Структурный полиморфизм геномных островов, кодирующих резистентность к бета-лактамным антибиотикам, у коагулазонегативных стафилококков, выделенных в стационарах Российской Федерации

Структурный полиморфизм геномных островов, кодирующих резистентность к бета-лактамным антибиотикам, у коагулазонегативных стафилококков, выделенных в стационарах Российской Федерации

О. А. ДМИТРЕНКО', А. С. АНКИРСКАЯ2, Л. А. ЛЮБАСОВСКАЯ2,

О. В. КОВАЛИШЕНА3, Д. А. ПОПОВ4, В. В. ГОСТЕВ5, С. В. СИДОРЕНКО5

' Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

2 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

3 Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации, Нижний Новгород

4 Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

5 Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург

Structural Polymorphism of Genome Islands Encoding Resistance to Beta-Lactams in Coagulase-Negative Staphylococci Isolated at Hospitals of the Russian Federation

O. A. DMITRENKO, A. S. ANKIRSKAYA, L. A. LYUBASOVSKAYA, O. V. KOVALISHENA, D. A. POPOV, V. V. GOSTEV, S. V. SIDORENKO

N. F. Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Moscow V. I. Kulakov Scientific Centre of Obstetries, Gynecology and Perinatology, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Moscow Nizhegorodskaya State Medical Academy, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Nizhny Novgorod A. N. Bakulev Scientific Centre for Cardiovascular Surgery, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Moscow Research Institute of Children's Infections, Federal Medical and Biological Agency, St. Petersburg

Коагулазонегативные стафилококки (coagulase-negative staphylococci — CoNS) рассматриваются как резервуар мобильных генетических элементов и, в первую очередь, стафилококковой хромосомной кассеты (staphylococcal cassette chromosome mec — SCCmec), определяющей устойчивость стафилококков к бета-лактамным антибиотикам. Среди 95 изоля-тов, выделенных в различных регионах Российской Федерации, были SCCmec кассеты II, IV, IVa, V, VII и VIII типов. Выявлены также кассеты подтипов CIa, CIb, CIc и CI (комплекс mec класса B, и два комплекса рекомбиназ ccrl и ccr2). Выявлены и другие типы кассет, содержащие комплексы mec классов A, C1 и С2 в сочетании с различными генами рекомбиназ. У изолятов S.epidermidis преобладали кассеты, несущие комплекс mec B, а у изолятов S.haemolyticus присутствовали кассеты, несущие комплекс mec классов C1 и C2. Из 9 изолятов S.hominis — пять несли новый тип кассет: комплекс mec класса A в сочетании с комплексом генов рекомбиназ ccrl. Не удалось идентифицировать SCCmec у представителей S.capitis и S.pasteuri. У представителей этих видов были выявлены либо комплекс mec (S.pasteuri — 1 изолят), либо комплексы рекомбиназ S.capitis (2 изолята). Выявленные у CoNS варианты SCCmec могут служить источником для формирования новых генетических линий метициллинорезистентных S.aureus (MRSA).

Ключевые слова: коагулазонегативные стафилококки, устойчивость к метициллину, стафилококковая хромосомная кассета SCCmec.

Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are considered as a reservoir of mobile genetic elements and first of all of the staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), defining staphylococci resistance to beta-lactams. Types II, IV, IVa, V, VII and VIII SCCmec were detected among 95 staphylococcal strains isolated in different regions of the Russian Federation. Subtypes Cla, Clb, Clc and Cl SCCmec were also identified (class B mec complex and two complexes of ccrl and ccr2 genes recombinases). Some other cassette types carrying A, C1 and C2 classes of the mec complexes in combination with various recombinase genes were detected. The S.epidermidis isolates mainly formed cassettes carrying mec complex B, while the S.haemolyticus isolates had cassettes carrying classes C1 and C2 mec complex. Out of 9 isolates of S.hominis 5 isolates carried a new type cassette: class A mec complex in combination with the complex of the recombinase ccrl genes. SCCmec was not identified in S.capitis and S.pasteuri. Their representatives carried either mec complex (1 isolate of S.pasteuri) or the recombinase complexes (2 isolates of S.capitis). The detected SCCmec variants in CoNS could be a source of emergence of new genetic lines of MRSA.

Key words: coagulase-negative staphylococci, methicillin resistance, staphylococcal cassette chromosome mec.

© Коллектив авторов, 2015

Адрес для корреспонденции: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18. НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи

Введение

Бактерии рода Staphylococcus насчитывают более 50 видов, из которыж около 20 выделяют из различных локусов организма человека. Для практических целей стафилококки подразделяют по признаку продуцирования фермента коагула-зы на коагулазоположительные и коагулазоотри-цательные (coagulase-negative staphylococci — CoNS). Продукция коагулазы исторически рассматривается как признак вирулентности стафилококков [1]. Среди стафилококков, наиболее характерных для человека, коагулазу продуцирует только Staphylococcus aureus. Коагулазу также продуцируют редко встречающиеся у человека виды — S.delphini, S.hyicus, S.intermedius, S.lutrae, S.schleiferi subsp. coagulans. CoNS в отличие от S.aureus являются относительно мало патогенными бактериями. Их роль резко возрастает по мере внедрения в медицинскую практику инвазивных технологий и увеличения числа иммунокомпро-метированныгх пациентов. Патогенез инфекций, вызываемых CoNS, во многом определяется способностью этих бактерий к образованию биоплёнок [2]. Среди этой группы микроорганизмов особенно значимая роль в патологии человека принадлежит S.epidermidis, S.haemolyticus S.homin-is, S.saprophyticus, S.warneri, S.capitis, S.lugdunensis.

На сегодняшний день CoNS — это типичные нозокомиальные патогены, вызывающие кате-тер-ассоциированные инфекции кровотока, инфекции внутрисосудистыж устройств и различ-ныж имплантатов, эндокардиты искусственныж и естественных клапанов, инфекции кожи и мягких тканей. Для молодых женщин характерны инфекции мочевыводящих путей, вызываемые S.saprophyticus [3, 4]. Экономические потери, связанные с лечением катетер-ассоцированной бактериемии (основной нозологической формы, вызываемой CoNS) только в США составляют более 2 млрд долларов ежегодно [5]. В группу риска развития инфекций, вызванных CoNS, входят пациенты ОРИТ, новорождённые с низкой массой тела, лица, перенёсшие пересадку костного мозга, множественные травмы и др. [3, 6, 7].

Трудности и значительная стоимость лечения инфекций, выиыгааемыж CoNS, обусловлены высокой частотой устойчивости к метициллину/ок-сациллину, являющейся маркёром устойчивости ко всем бета-лактамным антибиотикам. Устойчивость к метициллину была впервые описана у S.aureusв 1961 г., а вскоре и у S.epidermidis [8]. Указанный вид устойчивости опосредован низкоаффинным пенициллинсвязывающим белком ПСБ2а, кодируемым геном mecA. К настоящему времени известны несколько групп гомологов гена mecA (mecA, mecAl, mecA2, mecB, mecC), встречающихся как у стафилококков, так и у некоторых родственныж бактерий [9]. Ген mecA и большинст-

во его гомологов обычно расположены на мобильном генетическом элементе, получившем название стафилококковой хромосомной кассеты mec (staphylococcal cassette chromosome mec — SCCmec), являющейся геномным островом вариабельных размеров (21—67 тыс по.).

В генетическом строении SCCmec выделяют: mec-комплекс, ccr-комплекс и J-регионы. В основе типовой классификации лежат различия в строении этих структурных элементов. На сегодняшний день описано 11 основных типов SCCmec и множество субтипов, различающихся по генетическому строению. Структура SCCmec у CoNS отличается значительным разнообразием и часто не укладывается в схемы типирования, принятые для S.aureus. Описывают новые варианты mec- и ccr-комплексов, а также их новые комбинации, ряд таких вариантов получил временные названия, их структура нуждается в дальнейшем уточнении. Считается, что CoNS являются резервуаром разнообразия мобильных генетических элементов для S.aureus [10].

Учитывая ведущую роль SCCmec в эволюции антибиотикорезистентности и формировании новых генетических линий не только CoNS, но и S.aureus, изучение структуры этого генетического элемента представляется важной теоретической и практической задачей, решению которой и посвящена настоящая статья.

Материал и методы

В исследование включены 95 изолятов CoNS, выделенных в родовспомогательных учреждениях Москвы и Нижнего Новгорода, а также в Центре сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева. Для оценки чувствительности к антибиотикам использовали метод серийных разведений в агаре [11]. Интерпретацию результатов проводили согласно критериям CLSI [12]. ДНК выделяли по методике, описанной ранее [13]. Дифференциацию SCCmec элементов проводили на основании идентификации комплексов mec, комплексов генов ccr и анализа генетической области J1 с использованием мультиплексных праймеров и условий амплификации, предложенных в работе [14] и рекомендованных международной рабочей группой (IWG-SSCmec — International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements — http://www.sccmec.org). Для идентификации комплекса mec класса С1 использовали дополнительный праймер, предложенный в работе [15]. С целью возможной идентификации недавно охарактеризованной SCCmec XI типа, несущей гомолог гена mecA использовали праймеры и условия ПЦР, описанные [16].

Все праймеры были синтезированы фирмой «Евроген» (Москва, Россия). ПЦР-амплификацию проводили в объёме 25 мкл реакционной смеси, которая включала: ампли-фикационный буфер 2,5 мкл (10х) с pH 8,6, 2,5 мМ каждого дезооксирибонуклеотидтрифосфата ^месь dATP, dGTP, dCTP, dTTP); 0,4 мкл Taq-полимеразы (5 ед/мкл) фирмы «Силекс» (Москва, Россия); по 1 мкл каждого праймера и 1 мкл ДНК — матрицы; деионизированную воду добавляли до конечного объёма 25 мкл. Концентрация праймеров и количество MgCl2 могло изменяться в зависимости от свойств праймеров. Амплификацию ДНК осуществляли на термоциклере «Терцик» фирмы «ДНК-технология» (Москва, Россия). Визуализацию продуктов реакции осуществля-

Таблица 1. Видовой состав и источники выделения CoNS

Вид CoNS Количество _Образцы биологического материала, n_ Окружающая

изолятов n (%) кровь конъюнктива пупочная трахея моча ткань лёгких другое среда

рана при аутопсии

S.epidermidis 46 (48,4) 20 17 5 2 1 1

S.haemolyticus 27 (28,4) 13 4 5 3 2

S.warneri 9 (9,4) 5 1 1 1 1

S.hominis 9 (9,4) 5 3 1

S.capitis 2 (2,1) 2

S.pasteuri 2 (2,1) 1 1

Всего: 95 (100) 38 30 11 4 2 2 3 5

ли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с добавлением этидиум-бромида.

Секвенирование отдельных амплифицированных фрагментов стафилококковых хромосомных кассет после выделения из геля и последующей очистки с использованием набора GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Helthcare, Великобритания) выполнили в Центре коллективного пользования «Геном». Результаты секвенирования анализировали с использованием программы BLASN Интернет-ресурса NCBI.

В качестве контрольных использовали штаммы EMRSA-1 (SCCmeclII: комплекс класс A, ccr3), EMRSA-2 (SCCmec IV: комплекс mec класс B, ccr2), EMRSA-3 (комплекс mec класс B, ccr1), полученные из Центральной лаборатории общественного здравоохранения г. Лондона, а так же S.aureus ATCC 25923 (Oxas).

Результаты исследований

Характеристика изолятов CoNS. По результатам ранее выполненного секвенирования гена tuf изоляты CoNS относились к 4 видам: S.epider-midis — 48,4 %, S.haemolyticus — 28,4,2%, S.homin-is — 9,4%, S.warneri — 9,2, S.pasteuri — 2,1%, S.capitis — 2,1%. Как видно из данных, представленных в табл. 1, чаще всего выделяли S.epider-midis и S.haemolyticus, эти виды были выделены из разнообразных образцов биологического материала. Именно эти виды, а также S.hominis были изолированы от пациентов с катер-ассоцииро-ванной бактериемией. Наибольшим видовым разнообразием отличались изоляты, выделенные с конъюнктивы, среди них идентифицированы представители пяти видов, доминировали S.epi-dermidis и S.warneri. Представители двух последних видов, а также S.haemolyticus были идентифицированы в посевах отделяемого из пупочных ран. Из ткани лёгкого погибшего новорождённого были выделены изоляты, принадлежащие к видам S.epidermidis и S.warneri. Представителей видов S.warneri, S.hominis, S.capitis и S.pasteuri обнаруживали в смывах с поверхности предметов больничной обстановки.

Идентификация комплексов mec. Специфические продукты амплификации при использовании соответствующих праймеров образовали комплексы mec классов A, B, C1, C2, которые были выявлены у 13, 38, 26 и 5 изолятов соответственно. При идентификации комплекса mec класса C1, специфичного для кассет VII и X типов, образовалось два типа ампликонов. У изолята S.epider-

midis MCP 211 сформировался ампликон размером более 1000 н.п., тогда как у изолятов S.haemolyticus МСР455, МСР708, 708, 784 и др. образовались ампликоны размером около 300 н.п. В связи с этим определяли нуклеотидную последовательность двух типов ампликонов. Так, была выявлена 100% гомология короткого с последовательностью фрагментов гена mecA и транспозона tn431 у штамма JCSC6945, представленного как типичный для идентификации комплекса mec класса C1 у SCCmec X. Определение нуклеотидной последовательности амплифици-рованного фрагмента размером более 1500 н.п. и последующий анализ результатов с использованием программы BLASTN показали, что исследуемая область имеет 99% гомологию с регулятор-ной областью mecRl гена mecA кластера геномов S.aureus ST228, входящих в четвертую геномную группу GenBank. Таким образом, именно ампликон размером 300 н.п. оказался специфичным для области mec C1. У 10 изолятов идентифицировать комплекс mec не удалось.

Идентификация комплексов ccr. Были идентифицированы комплексы ccrl (n=41), ccr2 (n=44), ccr4 (n=3) ccr5 (n=7). У 33 изолятов не удалось идентифицировать комплекс генов рекомбиназ. Среди этих изолятов преобладали представители вида S.haemolyticus (n=19). У 32 изолятов S.epidermidis и 2 изолятов S.warneri были обнаружены два комплекса генов рекомбиназ ccrl и ccr2. Комплексы генов рекомбиназ ccr2 и ccr5 были выявлены у изолята S.haemolyticus MCV14, а ccrl и ccr5 — у изолята S.hominis MCV22. У изолята N.N.804 были обнаружены 3 комплекса генов рекомбиназ: ccrl, ccr2 и ccr5.

Выявление структурных особенностей генетической области J1. 27 изолятов несли вариант J1a, 3 — содержали вариант J1b и 2 изолята имели вариант J1c. Ни у одного из изолятов не обнаружен вариант J1d.

Идентификация кассет mec. Как видно из представленных в табл. 2 данных, на основании идентификации комплексов mec и комплексов рекомбиназ, а также генетической области J 1a были идентифицированы следующие типы кассет: SCCmec II (n=1); IV (n=2); IVa (n=2), V (n=3),

Таблица 2. Результаты идентификации кассет mec

Тип SCCmec Класс mec Комплекс Вид Всего

комплекса ccr S.epidermidis S.haemolyticus S.warneri S.hominis S.pasteuri S.capitis

II A 2 1 — — — — — 1

IV B 2 1 — 1 — — — 2

IVa B 2 2 — — — — — 2

V C2 5 — 3 — — — — 3

VII C1 5 1 1 — — — — 2

VIII A 4 2 1 — — — — 3

CI* B 1, 2 2 — 2 — — — 4

CIa B 1, 2 25 — — — — — 25

CIb B 1, 2 3 — — — — — 3

CIc B 1, 2 2 — — — — — 2

N1 A 1 — — — 5 5

N2 A 5 1 — — — — — 1

N3 C1 2 — 1 — — — — 1

N4 C1 2, 5 — 1 — — — — 1

N5 C2 1, 2, 5 1 — — — — — 1

N6 A, C1 1, 5 — — — 1 — — 1

н/и A н/и — — — 2 — — 2

н/и C1 н/и — 19 — — 1 — 19

н/и C2 н/и — 1 — — — — 1

н/и н/и н/и — — 2 mecA+; 4 mecA- 1 mecA- 1 mecA- — 8

н/и н/и 2 — — 2 2

Примечание. Н/и - не идентифицированы.

VII (n=3), VIII (n=3). Идентифицировано несколько новых типов кассет, не охарактеризованных ранее и отсутствующих на сайте IWG-SCC. Это — прежде всего композитная кассета, содержащая комплекс mec класс В и два комплекса ре-комбиназ ccrl и ccr2. На основании структурных особенностей области J1 выявлены 4 подтипа кассеты: SCCmec-CIa (25); SCCmec-CIb (3), SCCmec-CIc (2), а также SCCmec-CI (4), у которой не удалось идентифицировать область J1a. Выявлены и другие типы кассет, содержащие комплексы mec классов A, C1 и C2 в сочетании с различными генами рекомбиназ, а именно: N1 (комплекс mec класса A, ccrl); N2 (комплекс mec класса A, ccr5); N3 ( комплекс mec класса C1, ccr2); N4 (комплекс mec класса C1, ccr2, ccr5); N5 (комплекс mec класса C2, ccrl, 2, 5), а также N6 (комплексы mec классов A, C1 и комплексы ре-комбиназ ccrl, ccr5). Кроме того, у изолятов S.haemolyticus, вызвавших гнойно-воспалительные заболевания новорождённых и случаи кате-тер-ассоциированной бактериемии в Центре сердечно-сосудистой хирургии, обнаружен только комплекс mec класса C1, специфичный для кассет X типа, но комплекс генов рекомбиназ выявить не удалось.

Распределение типов кассет у различных видов. У S.epidermidis выявлены кассеты шести типов: SCCmec II (комплекс mec класса A, ccr2), SCCmec IV (комплекс mec класса В, ccr2), композитный тип SCCmec-CI, (комплекс mec класса B и два комплекса генов рекомбиназ: тип 1 и тип 2), SCCmec

VIII (комплекс mec класса A, ccr4). Один изолят содержал новый, ранее не охарактеризованный тип кассет, у которого комплекс mec класса A сочетался с рекомбиназой, кодируемой ccr5 (ccrC). Ещё у одного изолята был обнаружен комплекс mec класса C2 и геном рекомбиназы ccr5, специфичные для SCCmec V, однако этот изолят нёс дополнительные гены рекомбиназ ccrl и ccr2. Доминировал композитный тип — SCCmec-Cte.

В отличие от изолятов S.epidermidis, у которых преобладали кассеты, несущие комплекс mec B, у изолятов S.haemolyticus присутствовали кассеты, несущие комплекс mec классов C1 и C2. При этом у одного изолята комплекс mec C1 сочетался с генами рекомбиназ ccrl, образуя кассету VII типа, у двух других изолятов данный комплекс сочетался с комплексами рекомбиназ ccr2 и ccr2 + ccr5, образуя два новых типа кассет. У 19 изолятов идентифицировать комплекс ccr нам не удалось. гласно данным [6] комплекс mec класса C1 может сочетаться с комплексами рекомбиназ ccr5 или ccr7 (комплекс образован рекомбиназами с алло-типами ccrAl и ccrB6). У трёх изолятов S.haemolyticus была обнаружена кассета тип V, несущая комплекс mec класса C2 и комплекс реком-биназ ccr5. Еще у одного изолята была выявлена кассета тип VIII. У 2 изолятов S.warneri была обнаружена SCCmec-CI, еще у одного — SCCmec тип IV, однако у 6 изолятов выявить SCCmec нам не удалось. Два из них несли ген mecA. У оставшихся 4 изолятов ни ген mecA, ни ген mecC выявить не удалось.

Из 9 изолятов S.hominis — 5 несли новый тип кассет: комплекс mec класса A в сочетании с комплексом генов рекомбиназ ccrl. Еще у одного изолята, помимо данного типа кассет, были выявлены структурные элементы, характерные для кассеты типа VII. У двух изолятов удалось выявить только комплекс mec класса А, однако гены рекомбиназ идентифицировать не удалось. Не удалось идентифицировать и SCCmec у представителей S.capitis и S.pasteuri. У представителей этих видов были выявлены либо комплекс mec (S.pasteuri — 1 изолят), либо комплексы рекомбиназ S.capitis (2 изолята).

Филогенетические связи между кассетами различных типов. Кассета mec IV типа (комплекс mec класса B в сочетании с комплексом рекомбиназ ccr2) и композитная SCCmec -CI, несущая комплекс mec B и два комплекса генов рекомбиназ ccrl и ccr2, были идентифицированы в геноме изолятов, принадлежащих двум видам: S.epider-midis и S.warneri. Подобный рекомбинантный тип кассет был обнаружен нами ранее [17] в геноме изолятов S.aureus, принадлежащих эпидемическому штамму REMRSA-2, циркулирующему в стационарах нескольких регионов РФ. Данный тип кассет не описан у метициллинорезистент-ных штаммов S.aureus (MRSA), циркулирующих в других регионах мира. Согласно современной классификации, комплекс mec класса В несут кассеты либо первого типа, у которых они сочетаются с генами рекомбиназ типа 1, либо кассеты четвертого типа, когда они сочетаются с генами рекомбиназ типа 2. Очевидно, что рекомбинантный тип кассет мог сформироваться либо на основе кассеты типа I, либо на основе кассеты типа IV. Поскольку у тестированных изолятов S.epider-midis выявили кассету типа IV, была высказана рабочая гипотеза, что рекомбинантная кассета, несущая два комплекса генов ccrl и ccr2, сформировалась именно на основе кассеты типа IV путём приобретения второго комплекса генов рекомби-наз. Для дифференциации возможного наличия фрагментов кассет типа I или типа IV дополнительно исследовали область J1 в структуре кассет mec. Эта область несёт набор генов, продукты которых наименее изучены в настоящее время. У кассет типа ГУа выделяют несколько вариантов структурного компонента J1: J1a-h [14, 18].

Проведённые исследования показали, что подавляющее большинство изолятов S.epidermidis, несущих кассету тип IV, обладают областью J1a. Именно этот вариант области J1 был обнаружен и у большинства изолятов S.epidermidis, несущих и композитный тип кассет. Для подтверждения полученных данных о генетическом родстве кассеты типа IV и композитной кассеты исследовали и другие области кассет, в частности генные комплексы, кодирующие рекомбиназы. Известно, что ответствен-

ными за мобильность кассет типа IV являются гены рекомбиназ тип 2 (ccr2). В связи с этим структурный полиморфизм ампликонов протяжённостью более 900 н. п., образовавшихся при использовании прай-меров, позволяющих идентифицировать комплекс генов ccr2 как у изолятов, несущих SCCmec IV (изолят S.epidermidis Mcp754), так и композитный тип кассет (S.epidermidis Mcp 557, Mcv 35), исследовали методом секвенирования. Степень гомологии сек-венированных фрагментов и подобных областей у референс-штаммов S.aureus Mu 50 и N315 колебалась в пределах 94,7—95,8%, при этом гомология между собой трёх ампликонов составила 95,4% (при попарном сравнении она колебалась в пределах 97—97,7%). Подобным образом сравнили амплико-ны, образовавшиеся при идентификации комплекса генов ccrl у изолятов S.epidermidis Mcp 557 и Mcv 35. Идентичность этой области у тестированных изолятов составила 93%, при этом сходство с рефе-ренс-штаммом NCTC10442 не превышала 70,4%.

Согласно критериям (www.sccmec.org) полученные результаты позволяют говорить об идентификации нового аллотипа генов рекомбиназ ccrl. В связи с этим последовательность нуклеотидов комплекса ccr2 у изолята S.epidermidis Mcp 557 (SCCmec — композитный тип) сравнили с таковой же у изолята S.aureus 712 spa типа t-008, относящегося к эпидемическому штамму REMRSA-2. Гомология тестированных фрагментов составила 97,4%, что доказывает их идентичность. Гомология амплифицированного фрагмента ccrl изолята S.aureus 712 составила 96,6 и 97,8% для изолятов 557 и 35 соответственно, несущих композитный тип кассет.

Следовательно, как при использовании ПЦР-анализа, так и определения нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов генов рекомбиназ был получен ряд данных, подтверждающих гипотезу о формировании композитной кассеты на основе кассеты типа IV, а также о сходстве строения композитных кассет у S.epidermidis и S.aureus. Кроме того, проанализировали особенности структуры генов комплекса ccr у одного из 6 изолятов S.hominis, несущих новый тип SCCmec, представленный комплексом mec класса A и комплексом ccrl. Гомология с комплексом ccrl референс-штамма NCTC10442 составила 96,1%, что свидетельствует о том, что данный тип кассет возник в результате замены комплекса mec класса В у кассеты тип I на комплекс mec класса А. Данные секвенирования занесены в GenBank. Регистрационные номера KF 042470, KF042471, KF154274, KF 279295, KF056792, KF056793, KF154274, KF154275.

Обсуждение результатов

Проведённые исследования позволили выявить значительное разнообразие SCCmec у изученной выборки CoNS. Идентифицированы кас-

сеты пяти типов: SCCmec II (комплекс mec класса A, ccr2), IV (комплекс mec класса B, ccr2), V (комплекс mec класса C2, ccr5), VII (комплекс mec класса C1, ccr5), VIII (комплекс mec класса A, ccr4), а также композитным тип кассет, несущий комплекс mec класса В и два комплекса генов ccr типов 1 и 2. Кассеты IV, V, VII, VIII типов, а также композитный тип кассет вышвлены в геноме изолятов, принадлежащих различным видам CoNS, что свидетельствует о способности этих типов кассет к межвидовой передаче. У наиболее распространённого представителя группы CoNS — S.epidermidis выявлено значительное разнообразие SCCmec, для этих бактерий также характерно одновременное наличие нескольких типов ре-комбиназ. Принципиально сходные данные были получены и в других работах. Так, в коллекции метициллинорезистентных CoNS, выделенных от носителей в четырёх странах мира, 34% изоля-тов несли несколько комплексов генов рекомби-наз, при этом комплексы mec классов А, В, и С сочетались с различными комплексами рекомби-наз, среди которых преобладали ccr2, ccr4 и ccrC. [19]; среди клинических изолятов S.epidermidis, выщеленных из крови новорождённых, бышо обнаружено 13 различныгх комбинаций SCCmec с комплексами генов рекомбиназ, при этом, как и в настоящем исследовании, среди изолятов преобладал композитный тип кассет, несущий комплекс mec класса B в сочетании с комплексами генов рекомбиназ ccrl и ccr2 [20]. Вероятно, что наличие нескольких типов рекомбиназ в геноме CoNS и создает предпосылки для формирования новых типов кассет.

Проведённые исследования позволили выявить филогенетические связи между кассетами различных типов, а также кассетами, обнаруженными у представителей разных видов. На основе анализа генетической области J1a выявлено структурное сходство композитной кассеты mec с кассетами SCCmec типа ГУа, присутствующих у изолятов S.epidermidis. Вышвлены новые ранее не описанные типы кассет: комплекс mec класса A + ccr5; комплекс mec класса A + ccrl; комплекс mec класса С1 + ccr2; комплекс mec класса С1 + ccr2, ccr5; комплекс mec класса С2 + ccrl, 2, 5. Кроме того, у изолятов S.haemolyticus, вызвавших вспышки внутрибольничных инфекций, возможно также обнаружен новыш тип кассет, несущий комплекс mec класса С1, специфичный для кассет X типа, но неизвестный комплекс генов рекомбиназ. Однако не исключена и другая альтернатива. У данных изолятов ген mecA присутствует в хромосоме не в составе какой-либо кассеты, а в структуре транспозона, как у штамма S.haemolyticus WCH1 [21].

Определённый интерес представляет отсутствие у изученных CoNS кассет SCCmec III типа,

указанный тип кассет характерен для одного из двух доминирующих в России клональных комплексов MRSA — CC239 [22—24]. Вполне вероятно, что эффективный горизонтальный генетический обмен между отдельными видами стафилококков может иметь и определённые ограничения, которые могут опосредоваться различными механизмами, например системами рестрикции — модификации и CRISPR [25].

Впервые у изолятов S.epidermidis и S.haemolyticus, выделенных в стационарах РФ, идентифицирована SCCmec типа VIII. Ранее этот тип кассет был обнаружен у эпидемического штамма MRSA ST8 (spa t-008), распространившегося в стационарах Канады [26]. Следует отметить, генетическая линия является доминирующей в России MRSA ST8, однако в подавляющем большинстве случаев для неё характерна SCCmec кассета IV типа [22, 24].

Получены данные об особенностях структуры нового не охарактеризованного ранее типа SCCmec (комплекс mec класса A, ccrl), идентифицированного у представителей вида S.hominis, достаточно редко вызывающего заболевания у человека. Проведённый анализ нуклеотидной последовательности генов комплекса ccrl у S.hominis свидетельствует о том, что данный тип кассет возник в результате замены комплекса mec класса В у кассеты I типа на комплекс mec класса А. Приобретение комплекса mec класса A вносит существенный вклад в формирование патогенного потенциала CoNS, поскольку, как недавно было показано, в составе этой генетической области имеется ген, кодирующий синтез пептида, получившего название фенолорастворимого модули-на тип альфа, который обладает цитолитической активностью в отношении нейтрофилов и отсутствует в ядерной части генома CoNS [27]. Выявлено распространение клона S.hominis, содержащего новый тип SCCmec в стационарах г. Москвы, вызвавшего несколько случаев развития катетер-ассоциированной бактериемии.

У нескольких изолятов CoNS, несмотря на наличие гена mecA, были идентифицированы только отдельные компоненты кассет: либо ком-плекс(ы) генов рекомбиназ, либо комплекс mec, однако идентифицировать тип кассет не удалось. Возможно, они также несут ещё не описанные варианты SCCmec. У отдельных изолятов S.epidermidis, S.warneri, S.pasteuriи S.capitis, демонстрировавших устойчивость к оксациллину, не удалось обнаружить ни ген mecA, ни его гомологи. Более детальное изучение таких изолятов позволит выявить новые механизмы резистентности у стафилококков к бета-лактамным антибиотикам.

Не выявлено связи между присутствием определённого типа SCCmec и развитием тех или иных форм внутрибольничной инфекции. Вместе с тем было установлено, что изоляты CoNS различных

видов, даже выделенные в одном стационаре, несут, как правило, разные типы SCCmec, что свидетельствует о том, что их формирование происходило в различных условиях. Так, у изолятов S.epidermidis преобладал тип SCCmec, несущий комплекс mec класса В (SCCmec композитная и SCCmec IV типа); у изолятов S.haemolyticus кассеты, несущие комплекс mec классов С1и С2 в сочетании с различными генами рекомбиназ, у изолятов S.hominis — доминировал новый тип кассет, представленный комплексом mec класса A и комплексом ccrl. Подобная закономерность была отмечена и в ряде других исследований [19, 28].

Таким образом, структурное разнообразие SCCmec, выявленное при исследовании изолятов

ЛИТЕРАТУРА

1. Fairbrother R. W.Coagulase production as a criterion for the classification of the staphylococci. J Pathol Bacteriol 1940; 50: 1: 83—88.

2. Becker K, Heilmann C, Peters G. Coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 2014; 27: 4: 870—926.

3. Piette A., Verschraegen G. Role of coagulase-negative staphylococci in human disease. Vet Microbiol 2009; 134: 1—2: 45—54.

4. Otto M. Staphylococcus epidermidis — the 'accidental' pathogen. Nat Rev Microbiol 2009; 7: 8: 555—567.

5. Otto M. Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections. Semin Immunopathol 2012; 34: 2: 201—214.

6. Krediet T.G., Mascini E.M., van RooijE, Vlooswijk J., Paauw A., Gerards L.J., Fleer A. Molecular epidemiology of coagulase-negative staphylococci causing sepsis in a neonatal intensive care unit over an 11-year period. J Clin Microbiol 2004; 42: 3: 992—995.

7. Cheung G.Y., Otto M. Understanding the significance of Staphylococcus epidermidis bacteremia in babies and children. Curr Opin Infect Dis 2010; 23: 3: 208—216.

8. Kjellander J.O., Klein J.O., Finland M. In Vitro Activity of Penicillins against Staphylococcus albus. Proc Soc Exp Biol Med 1963; 113: 1023—1031.

9. Ito T, Hiramatsu K, Tomasz A., de Lencastre H, Perreten V., Holden M.T.G., Coleman D.C., Goering R, Giffard P.M., Skov R.L. et al: Guidelines for reporting novel mecA gene homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2012; 56: 10: 4997—4999.

10. Shore A.C., Coleman D.C. Staphylococcal cassette chromosome mec: recent advances and new insights. Int J Med Microbiol 2013; 303: 6—7: 350—359.

11. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4 2 1890-04 2004. / Metodicheskie ukazanija po opre-deleniju chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam. Metodicheskie ukazanija MUK 4 2 1890-04 2004. [in Russian]

12. CLSI.: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty-Fourth Informational Supplement. CLSI document M100-S24. In. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2014.

13. Воронина О.Л., Кунда M.C., Дмитренко O.A., Любасовская Л.А., Ко-валишена О.В., Попов Д.А. Оценка видового разнообразия коагула-зоотрицательных стафилококков, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2009—2010 гг. Журн микробиол эпидем иммунол 2011; 1: 3—8. / Voronina O.L., Kunda M.S., Dmitrenko O.A., Ljubasovskaja L.A. , Kovalishena O. V., Popov D.A. Ocenka vidovogo raznoobrazija koagulazootricatel'nyh stafilokokkov, vydelennyh v sta-cionarah Rossijskoj Federacii v 2009—2010 gg. Zhurn mikrobiol jepidem immunol 2011; 1: 3—8. [in Russian]

14. Kondo Y, Ito T, Ma X.X., Watanabe S, Kreiswirth B.N., Etienne J, Hiramatsu K. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: 1: 264—274.

15. Ruppe E, Barbier F, Mesli Y, Maiga A., Cojocaru R, Benkhalfat M, Benchouk S, Hassaine H, Maiga I., Diallo A. et al. Diversity ofstaphylo-coccal cassette chromosome mec structures in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus strains among outpatients from four countries. Antimicrobial Agents Chemother 2009; 53: 2: 442—449.

CoNS, выделенных в стационарах Российской Федерации, свидетельствует о высокой степени нестабильности этих генетических элементов, их способности к различным перестройкам. Полученные данные подтверждают гипотезу о ведущей роли CoNS как резервуара SCCmec для всего рода Staphylococcus [29]. Результаты исследования свидетельствуют о целесообразности включения SCCmec типирования CoNS в систему эпидемиологического надзора за возбудителями внутри-больничных инфекций в стационарах РФ.

Уведомление: Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда

16. Stegger M., Andersen P.S., Kearns A., Pichon B., Holmes M.A., Edwards G., Laurent F., Teale C., Skov R., Larsen A.R. Rapid detection, differentiation and typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring either mecA or the new mecA homologue mecA (LGA251). Clin Microbiol Infect 2012; 18: 4: 395—400.

17. Дмитренко О.А. Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксацил-лину. М.: 2008. / Dmitrenko O.A. Molekuljarno-geneticheskie aspekty jepidemiologii vnutribol'nichnyh infekcij, vyzvannyh predstaviteljami vida Staphylococcus aureus, ustojchivymi k meticillinu/oksacillinu. M.: 2008. [in Russian]

18. Milheirico C., Oliveira D.C., de Lencastre H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. J Antimicrob Chemother 2007; 60: 1: 42—48.

19. Ruppe E., Barbier F., Mesli Y., Maiga A., Cojocaru R., Benkhalfat M., Benchouk S., Hassaine H., Maiga I., Diallo A. et al. Diversity of staphylo-coccal cassette chromosome mec structures in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus strains among outpatients from four countries. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 2: 442—449.

20. SvenssonK., HellmarkB., SoderquistB. Characterization of SCCmecele-ments in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis isolated from blood cultures from neonates during three decades. APMIS 2011; 119: 12: 885—893.

21. ZongZ.Characterization of a complex context containing mecA but lacking genes encoding cassette chromosome recombinases in Staphylococcus haemolyticus. BMC Microbiol 2013; 13: 64.

22. Гостев В В. Метициллинорезистентные золотистые стафилококки: проблема распространения в мире и России. Фарматека 2015; 6: 30—38. / Gostev V.V. Meticillinorezistentnye zolotistye stafilokokki: problema rasprostranenija v mire i Rossii. Farmateka 2015; 6: 30—38. [in Russian]

23. Дмитренко O.A., Шагинян И.А., Прохоров В.Я., Матвеев C.M., Аляп-кина Ю.С., Ванюшева О.В., Шилов И.А., Лунин В.Г. Исследование полиморфизма коагулазного гена методом секвенирования у ме-тициллинорезистентных штаммов Staphylococccus aureus, выделенных в стационараз различных регионов России и Беларуси. Журн микробиол, эпидемиол иммунобиол 2005; 3: 27—32. / Dmitrenko O.A., Shaginjan I.A., Prohorov V.Ja., Matveev S.M., Aljapkina Ju.S., Vanjusheva O.V., Shilov I.A., Lunin V.G. Issledovanie polimorfizma koagulaznogo gena metodom sekvenirovanija u meticillinorezistentnyh shtammov Staphylococccus aureus, vydelennyh v stacionaraz razlichnyh regionov Rossii i Belarusi. Zhurn mikrobiol, jepidemiol immunobiol 2005; 3: 27—32. [in Russian]

24. Романов А.В., Чернов Е.А. Молекулярная эпидемиология внутри-больничных золотистых стафилококков в стационарах различных регионов России. Молекуляр мед 2013; 4: 55—64. / Romanov A.V., Chernov E. A. Molekuljarnaja jepidemiologija vnutribol'nichnyh zolo-tistyh stafilokokkov v stacionarah razlichnyh regionov Rossii. Molekuljar med 2013; 4: 55—64.

25. Lindsay J.A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. Int J Med Microbiol 2014; 304: 2: 103—109.

26. Zhang K., McClure J.A., Elsayed S., Conly J.M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 2: 531—540.

27. Chatterjee S.S., Chen L, Joo H.S., Cheung G.Y., Kreiswirth B.N., Otto M. Distribution and regulation of the mobile genetic element-encoded phenol-soluble modulin PSM-mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One 2011; 6: 12: e28781.

28. Bouchami O., Ben Hassen A., de Lencastre H., Miragaia M. High prevalence of mec complex C and ccrC is independent of SCCmec type

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

V in Staphylococcus haemolyticus. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 4: 605-614. 29. Ito T., Okuma K, Ma X.X., Yuzawa H, Hiramatsu K. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat 2003; 6: 1: 41-52.

тельное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Нижний Новгород

Попов Дмитрий Александрович — д. м. н., заведующий лабораторией клинической микробиологии и антимикробной терапии, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева», Москва

Гостев Владимир Валерьевич — к. б. н., научный сотрудник отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург

Сидоренко Сергей Владимирович — д. м. н., профессор, заведующий отделом медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург

Дмитренко Ольга Александровна — д. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ пато-генности (с группой стафилококковых инфекций) отдела бактериальных инфекций, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва Анкирская Алла Семеновна — д. м. н., профессор, научный консультант, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Любасовская Людмила Анатольевна — к. м. н., врач-бактериолог лаборатории микробиологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Ковалишина Ольга Васильевна — д. м. н., профессор кафедры эпидемиологии, Государственное бюджетное образова-