Способ повышения эффективности культивирования in vitro Березы повислой, Лимонника китайского, Рододендрона и Сирени
METHOD FOR INCREASING IN VITRO CULTIVATION EFFICIENCY FOR BIRCH, CHINESE MAGNOLIA, RHODODENDRON AND LILAC

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для повышения эффективности культивирования различных древесных культур на таких стадиях культивирования, как мультипликация, укоренение и адаптация в условиях ex vitro.
Современные достижения в области биотехнологии растений активно применяются для получения оздоровленного, физиологически выровненного посадочного материала.
Древесные культуры, в отличие от травянистых видов, труднее размножаются в условиях in vitro. Для большинства древесных видов характерны более низкие коэффициенты размножения, укоренения и адаптации. Период от получения асептической культуры до активного размножения в случае древесных видов может составлять от нескольких месяцев до года. Помимо всего вышеперечисленного древесные виды более склонны к уходу в состояние покоя в условиях in vitro. Повышение частоты мультипликации и укоренения часто достигается за счет увеличения концентрации регуляторов роста в питательной среде. Однако данный прием применим не ко всем древесным видам. Повышение содержания цитокининов в среде для размножения может спровоцировать витрификацию, а повышение содержания ауксинов в среде для укоренения приводит к избыточному росту каллуса, что может негативно сказаться на частоте как укоренения, так и последующей адаптации микрорастений.
Целью предлагаемого изобретения является повышение частоты мультипликации, частоты укоренения в условиях in vitro и ex vitro, а также повышение эффективности последующей адаптации микроразмноженных древесных растений на примере березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени.
Поставленная цель достигается за счет того, что продолжительность этапа мультипликации, составляющая 6 недель для рододендрона и березы и 5 недель для лимонника и сирени, сокращается до 3 недель.
Суть изобретения состоит в том, что растения, выращиваемые на стандартных питательных средах для мультипликации, а именно: лимонник китайский - на питательной среде QL (Quorin М. & Lepoivre Р. Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. 1977. V. 78. P. 437-442) с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-бензиламинопурина (6-БАП) 0,5 мг/л; рододендрон - на половинной по минеральным солям питательной среде WPM (Lloyd, G. and В.Н. McCown. 1980. // Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Int. Plant Prop. Soc., Comb. Proc., 30: 421-427) с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, N6-(2-Изопентил)аденина (2-iP) 2,0 мг/л и индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,5 мг/л; сирень - на питательной среде MS (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 1,0 мг/л; береза - на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,2 мг/л, переносятся на свежую питательную среду через 3 недели, допуская наличие на одном экспланте не более двух почек. При переносе растений на свежую питательную среду предпочтение отдается побегам, развившимся из пазушных почек, поскольку они характеризуются большей степенью ювенильности, чем побеги, полученные за счет апикального роста.
Анализ известных способов клонального микроразмножения растений, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна».
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, инозитола, объем доводится дистиллированной водой, рН 5,6-5,8 (в среде  WPM для культивирования рододендронов рН составляет 4,2-4,5). В колбы добавляются навески агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм (=1 изб. атм) в течение 20 минут. В остывшую до 55°С среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в контейнерах составляет 15-25 штук.
2. Через 3 недели производится срезка побегов для последующего укоренения, а оставшиеся нижние части растений пересаживаются на свежую питательную среду, при этом их черенкуют таким образом, чтобы на одном экспланте было по две пазушные почки.
В таблицах 1-3 представлены результаты исследований по продолжительности этапа мультипликации на эффективность, мультипликации, укоренения и адаптации в условиях ex vitro.
Продолжительность этапа мультипликации определяется периодом, за который растения в контейнере поглощают большую часть питательных веществ (органических и минеральных), а также регуляторов роста, некоторые из которых склоны к распаду под воздействием физических факторов внешней среды. Сокращения количества доступных питательных веществ, одновременно с накоплением в питательной среде продуктов жизнедеятельности растений, приводят к замедлению роста, а в случае большинства древесных культур это может инициировать состояние покоя, сопровождающееся изменениями на биохимическом и физиологическом уровнях. После переноса таких растений на свежую питательную среду им требуется определенное время, чтобы выйти из состояния покоя, что приводит к замедлению процесса размножения. Сокращение продолжительности этапа мультипликации не дает возможности растениям переходить в состояние покоя, а в сочетании с черенкованием микропобегов, включающих две пазушные почки, обеспечивает повышение степени ювенильности, что, в свою очередь, обеспечивает повышение частоты мультипликации, частоты укоренения в условиях in vitro и ex vitro и эффективности адаптации (частота приживаемости микрорастений и скорость начального роста).
Ювенильность - качественная характеристика, определяющая степень омоложения микрорастений. С увеличением степени ювенильности происходит истончение побегов, утрата антоциановой окраски побегов (необязательно), уменьшение размера и изменение формы листовой пластинки. Недопущение перехода растений в состояние покоя отражается и на скорости пробуждения пазушных почек микрорастений. При предлагаемом способе культивирования пробуждение пазушных почек наблюдалось через 2-4 дня после срезки апикальной почки, тогда как при классическом способе культивирования период пробуждения пазушных почек может достигать 10-14 дней. Вследствие этого при более частом пассировании наблюдается повышение частоты мультипликации (таблица 1). Различия между классическим и предлагаемым нами способами наиболее существенны в отношении рододендронов, которые среди анализируемых культур наиболее слоны к переходу в состояние покоя.
Механизм укоренения микрорастений основан на дедифференциации части клеток в месте среза побега и последующей их дифференциации в корневую меристему. Установлено, что чем клетка моложе, тем легче ей осуществить переход в дедифференцированное состояние (Grafi G. How cells dedifferentiate: a lesson from plants. 2004, 268(1): 1-6). Следовательно, повышая степень ювенильности растений мы обеспечиваем более частое укоренение растений, что подтверждается данными, представленными в таблице 2.
Как и в случае мультипликации, эффект укороченных пассажей наиболее выражен у рододендронов, более склонных к переходу в состояние покоя.
Эффект укороченных пассажей также оказывает влияние и на эффективность последующей адаптации микрорастений рододендрона и сирени к условиям окружающей среды, в особенности на время начала активного роста (таблица 3). При этом отсутствие влияния на лимонник китайский связано, скорее, с тем, что эффективность его адаптации в контроле была и так слишком высокой, но в случае других генотипов различия могут быть более выраженными.