Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги
PSEUDOMONAS YAMANORUM VKM B-3033D BACTERIA STRAIN FOR ACTIVATION OF OIL AND OIL PRODUCTS BIODESTRUCTION IN WATER AND OIL SOILS AT RAILWAY SECTIONS

Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D для активизации биодеструкции нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, предназначенного для активизации биодеструкции нефти и  нефтепродуктов  воде, в дерново-подзолистой почве, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.
Известен штамм бактерий Exiguobacterium sp. ELA-6, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C [Патент RU 2564105 C1, 27.09.2015, Бюл. № 27].
Известен штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C [Патент RU 2560272 C1, 20.08.2015, Бюл. № 23].
Известен биопрепарат, содержащий нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis. [SU № 1805097 A1, C02F 3/34, E02B 15/04, 1993.03.30].
Известны штаммы бактерий, используемые для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, Bacillus sp., см. патенты РФ [RU № 2083667 С1, C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, 1997.07.10;  RU № 2115629 С1, C12F 3/34, В09С 1/10, 1998.07.20; RU № 2182529 С1, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, 2002.05.20; RU № 2204597 C2, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, 2003.05.20].
Известные штаммы и биопрепараты направлены на очистку от нефти и нефтепродуктов в водных средах и почвах, но нет описания их работы на конкретных почвах и грунтах.
Задача изобретения – получение штамма бактерий, обеспечивающего активизацию биодеструкции нефти и  нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги.
В этом состоит технический результат.
Для достижения технического результата из загрязненного грунта, отобранного с участка железнодорожного полотна в г. Сыктывкар Республики Коми, выделен штамм бактерий Pseudomonas yamanorum, способный активизировать биодеструкцию нефти и нефтепродуктов в воде, а также в масляных грунтах на участках железной дороги. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM В-3033D.
4
2
Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды – Пептон –  20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSOх7HO –  0,5 г;  температура – 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.
Штамм характеризуется следующими признаками:
I. Культурально-морфологические:
На среде МПА колонии точечные Ø < 1 мм, со слизистым чехлом (до 5 мм), палево-желтые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. В среду диффундирует неоново-желтый пигмент. На средах Чапека-Докса, Виноградского и КАА окраска колоний палевая, на средах Виноградского и КАА не образует слизи. На средах Эндо и Гисса с глюкозой отмечено обильное образование слизи.
II. Физиолого-биохимические:
Аэроб с окислительным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Каталазаположительный. Способен к нитрификации. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит.
III. Данные молекулярно генетического анализа:
> S1-09.15 6SrRNA ,
AGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAATTAATACTTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAaACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTwATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTtGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG-AGTGGGTTGCACCAGAAGTAGcTAG
> S1-09.15 gyrase_subunit_B ,
aACTCCTATAAaGTATCCGGCGGTTTGCACGGTGTAGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTTTCTGAAGAGCTGATCCTGACTGTACGTCGTAGCGGCAAGATCTGGGAACAGACTTACGTTCATGGTGTTCCACAGGAACCGATGAAAATCGTCGGTGACAGCGAAAGCACTGGTACGCAGATTCACTTCAAGCCTTCGGCTGAAACCTTCAAGAACATCCACTTCAGCTGGGACATTCTGGCCAAGCGGATTCGTGAACTGTCTTTCCTGAACTCCGGTGTGGGTATCGTCCTCAAGGACGAACGCAGCGGCAAGGAAGAGCTGTTCAAGTACGAAGGCGGCCTGCGTGCGTTCGTTGAATACCTGAACACCAACAAGACCGCGGTCAATCAGGTGTTCCACTTCAACATCCAGCGTGAAGACGGCATCGGCGTAGAAATCGCCCTGCAGTGGAACGACAGCTTCAACGAGAACCTGTTGTGCTTCACCAACAACATTCCTCAGCGCGATGGCGGTACTCACCTGGTGGGTTTCCGTTCTGCACTGACGCGTAACCTGAACACCTACATCGAAGCGGAAGGCCTGGCGAAGAAACACAAAGTCGCCACCACCGGTGACGATGCCCGCGAAGGCCTAACCGCCATTATCTCGGTCAAGGTTCCGGATCCGAAGTTCAGCTCCCAGACCAAAGACAAGCTGGTGTCCTCCGAAGTGAAGACAGCGGTCGAACAGGAAATGGGCAAGTACTTCTCCGACTTCCTGCTGGAAAACCCGAACGAAGCCAAGCTGGTTGTCGGCAAGATGATCGACGCAGCACGGGCTCGTGAAGCGGCGCGTAAAGCCCGTGAGATGACGCGTCGTAAAGGTGCGCTGGATATCGCCGGCCTGCCGGGCAAACTGGCTGACTGCCAGGAGAAAGACCCTGCCCTCTCCGAACTGTACCTGGTGGAAGGTGACTC
S1-09.15_gyrB (фрагмент белковой последовательности)
SYKVSGGLHGVGVSVVNALSEELILTVRRSGKIWEQTYVHGVPQEPMKIVGDSESTGTQIHFKPSAETFKNIHFSWDILAKRIRELSFLNSGVGIVLKDERSGKEELFKYEGGLRAFVEYLNTNKTAVNQVFHFNIQREDGIGVEIALQWNDSFNENLLCFTNNIPQRDGGTHLVGFRSALTRNLNTYIEAEGLAKKHKVATTGDDAREGLTAIISVKVPDPKFSSQTKDKLVSSEVKTAVEQEMGKYFSDFLLENPNEAKLVVGKMIDAARAREAARKAREMTRRKGALDIAGLPGKLADCQEKDPALSELYLVEGD
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
4
2
Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на на 1000 мл воды – Пептон –  20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSOх7HO –  0,5 г;  агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.
Способность штамма к биодеструкции нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах. Результаты приведены в примерах ниже.
Пример 1. Биодеструкция нефтепродуктов в присутствии штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D.
3
2
4
4
2
9
Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти и отработанного масла. На 1 л воды добавляли NaNO - 5,0 г; KНРО - 3,0 г; KCl -0,5 г; MgSOx5HO - 0,5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение 20 минут в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры. В колбы добавили (по схеме опыта) 0,1 г сырой нефти или отработанного масла и 0,5 мл наработанного штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D (титр клеток 10КОЕ). Контрольную колбу микроорганизмами не заражали.
Условия опыта: культивирование в течение 14 суток (220 об/мин) при комнатной температуре.
Спустя 1 и 14 суток в пробах проводили определение нефтепродуктов.
Содержание нефтепродуктов в почве анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат – 02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98.
Как видно из таблицы 1, содержание остаточных углеводородов уменьшилось за 14 суток на 36.8 – 96%.
Таблица 1
Изменение концентрации нефтепродуктов в водных пробах
Вариант опыта
Концентрация нефтепродуктов в пробах после экспозиции, мг
1 сутки
14 суток
Контроль (водная среда + отработанное масло)
58.9
68.8
Среда + 0.1 г отработанного масла + 0.5 мл штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D
55.4
37.2
Контроль (водная среда + нефть)
85.8
68.7
Среда + 0.1 г нефть + 0.5 мл штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D
45.2
26.9
9
4
2
Пример 2.В масляный грунт – 250 г, отобранный с участка железнодорожного полотна добавляли биомассу  штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D (титр клеток 10КОЕ) в количестве  25 мл и перемешивали. Биомассу штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D нарабатывали на среде следующего состава: на 1000 мл воды – Пептон –  20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSOх7HO –  0,5 г; при температуре – 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации. Контролем служил необработанный масляный грунт, отобранный с железнодорожного полотна. Масляный грунт представлял из себя  мелкую песчано-гравийную смесь, сильно загрязненную маслом.
Пробы анализировали на остаточное содержание нефтепродуктов  в начале эксперимента, спустя 30 и 90 суток.
В процессе очистки наблюдается динамика снижения остаточных нефтепродуктов в масляном грунте (табл. 2). Эффективность очистки составила 35 % за 90 суток.
Таблица 2
Изменение концентрации нефтепродуктов в пробах масляного грунта
Вариант опыта
Концентрация нефтепродуктов в пробах после экспозиции, мг/г
0 суток
30 суток
90 суток
Контроль  (масляный грунт)
20.0 ± 5.0
20.0 ± 5.0
20.0 ± 5.0
Масляный грунт + 5 мл штамма Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D
17.0 ± 5.0
16.0 ± 5.0
13.0  ± 4.0