СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАТРИЦЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD OF OBTAINING BIOMATRIX IN EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в экспериментальной и клинической хирургии для получения биоматриц, применяемых для закрытия ран при механических повреждениях соединительной ткани.
Установлено, что ауто- и аллогенные фибробласты, вводимые в область раны в соединительной ткани, способствуют ее заживлению без образования рубцов, усиливая регенеративные процессы.
Известен метод клеточной терапии, который применяется для ускорения заживления ран различной этиологии и локализации. Он основан на применении культивируемых in vitro алло- или аутогенных фибробластов, находящихся в суспензии (Кузнецов С.С. и соавт. Способ лечения грыж передней брюшной стенки. Заявка на изобретение № 2004116749/14, публ. БИМП № 31, 10.11.2005).
Недостатки:
Фибробласты находятся в суспензии, что способствует их распределению в соседние с раной участки и препятствует созданию в области заживляемого участка высокой концентрации этих клеток.
Известно использование фибробластов в монослое, выращиваемом на подложке (Колокольцева Т.Д. и соавт. Перспективы использования фетальных фибробластов человека при лечении ран различной этиологии. Вестник РАМН. - 1998. - № 3. - с.32-34). В качестве опорного матрикса для фибробластов применяют коллагеновый гель (Мельцова А.Ж. и соавт. Применение дермальных фибробластов в комплексном лечении больных с трофическими язвами венозной этиологии. Вестник хирургии, 2007. - том 166. - № 1, с.72-77).
Недостатки:
Методы предназначены для лечения поверхностных ран на коже.
Для успешного устранения дефектов в других тканях используются другие типы клеток. Известен способ аутотрансплантации иммобилизованных стромальных стволовых клеток (Ступак В.В. и соавт. Способ аутотрансплантации иммобилизованных стромальных стволовых клеток костного мозга. - патент 2269961, МПК А61В 17/56, А61К 38/57, A61L 27/38, БИМП № 5, 20.02.2006).
Недостатки:
1. Матриксом является никелид титана, который трудно моделировать по месту закрываемого дефекта, кроме того, он может вызывать аллергическую реакцию.
2. Полученный имплантат используется с остеогенной целью и не может быть использован для заживления ран в соединительной ткани.
5
Наиболее близким к заявляемому является способ связывания нормальных фибробластов эмбрионов золотого хомяка с нейлоновыми волокнами, покрытыми молекулами лектина пшеницы (Rutishauser U, Sachs L. Receptor mobility and the binding of cells to lectin-coated fibers. - J Cell Biol. - 1975. - V.66. - № 1. - P.76-85). В описываемом способе нейлоновые волокна инкубировали с 0,0004-0,05% раствором лектина пшеницы в забуференном фосфатами физиологическом растворе, рН 7,4 (ЗФР), в течение 30 минут при 22°С, использовали вторичную культуру фибробластов эмбриона золотого хомяка. Фибробласты в концентрации 2,5-5×10 клеток/мл в ЗФР инкубировали с лектин-покрытыми волокнами в течение 30 минут при 22°С, и несвязавшиеся с волокнами клетки удаляли. При использовании 0,05% концентрации лектина пшеницы для покрытия им нейлоновых волокон число связавшихся с волокнами фибробластов составляло 300-400 клеток на 1 см волокна и было меньше при снижении концентрации лектина.
Недостатки:
1. Небольшое количество клеток, связавшихся с волокном.
2. Использование в качестве субстрата для клеток нейлоновых волокон, которые не применяются в клинической хирургии.
3. Отсутствие исследований о возможном росте и жизнеспособности этих клеток на нейлоновых волокнах с целью увеличения их количества.
Задача настоящего изобретения состоит в разработке способа получения биоматрицы на основе полипропиленовой сетки и культуры эмбриональных фибробластов, которую можно использовать для закрытия и стимуляции эффективного заживления механических повреждений соединительной ткани в экспериментальной и клинической хирургии.
Поставленная задача достигается способом, включающим выращивание фибробластов на основе из синтетического материала, покрытого лектином пшеницы. В качестве основы используют полипропиленовую сетку, которую перед нанесением клеток выдерживают 3 часа в 0,05% растворе пектина пшеницы при комнатной температуре. Затем полипропиленовую сетку помещают в суспензию свежевыделенных первичных или субкультивированных эмбриональных клеток крысы в культуральной среде и инкубируют при температуре 37°С в течение 7-9 дней, заменяя культуральную среду первый раз через сутки и далее каждые 3 дня. Раствор лектина пшеницы готовят на основе среды, выбранной из ряда: физиологический раствор, раствор Хэнкса, среда Игла и т.п. Суспензию для культивирования фибробластов готовят из первичных или субкультивированных эмбриональных клеток крысы в культуральной среде.
Новизна изобретения.
- В качестве основы используют полипропиленовую сетку. Сетку легко фиксировать к соединительной ткани, придать ей необходимую форму замещаемого участка. Полипропиленовая сетка широко используется в клинической хирургии.
- Перед нанесением клеток полипропиленовую сетку выдерживают 3 часа в 0,05% растворе лектина пшеницы при комнатной температуре. Фибробласты имеют на своей поверхности рецепторы к лектину пшеницы [Ljungquist P. И соавт.Lateral diffusion of plasma membrane receptors labelled with either platelet-derived growth factor (PDGF) or wheat germ agglutinin (WGA) in human polymorphonuclear leukocytes and fibro-blasts. - Biosci. Rep. - 1989. - V.9. - № 1. - P.63-73], благодаря которым усиливается адгезия этих клеток к волокнам полипропиленовой сетки, покрытым этим пектином, что способствует их эффективному прикреплению.
- Раствор лектина пшеницы готовят на основе забуференного фосфатами до рН 7,2 физиологического раствора или раствора Хэнкса или среды Игла, т.е среды, физиологичной для клеток, обеспечивающей их жизнеспособность.
- Сетку помещают в суспензию первичных эмбриональных клеток или субкультивированных эмбриональных фибробластов крысы в культуральной среде. Культуральную среду заменяют первый раз через сутки после начала культивирования клеток на сетке, т.е. после прикрепления клеток к волокнам, и затем каждые 3 дня для удаления продуктов жизнедеятельности и обеспечения клеток питательными веществами. Культуру эмбриональных фибробластов в виде монослоя клеток на волокнах сетки и многослойных клеточных мостиков между ними получают через 7-9 дней культивирования при 37°С. Культивирование клеток позволяет значительно увеличить их количество на полипропиленовой сетке.
- Суспензию для культивирования фибробластов готовят из первичных или субкультивированных эмбриональных клеток крысы в культуральной среде.
Существенность отличий заявленного способа для решения поставленной задачи подтверждается отсутствием в патентной и научной литературе сведений об аналогичном способе, обладающем такой же совокупностью признаков.
При использовании предлагаемый способ позволяет получить новый технический эффект - получить гибкую биоматрицу, легко устанавливаемую в месте дефекта, из которой можно получить трансплантат нужных размеров и формы, которая удобно, прошиванием, прикрепляется к соединительной ткани, в месте ее повреждения. Применение биоматрицы позволяет получить более высокую концентрацию, по сравнению с прототипом, жизнеспособных, культивируемых на волокнах синтетического субстрата фибробластов. Изобретение иллюстрируется фотографиями, представленными на фиг.1-4.
На фиг.1 представлена фотография волокон полипропиленовой сетки с прикрепленными к ним отдельными фибробластами шаровидной и вытянутой формы после культивирования в течение 5 суток. Увеличение 100х.
На фиг.2 и 3 представлены фотографии полипропиленовой сетки с монослоем фибробластов на ее волокнах и мостиком из клеток между волокнами после культивирования в течение 7 и 9 суток соответственно. Увеличение 100х.
На фиг.4 представлена фотография многослойного мостика из фибробластов между волокнами полипропиленовой сетки на 9 сутки культивирования. Увеличение 200х.
Способ осуществляется следующим образом.
В стерильные пенициллиновые флаконы или чашки Петри помещают стерилизованные кипячением кусочки полипропиленовой сетки с ячейками размером 75 мк ×75 мк. Во флаконы приливают 0,05% раствор лектина пшеницы. Сетки выдерживают в этом растворе 3 часа при комнатной температуре. После этого сетки помещают по одной на дно других пенициллиновых флаконов или чашек Петри и заливают их суспензией свежевыделенных или субкультивированных эмбриональных клеток крыс. Первоначально сетку заливают минимальным объемом клеточной суспензии, обеспечивающим покрытие ее клетками и лучшие условия для их осаждения на волокна сетки и прикрепление к ним. Минимальный объем клеточной суспензии предотвращает всплытие сетки на поверхность.
6
Для выделения эмбриональных клеток крыс костно-мышечную ткань эмбрионов измельчают ножницами и заливают смесью растворов 0,3% трипсина и 0,02% версена (1:1) на забуференном фосфатами физрастворе с рН 7,2, после чего взбалтывают на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 минут два раза. Третье взбалтывание проводят в культуральной среде Игла-МЕМ с добавлением 2 mM L-глютамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,05% гидролизата лактальбумина. Суспензию трипсинизированных клеток объединяют, фильтруют через двойной слой марли, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре. Осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве культуральной среды и после подсчета клеточной концентрации в камере Горяева суспензию доводят до концентрации 2×10/мл в среде для культивирования (Р.Адамс. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983, с.69-70).
6
6
Для получения субкультур эмбриональных фибробластов первичные клетки в концентрации 10/мл вносят в стеклянные матрасы, в которых после прикрепления ко дну клетки начинают размножаться и через 2-3 дня культивирования при 37°С образуют монослой. Для получения субкультивированных клеток культуральную среду из матраса сливают и приливают смесь растворов 0,3% трипсина и 0,02% версена в соотношении 1:4. После инкубации при 37°С в течение 5-10 минут смесь трипсин-версен удаляют и наливают питательную культуральную среду. Интенсивное встряхивание матраса приводит к отслаиванию клеточного монослоя и образованию суспензии фибробластов, которую разводят так же, как первичные клетки, до концентрации 2×10/мл в среде для культивирования.
В каждый пенициллиновый флакон или чашку Петри с сетками приливают небольшой объем суспензии полученных клеток в культуральной среде (1 и 4 мл соответственно) и инкубируют в течение одних суток при 37°С. Затем культуральную среду первый раз меняют на свежую, но добавляют ее в большем объеме (3 и 10 мл в пенициллиновые флаконы и чашки Петри соответственно) и культивирование продолжают в течение 7-9 дней до получения монослоя фибробластов на волокнах сетки и мостиков из этих клеток между волокнами. Культуральную среду заменяют каждые 3 суток. Полученный эффект адгезии и роста фибробластов на волокнах полипропиленовой сетки отслеживают путем проведения микроскопического контроля. Для этого по окончании культивирования сетку высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимза. Отмытую от несвязавшегося красителя сетку по окончании окрашивания последовательно обрабатывают в двух порциях 96° этанола и в одной порции ксилола для обезжиривания и обезвоживания, после чего сетку помещают на предметное стекло, покрывают каплей кедрового бальзама и закрывают покровным стеклом. Под микроскопом на волокнах сетки становятся видны окрашенные фибробласты вытянутой и шаровидной формы и образованные ими мостики.
При решении поставленной задачи исследовали, приводит ли повышение концентрации лектина выше 0,05% к увеличению его сорбции на волокнах сетки. Концентрации лектина меньше 0,05% не исследовались, так как в прототипе показано, что они приводят к уменьшению сорбции фибробластов на синтетических волокнах.
405
405
405
405
Одинаковые кусочки сеток последовательно помещали в 0,05% или 0,1% раствор лектина при комнатной температуре на 0,5-24 часа инкубации и 3% суспензию эритроцитов кролика на физрастворе на 1,5 час при 37°С. Агглютинабельность лектином пшеницы эритроцитов кролика была нами показана предварительно в реакции гемаглютинации. Титр гемагглютинирующей активности лектина пшеницы в реакции агглютинации с эритроцитами кролика был высоким и равнялся 1:1024. После инкубации с эритроцитами сетки отмывали от их избытка физраствором. Связанные с лектин-покрытыми волокнами сеток эритроциты лизировали водой и оптическую плотность лизата измеряли при 405 нм. Оптическая плотность лизата была максимальна и практически равна при инкубации сетки с 0,1% раствором лектина в течение 1 час (d=0,459) и инкубации сетки с 0,05% раствором лектина в течение 3 час (d=0,461). Увеличение срока инкубации до 3, 21 и 24 час при использовании 0,1% раствора лектина снижало оптическую плотность лизата до d=0,395-0,256. Увеличение срока инкубации до 21 и 24 час при использовании 0,05% раствора лектина снижало оптическую плотность лизата до d=0,302-0,210. При 30-минутной инкубации, как в прототипе, оптическая плотность лизата была равна 0,15-0,2 в случае обеих концентраций лектина. Таким образом, длительность инкубации сетки с раствором лектина влияет на количество связавшегося с волокнами лектина. Максимальное и практически равное количество лектина связывается при инкубации с сеткой его 0,1% раствора в течение 1 час и при инкубации с сеткой его 0,05% раствора в течение 3 час. Поэтому для предлагаемого способа выбран второй вариант обработки сетки лектином, как более экономичный, но дающий тот же результат.
При решении поставленной задачи проводили сравнительный анализ роста фибробластов на интактной полипропиленовой сетке, т.е. без обработки лектином, и полипропиленовой сетке, обработанной лектином пшеницы. В чашки Петри помещали стерилизованные кипячением кусочки полипропиленовой сетки. Приливали 0,05% раствор лектина пшеницы, приготовленный на разных средах. В качестве среды использовали ЗФР или раствор Хэнкса или среду Игла.
Сетки выдерживали в растворе лектина в течение 3 часов при комнатной температуре. Среда, выбранная для приготовления раствора лектина пшеницы, не влияла на количество адгезированного сеткой лектина.
На интактной сетке, в отличие от обработанной пектином пшеницы, в течение исследуемого срока культивирования (3-9 дней) наблюдались редкие прикрепленные к волокнам фибробласты. На волокнах лектин-покрытой сетки фибробласты наблюдались в виде монослоя и клеточных мостиков между волокнами, т.е. хорошо прикреплялись к волокнам и эффективно размножались на них, возможно, за счет митогенных свойств лектина пшеницы.
Пример
В пенфлаконы или чашки Петри помещали стерилизованные кипячением кусочки полипропиленовой сетки. Приливали 0,05% раствор лектина пшеницы. Сетки выдерживали в этом растворе 3 часа при комнатной температуре.
Затем подготовленные сетки помещали в другие чашки Петри и заливали их 4 мл суспензии первичных клеток в культуральной среде для инкубирования в течение одних суток при 37°С. Через сутки культуральную среду первый раз заменили на свежую, но добавили ее в большем объеме - 10 мл. Продолжили культивирование в течение 3-9 дней до получения монослоя фибробластов на волокнах сетки и мостиков из этих клеток между волокнами. Культуральную среду заменяли каждые 3 суток. Полученный эффект адгезии и роста фибробластов на волокнах полипропиленовой сетки отслеживали путем проведения микроскопического контроля.
На 3 сутки культивирования на волокнах сетки появлялись отдельные фибробласты шаровидной и распластанной формы, но без образования крупных скоплений клеток. Шаровидная форма клеток ассоциируется с делящимися клетками, что свидетельствует об интенсивном размножении клеток на волокнах. На 5 сутки культивирования клеток Фиг.1 фибробласты находились на поверхности почти всех волокон в большем количестве, а также появлялись клеточные мостики. На 7 сутки культивирования Фиг.2 наблюдалось наибольшее количество фибробластов на волокнах, а на 9 сутки Фиг.3, 4 между волокнами во многих местах образовывались многослойные клеточные мостики.
Предложенный способ позволяет увеличить количество фибробластов на полипропиленовой сетке, обработанной пектином пшеницы, вследствие их прикрепления к волокнам сетки и размножения на них при культивировании, с формированием не только монослоя на волокнах, но и многослойных клеточных мостиков между ними. Это позволяет получить более качественный и перспективный материал для использования в клинической хирургии.