Перспективы использования электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии) для оценки интенсивности свободнорадикальных процессов при создании тканеинженерных конструкций пищевода и диафрагмы

перспективы использования электронного

ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

для ОЦЕНКИ ИНТЕНСИВНОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛьных ПРОЦЕССОВ

при создании тканеинженерных конструкций пищевода и диафрагмы

Е.А. Губарева 1, А.А. Басов 1, Е.В. Куевда 1, А.С. Сотниченко 1, С.С. Джимак 2, С.Н. Болотин 2, И.В. Гилевич 3, К.А. Даниленко1, И.С. Гуменюк1, В.А. Маркушин 3, В.А. Порханов 3, П. Маккиарини 1

1 Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия

2 Кубанский государственный университет, Краснодар, Россия

3 Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница № 1 им. С.В. Очаповского, Краснодар, Россия

Prospects of EPR spectroscopy to the intensity of free radical processes evaluation in tissue-engineering esophagus and diaphragm

EA. Gubareva 1, AA. Basov 1, E.V. Kuevda 1, A.S. Sotnichenko 1, S.S. Dzhimak 2, S.N. Bolotin 2, I.V. Gilevich 3, K.A. Danilenko 1, I.S. Gumenyuk 1, V.A. Markushin 3, V.A. Porhanov 3, P. Macchiarini1

1 Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia

2 Kuban State University, Krasnodar, Russia

3 S.V. Ochapovsky Research Institute - Regional Clinical Hospital № 1, Krasnodar, Russia

Одной из задач регенеративной медицины является создание биологических либо искусственных каркасов, воспроизводящих структуру нативных тканей и обладающих соответствующими физическими, химическими и механическими свойствами для обеспечения клеточной адгезии и формирования трехмерной ткани при рецеллюляризации аутогенными и (или) аллогенными клетками . Чтобы сделать биологические каркасы неиммуногенными их необходимо децеллюляризировать . Однако, этот процесс должен обеспечить максимальное сохранение биохимического состава, морфологической структуры, а также биомеханических свойств полученного внеклеточного матрикса, сопоставимых с аналогичными свойствами нативной ткани Одним из важнейших вопросов является отработка критериев качества получаемого каркаса . В настоящей работе использован метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии) как один из перспективных биофизических методов оценки децеллюляризации . Также показана целесообразность применения ЭПР-спектроскопии для оценки сохранности биоматериала, полученного из на-тивных органов при криоконсервации, которая сама по себе уже может быть первым этапом децеллюляризации, что косвенно подтверждается проведенными исследованиями Ключевые слова: тканевая инженерия, пищевод, диафрагма, децеллюляризация, внеклеточный матрикс, биологический каркас, белки внеклеточного матрикса, ЭПР-спектроскопия

Tissue engineering can become an alternative option of treatment which is focused on restoration, replacement and regeneration of cells, tissues and failed organs . One of the tasks of regenerative medicine is creation of biological or artificial scaffolds reproducing structure of native tissue and possessing the required physical, chemical and mechanical properties for ensuring cell adhesion and formation of three-dimensional tissue as a result of recellularization with autologous cells . Biological scaffolds must be decellularized to become nonimmunogenic; however this process has to be aimed at the maximum preservation of biochemical composition, morphological structure, and maintenance of the biomechanical properties of the obtained extracellular matrix similar to the properties of native tissue One of the main issues is development of criteria of quality of the obtained scaffolds . In this work the spectroscopy EPR (electron paramagnetic resonance) method is used as one of promising biophysical methods of evaluation of decellularization EPR-spectroscopy applicability is also shown for evaluation of preservation of native organs at a cryopreservation which might already be the first stage of decellularization that is indirectly confirmed by the conducted researches

Keywords: tissue engineering, oesophagus, diaphragm, decellularization, extracellular matrix, biological scaffold, extracellular matrices proteins, EPR spectroscopy

Введение

В последние десятилетия интенсивно проявляются тенденции увеличения количества заболеваний и случаев инвалидизации людей трудоспособного возраста, что настоятельно требует освоения и внедрения в клиническую практику новых, более эффективных и доступных методов восстановительного лечения [1]. Современная медицина предлагает несколько альтернативных путей восстановления или замены поврежденных тканей и органов, таких как ауто- или аллотрансплантации, реконструктивные операции с установлением имплантатов и тканевая инженерия. Органная трансплантация является эффективным методом лечения пациентов, страдающих заболеваниями в терминальной стадии, но она связана с постоянным недостатком донорских органов, необходимостью пожизненной иммунносупрес-

е-таП: g_lena82@list. ги

сивной терапии . Кроме того, широкое использование трансплантации органов во многих странах по этическим или экономическим соображениям невозможно, а также сопровождается высокой частотой послеоперационной летальности [2]. Перспективным направлением является создание тканеинженерных конструкций на основе децеллюляризированных каркасов, воспроизводящих трехмерную структуру нативной ткани с сохранением основных компонентов внеклеточного матрикса и обладающих соответствующими физическими, химическими и биомеханическими свойствами для обеспечения клеточной адгезии, роста, пролиферации и дифференцировки при рецеллюляризации . Тканеинженерный подход в создании функционирующего органа включает в себя разработку и модификацию биологических (природных) и (или) искусственных каркасов, а также оценку

и поддержание жизнеспособности клеток или тканей, взаимодействующих с ними, и требует наличия ряда ключевых компонентов, включая, но не ограничиваясь перечисленными ниже:

— каркасы или матриксы (биологические или искусственные);

— клетки (ауто -, алло -, ксеногенные);

— биореактор;

— биоактивные молекулы [2—7].

Децеллюляризация основана на очищении донорского органа или ткани от клеток, способных вызывать иммунологическую реакцию отторжения Это обуславливает важность оценки качества получаемого матрикса с использованием различных методов контроля, которые классически базируются на макроскопическом анализе (изменение окраски ткани или органа), морфологических признаках, количественном анализе остатков ДНК, ультраструктурном анализе. Одним из дополнительных может быть биофизический метод оценки качества каркаса, основанный на регистрации электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии) лиофилизированных тканей Общеизвестно, что отдельные свободные радикалы участвуют в осуществлении ряда физиологических процессов, в том числе показана их важная роль в обеспечении ре-докс-регуляции на клеточном уровне . В связи с этим определение интенсивности свободнорадикальных процессов в нативных и децеллюляризированных тканях может служить одним из критериев наличия в их составе жизнеспособных клеточных структур В связи с низкими концентрациями свободных радикалов, образующихся при жизнедеятельности клеток в естественных условиях, их изучение в биологических системах возможно только с использованием современных биофизических методов, прежде всего ЭПР-спектроскопии . Сигналы ЭПР, которые можно наблюдать у парамагнитных частиц при комнатной температуре (в виде парамагнитных центров), характерны для многих семихинонных или феноксильных радикалов, например для семихинонного радикала убихинона (HQ-), образующегося в дыхательной цепи митохондрий, функционирование которой является одним из признаков жизнедеятельности клеток

Материал и методы

Эксплантация органов

Для создания децеллюляризированных матрик-сов тканеинженерного пищевода и диафрагмы использовали органы 3 мужских особей макак-резус (Macaca mulatta). Все манипуляции с животными осуществляли при соблюдении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (протокол локального этического комитета № 30/1, 2014 г . ). Материал получали в условиях операционной ГБУЗ «Научно-исследовательский институт — краевая клиническая больница № 1 имени профессора С . В . Очаповского» Министерства здравоохранения Краснодарского края. Далее органы (n = 2) помещали в охлажденный раствор PBS -/-(Gibco, Англия) при температуре +4°С и затем транспортировали в лабораторию Время доставки при этом составило не более 24 ч Для оценки влияния криоконсервации на сохранность биологических образцов, материал от одной особи (n = 1) помещали в морозильную камеру при температуре -30°С, транспортировали в лабораторию и хранили при этой

температуре не более 7 сут . Перед проведением децеллюляризации органы постепенно оттаивали до комнатной температуры . В стерильных условиях с помощью пинцета и ножниц пищевод и диафрагму отделяли от окружающей соединительной и жировой тканей. Для проведения децеллюляризации краниальную и каудальную части пищевода канюлировали пластиковыми катетерами в соответствии с их диаметром . Орган фиксировали к перистальтическому насосу посредством соединительных трубок и помещали в специализированный биореактор ORCA (Harvard Apparatus, США). Диафрагму помещали в стерильный сменный контейнер и устанавливали на ротирующую поверхность

Децеллюляризация пищевода

С целью оптимизации протокола в связи с ана-томо-морфологическими особенности животного для проведения последующей децеллюляризации пищевода, было увеличено время воздействия, изменен состав и порядок перфузии децеллюляризи-рующими растворами по сравнению с оригинальным протоколом [8]. Таким образом, использовали де-тергент-энзиматический метод согласно модифицированному протоколу [9], включающему в себя 2 цикла обработки пищевода (деионизированная вода — 1 ч . ; дезоксихолат натрия 4% (Sigma Aldrich, США) + 2mM раствор ЭДТА (Sigma Aldrich, США) - 1 ч . ; PBS -/- (Gibco, Life Technologies, США) - 10 мин . ; свиная панкреатическая ДНКаза-I (Sigma Aldrich, США) 2000 ЕД , разведенная в 200 мл PBS +/+ (Gibco, Life Technologies, США) - 1 ч ); перфузия раствором PBS -/- (Gibco, Life Technologies, США) 200 мл в течение 18 ч для удаления децеллюля-ризирующих агентов со скоростью 150 мл/мин . Все использованные растворы были стерильными, комнатной температуры (рис . 1А, Б) .

Рис. 1. Пищевод примата до (А) и после (Б) проведения децеллюляризации

Децеллюляризация диафрагмы

Диафрагму приматов перед началом децеллю-ляризации очищали от окружающих тканей и промывали стерильным раствором PBS-/- (Gibco, Life Technologies, США) в течение 2 ч . , а затем подвергали воздействию детергентов и энзимов, концентрацию которых подбирали в соответствии с модификацией авторского протокола децеллюляризации мелких лабораторных животных . В оригинальном протоколе [10, 11] децеллюляризация диафрагмы крысы проводилась детергент-энзиматическим методом, включающим в себя обработку 4% раствором дезоксихолата натрия (Sigma Aldrich, США) в течение 3 ч . ; PBS -/- (Gibco, Life Technologies, США) -10 мин . ; 2000 ЕД ДНК-азы I (Sigma Aldrich, США) в течение 1 ч два цикла обработки деионизиро-ванной водой по 30 мин . каждый . Затем орган был тщательно отмыт в PBS -/- (Gibco, Life Technologies, США) в течение 12 ч

При децеллюляризации диафрагмы применяли стандартный ротационный метод . Общая продолжительность протокола составила 2 сут . Растворы были стерильны и подогреты до комнатной температуры (рис . 2А, Б) .

Рис. 2. Диафрагма примата до (А) и после (Б) проведения децеллюляризации

Морфологический анализ

Для проведения морфологического анализа образцы нативных и децеллюляризированных органов фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике с использованием автоматического гистопроцессора Leica TP1020 (Германия) и модульной установки для изготовления парафиновых блоков Leica EG1150H (Германия). Парафиновые срезы толщиной 5 мкм, полученные при помощи ротационного микротома Leica RM2235 (Германия), депарафинизировали и гидратировали с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином, а также флуорофором (4',6-диамидино-2-фенилиндола) DAPI . Для изучения структуры соединительной ткани внеклеточного матрикса (ВКМ) срезы окрашивали трихромом по Массону (Richard-Allan Scientific, США). Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus IX51 (Япония).

Количественное определение

содержания ДНК

Количественное определение содержания ДНК в образцах определяли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc . , США) с использованием наборов реагентов (Dneasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция) по стандартной методике

Оценка интенсивности свободнорадикальных

процессов методом ЭПР-спектроскопии

Спектры ЭПР были получены при температуре 24°С в X-диапазоне на спектрометре JES FA 300 (JEOL, Япония), при следующих параметрах измерения: мощность сверхвысокочастотного излучения составляла 1 мВт, частота микроволнового излучения равнялась 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1 мТл [12]. Исследуемые образцы пищевода и диафрагмы предварительно подвергали лиофилизации в сушилке ЛС-1000 (Проинтех, Россия), а затем перед непосредственным проведением ЭПР-спектроскопии их взвешивали с точностью до 0,01 мг с использованием лабораторных весов (Ohaus, КНР) Сигнал ЭПР у взвешенного образца измеряли в кварцевой ампуле диаметром 5 мм, масса навески в зоне резонатора составляла 0,03 г, интегральную интенсивность сигнала ЭПР вычисляли путем двойного численного интегрирования [13, 14]. При этом концентрацию парамагнитных центров в образцах определяли путем сравнения полученного сигнала со спектром ЭПР стандартного образца TEMPO (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил) окси-данил), содержащего 6,4х10-7 моль парамагнитных центров

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием программного обеспечения Excel for Office . Полученные результаты выражали в виде средних значений (M) и стандартной ошибки среднего (m). При сравнении средних значений изучаемых групп вероятность возможной ошибки находили по таблице t-критерия Стьюдента для парных сравнений, выражаемый в виде значений достоверности различия — «р», где р<0,05 считалось статистически значимым .

Результаты и обсуждение

Макроскопический анализ полученных матриксов пищевода и диафрагмы после завершения проведения децеллюляризации показал, что ткани после проведения децеллюляризации приобретали молочно-белую окраску, что соотносится с литературными данными [15—20]. Просвет пищевода увеличивался в 1,2—1,5 раза из-за снижения эластических свойств органа . Рутинные методики гистологической окраски не выявили наличия клеток в децеллюляризирован-ном матриксе . Окрашивание нативных тканей гематоксилином и эозином позволило оценить гистологическую структуру слизистой оболочки пищевода (рис . 3А) . В децеллюляризированных образцах (рис . 3Б) обнаружили сохранность компонентов внеклеточного матрикса при отсутствии клеточных ядер

Волокна ВКМ локализовались в области базальной мембраны эпителия, а также в незначительном количестве в подслизистом и мышечном слоях как в нативных, так и децеллюляризированных образцах (рис . 3В, Г) .

После децеллюляризации диафрагмы сохранные клетки и клеточные ядра не обнаруживались, патологических изменений структуры, архитектоники, ориентации волокон внеклеточного матрикса и тин-кториальных свойств соединительной ткани не отмечалось (рис . 4А—Г).

При флуорохромировании йАР1 (4',6-диамидино-2-фенилиндолом) в парафиновых срезах нативных органов отмечалось интенсивная флуоресценция ядер, в децеллюляризированных — флуоресценция полностью отсутствовала

В децеллюляризированном пищеводе содержание остаточной ДНК снижалось до 29% от исходного уровня (293,59±27,09 нг/мг в нативном пищеводе и 75,49±7,46 нг/мг — в децеллюляризированном) . Полученные данные свидетельствовали о том, что процесс децеллюляризации был эффективным и позволил в значительной степени очистить матрикс от клеточного материала (р = 0,0011). Аналогичные данные получены и после завершения процесса децеллюляризации диафрагмы низшего примата: снижение концентрации остаточной ДНК до 30% от исходного уровня

При изучении интенсивности свободнорадикаль-ных процессов в нативных и децеллюляризирован-ных интраторакальных органах со скелетной мускулатурой было установлено наличие ЭПР сигнала,

Рис. 3.

Пищевод примата

до

децеллюляризации, парафиновые

срезы.

Окраска:

A, Б — гематоксилин и эозин;

B, Г — трихромом по Массону. Ув. х100

Рис. 4.

Диафрагма примата до (А, В) и после (Б, Г) децеллюляризации. Окраска:

A, Б — гематоксилин и эозин,

B, Г — трихромом по Массону. Ув. х100

соответствующего концентрации парамагнитных центров с g-фактором 2,007 (семихинонный радикал убихинона) около 10—8 моль/г лиофилизи-рованной ткани (рис . 5), что указывает на наличие живых клеточных элементов в изученных образцах и подтверждает целесообразность использования ЭПР-спектроскопии для оценки жизнеспособности клеточных структур в нативных тканях

В децеллюляризированных тканях сигнал с g-фактором в диапазоне от 2,007 до 2,011 не был обнаружен, что указывает на отсутствие системы переносчиков электронов (прежде всего в митохондриях) и свободнорадикальных процессов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клеточных структур [21], в децеллюляризированных тканях пищевода и диафрагмы (рис . 6А, Б).

Рис. 5. Спектр ЭПР нативного образца лиофилизированной диафрагмы макаки-резус. По оси ординат — первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом, по оси абсцисс — напряженность магнитного поля

А

Н, мТл

Рис. 6. Спектр ЭПР децеллюляризованных образцов лиофилизированного пищевода макаки-резус (6А) и диафрагмы макаки-резус (6Б). По оси ординат — первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом, по оси абсцисс — напряженность магнитного поля

При изучении возможности сохранения нативных образцов пищевода и диафрагмы с помощью крио-консервации было установлено, что замораживание органов на срок 7 сут . и более способствует снижению интенсивности ЭПР сигнала с g-фактором в диапазоне от 2,007 до 2,011, который по завершению периода замораживания и после оттаивания органов практически не отличался от нуля и был подобен спектрам ЭПР децеллюляризированных органов

Рис. 7. Спектр ЭПР нативного образца лиофилизированного пищевода макаки-резус после криоконсервации в течение 7 сут. По оси ординат — первая производная величины высокочастотного излучения к напряженности магнитного поля, поглощенного изучаемым образцом, по оси абсцисс — напряженность магнитного поля

Имеющийся опыт децеллюляризации пищевода и диафрагмы мелких лабораторных животных позволил транслировать данную методику с оптимизацией протокола по времени экспозиции и концентрации децеллюляризирующих растворов на наиболее приближенную к клинике модель с использованием приматов Разрабатываемые для оценки качества децеллюляризированных матриксов критерии должны быть комплексными . Децеллюляризированные донорские органы не должны содержать клеток, в том числе клеточных компонентов: цитоплазму и ядра [22, 23]. Поскольку при использовании любых методов децеллюляризации невозможно удалить 100% клеток, существуют различные методы количественной оценки оставшихся клеточных компонентов, таких как двухцепочечная ДНК, митохондрии или мембран-ассоциированные молекулы, например, фосфолипиды [24]. Пороговая концентрация остаточного клеточного материала в ВКМ, которая может быть достаточной для развития нежелательного эффекта, не была подробно изучена и может изменяться в зависимости от источника ВКМ, типа ткани, в которую он был имплантирован, и иммунной системы реципиента [25]. В настоящее время четко не определены количественные критерии эффективности децеллюляризации, существующие параметры оценки характеризуют лишь проведение денуклеари-зации тканей [26]. С учетом вышеизложенного нами были выбраны такие предварительные критерии оценки качества децеллюляризации матриксов, как отсутствие клеток, определяемых различными методами микроскопии; количественный анализ ДНК, указывающий на остатки ядерного материала; биофизический метод оценки сохранности клеточных структур по интенсивности свободнорадикальных процессов Следует отметить, что использование

ЭПР-спектроскопии позволяет проводить не только качественную, но и количественную оценку генерации свободных радикалов в тканях пищевода и диафрагмы, что расширяет возможности инструментального определения степени разрушения клеточных структур при проведении децеллюляризации, а, следовательно, завершенности этапа подготовки матрикса для создания биокаркасов внутренних органов

Заключение

Детергентно-энзиматический метод децеллю-ляризации интраторакальных органов и тканей представляется наиболее перспективным способом получения биологических каркасов для создания тканеинженерных конструкций, таких как диафрагма, пищевод и отвечающих необходимым требованиям: трехмерность структуры, отсутствие токсичности, устойчивость к инфекциям, биомеханическая прочность, эластичность, способность к поддержанию клеточной адгезии, росту и пролиферации клеток, что в будущем поможет решить проблему трансплантологии в целом . При этом очень важным является выбор критериев качества полученной конструкции с использованием всестороннего анализа

Полученные данные показывают пределы использования и чувствительность метода ЭПР-спектроскопии при оценке завершенности этапа подготовки биоматрикса по степени разрушения клеточных структур в децеллюляризированных тканях . Также была установлена способность последовательного замораживания и размораживания тканей приводить к угнетению физиологических свободнорадикальных процессов в мышечных тканях интраторакальных органов, что имеет практическое значение для оценки сохранности нативных структур при криоконсервации Таким образом, будущие исследования покажут, насколько эффективно удаляются клеточно-ассоци-ированные белки из нативного биоматериала и какие последствия они оказывают при системном ответе организма на трансплантацию, что даст более точную информацию о качестве децеллюляризации органов и тканей

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда для проведения фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными группами (номер проекта 14-45-00018 от 15.10.2014 года).

ЛИТЕРАТУРА:

I. WHO | World Health Statistics 2011. World Health Organization; [cited 2015 Dec 23]; Available from: http://www . who . int/gho/publications/world_health_statistics/2011/en/

2 . Fuchs J . R . , Nasseri B .A., Vacanti J . P . Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction . Ann . Thorac . Surg . 2001; 72: 577-91.

3 . McIntire L.V . WTEC Panel Report on Tissue Engineering Research . Academic Press; 2003 [cited 2015 Dec 23]; 3 . Available from: http://www . mendeley . com/research/wtec-panel-report-tissue-engineering-research/

4 . Vacanti J . P ., Langer R . Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation Lancet 1999; 354: S32-4

5 . Skalak R ., Fox С . , editors . NSF Workshop, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology . 1988 .

6 . Saxena A. K . Tissue engineering: Present concepts and strategies . J . Indian Assoc . Pediatr . Surg . Medknow 2005; 10(1): 14 .

7 Atala A Tissue engineering, stem cells and cloning: Applications in Urology . Contemp . Urol . 2002; 14: 40-57 .

8 . Sjoqvist S ., Jungebluth P ., Lim M . L . et al . Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats Nat . Commun . 2014; 5: 3562 . doi: 10 . 1038/ncomms4562 .

9 . Губарева Е .А., Сьоквист С ., Сотниченко А. С . и др . Децел-люляризация пищевода низших приматов . Гены и клетки 2014; 9(4): 64-9 .

10 . Губарева Е .А ., Сотниченко А. С ., Гилевич И . В . , Маккиарини П . Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(4): 38-45 .

II. Gubareva E . A. , Sjoqvist S ., Gilevich I .V . et al . Orthotopic transplantation of a tissue engineered diaphragm in rats Biomaterials 2016; 77: 320-35 .

12 . Baryshev M . G ., Basov A .A ., Bolotin S . N . et al . NMR, EPR, and mass spectroscopy estimates of the antiradical activity of water with modified isotope composition . Bull . Russ . Acad . Sci . Phys . 2012; 76(12): 1349-52 .

13 . Basov A .A ., Bykov I . M ., Baryshev M . G . et al . Determination of deuterium concentration in foods and influence of water with modified isotopic composition on oxidation parameters and heavy hydrogen

isotopes content in experimental animals . Vopr. Pitan . 2014; 83(5): 43-50 .

14 . Gubareva E ., Kuevda E . , Basov A . et al . EPR spectroscopy for the decellularization process evaluation of bioengineered intrathoracic organs; Reg . Med . 2015; 10(07s): 282 .

15 . Ott H . С ., Matthiesen T. S ., Goh S . K . et al . Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart . Nat . Med . 2008;14(2): 213-21.

16 . Badylak S . F ., Taylor D ., Uygun K . Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds . Annu . Rev . Biomed . Eng . 2011; 13: 27-53 .

17 . Sellaro T . L., Ravindra A. K ., Stolz D . B . et al . Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds . Tissue Eng . 2007; 13(9): 2301-10 .

18 Ott H c , Taylor D , inventors; Regents of the university of Minnesota, assignee Decellularization and recellularization of organs and tissues . US patent 20090202977 . 2009 Aug 13 .

19 . Wainwright J . M ., Czajka С .A ., Patel U . B . et al . Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart Tissue Eng Part С Methods 2009; 16(3): 525-32 .

20 . Сотниченко А . С ., Губарева Е .А ., Гилевич И . В . и др . Децел-люляризированный матрикс сердца крысы как основа для создания тканеинженерного сердца . Гены и клетки 2013; 8(3): 86-94 .

21. Владимиров Ю .А . Кинетическая хемилюминесценция как метод изучения реакции свободных радикалов . Биофизика клетки 2011; 56(6): 1081-90 .

22 Badylak S F The extracellular matrix as a biologic scaffold material Biomaterials 2007; 28(25): 3587-93

23 . Zhang Q ., Raoof M . , Chen Y . et al . Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury . Nature 2010; 464(7285): 104-7 .

24 . Куевда Е . В ., Губарева Е .А ., Сотниченко А . С . и др . Перспективы создания тканеинженерных легких с использованием методов регенеративной медицины . Гены и клетки 2015; 10(1): 35-40 .

25 . Crapo P . M ., Gilbert T .W ., Badylak S . F . An overview of tissue and whole organ decellularization processes . Biomaterials 2011; 32: 3233-43

26 Gilbert T W Strategies for tissue and organ decellularization J . Cell Biochem . 2012; 113(7): 2217-22 .

Поступила: 14.09.2015