -Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) обладает рядом вирусологических свойств, позволяющих рассматривать его как удобную биотехнологическую модель для получения диагностических и вакцинных препаратов:
- штамм имеет короткий цикл репродукции в клетках (1,5-2 суток) и обладает высокой репродуктивной активностью, что обеспечивает возможность получения большого количества вируса, быстрое и продуктивное накопление штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 в клеточных культурах обеспечивает возможность меньших затрат на этапах разработок,
- штамм вызывает цитопатический эффект (ЦПЭ) в культуре клеток, что позволяет быстро определять оптимальное время накопления вируса,
- инфекционная активность вируса легко определяется простыми методами биологического титрования: по наступлению ЦПЭ в клетках на микропланшетах или путем титрования в монослойной клеточной культуре по бляшкам (БОЕ\мл) под агаровым покрытием,
- специфические антитела к этому штамму вируса реагируют в высоких титрах с другими известными штаммами SV, циркулирующими в разных регионах России и в сопредельных странах. Штамм хорошо хранится при минус 70°С.
- генетическую «чистоту» штамма можно легко поддерживать путем культивирования штамма в чувствительной клеточной культуре,
- препаративные количества вируса можно получить в монослойной или суспензионной клеточной культуре,
- штамм может быть использован для получения корпускулярной и/или субъединичной вакцины,
- штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3, как представитель рода альфавирусов, менее патогенен для человека, чем особо опасные альфавирусы восточного, западного и венесуэльского энцефаломиелитов, его более удобно использовать для испытания противовирусных препаратов «in vitro» (в культуре ткани) и «in vivo» (на лабораторных животных) вместо других видов высоко патогенных альфавирусов.
- штамм может быть использован в качестве эффективного генетического вектора.
В отличие от других штаммов SV, штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 эффективно размножается в первичных и перевиваемых клеточных линиях, используемых для производственных целей (что позволяет быстро получать большие количества вируса), и обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью.
Полученные сведения о первичной структуре белков вириона SV (С, Е2, Е1) штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 позволяют контролировать фенотип вируса на генетическом уровне (для контроля генетической стабильности вируса при культивировании).
Поскольку штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 может быть использован и как генетический вектор для получения новых вариантов в лабораторных условиях (для получения вариантов с новыми свойствами, в том числе более патогенных), сохраняются актуальность создания методов диагностики, необходимость разработки профилактических препаратов и целесообразность текущего мониторинга в приграничных районах РФ. Штамм может быть использован для испытания противовирусных препаратов «in vitro» (в культуре тканей) и «in vivo» (на лабораторных животных).
Литература
1. Львов Д.К. и Урываев Л.В. (2008) «Тогавирусы (Togaviridae)» стр. 217-224 в кн: Медицинская вирусология, 2008, Москва, МИА
2. Strauss J.Н a. E.G. Strauss, (1994) The alphaviruses: gene expression, replication and evolution. Microbiol. Rev. 58, 491-562
3. Griffin D. "Alphaviruses" (2008), in: Fields Virology, 6th ed., editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley pp. 376-413
4. Hubalek Z. (2008) Mosquito-borne viruses in Europe. Parasitol. Res. 103 (suppl. 1) 529-543
5. Парасюк H.A., Ионова K.C., Михеева Т.Г., Урываев Л.В.,... (1990) Моноклональные антитела, дифференцирующие вирусы Карельской лихорадки и Синдбис в серологических реакциях. Сб. «Экология вирусов и диагностика арбовирусных инфекций» Москва, 1989, стр. 74-78.
6. R.J. Kuhn (2008) "Togaviridae", chapter 22, pp. 629-686 Fields Virology, 6th ed., editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley
7. Lundstrom J.O. a. Pfeffer M. (2010). Philogeographic of Sindbid virus and evolutionary history of Sindbis virus. Vector borne Zoonotic Dis. 10, 889-907
8. Kurkela S., Manni Т., Myllenen et al., (2005). Clinical and laboratory manifestation of Sindbis virus infection: prospective study, Finland 2002-2005. J. Infection Dis. 191, 1820-1829,
9. Turunen M., Kuusisto P., Uggeldahl P.E., ToivanenA. (1998) Pogosta disease: clinical observations during an outbreak in the province of North Karelia, Finland. Br. J. Rheumatol., 37, 1177-1180
10. Kurkela S. et al. (2004) Causative agent of Pogosta disease isolated from blood and skin lesions. Emerg. Infect. Dis. 10, 889-894
11. Sane J., Kurkela S., Putkin N., et. al. (2012 Complete coding sequence and molecular epidemiological analysis of Sindbis virus isolates from mosquitoes and humans. J. of General Virology (2012), v. 93, pp. 1984-1990
12. Skogh M. a. Espmark A. (1982) Ockelbo disease: epidemic arthritis-exantema syndrome in Sweden caused by Sindbis-virus like agent. Lancet 319, 795-771
13. Львов Д.К., Скворцова T.M., Громашевский В.Л. и др. (1985) Выделение вируса, вызвавшего Карельскую лихорадку, от комаров Aedes sp. Вопросы вирусологии, том 30, стр. 311-313
14. B.S. Graham, J.E. Crowe, J.E. Ledgerwood (2008) Immunization Against Viral Diseases, in: Fields Virology, 6th ed., editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley pp. 376-413
15. Kurkela S., Ratti O., Huhtamo E. et al.,(2008) Sindbis virus infection in resident birds, migratory birds, and humans, Finland. Emerg. Infect. Dis. 40, 167-173.
16. Frolov I., Hoffman T.A., Pragai A.W. et al. (1996). Alphavirus-based expression vectors: strategies a. applications. Pros. Natl. Acad. Sci. 1996, 93 (21), 11371-11377
17. Nenasheva V.V., Kovaleva G.V., Uryvaev L.V., et al., (2015). Enhanced expression of trim 14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunology research, 2015, vol. 62(3), pp. 255-262
18. Шубладзе A.K. и Гайдамович С.Я., 1958, Практическая вирусология, М. Медицина
19. Патент РФ на изобретение №2242512 «Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-WEE 163-А) ГКВ №964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов». Заявка №2003116404. Приоритет изобретения 04 июня 2003 г. Урываев Л.В. и др.