СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕПАТОПАТИИ
METHOD OF MODELLING CHRONIC TOXIC HEPATOPATHY

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия тяжелых металлов, в частности кобальта, на функции печени.
Найдя широкое применение в промышленности, кобальт активно используется в ее отраслях, что приводит к чрезмерному накоплению ксенобиотика, относящегося к веществам I класса опасности, в окружающей человека среде. Кобальт, проникая в организм человека преимущественно ингаляционным путем, накапливается практически во всех органах, но наибольшая его кумуляция отмечается в печени и почках, где он и оказывает свое выраженное цитотоксическое действие, что приводит к морфологическим и функциональным изменениям этих органов-мишеней [Орджоникидзе Э.К., Рощин А.В. Кобальт - Токсичность, биологический контроль. / Гигиена труда и профессиональные заболевания. - 1991. - №12. - С.1-4]. Одним из механизмов, обуславливающих гепатотоксическое действие кобальта в условиях хронической интоксикации, является его способность изменять активность микросомальных ферментов [Калиман П.А., Беловецкая И.В. Влияние хлорида кобальта на активность ключевых ферментов метаболизма гемма в печени крыс. / Биохимия. - 1986. - Т.51. - Вып.8. - С.1302-1307]. Кобальт, как и большинство тяжелых металлов, проникая в клеточные структуры, приводит к активации процессов перекисного окисления липидов, что усугубляет течение токсического процесса [Kamiya Т, Наrа Н, Inagaki N, Adachi T. The effect of hypoxia mimetic cobalt chloride on the expression of EC-SOD in 3T3-L1 adipocytes. / Redox Rep. 2010; 15(3): 131-7].
Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования хронической токсической гепатопатии, взятый за прототип (Патент 2343556 С1, опубликованный 10.01.2009, Бюл. №1, заявка 2007123406/14, от 21.06.2007, МКИ G09B 23/28, авторы: Ибаттулина Р.Б., Мышкин В.А., Бакиров А.Б.) заключающийся в том, что экспериментальным животным вводят 50% раствор 2,4-дихлорфенола на оливковом масле через зонд в желудок ежедневно однократно в течение трех недель в дозе 5 мг на 100 г массы тела.
Недостатком данного способа является то, что, во-первых, в качестве гепатотоксического вещества используется химический реактив, который не присутствует в окружающей внешней среде и не является ее загрязнителем; во-вторых, не исследуется активность процессов перекисного окисления липидов в крови и состояние системы антиоксидантной защиты в условиях токсического процесса, так как кровь является первой системой, сталкивающейся со всеми многочисленными ксенобиотиками, непосредственно перед их биотрансформацией в печени. Эритроциты имеют схожие черты метаболических процессов с гепатоцитами, именно поэтому патоморфологические изменения их структур имеют схожий характер. Однонаправленная реакция эритроцитов и клеток печени на патологическое воздействие позволяет использовать клетки крови как индикатор оценки тяжести патологических процессов в печени [Генинг Т.П., Белозерова Л.А. Система «ПОЛ-антиоксидант эритроцитов и ткани печени» в условиях хронического токсического гепатита и его коррекции аскорбиновой кислотой. / Вестник новых медицинских технологий. - 2005. - T.XII. - №2. - С.72-73].
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования хронической токсической гепатопатии.
Решение этой задачи позволяет более полно изучить патофизиологические механизмы развития гепатопатии при хроническом воздействии кобальта, создать способ моделирования хронической токсической гепатопатии, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на животных и экономически выгодный.
Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способ моделирования хронической токсической гепатопатии, включающий ежедневное однократное введение через зонд в желудок токсического вещества экспериментальным животным, отличается тем, что в качестве токсического вещества используют раствор хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг в пересчете на металл в течение месяца.
Данный способ отличается от прототипа использованием токсического вещества - хлорида кобальта, распространенного в окружающей среде, который вводится через зонд в желудок.
Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: длительное введение хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг приводит к развитию хронической токсической гепатопатии, что является удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.
По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования хронической токсической гепатопатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном и легко воспроизводимом способе развития хронической токсической гепатопатии, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость.
Данный способ осуществляется следующим образом.
Для получения токсического вещества хлорид кобальта растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 2 мг кобальта (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.
По истечении времени эксперимента (30 дней) исследовали функциональное состояние печени, что включало определение активности в плазме крови аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), определение содержания холестерина, концентрации общего и прямого билирубина, анализ активности щелочной фосфатазы. Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. Определение активности каталазы в плазме крови производилось с целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ). По истечении срока эксперимента крысы забивались с использованием тиопентала натрия. Для гистологических исследований образцы тканей (печень) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.
Сущность способа подтверждается морфологически. Чертеж иллюстрирует морфологические признаки гепатопатии. При гистологическом исследовании печени у экспериментальных животных, получавших внутрижелудочное введение хлорида кобальта, выявлялись: выраженная гидропическая (а), белковая (б) и жировая дистрофии гепатоцитов с явлениями фокального некроза (кариопикноз, кариорексис) (в), значительные клеточные инфильтраты вблизи полнокровных центральных сосудов, отечная строма, отдельный некроз гепатоцитов с нарушением балочной структуры (г), определялось также диффузное геморрагическое пропитывание ткани печени (см. чертеж).
Пример. Крысам-самцам линии Вистар массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг каждый день в течение 30 дней. Через 30 дней исследовали функциональное состояние печени и активность систем ПОЛ-АОЗ, что включало в себя определение активности в плазме крови аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), содержания холестерина, концентрации общего и прямого билирубина, активности щелочной фосфатазы, концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах, уровня гидроперекисей в плазме крови и активности каталазы в плазме крови.
Определение активности трансаминаз проводилось с помощью биохимического диагностического набора фирмы «LaChema» по методу Райтмана-Френкеля, по специальной формуле (соотношение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы) рассчитывали коэффициент де Ритиса. Определение содержания холестерина в плазме крови проводилось с помощью диагностического биохимического набора фирмы «Витал Диагностикс СПб» энзиматическим колориметрическим методом. Определение концентрации общего и прямого билирубина проводилось с помощью диагностического биохимического набора фирмы «Витал Диагностикс СПб» по методу Маллой-Эвелина. Для исследования активности щелочной фосфатазы использовали биохимический набор фирмы «Lachema». Все биохимические анализы проводились с использованием автоматического биохимического анализатора ChemWell (США). Определение активности каталазы в эритроцитах проводили спектрофотометрически по методу Е.Beutler. Определение концентрации гидроперекисей проводили спектрофотометрически по методу Гаврилова В.Б. Определение концентрации малонового диальдегида в эритроцитах проводили спектрофотометрически по методу Камышникова B.C. Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.
Результаты исследования показали, что у крыс с внутрижелудочным введением хлорида кобальта происходило достоверное повышение концентрации общего билирубина, относительно фоновых значений, тогда как концентрация прямого билирубина не имела достоверных отличий от показателей интактного контроля. Внутрижелудочное введение хлорида кобальта приводило к достоверному снижению активности как щелочной фосфатазы (ЩФ), так и аспартатаминотрансферазы относительно значений интактного контроля. Внутрижелудочное введение хлорида кобальта приводило к повреждению гепатоцитов, что подтверждалось повышением активности аланинаминотрансферазы и, как следствие, снижением коэффициента де Ритиса относительно фоновых значений, что свидетельствует о поражении печени (Табл.1).
Таблица 1
Влияние внутрижелудочного введения хлорида кобальта на показатели печеночных проб
Условия опыта
Стат. пока-зат.
Общий билирубин (мкмоль/л)
Прямой билирубин (мкмоль/л)
ЩФ (МЕ/л)
Холестерин (ммоль/л)
АЛТ (мккат/л)
ACT (мккат/л)
Коэффициент де Ритиса
Фон
М±m
1,6±0,359
0,82±0,142
429,6±51,51
1,56±0,081
0,27±0,009
0,255±0,015
1,072±0,051
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц)
М±m
2,85±0,378
0,73±0,085
288,5±18,99
1,7±0,123
0,312±0,0069
0,228±0,01
0,73±0,036
***)
-
***)
-
**)
*)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном
(**) - достоверное (p≤0,01) изменение по сравнению с фоном
(***) - достоверное (p≤0,02) изменение по сравнению с фоном
Снижение активности каталазы в эритроцитах у животных, внутрижелудочно получавших хлорид кобальта (группа №1), сочеталось с увеличением концентрации МДА в эритроцитах и повышением уровня гидроперекисей в плазме крови относительно фоновых значений, что свидетельствует об активации процессов липопероксидации (Табл.2).
Таблица 2
Активность каталазы, концентрация малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей у экспериментальных животных на фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта
Условия опыта
Стат. показат.
МДА (мкмоль/л)
Гидроперекиси (мкмоль/л)
Каталаза (МЕ/гHb)
Фон
М±m
70,97±2,96
2,16±0,15
382,2±7,313
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц)
М±m
86,37±1,252
3,69±0,146
313±6,267
p
*)
*)
*)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном
Предлагаемый способ моделирования хронической токсической гепатопатии является эффективным, позволяет подробно изучить патофизиологические механизмы токсического влияния тяжелого металла на функции печени и может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики хронической токсической гепатопатии.