ТЕРМОСЕНСИБИЛИЗАТОР ДЛЯ ЛАЗЕРНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
THERMAL SENSITISER FOR LASER HYPERTHERMIA AND METHOD FOR PRODUCING IT

Изобретение относится к нанотехнологии новых материалов, предназначенных для использования в биологии, ветеринарии и медицине.
Лазерная гипертермия - способ лечения (удаления) новообразований, основанный на лазерном нагреве опухолей. Для повышения эффективности лазерной гипертермии используются термосенсибилизаторы - вещества, способные эффективно поглощать лазерное излучения и конвертировать его в тепло. Для реальных применений предпочтительными является использование термосенсибилизаторов, поглощающих свет в инфракрасной области (700-1000 нм), где поглощение самих биотканей минимально (Tuchin V.V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnosis. - Bellingham: SPIE Press, 2000 - 942 p.). Известны термосенсебилизаторы инфракрасного диапазона на основе наночастиц различной формы и состава, включая золотые нанооболочки (Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Богатырев В.А., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В. Способ селективного разрушения меланомы. Патент на изобретение №2347563, дата приоритета 21.11.2007, опубликовано 27.02.2009, Бюл. №6), наночастицы фотосенсибилизаторов (Коган Б.Я., Бутенин А.В., Ворожцов Г.Н., Золотавкина Ю.Б., Лукьянец Е.А., Негримовский В.М., Панкратов А.А., Пучнова В.А., Фейзулова Р.К. - Г., Чиссов В.И., Якубовская Р.И. Способ подавления роста опухолей. Патент на изобретение №2339414, дата приоритета 2007.03.27, опубликовано 2008.11.27).
Недостатками этих частиц являются большие геометрические размеры (более 100 нм) и склонность к агрегации, что может служить препятствием для создания лекарственных форм вследствие низкой стабильности коллоидов при хранении.
-4
-3
-3
-6
Наиболее близким к заявляемому решению является индуцированный «зародышами» способ синтеза золотых наностержней с поглощением в инфракрасной области и геометрическими размерами менее 100 нм на основе мягких матриц (Nikoobakht В., El-Sayed M.A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods using seed-mediated growth method // Chem. Mater. - 2003. - V.15. - P.1957-1962.). Синтез золотых наностержней проводится в два этапа, на первом этапе получают золотые сферические наночастицы диаметром 1-3 нм. На втором этапе последовательно смешивают водные растворы цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ), нитрата серебра (НС), золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК), аскорбиновой кислоты (АА) и золотых наночастиц малого диаметра (НЧ) в молярном соотношении компонентов ЦТАБ 1/НС 2-10×10/3ХВК 5×10/АА 5.5×10/НЧ 3×10.
Недостатком способа является плохая воспроизводимость методики синтеза.
Получаемые данным способом термосенсибилизаторы (золотые наностержни) имеют толщину 12-15 нм и длину 30-100 нм, при этом поверхность золотых наностержней покрыта молекулами цетилтриметламмониибромида (ЦТАБ), которые являются потенциально токсичными.
Задачей настоящего изобретения является создание нового класса биосовместимых термосенсибилизаторов на основе золотых наностержней с поглощением в инфракрасной области и геометрическими размерами менее 50 нм.
Технический результат заключается в повышении стабильности и воспроизводимости синтеза золотых наностержней с поглощением в ИК-области прозрачности биотканей, а также снижении токсичности термосенсибилизатора, полученного заявляемым способом.
В предлагаемом решении предлагается способ, отличающийся от известных концентрациями реагентов, рН реакционной смеси и поверхностной функционализацией частиц.
Способ синтеза термосенсибилизатора заключается в следующем. На первом этапе синтезируются золотые сферические частицы диаметром 1-3 нм, которые используются в качестве шаблона для дальнейшего роста несферических частиц. На втором этапе проводится дополнительное восстановления золота аскорбиновой кислотой на частицах в среде цетилтриметиламмоний бромида в кислой среде (рН 1). На третьем этапе молекулы цетилтриметиламмоний бромида на поверхности частиц замещаются на полиэтиленгликоль для снижения биотоксичности золотых наностержней.
-4
-6
-3
-3
-6
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения термосенсибилизатора инфракрасного диапазона, включающий приготовление смеси водных растворов цетилтриметиламмонийбромида, нитрата серебра, золотохлористоводородной кислоты, аскорбиновой кислоты в молярном соотношении: цетиллтриметиламмонийбромид - 1, нитрат серебра - 10×10 25×10, золотохлористоводородная кислота - 5×10, аскорбиновая кислота - 5.5×10, с последующим добавлением золотых сферических наночастиц диаметром 1-3 нм, согласно решению после аскорбиновой кислоты добавляют соляную кислоту в молярном соотношении к цетилтриметиламмонийбромиду 0.1, золотые наночастицы добавляют в молярном соотношении к цетилтриметиламмонийбромиду 25×10, а через временной интервал не менее 24 часов после добавления золотых наночастиц добавляют тиолированный полиэтиленгликоль. Термосенсибилизатор для лазерной гипертермии новообразований, представляющий собой суспензию золотых наностержней, согласно решению стержни выполнены длиной 30-45 нм, толщиной 9-12 нм, и снабжены покрытием из молекул полиэтиленгликоля.
Ниже представлен пример реализации протокола для объема суспензии термосенсибилизатора 100 мл. Способ может быть масштабирован на любой объем образца.
3
4
Используются следующие реактивы: нитрат серебра AgNO (>99.9%, Aldrich, 20.913-9), цетилтриметиламмонийбромид (96%, Fluka, №52370), золотохлористоводородная кислота (HAuCl, >99%, Aldrich), изоаскорбиновая кислота (AsA, >99%, Fluka), боргидрид натрия (Sigma-Aldrich), соляная кислота (ОСЧ, Вектон), поташ (ОСЧ, Реахим), полиэтиленгликоль-тиол (Mw=5000, Nektar), вода очищенная.
Этап 1 - синтез золотых наночастиц малого размера («зародышей»)
4
4
Смешать последовательно 1 мл 0.1 М цетилтриметиламмонийбромида, 25 мкл 10 мМ HAuCl и 100 мкл 10 мМ раствора боргидрида натрия. После добавления HAuCl раствор СТАВ меняет цвет с бесцветного на желтый, после добавления боргидрида натрия цвет немедленно изменяется на бледно-коричневый, что свидетельствует об образовании золотых наночастиц диаметром 1-3 нм. Зародышевый раствор оставляли без перемешивания, не закрывая крышку на 30-120 минут. Зародыши необходимо использовать в экспериментах в указанный промежуток времени, т.к. в дальнейшем происходит их агрегация, которую можно визуально наблюдать по смене цвета суспензии с бледно-коричневого на розовый.
Этап 2 - синтез золотых наностержней
4
К 100 мл 0.1 М раствора цетилтриметиламмонийбромида добавить последовательно 2 мл 4 мМ раствора нитрата серебра, 5 мл 10 мМ раствора HAuCl, 1 мл 100 мМ раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 1 М соляной кислоты, 1 мл золотых наночастиц, полученных на предыдущем этапе. Полученную суспензию выдержать при 28°С в течение 240 часов.
Этап 3 - функционализация полиэтиленгликолем
Суспензию золотых наноетержней, полученных на предыдущем этапе, центрифугировать при 14000 g 1 час. Осадок, содержащий наночастицы, растворить в том же объеме воды. К 100 мл суспензии наночастиц добавить 1 мл 0.2 М раствора поташа и 1 мл 1 мМ раствора тиолированного полиэтиленгликоля. Суспензию выдержать 12 часов при 28°С. Суспензию золотых наностержней, центрифугировать при 14000 g 1 час. Осадок, содержащий термосенсибилизатор, растворить в 100 мл воды. Повторить процедуру центрифугирования-перерастворения 5 раз.
Изобретение поясняется чертежами.
Доказательство успешной реализации предлагаемого решения дано на фиг.1, где приведены электронно-микроскопические изображения полученных наночастиц. Видно, что частицы имеют форму стержня. Анализ электронно-микроскопических изображений показывает, что частицы имеют толщину 10-12 нм и длину 38±5 нм.
Доказательство наличия поглощения термосенсибилизатора в инфракрасной области дано на фиг.2, где представлены спектры оптической плотности (измеренные на спектрофотометре в 2 мм кювете) полученного термосенсибилизатора. Максимум поглощения, соответствует плазменному резонансу наночастиц (800±10 нм).
2
Доказательство фототермического эффекта при облучении фотосенсибилизатора светом инфракрасного диапазона представлено на фиг.3, где приведена кинетика нагрева под действием лазерного излучения (плотность мощности 1 Вт/см, длина волны 810 нм) пробирки эппендорф, содержащей термосенсибилизатор, в сравнении с аналогичной кинетикой для пробирки с водой. Наблюдалась разница в температуре 50°С через 200 минут облучения.
Доказательством возможности использования термосенсибилизатора для лазерной гипертермии является ниже приведенное исследование.
2
2
Исследование проводилось на линейных мышах Balb/c (женские особи), возраст 3 месяца, массой 20-22 г. Животные содержались в соответствии с «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986). До и в период эксперимента мыши находились в виварии при температуре воздуха +20-22°С, влажности - не более 50%, объеме воздухообмена (вытяжка: приток) - 8:10, в световом режиме день-ночь, в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой и получали стандартный рацион (гранулированный корм ПК120-3 согласно приказу №1179 МЗ СССР от 10.10.1983). Каждому животному подкожно перевивалась асцитная опухоль Эрлиха в объеме 0.2 мл. Перевивание осуществлялось в стерильных условиях в специальном боксе, по стандартной методике. Для исследования эффективности гипертермии было сформировано 3 группы животных по 14 мышей в каждой. На 11 сутки после перевивания опухолей животным первой экспериментальной группы вводилось в хвостовую вену по 0.4 мл раствора наностержней, животным первой и второй контрольных групп вводилось по 0.4 мл физиологического раствора. Спустя сутки после введения наночастиц проводился сеанс лазерной гипертермии животным экспериментальной группы и животным первой контрольной группы. Расстояние от торца волокна до объекта 27 мм, выходная мощность лазера 1.2 Вт, полупроводниковый лазер LIMO. Площадь пятна 0.3 см, диаметр пятна 6 мм, рабочий ток лазера 10.4 А. Плотность мощности 4 Вт/см. Температура регистрировалась каждые 10 секунд тепловизором, продолжительность нагрева 5 минут. Вторая контрольная группа не подвергалась лазерному воздействию. На Фиг.4 представлена динамика нагрева при внутривенном (в/в) введении наностержней. 1 - опухолевая ткань в/в введение наночастиц, 2 - здоровая ткань в/в введение наночастиц, 3 - контроль без введения частиц. Видно, что в результате пассивного селективного накопления наностержней в опухолевой ткани нагрев в ней значительно (на 30 градусов) выше, чем нагрев соседнего участка здоровых тканей у того же животного. Для контроля измерялась температура поверхности кожи без введения наночастиц, как над опухолевыми тканями, так и окружающих здоровых участков. Значимых различий в нагреве здоровых и опухолевых участков без введения наночастиц не выявлено. При внутривенном введении наностержней при нагреве здоровых тканей их температура превышала контрольные значения на 5-7 градусов. Основное повышение температуры биоткани с наночастицами происходит в первые 100 секунд лазерного нагрева, а затем скорость повышения температуры значительно уменьшается.
На фиг.5 представлены результаты термографических измерений двумерного распределения температуры на поверхности тела лабораторных животных при лазерном нагреве. Тепловизор при измерениях находился в одном и том же фиксированном положении. Представлено 2D распределение температуры на поверхности кожи лабораторного животного при лазерном воздействии с наночастицами, а - до нагрева, б - нагрев продолжительностью 1 минута, в - нагрев продолжительность 5 минут.
3
3
3
3
Размеры опухолей фиксировались непосредственно перед сеансом лазерной гипертермии и с интервалом 3 дня в течение трех недель после сеанса гипертермии. Средний размер опухоли перед лазерным воздействием составлял 1.7±0.3 см. Лазерное воздействие с наностержнями, сопровождавшееся более значительным повышением температуры, привело к уменьшению средних размеров опухолей 0.4±0.1 см, наиболее значительному на 9-12 день после воздействия. У животных контрольной группы с лазерным воздействием в диапазоне около 40°С наблюдалась стимуляция роста опухолей до 3.2±0.7 см. В контрольной группе без воздействия 2.7±0.7 см.
4
8
2
Доказательство снижения токсичности термосенсибилизатора на основе покрытых полиэтиленгликолем наночастиц по сравнению с наностержнями, содержащими цетиллтриметиламмонийбромид проводилось путем исследования выживаемости клеток HeLa при инкубации с различивши концентрациями образцов. Клеточные суспензии разделялись на три группы по 5 образцов в каждой. 1 Группа: к 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток добавлялось 1, 2, 5, 10, 50 мкл исследуемого термосенсибилизатора. 2 Группа: к 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток добавлялось 1, 2, 5, 10, 50 мкл суспензии наностержней покрытых ЦТАБ. 3 Группа: контроль - клеточные суспензии без добавления наночастиц. Клеточные суспензии инкубировались 1 час при 37°С в CO инкубаторе. Выживаемость клеток определялась с помощью МТТ-теста (Barbari M., Kraljevi S., Grce M., Zork B.Novel 1, 2, 5-oxadiazine derivatives - Synthesis and in vitro biological studies // Acta Pharm. - 2003. - V.53. - P.175-186). На фиг.6 представлены результаты выживаемости клеток - контрольной группы, после инкубации с термосенсибилизатором и после инкубации с суспензией наностержней, покрытых цетилтриметиламмоний бромидом. Видно существенное снижение токсического действия наностержней; не обнаружено достоверных отличий в выживаемости клеток после инкубации с термосенсибилизатором по сравнению с контрольной группой клеток.
Отличительные признаки предлагаемого решения обеспечивают следующие преимущества:
- Способ синтеза золотых наностержней позволяет получить наночастицы с размером менее 50 нм и резонансным поглощением света в инфракрасной области, которые могут использоваться для лазерной гипертермии новообразований.
- Функционализация наночастиц молекулами полиэтиленгликоля позволяет увеличить биосовместимость термосенсибилизатора.