СПОСОБ УДАЛЕНИЯ СМОЛИСТЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО МАСЛА И ЕГО РАФИНИРОВАНИЯ

1. Способ рафинирования растительного масла, содержащего фосфолипиды, предусматривающий осуществление ферментативного гидролиза фосфолипидов путем приведения растительного масла в контакт с одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды, в условиях, способствующих гидролизу фосфолипидов, после чего осуществление химического рафинирования растительного масла.
2. Способ по п. 1, где ферментативный гидролиз фосфолипидов осуществляют в первом реакционном сосуде, а химическое рафинирование осуществляют во втором реакционном сосуде, при этом два реакционных сосуда сообщены по текучей среде и/или сообщены таким образом, что обеспечивается возможность прохождения жидкости из первого во второй реакционный сосуд.
3. Способ по п. 1 или 2, где ферментативный гидролиз фосфолипидов осуществляют в первом реакционном сосуде, а химическое рафинирование осуществляют во втором реакционном сосуде, при этом сообщение по текучей среде между реакционными сосудами или прохождение жидкости из первого во второй реакционный сосуд обеспечивается не через разделительное устройство, такое как центрифуга.
4. Способ по п. 1, где ферментативный гидролиз фосфолипидов и химическое рафинирование осуществляют в одном и том же реакционном сосуде.
5. Способ по п. 3 или 4, где химическое рафинирование осуществляют непосредственно после ферментативного гидролиза; предпочтительно посредством непрерывного технологического процесса.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где:
– ферментативный гидролиз осуществляют в реакционной смеси, содержащей тяжелую фазу и легкую фазу, и
– до указанного химического рафинирования не происходит снижение или значительное снижение объема тяжелой фазы или не осуществляют отделение смолистых веществ/тяжелой фазы от масла.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий:
i) получение реакционной смеси, содержащей указанное растительное масло и один или несколько ферментов, обладающих активностью расщепления фосфолипидов, такой как реакционная смесь, определенная в п. 2;
ii) помещение реакционной смеси в условия, обеспечивающие возможность осуществления ферментативного гидролиза фосфолипидов в масле, с получением прореагировавшей смеси на основе указанного растительного масла и
iii) осуществление химического рафинирования прореагировавшей смеси на основе указанного растительного масла.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию подкисления, которую осуществляют после ферментативного гидролиза и до химического рафинирования.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий осуществление удаления из растительного масла смолистых веществ с помощью воды перед приведением его в контакт с одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло выбрано из группы, состоящей из масла асаи, миндального масла, масла из ореха бабассу, масла семян черной смородины, масла семян огуречника, масла канолы, масла из ореха кешью, касторового масла, кокосового масла, кориандрового масла, кукурузного масла, хлопкового масла, масла крамбе, масла семян льна, масла виноградных косточек, масла из лесного ореха, конопляного масла, ятрофного масла, масла жожоба, льняного масла, масла из ореха макадамия, масла из косточек манго, масла пенника лугового, горчичного масла, костного масла, оливкового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, пальмового олеина, арахисового масла/масла из земляного ореха, масла из ореха пекан, масла из кедрового ореха, фисташкового масла, макового масла, рапсового масла, масла из рисовых отрубей, сафлорового масла, масла сасанквы, кунжутного масла, масла ши, соевого масла, масла семян подсолнечника, таллового масла, масла камелии и масла из грецкого ореха.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло выбрано из группы, состоящей из рапсового масла, соевого масла, масла семян подсолнечника, пальмового масла, кокосового масла, масла из рисовых отрубей и арахисового масла/масла из земляного ореха.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло, которое приводят в контакт с указанными одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды, представляет собой неочищенное растительное масло.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий приведение растительного масла в контакт с одним или несколькими хелатообразующими средствами, которые могут образовывать комплексы с ионами Ca и/или Mg, до его приведения в контакт с одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, где из некоторого количества неочищенного масла с помощью указанного способа получают такое количество рафинированного масла, которое превышает на по меньшей мере 0,2% (вес/вес) количество рафинированного масла, получаемое с помощью способа, в котором химическое рафинирование осуществляют с таким же количеством указанного неочищенного масла без предварительного ферментативного гидролиза фосфолипидов, присутствующих в указанном неочищенном масле.
15. Способ по любому из пп. 6–14, где реакционная смесь характеризуется значением pH, которое находится в диапазоне 1,5–12, например, в диапазоне 1,5–7.
16. Способ по любому из пп. 6–15, где реакционная смесь характеризуется содержанием воды, находящимся в диапазоне 0,5–10% (вес/вес), например, в диапазоне 1–10% (вес/вес), в диапазоне 1–5% (вес/вес) или, например, в диапазоне 0,5–5% (вес/вес).
17. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло приводят в контакт с одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды, при температуре, которая находится в диапазоне 45–90ºC.
18. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный ферментативный гидролиз фосфолипидов характеризуется продолжительностью, составляющей 6 часов или меньше, например, 4 часа или меньше, например, продолжительностью, составляющей 0,5–6 часов или 0,5–4 часа, или, например, продолжительностью, составляющей 5 минут – 4 часа, например, от 5 минут до 2 часов, от 5 минут до 1 часа или, например, 5–30 минут.
19. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные один или несколько ферментов, обладающих активностью расщепления фосфолипидов, вводят в общем количестве, соответствующем 0,1–30 мг ферментного белка.
20. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло приводят в контакт с одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды, в таких условиях, при которых в ходе ферментативного гидролиза обеспечивается снижение количества интактных молекул фосфолипидов на 30–100%.
21. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло приводят в контакт с одним или несколькими ферментами, расщепляющими фосфолипиды, в таких условиях, при которых в результате ферментативной реакции происходит по меньшей мере 10% снижение содержания PC+PE+PI+PA в масле, например, по меньшей мере 25% или по меньшей мере 40% снижение содержания PC+PE+PI+PA в масле.
22. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло после осуществления химического рафинирования содержит фосфолипиды в количествах, соответствующих 20 ppm фосфора или меньше.
23. Способ по любому из предыдущих пунктов, где растительное масло и указанные один или несколько ферментов, обладающих активностью расщепления фосфолипидов, инкубируют в течение 0,1–6 часов при ряде условий, включающем:
a) температуру в диапазоне 45–90ºC;
b) значение pH в диапазоне от приблизительно 1,5 до приблизительно 12,0;
c) перемешивание или смешивание, например, путем смешивания со сдвиговым усилием, смешивания с высоким сдвиговым усилием, смешивания посредством кавитации или воздействия ультразвука.
24. Способ по любому из предыдущих пунктов, где химическое рафинирование предусматривает получение смеси растительного масла со щелочью, такой как смесь прореагировавшей смеси на основе указанного растительного масла, определенной в п. 4, со щелочью.
25. Способ по п. 22, где щелочь вводят в количествах, которые превышают стехиометрические количества относительно количеств свободных жирных кислот, присутствующих в масле.
26. Способ по п. 24 или 25, где количество щелочи, добавляемое в ходе химического рафинирования, составляет по меньшей мере 60% от общего количества щелочи, добавляемого в ходе осуществления способа.
27. Способ по любому из пп. 24–26, где щелочь выбрана из NaOH, KOH, карбоната натрия и их комбинаций.
28. Способ по любому из пп. 24–27, где смесь указанного растительного масла и указанной щелочи инкубируют от 1 минуты до 8 часов, например, от 1 минуты до 5 часов, от 1 минуты до 2 часов, от 5 минут до 8 часов, от 5 минут до 5 часов, от 5 минут до 2 часов, от 10 минут до 5 часов, от 10 минут до 2 часов, от 20 минут до 5 часов или от 20 минут до 2 часов.
29. Способ по любому из предыдущих пунктов, где химическое рафинирование предусматривает отделение смолистых веществ и/или соапстока от масла.
30. Способ по любому из пп. 24–29, предусматривающий осуществление переноса смеси растительного масла и химического вещества, такой как смесь прореагировавшей смеси на основе указанного растительного масла и химического вещества, в сепаратор, предпочтительно центробежный сепаратор или горизонтальный отстойник.
31. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий:
i) смешивание растительного масла или прореагировавшей смеси, определенной в п. 6, со щелочью при температуре 20–90ºC, например, 20–80ºC, например, 20–40ºC, при этом количества щелочи превышают стехиометрические количества;
ii) инкубирование смеси растительного масла и щелочи или смеси прореагировавшей смеси и щелочи при температуре 20–80ºC, например, 20–40ºC, в течение 2–15 минут с перемешиванием;
iii) повышение температуры смеси до 55–95ºC, например, до 55–85ºC; и
iv) после достижения температуры 55–95ºC, например, 55–85ºC, загрузку смеси в сепаратор с отделением смолистых веществ и/или соапстока от масла.
32. Способ по любому из предыдущих пунктов, предусматривающий:
i) смешивание растительного масла и кислоты или прореагировавшей смеси и кислоты со щелочью, при этом количества щелочи превышают стехиометрические количества;
ii) загрузку смеси растительного масла, кислоты и щелочи или смеси прореагировавшей смеси, кислоты и щелочи в сепаратор с отделением смолистых веществ и/или соапстока от масла.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ферментативный гидролиз фосфолипидов и химическое рафинирование осуществляют в системе, содержащей установку для дозирования фермента, смесительное устройство, секцию выдержки, такую как резервуар или камера, которые установлены на производственном участке, где осуществляют реакцию, или производственной линии предприятия, осуществляющего рафинирование растительного масла, например, выше по потоку или непосредственно выше по потоку от оборудования для химического рафинирования. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные один или несколько ферментов, обладающих активностью расщепления фосфолипидов, обладают активностью фосфолипазы.
34. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные один или несколько ферментов, обладающих активностью расщепления фосфолипидов, предусматривают фермент, обладающий активностью фосфолипазы A, фермент, обладающий активностью фосфолипазы С, лизофосфолипазу или их смесь.
35. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные один или несколько ферментов, расщепляющих фосфолипиды, обладают одним или несколькими из следующих свойств:
i) температура диссоциации (Td) в диапазоне 50–95ºC, например, 60–95ºC, 70–95ºC, например, в диапазоне 70–90ºC;
ii) оптимальное значение pH в диапазоне pH 4–7, pH 3–12, например, в диапазоне pH 3–6, например, 3,5–6 или 4–6, или, например, значение pH в диапазоне 5–9, например, 6–9 или 6–8, или, например, в диапазоне pH 7–12, например, 8–12 или 8–10;
iii) скорость реакции в отношении фосфолипидов в растительном масле, в которое было добавлено одно или несколько хелатообразующих средств, которые могут образовывать комплексы с ионами Ca и/или Mg, при этом указанная скорость реакции составляет по меньшей мере 40% от скорости реакции для одного или нескольких ферментов, расщепляющих фосфолипиды, в отношении фосфолипидов в указанном растительном масле, в которое не было добавлено хелатообразующее(–ие) средство(–а).
36. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанные один или несколько ферментов, расщепляющих фосфолипиды, выбраны из группы, состоящей из:
a. фосфолипазы C, обладающей специфичностью в отношении фосфатидилинозитола (PI),
b. фосфолипазы C, обладающей специфичностью в отношении фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилэтаноламина (PE),
c. фосфолипазы C, обладающей специфичностью в отношении фосфатидилхолина (PC), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидной кислоты (PA) и фосфатидилинозитола (PI),
d. комбинации фосфолипазы A и фосфолипазы C, такой как фосфолипаза C, определенная в a) или b),
e. комбинации фосфолипазы A и лизофосфолипазы,
f. фосфолипазы A,
g. комбинации a) и b)
h. и/или их комбинаций.
37. Способ по п. 36, где указанная фосфолипаза A выбрана из группы, состоящей из:
a. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под любым из SEQ ID NO: 1, 4 и 7;
b. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с полипептидом, изложенным под любым из SEQ ID NO: 2, 5 и 8;
c. фрагмента полипептида (a) или (b), который обладает активностью фосфолипазы A.
38. Способ по п. 37, где один из указанных одного или нескольких ферментов, расщепляющих фосфолипиды, представляет собой вариант зрелого полипептида или является вариантом зрелого полипептида под любым из SEQ ID NO: 1, 4 и 7 или представляет собой вариант полипептида, изложенного под любым из SEQ ID NO: 2, 5 и 8, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях.
39. Способ по п. 37 или 38, где один из указанных одного или нескольких ферментов, расщепляющих фосфолипиды, содержит последовательность, изложенную под любым из SEQ ID NO: 2, 5 и 8, по сути, состоит из нее или состоит из нее.
40. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанная фосфолипаза C выбрана из группы, состоящей из:
a. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под любым из SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 22, 25, 28,
b. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с полипептидом, изложенным под любым из SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26, 29; и
c. фрагмента полипептида (a) или (b), который обладает активностью фосфолипазы С.
41. Способ по п. 40, где один из указанных одного или нескольких ферментов, расщепляющих фосфолипиды, представляет собой вариант зрелого полипептида зрелого полипептида под любым из SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 22, 25 и 28 или представляет собой вариант полипептида, изложенного под любым из SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26 и 29, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях.
42. Способ по п. 40 или 41, где один из указанных одного или нескольких ферментов, расщепляющих фосфолипиды, содержит последовательность, изложенную под любым из SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26 и 29 или их комбинаций, по сути состоит из нее или состоит из нее.
43. Способ по любому из предыдущих пунктов, где один из указанных одного или нескольких ферментов, расщепляющих фосфолипиды, обладает активностью фосфолипазы C и выбран из группы, состоящей из:
i) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 9 или с полипептидом, изложенным под SEQ ID NO: 10,
ii) варианта полипептида, определенного в i), содержащего замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях,
iii) полипептида, который содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, по сути состоит из нее или состоит из нее.
44. Применение фермента, расщепляющего фосфолипиды, для гидролиза фосфолипидов в растительном масле, где растительное масло приводится в контакт с ферментом, расщепляющим фосфолипиды, и после этого осуществляется химическое рафинирование.
45. Применение по п. 44, где:
– ферментативный гидролиз указанных фосфолипидов осуществляется в реакционной смеси, содержащей тяжелую фазу или водную фазу и легкую фазу или масляную фазу/гидрофобную фазу, и
– до указанного химического рафинирования не происходит снижение или значительное снижение объема тяжелой фазы или не осуществляется отделение смолистых веществ/тяжелой фазы от масла.
.
46. Рафинированное растительное масло или соапсток, которые являются получаемыми или получены с помощью способа по любому из пп. 1–43
47. Выделенный или очищенный полипептид, обладающий активностью фосфолипазы А, выбранный из группы, состоящей из:
a. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под любым из SEQ ID NO: 3 и 5,
b. полипептида, характеризующегося по меньшей мере 75% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с полипептидом, изложенным под любым из SEQ ID NO: 4 и 6;
c. фрагмента полипептида (a) или (b), который обладает активностью фосфолипазы A.
48. Полипептид по п. 47, который представляет собой вариант зрелого полипептида зрелого полипептида под любым из SEQ ID NO: 1, 3 и 6 или представляет собой вариант полипептида, изложенного под любым из SEQ ID NO: 4 и 6, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях.
49. Полипептид по п. 47, содержащий последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, по сути состоящий из нее или состоящий из нее.
50. Выделенный или очищенный полипептид, обладающий активностью фосфолипазы С, выбранный из группы, состоящей из:
i) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под любым из SEQ ID NO: 22, 25, 28,
ii) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности с полипептидом, изложенным под любым из SEQ ID NO: 23, 26, 29, и
iii) фрагмента полипептида (a) или (b), который обладает активностью фосфолипазы С.
51. Полипептид по п. 50, который представляет собой вариант зрелого полипептида зрелого полипептида под любым из SEQ ID NO: 22, 25 и 28 или представляет собой вариант полипептида, изложенного под любым из SEQ ID NO: 23, 26 и 29, содержащий замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях.
52. Полипептид по п. 50, содержащий последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 23, 26 или 29, по сути состоящий из нее или состоящий из нее.
53. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 47–52.
54. Выделенный или очищенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 47–52.
55. Конструкция нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащие полинуклеотид по п. 54, где полинуклеотид предпочтительно функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием полипептида у экспрессирующего хозяина.
56. Рекомбинантная клетка–хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 54, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием полипептида, или содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии по п. 55.
57. Рекомбинантная клетка–хозяин по п. 56, где полипептид является гетерологичным по отношению к рекомбинантной клетке–хозяину.
58. Рекомбинантная клетка–хозяин по п. 56 или 57, где по меньшей мере одна из одной или нескольких регуляторных последовательностей является гетерологичной по отношению к полинуклеотиду, кодирующему полипептид.
59. Способ получения полипептида по любому из пп. 47–52, предусматривающий культивирование клетки, которая в своей форме дикого типа продуцирует полипептид, в условиях, способствующих продуцированию полипептида.
60. Способ по п. 59, дополнительно предусматривающий извлечение полипептида.
61. Способ получения полипептида, обладающего активностью фосфолипазы A, или полипептида, обладающего активностью фосфолипазы С, предусматривающий культивирование рекомбинантной клетки–хозяина по любому из пп. 56–58 в условиях, способствующих продуцированию полипептида.
62. Способ по п. 61, дополнительно предусматривающий извлечение полипептида.