Оценка видов микроорганизмов, встречающихся в медицинской практике и образующих биопленки на медицинских катетерах

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ОЦЕНКА ВИДОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В МЕДИЦИНСКОИ ПРАКТИКЕ И ОБРАЗУЮЩИХ БИОПЛЕНКИ НА МЕДИЦИНСКИХ КАТЕТЕРАХ

Дата поступления 28.08.2018

Введение. Значительную роль в инфекционном процессе, связанном с оказанием медицинской помощи, играют условно-патогенные микроорганизмы, присутствующие уже в организме пациента. Так, они способны образовывать биопленки на медицинских приборах (мочевые и кровяные катетеры). Цель работы. В работе изучены образцы катетеров с целью оценки микробного пейзажа поверхности катетеров. Материалы и методы. Оценку относительных показателей плотности биопленки на поверхности катетеров проводили с помощью метода окрашивания красителем кристаллическим фиолетовым. Результаты и обсуждение. Основными представителями микробного пейзажа образцов катетеров пациентов с заболеваниями мочеполовой системы являлись бактерии: Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae. С центрального венозного катетера в одном случае выявлена ассоциация Staphylococcus aureus и Candida аlbicans. Микст-биопленки отличались плотной структурой, с более развитым гликозидным каркасом, с большим количеством одиночных бактериальных и грибковых клеток, а также наличием сложных конгломератов, состоящих из псевдомицелия грибковых клеток. Заключение. В результате микробиологических исследований выявлены биопленки микроорганизмов во всех исследуемых типах катетеров как на внешней, так и на внутренней поверхностях.

Ключевые слова: микроорганизмы, штаммы, катетер, биопленки,

микст-биопленки.

С.А. Лисовская12, Н.Н. Хабипова23, Л.Р. Валеева3, М.Р. Шарипова3, Е.В. Халдеева1, К.К. Хазеева2, 1ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии», 2ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет», 3ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Лисовская Светлана Анатольевна -e-mail: s lisovskaya@mail.ru

Introduction. A significant role in the infectious process associated with the provision of medical care is played by conditionally pathogenic microorganisms already present in the patient's body. So, they are able to form biofilms on medical devices (urinary and blood catheters). Purpose of the study. In the work, samples of catheters were studied to assess the microbial landscape of the catheter surface. Materials and methods. Evaluation of the relative indices of the density of the biofilm on the surface of the catheters was carried out by staining with a dye crystal violet. Results and discussion. The main representatives of the microbial landscape of catheter samples of patients with diseases of the genitourinary system were bacteria: Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae. From the central venous catheter in one case, the association of Staphylococcus aureus and Candida albicans has been identified. Mixt biofilms differed in dense structure, with a more developed glycosidic framework, with a large number of single bacterial and fungal cells, as well as the presence of complex conglomerates consisting of pseudomycelia fungal cells. Conclusion. As a result of microbiological studies, biofilms of microorganisms were detected in all types of catheters studied, both on the outer and inner surfaces.

Key words: microorganisms, strains, catheter, biofilms, mixed biofilms.

ВВЕДЕНИЕ

Длительное нахождение большинства пациентов в клинических отделениях связано с высоким риском развития вторичных инфекционных заболеваний, вызываемых условно-патогенной микрофлорой. Значительно чаще они регистрируются у осложненных больных терапевтического и хирургического профиля, что связано с внедрением в повседневную клиническую практику новых высокотехнологических методов лечения, которые требуют увеличения объема инвазивных вмешательств, например установки имплантатов, внутрисосудистых катетеров, электрокардиостимуляторов, электродов и т. д. [1, 2].

Считается, что большинство инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), вызывают бактерии и грибы, уже присутствующие в организме пациента до инфекции. Кроме того, они же могут стать причиной перекрестной передачи между пациентами и медицинскими работниками. Так, микроорганизмы, вызывающие катетер-ассоциированные инфекции, обычно проникают с кожных покровов на месте введения катетера или через наружное отверстие катетера.

На сегодняшний день катетер-ассоциированные инфекции занимают третье место среди всех нозокомиальных инфекций. В связи с интенсивной антибиотикотерапией, а

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

также с увеличением числа пациентов с иммунодефицит-ными состояниями растет разнообразие микроорганизмов, вызывающих данные инфекции [3, 4, 5]. Спектр видов часто зависит от профиля отделения и пути инфицирования. Микроорганизмы на поверхности катетера могут образовывать биопленку, которая является не только более резистентной к антимикробным агентам, чем отдельные планктонные клетки, но и способна противостоять иммунным защитным механизмам хозяина. Формируются биопленочные структуры в результате адгезии, роста и размножения микроорганизмов и образования полисахаридного внеклеточного матрикса. Адгезия микроорганизмов зависит от адгезивной активности самого штамма, присутствия белков макроорганизма в просвете катетера, фенотипических изменений и т. д. Например, Staphylococcus aureus имеет рецепторы к фибронектину, фибриногену и наламинину, которые часто оседают на внутренней поверхности катетера с током крови, а грибы Candida albicans способны еще и адгезироваться к различным поверхностям, в том числе и к пластику.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ являлось изучение катетер-ассоции-рованных биопленок пациентов с инфекциями мочевыво-дящих систем и с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нами исследованы образцы катетеров пациентов с заболеваниями мочеполовой системы (11 образцов), предоставленные урологическим отделением, и с заболеваниями сердечно-сосудистой системы (12 образцов), представленные отделением реанимации и интенсивной терапии.

Идентификацию микроорганизмов проводили микроскопическими, биохимическими методами и с помощью биотипирования (MALDI-TOFMS, анализ белкового профиля). В работе использовались селективные хромоген-ные среды (Bio-Rad) и коммерческие тест-системы, основанные на исследовании ауксанограммы: «Auxacolor 2» (Bio-Rad). При MALDI-TOFMS анализе значения Score (условное значение, указывающее на точность и качество ТАБЛИЦА.

Результаты типирования изолятов, выделенных с поверхностей катетеров

анализа) выше 2,4 для всех штаммов при успешной интерпретации значений от 2 до 3.

Оценку относительных показателей плотности биопленки на поверхности катетеров проводили с помощью метода окрашивания красителем кристаллическим фиолетовым по Ramage et al. (2001). Методика основана на способности красителя связываться с клетками и компонентами матрикса биопленки и используется как основной метод обнаружения биопленок на различных поверхностях in vitro и in vivo. Образец катетера площадью 1 см2 промывали три раза стерильным фосфатным буфером, освобождая катетер от планктонной культуры. Затем добавляли 1 мл водного раствора 1% кристаллического фиолетового и инкубировали 20 мин при 37°С. После удаления избытка красителя и промывки образцов добавляли 95% этанол в количестве 1 мл, оптическую плотность регистрировали на ридере с вертикальным лучом света с использованием светофильтра 620 нм [6, 7, 8].

Статистический анализ проводили из расчета соотношения контроля (окрашенная стерильная лунка) и образца. Эффективность образования биопленок оценивали по методу, предложенному Stepanovic et al., 2007, где, ODc = OD (негативного контроля) + 3x (стандартное отклонение негативного контроля). Конечное значение оптической плотности исследуемого образца OD рассчитывали как разницу начального значения и ODc: OD =OD(нач)-ODc.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе работы был определен основной спектр микроорганизмов, характерный для каждого типа катетеров. Исследование образцов катетеров пациентов с заболеваниями мочеполовой системы выявило наличие биопленок у 65% исследованных образцов. Основными представителями микробного пейзажа внутренней поверхности катетера являлись бактерии: Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae. Тогда как с внешней поверхности катетера основное место занимали следующие штаммы бактерий, относящиеся к условно-патогенным микроорганизмам: Pseudomonas aeruginosa, K. oxytoca, E. cloacae, E. faecalis, Morganella morganii, Escherichia coli, Bacillus subtilis.

Тип катетера Внешняя поверхность катетера Внутренняя поверхность катетера

Enterobacter cloacae

Мочевой катетер Enterobacter faecalis Pseudomonas aeruginosa Klebsiella oxytoca Morganella morganii Escherichia coli Bacillus subtilis Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis

Центральный венозный катетер Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis Candida аl.bicans

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Микробиологический анализ центральных венозных катетеров показал незначительный спектр микроорганизмов. Наличие биопленок выявлено у 2-х образцов. Внутренняя поверхность катетера в двух случаях была колонизирована представителем коагулазонегативных стафилококков - Staphylococcus epidermidis, в одном случае S^aufeus, и в одиЬм образце, помимо бактериальной микрофлоры, присутствовали грибы Candida аlbicans (таблица).^-

Следует отметить тот факт, что с внутренней и внешней поверхности мочевых катетеров нами часто обнаруживались ассоциации со значительным количеством условно-патогенных бактерий (с так называемым протеолитиче-ским основным путем метаболизма) - Klebsiella spp., Escherichia coli и т. д. С центрального венозного катетера в одном случае выявлена ассоциация Staphylococcus aureus и Candida аlbicans.

Оценка относительных показателей плотности биопленки на поверхности катетеров проводимая с помощью метода окрашивания красителем кристаллическим фиолетовым показала, что для мочевых катетеров в 27% исследованных образцов установлено присутствие биопленок низкой плотности, в 27% - биопленки средней плотности, в 45% - биопленки высокой плотности. В образцах центральных венозных катетеров биопленки были сформированы с низкой плотностью.

Исследование морфологии биопленок мочевого катетера, на поверхности которого было определено наличие плотной биопленки, с помощью сканирующей электронной микроскопии показало наличие плотного неоднородного матрикса на внутренней и внешней поверхности катетера (рис. 1). Наблюдали палочковидные и кокковид-ные бактериальные клетки, а также различные включения

в составе биопленки, в том числе эритроциты крови, кристаллы солей.

Осмотр биопленки с центрального венозного катетера выявил особенности строения микст-биопленки, связанные с присутствием в структуре биопленки совместно с бактериями и грибов C. аlbicans. Так, пленки отличались плотной структурой, с более развитым гликозидным каркасом, с большим количеством одиночных бактериальных и грибковых клеток, а также наличием сложных конгломератов, состоящих из псевдомицелия грибковых клеток и клеток S. aureus (рис. 2), что может говорить о более сложной структурной организации.

ВЫВОДЫ

В результате микробиологических исследований выявлены биопленки микроорганизмов во всех исследуемых типах катетеров как на внешней, так и на внутренней поверхности. Присутствие на поверхностях катетеров широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов у иммунодефицитных больных может привести к возникновению вторичных инфекций. Некоторые авторы отмечают наиболее вероятное проникновение микроорганизмов по наружной поверхности катетера в течение первых 10 суток после установки [3]. Особый интерес представляет дальнейшее изучение обнаруженных микст-ассоциаций микроорганизмов на поверхности катетера и участвующих в формировании общей биопленки. Поскольку взаимное влияние участников ассоциаций друг на друга может вызывать повышение вирулентной активности штаммов, в том числе и антибиотикорезистентность, и как следствие отягощать клинические проявления заболевания [9, 10].

Таким образом, огромное значение имеет регулярное тщательное наблюдение за всеми пациентами на предмет

РИС. 1.

Сканирующая электронная микроскопия внутренней поверхности катетера. Увеличение 10000х.

РИС. 2.

Микст-биопленка. Образование сложных конгломератов, состоящих из псевдомицелия грибковых клеток C. аLb^cans и клеток S. aureus. Световая микроскопия увел. 20 х 20.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

инфекционных заболеваний, связанных с оказанием медицинской помощи в медицинском учреждении. Важно выявлять и ограничивать возможные эпидемические заболевания, наблюдая за пациентами из групп риска.

ЛИТЕРАТУРА

1. Климко Н.Н. Диагностика и лечение кандидемии и острого диссеминиро-ванного кандидоза. Инфек. и антимикроб. тер. 2002. Т 4. № 1. С. 30-37.

Klimko N.N. Diagnostika i letenie kandedemii I ostrogo disseminirovanogo kandidoza. Infekcionnaya I antimikrobnaia terapia. 2002. T4. № 1. S. 30-37.

2. Ferretti G., Mandala M, Di Cosimo S. Catheter related bloodstream Infections, part 1: pathogenesis, diagnosis, and management. Infections in Oncology November. 2002. Vol. 9, No. 6. Р. 513-523.

3. Бережанский Б., Жевнерев А. Катетер-ассоциированные инфекции кровотока. Клин микробиол. и антимикроб. химиотер. 2006. Т. 8. № 2. С. 130-144.

Berezhanskiy B. Zhevnerev A. Kateter-associirovannye infekcyi krovotoka. Klin. Mikrobiolog. I antimikrob. Himioter. 2006. T. 8. № 2. S. 130-144.

4. O'Grady N, Alexander M, Burns L, et al.; Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee. Guidelines for the prevention of intravascular catheter-related infections. Am J Infect Control. 2011. Vol. 39, No. 4. Р. 1-34.

5. Lundgren I. S., C. Zhou, F. R. Malone, N. G. Mcafee, S. Gantt and D. M. Zerr. Central Venous Catheter Repair is Associated with an Increased Risk of Bacteremia and Central Line Associated Bloodstream Infection in Pediatric Patients. Pediatr Infect Dis J. 2012 Vol.31, No. 4. P. 337-340.

6. Ramage G., Walle K.V., Wickes B.L., Lopez-Ribot J.L. Standartized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001. No. 45. P. 2475-2479

7. Stepanovic S., Vukovi D., Hola V. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by Staphylococci. APMIS. 2007. Vol. 115. P. 891-899.

8. Chandra J., Kuhn D.M., Mukherjee P.K., Hoyer L.L., McCormick T., Ghannoum, M.A. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 200. No. 183. P. 5385-5394.

9. Lakhtin M., Aleshkin V., Lakhtin V., Afanasiev S., Pozhalostina L., Pospelova V. Probiotic lactobacillus and bifidobacterial lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: new class of pathogen biofilm destructors. Probiotics & Antimicrobial Proteins. 2010. Vol. 2, No/ 3. P. 186-196. DOI: 10.1007/ s12602-010-9046-3.

10. Lakhtin M., Lakhtin V., Aleshkin V., Afanasiev S. Lectins of beneficial microbes: system organization, functioning and functional superfamily. Beneficial Microbes. 2011. Vol. 2, No. 2. P. 155-165. DOI: 10.3920/BM2010.0014.