КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОГО НАЦЕЛИВАНИЯ ТРАНСГЕНОВ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR EFFECTIVE TARGETING OF TRANSGENES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
В настоящей заявке заявлен приоритет по предварительной заявке на патент США №62/270180, поданной 21 декабря 2015 года, и по предварительной заявке на патент США №62/364715, поданной 20 июля 2016 года, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002]
Данное изобретение в целом относится к отраслям сельского хозяйства, биотехнологии растений и молекулярной биологии. Более конкретно, данное изобретение относится к композициям и способам получения трансгенных растений, демонстрирующих толерантность или резистентность к гербицидам.
Включение перечня последовательностей
[0003]
Перечень последовательностей в машиночитаемой форме подан с данной заявкой в электронном формате и включен в данную заявку посредством ссылки в полном объеме. Перечень последовательностей, содержащийся в файле под названием MONS389WO_ST25.txt, размером 122 килобайта (измерено в операционной системе MS Windows), был создан 19 декабря 2016 года.
Описание предшествующего уровня техники
[0004]
Продуцирование новых трансгенных растений обеспечивает возможность существенного усовершенствования сельскохозяйственных культур, демонстрирующих полезные характеристики, такие как повышенная толерантность к гербицидам, получая таким образом более эффективные стратегий борьбы с сорняками. Однако, при том, что белки, пригодные для получения полезных характеристик сельскохозяйственных культур, являются известными, эффективная субклеточная локализация (известная как нацеливание) и процессинг этих рекомбинантных белков в трансгенных клетках растений все еще представляют значительные трудности. Поэтому существует потребность в новых транзитных пептидах, способных эффективно локализовать рекомбинантные белки в клетках растений.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005]
Один аспект изобретения относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую транзитный пептид хлоропласта (CTP), функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей дикамба-монооксигеназу (DMO) или протопорфириногеноксидазу (PPO), при этом CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения последовательность ДНК, кодирующая CTP, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-14. В других вариантах осуществления данного изобретения DMO или PPO содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и 40-59. В одном варианте осуществления данного изобретения последовательность ДНК DMO или PPO содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28-37 и 61-102. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения DMO или PPO определяют как белок толерантности к гербициду, который способен придавать толерантность к гербициду при экспрессии в клетке растения. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения белок толерантности к гербициду представляет собой белок DMO, а CTP содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, или белок толерантности к гербициду представляет собой белок PPO, а CTP содержит выбранную последовательность из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 2.
[0006]
В другом аспекте данного изобретения предлагается конструкция ДНК, содержащая молекулу рекомбинантной ДНК, как описано в данном изобретении, функционально связанную с гетерологичным промотором, функциональным в клетке растения.
[0007]
Brassica
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается трансгенное растение, клетка растения, часть растения или семя, трансформированные рекомбинантной молекулой ДНК по данному изобретению. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения растение представляет собой однодольное растение. Однодольные растения, которые можно применять в данном изобретении, включают, но не ограничиваются ими, растения кукурузы или пшеницы. В другом варианте осуществления данного изобретения растение представляет собой двудольное растение. Двудольные растения, которые можно применять в данном изобретении, включают, но не ограничиваются ими, растения сои, хлопчатника, или растения рода  (рода капусты).
[0008]
В еще одном аспекте предлагается молекула рекомбинантной ДНК по данному изобретению, которая присутствует в неживом материале растения. В одном примере клетки растения находятся в пределах объема данного изобретения, когда они содержат рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению. В одном варианте осуществления данного изобретения такие клетки растения могут быть регенерируемыми клетками растений или могут быть нерегенерируемыми клетками растений, которые не могут быть регенерированы в растение.
[0009]
В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются способы продуцирования товарных продуктов, которые содержат обнаруживаемое количество молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению, включая продукты, полученные таким образом. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения товарные продукты, предлагаемые в данном изобретении, включают нежизнеспособные семена или их части, обезвоженную ткань растения, замороженную ткань растения, обработанную ткань растения, муку крупного помола, муку тонкого помола, хлопья, отруби и волокна. Товарные продукты могут быть жизнеспособными или нежизнеспособными. Нежизнеспособные товарные продукты включают, но не ограничиваются этим, нежизнеспособные семена и зерна; обработанные семена, части семян и части растений; обезвоженная ткань растения, замороженная ткань растения и обработанная ткань растения. Товарные продукты по данному изобретению содержат обнаруживаемое количество рекомбинантной молекулы ДНК, как описано в данном документе. Способы обнаружения молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению хорошо известны в данной области техники.
[0010]
В следующем аспекте данного изобретения предлагается способ продуцирования толерантного к гербицидам растения, включающий следующие этапы: а) трансформация клетки растения с конструкцией ДНК по данному изобретению и b) регенерация растения из трансформированной клетки растения, которая содержит указанную конструкцию ДНК. В одном варианте осуществления способа регенерированное растение является толерантным к гербициду, выбранному из группы, состоящей из дикамбы и ингибитора PPO.
[0011]
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ продуцирования толерантного к гербициду растения, включающий следующие этапы: а) скрещивание родительского растения, содержащего молекулу рекомбинантной ДНК по данному изобретению, с самим собой или со вторым растением для получения одного или большего количества растений потомства; и b) отбор растения потомства, содержащего указанную молекулу ДНК. В одном варианте осуществления способа растение потомства является толерантным к гербициду, выбранному из группы, состоящей из дикамбы и ингибитора PPO.
[0012]
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ экспрессии PPO или DMO в клетке, включающий введение рекомбинантной молекулы ДНК по данному изобретению в клетку растения. В одном варианте осуществления данного изобретения введение молекулы рекомбинантной ДНК включает трансформацию клетки растения.
[0013]
Brassica
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ контроля роста сорняков в среде выращивания сельскохозяйственных культур, включающий следующие этапы: а) посадка растения или семян по данному изобретению в среду выращивания сельскохозяйственных культур; и b) применение в среде выращивания сельскохозяйственных культур количества гербицида дикамба или ингибитора PPO, эффективного для контроля роста сорняков. В конкретных вариантах осуществления данного изобретения применение гербицида производится до или после всхода. В одном варианте осуществления данного изобретения количество гербицида не повреждает растение или семя. В некоторых вариантах осуществления указанного способа растение или семя представляют собой однодольное растение или семя, такие как растение или семя кукурузы или пшеницы. В других вариантах осуществления данного изобретения растение или семя представляют собой двудольное растение или семя, такие как соя, хлопчатник или растения рода  (рода капусты). В других вариантах осуществления данного изобретения гербицид представляет собой дикамбу или ингибитор РРО.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0014]
Фигура 1. Трансгенные растения кукурузы F1, экспрессирующие H_N10 (SEQ ID NO: 43), функционально связанный с APG6 (SEQ ID NO: 1) или 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), после обработки гербицидом в количестве 0,036 фунта активного ингредиента S-3100 на акр (фунт аи/акр), применяемого в V2, затем - в V4, а затем - V8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0015]
Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность CTP белого и бледно-зеленого  (APG6).
[0016]
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность аминоконцевого оптимизированного варианта APG6 CTP SEQ ID NO: 1.
[0017]
Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность белка теплового шока 90 кДа (CR88) CTP .
[0018]
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность Ph. ShkG-CTP4 CTP.
[0019]
SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность Ps. RbcS-3C CTP.
[0020]
SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность Os.Waxy CTP.
[0021]
SEQ ID NO: 7-11 представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие APG6 CTP SEQ ID NO: 1, оптимизированные для однодольной или двудольной экспрессии.
[0022]
SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую APG6 CTP SEQ ID NO: 2.
[0023]
SEQ ID NO: 13 и 14 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие At.CR88 CTP, оптимизированные для двудольной или однодольной экспрессии, соответственно.
[0024]
SEQ ID NO: 15-17 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 4-6 соответственно.
[0025]
SEQ ID NO: 18-27 представляют собой аминокислотные последовательности, кодирующие варианты дикамба-монооксигеназы (DMO).
[0026]
SEQ ID NO: 28-37 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты DMO SEQ ID NO: 18-27 соответственно.
[0027]
SEQ ID NO: 38 представляет собой аминокислотную последовательность транзитного пептида хлоропласта 12G088600TP хлопчатника, оптимизированную для двудольной экспрессии.
[0028]
SEQ ID NO: 39 представляет собой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 38.
[0029]
SEQ ID NO: 40 представляет собой аминокислотную последовательность H_N90.
[0030]
SEQ ID NO: 41 представляет собой аминокислотную последовательность H_N20.
[0031]
SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность H_N60.
[0032]
SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность H_N10.
[0033]
SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность H_N30.
[0034]
SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислотную последовательность H_N40.
[0035]
SEQ ID NO: 46 представляет собой аминокислотную последовательность H_N50.
[0036]
SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислотную последовательность H_N70.
[0037]
SEQ ID NO: 48 представляет собой аминокислотную последовательность H_N100.
[0038]
SEQ ID NO: 49 представляет собой аминокислотную последовательность H_N110.
[0039]
SEQ ID NO: 50-56 представляют собой аминокислотные последовательности, не содержащие стартовый метионин, соответствующий SEQ ID NO: 40, 41, 43, 44, 45, 46 и 48 соответственно.
[0040]
SEQ ID NO: 57-58 представляют собой аминокислотные варианты SEQ ID NO: 50.
[0041]
SEQ ID NO: 59 представляет собой аминокислотный вариант SEQ ID NO: 56.
[0042]
Amaranthus tuberculatus
SEQ ID NO: 60 представляет собой аминокислотную последовательность протопорфириногеноксидазы из  (щирица) (WH_PPO).
[0043]
E. coli
SEQ ID NO: 61-70 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 40-49 соответственно, кодон-оптимизированные для экспрессии .
[0044]
SEQ ID NO: 71-80 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 40-49 соответственно, кодон-оптимизированные для двудольной экспрессии.
[0045]
SEQ ID NO: 81-87 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 50-56 соответственно, кодон-оптимизированные для двудольной экспрессии.
[0046]
SEQ ID NO: 88 и 91 представляют собой нуклеотидные варианты SEQ ID NO: 50 и 51, соответственно.
[0047]
SEQ ID NO: 89, 90 и 92 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 57-59, соответственно.
[0048]
SEQ ID NO: 93-102 представляют собой нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 40-49 соответственно, кодон-оптимизированные для однодольной экспрессии.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0049]
Транзитные пептиды хлоропласта (CTP), локализующие белки толерантности к гербицидам в клетках, известны в данной области техники, но степень эффективной субклеточной локализации и процессинга для любой комбинации CTP и белка толерантности к гербициду трудно спрогнозировать. Локализация и процессинг определяют уровень экспрессии и функцию белка толерантности к гербициду и, таким образом, влияют на фенотип толерантности к гербициду трансгенной клетки, растения или семени, содержащих указанный белок. В трансгенных растениях были проанализированы различные CTP с применением пригодных белков толерантности к гербицидам, включая дикамба-монооксигеназы (DMO) и протопорфириногеноксидазы (PPO). Однако часто наблюдали слабый или неполный процессинг и локализацию белка.
[0050]
Данное изобретение преодолевает эти препятствия, обеспечивая новые молекулы рекомбинантной ДНК, способные обеспечить улучшенную локализацию и процессинг хлоропласта, а также композиции и способы их применения. Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению содержат последовательность ДНК, кодирующую CTP, функционально связанный с DMO или PPO. Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению обеспечивают локализацию хлоропласта DMO или PPO и повышенную толерантность к гербициду дикамба или PPO в растениях, содержащих молекулы рекомбинантной ДНК.
[0051]
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность ДНК, кодирующую CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок толерантности к гербициду. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие CTP, такие как CTP, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок DMO, например, белок DMO, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27. В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения предлагаются молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие последовательности ДНК, кодирующие CTP, такие как CTP, имеющие последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок PPO, такой как белок PPO, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-60.
Молекулы рекомбинантной ДНК
[0052]
В данном контексте термин «рекомбинантный» относится к неприродной (-ому) ДНК, полипептиду, белку, клетке, семени или растению, которое (-ая, -ый) является результатом генной инженерии и как таковое (-ая, -ой) обычно не встречается в природе, и которое (-ая, -ый) был создан в результате вмешательства человека. «Рекомбинантная молекула ДНК» представляет собой молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая не встречается в природе, и как таковая является результатом вмешательства человека, например, молекула ДНК, состоящая из комбинации по меньшей мере двух молекул ДНК, гетерологичных друг другу. Примером рекомбинантной молекулы ДНК является молекула ДНК, кодирующая CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок DMO, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27. Примеры белков DMO приведены в Таблице 1 ниже.
Таблица 1. Дикамба-монооксигеназы (DMO)
<b>БЕЛОК SEQ ID NO</b>
<b>ДНК SEQ ID NO</b>
<b>Длина белка</b>
<b>Прогнозируемое положение 2</b>
<b>Прогнозируемое положение 3</b>
<b>Прогнозируемое положение 112</b>
<b>Использование кодонов</b>
<b>18</b>
<b>28</b>
<b>340</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Trp</b>
<b>двудольный</b>
<b>19</b>
<b>29</b>
<b>339</b>
<b>Thr</b>
<b>Phe</b>
<b>Trp (в 111)</b>
<b>двудольный</b>
<b>20</b>
<b>30</b>
<b>340</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Trp</b>
<b>однодольный</b>
<b>21</b>
<b>31</b>
<b>340</b>
<b>Ala</b>
<b>Thr</b>
<b>Cys</b>
<b>двудольный</b>
<b>11</b>
<b>32</b>
<b>340</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Cys</b>
<b>двудольный</b>
<b>23</b>
<b>33</b>
<b>340</b>
<b>Ala</b>
<b>Thr</b>
<b>Cys</b>
<b>бактериальный</b>
<b>24</b>
<b>34</b>
<b>340</b>
<b>Ala</b>
<b>Thr</b>
<b>Trp</b>
<b>двудольный</b>
<b>25</b>
<b>35</b>
<b>340</b>
<b>Ala</b>
<b>Thr</b>
<b>Trp</b>
<b>однодольный</b>
<b>26</b>
<b>36</b>
<b>340</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Cys</b>
<b>двудольный</b>
<b>27</b>
<b>37</b>
<b>340</b>
<b>Leu</b>
<b>Thr</b>
<b>Trp</b>
<b>двудольный</b>
[0053]
Другим примером рекомбинантной молекулы ДНК является молекула ДНК, кодирующая CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей белок PPO, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-60. Рекомбинантной клеткой, семенем или растением является клетка, семя или растение, содержащее трансгенную ДНК, например, трансгенную клетку, семя, растение или часть растения, содержащую рекомбинантную молекулу ДНК по данному изобретению. Примеры белков PPO приведены в Таблице 2 ниже.
Таблица 2. Протопорфириногеноксидазы (PPO)
<b>PPO</b>
<b>Белок</b><b>SEQ ID NO</b>
<b>Бактериальная ДНК SEQ ID NO</b>
<b>Двудольная оптимизированная</b><b>ДНК SEQ ID NO</b>
<b>Однодольная оптимизированная ДНК SEQ ID NO</b>
H_N10
43, 52
64
74, 83
96
H_N20
41, 51
62
72, 82, 91
94
H_N30
44, 53
65
75, 84
97
H_N40
45, 54
66
76, 85
98
H_N50
46, 55
67
77, 86
99
H_N60
42
63
73
95
H_N70
47
68
78
100
H_N90
40, 50, 57, 58
61
71, 81, 88, 89, 90
93
H_N100
48, 56, 59
69
79, 87, 92
101
H_N110
49
70
80
102
WH_PPO
60
н/д
н/д
н/д
[0054]
Примеры последовательностей CTP, которые можно применять в соответствии с данным изобретением, приведены в Таблице 3 ниже.
Таблица 3. Транзитные пептиды хлоропласта (CTP)
<b>CTP</b>
<b>Белок SEQ ID NO</b>
<b>ДНК SEQ ID NO</b>
<b>Использование кодонов</b>
APG6
1
7, 10, 11
однодольный
8, 9
двудольный
N-opt APG6
2
12
двудольный
At.CR88
3
13
двудольный
14
однодольный
Ph. ShkG-CTP4
4
15
однодольный
Ps. RbcS-3C
5
16
двудольный
Os.Waxy
6
17
однодольный
12G088600TP
38
39
двудольный
[0055]
В данном контексте термин «выделенная молекула ДНК» означает, что молекула ДНК присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не находится в своей естественной среде. Например, молекула рекомбинантной ДНК, содержащая белок-кодирующую последовательность и гетерологичную последовательность CTP, представляет собой выделенную молекулу ДНК, когда она присутствует в геноме трансгенного растения, клетки или семени, поскольку компоненты этой молекулы рекомбинантной ДНК находятся не их естественной среде (т. е. геноме организма, в котором каждый компонент был впервые обнаружен). Молекула рекомбинантной ДНК, присутствующая в геноме трансгенного растения, представляет собой выделенную молекулу ДНК при том условии, что молекула рекомбинантной ДНК не была естественным образом обнаружена в этом геноме растения и поэтому является выделенной из ее естественной окружающей среды
[0056]
В данном контексте термин «генная инженерия» относится к созданию ДНК, белка или организма, которые обычно не встречаются в природе, посредством вмешательства человека. Генную инженерию можно использовать для получения ДНК, полипептида, белка, клетки, семени или растений, которые были сконструированы и созданы в лаборатории с применением одного или большего количества методов биотехнологии, таких как молекулярная биология, биохимия белков, бактериальная трансформация и трансформация растений. Например, генную инженерию можно использовать для создания химерного гена, содержащего молекулу ДНК, кодирующую CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанной с белком DMO, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и необязательно может дополнительно содержать гетерологичный промотор, функциональный в клетке растения. В другом примере, генную инженерию можно использовать для создания химерного гена, содержащего молекулу ДНК, кодирующую CTP, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, функционально связанный с белком PPO, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40-60 и необязательно может дополнительно содержать гетерологичный промотор, функциональный в клетке растения. Такой химерный ген может быть получен с помощью одного или большего количества методов молекулярной биологии, таких как клонирование генов, лигирование ДНК и синтез ДНК.
[0057]
Термин «трансген» относится к молекуле ДНК, искусственно встраиваемой в геном организма в результате вмешательства человека, например, с помощью способов трансформации растений. В данном контексте термин «трансгенный» означает, включающий трансген, например, «трансгенное растение» относится к растению, содержащему трансген в своем геноме, и «трансгенный признак» относится к характеристике или фенотипу, выраженному или предоставленному присутствием трансгена, встроенного в геном растения. В результате таких геномных изменений трансгенное растение является чем-то значительно отличным от родственного растения дикого типа, а трансгенный признак представляет собой признак, который естественным образом не обнаруживается у растения дикого типа. Трансгенные растения по данному изобретению содержат рекомбинантную молекулу ДНК, предложенную в данном изобретении.
[0058]
В данном контексте термин «гетерологичный» относится к взаимосвязи между двумя или более материалами, полученными из разных источников и, таким образом, обычно не связанными в природе. Например, белок DMO является гетерологичным по отношению к функционально связанному CTP, если такая комбинация обычно не встречается в природе. В другом примере рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая CTP, функционально связанный с белком DMO, является гетерологичной по отношению к функционально связанному промотору, который является функциональным в клетке растения, если такая комбинация обычно не встречается в природе. Конкретная рекомбинантная молекула ДНК также может быть гетерологичной по отношению к клетке, семени или организму, в который она вставлена, когда она не будет встречаться в естественной среде в этой конкретной клетке, семени или организме.
[0059]
В данном контексте термин «молекула ДНК, кодирующая белок» или «молекула ДНК, кодирующая полипептид» относится к молекуле ДНК, которая кодирует белок или полипептид, такой как белок или полипептид, для обеспечения толерантности к гербицидам или борьбы с насекомыми. Термин «последовательность ДНК, кодирующая белок» или «последовательность, кодирующая полипептид» означает последовательность ДНК, которая кодирует белок или полипептид. «Последовательность» означает последовательное расположение нуклеотидов или аминокислот. Границы последовательности, кодирующей белок, или последовательности, кодирующей полипептид, обычно определяются стартовым кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Молекула, кодирующая белок, или молекула, кодирующая полипептид, может содержать последовательность ДНК, кодирующую белковую или полипептидную последовательность. В данном контексте термин «экспрессия трансгена», «экспрессирование трансгена», «экспрессия белка», «экспрессия полипептида», «экспрессирование белка» и «экспрессирование полипептида» означает продуцирование белка или полипептида в процессе транскрипции молекулы ДНК в матричную РНК (мРНК) и трансляции мРНК в полипептидные цепи, которые могут быть в конечном счете свернуты в белки. Молекула ДНК, кодирующая белок, или молекула ДНК, кодирующая полипептид, может быть функционально связана с гетерологичным промотором в конструкции ДНК, для применения в экспрессии белка или полипептида в клетке, трансформированной рекомбинантной молекулой ДНК. В данном контексте термин «функционально связанный» означает две молекулы ДНК, связанные таким образом, что одна молекула может влиять на функцию другой. Функционально-связанные молекулы ДНК могут быть частью одной непрерывной молекулы и могут быть или не быть смежными. Например, промотор функционально связан с молекулой ДНК, кодирующей белок, или молекулой ДНК, кодирующей полипептид, в конструкции ДНК, где две молекулы ДНК расположены таким образом, что промотор может влиять на экспрессию трансгена.
[0060]
Stenotrophomonas maltophilia
Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают последовательность ДНК, кодирующую DMO, функционально связанную с последовательностью CTP. В данном контексте термин «дикамба-монооксигеназа» или «DMO» означает оксигеназу, способную ферментативно катализировать деградацию дикамбы (3,6-дихлор-о-анизиновая кислота) до 3,6-дихлорсалициловой кислоты (3,6-DCSA), такой как дикамба-монооксигеназа, кодируемая геном деметилазы (dmo) из . Дикамба-монооксигеназы известны в данной области техники и включают белковые последовательности, представленные как SEQ ID NO: 18-27, и идентифицированы в Таблице 1.
[0061]
Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают последовательность ДНК, кодирующую PPO, функционально связанную с последовательностью CTP. В данном контексте термин «протопорфириногеноксидаза» или «PPO» означает оксидазу, способную ферментативно превращать протопорфириноген IX в протопорфирин IX. Протопорфириногеноксидазы известны в данной области техники и включают белковые последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 40-60, и идентифицированы в Таблице 2.
[0062]
Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают последовательность ДНК, кодирующую последовательность CTP, функционально связанную с предложенными в данном изобретении молекулами ДНК, кодирующими белок, посредством чего CTP облегчает локализацию рекомбинантной белковой молекулы внутри клетки. CTP также известны в данной области техники как сигнальные последовательности, последовательности нацеливания, пептиды нацеливания и последовательности локализации. Хлоропласты также известны в данной области техники как пластиды. Способствуя локализации белка внутри клетки, CTP обеспечивает локализацию белка в хлоропласте для оптимальной активности фермента и может увеличить накопление рекомбинантного белка и защитить белок от протеолитического расщепления. Процесс, при котором CTP типично отщепляется от белка при транслокации в хлоропласт, также называется прооцессингом. Процессинг CTP может быть полным (что означает, что полный CTP отщепляется от аминотерминального конца белка), неполным (это означает, что одна или большее количество аминокислот CTP остаются на аминотерминальном конце белка), или приводит к удалению одной или большего количества аминокислот из аминотерминального конца белка. Полный процессинг CTP из белка DMO повышает уровень накопления белка, тем самым повышая толерантность к дикамбе и снижая уровни поражения в трансгенных клетках, семенах или организме после применения гербицида. CTP представлены как SEQ ID NO: 1-6 и 38 и идентифицированы в Таблице 3. Последовательность ДНК, кодирующая каждый CTP, оптимизированный для экспрессии в двудольных и однодольных, представлена как SEQ ID NO: 7-17 и 39.
[0063]
Рекомбинантные молекулы ДНК согласно данному изобретению могут быть синтезированы и модифицированы с помощью способов, известных в данной области техники, полностью или частично, особенно там, где желательно получить последовательности, пригодные для манипуляций с ДНК (такие как сайты распознавания рестрикционных ферментов или сайты клонирования на основе рекомбинации), предпочтительные по отношению к растению последовательности (например, использование кодонов растений или консенсусных последовательностей Козак) или последовательности, пригодные для конструирования конструкции ДНК (такие как спейсерные или линкерные последовательности). Молекулы рекомбинантной ДНК по данному изобретению включают вырожденные последовательности ДНК, кодирующие ту же аминокислотную последовательность, что и последовательность ДНК, представленная в данном изобретении. Вырожденные последовательности ДНК можно получить с помощью способов, известных в данной области техники, и таблицы кодонов ДНК. Данное изобретение включает в себя рекомбинантные молекулы ДНК и белки, имеющие по меньшей мере 85% идентичности последовательности, по меньшей мере 90% идентичности последовательности, по меньшей мере 95% идентичности последовательности, по меньшей мере 96% идентичности последовательности, по меньшей мере 97% идентичности последовательности, по меньшей мере 98% идентичности последовательности, и по меньшей мере 99% идентичности последовательности с любой из рекомбинантных молекул ДНК или полипептидных последовательностей, представленных в данном изобретении. Например, молекула рекомбинантной ДНК по данному изобретению может содержать последовательность ДНК, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичности последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-14 или последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 28-37 и 61-102. Молекула рекомбинантной ДНК по данному изобретению может кодировать последовательность белка, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичности последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3; или последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-27 и 40-59.
[0064]
В данном контексте термин «процент идентичности последовательности» или «% идентичности последовательности» относится к проценту идентичных нуклеотидов или аминокислот в эталонной («запрос») линейной полинуклеотидной или полипептидной последовательности (или ее комплементарной цепи) по сравнению с тестовой («субъект») последовательностью (или ее комплементарной цепью), когда две последовательности оптимально выровнены (с соответствующими нуклеотидными или аминокислотными вставками, делециями или пробелами, составляющими менее 20 процентов эталонной последовательности в окне сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может быть выполнено с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, алгоритм выравнивания гомологии Нидлмана и Вунша, способ поиска схожести Пирсона и Липмана, а также с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, которые доступны в составе пакета программного обеспечения Sequence Analysis GCG Wisconsin Package (Accelrys Inc.,Сан-Диего, Калифорния), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St.,Madison, WI 53715), и MUSCLE (версия 3.6) (Edgar, Nucleic Acids Research 32(5): 1792-7, 2004) с параметрами по умолчанию. «Доля идентичности» для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее количество компонентов в сегменте эталонной последовательности, то есть всю эталонную последовательность или меньшую определенную часть эталонной последовательности. Процент идентичности последовательности представлен как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или более последовательностей может производится с полноразмерной последовательностью или ее частью, или более длинной последовательностью.
[0065]
В данном контексте термин «конструкция ДНК» представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую две или большее количество гетерологичных последовательности ДНК. Конструкции ДНК являются пригодными для экспрессии трансгена и могут быть включены в векторы и плазмиды. Конструкции ДНК могут быть применены в векторах с целью трансформации, что представляет собой введения гетерологичной ДНК в клетку-хозяина, для получения трансгенных растений и клеток, и как таковые могут также содержаться в пластидной ДНК или геномной ДНК трансгенного растения, семени, клетки или части растения. В данном контексте термин «вектор» означает любую рекомбинантную молекулу ДНК, которую можно применить для трансформации растения. Рекомбинантные молекулы ДНК, как указано в перечне последовательностей, могут быть, например, вставлены в вектор как часть конструкции, имеющей рекомбинантную молекулу ДНК, функционально связанную с элементом экспрессии гена, который функционирует в растении, с целью влияния на экспрессию белка, кодируемого рекомбинантной молекулой ДНК. Способы конструирования конструкций ДНК и векторов хорошо известны в данной области техники. Компоненты конструкции ДНК или вектора, содержащего конструкцию ДНК, обычно включают, но не ограничиваются ими, один или большее количество из следующих элементов: промотор для экспрессии функционально связанной ДНК, функционально связанную молекулу ДНК, кодирующую белок, и 3'-нетранслируемую область. Элементы экспрессии генов, пригодные при осуществлении данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, один или большее количество элементов следующего типа: промотор, 5'-нетранслируемая область, энхансер, лидер, действующий в цис-положении элемент, интрон, 3'-нетранслируемая область и один или большее количество селектируемых маркерных трансгенов.
[0066]
Указанные конструкции ДНК по данному изобретению могут включать промотор, функционально связанный с кодирующей белок молекулой ДНК, предложенной в данном изобретении, посредством чего промотор стимулирует экспрессию молекулы рекомбинантного белка. Промоторы, которые применяются при осуществлении данного изобретения, включают те, которые функционируют в клетке для экспрессии функционально связанного полинуклеотида, например, промотор бактерии или растения. Промоторы растения разнообразны и хорошо известны в данной области техники и включают те, которые являются индуцибельными, вирусными, синтетическими, конститутивными, регулируемыми по времени, регулируемыми в пространстве и/или регулируемыми по времени и в пространстве.
[0067]
Brassica napus
Brassica napus
В данном контексте термин «отрицательный контроль» и «положительный контроль» означает экспериментальный контроль, предназначенный для целей сравнения. Например, растение из группы отрицательного контроля или растение из группы положительного контроля в анализе трансгенного растения может представлять собой растение того же типа, что и экспериментальное растение (тестируемое растение), но которое не содержит трансгенной вставки, рекомбинантной молекулы ДНК или конструкции ДНК экспериментального растения. Примером контрольного растения, пригодного для сравнения с трансгенными растениями кукурузы, является нетрансгенная кукуруза LH244 (патент США №6252148), или нетрансгенная кукуруза 01DKD2 (патент США №7166779); для сравнения с трансгенными растениями сои- нетрансгенная соя A3555 (патент США №7700846), или нетрансгенная соя A3244 (патент США №5659114, PVP 9600246); для сравнения с трансгенными растениями канолы или  - разновидность 65037 линии Restorer нетрансгенной ; для сравнения с трансгенными растениями пшеницы - зародышевая плазма Samson (PVP 1994) разновидности нетрансгенной пшеницы; а для сравнения с трансгенными растениями хлопчатника - нетрансгенная DP393 (патент США №6930228 PVP 200400266).
Трансгенные растения
[0068]
Аспект данного изобретения включает трансгенные растительные клетки, трансгенные растительные ткани, трансгенные растения и трансгенные семена, которые содержат рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении. Эти клетки, ткани, растения и семена, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, демонстрируют толерантность к гербицидам.
[0069]
Agrobacterium
Вставку трансгенной ДНК (известной как «трансген») в геном растения можно осуществить путем трансформации растения и приводит к созданию новой трансгенной геномной молекулярной последовательности, известной как «трансформант». Каждый трансформант является уникальным, и определенная последовательность ДНК трансформанта является специфичной для определенного трансформанта. Подходящие способы трансформации клеток растения-хозяина для применения в данном изобретении включают практически любой способ, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку (например, когда конструкция рекомбинантной ДНК стабильно интегрируется в хромосому растения) и который хорошо известный в данной области техники. Конструкция рекомбинантной ДНК, применяемая в иллюстративных способах введения конструкции рекомбинантной ДНК в растения, включает системы трансформации  и бомбардировки частицами ДНК, обе из которых хорошо известны специалистам в данной области техники. Другим иллюстративным способом введения конструкции рекомбинантной ДНК в растения является встраивание конструкции рекомбинантной ДНК в геном растения в заранее определенном месте с помощью способов сайт-направленной интеграции. Сайт-направленная интеграция может быть выполнена с помощью любого способа, известного в данной области техники, например, с применением нуклеаз с цинковыми пальцами, сконструированных или нативных мегануклеаз, TALE-эндонуклеаз или эндонуклеаз с РНК-управлением (например, системы CRISPR/Cas9). Трансгенные растения затем могут быть регенерированы из трансформированной растительной клетки с помощью методов культивирования растительных клеток. Трансгенное растение, гомозиготное по трансгену (т. е. имеющее две аллельные копии определенного трансгена), может быть получено путем самоопыления (самооплодотворения) трансгенного растения, которое содержит единственный аллель трансгена, например, растение R0, с целью получения семян R1. Одна четвертая часть полученных семян R1 будет гомозиготной по трансгену. Растения, выращенные из прорастающих семян R1, могут быть протестированы на зиготность, как правило, с помощью анализа SNP, секвенирования ДНК или анализа термической амплификации, что позволяет различать гетерозиготы и гомозиготы, и называется анализом зиготности.
[0070]
Растения, семена, части растений, ткани растений и клетки, предложенные в данном изобретении, проявляют толерантность к гербициду дикамба. Дикамбу можно вносить на участок произрастания растений, содержащий растения и семена, предложенные в данном изобретении, в качестве способа борьбы с сорняками, включая предотвращение роста сорняков. Растения и семена, предлагаемые в данном изобретении, содержат признак толерантности к гербициду, и как таковые являются толерантными к применению дикамбы. Может быть рекомендовано применение гербицида в коммерческом количестве (1X), или в любой его части, или в любой его кратности, такой как в два раза больше чем рекомендуемое коммерческое количество (2X). Количество применяемой дикамбы может быть выражено в виде кислотного эквивалента на фунт на акр (фунт к.э./акр) или кислотного эквивалента на грамм на гектар (грам к.э. /га). Участок произрастания растений может содержать или не содержать сорняки во время применения гербицида. Гербицидно-эффективная доза дикамбы для применения на участке с целью борьбы с сорняками должна составлять от около 0,1X до около 30X количества, указанного на этикетке в течение вегетационного периода. 1X количество, указанное на этикетке дикамбы составляет 0,5 фунта к.э./акр. Количества гербицидов могут быть преобразованы между английским и метрическим измерением следующим образом: (фунт аи/акр)*1,12=(кг аи/га) и (кг аи/га)*0,89=(фунт аи/акр).
[0071]
лу
2H
Растения, семена, части растений, ткани растений и клетки могут проявлять толерантность к одному или большему количеству ингибиторов PPO, называемым гербицидами PPO. Один или большее количество гербицидов PPO можно вносить на участок произрастания растений, содержащий растения и семена, предложенные в данном изобретении, в качестве способа борьбы с сорняками, включая предотвращение роста сорняков. Растения и семена, предлагаемые в данном изобретении, содержат признак толерантности к гербициду, и как таковые являются толерантными к применению одного или большего количества гербицидов PPO. Может быть рекомендовано применение гербицида в коммерческом количестве (1X), или в любой его части, или в любой его кратности, такой как в два раза больше чем рекомендуемое коммерческое количество (2X). Участок произрастания растений может содержать или не содержать сорняки во время применения гербицида. Гербицидно-эффективная доза гербицида PPO для применения на участке с целью борьбы с сорняками должна составлять от около 0,1X до около 30X количества, указанного на этикетке, в течение вегетационного периода. Гербициды PPO хорошо известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Примеры гербицидов PPO включают, но не ограничиваются ими, дифениловые эфиры (такие как ацифлуорфен, его соли и сложные эфиры, аклонифен, бифенокс, его соли и сложные эфиры, этоксифен, его соли и сложные эфиры, фторнитрофен, фурилоксифен, галогенофен, хлометоксифен, фторгликофен, его соли и сложные эфиры, лактофен, его соли и сложные эфиры, оксифлуорфен и фомеафен, его соли и сложные эфиры); тиадиазолы (такие как флутиацет-метил и тидиазимин); пиримидиндионы или фенилурацилы (такие как бензфендизон, бутафенацил, этил [3-2-хлор-4-фтор-5- (1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3-ил) фенокси] -2-пиридилокси] ацетат (имеет регистрационный номер CAS 353292-31-6 и упоминается в данном документе как S-3100), флупропацил, сафлуфенацил и тиафенацил); фенилпиразолы (такие как флюазолат, пирафлуфен и пирафлуфен-этил); оксадиазолы (такие как оксадиаргил и оксадиазон); триазолиноны (такие как азафенидин, бенкарбазон, карфентразон, его соли и сложные эфиры и сульфантразон); оксазолидиндионы (такие как пентоксиназон); N-фенилфталимиды (такие как цинидон-этил, флумикларат, флумихлорак-пентил и флумиоксазин); производные бензоксазинона (такие как 1,5-диметил-6-тиоксо-3-(2,2,7-трифоро-3,4-дигидро-3-оксо-4-проп-2-инил--1,4-бензоксазин-6-ил)-1,3,5-триазин-2,4-дион); флуфенпир и флуфенпир-этил; пираклонил; и профлуазол.
[0072]
Применение гербицидов может быть последовательным или гербицид может быть смешан в цистерне с одним, двумя или комбинацией нескольких гербицидов или любим другим совместимым гербицидом. Многократное применение одного гербицида, или двух или более гербицидов, в комбинации или отдельно, может быть использовано в течение вегетационного периода на участках, содержащих трансгенные растения согласно данному изобретению, для борьбы с широким спектром двудольных сорняков, однодольных сорняков или тех и тех, например, два применения (таких как применение перед посадкой растений и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и применение после появления всходов), или три применения (такие как применения для перед посадкой растений, применения перед появлением всходов и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и два применения после появления всходов).
[0073]
В данном контексте термин «толерантность» или «толерантность к гербицидам» означает способность растения, семени или клетки противостоять токсическому воздействию гербицида при его внесении. Толерантность к гербициду растения, семени, ткани растения, части растения или клетки можно измерить, сравнивая растение, семя, ткань растения, часть растения или клетку с подходящим экспериментальным контролем. Например, толерантность к гербицидам можно измерить или оценить путем нанесения гербицида на растение, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать толерантность к гербициду (тестируемое растение), и на растение того же вида, не содержащее рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать толерантность к гербициду (растение из группы отрицательного контроля), а затем сравнить поражение двух растений, при этом на толерантность к гербициду тестируемого растения указывает снижение показателя пораженности по сравнению с показателем пораженности растения из группы отрицательного контроля. Гербицидо-толерантное растение, семя, ткань растения, часть растения или клетки проявляют уменьшенный ответ на токсические эффекты гербицида по сравнению с растением, семенем, тканью растения, частью растения или клеткой из группы отрицательного контроля. В данном контексте термин «признак толерантности к гербициду» представляет собой трансгенный признак, придающий растению улучшенную толерантность к гербициду по сравнению с растением из группы отрицательного контроля.
[0074]
Трансгенные растения, потомство, семена, клетки растений и части растений согласно данному изобретению могут также содержать один или большее количество дополнительных трансгенных признаков. Дополнительные трансгенные признаки могут быть внесены путем скрещивания растения, содержащего трансген, содержащий рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении, с другим растением, содержащим дополнительный трансгенный признак (признаки). В данном контексте термин «скрещивание» означает размножение двух отдельных растений для получения потомства растений. Таким образом, два трансгенных растения могут быть скрещены для получения потомства, которое содержит трансгенные признаки. В данном контексте термин «потомство» означает потомство любого поколения родительского растения, при этом трансгенное потомство содержит конструкцию ДНК, предложенную в данном изобретении, унаследованную, по меньшей мере, от одного родительского растения. В альтернативном варианте, дополнительный трансгенный признак (признаки) может быть введен путем совместной трансформации конструкции ДНК для этого дополнительного трансгенного признака (признаков) с конструкцией ДНК, содержащей рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в данном изобретении (например, со всеми конструкциями ДНК, представленными как часть того же вектора, примененного для трансформации растений) или путем введения дополнительного признака (признаков) в трансгенное растение, содержащее конструкцию ДНК, предложенную в данном изобретении, или наоборот (например, применяя любой из способов трансформации растений к трансгенному растению или клетке растения). Такие дополнительные трансгенные признаки включают, но не ограничиваются ими: повышенную резистентность к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную устойчивость к засухе, повышенное качество семян, улучшенные питательные качества, производство семян гибрида, а также толерантность к гербицидам, при этом признак измеряется относительно растения дикого типа. Такие дополнительные трансгенные признаки известны специалистам в данной области техники; например, перечень таких признаков предоставляется Службой инспекции здоровья животных и растений (APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA).
[0075]
Трансгенные растения и потомство, которые содержат трансгенный признак, предложенный в данном изобретении, могут быть использованы с любыми способами скрещивания, которые широко известны в данной области техники. В линиях растений, содержащих два или большее количество трансгенных признаков, трансгенные признаки могут быть независимо сегрегирующими, сцепленными или комбинацией обоих в линиях растений, содержащих три или большее количество трансгенных признаков. Рассматривается также обратное скрещивание с родительским растением, и скрещивание с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описания способов скрещивания, которые обычно применяются для различных признаков и культур, хорошо известны специалистам в данной области техники. Для подтверждения присутствия трансгена(-ов) в конкретном растении или семени может быть выполнено множество анализов. Такие анализы включают, например, молекулярно-биологические анализы, такие как саузерн- и нозерн- блотинги, ПЦР и секвенирование ДНК; биохимические анализы, такие как обнаружение присутствия белкового продукта, например, иммунологическими способами (ИФА и вестерн-блоты) или с помощью ферментной функции; анализы части растений, такие как анализ листьев или корней; а также анализ фенотипа всего растения. Для анализа процессинга CTP в конкретном трансгенном растении или семени анализы, такие как расщепляющее секвенирование по Эдману или анализ масс-спектрометрии, могут быть выполнены на рекомбинантном белке DMO или PPO, полученном из трансгенной клетки, растения или семени, а полученные в результате данные последовательности сравнивали с данными белка DMO или PPO, соответственно.
[0076]
Интрогрессия трансгенного признака в генотип растения достигается в результате процесса конверсии обратного скрещивания. Генотип растения, в который был интрогрессирован трансгенный признак, можно назвать преобразованным с помощью обратного скрещивания генотипом, линией, инбредом или гибридом. Подобным же образом генотип растения, лишенный желаемого трансгенного признака, можно назвать непреобразованным генотипом, линией, инбредом или гибридом.
[0077]
В данном контексте термин «содержащий» означает «включающий, но не ограничивающийся этим».
Примеры
[0078]
Следующие примеры включены для демонстрации вариантов осуществления данного изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, в свете настоящего описания, что в конкретных предложенных вариантах осуществления данного изобретения можно совершить многие изменения, при этом по-прежнему получится сходный или аналогичный результат, без отступления от объема и концепции изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются химически или физиологически родственными, могут быть заменены описанными в данном документе агентами с получением того же или сходного результата. Все таковые сходные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы объема и концепции данного изобретения.
Пример 1. Экспрессия CTP-DMO и локализация в протопластах сои
[0079]
Анализ протопластов сои применяли для оценки относительной эффективности нацеливания хлоропласта рекомбинантного белка, содержащего один из пяти CTP, функционально связанных с последовательностью DMO (SEQ ID NO: 27). Для контроля распределения цитозоля и хлоропласта рекомбинантного белка, в кассету, кодирующую рекомбинантную комбинацию CTP и DMO (обозначенную в данном документе как CTP-DMO), добавляли последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок, в результате чего зеленый флуоресцентный белок сливался с карбокситерминальным концом DMO.
[0080]
2
Протопласты получали из семядолей бобов (зародышевая плазма A3244). Собирали незрелые семенные стручки сои и семена (длиной 4-6 мм) удаляли с помощью стерильных методик. Семядоли из каждого семени удаляли вручную, поперечно нарезали на кусочки толщиной 1 мм и инкубировали в буфере CPW (рН 5,8) с 0,7 М маннита в течение 1 часа при 24-26° С в темноте при встряхивании при 40 об/мин. Затем буфер удаляли и заменяли на ферментный буфер (4% целлюлаза 'onozuka' R-10, 2% гемицеллулаза, 0,3% макерозим R-10, в буфере CPW (рН 5,8, с 0,49 М маннита). Ткань семядоли инкубировали на ротационном шейкере при 50 об /мин при 24-26°С в течение 2 часов. В конце этой инкубации протопласты сои высвобождали из ткани семядолей, вручную осуществляя вихревые движения пластинки и фильтруя суспензию через двойной слой из нейлоновой сетки 60 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. Протопласты осторожно однократно промывали с последующим ресуспендированием и центрифугированием. Конечный осадок ресуспендировали в буфере (4 мМ MES, рН 5,7, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,5 М маннита) и оставляли на 1 час на льду. Затем протопласты центрифугировали, а осадок ресуспендировали в буфере для трансформации (0,4 М маннитола, 15 мМ MgCl2, 4 мМ MES, рН 5,7). Объем корректировали для получения 1 × 10 000 000 протопластов/мл. Трансформацию осуществляли путем смешивания 12,5 мкг ДНК для каждой конструкции. ДНК аккуратно объединяли с 1,5 × 1 000 000 протопластов с последующим добавлением эквивалентного объема ПЭГ-буфера. Смесь инкубировали в течение 5 минут, затем медленно разбавляли 300 мкл буфера W5 (154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl; 5 мM KCl; 2 мM MES, pH 5,7). Смесь инкубировали 5-10 минут и затем медленно добавляли 900 мкл буфера W5. Протопласты осаждали и ресуспендировали в буфере WI (0,5 М маннита, 4 мМ MES (рН 5,7), 20 мМ KCl) и инкубировали при температуре 24-26°C в темноте. Микроскопический анализ проводили с применением лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM510 META (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Торнвуд, штат Нью-Йорк), оснащенный криптон-аргоновым ионным (458, 488 нм) лазером, зеленым (543 нм) гелий-неоновым лазером и набором красных фильтров FITC и Texas. Получение и анализ изображений выполняли с помощью ZEN 2012 v. 8. 1 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Торнвуд, штат Нью-Йорк) и 40X водного 1. 2 светосильного объектива. Используемые длины волн возбуждения составляли 488 нм (GFP) и 543 нм (автофлуоресценция хлоропласта), а эмиссионные фильтры были 500-530 нм (GFP) и 630-700 нм (автофлуоресценция хлоропласта). В каждой конструкции оценивали по меньшей мере 50 отдельных клеток на предмет локализации конструкции: цитозоль, пластида, или и цитозоль и пластида. Результаты, которые регистрировались как процент клеток, имеющих белок, локализованный в цитозоле или пластиде (или и в цитозоле и в пластиде) от общего количества анализируемых клеток, представлены в Таблице 4.
Таблица 4. Анализ нацелевания на протопласты сои
<b>CTP</b>
<b>Общее количество подсчитанных клеток</b>
<b>Цитозоль </b>
<b>Цитозоль и пластида </b>
<b>Пластида </b>
APG6 (SEQ ID NO: 1)
58
0
0
100%
At.CR88 (SEQ ID NO: 3)
53
0
6%
94%
A
53
0
21%
79%
В
54
0
91%
9%
C
56
0
82%
18%
нет
55
100%
0
0
[0081]
Из пяти проанализированных комбинаций CTP-DMO только APG6 CTP (SEQ ID NO: 1) обуславливала наличие 100% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластиде. At.CR88 CTP (SEQ ID NO: 3) обуславливала наличие 94% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластиде и 6% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластиде. 'A' CTP обуславливала наличие 79% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластидах, и 21% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластиде. 'B' CTP обуславливала наличие 9% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластидах, и 91% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластидах. 'C' CTP обуславливала наличие 18% клеток, демонстрирующих локализацию белка исключительно в пластидах, и 82% клеток, демонстрирующих локализацию белка в цитозоле и пластидах. Без CTP, белок присутствовал только в цитозоле. Эти результаты указывают на то, что комбинация APG6 CTP является эффективной для нацеливания CTP-DMO на пластиды на 100%, а At.CR88 CTP является эффективной для нацеливания CTP-DMO на пластиды на 94%.
Пример 2. Процессинг CTP-DMO в трансгенной пшенице
[0082]
Трансгенные растения пшеницы, трансформированные конструкцией ДНК, содержащей молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующую один из четырех отдельных CTP, функционально связанную с DMO, применяли для оценки экспрессии белка и для определения процессинга CTP.
[0083]
Agrobacterium tumefaciens
Трансгенные растения пшеницы получали с помощью четырех различных векторов трансформации растений, каждый из которых содержал конструкцию ДНК, содержащую один из четырех различных CTP, функционально связанную с DMO, функционально связанного с промотором. Предварительно культивированные незрелые эмбрионы из пшеницы зародышевой плазмы Samson (PVP 1994) трансформировали с применением  для получения трансгенных ростков с помощью способов, известных специалистам в данной области техники. Образцы листьев отбирали для молекулярного анализа с целью подтверждения количества копий трансгена в геноме каждого уникального трансформанта, при этом растения R0 с одной копией трансгена самоопылялись, после чего собирали семена R1.
[0084]
Семена (50 г) измельчали до порошка, который затем добавляли в 250 мл экстракционного буфера (1 × TBE (89 мМ Трис-борат, 2 мМ ЭДТК, рН 8,4), 200 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 5 мМ бензамидина, 2 мМ дитиотреитола (DTT), ингибиторы протеазы cOmplete™ (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, штат Индиана)) и гомогенизировали с помощью Polytron (VWR, Раднор, штат Пенсильвания) в течение около 20 секунд, затем инкубировали при встряхивании при 4°C в течение 1-2 часов. Смесь центрифугировали при 4°C в течение 25 мин при 9000 об/мин и супернатант осаждали последовательно с помощью 10% и 55% насыщенного сульфата аммония (AS), причем каждую стадию осаждения центрифугировали при 18000 об/мин в течение 20 минут. Сгусток из осадка 10% AS удаляли.
[0085]
Сгусток из 10-55% фракции растворяли в 30 мл ФСБ (0,1 М фосфата натрия, 0,15 М NaCl) с 1 таблеткой ингибиторов протеазы cOmplete™. Растворенный сгусток центрифугировали и супернатант фильтровали через мембрану 0,22 мкм. Сыворотки с козьим поликлональным антителом против DMO смешивали с 1:1 суспензией белковой A/G агарозной смолы Pierce™ (ThermoFischer Scientific, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк), через 1,5 часа белковую A/G агарозную смолу, нагруженную анти-DMO Ab, промывали 3 раза ФСБ и добавляли к около 30 мл 10% -55% AS фильтрованной фракции. После инкубации смолу центрифугировали и промывали 3 раза ФСБ, затем ресуспендировали в 1 мл ФСБ и переносили в микроцентрифужную пробирку и снова осаждали центрифугованием.
[0086]
Конечный сгусток ресуспендировали в буфере 2X Laemmli, кипятили в течение 5 минут и образцы проганяли в 10% геле ДСН-ПААГ в трис-глициновом буфере при 185 В (постоянный ток). Белки в геле ДСН-ПААГ переносили на PVDF-мембрану с помощью буфера для переноса CAPS в течение 30 мин при 4°C и 100 В. Белки, связанные с мембраной PDVF, окрашивали голубым Кумасси в течение около 30 секунд, а полосу, соответствующую каждому из белков DMO в 10% -55% AS фракции, вырезали из пятна (блота) PVDF и применяли для анализа аминоконцевой последовательности белка. Аминоконцевое секвенирование белка проводили с помощью автоматизированного химического анализа расщепления по Эдману, причем каждый анализ проводили в течение 15 циклов с использованием автоматизированного химического анализа расщепления по Эдману. Для анализа и контроля с помощью программного обеспечения Procise Control (версия 2. 1) (ThermoFischer Scientific, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) применяли систему секвенирования Applied Biosystems 494 Procise (Applied Biosystems 494 Procise Sequencing System) с микроградиентным насосом 14°C и детектором Perkin Elmer серии 200 UV/Vis (Perkin Elmer Series 200 UV/Vis Detector). Хроматографические данные собирали с помощью программного обеспечения для анализа секвенирования белка SequencePro (версия 2. 1). Идентичность констатировали для каждого белка, если наблюдали по меньшей мере 8 аминокислот, согласующихся с прогнозированной последовательностью ожидаемого белка. Результаты аминоконцевого секвенирования представлены в Таблице 5.
Таблица 5. Аминоконцевое секвенирование рекомбинантного белка
<b>Тестируемый трансформант</b>
<b>CTP</b>
<b>DMO</b>
<b>Процессинг CTP-DMO</b>
<b>2</b>
<b>APG6 (SEQ ID NO: 1)</b>
<b>DMO (SEQ ID NO: 18)</b>
<b>DMO+1</b>
<b>3</b>
<b>At.CR88 (SEQ ID NO: 3)</b>
<b>DMO (SEQ ID NO: 18)</b>
<b>DMO и DMO+1</b>
<b>1</b>
<b>CTP4 (SEQ ID NO: 4)</b>
<b>DMO (SEQ ID NO: 19)</b>
<b>DMO+12 </b>
<b>2</b>
<b>Os.Waxy (SEQ ID NO: 6)</b>
<b>DMO (SEQ ID NO: 18)</b>
<b>DMO+10 и DMO-1</b>
[0087]
Идентификаторы DMO, DMO+1, DMO+10 и DMO+12 применяли для обозначения того, что в результате секвенирования белка на аминотерминальном конце DMO после процессинга оставалось 0, 1, 10 или 12 аминокислот CTP, соответственно. Идентификатор DMO-1 применяли для обозначения того, что первый метионин DMO удалялся после процессинга. Два уникальных трансформанта тестировали на предмет CTP APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Оба образца продемонстрировали одну аминокислоту CTP, оставшуюся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO+1). Два уникальных объекта анализировали на предмет At.CR88 CTP (SEQ ID NO: 3), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Все три образца продемонстрировали либо отсутствие, либо одну аминокислоту CTP, оставшуюся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO и DMO+1). Трансформант, протестированный из CTP4 (SEQ ID NO: 4), функционально связанного с DMO (SEQ ID NO: 19), продемонстрировал двенадцать аминокислот CTP, оставшихся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO+12). Два уникальных трансформанта тестировали на предмет Os.Waxy CTP (SEQ ID NO: 6), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Один образец продемонстрировал десять аминокислот CTP, оставшихся на аминотерминальном конце DMO после процессинга (DMO+10), и один образец продемонстрировал удаление первого метионина DMO после процессинга (DMO-1). Эти результаты указывают на то, что CTP APG6 и At.CR88 CTP эффективно процессируются из DMO при экспрессии в трансгенных растениях.
Пример 3. Экспрессия CTP-DMO в трансгенной
Brassica napus
[0088]
Brassica napus
Способность конструкций ДНК, содержащих рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из трех отдельных CTP, функционально связанный с DMO, обеспечивать толерантность к дикамбе, оценивали с помощью трансгенных растений .
[0089]
Brassica napus
Brassica napus
Agrobacterium
Трансгенные растения  получали с помощью трех различных векторов трансформации растений, каждый из которых содержал конструкцию ДНК, содержащую один из трех различных CTP, функционально связанный с DMO, функционально связанного с промотором. Разновидность 65037 линии Restorer  применяли для -опосредованной трансформации и выращивали растения R0 в теплице. Уникальные трансформанты скринировали на предмет числа копий трансгена. Растения R0 с одной копией трансгена подвергали самоопылению, после чего собирали семена R1.
[0090]
Толерантность к дикамбе оценивали с применением растений R0 с одной копией трансгена с векторным остовом или двумя копиями трансгена. Толерантность к дикамбе определяли при показателе пораженности 20% растения или менее, обусловленного дикамбой в условиях теплицы. Трансформанты R0 в горшках разделяли на три группы, а дикамбу (Clarity) применяли в одном из трех количеств: (1) дикамбу не применяли, (2) 1 фунт к.э./акр дикамбы (количество 2X), или (3) 2 фунта к.э./акр дикамбы (количество 4X). Трансгенные растения опрыскивали, а оценку пораженности проводили через 21 день. Растения, содержащие комбинацию ʺAʺ CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), не продемонстрировали каких-либо трансформантов, толерантных к дикамбе. Растения, содержащие RbcS CTP (SEQ ID NO: 5), функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), продемонстрировали 8 из 9 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 2Х, и 7 из 7 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 4Х. Растения, содержащие APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 20), продемонстрировали 7 из 14 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 2Х, и 6 из 18 трансформантов, характеризующихся толерантностью к дикамбе в количестве 4Х. Результаты приведены в Таблице 6.
Таблица 6. Толерантность растений рода капусты (
Brassica napus)
R0 к дикамбе
<b>CTP</b>
<b>DMO</b>
<b>Трансформанты с толерантностью к 2X</b>
<b>Трансформанты с толерантностью к 4X</b>
<b>APG6 (SEQ ID NO: 1)</b>
<b>SEQ ID NO: 20</b>
<b>7/14</b>
<b>6/18</b>
<b>RbcS (SEQ ID NO: 5)</b>
<b>SEQ ID NO: 21</b>
<b>8 /9</b>
<b>7/7</b>
<b>A (Конструкция 7)</b>
<b>SEQ ID NO: 21</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
[0091]
Толерантность к дикамбе оценивали на растениях R0 с одной копией трансгена. В теплице растения опрыскивали дикамбой (Clarity) в количестве 1 фунт к.э./акр (количество 2Х), а толерантность к дикамбе оценивали через 14-21 день. Растения, содержащие комбинацию APG6 CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 20), продемонстрировали 13 трансформантов из 31, характеризующихся толерантностью к дикамбе. Растения, содержащие RbcS CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), продемонстрировали 13 трансформантов из 17, характеризующихся толерантностью к дикамбе. Растения, содержащие ʺAʺ CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21), продемонстрировали 7 трансформантов из 18, характеризующихся толерантностью к дикамбе. Результаты приведены в Таблице 7.
Таблица 7. Толерантность растений рода капусты (
Brassica napus)
R0 к дикамбе
<b>CTP</b>
<b>DMO</b>
<b>Трансформанты с толерантностью к 2X</b>
<b>APG6 (SEQ ID NO: 1)</b>
<b>SEQ ID NO: 20</b>
<b>13/31</b>
<b>RbcS (SEQ ID NO: 5)</b>
<b>SEQ ID NO: 21</b>
<b>13/17</b>
<b>A (Конструкция 7)</b>
<b>SEQ ID NO: 21</b>
<b>7/18</b>
[0092]
Десять семян от каждого из 28 растений R1, содержащих CTP APG6, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 20) (APG6+DMO), и десять семян от каждого из 17 растений R1, содержащих RbcS CTP, функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 21 ) (RbcS+DMO), выращивали в теплице. Растения опрыскивали дикамбой в количестве 2 фунта к.э./акр (4X) в день посадки, затем - 1 фунт к.э./акр (2X) дикамбы в фазе V3 и 1 фунт к.э./акр дикамбы(2X) при первом цветении (цветение определяли как > 90% растений, имеющих бутоны, и около 25% растений, имеющих по меньше мере один открытый цветок). Оценку пораженности проводили через семь дней после каждого опрыскивания и выражали в виде процентного показателя пораженности по сравнению с группами с контрольным опрыскиванием. Среди растений, содержащих APG6+DMO, было в общей сложности 9 потомков от 2 трансформантов с показателем пораженности дикамбой ≤ 20% в каждом из трех периодов оценки. Среди растений, содержащих RbcS+DMO, зарегистрировано 77 растений среди 16 трансформантов с толерантностью к дикамбе менее 20% в каждом из трех периодов оценки.
[0093]
Белок характеризовали с применением листьев, собранных от трансформантов R0. Ткань листьев измельчали в жидком азоте и экстрагировали двумя объемами 2X буфера Лэммли (BioRad, Геркулес, штат Калифорния), содержащим 10% 2-меркаптоэтанола и 5 мМ DTT. Образцы кипятили и 10 мкл загружали в 4-20% готовый гель Criterion™ (BioRad, Геркулес, штат Калифорния) и анализировли в буфере Трис/глицин/SDS при 250 В в течение 45 минут. Белок в геле переносили на мембрану PVDF при 400 мА в течение 30 минут в буфере Трис/глицин, содержащем 20% метанола. Белок DMO обнаруживали с применением поликлональной кроличьей антисыворотки анти-DMO и HRP-конъюгированного анти-кроличьего вторичного антитела. Сигнал обнаруживали с применением хемилюминесцентного набора SuperSignal™ West Pico (Thermo Fisher Scientific, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк). Для каждого из трех трансформантов, содержащих APG6-DMO, регистрировали одну полосу около 38 кДа, которая имела ожидаемый размер для полностью процессированного белка DMO. Для каждого из шести трансформантов, содержащих RbcS-DMO, регистрировали две полосы около 38 кДа и около 41 кДа. Полоса 41 кДа соответствует DMO+27, и о ней ранее сообщалась в сое, содержащей RbcS-DMO (патент США №7838729). Регистрировали очень низкий уровень экспрессии белка DMO во всех трансформантах, содержащих ʺAʺ CTP-DMO, а сигнал, обнаруженный после длительного воздействия, представлял собой полосу около 50 кДа и полосу около 39 кДа. Полоса 50 кДа приближалась к ожидаемому размеру непроцессированного ʺAʺ CTP-DMO. Эти результаты показывают, что APG6-DMO продуцирует одну полосу ожидаемого размера, соответствующую полностью процессированному DMO.
[0094]
Рекомбинантный белок очищали из ткани листьев растений R0, содержащих APG6-DMO или RbcS-DMO. Анализ аминоконцевой последовательности проводили с помощью описанного химического анализа расщепления по Эдману. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие DMO аминоконцевых последовательностей DMO+27 и DMO-1, присутствующих в растениях, содержащих RbcS-DMO, соответствующих размеру полос DMO, регистрируемых при анализе вестерн-блот. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие только DMO-аминоконцевых последовательностей DMO+1, присутствующих в растениях, содержащих APG6-DMO, соответствующих размеру полос DMO, регистрируемых при анализе вестерн-блот. Этот результат подтверждает, что применение APG6 CTP приводит к полному процессингу функционально связанного DMO в растениях.
Пример 4. Экспрессия CTP-DMO в трансгенной кукурузе
[0095]
Экспрессия конструкций ДНК, содержащих рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из двух отдельных CTP, функционально связанный с DMO, анализировали в трансгенных клетках и растениях кукурузы.
[0096]
Транзиентную трансформацию протопласта мезофилла кукурузы применяли для оценки относительной экспрессии DMO двух комбинаций CTP-DMO. Указанные конструкции ДНК были идентичны, за исключением того, что CTP, функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18), представлял собой либо APG6 (SEQ ID NO: 1), либо CTP4 (SEQ ID NO: 4). Протопласты получали в основном так, как описано в Примере 1. После трансформации клетки собирали, а уровни белка DMO определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Протеин из четырех трансформированных образцов протопластов измеряли для каждой комбинации CTP-DMO в нанограммах (нг) DMO на миллиграмм (мг) общего белка. Протопласты, трансформированные APG6-DMO, имели приблизительно в 4 раза более высокие уровни DMO по сравнению с протопластами, трансформированными CTP4-DMO. Данные представлены в Таблице 8.
[0097]
Трансгенные растения кукурузы получали с применением указанных конструкций ДНК, и выращивали растения R0. Образцы листьев собирали из растений R0, представляющих восемь уникальных однокопийных трансформантов, и применяли для количественного ИФА с целью измерения уровней DMO. Экспрессия DMO в ткани листьев R0 была приблизительно в 4 раза выше у трансформантов, содержащих APG6-DMO, по сравнению с трансформантами, содержащими CTP4-DMO. Данные представлены в Таблице 8.
[0098]
Аминоконцевое секвенирование проводили для DMO, экспрессируемого в трансгенных растениях кукурузы. Белок очищали из трансгенных растений кукурузы, экспрессирующих CTP4-DMO или APG6-DMO, и готовили для расщепляющего секвенирования по Эдману, по существу, как описано в Примере 2. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие DMO аминоконцевых последовательностей DMO+6, DMO+7 и DMO+12 в растениях, содержащих CTP4-DMO. Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил наличие DMO аминоконцевых последовательностей DMO and DMO+1 в растениях, содержащих APG6-DMO. Эти результаты показывают, что процессинг CTP является более полным с APG6 по сравнению с CTP4, о чем свидетельствует меньшее количество аминокислот CTP, оставшихся на аминотерминальном конце DMO. Данные представлены в Таблице 8.
Таблица 8. Экспрессия белка DMO в кукурузе
<b>CTP</b>
<b>Уровни DMO протопласта </b><b>(нг/мг) (СО)</b>
<b>Уровни DMO растения R0 (нг/мг) (СО)</b>
<b>Процессинг CTP-DMO</b>
<b>APG6 </b><b>(SEQ ID NO: 1)</b>
<b>12,44 (1,91)</b>
<b>5,44 (0,82)</b>
<b>DMO и DMO+1</b>
<b>CTP4 </b><b>(SEQ ID NO: 4)</b>
<b>3,10 (0,64)</b>
<b>1,19 (0,55)</b>
<b>DMO+12, DMO+7 и DMO+6</b>
[0099]
Agrobacterium
Трансгенную кукурузу генерировали посредством трансформации, опосредованной , с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, с конструкцией ДНК, содержащей молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующую APG6-DMO или CTP4-DMO. Толерантность к дикамбе оценивали в испытании в поле для трансгенных гибридных растений F1. Испытание в поле включало четыре обработки в двух местах с двумя повторениями каждая. Четыре обработки были следующие: (1) дикамба (Clarity), применяемая в количестве 2 фунта к.э./акр (4X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8; (2) дикамба, применяемая в количестве 4 фунта к.э./акр (8X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8; (3) дикамба, применяемая в количестве 8 фунтов к.э./акр (16X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8; и (4) дикамба, применяемая в количестве 16 фунтов к.э./акр (32X) в фазе V2, затем - V4, и затем - V8. Пораженность культур оценивали через десять дней после обработки и определяли как процент пораженных культур на V-фазу (CIPV2, CIPV4 или CIPV8). В конце сезона зерно собирали, а урожай измеряли в бушелях/акр. Как для оценки пораженности в фазах CIPV, так и для оценки пораженнности урожая рассчитывали наименьшую значимую разницу (НЗР) с вероятностью 5% (р=0,05). Самые высокие количества дикамбы (16X и 32X), наносимые на гибридные растения F1, содержащие APG6-DMO, обуславливали несколько меньшее вегетативное поражение и более высокий урожай зерна по сравнению с растениями, содержащими CTP4-DMO. Данные представлены в Таблице 9.
Таблица 9. Испытание в поле гибридного растения F1 на предмет пораженности, вызванной дикамбой, и урожайности
<b>Дикамба </b>
<b>CTP-DMO</b>
<b>CIPV2 (НЗР=0,05)</b>
<b>CIPV4 (НЗР=0,05)</b>
<b>CIPV8 (НЗР=0,05)</b>
<b>Урожайность бу/акр (НЗР=0,05)</b>
<b>CTP4-DMO</b>
<b>0,75 (4,7)</b>
<b>0,75 (7,1)</b>
<b>4,25 (4,6)</b>
<b>239,13 (21,17)</b>
<b>APG6-DMO</b>
<b>0,75 (4,7)</b>
<b>2 (7,1)</b>
<b>3 (4,6)</b>
<b>231,99 (21,17)</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>40,63 (4,7)</b>
<b>45 (7,1)</b>
<b>49,38 (4,6)</b>
<b>58,25 (21,17)</b>
<b>CTP4-DMO</b>
<b>2 (5,4)</b>
<b>1,25 (6,6)</b>
<b>7,5 (5,3)</b>
<b>232,87 (17,11)</b>
<b>APG6-DMO</b>
<b>1,5 (5,4)</b>
<b>2 (6,6)</b>
<b>7,5 (5,3)</b>
<b>230,44 (17,11)</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>46,875 (5,4)</b>
<b>65 (6,6)</b>
<b>80 (5,3)</b>
<b>5,69 (17,11)</b>
<b>CTP4-DMO</b>
<b>2,5 (8,4)</b>
<b>4 (5,3)</b>
<b>15 (6,7)</b>
<b>206,63 (28,15)</b>
<b>APG6-DMO</b>
<b>1,5 (8,4)</b>
<b>4 (5,3)</b>
<b>11,25 (6,7)</b>
<b>242,37 (28,15)</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>73,125 (8,4)</b>
<b>81,25 (5,3)</b>
<b>87,375 (6,7)</b>
<b>3,51 (28,15)</b>
<b>CTP4-DMO</b>
<b>6,25 (4,8)</b>
<b>8,75 (3,1)</b>
<b>16,25 (0)</b>
<b>199,8 (18,35)</b>
<b>APG6-DMO</b>
<b>2 (4,8)</b>
<b>5,75 (3,1) </b>
<b>17,5 (0)</b>
<b>212,34 (18,35)</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>82,5 (4,8)</b>
<b>90,625 (3,1)</b>
<b>99,5 (0)</b>
<b>5,03 (18,35)</b>
Пример 5. Экспрессия CTP-DMO в трансгенном хлопчатнике и сое
[00100]
APP6 CTP оптимизировали для повышения эффективности трансляции белка (синтез белка) и увеличения накопления белка. Оптимизированная композиция APG6 CTP (SEQ ID NO: 2) характеризуется изменением аминокислоты треонина (Т) на серин (S) в положениях 3 и 4 APP6 CTP (SEQ ID NO: 1). Были созданы конструкции ДНК для сравнения двух CTP, каждый из которых является функционально связанным с DMO в сое.
[00101]
Agrobacterium.
Трансгенные растения сои создавали с помощью двух конструкций ДНК, которые были идентичны, за исключением APG6 CTP. Первая конструкция ДНК содержала APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18). Вторая конструкция ДНК содержала оптимизированный APG6 (SEQ ID NO: 2), функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18). Каждую конструкцию ДНК применяли для трансформации сои A3555 с помощью способов трансформации, опосредованных После трансформации, трансгенные растения R0, содержащие одну копию трансгена, идентифицировали с помощью анализа ПЦР. Растения R0 с одной копией трансгена выращивали в теплице, а семена R1 собирали. Десять семян R1 на один трансформант для 4 трансформантов, сгенерированных с помощью каждой из двух конструкций ДНК, и семена AG3555 высаживали для оценки толерантности культуры к послевсходовой обработке дикамбой в стандартных тепличных условиях выращивания. Дикамбу (Clarity) применяли в фазе V4 в количестве 1120 г аи/га. Оценку пораженности культуры проводили через 10 дней после обработки. Образцы листьев от толерантных к дикамбе растений сои отбирали для измерений уровня рекомбинантного белка и анализа аминоконцевой последовательности. Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составлял 13,35 ± 2,7 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенной сои, толерантных к дикамбе, с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составлял 18,55 ± 3,1 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенной сои, толерантных к дикамбе, с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2). В ткани листьев сои A3555 из группы отрицательного контроля никакого белка DMO не обнаруживали. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенной сои с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 3,6%. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенной сои с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 2,7%. У сои A3555 из группы отрицательного контроля показатель пораженности, обусловленных дикамбой, составил 99,8%. Образцы листьев от однокопийных растений R1 трансгенной сои, толерантных к дикамбе, применяли для аминоконцевого секвенирования (как описано в Примерах 2 и 4). Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил, что процессинг APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO приводит к полному процессингу CTP из аминоконца белка DMO. Уровни DMO, показатель пораженности, обусловленной дикамбой, и процессинг APG6-DMO продемонстрировали, что как APG6, так и оптимизированный APG6, если они функционально связаны с DMO, обеспечивают толерантность к дикамбе, и оба CTP подвергаются полному процессингу в растениях. Данные представлены в Таблице 10.
Таблица 10. Тестирование сои R1 в теплице
<b>CTP</b>
<b>Уровни DMO листьев (нг/мг)</b>
<b>Пораженность, вызванная дикамбой</b><b>фаза V4</b>
<b>APG6-DMO</b><b>процессинг</b>
<b>APG6</b><b>SEQ ID NO: 1</b>
<b>13,35 ± 2,7</b>
<b>3,6%</b>
<b>DMO</b>
<b>Оптимизированный APG6</b><b>SEQ ID NO: 2</b>
<b>18,55 ± 3,1</b>
<b>2,7%</b>
<b>DMO</b>
<b>Отрицательный контроль A3555</b>
<b>Не обнаружено</b>
<b>99,8%</b>
<b>неприменимо</b>
[00102]
Agrobacterium,
Трансгенные растения хлопчатника создавали с помощью двух конструкций ДНК, которые были идентичны, за исключением APG6 CTP. Первая конструкция ДНК содержала APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с DMO (SEQ ID NO: 18). Вторая конструкция ДНК содержала оптимизированную APG6 CTP (SEQ ID NO: 2), функционально связанную с DMO (SEQ ID NO: 18). Каждую конструкцию ДНК трансформировали в хлопчатник с помощью способов трансформации, опосредованных  и известных в данной области техники. После трансформации, трансгенные растения хлопчатника R0, содержащие одну копию трансгена, идентифицировали с помощью анализа ПЦР, выращивали в теплице, и собирали семена R1. Десять семян R1 на один трансформант для 10 трансформантов для каждой конструкции и семена хлопчатника DP393 высаживали для оценки толерантности культуры к послевсходовой обработке дикамбой. Дикамбу (Clarity) применяли в фазе V4 в количестве 1120 г аи/га. Процентную оценку пораженности культуры проводили через 9 дней после обработки. Образцы листьев толерантных растений хлопчатника использовали для измерения уровня белка и анализа аминоконцевой последовательности APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO. Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составил 176,2 ± 103 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника, толерантных к дикамбе, с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18). Уровень белка DMO, определяемый с помощью ИФА, составил 136,5 ± 58,6 нг/мг для однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника, толерантных к дикамбе, с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2). В ткани листьев хлопчатника DP393 из группы отрицательного контроля никакого белка DMO не обнаруживали. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника с APG6 CTP (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 2,6%. Показатель пораженности, обусловленной дикамбой, у однокопийных растений R1 трансгенного хлопчатника с оптимизированной APG6 CTP (SEQ ID NO: 2), функционально связанной с DMO (SEQ ID NO: 18), определяли на уровне 2,2%. Показатель пораженности хлопчатника DP393 из группы отрицательного контроля составил 85%. Образцы листьев от однокопийных растений R1, толерантных к дикамбе, применяли для аминоконцевого секвенирования (как описано в Примерах 2 и 4). Анализ аминоконцевой последовательности подтвердил, что процессинг APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO приводит к полному процессингу CTP из аминоконца белка DMO. Уровни экспрессии белка DMO, показатель пораженности, обусловленной дикамбой, и процессинг APG6-DMO и оптимизированной APG6-DMO продемонстрировали, что как APG6, так и оптимизированный APG6, если они функционально связаны с DMO, обеспечивают толерантность к дикамбе, и оба CTP подвергаются полному процессингу в растениях. Данные представлены в Таблице 11.
Таблица 11. Тестирование хлопчатника R1 в теплице
<b>CTP</b>
<b>Уровни</b><b>DMO листьев (нг/мг)</b>
<b>Пораженность, вызванная дикамбой, %</b><b>фаза V4</b>
<b>Процессинг APG6-DMO</b>
<b>APG6</b><b>(SEQ ID NO: 1) </b>
<b>176,2 ± 103</b>
<b>2,6%</b>
<b>DMO</b>
<b>Оптимизированный APG6 (SEQ ID NO: 2)</b>
<b>136,5 ± 58,6</b>
<b>2,2%</b>
<b>DMO</b>
<b>Отрицательный контроль DP393</b>
<b>Не обнаружено</b>
<b>85%</b>
<b>неприменимо</b>
Пример 6. Экспрессия CTP-PPO в трансгенной кукурузе
[00103]
E. coli
Новые PPO, которые являются толерантными к гербицидам PPO, идентифицировали с помощью скрининговой системы, использующей гербициды и бактерии. Эта скрининговая система анализировала рост нокаутного штамма  в жидкой среде LB с гербицидом PPO для идентификации PPO, которые не чувствительны к гербициду PPO.
[00104]
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Нокаутный штамм  трансформировали бактериальным экспрессионным вектором, содержащим подтвержденную активность PPO и культивировали в жидкой среде LB. К среде добавляли очищенную кристаллическую форму одного из пяти различных гербицидов PPO (ацифлуорфен (1 мМ), флумиоксазин (0,5 мМ), лактофен (0,5 мМ), фомесафен (1 мМ) и S-3100 (100 мкМ), представляющей три разных химических подкласса PPO. Рекомбинантные белки экспрессировали и измеряли темпы роста Кривые роста (OD600) анализировали для разных вариантов в присутствии и отсутствии гербицидов PPO в выбранных моментах времени от момента времени "0" до момента времени "24 часа". Рост трансформированного нокаутного штамма  в среде LB в присутствии гербицида PPO указывает на то, что ген, применяемый для трансформации , кодировал невосприимчивую к гербицидам протопорфириногеноксидазу (iPPO).
[00105]
E. coli
E. coli
Обнаружено, что десять PPO, представленные как SEQ ID NO: 40-49, обеспечивают нормальные темпы роста на нокаутного штамма  в среде LB в присутствии гербицида PPO, что указывает на то, что эти белки представляют собой невосприимчивые к гербицидам протопорфириногеноксидазы (iPPO). Нокаутный штамм , экспрессирующий WH_PPO (SEQ ID NO: 60), был чувствителен ко всем пяти гербицидам PPO, подтверждая то, что анализ был способен различать чувствительные и нечувствительные PPO для каждого из гербицидов.
[00106]
в условиях поля
Были созданы четыре вектора трансформации растений для экспрессии PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) . Конструкции трансформации 1 и 11 имели такую же комбинацию промотора плюс лидер плюс интрон, ту же последовательность 3'UTR, тот же PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), но отличались последовательностями CTP и применялись для трансформации сои. Конструкции трансформации 6 и 16 имели такую же комбинацию промотора плюс лидер плюс интрон, ту же последовательность 3'UTR, тот же PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), но отличались последовательностями CTP и применялись для трансформации кукурузы. В Таблице 12 представлена конфигурация конструкций трансформации растений PPO H_N10.
Таблица 12. Конфигурация конструкции с PPO H_N10
<b>Трансформация культуры</b>
<b>Конструкция</b>
<b>CTP</b>
<b>CTP SEQ ID NO</b>
<b>Соя и хлопчатник</b>
<b>1</b>
<b>APG6</b>
<b>SEQ ID NO: 1</b>
<b>Соя</b>
<b>11</b>
<b>12G088600TP</b>
<b>SEQ ID NO: 38</b>
<b>Кукуруза</b>
<b>6</b>
<b>APG6</b>
<b>SEQ ID NO: 1</b>
<b>16</b>
<b>12G088600TP</b>
<b>SEQ ID NO: 38</b>
[00107]
Ферменты PPO экспрессировали в трансгенных растениях кукурузы, а трансгенные растения анализировали на предмет толерантности к гербициду PPO. Были сконструированы векторы трансформации растений, содержащие рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из ферментов PPO, представленные как SEQ ID NO: 40-59. Последовательность ДНК, кодирующая фермент РРО, может включать на 5'-конце кодон для метионина, обычно известный как стартовый кодон, или этот кодон можно исключить с целью облегчения функциональной связи последовательности транзитного пептида хлоропластаста с 5'-концом кодирующей последовательности. Примеры белковых последовательностей фермента PPO, содержащих метионин на аминоконце, представлены как SEQ ID NO: 40-49. Примеры белковых последовательностей фермента PPO, не содержащих метионин на аминоконце, представлены как SEQ ID NO: 50-59. Для трансформации растений, нуклеотидные последовательности, кодирующие предполагаемые ферменты РРО, оптимизировали кодоном с целью либо двудольной, либо двудольной экспрессии. В Таблице 2 представлены SEQ ID NO, соответствующие белковым и нуклеотидным последовательностям ферментов PPO в векторах трансформации.
[00108]
в условиях поля
Agrobacterium tumefaciens
При тестировании кукурузы кукурузу (LH244) трансформировали, применяя  и стандартные способы, известные в данной области техники. Трансгенные растения F1, полученные в результате ауткроссинга однокопийных растений R0, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID NO: 43) в одной из двух конфигураций конструкции, были протестированы в теплице на предмет толерантности к гербициду. Растения обрабатывали гербицидом S-3100 в количестве 40 г/га в фазе роста V3, и через семь дней после обработки оценивали показатель пораженности. Среди трансгенных растений кукурузы, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID NO: 43) в конфигурации конструкции 6 (APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), получили 13 из 18 трансформантов, продуцирующих растения с высокой толерантностью (10% или меньше поражений), тогда как в результате применения конфигурации конструкции 16 (12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), не получили трансформантов, продуцирующих растения с высокой толерантностью.
[00109]
Трансгенные растения F1, полученные в результате ауткроссинга однокопийных растений R0, экспрессирующих H_N10 (SEQ ID NO: 43) в одной из двух конфигураций конструкции (конструкции 6 и 16), были протестированы в поле на предмет толерантности к гербициду. Эта популяция F1 была сегрегированной (50% гемизиготных и 50% нулевых), причем селекцию для трансгенных растений до оценки пораженности не проводили. Ожидается, что общий средний показатель пораженности для такой популяции будет выше, чем для гомогенной трансгенной популяции, поскольку нетрансгенные растения среди трансгенных растений обнаружить трудно. Испытания проводили в двух местах с двумя повторениями и 3 обработками на каждую конструкцию. В качестве отрицательного контроля применяли нетрансгенные растения кукурузы. Обработки с нанесением гербицидов проводили следующим образом: Обработку 1 осуществляли гербицидом S-3100 в количестве 0,036 фунтов аи/акр, наносимым в V2, затем - в V4, а затем - V8; Обработку 2осуществляли гербицидом S-3100 в количестве 0. 072 фунтов аи/акр, наносимым в V2, затем - в V4, а затем - V8; Обработку 3осуществляли гербицидом S-3100 в количестве 0. 144 фунтов аи/акр, наносимым в V2, затем - в V4, а затем - V8. Процентный показатель пораженности культуры оценивали в фазе роста V2 (CIPV2) и в фазе роста V4 (CIPV4) на 5-7 день после обработки (ошибка V2 и ошибка V4 составляют половину наименьшей значимой разницы (НЗР)). Оценку пораженности культуры комбинировали для обоих мест. Все нетрансгенные растения и растения с трансформантами, генерируемыми с помощью конструкции 16 (12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), продемонстрировали показатель пораженности от 94,6 до 99,5% после применения гербицида как в фазе V2, так и в фазе V4 для каждой из трех обработок. Все растения с трансформантами, генерируемыми с помощью конструкции 6 (APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанной с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), продемонстрировали только 30% -50% пораженность после применения гербицида в фазе V2 и отсутствие пораженности после применения гербицида в фазе V4. Данные представлены в Таблице 13.
Таблица 13. Полевое испытание эффективности кукурузы F1, содержащей PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)
<b>Обра-ботка</b>
<b>Конструкция</b>
<b>CTP</b>
<b>CTP</b><b>SEQ ID NO</b>
<b>CIPV2</b>
<b>CIPV4</b>
<b>Ошибка</b><b>V2</b>
<b>Ошибка</b><b>V4</b>
Обр 1
отрицательный контроль
н/д
н/д
94,6
99
8,6
1,2
6
APG6
1
37,5
0
8,6
1,2
16
12G088600TP
38
96,3
98,5
8,6
1,2
Обр 2
отрицательный контроль
н/д
н/д
99,5
99,5
5,4
0
6
APG6
1
37,5
0
5,4
0
16
12G088600TP
38
99,5
99,5
5,4
0
Обр 3
отрицательный контроль
н/д
н/д
99,5
99,5
0
0
6
APG6
1
50
0
0
0
16
12G088600TP
38
99,5
99,5
0
0
[00110]
Данные исследований трансгенной кукурузы F1 в теплице и в поле продемонстрировали, что APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)), приводил к снижению показателей пораженности при экспрессии в трансгенных растениях по сравнению с показателями пораженности, наблюдаемыми, когда 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), экспрессировался в трансгенных растениях. См. Фигуру 1.
[00111]
в условиях поля
Agrobacterium tumefaciens
Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии либо PPO H_N40 (SEQ ID NO: 54), либо PPO H_N90 (SEQ ID NO: 50), функционально связанных с APG6 (SEQ ID NO: 1), CTP D или CTP E. Кукурузу (01DKD2) трансформировали, применяя  и стандартные способы, известные в данной области техники. Образцы листьев, взятые из полученных растений R0, анализировали с помощью ПЦР для определения количества копий трансгенной вставки. Растения R0, каждое из которых содержало уникальный трансформант, опрыскивали гербицидом S-3100 в количестве 40 г аи/га или 80 г аи/га приблизительно в фазе роста V5, и через 4-7 дней после обработки осуществляли оценку пораженности. Регистрировали количество растений с ≤10% пораженностью (высокая толерантность) или ≤20% пораженностью (толерантность) от общего количества орошенных растений. Растения, которые были определены как однокопийные трансформанты и после опрыскивания характеризовались пораженностью ≤20%, подвергались самоопылению и ауткроссингу. Данные представлены в Таблице 14.
Таблица 14
. Оценка толерантности трансгенной кукурузы к гербицидам CTP-PPO
<b>Конфигурация конструкции</b>
<b>CTP</b>
<b>PPO</b>
<b>Количество S-3100</b><b>(г аи/га)</b>
<b>≤ 10% пораженность</b>
<b>≤ 20% пораженность</b>
17
APG6
H_N40
80
42/112 (37,5%)
65/112(58%)
17
D
H_N40
80
0/46(0%)
1/46(2,2%)
17
E
H_N40
40
0/101(0%)
13/101(12,9%)
17
APG6
H_N90
40
55/112(49,1%)
63/112(56,3%)
18
APG6
H_N40
80
45/112(40,2%)
66/112(58,9%)
18
E
H_N40
40
9/112(8%)
36/112(32,1%)
19
APG6
H_N40
80
12/56(21,4%)
23/56(41,1%)
19
E
H_N40
40
3/112(2,7%)
9/112(8,0%)
[00112]
Полученные результаты демонстрируют, что APG6 (SEQ ID NO: 1) последовательно продуцировал более высокую толерантность к гербицидам по сравнению с растениями, трансформированными CTP D или CTP E, когда они функционально связаны с H_N40 (SEQ ID NO: 54) или H_N90 (SEQ ID NO: 50). APG6, когда он являлся функционально связанным с H_N40, приводил к тому, что от 21,4% до 40,2% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и от 41,1% до 58,9% трансгенных растений были толерантными к S-3100 при применении в количестве 80 г аи/га. APG6, когда он являлся функционально связанным с H_N90, приводил к тому, что 49,1% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и 56,3% трансгенных растений были толерантными к S-3100 при применении в количестве 40 г аи/га. CTP D, когда он являлся функционально связанным с H_N40, приводил к тому, что 0% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и 2,2% были толерантными к S-3100 при применении в количестве 80 г аи/га. CTP E, когда он являлся функционально связанным с H_N40, приводил к тому, что от 0% до 8% трансгенных растений характеризовались высокой толерантностью, и 12. 9% to 32. 1% были толерантными к S-3100 при применении более низкого количества гербицида 40 г аи/га.
[00113]
Трансгенную гибридную кукурузу F1, экспрессирующую APG6, функционально связанный с PPO H_N10, оценивали на предмет толерантности к семи различным гербицидам PPO: S-3100, фомесафену, ацифлуорфену, лактофену, флумиоксазину, сульфентразону, и сафлюфенацилу. Собранные вместе семена, представляющее 5 уникальных трансформантов, высаживали в горшки в теплице вместе с гибридным семенами кукурузы в качестве отрицательного контроля.
[00114]
Для анализа довсходовой толерантности к гербицидам, гербициды PPO применяли индивидуально в одном из двух количеств с шестью повторениями на обработку следующим образом: S-3100 (80 или 160 г аи/га), фомесафен (Рефлекс, 840 или 1680 г аи/га), флумиоксазин (Валор SX, 210 или 420 г аи/га), сульфантразон (Спартан 4L, 840 или 1680 г аи/га) и сафлуфенацил (Шарпен, 200 или 400 г аи/га). Растения оценивали на предмет процентного показателя пораженности культуры через 20 дней после обработки, а семена кукурузы были включены в качестве отрицательного контроля. Трансгенные растения с APG6, функционально связанным с PPO H_N10, характеризовались показателем пораженности для различных применений гербицидов PPO до появления всходов в пределах от 0% до 5,8%, что указывает на то, что APG6, функционально связанный с PPO H_N10, обеспечивает отличную довсходовую толерантность кукурузы при обоих количествах гербицидов для всех пяти гербицидов PPO. Растения кукурузы из группы отрицательного контроля характеризовались показателем пораженности от 17,5% до 94,2%, за исключением применения сафлуфенацила, что было ожидаемым, поскольку этот гербицид продается для применения на обычных растениях кукурузы. Данные со стандартной ошибкой, обозначенной как +/-, представлены в Таблице 15.
Таблица 15
. Показатели пораженности кукурузы в результате довсходового применения гербицидов PPO
<b>№ Обр</b>
<b>Химическое вещество</b>
<b>Количество</b><b>(г аи/га)</b>
<b>% пораженности</b><b>в группе отрицательного контроля</b>
<b>% пораженности</b><b>PPO H_N10</b>
1
S-3100
80
19,2% +/- 2. 39
3,3% +/- 1,67
2
160
20,8% +/- 8,31
4,2% +/- 1,54
3
Фомесафен
840
75,8% +/- 5,83
4,2% +/- 1,54
4
1680
94,2% +/- 1,54
5,8% +/- 0,83
5
Флумиоксазин
210
30% +/- 6,32
1,7% +/- 1,05
6
420
60,8% +/- 6,38
2,5% +/- 1,71
7
Сульфентразон
840
17,5%+/- 11,6
0% +/- 0
8
1680
20% +/- 11,11
0% +/- 0
9
Сафлуфенацил
200
0% +/- 0
0% +/- 0
10
400
0,8% +/- 0,83
0,8% +/- 0,83
[00115]
Для анализа послеовсходовой (от V3 до V4) толерантности к гербицидам, гербициды PPO применяли индивидуально в одном из трех количеств с шестью повторениями на обработку следующим образом: S-3100 (40, 80 или 160 г аи/га), фомесафен (Рефлекс, 420, 840 или 1680 г аи/га), ацифлуорфен (Ультра Блазер, 420, 840 или 1680 г аи/га), лактофен (Кобра, 220, 440 или 880 г аи/га), флумиоксазин (Валор SX, 105, 210 или 420 г аи/га), сульфантразон (Спартан 4L, 420, 840 или 1680 г аи/га) и сафлуфенацил (Шарпен, 100, 200 или 400 г аи/га). Растения оценивали на предмет процентного показателя пораженности культуры через 14 дней после обработки, а обычное гибридное семя кукурузы было включено в качестве отрицательного контроля. Трансгенные растения с APG6, функционально связанным с PPO H_N10, характеризовались процентным показателем пораженности для различных применений гербицидов PPO после появления всходов в пределах от 0,5% до 5,8%, за исключением применения фомесафена в количестве 1680 г аи/га, при котором процентный показатель пораженности составил 13,8%, что указывает на то, что APG6, функционально связанный с PPO H_N10, обеспечивает отличную послевсходовую толерантность кукурузы при всех количествах гербицидов для всех семи гербицидов PPO. Растения кукурузы из группы отрицательного контроля характеризовались процентным показателем пораженности от 36,7% до 100%. Данные со стандартной ошибкой, обозначенной как +/-, представлены в Таблице 16.
Таблица 16
. Показатели пораженности кукурузы в результате послевсходового применения гербицидов PPO
<b>Гербицид PPO</b>
<b>Количество </b><b>(г аи/га)</b>
<b>% пораженности</b><b>в группе отрицательного контроля</b>
<b>% пораженности</b><b>PPO H_N10</b>
S-3100
40
100% +/- 0
1,80% +/- 0,87
80
100% +/- 0
3,80% +/- 0,83
160
100% +/- 0
3,80% +/- 0,98
Фомесафен
420
98,50% +/- 0,81
2,30% +/- 0,8
840
100% +/- 0
4,70% +/- 0,8
1680
100% +/- 0
13,80% +/- 1,54
Ацифлуорфен
420
84,20% +/- 5,69
1,80% +/- 0,87
840
87,50% +/- 2,14
4,70% +/- 0,8
1680
95,50% +/- 1,38
5,30% +/- 0,61
Лактофен
220
58,30% +/- 3,07
1% +/- 0,63
440
59,20% +/- 2,71
2,20% +/- 1,01
880
61,70% +/- 6,54
5,80% +/- 0,98
Флумиоксазин
105
51,70% +/- 3,07
1% +/- 0,63
210
69,20% +/- 6,38
1,30% +/- 0,88
420
68,30% +/- 2,79
1,80% +/- 0,87
Сульфентразон
420
61,70% +/- 5,43
0,50% +/- 0,5
840
79,20% +/- 5,97
1% +/- 0,63
1680
84,20% +/- 3,27
2,70% +/- 0,92
Сафлуфенацил
100
43,30% +/- 2,11
0,80% +/- 0,83
200
36,70% +/- 2,11
1,30% +/- 0,88
400
53,30% +/- 2,11
1,80% +/- 0,87
Пример 7. Экспрессия CTP-PPO в трансгенной сое
[00116]
Ферменты PPO, функционально связанные с различными СТР, экспрессировали в трансгенных растениях сои, а трансгенные растения анализировали на предмет толерантности к гербициду PPO.
[00117]
в условиях поля
Agrobacterium tumefaciens
Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанного с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), или APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанного с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43). Сою A3555 трансформировали с помощью этих векторов трансформации растений и, применяя при этом стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные ростки выращивали в теплице, подвергали самоопылению, и собирали семена R1. Трансгенные растения R1 опрыскивали в теплице, применяя одну из трех обработок гербицидом в фазе V4 и R1: (1) 5 г аи/га S-3100, (2) 10 г аи/га S-3100, или (3) 30 г аи/га S-3100. Оценку пораженности культуры проводили через 10 дней после обработки. Трансгенные растения, экспрессирующие APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), характеризовались показателем пораженности от 4,2%, 7,8% и 9,4% в фазе V4 и 3%, 6,5% до 15,7% в фазе R1, при применении количества гербицида 5, 10 и 30 г аи/га, соответственно. Трансгенные растения, экспрессирующие 12G088600TP (SEQ ID NO: 38), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), характеризовались средним показателем пораженности от 82,7%, 92,7% до 98,2% при применении количества гербицида 5, 10 и 30 г аи/га, соответственно, и не доживали до проведения оценки в фазе R1. Растения из группы отрицательного контроля характеризовались сходными средним показателем пораженности 89%, 98% и 100% при применении количества гербицида 5, 10 и 30 г аи/га, соответственно, и не доживали до проведения оценки в фазе R1. Данные представлены в Таблице 17.
Таблица 17. Тестирование воздействия гербицидов PPO на сою R1
<b>Конструкция</b>
<b>Количество S-3100</b>
<b>Пораженность в фазе V4</b>
<b>Пораженность в фазе R1</b>
<b>APG6+H_N10</b>
<b>5 г/га</b>
<b>4,2%</b>
<b>3%</b>
<b>APG6+H_N10</b>
<b>10 г/га</b>
<b>7,8%</b>
<b>6,5%</b>
<b>APG6+H_N10</b>
<b>30 г/га</b>
<b>9,4%</b>
<b>15,7%</b>
<b>12G088600TP+H_N10</b>
<b>5 г/га</b>
<b>82,7%</b>
<b>не доступно</b>
<b>12G088600TP+H_N10</b>
<b>10 г/га</b>
<b>92,7%</b>
<b>не доступно</b>
<b>12G088600TP+H_N10</b>
<b>30 г/га</b>
<b>98,2%</b>
<b>не доступно</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>5 г/га</b>
<b>89%</b>
<b>не доступно</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>10 г/га</b>
<b>98%</b>
<b>не доступно</b>
<b>Отрицательный контроль</b>
<b>30 г/га</b>
<b>100%</b>
<b>не доступно</b>
[00118]
в условиях поля
Agrobacterium tumefaciens
Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии  PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), функционально связанного с одним из трех разных CTP, APG6 (SEQ ID NO: 1) CTP F и CTP H. Сою A3555 трансформировали с помощью этих векторов трансформации растений и, применяя при этом стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивали в теплице, а образцы листьев, взятые из полученных растений R0, анализировали с помощью ПЦР для идентификации растений, содержащих одну трансформанта. Трансгенные однокопийные растения R0, каждое из которых представляет собой уникальный трансформант, опрыскивали в теплице гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемым приблизительно в фазе V3. Оценку пораженности проводили через 14 дней после обработки и выражали количеством растений, признанных высокотолерантными (≤10% пораженность) или толерантными (≤20% пораженность). Среди трансгенных растений, экспрессирующих APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), получили 21,4% уникальных высокотолерантных трансформантов и 57,1% толерантных трансформантов. Среди трансгенных растений, экспрессирующих CTP F, функционально связанный с PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), получили 11,7% уникальных высокотолерантных трансформантов и 41,1% толерантных трансформантов. Среди трансгенных растений, экспрессирующих CTP H, функционально связанный с PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47), не получили ни одного уникального высокотолерантного либо толерантного трансформанта. Данные представлены в Таблице 18.
Таблица 18. Оценка эффективности S-3100 для сои R0
<b>CTP</b>
<b>PPO</b>
<b>≤ 10% пораженность</b>
<b>≤ 20% пораженность</b>
<b>APG6</b>
<b>H_N90</b>
<b>3/14 (21,4%)</b>
<b>8/14 (57,1%)</b>
<b>F</b>
<b>H_N90</b>
<b>2/17 (11,7%)</b>
<b>7/17 (41,1%)</b>
<b>H</b>
<b>H_N90</b>
<b>0/22 (0%)</b>
<b>0/22 (0%)</b>
[00119]
Эти данные продемонстрировали, что специфический CTP, который функционально связан с ферментом PPO, имеет решающее значение для достижения толерантности к гербициду, тем самым демонстрируя важность выбора CTP и неожиданного превосходства CTP APG6 по сравнению с другими CTP для применения при продуцировании толерантных к гербицидам трансгенных растений.
Пример 8. Экспрессия CTP-PPO в трансгенном хлопчатнике
[00120]
Agrobacterium tumefaciens
Были созданы векторы трансформации растений для экспрессии APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанного с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), в трансгенных растениях хлопчатника, после чего трансгенные растения были проанализированы на предмет толерантности к гербицидам РРО. Хлопчатник DP393 трансформировали с помощью этих векторов трансформации растений и , применяя при этом стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные трансгенные ростки R0 выращивали в теплице, а образцы листьев, взятые из полученных растений R0, анализировали с помощью ПЦР для идентификации растений, содержащих одну трансформанта. Трансгенные однокопийные растения R0, каждое из которых представляет собой уникальный трансформант, опрыскивали в теплице гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемым в фазе V2. Кроме того, трансгенные мультикопийные растения (≥2 копии/растение) опрыскивали в теплице гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемым в фазе V2. Оценку пораженности проводили через три дня после обработки.
Отрицательный контроль, хлопчатник DP393, характеризовался 100% пораженностью через три дня после обработки гербицидом S-3100 в количестве 20 г аи/га. Напротив, у 21 однокопийного растения R0 средний показатель пораженности составил 26,7%. Распределение пораженности для 21 однокопийного растения R0 было следующим: 3 растения не имели поражений; 3 растения имели 10% пораженность; 3 растения имели 15% пораженность; 2 растения имели 20% пораженность; 7 растений имели 30% пораженность; и 3 растения имели 40% пораженность. Среди мультикопийных растений R0, 14 растений подвергались обработке гербицидом, при средний показатель пораженности составил 10,4%. Распределение пораженности для 14 мультикопийных растении было следующим: 5 растений не имели поражений; 3 растения имели 5% пораженность; 1 растение имело 10% пораженность; 2 растения имели 15% пораженность; 1 растение имело 20% пораженность; 1 растение имело 30% пораженность; и 1 растение имело 40% пораженность. Эти данные демонстрируют, что трансгенный хлопчатник R0, экспрессирующий APG6 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный с PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), характеризуется толерантностью к применению гербицида S-3100 в количестве 20 г аи/га, применяемого в фазе V2.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Monsanto Technology LLC
<120>  КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОГО НАЦЕЛИВАНИЯ ТРАНСГЕНОВ
<130>  MONS:389wo
<150>  US 62/270,180
<151>  2015-12-21
<150>  US 62/364,715
<151>  2016-07-20
<160>  102
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  68
<212>  PRT
<213>  Arabidopsis thalinana
<400>  1
Met Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Ser Gly Val Val
1               5                   10                  15
Ser Val Gly Thr Glu Thr Arg Arg Ile Tyr Ser Phe Ser His Leu Gln
20                  25                  30
Pro Ser Ala Ala Phe Pro Ala Lys Pro Ser Ser Phe Lys Ser Leu Lys
35                  40                  45
Leu Lys Gln Ser Ala Arg Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Arg Pro Phe
50                  55                  60
Val Val Arg Cys
65
<210>  2
<211>  68
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  2
Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Ser Gly Val Val
1               5                   10                  15
Ser Val Gly Thr Glu Thr Arg Arg Ile Tyr Ser Phe Ser His Leu Gln
20                  25                  30
Pro Ser Ala Ala Phe Pro Ala Lys Pro Ser Ser Phe Lys Ser Leu Lys
35                  40                  45
Leu Lys Gln Ser Ala Arg Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Arg Pro Phe
50                  55                  60
Val Val Arg Cys
65
<210>  3
<211>  61
<212>  PRT
<213>  Arabidopsis thalinana
<400>  3
Met Ala Pro Ala Leu Ser Arg Ser Leu Tyr Thr Ser Pro Leu Thr Ser
1               5                   10                  15
Val Pro Ile Thr Pro Val Ser Ser Arg Leu Ser His Leu Arg Ser Ser
20                  25                  30
Phe Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Arg Thr Gly Val Ser Cys Ser Trp
35                  40                  45
Asn Leu Glu Lys Arg Cys Asn Arg Phe Ala Val Lys Cys
50                  55                  60
<210>  4
<211>  72
<212>  PRT
<213>  Petunia hybrida
<400>  4
Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro
1               5                   10                  15
Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu
20                  25                  30
Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val
35                  40                  45
Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile
50                  55                  60
Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Cys
65                  70
<210>  5
<211>  57
<212>  PRT
<213>  Pisum sativum
<400>  5
Met Ala Ser Met Ile Ser Ser Ser Ala Val Thr Thr Val Ser Arg Ala
1               5                   10                  15
Ser Arg Gly Gln Ser Ala Ala Met Ala Pro Phe Gly Gly Leu Lys Ser
20                  25                  30
Met Thr Gly Phe Pro Val Arg Lys Val Asn Thr Asp Ile Thr Ser Ile
35                  40                  45
Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Lys Cys
50                  55
<210>  6
<211>  77
<212>  PRT
<213>  Oryza sativa
<400>  6
Met Ala Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe
1               5                   10                  15
Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe
20                  25                  30
Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu
35                  40                  45
Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val
50                  55                  60
Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Cys
65                  70                  75
<210>  7
<211>  204
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  7
atggccaccg ccaccactac cgccaccgct gcgttctccg gcgtggtgag cgtcggcact       60
gagacgcgca ggatctactc cttcagccac ctccagcctt ctgctgcgtt ccccgctaag      120
ccgtcttcgt tcaagagcct gaagctgaaa cagtccgcac gccttacccg gcgcctggac      180
cataggccat tcgttgtcag gtgc                                             204
<210>  8
<211>  204
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  8
atggcgacgg ctacgacgac tgctacggcg gcgtttagtg gtgtagtcag tgtaggaacg       60
gagactcgaa ggatttattc gttttctcat cttcaacctt ctgcggcttt tccggcgaag      120
cctagttcct tcaaatctct caaattaaag cagagcgcga ggctcacacg gcggcttgat      180
catcggccgt tcgttgtccg atgt                                             204
<210>  9
<211>  204
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  9
atggctactg ctactaccac agctaccgct gcattctctg gtgttgtgag tgttggaacc       60
gagacacgta gaatttactc tttctcacac ttgcaaccta gcgcagcctt ccctgccaag      120
ccatcatcct ttaagtcctt gaagctgaaa cagtcggcga ggcttacgag gcgcctcgat      180
catagaccct ttgtggtccg atgc                                             204
<210>  10
<211>  204
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  10
atggcaaccg cgactaccac cgcaacggca gctttctccg gggtagtttc agtcgggacg       60
gaaacccgca ggatctattc gttcagccat ttgcaacctt ccgcggcctt tcccgccaaa      120
ccctcgtctt ttaaatcgct gaaactcaaa cagtcagcac ggttgacccg aagattggac      180
caccgcccat ttgtagtgag gtgc                                             204
<210>  11
<211>  204
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  11
atggccacgg ccacgaccac ggcaacagcg gccttttcgg gcgttgtatc cgtcgggaca       60
gaaaccagac gcatatatag cttctcacac ctgcaaccta gtgccgcttt tccggccaaa      120
cctagctcgt ttaaatcgct gaagctcaaa cagagcgctc ggttaactag acgactggac      180
cataggccat ttgtcgtccg ctgc                                             204
<210>  12
<211>  204
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  12
atggcttcct ccacgacgac tgctacggcg gcgtttagtg gtgtagtcag tgtaggaacg       60
gagactcgaa ggatttattc gttttctcat cttcaacctt ctgcggcttt tccggcgaag      120
cctagttcct tcaaatctct caaattaaag cagagcgcga ggctcacacg gcggcttgat      180
catcggccgt tcgttgtccg atgt                                             204
<210>  13
<211>  183
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  13
atggctcctg ctttgagtag aagtctctac acatctcctt tgacttcagt tccaatcact       60
cctgtctctt ctcgtctctc tcatctgaga agctcgtttc tcccacacgg cggcgcttta      120
agaaccggcg tttcgtgtag ctggaatctc gaaaagagat gtaaccgatt cgccgtgaag      180
tgt                                                                    183
<210>  14
<211>  183
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  14
atggctccgg ctctcagccg ctccctctac accagccctc tcacctccgt gcccatcacc       60
ccggtgtcct cccgcctctc ccacctccgc tcctccttcc tccctcacgg cggcgcgctc      120
cgcaccggcg tgtcctgctc ctggaacctg gagaagcgct gcaaccgctt cgccgtgaag      180
tgc                                                                    183
<210>  15
<211>  216
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  15
atggcccaga tcaacaacat ggcccagggc atccagaccc tgaaccctaa ctctaacttc       60
cacaagccgc aagtgcccaa gtctagctcc ttcctcgtgt tcggctccaa gaagctcaag      120
aatagcgcca attccatgct ggtcctgaag aaagactcga tcttcatgca gaagttctgc      180
tcctttcgca tcagtgcttc ggttgcgact gcctgc                                216
<210>  16
<211>  171
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  16
atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc tagggggcaa       60
tccgccgcaa tggctccatt cggcggcctc aaatccatga ctggattccc agtgaggaag      120
gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg c               171
<210>  17
<211>  231
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  17
atggcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac       60
aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc      120
gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag      180
cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgtg c               231
<210>  18
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  18
Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  19
<211>  339
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  19
Met Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu Ala
20                  25                  30
Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile Cys
35                  40                  45
Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly His
50                  55                  60
Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln Cys
65                  70                  75                  80
Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn Val
85                  90                  95
Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp Pro
100                 105                 110
Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly Cys
115                 120                 125
Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val Asp
130                 135                 140
Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His Ala
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg Leu
165                 170                 175
Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met Lys
180                 185                 190
Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg Gly
195                 200                 205
Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys Val
210                 215                 220
Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro Lys
225                 230                 235                 240
Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu Thr
245                 250                 255
Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly Ile
260                 265                 270
Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln Ala
275                 280                 285
Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg Arg
290                 295                 300
Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys Asp
305                 310                 315                 320
Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln Leu
325                 330                 335
Glu Ala Ala
<210>  20
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  20
Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  21
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  21
Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  22
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  22
Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  23
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  23
Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  24
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  24
Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  25
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  25
Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Cys
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  26
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  26
Met Ala Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro His Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Val Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  27
<211>  340
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  27
Met Leu Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp Thr Pro Leu
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Arg Gln Pro Asp Gly Val Val Ala Ala Leu Leu Asp Ile
35                  40                  45
Cys Pro His Arg Phe Ala Pro Leu Ser Asp Gly Ile Leu Val Asn Gly
50                  55                  60
His Leu Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Phe Asp Gly Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Cys Val His Asn Pro Leu Gly Asn Gly Ala Arg Pro Ala Ser Leu Asn
85                  90                  95
Val Arg Ser Phe Pro Val Val Glu Arg Asp Ala Leu Ile Trp Ile Trp
100                 105                 110
Pro Gly Asp Pro Ala Leu Ala Asp Pro Gly Ala Ile Pro Asp Phe Gly
115                 120                 125
Cys Arg Val Asp Pro Ala Tyr Arg Thr Val Gly Gly Tyr Gly His Val
130                 135                 140
Asp Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Val Asp Asn Leu Met Asp Leu Gly His
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Val His Arg Ala Asn Ala Gln Thr Asp Ala Phe Asp Arg
165                 170                 175
Leu Glu Arg Glu Val Ile Lys Gly Asp Gly Glu Ile Gln Ala Leu Met
180                 185                 190
Lys Ile Pro Gly Gly Thr Pro Ser Val Leu Met Ala Lys Phe Leu Arg
195                 200                 205
Gly Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Trp Asn Asp Ile Arg Trp Asn Lys
210                 215                 220
Val Ser Ala Met Leu Asn Phe Ile Ala Val Ala Pro Glu Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Lys Glu Gln Ser Ile His Ser Arg Gly Thr His Ile Leu Thr Pro Glu
245                 250                 255
Thr Glu Ala Ser Cys His Tyr Phe Phe Gly Ser Ser Arg Asn Phe Gly
260                 265                 270
Ile Asp Asp Pro Glu Met Asp Gly Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln
275                 280                 285
Ala Leu Val Lys Glu Asp Lys Val Val Val Glu Ala Ile Glu Arg Arg
290                 295                 300
Arg Ala Tyr Val Glu Ala Asn Gly Ile Arg Pro Ala Met Leu Ser Cys
305                 310                 315                 320
Asp Glu Ala Ala Val Arg Val Ser Arg Glu Ile Glu Lys Leu Glu Gln
325                 330                 335
Leu Glu Ala Ala
340
<210>  28
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  28
atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag       60
aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga      120
gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt      180
ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag      240
tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc      300
cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat      360
cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt      420
tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac      480
gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag      540
gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca      600
gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc      660
cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg      720
aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc      780
tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt      840
gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct      900
atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc      960
gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg     1020
tga                                                                   1023
<210>  29
<211>  1020
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  29
atgaccttcg tccgcaatgc ctggtatgtg gcggcgctgc ccgaggaact gtccgaaaag       60
ccgctcggcc ggacgattct cgacacaccg ctcgcgctct accgccagcc cgacggtgtg      120
gtcgcggcgc tgctcgacat ctgtccgcac cgcttcgcgc cgctgagcga cggcatcctc      180
gtcaacggcc atctccaatg cccctatcac gggctggaat tcgatggcgg cgggcagtgc      240
gtccataacc cgcacggcaa tggcgcccgc ccggcttcgc tcaacgtccg ctccttcccg      300
gtggtggagc gcgacgcgct gatctggatc tggcccggcg atccggcgct ggccgatcct      360
ggggcgatcc ccgacttcgg ctgccgcgtc gatcccgcct atcggaccgt cggcggctat      420
gggcatgtcg actgcaacta caagctgctg gtcgacaacc tgatggacct cggccacgcc      480
caatatgtcc atcgcgccaa cgcccagacc gacgccttcg accggctgga gcgcgaggtg      540
atcgtcggcg acggtgagat acaggcgctg atgaagattc ccggcggcac gccgagcgtg      600
ctgatggcca agttcctgcg cggcgccaat acccccgtcg acgcttggaa cgacatccgc      660
tggaacaagg tgagcgcgat gctcaacttc atcgcggtgg cgccggaagg caccccgaag      720
gagcagagca tccactcgcg cggtacccat atcctgaccc ccgagacgga ggcgagctgc      780
cattatttct tcggctcctc gcgcaatttc ggcatcgacg atccggagat ggacggcgtg      840
ctgcgcagct ggcaggctca ggcgctggtc aaggaggaca aggtcgtcgt cgaggcgatc      900
gagcgccgcc gcgcctatgt cgaggcgaat ggcatccgcc cggcgatgct gtcgtgcgac      960
gaagccgcag tccgtgtcag ccgcgagatc gagaagcttg agcagctcga agccgcctga     1020
<210>  30
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  30
atgctcacct tcgttaggaa cgcctggtac gtcgccgctc tccctgagga gctgagcgag       60
aagcccttgg gtcgcaccat cctagacact ccgttagccc tttaccgcca gcctgacggc      120
gtagtggcgg ccctgcttga catctgcccg cataggttcg ctccgctcag cgacggcatc      180
ctcgtcaacg ggcatcttca gtgcccgtac cacgggctgg aatttgacgg cggtgggcag      240
tgtgtccaca acccgcacgg caacggcgca cggccagctt ccctcaacgt taggtcgttc      300
cctgttgtcg agcgcgacgc actgatctgg atctggcctg gcgacccagc tctggccgat      360
ccaggagcca ttcccgactt cggttgccgc gtggacccag cctatcggac ggtcggcggt      420
tacgggcacg tcgattgtaa ctataagctc cttgtggaca accttatgga tttgggccac      480
gctcagtacg tgcaccgggc taacgctcag actgacgcct ttgaccgtct cgaaagggag      540
gtcatcgtcg gcgacggaga gattcaggcg ctgatgaaga tccctggagg cacgccctct      600
gtgctcatgg cgaagtttct cagaggcgcg aacacgcccg tggacgcctg gaacgacatc      660
cgctggaata aggtctccgc gatgctgaac ttcatcgccg ttgcgcccga gggcacaccc      720
aaagagcagt caatccacag cagagggacc catattctta caccggaaac cgaggctagt      780
tgccactact tcttcggctc gtcacggaat ttcgggatag acgatccgga gatggacggt      840
gttcttcgat cttggcaagc gcaagctctc gtcaaggaag ataaggtggt cgtggaggct      900
atcgagcgta ggcgcgccta cgttgaggcg aacggtatta ggcccgcgat gctgtcctgc      960
gacgaggccg cagttagagt gtcgcgcgag atagaaaagc tggagcagct agaggccgcc     1020
tga                                                                   1023
<210>  31
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  31
atggccactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag       60
aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga      120
gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt      180
ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag      240
tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc      300
cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctgccctg gagatccagc actcgcagat      360
cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt      420
tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac      480
gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag      540
gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca      600
gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc      660
cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg      720
aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc      780
tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt      840
gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct      900
atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc      960
gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg     1020
tga                                                                   1023
<210>  32
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  32
atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag       60
aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga      120
gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt      180
ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag      240
tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc      300
cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctgccctg gagatccagc actcgcagat      360
cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt      420
tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac      480
gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag      540
gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca      600
gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc      660
cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg      720
aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc      780
tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt      840
gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct      900
atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc      960
gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg     1020
tga                                                                   1023
<210>  33
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  33
atggccacct tcgtccgcaa tgcctggtat gtggcggcgc tgcccgagga actgtccgaa       60
aagccgctcg gccggacgat tctcgacaca ccgctcgcgc tctaccgcca gcccgacggt      120
gtggtcgcgg cgctgctcga catctgtccg caccgcttcg cgccgctgag cgacggcatc      180
ctcgtcaacg gccatctcca atgcccctat cacgggctgg aattcgatgg cggcgggcag      240
tgcgtccata acccgcacgg caatggcgcc cgcccggctt cgctcaacgt ccgctccttc      300
ccggtggtgg agcgcgacgc gctgatctgg atctgtcccg gcgatccggc gctggccgat      360
cctggggcga tccccgactt cggctgccgc gtcgatcccg cctatcggac cgtcggcggc      420
tatgggcatg tcgactgcaa ctacaagctg ctggtcgaca acctgatgga cctcggccac      480
gcccaatatg tccatcgcgc caacgcccag accgacgcct tcgaccggct ggagcgcgag      540
gtgatcgtcg gcgacggtga gatacaggcg ctgatgaaga ttcccggcgg cacgccgagc      600
gtgctgatgg ccaagttcct gcgcggcgcc aatacccccg tcgacgcttg gaacgacatc      660
cgctggaaca aggtgagcgc gatgctcaac ttcatcgcgg tggcgccgga aggcaccccg      720
aaggagcaga gcatccactc gcgcggtacc catatcctga cccccgagac ggaggcgagc      780
tgccattatt tcttcggctc ctcgcgcaat ttcggcatcg acgatccgga gatggacggc      840
gtgctgcgca gctggcaggc tcaggcgctg gtcaaggagg acaaggtcgt cgtcgaggcg      900
atcgagcgcc gccgcgccta tgtcgaggcg aatggcatcc gcccggcgat gctgtcgtgc      960
gacgaagccg cagtccgtgt cagccgcgag atcgagaagc ttgagcagct cgaagccgcc     1020
tga                                                                   1023
<210>  34
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  34
atggccactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag       60
aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga      120
gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt      180
ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag      240
tgtgtccaca acccgcacgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc      300
cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat      360
cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt      420
tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac      480
gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag      540
gtgatcgttg gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca      600
gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc      660
cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg      720
aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc      780
tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt      840
gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct      900
atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc      960
gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg     1020
tga                                                                   1023
<210>  35
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  35
atgctcacct tcgtccgcaa tgcctggtat gtggcggcgc tgcccgagga actgtccgaa       60
aagccgctcg gccggacgat tctcgacaca ccgctcgcgc tctaccgcca gcccgacggt      120
gtggtcgcgg cgctgctcga catctgtccg caccgcttcg cgccgctgag cgacggcatc      180
ctcgtcaacg gccatctcca atgcccctat cacgggctgg aattcgatgg cggcgggcag      240
tgcgtccata acccgcacgg caatggcgcc cgcccggctt cgctcaacgt ccgctccttc      300
ccggtggtgg agcgcgacgc gctgatctgg atctgtcccg gcgatccggc gctggccgat      360
cctggggcga tccccgactt cggctgccgc gtcgatcccg cctatcggac cgtcggcggc      420
tatgggcatg tcgactgcaa ctacaagctg ctggtcgaca acctgatgga cctcggccac      480
gcccaatatg tccatcgcgc caacgcccag accgacgcct tcgaccggct ggagcgcgag      540
gtgatcgtcg gcgacggtga gatacaggcg ctgatgaaga ttcccggcgg cacgccgagc      600
gtgctgatgg ccaagttcct gcgcggcgcc aatacccccg tcgacgcttg gaacgacatc      660
cgctggaaca aggtgagcgc gatgctcaac ttcatcgcgg tggcgccgga aggcaccccg      720
aaggagcaga gcatccactc gcgcggtacc catatcctga cccccgagac ggaggcgagc      780
tgccattatt tcttcggctc ctcgcgcaat ttcggcatcg acgatccgga gatggacggc      840
gtgctgcgca gctggcaggc tcaggcgctg gtcaaggagg acaaggtcgt cgtcgaggcg      900
atcgagcgcc gccgcgccta tgtcgaggcg aatggcatcc gcccggcgat gctgtcgtgc      960
gacgaagccg cagtccgtgt cagccgcgag atcgagaagc ttgagcagct cgaagccgcc     1020
tga                                                                   1023
<210>  36
<211>  1023
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  36
atggccacct tcgttaggaa cgcctggtac gtcgccgctc tccctgagga gctgagcgag       60
aagcccttgg gtcgcaccat cctagacact ccgttagccc tttaccgcca gcctgacggc      120
gtagtggcgg ccctgcttga catctgcccg cataggttcg ctccgctcag cgacggcatc      180
ctcgtcaacg ggcatcttca gtgcccgtac cacgggctgg aatttgacgg cggtgggcag      240
tgtgtccaca acccgcacgg caacggcgca cggccagctt ccctcaacgt taggtcgttc      300
cctgttgtcg agcgcgacgc actgatctgg atctggcctg gcgacccagc tctggccgat      360
ccaggagcca ttcccgactt cggttgccgc gtggacccag cctatcggac ggtcggcggt      420
tacgggcacg tcgattgtaa ctataagctc cttgtggaca accttatgga tttgggccac      480
gctcagtacg tgcaccgggc taacgctcag actgacgcct ttgaccgtct cgaaagggag      540
gtcatcgtcg gcgacggaga gattcaggcg ctgatgaaga tccctggagg cacgccctct      600
gtgctcatgg cgaagtttct cagaggcgcg aacacgcccg tggacgcctg gaacgacatc      660
cgctggaata aggtctccgc gatgctgaac ttcatcgccg ttgcgcccga gggcacaccc      720
aaagagcagt caatccacag cagagggacc catattctta caccggaaac cgaggctagt      780
tgccactact tcttcggctc gtcacggaat ttcgggatag acgatccgga gatggacggt      840
gttcttcgat cttggcaagc gcaagctctc gtcaaggaag ataaggtggt cgtggaggct      900
atcgagcgta ggcgcgccta cgttgaggcg aacggtatta ggcccgcgat gctgtcctgc      960
gacgaggccg cagttagagt gtcgcgcgag atagaaaagc tggagcagct agaggccgcc     1020
tga                                                                   1023
<210>  37
<211>  1020
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  37
atgctcactt tcgttagaaa cgcttggtac gttgctgcac ttcctgagga gttgagcgag       60
aagcctctag gaagaactat cctcgatact ccactagctc tctatcgtca acctgacgga      120
gttgtcgctg ccctgcttga tatttgtccg catcgcttcg ctccgttgag tgacggtatt      180
ctagtcaacg gacatctcca gtgtccatat cacggtctgg aatttgacgg aggtggccag      240
tgtgtccaca acccgctcgg caacggagcc cgccctgctt ctctgaacgt gcgatcattc      300
cctgtcgtgg aaagagacgc attgatctgg atctggcctg gagatccagc actcgcagat      360
cccggtgcta tccctgactt tgggtgtcgt gttgatccag cttaccgtac tgtcggaggt      420
tacggtcacg tggactgcaa ctacaagctc cttgtggata acctcatgga tcttggacac      480
gctcagtacg tgcaccgcgc taacgcccaa acagacgcct tcgatagact tgagcgtgag      540
gtgatcaaag gcgacggcga gatccaggcg ctcatgaaga tccctggtgg cacaccctca      600
gttctcatgg ctaagttctt gcgtggtgct aacacaccag ttgacgcctg gaacgacatc      660
cggtggaata aggtgtcggc tatgctgaac ttcatcgcgg tcgcgccgga agggacgccg      720
aaggagcagt caatccactc ccgaggaacc catatcctta ctcctgagac cgaggcaagc      780
tgccattact tcttcggtag ttcccgcaac ttcggtatag acgatccaga gatggacggt      840
gttctcagga gctggcaagc tcaagccctg gtgaaggagg acaaagtggt cgttgaagct      900
atcgaaaggc ggagggctta cgtcgaagcg aacgggatca gacccgccat gttgtcctgc      960
gacgaggcag ccgtcagggt atccagggag attgagaagc tcgaacaact agaagcggcg     1020
<210>  38
<211>  35
<212>  PRT
<213>  Gossypium raimondii
<400>  38
Met Leu Asn Ile Ala Pro Ser Cys Val Leu Ala Ser Gly Ile Ser Lys
1               5                   10                  15
Pro Val Thr Lys Met Ala Ser Thr Glu Asn Lys Asp Asp His Ser Ser
20                  25                  30
Ala Lys Arg
35
<210>  39
<211>  105
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  39
atgcttaaca ttgcgccgag ttgtgttttg gccagcggga tctctaagcc cgtgaccaag       60
atggctagca cggagaacaa ggacgaccac agcagcgcca agagg                      105
<210>  40
<211>  179
<212>  PRT
<213>  Enterobacter cloacae
<400>  40
Met Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp
20                  25                  30
Val Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp
35                  40                  45
Gln Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val
50                  55                  60
Leu Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro
65                  70                  75                  80
Ser Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg
85                  90                  95
Thr Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Glu Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys
165                 170                 175
Lys Ala Leu
<210>  41
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Pantoea ananatis
<400>  41
Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Gln Lys
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Ala Ile Ala Asp Glu Ile Lys Gly Gln Gln Ser Cys Asp
20                  25                  30
Val Ile Asn Ile Gln Asp Ala Lys Thr Leu Asp Trp Gln Gln Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val
50                  55                  60
Val Asn Glu Phe Val Lys His Asn Leu Leu Ala Leu Gln Gln Arg Val
65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg
85                  90                  95
Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Val Lys Phe Leu Ala Gln Ser Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Phe Ile Met Arg Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ala Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Gln Gln Val Gln Arg Phe Ala Arg Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys
165                 170                 175
Ser Tyr
<210>  42
<211>  177
<212>  PRT
<213>  Pantoea stewardii
<400>  42
Met Lys Ala Leu Ile Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Lys
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Ser Ile Ala Asp Val Ile Arg Gln Gln Gln Gln Cys Asp
20                  25                  30
Val Leu Asn Ile Lys Asp Ala Ser Leu Pro Asp Trp Ala Gln Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val
50                  55                  60
Val Asp Lys Phe Val Lys Gln His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Thr
65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg
85                  90                  95
Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Phe Leu Ala His Ser Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Gln Gln Val Ser Thr Phe Ala Asn Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys
165                 170                 175
Ser
<210>  43
<211>  181
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  43
Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gln Ala
20                  25                  30
Asp Val Ala Asn Val His Arg Ile Glu Glu Pro Gln Trp Glu Asn Tyr
35                  40                  45
Asp Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Tyr His Ser
50                  55                  60
Ala Phe Gln Glu Phe Val Lys Lys His Ala Thr Arg Leu Asn Ser Met
65                  70                  75                  80
Pro Ser Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys
85                  90                  95
Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Leu Met Asn Ser
100                 105                 110
Gln Trp Arg Pro Asp Arg Cys Ala Val Ile Ala Gly Ala Leu Arg Tyr
115                 120                 125
Pro Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Lys Leu Ile Met Lys
130                 135                 140
Met Ser Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp
145                 150                 155                 160
Trp Glu Gln Val Ala Asn Phe Ala Arg Glu Ile Ala His Leu Thr Asp
165                 170                 175
Lys Pro Thr Leu Lys
180
<210>  44
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Erwinia toletana
<400>  44
Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Glu
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Cys Asp
20                  25                  30
Val Phe Asn Ile Leu Arg Val Glu Gln Ile Asp Trp Ser Gln Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Leu Ile Gly Gly Ser Ile His Tyr Gly His Phe His Pro Ala
50                  55                  60
Val Ala Lys Phe Val Lys Arg His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Ser
65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Ala Asp Lys Arg
85                  90                  95
Thr Pro Gln Thr Asn Ala Tyr Met Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Thr
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Thr Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala His Leu Pro Gly Lys
165                 170                 175
Thr Gln
<210>  45
<211>  179
<212>  PRT
<213>  Pectobacterium carotovorum
<400>  45
Met Lys Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Arg Ala
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Lys Gly Thr Leu Glu Cys Asp
20                  25                  30
Val Val Asn Val Leu Asn Ala Asn Asp Ile Asp Leu Ser Gln Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Ala Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Phe His Pro Ala
50                  55                  60
Val Asn Gln Phe Ile Arg Lys His Leu Thr Ser Leu Gln Gln Leu Pro
65                  70                  75                  80
Ser Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg
85                  90                  95
Thr Ile Gln Thr Asn Ala Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Asp Leu Cys Cys Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Ile Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Gln Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Asp Phe Ala Gln Leu Ala Ala Lys
165                 170                 175
Asn Pro Ala
<210>  46
<211>  179
<212>  PRT
<213>  Shimwellia blattae
<400>  46
Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Lys
1               5                   10                  15
Ile Ala Arg His Ile Ala Gly Val Leu Glu Glu Gln Gly Lys Ala Cys
20                  25                  30
Glu Leu Val Asp Leu Leu Gln Pro Gly Glu Pro Asp Trp Ser Thr Val
35                  40                  45
Glu Cys Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Lys
50                  55                  60
Ser Phe Ile Arg Phe Val Asn Thr His Ala Gln Arg Leu Asn Asn Met
65                  70                  75                  80
Pro Gly Ala Leu Phe Thr Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys
85                  90                  95
Gln Ser Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Ala Ala Ser
100                 105                 110
Pro Trp Gln Pro Gln Arg Cys Gln Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr
115                 120                 125
Pro Arg Tyr Ser Trp Tyr Asp Arg Met Met Ile Arg Leu Ile Met Lys
130                 135                 140
Met Ala Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp
145                 150                 155                 160
Trp Gln Ser Val Thr Arg Phe Ala Arg Glu Ile Ala Gln Leu Pro Gly
165                 170                 175
Glu Thr Arg
<210>  47
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Pantoea stewardii
<400>  47
Met Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Gln Leu
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Ser Ile Ala Lys Glu Leu Glu Gly Lys Gln Ala Cys Asp
20                  25                  30
Val Leu Asn Ile Leu Asp Thr Thr Asn Val Glu Trp Thr Gln Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala
50                  55                  60
Val Ala Glu Phe Val Lys Arg His Gln Arg Glu Leu Gln Gln Arg Ser
65                  70                  75                  80
Ser Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg
85                  90                  95
Ser Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Ala Lys Phe Leu Asn Gln Ser Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Ile Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Ser Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Gln Gln Val Thr Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala Arg Leu Pro Gly Lys
165                 170                 175
Thr Ser
<210>  48
<211>  180
<212>  PRT
<213>  Enterobacter cloacae
<400>  48
Met Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu
1               5                   10                  15
Ile Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala
20                  25                  30
Asp Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr
35                  40                  45
Asp Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro
50                  55                  60
Ala Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Pro Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys
85                  90                  95
Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser
100                 105                 110
Pro Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr
115                 120                 125
Pro Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys
130                 135                 140
Met Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp
145                 150                 155                 160
Trp Ser Gln Val Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg
165                 170                 175
Ser Ser Arg Leu
180
<210>  49
<211>  177
<212>  PRT
<213>  Enterobacter mori
<400>  49
Met Lys Ile Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu
1               5                   10                  15
Ile Ala Ala Ser Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Ala Phe Asp Val
20                  25                  30
Asp Val Val Asn Leu His Arg Ala Glu Asn Ile Ala Trp Glu Glu Tyr
35                  40                  45
Asp Gly Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Ser
50                  55                  60
Thr Leu Asn Ser Phe Val Lys Lys His Gln Gln Ala Leu Lys Lys Leu
65                  70                  75                  80
Pro Gly Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys
85                  90                  95
Arg Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asp Ser
100                 105                 110
Pro Trp Gln Pro Asp Leu Ser Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr
115                 120                 125
Pro Arg Tyr Asn Trp Tyr Asp Arg Ile Met Ile Arg Leu Ile Met Lys
130                 135                 140
Ile Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp
145                 150                 155                 160
Trp Gln Gln Val Thr His Phe Ala His Glu Ile Val Gln Leu Val Arg
165                 170                 175
Lys
<210>  50
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Enterobacter cloacae
<400>  50
Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val
20                  25                  30
Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln
35                  40                  45
Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu
50                  55                  60
Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr
85                  90                  95
Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp
100                 105                 110
Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg
115                 120                 125
Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr
130                 135                 140
Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu
145                 150                 155                 160
Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys Lys
165                 170                 175
Ala Leu
<210>  51
<211>  177
<212>  PRT
<213>  Pantoea ananatis
<400>  51
Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Gln Lys Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Ala Ile Ala Asp Glu Ile Lys Gly Gln Gln Ser Cys Asp Val
20                  25                  30
Ile Asn Ile Gln Asp Ala Lys Thr Leu Asp Trp Gln Gln Tyr Asp Arg
35                  40                  45
Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Gln Pro Val Val
50                  55                  60
Asn Glu Phe Val Lys His Asn Leu Leu Ala Leu Gln Gln Arg Val Ser
65                  70                  75                  80
Gly Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Ser
85                  90                  95
Pro Glu Thr Asn Ala Tyr Thr Val Lys Phe Leu Ala Gln Ser Pro Trp
100                 105                 110
Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Tyr Tyr Pro Arg
115                 120                 125
Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Phe Ile Met Arg Met Thr
130                 135                 140
Gly Gly Glu Thr Asp Ala Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Gln
145                 150                 155                 160
Gln Val Gln Arg Phe Ala Arg Asp Phe Ala Gln Leu Pro Gly Lys Ser
165                 170                 175
Tyr
<210>  52
<211>  180
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  52
Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Leu Gly Ile Gln Ala Asp
20                  25                  30
Val Ala Asn Val His Arg Ile Glu Glu Pro Gln Trp Glu Asn Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Tyr His Ser Ala
50                  55                  60
Phe Gln Glu Phe Val Lys Lys His Ala Thr Arg Leu Asn Ser Met Pro
65                  70                  75                  80
Ser Ala Phe Tyr Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg
85                  90                  95
Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Ala Arg Lys Phe Leu Met Asn Ser Gln
100                 105                 110
Trp Arg Pro Asp Arg Cys Ala Val Ile Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Lys Leu Ile Met Lys Met
130                 135                 140
Ser Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Glu Gln Val Ala Asn Phe Ala Arg Glu Ile Ala His Leu Thr Asp Lys
165                 170                 175
Pro Thr Leu Lys
180
<210>  53
<211>  177
<212>  PRT
<213>  Erwinia toletana
<400>  53
Lys Ala Leu Ile Leu Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Glu Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Cys Asp Val
20                  25                  30
Phe Asn Ile Leu Arg Val Glu Gln Ile Asp Trp Ser Gln Tyr Asp Arg
35                  40                  45
Val Leu Ile Gly Gly Ser Ile His Tyr Gly His Phe His Pro Ala Val
50                  55                  60
Ala Lys Phe Val Lys Arg His Leu His Glu Leu Gln Gln Arg Ser Ser
65                  70                  75                  80
Gly Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Ala Asp Lys Arg Thr
85                  90                  95
Pro Gln Thr Asn Ala Tyr Met Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Pro Trp
100                 105                 110
Gln Pro Asp Cys Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Thr Arg
115                 120                 125
Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr
130                 135                 140
Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Thr
145                 150                 155                 160
Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Glu Phe Ala His Leu Pro Gly Lys Thr
165                 170                 175
Gln
<210>  54
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Pectobacterium carotovorum
<400>  54
Lys Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Asp Gly Gln Thr Arg Ala Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Lys Gly Thr Leu Glu Cys Asp Val
20                  25                  30
Val Asn Val Leu Asn Ala Asn Asp Ile Asp Leu Ser Gln Tyr Asp Arg
35                  40                  45
Val Ala Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly Arg Phe His Pro Ala Val
50                  55                  60
Asn Gln Phe Ile Arg Lys His Leu Thr Ser Leu Gln Gln Leu Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr
85                  90                  95
Ile Gln Thr Asn Ala Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro Trp
100                 105                 110
Gln Pro Asp Leu Cys Cys Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg
115                 120                 125
Tyr Arg Trp Phe Asp Arg Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile Thr
130                 135                 140
Gly Gly Glu Thr Asp Ser Thr Lys Glu Ile Glu Tyr Thr Asp Trp Gln
145                 150                 155                 160
Gln Val Ala Arg Phe Ala Gln Asp Phe Ala Gln Leu Ala Ala Lys Asn
165                 170                 175
Pro Ala
<210>  55
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Shimwellia blattae
<400>  55
Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Lys Ile
1               5                   10                  15
Ala Arg His Ile Ala Gly Val Leu Glu Glu Gln Gly Lys Ala Cys Glu
20                  25                  30
Leu Val Asp Leu Leu Gln Pro Gly Glu Pro Asp Trp Ser Thr Val Glu
35                  40                  45
Cys Val Val Leu Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Lys Ser
50                  55                  60
Phe Ile Arg Phe Val Asn Thr His Ala Gln Arg Leu Asn Asn Met Pro
65                  70                  75                  80
Gly Ala Leu Phe Thr Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Gln
85                  90                  95
Ser Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Ala Ala Ser Pro
100                 105                 110
Trp Gln Pro Gln Arg Cys Gln Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Ser Trp Tyr Asp Arg Met Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met
130                 135                 140
Ala Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Gln Ser Val Thr Arg Phe Ala Arg Glu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu
165                 170                 175
Thr Arg
<210>  56
<211>  179
<212>  PRT
<213>  Enterobacter cloacae
<400>  56
Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile
1               5                   10                  15
Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala Asp
20                  25                  30
Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala
50                  55                  60
Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu Pro
65                  70                  75                  80
Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys Arg
85                  90                  95
Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro
100                 105                 110
Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Ser Gln Val Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg Ser
165                 170                 175
Ser Arg Leu
<210>  57
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  57
Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val
20                  25                  30
Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln
35                  40                  45
Val Leu Ile Gly Ala Asn Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu
50                  55                  60
Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr
85                  90                  95
Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp
100                 105                 110
Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg
115                 120                 125
Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr
130                 135                 140
Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu
145                 150                 155                 160
Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ser Tyr Lys Lys
165                 170                 175
Ala Leu
<210>  58
<211>  172
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  58
Lys Ala Leu Val Leu Tyr Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr His Ala Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Tyr Ile Ala Ser Cys Met Lys Glu Lys Ala Glu Cys Asp Val
20                  25                  30
Ile Asp Leu Thr His Gly Glu His Val Asn Leu Thr Gln Tyr Asp Gln
35                  40                  45
Val Leu Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe Asn Ala Val Leu
50                  55                  60
Asp Lys Phe Ile Lys Arg Asn Val Asp Gln Leu Asn Asn Met Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Phe Phe Cys Val Asn Leu Thr Ala Arg Lys Pro Glu Lys Arg Thr
85                  90                  95
Pro Gln Thr Asn Pro Tyr Val Arg Lys Phe Leu Leu Ala Thr Pro Trp
100                 105                 110
Gln Pro Ala Leu Cys Gly Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro Arg
115                 120                 125
Tyr Arg Trp Ile Asp Lys Val Met Ile Gln Leu Ile Met Arg Met Thr
130                 135                 140
Gly Gly Glu Thr Asp Thr Ser Lys Glu Val Glu Tyr Thr Asp Trp Glu
145                 150                 155                 160
Gln Val Lys Lys Phe Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu
165                 170
<210>  59
<211>  179
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  59
Lys Thr Leu Ile Leu Phe Ser Thr Arg Asp Gly Gln Thr Arg Glu Ile
1               5                   10                  15
Ala Ala Phe Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Gly Ile Tyr Ala Asp
20                  25                  30
Val Ile Asn Leu Asn Arg Thr Glu Glu Ile Ala Trp Gln Glu Tyr Asp
35                  40                  45
Arg Val Val Ile Gly Ala Ser Ile Arg Tyr Gly His Phe His Pro Ala
50                  55                  60
Val Asp Arg Phe Val Lys Lys His Thr Glu Thr Leu Asn Ser Leu Pro
65                  70                  75                  80
Gly Ala Phe Phe Ser Val Asn Leu Val Ala Arg Lys Ala Glu Lys Arg
85                  90                  95
Thr Pro Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Arg Lys Phe Leu Leu Asn Ser Pro
100                 105                 110
Trp Lys Pro Ala Ala Cys Ala Val Phe Ala Gly Ala Leu Arg Tyr Pro
115                 120                 125
Arg Tyr Arg Trp Tyr Asp Arg Phe Met Ile Arg Leu Ile Met Lys Met
130                 135                 140
Thr Gly Gly Glu Thr Asp Thr Arg Lys Glu Val Val Tyr Thr Asp Trp
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ile Ala Ser Phe Ala Arg Glu Ile Val Gln Leu Thr Arg Ser
165                 170                 175
Ser Arg Leu
<210>  60
<211>  504
<212>  PRT
<213>  Amaranthus tuberculatus
<400>  60
Met Gly Asn Ile Ser Glu Arg Glu Glu Pro Thr Ser Ala Lys Arg Val
1               5                   10                  15
Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu
20                  25                  30
Lys Ser His Gly Leu Ser Val Thr Leu Phe Glu Ala Asp Ser Arg Ala
35                  40                  45
Gly Gly Lys Leu Lys Thr Val Lys Lys Asp Gly Phe Ile Trp Asp Glu
50                  55                  60
Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Ala Glu Val Ser Ser Leu Ile
65                  70                  75                  80
Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Leu Pro Ile Ser Gln Asn
85                  90                  95
Lys Arg Tyr Ile Ala Arg Asp Gly Leu Pro Val Leu Leu Pro Ser Asn
100                 105                 110
Pro Ala Ala Leu Leu Thr Ser Asn Ile Leu Ser Ala Lys Ser Lys Leu
115                 120                 125
Gln Ile Met Leu Glu Pro Phe Leu Trp Arg Lys His Asn Ala Thr Glu
130                 135                 140
Leu Ser Asp Glu His Val Gln Glu Ser Val Gly Glu Phe Phe Glu Arg
145                 150                 155                 160
His Phe Gly Lys Glu Phe Val Asp Tyr Val Ile Asp Pro Phe Val Ala
165                 170                 175
Gly Thr Cys Gly Gly Asp Pro Gln Ser Leu Ser Met His His Thr Phe
180                 185                 190
Pro Glu Val Trp Asn Ile Glu Lys Arg Phe Gly Ser Val Phe Ala Gly
195                 200                 205
Leu Ile Gln Ser Thr Leu Leu Ser Lys Lys Glu Lys Gly Gly Glu Asn
210                 215                 220
Ala Ser Ile Lys Lys Pro Arg Val Arg Gly Ser Phe Ser Phe Gln Gly
225                 230                 235                 240
Gly Met Gln Thr Leu Val Asp Thr Met Cys Lys Gln Leu Gly Glu Asp
245                 250                 255
Glu Leu Lys Leu Gln Cys Glu Val Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Gln Lys
260                 265                 270
Gly Ile Pro Ser Leu Gly Asn Trp Ser Val Ser Ser Met Ser Asn Asn
275                 280                 285
Thr Ser Glu Asp Gln Ser Tyr Asp Ala Val Val Val Thr Ala Pro Ile
290                 295                 300
Arg Asn Val Lys Glu Met Lys Ile Met Lys Phe Gly Asn Pro Phe Ser
305                 310                 315                 320
Leu Asp Phe Ile Pro Glu Val Thr Tyr Val Pro Leu Ser Val Met Ile
325                 330                 335
Thr Ala Phe Lys Lys Asp Lys Val Lys Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly
340                 345                 350
Val Leu Ile Pro Ser Lys Glu Gln His Asn Gly Leu Lys Thr Leu Gly
355                 360                 365
Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ser Asp Met
370                 375                 380
Cys Leu Phe Thr Thr Phe Val Gly Gly Ser Arg Asn Arg Lys Leu Ala
385                 390                 395                 400
Asn Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gln Ile Val Ser Ser Asp Leu Gln
405                 410                 415
Gln Leu Leu Gly Thr Glu Asp Glu Pro Ser Phe Val Asn His Leu Phe
420                 425                 430
Trp Ser Asn Ala Phe Pro Leu Tyr Gly His Asn Tyr Asp Ser Val Leu
435                 440                 445
Arg Ala Ile Asp Lys Met Glu Lys Asp Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala
450                 455                 460
Gly Asn His Lys Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ala Met Ala Ser Gly
465                 470                 475                 480
Cys Lys Ala Ala Glu Leu Val Ile Ser Tyr Leu Asp Ser His Ile Tyr
485                 490                 495
Val Lys Met Asp Glu Lys Thr Ala
500
<210>  61
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  61
atgaaagcgc tggtgctgta tagcacccgc gatggccaga cccatgcgat tgcgagctat       60
attgcgagct gcatgaaaga aaaagcggaa tgcgatgtga ttgatctgac ccatggcgaa      120
catgtgaacc tgacccagta tgatcaggtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat      180
tttaacgcgg tgctggataa atttattaaa cgcaacgtgg atcagctgaa caacatgccg      240
agcgcgtttt tttgcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcac cccgcagacc      300
aacccgtatg tgcgcaaatt tctgctggcg accccgtggc agccggcgct gtgcggcgtg      360
tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggattg ataaagtgat gattcagctg      420
attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat accagcaaag aagtggaata taccgattgg      480
gaacaggtga aaaaatttgc ggaagatttt gcgaaactga gctataaaaa agcgctg         537
<210>  62
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  62
atgaaagcgc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccagaaaat tgcgagcgcg       60
attgcggatg aaattaaagg ccagcagagc tgcgatgtga ttaacattca ggatgcgaaa      120
accctggatt ggcagcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat      180
tttcagccgg tggtgaacga atttgtgaaa cataacctgc tggcgctgca gcagcgcgtg      240
agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc      300
aacgcgtata ccgtgaaatt tctggcgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg      360
tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagttt      420
attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat gcgagcaaag aagtggaata taccgattgg      480
cagcaggtgc agcgctttgc gcgcgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag ctat            534
<210>  63
<211>  531
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  63
atgaaagcgc tgattctgta tagcacccgc gatggccaga cccgcaaaat tgcgagcagc       60
attgcggatg tgattcgcca gcagcagcag tgcgatgtgc tgaacattaa agatgcgagc      120
ctgccggatt gggcgcagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat      180
tttcagccgg tggtggataa atttgtgaaa cagcatctgc atgaactgca gcagcgcacc      240
agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc      300
aacgcgtata cccagaaatt tctggcgcat agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg      360
tttgcgggcg cgctgtatta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg      420
attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aagtggaata taccgattgg      480
cagcaggtga gcacctttgc gaacgatttt gcgcagctgc cgggcaaaag c               531
<210>  64
<211>  546
<212>  ДНК
<213>  Escherichia coli
<400>  64
gtgaaaacat taattctttt ctcaacaagg gacggacaaa cgcgcgagat tgcctcctac       60
ctggcttcgg aactgaaaga actggggatc caggcggatg tcgccaatgt gcaccgcatt      120
gaagaaccac agtgggaaaa ctatgaccgt gtggtcattg gtgcttctat tcgctatggt      180
cactaccatt cagcgttcca ggaatttgtc aaaaaacatg cgacgcggct gaattcgatg      240
ccgagcgcct tttactccgt gaatctggtg gcgcgcaaac cggagaagcg tactccacag      300
accaacagct acgcgcgcaa gtttctgatg aactcgcaat ggcgtcccga tcgctgcgcg      360
gtcattgccg gggcgctgcg ttacccacgt tatcgctggt acgaccgttt tatgatcaag      420
ctgattatga agatgtcagg cggtgaaacg gatacgcgca aagaagttgt ctataccgat      480
tgggagcagg tggcgaattt cgcccgagaa atcgcccatt taaccgacaa accgacgctg      540
aaataa                                                                 546
<210>  65
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  65
atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gaaggccaga cccgcgaaat tgcgagctat       60
attgcgaaca gcattaaaga agaaatggaa tgcgatgtgt ttaacattct gcgcgtggaa      120
cagattgatt ggagccagta tgatcgcgtg ctgattggcg gcagcattca ttatggccat      180
tttcatccgg cggtggcgaa atttgtgaaa cgccatctgc atgaactgca gcagcgcagc      240
agcggctttt tttgcgtgaa cctgaccgcg cgcaaagcgg ataaacgcac cccgcagacc      300
aacgcgtata tgcgcaaatt tctgctgcag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg      360
tttgcgggcg cgctgcgcta tacccgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg      420
attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat accagcaaag aagtggaata taccgattgg      480
acccaggtgg cgcgctttgc gcaggaattt gcgcatctgc cgggcaaaac ccag            534
<210>  66
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  66
atgaaagcgc tgattgtgtt tagcagccgc gatggccaga cccgcgcgat tgcgagctat       60
attgcgaaca ccctgaaagg caccctggaa tgcgatgtgg tgaacgtgct gaacgcgaac      120
gatattgatc tgagccagta tgatcgcgtg gcgattggcg cgagcattcg ctatggccgc      180
tttcatccgg cggtgaacca gtttattcgc aaacatctga ccagcctgca gcagctgccg      240
agcgcgtttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcac cattcagacc      300
aacgcgtata cccgcaaatt tctgctgaac agcccgtggc agccggatct gtgctgcgtg      360
tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcgtgat gattcagctg      420
attatgcgca ttaccggcgg cgaaaccgat agcaccaaag aaattgaata taccgattgg      480
cagcaggtgg cgcgctttgc gcaggatttt gcgcagctgg cggcgaaaaa cccggcg         537
<210>  67
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  67
atgaagacct tgatcctatt ctccaccagg gacggccaaa cacacaagat cgcaaggcac       60
atcgcaggag tcctcgaaga gcaggggaag gcctgcgagt tggtcgatct gttacagccc      120
ggcgaaccag actggagtac cgttgaatgc gtcgttctag gggccagcat tagatatggt      180
cacttccata agtctttcat caggttcgta aacactcacg cgcagcgctt gaataatatg      240
ccaggcgccc ttttcacagt taacttagtc gcccgaaagc ccgagaagca gagtccacag      300
acgaactctt acacccgcaa gtttctcgcc gcctcccctt ggcagccaca gcgatgccaa      360
gttttcgcgg gcgctttgag gtaccctagg tactcgtggt acgacagaat gatgatacgt      420
ttgataatga agatggccgg gggcgagact gacacaagga aggaggttga gtacactgac      480
tggcagtcgg tgactcggtt cgcgagggag atcgctcagc tgccgggaga gacgcgg         537
<210>  68
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  68
atgaaagcgc tgattctgtt tagcagccgc gatggccaga cccagctgat tgcgagcagc       60
attgcgaaag aactggaagg caaacaggcg tgcgatgtgc tgaacattct ggataccacc      120
aacgtggaat ggacccagta tgatcgcgtg ctgattggcg cgagcattcg ctatggccat      180
tttcatccgg cggtggcgga atttgtgaaa cgccatcagc gcgaactgca gcagcgcagc      240
agcggctttt ttagcgtgaa cctgaccgcg cgcaaaccgg aaaaacgcag cccggaaacc      300
aacgcgtata ccgcgaaatt tctgaaccag agcccgtggc agccggattg ctgcgcggtg      360
tttgcgggcg cgctgcgcta tccgcgctat cgctggtttg atcgcattat gattcagctg      420
attatgcgca tgaccggcgg cgaaaccgat agcagcaaag aagtggaata taccgattgg      480
cagcaggtga cccgctttgc gcaggaattt gcgcgcctgc cgggcaaaac cagc            534
<210>  69
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  69
atgaaaaccc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgttt       60
ctggcgagcg aactgaaaga acagggcatt tatgcggatg tgattaacct gaaccgcacc      120
gaagaaattg cgtggcagga atatgatcgc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc      180
cattttcatc cggcggtgga tcgctttgtg aaaaaacata ccgaaaccct gaacagcctg      240
ccgggcgcgt tttttagcgt gaacctggtg gcgcgcaaag cggaaaaacg caccccgcag      300
accaacagct atacccgcaa atttctgctg aacagcccgt ggaaaccggc ggcgtgcgcg      360
gtgtttgcgg gcgcgctgcg ctatccgcgc tatcgctggt atgatcgctt tatgattcgc      420
ctgattatga aaatgaccgg cggcgaaacc gatacccgca aagaagtggt gtataccgat      480
tggagccagg tggcgagctt tgcgcgcgaa attgtgcagc tgacccgcag cagccgcctg      540
<210>  70
<211>  531
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  70
atgaaaattc tgattctgtt tagcacccgc gatggccaga cccgcgaaat tgcggcgagc       60
ctggcgagcg aactgaaaga acaggcgttt gatgtggatg tggtgaacct gcatcgcgcg      120
gaaaacattg cgtgggaaga atatgatggc gtggtgattg gcgcgagcat tcgctatggc      180
cattttcata gcaccctgaa cagctttgtg aaaaaacatc agcaggcgct gaaaaaactg      240
ccgggcgcgt tttatagcgt gaacctggtg gcgcgcaaac cggaaaaacg caccccgcag      300
accaacagct atacccgcaa atttctgctg gatagcccgt ggcagccgga tctgagcgcg      360
gtgtttgcgg gcgcgctgcg ctatccgcgc tataactggt atgatcgcat tatgattcgc      420
ctgattatga aaattaccgg cggcgaaacc gatacccgca aagaagtggt gtataccgat      480
tggcagcagg tgacccattt tgcgcatgaa attgtgcagc tggtgcgcaa a               531
<210>  71
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  71
atgaaggcct tggtactgta ctcgacgcgg gacggccaga cccacgcaat tgcttcatac       60
atcgcctcct gcatgaagga gaaggccgaa tgcgacgtga tcgacctcac ccacggggag      120
cacgtgaacc tcacccaata cgatcaggtg ctaatcggtg cgagtattcg ttacggccac      180
ttcaacgccg tgcttgacaa gttcatcaag agaaacgtgg atcagctgaa caacatgcca      240
agcgcgttct tctgcgtaaa cctcacagca aggaagcccg agaagcgtac tccccagaca      300
aacccttatg tccgaaaatt cttgcttgct accccctggc agcccgcgtt gtgcggagtg      360
ttcgcagggg cccttcggta cccgcgatac cggtggatcg acaaggtgat gatccagcta      420
ataatgcgga tgactggggg agagacagac acgagcaagg aggtcgagta cacggattgg      480
gagcaggtta agaagttcgc ggaggatttt gcaaagctat cgtacaagaa ggccctctag      540
<210>  72
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  72
atgaaggcct tgatcctgtt ctctacacgc gacggacaga cacagaagat cgcatctgcc       60
atcgctgatg agataaaggg gcagcaatcg tgcgacgtga ttaacataca ggatgccaaa      120
accctcgact ggcagcagta cgaccgggta ctcatcggcg cctccattcg ttacgggcat      180
ttccagcccg ttgtgaatga gtttgtcaag cacaacctct tggccctaca gcagagagtt      240
tccggattct tctccgtgaa cttgacagcc cgaaagccag agaagcggag ccccgagact      300
aacgcttata cagtcaaatt cttggcgcag tcaccctggc aaccggactg ctgcgctgtt      360
tttgcggggg ccctgtacta cccacggtac cggtggttcg atagggtgat gatacagttc      420
ataatgcgaa tgacgggggg agagaccgac gcatcgaaag aggtggagta cactgactgg      480
cagcaggtgc agcggttcgc gcgagacttc gcgcagttac cgggtaagtc ctactga         537
<210>  73
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  73
atgaaggcgc tgatcttgta ctcaaccagg gacggtcaga ctcgcaagat tgcaagtagc       60
attgcggacg tcatcaggca gcagcagcag tgcgacgtct taaacattaa agacgcatca      120
cttcctgact gggcccaata tgaccgagtg ctcatcggag ctagcatccg ttacgggcat      180
ttccagcccg ttgtagacaa gttcgtgaag cagcacttgc acgagcttca gcagcggacc      240
tccggcttct tctccgtgaa cctgacggcg aggaagcctg aaaaaaggag ccctgagacc      300
aatgcctaca cccagaaatt cttggcgcac tccccttggc agcccgattg ctgtgccgtt      360
ttcgcggggg ccctttacta ccccaggtac cgttggttcg accgggtgat gatccagttg      420
attatgcgca tgactggtgg agagaccgac tctaccaagg aagtggagta cactgactgg      480
cagcaggtga gtaccttcgc caacgatttt gcccagcttc caggcaagag ctaa            534
<210>  74
<211>  546
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  74
atgaagacct tgattctatt ctccacaagg gacggccaga ctagggagat cgcttcctac       60
ctggccagcg agctaaagga gcttggcatt caggcagacg tggctaacgt gcaccgaatt      120
gaggagccgc agtgggagaa ctacgatcgg gtcgtgatcg gcgccagcat ccggtatgga      180
cactaccaca gcgcgttcca ggagttcgtg aaaaagcacg cgacccgtct gaatagcatg      240
ccatcagcgt tctactcggt caacctcgtg gctcgtaagc ccgagaagcg gacaccccag      300
accaactcgt atgccaggaa gttccttatg aactcgcagt ggcgaccgga ccgctgcgcg      360
gtgatcgccg gtgcgctcag gtaccctcgt tataggtggt acgacaggtt tatgattaaa      420
cttataatga aaatgagcgg cggagagacc gacaccagaa aagaggtggt ttacacagac      480
tgggagcagg tagcaaactt cgctagggag attgctcacc tcaccgacaa gccgaccttg      540
aagtaa                                                                 546
<210>  75
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  75
atgaaggccc ttatactgtt cagttccaga gaaggccaga cgagggagat agcgagttac       60
attgccaact cgataaagga ggaaatggaa tgcgacgtgt tcaacatcct tcgtgtggag      120
cagatcgact ggtctcaata cgaccgcgtc ctgatcgggg gctcgataca ctacggccat      180
ttccacccag cggtggcaaa atttgtcaag aggcacctcc atgagttgca acagaggtct      240
tccggctttt tctgcgtcaa cctgacggcc aggaaggccg acaagcggac tccccagacc      300
aatgcctaca tgagaaagtt cttgttgcag tccccatggc aacccgattg ctgcgccgtg      360
tttgcggggg cccttaggta cacccgttac aggtggttcg acagggtaat gattcagctg      420
atcatgagga tgacgggcgg agagactgac acatcgaagg aggtggagta cacagactgg      480
acgcaggtcg cccgcttcgc gcaggagttc gcccatttgc ccggcaaaac tcagtga         537
<210>  76
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  76
atgaaggctc ttatcgtatt ctcttcgagg gatggccaaa cccgagcgat cgcgtcttat       60
attgctaata ccctcaaagg gaccctagag tgcgacgtcg tcaacgtcct caatgctaac      120
gacattgatt tgagccagta cgaccgtgtg gccattggcg cctccattcg ctacgggagg      180
ttccacccag ctgttaacca gtttatccgg aagcacctta cgagcctcca gcagctacca      240
tctgcgttct tctccgtgaa cctcacagct cggaagcccg agaagaggac tatacaaacc      300
aacgcgtaca ctaggaagtt tctactgaac tcgccgtggc agccggacct gtgctgcgtg      360
ttcgcgggag cccttcgcta tccccgttac aggtggtttg accgagtgat gattcaactc      420
ataatgcgca taacgggggg cgagacagac tccaccaagg agatcgagta caccgactgg      480
cagcaggtcg cgcgattcgc ccaggatttt gcacagcttg ccgcaaagaa cccggcatga      540
<210>  77
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  77
atgaagacct tgatcctatt ctccaccagg gacggccaaa cacacaagat cgcaaggcac       60
atcgcaggag tcctcgaaga gcaggggaag gcctgcgagt tggtcgatct gttacagccc      120
ggcgaaccag actggagtac cgttgaatgc gtcgttctag gggccagcat tagatatggt      180
cacttccata agtctttcat caggttcgta aacactcacg cgcagcgctt gaataatatg      240
ccaggcgccc ttttcacagt taacttagtc gcccgaaagc ccgagaagca gagtccacag      300
acgaactctt acacccgcaa gtttctcgcc gcctcccctt ggcagccaca gcgatgccaa      360
gttttcgcgg gcgctttgag gtaccctagg tactcgtggt acgacagaat gatgatacgt      420
ttgataatga agatggccgg gggcgagact gacacaagga aggaggttga gtacactgac      480
tggcagtcgg tgactcggtt cgcgagggag atcgctcagc tgccgggaga gacgcggtag      540
<210>  78
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  78
atgaaggccc taattttatt cagtagtagg gacggccaga cccagcttat agcatcgtct       60
atcgccaagg agctcgaagg gaagcaggcg tgcgacgtgt tgaatatcct cgacacgact      120
aatgtggagt ggacccagta cgaccgcgtg ctgattggag catccatccg gtacgggcac      180
tttcaccctg cggtcgccga gttcgtaaag cgtcaccagc gagagctaca gcagagaagt      240
agtggctttt tctctgtgaa cttgacggcc cgtaagccgg aaaagaggtc ccccgagact      300
aacgcctata ccgccaagtt ccttaaccaa agtccatggc agcctgactg ttgcgctgtg      360
ttcgctgggg ctttgcgata ccctcggtac cgctggttcg acagaattat gatccagcta      420
atcatgcgga tgactggggg tgagacagat tcttcaaagg aggtcgagta caccgactgg      480
cagcaggtga cccgcttcgc gcaagagttc gccaggcttc cgggaaagac cagttga         537
<210>  79
<211>  543
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  79
atgaagaccc taatactgtt ctctacccgc gacgggcaga caagggagat cgccgcgttc       60
cttgcctcgg agctgaagga gcaggggatt tacgctgacg tcataaacct taaccggacg      120
gaggagatag cttggcagga gtatgataga gtcgtaatcg gggcgtcgat ccgatacggg      180
catttccacc ctgctgtcga ccgcttcgtg aagaagcaca cagagacact caactcactg      240
cccggcgcct ttttctctgt aaaccttgtt gcccggaaag ccgagaagag aacgccgcag      300
acgaactcat acaccaggaa gttcctatta aacagcccgt ggaagccagc ggcctgcgcg      360
gtctttgctg gggccctccg ctaccctaga taccgctggt acgacaggtt catgatacga      420
ctgattatga aaatgacagg cggggagacg gatacccgaa aggaggtagt ctacactgac      480
tggtcgcagg tcgcgtcgtt tgccagagag atagtccagt tgaccaggtc atcgcgcttg      540
tga                                                                    543
<210>  80
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  80
atgaagatat taatcctttt ctccacccgt gacggccaaa cccgtgagat tgcggcgtcc       60
ttggcgtccg aactcaagga gcaggcattc gacgtggacg tcgtcaacct tcaccgggcc      120
gagaacatcg catgggagga gtacgacggt gttgtcatcg gagcgtccat caggtacggc      180
cactttcata gtaccctgaa ctcatttgtc aagaagcatc agcaggctct taagaagctt      240
cccggggctt tctacagcgt gaacctcgtc gcccggaagc ctgagaagcg cacaccgcag      300
accaatagct acacccgcaa gttcctcttg gattccccgt ggcagcccga cctttcagcc      360
gtgttcgccg gggcactcag gtaccctcgg tacaattggt acgaccgtat catgattaga      420
cttatcatga agattacagg cggcgagact gataccagga aggaagtagt ctacacagac      480
tggcagcagg tcactcactt tgctcacgag atcgtccagc tcgtgcggaa gtag            534
<210>  81
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  81
aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc       60
gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac      120
gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc      180
aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc      240
gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac      300
ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc      360
gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata      420
atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag      480
caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag         537
<210>  82
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  82
aaggccttga tcctgttctc tacacgcgac ggacagacac agaagatcgc atctgccatc       60
gctgatgaga taaaggggca gcaatcgtgc gacgtgatta acatacagga tgccaaaacc      120
ctcgactggc agcagtacga ccgggtactc atcggcgcct ccattcgtta cgggcatttc      180
cagcccgttg tgaatgagtt tgtcaagcac aacctcttgg ccctacagca gagagtttcc      240
ggattcttct ccgtgaactt gacagcccga aagccagaga agcggagccc cgagactaac      300
gcttatacag tcaaattctt ggcgcagtca ccctggcaac cggactgctg cgctgttttt      360
gcgggggccc tgtactaccc acggtaccgg tggttcgata gggtgatgat acagttcata      420
atgcgaatga cggggggaga gaccgacgca tcgaaagagg tggagtacac tgactggcag      480
caggtgcagc ggttcgcgcg agacttcgcg cagttaccgg gtaagtccta ctga            534
<210>  83
<211>  543
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  83
aagaccttga ttctattctc cacaagggac ggccagacta gggagatcgc ttcctacctg       60
gccagcgagc taaaggagct tggcattcag gcagacgtgg ctaacgtgca ccgaattgag      120
gagccgcagt gggagaacta cgatcgggtc gtgatcggcg ccagcatccg gtatggacac      180
taccacagcg cgttccagga gttcgtgaaa aagcacgcga cccgtctgaa tagcatgcca      240
tcagcgttct actcggtcaa cctcgtggct cgtaagcccg agaagcggac accccagacc      300
aactcgtatg ccaggaagtt ccttatgaac tcgcagtggc gaccggaccg ctgcgcggtg      360
atcgccggtg cgctcaggta ccctcgttat aggtggtacg acaggtttat gattaaactt      420
ataatgaaaa tgagcggcgg agagaccgac accagaaaag aggtggttta cacagactgg      480
gagcaggtag caaacttcgc tagggagatt gctcacctca ccgacaagcc gaccttgaag      540
taa                                                                    543
<210>  84
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  84
aaggccctta tactgttcag ttccagagaa ggccagacga gggagatagc gagttacatt       60
gccaactcga taaaggagga aatggaatgc gacgtgttca acatccttcg tgtggagcag      120
atcgactggt ctcaatacga ccgcgtcctg atcgggggct cgatacacta cggccatttc      180
cacccagcgg tggcaaaatt tgtcaagagg cacctccatg agttgcaaca gaggtcttcc      240
ggctttttct gcgtcaacct gacggccagg aaggccgaca agcggactcc ccagaccaat      300
gcctacatga gaaagttctt gttgcagtcc ccatggcaac ccgattgctg cgccgtgttt      360
gcgggggccc ttaggtacac ccgttacagg tggttcgaca gggtaatgat tcagctgatc      420
atgaggatga cgggcggaga gactgacaca tcgaaggagg tggagtacac agactggacg      480
caggtcgccc gcttcgcgca ggagttcgcc catttgcccg gcaaaactca gtga            534
<210>  85
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  85
aaggctctta tcgtattctc ttcgagggat ggccaaaccc gagcgatcgc gtcttatatt       60
gctaataccc tcaaagggac cctagagtgc gacgtcgtca acgtcctcaa tgctaacgac      120
attgatttga gccagtacga ccgtgtggcc attggcgcct ccattcgcta cgggaggttc      180
cacccagctg ttaaccagtt tatccggaag caccttacga gcctccagca gctaccatct      240
gcgttcttct ccgtgaacct cacagctcgg aagcccgaga agaggactat acaaaccaac      300
gcgtacacta ggaagtttct actgaactcg ccgtggcagc cggacctgtg ctgcgtgttc      360
gcgggagccc ttcgctatcc ccgttacagg tggtttgacc gagtgatgat tcaactcata      420
atgcgcataa cggggggcga gacagactcc accaaggaga tcgagtacac cgactggcag      480
caggtcgcgc gattcgccca ggattttgca cagcttgccg caaagaaccc ggcatga         537
<210>  86
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  86
aagaccttga tcctattctc caccagggac ggccaaacac acaagatcgc aaggcacatc       60
gcaggagtcc tcgaagagca ggggaaggcc tgcgagttgg tcgatctgtt acagcccggc      120
gaaccagact ggagtaccgt tgaatgcgtc gttctagggg ccagcattag atatggtcac      180
ttccataagt ctttcatcag gttcgtaaac actcacgcgc agcgcttgaa taatatgcca      240
ggcgcccttt tcacagttaa cttagtcgcc cgaaagcccg agaagcagag tccacagacg      300
aactcttaca cccgcaagtt tctcgccgcc tccccttggc agccacagcg atgccaagtt      360
ttcgcgggcg ctttgaggta ccctaggtac tcgtggtacg acagaatgat gatacgtttg      420
ataatgaaga tggccggggg cgagactgac acaaggaagg aggttgagta cactgactgg      480
cagtcggtga ctcggttcgc gagggagatc gctcagctgc cgggagagac gcggtag         537
<210>  87
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  87
aagaccctaa tactgttctc tacccgcgac gggcagacaa gggagatcgc cgcgttcctt       60
gcctcggagc tgaaggagca ggggatttac gctgacgtca taaaccttaa ccggacggag      120
gagatagctt ggcaggagta tgatagagtc gtaatcgggg cgtcgatccg atacgggcat      180
ttccaccctg ctgtcgaccg cttcgtgaag aagcacacag agacactcaa ctcactgccc      240
ggcgcctttt tctctgtaaa ccttgttgcc cggaaagccg agaagagaac gccgcagacg      300
aactcataca ccaggaagtt cctattaaac agcccgtgga agccagcggc ctgcgcggtc      360
tttgctgggg ccctccgcta ccctagatac cgctggtacg acaggttcat gatacgactg      420
attatgaaaa tgacaggcgg ggagacggat acccgaaagg aggtagtcta cactgactgg      480
tcgcaggtcg cgtcgtttgc cagagagata gtccagttga ccaggtcatc gcgcttgtga      540
<210>  88
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  88
aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc       60
gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac      120
gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc      180
aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc      240
gcgttcttct gcgtaaacct cacggcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac      300
ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc      360
gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata      420
atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag      480
caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag         537
<210>  89
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  89
aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc       60
gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac      120
gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga atattcgtta cggccacttc      180
aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc      240
gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac      300
ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc      360
gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata      420
atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag      480
caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatcgt acaagaaggc cctctag         537
<210>  90
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  90
aaggccttgg tactgtactc gacgcgggac ggccagaccc acgcaattgc ttcatacatc       60
gcctcctgca tgaaggagaa ggccgaatgc gacgtgatcg acctcaccca cggggagcac      120
gtgaacctca cccaatacga tcaggtgcta atcggtgcga gtattcgtta cggccacttc      180
aacgccgtgc ttgacaagtt catcaagaga aacgtggatc agctgaacaa catgccaagc      240
gcgttcttct gcgtaaacct cacagcaagg aagcccgaga agcgtactcc ccagacaaac      300
ccttatgtcc gaaaattctt gcttgctacc ccctggcagc ccgcgttgtg cggagtgttc      360
gcaggggccc ttcggtaccc gcgataccgg tggatcgaca aggtgatgat ccagctaata      420
atgcggatga ctgggggaga gacagacacg agcaaggagg tcgagtacac ggattgggag      480
caggttaaga agttcgcgga ggattttgca aagctatagt acaagaaggc cctctag         537
<210>  91
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  91
aaggccttga tcctgttctc tacacgcgac ggacagacac agaagatcgc atctgccatc       60
gctgatgaga taaaggggca gcaatcgtgc gacgtgatta acatacagga tgccaaaacc      120
ctcgactggc agcagtacga ccgggtactc atcggcgcct ccattcgtta cgggcatttc      180
cagcccgttg tgaatgagtt tgtcaagcac aacctcttgg ccctacagca gagagtttcc      240
ggattcttct ccgtgaactt gacagcccga aagccagaga agcggagccc cgagactaac      300
gcttatacag tcaaattctt ggcgcagtca ccctggcaac cggactgctg cgctgttttt      360
gcgggggccc tgtactaccc acggtaccgg tggttcgata gggtgatgat acagttcata      420
atgcgaatga cgggggggga gaccgacgca tcgaaagagg tggagtacac tgactggcag      480
caggtgcagc ggttcgcgcg agacttcgcg cagttaccgg gtaagtccta ctga            534
<210>  92
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  92
aagaccctaa tactgttctc tacccgcgac gggcagacaa gggagatcgc cgcgttcctt       60
gcctcggagc tgaaggagca ggggatttac gctgacgtca taaaccttaa ccggacggag      120
gagatagctt ggcaggagta tgatagagtc gtaatcgggg cgtcgatccg atacgggcat      180
ttccaccctg ctgtcgaccg cttcgtgaag aagcacacag agacactcaa ctcactgccc      240
ggcgcctttt tctctgtaaa ccttgttgcc cggaaagccg agaagagaac gccgcagacg      300
aactcataca ccaggaagtt cctattaaac agcccgtgga agccagcggc ctgcgcggtc      360
tttgctgggg ccctccgcta ccctagatac cgctggtacg acaggttcat gatacgactg      420
attatgaaaa tgacaggcgg ggagacggat acccgaaagg aggtagtcta cactgactgg      480
tcgcagatcg cgtcgtttgc cagagagata gtccagttga ccaggtcatc gcgcttgtga      540
<210>  93
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  93
atgaaggcgc tcgtgctcta cagcacacgc gacggccaga ctcatgcgat cgcctcttac       60
atcgcgtcct gtatgaagga gaaggccgag tgcgacgtca tcgatctcac gcacggggag      120
cacgtgaatc ttacgcagta cgaccaagtg ctgataggcg cctctatccg ttacggccat      180
tttaacgccg tcctcgacaa attcatcaag cgcaatgtag accagctgaa caacatgccc      240
tccgcgttct tttgcgtgaa cctgacggct cggaagcctg agaagcgaac acctcagacc      300
aacccatacg tgcggaaatt cctactcgca acgccatggc agcccgccct gtgcggggtt      360
ttcgcagggg cgctacgcta tccgcgttac cgctggatcg ataaggtgat gatccagcta      420
ataatgcgca tgaccggcgg cgagacagac acatcgaagg aagtcgaata cacagactgg      480
gaacaggtga agaagtttgc agaggatttc gccaagctct catacaaaaa ggcattgtga      540
<210>  94
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  94
atgaaggcgc ttatactgtt ctcgacacgc gacggtcaga cgcagaaaat cgcctcagcc       60
atcgccgacg agatcaaggg ccagcagagc tgcgatgtga tcaatattca ggacgccaaa      120
actctcgact ggcagcagta tgaccgcgtg ctcattggcg catcaatccg ctacgggcat      180
ttccagccag tcgtcaatga gtttgtgaaa cataacctct tggcattgca gcagcgggtg      240
tctggcttct tctccgtgaa ccttacagct agaaaaccag agaagcggtc gcccgagact      300
aacgcctaca ccgttaagtt ccttgcgcag tcaccgtggc agcctgattg ctgcgcggtc      360
ttcgccgggg cactgtacta ccctcgatac cggtggtttg atagggtaat gatccagttc      420
ataatgcgca tgaccggtgg ggagaccgac gcaagtaaag aagttgagta cacggattgg      480
cagcaggtgc aaaggttcgc acgcgacttc gcgcagctcc cgggcaagtc ttactga         537
<210>  95
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  95
atgaaagccc tgatcctcta ttccaccagg gacggccaga cccgcaagat agcctcctcc       60
atcgctgatg tcatccgcca gcagcagcag tgcgacgttt taaacattaa ggacgcttca      120
ctgcctgatt gggcccagta tgaccgcgtc ctgatcggcg cgtcgattcg gtacggccac      180
ttccagcctg tggttgacaa gttcgtcaag cagcacctgc atgagctgca gcagcgaact      240
agcgggttct tcagtgtgaa cctgacagct agaaagcccg aaaagagatc cccagaaacc      300
aacgcctata cgcagaaatt ccttgctcac tcaccctggc agcctgactg ttgtgccgtc      360
ttcgcgggcg ccttgtacta tccccgctac cgctggttcg atagggtgat gatccagctg      420
attatgagaa tgacgggagg ggagaccgat tcgaccaagg aggtagagta cactgactgg      480
caacaggtgt caactttcgc aaacgacttc gcacaactac ccggtaagtc ttga            534
<210>  96
<211>  546
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  96
atgaaaaccc taatactgtt ctcgacccgc gacggccaga cgcgtgagat tgcgagctac       60
ctggcctccg agctcaagga gctggggatc caagccgatg tcgcgaacgt gcaccgcatt      120
gaggagccgc agtgggagaa ttacgatcgc gttgtgatag gggccagcat ccgctatggc      180
cactaccact cggcctttca ggagtttgta aagaaacacg ccacaagatt aaactccatg      240
cctagcgcct tctactccgt caaccttgtc gcgcgcaagc cggagaagcg gacacctcag      300
acgaactcct acgcgcggaa gttcctgatg aacagccagt ggcggccgga cagatgtgct      360
gttattgcgg gagccctgag atacccgagg taccggtggt acgataggtt tatgattaaa      420
cttattatga agatgtctgg tggggagact gacaccagga aggaggtggt atatacagac      480
tgggagcagg tcgccaattt cgctcgggaa atcgcgcatc tgacagacaa gcctacactg      540
aagtag                                                                 546
<210>  97
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  97
atgaaggccc tgatcctctt tagctctagg gagggccaga cccgcgagat cgcgtcatat       60
atcgcgaatt ccataaagga ggagatggag tgcgatgtgt ttaacatcct tagggtggag      120
caaatagact ggtctcagta tgaccgtgtg ctcatagggg ggagcatcca ctacggccac      180
tttcacccgg ccgtggcgaa attcgtcaag cgacacctcc acgagcttca gcagcgctcc      240
tcagggttct tctgcgtcaa cctgacagca agaaaggcag ataaacgcac cccgcagacg      300
aacgcctaca tgaggaagtt ccttctgcag tctccttggc agcccgattg ctgcgcggtg      360
ttcgccggtg cactgcgcta tacgcgctat agatggtttg atagagtcat gattcagctc      420
atcatgcgga tgaccggcgg ggaaacggat actagtaagg aggtggagta cacggactgg      480
acccaggtgg cacgtttcgc ccaggagttt gcacatcttc ctgggaagac ccaatga         537
<210>  98
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  98
atgaaggcgc taattgtgtt cagctccagg gatggccaga cgagggctat agcatcctat       60
atcgccaata ccttgaaagg aacgctcgag tgtgacgtgg tcaacgtctt gaacgccaat      120
gacattgacc tttcccagta cgaccgagtt gccataggcg cgtcgatccg ctacgggcga      180
tttcaccctg cagtcaacca gtttatacgg aagcatttga cctcgctgca gcagctcccg      240
tcagccttct tctctgtgaa tttaaccgcg cggaagcctg agaaacggac gatccaaaca      300
aacgcctata cccgaaagtt cctcctgaac agcccatggc agccagacct gtgctgtgtc      360
ttcgccggcg cgttgcggta tccccgctac aggtggttcg atagagtgat gatccagctc      420
atcatgagga tcaccggggg agagaccgat agtaccaagg agatcgagta cacggactgg      480
cagcaggtgg ctcgcttcgc ccaggacttc gctcagttgg ccgcaaagaa tccagcataa      540
<210>  99
<211>  540
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  99
atgaagacac tgatcctgtt ctcgactcga gatggccaga ctcataaaat tgcgcgccac       60
attgcggggg tcctggagga gcagggcaaa gcgtgcgagc tcgtggactt actccagccc      120
ggggagccgg actggagcac ggtggagtgc gtcgttctgg gcgcttccat acgttacggg      180
catttccaca aaagtttcat ccggttcgtc aacacccacg ctcaacggct gaacaacatg      240
cctggcgcgc tattcactgt taacttagtg gctcgtaagc ccgagaagca gtctccgcag      300
actaactcct acacaaggaa atttctagca gcaagcccat ggcaaccgca gcggtgccag      360
gtgttcgctg gagctctgcg ctatcctagg tacagttggt acgacagaat gatgatacgg      420
ttgattatga agatggcagg cggggagacg gacaccagga aagaggtcga atacactgac      480
tggcaatcag tcactcggtt tgctagagag atcgcgcaat taccaggtga gacgcggtaa      540
<210>  100
<211>  537
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  100
atgaaggctc tcatactgtt cagctcgaga gacgggcaga cccagctgat cgcctcctcc       60
atagcaaagg agctagaggg caagcaagcc tgcgacgtgc tcaatattct cgacacaacc      120
aacgtggagt ggactcagta cgacagagtc ctaatcggcg cgtccatcag atacggccac      180
ttccatcccg ccgtcgctga attcgtgaaa cgccaccagc gtgagctcca gcagcgcagc      240
agcggcttct tcagcgtgaa tcttactgcg agaaagccgg aaaagcggag tcccgagact      300
aacgcttata cggcaaagtt cctcaaccaa tctccctggc aaccagactg ctgtgccgtg      360
ttcgctgggg cactgaggta tccgcgctat cggtggttcg atagaatcat gatacagctg      420
ataatgcgta tgactggtgg ggagacggat tccagtaaag aggtagagta tactgattgg      480
cagcaggtca ctaggttcgc gcaggagttt gctaggctgc cgggcaagac atcctga         537
<210>  101
<211>  543
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  101
atgaaaacct taatcttgtt cagcacccgc gacggccaga cgcgtgaaat cgcagcgttc       60
ctcgcttcgg agctcaagga acagggaatt tacgccgacg tcattaacct aaaccgtacc      120
gaagagattg cgtggcagga gtatgaccgc gtggtgattg gcgcttctat ccgctatggc      180
cacttccacc cggctgttga ccggttcgtg aagaagcaca cggagacctt gaactcactg      240
ccgggggcat tctttagcgt aaatctggtg gcgcgcaagg ccgagaagcg caccccccag      300
acgaacagct acacccgcaa atttttactt aactccccat ggaaacctgc ggcctgcgca      360
gtgttcgcag gagctctccg ctatcctcgc tatcgatggt acgatcggtt catgattcgg      420
ctgattatga aaatgacggg cggcgagacg gatacgcgaa aggaagttgt ctacactgac      480
tggtcccagg tggcctcgtt tgcaagggag atcgtacagc tcactcgatc tagtaggctc      540
tga                                                                    543
<210>  102
<211>  534
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Рекомбинантная
<400>  102
atgaagattc tcatcttatt ttccacccga gacggccaaa cccgcgagat tgcggcgtcc       60
ctcgcctccg agttgaagga gcaggcgttt gatgtggatg tggtcaacct ccaccgcgca      120
gaaaacatag cgtgggagga gtacgatggg gtcgtcatcg gagcgtcaat ccgctacgga      180
catttccact caacgctgaa ttcatttgtg aagaagcacc aacaagcgct caagaagctg      240
cccggagcat tctacagcgt caacctcgtg gctcggaagc cggaaaagcg caccccgcaa      300
acaaacagct acacacgcaa gtttctgctc gactcgccct ggcaacccga cctgagtgcc      360
gttttcgccg gggcactgcg ctatccccgt tacaactggt acgatcgcat aatgattcga      420
ctgatcatga agattacagg cggggaaacc gatactcgga aggaggtggt gtatacagac      480
tggcagcagg ttacccactt cgcccacgag atcgtccagc tcgttcgtaa gtga            534
<---