СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЦВЕТКАХ БАРХАТЦЕВ ОТКЛОНЕННЫХ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF SUM OF FLAVONOIDS IN SPREADING MARIGOLD FLOWERS

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных (Tagetes patula L.).
В настоящее время, система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах. Полученные данные позволяют объективно и селективно определять содержание целевых соединений (1).
Бархатцы отклоненные (Tagetes patula L.) - представитель рода Бархатцы (Tagetes L.) семейства Астровые (Asteraceae), или Сложноцветные (Compositae). Цветки бархатцев отклоненных широко используются в различных сферах народного хозяйства (пищевой, парфюмерно-косметической, парафармацевтической промышленности), а также имеется существенный опыт применения в народной медицине. Известно, что растения рода Бархатцы являются перспективным источником таких биологически активных соединений, как: флавоноиды, простые фенолы, эфирное масло, витамины (каротиноиды) (2, 3). В этой связи, на наш взгляд, этот вид представляет интерес, как потенциальное лекарственное растение.
Обзор литературы показал возможность стандартизации цветков бархатцев отклоненных при проведении количественного определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофоометрии в пересчете на патулетин. Извлечение получали методом трехкратной экстракции 40% этиловым спиртом с последующим упариванием, и последовательной обработкой гексаном, ацетоном, хлороформом, диэтиловым эфиром и другими элюентами. При этом определено, что содержание флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных достигает 2,98%±0,06% в пересчете на патулетин. Принимая во внимание достаточную трудоемкость в ходе проведения пробоподготовки (трехкратная экстракция сырья), большой объем вспомогательных операций, в том числе по экстракции, упариванию, фильтрованию, актуальным является продолжение исследований в направлении создания оптимальной методики определения содержания суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных (3).
Кроме того, известен способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин в траве хвоща полевого с использованием дифференциальной спектрофотометрии (1). Данная методика включает такие стадии, как экстракцию сырья 70% этиловым спиртом, реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 430 нм и расчет содержания суммы флавоноидов на основе значений оптической плотности комплекса государственного стандартного образца кверцетина с алюминием хлоридом. Данный метод взят нами в качестве прототипа для разработки метода количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных.
Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных, обладающего высокой специфичностью и точностью.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных в пересчете на кверцетин.
Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 80% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100, время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 30 мин, степень измельчения сырья - 2 мм, реакция комплексообразования с хлоридом алюминия в течение 30 мин. Количественное определение суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных проводят при длине волны 434 нм в пересчете на кверцетин; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца кверцетина;
m - масса сырья, г;
o
m - масса Государственного стандартного образца кверцетина, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.
В случае отсутствия стандартного образца кверцетина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 434 нм - 789:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
o
m - масса ГСО кверцетина, г;
789 - теоретическое значение удельного показателя поглощения при 434 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно кверцетин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из цветков бархатцев отклоненных. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения бархатцев отклоненных наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов - Фигура 1, как и в случае кверцетина - Фигура 2, где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из цветков бархатцев отклоненных или исходный раствор кверцетина соответственно, а кривая 2 - раствор водно-спиртового извлечения из цветков бархатцев отклоненных в присутствии алюминия хлорида или раствор кверцетина в присутствии алюминия хлорида соответственно.
Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор кверцетина, а кривая 2 -раствор кверцетина с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО кверцетина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 434 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из цветков бархатцев отклоненных в дифференциальном варианте на фигуре 3 обнаруживается при длине волны 434 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора кверцетина.
Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных при аналитической длине волны 434 нм.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода флавоноидов цветков бархатцев отклоненных от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 80% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 представлена зависимость выхода флавоноидов цветков бархатцев отклоненных от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 30 минут.
В таблице 3 представлена зависимость выхода флавоноидов цветков бархатцев отклоненных от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:100, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 80% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 30 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100.
Принимая по внимание тот факт, что специфическим для цветков бархатцев отклоненных является кверцетин, а максимумы поглощения раствора кверцетина и водно-спиртового извлечения цветков бархатцев отклоненных находятся в области 434 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин при длине волны 434 нм, причем с использованием стандартного образца кверцетина, позволяющего повысить объективность методики анализа.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 100 мл 80% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца кверцетина, добавляют к нему 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 434 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца кверцетина
Около 0,02 г (точная навеска) кверцетина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл 96% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А кверцетина). 1 мл раствора А кверцетина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б кверцетина).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 434 нм через 30 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
o
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца кверцетина;
m - масса сырья, г;
o
m - масса Государственного стандартного образца кверцетина, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.
В случае отсутствия стандартного образца кверцетина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 434 нм - 789:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
o
m - масса ГСО кверцетина, г;
789 - удельный показатель поглощения  ГСО кверцетина при 434 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья бархатцев отклоненных измельчают до размера частиц 2 мм (заготовлено в г. Самаре, Ботанический сад, сентябрь 2018 г.). 1,0006 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 100 мл 80% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца кверцетина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 434 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца кверцетина
0,0205 г кверцетина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл 96% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А кверцетина). После чего 1 мл раствора А кверцетина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 434 нм через 30 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где 0,5413 - оптическая плотность испытуемого раствора;
1,2947 - оптическая плотность раствора стандартного образца кверцетина;
1,0006 - масса сырья, г;
0,0205 - масса стандартного образца кверцетина, г.
10 - потеря в массе при высушивании, %.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин = 3,81%.
Пример 2.
При необходимости определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев отклоненных в отсутствии стандартного образца кверцетина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца кверцетина.
После измерения оптической плотности извлечения из цветков бархатцев отклоненных при длине волны 434 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения при 434 нм - 789.
где 0,5060 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,9973 - масса сырья, г;
789 - удельный показатель поглощения  - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца кверцетина при 434 нм;
10 - потеря в массе при высушивании, %.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин = 3,57%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±3,49%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин в цветках бархатцев отклоненных с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 80% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для цветков бархатцев отклоненных вещество - кверцетин.
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±3,49%.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа цветков бархатцев отклоненных {Tagetes patula L.).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. XIV изд. Т. I-IV. М., 2018. [Электронный ресурс] URL: http:// http://femb.ru/femb/pharmacopea.php (дата обращения: 05.02.2020).
2. Ломкина Е.М., Червонная Н.М., Оганесян Э.Т. Влияние экстракта бархатцев на заживление ран при сахарном диабете // Фармация. 2016. Т. 65, №3. С. 37-39.
3. Червонная Н.М., Андреева О.А., Аджиахметова С.Л., Оганесян Э.Т. О содержании фенольных соединений в соцветиях бархатцев распростертых {Tagetes patula L.) // Химия растительного сырья. 2018. №3. С. 91-98.