ПОЛИМЕРОСОДЕРЖАЩЕЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ЭТОПОЗИДА
POLYMER CONTAINING MEDICINAL AGENT BASED ON ANTITUMOR AGENT ETOPOSIDE

Область техники
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к новому поколению противоопухолевых препаратов на основе этопозида.
Уровень техники
Повышение эффективности лечения злокачественных новообразований является актуальной медицинской и социально-экономической проблемой. Известно, что химиотерапевтические методы лечения злокачественных опухолей затруднены низкой специфичностью многих препаратов, действующих также на здоровые ткани. Полимерные системы доставки противоопухолевых средств можно рассматривать в качестве перспективного технологического подхода повышения эффективности и безопасности противоопухолевых препаратов. Известно, что опухолевые ткани обладают способностью аккумулировать полимерные частицы. Для некоторых противоопухолевых лекарственных средств, таких как паклитаксел, доцетаксел, цисплатин, показано значительное увеличение эффективности полимерных систем доставки по сравнению со свободными веществами.
В соответствии с современными представлениями идеальный полимерный носитель должен обладать рядом свойств, такими как: биосовместимость и биодеградируемость; способность защищать лекарственное вещество от быстрой деградации и обеспечивать селективность транспорта лекарственного средства в органы/клетки-мишени; способность обеспечивать пролонгированное действие лекарственного вещества; пригодность для различных способов введения; стабильность; апирогенность; возможность стерилизации. Всем вышеперечисленным требованиям в полной мере удовлетворяет биодеградируемый фармацевтический полимер полилактидгликолид (сополимер молочной и гликолевой кислот - PLGA), в связи с чем весьма актуальным представляется создание полимерных форм противоопухолевых препаратов на его основе.
Одним из самых активных и полезных противоопухолевых агентов является этопозид, который используется обычно при лечении герминогенных опухолей (опухоли яичка, хориокарцинома), рака яичников, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого, лимфогранулематоза, неходжкинских лимфом, рака желудка (монотерапия и в составе комбинированной терапии), саркомы Юинга, саркомы Калоши, нейробластом, рака молочной железы (с метастазами в печень, в плевру), острых нелимфобластный лейкозов, мезотелиомы [1, 2].
Этопозид относится к полусинтетическим эпиподофиллотоксинам, производным 4′-диметилэпиподофиллотоксина, содержащегося в экстракте мандрагоры [3]. Этопозид в форме раствора для инъекций включен в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов. Фармакологически активным является транс-изомер этопозида. Этопозид является ингибитором ДНК-топоизомеразы II - фермента, создающего временные разрывы в обеих цепях ДНК и тем самым предотвращающего ее суперспирализацию [4]. Этопозид стабилизирует комплекс ДНК с ДНК-топоизомеразой II, мешая ферменту зашить разрывы в цепях ДНК.
2
Препарат принимается внутривенно или перорально. Режим дозирования устанавливают индивидуально, в зависимости от используемой схемы химиотерапии. Для приема внутрь суточная доза составляет около 50 мг/м в течение 21 дня ежедневно, затем в той же дозе - на 28-й день. При необходимости курс лечения можно повторять 4-6 раз. Интервалы между курсами лечения устанавливают также индивидуально, в зависимости от восстановления гемопоэза. Доза может быть изменена с учетом эффективности препарата и его переносимости. Для внутривенных инфузий применяют растворы с концентрацией этопозида 200 мкг/мл, реже - до 400 мкг/мл.
При приеме внутрь этопозид всасывается из желудочно-кишечного тракта. Биодоступность не превышает 50%. Имеются доказательства, что биодоступность этопозида уменьшается с увеличением дозы, по-видимому, из-за снижения растворимости этопозида в желудке и тонкой кишке при повышении концентрации препарата [5]. Метаболизируется этопозид в печени. Конечный период полувыведения в среднем составляет 7 ч. Выводится в основном почками (44-60%).
Применение препарата приводит к существенным нарушениям со стороны системы кроветворения, со стороны пищеварительной системы, со стороны ЦНС и периферической нервной системы, со стороны обмена веществ, со стороны сердечнососудистой системы, со стороны репродуктивной системы. Препарат вызывает аллергические реакции: озноб, лихорадка, бронхоспазм и дерматологические реакции: алопеция.
После внутривенного введения препарат обнаруживается в плевральной жидкости, в слюне, ткани печени, селезенке, почках, миометрии, в тканях мозга (в том числе в опухолях). Препарат проникает через плацентарный и гематоэнцефалический барьеры. Немногочисленные данные позволяют предположить, что этопозид поступает в ткань опухоли мозга быстрее, чем в здоровую ткань мозга. Было показано, что концентрации этопозида в здоровой ткани легких выше, чем в легочных метастазах, а уровни, достигаемые в первичных опухолях миометрия сходны с таковыми в здоровой ткани миометрия.
Для повышения биодоступности этопозида получают водорастворимые производные этопозида (например, фосфат этопозида) [6], примененяют микроэмульсии этопозида с фосфолипидами или холестеролом [7], получают липосомальные формы этопозида [8], а также полимерные частицы, содержащих этопозид [9-11].
Из уровня техники известна международная публикация заявки на изобретение WO №2007069272 [16], опубл. 21.06.2007, в которой раскрывается состав композиций на основе биодеградируемого полимера и противоопухолевого препарата. Биодеградируемый полимер выбирается из круга белков, пептидов, поли (ε-капролактона), поли (β-гидроксибутирата), поли (гидроксивалерата) и (β-оксибутират-гидроксивалерата), поли(молочной кислоты), поли (гликолевой кислоты), поли (D, L-молочной-со-гликолевой кислоты), амфифильных блок-сополимеров полимолочной кислоты оксида-полиэтилена, полиалкиленгликоля, полиэтиленоксида, блок-сополимеров полиэтилен оксид-оксида полипропилена, полиангидридов, полиортоэфиров, поли (N-винилпирролидона), поливинилового спирта, поливинилацетата, сложных полиэфиров, полиаминокислот, поливинилпирролидона. В состав композиции дополнительно входит вторичный полимер, обеспечивающий рН-чувствительность и температурную чувствительность, выбираемый из круга поли (N-ацетилфкриламида), поли (N-изопропилакриламида), поли (N-изопропилакриламид-СО-акриламида), поливинилового спирта, полиэтиленгликолья, полиакриламида, поли (метакриламида). Лекурственное вещество выбирается из широкого круга противоопухолевых препаратов - паклитаксел, доцетаксел, таксотер, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид. тенипозид, флюоксиместерон, тестолактон, бикалутамид, ципротерона, флутамид, нилутамид, аминоглютетимид, анастрозол, эксеместан, форместан, летрозол, дексаметазон, преднизолон, диэтилстилбестрол, фулвестрант, ралоксифен, тамоксифен, toremifine, бузерелин, госерелин, леупролид, трипторелин и др. Итоговой композицией является композиция, которая содержит в качестве лекарственного вещества - паклитаксел в количестве от примерно 0,5% до примерно 99,5%; в качестве полимера - поли(D, L-молочную-со-гликолевую кислоты) или альбумин в количестве от примерно 2,0% до примерно 99,0%; необязательно, в качестве вторичного полимера - поли (N-изопропилакриламид) в количестве от примерно 2,0% до примерно 90,0%, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, носителей или их комбинацией от около 0,01% до около 99,9% от веса. Размер частиц менее 80 nm (10% частиц), менее 200 nm (50% частиц), менее 450 nm (90% частиц).
В данной международной публикации заявки не содержится сведений о биологической активности полимерной композиции с этопозидом, поэтому трудно судить о перспективности его дальнейшего использования в медицине.
В Европейском патенте на изобретение ЕР 2105150 [17], опубл. 10.01.2007, описан состав рентгеноконтрастных биоразлагаемых микросфер для сосудистой эмболии, включающих три компонента: биоразлагаемый полимерную матрицу, терапевтический агент(ы) и рентгеноконтрастный материал. В качестве полимерной матрицы могут быть использованы полимеры из группы: полилактид, поли (лактид-ко-гликолид), поли (лактид-эфир), поликапролактон, поли (капролактон-эфир)блок-сополимер, коллаген, хитин, хитозан, желатин, альгинат. Терапевтический агент выбирается из группы противоопухолевых препаратов: карбоплатин, цисплатин, паклитаксел, доцетаксел, оксалиплатин, циклофосфамид, ифосфамид, доксорубицин, пегилированной липосомальной доксорубицин, эпирубицин, топотекан, иринотекан, этопозид, фторурацил, блеомицин, винкристин, гемцитабин, актиномицин, и их комбинации.
Частицы с цитостатиками имеют достаточно крупные размеры - от 10 до 1500 µm, по этому не могут проникать в опухолевые клетки путем эндоцитоза и преодолевать барьеры резистентности, вызванные действием А, В, С - транспортеров в отличие от частиц нано- и субмикронного размеров.
n
w
В патенте на изобретение РФ №2290950 [18], опубл. 10.01.2007, описана биоразлагаемая противоопухолевая композиция с пролонгированным высвобождением противоопухолевого агента, предназначенная для введения в ткани. Композиция состоит из одного противоопухолевого агента и полимерного носителя, состоящего из биоразлагаемого олигомерного сложного эфира, со среднечисленной относительной молекулярной массой M=650-7500, средневесовой относительной молекулярной массой M=800-10000. Биоразлагаемый носитель представляет собой низкомолекулярный олигомерный сложный эфир с сильно разветвленной цепью, который синтезируют по реакции поликонденсации. Полифункциональный разветвляющий компонент представляет собой многоатомный спирт или сахар с тремя или более гидроксильными группами, такой как глицерин, пентаэритрит, инозит, ксилит, манит, сорбит, эритроза, треоза, арабиноза, рибоза, гюлоза, идоза, альтроза, алоза, талоза, сорбоза, манноза, глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, лактоза. Цепи альфа-гидроксикислот, например таких как DL-молочная кислота, гликолевая кислота, альфа-гидроксимаслянная кислота, альфа-гидроксивалериановая кислота, альфа-гидроксикапроновая кислота, соединены посредством сложноэфирных связей с молекулами многоатомного спирта. В связи с этим олигомерный сложный эфир имеет звездообразную структуру с центральной молекулой из многоатомного спирта, которая играет роль разветвляющего компонента в ходе реакции поликонденсации. Способ получения противоопухолевой композиции заключается в том, что противоопухолевый агент, носитель, а также биологически совместимый пластификатор, агент, влияющий на кинетику высвобождения противоопухолевого агента, стабилизатор противоопухолевого агента или стабилизатор носителя, нагревают до температуры 35-75°С и смешивают. Среди соединений с противоопухолевой активностью, подходящих для использования в составе композиции, можно отметить фармацевтические средства из группы производных фолиевой кислоты, такие как метотрексат и т.п., аналоги пиримидина, такие как 5-фтороурацил и т.п., группу алкилирующих агентов, такую как цисплатин и его производные, комплексы платины в состоянии окисления IV, группу производных мочевины, таких как кармустин, ломустин и т.п., группу антибиотиков, действующих по механизму включения, таких как антибиотики группы антрациклина, например доксорубицин, идарубицин и т.п., производные антрацена и антрапиразолов, такие как митоксантрон, орацин и т.п., группу ингибиторов митоза, такие как винкаалкалоиды, а также таксаны, такие как паклитаксел, доцетаксел, группу ингибиторов топоизомеразы, таких как топотекан, каптотецин и т.п., этопозид, тенипозид и т.п., при этом с успехом также могут применяться соединения из группы гормонов, такие как аналоги гонадолиберина, госерелин, леупролин и т.п., группу ингибиторов CDK (циклинзависимая киназа), предпочтительно три- и тетразамещенных. Данная композиция предназначена для введения в ткани и характеризуется пролонгированным высвобождением противоопухолевого агента. Эрозия олигомерных сложноэфирных частиц происходит по механизму диффузии и элюирования низкомолекулярных и водно-растворимых продуктов деградации в биологическое гидрофильное окружение. Подложка, состоящая из носителей такого типа, находится в водной среде или внутри организма и постепенно уменьшается до полного исчезновения без остатка. Низкая степень набухания и гетерогенная природа деградации разветвленного полимерного носителя создает условия для непрерывного длительного высвобождения биологически активных соединений в окружающую ткань. Противоопухолевый агент включен в состав олигомерного сложного эфира звездообразной структуры с центральной молекулой из многоатомного спирта, которая играет роль разветвляющего компонента, в отличие от, предлагаемого нами, линейного полилактидгликолида. Кроме того, в данном патенте не содержится сведений о биологической активности полимерной композиции с этопозидом.
3
4

В патенте на изобретение РФ №2480201 [19], опубл. 27.04.2013, описана композиция, содержащая наночастицы, предназначенная для переноса терапевтически активных веществ в раковые клетки. Наночастицы состоят из трех компонентов - полимерной матрицы, положительно заряженной оболочки и магнитного материала. Полимерная матрица состоит из биологически стабильных биодеградируемых полимеров (предпочтительно поливалеролактоны, полилактоновая кислота, полигликолевая кислота, полилактиды, полигликолиды, сополимеры полилактидов и полигликолидов, полигидроксибутират, полицианоакрилаты, поликапролактон диметилакрилат, мультиблочные полимеры, например, из олигокапролактондиолов и олигодиоксанондиолов, полиэфир сложноэфирные мультиблочные полимеры, такие как ПЭГ и поли(бутилентерефталат), триметилкарбонаты полигликолевой кислоты, поликапролактон гликолиды, полиортоэфиры, поли(N-винил)-пирролидон, поливиниловые спирты, полиэфирные амиды, полиангидриды, полиэтиленоксидпропиленоксид, полиэфирные сложные эфиры, такие как полиэтиленоксид, полиалкиленоксалаты, полиортоэфиры, а также их сополимеры, полимеры на основе белков, полиаминокислоты, альбумин, гиалуроновая кислота, хитозан и его производные, гепарансульфаты, декстран, - циклодекстрины, альгинаты, сополимеры с ПЭГ и полипропиленгликолем и ряд др.). Отличительным свойством наночастиц является наличие положительного поверхностного заряда, которое можно получить покрытием наночастиц веществами, которые могут положительно поляризоваться и/или положительно ионизироваться за счет содержания аминогрупп или протонируемых атомов азота, которые могут находиться в протонированной форме при соответствующем рН (предпочтительно мономерные аминосиланы, таких как 3-аминопропилтриэтоксисилан, 2-аминометил-3-аминопропилтриметоксисилан, триметоксисилил-пропил-диэтилентриамин или N-(6-аминогексил)-3-аминопропил-триметоксисилан. Сами же наночастицы состоят из магнитного материала, предпочтительно ферромагнитного, антиферромагнитного, ферромагнитного, антиферромагнитного или суперпарамагнитного материала, более предпочтительно из оксидов железа, в частности из суперпарамагнитных оксидов железа или из чистого железа с оксидным слоем (предпочтительно из оксидов железа, в частности из магнетита (FeO). Наночастицы предпочтительно имеют диаметр менее 500 нм. Данные наночастицы подходят для переноса терапевтических веществ, предпочтительно противоопухолевых лекарств, цитостатиков, цитотоксические агентов, антипролиферативных агентов (в том числе, алкилирующих средств, антибиотиков с цитостатическими свойствами, антиметаболитов, ингибиторов микротрубочек и ингибиторов топоизомеразы, платины, алкалоидов, таксанов, гормонов, иммуномодуляторов, сигнальных трансдукторов и цитокинов). Примеры алкилирующих средств включают, помимо прочих, хлорэтамин, циклофосфамид, трофосфамид, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, кармустин, ломустин, дакарбазин, прокарбазин, темозолумид, треосульфан, эстрамустин и нимустин. Примеры антибиотиков с цитостатическими свойствами включают даунорубицин и липосомальный даунорубицин, доксорубицин (адриамицин), дактиномицин, митомицин С, блеомицин, эпирубицин (4-эпиадриамицин), идарубицин, дактиномицин, митоксантрон, амсакрин и актиномицин D. Метотрексат, 5-фторурацил, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин, флударубин, кладрибин, пентостатин, гемцитабин, цитарабин, азатиоприн, ралтитрексед, капецитабин, цитозин арабинозид, тиогуанин и меркаптопурин можно привести в качестве примеров антиметаболитов (антиметаболических агентов). К ингибиторам микротрубочек относятся, например, такие алкалоиды, как алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин) и паклитаксел (Taxol), а также производные паклитаксела. Примеры ингибиторов топоизомеразы включают этопозид, тенипозид, камптотецин, топотекан и иринотекан. Наночастицы способны переносить терапевтические вещества и повышать уровень накопления терапевтических веществ в опухолевой ткани. Применение композиции приводит к снижению побочных эффектов по сравнению с использованием терапевтических веществ без наночастиц. Данное изобретение предназначено для комбинированной терапии опухолей - гипертермии, термотерапии, радиотерапии и химиотерапии. Лекарственные средства, описанные в данном патенте, содержат кроме полимерной матрицы также положительно заряженную оболочку и магнитный материал.
Недостатком данного изобретения является сложная структура и технология получения данных препаратов и связанная с этим их высокая стоимость. Кроме того, в данном патенте не содержится сведений о противоопухолевой активности и токсичности полимерной композиции с этопозидом.
В заявке Китая CN 102247320 [20], опубл. 13.03.2013, раскрыто изобретение, относящееся к области лекарственных средств, и длительно циркулирующей эмульсии для инъекций на основе этопозида, и способу ее приготовления. Длительно циркулирующая эмульсия на основе этопозида содержит этопозид, жидкое масло, эмульгаторы, полиэтиленгликоль (ПЭГ)-модифицированные эфиры и т.п., и имеет характеристики высокой степени включения, хорошей стабильности и низкой токсичности. Длительно циркулирующая эмульсия на основе этопозида улучшает растворимость и стабильность этопозида, уменьшает токсические эффекты этопозида на кровеносные сосуды, увеличивает время циркуляции этопозида в крови, и улучшает биораспределение этопозида in vivo, таким образом, улучшая его лечебные эффекты. Получение длительно циркулирующей эмульсии на основе этопозида решает проблему лекарственных средств с плохой растворимостью в воде и жировой растворимостью, достигая стабильности хранения. Данный препарат представляет собой мелкодисперсную форму этопозида, стабилизированную от агрегации эмульгатором (жидкое мыло, ПЭГ и т.д.) и не содержит полимерную матрицу, в которую встраивается цитостатик.
Для таких лекарственных форм не характерны: пролонгированность действия; способность защиты активных веществ, находящиеся внутри частиц, от воздействия различных факторов в организме человека, в том числе и многих ферментов; эффект пассивного направленного транспорта.
В патенте Китая CN 1961864 [21], опубл. 16.05.2007, приведено изобретение, в котором раскрывается противоопухолевая инъекционная композиция, которая включает микросферы, обеспечивающие замедленное высвобождение лекарственных веществ и состоящая из вспомогательных веществ, производных эпотилона, глиоксалин пиперазидина, комбинации ингибиторов фермента топоизомеразы, выбранных их SN-38, СРТ-11, НСРТ, топотекана, иринотекана, этопозида, тенипозида, амрубицина, валтаксина, ХК469, AD312, ICRF-187 или ICRF-193, растворителя, состоящего из адъюванта суспендируемости, вспомагательных веществ, обеспечивающих замедленное высвобождение, выбираемые из полимолочной кислоты и ее сополимера, полиэтилен/полимолочной кислоты, сополимера гликолевой кислоты, алифатических кислот, при этом вязкость адъюванта суспендируемости составляет 80-3000 сР (на 20-30 град С), и его выбирают из карбоксиметилцеллюлозы. Микросферы, обеспечивающие замедленное высвобождение, могут быть также получены из имплантируемого агента для медленного высвобождения, предназначенного для инъекций или размещения в или вокруг опухоли с периодом высвобождения около 40 дней. Инъекционная композиция для замедленного высвобождения или имплантируемый агент для замедленного высвобождения, могут быть использованы независимо для эффективного подавления опухолевого роста или использованы в сочетании с нехирургическими методами, такими как химиотерапия и/или радиотерапия с целью повышения эффективности лечения.
Частицы с цитостатиками, имеющие микронные размеры, непосредственно не могут проникать в опухолевые клетки путем эндоцитоза и преодолевать барьеры резистентности, вызванные действием А, В, С - транспортеров в отличие от частиц нано- и субмикронного размеров, и не могут быть использованы для лечения опухолей, резистентных к используемым лекарствам.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявленного изобретения является:
- достижение высокой цитотоксической активности в отношении широкого спектра опухолевых клеток разных типов, включая резистентные к химиотерапевтическим препаратам;
- пониженная токсичность;
- сниженный уровень побочных эффектов;
- пригодность для различных способов введения.
Технический результат достигается тем, что полимерсодержащее лекарственное средство на основе противоопухолевого препарата этопозида включает биодеградируемый полимер в виде сополимера молочной и гликолевой кислот с характеристической вязкостью 0,41 дл/г и молярным соотношением мономерных звеньев 50 на 50%, поверхностно-активное вещество в виде поливинилового спирта, криопротектор в виде D-маннитола, представляющее собой частицы субмикронного размера, следующего состава, % масс:
этопозид
5.0÷8.0
сополимер молочной и гликолевой кислот
55.0÷61.0
поливиниловый спирт
16.0÷18.0
D-маннитол
17.0÷20.0
Полимерсодержащее лекарственное средство может быть выполнено, например, в виде капсул, гранул, порошка или другой пероральной формы, а также суспензии для инъекций.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены данные по торможению роста асцита у экспериментальных животных при подкожном введении препаратов в дозе 15 мг/кг (по этопозиду). Несмотря на окончание лечения экспериментальных животных на 9-е сутки, противоопухолевый эффект полимерной формы этопозида сохранялся на 15-е сутки и 21-е сутки.
На фиг. 2 представлены данные по торможению роста асцита у экспериментальных животных при внутрибрюшинном введении полимерной формы этопозида в дозе 15 мг/кг. Противоопухолевый эффект, оцениваемый по торможению роста асцитной опухоли, был сходен с противоопухолевым эффектом при подкожном введении препарата. Торможение роста опухоли на 25 сутки эксперимента (16-е сутки после окончания лечения) достигало 59,3% (60% в случае подкожного введения). Противоопухолевый эффект полимерной формы этопозида сохранялся и далее, препарат эффективно блокировал рост асцитных опухолей.
Торможение роста асцитной опухоли сопровождалось увеличением продолжительности жизни леченых животных (см. фиг. 3). При внутрибрюшинном введении полимерной формы этопозида увеличение продолжительности жизни животных составило 110% на 70-е сутки эксперимента.
При анализе результатов исследования противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной солидной модели лимфолейкоза мышей Р388 обнаружена высокая эффективность терапии данным препаратом при всех схемах лечения.
На фигурах 4 и 5 приведена динамика роста опухоли у экспериментальных животных при трехкратном введении в разовой дозе 25 мг/кг (см. фиг. 4) и пятикратном введении в разовой дозе 15 мг/кг (см. фиг. 5) внутрибрюшинном введении полимерной формы этопозида (суммарная курсовая доза 75 мг/кг).
Как следует из графиков, полимерная форма этопозида в значительной степени подавляла рост солидной опухоли Р388. Трехкратное внутривенное введение полимерной формы этопозида в дозе 20 мг/кг через день (1, 3, 5 сутки после прививки опухолевых клеток) так же, как и внутрибрюшинное введение, индуцировало выраженное торможение роста опухоли (см. фиг. 6).
Таким образом, показана высокая эффективность противоопухолевого действия полимерной формы этопозида при терапии солидной модели лимфолейкоза мышей Р388 как при внутрибрюшинном, так и внутривенном введении.
Осуществление и примеры реализации изобретения
Полимерсодержащее лекарственное средство на основе этопозида в виде субмикронных частиц (полимерная форма этопозида) получали известным методом простого эмульгирования (вода/масло). Подробное описание методики представлено в примере 1.
При проведении исследования противоопухолевой активности разработанного лекарственного средства использовали методику учета выживаемости на клеточных линиях. Для исследования цитотоксической активности (ЦТА) полимерной формы этопозида in vitro использовались следующие линии опухолевых клеток - лимфолейкоза мыши линии Р388, чувствительной и резистентной сублиний клеток линии аденокарциномы молочной железы MCF-7 и MCF-7ADR и чувствительной и резистентной сублиний клеток миелолейкоза человека линии К562 и K562ADR, аденокарциномы ободочной кишки линии Сасо-2, аденокарциномы прямой кишки линии SW837. В виду актуальности проблемы преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток при проведении исследования противоопухолевой активности в число тестерных клеточных линий были включены линии опухолевых клеток, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью: резистентная сублиния клеток линии аденокарциномы молочной железы MCF-7ADR и резистентная сублиния клеток миелолейкоза человека K562ADR, резистентность которых определяется высоким уровнем экспрессии белка MDR1. Оценку выживаемости клеток в культуре проводили с помощью биохимического МТТ-теста. Для этого в лунки с клетками добавляли раствор МТТ, инкубировали 2-4 часа при 37°C, после чего удаляли раствор МТТ, вносили ДМСО и измеряли оптическую плотность по поглощению при 540 нм с помощью многоканального спектрофотометра. В качестве вещества сравнения использовали субстанцию этопозида. Подробное описание материалов, методов и схемы эксперимента представлено в примере 2. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Полученные результаты позволяют заключить, что полимерная форма этопозида обладает более высокой специфической активностью, чем субстанция этопозида в отношении высоко резистентных сублиний опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7ADR и миелолейкоза человека K562ADR. Значения IC50 в обоих вариантах резистентных клеток значительно ниже при использовании полимерной формы этопозида. Таким образом, обнаружено, что полимерная форма этопозида обладает высокой цитотоксической активностью в отношении широкого спектра опухолевых клеток разных типов, включая резистентные к химиотерапевтическим препаратам опухолевые клетки. ЦТА полимерной формы этопозида, оцениваемая по показателю IC50, была, в зависимости от типа клеток либо близка к субстанции этопозида, либо превышала ЦТА субстанции этопозида.
6
Исследование противоопухолевой активности активности разработанного лекарственного средства in vivo проводили на экспериментальной модели перевиваемого лимфолейкоза мышей Р388. Лимфолейкоз Р388 прививали мышам линии DBA/2 внутрибрюшинно (экспериментальная асцитная модель) или подкожно (экспериментальная солидная модель) суспензией клеток, полученных из асцита, в прививочной дозе 10 клеток на особь. При исследования противоопухолевой активности полимерной формы этопозида использовали три способа введения препарата - внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный. При исследовании противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной асцитной модели препараты вводили, используя два способа введения - подкожный и внутрибрюшинный. При исследовании противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной солидной модели препараты вводили, используя два способа введения - внутрибрюшинный и внутривенный. Для определения противоопухолевой активности препаратов проводили оценку степени торможения роста опухоли по размеру (объему) опухолей и оценку увеличения продолжительности жизни животных в сутках по сравнению с соответствующими контрольными группами. В качестве препарата сравнения использовался препарат Этопозид, производства «Эбеве Фарма Гес.м.б.Х. Нфг. КГ» (Австрия). Подробное описание схемы исследования приведено в примере 3.
При анализе результатов исследования противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной асцитной модели лимфолейкоза мышей Р388 обнаружено, что полимерная форма этопозида в дозе 15 мг/кг проявляла значительную противоопухолевую активность, сравнимую с активностью препарата сравнения этопозидом.
Для исследования токсических свойств полимерной формы этопозида избраны внутривенный и внутрибрюшинный пути введения экспериментальным животным. Были определены летальные дозы полимерной формы этопозида в сравнении с препаратом сравнения этопозидом, производства «Эбеве Фарма Гес.м.б.Х. Нфг.КГ» (Австрия). При выборе доз для испытания острого токсического действия при однократном введении полимерной формы этопозида руководствовались литературными данными о токсичности субстанции этопозида [22, 23], а также сведениями базы данных (RTECS - «Реестр токсических воздействий химических веществ», RTECS No: KC0190000, http://www.ccohs.ca/products/rtecs/).
Исследование острого токсического действия проводили на мышах линии BALB/c обоего пола при двух способах введения (в/в и в/б) в 4-х дозах. Для испытания сравниваемых препаратов было сформировано по 8 опытных групп мышей для каждого способа введения (в/в и в/б) из расчета по две однополые группы (6 самок/6 самцов) на каждую дозу и по 2 группы контроля - контроль 1 с введением стерильной воды для инъекций и контроль 2 интактный (6 самок/6 самцов). Всего 20 групп животных для каждого способа введения. Определение диапазона летальных доз полимерной формы этопозида проводили путем токсикометрического анализа выживаемости животных после однократного внутривенного/внутрибрюшинного введения с последующим 30-дневным наблюдением. Проводили подсчет летальности, время гибели животных, наблюдение общего состояния, поведения и картины интоксикации, оценку изменения массы тела животных (перед испытаниями - день 0 и на 2, 7, 14, 21, 30 дни от момента введения препаратов), патоморфологические исследования (некропсия). Изучение отсроченной токсичности проводилось в течение 30 дней (после однократного введения полимерных форм этопозида) с характеристикой смертности, наблюдениями за общим состоянием и оценкой изменения массы тела животных. Данные испытания острого токсического действия полимерной формы этопозида на мышах линии BALB/c при в/в и в/б введении позволили рассчитать значения среднесмертельных доз. Для полимерной формы этопозида значение среднесмертельной дозы на мышах линии BALB/c при в/в введении составило - ЛД50=129.6 мг/кг (не зависимо от пола животных), а для препарата сравнения этопозида значение среднесмертельной дозы на мышах линии BALB/c составило - ЛД50=70.0 мг/кг (не зависимо от пола животных). Для полимерной формы этопозида значение среднесмертельной дозы на мышах линии BALB/c при в/б введении составило - ЛД50=172.7 мг/кг (не зависимо от пола животных), а для препарата сравнения этопозида значение среднесмертельной дозы на мышах линии BALB/c составило - ЛД50=79.6 мг/кг (не зависимо от пола животных). Сравнение значения LD50 полимерной формы этопозида и препарата сравнения указывает на существенно меньшее острое токсическое действие разработанного препарата, чем токсическое действие препарата сравнения при внутривенном и внутрибрюшинном введении. Подробное описание схемы эксперимента представлено в примере 4.
Изучение токсического действия полимерной формы этопозида при курсовом введении при в/в способе введения проводили на мышах линии BALB/c в разовой дозе 20 мг/кг в пересчете на действующее вещество этопозид (группы №1 и 2); в такой же дозе испытывался препарат сравнения этопозид (группы №3 и 4). Курс введения составил 5 дней. Суммарная доза составила 100 мг/кг. Препараты вводили внутривенно в боковую хвостовую вену мыши, максимальный объем однократного введения не превышал 0,5 мл. Изучение токсического действия полимерной формы этопозида при курсовом введении при внутрибрюшинном способе введения проводили в разовой дозе 25 мг/кг в пересчете на действующее вещество этопозид (группы №1 и 2); в такой же дозе испытывался препарат сравнения этопозид (группы №3 и 4). Курс введения составил 5 дней. Суммарная доза составила 125 мг/кг. Препараты вводили внутрибрюшинно в предпаховую область мыши, максимальный объем однократного введения 1,0 мл. Определяли летальность и время гибели животных, проводили ежедневное наблюдение общего состояния, поведения и картины интоксикации у животных в процессе и после окончания курса введения (общий срок наблюдений от начала введения препаратов составил 30 дней), проводили оценку изменения массы тела животных (перед испытаниями - день 0 и на 2, 5, 14, 21, 30 дни от начала введения препаратов), проводили гематологические исследования (определение уровня лейкоцитов перед испытаниями - день 0 и на 3, 5, 30 дни от начала введения препаратов). При изучении токсического действия полимерной формы этопозида при 5-дневном курсовом в/в и в/б введении летальных исходов не отмечено на протяжении всего курса введений, а также на протяжении последующих 30-ти дней наблюдения. Животные перенесли курсовое введение полимерной формы этопозида по оценке общего состояния и поведения животных удовлетворительно. Согласно данным клинического использования этопозида наиболее серьезным побочным токсическим эффектом, ограничивающим дозу применения препарата, является лейкопения [24, 25], в связи с чем проведен сравнительный анализ влияния курсового в/в и в/б ведения полимерной формы этопозида и препарата сравнения на уровень лейкоцитов в крови животных. Анализ изменения уровня лейкоцитов показывает обратимое снижение показателя на начальном периоде курса введения (3-5 дни), особенно выраженное в группе препарата сравнения. Токсические эффекты, имевшие место в период курсового введения препаратов (угнетение поведенческой активности, снижения динамики роста массы тела, лейкопения), носили обратимый характер и исчезали вскоре после отмены инъекций. В целом, побочные токсические проявления (угнетение поведенческой активности, снижения динамики роста массы тела, лейкопения), сопровождавшие курсовое введение полимерной формы этопозида были существенно менее выражены, чем при действии препарата сравнения этопозида.
Таким образом, результаты сравнительного анализа показателей острой токсичности при однократном введении и показателей переносимости при курсовом введении, свидетельствуют о том, что полимерная форма этопозида менее токсична и лучше переносится по сравнению с препаратом сравнения этопозидом.
Заявленное изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Получение полимерных частиц с включенным в них этопозидом методом простых эмульсий
Получение композиции на основе полимера PLGA 50/50 (№-4).
В стеклянном флаконе взвешивали субстанцию этопозида в количестве 29.5÷47.3 мг. (5.0÷8.0%, мас. от загруженных сухих веществ). Добавляли 324.9÷360.4 мг (55.0÷61.0%, мас.) полимера PLGA 50/50. Пипеточным дозатором загружали 5.0 мл (6.7 г) метилена хлористого (дихлорметана), закрывали флакон крышкой и перемешивали на магнитной мешалке при 500 об/мин в течение 10 мин. Флакон помещали в подогретую до 40÷45°C баню с водой и продолжали перемешивание суспензии еще 10÷15 мин, после чего раствор охлаждали до комнатной температуры. В сосуде взвешивали 18.9÷21.3 г (16.0÷18.0%, мас.) 0.5% раствора ПВС в деионизированной воде. Опускали в сосуд магнит для перемешивания и постепенно добавляли порциями к раствору ПВС при интенсивном перемешивании (700 об/мин) на магнитной мешалке в течение 10 мин раствор этопозида и полимера в органическом растворителе. Продолжали перемешивание смеси в течение 20 мин, магнит извлекали и проводили эмульгирование смеси погружным гомогенизатором Ultra-Turrax Т-25 basic (IKA, ФРГ) с помощью диспергирующего элемента (насадки) S25N-25F при комнатной температуре и 24 тыс. об/мин 3 раза по 0.5 мин с 2 перерывами по 0.5 мин. Смесь перегружали в круглодонную колбу. Остатки эмульсии смывали из реакционного сосуда и с насадки гомогенизатора д/и водой. Упаривали дихлорметан с помощью роторного испарителя в вакууме водоструйного насоса. Полученную смесь фильтровали через стеклянный фильтр (пор. 40÷110 мкм) в грушевидную колбу с раствором D-маннитола 100.4÷118.1 мг (17.0÷20.0%, мас.) в 1.0 мл д/и воды). Остатки смеси из колбы для упаривания и с фильтра смывали д/и водой в приемник. Содержимое колбы замораживали в бане с жидким азотом.
Колбу с замороженной смесью надевали на резиновый шлиф клапана заранее выведенной на режим лиофильной сушилки Christ Alpha I-6 (ФРГ). Процесс высушивания проводили при остаточном давлении 0.03÷0.1 мБар и комнатной температуре в помещении в течение 20 ч. Выход готового продукта составил примерно 94% от общей массы взятых ингредиентов.
Аналогичные опыты были проведены с использованием сополимеров молочной и гликолевой кислот PLGA-COOH 50:50 (№-5), PLGA 75:25 (№-6), а также с использованием Poloxamer 188 (№-8) и Tween 80 (№-9) в качестве стабилизаторов эмульсии.
Полученные частицы оценивались по следующим параметрам: размерам и степени включения лекарственного вещества в частицы. Средний размер частиц определяли методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD (USA). Полученные частицы имели субмикронные размеры (размер из диапазона от 100 до 1000 нм). Распределение частиц по размерам было унимодальным во всех образцах (таблица 2).
Из экспериментальных данных следует, что: из полимеров, использованных для получения композиций с этопозидом, оптимальным является полимер PLGA 50/50; лучшим из исследованных ПАВ является 0.5% водный раствор поливинилового спирта. Полученное лекарственное средство может быть выполнено в виде суспензии для инъекций.
Пример 2. Исследование противоопухолевой активности полимерной формы этопозида in vitro
2
2
50
Проведены исследования по изучению противоопухолевой активности полимерной формы этопозида и субстанции этопозида (образец сравнения) в отношении опухолевых клеток человека: чувствительной и резистентной сублиний клеток линии аденокарциномы молочной железы MCF-7 и MCF-7ADR и чувствительной и резистентной сублиний клеток миелолейкоза человека линии К562 и K562ADR, аденокарциномы ободочной кишки линии Сасо-2, аденокарциномы прямой кишки линии SW837 и лимфолейкоза мыши линии Р388. Культивирование клеток проводили в обычных условиях в СО-инкубаторе при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO, в среде ДМЕМ или RPMI1649 (клетки линии Н69), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина (Life Technologies, США). Перед экспериментом клетки снимали с подложки и суспензию клеток переносили в культуральные 96-луночные платы. Исследуемый образец полимерной формы этопозида и субстанцию этопозида вносили к клеткам не менее чем в трех повторах для каждой исследуемой концентрации в диапазоне от 1 до 200 мкМ по этопозиду. При работе с полимерной формой этопозида при приготовлении растворов концентрацию рассчитывали, исходя из процентной доли этопозида в препаратах. Выживаемость клеток после инкубации с препаратами оценивали с помощью МТТ-теста и по кривым выживаемости рассчитывали значения IC для характеристики чувствительности опухолевых клеток к субстанции этопозида и к полимерной форме этопозида. Результаты исследования приведены в таблице 1.
Пример 3. Исследование противоопухолевой активности полимерной формы этопозида in vivo
При исследовании противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной асцитной модели препараты вводили, используя два способа введения:
- подкожный способ введения по схеме - через 1, 5 и 9 суток после прививки опухолевых клеток в двух дозах: разовая доза 7,5 мг/кг по этопозиду (суммарная курсовая доза 22,5 мг/кг) и разовая доза 15 мг/кг по этопозиду (суммарная курсовая доза 45 мг/кг);
- внутрибрюшинный способ введения по схеме - через 1, 5 и 9 суток после прививки опухолевых клеток в разовой дозе 15 мг/кг по этопозиду (суммарная курсовая доза 45 мг/кг).
Препараты вводили, растворяя в 0,1 мл стерильного физиологического раствора при подкожном введении и в 0,2 мл стерильного физиологического раствора при внутрибрюшинном введении. Контрольным животным вводили физиологический раствор (0,1 или 0,2 мл) в соответствии со схемой. Курс лечения составлял 3 инъекции.
При исследовании противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной солидной модели препараты вводили, используя два способа введения:
- внутрибрюшинный способ введения по схеме - через 1, 5 и 9 суток после прививки опухолевых клеток в разовой дозе 25 мг/кг по этопозиду (суммарная курсовая доза 75 мг/кг);
- внутрибрюшинный способ введения по схеме - через 1, 3, 5, 7, 9 суток после прививки опухолей в разовой дозе 15 мг/кг по этопозиду (суммарная курсовая доза 75 мг/кг);
- внутривенный способ введения по схеме - через 1, 3 и 5 суток после прививки опухолевых клеток в разовой дозе 20 мг/кг по этопозиду (суммарная курсовая доза 60 мг/кг).
Препараты вводили, растворяя в 0,2 мл стерильного физиологического раствора при внутривенном и внутрибрюшинном введении. Контрольным животным вводили физиологический раствор (0.2 мл) в соответствии со схемой.
Для испытаний противоопухолевой активности полимерной формы этопозида было сформировано 17 экспериментальных групп мышей линии DBA/2, по 6 особей в каждой группе. Для исследования противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной асцитной модели было сформировано 8 экспериментальных групп мышей - две контрольных и шесть опытных. Для исследования противоопухолевой активности полимерной формы этопозида на экспериментальной солидной модели было сформировано 9 экспериментальных групп мышей - 3 контрольных и 6 опытных. В качестве препарата сравнения использовали препарат этопозид, производства «Эбеве Фарма Гес.м.б.Х. Нфг.КГ» (Австрия).
Для определения противоопухолевой активности препаратов проводили оценку степени торможения роста опухоли по размеру (объему) опухолей и оценку увеличения продолжительности жизни животных в сутках по сравнению с соответствующими контрольными группами. Результаты исследования представлены на фигурах 1-6.
Пример 4. Исследование токсикологических свойств полимерной формы этопозида
2
При проведении токсикологических исследований использовались мыши белые, BALB\c (количество самок - 180, количество самцов - 180). Источник животных - питомник лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН (филиал «Андреевка»). Прибывшие животные до начала исследования были помещены в отдельную комнату содержания на период карантина - 14 дней. Все процедуры по рутинному уходу за животными выполнялись в соответствии с принятыми правилами и СОП вивария. Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Световой режим: 12 час - свет, 12 час - темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 21-23°C, относительная влажность - 55-70%. Режим вентелирования, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO не более 0,15 объемных %, аммиака - не более 0,001 мг/л. К началу эксперимента масса мышей линии BALB/c составляла 19,0-20,0 г - самки, 20,0-22,0 г - самцы.
Изучение острого токсического действия полимерной формы этопозида при в/в введении проводили в 4-х дозах (дозы в пересчете на действующее вещество этопозид): 100 мг/кг; 110 мг/кг; 120 мг/кг; 130 мг/кг (группы №1-8). Препарат сравнения этопозид испытывался в дозах: 50 мг/кг; 60 мг/кг; 70 мг/кг; 80 мг/кг (группы №9-16). Препараты вводили внутривенно в боковую хвостовую вену мыши, максимальный объем однократного введения не превышал 0,5 мл. В качестве контроля служили животные, которым внутривенно вводили стерильную воду для инъекций в эквивалентном объеме (Контроль №1, группы №17, 18) и интактные животные (Контроль №2, группы 19, 20).
Изучение острого токсического действия полимерной формы этопозида при в/б введении проводили в 4-х дозах (дозы в пересчете на действующее вещество этопозид): 150 мг/кг; 160 мг/кг; 170 мг/кг; 180 мг/кг (группы №1-8). Препарат сравнения этопозид испытывался в дозах: 70 мг/кг; 80 мг/кг; 90 мг/кг; 100 мг/кг (группы №9-16). Препараты вводили внутрибрюшинно в предпаховую область мыши, максимальный объем однократного введения составлял 1,0 мл. В качестве контроля служили животные, которым внутрибрюшинно вводили стерильную воду для инъекций в эквивалентном объеме (Контроль №1, группы №17, 18) и интактные животные (Контроль №2, группы №19, 20).
В результате проведено исследование противоопухолевой активности разработанного лекарственного средства in vitro на различных линиях опухолевых клеток (лимфолейкоз мыши линии Р388, чувствительная и резистентная сублинии клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 и MCF-7ADR, чувствительная и резистентная сублинии клеток миелолейкоза человека линии К562 и K562ADR, аденокарцинома ободочной кишки линии Сасо-2, аденокарцинома прямой кишки линии SW837 и карцинома ободочной кишки линии COLO 320 HSR). Показано, что лекарственное средство обладает высокой цитотоксической активностью в отношении широкого спектра опухолевых клеток разных типов, включая резистентные к химиотерапевтическим препаратам.
В ходе испытаний разработанного лекарственного средства на модели перевиваемого лимфолейкоза мышей Р388 было обнаружено, что препарат проявлял высокую противоопухолевую активность (при подкожном, внутрибрюшинном и внутривенном путях введения), сравнимую с активностью препарата сравнения этопозидом, но при этом существенно лучше переносился животными. Торможение роста опухолей превышало 80%, увеличение продолжительности жизни превышало 100%.
Проведено исследование общетоксических свойств разработанного лекарственного средства при разных способах введения in vivo на мышах линии BALB/c, в ходе которого установлено, что значения среднесмертельной дозы составили: при в/в введении - LD50=129.6 мг/кг, при в/б введении - LD50=172.7 мг/кг. Результаты сравнительного анализа показателей острой токсичности при однократном введении, а также данных о переносимости курсового введения, проведенные на мышах линии BALB/c, свидетельствуют о том, что разработанное лекарственное средство менее токсично и лучше переносится по сравнению с препаратом сравнения этопозидом.
Таким образом, по совокупности всех полученных результатов испытаний лекарственное средство на основе этопозида, содержащее также биодеградируемый полимер PLGA (50/50), стабилизатор эмульсии - 0,5% раствор поливинилового спирта и криопротектор D-маннитола, в виде частиц субмикронного размера, обладает высокой противоопухолевой активностью (при подкожном, внутрибрюшинном и внутривенном путях введения), а также пониженным уровнем токсического действия по сравнению с препаратом этопозид, что свидетельствует о росте терапевтической широты и увеличении терапевтического индекса для разрабатываемого лекарственного средства.
Источники информации
1. Johnson D.H., Greco F.A., Strupp J., Hande K.R., Hainsworth J.D. Prolonged administration of oral etoposidein patients with relapsed or refractory small-cell lung cancer: a phase II trial // J. Clin. Oncol. 1990. Vol. 8. №10. P. 1613-1617.
2. Hande K.R. Etoposide four decades of development of a topoisomerase II inhibitor // Eur. J. Cancer. 1998. Vol. 34. №10. P. 1514-1521.
3. Sinkule J.A. Etoposide: a semisynthetic epipodophyllotoxin. Chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, adverse effects and use as an antineoplastic agent // Pharmacotherapy. - 1984. - Vol. 4. - №2. - P. 61-73.
4. Gantchev T.G., Hunting D.J. Enhancement of etoposide (VP-16) cytotoxicity by enzymatic and photodynamically induced oxidative stress // Anticancer Drugs. - 1997. - Vol. 8. - №2. - P. 164-173.
5. Ciccolini, J.; Monjanel-Mouterde, S.; Bun, S.S.; Blanc, C; Duffaud, F.; Favre, R.; Durand, A. Population pharmacokinetics of etoposide: application to therapeutic drug monitoring // Ther Drug Monit. - 2002. - Vol. 24. - №6. - P. 709-714.
6. Shah, J.C.; Chen, J.R.; Chow, D. Metastable polymorph of etoposide with higher dissolution rate // Drug Dev Ind Pharm. - 1999. - Vol. 25. - №1. - P. 63-67.
7. Jain, J.; Fernandes, C; Patravale, V. Formulation development of parenteral phospholipid-based microemulsion of etoposide // AAPS PharmSciTech. - 2010. - Vol. 11. - №2. - P. 826-831.
8. Sistla, A.; Smith, D.J.; Kobrinsky, N.L.; Kumar, K. Pharmacokinetics and tissue distribution of liposomal etoposide in rats // Drug Deliv. - 2009. - Vol. 16. - №8. - P.423-429.
9. Qian, W.Y.; Sun, D.M.; Zhu, R.R.; Du, X.L.; Liu, H.; Wang, S.L., pH-sensitive strontium carbonate nanoparticles as new anticancer vehicles for controlled etoposide release // Int J Nanomedicine. - 2012. - Vol. 7. - P. 5781-5792.
10. Saadati, R.; Dadashzadeh, S.; Abbasian, Z.; Soleimanjahi, H. Accelerated blood clearance of PEGylated PLGA nanoparticles following repeated injections: effects of polymer dose, PEG coating, and encapsulated anticancer drug // Pharm Res. - 2013. - Vol. 30. - №4. - P. 985-995.
11. Yordanov, G.; Skrobanska, R.; Evangelatov, A. Colloidal formulations of etoposide based on poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles: preparation, physicochemical properties and cytotoxicity // Colloids Surf В Biointerfaces. - 2013. - Vol. 101. - P. 215-222.
12. Yadav, K.S.; Jacob, S.; Sachdeva, G.; Sawant, K.K. Intracellular delivery of etoposide loaded biodegradable nanoparticles: cytotoxicity and cellular uptake studies // J Nanosci Nanotechnol. - 2011. - Vol. 11. - №8. - P. 6657-6667.
13. Snehalatha, M; Venugopal, K.; Saha, R.N.; Babbar, A.K.; Sharma, R.K. Etoposide loaded PLGA and PCL nanoparticles II: biodistribution and pharmacokinetics after radiolabeling with Tc-99m // Drug Deliv. - 2008. - Vol. 15. - №5. - P. 277-287.
14. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine / Ed. B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons. - 2012. Academic Press, 1576 p.
15. Cellular Response to Biomaterials / L. Di Silvio. - 2008. Woodhead Publishing, 648 p..
16. Международная публикация заявки WO №2007069272 на изобретение, «NOVEL IMPROVED COMPOSITIONS FOR CANCER THERAPY», опубл. 21.06.2007.
17. Европейский патент EP 2105150 на изобретение «Developable biodegradable microspheric blood vessel embolism materials», опубл. 30.09.2009.
18. Патент РФ №2290950 на изобретение «БИОРАЗЛАГАЕМАЯ КОМПОЗИЦИЯ С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ», опубл. 10.01.2007.
19. Патент РФ №2480201 на изобретение «СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ», опубл. 27.04.2013.
20. Заявка Китая CN 102247320 на изобретение, опубл. 13.03.2013.
21. Патент Китая CN 1961864 на изобретение, опубл. 16.05.2007.
22. Sinkule, J.A. Etoposide: a semisynthetic epipodophyllotoxin. Chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, adverse effects and use as an antineoplastic agent // Pharmacotherapy. - 1984. - Vol. 4(2). - P. 61-73.
23. Takahashi, N.; Kadota, T; Kawano, S; Ohta, K.; Ishikawa, K.; Kuroyanagi, K.; Hamajima, Y.; Ohta, S.; Kai, S.; Kohmura, H. Toxicity studies of VP 16-213 (IV) - Intravenous one-month subacute toxicity in rats // J Toxicol Sci. - 1986. - Vol. 11. - Suppl 1. - P. 89-122.
24. http://www.rlsnet.ru/tn_index_id_7535.htm
25. http://grls.rosminzdrav.ru