Кинетика процесса раневой репарации клубней картофеля, обработанного биологическими средствами защиты

УДК 632.937:635.21

Кинетика процесса раневой репарации клубней картофеля, обработанного биологическими средствами защиты

Канд. техн. наук Е.И.КИПРУШКИНА СПбГУНиПТ

The peculiar features of the process of the wound repair in the case of mechanical damage of tissues of potatoes tubers, treated with biological means of protection at the temperatures (3±1) °C and (18±1) °C are considered. The kinetic relationships are found, the values of kinetic constants of the accumulation of phenol compounds and of the change in activities of peroxidase and phenoloxidase enzymes in the course of the wound repair at different temperatures of the experiment are determined.

Механические повреждения клубней при уборке урожая являются одной из причин высоких потерь при хранении и резкого ухудшения качества картофеля. Наличие даже незаметных на первый взгляд поранений клубней способствует их поражению фитопатогенными микроорганизмами.

Одним из альтернативных путей зашиты растительной продукции является максимальное использование биологического потенциала сельхозкультур, применение биологических средств защиты плодов и овощей.

Активно разрабатываются экологически безопасные биопрепараты, повышающие защитные свойства растений, в частности, активизирующие фенольный метаболизм, индукцию окислительных ферментов, стимулирующих синтез лигнина, суберина, повышение прочности клеточных стенок, заживление ран.

В работе проведен анализ динамических свойств данных регуляторных механизмов с помощью основных приемов биокинетики. Количественно описывали протекание биологических процессов, связанных с интенсификацией раневой репарации, во времени.

Защитные механизмы, протекающие в раневой перидерме, оценивали по качественным и количественным превращениям фенольных соединений, изменению активности ферментов фенолоксидазы и перок-сидазы. Для этого механически поврежденные клубни картофеля сорта Невский без обработки (контроль) и обработанные методом опрыскивания суспензией бак-терий-антагонистов Pseudomonas sp. 115 и Pseudomonas aureofaciens 35 (титр 108кл/мл) закладывали на хранение при двух температурах: 18 ± 1 °С, рекомендуемой для проведения лечебного периода, и 3 ± 1 °С — температуре хранения продовольственного картофеля. При температуре 18+1 °С картофель хранили в течение 14 сут, при 3 ± 1 °С — 21 сут.

Качественный и количественный состав фенольных соединений определяли методом хроматографии на бумаге [9J, активность ферментов фенолоксидазы и пероксида-зы — с помощью микрометода Д. Михлина и 3. Броновиц-кой (б].

В месте инициации раневой репарации резко изменяется метаболизм, что выражается в активации многих ферментов, изменении синтеза их субстратов, аккумулировании фенолов и хинонов. Фенолы - нормальные метаболиты растений, входящие в состав пигментов, регуляторов роста, структурных элементов клеточных стенок. В то же время фенолы — стрессовые метаболиты, синтез которых резко возрастает при поранении или заражении.

Результаты исследования по влиянию опрыскивания механически поврежденных клубней картофеля сорта Невский бактериями рода Pseudomonas aureofaciens, штамм

С, мг / 100г 140,------------------

120

100

80

60

40

20

О

І | Хлорогеновая кислота П-кумаровая уислота Катехины Кофейная кислота Феруловая кислота

С, мг/100г 120

Рис. 1. Накопление фенольных соединений в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский при t = 18 ± 1 “С: а — через 7 сут; б — через 14 сут после начала опыта;

1 — контроль; 2 — Pseudomonas aureofaciens 35;

3 — Pseudomonas sp. 115

С, м г / 100г 120

100

80

60

40

20

О

І | Хлорогеновая кислота ІЇЇТП П-кумаровая уислота Э Катехины И Кофейная кислота Ш Феруловая кислота

Рис. 2. Накопление фенольных соединений в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский при I = 3 ± 1 °С: а - через 14 сут; б — через 21 сут после начала опыта;

1 — контроль; 2 — Pseudomonas aureofaciens 35;

З — Pseudomonas sp. 115

35 и Pseudomonas sp., штамм 115 на накопление фенольных соединений и на изменение активности ферментов пероксидазы и фенолоксидазы в процессе раневой репарации клубней представлены на рис. 1 - 3.

При изучении динамики фенольных соединений в механически поврежденном картофеле установлены также кинетические зависимости накопления основных фенольных соединений, присутствующих в растительных тканях и ответственных за реакции сверхчувствительности, при различных температурах и условиях проведения эксперимента.

В кинетике кривые, полученные в эксперименте, стремятся путем математических операций превратить в прямые линии, поскольку анализ прямых позволяет получать параметры, включающие в себя константы скоростей реакций. Обсчет кинетических кривых осуществляли с помощью методов химической и ферментативной кинетики [2, 3|.

В случае односторонней реакции первого порядка дифференциальное уравнение, описывающее зависимость скорости реакции vot концентрации реагента с, имеет вид

А, мг Н20 /г; мгУ j /г 100

Пероксидаза

А, мг Н20 /г; мг\2 /г 100

Рис. 3. Активность ферментов в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский: а — при t = 3 ± 1 "С:

1 — контроль, 14 сут; 2 — контроль, 21 сут;

3 - Pseudomonas aureofaciens 35, 14 сут; 4 - Pseudomonas aureofaciens 35, 21 сут; 5 — Pseudomonas sp. 115, 14 сут; 6 — Pseudomonas sp. 115, 21 сут; б — при t — 18 ± 1 °С:

1 — контроль, 7 сут; 2 — контроль, 14 сут;

3 — Pseudomonas aureofaciens 35, 7 сут; 4 — Pseudomonas aureofaciens 35, 14 сут; 5 - Pseudomonas sp. 115, 7 сут; 6 — Pseudomonas sp. 115, 14 сут

-сіс/Ж = кс, где к- константа скорости реакции.

Интегрирование данного уравнения при начальном условии с = с0, в момент времени {— 0 приводит к соотношению с = с0е~к1 или

1п с = 1п с0 —

Из последнего выражения следует, что для реакции первого порядка график в координатах 1п с, Г имеет вид прямой линии, тангенс угла наклона которой равен —к (так называемая полулогарифмическая анаморфоза). Аналогично график в координатах 1п с0/с, / имеет вид прямой линии, проходящей через начало координат с тангенсом угла наклона, равным константе скорости реакции к.

Проведенный анализ кинетических кривых биосинтеза и окисления фенольных соединений в картофеле при механическом поранении в полулогарифмических координатах «логарифм относительной концентрации фенольных соединений — время» (1п с/со — /) показали, что существует линейная зависимость между логарифмом концентрации фенольных соединений и временем (рис. 4, 5). В процессе образования раневой репарации в клубнях протекают необратимые мономолекулярные реакции изменения количества фенольных соединений.

Для проверки порядка реакции строили графики в координатах (1^, ^с). Для этого графически дифференцировали кинетические кривые фенольных соединений, находили значения скоростей реакции, соответствующие определенным концентрациям веществ фенольной природы. Линеаризуя полученные значения в координатах (^у, ^с), получали тангенс угла наклона прямой, равный единице.

Рис. 4. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых фенольных соединений в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский при температуре 18 ± 1 *С:

1 — контроль; 2 — Pseudomonas aureofaciens 35;

3 - Pseudomonas sp. 115

Расчет порядка реакции п проводили одновременно и по формуле [3]: п= lg (v1/v2)/lg(c,/c2), где vb v2 - начальные скорости реакции, которые соответствуют концентрациям субстрата q и с2.

Используя данную формулу, рассчитали порядок реакции для всех вариантов эксперимента, равный приблизительно единице. Вероятность ошибки по формуле достаточно велика, так как в расчет принимаются только две точки. Данный расчет может использоваться только как оценочный.

Погрешность статистического определения кинетических параметров, рассчитанных по методу наименьших квадратов по компьютерной программе «Microsoft Excel», составила около 10 %.

Сопоставление полученных полулогарифмических анаморфоз кинетических кривых фенольных соединений в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский показало неодинаковое влияние температуры на изменение фенольных соединений (см. рис. 4, 5). Кривые образования фенолов при механическом повреждении тканей картофеля при повышенной температуре имели большую скорость процесса, располагались круче. Разница в значениях констант накопления различных фенольных соединений в вариантах эксперимента внешне проявляется в расхождении анаморфоз «веером» от начальной точки.

Зависимость скорости синтеза и-кумаровой кислоты (Pseudomonas aureofaciens 35) и катехина (Pseudomonas sp. 115) имела сложную форму (см. рис. 4). Условно на кинетических кривых можно выделить два участка, соответствующие быстрой и медленной стадиям биосинтеза. В табл. 1 приведены величины констант скоростей быстрой стадии накопления указанных фенолов.

Ускорение биохимических превращений в клетке, как известно, связано с функционированием природных ка-

1п

Рис. 5. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых фенольных соединений в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский при температуре 3 ± 1 *С:

1 - контроль; 2 — Pseudomonas aureofaciens 35;

3 — Pseudomonas sp. 115

тализаторов — ферментов, работающих при умеренных температурах и pH. Основная функция ферментов состоит в снижении энергетических барьеров химических реакций, которые имеют значительную величину при неферментативном катализе. Для каждой реакции существует своя энергия активации, зависящая от природы реагирующих веществ. Изменение температуры приводит к изменению константы скорости реакции.

Уменьшение температуры приводит к снижению скорости химических реакций за счет уменьшения доли молекул фермента и субстрата с высокой энергией, что соответствует обычной химической кинетике. Экспериментальные данные по температурной зависимости равновесия ферментативных реакций можно обрабатывать точно так же, как и данные обычных химических реакций [2].

Скорость большинства ферментативных реакций колоколообразно зависит от температуры: при любом отклонении от «температурного оптимума» наблюдается уменьшение скорости ферментативной реакции. При низких температурах уменьшение скорости связано с уменьшением доли активных молекул, при высоких — с конформа-ционными изменениями ферментов.

Уравнение Аррениуса (зависимость константы скорости реакции от температуры) формально применимо и к температурным зависимостям многостадийных ферментативных процессов.

При разных температурах разные стадии могут лимитировать скорость ферментативной реакции. В этих случаях энергия активации обычно эффективная величина.

При расчете энергии активации образования фенольных соединений в раневой перидерме клубней при температурах холодильного хранения картофеля 3 + ГСи лечебного периода 18 ± 1 °С использовали уравнение Аррениуса:

Таблица 1

Кинетические характеристики фенольных соединений в клубнях картофеля сорта Невский в процессе раневой репарации

k = ktpxpi-E/RT), где &о - предэкспоненциальный множитель;

Е—энергия активации;

R — газовая постоянная;

Т- абсолютная температура.

Для двух указанных температур проведения эксперимента уравнения константы скоростей реакции будут иметь вид:

кх = k^expi-E/RTi);

*2 = k0exp

Разделив (2) на (1), получим:

к,

Логарифмируя (3) и преобразуя полученное выражение, найдем формулу энергии активации:

JUnjkj/kJ ~ 1/7|-1/Г2 '

Из табл. 1 следует, что низкая температура холодильного хранения увеличивает свободную энергию активации реакций образования фенольных соединений в клеточных тканях, что соответственно способствует замедлению химического процесса.

Физический смысл этой взаимосвязи очевиден: чем больше избыток энергии, необходимый для осуществления реакции при столкновении молекул, тем медленнее протекает реакция. Очевидно также, что энергия активации, входящая в показатель степени, влияет на скорость реакции более существенно, чем предэкспонента.

Исследования показали (см. табл. 1), что при механическом поранении в поврежденных участках клубней возрастало общее содержание фенольных соединений. Обработка картофеля биологическими средствами защиты несколько изменяет естественную динамику накопления фенольных соединений, свойственную необработанным клубням, способствует активизации их биосинтеза. С увеличением температуры индуцировалось накопление фенольных соединений в раневой перидерме картофеля, причем различные фенолы образовывались с разной скоростью. С наибольшей скоростью происходил синтез хло-рогеновой кислоты, константа скорости которой при использовании бактерий-антагонистов Pseudomonas aureofaciens 35 была в 2 раза выше константы контрольного варианта как при температуре лечебного периода, так и при температуре холодильного хранения картофеля. Труднее происходил синтез катехина в процессе фенилпропано-идного обмена веществ, о чем свидетельствуют низкое значение кинетической константы его накопления и наибольшая энергия активации, особенно в варианте с применением Pseudomonas sp. 115.

Предшественником многих флавоноидных соединений, к которым относится катехин, является п-кумаровая кислота. В варианте с Pseudomonas sp. 115 присутствие данной кислоты не было зафиксировано, вероятно, в результате её малого содержания или, скорее всего, активного участия в синтезе лигнина и суберина, предшественником которых она также является. Некоторые из флавоноидных соединений также могут образовываться при воздействии на L-тирозин ферментом аммонийтирози-назы.

Вид обработки Фенольное соединение Константа скорости накопления k-10_J, «г1 при температуре, "С Энергия активации,

3 ± 1 18 ± 1 кДх/моль

Хлорогеновая кислота 2,42 6,63 45,67

Без Кофейная кислота 2,45 5,74 9,96

обработки (контроль) Катехины 4,14 5,87 15,82

п-Кумаровая кислота 6,52

Феруловая кислота

Хлорогеновая кислота 4,8 13 45,13

Pseudomonas Кофейная кислота 4,07 4,48 4,31

aureofaciens Катехины 4,28 0,79 76,61

35 п-Кумаровая кислота 7,19 11,1 19,68

Феруловая кислота -

Хлорогеновая кислота 2,53 5,92 38,47

Кофейная кислота 4,86 6,52 13,35

Pseudomonas sp.115 Катехины 1,53 9,22 81,47

п-Кумаровая кислота -

Феруловая кислота 7.76 10,48 13,61

В опытном варианте картофеля, обработанного бакте-риями-антагонистами и их метаболитами Pseudomonas sp. 115, в клетках раневой перидермы клубней обнаружена феруловая кислота с одним из наибольших значений кинетической константы биосинтеза. Феруловая кислота представляет собой один из трёх известных первичных фенольных мономеров, участвующих в биосинтезе лигнина и суберина. Данная кислота считается ответственной за придание структурной жесткости и прочности стенкам клеток благодаря сшиванию пентозных цепочек, ара-биноксиланов и гемицеллюлоз, в результате чего стенки клеток становятся менее чувствительны к разложению ферментами патогенов, приобретают устойчивость к механическим повреждениям. Это подтверждают данные эксперимента по определению суберина: именно в клубнях картофеля с биологизированной защитой Pseudomonas sp. 115 определено наибольшее содержание суберина в раневой перидерме и получен стойкий защитный эффект [5].

Поскольку защита растений мультикомпонентна по своей природе, нелегко определить, какое именно фенольное вещество и в какой концентрации может защищать растение.

Принимая во внимание сравнительно высокую токсичность кофейной кислоты [4|, можно предположить, что это соединение является одним из факторов устойчивости растений к патогенам и повреждениям. Обработка картофеля биологическими средствами защиты индуцировала скорость образования хлорогеновой кислоты, которая является основным фенольным соединением периферийного слоя клубней картофеля. Хлорогеновая кислота сама по себе нетоксична, однако служит источником образования соединений, обладающих значительной ро-

Рис. 6. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых активности ферментов пероксидазы (ПО) и фенолоксидазы (ФО) в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский при температуре 18 ± 1 "С: 1 - контроль; 2 - Pseudomonas aureofaciens 35;

3 — Pseudomonas sp. 115

лью в некрогенезе и патогенезе. Одним таким фрагментом хлорогеновой кислоты как раз является кофейная кислота.

Скорость окисления хлорогеновой кислоты с образованием кофейной максимальна в опытных образцах. Особенно интенсивно на скорость данной реакции повлияла обработка картофеля бактериями-антагонистами и их метаболитами рода Pseudomonas aureofaciens 35. Энергия активации образования кофейной кислоты в данном случае снижалась в 2 раза относительно контрольного варианта. Важно отметить, что при пониженной температуре холодильного хранения картофеля проявилась способность данных биологических средств защиты адаптироваться к внешним условиям и активизировать стрессовый метаболизм растительных клеток при механическом повреждении клубней. Значения кинетических констант синтеза хлорогеновой и кофейной кислот при температуре 3 ± 1 °С были в 2 раза больше контрольных показателей, что особенно важно для интенсивного создания химического и механического барьеров при поранении или поражении картофеля микробиологическими заболеваниями в условиях низких температур.

Согласованность процесса окисления полифенолов и восстановления хинонов может наблюдаться только в живой неповрежденной ткани растений. Под влиянием различных воздействий (инфекционных и неинфекционных) на ткань растений происходит накопление продуктов окисления и последующая конденсация фенольных соединений, отмирание клеток и появление темноокра-шенных некротических пятен.

Рис. 7. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых активности ферментов пероксидазы (ПО) и фенолоксидазы (ФО) в раневой перидерме клубней картофеля сорта Невский при температуре 3 ± 1 *С:

1 - контроль; 2 — Pseudomonas aureofaciens 35;

3 — Pseudomonas sp. 115

In

Контроль о— Pseudomonas sp. 115 •— Pseudomonas aureofaciens 35

Комплекс фенолоксидаза — фенолы-хиноны — перокси-даза, присутствующий в клетках высших растений, составляет один из активных физиологических механизмов, участвующих в защите растений от поражений. Некрозогенез ассоциируется с аккумуляцией полифенолов, окисляющихся до хинонов. Быстрая аккумуляция хинонов, в свою очередь, служит медиатором д ля действия ферментов.

Сродство пероксидазы, фенолоксидазы к различным соединениям, являющимся субстратами фермента, может характеризоваться константой Михаэлиса-Ментен (Кт) и каталитической константой. Однако важно отметить, что без детального знания механизма реакции интерпретация Кт как константы скорости превращения фермент -субстратного комплекса неправильна, поскольку для разных кинетических схем может отражать совершенно различные процессы. Действие фермента в нативной клетке невозможно со всей полнотой моделировать in vitro.

Для определения кинетических параметров процесса экспериментальные кинетические кривые активности указанных ферментов обрабатывались в координатах уравнения первого порядка. Полученные результаты приведены на рис. 6 и 7, из которых видно, что кинетические кривые в полулогарифмических координатах «логарифм относительной активности фермента - время» (In А/А^ - t) для большинства вариантов эксперимента имеют по два линейных участка, соответствующих активации и инактивации фермента.

Регенерация поврежденных тканей сопровождается резким возрастанием активности пероксидазы и фенолоксидазы. Есть предположение, что предпосылкой для индукции механизма локализации и образования некроза является разрыв клеточных мембран, который способствует контакту между ферментами и их субстратами. Клеточная стенка помимо наличия структурных функций ведет себя как «железа», служащая хранилищем определенного класса регуляторных молекул, которые, выделяясь из нее,

способны контролировать целый ряд функций растения, в том числе и защитных [ 1 ].

Пока некрозы не сформированы, наиболее интенсивно индуцируется активность пероксидазы во всех вариантах опыта. Достоверное увеличение активности пероксидазы регистрируется через 24 ч после нанесения механического повреждения. Пероксидаза — функционально очень лабильный фермент, способный реагировать на любое изменение окружающей среды и на любые стрессовые ситуации. Пероксидазные системы растений, окисляя фенолы, превращают их в более токсичные д ля фитопатогенов хиноны. Сами хиноны подвергаются или двухэлектронному восстановлению до гидрохинона, или одноэлектронному восстановлению до семихинонового радикала, которые и проявляют цитотоксическое действие [7|.

Бактерии-антагонисты и продукты их жизнедеятельности, существенно изменяя метаболизм растения-хозяина, индуцируют синтез белков, обладающих пероксидаз-ной активностью. Активность фермента пероксидазы опытных образцов значительно превышает его активность в контроле при различных условиях проведения эксперимента, особенно с использованием суспензиии Pseudomonas sp., штамм 115. В ответ на механическое поранение клубней пероксидаза активизируется и наиболее интенсивно — в присутствии бактерий-антагонистов и продуктов их метаболизма: более чем в 17 — 19 раз при 18 ± 1 °С в течение 14 сут и в 8 — 13 раз - при температуре 3 ± 1 °С в течение 21 сут.

Из экспериментальной зависимости активности фермента от времени проведения модельного опыта находили константу скорости первого порядка для указанных ферментов, которая является мерой стабильности ферментативного процесса (табл. 2).

Сопоставление кинетических зависимостей скоростей активации и инактивации указывает на различия перок -свдазного и фенолоксидазного окисления фенольных соединений при механическом поранении картофеля и изменении температуры.

Активность фенолоксидазы индуцируется при механическом повреждении тканей клубней и температуре 18 °С так же интенсивно, как и активность пероксидазы, однако непродолжительное время. Наиболее заметно воздействие бактерий-антагонистов на увеличение активности фенолоксидазы при повышении температуры, особенно при применении Pseudomonas aureofaciens 35. Данный фермент активизируется, достигая максимума на 7-е сутки от начала эксперимента, после чего активность фенолоксидазы во всех вариантах опыта начинает снижаться, постепенно возвращаясь к исходному уровню. При температуре 3 °С фермент начинает инактивироваться на 14-е сутки проведения исследования. Тогда как пероксидаза повышает свою активность в течение всего периода и различных условиях проведения эксперимента.

Таблица 2

Кинетические характеристики ферментов в клубнях картофеля сорта Невский в процессе раневой репарации

Константа скорости накопления НО-*, ч-1

Вид обработки Фермент к при температуре, °С температуре, *С

3 ± 1 18 ± 1 3 ± 1 18 ± 1

Без обработки (контроль) Пероксидаза 2,34 7.45

Фенолоксидаза 0,57 8,09 1,13 1,93

Pseudomonas aureofaciens Пероксидаза 6,35 8,46 3,09

35 Фенолоксидаза 4,11 7,67 8,15 7,27

Pseudomonas Пероксидаза 5,13 13,13

sp.115 Фе нолоксидаза 3,3 4,74 3,61 1,27

При снижении температуры до общепринятого режима холодильного хранения картофеля 3 ± 1 °С резко снижается каталитическая деятельность ферментов, особенно низкими значениями кинетических констант характеризовались реакции фенолоксидазного окисления фенольных соединений. Пероксидаза при низких температурах стабильна, инактивации фермента не происходит. При пониженных температурах изменяются физические свойства липидного слоя мембран: мембрана сжимается, существенно уменьшается ее площадь, увеличивается толщина, снижается гидрофобное взаимодействие и усиливается электростатическое. Все это приводит к высвобождению периферических мембранных белков из мембраны, изменению структуры интегральных белков, что наряду с прямым влиянием низкой температуры на структуру белков существенно модифицирует их ферментативные свойства 110). Гипотермия активно индуцирует синтез стрессовых белков. Известно [8], что при понижении температуры происходят конформационные перестройки глобулы вновь синтезированных форм пероксидазы, затрагивающие активный центр фермента. При этом происходят изменения как в наборе молекулярных форм фермента, так и в проявлении их активности и соответственно в адаптации пероксидазы к стрессовым условиям.

Активизация фенолоксидазы в местах образования некрозов является вторичным эффектом, так как нет прямой зависимости между образованием некрозов и повышением активности этого фермента (1 ]. Увеличение активности фенолоксидазы иногда соотносят с активированием изоэнзимов пероксидазы, так как эти два фермента могут проявлять перекрывающуюся субстратную специфичность. Было показано [8], что пероксидаза обладает не только пероксидазными свойствами (окисляет органические соединения за счет кислорода перекиси), но и оксидазными свойствами, т.е. катализирует окисление целого ряда соединений за счет неактивированного молекулярного кислорода. Фенолоксидаза же окисляет различные фенолы и их производные в присутствии только молекулярного кислорода. Кроме того, известна способность фенольных соединений подавлять активность большинства оксидаз (исключение составляет только пероксидаза).

Функционально активное состояние пероксидазы продолжалось и после завершения модельного опыта. Это свидетельствует о продолжительной напряженности метаболических процессов в клетках поврежденного растения, а наличие стабильного состояния пероксидазы можно объяснить ее способностью перемещаться по эндо-плазматическому ретикулу и аппарату Гольджи, проникать в пространство между клеточной мембраной и клеточной стенкой, способностью перехода в более активное состояние уже имеющихся изоформ фермента [8|.

Активное участие лигнина и суберина в защитном механизме растений имеет место именно там, где образуются некрозы и поранения. Пероксидаза может участвовать в формировании ковалентных поперечных связей в клеточных стенках растений при заражении их патогенами и при механических повреждениях [11]. Причем, как считают многие авторы, в синтезе лигнина, входящего в состав суберинизированных клеток, принимают участие только пероксидазы (1,4,8).

По полученным результатам эксперимента индукция активности пероксидазы в опытных образцах сопровождается активизацией защитных реакций клубней в ответ на неблагоприятные условия проведения опыта — более активным синтезом суберина.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что механическое поранение картофеля, обработка его биологическими средствами защиты на основе бактерий-антагонистов рода Pseudomonas интенсифицируют биогенез фенолов приводят к изменению их качественного состава.

При сравнительном изучении кинетических свойств ферментов пероксидазы и фенолоксидазы в процессе протекания раневой репарации установлено, что бактерии-антагонисты и их метаболиты оказывают существенное влияние на кинетику ферментативных реакций: ферменты опытных образцов отличаются от ферментов контрольных клубней кинетическими свойствами, термической устойчивостью, скоростью окисления субстратов. Термостабильность пероксидазы и фенолоксидазы при пониженной температуре холодильного хранения картофеля в опытных образцах превышает в несколько раз стабильность контрольного варианта. В обработанных клубнях снижается вероятность развития патогенных микроорганизмов на первых уязвимых этапах после повреждения клеточной стенки картофеля (благодаря интенсификации защитных реакций растительного организма).

Применение бактерий-антагонистов иммунизирует растительные клетки клубней, оказывая значительное положительное влияние на процесс раневой репарации картофеля.

Список литературы

1. Андреева В. А. Фермент пероксидаза: Участие в защитном механизме растений. — М.: Наука, 1988.

2. Березин И.В, Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. — М.: МГУ, 1976.

3. Варфоломеев С.Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический курс. — М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.

4. Дьяков Ю. Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г. Общая и молекулярная фитопатология. — М.: Изд-во Общества фитопатологов, 2001.

5. Кипрушкина Е.И., Колодязная B.C., Чеботарь В.К. Экологически безопасный биологический метод сохранения сельскохозяйственной продукции//Вестник защиты растений. №3. 2003.

6. Методы биохимических исследований растений / Под. ред. Ермакова. — Л.: Колос, 1972.

7. Роговина В.В., Муравьева Р.А. и др. Пероксидазосомы клеток растений// Изв. РАН. Сер. Биол. 1996. № 1.

8. Рогожин В. В. Пероксидаза как компонент антиокси-дазной системы живых организмов. — СПб.: ГИОРД, 2004.

9. Самородова-БианкиГ.Б., Стрельцина С.А. Исследование биологически активных веществ плодовых культур. — Л.: ВИР. 1989.

10. Effects oflow temperatures on biological membranes/ Eds. MorrisG.J., Clarke A. London etc.: Acad.press, 1981.

11. Zimmerlin A., Wajtaszek P., Boiwell G.P. Synthesis of dehydrogenation polymers of ferulic acid with high specificity by a purified cell-wall peroxidase from french bean // Biochem.J. 1994. \bl.299. № 3.