РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ РАСТЕНИЙ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
PLANT REGULATORY ELEMENTS AND THEIR APPLICATION OPTIONS

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[0001]
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/340656, поданной 24 марта 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002]
Список последовательностей, который содержится в файле с названием «MONS419WO-sequence_listing», размер которого составляет 14,1 кБ (измерено в Microsoft Windows) и который был создан 22 марта 2017 г., подан вместе с настоящей заявкой в электронном виде и включен в настоящее описание посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003]
Настоящее изобретение относится к областям молекулярной биологии растений и генной инженерий растений. В частности, изобретение относится к молекулам ДНК, подходящим для модуляции экспрессии генов в растениях.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004]
Регуляторные элементы представляют собой генетические элементы, которые регулируют работу генов путем модуляции транскрипции функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК. Такие элементы могут включать промоторы, лидерные последовательности (лидеры), интроны и 3'-нетранслируемые области, и их можно применять в областях молекулярной биологии растений и генной инженерии растений.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005]
Согласно изобретению предложены новые регуляторные элементы генов для применения в растениях. Согласно изобретению также предложены конструкты ДНК, содержащие регуляторные элементы. Согласно настоящему изобретению также предложены трансгенные растительные клетки, растения и семена, содержащие регуляторные элементы. В одном варианте реализации регуляторные элементы функционально связаны с транскрибируемой молекулой ДНК. В некоторых вариантах реализации транскрибируемая молекула ДНК может быть гетерологичной по отношению к регуляторной последовательности. Таким образом, предложенную согласно изобретению последовательность регуляторных элементов в конкретных вариантах реализации может быть определена как функционально связанная с гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК. Согласно настоящему изобретению также предложены способы получения и применения регуляторных элементов, ДНК-конструктов, содержащих регуляторные элементы, и трансгенные растительные клетки, растения и семена, содержащих регуляторные элементы, функционально связанные с транскрибируемой молекулой ДНК.
[0006]
Таким образом, в одном аспекте изобретения предложена рекомбинантная молекула ДНК, содержащая последовательность ДНК, которая выбрана из группы, состоящей из: (a) последовательности, характеризующейся по меньшей мере примерно 85-процентной идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-5 или 7; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7, где фрагмент обладает регулирующей ген активностью; при этом указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК. Под «гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК» подразумевается, что транскрибируемая молекула ДНК является гетерологичной по отношению к полинуклеотидной последовательности, с которой она функционально связана. В определенных вариантах реализации рекомбинантная молекула ДНК содержит последовательность ДНК, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности с последовательностью ДНК любой из SEQ ID NO: 1-5. В отдельных вариантах реализации последовательность ДНК содержит регуляторный элемент. В некоторых вариантах реализации регуляторный элемент содержит промотор. В других вариантах реализации гетерологичная транскрибируемая молекула ДНК содержит ген, представляющий интерес с точки зрения агрономии, как, например, ген, обладающий способностью обеспечивать устойчивость растений к гербицидам, или ген, обладающий способностью обеспечивать устойчивость растений к вредителям растений. В других вариантах реализации изобретения предложен конструкт, содержащий рекомбинантную молекулу ДНК, предложенную в настоящем документе.
[0007]
В другом аспекте, в настоящем документе предложены трансгенные растительные клетки, которые содержат рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая выбрана из группы, состоящей из: (a) последовательности, характеризующейся по меньшей мере 85-процентной идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-5 или 7; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7, где фрагмент обладает регулирующей ген активностью; при этом последовательность ДНК функционально связана с гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК. В определенных вариантах реализации трансгенная растительная клетка представляет собой клетку однодольного растения. В других вариантах реализации трансгенная растительная клетка представляет собой клетку однодольного растения или клетку двудольного растения.
[0008]
В еще одном аспекте в настоящем документе дополнительно предложено трансгенное растение или его часть, которое(ая) содержит рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая выбрана из группы, состоящей из: (a) последовательности, характеризующейся по меньшей мере 85-процентной идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-5 или 7; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7, где фрагмент обладает регулирующей ген активностью; при этом последовательность ДНК функционально связана с гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК. В конкретных вариантах реализации трансгенное растение представляет собой растение-потомок любого поколения, которое содержит рекомбинантную молекулу ДНК. В настоящем документе также предложено трансгенное семя, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК, из которого вырастает такое трансгенное растение.
[0009]
Согласно другому аспекту изобретения предложен способ получения товарного продукта, включающий получение трансгенного растения или его части, содержащего(ей) рекомбинантную молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, и получение из него(нее) указанного товарного продукта. Согласно одному варианту реализации товарный продукт представляет собой обработанные семена, зерна, части растений, масла и шрот.
[0010]
Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ получения трансгенного растения, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, который включает трансформацию растительной клетки молекулой рекомбинантной ДНК согласно настоящему изобретению с получением трансформированной растительной клетки и регенерацию трансгенного растения из этой трансформированной растительной клетки.
[0011]
Согласно некоторым аспектам изобретения предложены способы получения клетки трансгенного растения, включающие введение в растительную клетку рекомбинантной молекулы ДНК, предложенной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации введение указанной рекомбинантной молекулы ДНК в указанную растительную клетку включает трансформацию или регенерацию трансгенного растения из указанной растительной клетки. В дополнительных вариантах реализации введение указанной рекомбинантной молекулы ДНК в указанную растительную клетку включает скрещивание предложенного в настоящем документе трансгенного растения с другим растением с получением растения-потомка, содержащего указанную растительную клетку.
[0012]
В дополнительном аспекте изобретения предложены способы получения трансгенного растения, включающие трансформацию растительной клетки рекомбинантной молекулой ДНК, предложенной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации способы согласно изобретению дополнительно включают регенерацию трансгенного растения из растительной клетки, которая трансформирована молекулой ДНК, предложенной в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0013]
Bouteloua gracilis
SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность ДНК группы регулирующих экспрессию элементов (EXP), которая содержит промотор, полученный из предполагаемого гена убиквитина из бутелуа изящной (), функционально связанного на 5' конце со своим лидером, который функционально связана на 5' конце со своим нативным первым интроном.
[0014]
Bouteloua gracilis
SEQ ID NO: 2 представляет собой промоторную последовательность, полученную из предполагаемого гена убиквитина из бутелуа изящной ().
[0015]
Bouteloua gracilis
SEQ ID NO: 3 представляет собой лидер, полученный из предполагаемого гена убиквитина из бутелуа изящной ().
[0016]
Bouteloua gracilis
SEQ ID NO: 4 представляет собой интронную последовательность, полученную из предполагаемого гена убиквитина из бутелуа изящной ().
[0017]
Bouteloua gracilis
SEQ ID NO: 5 представляет собой 3' нетранслируемую область (НТО), полученную из предполагаемого гена убиквитина из бутелуа изящной ().
[0018]
SEQ ID NO: 6 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, кодирующую β-глюкуронидазу, предназначенную для экспрессии в растительной клетке.
[0019]
Bouteloua gracilis
SEQ ID NO: 7 представляет собой энхансер промотора, полученный из предполагаемого гена убиквитина .
[0020]
Oryza sativa
SEQ ID NO: 8 представляет собой 3' нетранслируемую область (НТО), полученную из гена белка, подобного белку-переносчику липидов (БПЛ) .
[0021]
SEQ ID NO: 9 представляет собой усиленный энхансером промотор и лидер последовательность, полученные из вируса мозаики цветной капусты.
[0022]
Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 10 представляет собой 3' нетранслируемую область (НТО), полученную из гена нопалинсинтазы .
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0023]
Согласно изобретению предложены молекулы ДНК, обладающие регулирующей гены активностью в растениях. Нуклеотидные последовательности таких молекул ДНК предложены в виде SEQ ID NO: 1-5 или 7. Эти молекулы ДНК обладают способностью влиять на экспрессию функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК в тканях растений и, следовательно, регулировать экспрессию функционально связанного трансгена в трансгенных растениях. Согласно изобретению также предложены способы модификации, получения и применения таких молекул. Согласно изобретению также предложены композиции, которые содержат трансгенные растительные клетки, растения, части растений и семена, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК согласно настоящему изобретению, а также способы их получения и применения.
[0024]
Следующие определения и способы приведены для того чтобы лучше определить настоящее изобретение и дать руководство для средних специалистов в данной области техники по реализации настоящего изобретения. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их стандартным применением средними специалистами в соответствующей области техники.
Молекулы ДНК
[0025]
т.е.,
В настоящем документе термин «ДНК» или молекула «ДНК» относится к двухцепочечной молекуле ДНК геномного или синтетического происхождения, к полимеру дезоксирибозных оснований или молекуле ДНА, читаемому от 5' конца (обратное направление) к 3' концу (прямое направление). В настоящем документе термин «последовательность ДНК» относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Используемая в настоящем документе номенклатура соответствует номенклатуре раздела 37 Свода нормативных актов федеральных органов исполнительной власти Соединенных Штатов 1.822 и приведена в таблицах Стандарта ВОИС ST.25 (1998), приложение 2, таблицы 1 и 3.
[0026]
В настоящем документе термин «рекомбинантная молекула ДНК» обозначает молекулу ДНК, содержащую комбинацию молекул ДНК, которые не встречаются в естественных условиях совместно без вмешательства человека. Например, рекомбинантная молекула ДНК может представлять собой молекулу ДНК, которая содержит по меньшей мере две молекулы ДНК, гетерологичные друг другу, молекулу ДНК, которая содержит последовательность ДНК, отличную от последовательностей ДНК, которые существуют в естественных условиях, или молекулу ДНК, которую встроили в ДНК клетки-хозяина посредством генетической трансформации или редактирования генома.
[0027]
т.e
Если в настоящей заявке приведено указание на «выделенную молекулу ДНК» или соответствующий термин или фраза, это должно означать, что молекула ДНК присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но в своем естественном окружении. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, последовательность терминации транскрипции и тому подобные, которые в естественных условиях находятся в ДНК генома организма, не считаются «выделенными», пока элемент находится в геноме организма и в том участке генома, в котором он встречается в естественных условиях. Однако каждый из таких элементов и составные части таких элементов будут «выделенными» в объеме данного описания, если указанный элемент не находится в геноме организма и в том участке генома, в котором он встречается в естественных условиях. Аналогично, нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в естественных условиях вариант такого белка, будет выделенной нуклеотидной последовательностью при условии, что нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой кодирующая белок последовательность встречается в естественных условиях. В целях настоящего описания синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность встречающегося в естественных условиях инсектицидного белка, будет считаться выделенной. В целях настоящего описания любая трансгенная нуклеотидная последовательность, . нуклеотидная последовательность ДНК, встроенная в геном растительных или бактериальных клеток, или присутствующая в экстрахромосомном векторе, будет считаться выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или подобной структуре, применяемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или же присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии.
[0028]
например
В настоящем документе термин «идентичность последовательности» относится к степени, в которой две оптимально выровненные полинуклеотидные последовательности или две оптимально выровненные полипептидные последовательности идентичны. Оптимальное выравнивание последовательностей производят посредством ручного выравнивания двух последовательностей, , референсной последовательности и другой последовательности, с целью максимизации количества совпадений нуклеотидов в выровненной последовательности с соответствующими внутренними нуклеотидными вставками, делециями или разрывами. В настоящем документе термин «референсная последовательность» относится к последовательности ДНК, предложенной как SEQ ID NO: 1-5 или 7.
[0029]
например
В настоящем документе термин «процент идентичности последовательности» или «процент идентичности» или «% идентичности» представляет собой долю идентичности, умноженную на 100. «Доля идентичности» последовательности, оптимально выровненной с референсной последовательностью, представляет собой количество совпадений нуклеотидов при оптимальном выравнивании, поделенное на общее количество нуклеотидов в референсной последовательности, , общее количество нуклеотидов в полноразмерной референсной последовательности. Так, согласно одному варианту реализации изобретения предложена молекула ДНК, содержащая последовательность, которая при оптимальном выравнивании с референсной последовательностью, описанной в настоящем документе как SEQ ID NO: 1-5 и 7, имеет по меньшей мере примерно 85-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 86-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 87-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 88-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 89-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 90-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 91 процент идентичности, по меньшей мере примерно 92 процента идентичности, по меньшей мере 93 процента идентичности, по меньшей мере примерно 94 процента идентичности, по меньшей мере примерно 95-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 96-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 97-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 98-процентную идентичность, по меньшей мере примерно 99-процентную идентичность или по меньшей мере примерно 100-процентную идентичность с референсной последовательностью. В определенных вариантах реализации в настоящем документе предложены последовательности, имеющие некоторую процентную идентичнось с любой из SEQ ID NO: 1-5 или 7 и обладающие активностью полноразмерной последовательности.
Регуляторные элементы
[0030]
Регуляторные элементы, такие как промоторы, лидеры (также известные как 5' НТО), энхансеры, интроны и участки терминации транскрипции (также известные как 3'-НТО) играют неотъемлемую роль в общей экспрессии генов в живых клетках. В настоящем документе термин «регуляторный элемент» относится к молекуле ДНК, обладающей активностью регуляции генов. В настоящем документе термин «активность регуляции генов» относится к способности влиять на экспрессию функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК, например, за счет влияния на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК. Таким образом, регуляторные элементы, такие как промоторы, лидеры, энхансеры, интроны и 3' НТО, которые функционируют в растениях, подходят для модификации фенотипов растений посредством генной инженерии.
[0031]
В настоящем документе термин последовательность «группы регуляторных элементов экспрессии» или «EXP» может относиться к группе функционально связанных регуляторных элементов, таких как энхансеры, промоторы, лидеры и интроны. Таким образом, группа регуляторных элементов экспрессии может содержать, например, промотор, функционально связанный с 5'-концом лидерной последовательности. EXP, которые можно применять для реализации настоящего изобретения представлены в виде SEQ ID №: 1.
[0032]
например
Регуляторные элементы можно охарактеризовать по их паттерну экспрессии гена, , по положительным и/или отрицательным эффектам, таким как постоянная или временная экспрессия, пространственный, физиологический, патологический эффект, эффект в отношении развития, ткани, окружения, клеточного цикла, и/или химически чувствительная экспрессия, и любая их комбинация, а также по количественным или качественным показателям. В настоящем документе термин «паттерн экспрессии гена» представляет собой любой паттерн транскрипции функционально связанной молекулы ДНК в транскрибированную молекулу РНК. Транскрибированную молекулу РНК можно транслировать с получением молекулы белка или можно получить антисмысловую или другую молекулу РНК с регуляторной функцией, такую как двухцепочечная РНК (дцРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомальная РНК (рРНК), микроРНК и им подобные.
[0033]
В настоящем документе термин «экспрессия белка» обозначает любой паттерн трансляции транскрибируемой молекулы РНК в молекулу белка. Экспрессию белка можно описывать ее временными, пространственными, относящимися к развитию или морфологическими качествами, а также количественными или качественными показателями.
[0034]
т.е.
Промотор можно применять в качестве регуляторного элемента для модуляции экспрессии функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК. В настоящем документе термин «промотор» в целом относится к молекуле ДНК, которая участвует в распознавании и связывании РНК-полимеразы II и других белков, таких как действующие в транс-положении факторы транскрипции, при инициации транскрипции. Промотор можно изначально выделить из 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) геномной копии гена. В качестве альтернативы, промоторы могут представлять собой синтетически полученные или обработанные молекулы ДНК. Промоторы также могут быть химерными. Химерные промоторы получают в результате гибридизации двух или более гетерологичных молекул ДНК. Промотор, который можно применять для реализации настоящего изобретения, включает промоторные элементы, которые содержатся в SEQ ID NO: 2, или ее фрагментах или вариантах. В конкретных вариантах реализации изобретения указанные в формуле изобретения молекулы ДНК и любые их варианты или производные, описанные в настоящем документе, дополнительно определены как обладающие промоторной активностью, способные действовать в качестве промотора в клетке-хозяине, например, в трансгенном растении. В других определенных вариантах реализации фрагмент можно определить как проявляющий промоторную активность, которой обладает исходная промоторная молекула, из которой он был получен, или фрагмент может содержать «минимальный промотор», который обеспечивает базовый уровень транскрипции и состоит из TATA-бокса, другого известного мотива сайта связывания транскрипционных факторов, или эквивалентной последовательности ДНК для распознавания и связывания комплекса РНК-полимеразы II для инициации транскрипции.
[0035]
В одном варианте реализации предложены фрагменты промоторной последовательности, описанной в настоящем документе. Фрагменты промоторов могут обладать промоторной активностью, как описано выше, и могут применяться по отдельности или в комбинации с другими промоторами и фрагментами промоторов, как, например, при создании химерных промоторов, или в комбинации с другими элементами экспрессии и фрагментами элементов экспрессии. В определенных вариантах реализации предложены фрагменты промотора, содержащие по меньшей мере примерно 50, по меньшей мере примерно 75, по меньшей мере примерно 95, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 125, по меньшей мере примерно 150, по меньшей мере примерно 175, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 225, по меньшей мере примерно 250, по меньшей мере примерно 275, по меньшей мере примерно 300, по меньшей мере примерно 500, по меньшей мере примерно 600, по меньшей мере примерно 700, по меньшей мере примерно 750, по меньшей мере примерно 800, по меньшей мере примерно 900 или по меньшей мере примерно 1000 или более смежных нуклеотидов молекулы ДНК, обладающей промоторной активностью, которая описана в настоящем документе. В определенных вариантах реализации В настоящем документе предложены фрагменты любой из SEQ ID NO: 1-5 и 7, обладающие активностью полноразмерной последовательности. Способы получения таких фрагментов из исходной промоторной молекулы общеизвестны в данной области техники.
[0036]
Композиции, полученные из любого из промоторных элементов, содержащихся в SEQ ID NO: 2, такие как внутренние или 5' делеции, например, можно получить с помощью известных в данной области техники способов улучшения или изменения экспрессии, включая удаление элементов, которые оказывают положительное либо отрицательное воздействие на экспрессию; дублирование элементов, оказывающих положительное либо отрицательное воздействие на экспрессию; и/или дублирование или удаление элементов, которые оказывают тканеспецифичное или клеткоспецифичное воздействие на экспрессию. Композиции, которые получены из любого из содержащихся в SEQ ID NO: 2 промоторных элементов, содержащие 3'-делеции, в которых удален элемент TATA-бокса или эквивалентная ему последовательность и расположенная в прямом направлении считывания последовательность, можно применять, например, для создания энхансерных элементов. Можно ввести дополнительные делеции для удаления любых элементов, которые оказывают положительное или отрицательное; тканеспецифичное; клеткоспецифичное; или времяспецифичное (включающее циркадный ритм, но не ограниченно им) воздействие на экспрессию. Любые из промоторных элементов, содержащихся в SEQ ID NO: 2, и полученные из них фрагменты или энхансеры можно применять для создания композиций химерных регуляторных элементов транскрипции.
[0037]
т.е.
В соответствии с настоящим изобретением можно провести анализ промотора или фрагмента промотора, чтобы установить присутствие известных промоторных элементов, характеристик последовательности ДНК, такие как TATA-бокс и другие известные мотивы сайта связывания транскрипционных факторов. Специалист в данной области техники может применять идентификацию таких известных промоторных элементов для разработки вариантов промотора, имеющих аналогичный исходному промотору паттерн экспрессии.
[0038]
В настоящем документе термин «лидер» относится к молекуле ДНК, выделенной из нетранслируемой 5'-области (5'-НТО) гена, и в целом его определяют как нуклеотидный сегмент между сайтом начала транскрипции (TSS) и сайтом начала кодирующей последовательности белка. В альтернативном варианте лидеры могут представлять собой синтетически полученные или обработанные элементы ДНК. Лидеры можно применять в качестве 5' регуляторного элемента для модуляции экспрессии функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК. Лидеры можно применять с гетерологичным промотором или с их нативным промотором. Лидеры, которые можно применять для реализации настоящего изобретения, представлены как SEQ ID NO: 3 или любые из лидерных элементов, содержащихся в SEQ ID NO: 3 или их фрагментах и вариантах. В определенных вариантах реализации такие последовательности ДНК можно определить как обладающие способностью действовать в качестве лидера в хозяйской клетке, включая, например, трансгенную растительную клетку. В одном варианте реализации такие последовательности расшифрованы как обладающие лидерной активностью.
[0039]
Лидерные последовательности (также обозначаемые как 5' НТО), представленные как SEQ ID NO: 3, или любые из лидерных элементов, входящих в состав SEQ ID NO: 3, могут иметь в своем составе регуляторные элементы или могут принимать вторичные структуры, которые могут оказывать воздействие на транскрипцию или трансляцию функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК. Лидерную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3, или любой из лидерных элементов, входящих в состав SEQ ID NO: 3, можно применять согласно изобретению для создания химерных регуляторных элементов, которые воздействуют на транскрипцию или трансляцию функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК.
[0040]
В настоящем документе термин «интрон» относится к молекуле ДНК, которую можно выделить из гена или идентифицировать в нем, и в целом его можно определить как область, подвергаемую сплайсингу во время процессинга матричной РНК (мРНК) перед трансляцией. В качестве альтернативы, интрон может представлять собой синтетически полученный или обработанный элемент ДНК. Интрон может содержать энхансерные элементы, которые влияют на транскрипцию функционально связанных генов. Интрон можно применять в качестве регуляторного элемента для модуляции экспрессии функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК. Конструкт может содержать интрон, и этот интрон может быть или может не быть гетерологичным по отношению к транскрибируемой молекуле ДНК. Примеры интронов в данной области техники включают интрон актина риса и интрон кукурузы HSP70.
[0041]
например
например
например
например
Arabidopsis thaliana
например
A. thaliana
У растений включение некоторых интронов в генетические конструкты приводит к увеличению накопления мРНК и белка по сравнению с конструкциями без интрона. Этот эффект был назван «интрон-опосредованное усиление» (IME) экспрессии гена. Интроны, установленно стимулирующие экспрессию у растений, идентифицированы в генах маиса (, tubA1, Adh1, Sh1 и Ubi1), в генах риса (, tpi) и в генах двудольных растений, таких как гены петунии (, rbcS), картофеля (, st-ls1), и (, ubq3 и pat1). Показано, что делеции или мутации в сайтах сплайсинга интрона снижают экспрессию гена, что свидетельствует о том, что для IME может быть необходим сплайсинг. Однако в двудольных растениях продемонстрирован IME при точечных мутациях в сайтах сплайсинга гена pat1 из . Показано, что многократное использование одного и того же интрона в одном растении имеет недостатки. В таких случаях необходимо иметь коллекцию основных контролирующих элементов, чтобы сконструировать подходящие элементы рекомбинантной ДНК.
[0042]
цис
Интрон, которые можно применять для реализации настоящего изобретения, представлен в виде SEQ ID NO:4. Полученные из интрона композиции, представленные в виде SEQ ID NO:4, могут иметь в своем составе внутренние делеции или дупликации регуляторных элементов. Кроме того, изменения 5'- и 3'-последовательностей, содержащие границы сплайсинга интрон/экзон, можно применять для усиления экспрессии или специфичности экспрессии, если они функционально связаны с промотором+лидером или химерным промотором+лидером и кодирующей последовательностью. При модификации последовательностей границ интрон/экзон может оказаться полезным избегать применения нуклеотидной последовательности АТ или нуклеотида А непосредственно перед 5'-концом сайта сплайсинга (GT) и нуклеотида G или нуклеотидной последовательности TG сразу после 3' конца сайта сплайсинга (AG), чтобы исключить возможность появления нежелательных стартовых кодонов во время процессинга матричной РНК в конечный транскрипт. Таким образом можно модифицировать последовательности ДНК рядом с 5' или 3' концами сайтов границ сплайсинга. Интрон и варианты интронов, измененные, как описано в настоящей заявке, и соответствующие способы, известные в данной области техники, можно проверить эмпирически, как описано в рабочих примерах, чтобы определить влияние интрона на экспрессию функционально связанной молекулы ДНК. Изменения 5' и 3' участков, которые содержат границу сплайсинга интрон/экзон, можно также сделать, чтобы уменьшить потенциальное введение ложных стартовых кодонов и стоп-кодонов, образовавшихся в ходе процессинга транскрипта и сплайсинга матричной РНК. Интроны можно проверить эмпирически, как описано в рабочих примерах, чтобы определить влияние интрона на экспрессию трансгена.
[0043]
В одном варианте реализации предложены фрагменты интронной последовательности, описанной в настоящем документе. Фрагменты интрона могут обладать активностью полноразмерной интронной последовательности, и их можно применять отдельно или в комбинации с другими интронами или регуляторными элементами или фрагментами элементов экспрессии. В определенных вариантах реализации предложены фрагменты интрона, содержащие по меньшей мере примерно 50, по меньшей мере примерно 75, по меньшей мере примерно 95, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 125, по меньшей мере примерно 150, по меньшей мере примерно 175, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 225, по меньшей мере примерно 250, по меньшей мере примерно 275, по меньшей мере примерно 300, по меньшей мере примерно 500, по меньшей мере примерно 600, по меньшей мере примерно 700, по меньшей мере примерно 750, по меньшей мере примерно 800, по меньшей мере примерно 900 или по меньшей мере примерно 1000 или более смежных нуклеотидов молекулы ДНК, обладающей активностью интрона, которая описана в настоящем документе. В определенных вариантах реализации в настоящем документе предложены фрагменты любой из SEQ ID NO: 4, обладающие активностью полноразмерной последовательности. Способы получения таких фрагментов из исходной молекулы интрона общеизвестны в данной области техники.
[0044]
В настоящем документе термины «3' молекула терминации транскрипции», «3' нетранслируемая область» или «3'-НТО» относятся к молекуле ДНК, которая используется во время транскрипции к нетранслируемой области 3' участка молекулы мРНК. 3'-нетранслируемую область молекулы мРНК можно создать путем специфичного расщепления и 3'-полиаденилирования, также известного как поли(A)-хвост. 3'-НТО может быть функционально связана с транскрибируемой молекулой ДНК и располагаться в прямом направлении считывания от нее и может иметь сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, обладающие способностью влиять на транскрипцию, процессинг мРНК или экспрессию гена. Считают, что поли(А)-хвосты задействованы в стабильности мРНК и инициации трансляции. Примеры известных в данной области техники 3' молекул терминации транскрипции - 3'-область нопалинсинтазы, 3'область hsp17 пшеницы, 3'-область малой субчастицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы гороха, 3'-область E6 хлопка и 3'-НТО коиксина.
[0045]
например
in vivo
3'-НТО обычно находят полезное применение для рекомбинантной экспрессии определенных молекул ДНК. Слабая 3'-НТО обладает потенциалом для создания сквозного прочитывания, что может влиять на экспрессию молекулы ДНК, расположенной в соседних экспрессионных кассетах. Соответствующий контроль за терминацией транскрипции может предотвращать сквозное прочитывание в последовательностях ДНК (, в других экспрессионных кассетах), расположенных в прямом направлении считывания, и может также способствовать эффективному возобновлению цикла РНК-полимеразы, усиливая тем самым экспрессию гена. Эффективная терминация транскрипции (высвобождение РНК-полимеразы II из ДНК) является предварительным условием для повторной инициации транскрипции и тем самым непосредственно влияет на общий уровень транскрипта. После терминации транскрипции зрелая мРНК выходит из сайта синтеза и транспортируется в цитоплазму. Эукариотические мРНК накапливаются в форме поли(А), что затрудняет определение сайтов ерминации транскрипции стандартными способами. Кроме того, прогнозирование функциональных и эффективных 3'-НТО при помощи биоинформационных методов затруднено вследствие отсутствия консервативных последовательностей ДНК, которые позволили бы легко прогнозировать эффективную 3'-НТО.
[0046]
С практической точки зрения обычно полезно, чтобы 3'-НТО, применяемая в экспрессионной кассете, обладала следующими характеристиками. Во-первых, 3'-НТО должна быть способна быстро и эффективно терминировать транскрипцию трансгена и предотвращать сквозное прочитывание транскрипта в любую соседнюю последовательность ДНК, которая может содержать другую экспрессионную кассету, как в случае нескольких экспрессионных кассет, расположенных в одной транспортной ДНК (Т-ДНК), или в соседней хромосомной ДНК, в которую встроена Т-ДНК. Во-вторых, 3'-НТО не должна вызывать снижения траскрипционной активности, обусловленной промотором, лидером, энхансерами и интронами, которые применяют для стимулирования экспрессии молекулы ДНК. Наконец, в области биотехнологии растений 3'-НТО часто используют для прайминга реакций амплификации обратно транскрибированной РНК, выделенной из трансформированного растения, что применяют для: (1) оценки транскрипционной активности или экспрессии экспрессионной кассеты, встроенной в хромосому растения; (2) оценки количества копий инсерций в ДНК растения; и (3) оценки зиготности образовавшихся после размножения семян. 3'-НТО также применяют в реакциях амплификации ДНК, выделенной из трансформированного растения, чтобы охарактеризовать сохранность встроенной кассеты. Пример 3'-НТО, применимой в практике настоящего изобретения, представлен в виде SEQ ID NO: 5.
[0047]
В одном варианте реализации предложены фрагменты 3'-НТО, раскрытой в настоящем документе. Фрагменты 3'-НТО могут обладать активностью полноразмерной 3'-НТО последовательности, и их можно применять отдельно или в комбинации с другими регуляторными элементами или фрагментами элементов экспрессии. В определенных вариантах реализации предложены фрагменты 3' НТО, содержащие по меньшей мере примерно 50, по меньшей мере примерно 75, по меньшей мере примерно 95, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 125, по меньшей мере примерно 150, по меньшей мере примерно 175, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 225, по меньшей мере примерно 250, по меньшей мере примерно 275, по меньшей мере примерно 300, по меньшей мере примерно 500, по меньшей мере примерно 600, по меньшей мере примерно 700, по меньшей мере примерно 750, по меньшей мере примерно 800, по меньшей мере примерно 900 или по меньшей мере примерно 1000 или более смежных нуклеотидов молекулы ДНК, обладающей 3' НТО активностью, которая описана в настоящем документе. В определенных вариантах реализации в настоящем документе предложены фрагменты любой из SEQ ID NO: 5, обладающие активностью полноразмерной последовательности. Способы получения таких фрагментов из исходной 3' НТО молекулы общеизвестны в данной области техники.
[0048]
цис
цис
цис
Bouteloua gracilis
В настоящем документе термин «энхансер» или «энхансерный элемент» относится к -активному регуляторному элементу функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК, также известному как -элемент, который обеспечивает один из аспектов общего паттерна экспрессии, но обычно его одного недостаточно для стимулирования транскрипции. В отличие от промоторов, энхансерные элементы обычно не содержат сайт начала транскрипции (TSS), TATA-бокса или эквивалентной последовательности ДНК. Промотор или фрагмент промотора в естественных условиях может содержать один или больше энхансерных элементов, которые влияют на транскрипцию функционально связанной последовательности ДНК. Энхансерный элемент также можно соединить с промотором для получения химерного промотора с -элементом, который обеспечивает один аспект общей модуляции экспрессии гена. Применяемый для реализации изобретения пример энхансерного элемента, полученного из предполагаемого промотора гена убиквитина , представлен в виде SEQ ID NO: 7.
[0049]
т.е..
in vivo
цис
Считают, что многие промоторные энхансерные элементы связывают ДНК-связывающие белки и/или влияют на топологию ДНК, давая локальные конформации, которые избирательно позволяют или ограничивают доступ РНК-полимеразы к ДНК-матрице, или способствуют избирательному раскрытию двойной спирали на сайте инициации транскрипции. Функцией энхансерного элемента может быть связывание транскрипционных факторов, которые регулируют транскрипцию. Некоторые энхансерные элементы связывают более одного транскрипционного фактора, и транскрипционные факторы могут взаимодействовать с различными аффинностями с более чем одним энхансерным доменом. Энхансерные элементы можно идентифицировать различными методиками, включая делеционный анализ, удаление одного или более нуклеотидов с 5' конца или со стороны промотора, анализ ДНК-связывающего белка с использованием футпринтинга ДНК-азой I, интерференцию метилирования, анализ изменения подвижности при электрофорезе, геномный футпринтинг с помощью опосредованной лигированием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и другие стандартные анализы, или с помощью анализа сходства последовательностей ДНК с использованием известных мотивов -элементов в качестве целевой последовательности или энхансерных элементов в качестве целевого мотива с помощью стандартных методов сравнения последовательностей ДНК, таких как BLAST. Тонкую структуру энхансерного домена можно дополнительно исследовать с помощью мутагенеза (или замены) одного или более нуклеотидов или другими стандартными методами, известными в данной области техники. Энхансерные элементы можно получить путем химического синтеза или выделения из регуляторных элементов, которые содержат такие элементы, и их можно синтезировать с дополнительными фланкирующими нуклеотидами, которые содержат полезные сайты ферментов рестрикции для облегчения последующей работы. Дизайн, конструкция и применение энхансерных элементов для модуляции экспрессии функционально связанных транскрибируемых молекул ДНК включены в объем настоящего изобретения.
[0050]
т.е.
В настоящем документе термин «химерный» относится к отдельной молекуле ДНК, полученной путем гибридизации первой молекулы ДНК со второй молекулой ДНК, при этом ни первая, ни вторая молекула ДНК обычно не встречаются в такой конфигурации, не слиты друг с другом. Таким образом, молекула химерной ДНК представляет собой новую молекулу ДНК, которая обычно не встречается в естественных условиях. В настоящем документе термин «химерный промотор» относится к промотору, полученному в результате такой манипуляции с молекулами ДНК. Химерный промотор может объединять два или более фрагментов ДНК; например, промотор может быть гибридизирован с энхансерным элементом. Дизайн, конструкция и применение химерных промоторов для модуляции экспрессии функционально связанных транскрибируемых молекул ДНК включены в объем настоящего изобретения.
[0051]
Химерные регуляторные элементы можно сконструировать так, чтобы они содержали различные составляющие элементы, которые могут быть функционально связаны с помощью различных известных в данной области техники способов, таких как расщепление ферментами рестрикции и лигирование, безлигазное клонирование, модульная сборка продуктов ПЦР во время амплификации или прямой химический синтез регуляторного элемента, а также других способов, известных в данной области техники. Полученные различные химерные регуляторные элементы могут иметь в своем составе такие же составляющие элементы или их варианты, но отличаться в последовательности ДНК или последовательностях ДНК, которые содержат связывающую(ие) последовательность или последовательности ДНК, которые позволяют составляющим частям быть функционально связанными. Согласно изобретению последовательности ДНК, предложенные в виде SEQ ID NO: 1-5 или 7, могут обеспечивать референсные последовательности регуляторных элементов, где составляющие элементы, которые содержат референсную последовательность, могут быть присоединены способами, известными в данной области, и могут содержать замены, делеции и/или инсерции одного или более нуклеотидов или мутации, которые естественным образом возникают при бактериально-растительной трансформации клетки.
[0052]
т.е.
т.е.
В настоящем документе термин «вариант» относится ко второй молекуле ДНК, такой как регуляторный элемент, которая по своему составу аналогична, но не идентична первой молекуле ДНК, и при этом вторая молекула ДНК все еще сохраняет общую функциональность, тот же или близкий профиль экспрессии, например, в результате большей или меньшей эквивалентности транскрипционной активности, первой молекулы ДНК. Вариант может представлять собой укороченную или усеченную версию указанной первой молекулы ДНК или измененную версию последовательности первой молекулы ДНК, например, с различными сайтами ферментов рестрикции, или внутренними делециями, заменами или инсерциями. «Вариант» может также включать регуляторный элемент, имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую замену, делецию или инсерцию одного или более нуклеотидов референсной последовательности, где производный регуляторный элемент имеет большую или меньшую или эквивалентную транскрипционную активность, чем соответствующая родительская регуляторная молекула. «Варианты» регуляторного элемента также охватывают варианты, возникшие из-за мутаций, которые естественным образом происходят при бактериально-растительной трансформации клетки. Согласно настоящему изобретению полинуклеотидные последовательности, предложенные в виде SEQ ID NO: 1-5 или 7 можно применять для создания вариантов, которые аналогичны, но не идентичны по композиции последовательности ДНК исходного регуляторного элемента, при сохранении общей функциональности, такого же или аналогичного паттерна экспрессии, как у исходного регуляторного элемента. Получение таких вариантов согласно изобретению общеизвестно специалистам в данной области техники в свете описания настоящего изобретения и входит в объем изобретения.
[0053]
Влияние модификаций, дупликаций или делеций, описанных в настоящем документе, в отношении желаемых аспектов экспрессии конкретного трансгена, можно исследовать эмпирически в анализах стабильной и транзиентной экспрессии у растений, как, например, тех, которые описаны в рабочих примерах настоящего документа, для подтверждения результатов, которые могут варьироваться в зависимости от произведенных изменений и цели изменения в исходной молекуле ДНК.
Конструкты
[0054]
т.е.
т.е
В настоящем документе термин «конструкт» означает любую рекомбинантную молекулу ДНК, такую как плазмида, космида, вирус, фаг, или линейная или кольцевая молекула ДНК или РНК, полученную из любого источника, способную к интеграции в геном или автономной репликации, которая содержит молекулу ДНК, при этом по меньшей мере одна молекула ДНК связана с другой молекулой ДНК функциональным образом, функционально связана. В настоящем документе термин «вектор» означает любой конструкт, который можно применять с целью трансформации, .встраивания в хозяйскую клетку гетерогенной ДНК или РНК. Конструкт обычно содержит по меньшей мере одну или более экспрессионную кассету. В настоящем документе «экспрессионная кассета» относится к молекуле ДНК, содержащей по меньшей мере одну транскрибируемую молекулу ДНК, функционально связанную с одним или более регуляторными элементами, обычно по меньшей мере промотором и 3'-НТО.
[0055]
В настоящем документе термин «функционально связанная» относится к первой молекуле ДНК, присоединенной ко второй молекуле ДНК, при этом эти первая и вторая молекулы ДНК расположены так, что первая молекула ДНК влияет на функцию второй молекулы ДНК. Две молекулы ДНК могут являться или могут не являться частью единой непрерывной молекулы ДНК, и могут располагаться или не располагаться рядом. Например, промотор функционально связан с транскрибируемой молекулой ДНК в случае, если промотор модулирует транскрипцию представляющей интерес транскрибируемой молекулы ДНК в клетке. Лидер, например, функционально связана с последовательностью ДНК в случае, если она обладает способностью влиять на транскрипцию или трансляцию последовательности ДНК.
[0056]
Agrobacterium tumefaciens,
A. tumefaciens
например
Escherichia coli
aadA
A. tumefaciens
Конструкты согласно изобретению могут быть предложены, в одном варианте реализации, как конструкты опухоль-индуцирующей (Ti) плазмиды с двойной границей, которые имеют правую границу (ПГ или AGRtu.RB) и левую границу (ЛГ или AGRtu.LB) участков Ti-плазмиды, выделенной из содержащие T-ДНК, которая, наряду с транспортными молекулами из клеток , позволяет интегрировать T-ДНК в геном растительной клетки (см., например, патент США 6603061). Конструкты также может содержать сегменты остова ДНК плазмиды, которые обеспечивают функцию репликации и антибиотическую селекцию в бактериальных клетках, начало репликации , , такие как ori322, начало репликации с широким диапазоном хозяев, такое как oriV или oriRi, и кодирующий участок селективного маркера, такой как Spec/Strp, который кодирует Tn7 селективный маркерный ген аминогликозид-аденилтрансферазы (), обеспечивающий устойчивость к спектиномицину или стрептомицину, или гентамицину (Gm, Gent). При трансформации растений штамм бактерии-хозяина часто представляет собой ABI, C58 или LBA4404; однако другие штаммы, известные специалистам в данной области, могут функционировать согласно изобретению.
[0057]
Agrobacterium tumefaciens
Способы сборки и введения конструктов в клетку таким образом, чтобы транскрибируемая молекула ДНК транскрибировалась в функциональную молекулу мРНК, которая транслируется и экспрессируется как белок, известны в данной области техники. Стандартные композиции и способы получения и применения конструктов и хозяйских клеток в практике согласно изобретению общеизвестны специалистам в данной области техники. Типичные векторы, применяемые для экспрессии нуклеиновых кислот у высших растений, общеизвестны в данной области техники и включают векторы, полученные из Ti-плазмиды и pCaMVCN транспортный контрольный вектор.
[0058]
Конструкт может содержать различные регуляторные элементы, включая все, предложенные в настоящем документе. Любые такие регуляторные элементы могут быть предложены в комбинации с другими регуляторными элементами. Такие комбинации можно конструировать или модифицировать для получения желаемых регуляторных свойств. В одном варианте реализации конструкты согласно изобретению содержат по меньшей мере один регуляторный элемент, функционально связанный с транскрибируемой молекулой ДНК, функционально связанной с 3'-НТО.
[0059]
Конструкты согласно изобретению могут содержать любой промотор или лидер, предложенные в настоящем документе или известные в данной области техники. Например, промотор согласно изобретению может быть функционально связан с гетерологичной нетранслируемым 5' лидером, таким как лидер, полученный из гена белка теплового шока. В качестве альтернативы, лидер согласно изобретению может быть функционально связан с гетерологичным промотором, таким как промотор транскрипта 35S вируса мозаики цветной капусты.
[0060]
Экспрессионные кассеты также могут содержать кодирующую транзитный пептид последовательность, которая кодирует пептид, который можно применять для нацеливания функционально связанного белка на субклеточную единицу, в частности, на хлоропласт, лейкопласт или другую пластидную органеллу; митохондрии; пероксисому; вакуоль или внеклеточное пространство. Многие локализованные в хлоропластах белки экспрессируются с ядерных генов как прекурсоры, и транзитный белок хлорлопласта (CTP) помогает им связаться с хлоропластом. Примеры таких выделенных белков хлоропластов включают, но не ограничиваются ими, те белки, которые связаны с малой субъединицей (SSU) рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксином, ферредоксиноксидоредуктазой, белком I и белком II светопоглощающего комплекса, тиоредоксином F и энолпирувилшикиматфосфатсинтазой (EPSPS). Транзитные белки хлоропластов описаны, например, в патенте США №7193133. Продемонстрировано, что хлоропласт может становиться мишенью не относящихся к хлоропластам белков благодаря экспрессии гетерологичного CTP, функционально связанного с трансгеном, кодирующим не относящиеся к хлоропластам белки.
Транскрибируемые молекулы ДНК
[0061]
например
В настоящем документе термин «транскрибируемая молекула ДНК» относится к любой молекуле ДНК, которая может быть транскрибирована в молекулу РНК, включая, но не ограничиваясь ими, те молекулы, которые содержат кодирующие белок последовательности, и те молекулы, на которых синтезируются молекулы РНК, содержащие последовательности, которые подходят для супрессии гена. Тип молекулы ДНК может включать, но не ограничиваться ими, молекулу ДНК, полученную из того же растения, молекулу ДНК, полученную из другого растения, молекулу ДНК, полученную из другого организма, или синтетическую молекулу ДНК, такую как молекулу ДНК, содержащую антисмысловой код гена, или молекулу ДНК, кодирующую искусственную, синтетическую или иным образом модифицированную версию трансгена. Примеры транскрибируемых молекул ДНК для встраивания в конструкт согласно настоящему изобретению включают, , молекулы ДНК или гены вида, отличного от вида, в который встроена данная молекула ДНК, или гены, которые присутствуют в одном и том же виде или происходят от него, но которые встроены в клетки-реципиенты при помощи способов генной инженерии, а не классическими методами селекции.
[0062]
«Трансген» относится к транскрибируемой молекуле ДНК, гетерологичной клетке-хозяину, по меньшей мере, относительно ее положения в геноме указанной клетки-хозяина, или транскрибируемой молекуле ДНК, искусственно встроенной в геном клетки-хозяина в текущем или любом предыдущем поколении клетки.
[0063]
например,
т.е.,
Регуляторный элемент, такой как промотор согласно изобретению, может быть функционально связан с транскрибируемой молекулой ДНК, которая гетерологична по отношению к регуляторному элементу. В настоящем документе термин «гетерологичный» относится к комбинации двух или более молекул ДНК, если такой комбинации обычно нет в естественных условиях. Например, две молекулы ДНК могут быть получены от разных видов или две молекулы ДНК могут быть получены из разных генов, различных генов от одного вида или одинаковых генов из разных видов. Регуляторный элемент, таким образом, гетерологичен по отношению к функционально связанной транскрибируемой молекулы ДНК, если такой комбинации обычно нет в естественных условиях, транскрибируемая молекула ДНК обычно не связана функционально с регуляторным элементом.
[0064]
Транскрибируемая молекула ДНК в целом может представлять собой любую молекулу ДНК, для которой желательна экспрессия транскрипта. Такая экспрессия транскрипта может приводить к трансляции полученной молекулы мРНК и, таким образом, к экспрессии белка. В качестве альтернативы, например, транскрибируемую молекулу ДНК можно разработать таким образом, чтобы в конечном итоге обеспечивать снижение экспрессии конкретного гена или белка. В одном варианте реализации этого можно достигнуть, применив транскрибируемую молекулу ДНК, которая ориентирована в антисмысловом направлении. Обычный специалист в данной области техники хорошо знаком с применением такой антисмысловой технологии. Любой ген можно негативно регулировать таким образом, и в одном варианте реализации транскрибируемую молекулу ДНК можно разработать для супрессии определенного гена посредством экспрессии молекулы дцРНК, малой РНК или микроРНК.
[0065]
Таким образом, один вариант реализации изобретения представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую регуляторный элемент согласно изобретению, такой как регуляторные элементы, предложенные в виде SEQ ID NO: 1-5 или 7, функционально связанные с гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК, для того чтобы модулировать транскрипцию молекулы ДНК на желаемом уровне или в желаемом паттерне, когда конструкт интегрирован в геном клетки трансгенных растений. В одном варианте реализации транскрибируемая молекула ДНК содержит кодирующий белок участок гена, а в другом варианте реализации транскрибируемая молекула ДНК содержит антисмысловой участок гена.
Гены, представляющие интерес с точки зрения агрономии
[0066]
Транскрибируемая молекула ДНК может являться геном, представляющим интерес с точки зрения агрономии. В настоящем документе термин «ген, представляющий интерес с точки зрения агрономии» относится к транскрибируемой молекуле ДНК, которая при экспрессии в определенной ткани растения, клетке или типе клеток обеспечивает желаемую характеристику. Продукт гена, представляющего интерес с точки зрения агрономии, может действовать внутри растения, оказывая воздействие на морфологию, физиологию, рост, развитие, урожайность, состав зерна, пищевые характеристики, устойчивость к заболеваниям или вредителям, невосприимчивость к воздействию окружающей среды или химическим веществам данного растения, или может действовать как пестицид при питании вредителя, который поедает данное растение. В одном варианте реализации изобретения регуляторный элемент согласно изобретению встроен в конструкт таким образом, что регуляторный элемент функционально связан с транскрибируемой молекулой ДНК, которая является геном, представляющим интерес с точки зрения агрономии. В трансгенном растении, содержащем такой конструкт, экспрессия гена, представляющего интерес с точки зрения агрономии, может придавать полезное с точки зрения агрономии свойство. Полезный с точки зрения агрономии признак может включать, например, но не ограничиваться ими, устойчивость к гербицидам, борьбу с насекомыми-вредителями, модифицированную урожайность, устойчивость к заболеваниям, устойчивость к патогенам, рост и развитие модифицированных растений, содержание модифицированного крахмала, содержание модифицированного масла, содержание модифицированных жирных кислот, содержание модифицированного белка, созревание модифицированных плодов, улучшенную питательность для животных и человека, продукцию биополимеров, устойчивость к экологическому стрессу, фармацевтические пептиды, улучшенные характеристики обработки, улучшенный вкус, технологию получения гибридных семян, улучшенную продукцию волокна и продукцию желаемого биотоплива.
[0067]
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
Известные в данной области техники примеры генов, представляющих интерес с точки зрения агрономии, включают гены устойчивости к гербицидам (, Патенты США №№.6803501, 6448476, 6248876, 6225114, 6107549, 5866775, 5804425, 5633435, и 5463175), повышенной урожайности (, Патенты США №№. USRE38446, 6716474, 6663906, 6476295, 6441277, 6423828, 6399330, 6372211, 6235971, 6222098, и 5716837), борьбы с насекомыми-вредителями (, Патенты США №№. 6809078, 6713063, 6686452, 6657046, 6645497, 6642030, 6639054, 6620988, 6593293, 6555655, 6538109, 6537756, 6521442, 6501009, 6468523, 6326351, 6313378, 6284949, 6281016, 6248536, 6242241, 6221649, 6177615, 6156573, 6153814, 6110464, 6093695, 6063756, 6063597, 6023013, 5959091, 5942664, 5942658 5880275, 5763245, и 5763241), устойчивости к грибковым заболеваниям (, Патенты США №№. 6653280, 6573361, 6506962, 6316407, 6215048, 5516671, 5773696, 6121436, 6316407, и 6506962), устойчивости к вирусам (, Патенты США №№. 6617496, 6608241, 6015940, 6013864, 5850023, и 5304730), устойчивости к нематодам (, патент США №6228992), устойчивости к бактериальным заболеваниям (, патент США №5516671), роста и развития растения (, Патенты США №№. 6723897 и 6518488), продукции крахмала (, Патенты США №№. 6538181, 6538179, 6538178, 5750876, 6476295), продукции модифицированных масел (, Патенты США №№. 6444876, 6426447, и 6380462), высокой продукции масел (, Патенты США №№. 6495739, 5608149, 6483008, и 6476295), содержания модифицированных жирных кислот (, Патенты США №№. 6828475, 6822141, 6770465, 6706950, 6660849, 6596538, 6589767, 6537750, 6489461, и 6459018), высокой продукции белка (, патент США №6380466), созревания плодов (Патент США №5512466), повышенной питательности для животных и людей (, Патенты США №№. 6723837, 6653530, 6541259, 5985605, и 6171640), биополимеров (, Патенты США №№. USRE37543, 6228623, и 5958745 и 6946588), устойчивости к экологическим стрессам (, патент США №6072103), фармацевтических пептидов и секретируемых пептидов (, Патенты США №№. 6812379, 6774283, 6140075, и 6080560), улучшенных характеристик обработки (, патент США №6476295), улучшенной перевариваемости (, патент США №6531648) низкой раффинозы (, патент США №6166292), промышленной продукции ферментов (, патент США №5543576), улучшенного вкуса (, патент США №6011199), фиксации азота (, патент США №5229114), продукции гибридных семян (, патент США №5689041), продукции волокон (, Патенты США №№6576818, 6271443, 5981834, и 5869720) и продукции биотоплива (, патент США №5998700).
[0068]
см., например
например
например
см., например
В качестве альтернативы, ген, представляющий интерес с точки зрения агрономии, может влиять на вышеупомянутые характеристики растений или фенотипов путем кодирования молекулы РНК, которая вызывает целенаправленную модуляцию экспрессии эндогенного гена, например, с помощью антисмысловой (, патент США 5107065); ингибиторную РНК («РНКи», включая модуляцию экспрессии гена с помощью механизмов, опосредованных микроРНК, миРНК, транс-действующими миРНК и фазированными малыми РНК, , как описано в опубликованных заявках США 2006/0200878 и 2008/0066206 и в заявке на патент США 11/974 469); или с помощью опосредованных косупрессией механизмов, опосредуемые косупрессией. РНК также может представлять собой каталитическую молекулу РНК (, рибозим или рибопереключатель; , США 2006/0200878), сконструированный для расщепления желаемого эндогенного продукта мРНК. Способы конструирования и введения конструктов в клетку таким образом, чтобы транскрибируемая молекула ДНК транскрибировалась в молекулу, которая способна вызывать супрессию гена, известны в данной области техники.
Селективные маркеры
[0069]
С регуляторными элементами согласно изобретению можно также применять селективный маркер трансгенов. В настоящем документе термин «селективный маркер трансгена» относится к любой транскрибируемой молекуле ДНК, экспрессию которой или же ее отсутствие в трансгенном растении, ткани или клетке можно выявить при помощи скрининга или оценить каким-либо образом. Селективные маркеры генов и связанные с ними методы селекции и скрининга, применяющиеся в практике изобретения, известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, транскрибируемые молекулы ДНК, кодирующие β-глюкуронидазу (GUS), зеленый флюоресцентный белок (GFP), белки, которые обуславливают устойчивость к антибиотикам, и белки, которые обуславливают устойчивость к гербицидам. Пример селективного маркера трансгена предложен в виде SEQ ID №: 6.
Клеточная трансформация
[0070]
Настоящее изобретение также относится к способу получения трансформированных клеток и растений, которые содержат по меньшей мере один или более регуляторный(х) элемент(ов), функционально связанный(х) с транскрибируемой молекулой ДНК.
[0071]
Термин «трансформация» относится к введению молекулы ДНК в реципиента-хозяина. В настоящем документе термин «хозяин» относится к бактериям, грибам или растениям, включая любые клетки, ткани, органы или потомство бактерий, грибов или растений. Растительные клетки и ткани растений, представляющие особый интерес, включают протопласты, каллусы, корни, клубни, семена, стебли, листья, саженцы, эмбрионы и пыльцу.
[0072]
В настоящем документе термин «трансформированный» относится к клетке, ткани, органу или организму, в который была введена чужеродная молекула ДНК, как, например, конструкт. Введенная молекула ДНК может быть интегрирована в геномную ДНК клетки-реципиента, ткани, органа или организма, так что введенная молекула ДНК наследуется последующим потомством. «Трансгенная» или «трансформированная» клетка или организм может также включать потомство данной клетки или организма и потомство, полученное в результате программ разведения с использованием такого трансгенного организма в качестве родителя при скрещивании, и проявляющее измененный фенотип, возникающий в результате присутствия чужеродной молекулы ДНК. Введенная молекула ДНК также может быть временно интегрирована в клетку-реципиент, так что введенная молекула ДНК не наследуется последующим потомством. Термин «трансгенный» относится к бактерии, грибу или растению, содержащему по меньшей мере одну или более гетерологичную(ые) молекулу(ы) ДНК.
[0073]
например
Agrobacterium
например
например
Существует много способов введения молекул ДНК в растительные клетки, общеизвестных специалистам. Обычно этот процесс включает стадии отбора подходящей клетки-хозяина, трансформации клетки-хозяина вектором и получения трансформированной клетки-хозяина. Способы и материалы для трансформации растительных клеток путем введения растительного конструкта в геном растения в практике настоящего изобретения могут включать любой из общеизвестных и продемонстрированных способов. Подходящие способы включают, но не ограничиваются ими, бактериальную инфекцию (, ), бинарные векторы BAC, прямую доставку ДНК (, с помощью ПЭГ-опосредованной трансформации, поглощение ДНК, опосредованное сушкой/ингибированием, электропорацию, возбуждение карбидокремниевыми волокнами и ускорение покрытых ДНК частиц), редактирования генов (, систем CRISPR-Cas), среди прочих.
[0074]
Клетки-хозяева могут представлять собой любую клетку или организм, как, например, растительную клетку, клетку водоросли, водоросль, клетку гриба, гриб, бактериальную клетку или клетку насекомых. В конкретных вариантах реализации клетки-хозяева и трансформированные клетки могут включать клетки, полученные из культурных растений.
[0075]
Трансгенное растение затем можно регенерировать из трансгенной растительной клетки согласно настоящему изобретению. Используя традиционные методы разведения или самоопыления, можно получить семена из такого трансгенного растения. Такие семена и полученное растение-потомок, выращенное из таких семян, будут содержать рекомбинантную молекулу ДНК согласно настоящему изобретению и, следовательно, будут трансгенными.
[0076]
т.е.
см., например
Principles of Plant Breeding
Principles of Crop Improvement
Plant breeding Perspectives
Soybeans: Improvement, Production and Uses
Principles of Variety Development
Theory and Technique,
Crop Species Soybean
Трансгенные растения согласно настоящему изобретению могут самоопыляться, обеспечивая семена для гомозиготных трансгенных растений согласно настоящему изобретению (гомозиготные по рекомбинантной молекуле ДНК), или могут скрещиваться с растениями, не являющимися трансгенными, или различными трансгенными растениями, обеспечивая семена для гетерозиготных трансгенных растений согласно настоящему изобретению (гетерозиготные по рекомбинантной молекуле ДНК). Как гомозиготные, так и гетерозиготные трансгенные растения упоминаются в настоящем документе как «растения-потомки». Растения-потомки представляют собой трансгенные растения, происходящие от исходного трансгенного растения и содержащие рекомбинантную молекулу ДНК согласно изобретению. Семена, получаемые с применением трансгенного растения согласно изобретению, можно собрать и применить для выращивания поколений трансгенных растений, растительного потомства согласно изобретению, включая конструкт согласно настоящему изобретению и экспрессию гена, представляющего интерес с точки зрения агрономии. Описания способов размножения, которые обычно применяют для разных культур, можно найти в одном из нескольких справочников: , Allard, , John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, , Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep и Hendriksen, , Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, , 2-е издание, монография, 16:249 (1987); Fehr, , (Vol. 1) и (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
[0077]
Трансформированные растения можно исследовать на присутствие представляющего интерес гена или генов и уровня и профиля экспрессии, обеспечиваемого регуляторными элементами согласно настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники известны многочисленные способы, доступные для исследования трансформированных растений. Например, способы анализа растений включают, но не ограничиваются ими, саузерн-блоты или нозерн-блоты, анализы на основе ПЦР, биохимические анализы, способы скрининга по фенотипу, полевые оценки и иммунодиагностические анализы. Экспрессию транскрибируемой молекулы ДНК можно измерить с применением TaqMan (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния), реакивы и способы описаны производителем, и при помощи определения времени ПЦР-циклов с применением TaqMan TestingMatrix. В качестве альтернативы, для оценки экспрессии трансгена можно применять Invader (Third Wave Technologies, Madison, WI), реактивы и способы описаны производителем.
[0078]
Согласно настоящему изобретению также предложены части растения согласно изобретению. Части растений включают, но не ограничиваются ими, листья, стебли, корни, клубни, семена, эндосперм, семязачаток и пыльцу. Части растений согласно изобретению могут быть жизнеспособными, нежизнеспособными, способными к регенерации и неспособными к регенерации. Согласно изобретению также включены и предложены трансформированные растительные клетки, содержащие молекулу ДНК согласно изобретению. Трансформированные или трансгенные растительные клетки согласно изобретению включают способные к регенерации и неспособные к регенерации растительные клетки.
[0079]
Согласно изобретению также предложен товарный продукт, который получен из трансгенного растения или его части, содержащего(ей) рекомбинантную молекулу ДНК согласно настоящему изобретению. Товарные продукты согласно изобретению содержат детектируемое количество ДНК, содержащей последовательность ДНК, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-5 или 7. В настоящем документе «товарный продукт» относится к любой композиции или продукту, которая(ый) состоит из материала, полученного из трансгенного растения, семени, растительной клетки или части растения, содержащего(ей) рекомбинантную молекулу ДНК согласно настоящему изобретению. Товарные продукты включают, но не ограничиваются ими, обработанные семена, зерна, части растений и шрот. Товарный продукт согласно изобретению будет содержать детектируемое количество ДНК, соответствующее рекомбинантной молекуле ДНК согласно изобретению. Детекцию одной или более из таких ДНК в образце можно применять для определения содержимого товарного продукта или его источника. Можно применять любой стандартный способ детекции молекул ДНК, включая способы детекции, описанные в настоящем документе.
[0080]
Изобретение можно лучше понять, обратившись к следующим примерам, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, если не указано иное. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методики, описанные в следующих примерах, представляют собой методики, которые, как обнаружили авторы изобретения, хорошо работают при реализации изобретения. Однако специалистам в данной области техники в свете настоящего описания должно быть понятно, что в конкретные варианты реализации, описанные в настоящем документе, можно внести много изменений и, тем не менее, получить аналогичные или сходные результаты без отступления от сущности и объема изобретения, поэтому всю информацию, изложенную или показанную здесь, следует интерпретировать как иллюстративную, а не как ограничивающую.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Идентификация и клонирование регуляторных элементов
[0081]
Bouteloua gracilis
Новые регуляторные элементы транскрипции и группа регуляторных элементов экспрессии (EXP) были идентифицированы и клонированы из геномной ДНК однодольных растений .
[0082]
Bouteloua gracilis
Применяя идентифицированные последовательности, проводили биоинформационный анализ для идентификации регуляторных элементов в амплифицированной ДНК. Например, проводили биоинформационный анализ для идентификации сайта начала транскрипции (TSS) и любой двунаправленной, интронной или расположенной выше кодирующей последовательности, присутствующей в данной последовательности. Используя результаты данного анализа, в последовательности ДНК определили регуляторные элементы и разработали праймеры для амплификации регуляторных элементов. Соответствующие молекулы ДНК для регуляторных элементов амплифицировали с использованием стандартных условий полимеразной цепной реакции с праймерами, содержащими уникальные сайты ферментов рестрикции, и геномной ДНК, выделенной из . Полученные фрагменты ДНК лигировали в базовые растительные векторы экспрессии с применением стандартных способов расщепления ферментом рестрикции совместимого сайта рестрикции и лигирования ДНК.
[0083]
Анализ регуляторного элемента TSS и границ сплайсинга интрон/экзон можно провести с применением ткани трансформированного растения. Вкратце, растения трансформируют растительными векторами экспрессии, содержащими клонированные фрагменты ДНК, функционально связанные с гетерологичной транскрибируемой молекулой ДНК. Затем применяют 5'-RACE Систему для быстрой амплификации кДНК-концов, версия 2.0 (5' RACE System for Rapid Amplification of cDNAEnds, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, 92008) для подтверждения регуляторного элемента TSS и границы сплайсинга интрон/экзон путем анализа последовательности ДНК по полученным транскриптам мРНК.
[0084]
Bouteloua gracilis,
Bouteloua gracilis,
Последовательность ДНК, кодирующая группу транскрипционных регуляторных элементов экспрессии или последовательность EXP, полученную из предполагаемого гена убиквитина которая содержит промоторный элемент, функционально связанный с интронным элементом, представлена в таблице 1, вместе со своим соответствующим промотором, лидером и интроном. 3'-НТО, соответствующая предполагаемому гену убиквитина также представлена в таблице 1.
Таблица 1. Транскрипционная группа регуляторных элементов экспрессии, промотор, лидер, интрон и 3'-НТО, выделенные из
Bouteloua gracilis
Описание
SEQ ID NO:
Описание и/или регуляторные элементы EXP, связанные в 5 '→ 3' направлении (SEQ ID NO:)
EXP-BOUgr.Ubq:2
1
EXP: P-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 2); L-BOUgr.Ubq:1 (SEQ ID NO: 3); I-BOUgr.Ubq:1 (SEQ ID NO: 4)
P-BOUgr.Ubq:2
2
Промотор
L-BOUgr.Ubq:1
3
Лидер
I-BOUgr.Ubq:1
4
Интрон
T-BOUgr.Ubq:1
5
3'-НТО
Пример 2
Анализ регуляторных элементов, стимулирующих экспрессию GUS в стабильно трансформированных растениях кукурузы
[0085]
Растения кукурузы трансформировали вектором, а именно растительным вектором экспрессии, содержащим исследуемый регуляторный элемент, стимулирующий экспрессию трансгена β-глюкуронидазы (GUS). В полученных растениях анализировали экспрессию белка GUS, чтобы оценить влияние выбранных регуляторных элементов на экспрессию.
[0086]
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Растения кукурузы трансформировали с помощью растительного экспрессионного конструкта GUS. Регуляторные элементы клонировали в базовый растительный вектор экспрессии с применением стандартных способов, известных в данной области техники. Полученный вектор экспрессии растений содержал левую пограничную область из (левая граница B-AGRtu), первую трансгенную селективную кассету, используемую для отбора трансформированных растительных клеток, которая придает устойчивость к гербициду глифосату; вторую трансгенную кассету для оценки активности регуляторного элемента, которая содержала EXP-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 1), функционально связанный 5' с синтетической кодирующей последовательностью, разработанной для экспрессии в расительной клетке, кодирующей β-глюкуронидазу (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 6) и содержащей процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифичного гена картофеля ST-LS1 (Genbank Accession: X04753), функционально связанного 5' с 3' участком терминации, T-BOUgr.Ubq:1 (SEQ ID NO: 5); и правой пограничной областью из (правая граница B-AGRtu).
[0087]
Agrobacterium
Растительные клетки кукурузы трансформировали с применением бинарного векторного конструкта, описанного выше, при помощи опосредованной трансформации, как общеизвестно в данной области техники. Из полученных трансформированных клеток стимулировали образование целого растения кукурузы.
[0088]
Гистохимический анализ GUS применяли для качественного и количественного анализа экспрессии трансформированных растений. Цельные тканевые срезы инкубировали с окрашивающим GUS раствором X-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил-b-глюкуронид) (1 миллиграмм/миллилитр) в течение подходящего отрезка времени, промывали и визуально проверяли на наличие синей окраски. Активность GUS качественно определяли при помощи прямого визуального осмотра или осмотра под микроскопом с применением отобранных органов и тканей растения.
[0089]
Для количественного анализа экспрессии GUS из отобранных тканей трансформированных растений кукурузы экстрагировали общий белок. Один микрограмм общего белка использовали с флюорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-β-D-glucuronide (MUG) в общем реакционном объеме 50 микролитров. Продукт реакции, 4-метилумбеллиферон (4-MU), проявляет максимальный уровень флюоресценции при высоком рН, когда ионизирована гидроксильная группа. Добавление основного раствора карбоната натрия одновременно останавливает анализ и регулирует рН для количественного определения продукта флюоресценции. Флуоресценцию измеряли с помощью излучения при 365 нм, эмиссии при 445 нм с использованием Fluoromax-3 с ридером Micromax Reader, с шириной щели, установленной при излучении 2 нм и при эмиссии 3 нм. Значения приведены в единицах нмоль GUS/час/мг общего белка.
[0090]
0
Для экспрессии GUS в поколении R отобрали следующие ткани: стадия V4 листьев и корней; стадия V7 листьев и корней; стадия VT цветка/пыльников, листьев и корней; R1 стадия початка и нитевидных рылец; стадия R3 зародышей семян и эндосперма через 21 день после опыления (DAP). В таблице 2 ниже показано средняя количественная экспрессия GUS для всех отобранных тканей, стимулированных трансгенной кассетой с регуляторным элементом, содержащей EXP-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 1) и T-BOUgr.Ubq:1 (SEQ ID NO: 5).
Таблица 2. Средняя количественная экспрессия GUS в стабильно трансформированной кукурузе, стимулированной регуляторными элементами, полученными из
Bouteloua gracilis
Стадия
Орган
Среднее
Стандартная ошибка
V4
Лист
2552,55
895,34
Корень
6476,58
1383,15
V7
Лист
3622,05
1091,84
Корень
3953,61
1121,73
VT
Цветок, пыльники
9207,81
1587,9
Лист
8795,48
1795,25
Корень
4123,47
1207,1
R1
Початок, нитевидное рыльце
5994,73
1548,68
R3
Семя, 21DAP, Em
10338,8
1592,33
Семя, 21DAP, En
11249,6
746,08
[0091]
Как можно видеть из таблицы 2, наиболее высокий уровень экспрессии, связанный с регуляторными элементами, наблюдали в зародышах семян и эндосперме на стадиях R3, 21 DAP. Высокую экспрессию наблюдали также в стадии VT цветков, пыльников и листьев. Экспрессия в листьях, по-видимому, возрастала в листьях от стадии V4 до стадии V7. Экспрессия в корнях, по-видимому, снижалась от стадии V4 до стадии V7, а затем оставалась одинаковой от стадии V7 до стадии VT.
Пример 3
Энхансерные элементы, полученные из регуляторных элементов
[0092]
cis
Энхансеры, полученные из промоторного элемента, представлены в виде SEQ ID NO: 2. Энхансерный элемент может содержать один или более регуляторный элемент, который, будучи функционально связан 5' или 3' с промоторным элементом или функционально связан 5' или 3' с дополнительными энхансерными элементами, которые функционально связаны с промотором, может усиливать или модулировать уровни экспрессии транскрибируемой молекулы ДНК или обеспечивать экспрессию транскрибируемой молекулы ДНК в определенном типе клеток или органе растения, или на определенной временной точке развития или циркадного ритма. Энхансеры создают путем удаления из промоторов TATA-бокса или функционально подобных элементов и любой последовательности в прямом направлении считывания, что позволяет инициировать транскрипцию от промотора, представленного в виде SEQ ID NO: 2 или ее фрагментов.
[0093]
TATA-бокс в промоторах растений не является настолько высококонсервативным, как в некоторых других эукариотических организмах. Следовательно, для определения фрагмента в качестве энхансера для начала необходимо идентифицировать сайт начала транскрипции (TSS) гена, при этом сначала транскрибируют 5'-НТО. Например, транскрипционный регуляторный элемент, EXP-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 1), содержит промоторный элемент, P-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 2), функционально связанный с 5'-НТО или лидерным элементом, L-BOUgr.Ubq:1 (SEQ ID NO: 3), который функционально связан с интронным элементом, I-BOUgr.Ubq:1 (SEQ ID NO: 4). В пределах 1095 пар оснований промоторного элемента, P-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 2), предполагаемый основной ТАТА-подобный элемент обнаружен в пределах нуклеотидов от 1046 до 1053. Энхансерный фрагмент, полученный из P-BOUgr.Ubq:2, может содержать нуклеотиды от 1 до 1045 из SEQ ID NO: 2, что дает последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 7 (E-BOUgr.Ubq). Энхансеры, полученные из промотора, P-BOUgr.Ubq:2 (SEQ ID NO: 2), могут дополнительно содержать менее крупные фрагменты E-BOUgr.Ubq (SEQ ID NO: 7). Эффективность энхансерных элементов, полученных из промотора, P-BOUgr.Ubq:2, эмпирически определяют, конструируя химерный транскрипционный регуляторный элемент, содержащий энхансер, полученный из промотора, P-BOUgr.Ubq:2, который функционально связан с промотором и лидером последовательностью и используется для стимуляции экспрессии транскрибируемой молекулы ДНК, такой как GUS, в анализе стабильных или транзиентных растений.
[0094]
Может быть необходимо дополнительное усовершенствование энхансерного элемента, проверяемое эмпирически. Кроме того, положение энхансерного элемента относительно других элементов в химерном транскрипционном регуляторном элементе также определяют эмпирически, поскольку порядок каждого элемента в химерном транскрипционном регуляторном элементе может оказывать различное влияние в зависимости от относительного положения каждого элемента. Некоторые промоторные элементы будут содержать много TATA-боксов или подобных TATA-боксу элементов и, возможно, много сайтов начала транскрипции. В таких обстоятельствах может оказаться необходимым вначале идентифицировать местоположение первого TSS, а затем начать конструирование энхансеров с применением первого TSS для предотвращения возможной инициации транскрипции в предполагаемом энхансерном элементе.
[0095]
Agrobacterium tumefaciens
Oryza sativa
A. tumefaciens
Энхансерные элементы, полученные из промоторного элемента, представленного в виде SEQ ID NO: 2, клонируют с применением известных в данной области техники способов так, чтобы они были функционально связаны 5' или 3' с промоторным элементом или функционально связаны 5' или 3' с дополнительными энхансерными элементами, которые функционально связаны с промотором. В качестве альтернативы, энхансерные элементы можно клонировать с применением способов, известных в данной области техники, для обеспечения большего по размеру энхансерного элемента, который содержит две или более копии энхансера и клонирован с применением способов, известных в данной области техники, так чтобы быть функционально связанным 5' или 3' с дополнительными энхансерными элементами, которые функционально связаны с промотором, что приводит к получению химерного транскрипционного регуляторного элемента. Энхансерные элементы также можно клонировать с применением известных в данной области техники способов, так чтобы они были функционально связаны 5' с промоторным элементом, полученным из организма другого рода, или функционально связаны 5' или 3' с дополнительными энхансерными элементами, полученными из организмов другого рода, которые функционально связаны с промотором, полученным либо из организма того же рода, либо из организма другого рода, что приводит к получению химерного транскрипционного регуляторного элемента. Растительный трансформационный вектор экспрессии GUS можно сконструировать с применением известных в данной области техники способов подобно конструкту, описанному в Примере 2, в котором полученные растительные векторы экспрессии содержат левый пограничный участок из (B-AGRtu.l левая граница), первую трансгенную селективную кассету, используемую для отбора трансформированных растительных клеток, которая придает устойчивость к гербициду глифосату; и вторую трансгенную кассету для оценки активности регуляторного элемента, содержащую энхансерный элемент, функционально связанный 5' или 3' с промоторным элементом или функционально связанный 5' или 3' с дополнительными энхансерными элементами, которые в свою очередь функционально связаны с промотором который функционально связан 5' с лидерным элементом, функционально связанным 5' с интронным элементом, функционально связанным с последовательностью, кодирующей β-глюкуронидазу (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 6), содержащую процессируемый интрон, полученный из светоиндуцируемого тканеспецифичного гена картофеля ST-LS1 (Genbank Accession: X04753), функционально связанный 3' с участком терминации из гена белка, подобного белку-переносчику липидов (T-Os.LTP:1, SEQ ID NO: 8); и правым пограничным участком из (B-AGRtu. правая граница). Полученные плазмиды применяют для трансформации растений кукурузы или других родов растений способами, описанными выше. В качестве альтернативы, клетки протопласта, полученные из растения сои или других родов растений, трансформируют с применением способов, известных в данной области техники, для проведения анализов транзиентности экспрессии.
[0096]
Экспрессию GUS, опосредованную регуляторным элементом, содержащим по меньшей мере один энхансер, оценивают в анализах на определение стабильности или транзиентности экспрессии у растений для определения влияния энхансерного элемента на экспрессию транскрибируемой молекулы ДНК. Модификации одного или более энхансерных элементов или дупликации одного или более энхансерного элемента можно осуществить на основе эмпирического эксперимента и полученной регуляции экспрессии генов, которую наблюдают при применении каждой композиции регуляторных элементов. Изменение относительного положения одного или более энхансера в полученных регуляторных или химерных регуляторных элементах может влиять на транскрипционную активность или специфичность регуляторного или химерного регуляторного элемента, и это определяют эмпирически, чтобы идентифицировать наилучшие энхансеры для желаемого профиля экспрессии трансгена в растении кукурузы или растении другого рода.
Пример 4
Анализ интронного усиления активности GUS с применением полученных из растений протопластов.
[0097]
Интрон выбирают на основе экспериментов и сравнения с лишенным интрона контрольным вектором экспрессии, чтобы эмпирически выбрать интрон и конфигурацию расположения элемента внутри транспортного вектора ДНК (T-ДНК) для оптимальной экспрессии трансгена. Например, при экспрессии гена устойчивости к гербицидам, например CP4, который обеспечивает переносимость глифосфата, желательно получить трансгенную экспрессию в репродуктивных тканях, а также вегетативных тканях, для предотвращения потери урожайности при применении гербицидов. Интрон в данном случае отбирают по его способности при функциональном связывании с конститутивным промотором усиливать экспрессию трансгена, обеспечивающего устойчивость к гербицидам, в частности в репродуктивных клетках и тканях трансгенного растения, тем самым обеспечивая как вегетативную, так и репродуктивную переносимость обработки гербицидом у трансгенного растения. В большинстве генов убиквитина 5'-НТО содержит лидер, который имеет внутри интронную последовательность. Поэтому регуляторные элементы, полученные из таких генов, исследуют с использованием полной 5'НТО, содержащей промотер, лидер и интрон. Чтобы добиться различных профилей экспрессии или модулировать уровень экспрессии трансгена, интрон из такого регуляторного элемента можно удалить или заменить на гетерологичный интрон.
[0098]
Интрон I-BOUgr.Ubq:1, представленный в настоящем документе в виде SEQ ID NO: 4, идентифицируют с использованием контигов геномной ДНК в сравнении с кластерами экспрессируемых последовательностей с метками или контигами кДНК, чтобы идентифицировать экзонные и интронные последовательности в геномной ДНК. Кроме того, 5'-НТО или лидер также используют для определения границы сплайсинга интрон/экзон одного или более интронов в условиях, когда последовательность гена кодирует лидерную последовательность, которую прерывает один или более интронов. Интроны клонируют с применением известных в данной области техники способов в растительный трансформационный вектор так, чтобы они были функционально связаны 3' с регуляторным элементом и фрагментом лидера и функционально связаны 5' либо с вторым фрагментом лидера, либо с кодирующими последовательностями.
[0099]
Как обсуждали выше, может быть предпочтительно избегать использования нуклеотидной последовательности АТ или нуклеотида А непосредственно перед 5'-концом сайта сплайсинга (GT), и нуклеотида G или нуклеотидной последовательности TG, соответственно, сразу после 3' конца сайта сплайсинга (AG), чтобы исключить возможность появления нежелательных стартовых кодонов во время процессинга матричной РНК в конечный транскрипт. Таким образом, можно модифицировать последовательности ДНК рядом с 5' или 3' концами сайтов границ сплайсинга.
[00100]
например
A. tumefaciens
Agrobacterium
Усиливающее влияние интронов оценивают по их способности усиливать экспрессию в анализе стабильно трансформированных растений. Для транзиентного анализа усиливающего влияния интронов конструируют базовый растительный вектор с применением известных в данной области техники способов, Интрон клонируют в базовый растительный вектор, аналогичный описанному в Примере 2, который имеет экспрессионную кассету, содержащую конститутивный промотор, такой как энхансерный промотор вируса мозаики цветной капусты, и лидер P+L-CaMV.35S-enh (SEQ ID NO: 9), функционально связанную 5' с исследуемым интронным элементом (., SEQ ID NO: 4), функционально связанным с последовательностью, кодирующей GUS, которая имеет процессируемый интрон (GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1, SEQ ID NO: 6), функционально связанный с 3'-НТО нопалинсинтазы из (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 10); и вторую экспрессионную кассету для селекции трансформированных растительных клеток. Растительные клетки кукурузы трансформируют с применением бинарного векторного конструкта, описанного выше, при помощи опосредованной трансформации, как общеизвестно в данной области техники. Из полученных трансформированных клеток стимулировали образование целого растения кукурузы. Трансформанты с одной копией или малым количеством копий отбирают для сравнения с растениями с одной копией или малым количеством копий, трансформированными растительным трансформационным вектором, идентичным исследуемому вектору, но без исследуемого интрона, чтобы определить, обеспечивает ли интрон эффект усиления, опосредованный интроном.
[00101]
Интрон I-BOUgr.Ubq:1, представленный в настоящем документе в виде SEQ ID NO: 4, можно изменить различными способами, такими как удаление фрагментов в интронной последовательности, которые могут снизить экспрессию или дупликацию фрагментов с интроном, которые могут усиливать экспрессию. Кроме того, последовательности ДНК внутри интрона, которые могут влиять на специфичность экспрессии в определенных типах клеток или тканей и органов, можно дуплицировать или изменить или удалить, чтобы повлиять на экспрессию и паттерны экспрессии трансгена. Кроме того, предложенный в настоящем документе интрон можно модифицировать, чтобы удалить любые потенциальные стартовые кодоны (ATG), которые могут привести к возникновению незапланированных транскриптов при их экспрессии со сплансированных не должным образом интронов, как то к отличающимся, более длинным или усеченным белкам. После того как интрон эмпирически исследовали или изменили на основе экспериментов, интрон применяют для усиления экспрессии трансгена в стабильно трансформированных растениях, которые могут относиться как к родам однодольных, так и к родам двудольных растений, до тех пор пока интрон обеспечивает усиление трансгена. Интрон можно также применять для усиления экспрессии в других организмах, таких как водоросли, грибы или клетки животных до тех пор, пока интрон обеспечивает усиление или ослабление или специфичность экспрессии трансгена, с которым он функционально связан.
[00102]
На основании иллюстрации и описания принципов настоящего изобретения специалистам в данной области техники должно быть понятно, что настоящее изобретение можно модифицировать в структуре и деталях без отступления от его принципов. Мы заявляем права на все модификации, в пределах сущности и объема формулы изобретения. Все цитируемые в настоящем документе публикации и опубликованные патентные документы включены в него посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была особо и отдельно указана как включенная посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Monsanto Technology, LLC
<120>  РАСТИТЕЛЬНЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  MONS:419WO
<150>  US 62/340,656
<151>  2016-05-24
<160>  10
<170>  PatentIn, версия3.5
<210>  1
<211>  2066
<212>  ДНК
<213>  Bouteloua gracilis
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(2066)
<223>  Последовательность ДНК группы регуляторных элементов экспрессии, содержащая промотор, лидер и интрон, функционально связанные и полученные из предполагаемого гена убиквитина бутелоа изящной.
<400>  1
tacgagcaaa cgcacaaccg ggatacagat ctacggtaca gaggttactt ccaacgggaa       60
ggttcccgtc cctctagcgc aagcaagacg acgcagagat ggtgaccaaa aacgattctt      120
tgctttacct ggtcatgaca ccaccggata cggataagaa ggaaaaccgg agcatctcta      180
gcaatagaga aatcgacgtt gcctcctaga ggaagaaagc gacggcctat gcttttttct      240
tttgtcgatg attccactga attgtttctc tatttttttc gttgtgtaat ggtcctggta      300
caaacgttca tccaatcatg caacttgcaa gaataaaaat aaaaaatata atctcagacg      360
tccaatcatg gcttcctaaa aaaataaaaa ggacgagaaa ctactcagaa aaaataaata      420
aatacacaac tgtaggaacc aaagcaaagt tgacaaggaa ccaaagcaag gcaggtccac      480
atgtgctgcg agcaggtgcg cctcctcctc cgtttcttcg ccttgctaat cacgtcgcta      540
aatacagagg ccgacttaag aatgccgaca tggcaatttt gctggatatt tttgcttcct      600
tgtagtatca aacagaagaa tattaacgtg ggagtataca gtaattttct tttaccattt      660
ttctttaatc gcgtttttgt tcaaccaaac acaactttag acgtactagt actccactat      720
tttttatttt attttctcct acagtacttt tgaaaaaaag gaatcttgtc atgcatgatt      780
gagatcacgg taacggcgac tcacgccgcc gcacgggtaa cggccaccaa ccaaaagtag      840
caaacggcgt caacctcctc gacatctccg cgtcgctttt ctttttctcc gcagagaatg      900
agtggcgggg agggacccca cgacgcaacc ccacgacgca accgcttatc gcagccgggt      960
ccacaccgca ccgctgccgt agcgtcatgg gactcggccc gcggcccgcc ctccgacccg     1020
gacccgcttt ccttcccctc ccgtgtataa ataccgcccc ccctgctcgc ctcctcccca     1080
atccatccga tccccaatcc agtcccgcga gcgaaatcgc cgacgaccga tcgaagcgaa     1140
gcagccttcc cccatcctct caaggtatgc gaattctcga tcctcctctc ctatgttcgt     1200
tgtggatctg ctggttagga ttgattaggt tgtcgtacca tgcctttttc ctgttcgtgt     1260
tcctcagatc tatagtcggt ttgcacaggt agagggctaa tctctagtcg atctgcgggt     1320
agagttgttg aatcatgtgc tgccttcagt tcatgtggtt tagatccgtg ttgcttgttg     1380
cggtcatgtg ttcacacaac acgtacggtt cctgccgtgc gcggattagc cgcgctgagg     1440
ctctgacgtt gtcggtgtgg gcgtgatcgc gcgggctgcc taggcttgtt attgttgaat     1500
taggcttggt cgattgggtc tgtttctatt cacggatggt cttcgatggt tcatgtgcat     1560
gctgttggtc gctggttagg tggtgatacc gttcgatttt tgtttaatct gtctagaatt     1620
ccttagatct gaaattctgt gatgtctaca tccagctgct tgttgttgaa tattttagct     1680
atgttaatct gccatggtct tcgtagtttc catgcataaa gccatgcaaa tacgttgtat     1740
atttactgtt gctgcaaccc atctcagatt ctagtttgct gtgtactatt aggccttgta     1800
aatgcttgtt aaaatggtta taaattgtgt tcatggttct gtgcctgtta agtcgtcatg     1860
tttattttct ggctgatgct atctgtgggt agaatttgca taggcttcaa tctactgact     1920
ctatgggtag gatctgtgta gcgttgcatc aaacatggca gtgtcttaat gctttcacat     1980
aaaatgtgga actgtttata ttattattat gtactgcatg ttttggtggc ctaactttgc     2040
ctctgctgct aaatttgcag gtgcag                                          2066
<210>  2
<211>  1095
<212>  ДНК
<213>  Bouteloua gracilis
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(1095)
<223>  Промоторная последовательность, полученная из предполагаемого гена убиквитина бутелоа изящной.
<400>  2
tacgagcaaa cgcacaaccg ggatacagat ctacggtaca gaggttactt ccaacgggaa       60
ggttcccgtc cctctagcgc aagcaagacg acgcagagat ggtgaccaaa aacgattctt      120
tgctttacct ggtcatgaca ccaccggata cggataagaa ggaaaaccgg agcatctcta      180
gcaatagaga aatcgacgtt gcctcctaga ggaagaaagc gacggcctat gcttttttct      240
tttgtcgatg attccactga attgtttctc tatttttttc gttgtgtaat ggtcctggta      300
caaacgttca tccaatcatg caacttgcaa gaataaaaat aaaaaatata atctcagacg      360
tccaatcatg gcttcctaaa aaaataaaaa ggacgagaaa ctactcagaa aaaataaata      420
aatacacaac tgtaggaacc aaagcaaagt tgacaaggaa ccaaagcaag gcaggtccac      480
atgtgctgcg agcaggtgcg cctcctcctc cgtttcttcg ccttgctaat cacgtcgcta      540
aatacagagg ccgacttaag aatgccgaca tggcaatttt gctggatatt tttgcttcct      600
tgtagtatca aacagaagaa tattaacgtg ggagtataca gtaattttct tttaccattt      660
ttctttaatc gcgtttttgt tcaaccaaac acaactttag acgtactagt actccactat      720
tttttatttt attttctcct acagtacttt tgaaaaaaag gaatcttgtc atgcatgatt      780
gagatcacgg taacggcgac tcacgccgcc gcacgggtaa cggccaccaa ccaaaagtag      840
caaacggcgt caacctcctc gacatctccg cgtcgctttt ctttttctcc gcagagaatg      900
agtggcgggg agggacccca cgacgcaacc ccacgacgca accgcttatc gcagccgggt      960
ccacaccgca ccgctgccgt agcgtcatgg gactcggccc gcggcccgcc ctccgacccg     1020
gacccgcttt ccttcccctc ccgtgtataa ataccgcccc ccctgctcgc ctcctcccca     1080
atccatccga tcccc                                                      1095
<210>  3
<211>  69
<212>  ДНК
<213>  Bouteloua gracilis
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(69)
<223>  Лидерная последовательность, полученная из предполагаемого гена убиквитина бутелоа изящной.
<400>  3
aatccagtcc cgcgagcgaa atcgccgacg accgatcgaa gcgaagcagc cttcccccat       60
cctctcaag                                                               69
<210>  4
<211>  902
<212>  ДНК
<213>  Bouteloua gracilis
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(902)
<223>  Интронная последовательность, полученная из предполагаемого гена убиквитина бутелоа изящной.
<400>  4
gtatgcgaat tctcgatcct cctctcctat gttcgttgtg gatctgctgg ttaggattga       60
ttaggttgtc gtaccatgcc tttttcctgt tcgtgttcct cagatctata gtcggtttgc      120
acaggtagag ggctaatctc tagtcgatct gcgggtagag ttgttgaatc atgtgctgcc      180
ttcagttcat gtggtttaga tccgtgttgc ttgttgcggt catgtgttca cacaacacgt      240
acggttcctg ccgtgcgcgg attagccgcg ctgaggctct gacgttgtcg gtgtgggcgt      300
gatcgcgcgg gctgcctagg cttgttattg ttgaattagg cttggtcgat tgggtctgtt      360
tctattcacg gatggtcttc gatggttcat gtgcatgctg ttggtcgctg gttaggtggt      420
gataccgttc gatttttgtt taatctgtct agaattcctt agatctgaaa ttctgtgatg      480
tctacatcca gctgcttgtt gttgaatatt ttagctatgt taatctgcca tggtcttcgt      540
agtttccatg cataaagcca tgcaaatacg ttgtatattt actgttgctg caacccatct      600
cagattctag tttgctgtgt actattaggc cttgtaaatg cttgttaaaa tggttataaa      660
ttgtgttcat ggttctgtgc ctgttaagtc gtcatgttta ttttctggct gatgctatct      720
gtgggtagaa tttgcatagg cttcaatcta ctgactctat gggtaggatc tgtgtagcgt      780
tgcatcaaac atggcagtgt cttaatgctt tcacataaaa tgtggaactg tttatattat      840
tattatgtac tgcatgtttt ggtggcctaa ctttgcctct gctgctaaat ttgcaggtgc      900
ag                                                                     902
<210>  5
<211>  498
<212>  ДНК
<213>  Bouteloua gracilis
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(498)
<223>  3' нетранслируемая область, полученная из предполагаемого гена убиквитина бутелоа изящной.
<400>  5
gtttggtcag gagctgctct tgtctctggt ttcacaagta tggtgtctct ggtgtatggc       60
gtgtccagtc ccgttgtggt tcgactgatg tctctgtcgt gttatgagtc ctatgtcgtc      120
tggttgtccg tgtgaaacat tgctgcatgt gcagctaatt cgtgtgaaac attgctgcat      180
gtgcagctgg ttggtttatg aataagtgaa acctgaactt tgtgtgaatt ctgcttcctc      240
tatgcgctga atgttttgat tgtgatcttt tatctactca cagttgctga gatgataagg      300
ctgaatcaat gtagagctaa gattctctcg taaatgttta tattaaatac cttgtgtaat      360
tgcgagtaca aatcgacagt aattcaagct gcggttcttt gttcatccag aaggccaaga      420
ttgcaaattc aggtttcttg gcagtgaaag attgaacgca tgcaaatttc ctttgttctt      480
ttgatcacaa aattgatc                                                    498
<210>  6
<211>  2001
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая кодирующая последовательность, кодирующая бета-глюкуронидазу, сконструированная для экспрессии в растительной клетке.
<400>  6
atggtgaggc ccgttgagac cccgactagg gagatcaaga agctggacgg cctctgggcc       60
ttctccctcg accgtgagaa ctgcggcatc gaccagcgct ggtgggagtc cgccctccag      120
gagtctaggg ccatcgccgt gcccggttcc ttcaacgacc agttcgccga cgccgacatc      180
cgcaactacg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaggtgt tcatcccgaa gggctgggcg      240
ggccagcgca tcgtgctccg cttcgacgcc gtgacccact acggcaaggt ctgggtgaac      300
aatcaggagg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta      360
gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt      420
gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca      480
aaatttgttg atgtgcaggt gatggagcac cagggcggtt acaccccgtt cgaggccgac      540
gtgacgccgt acgtgatcgc cgggaagtcc gtccgcatca ccgtctgcgt gaacaatgag      600
ctgaactggc agaccatccc gcctggcatg gtcatcaccg acgagaacgg caagaagaag      660
cagtcctact tccacgactt cttcaactac gctggcatcc accgctccgt gatgctctac      720
accactccca acacctgggt ggacgacatc accgtggtca cccacgtggc ccaggactgc      780
aaccacgcct ccgtggactg gcaagtcgtt gccaacggcg acgtcagcgt cgagctgcgc      840
gacgccgacc agcaagtcgt tgccaccggc cagggcacca gcggcaccct ccaagtcgtc      900
aaccctcacc tctggcagcc tggcgagggc tacctctacg agctgtgcgt caccgccaag      960
agccagactg agtgcgacat ctaccctctc cgcgtcggca tcaggagcgt cgctgtcaag     1020
ggcgagcagt tcctcatcaa ccacaagcct ttctacttca ctggtttcgg ccgccacgag     1080
gacgctgacc tgaggggcaa gggtttcgac aacgtcctga tggtccacga ccacgctctg     1140
atggactgga tcggtgccaa cagctacagg accagtcact acccgtacgc tgaggagatg     1200
ctggactggg ctgacgagca cggtatcgtc gtgatcgacg agactgctgc ggtcggtttc     1260
aacctgtctc tgggcattgg tttcgaggct gggaacaagc cgaaggagct gtactctgag     1320
gaagctgtca acggcgagac tcagcaagct catctccagg cgattaagga gctgattgcc     1380
agggacaaga accatccgtc tgtcgtgatg tggtctattg cgaatgagcc ggacaccaga     1440
ccgcaagggg cgcgtgaata cttcgcgccg ctggcggagg cgactcgcaa actggaccca     1500
acccgtccaa tcacgtgcgt caatgtcatg ttctgcgacg cccatacgga tacgatctcg     1560
gacctgttcg atgttctttg tctcaatcgg tactatgggt ggtatgttca gagcggggat     1620
cttgagacgg cggagaaggt tcttgagaag gaactcctgg cgtggcaaga gaagctccat     1680
cagccgatca ttatcacgga gtacggggtt gacacacttg cgggccttca cagtatgtac     1740
acagatatgt ggtcggagga ataccagtgt gcatggttgg atatgtacca tcgtgtcttc     1800
gaccgggttt cagcggttgt cggcgaacaa gtctggaact tcgcagactt cgccacgagc     1860
caagggatac tgcgggtagg agggaacaag aagggaatct tcacacggga tcggaagccc     1920
aagtcagcag ccttcctgtt gcagaagcga tggacaggaa tgaacttcgg agaaaagcca     1980
cagcaaggcg gaaagcagtg a                                               2001
<210>  7
<211>  1045
<212>  ДНК
<213>  Bouteloua gracilis
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(1045)
<223>  Энхансер, полученный из промотора предполагаемого гена убиквитина бутелоа изящной.
<400>  7
tacgagcaaa cgcacaaccg ggatacagat ctacggtaca gaggttactt ccaacgggaa       60
ggttcccgtc cctctagcgc aagcaagacg acgcagagat ggtgaccaaa aacgattctt      120
tgctttacct ggtcatgaca ccaccggata cggataagaa ggaaaaccgg agcatctcta      180
gcaatagaga aatcgacgtt gcctcctaga ggaagaaagc gacggcctat gcttttttct      240
tttgtcgatg attccactga attgtttctc tatttttttc gttgtgtaat ggtcctggta      300
caaacgttca tccaatcatg caacttgcaa gaataaaaat aaaaaatata atctcagacg      360
tccaatcatg gcttcctaaa aaaataaaaa ggacgagaaa ctactcagaa aaaataaata      420
aatacacaac tgtaggaacc aaagcaaagt tgacaaggaa ccaaagcaag gcaggtccac      480
atgtgctgcg agcaggtgcg cctcctcctc cgtttcttcg ccttgctaat cacgtcgcta      540
aatacagagg ccgacttaag aatgccgaca tggcaatttt gctggatatt tttgcttcct      600
tgtagtatca aacagaagaa tattaacgtg ggagtataca gtaattttct tttaccattt      660
ttctttaatc gcgtttttgt tcaaccaaac acaactttag acgtactagt actccactat      720
tttttatttt attttctcct acagtacttt tgaaaaaaag gaatcttgtc atgcatgatt      780
gagatcacgg taacggcgac tcacgccgcc gcacgggtaa cggccaccaa ccaaaagtag      840
caaacggcgt caacctcctc gacatctccg cgtcgctttt ctttttctcc gcagagaatg      900
agtggcgggg agggacccca cgacgcaacc ccacgacgca accgcttatc gcagccgggt      960
ccacaccgca ccgctgccgt agcgtcatgg gactcggccc gcggcccgcc ctccgacccg     1020
gacccgcttt ccttcccctc ccgtg                                           1045
<210>  8
<211>  300
<212>  ДНК
<213>  Oryza sativa
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(300)
<223>  3' нетранслируемая область, полученная из рисового гена белка, подобного белку-переносчику липидов.
<400>  8
attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata       60
tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg      120
aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg      180
ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca      240
tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg      300
<210>  9
<211>  631
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Энхансерный промотор и наивная лидерная последовательность, полученные из вируса мозаики цветной капусты.
<400>  9
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg       60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg      120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa      180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc      240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg      300
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa      360
aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg      420
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag      480
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa      540
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat      600
ttcatttgga gaggacacgc tgaacacgct g                                     631
<210>  10
<211>  253
<212>  ДНК
<213>  Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(253)
<223>  3' нетранслируемая область, полученная из гена нопалинсиназы
Agrobacterium tumefaciens.
<400>  10
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg       60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc      120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac      180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct      240
atgttactag atc                                                         253
<---