Питательная среда плотная для культивирования и сбора биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y.pestis EV
DENSE NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION AND COLLECTION OF BIOMASS OF PLAGUE MICROBE OF YPESTIS EV VACCINE STRAIN

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы Y.pestis EV и может быть использована в получении достаточного количества биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.
Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, содержащего аминный азот 0,12%; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; натрий сернистокислый 0,04; кислота соляная (1:1) 1,6; агар микробиологический 24,0; питьевая вода до 1 литра (Промышленный регламент на производство, вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. ПР 01897080-09-09. Регистрационный №2134-09. 2009 г. 253 с.).
Недостатком данной среды является ее дороговизна.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению относится питательная среда, состоящая из смеси двух гидролизатов в отношении 1:2 для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат кукурузного экстракта, содержащего аминный азот 0,45%; гидролизат казеиновый, содержащий аминный азот 0,45%, - 85; натрий хлористый 3,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 2,0; натрий сернистокислый 0,4; молибденовый аммоний 0,5; агар микробиологический 30,0; pH 7,0±0,2 питьевая вода до 1 литра. Смесь тщательно перемешивают и выливают в загрузочный люк установки для сушки белковых гидролизатов. Высушивание ведут при температуре (80±2)°C, под вакуумом не менее 0,6 атм (НПО» Аллерген» г. Ставрополь). Высушенный агар измельчают керамическими шарами в сушильной камере в течение 2,5-3 ч, периодически (каждые 15-20 мин), меняя ее положение (от горизонтального до предельного наклона влево и право) для перемешивания. (Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук., Саратов 1994 г. Гюлушанян К.С.)
Недостатком данной среды является ее сложность и громоздкость.
Целью изобретения является получение качественной питательной среды плотной для культивирования и выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV на белковой основе из растительного сырья - ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный), которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток, а также значительный экономический эффект.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда плотная в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный), натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический, питьевую воду, с добавлением в среду стимулирующей добавки - соли Мора при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Ферментативный гидролизат кукурузного экстракта
(сгущенный)
40,0-56,0
Натрий хлористый
4,0-6,0
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный
3,0-5,0
Соль Мора
0,08-0,12
Агар микробиологический
15,0-19,0
Питьевая вода
до 1 л
1
2
3
4
5
6
В качестве исходного сырья используют кукурузный экстракт-(сгущенный), содержащий в среднем 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), экстракт является хорошей питательной средой при производстве пенициллина и других антибиотиков и витаминов. Кроме того, он богат микроэлементами, мг/кг: цинк 22; марганец 5; медь 5; кобальт 0,02; йод 0,30, макроэлементами, %: фосфор 0,25; натрий 0,04; кальций 0,59; калий 0,36; магний 0,12; сера 0,11; хлор 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидин 72,0; лейцин 72,0; изолейцин 89,0; фенилаланин 59,0; треонин 95,0; валин 12,7; лизин 0,96; метионин 0,56; триптофан 0,22; метионин + цистин 0,27, и витаминами, мг/кг: каротин (витамин A) 8,0; B 4,0; B 1,0; B (пантотеновая кислота) 6,5; B (холин) 400; B 17; B 2,9. Как известно (И.В. Петрухин, 1989), кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи, кукурузные белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как изолейцин, лейцин, аргинин, фенилаланин. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.). Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.А. Газов, X.С. Морган, / США / 1989).
Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24, срок годности 12.2015. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.
Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2 замещенного 12-водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов-М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).
Соль Мора ГОСТ 4208-72. Двойная сернокислая соль закиси железа и аммония. Не горюча, не ядовита. Партия 14, дата изготовления октябрь 2014 г. Срок годности 3 года. Поставщиком соли Мора является ООО «НПФ Невский химик» Санкт-Петербург (Нева реактив).
Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г.
Питьевая вода-ГОСТ Р 51232-98 отвечает всем гигиеническим требованиям.
Приготовление ферментативного гидролизата из кукурузного экстракта (сгущенного).
Способ приготовления питательной основы для выращивания чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV заключается в следующем: кукурузный экстракт (сгущенный) в количестве 4,0 кг помещают в варочный котел, затем добавляют 24 л питьевой воды кипятят в течение 5 минут, устанавливают pH до 8,2 40% раствором натрия гидроокиси в количестве 52 мл, затем настой сливают в 10 л баллоны, охлаждают до 46°C. В остуженный настой добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) из расчета 30,0 на 1 л, устанавливают pH до 8,2-8,5, добавляют 1,5% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 46°C в течение 10 сут. В первые 24 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. На 10 сутки аминный азот составил 1120 мг %, а сухой остаток соответственно 25,5%. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, прекращают перемешивать и подогревать. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°C.
Приготовление питательной среды плотной
Питательную среду на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный) для культивирования чумного микроба и выращивания вакцинного штамма Y. pestis EV готовят следующим способом: ферментативный гидролизат, разбавленный питьевой водой до показания аминного азота 0,12% 48 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водного 4,0; агар микробиологический 17,0; питьевая вода до 1 литра. Среду кипятят до полого растворения, затем устанавливают pH 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют стимулирующую добавку: соль Мора в концентрации соответственно 0,1 г/л, разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°C, затем скашивают.
9
9
Перед приготовлением производственной культуры проводят анимализацию вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV путем пассажа через организм морской свинки. Все стерильные бактериологические пипетки перед работой хранят в условиях холодильника при (4±1)°C. Ампулу с сухой культурой штамма EV вскрывают с соблюдением правил асептики, разводят ее содержимое 0,9% раствором натрия хлорида и засевают микробной взвесью ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера pH 7,1±0,1 (исходная культура или культура I генерации). Одновременно контролируют ее культурально-морфологические и ферментативные свойства, высевают по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой, рамнозой и глицерином, к которым добавляют индикатор Андреде, и высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,3±0,1. Также культуру высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,1±0,1, которые в дальнейшем используют последовательного рассева с целью получения изолированных колоний. Все чашки Петри с посевами помещают на (48±2) ч для выращивания в термостат при температуре (27±1)°C. В том случае, если культура без диссоциации, т.е. морфология колоний типична для чумного микроба и вакцинный штамм стойко удерживает свой биохимический тип, исходную культуру I генерации пересевают в бактериологические пробирки (культура II генерации). Посевы инкубируют (24±1) ч при (27±1)°C. Через сутки пробирки с культурой II генерации используют для культивирования вакцинного штамма чумного микроба на скошенные поверхности во флаконы (матрацы). В качестве примера испытывают культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, pH 7,2±0,1 при температуре (27±1)°C. Затем готовят взвесь I суточной культуры тест-штамма, соответствующую 10 ед. по оптическому стандартного образца мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0×10 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, затем разведением взвеси 1×1 из 1,0×10 доводят содержания в 1 мл 500 млн. м.к. из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°C.
Учет результатов проводят через (48±2) ч. После чего производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствором натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отсасывания биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности.
Методика подсчета количества микробных клеток
-1
-1
-7
-8
-7
-8
Питательные среды из ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный) для определения количества живых микробных клеток должны обеспечивать, без добавления стимуляторов, рост микробов вакцинного штамма Y. pestis EV на всех чашках Петри с агаром, засеянных 10 м.к. по ОСО мутности 42-28-85П 10МЕ. В качестве стимулятора роста, к питательным средам перед розливом их в чашки Петри, добавляют 1 мл/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного натрия сернистокислого. Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробов в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°C. Из каждой пробирки с жидкой питательной средой содержимое в количестве 0,1 мл разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл (основное разведение 10). Добавляют последовательно физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл. Затем пипеткой делают последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9% растворе натрия хлористого, начиная с 10 по (0,5±0,01) мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида, заканчивая (10) и (10). Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10) и (10) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (pH 7,2±0,1) и выдерживают при температуре (27±1)°C 2-3 суток. (Промышленный регламент ПР на производство Вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекционного накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-09) от 11.12.2009 г.
Пример 1. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 40,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2- замещенный 12-водный 3,0; соль Мора 0,08; агар микробиологический 15,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составляет 13 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 59 млрд. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 51, после сушки получено 20% живых микробных клеток.
Пример 2. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 48,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; соль Мора 0,1; агар микробиологический 17,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 15 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 100 млрд. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 86,6, после сушки получено 43,8% живых микробных клеток.
Пример 3. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 56,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 5,0; соль Мора 0,12; агар микробиологический 19,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 14 мл взвеси, в 0.1 мл, которой получено 65 млрд. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч соответственно 65, после сушки получено 23% живых микробных клеток.
Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы вакцинного штамма Y. pestis EV (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный), может применяться для культивирования и выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток и значительный экономический эффект при замене мясных питательных основ на кукурузные. Рентабельность среды составляет 31%.