Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышек сибирской язвы в Казахстане в 2016 г

DOI: 10.29413/ABS.2019-4.5.7

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышек сибирской язвы в Казахстане в 2016 г.

Избанова У.А. 1, Лухнова Л.Ю.1, Мека-Меченко Т.В. 1, Сансызбаев Е.Б. 1, Каиржанова А.Д. 2, Шведюк В.Б. 2,

Бегимбаева Э.Ж. 1, Сущих В.Ю. 1, Шевцов А.Б. 2

1 Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева МЗ РК (050054, г. Алматы, ул. Капальская, 14, Казахстан); 2 Национальный центр биотехнологии Комитета науки МОН РК, Нур-Султан (010000, г. Астана, ул. Валиханова,

13/1, Казахстан)

Автор, ответственный за переписку: Избанова Уинкуль Айтеновна, e-mail: uizbanova@gmail.com

Резюме

На сегодняшний день сибирская язва регистрируется во многих странах мира, в Казахстане - в виде спорадических случаев или небольших вспышек. Несмотря на эндемичность сибирской язвы в Казахстане, генетическое разнообразие штаммов недостаточно описано. На данный момент одним из самых дискриминационных методов генотипирования признан MLVA-25, достаточный для проведения молеку-лярно-эпидемиологического мониторинга.

Цель работы: определение культурально-морфологических свойств, геномных особенностей штаммов возбудителя сибирской язвы, их географическое распространение на территории Казахстана во время вспышек в 2016 г., сравнительный анализ с коллекционными штаммами, выделенными с 1962 г. Методы. В работе использованы микробиологические, генетические методы исследования. Результаты. Исследовали 11 штаммов B. anthracis, выделенных в 2016 г. в Казахстане. Для сравнения генотипов использовали 26 штаммов из коллекции патогенных микроорганизмов Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева. Филогенетический анализ кластеризовал 3? штаммов B. anthracis в три кластера и 23 генотипа. Результаты изучения фенотипических свойств штаммов сибирской язвы по основным тестам идентификации показали, что все штаммы, изученные в эксперименте и, выделенные в период с 1961 по 2016 гг., имели биологические свойства, характерные для типичных штаммов B. аnthracis.

Штаммы сибирской язвы, выделенные в 2016 г., характеризуются как значительной вариабельностью, также и циркуляцией одних и тех же генотипов и кластеров в разных областях Казахстана. MLVA-профили анализируемых Казахстанских штаммов уникальны и не совпадают полностью ни с одним исследуемым штаммом из MLVAbank. На MST дереве Казахстанские штаммы располагаются тремя кластерами, как и на филогенетическом дереве.

Заключение. Молекулярно-генетический анализ штаммов B. anthracis расширяет возможности эпидемиологов в отслеживании источников и путей распространения инфекции. Необходимо усовершенствовать систему отслеживания штаммов особо опасных инфекций в Казахстане с применением современных молекулярно-генетических методов.

Ключевые слова: штаммы сибирской язвы, генотип, мультилокусный анализ

Для цитирования: Избанова УА., Лухнова Л.Ю., Мека-Меченко Т.В., Сансызбаев Е.Б., Каиржанова А.Д., Шведюк В.Б., Бегимбаева Э.Ж., Сущих В.Ю., Шевцов А.Б. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышек сибирской язвы в Казахстане в 2016 г. Acta biomedica scientifica. 2019; 4(5): 43-49. doi: 10.29413/ABS.2019-4.5.7

Biological Properties and Molecular Genetic Characteristics of Bacillus Anthracis Strains Isolated During Anthrax Outbreaks in Kazakhstan in 2016

Izbanova U.A. \ Lukhnova L.Yu. \ Meka-Mechenko T.V. \ Sansyzbaev E.B. \ Kairzhanova A.D. 2> Shvedyuk V.B. 2> Begimbayeva E.Zh. \ Sushchih V.Yu. \ Shevtsov A.B. 2

1 Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic infections named after M. Aykimbaev of the Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan

Corresponding author: Uinkul A. Izbanova, e-mail: uizbanova@gmail.com

Abstract

Today, anthrax is recorded in many countries around the world, in Kazakhstan - in the form of sporadic cases or small outbreaks. Despite the endemicity of anthrax in Kazakhstan, the genetic diversity strains is not well described. At the moment, MLVA-25, which is sufficient for molecular and epidemiological monitoring, is recognized as one of the most discriminatory methods of genotyping.

Objective: to determine the cultural and morphological properties, the genomic characteristics of the strains of the anthrax pathogen, their geographical distribution in the territory of Kazakhstan during the outbreaks in 2016, a comparative analysis with collection strains isolated since 1962. Methods: microbiological, genetic research methods were used in the work.

Results. We investigated 11 strains ofB. anthracis, which were isolated in 2016 in Kazakhstan. For comparison of genotypes, 26 strains were used from the collection of pathogenic microorganisms of the A.M. Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases. Phylogenetic analysis clustered 37 strains of B. anthracis into three clusters and 23 genotypes.

The results of studying the phenotypic properties of anthrax strains by the main identification tests showed that all the strains studied in the experiment and isolated from 1961 to 2016 had biological properties characteristic of typical of B. anthracisstrains.

The anthrax strains isolated in 2016 are characterized as significant variability, as well as the circulation of the same genotypes and clusters in different areas of Kazakhstan. MLVA-profiles of analyzed Kazakhstan strains are unique and do not fully coincide with any studied strain from MLVAbank. On the MST-tree, Kazakhstan's strains are located in three clusters, as on the phylogenetic tree.

Conclusion: Molecular genetic analysis ofB. anthracis strains enhances the ability of epidemiologists to track the sources and pathways of infection.

It is necessary to improve the tracking system for strains of especially dangerous infections in Kazakhstan using modern molecular genetic methods.

Key words: anthrax strains, genotype, multilocus analysis

For citation: Izbanova U.A., Lukhnova L.Yu., Meka-Mechenko T.V., Sansyzbaev E.B., Kairzhanova A.D., Shvedyuk V.B., Begimbayeva E. Zh., Sushchih V.Yu., Shevtsov A.B. Biological Properties and Molecular Genetic Characteristics of Bacillus Anthracis Strains Isolated During Anthrax Outbreaks in Kazakhstan in 2016. Acta biomedica scientifica. 2019; 4(5): 43-49. doi: 10.29413/ABS.2019-4.5.7

АКТУАЛЬНОСТЬ

Случаи сибирской язвы человека почти ежегодно регистрируют в Казахстане. В настоящее время эпидемиологический контроль за особо опасными заболеваниями включает молекулярно-генетическую «дактилоскопию» с целью отслеживания источников инфицирования и распространения инфекции. На территории республики Казахстан зарегистрировано 1778 стационарно неблагополучных по сибирской язве населенных пунктов, 2249 почвенных очагов, где захоронены сельскохозяйственные животные, павшие от сибирской язвы [1]. Общие потери от данного заболевания с 1935 по 2018 гг. составляют более 27 000 голов сельскохозяйственных животных, зарегистрировано 1887 случаев заболеваний у людей. Ежегодно происходит регистрация новых вспышек и выделение штаммов Bacillus anthracis. Тем не менее обязательное генотипирование не включено в практику контроля за инфекцией.

Сходство Bacillus anthracis с другими видами рода Bacillus по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам создают значительные трудности в лабораторной диагностике сибирской язвы. Bacillus anthracis, В. cereus, В. mycoides, В. pseudomycoides, В. thuhngiensis и В. weihenstephanensis составляют единую таксономическую группу «Bacillus cereus» [2]. Данная группа микроорганизмов имеет высокое промышленное и медицинское значение. Так, например, штаммы В. cereus и В. thuhngiensis широко используются в сельском хозяйстве в качестве инсектицидных или ростостимулирующих препаратов. В то же время генетически близкий вид B. anthracis остаётся проблемой здравоохранения и животноводства. Важным элементом эпидемиологического мониторинга за сибирской язвой является генетическая характеристика штаммов, осуществляемая с целью оценки географического происхождения. Полученная информация позволяет оценивать распространение вспышки в глобальном масштабе устанавливать регион происхождения штамма и дифференцировать естественную вспышку от актов биологического терроризма.

Основные исследования по типированию штаммов сибиреязвенного микроба были проведены P. Keim et al. (2000), который разработал систему многолокусного анализа вариабельных тандемных повторов (MLVA), позволяющую дифференцировать штаммы B. anthracis [3]. Ранее нами было проведено молекулярное типирование (MLVA-8) коллекционных штаммов B. anthracis, что позволило определить, что в очагах инфекции Казахстана циркулируют штаммы B. anthracis четырёх кластеров (А1а, А4,

А3в, А5) [4]. Определены размеры хромосомных локусов, характерные для возбудителя сибирской язвы, что позволяет выявлять атипичные штаммы, дифференцировать от близкородственных бацилл. Размеры хромосомных и плазмидных ампликонов: vrrA 296-320; vrrB1 223-224; vrrB2 152-156; vrrC, 535-619; vrrC2 528-602; CG-3 147-152; рХО1 123-135; рХО2 134-138 свидетельствуют о принадлежности штаммов к виду B. anthracis.

Дискриминационная способность MLVA-8 ограничена и не позволяет проводить полноценный эпидемиологический мониторинг, и, тем более дифференцировать вспышку по происхождению [5]. В последнее десятилетие схема генотипирования B. anthracis неоднократно совершенствовалась, постоянно увеличивая дискриминационную способность [5, 6, 7]. На данный момент комбинация 25 MLVA-маркеров и 12 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), позволяет получить данные достаточные для проведения молекулярно-эпидемиологического мониторинга и отслеживать географическое происхождение штаммов на глобальном и локальном уровнях.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение культура льно-морфологических свойств, геномных особенностей штаммов возбудителя сибирской язвы, их географическое распространение на территории Казахстана во время вспышек в 2016 г., сравнительный анализ с коллекционными штаммами, выделенными с 1961 года.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 37 штаммов, из которых 11 были выделены при вспышках сибирской язвы в 2016 г., остальные штаммы были взяты из коллекции патогенных микроорганизмов Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева (табл. 1).

Выделение ДНК проводили с использованием набора «QIAamp DNA Mini Kit» производства фирмы QIAGEN (США).

Для молекулярного типирования штаммов B. anthracis был использован мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (MLVA), включающий в себя 25 локусов, предложенный Florigio Lista (2006) [5]. Для амплификации целевых фрагментов использовано 4 мультиплексных ПЦР реакции. Концентрация прай-меров в реакции соответствовала рекомендациям Lista. Смесь включала: 0,2 мМ каждого дНТФ; 1-х ПЦР буфер (20 mM (NH4)2 SO4, 0,01% (v/v) Tween 20 (Fermentas), ионы

Таблица 1

Характеристика исследованных штаммов Bacillus anthracis

Table 1

Characteristics of the investigated strains of Bacillus anthracis

Шифр штамма Год Выделен: внешняя среда/ Географическое место выделения В. апШгааБ Характеристика эпидемиологического

выделения источник (область, населенный пункт) случая

Almaty_31 2004 Мясо крупного рогатого скота Актюбинская, Муголжарский район, г. Эмба Случай

Almaty_9 1963 Кожа овцы Алматинская, г. Алматы Случай

Almaty_37 2016 Мясо крупного рогатого скота Алматинская, Кербулакский район, с. Карашокы Случай

Almaty_11 1983 верблюд Атырау, г. Эмба Случай

Almaty_4 1962 Карбункул человека Атырау, колхоз Сталина Случай

Almaty_44 2016 Мясо крупного рогатого скота

Almaty_45 2016 Почва на месте снятия шкуры ВКО Жарминский район, с. Калбатау Вспышка

Almaty_43 2016 Почва с места убоя

Almaty_19 2001 Почва с места убоя

ВКО Урджарский район, с. Маканчи Вспышка

Almaty_18 2001 Карбункул человека

Almaty_30 2004 Шерсть лошади ВКО, Семипалатинск, с. Знаменка Случай

Almaty_28 2004 Шкура крупного рогатого скота ВКО, Шемонаихинский район, с. Усть-Таловка Случай

Almaty_16 1999 Навоз Жамбылская область, Луговской район Случай

Almaty_29 2004 Селезёнка мелкого рогатого скота Жамбылская, Кордайский район, с. Кенен Случай

Almaty_15 1998 Мясо крупного рогатого скота Жамбылская, Кордайский район, с. Сулутор Случай

Almaty_14 1997 Почва Жамбылская, Турар Рыскулова, Вспышка

Almaty_12 1997 Карбункул человека с. Алгабас

Almaty_32 2009 Мясо крупного рогатого скота Западно-Казахстанская область Случай

(ЗКО), Бурлинский район, п. Ак-Булак

Almaty_21 1963 Карбункул человека ЗКО, Калмыковская лаборатория Случай

Almaty_49 2016 Язва больного Караганда, Актогайский район, Вспышка

Almaty_50 2016 Язва больного с. Ушарал

Almaty_39 2016 Язва больного

Almaty_40 2016 Мясо КРС Караганда, Шесткий район, с. Еркиндык Вспышка

Almaty_41 2016 Язва больного

Almaty_2 1961 Кровь человека Кызылординская, Казалинский Вспышка

Almaty_3 1961 Карбункул человека район, с. Шакен

Almaty_20 неизвестно Неизвестно Кыргыстан Случай

Almaty_47 2016 Шкура крупного рогатого скота Павлодарская, Иртышский район, Вспышка

Almaty_48 2016 Холодец с. Узынсу

Almaty_22 2000 Карбункул человека Туркестанская, Байдибекский район, с. Акбастау Случай

Almaty_10 1963 Карбункул человека Туркестанская, Казгуртский, с. Кызыл Тан Случай

Almaty_36 2011 Карбункул больного Туркестанская, Ордабасинский район, с. Токсансай Случай

Almaty_23 2000 Смыв с весов Туркестанская, Сайрамский район, с. Сайрам Случай

Almaty_5 1962 Кожа мелкого рогатого скота Туркестанская, Тюлькубасский район, п. Жданова Случай

Almaty_6 1962 Селезёнка овцы Туркестанская, Тюлькубасский район, с. Антоновка Случай

Almaty_7 1962 Карбункул человека Туркестанская, Тюлькубасский район, с. Кереит Случай

Almaty_8 1962 Кожа овцы Туркестанская, Казгуртский район, с. Коммунизм Случай

магния 2,5 мМ, DMSO - 1 мкл, смесь Taq ДНК полимеразы и Pfu ДНК полимеразы в соотношении 1:8 (Fermentas). Программа ПЦР амплификации включала: 96 °С в течение 3 минут; 35 циклов 95 °С - 20 секунд, 60 °С - 30 секунд, 65 °С - 2 минуты; финальная элонгация 65 °С - 20 минут. После амплификации образцы разводили в 70 раз и 1,5 мкл использовали для капиллярного разделения на автоматическом генетическом анализаторе ABI3730xl (Applied Biosystems, Tokyo, Japan), с POP 7 и размерным стандартом LIZ 1200. Анализ размеров VNTR повторов проводили с использованием программного обеспечения GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems). Построение ден-дограммы проводили с использованием программного обеспечения BioNumerics 7.5 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium). Кластерный анализ был проведён методом невзвешенного попарного среднего (UPGMA). При построении минимального остовного дерева (MST) использовали стандартный протокол.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время на территории Казахстана сохраняется неблагополучная ситуация по сибирской язве, которая определяется социально-экономическими условиями жизни населения, активизацией почвенных очагов, возможностью завоза инфекции из-за рубежа, нарушением действующих ветеринарно-санитарных правил и другими факторами.

В 2016 г. в период с мая по сентябрь зарегистрировано 19 случаев заболевания людей (из них три случая заболевания закончились летальным исходом) сибирской язвой были зарегистрированы в четырёх областях Казахстана - в Восточно-Казахстанской (ВКО), Алматин-

ской, Павлодарской и Карагандинской (табл. 1). Заражение людей произошло при убое больных животных, без ведома ветеринарного врача.

Дополнительно были включены штаммы, хранящиеся в коллекции, выделенные в различных регионах Казахстана с 1961 года. Восемнадцать из анализируемых штаммов представляют собой 7 вспышек.

Результаты изучения фенотипических и генетических свойств штаммов сибирской язвы по основным тестам идентификации и дополнительным признакам показали, что все штаммы, изученные в эксперименте и, выделенные в период с 1961 по 2016 гг., имели биологические свойства, характерные для типичных штаммов B. anthracis.

Штаммы формировали колонии в R-форме на плотных питательных средах и придонный рост с сохранением прозрачности среды в питательном бульоне, обладали способностью к спорообразованию. У штаммов не выявлялась фосфатазная, лецитиназная, гемолитическая активность, штаммы обладали способностью к капсулоо-бразованию in vitro и in vivo. Штаммы были чувствительны к сибиреязвенному бактериофагу, широкому спектру антибиотиков. В ПЦР выявлены гены pag и cap.

В результате проведённых исследований значения VNTR-повторов получены для 37 анализируемых штаммов. Филогенетический анализ кластеризовал 37 штаммов B. anthracis в три кластера и 23 генотипа, из которых 15 генотипов представлены единичными штаммами (рис. 1).

На основе MLVA-25 при UPGMA анализе штаммы формируют три обособленных кластера. Первый (I) кластер самый многочисленный, включает в себя 29 (78 %) штаммов, выделенных с 1961 по 2016 гг. в Алматинской, Карагандинской, Восточно-Казахстанской, Кызылордин-

iE

i

н

ч

с

1 i 1 i 9 1 II 1 I I I I I I I Ii 1 1 I I 1 I 1 Strain Region Year

4 19 12 57 21 1 8 7 13 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 79 64 7 8 9 В Almaty_3 7 АЯтаду 201B

4 1» 12 57 21 1 8 7 13 30 7 30 '5 to 16 11 11 1 14 7» 64 7 8 В В Alm»1y_39 Karaganda 2016

4 IB 11 57 21 1 e 7 13 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 79 04 7 8 В в Almaty_44 East Kanutten 2016

4 IB 1? 57 21 1 8 7 13 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 79 64 7 8 в в Aimety_45 East Kazakhstan 2016

4 19 12 67 21 1 7 T 13 30 7 30 46 to 16 11 К 1 14 79 64 7 Й 9 8 AJmatyje Jam by! 1999

4 19 12 57 21 i 10 ? 13 30 7 30 46 to 16 11 11 1 14 7» 64 7 8 В 9 Aim*y_43 East Kazakhstan 2016

4 19 12 57 21 \ 7 7 13 22 7 30 46 to m 11 11 1 14 79 64 7 8 В 8 AJmaty_15 Jambyl 1998

4 ig 12 57 21 1 8 7 13 24 7 30 45 to 16 11 11 1 14 75 64 7 8 В В AJmaty_2 Kyzytafda 1961

4 i» 12 57 21 1 8 7 13 24 7 30 45 to 16 11 11 1 14 75 64 7 8 в 8 Aimaty_3 Kyzyforda 1961

4 is 12 57 21 1 8 7 13 24 7 30 45 to 16 11 11 1 14 75 64 7 8 в 8 Aimaty_4 Alyrag 1962

4 IB 12 57 21 1 8 7 13 24 7 30 45 10 16 11 11 1 14 75 64 7 8 в 8 AJro»iy_19 East Kazakhstan 2001

4 19 12 67 21 1 fi 7 13 30 7 30 45 10 16 11 111 14 75 64 7 8 9 8 AJmaty_32 West Kazakhstan 2009

4 19 12 5? 21 1 в 7 13 24 7 30 46 to 16 11 11 1 14 75 64 7 8 В 8 Almaty_36 South Kazakhstan 2011

4 19 12 57 21 1 7 7 13 30 7 30 46 to 16 11 It 1 14 76 64 7 8 В 8 A)maty_3l AMobe 2004

4 IB 12 57 21 1 to 7 12 30 7 30 45 10 16 11 11 1 14 72 64 7 8 В В AJmaty_0 Afcnaly 1963

4 IB 12 57 21 1 10 7 12 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 72 64 7 8 а В AJma1y_16 East Kazakhstan 2001

4 IB 12 57 21 * to 7 12 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 72 64 7 8 в В Alm«y_28 JrVribyl 2004

4 IB 12 57 21 1 9 7 13 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 72 64 7 8 в 8 AJm»ty_S South Kazakhstan 1962

4 IB 12 57 21 9 r 13 30 T 30 46 to 16 11 11 1 14 72 64 7 8 в 8 Almaty J 2 Jambyt 1987

4 19 12 57 21 1 9 7 13 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 72 64 7 8 в 8 Almaty_14 Jambyt 1997

4 IB 12 57 21 1 В В 13 30 7 30 45 to 16 11 11 1 14 65 64 7 8 в 8 Almaty_t0 South Kazakhstan 1063

3 IB 12 57 21 1 7 7 13 29 7 30 45 to 16 11 11 1 14 69 64 7 3 9 8 AJmaty_30 East Kazakhstan 2004

s IB 12 57 21 2 В 7 13 30 7 30 38 to 14 11 11 1 14 75 64 7 8 В 8 Aim»1y„7 South Kazakhstan 1962

5 IB 12 57 21 2 В 7 13 30 7 30 IS to 14 11 11 1 14 75 64 7 8 в 8 AlmatyJJ South Kazakhstan 1962

5 IB 12 57 21 2 9 7 13 30 7 30 45 to 14 11 11 1 14 75 64 7 8 в 8 AJmety_23 South Kazakhstan 2 ООО

5 19 12 67 21 2 fi 7 13 25 7 30 46 to 14 11 11 1 14 75 64 7 8 9 8 Alm*ty_22 Soutil Kajakhslan 2000

4 IB 12 57 21 1 В 7 13 30 7 30 46 to 14 11 1 14 75 64 7 8 В 8 AJm»ty_2i West Kazakhstan 1963

4 IB 12 47 21 2 7 7 13 30 6 30 45 to 16 11 11 1 14 55 64 7 8 В 6 AJmatyje South Kazakhstan 1962

4 IS 12 47 21 2 7 7 13 30 9 20 46 to 16 11 11 1 14 69 64 7 8 В В Almaty, tl Aiyrau 1983

4 IB 12 51 17 2 8 10 1в 2S 7 30 45 to 16 11 11 1 14 57 24 t 8 В 8 Aimaty_40 Karaganda 2016

4 IB 12 51 17 2 8 В 16 28 7 30 45 to 16 11 11 1 14 57 24 9 8 9 8 AJmHy,41 Karaganda 2016

4 IB 12 51 17 2 7 8 16 26 7 30 45 to 16 11 11 1 14 57 64 9 8 9 8 AJmaty_26 East Kazakhstan 2004

4 19 12 51 17 1 a 9 16 20 7 30 41 10 16 11 11 1 14 57 64 7 8 9 8 Almaty_20 Kyrgysstan nhj

3 22 12 51 17 2 a 7 14 27 7 2* 45 to IS 10 11 1 IT 17 13 9 8 6 9 AJmaty_4B Karaganda 2016

3 22 12 51 17 2 в 7 14 27 7 24 45 to 16 10 11 1 11 17 13 9 8 6 8 Almaty_5G Karaganda 2016

3 22 12 51 17 2 8 7 14 27 7 24 45 10 15 to 11 1 11 17 13 7 8 6 В Almaty_4 7 Pwfoddf 2016

3 22 12 51 17 2 8 7 14 27 7 24 45 to 15 to 11 1 11 17 13 7 8 6 В Almaty_48 Pavtodai 2016

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основании 25 VNTR маркеров. Fig. 1. Phylogenetic tree, built on the basis of 25 VNTR markers.

ской, Атырауской, Туркестанской, Западно-Казахстанской и Жамбылской областях. Второй кластер (II) объединил в себе четыре штамма, из которых один штамм выделен в Республике Кыргызстан, два во время вспышке в Карагандинской области в 2016 г. и один штамм из ВКО, выделенный 2004 г. В третий кластер вошли 4 штамма, выделенные при вспышке 2016 г. в Карагандинской и Павлодарской областях.

Для многих генотипов чётко прослеживается кластеризация по вспышкам: штаммы под номерами А1та1у_2 и А1та1у_3, выделенные при вспышке в 1961 г. в Кызы-лординской; А1та1у_47 и А1та1у_48, выделенные при вспышке в Павлодарской области в 2016 г.; А1та1у_49 и А1та1у_50 - при вспышке в Ушарал, Карагандинской области в 2016 г.; А1та1у_7 и А1та1у_8 - при вспышке в Туркестанской области в 1962 году; А1та11у_12 и А1та1у_14 - в Жамбылской области, при этом в последних двух случаях установлен источник инфицирования. Два из трёх штам-

мов, выделенные при вспышке в ВКО в 2016 г. идентичны по генотипам (Almaty_44 и Almaty_45), штамм Almaty_43 из той же вспышки, отличается по гипервариабельному локусу pXO1.

Нехарактерно кластеризуются штаммы, выделенные во время вспышки 2016 г. в селе Еркиндык Карагандинской области, так Almaty_41 и Almaty_40 кластриро-вались во второй кластер и отличаются между собой по гипервариабельным локусам pXO2 и Bams34, в то время как штамм Almaty_39 вошёл в первый кластер и полностью идентичен генотипам из Алматинской и ВКО областей 2016 г.

Результаты филогенетического анализа свидетельствуют, что в 2016 г. на территории Казахстана циркулировали штаммы сибирской язвы, входящие в состав трёх кластеров, шести генотипов (№№ 1, 24, 19, 20, 23, 3). Штаммы сибирской язвы, относящиеся ко II и III кластеру

Рис. 2. Минимальное остовное дерево. Fig. 2. Minimum spanning tree.

и генотипам (№№ 1, 24, 19, 20, 23, 3), ранее, до 2016 г., не выделяли в Казахстане.

Штаммы сибирской язвы, выделенные в 2016 г., характеризуются как значительной вариабельностью, также и циркуляцией одних и тех же генотипов и кластеров в разных областях Казахстана. Так, штаммы сибирской язвы I кластера и I генотипа циркулируют в Алматинской, ВКО, Карагандинской областях.

Таким образом, результаты филогенетического анализа штаммов сибирской язвы, выделенных на территории Казахстана, свидетельствуют о том, что штаммы сибирской язвы, выделенные в 2016 г., характеризуются как значительной вариабельностью, также и циркуляцией одних и тех же генотипов и кластеров в разных областях Казахстана. Это может быть связано с отсутствием учёта движения животных, территориальной близостью и другими, пока ещё не определёнными факторами.

Для изучения глобального положения штаммов, циркулирующих в Казахстане, было построено минимальное остовное дерево с MLVA-профилями 37 штаммов, циркулирующих в Казахстане и MLVA-профилями 1527 штаммов B. anthracis из MLVAbank (http://microbesgenotyping.i2bc. paris-saclay.fr/) (рис. 2).

Как видно из рис. 2 MLVA-профили анализируемых казахстанских штаммов уникальны и не совпадают полностью ни с одним исследуемым штаммом из MLVAbank. На MST-дереве казахстанские штаммы располагаются тремя кластерами, как и на филогенетическом дереве.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты филогенетического анализа свидетельствуют, что в 2016 г. на территории Казахстана циркулировали штаммы сибирской язвы, входящие в состав трёх кластеров, шести генотипов (№№ 1, 24, 19, 20, 23, 3). Штаммы сибирской язвы, относящиеся ко II и III кластеру и генотипам (№№ 1, 24, 19, 20, 23, 3), ранее, до 2016 г., не выделяли в Казахстане.

Штаммы сибирской язвы, выделенные в 2016 г., характеризуются как значительной вариабельностью, также и циркуляцией одних и тех же генотипов и кластеров в разных областях Казахстана. Это может быть связано с отсутствием учёта движения животных, территориальной близостью и другими, пока ещё не определёнными факторами.

Не характерно кластеризуются штаммы, выделенные во время вспышки 2016 года в селе Еркиндык Карагандинской области, так Almaty_41 и Almaty_40 кластри-ровались во второй кластер и отличаются между собой по гипервариабельным локусам pXO2 и Bams34, в то время как штамм Almaty_39 вошёл в первый кластер и полностью идентичен генотипам из Алматинской и ВКО областей 2016 г.

Профили анализируемых казахстанских штаммов уникальны и не совпадают полностью ни с одним исследуемым штаммом из MLVAbank.

Молекулярно-генетический анализ штаммов B. anthracis расширяет возможности эпидемиологов в отслеживании источников и путей распространения инфекции. На основании полученных результатов можно предположить более высокое генетическое разнообразие циркулирующих штаммов.

Результаты опытов хотя и свидетельствуют о близости генотипов у штаммов возбудителя сибирской язвы,

но имеют значительные различия в зависимости от территориального выделения.

Необходимо усовершенствовать систему отслеживания штаммов особо опасных инфекций в Казахстане с применением современных молекулярно-генетических методов.

Конфликт интересов

Авторы статьи сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование

Статья написана в рамках НТП «Разработка научных основ единой для Республики Казахстан системы мониторинга, диагностики и микробного коллекционирования возбудителей особо опасных, «возвращающихся», вновь возникающих и завозных инфекций».

Вклад авторов

Избанова У.А., Лухнова Л.Ю., Мека-Меченко Т.В., Сансызбаев Е.Б., Бегимбаева Э.Ж., Сущих В.Ю. - изучение культурально-морфологических свойств 37 штаммов коллекционных сибирской язвы, подготовка обзора, проведение анализа полученных результатов

Каиржанова А.Д., Шведюк В.Б., Бегимбаева Э.Ж., Сущих В.Ю., Шевцов А.Б. - изучение генетических свойств 37 коллекционных штаммов сибирской язвы

ЛИТЕРАТУРА

1. Султанов А.А., Адбыбекова А.М., Сущих В.Ю. (ред.). Кадастр почвенных очагов сибирской язвы на территории Республики Казахстан. Алматы: ТОО «КазНИВИ»; 2017.

2. Цыганкова О.И. Фенотипическая и генотипическая вариабельность штаммов сибиреязвенного микроба (теоретические и практические аспекты): автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Ростов-на-Дону; 2007.

3. Keim P, Price LB, Klevytska AM, Smith KL, Schupp JM, Okina-ka R, et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2000; 182(10): 2928-2936. doi: 10.1128/jb.182.10.2928-2936.2000

4. Aikimbayev A, Blackburn J, Van Ert MN, Easterday R, Zakary-an S, Lukhnova L, et al. Historical Incidence and Molecular Diversity of Bacillus anthracis in Kazakhstan. In: Proceedings of URISA's GIS in Public Health Conference, May 20-23, 2007, New Orleans. New Orleans; 2007. p. 456-461.

5. Lista F, Faggioni G, Valjevac S, Ciammaruconi A, Vaissaire J, le Doujet C, et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiol. 2006; 6: 33-39. doi: 10.1186/1471-2180-6-33

6. Van Ert MN, Easterday WR, Huynh LY, Okinaka RT, Hugh-Jones ME, Ravel J, et al. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PLoSOne. 2007; 2(5): e461. doi: 10.1371/journal. pone.0000461

7. Beyer W, Bellan S, Eberle G, Ganz HH, Getz WM, Haumacher R, et al. Distribution and molecular evolution of Bacillus anthracis genotypes in Namibia. PLoSNegl Trop Dis. 2012; 6(3):1534. doi: 10.1371/journal.pntd.0001534

REFERENCES

1. Sultanov AA, Adbybekova AM, Sushchikh VYu

2. Tsygankova OI. Phenotypic and genotypic variability of anthrax microbe strains

3. Keim P, Price LB, Klevytska AM, Smith KL, Schupp JM, Okinaka R, et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis

reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2000; 182(10): 2928-2936. doi: 10.1128/ib.182.10.2928-2936.2000

4. Aikimbayev A, Blackburn J, Van Ert MN, Easterday R, Zakary-an S, Lukhnova L, et al. Historical Incidence and Molecular Diversity of Bacillus anthracis in Kazakhstan. In: Proceedings of URISA's GIS in Public Health Conference, May 20-23, 2007, New Orleans. New Orleans; 2007. p. 456-461.

5. Lista F, Faggioni G, Valjevac S, Ciammaruconi A, Vaissaire J, le Doujet C, et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number

tandem repeats analysis. BMC Microbiol. 2006; 6: 33-39. doi: 10.1186/1471-2180-6-33

6. Van Ert MN, Easterday WR, Huynh LY, Okinaka RT, Hugh-Jones ME, Ravel J, et al. Global genetic population structure of Bacillus anthracis. PLoSOne. 2007; 2(5): e461. doi: 10.1371/journal. pone.0000461

7. Beyer W, Bellan S, Eberle G, Ganz HH, Getz WM, Haumacher R, et al. Distribution and molecular evolution of Bacillus anthracis genotypes in Namibia. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6 (3): 1534. doi: 10.1371/journal.pntd.0001534

Сведения об авторах

Избанова Уинкуль Айтеновна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией зоонозных бактериальных инфекций, РГП на ПХВ «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, e-mail: uizbanova@gmail.com_ ЛухноваЛариса Юрьевна - доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории зоонозных бактериальных инфекций, РГП на ПХВ «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, e-mail: larissa.lukhnova@mail.ru Мека-Меченко Татьяна Владимировна - доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории чумы, РГП на ПХВ «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, e-mail: tmeka-mechenko@kscqzd.kz_

Сансызбаев Ерлан Байсалович - кандидат медицинских наук, заместитель директора РГП на ПХВ «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, е-mail: ncorg@kscqzd.kz

Кайржанова Алма Дуйсенбайфиы - магистр младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии, РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, e-mail: ncbshevtsov@gmail.com

Шведюк Виктория Борисовна - младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии, РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, e-mail: diwr@mail.ru_

Бегимбаева Эльмира Жуазбаевна - кандидат медицинских наук, заведующий музеем живых культур, РГП на ПХВ «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, e-mail: ebegimbay@mail.ru_

Сущих Владлена Юрьевна - кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник вакцинной лаборатории, РГП на ПХВ «Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, е-mail: vladasali@mail.ru

Шевцов Александр Борисович - заведующий лабораторией биотехнологии, РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан. e-mail: ncbshevtsov@gmail.com

Information about the authors

Uinkul A. Izbanova - Cand. Sc. (Med.), Head of the Laboratory of Zoonotic Bacterial Infections, Masgut Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, e-mail: uizbanova@gmail.com_

Larisa Yu. Lukhnova - Dr. Sc. (Med.), Senior Research Officer, Laboratory of Zoonotic Bacterial Infections, Masgut Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, e-mail: larissa.lukhnova@mail.ru

Tatyana V. Meka-Mechenko - Dr. Sc. (Med.), Senior Research Officer, Plague Laboratory, Masgut Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, e-mail: tmeka-mechenko@kscqzd.kz_

Erlan B. Sansyzbaev - Cand. Sc. (Med.), Deputy Director, Masgut Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, e-mail: ncorg@kscqzd.kz

Alma D. Kairzhanova - Graduate, Junior Research Officer, Laboratory of Biotechnology , National Center for Biotechnology of the Committee of Science, Ministry of Education and Science, e-mail: ncbshevtsov@gmail.com

Viktoria B. Shvedyuk - Junior Research Officer, Laboratory of Biotechnology, National Center for Biotechnology of the Committee of Science, Ministry of Education and Science, e-mail: diwr@mail.ru

Elmira Zh. Begimbayeva - Cand. Sc. (Vet.), Senior Research Officer of the Museum of Living Cultures, Masgut Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, e-mail: ebegimbay@mail.ru

Vladlena Yu. Sushchykh - Cand. Sc. (Vet.), Senior Research Officer at the Vaccine Laboratory, Masgut Aykimbaev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, e-mail: vladasali@mail.ru

Alexander B. Shevtsov - Head of the Laboratory of Biotechnology of National Center for Biotechnology of the Science Committee of the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan, e-mail: ncbshevtsov@gmail.com

Статья получена: 13.03.2019. Статья принята: 15.08.2019. Статья опубликована: 26.10.2019.

Received: 13.03.2019. Accepted: 15.08.2019. Published: 26.10.2019.