СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ПОЛИКИСТОЗНОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК
METHODS OF TREATING POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке США №62/210031, поданной 26 августа 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для любых целей.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном документе представлены способы и композиции для лечения поликистозной болезни почек.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
PKD1
PKD2
Поликистозная болезнь почек - это генетическое заболевание, при котором в почках и в других частях тела развиваются множественные кисты, заполненные жидкостью. Поликистозная болезнь почек может быть унаследована как аутосомно-рецессивная (АРПБП) или аутосомно-доминантная (АДПБП). Аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек вызвана мутациями в гене  или . АДПБП является прогрессирующим заболеванием, при котором образование кист и увеличение почек приводят к почечной недостаточности и, впоследствии, к терминальной стадии почечной недостаточности у 50% пациентов к 60-летнему возрасту. Пациенты с АДПБП могут нуждаться в пожизненном диализе и/или пересадке почки. В настоящее время нет одобренного терапевтического средства для лечения АДПБП.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном документе приведены способы лечения поликистозной болезни почек, включающие в себя введение субъекту, имеющему в этом необходимость, терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-25 связанных нуклеозидов, причем последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения субъект имеет поликистозную болезнь почек. В определенных вариантах реализации изобретения субъект подозревается в наличии поликистозной болезни почек.
В определенных вариантах реализации изобретения у субъекта была диагностирована поликистозная болезнь почек до введения соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта определяли повышенный уровень miR-17 в почках, моче или крови, перед введением соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид.
PKD1
PKD2
В определенных вариантах реализации изобретения поликистозная болезнь почек является аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек (АДПБП). В некоторых вариантах реализации изобретения поликистозная болезнь почек является аутосомно-рецессивной поликистозной болезнью почек (АРПБП). В некоторых вариантах реализации изобретения, субъект имеет мутацию в гене . В некоторых вариантах реализации изобретения, субъект имеет мутацию в гене .
В определенных вариантах реализации изобретения субъект имеет увеличенный общий объем почек. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет гипертонию. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта нарушена функция почек. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект нуждается в улучшении функции почек.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17, субъекту, имеющему поликистозную болезнь почек, может улучшить функцию почек у субъекта; задержать ухудшение функции почек у субъекта; уменьшить общий объем почек у субъекта; замедлить увеличение общего объема почек у субъекта; ингибировать рост кисты у субъекта; замедлить ускорение роста кисты у субъекта; уменьшить боль в почках у субъекта; замедлить усиление боли в почках у субъекта; отсрочить возникновение боли в почках у субъекта; уменьшить гипертонию у субъекта; замедлить прогрессирование гипертонии у субъекта; отсрочить возникновение гипертонии у субъекта; уменьшить фиброз в почках субъекта; замедлить прогрессирование фиброза в почках субъекта; отсрочить возникновение терминальной стадии почечной недостаточности у субъекта; отсрочить время диализа для субъекта; отсрочить время пересадки почки для субъекта; и/или улучшить ожидаемую продолжительность жизни субъекта.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17, субъекту, имеющему поликистозную болезнь почек, может снизить альбуминурию у субъекта; замедлить прогрессирование альбуминурии у субъекта; отсрочить возникновение альбуминурии у субъекта; уменьшить гематурию у субъекта; замедлить прогрессирование гематурии у субъекта; отсрочить возникновение гематурии у субъекта; снизить уровень азота мочевины в крови субъекта; снизить уровень креатинина в крови субъекта; улучшить клиренс креатинина у субъекта; снизить соотношение альбумин:креатинин у субъекта; улучшить скорость клубочковой фильтрации у субъекта; замедлить снижение скорости клубочковой фильтрации у субъекта; уменьшить уровень белка липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL) в моче субъекта; и/или уменьшить уровень белка молекулы повреждения почек-1 (KIM-1) в моче субъекта.
Любой из вариантов реализации изобретения, представленный в данном документе, может включать в себя измерение общего объема почек у субъекта; измерение гипертонии у субъекта; измерение боли в почках у субъекта; измерение фиброза в почках субъекта; измерение уровня азота мочевины в крови субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение клиренса креатинина у субъекта; измерение альбуминурии у субъекта; измерение соотношения альбумин:креатинин у субъекта; измерение скорости клубочковой фильтрации у субъекта; измерение уровня белка липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL) в моче субъекта; и/или измерение уровня белка молекулы повреждения почек-1 (KIM-1) в моче субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения общий объем почек является объемом почек с поправкой на рост.
В определенных вариантах реализации изобретения киста присутствует в почке субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения киста присутствует в почке и печени субъекта.
Любой из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, может включать в себя введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, которое является антигипертензивным средством.
Любой из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, может включать в себя введение, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического средства, выбранного из ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), блокатора рецепторов ангиотензина II (БРА), диуретика, блокатора кальциевых каналов, ингибитора киназы, антагониста адренергического рецептора, вазодилататора, бензодиазепина, ингибитора ренина, антагониста альдостеронового рецептора, блокатора рецептора эндотелина, ингибитора мишени рапамицина млекопитающих (mTOR), аналога гормона, антагониста рецептора вазопрессина 2, антагониста рецептора альдостерона, диализ и пересадку почки.
В определенных вариантах реализации изобретения антагонистом рецептора вазопрессина 2 является толваптан.
В определенных вариантах реализации изобретения ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) выбраны из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла, рамиприла, цилазаприла, периндоприла и трандолаприла.
В определенных вариантах реализации изобретения блокаторы рецепторов ангиотензина II (БРА) выбраны из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.
2
2
2
2
2
В определенных вариантах реализации изобретения ингибитор АПФ вводится в дозе от 0,5 до 1 мг/м/день, от 1 до 6 мг/м/день, от 1 до 2 мг/м/день, от 2 до 4 мг/м/день или от 4 до 8 мг/м/день.
2
2
2
2
2
2
2
В определенных вариантах реализации изобретения БРА вводится в дозе от 6,25 до 150 мг/м2/день. В любом из этих вариантов реализации изобретения БРА вводится в дозе 6,25 мг/м/день, 10 мг/м/день, 12,5 мг/м/день, 18,75 мг/м/день, 37,5 мг/м/день, 50 мг/м/день или 150 мг/м/день.
В определенных вариантах реализации изобретения по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство является антагонистом альдостеронового рецептора. В определенных вариантах реализации изобретения антагонистом альдостеронового рецептора является спиронолактон. В определенных вариантах реализации изобретения спиронолактон вводится в дозе от 10 до 35 мг в день. В определенных вариантах реализации изобретения спиронолактон вводится в дозе 25 мг в день.
В определенных вариантах реализации изобретения ингибитор киназы выбран из бозутиниба и KD019.
В определенных вариантах реализации изобретения ингибитор mTOR выбран из эверолимуса, рапамицина и сиролимуса.
В определенных вариантах реализации изобретения аналог гормона выбран из соматостатина и адренокортикотропного гормона.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида является, по меньшей мере, на 90% комплементарной, по меньшей мере, на 95% комплементарной или на 100% комплементарной последовательности нуклеиновых оснований miR-17 (SEQ ID NO:1).
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-GCACTTTG-3' (SEQ ID NO:3), при этом каждый T в последовательности нуклеиновых оснований независимо выбран из T и U.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8-25, 8-12, 12-25, 15-25 или 17-23 связанных нуклеозидов. В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11 или 12 связанных нуклеозидов. В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 связанных нуклеозидов. В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 связанных нуклеозидов. В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 связанных нуклеозидов.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, один модифицированный нуклеозид. Модифицированный нуклеозид может быть выбран из нуклеозида S-cEt, 2'-O-метоксиэтил-нуклеозида и нуклеозида ЗНК. Модифицированный олигонуклеотид может содержать, по меньшей мере, одну модифицированную межнуклеозидную связь. Каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида может быть модифицированной межнуклеозидной связью. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, субъекту вводят терапевтически эффективное количество соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17.
В данном документе представлено применение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-25 связанных нуклеозидов, причем последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-17, для лечения поликистозной болезни почек.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1A-В. (A) Геномная организация miR-17~92 и ее паралогичных кластеров miR-106a~363 и miR-106b~25; (B) miR-17, miR-18, miR-19 и miR-92 семейства микроРНК.
Фигура 2A-В. Лечение мышей Pcy с помощью анти-miR-17 приводит к (А) уменьшению соотношения веса почки к массе тела и (B) кистозного индекса.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится изобретение. При отсутствии конкретных определений, номенклатура, используемая в связи с данными определениями, а также в связи с приемами и методиками аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описанная в данном документе, является общеизвестной и общепринятой в данной области техники. В случае наличия множества определений для терминов в данном документе, то имеют преимущество те, которые упоминаются в данном разделе. Стандартные методы могут использоваться для химического синтеза, химического анализа, фармацевтической подготовки, разработки и доставки, а также лечения субъектов. Определенные такие методики и приемы могут быть представлены, например, в публикациях "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" под редакцией Sangvi и Cook, American Chemical Society, Washington D. C., 1994 год; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания,18-е издание, 1990 год; и которая включена в данную заявку посредством ссылки для любых целей. В тех случаях, когда это допустимо, все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности GENBANK, веб-сайты и другие опубликованные материалы, упоминаемые в тексте описания данного документа, если не указано иное, включены в качестве ссылки в полном объеме. Если делается ссылка на URL-адрес или другой такой идентификатор или адрес, следует понимать, что такие идентификаторы могут изменяться и конкретная информация в интернете может измениться, но эквивалентную информацию можно найти с помощью функции поиска в интернете. Ссылка на них свидетельствует о доступности и открытом распространении такой информации.
Прежде чем данные композиции и способы будут раскрыты и описаны, следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, приведена исключительно с целью описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что в контексте описания настоящего изобретения и прилагаемой формулы настоящего изобретения существительные в единственном числе включают существительные во множественном числе, если контекст явно не указывает на иное.
Определения
"Поликистозная болезнь почек" или "ПБП" является наследственной формой заболевания почек, в которой множественные кисты образуются, по меньшей мере, в одной почке, что приводит к увеличению пораженной почки(почек) и прогрессирующей потере функции почек.
PKD1
PKD2
PKD1
PKD2
"Аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек" или "АДПБП", как правило, вызвана одной или более мутациями в гене  и/или . 85% АДПБП вызвано мутациями в , который расположен на хромосоме 16, а большинство остальных случаев АДПБП вызвано мутациями в , который расположен на хромосоме 4.
PKHD1
"Аутосомно-рецессивная поликистозная болезнь почек" или "АРПБП" обычно вызвана одной или более генетическими мутациями в гене , который расположен на хромосоме 6. До 50% новорожденных с АРПБП умирают от осложнений внутриутробного заболевания почек, а у около трети выживших развивается терминальная стадия почечной недостаточности (ТСПН) в течение 10 лет.
"Общий объем почек" или "ООП" является измерением общего объема почек, который может быть определен методом магнитно-резонансной томографии (МРТ), компьютерной томографии (КТ) или ультразвуковой (УЗ) визуализации, а также объем, рассчитанный по стандартной методике, например, формуле объема эллипсоида (для ультразвука) или с помощью количественной стереологии или прослеживания границ (для КТ/МРТ). ООП обычно неуклонно увеличивается у пациентов с АДПБП, причем увеличение коррелирует со снижением функции почек.
"Общий объем почек с поправкой на рост " или "HtTKV" (Height-adjusted total kidney volume) является мерой общего объема почки на единицу роста. У пациентов со значением HtTKV ≥ 600 мл/м прогнозируется развитие хронической почечной недостаточности 3 стадии в течении 8 лет.
"Боль в почках" означает клинически значимую боль в почках, требующую отпуска по болезни, фармакологического лечения (наркотическими средствами или болеутоляющими средствами последней надежды) или инвазивного вмешательства.
"Прогрессирование гипертонии" означает изменение артериального давления, которое требует усиления гипертонического лечения.
"Фиброз" означает образование или развитие избыточной волокнистой соединительной ткани в органах или тканях. В определенных вариантах реализации изобретения фиброз возникает как восстановительный или реактивный процесс. В определенных вариантах реализации изобретения фиброз возникает в ответ на повреждение или травму. Термин "фиброз" следует понимать, как образование или развитие избыточной волокнистой соединительной ткани в органе или ткани как восстановительный или реактивный процесс, в отличие от образования волокнистой ткани в качестве нормальной составляющей органа или ткани
"Гематурия" означает наличие красных кровяных клеток в моче.
"Альбуминурия" означает наличие избытка альбумина в моче и включает в себя, без ограничений, нормальную альбуминурию, высокую-нормальную альбуминурию, микроальбуминурию и макроальбуминурию. Обычно барьер проницаемости клубочковой фильтрации, который состоит из подоцитов, клубочковой базальной мембраны и эндотелиальных клеток, предотвращает утечку сывороточного белка в мочу. Альбуминурия может отражать повреждение барьера проницаемости клубочковой фильтрации. Альбуминурия может быть рассчитана по 24-часовому образцу мочи, пробе мочи в течение ночи или образцу разовой порции мочи.
"Высокая-нормальная альбуминурия" означает повышенную альбуминурию, характеризующуюся (i) экскрецией от 15 до < 30 мг альбумина в моче за 24 часа и/или (ii) соотношением альбумин/креатинин от 1,25 до < 2,5 мг/ммоль (или от 10 до < 20 мг/г) у мужчин или от 1,75 до < 3,5 мг/ммоль (или от 15 до < 30 мг/г) у женщин.
"Микроальбуминурия" означает повышенную альбуминурию, характеризующуюся (i) экскрецией от 30 до 300 мг альбумина в моче за 24 часа и/или (ii) соотношением альбумин/креатинин от 2,5 до < 25 мг/ммоль (или от 20 до < 200 мг/г) у мужчин или от 3,5 до < 35 мг/ммоль (или от 30 до < 300 мг/г) у женщин.
"Макроальбуминурия" означает повышенную альбуминурию, характеризующуюся экскрецией более чем 300 мг альбумина в моче за 24 часа и/или (ii) соотношением альбумин/креатинин > 25 мг/ммоль (или > 200 мг/г) у мужчин или > 35 мг/ммоль (или > 300 мг/г) у женщин.
"Соотношение альбумин/креатинин" означает отношение альбумина мочи (мг/дл) к креатинину мочи (г/дл) и выражается в мг/г. В определенных вариантах реализации изобретения соотношение альбумин/креатинин может быть рассчитано по образцу разовой порции мочи и может быть использовано в качестве оценки экскреции альбумина в течение 24-часового периода.
2
2
2
"Расчетная скорость клубочковой фильтрации (рСКФ)" или "скорость клубочковой фильтрации (СКФ)" означает измерение того, насколько хорошо почки фильтруют креатинин, и используется в качестве оценки того, сколько крови проходит через клубочки в минуту. Нормальные результаты могут варьироваться от 90-120 мл/мин/1,73 м. Уровни ниже 60 мл/мин/1,73 м в течение 3 или более месяцев могут являться индикатором хронической почечной недостаточности. Уровни ниже 15 мл/мин/1,73 м могут являться индикатором почечной недостаточности.
"Протеинурия" означает наличие избытка сывороточных белков в моче. Протеинурия может быть охарактеризована экскрецией > 250 мг белка в моче в течение 24 часов и/или соотношением белка к креатинину в моче ≥ 0,20 мг/мг. Сывороточные белки, повышенные в сочетании с протеинурией, включают в себя, без ограничений, альбумин.
"Азот мочевины крови" или "АМК" означает меру количества азота в крови в виде мочевины. Печень продуцирует мочевину в цикле мочевины как отработанный продукт расщепления белка, и мочевина удаляется из крови почками. Нормальная кровь взрослого человека может содержать от 7 до 21 мг азота мочевины на 100 мл (7-21 мг/дл) крови. Измерение азота мочевины крови используется в качестве показателя здоровья почек. Если почки не в состоянии удалить мочевину из крови нормальным путем, АМК субъекта поднимается.
"Терминальная стадия почечной недостаточности (ТСПН)" означает полное или почти полное нарушение функции почек.
"Нарушение функции почек" означает снижение функции почек по сравнению с нормальной функцией почек.
"Замедление прогрессирования" и "медленное прогрессирование" означают снижение скорости, с которой патологическое состояние переходит в прогрессивное состояние.
"Отсрочка времени до диализа" означает поддержание достаточной функции почек, вследствие чего потребность в лечении диализом отсрочивается.
"Отсрочка времени пересадки почки" означает поддержание достаточной функции почек, вследствие чего потребность в пересадке почки отсрочивается.
"Улучшение ожидаемой продолжительности жизни" означает увеличение продолжительности жизни субъекта путем лечения одного или более симптомов заболевания у субъекта.
"Субъект" означает человека или нечеловекоподобное животное выбранное для лечения или терапии.
"Субъект, имеющий в этом необходимость" означает субъект, который идентифицируется как нуждающийся в терапии или лечении.
"Субъект, подозреваемый в наличии" означает субъект, демонстрирующий один или более клинических показателей заболевания.
"Введение" означает предоставление фармацевтического вещества или композиции субъекту и включает в себя, но без ограничений, введение препарата медицинским специалистом и самостоятельное введение.
"Парентеральное введение" означает введение посредством инъекции или инфузии.
Парентеральное введение включает в себя, но не ограничивается этим, подкожное введение, внутривенное введение и внутримышечное введение.
"Подкожное введение" означает введение непосредственно под кожу.
"Внутривенное введение" означает введение в вену.
"Сопутствующее введение" обозначает совместное введение двух или более средств в любой форме, в которой фармакологические эффекты обоих проявляются в организме пациента в одно и то же время. При сопутствующем введении нет необходимости, чтобы оба в вещества были введены в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним и тем же способом введения. Эффекты обоих веществ не обязательно должны проявляться одновременно. Эффекты должны только перекрываться в промежутке времени и не обязательно должны иметь одинаковую продолжительность.
"Продолжительность" означает период времени, в течение которого действие или явление продолжается. В определенных вариантах реализации изобретения продолжительность лечения являет собой период времени, в течение которого вводят дозы фармацевтического вещества или фармацевтической композиции.
"Терапия" означает способ лечения заболевания. В определенных вариантах реализации изобретения терапия включает в себя, но не ограничивается ими, введение одного или более фармацевтических веществ субъекту, имеющему заболевание.
"Лечить" означает применение одной или более конкретных процедур, используемых для лечения болезни или облегчения по меньшей мере одного показателя заболевания. В определенных вариантах реализации изобретения конкретная процедура является введением одного или более фармацевтических веществ. В определенных вариантах реализации изобретения лечение ПБП включает в себя, но не ограничивается ими, уменьшение общего объема почек, улучшение функции почек, снижение гипертонии и/или уменьшение боли в почках.
"Облегчать" означает уменьшить тяжесть по меньшей мере одного показателя патологического состояния или заболевания. В определенных вариантах реализации изобретения облегчение включает в себя отсрочку или замедление развития одного или более показателей патологического состояния или заболевания. Степень тяжести показателей может быть определена субъективными или объективными мерами, которые известны специалистам в данной области техники.
"Подверженный риску развития" означает состояние, в котором субъект предрасположен к развитию патологического состояния или заболевания. В определенных вариантах реализации изобретения субъект, подверженный риску развития патологического состояния или заболевания, проявляет один или более симптомов патологического состояния или заболевания, но не проявляет достаточного количества симптомов, чтобы был поставлен диагноз патологического состояния или заболевания. В определенных вариантах реализации изобретения субъект, подверженный риску развития патологического состояния или заболевания, проявляет один или более симптомов патологического состояния или заболевания, но в меньшей степени, чем требуемая для постановки диагноза патологического состояния или заболевания.
"Предотвращение возникновения" означает предотвращение развития патологического состояния или заболевания у субъекта, который подвержен риску развития заболевания или патологического состояния. В определенных вариантах реализации изобретения субъект, подверженный риску развития заболевания или патологического состояния, получает лечение, подобное лечению, полученному субъектом, который уже имеет заболевание или патологическое состояние.
"Отсрочка возникновения" означает отсрочить развитие патологического состояния или заболевания у субъекта, который подвержен риску развития болезни или патологического состояния. В определенных вариантах реализации изобретения субъект, подверженный риску развития заболевания или патологического состояния, получает лечение, подобное лечению, полученному субъектом, который уже имеет заболевание или патологическое состояние.
"Лекарственное средство" означает фармацевтическое вещество, используемое для лечения, облегчения или профилактики заболевания.
"Доза" означает определенное количество фармацевтического вещества, предоставленного при однократном введении. В определенных вариантах реализации изобретения доза может быть введена в виде двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в определенных вариантах реализации изобретения, где желательно подкожное введение, желаемая доза требует объем, который нелегко обеспечить однократной инъекцией. В таких вариантах реализации изобретения для достижения желаемой дозы могут быть использованы две или более инъекций. В определенных вариантах реализации изобретения доза может быть введена двумя или более инъекциями для минимизации реакции в месте инъекции у индивидуума. В определенных вариантах реализации изобретения доза вводится в виде медленной инфузии.
"Стандартная дозировка" означает форму, в которой предоставляется фармацевтическое вещество. В определенных вариантах реализации изобретения стандартная дозировка представляет собой флакон, содержащий лиофилизированный олигонуклеотид. В определенных вариантах реализации изобретения стандартная дозировка представляет собой флакон, содержащий ресуспендированный олигонуклеотид.
"Терапевтически эффективное количество" относится к количеству фармацевтического вещества, которое обеспечивает терапевтический эффект для животного.
"Фармацевтическая композиция" означает смесь веществ, пригодных для введения индивидууму, которая включает фармацевтическое вещество. Например, фармацевтическая композиция может содержать стерильный водный раствор.
"Фармацевтическое вещество" означает субстанцию, которая обеспечивает терапевтический эффект при введении субъекту.
"Активный фармацевтический ингредиент" означает субстанцию в фармацевтической композиции, которая обеспечивает желаемый эффект.
то есть
"Фармацевтически приемлемые соли" означают физиологически и фармацевтически приемлемые соли соединения, представленного в данном документе, , соль, которая сохраняет желаемую биологическую активность соединения и не имеет нежелательных токсикологических эффектов при введении субъекту. Неограничивающие типовые фармацевтически приемлемые соли соединений, представленных в данном документе, включают в себя формы натриевой и калиевой соли. Используемый в контексте данного документа термин "соединение" включает его фармацевтически приемлемые соли, если специально не указано иное.
"Улучшенная функция органа" означает изменение функции органа в нормальных пределах. В определенных вариантах реализации изобретения функцию органа оценивают путем измерения молекул, обнаруженных в крови или моче субъекта. Например, в определенных вариантах реализации изобретения, улучшение функции почек измеряется по уменьшению азота мочевины крови, снижению протеинурии, снижению альбуминурии и т. д.
"Приемлемый профиль безопасности" означает набор побочных эффектов, который находится в клинически приемлемых пределах.
"Побочный эффект" означает физиологическую реакцию, обусловленную лечением, отличную от желаемых эффектов. В определенных вариантах реализации изобретения побочные эффекты включают, без ограничения, реакции в месте инъекции, отклонения функциональных проб печени, отклонения в функции почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, нарушения центральной нервной системы и миопатии. Такие побочные эффекты могут быть выявлены прямо или косвенно. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени.
"Соблюдение режима терапии субъектом" означает строгое соблюдение субъектом рекомендуемой или предписанной терапии.
"Соблюдать" означает строгое соблюдение субъектом рекомендуемой терапии.
"Рекомендуемая терапия" означает лечение, рекомендованное медицинским специалистом для лечения, облегчения или профилактики заболевания.
Используемый в контексте данного документа термин "кровь" охватывает цельную кровь и фракции крови, такие как сыворотка и плазма.
"Анти-miR" означает олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную микроРНК. В определенных вариантах реализации изобретения анти-miR представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
"Анти-miR-X", в котором "miR-X" обозначает конкретную микроРНК, означает олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную miR-X. В определенных вариантах реализации изобретения анти-miR-X является полностью комплементарной (то есть,100% комплементарная) miR-X. В определенных вариантах реализации изобретения анти-miR-X является, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95%, комплементарной miR-X. В определенных вариантах реализации изобретения анти-miR-X представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
"miR-17" означает зрелую микроРНК с последовательностью нуклеиновых оснований CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG (SEQ ID NO:1).
"Последовательность шпильки miR-17" означает последовательность шпильки, имеющую последовательность нуклеиновых оснований GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGUGAUAUGUGCAUCUACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCAUUAUGGUGAC (SEQ ID NO:2).
"Затравочная последовательность 2-7 miR-17" означает последовательность нуклеиновых оснований из положений 2-7 SEQ ID NO:1, AAAGUG.
"Член семейства miR-17" означает зрелую микроРНК, имеющую последовательность нуклеиновых оснований, содержащую затравочную последовательность 2-7 miR-17.
"Семейство miR-17" означает группу микроРНК, каждая из которых имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую затравочную последовательность 2-7 miR-17.
"Целевая нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, для гибридизации с которой сконструировано олигомерное соединение.
"Нацеливание" означает процесс проектирования и выбора последовательности нуклеиновых оснований, которая будет гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой.
"Нацелен на" означает обладание последовательностью нуклеиновых оснований, которая позволит гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой.
"Модуляция" означает отклонение функции, количества или активности. В определенных вариантах реализации изобретения модуляция означает увеличение функции, количества или активности. В определенных вариантах реализации изобретения модуляция означает снижение функции, количества или активности.
"Экспрессия" означает любые функции и этапы, благодаря которым информация, закодированная в гене, преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке.
"Последовательность нуклеиновых оснований" означает порядок смежных нуклеиновых оснований в олигомерном соединении или нуклеиновой кислоте, обычно указанный в 5'-3'-ориентации, независимо от любого сахара, связи и/или модификации нуклеинового основания.
"Смежные нуклеиновые основания" означают нуклеиновые основания, непосредственно смежные друг с другом в нуклеиновой кислоте.
"Комплементарность нуклеиновых оснований" означает способность двух нуклеиновых оснований нековалентно спариваться посредством водородной связи.
"Комплементарный" означает, что одна нуклеиновая кислота способна гибридизоваться с другой нуклеиновой кислотой или олигонуклеотидом. В определенных вариантах реализации изобретения комплементарный относится к олигонуклеотиду, способному гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой.
"Полностью комплементарный" означает, что каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида способно спариваться с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в целевой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах реализации изобретения олигонуклеотид является полностью комплементарным микроРНК, то есть каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида является комплементарным нуклеиновому основанию в соответствующем положении в микроРНК. Модифицированный олигонуклеотид может быть полностью комплементарным микроРНК и содержать ряд связанных нуклеозидов, меньший, чем длина микроРНК. Например, олигонуклеотид с 16 связанными нуклеозидами, где каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида является комплементарным нуклеотидному основанию в соответствующем положении в микроРНК, является полностью комплементарным микроРНК. В определенных вариантах реализации изобретения олигонуклеотид, в котором каждое нуклеиновое основание обладает комплементарностью к нуклеиновому основанию в области последовательности шпильки микроРНК, является полностью комплементарным последовательности шпильки микроРНК.
"Процент комплементарности" означает процентное содержание нуклеиновых оснований олигонуклеотида, которые являются комплементарными участку равной длины целевой нуклеиновой кислоты. Процент комплементарности рассчитывают путем деления числа нуклеиновых оснований олигонуклеотида, которые являются комплементарными нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях целевой нуклеиновой кислоты, на общее число нуклеиновых оснований в олигонуклеотиде.
"Процент идентичности" означает число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте, которые являются идентичными нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях во второй нуклеиновой кислоте, деленное на общее число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой микроРНК, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой микроРНК. В определенных вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.
"Гибридизировать" означает отжиг комплементарных нуклеиновых кислот, который происходит за счет комплементарности нуклеиновых оснований.
"Неправильно спаренный" означает нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты, которое не способно к уотсон-криковскому спариванию с нуклеиновым основанием в соответствующем положении второй нуклеиновой кислоты.
"Идентичный" в контексте последовательностей нуклеиновых оснований означает наличие тождественной последовательности нуклеиновых оснований, независимо от сахара, связи и/или модификаций нуклеинового основания и независимо от метильного состояния любых присутствующих пиримидинов.
"МикроРНК" означает эндогенную некодирующую РНК длиной между 18 и 25 нуклеиновых оснований, которая является продуктом расщепления пре-микроРНК ферментом Dicer. Примеры зрелых микроРНК находятся в базе данных микроРНК, известной как miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/). В определенных вариантах реализации изобретения микроРНК сокращается как "микроРНК" или "miR".
"Пре-микроРНК" или "пре-miR" означает некодирующую РНК, имеющую структуру шпильки, которая является продуктом расщепления pri-miR с помощью рибонуклеазы, известной как Drosha, специфически распознающей двухцепочечную РНК.
"Последовательность шпильки" означает РНК, имеющую структуру шпильки и содержащую зрелую последовательность микроРНК. Последовательности пре-микроРНК и последовательности шпилек могут перекрываться. Примеры последовательностей шпилек находятся в базе данных микроРНК, известной как miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/).
"Pri-микроРНК" или "pri-miR" означает некодирующую РНК, имеющую шпилькообразную структуру, которая является субстратом для рибонуклеазы Drosha, специфически распознающей двухцепочечную РНК.
"Предшественник микроРНК" означает транскрипт, который происходит из геномной ДНК и который содержит некодирующую структурированную РНК, содержащую одну или более последовательностей микроРНК. Например, в определенных вариантах реализации изобретения предшественником микроРНК является пре-микроРНК. В определенных вариантах реализации изобретения предшественником микроРНК является pri-микроРНК.
"Транскрипт, регулируемый микроРНК" означает транскрипт, который регулируется микроРНК.
"Затравочная последовательность" означает последовательность нуклеиновых оснований, содержащую от 6 до 8 смежных нуклеиновых оснований из нуклеиновых оснований c 1 по 9 с 5'-конца зрелой последовательности микроРНК.
"Последовательность, подходящая для спаривания с затравочной последовательностью" означает последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной затравочной последовательности и имеет такую же длину, что и затравочная последовательность.
"Олигомерное соединение" означает соединение, которое содержит множество связанных мономерных субъединиц. Олигомерные соединения включают олигонуклеотиды.
"Олигонуклеотид" означает соединение, содержащее множество связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным, независимо друг от друга.
"Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь" означает 3′-5′ фосфодиэфирную связь между нуклеозидами.
"Природный сахар" означает сахар, находящийся в ДНК (2′-Н) или РНК (2′-ОН).
"Межнуклеозидная связь" означает ковалентную связь между соседними нуклеозидами.
"Связанные нуклеозиды" означает нуклеозиды, соединенные ковалентной связью.
"Нуклеиновое основание" означает гетероциклический компонент, способный нековалентно спариваться с другим нуклеиновым основанием.
"Нуклеозид" означает нуклеиновое основание, связанное с сахарным компонентом.
"Нуклеотид" означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
то есть
"Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из" ряда связанных нуклеозидов, означает соединение, которое включает в себя модифицированный олигонуклеотид, имеющий указанное количество связанных нуклеозидов. Таким образом, соединение может включать в себя дополнительные заместители или конъюгаты. Если не указано иное, соединение не включает никаких дополнительных нуклеозидов, помимо тех, которые содержатся в модифицированном олигонуклеотиде. Например, если не указано иное, соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, не включает в себя комплементарную цепь, гибридизованную с модифицированным олигонуклеотидом, (, модифицированный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид).
"Модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, имеющий одну или более модификаций, относящихся к встречающимся в природе терминальной части, сахару, нуклеиновому основанию и/или межнуклеозидной связи. Модифицированный олигонуклеотид может содержать немодифицированные нуклеозиды.
"Одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид" означает модифицированный олигонуклеотид, который не гибридизируется с комплементарной цепью.
"Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий любое изменение нуклеозида естественного происхождения. Модифицированный нуклеозид может содержать модифицированный сахар и немодифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может содержать модифицированный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может содержать естественный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный нуклеозид представляет собой бициклический нуклеозид. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный нуклеозид представляет собой не бициклический нуклеозид.
"Модифицированная межнуклеозидная связь" означает любое изменение межнуклеозидной связи естественного происхождения.
"Тиофосфатная межнуклеозидная связь" означает связь между нуклеозидами, в которой один из немостиковых атомов представляет собой атом серы.
"Модифицированный сахарный компонент" означает замещение и/или любое изменение природного сахара.
"Немодифицированное нуклеиновое основание" означает встречающееся в природе гетероциклические основания РНК или ДНК:пуриновые основания аденин (A) и гуанин (Г) и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (Ц) (включая 5-метилцитозин) и урацил (У).
"5-метилцитозин" означает цитозин, содержащий метильную группу, прикрепленную в 5 положении.
"Неметилированный цитозин" означает цитозин, который не содержит метильную группу, прикрепленную в 5 положении.
"Модифицированное нуклеиновое основание" означает любое нуклеиновое основание, которое не является немодифицированным нуклеиновым основанием.
"Сахарный компонент" означает встречающийся в природе фуранозил или модифицированный сахарный компонент.
"Модифицированный сахарный компонент" означает замещенный сахарный компонент или заменитель сахара.
"2'-O-метил сахара" или "2'-OMe сахара" означает сахар, содержащий O-метильную модификацию в 2' положении.
"2'-O-метоксиэтил сахара" или "2'-MOE сахара" означает сахар, содержащий O-метоксиэтильную модификацию в 2' положении.
"2'-фтор" или "2'-F" означает сахар, имеющий модификацию со фтором в 2' положении.
"Бициклический сахарный компонент" означает модифицированный сахарный компонент, содержащий 4-7-членное кольцо (включая, но не ограничиваясь им, фуранозил), содержащее мостик, связывающий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что приводит к получению бициклической структуры. В определенных вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой кольцо сахара. В определенных вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В определенных вариантах реализации изобретения мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила. Неограничивающие типовые бициклические сахарные компоненты включают в себя ЗНК, ЭНК, cEt, S-cEt и R-cEt.
2
"Сахарный компонент закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК)" означает замещенный сахарный компонент, содержащий (CH)-O мостик между 4' и 2' атомами фуранозного кольца.
2
2
"Сахарный компонент ЭНК" означает замещенный сахарный компонент, содержащий (CH)-O мостик между 4' и 2' атомами фуранозного кольца.
3
3
2
2
"Сахарный компонент, содержащий пространственно затрудненный этил (cEt)" означает замещенный сахарный компонент, содержащий CH(CH)-O мостик между 4' и 2' атомами фуранозного кольца. В определенных вариантах реализации изобретения CH(CH)-O мостик пространственно затруднен в S ориентации. В определенных вариантах реализации изобретения (CH)-O пространственно затруднен в R ориентации.
3
"Сахарный компонент S-cEt" означает замещенный сахарный компонент, содержащий S-пространственно затрудненный мостик CH(CH)-O между 4' и 2' атомами фуранозного кольца.
3
"Сахарный компонент R-cEt" означает замещенный сахарный компонент, содержащий R-пространственно затрудненный мостик CH(CH)-O между 4' и 2' атомами фуранозного кольца.
"2'-O-метил нуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-O-метильную модификацию сахара.
"2'-O-метоксиэтил нуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-O-метоксиэтильную модификацию сахара. 2'-O-метоксиэтил нуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"2'-фтор нуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-фтор модификацию сахара. 2'-фтор нуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"Бициклический нуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий бициклический сахарный компонент. Бициклический нуклеозид может иметь модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"Нуклеозид cEt" означает нуклеозид, содержащий сахарный компонент cEt. Нуклеозид cEt может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"Нуклеозид S-cEt" означает нуклеозид, содержащий сахарный компонент S-cEt.
"Нуклеозид R-cEt" означает нуклеозид, содержащий сахарный компонент R-cEt.
"β-D-дезоксирибонуклеозид" означает встречающийся в природе нуклеозид ДНК.
"β-D-рибонуклеозид" означает встречающийся в природе нуклеозид РНК.
"Нуклеозид ЗНК" означает нуклеозид, содержащий компонент сахара ЗНК.
"Нуклеозид ЭНК" означает нуклеозид, содержащий компонент сахара ЭНК.
Обзор
Поликистозная болезнь почек (ПБП)представляет собой наследственную форму заболевания почек, при которой в почках развиваются кисты, заполненные жидкостью, что приводит к увеличению почек, почечной недостаточности и, часто, терминальной стадии почечной недостаточности. Чрезмерная пролиферация кист является отличительным патологическим признаком ПБП. В тактике лечения ПБП основной целью лечения является поддержание функции почек и предотвращение возникновения терминальной стадии почечной недостаточности (ТСПН), что, в свою очередь, улучшает ожидаемую продолжительность жизни пациентов с ПБП.
и соавт
PNAS
Множество членов кластера микроРНК miR-17~92 являются повышенными в мышиных моделях ПБП. Генетическая делеция кластера miR-17~92 в мышиной модели ПБП уменьшает рост кист в почках, улучшает функцию почек и продлевает выживаемость (Patel .,, 2013; 110(26):10765-10770). Кластер miR-17~92 содержит 6 различных микроРНК, каждая из которых имеет различные последовательности: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19-b-1 и miR-92a-1. Таким образом, генетическая делеция всего кластера удаляет шесть различных генов микроРНК. Данный эксперимент с генетической делецией не позволяет узнать, приведет ли ингибирование набора микроРНК в этом кластере к таким же улучшениям клинических показателей ПБП.
В данном документе показано, что модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-17, улучшает функцию почек и уменьшает массу почек в экспериментальной модели ПБП. Дополнительно, ингибирование miR-17 также подавляло пролиферацию и рост кист первичных культур, полученных из кист доноров. Эти данные показывают, что модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на miR-17, являются пригодными для лечения ПБП.
Определенные виды применения данного изобретения
В данном документе приведены способы лечения поликистозной болезни почек (ПБП), включающие в себя введение субъекту, имеющему или подозреваемому в наличии ПБП, соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17.
PKD1
PKD2
PKHD1
В определенных вариантах реализации изобретения субъект был диагностирован как имеющий ПБП до введения соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид. Диагностика ПБП может быть осуществлена путем оценки параметров, включающих, без ограничений, семейный анамнез субъекта, клинические особенности (включая, без ограничения, гипертонию, альбуминурию, гематурию и нарушенную СКФ), а также визуализирующие методы исследования почек (включая, без ограничений, МРТ, ультразвук и сканирование КТ). Диагностика ПБП может также включать в себя скрининг на мутации в одном или более из генов , , или .
PKD1
PKD2
Субъект, имеющий или подозреваемый в наличии АДПБП, может иметь мутацию в гене  или мутацию в гене . Субъект, имеющий или подозреваемый в наличии АРПБП, может иметь мутацию в гене PKHD1.
В определенных вариантах реализации изобретения субъект имеет увеличенный общий объем почек. В определенных вариантах реализации изобретения общий объем почек является общим объемом почек с поправкой на рост (HtTKV). В определенных вариантах реализации изобретения субъект имеет гипертонию. В определенных вариантах реализации изобретения у субъекта нарушена функция почек. В определенных вариантах реализации изобретения субъект нуждается в улучшении функции почек. В определенных вариантах реализации изобретения субъект идентифицирован как имеющий нарушения функции почек.
В определенных вариантах реализации изобретения уровни miR-17 являются повышенными в почках у субъекта, имеющего ПБП. В определенных вариантах реализации изобретения, перед введением, субъект определяется, как имеющий повышенный уровень miR-17 в почках. Уровни miR-17 могут быть измерены из материала биопсии почек. В определенных вариантах реализации изобретения, перед введением, субъект определяется, как имеющий повышенный уровень miR-17 в моче и крови субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17, приводит к одному или более клинически благоприятным результатам. В определенных вариантах реализации изобретения введение улучшает функцию почек у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение задерживает ухудшение функции почек у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает общий объем почек у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет увеличение общего объема почек у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение снижает общий объем почек с поправкой на рост (HtTKV). В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет увеличение HtTKV.
В определенных вариантах реализации изобретения введение ингибирует рост кисты у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет увеличение роста кисты у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения киста присутствует в почке субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения киста присутствует как в печени, так и в почках субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает боль в почках у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет усиление боли в почках у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение отсрочивает возникновение боли в почках у субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает гипертонию у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет прогрессирование гипертонии у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение отсрочивает возникновение гипертонии у субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает фиброз в почках субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет образование фиброза в почках субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения введение отсрочивает возникновение терминальной стадии почечной недостаточности у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение продлевает время до начала диализа для субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение продлевает время до пересадки почки для субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение продлевает ожидаемую продолжительность жизни субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает альбуминурию у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет прогрессирование альбуминурии у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение отсрочивает возникновение альбуминурии у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает гематурию у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет прогрессирование гематурии у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение отсрочивает возникновение гематурии у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение снижает уровень азота мочевины в крови субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает уровень креатинина в крови субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение улучшает клиренс креатинина у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение снижает соотношение альбумин:креатинин у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение улучшает скорость клубочковой фильтрации у субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение замедляет снижение скорости клубочковой фильтрации у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения снижение скорости клубочковой фильтрации оценивается путем расчета скорости снижения скорости клубочковой фильтрации. В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает уровень белка липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), в моче субъекта. В определенных вариантах реализации изобретения введение уменьшает уровень белка молекулы повреждения почек-1 (KIM-1) в моче субъекта.
В любом из вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе, субъект может быть подвергнут определенным тестам для оценки степени заболевания у субъекта. Такие тесты включают в себя, без ограничения, измерение общего объема почек у субъекта; измерение гипертонии у субъекта; измерение боли в почках у субъекта; измерение фиброза в почках субъекта; измерение азота мочевины крови у субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение клиренса креатинина в крови субъекта; измерение альбуминурии у субъекта; измерение соотношения альбумин:креатинин у субъекта; измерение скорости клубочковой фильтрации у субъекта; измерение уровня белка липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL) в моче субъекта; и/или измерение уровня белка молекулы повреждения почек-1 (KIM-1) в моче субъекта.
Определенные дополнительные терапии
Лечения при поликистозной болезни почек или любом из перечисленных в данном документе патологических состояний могут включать более чем одну терапию. Таким образом, в определенных вариантах реализации изобретения, представленных в данном документе, представлены способы лечения субъекта, имеющего поликистозную болезнь почек или подозреваемого в ее наличии, включающие введение, по меньшей мере, одного терапевтического средства в дополнение к введению соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную miR-17.
В определенных вариантах реализации изобретения, по меньшей мере, одно дополнительное терапевтическое средство включает фармацевтическое вещество.
В определенных вариантах реализации изобретения, по меньшей мере, одно дополнительное терапевтическое средство является антигипертензивным средством. Антигипертензивные средства используются для контроля артериального давления субъекта.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическое вещество представляет собой антагонист рецептора вазопрессина 2. В определенных вариантах реализации изобретения антагонистом рецептора вазопрессина 2 является толваптан.
2
2
2
2
2
2
2
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические вещества включают в себя блокаторы рецепторов ангиотензина II (БРА). В определенных вариантах реализации изобретения блокатором рецепторов ангиотензина II является кандесартан, ирбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмисартан или эпросартан. В определенных вариантах реализации изобретения БРА вводится в дозе от 6,25 до 150 мг/м2/день. В любом из этих вариантов реализации изобретения БРА вводится в дозе 6,25 мг/м/день, 10 мг/м/день, 12,5 мг/м/день, 18,75 мг/м/день, 37,5 мг/м/день, 50 мг/м/день или 150 мг/м/день.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические вещества включают в себя ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). В определенных вариантах реализации изобретения ингибитором АПФ является каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фозиноприл или рамиприл. В определенных вариантах реализации изобретения ингибитор АПФ вводится в дозе от 0,5 до 1 мг/м2/день, от 1 до 6 мг/м2/день, от 1 до 2 мг/м2/день, от 2 до 4 мг/м2/день или от 4 до 8 мг/м2/день.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическими веществом является диуретик. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является блокатор кальциевых каналов.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является ингибитор киназы. В определенных вариантах реализации изобретения ингибитором киназы является бозутиниб или KD019.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является антагонист адренергического рецептора.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является антагонист альдостеронового рецептора. В определенных вариантах реализации изобретения антагонистом альдостеронового рецептора является спиронолактон. В определенных вариантах реализации изобретения спиронолактон вводится в дозе от 10 до 35 мг в день. В определенных вариантах реализации изобретения спиронолактон вводится в дозе 25 мг в день.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является ингибитор мишени рапамицина млекопитающих (mTOR). В определенных вариантах реализации изобретения ингибитором mTOR является эверолимус, рапамицин или сиролимус.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является аналог гормона. В определенных вариантах реализации изобретения вариантом гормона является соматостатин или адренокортикотропный гормон.
В определенных вариантах реализации изобретения дополнительным терапевтическим средством является противофиброзное средство. В определенных вариантах реализации изобретения противофиброзное средство представляют собой модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-21.
В определенных вариантах реализации изобретения дополнительным терапевтическим средством является диализ. В определенных вариантах реализации изобретения дополнительным терапевтическим средством является пересадка почки.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические вещества включают в себя противовоспалительные средства. В определенных вариантах реализации изобретения противовоспалительным средством является стероидное противовоспалительное средство. В определенных вариантах реализации изобретения стероидным противовоспалительным средством является кортикостероид. В определенных вариантах реализации изобретения кортикостероидом является преднизон. В определенных вариантах реализации изобретения противовоспалительным средством является нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. В определенных вариантах реализации изобретения нестероидным противовоспалительным препаратом является ибупрофен, ингибитор ЦОГ-1 или ингибитор ЦОГ-2.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическое вещество представляет собой фармацевтическое вещество, которое блокирует один или более ответов на фиброгенные сигналы.
В определенных вариантах реализации изобретения дополнительным терапевтическим средством может быть фармацевтическое вещество, которое усиливает иммунную систему организма, включая низкодозированный циклофосфамид, тимостимулин, витамины и пищевые добавки (например, антиоксиданты, включая витамины А, С, Е, бета-каротин, цинк, селен, глутатион, коэнзим Q-10 и эхинацею) и вакцины, например, иммуностимулирующий комплекс (ИСКОМ), который содержит вакцинный состав, совмещающий мультимерную презентацию антигена и адъюванта.
В определенных вариантах реализации изобретения дополнительная терапия выбирается для лечения или облегчения побочного действия одной или более фармацевтических композиций данного изобретения. Такие побочные эффекты включают, без ограничения, реакции в месте инъекции, отклонения функциональных проб печени, отклонения в функции почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, нарушения центральной нервной системы и миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени.
Определенные последовательности нуклеиновых оснований микроРНК
Модифицированные олигонуклеотиды, описанные в данном документе, имеют последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной miR-17 (SEQ ID NO:1), или ее предшественнику (SEQ ID NO:2). В определенных вариантах реализации изобретения каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида способно осуществлять спаривание оснований с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в последовательности нуклеиновых оснований miR-17 или ее предшественника. В определенных вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида может иметь одну или более неправильно спаренных пар оснований по отношению к последовательности нуклеиновых оснований miR-17 или последовательности предшественника, и остается способной к гибридизации с ее целевой последовательностью.
Поскольку последовательность miR-17 содержится внутри последовательности предшественника miR-17, модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную miR-17, также комплементарен области предшественника miR-17.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из ряда связанных нуклеозидов, который равен длине miR-17.
В определенных вариантах реализации изобретения количество связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида является меньшим, чем длина miR-17. Модифицированный олигонуклеотид, имеющий ряд связанных нуклеозидов, меньший, чем длина miR-17, в котором каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида является комплементарным каждому нуклеиновому основанию в соответствующем положении miR-17, считается модифицированным олигонуклеотидом, имеющим последовательность нуклеиновых оснований, полностью комплементарную области последовательности miR-17. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 19 связанных нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание комплементарно соответствующему положению в miR-17, которая в длину состоит из 22 нуклеиновых оснований, является полностью комплементарным области miR-17 длиной в 19 нуклеиновых оснований. Такой модифицированный олигонуклеотид имеет 100% комплементарность (или является полностью комплементарным) сегменту miR-17 длиной в 19 нуклеиновых оснований и считается 100% комплементарным (или полностью комплементарным) miR-17.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной затравочной последовательности, то есть модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность, спаривающуюся с затравочной последовательностью. В определенных вариантах реализации изобретения затравочная последовательность является гексамерной затравочной последовательностью. В определенных таких вариантах реализации изобретения затравочная последовательность представляет собой 1-6 нуклеиновые основания miR-17. В определенных таких вариантах реализации изобретения затравочная последовательность представляет собой 2-7 нуклеиновые основания miR-17. В определенных таких вариантах реализации изобретения затравочная последовательность представляет собой 3-8 нуклеиновые основания miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения затравочная последовательность является гептамерной затравочной последовательностью. В определенных таких вариантах реализации изобретения гептамерная затравочная последовательность представляет собой 1-7 нуклеиновые основания miR-17. В определенных таких вариантах реализации изобретения гептамерная затравочная последовательность представляет собой 2-8 нуклеиновые основания miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения затравочная последовательность является октамерной затравочной последовательностью. В определенных таких вариантах реализации изобретения октамерная затравочная последовательность представляет собой 1-8 нуклеиновых оснований miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения октамерная затравочная последовательность представляет собой 2-9 нуклеиновых оснований miR-17.
miR-17 является членом семейства микроРНК, известных как семейство miR-17. Семейство miR-17 включает в себя miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a и miR-106b. Каждый член семейства miR-17 имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований 5'-AAAGUG-3, или затравочную область miR-17, которая является последовательностью нуклеиновых оснований в положениях с 2 по 7 в SEQ ID NO:1. Кроме того, все члены семейства miR-17 имеют определенную идентичность между собой в последовательности нуклеиновых оснований за пределами затравочной области. Следовательно, модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17, может быть нацелен на микроРНК семейства miR-17, в дополнение к miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид нацелен на две или более микроРНК семейства miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид нацелен на три или более микроРНК семейства miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид нацелен на четыре или более микроРНК семейства miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид нацелен на пять или более микроРНК семейства miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид нацелен на шесть микроРНК семейства miR-17.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-GCACTTTG-3' (SEQ ID NO:3). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-AGCACTTT-3' (SEQ ID NO:4). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-AGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:5). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-AAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:6). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-TAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:7). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-GTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:8). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-TGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:9). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-CTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:10). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-ACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:11). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-CACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:12). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-GCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:13). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-TGCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:14). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-CTGCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:15). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-CCTGCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:16). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-ACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:17). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-CACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:18). В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований 5'-CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3' (SEQ ID NO:19). В любом из этих вариантов реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из последовательности нуклеиновых оснований, выбранной из любой из SEQ ID No 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 и 18. В каждой последовательности нуклеиновых оснований T является независимо выбранным из T и U.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, имеющую одно неправильное спаривание по отношению к последовательности нуклеиновых оснований miR-17 или ее предшественника. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, имеющую два неправильных спаривания по отношению к последовательности нуклеиновых оснований miR-17 или ее предшественника. В определенных таких вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, имеющую не более двух неправильных спариваний по отношению к последовательности нуклеиновых оснований miR-17 или ее предшественника. В определенных таких вариантах реализации изобретения неправильно спаренные нуклеиновые основания являются смежными. В определенных таких вариантах реализации изобретения неправильно спаренные нуклеиновые основания не являются смежными.
В определенных вариантах реализации изобретения количество связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида является большим, чем длина miR-17. В определенных таких вариантах реализации изобретения нуклеиновое основание дополнительного нуклеозида является комплементарным нуклеиновому основанию последовательности шпильки miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения количество связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида является на единицу большим, чем длина miR-17. В определенных таких вариантах реализации изобретения дополнительный нуклеозид находится на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных таких вариантах реализации изобретения дополнительный нуклеозид находится на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах реализации изобретения количество связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида является большим на два, чем длина miR-17. В определенных таких вариантах реализации изобретения два дополнительных нуклеозида находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных таких вариантах реализации изобретения два дополнительных нуклеозида находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных таких вариантах реализации изобретения один дополнительный нуклеозид расположен на 5'-конце и один дополнительный нуклеозид расположен на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах реализации изобретения область олигонуклеотида может быть полностью комплементарной последовательности нуклеиновых оснований miR-17, но целый модифицированный олигонуклеотид не является полностью комплементарным miR-17. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 24 связанных нуклеозидов, где нуклеиновые основания нуклеозидов с 1 по 22 каждое является комплементарным соответствующему положению в miR-17, которая в длину состоит из 22 нуклеиновых оснований, имеет часть из 22 нуклеозидов, являющуюся полностью комплементарной последовательности нуклеиновых оснований miR-17, и приблизительно 92% общей комплементарности с последовательностью нуклеиновых оснований miR-17.
Определенные модифицированные олигонуклеотиды
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 8-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 8-12 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 17-23 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 19-23 связанных нуклеозидов.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 8 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 9 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 10 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 11 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 12 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 13 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 15 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 связанного нуклеозида. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит один или более 5-метилцитозинов. В определенных вариантах реализации изобретения каждый цитозин модифицированного олигонуклеотида представляет собой 5-метилцитозин.
Определенные модификации
В определенных вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, представленные в данном документе, могут содержать одну или более модификаций нуклеинового основания, сахара и/или межнуклеозидной связи и, в данном качестве, являться модифицированным олигонуклеотидом. Модифицированное нуклеиновое основание, сахар и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана взамен немодифицированной форме за счет желаемых свойств, таких как, например, увеличение поглощения клеткой, увеличение сродства к другим олигонуклеотидам или целевым нуклеиновым кислотам и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит один или более модифицированных нуклеозидов. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный нуклеозид представляет собой стабилизирующий нуклеозид. Примером стабилизирующего нуклеозида является нуклеозид с модифицированным сахаром.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром. В определенных таких вариантах реализации изобретения нуклеозиды с модифицированным сахаром могут дополнительно содержать компонент природного или модифицированного гетероциклического основания и/или природную или модифицированную межнуклеозидную связь и могут включать в себя дополнительные модификации независимо от модификации сахара. В определенных вариантах реализации изобретения нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид, в котором кольцо сахара модифицировано по 2'-углероду природной рибозы или 2'-дезокси-рибозы.
В определенных вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный нуклеозид имеет бициклический сахарный компонент. В определенных таких вариантах реализации изобретения бициклический сахарный компонент является D сахаром в альфа-конфигурации. В определенных таких вариантах реализации изобретения бициклический сахарный компонент является D сахаром в бета-конфигурации. В определенных таких вариантах реализации изобретения бициклический сахарный компонент является L сахаром в альфа-конфигурации. В определенных таких вариантах реализации изобретения бициклический сахарный компонент является L сахаром в бета-конфигурации.
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
Нуклеозиды, содержащие такие бициклические сахарные компоненты, называются бициклическими нуклеозидами или БНК. В определенных вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают в себя, без ограничений, (A) α-L-метиленокси (4'-CH-O-2') БНК; (B) β-D-метиленокси (4'-CH-O-2') БНК; (C) этиленокси (4'-(CH)-O-2') БНК; (D) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2') БНК; (E) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2') БНК; (F) метил(метиленокси) (4'-CH(CH)-O-2') БНК (также называемая пространственно затрудненным этилом или cEt); (G) метилен-тио (4'-CH-S-2') БНК; (H) метилен-амино (4'-CH2-N(R)-2') БНК; (I) метил карбоциклическую (4'-CH-CH(CH)-2') БНК; (J) c-MOE (4'-CH(CH-OMe)-O-2') БНК и (K) пропилен карбоциклическую (4'-(CH)-2') БНК, как показано ниже.
1
12
где Bx представляет собой компонент нуклеинового основания и R, независимо, представляет собой H, защитную группу или C-C алкил.
3,
3
2
2
3
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
3
В определенных вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группа, выбранную из F, OCF O-CH, OCHCHOCH, 2'-O(CH)SCH, O-(CH)-O-N(CH), -O(CH)O(CH)N(CH) и O-CH-C(=O)-N(H)CH.
3
2
2
3
В определенных вариантах реализации изобретения 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группа, выбранную из F, O-CH и OCHCHOCH.
3
2
2
3
В определенных вариантах реализации изобретения нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах реализации изобретения нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид. 4'-тио модифицированный нуклеозид имеет β-D-рибонуклеозид, в котором 4'-O заменено на 4'-S. 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид представляет собой 4'-тио модифицированный нуклеозид, имеющий замененную 2'-OH на 2'-замещающую группу. Подходящие 2'-замещающие группы включают в себя 2'-OCH, 2'-O-(CH)-OCHи 2'-F.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит одну или более межнуклеозидных модификаций. В определенных вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированная межнуклеозидная связь содержит атом фосфора.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, одну тиофосфатную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь в модифицированном олигонуклеотиде представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание выбирается из 5-гидроксиметилцитозина, 7-деазагуанина и 7-деазааденина. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание выбирается из 7-деазааденина, 7-деазагуанозина, 2-аминопиридина и 2-пиридона. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание выбирается из 5-замещенных пиримидинов, 6-азапиримидинов и N-2, N-6 и O-6 замещенных пуринов, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание содержит многоядерный гетероцикл. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание содержит трициклический гетероцикл. В определенных вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание содержит производное феноксазина. В определенных вариантах реализации изобретения феноксазин может быть дополнительно модифицирован с образованием нуклеинового основания, известного в данной области техники как G-clamp.
В определенных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является конъюгированным с одним или более компонентами, которые усиливают активность, распространение в клетке или поглощение клеткой полученных антисмысловых олигонуклеотидов. В определенных таких вариантах реализации изобретения этот компонент представляет собой холестериновый компонент. В определенных вариантах реализации изобретения этот компонент представляет собой липидный компонент. Дополнительные компоненты для конъюгации включают в себя углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. В определенных вариантах реализации изобретения углеводный компонент представляет собой N-ацетил-D-галактозамин (GalNac). В определенных вариантах реализации изобретения группа конъюгата присоединена непосредственно к олигонуклеотиду. В определенных вариантах реализации изобретения группа конъюгата присоединена к модифицированному олигонуклеотиду посредством связующего компонента, выбранного из амино, гидроксила, карбоновой кислоты, тиола, ненасыщенных групп (например, с двойными или тройными связями), 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (ADO), сукцинимидил-4- (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), 6-аминогексановой кислоты (AHEX или 6-АГК), замещенного C1-C10-алкила, замещенного или незамещенного C2-C10 алкенила и замещенного или незамещенного C2-C10 алкинила. В определенных таких вариантах реализации изобретения замещающая группа выбирается из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро, тиола, тиоалкокси, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
В определенных таких вариантах реализации изобретения соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий одну или более стабилизирующих групп, которые присоединены к одному или обеим концам модифицированного олигонуклеотида для улучшения свойств, таких как, например, стабильность в присутствии нуклеаз. В стабилизирующие группы включены кэп-структуры. Такие модификации на концах защищают модифицированный олигонуклеотид от деградации экзонуклеазами и могут помочь в доставке и/или локализации внутри клетки. Кэп может быть расположен на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может находиться на обоих концах. Кэп-структуры включают в себя, например, инвертированные дезокси кэпы с удаленными азотистыми основаниями.
Определенные фармацевтические композиции
В данном документе представлены фармацевтические композиции. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, включает в себя соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-25 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, включает в себя соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 8-12 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, включает в себя соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 15-25 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную miR-17. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, включает в себя соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17-23 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную miR-17.
Подходящие способы введения включают, но не ограничиваются ими, пероральный, ректальный, трансмукозальный, интестинальный, энтеральный, местный, суппозитории, через ингаляции, интратекальный, интракардиальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокулярный, внутриопухолевый и парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, интрамедуллярный и подкожный). В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические средства для интратекального введения вводят для достижения местных, а не системных воздействий. Например, фармацевтические композиции могут быть введены инъекцией непосредственно в область желаемого эффекта (например, в почку).
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция вводится в виде стандартной дозировки (например, таблетки, капсулы, болюса и т. д.). В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид в дозе в пределах выбранного диапазона от 25 мг до 800 мг, от 25 мг до 700 мг, от 25 мг до 600 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 400 мг, от 25 мг до 300 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 100 мг до 800 мг, от 200 мг до 800 мг, от 300 мг до 800 мг, от 400 мг до 800 мг, от 500 мг до 800 мг, от 600 мг до 800 мг, от 100 мг до 700 мг, от 150 мг до 650 мг, от 200 мг до 600 мг, от 250 до 550 мг, от 300 мг до 500 мг, от 300 мг до 400 мг и от 400 мг до 600 мг. В определенных вариантах реализации изобретения такие фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид в дозе, выбранной из 25 мг, 30 мг, 35 мг, 40 мг, 45 мг, 50 мг, 55 мг, 60 мг, 65 мг, 70 мг, 75 мг, 80 мг, 85 мг, 90 мг, 95 мг, 100 мг, 105 мг, 110 мг, 115 мг, 120 мг, 125 мг, 130 мг, 135 мг, 140 мг, 145 мг, 150 мг, 155 мг, 160 мг, 165 мг, 170 мг, 175 мг, 180 мг, 185 мг, 190 мг, 195 мг, 200 мг, 205 мг, 210 мг, 215 мг, 220 мг, 225 мг, 230 мг, 235 мг, 240 мг, 245 мг, 250 мг, 255 мг, 260 мг, 265 мг, 270 мг, 270 мг, 280 мг, 285 мг, 290 мг, 295 мг, 300 мг, 305 мг, 310 мг, 315 мг, 320 мг, 325 мг, 330 мг, 335 мг, 340 мг, 345 мг, 350 мг, 355 мг, 360 мг, 365 мг, 370 мг, 375 мг, 380 мг, 385 мг, 390 мг, 395 мг, 400 мг, 405 мг, 410 мг, 415 мг, 420 мг, 425 мг, 430 мг, 435 мг, 440 мг, 445 мг, 450 мг, 455 мг, 460 мг, 465 мг, 470 мг, 475 мг, 480 мг, 485 мг, 490 мг, 495 мг, 500 мг, 505 мг, 510 мг, 515 мг, 520 мг, 525 мг, 530 мг, 535 мг, 540 мг, 545 мг, 550 мг, 555 мг, 560 мг, 565 мг, 570 мг, 575 мг, 580 мг, 585 мг, 590 мг, 595 мг, 600 мг, 605 мг, 610 мг, 615 мг, 620 мг, 625 мг, 630 мг, 635 мг, 640 мг, 645 мг, 650 мг, 655 мг, 660 мг, 665 мг, 670 мг, 675 мг, 680 мг, 685 мг, 690 мг, 695 мг, 700 мг, 705 мг, 710 мг, 715 мг, 720 мг, 725 мг, 730 мг, 735 мг, 740 мг, 745 мг, 750 мг, 755 мг, 760 мг, 765 мг, 770 мг, 775 мг, 780 мг, 785 мг, 790 мг, 795 мг и 800 мг. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит дозу модифицированного олигонуклеотида, выбранную из 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг и 800 мг.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическим веществом является стерильный лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид, который ресуспендируют в подходящем разбавителе, например, стерильной воде для инъекций или стерильном солевом растворе для инъекций. Ресуспендированный продукт вводят в виде подкожной инъекции или в виде внутривенной инфузии после разбавления в солевом растворе. Лиофилизированный лекарственный продукт состоит из модифицированного олигонуклеотида, который был приготовлен в воде для инъекций или в солевом растворе для инъекций, доведен до рН 7,0-9,0 с помощью кислоты или щелочи во время приготовления и затем лиофилизирован. Лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид может составлять 25-800 мг олигонуклеотида. Следует понимать, что это охватывает 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 и 800 мг модифицированного лиофилизированного олигонуклеотида. Дополнительно, в определенных вариантах реализации изобретения лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид представляет собой количество олигонуклеотида, выбранное в диапазоне от 25 мг до 800 мг, от 25 мг до 700 мг, от 25 мг до 600 мг, от 25 мг до 500 мг, от 25 мг до 400 мг, от 25 мг до 300 мг, от 25 мг до 200 мг, от 25 мг до 100 мг, от 100 мг до 800 мг, от 200 мг до 800 мг, от 300 мг до 800 мг, от 400 мг до 800 мг, от 500 мг до 800 мг, 600 мг до 800 мг, от 100 мг до 700 мг, от 150 мг до 650 мг, от 200 мг до 600 мг, от 250 до 550 мг, от 300 мг до 500 мг, от 300 мг до 400 мг и от 400 мг до 600 мг. Лиофилизированный лекарственный продукт может быть упакован в 2 мл прозрачный стеклянный флакон типа I (обработанный сульфатом аммония), закупоренный бромбутиловой резиной и запечатанный алюминиевым колпачком FLIP-OFF.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, представленные в данном документе, могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, стандартно встречающиеся в фармацевтических композициях, в соответствии с установленными в данных областях техники уровнями использования. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные, совместимые, фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные обезболивающие средства или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные вещества, пригодные для разработки различных лекарственных форм композиций данного изобретения, такие как красители, ароматизаторы, консерванты, антиоксиданты, замутняющие агенты, загустители и стабилизаторы. Однако, такие вещества, в случае добавления, не должны чрезмерно препятствовать биологической активности компонентов композиций данного изобретения. Лекарственные формы могут быть стерилизованы и, при желании, смешаны со вспомогательными агентами, например, смазочными средствами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, красителями, ароматизаторами и/или ароматическими веществами и тому подобными, которые не оказывают отрицательного взаимодействия с олигонуклеотидом(ами) лекарственной формы.
Липидные компоненты были использованы в терапиях нуклеиновой кислотой различными способами. В одном способе нуклеиновая кислота вводится в предварительно сформированные липосомы или липоплексы, изготовленные из смесей катионных липидов и нейтральных липидов. В другом способе комплексы ДНК с моно- или поликатионными липидами образуются без присутствия нейтрального липида. В определенных вариантах реализации изобретения липидный компонент выбран для увеличения распространения фармацевтического вещества в конкретную клетку или ткань. В определенных вариантах реализации изобретения липидный компонент выбран для увеличения распространения фармацевтического вещества в жировую ткань. В определенных вариантах реализации изобретения липидный компонент выбран для увеличения распространения фармацевтического вещества в мышечную ткань.
В определенных вариантах реализации изобретения ИНТРАЛИПИД используют для приготовления фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид. Интралипид представляет собой эмульсию жиров, приготовленную для внутривенного введения. Он состоит из 10% соевого масла, 1,2% фосфолипидов яичного желтка, 2,25% глицерина и воды для инъекций. Кроме того, гидроксид натрия добавляли для доведения рН, чтобы конечный диапазон рН продукта составлял от 6 до 8,9.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит полиаминовое соединение или липидный компонент, в комплексе с нуклеиновой кислотой. В определенных вариантах реализации изобретения такие составы включают одно или более соединений, каждое из которых в отдельности имеет структуру, определенную формулой (Z) или его фармацевтически приемлемую соль,
где каждый Xa и Xb, для каждого случая, независимо представляет собой C1-6 алкилен; n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; каждый R независимо представляет собой H, причем по меньшей мере n+2 фрагментов R у, по меньшей мере, около 80% молекул соединения формулы (Z) в составе не являются H; m равно 1, 2, 3 или 4; Y является O, NR2 или S; R1 представляет собой алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых в некоторых случаях замещен одним или более заместителями; и R2 представляет собой Н, алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых в некоторых случаях замещен одним или более заместителями; при условии, что если n=0, то, по меньшей мере, n+3 фрагментов R не являются H. Такие составы описаны в публикации РСТ WO/2008/042973, которая включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме для раскрытия липидных составов. Определенные дополнительные составы описаны в Akinc и соавт., Nature Biotechnology 26, 561-569 (01 мая 2008 года), которая включена в данном документе в качестве ссылки в полном объеме для раскрытия липидных составов.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, представленные в данном документе, содержат один или более модифицированных олигонуклеотидов и одно или более вспомогательных веществ. В определенных таких вариантах реализации изобретения вспомогательные вещества выбраны из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, приготовлена с использованием известных методов, включая, но не ограничиваясь ими, процессы смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, улавливания или таблетирования.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, представляет собой жидкость (например, суспензию, эликсир и/или раствор). В определенных таких вариантах реализации изобретения жидкая фармацевтическая композиция приготовлена с использованием ингредиентов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты и красящие средства.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, представляет собой твердую форму (например, порошок, таблетку и/или капсулу). В определенных таких вариантах реализации изобретения твердая фармацевтическая композиция, содержащая один или более олигонуклеотидов, приготовлена с использованием ингредиентов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие агенты, смазывающие вещества, связующие вещества и дезинтегрирующие агенты.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, изготовлена в качестве депо-препарата. Определенные такие депо-препараты обычно имеют более продолжительное действие, чем не депо-препараты. В определенных вариантах реализации изобретения такие препараты вводят путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. В определенных вариантах реализации изобретения депо-препараты приготовлены с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, эмульсия в приемлемом масле) или ионообменных смол, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают в себя, но не ограничиваются ими, липосомы и эмульсии. Определенные системы доставки подходят для получения определенных фармацевтических композиций, включая композиции, содержащие гидрофобные соединения. В определенных вариантах реализации изобретения используют определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит одну или более тканеспецифичных молекул доставки, предназначенных для доставки одного или более фармацевтических веществ данного изобретения в конкретные ткани или типы клеток. Например, в определенных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифичным антителом.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит систему замедленного высвобождения. Неограничивающим примером такой системы замедленного высвобождения является полупроницаемая матрица твердых гидрофобных полимеров. В определенных вариантах реализации изобретения системы замедленного высвобождения могут, в зависимости от их химической природы, высвобождать фармацевтические вещества в течение нескольких часов, дней, недель или месяцев.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция приготовлена для введения путем инъекции (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной и т. д.). В определенных таких вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит носитель и приготовлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. В определенных вариантах реализации изобретения включены другие ингредиенты (например, ингредиенты, которые способствуют растворимости или служат в качестве консервантов). В определенных вариантах реализации изобретения суспензии для инъекций приготовлены с использованием соответствующих жидких носителей, суспендирующих веществ и тому подобного. Определенные фармацевтические композиции для инъекций представлены в стандартной дозировке, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах. Определенные фармацевтические композиции для инъекций представляют собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных наполнителях, и они могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Определенные растворители, подходящие для применения в фармацевтических композициях для инъекций, включают, но не ограничиваются ими, липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды и липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. В некоторых случаях, такие суспензии могут также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость фармацевтических веществ, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов.
В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит модифицированный олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В определенных вариантах реализации изобретения терапевтически эффективное количество является достаточным для предотвращения, смягчения или облегчения симптомов заболевания или для увеличения продолжительности жизни субъекта, подлежащего лечению. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники.
in vivo
В определенных вариантах реализации изобретения один или более модифицированных олигонуклеотидов, представленных в данном документе, приготовлены в качестве пролекарства. В определенных вариантах реализации изобретения при введении  пролекарство химически превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму олигонуклеотида. В определенных вариантах реализации изобретения пролекарства являются удобными благодаря тому, что их проще вводить, чем соответствующую активную форму. Например, в определенных случаях пролекарство может быть более биодоступным (например, при пероральном введении), чем соответствующая активная форма. В определенных случаях пролекарство может обладать улучшенной растворимостью по сравнению с соответствующей активной формой. В определенных вариантах реализации изобретения пролекарства являются менее водорастворимыми, чем соответствующая активная форма. В определенных случаях такие пролекарства обладают превосходной передаваемостью через клеточные мембраны, где водорастворимость отрицательно влияет на подвижность. В определенных вариантах реализации изобретения пролекарство представляет собой сложный эфир. В определенных таких вариантах реализации изобретения сложный эфир при введении метаболически гидролизуется до карбоновой кислоты. В определенных случаях соединение, содержащее карбоновую кислоту, представляет собой соответствующую активную форму. В определенных вариантах реализации изобретения пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В определенных из таких вариантов реализации изобретения пептид расщепляется при введении с образованием соответствующей активной формы.
in vivo
in vivo
В определенных вариантах реализации изобретения пролекарство производится путем модификации фармацевтически активного соединения, так что активное соединение будет восстановлено при введении . Пролекарство может быть сконструировано так, чтобы изменять метаболическую стабильность или транспортные характеристики лекарственного средства, скрывать побочные эффекты или токсичность, улучшать вкус лекарственного средства или изменять другие характеристики или свойства лекарственного средства. Руководствуясь знаниями фармакодинамических процессов и метаболизма лекарственного средства , специалисты в данной области техники, как только фармацевтически активное соединение становится известным, могут проектировать пролекарства этого соединения (см., например, Nogrady (1985 год) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Нью-Йорк, страницы 388-392).
Определенные наборы
Данное изобретение также предлагает наборы. В некоторых вариантах реализации изобретения наборы содержат одно или более соединений данного изобретения, включающих модифицированный олигонуклеотид, в котором последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида комплементарна последовательности нуклеиновых оснований miR-17. Соединения могут иметь любую из описанных в данном документе нуклеозидных структур. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения могут присутствовать внутри флакона. Множество флаконов, например, 10, может присутствовать, например, в фасовочных упаковках. В некоторых вариантах реализации изобретения флакон изготовлен таким образом, чтобы быть доступным для шприца. Набор также может содержать инструкции по использованию указанных соединений.
В некоторых вариантах реализации изобретения наборы могут быть использованы для введения соединения субъекту. В таких случаях, в дополнение к соединениям, содержащим модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17, набор может дополнительно содержать одно или более из следующего: шприц, спиртовой тампон, ватный шарик и/или марлевую салфетку. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения могут присутствовать в предварительно заполненном шприце (как например одноразовые шприцы с, например, калибром 27, ½ дюймовой иглой с предохранителем иглы), а не во флаконе. Множество предварительно заполненных шприцев, как например, 10, может присутствовать, например, в фасовочных упаковках. Набор может также содержать инструкции для введения соединений, содержащих модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17.
Определенные экспериментальные модели
В определенных вариантах реализации изобретения данное изобретение предоставляет способы использования и/или тестирования модифицированных олигонуклеотидов данного изобретения на экспериментальной модели. Специалисты в данной области техники могут выбирать и модифицировать протоколы для таких экспериментальных моделей для оценки фармацевтического вещества данного изобретения.
in vivo
Как правило, модифицированные олигонуклеотиды сначала тестируют на культивируемых клетках. Подходящие типы клеток включают те, которые являются родственными типу клеток, для которого является желаемой доставка модифицированного олигонуклеотида . Например, подходящие типы клеток для изучения описанных в данном документе способов включают первичные или культивируемые клетки.
В определенных вариантах реализации изобретения степень, в которой модифицированный олигонуклеотид препятствует активности miR-17, оценивается на культивируемых клетках. В определенных вариантах реализации изобретения ингибирование активности микроРНК может быть оценено путем измерения уровней микроРНК. В альтернативном варианте может быть измерен уровень прогнозируемого или подтвержденного транскрипта, регулируемого микроРНК. Ингибирование активности микроРНК может приводить к увеличению транскрипта, регулируемого miR-17, и/или белка, кодируемого транскриптом, регулируемым miR-17. Дополнительно, в некоторых вариантах реализации изобретения, могут быть измерены определенные фенотипические результаты.
Pkd1
Pkd2
Pkd1
Pkd2
Pkd1
Pkd2
Pkd1
Pkd2
Pkhd1
Nek8
Nphp3
например
и соавт
Human Mol. Genet.
Nat Rev Nephrol
и соавт
PNAS
Несколько животных моделей доступны специалистам в данной области техники для изучения miR-17 на моделях заболевания человека. Модели поликистозной болезни почек включают, но не ограничиваются ими, модели с мутациями и/или делециями в  и/или ; и модели, содержащие мутации в других генах. Неограничивающие типовые модели ПБП, содержащие мутации и/или делеции в  и/или  включают гипоморфные модели, такие как модели, содержащие миссенс-мутации в  и модели со сниженной или неустойчивой экспрессией ; модели с индуцируемым условным нокаутом; и модели с условным нокаутом. Неограничивающие типовые модели ПБП, содержащие мутации в генах, отличных от  и  включают в себя модели с мутациями в , , Kif3a и/или . Модели ПБП рассматриваются, , в Shibazaki ., , 2008 год; 17(11):1505-1516; Happe and Peters, ., 2014 год; 10(10):587-601; и Patel .,, 2013 год; 110(26):10765-10770.
Определенные количественные анализы
in vitro
in vivo
В определенных вариантах реализации изобретения уровни микроРНК количественно определяют в клетках или тканях  или . В определенных вариантах реализации изобретения изменения уровней микроРНК измеряются с помощью анализа на микрочипах. В определенных вариантах реализации изобретения изменения уровней микроРНК измеряются одним из нескольких коммерчески доступных ПЦР-анализов, таких как TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems).
Модуляция активности микроРНК с помощью анти-miR или миметика микроРНК может быть оценена путем профилирования мРНК с помощью микрочипов. Последовательности мРНК, которые подлежат модуляции (либо увеличению, либо уменьшению) с помощью анти-miR или миметика микроРНК, ищутся по затравочным последовательностям микроРНК для сравнения модуляции мРНК, которые являются мишенями микроРНК, с модуляцией мРНК, которые не являются мишенями микроРНК. Таким образом, может быть оценено взаимодействие анти-miR с miR-17 или миметика miR-17 с его мишенями. В случае c анти-miR, мРНК, уровни экспрессии которых увеличены, подвергают скринингу на наличие последовательностей мРНК, содержащих последовательности, подходящие для спаривания с затравочной последовательностью микроРНК, к которой анти-miR является комплементарной.
Модуляция активности микроРНК с помощью соединения анти-miR-17 может быть оценена путем измерения уровня мРНК-мишени miR-17, либо путем измерения уровня самой мРНК, либо белка, считанного с нее. Антисмысловое ингибирование микроРНК обычно приводит к увеличению уровня мРНК и/или белка из мРНК-мишени микроРНК.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации некоторых вариантов реализации данного изобретения. Однако, они никоим образом не должны толковаться как ограничивающие широкий объем данного изобретения. Специалисты в данной области техники легко поймут основополагающие принципы этого открытия для разработки различных соединений, не отступая от сущности данного изобретения.
Пример 1: Анти-miR-17 в модели поликистозной болезни почек
Pkd2
См.
и соавт
PNAS
F/F
Мыши Pkhd1/cre;  спонтанно развивали поликистозную болезнь почек и были использованы в качестве модели АДПБП. Patel ., , 2013 год; 110(26):10765-10770.
Pkd2
F/F
Модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17 (соединение анти-miR-17), был испытан на модели АДПБП мышей Pkhd1/cre; . Мышей дикого типа использовали в качестве контрольных мышей. Олигонуклеотид, комплементарный микроРНК, не связанный с miR-17, использовался в качестве контроля лечения на специфичность (анти-miR-контроля). Соединение анти-miR-17 представляло собой полностью тиофосфорилированный олигонуклеотид из 19 связанных нуклеозидов в длину (5'-CTGCACTGTAAGCACTTTG-3'; SEQ ID NO:15), с ДНК, сахарными компонентами 2'-MOE и S-cEt.
Pkd2
Pkd2
Pkd2
F/F
F/F
F/F
С 10-го по 12-й день жизни, однополые однопометные мыши получали анти-miR-17 (20 мг/кг) или ФСБ, в общей сложности три ежедневные дозы. На 19-й день жизни мыши получали четвертую дозу анти-miR-17 (20 мг/кг) или ФСБ. Анти-miR-17 вводили подкожно. (1) Мыши Pkhd1/cre; , введение ФСБ, n=8; (2) Мыши Pkhd1/cre;, введения анти-miR-контроля, n=8; (3) Мыши Pkhd1/cre;, введение анти-miR-17, n=8. Мышей умерщвляли на 28-й день, измеряли массу почек, кистозный индекс, функцию почек и маркеры почек. Статистическую значимость рассчитывали с помощью критерия Уэлча.
Pkd2
Pkd2
Pkd2
Pkd2
Pkd2
Pkd2
Pkd2
Pkd2
Pkd2
F/F
F/F
F/F
F/F
F/F
F/F
F/F
F/F
F/F
Среднее соотношение веса почки к весу тела у мышей Pkhd1/cre;, получавших анти-miR-17, являлось на 17% ниже, чем среднее соотношение веса почки к весу тела у мышей Pkhd1/cre;, которым вводили только анти-miR-контроль или ФСБ (p=0,017). Мыши Pkhd1/cre;, получавшие анти-miR-17, показали снижение кистозного индекса в среднем на 6% по сравнению с мышами Pkhd1/cre; , которым вводили анти-miR-контроль или ФСБ, хотя разница не являлась статистически значимой (p=0,072). Кистозный индекс представляет собой гистологическое измерение кистозной площади относительно общей площади почек. Средние уровни креатинина в сыворотке крови у мышей Pkhd1/cre;, получавших анти-miR-17, были на 25% ниже, чем у мышей Pkhd1/cre;, которым вводили анти-miR-контроль или ФСБ, однако, результат не был статистически значимым (p=0,069). Экспрессия Kim1 была снижена на 33% у мышей Pkhd1/cre;, получавших анти-miR-17 по сравнению с анти-miR-контролем или ФСБ (p=0,024), и экспрессия Ngal была снижена на 36% у мышей Pkhd1/cre;, получавших анти-miR-17 по сравнению с анти-miR-контролем или ФСБ (p=0,028). В конечном счете, уровни азота мочевины крови (АМК) были снижены на 20% у мышей Pkhd1/cre;, получавших анти-miR-17 по сравнению с анти-miR-контролем или ФСБ (p=0,006). АМК является маркером крови функции почек. Повышенный АМК коррелирует со слабой функцией почек. Снижение АМК является показателем уменьшения повреждения и травмирования почек, и улучшения функции.
Pkd2
Pkd2
Pkd2
F/F
F/F
F/F
Эти результаты показывают, что лечение анти-miR-17 приводит к положительному результату у мышей Pkhd1/cre; в главной конечной точке лечения, в объеме почек. Лечение анти-miR-17 также значительно уменьшало АМК и экспрессию мРНК биомаркеров повреждения почек, Kim1 и Ngal, у мышей Pkhd1/cre;. В конечном счете, лечение анти-miR-17 обусловило тенденцию к снижению креатинина сыворотки и снижению кистозного индекса у мышей Pkhd1/cre;. Такие результаты не наблюдались при анти-miR-контроле, что указывает на то, что они обусловлены исключительно ингибированием miR-17.
Пример 2: Распространение анти-miR в почках мышей Pkhd1/cre;
Pkd2
F/F
Sci Transl Med
Oligonucleotides
Известно, что олигонуклеотиды, включая соединения анти-miR, распространяются по нескольких типах клеток в почках. По данным Chau и соавт., ., 2012 год, 121ra18, после введения Cy3-меченого анти-miR либо нормальным мышам, либо мышам, подвергшимся повреждению почек (односторонняя обструкция мочеточника, модель интерстициального фиброза), наибольшая интенсивность флуоресценции в почках была в эпителии проксимального канальца. Эндотелий, перициты, миофибробласты и макрофаги также содержали обнаруживаемые количества Cy3-меченого анти-miR. Однако клубочек, в частности подоциты, не поглощали значительных количеств анти-miR, в соответствии с известным распространением химически модифицированных олигонуклеотидов (Masarjian и соавт., , 2004 год, 14, 299-310).
Pkd2
F/F
Чтобы исследовать распространение анти-miR на мышиной модели поликистозной болезни почек, соединение анти-miR-17 вводили двум различным группам мышей Pkhd1/cre;, одной начиная с 10-го дня жизни (n=4, считалась предикистозной) и одной начиная с 21-го дня жизни (n=4, считалась кистозной), и одной группе мышей дикого типа, начиная с 21-го дня жизни (n=4). В каждой группе соединение вводили по 20 мг/кг ежедневно в трех дозах. Мышей умерщвляли через три дня после последней дозы, а почки брали и обрабатывали для гистологического анализа. Анти-miR-17 был обнаружен с помощью антитела, которое распознает тиофосфорилированные олигонуклеотиды.
Срезы ткани почек окрашивали антителом, которое распознает тиофосфорилированные олигонуклеотиды, в качестве маркера для соединения анти-miR-17 или агглютинином из долихоса двухцветкового (DBA) в качестве маркера для собирающих протоков. Во всех группах, большинство окрашиваний было обнаружено за пределами собирающих протоков, с некоторой вероятностью в эпителии проксимального канальца. Анти-miR-17 также доставляли в кисты собирающих протоков даже если введение производили после того, как в почке образовались многочисленные кисты. Окрашивание в собирающих протоках сильнее проявлялось в кистах по сравнению с обычными собирающими протоками, из чего допускается, что доставка соединения может увеличиваться с течением заболевания.
Pkd2
F/F
С целью подтверждения функциональной доставки использовали ОТ-кПЦР для измерения изменений экспрессии генов, индуцированных соединением анти-let-7. Панель из 36 генов-мишеней let-7 показала значительное увеличение экспрессии как в предкистозных, так и в кистозных почках мышей Pkhd1/cre;, так же как у мышей дикого типа, которым вводили анти-let-7.
Эти результаты показывают, что соединения анти-miR могут быть успешно доставлены в кистозные почки для ингибирования микроРНК.
Пример 3: Ингибирование членов семейства miR-17
Многие микроРНК имеют идентичность затравочной последовательности и, таким образом, являются членами семейства микроРНК. Поскольку затравочная область микроРНК является определяющим фактором специфичности мишени, члены семейства микроРНК часто регулируют аналогичные наборы целевых матричных РНК. За пределами затравочной области члены семейства микроРНК имеют разную степень идентичности последовательностей.
Одним из таких семейств является семейство miR-17, которое включает в себя miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a и miR-106b. Индивидуальные микроРНК этого семейства микроРНК расположены на трех разных хромосомах в трех разных кластерах микроРНК. miR-17 и miR-20a находятся в кластере miR-17~92 на хромосоме 13 человека; miR-20b и miR-106a находятся в кластере miR-106a~363 на Х-хромосоме человека, а miR-93 и miR-106b находятся в кластере miR-106b~25 на хромосоме 7 человека (фиг. 1A). Каждый из этих трех кластеров содержит другие микроРНК, которые не являются членами семейства miR-17, и поэтому не содержат затравочную последовательность 2-7 miR-17. Такие микроРНК, однако, являются членами других семейств miR, как показано на фиг. 1B. Члены семейства miR-17 показаны на фиг. 1B, с выделенной жирным шрифтом затравочной последовательностью 2-7 miR-17. Затравочная последовательность членов семейства miR-18 (miR-18a и miR-18b) различается на одно нуклеиновое основание по отношению к затравочной последовательности 2-7 miR-17, однако за пределами затравочной области последовательности отличаются друг от друга.
Вследствие идентичности последовательностей среди членов семейства микроРНК и ввиду того, что модифицированный олигонуклеотид с менее чем 100% комплементарностью к последовательности микроРНК может все же ингибировать активность этой микроРНК, модифицированный олигонуклеотид с последовательностью нуклеиновых оснований, 100% комплементарной последовательности нуклеиновых оснований первого члена семейства и который имеет менее чем 100% комплементарности к одному или более другим членам семейства, может ингибировать эти один или более других членов семейства в дополнение к ингибированию активности первого члена семейства микроРНК. Например, модифицированный олигонуклеотид с последовательностью нуклеиновых оснований, которая является на 100% комплементарной miR-17 (5'-CTGCACTGTAAGCACTTTG-3'; SEQ ID NO:15) и имеет менее чем 100% комплементарности к другим членам семейства miR-17 (таблица 1), будет ингибировать эти другие члены семейства miR-17.
Таблица 1: % комплементарности анти-miR-17 к членам семейства miR-17
<b>МикроРНК</b>
<b>Последовательность (5'-3')</b><b>Затравочная последовательность 2-7 miR-17 выделена жирным шрифтом</b>
<b># комплемен-тарных нуклеиновых оснований</b>
<b>% комплемен-тарности</b>
<b>SEQ ID NO:</b>
miR-17
c<b>aaagug</b>cuuacagugcagguag
19
100%
1
miR-20a
U<b>AAAGUG</b>CUUAUAGUGCAGGUAG
17
89,5%
21
miR-20b
C<b>AAAGUG</b>CUCAUAGUGCAGGUAG
17
89,5%
22
miR-93
C<b>AAAGUG</b>CUGUUCGUGCAGGUAG
14
73,7%
23
miR-106a
A<b>AAAGUG</b>CUUACAGUGCAGGUAG
17
89,5%
24
miR-106b
U<b>AAAGUG</b>CUGACAGUGCAGAU
16
84,2%
25
Чтобы проверить ингибирование членов семейства miR-17, использовали анализ репортерного гена люциферазы. Для каждой miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93 и miR-106b была сконструирована репортерная плазмида, содержащая ген люциферазы, с полностью комплементарным сайтом связывания микроРНК в 3'-UTR гена люциферазы. Для каждой микроРНК, клетки HeLa трансфицировали миметиком микроРНК и одного с ней происхождения репортером люциферазы с последующей трансфекцией анти-miR-17. Каждая из miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93 и miR-106b ингибировалась соединением анти-miR-17, демонстрируя, что соединение анти-miR-17 ингибирует множество членов семейства miR-17, даже когда имеются неправильные спаривания между последовательностями анти-miR-17 и микроРНК.
Nucleic Acids Research
Отдельный анализ, определение микроРНК с помощью полисомного сдвига (miPSA - microRNA polysome shift assay), подтвердил, что соединение анти-miR-17 непосредственно взаимодействует с тремя членами семейства miR-17, miR-17, miR-20b и miR-106a (Androsavich и соавт., , 2015 год, 44:e13). miPSA опирается на принцип, согласно которому активные микроРНК связываются с их мРНК-мишенями на трансляционно активных высокомолекулярных (HMW) полисомах, тогда как ингибированные микроРНК находятся на низкомолекулярных (LMW) полисомах. Лечение с использованием анти-miR приводит к сдвигу микроРНК от HMW полисом к LMW полисомам. Таким образом, miPSA обеспечивает непосредственное измерение взаимодействия микроРНК с мишенью под влиянием комплементарной анти-miR. Androsavich и соавт. дополнительно подтвердили, что, в то же время, микроРНК не из семейства miR-17 не реагировали при сравнении, за одним исключением: miR-18a неожиданно проявила сильную перекрестную реактивность при более высоких дозах (что может быть объяснено затравочными последовательностями miR-17 и miR-18, отличающимися только одним нуклеотидом A/G (фиг. 1).
Следовательно, лечение соединением анти-miR-17 ингибирует все члены семейства miR-17 даже в случае, если имеются неправильные спаривания между последовательностями анти-miR-17 и микроРНК.
Пример 4: Ингибирование miR-17 в человеческих кистах АДПБП
Am J Physiol Renal Physiol
Эффекты ингибирования miR-17 изучались в первичных культурах, полученных из кист человека с АДПБП. Замороженные первичные клетки АДПБП человека были предоставлены Исследовательским центром биоматериалов и клеточных моделей ПБП в Медицинском центре Университета Канзаса (KUMC). Первичные клетки АДПБП человека выращивали в среде DMEM:F12 (Gibco), с добавлением 5% ФБС, 5 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл трансферрина и 5 нг/мл селенита натрия (ITS) (Lonza), как было описано ранее (Yamaguchi и соавт., , 2010 год, 299:F944-951).
Анализ пролиферации
+2
+2
При конфлюентности 80%, клетки АДПБП человека трипсинизировали, используя разведение трипсина 1:10 в ФСБ, не содержащем Ca и Mg. Клетки трансфицировали с помощью RNAiMAX (Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя при плотности 2500 клеток/лунку в 96-луночном планшете. Обработка происходила следующим образом:
анти-miR-17 (в дозах 3 нМ, 10 нМ или 30 нМ; n=5 для каждой обработки)
контрольный олигонуклеотид (в дозах, обозначенных в таблице 3; n=5 для каждой обработки). Для варьирования контрольноых обработок использовались две различные контрольные группы. Для культур, полученных от доноров 1-4, испытывались 3 или 5 контрольные олигонуклеотиды, каждый в разовой дозе 30 нМ. Для клеток, полученных от донора 5, испытывали один контрольный олигонуклеотид в трех разных дозах.
трансфекция вектором без вставки с помощью RNAiMAX (n=5)
ФСБ (n=5)
Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа MTT (Promega) на третий день в соответствии с протоколом производителя. Результаты представлены в таблице 2. Среднее значение для каждой группы обработки анти-miR-17 или контрольной группы обработки олигонуклеотидом нормализуется по среднему значению для группы обработки вектором без вставки. Указана стандартная ошибка среднего значения. Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента для попарных сравнений или дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием апостериорного критерия Тьюки для множественного сравнения. Р-значения являются следующими: * означает значение p < 0,05, **означает значение p < 0,01, ***означает значение p < 0,005 ****означает значение p < 0,001. Для обработки анти-miR-17 р-значение указывает на значимость по отношению к обработке вектором без вставки. Для обработки контрольным олигонуклеотидом показаны два разных р-значения, одно из которых указывает на значимость по отношению к обработке вектором без вставки (р-значение 1 в таблице 2), а другое указывает на значимость по отношению к обработке 30 нМ анти-miR-17 (р-значение 2 в таблице 2). Н. т. означает не тестировали.
Обработка анти-miR-17 вызывало дозозависимое снижение пролиферации эпителия кист по сравнению с обработкой трансфекцией вектором без вставки. В отличие от обработки анти-miR-17, большинство обработок контрольными олигонуклеотидами не снижали последовательно пролиферацию в статистически значимом количестве.
В качестве примера, обработка кистозных эпителиальных культур от донора 1 с помощью 30 нМ анти-miR-17 снижало пролиферацию клеток на 47% по сравнению с трансфекцией вектором без вставки (р < 0,0001), тогда как обработка контрольными олигонуклеотидами не приводило к снижению пролиферации клеток в статистически значимом количестве. Дополнительно, для кистозных эпителиальных культур одного и того же донора сравнение обработки 30 нМ анти-miR-17 с каждым из трех контрольных обработок также показывает статистически значимое снижение пролиферации клеток в результате обработки анти-miR-17 (р < 0,0001).
Таблица 2: Пролиферация эпителия кист
<b>Среднее значение на донора </b>
<b>Обработка</b>
<b>ФСБ</b>
<b>Вектор без вставки</b>
<b>анти-miR-17</b>
<b>Контрольные олигонуклеотиды</b>
3 нМ
10 нМ
30 нМ
#130 нМ
#230 нМ
#330 нМ
#430 нМ
#530 нМ
<b>Среднее значение для донора 1</b>
1,94
1,00
0,98
0,89
0,53
1,09
0,94
1,15
н.т.
н.т.
СОС
0,03
0,05
0,03
0,02
0,01
0,04
0,06
0,04
p-значение 1
ns
ns
****
ns
ns
ns
р-значение 2
****
****
****
<b>Среднее значение для донора 2</b>
1,00
1,00
1,00
0,94
0,78
0,97
0,91
0,83
0,64
0,97
СОС
0,03
0,03
0,03
0,02
0,03
0,02
0,03
0,05
0,04
0,01
p-значение 1
ns
ns
***
ns
ns
*
****
ns
р-значение 2
**
ns
ns
ns
**
<b>Среднее значение для донора 3</b>
1,01
1,00
0,65
0,58
0,27
0,59
0,68
0,63
0,23
0,63
СОС
0,03
0,02
0,04
0,02
0,06
0,03
0,03
0,03
0,04
0,04
p-значение 1
****
****
****
****
****
****
****
****
р-значение 2
****
****
****
ns
****
<b>Среднее значение для донора 4</b>
1,36
1,00
0,75
0,62
0,17
0,74
0,67
0,57
0,40
0,29
СОС
0,05
0,07
0,03
0,05
0,01
0,04
0,03
0,02
0,02
0,02
p-значение 1
**
****
****
***
****
****
****
****
р-значение 2
****
****
****
**
ns
<b>Обработка</b>
<b>Среднее значение на донора</b>
<b>ФСБ</b>
<b>Вектор без вставки</b>
<b>анти-miR-17</b>
<b>Контроль</b><b>Олигонуклеотид</b>
3 нМ
10 нМ
30 нМ
# 13 нМ
#110 нМ
#130 нМ
<b>Среднее значение для донора 5</b>
1,00
0,99
0,89
0,64
0,42
1,11
0,92
0,88
СОС
0,09
0,10
0,06
0,06
0,04
0,12
0,07
0,05
p-значение 1
ns
ns
***
ns
ns
ns
р-значение 2
****
**
**
Образование кист in vitro
+2
+2
Первичные клетки АДПБП человека выращивали до конфлюентности 80% и трипсинизировали, используя разведение трипсина 1:10 в ФСБ, не содержащем Ca и Mg. На первый день клетки трансфицировали с помощью RNAiMAX в шести-луночном планшете. Группы обработки были следующими:
анти-miR-17 в дозах 1 нМ, 5 нМ или 20 нМ (n=3 для каждой дозы)
пять контрольных олигонуклеотидов, каждый в дозе 20 нМ (n=3 для каждого контрольного олигонуклеотида)
трансфекция вектором без вставки с помощью RNAiMAX (n=3)
ФСБ
Через 24 часа после трансфекции клетки трипсинизировали до суспензии отдельных клеток, подсчитывали и высевали в 96-луночный планшет при плотности 4000 клеток/лунку в 130 мкл среды плюс Матригель в соотношении 4:5. После затвердевания матригеля в лунку добавляли полную питательную среду. Среду пополняли каждые 72 часа до 8 дней после высеивания, когда оценивали размер и количество кист.
3
Каждая лунка рассматривалась на наличие пролиферации кисты с помощью светового микроскопа Olympus D8. Изображения были записаны с помощью камеры Olympus DP26 (Olympus Corporation) из 28 фокальных плоскостей, расположенных на расстоянии 150 мкм, в глубину лунки (по оси z) как двадцати восьми 24-битным цветом TIFF-изображения с разрешением 2448-на-1920 пикселей при 72 тнд. Изображение каждой фокальной плоскости из каждой лунки обрабатывалось с использованием пользовательского скрипта R (R Core Team 2015 R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия, находится на www. R-project. org.) который использовал пакет 15 EBImage Bioconductor. Этот скрипт обнаруживал кисты в автоматическим и воспроизводимым способом и был применен ко всем анализам матригелей у всех доноров. Кратко, каждое изображение было экранировано от артефактов, прошло через фильтр верхних частот Лапласа и было сегментировано с помощью адаптивного порога. Обнаруженные объекты в сегментированных изображениях были дополнительно обработаны путем растяжения пикселей, заполнения отверстий и размывания пикселей. Были собраны статистические данные о размерах, радиусе и эксцентриситете на каждом сегментированном объекте. Объекты отфильтровывались, если они имели средний радиус меньше или равный 15 пикселям, или имели средний радиус объекта более 200 пикселей, или коэффициент изменения радиуса более 0,2 или если эксцентриситет обнаруженного объект был больше 0,75. Поскольку кисты часто были больше расстояния между фокальными плоскостями, был исключен подсчет таких кист более, чем один раз. Если объект кисты на одном изображении попадал в одинаковые x- и y-координаты, что и на соседнем изображении (например, одна фокальная плоскость выше по оси z), то это считалось одной и той же кистой. Все изображения в каждой лунке обрабатывались последовательно таким образом по оси z. В конечном счете, каждый объем кисты оценивался путем умножения среднего значения радиуса наибольшего объекта на 4/3πr, предполагая, что каждая киста является сферой.
Результаты представлены в таблице 3. Среднее значение для каждой группы обработки анти-miR-17 или контрольной группы обработки олигонуклеотидом нормализуется по среднему значению для группы обработки вектором без вставки. Указана стандартная ошибка среднего значения. Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента для попарных сравнений или дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим использованием апостериорного критерия Тьюки для множественного сравнения. Р-значения являются следующими: * означает значение p < 0,05, **означает значение p < 0,01, ***означает значение p < 0,005 ****означает значение p < 0,001. Для обработки анти-miR-17 р-значение указывает на значимость по отношению к обработке вектором без вставки. Для обработки контрольным олигонуклеотидом показаны два разных р-значения, одно из которых указывает на значимость по отношению к обработке вектором без вставки (р-значение 1 в таблице 3), а другое указывает на значимость по отношению к обработке 30 нМ анти-miR-17 (р-значение 2 в таблице 3).
Обработка анти-miR-17 вызывало дозозависимое уменьшение количества кист по сравнению с обработкой трансфекцией вектором без вставки. В отличие от обработки анти-miR-17, большинство обработок контрольными олигонуклеотидами не уменьшали последовательно количество кист в статистически значимом количестве.
В качестве примера, обработка кистозных эпителиальных культур от донора 3 с помощью 30 нМ анти-miR-17 снижало пролиферацию клеток на 63% по сравнению с трансфекцией вектором без вставки (р < 0,0001), тогда как обработка контрольными олигонуклеотидами не уменьшало последовательно количество кист в статистически значимом количестве. Дополнительно, при подсчете кист от одного и того же донора, сравнение обработки с использованием 30 нМ анти-miR-17 с каждой из трех контрольных обработок также показывает статистически значимое снижение пролиферации клеток в результате обработки анти-miR-17 (р < 0,0001).
Таблица 3: Количество кист
<b>Среднее количество кист на </b><b>донора</b>
<b>Обработка</b>
<b>ФСБ</b>
<b>Вектор без вставки</b>
<b>анти-miR-17</b>
<b>Контрольные олигонуклеотиды</b>
1 нМ
5 нМ
20 нМ
#130 нМ
#230 нМ
#330 нМ
#430 нМ
#530 нМ
Среднее значение для донора 3
0,85
1,00
0,86
0,65
0,37
0,79
1,11
0,90
0,53
0,86
СОС
0,04
0,02
0,04
0,03
0,05
0,05
0,02
0,06
0,03
0,05
p-значение 1
ns
***
****
*
ns
ns
****
ns
р-значение 2
****
****
****
ns
****
Среднее значение для донора 4
1,22
1,00
0,69
0,46
0,24
1,08
1,02
0,88
0,44
0,75
СОС
0,04
0,07
0,01
0,06
0,03
0,06
0,09
0,07
0,05
0,04
p-значение 1
*
****
****
ns
ns
ns
****
ns
р-значение 2
****
****
****
ns
***
Эти данные показывают, что обработка с использованием анти-miR-17 ингибирует пролиферацию кист, полученных от человеческих пациентов с АДПБП.
Пример 5: Анти-miR-17 в модели ПБП Pcy
Nphp3
Pkd2
F/F
У мышей Pcy, имеющих мутацию в , спонтанно развивалась поликистозная болезнь почек, с более медленным прогрессированием заболевания, чем наблюдалось у мышей Pkhd1/cre;. Модель Pcy используется как модель ПБП человека, так же как модель комплекса нефронофтиза/медуллярно-кистозной болезни почек (NPH/MCD). Модифицированный олигонуклеотид, комплементарный miR-17, (соединение анти-miR-17) испытывали на мышиной модели Pcy. Мышей дикого типа использовали в качестве контрольных мышей. Олигонуклеотид, комплементарный микроРНК, не связанный с miR-17, использовался в качестве контроля лечения на специфичность (анти-miR-контроля). Соединение анти-miR-17 представляло собой полностью тиофосфорилированный олигонуклеотид из 19 связанных нуклеозидов в длину (5'-CTGCACTGTAAGCACTTTG-3'; SEQ ID NO:15), с ДНК, сахарными компонентами 2'-MOE и S-cEt.
Мыши Pcy (CD1-pcylusm) были получены от PreClinOmic. С четырехнедельного возраста мышей Pcy лечили один раз в неделю анти-miR-17 (50 мг/кг посредством подкожной инъекции) или ФСБ, в общей сложности 26 доз. Группа, получавшая анти-miR-17, состояла из 12 мышей, а контрольная группа, получавшая ФСБ, состояла из 11 мышей.
Дополнительная контрольная группа включала мышей CD1 соответствующего возраста, полученных от Charles River Laboratories. Мышам CD1 подкожно вводили ФСБ один раз в неделю, в общей сложности в течении 26-ти недель.
По окончании 26-недельного периода лечения мышей умерщвляли и одну почку извлекали и взвешивали, а другую обрабатывали для гистологического анализа. Измеряли азот мочевины крови (АМК) и креатинин сыворотки.
Для гистологического анализа одну почку перфузировали с холодным ФСБ и 4% (масса/объем) параформальдегидом, а затем брали для анализа. Почки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 2 часов и затем заливали в парафин для изготовления срезов. Сагиттальные срезы почек окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Все этапы обработки изображений были автоматизированы и происходили на программном обеспечении, находящемся в свободном доступе: Скрипт R1, который использовал функции из пакета 2 EBImage Bioconductor и набор инструментов обработки изображений ImageMagick3. Изображения почки H&E в формате Aperio SVS были преобразованы в TIFF-изображения, а первый кадр был сохранен для анализа изображения. Сначала, общая площадь среза почек рассчитывалась с использованием сегментации изображения. Сегментацию изображений аналогичным образом использовали для нахождения всех внутренних структур, включая кисту почки. Применяли фильтр для удаления всех объектов, чей средний радиус меньше трех пикселей. Кистозный индекс представляет собой площадь изображения, связанного с кистами, разделенную на полную площадь почки. Кистозный индекс отдельно рассчитывали для продольных и поперечных срезов почек для каждого отдельного животного. Комбинированный кистозный индекс отдельных животных сравнивали для каждой группы лечения.
Результаты, полученные от мышей CD1, получавших ФСБ, использовали для установления контрольного показателя по каждому параметру (соотношению вес почки/вес тела, кистозному индексу, содержанию азота мочевины крови и креатинина сыворотки) на модели, не связанной с болезнью. Как и ожидалось, мыши CD1, получавшие лечение, не проявляли никаких патологий, связанных с ПБП.
Среднее соотношение веса почки к весу тела у мышей Pcy, получавших лечение анти-miR-17, было на 19% ниже среднего соотношения веса почки к весу тела у мышей Pcy, которым вводили только ФСБ (p=0,0003) (фиг. 2A). Мыши Pcy, получавшие лечение анти-miR-17, показали снижение кистозного индекса в среднем на 28% по сравнению с мышами Pcy, которым вводили только ФСБ (p=0,008) (фиг. 2B). Никаких значительных изменений в содержании АМК или креатинина сыворотки не наблюдалось. Показаны р-значения однофакторного анализа ANOVA после коррекций множественного сравнивания Даннета.
Эти данные демонстрируют на дополнительной модели ПБП, что лечение с использованием анти-miR-17 приводит к уменьшению веса почек и кистозного индекса.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  REGULUS THERAPEUTICS INC.
ПОПЕЧИТЕЛЬСКИЙ СОВЕТ  СИСТЕМЫ УНИВЕРСИТЕТ ТЕХАСА
<120>  СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ПОЛИКИСТОЗНОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК
<130>  01138-0021-00PCT
<150>  США 62/210,031
<151>  2015-08-26
<160>  32
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
caaagugcuu acagugcagg uag                                               23
<210>  2
<211>  84
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
gucagaauaa ugucaaagug cuuacagugc agguagugau augugcaucu acugcaguga       60
aggcacuugu agcauuaugg ugac                                              84
<210>  3
<211>  8
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(8)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  3
gcactttg                                                                 8
<210>  4
<211>  8
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(8)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  4
agcacttt                                                                 8
<210>  5
<211>  9
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(9)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  5
agcactttg                                                                9
<210>  6
<211>  10
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(10)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  6
aagcactttg                                                              10
<210>  7
<211>  11
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(11)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  7
taagcacttt g                                                            11
<210>  8
<211>  12
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(12)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  8
gtaagcactt tg                                                           12
<210>  9
<211>  13
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(13)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  9
tgtaagcact ttg                                                          13
<210>  10
<211>  14
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(14)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  10
ctgtaagcac tttg                                                         14
<210>  11
<211>  15
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(15)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  11
actgtaagca ctttg                                                        15
<210>  12
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(16)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  12
cactgtaagc actttg                                                       16
<210>  13
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(17)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  13
gcactgtaag cactttg                                                      17
<210>  14
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(18)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  14
tgcactgtaa gcactttg                                                     18
<210>  15
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(19)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  15
ctgcactgta agcactttg                                                    19
<210>  16
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(20)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  16
cctgcactgt aagcactttg                                                   20
<210>  17
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(21)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  17
acctgcactg taagcacttt g                                                 21
<210>  18
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(22)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  18
cacctgcact gtaagcactt tg                                                22
<210>  19
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  модифицированный олигонуклеотид
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(23)
<223>  Т независимо выбран из Т и U
<400>  19
ctacctgcac tgtaagcact ttg                                               23
<210>  20
<400>  20
000
<210>  21
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
uaaagugcuu auagugcagg uag                                               23
<210>  22
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  22
caaagugcuc auagugcagg uag                                               23
<210>  23
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  23
caaagugcug uucgugcagg uag                                               23
<210>  24
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  24
aaaagugcuu acagugcagg uag                                               23
<210>  25
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  25
uaaagugcug acagugcaga u                                                 21
<210>  26
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
uaaggugcau cuagugcaga uag                                               23
<210>  27
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  27
uaaggugcau cuagugcagu uag                                               23
<210>  28
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  28
ugugcaaauc uaugcaaaac uga                                               23
<210>  29
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  29
ugugcaaauc caugcaaaac uga                                               23
<210>  30
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  30
cauugcacuu gucucggucu ga                                                22
<210>  31
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  31
uauugcacuu gucccggccu gu                                                22
<210>  32
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  32
aauugcacgg uauccaucug ua                                                22
<---