СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНОСТИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА ПРОТИВОРАКОВУЮ ХИМИОТЕРАПИЮ СЕРДЕЧНЫМ ГЛИКОЗИДОМ
METHOD FOR DETERMINING PROBABILITY OF THERAPEUTIC RESPONSE ON CANCER THERAPY WITH CARDIAC GLYCOSIDE

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования результата противораковой химиотерапии сердечным гликозидом. В частности, настоящее изобретение относится к способу определения вероятности терапевтического ответа in vitro или in vivo в ответ на лечение клеточного заболевания или расстройства, имеющего этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, сердечным гликозидом.
Предшествующий уровень техники
Многие заболевания и расстройства, имеющие этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, приводят к летальному исходу. Из таких заболеваний, наиболее распространенными являются раковые и опухолевые заболевания. Однако, нераковые пролиферативные заболевания также могут представлять угрозу для жизни или приводить к снижению качества жизни. Такими заболеваниями могут быть, например: 1) аутоиммунные заболевания, такие как индуцированный антигеном артрит и аллергический энцефаломиелит, 2) хронические воспалительные пролиферативные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системный ювенильный хронический артрит, остеопороз и псориаз, 3) пролиферативные заболевания молочной железы, включая фиброкистозное заболевание, 4) пролиферативные заболевания предстательной железы, включая доброкачественную гиперплазию предстательной железы (ДГПЖ), 5) пролиферативные глазные болезни, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию и 6) сосудистые пролиферативные заболевания, включая атеросклероз и стеноз коронарной артерии. Для лечения этих заболеваний было предпринято множество попыток разработать методы лечебной или симптоматической терапии, однако, несмотря на появление множества химиотерапевтических средств, которые оказались эффективными для лечения различных раковых заболеваний, опухолей и пролиферативных заболеваний других типов, пока еще не было разработано какой-либо комплексной или универсальной лечебной терапии.
В попытке разработать специальные схемы лечения, подходящие для индивидуального лечения пациентов, врачи-клиницисты назначают химиотерапевтические средства, которые могут быть введены отдельно или в комбинации с другими средствами. И в этом случае, основным препятствием в разработке индивидуальных схем лечения является непредсказуемость эффективности химиотерапевтических средств в лечении раковых или опухолевых заболеваний конкретного фенотипа. Для лечения этих опасных для жизни заболеваний, врачи-клиницисты вынуждены прибегать к методам «тыка». Они вынуждены полагаться на уже имеющиеся в литературе данные об известных конкретных химиотерапевтических средствах и их показаниях, а затем подумать или догадаться, будет ли данное отдельное химиотерапевтическое средство или комбинация химиотерапевтических средств эффективными в выбранной врачом-клиницистом терапии ракового заболевания или опухоли. Успех таких традиционных методов клинической терапии весьма ограничен.
Врачи-клиницисты сталкиваются с необходимостью проводить прогностический анализ, который позволяет с некоторым достаточным уровнем уверенности предсказать, является ли данное раковое или опухолевое заболевание терапевтически восприимчивым к отдельному конкретному химиотерапевтическому средству или к комбинации терапевтических средств. Прогностический анализ такого типа является крайне важным для выбора химиотерапевтических средств, которые ранее имели ограниченное применение, а именно тех средств, которые только начинают входить в клиническую практику. Было бы желательно разработать такой прогностический анализ, который позволил бы врачам-клиницистам проводить оценку действия одного или нескольких химиотерапевтических средств.
Данные, полученные в результате преклинического обследования и ранее проводимых осмотров пациента, позволяют сделать предположения о потенциальной эффективности сердечных гликозидов (например, буфалина, дигогсина, дигитоксина, убаина и олеандрина) для лечения различных раковых заболеваний, включая, например, рак молочной железы, рак легких, рак предстательной железы и лейкоз.
+
+
+
+
Один из фармакологических механизмов действия сердечных гликозидов заключается в их способности связываться с ионообменным насосом, Na,K-ATФазой, и ингибировать активность этого конкретного фермента. Na,K-ATФаза, то есть, трансмембранный белок, который катализирует активный транспорт Na и K через плазматическую мембрану, представляет собой хорошо известный фармакологический рецептор для сердечных гликозидов. Этот фермент гидролизует АТФ и использует свободную энергию для инициации транспорта K в клетки и транспорта Na из клеток в соответствии с их электрохимическими градиентами (Hauptman, P. J., Garg, R., and Kelly, R. A. Cardiac glycosides in the next millieum. Prog. Cardiovasc. Dis. 41: 247-254, 1999).
+
+
Na,K-АТФaза состоит из двух гетеродимерных субъединиц, то есть, каталитической α-субъединицы и гликозилированной β-субъединицы. Существует также и γ-субъединица, но она пока еще подробно не изучена. α-субъединица имеет сайты связывания с АТФ, Na, K и сердечными гликозидами. Функция β-субъединицы заключается в стабилизации каталитической α-субъединицы, и такая субъединица может также играть регуляторную роль. В клетках млекопитающих были идентифицированы четыре различных α-изоформы (α1, α2, α3, α4) и три различных β-изоформы (β1, β2 и β3). Относительная экспрессия субъединиц каждого типа при нормальных и патологических состояниях значительно отличается. Экспрессия α-изоформ является тканеспецифической и ее уровень в тканях грызунов и человека варьируется (Blanco, G. and Mercer, R. W. Isozymes of the Na,K-АТРase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44): F633-F650, 1998). Также сообщалось, что экспрессия изоформ Na,K- АТФaзы при раковых заболеваниях человека, таких как рак почек, рак легких, гепатоцеллюлярный рак и рак толстой кишки отличается от экспрессии таких изоформ в соответствующих нормальных тканях (Rajasekaran, S. A., Ball, W. J., Bander, N. H., Pardee, J. D. and Rajasekaran, A. K. Reduced expression of beta subunit of Na/K-APTase in human clear cell renal cell carcinoma. J. Urol. 162: 574- 580, 1999; Avila, J., Lecuona, E., Morales, M., Soriano, A., Alonso, T., and Martin-Vasallo, P. Opposite expression pattern of the human Na/K-АТФase beta-1 isoform in stomach and colon adenocarcinomas. Ann. N. Y. Acad. Sci. 834: 633-635, 1997; Espineda, C, Seligson, D. B., Ball, W. J., Rao, J., Palotie, A., Horvath, S., Huang, Y., Shi. T and Rajasekaran, A. K. Analysis of the Na,K-АТФase α- and β-subunit expression profiles of bladder cancer using tissue microarrays. Cancer 97: 1851868, 2003; Jung, M. H., Kim, S.C., Jeon, G. A., Kim, S. H., Kim, Y., Choi, K. S., Park, S. L, Joe, M. K., and Kimm, K. Identification of differentially expressed genes in normal and tumor human gastric tissue. Genomics 69: 281-286, 2000). Кроме того, кажущаяся аффинность сердечных гликозидов по отношению к различным α-изоформам абсолютно отличаются друг от друга. Уровень связывания сердечных гликозидов с αl-изоформой ниже уровня связывания с α2- и α3-изоформами, которые обладают в 250 раз большей или даже еще большей чувствительностью к ингибированию лекарственными средствами этого типа (Blanco, G. and Mercer, R. W. Isozymes of the Na, K-АТФase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44): F633-F650, 1998). В публикации Sakai et al. (FEBS Letters 563: 151- 154, 2004) сообщается, что уровень экспрессии α3-изоформы субъединицы в раковых клетках прямой и ободочной кишки человека превышает уровень ее экспрессии в нормальных клетках прямой и ободочной кишки.
2+
2+
Олеандрин и олеандригенин ингибируют пролиферацию раковых клеток человеческой предстательной железы посредством индуцирования апоптоза, который вызывается, по меньшей мере частично, повышением уровня внутриклеточного Ca благодаря ингибированию Na,K-ATФазы (McConkey, D. J., Lin, Y.., Nutt, L. K., Ozel, H. Z., and Newman, R. A. Cardiac glycosides stimulate Ca increases and apoptosis in androgen-independent, metastatic human prostate adenocarcinoma cells. Cancer Res. 60: 3807-3812, 2000). Олеандрин и олеандригенин также ингибируют экспорт фактора роста фибробластов-2 посредством взаимодействия с мембраной и ингибирования активности Na,K-ATФазы (Smith, J. A., Madden, T., Vijjeswarapu, M., and Newman, R. A. Inhibition of export of fibroblast growth factor-2 (EGF-I) from the prostate cancer cell lines PC3 and DU145 by Anvirzel and its cardiac glycoside component, oleandrin. Biochem. Pharmacol. 62: 469-472, 2001).
1
1
α1-субъединица Na,K-ATФазы присутствует во многих тканях благодаря комплексу αβ, рассматриваемому как ген «домашнего хозяйства», а α3-субъединица детектируется преимущественно в возбуждаемых тканях, в корковом веществе почки, в костном мозге и в сосочках, а также в нервных тканях.
Nerium oleander представляет собой декоративное растение, широко распространенное в субтропической Азии, в юго-западных районах Соединенных Штатов и в странах Средиземноморья. Его лечебные и токсикологические свойства уже давно известны специалистам. Это растение было использовано, например, для лечения геморроя, язвы, лепры, змеиных укусов и даже для стимуляции выкидыша. Олеандрин, который является важным компонентом экстракта олеандра, представляет собой сильный ингибитор роста человеческих опухолевых клеток (Afaq F et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 195:361-369, 2004). Опосредуемая олеандрином гибель клеток ассоциируется с притоком кальция, высвобождением цитохрома С из митохондрий, протеолитическими процессами с участием каспаз 8 и 3, расщеплением под действием поли(АДФ-рибозо)полимеразы и фрагментацией ДНК.
2
Было продемонстрировано, что олеандрин представляет собой основной цитотоксический компонент Nerium oleander (Newman, et al., J. Herbal Pharmacotherapy, vol. 13, pp. 1-15, 2001). Олеандрин представляет собой сердечный гликозид, который является экзогенным и обычно не присутствует в организме. Олеандрин индуцирует апоптоз человеческих, но не мышиных опухолевых клеточных линий (Pathak et al., Anti-Cancer Drugs, vol. 11, pp. 455-463, 2000), ингибирует активацию NF-kB (Manna et al., Cancer Res., vol. 60, pp. 3838-3847, 2000) и опосредует клеточную гибель отчасти благодаря опосредуемому кальцием высвобождению цитохрома C (McConkey et al., Cancer Res., vol. 60, pp. 3807-3812, 2000). Недавно была завершена фаза I испытания экстракта олеандра в горячей воде (то есть, Anvirzel™) (Mekhail et al., Am. Soc. Clin. Oncol., vol. 20, p. 82b, 2001). Было сделано заключение, что экстракты олеандра в дозах до 1,2 мл/м/день являются безопасными для введения человеку. Какой-либо дозоограничивающей токсичности не наблюдалось.
Сообщалось, что убаин, сердечный гликозид, который является эндогенным для организма, усиливает in vitro чувствительность клеток человеческой аденокарциномы легких A549 к лучевой терапии, но является неэффективным для модификации чувствительности фибробластов здоровых легких человека к лучевой терапии (Lawrence, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., vol. 15, pp. 953-958, 1988). Позже было показано, что убаин сообщает человеческим опухолевым клеткам различных гистологических типов, включая клетки плоскоклеточной карциномы и меланомы (Verheye-Dua et al., Strahlenther. Onkol, vol. 176, pp. 186-191, 2000), чувствительность к лучевой терапии. Сердечный гликозид олеандрин также обладает способностью повышать чувствительность клеток к цитотоксическому действию ионизирующего излучения (заявка на патент США рег. No. 10/957875, Newman, et al. и Nasu et al., Cancer Lett. Vol 185, pp.145-151, 2002). В публикации pre-grant заявки на патент США No. 20050112059, Newman et al., описана лучевая терапия усиленного действия, применяемая для лечения рака путем введения олеандрина.
+
+
Chen и др. (Breast Cancer Research and Treatment (2006), 96, 1-15) высказали предположение, что сердечные гликозиды, такие как убаин и наперстянка, могут быть использованы для разработки лекарственных средств против рака молочной железы, таких как ингибиторы Na,K-АТФaзы и антагонисты ER.
Smith и др. (Biochemical Pharmacology (2000), 62, 1-4) сообщают, что ANVIRZEL и его основной компонент, а именно, сердечный гликозид олеандрин, ингибирует экспорт фактора роста опухоли, фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) из клеточных линий рака предстательной железы PC3 и DU145.
Newman и др. (J. Experimental Therapeutics and Oncology (2006), 5, 167-181) сообщают, что инкубирование клеток человеческой злокачественной меланомы BRO с олеандрином приводит к зависимому от времени образованию молекул реактивного кислорода, радикалов супероксид-аниона, которые опосредуют митохондриальные повреждения и потерю пулов клеточного глутатиона (GSH), что в конечном счете приводит к гибели опухолевых клеток.
После экстракции гликозидов из растений вида Nerium были получены фармакологически/терапевтически активные ингредиенты Nerium oleander. Такими компонентами, среди прочих, являются олеандрин, нерин и другие соединения сердечных гликозидов. Растительные экстракты могут быть использованы для лечения клеточно-пролиферативных заболеваний у животных. Экстракты олеандрина, получаемые путем экстракции гликозида Nerium oleander в горячей воде и выпускаемые под торговым знаком ANVIRZEL™, являются коммерчески доступными и содержат концентрированную форму или порошкообразную форму экстракта гликозида Nerium oleander в горячей воде.
Хуа-Чан-Су (Huachansu) представляет собой экстракт, полученный из кожи жабы и содержащий буфадиенолиды, такие как буфалин, сердечный гликозид. Хуа-Чан-Су представляет собой препарат, разрешенный для его применения при лечении рака в Китае. Этот препарат был использован для лечения различных раковых заболеваний, включая рак печени, рак желудка, рак легких, рак кожи и рак пищевода.
Если учесть особую ценность сердечных гликозидов для лечения заболеваний или расстройств, имеющих этиологию, связанную с пролиферацией клеток, то необходимость в разработке способа предсказания терапевтического ответа на лечение данного заболевания или расстройства сердечным гликозидом является совершенно очевидной. Такой способ не был описан ранее, а также не существует упоминаний о каких-либо попытках его разработки.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способу предсказания эффективности сердечного гликозида или композиции, содержащей сердечный гликозид, в отношении конкретного фенотипа заболевания или расстройства, имеющего этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что восприимчивость или чувствительность такого заболевания или расстройства к лечению сердечным гликозидом зависит от отношения уровней экспрессии изоформы α3 к изоформе α1 субъединиц Na,K-АТФазы в клетках или тканях, пораженных заболеванием или пролиферативным расстройством. В общих чертах, чем выше отношение уровня экспрессии изоформы α3 Na,K-АТФазы к уровню экспрессии изоформы α1 Na,K-АТФазы в клетках или тканях, тем более чувствительными (терапевтически восприимчивыми) являются клетки к действию сердечных гликозидов. То есть, чем выше отношение изоформы α3 (восприимчивой к действию лекарственного средства) к изоформе αl (не восприимчивой к действию лекарственного средства), тем более чувствительными являются клетки или ткани к ингибированию их пролиферации сердечными гликозидами.
В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к in vitro прогностическому анализу, который может быть использован для предсказания in vivo терапевтического ответа на заболевание или расстройство, имеющее этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, в целях проведения лечения с использованием сердечного гликозида или композиции, содержащей сердечный гликозид, где указанный анализ включает:
определение отношения α3-изоформы к αl-изоформе α-субъединиц Na, K-АТФазы в образце, выделенном непосредственно или опосредованно из пораженной клеточной ткани in vivo у индивидуума с заболеванием или расстройством, имеющим этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, где указанный образец содержит одну или несколько изоформ α-субъединицы Na, K-ATФазы; и
определение вероятности терапевтического ответа у индивидуума, подвергнутого лечению терапевтически релевантной дозой сердечного гликозида.
В некоторых вариантах изобретения: 1) указанный анализ также включает предсказание терапевтического ответа клеточной ткани на лечение сердечным гликозидом, если отношение превышает или равно по меньшей мере 1; 2) указанный анализ также включает предсказание по меньшей мере частичного терапевтического ответа клеточной ткани на лечение сердечным гликозидом, если отношение составляет в пределах от 0,5 до 1,0; 3) указанный анализ также включает предсказание, по существу, отсутствия терапевтического ответа клеточной ткани на лечение сердечным гликозидом, если отношение составляет менее 0,3; 4) указанный анализ также дополнительно включает предсказание того факта, что ткани, имеющие отношение субъединиц 1:100, будут давать больший ответ на терапевтическое лечение, чем ткани, имеющие отношение изоформ менее, чем 1; 5) указанный анализ также включает предсказание того факта, что ткани, в которых детектируется лишь изоформа α3, но не изоформа α1, будут наиболее восприимчивыми к терапевтическому лечению сердечными гликозидами; и/или 6) указанный анализ также включает предсказание терапевтического ответа клеточной ткани на лечение сердечным гликозидом, если указанное отношение составляет ≥2, ≥3, ≥4, ≥5, ≥7, ≥9, ≥10, ≥15, ≥20, ≥25, ≥40, ≥50, ≥75 или ≥100.
В некоторых вариантах изобретения, вероятность терапевтического ответа выражается как отношение α3-изоформы к α1-изоформе Na,K-АТФазы, представленное в нижеследующей таблице:
Отношение
Вероятность терапевтического ответа у индивидуума
от 0,3 до менее, чем 0,5
от 20 до <30%
от 0,5 до менее, чем 1
от 30 до 50%
≥1
>50%
>10
>75%
В вышеуказанной таблице, терапевтическим ответом может быть частичный или полный терапевтический ответ или замедление прогрессирования заболевания.
В некоторых вариантах изобретения: 1) стадия анализа включает количественную оценку уровня экспрессии каждой изоформы α3 субъединицы Na,K-AТФазы и изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы в образце in vitro или в биоптате, и вычисление их отношения; 2) стадия анализа включает определение количества каждой изоформы α3 субъединицы Na,K-АТФазы по отношению к количеству изоформы α1 субъединицы Na,K-АТФазы в образце in vitro и вычисление их отношения; 3) указанный анализ также включает проведение статистического анализа на основе данных, по которым было определено указанное отношение; 4) указанным образцом является клеточная ткань, клеточная масса, клеточный лизат, мембранные препараты, приготовленные из этих компонентов, или их гистопатологические срезы, фиксированные на предметных стеклах; 5) указанным образцом является образец in vitro; 6) указанный образец содержит по меньшей мере две изоформы α-субъединицы Na, K-ATФазы; 7) указанный образец содержит по меньшей мере α1- и α3-изоформы α-субъединицы Na,K-AТФазы; 8) указанный способ также включает лизис или разрушение клеток или тканей, или взятие биоптатов, или фиксацию срезов ткани для гистопатологической оценки пораженной клеточной ткани in vivo с последующим получением образца; 9) указанный способ включает проведение вестерн-блот-анализа или анализа методом иммуногистохимического окрашивания образца для определения количества и относительного уровня экспрессии изоформы α3 субъединицы Na,K-AТФазы по отношению к изоформе α3 субъединицы Na,K-ATФазы в данном образце и вычисление их отношения; 10) указанный способ также включает проведение радиометрического или денситометрического анализа геля для определения содержания изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы по отношению к содержанию изоформы αl-субъединицы Na,K-ATФазы в образце; 11) указанный способ также включает проведение радиометрического или денситометрического анализа геля для детектирования присутствия и для количественной оценки содержания изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы и изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы в образце; 12) проводят сравнение уровня содержания изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы и изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы в образце с уровнем содержания изоформы α3 субъединицы Na,K-AТфазы и/или изоформы α1 субъединицы Na,K- ATФазы в образце, используемом в качестве позитивного контроля и/или в образце, используемом в качестве негативного контроля; и/или 13) проводят сравнение уровня содержания изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы и изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы в образце ткани, где, как известно, в качестве контроля используется экспрессия только одной из изоформ α3 и α1 субъединиц.
В некоторых вариантах изобретения: 1) пораженную клеточную ткань берут у индивидуума, такого как млекопитающее; 2) пораженную клеточную ткань берут у человека, коров, собак, кошек, лошадей, свиней или других домашних животных, независимо от того, представляют ли они промышленную ценность или нет; 3) заболеванием или расстройством, имеющим этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, является раковое или опухолевое заболевание, или другие пролиферативные заболевания, оказывающие негативное влияние на качество жизни человека или животного; и/или 4) раковое или опухолевое заболевание выбрано из группы, состоящей из рака прямой и ободочной кишки, рака головы и шеи, рака коры надпочечника, рака заднего прохода, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака кости, метастазов в кости, саркомы кости, рака головного мозга, рака молочной железы, рака шейки матки, не-ходжкинской лимфомы, рака прямой кишки, рака пищевода, рака глаз, рака желчного пузыря, карциноидного рака желудочно-кишечного тракта, трофобластоза беременных, болезни Ходжкина, саркомы Капоши, рака почек, рака гортани и гортанной части глотки, рака печени, рака почек (немелкоклеточных и мелкоклеточных карцином), карциноидных опухолей легких, злокачественной мезотелиомы, рака, дающего метастазы, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, рака носовой полости и параназального рака, рака носоглотки, нейробластомы, новообразований в области центральной нервной системы, рака ротовой полости и ротоглотки, остеосаркомы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака пениса, рака гипофиза, рака предстательной железы, ретинобластомы, рака слюнных желез, саркомы, рака кожи, рака желудка, рака яичек, рака тимуса, рака щитовидной железы, рака мочеточника, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы или опухоли Вильмса.
В некоторых вариантах изобретения: 1) указанный способ также включает идентификацию индивидуума, страдающего заболеванием или расстройством, имеющим этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток; 2) указанный способ также включает стадию взятия образца пораженных клеток у индивидуума; 3) указанный способ включает получение точной информации о проведении анализов на присутствие α3- и α1-изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы; и/или 4) указанный способ включает получение подробной информации по поводу интерпретации прогностических данных.
В некоторых вариантах изобретения, пролиферативными заболеваниями являются, но не ограничиваются ими: 1) аутоиммунные заболевания, такие как индуцированный антигеном артрит и аллергический энцефаломиелит; 2) хронические воспалительные пролиферативные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системный хронический ювенильный артрит, остеопороз и псориаз; 3) пролиферативные заболевания молочной железы, включая фиброкистоз; 4) пролиферативные заболевания предстательной железы, включая доброкачественную гиперплазию предстательной железы (BPH); 5) пролиферативные болезни глаз, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию; и 6) сосудистые пролиферативные заболевания, включая атеросклероз и стеноз коронарной артерии. В некоторых вариантах изобретения, лечение двух или более пролиферативных заболеваний осуществляют одновременно.
Раковыми заболеваниями, которые, как очевидно, являются особенно восприимчивыми к лечению сердечными гликозидами, на что указывают лабораторные исследования, проводимые с использованием человеческих опухолевых клеточных линий, являются рак предстательной железы, рак легких, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, остеогенная саркома, рак головного мозга (полиморфная глиобластома) и рак толстой кишки. Раковыми опухолями могут быть опухоли, имеющиеся у человека, у индивидуума, не являющегося человеком, или у животного.
В некоторых вариантах изобретения: 1) сердечный гликозид выбран из группы, состоящей из олеандрина, убаина, буфалина, дигитоксина, дигоксина, цинобуфаталина, цинобуфагина и резибуфогенина; 2) сердечный гликозид присутствует в чистой форме независимо от того, был ли он получен путем экстракции из источника растительного или животного происхождения, или синтезирован или получен путем химической модификации (например, дериватизации) коммерчески доступного сердечного гликозида; 3) сердечный гликозид присутствует в экстракте; 4) сердечный гликозид присутствует в фармацевтическом препарате или в фармацевтической композиции; 5) сердечный гликозид был получен из растительной массы растения олеандра; 6) растения олеандра включают виды Nerium, такие как Nerium oleander, или виды Thevetia, такие как Thevetia nerifolia (также известные как желтый олеандр); и/или 7) экстракт сердечного гликозида был получен путем экстракции из надкритической жидкости (SCF), необязательно, в присутствии модификатора.
В некоторых вариантах изобретения: 1) SCF-экстракт также включает, помимо сердечного гликозида, по меньшей мере одно другое фармакологически приемлемое активное вещество; 2) указанное другое активное вещество может сообщать терапевтическую эффективность сердечному гликозиду при введении указанного экстракта индивидууму; 3) указанное другое активное вещество усиливает терапевтический эффект сердечного гликозида благодаря аддитивному или синергическому действию вместе с указанным сердечным гликозидом и/или 4) указанный экстракт был получен из кожи жабы или выделенного из нее секрета.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к набору, подходящему для его применения при проведении прогностического анализа согласно изобретению. Указанный набор содержит: a) первое «первичное» антитело, обладающее аффинностью связывания с изоформой α3 субъединицы Na,K-АТФазы; и b) второе «первичное» антитело, обладающее аффинностью связывания с изоформой α1 субъединицы Na,K-ATФазы. Указанный набор может быть адаптирован для его применения при проведении вестерн-блот-анализа методом гель-электрофореза и/или анализа на иммуногистохимическое окрашивание.
Указанный набор может также включать, но необязательно: a) композицию для лизиса; b) образец, используемый в качестве позитивного контроля и содержащий изоформу α3 субъединицы Na,K-ATФазы; c) образец, используемый в качестве позитивного контроля и содержащий изоформу α3 субъединицы Na,K-ATФазы и изоформу α1 субъединицы Na,K-ATФазы; d) образец, используемый в качестве негативного контроля и содержащий изоформу α3 субъединицы Na,K-ATФазы и изоформу α1 субъединицы Na,K-ATФазы; e) «второе» антитело, то есть, ПХ-конъюгированное козье антитело против мышиных IgG (которое может быть использовано, например, для визуализации представляющих интерес белков); f) гель-образующий материал, подходящий для проведения анализа методом гель-электрофорезы; g) радиоактивно меченные или окрашивающие маркеры молекулярной массы (хромогенные маркеры, способные продуцировать визуально или инструментально детектируемый сигнал); h) инструкции по применению набора и осуществлению прогностического анализа; i) денситометр или радиометр; j) водную жидкую среду; k) набор для приготовления геля/мембраны; l) блокирующий раствор; m) промывочный буфер; n) материалы, содержащиеся в наборе для вестерн-блот-анализа; или o) их комбинации.
В некоторых вариантах набора: a) первое «первичное» антитело обладает специфической аффинностью связывания с изоформой α3 субъединицы Na,K-ATФазы; b) второе «первичное» антитело обладает специфической аффинностью связывания с изоформой α1 субъединицы Na,K-ATФазы; c) «вторым» антителом является конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против α-цепи мышиного IgG, либо другие, но не мышиные «вторые» антитела против мышиного IgG, связанные с соответствующим маркером, таким как пероксидаза хрена; и/или d) первичными антителами являются моноклональные антитела.
В некоторых вариантах изобретения, набор для анализа на иммуногистохимическое окрашивание включает: a) раствор для обнаружения антигена (который может иметь высокий pH или может быть получен на основе лимонной кислоты); b) буфер; c) материал для гашения эндогенной пероксидной активности (который может содержать пероксид водорода, необязательно в метаноле); d) антитело против изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы и/или антитело против изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы; e) неиммунное антитело против мышиного IgGl; f) универсальный реагент-антитело, содержащий смесь реагентов-антител против кроличьих IgG и против мышиных IgG; g) первичный химический краситель, такой как диаминобензидин; h) общий химический краситель для контрастного окрашивания, такой как гематоксилин или эозин; i) специфический краситель для клеточных органелл, такой как краситель, используемый для окрашивания ядер (например, этидийбромид, бисбензимидазол или сульфат калия-алюминия) или митохондрий (например, красный краситель-метка для митохондрий, 10-нонилакридиновый оранжевый); j) материалы, содержащиеся в наборе для иммуногистологического окрашивания; или k) комбинацию из двух или более указанных компонентов. С использованием смежных срезов тканей или клеток, окрашивание изоформы α1 субъединицы может быть осуществлено методом, аналогичным методу, применяемому для окрашивания изоформы α3 субъединицы, где используются соответствующие специфические «первые» антитела против изоформы α1 субъединицы и изоформы α3 субъединицы. Используемый здесь специфический краситель для клеточных органелл представляет собой агент или комбинацию агентов, используемых для специфического окрашивания органелл конкретных типов (метахондрий, ядер, ядрышек, аппарата Гольджи, вакуолей и т.п.) в клетках (человеческих клетках, нечеловеческих клетках или в клетках животных).
В некоторых вариантах изобретения, анализ на иммуногистохимическое окрашивание включает стадии: a) получения образца ткани млекопитающего; b) иммунохимического окрашивания α3-изоформы или α1-изоформы α-субъединицы Na,K-ATФазы, присутствующих в образце; c) определения содержания изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы и содержания изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы в образце; и d) определения отношения α3-изоформы к α1-изоформе, присутствующих в образце.
В некоторых вариантах изобретения, анализ на иммуногистохимическое окрашивание включает стадии: a) получения образца ткани млекопитающего; b) осуществления процедуры восстановления антигена на ткани; c) гашения активности эндогенного пероксида в ткани; d) обработки инактивированной ткани «первыми» антителами против изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы и/или изоформы α1 субъединицы Na,K-ATФазы; е) воздействия на обработанную антителом ткань «вторыми» антителами против кроличьих IgG, против мышиных IgG или их комбинациями; f) окрашивания IgG-обработанной ткани первичным красителем; g) обработки окрашенной ткани красителем для контрастного окрашивания в целях получения иммуногистохимически окрашенной ткани; h) анализа иммуногистохимически окрашенной ткани визуальными или фотометрическими методами; и i) оценки количества α3- и/или α1-изоформ, присутствующих в ткани млекопитающего. Количественная оценка окрашивания антителом против данной изоформы может быть осуществлена, например, в том случае, если «второе» антитело является биотинилированным. Затем может быть добавлен краситель вектастатин ABC с последующим инкубированием в течение 30 минут. После промывки окрашенных срезов, они могут быть инкубированы с диаминобензидиновым субстратом для достижения достаточного уровня окрашивания. Количественная оценка окрашенных тканей может быть затем осуществлена вручную путем определения интенсивности окрашивания или на электронном устройстве с использованием компьютеризированной фиксации изображения и цифрового сканирования представляющих интерес областей. Количественная оценка может быть также упрощена с использованием коммерчески доступной компьютерной программы обработки цифрового изображения. В некоторых вариантах изобретения, данный анализ также включает стадии: j) промывки ткани, полученной в стадии a); k) промывки ткани, полученной в стадии c); l) получения срезов, используемых в качестве негативного контроля (не имеющих опухолевых или раковых клеток), то есть, «непервичного» контроля; m) обработки срезов негативного контроля неиммунным антителом против мышиных IgG; n) промывки ткани, полученной в стадии e); o) промывки ткани, полученной в стадии f); и/или промывки ткани, полученной в стадии g). Промывка может быть осуществлена водой, забуференной водой и/или TBS (примерно 50 мМ трис-HCl, примерно 300 мМ NaCl, примерно 0,1% твин 20, pH примерно 7,6).
Образцом позитивного контроля может быть ткань, клеточная масса, клеточный лизат или приготовленные из них мембранные препараты, которые могут быть получены посредством биопсии или другими хирургическими способами. Образцом негативного контроля может быть ткань, клеточная масса, клеточный лизат или приготовленные из них мембранные препараты, которые, как известно из предварительных анализов, не содержат α3-изоформы α-субъединицы Na,K-ATФазы. В некоторых вариантах изобретения, негативный контроль состоит из клеточной массы опухолевой ткани грызунов (мышей или крыс) или мышиных или крысиных клеток, культивированных in vitro.
Для определения отношения изоформы α3 к α1 могут быть применены аналитические методы, которые представляют собой альтернативные методы оценки относительного состава изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы и их отношений в соответствии с настоящим изобретением. Эти методы могут быть осуществлены, например, с использованием соответствующих антител в ELISA (твердофазном иммуноферментном анализе) или массивов белок-содержащих тканей или клеточных лизатов. Альтернативно, для определения мРНК, кодирующей различные изоформы α-субъединицы Na,K-ATФазы, могут быть осуществлены Нозерн-блот-анализы и родственные методы (например, rtPCR, полимеразная цепная реакция в реальном времени). Для оценки количества α3-изоформы и α1-изоформы α-субъединицы, присутствующей в образце, может быть также проведен анализ на иммуногистохимическое окрашивание.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения у индивидуума заболевания или расстройства, имеющего этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, с использованием композиции, содержащей сердечный гликозид, где указанный способ включает:
определение отношения α3-изоформы к αl-изоформе α-субъединиц Na,K-АТФазы в образце, выделенном непосредственно или опосредованно из пораженной клеточной ткани in vivo у индивидуума с заболеванием или расстройством, имеющим этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, где указанный образец содержит одну или несколько изоформ α-субъединицы Na, K-ATФазы; и
если данное отношение составляет ≥0,3, ≥0,5, ≥1, или ≥10, введение указанному индивидууму композиции, содержащей сердечный гликозид.
В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения у индивидуума заболевания или расстройства, имеющего этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, с использованием композиции, содержащей сердечный гликозид, где указанный способ включает:
взятие образца пораженной ткани у индивидуума, страдающего заболеванием, имеющим этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, и образца, содержащего одну или несколько изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы;
определение отношения α3-изоформы к αl-изоформе α-субъединиц Na,K-АТФазы в образце; и
если данное отношение составляет ≥0,3, ≥0,5, ≥1, или ≥10, введение указанному индивидууму композиции, содержащей сердечный гликозид.
2
Некоторыми вариантами настоящего изобретения являются варианты, в которых: 1) указанному индивидууму назначают и вводят терапевтически релевантную дозу композиции, содержащей сердечный гликозид; 2) указанному индивидууму вводят композицию, содержащую сердечный гликозид, в соответствии с назначенной схемой введения доз; 3) указанному индивидууму вводят композицию, содержащую экстракт, включающий сердечный гликозид; 4) указанный экстракт также содержит один или несколько других терапевтически эффективных агентов; 5) указанная композиция также содержит один или несколько других терапевтически эффективных агентов; 6) указанному индивидууму вводят приготовленный в горячей воде экстракт, взятый от растения или животного и содержащий сердечные гликозиды, в дозе от 2 мг до 22,5 мг в день; или 7) указанному индивидууму вводят концентрированный экстракт (например, экстракт в надкритическом количестве CO), взятый от растения или животного и содержащий сердечные гликозиды, в дозе от 0,6 до 4,8 мг; или 8) указанному индивидууму вводят отдельный сердечный гликозид в химически чистой форме в дозе от 10 до 500 мкг.
Отдельные стадии способов согласно изобретению могут быть проведены на отдельном оборудовании или на одном и том же оборудовании.
Настоящее изобретение включает все комбинации описанных здесь аспектов, вариантов и подвариантов.
Краткое описание графического материала
Нижеследующий графический материал представляет часть описания настоящего изобретения и иллюстрирует репрезентативные варианты заявленного изобретения. Исходя из этого графического материала и описания настоящего изобретения, специалист в данной области может осуществить настоящее изобретение без излишнего экспериментирования.
На фиг. 1A представлена фотография релевантных полос на гель-электрофореграмме, полученной в процессе вестерн-блот-анализа человеческих и мышиных клеточных линий, проводимого для оценки относительного количества α1- и α3-изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы.
На фиг. 1В представлен график зависимости концентрации олеандрина (нМ) от процента ингибирования роста клеток человеческой и мышиной опухоли.
На фиг. 2 представлена фотография релевантных полос на гель-электрофореграмме, полученной в процессе вестерн-блот-анализа нормальных и злокачественных человеческих клеток толстой кишки.
На фиг. 3A представлен график зависимости концентрации олеандрина (нМ) от процента ингибирования роста клеток различных опухолевых клеточных линий, в которых наблюдаются различные уровни относительной экспрессии α1- и α3-изоформ субъединиц Na,K-ATФазы.
50
На фиг. 3B представлена гистограмма средних значений концентрации IC олеандрина, ингибирующей рост клеток двух различных групп опухолевых клеточных линий: первой группы, имеющей отношение изоформ субъединиц α3:α1, составляющее более, чем 1, и второй группы, имеющей отношение изоформ субъединиц α3:α1, составляющее менее, чем 1.
На фиг. 4А представлена фотография релевантных полос на гель-электрофореграмме, полученной в процессе вестерн-блот-анализа нетрансфицированных и трансфицированных человеческих опухолевых клеток.
На фиг. 4В представлена гистограмма, иллюстрирующая относительную экспрессию α3-изоформы в нетрансфицированных и трансфицированных клетках, представленных на фиг.4А.
На фиг. 4С представлен график зависимости концентрации олеандрина (нМ) от процента ингибирования роста раковых клеток, представленных на фиг.4А.
На фиг. 5А представлена фотография релевантных полос на гель-электрофореграмме, полученной в процессе вестерн-блот-анализа нетрансфицированных и трансфицированных клеток Panc-1.
На фиг. 5В представлена гистограмма, иллюстрирующая относительную экспрессию α3-изоформы в нетрансфицированных и трансфицированных клетках, представленных на фиг.5А.
На фиг. 5С представлен график зависимости концентрации олеандрина (нМ) от процента ингибирования роста раковых клеток, представленных на фиг.5А.
На фиг. 6A-6F представлены фотографии иммуногистохимически окрашенных клеток нормальной кожи DI 13782.
На фиг. 7A-7H представлены фотографии иммуногистохимически окрашенных клеток меланомы кожи: на фиг. 7A-7B изображены клетки DI 15041; на фиг. 7C-7D изображены клетки DI 15832; на фиг. 7E-7F изображены клетки DI 15833; на фиг. 7G-7H изображены клетки DI 15834.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу предсказания клинически благоприятного ответа у индивидуума, страдающего заболеванием или расстройством, имеющим этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток, на его лечение композицией, содержащей сердечный гликозид. Этот способ применяется для определения степени терапевтической восприимчивости индивидуума, страдающего указанным заболеванием или расстройством, на его лечение композицией, содержащей сердечный гликозид. Другими словами, указанный способ применяется для определения вероятности терапевтического ответа у индивидуума после его лечения терапевтически релевантной дозой (или эффективной дозой) одного или нескольких сердечных гликозидов.
Вкратце, образец берут из пораженной ткани индивидуума. Указанный образец содержит одну или несколько изоформ α-субъединиц Na,K-ATФазы, которые присутствуют в пораженной ткани, и которые анализируют описанным здесь способом в целях определения относительных количеств или концентраций α3- и α1- изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы. Затем вычисляют отношение относительных количеств или концентраций. Если отношение α3-изоформы к α1-изоформе превышает или равно 0,3, то этот способ позволяет с большей вероятностью предсказать, что данное заболевание или расстройство будет терапевтически восприимчивым к лечению сердечным гликозидом. Так, например, если отношение составляет 0,3-0,45±0,05, то вероятность того, что данное заболевание или расстройство будет терапевтически восприимчивым к лечению сердечным гликозидом, составляет по меньшей мере 20% или от 20% до менее, чем 30%. Если это отношение составляет менее, чем 0,2 или менее, чем 0,3, то такой способ позволяет предсказать, что вероятность того, что данное заболевание или расстройство будет терапевтически восприимчивым к лечению сердечным гликозидом, составляет менее, чем 20%. В общих чертах, чем выше отношение, тем выше вероятность терапевтического ответа. Так, например, если такое отношение составляет 0,5-0,95±0,05, то вероятность того, что данное заболевание или расстройство будет терапевтически восприимчивым к лечению сердечным гликозидом, составляет по меньшей мере 30% или 30%-50%. Если это отношение выше или равно 1±0,05, то вероятность того, что данное заболевание или расстройство будет восприимчивым к лечению сердечным гликозидом, составляет по меньшей мере 50%. Если это отношение превышает 10±0,05, то вероятность того, что данное заболевание или расстройство будет терапевтически восприимчивым к лечению сердечным гликозидом, составляет по меньшей мере 75%.
Термин «терапевтический ответ» означает, что, в результате лечения сердечным гликозидом, у индивидуума, страдающего указанным заболеванием или расстройством, будет наблюдаться по меньшей мере один из нижеследующих клинически благоприятных эффектов, таких как: ослабление симптомов указанного заболевания или расстройства, уменьшение чистоты возникновения симптомов, ассоциированных с указанным заболеванием или расстройством, частичная ремиссия указанного заболевания или расстройства, полная ремиссия указанного заболевания или расстройства, или более замедленное прогрессирование такого заболевания или расстройства. Другими словами, терапевтическим ответом может быть полный или частичный терапевтический ответ, и описанный способ может быть применен для определения вероятности терапевтического ответа независимо от того, является ли он полным или частичным.
Используемый здесь термин «время до прогрессирования» означает период, отрезок времени или срок, прошедшие после диагностики (или лечения) заболевания, до возникновения обострения заболевания (то есть, до того момента, когда опухоль начинает или продолжает расти). Такое время представляет собой период времени, в течение которого заболевание протекает на одном и том же уровне без прогрессирования, и этот период времени заканчивается, когда заболевание начинает прогрессировать. Прогрессирование заболевания определяется «стадией» клеточного пролиферативного заболевания у пациента до начала или в начале терапии. Так, например, размер, локализацию и число опухолей у индивидуума определяют до начала или в начале терапии. Затем данного индивидуума подвергают лечению сердечным гликозидом и периодически проводят мониторинг размера и числа опухолей. На некоторых более поздних стадиях, размер и/или число опухолей может увеличиваться, что тем самым указывает на прогрессирование заболевания и окончание периода «времени до прогрессирования». Период времени, в течение которого заболевание не прогрессирует или в течение которого степень или тяжесть заболевания не ухудшается, называется «временем до прогрессирования».
При этом, следует отметить, что терапевтическим ответом может быть полный или частичный ответ при введении индивидууму терапевтически релевантных доз. Другими словами, уровень предсказанного терапевтического ответа определяют в дозе, которая не является летальной для индивидуума, подвергаемого лечению сердечным гликозидом. Поэтому, терапевтически релевантной дозой является терапевтическая доза, при которой наблюдается терапевтический эффект от лечения указанного заболевания или расстройства сердечным гликозидом, и при которой индивидууму может быть введен сердечный гликозид без заметного продуцирования нежелательных или серьезных побочных эффектов. Терапевтически релевантная доза не является летальной для индивидуума, даже если она может вызывать у пациента некоторые побочные эффекты. Такой дозой является доза, при которой уровень клинически благоприятных эффектов у индивидуума, которому был введен сердечный гликозид, превышает уровень серьезных побочных эффектов, наблюдаемых у индивидуума после введения сердечного гликозида. Терапевтически релевантная доза для различных индивидуумов может варьироваться в зависимости от ряда установленных фармакологических, фармакодинамических и фармакокинетических параметров. Однако, терапевтически релевантная доза (например, применительно к олеандрину) обычно не превышает 25, 100, 250, 500 или 1000 микрограммов сердечного гликозида в день, либо такая доза может составлять в пределах 25-500 или 25-1000 микрограммов сердечного гликозида в день. Поэтому, способ согласно изобретению применяется для предсказания степени восприимчивости данного заболевания или расстройства к терапевтическому лечению индивидуума, которому была введена терапевтически релевантная доза. Специалистам в данной области известно, что фактическое количество лекарственного средства, необходимое для достижения желаемого терапевтического эффекта у индивидуума, может варьироваться у различных индивидуумов в зависимости от основных положений фармацевтической практики.
Терапевтически релевантная доза может быть введена в соответствии с любой схемой введения доз, обычно применяемой для лечения заболеваний или расстройств, имеющих этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток. Терапевтически релевантная доза может быть введена один раз в день, два раза в день, три раза в день или более. Такая доза может быть введена через день, через два дня, через три дня, два раза в неделю, каждую неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, ежемесячно, два раза в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца, раз в четыре месяца, два раза в год, один раз в год или в любых вышеуказанных комбинациях. Так, например, терапевтически релевантная доза может быть введена один раз в день в течение одной или нескольких недель.
Термин «композиция для лизиса» означает один или несколько агентов, способных осуществлять лизис клеточной мембраны с образованием клеточного лизата или до полного растворения клеточных компонентов. Такая композиция для лизиса может содержать один или несколько из нижеследующих агентов, таких как водная жидкая среда, забуферивающий агент, соль, хелатообразующий агент, поверхностно-активное вещество, противовспениватель, ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы и АТФазы.
«Образец позитивного контроля», если он используется здесь по отношению к набору, содержит изоформу α3 субъединицы Na,K- АТФазы. Позитивный контроль может также включать изоформу α1 субъединицу Na,K-АТФазы. Количество или концентрации каждой изоформы субъединицы независимо могут быть определены предварительно, либо они являются известными. Количество или концентрация изоформы субъединицы могут быть достаточными для получения позитивного ответа на присутствие изоформы субъединицы, как было определено в соответствии со стандартным методом, применяемым в анализе с использованием позитивного контроля. Так, например, в вестерн-блот-анализе, количество или концентрация изоформы субъединицы в позитивном контроле должны быть достаточными для связывания с соответствующим антителом, а именно, они должны быть такими, чтобы при проведении анализа на присутствие субъединицы, например, денситометрическим или радиометрическим методом, мог быть получен позитивный ответ на присутствие данной изоформы субъединицы. При проведении анализа на иммуногистохимическое окрашивание (подробно описанного в примере 27), количество или концентрация изоформы субъединицы в позитивном контроле должны быть достаточными для улучшения визуализации и количественной оценки при нанесении образца на гель, для облегчения отделения от других белков с помощью электрофореза с последующим окрашиванием «первыми» и «вторыми» антителами, как описано выше, или для проведения количественного анализа под микроскопом с помощью компьютерной программы для фиксации изображения на цифровом устройстве и для количественного анализа данного изображения. Если количество или концентрация изоформы субъединицы в контрольном образце уже известны или были определены перед проведением анализа, то калибровочная кривая для данной изоформы субъединицы может быть построена по данным зависимости уровня позитивного ответа от количества или концентрации образца.
Если изоформа α3 субъединицы Na,K-ATФазы присутствует в образце позитивного контроля, то отношение α3-изоформы к α1-изоформе обычно составляет в пределах от 0,3 до 100 или выше. Подходящими интервалами отношений также являются 0,3-0,5, 0,5-1,0, 1,0-20 и 20-100.
Термин «образец негативного контроля», используемый здесь применительно к набору, включает изоформу α1 субъединицы Na,K-ATФазы, но не включает изоформу α3 субъединицы Na,K-ATФазы. Количество или концентрация изоформы α1 субъединицы должны быть достаточными для получения позитивного ответа на присутствие данной изоформы, как было определено в соответствии с конкретным методом, применяемым в анализе, таком как вестерн-блот-анализ, в котором данная изоформа используется в качестве негативного контроля. Количество или концентрация могут быть уже известны или определены заранее, и в этом случае, они могут быть использованы для построения калибровочной кривой для данной изоформы.
В процессе оценки пригодности данного метода и набора для применения в настоящем изобретении, авторами настоящего изобретения были проведены преклинические анализы композиции, содержащей сердечный гликозид, на возможность ее применения для лечения раковых и опухолевых заболеваний различных фенотипов. Такая оценка была проведена in vivo, ex vivo, in vitro и на животных с моделями ксенотрансплантатов. Для оценки каждого фенотипа, клеточный образец ткани или клеточной массы анализировали как описано в настоящей заявке для определения отношения изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы к изоформе α1 субъединицы Na,K-ATФазы. При этом наблюдалась корреляция между фенотипами, которые являются восприимчивыми к лечению сердечным гликозидом, и отношением изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы к изоформе α1 субъединицы Na,K-ATФазы для каждого фенотипа в различных человеческих опухолевых клеточных линиях. Было сделано заключение, что фенотипу ракового или опухолевого заболевания, восприимчивого (или имеющего повышенную вероятность терапевтического ответа) к терапевтическому лечению, соответствует отношение изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы к изоформе α1 субъединицы Na,K-ATФазы, составляющее по меньшей мере 0,3.
Раковые клетки грызунов (крыс или мышей) могут быть использованы в качестве образца негативного контроля. На фиг. 1А представлена пленка, проявленная на геле в вестерн-блот-анализе опухолевых клеточных линий грызунов. Полученные заявителем данные показали, что все опухолевые клеточные линии грызунов (мышей и крыс), протестированные на данный момент времени, не содержали изоформы α3 субъединицы, а пролиферация этих клеток in vitro не подвергалась значительному ингибированию при их инкубировании с сердечными гликозидами (например, с убаином, олеандрином, буфалином и т.п.). Человеческие опухолевые клеточные линии, по существу, являются более восприимчивыми к лечению композицией, содержащей сердечный гликозид, чем мышиные опухолевые клетки (фиг. 1B). Авторы настоящего изобретения считают, что такое различие в терапевтической восприимчивости обусловлено различиями отношений изоформ α3:α1 у двух различных видов, как указывалось выше.
Следует отметить, что антитела против α3-изоформы могут быть закуплены у различных фирм-поставщиков, включая Affinity Bioreagents (Golden, CO), Novus (Littleton, CO) или Sigma hemical Co. (St Louis, MO), и все эти антитела обнаруживали одинаковые способности реагировать (то есть, связываться) с эпитопом α3 в образце позитивного контроля.
У человека, отношение изоформ α3:α1 для α-субъединицы Na,K-ATФазы может варьироваться в зависимости от природы и степени злокачественности ткани. Образцы нормальной и злокачественной ткани толстой кишки были взяты у каждого индивидуума в группе из четырнадцати индивидуумов. Отношение изоформ α3:α1 для каждого образца ткани определяли как описано в настоящей заявке. Данные, представленные на фиг. 2 и в нижеследующей таблице, указывают на относительный дефицит α3-изоформы в нормальных тканях и на присутствие α3-изоформы приблизительно в 66-70% злокачественных тканей. Нормальные и злокачественные ткани содержат изоформу α1 субъединицы.
Индивидуум
Ткань нормальной толстой кишки
Ткань опухоли толстой кишки
отношение α3:α1
отношение α3:α1
1
0,0
0,0
2
0,02
0,64
3
0,03
0,07
4
0,01
0,04
5
0,03
0,0
6
0,0
0,56
7
0,0
3,4
8
0,0
6,0
9
0,0
100,0
10
0,0
0,0
11
0,0
6,2
12
0,0
0,83
13
0,0
0,36
14
0,0
0,00
Отношение изоформ α3:α1 для α-субъединицы Na,K-ATФазы определяли для различных фенотипов человеческих раковых и опухолевых клеток в культивированных клеточных линиях, а также в образцах биоптатов истинных опухолей. Кроме того, относительную восприимчивость каждого фенотипа к лечению композицией, содержащей сердечный гликозид, определяли с использованием данных, полученных в экспериментах, проводимых на клеточных культурах in vitro. Конкретные данные, полученные для композиции, содержащей олеандрин, приводятся в нижеследующей таблице и на фиг. 3A.
Клеточная линия
Тип опухоли
α3:α1
in vitro ответ на олеандрин
IC<sub>50</sub> (нМ)
MDA231
Молочная железа
0,01
Отсутствует*
N/A
BXPC3
Поджелудочная железа
0,29
Отсутствует*
N/A
MCF7
Молочная железа
0,2
Отсутствует*
N/A
SUM149
Молочная железа
0,3
Частичный**
22,5
HCT116
Толстая кишка
1,7
Частичный**
36,2
MiaPaca
Поджелудочная железа
1,5
Полный***
14,2
CACO2
Толстая кишка
4,6
Полный***
9,4
HT29
Толстая кишка
6,8
Полный***
15,6
LS174T
Толстая кишка
7,6
Полный***
20,7
BRO
Меланома
11,5
Полный***
8,2
DOD-1
Толстая кишка
19,8
Полный***
19,6
PANC1
Поджелудочная железа
60
Полный***
6,1
Клеточная линия
Тип опухоли
α3:α1
in vitro ответ на буфалин
IC<sub>50</sub> (нМ)
BXPC3
Поджелудочная железа
0,29
Нет*
N/A
MiaPaca
Поджелудочная железа
1,5
Полный***
2,1
PANC1
Поджелудочная железа
60
Полный***
1,2
* означает менее чем 50%-ное ингибирование роста опухоли, достигаемое при концентрации до 125 нМ** означает более чем 50%-ное, но менее, чем 75%-ное ингибирование роста опухоли, достигаемое при концентрации 62 нМ*** означает более чем 75%-ное ингибирование роста опухоли, достигаемое при концентрации 62 нМ
50
Как указано выше в таблицах, «in vitro ответ» означает степень ингибирования пролиферации данной опухолевой клеточной линии при введении указанной концентрации лекарственного средства (сердечного гликозида) в течение определенного периода времени. Термин «отсутствие ответа» означает менее, чем 50%-ное ингибирование роста, достигаемое в любой из множества тестируемых концентраций лекарственного средства. То есть, такая концентрация не могла быть идентифицирована как величина IC (концентрация, дающая 50%-ное ингибирование клеточного роста в течение определенного периода времени проведения эксперимента). В соответствии с этим, если эта опухолевая клеточная линия обнаруживала рост у млекопитающего, такого как человек, то вероятно, что указанное лекарственное средство является неэффективным в отношении значимого ингибирования роста опухоли. В вышеуказанной таблице, термин «частичный ответ» означает способность данного сердечного гликозида, такого как олеандрин или буфалин, ингибировать пролиферацию клеток более, чем на 50%, но менее, чем на 75% по сравнению с ростом необработанных опухолевых клеток. В соответствии с этим, такой ответ должен соответствовать частичному или не совсем полному терапевтическому ответу опухоли на действие сердечного гликозида в том случае, если это средство было использовано для ингибирования роста опухоли у млекопитающего, такого как человек. И наконец, в вышеуказанной таблице, термин «полный ответ» означает более, чем 75%-ное ингибирование пролиферации опухолевых клеток по сравнению с ингибированием популяции необработанных опухолевых клеток. В соответствии с этим, существует вероятность достижения полного ингибирования роста опухоли (или полного терапевтического ответа) у млекопитающего.
На основе полученных выше данных для отношения изоформ, указанный способ позволяет предсказать, что: 1) клеточные линии MDA231, BXPC3 и MCF7, по существу, должны быть невосприимчивыми к лечению терапевтически релевантным количеством сердечного гликозида; 2) клеточные линии SUM149 и HCTl16 должны давать по меньшей мере частичный ответ на лечение терапевтически релевантным количеством сердечного гликозида; и 3) клеточные линии CACO2, HT29, LS174T, BRO, DOD-I и PANCl должны давать полный терапевтический ответ на лечение терапевтически релевантным количеством сердечного гликозида.
На фиг. 3A представлен график концентрации (нМ) олеандрина (указанного как олеандрин) в зависимости от процента роста опухолевых клеток по отношению к контролю. Полученные данные показали, что оцениваемые клеточные линии можно подразделить на три различные группы в зависимости от их ответа на лечение сердечным гликозидом, как было определено по относительному ингибированию пролиферации человеческих опухолевых клеточных линий: группа I-клетки, рост которых ингибируется менее, чем на 50% при концентрациях до 125 нМ сердечного гликозида; группа II-клетки, рост которых ингибируется на 50% или более при концентрациях до 62 нМ сердечного гликозида; и группа III-клетки, рост которых ингибируется на 75% или более при концентрациях до 62 нМ сердечного гликозида. Репрезентативными клеточными линиями для данных групп являются: группа I-MDA231, BXPC3, MCF-7; группа II-SUM149, BRO; группа III-Panc-1, CaCo2. Результаты, полученные для этих ответов, были предсказаны, исходя из данных отношений изоформ. Для установления степени надежности способа и набора согласно изобретению был проведен статистический анализ данных клеточного ответа. Данные, представленные на фиг.3B, указывают на относительную способность олеандрин-содержащей композиции ингибировать пролиферацию человеческих опухолевых клеток in vitro. Эти данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Опосредованное олеандрином ингибирование роста оценивали в десяти клеточных линиях (представляющих ряд солидных опухолей), в которых отношение содержания изоформ субъединиц α3:α1 составляет >1,0, и в шести клеточных линиях, в которых отношение содержания изоформ α3:α1 составляет <1,0. Эти данные показали, что между этими группами имеется 8-кратное (800%) различие. То есть, было обнаружено, что в клеточных линиях, в которых отношение изоформ α3:α1 составляет ≥1,0, олеандрин является гораздо более эффективным лекарственным средством по сравнению с клетками, в которых изоформа α3 субъединицы экспрессируется лишь на очень низком уровне. Полученные данные показали, что отношение изоформ субъединиц α3:α1 может быть использовано для предсказания восприимчивости раковой или опухолевой клеточной линии на лечение композицией, содержащей сердечный гликозид.
Другие подтверждения относительной важности отношения изоформ α3/α1 с точки зрения предсказания восприимчивости злокачественной ткани-мишени к терапевтическому лечению сердечным гликозидом, приводятся ниже. Искусственное ингибирование экспрессии изоформы α3 в человеческих раковых клетках поджелудочной железы, то есть, изменение содержания изоформ субъединиц Na,K-ATФазы, было достигнуто путем трансфекции клеток с использованием киРНК (РНК, осуществляющей сайленсинг), специфичной к α3-изоформе. Эти данные продемонстрировали снижение уровня экспрессии α3-изоформы (как было определено с помощью вестерн-блот-анализа (фиг. 4A)). Количественная оценка снижения уровня экспрессии α3 с помощью вестерн-блот-анализа подробно проиллюстрирована на фиг. 4В. На фиг. 4C продемонстрировано, что трансфицированные клетки, в которых наблюдается снижение уровня экспрессии α3, теряли свою чувствительность к обработке олеандрином.
50
Другие подтверждения относительной важности отношения изоформ α3/α1 с точки зрения предсказания восприимчивости злокачественной ткани-мишени к лечению сердечным гликозидом, были получены путем трансфекции клеток Panc-1 изоформой αl-субъединицы. Изоформу α1 субъединицы Na,K-ATФазы переносили в клетки Panc-1, которые обычно не экспрессируют α1. Контрольным образцом, представленным на фиг. 5A является образец нетрансфицированных клеток Panc-1, а образцом αl-кДНК, представленным на фиг. 5A, являются клетки Panc-1, трансфицированные изоформой αl-субъединицы. В результате этого, отношение α3:α1 в трансфицированных клетках Panc-1 снижалось (фиг. 5B). Затем оценивали чувствительность трансфицированных клеток Panc-1 к обработке олеандрином. Чувствительность этих трансфицированных клеток к обработке олеандрином снижалась, на что указывало изменение величины IC олеандрина от 4,1 нМ, для нетрасфицированных клеток Panc-1 до более, чем 50 нМ, для α1-трансфицированных клеток (фиг. 5C). В соответствии с этим, в клетках Panc-1, трансфицированных изоформой α1 субъединицы, антипролиферативная активность олеандрина заметно снижалась.
Детектирование и количественная оценка α1- и α3-изоформ субъединицы Na,K-ATФазы могут быть также осуществлены методом иммуногистохимического окрашивания, подробно описанным в примере 27. Клетки подвергали иммуногистохимическому окрашиванию так, чтобы изоформы α3 и αl были окрашены дифференциально. Затем проводили количественную оценку содержания изоформы каждого типа и определяли отношение содержания изоформ α3:α1. Дифференциальное иммуногистохимическое окрашивание изоформ α3 и α1 может быть осуществлено различными методами. В некоторых вариантах изобретения, образец ткани окрашивают двумя различными красителями, где один краситель является селективным или специфичным к α3-изоформе, а другой краситель является селективным или специфичным к α1-изоформе. В некоторых вариантах изобретения, два бликородственных, но различных образца были получены из одной и той же ткани, а затем окрашены, так, чтобы первый образец был обработан α3-изоформой для окрашивания, а второй образец был обработан α1-изоформой для окрашивания. Затем проводили количественную оценку изоформ α3 и α1, после чего определяли отношение изоформы α3 к изоформе α1. Исходя из этого отношения было сделано предсказание относительно вероятности формирования терапевтического ответа ткани на лечение сердечным гликозидом.
Количественная оценка α3-изоформы и α1-изоформы субъединицы Na,K-ATФазы в иммуногистохимически окрашенном образце (предметном стекле с клетками или тканью) может быть осуществлена вручную или автоматизированным методом. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, индивидуальная оценка интенсивности окрашивания фиксированных площадей на соответствующим образом окрашенных предметных стеклах (например, путем визуального наблюдения относительной интенсивности окрашивания (например, оценки интенсивности по шкале 0-5, где оценка 0 означает недетектируемое окрашивание, а оценка 5 означает интенсивное окрашивание), а затем регистрирования средних интенсивностей окрашивания ряда исследуемых областей и сравнения относительного окрашивания предметных стекол с α3 и с αl, с последующим вычислением отношения содержания α3 к содержанию α1 в образце. Другой способ количественной оценки относительного окрашивания α1 и α3 (то есть, отношения α3:α1 в образце) может быть осуществлен путем исследования под микроскопом фиксированных площадей окрашенных предметных стекол и с помощью компьютерной программы для анализа на цифровом устройстве в целях определения относительных интенсивностей окрашивания. Аналогичным образом, компьютерный анализ цифрового видео может быть также осуществлен для определения относительного окрашивания изоформ и вычисления отношения α3:α1 по интенсивностям окрашивания, и тем самым определения отношения содержания изоформы α3 к изоформе α1 в образце.
+
+
Так, например, на фиг. 6A-6F представлены фотографии нормальных клеток кожи DI 13782. На фиг. 6A, 6C и 6E проиллюстрирована иммунореактивность α-субъединицы Na/K-ATФазы (иммуногистохимически окрашенной). На фиг. 6B, 6D и 6F представлены фотографии соответствующих срезов, инкубированных с неиммунным (контрольным) IgG. У всех доноров со здоровой кожей наблюдались высокие уровни, 2+ или 3+, иммунореактивности. Все образцы, а именно, образцы плоскоклеточного эпителия, эпителия волосяного мешочка, базальной мембраны сальных желез, клубочковидных потовых желез и мононуклеарных лимфоцитов в кровеносных сосудах были позитивно окрашены. Выпрямляющая мышца привратника имела слабую иммунореактивность.
+
+
+
+
На фиг. 7A-7H представлены фотографии клеток меланомы. На фиг. 7A, 7C, 7E и 7G проиллюстрирована иммунореактивность α-субъединицы Na/K-ATФазы (иммуногистохимически окрашенной). На фиг. 7B, 7D, 7F и 7H представлены соответствующие срезы, инкубированные с неиммунным (контрольным) IgG. На фиг. 7A и 7B проиллюстрированы клетки DI 15838. На фиг. 7C и 7D проиллюстрированы клетки DI 15840. На фиг. 7E и 7F проиллюстрированы клетки DI 15842. На фиг. 7G и 7H проиллюстрированы клетки DI 15844. Все образцы BCC были позитивными по α-субъединице Na/K-ATФазы с различной степенью интенсивности. Вся иммунореактивность была сосредоточена в ядре и в цитоплазме опухолевых клеток. После дифференциального иммуногистохимического окрашивания срезов может быть определено отношение α3-изоформы субъединицы к α1-изоформе субъединицы, и может быть предсказана терапевтическая восприимчивость к лечению сердечным гликозидом.
Была проведена оценка надежности способа согласно изобретению в отношении другого сердечного гликозида. Хуа-чан-су представляет собой экстракт из кожи жабы, содержащей сердечные гликозиды, известные как буфадиенолиды. Была проведена оценка терапевтической восприимчивости двух человеческих клеточных линий поджелудочной железы (SW 1990 и Panc-1) к лечению препаратом хуа-чан-су. Исходя из данных, представленных выше в таблицах, можно предсказать, что клетки SW 1990 не обладают терапевтической восприимчивостью к лечению препаратом хуа-чан-су, а клетки Panc-1 обладают такой восприимчивостью. Данные, полученные для ответов, дали ожидаемые результаты.
В представленных ниже примерах проиллюстрирована эффективность сердечных гликозидов при их использовании для лечения раковых и опухолевых заболеваний и расстройств. В примере 21 приводится описание клинического случая лечения пациента с метастазирующей гастриномой поджелудочной железы. Прогностические анализы, способы и наборы согласно изобретению могут быть применены в комбинации с одним или несколькими другими прогностическими или диагностическими анализами, способами и наборами, известными специалистам в области лечения заболеваний или расстройств, имеющих этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток. Так, например, если врач-клиницист проводит лечение индивидуума, страдающего раковым или опухолевым заболеванием, с использованием комбинации сердечного гликозида и другого химиотерапевтического средства или лучевой терапии, и если известно, что раковое или опухолевое заболевание конкретного фенотипа, которым страдает данный индивидуум, обладает частичной терапевтической восприимчивостью к лечению указанным другим химиотерапевтическим средством или лучевой терапией, то способ согласно изобретению может быть применен для определения вероятности по меньшей мере частичного терапевтического ответа ракового или опухолевого заболевания у индивидуума на лечение сердечным гликозидом. Если полученные результаты указывают на более высокую вероятность терапевтической восприимчивости данного ракового или опухолевого заболевания на лечение сердечным гликозидом, то врач-клиницист может назначить и/или проводить лечение такого ракового или опухолевого заболевания сердечным гликозидом и другим терапевтическим средством или лучевой терапией или их комбинациями.
2
2
Сердечным гликозидом может быть любой сердечный гликозид, который, как известно, обладает терапевтической активностью при лечении заболевания или расстройства, имеющего этиологию, связанную с избыточной пролиферацией клеток. Сердечный гликозид может быть получен в чистой форме или в виде смеси с одним или несколькими другими соединениями. Сердечный гликозид может быть получен в виде экстракта. Экстракт может быть приготовлен путем экстракции из надкритической жидкости (SCF) диоксида углерода (CO), либо он может быть приготовлен в виде его химически модифицированной формы (например, в виде экстракта, включающего этанол или приготовленного с использованием SCF-CO и этанола). Экстракт может быть получен из материала растительного или животного происхождения. Материалом животного происхождения может быть экссудат жабы (например, Bufo bufo). Материалом растительного происхождения может быть растительная масса, например, растительная масса, полученная из растений вида Nerium, такого как Nerium oleander, или растения вида Thevetia, такого как Thevetia nerifolia или Thevetia puruviana (также известного как желтый олеандр). Способ экстракции может быть проведен на осушенном порошке листьев Nerium oleander, полученном способом, описанным в совместно рассматриваемой предварительной заявке на патент США, рег. No. 60/653210, поданной 15 февраля 2005 под названием Addington или заявке на патент США рег No. 11/340016, поданной 26 января 2006 под названием Addington, в заявке на патент США рег No. 11/191650, поданной 28 июля 2006 (в настоящее время, в патенте США No. 7402325, выданном 22 июля 2008) под названием Addington, или в международной патентной заявке PCT No. PCT/US06/29061, поданной 26 июля 2006, полное описание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки, или способом, описанным в настоящей заявке.
Используемый здесь термин «олеандрин» означает все известные формы олеандрина, если это не оговорено особо. Олеандрин может присутствовать в рацемической, оптически чистой или оптически обогащенной форме. Материал из растения Nerium oleander может быть получен, например, в виде коммерчески доступного продукта от таких поставщиков, как Aldridge Nursery, Atascosa, Texas.
Экстракт может быть получен путем экстракции модифицированной (например, этанолом) или немодифицированной надкритической жидкости растительной массы, содержащей сердечный гликозид. Экстракт надкиритической жидкости может содержать по меньшей мере одно другое фармакологически активное вещество, которое, при введении экстракта индивидууму, будет сообщать сердечному гликозиду терапевтическую эффективность. Этот экстракт и вводимый вместе с ним сердечный гликозид могут обладать аддитивным или синергическим терапевтическим действием.
Этот экстракт может быть получен различными способами. Такой экстракт может быть получен способом, разработанным Dr. Huseyin Ziya Ozel, см. патент США No. 5135745, где описана процедура получения экстракта данного растения в воде. Как сообщалось, этот водный экстракт содержит несколько полисахаридов с молекулярными массами, варьирующимися в пределах от 2 кД до 30 кД, а именно, олеандрин и олеандригенин, одорозид и нериталозид. Как сообщалось, указанными полисахаридами являются кислотные гомополигалактуронаны или арабиногалатуронаны. В патенте США No. 5869060, Selvaraj и др. описаны экстракты растения вида Nerium в горячей воде и методы их получения. Затем полученный экстракт может быть лиофилизован с получением порошка. В патенте США No. 6565897 (публикация No. 20020114852 и Международная заявка PCT No. WO 2000/016793, Selvaraj и др.) описан способ экстракции в горячей воде с получением, по существу, стерильного экстракта. Erdemoglu и др. (J. Ethnopharmacol. (2003) Nov. 89(1), 123-129) описали результаты сравнения водных и этаноловых экстрактов растений, включая Nerium oleander, которые проводили, исходя из антиноцицептивных и противовоспалительных свойств. Экстракты Nerium oleander из органического растворителя описаны Adome et al. (Afr. Health Sci. (2003) Aug. 3(2), 77-86; этаноловый экстракт), el-Shazly et al. (J. Egypt Soc. Parasitol. (1996), Aug. 26(2), 461-473; этаноловый экстракт), Begum et al. (Phyto chemistry (1999) Feb. 50(3), 435-438; метаноловый экстракт), Zia et al. (J. Ethnolpharmacol. (1995) Nov. 49(1), 33-39; метаноловый экстракт), и Vlasenko et al. (Farmatsiia. (1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; спиртовой экстракт). В публикации заявки на патент США No. 20040247660, Singh et al., описано получение стабилизированного белком липосомного препарата олеандрина, используемого для лечения рака. В публикации заявки на патент США No. 20050026849, Singh et al., описан водорастворимый препарат олеандрина, содержащий циклодекстрин. В публикации заявки на патент США No. 20040082521, Singh et al., описано получение стабилизированных белком препаратов из наночастиц олеандрина, приготовленного в виде экстракта в горячей воде.
Экстракция из SCF может быть осуществлена в присутствии модификатора в надкритической жидкости, такой как этанол, используемого для улучшения экстракции нужного(ых) соединения(й) из растительной массы. Модификаторы обычно имеют летучесть, степень которой колеблется между летучестью надкритической жидкости и экстрагируемого соединения, и такие модификаторы должны быть смешаны с надкритической жидкостью. В некоторых вариантах изобретения, таким модификатором является жидкость при комнатной температуре. Неограничивающими примерами могут служить модификаторы, выбранные из группы, состоящей из этанола, метанола, пропанола, ацетона, этилацетата, метиленхлорида и т.п.
Экстракт представляет собой смесь фармакологически активных соединений, таких как олеандрин или другие сердечные гликозиды, олеазид и другие растительные материалы. Теоретически, экстракт олеандрина, полученный путем экстракции из надкритической жидкости, содержит 0,9-2,5 масс.% олеандрина. Были получены SCF-экстракты, содержащие различные количества олеандрина. В одном из вариантов изобретения, SCF-экстракт содержит примерно 2 масс.% олеандрина.
Как свидетельствуют полученные здесь данные, SCF-экстракт содержит смесь различных компонентов. Некоторыми из таких компонентов являются олеандрин, олеазид A, олеандригенин, нериталозид, одорзид (Wang X, Plomley JB, Newman RA and Cisneros A. LC/MS/MS analyses of an oleander extract for cancer treatment, Analytical Chem. 72: 3547-3552, 2000), и другие неидентифицированные компоненты. SCF-экстрагируемые неидентифицированные компоненты SCF-экстракта, очевидно, включают по меньшей мере один другой фармакологически активный компонент, который повышает эффективность олеандрина в SCF-экстракте. То есть, исходя из наблюдаемой эффективности, очевидно, что по меньшей мере один другой SCF-экстрагируемый компонент и олеандрин действуют аддитивно или синергически.
При этом, возможно, что относительные эффективности этих экстрактов также отличаются, как показала оценка эффективности в отношении нескольких опухолевых клеточных линий. В этом случае, даже если в этом экстракте сердечный гликозид присутствует в количестве или в концентрации, которые являются слишком высокими для получения терапевтически релевантной дозы, то такой экстракт также является частью настоящего изобретения. В представленной ниже таблице систематизированы некоторые данные относительной эффективности трех различных форм сердечного гликозида олеандрина.
Лекарственное средство
Клетки человеческой меланомы BRO (IC<sub>50</sub>, мкМ)
Раковые клетки человеческой поджелудочной железы PANC-1 (IC<sub>50</sub>, мкМ)
Чистый олеандрин
0,017*
0,01
Экстракт в горячей воде, содержащий олеандрин и сложные полисахариды
0,052
0,03
Экстракт надкритического СО<sub>2</sub>, содержащий олеандрин и родственные сердечные гликозиды
0,007
0,004
* IC<sub>50</sub> тестируемых соединений выражены в микромолярных (мкМ) эквивалентных концентрациях олеандрина в этих экстрактах. То есть, эти данные представляют собой концентрацию олеандрина как свободного химического соединения или как части экстракта, необходимую для 50%-ного ингибирования роста или пролиферации опухолевых клеток по сравнению с необработанными клетками.
50
2
50
2
2
2
2
Как показано в вышеприведенной таблице, величина IC экстракта из надкритической жидкости CO составляет лишь 50% от величины ICотдельно взятого олеандрина в отношении ингибирования клеток Panc-1 и BRO, что дает основание предположить, что экстракт олеандра в надкритической жидкости CO является по меньшей мере в два раза более сильным (более эффективным), чем сам олеандрин в отношении ингибирования роста клеток Panc-1 или BRO. При сравнении был сделан вывод, что из трех протестированных продуктов, экстракт в горячей воде был наименее эффективным. Полученные данные продемонстрировали сильную цитотоксичность олеандрина в отношении человеческих опухолевых клеточных линий, а также экстрактов с относительно высокой активностью, а именно, по мере убывания, экстрактов в надкритическом CO> олеандрина> экстрактов в горячей воде. Эти данные указывают на то, что цитотоксичность экстрактов в надкритическом CO, вероятно, обусловлена присутствием в SCF-экстракте, помимо олеандрина, по меньшей мере одного другого фармакологически активного компонента, и что эффективность экстракта в надкритическом CO значительно превышает (в 7,4 раза) эффективность экстракта в горячей воде. Полученные данные явно продемонстрировали значительно более высокую эффективность SCF-экстракта по сравнению с экстрактом в горячей воде и даже по сравнению с самим олеандрином. Такое увеличение эффективности превышает ожидаемое увеличение, которое могло быть достигнуто только в результате увеличения концентрации олеандрина в SCF-экстракте.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования пролиферации раковых или опухолевых клеток путем обработки клеток эффективным количеством экстракта, такого как SCF-экстракт или водный экстракт согласно изобретению.
Сердечный гликозид может быть приготовлен в любой подходящей фармацевтически приемлемой дозированной форме. В частности, могут быть использованы дозированные формы для парентерального введения, внутриушного введения, офтальмического введения, интраназального введения, введения путем ингаляции, трансбукального введения, подъязычного введения, внутрикишечного введения, местного введения, введения в ротовую полость, перорального введения и введения путем инъекции. Конкретными лекарственными формами являются твердые или жидкие дозированные формы. Репрезентативными подходящими лекарственными формами являются таблетки, капсулы, пилюли, маленькие капсулы, пастилки, саше и другие дозированные формы, известные среднему специалисту-фармацевту.
Количество олеандрина, включенного в единичную дозированную форму согласно изобретению, может составлять по меньшей мере одну или несколько доз и может быть выбрано, исходя из основных положений фармацевтической практики. Эффективное количество и терапевтически приемлемое количество терапевтического соединения рассчитывается для каждого конкретного случая. Термин «эффективное количество», если он относится, например, к фармацевтическим средствам, рассматривается как фармацевтически эффективное количество. Фармацевтически эффективное количество представляет собой количество или уровень активного ингредиента, которые являются достаточными для формирования необходимого или желательного терапевтического ответа, или, другими словами, количество, которое является достаточным для формирования значительного биологического ответа при его введении пациенту. Значительный биологический ответ может вырабатываться в результате введения одной или множества единичных доз активного вещества. Единичная доза может составлять одну или несколько доз. При этом, следует отметить, что конкретная доза для любого пациента зависит от ряда факторов, включая заболевание, подвергаемое лечению, тяжесть такого заболевания, состояние здоровья пациента, возраст, пол, массу, режим питания, фармакологический ответ, конкретно применяемую дозированную форму и другие факторы.
Желательная доза для перорального введения составляет до 5 доз, хотя могут быть введены по меньшей мере одна и до десяти доз. Репрезентативные дозированные формы содержат 0,6 мг SCF-экстракта на дозированную форму, всего от 0,6 до 60 мг на дозу (1-10 доз).
Сердечный гликозид может присутствовать в дозированной форме в количестве, достаточном для введения индивидууму, начиная с дозы олеандрина от 12 до 1200 мкг, или еще большей или меньшей дозы.
Для лечения млекопитающих, сердечный гликозид может быть включен в дозированную форму. В некоторых своих вариантах, дозированная форма не имеет энтеросолюбильного покрытия и высвобождает содержащийся в ней сердечный гликозид за период времени от 0,5 до 1 часа или менее. В некоторых своих вариантах, дозированная форма имеет энтеросолюбильное покрытие и высвобождает содержащийся в ней сердечный гликозид в область, расположенную ниже желудка, например, в тощую кишку, подвздошную кишку, тонкий кишечник и/или толстый кишечник (толстую кишку). Дозированные формы с энтеросолюбильным покрытием высвобождают сердечные гликозиды в системный кровоток через 1-10 часов после перорального введения.
Из полученных ранее данных о дозах для животных было сделано предположение, что при пероральном введении будут биологически доступны 50-75% вводимой дозы экстракта олеандра, а именно, 0,25-0,4 мг, 0,1-50 мг, 0,1-40 мг, 0,2-40 мг, 0,2-30 мг, 0,2-20 мг, 0,2-10 мг, 0,2-5 мг, 0,2-2,5 мг, 0,2-2 мг, 0,2-1,5 мг, 0,2-1 мг, 0,2-0,8 мг, 0,2-0,7 или 0,25-0,5 мг олеандрина на дозированную форму. Из расчета среднего объема крови у взрослого человека, составляющего 5 литров, ожидаемая концентрация олеандрина в плазме будет составлять в пределах 0,05-2 нг/мл, 0,005-10 нг/мл, 0,005-8 нг/мл, 0,01-7 нг/мл, 0,02-7 нг/мл, 0,03-6 нг/мл, 0,04-5 нг/мл или 0,05-2,5 нг/мл. Рекомендованная суточная доза олеандрина, присутствующего в SCF-экстракте, обычно составляет примерно 0,25-50 мг при введении два раза в день или примерно 0,9-5 мг при введении два раза в день или примерно через каждые 12 часов. Такая доза может составлять примерно 0,5-100 мг/день, примерно 1-80 мг/день, примерно 1,5-60 мг/день, примерно 1,8-60 мг/день, примерно 1,8-40 мг/день. Максимально допустимая доза может составлять примерно 100 мг/день, примерно 80 мг/день, примерно 60 мг/день, примерно 40 мг/день, примерно 38,4 мг/день или примерно 30 мг/день экстракта олеандра, содержащего олеандрин, а минимальная эффективная доза может составлять примерно 0,5 мг/день, примерно 1 мг/день примерно 1,5 мг/день, примерно 1,8 мг/день, примерно 2 мг/день, или примерно 5 мг/день.
Набор или композиция согласно изобретению могут включать любые эксципиенты, подходящие для аналитического или фармацевтического применения.
Следует отметить, что описанное здесь соединение может обладать одной или несколькими функциями препарата согласно изобретению. Так, например, такое соединение может служить в качестве поверхностно-активного вещества и смешиваемого с водой растворителя, а также в качестве поверхностно-активного вещества и не смешиваемого с водой растворителя.
Жидкая композиция может содержать один или несколько фармацевтически или аналитически приемлемых жидких носителей. Жидким носителем может быть водный, безводный, полярный, неполярный и/или органический носитель. Жидкими носителями являются, например, но не ограничиваются ими, смешиваемый с водой растворитель, не смешиваемый с водой растворитель, вода, буфер и их смеси.
Используемые здесь термины «водорастворимый растворитель» или «смешиваемый с водой растворитель» являются взаимозаменяемыми и означают органическую жидкость, которая не образует двухфазную смесь с водой и обладает растворимостью в воде, достаточной для получения водной смеси растворителя, содержащей по меньшей мере пять процентов растворителя и не отделенной от жидких фаз. Такой растворитель является подходящим для введения человеку или животным. Репрезентативными водорастворимыми растворителями являются, например, но не ограничиваются ими, ПЭГ (полиэтиленгликоль), ПЭГ 400 (полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу приблизительно 400), этанол, ацетон, алканол, спирт, эфир, пропиленгликоль, глицерин, триацетин, полипропиленгликоль, ПВП (поливинилпирролидон), диметилсульфоксид, N,N-диметилформамид, формамид, N,N-диметилацетамид, пиридин, пропанол, N-метилацетамид, бутанол, солюфор (2-пирролидон), фармазольв (N-метил-2-пирролидон).
Используемые здесь термины «не растворимый в воде растворитель» или «не смешиваемый с водой растворитель», являются взаимозаменяемыми и означают органическую жидкость, которая образует двухфазную смесь с водой или отдельные фазы, в случае, если концентрация растворителя в воде превышает пять процентов. Такой растворитель является подходящим для его введения человеку или животным. Репрезентативными не растворимыми в воде растворителями являются, например, но не ограничиваются ими, триглицериды со средней длиной цепи/длинноцепочечные триглицериды, масло, касторовое масло, кукурузное масло, витамин E, производное витамина Е, олеиновая кислота, жирная кислота, оливковое масло, софтизан 645 (диглицерилкаприлат/капрат/стеарат/гидроксистеарат-адипат), миглиол, каптекс (Captex 350: глицерилтрикаприлат/капрат/ триглицеридлаурат; Captex 355: глицерилтрикаприлат/триглицерилкапрат; Captex 355 EP/NF: глицерилтрикаприлат/триглицеридкапрат со средней длиной цепи).
Подходящие растворители перечислены в «Международном соглашении по нормализации технических требований для регистрации фармацевтических средств, применяемых в медицине (ICH), в руководстве по содержанию промышленных примесей Q3C: остаточные растворители» (1997), в котором приводятся рекомендации по содержанию остаточных растворителей, рассматриваемому как безопасное при приготовлении фармацевтических средств. Репрезентативными растворителями являются растворители, представленные как растворители класса 2 или класса 3. Растворителями класса 3 являются, например, уксусная кислота, ацетон, анизол, 1-бутанол, 2-бутанол, бутилацетат, трет-бутилметиловый эфир, кумол, этанол, этиловый эфир, этилацетат, этилформиат, муравьиная кислота, гептан, изобутилацетат, изопропилацетат, метилацетат, метил-1-бутанол, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, 2-метил-1-пропанол, пентан, 1-пентанол, 1-пропанол, 2-пропанол или пропилацетат.
Другими веществами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении в качестве не смешиваемых с водой растворителей, являются: Captex 100: дикапрат пропиленгликоля; Captex 200: дикаприлат/дикапрат пропиленгликоля; Captex 200 P: дикаприлат/дикапрат пропиленгликоля; дикаприлокапрат пропиленгликоля; Captex 300: глицерилтрикаприлат/капрат; Captex 300 EP/NF: глицерилтрикаприлат/триглицеридкапрат со средней длиной цепи; Captex 350: глицерилтрикаприлат/капрат/лаурат; Captex 355: глицерилтрикаприлат/капрат; Captex 355 EP/NF: глицерилтрикаприлат/триглицеридкапрат со средней длиной цепи; Captex 500: триацетин; Captex 500 P: триацетин (фармацевтической чистоты); Captex 800: пропиленгликоль-ди(2-этилгексаноат); Captex 810 D: глицерилтрикаприлат/капрат/линолеат; Captex 1000: глицерилтрикапрат; Captex CA: триглицериды со средней длиной цепи; Captex MCT-170: триглицериды со средней длиной цепи; Capmul GMO: глицерилмоноолеат; Capmul GMO-50 EP/NF: глицерилмоноолеат; Capmul MCM: моно- и диглицериды со средней длиной цепи; Medium Capmul MCM C8: глицерилмонокаприлат; Capmul MCM C10: глицерилмонокапрат; Capmul PG-8: монокаприлат пропиленгликоля; Capmul PG-12: монолаурат пропиленгликоля; Caprol 10G10O: декаолеат декаглицерина; Caprol 3GO: моноолеат триглицерина; Caprol ET: сложный эфир полиглицерина и смешанных жирных кислот; Caprol MPGO: диолеат гексаглицерина; Caprol PGE 860: моно-, диолеат декаглицерина.
Используемый здесь термин «поверхностно-активное вещество” означает соединение, содержащее полярные или заряженные гидрофильные группы, а также неполярные гидрофобные (липофильные) группы, то есть, поверхностно-активное вещество является амфифильным. Термин «поверхностно-активное вещество» может означать одно соединение или смесь соединений. Поверхностно-активным веществом может быть солюбилизирующий агент, эмульгирующий агент или диспергирующий агент. Поверхностно-активное вещество может быть гидрофильным или гидрофобным.
Гидрофильным поверхностно-активным веществом может быть любое гидрофильное поверхностно-активное вещество, которое может быть использовано в фармацевтических композициях. Такое поверхностно-активное вещество может быть анионогенным, катионогенным, цвиттерионным или неионогенным, хотя предпочтительным является неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество. Как обсуждалось выше, неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество обычно имеет величину ГЛБ, превышающую примерно 10. В объем настоящего изобретения также входят смеси гидрофильных поверхностно-активных веществ.
Аналогичным образом, гидрофобным поверхностно-активным веществом может быть любое гидрофобное поверхностно-активное вещество, подходящее для его применения в фармацевтических композициях. В основном, подходящие гидрофобные поверхностно-активные вещества обычно имеют величину ГЛБ, превышающую примерно 10. В объем настоящего изобретения также входят смеси гидрофобных поверхностно-активных веществ.
Примерами дополнительных подходящих солюбилизаторов являются: спирты и полиолы, такие как этанол, изопропанол, бутанол, бензиловый спирт, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутандиолы и их изомеры, глицерин, пентаэритритол, сорбит, маннит, транскутол, диметилизосорбид, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, циклодекстрины и производные циклодекстринов; эфиры полиэтиленгликолей, имеющие среднюю молекулярную массу примерно от 200 до 6000, такие как эфир тетрагидрофурфурилового спирта и ПЭГ (гликофурол, который является коммерчески доступным и поставляется фирмой BASF под торговым знаком Тетрагликоль) или метокси-ПЭГ (Union Carbide); амиды, такие как 2-пирролидон, 2-пиперидон, капролактам, N-алкилпирролидон, N-гидроксиалкилпирролидон, N-алкилпиперидон, N-алкилкапролактам, диметилацетамид и поливинилпирролидон; сложные эфиры, такие как этилпропионат, трибутилцитрат, ацетилтриэтилцитрат, ацетилтрибутилцитрат, триэтилцитрат, этилолеат, этилкаприлат, этилбутират, триацетин, моноацетат пропиленгликоля, диацетат пропиленгликоля, капролактон и его изомеры; валеролактон и его изомеры, бутиролактон и его изомеры; и другие солюбилизаторы, известные специалистам, такие как диметилацетамид, диметилизосорбид (Арлазольв DMI (ICI)), N-метилпирролидоны (фармазольв (ISP)), монооктаноин, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля (поставляемый фирмой Gattefosse под торговым знаком Транскутол) и вода. В объем настоящего изобретения также входят смеси солюбилизаторов.
Если это не оговорено особо, упомянутые здесь соединения представляют собой легко доступные стандартные соединения, выпускаемые промышленностью.
Прозрачная жидкая композиция является прозрачной на вид, поскольку она содержит менее, чем 5 масс.%, менее, чем 3 масс.% или менее, чем 1 масс.% суспендированных твердых веществ по всей массе композиции.
Композиция или набор согласно изобретению могут включать, хотя и необязательно, хелатообразующий агент, консервант, антиоксидант, адсорбенты, подкисляющий агент, подщелачивающий агент, противовспенивающий агент, забуферивающий агент, краситель, электролит, соль, стабилизатор, модификатор тоничности, разбавитель, другой фармацевтический эксципиент или их комбинации.
Используемый здесь термин «антиоксидант» означает вещество, ингибирующее окисление и используемое для предупреждения повреждения препаратов в результате окислительных реакций. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, аскорбиновая кислота, пальмитат аскорбиновой кислоты, витамин Е, производное витамина Е, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, гипофосфорная кислота, монотиоглицерин, пропилгаллат, аскорбат натрия, бисульфит натрия, сульфоксилат натрия-формальдегида, метабисульфит натрия и другие вещества, известные среднему специалисту в данной области.
2
Используемый здесь термин «хелатообразующий агент» означает соединение, образующее хелатные комплексы с ионами металлов в растворе. Примерами хелатообразующих агентов являются EDTA (этилендиаминтетраацетат четырехвалентного натрия), DTPA (диэтилентриаминпентаацетат пятивалентного натрия), HEDTA (тринатриевая соль N-(гидроксиэтил)этилендиаминтриуксусной кислоты), NTA (тринатрийнитролотриацетат), динатрийэтанолдиглицин (NaEDG), натрий-диэтанолглицин (DEGNa), лимонная кислота и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «адсорбент» означает средство, способное удерживать другие молекулы на своей поверхности посредством физических или химических свойств (хемисорбция). Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, порошкообразный и активированный уголь и другие вещества, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «подщелачивающий агент» означает соединение, используемое для создания щелочной среды. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, раствор аммиака, карбонат аммония, диэтаноламин, моноэтаноламин, гидроксид калия, борат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия, гидроксид натрия, триэтаноламин и троламин и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «подкисляющий агент» означает соединение, используемое для создания кислотной среды. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, уксусная кислота, аминокислота, лимонная кислота, фумаровая кислота и другие альфа-оксикислоты, соляная кислота, аскорбиновая кислота и азотная кислота, и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «противовспенивающий агент» означает соединение или соединения, которые предотвращают или снижают образование пены на поверхности готовой композиции. Подходящими противовспенивающими агентами являются, например, но не ограничиваются ими, диметикон, SIMETHICONE, октоксинол и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «забуферивающий агент» означает соединение, используемое для предотвращения изменения pH после разбавления или добавления кислоты или щелочи. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, метафосфат калия, фосфат калия, одноосновный ацетат натрия и безводный цитрат натрия, дегидрат и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «разбавитель» или «эксципиент» означает инертные вещества, используемые в качестве наполнителей для достижения желаемого объема, придания свойств текучести и сжимаемости при приготовлении таблеток и капсул. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, двухосновный фосфат кальция, каолин, лактоза, сахароза, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, порошкообразная целлюлоза, осажденный карбонат кальция, сорбит, крахмал, и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «консервант» означает соединение, используемое для предотвращения размножения микроорганизмов. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, хлорид бензалкония, хлорид бензэтония, бензойная кислота, бензиловый спирт, хлорид цетилпиридиния, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, нитрат фенилртути, ацетат фенилртути, тимерозал, метакрезол, хлорид миристил-гамма-пиколиния, бензоат калия, сорбат калия, бензоат натрия, пропионат натрия, сорбиновая кислота, тимол, метил-, этил-, пропил- или бутилпарабены и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «краситель» означает соединение, используемое для окрашивания фармацевтических препаратов. Такими соединениями являются, например, но не ограничиваются ими, FD&C красный No. 3, FD&C красный No. 20, FD&C желтый No. 6, FD&C синий No. 2, FD&C зеленый No. 5, FD&C оранжевый No. 5, FD&C красный No. 8, карамельный и окись железа (черный, красный, желтый), другие красители FD&C и натуральные красители, такие как экстракт из кожицы винограда, красный порошок из сахарной свеклы, бета-каротин, аннато, карминовый, куркума, паприка, их комбинации и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «стабилизатор» означает соединение, используемое для защиты активного агента от действия физических, химических или биохимических процессов, которые тем или иным способом снижают терапевтическую активность данного агента. Подходящими стабилизаторами являются, например, но не ограничиваются ими, альбумин, сиаловая кислота, креатинин, глицин и другие аминокислоты, ниацинамид, ацетилтриптофонат натрия, окись цинка, сахароза, глюкоза, лактоза, сорбит, маннит, глицерин, полиэтиленгликоли, каприлат натрия, натрий-содержащий сахарин и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
Используемый здесь термин «модификатор тоничности» означает соединение или соединения, которые могут быть использованы для придания жидкому препарату тоничности. Подходящими модификаторами тоничности являются глицерин, лактоза, маннит, декстроза, хлорид натрия, сульфат натрия, сорбит, трегалоза, и другие соединения, известные среднему специалисту в данной области.
В примерах 3 и 6 описана репрезентативная дозированная форма в виде капсулы. В примере 12 описана репрезентативная дозированная форма в виде таблетки.
Композиция согласно изобретению может также включать масла, такие как жирные масла, арахисовое масло, кунжутное масло, масло из семян хлопчатника, кукурузное масло и оливковое масло; жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, стеариновая кислота и изостеариновая кислота; и сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, изопропилмиристат, глицериды жирных кислот, и глицериды ацелированной жирной кислоты. Указанная композиция может также включать спирт, такой как этанол, изопропанол, гексадециловый спирт, глицерин и пропиленгликоль; кетали глицерина, такие как 2,2-диметил-l,3-диоксолан-4-метанол; простые эфиры, такие как полиэтиленгликоль 450; углеводороды нефти, такие как минеральное масло и вазелин; вода; фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество, суспендирующий агент и эмульгирующий агент; или их смеси.
Следует отметить, что соединения, используемые в фармацевтических препаратах, обычно имеют различные функции или применяются в различных целях. Таким образом, если названное здесь соединение упоминается только один раз или используется для определения более одного термина, то его функция или применение не ограничивается лишь названной(ыми) целью(ями) его применения или его функцией(ями).
th
Один или несколько компонентов данного препарата могут присутствовать в виде их свободного основания или в виде фармацевтически или аналитически приемлемой соли. Используемый здесь термин «фармацевтически или аналитически приемлемая соль» означает соединение, которое было модифицировано посредством его реакции с кислотой, если это необходимо для образования ионной пары. Примерами таких солей являются стандартные нетоксичные соли, образованные, например, нетоксичными неорганическими или органическими кислотами. Подходящими нетоксичными солями являются соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромистоводородная, серная, сульфоновая, сульфамовая, фосфорная, азотная и другие кислоты, известные среднему специалисту в данной области. Соли также получают из органических кислот, таких как аминокислоты, уксусная кислота, пропионовая кислота, янтарная кислота, гликолевая кислота, стеариновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, памовая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, фенилуксусная кислота, глутаминовая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, сульфанилиновая кислота, 2-ацетоксибензойная кислота, фумаровая кислота, толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, этандисульфоновая кислота, щавелевая кислота, изетионовая кислота и другие кислоты, известные среднему специалисту в данной области. Список других подходящих кислот можно найти в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, соответствующее описание которого вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые, в соответствии со стандартной фармацевтической практикой, могут быть подвергнуты контактированию с тканями организма человека и животных, не вызывая при этом избыточной токсичности, раздражения, аллергического ответа или любых других побочных эффектов или осложнений, и имеют приемлемое отношение «польза/риск».
Исходя из приведенного выше описания и нижеследующих примеров, средний специалист в данной области может самостоятельно применять заявленное изобретение на практике без излишнего экспериментирования. Для лучшего понимания настоящего изобретения, ниже приводятся примеры, в которых подробно описаны некоторые процедуры получения вариантов настоящего изобретения. Все ссылки, приведенные в этих примерах, даются лишь в целях иллюстрации. Нижеследующие примеры не должны рассматриваться как исчерпывающие, а лишь иллюстрируют некоторые из многих вариантов, рассматриваемых в настоящем изобретении.
2
Олеандрин и MTT были закуплены у Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). BODIPY-олеандрин, красный краситель Mito-Tracker Red CM-HXRoS, ацетоксиметиловый эфир кальцеина (CAM) и 4'-6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) были получены от Molecular Probes- Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Антитело против β-актина было также закуплено у Sigma.
2
Человеческие раковые клетки поджелудочной железы: Panc-1, BxPC3, MiaPaca; раковые клеточные линии человеческой толстой кишки: CaCO-2, DOD-I, HCT-116, HT29, RKO и LST174; клетки меланомы грызунов B16; раковые клетки человеческой молочной железы: SUM149, MCF-7 и MDA231; раковые клетки ротовой полости человека: SCC9 и CAL-27; раковые клетки яичника человека ES3, TOVl120 и SKOV, и клетки немелкоклеточного рака легких человека A549 и H1299 получали из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA) и поддерживали в атмосфере повышенной влажности, содержащей 5% CO, при 37°C. Клетки человеческой меланомы BRO были любезно предоставлены организацией Stehlin Foundation (Houston, TX). Клеточные линии, происходящие от различных эпителиальных тканей, подвергали рутинному культивированию в среде для культивирования тканей (Invitrogen Corp., Grand Island, NY) (таблица 1), в которую были добавлены 10% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, и 2 мМ L-глутамина от GIBCO (Invitrogen).
Пример 1
Получение экстракта измельченных в порошок листьев олеандра из надкритической жидкости
Метод А, проводимый с использованием диоксида углерода
Порошок из листьев олеандра получали путем сбора, промывки и сушки листового материала олеандра, с последующим пропусканием листового материала олеандра через измельчитель и дегидратирующее устройство, такое как устройство, описанное в патентах США №№ 5236132, 5598979, 6517015 и 6715705. Масса используемого исходного материала составляла 3,94 кг.
2
2
2
Исходный материал объединяли с чистым CO под давлением 300 бар (30 МПа, 4351 фунт/кв.дюйм) и при температуре 50°С (122°F) в экстракторе. Всего было использовано 197 кг CO, в результате чего было получено отношение растворителя к исходному материалу, составляющее 50:1. Затем смесь CO и исходного материала пропускали через сепаратор, что приводило к изменению давления и температуры смеси, и позволяло отделять экстракт от диоксида углерода.
Экстракт (65 г) получали в виде коричневатого клейкого вязкого материала, имеющего приятный запах. Цвет, вероятно, образовывался под действием хлорофилла. Для точного определения выхода, пробирки и сепаратор ополаскивали ацетоном, а затем ацетон выпаривали с получением еще 9 г экстракта. Общее количество экстракта составляло 74 г. В расчете на массу исходного материала, выход экстракта составлял 1,88%. Содержание олеандрина в экстракте, вычисленное с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометрии, составляло 560,1 мг, а его выход составлял 0,76%.
Метод В, проводимый с использованием смеси диоксида углерода и этанола
Порошок из листьев олеандра получали путем сбора, промывки и сушки листового материала олеандра, с последующим пропусканием листового материала олеандра через измельчитель и дегидратирующее устройство, такое как устройство, описанное в патентах США №№ 5236132, 5598979, 6517015 и 6715705. Масса используемого исходного материала составляла 3,85 кг.
2
2
2
Исходный материал объединяли с чистым CO и 5% этанолом, используемым в качестве модификатора, под давлением 280 бар (28 МПа, 4061 фунт/кв.дюйм) и при температуре 50°С (122°F) в экстракторе. Всего было использовано 160 кг CO и 8 кг этанола, в результате чего было получено отношение растворителя к исходному материалу, составляющее 43,6:1. Затем смесь CO, этанола и исходного материала пропускали через сепаратор, что приводило к изменению давления и температуры смеси, и позволяло отделять экстракт от диоксида углерода.
После удаления этанола получали экстракт (207 г) в виде темно-зеленой клейкой вязкой массы, которая, очевидно, содержала некоторое количество хлорофилла. В расчете на массу исходного материала, выход экстракта составлял 5,38%. Содержание олеандрина в экстракте, вычисленное с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометрии, составляло 1,89 г, а его выход составлял 2,1%.
Пример 2
Получение экстракта измельченных в порошок листьев олеандра в горячей воде
Экстракцию в горячей воде обычно применяют для экстрагирования олеандрина и других активных компонентов из листьев олеандра. Репрезентативные способы экстракции в горячей воде можно найти в патентах США № 5135745 и 5869060.
Экстракцию в горячей воде осуществляли с использованием 5 г измельченных в порошок листьев олеандра. К измельченным в порошок листьям олеандра добавляли десять объемов кипящей воды (по массе исходного материала олеандра), и смесь непрерывно перемешивали в течение 6 часов. Затем смесь фильтровали и остаток листьев собирали и снова экстрагировали в тех же самых условиях. Фильтраты объединяли и лиофилизовали. На вид, экстракт имел коричневый цвет. Масса осушенного материала экстракта составляла примерно 1,44 г. 34,21 мг этого материала экстракта растворяли в воде и анализировали на содержание олеандрина с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и масс-спектрометрии. Количество олеандрина составляло 3,68 мг. Выход олеандрина, в расчете на общее количество экстракта, составлял 0,26%. В таблице, приведенной ниже, показано сравнение выходов олеандрина для двух экстрактов, полученных из надкритической жидкости диоксида углерода, как описано в примере 1, и экстракта в горячей воде.
Сравнение выходов
Среда для экстракции
Выход олеандрина в расчете на общую массу экстракта
Надкритическая жидкость диоксида углерода: Пример 1, Метод А
0,76%
Надкритическая жидкость диоксида углерода: Пример 1, Метод В
2,1%
Экстракт в горячей воде: Пример 2
0,26%
Пример 3
Клеточные линии
2
Человеческие раковые клетки поджелудочной железы: Panc-1, BxPC3, MiaPaca; раковые клеточные линии человеческой толстой кишки: CaCO-2, DOD-I, HCT-116, HT29, RKO и LST174; клетки меланомы грызунов B16; раковые клетки человеческой молочной железы: SUM149, MCF-7 и MDA231; раковые клетки ротовой полости человека: SCC9 и CAL-27; раковые клетки яичника человека ES3, TOVl120 и SKOV, и клетки немелкоклеточного рака легких человека A549 и H1299 получали из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA) и поддерживали в атмосфере повышенной влажности, содержащей 5% CO, при 37°C. Клетки человеческой меланомы BRO были любезно предоставлены организацией Stehlin Foundation (Houston, TX). Клеточные линии, происходящие от различных эпителиальных тканей, подвергали рутинному культивированию в среде для культивирования тканей (Invitrogen Corp., Grand Island, NY) (таблица 1), в которую были добавлены 10% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, и 2 мМ L-глутамина от GIBCO (Invitrogen).
Пример 4
Определение цитотоксичности in vitro
4
Клетки культивировали в соответствующей среде, как показано ниже в таблице, при плотности 1×10 клеток/лунку. После 24-часового инкубирования, клетки обрабатывали различными концентрациями олеандрина (1-500 нМ). Еще через 72 часа, ингибирование пролиферации клеток оценивали с помощью MTT-анализа (23). Оптическую плотность считывали на длине волны 570 нм и на эталонной длине волны 650 нм на микропланшет-ридере V-Max Micro-plate Reader, Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, CA). Относительная степень ингибирования пролиферации клеток, обусловленного присутствием данной концентрации экстракта олеандра или другого растительного экстракта, содержащего соединение(я) сердечного гликозида, может быть определена путем сравнения числа обработанных клеток с числом необработанных клеток по истечении определенного периода времени, достаточного для роста клеток (например, через 24-72 часа).
Название клеток
Описание фенотипа
Среда для культивирования клеток
PANC-1
Карцинома человеческой поджелудочной железы
DMEM/10% FBS
BXPC3
Аденокарцинома человеческой поджелудочной железы
RPMI164/10% FBS/пируват натрия (NaP)
MiaPaca
Аденокарцинома человеческой поджелудочной железы
DMEM/10% FBS/2% лошадиная сыворотка
MDA231
Рак молочной железы
DMEM/10% FBS
SUM149
Рак молочной железы
F12/5% FBS/HEPES/инсулин/гидрокортизон
CaCO2
Карцинома толстой кишки
RPMI 1640/10% FBS
DOD-1
Карцинома толстой кишки
RPMI 1640/10% FBS
HCT116
Карцинома толстой кишки
RPMI 1640/10% FBS
HT29
Карцинома толстой кишки
RPMI 1640/10% FBS
LIS-174t
Карцинома толстой кишки
MEM/10% FBS/NaP/NEAA
BRO
Острый лимфобластный лейкоз
MEM/10% FBS/NaP
SCC-9
Плоскоклеточная карцинома ротовой полости
DMEM/10% FBS
CAL27
Плоскоклеточная карцинома ротовой полости
DMEM/10% FBS
MCF-7
Рак молочной железы
MEM/10% FBS/инсулин/гидрокортизон/EGF
Примечания: DMEM = модифицированная по способу Дульбекко среда Игла; MEM = минимальная поддерживающая среда; FBS = фетальная телячья сыворотка; NEAA = заменимые аминокислоты; EGF = эпидермальный фактор роста.
Пример 5
Определение поглощения сердечного гликозида клетками
2
Поглощение олеандрина и убаина в клетках Panc-1 (наиболее высокое отношение изоформ α3:α1) и в клетках BxPC3 (более низкое отношение α3:α1) определяли после обработки клеток BODYPI-олеандрином, флуоресцентным аналогом олеандрина, с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки в 96-луночных планшетах обрабатывали 0, 5, 20 и 50 нМ олеандрина в течение 2 часов или 24 часов. Обработку проводили в 0,5% фетальной телячьей сыворотке в среде DMEM/F12. Клетки одновременно инкубировали с красным красителем MitoTracker Red CM-HXRoS (1 мкМ) и DAPI (1 нг/мл), селективным ядерным красителем (Molecular Probes). Морфологию ядра, уровень ДНК и поглощение красителя митохондриями оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии на инвертированном микроскопе Olympus IX-70. Изображение получали с использованием камеры с зарядовой связью Quantix и компьютерной программы IP Labs (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Изменения в поглощении олеандрина клетками дикого типа и клетками Panc-1, трансфицированными киРНК α3, определяли в клетках, культивированных на покровных стеклах, покрытых ламинином, и обработанных BODIBY-олеандрином в течение 1 часа.
Пример 6
Определение уровней экспрессии α1- и α3-изоформ Na,K-ATФазы
Клетки промывали холодным PBS и соскабливали в присутствии буфера для лизиза (20 мМ MOPS, 2 мМ EGTA, 5 мМ EDTA, 30 мМ NaF, 40 мМ β-глицерофосфата, 20 мМ пирувата натрия, 0,5% тритона X-100 и 1 мМ ортованадата натрия со смесью ингибиторов протеазы). Затем, клеточные лизаты обрабатывали ультразвуком на льду в течение 3 минут, инкубировали еще 10 минут при 4°C, после чего центрифугировали при 14000×g (10 минут при 4°C). Количественную оценку уровней белка проводили с помощью анализа на белок BioRad Dc (BioRad, Inc., Hercules, CA). Равные количества белка (50 мкг) наносили на преформированные гели (BioRad), а затем переносили на поливинилидендифторидные мембраны стандартными методами. После 1-2-часового инкубирования в блокирующем буфере, содержащем 5% обезжиренное сухое молоко и приготовленном в трис-забуференном физиологическом растворе с 0,1% твина 20, мембраны зондировали «первыми» антителами против изоформ α3 (Affinity Bioreagents, Golden, CO) и α1 (Upstate, Lake Placid, NY), разведенными 1:2000 в блокирующем буфере. Полосы белка визуализировали хемилюминесцентным методом с использованием набора для детектирования ЭХЛ+ и сверхчувствительной пленки (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Одинаковая загрузка образцов была проиллюстрирована с помощью вестерн-блот-анализа на присутствие β-актина. Полосы белка количественно оценивали с использованием компьютерной программы Alpha DigiDoc 1000 software (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA).
Пример 7
Лечение кожных болезней, таких как рак, включая, но не ограничиваясь ими, предупреждение или лечение меланомы, базально-клеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, а также нераковых воспалительных заболеваний кожи, включая, но не ограничиваясь ими, лучевой кератоз, псориаз и экзему
SCF-экстракт вводили индивидууму, страдающему злокачественными или незлокачественными пролиферативными заболеваниями кожи, такими как заболевания, указанные выше. SCF-экстракт вводили в виде крема или мази или в виде кожного пластыря, содержащего 0,01 мг - 10 мг SCF-экстракта на единичную дозу. Указанному индивидууму вводили единичную дозу до 3 раз в день в течение 1-14 дней или до наступления ремиссии данного кожного заболевания. Предполагается, что такое лечение будет способствовать значительному снижению или элиминации воспаления и процессов озлокачествования, приводящих к прогрессированию заболевания. У индивидуума должно наблюдаться снижения тяжести поражения(й) дермы и, в конечном счете, прекращение развития самого кожного заболевания. При этом, предполагается, что будет снижаться скорость развития злокачественных заболеваний или тяжесть таких заболеваний. Можно также ожидать фактическую регрессию диагностированных злокачественных поражений.
Пример 8
Предупреждение кожных болезней, таких как рак кожи
SCF-экстракт вводили индивидууму, имеющему предрасположенность к развитию рака кожи, такому как рак кожи, часто индуцируемый ультрафиолетовым излучением (солнечным светом) или канцерогенами, присутствующими в химических препаратах. SCF-экстракт вводили в виде крема или мази или в виде кожного пластыря, содержащего 0,01 мг - 10 мг SCF-экстракта на единичную дозу. Указанному индивидууму вводили единичную дозу до трех раз в день ежедневно с непрерывным воздействием канцерогеном, стимулирующим ожидаемое развитие заболевания (облучением солнечным светом). Такое введение может быть, например, осуществлено с помощью солнцезащитного препарата для блокирования солнечного УФ-излучения и SCF-экстракта для предупреждения возникновения опухоли в ткани дермы. Было высказано предположение, что такое применение SCE в препарате для лечения кожных заболеваний будет блокировать образование и/или стимуляцию развития злокачественного кожного заболевания или незлокачественных кожных заболеваний, при которых пролиферация клеток приводит к ухудшению патологического состояния (например, лучевого кератоза, псориаза и/или экземы).
Пример 9
Лечение солидных опухолей у человека или других позвоночных животных
SCF-экстракт, полученный от растений или животных и содержащий сердечные гликозиды, может быть использован для лечения рака прямой кишки, заднего прохода, тканей прямой и ободочной кишки, тканей головы и шеи, тканей пищевода, легких (немелкоклеточных и мелкоклеточных карцином), молочной железы, желудка, поджелудочной железы, предстательной железы, печени, почек, мочевого пузыря, мочеточника, ткани яичника, а также карциноидных опухолей, саркомы кости, мезотелиомы и новообразований центральной нервной системы.
SCF-экстракт вводили индивидууму, страдающему солидными злокачественными заболеваниями, такими как заболевания, упомянутые выше. SCF-экстракт вводили в виде пероральной лекарственной формы, содержащей 1-50 мг SCF-экстракта на единичную дозу. Индивидууму вводили единичную дозу до двух раз в день ежедневно в течение 28 дней/цикл лечения. При этом, может потребоваться до трех циклов лечения. У индивидуума должно наблюдаться замедление скорости пролиферации клеток опухоли, или прекращение развития данной опухоли. При этом, может наблюдаться полное исчезновение опухоли. Лечение SCF-экстрактом может быть проведено с использованием одного средства или в комбинации с химиотерапией цитотоксическими средствами или лучевой терапией, либо оно может быть проведено в комбинации с соответствующей иммунотерапией, не оказывающей какого-либо негативного влияния на желаемое противоопухолевое действие стандартной терапии.
Пример 10
2
Сравнение цитотоксичности экстракта Nerium oleander в горячей воде с цитотоксичностью SCF-экстракта, полученного с использованием надкритической жидкости CO, в двух человеческих опухолевых клеточных линиях
Цитотоксическое действие обоих экстрактов сравнивали непосредственно с действием самого олеандрина. Образцы содержали одинаковые количества олеандрина, хотя концентрации в них олеандрина отличались из-за различий концентраций олеандрина, присутствующего в экстрактах.
3
Клетки BRO (человеческой меланомы) и клетки Panc-1 (рака поджелудочной железы человека) (8×10/лунку) высевали в 96-луночный планшет и оставляли на ночь для прикрепления к планшету. Затем к клеткам добавляли лекарственное средство или экстракты. После 72-часового инкубирования оценивали относительную пролиферацию клеток (по отношению к необработанному контролю) методом окрашивания кристаллическим фиолетовым.
Пример 11
ВЭЖХ-анализ растворов, содержащих олеандрин
Образцы (стандартный олеандрин, SCF-экстракт и экстракт в горячей воде) анализировали с помощью ВЭЖХ (Waters) в следующих условиях: колонка Symmetry C18 (5,0 мкм, внут. диаметр 150×4,6 мм; Waters); подвижная фаза MeOH:вода = 54:46 (об/об) и скорость потока 1,0 мл/мин. Детектирование проводили на длине волны 217 нм. Образцы получали путем растворения соединения или экстракта в фиксированном количестве ВЭЖХ-растворителя до достижения приблизительно желаемой концентрации олеандрина.
Пример 12
Оценка антивирусной активности SCF-экстракта
50
50
Тест состоял из определения относительной способности экстракта олеандра или позитивного контроля (AZT) ингибировать пролиферацию штамма ROJO ВИЧ-1 в мононуклеарных клетках человеческой периферической крови (МКПК). Инфицированные клетки обрабатывали лекарственным средством или экстрактом в течение 48 часов. Этот тест использовали для определения IC экстракта олеандра (указанная концентрация экстракта дает 50%-ное ингибирование пролиферации вируса) по сравнению с IC экстракта, способного к цитолизу человеческих МКПК. То есть, это фактически означает определение терапевтического индекса экстракта. То есть, это, по существу, позволяет определить, может ли данный экстракт уничтожать вирус ВИЧ-1, но, при этом, не оказывать влияние на сами МКПК.
50
Для ингибирования пролиферации вируса, IC должна составлять примерно 5,0 мкг/мл или менее, а концентрация, необходимая для уничтожения клеток, не может быть достигнута даже при концентрациях 100 мкг/мл. Полученные данные позволяют предположить, что экстракт олеандра может быть использован для ингибирования пролиферации вируса ВИЧ-1 или инфекционности вируса, присутствующего в клетках МКПК.
Пример 13
Трансфекция клеток Panc-1 короткой интерферирующей РНК (киРНК) для α3
Клетки Panc-1 высевали в 6- и 48-луночные планшеты и оставляли на ночь для прикрепления к планшету. Временную трансфекцию молекул киРНК α3 осуществляли с использованием аминового агента для трансфекции siPORT™ (Ambion Austin, TX) и 0,4 мкМ РНК, осуществляющей сайленсинг α3 (Santa Cruz Biotech.), в соответствии с инструкциями производителей. Через двадцать четыре часа после трансфекции, клетки обрабатывали 10-50 нМ олеандрина в течение 48 часов. Белок собирали из 6-луночных планшетов для вестерн-блот-анализа и проводили оценку на жизнеспособность клеток путем окрашивания красителем Calcien AM.
Пример 14
Определение экспрессии α3 и α1 в биоптате нормальных тканей и опухолевых тканей толстой кишки
Получали быстро замороженные биоптаты слизистой здоровой и опухолевой ткани толстой кишки, и эти ткани измельчали в ступке, охлажденной жидким азотом. Образцы обрабатывали буфером для лизиса как указано выше. Затем лизаты обрабатывали ультразвуком на льду в течение 3 минут, инкубировали при 4°С в течение 10 минут и центрифугировали при 14000 об/мин (10 минут при 4°С), после чего α3- и α1-изоформы α-субъединицы подвергали вестерн-блот-анализу как описано выше.
Пример 15
Статистический анализ
Для определения статистических различий между различными экспериментальными группами использовали t-критерий Стьюдента, где величина P<0,05 рассматривалась как значимая.
Пример 16
Определение чувствительности анти-α3 антитела
Для сравнения чувствительности различных анти-α3 антител, равные количества одних и тех же лизатов образцов, используемых в качестве позитивного и негативного контроля, загружали на 3 преформированных геля (Bio Rad, Inc., Hercules, CA), а затем переносили на поливинилидендифторидные мембраны стандартными методами. После 1-2-часового инкубирования в блокирующем буфере, содержащем 5% обезжиренное сухое молоко и приготовленном в трис-забуференном физиологическом растворе с 0,1% твина 20 (TBS-T), мембраны зондировали анти-α3 антителами, поставляемыми от Sigma (St Luoise, MO), от Affinity Bioreagents (Golden, CO) и от Novus (Littleton, CO), где каждое антитело разводили 1:2000 в блокирующем буфере. Полосы белка визуализировали хемилюминесцентным методом с использованием набора для детектирования Chemiglow West и устройства для визуализации Alpha Imager (Alpha InnotechCorp., San Leandro, CA). Полосы белка количественно оценивали и сравнивали для трех антител с использованием компьютерной программы Alpha DigiDoc 1000 (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA). Одинаковая загрузка образцов проиллюстрирована на фигуре для вестерн-блот-анализа на присутствие β-актина. Полученные данные показали, что чувствительность каждого из выбранных антител против α3, по существу, является одинаковой.
Источник моноклональных анти-α3 антител
Средняя плотность*
Affinity Bioreagents
45174
Novus
41110
Sigma
44572
* Среднюю плотность вычисляли, исходя из абсолютной плотности каждой полосы, деленной на определенную площадь, которая была количественно определена с помощью компьютерной программы Alpha DigiDoc 1000.
Пример 17
Набор для проведения прогностического анализа
Этот набор может быть использован в способе согласно изобретению для проведения прогностического анализа вестерн-блот-методом, подробно описанным в примере 18.
1. Композиция для лизиса
5 мл
Концентрация в маточном растворе
20 мМ трис-HCl, pH 8,0
100 мкл
1М
137 мМ NaCl
685 мкл
1М
10% глицерин
500 мкл
5 мМ EDTA
25 мкл
1М
1% NP-40
50 мкл
Смесь ингибиторов протеазы (Sigma, Cat# P8340)
50 мкл
1 мМ ортованадат натрия
50 мкл
100 мМ
Н<sub>2</sub>О
3540 мкл
2. «Первые» антитела: (1:2000 в блокирующем растворе)
Alpha 3 (Affinity Bioreagents Cat# MA3-915)
Alpha 1 (Upstate Cat# 05-369)
3. «Второе» антитело: ПХ-конъюгированное козье антитело против мышиных IgG (Santa Cruz Cat# sc-2005)
4. Гель/мембранный препарат:
7,5-10% гели (Precast, BioRad)
Буфер для образцов Лэммли BioRad (Cat# 161-0737)
Маркер молекулярной массы (Cat# 161-0318)
Рабочий буфер (BioRad 1OX трис/глицин/ДСН) (Cat# 161-0732)
Мембраны (ПВДФ-мембраны BioRad)
Буфер для переноса:
3,03 г триса (конечная концентрация - 25 мМ)
14,4 г глицина (конечная концентрация - 0,192 мМ)
200 мл метанола (20%)
2
до 1 л HO
5. Блокирующий раствор: 5% молоко в TBS (20 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl).
6. Промывочный буфер: TBS-T (20 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% твина-20).
8. Клетки, используемые в качестве позитивного контроля: клеточный лизат человеческих раковых клеток Panc-1 поджелудочной железы.
9. Клетки, используемые в качестве негативного контроля: клетки мышиной меланомы B16.
10. Брошюра, включающая подробное описание протокола проведения вестерн-блот-анализа изоформ α-субъединицы.
Пример 18
Получение образцов клеточной ткани
Метод A. Получение препарата из клеточного осадка
Был получен клеточный осадок, содержащий 2-4 миллиона клеток. Затем осадок промывали сбалансированным физиологическим раствором (PBS) для удаления среды. Добавляли 100 мкл буфера для лизиса. Все эти процедуры проводили при охлаждении (на льду). Стадию обработки ультразвуком проводили как описано в примере 19.
Метод В. Получение препарата из клеток на планшете
1,2-1,5 миллионов клеток культивировали на 100 мм-планшетах для культивирования тканей в течение 24 часов. Среду для культивирования клеток осторожно декантировали и отбрасывали. Планшет 2 раза ополаскивали 1 мл PBS. Добавляли 100 мкл буфера для лизиса, клетки соскабливали с планшета и собирали в пробирки. Все эти процедуры проводили при охлаждении (на льду). Стадию обработки ультразвуком проводили как описано в примере 19.
Метод С. Получение препарата из ткани
Замороженную ткань измельчали. Измельченную ткань помещали в пробирки. Минимум к 5 мг измельченной ткани добавляли 100 мкл холодного буфера для лизиса. Все эти процедуры проводили при охлаждении (на льду). Стадию обработки ультразвуком проводили как описано в примере 19.
Пример 19
Определение содержания изоформ α-субъединицы в образце с помощью вестерн-блот-анализа
Нижеследующая процедура является просто одним из способов согласно изобретению, который может быть применен для детектирования и количественной оценки содержания изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы в образце. Порядок проведения стадий может быть изменен, если это необходимо.
Вестерн-блот-анализ
1. Клеточный лизат обрабатывают ультразвуком при охлаждении, например, на бане со льдом.
2. Лизат центрифугируют при 4°С в течение 10 минут при 14000 об/мин.
3. Супернатант собирают при постоянном охлаждении льдом.
4. Уровни белка определяют с помощью анализа на белок.

(см. инструкции, прилагаемые к набору для анализа на белок BioRad Protein Assay Kit)
5. Получают образцы для загрузки на гель, исходя из анализа на белок (50 мкг белка на лунку).
а. Параллельно с образцами получают лизат, используемый в качестве позитивного и негативного контроля.
i. Позитивный контроль: лизат белка Panc-1.
ii. Негативный контроль: лизат белка Panc-2 или B16.
b. К образцам и контролю добавляют буфер для образцов Лэммли (LSB) (см. инструкции для LSB).
c. Образцы и контроль нагревают при 95°С в течение 5 минут.
d. Образцы центрифугируют.
6. Загружают гели.
7. Проводят электрофорез геля при 200 Вольт до тех пор, пока краситель не стечет со дна геля.
8. Осуществляют перенос на мембрану при 100 Вольт и оставляют на 1-2 часа.
9. Мембрану блокируют в течение 30 мин. - 1 часа в блокирующем буфере при комнатной температуре.
10. Мембрану инкубируют в течение ночи при 4°С.
11. Мембрану промывают промывочным буфером:
3 быстрых промывки, промывка в течение 1-15 минут, промывка в течение 2-10 минут.
12. Мембрану инкубируют в течение 45 минут - 1 часа со «вторым» антителом при комнатной температуре.
13. Мембрану промывают промывочным буфером:
3 быстрых промывки, промывка в течение 1-15 минут, промывка в течение 2-10 минут.
14. Мембрану инкубируют в течение 5 минут в ЭХЛ+ (Amersham Cat# RPN2132).
15. Мембрану экспонируют с пленкой (Amersham Cat# RPN3114k) и пленку проявляют на устройстве для проявления пленок.
16. Изображение экспонированной пленки получают на визуализирующем устройстве Alpha Imager с использованием компьютерной программы Alpha Digi Doc (или на имеющемся в распоряжении визуализаторе).
17. С использованием прикладной программы Spot Denso, прилагаемой к пакету аналитических программ Alpha Digi Doc, отбирают соответствующие полосы на изображениях Alpha 1 и Alpha 3.
18. Для каждой полосы получают суммарную величину плотности (IDV).
19. Вычисляют отношение для изоформ α3:α1.
Пример 20
ОТ-ПЦР-метод определения мРНК для специфических альфа-субъединиц Na,K-ATФазы
РНК-реагент STAT-60 (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX) использовали для экстракции всей РНК, которую обрабатывали ДНКазой I, а затем использовали в анализе, проводимом с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Один микрограмм РНК подвергали реакции обратной транскрипции с обратной транскриптазой (ОТ) вируса опухоли мышиной молочной железы (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). 371 п.н.-последовательности α3 амплифицировали с использованием набора праймеров α3-NKA3VSAS-2-F: 5'-NNNNNNNNNN-3' (прямого) и -R: 5'-NNNNNNNN-3' (обратного). Эти и дополнительные наборы праймеров конструировали и подтверждали с использованием программы Oligo 6.7 Molecular Biology Insights (Cascade, CO). В ОТ-ПЦР-анализах, для детектирования мРНК GAPDH использовали пары праймеров: (5'-CAGCTCTGGAGAACTGCTG-3'; 5'- GTGTACTCAGTCTCCACAGA-3').
Пример 21
Клиническая оценка комбинации экстракта, содержащего сердечный гликозид, с другими противораковыми средствами, используемыми для лечения метастазирующей гастриномы поджелудочной железы
Ниже приводится описание истории болезни пациента, страдающего метастазирующей гастриномой поджелудочной железы и прошедшего лечение экстрактом, содержащим сердечный гликозид.
Мужчина в возрасте 63 года поступил в клинику Ракового центра M.D. Anderson 8-30-02 (30 августа 2002) с подозрением на заболевание поджелудочной железы. Компьютерная томография выявила опухолевую массу в хвосте поджелудочной железы. 17 сентября 2002 пациент начал самостоятельно принимать экспериментальное лекарственное средство, содержащее сердечные гликозиды, главным образом, олеандрин. 9 октября 2002, у пациента была диагностирована высокодифференцированная опухоль островковых клеток поджелудочной железы. Пациенту было рекомендовано пройти восемь циклов химиотерапии адриамицином, стрептозоцином и 5-FU, а затем три цикла химиотерапии стрептозоцином и 5-FU. 13 ноября 2002, пациенту была рекомендована терапия, при которой он продолжал самостоятельно принимать лекарственное средство, содержащее олеандрин. 23 июля 2003, пациент закончил рекомендованный курс химиотерапии. Каких-либо изменений в первичном диагностированном заболевании не наблюдалось. После 23 июля 2003, пациент не проходил химиотерапию. После завершения курса химиотерапии, пациент продолжал самостоятельно принимать экстракт, содержащий сердечные гликозиды. Уже на 16 февраля 2007, у пациента было установлено радиологически стабильное заболевание. Пациент продолжал самостоятельно принимать экстракт, содержащий сердечный гликозид, такой как олеандрин, и к этому времени у него не наблюдалось симптомов и его повседневная активность составляла 100% согласно тесту Карнофского.
Пример 22
Клиническая оценка экстракта, содержащего сердечный гликозид и используемого для лечения аденокарциномы
35-летний мужчина после обычного приема пищи ощущал боль в области брюшины и метеоризм. Он обратился в частную клинику, где ему была сделана спиральная компьютерная томография брюшной полости (CAT). По заключению врачей, у пациента наблюдалось волюмометрическое увеличение головки поджелудочной железы, неоднородность по плотности паренхимы и множественная лимфаденопатия в передней области головки поджелудочной железы. Оценка изображения, полученного с помощью магнитного резонанса (MRI) подтвердила имеющиеся данные. В этот же день проводили ультразвуковую биопсию путем аспирации тонкой иглой. Ультразвуковое обследование обнаружило опухолевую массу размером 39×33 мм в головке поджелудочной железы. В результате гистопатологического анализа биоптата был поставлен диагноз аденокарцинома. Пациенту был рекомендован курс химиотерапии, но пациент от нее отказался.
Через месяц, пациент самостоятельно начал терапию растительным экстрактом, содержащим очень небольшое количество олеандрина. Верхняя часть брюшной полости на изображениях, полученных через месяц с помощью магнитного резонанса, показала явное сохранение поражений размером 35×25 мм в головке поджелудочной железы. В передней области головки поджелудочной железы и в заднем отделе пещеры желудка были также обнаружены множественные лимфаденопатии, самая большая из которых имела размер 5 мм.
MRI-изображения, полученные через три месяца, показали, что опухоль в головке поджелудочной железы имела размер 30×25 мм. Тогда доза экстракта, содержащего небольшие количества олеандрина, была увеличена. Через три недели проводили сцинтиграфию кости. Каких-либо явных метастазов не наблюдалось. MRI-изображения верхнего и нижнего отдела брюшной полости, полученные через семь недель, указывали на ремиссию опухолевой массы в головке поджелудочной железы и снижение уровня всех лимфаденопатий. MRI-изображения верхнего и нижнего отдела брюшной полости, полученные через два месяца, указывали на отсутствие какой-либо заметной аденокарциномы поджелудочной железы и/или лимфаденопатии. Через четыре месяца снова получали MRI верхнего и нижнего отдела брюшной полости. И снова какой-либо заметной аденокарциномы поджелудочной железы и метастазирующего заболевания обнаружено не было.
На март 2007, у пациента все еще наблюдалась ремиссия.
Пример 23
Культивирование раковых и опухолевых клеток
2
Для оптимизации культивирования конкретных раковых или опухолевых клеток, нижеследующая процедура может быть, если это необходимо, модифицирована. Человеческие раковые клетки поджелудочной железы Panc-1 закупали в Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Клетки культивировали в среде DMEM, в которую было добавлено 10-15% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 ед./мл пенициллина (Invitrogen) и 2,5 мкг/мл противогрибкового средства (Fungizone; Invitrogen) при 37°C в 5% CO. Относительное ингибирование пролиферации клеток под действием олеандрина и адриамицина определяли после 72-часового непрерывного введения лекарственного средства, где каждое лекарственное средство использовали в серии концентраций. Для оценки роста клеток, по сравнению с пролиферацией необработанных клеток Panc-1, проводили МТТ-анализ, описанный выше (Mosmann, 1983). За 72 часа до оценки роста клеток, эти клетки либо не обрабатывали (контроль), либо обрабатывали олеандрином или адриамицином.
Пример 24
Окрашивание клеток
Нижеследующую процедуру проводили для окрашивали клеток акридиновым оранжевым.
Клетки окрашивали 1 мкг/мл акридинового оранжевого в течение 15 минут при 37°С. Клетки промывали PBS, трипсинизировали из планшетов, собирали в PBS с использованием FBS и анализировали посредством проточной цитометрии.
Пример 25
Анализ клеточного цикла
Нижеследующую процедуру проводили для определения клеточного цикла.
Клетки Panc-1 обрабатывали олеандрином (0, 20 и 40 мкМ) в течение 72 часов, трипсинизировали, фиксировали 70%-ным этанолом при 4°С, окрашивали иодидом пропидия с использованием набора реагентов для анализа клеточной ДНК посредством проточной цитометрии (Roche), а затем анализировали на содержание ДНК с помощью устройства FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Полученные данные анализировали с помощью компьютерной программы Cell Quest (Becton Dickinson). Для каждого образца было проанализировано по меньшей мере 100000 клеток.
Пример 26
Клиническая оценка экстракта, содержащего сердечный гликозид и используемого для лечения немелкоклеточного рака легких
У мужчины в возрасте 81 года был диагностирован немелкоклеточный рак легких в левой верхней доле. Пациенту была рекомендована лучевая терапия с последующим проведением курса химиотерапии. Через семь недель, пациент начал проходить лучевую терапию и завершил эту терапию через 24 дня. Затем, через 6 дней, пациент начал курс химиотерапии из пяти химиотерапевтических средств, который был завершен через восемь месяцев. За 27 дней до ее завершения, он обратился в клинику для подтверждения предварительного диагноза немелкоклеточного рака легких в левой верхней доле. В связи с этим была проведена позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) всего организма, результаты которой указывали на обширную область аномальной гиперметаболической активности в левой верхней доле, соответствующей уже установленному злокачественному заболеванию пациента. Кроме того, едва различимые области гиперметаболической активности наблюдались в правых воротах и в переднем средостении, и эти области напоминали узелковые образования. Компьютерная томография (КТ) грудной клетки подтвердила наличие мягкой 5-см плотной ткани в верхней левой доле. Затем снова проводили курс химиотерапии. Через один месяц, химиотерапию прерывали из-за ее непереносимости пациентом. Через неделю, для сравнения проводили КТ грудной клетки. В заднем сегменте левой верхней доли наблюдалась масса мягкой ткани приблизительно 4 см. За этот интервал времени наблюдалось снижение общего объема массы левой верхней доли. Через пять недель, пациент начал самостоятельно принимать растительный экстракт, содержащий олеандрин. Через три месяца было проведено дополнительное сравнение снимков задне-передних и боковых отделов грудной клетки с ранее полученными снимками, и было обнаружено, что плотность опухолевой массы в левой верхней доле оставалась неизменной. Через год, снимки задне-передних и боковых отделов грудной клетки сравнивали со снимками трехмесячной давности, и было обнаружено, что плотность опухолевой массы размером примерно 4 см в левой верхней доле, расположенной выше воротной области, оставалась неизменной.
Пациент продолжал самостоятельно принимать растительный экстракт, содержащий олеандрин. Через четыре месяца проводили КТ грудной клетки с внутривенным введением контрастного вещества. При этом, наблюдалось приблизительно 20%-ное снижение размера центральной массы в верхней левой доле. В это время, пациент продолжал самостоятельно принимать растительный олеандрин-содержащий экстракт, в результате чего была получена высокая оценка активности в соответствии с тестом Карнофского. Клинические данные дают основание предположить, что указанный растительный экстракт имеет терапевтический эффект, поскольку такие изменения размера центральной массы наблюдались через много месяцев после окончания химиотерапии, проводимой пациенту.
Пример 27
Определение содержания изоформ α-субъединицы в образце посредством иммуногистохимического окрашивания
Нижеследующая процедура является простой альтернативой одному из способов согласно изобретению, который может быть применен для детектирования и количественной оценки содержания изоформ α-субъединицы Na,K-ATФазы в образце. Порядок проведения стадий может быть изменен, если это необходимо. Материалы, используемые в этом анализе, могут быть получены из лаборатории Vector Laboratories (Burlingame, CA или Peterborough, England).
Иммуногистохимический анализ
Были использованы свежезамороженные срезы человеческих тканей. Из срезов удаляли парафин тремя обработками ксилолом (по 5 минут каждой), подвергали регидратации этанолом со снижением концентрации (99%×2, 90%×2, 5 минут каждая) и тщательно промывали дистиллированной водой. Методику термического восстановления антигена осуществляли путем инкубирования срезов в течение 3×5 минут в кипящем растворе для идентификации антигена Vector (Vector-AMS) с высоким рН (Vector Laboratories Catalog # H-3301).
После восстановления антигена, срезы промывали в 50 мМ трис-HCl, 300 мМ NaCl, 0,1%, pH 7,6 (TBS), в течение 2×5 минут. Активность эндогенного пероксида гасили путем инкубирования срезов в течение 20 минут в 0,3% (об/об) пероксида водорода в метаноле, с последующей промывкой в TBS в течение 10 минут.
Срезы инкубировали в течение 1 часа с антителом против изоформы α3 субъединицы Na,K-ATФазы (Sigma-Aldrich Cat # A273), разведенным в 2,5% (об/об) нормальной лошадиной сыворотки (2,5% NHS) в TBS при 4 мкг/мл. Срезы, используемые в качестве негативного контроля, инкубировали с неиммунным антителом против мышиного IgGl (Biostat Diagnostics, Cat #093101) при 4 мкг/мл или в 2,5% NHS («непервичный» контроль).
TM
После промывки в TBS в течение 2×5 минут, срезы инкубировали с универсальным реагентом-антителом Vector ImmPress (смесью реагентов-антител против кроличьих IgG и против мышиных IgG; Vector Laboratories Ltd., Cat #MP-7500) в течение 30 минут. Затем срезы промывали в течение 2×5 минут и инкубировали с субстратом диаминобензидином (DAB), при этом, проводили мониторинг до тех пор, пока не наблюдался приемлемый уровень окрашивания. Хромогенную реакцию прекращали путем погружения предметных стекол в дистиллированную воду.
После хромагенеза, срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином, дегидратировали в этаноле с увеличением концентрации (90-99-100%), осветляли двумя обработками ксилолом и помещали на покровные стекла под микроскоп DePeX.
TM
Для оценки надежности реагента ImmPress и хромогенных реагентов, в эксперимент включали контрольный анализ, иллюстрирующий иммунореактивность цитокератина в слизистой толстой кишки. «Непервичный контроль» включали для оценки неспецифического связывания «второго» антитела и других аналитических реагентов. Окрашенные срезы анализировали, и соответствующие цифровые изображения фиксировали на микроскопе Olympus BX51 с помощью камеры Leica DFC290.
Фотографии иммуногистохимически окрашенных клеток представлены на фиг. 6A-6F и 7A-7H. Количественная оценка изоформ субъединицы может быть осуществлена как описано в настоящей заявке. После определения отношения содержания α3-изоформы к α1-изоформе в образце определяли вероятность терапевтического ответа на лечение сердечным гликозидом.
Выше было представлено подробное описание конкретных вариантов настоящего изобретения. Следует отметить, что описанные здесь конкретные варианты осуществления изобретения приводятся лишь в целях иллюстрации, однако в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификации, не выходящие за рамки существа и объема изобретения. В соответствии с этим, настоящее изобретение ограничено лишь прилагаемой формулой изобретения. Исходя из представленного здесь описания, все описанные и заявленные здесь варианты могут быть осуществлены без излишнего экспериментирования.