СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ОТБОРА МОЛЕКУЛ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ДВЕ РАЗЛИЧНЫЕ ГРУППИРОВКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Способ получения полипептида, содержащего по меньшей мере два полипептидных домена, включающий этап культивирования клетки, содержащей:
a) нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S. aureus с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме,
b) нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептидный домен, содержащий на его С-конце сортазный мотив, за которым следует сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, и
c) нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептидный домен, содержащий на его N-конце по меньшей мере диглицин,
где клетка секретирует опосредованный сортазой А конъюгат первого полипептидного домена и второго полипептидного домена,
и, таким образом, получения полипептида, содержащего по меньшей мере два полипептидных домена.
2. Способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, который включает этап культивирования клетки, содержащей:
a) нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S. aureus с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме,
b) нуклеиновую кислоту, кодирующую первую связывающую группировку, содержащую на ее С-конце сортазный мотив, за которым следует сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, и
c) нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую связывающую группировку, содержащую на ее N-конце по меньшей мере диглицин,
где клетка секретирует опосредованный сортазой А конъюгат первой связывающей группировки и второй связывающей группировки,
где первая связывающая группировка специфически связывается с первым антигеном или мишенью, а вторая связывающая группировка специфически связывается со вторым антигеном или мишенью,
и, таким образом, получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающие группировки.
3. Способ выбора мультиспецифической связывающей молекулы, которая специфически связывается с двумя различными эпитопами или антигенами, включающий этап выбора из множества мультиспецифических связывающих молекул, содержащих различные комбинации первой связывающей группировки и второй связывающей группировки, такой мультиспецифической связывающей молекулы, которая специфически связывается с двумя различными эпитопами или антигенами,
где каждый из участников множества мультиспецифических связывающих молекул получен способом по п. 2.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что мультиспецифическая связывающая молекула выбрана на основании ее специфичности связывания, и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полужизни in vivo.
5. Способ по любому из пп. 2-4, характеризующийся тем, что связывающая группировка является родственной парой вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела.
6. Способ по п. 2 или 3, характеризующийся тем, что мультиспецифическая связывающая молекула является биспецифическим антителом, содержащим две или четыре связывающих группировки.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что первый полипептидный домен и второй полипептидный домен независимо друг от друга выбраны среди полноразмерного антитела, scFv, scFab, тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, фрагмента Fc-области тяжелой цепи антитела, пары вариабельного домена легкой цепи антитела и вариабельного домена тяжелой цепи антитела, VH, VL, СН1, СН2, СН3, СН4, CL, шарнирной области антитела, цитокинов, рецепторов, рецепторных лигандов, обнаруживаемых меток, маркеров и партнеров связывающей пары.
8. Способ по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме выбран из SEQ ID №02 (KDEL), SEQ ID №03 (HDEL) или SEQ ID №04 (SFIXXXXMP).
9. Способ по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что сортазный мотив представляет собой LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком).
10. Способ по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что первый связывающий домен или первая связывающая группировка имеет среди 20 С-концевых аминокислотных остатков аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком).
11. Способ по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что клетка представляет собой клетку млекопитающего или дрожжевую клетку.
12. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что клетка млекопитающего выбрана из клетки человеческой эмбриональной почки (НЕК), клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки почки детеныша хомяка (ВНК).
13. Способ выбора биспецифического антитела, включающий следующие этапы:
(i) определение маркеров клеточной поверхности, присутствующих в образце, содержащем клетку, и выбор по меньшей мере первого поверхностного маркера и второго поверхностного маркера,
m
(ii) трансфекция клетки (а) нуклеиновой кислотой, кодирующей Fab-фрагмент антитела, или scFab антитела, или scFv антитела, содержащий среди 20 С-концевых аминокислотных остатков аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком), а затем сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме KDEL (SEQ ID №02), где Fab-фрагмент или scFv антитела специфически связываются с первым поверхностным маркером или его лигандом, (b) нуклеиновой кислотой, кодирующей фрагмент антитела с одной ветвью, содержащий тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются родственными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образуют антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается со вторым поверхностным маркером или его лигандом, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через один или более чем один дисульфидный мостик, формируя шарнирную область антитела, и где полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G (m=2, или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (с) нуклеиновой кислотой, кодирующей растворимую сортазу А из S. aureus с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме,
и, таким образом, получения биспецифического антитела.
14. Способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие этапы:
m
(i) определение специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полужизни in vivo для множества биспецифических антител, полученных путем объединения (а) каждого участника из первого множества Fab-фрагментов антитела или scFv-фрагментов антитела, где каждый участник содержит среди 20 С-концевых аминокислотных остатков аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком), а затем сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме KDEL (SEQ ID №02), где Fab-фрагмент или scFv антитела специфически связывается с первым эпитопом или антигеном, с (b) каждым участником множества фрагментов антитела с одной ветвью, содержащих тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются родственными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образуют антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается со вторым эпитопом или антигеном, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через один или более чем один дисульфидный мостик, формируя шарнирную область антитела, и где полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G (m=2, или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, за счет внутриклеточной реакции ферментативного сочетания, опосредованной сортазой А из S. aureus,
и
(ii) выбор биспецифического антитела с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полужизни in vivo и, таким образом, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.
15. Биспецифическое антитело, полученное способом по любому из пп. 6-13.
16. Биспецифическое антитело, содержащее аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком) в одной из своих тяжелых цепей.
17. Способ по п. 7 или антитело по любому из пп. 15 или 16, характеризующийся тем, что Fc-область содержит мутацию природного аминокислотного остатка в позиции 329 и по меньшей мере одну дополнительную мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, включающей аминокислотные остатки в позициях 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, с заменой на другой остаток, где остатки в Fc-области пронумерованы в соответствии с индексом ЕС по Кабату.
18. Фармацевтический состав, содержащий биспецифическое антитело по п. 15 или 16, или 17.
19. Применение биспецифического антитела по п. 15 или 16, или 17 при изготовлении лекарственного средства.