Способ определения функциональной активности системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции
METHOD FOR DETERMINING THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE HUMAN COMPLEMENT SYSTEM FOR PREDICTING THE SEVERITY OF THE COURSE OF A SYSTEMIC INFLAMMATORY REACTION

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может быть использовано для прогноза тяжести системной воспалительной реакции у человека при COVID-19 путем определения функциональной активности системы комплемента.
Коронавирус человека был впервые выделен D. Tyrrell и М. Bynoe в 1965 г. от больного острым респираторным заболеванием, им удалось культивировать человеческий коронавирус на клетках трахеи [Tyrrell D.A.J., Bynoe М.А. Cultivation of novel type of commoncold virus in organ culture. Br. Med. J. - 1965. - №1. - P. 1467-1470]. После открытия в 1965 году коронавирусы почти не привлекали внимание исследователей, поскольку выделенные штаммы 229Е и ОС43 вызывали относительно легкие заболевания. Врачи лечили их как обычную простуду, пока в Китае в 2002-2003 годах не была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии, или тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС, SARS). Заболевание зарегистрировано в 32 странах, наибольшее количество в Китае, Сингапуре, Канаде. Всего заболело 8273 человека, а 775 умерло (летальность 9,6%). 17 марта 2003 года ВОЗ была объявлена «глобальная тревога» в связи с распространением «атипичной пневмонии». Были привлечены 13 лабораторий из 9 стран для проведения объединенных исследований этого заболевания. В качестве приоритетных задач ставилось определение этиологического агента, и затем на основании этого - разработка диагностических тест систем. В результате тесного сотрудничества ученых из лабораторий разных стран первая часть поставленной задачи была выполнена поразительно быстро. 16 апреля 2003 года ВОЗ было объявлено, что этиологическим агентом "атипичной пневмонии" является новый патоген, вирус SARS, относящийся к семейству коронавирусов, но не родственный ни одному из известных штаммов этого вируса [Coronavirus never before seen in humans is the cause SARS. 2003. Сайт ВОЗ. http://www.who.int/mediacentre/releases/2003/pr31/en/print.html]. С тех пор обнаружилось еще два коронавируса, которые тоже вызывают простуду - NL63 и HKU1. В 2012 году - почти через 50 лет после его открытия - был окончательно секвенирован полный геном штамма 229Е.
В 2012 году были зарегистрированы первые случаи заболевания, вызванного коронавирусом. Заболевание в дальнейшем получило название ближневосточного респираторного синдрома (MERS), возбудителем которого являлся коронавирус MERSCoV [Enserink Μ. SARS: chronology of the epidemic, (англ.) // Science (New York, N.Y.). - 2013. - 15 March (vol. 339, no. 6125). - P. 1266-1271. - doi:10.126/science.339.6125.1266]. В 2015 году в Южной Корее произошла вспышка ближневосточного респираторного синдрома, в ходе которой заболело 183 человека, умерло 33.
В декабре 2019 года несколько медицинских учреждений в китайском городе Ухань (провинция Хубэй) сообщили о пациентах с пневмонией [Huang С, Wang Y., Li X. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China // Lancet. - 2020. - Feb 15;395(10223):497-506. doi: 10.1016/S0140-6736(20) 30183-5]; клинические проявления напоминали симптомы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), заболевания, появившегося в 2002 году в соседнем районе - провинции Гуандун, вызванного коронавирусом SARS-CoV [Peiris J.S.M, Guan Y., Yuen K.Y. Severe acute respiratory syndrome // Nat Med. - 2004;10 (suppl 12):S88-S97. DOI: 10,1038 / nm1143, 10; CDC, 2019 Novel Coronavirus, Wuhan, China. CDC. Available at https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/abaut/index.html.; Accessed: January 27, 2020].
7 января 2020 г. был выделен новый штамм коронавируса, названный SARS-CoV-2, который вызывает коронавирусную болезнь 2019 года COVID-19. Полный геном SARS-CoV-2 уже достаточно изучен, его первая широкая публикация китайскими органами здравоохранения была сделана вскоре после обнаружения вируса, что облегчило процесс диагностики и идентификации возбудителя инфекции.
SARS-CoV-2 - одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относится к семейству Coronaviridae, группе 2b бета-коронавирусов, который имеет по меньшей мере 70% сходство в генетической последовательности с SARS-CoV, его размер составляет около 100 нм [Hui D.S.I., Azhar Ε., Madani Τ.Α., Ntoumi F., Kock R., Dar O., et al The Continuing 2019-nCoV epidemic threat of novel coronaviruses to global health-The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China // Int. J. Infect. Dis. - 2020 Jan 14.91:264-266]. Все известные коронавирусы (CoV) делятся на четыре рода, включая α-, β-, γ-, и δ-CoV. Представители первых двух родов способны инфицировать млекопитающих, тогда как γ- и δ-CoV инфицируют преимущественно птиц. Ранее было известно о шести коронавирусах, которые способны инфицировать человека. Это HCoV-229E и HCoVNL63 (оба α-CoV), HCoV-HKU1 и HCoV-OC43 (оба β-CoV), - они вызывают легкие респираторные симптомы, сходные с простудой [Larson Н.Е., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229]. Два других β-коронавируса, SARSCoV и MERS-CoV, приводят к тяжелым и потенциально смертельным инфекциям дыхательных путей человека [Yin Υ., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia//Respirology. - 2018 Feb; 23(2):130-137. doi: 10.1111/resp.13196. Epub 2017 Oct 20; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. -№6. - P. 385-399; Информационный Экспресс-Бюллетень. Коронавирус SARS-возбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации). - СПб-Москва, 2003]. Несмотря на тщательное изучение коронавирусов после вспышки ТОРС, пока не совсем ясно, почему три из них - SARS-CoV-1, MERSCoV и SARS-CoV-2 (источник пандемии COVID-19) - вызывают более тяжелые симптомы и приводят к более высокому уровню смертности, в то время как другие известные четыре коронавируса человека гораздо слабее.
Коронавирусы обладают широким тропизмом и могут поражать помимо дыхательных путей печень, почки, кишечник, нервную систему, сердце и глаза [Yin Υ., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia // Respirology. -2018 Feb; 23(2):130-137. doi: 10.111 l/resp.13196. Epub 2017 Oct 20; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. -1982. - 99. - P, 165-200; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - №6. - P. 385-399; Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия // Под редакцией О.И. Киселева, И.Г. Маринича, А.А. Сомининой). - СПб.: «Боргес», 2003; Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715]. Типичная коронавирусная инфекция клинически проявляется гриппоподобным синдромом и/или кишечными расстройствами. При коронавирусной инфекции поражается альвеолярный эпителий. Коронавирусы, обладая способностью к индукции апоптоза, вызывают некроз пораженных тканей, а у пациентов после выздоровления остаются фиброзные рубцы в легких. Коронавирусы, индуцируя слияние клеток, оказывают сильное воздействие на проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-солевого баланса и транспорта белков. Вероятно, в этих условиях развиваются недостаточность сурфактанта (антиателектатический фактор), что приводит к коллапсу альвеол, и легочному дистресс-синдрому. Наиболее опасным свойством коронавирусов является их способность поражать макрофаги. Вероятнее всего, заболевание в особо тяжелой форме развивается на фоне блокирования основных звеньев иммунного ответа [Информационный Экспресс-Бюллетень. Коронавирус SARS-возбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации). - СПб-Москва, 2003; Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия // Под редакцией О.И. Киселева, И.Г. Маринича, А.А. Сомининой). - СПб.: «Боргес», 2003; World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19-11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opemng-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020); Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https://www.Medscape, com/viewarticle/924596; Accessed: January31, 2020].
Коронавирусы домашних и лабораторных животных вызывают инфекционный бронхит птиц, гепатит мышей, пневмонии у крыс, гастроэнтериты и энцефаломиелиты у свиней, часто заканчивающихся у животных смертельным исходом, что приводит к большим экономическим потерям [Wege Η., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200].
Постановлением Главного санитарного врача РФ вирус SARS-CoV-2, как и некоторые другие представители этого семейства (вирусы SARS-CoV, MERS-CoV), отнесен ко II группе патогенности (патогенные биологические агенты, в отношении которых известны случаи летальных исходов заболевания и/или имеются сведения о высоком эпидемическом потенциале). SARS-CoV-2 включен в перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих [Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715; Ramzy Α., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020].
Случаи заболевания COVID-19 зарегистрированы в большинстве стран мира на всех континентах. 30 января ВОЗ признала вспышку нового коронавируса глобальной чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение [Larson Н.Е., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229; Wege H., Siddell S., ter Meulen V. The biology and pathogenesis of coronaviruses // Curr. Top.Microbiol. Immunol. - 1982. - 99. - P, 165-200; Yin Y., Wunderink R.G. MERS, SARS and other coronaviruses as causes ofpneumonia//Respirology. -2018 Feb; 23(2): 130-137. doi: 10.1111/resp.13196. Epub 2017 Oct 20;
World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 - 11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020); Callegos A. WHO Declares Public Health Emergency for novel coronavirus // Medscape medical news. Available at https://www.Medscape, com/viewarticle/924596; Accessed: January 31, 2020; Ramzy Α., McNeil D.G. W.H.O. Declares Global Emergency as Wuhan Coronavirus Spreads // The New York Times. Available at https://nyti.ms/2RER70M; Accessed: January 30, 2020]. 11 марта 2020 года Президент ВОЗ объявил COVID-19 глобальной пандемией, впервые назвав пандемией инфекционный процесс после пандемии гриппа H1N1 в 2009 году [Larson Н.Е., Reed S.E., Tyrrell D.A.J. Isolation of rhinoviruses and coronaviruses from 38 coldsin adults // J. Med. Virol. - 1980. - №5. - P. 221-229; Risri H., Hovi T. Coronavirus infections of man associated with diseases other than the common cold // J. Med. Virol. - 1980. - №6. - P. 385-399; World Health Organization. WHO Director-General's opening remarks at the media briefing on COVID-19 -11 March. Available from URL: https://www.who.int/dg/speeches/detail/whodirector-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19, 11 march 2020 (accessed April 2020); The New York Times. Coronavirus Live Updates: W.H.O. Declares Pandemic as Number of Infected Countries Crows. The New York Times. Available at https:// www.nytimes.com/2020/03/1 l/world/coronavirus-news.html#link-282e5b06. Accessed: March 11, 2022].
Большинство пациентов, заболевших тяжелой формой Covid-19 находятся в критическом состоянии из-за развития острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Ухудшение функции легких объясняется дезадаптивным иммунным ответом, а не повышенной вирусной нагрузкой. Одна из теорий заключается в том, что активация резидентных иммунных клеток в легких посредством распознавания рецепторов стимулируют высвобождение провоспалительных цитокинов, выход нейтрофилов и моноцитов из сосудистого русла в бронхи. Эти клетки могут нарушить барьер между воздухом и кровью, вызывая повреждение коллатеральных тканей, особенно эпителиальных клеток дыхательных путей и эндотелиальные клетки сосудов, которые экспрессируют рецептор входа, ангиотензин-превращающий фермент 2 (АСЕ2) для SARS-CoV-2. Повреждение клеток эндотелия сосудов могут быть причиной тромботических микроангиопатий.
В недавних исследованиях SARS-CoV, которые тесно связаны с SARS-CoV-2, было показано, что активация компонента комплемента С3 обостряет заболевание при ОРДС, ассоциированном с SARS-CoV-2. С3- дефицитные мыши, инфицированные SARS-CoV, имели меньше респираторных дисфункций, несмотря на эквивалентную вирусную нагрузку в легких, и это было связано с уменьшением инфильтрации легких нейтрофилами и моноцитами, более низким уровнем цитокинов и хемокинов в легких и сыворотке крови [Gralinski, L. Ε. Etal. Complement activation contributes to severe acute
respiratory syndrome coronavirus pathogenesis. mBiohttps://doi.org/10.1128/mBio.01753-18 (2018)]. Полученные данные свидетельсвуют о том, что ингибирование ключевого компонента С3 комплемента может также уменьшить воспалительные легочные повреждения, обусловленные SARS-CoV-2 инфекцией. Заметное снижение инфильтрации легких нейтрофилами и снижение уровней как внутрилегочного, так и плазменного IL-6, наблюдаемый у инфицированных SARS-CoVC3-дефицитных мышей предполагает возможность комбинирования ингибиторов С3 в схемах лечения для снижения уровня IL-6. Более того, восходящее позиционирование передачи сигналов С3 во врожденном иммунном каскаде также свидетельствует в пользу более широкого противовоспалительного потенциала блокады С3 с такими агентами как компстатин (AMY-101) [Mastellos, D. С, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next- generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov. 18, 707-729 (2018)], который в настоящее время проходит испытания у пациентов с COVID-19. Подавление активации С3 вызывает блокаду генерации С3а и С5а анафилатоксинов, а также внутрилегочной активации С3 и высвобождению IL-6 из альвеолярных макрофагов или других клеток, экспрессирующих СЗа рецепторы (C3aR) и/или рецепторы С5а (C5aR), тем самым снижая повреждение легких.
Ex vivo инфицирования цельной крови SARS-CoV в присутствии ингибитора С3, AMY-101, показали, что это препятствует высвобождению IL-6 [Mastellos, D. С, Ricklin, D., Lambris, J. D. Clinical promise of next- generation complement therapeutics. Nat. Rev. DrugDiscov. 18, 707-729 (2018)].
Хотя роль активации комплемента в патофизиологии ОРДС, вызванного различными тяжелыми заболеваниями убедительно доказана. Клинические же данные о роли гиперактивации комплемента в развитие ОРДС, ассоциированного с SARS-CoV-2, в настоящее время немногочисленны [Zilow, G. et al. Generation of anaphylatoxin СЗа in plasma and bronchoalveolar lavage fluid in trauma patients at risk for the adult respiratory distress syndrome. Crit. CareMed. 20, 468-73(1992)].
Недавние исследования образцов легких, умерших пациентов с тяжелой формой COVID-19, показали гиперактивацию комплемента, которая характеризовалась генерацией С3а в бронхо-альвеолярной жидкости, обнаружением большого количества C3B-фрагментов в тканях легких и повышением уровня С5а в сыворотке крови [Gao, Т. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over- activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].
Важно отметить, что лечение пациентов с тяжелой формой Ковид-19 анти-С5а моноклональными антителами приводит к быстрому улучшению состояния больных с ОРДС, увеличению степени оксигенации крови и снижению системной воспалительной реакции в организме больного [Gao, Т. et al. Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury by MASP-2-mediated complement over- activation. medRxiv Preprint at https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20041962 (2020)].
Ингибиторы C5 эффективно используются в клинике почти 15 лет, и их использование в клинических испытаниях при тяжелом течении SARS-CoV-2 подкреплены хорошо известной ролью оси С5а - C5aR в патофизиологии ОРДС. Однако ингибирование С5 может быть частичным, что позволяет остаточной активности терминального пути снижать эффективность при гиперактивации комплемента, который наблюдается при инфекциях. Также эти препараты не будут влиять на ось С3а - C3aR. Ингибиторы проксимального комплемента (которые нацелены на С3 или его предшествующие активаторы) могут быть более эффективными, но они все еще находятся на стадии разработки, и ни один из них не одобрен для применения, хотя имеются обнадеживающие данные фазы II клинических испытаний.
Остаются дополнительные вопросы относительно терапевтического использование ингибиторов комплемента при COVID-19. Лишь у небольшой части пациентов развивается тяжелая форма болезни в виде ОРДС. Однако надежные клинические маркеры для прогнозирования тяжести течения на ранней стадии заболевания в настоящий момент отсутствуют. Биомаркеры активации системы комплемента обычно не используется, так как большинство из них нестабильны и имеют очень короткий период полураспада [Mastellos D.C., Pires da Silva B.G.P., Fonseca B.A.L., Fonseca N.P. et al. Complement C3 vs C5 inhibition in severe COVID-19: Early clinical findings reveal differential biological efficacy //Clin Immunol. 2020 Nov; 220:108598. doi: 10.1016/j.clim.2020.108598. Epub 2020 Sep 19. PMID: 32961333].
Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 30 компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль, как в клиренсе иммунных комплексов, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки. Система комплемента может активироваться тремя путями: классическим, альтернативным и лектиновым.
2+
2+
Классический путь является Ca/Mg-зависимым каскадом, который в норме активируется при формировании иммунного комплекса (ИК). Компонент С1, первый ферментный комплекс в каскаде, является пентамолекулярным комплексом. Включает одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. С1 комплекс связывается с Fc-фрагментом иммуноглобулинов в составе ИК через C1q и инициирует ферментативный каскад системы комплемента. Как только активируется С1 комплекс, C1s расщепляет компонент С4, приводя к образованию C4b, который затем связывает компонент С2. Иммобилизованный компонент С2 расщепляется при помощи фермента C1s с образованием С3-конвертазы (C4bC2a) классического пути.
2+
Альтернативный путь является Mg-зависимым и активируется рядом разнообразных веществ, включающих полисахариды клеточных стенок дрожжей и бактерий, определенные биополимерные материалы. При иммобилизации C3b на поверхности на него садится фактор В, который под действием фермента, фактора D, расщепляется и образуется С3-конвертаза (C3bBb) альтернативного пути.
Пектиновый путь активирует комплемент при помощи маннан-связывающего лектина (МСЛ) и двух ассоциированных с ним сериновых протеаз (МАСП-1 и МАСП-2) (подобно c C1r и C1s в классическом пути активации комплемента). Как и в классическом пути активации комплемента, для лектинового пути также требуются компоненты С2 и С4. Активация лектинового пути приводит к формированию С3-конвертазы, аналогичной с С3-конвертазой классического пути (C4bC2a) [Ройт Α., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с.].
Субстратом С3-конвертазы трех путей активации является ключевой компонент комплемента, компонент С3, при гидролизе которого образуется С3а (анафилатоксин) и C3b (опсонин). Присоединяя дополнительно молекулу C3b, С3конвертаза обретает способность гидролизовать компонент С5, который запускает реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).
При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С3 и С5 (С3а и С5а - анафилатоксины) и C5b-9 (МАК), которые опосредуют воспалительные активности, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и тканевое повреждение [SahuA., LambrisJ.D. Complement inhibitors are surget conceptin anti-inflamatory therapeutics // Immunopharmacology - 2000. - V.49. - P. 133-148.].
Избыточная (неконтролируемая) активация системы комплемента является частью патогенеза большого числа воспалительных заболеваний. Патологические эффекты могут быть обусловлены повышенной, продолжительной активацией, например, вызванной присутствием иммунных комплексов (системная красная волчанка и связанные с ней заболевания), а также сниженной экспрессией и функцией различных ингибиторов комплемента, или комбинацией этих двух факторов [Carroll M.V., R. В. Sirn R.B. Complement in health and disease //Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011.-V.63, №12.-P. 965-975].
Ишемия и последующая реперфузия органов и тканей наблюдается при таких состояниях как инфаркт миокарда или инсульт. Неконтролируемая активация системы комплемента играет важную роль при реперфузионном повреждении. Результатом чего является мультифункциональный воспалительный процесс, вовлекающий генерацию анафилатоксинов, повышенную экспрессию адгезивных белков и тканевых факторов на эндотелиальных клетках и выход из сосудов полиморфно-ядерных лейкоцитов [Banz Υ., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage // Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, №3. - P. 205-217].
50
50
Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (ЕА); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор после центрифугирования. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента (СН) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% 0,5 мл стандартной суспензии ЕА при 37°С за 45 мин. В 1 мл сыворотки крови человека содержится 20-40 СН [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368 с.].
Существенным недостатком этого метода является использование гетерологичных эритроцитов барана с коротким сроком их хранения, длительность выполнения теста, недостаточная точность (колебания нормальных значений в два раза), для оценки степени лизиса требуется центрифугирование и определение гемоглобина в супернатанте (дополнительный контакт оператора с биоматериалом).
2+
2+
Из уровня техники известен способ определения чувствительности эритроцитов человека к лизису по тромбиновому пути активации комплемента [патент РФ №2 696 981, опубл. 08.08.2019 Бюл. №22, МПК G01N 31/00]. Суть метода заключается в том, что для определения чувствительности эритроцитов человека к лизису при активации системы комплемента по тромбиновому пути используют цитратную плазму с высокой активностью тромбина, связанного с фибрином. Для ингибирования активации комплемента по одному из известных трех путей (классическому, альтернативному или лектиновому) используют цитрат натрия в качестве хелатора для связывания Саи Mg. В присутствии активного тромбина, связанного с фибрином, активируется компонент С5 и формируется мембрано-атакующий комплекс, который определяют по лизису эритроцитов человека (ЭЧ). Параллельно определяют стандартным методом группу крови ЭЧ по системе АВ0. Наиболее чувствительными к лизису по тромбиновому пути активации комплемента оказались эритроциты человека с группой крови А, на втором месте - АВ, на третьем месте - В. Наиболее устойчивыми к лизису оказались эритроциты человека 0 группой крови.
Таким образом, авторами убедительно показан лизис эритроцитов человека мембрано-атакующим комплексом, который формируется на эритроцитах человека кроме О группы, под действием тромбина, связанного с фибрином и вызывает лизис.
Также из уровня техники известен тест определения функциональной активности системы комплемента по классическому пути, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА). Суть теста заключается в определении активности классического пути системы комплемента по сорбции мембрано-атакующего комплекса (МАК) на подложке 96-ти луночной планшеты, сорбированной агрегированными иммуноглобулинами. Связывание МАК проявляют моноклональными антителами, конъюгированными с ферментом, щелочной фосфатазой, с использованием его субстрата. В качестве стандарта используют лиофильно высушенный препарат сыворотки крови человека. Рассчитывают в процентах функциональную активность классического пути активации комплемента относительно стандарта [WIESLAB Complement system Classical pathway. "TuroDiagnostica"].
Существенным недостатком ИФΑ-теста скрининга комплемента по классическому пути является длительность проведения анализа (не менее 3 часов), использование моноклональных антител, которые делают данный анализ недоступным для рутинных исследований. Также использование лиофильно высушенной сыворотки в качестве стандарта требуют специальных условий для хранения и транспортировки (-20°С), а также подобный стандарт может завышать активность комплемента при анализе из-за потери функциональной активности самого стандарта при лиофилизации, хранении и транспортировке.
2+
Наиболее близким аналогом (прототипом) является скрининг-тест определения активности классического пути активации системы комплемента человека методом турбидиметрии [патент на изобретение РФ №2 704 121, опубл. 24.10.2019 Бюл. №30, МПК G01N 33/50]; - Суть метода заключается в определении функциональной активности классического пути системы комплемента с использованием реакции лизиса эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), в условиях вероналового солевого буфера (VBS) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 10 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса ЕА определяют турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии ЕА при длине волны 620 нм, затем определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль ЕА представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса ΕА - 100% лизис.
Недостатком данного гемолитического теста является использование также эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика, которые не всегда доступны для рутинных исследований и ограничены в сроках использования.
Таким образом, на настоящий момент не существует доступного теста для скрининга функциональной активности классического пути системы комплемента для рутинных исследований.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности метода исследования функциональной активности классического пути системы комплемента, а также упрощения регистрации результатов анализа функциональной активности классического пути системы комплемента в рутинных исследованиях и адаптации способа для скрининг-исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий
2+
Указанный результат достигается тем, что определение функциональной активности классического пути системы комплемента проводят с использованием 1% суспензии эритроцитов человека с группой А по системе АВО Е(А), сенсибилизированных анти-А моноклональными антителами [Е(А)мАт], 12,5% сыворотки в условиях вероналового солевого буфера (VBS) при температуре (37,0±0,5)°С в течение 15 мин. Реакцию комплемент-зависимого лизиса Е(А)мАт оценивают турбидиметрически по снижению оптической плотности суспензии Е(А)мАт при длине волны 620 нм, затем определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по графику, где контроль Е(А)мАт представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса Е(А)мАт - 100% лизис, при этом повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента считают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную, а при степени лизиса менее 30% как пониженную активность.
Заявленное изобретение поясняется фигурами:
на фиг. 1 представлен график зависимости оптической плотности суспензии эритроцитов человека при длине волны 620 нм от концентрации эритроцитов;
на фиг. 2 представлен график для определения степени лизиса эритроцитов человека в % методом турбидиметрии;
на фиг. 3 представлен график определения оптимальной концентрации моноклональных анти-А IgM антител для активации комплемента по классическому пути;
на фиг. 4 представлена раститровка пулированной сыворотки с эритроцитами А группы человека, сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами;
на фиг. 5 представлено влияние времени инкубации на гемолиз эритроцитов человека.
2+
2+
2+
620
Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготавливают сыворотку, проводят литический тест и осуществляют расчет степени лизиса в опытных пробах. Гемолитический тест проводят с использованием 1% суспензии эритроцитов человека группы AI) [Е(А)], сенсибилизированных анти-А-моноклональными IgM антителами [Е(А)мАт] в вероналовом солевом буфере, содержащем Саи Mg(VBS). Время проведения скрининг-теста - 15 мин. Суть метода заключается в изменении светорассеивания эритроцитов при их лизисе в 96-ти луночных иммунологических плоскодонных планшетах. Изменение светорассеивания при лизисе эритроцитов определяют турбидиметрически при длине волны 620 нм с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. Для определения степени лизиса эритроцитов в опытных образцах строят калибровочный график зависимости оптической плотности А от лизиса эритроцитов человека по которому определяют степень лизиса (фиг. 2), где за 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов человека Е(А)мАт, на спонтанный лизис, соответственно за 100% лизиса принимают оптическую плотность контроля на полный лизис.Повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента считают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную, а при степени лизиса менее 30% как пониженную активность.
2+
2+
620
Определение оптимальной концентрации эритроцитов человека для определения функциональной активности системы комплемента. Эритроциты человека группы А [Е(А)] по системе АВ0 3 раза отмывают в вероналовом солевом буфере (VBS) центрифугированием в течение 10 мин при 2800 об/мин. Строят график зависимости оптической плотности суспензии Е(А) при длине волны 620 нм от концентрации эритроцитов, %. Для этого 4% суспензии Е(А) прогрессивно разводят в плоскодонной 96-ти луночной иммунологической планшете в объеме 50 мкл VBS. Объем доводят до 100 мкл тем же буфером. Тщательно перемешивают и измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при А (фиг. 1).
620
620
2
7
2+
Как видно из данных, представленных на фиг.1, наблюдается линейная зависимость оптической плотности суспензии эритроцитов человека от концентрации их в растворе до А равной 0,68 единиц оптической плотности (ЕОП). Выше 0,68 ЕОП при Анаблюдается незначительный загиб. Поэтому для теста определения функциональной активности классического пути активации системы комплемента нами выбрана концентрация эритроцитов Е(А), которая в объеме 100 мкл в лунке 96-луночного планшета дает оптическую плотность, равную 0,68, что соответствует 0,5% концентрации эритроцитов (0,5×10 кл/мл). Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график (фиг. 2), где степень лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов человека на спонтанный лизис (25 мкл 2% Е(А) + 75 мкл VBS), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (25 мкл 2% Е(А) + 75 мкл НО).
Как видно из фиг.2, построение калибровочного графика по 2 точкам и 7 точкам, полученным прогрессивным разбавлением суспензии эритроцитов человека, практически совпадают. Разброс максимальный в области 50% лизиса, но меньше 5%, что вполне допустимо для расчета степени лизиса эритроцитов при активации комплемента.
Таким образом, калибровочный график позволяет определять методом турбидиметрии степень лизиса эритроцитов человека в процентах по оптической плотности пробы без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа функциональной активности классического пути системы комплемента в рутинных исследованиях. Определение степени лизиса эритроцитов методом турбидиметрии также позволяет проводить кинетические исследования функциональной активности комплемента, т.е. исследования комплемент-опосредованного лизиса эритроцитов во времени без остановки реакции для измерения степени лизиса.
2+
2+
620
2
Определение оптимальной концентрации моноклональных анти-А IgM антител для активации комплемента по классическому пути. Предварительно моноклональные IgM анти-А антитела по 25 мкл прогрессивно разводят в иммунологических планшетах с плоским дном, затем добавляют по 25 мкл буфера VBS, пулированной сыворотки крови человека и 2% суспензии Е(А) человека. После тщательного перемешивания измеряют мутность проб при А (0 мин) и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (25 мкл Е(А) + 75 мкл VBS); 2 - Контроль на полный лизис (25 Е(А) + 75 мкл НО). Степень лизиса Е(А) в % определяли по графику (фиг.2), где контроль Е(А) на спонтанный лизис представляет 0% лизис, а контроль на полный лизис - 100% лизис. Полученные результаты представлены на фиг.3. Как видно на фиг.3, максимальный лизис эритроцитов человека группы А наблюдается при разведении анти-А моноклональных IgM антител от 32 до 256. При дальнейшем разведении анти-А моноклональных IgM антител наблюдается снижение лизиса. При разведении 1024 раз - полное отсутствие лизиса.
Таким образом, нами в дальнейших исследованиях использовано разведение в 128 раз исходного препарата анти-А моноклональных IgM антител в тестируемых пробах.
2+
2+
2
Титрование пулированной сыворотки крови человека на функциональную активность классического пути системы комплемента методом турбидиметрии. Предварительно от 10 до 25 мкл пулированной сыворотки крови от 10 здоровых доноров вносят в лунки иммунологических планшет с плоским дном, затем объем в каждой пробе доводят до 50 мкл буфером VBS. В разведенные сыворотки вносят по 50 мкл 1% эритроцитов человека А группы, сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами (Е(А)мА/Т (конечный объем гемолитической системы 100 мкл), тщательно перемешивают и измеряют мутность проб при 620 нм (0 мин) на фотометре для ИФА. Затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е(А)мА/Т + 50 мкл VBS); 2 - контроль на полный лизис (50 Е(А)мА/Т + 50 мкл НО). После инкубации тщательно перемешивают, измеряют мутность проб и определяют степень лизиса эритроцитов в % по калибровочному графику (фиг. 2), где контроль эритроцитов на спонтанный лизис принимают за 0% лизиса, контроль на полный лизис представляет 100% лизис. Полученные результаты представлены на фиг. 4. Как видно из фиг. 4, степень лизиса от 62 до 95% зависит линейно от концентрации сыворотки в гемолитической системе при инкубации в течение 30 мин.
Таким образом, для дальнейших исследований использовали 12,5 мкл сыворотки в тест-системе, содержащей 0,5% суспензию группы А эритроцитов человека, сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами.
2+
2+
2
Определение оптимального времени инкубации для определения функциональной активности системы комплемента. К 12,5 мкл сыворотки крови добавляют 37,5 мкл буфера VBS и 50 мкл 1% суспензии Е(А)мАт) в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 минут при 37°С при постоянном перемешивании. В процессе инкубации измеряют оптическую плотность проб на фотометре Multiscan FC с блоком термостатирования и шейкером, при длине волны 620 нм через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. В качестве контроля используют: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е(А)мАт + 50 мкл VBS); 2 - Контроль на полный лизис (50 Е(А)мАт + 50 мкл НО). Степень лизиса Е(А)мАт в % определяют, как описано выше. Полученные результаты представлены на фиг. 5. Как видно на фиг. 5, максимальный лизис наблюдается первые 15 мин и при дальнейшей инкубации увеличение степени гемолиза зависит от величины 10-ти минутной инкубации. То есть, при высоком лизисе на 10 минуте инкубации продолжение инкубации незначительно увеличивает гемолиз. При слабом гемолизе на 10 минуте инкубации, дальнейшая инкубация приводит к более высокому гемолизу.
Таким образом, оптимальным временем инкубации данной гемолитической системы является 15-ти минутная инкубация при 37°С.
Примеры осуществления.
Пример 1. Определение функциональной активности классического пути системы комплемента в сыворотках крови относительно здоровых лиц.
2+
К 12,5 мкл сыворотки крови добавляют 37,5 мкл буфера VBS и 50 мкл 1% Е(А)мАт (эритроциты человека с группой А, сенсибилизированные моноклональными анти-А IgM антителами), в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 15 минут при 37°С при постоянном перемешивании. Степень лизиса Е(А)мАт в % определяют, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в 3 пробах из 30 (10%) определяется повышенная функциональная активность системы комплемента (степень лизиса более или равно 60%). В 12 пробах (40%) - нормальная активность системы комплемента (степень лизиса от 31 до 59%). В остальных 15 пробах (50%) наблюдается пониженная функциональная активность системы комплемента (степень лизиса менее 30%).
Пример 2. Сравнительные исследования функциональной активности классического пути системы комплемента предлагаемым методом и прототипом.
Проведены сравнительные исследования функциональной активности классического пути системы комплемента предлагаемым методом и прототипом.
Определения функциональной активности классического пути комплемента предлагаемым методом проводили как описано выше.
2+
2+
8
Определение функциональной активности классического пути активации системы комплемента по прототипу проводили следующим образом. К 8 мкл сыворотки крови, разведенной 1:7 буфером VBS, добавляли 42 мкл буфера VBS и 50 мкл стандартизированных (1,5x10 кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) в лунки иммунологических 96-ти луночных плоскодонных планшет для ИФА. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 10 минут при 37°С при постоянном перемешивании. Степень лизиса ЕА в % определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности А620 от лизиса эритроцитов барана. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, анализ функциональной активности системы комплемента по классическому пути с использованием прототипа выявляет в 6 пробах (20%) из тестированных 30 проб сыворотки пониженную (<50%) активность и в 3 пробах (10%) повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента (>80%). Причем повышенная гемолитическая активность в 100% совпала по двум методам. Наибольшее расхождение (почти 2 с липшим раза) наблюдается в группе с низкой активностью комплемента. Данный факт можно объяснить влиянием ингибиторов комплемента при использовании 12,5% сыворотки в тестах, т.е. в прототипе концентрация сыворотки составляет всего 1%, что приводит к снижению их роли при проведении гемолитического теста с одной стороны. И отсутствие ингибитора мембрано-атакующего комплекса (CD59) на поверхности эритроцитов барана делает их более чувствительными к комплемент-опосредованному лизису.
Таким образом, предлагаемый способ определения и прогнозирования функциональной активности классического пути активации системы комплемента является более информативным при выявлении сниженной активности данного пути активации комплемента. Дальнейшие исследования функциональной активности классического пути системы комплемента у больных с аутоиммунными заболеваниями, связанными солюбилизацией и элиминацией иммунных комплексов (болезни иммунных комплексов, включающие ревматоидный артрит, системную красную волчанку, гломерулонефрит) позволят как контролировать эффективность проводимой терапии, так и на ранних, доклинических стадиях, выявлять скрытое течение заболеваний.
Повышенная функциональная активность классического пути системы комплемента свидетельствует о наличии воспалительного состояния в организме человека и является прогностическим маркером тяжести системной воспалительной реакции при COVID-19 инфекции. Данное предположение также подтверждается результатами исследования титра анти-COVID-19 антител, где убедительно показано прямая зависимость тяжести ОРДС от концентрации этих антител [Holier J.C., Pischke S.E., Eline de Boer, Andreas Lind et al. Systemic complement activation is associated with respiratory failure in COVID-19 hospitalized patients // Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Oct 6; 117(40):25018-25025. doi: 10.1073/pnas.2010540117; Noris M, Benigni A, Remuzzi G. The case of complement activation in COVID-19 multiorgan impact. Kidney Int. 2020 Aug;98(2):314-322. doi: 10.1016/j.kint.2020.05.013. Epub 2020 May 24.PMID: 32461141; Ma L, Sahu SK, Cano M, Kuppuswamy V. et al. Increased complement activation is a distinctive feature of severe SARS-CoV-2 infection // bioRxiv. 2021 Feb 23:2021.02.22.432177. doi: 10.1101/2021.02.22.432177; Vitiello A, La Porta R, D'Aiuto V, Ferrara F. Pharmacological approach for the reduction of inflammatory and prothrombotic hyperactive state in COVID-19 positive patients by acting on complement cascade // Hum Immunol. 2021 Jan 20:S0198-8859(21)00014-8. doi: 10.1016/j.humimm.2021.01.007]. Повышенный уровень антител с высокой эффекторной (комплемент-активирующей) функцией является причиной неконтролируемой активации системы комплемента по классическому пути и как итог - полиорганная недостаточность. Раннее выявление лиц с повышенной функциональной активностью классического пути системы комплемента позволит сформировать группу риска при COVID-19 инфекции и тем самым снизить тяжесть течения ОРДС путем использования Экулизумаба, моноклональных антител к С5 компоненту системы комплемента.