СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЗАХВАТА БОТУЛИНОВЫХ НЕЙРОТОКСИНОВ КЛЕТКАМИ

1. Способ повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, включающий:
+
инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере два из следующих этапов: (i) K-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, что приводит к повышению специфического захвата нейротоксического полипептида указанными клетками.
2. Способ по п. 1 с последующим определением биологической активности нейротоксического полипептида в клетках.
3. Способ прямого определения биологической активности нейротоксического полипептида в клетках, включающий:
+
a) инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере два из следующих этапов: (i) K-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида;
b) фиксацию клеток и необязательно увеличение проницаемости мембраны клеток детергентом;
c) контактирование клеток по меньшей мере с первым захватывающим антителом, специфически связывающимся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым захватывающим антителом, специфически связывающимся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, в условиях, которые делают возможным связывание указанных захватывающих антител с указанными субстратами;
d) контактирование клеток по меньшей мере с первым детекторным антителом, специфически связывающимся с первым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного первого детекторного антитела с указанным первым захватывающим антителом, с образованием первых детекторных комплексов, и по меньшей мере со вторым детекторным антителом, специфически связывающимся со вторым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного второго детекторного антитела с указанным вторым захватывающим антителом, с образованием вторых детекторных комплексов;
e) определение количества первых и вторых детекторных комплексов этапа d); и
f) расчет количества субстрата, расщепленного указанным нейротоксическим полипептидом в указанных клетках, с использованием вторых детекторных комплексов для определения биологической активности указанного нейротоксического полипептида в указанных клетках.
+
+
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором K-опосредованную деполяризацию клеток выполняют при дополнительной концентрации K от около 20 мМ до около 55 мМ в течение по меньшей мере 2 часов.
+
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором K-опосредованную деполяризацию клеток и/или воздействие нейротоксическим полипептидом выполняют в присутствии GT1b.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором GT1b используют в концентрации от 15 до 50 мкМ, предпочтительно 20 мкМ.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида представляет собой воздействие на клетки нейротоксическим полипептидом в течение по меньшей мере 24 часов и менее 96 часов, предпочтительно в течение по меньшей мере 48 часов и максимум 72 часов.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида выполняют с помощью магнитной мешалки, вращающихся роторных колб или встряхивания клеток шейкером, предпочтительно со средней скоростью потока среды от около 25 см/мин до около 300 см/мин.
+
+
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором K-опосредованную деполяризацию клеток выполняют при дополнительной концентрации K по меньшей мере от около 20 мМ до около 55 мМ в течение по меньшей мере 2 часов в присутствии 20 мкМ GT1b и нейротоксического полипептида с последующим воздействием нейротоксическим полипептидом в течение еще 70 часов при встряхивании.
10. Способ по любому из пп. 1-8, в котором перед воздействием нейротоксического полипептида инкубацию некоторое время выполняют без нейротоксического полипептида.
11. Способ по п. 10, в котором время инкубации без нейротоксического полипептида составляет от 16 до 48 часов.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором метод представляет собой метод флуоресценции.
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором нейротоксический полипептид представляет собой BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H, TeNT или их подтипы.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором субстрат представляет собой VAMP/синаптобревин, SNAP-25 или синтаксин.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором клетки представляют собой нейронные клетки или нейронные дифференцированные клетки, выбранные из группы, состоящей из первичных нейронных клеток, опухолевых клеток, способных дифференцироваться до нейронных клеток, таких как нейробластомные клетки, клеток Р19 или нейронов, полученных из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (иПСК).