Способ восстановления диафизов длинных трубчатых костей с применением клеточных технологий
METHOD FOR RESTORATION OF DIAPHYSIS OF LONG TUBULAR BONES USING CELLULAR TECHNOLOGIES

Область техники
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, экспериментальной хирургии, стоматологии, пластической хирургии, травматологии и ортопедии.
Уровень техники
Восстановление дефекта кости, в том числе дефекта критического размера, остается одной из главной клинической ортопедической проблемой. Дефекты кости критического размера технически определены как те, которые не заживают спонтанно естественным путем. Критический дефект может возникать как в случае случайного события (травма, остеомиелит), вынужденной хирургической операции (опухоли), так и преднамеренно (экспериментальные исследования на лабораторных животных). Для большинства костей определены размеры критических дефектов, для каждой кости они свои, отличаются как по объему, так и по конфигурации. При наличии критического дефекта восстановление целостности кости путем спонтанной регенерации без искусственного воздействия невозможно.
Костные трансплантаты используются в реконструктивной хирургии для восстановления структурной целостности костей, как составляющих опорно-двигательного аппарата для реализации частного способа костной регенерации - трансплантационной регенерации, а также для повышения остеогенного потенциала регенерирующей соединительной ткани. Потребность в костных трансплантатах возникает для реконструкции скелета, для восстановления целостности костей, при пластических операциях, восстановлениях челюстей в стоматологии, при замещении дефектов на месте костных опухолей, ревизионной артропластике и т. д. В медицине за последнее десятилетие потребность в костной трансплантации увеличилась. Костная трансплантация по частоте востребованности уступает только переливаниям крови.
Аутогенная (аутологичная) костная пластика — процесс, при котором костный материал собирается из одного участка и пересаживается в другой участок у того же пациента. Метод аутотрансплантации фрагментов кости широко применяется в травматологии и ортопедии, челюстно-лицевой хирургии, пластической и реконструктивной хирургии, онкологии, нейрохирургии и др. В настоящее время считается «золотым стандартом» в восстановлении костей, благодаря возможности получения прогнозируемого клинического результата. Однако возможности получения аутотрансплантатов кости в достаточном количестве для замещения обширных костных дефектов весьма ограничены, поэтому поиск заменителей – костнопластических материалов и биоискусственных тканей, способных составить достойную альтернативу аутотрансплантатам, продолжается. Крайне важно сохранять жизнеспособность костных трансплантатов, так как при свободной трансплантации нарушается их кровоснабжение, часто происходит лизис костных трансплантатов, и эта проблемная сторона недостаточно исследована.
Известен подход для защиты костных трансплантатов от лизирования. Так называемая, техника Masquelet, включающая индукцию фиброзной тканевой мембраны вокруг места дефекта кости с использованием реакции организма на инородное тело на присутствие спейсера из полиметилметакрилата (ПММА). Целью этого исследования было изучить свойства и характеристики этой индуцированной мембраны и ее эффективность при использовании в сочетании с аллотрансплантатом или смесью аллотрансплантат/аутотрансплантат в качестве наполнителя в модели дефекта критического размера у овец. Было обнаружено, что полученная в результате индуцированная мембрана эффективна для удержания привитых материалов на месте. Было продемонстрировано, что это организованная псевдосиновиальная мембрана, которая экспрессирует костный морфогенный белок 2 (BMP2), трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор фон Виллербранда (vWF), интерлейкин 6 (IL-6) и интерлейкин 8 (IL-8). Хотя через 12 недель в экспериментальных группах наблюдался больший рост новой кости по сравнению с контрольными животными, объемы статистически не различались, и дефекты полностью не перекрывались. Было показано, что из двух групп трансплантата смесь аллотрансплантат/аутотрансплантат имеет более высокую скорость резорбции трансплантата, чем группа только аллотрансплантата. Хотя метод Masquelet оказался эффективным в производстве мембраны, закрывающей материалы трансплантата, его способность помогать в заживлении сегментарных дефектов критического размера по сравнению с пустыми контролями оставалась неубедительной. Хотя через 12 недель в экспериментальных группах наблюдался больший рост новой кости по сравнению с контрольными животными, объемы статистически не различались, и дефекты полностью не восстанавливались. Было показано, что из двух групп трансплантата смесь аллотрансплантат/аутотрансплантат имеет более высокую скорость резорбции трансплантата, чем группа только аллотрансплантата (Christou C., Oliver R. A., Yu Y., Walsh W. R. The Masquelet Technique for Membrane Induction and the Healing of Ovine Critical Sized Segmental Defects/ PLoS One. 2014; 9(12): e114122.  Published online 2014 Dec 2. doi: 10.1371/journal.pone.0114122).
Для заполнения костного дефекта может быть использована остеокондуктивная и остеоиндуктивная матрица естественного или искусственного происхождения, которая, являясь временным каркасом (аллогенная, ксеногенная губчатая или кортикальная кость, разнообразные костнопластические материалы), поддерживает врастание костного регенерата со стороны живой кости; может являться носителем остеоиндуктивных цитокинов, которые стимулируют и поддерживают деление камбиальных клеток соединительной ткани, их дифференцировку в направлении скелетных тканей, и в целом костную дифференцировку клеток регенерата. Остеогенные клетки (остеобласты и их предшественники), способны формировать кость, если помещены в подходящую локальную среду регенерации.
Важно отметить, что искусственный материал для замещения костных дефектов должен обладать набором определенных свойств, в частности, биоинертностью. Биоинертность – способность материала в течение длительного времени сохранять постоянство своего состава и структуры благодаря отсутствию локального и системного взаимодействия с организмом либо его минимально выраженному химическому, электрохимическому и поверхностно-каталитическому проявлению. К биоинертным материалам относятся металлы, их сплавы, полимеры, корундовая керамика, углерод. Вокруг биоинертных материалов, особенно с гладкой поверхностью, зачастую образуется фиброзная капсула, посредством которой организм защищается от инородного тела. Толщина и клеточный состав капсулы являются своеобразной мерой биосовместимости материала. Следует отметить, что любые импланты способны лишь к временной остеоинтеграции и уступают живой кости.
Многочисленные публикации свидетельствуют, что проблема полноценного восстановления анатомической целостности кости и функциональной состоятельности костной ткани в случае дефекта, в частности, критического размера, остается актуальной.
Раскрытие изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового способа восстановления (заживления) костного дефекта, в частности, дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект).
de novo
Технический результат данного изобретения заключается в разработке нового и эффективного способа восстановления костной и/или хрящевой ткани в области костного дефекта у субъекта, в частности, дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект), позволяющего вырастить костный и/или хрящевой регенерат в области дефекта  на индуцированной псевдосиновиальной мембране с помощью клеточных технологий. Способ по изобретению основан на применении клеточных сфероидов, осажденных на поверхности перфорированной мембраны. При этом указанный способ характеризуется более быстрым периодом восстановления костной и/или хрящевой ткани и является менее ресурсозатратным. Кроме того, для восстановления кости используются сфероиды из аутологичных клеток ростковой зоны надкостницы, которая является источником костной регенерации. Надкостница может быть забрана у самого субъекта в ходе простой амбулаторной операции под местной анестезией. На месте удаленной надкостницы возможна ее полноценная регенерация.
Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа восстановления костной и/или хрящевой ткани в области дефекта кости субъекта, включающего следующие этапы:
- установка временной вставки-спейсера, соответствующей размеру дефекта, в область дефекта кости для формирования индуцированной псевдосиновиальной мембраны;
- удаление временной вставки-спейсера через 7-30 дней после установки и формирования вокруг вставки-спейсера индуцированной псевдосиновиальной мембраны;
- установка перфорированной резорбируемой мембраны с осажденными на её поверхность, адгезированными и частично распластанными клеточными сфероидами из аутологичной надкостницы, причем перфорированная мембрана складывается в виде цилиндра и крепится к надкостнице концов опилов кости с помощью хирургических швов.
В частных вариантах воплощения изобретения резорбируемая мембрана выполнена из биоразлагаемого материала. В частных вариантах воплощения изобретения биоразлагаемый материал выбран из аллогенной, ксеногенной или аутологичной лиофилизированной надкостницы.
В частных вариантах воплощения изобретения мембрана представляет собой коллагеновую барьерную мембрану.
В частных вариантах воплощения изобретения отверстия перфорированной мембраны имеют диаметр 150-350 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения расстояния между центрами отверстий составляет 550-1000 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения отверстия в мембране могут составлять 10-50 % от общей площади поверхности всей мембраны.
В частных вариантах воплощения изобретения при установке перфорированной мембраны с клеточными сфероидами она фиксируется по краям шовными рассасывающимися нитями.
В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды на основе клеток надхрящницы имеют размер 250-450 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.
В частных вариантах воплощения изобретения костный дефект является дефектом трубчатой кости.
В частных вариантах воплощения изобретения временная вставка-спейсер устанавливается в форме цилиндра, препятствующей образованию замыкательных костных пластинок.
В частных вариантах воплощения изобретения полость внутри мембраны заполняется альгинатным гелем.
В дефект вставляется временная вставка-спейсер, повторяющая формы и размеры удаленной кости. Вставка-спейсер сжимается с помощью аппарата внешней фиксации краями костных опилов вокруг открытых костномозговых полостей. Вставка может быть в виде цилиндра, в частности, из костного цемента (полиметилметакрилата - ПММА), гидроксиапатита, силикона или в виде силиконовой полой трубки, подшиваемой к надкостнице.
Операция по удалению вставки-спейсера. В стерильных условиях операционной осуществляется хирургический доступ, проводиться удаление вставки-спейсера, в частности, из костного цемента, под общей анестезией. Индуцированная псевдосиновиальная мембрана рассекается со стороны оперативного доступа для удаления вставки-спейсера в продольном направлении, максимально бережно.
Целью авторов настоящего изобретения является использование этой индуцированной мембраны, основные свойства которой действовать в качестве биологической камеры, которая предотвращает резорбцию трансплантата и секретирует факторы роста, как реципиентной поверхности для клеточной трансплантации. Индуцированная псевдомембрана не только защищает, но и служит источником регенерирующих сосудов и поддержания достаточного парциального давления кислорода для костного трансплантата. Было продемонстрировано, что индуцированная псевдомембрана обильно васкуляризируется многочисленными капиллярами во всех слоях. В то время как высокие концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и трансформирующего фактора роста B (TGF-B) были получены уже на второй неделе, концентрация морфогенетического белка-2 (BMP-2) в мембране была увеличена до самого высокого уровня на четвертой неделе.
in vitro
in vivo
Перфорированная мембрана со сфероидами сворачивается в трубку, соответствующей внутренним размерам индуцированной псевдосиновиальной мембраны, сформированной вокруг вставки-спейсера. Поверхность с пересаженными сфероидами должна плотно прилегать к индуцированной псевдосиновиальной мембране. Перфорированная мембрана по краям подшивается рассасывающимися хирургическими нитями к надкостнице опилов костей. Продольно перфорированная мембрана вдоль сшивается рассасывающимся шовным материалом. Проводится послойное ушивание тканей. В полость, выстланную перфорированной мембраной под давлением с помощью иглы шприца вводиться гель, который обеспечивает плотное прилежание выращенной перфорированной мембраны со сфероидами к индуцированной псевдосиновиальной мембране, сформированной вокруг вставки-спейсера в области дефекта. Этап формирования и роста костного регенерата осуществляется в условиях аппаратной внешней фиксации отломков кости.
Определение и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.
Используемый в данном документе термин «дефект» относится к костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект костей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы. «Критический костный дефект» это повреждение кости, при котором костное сращение невозможно спонтанно, то есть при котором естественным путем кость органотипично с восстановлением своей структуры и анатомической целостности не регенерирует, а открытый костномозговой канал костных отломков часто закрывается замыкательными пластинами.
Дефекты кости критического размера (Critical-sized bone defects, CSBD) определяются как «наименьший костный дефект в конкретной кости и видах животных, который не заживает самопроизвольно в течение жизни животного».
Трансплантационная регенерация – регенерация по трансплантату, стимуляция регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления путем трансплантации тканей, которые в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, создают модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию. Метод трансплантации используют для стимуляции регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления.
Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента. Тканевые (клеточные) сфероиды имеют тканеподобное строение – часто называют трехмерными микротканями, в которых при их производстве максимизированы межклеточные взаимодействия.
Биофабрикация – это процесс искусственного конструирования и выращивания вне организма живых, функциональных тканей или органов для последующей трансплантации пациенту с целью замены или стимуляции регенерации поврежденных органов или тканей, чаще всего с использованием технологии биопечати.
Индуцированная псевдосиновиальная мембрана – это мембрана, индуцированная инородным телом (образованная вокруг вставки-спейсера на месте костного дефекта, представлена соединительнотканным регенератом богатым сосудами), которая обладает способностью консолидировать фрагменты обычного губчатого костного аутотрансплантата, пересаженных для восстановления дефектов длинных костей. Основные свойства мембраны - предотвращать рассасывание костного трансплантата и секретировать факторы роста. Индуцированная мембрана формирует своеобразную биологическую камеру, которая позволяет создавать многочисленные экспериментальные модели реконструкции кости.
2
Альгинатный гель в настоящем документе, в частности, может быть получен способом, описанным в Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D. et al./ In vivo engineering of organs: the bone bioreactor/Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 9;102 (32):11450-5. В частности, гелеобразование может быть инициировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-β1 и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл.
Подробное раскрытие изобретение
Пример осуществления изобретения
Под общим наркозом в стерильных условиях операционной производиться хирургический доступ к большеберцовой кости кролика. С помощью хирургической проволочной пилыДжильи выпиливается часть диафиза кости для формирования костного дефекта критического размера – 3 см. Выпиленная кость в стерильной среде F12 передается в лабораторию клеточных технологий.
Накладывается аппарат внешней фиксации (типа аппарата Илизарова). В область костного дефекта вставляется временная вставка–спейсер из костного цемента цилиндрической формы, повторяющей размеры и форму выпиленной части кости. С помощью аппарата внешней фиксации вставка-спейсер сжимается посредством опилов костей с двух сторон. Производиться послойное ушивание раны с наложением асептической повязки. Животное выводиться из наркоза и содержится в виварии.
С извлеченной части кости в лаборатории производиться забор аутологичной надкостницы. Под надкостницу с помощью шприца вводят стерильный физиологический раствор или питательную среду F12. В виде пленки надкостница снимается с кости. С внутреннего слоя с помощью стерильного скальпеля тщательно соскабливается внутри чашки Петри заполненной F12 внутренний слой надкостницы. Фрагменты надкостницы помещаются в раствор коллагеназы.
2
Для получения первичной культуры выделенные из надкостницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/ F 12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования). Культивирование проводят в течение 24 суток.
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды (выращенные клетки надкостницы в виде суспензии переносятся в 3D Petri Dish из агарозы (агарозных микролунках) (MicroTissues Inc.)).
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 7 суток со сменой питательной культуральной среды каждые 2-3 дня.
Для размещения сфероидов на перфорированной мембране их собирают из лунок и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования.
2
После этого сфероиды помещают в шприц и переносят на перфорированную мембрану, которая находиться в культуральной среде внутри культуральных флаконов (матрасы для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой. У всех флаконов – неадгезивная (необработанная) поверхность дна флакона. Под бинокуляром вручную сфероиды раскладывают над каждым перфорированным отверстием в мембране. Флаконы заполняются питательной средой и помещаются в СО-инкубатор. В течение 3-5 суток клеточные сфероиды прилипают и частично распластываются на этой мембране. Фактически выращивается тканеинженерная конструкция – биоискусственную надкостницу или живой эквивалент надкостницы.
Перфорированная мембрана может быть выполнена из децеллюляризованной аллогенной лиофилизированной надкостницы или материала OSSIX Plus - резорбируемая поперечно-связанная коллагеновая барьерная мембрана для направленной костной (GBR) и тканевой регенерации (GTR), по всей площади мембраны проводится лазерная прошивка отверстий за счет сублимации материала.
Когда живой эквивалент надкостницы (перфорированная мембрана с осажденными сфероидами) готов к трансплантации, проводится удаление вставки-спейсера. В стерильных условиях операционной осуществляется хирургический доступ, проводится удаление вставки из костного цемента, под общей анестезией. Аппарат внешней фиксации ослабляется. Индуцированная псевдосиновиальная мембрана рассекается со стороны оперативного доступа в продольном направлении максимально бережно и вставка-спейсер максимально бережно извлекается из окружающей его соединительнотканной капсулы - индуцированной псевдосиновиальной мембраны.
in vitro
in vivo
Перфорированная мембрана со сфероидами сворачивается в трубку, соответствующей внешним размерам удаленной вставки-спейсера. Поверхность перфорированной мембраны с пересаженными сфероидами должна плотно прилежать к индуцированной псевдосиновиальной мембране. Перфорированная мембрана по краям подшивается рассасывающимися хирургическими нитями к надкостнице опилов костей. Продольно перфорированная мембрана вместе с рассеченной псевдосиновиальной мембраной вдоль сшивается рассасывающимся шовным материалом. Проводиться послойное ушивание тканей. В полость, выстланную перфорированной мембраной, под давлением с помощью иглы шприца вводиться гель, в частности альгинатный, который обеспечивает плотное прилежание выращенной перфорированной мембраны со сфероидами к индуцированной псевдосиновиальной мембране, сформированной  вокруг вставки-спейсера. Указанный гель способствует остеогенезу и временно выполняет функцию заполнения свободного пространства.
Аппарат внешней фиксации остается на весь период наблюдения формирования и роста костного регенерата.
В течение 2 месяцев обнаруживается формирование репаративных регенератов скелетных тканей (гипертрофический хрящ, ретикулофиброзная минерализованная (грубоволокнистая) костная ткань) в области костных дефектов.
Клеточные сфероиды
Сфероиды согласно настоящему изобретению относится к клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных из живых клеток путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. В качестве источника клеток скелетных соединительных тканей для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используются клетки внутреннего слоя надкостницы, являющиеся для скелетных соединительных тканей камбиальной зоной, поставляющей прогениторные и стволовые клетки для физиологической и репаративной регенерации, следовательно, содержащая большее количество прогенеторных клеток. В частных вариантах воплощения изобретения размер таких сфероидов составляет 200-450 мкм. Способ получения таких сфероидов приводится ниже.
Забор клеток надкостницы осуществляется малоинвазивным методом. Проводится местная анестезия кожи, подкожной клетчатки и надкостницы. Через меленький разрез, достигаем надкостницы, с помощью иглы с физиологическим раствором отделяем надкостницу от ребра, наполняем пространство между компактной костью ребра и его надкостницей, а затем аккуратно иссекаем лоскут – надкостницу. Выделение клеток из надкостницы производили путем предварительного механического выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей этого слоя до единичных клеток.
0
2
Для получения первичной культуры выделенные из надкостницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
Субкультивирование монослойной культуры прогениторных клеток скелетных соединительных тканей осуществляют до третьего - четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.
После последнего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 миллионов клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.
Сфероиды формируются в лунках на протяжении до 7 суток со сменой питательной среды каждые 2-3 дня.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.