ЛЕГКОВЫДЕЛЯЕМЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА С ПРИРОДНЫМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫМ ФОРМАТОМ

1. Способ выделения биспецифического антигенсвязывающего белка, включающий:
контактирование разрушенной клетки или смеси антигенсвязывающих белков с аффинной подложкой с белком А; и
элюирование биспецифического антигенсвязывающего белка с использованием градиента pH в присутствии ионного модификатора;
при этом биспецифический антигенсвязывающий белок содержит гетеродимерную область IgG СН3, содержащую первый и второй IgG СН3 домен, каждый из которых обладает различной аффинностью к белку А.
2. Способ по п. 1, в котором ионный модификатор представляет собой соль,
необязательно бериллия, лития, натрия или калия ацетат; натрия или калия бикарбонат; лития, натрия, калия или цезия карбонат; лития, натрия, калия, цезия или магния хлорид; натрия или калия фторид; натрия, калия или кальция нитрат; натрия или калия фосфат; или кальция или магния сульфат; или
необязательно соль щелочного металла, щелочноземельного металла, или галогена; или
2
2
необязательно NaCl, KCl, LiCl, CaCl или MgCl, или
необязательно NaCl.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором ионный модификатор присутствует в концентрации от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,5 моль.
4. Способ по п. 3, в котором ионный модификатор представляет собой NaCl и присутствует в концентрации по меньшей мере приблизительно 150 mM.
5. Способ по п. 1 или 2, в котором ионный модификатор присутствует в концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0 моль, необязательно в концентрации приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 моль.
6. Способ по п.1 или 2, в котором градиент pH представляет собой от pH приблизительно 3,9 до pH приблизительно 4,5, или от pH приблизительно 4,0 до pH приблизительно 4,4, или от pH приблизительно 4,1 от pH приблизительно pH 4,3.
7. Способ по п. 1 или 2, в котором градиент pH представляет собой линейный градиент.
8. Способ по п. 1 или 2, в котором градиент pH представляет собой ступенчатый градиент, и необязательно способ дополнительно включает применяемый для уравновешивания колонки с белком А этап с pH приблизительно 3,9, pH приблизительно 4,0, pH приблизительно 4,1, pH приблизительно 4,2, pH приблизительно 4,3, pH приблизительно 4,4 или pH приблизительно 4,5.
9. Способ по п. 1 или 2, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок элюируют при pH между приблизительно 3,9 и приблизительно 4,4, приблизительно 4,0 и приблизительно 4,3, приблизительно 4,1 и приблизительно 4,2, или приблизительно pH 4,2.
10. Способ по п. 1 или 2, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок элюируют при pH приблизительно 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 или 4,5.
11. Способ по п. 1 или 2, в котором смесь представляет собой среду для культивирования.
12. Способ по п. 1 или 2, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий гетеродимерную область IgG СН3 элюируют в одной или нескольких фракциях, содержащих менее чем приблизительно 1%, 0,5% или 0,1% суммарного белка по массе антител, включающих гомодимерную область IgG СН3, которая включает области СН3 с одинаковой аффинностью к белку А.
13. Способ по п. 1 или 2, в котором вторая область IgG СН3 содержит модификацию, которая снижает или устраняет связывание второго домена СН3 с белком А.
14. Способ по п. 13, в котором каждый из первого и второго домена IgG СН3 представляет собой домен СН3 тяжелой цепи IgG человека, выбранную из группы, состоящей из домена СН3 тяжелой цепи IgG1 человека, домена СН3 тяжелой цепи IgG2 человека и домена СН3 тяжелой цепи IgG4 человека.
15. Способ по п. 14, в котором модификация выбрана из группы, состоящей из (a) 95R и (b) 95R и 96F в нумерации экзонов IMGT, или (а') 435R и (b') 435R и 436F в нумерации системы EU.
16. Способ по п. 15, в котором второй домен СН3 представляет собой:
домен СН3 IgG1 человека и дополнительно содержит от одной до пяти модификаций, выбранных из группы, состоящей из 16Е, 18М, 44S, 52N, 57М и 82I в нумерации экзонов IMGT, или 356Е, 358М, 384S, 392N, 397М и 422I в нумерации системы EU;
домен СН3 IgG2 человека и дополнительно содержит от одной до двух модификаций, выбранных из группы, состоящей из 44S, 52N и 82I в нумерации экзонов IMGT, или 384S, 392N и 422I в нумерации системы EU; или
домен СН3 IgG4 человека и дополнительно содержит от одной до семи модификаций, выбранных из группы, состоящей из 15R, 44S, 52N, 57М, 69K, 79Q и 82I в нумерации экзонов IMGT, или 355R, 384S, 392N, 397М, 409K, 419Q и 422I в нумерации системы EU.
17. Способ по п. 15 или 16, в котором второй домен СН3 представляет собой домен СН3 IgG4 человека и дополнительно содержит модификацию 105Р в нумерации экзонов IMGT, или 445Р в нумерации системы EU.
18. Способ по п. 15 или 16, в котором первый и второй IgG СН3 домены одинакового изотипа.
19. Способ по п. 13, в котором гетеродимерные области СН3 биспецифического антигенсвязывающего белка являются неиммуногенными или по существу неиммуногенными для человека.
20. Способ по п. 13, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок содержит две легкие цепи, которые являются одинаковыми.
21. Способ по п. 13, в котором биспецифический антигенсвязывающий белок демонстрирует фармакокинетический профиль, который не существенно отличается от такого же биспецифичного антигенсвязывающего белка, содержащего гомодимерную IgG СН3 область.
22. Способ по п. 1 или 2, в котором аффинная подложка с белком А представляет собой на колонку с белком А.
23. Биспецифический антигенсвязывающий белок, выделенный способом по любому из пп. 1-22.