СИНЕРГИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИ РАЗРАБОТКЕ НЕФТЕДЕСТРУКТИВНЫХ БАКТЕРИАЛЬНО-ГРИБНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

УДК 579.64

СИНЕРГИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИ РАЗРАБОТКЕ НЕФТЕДЕСТРУКТИВНЫХ БАКТЕРИАЛЬНО-ГРИБНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

Шарапова И.Э.

Институт агробиотехнологий им. А.В.Журавского Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар; Россия

SYNERGISTIC INTERACTION IN THE DEVELOPMENT OF BACTERIAL-FUNGIC COMPLEX BIOPREPARATIONS FOR OIL DEGRADATION

Sharapova I.E.

Institute of agrobiotechnology named after A. V. Zhuravsky of Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. Syktyvkar, Russia

DOI: 10.31618/NAS.2413-5291.2022.2.82.626 Представлен скрининг штаммов как важный этап для разработки и конструирования комплексной формы биопрепарата, основанного на синергическом взаимодействии микроорганизмов различных таксономических групп и предназначенного для эффективной нефтедеструкции. Для исследований использованы штаммы бактерий и грибов родов Rhodococcus, Rhodotorula, Trichoderma. Изучение окислительной активности штаммов дрожжей и микромицетов проведено с различным сочетанием монокультур, где основным компонентом микробного комплекса выступали бактерии. Показано, что бактериально-грибные комплексы, составленные из бактерий Rhodococcus в сочетании с дрожжевым грибом Rhodotorula или микромицетом Trichoderma соответственно, наиболее эффективны для биодеструкции нефтеуглеводородов в смоделированных условиях загрязнения водных сред, чем бактериальная монокультура. По показателям снижения содержания нефти, прироста биомассы и общей микробной численности были выделены штаммы дрожжей R. glutinis (Y-1112) и мицелиального гриба T.lignorum (F-98), которые показали положительные результаты с бактериями R. equi (B-1117).

The strain screening is shown as a valuable stage for the development and constructional design of a complex form of biopreparation based on the synergistic interaction of microorganisms belonging to various phyla and intended for effective oil degradation. The strains of bacteria and fungi of the genera Rhodococcus, Rhodotorula, Trichoderma were used for our research. The study of the yeast strains and micromycetes oxidative activity was conducted with various combinations of monocultures, containing bacteria as the main component of the microbial complex. It was concluded that bacterial-fungic complexes consist of Rhodococcus bacteria in combination with the yeast fungus Rhodotorula or micromycete Trichoderma, respectively, are the most effective ones for the petroleum hydrocarbons biodegradation than a bacterial monoculture under simulated conditions of aquatic environment pollution environments. In terms of oil content reduction, biomass growth and total microbial abundance, strains of yeast R.glutinis (Y-1112) and filamentous fungus T.lignorum (F-98), which showed positive results with bacteria R. equi (B-1117), were isolated.

Ключевые слова: бактерии, дрожжи, микромицеты, биопрепараты, нефтеуглеводороды, биоремедиация воды

Key words: bacteria, yeast, micromycetes, biopreparation, petroleum hydrocarbons, bioremediation of water

Введение

Нефтяные углеводороды (НУГВ) при попадании в окружающую среду могут приводить к значительным негативным изменениям в биоценозах [1]. Особенно опасны нефть и нефтепродукты при загрязнении водных объектов, где НУГВ частично растворяются и медленно подвергаются процессам, ведущим к их разложению [2,3]. Наибольшей токсичностью обладают нерастворимая составляющая нефти, а также нефтепродукты, которые содержат максимальное количество растворимых в воде ароматических углеводородов [4]. Методом, который обладает эффективностью,

экономичностью, экологической безопасностью и отсутствием вторичных загрязнений, является биоремедиация с применением биопрепаратов на основе углеводородокисляющих микроорганизмов [5,6]. В настоящее время известно более ста видов бактерий, грибов, водорослей способных

превращать углеводороды нефти в двуокись углерода и воду [7,8]. Известно, что наиболее перспективными для использования в качестве биопрепаратов являются микроорганизмы, способные к активной биодеградации органических соединений и загрязнителей [9,10]. При этом установлено, что сложные сообщества способны с большей полнотой и скоростью разрушать углеводороды и осуществлять более глубокую деструкцию поллютантов [11, 12]. Для создания нефтедеструктивных биопрепаратов применяют природные или искусственно созданные ассоциации, в которых микроорганизмы отличаются по спектру потребляемых субстратов [7,12]. Известны бактерии и грибы, а также консорциумы, состоящие из нескольких штаммов, которые демонстрировали более высокую биодеградационную способность, чем

монокультура [13,14,15]. Однако включение в состав биопрепарата большого числа активных

микроорганизмов-нефтедеструкторов необязательно должно способствовать повышению биоокисления нефти и нефтепродуктов. Также следует отметить, что четких критериев составления консорциумов микроорганизмов до настоящего времени не предложено и в состав биопрепаратов включают штаммы по принципу их совместимости и высокой углеводородокисляющей активности. Межвидовое взаимодействие, кометаболизм, биохимическая кооперация микробного комплекса играют важную роль для повышения полноты и скорости деградации опасных веществ в окружающей среде. Поэтому особенно актуальна разработка состава комплексных форм биопрепаратов, а также приемов их получения, обеспечивающих направленное воздействие для эффективной очистки нефтезагрязненных водных сред.

Цель данной работы - отбор штаммов бактерий и грибов в смоделированных условиях загрязнения водных сред для конструирования нефтеокисляющего микробного комплекса.

Материалы и методы исследований

Объектами исследований были

депонированные штаммы микроорганизмов: бактерии Rhodococcus eritropolis (B-1115), R. equi (B-1117); дрожжевые грибы Rhodotorula sp., R. glutinis (Y-1112), R.glutinis (Y-1113); мицелиальные грибы Trichoderma lignorum (синоним T.viride, ВКПМ F-98), T.lignorum (ВКПМ F-119), T.viride (ВКПМ F-13/10). Для выращивания бактерий применяли жидкую минеральную среду Раймонда (г/л): Na2CO3 - 0.1; MgSo4 х 7 H20 - 0.2; FeSo4 х 7 H2O - 0.02; CaCl2 - 0.01; MnSo4 х 7 H2O - 0,02; K2HPO4 х 3 H2O - 1.0; NaH2PO4 х 3 H2O - 1.5; NH4Cl - 3. Выращивание дрожжевых и мицелиальных грибов проводили на среде Чапека (г/литр): Сахароза - 20; NaNO3 - 3; KH2PO4 - 1; MgSO4 *7Н2О - 0.5; KCl - 0.5; FeSO4*7H2O - 0.01. В качестве поллютантов использовали образцы сырой товарной нефти Усинского района Республики Коми. Скрининг провели на минеральной среде Раймонда с 3% нефти от объема воды в динамических условиях (150 оборотов/мин и Т= 23±2 0С) в течение 10 суток с различным сочетанием монокультур бактерий и грибов, где основным компонентом выступали бактерии Rhodococcus. В колбы с нефтезагрязненной средой вносили по 1 мл культуральной суспензии соответственно схеме, вариантам и повторностям (n=3). Оценивали взаимодействие

микроорганизмов по показателям снижения содержания нефти (в том числе визуальное изменение загрязненной водной среды от контрольного варианта), прироста биомассы и увеличения общей микробной численности (ОМЧ) [16]. Определение содержания углеводородов

нефти проводили измерением массовой доли нефтепродуктов в пробах на анализаторе нефтепродуктов. Полученные экспериментальные данные были обработаны статистически с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel и CXSTAT. Все экспериментальные данные представлены в виде среднего арифметического с доверительным интервалом для Р=0.95, рассчитанного по результатам измерения соответствующего параметра в трех повторениях.

Результаты исследований и их обсуждение

Выбор бактерий для основы микробного комплекса в качестве активного агента-нефтедеструктора обоснован тем, что ведущая роль в процессе трансформации нефтяных загрязнений в воде принадлежит нефтеокисляющим бактериям. Обоснованием выбора таксономически различных групп микроорганизмов для конструирования комплексного биопрепарата послужили данные о том, что бактерии, дрожжевые и мицелиальные грибы отличаются различными метаболическими путями окисления н-алканов, что многие виды мицелиальных грибов рода Trichoderma способны окислять ПАУ, а также данные об окислительной активности бактерий рода Rhodococcus и дрожжей рода Rhodotorula, выделенных из нефтезагрязненных почв Республики Коми. Для создания высокоактивных искусственных ассоциаций культур бактерий необходимо учитывать взаимоотношения между

микроорганизмами. С этой целью исследовали наличие или отсутствие антагонизма между культурами. Результаты исследования показали, что все штаммы микроорганизмов были взаимно толерантны друг к другу.

Для отбора штаммов в бактериально-дрожжевой или бактериально-грибной комплекс проведено изучение окислительной активности штаммов дрожжей и микромицетов с различным сочетанием монокультур, где основным компонентом микробного комплекса выступала монокультура бактерий Rhodococcus (Таблица 1, 2). В водной среде, где минеральный состав является оптимальным для размножения бактерий, единственным источником питания и энергии выступали углеводороды нефти. О биодеструкции нефти судили по изменениям в колбах при визуальном наблюдении. В вариантах опыта, где за 10 суток нефтяная пленка уменьшилась или исчезла, было определено остаточное содержание нефтеуглеводородов, титр и содержание биомассы микроорганизмов. Критерием отбора было повышение нефтепотребления бактериально-грибным комплексом в отличие от нефтепотребления бактериальной монокультурой и увеличение общей микробной численности (ОМЧ) от исходного не менее чем на 2 порядка.

Таблица 1.

Скрининг штаммов бактерий и грибов для нефтеокисляющего комплекса

Основной компонент микробного комплекса Компонент микробного комплекса (бактериально- грибного; бактериально-дрожжевого) Общее микробное число (ОМЧ), КОЕ/1 мл Биомасса, г/л Снижение содержания НУГВ (убыль) - степень нефтепотребления, %

Сутки 0 Сутки 1 Сутки 10 Сутки 10 Сутки 10

Rhodococcus eritropolis (B-1115) (3.6±0.5) x102 (1.3±0.3) х106 (6.5±0.6)x 1010 2.28±0.15 29.7±1.3

Rhodococcus eritropolis (B-1115) T. lignorum (F-98) (1.2±0.5) х102 (2.5±0.2) х104 (3.2±0.3) х1010 3.15± 0.25 26.1± 1.1

T.lignorum (F-119) (1.1±0.5) х102 (3.2±0.3) х103 (8.1±0.5) х106 -/+ 11.5± 1.5

T.viride (F-13/10) (1.0±0.5) х103 (9.6±0.5) х104 (2.1±0.2) х109 3.85± 0.25 33.1± 1.7

Rhodococcus eritropolis (B-1115) Rhodotorula glutinis sp. (1.5±0.2) х103 (6.8±0.2) х103 (1.5±0.5) х105 -/+ 16.7± 1.6

R. glutinis (Y-1112) (2.5±0.3) x103 (2.3±0.4) х105 (3.8±0.3) x109 2.72± 0.21 31.8± 1.5

R.glutinis (Y-1113) (6.1х±0.2) х 103 (2.1х±0.2) х106 (1.1±0.2) х1010 1.85± 0.15 29.8± 1.3

LSD 0,5 (lg) 1.33 2.85 7.81

Rhodococcus equi (B-1117) (5.6±0.3) х102 (3.2±0.3) х106 (1.5±0.3) x1010 1.98±0.15 25.5± 0.9

Rhodococcus equi (B-1117) T. lignorum (F-98) (6.5±0.6) x103 (4.3±0.5) х105 (5.2±0.6) x10n 3.65± 0.09 36.1± 1.5

T.lignorum (F-119) (2.1±0.2) х103 (2.9±0.3) х103 (7,3±0.6) х105 -/+ 13.5± 1.5

T.viride (F-13/10) (1.1±0.5) х103 (5.1±0.5) х104 (4.3±0.6) х109 2.31± 0.25 23.8± 1.1

Rhodococcus equi (B-1117) Rhodotorula glutinis sp. (3.5±0.3) х103 (2.8±0.3) х103 (1.5±0.5) х106 -/+ 19.5± 1.9

R. glutinis (Y-1112) (2.5±0.3) x103 (6.5±0.6) х104 (1.8±0.2) x109 1.62± 0.15 31.8± 1.5

R.glutinis (Y-1113) (6.1±0.5) х103 (2.1±0.3) х104 (4.1±0.5) х108 1.22±0,25 22.2± 1.1

LSD 0,5 (lg) 0.98 3.29 8.31

Примечание: (-) - отсутствие изменений; (-/+) - незначительные изменения

В результате отмечены варианты с сочетанием культур дрожжевого и мицелиального грибов в микробном комплексе с бактериями Rhodococcus equi. Некоторые штаммы дрожжей Rhodotorula являются активными нефтедеструкторами, но в сочетании с родококками способны к повышению биоокисления углеводородов нефти. В варианте с бактериально-грибным комплексом при сочетании бактерий Rhodococcus equi с микромицетом T. lignorum F-98 образовался конгломерат из микробной биомассы бурого цвета, который плавал

в прозрачной без нефтяной пленки водной среде. Возможно, разросшийся мицелий гриба служил матрицей-подложкой для клеток бактерий и нефти. Мицелиальный гриб T. lignorum F-98 при совместном культивировании с бактериями R. equi проявил нефтедеструктивную активность. Тогда как при инкубировании монокультуры штамма T. lignorum F-98 убыли нефтяной пленки и существенного накопления мицелиальной массы не наблюдали.

Таблица 2.

Выделенные варианты скрининга штаммов бактерий и грибов

Наименование исследуемых микроорганизмов в составе комплекса 0 сутки 10 сутки

1 1 2 3

Rhodococcus equi B-1117 (5.6±0.5)x102 (1.5±0.3)x109 1.98±0.15 25.5± 0.9

R. equi B-1117 + Т. lignorum F98 (6.5±0.6)x103 (5.2±0.6)x10n 3.65± 0.09 36.1± 1.5

Выводы

Проведенный скрининг бактерий, дрожжевых и мицелиальных грибов показал перспективность предложенного метода конструирования комплексных форм биопрепарата, составленного из микроорганизмов различных таксономических групп и основанного на синергическом взаимодействии для эффективной очистки водных сред от загрязнений углеводородами нефти. Комплексная форма бактериально-грибного биопрепарата включает культуры

нефитеокисляющих бактерий в сочетании с дрожжевым или мицелиальным грибами. По показателям снижения содержания нефти, прироста биомассы и общей численности микроорганизмов отобрали штаммы дрожжей Rhodotorula glutinis (Y-1112) и мицелиального гриба Trichoderma lignorum (синоним T.viride; F-98), которые показали положительные результаты с бактериями Rhodococcus equi (B-1117).

Работа выполнена в рамках Государственного задания FUUU-2022-0052. Конфликт интересов: автор подтверждает отсутствие конфликта интересов.

Presented study was carried out in accordance with the State assignment FUUU-2022-0052. Conflict of interest: The author declares no conflict of interest.

Список литературы

Voyno, L.I. Biodegradation of oil-contaminated soils and waters. Fundamental Research. 2006. no 5. Р. 68-70.

Dolina, L.F. Modern technology and facilities for oil-contaminated wastewater treatment. Dnepropetrovsk: Continent. 2005. 296 p.

Cuenca M.A. et al. Anaerobic biodegradation of diesel fuel-contaminated wastewater in a fluidized bed reactor. Bioprocess and Biosystems Engineering. 2006.Vol. 29. no 1. Р. 29-37.

Ратушняк А.А., Андреева М.Г., Латыпова В.З., Гарипова Л.Г. Токсическое действие нефти и продуктов ее переработки на Daphnia magna Straus // Гидробиол. журнал. 2000. № 3. С. 25-29.

Брянская А. В., Уварова Ю. Е., Слинько Н. М., Демидов Е. А., Розанов А. С., Пельтек С. Е. Теоретические и практические вопросы биологического окисления углеводородов микроорганизмами // Русский J. Genet.: Appl. Res. 2015. №4. С. 383-393.

Vilchez-Vargas R., Junca H., Pieper D.H. Metabolic networks, microbial ecology and 'omics' technologies: towards understanding in

situ biodegradation processes. Environ.

Microbiol. 2010. no 12. Р. 3089-3104

Mikesková H., Novotny C., Svobodová K. Interspecific interactions in mixed microbial cultures in a biodegradation perspective. Applied. Microbiology and Biotechnology. 2012.Vol. 95, no 4. Р. 861- 870.

Varjani S.J. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons. Bioresour. Technol. 2017. no 223. Р. 277-286.

McMullan G, Meehan C, Conneely A, Kirby N, Robinson T, Nigam P, Banat IM, Marchant R, Smyth W. Microbial decolourisation and degradation of textile dyes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. no 56. Р. 8187

Rabinovich ML, Bolobova AV, Vasil'chenko LG. Fungal decomposition of natural aromatic structures and xenobiotics: a review. Appl. Biochem. Microbiol. 2004. 40 no 1. Р.1-17

Machín-Ramírez C, Morales D, Martínez-Morales F, Okoh AI, Trejo-Hernández MR Benzo(a)pyrene removal by axenic- and co-cultures of some bacterial and fungal strains. Int. Biodeter. Biodegr. 2010. 64. Р. 538-544.

Xu X, Liu W, Tian S, Wang W, Qi Q, et al. Petroleum hydrocarbon-degrading bacteria for the remediation of oil pollution under aerobic conditions: a perspective analysis. Front. Microbiol. 2018. 9: 02885.

Kadam, A. A., Telke, A. A., Jagtap, A. S., Govindwar, S. P. Decolorization of adsorbed textile dyes by developed consortium of Pseudomonas sp. SUK1 and Aspergillus ochraceus NCIM-1146 under solid state fermentation. J. Hazard. Mater. 2011.189. Р. 486-494.

Matilla M.A. Problems of solventogenicity, solvent tolerance: an introduction. In: Krell T (Ed.), Cellular Ecophysiology of Microbe: Hydrocarbon and Lipid Interactions, Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Springer, Cham. Germany. 2018. Р. 327-334.

Marilena Stancu Mihaela. Bioremediation of Petroleum Contaminated Environments by Pseudomonas species. J. Biotech. Biores. 2019. 2. no 1. JBB.000530.2019.

Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. М: Издательский центр «Академия». 2005. 608 с.

R. equi B-1117+ R.glutinis Y-1112 (2.5±0.3)x103 (1.8±0.2) x109 1.62± 0.15 31.8± 1.5

R.equi B-1117 + R.glutinis Y-1112 + T. lignorum F 98 (1.3±0.2) x103 (2.8±0.3) x1010 2.41±0.8 27.3± 1.3

Примечание: 1 - общее микробное число, КОЕ/1 мл; 2 - биомасса, г/л; 3 - снижение содержания НУГВ - степень нефтепотребления (убыль), %.