СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD FOR PLATELETS FREEZING

Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для заготовки замороженных тромбоцитов.
Уровень техники
Известен способ замораживания богатой тромбоцитами плазмы без использования криопротекторов [патент РФ на изобретение «Способ криоконсервации богатой тромбоцитами плазмы» авторы Суханов В.А., Трофимов И.М., Левит А.Л., №2138162, 1999], согласно которому плазму помещают в контейнер с жидким азотом, располагают контейнер между двумя металлическими пластинами, после чего последовательно подвергают процессам замораживания и хранения, при этом процесс замораживания плазмы ведут при скорости 2-3°С/с. Однако этот способ не включает оценку параметров структурной полноценности и функциональной активности тромбоцитов человека.
Известен способ замораживания тромбоцитов с содержанием ДМСО в замороженных тромбоцитах 10% [Khuri S.F., Healey N., MacGregor H. et al. Comparison of the effects of transfusions of cryopreserved and liquid-preserved platelets on hemostasis and blood loss after cardiopulmonary bypass J Thorac Cardiovasc Surg 1999; 117: 172-84]. Однако данный способ предусматривает использование эндоцелюлярного криопротектора - ДМСО, что не позволяет достигнуть высокой степени сохранности тромбоцитов в замороженном состоянии.
11
9
9
Наиболее близким к заявляемому решению является способ замораживания тромбоцитов с ДМСО с последующим хранением клеток в замороженном состоянии при температуре минус 80°С [С. Robert Valery, Gina Rango, and Shukri Khuri Freezing human platelets with 6 percent dimethyl sulfoxide with removal of the supernatant solution before freezing and storage at -80°C without postthaw processing // Transfusion 2005; 45: 1890-1898]. Исходные тромбоцитные концентраты (ТК) получают путем аппаратного афереза на сепараторах Cobe Spectra и Amicus, общий объем ТК составляет 200-300 мл, содержание тромбоцитов - от 3,5 до 4,0×10 клеток в 1 дозе (концентрация 1,3-2,0×10 в мл). Оценка качества клеток ТК проводится перед замораживаем ТК и включает следующие параметры: количество тромбоцитов (10/мл); рН тромбоконцентрата, величину R-периода на тромбоэластограмме, агрегационную активность тромбоцитов (индукторы - 50 мкг/мл арахидоновой кислоты и 2 мкМоль/л АДФ); продукцию тромбоксана В2 после стимуляции 50 мкг/мл арахидоновой кислоты и 2 мкМоль/л АДФ; содержание аннексин-положительных тромбоцитов. Процедура подготовки ТК к замораживанию включает 4 технологических этапа: внесение криопротектора в дозу ТК; центрифугирование дозы ТК в присутствие криопротектора; удаление избытка криопротектора с бесклеточной плазмой после центрифугирования; ресуспендирование клеток ТК с криопротектором. В качестве криопротектора используют солевой раствор 27% ДМСО (эндоцитраный криопротектор), который добавляют к ТК при постоянном покачивании с частотой 180 колебаний в минуту до конечной концентрации 6% ДМСО в ТК. Затем ТК центрифугируют при 1250g в течение 10 минут с целью удаления супернатанта, содержащего избыток ДМСО. Весь супернатантный раствор удаляют. Это снижает остаточное количество ДМСО в замороженном ТК как минимум на 95%. Оставшийся осадок объемом 10-15 мл ресуспендируют покачиванием в течение 3-5 минут, контейнер с суспензией тромбоцитов помещают в защитный полимерный пакет, затем в картонную коробку и замораживают на дне механического морозильника при температуре минус 80°С.
Однако данный способ замораживания включает методы анализа тромбоцитов в ТК: агрегометрия, тромбоэластография и проточная цитометрия, которые не отражают структурную целостность тромбоцитов, что снижает достоверность общего анализа тромбоцитов перед замораживанием; использует только эндоцитарный (внутриклеточный) криопротектор ДМСО, который обладает низкой способностью к сохранению наружных мембранных структур клеток при заморозке, что повышает риск повреждения тромбоцитарных рецепторов; процедура подготовки ТК к криоконсервированию включает 4 последовательных технологических этапа, которые в сумме занимают 25-30 мин, что существенно повышает риск токсического действия ДМСО на тромбоциты.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа замораживания тромбоцитов для получения лечебных доз ТК длительного хранения с высокой сохранностью биологически полноценных тромбоцитов.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение качества получаемых после размораживания криоконсервированных тромбоцитов за счет комплекса используемых технологических операций, качественных и количественных параметров криопротектора и режимов, позволяющих сократить время контакта тромбоцитов с криопротектором, сохранить гораздо большее число биологически полноценных тромбоцитов (в 1,5-1,8 раза по сравнению с технологией по прототипу), хранить размороженные ТК при комнатной температуре в течение 4 часов без угрозы потери структурной или функциональной полноценности тромбоцитов, получить осмолярность дозы ТК, соответствующей физиологической норме, не вызывающей развития у пациентов посттрансфузионных реакций.
Поставленная задача решается тем, что способ замораживания тромбоцитов включает следующие этапы:
- отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК) с концентрацией тромбоцитов от 1×109/мл до 1,5×109/мл, содержащего функционально активные тромбоциты;
- разделение ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму с последующим отделением плазмы от тромбоцитсодержащей части;
- ресуспендирование тромбоцитсодержащей части предварительно приготовленным комбинированным криопротектором, который вводят в тромбоцитсодержащую часть по 1-3 мл с интервалами 1-3 минуты при постоянном перемешивании до конечной концентрации ДМСО в суспензии тромбоцитов от 5 до 7%;
- замораживание суспензии тромбоцитов и плазмы со скоростью 1-3°/мин в отдельных контейнерах в морозильной камере при температуре от минус 80°С до минус 100°С;
- хранение замороженных тромбоцитов и плазмы при температуре от минус 85°С до минус 196°С;
при этом комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМСО и 5% декстран 40, перед ресуспендированием тромбоцитсодержащей части предварительно разводят плазмой до конечной концентрации ДМСО от 10 до 15%.
Функционально активными в исходном ТК считают тромбоциты, которые соответствуют следующим параметрам: тромбоциты с гранулами от 40% до 70% и тромбоциты с адгезивной активностью от 40 до 70%.
Кроме того, разделение ТК на тромбоцитсодержащую часть и плазму может быть реализовано с помощью центрифугирования со скоростью от 1100g до 1400g в течение от 7 до 12 минут. В качестве криопротектора может быть использован DIMETYLSULFOXIDE/DEXTRAN 40 SOLUTION (Cryopreservative Solution) 5 ml. Ресуспендирование тромбоцитсодержащей части криопротектором осуществляют в течение от 9 до 12 минут.
В конкретном варианте осуществления изобретения исходный тромбоцитный концентрат отбирают объемом от 180 до 220 мл, для приготовления комбинированного криопротектора с конечной концентрации ДМСО от 10 до 15% исходный криопротектор разводят плазмой в объемном соотношении 1:9, ресуспендирование тромбоцитсодержащей части разведенным криопротектором для получения суспензии тромбоцитов с конечной концентрацией ДМСО от 5 до 7% осуществляют в объемном соотношении 1:1.
После размораживания измеряют следующие параметры тромбоцитов: количество тромбоцитов, количество тромбоцитов с гранулами и количество адгезивно активных тромбоцитов. Данную информацию наносят на контейнер для последующего выбора контейнера с необходимыми параметрами для транфузии конкретному пациенту в зависимости от его антропометрических характеристик.
Таким образом, поставленная задача решается за счет внедрения в технологию замораживания тромбоцитов адекватных методов анализа структурной целостности и функциональной активности тромбоцитов, использование комбинированного (эндоцитарного и экзоцитарного) криопротектора, предварительное разделение ТК путем центрифугирования на тромбоцитную часть и бедную тромбоцитами плазму с последующим замораживанием тромбоцитной части и бедной тромбоцитами плазмы при температуре минус 80°С, хранение замороженного ТК при температуре от минус 80°С до минус 196°С от 180 суток до 24 месяцев с целью карантинизации тромбоцитов и плазмы.
Использование адекватного метода морфофункционального анализа тромбоцитов человека позволило оптимизировать оценку качества клеток в ТК на разных этапах криоконсервирования. В качестве такого приема был предложен разработанный ранее способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека [Патент РФ на изобретение №2485502 «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека», авторы Хубутия М.Ш., Макаров М.С., Хватов В.Б., Высочин И.В., Кобзева Е.Н., Боровкова Н.В., Конюшко О.И., 20.06.2013], основанный на витальном (прижизненном) окрашивании тромбоцитов флуорохромным красителем на основе трипафлавина и акридинового оранжевого с последующим их анализом во флуоресцентном микроскопе. Данный метод позволяет параллельно оценить структурную целостность и функциональную активность тромбоцитов независимо от их концентрации в пробе. Таким образом, используя данный метод, появляется возможность оценить общее содержание биологически Полноценных тромбоцитов в исследуемом ТК. Проведенные исследования показывают, что биологически полноценными (с нормальной структурой и функциями) являются лишь те тромбоциты, в которых при витальном окрашивании отчетливо выявляются гранулы - не менее 3 гранул диаметром более 300 мкм на клетку во флуоресцентном микроскопе, яркость свечения клетки - не менее 40 фут-кандел (Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Высочин И.В., Боровкова Н.В., Хватов В.Б. Морфофункциональный анализ тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - №9. - С. 388-391). Следовательно, оценка содержания тромбоцитов с гранулами может быть использована для контроля качества клеток ТК (до и после криоконсервирования).
При экспозиции, богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) с ДМСО в конечной концентрации от 0,5 до 20% при комнатной температуре, было установлено, что в процессе контакта с ДМСО биологическая полноценность клеток БоТП снижается, параллельно с этим уменьшается содержание тромбоцитов с гранулами (табл. 1). Так, при 0,5% ДМСО содержание тромбоцитов с гранулами в БоТП практически не менялось в течение 2 часов при комнатной температуре, через 4 часа снижалась на 7-10%, через 20 часов - на 70%. При концентрации ДМСО от 1 до 20% динамика снижения числа тромбоцитов с гранулами была сходной в течение первых двух часов: через 1 час потеря тромбоцитов с гранулами составила 10-20%, через 2 часа - 40-50%, через 4 часа - от 60 до 80%, через 20 часов тромбоциты с гранулами в БоТП полностью отсутствовали. Еще более выраженной динамика снижения тромбоцитов с гранулами была при 10-20% ДМСО: через 2 часа потеря тромбоцитов с гранулами составила 55-65%, через 4 часа - 90-99%. Стоит особо отметить, что при концентрации ДМСО 5% и выше адгезивная активность тромбоцитов с гранулами падает гораздо быстрее, чем их содержание. Этот эффект становится выражен уже при концентрации ДМСО 2% и выше. При использовании 5% ДМСО после 30 мин экспозиции адгезивная активность тромбоцитов снижалась в среднем в 2 раза (табл. 2). Таким образом, уже через 30 мин экспозиции БоТП с 5% ДМСО при комнатной температуре в среднем 50% тромбоцитов с гранулами не проявляли функциональной активности. Это указывает на то, что время контакта тромбоцитов с 5% ДМСО при комнатной температуре должно быть минимизировано. С другой стороны, при концентрации 0,3-0,5% ДМСО биологическая полноценность тромбоцитов практически не нарушается в течение нескольких часов. Следовательно, разведение размороженных ДМСО-содержащих ТК до концентрации 0,3-0,5% ДМСО позволит сохранить их структурную и функциональную полноценность в течение 4-6 часов после разморозки.
В процессе проведения научно-исследовательской работы была разработана процедура замораживания ТК, при которой время контакта тромбоцитов под действием ДМСО было минимизировано. Был выбран комбинированный стерильный криоконсервирующий раствор, содержащий 55% ДМСО (эндоцитарный криопротектор) и 5% декстран (экзоцитарный криопротектор), который позволяет адекватно проводить заморозку клеток и межклеточной среды. Вносить криопротектор в ТК предлагается после его центрифугирования и разделения на тромбоцитсодержащую часть и бедную тромбоцитами плазму. Для получения бедной тромбоцитами плазмы ТК необходимо подвергнуть центрифугированию при ускорении 1250 g. Проведенные ранее исследования показали, что центрифугирование БоТП и ТК с ускорением от 500g до 2000g значимо не влияет на содержание клеток с гранулами [Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Боровкова Н.В., Хватов В.Б. Влияние центрифугирования на биологическую полноценность тромбоцитов человека // Вестник службы крови России. - 2015. - №1. - С. 41-44]. Как и в прототипе, объем полученной тромбоцитсодержащей части составлял 10-15 мл. Однако, в отличие от прототипа, вносили комбинированный криопротектор на основе ДМСО и декстрана уже после центрифугирования и отделения бедной тромбоцитами плазмы. Общая продолжительность этой процедуры составляет 8-12 мин, тогда как в прототипе - от 25 до 30 минут. Таким образом, заявляемая технология в 2,5-3,0 раза сокращает время контакта тромбоцитов с криопротектором.
Было проведено сравнение качества тромбоцитов в криоконсервированных ТК, полученных с помощью технологии-прототипа и с помощью заявляемой технологии (таблица 3.). Для оценки эффективности криоконсервирования тромбоцитов решено было определять сохранность тромбоцитов с гранулами и сохранность их адгезивной активности. Было установлено, что заявляемая технология позволяет сохранить гораздо большее число биологически полноценных тромбоцитов (в 1,5-1,8 раза), чем технология-прототип. Разведение криконсервированных ТК осуществляли с помощью бесклеточной плазмы того же донора, которую параллельно замораживали (без криопротектора), а затем размораживали. Объем размороженной плазмы составлял 90-100 мл, что позволяло развести тромбоцитсодержащую часть ТК в 10 раз, снижая концентрацию ДМСО в ней до 0,4-0,6%. В то же время в прототипе концентрация ДМСО составляет 2,5-3%, осмолярность - более 800 мОсмоль/л, что является токсичным для тромбоцитов человека. При этом для дилюции ТК используется 0,9% раствор хлорида натрия, не обладающий буферными свойствами и не препятствующий закислению среды. В результате хранение размороженных ТК, полученных по технологии-прототипу, сопровождается выраженным снижением структурной и функциональной полноценности тромбоцитов. Так, через 1 час хранения в размороженных ТК адгезивная активность клеток снижается на 70%, через 2 часа - на 90%, через 4 часа - на 95-98% (фиг. 1). Это указывает на неэффективность хранения ТК (в прототипе) при комнатной температуре. Напротив, при разведении тромбоцитсодержащей части ТК бесклеточной плазмой (предлагаемая технология) адгезивная активность тромбоцитов снижается через 4 часа лишь на 10% фиг. 1). Таким образом, появляется возможность хранения размороженных ТК при комнатной температуре в течение 4 часов без угрозы потери структурной или функциональной полноценности тромбоцитов. Осмолярность полученной дозы ТК составляет 360-380 мОсмоль/л, что соответствует физиологической норме и не вызывает развития у пациентов посттрансфузионных реакций.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется графиком, на котором представлена динамика изменения адгезивной активности тромбоцитов в размороженных ТК, приготовленных с использованием технологии-прототипа и заявляемой технологии.
Осуществление изобретения
Ниже представлено подробное описание заявляемого способа замораживания тромбоцитов с указанием в некоторых случаях конкретных значений параметров, которые не ограничивают заявляемое изобретение, а представлены лишь для лучшего понимания сущности изобретения. Заявляемый способ включает следующие этапы.
1. Отбор исходного тромбоцитного концентрата (ТК)
9
9
Отбор ТК, полученного методом афереза или из дозы крови, проводят по показателям: концентрация и морфофункциональный статус тромбоцитов. Концентрацию тромбоцитов в ТК определяют на геманализаторе. Функциональную активность тромбоцитов оценивают методом витального окрашивания. Для этого готовят витальный краситель для тромбоцитов путем разведения 10 мг трипафлавина и 20 мг акридинового оранжевого при комнатной температуре в 100 мл фосфатного буфера (рН - 7,2-7,4), окрашивают пробу ТК из расчета 200 мкл готового красителя на 1 мл пробы в течение 2-5 мин при комнатной температуре, после чего 5 мкл пробы с окрашенными тромбоцитами переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Витально окрашенный препарат анализируют во флуоресцентном микроскопе (объектив ×100, числовая апертура 0.6, λ возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. Анализируют изображения 100-200 клеток, определяют содержание тромбоцитов с гранулами (в %) и адгезивную активность тромбоцитов (в %). Для криоконсервирования используют ТК, содержащие от 1×10/мл до 1,5×10/мл тромбоцитов, имеющие тромбоциты с гранулами от 40% до 70% и тромбоциты с адгезивной активностью от 40% до 70%.
2. Фракционирование ТК
Для концентрирования тромбоцитов ТК центрифугируют со скоростью от 1100g до 1400g в течение от 7 до 12 минут. После центрифугирования получают надосадок (плазму бедную тромбоцитами) и тромбоцитсодержащую часть.
3. Приготовление (разведение) криопротектора
Набирают в 10 мл шприц от 1 до 3 мл комбинированного стерильного криопротектора («DIMETYLSULFOXIDE/DEXTRAN 40 SOLUTION (Cryopreservative Solution) 5 ml», содержащего 55% ДМСО и 5% декстран 40. Подсоединяют шприц с криопротектором к контейнеру, содержащему ТК, размещенному в плазмоэкстракторе. Набирают в шприц, содержащий криопротектор, от 10 до 12 мл плазмы. В результате разведения криопротектора концентрация ДМСО снижается в 5 раз.
4. Отделение плазмы от тромбоцитсодержащей части
Контейнер, содержащий надосадок (плазму бедную тромбоцитами) и тромбоцитсодержащую часть, помещают в плазмоэкстрактор и удаляют плазму в другой контейнер для последующего замораживания.
5. Ресуспендирование тромбоцитов криопротектором
Приготовленным криопротектором DIMETYLSULFOXIDE/DEXTRAN 40 SOLUTION (Cryopreservative Solution), содержащим 55% ДМСО и 5% декстран, предварительно разведенным плазмой до конечной концентрации ДМСО 10-15% (в соотношении 1:4), ресуспендируют тромбоцитсодержащую часть. Приготовленный криопротектор вводят по 2 мл с интервалами 2 минуты при постоянном перемешивании содержимого контейнера до достижения конечной концентрации ДМСО в суспензии тромбоцитов от 5 до 7%.
6. Замораживание тромбоцитов
Ресуспендированные криопротектором тромбоциты замораживают со скоростью 1-3°/мин в морозильной камере при температуре от минус 85°С до минус 100°С.
7. Хранение замороженных тромбоцитов
Замороженные тромбоциты хранят при температуре от минус 85°С до минус 196°С.
8. Контроль качества размороженных тромбоцитов.
Качество размороженных тромбоцитов определяют по параметрам: объем (от 180 до 220 мл), сохранность тромбоцитов не менее 75% от исходного, сохранность тромбоцитов с гранулами и тромбоцитов с адгезивной активностью не менее 50% от исходного.
Пример
9
Для получения замороженных тромбоцитов заготовили тромбоцитный концентрат (ТК) методом афереза на сепараторе крови Trima Accel. Объем ТК составил 200 мл, содержание тромбоцитов - 218×10/дозе, содержание тромбоцитов с гранулами - 51%, адгезивная активность тромбоцитов - 50%. ТК разделили на две равные части: одну часть (ТК №1) замораживали, используя технологию-прототип, другую (ТК №2) - используя предлагаемую технологию. Параметры качества криоконсервированных тромбоцитов представлены в таблице 4.
Анализ результатов хранения замороженных тромбоцитов показал, что заявляемая технология по сравнению с прототипом обеспечивает значимо большую сохранность жизнеспособных клеток в размороженных ТК. Так после размораживания тромбоцитов по предложенной технологии содержание жизнеспособных клеток было больше, чем в прототипе, в 2,5-3 раза.