СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ HBsAg ВИРУСА ГЕПАТИТА В
METHOD OF PRODUCING DIAGNOSTIC IMMUNOGLOBULINS FOR DETECTING HEPATITIS B VIRUS HBsAg

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биотехнологии, ветеринарии и может быть использовано для диагностики заболеваний человека и животных вирусной, бактериальной и др. этиологии.
Известен способ получения иммуноглобулинов от животных, заключающийся в получении гипериммунных сывороток и приготовлении на их основе диагностикумов путем многократной иммунизации животных-доноров антигеном с масляным адъювантом (полным и неполным адъювантом Фрейда). Гипериммунизация проводится путем внутрикожных, подкожных и внутримышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированным антигеном при многократном введении: в течение двух-трех суток вводится антиген в несколько анатомических областей тела животного, а затем через семь-восемь суток проводится реиммунизация аналогичным способом. При недостаточном уровне антител в сыворотке крови животного цикл иммунизации повторяют до тех пор, пока не будет достигнут необходимый титр антител. Общее число иммунизации может составлять от восьми до десяти циклов и более. После последнего введения через 7-10 сут. производят забор пробы биологической среды (крови или асцитной жидкости) и определяют титр специфических антител. При достижении удовлетворяющего титра производят забор максимально допустимого объема пробы биологической среды, не приводящий к гибели животного-донора (Гринь С.А. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов: Автореф. дисс. … докт. биол. наук. - Щелково: ГНУ ВНИТИБП РАСХН, 2008. - 51 с).
В качестве животных-доноров могут быть использованы многие виды животных, особенности которых необходимо учитывать при последующем получении специфических иммуноглобулинов. При этом одним из основополагающих факторов являются требования GMP при производстве лекарственных средств.
Недостатками вышеизложенного способа получения диагностических иммуноглобулинов являются:
- дороговизна;
- низкое качество получаемого сырья.
Цель изобретения: удешевление, снижение себестоимости и повышение качества при получении необходимого, в том числе большого, количества специфических иммуноглобулинов.
Цель достигается тем, что биологическим объектам вводят специфический антиген с последующим получением специфических антител, причем антиген вводят самкам перепелов в возрасте 20-25 сут непосредственно в область иммунокомпетентного органа (тимуса), и в качестве конечного продукта используют иммуноглобулины, получаемые из желтков перепелиных яиц.
В таблице 1 представлены доказательства возможности достижения поставленной цели.
Способ реализуется следующим образом: антиген, подготовленный путем сорбции его на гидроокиси алюминия и внедрения его в состав обратной масляной эмульсии, вводят однократно в верхнюю треть дорсальной поверхности шеи параллельно продольной оси шейного отдела позвоночника, равномерно распределяя вводимую эмульсию с антигеном по дорсальной поверхности подкожной клетчатки шеи непосредственно в области тимуса, не травмируя его. По истечении 30 сут производят пробный забор проб крови для определения титра специфических антител. При достижении титра специфических антител 1:8000 и выше, определяемом твердофазным иммунноферментным анализом (тИФА), производят сбор перепелиного яйца. В последующем ежемесячно выполняют определение титра специфических антител к иммунизирующему антигену. Осуществляют сбор яйца до момента обнаружения факта снижения титра специфических антител. Одновременно с забором крови для определения специфических антител к иммунизирующему антигену производят определение иммунного статуса птицы на соответствие требованиям SPF.
Для доказательства возможности промышленного использования изобретения были проведены исследования, описанные ниже.
В условиях вивария содержалось 26 самок перепелов породы «Фараон», каждая массой 100-140 г. Самки перепелов были получены из ОАО «Перепелочка» (Ленинградская область) в возрасте 20 суток. Предварительно экспериментальное птицепоголовье для определения эпизоотического (эпидемического) статуса было проверено на 12 инфекций. Положительно реагирующих птиц в ходе серологического обследования не выявлено. Это дало нам основание утверждать, что экспериментальное птицепоголовье можно отнести к категории SPF, что является необходимым и основным условием при получении лекарственных средств на основе иммуноглобулинов животных-доноров. Вышеперечисленные технологические положения производства лекарственных средств соответствуют требованиям GMP.
Полученное птицепоголовье находилось в условиях опыта 86 суток.
В процессе выполнения исследований были созданы две экспериментальных группы: опытная, в которой проводилась иммунизация птиц HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия и заключенным в обратную эмульсию «вода-масло», и контрольная.
Опытная группа была предназначена для получения специфических желточных иммуноглобулинов к HBsAg вируса гепатита В.
Контрольная группа предназначалась для определения влияния условий содержания и кормления на здоровье перепелов и их яичную продуктивность.
Иммунизирующий антиген вводили однократно в верхнюю треть дорсальной поверхности шеи параллельно продольной оси шейного отдела позвоночника, не травмируя кожу и мышцы птицы-донора, равномерно распределяя вводимую эмульсию с антигеном по дорсальной поверхности подкожной клетчатки шеи непосредственно в области иммунокомпетентного органа (тимуса), не травмируя его, по 20 мкг иммунизирующего антигена на инъекцию для каждого животного.
По истечении 30 сут производили пробный забор проб крови для определения титра специфических антител к HBsAg вируса гепатита В. Титр антител оказался достаточным и составлял 1:8000 в тИФА, что соответствовало уровню антител в сыворотке крови перепелов. После получения результатов определения уровня антител к HBsAg в сыворотке крови, начали производить сбор перепелиного яйца. Сбор яйца начали производить по достижении птицей возраста в 50 сут. При этом ежедневный сбор яйца в пересчете на одну несушку составил около 0,75 яйца. Концентрация иммуноглобулинов в желтках перепелиных яиц составила 10-12 мг/мл. При перерасчете на одну несушку количество антител, выделенных из желтков перепелиных яиц, за месяц составило 270 мг. Каждые 30 сут проводили серологические исследования экспериментального птицепоголовья на соответствие статусу SPF. В течение всего опыта положительно реагирующих на возбудителей заболеваний, регламентируемых статусом SPF, не выявлено.
Суммарный объем желточной массы перепелиных яиц за весь период опыта полученной от птиц опытной группы, составил 655,2 мл. Масса желточных иммуноглобулинов составила 6,5 г.
В процессе проведения опыта клинически больной и павшей птицы не зарегистрировано. Нарушений в физиологическом процессе яйцекладки не обнаружено.
Доказательство возможности достижения поставленной цели представлены в таблице 1.
Таблица составлена на основе данных, опубликованных университетом Висконсин-Мадисон (University of Wisconsin-Madison, Research animal resources center): Uw-Madison researcher's guide to animal care & use - http://www.rarc.wisc.edu/guide/techniques.html и университетом мичиганской медицинской школы (University of Michigan Medical School, unit for laboratory animal medicine): Blood collection guidelines - http://www.ulam.umich.edu/.
Из данных таблицы 1 следует: использование млекопитающих в качестве доноров имеет существенные недостатки, заключающиеся в травмировании животного-донора, развитии различных воспалительных процессов, которые могут привести к гибели животного. Использование практически любого вида животных в качестве донора требует проведения комплекса мероприятий: проведения премедикации, анестезии и комплексной терапии. При работе с крупными животными-донорами необходима специальная подготовка персонала и наличие помощников. А поддержание статуса SPF возможно только у мелких животных-грызунов. Получение больших количеств иммуноглобулинов от животных-доноров ограничено объемом разового взятия крови.
Предлагаемый способ получения иммуноглобулинов заключается в использовании естественных физиологических процессов самок перепелов, позволяющих получать в течение года большое количество перепелиного яйца, т.е. до 300 штук в год от каждой особи.
Удешевление при предлагаемом способе получения диагностических иммуноглобулинов заключается в том, что в качестве объекта получения диагностических иммуноглобулинов используют самок перепелов в начальном возрасте 20-25 сут, не требующих значительных затрат на содержание. Кроме того, удешевление получения диагностических иммуноглобулинов достигается за счет: исключения необходимости подготовки высокоспециализированных специалистов и снижения трудоемкости процесса и уровня стрессовых ситуаций у вспомогательного персонала; обеспечения получения больших количеств иммуноглобулинов; снижения длительности цикла иммунизации, т.е. однократного введения антигена; однократного травмирования кожи животного; отсутствия постинъекционных осложнений в виде абсцессов и флегмон; незначительных производственных площадей для содержания перепелов; незначительных экономических затрат на получение продукции и использования естественных физиологических функций перепелов при получении исходного биологического сырья; отсутствия необходимости в специальной профессиональной и психологической подготовке персонала при получении исходного биологического сырья; применения менее затратных технологий содержания и эксплуатации животных с соблюдением статуса SPF.
Повышение качества получаемого сырья достигается за счет снижения уровня неспецифических реакций. Использование в качестве продуцентов диагностических иммуноглобулинов яйца от самок SPF-перепелов дает возможность получения высоко специфичных иммуноглобулинов, а также соответствует требованиям GMP при производстве лекарственных средств. При этом используют нормальные физиологические функции организма перепелов для получения диагностических иммуноглобулинов и повышается уровень гуманного отношения к животным-продуцентам биологического сырья.
Табл. 1
Способ получения диагностических иммуноглобулинов для выявления HBsAg вируса гепатита B
Вид животного
Анатомическая область (орган) взятия пробы крови
Максимальный объем пробы крови при единичном заборе, не приводящий к гибели животного-донора, см<sup>3</sup>
Концентрация иммуноглобулинов в крови, мг/см<sup>3</sup>
Необходимость выполнения дополнительных мероприятий
Возможность осложнения после забора пробы крови
Возможность поддержания статуса SPF
Белые мыши
Орбитальный синус, хвостовая вена, вены голени
0,15
1,7-1,9
Анестезия, поддерживающая (компенсационная) терапия
Сепсис, гибель животного
Да
Крысы
Орбитальный синус, хвостовая вена, вена голени, подключичная вена
0,5
3,1-3,3
Анестезия, поддерживающая (компенсационная) терапия
Сепсис, гибель животного
Да
Кролики
Сердце, краевая вена ушной раковины
25,0
7,0
Анестезия, поддерживающая (компенсационная) терапия
Абсцедирование места пункции, гибель животного
Да
Собаки (массой не менее 30 кг)
Яремная вена, латеральная вена голени, затылочная вена, вена внутренней поверхности стопы
300,0-400,0
3,0-4,7
Фиксация животного, премедикация, анестезия, поддерживающая (компенсационная) терапия
Абсцедирование места пункции, гибель животного
Да
Козы, овцы
Яремная вена
200,0-300,0
10,0-12,0
Фиксация животного, поддерживающая (компенсационная) терапия
Абсцедирование места пункции, гибель животного
Нет
Лошади
Яремная вена
1000,0
10,0
Фиксация животного, поддерживающая (компенсационная) терапия
Абсцедирование места пункции, гибель животного. При постоянном заборе крови с интервалом в один месяц в течение двух лет развивается гепатоз
Нет
Куры (весом 2,5-4,0 кг)
Подкрыльцовая вена, сердце
3,0-5,0
10,0
Фиксация животного, поддерживающая (компенсационная) терапия
Повреждение лучевого нерва, каннибализм, гибель животного
Да