ЭКСПРЕССИЯ МРНК МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ И РАСТВОРИМОЙ ИЗОФОРМ α-СУБЪЕДИНИЦЫ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 В ИНДУЦИРОВАННОЙ МОКРОТЕ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

Экспрессия мРНК мембраносвязанной и растворимой изоформ a-субъединицы рецептора интерлейкина-5 в индуцированной мокроте и периферической крови больных бронхиальной астмой

Сазонов А.Э., Иванчук И.И., Попова И.С., Деев И.А., Орлова Е.В., Агеева Е.С., Першина А.Г., Хитринская Е.Ю.

Expression of mRNA membrane-anchored and soluble isoforms of receptor of interleukin-5 a-subunit in induced sputum and peripheral blood in patients with bronchial asthma

SazonovA.E., Ivanchuk I.I., Popova I.S., DeyevI.A., Orlova Ye.V., Ageyeva Ye.S., Pershina A.G., Hitrinskaya Ye.Yu.

Проведена оценка экспрессии мРНК мембраносвязанной и растворимой изоформ рецептора интерлейкина-5 в периферической крови и мокроте больных бронхиальной астмой (БА) различной степени тяжести в периоды обострения и ремиссии (после проведенного лечения ингаляционными кортикостероидами). Обнаружена повышенная экспрессия обеих изоформ рецептора по сравнению с контролем, характеризуемая преимущественным образованием мембраносвязанной изоформы. Действие ингаляционных кортикостероидов приводит к повышению экспрессии мРНК растворимой и снижению мРНК мембраносвязанной изоформы рецептора в случае легкой и среднетяжелой БА, тогда как при тяжелой БА этот процесс менее выражен. Таким образом, воспаление при астме связано с дисрегуля-цией цитокинового звена, контролирующего эозинофилию, причем данное нарушение наблюдается как на уровне образования самого цитокина, так и его рецептора и наиболее выражено при тяжелой бронхиальной астме.

Ключевые слова: рецептор интерлейкина-5, бронхиальная астма, ингаляционные кортикостероиды.

Present study was intended to evaluate the expression of a-subunit of the receptor interleukin-5 mRNA: membrane-anchored and soluble isoforms in peripheral blood and induced sputum of atopic asthmatics with mild, maderate and severe forms at periods of the intensification and remissions (after treatment inhaled glucocorticoids). The higher level both membrane-anchored and soluble isoforms expression of asthmatics compared to healthy controls were found. Glucocorticoid treatment has been shown to increase the expression mRNA of soluble form and decrease the expression mRNA of membrane-anchored in mild and maderate asthma, but not severe asthma. Thus we speculate that inflammation in asthma is linked with disregulation of cytokines profile that control eosinophilia. This abnormality is observed in the process of cytokine and its reseptor syntheses its most evident in

severe form of bronchial asthma.

Key words: receptor of interleukin-5, bronchial asthma, inhaled corticosteroids.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Сазонов А.Э., Иванчук И.И., Попова И.С. и др.

УДК 616.248

Введение

эритропоэтину [3, 11]. а-Субъединица рецептора является интегральным мембранным гликопротеином, аминотерми-нальный участок которого расположен внутриклеточно и имеет единичный заякоренный в мембране домен [5]. Особенностью этой субъединицы является альтернативный сплайсинг ее мРНК, который приводит к образованию различных изоформ белка, обладающих антагонистическими свойствами: мембраносвязанная изоформа (мИЛ-5Ра) образует

Действие интерлейкина-5 (ИЛ-5) на клетку-мишень опосредуется через рецепторный комплекс к ИЛ-5, который состоит из двух нековалентно ассоциированных субъединиц - а и р, причем именно а-субъединица специфически связывает ИЛ-5, тогда как р-субъединица проводит сигнал в клетку [15, 16]. Рецептор ИЛ-5 (ИЛ-5Р) наряду с ИЛ-2, ИЛ-7, ГМ-КСФ, Г-КСФ относится к семейству цитокиновых рецепторов I типа и

Сазонов А.Э., Иванчук И.И., Попова И.С. и др.

комплекс с р-субъединицей, растворимая изоформа (рИЛ-5Ра) может связывать свободный ИЛ-5, блокируя его физиологическую активность [9, 15].

ИЛ-5 является ключевым фактором в созревании, диф-ференцировке и активации эозинофилов, поскольку его рецепторы экспрессируются преимущественно на этих клетках [13]. ИЛ-5 является основным и, возможно, единственным цитоки-ном, специфически вовлеченным в процесс продукции эозино-филов [14]. Эозинофилы играют важнейшую роль в поздней фазе воспаления при бронхиальной астме (БА) [2, 8, 10].

Воспаление при БА сопровождается эозинофильной инфильтрацией дыхательных путей, причем существует положительная корреляция между содержанием эозинофилов в стенке бронхов и степенью тяжести заболевания [4]. Эози-нофилы могут модулировать воспалительный процесс, продуцируя большое количество факторов, таких как токсические основные (щелочные) белки, липидные медиаторы, ци-токины и супероксид-анионы. Несмотря на то, что эозинофи-лию давно связывают с воспалением, молекулярные механизмы, быстро и специфически регулирующие уровень эози-нофилии, остаются малоизученными.

В связи с тем, что различные изоформы а-субъедини-цы рецептора ИЛ-5 могут по-разному влиять на эффекты ИЛ-5 в отношении эозинофилов, представляется актуальным оценить особенности экспрессии гена а-субъединицы рецептора ИЛ-5 в крови и мокроте пациентов с различной степенью тяжести БА.

Материал и методы

В ходе выполнения работы было обследовано 154 человека в возрасте от 7 до 64 лет, в том числе 30 здоровых и 124 больных БА с легкой, среднетяжелой и тяжелой формой. В исследование было включено сопоставимое количество лиц мужского и женского пола. Продолжительность заболевания пациентов на момент включения в исследование составила в среднем (12,3 ± 4,8) года. Ни один из включенных в исследование пациентов ранее не получал систематической противовоспалительной терапии с регулярным использованием ингаляционных глюкокортико-стероидов. Предварительно все обследуемые были разделены на три возрастные группы: 7-15 лет, 16-25 лет и старше 25 лет. Однако при оценке основных исследуемых параметров (экспрессия мРНК мИЛ-5Ра и рИЛ-5Ра) не было установлено межгрупповых различий по возрасту. Кроме того, по данным показателям не было выявлено различий между мужчинами и

Экспрессия мРНК мембраносвязанной и растворимой изоформ...

женщинами. Такие результаты позволили проводить сравнительный анализ данных только с учетом тяжести заболевания.

Верификация диагноза и определение степени тяжести заболевания проведены в соответствии с критериями документа GINA (2002) [7]. На основании этого документа были сформированы критерии включения и исключения для исследуемых и контрольной групп. Все пациенты имели не менее чем шестимесячный подтвержденный анамнез БА. Кроме того, у всех пациентов были определены положительные аллергопробы с одним и более аэроаллергенами.

До включения в исследуемые группы пациенты не имели острых респираторных заболеваний и в течение 4 нед, предшествовавших началу исследования, не принимали следующие препараты: глюкокортикостероиды (системные, ингаляционные, топические), антилейкотриеновые, пролонгированные теофиллины, пролонгированные Р2-агони-сты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб.

Исследования были проведены при первичном обращении к врачу (в период обострения) и спустя 12 нед после лечения (в стадию ремиссии). Фазы обострения и ремиссии были подтверждены клиническим диагнозом врача и данными функциональных тестов (ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 с, ПСВ - пиковая скорость выдоха). Функцию легких оценивали с помощью спирографа «MasterScope» («Erich Jaeger GmbH», Германия). Терапию назначали в соответствии со степенью тяжести заболевания: при легкой БА суточная доза флютиказона пропионата составляла 250 мкг, при среднетяжелой астме - 500 мкг, при тяжелой - 750 мкг.

Объектом исследования служили индуцированная мокрота и мононуклеары периферической крови, которые получали в период обострения и ремиссии. Индуцированную мокроту получали после ингаляции с 3-5%-м гипертоническим солевым раствором в течение 530 мин по методике Попова [12]. Образцы мокроты объемом до 2 мл собирали в пластиковые контейнеры, помещали в лед и в течение 2 ч замораживали при температуре -70 °С. Перед исследованием мокроту обрабатывали муколизином (раствор дитиотриола, Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва) согласно приложенной инструкции. Отбирали по 50 мкл суспензии клеток на анализ.

Периферическую кровь забирали из локтевой вены утром натощак в стерильную пробирку, смешивали с 3%-м ЭДТА (4:1), инкубировали 45-60 мин при температуре 37 °С. Образовавшийся над эритроцитами слой плазмы осторожно собирали пастеровской пипеткой и переносили в стериль-

ную пробирку. Добавляли 0,9%-й NaCl (1:1) и центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 10 мин. Затем удаляли супернатант и повторяли процедуру. Супернатант сливали, осадок клеток использовали для дальнейшего исследования.

Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения ДНК и РНК на колонках «QIAGEN RNA/DNA» («QIAGEN», Германия) согласно приложенной инструкции. Реакцию амплификации проводили в микроцентрифужных пробирках типа «Eppendorf» объемом 0,5 мл на автоматическом амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-технология», г. Москва). РТ-ПЦР (reverse transcription PCR) проводили с использованием набора «Titan One Tube RT-PCR System» («Roche Diagnostics GmbH», Германия) согласно приложенной инструкции. Использование данного набора позволяет проведение One-Step РТ-ПЦР (реакция обратной транскрипции с мРНК и амплификация кДНК в одной пробирке «в один шаг»). Такая реакция основана на принципе совместного использования AMV-ревертазы и Taq ДНК-по-лимеразы.

В настоящее время, по данным NCBI, существует семь известных последовательностей мРНК a-субъединицы рецептора ИЛ-5 [6]. Четыре из них кодируют растворимую изо-форму рецептора, три - мембраносвязанную. В представленном исследовании дизайн праймеров был выполнен таким образом, что одна пара праймеров была специфична для мРНК всех растворимых изоформ, а другая пара праймеров - для мРНК всех мембраносвязанных.

Для выполнения РТ-ПЦР использовали следующие праймеры:

для мРНК мИЛ-5Ра (размер продукта - 550 п.о.) -прямой -

5'-GCC CTT CAC GCC ATT GAT CAT-3';

5'-TCT TGA GAA CCC CAT ATC GAT-3'.

Полуколичественную оценку экспрессии мРНК проводили в сравнении с экспрессией гена глицеральдегид-3-фос-фат дегидрогеназы (GAPDH), для чего были подобраны следующие праймеры: прямой -

5'-GGG AAG CTC ACT GGC ATG GCC TTC C-3'; обратный -

5'-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-3'. Ген этого фермента относится к постоянно экспрессирую-щим (house keeping) генам, и его экспрессия является стабильной и постоянной во всех клетках организма. Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 2%-м агарозном геле. Изображения электрофореграмм получали с использованием стационарной видеосистемы и обрабатывали при помощи адаптированной компьютерной программы «Biotest D» с целью получения количественной информации по каждой пробе. В каждой серии экспериментов результат оценки экспрессии мРНК ГАФД принимали в качестве эталонной пробы, а количественное значение - за 100%. Количественные значения остальных проб в серии экспериментов оценивали относительно эталонной пробы и выражали в процентах.

Все праймеры были синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе («Биосет», г. Новосибирск).

Математические расчеты проводили с помощью пакета программ Statistica for Windows 5.0. Вычисляли медиану и квартели. Выявление межгрупповых различий проводили по критерию Краскала-Уоллиса с применением поправки Бон-ферони. В связи с тем, что распределение полученных цифровых данных не соответствовало нормальному, использовали непараметрический С-критерий Манна-Уитни для независимых совокупностей. Для оценки различий зависимых совокупностей использовали парный критерий Вилкоксона.

Результаты и обсуждение

обратный -

5'-ATC CTC CAG GGT CTC AAC TCC -3'; для мРНК рИЛ-5Ра (S1) (размер продукта - 500 п.о.) -прямой -

5'-TTG CTC TAC TAT AGG TAT GGC-3'; обратный -

Экспрессия мРНК мембраносвязанной изоформы а-субъединицы рецептора ИЛ-5 (мИЛ-5Ра), растворимой изоформы а-субъединицы рецептора ИЛ-5 (рИЛ-5Ра) в сыворотке крови и мокроте у пациентов с БА различной степени тяжести в период обострения и ремиссии

Данные, полученные при оценке экспрессии мИЛ-5Ра, рИЛ-5Ра в мокроте и периферической крови больных БА различной степени тяжести, представлены в таблице.

Степень тяжести БА Контрольная

Показатель Период Легкая Среднетяжелая Тяжелая группа

Сазонов А.Э., Иванчук И.И., Попова И.С. и др.

Экспрессия мРНК мембраносвязанной и растворимой изоформ.

мРНК О 32 Р1 = 0,002 31 р1 = 0,003 14 р1 = 0,004

рИЛ-5Ра, % (31-36) 0,001 р2 < 0,001 (25-35) 0,615 р2 < 0,001 (11-18) < 0,001 7

ская кровь)

мРНК рИЛ-5Ра, % (мокрота) О 25,5 (22-36) 0,017 р1 = 0,021 р = 0,001 25 (23-26) 0,008 р1 = 0,038 р2 = 0,005 17 (15-20) 0,001 Достоверные различия 16

Р 39,5 р1 = 0,007 39 р1 = 0,005 21,5 отсутствуют

(37-44,5) р < 0,001 (35-41) р2 < 0,001 (18-25) То же

мРНК О 17,5 р1 = 0,002 21 р1 = 0,003 78 р1 = 0,001

мИЛ-5Ра,% (16-23) 0,001 р < 0,001 (16-29,5) 0,605 р2 < 0,001 (65-84) < 0,001 4

ская кровь)

мРНК мИЛ-5Ра, % (мокрота) О 37 р1 = 0,007 34 р1 = 0,005 45 р1 = 0,001

(27,5-41) > 0,05 р = 0,011 (26-37) 0,678 р2 = 0,002 (36-47) 0,001 14

Р 33

Примечание. О - обострение; Р - ремиссия; п - количество обследованных пациентов; р - достоверность различий при сравнении показателей, полученных в обострении и ремиссии; р* - достоверность различий при сравнении показателей между исследуемыми группами, указана только для статистически значимых различий р - с контролем, р2 - с тяжелой бронхиальной астмой).

Во всех исследуемых случаях обнаружена повышенная экспрессия рецептора по сравнению с контролем, исключение составила экспрессия мРНК рИЛ-5Ра в мокроте больных с тяжелой степенью БА (ТБА), которая была ниже, чем у пациентов с легкой (ЛБА) и среднетяжелой (СБА) степенью в период обострения. После лечения эта разница стала еще более значимой за счет увеличения уровня мРНК рИЛ-5Ра у больных легкой и среднетяжелой БА.

В периферической крови больных ЛБА и СБА в стадии обострения экспрессия растворимой изоформы рецептора была выше, чем у больных с тяжелой степенью БА. В стадии ремиссии различия сохранялись, но повышенная экспрессия была определена и у больных ТБА. Уровень экспрессии мембраносвязанной изоформы рецептора у больных ТБА во всех случаях был выше, чем у больных ЛБА и СБА. Динамика мРНК изоформ рецептора на фоне лечения различалась в зависимости от изучаемого материала. Так, в период ремиссии в периферической крови у больных ЛБА экспрессия мРНК растворимой изоформы снижалась, у пациентов с СБА - не изменялась, с ТБА - повышалась. В мокроте всех пациентов с БА значения этого показателя только повышались.

Экспрессия мРНК мембраносвязанной изоформы рецептора после проведенного лечения повышалась в периферической крови и не изменялась в мокроте при ЛБА, снижалась в периферической крови и повышалась в мокроте при ТБА. При среднетяжелой БА изменений не зафиксировано.

В целом после лечения наблюдалось повышение экспрессии мРНК растворимой изоформы рецептора (особенно в мокроте) на фоне незначительной динамики экспрессии мРНК мембраносвязанной изоформы.

Если экспрессию мРНК обеих изоформ а-субъединицы рецептора принять за 100%, то процентное распределение экспрессии мембраносвязанной и растворимой изоформ не будет зависеть от общего количества эозинофилов и может быть более показательной характеристикой продукции рецептора. В периферической крови процентное распределение мРНК мИЛ-5Ра и мРНК рИЛ-5Ра при обострении заболевания выглядело следующим образом: для пациентов с ЛБА -37 и 63%; для пациентов с СБА - 45,9 и 54,1%; для пациентов с ТБА - 79,2 и 20,8% соответственно. В контрольной группе определялось 62,4% растворимой изоформы рецептора и 37,6% мембраносвязанной. Лечение ингаляционными кортикостероидами привело к тому, что при тяжелой БА мембраносвязанной и растворимой изоформ рецептора стало 58 и 42% соответственно, тогда как для ЛБА и СБА их соотношение почти не изменилось. В целом в периферической крови экспрессия мРНК мИЛ-5Ра и мРНК рИЛ-5Ра имели схожий характер, и только при обострении ТБА наблюдался грубый сдвиг в сторону преимущественного образования мембраносвязанной изоформы рецептора.

В индуцированной мокроте процентное распределение выглядело по-иному. У пациентов с ЛБА в период обострения заболевания мРНК рИЛ-5Ра было 44,7%, а в период ремиссии - 55%. У пациентов с СБА лечение кортикостероида-

ми также приводило к относительному повышению экспрессии мРНК растворимой изоформы рецептора от 43,3% при обострении до 54,6% в период ремиссии. И только при ТБА как в обострении, так и в ремиссии относительная экспрессия мРНК мембраносвязанной и растворимой изоформ оставалась на уровне 70-30%.

Можно заметить, что динамика соотношения форм рецептора на фоне лечения наблюдалась в периферической крови у пациентов с тяжелой формой заболевания и в мокроте у пациентов с легкой и среднетяжелой БА преимущественно за счет повышения экспрессии мРНК растворимой изоформы. У пациентов с ТБА в мокроте значительного повышения экспрессии мРНК рИЛ-5Ра не наблюдалось, при этом экспрессия мРНК мИЛ-5Ра в стадии ремиссии не только не снижалась по сравнению с обострением, но, напротив, повышалась. В связи с этим к особенностям ТБА можно отнести повышенную экспрессию мембраносвязанной изофор-мы рецептора по отношению к экспрессии растворимой изо-формы, которая наблюдается в период обострения и ремиссии заболевания.

Выводы

Таким образом, обострение БА характеризуется изменением продукции изоформ рецептора. Действие ингаляционных кортикостероидов приводит к восстановлению механизмов регуляции в случае легкой и среднетяжелой БА, что выражается в повышении экспрессии мРНК рИЛ-5Ра и снижении мРНК мИЛ-5Ра, тогда как при тяжелой БА этот процесс менее выражен. Ранее проведенные исследования показали значительное повышение продукции самого цитокина ИЛ-5 при БА [1]. Очевидно, что воспаление при астме связано с дисрегуляцией цитокинового звена, контролирующего эозинофилию, причем данное нарушение наблюдается как на уровне образования самого цитокина, так и его рецептора и наиболее выражено при тяжелой БА.

Литература

1. Сазонов А.Э., Петровский Ф.И., Иванчук И.И. и др. Экспрессия

интерлейкина-5 в мокроте больных бронхиальной астмой // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2003. Т. 135. № 4. С. 437-440.

2. Чучалин А.Г. Бронхиальная астма. М.: Медицина, 1997. Т. 1. C. 431; Т. 2. C. 399.

3. Bazan J.F. Structural desing and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. V. 87. P. 69346938

4. Bochner B.S., Luscinskas FW, Gimbrone M.A. et al. Adhesion of human basophils, eosinophils, and neutrophils to interleukin 1-activated human vascular endothelial cells: Contributions of endothelial cell adhesion molecules // J. Exp. Med. 1991. V. 173. P. 15531557.

5. Corrigan C.J. Allergy and allergic diseases / Editor by A.B. Kay. Blackwell Science, Oxford, 1997. V. 1. P. 143-159.

6. Gene of IL-5 receptor a [электронный ресурс]. Электрон. дан. Режим доступа: (http://www.ncbi.nih.gov/IEB/ Research/ Acembly/av.cgi?db=34&c=Gene&l=IL5RA).

7. Global Initiative for Asthma Workshop Report [электронный ресурс]. Электрон. дан. 2002. Режим доступа: (http://www.ginasth-ma.com/workshop.pdf).

8. Huber H.L. Koessler K.K. The pathology of bronchial asthma // Arch. Int. Med. 1922. V. 30. P. 689-697.

9. Johanson K, Appelbaum E., Doyle M. et al. Binding interactions of human interleukin 5 with its receptor a subunit // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 16. P. 9459-9471.

10. Kita H, Adolphson C.R., Gleich G.J. Allergy: principles and practice / Edited by E. Middleton, C.E. Reed, E.F. Ellis et al. 5th ed. St. Louis: Mosby, 1998. P. 240-260.

11. Miyajima A., Kitamura T., Harada N. et al. Cytokine receptors and signal transduction // Ann. Rev. Immunol. 1992. V. 10. P. 295-331.

12. Popov T.A., PizzichiniM.M., Pizzichini E. et al. Some technical factors influencing the induction sputum for cells analysis // Clin. Exp. Allergy. 1995. V. 8. P. 559-565.

13. Sehmi R., Wood L.J., Watson R. et al. Allergen-induced increases in IL-5 receptor a-subunit expression on bone marrow-derived CD34+ cells from asthmatic subjects. A novel marker of progenitor cell commitment towards eosinophilic differentiation // J. Clin. Invest. 1997. V. 100. P. 2466-2475.

14. Tanaka H, Komai M., Nagao K. et al. Role of IL-5 and eosinophils in allergen-induced airway remodeling in mice // Am. J. Res. Cell Mol. Biol. 2004. V. 31. P. 62-68.

15. Tavernier J., Tuypens T., Plaetinck G. et al. Molecular basis of the membrane-anchored and two soluble isoforms of the human inter-leukin-5 receptor subunit // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. V. 89. P.7041-7045.

16. Tavernier J., Tuypens T., Plaetinck G. et al. Interleukin-5 regulates the isoform expression of its own receptor a-subunit // Blood. 2000. V. 95. № 5. P. 1600-1607.

Поступила в редакцию 20.01.2005 г.