Способ обработки трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии с использованием суб- и сверхкритического диоксида углерода
METHOD OF PROCESSING GRAFTS FOR CARDIOVASCULAR SURGERY USING SUB- AND SUPERCRITICAL CARBON DIOXIDE

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам повышения биосовместимости и подавления кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов путем их специальной обработки до имплантации. Известно, что после трансплантации клапанов сердца и сосудов имеет место их кальцификация, дегенерация и отторжение, что значительно уменьшает длительность их функционирования. Эти ограничения являются одной из основных причин реопераций у взрослых больных и высокой смертности у пациентов в раннем детском возрасте. В качестве одной из наиболее значимых причин иммунной реакции на трансплантаты и их кальцификации в научной литературе рассматриваются клетки донора. В связи с этим для уменьшения иммунного ответа на трансплантат и для предотвращения его кальцификации предлагаются методы обработки трансплантатов клапанов сердца и сосудов, обеспечивающие разрушение в них клеток донора (децеллюляризация) до имплантации в организм реципиента. Для децеллюляризации трансплантатов клапанов сердца и сосудов используют различные подходы, включая обработку гипотоническим шоком, протеолитическими ферментами, нуклеазами, детергентами (Ann. Thorac. Surg. 2001, v. 71 (5 Suppl) p. S428-432; Ann Thorac Cardiovasc Surg 2009; 15: 362-367; J. Heart Valve Disease 2011; v. 20, p. 341-347; Ann Thorac Surg, 2011; 92: 131-137). Известен способ обработки коллагенсодержащих тканей, в котором для повышения эффективности регенерации тканей и уменьшения иммунной реакции на трансплантируемую ткань, их обрабатывают до имплантации таким образом, что элиминируют все неколлагеновые компоненты, включая клетки и такие компоненты тканевого матрикса, как эластин, протеогликаны, гликозаминогликаны, используя для этого щелочи, хелатирующие агенты, кислоты и соли (см.: Патент США N 5993844, 30-11-1999). Согласно указанному изобретению, после удаления неколлагеновых компонентов сохраняется структурная организация коллагенового матрикса, его способность к ремоделированию, что предполагает миграцию в него клеток реципиента, ответственных за поддержание нативности ткани. В предложенном способе не используются детергенты и ферменты, которые способны отрицательно влиять на восстановление коллагенового матрикса после его имплантации. Недостатком способа является то, что предложенная обработка вызывает разрушение/удаление из тканевого матрикса не только клеток, но также ряда протеогликанов, которые играют важную роль в защите ткани от кальцификации. Следует также отметить, что коллаген является существенным компонентом поверхности миофибробластов и гладкомышечных клеток, и поэтому невозможно разрушить клетки, не повреждая коллаген тканевого матрикса. Кроме того, согласно указанному способу удаляются все неколлагеновые белки, и, следовательно, эластин, что также указывает на повреждение тканевого матрикса. Как известно повреждение тканевого матрикса индуцирует иммунный ответ, воспаление, фиброзное перерождение. Таким образом, согласно известным биологическим представлениям, предложенная обработка будет повреждать структуру тканевого матрикса, а это, как известно, усиливает реакцию отторжения трансплантата и, в конечном счете, сокращает срок его функционирования. Известен способ децеллюляризации трансплантатов клапанов сердца и сосудов, основанный на обработке биоматериалов раствором трипсина (0.25%) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0.02%) при рН 7.4 и температуре 37°С в течение 1 суток с последующей отмывкой от указанных компонентов и обработкой раствором дезоксирибонуклеазы (0.2 мг/мл) и рибоксинуклеазы (0.02 мг/мл) (Патент ЕС №5 10 15 20 25 30 35 40 45 50, Патент РФ №2499611 С1). Такая обработка позволяет разрушать клетки донора и рассматривается как один из основных способов децеллюляризации, обеспечивающей подавления иммунного ответа организма на имплантируемые ткани. Недостатком этого способа является тот факт, что длительная обработка трипсином вызывает не только разрушение клеток донора, но и повреждение коллагеновых фибрилл, эластина и других белков тканевого матрикса, что вызывает усиление иммунной реакции на трансплантат. Более того, имеются экспериментальные данные, свидетельствующие об усилении кальцификации трансплантатов после обработки таким способом, что ставит под сомнение целесообразность его применения для повышения биосовместимости трансплантируемых материалов для сердечно-сосудистой хирургии.
Известен способ обработки трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии, заключающийся в предварительной инкубации тканей до имплантации в физиологическом солевом растворе с ЭДТА, с последующей обработкой неионным детергентом деоксихолатом натрия, вызывающим гибель клеток донора, и с последующей отмывкой неионного детергента в растворе этилового спирта, (патент РФ №2291675(13) С2). Согласно этому изобретению, принятому в качестве прототипа, предварительную инкубацию трансплантатов выполняют в течение 4-6 часов в физиологическом растворе, содержащем 0,5-2 мМ ЭДТА и органический буфер HEPES при рН 7.0, последующую инкубацию с деоксихолатом натрия выполняют в течение 30-48 часов при 37°С, также используя физиологический раствор, содержащий органический буфер HEPES при рН 7.8, а отмывку ткани от деоксихолата выполняют в физиологическом растворе, содержащем хлористый натрий (0,9%), HEPES (рН 7,8) и 15-25% этилового спирта, в течение 8 суток при 37°С с 2-х кратной сменой среды каждые сутки на свежую. В предпочтительном варианте способа используют 0,5 мМ ЭДТА, 4 часа обработки в растворе ЭДТА, 40 часов обработки деоксихолатом и 20% этилового спирта в отмывочном растворе. Применение низкой концентрации ЭДТА в растворе для предварительной инкубации, и малое время предварительной инкубации обеспечивают защиту тканевого матрикса от повреждения, связанного с избыточным хелатированием кальция. Применение органического буфера HEPES позволяет избежать прочного связывания деоксихолата в тканевом матриксе, которое возникает при использовании фосфатного буфера и особенно Трис-буфера. В результате такого связывания возникают проблемы с отмывкой деоксихолата из матрикса, что вызывает токсичность такого матрикса для клеток. Увеличение времени обработки деоксихолатом позволяет более эффективно удалять липидные компоненты из матрикса, что необходимо для подавления кальцификации трансплантата и повышает его биосовместимость. Применение этилового спирта в отмывочном растворе и длительная отмывка необходимы для тщательного удаления из матрикса деоксихолата, и соответственно этому для предотвращения токсичности, что в конечном счете ведет к повышению биосовместимости.
Наиболее близким, принятым за второй прототип, является способ обработки тканей аллотрансплантатов клапанов сердца, согласно которому для уменьшения иммуногенности, подавления кальциноза, ткани до имплантации обрабатывают в течение 8-20 часов в умеренно щелочном буфере, предпочтительно рН 8.0, затем протеолитическими ингибиторами, для чего используют этилендиаминтетрауксусную кислоту или апротинин, после чего инкубируют в умеренно щелочном буфере, предпочтительно рН 8.0 в растворе неионного детергента, предпочтительно используя раствор додецилсульфата натрия (от 0,03% до 0,1%) или деоксихолата натрия (от 0.5% до 2%) в течение 20-28 ч (преимущественно 24 часа), затем многократно (преимущественно 3 раза) отмывают ткани от детергентов умеренно щелочным раствором (рН 8,0), забуференным Трис и содержащим ингибиторы протеаз, а затем таким же раствором, но без протеаз, после чего ткани инкубируют в растворе дезоксирибонуклеазы (0.005-0.1 мг/мл) и рибонуклеазы (0.0001-0.01 мг/мл), помещают в среду для криоконсервации и замораживают для хранения в жидком азоте (Патент США №7354749 В2, 08-04-2008). Недостатком способа является то, что раствор додецилсулфата натрия, вызывая лизис клеток, воздействует при этом на белки тканевого матрикса, и согласно известным экспериментальным данным, повышает кальцификацию тканей трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Другим недостатком этого способа является применение Трис-забуференного раствора, поскольку Трис способствует прочному связыванию деоксихолата с тканевым матриксом, в результате чего деоксихолат не удается отмыть даже в течение 2-4 недель с ежедневной сменой среды, и такой матрикс остается токсичным для клеток. Еще одним недостатком указанного способа является неоправданно широкий диапазон ЭДТА (1-100 мМ), поскольку в процессе обработки при концентрациях ЭДТА 5 мМ и выше происходит повреждение тканевого матрикса, которое усиливает иммунную реакцию на обработанную таким образом ткань. Причиной этого является хелатирование ионов кальция, которые играют существенную роль как ионные мостики между различными молекулами белков в нативной структуре матрикса. Поэтому, инкубация тканей с ЭДТА в концентрации 10 мМ, заявленной как предпочтительная, продолжающаяся в течение 14 часов будет вызывать нарушение структуры матрикса. Такие недостатки известного способа обработки трансплантируемых тканей неионными детергентами способны вызывать осложнения при их хирургическом применении, на что указывают некоторые данные литературы (Europ.J Cardio-Thorac. Surg. 2012, v. 41, p. 1320-1325).
Известен способ получения ксенотрансплантата (Патент РФ №2120212), включающий обработку в растворе 0,625% глутарового альдегида и децеллюляризацию поверхностно-активным веществом (ПАВ). В качестве ПАВ используют, например, 1% раствор додецилсульфата натрия (SDS). Недостатками данного способа являются низкая биосовместимость вследствие цитотоксичности данного ПАВ, а также относительно высокий уровень кальцификации вследствие наличия в ткани большого количества непрореагировавших альдегидных групп. Действительно, известно, что наличие свободных остаточных альдегидных групп, контактирующих с элементами крови, является одной из основных причин отложения фосфатов кальция на поверхности имплантата, что приводит к выходу его из строя.
Известен способ снижения кальцификации ксенотрансплантата для повышения срока его функционирования в организме (Патент РФ №2372945). Способ включает этап очистки путем обработки гексаном, а также этап получения защитного покрытия из смеси реактивов на основе полиэтилгидридсилоксана (пленкообразующий компонент) и триацетоксисилана (отвердителя). Главными недостатками данного способа является потенциальная цитотоксичность, за счет возможных остатков реактивов неприродного происхождения, а также проблема возрастания толщины покрытия, так как излишне толстое и жесткое покрытие может ухудшить механико-прочностные свойства получаемого биопротеза.
Известен способ обработки тканей ксенотрансплантатов клапанов сердца, согласно которому для уменьшения имунногенности и подавления кальциноза, исходную ксеноткань, обрабатывают 0,625% глутаровым альдегидом, затем формируют защитный экран, покрывая агентом, который реагирует с альдегидными группами на ткани (в растворе этиленамина (0,06%)и боргидрата натрия (0,42%) в фосфатном буфера), и затем дегидрируют имплантат раствором глицерина и этанола после стадии стерилизации в цитотоксичном растворе (формальдегид или глутаровый альдегид) с целью снижения окисления (Патент ЕС 2647393 А1). Несмотря на показанную высокую эффективность в плане подавления кальцификации, недостатками данного способа также является потенциально высокая цитотоксичность за счет применения токсичных растворителей, остатки которой могу присутствовать в ксенотрансплантате.
Задача создания защитного экрана для обеспечения биосовместимости поверхности биологического трансплантанта и предотвращения его кальцификации должна быть решена использованием природных безопасных соединений, покрытие из которых не нарушало бы основных преимуществ биотрансплантатов.
2
В заявляемом изобретении предлагается использовать способ обработки биологического трансплантата (ксеногенного или аллогенного) сочетающий кратковременную (в течение 1 ч) децеллюляризацию в 1% растворе SDS под высоким давлением (десятки МПа) и в мультикомпонентной с детергентом Tween-80 и скСО обработке исходной ткани, с последующей обработкой очищенной ткани в растворе глутарового альдегида и создания «интеллектуального» защитного экрана формируемого, последовательным нанесением: 1) биологически безвредного хитозанового покрытия, способного ковалентно связываться с альдегидными группами из раствора угольной кислоты под высоким давлением, 2) антимикробного агента, и 3) слоя гиалуроновой кислоты маскирующего антимикробные, потенциально токсичные агенты. Сведения о подобном способе обработки биологических трансплантатов отсутствуют в научно-технической литературе. Нами установлено, такая обработка вызывает гибель клеток донора и освобождает ткань от иммуногенных и кальциноз-индуцирующих липидньгх компонентов, предотвращает кальциноз в организме реципиента, повышает биосовместимость таких трансплантатов и позволяет создать защитный экран, индуцирующий эмиссию антимикробных агентов при развитии инфекционного заражения. Подбирая условия нанесения полимеров в растворе угольной кислоты под давлением, можно добиваться создания устойчивого бислойного покрытия инкапсулирующего антимикробные агенты. Было установлено, что в воде насыщенной диоксидом углерода под высоким давлением, создаются условия для растворения хитозана, за счет достижения кислотности среды значений рН ~3, а при последующем нанесении гиалуроновой кислоты в растворе HEPES буфера, насыщенного CO2 под давлением, можно создать рН ~4-6, достаточный для протонирования слоя нанесенного хитозана и сохраняющего отрицательный заряд на поликислоте, что приводит к устойчивому электростатическому связыванию полимерных слоев друг с другом. Таким образом, заявляемый способ нанесения хитозана на биологический протез клапана сердца прямым методом из раствора в сравнении со своим наиболее близким аналогом отличается тем, что в биоткань эффективно предварительно децеллюляризуется биосовместимым методом с применением сверхкритических технологий и защитный экран состоит из двух слоев полиэлектролитов, инкапсулирующих антимикробный агент.
Таким образом, техническим результатом настоящего изобретения является получение нецитотоксичного и неимунногенного матрикса биологических имплантатов с защитным устойчивым полиэлектролитным «интеллектуальным» экраном, что обеспечивает выраженный антимикробный ответ, индуцированный развитием инфекционного заражения, рекордные характеристики в плане подавления кальцификации в сочетании с и биосовместимыми характеристиками, а также высокой механической стабильностью и долговечностью.
При этом технический результат достигается комплексным подходом:
2
Во-первых, децеллюляризация с применением SDS, Tween-80, а также сверхкритического СО, обеспечивает гибель клеток донора и освобождая ткань от иммуногенных и кальциноз-индуцирующих липидных компонентов, предотвращая кальцификацию в организме реципиента и повышает биосовместимость таких трансплантатов.
Во-вторых, хитозановое покрытие, наносимое из угольной кислоты под давлением, позволяет эффективно маскировать свободные альдегидные группы глутарового альдегида. Такое экранирование, как известно, способствует значительному снижению интенсивности процессов кальцификации на поверхности биологической ткани [Kuribayashi R, Efficacy of the chitosan posttreatment in calcification prevention of the glutaraldehyde-treated porcine aortic noncoronary cusp implanted in the right ventricular outflow tract in dogs / Kuribayashi R, Chanda J, Abe T. // Artificial organs. - 1996. - V. 20(7). - P. 761-766; Rodas A, Cytotoxicity and endothelial cell adhesion of lyophilized and irradiated bovine pericardium modified with silk fibroin and chitosan. / Rodas A, Polak R, Hara P, Lee E, Pitombo R, Higa O. // Artificial Organs. - 2011. - V. 35(5). - P. 502-507]. Более того, при нанесении хитозана заявляемым способом на децеллюляризованную и сшитую глутаровым альдегидом биоткань была высокая степень подавления кальцификации по сравнению с наиболее близким аналогом, по-видимому, вследствие эффективного удаления потенциально имунногенных кальциноз-промоутирующих клеточных остатков предварительно перед нанесением защитного экрана.
2
2
В-третьих, предлагаемый способ децеллюляризации ткани имплантата и нанесения защитного экрана из растворителей на основе диоксида углерода под давлением (скСО и угольной кислоты), которые после декомпрессии спонтанно и полностью переходят в абсолютно безопасные для организма человека гипоаллергенные компоненты: воду и углекислый газ способствует понижению цитотоксичности и иммуногенности имплантатов. Действительно, изменением внешнего давления можно избежать проблему остаточного растворителя при децеллюляризации в скСO, а также степень насыщения воды углекислым газом, и, соответственно, рН угольной кислоты, меняя степень протонирования хитозана, что позволяет менять растворимость хитозана [Sakai Y, A novel method of dissolving chitosan in water for industrial applications / Sakai Y, Hayano K, Yoshioka H, Yoshioka H. // Polym. J. - 2001. - V. 33. - Р. 640-642].
2
В-четвертых, среды, в которых проводятся децеллюляризация и нанесение защитного экрана на биоткань, имеют стерилизующие свойства. Действительно, при высоком давлении молекулы углекислого газа, растворенные в воде, или находясь в сверхкритическом состоянии диффундируют в бактерии, споры бактерий, вирусы и биологически инактивируют их [Ellis J, (2010) Supercritical СО sterilization of ultra-high-molecular weight polyethylene / Ellis J. // J. Supercrit. Fluids. - 2010. - V. 52. - Р. 235-240]. Благодаря этому свойству сред можно исключить дополнительную стерилизацию имплантатов, и, тем самым, упростить технологический процесс их подготовки для последующей хирургической операции.
В-пятых, использование угольной кислоты в качестве растворителя хитозана, а также буферного раствора, насыщенного углекислым газом в качестве растворителя гиалуроновой кислоты, способствует образованию более прочной связи с коллагеновыми фибриллами ткани трансплантата, а также большей стабильности бислойного покрытия хитозан/гиалуроновая кислота, по сравнению с хитозаном связанным с ацетат-ионами при нанесении хитозана из растворов в уксусной кислоте. Действительно, вследствие слабого связывания карбонат-анионов с поликатионными макромолекулами хитозана, изначально протонированные (имеющие положительный заряд) в угольной кислоте цепи хитозана теряют заряд при сбросе давления после нанесения. С другой стороны, можно подобрать рН водной среды (используя буферные раствор), так чтобы при нанесении верхнего слоя (полианиона гиалуроновой кислоты) хитозановый, уже нанесенный, слой имел положительный заряд, а цепи гиалуроновой кислоты отрицательный, что обеспечит лучшую адсорбцию полианиона на ткань имплантата с хитозановым покрытием. Поскольку значение pKa гиалуроновой кислоты составляет 3-4 и, как следствие, этот полимер отрицательно заряжен в широком диапазоне рН [Mero & Campisi. // Polymers, 2014, 6(1), 346-369], а pKa хитозана составляет 6.1 и является поликатионом при более низких рН, то выбор буферной системы при рН=4.5-5.0 позволит создать наиболее устойчивое покрытие. Кроме того, гиалуроновая кислота имеет антиадгезивные свойства по отношению к бактериальной биопленке, благодаря своей высокой гидратационной емкости, что позволяет создавать покрытия с высокой поверхностной энергией [Junter, Thébault, & Lebrun // Acta Biomaterialia. 2016, 30, 13-25]. При сбросе давления, при повышении рН, заряды на уже адсорбированных полиэлектролитах будут снижаться и покрытие примет устойчивую водонерастворимую форму. Таким образом, в условиях внутренней среды организма потерявшие заряд цепи полиэлектролитов не будут иметь сродства к воде, что приведет к лучшей механической стабильности нанесенного покрытия.
В-шестых, бислойное полиэлектролитное покрытие с верхним слоем гиалуроновой кислоты обеспечит реализацию эффекта «интеллектуального» антимикробного отклика, запускаемого при заражении. Действительно, слой биосовместимого полианиона гиалуроновой кислоты может экранировать потенциально цитотоксичные антимикробные агенты, отделяя их от кровотока. При этом, данный слой может быть гидролизован («вскрыт») в результате лизиса гликозидных связей гиалуроновой кислоты при понижении рН среды, в результате жизнедеятельности бактериальной пленки [Tømmeraas, Melander. // Biomacromolecules 2008. 9. 1535-1540; Albright et.al. // ActaBiomater. 2017. 61. 66-74.], и выделение специфических ферментов со стороны бактерий (гиалуронидаз) (рис. 1) [Haas et.al. // Biomacromolecules. 2015. V. 16. 832-841], что запустит выделение токсичного для микробов антимикробного агента, который сможет их инактивировать.
2
Указанный комплексный технический результат достигается тем, что в качестве децеллюляризирующей среды используется растворы SDS, Tween-80 и сверхкритический СО, в качестве полимера для покрытия поверхности биологического имплантата используется хитозан, в качестве полимера покрывающего антимикробные агенты - полианион гиалуроновой кислоты, а в качестве растворителя хитозана при его нанесении на имплантат используется вода, насыщенная углекислым газом при высоком давлении, а в качестве растворителя гиалуроновой кислоты -насыщенный углекислым газом водный буферный раствор.
В качестве метода децеллюляриазции трансплантата целесообразно использовать гибридный метод, сочетающий предварительную обработку в растворе полярного детергента додецилсильфата натрия с последующей обработкой в сверхкритическом растворе диоксида углерода с неполярным детергентом Твин 80, сорастворителями водой и этанолом.
Предварительную обработку трансплантата предпочтительно проводить 1% водном растворе SDS насыщенным диоксидом углерода под давлением 10-30 МПа, поскольку при таких давлениях происходит более проникновение растворе детергента вглубь пористого матрикса трансплантата в том числе и мелкие наноразмерные поры.
Предварительную обработку трансплантата предпочтительно проводить относительно малое время - в течение 1-2 часов, чтобы избежать разрушения гистоархитектоники ткани при более длительном воздействии детергента.
Обработку (децеллюляризацию) трансплантата предпочтительно проводить в сверхкритическом диоксиде углерода при температуре 39°С и давлении 15-17 МПа, вдали от критической точки для эффективной экстракции неполярных компонентов матрикса трансплантата, поскольку растворимость диоксида углерода возрастает с ростом давления и плотности среды.
В раствор сверхкритического диоксида углерода предпочтительно добавлять сорастворитель этанол для повышения полярности среды с целью экстракции полярных компонентов ткани трансплантата.
В раствор сверхкритического диоксида углерода предпочтительно добавлять детергент Tween-80 и сорастворители воду и этанол в количестве 0,5-1,0 объемный % для формирования гомофазной среды, позволяющей протекать экстракции ксеногенных клеток и клеточных компонентов однородно и изотропно во всем объеме раствора.
В раствор сверхкритического диоксида углерода предпочтительно добавлять детергент Твин-80 и сорастворители воду и этанол в соотношении 1:10:40 для формирования в растворе стабильных мицелл по типу вода в масле [С. Prieto, L. Calvo, J. Appl. Chem. 2013, ID 930356, 10-13,], которые обладают высокой проникающей способностью, и могут усиливать взаимодействие раствора взаимодействовать как с полярными, так и с неполярными компонентами ткани трансплантата [S. Gupta, S.P. Moulik, // J. Pharm. Sci. 97 (2008) 22-45; Z. Gao, H. Choi, H. Shin, K. Park, S.J. Lim, K.J. Hwang, C. Kim // Int. J. Pharm. 161 (1999) 75-86].
Децеллюляризацию в сверхкритическом диоксиде углерода предпочтительно проводить в 2-3 цикла с экспозицией в течение цикла 30-40 минут с этапами закачки и сброса давления с 15-17 МПа до 8-9 МПа с целью максимально эффективного удаления уже растворенных компонентов ткани.
После стабилизации децеллюляризованной ткани трансплантата глутаровым альдегидом и нанесения хитозанового покрытия, предпочтительно наносить антимикробные агенты из водных растворов под давлением.
В качестве антимикробного агента предпочтительно использовать антибиотик -ванкомицин, или антисептик мирамистин, поскольку данные вещества проявляют выраженную антимикробную активность против золотистого стафилококка (S. Aureus), вызывающего постоперационный эндокардит [Mader, Т. Stanton, Т., 1999. Feeding High Moisture Corn. Beef Cattle Handbook. Product of Extension Beef Cattle Resource Committee. Iowa State University].
Предпочтительно, чтобы нанесение антимикробных агентов происходило из заранее приготовленного 0,05-0,1% раствора в водном растворе буферной системы, поскольку меньшая, чем в указанном интервале, концентрация вещества не приведет к достаточному антимикробному воздействию, а большая, чем в указанном интервале, концентрация нецелесообразна с экономической точки зрения.
Предпочтительно, чтобы рН буферного раствора была близка к нейтральной, с целью сохранения жизнеспособности антибиотика, а также максимальной адсорбции вещества на хитозановый слой, поскольку при данном рН можно ожидать наименьшее электростатическое отталкивание хитозана и антимикробного агента.
После нанесения антимикробного агента на децеллюляризованную и стабилизированную глутаровым альдегидом ткань трансплантата с хитозановым покрытием, предпочтительно нанести маскирующий антимикробный агенты слой полианиона гиалуроновой кислоты из водных растворов под давлением.
В качестве полианиона гиалуроновой кислоты, а также поликатиона хитозана предпочтительно использовать полимеры со сходной молекулярной массой 100-300 кДа для получения наиболее однородного покрытия, поскольку в случае, когда макромолекул обоих полиэлектролитов сходны по размеру будет наблюдаться наиболее полное их межмолекулярное электростатическое связывание.
Предпочтительно, чтобы рН буферного раствора была близка к 5.0-6.0, с е максимальной адсорбции гиалуроновой кислоты и наиболее прочного электростатического связывание полиэлектролитных слоев друг с другом, поскольку при данном рН можно ожидать разноименные заряды гиалуроновой кислоты и хитозана [Mero & Campisi. // Polymers, 2014, 6(1), 346-369].
Предпочтительно, чтобы концентрация полимеров в растворах воды, насыщенной диоксидом углерода под давлением была в интервале 0,1-1,0 вес.% для достижения полного покрытия поверхности транплантата. Использование более высоких концентраций полимеров экономически нецелесообразно.
Нанесение хитозана, антимикробного агента, и гиалуроновой кислоты, производится прямым методом из водных растворов в воде, насыщенной углекислым газом в автоклаве.
Нанесение компонентов покрытия производиться последовательно на стабилизированную глутаровым альдегидом и предварительно децеллюляризованную ткань трансплантата в следующем порядке: хитозан - антимикробный агент - гиалуроновая кислота.
В частности, в качестве автоклава, в котором происходит нанесение компонентов покрытия и приготовления раствора хитозана, можно использовать автоклавы, предназначенные для работы со сверхкритическими флюидами, рассчитанные на давления более 10 МПа.
В частности, время экспозиции полимера может быть 1-6 часов, поскольку более длительное воздействие условий осаждения может приводить к ухудшению механических характеристик ткани трасплантата (возможно, за счет экстракции эластина), а меньшие времена экспозиции недостаточны для формирования однородного и механически стабильного полиэлектролитного покрытия на ткани трасплантата.
В частности, время декомпрессии автоклава должно быть не менее 10-20 мин. При меньших временах декомпрессии возможен срыв компонентов покрытия вместе с потоком углекислого газа и воды.
2
2
2
В дальнейшем изобретение поясняется графиками, описанием конкретных примеров его выполнения со ссылками на сопутствующие графики. На чертежах изображена схема очистки трансплантата (Фиг. 1) и схема нанесения полиэлектролитного покрытия на него (Фиг. 2). Очистку производят в две стадии с помощью установки, состоящей из автоклава (1) баллона с СО (4), электрического пресса (5), регулятора давления (6). На первой стадии очистку производят, погружая трансплантат (2) в автоклав, наполовину заполненный водным раствором SDS и производят экспозицию в течение 1 ч. Затем трансплантат очищают с помощью сверхкритического CO2 в автоклаве (1), погружая ватный диск, пропитанный раствором детергента Tween-80 (3). После очистки трансплантата проводят этапы нанесения полиэлектролитного покрытия (Фиг. 2). Перед созданием высокого давления СО трансплантат (4) помещают в автоклав, содержащий воду и раствор макромолекул хитозана (3), предварительно подготовленный, путем экспозиции навески хитозана (2) в автоклаве (1) в течение 5-7 суток (а). Затем в автоклаве создают высокое давление СО и тем самым осуществляют нанесение хитозана на трансплантат (б). Следующим этапом (в) на трансплантат с хитозановым покрытием наносят антимикробный агент (5) под давлением при рН=7.4. На финальном этапе (г) на трансплантат с хитозановым покрытием и антимикробным агентом наносят покрытие из макромолекул полианионов гиалуроновой кислоты (7) под давлением при рН=5.0-6.0.
Заявляемое изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1
2
2
2
Трансплантат (перикард биологического протеза клапана сердца в виде пластин площадью 40 см и толщиной 0,4-0,5 мм) погружают в автоклав с раствором SDS (1% раствор), занимаемый половину объема автоклава. Затем в автоклав нагентают диоксид углерода до давления 20 МПа и проводят экспозицию в течение 1 часа. Затем ткань перикарда погружают в пустой автоклав с малым количеством (1 объемный %) 2% раствора Tween-80 в воде со спиртом (2% Tween-80, 78% воды, 20% этанола) и запускают в термостатируемый автоклав СО при Т=39°С, до давления Р=15 МПа. Экспозицию проводят 3 циклами длительностью 30 мин. Затем очищенную ткань обрабатывают 0,625% раствором глутарового альдегида, и несколько раз тщательно промывают стерильным физиологическим раствором с 6-кратной сменой раствора из расчета 500-550 мл на 100 г перикарда. Затем очищенную ткань перикарда и сшитую глутаровым альдегидом ткань перикарда погружают в раствор хитозана фирмы Sigma-Aldrich (сорт «low molecular weight», каталожный номер 448877) в дистиллированной воде, насыщенной углекислым газом при давлении 30 МПа. На чертеже показана схема установки для нанесения хитозана на перикард биологического протеза клапана сердца. Раствор предварительно приготавливают по следующей методике: в автоклав помещают навеску хитозана в количестве 0,8% по весу раствора, затем наливают дистиллированную воду до половины объема автоклава, затем нагнетают углекислый газ до давления в автоклаве 30 МПа, после этого оставляют растворяться хитозан в течение 5 суток при температуре 20°С с периодическим помешиванием раствора, путем установки автоклава на магнитную мешалку в процессе приготовления раствора. Давление в установке сбрасывают, и перикард биологического протеза клапана сердца погружают в раствор хитозана. Затем в автоклав нагнетают углекислый газ до давления 30 МПа. В этих условиях происходит нанесение хитозана на перикард в автоклаве при температуре 25°С в течение 3 часов. После нанесения хитозана готовят в автоклаве 0,1% раствор ванкомицина фирмы Sigma-Aldrich в HEPES буфере с=0.1 М/л, рН=7.4. Затем в автоклав с вакномицином погружают ткань перикарда с хитозановым покрытием, нагнетают СО и проводят экспозицию при Т=25°С и давлении Р=30 МПа в течение 3 часов. Затем готовят раствор гиалуроновой кислоты с концентрацией 0,2 вес.%. фирмы Lifecore Biomedical (сорт «НА-300») в HEPES буфере с=0.1 М/л, рН=5.5. Затем в автоклав с этим раствором погружают перикардиальную ткань с хитозановым покрытием и ванкомицином, нагнетают диоксид углерода до давления Р=30 МПа и проводят экспозицию в течение 3 часов.
Пример 2.
2
Перикард децеллюляризируют и наносят хитозан согласно условиям примера 1, после чего погружают в автоклав с 0,05% раствором ванкомицина в HEPES буфере с=0.1 М/л, рН=7.4 и нагнетают СО и проводят экспозицию при Т=25°С и давлении Р=30 МПа в течение 3 часов. Затем наносят гиалуроновую кислоту из автоклава под давлением, согласно условиям примера 1.
Пример 3.
Перикард децеллюляризируют, наносят хитозан и ванкомицин согласно условиям примера 1 и примера 2, затем погружают в автоклав с раствором гиалуроновой кислоты с концентрацией 0,5 вес.% фирмы Lifecore Biomedical (сорт «НА-300») в HEPES буфере с=0.1 М/л, рН=5.5. Затем в автоклав с этим раствором погружают перикардиальную ткань с хитозановым покрытием и ванкомицином, нагнетают диоксид углерода до давления Р=30 МПа и проводят экспозицию в течение 3 часов.
Пример 4
Перикард децеллюляризуют и покрытие наносят на трансплантат согласно методике, описанной в примерах 1-3, за исключением того, что в качестве гиалуроновой кислоты берется полимер фирмы Lifecore Biomedical (сорт «НА-200»).
Пример 5
Перикард децеллюляризуют и покрытие наносят на трансплантат согласно методике, описанной в примерах 1-4, за исключением того, что нанесение вакномицина и гиалуроновой кислоты проводят при давлении Р=20 МПа.
Пример 6
Перикард децеллюляризуют и покрытие наносят на трансплантат согласно методике, описанной в примерах 1-5, за исключением того, что нанесение вакномицина и гиалуроновой кислоты проводят в течение 4 часов.
Пример 7
2
Перикард децеллюляризируют и наносят хитозан согласно условиям примера 1, после чего погружают в автоклав с 0,1% раствора мирамистина в HEPES буфере с=0.1 М/л, рН=7.4 и нагнетают СО и проводят экспозицию при Т-25°С и давлении Р=30 МПа в течение 3 часов. Затем наносят гиалуроновую кислоту из автоклава под давлением, согласно условиям примера 1.
Пример 8
Трансплантат децеллюляризируют и наносят покрытие согласно методике, указанной в примерах 1-7, за исключением того, что в качестве трансплантата используют аллогенная аорта, высотой 5-7 см, диаметром 2-3 см, толщиной стенок 2-3 мм.
Сравнительный пример 1
2
Перикард биологического протеза клапана сердца в виде пластин площадью 30 сми толщиной 0,4-0,5 мм, предварительно обработанный 0,625% раствором глутарового альдегида, несколько раз тщательно промывают стерильным физиологическим раствором с 6-кратной сменой раствора из расчета 500-550 мл на 100 г перикарда, таким образом получают исходный нативный перикард, предварительно обработанный глутаровым альдегидом без хитозанового покрытия.
Сравнительный пример 2
Перикард отмывают согласно сравнительному примеру 1, отмытый перикард погружают в 1% весовой раствор хитозана фирмы Aldrich (сорт «low molecular weight», каталожный номер 448877) в 1%-ной уксусной кислоте. Раствор предварительно приготавливают по следующей методике: хитозан Aldrich в количестве 1% от веса раствора погружают в 2% раствор муравьиной кислоты. Раствор перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 часов. Нанесение хитозана на перикард проводится согласно условиям примера 1.
Сравнительный пример 3
Перикард отмывают согласно сравнительному примеру 1, отмытый перикард погружают в 1% весовой раствор хитозана фирмы Aldrich (сорт «low molecular weight», каталожный номер 448877) в автоклав в угольной кислоте. Раствор предварительно приготавливают по следующей методике: хитозан Aldrich в количестве 1% от веса раствора погружают в угольной кислоте, полученной в автоклаве путем насыщения воды диоксидом углерода под давлением Р=30 МПа, согласно патенту РФ 2519219 С1. Раствор перемешивают на магнитной мешалке в течение 5 суток часов. Нанесение хитозана на перикард проводится согласно условиям патента РФ 2519219 С1 в угольной кислоте под давлением Р=30 МПа.
Сравнительный пример 4
Перикард подготавливают согласно методике, изложенной в примерах 1-7, за исключением того, что исключается стадия нанесения антимикробного агента, перед стадией нанесения ГК.
Сравнительный пример 5
Аллотрансплантаты (корневая и восходящая части аорты) были собраны в морге с трупов людей в возрасте 20-50 лет, погибший в результате несчастного случая. Собранный материал подвергали первичной механической обработке, затем 3 раза промывали стерильным физиологическим раствором, после чего помещали в среду RPMI-1640 и хранили при температуре 4 градуса.
Сравнительный пример 6
Аллотрансплантаты подготовленные согласно сравнительному примеру 5, и децеллюляризованные обрабатывали способом, взятым за один из прототипов, включая предварительную инкубацию в течение 14 ч в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 10 мМ ЭДТА, буфер Трис-HCl (50 мМ, рН 8.0), последующую инкубацию в физиологическом растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, буфер Трис-HCl (20 мМ, рН 8.0), в течение 24 часов, отмывку деоксихолата натрия указанным выше раствором ЭДТА с 3-кратной заменой среды через каждые 6 часов и последующую отмывку таким же раствором без ЭДТА.
Пример 9
Перикард, полученный согласно примерам 1-7, и перикард, полученный по сравнительным примерам 1-3, тестируют на механическую стабильность полимерного покрытия, для этого их помещают в ультразвуковую диспергирующую ванну на 15 мин. После этого поверхность перикарда, полученного по примерам 1-7 и сравнительным примерам 1-3, исследуют с помощью сканирующего электронного микроскопа (например, Hitachi SU 8000). Перикард, полученный согласно сравнительным примерам 1-3, имеет поверхность с шероховатой морфологией с коллагеновыми фибриллами без признаков покрытия или с ультратонким покрытием слабо маскирующим характерную периодичность коллагеновых фибрилл (D=60 нм), характерной для нативного перикарда или перикарда с ультратонким хитозановым покрытием, в отличие от поверхности перикарда, полученного согласно примерам 1-7, где поверхность образца имеет более гладкую однородную морфологию, типичную для полимерных покрытий. Таким образом, можно сделать вывод о механической стабильности полиэлектролитного покрытия на перикарде, полученного согласно примерам 1-7, в отличие от хитозанового покрытия на перикарде, полученного согласно сравнительным примерам 1-3.
Пример 10
Перикард, полученный согласно примерам 1-7, и перикард, полученный по сравнительному примеру 1, тестируют на биосовместимость. Для этого в культуру клеток фибробластов мыши линии NIH/3T3 вносят экстракты, приготовленные согласно ГОСТ Р ИСО 10993-12-2009 в физиологическом растворе при условиях, близких к условиям эксплуатации перикарда биологического протеза клапана сердца (температура 37°С, время экстракции 72 ч) из образцов перикарда, полученного согласно примерам 1-7 и сравнительному примеру 1. Через 24 ч инкубации оценивают морфологию и лизис клеток. В таблице 1 приведены данные исследований образцов перикарда, полученных согласно примерам 1-7, и образцов перикарда, полученных согласно сравнительному примеру 1. Проведенные испытания показали, что экстракты из образцов полученного согласно сравнительному примеру 1 перикарда оказывают незначительное цитотоксическое действие на культуру фибробластов мыши линии NIH/3T3, экстракты из образцов перикарда, полученных согласно примерам 1-7, не оказывают цитотоксического действия на культуру фибробластов мыши линии NIH/3T3 Представленные результаты показывают снижение цитотоксичности модифицированного полиэлектролитным покрытием, биологического протеза клапана сердца по сравнению с биологическим протезом клапана сердца, только предобработанным глутаровым альдегидом.
Пример 11
6
Перикард, полученный согласно примерам 1-6, и перикард, полученный по сравнительным примерам 1 и 3, тестируют на антимикробность. На образцы перикарда, полученного согласно примерам 1-7, и перикарда, полученного по сравнительному примеру 1, наносят тест-культуры, затем определяют количество жизнеспособных клеток тест-культур на поверхностях образцов. В качестве тест-культур были выбраны клинические штаммы бактерий, вызывающие осложнения после проведения операции по замене клапана: грамположительны Staphylococcus aureus в концентрации 10 клеток/мл.
Все подготовительные работы и исследования проводили в стерильных условиях при температуре окружающей среды - 20-22°С.
6
Из суточных культур готовили суспензии по Мак-Фарланду с концентрацией 10Клеток/мл. Исследуемые тест-объекты погружали в подготовленные суспензии культур и инкубировали в термостате при 37°С в течение 4 часов и 24 ч. Длительность инкубации 4 ч позволяет бактериям лишь только набирать питательные вещества для своего роста, размножение бактерий происходит после 18 часов подобной инкубации. Таким образом, по завершении экспозиции, на образцах, которые инкубировали в течение 4 ч, находились бактерии в количестве не большем, чем их могло адгезироваться на образцы («адгезия»), а на образцах, которые инкубировали в течение 24 ч, находились бактерии, выжившие на исследуемых коллагеновых матрицах («выживаемость»).
Таблице 2 показаны результаты исследования антимикробных свойств (количество проросших после инкубации колоний после 4 часов инкубации - «адгезия» и после 24 ч инкубации «выживаемость») образцов перикарда, полученного согласно примерам 1-6, и перикарда, полученного согласно сравнительному примеру 1.
Представленные данные свидетельствуют о том, что адгезия бактерий на матрицы с бислойными покрытиями с и без антимикробного агента примерна одинакова, количество выживших бактерий для образцов с антимикробным агентом существенно ниже, чем без такового. Таким образом, можно заключить, что перикард, полученный согласно примерам 1-6 имеет выраженный антимикробный эффект (выживает ~ 3% адгезированных бактерий). При этом, такой биоматериал имеет эффект индуцированного антимикробного отклика со стороны бислойного покрытия хитозан/ГК с внедренным антибиотиком, что проявляется в гибели бактерий после длительной экспозиции, в отличие от перикарда, полученного согласно сравнительному примеру 3.
Пример 12
Тестируют механико-прочностные характеристики перикарда, полученного согласно примерам 1-7 и сравнительным примерам 1-2, с помощью разрывной машины (например, «Instron», США). В Таблице 3 показаны средние значения механико-прочностных характеристик исходного перикарда, перикард с хитозановым покрытием, нанесенным согласно сравнительным примерам 1, 3, перикард с хитозановым покрытием, нанесенным согласно примерам 1-6
Представленные данные свидетельствуют о том, что модификация перикарда биологического протеза клапана сердца предлагаемым методом согласно примерам 1-6 улучшает механическую прочность перикарда.
Пример 13
2
Перикард, полученный согласно примерам 1-6, и перикард, полученный по сравнительным примерам 1-3, тестируют на способность подавления кальцификации. Подавление кальцификации исследуют методом подкожной имплантации крысам, для чего образцы перикарда биологического протеза клапана сердца размером 10*10 мм, толщиной 0,4-0,5 мм имплантируют подкожно крысам линии Wistar под тиопенталовым наркозом на спине по 4 штуки на животное, причем контрольные и опытные образцы помещают каждому животному попарно. После имплантации животных содержат в нормальных условиях вивария, питание ad libitum. В рацион питания включают эргокальциферол (витамин ДЗ). Через 4 месяца после имплантации образцы перикарда под наркозом извлекают из животных, промывают физиологическим раствором для удаления формульных элементов крови животных, высушивают в течение 1 недели в суховоздушном термостате при 25°С. Пробы помещают в кварцевые стаканчики, смачивают дистиллированной водой, добавляют 2 мл концентрированной азотной кислоты, оставляют на ночь при комнатной температуре, затем нагревают до 150-200°С на электроплитке до полного высушивания, потом помещают в муфель и нагревают 30 минут при 300°С, и затем 30 минут при 550°С. Если осадки были темного цвета, то обработку кислотой повторяют до полного отсутствия в них золы. После чего к ним добавляют 2 мл 2% азотной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, и оставляют на 30 минут для полного растворения, затем измеряют в них содержание минерализованного кальция методом атомной абсорбционной спектроскопии. В Таблице 4 показаны результаты исследования интенсивности процесса кальцификации in vivo на крысах 1) на образцах перикарда, полученного согласно сравнительному примеру 1, 2) образцах перикарда, полученного согласно сравнительным примерам 2-3, 3) образцах перикарда, полученного согласно примерам 1-6.
2
Представленные данные свидетельствуют о том, что модификация перикарда биологического протеза клапана сердца предлагаемым методом согласно примерам 1-6 позволяет существенно уменьшить их кальцификацию по сравнению с исходным перикардом и перикардом, модифицированным по способу-прототипу, согласно сравнительному примеру 2. Уровень кальцификации модифицированного биоматериала сопоставим (даже немного ниже) с уровнем для биоматериала, подготовленного согласно патенту РФ 2519219 С1, где покрытие на основе одного слоя полимера хитозана, нанесенного так же из угольной кислоты на перикард децеллюляризованный классическим способом без использования сверхкритического СО.
Пример 14
Сравнивали биосовместимость стенок трансплантатов (аорты человека) и обработанных заявляемым способом (приготовленных согласно методике изложенным в примерах 1-8) и способами, согласно сравнительным примерам 5-6. Для этого на обработанные материалы высевали клетки линии NIH 3Т3 (фибробласты, полученные из эмбриона мыши) и оценивали их жизнеспособность через 1 сутки и 3 суток культивирования. Клетки получены из Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Фрагменты стенки аорты человека, подготовленные согласно сравнительным примерам 5-6, по результатам флуоресцентного микроскопического анализа, содержали гладкомышечные и эндотелиальные клетки в отличие от биоматериала, приготовленного согласно примерам 1-8. (Фиг. 3). Для исследования биосовместимсоти фрагменты помещали в питательную среду Дальбекко, в которую были добавлены 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, и антибиотик гентамицин (50 мг/л) и антимикотик флуканазол (5 мг/л). Другую партию фрагментов обрабатывали заявленным способом, включая предварительную инкубацию в течение 4 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 0,5 мМ ЭДТА, органический буфер HEPES рН 7,0, затем инкубировали фрагменты ткани 40 ч в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, 1% деоксихолата натрия, органический буфер HEPES рН 7,8, после чего фрагменты отмывали в растворе, содержащем 0,9% хлористого натрия, органический буфер HEPES рН 7,8, 20% этилового спирта в течение 8 суток с 2-кратной сменой среды на свежую каждые сутки, а два раза в течение последующих суток отмывали от этилового спирта в растворе 0,9% хлористого натрия, рН 7.2. После такой многостадийной инкубации фрагменты второй группы помещали в культуральную среду, идентичную той, что использовали для первой группы. Клетки NIH 3Т3 выращивали в ростовой среде Дальбекко с 10% сыворотки и с антибиотиком гентамицином 50 мкг/мл и флуконазолом. После достижения монослоя, клетки открепляли от культуральных флаконов раствором трипсина и высевали на поверхность фрагментов контрольной (приготовленные согласно сравнительному примеру 5) и опытной (приготовленные согласно примерам 1-8) групп. Через сутки после посева проводили микроскопический флуоресцентный анализ жизнеспособности клеток по окраске ядерными красителями, один из которых проникает в живые клетки и, связываясь с ДНК, флуоресцирует в сине-зеленой области спектра (Hoechst 33342), а другой связывается с ДНК только в погибших клетках и флуоресцирует красным цветом. Флуоресцентный микроскопический анализ показал, что в опытной группе через 1 сутки и трое суток (97±2) % клеток были живыми. В контрольной группе через 1 сутки живыми были (45±3) %, а через 3 суток живыми оставались (11±2) % клеток. Это указывает на то, что заявленный способ повышает биосовместимость стенок аорты с живыми клетками.
Пример 15.
Исследовали механические свойства аллотрансплантатов подготовленных согласно сравнительным примерам 5-6 и подготовленных согласно заявляемому способу (примеры 1-8). Анализ механических свойств показал, что предельное напряжение при растяжении, аллотрансплантатов, обработанных согласно сравнительному примеру 6 и заявляемым способом, было значительно выше, чем у образцов из нативных (сравнительный пример 5) аллотрансплантатов (таблица 5). Наибольшее увеличение предела прочности при растяжении аллотрансплантатов в радиальном направлении достигается при их обработке согласно заявляемому способу (трансплантат, полученный согласно примерам 1-8, таблица 5) - Δσ=20±5%, (р<0,05, по сравнению с нативными аллотрансплантатами). Представленные данные свидетельствуют о том, что аллотрансплантат полученный согласно заявляемому способу (согласно примерам 1-8) более прочный чем, классический донорский аллотрансплантат.