КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
COSMETIC APPLICATION OF DEDIFFERENTIATED PLANT CELLS

Настоящее изобретение касается области косметики и относится к применению дедифференцированных растительных клеток Rosa sp. в качестве активного агента для эстетического ухода за кожей и волосами.
Настоящее изобретение также относится к клеточной линии дедифференцированных растительных клеток, полученных из кустовой розы Lancôme, которые способны к восстановлению регенерационной способности кожи и эффективны для такого восстановления.
В частности, настоящее изобретение относится к клеточной линии дедифференцированных растительных клеток, полученных из кустовой розы сорта Lancôme, которые функциональны и эффективны в восстановлении регенерационной способности модели реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом, и способности к самообновлению резервуара кожных стволовых клеток, SKP (skin-derived precursors, предшественники, происходящие из кожи), полученного с помощью биопсий кожи человека (волосистая часть головы и крайняя плоть).
Кожа представляет собой ткань, которая постоянно самообновляется на протяжении всей жизни человека. Это возобновление поддерживается с помощью кератиноцитов, которые располагаются в базальном слое эпидермиса. Это популяция клеток содержит, с одной стороны, стволовые клетки, немногочисленные клетки, которые характеризуются весьма существенной способностью к долгосрочному росту, а также способностью к самообновлению, и, с другой стороны, клетки, называемые предшественниками, которые активно размножаются и, вероятно, дифференцируются при переходе к роговому слою.
Относительно волосяных фолликулов известно, что взаимодействие эпителиального и дермального слоя имеет важное значение для морфогенеза и повторного роста волос, а также для поддержания цикла волосяного фолликула. Поддержание функциональности этих двух слоев зависит от наличия и от активности различных резервуаров стволовых клеток. Первый резервуар эпителиальных стволовых клеток был идентифицирован в области, называемой «вздутие», у грызунов (Cotsarelis et al., Cell, 1990, 61:1329). После этого первого открытия были выявлены другие резервуары кератиноцитов стволовых клеток, и оказалось, что у людей несколько более или менее активных резервуаров встроены в наружное корневое влагалище (ORS, outer root sheath) волосяного фолликула (Rochat et al., Cell, 1994, 76:1063; Commo et al., Differentiation, 2000, 66:157; Jaks et al., Nature Genetics, 2008, 40:1291).
Что касается дермального слоя, клетки, называемые SKPs (skin-derived precursors предшественники, происходящие из кожи), которые находятся в кожных сосочках и в соединительной ткани влагалища, были идентифицированы как мультипотентные клетки, участвующие в индукции роста волос и в восстановлении кожи у мышей (Biernaskie et al., Cell Stem Cell, 2009, 5:310). Несколько групп продемонстрировали присутствие SKPs в тканях человека и, в частности, в кожных сосочках волосяных фолликулов (Toma et al., Stem Cells, 2005, 23:727; Hunt et al., Stem Cells, 2008, 26:163).
Старение кожных слоев выражается, в частности, в значительной модификации эпидермальной поверхности, затемнении и поверхностных неоднородностях (потеря гладкого вида), в потере эластичности, появлении морщин, в замедлении восстановления/выздоровления после повреждений, в утончении эпидермиса и/или в потере и/или побелении волос, в снижении густоты волос и т.д.
Все эти видимые изменения в коже и волосах указывают на изменение регенерационной способности кожных слоев. Они также позволяют предположить, что основные биологические функции, обеспечивающие гомеостаз и обновление этих тканей, ослабляются с возрастом.
Существующие данные позволяют предположить, что с возрастом количество регенеративных клеток эпидермиса не уменьшается (Giangreco et al., Aging Cell, 2008, 7:250), но что их функциональность, как представляется, сильно зависит от модификаций их микросреды, контролирующих регенеративную способность базального слоя. Таким образом, снижение качества кожи, связанное с возрастом, по-видимому, связано с измененной регенеративной способностью этих клеток. Среди основных компонентов микроокружения клеток могут быть упомянуты межклеточные взаимодействия, физические ограничения базального слоя, и паракринные факторы, секретируемые окружающими клетками и резидентными клетками дермального слоя.
Равным образом, уменьшение значений таких параметров, как количество и/или качество волос, которое связано с облысением или также с возрастным старением, позволяет предположить измененную регенеративную способность. Действительно, было показано, что фолликулы алопецильной кожи головы уменьшаются в длину и содержат меньше пролиферирующих кератиноцитов по сравнению с таковыми на неалопецильной коже головы (Ashrafussaman et al., Acta Hisflochem Cytochem, 2010, 43:9). Более того, недавние исследования показывают, что недостаток в превращении эпителиальных стволовых клеток в клетки-предшественники, играет важную роль в андрогенной алопеции (Garza et al., J Clin Invest, 2010). В дермальном слое клетки, произошедшие из кожных сосочков из алопецильной кожи головы, размножаются in vitro не так быстро и, как оказывается, подвержены влиянию преждевременного старения, если сравнивать их с клетками, полученными из неалопецильной кожи головы (Bahta et al., J Invest Dermatol, 2008, 128:1088), a в тканях человека наблюдается снижение числа SKPs с возрастом (Gago et al., Stem Cells, 2009, 27:1164). Все эти наблюдения позволяют предположить модификацию регенеративной способности частей волосяного фолликула в связи с алопецией и/или возрастным старением.
Таким образом, для того, чтобы найти решения для противодействия изменениям кожи и волос, связанных со старением, особое внимание следует обратить на регенеративные клетки, или даже на стволовые клетки кожи и волос.
Дедифференцированные растительные клетки возникли благодаря исследованиям Хаберланда в 1902 году. За последние 40 лет культуры растительных клеток использовали для производства нужных метаболитов или для размножения одинаковых растений (соматического эмбриогенеза). Такая биотехнология растений основана на концепции клеточной тотипотентности: «любая растительная клетка способна к дедифференцировке и к регенерации другой особи, идентичной той, от которой она произошла». Дедифференцированная растительная клетка является растительной клеткой, полученной из органа (лист, стебель, корень, лепесток, и т.д.), который был размещен в культуре и который снова принимает дедифференцированную форму, то есть теряет свою специфичность листа, стебля, корня или лепестка и снова становится, вероятно, способным дать начало целому растению.
Недифференцированная клетка растения является эквивалентом реальной растительной стволовой клетки, полученной из меристематических клеток растения, и не имеющей органспецифического биологического прошлого.
WO 2009/151302 и КР 2009-0118877 описывают противовозрастные или антиоксидантные композиции, содержащие недифференцированные клетки растений, полученные из камбия Panax ginseng или из растения рода Taxus.
ЕР 1985280 описывает применение дедифференцированных растительных клеток, полученных из растения семейства Rosaceae и, в частности, из яблони Malus domestica, для защиты стволовых клеток кожи, которая подвергается различным внутренним и внешним стрессовым воздействиям, в частности, для лечения повреждений кожи или волос, связанных с возрастом.
ЕР 1699423 описывает применение лиофилизата дедифференцированных растительных клеток, полученных из галофильного растения, для омоложения внешнего вида кожи.
DE-A-102009027361 и ЕР 2266529 описывают применение дедифференцированных растительных клеток, в частности, полученных из растения рода Malus, для лечения кератиновых волосяных волокон, в частности, для их защиты от УФ-излучения, или для лечения постаревшей кожи.
ЕР 0909556 описывает применение экстракта растения из семейства Rosaceae, в частности, розы, возможно, полученного из недифференцированных растительных клеток, в качестве антагониста брадикинина для лечения различных состояний, в частности, кожи.
WO 2011121051 описывает препарат, полученный из культуры дедифференцированных нестимулированных клеток дерева аргания, их применение для лечения старения кожи, воспаления и образования рубцов, и их производство.
WO 200482643 описывает косметическую композицию, содержащую дедифференцированные, стимулированные растительные клетки Olibanum, Boswelia or Negundo и обладающие тонизирующим эффектом.
ЕР 2436759 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Solanaceae и обладающую антивозрастным эффектом.
ЕР 2436758 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Ginkgoaceae и обладающую усиленным антиоксидантным эффектом.
ЕР 2436757 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Asteraceae и обладающую усиленным противовоспалительным эффектом.
WO 2010137879 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Salicaceae и обладающую усиленным противовоспалительным эффектом.
ЕР 1064932 описывает применение дедифференцированных клеток, проявляющих дезодорирующий эффект.
ЕР 1244464 описывает применение экстрактов дедифференцированных клеток рода Leontopodium в качестве агента, защищающего от ультрафиолета.
Насколько известно заявителю, ни один документ, таким образом, не ссылается на получение линии дедифференцированных клеток кустовой розы, обладающей конкретными косметическими свойствами, описанными в данном описании.
Существует потребность идентифицировать технические решения для улучшения функциональности и/или активности регенеративных клеток, в том числе стволовых клеток кожи или волос, для сохранения качества и функциональности кожи, а также качества волос, их густоты и формы, в течение всей жизни человека, и, в частности, для профилактики и/или лечения эффектов, оказанных на внешний вид кожи или волос и связанных с возрастом.
В частности, существует потребность в создании новых активных агентов для противодействия недостаткам в обновлении ткани кожи или волос, в частности, для сокращения истончения эпидермиса, улучшения внешнего вида поверхности кожи, коррекции морщин, для замедления и/или подавления выпадения волос или для замедления и/или ингибирования побеления волос.
Целью настоящего изобретения является, в частности, удовлетворение этих потребностей.
В соответствии с одним из своих первых аспектов, настоящее изобретение относится к косметическому применению дедифференцированных растительных клеток растения рода Rosa sp. и, в частности, кустовой розы Lancôme или экстракта или лиофилизата указанных клеток в качестве активного агента для ухода за стареющей кожей или стареющими волосами.
Неожиданно изобретатели обнаружили, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток, оказались особенно функциональными и эффективными для восстановления in vitro регенеративной способности модели реконструированной кожи, полученной из популяции кератиноцитов с уменьшенной численностью эпидермальных стволовых клеток и клеток-предшественников. Увеличение толщины эпидермиса и весьма заметное улучшение морфологических качеств (организация базального слоя, стратификация и дифференциация и т.д.) были обнаружены после 3 недель культивирования, в том числе - 2 недель обработки.
Изобретателями было показано что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат из указанных клеток, оказывают про-регенерирующий эффект, по меньшей мере частично, посредством оптимизации сообщения между эпидермисом и дермой. В самом деле, авторы изобретения наблюдали, что лечение реконструированной кожи с уменьшенным регенеративным потенциалом с применением дедифференцированных растительных клеток розы из настоящего изобретения или экстракта или лиофилизата указанных клеток, индуцирует экспрессию многочисленных диффузабельных биологических факторов и, в частности, KGF (Keratinocyte Growth Factor, фактор роста кератиноцитов), известного своим благотворным влиянием на регенерацию эпидермиса. Таким образом, авторы изобретения наблюдали, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток, оказались особенно функциональными и эффективными для индукции производства кожей физиологических факторов, которые восстанавливают регенерационную способность в базальном слое, включающем в себя стволовые клетки и клетки-предшественники.
Опять же неожиданно, изобретатели обнаружили, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток оказались особенно эффективными для стимулирования способности к самообновлению резервуара стволовых клеток кожи, SKPs, полученных из биопсий человека (волосистая часть головы и крайняя плоть). Таким образом, можно было наблюдать увеличение способности к самообновлению SKPs примерно на 65% после лечения в течение 10 дней. Это оценочное исследование активного агента позволяет сделать вывод о том, что способность к самообновлению SKPs in vitro может подвергаться положительному влиянию обработки дедифференцированными клетками или экстрактом или лиофилизатом указанных клеток.
Неожиданно, авторы изобретения также показали, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток обладают способностью стимулировать или восстанавливать регенеративную способность кожи, в то время как соединения, описанные на предшествующем уровне техники как имеющие кожно-регенерирующие свойства, такие как ретинол, не оказали заметного эффекта при тех же условиях тестирования.
Стимуляция самообновления регенеративных клеток кожи, дермы и волосяного фолликула делает возможным улучшение их функциональности с пользой для кожи и для волос. Это стимулирующее влияние на этот резервуар кожных стволовых клеток, предпочтительно, делает возможным сохранение или даже восстановление биологических функций этих клеток с косметической пользой для кожи и для волос.
Применительно к настоящему изобретению термин «кожа» означает всю кожную поверхность индивида, в том числе волосистую часть головы.
Применительно к настоящему изобретению термин «волос» предназначен для обозначения комплекса, содержащего волосяной стержень и волосяной фолликул.
Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к косметическому применению дедифференцированных растительных клеткок из растения рода Rosa sp., в частности, кустовой розы Lancôme или экстракта или лиофилизата указанных клеток в качестве активного агента для лечения и/или профилактики эстетического дефекта, следующего за недостатком в тканевом обновлении стареющей кожи или стареющих волос.
Применительно к настоящему изобретению термин «предотвращение» означает снижение риска проявления рассматриваемого явления.
Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение направлено на противодействие недостатку в тканевом обновлении стареющей кожи или волос, в частности, на сокращение истончения эпидермиса или кожи, улучшение внешнего вида поверхности кожи, коррекцию морщин, замедление и/или ингибирование потери волос или замедление и/или ингибирование побеления волос.
4
3
3
2
2
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
В соответствии с еще одной из его целей, настоящее изобретение относится к косметической композиции, включающей в качестве активного агента по меньшей мере одну дедифференцированную растительную клетку растения рода Rosa sp. или экстракт или лиофилизат из указанных клеток, при этом указанные дедифференцированные растительные клетки получают путем размещения клеток растения рода Rosa sp. в культуре в культуральной среде, содержащей по меньшей мере NHNO; KNO; CaCl⋅2HO; MgSO; KHPO; MnSO⋅HO; ZnSO⋅7HO; NaMoO⋅2HO; CuSO⋅5HO; FeSO⋅7HO; миоинозитол; никотиновую кислоту; пиридоксин HCl; тиамин HCl и сахарозу; и, возможно, кинетин, Kl, NaEDTA⋅2HO и/или нафталинуксусную кислоту.
Согласно другому его предмету, настоящее изобретение относится к косметической композиции, включающей в качестве активного агента по меньшей мере одну дедифференцированную растительную клетку, полученную из кустовой розы Lancôme, или экстракт или лиофилизат указанной клетки. Согласно другому его предмету, настоящее изобретение относится к косметическому способу ухода за стареющей кожей или стареющими волосами, содержащему по меньшей мере одну стадию, состоящую во введении в качестве активного агента по меньшей мере, одной дедифференцированной растительной клетки растения рода Rosa sp. или экстракта или лиофилизата указанной клетки индивиду, нуждающемуся в этом.
Согласно еще одному варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки растения рода Rosa sp, или экстракт или лиофилизат указанных клеток, в соответствии с изобретением, могут быть введены перорально или местно. Согласно одному предпочтительному варианту реализации изобретение применяется наружно.
В соответствии с одним предпочтением настоящего изобретения, активный агент из настоящего изобретения делает возможным стимулирование дермальных клеток волосяного фолликула.
Опять же предпочтительно, активный агент из настоящего изобретения делает возможным стимулировать самообновление стволовых клеток или клеток-предшественников кожи или волос, а также улучшить их функциональность с целью оказания благотворного влияния в отношении кожи и волос, в частности, стареющих кожи и волос.
В соответствии с другим предпочтением, активный агент из настоящего изобретения делает возможным сохранить или даже восстановить биологические функции резервуара стволовых клеток кожи и волос.
Дедифференцированные растительные клетки и способ их получения Применительно к настоящему изобретению термин «дедифференцированная клетка растения» предназначен для обозначения любой клеточной линии, полученной из органов кустовой розы рода Rosa sp. и полученной посредством конкретных условий культуры in vitro, которая больше не проявляет какого-либо характера специализации и которая способна, под действием индукции, к любой дифференциации в соответствии с ее геномом и к созданию из себя самой целого растения, сходного с растением, из которого она берет свое начало. Такие клетки способны жить сами по себе, не находясь в зависимых отношениях с другими клетками.
Дедифференцированные растительные клетки отличаются от недифференцированных клеток растений, которые естественным образом существуют в растениях.
Применительно к настоящему изобретению термин «дедифференцированная клетка растения» обозначает штамм, полученный с помощью культуры in vitro или in vivo, полученного из органов кустовой розы Lancôme, способный дифференцироваться, и/или приобретать новые характеристики специализированной клетки, под действием индукции в любой тип клеток (тотипотентных) или в несколько типов клеток (плюрипотентных), в частности, в эмбриогенные или меристематические клетки. В нормальных условиях растительные клетки экспрессируют примерно 20% их генома, при этом остальные 80% экспрессируются только в ответ на особые условия окружающей среды. Культивирование этих клеток in vitro при определенных условиях культивирования делает возможным «перепрограммировать» клетки и, таким образом, получить доступ к этой части генома, не экспрессирующейся в целом растении. Некоторые соединения, которые трудно получить с помощью экстракции из растений, становятся более доступными в клеточных культурах.
Таким образом, в качестве преимущества, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению позволяют получить доступ к новым соединениям, не присутствующим в целом растении, или значительно увеличить экспрессию молекул, которые известны, но редки в целом растении.
Дедифференцированные растительные клетки из настоящего изобретения могут быть получены из любого растения рода Rosa sp. Эти клетки могут быть получены из растительного материала, полученного из целых растений или из частей растений, таких как листья, стебли, цветы, лепестки, чашелистики или корни, культивируемые in vivo или in vitro.
Термин «культура in vivo» предназначен для обозначения любого культивирования обычного типа, то есть в грунте на открытом воздухе или в теплице, либо еще где-то вне грунта.
Термин «культура in vitro» предназначен для обозначения всех техник, известных специалистам в данной области, для искусственного получения растения или части растения. Давление отбора, налагаемое физико-химическими условиями во время роста растительных клеток in vitro, позволяет получить стандартизированный растительный материал, который доступен в течение всего года, в отличие от растений, выращиваемых in vivo.
Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, используемое растение получают из культуры in vivo.
Предпочтительно, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению получают из по меньшей мере одного листа растения рода Rosa sp.
Род Rosa насчитывает более 200 видов, среди которых можно упомянуть Rosa alba, Rosa alpina, Rosa canina, Rosa cinnamonea, Rosa gallica, Rosa repens, Rosa rubrifolia, Rosa rubiginosa, Rosa sempervirens, Rosa spinosissima, Rosa stylosa, Rosa domendosa, или Rosa villosa Более предпочтительно, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению получают из кустовой розы Lancôme, а более конкретно - из кустовой розы, называемой роза Lancome delboip. Такой куст является коммерчески доступным, например, в компании DELBARD (Франция).
Наиболее предпочтительно, дедифференцированные растительные клетки в соответствии с настоящим изобретением получают с применением в качестве исходного продукта листьев кустовой розы Lancôme delboip или клеток, полученных из указанных листьев.
Кустовая роза Lancôme является чайным гибридом, женские корни которого являются гибридом, полученным путем скрещивания Dr. Albert Schweitzer×[Michèle Meilland×Bayadère], который был опылен сортом Melmet.
В зависимости от выбранного способа культивирования и, в частности, в зависимости от выбранной культуральной среды, можно получить, из одного и того же растения дедифференцированные растительные клетки, имеющие разные характеристики.
Согласно одному предпочтительному варианту реализации дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению получают из растительного материала, полученного из листьев кустовой розы Lancôme.
Согласно одному предпочтительному варианту реализации, культуральная среда, подходящая для получения дедифференцированных растительных клеток по настоящему изобретению, включает в себя гормоны, которые в природе присутствуют в растениях.
Согласно одному предпочтительному варианту реализации, дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme получают с помощью способа, включающего в себя следующие стадии:
a) получение листьев розы Lancôme или клеток, полученных из указанных листьев,
b) культивирование листьев или клеток, полученных на стадии а), в присутствии по меньшей мере одного растительного гормона, таким образом, чтобы получить дедифференцированные клетки, и
c) выделение дедифференцированных клеток, полученных в конце стадии b).
На стадии а) термин «листья» охватывает целые листья и фрагменты листьев. На стадии а) клетки, происходящие из листьев, могут быть получены в соответствии с любым способом, хорошо известным специалистам в данной области.
Предпочтительно, листья или клетки, полученные из листьев, предоставляются в аксеничной форме (освобожденные от любого биологического загрязнителя).
На стадии b) данного способа листья или клетки, полученные из листьев, культивируют в подходящей культуральной среде, которая содержит по меньшей мере один растительный гормон. В некоторых вариантах реализации указанная культуральная среда содержит множество растительных гормонов, например, два или три растительных гормона.
Предпочтительно, культуральная среда содержит по меньшей мере один гормон, и полностью предпочтительно - по меньшей мере один фитогормон. Фитогормоны включают в себя, в частности, ауксины, цитокинины и гиббереллины.
Ауксины, которые особенно подходят для изобретения, представляют собой в основном IAA (indole-3-acetic acid, индол-3-уксусная кислота), IBA (indolebutyric acid, индолилмасляная кислота), фенилуксусную кислоту и NAA (naphthaleneacetic acid, нафталинуксусная кислота). Предпочтительно, 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) исключается из ауксинов, которые подходят для настоящего изобретения, так как является неприродным соединением.
Наиболее важные цитокинины, вовлеченные в удлинение клеток, которые особенно подходят для настоящего изобретения, представляют собой кинетин (N-(фуран-2-илметил)-7Н-пурин-6-амин; CAS Ref n° 525-79-1), зеатин (2-метил-4-(7Н-пурин-6-иламино) бут-2-ен-1-ол; CAS Ref n° 1637-39-4) и бензиладенин (N-бензил-7Н-пурин-6-амин; CAS Ref n° 1214-39-7). Гиббереллины образуют семейство растительных гормонов или фитогормонов, которое охватывает более ста соединений или примерно около того; эти соединения перечислены согласно их порядковому номеру GA1, GA2, …/… GA126. Различные гиббереллины очень близки друг к другу по структуре. Гиббереллины, которые особенно подходят для настоящего изобретения, в основном получают из корней и включают в себя очень большое число производных, наиболее важными из которых являются гибберелловая кислота, называемая также гиббереллин A3, и гиббереллины А1 и А12.
На стадии b) настоящего способа растительный(ые) гормон(ы) предпочтительно выбирают из индол-3-уксусной кислоты, индолилмасляной кислоты, фенилуксусной кислоты, нафталинуксусной кислоты, кинетина, зеатина, бензиладенина, гибберелловой кислоты и гиббереллинов А1, A3 и GA3. На стадии b) может быть использована комбинация растительных гормонов, например комбинация нафталинуксусной кислоты и кинетина.
4
3
3
2
2
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
4
3
3
2
2
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
Согласно одному варианту реализации, культуральная среда, которая подходит для получения дедифференцированных растительных клеток по настоящему изобретению содержит по меньшей мере NHNO; KNO; CaCl⋅2HO; MgSO; KHPO; MnSO⋅4HO; ZnSO⋅7HO; NaMoO⋅2HO; CuSO⋅5HO; FeSO⋅7HO; миоинозитол; никотиновую кислоту; пиридоксин HCl; тиамин HCl и сахарозу; и, возможно, Kl; кинетин, NaEDTA⋅2HO, и/или нафталинуксусную кислоту. Согласно другому варианту реализации, культуральная среда, которая подходит для получения дедифференцированных растительных клеток по настоящему изобретению содержит по меньшей мере NHNO; KNO; CaCl⋅2HO; MgSO; KHPO; MnSO⋅4HO; ZnSO⋅7HO; Kl; NaMoO⋅2HO; CuSO⋅5HO; NaEDTA⋅2HO; FeSO⋅7HO; миоинозитол; никотиновую кислоту; пиридоксин HCl; тиамин HCl; нафталинуксусную кислоту; кинетин и сахарозу.
4
3
3
2
2
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
Преимущественно, культуральная среда может содержать от 1200 до 2000 мг/л NHNO; от 1500 до 2100 мг/л KNO; от 300 до 500 мг/л CaCl⋅2HO; от 150 до 200 мг/л MgSO; от 153 до 187 мг/л KHPO; от 10 до 30 мг/л MnSO⋅4HO; от 5 до 10 мг/л ZnSO⋅7HO; от 0 до 0.91 мг/л Kl; от 0 до 0.30 мг/л NaMoO⋅2HO; от 0.01 до 0.05 мг/л CuSO⋅5HO; от 10.5 до 50 мг/л NaEDTA⋅2HO; от 10 до 30 мг/л FeSO⋅7HO; от 70 до 150 мг/л мио-инозитол; от 0,3 до 0,6 мг/л никотиновой кислоты; от 0,4 до 0,6 мг/л пиридоксина; от 0,08 до 0,15 мг/л тиамина; от 0 до 11 мг/л нафталинуксусной кислоты; от 0 до 0,066 мг/л кинетина; и от 10 до 35 г/л сахарозы.
2
Культивирование на стадии b) предпочтительно проводят при температуре в диапазоне от 24 до 30°C, предпочтительно от 26 до 27°C. Культивирование на стадии b) предпочтительно проводят в атмосфере с парциальным давлением O, составляющим примерно 10%.
Способ предпочтительно осуществляют партиями в течение 6-10 дней. Способ может быть осуществлен в соответствии с подпитываемым периодическим выращиванием или с непрерывной техникой выращивания. После культивирования в подходящей среде дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению собирают на стадии с), например, путем фильтрации, и могут лиофилизировать или подвергнуть процессу экстракции.
Согласно одному конкретному варианту реализации, стадию культивирования b) осуществляют в течение периода от 6 до 14 дней, и предпочтительно, от 6 до 10 дней.
Настоящее изобретение также относится к дедифференцированным клеткам кустовой розы Lancôme, в частности к этим дедифференцированным клеткам кустовой розы Lancôme delboip, при этом указанные дедифференцированные клетки получают с помощью способа, подробно изложенного в настоящем описании, в том числе в примерах.
Авторы настоящего изобретения показали, что способ в соответствии с настоящим изобретением дает возможность получить клеточные линии дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme, причем клетки клеточных линий могут культивироваться в виде дедифференцированных клеток в течение очень длительного периода времени или даже бессрочно без обнаруживаемого изменения их морфологии и без обнаруживаемой модификации их свойств, в частности без обнаруживаемого изменения их кожно-регенерирующих свойств.
Клеточные линии дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme, согласно настоящему изобретению, характеризуются, в частности, следующими характеристиками:
- Размер редких изолированных клеток (<5%) не превышает диаметр от 10 до 30 мкм,
- Наиболее сильно преобладающие агрегаты клеток имеют диаметр от 50 до 300 мкм,
- Клетки имеют шарообразную морфологию и белый цвет,
- По сравнению с другими клеточными линиями кустовой розы культура включает в себя очень мало клеточного детрита, и агрегаты довольно однородны, со средним диаметром около ста микрон,
- Культуры дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme не демонстрируют никакой особенный запах.
Изобретение также относится к клеточной линии, изолированной заявителем и депонированной в соответствии с Будапештским Договором в Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) 4 июля 2012 года, под номером 2-6307.
Преимущественно, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть применены свежие или лиофилизированные дедифференцированные растительные клетки или их экстракты или они включены в состав композиций, стабилизирующих их.
Лиофилизированные дедифференцированные растительные клетки могут быть повторно экстрагированы водой. В качестве преимущества, лиофилизация дедифференцированных растительных клеток делает возможным отделить активные вещества от биополимерных наполнителей, таких как полисахариды клеточной стенки.
В некоторых вариантах реализации дедифференцированные клетки лиофилизируют, а затем ресуспендируют. Клеточный детрит, который может присутствовать в полученной суспензии, удаляют, например, с помощью пропускания через шприц и последующего центрифугирования. Суспензию с удаленным клеточным детритом можно использовать в качестве активного агента, полученного из дедифференцированных клеток растений в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, может быть применен экстракт дедифференцированных растительных клеток. Изобретение обязательно относится к активным экстрактам дедифференцированных растительных клеток по параметрам полученного воздействия на стареющую кожу и стареющие волосы. Активность экстракта по настоящему изобретению может, в частности, быть оценена с помощью различных экспериментальных протоколов, описанных в примерах, указанных ниже.
Любой способ экстракции, известный специалистам в данной области техники, может быть применен для получения экстракта дедифференцированных растительных клеток в соответствии с изобретением.
В качестве экстрактов, которые подходят для реализации настоящего изобретения, можно упомянуть водные экстракты, спиртовые экстракты или экстракты с органическим растворителем.
Термин «водный растворитель» означает любой растворитель, полностью или частично состоящий из воды. Можно, таким образом, упомянуть саму воду, водно-спиртовые растворители в любом соотношении или же растворители, состоящие из воды и соединения, такого как пропиленгликоль, в любом соотношении. Среди спиртовых растворителей, можно назвать, в частности, этанол.
Способ экстракции, который подходит для настоящего изобретения, может включать в себя первый этап измельчения дедифференцированных растительных клеток, например, в холодном водном растворе, затем второй этап удаления частиц в суспензии из водного раствора, полученного на первой стадии, и третий этап стерилизации водного раствора, полученного на второй стадии. Этот водный раствор соответствует экстракту.
Полученный экстракт затем могут лиофилизировать любыми обычными способами лиофилизации. Таким образом получают порошок, который может быть применен непосредственно, либо смешан с подходящим растворителем перед применением.
Дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению также могут быть применены в виде лиофилизата. Такой лиофилизат может быть получен любым способом лиофилизации, известным специалистам в данной области.
В принципе, лиофилизация состоит в удалении воды из жидкого, пастообразного или твердого продукта посредством комбинированного действия холода и вакуума. Когда вода нагревается в твердом состоянии при очень низком давлении, вода сублимирует, то есть переходит непосредственно из твердого состояния в газообразное состояние. Водяной пар (или пар любого другого растворителя) покидает продукт и захватывается с помощью замораживания, с использованием конденсатора, или ловушки. Эта методика дает возможность сохранить и объем, и внешний вид обрабатываемого продукта. Это может происходить в природе (высыхание в горах) или более быстро, в сублимационной сушилке.
Лиофилизация обычно включает в себя три этапа: замораживание, сублимация и вторичная сушка.
Замораживание состоит в очень быстром переносе вещества в температуру между -20°C и -80°C, таким образом, чтобы заблокировать воду в форме льда в том положении, в котором она была в жидком состоянии; таким образом избегают лизиса клеток.
Сублимация состоит в устранении «свободной» воды. Под вакуумом примерно 100 мкбар, значение которого, однако, может значительно варьировать в зависимости от продукта, к продукту подводится тепло; лед подвергается сублимации. В зависимости от продукта и производственных потребностей, температура может варьировать в течение цикла. Водяной пар захватывается «ловушку» или «конденсатор», и дегидратация продукта происходит непрерывно. Когда большая часть воды претерпела сублимацию, продукт теряет около 80%-90% воды.
Сушка состоит в удалении захваченной воды из продукта. На этом этапе вакуум более сильный, примерно до 5 мкбар. На этой стадии продукт становится сухим на 95%.
Например, после извлечения клеток из культуральной среды путем фильтрации на ткани с контролируемой пористостью (примерно 80 мкм), клетки замораживают при низкой температуре, предпочтительно от -20°C до -80°C, в условиях, которые позволят избежать образования крупных кристаллов льда, способных повредить их. Замороженные клетки затем подвергают этапу сублимации льда в вакууме в диапазоне от 5 до 500 мкбар и, предпочтительно, в вакууме, составляющем 100 мкбар.
Как указано выше, лиофилизированные клетки растений по настоящему изобретению могут быть регидратированы перед использованием.
Неожиданно, заявитель показал, что эффекты, оказываемые на кожу дедифференцированными клетками кустовой розы Lancôme в соответствии с настоящим изобретением или экстрактом или лиофилизатом указанных клеток, значительно отличаются от тех, которые наблюдали у недедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme или у экстракта или лиофилизата из указанных клеток.
Также неожиданно, что заявитель показал, что дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme или экстракт или лиофилизат указанных клеток оказывают особенный эффект на профиль экспрессии генов в клетках кожи человека. Авторы настоящего изобретения показали, что дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme или экстракт или лиофилизат из указанных клеток оказывают специфическое действие на экспрессию генов в клетках кожи человека, по сравнению с эффектом, оказываемым на генную экспрессию в клетках кожи, который индуцируется дедифференцированными клетками кустовых роз других сортов (или экстрактом или лиофилизатом указанных клеток), а также недедифференцированными клетками кустовой розы Lancôme (или экстрактом или лиофилизатом указанных клеток).
Стареющая кожа и признаки старения кожи
Термин «стареющая кожа» означает общее эстетическое состояние кожи, которое является результатом возрастного старения и/или фотоиндуцированного старения.
Более конкретно, настоящее изобретение направлено на предотвращение и/или сокращение и/или лечение признаков старения кожи.
Выражение «признаки старения кожи» означает любое из изменений внешнего вида кожи, происходящее в результате старения, которое имеет возрастное или и/или фото-индуцированное происхождение.
В качестве примеров такого изменения, рассматриваемого в данном изобретении, можно упомянуть поверхность, являющуюся не вполне однородной и менее гладкой, эпидермис, ставший тоньше и/или ставший менее эффективным в барьерной функции (медленнее восстанавливается после вредных воздействий), морщины и тонкие линии, сухая кожа, потеря эластичности и/или тонуса кожи, истончение дермы и/или деградация коллагеновых волокон, что приводит к появлению вялой и морщинистой кожи.
Указанное выражение также означает все внутренние изменения кожи, которые не отражены систематически измененным внешним видом, например все внутренние деградации кожи и, более конкретно, деградация эластиновых волокон, или эластичных волокон, наступающая после воздействия ультрафиолетового излучения.
В частности, признаки старения кожи, на которые ориентировано настоящее изобретение, выбирают из следующих: истончение кожи, потеря упругости, потеря эластичности, потеря плотности или потеря тонуса кожи, сухость кожи, изменение внешнего вида поверхности кожи, появление заметного микрорельефа кожи, появление шероховатости, формирование и/или наличие тонких линий и/или морщин, изменение интенсивности цвета кожи лица, морщинистый вид кожи, изменение запаха кожи, дряблость кожи или увядание кожи.
Предпочтительно, признаки старения кожи, на которые ориентировано настоящее изобретение, выбирают из следующих: истончение кожи, появление заметного микрорельефа кожи, образование и/или наличие тонких линий и/или морщин, дряблость кожи и увядание кожи.
Более предпочтительно, признаки старения кожи, на которые ориентировано настоящее изобретение, выбирают из следующих: появление заметного микрорельефа кожи, образование и/или наличие тонких линий и/или морщин, дряблость кожи и увядание кожи.
Омоложение волос
Изменения в качестве волос, которые появляются с возрастом, заключаются, в частности, в изменении внешнего вида волокна (тонкие, безжизненные, слабые, выпадающие волосы), в том, что у волос отсутствует сияние и/или они седеют, легко ломаются, а также в потере плотности волос.
Настоящее изобретение, таким образом, направлено на восстановление/поддержание хорошей густоты волос и/или улучшение качества копны волос и/или волосяных волокон и, в частности, в стареющих волосах. Более конкретно, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, делают возможным предотвратить потерю плотности волос и защищать, усиливать или повышать качество стареющих волос для придания вида молодых и густых волос.
Согласно одному варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток особенно пригодны для профилактики и/или ограничения образования тонких, безжизненных, хрупких, слабых выпадающих волос без блеска и/или седеющих.
Согласно другому варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, также пригодны для улучшения качества кератиновых волокон, в частности, за счет стимулирования роста блестящих и/или густых и/или сильных волос.
Согласно другому варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток пригодны для применения для профилактики и/или лечения секущихся концов, для улучшения мягкости ощущаемой потребителем, или для улучшения силы волокна, объема шапки волос и их блеска.
Согласно другому варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, пригодны для профилактики и/или лечения частичной или полной потери волосяных волокон, и, более конкретно, волос. Также предпочтительно, изобретение пригодно для профилактики и/или лечения облысения.
Облысение более конкретно выражается в частичной или полной потере волос у индивидуума. Индивидуумы, которые страдают от алопецийного состояния, могут, в частности, быть жертвами диффузного облысения, например андрогенного облысения или себорейного облысения, или же общего облысения, в связи с избытком андрогенов (мужских гормонов). Для этого типа облысения замечено, преимущественно у мужчин, что в области, образующей верхнюю часть головы (макушка), циклы формирования волос иногда останавливаются преждевременно - явление, которое не наблюдается в областях окружности головы, и, в частности, в задней части шеи.
Согласно другому варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки или экстракт или лиофилизат указанных клеток особенно подходят для профилактики и/или лечения побеления волос и, предпочтительно, поседения.
Поседение соответствует естественному побелению волос, которое появляется с возрастом или после окислительного стресса. В частности, поседение связано со специфическим и постепенно увеличивающимся дефицитом меланоцитов волос, затрагивающим как меланоциты волосяной луковицы, так и клетки-предшественники меланоцитов.
Предпочтительно, настоящее изобретение делает возможным предотвращение, ограничение и/или уменьшение степени побеления и поседения волос и/или волос на теле. В частности, дедифференцированные растительные клетки или экстракт или лиофилизат указанных клеток, могут быть использованы для предотвращения, ограничения и/или остановки развития и/или прогрессирования поседения.
Дедифференцированные растительные клетки или экстракт или лиофилизат указанных клеток также могут быть использованы для профилактики и/или ограничения и/или замедления увеличения количества белых волос в общей копне волос, и/или снижения или поддержания процента белых волос по отношению к общему количеству волос.
Согласно одному конкретному варианту реализации, изобретение также направлено на поддержание естественной пигментации волос.
Галеновый препарат
Дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток могут быть включены в состав любых композиций, пригодных для косметического или фармацевтического применения.
Композиция, согласно настоящему изобретению, содержит физиологически или фармацевтически приемлемую среду.
После культивирования в подходящей среде дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению собирают путем фильтрации и могут лиофилизировать или экстрагировать или поместить в раствор.
Преимущественно, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток могут быть включены в состав смеси или могут быть помещены в водный раствор или в раствор с растворимым в воде органическим растворителем, или в их смеси. Водорастворимый органический растворитель, пригодный для настоящего изобретения, может быть выбран из соединений на основе углеводородов С2-С8, предпочтительно С3-С6, содержащих от 2 до 6 гидроксильных групп, предпочтительно от 3 до 5 гидроксильных групп, и их смесей.
Среди водорастворимых органических растворителей, пригодных для реализации настоящего изобретения, можно назвать, в частности, гликоли, содержащие от 2 до 8 атомов углерода, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или 1,3-пропандиол, 1,3-бутиленгликоль, дипропиленгликоль, глицерин, сорбит и их смеси. Предпочтительно, в особенности подходящими для реализации изобретения являются пропиленгликоль или 1,3-пропандиол.
Водорастворимый органический растворитель может составлять от 20 до 100 масс. % композиции, содержащей его, предпочтительно от 30 до 90 масс. %, предпочтительно от 40 до 80 масс. % и более предпочтительно от 50 до 70 масс. % композиции, содержащей его.
Вода, подходящая для настоящего изобретения может быть ключевой и/или минеральной водой, выбранной, в частности, из воды Vittel, воды из водоема Vichy и воды La Roche Posay.
Вода может составлять от 20 до 100 масс. % композиции, содержащей ее, предпочтительно от 30 до 90 масс. %, предпочтительно от 40 до 80 масс. % и более предпочтительно от 50 до 70 масс. % композиции, содержащей ее.
Предпочтительно, вода составляет до 50 масс. % композиции, содержащей ее.
Согласно одному варианту реализации, препарат, содержащий дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, может содержать по меньшей мере один гидрофильный гелеобразующий агент. Такой агент делает возможным избежать осаждения клеток или уменьшить его.
Гидрофильный гелеобразующий агент, подходящий для изобретения, может быть выбран из полисахаридных полимеров и их смесей. Применительно к настоящему изобретению термин «полисахаридный полимер» предназначен для обозначения любой углеводной молекулы, образованной за счет связывания большого числа элементарных сахаров, например ксилозы, глюкозы, галактозы, рамнозы, маннозы, фукозы и арабинозы и их соответствующих кислот. Полисахаридные полимеры в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбирают из полимеров, имеющих молекулярные массы в диапазоне от 10 до 250 кДа. Из полисахаридных полимеров, пригодных для реализации настоящего изобретения, можно назвать, в частности, пектин, гуаровую камедь, целлюлозу, декстрин, мальтодекстрин, крахмал, камедь тара, камедь рожкового дерева, инулин, камедь акации, гуммиарабик, богатые фукозой полимеры, такие как Фукогель, каррагинаны, конжаковую камедь, ксантановую камедь, декстран, хитозан, трагакантовую камедь, гхатти камедь, камедь карайи, тамариндовую камедь, агар-агар, альгинат, геллановую камедь и их смеси. Предпочтительно используют ксантановую камедь, камедь плодов рожкового дерева, гуаровую камедь, геллановую камедь, агар-агар, альгинат и их смеси. Согласно одному предпочтительному варианту реализации препарат, содержащий дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, может содержать ксантановую камедь.
Гелеобразующий агент может присутствовать в соотношении в диапазоне от 0,01 до 10 масс. % и, предпочтительно, от 0,1 до 5 масс. % полисахаридного полимера(-ов) по отношению к общей массе композиции.
Согласно другому варианту реализации, препарат, содержащий дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток может содержать по меньшей мере один сахар.
Сахар, подходящий для реализации настоящего изобретения, может быть моносахаридом С4-С6 и, в частности, может быть выбран из инозита, маннита, глюкозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, ксилита и фруктозы и их смесей. Содержание сахара в композиции по настоящему изобретению может находиться в диапазоне от 1 до 80 масс. %, например от 5 до 75 масс. % и, в частности, от 10 до 70 масс. % по отношению к общей массе композиции.
Согласно одному предпочтительному варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток могут быть приготовлены в присутствии воды, 1,3-пропандиола и/или ксантановой камеди.
Независимо от рецептуры, используемой для применения дедифференцированных растительных клеток Rosa sp. или экстракта или лиофилизата указанных клеток, они обязательно применяются в эффективном количестве.
Эффективным количеством является количество, необходимое для получения желаемого эффекта в отношении показателей, рассматриваемых в данном изобретении.
Это количество, разумеется, зависит от различных параметров, таких как желаемый эффект или возраст, вес, рост и тип индивидуума, подлежащего лечению, и от пути введения, и, следовательно, может варьировать в значительной степени. Это количество может быть определено любым способом, известным специалистам в данной области.
Если говорить о порядке количества, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, могут быть использованы в количестве, составляющем от 0,01 до 30 масс. % сухого вещества по отношению к общей массе композиции, содержащей их, и, предпочтительно, в количестве, составляющем от 0,1 до 50 масс. % сухого вещества по отношению к общей массе композиции.
Дедифференцированные растительные клетки Rosa sp. по настоящему изобретению или экстракт или лиофилизат указанных клеток, могут быть включены в состав любых косметических композиций, в частности, предназначенных для проглатывания, введения или нанесения на кожу, волосы, ногти или слизистые оболочки (оральную, скуловую, десенную, генитальную, конъюнктивальную). В зависимости от выбранного способа введения, композиция по настоящему изобретению может находиться в любом из обычно используемых галеновых препаратов.
Для местного нанесения на кожу, композиция может быть в форме, в частности, водного или масляного раствора или дисперсии типа лосьона или сыворотки, эмульсий жидкой или полужидкой консистенции типа молока, полученных путем дисперсии жировой фазы в водной фазе (O/W), или наоборот (W/O), или в форме суспензий или эмульсий мягкой консистенции, водного или безводного варианта геля или крема, или же из микрокапсул или микрочастиц, или везикулярных дисперсий ионного и/или неионного типа. Эти композиции получают в соответствии с обычными способами.
Эти композиции могут представлять собой очищающие, защитные, лечебные или ухаживающие кремы для лица, рук, ног, основных анатомических складок или для тела (например, дневные кремы, ночные кремы, кремы для удаления макияжа, кремы-основы или солнцезащитные кремы), жидкие основы, молочко для удаления макияжа, защитное или ухаживающее молочко для тела, солнцезащитное молочко, лосьоны по уходу за кожей, гели или пены, например очищающие лосьоны, солнцезащитные лосьоны, лосьоны для искусственного загара, композиции для ванны, композиции для дезодорантов, содержащие бактерицидные агенты, гели или лосьоны после бритья, кремы для удаления волос. Эти композиции также могут состоять из твердых препаратов, представляющих собой мыла или очищающие бруски или могут быть упакованы в виде аэрозольной композиции, содержащей также газ-вытеснитель под давлением.
Композиция, предназначенная для применения для волос, может находиться в форме водных, спиртовых или водно-спиртовых растворов или в виде кремов, гелей, эмульсий или муссов, либо в виде аэрозольных композиций, также содержащий газ-вытеснитель под давлением. Такая композиция может быть в форме композиции для ухода за волосами, например, шампуня, лосьона для укладки волос, лечебного лосьона, парикмахерского геля или крема, краски (в частности, окислительной краски), окрашивающего шампуня, лосьона, изменяющего структуру, композиции для перманентной завивки, (в частности, композиции для первой стадии перманентной завивки), геля или лосьона против облысения.
Для подкожного или внутрикожного введения композиция может быть в форме водного или масляного лосьона или в форме сыворотки.
Композиция, пригодная для приема внутрь, может быть в форме капсул, гранул, сиропов или таблеток.
Количества различных составляющих композиций согласно настоящему изобретению являются такими, которые обычно используются в рассматриваемых областях.
Когда композиция представляет собой эмульсию, доля жировой фазы может составлять от 5 до 80 масс. % и, предпочтительно, от 5 до 50 масс. % по отношению к общей массе композиции. Масла, воски, эмульгаторы и соэмульгаторы, используемые в композиции в форме эмульсии, выбирают из тех, которые обычно используют в области косметики. Эмульгатор и соэмульгатор могут присутствовать в композиции в количестве от 0,3 до 30 масс. % и, предпочтительно от 0,5 до 20 масс. % по отношению к общей массе композиции.
Если композиция представляет собой масляный раствор или гель, жировая фаза может составлять более 90 масс. % композиции.
Известным образом, косметическая композиция по настоящему изобретению может также содержать адъюванты, которые обычно применяют в области косметики, например, гидрофильные или липофильные желирующие агенты, гидрофильные или липофильные добавки, консерванты, антиоксиданты, растворители, ароматизаторы, наполнители, экранирующие агенты, поглотители запахов и красители. Количества этих различных адъювантов являются такими, какие обычно применяют в области косметики, и составляют, например, от 0,01 до 10 масс. % композиции. В зависимости от своей природы, эти агенты могут быть введены в жировую фазу, в водную фазу и/или в липидные сферулы.
R
Из масел или восков, которые могут применяться в настоящем изобретении, можно упомянуть минеральные масла (жидкий вазелин), растительные масла (жидкая фракция масла дерева ши, подсолнечное масло), животные масла (пергидросквален), синтетические масла (пурцеллиновое масло), силиконовые масла или воски (циклометикон) и фторированные масла (перфторполиэфиры), пчелиный воск, карнаубский воск или парафиновый воск. Жирные спирты и жирные кислоты (стеариновая кислота) могут быть добавлены к этим маслам. В качестве эмульгаторов, которые можно применять в настоящем изобретении, можно упомянуть, например, стеарат глицерина, полисорбат 60 и смесь PEG-6/PEG-32/гликоль стеарат, выпускаемая под названием Tefose 63 фирмой Gattefosse.
В качестве растворителей, которые можно применять в настоящем изобретении, можно упомянуть низшие спирты, в частности, этанол и изопропанол, и пропиленгликоль.
В качестве гидрофильных гелеобразующих агентов, которые можно применять в изобретении, можно упомянуть карбоксивиниловые полимеры (карбомер), акриловые сополимеры, такие как акрилат/алкил-акрилатные сополимеры, полиакриламиды, полисахариды, такие как гидроксипропилцеллюлоза, натуральные смолы, предпочтительно ксантан, и глины, и в качестве липофильных гелеобразующих агентов могут быть упомянуты модифицированные глины, такие как бентониты, соли металлов жирных кислот, например, стеараты алюминия и гидрофобный диоксид кремния, этилцеллюлоза и полиэтилен.
Косметический способ
Согласно другому своему аспекту, настоящее изобретение относится к способу косметического ухода за зрелой кожей или стареющими волосами, содержащему по меньшей мере одну стадию, состоящую во введении, в качестве активного агента, по меньшей мере одной дедифференцированной растительной клетки растения рода Rosa sp. или экстракта или лиофилизата указанной клетки индивидууму, нуждающемуся в этом. Такой способ может быть осуществлен в частности, путем введения косметической композиции, как определено выше, в соответствии с обычной технологией применения этой композиции.
Согласно одному варианту реализации, данное изобретение относится к косметическому способу лечения и/или профилактики эстетического дефекта, являющегося следствием недостатка в обновлении тканей стареющей кожи или стареющих волос у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащему по меньшей мере один этап введения указанному индивидууму, в качестве активного агента по меньшей мере одной дедифференцированной растительной клетки растения рода Rosa sp. или экстракта или лиофилизата указанной клетки.
Способ, по настоящему изобретению, может включать в себя стадию, состоящую в наблюдении сокращения или даже исчезновения эстетических дефектов являющихся следствием недостатка в обновлении тканей зрелой кожи или стареющих волос.
Преимущественно, осуществление способа согласно настоящему изобретению дает возможность усилить, улучшить или даже восстановить молодой вид кожи и/или шапки волос.
Косметический способ, соответствующий настоящему изобретению, может быть осуществлен в частности, путем перорального или местного, предпочтительно местного, введения косметической композиции, как определено выше.
Способ, соответствующий настоящему изобретению, может быть осуществлен, например, на ежедневной основе, например, с такой частотой как одно введение в день или одно введение два раза в день, например один раз утром и один раз вечером.
Косметический способ, по настоящему изобретению, может быть осуществлен, например, путем ежедневного введения композиции, находящейся, например, в форме гелей, лосьонов, кремов, пен, гелевых капсул, драже, эмульсий, таблеток, капсул или пероральных емкостей, в соответствующем количестве и числе, в зависимости от их формы.
Эффективное количество активного агента по настоящему изобретению можно вводить в виде одной дозы в день или в дробных дозах в течение дня, например, два или три раза в день.
Способ, соответствующий настоящему изобретению, может, преимущественно, включать в себя одно введение.
Косметический способ, соответствующий настоящему изобретению, может быть осуществлен в течение временного периода, составляющего от одной недели до нескольких недель или даже нескольких месяцев; более того, этот период, возможно, повторяется после периодов без обработки, в течение нескольких месяцев или даже нескольких лет.
В качестве примера, введение активного агента в соответствии с изобретением может повторяться, например, от 2 до 3 раз в день или более и, обычно, в течение продолжительного периода не менее 4 недель или даже от 4 до 15 недель, при необходимости - с одним или несколькими периодами прерывания.
Фигуры
Фигура 1: представляет собой фотографии моделей реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом, в сечении, после обработки в течение 10 дней в отсутствии (контроль) или в присутствии дедифференцированных клеткок кустовой розы Lancôme в количестве 0,43 мг/мл или 0,043 мг/мл и после культивирования до срока 13 (верхняя фотография) или 20 (нижняя фотография) дней.
Фигура 2: представляет количество фактора роста кератиноцитов (KGF), определенного в культуральной среде моделей реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом, обработанных в отсутствие или в присутствии дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme (0,43 мг/мл). Анализы проводились на сроках D3, D5, D7, D10, D13, D17 и D23. Светло-серая гистограмма: контроль. Темно-серая гистограмма: дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme в количестве 0,43 мг/мл. Белая гистограмма: дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme в количестве 0,0043 мг/мл.
Фигура 3: представляет фотографии моделей реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом, в сечении, которые не были обработаны (контроль) или которые были обработаны в присутствии дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme в количестве 0,43 мг/мл или в присутствии ретинола в количестве 10 мкм.
В описании и в примерах, которые следуют ниже, если не указано иное, проценты являются массовыми процентами, и диапазоны значений, записанные в виде «между … и …» включают указанные нижний и верхний пределы. Ингредиенты смешивают перед формированием в таком порядке и при таких условиях, которые легко определяются специалистами в данной области.
Примеры, следующие ниже, представлены в качестве неограничивающих иллюстраций области изобретения.
Примеры
Пример 1
Культивирование дедифференцированных растительных клеток кустовой розы Lancôme с использованием растительной ткани Листья кустовой розы (роза Lancôme) стерилизовали с применением обычных методик, известных специалистам в данной области техники, и поместили на следующую культуральную среду:
Гормоны, используемые здесь, присутствуют в растениях в природе.
После последовательных пассажей были получены дедифференцированные растительные клетки, которые можно культивировать в ферментере, и которые, таким образом, подходят для промышленного производства. Параметры, используемые для управления культурой в биореакторе, были следующими:
Т: от 24°C до 30°C, идеально - 26-27°C
2
Аэрация: PO10%, регулируется за счет поступающего стерильного воздуха и/или за счет перемешивания, при котором избегается любое механическое раздражение клеток.
Периодическое производство длится от 6 до 14 дней. Затем клетки собирают путем фильтрации на ткани с пористостью 80 мкм.
Полученные дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme, смешивают с водой в присутствии 1,3-пропандиола и ксантановой камеди в количестве 10 масс. % свежей биомассы по отношению к общей массе композиции.
Пример 2
Демонстрация «прорегенерирующих» эффектов дедифференцированных растительных клеток кустовой розы Lancôme на модели реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом а) Получение образцов реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом.
Кератиноциты были выделены из образца кожи человека.
После удаления подкожной ткани скальпелем, образец кожи разрезали на фрагменты и затем обеззараживали с помощью антибиотической и антимикотической отбработки в культуральной среде DMEM (Life Technologies Ltd, Scotland).
Для того чтобы отделить дерму от эпидермиса, образец затем подвергали протеолитической обработке (Диспаза II)/Трипсин 0,25%) в течение ночи при 4°C. Фрагменты эпидермиса, отделенные от дермальной ткани, помещали в однократный раствор трипсин-ЭДТА на 20 минут при 37°C. Действие трипсина нейтрализовали добавлением среды культивирования, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (FCS, fetal calf serum). Клеточную суспензию гомогенизировали, а затем промывали в культуральной среде кератиноцитов (KGM, keratinocyte growth medium, среда для роста кератиноцитов) (KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clonetics Corp., San Diego, CA, USA). Клеточную суспензию затем помещали в колбы для культивирования предварительно «покрытые» коллагеном типа I (Sigma Chemical Со Ltd, Irvine, UK). Через 15 минут, кератиноциты, которые не прикрепились, извлекали путем промывки в буфере PBS. Отобранные таким образом неприкрепившиеся клетки характеризовались малым количеством стволовых клеток и клеток-предшественников из базального слоя.
Эту субпопуляцию кератиноцитов высевали, в количестве от 150000 до 450000 клеток, в культуральную среду (N Fortunel et al (2011). Eur J Dermatol. 21 (S2):12-20) на верхнюю часть дермальной подложки, заранее размещенной во вставке.

2
2
Используемый субстрат для культуры представляет собой нежизнеспособную дерму человека, лишенную эпидермиса или живой дермы, содержащую фибробласты в коллагеновом каркасе Collegen решетки (растянутая модель, производство Episkin). Среду затем добавляют ниже и выше каждой вставки, и эта среда обновляется каждые два дня. Через 6-7 дней при 37°C в инкубаторе при 5% СО среду из верхней части образца полностью сливали, а среду под вставкой заменяли на такую же среду, как та, что описана ниже, но лишенную трансферрина, трийодтиронина и аденина. Это инициирует фазу всплывания, необходимую для индукции стратификации и дифференцировки слоя эпидермиса отсека. Образцы культивировали в течение 1-3 недель при 37°C и 5% СО; среду обновляли каждые два дня.
b) Обработка дедифференцированными растительными клетками
Дедифференцированные клетки розы, полученные в примере 1, лиофилизировали, затем ресуспендировали путем последовательного пропускания через шприц.
Клеточный детрит удаляли центрифугированием. Полученный активный агент с удаленным клеточным детритом использовали в пропорции 0,43 мг/мл и 0,043 мг/мл. Активный агент применяли системно (в культуральной среде ниже вставок), как только на дермальную подложку засевали кератиноциты. Применение активного агента повторяли на 3, 6, 8 и 10 дни. Гистологические оценки таких параметров, как:
- Толщина эпидермиса,
- Общая организация,
- Стратификация,
- Качество базального слоя и т.д.,
проводились на 13-й день и на 20 день.
Контроль соответствует культуральной среде, лишенной дедифференцированных клеток розы.
Как показано на Фигуре 1, в присутствии дедифференцированных клеток розы наблюдалось утолщение эпидермиса. Кроме того, базальный слой более плотный, морфологическое качество улучшено и наблюдается правильная дифференцировка, а именно - стратификация живых слоев и подобие зернистого слоя.
Эти результаты демонстрируют восстановление регенерационной способности моделей реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом после обработок, проведенных при помощи дедифференцированных клеток кустовой розы (Lancôme Rose) и являются доводом в пользу применения такого ингредиента для лечения кожи.
Пример 3
Титрование секреции фактора роста кератиноцитов (KGF), вызванной обработкой модели реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом дедифференцированными растительными клетками кустовой розы Lancôme. Культуральные среды из экспериментов, описанных в примере 2, собирали на 3, 5, 7, 11, 13, 17 и 20 день. Растворимые количества KGF, секретируемые образцами реконструированной кожи и присутствующие в таких средах, затем анализировали с помощью ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) (R&D Systems, Catalog N°DKG00).
Как показано на фигуре 2, наблюдалось увеличение секреции KGF по сравнению с контролем (необработанным), в особенности на 13-й день после обработок дедифференцированными клетками розы в количестве в 0,43 мг/мл. Этот фактор роста вырабатывается фибробластами, и известно, что он оказывает на кератиноциты митогенное воздействие (Finch PW et al. Science 1989 245:752; Marchese et al. / J Cell Physiol 1990 144:326). Этот результат демонстрирует, что дедифференцированные растительные клетки розы (Lancôme Rose) индуцируют секрецию диффузабельных факторов, вырабатываемых, по меньшей мере частично, фибробластами, которые оказывают благоприятное воздействие на регенерацию эпидермиса. Таким образом, между дермой и эпидермисом возникает способствующее регенерации взаимодействие
Пример 4
Демонстрация благотворного влияния на самообновление дермальных стволовых клеток in vitro.
Выделение дермальных стволовых клеток, полученных из биопсии человека
Стволовые клетки, полученные из дермального слоя (SKPs), обладают способностью к пролиферации и самообновлению в сферической форме в суспензии, когда их культивируют in vitro в присутствии FGF2 и EGF. Их отделяют от кожи и волосяных фолликулов в соответствии с протоколом, описанным в публикации Nature Protocols (Biernaskie et al. 2006). Используемая питательная среда состоит из DMEM/F12 (Invitrogen) с добавлением антибиотиков пенициллина (Lonza) и стрептомицина (Lonza) и фунгицидного агента Fungizone (Invitrogen), а также с факторами роста EGF (BD) и FGF2 (BD) и с добавкой В27 (Invitrogen), заменяющей сыворотку.
Используемые SKPs получают из образцов кожи и, в частности, из крайней плоти 3 различных доноров (возрастом 8 лет, 10 лет, 22 года). После первого пассажа в культуре в колбах сферы объединяют с коллагеназой и затем помещают обратно в культуру в виде индивидуальных клеток в присутствии 50% питательной среды и 50% кондиционированной среды (кондиционированной самими клетками).
Оценка уровня самообновления в присутствии или в отсутствие дедифференцированных клеток розы.
2
2
Способ, применяемый для оценки уровней самообновления, сходен с таковым, применяемым в ходе пассажей клеток. SKPs сначала диссоциируют с помощью коллагеназы, затем высевают в количестве 3000 клеток на лунку (в 96-луночных планшетах). Клетки культивируют в смеси, содержащей половину кондиционированной среды и половину питательной среды, как описано выше. Клетки культивируют при 37°C (21% О - 5% СО) и обработку проводят в отсутствие (контроль) или в присутствии 0,43 мг/мл активного агента, полученного из дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme, как описано в примере 2. После 10 дней культивирования образовавшиеся сферы подсчитывают, чтобы оценить способность этих клеток к самообновлению после обработки.
Результаты приведены в таблице I ниже.
Самообновления дермальных стволовых клеток значительно возрастает после обработки активным агентом, полученным из дедифференцированных клеток розы (+обработка) по сравнению с контролем (-обработка).
Это исследование позволяет сделать вывод о том, что обработка активным агентом, полученным из дедифференцированных клеток розы, значительно увеличивает потенциал самообновления дермальных стволовых клеток in vitro. С учетом важности роли этих клеток в биологических процессах, таких как восстановление волосяного фолликула, в контроле формы волосяного стержня и в восстановлении кожи, этот результат подчеркивает преимущество этого ингредиента в качестве технического решения для лечения старения кожи и волос.
Пример 5
Сравнение «прорегенерирующих» эффектов дедифференцированных клеток розы с таковыми у другого упоминаемого «омолаживающего» активного агента на модели реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом
Модель реконструированной кожи получали, как указано в примере 2. Активный агент, полученный из дедифференцированных клеток розы получали, как указано в примере 2. Модель реконструированной кожи обрабатывали в отсутствие (контроль - только культуральная среда) или в присутствии активного агента, полученного из дедифференцированных клеток розы, в соотношении 0,43 мг/мл или ретинола в соотношении 10 мкМ в течение 12 дней.
Были сделаны гистологические наблюдения, как указано в примере 2.
Как показано на фигуре 3, в присутствии активного агента, полученного из дедифференцированных растительных клеток розы, наблюдалось утолщение эпидермиса. Кроме того, базальный слой более плотный, морфологическое качество улучшено и наблюдается правильная дифференцировка (стратификация живых слоев, подобие зернистого слоя).
С другой стороны, обработка ретинолом не улучшила качество эпидермиса, и она даже, по-видимому, ингибирует дифференцировку.