Способы обнаружения ДНК, РНК и белка в биологических образцах

1. Способ зондирования нескольких мишеней в биологическом образце, включающий следующие стадии:
(а) образец подвергают реакции гибридизации in situ, используя меченый нуклеиново-кислотный зонд, который прямо или опосредовано связывается с РНК-мишенью;
(б) наблюдают сигнал от меченого зонда, связанного с РНК-мишенью;
(в) возможно удаляют сигнал от меченого зонда;
(г) образец подвергают протоколу демаскировки антигенов для демаскировки белковых эпитопов в образце;
(д) образец подвергают реакции гибридизации in situ, используя способ, основанный на антителах, и присоединяют один или более антительных зондов к антигенам на образце;
(е) наблюдают сигнал от одного или более антительных зондов;
(ж) удаляют сигнал от антительных зондов;
(з) возможно используют обработку протеазой для получения доступа к ДНК-мишеням образца;
(и) образец подвергают реакции гибридизации in situ, используя меченый нуклеиново-кислотный зонд, чтобы прямо или опосредовано пометить одну или более ДНК-мишеней образца;
(к) наблюдают сигнал от меченых ДНК-мишеней;
(л) возможно удаляют сигнал от одной или более меченых ДНК-мишеней.
2. Способ по п. 1, где стадия (а) дополнительно включает стадию предварительной гибридизации для блокирования ДНК, использование блокирующего агента в реакции гибридизации или их комбинацию.
3. Способ по п. 1, где после наблюдения сигнала от меченого зонда, связанного с РНК-мишенью, образец подвергается стадии (в) и стадии (а), (б) и (в) повторяют один или более раз с другими мечеными нуклеиново-кислотными зондами для разных РНК-мишеней.
4. Способ по п. 1, где реакция гибридизации in situ с использованием метода, основанного на антителах, включает иммуногистохимические (IHC) или иммунофлуоресцентные (IF) методы.
5. Способ по п. 4, где антительный зонд содержит смесь из более чем одного зонда.
6. Способ по п. 4, где после наблюдения и удаления сигнала от одного или более антительных зондов стадии (д), (е) и (ж) повторяют один или более раз с другим антительный зондом для другого антигена.
7. Способ по п. 1, после обработки протеазой дополнительно включающий стадию сохранения морфологии ткани, предварительной гибридизации или их комбинацию.
8. Способ по п. 1, где после наблюдения сигнала от меченого зонда, связанного с ДНК-мишенью, стадии (и), (к) и (л) повторяют один или более раз с другим меченым нуклеиново-кислотным зондом для другой ДНК-мишени.
9. Способ по п. 1, где удаление сигналов на стадиях (в), (ж) и (и) включает использование агента инактивации сигнала, фотореакцию, фотоактивированное химическое обесцвечивания, стриппинг зонда, окисление, перенос электрона или их комбинацию.
10. Способ по п. 1, дополнительно включающий окрашивание образца одним или более контрольными зондами, чтобы обеспечить регистрацию нескольких изображений образца.
11. Способ по п. 10, где контрольный зонд представляет собой морфологический краситель.
12. Способ по п. 10, дополнительно включающий регистрацию нескольких изображений образца, где регистрация включает:
получение нескольких изображений образцов на стадиях (б), (е), (к) или их комбинацию;
выравнивание и наложение нескольких изображений в соответствии с сигналами, детектируемыми у контрольного зонда.
13. Способ по п. 12, дополнительно включающий стадию анализа экспрессии белка, РНК и ДНК на наложенных друг на друга изображениях.
14. Способ по п. 1, дополнительно включающий измерение одного или более значений интенсивности сигнала, наблюдаемого на стадиях наблюдения (б), (е), (к), или их комбинации.
15. Способ по п. 14, где измерение одного или более значений интенсивности сигнала включает метод усиления сигнала.