Структура фермент-субстратного комплекса каталитического домена фосфодиэстераз с циклическим дигуанозинмонофосфатом

УДК 517.15

СТРУКТУРА ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДОМЕНА ФОСФОДИЭСТЕРАЗ С ЦИКЛИЧЕСКИМ ДИГУАНОЗИНМОНОФОСФАТОМ Б.Л. Григоренко, А.В. Немухин, М.Г. Хренова, Д.А. Новичкова

По результатам расчетов комбинированным методом квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) построена полноатомная трехмерная структура фермент-субстратного комплекса каталитического домена фосфодиэстераз с циклическим дигуанозинмонофосфатом.

Ключевые слова: циклический дигуанозинмонофосфат, фосфодиээстеразы, метод КМ/ММ.

Реакции гидролиза, приводящие к преобразованию циклических форм гуанозинмонофосфата (ц-ГМФ) и дигуанозинмонофосфата (ц-ди-ГМФ) в соответствующие нециклические формы ГМФ и ди-ГМФ, осуществляются ферментами семейства фосфодиэстераз, регулирующих концентрацию вторичных посредников ц-ГМФ и ц-ди-ГМФ при передачах сигналов в клетках. Механизмы химических реакций в активных центрах фосфодиэстераз являются предметом текущих исследований, причем на сегодняшний день основные предположения сформулированы по результатам рентгено-структурного анализа соответствующих белков [1-4]. В настоящей работе применяются современные приемы молекулярного моделирования на основе метода квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) [5] для построения полноатомной трехмерной структуры фермент-субстратного комплекса каталитического домена (EAL-домена) фосфодиэстераз с ц-ди-ГМФ. Знание этой структуры позволяет предсказать направления отдельных стадий реакции гидролиза ц-ди-ГМФ в белковой матрице.

Следуя выводам недавней работы [4], мы выделили две кристаллографические структуры EAL домена, относящиеся к фосфодиэстеразам с высокой ферментативной активностью, доступные в базе данных белковых структур (PDB), а именно, PDBid:3GG0 [1] и PDBid:3N3T [2]. Первая относится к многодоменному белку BlrPl из Klebsiella pneumoniae; вторая - к димерному белку Tbd1265 из Thiobacillus denitrificans. EAL домен содержит два иона металла в активном центре; известно, что каталитической активностью обладают белки с ионами магния или марганца. В структуре PDBid:3GG0 координаты ионов металла отнесены к марганцу, в структуре PDBid:3N3T - к

магнию. В нашей модельной системе мы рассматривали только ионы Mg2+.

При построении модели за основу были взяты ко -ординаты тяжелых атомов структуры PDBid:3GG0. После добавления атомов водорода в предположении общепринятого состояния протонирования полярных аминокислотных остатков, приводящего к возникновению отрицательно (Asp, Glu) и положительно (Lys, Arg) заряженных боковых цепей, и предварительной оптимизации координат методом молекулярной механики, система была подразделена на КМ- и ММ-части. В КМ-подсистему были включены все атомы субстрата ц-ди-ГМФ, боковые цепи Asp302, Asp303, Glu359 (по нумерации PDBid:3GG0) и 12 молекул воды. Модельная система представлена на рис. 1. Здесь явно показана только одна молекула воды, ко -торой по результатам моделирования отведена роль нуклеофильного агента в реакции гидролиза.

Вычисления значений энергии и силы в КМ-части проводили в приближении теории функционала электронной плотности в варианте PBE0/6-31G*. Для описания ММ-части применяли силовое поле AMBER. Использовали вариант метода КМ/ММ с конформационно-подвижными эффективными фрагментами [6, 7], позволяющий получать результаты, достаточно близкие к полному квантовому описанию всей системы. Проведена полная оптимизация равновесных геометрических параметров по минимуму полной энергии.

На рис. 2 результаты расчетов для ряда расстояний между тяжелыми атомами в активном центре сопоставлены с экспериментальными данными.

Можно заключить, что рассчитанная структура модельной системы в целом хорошо согласуется с

Рис.1. Модельная система для расчетов структуры фермент-субстратного комплекса каталитического БЛЬ-домена с ц-ди-ГМФ (с-Ш-вМР) методом КМ/ММ. Группы, включенные в квантовую подсистему выделены шарами и стержнями (показана лишь одна из 12 молекул воды). Группы молекулярно-механической подсистемы показаны

линиями

кристаллографическими данными из двух независимых источников [1, 2]. Четко воспроизведено окружение ионов магния кислородными атомами боковых цепей Asp и Glu, причем вне зависимости от того, были ли включены эти группы в КМ- или ММ-части системы при вычислениях.

Одно различие между теоретическими и экспериментальными результатами имеет большое значение. Обе экспериментальные структуры идентифицируют одну из молекул воды вблизи боковой цепи Asp303/647 и недалеко от фосфатной группы субстрата, показанной на рис. 2. Однако авторы исследований [1, 2, 4] не приписывают ей роль реакционного агента. Вместо этого предполагается, что оба иона металла вовлечены в активацию (другой) каталитической молекулы воды, из которой образуется нукле-офильный гидроксил-анион OH-. По нашим расчетным данным, сценарий химических преобразований должен быть иным.

На рис. 3 показано расположение частиц в активном центре. Реакционная молекула воды (рис. 2, 3) ориентирована одним ионом металла (Mg2), боковой цепью Glu359/703 и другими молекулами воды (не показанными на рисунках), образующими сетку водородных связей.

Конфигурация О(1№а0-Р-О-Ч(Л8п239/584) достаточно характерна для реакций гидролиза нуклео-зидфосфатов [8, 9]. Можно ожидать, что качественно механизм реакции раскрытия цикла будет похож на механизм гидролиза ц-ГМФ и ц-ди-ГМФ в водном растворе [10, 11]. При приближении молекулы воды к фосфатному центру будет образовываться интермедиат с пентакоординированным фосфором с передачей протона от воды на акцептор по сетке водородных связей. Последующее перераспределение протонов по цепи обеспечит разрыв связи Р-О и формирование продуктов реакции гидролиза. Следует отметить, что расстояние О^а1:)-Р в белковой матрице (2.89 А) заметно меньше, чем в кластере молекул воды [10] (3,20 А), что должно коррелировать с каталитическим эффектом фермента по отношению к водному раствору.

Таким образом, по результатам расчетов методом КМ/ММ построена модель фермент-субстратного комплекса БЛЬ-домена фосфодиэстеразы с ц-ди-ГМФ, хорошо согласующаяся с кристаллическими структурами фосфодиэстераз белков Б1гР1 [1] и ТЬ^265 [2] с высокой ферментативной активностью. Анализ расположения молекулярных групп в равновесной геометрической конфигурации модельной

Рис. 2. Структура активного центра БЛЬ-домена с ц-ди-ГМФ. Расстояния приведены в А; верхнее значение относится к расчетным результатам, нижние значения - к экспериментальным данным. Ука -зана нумерация аминокислотных остатков в структурах РББ1±30в0 (до косой черты) и РББ1±3ШТ (после косой черты); таким же способом на рисунке приведены расстояния в кристаллографических

структурах

Рис. 3. Расположение молекулярных групп в активном центре фермент-субстратного комплекса БЛЬ-домена с ц-ди-ГМФ. Расстояния приведены в А

системы подсказывает перспективный механизм реакции гидролиза.

При написании данной статьи использованы работы, поддержанные РФФИ (проект 13-03-00210-а).

Авторы выражают благодарность суперкомпьютерным центрам МГУ имени М.В. Ломоносова и РАН за возможность использовать вычислительные ресурсы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Barends T. R., Hartmann E., Griese J. J., et al. // Nature (London). 2009. 459. P. 1015.

2. Tchigvintsev A., Xu X., Singer A., et al. // Mol. Biol. 2010. 402. P. 524.

3. Ko-Hsin C., Wei-Ting K., Yu-Jen Yu et al. // Acta Cryst. 2012. D68. P. 1380.

4. Tarnawski M., Barends T.R.M., Hartmann E., et al. // Acta Cryst. 2013. D69. P. 1045.

5. WarshelA., LevittM. // J. Mol. Biol. 1976. 103. P. 227.

6. Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Topol I.A., et al. // J. Phys. Chem. A. 2002. 106. P. 10663.

7. Nemukhin A.V., Grigorenko B.L., Topol I.A., et al. // J. Com-put. Chem. 2003. 24. P. 1410.

8. Grigorenko B.L., Rogov A.V., Topol I.A. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. 104. P.7057.

9. Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Лущекина С.В., и др. // Усп. хим. 2012. 81. С. 1011.

10. Андрийченко Н.Н., Хренова М.Г., А.В.Немухин, и др. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2011. 52. С. 277.

11. Morozov D., Khrenova M., Andrijchenko N., et al. // Com-put. Theor. Chem. 2012. 983. P. 88.

Поступила в акцию 12.11.13..

STRUCTURE OF THE ENZYME-SUBSTRATE COMPLEX FOR THE CATALYTIC DOMAIN OF PHOSPHODIESTERASES WITH THE CYCLIC DIGUANOSINE MONOPHOSPHATE

Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Khrenova M.G., Novichkova D.A.

The full-atom three-dimentional structure of the enzyme-substrate complex for the catalytic domain of phosphodiesterases with the cyclic diguanosine monophosphate is constructed by results of the combined quantum mechanical - molecular mechanical (QM/MM) simulations.

Key words: cyclic diguanosine monophosphates, phosphodiesterases, QM/MM method.

Сведения об авторах: Григоренко Белла Людвиговна - вед. науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ, докт. физ.-матем. наук (bell_grig@yahoo. com); Немухин Александр Владимирович - профессор кафедры физической химии химического факультета МГУ, лаборатория химической кибернетики, докт. хим. наук (anemukhin@yahoo.com); Хренова Мария Григорьевна - науч. сотр. лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии химического факультета МГУ, канд. физ.-матем. наук (wasabiko13@gmail.com); Новичкова Дана Александровна - аспирант химического факультета МГУ (dana.novichkova@gmail.com).