Экспериментальная оценка действия оксида азота на электрокинетические свойства мембран эритроцитов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА. ДЕЙСТВИЯ ОКСИДА АЗОТА НА ЭЛХКТРОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ

А. А. Мартусевич. А. В. Дерюгина

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия

Abstract

The aim of this study was estimation of erythrocyte electrophoretic mobility under the action of exogenous nitric oxide on blood specimens and organism of healthy rats. First (in vitro) stage of experiment was executed on blood specimens of 15 healthy peoples. Each specimen was divided into 3 portions (5 ml.). First portion was control (without any manipulations), other ones was sparged with NO-containing gas mixture with 20 and 100 ppin of NO. Second (in vivo) stage of experiment was performed on 40 male Wistar rats, dvided into 4 groups, first of ones (n=10) was control. Animals of second to fourth group (n=10) got a daily inhalations of nitric oxide (NO concentration - 20, 50 and 100 ppm, respectively). Our study allows to demonstrate the single response for direct (at blood processing) and indirect (at inhalation course) action of these substances. High dose of nitric oxide (100 ppm) caused the decreasing of erythrocyte electrophoretic mobility. In opposite, low dose of NO (20 ppm) stabilized erythrocyte membranes by elevation of biofluid antioxidant potential. This effect leads to activation of erythrocyte electrokinetic properties in vivo (after the course of inhalation).

Key words: erythrocyte, electrophoretic motility, nitric oxide

Целью настоящего исследования служило экспериментальное изучение электрофоретнческой подвижности эритроцитов при действии экзогенного оксида азота на образцы крови практически здоровых доноров и организм здоровых животных (крыс). Первый этап эксперимента выполнен на образцах кровн 15 здоровых доноров. Каждый образец был разделен на 3 равных порции по 5 мл., первая из которых являлась контрольной (с ней не производили никаких манипуляций), остальные барботировали NO- содержащей газовой смесью с концентрацией оксида азота 20 и 100 ppm соответственно. Второй этап эксперимента (ш vivo) выполнен на 40 половозрелых крысах-самцах линии Вистар. разделенных на 4 группы. Первая группа животных (п=10) являлась контрольной. Животные второй-четвертой группы (n= 10) на протяжении 10 дней получали ежедневные ингаляции газообразного оксида азота (концентрация соединения— 20, 50 и 100 ppm соответственно). На основании проведенных исследований обнаружен единый характер реагирования биосистем на непосредственное (при обработке крови) и опосредованное (в форме ингаляций) воздействие экзогенного газообразного оксида азота в изучаемых условиях. Так, высокие концентрации оксида азота (100 ppm) обеспечивают снижение

электрофоретической подвижности эритроцитов. Напротив, более низкие дозы NO (20 ррш оказывают стабилизирующее влияние на состояние мембран красных клеток крови, повышая антноксидантный потенциал биосреды.

Ключевые слова: эритроциты, электрофоретическая подвижность, оксид азота

В настоящее время большое внимание уделяется активным формам кислорода и азота, объединенным общим понятием «биорадикалы» [1-3]. Известно, что данные соединения способны выступать в качестве универсальных молекулярных биорегуляторов, включающихся как в физиологические, так и патологические пути метаболизма [2. 4. 5]. Многими авторскими коллективами показано их многогранное н неоднозначное участие практически во всех компонентах метаболизма [1-3, 6-8], причем результирующий эффект биологического действия биорадикалов зависит непосредственно от дозы действующего агента [9. 10]. Следует отметить, что в отношении данных соединений часто имеет место нелинейная зависимость «доза - эффект» [11].

С другой стороны, особенности реализации модулирующего влияния биорадикалов, а особенно оксада азота, на биосистемы, обусловленные их природой и физико-химическими свойствами, расшифрованы недостаточно полно [4]. Так. неизвестным по прежнему остается характер действия газообразного монооксида азота на электрокинетнческие свойства эритроцитов. Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФПЭ), являющаяся их количественным параметром, может рассматриваться как неспецифнческий индикатор состояния эритрона и его реакции на изменения гомеостаза и внешние воздействия на организм [9, 12-15]. В то же время подобные сведения имеются лишь в отношении озона, причем они приводятся только б единичных публикациях [9]. На основании этого пелью раооты служило изучение электрофоретической подвижности эритроцитов при действии экзогенного оксида азота в разных концентрациях на образцы крови и организм здоровых крыс.

Материал и методы исследования Проведенное исследование имело двухэтапный дизайн. На первом этапе изучали непосредственное влияние экзогенного оксида азота на кровь, а на втором — характер опосредованного эффекта указанных соединения на организм животного при ингаляционном воздействии.

Первый этап эксперимента (in vitro) выполнен на образцах крови 15 здоровых доноров. Каждый образец был разделен на 3 равных порции по 5 мл., первая из которых являлась контрольной (в ней не проводили никаких манипуляций), остальные барботнровали N0- содержащей газовой смесью (концентрация оксида азота - 20 и 100 ррш соответственно). Барботаж производили путем медленного пропускания газа через весь объем биологической жидкости, находящейся в стандартной стеклянной пробирке (выходное отверстие-выпускник газа находилось на дне пробирки). Продолжительность экспозиции после обработки - 5 мин.

Второй этап эксперимента (ш \-ivo) выполнен на 40 половозрелых крыса х-самцах лннин Вистар. разделенных на 4 групп. Первая группа животных (п=10) являлась контрольной, с ними не проводили никаких манипуляций, кроме однократного получения крови. Животные второй-четвертой группы (п=10) на протяжении 10 дней получали ежедневные ингаляции оксида азота (концентрация соединения в газовом потоке - 20, 50 и 100 ррш для указанных групп соответственно). Продолжительность воздействия составляла 10 мин., скорость потока газовой смеси - 2 л/мин. Синтез >Ю-содержащей воздушной смеси осуществляли с помощью экспериментального генератора, разработанного в РФЯЦ-ВНИИЭФ (г. Саров) [16].

Для проведения ингаляций крыс (по одной) помещали в эксикатор, через который осуществляли продувание газового потока.

По завершении полного курса воздействий у животных всех групп получали образцы крови. Из них выделяли эритроциты трехкратным отмыванием 0,85% раствором хлористого натрия с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об./мин. Измерение ЭФПЭ проводили методом микроэлектрофореза в собственной модификации [9, 12, 17]. Суспензию эритроцитов (0,1%) помещали в 10 мМ трис-НС1 буфер (рН 7.4) и фиксировали перемещение клеток при силе тока 8 мА. Величину ЭФПЭ определяли по формуле: и= $'ТН. где $ - расстояние, на которое перемещались клетки. Т -время перемещения клеток на расстояние $, Н - градиент потенциала.

Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете $ГаИ$Иса 6.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапнро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различии применяли Н-критернн Краскала-Уоллеса.

Результаты исследований

Оценка влияния различных концентраций оксида азота на электрокинетические свойства эритроцитов позволила установить, что данное воздействие вызывает дозозависнмое снижение уровня ЭФПЭ (рис. 1).

При этом если при обработке крови относительно небольшим количеством N0 (концентрация в газовой смеси - 20 ррш) эти сдвиги обнаруживаются лишь на уровне тенденции (р<0,1 по сравнению с контрольным образцом), то при барботаже биологической жидкости более высокой концентрацией оксида азота (100 ррш) выявлено снижение изучаемого параметра на 23% по отношению к контролю (р<0,05).

На втором этапе исследования изучали особенности модификации электрокинетических свойств мембран эритроцитов крыс при системном воздействии оксида азота. Было установлено, что, как и в отношении непосредственной обработки крови источниками радикалов, характер формируемых сдвигов ЭФПЭ определяется количеством воздействующего соединения. В частности, минимальная из примененных концентраций

дозозависимо снижало ЭФПЭ (на 15 и 31% относительно интактных животных соответственно; р<0,05 для обоих случаев). Это свидетельствует о особенностях реакции мембран изучаемых клеток крови на курсовое ингаляционное применение экзогенного окснда азота в указанных концентрациях.

—Ь-1

1 1 *

—\г-

контроль N0 20 ррш N0 100 ррш

Рис. 1. Электрофоретическая подвижность эритроцитов

контроль N020 ррш N050 ррш N0100 ррш

Рис. 2. Электрокинетические свойства эритроцитов крыс (мкм'см^В'^с"1) при проведении ингаляций оксида азота (* - статистическая значимость различий по

сравнению с контролем р<0,05)

Обсуждение результатов В настоящее время убедительно показана биорегуляторная роль малых молекул-радикалов [2, 5, 24], к числу которых относятся активные формы кислорода и монооксид азота [1, 6. 25-27]. С другой стороны, этот постулат касается преимущественно эндогенно генерируемых соединений [5, 6, 20, 21], тогда как в отношении экзогенного их введения подобные сведения

немногочисленны [4. 7, 19, 22]. В наших предшествующих работах было экспериментально показано, что экзогенные источники нитросодержащих радикалов способны изменять ряд метаболических параметров крови, включая индикаторы состояния окислительного и энергетического обмена, эритроцнтарных ферментных систем детоксикации. как в условиях in vitro (на образцах крови) [3, 11], так и ш vivo (у здоровых крыс линии Вистар при ингаляционном н внутрибрюшинном введении) [8, 28, 29]. При этом продемонстрирован дифференцированный и дозозависимый характер ответа на воздействие данного химического соединения. В частности, в этих исследованиях установлено модулирующее действие оксида азота на состояние мембран эритроцитов. Данный эффект был проиллюстрирован на примере динамики перекисной резистентности, характеризующей интенсивность процессов липопероксидацни в эритроцнтарных мембранах [28, 29].

Учитывая то обстоятельство, что ЭФПЭ в последние десятилетия рассматривается как интегральный параметр, позволяющий оценивать целостность и функциональные свойства мембран изучаемых клеток крови [9, 12, 14, 15, 17], представляло интерес уточнить особенности сдвигов данного показателя в условиях влияния эндогенного источника радикалов и сопоставить его реализацию при непосредственной обработке крови и при системном применении фактора (в форме курса ингаляций).

Установлено газообразный оксид азота в низкой концентрации (20 ррш). для которого ранее нами показано выраженное антиоксидантное действие на биосистемы [3, 8. 26]. способствует упрочнению лнпидного каркаса мембран, ингибируя процессы перекисного окисления липидов в последних, повышая мобильность эритроцитов в электрическом поле. Эти сдвиги ЭФПЭ. характерные для курсовых ингаляций NO в концентрации 20 ррш. трактуются нами как благоприятные. проадаптивные. Приведенные результаты полностью подтверждают ранее продемонстрированное положительное действие указанного фактора на метаболические параметры крови, в частности, на состояние окислительного и энергетического обмена, ферментных систем детоксикации и др. [8, 28. 29]. Это позволяет предположить, что одной из основных «точек приложения» экзогенных источников радикалов выступают свободнорадикальные процессы в мембранах эритроцитов, опосредующие биологические эффекты изучаемых соединений.

Высокие концентрации оксида азота (ЮОррш) обеспечивают снижение электрофоретической подвижности эритроцитов.

По нашему мнению, подобный характер ответа биосистемы на введение N0 связан с тем. что небольшие количества последнего, утнливируясь в процессе реализации его биорегуляторной активности [4, 19-21] и частично трансформируясь в депонирующие соединения (S-нитрозотиоды. динитрознльные комплексы железа с высоко- н низкомолекулярнымн лигандами [4, 22, 23]). не включаются в свободнорадикальные процессы, протекающие в плазме и клетках крови.

С другой стороны, воздействие более высокой концентрацией NO обеспечивает условия для формирования его неутилизированного избытка.

который способен транс формироваться в высокореактивные химические соединения, в частности пероксинтриг [10, 24]. Обладая крайне высоким окислительным потенциалом, он может атаковать мембраны клеток крови, в том числе эритроцитов, потенцируя интенсивность свободнорадикальных процессов в них. Это. в свою очередь, приводит к изменению структуры эритроцнтарных мембран и, как следствие. - к сдвигами ЭФПЭ.

Заключение

На основании проведенных исследований обнаружен единый характер реагирования биосистем на непосредственное (при обработке крови) и опосредованное (в форме ингаляций) воздействие газообразного оксида азота в изучаемых условиях Так, высокие концентрации оксида азота (100 ррш) обеспечивают снижение электрофоретической подвижности эритроцитов. Напротив, более низкие дозы NO (20 ррш) оказывают стабилизирующее влияние на состояние мембран красных клеток крови, повышая антноксидантный потенциал биосреды. Подобный эффект указанных концентраций способствует стимуляции электрокинетнческнх свойств эритроцитов в эксперименте in vivo (при курсовых ингаляциях). Таким образом, показано, что оксид азота специфично и дозозавнснмо влияет на электрокинетические свойства эритроцитов в условиях ш vitro и ш vivo.

Список литературы

1. Граннк В.Г.. Григорьев Н.Б. Оксид азота (N0). Новый путь к поиску лекарств. Вузовская книга. Москва. 2004.

2. Костюк В.А.. Потаповнч А.И. Биораднкалы н бноантиокснданты. БГУ, Минск. 2004.

3. Мартусевич АК.. Соловьева А.Г., Перетягин С.П.. Митрофанов В Н. // Бномеднцина. 2013. №1. С. 103.

4. Vanin A.F. // Nitric Oxide Biol. Chem. 2009. Vol. 21. P. 136.

5. Гусакова С.В., Ковалев И.В.. Смаглий JI.B. с соавт. // Успехи физиологических наук. 2015. Т. 46. №4. С. 53.

6. Реутов В.П., Охотин В.Е., Шуклин АВ. с соавт. // Успехи физиологических наук. 2007. Т. 38. №4. С. 39.

7. Ванин А.Ф.. Чазов Е.И.. Капелько В.И. с соавт. // Кардиологический вестник. 2007. Ш. С. 31.

8. Мартусевич А.А.. Соловьева А.Г.. Мартусевич А.К. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. Т. 156. №7. С. 51.

9. Снмугнс И.С.. Дерюгина АВ.. Боярннов Г.А. с соавт. // Медиаль. 2013. №4. С. 20.

10. van der Vliet A.. Eisench J.P., Halliwell В., Cross C.E. // J. Biol. Cliem. 1997. Vol. 272. P. 7617.

11. Мартусевич A.K.. Соловьева А.Г., Перетягин С.П. // Современные технологии в медицине. 2013. Т. 5, №4. С. 33.

12. Крылов В Н.. Дерюгина А.В. // Гематология и трансфузнология. 2011ю №5. С. 18.

13. Nihei Y., Asai Н.„ Ukai Т.. Marimoto Н.. Nakajima Y., Hanajiri Т., Maekawa Т. // Sensors and actuators. 2008. Vol. 131. P. 285.

14. Shereinetev Y.A., Suslov Fl, Denugina A.V.. Sheremetev A.V. // Biophysics. 2000. Vol 45, № 1 P. 79.

15. Xie L.7 Sun D., Yao W , Wen Z // Science ш China. 2002. Vol. 45, №1 C.

50.

16. Карельш В.II, Блранов C.H., Пименов О.А. с соавт // Медналь. 2013. №4. С. 46.

17. Крылов В.Н., Дерюгина А.В.. Плеском С.Н. // Современные технологии в медицине. 2010 №4. С. 23.

1S. Перетяг™ С.П.. Стручков А.А.. Мартусевич А.К. с соавт. // Скорая медицинская помощь. 2011. Т. 12, №3. С. 39.

19. Ваннн А.Ф., Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. с соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии н медицины. 2006. №12. С. 626.

20. Ignarro L.J., Byms R.E.. Buga G.M. // Circulation Research. 19S7. Vol. 61 P. 866.

21. Miirad F. // Neurotransmissions. 1994. Vol. 10. P. 1.

22. Shumaev K.B.. Gubkin A.A.. Serezheukov V.A. et aL // Nitric Oxide Biol. Chem. 200S. Vol 18. P 37.

23. Титов В.Ю. с соавт. Н Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2012. Т. 153. С. 816.

24. Halliwell В.. Cmtteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. Oxford. UK: Oxford University Press, 1999.

25. Заверенная P.M. // Украинский ревматологический журнал. 2002. №1. С. 35.

26. Мартусевнч А А.. Перетяган С. П.. Мартусевич А.К. // Современные технологии в медицине 2012. №2. С. 128-134.

27. Самосюк И.З.. Фнсенко ЛИ. (ред.) Синглетно-кнсдородная терапия, Киев. 2007.

2S. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г.. Ашнхмнн С.П.. Перетягнн С.П. П Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2015. Т. 101, №2. С. 180.

29. Martusevich А К, Peretyagin S.P., A.G. Soloveva, Martusevich АА, Plekhaniova A D. //Biophysics (Moscow). 2016 Vol 61. №1. P. 139.