СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОЙ СТАБИЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ
METHOD OF PRODUCING LIQUID STABLE WHEY

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии, а именно к получению жидкой стабильной шигеллезной сыворотки, которая может быть использована для постановки реакции пассивной гемагпотинации (РПГА), а также в реакции агглютинации (РА). Изобретение может быть также использовано для получения набора для выявления специфических антител к различным видам шигелл в сыворотке крови человека в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Шигеллы (лат. Shigella) - род грамотрицательных палочковидных бактерий, не образующих спор. Для человека и приматов являются возбудителями болезней из группы шигеллезов. Шигеллы хорошо растут на обычных питательных средах; при разрушении микробных клеток выделяется эндотоксин, который играет большую роль в патогенезе такой болезни, как дизентерия, и обусловливает клинические проявления. Кроме того, шигеллы продуцируют несколько видов экзотоксина: цитотоксин, повреждающий мембраны эпителиальных клеток; энтеротоксины, усиливающие секрецию жидкости и солей в просвет кишки; нейротоксин, обнаруживаемый в основном у бактерий Григорьева-Шига (Sh. dysenteriae серовара 1). В современных условиях наибольшее распространение имеют шигеллы Флекснера и Зонне.
Лабораторное подтверждение дизентерии проводится бактериологическим и серологическим методами. Бактериологический метод (высев шигелл из испражнений) при 3-кратном исследовании обеспечивает подтверждение диагноза у 40-60% больных.
Ускоренная диагностика острых кишечных диарейных инфекций может осуществляться без выделения чистых культур по обнаружению антигенов возбудителей и их токсинов в биосубстратах - слюне, моче, копро-фильтратах, крови. С этой целью используют иммунологические методы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью: иммуно-ферментный анализ (ИФА), реакция агглютинации латекса (РАЛ), реакции коагтлютинации (РКА), иммунофлуоресценции (РИФ), полимеразной цепной реакции (ПНР). В патентной литературе описаны способы диагностики дизентерии (см., например, SU 833211, SU 971269, SU 1651139).
Для выявления антител к шигеллам в лабораторной практике используется реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) (Каральник Б.В. Эритроциртарные диагностикумы, М.: Медицина, 1976).
Агглютинация подразделяется на прямую (активную) и непрямую (пассивную). Феномен прямой (активной) агглютинации реализуется при специфическом взаимодействии узнающих антител с собственными структурными антигенами мембран эритроцитов или бактериальных клеток.
В последние годы широкое распространение получили эритроцитарные диагностикумы из шигелл Зонне и Флекснера, с помощью которых в реакции пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА) определяют наличие антител у больных и переболевших. В настоящее время выпускается для РПГА несколько видов эритроцитарных диагностикумов (из шигелл Зонне, Флекснера, Флекснера-6, дизентерии-1, дизентерии-2 и т.д.). Реакцию ставят с парными сыворотками в соответствии с рекомендациями к указанным диагностическим препаратам. Диагностически достоверным показателем, подтверждающим заболевание, является увеличение титра антител не менее чем в 8 раз.
В настоящее время для постановки реакции РПГА, так же как и для постановки реакции агглютинации (РА), сухая лиофильно высушенная шигеллезная сыворотка требует разведения, например, раствором хлорида натрия. Однако полученный разведенный раствор имеет маленький срок хранения. В лабораториях обычно используется лишь малая часть сыворотки из вскрытой ампулы. Большую часть приходится утилизировать, поскольку в разведенном состоянии сыворотка быстро теряет свою специфическую активность. Таким образом, на настоящий момент существует задача сохранения функциональной активности антител сывороток, т.е. способности к специфическому взаимодействию с соответствующим антигеном при длительном их нахождении в водных растворах.
Ранее были предприняты попытки по увеличению срока годности сывороток. Так, в автореферате Михайловой В.А. «Разработка технологии получения кроличьей холерной агглютинизирующей О-сыворотки», Иркутск, 1998, был изложен способ стабилизации кроличьей холерной О-сыворотки с целью повышения срока ее годности. При поиске стабилизатора диагностических сывороток были исследованы вещества, известные своим стабилизирующим действием на молекулы иммуноглобулинов, прежде всего многоатомные спирты (сорбит), углеводы (сахароза) и аминокислоты (цистеин, глутамин). В качестве стабилизатора испытаны также тиосульфат натрия и глутатион - исходя из предположения, что эти вещества как антиоксиданты могут предотвратить свободнорадикальное окисление.
В результате сравнительных исследований установлено, что наилучший стабилизирующий эффект оказывает смесь сахарозы (в концентрации от 2.2 до 3.0%) и тиосульфата натрия (от 0.75 до 1.0%). Оба компонента стабилизатора растворяют в 0.9% растворе хлористого натрия и вносят в сыворотку в соотношении, зависящем от специфической активности сыворотки. Сыворотку с титром антител 1:3200 и выше разводят 3:1 стабилизатором, содержащим 9% сахарозы и 3% тиосульфата натрия, с титром антител не ниже 1:1600-12:1 раствором, содержащим 30% сахарозы и 10% тиосульфата натрия. Конечное содержание стабилизирующих веществ в сыворотке в обоих случаях было одинаково: 3% - сахарозы и 1% - тиосульфата натрия. В результате стабильность экспериментальной сыворотки была выше, чем у контрольной, в 5 и более раз. Кроме того, сахароза и тиосульфат натрия значительно улучшали растворимость препарата. На специфическую активность и растворимость оказывала влияние остаточная влажность препарата: наиболее стабильными были холерные агглютинирующие О-сыворотки с остаточной влажностью не более 2.0-2.2%.
Авторами же настоящего изобретения было обнаружено, что можно получить жидкую сыворотку с длительным сроком хранения вплоть до 3 лет с сохранением ее функциональной активности. Таким образом, получение такой сыворотки позволяет в любой момент времени иметь уже готовую к использованию сыворотку, сократить расход используемых материалов, исключить из стадии получения трудоемкую и энергозатратную стадию лиофильной сушки, что значительно упрощает и удешевляет процесс получения сыворотки.
Это также приводит к упрощению проведения реакции агглютинации, поскольку жидкие сыворотки не требуют стадии разведения сухой сыворотки раствором для разведения.
Таким образом, технический результат заключается в сохранении функциональной активности антител сыворотки при длительном нахождении в водном растворе, что приводит также и к упрощению способа получения сыворотки, а также к упрощению проведения реакции агглютинации.
Технический результат достигается тем, что в качестве основного разводящего и стабилизирующего раствора исходной жидкой адсорбированной сыворотки использовали растворы, содержащие
1) полиглюкин (ПГ) - международное непатентованное название - декстран (ср. мол. масса 50000-70000) (крупномолекулярный стабилизатор антител) - 60 г; натрия хлорид - 9 г, вода для инъекций - до 1 л; прозрачная бесцветная или слегка желтоватая жидкость, и азид натрия в конечной концентрации 0.2%.
2) красгемодез 8000 (ГД) - поливинилпирролидон низкомолекулярный 8000±2000) 60,00 г, натрия хлорид 5,5 г, калия хлорид 0,42 г; кальция хлорид гексагидрат - 0,5 г, магния хлорид гексагидрат - 0,005 г, натрия гидрокарбонат - 0,23 г, вода для инъекций - до 1 л, прозрачная жидкость светло-желтого или желтого цвета, азид натрия в конечной концентрации 0.2% и сорбит в конечной концентрации 0.2%.
Известно, что полиглюкин и красгемодез используют в качестве криопротектров при лиофильном высушивании препаратов, поскольку они оказывают защитное действие на белковые молекулы (см., например, RU 2326655, 20.06.2008, RU 2214836, 27.10.2003, RU 2236866, 27.09.2004).
При этом в уровне техники не описана возможность использования полиглюкина и красгемодеза 8000 для придания сохранения свойств входящих в состав сывороток антител при нахождении их в водном растворе.
Таким образом, изобретение представляет собой:
1. Набор для выявления специфических антител к различным видам шигелл в сыворотке крови, включающий:
- диагностикум эритроцитарный шигеллезный, представляющий собой взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из шигелл в буферном растворе,
- стабильную жидкую сыворотку диагностическую шигеллезную, полученную путем разведения жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации или красгемодезом 8000, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0.2% сорбита в конечной концентрации,
- взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана,
- планшет для иммунологических реакций.
2. Способ получения стабильной жидкой сыворотки диагностической шигеллезной, включающий разведение жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации или красгемодезом 8000, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0.2% сорбита в конечной концентрации.
3. Стабильную жидкую сыворотку диагностическую шигеллезную, полученную способом, включающим разведение жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации или красгемодезом 8000, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации и 0.2% сорбита в конечной концентрации.
4. Применение стабильной жидкой сыворотки по п. 3 в реакции агглютинации (РА).
5. Применение стабильной жидкой сыворотки по п. 3 в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Изобретение осуществляется следующим способом.
Были приготовлены разводящие растворы для сыворотки.
В 6%-ный полиглюкин был внесен азид натрия в конечной концентрации 0.2%.
В красгемодез 8000 был внесен сорбит в конечной концентрации 0.2% и азид натрия в конечной концентрации 0.2%.
Исходную жидкую адсорбированную шигеллезную сыворотку разбавляют раствором, полученным внесением в полиглюкин 0.2% азида натрия, или раствором, полученным внесением в красгемодез 8000 0.2% сорбита и 0.2% азида натрия.
В качестве дополнительных стабилизаторов были использованы - лс-18 - 0,2%, сорбит 2% (для полиглюкина), глицин 0,2%, глютатион 0,2%, тиосульфат натрия 0,2 и 0,4% (в дальнейшем от использования тиосульфата натрия отказались в связи с резким снижением активности сывороток).
Степень разведения сывороток зависит от того, какая сыворотка используется в качестве исходной и для какой реакции (РА или РПГА). Однако вне зависимости от степени разведения сыворотки использование в качестве стабилизирующего и разводящего раствора полиглюкина с 0.2%-ным азидом натрия или раствора красгемодеза 8000 с 0.2%-ным сорбитом и 0.2%-ным азидом натрия позволяет получить жидкую стабильную в течение трех лет диагностическую сыворотку.
Полученные сыворотки были проверены по показателю специфическая активность в реакции РПГА с использованием шигеллезных диагностикумов, производимых ООО «Био-Диагностика» - Зонне; Флекснер 1-5, Флекснер 6 в разведении 1/10 и 1/100 ив реакции РА без разведения с использованием тест штаммов - Shigella Sonnei №5063, Sh.Flexneri 1в №1818, Sh.Flexneri 2а №1605, Sh.Flexneri 3а №2167, Sh.Flexneri 4а №1359, Sh.Flexneri 5 №207, Sh.Flexneri 6 №281.
Были исследованы сыворотки в различных вариантах, а именно:
1. ПГ без добавок
6. ГД без добавок
2. ПГ+лс-18 0,2%
7. ГД+лс-18 0,2%
3. ПГ+ сорбит 2%
8. ГД+ сорбит 2%
4. ПГ+ глютатион 0,2%
9. ГД+ глицин 0,2%
5. ПГ+ глицин 0,2%
В процессе хранения все сыворотки проверялись в реакциях РПГА и РА. В РПГА все сыворотки использовались в разведении 1/10. В РА сыворотки использовали без разведения.
Реакция РА.
Когда бактериальная культура смешивается с антисывороткой, специфичной строго к компонентам поверхности клеток бактерий, клетки скрепляются вместе благодаря взаимодействию антиген-антитело и формируют агрегаты (происходит агглютинация). Обычно данную реакцию можно наблюдать невооруженным глазом в виде хлопьев в суспензии. Благодаря смешиванию специфичной антисыворотки с культурой микроорганизмов происходит идентификация определяемых антигенов (например, О и Н). На основе наблюдаемой агглютинации образца серотип определяется по схеме Кауффманна-Уайта.
Реакция протекает следующим образом.
1. Готовят клетки микроорганизмов для постановки реакции. Суспензию обезвреженных клеток микроорганизмов разводят физиологическим раствором (0.9% NaCl, рН=6.5-7.2) до концентрации 20-40 МЕ/мл (используя стандарт мутности МакФарланда). Либо исследуемую культуру берут бактериологической петлей, добавляют в лунку планшета к раствору для разведения и растирают ее до получения однородной суспензии бежево-белого цвета мутностью от 20 до 40 МЕ/мл.
2. Используют сыворотку для реакции, учитывая титр антител (если известен). Исходная сыворотка разводится таким образом, чтобы минимальный титр составлял не менее 1/80. То есть при использовании исходной сыворотки с титром 1/320 развести необходимо будет в 4 раза:
k=t/80, где k - коэффициент разведения, t - титр исходной сыворотки.
Исходную жидкую адсорбированную шигеллезную сыворотку разводят раствором, полученным внесением в полиглюкин 0.2% азида натрия, или раствором, полученным внесением в красгемодез 8000 0.2% сорбита и 0.2% азида натрия.
3. В центр лунки 8-луночного планшета для реакции агглютинации вносится 50 мкл исследуемой культуры и рядом 50 мкл разведенной сыворотки. Капли соединяют, наклоняя планшет. Реакцию определяют визуально в течение 2-6 минут. При развитии реакции агглютинации происходит выпадение агрегатов клеток с антителами, при этом раствор становится более прозрачным.
Учет реакции проводится по четырехкрестной системе:
(4+) - отчетливый агглютинат при полном просветлении жидкости
(3+) - отчетливый агглютинат на фоне мутноватой жидкости
(2+) - незначительный агглютинат на фоне мутной жидкости
(1+) - незначительное количество агглютината на фоне мутной жидкости
(-) - признаков агглютинации нет. Однородная мутная жидкость.
Положительной считается реакция агглютинации интенсивностью не менее чем на (3+).
Реакция РПГА.
Принцип РПГА заключается в том, что при специфическом взаимодействии антител к различным видам шигелл исследуемой сыворотки крови с антигенами, фиксированными на поверхности индикаторных эритроцитов, наблюдается их характерная агглютинация.
Реакция РПГА проводится в соответствии с рекомендациями используемого диагностикума. В состав набора для диагностики входят:
- диагностикум эритроцитарный шигеллезный, представляющий собой взвесь формалинзированных эритроцитов барана, сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из шигелл в буферном растворе,
- стабильная сыворотка диагностическая шигеллезная, полученная путем разведения жидкой адсорбированной сыворотки 6% полиглюкином, содержащим 0.2% азида натрия в конечной концентрации или красгемодезом 8000, содержащим 0.2% сорбита в конечной концентрации и 0.2% азида натрия в конечной концентрации,
- взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана,
- планшет для иммунологических реакций.
Учет РПГА проводится по четырехкрестной системе:
(4+) - все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки в виде "зонтика"
(3+) - агглютинированы почти все эритроциты, на фоне их имеется малозаметное кольцо из осевших неагглютинированньгх эритроцитов
(2+) - наряду с равномерным агглютинатом на дне лунки имеется осадок в виде маленького "колечка" или "пуговки"
(1+) - большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в виде маленького "колечка" в центре дна лунки
(-) - признаков агглютинации нет. Эритроциты осели в виде "пуговки" или "колечка"
Результаты исследований представлены в таблице 1.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что все шигеллезные сыворотки рекомендовано разбавлять полиглюкином без добавок, т.е только с натрия азидом 0,2% или гемодезом с сорбитом 0.2% и азидом натрия 0.2%. Это позволяет сделать сыворотку в жидком виде стабильной в течение длительного времени (до трех лет).
Добавка глютатиона приводит к наибольшему снижению титра в РПГА и замедлению реакции РА. Присутствие сорбита в ПГ также приводит к замедлению РА. Использование ГД с сорбитом незначительно влияет на стабильность сыворотки и, учитывая то, что ГД имеет сложный солевой состав, для разведения сыворотки был выбран вариант ПГ без добавок.
Таким образом, в результате осуществления изобретения было подтверждено, что можно получить жидкую сыворотку с длительным сроком хранения вплоть до 3 лет с сохранением ее функциональной активности.