Изучение антимикробной фотодинамической активности водных растворов наночастиц металлов

ХИМИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ

УДК 577.344.3

В.Б. Байбурин, Т.А. Шульгина, Е.С. Тучина, О.В. Нечаева, О.Г. Шаповал, Е.И. Тихомирова, Н.В. Беспалова, М.В. Корченова, О.А. Морозов

ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВОДНЫХ

РАСТВОРОВ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ

Проведено исследование антимикробной фотодинамической активности субингибирующих концентраций водных растворов наночастиц серебра и меди при фотодинамическом воздействии синего светодиодного излучения в отношении стандартного и клинического штамма Staphylococcus aureus. Наибольшая чувствительность к сочетанному воздействию излучения и наночастиц металлов проявил метициллинрезистентный клинический штамм золотистого стафилококка. Более выраженной антимикробной активностью характеризовались препараты, содержащие наночастицы серебра, которые могут рассматриваться как перспективные фотосенсибилизаторы для проведения фотодинамической терапии гнойно-воспалительных заболеваний.

Фотосенсибилизатор, Staphylococcus aureus, водные растворы наночастиц серебра и меди

V.B. Baibui in, T.A. Shulgina, E.S. Tuchina, O.V. Nechaeva, O.G. Shapoval, E.I. Tikhomirova, N.V. Bespalova, M.V. Korchenova, O.A. Morozov

ANTIMICROBIAL PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF AQUEOUS SOLUTIONS

OF METAL NANOPARTICLES

The paper provides the research data realting the combined antimicrobial activity of subinhibitory concentrations of argentum and copper nanoparticles aqueous solution and photodynamic action of blue light-emitting diode in terms of the standard and clinical strains of the Staphylococcus aureus. The clinical methicillin-resistant strain was most sensitive to the combined action. Preparations of argentum nanoparticles showed most effective antimicrobial activity. They can be considered as perspective photosensi-tizers for the photodynamic therapy of pyoinflammatory diseases.

Photosensitizer, Staphylococcus aureus, argentum and copper nanoparticles aqueous solution

Для лечения гнойно-воспалительных заболеваний помимо использования химиотера-певтических средств широкое применение находит фотодинамическая терапия [1, 2]. Это связано с необходимостью поиска новых эффективных и безопасных методик антимикробного воздействия.

Метод фотодинамической терапии основан на световой активации фотосенсибилизаторов лазерным излучением [3-6]. Фотосенсибилизаторы представляют собой специфические вещества, которые характеризуются избирательной чувствительностью к определенным длинам волн оптического диапазона.

В настоящее время известно более 1000 веществ, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов, которые имеют природное или синтетическое происхождение [7, 8].

Положительные результаты лечения гнойно-воспалительных заболеваний методом фотодинамической терапии показывают высокую эффективность данного метода в отношении аэробных, факультативно- и облигатноанаэробных бактерий, микроскопических грибов [9-12].

Отмечено отсутствие осложнений и развития устойчивости к антимикробной фотодинамической терапии, а также возможность проведения повторных курсов лечения [13, 14,]. Помимо этого установлена эффективность использования антимикробной фотодинамической терапии для лечения гнойно-восполительных заболеваний различной локализации, вызванных микроорганизмами, характеризующимися в том числе множественной антибиотикоустойчивостью [15-17].

К характеристикам эффективных фотосенсибилизаторов предъявляются определенные требования:

1. Химическая чистота и однородность состава.

2. Отсутствие темновой токсичности.

3. Высокая способность к аккумуляции в ткани-мишени.

4. Быстрая элиминация из организма больного.

5. Высокая фотохимическая активность, характеризующаяся высоким квантовым выходом синглетного кислорода.

6. Поглощение света в длинноволновой части спектра (600 - 800 нм), в которой биологические ткани наиболее прозрачны, с высоким коэффициентом экстинкции.

В последние годы были синтезированы десятки веществ, обладающих фотосенсибилизирую-щими свойствами. Основные классы фотосенсибилизаторов - это производные порфирина, бен-зопорфирина, хлорина, фталоцианина, а также текзафирины, порфицены, толуидин голубой, фтало-цианин алюминия. Однако поиски «идеального» фотосенсибилизатора пока продолжаются. В связи с этим целью нашей работы явилось изучение антимикробной фотодинамической активности субинги-бирующих концентраций водных растворов наночастиц серебра и меди в отношении стандартного и клинического штаммов золотистого стафилококка.

Материалы и методы

В качестве экспериментальной модели использовали клетки стандартного и клинического штаммов Staphylococcus aureus, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СГМУ им. В.И. Разумовского. Выбор данных микроорганизмов был связан с их ведущей ролью в развитии внебольничных и нозокомиальных гнойно-воспалительных заболеваний. Стандартный штамм S. aureus 209 P характеризовался метициллин-чувствительностью (MSSA), а клинический метициллинрезистентностью (MRSA). Для культивирования бактерий использовали универсальную плотную питательную среду - ГРМ-агар (Россия, Оболенск).

Для проведения опытов по фотодинамическому воздействию использовали светодиодный излучатель собственной конструкции с максимумом спектра испускания ^=405±20 нм и плотностью мощности 70 мВт/см2 [18]. По данным литературы именно такой диапазон излучения обладает аналь-гетическим, противовоспалительным, а также бактериостатическим действием и используется в медицинской практике для фотодинамической терапии. Во всех экспериментах режим излучения был непрерывный. Время облучения варьировали от 5 до 30 мин.

Для сенсибилизации бактериальных клеток использовали водные растворы наночастиц меди и серебра, содержащие стабилизатор - поверхностно активное вещество АОТ - диоктилсульфосук-цинат натрия, предоставленные ООО НПК «Наномет» (Москва) (табл. 1). В исследованиях применяли субингибирующие концентрации препаратов (0,5%), которые были установлены ранее экспериментальным путем [19].

Таблица 1

Содержание наночастиц металлов в растворах и стабилизатора ПАВ АОТ в растворах наночастиц металлов

Исходные Растворы Условные сокращения Содержание наночастиц металлов в 0,5% растворе, мкг/мл Содержание АОТ в 0,5% растворе, мМ

Сдд = 3,9 мМ, Саот = 37 мМ Ag1 2,11 0,185

Сдд = 4,3 мМ, Саот = 5 мМ Ag2 2,325 0,025

Сси = 0,25 мМ, Саот = 60 мМ Cu1 0,08 0,3

Сси = 0,25 мМ, Саот = 23 мМ Cu2 0,08 0,115

Оптическую плотность водных растворов наночастиц в рабочих концентрациях измеряли с помощью спектрофотометра Lambda 950 (PerkinElmer Ink., USA). Спектры регистрировались при комнатной температуре при толщине кварцевой кюветы 10 мм.

Для создания асептических условий иммунологический полистирольный 96-луночный планшет помещали в пластиковый корпус. Источник света располагали над ячейками планшета. Бактериальную взвесь готовили в стерильном физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности 5 Ед (ГИСК им. Тарасевича); конечная концентрация составляла 103 м.к./мл. Из разведения микроорганизмов 104 м.к./мл 0,1 мл взвеси вносили в 0,9 мл раствор наночастиц, инкубировали в течение 15 мин без доступа света. Из конечного разведения, а также из раствора наночастиц бактериальную взвесь в объеме 0,2 мл вносили в ячейки планшета.

Воздействие проводили на взвеси бактериальных клеток, находящейся в соответствующих ячейках последовательно увеличивая дозу излучения. Затем из каждой ячейки делали высев по 0,1 мл взвеси на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Контролем служили взвеси бактерий не обработанные наночастицами и не подвергнутые облучению. Посевы контрольных и облученных микроорганизмов инкубировали в течение 24-72 часов при 37 °С. Оценку влияния излучения на микроорганизмы проводили путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). Все эксперименты проводили в десятикратных повторностях.

Результаты и обсуждение При фотодинамическом воздействии важным условием генерации активных форм кислорода и свободных радикалов является совпадение максимума испускания источника излучения и максимума поглощения фотосенсибилизатора [2, 4, 15]. Для прогнозирования эффективности фотодинамического воздействия с использованием исследуемых образцов наночастиц измеряли оптическую плотность их водных суспензий в рабочих концентрациях.

Установлено, что раствор наночастиц серебра Ag1 имеет максимум поглощения в области 410 нм (0,707 отн.ед.). При этом оптическая плотность при длине волны 405 нм составила 0,702 отн. ед (рис. 1).

о

300 400 500 600

Длина волны, нм

-Agi -----Ag2---Cul---Cu2

Рис. 1. Спектры оптической плотности исследуемых наночастиц

Измерения суспензии наночастиц серебра Ag2 показали, что данный образец наночастиц имеет максимум поглощения в спектральном регионе 405-410 нм (1,557-1,564 отн. ед.). Оптическая плотность раствора при длине волны возбуждения 405 нм была выше, чем в предыдущем случае, и составила 1,557 отн. ед.

Спектральный анализ раствора наночастиц меди Cu1 выявил довольно широкую область с высоким поглощением от 300 до 400 нм. Оптическая плотность суспензии этого образца наночастиц при длине волны 405 нм составила 0,228 отн. ед. Установлено, что наночастицы меди Cu2 имеют аналогичный спектр с оптической плотностью раствора равной 0,197 отн. ед. при 405 нм.

Проведенные исследования показали, что использование выбранных образцов наночастиц в сочетании с синим (405 нм) светодиодным излучением может быть перспективным для антимикробного фотодинамического воздействия.

На следующем этапе исследовали действие синего (405 нм) светодиодного излучения на клетки стандартного штамма S. aureus 209 P. Показано, что фотовоздействие синим светом не вызывало существенного сокращения численности исследованного микроорганизма (рис. 2, А). Так воздействие в течение 5 мин приводило к снижению КОЕ на 9% относительно контроля, а время облучения 10 мин обуславливало сокращение показателя КОЕ на 22%. Действие синего излучения в течение 30 мин сокращало относительную численность исследованных бактерий на 39%.

Клинический штамм золотистого стафилококка (MRSA) демонстрировал большую восприимчивость к действию светодиодного синего излучения (рис. 2, Б). Экспозиция света в течение 1015 мин приводила к сокращению численности популяции бактерий на 35-47% по сравнению с контролем. Облучение длительностью 30 мин вызывало уменьшение числа КОЕ на 58%.

Обработка клеток S. aureus 209 P водным раствором наночастиц серебра Ag 1 вызывала существенное усиление действия светодиодного излучения (рис. 3). После 5 мин экспозиции численность бактерий сокращалась на 41%, после 15 мин - на 88%, после 30 мин - на 97% (рис. 2, А). Использование водного раствора наночастиц серебра Ag2 обеспечивало более выраженное подавляющее действие на клетки S. aureus 209 P в течение первых 5-10 мин облучения: уменьшение числа КОЕ отмечено на 51-75%. При дальнейшем увеличении времени облучения снижение численности отмечено на 82% после 15 мин и на 96% после 30 мин (рис. 2, А).

£ 120

i 100 J 80 60 40 Н 20 0

й

30

Время, мин

А

80 -60 -40 -20 0

10

15

30

Время, мин

1405 нм "405 нм + Ag1 П405 нм + Ag2 П405 нм + Cu1 П405 нм + Cu2

Б

Рис. 2. Влияние синего (405 нм) светодиодного излучения и наночастиц на численность микроорганизмов: А - MSSA ; Б - MRSA

0

0

5

Рис. 3. Чашки Петри с колониями S. aureus 209 P: А - контроль; Б - после обработки наночастицами Agi и облучении синим светом 15 мин

Сходная динамика изменения численности бактерий при использовании двух образцов водных растворов наночастиц серебра и облучении светодиодным синим излучением отмечена для ме-тициллинрезистентного штамма S. aureus. При варьировании времени облучения от 5 до 30 мин снижение числа КОЕ происходило в среднем на 60-98% (рис. 2, Б).

Необходимо отметить, что сокращение числа микроорганизмов двух исследованных штаммов, клетки которых были обработаны наночастицами серебра и подвергнуты облучению в течение 15-30 мин, не имело достоверных различий друг с другом. Незначительное усиление эффекта (2-3%) в случае с образцом наночастиц Ag 1 можно объяснить более высоким содержанием ПАВ АОТ, который обладает незначительным токсическим действием.

На следующем этапе было изучено действие водных растворов наночастиц меди Cu1 на выживаемость S. aureus 209 P. Установлено, что данные наночастицы усиливают действие синего (405 нм) излучения. Снижение КОЕ после 5 мин воздействия отмечено на 47%, после 30 мин - на 95% (рис. 2, А). Образец наночастиц меди Cu2 обладал менее выраженными фотодинамическими свойствами. Уменьшение численность S. aureus 209 P происходило на 35 - 75% после 5 - 30 мин облучения синим светом (рис. 2, А).

Для клинического штамма S. aureus эффект усиления фотодинамического действия синего излучения водными растворами наночастиц меди был более выражен. Сокращение численности КОЕ бактерий в случае использования образца Cu1 показано на 44% после 5 мин облучения, на 71% после 10 мин, на 81% после 15 мин и на 96% после 30 мин (рис. 2, Б). Использование образца водного раствора наночастиц меди Cu2 также вызывало гибель бактериальной популяции. Снижение численности микроорганизмов происходило на 77% после 15 мин облучения синим светом и на 84% после 30 мин (рис. 2, Б).

Как видно из приведенных данных в таблице 1, содержание стабилизатора АОТ в образце Cu1 водного раствора наночастиц меди в 2 раза выше, чем в образце Cu2, с чем, вероятно, и связано более эффективное снижение числа КОЕ исследованных микроорганизмов.

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что наибольшую фотодинамическую активность в отношении исследованных штаммов проявляли водный раствор наноча-стиц серебра образца Ag2, причем наиболее чувствительным к ним оказался метициллинрезистент-ный клинический штамм S. aureus. Поскольку по данным производителя в соответствии с паспортом качества срок годности наночастиц составляет до 2-х лет с даты изготовления, то полученные нами результаты позволяют рассматривать водные растворы наночастиц серебра и меди в качестве перспективных фотосенсибилизаторов для усиления эффекта действия синего излучения на возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний при проведении антимикробной фотодинамической терапии.

Авторы выражают признательность проф., д-ру физ.-мат. наук Кочубею В.И. за спектральный анализ образцов наночастиц, а также доценту, канд. физ.-мат. наук Долотову Л.Е. за разработку источника светодиодного излучения и помощь при проведении экспериментов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Толстых П.И., Тамразова О.Б., Кулешов И.Ю. и др. Лазерная фотодинамическая терапия гнойных ран с фотосенсибилизатором хлоринового ряда // Хирургия. 2010. № 12. С. 17-22.

2. Васильев Н. Е., Огиренко А. П. Антимикробная фотодинамическая терапия // Лазерная медицина. 2002. № 6 (1). С. 32-38.

3. Беликов А.В., Скрипник А.В. Лазерные биомедицинские технологии: Учебное пособие: В 2-х ч. СПб: СПбГУ ИТМО. 2008. 116 с.

4. Гейниц А.В., Сорокатый А.Е., Ягудаев Д.М. и др. Современный взгляд на механизм фотодинамической терапии. Фотосенсибилизаторы и их биодоступность // Урология. 2006. № 5. С. 94-98.

5. Шин Ф.Е., Толстых П.И., Странадко Е.Ф. и др. Фотодинамическая терапия экспериментальных ожоговых ран // Лазерная медицина. 2009. № 13. С. 55-59.

6. Braham P., Herron C., Street C. et al. Antimicrobial photodynamic therapy may promote periodontal healing through multiple mechanisms // Journal of Periodontology 2009. Vol. 80, № 11. Р. 17901798.

7. Бондаренко В.М., Николаева Е.В., Кузиков А.Н. и др. Эффект фотодинамического воздействия металлокомплексов производных хлорина Е6 на условно-патогенные бактерии с использованием сверхъярких светодиодов «холодного» белого света // Лазерная медицина. 2008. № 12. С. 2630.

8. Kassab K., Ben Amor T., Jori G. et al. Photosensitisation of Colpoda inflata by meso-substituted cationic porphyrins // Photochemistry and Photobiological Sciences. 2002. № 1. P. 560-564.

9. Анфимова Н. А. Фотодинамическая терапия: патогенетическое обоснование эффективности при вульгарных угрях // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. 2005. № 5. С. 35-40.

10. Дуванский В.А. Фотодинамическая терапия в комплексном лечении больных с острыми гнойными заболеваниями мягких тканей // Лазерная медицина. 2003. № 7 (3-4). С. 41-45.

11. Donnelly R.F., McCarron P.A., Tunney M.M. Antifungal photodynamic therapy // Microbiological Research. 2008. Vol. 163. Р. 1-12.

12. Westergren H., Westergren V., Forsum U. Propionebacterium acnes in cultures from ventriculo-peritoneal shunts: infection or contamination? // Acta Neurochirurgica. 1997. Vol. 139. P. 33-36.

13. Брофман A.B., Сандул A.M., Нахаба В.А. и др. Влияние гелий-неонового и ультрафиолетового лазерного излучения па стафилококковую микробную флору при гнойных гайморитах // Здравоохранение. 1989. № 4. С. 14-16.

14. Корабоев У.М., Толстых М.П., Дуванский В.А. Изучение антибактериальной активности ФДТ на заживление ран // Лазерная медицина. 2001. Том. 5, Вып. 2. С. 23-27.

15. Странадко Е.Ф. Гастродуоденальный геликобактериоз и ассоциированные с ним заболевания как объекты для фотодинамической терапии // Лазерная медицина. 2002. № 6. С. 53-58.

16. Туровский А.Б. Эффективность антибактериальной терапии нозокомиального синусита в отделениях реанимации и интенсивной терапии / А. Б. Туровский // Справочник поликлинического врача. 2008. №2. С. 37-38.

17. Bonten M., Gaillard C. Ventilator-associated pneumonia: do the bacteria come from the stomach? / M. Bonten, // Netherlands Journal of Medicine. 1995. № 46. P. 1-3.

18. Тучина Е.С., Петров П.О., Кочубей В.И., Тучин В.В. Фотодинамическое воздействие на микроорганизмы с использованием синего (405 нм) излучения и наночастиц оксида железа (III) // Известия Саратовского университета. «Серия Химия. Биология. Экология». Изд-во Саратовского ун-та, 2012. № 1. Т. 12. С. 61-66.

19. Шульгина Т.А., Нечаева О.В. Анализ эффективности действия нанопрепаратов на основе водных растворов на биологическую активность грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов // Вестник Костромского государственного университета имени Н.А. Некрасова. 2014. № 4, Т. 20. С. 31-36.

Байбурин Вил Бариевич - Vil B. Baiburin -

доктор физико-математических наук, профессор, Dr. Sc., Professor

заведующий кафедрой «Информационная Head: Department of Information Security

безопасность автоматизированных систем» of Automated Systems,

Саратовского государственного технического Yuri Gagarin State Technical University of Saratov университета имени Гагарина Ю.А. 86

Шульгина Татьяна Андреевна -

биолог отдела лабораторной диагностики Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии

Тучина Елена Святославовна -

кандидат биологических наук, доцент кафедры «Биохимии и биофизики» Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Нечаева Ольга Викторовна -

кандидат биологических наук, ассистент кафедры «Микробиологии, вирусологии и иммунологии» Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского

Шаповал Ольга Георгиевна -

кандидат медицинских наук, ассистент кафедры «Микробиологии, вирусологии и иммунологии» Саратовского государственного медицинского университета им. В.И.Разумовского

Тихомирова Елена Ивановна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Экология» Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А.

Tatiana A. Shulgina -

Biologist

Department of Laboratory Diagnostics, Saratov R&D Institute of Traumatology and Orthopaedics

Elena S. Tuchina -

Ph. D., Associate Professor Department Biochemistry and Biophysics, Chernyshevsky Saratov State University

Olga V. Nechaeva -

Ph. D., Assistant Lecturer Department of Microbiology, Virology and Immunology,

V.I. Razumovsky Saratov State Medical University

Olga G. Shapoval -

Ph. D., Assistant Lecturer Department of Microbiology, Virology and Immunology,

V.I. Razumovsky Saratov State Medical University

Elena I. Tikhomirova -

Dr. Sc. Professor

Head: Department of Ecology

Yuri Gagarin State Technical University of Saratov

Беспалова Наталья Викторовна -

кандидат физико-математических наук, доцент кафедры «Информационная безопасность автоматизированных систем» Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А.

Корченова Мария Владимировна -

студентка биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Морозов Олег Алексеевич -

студент биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Статья,

Natalya V. Bespalova -

Ph. D., Associate Professor Department of Information Security of Automated Systems,

Yuri Gagarin State Technical University of Saratov

Mariya V. Korchenova -

Undergraduate, Department of Biology, Chernyshevsky Saratov State University

Oleg A. Morozov -

Undergraduate, Department of Biology, Chernyshevsky Saratov State University

пила в редакцию 12.10.14, принята к опубликованию 25.12.14