СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ К ФНО-АЛЬФА НА ОСНОВЕ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПРОМОТОРА ГЕНА ФНО
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL EFFECTIVENESS OF RHEUMATOID ARTHRITIS BY TNF-ALPHA MONOCLONAL ANTIBODIES ON BASIS OF ALLELIC POLYMORPHISM OF TNF GENE PROMOTER

Изобретение относится к медицине, а именно к способам прогнозирования эффективности лечения больных ревматоидным артритом моноклональными антителами к ФНО-α.
Основную роль в развитии воспалительного процесса играют провоспалительные цитокины. Особое внимание уделяют провоспалительным свойствам фактора некроза опухолей (ФНО), которые имеют фундаментальное значение в патогенезе многих воспалительных заболеваний. К числу аутоиммунных заболеваний и заболеваний с выраженным иммунопатогенезом, при которых наблюдается гиперпродукция ФНО, относятся ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, системная красная волчанка, полимиозит, дерматомиозит, псориаз, атопический дерматит и многие другие. Наиболее веские доказательства патогенетического значения ФНО получены при ревматоидном артрите, характеризующемся неуклонно прогрессирующим поражением суставов и внутренних органов, приводящим к ранней потере трудоспособности и сокращению продолжительности жизни. Согласно современным представлениям, именно цитотоксическими эффектами ФНО обусловлены основные проявления заболевания, в том числе хронический синовит, деструктивные поражения хряща и кости. Под действием ФНО повышается функциональная активность нейтрофилов, в том числе мигрировавших в сустав с образованием активных форм кислорода и высвобождением лизосомальных ферментов, которые оказывают непосредственное повреждающее действие на хрящевую и костную ткань. Хронические воспалительные процессы (в т.ч. аутоиммунные, к которым относится ревматоидный артрит) часто сопровождаются формированием анемии. В основе патогенеза анемии хронических заболеваний лежат ФНО-опосредованные нарушения пролиферации эритроидных предшественников и продукции эритропоэтина. Таким образом, среди широкого спектра провоспалительных медиаторов, участвующих в развитии воспалительных процессов, особое внимание привлечено к ФНО - основному цитокину, определяющему развитие воспаления [Насонов, 2003].
Самое крупное достижение в фармакотерапии воспалительных ревматических заболеваний, несомненно, связано с разработкой группы препаратов, объединяющихся общим термином - «биологические» агенты или биологические модификаторы иммунного ответа. Их отличительная особенность - селективное влияние на наиболее важные звенья иммунопатогенеза воспалительных болезней, при минимальной интерференции с нормальными механизмами иммунного ответа. В настоящее время в клиническую практику прочно вошел препарат, относящийся к классу «биологических» агентов - инфликсимаб (химерные моноклональные антитела против ФНО), который блокирует растворимый и мембрансвязанный ФНО. Следует отметить, что данный препарат назначается пациентам в случае неэффективности применения стандартных терапевтических схем и препаратов и показывает положительную динамику уже после первых инфузий. Однако по данным разных авторов продолжительная терапия инфликсимабом эффективна только у 50-60% больных ревматоидным артритом. [Licastro F. et all. 2009, Taylor PC et all. 2009]. В научной литературе активно дискутируются причины неэффективности антицитокиновой терапии ревматоидного артрита у части пациентов. В качестве причин обсуждается генетическая разнородность больных, определяющая различный уровень чувствительности к терапии. Накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что полиморфизм генов цитокинов вносит вклад в индивидуальные особенности иммунитета. Наличие определенных аллельных вариантов, влияющих на экспрессию белка, может приводить к изменению функциональной активности клеток, регулируемых данным медиатором? и формированию предрасположенности к определенной иммунопатологической реакции. [Bidwell J, et al. 1999, Haukim N, et all. 2002]. Изучение полиморфизма генов регуляторных молекул воспаления, влияющих на скорость транскрипции генов, стабильность мРНК и, тем самым, приводящих к увеличению или уменьшению количества и уровня биологической активности синтезируемого медиатора, приобретает особую актуальность как фундаментальных, так и для клинических исследований. Это в полной мере относится и к ФНО, известно, что аллельный полиморфизм гена ФНО может приводить как к повышению, так и к понижению уровня продукции медиатора, что может обусловливать разную чувствительность больных к терапии блокаторами ФНО [Mugnier В et all. 2003, Cuchacovich М et all. 2004].
Описан способ прогнозирования эффективности лечения ревматоидного артрита на основе определения экспрессии ряда генов, в том числе провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-18 (патент WO 2008132176). Недостатками данного подхода являются: 1) использование в качестве биологического материала синовиальной жидкости из пораженных суставов, отбор которой технически более сложен и травматичен для пациента; 2) способ оценки экспрессии подразумевает использование более сложного и дорогостоящего метода - количественного определения мРНК, в том числе технологии микрочипов; 3) метод не предполагает исследования самой терапевтической мишени - гена ФНО-альфа.
В качестве прототипа выбран способ, основанный на генотипировании полиморфизмов провоспалительных цитокинов, в том числе и гена ФНО-α, для прогноза эффективности терапии ревматоидного артрита блокаторами ФНО (WO 2010009377). Однако описанный способ опирается на полиморфизм в позиции-308 промотора гена ФНО-α, информативность которого подтверждается не во всех популяциях, а результаты исследований его функционального значения зачастую противоречивы.
Принципиальным отличием разработанного способа является использование функционального полиморфизма в промоторе гена ФНО-альфа, который связан с уровнем продукции самого белка ФНО и является информативным при прогнозе эффективности терапии ревматоидного артрита препаратом инфликсимаб у больных в российских популяциях.
Поставленной задачей являлось создание на основе молекулярно-генетических маркеров способа прогноза эффективности применения анти-ФНО терапии препаратом инфликсимаб у больных ревматоидным артритом.
Сущность предполагаемого изобретения заключается в проведении генотипирования функционального полиморфизма промотора гена провоспалительного цитокина ФНО-α и выявлении аллельных вариантов, связанных с продукцией ФНО-альфа, на анализе которых строится прогноз. Проводят исследования аллельного полиморфизма промотора гена ФНО-альфа в позиции-857, и при выявлении гетерозиготного состояния (генотип-857СТ), либо гомозиготного носительства алеля Т (генотип-857ТТ), связанных с повышенным уровнем продукции ФНО-альфа иммунокомпетентными клетками, прогнозируют высокую вероятность эффективности терапии препаратом инфликсимаб. При выявлении гомозиготного носительства аллеля С в позиции-857 промотора гена ФНО-альфа (генотип-857СС), связанного с пониженной продукцией ФНО-альфа иммунокомпетентными клетками, прогнозируют повышенную вероятность неэффективности терапии препаратом инфликсимаб.
Техническим результатом изобретения является выявление прогностических критериев вероятной эффективности применения анти-ФНО терапии моноклональными антителами к цитокину ФНО-α, основанных на полиморфизме в позиции-857 промотора гена ФНО-α, который связан с уровнем продукции самого белка ФНО.
Изобретение осуществляется следующим образом.
У пациентов производится отбор 2-5 мл периферической венозной крови в одноразовые пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта. Ядерные клетки освобождают от эритроцитов и выделяют высокомолекулярную ДНК одним из известных методов, например фенол-хлороформенной экстракцией или сорбционным методом. Далее проводится молекулярно-генетическое определение аллельных вариантов в промоторе гена ФНО-альфа.
4
4
Аллельные варианты идентифицируются методом ПДРФ-анализа, включающем три этапа. На первом этапе проводится амплификация фрагмента ДНК промотора гена ФНО-альфа в полимеразной цепной реакции (ПНР) со специфическими олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими участок промотора, содержащий функциональный полиморфизм в позиции-857. ПЦР смесь для амплификации объемом 20 мкл содержит: 75 мМ Tris-HCl, pH 8.8, 20 мМ (NH)2SO, 0.01% Tween-20, 0.2 мкг тотальной ДНК, по 0.25 мкМ каждого из праймеров, 0.2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2.5 мМ MgCl2 и 1-2 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в следующем режиме: денатурацию при 95°C в течение 3 мин, затем 30 циклов, включающих денатурацию при 95°C (10 сек.), отжиг при 65°C (15 сек.) и элонгацию при 72°C (20 сек). Далее осуществляют гидролиз полученного фрагмента ДНК с помощью специфической энодонуклеазы (рестриктазы) HindII («Сибэнзим», Новосибирск), для чего 5 мкл амплификата смешиваются с 5 мкл 2-кратного буфера, прилагаемого к рестриктазе, и вносят 5 ед.акт. фермента. Смесь инкубируется 3 часа при 37°C. На третьем этапе проводят идентификацию генотипа при электрофоретическом разделении продуктов рестрикции в 2% агарозном геле или с помощью капилярного электрофореза на станции Qiaxcel.
При выявлении гомозиготного генотипа -857СС, связанного с пониженной продукцией белка ФНО-альфа мононуклерными клетками, у пациентов имеется повышенная вероятность неэффективности назначения химерных моноклональных антител (инфликсимаб), блокирующих ФНО-альфа. Напротив, при выявлении в позиции -857, промотора гена ФНО-альфа генотипов -857СТ и -857ТТ, связанных с повышенным уровнем продукции белка ФНО-альфа, у пациентов с большей вероятностью терапия препаратом инфликсимаб будет эффективной.
Обоснованность данного способа была оценена при исследовании ассоциации уровня продукции ФНО-α в культурах мононуклеарных клеток периферической крови (МНК ПК), полученных от 148 условно здоровых доноров. В результате проведенных исследований выявлена статистически значимая связь (Z=-2,2; р=0,03) продукции ФНО-α с полиморфным вариантом промоторного региона -857C>Т. Носители генотипа -857СС характеризовались меньшей продукцией ФНО-α в культурах МНК при обработке клеток КонА, данные проиллюстрированы в таблице 1.
Способ поясняется на примере генотипирования 104 больных ревматоидным артритом, которым проводилась анти-ФНО терапия препаратом инфликсимаб в течение 30 недель (6 инфузий) с параллельной оценкой эффективности лечения с использованием критериев, рекомендованных EULAR и ACR.
2
При анализе данных по эффективности терапии после шести инфузий препарата инфликсимаб, проиллюстрированных в таблице 2, показана статистически значимая связь эффективности терапии - критерий DAS28 и полиморфизма в позиции -857 промотора гена ФНО, индекс корреляции Спирмена составил для этих параметров R=-0,24 (р=0,03). Кроме того установлено, что как аллель С, так и генотип СС чаще представлены у больных с неэффективной терапией (χ=4,68, р=0,033). Отношение риска (RR) для носителей генотипа СС и генотипов СТ+ТТ составляет 5,85, или, иными словами, риск неэффективной терапии анти-ФНО антителами у носителей генотипа -857СС выше на 20% в сравнении с носителями альтернативных вариантов полиморфизма.
Таблица 1.
Продукции ФНО-α в кондиционных средах МНК ПК у носителей разных аллельных вариантов полиморфизма -857C>Т.
Полиморфизм или сочетание
Генотип -8570Т
Медиана
Нижний квартиль
Верхний квартиль
Уровень ФНО-α в культурах, стимулированных КонА (пг/мл)*
СС
247,1
136,2
484,9
NT (СТ+ТТ)
337,0
226,4
551,7
Индекс стимуляции КонА
СС
2,86
1,75
4,66
NT (СТ+ТТ)
3,31
1,99
6,74
* - статистически значимые различия (р=0,03)
Таблица 2.
Частоты генотипов (%) в позиции -857 промотора гена ФНО-α у больных ревматоидным артритом с разной эффективностью терапии.
Аллель, генотип
С
Т
СС
СТ
ТТ
Эффективная терапия РА
78
22
67
22
11
Неэффективная терапия РА
94
6
94
0
6