БИБЛИОТЕКИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИПЕПТИДОВ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ ПОЛИПЕПТИДОВ С ЕСТЕСТВЕННЫМ РАЗНООБРАЗИЕМ

1. Способ получения коллекции нуклеиновых кислот, где каждая нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен иммуноглобулина человека, содержащий совокупность последовательностей гипервариабельного участка 3 (CDR3), выделенных по отдельности из репертуара вариабельных доменов иммуноглобулинов млекопитающих.
2. Способ получения коллекции нуклеиновых кислот, где каждая нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен иммуноглобулина человека, содержащий совокупность последовательностей гипервариабельного участка 3 (CDR3), выделенных по отдельности из репертуара вариабельных доменов иммуноглобулинов млекопитающих, отличных от человека.
3. Способ получения коллекции нуклеиновых кислот, где каждая нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен иммуноглобулина человека, содержащий совокупность последовательностей гипервариабельного участка 3 (CDR3), выделенных по отдельности из репертуара вариабельных доменов иммуноглобулинов человека.
4. Способ по пп.1, 2 или 3, который включает:
(a) получение совокупности последовательностей нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка, кодирующих разные вариабельные домены иммуноглобулина человека, где каждая последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит первый каркасный участок (FR1), второй каркасный участок (FR2), третий каркасный участок (FR3) и четвертый каркасный участок (FR4), причем участки FR1 и FR2 разделены гипервариабельным участком 1 (CDR1), участки FR2 и FR3 разделены гипервариабельным участком 2 (CDR2), а участки FR3 и FR4 разделены "лишней" последовательностью нуклеиновых кислот, содержащей по меньшей мере два участка распознавания ферментами рестрикции типа IIs, разделенные произвольной последовательностью нуклеиновых кислот;
(b) получение совокупности диверсифицированных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности гипервариабельного участка 3 (CDR3), выделенных из репертуара иммуноглобулинов млекопитающих, где каждая из совокупности диверсифицированных последовательностей нуклеиновых кислот содержит на каждом конце участок распознавания ферментом рестрикции типа IIs;
(c) расщепление каждой последовательности из совокупности последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих участки CDR3, с помощью фермента рестрикции типа IIs, который связывается с участком распознавания ферментом рестрикции типа IIs, указанным на стадии (b), и отщепление "лишней" последовательности нуклеиновых кислот, указанной на стадии (a), от акцепторного каркасного участка с помощью фермента рестрикции типа IIs, который связывается с участком распознавания ферментом рестрикции типа IIs, указанным на стадии (a); и
(d) лигирование расщепленных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих участки CDR3 или аминокислотные последовательности, указанные на стадии (c), в расщепленный акцепторный каркасный участок, указанный на стадии (c), так, чтобы участки FR3 и FR4 были разделены последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими участок CDR3 или аминокислотные последовательности, которые могут выполнять роль участка CDR3, с восстановлением полноразмерной последовательности, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина, которая не содержит участки распознавания ферментами рестрикции типа IIs, указанные на стадиях (a) и (b).
5. Способ по п.4, где стадию (b) проводят путем амплификации последовательности CDR3 млекопитающих с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих участок рестрикции типа IIs.
6. Способ по п.5, где олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы повысить совместимость последовательности CDR3 млекопитающего и акцепторного каркасного участка, кодирующего вариабельный домен иммуноглобулина человека.
7. Способ по п.6, где олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы модифицировать последовательность нуклеиновых кислот на границе последовательности CDR3 млекопитающих с получением совместимой липкой нуклеотидной последовательности в акцепторном каркасном участке, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина человека.
8. Способ по п.5, где стадию (b) проводят путем амплификации последовательностей CDR3 отличных от человека видов с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих участок рестрикции FokI IIs.
9. Способ по п.2, где отличные от человека виды включают отличных от человека приматов, грызунов, собак, кошек, овец, коз, крупный рогатый скот, лошадей, членов семейства Camelidae, лам, верблюдов, одногорбных верблюдов или свиней.
10. Способ по п.4, где участки распознавания ферментами рестрикции типа IIs, указанные на стадии (a) и на стадии (b), распознаются разными ферментами рестрикции типа IIs.
11. Способ по п.10, где участки распознавания ферментами рестрикции типа IIs представляют собой участки распознавания BsmBI, участки распознавания BsaI, участки распознавания FokI или их сочетания.
12. Способ по п.4, где диверсифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности CDR3, кодируют последовательности CDR3 тяжелой цепи (CDRH3).
13. Способ по п.4, где диверсифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности CDR3, кодируют последовательности CDR3 легкой цепи (CDRL3).
14. Способ по п.4, где последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит последовательность гена вариабельного домена тяжелой цепи человека, выбранного из VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 и VH5-51.
15. Способ по п.4, где последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит последовательность гена вариабельного домена легкой цепи каппа человека.
16. Способ по п.15, где последовательность гена вариабельного домена легкой цепи каппа человека может быть выбрана из VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 и VK3-20.
17. Способ по п.4, где последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит последовательность гена вариабельного домена легкой цепи лямбда человека.
18. Способ по п.17, где последовательность гена вариабельного домена легкой цепи лямбда человека может быть выбрана из VL1-44 и VL1-51.
19. Способ по п.4, где совокупность последовательностей нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка включает смесь по меньшей мере одной последовательности нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и по меньшей мере одной последовательности нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка вариабельного домена легкой цепи.
20. Способ по п.4, дополнительно включающий следующие стадии: (e) клонирование библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулина, указанные на стадии (d), в векторе экспрессии и (f) трансформацию клетки-хозяина вектором экспрессии, указанным на стадии (e), и культивирование клетки-хозяина в условиях, достаточных для экспрессии совокупности кодируемых библиотекой вариабельных доменов иммуноглобулина.
E.coli
21. Способ по п.20, где клетка-хозяин представляет собой .
22. Способ по п.20, где вектор экспрессии представляет собой фагмидный или фаговый вектор.
23. Способ получения коллекции нуклеиновых кислот, где каждая нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен иммуноглобулина человека, содержащий совокупность последовательностей гипервариабельного участка 3 (CDR3), выделенных по отдельности из вариабельных доменов иммуноглобулинов иммунизированного отличного от человека млекопитающего.
24. Способ по п.23, включающий следующие стадии:
(a) получение совокупности последовательностей нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка, кодирующих разные вариабельные домены иммуноглобулина человека, где каждая последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит первый каркасный участок (FR1), второй каркасный участок (FR2), третий каркасный участок (FR3) и четвертый каркасный участок (FR4), причем участки FR1 и FR2 разделены гипервариабельным участком 1 (CDR1), участки FR2 и FR3 разделены гипервариабельным участком 2 (CDR2), а участки FR3 и FR4 разделены "лишней" последовательностью нуклеиновых кислот, содержащей по меньшей мере два участка распознавания ферментами рестрикции типа IIs, разделенные произвольной последовательностью нуклеиновых кислот;
(b) получение совокупности диверсифицированных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности гипервариабельного участка 3 (CDR3), выделенные из иммунизированного отличного от человека млекопитающего, где каждая из совокупности диверсифицированных последовательностей нуклеиновых кислот содержит на каждом конце участок распознавания ферментом рестрикции типа IIs;
(c) расщепление каждой последовательности из совокупности последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих участки CDR3, с помощью фермента рестрикции типа IIs, который связывается с участком распознавания ферментом рестрикции типа IIs, указанным на стадии (b), и отщепление "лишней" последовательности нуклеиновых кислот, указанной на стадии (a), от акцепторного каркасного участка с помощью фермента рестрикции типа IIs, который связывается с участком распознавания ферментом рестрикции типа IIs, указанным на стадии (a); и
(d) лигирование расщепленных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих участки CDR3 или аминокислотные последовательности, указанные на стадии (c), в расщепленный акцепторный каркасный участок, указанный на стадии (c), так, чтобы участки FR3 и FR4 были разделены последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими участок CDR3 или аминокислотные последовательности, которые могут выполнять роль участка CDR3, с восстановлением полноразмерной последовательности, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина, которая не содержит участки распознавания ферментами рестрикции типа IIs, указанные на стадиях (a) и (b).
25. Способ по п.24, где стадию (b) проводят путем амплификации последовательности CDR3 иммунизированного отличного от человека млекопитающего с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих участок рестрикции типа IIs.
26. Способ по п.25, где олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы повысить совместимость последовательности CDR3 млекопитающего с акцепторным каркасным участком, кодирующим вариабельный домен иммуноглобулина человека.
27. Способ по п.26, где олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы модифицировать последовательность нуклеиновых кислот на границе последовательности CDR3 млекопитающих с получением липкой нуклеотидной последовательности, совместимой с акцепторным каркасным участком, кодирующим вариабельный домен иммуноглобулина человека.
28. Способ по п.25, где стадию (b) проводят путем амплификации последовательности CDRH3 отличного от человека млекопитающего с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих участок рестрикции FokI IIs.
29. Способ по п.24, где отличные от человека млекопитающие включают отличных от человека приматов, грызунов, собак, кошек, овец, коз, крупный рогатый скот, лошадей, лам, верблюдов, одногорбных верблюдов или свиней.
30. Способ по п.24, где участки распознавания ферментами рестрикции типа IIs, указанные на стадии (a) и на стадии (b), распознаются разными ферментами рестрикции типа IIs.
31. Способ по п.30, где участки распознавания ферментами рестрикции типа IIs представляют собой участки распознавания BsmBI, участки распознавания BsaI, участки распознавания FokI или их сочетания.
32. Способ по п.24, где диверсифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности CDR3, кодируют последовательности CDR3 тяжелой цепи (CDRH3).
33. Способ по п.24, где диверсифицированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности CDR3, кодируют последовательности CDR3 легкой цепи (CDR L3).
34. Способ по п.24, где последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит последовательность гена вариабельного домена тяжелой цепи человека, выбранную из VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 и VH5-51.
35. Способ по п.24, где последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит последовательность гена вариабельного домена легкой цепи каппа человека.
36. Способ по п.35, где последовательность гена вариабельного домена легкой цепи каппа человека может быть выбрана из VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 и VK3-20.
37. Способ по п.24, где последовательность нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит последовательность гена вариабельного домена легкой цепи лямбда человека.
38. Способ по п.37, где последовательность гена вариабельного домена легкой цепи лямбда человека может быть выбрана из VL1-44 и VL1-51.
39. Способ по п.24, где совокупность последовательностей нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка содержит смесь по меньшей мере одной последовательности нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и по меньшей мере одной последовательности нуклеиновых кислот акцепторного каркасного участка вариабельного домена легкой цепи.
40. Способ по п.24, дополнительно включающий следующие стадии: (e) клонирование библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулина, указанные на стадии (d), в векторе экспрессии и (f) трансформация клетки-хозяина вектором экспрессии, указанным на стадии (e), и культивирование клетки-хозяина в условиях, достаточных для экспрессии совокупности кодируемых библиотекой вариабельных доменов иммуноглобулина.
E.coli
41. Способ по п.40, где клетка-хозяин представляет собой .
42. Способ по п.40, где вектор экспрессии представляет собой фагмидный или фаговый вектор.