СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2,4-ДИГИДРОКСИБУТИРАТА

1. Способ получения 2,4-дигидроксибутирата (аналогичен 2,4-дигидроксимасляной кислоте) из гомосерина, включающий два этапа:
- первый этап замещения первичной аминогруппы гомосерина карбонильной группой для получения 2-оксо-4-гидроксибутирата, и
- второй этап восстановления полученного 2-оксо-4-гидроксибутирата (ОГБ) до 2,4-дигидроксибутирата.
2. Способ по п. 1, в котором первый и/или второй этап(ы) катализируют ферментом, кодируемым эндогенно или гетерологичным геном.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором первый этап катализируют ферментом, обладающим гомосерин трансаминазной, гомосерин дегидрогеназной или гомосерин оксидазной активностью, соответственно.
4. Способ по п. 3, в котором фермент, обладающий гомосерин трансаминазной активностью, кодируется геном ilvE, tyrB, aspC, araT, bcaT, ARO8.
5. Способ по п. 4, в котором фермент, обладающий гомосерин трансаминазной активностью, кодируется последовательностью SEQ ID No.59, SEQ ID No.61, SEQ ID No.63, SEQ ID No.65, SEQ ID No.67 или SEQ ID No.69 или любой последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 50% указанным последовательностям, или соответствует последовательности SEQ ID No.60, SEQ ID No.62, SEQ ID No.64, SEQ ID No.66, SEQ ID No.68, SEQ ID No.70 или любой последовательности, гомологичной по меньшей мере на 50% указанным последовательностям.
6. Способ по п. 1 или 2, в котором второй этап катализируют ферментом, обладающим активностью редуктазы ОГБ.
7. Способ по п. 6, в котором фермент, обладающий активностью редуктазы ОГБ, представляет собой лактатдегидрогеназу, или малатдегидрогеназу, или дегидрогеназу 2-гидроксикислот с разветвленной цепью.
8. Способ по п. 7, в котором редуктаза ОГБ представляет собой (D)-лактатдегидрогеназу Escherichia coli, (L)-лактатдегидрогеназу Lactococcus lactis, Oryctalagus cuniculus, Geobacillus stearothermophilus или Bacillus subtilis, (L)-малатдегидрогеназу Escherichia coli, дегидрогеназу (D)-2-гидроксикислоты с разветвленной цепью Lactococcus lactis или их гомологи.
9. Способ по п. 8, в котором редуктаза ОГБ представляет собой:
- лактатдегидрогеназу, содержащую по меньшей мере одну мутацию в положении V17, Q85, Е89, I226 или А222, причем указанные положения определены путем ссылки на L-Lactis LdhA (SEQ. ID No 6);
- малатдегидрогеназу, содержащую по меньшей мере одну мутацию в положении 112, R81, М85, D86, V93, G179, Т211 или М227, причем указанные положения определены путем ссылки на E.coli Mdh (SEQ ID No 2).
10. Способ по п. 8 или п. 9, в котором редуктаза ОГБ:
- представлена последовательностью SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8, SEQ ID No.10, SEQ ID No.12, SEQ ID No.14, SEQ ID No.288, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.102, SEQ ID No.104, SEQ ID No.106, SEQ ID No.108, SEQ ID No.110, SEQ ID No.112, SEQ ID No.114, SEQ ID No.116 или SEQ ID No.118 или любой последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 50% указанным последовательностям;
- кодирована последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, SEQ ID No.287, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.101, SEQ ID No.103, SEQ ID No.105, SEQ ID No.107, SEQ ID No.109, SEQ ID No.111, SEQ ID No.113, SEQ ID No.115 или SEQ ID No.117 или любой последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 50% указанным последовательностям.
11. Модифицированный микроорганизм для получения 2,4-дигидроксибутирата (ДГБ) из гомосерина, при этом получение включает два этапа, состоящих из/включающих:
- первый этап замещения первичной аминогруппы гомосерина карбонильной группой для получения 2-оксо-4-гидроксибутирата, и
- второй этап восстановления полученного 2-оксо-4-гидроксибутирата для получения 2,4-дигидроксибутирата.
12. Модифицированный микроорганизм по п. 11, в котором ферменты, катализирующие первую и вторую стадии, представляют собой описанные в пп. 2-10.
13. Модифицированный организм по п. 11 или 12, в котором получение гомосерина усилено по сравнению с таким же нетрансформированным микроорганизмом.
14. Модифицированный организм по п. 11 или 12, в котором усилена активность аспартаткиназы, аспартат полуальдегид дегидрогеназы и/или гомосерин дегидрогеназы.
15. Микроорганизм по п. 11 или 12, в котором получение 2,4-ДГБ усилено по сравнению с таким же, нетрансформированным микроорганизмом.
16. Микроорганизм по п. 11 или 12, представляющий собой бактерию, предпочтительно выбранную из Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae и Corynebacteriaceae, наиболее предпочтительно из Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens или Lactococcus lactis, или дрожжи, предпочтительно выбранные из Saccharomycetaceae, Pichiaceae и Schizosaccharomycetaceae, наиболее предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Pichia stipitis или Pichiapastoris; или грибы, предпочтительно выбранные из Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium или Trichoderma.
17. Микроорганизм по п. 11 или 12, в котором повышена экспрессия по меньшей мере одной ферментативной активности, выбранной из фосфоенолпируваткарбоксилазной, фосфоенолпируваткарбоксикиназной, изоцитратлиазной, пируваткарбоксилазной и активности симпортера пермеазы гексозы, и/или понижена экспрессия по меньшей мере одной ферментативной активности, выбранной из лактатдегидрогеназной, алкогольдегидрогеназной, ацетаткиназной, фосфат ацетилтрансферазной, пируват оксидазной, изоцитратлиазной, фумаразной, 2-оксоглутарат дегидрогеназной, пируваткиназной, активности малеинового фермента, фосфоглюкозо-изомеразной, фосфоенолпируваткарбоксилазной, фосфоенолпируваткарбоксикиназной, пируватформиатлиазной, аспартат полуальдегид дегидрогеназной, фосфотрансферазной транспорта сахаров, кетогидроксиглутарат альдолазной, гомосерин-О-сукцинил-трансферазной, гомосеринкиназной, активности эффлюксного переносчика гомосерина, диаминопимелатдекарбоксилазной и/или метилглиоксальсинтазной.
18. Микроорганизм по п. 16, представляющий собой Escherichia coli, сверхэкспрессирующий по меньшей мере один ген, выбранный из ррс, pck, aceA, galP, asd, thrA, metL, lysC E coli; pycA L lactis, и/или в котором по меньшей мере один ген, выбранный из IdhA, adhE, ackA, pta, рохВ, focA, pfIB, sad, gabABC, sfcA, maeB, ррс, pykA, pykF, mgsA, sucAB, ptsl, ptsG, pgi, fumABC, aldA, IIdD, icIR, metA, thrB, lysA, eda, rthA, rthB, rthC, делетирован.
19. Способ получения 2,4-ДГБ, включающий этапы:
- культивирование модифицированного микроорганизма по любому из пп. 11-18 в подходящей культуральной среде,
- выделение 2,4-ДГБ из культуральной среды.
20. Способ по п. 19, в котором 2,4-ДГБ дополнительно очищают.
21. Применение любого фермента, обладающего гомосерин трансаминазной, гомосерин дегидрогеназной или гомосерин оксидазной активностью, для трансформации гомосерина в ОГБ.
22. Применение любых ферментов, обладающих (L)-лактатдегидрогеназной, (L)-малатдегидрогеназной или дегидрогиназной 2-гидроксикислот активностью, для трансформации ОГБ в 2,4-ДГБ.