Фиксация бактерий E . C Oli на подложке для измерений в жидкости методом атомно-силовой микроскопии

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2012, том 22, № 4, c. 56-61

ПОВЕРХНОСТЬ

УДК 57.086.2+57.086.164 + 53.086

© И. В. Кухтевич, М. В. Жуков, В. И. Чубинский-Надеждин, А. С. Букатин, А. А. Евстрапов

ФИКСАЦИЯ БАКТЕРИЙ Е.СоН НА ПОДЛОЖКЕ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЙ В ЖИДКОСТИ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Для фиксации биологических объектов в жидкости использованы гелеобразующие вещества (желатин и агар-агар). Выполнены исследования по подбору наиболее подходящей массовой доли желатина и агар-агара в исходном растворе для фиксации бактерий Е.СоН в жидкости и проведено изучение результатов фиксации методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Методом атомно-силовой микроскопии получены изображения бактерий Е.СоН в нативном состоянии, зафиксированных на пленках агар-агара в жидкости.

Кл. сл.: бактерия Е.СоИ, гелеобразующее вещество, желатин, агар-агар, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, атомно-силовая микроскопия

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время интерес к изучению биологических объектов (клеток, бактерий, ДНК и т. д.) методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) существенно возрос благодаря возможности получения более высокого пространственного разрешения при изучении биообъектов, чем методами традиционной оптической микроскопии [1-4]. Важной особенностью метода АСМ, препятствующей его широкому распространению при исследовании биологических объектов, является необходимость фиксации объекта исследования на время его измерений. Для неживых объектов или структур, обработанных специальным способом, это условие легко реализовать. При исследованиях в воздушной среде биологические объекты размещаются на предварительно очищенной подложке (щелочью, спиртом, дистиллированной в ультразвуке водой и т. д.) и высушиваются различными способами [5]. Недостатком такого метода является то, что биологические объекты подвергаются дегидратации и, как правило, усыхают в несколько раз, что вносит существенные искажения в получаемые методом АСМ данные. Устранить этот недостаток призваны более сложные методы пробопод-готовки, позволяющие проводить измерения не только на воздухе, но и в жидкости. К ним следует отнести:

1. Методы химической обработки пробы. Проводят замену ростовой среды биологических объектов на натриево-фосфатный буфер (PBS), при этом сменяют буфер как минимум 2 раза. Далее в пробу добавляют глутаральдегид, парафор-мальдегид, формалин, метанол (или ацетон, или этанол, или уксусную кислоту) и наносят полу-

ченную суспензию на предварительно очищенное предметное стекло, после чего ее высушивают [6]. Это позволяет достичь снижения эффекта дегидратации на воздухе, однако о проведении исследований биологических объектов в нативном состоянии говорить нельзя.

2. Методы с применением гелей. Используются специальные гелеобразующие вещества, предварительно наносимые на подложку, например желатин [7] или агар-агар. Главными достоинствами методов являются относительная простота и возможность фиксировать биологические объекты не только на воздухе, но и в жидкости, что позволяет проводить их измерение в нативном состоянии.

3. Методы специальной обработки поверхности. Ярким примером таких методов может служить метод с обработкой поверхности полилизином [7]. В этом случае биологические объекты могут быть зафиксированы и в воздушной, и в жидкой средах.

4. Методы с использованием специальных материалов и структур. К данным методам можно отнести нанесение пробы на нано- или микроструктурированные материалы, например на полидиметилсилоксан с поверхностью в виде матрицы квадратных ячеек микронного размера [8]. В такой системе за счет конвективного/капиллярного осаждения происходит концентрирование и фиксация биологических объектов непосредственно в ячейках, после чего остается только закрепить полученный образец и проводить измерения. При подборе соответствующих условий измерения можно осуществлять в жидкости. Другими примерами подобных методов является использование пористых мембран [9] и специальных структур,

Рис. 1. КЛСМ-изображение суспензии Е.СоН на предметном стекле (образец-свидетель). Размер изображения 50*50 мкм

размещенных в канале микрофлюидного чипа, на которых за счет гидродинамических сил фиксируются и удерживаются биологические объекты [10]. К достоинствам этих методов следует отнести возможность подбора материалов и структур, которые будут наиболее эффективны для выбранного биологического объекта как при измерениях на воздухе, так и в жидкости. Однако это является и их недостатком, поскольку процесс производства материалов и структур с заданными характеристиками требует специального технологического оборудования и поэтому является дорогим.

Целью данной работы являлось изучение возможности применения гелеобразующих веществ (желатина и агар-агара) для фиксации бактерий E.Coli в нативном состоянии в жидкости и проведения их исследований методом АСМ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ВЫБОРУ УСЛОВИЙ ФИКСАЦИИ БАКТЕРИЙ E.Coli НА ГЕЛЕ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ

Для иммобилизации бактерий E.Coli, предоставленных Институтом цитологии РАН (Санкт-Петербург), на поверхности пластиковых чашек Петри использовались гелеобразующие вещества

желатин и агар-агар. Изучение влияния состава геля на эффективность иммобилизации проводилось с использованием гелей с массовой долей желатина или агар-агара 0.5 % и 1.8 %.

В работе использовался следующий протокол подготовки желатина и агар-агара.

1. Желатин (агар-агар) массовой долей 0.5 % или 1.8 % разводился в дистиллированной воде в термоустойчивой стеклянной посуде.

2. Полученный раствор в течение часа перемешивался при помощи шейкера до набухания желатина (в случае агар-агара данный пункт не выполнялся).

3. Раствор желатина (агар-агара) в термоустойчивой стеклянной посуде доводился до кипения.

4. Остывший до ~ 60 °C раствор разливался в заранее подготовленные стерильные чашки Петри.

5. При комнатной температуре раствор желатина (агар-агара) в чашках Петри оставался до полного затвердевания (образования пленок на дне чашек).

Бактерии E.Coli культивировались в среде LB (Триптон + дрожжевой экстракт + NaCl, pH = = 7.0-7.2) в течение 15-18 ч в термостатируемом шейкере-инкубаторе Biosan ES-20 при температуре t = 37 °C и скорости вращения 250 об./мин. Перед проведением исследований бактерии окрашивались флуоресцеин-изотиоцианатом (fluorescein isothiocyanate — FITC). Для этого бактерии были ресуспендированы в растворе FITC в натрий-фосфатном буфере PBS (0.1 мг / мл, pH = 7.0-7.3), инкубировались в течение 30 мин при температуре 37 °C, а затем пятикратно промывались в PBS-бу-фере, не содержащем красителя.

Регистрация результатов по иммобилизации бактерий E.Coli на геле осуществлялась при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SL (Германия). Возбуждение флуоресценции производилось на длине волны 488 нм, а регистрация в диапазоне 510-530 нм.

Первоначально для получения изображения-свидетеля суспензия, содержащая E.Coli, наносилась непосредственно на предметное стекло, и выполнялись измерения методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) (рис. 1). Затем суспензия объемом 50 мкл, содержащая E.Coli, распределялась по поверхности пленки желатина / агар-агара, образовавшейся на дне чашек Петри, и выдерживалась в таком виде в течение 10-15 мин. Далее осуществлялась 3-кратная промывка чашек Петри дистиллированной водой для предотвращения оседания соли во время измерений. После промывки чашка Петри

58

И. В. КУХТЕВИЧ, М. В. ЖУКОВ, В. И. ЧУБИНСКИЙ-НАДЕЖДИН и др.

Г V

ч

* %

т

Рис. 2. КЛСМ-изображение Е.СоИ после 3- (а, б) и 5-кратной (в, г) промывок на пленках агар-агара с массовой долей в исходном растворе 0.5 % (а, в) и 1.8 % (б, г). Размер изображения 50x50 мкм

г

заполнялась на 1/3 дистиллированной водой, и затем проводились измерения бактерий методом КЛСМ. Изображения, полученные методом КЛСМ для пленки агар-агара, приведены на рис. 2. Изображения для пленки желатина в статье не приводятся. Отметим, что в сравнении с изображением-свидетелем (рис. 1) в случае 3-кратной промывки дистиллированной водой суспензии с Е.СоИ, распределенной на поверхности пленки желатина (как для 0.5 %, так и для 1.8 %), наблюдается фиксация около половины нанесенных бактерий. Напротив, на агар-агаре с массовой долей 0.5 % в исходном растворе наблюдалась худшая фиксация по сравнению с пленкой желатина, имеющей такую же массовую долю. На агар-агаре с массовой долей 1.8 % в исходном растворе наблюдается лучшая фиксация, чем для желатина такой же массовой доли.

Для выяснения прочности фиксации бактерий были проведены эксперименты по изучению результатов после 5-кратной промывки дистиллированной водой чашек Петри с пленками желатина (агар-агара) с массовой долей 0.5 % и 1.8 % в исходном растворе и нанесенной суспензией с бактериями Е.СоИ. После этого, как и в предыдущих экспериментах, чашки Петри заполнялись на 1/3

дистиллированной водой, и выполнялись измерения методом КЛСМ. Результаты этих измерений для пленки агар-агара приведены на рис. 2 (в, г). В случае использования пленок желатина (0.5 % и 1.8% в исходном растворе) наблюдалась фиксация бактерий, намного меньшая, чем в случае 3-кратной промывки. При использовании пленок агар-агара с массовой долей 0.5 % наблюдалось хаотичное круговое движение бактерий вокруг точек фиксации, что, вероятно, является следствием локального связывания бактерий в отдельных точках, а не по всей поверхности. Напротив, в случае агар-агара с массовой долей 1.8 % в исходном растворе наблюдается более устойчивая фиксация бактерий, чем для желатина такой же массовой доли после 5-кратной промывки.

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ БАКТЕРИЙ Е.СоИ В ЖИДКОСТИ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

На основании результатов вышеописанных экспериментов было решено использовать агар-агар с массовой долей 1.8 % в исходном растворе для

оэ о

г^ 43

ю о о Ln

Ln о о

£ а т о о СП £ с

т о о

ГЧ1 ГМ

т—1 о о

о о

012345678

мт

Рис. 3. АСМ-изображение бактерии E.Coli, за-

фиксированной на пленке агар-агара (массовая

доля 1.8 %) в жидкости

проведения исследований бактерий Е.СоИ методом АСМ.

Измерения проводились на сканирующем зон-довом микроскопе ИНТЕГРА Аура (НТ-МДТ, Россия) в контактном режиме. Для измерений использовалась штатная ячейка и держатель зонда с призмой для работы в жидкости. Для подготовки бактерий Е.СоИ использовался тот же протокол, что и в случае проведения экспериментов методом КЛСМ за исключением операций по окраске бактерий. При измерениях бактерий Е.СоИ методом АСМ в жидкости применялся следующий порядок подготовки образцов:

1. Пленка агар-агара с массовой долей 1.8 % в исходном растворе сегментировалась на неболь-

шие кусочки (~ 10*10 мм), отделялась от дна чашки Петри и переносилась в ячейку для измерений в жидкости, где неподвижно крепилась на дно измерительной ячейки.

2. На пленку агар-агара наносилась суспензия с бактериями E.Coli объемом 10 мкл и выдерживалась в таком виде в течение 10-15 мин.

3. Осуществлялась 3-кратная помывка ячейки дистиллированной водой.

4. Ячейка с пленкой агар-агара и с распределенными на ней бактериями Е. Coli заполнялась на 1/2 дистиллированной водой.

В ходе измерений методом АСМ удалось визуализировать отдельную бактерию E.Coli в жидкости, зафиксированную на пленке агар-агара (рис. 3). Однако оказалось, что из-за наличия микротечений в жидкости, где находился образец, высокой эластичности пленки агар-агара в ряде случаев при попадании жидкости под пленку наблюдалось ее набухание и деформация. Это приводило к тому, что не удавалось измерить относительно протяженные участки поверхности

с высоким пространственным разрешением и, следовательно, визуализировать группы бактерий E.Coli.

Для устранения этого эффекта решено было нанести агар-агар на пластинку слюды таким образом, чтобы на ее поверхности образовалась тонкая пленка. Применяя данный подход, удалось визуализировать не только одиночные бактерии, но и группы бактерий E.Coli (рис. 4). Результаты исследований позволили получить оценки размеров бактерий E.Coli, соответствующие литературным данным (диаметр ~ 0.5 мкм, длина ~ 2-3 мкм) [11].

е

з.

N

fjm

10 12 14

б

Рис. 4. АСМ-изображения бактерий Е.СоН, зафиксированных на пленке агар-агара (массовая доля 1.8 %) на слюде в жидкости. а — отдельная бактерия, б — группа бактерий

а

60

И. В. КУХТЕВИЧ, М. В. ЖУКОВ, В. И. ЧУБИНСКИЙ-НАДЕЖДИН и др.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате экспериментов по подбору массовой доли желатина и агар-агара для фиксации бактерий E.Coli выявлено следующее.

— При 3-кратной промывке дистиллированной водой пленки желатина с распределенными на поверхности бактериями E.Coli (как для 0.5 %, так и для 1.8 %) наблюдается фиксация как минимум половины бактерий E.Coli. На пленке агар-агара с массовой долей 0.5 % наблюдалась худшая фиксация по сравнению с желатином, в то время как на пленке агар-агара с массовой долей 1.8 % наблюдается лучшая фиксация, чем для желатина.

— При 5-кратной промывке и при использовании пленок желатина (0.5 %, 1.8% в исходном растворе) наблюдалось меньшее число зафиксированных бактерий E.Coli, чем в случае 3-кратной промывки. Для пленок агар-агара с массовой долей 0.5 % наблюдались осцилляции большинства бактерий E.Coli, свидетельствующие о локальном (точечном) связывании с агар-агаром, в то время как для агар-агара с массовой долей 1.8 % наблюдалась лучшая фиксация бактерий E.Coli, чем для желатина.

— При использовании пленок агар-агара для фиксации бактерий E.Coli в жидкости при проведении измерений методом АСМ из-за наличия микротечений и высокой эластичности пленки агар-агара при попадании жидкости под пленку происходит ее набухание и деформация, что не позволяет проводить измерения на относительно протяженных участках поверхности. Это приводит к тому, что удается визуализировать только отдельные бактерии E.Coli.

— Использование тонкого слоя агар-агара, нанесенного на поверхность слюды, позволяет предотвратить набухание и деформацию пленки и визуализировать достаточно протяженные участки исследуемой поверхности, что дает возможность получить изображения как групп, так и одиночных бактерий E. Coli.

Таким образом, фиксация бактерий E.Coli на агар-агаре, нанесенном на поверхность слюды, позволяет проводить измерения методом АСМ в жидкости и осуществлять визуализацию бактерий в нативном состоянии с высоким пространственным разрешением.

Авторы выражают благодарность н. с. Г.Е. Рудницкой за консультации по подготовке растворов ге-леобразующих веществ.

Работа проведена при поддержке: ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы; программы У.М.Н.И.К.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Touhami A., Jericho M.H., Beveridge T.J.Atomic force microscopy of cell growth and division in staphylococcus aureus // Jurnal of bacteriology. 2004. V. 186, N 11. P. 3286-3295.

2. Kailas L., Ratcliffe E.C., Hayhurst E.J. et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes // Ultramicroscop. 2009. V. 109, N 7. P. 775-780.

3. Lyubchenko Y.L. Preparation of DNA and nucleoprote-in samples for AFM imaging // Micron. 2011. V. 42, N 2. P. 196-206.

4. Yamashita H., Taoka A., Uchihashi T. et al. Single-molecule imaging on living bacterial cell surface by high-speed AFM // Journal of molecular biology. 2012. (in press). URL: (http://dx.doi.org/10.1016/ j.jmb.2012.05.018).

5. Lu Z.-X., Zhang Z.-L., Shi W.-L. et al. Heat-fixation method used in an atomic force microscopy study of cell morphology // Analytical sciences. 2008. V. 24. P. 257-260.

6. Chao Y., Zhang T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 92, N 2. P. 381392.

7. Meyer R.L., Zhou X., Tang L. et al. Flemming besenbacher. immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions // Ultramicrosco-py. 2010. V. 110, N 11. P. 1349-1357.

8. Dague E., Jauvert E., Laplatine L. et. al. Assembly of live micro-organisms on microstructured PDMS stamps by convective / capillary deposition for AFM bio-experiments // Nanotechnology. 2011. V. 22, N 39. 395102.

9. Dufrene Y.F. Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology // Jurnal of bacteriology. 2002. V. 184, N 19. P. 5205-5213.

10. Ryu W.H., Huang Z., Park J.S. et al. Open micro-fluidic system for atomic force microscopy-guided in situ electrochemical probing of a single cell // Lab. Chip. 2008. V. 8. P. 1460-1467.

11. Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbiology (7th ed.). N. Y.: McGraw-Hill Publ., 2008. 1088 p.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Санкт-Петербургский академический университет — научно-образовательный центр нанотехнологий

РАН

Контакты: Кухтевич Игорь Владимирович,

ba@inbox.ru Материал поступил в редакцию 10.09.2012

E. COLI BACTERIA FIXING ON A SUBSTRATE FOR MEASUREMENTS IN LIQUID BY THE METHOD

OF ATOMIC-FORCE MICROSCOPY

I. V. Kukhtevic1, 2, M. V. Zhukov2, V. I. Chubinskiy-Nadezhdin3, A. S. Bukatin1, 2' 4, A. A. Evstrapov1, 2' 4

1 Institute for Analytical Instrumentation ofRAS, Saint-Petersburg

2Saint-Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics

33Institute of Cytology RAS, Saint-Petersburg

4Saint-Petersburg Academic University — Nanotechnology Research and Education Center of RAS

For biological objects fixation in a liquid proposed to use gelling agents (gelatin and agar-agar). The studies on selection of the most appropriate mass fraction of gelatin and agar-agar in an initial solution for fixation E.Coli bacteria in the liquid media and studies of the results of fixation by method of confocal laser scanning microscopy were done. The image data of E.Coli bacterium in native state, fixated on agar-agar films in a liquid were received by method of atomic-force microscopy.

Keywords: E.Coli bacterium, gelling agent, gelatin, agar-agar, high resolution microscopy, confocal laser scanning microscopy, atomic-force microscopy