СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОНАНОКОМПОЗИТОВ СЕЛЕНА
METHOD FOR PREPARATION OF SELENIUM BIONANOCOMPOSITES

Изобретение относится к областям микологии, бионанотехнологии и технологии получения новых наноструктурированных материалов и может быть использовано для получения биологическим путем субмикроразмерных композитов селена на основе внеклеточных метаболитов из жидких сред культивирования лекарственных грибов-базидиомицетов. Полученные биокомпозиты могут быть использованы при проведении научных и прикладных исследований в области биохимии, медицины и пищевой промышленности, а также в технологии производства антимикробных средств, лечебных препаратов, препаратов сельскохозяйственного назначения.
Созданию материалов из наночастиц препятствует агрегация последних, что приводит к потере большинства уникальных характеристик. Одним из эффективных способов противодействия этому является закрепление частиц на поверхности матрицы. В результате частицы утрачивают способность к легкой агрегации, сохраняют основной комплекс свойств и остаются доступными для взаимодействия с внешними реагентами. Биологические матрицы на основе полисахаридов ксилотрофных базидиомицетов (дереворазрушающих грибов с макроскопическими размерами плодовых тел) обладают преимуществами как получаемые из съедобных биологических объектов, доступных в лабораторных (не полевых) условиях, с использованием "зеленых" технологий (Не X., Wang X., Fang J., Chang Y., Ning N., Guo H., Huang L. (Linhong), Huang X. (Xiaoqiang), Zhao Z. Structures, biological activities, and industrial applications of the polysaccharides from Hericium erinaceus (Lion’s Mane) mushroom: A review // International Journal of Biological Macromolecules. 2017. V. 97. P. 228-237).
2
4
Известен способ получения нанокомпозита селена на основе природного гетерополисахарида арабиногалактана (Папкина А.В., Перфильева А.И., Живетьев М.А., Боровский Г.Б., Граскова И.А., Лесничая М.В., Клименков И.В., Сухов Б.Г., Трофимов Б.А. Влияние нанокомпозита селена и арабиногалактана на жизнеспособность фитопатогена Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus // Доклады академии наук. 2015. Т. 461, №2. С. 239-241), заключающийся в том, что восстановлением диоксида селена борогидридом натрия в воде в присутствии арабиногалактана в качестве стабилизатора образующихся наночастиц элементного селена получают водорастворимый нанокомпозит селена. К водному раствору арабиногалактана добавляют водный раствор оксида селена(IV) SeO. По истечении 30 мин к полученной смеси добавляют водный раствор NaBH и перемешивают в течение 15 мин. Выделение нанокомпозита проводят осаждением реакционной смеси в 4-кратном избытке этилового спирта с последующей многократной промывкой на фильтре тем же растворителем.
Однако изготовленный по данной технологии нанокомпозит получен не экологически чистым химическим путем, характеризуется относительно высоким удельным содержанием селена (1,23%) как необходимым условием проявления биологической активности (в указанной работе тестировали антибактериальную активность против фитопатогена), что повышает токсичность нанокомпозита и расход селенсодержащего реактива. Данный способ предполагает использование для получения искомого композита селена химических реагентов - оксида селена, борогидрида натрия, наряду с выделенным из древесины лиственницы сибирской Larix sibirica арабиногалактаном (Дубровина В.И., Медведева С.А., Витязева С.А., Колесникова О.Б., Александрова Г.П., Гуцол Л.О., Грищенко Л.А., Четверикова Т.Д. Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных. Иркутск: Аспринт, 2007. 145 с.), что существенно удорожает технологию и снижает экологическую безопасность получения композита селена.
Известен способ получения нанокомпозита элементного селена и гетерополисахарида арабиногалактана (Родионова Л.В., Шурыгина И.А., Сухов Б.Г., Попова Л.Г., Шурыгин М.Г., Артемьев А.в., Погодаева Н.Н., Кузнецов С.В., Гусарова Н.К., Трофимов Б.А. Нанобиокомпозит селена и арабиногалактана: синтез, строение и применение // Журнал общей химии. 2015. Т. 85, вып. 2. С. 314-316), заключающийся в том, что синтез нанокомпозита элементного селена и гетерополисахарида арабиногалактана проводится окислением в водном растворе бис(2-фенилэтил)диселенофосфината натрия пероксидом водорода в присутствии арабиногалактана в качестве стабилизирующей матрицы. Арабиногалактан растворяют в дистиллированной воде, добавляют бис(2-фенилэтил)диселенофосфинат натрия. Полученную реакционную смесь перемешивают 3 ч при 35°C, после чего добавляют 30%-ный водный раствор пероксида водорода. Реакционную смесь перемешивают при той же температуре в течение 1 ч, затем выливают в этанол. Полученный порошок нанокомпозита многократно промывают декантацией, отфильтровывают и сушат в вакууме до постоянной массы.
Однако следует отметить, что в данном источнике информации технология получения нанокомпозита селена основана на использовании токсичных химических реагентов, фосфорорганических соединений, пероксида водорода как обязательных компонентов смеси для выделения композита, наряду с выделенным из древесины лиственницы сибирской арабиногалактаном, что существенно удорожает технологию и снижает экологическую безопасность получения композита селена. Полученный по данной технологии композит селена характеризуется относительно высоким удельным содержанием селена (0,54%) как необходимым условием проявления биологической активности (в указанной работе изучали модификацию репаративного процесса в условиях костной травмы), что повышает токсичность нанокомпозита и расход селенсодержащего реактива.
Все известные способы получения нанокомпозитов элементного селена таким образом являются химическими, предполагают использование для получения искомого композита селена химических реагентов, что существенно удорожает технологию и снижает экологическую безопасность получения композита селена; характеризуются относительно высоким удельным содержанием селена как необходимым условием проявления биологической активности, что повышает токсичность нанокомпозита и расход селенсодержащего реактива.
Не известно способов получения нанокомпозитов селена с использованием грибов-базидиомицетов. Задачей изобретения является получение бионанокомпозита селена с высокой биологической активностью, используя процесс выделения из культуральной жидкости гриба-базидиомицета, характеризующегося отсутствием токсичности исходного сырья и низкой себестоимостью его получения.
Поставленная задача решается тем, что на первоначальной стадии культивирования гриба-базидиомицета на питательной среде с целью получения грибной субстанции как источника биокомпозита и дальнейшего выделения биокомпозита из грибной субстанции в виде разбавленного раствора, содержащего композит селена грибного происхождения (полученного с использованием гриба-базидиомицета), согласно предложенному способу, в качестве гриба-базидиомицета выбрана Ganoderma applanation, в качестве питательной среды выбран водный раствор с растворенными веществами, представляющими собой источник углерода, источник азота и 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 (диацетофенонилселенид, бис(бензоилметил)селенид, препарат ДАФС-25 (Пат. 2171110, Российская Федерация), в качестве грибной субстанции выбрана культуральная жидкость гриба, а в качестве разбавленного раствора, содержащего композит селена грибного происхождения, выбран растворенный в воде селенсодержащий осадок грибного биополимера, полученный в результате добавления этанола к упаренному фильтрату культуральной жидкости.
Наиболее близким по существу к заявляемой технологии является содержание источника информации «Growth behavior of phytopathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus treated with selenium biocomposites of mushroom origin», Journal of Stress Physiology and Biochemistry, 2016, V. 12, No. 1, P. 13-20, под авторством Цивилевой O.M., Перфильевой А.И., Кофтина О.В. Однако следует отметить, что в данном источнике информации не раскрыт способ получения бионанокомпозитов селена, а лишь рассмотрены совокупные, результирующие свойства растворов композитов в отношении бактериального фитопатогена, кольцевой гнили картофеля. А именно: способность этих растворов подавлять рост и снижать численность Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. О способе выделения и о характеристике бионанокомпозитов селена речь в данном источнике информации не идет.
Заявленный способ получения биокомпозита является новым, поскольку из уровня техники не известен способ получения селенсодержащего препарата, полученного с использованием внеклеточных метаболитов грибов-базидиомицетов. Заявляемая технология получения селенсодержащих субстанций с помощью глубинных культур высших грибов предлагает способ биологического синтеза субмикроструктурированных композитов элементного селена. Поэтому по заявляемой технологии выделен новый биокомпозит.
Технический результат заключается в получении нового биологически активного препарата, устойчивого при хранении, по одностадийной, "one-pot", экологически чистой технологии.
Способ осуществляется следующим образом.
Проводят глубинное культивирование гриба-базидиомицета (например, гриба рода Armillariella, или Flammulina, или Ganoderma, или Grifola, или Laetiporus, или Lentinula, или Pleurotus, или Tomophagus), в качестве питательной среды используют водный раствор, содержащий источник углерода (например, D-глюкозу, или L-арабинозу, или D-галактозу, или D-лактозу), источник азота (например, дрожжевой экстракт, или глицин, или аспарагин) и диацетофенонилселенид в следующих концентрациях: источник углерода 18-22 г/л, источник азота - 1,3-1,7 г/л, диаетофенонилселенид - 0,1-0,2 мМ. При использовании концентраций источников углерода и азота, не достигающих нижнего предела диапазона, рост гриба и синтез внеклеточных метаболитов, необходимых для получения целевого биокомпозита, существенно замедляется. Использование концентраций источников углерода и азота, превышающих верхний предел диапазона, нецелесообразен, так как не приводит к увеличению выхода целевого биокомпозита. Использование концентраций диацетофенонилселенида, не достигающих нижнего предела диапазона, приводит к снижению выхода целевого биокомпозита. При использовании концентраций диацетофенонилселенида, превышающих верхний предел диапазона, рост гриба и синтез внеклеточных метаболитов, необходимых для получения целевого биокомпозита, существенно замедляется. Культивирование гриба-базидиомицета проводят при температуре +24 - +28°C в течение 14-21 суток. Использование температурных условий или продолжительности культивирования, характеристики которых не укладываются в указанные диапазоны, приводит к снижению выхода целевого биокомпозита.
Таким образом, получают культуральную жидкость - источник нанокомпозита селена грибного происхождения. Культуральную жидкость отделяют от глубинного мицелия фильтрованием. Фильтрат культуральной жидкости упаривают до остаточного количества 0,03-0,10 первоначального объема при температуре 35-37°C, добавляют 96%-ный этанол в качестве осаждающего агента при соотношении этанола к остаточному количеству фильтрата (2,5-3,5):1 и выдерживают упаренный фильтрат с этанолом до визуально полного выпадения красно-оранжевого осадка биокомпозита. Осадок промывают этанолом и хранят под слоем этанола. Для получения водного раствора селенового биокомпозита осадок отделяют от надосадочной жидкости (супернатанта) и растворяют в дистиллированной воде. Выход нанокомпозита не менее 80%, массовая доля Se 0,004%.
Использование препарата ДАФС-25 в качестве добавки к питательной среде - источнику бионанокомпозита позволило оптимизировать процессы культивирования гриба-базидиомицета на питательной среде с целью получения грибной субстанции и выделения биокомпозита из грибной субстанции в виде разбавленного водного раствора, содержащего биокомпозит грибного происхождения. При этом эффективность процессов была достигнута при использовании в качестве компонентов жидкой питательной среды, наряду с источником углерода и источником азота, диацетофенонилселенида в определенных, экспериментально подобранных, интервалах концентраций.
Предлагаемый способ позволил выделить бионанокомпозит селена, являющийся гибридным органо-неорганическим композитом, синтез которого основан на эффекте самоорганизации частиц элементного селена "в момент образования" (формирующихся в водном растворе из селенорганического прекурсора) и органических полимерных структур. Происходит регуляция размеров гибридных фрагментов на наноразмерном уровне за счет специфической адсорбции макромолекул биополимеров на растущем в результате агрегации наноядре элементного селена. В качестве биополимерных компонентов композита используются образовавшиеся в глубинных культурах съедобных грибов внеклеточные полисахариды, при этом происходящее инкапсулирование в них наночастиц селена препятствует дальнейшей их агрегации на наноуровне. Способ обеспечивает мягкое воздействие на стабилизирующую биополимерную матрицу, не нарушающее структуру биологически активных селенсодержащих композитов.
Пример. Выращивали культуру Ganoderma applanation (трутовик плоский) на чашках Петри с агаризованным пивным суслом (3-4 градуса по Баллингу), рН 6-6,5. Температура 26°C. После полного зарастания чашек Петри блоки агаризованной среды с культурой ганодермы использовали в качестве инокулята жидкой питательной среды - водного раствора с растворенными веществами, представляющими собой источник углерода, источник азота и диацетофенонилселенид. Источником углерода служила D-глюкоза в концентрации 20 г/л, источником азота дрожжевой экстракт в концентрации 1,5 г/л, концентрация препарата ДАФС-25 составляла 0,15 мМ. Инкубировали в термостате при 27°C в течение 14 суток. Культуральную жидкость Ganoderma applanatum, полученную таким образом, отделяли от глубинного мицелия фильтрованием, фильтрат упаривали до остаточного количества 0,05 первоначального объема при температуре 35°C. К выпаренному фильтрату добавляли 96%-ный этанол, соблюдая соотношение объемов 1:3 соответственно, и выдерживали при комнатной температуре в течение нескольких часов (до визуально полного выпадения красно-оранжевого осадка). Осадок либо отделяли от супернатанта и растворяли в дистиллированной воде, либо хранили под слоем этанола, в зависимости от целей дальнейшего использования (изучение свойств биокомпозита или длительное хранение соответственно). Полученный нанокомпозит содержит массовую долю Se 0,004%.
Как видно из описания и примера, предложенный способ получения нанокомпозитов селена является биологическим, характеризуется отсутствием токсичности исходного сырья, не предполагает использование для получения искомого композита селена токсичных химических реагентов, что существенно удешевляет технологию и повышает экологическую безопасность получения композита селена. Получаемый по предложенной технологии нанокомпозит характеризуется относительно низким удельным содержанием селена без снижения уровня проявления биологической активности, что снижает токсичность нанокомпозита, расход селенсодержащего реактива и себестоимость получения целевого продукта.