Изучение энтомопатогенного гриба М. Anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых-фитофагов

М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В. Гулий

ИЗУЧЕНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА M. Anisopliae КАК БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА ДЛЯ БИОКОНТРОЛЯ НАСЕКОМЫХ-ФИТОФАГОВ

В качестве характеристики биологического ресурса коллекционных штаммов и морфоваров Metarhizium anisopliae

Sor. изучена активность протеазы, липазы, хитиназы, амилазы и эстеразы наряду с устойчивостью к ультрафиолетовому облучению (УФО). Изолят гриба с наибольшей вирулентностью имеет самые высокие показатели ферментативной активности и устойчивости к УФО. Частичную защиту от УФО обеспечивает антиоксидант тирозол.

Естественными регуляторами численности насекомых в природе являются энтомопатогенные микроорганизмы, в том числе грибы. Этот биологический ресурс обеспечивает использование природных энтомо-патогенов как основы биологических препаратов для защиты растений от фитофагов-насекомых. Энтомопа-тогенный гриб Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. был впервые выделен И.И. Мечниковым из погибших в природных условиях жуков рода Anisoplia и предложен им для размножения на питательных средах и дальнейшего использования биомассы гриба как экологически безопасного средства защиты растений. Этот факт признается во всем мире как начало микробиологического метода защиты растений [1]. Однако недостаток знаний не позволил длительное время производить и использовать препарат на основе этого гриба. В последние годы коллективом ученых нескольких стран разработан препарат на основе M. anisopliae var. ac-ridum, который успешно используется в ряде регионов мира для контроля численности саранчовых [2]. В России препараты на основе гриба M. anisopliae не зарегистрированы.

Для разработки биологического препарата, способного заменять синтетические химические инсектициды, необходимо детальное изучение биологического ресурса M. anisopliae в целях рационального использования его в биологическом контроле численности насекомых-фитофагов. Известно, что одним из возможных механизмов, обусловливающих изменение вирулентных свойств энтомопатогенных грибов, может быть спонтанная изменчивость [3-6]. Процессы спонтанной изменчивости периодически происходят в природных агроценозах, поэтому изучение этих процессов способно прояснить механизмы возникновения эпизоотий в популяциях насекомых, во время которых наиболее ярко проявляется биологический ресурс гриба, играющего важную роль в сохранении биоразнообразия экосистем.

Ранее было показано, что морфовары, полученные при спонтанной изменчивости двух коллекционных штаммов Р-72 и 85-69р гриба M. anisopliae, отличаются по структуре колоний и цвету воздушного мицелия [7]. Коллекционные штаммы при моноспоровых рассевах четко дифференцировались на 2 морфологических подтипа каждый. При этом выделенные варианты имели различную структуру, цвет колоний и интенсивность спороношения. С точки зрения рационального использования биологического ресурса важно, что морфовары с пушистой структурой колоний (Р-72-1 и 85-69р-1) обладали более высокой инсектицидной активностью, чем морфовары с порошистой структурой колоний (Р-72-2 и 85-69р-2). Для более полной оценки биологического ресурса выделенных морфоваров гриба пред-

ставляет интерес изучение и других их биологических особенностей, в частности ферментативной активности и восприимчивости к ультрафиолетовому облучению, что и явилось целью настоящей работы.

Объекты и методы исследования

В работе использованы музейные штаммы Р-72 и 85-69р гриба Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. из коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН. Морфовары Р-72-1, Р-72-2, 85-69р-1 и 85-69р-2 получены путем спонтанной изменчивости коллекционных штаммов [7]. Культуры грибов поддерживали методом периодических пересевов на среде Сабуро в пробирках на скошенном агаре. Пробирки с грибами хранили при +5±1°С, пересев на свежие питательные среды осуществляли через каждые 6 месяцев. Для наработки спорового материала, используемого в экспериментах, грибы выращивали на пшене, подготовленном согласно рекомендациям Е. А. Никольской [8].

Определение активности протеазы, липазы и амилазы проводили по методике, описанной В.В. Смирновым с соавт. [9]. Для измерения активности хитиназы использовали расщепление хитина до N-ацетил-глюкозамина [10]. Активность эстеразы измеряли по известной методике [11].

В экспериментах по УФО суспензии спор тонким слоем толщиной 0,1 мм разливали в стерильные чашки Петри диаметром 9 см. Затем чашки помещали на расстоянии 10 см от источника УФО и снимали крышки в момент включения секундомера. Облучение вели в стационарном состоянии в темном боксе. В качестве источника УФО использовали бактерицидную лампу низкого давления TUV-30W, ДБ-30 с длиной волны 253,7 нм. Через заданные промежутки времени чашки закрывали крышками и облученные конидии высевали методом последовательных разведений на поверхность среды Сабуро. Облучение проводили через промежутки времени: 1, 3, 5, 7 и 10 мин. Антиоксидант тирозол предоставлен Новосибирским институтом органической химии СО РАН.

Полученные данные обрабатывали методом однофакторного дисперсионного анализа с расчетом наименьшей существенной разности (НСР05).

Результаты и их обсуждение

Изучение ферментативной активности изоля-тов. Отличительная особенность энтомопатогенных грибов от энтомопатогенов вирусной или бактериальной природы состоит в способности проникать в организм насекомых через кутикулу. В составе кутикулы

содержатся белки, хитин и липиды, поэтому для преодоления этого барьера энтомопатогенные грибы должны обладать соответствующей ферментативной активностью. В ряде работ продемонстрирована корреляция ферментативной активности с культуральноморфологическими признаками и, что особенно важно, с вирулентностью грибов, в том числе M. anisopliae [12-15]. Отбор изолятов с повышенной продукцией гидролитических ферментов (протеазы, липазы, хити-

назы, эстеразы и др.) может оказаться более эффективным, чем отбор по культурально-морфологическим признакам. Этот биохимический критерий важен для оценки штаммов и морфоваров энтомопатогенного гриба как биологического ресурса.

Нами изучена ферментативная активность коллекционных штаммов и отобранных морфоваров энтомо-патогенного гриба M. anisopliae. Результаты представлены в таблице.

Ферментативная активность коллекционных штаммов и морфологических вариантов М. анморИав

Штамм Ферментативная активность

Протеазная* Эстеразная** Липазная* Амилазная* Хитиназная**

Р-72 5 0,38 3 17 61

Р-72-1 12 0,78 11 24 80

Р-72-2 4 0,11 3 8 23

85-69р 4 0,08 3 10 25

85-69р-1 7 0,08 6 12 20

85-69р-2 4 0,05 4 9 21

НСР05 2 0,05 2 2 2

Примечание. * - зона лизиса специфического субстрата, мм; ** - единицы активности в 1 мл культуральной жидкости.

Результаты показали, что морфологически разные варианты отличаются и по ферментативной активности. Среди них есть варианты как с повышенной по отношению к родительским штаммам, так и с пониженной ферментативной активностью. Так, например, более высокие показатели по всем видам ферментативной активности оказались у варианта Р-72-1 по сравнению с Р-72: протеолитическая активность превышала аналогичную родительского штамма в 2,4 раза, эсте-разная активность - в 2,1, липазная - в 3,7, амилазная -в 1,4 и хитиназная - в 1,3 раза. Что касается штамма 85-69р и его морфоваров, то резкое увеличение активности наблюдали у 85-69р-1 по сравнению с исходным штаммом только в отношении протеаз (в 1,8 раза) и липаз (в 2 раза). Согласно данным, представленным в литературе [16, 17], для проявления инсектицидной активности большее значение имеет протеаза по сравнению с хитиназой, ей принадлежит главенствующая роль в ранней стадии проникновения гриба M. ani-sopliae через кутикулу насекомых. По результатам, приведенным в таблице, для морфоваров с пушистой структурой колоний повышение протеолитической активности преобладает над повышением хитинолити-ческой активности по сравнению с исходными штаммами. Обращает на себя внимание резкое увеличение липазной и эстеразной активности при переходе от штамма Р-72 к морфовару Р-72-1. Это означает, что данный морфовар может быть более активным для видов насекомых с высоким содержанием липидов в кутикуле. Более высокая эстеразная активность морфова-ра Р-72-1 с учетом его более высокой вирулентности [7] указывает на возможное ускорение патологического процесса при развитии микоза хозяина-мишени, инфицированного этим морфоваром. Разница в амилазной активности особенно четко проявляется у двух морфо-варов Р-72-1 и Р-72-2, имеющих пушистую и пороши-стую структуру колоний соответственно. Судя по всем абсолютным значениям ферментативной активности, наибольший интерес с точки зрения биологического ресурса в отношении регуляции численности фитофа-

гов представляет морфовар Р-72-1. Это объясняется, прежде всего, тем, что энтомопатогенные грибы должны преодолевать барьер в виде кутикулы насекомых, содержащей белок, липиды и хитин, что требует проявления грибом как минимум протеазной, липазной и хитиназной активности.

Восприимчивость М. anisopliae к ультрафиолетовому облучению. Энтомопатогенные грибы, являясь компонентом природных биоценозов, подвергаются как положительному, так и отрицательному влиянию различных абиотических факторов окружающей среды (температуры, влажности, солнечной радиации и др.) [18-20]. Для повышения биологического ресурса микроорганизмов, используемых в качестве регуляторов численности насекомых, необходимо защищать их от отрицательного влияния факторов окружающей среды. Признанным фактором отрицательного влияния на энтомо-патогенные грибы, являющимися как естественными, так и привнесенными компонентами биоценозов, считается солнечная радиация (УФО), действие которой приводит к снижению жизнеспособности и вирулентности спор [21-23]. Солнечная радиация, главным образом ультрафиолетовое излучение, - самый мощный фактор инактивации энтомопатогенных грибов при сохранении их во внешней среде. Показано, что под влиянием УФО лизис биополимеров, составляющих мембрану живой клетки, протекает через стадию образования свободных радикалов [24]. В связи с этим для защиты клеток, в том числе спор энтомопатогенных грибов, актуально использование антиоксидантов, ингибирующих или полностью предотвращающих образование свободных радикалов и таким образом защищающих споры от вредного воздействия солнечного света. При этом, соответственно, сохраняются более длительное время вирулентные свойства энтомопатогенов при внесении их в биоценозы. Поэтому нами проведены эксперименты по УФО коллекционных штаммов и их морфоваров, в том числе с добавлением антиоксиданта тирозола. Данные по УФО M. anisopliae представлены на рис. 1-4.

Рис. 3. ВлияниеУФО на титр жизнеспособных спор М. атйорИае штаммаР-72 и его морфоваров без добавления антиоксиданта

% жизнеспособных спор

I

<1

ы

е

о

° I

й "О

° ¡*2 р я

03 СО

й а

я> о аз 2 к я

я> о

к

а

р

а

к

к

00

(Л

00

(Л

£

о

£

м

о

о\

X

о

X

^3

% жизнеспособных спор

% жизнеспособных спор

а

й

к

эд

к

к

гь

к ^ 2 в о О 2 ЕС О

^3 н 8- к о д и Ъ

8 * О §

и Ш

0\ гь сь о м я й о о

р 2* ю я й Е

2 х

Я ^

ь л

р ^5

х &?

Е

й

2

2

00

и>

I

С\

V©

43

00

и>

I

V©

00 и>

1

о\

V©

43

ГО

43

л

о

о\

X

о

я

100

а

о

С

о

§

Л

К

ю

о

о

о

с

о

<и

к

ет

S

й

80 --

60 --

40 --

20 -

0

I I I I I Г

1 3 5 7 10

Время облучения, мин

Р-72  Р-72-1  Р-72-2

Рис. 4. Влияние УФО на титр жизнеспособных спор М. атзорНав штамма Р-72 и его морфоваров с добавлением тирозола в концентрации 0,15%

Результаты опытов показали, что при жестком модельном УФО жизнеспособность конидий коллекционных штаммов и их морфоваров резко снижается. Так, через 1 мин после УФО осталось около 60% для штамма 85-69р и его морфоваров (рис. 1) и около 80% от первоначального количества конидий штамма Р-72 и его морфоваров (рис. 3). Через 3 мин в первом случае произошло снижение жизнеспособности спор не менее, чем в 5 раз, а во втором - не менее чем в 2,5 раза. Почти не осталось жизнеспособных спор через 5 и 7 мин соответственно для двух штаммов. Это означает, что восприимчивость к УФО более высока для коллекционного штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению с Р-72 с соответствующими морфоварами. С другой стороны, выявились и некоторые различия в устойчивости исходных штаммов и мор-фоваров с разной структурой колоний. Так, через 1 мин после УФО осталось 80% жизнеспособных конидий мор-фовара Р-72-1 с пушистой структурой и лишь 63% мор-фовара Р-72-2 с порошистой структурой. Однако в случае морфоваров штамма 85-69р эти различия несущественны. При добавлении антиоксиданта наблюдали частичный защитный эффект от УФО (рис. 2, 4). Например, для Р-72 без антиоксиданта через 7 мин после УФО практически не оставалось жизнеспособных конидий, а с добавлением антиоксиданта сохранялось около 10%. Аналогичная ситуация наблюдалась для морфовара 85-69р. Через 5 мин облучения без антиоксиданта происходило полное разрушение конидий, а с его добавлением - сохранялось 16-

20%. Это свидетельствует о необходимости скрининга более разнообразного спектра антиоксидантов с использованием их разных концентраций как протекторов от УФО. В то же время следует отметить, что изучаемый антиоксидант оказался более эффективным для защиты штамма гриба, который более восприимчив к УФО (в данном случае 85-69р).

Результаты, полученные в данной работе, показали, что разные величины вирулентности штаммов и мор-фоваров энтомопатогенного гриба М. апг^орНав, продемонстрированные ранее [7], зависят не только от культурально-морфологических признаков, но связаны также с ферментативной активностью, в первую очередь с протеазной, липазной и хитиназной. Наиболее высокая ферментативная активность по всем показателям наблюдалась у изолята Р-72-1, обладающего самой высокой инсектицидной активностью.

Этот же изолят М. апг^орНав показал наибольшую, по сравнению с остальными, устойчивость к ультрафиолетовому облучению, что важно для сохранности энтомопатогенных грибов в окружающей среде.

Полученные результаты дополнили знания по характеристике энтомопатогенного гриба М. апг^орНав как биологического ресурса, используемого в биологической регуляции численности насекомых-фитофагов. Эти данные следует учитывать при разработке биопрепаратов на основе энтомопатогенного гриба, а также при мониторинге естественных эпизоотий насекомых.

ЛИТЕРАТУРА

1. Lord J.C. From Metchnikoff to Monsanto and beyond: The path of microbial control / J.C. Lord // J. Invertebr. Pathol. - 2005. Vol. 89. - P. 19-29.

2. Lomer C.J. Biological control of locusts and grasshoppers / C.J. Lomer, R.P. Bateman, D.L. Johnson, J. Langewald, M. Thomas // Annu. Rev, Ento-

mol. - 2001. - Vol. 46. - P. 667-702.

3. Алешина О.А. Основные критерии для отбора гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. для производственных целей / О.А. Алешина,

С.Н. Ильичева, Э.В. Кононова, Н.А. Коляда // Микология и фитопатология. - 1972. - Т. 8. - С. 341-344.

4. Огарков Б.Н. Энтомопатогенные грибы Восточной Сибири / Б.Н. Огарков, Г.Р. Огаркова. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 2000. - 134 с.

5. ГештовтН.Ю. Энтомопатогенные грибы (биотехнологические аспекты) / Н.Ю. Гештовт. - Алматы, 2002. - 288 с.

6. Митина Г.В. Влияние биохимических и морфолого-культуральных особенностей природных изолятов Verticillium lecanii (Zimn.) Viegas на

вирулентность в отношении личинок оранжерейной белокрылки / Г.В. Митина, Г.Е. Сергеев, В.А. Павлюшин // Микология и фитопатология. - 1997. - Т. 31. - С. 57-64.

7. Serebrov V. Spontaneous variability of Metarhizium anisopliae strains as an approach for enhancement of insect activity / V. Serebrov, A. Maljarchuk,

M.V. Shternshis // Plant Sci. (Sofia). - 2007. - Vol. 44. - P. 244-247.

8. Никольская Е.А. Культивирование микроскопических грибов / Е.А. Никольская // Методы экспериментальной микологии. - Киев: Наукова

думка, 1982. - С. 106-137.

9. Смирнов В.В. Спороообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И. А. Ва-

силевская. - Киев: Наукова думка, 1982. - 280 с.

10. St. Leger R.G. Entomopathogenic isolates of Metarhizium anisopliae and Aspergillus flavus produce multiple extracellular chitinase isosymes / R.G. St. Leger, R.C. Staples, D.W. Roberts // J. Invertebr. Pathol. - 1993. - Vol. 61. - P. 81-84.

11. Staeudinger M. Esterase. VIII. Histochemische elerophoretishe und quantitative Untersuchungen zum einfluss von phenobarbital auf die / M. Staeudinger, O. Diemling, C. Grossarth, T. Wienker // Histochemie. - 1973. - Hbd. 37. - S. 107-116.

12. Павлюшин В.А. Ферментативная активность и вирулентность энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. / В.А. Павлюшин // Микология и фитопатология. - 1977. - Т. 11. - С. 283-289.

13. Xia Y. Tregalose hydrolyzing enzymes of Metarhizium anisopliae and their role in pathogenesis of the tobacco hornworm / Y. Xia, J.M. Clarkson,

A.K. Charnley // J. Invertebr. Pathol. - 2002. - Vol. 80. - P. 139-147.

14. Charnley A.K. Fungal pathogens of insects: cuticle degrading enzymes and toxins / A.K. Charnley // Adv. Botan. Res. - 2003. - Vol. 40. - P. 241321.

15. Jarrold S.L. The contribution of surface waxes to pre-penetration growth of an entomopathogenic fungus on host cuticle / S.L. Jarrold, D. Moore, U. Potter, A.K. Charnley // Mycol. Res. - 2007. - Vol. 111. - P. 240-249.

16. Kang S.C. Purification and characterization of a novel chitinase from entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae / S.C. Kang, S. Park,

D.G. Lee // J. Invertebr. Pathol. - 1999. - Vol. 73. - P. 276-281.

17. St. Leger R.G. Ambient p His a major determinant in the expression of cuticle-degrading enzymes and hydrophobin by Metarhizium anisopliae

/ R.G. St. Leger, L. Joshi, D. Roberts // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 709-713.

18. Громовых Т.И. Энтомопатогенные грибы в защите леса / Т.И. Громовых. - Новосибирск: Наука, 1982. - 80 с.

19. Shah P.F. Natural levels of fungal infections in grasshoppers in Nothern Benin / P.F. Shah, I. Godonou, C. Gbongboui, C.J. Lomer // Biocontrol Sci

Technol. - 1994. - Vol. 4. - P. 331-341.

20. Vanninen I. Persistence of augmented Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana in Finnish agricultural soils / I. Vanninen, J. Tyni-Juslin, H. Hokkanen // Bio Control. - 2000. - Vol. 45. - P. 201-222.

21. Hunt T.R. Effect of sunscreen, irradiance and resting period on the germination of Metarhizium flavoviride conidia / T.R. Hunt, D. Moore, P.M. Higgins, P.M. Prior // Entomophaga. - 1994. - Vol. 39. - P. 313-322.

22. Inglis G.D. Influence of ultraviolet light protectants on persistence of the entomopathogenic fungi / G.D. Inglis, M.S. Goettel, D. Johnson // Biological Control. - 1995. - Vol. 5. - P. 581-590.

23. Moore D. Ultra-violet radiation damage to Metarhizium flavoviride conidia / D. Moore, P.D. Bridge, P.M. Higgins, R.P. Bateman, C. Prior // Annals

Appl. Biol. - 1993. - Vol. 122. - P. 605-616.

24. Фут Ф. Фотосенсибилизированное окисление и синглетный кислород / Ф. Фут // Свободные радикалы в биологии. - М.: Мир, 1979. -Т. 2. - С. 96-150.

Статья представлена научной редакцией «Биология» 19 мая 2008 г.