Действие кофеина на эндоредупликацию у Drosophila melanogaster Meig

УДК 575.22: 547.857.4 О.В. Горенская

действие кофеина на эндоредупликацию у DROSOPHILA

MELANOGASTER MEIG

Харьковский национальный университет имени В.н. Каразина

Работа выполнена в рамках научной тематики отдела генетики НИИ биологии Харьковского национального университета имени В. Н. Каразина «Вивчити клітинні, генетичні механізми вікових змін і адаптивності» (номер госрегистрации 0103Ш04274).

Вступление. Оценка биологической эффективности хронического действия различного рода биологически активных веществ на генетический аппарат является чрезвычайно актуальной в современных условиях. Существенную часть чужеродных соединений, регулярно попадающих в организм человека, составляют лекарственные препараты. Наиболее часто используемым веществом умеренно токсического действия является кофеин (1,3,7,-триметилксантин). Известно, что высокие концентрации этого вещества оказывают мутагенный эффект, нарушая репарационные процессы [20]; малые дозы влияют на адаптивно важные признаки, в частности, снижают плодовитость и жизнеспособность у дрозофилы [3, 5]. Однако малочисленны и неполны данные об изменениях на уровне генома при хроническом действии малых концентраций кофеина.

Дрозофила, как классический генетический объект, является уникальной моделью для изучения различных явлений на генетическом уровне. Уникальность этого объекта связана во-первых, с полностью секвениро-ванным геном, во-вторых, с тем фактом, что 39% ее генов гомологичны генам человека [30]. Кроме того, стресс-реакция, которая развивается у насекомых в ответ на действие неблагоприятных факторов внешней среды, обладает высокой степенью эволюционного консерватизма и аналогична стресс-реакции млекопитающих [15]. Все это делает дрозофилу уникальной моделью для изучения хронического действия различных биологически активных веществ.

Развитие дрозофилы, как и большинства двукрылых насекомых, характеризуется формированием в клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов и некоторых других органах политенных хромосом. Особенности функционирования и строения политенных ядер реализуются в итоге в более высокий функциональный уровень органа и приспособленность организма в целом [2, 9]. Регуляция процесса эндоредупликциии осущест-

вляется циклинами и циклин-зависимыми киназами, контролирующими фазы клеточного цикла [24, 27, 22], кроме того, предполагается участие в этом процессе эндокринной системы, а именно экдизона и ювенильного гормона [1, 11]. Изменения в степени полите-низации представляют один из генетических механизмов адаптации организмов к изменяющимся условиям среды. Ранее нами показано угнетение функции эндоредупликации в слюнных железах дрозофилы после двух поколений воздействия кофеина в концентрации 1 мг/мл [4]. Однако не изученным остается длительное хроническое воздействие данного биологически активного вещества, особый интерес представляют изменения на уровне генома при действии малых доз кофеина.

Целью работы было исследовать влияние различных концентраций кофеина на эндоредупликацию у дрозофилы на протяжении семи поколений воздействия.

Объект и методы исследования. В работе использовалась неселектированная линия дикого типа Canton-S (C-S) Drosophila me-lanogaster. Мухи развивались при температуре 24,0 ± 0,5 0С на стандартной сахарнодрожжевой среде с добавление кофеина в концентрациях 1 мг/мл (опыт 1), 0,5 мг/мл (опыт 2) и 0,25 мг/мл (опыт 3) на протяжении семи поколений.

Степень политении хромосом (СПХ) исследовали у самок личинок в конце 3-го возраста. На данном этапе развития инициации новых циклов эндоредупликации не происходит и в слюнных железах дрозофилы можно наблюдать четыре класса ядер с уровнем политении 256С, 512С, 1024С и 2048С [26]. Препараты готовили по методике давленных ацетоорсеиновых препаратов слюнных желез дрозофилы [12]. Различия по СПХ оценивали цитоморфометрическим методом: хромосомы с разной степенью политении различаются по ширине хромосом и интенсивности их окрашивания ацетоорсеином [16, 18]. Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики [10].

Результаты исследований и их обсуждение. В таблице представлены данные о влиянии различных концентраций кофеина на протяжении семи поколений на распределение в слюнных железах дрозофилы классов ядер с разным уровнем политенизаци.

Таблица

Влияние кофеина на распределение классов ядер с разным уровнем политенизаци в слюнных железах дрозофилы

Вариант опыта Длительность воздействия Доля ядер с разной СПХ, %

256C 5^ 1024C 2048C

Контроль 4,67 ± 1,6 14,02 ± 2,1 81,03 ± 3,1 0,86 ± 0,29

Опыт 1 F, 3,76 ± 0,6 26,8 ± 2,0** 69,3 ± 2,1** 0,21 ± 0,08*

2,4 ± 0,4 19,6 ± 1,9 77,2 ± 2,1 0,22 ± 0,1*

3,18 ± 1,8 14,7 ± 1,7 82,03 ± 1,7 0,23 ± 0,16

^7 11,08 ± 1,68** 17,23 ± 1,24 71,52 ± 2,3* 0,26 ± 0,07

Опыт 2 3,0 ± 0,4 22,4 ± 1,8** 73,9 ± 1,9 0,44 ± 0,2

F2 2,15 ± 0,5 18,5 ± 1,1 78,9 ± 1,4 0,38 ± 0,15

^3 2,6 ± 1,4 22,5 ± 6,8 74,7 ± 7,3 0,1 ± 0,08*

F7 10,41 ± 0,5** 29,34 ± 0,4*** 59,9 ± 0,5*** 0,32 ± 0,06

Опыт 3 ^1 2,4 ± 0,6 18,4 ± 1,6 78,8 ± 2,1 0,31 ± 0,1

F2 2,4 ± 0,4 19,6 ± 1,8 77,9 ± 1,8 0,26 ± 0,08

^3 6,7 ± 2 22,4 ± 2,3* 70,3 ± 3,7* 0,48 ± 0,1

F7 7,34 ± 0,37 18,11 ± 1,12 74,53 ± 1,34 0,08 ± 0,05*

Примечание: * Достоверность отличий от контроля р<0,001.

** Достоверность отличий от контроля р<0,01. *** Достоверность отличий от контроля р<0,05.

В контроле в слюнных железах линии дикого типа С^ преобладают ядра со степенью политении 1024С, что согласуется с данными Родмана [26].

Действие кофеина привело к достоверному перераспределению классов ядер после одного поколения развития мух в среде, содержащей биологически активное вещество, в опытах 1 и 2. В F1 показано увеличение (р<0,01) количества ядер со степенью политении 512С на 91,2% и 59,8% в опытах 1 и 2 соответственно и снижение количества ядер 1024С и 2048С на 14,5% (р<0,01) и 75,6% (р<0,001) в опыте 1. Начиная со второго поколения в опытах 1 и 2 распределение ядер с разным уровнем политенизации практически не отличается от уровня контроля. Изменение изучаемого показателя наблюдается уже после семи поколений воздействия, при этом отмечается увеличение количества ядер с уровнем политении 256С в 2,4 раза (р<0,01) (опыт 1) и в 2,2 раз (р<0,01) (опыт 2). Количество ядер с уровнем политении 1024С снижется после семи поколений воздействия на 11,7% (р<0,001) и на 26,1% (р<0,05) в опытах 1 и 2 соответственно.

Действие минимальной концентрации кофеина (опыт 3) вызывает перераспределение ядер с разным уровнем политении по сравнению с контролем после трех поколений воздействия, при этом отмечена такая же тенденция, как и в предыдущих вариантах эксперимента - снижение количества ядер с уровнем политенизации 1024С на 13,2% (р<0,001) и увеличение количе-

ства ядер с уровнем политенизации 512С на 59,8% (р<0,001).

Средние значения СПХ под влиянием кофеина (рис.) снижаются на 6,7% и на 3,7% (соответственно опыт 1 и опыт 2) после одного поколения воздействия, затем, к F , достигают уровня контроля и к седьмому поколению снижение показателя средней СПХ составляет 7,4%, 13,6% и 5,1% соответственно опыт 1, опыт 2 и опыт 3.

Рис. Изменение средних значений СПХ под влиянием разных концентраций кофеина на протяжении семи поколений воздействия.

Примечание: * Достоверность отличий от контроля р<0,001.

** Достоверность отличий от контроля р<0,01.

*** Достоверность отличий от контроля р<0,05.

Результат двухфакторного дисперсионного анализа показал наличие зависимости

показателя средней степени политенизации гигантских хромосом от концентрации биологически активного вещества F=15,17 и комбинации этого фактора с длительностью воздействия кофеина F = 6,19. Сила влияния составила соответственно 23,2 % (p<0,001) и 26,2% (p<0,001).

Анализируя полученные результаты, можно констатировать, что снижение показателя средней СПХ, наблюдаемое во всех вариантах опыта, происходит за счет уменьшения количества ядер с уровнем политенизации 1024С и 2048С и увеличения доли ядер 256С и 512С.

Интересно отметить, что низкими значениями СПХ характеризуются линии с низкой приспособленностью. Например, наименьшие значения этого показателя выявлены в высокоинбредных линиях НА (низкоактивная) и ВА (высокоактивная) и в мутантной линии vestigial. При этом в клетках слюнных желез у данных линий отсутствуют ядра с уровнем политении 2048С и снижена доля ядер 1024С по сравнению с линиями дикого типа [18]. Степень умножения генома в клеточном ядре положительно коррелирует со стрессоустойчивостью, плодовитостью и другими компонентами приспособленности организма [16, 18]. Ранее нами показано, что к пятому поколению хронического действия кофеина в концентрации 0,25 мг/мл развивается устойчивость к изучаемому воздействию у мух дикого типа, и показатели жизнеспособности и реальной плодовитости практически достигают уровня контроля [5, 6]. В настоящем эксперименте значение средней СПХ достигает уровня контроля после двух поколений воздействия, что, возможно, связано с особенностями генетических механизмов адаптации к изменяющимся условиям существования.

Следует также отметить, что степень поли-тении хромосом подвержена значительным модификационным изменениям, например, влияние температурных условий развития мух или плотности популяции [16, 13].

Хотя механизм, запускающий дифферен-цировку клеток по типу политении, до сих пор остается неизученным, можно предположить несколько возможных объяснений полученных в работе результатов.

Известно, что механизм действия кофеина связан с его способностью конкурентно связываться с некоторыми подтипами аде-нозиновых рецепторов, регулируя, таким образом, уровень цАМФ в клетках [28]. Кроме того, показано, что кофеин может блокировать клеточный цикл культуры клеток человека на стадии G2 и снижать митотический индекс у личинок третьего возраста Drosophi-

1аprosaltans [23]. В то же время известно, что переход от митотического цикла к циклам эндоредупликации связан с ингибированием М-фазной циклинзависимой киназы и активацией S-фазных киназ [27]. Установлена экспрессия циклина Е, активирующего S-фазу клеточного цикла [24]. Анализируя полученные в работе результаты, можно предположить, что кофеин участвует в регуляции перехода от митотических циклов к циклам эндоредупликции, контролируя уровень ци-клинов и циклинзависимых киназ.

В то же время установлено, что процессы эндоредупликации находятся под гормональным контролем, а именно экдизон и ювенильный гормон, действуя как неполные антагонисты, детерминируют процессы, которые ведут к нарушению нормального хода митоза и дифференцировке политенных клеток. Показано, что добавление аналога экдизона в питательную среду приводит к снижению эндорепликативной активности политенных хромосом дрозофилы [17]. После инкубации слюнных желез D. nasuta в растворе аналога ЮГ индекс мечения ядер повышался [29]. Аналогично, в работе [1] показано увеличение показателя степени политении хромосом в ядрах клеток слюнных желез при выращивании дрозофилы на среде с добавлением ме-топрена (аналог ювенильного гормона).

Известно также, что действие различных стрессовых факторов вызывают формирование неспецифической адаптивной гормональной реакции насекомых, суть которой заключается в резком возрастании уровня биогенных аминов (дофамин, октопамин), ювенильного гормона и экдистероидов, обеспечивая повышение энергетического метаболизма. Это приводит к задержке метаморфоза [15]. Стрессовое воздействие существенно выше порогового, может вызывать обратную реакцию - ускорение метаморфоза [14]. Можно предположить, что в ответ на действие стрессового фактора - кофеина, в гемолимфе личинок после одного поколения воздействия нарушается баланс основных гормонов развития - экдистерона и ювенильного гормона, вызывая угнетение функции эндоредупликации. Затем, в ¥2, среднее значение СПХ достигает уровня контроля, что, как уже говорилось, может быть связано с развитием адаптации к неблагоприятным внешним воздействиям. Этот вывод подтверждают и ранее полученные данные - хроническое воздействие кофеина приводит к снижению плодовитости у мух [3], что вызвано изменением уровня экдстерона и ювенильного гормона в гемолимфе личинок [8].

Следует так же отметить, что основным механизмом регуляции процесса эндореду-

пликации является дифференциальная активность генов гормонами развития, которые активируют в онтогенезе одни локусы и репрессируют другие [19, 7]. В то же время кофеин способен напрямую связываться с биополимерами, такими, как нуклеиновые кислоты и ферменты [21, 25]. Связывание с двуспиральной ДНК может привести, в свою очередь, к изменению конформации молекулы, а это один из уровней регуляции генной активности, а так же быть причиной подавления активности ферментов, участвующих в репарации. Можно предположить, что изменение показателя степени политенизации хромосом, показанное в данном исследовании, может быть в какой-то мере обусловлено особенностями связывания кофеина с молекулой ДНК.

Выводы. Таким образом показано, что хроническое действие кофеина оказывает значительное влияние на эндоредупликацию в клетках слюнных желез дрозофилы линии дикого типа Canton-S. Угнетение функции эндоредупликации, наблюдаемое после семи поколений воздействия кофеина в концентрациях 1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл, происходит за счет уменьшения количества ядер с уровнем политенизации 1024С и 2048С и увеличения доли ядер 256С и 512С. Адаптация к внешнему воздействию, при котором средняя СПХ достигает уровня контроля, наблюдается в F3 и в F2, соответственно при действии концентраций 1 мг/мл и 0,5 мг/мл. Хроническое действие минимальной концентрации кофеина (0,25 мг/мл) угнетает СПХ к F3. Показано, что изменение показателя средней СПХ зависит от концентрации кофеина (F=15,17), при этом сила влияния составила 23,2 % (p<0,001); от комплекса факторов концентрации и длительности воздействия кофеина F = 6,19 (сила влияния 26,2% (p<0,001)).

Перспективы дальнейших исследований. Результаты исследований показали, что хроническое действие минимальных концентраций кофеина сопровождаются изменениями на уровне генома. На следующем этапе экспериментальной работы планируется оценить изменения в транскрипционной активности генов, используя в качестве объекта политен-ные хромосомы слюнных желез дрозофилы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бєлоусова І. Б. Вплив метопрену на ступінь політенії гігантських хромосом і прояви кількісних ознак у Drosophila melanogaster Meig. / І. Б. Бєлоусова, В. Ю. Страшнюк, В. Г. Шахбазов // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип.37. - С. 125-130.

2. Бродский В. Я. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка / В. Я. Бродский, И. В. Урываева. -М. Наука, 1981. - 260с.

3. Влияние плотности культуры на экспрессивность признака eyeless и степень политении гигантских хромосом у Drosophila melanogaster / М. А. Рарог, В. Ю. Страшнюк, А. О. Кондратьева [и др.] // Генетика. - 1999. - Т.35, №7.

- С. 898-902.

4. Вплив віку та аналога екдизону на ендоредуплікацію політенних хромосом і швидкість розвитку Drosophila melanogaster Meig. / В. Страшнюк, О. Горенська, С. Не-пейвода [и др.] // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. -2004. - Вип.38. - С. 99-106.

5. Горенская О. В. Анализ плодовитости Drosophila melanogaster при хроническом действии кофеина в малых дозах / Горенская О. В.// Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: III междунар. конф., 1-4 окт. 2009 г.: сборник научных трудов. - Ростов-на-Дону, 2009. - С.82-83.

6. Горенская О. В. Влияние кофеина на степень политении гигантских хромосом Drosophila melanogaster Mg. / О. В. Горенская // Дрозофіла в експериментальній генетиці та біології: I міжнар. конф., 15-20 вер. 2008 р.: збірник наукових праць. - Харків, 2008. - С. 10-12.

7. Горенская О.В. Влияние кофеина на некоторые адаптивно важные признаки у Drosophila melanogaster Meig. / О. В. Горенская, Н. В. Бугорская // Вісник Харківського національного університету. - Сер. біологія. - 2008. -Вип. 8 (828 ), С. 30-34.

8. Горенская О.В. Изменения приспособленности Drosophila melanogaster при хроническом действии биологически активных веществ / О. В. Горенская, Н. В. Бу-горская // Биологическое разнообразие и устойчивое развитие природы и общества: междунар. науч.-практ. конф., 12-13 мая 2009 г.: тезисы докл. - Казахстан, 2009.

- С. 226-228.

9. Горенская О. В. Влияние разных концентраций экдизона на пуфовую активность политенных хромосом слюнных желез Drosophila melanogaster в условиях in vitro / О. В. Горенская, В. Ю. Страшнюк // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: міжнар. конф., 24-28 вер. 2007 р.: збірник наукових праць. - Київ, 2007. - Т. 2.

- С. 470-474.

10. Грунтенко Н. Е. Экспериментальное снижение уровня дофамина драматически снижает приспособленность Drosophila virilis / Н. Е. Грунтенко, Е. К. Карпова, А. А. Алексеев // Доклады Академии Наук. - 2005. - Т.401. -С.424-426.

11. Жимулев И. Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура / Жимулев И. Ф. - Новосибирск: Наука, 1992.

- 480с.

12. Изменение структуры и функции политенных хромосом как механизм температурной адаптации и эффекта гетерозиса у дрозофилы / В. Ю. Страшнюк, С. Аль-Хамед, Ю. А. Шаламов [и др.] // Доп. НАН України. - 1995. - №5.

- С. 139-142.

13. Лакин Г. Ф. Биометрия. / Лакин Г. Ф. - М.: Высшая школа, 1990. - 352с.

14. Марченко А. Ю. Генетическая вариабельность степени политении гигантских хромосом и действие 20ОН-экдистерона на эндоредупликацию у Drosophila melanogaster Meig. / А. Ю. Марченко, В. Ю. Страшнюк // Вісник Харківського національного університету. - Сер. біологія. - 2006. - Вип. 3 (729), С. 93-99.

15. Полуэктова Е.В. Техника изготовления препаратов политенных хромосом / Е. В. Полуэктова, М. Б. Евгеньев // Методы биологии развития. М.: Наука, 1974. - С. 517-519.

16. Раушенбах И. Ю. Нейрэндокринная регуляция развития насекомых в условиях стресса / Раушенбах И. Ю. - Новосибирск: Наука, 1990. - 160 с.

17. Раушенбах И.Ю. Стресс-реакция насекомых: механизм, гормональный контроль, роль в адаптации / И. Ю. Раушенбах // Генетика. - 1997. - Т.33, №8. - С.1110-1118.

18. Страшнюк В.Ю. Цитоморфометрическое исследование политенных хромосом Drosophila melanogaster Meig. в связи с эффектом гетерозиса, отбором по адаптивно важным признакам и полом / В. Ю. Страшнюк, С. Н. Не-пейвода, В. Г. Шахбазов // Генетика. - 1995. - Т.31, №1.

- С. 24-29.

19. Эшбернер М. Генетический и гормональный контроль пуфинга политенных хромосом Drosophila melanogaster / М. Эшбернер // Онтогенез. - 1974. - Т. 5, № 2. - С. 107121.

20. Caffeine interaction with nucleic acids. Molecular mechanics calculations of model systems for explanation of mechanisms of biological actions V. I. Poltev, T. I. Grokhlina, A. S. Deriabina [et al.] // Theor. Chem. Acc. - 2003. - V.110, №6. - Р. - 466-472.

21. Clark A.M. The genetic effects of caffeine in Drosophila melanogaster / A. M. Clark, E. G. Clark // Mutation Research.

- 1968. - №6. - Р. 227-234.

22. Hua X.H. A role for cdk2 kinase in negatively regulating DNA replication during S phase of the cell cycle / X. H. Hua, H. Yan, J. Newport // Cell Biol. - 1997. - Vol.137. - P. 183-192.

23. Itoyama M. M. Effects of caffeine on mitotic index in Drosophila prosaltans (Diptera) / M. M. Itoyama, H. E. Bicudo, J. A. Cordeiro // Rev. Bras. Genet. - 1997. - № 20.

- Р. 655-658.

24. Larkins B. A. Investigating hows and why of DNA endoreduplication / B. A. Larkins, B. P. Dilkes, R. A. Dante // J. Exp. Bot. - 2001. - Vol.52, №355. - P. 183-194.

25. Rodman T.C. DNA replication in salivary gland nuclei of Drosophila melanogaster at successive larval and prepupal

stages / T. C. Rodman // Genetics. - 1967. - Vol.55. - P. 375-386.

26. Sauer K. Distinct modes of cycling E/cdc2c kinase regulation and S-phase control in mitotic and endoreduplication cycles of Drosophila embryogenesis / K. Sauer, J. A. Knoblich, H. Richardson // Genet. Dev. - 1995. - V.9. - P. 1327-1339.

27. Sawin E. R. C. elegans locomotor rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway / E. R. Sawin, R. Ranganathan, H. R. Horvitz // Neuron.-2000.-№ 26-P. 619-31.

28. Sinha P. Replication in Drosophila chromosomes XI. Stimulation of initiation of polytene replication cycles in vitro by juvenile hormone / P. Sinha, S. C. Lakhotia // Cell Different. - 1983. - Vol.12. - P. 11-17.

29. Study of Mechanisms of Some Caffeine Biological Effects via Computer. Simulation of Its Interactions with DNA Fragments / A. S. Deriabina, T. I. Grokhlina, N. A. Polteva [et al.] // J.Mol.Struct. (Theochem). - 2006. - V.769, №1-3. -P.97-101.

30. Vijg J. Aging of the genome. The dual role of DNA in life and death / Vijg J. - Oxford: Oxford Univ. Press, 2007. - 384 p.

УДК 575.22: 547.857.4

вплив кофеїну на ЕндорЕдуплЖАціЮ у DROSOPHILA MELANOGASTER MEIG Горенська О.В.

Резюме. У роботі вивчався вплив різних концентрацій кофеїну на ендоредуплікацію гігантських хромосом у лінії Canton-S Drosophila melanogaster впродовж семи поколінь. Показано, що пригничення функції ендоредуплікації, яке спостерігається після семи поколінь дії кофеїну в концентраціях 1 мг/мл, 0,5 мг/мл і 0,25 мг/мл відбувається за рахунок зменшення кількості ядер з рівнем політенізації 1024С і 2048С і збільшення частки ядер 256С і 512С. Адаптація до зовнішньої дії, при якій середня СПХ (ступінь політенії хромосом) досягає рівня контролю, спостерігається в F3 і в F2, відповідно при дії кофеїну у концентрації 1 мг/ мл і 0,5 мг/мл. Хронічна дія мінімальної концентрації кофеїну пригнічує СПХ починаючи з F3.

Ключові слова: ендоредуплікація, ступінь політенії, дрозофіла, кофеїн.

UDC 575.22: 547.8574

the effects of caffeine on endoreduplication in drosophila melanogaster mg

Gorenskaya O.V.

Summary. The effects of different concentrations of caffeine on a giant chromosomes reduplication process at the during seven generations of influence was studied in stock Canton-S Drosophila melanogaster. The depressive action on reduplication process after seven generations development of flies in the environment containing caffeine in the concentrations of a 1 mg/ml, 0,5 mg/ml and 0,25 mg/ml takes place for an account to diminishing nucleus with the chromosomes polytheny level (LPC) 1024С and 2048С and increase nucleus with the LPC of 256С and 512С was shown. Adaptation to external influence at which middle LPC achieves a control level is observed in F3 and in F2, accordingly at the action of concentrations a 1 mg/ml and 0,5 mg/ml. The depressive action on reduplication process after three generations of caffeine influence in concentration 0,25 mg/ml was observed.

Key words: endoreduplication, level of polytheny, drosophila, caffeine.

Стаття надійшла 15.11.2009 р.