СЛИТНЫЕ БЕЛКИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
FUSED IMMUNOGLOBULIN PROTEINS

Область техники
Настоящее изобретение относится к гибридному Fc человека и слитному белку иммуноглобулина, в котором гибридный Fc человека соединен с биологически активной молекулой. В частности, оно относится к гибридному Fc человека, который получен из сочетаний субклассов иммуноглобулина G человека (IgG) или комбинаций IgD и IgG человека, и слитного белка, в котором такой Fc соединен с биологически активной молекулой через ковалентную связь.
Предпосылки изобретения
in vivo
Биологически активные молекулы могут обладать большим терапевтическим интересом. Однако в качестве терапевтического средства они могут обладать недостатками, так как низка их стабильность . Их период полураспада в циркуляции или период полураспада в сыворотке короток, так как в живом организме они расщепляются различными ферментами. Поэтому было бы желательно усовершенствовать период полураспада в циркуляции биологически активных молекул.
Было известно, что увеличение размера белка может увеличить его период полураспада, препятствуя удалению белка почками (Knauf et al., J. Biol. Chem. 1988. 263:15064-15070). Например, сообщалось об увеличении стабильности белка за счет присоединения активного белка к альбумину человека (Kinstler et al., Pharm. Res. 1995. 12:1883-1888). Однако, так как присоединение активного белка к альбумину человека лишь слегка увеличивает его время удержания, это не являлось эффективным способом для разработки эффективного фармацевтического состава, содержащего активный белок, который соединен с альбумином человека.
Другой способ, о котором сообщалось, состоит в модулировании гликозилирования белка. Дополнительное гликозилирование белка и введение сиаловых кислот в белки приводит к предотвращению деградации белков в печени. Но увеличение гликозилирования белков также ведет к снижению биологической активности белков.
Чтобы стабилизировать белки и предотвратить клиренс почками, белки конъюгировали с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Ковалентное конъюгирование с ПЭГ широко использовалось для доставки лекарственного средства с пролонгированным периодом полураспада (Delgado et al., 1992. 9:249-304). Однако сообщалось, что конъюгирование ПЭГ с цитокинами или гормонами приводит к снижению аффинности связывания с рецептором из-за стерических препятствий, вызванных конъюгированием.
В последнее время исследовались и разрабатывались слитные белки, производимые с использованием иммуноглобулина (Ig). Ig является важным компонентом крови. Ig человека (hIg) содержит различные классы, такие как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE (Roitt et al., «Immunology» 1989, Gower Medical Publishing, London, U. K.; New York, N. Y.). IgG человека могут быть дополнительно разделены на разные субтипы, известные как IgG1 человека (hIgG1), IgG2 человека (hIgG2), IgG3 человека (hIgG3) и IgG4 человека (hIgG4).
Иммуноглобулины состоят из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых цепей и двух легких цепей, которые связаны через дисульфидные связи и образуют тетрамеры. Каждая цепь состоит из вариабельной области и константной области. Константная область тяжелой цепи дополнительно разделена на три или четыре области (CH1, CH2, CH3 и CH4), в зависимости от изотипа. Часть Fc константной области тяжелой цепи, в зависимости от изотипа Ig, содержит шарнир, домены CH2, CH3 и/или CH4.
Относительно периода полураспада в сыворотке, IgG1, IgG2 и IgG4 обладают длительными периодами полураспада, равными 21 дню, тогда как другие иммуноглобулины обладают относительно короткими периодами полураспада, которые составляют менее чем неделю. Химерные белки, слитые с участком Fc из IgG, показывают увеличенную стабильность и увеличенный период полураспада в сыворотке (Capon et al., Nature 1989. 337:525-531). Биологически активные белки были слиты на N-конце области CH1, N-конце области Fc или на C-конце области CH3 из IgG.
В начальный период слитные белки IgG создавали с внеклеточными доменами рецепторов с поверхности клетки, таких как CD4 (Capon et al., Nature 1989. 337:525-531), TNFR (Vbhler et al., J. Immunology 1993. 151:1548-1561), CTLA4 (Linsley et al., J. Exp. Med. 1991, 173:721-730), CD86 (Morton et al., J. Immunology 1996. 156:1047-1054). Также имеют место некоторые цитокины и гормоны роста, которые были слиты с доменами IgG. Однако, в отличие от слияния с внеклеточными доменами рецепторов с поверхности клетки, слияние растворимых белков с иммуноглобулинами G приводит к снижению биологических активностей, по сравнению с неслитыми цитокинами или факторами роста. Химерные белки существуют в виде димеров, что ведет к стерическим препятствиям для взаимодействия с их молекулами-мишенями, такими как рецепторы, из-за присутствия двух активных белков в тесной близости друг к другу. Поэтому можно преодолеть эту проблему создания эффективного слитного белка.
Другое ограничение технологии слияния Fc состоит в наличии нежелательных иммунных ответов. Домен Fc иммуноглобулина также обладает эффекторными функциями, такими как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC). Эти эффекторные функции, как правило, выполняются через взаимодействие Fc-области Ig и FcR на эффекторных клетках или через связывание комплемента. Поэтому блокирование эффекторных функций Fc должно быть выполнено для снижения нежелательных реакций, таких как цитолиз клеток, высвобождение цитокинов или воспаление.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Таким образом, существует необходимость в улучшенных Fc слитных белках с минимальной потерей биологической активности и с меньшим риском нежелательных иммунных ответов.
Техническое решение
Настоящее изобретение относится к гибридному Fc, который выведен из комбинаций субклассов IgG человека или комбинаций IgD и IgG человека. Гибридный Fc эффективен, когда соединен с биологически активной молекулой для увеличения периода полураспада биологически активной молекулы в сыворотке, а также увеличения уровня экспрессии полипептида, когда экспрессируется нуклеотид, кодирующий слитный белок Fc-полипептид.
Настоящее изобретение также относится к гибридному Fc слитному полипептиду, в котором гибридный Fc соединен с биологически активной молекулой. Слитный белок иногда обозначается как «биологически активная молекула-Fc слитный белок» или просто «слитный белок». Слитный белок может содержать линкер между Fc и биологически активной молекулой. Fc может быть соединен своим N-концом с C-концом биологически активной молекулы.
Слитный белок может быть синтезирован посредством изготовления нуклеотидной конструкции, кодирующей и способной экспрессировать слитный белок, экспрессии его в клетке-хозяине и сбора слитного белка. Альтернативно, слитный белок может быть синтезирован посредством экспрессии нуклеотида, кодирующего Fc, и соединения его с биологически активной молекулой традиционным способом.
Полипептид согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения может быть представлен следующей формулой:
P
N'-(Z1)-Y-Z2-Z3-Z4-C'
где N' представляет собой N-конец и C' представляет собой C-конец полипептида;
Z1 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:14;
Y обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 99 до 162 из SEQ ID NO:14;
Z2 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 111 до 147 из SEQ ID NO:12 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14;
Z3 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24 или с 115 до 220 из SEQ ID NO:13;
Z4 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11, 220-326 из SEQ ID NO:12, 271-377 из SEQ ID NO:24 или 221-327 из SEQ ID NO:13 и
p представляет собой целое число, равное 0 или 1,
где общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 составляет от 80 до 140, включая оба предела.
Z1 может быть аминокислотной последовательностью, включающей от 5 до 9 последовательных аминокислотных остатков с C-концевой стороны аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:11, или 5-9 последовательных аминокислотных остатков с C-концевой стороны аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления Z1 может представлять собой 5, 6, 7, 8 или 9 C-концевых аминокислотных остатков из домена CH1 IgG1 (SEQ ID NO:11) или домена CH1 IgD (SEQ ID NO:14).
В другом варианте осуществления Z1 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из 5-9 аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 также может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.
Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей 5 или более, или 10 или более последовательных аминокислотных остатков из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11 или 5 или более, или 10 или более последовательных аминокислотных остатков из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14. В определенных вариантах осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11, аминокислотные остатки в положениях с 158 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях с 153 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях с 143 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях с 133 до 162 из SEQ ID NO:14, или аминокислотные остатки в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14.
Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей от 4 до 37, или 6-30 последовательных аминокислотных остатков из N-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 111 до 147 из SEQ ID NO:12(hIgG2) или с 4 до 37, или 6-30 последовательных аминокислотных остатков из N-концевой части аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14 (hlgD). В определенных вариантах осуществления Z2 может представлять собой 6 N-концевых аминокислотных остатков из домена CH2 IgG2 человека или 8 N-концевых аминокислотных остатков из домена CH2 IgD человека.
Общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может быть между 80 и 140. В варианте осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет между 90 и 120, включая оба предела. В другом варианте осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет между 105 и 115, включая оба предела. В одном из вариантов осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет 108. В еще одном варианте осуществления общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 составляет 109.
Z4 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей 90 или более, или 100 или более последовательных аминокислотных остатков в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11 (hIgG1), 220-326 из SEQ ID NO:12 (hIgG2), 271-377 из SEQ ID NO:24 (hIgG3) или от 221 до 327 из SEQ ID NO:13 (hIgG4). Z4 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11, 220-326 из SEQ ID NO:12, 271-377 из SEQ ID NO:24 или с 221 до 327 из SEQ ID NO:13.
Согласно варианту осуществления, Z3-Z4 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 118 до 223 из SEQ ID NO:11 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 224 до 330 из SEQ ID NO:11, (ii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 114 до 219 из SEQ ID NO:12 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 220 до 326 из SEQ ID NO:12, (iii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 165 до 270 из SEQ ID NO:24 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 271 до 377 из SEQ ID NO:24, и (iv) непрерывной аминокислотной последовательности из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 115 до 220 из SEQ ID NO:13 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 221 до 327 из SEQ ID NO:13.
Общее количество аминокислотных остатков полипептида согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения составляет от 154 до 288.
В одном из вариантов осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 99-113 из SEQ ID NO:11, p может быть равен 1 или 0, Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 111-147 из SEQ ID NO:12, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24 или со 115 до 220 из SEQ ID NO:13. В этом варианте осуществления, когда p равно 1, Z1 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11.
В дополнительных вариантах осуществления Z3 может быть равен от 73 до 106 последовательных аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24 или 115-220 из SEQ ID NO:13, и общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может составлять 110. Z2 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 111-116 из SEQ ID NO:12, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 120-223 из SEQ ID NO:11, 116-219 из SEQ ID NO:12, 167-270 из SEQ ID NO:24 или с 118 до 220 из SEQ ID NO:13.
В другом варианте осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14, p может быть равно 1 или 0 (нулю), Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 121 до 220 из SEQ ID NO:13. В этом варианте осуществления, когда p равно 1, Z1 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.
В дополнительных вариантах осуществления Y может представлять собой 20 последовательных аминокислотных остатков или более, 30 последовательных аминокислотных остатков или более, 40 последовательных аминокислотных остатков или более, 50 последовательных аминокислотных остатков или более или 60 последовательных аминокислотных остатков или более из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях 99-162 из SEQ ID NO:14. Z2 может представлять собой аминокислотные остатки в положениях с 163 до 170 из SEQ ID NO:14, Z3 может содержать от 71 до 100 последовательных аминокислотных остатков из C-концевой части аминокислотных остатков в положениях 124-223 из SEQ ID NO:11, 120-219 из SEQ ID NO:12, 171-270 из SEQ ID NO:24 или 121-220 из SEQ ID NO:13. Общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 может составлять 108.
В одном из вариантов осуществления полипептид может кодироваться нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27. Полипептид представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29.
В варианте осуществления полипептид слит своим N-концом с биологически активной молекулой, которая проявляет увеличенный период полураспада в циркуляции по сравнению с периодом полураспада в циркуляции нативной формы указанной биологически активной молекулы. Биологически активная молекула может представлять собой полипептид, белок или apeptide. Биологически активная молекула может представлять собой полипептид, пептид или белковое лекарственное средство. Биологически активная молекула может являться растворимым белком, таким как, но без ограничений, гормон, цитокин, фактор роста, ко-стимулирующая молекула, рецептор гормона, рецептор цитокина, рецептор фактора роста или короткий пептид. Биологически активная молекула может представлять собой эритропоэтин или его варианты/фрагменты, p40 или его варианты/фрагменты (например, вариант p40, который содержит замену Asn303Gln), G-CSF или его варианты/фрагменты, Рецептор TNF, GMCSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, рецептор IL-10, TGF-β, рецептор TGF-β, IL-17, рецептор IL-17, фактор VII, CXCL-11, FSH, гормон роста человека, морфогенетический белок кости-1 (BMP-1), CTLA4, PD-1, GLP-1, бетацеллюлин, OPG, RNAK, интерферон α, интерферон β или их варианты/фрагменты. Биологически активная молекула может представлять собой секретируемый белок, который может присутствовать в зрелой форме.
В одном из вариантов осуществления предоставлен способ синтеза полипептида по п.1, где способ включает в себя стадии: (i) введение молекулы ДНК, кодирующей полипептид, в клетку-хозяин млекопитающего, (ii) выращивание клетки в условиях, в которых полипептид может быть экспрессирован в ее среду для выращивания; и (iii) сбор экспрессированного полипептида. Клетка-хозяин млекопитающего может представлять собой клетки CHO, COS или BHK.
В другом варианте осуществления предоставлен способ (i) снижения симптомов, предотвращения или лечения аутоиммунного заболевания, (ii) подавления отторжения имплантата, или (iii) предотвращения и лечения эндотоксин-индуцированного шока, включая введение терапевтически эффективного количества полипептида, описанного выше, где полипептид слит с биологически активной молекулой.
В одном из вариантов осуществления предоставлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Полипептид может обладать аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29. Молекула нуклеиновой кислоты может обладать нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:27. Молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать сигнальную последовательность или лидерную последовательность.
Согласно варианту осуществления изобретения, предоставлен экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты и клетку-хозяин, содержащую вектор. Примеры экспрессирующего вектора могут включать, без ограничений, pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1, pAD11 p40N303Q-hFc-1, pAD11 EPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-5 и pAD11 TNFR-hFc-5.
В одном из вариантов осуществления предоставлен способ доставки биологически активной молекулы в млекопитающее, включающий стадию введения молекулы нуклеиновой кислоты млекопитающему по его необходимости.
В другом варианте осуществления полипептид содержит домен Fc, который состоит из шарнирной области, домена CH2 и домена CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где указанная шарнирная область содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков шарнирной области из IgD человека или шарнирной области из IgG1 человека; указанный домен CH2 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков из домена CH2 IgG4 человека, где 4-37 последовательных аминокислотных остатков на N-конце домена CH2 IgG4 человека замещены, по меньшей мере, участком аминокислотных остатков из N-концевой области домена CH2 IgG2 человека или N-концевой области домена CH2 IgD человека, и указанный домен CH3 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH3 IgG4 человека.
Шарнирная область может содержать, по меньшей мере, участок из аминокислотных остатков шарнирной области IgG1 человека, указанный домен CH2 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH2 IgG4 человека, где 4-37 аминокислотных остатков на N-конце домена CH2 IgG4 человека замещены, по меньшей мере, участком аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgG2 человека.
Шарнирная область может содержать, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков шарнирной области IgD человека, указанный домен CH2 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH2 IgG4 человека, где 4-37 аминокислотных остатков на N-конце домена CH2 IgG4 человека замещены, по меньшей мере, участком аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgD человека.
Полипептид может дополнительно содержать домен CH1, где указанный домен CH1 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH1 IgG1 человека, и где указанный домен CH1 соединен с N-концом указанной шарнирной области. Полипептид может дополнительно содержать домен CH1, где указанный домен CH1 содержит, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков домена CH1 IgD человека, и где указанный домен CH1 соединен с N-концом указанной шарнирной области. Полипептид может дополнительно содержать второй полипептид, соединенный с N-концом указанной шарнирной области, где второй полипептид является биологически активным неиммуноглобулиновым полипептидом. Полипептид может дополнительно содержать биологически активную молекулу, соединенную с N-концом указанного домена CH1 или с C-концом указанного домена CH4 через линкер, где указанная биологически активная молекула не является иммуноглобулиновым полипептидом. Полипептид и биологически активная молекула могут быть соединены друг с другом через линкер. Линкерная молекула представляет собой альбуминовый линкер или синтетический линкер. Альбуминовый линкер содержит аминокислотную последовательность с 321 до 323, с 318 до 325, с 316 до 328, с 313 до 330, с 311 до 333 или с 306 до 338 из SEQ ID NO:25. Синтетический линкер может представлять собой пептид от 10 до 20 аминокислотных остатков, состоящий из остатков Gly и Ser. В одном из вариантов осуществления такой Gly-Ser линкер представляет собой GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO:32).
Настоящее изобретение также охватывает молекулу антитела, содержащую рекомбинантную Fc-область, рекомбинантная Fc-область описана выше.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 показывает схематически рисунок гибридного Fc (hFc), который можно использовать в качестве носителя белка для биологически активных молекул, обозначенный как «X».
Фиг.2 показывает схематические представления hFc с последующим подробным описанием аминокислотных положений, полученных из IgG1 (SEQ ID NO:11), IgG2 (SEQ ID NO:12), IgG4 (SEQ ID NO:13) и IgD (SEQ ID NO:14). Такое же правило применяется для обозначения аминокислотных положений в полипептиде на всем протяжении заявки, если не указано иначе.
Фиг.3 показывает схематическое представление hFc, каждый из которых конъюгирован с биологически активными молекулами, обозначенными «X» на C-конце через пептид альбуминового линкера, обозначенного как «AL».
Фиг.4 показывает схематические представления hFc, конъюгированных с линкерами с последующим подробным описанием аминокислотных положений альбуминовых линкеров, полученных из альбумина человека (SEQ ID NO:25).
Фиг.5 показывает результаты графика гидрофобности для hFc-6.
Фиг.6(a) показывает результаты активностей связывания FcγRI c MabThera (ритуксимаб), hIgG1, Энбрелом (этанерцепт), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5 с использованием специфичного теста ELISA; Фиг.6(b) показывает результаты активностей связывания C1q с MabThera (ритуксимаб), hIgG1, Энбрелом (этанерцепт), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5 с использованием специфичного теста ELISA.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
Фиг.7(a) показывает результаты биоактивностей EPO-IgG1 Fc, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5, EPO-hFc-6 и Aranesp (дарбэпоэтин альфа), по сравнению с биоактивностью EPO в человеческой клеточной линии F36E; фиг.7(b) показывает результаты биоактивностей Нейласты (пегфилграстим) и G-CSF-hFc-5 в мышиной гематопоэтической клеточной линии (NFS-60); фиг.7(c) показывает результаты биоактивностей p40 и p40N303Q-hFc-5 в человеческих PBMC. Фиг.7(d) показывает результаты биоактивностей Энбрела (этанерцепт) и TNFR-hFc-5 в мышиных клетках L929; и фиг.7(e) показывает результаты биоактивностей thFc-1-AL(0)-IFN-β и thFc-1-AL(3)-IFN-β в человеческих клетках WISH .
in vivo
Фиг.8(a) показывает результаты периода полураспада Aranesp (дарбэпоэтин альфа), EPO-hFc-1 или EPO-hFc-5 , введенных обезьянам рода Cynomolgus через подкожный путь (левый график) и через внутривенный путь (правый график). Фиг.8(b) показывает результаты фармакокинетики Лейкостима (филграстим) и G-CSF-hFc-1, введенных крысам Sprague Dawley через подкожный путь (левый график) и через внутривенный путь (правый график); фиг.8(c) показывает результаты фармакокинетики p40N303Q-hFc-5 и Энбрела (этанерцепт), введенных обезьянам рода Cynomolgus через подкожный путь: фиг.8(d) показывает результаты фармакокинетики TNFR-hFc-5 и Энбрела (этанерцепт), введенных крысам Sprague Dawley через подкожный путь.
in vivo
in vivo
Фиг.9(a) показывает результаты биоактивностей Aranesp (дарбэпоэтин альфа) и EPO-hFc-5 , введенных обезьянам рода Cynomolgus через подкожный путь (верхний левый график) и через внутривенный путь (нижний правый график) и фиг.9(b) показывает результаты биоактивностей Лейкостима (филграстим) и G-CSF-hFc-1 , введенных крысам Sprague Dawley через подкожный путь (нижний график) и через внутривенный путь (верхний).
Лучший вариант осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к гибридному Fc фрагменту иммуноглобулина человека, который содержит шарнирную область, домен CH2 и домен CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где шарнирная область представляет собой, по меньшей мере, частичную аминокислотную последовательность шарнирной области IgD человека или шарнирной области IgG1 человека; и домен CH2 представляет собой домен CH2 IgG4 человека, участок которого, в его N-концевой области, заменен на 4-37 аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgG2 человека или домена CH2 IgD человека. Такой гибридный Fc фрагмент, при соединении с биологически активной молекулой, такой как биологически активный полипептид биологически активной молекулы, для создания Fc слитного белка, сводит к минимуму неспецифические иммунные реакции Fc слитного белка, удлиняет период полураспада в сыворотке биологически активного полипептида биологически активной молекулы и оптимизирует активность биологически активного полипептида биологически активной молекулы.
В Fc слитном белке согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения сочетание N-конца домена CH2 IgD с оставшимся участком домена CH2 IgG4 было разработано так, чтобы область полученного слитного белка, представляющая собой две различные рекомбинированные субъединицы Ig, была гидрофобной. Гидрофобная область полученного слитого белка будет расположена внутри уложенного белка, минимизируя нежелательную неспецифическую иммунную реакцию.
Термин «Fc фрагмент» или «Fc», как применяют в настоящем документе, относится к белку, который содержит константную область 1 (CH1) тяжелой цепи, константную область 2 (CH2) тяжелой цепи и константную область 3 (CH3) тяжелой цепи иммуноглобулина, и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, и константную область 1 (CL1) легкой цепи иммуноглобулина. Он может дополнительно содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Гибридный Fc или гибридный Fc фрагмент иногда обозначается в настоящем документе как «hFc».
in vivo
Кроме того, Fc фрагмент по настоящему изобретению может находиться в форме, обладающей природными цепочками сахаров, увеличенными цепочками сахаров по сравнению с природной формой или уменьшенными цепочками сахаров по сравнению с природной формой, или может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление цепочек сахаров Fc иммуноглобулина может быть достигнуто способами, распространенными в данной области, такими как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизма. Удаление цепочек сахаров с Fc фрагмента приводит к резкому снижению аффинности связывания с частью C1q первого компонента комплемента C1 и уменьшению или потере антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), таким образом, не вызывая излишних иммунных ответов . В этом отношении Fc фрагмент иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме в некоторых случаях может быть более пригодным для цели настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.
E. coli
Как применяют в настоящем документе, термин «дегликозилирование» относится к тем остаткам сахаров, которые ферментативно удаляются с Fc фрагмента, и термин «агликозилирование» обозначает, что Fc фрагмент синтезирован в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно .
Термин «гибрид», как применяют в настоящем документе, обозначает, что последовательности, кодирующие два или более Fc фрагментов иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в единой цепи Fc фрагмента иммуноглобулина.
В варианте осуществления гибридный Fc человека содержит шарнирную область, домен CH2 и домен CH3 в направлении от N-конца к C-концу, где шарнирная область представляет собой, по меньшей мере, частичную аминокислотную последовательность шарнирной области IgD человека или шарнирной области IgG1 человека; и домен CH2 - домена CH2 IgG4 человека, участок которого, в его N-концевой части, замещен на 4-37 аминокислотных остатков N-концевой части домена CH2 IgG2 человека или домена CH2 IgD человека. Гибридный Fc человека может быть присоединен своим N-концом к C-концу биологически активной молекулы через ковалентную связь.
В другом варианте осуществления слитный полипептид из биологически активной молекулы и гибридного Fc может быть представлен следующей формулой:
p
N'-X-(Z1)-Y-Z2-Z3-Z4-C', или
p
q
N'-(Z1)-Y-Z2-Z3-Z4-(линкер)-X-C',
где N' представляет собой N-конец и C представляет собой C-конец полипептида; Z1 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 90-98 из SEQ ID NO:14; Y обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11 или, по меньшей мере, участок аминокислотных остатков в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14; Z2 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, an N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 111 до 147 из SEQ ID NO:12 или, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях с 163 до 199 из SEQ ID NO:14; Z3 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, C-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24, или со 115 до 220 из SEQ ID NO:13; Z4 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, N-концевой участок аминокислотных остатков в положениях 221-327 из SEQ ID NO:13, и каждый из p и q представляют собой целое число, равное 0 или 1, где общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 составляет между 80 и 140, включая оба предела, линкер представляет собой линкерную молекулу, и X представляет интересующую биологически активную молекулу.
В одном из вариантов осуществления Z3-Z4 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (i) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 118 до 223 из SEQ ID NO:11 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 224 до 330 из SEQ ID NO:11, (ii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 114 до 219 из SEQ ID NO:12 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 220 до 326 из SEQ ID NO:12, (iii) непрерывной аминокислотной последовательности, состоящей из C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 165 до 270 из SEQ ID NO:24 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 271 до 377 из SEQ ID NO:24, и (iv) непрерывной аминокислотной последовательности C-концевого участка аминокислотных остатков в положениях со 115 до 220 из SEQ ID NO:13 и N-концевого участка аминокислотных остатков в положениях с 221 до 327 из SEQ ID NO:13.
Общее количество аминокислотных остатков полипептида согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения составляет от 154 до 288.
P
P
q
Полипептиды с формулой N'-X-(Z1)-Y-Z2-Z3-Z4-C' и N'-(Z1) -Y-Z2-Z3-Z4-(линкер)-X-C' увеличивают период полураспада в циркуляции биологически активной молекулы X по сравнению с периодом полураспада в циркуляции одиночной Х при введении субъекту.
Линкер может быть получен из альбумина человека (CAA00606 SEQ ID NO:25). Линкер может содержать аминокислотную последовательность с 321 до 323, с 318 до 325, с 316 до 328, с 313 до 330, с 311 до 333 или с 306 до 338 из SEQ ID NO:25. Альтернативно, линкер может представлять собой синтетический линкер. Синтетический линкер может представлять собой пептид, состоящий всего из 10-20 остатков Gly и Ser. В одном из вариантов осуществления Gly-Ser линкер представляет собой GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO:32).
Z1 может содержать, по меньшей мере, участок домена CH1 IgG1 (SEQ ID NO:11) или IgD (SEQ ID NO:14) человека. Z1 может содержать от 5 до 9 или от 7 до 9 последовательных аминокислотных остатков C-концевой области домена CH1 IgG1 (положения 90-98 из SEQ ID NO:11) или C-концевой области домена CH1 IgD (положения 90-98 из SEQ ID NO:14). В некоторых вариантах осуществления Z1 может представлять собой 5, 6, 7, 8 или 9 C-концевых аминокислотных остатков домена CH1 IgG1 или домена CH1 IgD.
В некоторых вариантах осуществления Z1 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из от 5 до 9 аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14. Z1 также может представлять собой аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:11 или аминокислотных остатков с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.
Y может содержать, по меньшей мере, участок шарнирной области IgG1 или IgD человека. Y может содержать 5 или более или 10 или более последовательных аминокислотных остатков C-конца шарнирной области IgG1 (аминокислотные положения с 99 до 113 из SEQ ID NO:11) или шарнирной области IgD (аминокислотные положения 99 до 162 из SEQ ID NO:14). В определенных вариантах осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки в положениях с 99 до 113 из SEQ ID NO:11, аминокислотные остатки в положениях со 158 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях со 153 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях со 143 до 162 из SEQ ID NO:14, аминокислотные остатки в положениях со 133 до 162 из SEQ ID NO:14 или аминокислотные остатки в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14.
Z2 может содержать от 4 до 37, от 6 до 30, от 6 до 12, от 6 до 8, 8 или 6 последовательных аминокислотных остатков N-концевой области домена CH2 IgG2 человека (аминокислотные остатки в положениях со 111 до 147 из SEQ ID NO:12) или N-концевой области домена CH2 IgD (аминокислотные остатки в положениях со 163 до 199 из SEQ ID NO:14). В определенных вариантах осуществления Z2 может представлять собой 6 N-концевых аминокислотных остатков домена CH2 IgG2 человека (аминокислотные остатки 111-116 из SEQ ID NO:12) или 8 N-концевых аминокислотных остатков домена CH2 IgD человека (аминокислотные остатки 163-170 из SEQ ID NO:14).
Общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может составлять между 90 и 120, включая оба предела, или 105 и 115, включая оба предела.
Z4 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей 90 или более или 100 или более последовательных аминокислотных остатков домена CH3 IgG4 (аминокислотные остатки в положениях 224-330 из SEQ ID NO:11, 220-326 из SEQ ID NO:12, 271-377 из SEQ ID NO:24, или с 221 до 327 из SEQ ID NO:13). Z4 может состоять из более чем 98% аминокислотных остатков или 95% аминокислотных остатков домена CH3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В одном образцовом варианте осуществления Z4 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую полную аминокислотную последовательность домена CH3 IgG человека. Например, Z4 представляет собой аминокислотную последовательность домена CH3 IgG4 человека, соответствуя аминокислотным остаткам 341-447 из IgG4 человека, при нумерации в соответствии с EU Index, Kabat (которые соответствуют аминокислотным остаткам в положениях 221-327 из SEQ ID NO:13).
В одном из вариантов осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок C-концевых аминокислотных остатков шарнирной области IgG1 человека (аминокислотные остатки 99-113 из SEQ ID NO:11), p может быть равно 1 или 0, Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок N-концевой области CH2 IgG2 человека (аминокислотные остатки в положениях 111-147 из SEQ ID NO:12), и Z3 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок C-концевой области любого из субклассов IgG человека (аминокислотные остатки в положениях 118-223 из SEQ ID NO:11, 114-219 из SEQ ID NO:12, 165-270 из SEQ ID NO:24, или со 115 до 220 из SEQ ID NO:13). В этом варианте осуществления, когда p равно 1, Z1 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок C-концевой области домена CH1 IgG1 человека (аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:11). Например, Z1 может представлять собой аминокислотные остатки с 90 до 98 из SEQ ID NO:11.
В дополнительных вариантах осуществления Z3 может представлять собой от 73 до 106 последовательных аминокислотных остатков C-концевой области домена CH2 IgG4 человека (положения 115-220 из SEQ ID NO:13), домена CH2 IgG1 человека (положения 118-223 из SEQ ID NO:11), домена CH2 IgG2 человека (положения 114-219 из SEQ ID NO:12), домена CH2 IgG3 человека (положения 165-270 из SEQ ID NO:24), и общее количество аминокислотных остатков Z2 и Z3 может составлять 110. Например, Z2 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях 111-116 из SEQ ID NO:12, и Z3 может быть аминокислотной последовательностью аминокислотных остатков в положениях со 117 до 220 из SEQ ID NO:13.
В другом варианте осуществления Y может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок C-концевой области шарнирной области IgD человека (аминокислотные остатки в положениях с 99 до 162 из SEQ ID NO:14), p может быть равно 1 или 0 (ноль), Z2 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок N-концевой области домена CH2 IgD человека (аминокислотные остатки в положениях со 163 до 199 из SEQ ID NO:14), и Z3 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, участок C-концевой области домена CH2 IgG4 человека (аминокислотные остатки в положениях со 121 до 220 из SEQ ID NO:13). Например, Y может представлять собой аминокислотные остатки в положениях со 158 до 162, со 133 до 162, или с 99 до 162 из SEQ ID NO:14, Z2 может представлять собой аминокислотные остатки в положениях со 163 до 170 из SEQ ID NO:14, и Z3 может представлять собой аминокислотные остатки в положениях 121-220 из SEQ ID NO:13.
В этом варианте осуществления, когда p равно 1, Z1 может быть аминокислотной последовательностью, содержащей C-концевую область домена CH1 IgD человека (аминокислотные остатки в положениях с 90 до 98 из SEQ ID NO:14). Например, Z1 может представлять собой аминокислотные остатки с 90 до 98 из SEQ ID NO:14.
В этом варианте осуществления Y может представлять собой 20 последовательных аминокислотных остатков или более, 30 последовательных аминокислотных остатков или более, 40 последовательных аминокислотных остатков или более, 50 последовательных аминокислотных остатков или более, или 60 последовательных аминокислотных остатков или более C-концевой части шарнирной области IgD человека (аминокислотные остатки в положениях 99-162 из SEQ ID NO:14). Z3 может содержать от 71 до 100 последовательных аминокислотных остатков C-концевой части аминокислотных остатков в положениях 121-220 из SEQ ID NO:13. Общее количество аминокислотных остатков для Z2 и Z3 может составлять 108.
Таблица 1 показывает аминокислотные последовательности фрагментов IgG1, IgG2, IgG3 и IgD человека, пригодные для создания hFc в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Таблица 1
Домен hFc
Допустимый диапазон фрагментов Ig
Последовательность самых длинных фрагментов в пределах допустимого диапазона в направлении от C-конца к N-концу
SEQ ID NO:
Локализация в SEQ ID
Локализация в EU Index*
CH1 (Z1)
C-концевых аминокислотных остатков из CH1 IgG1 5-9
<img file="00000001.tif" he="3" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
11
90-98
207-215
C-концевых аминокислотных остатков из CH1 IgD 5-9
<img file="00000002.tif" he="5" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" />
14
90-98
Данные отсутствуют
Шарнир (Y)
C-концевых аминокислотных остатков из шарнирной области IgG1 5-15
<img file="00000003.tif" he="3" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
11
99-113
216-230
C-концевых аминокислотных остатков из шарнирной области IgD 5-64
<img file="00000004.tif" he="22" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
14
99-162
Данные отсутствуют
CH2, N-концевая часть (Z2)
N-концевых аминокислотных остатков CH2 IgG2 4-37
<img file="00000005.tif" he="14" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
12
111-147
231-267
N-концевых аминокислотных остатков домена CH2 IgD 4-37
<img file="00000006.tif" he="13" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
14
163-199
Данные отсутствуют
CH2, C-концевая часть (Z3) + CH3 (Z4)
C-концевые аминокислотные остатки CH2 IgG4 + 80-107 N-концевые аминокислотные остатки домена CH3 IgG4 71-106
<img file="00000007.tif" he="65" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
13
115-220+221-327
235-340+341-447
C-концевые аминокислотные остатки CH2 IgG3 + 80-107 N-концевые аминокислотные остатки домена CH3 IgG3 71-106
<img file="00000008.tif" he="63" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
24
165-270+271-377
235-340+341-447
C-концевые аминокислотные остатки CH2 IgG1 + 80-107 N-концевые аминокислотные остатки домена CH3 IgG1 71-106
<img file="00000009.tif" he="22" wi="29" img-content="undefined" img-format="tif" />
12
114-219+220-326
234-340+341-447
С-концевые аминокислотные остатки80-107 доменаCH3 lgG2
<img file="00000010.tif" he="40" wi="29" img-content="undefined" img-format="tif" />
C-концевые аминокислотные остатки 71-106 lgG1 CH2 + N-концевые аминокислотные остатки 80-107
<img file="00000011.tif" he="115" wi="15" img-content="undefined" img-format="tif" />
11
11-8223+224-330
235-340+341-447
<img file="00000012.tif" he="13" wi="15" img-content="undefined" img-format="tif" />
*EU index описан в «Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services».**Подчеркнутая область в каждой из аминокислотных последовательностей обозначает самые короткие фрагменты допустимых пределов аминокислотных остатков.
В варианте осуществления настоящее изобретение относится к гибридному Fc, который представляет собой один из hFc-1, hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5 или hFc-6, показанных на фиг.1 и 2, или thFc-1 или thFc-2, показанных на фиг.3 и 4. Хотя фиг.1 и 3 изображают двойную цепь Fc, настоящее изобретение относится к одноцепочечным гибридным молекулам Fc. Аминокислотные последовательности с hFc-1 по hFc-6 показаны в SEQ ID NO:18-23, соответственно, и аминокислотные последовательности thFc-1 и thFc-2 показаны в SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29, соответственно. Настоящее изобретение также охватывает полинуклеотидную молекулу, кодирующую гибридный Fc. Они включают в качестве неограничивающих примеров полинуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 (hFc-1), SEQ ID NO:2 (hFc-2), SEQ ID NO:3 (hFc-3), SEQ ID NO:4 (hFc-4), SEQ ID NO:5 (hFc-5), SEQ ID NO:6 (hFc-6), SEQ ID NO:26 (thFc-1) и SEQ ID NO:27 (thFc-2).
Аминокислотные последовательности иммуноглобулинов человека известны в данной области и они хранятся в общедоступном хранилище. Например, аминокислотные последовательности константной области IgG1 человека, константной области IgG2 человека, константной области IgG3 человека, константной области IgG4 человека и константной области IgD человека доступны под номерами CAA75032, CAC20455, CAC20456, AAH25985 и P01880, соответственно. Эти последовательности воспроизведены в SEQ ID NO:11, 12, 24, 13 и 14, соответственно.
Биологически активная молекула X может представлять собой растворимый белок. Он может содержать, в качестве неограничивающих примеров, гормон, цитокин, фактор роста, ко-стимуляторную молекулу, рецептор гормона, рецептор цитокина, рецептор фактора роста или короткий пептид. Например, X может представлять собой EPO, p40, G-CSF, рецептор TNF или их варианты/фрагменты. X может представлять собой GMCSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, рецептор IL-10, TGF-β, рецептор TGF-β, IL-17, Рецептор IL-17, фактор VII, CXCL-11, FSH, гормон роста человека, морфогенетический белок кости-1, CTLA4, PD-1, GLP-1, бетацеллюлин, OPG, RNAK, интерферон α, интерферон β или их варианты/фрагменты. Он также может включать, в качестве неограничивающих примеров, Fab-область антитела. Биологически активная молекула также может представлять собой секретируемый белок. В одном из вариантов осуществления биологически активная молекула не принадлежит к семейству иммуноглобулинов.
Термин «вариант» относится к полинуклеотиду или нуклеиновой кислоте, отличающейся от эталонной нуклеиновой кислоты или полипептида, но сохраняющей его существенные свойства. Как правило, варианты в целом близко схожи и, во многих областях, идентичны эталонной нуклеиновой кислоте или полипептиду. Также термин «вариант» относится к биологически активному участку биологически активной молекулы из лекарственного средства и сохраняет, по меньшей мере, одно ее функциональное и/или терапевтическое свойство, как описано в другом месте настоящего документа или же известно в данной области. Как правило, варианты в целом очень схожи и во многих областях идентичны аминокислотной последовательности интересующего биологически активного полипептида.
Настоящее изобретение также относится к белкам, которые содержат, или альтернативно состоят из, аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична, например, аминокислотной последовательности полипептидов, приведенных в SEQ ID NO:18-23 и 28-29. Фрагменты этих полипептидов также предоставлены. Добавочные полипептиды, охватываемые изобретением, представляют собой полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые гибридизуются с комплементарными молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды по изобретению при строгих условиях гибридизации (например, гибридизация для отфильтровывания связанной ДНК в 6 X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) приблизительно при 45°C с последующими одной или несколькими отмывками в 0,2×SSC, 0,1% SDS приблизительно при 50-65°C), при крайне строгих условиях (например, гибридизация для отфильтровывания связанной ДНК в 6 X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) приблизительно при 45°C, с последующими одной или несколькими отмывками в 0,1×SSC, 0,2% SDS приблизительно при 68%C), или при других строгих условиях гибридизации, которые известны специалистам в данной области (см., например, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, на стр.6.3.1, 6.3.6 и 2.10.3). Полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, также охвачены изобретением.
Под полипептидом, обладающим аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, например, на 95% «идентичной» по отношению к запросной аминокислотной последовательности, подразумевается, что аминокислотная последовательность рассматриваемого полипептида идентична запросной последовательности, за исключением того, что обсуждаемая полипептидная последовательность может содержать до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запросной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной запросной аминокислотной последовательности, до 5% аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности может быть вставлено, удалено или заменено на другие аминокислоты. Эти изменения эталонной последовательности могут произойти в амино- или карбокси-концевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, рассеянные или по отдельности среди остатков в эталонной последовательности или в одной или нескольких смежных группах в эталонной последовательности.
На практике, идентичен ли любой конкретный полипептид, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например, аминокислотной последовательности альбуминового слитного белка по изобретению или его фрагмента, может быть определено традиционно с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ для определения лучшего полноразмерного совпадения между запросной последовательностью (последовательностью по настоящему изобретению) и обсуждаемой последовательностью, также обозначаемой как глобальное выравнивание последовательностей, может быть определен с использованием компьютерной программы FASTDB, основанной на алгоритме авторов Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237245 (1990)). В выравнивании последовательностей как запросная, так и обсуждаемая последовательности представляют собой или нуклеотидные последовательности, или аминокислотные последовательности. Результат глобального выравнивания последовательностей выражается в виде процента идентичности. Предпочтительные параметры для использования при выравнивании аминокислот в FASTDB: Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0,05, Window Size=500 или длина обсуждаемой аминокислотной последовательности, в зависимости от того, что короче.
Обычно вариант будет обладать, по меньшей мере, 75% (предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 80%, 90%, 95% или 99%) сходством последовательности при длине нормального HA или терапевтического белка, который обладает той же длиной, что и вариант. Гомологию или идентичность на уровне нуклеотидной или аминокислотной последовательности определяют с помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) анализа с использованием алгоритма, используемого программами blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 87:2264 2268 (1990) и Altschul, J. Mol. Evol. 36:290 300 (1993), полностью включенные посредством ссылки), которые приспособлены для поиска сходства последовательностей.
E. coli
Варианты полинуклеотида по изобретению могут содержать изменения в кодирующих областях, некодирующих областях, или и там, и там. Особо предпочтительны варианты полинуклеотида, содержащие изменения, которые образуют молчащие замены, вставки или делеции, но не изменяют свойства или активности кодируемого полипептида. Варианты нуклеотида, образуемые посредством молчащих замен из-за вырожденности генетического кода являются предпочтительными. Кроме того, варианты полипептида, в которых менее чем 50, менее чем 40, менее чем 30, менее чем 20, менее чем 10 или 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 или 1-2 аминокислоты заменены, удалены или добавлены в любом сочетании также являются предпочтительными. Варианты полинуклеотида могут быть образованы по многим причинам, например, для оптимизации кодонной экспрессии для определенного хозяина (замена кодонов в человеческой мРНК на кодоны, предпочитаемые бактериальным хозяином, таким как дрожжи или ).
С целью создания различных Fc слитных белков, таких как слитная конструкция EPO-Fc, слитная конструкция G-CSF-Fc или человеческая слитная конструкция p40-Fc, аминокислотные последовательности EPO человека, G-CSF человека, p40 человека и рецептора TNF человека доступны из NP_000790 (SEQ ID NO:15), CAA27291 (SEQ ID NO:16), AAG32620 (SEQ ID NO:17) и NP_001057 (SEQ ID NO:31), соответственно. В одном из вариантов осуществления модифицированный p40 человека, где аминокислотный остаток Asn в положения 303 замещен на Gln, соединен с полипептидом.
По другому аспекту настоящего изобретения предоставлено целое антитело, содержащее сконструированную Fc-область. Термин «антитело», как применяют в настоящем документе, включает целые антитела и фрагменты антител, которые включают, по меньшей мере, две из шарнирных областей CH1, CH2 или CH3. Целые моноклональные антитела являются предпочтительными. Вариабельная область тяжелой цепи антитела выбрана по ее специфичности связывания и может быть любой, например, не принадлежащей человеку, гуманизированной или полностью человеческой. Когда вариабельная область тяжелой цепи антитела не принадлежит человеку (например, принадлежит мыши) и рекомбинантно соединена со сконструированной Fc-областью в соответствии с этим раскрытием, полученное рекомбинантное антитело обозначают как химерное антитело. Когда вариабельная область тяжелой цепи антитела гуманизирована и рекомбинантно соединена со сконструированной Fc-областью в соответствии с этим раскрытием, полученное рекомбинантное антитело обозначают как гуманизированное антитело. Где вариабельная область тяжелой цепи антитела является человеческой и рекомбинантно соединена со сконструированной Fc-областью в соответствии с этим раскрытием, полученное рекомбинантное антитело обозначают как полностью человеческое антитело. Например, вариабельная область тяжелой цепи гуманизирована и содержит каркасные области человека и не принадлежащие человеку (в этом случае, принадлежит мыши) гипервариабельные области (CDR). Следует понимать, что каркасные области могут быть получены из одного источника или более чем из одного источника и что определяющие комплементарность области могут быть получены из одного источника или более чем из одного источника. Способы гуманизации антител известны специалистам в данной области и известны в данной области.
Легкая цепь антитела может быть человеческой, не принадлежащей человеку или гуманизированной. В варианте осуществления, показанном на фиг.1B, легкая цепь гуманизирована и содержит каркасные области человека, не принадлежащие человеку (в этом случае принадлежащие мыши) определяющие комплементарность области и константную область человека. Следует понимать, что каркасные области могут быть получены из одного источника или более чем из одного источника и что определяющие комплементарность области могут быть получены из одного источника или более чем из одного источника.
Антитело, содержащее сконструированную Fc-область, выбрано на основе его способности связывать молекулу на поверхности клетки или растворимую молекулу, которая связывается с молекулой на поверхности клетки. Таким образом, например, антитело может быть выбрано на основе его способности связывать молекулы на поверхности клетки, такие как рецепторы цитокинов (например, IL-2R, TNF-aR, IL-15R, и т.д.), молекулы адгезии (например, E-селектин, P-селектин, L-селектин, VCAM, ICAM и т.д.), антигены клеточной дифференциации или активации (например, CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD40 и т.д.) и другие. Альтернативно, антитело может быть выбрано на основе его способности связывать растворимую молекулу, которая связывается с молекулами на поверхности клетки. Такие растворимые молекулы включают в качестве неограничивающих примеров, цитокины и хемокины (например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-5, IL-6 и т.д.), факторы роста (например, EGF, PGDF, GMCSF, HGF, IGF, BMP-1 и т.д.), молекулы, вызывающие клеточную дифференциацию (например, EPO, TPO, SCF, PTN и т.д.) и другие.
В основном, конструирование антител, описываемых в настоящем документе, достигается посредством использования общепризнанных манипуляций, используемых в технологии генной инженерии. Например, способы выделения ДНК, изготовления и отбора векторов для экспрессии ДНК, очистки и анализа нуклеиновых кислот, специальные способы изготовления вектора с рекомбинантной ДНК, расщепление ДНК рестрикционными ферментами, лигирование ДНК, введение ДНК, включая ДНК вектора, в клетки-хозяева с помощью постоянных или кратковременных средств, культивирование клеток-хозяев в селективных или неселективных средах для отбора и поддержания клеток, которые экспрессируют ДНК, как правило, известны в области.
Моноклональные антитела, описываемые в настоящем документе, могут быть получены с использованием гибридомного способа, который известен в данной области, или других способов с рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области. В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют с помощью ДНК, пептида или белка, которые вызывают образование антител лимфоцитами.
in vitro
Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы . Затем лимфоциты, образуемые в ответ на антиген, сливают с миеломными клетками с использованием подходящего фактора, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки. Затем гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей среде для культивирования, которая предпочтительно содержит одну или несколько субстанций, которые подавляют рост или выживание неслитых, родительских миеломных клеток. Предпочтительные миеломные клетки представляют собой миеломные клетки, которые сливаются эффективно, поддерживают стабильный синтез антитела выбранными антитело-продуцирующими клетками, и не чувствительны к среде, такой как ГАТ среда (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mx, Catalog № H-0262).
Антитела, содержащие сконструированную Fc-область, также могут быть использованы в качестве раздельно вводимых композиций, которые дают в сочетании с терапевтическими средствами. Для диагностических целей антитела могут быть мечеными или немечеными.
Немеченые антитела можно использовать в сочетании с другими мечеными антителами (вторые антитела), которые реактивны по отношению к сконструированному антителу, такому как антитела, специфичные к константным областям иммуноглобулинов человека. Альтернативно, антитела могут быть помечены непосредственно. Может использоваться большое разнообразие меток, таких как радионуклиды, флуоресцирующие агенты, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, лиганды (в особенности, гаптены) и т.д. Множество типов иммунологических тестов доступно и хорошо известно специалистам в данной области.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу создания слитного белка, этот способ включает в себя: (i) введение молекулы ДНК, кодирующей слитный белок, в клетку-хозяина млекопитающего, (ii) выращивание клетки в условиях, в которых слитный белок экспрессируется в ее среду для выращивания; и (iii) сбор синтезированного слитного белка.
В другом образцовом варианте осуществления предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая слитный белок или молекулу антитела или фрагмент антитела, описанного выше. Также предоставлен способ лечения или предупреждения определенных симптомов с помощью введения фармацевтической композиции. Например, предоставлен способ, который (i) уменьшает симптомы/предотвращает/лечит аутоиммунное заболевание, (ii) подавляет отторжение имплантата, (iii) лечит/предупреждает эндотоксин-индуцированный шок, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества слитного белка гибридного Fc и белка p40 или их вариантов/фрагментов.
Композиция может содержать фармацевтический носитель. Фармацевтический носитель может представлять собой любую совместимую, нетоксичную субстанцию, пригодную для доставки антител пациенту. Стерильная вода, спирт, жиры, воски и инертные твердые вещества могут быть включены в носитель. Фармацевтически приемлемые адъюванты (буферные вещества, диспергирующее вещество) также могут быть примешаны в фармацевтическую композицию.
Композиция с антителами могут быть введены субъекту разными путями. Например, фармацевтические композиции могут быть введены парентерально, например, подкожно, внутримышечно или внутривенно. Эти композиции могут быть стерилизованы традиционными, хорошо известными способами стерилизации. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные субстанции, требуемые для соответствия физиологическим условиям, таким как подбор pH и буферные вещества, вещества, регулирующие токсичность, и т.п., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и т.д. Концентрация слитного белка, антитела или фрагмента антитела в этих составах может широко варьировать, например, менее чем приблизительно от 0,5% обычно или, по меньшей мере, приблизительно 1% вплоть до 15 или 20% по массе и будет выбрана, основываясь, в первую очередь, на объемах жидкости, вязкостях и т.д., в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Настоящее изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитный белок, и экспрессирующему вектору, несущему молекулу нуклеиновой кислоты. Такая нуклеиновая кислота может быть непосредственно доставлена субъекту, который нуждается в полипептиде, кодируемом нуклеиновой кислотой. Альтернативно, полинуклеотид синтезируется посредством экспрессии нуклеиновой кислоты в среду и затем вводится субъекту.
Термин «пептид» «полипептид» или «белок» относится к молекулам от 2 до 40 аминокислот, с предпочтительными молекулами от 3 до 20 аминокислот и наиболее предпочтительными молекулами от 6 до 15 аминокислот. Образцовые пептиды могут быть случайным образом созданы с помощью любых вышеуказанных способов, могут содержаться в пептидной библиотеке (например, библиотека фагового дисплея), или могут быть получены расщеплением белков.
Термин «лекарственное средство», как применяют в настоящем документе, относится к субстанции, проявляющей терапевтическую активность при введении людям или животным, и примеры лекарственного средства включают в качестве неограничивающих примеров полипептиды, соединения, экстракты и нуклеиновые кислоты. Предпочтительным является полипептидное лекарственное средство.
in vivo
Термины «физиологически активный полипептид», «биологически активная молекула», «физиологически активный белок», «активный полипептид», «полипептидное лекарственное средство» и «белковое лекарственное средство», как применяют в настоящем документе, взаимозаменимы в своих значениях и отличаются тем, что они находятся в физиологически активной форме, проявляющей различные физиологические функции .
in vivo
in vivo
in vivo
Полипептидное лекарственное средство обладает недостатком, который состоит в неспособности поддерживать физиологическое действие в течение длительного периода времени из-за его способности легко денатурироваться или расщепляться протеолитическими ферментами, присутствующими в организме. Однако, когда полипептидное лекарственное средство соединено (или связано) с Fc фрагментами иммуноглобулина согласно вариантам осуществления настоящего изобретения для образования слитного белка, лекарственное средство обладает увеличенной структурной стабильностью и периодом полураспада в сыворотке. Также полипептид, соединенный с Fc фрагментом, обладает значительно меньшим снижением физиологической активности, чем другие известные полипептидные лекарственные составы. Поэтому по сравнению с биодоступностью традиционных полипептидных лекарственных средств , слитый полипептид, содержащийся в полипептидном лекарственном средстве, и Fc фрагмент, или конъюгат полипептидного лекарственного средства и Fc фрагмента по настоящему изобретению отличается наличием заметно улучшенной биодоступности . Также это ясно описано в вариантах осуществления настоящего изобретения. То есть, при присоединении к Fc фрагменту по настоящему изобретению, IFN-α, G-CSF, EPO, p40, рецептор TNF и другие белковые лекарственные средства проявляют увеличенную биодоступность  по сравнению с их природными формами или другими традиционными слитными формами.
Понятно, что настоящее изобретение использует традиционные технологии, касающиеся рекомбинантной ДНК, для создания Fc слитных белков, антител, содержащих сконструированную Fc-область по настоящему изобретению, и фрагментов антител, полезных в применении изобретения на практике. Fc слитные конструкции предпочтительно создают на уровне ДНК, и полученную ДНК встраивают в экспрессирующие векторы и экспрессируют для синтеза слитных белков, антител или фрагментов антител по изобретению.
Как применяют в настоящем документе, подразумевается, что термин «вектор» обозначает любую нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, комплементарную встраиваемой в клетку-хозяина и рекомбинируемой в геном клетки-хозяина и интегрируемой с ним, или реплицируемой автономно в качестве эписомы. Такие векторы содержат линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды, космиды, РНК векторы, вирусные векторы и т.п. Неограничивающие примеры вирусного вектора включают ретровирус, аденовирус и аденоассоциированный вирус. Как применяют в настоящем документе, подразумевается, что термин «экспрессия гена» или «экспрессия» целевого белка обозначает транскрипцию ДНК-последовательности, трансляцию мРНК транскрипта и секрецию Fc слитного белкового продукта или антитела или фрагмента антитела.
Пригодным экспрессирующим вектором является RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) или его варианты. Пригодный экспрессирующий вектор должен нести промоторы цитомегаловируса человека (ЦМВ), чтобы содействовать установлению транскрипции интересующего гена в клетках млекопитающих и нести сигнальную последовательность полиаденилирования коровьего гормона роста для повышения уровня РНК в устойчивом состоянии после транскрипции. В варианте осуществления настоящего изобретения экспрессирующий вектор представляет собой pAD11, который представляет собой модифицированный вектор RcCMV. Примеры экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, кодирующую биологически активную молекулу лекарственного средства, могут включать, но без ограничений, pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1, pAD11 p40N303Q-hFc-1, pAD11 EPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-5 или pAD11 TNFR-hFc-5, более подробно описанные в примерах.
Подходящая клетка-хозяин может быть трансформирована или трансфицирована ДНК последовательностью по изобретению и использована для экспрессии и/или секреции целевого белка. Предпочитаемые в настоящее время клетки-хозяева для использования в изобретении включают бессмертные гибридомные клетки, NS/0 миеломные клетки, клетки 293, клетки яичника китайского хомяка, клетки HeLa и клетки COS.
Одна система экспрессии, которую использовали для создания высокоуровневой экспрессии слитных белков или антитела или фрагмент антитела в клетках млекопитающих, представляла собой ДНК-конструкцию, кодирующую в направлении от 5' к 3' секреционную кассету, содержащую сигнальную последовательность и Fc-область иммуноглобулина, и целевой белок, такой как p40, EPO, G-CSF, рецептор TNF. Некоторые целевые белки успешно экспрессировались в такой системе и включают, например, IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, ss; IG-H3, рецептор IgE, РSMA и gp120. Эти экспрессионные конструкции раскрыты в патентах США №№ 5541087 и 5726044 авторами Lo et al., содержимое которых включено в настоящий документ в качестве ссылки.
При экспрессии слитные белки или молекула антитела или фрагменты антител по изобретению могут содержать или могут не содержать сигнальную последовательность. Как применяют в настоящем документе, подразумевается, что термин «сигнальная последовательность» обозначает сегмент, который направляет секрецию биологически активной молекулы лекарственного средства; слитный белок и впоследствии отщепляется после трансляции клетка-хозяин. Сигнальная последовательность по изобретению представляет собой полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, которая инициирует транспорт белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности, применимые в изобретении, включают сигнальные последовательности легкой цепи антитела, например, антитела 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth. 1989. 125:191-202), сигнальные последовательности тяжелой цепи антитела, например, сигнальная последовательность тяжелой цепи антитела M0PC141 (Sakano et al., Nature 1980, 286:676-683), и любые другие сигнальные последовательности, известные в данной области (см., например, Watson et al., Nucleic Acids Research 1984, 12:5145-5164).
Сигнальные последовательности были хорошо описаны в данной области, и известно, что обычно они содержат от 16 до 30 аминокислотных остатков и могут содержать больше или меньше аминокислотных остатков. Обычный сигнальный пептид состоит из трех областей: основная N-концевая область, центральная гидрофобная область и более полярная C-концевая область. Центральная гидрофобная область содержит от 4 до 12 гидрофобных остатков, которые заякоривают сигнальный пептид в липидном бислое мембраны в ходе транспорта возникающего полипептида. После инициации сигнальный пептид обычно расщепляется в полости эндоплазматического ретикулума с помощью клеточных ферментов, известных как сигнальные пептидазы. Потенциальные сайты расщепления сигнального пептида, как правило, следуют правилу «(-3,-1)». Таким образом, обычный сигнальный пептид обладает маленькими, нейтральными аминокислотными остатками в положениях -1 и -3 и не содержит остатки пролина в этой области.
Сигнальная пептидаза будет расщеплять такой сигнальный пептид между -1 и +1 аминокислотами. Таким образом, сигнальная последовательность может быть отщеплена с амино-tenninus конца слитного белка в ходе секреции. Это приводит к секреции Fc слитного белка, состоящего из Fc-области иммуноглобулина и целевого белка. Подробное обсуждение последовательностей сигнальных пептидов предоставлено автором von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683.
Как будет ясно специалисту в данной области, пригодность определенной сигнальной последовательности для использования в секреционной кассете может требовать некоторых стандартных экспериментов.
Такие эксперименты будут включать определение способности сигнальной последовательности направлять секрецию Fc слитного белка и также определение оптимальной конфигурации, геномной или кДНК, подлежащей использованию последовательности для того, чтобы достичь эффективной секреции Fc слитных белков. Дополнительно, профессионал данной области способен создать синтетический сигнальный пептид, следуя правилам, приведенным von Heijne (1986), и протестировать эффективность такой синтетической сигнальной последовательности с помощью стандартных экспериментов. Сигнальная последовательность также может обозначаться как «сигнальный пептид», «лидерная последовательность» или «лидерные пептиды».
Слияние сигнальной последовательности и Fc-области иммуноглобулина иногда обозначается как секреционная кассета. Образцовая секреционная кассета, пригодная для осуществления изобретения на практике, представляет собой полинуклеотид, кодирующий в направлении от 5' к 3' сигнальную последовательность легкой цепи гена иммуноглобулина и область Fcy1 гена y1 иммуноглобулина человека. Область Fcy1 гена Fcy1 иммуноглобулина предпочтительно содержит, по меньшей мере, участок с шарнирным доменом иммуноглобулина и, по меньшей мере, домен CH3, или более предпочтительно - по меньшей мере, участок шарнирного домена, домен CH2 и домен CH3. Как применяют в настоящем документе, подразумевается, что «участок» шарнирной области иммуноглобулина обозначает участок шарнира иммуноглобулина, который содеpжит, по меньшей мере, один, предпочтительно два остатка цистеина, способных образовывать дисульфидные связи между цепями. ДНК, кодирующая секреционную кассету, может быть в своей геномной конфигурации или своей кДНК конфигурации. При определенных условиях может быть полезным синтез последовательности Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина человека Fcy2. Хотя Fc слитные белки, основанные на последовательностях иммуноглобулинов человека y1 и y2, в мышах ведут себя сходно, Fc слитные белки, основанные на последовательности y2, могут проявлять улучшенную фармакокинетику у людей.
В другом варианте осуществления ДНК последовательность кодирует сайт протеолитического расщепления, расположенный между секреционной кассетой и целевым белком. Сайт расщепления предусматривает протеолитическое расщепление кодируемого слитного белка, таким образом, отделяя Fc домен от целевого белка. Как применяют в настоящем документе, подразумевается, что «сайт протеолитического расщепления» означает аминокислотные последовательности, которые предпочтительно расщепляются протеолитическим ферментом или другими средствами протеолитического расщепления. Пригодные сайты протеолитического расщепления включают аминокислотные последовательности, которые распознаются протеолитическими ферментами, такими как трипсин, плазмин или энтерокиназа K. Известно много пар сайт расщепления/средство расщепления (см., например, патент США № 5726044).
Дополнительно, также будет полезна замена или делеция в конструкциях из этих константных областей, в которых один или несколько аминокислотных остатков доменов константной области заменены или удалены. Один пример будет вводить замены аминокислот в верхнюю CH2 область для создания варианта Fc со сниженной аффинностью к Fc рецепторам (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613). Специалист в данной области сможет изготовить такие конструкции с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии.
Неограничивающие примеры белковых лекарственных средств, допускающих конъюгирование с Fc фрагментом иммуноглобулина по настоящему изобретению, включают гормон роста человека, морфогенетический белок кости-1 (BMP-1), релизин-гормон гормона роста, релизинг-пептид гормона роста, интерфероны и рецепторы интерферонов (например, интерферон-α, -β и -γ, водорастворимый рецептор интерферона типа 1 и т.д.), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GMCSF), глукагонподобные пептиды (например, GLP-1 и т.д.), рецептор, сопряженный с G-белком, интерлейкины (например, интерлейкин-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 и т.д.) и рецепторы интерлейкинов (например, рецептор IL-1, рецептор IL-4 и т.д.), ферменты (например, глюкоцереброзидаза, идуронат-2-сульфатаза, α-галактозидаза-A, агалзидаза α и β, α-L-идуронидаза, бутирилхолинэстераза, хитиназа, глутаматдекарбоксилаза, имиглюцераза, липаза, уриказа, ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов, нейроэндопептидаза, миелопероксидаза и т.д.), интерлейкин- и цитокинсвязывающие белки (например, IL-18bp, TNF-связывающий белок и т.д.), фактор активации макрофагов, макрофагальный пептид, B-клеточный фактор, T-клеточный фактор, белок A, ингибитор аллергии, гликопротеины клеточного некролиза, иммунотоксин, лимфотоксин, фактор некроза опухоли, супрессоры опухолей, фактор роста метастазов, α- 1 антитрипсин, альбумин, α-лактальбумин, аполипопротеин-E, эритропоэтин, высокогликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины; гемоглобин, тромбин, пептид-активатор тромбинового рецептора, тромбомодулин, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор IX, фактор XIII, фактор активации плазминогена, фибрин-связывающий пептид, урокиназа, стрептокиназа, гирудин, протеин C, C-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутаза, лептин, тромбоцитарный фактор роста, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, костный фактор роста, стимулирующий белок кости, кальцитонин, инсулин, атриопептин, хрящевой индуцирующий фактор, элькатонин, активирующий фактор соединительной ткани, ингибитор тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, релизинг-гормон лютеинизирующего гормона, факторы роста нервов (например, фактор роста нервов, цилиарный нейротрофический фактор, фактор аксогенеза 1, натрийуретический пептид головного мозга, глиальный нейротрофический фактор, нетрин, ингибирующий фактор нейтрофилов, нейротрофический фактор, нейтурин и т.д.), паратиреоидный гормон, летаксин, секретин, соматомедин, инсулиноподобный фактор роста, гормон коры надпочечников, глюкагон, холецистокинин, панкреатический полипептид, гастрин-высвобождающий пептид, релизинг-фактор кортикотропина, тиреостимулирующий гормон, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, рецепторы (например, TNFRP75), TNFRP55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор фактора активации B-клеток и т.д.), антагонисты рецепторов (например, IL1-Ra и т.д.), антигены клеточной поверхности (например, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 и т.д.), антигены вирусных вакцин, моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 и Fd), и антигены вакцин, выделенные из вирусов. Фрагмент антитела может представлять собой Fab, Fab', F (ab') 2, Fd или scFv, которые способны связываться со специфическим антигеном, и предпочтительно Fab'. Fab фрагменты содержат вариабельный домен (VL) и константный домен (CL) легкой цепи и вариабельный домен (VH) и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab с точки зрения добавления нескольких аминокислотных остатков, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области к карбоксильному концу домена CH1. Fd фрагменты содержат только домены VH и CH1, и F(ab')2 фрагменты созданы в качестве пары для фрагментов Fab' или посредством образования дисульфидных связей или химической реакции. scFv (одноцепочечные Fv) фрагменты содержат домены VL и VH, которые соединены друг с другом пептидным линкером и, таким образом, представлены в единой полипептидной цепи. В частности, в качестве биологически активных молекул предпочтительны те, что требуют частого дозирования при введении в организм для лечения или предупреждения заболеваний, которые включают гормон роста человека, интерфероны (интерферон-α, -β, -γ и т.д.), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), эритропоэтин (EPO), рецептор TFN, p40 и фрагменты антител. Кроме того, определенные производные включены в рамки биологически активных молекул по настоящему изобретению до тех пор, пока они обладают функцией, структурой, активностью или стабильностью, главным образом, идентичными или улучшенными по сравнению с природными формами биологически активных молекул. В настоящем изобретении наиболее предпочтительным полипептидным лекарственным средством является интерферон α.
В другом аспекте по изобретению слитные белки IgG-Fc и IgG-CH, например, синтезируют в виде мономеров, которые можно собрать для образования димеров. Обычно димеры соединяются с помощью дисульфидных связей в шарнирной области IgG. Кондиционированная среда от клеток, секретирующих IgG слитные белки, может содержать смеси мономеров и димеров IgG слитных белков. Для применения в качестве лекарственного средства для человека желательно использовать гомогенные популяции мономеров или димеров IgG слитных белков, но не смеси этих двух форм.
Также предоставлены способы для получения в высокой степени чистых препаратов димерных слитных белков из активного полипептида и IgG. Как правило, способы выполняются посредством получения клетки-хозяина, способной экспрессировать IgG слитный белок, сбора кондиционированной среды и очистки димерного слитного белка от мономерного слитного белка, агрегатов и загрязняющих белков с помощью процедур колоночной хроматографии. Пригодные клетки-хозяева для экспрессии IgG слитных белков включают клетки дрожжей, насекомых, млекопитающих или другие эукариотические клетки. В варианте осуществления клетка-хозяин может представлять собой клетку млекопитающего, в частности, клетки COS, CHO или BHK.
Также предоставлены новые слитные белки полипептидного лекарственного средства и Fc фрагмента. В одном из вариантов осуществления полипептидное лекарственное средство, такое как EPO, p40, G-CSF или рецептор TNF, присоединено непосредственно к гибридному Fc фрагменту без промежуточного пептидного линкера. В другом варианте осуществления полипептидное лекарственное средство присоединено друг к другу через пептидный линкер от 1 до 50 аминокислот и более предпочтительно через пептидный линкер от 1 до 7 аминокислот. Линкеры, в высокой степени пригодные для этой цели, включают иммунологически неактивный пептид, состоящий из остатков Gly и Ser (например, Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser SEQ ID NO:32) или состоящий из аминокислот в положениях 282-314 из SEQ ID NO:25, выделенных в альбумине человека.
В случае, когда линкер используется, линкер и полипептидное лекарственное средство может быть изготовлено в определенном направлении. То есть линкер может быть соединен с N-концом, C-концом или свободной группой гибридного Fc фрагмента, и также может быть соединен с N-концом, C-концом или свободной группой полипептидного лекарственного средства. Когда линкер представляет собой пептидный линкер, соединение может иметь место в определенном сайте соединения. Когда полипептидное лекарственное средство и гибридный Fc экспрессируются раздельно и затем присоединяются друг к другу, присоединение может быть выполнено с использованием любого количества соединяющих веществ, известных данной области. Неограничивающие примеры соединяющих веществ включают 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидовые сложные эфиры, такие как сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеилимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан.
Настоящее изобретение также относится к способам для производства полипептидного лекарственного средства-гибридного Fc фрагмента.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения состояний, облегчаемых посредством введения полипептидного лекарственного средства. Эти способы включают введение млекопитающему, обладающему состоянием, которое может быть напрямую или не напрямую связано с интересующим заболеванием, эффективного количества полипептида по изобретению. Например, нуклеиновая кислота, такая как ДНК или РНК, кодирующая слитный белок желаемого полипептидного лекарственного средства-гибридного Fc фрагмента, может быть введена субъекту, предпочтительно, млекопитающему, в качестве терапевтического средства. Дополнительно, клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую слитный белок из полипептидного лекарственного средства-гибридного Fc фрагмента, может быть введена субъекту, предпочтительно млекопитающему, в качестве терапевтического средства. Кроме того, слитная конструкция из полипептидного лекарственного средства-гибридного Fc фрагмента может быть введена субъекту, предпочтительно млекопитающему, в качестве терапевтического средства. Такой химерный полипептид может быть введен внутривенно, подкожно, перорально, трансбуккально, сублингвально, назально, парентерально, ректально, вагинально или через пульмональный путь.
EPO (включая его варианты/фрагменты)-Fc слитный белок по настоящему изобретению может быть полезен при повышении и поддержании гематокрита у млекопитающих.
in vivo
p40 является субъединицей IL-12. IL-12 представляет собой 75 кДа гетеродимерный цитокин, который обладает несколькими функциями . Например, IL-12 стимулирует пролиферацию активированных T и NK клеток и способствует ответам хелперных клеток типа Th1. IL-12 приводит в действие свои биологические эффекты посредством связывания с рецептором IL-12 на плазматической мембране активированных T и NK клеток, и способность IL-12 связываться с рецептором IL-12 приписывается субъединице p40 IL-12. Следовательно, p40 (включая его варианты/фрагменты)-Fc слитный белок по настоящему изобретению может быть полезен в снижении симптомов/предупреждении/лечении аутоиммунного заболевания, () подавлении отторжения трансплантата, или (D) лечении/предупреждении эндотоксин-индуцированного шока. Также, p40 (включая его варианты/фрагменты)-Fc слитный белок по настоящему изобретению может быть полезен в лечении/предупреждении/уменьшении интенсивности симптомов ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, воспалительного заболевания кишечника, рассеянного склероза или псориаза. Варианты и фрагменты известны в данной области, включая, без ограничений, WO 97/20062, содержимое которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Один из вариантов осуществления варианта p40 включает в качестве неограничивающих примеров, p40, содержащий замену Asn303Gln.
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой белок, который необходим для пролиферации и дифференциации гранулоцитов, в частности, нейтрофилов. Гранулоциты поглощают и разрушают микробных вселенцев и обломки клеток и, таким образом, являются ключевыми для ответа на инфекцию. Химиотерапия разрушает гранулоциты и/или снижает образование гранулоцитов. Поэтому G-CSF(включая его варианты/фрагменты)-Fc слитный белок по настоящему изобретению может быть полезен в лечении/предупреждении/уменьшении интенсивности симптомов вызванной химиотерапией нейтропенической миелосупрессии после трансплантации костного мозга, острой лейкемии, апластической анемии, миелодиспластического синдрома, тяжелой хронической нейтропении или мобилизации клеток-предшественников периферической крови для трансплантации.
Слитные белки по изобретению полезные не только в качестве терапевтических средств, но профессионал в данной области признает, что слитные белки полезны при синтезе антител для диагностического использования. Так же, соответствующее введение ДНК или РНК, например, в векторе или другой системе доставки для подобных целей, включено в способы использования изобретения.
Композиции по настоящему изобретению могут быть введены любым путем, который совместим с определенными молекулами. Предполагается, что композиции по настоящему изобретению могут быть предоставлены животному любыми подходящими средствами, напрямую (например, локально, как при инъекции, имплантации или местном введении в участок ткани) или системно (например, парентерально или перорально). Когда композиция должна быть предоставлена парентерально, например, при внутривенном, подкожном, глазном, интраперитонеальном, внутримышечном, трансбуккальном, ректальном, вагинальном, интраорбитальном, интрацеребральном, интракраниальном, интраспинальном, внутрижелудочковом, интратекальном, интрацистернальном, интракапсулярном, интраназальном или аэрозольном введении, композиция предпочтительно содержит часть водной или физиологически совместимой жидкой суспензии или раствора. Таким образом, носитель или наполнитель физиологически приемлем для того, чтобы в дополнение к доставке желаемой композиции пациенту он иным образом отрицательно не влиял на электролитный и/или объемный баланс пациента. Таким образом, жидкая среда для агента может включать нормальный физиологический раствор.
ДНК конструкции (или генные конструкции) по изобретению также можно использовать как часть протокола генной терапии для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих полипептидное лекарственное средство или его слитную белковую конструкцию.
in vivo
in vivo
Изобретение характеризуется экспрессирующими векторами для трансфекции или экспрессии интересующего полипептидного лекарственного средства или его слитной белковой конструкции  в определенных типах клеток для того, чтобы восстановить или дополнить функцию желаемого полипептидного лекарственного средства. Экспрессионные конструкции желаемого полипептидного лекарственного средства, или его слитной белковой конструкции, могут быть введены в биологически активном носителе, например, в любом составе или композиции, допускающей эффективную доставку гена, кодирующего желаемое полипептидное лекарственное средство, или его слитной белковой конструкции в клетки .
Подходы включают в себя вставку рассматриваемого гена в вирусные векторы, включая рекомбинантные ретровирусы, аденовирус, адено-ассоциированный вирус и вирус простого герпеса 1 или рекомбинантные бактериальные или эукариотические плазмиды. Предпочтительные дозировки за одно введение нуклеиновых кислот, кодирующих слитные белки по изобретению, находятся в пределах диапазона от 0,1 мг до 100 мг для людей, более предпочтительно от 1 мг до 10 мг и наиболее предпочтительно от 2 мг до 10 мг. Предполагается, что оптимальная дозировка и способ введения могут быть определены с помощью стандартных экспериментов при хорошем уровне навыков в данной области.
Предпочтительные дозировки слитного белка за одно введение находятся в пределах диапазона от 0,1 мг до 1000 мг для людей, более предпочтительно 1 мг - 100 мг и наиболее предпочтительно 5 мг - 20 мг. Однако предполагается, что оптимальная дозировка также зависит от заболевания, подлежащего лечению, и от наличия побочных эффектов. Однако оптимальные дозировки могут быть определены с помощью стандартных экспериментов. Введение слитного белка может представлять собой периодические инъекции ударной дозы вещества или непрерывное внутривенное, подкожное или интраперитонеальное введение из внешнего резервуара (например, из внутривенного баллона) или внутреннего резервуара (например, из биоразрушимого имплантата).
Кроме того, предполагается, что слитные белки по изобретению также могут быть введены назначенному реципиенту вместе со многими различными биологически активными молекулами. Однако предполагается, оптимальное сочетание слитного белка и других молекул, способов введения, дозировок может быть определено с помощью стандартных экспериментов при хорошем уровне навыков в данной области.
Вариант осуществления изобретения
Далее изобретение проиллюстрировано с помощью следующих неограничивающих примеров.
<Пример 1> Подготовка экспрессирующих векторов для слитных белков hFc-1, hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5 и hFc-6
hFc-1 содержит 9 аминокислот (90-98) из C-концевой области CH1 IgG1, шарнирную область (99-113) из IgG1, 6 аминокислот (111-116) из N-концевой области CH2 IgG2, 103 аминокислоты (118-220) из области CH2 IgG4 и 107 аминокислот (221-327) из области CH3 IgG4 (фиг.1 и 2). Аминокислотная последовательность hFc-1 показана в SEQ ID NO:18. Для получения кодон-оптимизированных нуклеотидов каждый кодирует hFc-1 (SEQ ID NO:1), EPO человека (SEQ ID NO:7), G-CSF человека (SEQ ID NO:8) и p40N303Q человека (мутант, полученный заменой Asn на Gln в 303-ей аминокислоте субъединицы p40 человека) (нуклеотидная последовательность p40N303Q показана в SEQ ID NO:9, и аминокислотная последовательность p40 человека показана в SEQ ID NO:17), соответственно, эти нуклеотидные молекулы синтезировали с помощью специализировнной службы TOP Gene Technologies (Quebec, Canada) (www.topgenetech.com). Для увеличения уровня экспрессии белка очень полезно оптимизировать использование кодонов в гене. Характер использования кодонов различается между организмами. Некоторые кодоны более часто используются в одном организме, но более редко используются в другом организме. Эта склонность в использовании кодонов приписывается трансляционной эффективности, способности организма синтезировать кодируемый белок. Чтобы вставить каждый слитный ген в экспрессирующий вектор, pAD11 (SEQ ID NO:10), создали сайт EcoRI на 5'-конце последовательности ATG в EPO, G-CSF и p40N303Q и создали сайт XbaI на 3'-конце терминирующего кодона в hFc-1. Экспрессирующий вектор pAD11 получили из каркаса RcCMV (доступен в Invitrogen, Carlsbad). pAD11 содержит промоторы, выделенные из цитомегаловируса (ЦМВ), поли (A) последовательности, выделенные из коровьего гормона роста, промежуточную последовательность глобина (gIVS), выделенную из β глобина кролика (Mol Cell Biol, 1988 8:4395) и т.д. Для изготовления вектора pAD11 из вектора RcCMV (Invitrogen) существует несколько модификаций. Область устойчивости к неомицину удалили обработкой ферментом XhoI и добавили gIVS на 3' промоторной области ЦМВ. Кроме того, ген мышиной дигидрофолатредуктазы (DHFR) (Pubmed, NM 010049) добавили на 5' промоторов ЦМВ. Вектор pAD11 был создан после многих экспрессионных тестов в сочетании с некоторыми элементами, включая описанные выше. В нашем неопубликованном результате, вектор pAD11 показал примерно 12-кратное увеличение уровня экспрессии по сравнению с вектором RcCMV (Invitrogen). Чтобы создать сайт соединения между 3'-концом EPO, G-CSF и p40N303Q и 5'-концом hFc-1 с сохранением рамки считывания, создали сайт NheI на 3'-конце кодирующей последовательности EPO, G-CSF и p40N303Q и 5'-конце кодирующей последовательности hFc-1. После субклонирования с использованием каждого сайта рестриктаз были созданы конечные экспрессирующие векторы для hFc-1, слитого с EPO, G-CSF или p40N303Q, и затем обозначены как pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1 и pAD11 p40N303Q-hFc-1, соответственно.
th
Аминокислотные последовательности hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5 и hFc-6 показаны в SEQ ID NO:19-23, соответственно. hFc-6 содержит 9 аминокислот (90-98) C-концевого домена CH1 IgD, 64 аминокислоты шарнирной области (99-162) из IgD, 8 аминокислот (shtqplgv 163-170) N-концевого домена CH2 IgD, 100 аминокислот (121-220) домена CH2 IgG4 и 107 аминокислот (221-327) домена CH3 IgG4 (фиг.1 и 2). Для получения кодон-оптимизированной нуклеотидной молекулы, кодирующей hFc-6 (SEQ ID NO:6), ген синтезировали с помощью специализированной службы TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com). Для выполнения слияния между 3'-концом EPO, G-CSF или p40N303Q и 5'-концом hFc-6 с сохранением рамки считывания использовали сайт NheI (gctagc: Ala-Ser), содержащийся в N-концевой кодирующей области (90 и 91 аминокислоты) hFc-6. Также, для того, чтобы вставить каждый hFc-6 слитный ген в вектор pAD11, создали сайт XbaI на 3'-конце гена hFc-6. После субклонирования с использованием каждого сайта рестриктаз создали конечные экспрессирующие векторы для hFc-6, слитого с EPO, G-CSF и p40N303Q, и затем обозначили как pAD11 EPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6 и pAD11 p40N303Q-hFc-6, соответственно. hFc-2, hFc-3, hFc-4 и hFc-5 обладают идентичными областями CH2 и CH3, но они обладают шарнирами из IgD с разным размером (фиг.1 и 2). hFc-2 (SEQ ID NO:19), hFc-3 (SEQ ID NO:20), hFc-4 (SEQ ID NO:21) и hFc-5 (SEQ ID NO:22) содержат 5 аминокислот (158-162), 10 аминокислот (153-162), 20 аминокислот (143-162), 30 аминокислот (133-162) C-концевого шарнира IgD, соответственно (фиг.1 и 2). Для выполнения слияния генов между EPO, G-CSF, p40N303Q или TNFR (рецептор фактора некроза опухоли II) (SEQ ID NO:30) и молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими эти hFc (SEQ ID NO:2-5), минимальные фрагменты генов с общим размером слитых генов синтезировали с помощью специализировнной службы TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com). Каждый синтезированный фрагмент EPO, G-CSF, p40N303Q или TNFR слили с нуклеотидной молекулой, кодирующей шарнир и N-концевую CH2 область каждого из hFc-2, hFc-3, hFc-4 или hFc-5, включая последовательности в диапазоне от полноразмерных EPO, G-CSF, p40N303Q или TNFR последовательностей до идентичного сайта фермента, сайта BstEII (GGTGACC), который расположен в 138-140 аминокислотных остатках области CH2 в IgG4 (SEQ ID NO:13). Субклонирующие векторы, включая некоторые фрагменты генов, расщепляли с помощью EcoRI и BstEII, расположенных на 5'-конце и 3'-конце, соответственно, и затем лигировали в область CH2-CH3 из hFc-6. В итоге, каждый слитный ген клонировали в pAD11 с использованием сайтов EcoRI и XbaI и затем обозначили как pAD11 EPO-hFc-2, pAD11 EPO-hFc-3, pAD11 EPO-hFc-4, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-2, pAD11 G-CSF-hFc-3, pAD11 G-CSF-hFc-4, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-2, pAD11 p40N303Q-hFc-3, pAD11 p40N303Q-hFc-4, pAD11 p40N303Q-hFc-5 и pAD11 TNFR-hFc-5, соответственно.
<Пример 2> Подготовка экспрессирующих векторов для thFc-1 и thFc-2, соединенных с IFN-b
thFc-1 содержит 23 аминокислоты (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS) сигнальной последовательности тканевого активатора плазминогена (tPA) человека, 15 аминокислот (99-113) из шарнирной области IgG1, 6 аминокислот (111-116) N-концевой области CH2 IgG2, 103 аминокислоты (118-220) из области CH2 IgG4 и 107 аминокислот (221-327) из области CH3 IgG4 (фиг.3). Аминокислотная последовательность thFc-1 показана в SEQ ID NO:28. thFc-2 содержит 23 аминокислоты (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS) сигнальной последовательности tPA, 15 аминокислот (148-162) из шарнирной области IgD, 8 аминокислот (163-170) N-концевой области CH2 IgD, 100 аминокислот (121-220) из области CH2 IgG4 и 107 аминокислоты (221-327) из области CH3 IgG4 (фиг.3). Аминокислотная последовательность thFc-2 показана в SEQ ID NO:29. Для получения кодон-оптимизированных нуклеотидов, кодирующих thFc-1 (SEQ ID NO:26) или thFc-2 (SEQ ID NO:27), соединенных с N-концом IFN-β человека с удаленной сигнальной последовательностью, эти нуклеотидные молекулы синтезировали с помощью специализировнной службы TOP Gene Technologies (Quebec, Canada) (www.topgenetech.com). Для того, чтобы вставить каждый слитный ген в экспрессирующий вектор, pAD11 (SEQ ID NO:10), создали сайт EcoRI на 5'-конце thFc-1 или thFc-2 и создали сайт NotI на 3'-конце терминирующего кодона в IFN-β. После субклонирования с использованием каждого сайта рестрикции конечные экспрессирующие векторы обозначили как pAD11 thFc-1-AL(0)-IFN-β и pAD11 thFc-2-AL(0)-IFN-β, соответственно.
Чтобы присоединить thFc к IFN-β через альбуминовые линкеры различных размеров или Gly-Ser линкер, фрагменты генов, в диапазоне от сайта PstI области CH3 thFc-1, соединенные с IFN-β с удаленной сигнальной последовательностью через альбуминовые линкеры различных размеров (3 а.о., 8 а.о., 13 а.о., 18 а.о., 23 а.о. и 33 а.о.) или Gly-Ser линкер (15 а.о.), синтезировали с помощью специализировнной службы TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com) (фиг.4). Чтобы вставить 7 различных фрагментов генов в экспрессирующие векторы, pAD11 thFc-1-AL(0)-IFN-β и pAD11 thFc-2-AL(0)-IFN-β, создали сайт PstI на их 5'-концах и создали сайт NotI на 3'-конце терминирующего кодона в IFN-β. После субклонирования с использованием каждого сайта рестрикции конечные экспрессирующие векторы обозначили как pAD11 thFc-1-AL(1)-IFN-β, pAD11 thFc-1-AL(2)-IFN-β, pAD11 thFc-1-AL(3)-IFN-β, pAD11 thFc-1-AL(4)-IFN-β, pAD11 thFc-1-AL(5)-IFN-β, pAD11 thFc-1-AL(6)-IFN-β pAD11, thFc-1-GS-IFN-β и pAD11 thFc-2-AL(1)-IFN-β, pAD11 thFc-2-AL(2)-IFN-β, pAD11 thFc-2-AL(3)-IFN-β, pAD11 thFc-2-AL(4)-IFN-β, pAD11 thFc-2-AL(5)-IFN-β, pAD11 thFc-2-AL(6)-IFN-β pAD11 и thFc-2-GS-IFN-β.
<Пример 3> Экспрессия белков EPO-hFc человека, G-CSF-hFc человека, p40N303Q-hFc человека, TNFR-hFc-5 человека и thFc-IFN-β
6
Клетки COS-7 использовали для тестирования экспрессии и культивировали в среде DMEM (Invitrogen, Carlsbad) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, South Logan) и антибиотиков (Invitrogen, Carlsbad). Векторы, кодирующие EPO-hFc, G-CSF-hFc, p40N303Q-hFc, TNFR-hFc-5, thFc-IFN-β трансфицировали, в 5×10 клеток COS-7 с использованием традиционного способа электропорации. Через 48 ч после трансфекции собрали супернатанты и клетки. Чтобы проверить экспрессию слитного белка из каждого вектора, все образцы использовали для теста ELISA с несколькими наборами (R&D system, Minneapolis, #DEP00 для EPO; Biosource, Camarillo, #KHC2032, для G-CSF; R&D system, Minneapolis, #DY1240 для p40N303Q R&D system, Minneapolis, #DRT200 для TNFR, PBL Biomedical Laboratories, #41410-1A для IFN-β) и анализа вестерн-блоттинга антителами к IgG человека (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz). В результате, все векторы показали правильный профиль экспрессии в супернатантах и клеточных лизатах (данные не приведены).
<Пример 4> Очистка hFc слитных белков
4
Клетки CHO/DHFR (клетки яичника китайского хомяка, DG44, ATCC) культивировали в MEM (Invitrogen, Carlsbad), 10% диализированной эмбриональной телячьей сыворотке (JRH Biosciences, Kansas), добавкой HT (Invitrogen, Carlsbad) и антибиотиками (Invitrogen, Carlsbad). Экспрессирующие векторы трансфицировали в клетки CHO в соответствии с традиционными способами копреципитации с CaPO. Через 48 ч после трансфекции клетки CHO отделили от чашек и сделали несколько разведений (1/2, 1/5, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500). Разведенные клетки поместили в 100 мм чашки и культивировали в среде без добавления HT. В ходе процесса скрининга свежую среду без добавления HT подавали клеткам без пересеивания. Колонии были образованы в течение 2-3 недель после помещения в чашки и отдельные колонии перенесли в 48-луночные планшеты. После теста ELISA положительные колонии скринировали для обнаружения EPO, G-CSF, p40N303Q и TNFR. Каждую колонию, которая показала самую высокую экспрессию, культивировали в большом масштабе (5 л) с использованием среды, не содержащей сыворотку (JRH Biosciences, Kansas). Не содержащие сыворотку супернатанты собрали и использовали для очистки слитный белок. Для очистки, колонки HiTrap recombinant protein A FF (Amersham biosciences, Piscataway) уравновесили 20 мМ фосфатом натрия (pH 7,0). Фильтрованные супернатанты добавили в колонки и элюировали 0,1 M цитратом натрия (pH 3,0). Элюированные белки окончательно получили после диализа с мембраной (MWCO 12 14K, Spectrapor, Rancho Dominguez) более трех раз. Все концентрации в образцах белков определяли с помощью набора BCA (Pierce Biotechnology, Rockford) для измерения общего белка и с помощью наборов ELISA для измерения EPO-hFc, G-CSF-hFc, p40N303Q-hFc, TNFR-hFc-5 и thFc-IFN-β.
<Пример 5> FcgRI и C1q binding assay
2
4
Для того, чтобы узнать, связываются ли hFc-5 слитные белки с FcgRI и C1q, сделали серию разведений (двукратных, от 2 мкг/мл до 16 нг/мл) Мабтера (ритуксимаб, Roche), hIgG1 (Calbiochem, Cat#, 400120), Энбрел (этанерцепт, Amgen), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5 и p40N303Q-hFc-5 и нанесли на 8-луночную полоску (COSTAR, New York) на ночь при 4. Чтобы сделать калибровочную кривую, также сделали серию разведений (двукратных, от 2 мкг/мл до 32 нг/мл) FcgRI (R&D, cat# BAF1257) или C1q (AbD serotech, Cat#. 2221-5504) и нанесли на 8-луночную полоску (COSTAR, New York) на ночь при 4. После отмывки каждой полоски с образцами с помощью отмывочного буфера (PBS, содержащий 0,05% Tween) и блокирования с помощью 10% FBS в PBS в течение 1 часа при RT, FcgRI или C1q добавили в каждую лунку при 2 мкг/мл и затем инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре (RT). Все полоски отмыли с помощью отмывочного буфера. Для теста связывания с C1q HRP конъюгированные анти-C1q (AbD serotech, cat#. 2221-5004P) добавили в каждую лунку при 2,5 мкг/мл с последующей инкубацией 30 мин при RT в темноте. Для теста связывания с FcgRI биотинилированные анти-FcgRI (R&D, cat#. 1257-FC) добавили в каждую лунку при 2 мкг/мл с последующей инкубацией 1 при RT. После отмывки их с помощью отмывочного буфера Streptavidine-HRP (BD, cat#. 554066), разбавленный в 3000 раз, добавили в каждую полоску с последующей инкубацией 30 минут при RT в темноте. После отмывки полосок для развития добавили раствор TMB (1:1 смесь из TMB Peroxidase substrate и Peroxidase substrate solution B, KPL, cat#. 50-76-01, cat#, 50-65-00) и 2н HSO добавили для остановки развития. Как показано на фиг.6(a) и фиг.6(b), для Мабтеры, Энбрела и hIgG1 было показано, что они хорошо связываются с FcgRI и C1q, а для EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5 и p40N303Q-hFc-5 - нет.
in vitro
<Пример 6> Биоактивность очищенных hFc слитных белков
in vitro
4
2
Для исследования биоактивностей EPO-hFc белков  клеточную линию человека F35E культивировали в среде RPMI 1640 (Cambrex, Charles City) с добавлением 10% FBS, антибиотиков и рекомбинантного человеческого EPO 5 МЕ/мл (DongA, Республика Корея). Биопробы подготавливали посредством высева 2×10 клеток в тестовые лунки 96-луночного клеточного культурального планшета (Corning, Netherlands). Образцы с серийными разведениями (пятикратными 0, от 0,064 мМЕ/мл до 25 МЕ/мл) EPO, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5, EPO-hFc-6, EPO-IgG1 Fc или aranesp (дарбэпоэтин альфа, Amgen) добавили в эти лунки и планшеты инкубировали при 37°C в течение 72 часов в увлажненном 5% CO инкубаторе. В соответствии с протоколом изготовителя, тест MTT проводили с использованием набора для колориметрического анализа клеточного роста (Sigma-Aldrich. Корея). Клеточная линия человека F35E показала сильный пролиферативный ответ на rEPO, что доказывается дозозависимым характером для числа клеток и величин оптической плотности. Как показано на фиг.7(a), Aranesp и EPO белки, соединенные с Fc или hFc IgG1, показали потерю биологической активности по сравнению с белком EPO. Однако EPO-hFc-1, EPO-hFc-5 и EPO-hFc-6 показали значительно более высокую биоактивность, чем EPO-Fc IgG1. Кроме того, EPO-hFc-5 и EPO-hFc-6 показали слегка повышенную биоактивность, чем Aranesp, что указывает на то, что эти hFc слитные белки кажутся лучшими, чем Aranesp с точки зрения поддержания биоактивности белка EPO.
in vitro
in vitro
4
2
Для исследования биоактивностей белка G-CSF-hFc  мышиную гематопоэтическую клеточную линию NFS-60 культивировали в среде RPMI1640 (Cambrex, Charles City) с добавлением 10% FBS, антибиотиков и 100 единиц/мл рекомбинантного мышиного IL-3 (R&D system, Minneapolis). Биопробы подготавливали посредством высева 2×10 клеток в лунки 96-луночного клеточного культурального планшета (Corning, Netherlands). Образцы с серийными разведениями (трехкратными, в диапазоне от 0 до 10000 пг/мл) G-CSF-hFc-5 и Нейласты (пегфилграстим, Amgen) добавили в эти лунки, и планшеты инкубировали при 37°C в течение 72 часов в увлажненном 5% CO инкубаторе. Образцы белков трижды анализировали в лунках и этот эксперимент выполняли повторно 5 раз. Через 72 часа после инкубации анализ MTT выполнили с использованием набора для колориметрического анализа клеточного роста (Sigma-Aldrich. Корея), в соответствии с протоколом изготовителя. Как показано на фиг.7(b), G-CSF-hFc-5 показал слегка повышенную биоактивность , чем Нейласта.
in vitro
+
+
Для исследования биоактивности белка p40N303Q-hFc  мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от пациента с ревматоидным артритом инкубировали с 2 мкг/мл антител к CD3 человека (R&D system, # MAB100) в присутствии или в отсутствие 10 нг/мл p40 человека (R&D system) или p40N303Q-hFc-5 в среде RPMI 1640 (Cambrex, Charles City) с добавлением 10% FBS и антибиотиков. После 6 дня клетки, положительные на CD4 и IL-17, измеряли с помощью анализа FACS. Как показано на фиг.7(c), p40N303Q-hFc-5 показал более сильный подавляющий эффект на генерацию клеток CD4/IL-17, чем белок p40, указывая на то, что ингибиторное действие p40N303Q-hFc-5 на поляризацию Th 17.
in vitro
in vitro
4
2
Для исследования биоактивности белка TNFR-hFc  мышиные клетки L929 культивировали в среде RPMI1640 (Cambrex, Charles City) с добавлением 10% FBS и антибиотиков. Тест на цитопатическое ингибирование подготавливали посредством высева 3×10 клеток в лунки 96-луночного клеточного культурального планшета (Corning, Netherlands), затем обработали с помощью 1 нг/мл TNF-a. Образцы с серийными разведениями (двукратными, в диапазоне от 15,6 до 1000 нг/мл) TNFR-hFc-5 и Энбрел (этанерцепт, Amgen) добавили в эти лунки и планшеты инкубировали при 37°C в течение 48 часов в увлажненном 5% CO инкубаторе. После инкубирования тест MTT выполняли с использованием набора для колориметрического анализа клеточного роста (Sigma- Aldrich., Корея), в соответствии с протоколом изготовителя. Как показано на фиг.7(d), TNFR-hFc-5 проявил слегка повышенную биоактивность  по сравнению с Энбрелом.
in vitro
in vitro
4
2
Для исследования биоактивностей белков thFc-1-AL(0)-IFN-β и thFc-1-AL(3)-IFN-β  клетки WISH (ATCC, CCL-25) культивировали в DMEM/F12 (Cambrex, Charles City) с добавлением 10% FBS и антибиотиков. Тест на цитопатическое ингибирование подготавливали посредством высева 3×10 клеток в лунки 96-луночного клеточного культурального планшета (Corning, Netherlands), затем обрабатывали с помощью 1500 PFU/лунка VSV (ATCC, VR- 158). Образцы с серийными разведениями (двукратными, от 40 МЕ/мл) рекомбинантного IFN-β (стандарт WHO, NIBSC 00/572), белков thFc-1-AL(0)-IFN-β и thFc-1-AL(3)-IFN-β добавляли в эти лунки и планшеты инкубировали при 37°C в течение 48 часов в увлажненном 5% CO инкубаторе. После инкубирования тест MTT выполняли с использованием набора для колориметрического анализа клеточного роста (Sigma-Aldrich. Корея), в соответствии с протоколом изготовителя. Как показано на фиг.7(e), thFc-1-AL(3)-IFN-β показал приблизительно в 20 раз большую биоактивность , чем thFc-1-AL(0)-IFN-β, что указывает на важную роль альбуминового линкера для поддержания биоактивности IFN-β, слитого с Fc.
in vivo
<Пример 7> Период полураспада очищенных hFc слитных белков
Для сравнения периода полураспада EPO-hFc-1, EPO-hFc-5 и Aranesp пятнадцати обезьянам рода Cynomolgus вводили эти белки в дозировке 2400 IU/кг посредством одной подкожной (SC) инъекции или одной внутривенной (IV) инъекции. Образцы крови каждой обезьяны забирали перед инъекцией и через 1, 3, 6, 12, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96, 120, 168, 336, 504, и 672 ч после инъекции. Образцы крови инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин для свертывания крови. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин получали сыворотки из каждого образца и хранили при глубокой заморозке. Для всех образцов, полученных в каждый момент, проводили количественное тестирование EPO с помощью EPO ELISA kit (R&D, cat #. DEPOO). Как показано на фиг. 8(a), все особи обезьян, которым вводили EPO-hFc-1 или EPO-hFc-5 через подкожный или внутривенный пути, показали более длинный период полураспада, чем особи обезьян, которым вводили Aranesp через подкожный или внутривенный пути.
1/2
in vivo
Для исследования фармакокинетики G-CSF-hFc-1, 100 мкг/кг Лейкостим (филграстим, DongA, Республика Корея) в качестве контроля и G-CSF-hFc-1 вводили через подкожный или внутривенный пути двум самцам крыс Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington) на группу. Кровь забирали перед инъекцией и через 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 192 ч после инъекции. Сыворотки получали посредством центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут после инкубирования при комнатной температуре в течение 30 минут и хранили при глубокой заморозке. Проводили количественное определение образцов при нескольких разведениях, например, 1/2, 1/5, 1/50, 1/250, 1/500, с использованием G-CSF kit (Biosource, Camarillo, #KHC2032). Как показано на фиг.8(b), G-CSF-hFc-1, введенный через подкожный или внутривенный пути, показал более длительный период полураспада, чем Лейкостим G-CSF-hFc-1 и G-CSF имели 8,76 ч и 2,36 ч t после подкожного введения и 10,42 ч и 1,78 ч после внутривенного введения, соответственно. Следовательно, G-CSF-hFc-1 показал увеличение в 3,7 раза после подкожных инъекций и в 5,9 раза после внутривенных инъекций по сравнению с Лейкостимом.
Для исследования фармакокинетики трем обезьянам рода Cynomolgus на группу вводили p40N303Q-hFc-5 и Энбрел одной подкожной инъекцией в дозировке 100 мкг/кг. Образцы крови каждой обезьяны забирали перед инъекцией и через 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 336, 504 и 672 ч после инъекции. Образцы крови инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин для свертывания. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин получали сыворотки из каждого образца и хранили при глубокой заморозке. Для всех образцов, полученных в каждый момент, проводили количественное тестирование на p40 человека и TNFR II человека с помощью ELISA kits (R&D system, Mnneapolis, #DY1240 и #DRT200, соответственно). Как показано на фиг.8(c), p40N303Q-hFc-5 показал более длительный период полураспада, чем Энбрел, в среднем 199 ч против 127 ч), хотя p40N303Q-hFc-5 показал меньшее значение Cmax, чем Энбрел (в среднем 3 нг/мл против 7 нг/мл).
Для исследования фармакокинетики трем самцам крыс Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington) на группу вводили TNFR-hFc-5 и Энбрела одной подкожной инъекцией в дозировке 500 мкг/кг. Образцы крови каждой крысы забирали перед инъекцией и через 2, 4, 8, 12, 24, 30, 48, 72 и 120 ч после инъекции. Образцы крови инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин для свертывания. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин получали сыворотки из каждого образца и хранили при глубокой заморозке. Для всех образцов, полученных в каждый момент, проводили количественное тестирование на TNFR II человека с помощью ELISA kits (R&D system, Mnneapolis, #DRT200). Как показано на фиг.8(d), TNFR-hFc-5 показал немного более высокий уровень AUC, чем Энбрел (в среднем 198,1 против 172,9 мкг*ч/мл), хотя TNFR-hFc-5 показал период полураспада, схожий с Энбрелом (в среднем 28,6 ч против 29,4 ч).
in vivo
<Пример 8> Биоактивность очищенных hFc слитных белков
in vivo
in vivo
in vitro
Для сравнения биоактивности трем обезьянам рода Cynomolgus на группу вводили EPO-hFc-5 и Aranesp подкожной инъекцией или одной внутривенной инъекцией в дозировке 2400 МЕ/кг. Образцы крови каждой обезьяны забирали перед инъекцией и через 1, 3, 6, 12, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96, 120, 168, 336, 504 и 672 ч после инъекции. Количество различных клеток крови, включая ретикулоциты, измеряли для оценки биоактивности EPO-hFc-5 и Aranesp . Как показано на фиг.9(a), EPO-hFc-5 показал слегка более высокую эффективность , чем Aranesp как при подкожном, так и при внутривенном пути с точки зрения увеличения ретикулоцитов у обезьян.
in vivo
in vivo
Для исследования биоактивности G-CSF-hFc-1, Лейкостим (филграстим, Dong A, Республика Корея) в качестве контроля и G-CSF-hFc-1  в дозировке 100 мкг/кг вводили через подкожный или внутривенный пути двум самцам крыс Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington) на группу. Кровь забирали с использованием пробирок с ЭДТА перед инъекцией и через 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 192 ч после инъекции. Каждый образец крови обработали лизисным буфером RBC (BD Bioscience, Корея) в течение 4 минут и общие WBC (белые клетки крови), разбавленные буфером FACS, подсчитали трижды с использованием гематоцитометра. Количество гранулоцитов измеряли с использованием FACS калибра посредством определения размера клетки с помощью FSC (рассеивания вперед) и гранулы посредством SSC (бокового рассеивания). Как показано на фиг.9(b), Лейкостим, введенный через подкожный и внутривенный пути, вызывал пиковое количество WBC и гранулоцитов через 24 часа после инъекции, хотя G-CFS-hFc-1 вызывал пиковое количество WBC и гранулоцитов через 72 часа после подкожной инъекции и через 48 часов после внутривенной инъекции. После 24-120 ч после инъекции G-CSF-hFc-1 обладал более длительной биоактивностью  по сравнению с Лейкостимом.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было частично показано и описано со ссылкой на образцовые варианты его осуществления, обладателю обыкновенных навыков в данной области будет понятно, что различные изменения в форме и деталях могут быть выполнены здесь без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, определяемых следующими пунктами формулы изобретения.
Промышленное применение
Раскрыты слитные белки, содержащие биологически активную молекулу и домен Fc иммуноглобулина (Ig), который присоединен к биологически активной молекуле. Домен Fc представляет собой домен гибридного Fc человека из (i) IgG1, IgG2 или IgG4 или (ii) IgG4 и IgD. Гибридный Fc пригоден в качестве носителя биологически активных молекул.