СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ЛИМФОГЕННЫХ МЕТАСТАЗОВ ПРИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫХ КАРЦИНОМАХ ГОЛОВЫ И ШЕИ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОГО ЛЕЧЕНИЯ
METHOD FOR PREDICTION OF DEVELOPING LYMPHOGENIC METASTASES IN SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF HEAD AND NECK FOLLOWING COMBINATION THERAPY

Изобретение относится к области медицины, онкологии и может быть использовано для прогнозирования развития лимфогенных метастазов при плоскоклеточных карциномах головы и шеи после проведения комбинированного лечения.
К числу социально значимых онкологических заболеваний относят и плоскоклеточные карциномы головы и шеи (ПКГШ). Несмотря на то, что ПКГШ являются опухолями наружной локализации, они характеризуются высокой запущенностью, связанной анатомо-топографическими особенностями с бессимптомным течением и высокой агрессивностью заболевания [Ridge J.A., 2011]. Статус лимфатических узлов, их вовлеченность в патологический процесс является важным прогностическим признаком опухолей области головы и шеи, что, в первую очередь, ассоциировано с выживаемостью больных [Layland MK, 2005]. Известно, что точность радиографических методов исследования в диагностике лимфогенных метастазов составляет от 75 до 83%, а КТ - равно 60% [Yoon Y.C. et al., 2003].
Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования исходов плоскоклеточных карцином головы и шеи (ПКГШ), учитывающий появление лимфогенных метастазов у больных ПКГШ (патент РФ№2426991, опубл. 27.11.2010). В способе проводят иммуноферментное определение уровня матриксных металлопротеиназ (ММП) - 2 и 9, тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ТИМП) - 1 и 2 в сыворотке крови до лечения, и при уровне ММП-9 более 550 нг/мл и уровне ТИМП-1 более 230 нг/мл, прогнозируют снижение общей и безрецидивной 2-летней выживаемости, при ТИМП-2 более 120 нг/мл, ММП-2 более 250 нг/мл, дополнительно к упомянутым показателям прогнозируют высокую вероятность появления метастазов.
Недостатками известного способа являются:
- низкая чувствительность и специфичность, что не позволяет оценить практическую значимость и эффективность применения;
- не учитывается биологическое поведение самой опухоли, в то время как она может оказывать выраженное влияние на прогноз заболевания, что снижает точность и информативность способа.
Новая техническая задача - повышение точности и информативности прогнозирования заболевания в отношении риска развития лимфогенных метастазов.
Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования развития лимфогенных метастазов при плоскоклеточных карциномах головы и шеи после проведения комбинированного лечения, заключающемся в исследовании биологически активных молекул опухоли, в ткани опухоли определяют тотальную активность протеасом, активность 20S протеасом и экспрессию NF-κB p50, HIF-1α и рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям:
Y1=-39,5+28,6·Х1-0,05·Х2+0,09·Х3+1,4·Х4-0,87·Х5 (отсутствие лимфогенных метастазов);
Y2=-23,6+20,1·Х1-0,0003·Х2+0,04·Х3+0,84·Х4-0,38·Х5 (наличие лимфогенных метастазов),
где X1 - степень дифференцировки (1 - низкодифференцированная опухоль, 2 - умеренно дифференцированная, 3 - высокодифференцированная);
-3
Х2 - тотальная активность протеасом ·10 Ед/мг белка;
-3
Х3 - активность 20S протеасом ·10 Ед/мг белка;
Х4 - Экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке;
Х5 - Экспрессия NF-κВ p50, УЕ/мг белка в лунке;
и при Y1>Y2 прогнозируют отсутствие; а при Y1<Y2 прогнозируют развитие лимфогенных метастазов.
Данные существенные признаки не выявлены из научно-медицинской литературы. Они явным образом не следуют из уровня техники для специалистов. Способ апробирован на базе клиник НИИ онкологии СО РАМН. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям «новизна», «изобретательский уровень», «промышленно применимо».
Способ осуществляют следующим образом.
Для прогнозирования развития лимфогенных метастазов ПКГШ проводят флуорометрическое определение тотальной активности протеасом, активности 20S протеасом, а также иммуноферментное определение экспрессии NF-κB p50 и HIF-1α:
NF-κB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - ядерный транскрипционный фактор κB p50. HIF-1α - hypoxia inducible transcription factor в опухолевой ткани. Для этого из операционного материала берут образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образцы тканей до определения активности ферментов хранят при температуре -70°С и размораживают не более 1 раза для исследования активности и содержания маркеров. Перед определением активности исследуемых ферментов замороженную опухолевую ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. 20S протеасомы выделяют методом высаливания с помощью сульфата аммония до 70% насыщения [Абрамова Е.Б., 2006]. Химотрипсинподобную активность 26S протеасом, осуществляющуюся химотрипсинподобными центрами протеасом, оценивают по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) [Ben-Shahar S., 1999]. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяют специфический ингибитор протеасом - MG132. За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури.
Приготовление ядерных экстрактов для определения NF-κB p50, HIF-1α проводят в соответствии с рекомендациями фирмы производителя Caymanchem (США). Замороженную ткань (100 мг) гомогенизируют в жидком азоте, затем ресуспендируют. Гомогенат центрифугируют при 2400 g и 4°С для получения осадка, который ресуспендируют в 50 мкл 50 mM Трис-HCl буфера (рН 7,5) и затем центрифугируют при 14000 g и 4 С. Полученный супернатант используют для определения экспрессии транскрипционных факторов. Экспрессию NF-κB p50 и HIF-1α определяют в ядерных экстрактах иммуноферментным методом. Результаты определения содержания транскрипционных факторов выражают в условных единицах на мг белка в лунке Рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям:
Y1=-39,5+28,6·Х1-0,05·Х2+0,09·Х3+1,4·Х4-0,87·Х5 (отсутствие лимфогенных метастазов);
Y2=-23,6+20,1·X1-0,0003·X2+0,04·X3+0,84·X4-0,38·Х5 (наличие лимфогенных метастазов);
где X1 - степень дифференцировки (1 - низкодифференцированная опухоль, 2 - умеренно дифференцированная, 3 - высокодифференцированная);
-3
Х2 - тотальная активность протеасом ·10 Ед/мг белка;
-3
Х3 - активность 20S протеасом ·10 Ед/мг белка;
Х4 - Экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке;
Х5 - Экспрессия NF-κВ p50, УЕ/мг белка в лунке;
и при Y1>Y2 прогнозируют отсутствие; а при Y1<Y2 прогнозируют развитие лимфогенных метастазов.
Классификацию проводят следующим образом для групп: 1 - нет лимфогенных метастазов, 2 - имеются лимфогенные метастазы. Относят больного к одному из классов на основании следующих неравенств: если Y1>Y2, то объект относится к первому классу, к группе с отсутствием лимфогенных метастазов; если Y1<Y2, то объект относится ко второму классу. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составляет, соответственно, 96% и 90%, диагностическая точность - 93%.
Такой подход к прогнозированию риска возникновения лимфогенных метастазов ПКГШ обусловлен рядом предпосылок:
- одним из патогенетических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования плоскоклеточного рака области головы и шеи, является изменение активности протеасомной системы и экспрессии регулируемых ими субстратов, в том числе NF-κB. Необходимо отметить, что регуляторным этапом многих физиологических и патологических процессов является внутриклеточная деградация белков в протеасомах. Протеасомы способны активировать NF-κB за счет быстрой деградации его собственного ингибитора 1 кВ, что способствует выработке р105 - предшественника р50 субъединицы NF-κB [Goldberg A.L. 2007; Shah S.A., 2001]. Известно, что посттрансляционная модификация р105 - предшественника NF-κB р50 осуществляется с помощью 20S протеасом без процесса убиквитинирования [Moorthy A.K., 2006].
На культуре плоскоклеточных опухолей выявлен цитостатический эффект применения ингибитора протеасом, что коррелировало с экспрессией транскрипционного фактора NF-κB, уровнем проапоптотических белков Bik и Bim [Chen Z, 2008; Li C., 2008J. Рост экспрессии HIF-1 и связанная с ним продукция в опухоли ангиогенных белков и пептидов, находящаяся под контролем протеолитических систем, играет роль в развитии ПКГШ [Winter, S.C. 2006; Fillies, Т. 2005].
2-3
0-2
Информативность отобранных критериев обоснована наличием связи активности протеасом, экспрессии NF-кВ р50 и HIF-lα с возникновением лимфогенных метастазов опухолей головы и шеи, что было подтверждено при исследовании 66 пациентов (средний возраст 57,1±1,7 лет) с морфологически верифицированным диагнозом плоскоклеточного рака области головы и шеи ТN.
В исследование были включены 25 больных раком гортани и гортаноглотки, 23 пациентов с опухолями ротовой полости и 18 больных - с раком языка, которые в виду одинакового гистологического строения опухоли составили общую группу больных плоскоклеточными карциномами области головы и шеи. Объемы диагностики (TNM, 2009) и лечения больных соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований, утвержденным министерством здравоохранения и социального развития РФ. Всем пациентам было проведено хирургическое иссечение опухоли. При наличии регионарных метастазов выполняли фасциально-футлярное иссечение шейной клетчатки, операцию Кайла. Проведение данной работы одобрено этическим комитетом ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН, получены информированные согласия от всех пациентов.
Опухолевая ткань забиралась из операционного материала не позднее чем через 2-3 часа после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность 26S протеасом, экспрессия NF-κВ р50 и HIF-1α. Оценку качества полученных функций проводили на 10 пациентах, не включенных в основную выборку. Рассчитывали дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям:
Y1=-39,5+28,6·Х1-0,05·Х2+0,09·Х3+1,4·Х4-0,87·Х5 (отсутствие лимфогенных метастазов);
Y2=-23,6+20,1·X1-0,0003·X2+0,04·X3+0,84·X4-0,38·Х5 (наличие лимфогенных метастазов);
где X1 - степень дифференцировки (1 - низкодифференцированная опухоль, 2 - умеренно дифференцированная, 3 - высокодифференцированная);
-3
Х2 - тотальная активность протеасом ·10 Ед/мг белка;
-3
Х3 - активность 20S протеасом ·10 Ед/мг белка;
Х4 - Экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке;
Х5 - Экспрессия NF-κВ р50, УЕ/мг белка в лунке;
и при Y1>Y2 прогнозировали отсутствие; а при Y1<Y2 прогнозировали развитие лимфогенных метастазов.
Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составила, соответственно, 96% и 90%, диагностическая точность - 93%.
Показатели специфичности и прогностической значимости положительного результата (риска развития метастазов) свидетельствуют о высокой информативности заявляемого способа, который предполагает большее число возможных случаев лимфогенного метастазирования, чем реально выявлено на момент клинического обследования. Выделение группы больных ПКГШ, характеризующихся высоким риском лимфогенного метастазирования, позволяет определить адекватные сроки динамического наблюдения (более частое посещение врача-онколога) и в случае прогрессирования заболевания принять своевременные лечебные меры.
Клинические примеры.
3
0
0
1
2
Пример 1. Больной Л. 68 лет обратился в НИИ онкологии СО РАМН г.Томска, где по результатам комплексного обследования у него был диагностирован рак гортани высокой степени дифференцировки, стадия TNM. Было проведено исследование с целью определения вероятности лимфогенного метастазирования согласно предлагаемому способу. Опухолевая ткань забиралась из операционного материала не позднее чем через 2-3 часа после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность 26S протеасом, экспрессия NF-κВ р50 и HIF-1. Тотальная активность протеасом составила 45,6·1000 Ед/мг белка, активность 20S протеасом - 25,6·1000 Ед/мг белка; экспрессия HIF-1α была равна 4,1 УЕ/мг белка в лунке, экспрессия NF-κВ р50 - 2,2 УЕ/мг белка в лунке. Вычисление дискриминантных функций с использованием биохимических и клинико-морфологических показателей классифицировало данный клинический случай с минимальным риском развития лимфогенного метастазирования (Y=73,4; что больше чем Y=64,8), что было подтверждено дальнейшими наблюдениями. При динамическом наблюдении в течение 20 месяцев с момента диагностирования опухоли не были выявлены лимфогенные метастазы.
3
0
0
1
2
Пример 2. Больной П. 70 лет обратился в НИИ онкологии СО РАМН г.Томска, где по результатам комплексного обследования у него был диагностирован рак гортани умеренной степени дифференцировки, стадия TNM. Было проведено исследование с целью определения вероятности лимфогенного метастазирования согласно предлагаемому способу. Опухолевая ткань забиралась из операционного материала не позднее чем через 2-3 часа после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность 26S протеасом, экспрессия NF-κВ р50 и HIF-1. Тотальная активность протеасом составила 43,5-1000 Ед/мг белка, активность 20S протеасом - 33,9·1000 Ед/мг белка; экспрессия HIF-1α была равна 5,1 УЕ/мг белка в лунке, экспрессия NF-κВ р50 - 7,4 УЕ/мг белка в лунке. Вычисление дискриминантных функций с использованием биохимических и клинико-морфологических показателей классифицировало данный клинический случай как сопряженный с риском развития лимфогенного метастазирования (Y=50,0; что меньше чем Y=59,6), что было подтверждено дальнейшими наблюдениями. При динамическом наблюдении через 10 месяцев с момента диагностирования опухоли были выявлены лимфогенные метастазы.
Таким образом, предлагаемый способ дает возможность с достаточной точностью и информативностью прогнозировать развитие лимфогенных метастазов при ОГШ и на основании этого выбирать наиболее адекватную тактику лечения данной категории пациентов.
Список источников информации
1. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Изв. РАН Сер.биол. - 2006. - №2. - С.150-156.
2. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate / Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol.274. - No.31. - P.21963 -21972.
3. Bortezomib induces apoptosis via Bim and Bik up-regulation and synergizes with cisplatin in the killing of head and neck squamous cell carcinoma cells / Li C., Li R., Grandis J. R. et al. // Mol Cancer Ther. 2008. 7(6). 1647-1655.
4. Differential bortezomib sensitivity in head and neck cancer lines corresponds to proteasome, nuclear factor-kappaB and activator protein-1 related mechanisms / Chen Z., Ricker J.L., Malhotra P.S. et al. // Mol Cancer Ther. 2008. 7(7). 1949-1960.
5. Goldberg A.L. Functions of the proteasome: from protein degradation and immune surveillance to cancer therapy // Biochemical Society Transactions - 2007 - Vol.35. - P.12-17.
6. HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage squamous cell carcinomas of the oral floor / T. Fillies, R. Werkmeister, P.J. Diest et al. // BMC Cancer. - 2005. - Vol.5. P.84.
7. Layland M.K. The influence of lymph node metastasis in the treatment of squamous cell carcinoma of the oral cavity, oropharynx, larynx, and hypopharynx: NO versus N+/M.K. Layland, D.G. Sessions, J. Lenox // Laryngoscope. - 2005. - Vol.115. - P.629-639.
8. Metastasis to regional lymph nodes in patients with esophageal squamous cell carcinoma: CT versus FDG PET for presurgical detection - prospective study / Y.C. Yoon, K.S.L. Lee, B.-T. Shim et al. // Nuclear medicine. - 2003. - Vol.227. - P.764-770.
9. Moorthy A.K., Savinova O.V., Ho J.Q., Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. The 20S proteasome processes NF-kappaBI pl05 into p50 in a translation-independent manner. // EMBO J. - 2006. - Vol.25(9). - P.1945-56.
10. Head and Neck Tumors cancer management: 14th edition. / J.A. Ridge, B.S. Glisson, M.N. Lango, S. Feigenberg http://cancernetwork.com/cancer-management/head-and-neck/article/10165/1802498 Accessed 2 November 2011.
11. 26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer / S.A. Shah, M.W. Potter, T.P. McDade et al // J. Cell Biochem. - 2001. - Vol.82(1). - P.110-122.
12. The relation between hypoxia-inducible factor (HIF)-1 alpha and HIF-2alpha expression with anemia and outcome in surgically treated head and neck cancer / S.C. Winter, K.A. Shah, C. Han et al. // Cancer. - 2006. - Vol.107. - P.757-766.