Анализ закономерностей состава жирных кислот в различных штаммах энтеропатогенных видов бактерий рода Yersinia

© Коллектив авторов, 2014 г УДК 616.127-005.4-07:631.46

Б.Г. Андрюков, Н.Ф.Тимченко, Е.П. Недашковская, Л.И. Соколова1

анализ закономерностей состава жирных кислот в различных штаммах энтеропатогенных видов бактерий рода yersinia

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», г. Владивосток;

1ГБОУ ВПО «Дальневосточный Федеральный государственный университет» Министерства образования Российской Федерации, г. Владивосток.

Сохраняющееся на протяжении многих лет внимание к иерсиниозам связано с клинической полиморфностью, трудностью лабораторной диагностики, отсутствием специфических симптомов, что дает основание рассматривать эту группу инфекций как серьезную проблему. Актуальность проблемы видовой изменчивости спектра жирных кислот (ЖК) у разных видов иерсиний сохранился до настоящего времени. Целью настоящего исследования явился анализ закономерностей состава жирных кислот в различных штаммах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica для выявления возможностей использования их для дифференциальной клинической и эпидемиологической диагностики. Анализ спектров жирных кислот Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, выращенных при 28°С, не выявил достоверных отличий в их составе. С учетом аналогичных исследований, проведенных ранее, родовым признаком Yersinia является преобладание в спектре ЖК гексадекановой кислоты (32-36%).

Ключевые слова: жирные кислоты (ЖК), Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Yersinia, родовой признак. Цитировать: Андрюков Б.Г., Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Соколова Л.И. Анализ закономерностей состава жирных кислот в различных штаммах энтеропатогенных видов бактерий рода Yersinia // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015. № 5(63). С. 31-35. URL: https://yadi.sk/i/uwi8KOMqkcbag

Среди заболеваний, вызванных бактериями семейства Enterobacteriaceae, особое место занимают инфекции, возбудителями которых являются патогенные бактерии рода Yersinia. Род Yersinia включает в себя 17 видов микроорганизмов, три из которых играют значительную роль в патологии человека -Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis, являющаяся клональным вариантом Y. pseudotuberculosis [9]. Установлено, что у всех видов Yersinia. имеется большая степень родства между отдельными детерминантами патогенности и химическим составом бактериальных клеток [1, 12, 20].

Сохраняющееся на протяжении многих лет внимание к иерсиниозам не является случайным. Широкое распространение, трудности лабораторной диагностики, клиническая полиморфность дают основание рассматривать иерсиниозы как серьезную проблему [1, 2, 10].

С 70-х годов ХХ в. с целью таксономической характеристики представителей рода Yersinia [7], изучения тепловых адаптационных стратегий [2, 8], а также выявления видовых особенностей и различий [11, 14] активно проводился анализ спектра ЖК (ЖК) различных видов Yersinia с помощью газовой хроматографии. Интерес к проблеме видовой изменчивости спектра ЖК у разных видов иерсиний сохранился до настоящего времени. Он связан с особенностями мембранных липид-ных структур иерсиний [2, 4], изучением возможности использования ЖК Y. pestis и Y. pseudotuberculosis в качестве таксономических маркеров, а также индикаторов видовой дифференциации [3, 19].

В последние годы было показано, что ЖК иерсиний активно участвуют в поддержании жидкокристаллического состояния клеточных мембран. Это состояние мембран является необходимым условием для активной жизни бактерий, их устойчивости к воздействию различных факторов окружающей среды («гомеофаз-ная адаптация», Hartig et al., 2005). Результатами этих исследований стали выводы о возможности использования жирнокислотных маркеров и отношений ЖК иерсиний для раннего специфического выявления возбудителя в дополнение к существующим видам клинической и эпидемиологической диагностики.

В повседневной практике часто приходится сталкиваться с дифференциальной диагностикой гастро-интестинальной формы псевдотуберкулеза от кишечного иерсиниоза, вызванных Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. В клиническом аспекте эти заболевания очень сходны и имеют одинаковые симптомы [5, 6].

Целью настоящего исследования явился анализ закономерностей состава жирных кислот в различных штаммах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica для выявления возможностей использования их для дифференциальной клинической и эпидемиологической диагностики.

Полученные данные позволят дополнить библиотеку Международной системы микробной идентификации (Шерлок MIS-протокол) для быстрого и простого выявления микроорганизмов в объектах окружающей среды и биосубстратах в клинической практике, в том числе для диагностики инфекций, вызванных этими энтеропатогенными микроорганизмами.

Таблица 1

Характеристика исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica

Виды Yersinia Штамм Серотип Плазмида, MD Источник

Y. pseudotuberculosis 156 la Нет Типовой, 1980

274 Мс Нет Типовой, 1988

160 IIb Нет Типовой, 1980

2517 III 40 МоНаге^ 1980

3D III 45 Прим. край, 1980

2053 I 82, 48 Прим. край, 2008

2204 1 82, 48 Прим. край, 1976

Y. enterocolitica 22 O:5 2,7 Прим. край, 1984

455 O:9 Нет Прим. край, 1976

79 O:3 45 Прим. край, 1979

55 O:9 ? Прим. край, 1988

4626 O:6.31 Нет Прим. край, 1976

280 O:6.31 Нет Прим. край, 1976

246 О:5 Нет Прим. край, 1976

Материалы и методы

Штаммы бактерий: для исследования были использованные штаммы Y pseudotuberculosis и Y enterocolitica из музея живых культур НИИ ЭМ СО РАМН. Все культуры были идентифицированы традиционными методами и их характеристики приведены в табл. 1.

Условия культивирования. Иерсинии были выращены на мясо-пептонном агаре при 28°С в течение 24 ч до стационарной фазы роста, когда спектр ЖК становится достаточно стабильным [10].

Получение метиловых эфиров ЖК проводилось по методике, утвержденной Европейским комитетом по стандартизации (CEN, 2003 г.) и рекомендованной Шерлок MIS-протоколом. Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводился методом газовой хроматографии (ISO 5508:1990) в сочетании с масс-спектрометрией сотрудниками кафедры аналитической химии Дальневосточного Федерального государственного университета.

Образцы суточных культур обрабатывали сразу после отбора. При невозможности немедленного анализа их консервировали в органических растворителях или замораживали при -5°С. Пробы промывали, центрифугировали, супернатант сливали, а осадок высушивали и подвергали кислому метанолизу в 2,5 М HCl в метаноле. Метанолиз проводили в 0,5 мл реактива на 2-10 мг сухого остатка в течение двух часов при 70°С.

Полученные продукты метанолиза (метиловые эфиры и диметилальдегиды) двукратно экстрагировали гексаном, высушивали и обрабатывали 20 мкл ^О-бис(триметил-силил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 65°С для получения триметил-силильных эфиров окси-кислот. Реакционную смесь эфиров в количестве 2-4 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы Hewlett-Packard 6890 (модуль версии А.03.02). Для управления и обработки данных использовали штатное программное обеспечение

прибора (ver. 4.5). Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с ме-тилсиликоновой фазой Ultra-1 Hewlett-Packard длиной 25 м и внутренним диаметром 0.2 мм. Режим анализа 120°С - 2 мин. Масс-спектрометр - квадру-польный, с ионизации электронами (70 эв) работал в режиме селективных ионов. Для оценки воспроизводимости результатов проводился трехкратный анализ проб в одинаковых условиях.

Для статистического анализа количественных данных был применен пакет программ Statistica 6.1 Statsoft Inc., USA c использованием методов описательной статистики и непараметрических критериев (multiple measures ANOVA). Количественные данные представлены в виде среднего арифметического значения ± среднее квадратическое отклонение (M±o) при оценке данных естественного разброса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Иерархический кластерный анализ выполнялся с использованием агломеративно-го модуля и коэффициента корреляции Пирсона. Для дисперсионного анализа зависимых выборок применялись критерии Фридмана и Кендалла.

Результаты и обсуждение

Оценка воспроизводимости результатов АЖК исследуемых штаммов иерсиний показала, что полученные результаты

Наука и практика • Таблица 2

Оценка воспроизводимости метода, используемого для анализа жирных кислот штаммов У pseudotuberculosis

№ проб Жирные кислоты (мажорные фракции)*

С 12:0 С 14:0 С 16:0 С 16:1ш7 С 17:1 С 18:0 С 18:1 ш9 С 18:1 ш7 С 18:2 ш6

Штамм 156

1 1,035 2,909 36,721 13,969 12,276 6,477 20,289 7,182 5,964

2 1,011 2,894 35,972 13,783 12,195 6,395 21,301 7,215 5,818

3 1,112 3,005 36,191 13,771 12,314 5,913 19,893 7,238 5,916

М 1,053 2,936 36,395 13,841 12,262 6,262 20,494 7,212 5,899

ст 0,030 0,035 0,238 0,064 0,033 0,174 0,403 0,015 0,041

Уст (%) 2,849 1,175 0,655 0,462 1,474 2,784 1,968 0,206 0,689

Штамм 3D

1 3,402 3,453 30,528 11,961 9,905 11,542 11,009 11,099 3,983

2 3,821 3,994 30,367 11,824 10,129 11,386 11,302 11,283 3,881

3 3,013 3,762 31,282 11,903 10,125 11,403 11,187 10,985 3,569

М 3,412 3,736 30,726 11,896 10,053 11,444 11,166 11,122 3,811

ст 0,205 0,142 0,278 0,036 0,074 0,049 0,079 0,080 0,121

Уст (%) 5,994 3,792 0,905 0,303 0,736 0,430 0,703 0,722 3,175

Штамм 2053

1 2,972 2,503 28,122 10,256 9,816 8,874 11,009 8,839 4,975

2 3,021 2,275 28,157 10,348 9,673 9,096 10,882 9,063 4,879

3 3,014 2,483 27,985 10,515 9,346 8,914 9,996 8,985 4,555

М 3,002 2,420 28,088 10,373 9,612 8,961 10,629 8,962 4,803

ст 0,015 0,073 0,052 0,071 0,133 0,067 0,317 0,062 0,124

Уст (%) 0,505 3,002 0,183 0,684 1,382 0,751 2,978 0,688 2,582

Условные обозначения: М - среднее значение; ст - среднее квадратическое отклонение; Уст (%) - коэффициент вариации. Примечания: 1 - относительное содержание ЖК даны в процентном содержании относительно общего количества ЖК. 2 - каждый штамм был проанализирован трижды.

Анализ спектров ЖК, выявленных у исслед о -ванных штаммов Yeедита, обнаружил преиму-щественноо соднржанне глксодеканоиоН (паде-митинлвой) иислоты (С1Д:И). Относнмельное количвсдво этой кислоты дарнндовало от Д8н0Д% до 36,49% у Y. pseudotuberculosis (32,16±3,98%) и В2,18(И> до 41,54% у Y. entervœaitica (36,7345,03%; р>0,0н). У штаммод Y. pootie [l)(] такс«; быдо bmi-яидвко сокое обноситвльное содержание С 16:0 (30,0а±2,64%; р>0,Д5) в одабнании с эндирлпато-

С4:0 _ h1 С10:0 - ¿^Н С12:0

С13:0 - 22â-l С14:0 -1"1 С15:0 .S"1

С16:0 -3 С16:1:«7. § С17:0  С17:1 С18:0 С18:3:ш9-С18:1:ш7-С18:2:ш6-С18:3:ш6. С18:3:ш3. С20:1

"шлшшпшшпшшпшшпшлт-^

шшшш^т^

генными видами иерсиний).

Отношение насыщенных ЖК к ненасыщенным у исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis составило (44,54:55,46), а у Y enterocolitica -(48,23:51,77). При этом совокупное содержание гексадекановой и октадекановой (С18:0) относительно общего содержание насыщенных ЖК у Y. pseudotuberculosis составило до 89,73% (рис. 1). Аналогичный показатель у исследованных штаммов Y enterocolitica составил 92,35% (рис. 2).

С4:0 .И

С10:0

0-3-

С14:0 С15:0 С16:0 -3 С16:1:«7-§ С17:0 2 С17:1 . С18:0 . С18:3:ш9. С18:1:«7. С18:2:ш6-С18:3:ш6. С18:3:ш3. С20:1-

.h

»-Я—-lh

Рис.1.Составжирныхкислот Y. pseudotuberculosis

Рис. 2. Состав жирных кислот Y. enterocolitica

С12:0

10

15

25

30

40

10

15

20

25

30

35

40

%%

%%

Для оценки достоверности видовых различий в оценке этих значений был использован непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Полученные результаты (р = 0,212) позволяют говорить об отсутствии статистической значимости различий совокупного содержания С16:0 и С18:0 у исследованных видов иерсиний.

В исследованиях Tan U. et al.

Анализируемые парные отношения подбирались с учетом результатов исследований, проведенных Tan U. et al. (2010) [19], Palonen Е. et al. (2011) [16] и Heroven А. et al. (2014) [15] и в которых по-разному оценивается диагностическая ценность парных отношений при АЖК. Приведенные в табл. 3 примеры статистической оценки значимости различий Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica отношений ЖК c использованием U-критерия Манна-Уитни позволяют для всех исследуемых пар отклонить нулевую гипотезу о наличии различий (р>0,05).

Полученные результаты свидетельствуют, что указанные маркеры не могут быть использованы для дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Принимая во внимание данные ранее проведенных исследований Tan U. et al. (2010) [19] и Erhardt M. et al. (2010) [13], в которых также не было обнаружено достоверных различий между спектрами ЖК Y. pseudotuberculosis и Y. pestis, можно сделать вывод о том, что выявленные различия обусловлены использованием разного оборудования и различных методов получения метиловых эфиров ЖК.

Выводы

Таким образом, анализ спектров жирных кислот Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, выращенных при28°С,невыявилдостоверныхотличийвихсоставе. С учетом аналогичных исследований, проведенных ранее, родовым признаком Yersinia является преобладание в спектре ЖК гексадекановой кислоты (32-36%).

[7], Сулаквелидзе (2000) [18] и Сельникова и соавт., (2005) [3] была обнаружена высокая доля С16:0 у штаммов Y. pseudotuberculosis. Это, возможно, свидетельствует в пользу оценки указанного феномена в качестве родового признака, так как у других представителей семейства Enterobacteriaceae преобладания гексадекановой не было выявлено [7, 17].

Анализ парных отношений содержания ЖК (С14:0/ С18:0; С18:1ю7/С18:0 и др.) показал, что у исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica они носили специфический характер (табл. 3).

ЛИТЕРАТУРА

1. Андрюков Б.Г., Сомова Л.М., Тимченко Н.Ф. Жирные кислоты как объект исследования температурных адаптационных стратегий микроорганиз-мов-психрофилов // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015. Т. 61. № 3. С. 43-9.

2. Васюренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В., Рубан Н.М. Жирнокислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных. - Киев: Наук. думка, 1992. 263 с.

3. Сельникова О.П., Васюренко З.П., Полищук Е.И. и др. Отсутствие различий в жирнокислотном составе клеток и липополисахаридов иерсиний разных видов в условиях роста при низкой температуре // Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. № 6. С.10-4.

4. Сомова Л.М., Бузолева Л.С., Плехова Н.Г. Ультраструктура патогенных бактерий в разных экологических условиях. Владивосток: Медицина ДВ, 2009. 200 с.

5. Сомов Г.П., Покровский В.И., Н.Н. Беседнова и др. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001. 256 с.

6. Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. Владивосток, 2004. 168 с.

7. Фролов А.Ф., Рубан Н., Васюренко З.П. Жир-нокислотный состав липополисахаридов штаммов различных видов иерсиний. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol.1989; 33(1): 55-61.

8. Abel K., De Schmertzing H., Peterson J.I. Classification of microorganisms of chemical composition. I. Feasibility of utilizing gas chromatography. J Bacteriol., 1963; 85: 1039-44.

Таблица 3

Парные отношения содержания клеточных жирных кислот у Y. pseudotuberculosis и У enterocolitica

Парные отношения Штаммы Y. pseudotuberculosis Штаммы Y. enterocolitica Р*

156 274 160 2517 22 455 79 4626

С14:0/С18:0 0,17 0,30 0,34 0,31 0,41 0,38 0,46 0,36 0,103

С18:1ш7/С18:0 1,15 0,97 1,00 1,05 2,011 2,163 2,10 1,99 0,078

С16:0/С17:1 2,97 3,06 2,92 2,92 0,945 1,275 1,18 1,03 0,133

С16:0/С18:1ш9 5,05 2,76 3,13 3,13 13,43 15,87 14,03 13,19 0,123

C12/C16 0,03 0,11 0,11 0,11 0,08 0,04 0,123 0,10 0,134

C14/C16 0,08 0,09 0,09 0,09 0,06 0,06 0,08 0,09 0,239

С16:0/С18:1 1,31 1,38 1,43 1,43 3,19 2,57 4,50 2,52 0,058

Примечание: р - уровень значимости различий значений парных отношений ЖК в штаммах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica

9. Achtman M., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 0: 14043-8.

10. Bakholdina S.I., Sanina N.M., Krasikova I.N. et al. The impact of abiotic factors (temperature and glucose) on physicochemical properties of lipids from Yersinia pseudotuberculosis. Biochimie, 2004; 86: 875-81.

11. Bengoechea J.A., Brandenburg K., Seydel U. et al. Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis show increased outer membrane permeability to hydrophobic agents which correlates with lipopolysaccharide acyl-chain fluidity. Microbiology, 1998; 144: 1517-26.

12. Davis A. J., De Jesús Díaz D. A. Mecsas J. A dominant-negative needle mutant blocks type III secretion of early but not late substrates in Yersinia. Molecular Microbiology, 2010; 76: 236-59.

13. Erhardt M., Dersch P. Regulatory principles governing Salmonella and Yersinia virulence. Front Microbiol. 2015; 6: 949.

14. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited. Microbiol Mol Biol Rev., 1997; 61: 136-69.

15. Heroven A.K., Dersch P. Coregulation of host-adapted metabolism and virulence by pathogenic yersiniae. Front Cell Infect Microbiol. 2014; 4: 146.

16. Palonen E., Lindström M., Korkeala H. et al. Expression of Signal Transduction System Encoding Genes of Yersinia pseudotuberculosis IP32953 at 28°C and 3°C. PloS One, 2011; 6(9): e25063.

17. Parsons J.B., Rock C.O. Bacterial Lipids: Metabolism and Membrane Homeostasis. Prog Lipid Res. 2013; 52(3): 249-76.

18. Sulakvelidze A. Yersiniae other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis: the ignored species. Microbes Infect., 2000; 2(5): 497-513.

19. Tan U., Vu M., Lyu N. et al. Cellular fatty acids as chemical markers for differentiation of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Lett Appl Microbiol., 2010; 50(1): 104-11.

20. Wanger A. Yersinia. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 2010. 432 рр.

21. Whittaker P. Comparison of Yersinia pestis to other closely related Yersinia species using fatty acid profiles. Food Chem, 2009; 116: 629-32.

B.G. Andrukov, N.F. Timchenko, E.P. Nedashkovskaya, L.I. Sokolova1

analysis of regularities fatty acid composition of different strains

of enteropathogenic bacteria genus yersinia

Federal State Scientific Institution «Scientific research institute here, Epidemiology and Microbiology named

G.P. Somov», Vladivostok, Russia;

1Far East State Federal University, Vladivostok, Russia.

The continued over the years to account yersiniosis associated with clinical polymorphism, the difficulty of laboratory diagnosis, the lack of specific symptoms, which gives grounds to consider this group of infections as a serious problem. The urgency of the problem of the variability of the species spectrum of fatty acids (FA) in different species of Yersinia survived to the present day. The purpose ofthis study was to analyze the laws ofthe fatty acid composition in different strains of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica to identify opportunities for the use of their clinical and epidemiological differential diagnosis. Analysis of the spectra of fatty acids Y pseudotuberculosis and Y enterocolitica, grown at 28°C, showed no significant differences in their composition. In view of similar studies conducted earlier, the generic feature is the prevalence of Yersinia in the spectrum of LCD hexadecanoic acid (32-36%).

Keywords: fatty acids (FA), Y. pseudotuberculosis, Y enterocolitica, Yersinia, a generic indication.

Citation: Andrukov B.G., Timchenko N.F., Nedashkovskaya E.P., Sokolova L.I. Analysis of regularities fatty acid composition of different strains of enteropathogenic bacteria genus Yersinia. Health. Medical ecology. Science. 2015; N 5(63): 31-35. URL: https://yadi.sk/i/uwi8KOMqkcbag

Сведения об авторах

Андрюков Борис Георгиевич - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», телефоны: 8(423)-246-78-14, 89242304647; 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1; e-mail: andrukov_bg@mail.ru;

Тимченко Нэлли Федоровна - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1; Тел.: 244-1147; e-mail: ntimch@mail.ru

Недашковская Елена Петровна - кандидат биологических наук, ученый секретарь ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1; Тел.: 244-11-47; e-mail: nelena06@rambler.ru

Соколова Лариса Ивановна - кандидат химических наук, заведующая кафедрой аналитической химии Дальневосточного федерального государственного университета. Адрес: 690950, г. Владивосток, ул. Суханова, 8; e-mail: lisokolova@bk.ru