СРЕДСТВО КОРРЕКЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПОСЛЕ КРИОДЕСТРУКЦИИ ПЕЧЕНИ (В ЭКСПЕРИМЕНТЕ)
AGENT OF CORRECTION OF METABOLIC DISTURBANCES AFTER LIVER CRYOLYSIS (IN EXPERIMENT)

Изобретение относится к медицине и медицинской фармакологии, связано с онкологией и хирургией.
Практикой лечения отдаленных метастазов колоректального рака, рака почки и рака некоторых других локализаций стало хирургическое вмешательство (В.А.Вишневский, С.А.Шалимов, М.Е.Нечитайло, Ю.И.Патютко). Хирургическое лечение метастатического рака печени в целом сопровождается 5-летней выживаемостью в 25% случаев. Осложнения наблюдаются 23,4% больных. Послеоперационная летальность в среднем -13,2%. В основном причинами смерти больных послужили полиорганная, острая печеночная и сердечно сосудистая недостаточность, ДВС синдром [Tepper J.E., O'Connell M., Donna H.et al.Analysis of surgical salvage after failure of primary therapy in rectal cancer: results from INT 0114. Program and abstracts of the American Society of Clinical Oncology 38th Annual Meeting; May 18 21, 2002. - Orlando, Florida. - Abstr.507]. Неудовлетворенность результатами заставляет онкологов применять альтернативные способы воздействия на опухолевую ткань. Одна из них - низкотемпературное воздействие, обладающее рядом преимуществ в комплексном лечении метастатических поражений печени. [Альперович Б.И., Парамонова Л. М., Мерзликин Н.В. Криохирургия печени и поджелудочной железы.- Томск, 1985. - 126 с.].
В печени после криодеструкции усиливаются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициатором которых являются активные формы кислорода. Последние усиленно продуцируются ксантиноксидазой в процессе глубокого метаболизма пуринов [Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шеринг С.М. Окислительный стресс диагностика, терапия, профилактика. - Новосибирск, 1993. - 181 С.]. Поэтому целью изобретения является уменьшение интенсивности распада пуриновых производных до мочевой кислоты путем ингибирования ксантиноксидазы. Торможение активности этого фермента позволит снизить необратимую потерю гипоксантина тканями печени и уменьшить продукцию супероксидных радикалов и перекиси водорода. Этот вопрос заслуживает внимания, так как побочный токсический эффект криодеструкции может стать причиной грозных осложнений в послеоперационном периоде [Милонов О.Б., Колосс О.Е., Минкина С.М., Марченко А.Л., Лазарева И.В., Смирнова Л.А. Результаты применения криовоздействия в хирургическом лечении распространенного альвеококкоза печени // Хирургия. - 1988. - №2. - С.40-44].
Известен препарат аллопуринол (химическая формула 4-окси-пирозоло-[3,4-d] пиримидин) аналог гипоксантина, снижающий активность ксантиноксидазной реакции на этапе превращения последнего в ксантин (Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М.: Астра-Фарм-Сервис, 2006 г., на с.225). Однако при этом он не позволяет получить технический (медицинский) результат, выраженный в уменьшении продукции активных форм кислорода, торможению перекисного окисления липидов и уменьшению побочных эффектов глубокого метаболизма пуринов в печени, сокращении сроков биохимических нарушений в послеоперационном периоде [Конвай В.Д. Нарушение пуринового обмена в печени в постреанимационном периоде и его профилактика: Дисс.… д-ра мед. наук. - Томск, 1988. - 426 л].
Известен также лекарственный препарат метронидазол (химическая формула 1-(в-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазол), например, "Метронидазол-Тева". Состав: Метронидазол - 250 мг. Производитель: фирма "TEVA", Израиль, применяемый при лечении бактериальных и протозойных инфекций. Эти заболевания, вызываемые такими возбудителями как хламидии, анаэробные микроорганизмы, сопровождаются воспалительными процессами различных органов. Это лекарственное средство обладает сходным химическим строением с мочевой кислотой конечным продуктом ксантиноксидазной реакции. Сведения об этом препарате приведены в изданиях "Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России". М.: Астра-Фарм-Сервис, 2006 г. и М.Д.Машковский. "Лекарственные средства", т.2, Харьков, Гарант, 1997, сведения о метронидазоле - на с.272. В результате проведенного поиска по источникам медицинской и патентной информации не обнаружено описания свойств этого препарата (вещества) с совокупностью существенных признаков, а именно способности снижать активность ксантиноксидазы и продукцию последней активных форм кислорода, совпадающей с предлагаемым изобретением и обеспечивающего заявленный технический результат.
Указанный технический результат достигается тем, что в послеоперационном периоде парентерально вводится метронидазол 20 мг/кг массы тела. Заявленное свойство лекарственного средства прошло экспериментальную проверку. Его применение основывается на результатах исследования, где изучали активность ксантиноксидазы и состояние системы перекисного окисления липидов в неповрежденных участках печени и влияние метронидазола (20 мг/кг массы тела внутрибрюшинно) на процессы чрезмерной липопероксидации. В опытах с лабораторными животными использовали 85 белых беспородных крыс-самцов массой 200±20 г.
Первая экспериментальная контрольная группа (группа "К") включала в себя 29 белых крыс, которых подвергали тем же воздействиям, что и животные в 2 и 3 группах (наркозу, фиксации, лапаротомии), за исключением криовоздействия. Вторая группа (группа "КД") состояла из 28 белых крыс, которым под эфирным наркозом производили лапаротомию и криодеструкцию участка левой латеральной доли печени температуры -20°С, и экспозицией 3 минуты. Третья экспериментальная группа (группа «КД+М») состояла из 28 белых крыс, которым под эфирным наркозом выполняли лапаротомию и криодеструкцию участка левой латеральной доли печени с параметрами, аналогичными параметрам воздействия в 2 группе. Животные этой группы в послеоперационном периоде получали метронидазол в дозе 20 мг/кг массы тела в сутки.
Для определения биохимических показателей в ткани печени, орган прижизненно фиксировали и хранили в жидком азоте. Из тканей печени готовили липидный экстракт по Folch et аl. В нем определяли содержание общих липидов по Bragdon, диеновых конъюгатов (DC)- по Plazer, липофусциноодобного пигмента (ЛФП) - по Fletcher et al. Для определения активности ферментов замороженную ткань печени гомогенезировали при 0-20°С в стеклянном гомогенезаторе Поттера с 0,25 М раствором сахарозы, приготовленном на 10 мм растворе трис-НСl, рН 7,4 и центрифугировали в течение 20 минут при 2000 g и температуре 0-2°С. Активность супероксиддисмутазы (SOD) [1.15.1.1.] определяли методом В.Н.Чумакова и Л.Ф.Осинской, каталазы (КАТ) [1.11.1.6.] - по В.Д.Конвай и А.В.Лукошкину, глутатионпероксидазы (GPO) [1.11.1.9] - по Paglia et Valentine, глутатионредуктазы (GR) [1.6.4.2] - по Racker, a глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G-6-PDH) [1.1.1.49] - по Ю.Л.Захарьину. Содержание глутатиона (G-SH) определяли по Sedlak et Linsey.
В сыворотке крови исследовали содержание мочевой кислоты (Ur), лактата (Lac), белка и белковых фракций, глюкозы, активность аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) с помощью унифицированных лабораторных методов исследования.
Результаты исследования, полученные в группе «К», сравнивали с данными, полученными в группах «КД» и «КД+М» с помощью общепринятых методов вариационной статистики.
Установлено, что введение препарата вызывало снижение концентрации мочевой кислоты в плазме крови крыс группы "КД+М": через 1 сутки после операции на 13% (Р<0,01), через 3-е сутки - на 14,6% (Р<0,01), через 7 сутки - на 28,8% (Р<0,01) по сравнению с аналогичным показателем в группе "КД" (табл.1, 2, 3).
Таблица 1
Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в плазме крови и печени крыс в группах «К», «КД» и «КД+М» к концу 1-х суток после криовоздействия M±m для каждой группы
Показатели
Группы животных
«К» n=11
«КД» n=10
«КД+М» n=10
В крови
Ur (мкмоль/л)
154±4
192±5<sup>*</sup>
167±4<sup>*</sup>#
Глюкоза (ммоль/л)
8,66±0,29
9,82±0,26<sup>*</sup>
9,62±0,27<sup>*</sup>
Lac (ммоль/л)
5,10±0,41
6,80±0,49<sup>*</sup>
7,08±0,47<sup>*</sup>
ALT (МЕ/л)
110±4
1193±20<sup>*</sup>
921±65<sup>*</sup>#
AST (МЕ/л)
237±11
2301±125<sup>*</sup>
1977±81<sup>*</sup>
В печени
SOD (единиц/г ткани)
1929±142
2116±84
2717±119<sup>*</sup>#
КАТ (единиц/г ткани)
1738±94
2641±86<sup>*</sup>
2493±59<sup>*</sup>
DC (Мэкв/мг липидов)
6,85±0,43
13,83±0,77<sup>*</sup>
6,13±0,32#
ЛФП(ед.флюорисценции/мг липидов)
8,02±087
17,76±1,16<sup>*</sup>
11,73±0,61<sup>*</sup>#
GPO (мкмоль/г ткани*мин)
3,68±0,08
3,23±0,24
3,52±0,11
G-SH (мкмоль/г ткани)
3,91±0,17
4,24±0,13
4,04±0,36
GR (мкмоль/г ткани*мин)
2,80±0,05
3,76±0,15<sup>*</sup>
3,42±0,23<sup>*</sup>
G-6-PDH (нмоль/г ткани*мин)
477±9
674±7<sup>*</sup>
622±11<sup>*</sup>#
*различие достоверно по сравнению с группой «К»# различие достоверно по сравнению с группой «КД»
Активность SOD крыс, получавших в послеоперационном периоде метронидазол, достоверно повышена относительно показателя активности этого фермента в группах "К" и "КД" через 1 суток после операции соответственно на 40,9% (Р<0,01) и 28,4% (Р<0,05) (табл.1). В остальные сроки наблюдения этот показатель достоверно не отличается от аналогичного показателя у животных группы «КД» и превышает активность SOD в печени контрольных крыс через 3-е сутки после операции на 97,5% (Р<0,001), через 7 суток - в 2,2 раза (Р<0,001).
Уровень активности каталазы в группе «КД+М» через 1 сутки после операции не достоверно отличается от аналогичного показателя в группе "КД" и превышает контрольные цифры на 43,4% (Р<0,001) (табл.1). К исходу 3-х суток активность каталазы достоверно повышена относительно уровня активности фермента в группе "КД" на 25,6% (Р<0,01) и относительно контроля на 67,9% (Р<0,001) (табл.2). К исходу недели эксперимента показатель активности каталазы в исследуемой группе существенно не отличается от аналогичного показателя в группе "КД", но достоверно выше контрольных цифр в эти же сроки на 64,4% (Р<0,001) (табл.3).
Эффект введения препарата в послеоперационном периоде выражен к 1-м к 3-м суткам, когда содержание продуктов перекисного окисления липидов в печени крыс группы "КД+М" достоверно ниже, чем в группе животных, не получавших препарат в послеоперационном периоде. Так концентрация DC и ЛФП снижены через 1 суткам соответственно на 55,7% (Р<0,001) и 34% (Р<0,001), к исходу 3-х суток - на 36,1% (Р<0,001) и 21,7% (Р<0,05) (табл.1,2).
Введение в послеоперационном периоде метронидазола предотвращает падение активности GPO в печени крыс после криодеструкции на 3 и 7 сутки эксперимента и предупреждает снижение концентрации глутатиона в печени крыс к концу недели послеоперационного периода. Уровень активности GPO в печени животных группы «КД+М» достоверно выше аналогичного показателя в группе «КД» через 3 и 7 суток соответственно на 20,3% (Р<0,001) (табл.2) и 18,2% (Р<0,01) (табл.3). А содержание глутатиона к концу недели выше на 29,9% (Р<0,05) у крыс, перенесших криодеструкцию печени на фоне введения метронидазола (табл.3).
Таблица 2
Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в плазме крови и печени крыс в группах «К», «КД» и «КД+М» к концу 3-х суток после криовоздействия M±m для каждой группы
Показатели
Группы животных
«К» n=10
«КД» n=9
«КД+М» n=9
В крови
Ur (мкмоль/л)
149±5
198±5<sup>*</sup>
169±3<sup>*</sup>#
Глюкоза (ммоль/л)
9,21±0,29
8,88±0,48
8,58±0,47
Lac (ммоль/л)
5,14±0,32
6,55±0,52<sup>*</sup>
6,33±0,30<sup>*</sup>
ALT (МЕ/л)
94,8±3,1
1307±13<sup>*</sup>
863±81<sup>*</sup>#
AST (МЕ/л)
217±13
2594±169<sup>*</sup>
1679±68<sup>*</sup>#
В печени
SOD (единиц/г ткани)
1629±197
3257±244<sup>*</sup>
3217±195<sup>*</sup>
КАТ (единиц/г ткани)
1416±42
1893±130<sup>*</sup>
2377±53<sup>*</sup>#
DC (Мэкв/мг липидов)
5,33±0,18
12,26±0,75<sup>*</sup>
7,84±0,40<sup>*</sup>#
ЛФП (ед. флюорисценции/мг липидов)
11,09±0,63
15,9±1,23<sup>*</sup>
12,45±0,52#
GPO (мкмоль/г ткани*мин)
3,47±0,1
3,01±0,1<sup>*</sup>
3,62±0,05#
G-SH (мкмоль/г ткани)
3,77±0,19
4,10±0,64
3,86±0,19
GR (мкмоль/г ткани*мин)
2,76±0,07
2,9±0,06<sup>*</sup>
3,50±0,25<sup>*</sup>#
G-6-PDH (нмоль/г ткани*мин)
498±11
541±29
576±13<sup>*</sup>
*различие достоверно по сравнению с группой «К»# различие достоверно по сравнению с группой «КД»
Активность GR в печени животных группы «КД+М» в послеоперационном периоде через 1 сутки существенно не отличалась от значения активности этого фермента в группе «КД», но превышает контрольные значения на 221% (Р<0,05) (табл.1). Через 3-е суток уровень активности энзима достоверно выше показателей в группе «КД» и в контроле соответственно на 20,3% (Р<0,05) и 26,8% (Р<0,01) (табл.2). А к исходу недели эксперимента активность GR в печени крыс исследуемой группы достоверно отличается только от аналогичного значения в контроле на 28,4% (Р<0,01).
Таблица 3
Показатели энергетического обмена и перекисного окисления липидов в плазме крови и печени крыс в группах «К», «КД» и «КД+М» к концу 7-х суток после криовоздействия M±m для каждой группы
Показатели
Группы животных
«К» n=8
«КД» n=9
«КД+М» n=9
В крови
Ur (мкмоль/л)
144±6
274±18<sup>*</sup>
195±4<sup>*</sup>#
Глюкоза (ммоль/л)
7,79±0,34
7,99±0,33
8,03±0,34
Lac (ммоль/л)
4,54±0,48
8,01±0,42<sup>*</sup>
6,85±0,37<sup>*</sup>
ALT (МЕ/л)
81,6±5,8
1048±31<sup>*</sup>
807±49<sup>*</sup>#
AST (МЕ/л)
250±22
2130±130<sup>*</sup>
1778±63<sup>*</sup>#
В печени
SOD (единиц/г ткани)
1436±148
2695±201<sup>*</sup>
3180±233<sup>*</sup>
КАТ (единиц/г ткани)
1403±82
1852±194<sup>*</sup>
2307±54<sup>*</sup>
DC (Мэкв/мг липидов)
5,02±0,34
8,95±0,81<sup>*</sup>
8,03±0,39<sup>*</sup>
ЛФП (ед. флюорисценции/мг липидов)
9,58±1,07
15,36±2,30<sup>*</sup>
14,67±0,38<sup>*</sup>
GPO (мкмоль/г ткани *мин)
3,57±0,16
2,87±0,13<sup>*</sup>
3,40±0,08#
G-SH (мкмоль/г ткани)
3,81±0,30
2,71±0,27<sup>*</sup>
3,52±0,22#
GR (мкмоль/г ткани* мин)
2,68±0,06
2,98±0,16
3,44±0,25<sup>*</sup>
G-6-PDH (нмоль/г ткани*мин)
471±12
481±24
574±14<sup>*</sup>#
*различие достоверно по сравнению с группой «К»# различие достоверно по сравнению с группой «КД»
Активность G-6-PDH в печени экспериментальных животных через 1 сутки после криодеструкции на фоне введения метронидазола ниже показателя в группе «КД» на 7,7% (Р<0,01) и выше контроля на 30,4% (Р<0,001) (табл.1). К концу 3-х суток активность этого фермента в группе «КД+М» существенно не отличается от аналогичного показателя в группе животных «КД», но выше контрольных значений на 15,7% (Р<0,01). И к исходу 7-х суток значения активности G-6-PDH в печени крыс, перенесших криодеструкцию на фоне введения метронидазола, достоверно выше активности этого энзима в группе животных, не получавших препарат в послеоперационном периоде и в контрольной группе соответственно на 19,3% (Р<0,01) и 21,8% (Р<0,001) (табл.3).
Из представленных в таблицах сведений о результатах биохимических тестов крови крыс группы "КД+М" видно, что через 1,3-е и 7 сутки активность ALT в этой группе достоверно ниже аналогичного показателя в группе "КД" соответственно на 22,8% (Р<0,01), 34% (Р<0,001) и 23% (Р<0,01). Уровень активности AST в крови крыс, получавших в послеоперационном периоде метронидазол также ниже значений активности этого фермента в группе животных, которым препарат не вводился через 1 сутки - на 14,1% (Р<0,1), к 3-м суткам - на 35,3% (Р<0,001) и к концу недели опыта - на 16,5% (Р<0,05). При сравнении данных протеинограммы в группах крыс, получавших метронидазол в послеоперационном периоде и перенесших криодеструкцию без введения препарата, обращает на себя внимание некоторое снижение концентрации Е-глобулинов в плазме крови через 1 и 3-е сутки после операции в первой группе соответственно на 10,4% (Р<0,2) и 17,8% (Р<0,05) повышение относительного количества альбуминов к 3-м и 7-м суток послеоперационного периода на 12% (Р<0,2) и на 17,4% (Р<0,01). Соответственно увеличивается альбумино-глобулиновый коэффициент, который через 7 суток в группе "КД+М" составляет 126,3% (Р<0,01) от аналогичного показателя в группе "КД".
Сравнивая результаты исследований в группах "КД" и "КД+М" можно сделать следующие выводы.
- Введение экспериментальным животным в послеоперационном периоде метронидазола в дозе 20 мг/кг веса снижает уровень урикемии, что связано с ингибированием этим препаратом ксантиноксидзы.
- Изолированное торможение активности одного из ключевых ферментов, продуцирующих активные формы кислорода, способствует снижению уровня липопероксидации, последнее отражается на концентрации продуктов ПОЛ в ткани печени.
- Обезвреживание перекисей липидов в системе, поддерживающей глутатиондисульфидное равновесие, происходит более эффективно, что следует из понижения их концентрации в ткани печени к исходу 1-х к 3-х суток и повышения активности ферментов, обеспечивающих функционирование названной выше системы: GPO на 3-й и 7-е сутки, GR к исходу 3-х суток и G-6-PDH на 7-е сутки послеоперационного периода, а также повышения содержания глутатиона в ткани печени к исходу 7-х суток после криодеструкции.
- Торможение процессов ПОЛ и изменения в системе антирадикальной и антиперекисной защиты положительно сказались на функциональных тестах печени, применяемых в клинической практике. Это выразилось в снижении активности ALT и AST в плазме крови оперированных животных и уменьшении степени выраженности диспротеинемии к исходу недели эксперимента.
Как видно из всего вышеописанного, именно заявленная совокупность существенных признаков предлагаемого изобретения, реализованная при заданных параметрах, позволяет обеспечить технический (медицинский) результат. Последний выражается в уменьшении побочного эффекта, проявляемого как чрезмерная липопероксидация фосфолипидов мембранных структур гепатоцитов при применении криодеструкции, путем снижения продукции ксантиноксидазой активных форм кислорода, а также сокращении сроков и степени биохимических нарушений. Таким образом, можно сделать вывод, что предлагаемое изобретение является патентоспособным, так как обладает новизной, изобретательским уровнем и практически применимо.