ПРОТИВОВИРУСНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ ПОЛИ(А):ПОЛИ(У)
ANTIVIRAL COMPOSITION FOR PROTECTING PLANTS BASED ON POLY(A):POLY(U)

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и молекулярной биологии и направлено на разработку эффективного средства биологической защиты Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(А):поли(У) растений широкого спектра действия против вирусов на основе стимуляции неспецифического защитного ответа растения по типу иммунитета, связанного с узнаванием молекулярных паттернов, ассоциированных с патогеном (МАМР или РАМР), рецепторами растения (РАМР-иммунитет - PTI) (иммуномодулирующее действие). В соответствии с настоящим изобретением получен биомолекулярный комплекс, включающий наночастицы хитозана, функционализированные синтетической двуцепочечной полирибонуклеиновой кислотой полиадениловая:полиуридиловая кислота (поли(А):поли(У)), который может быть использован для обработки сельскохозяйственных растений с целью их защиты от различных вирусов.
Описание чертежей
Фигура 1. Анализ синтетической поли(А):поли(У) методом электрофореза в геле агарозы. а - исходный препарат поли(А):поли(У); б - препарат поли(А):поли(У) после обработки ультразвуком различной мощности в течение 1, 2, 5, 7 и 10 мин.
Фигура 2. Характеристика синтезированных наночастиц хитозана методом трансмиссионной электронной микроскопии (а) и методом динамического лазерного светорассеяния (б).
Фигура 3. Связывание дцРНК с НЧХ, изученное методом «задержки» в агарозном геле. Постоянное количество поли(А):поли(У) инкубировали с возрастающим количеством НЧХ (наночастиц хитозана), образцы наносили в лунки неденатурирующего геля агарозы и проводили электрофорез. Над лунками указано весовое соотношение компонентов поли(А):поли(У):НЧХ.
Фигура 4. Стабильность комплекса поли(А):поли(У):НЧХ в растворе, охарактеризованная методом ДЛС в течение двух часов после начала эксперимента. Приведены данные по интенсивности и числу частиц.
Фигура 5. Угнетение репродукции Υ вируса картофеля (ΥΒΚ) в растениях картофеля сорта Индиго на 14 и 21 дни после начала инфекции (дли) препаратом поли(А):поли(У) различной полимерности.
Фигура 6. Угнетение репродукции X вируса картофеля (ХВК) в растениях картофеля сорта Индиго на 14 и 21 дни.
Фигура 7. Угнетение репродукции S вируса картофеля (SBK) в растениях картофеля сорта Г265 на 14 и 21 дни.
Фигура 8. Угнетение репродукции репродукции Μ вируса картофеля (МВК) в растениях картофеля сорта Прайм на 14 и 21 дни.
Термины и определения
НЧХ - наночастицы хитозана
поли(А):поли(У) - синтетическая двуцепочечная полирибонуклеиновая кислота, polyadenylic-polyuridylic acid. Встречаются различные варианты написания: PolyA. PolyU, PolyA:PolyU, PolyA:U, Poly(A): Poly(U), polyA-polyU и др.
Функционализированная частица - частица, связанная с какими-либо молекулами, наделяющими частицу способностью выполнять определять функцию.
дцРНК - двуцепочечная РНК
шдцРНК - шпилечная двуцепочечная РНК
ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние
дпи - дни после инфицирования
пн - пары нуклеотидов
Задача настоящего изобретения состояла в разработке технически простого универсального средства защиты растений, стимулирующего врожденный защитный ответ растений на инфекцию различными вирусами. В соответствии с настоящим изобретением получен комплекс, включающий наночастицы хитозана, функционализированные синтетической полирибонуклеиновой кислотой поли(А):поли(У), для обработки путем опрыскивания листьев растений с целью защиты сельскохозяйственных культур от заражения вирусами. Данный подход основан на использовании естественных механизмах иммунитета растений. Недавние исследования показали, что растения способны успешно экспрессировать искусственные гены, ответственные за синтез двуцепочечных РНК (дцРНК) и шпилечных двуспиральных РНК (шдцРНК), а также процессировать экзогенные дцРНК и шдцРНК для подавления экспрессии целевых генов патогенов. Как эндогенные, так и экзогенные дцРНК процессируются в малые интерферирующие РНК, которые распространяются по растению локально и системно и индуцируют резистентность растений к вирусам и другим патогенам на основе механизма РНК-интерференции. Эта весьма целенаправленная и экологически чистая стратегия защиты растений гораздо более приемлема для общественного мнения, чем, например, химические обработки. Вместе с тем технология использования дцРНК является специфической и направлена на придание устойчивости растений против индивидуального вируса/патогена или группы близкородственных патогенов, поскольку ее мишенью является специфическая РНК, синтезируемая данным вирусом/патогеном в процессе его репродукции в зараженном растении. Однако существуют препараты на основе аналогов дцРНК, давно применяемые в биомедицине и ветеринарии, которые стимулируют неспецифический иммунитет человека и животных путем индукции синтеза интерферона или активации Т-клеточного иммунитета, в частности, препараты на основе синтетических полирибонуклеиновых кислот - препараты поли(А):поли(У) и полиИ:полиЦ.
Двуцепочечные молекулы РНК, такие как поли(А):поли(У) и полиИ:поли(У) (polyI:polyU) и композиции, содержащие смесь Poly(I) (полиИ), Poly(С) (полиЦ), или PolyI:C (полиИ:полиЦ), известны как неспецифические иммуностимулирующие/ иммуномодулирующие агенты и достаточно давно применяются в различных областях биомедицины и ветеринарии. Первые публикации об их активности появились около полувека назад (например,  Η et al., 1974). Так доклинические исследования, выполненные в 1970-1980-х годах показали, что инкубация мононуклеарных клеток крови с poly A-poly U индуцирует секрецию альфа интерферона, а инъекции poly A-poly U активирует натуральные киллеры in vitro (ЕР281 380; ЕР113 162). На основании результатов биологического тестирования среди двуспиральных полирибонуклеотидных комплексов разной структуры были отобраны поли(А):поли(У), полиИ:полиЦ и полиГ:полиЦ, имеющие наиболее выраженные интерферон-индуцирующую и противовирусную активности. Серией экспериментальных и клинических исследований установлено, что двуспиральные полирибонуклеотиды могут быть использованы в качестве адъювантов для модуляции и оптимизации антиген-специфического иммунного ответа (Caskey et al., 2011). Например, совместное введение полиИ-полиЦ, липотейхоевой кислоты и CL097 (имидазолхолинового соединения) с инактивированной вакциной против вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней обеспечивало высокий уровень защиты от инфекции (Zhan et al., 2013).
В экспериментах in vitro и in vivo показано, что полиА:поли(У) подавляет репродукцию вирусов герпеса, репродуктивно-респираторного синдрома, трансмиссивного гастроэнтерита и африканской чумы свиней (Yershov and Zdanov, 1982; Sharypova et al., 2018), и является активным индуктором интерферонов.
В России на основе поли(А):поли(У) в 1970-х годах был создан и зарегистрирован в качестве лекарственного средства препарат Полудан («Верофарм», Россия), который до 2016 года применялся в виде глазных и назальных капель при вирусных заболеваниях глаз, в комплексной терапии гриппа и других острых респираторных инфекций. Во Франции на основе поли(А):поли(У) создан препарат Polyadenur («Beaufour Ipsen» (France) совместно с «Hemispherx Biopharma» (USA)), успешно прошедший клинические испытания в качестве компонента комплексной терапии гепатитов В и С, а также лечения рака молочной железы (De Paillette, 2003, Patent No.: US 6,509,154 B1. Appl. No 09/485,086, Date of Patent 21.01.2003; Fabrice and Sabourin, 2006, Int.Pub.No: WO 2006/054129 A1. International Appl. No: РСТ/IB2004/004093, Publication Date 26.05.2006). Еще в серии ранних работ Вильнера с соавт.(Vilner et al., 1982; Vilner et al., 1985) было показано, что противовирусная активность синтетических полирибонуклеотидов существенным образом зависит от длины полимера.
Проводятся исследования, направленные на повышение терапевтической эффективности двуспиральных полирибонуклеотидов, в частности получение комбинированых композиций с веществами, стабилизирующих нуклеиновые кислоты, усиливающими действие основного вещества или ослабляющими побочные эффекты, получение препаратов на полимерных носителях и в средствах адресной доставки (Nacano et al., 2018; Torchilin, 2013; Ghosh and Chowdhury, 2013; Alikin et al., 2001, Patent RF №2172631. Appl.99121277 from 08.10.1999; publ. 27.08.2001 in BI №24). Так, на основе полиИ-полиЦ, стабилизированной поли L-лизином и карбоксиметилцеллюлозой компанией «Oncovir» (USA) был разработан препарат Hiltonol (Levy, 1982, Patent No.: US 4,349,538. Appl. No.: 208029. Publication Date: 14.09.1982): Этот препарат индуцирует синтез интерферонов, оказывает модулирующее действие на клетки иммунной системы, включая активацию Т-клеток, натуральных киллеров и дендритных клеток, синтез интерлейкинов и альфа-TNF, кортикостероидов, отличается сниженной по сравнению с аналогами токсичностью, что позволяет применять более высокие дозы вещества при лечении запущенных неоперабельных случаев рака (Levy, 1982, Patent No.: US 4,349,538. Appl. No.: 208029. Publication Date: 14.09.1982). В Базе данных ClinicalTrials.gov зарегистрировано 97 клинических испытаний соединения Hiltonol для лечения онкологических заболеваний различной локазизации, гриппа, тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и других вирусных заболеваний (Salazar, Oncovir Inc. http://www.oncovir.com/id2.html. Дата обращения 11.01.2018). В настоящее время механизм действия полирибонуклеотидов рассматривается с точки зрения регуляции ими экспрессии генов, однако подробно не изучен (Zarudnaya et al., 2019).
Сведения по использованию поли(А)-поли(У) в качестве средства профилактики и лечения вирусных заболеваний растений в литературе отсутствуют.
Наиболее близким аналогом к молекулам, применяемым в настоящем изобретении, является полиинозиновая:полицитидиловая кислота (далее polyI:C или полиИ:полиЦ). Эта синтетическая полирибонуклеиновая кислота с известным иммуномодулирующим действием у животных и человека, использование препаратов на основе которой защищено многими патентами, была испытана на растениях (Double-stranded RNAs induce a pattern-triggered immune signaling pathway in plants, Niehl et al., 2016). Исследования, проведенные на животных, показали, что интерферон-индуцирующая активность поли(А):поли(У) несколько ниже, чем активность полиИ:полиЦ и полиГ:полиЦ, но токсичность поли(А):поли(У) также ниже, чем у этих препаратов. Таким образом, применение защитной композиции на основе поли(А):поли(У) для индукции неспецифического иммунитета у растений могло быть предпочтительнее в части биобезопасности, однако до настоящего эффективность ее не была где-либо показана. В заявленном изобретении впервые продемонстировано успешное применение подобной композиции на практике. Показано, что вызываемая ею неспецифическая индукция иммунитета достаточна для того, чтобы в обработанном растении успешно подавлялась репродукция различных видов вирусов.
Публикации об использовании поли(А):поли(У) как средства защиты от патогенов в растениеводстве отсутствуют. Известные публикации относятся к применению данного вещества в области биомедицины и ветеринарии при лечении вирусных инфекций и онкологических заболеваний.
В пионерской работе Niehl с соавторами (2016) показано, что аналог дцРНК -поли(И):поли(Ц) (polyI:C) способен индуцировать в растениях Arabidopsis типичный неспецифический защитньш ответ по типу иммунитета, связанного с узнаванием молекулярных паттернов, ассоциированных с патогеном (МАМР или РАМР), рецепторами растения (РАМР-иммунитет - PTI). Этот защитный ответ (PTI), зависит от корецептора рецептор-подобной киназы-1 соматического эмбриогенеза (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1, SERK1), но не зависит от DICER-подобных белков, участников механизма РНК-интерференции. Обработка поли(И):поли(Ц) растений Arabidopsis индуцирует SERK1-зависимую антивирусную устойчивость. Авторы предположили, что дцРНК могут распознаваться растениями как подлинные РАМР, индуцирующие сигнальные каскады, в которые вовлечены SERK1 и специфический рецептор дцРНК. Таким образом, опосредованные неспецифической дцРНК процессы оперируют независимо от механизма РНК-интерференции, что может быть использовано в практическом плане для повышения антивирусной устойчивости у сельскохозяйственных растений.
Задача настоящего изобретения состояла в разработке универсального (в отличие от метода, основанного на механизме специфической РНК-интерференции) метода защиты растений от неродственных вирусов, основанного на естественном механизме защиты растений - механизме врожденного неспецифического защитного ответа растения.
Ключевые для потребителя характеристики, по которым у продукта/технологии есть преимущества над аналогами: Для конечных потребителей создаваемых препаратов основное преимущество противовирусного препарата - возможность прямой защиты против вирусов из различных таксономических групп с частичным отказом (сокращением объемов) от трудозатратных профилактических мероприятий по фитопрочистке, выбраковке посадок.
В результате осуществления заявленного изобретения получена композиция на основе полиадениловой + полиуридиловой кислоты (далее поли(А):поли(У)) широкого спектра действия для обработки сельскохозяйственных растений с целью защиты их от вирусов. Один из дополнительных вариантов композиции раскрывает состав, содержащий частицы хитозана размером до 100 нм, покрытые молекулами поли(А):поли(У). Определен уровень оптимальной степени полимерности поли(А):поли(У) в составе композиции.
Способ защиты растений с использованием предложенной композиции включает приведение поверхности листа растения и указанного композиции в контакт друг с другом посредством опрыскивания. Далее композиция поглощается растительной клеткой, содержащей клеточную стенку, что и обеспечивает ингибирование размножения вируса в растении более, чем в 2 раза в течение не менее 21 дня после однократной обработки препаратом.
Технический результат достигается за счет оптимальной комбинации приемов и средств, применяемых при осуществлении процедуры обработки растений: в частности, получения частиц хитозана оптимальной величины, их связывания с поли(А):поли(У) определенной молекулярной массы и обработки приготовленным таким образом препаратом/комплексом листьев растений путем опрыскивания.
Однократное опрыскивание листьев растений картофеля восприимчивых сортов композицией, которая содержит 15 мкг или 7,5 мкг наночастиц хитозана, функционализированных 30 или 15 мкг поли(А):поли(У), соответственно, в 100 мкл раствора, приводит к ингибированию размножения 4-х вирусов, имеющих важное экономическое значение для картофелеводства (Y вируса картофеля (род Potyvirus); X вируса картофеля (род Potexvirus); Μ вируса картофеля и S вируса картофеля (оба представители рода Carlavirus)), в условиях искусственного заражения в диапазоне от 5 до 20% до 14 дня и 20-50% до 21 дня после заражения по сравнению с контрольными растениями.
Осуществление изобретения
1. Получение композиции поли(А):поли(У)
Поли(А):поли(У) является коммерчески доступным веществом. Для оценки антивирусной активности нами был использован поли(А):поли(У) отечественного производства (синтезирован в Филиале ИБХ РАН). Исходное соединение имеет высокую полимерность, от 10000 до 40000 пн. Для получения действующего вещества необходимой полимерности, оптимальной для доставки в клетки растения, и обладающего биологической активностью, перед использованием высокомолекулярный препарат поли(А):поли(У) обрабатывали ультразвуком («озвучивали») в течение до 10 мин для получения фрагментов, длина которых варьирует от 250 до 2500 пн, в среднем около 1000 пн (Фиг. 1а.б).
2. Получение частиц хитозана и их функционализация
3
3
Хитозан (Sigma, CAS Number 9012-76-4) в концентрации 3,0 мг/мл растворяли в 30 мМ Na-ацетатном буфере рН 4,5 (буфер готовили, подводя рН раствора 30 мМ CHCOONa до 4,5 10% раствором СНСООН) при постоянном встряхивании до полного растворения хитозана. Затем к раствору добавляли водный раствор триполифосфата натрия (ТПФ, Галреахим) в концентрации 1 мг/мл в соотношении хитозан:ТПФ, равном 5:2 (объем/объем). Данные условия приводили к формированию гомогенного препарата частиц хитозана с диаметром около 20 нм (фазово-контрастное изображение, полученное с помощью моторизованного инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия), Фиг. 2а. Сходные данные были получены с помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) (Фиг. 2б).
Подбор оптимальных соотношений НЧХ и поли(А):поли(У) проводили методом «задержки» в агарозном геле. Получение комплекса дцРНК-носитель осуществлялось за счет электростатической адсорбции поли(А):поли(У) на наночастицах хитозана. Постоянное количество дцРНК инкубировали с возрастающим количеством НЧХ, образцы наносили в лунки неденатурирующего геля агарозы и проводили электрофорез. Данные, представленные на Фиг. 3, показывают, что полное связывание дцРНК в пробе НЧХ наблюдается при весовых соотношениях поли(А):поли(У):НЧХ около 2:1. Агрегация функционализированных дцРНК оценивалась методом ДЛС. При весовом соотношении поли(А):поли(У):НЧХ, соответствующем 2:1 и концентрации поли(А):поли(У) 30 или 15 мкг в 100 мкл заметной агрегации частиц комплекса в течение времени эксперимента, соответствующего 2-м часам, не наблюдалось (Фиг. 4). Размер комплексов варьировал от 150 до 250 нм.
Антивирусный эффект различных композиций, содержащих поли(А):поли(У) и/или поли(А):поли(У):НЧХ испытывали на сортах растений картофеля, чувствительных к определенному вирусу, которые были выращены в теплице в стандартных условиях из безвирусных пробирочных растений. В опытах использовали растения на стадии 5-6 взрослых листьев. Три нижних листа опрыскивали из атомайзера приготовленными опытными и контрольными растворами в присутствии поверхностно активного вещества Неон-99 в разведении 1:2000 из расчета 100 мкл исследуемой композиции на 1 лист. На следующий день обработанные листья, припыленные абразивным материалом - целлитом, заражали вирусом. В экспериментах были использованы следующие вирусы: Υ вирус картофеля (род Potyvirus) штамм обыкновенный (YBK-O); X вирус картофеля (род Potexvirus); Μ вирус картофеля и S вирус картофеля (род Carlavirus). Для оценки уровня заражения растения на 14 и 21 дни после инфицирования (дпи) отбирали пробы с 2-3 листьев над инфицированными, листовой материал гомогенизировали и анализировали на наличие вируса методом ИФА с использованием коммерческих наборов.
В качестве материала для заражения (инокулюма) YBK использовали гомогенат листьев табака сорта Самсун, зараженного YBK в 0,05 Μ фосфатном буфере с приблизительным уровнем рН 7,0 или в стерильной воде (весовое соотношение 2:1). Для заражения ХВК, SBK и МВК в качестве инокулюма использовали гомогенат листьев картофеля, зараженных соответствующим вирусом, в стерильной воде (весовое соотношение 2:1).
Антивирусный эффект комплекса против вирусов ΥΒΚ и ХВК испытывали на растениях картофеля сорта Индиго, SBK - на растениях сорта Г265, МВК - на растениях сорта Прайм.
Пример 1.
Продемонстрировано действие следующих композиций: 1) водный раствор поли(А):поли(У) (30 мкг или 15 мкг в 100 мкг); 2) - наночастицы хитозана, функционализированные поли(А):поли(У) - 15 мкг по хитозану и 30 мкг поли(А):поли(У) в 100 мкл или 7,5 мкг по хитозану и 15 мкг поли(А):поли(У) в 100 мкл. Соотношение НЧХ: поли(А):поли(У) подбирали предварительно на основании данных по связыванию препарата с НЧХ, тестируемому электрофорезом в неденатурирующем геле агарозы (Фиг. 3). Перед использованием высокомолекулярный препарат поли(А):поли(У) «озвучивали» для получения фрагментов с требуемой полимерностью. Оценка антивирусной активности и эффекта полимерности поли(А):поли(У) на антивирусную активность препарат против YBK показала, что до 14 дли все использованные варианты (с полимерностью поли(А):поли(У) более 1500 пн, более 1000 пн и более 500 пн) при содержании поли(А):поли(У) 30 мкг в 100 мкг раствора эффективно ингибировали размножение вируса (от 5 до 25% от контроля). На 21 дпи наиболее эффективным оказался комплекс, включающий поли(А):поли(У) с полимерностью более 1000 пн и количеством 30 мкг поли(А):поли(У) на 15 мкг НЧХ (в расчете на хитозан) в 100 мкл раствора (Фиг. 5).
Пример 2. Угнетение репродукции вирусов ХВК, SBK и МВК в растениях картофеля сортов, чувствительных к данным вирусам.
Композиция и условия эксперимента использовали те же, что и в примере 1. Очевидное угнетение было продемонстрировано как при анализе активности препарата поли(А):поли(У) (полимерность более 1000 пн), так и комплекса поли(А):поли(У):НЧХ против X вируса картофеля (Фиг. 6), S вируса картофеля (Фиг. 7) и Μ вируса картофеля (Фиг. 8).
Таким образом, показано, что однократное опрыскивание листьев растений картофеля, восприимчивых к вирусам сортов, композицией, содержащей поли(А):поли(У) или поли(А):поли(У):НЧХ, ингибирует размножение 4-х экономически значимых вирусов картофеля.