СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ ОТСЛОЙКИ НОРМАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННОЙ ПЛАЦЕНТЫ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PREMATURE DETACHMENT OF NORMALLY LOCATED PLACENTA

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволит с точки зрения иммуногистохимического анализа базальной децидуальной оболочки диагностировать преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты (ПОНРП), вызванной воспалением.
Актуальность
В настоящее время проблема снижения материнской и перинатальной смертности в практическом здравоохранении остается одной из самых актуальных. В среднем в Российской Федерации остается высокий процент материнской (58,7%) и перинатальной (17,5-62,2%) смертности (Милованов А.П. Патология системы мать-плацента-плод. - М.: Медицина, 1999. - 446 с.).
Среди причин материнской смертности преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты находится на втором месте после гипо- и атонических кровотечений, на ее долю приходится 32,5-42% случаев (Корнилова Н.К. Патоморфология ворсин и плацентарного ложа матки при преждевременной отслойке нормально расположенной плаценты: автореф. дис…канд. мед. наук. - М., 2003. - 27 с.). В общей структуре акушерских кровотечений ПОНРП составляет 20-45,1%. Согласно литературным данным (Серов В.Н., Маркин С.А. Критические состояния в акушерстве. - М.: Медиздат, 2003. - 702 с.), преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты встречается с частотой 1: 100-120 родов. Следует отметить, что статистически учитываются только клинически диагностированные отслойки плаценты. В действительности, данное осложнение беременности встречается гораздо чаще, особенно при преждевременном прерывании на ранних сроках беременности. Врачами-акушерами не диагностируются микроотслойки плаценты до и во время родового акта. При макроскопическом исследовании плаценты врач-патологоанатом не всегда визуализирует микроотслойку, поэтому при иссечении кусочков для гистологического исследования данная патология может не попасть в препараты. В связи с этим, особую актуальность приобретает поиск методов, позволяющих диагностировать не только макро-, но и микроотслойку плаценты.
Существуют различные способы диагностики преждевременной отслойки плаценты. В первую очередь - это клиническая диагностика, включающая в себя влагалищное обследование, при котором у женщины диагностируют влагалищное кровотечение (обычно темной кровью), боли в животе и повышение тонуса матки. Известна диагностика отслойки плаценты с помощью компьютерной томографии (Kopelman T.R, Berardoni N.E, Manriquez M, Gridley D, Vail S.J, Pieri P.G, O'Neill, Pressman M.A. The ability of computed tomography to diagnose placental abruption in the trauma patient // J Trauma Acute Care Surg. - 2013. - Vol. 74(1). - P. 236-241). В литературных источниках описаны биохимические методы диагностики преждевременной отслойки при преэклампсии посредством исследования крови. Установлено, что острая плацентарная недостаточность, развившаяся в результате преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, сопровождается снижением содержания в крови аннексина Y, s VCAM-1 и IL-ip в сочетании с увеличением содержания в крови тромбомодулина и фактора Виллебранда (Зайнулина М.С. Роль дисфункции эндотелия в патогенезе плацентарной недостаточности // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2003. - Т. 2, №2. - С. 36-42). Однако данный способ является трудоемким и не относится к морфологическим методам исследования.
Наиболее близким по техническому решению является морфологический способ диагностики преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, в том числе вызванной воспалением, заключающийся в описании морфологических изменений в плаценте. Патоморфологическими изменениями являются как острые расслаивающие очаговые кровоизлияния в базальной децидуальной оболочке (БДО), острые геморрагические инфаркты, стаз в межворсинчатом пространстве суббазальных зон, так и хронические расстройства материнского и плодового кровотока, такие как псевдоинфаркты, хронические геморрагические инфаркты, тромбозы межворсинчатого пространства суббазальных и центральных зон. В большей части последов диагностируют экссудативное воспаление базальной децидуальной оболочки и хориальной пластинки, стромы ворсин, стенки сосудов (Курицына О.П., Перетятко Л.П., Кулида Л.В., Посисеева Л.В. Клинико-морфологический анализ особенностей течения беременности, родов и состояния новорожденного при острой плацентарной недостаточности // Актуальные проблемы лабораторной и функциональной диагностики в акушерстве, гинекологии и перинатологии: - Иваново, 2002. - С. 75-78).
Недостатки способа
1. Позволяет выявить только видимые нарушения отделения последа.
2. Субъективная оценка полученных данных.
Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.
Заявляемый технический результат достигается тем, что при иммуногистохимическом исследовании базальной децидуальной оболочки определяют удельную площадь фибронектина и индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами. При значении удельной площади фибронектина равном 20% или менее, а индекса экспрессии (ИЭ) молекул CD68 макрофагами равном 2,90 у.е. или более диагностируют преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты.
Техническим результатом заявляемого способа является расширение арсенала морфологических диагностических средств выявления ПОНРП, позволяющего диагностировать любые по площади отслойки, включая микроотслойку нормально расположенной плаценты, не диагностированную клинически.
Новизна изобретения заключается в том, что для диагностики преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты впервые определяют удельную площадь фибронектина и индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами в структурах последа, а именно в базальной децидуальной оболочке.
Фибронектин - один из ключевых белков межклеточного матрикса, неколлагеновый структурный гликопротеин, синтезируемый и выделяемый в межклеточное пространство. Благодаря своей структуре фибронектин выполняет интегрирующую роль в организации межклеточного вещества и способствует адгезии клеток. Существует несколько форм фибронектина. Растворимый или плазменный фибронектин синтезируется гепатоцитами. Нерастворимый или тканевый фибронектин синтезируется в основном эпителиальными клеткамии и эндотелиоцитами, фибробластами и глиоцитами (Биохимия: учебник для вузов / под ред. Е.С. Северина. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2003. - 779 с.). Уменьшение нерастворимого фибронектина в базальной децидуальной оболочке при ПОНРП можно объяснить предшествующими структурными перестройками в материнской части плаценты, такими как уменьшение толщины пластинки, за счет количественного уменьшения децидуальных и трофобластических клеток, их деструкции и замещения зон некроза фибрином и коллагеновыми волокнами. Ранее фибронектин исследовался в сыворотке крови у недоношенных детей больных сепсисом (Авалиашвили Т.В. Фибронектин сыворотки и показатели НСТ-теста у недоношенных детей первых месяцев жизни при сепсисе // Педиатрия. - 1997. - Т. 76, №3. - С. 8-10). В литературе имеются данные об исследовании плазменного фибронектина при хронических гепатитах и циррозах печени. Показана связь между фибронектином и синдромом эндогенной интоксикации. Установлена обратная корреляционная зависимость между фибронектином в плазме крови и циркулирующими иммунными комплексами антиэндотоксиновых антител, что является отражением его повышенного потребления как опсонина (Левитан Б.Н., Умерова А.Р., Астахин А.В. Плазменный фибронектин как маркер синдрома эндогенной интоксикации при хронических гепатитах и циррозах печени // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - №4. - С. 116-119). Проводилось исследование с оценкой фетального фибронектина (fFN) в плазме крови для прогнозирования преждевременных родов у женщин с симптомами угрозы преждевременных родов (Рибони Ф., Витуло А., Дельаванцо М. и др. Биохимические маркеры прогнозирования преждевременных родов: фосфорилированный протеин - 1, связывающий инсулиноподобный фактор роста и фетальный фибронектин // Репродуктивное здоровье Восточная Европа. - 2013. - №5(29). - С. 30-37). Имеются литературные сведения о диагностической ценности фетального фибронектина в цервикальном содержимом у беременных женщин. Повышение концентрации фибронектина является маркером прогнозирования преждевременных родов (Бапаева Г.Б. Биохимические маркеры преждевременных родов // Журнал акушерства и женских болезней. - 2005. - Т. LIV, №3. - С. 38-41). Исследования Зайнулиной М.С. выявили увеличение содержания в крови фибронектина при преждевременной отслойке нормально расположенной плаценты (Зайнулина М.С. Маркеры дисфункции эндотелия и тромбофилии в диагностике преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты // Журнал акушерства и женских болезней. - 2005. - Т. LIV, №2. - С. 9-16). По результатам исследований Болотских В.М., свидетельствующих о достоверном повышении уровня плазменного фибронектина (ПФН) в крови у пациенток с субинволюцией матки, установлено, что ПФН является маркером послеродовых осложнений (Болотских В.М. Содержание плазменного фибронектина и С-реактивного белка при проведении активно-выжидательной тактики у беременных с преждевременным излитием околоплодных вод // Журнал акушерства и женских болезней. - 2011. - Т. LX, №3. - С. 56-62). При анализе отечественной и зарубежной литературы выявлено, что фибронектин в БДО с целью диагностики ПОНРП ранее не изучался.
+
+
+
+
а
CD68 (кластер дифференцировки 68, макросиалин) - гликопротеин из семейства LAMP. Белок, обнаруженный в моноцитах крови и тканевых макрофагах, присутствующий в лимфоцитах, фибробластах и эндотелиальных клетках, повышает фагоцитарную активность тканевых макрофагов, влияет на внутриклеточный лизосомальный метаболизм, на внеклеточные взаимодействия. Используется как маркер макрофагов и опухолевых клеток макрофагального происхождения (Барсук А.В., Славинский А.А. Особенности экспрессии CD68 в тканевом воспалительном инфильтрате поджелудочной железы при остром панкреатите // Успехи современного естествознания. - 2013. - №2. - С. 106). Имеется работа, в которой представлены результаты исследования топографии и клеточной плотности CD68 клеток макрофагального ряда в ткани аденоидных вегетаций у часто болеющих детей (Саидов М.З., Джамалудинова Ю.А., Даудов Х.Ш., Нажмудинов И.И. Изучение состояния макрофагального звена местного иммунитета у часто болеющих детей с патологией ЛОР-органов // Иммунология. - 2007. - Т. 28, №5. - С. 303-307). Существуют сведения о том, что молекулы CD68 присутствуют в воспалительном инфильтрате первичной опухоли больных раком молочной железы (Перельмутер В.М., Вторушин С.В., Одинцов Ю.Н. и др. Особенности воспалительной инфильтрации в строме инвазивного протокового рака молочной железы при развитии рецидивов // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - №5. - С. 11-16). Для диагностики ПОНРП индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами ранее не использовался. В ряде исследований оценивалась интенсивность воспалительного процесса в эндометрии при хроническом эндометрите (ХЭ). Показано, что число макрофагов (CD68 клетки) в эндометрии в 2 раза превышало аналогичные показатели, полученные у здоровых женщин (Применение Вильпрафена у пациенток с бесплодием и привычным невынашиванием беременности на этапе прегравидарной подготовки // www.medem.ru). В проведенном нами исследовании установлено, что в материнской части плацент с воспалением, осложнившемся ПОНРП, количество CD68 позитивных клеток, как и индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами достоверно увеличиваются (p<0,0001). CD68 клетки использовались нами в качестве маркера воспаления при ПОНРП. CD68 макрофаги в строме базальной децидуальной оболочки локализуются диффузно. Расположение макрофагов чаще встречается вблизи базальной мембраны сосудов и преобладает над проникающими через интерэпителиальные промежутки и мигрующими за пределы сосудов клетками. Миграция макрофагов в зону воспаления, их присутствие в воспалительном инфильтрате при плацентите способствует развитию ПОНРП за счет активации TNF-α, приводящей к некрозу клеток. Отличительные признаки способа: иммуногистохимическим методом определяют удельную площадь базальной пластинки плаценты, приходящуюся на фибронектин-позитивные структуры, которую рассчитывают по формуле  где  - количество точек в сетке, приходящихся на фибронектин-позитивные структуры; А - общее количество точек в сетке (100), определяют индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами и при значении удельной площади базальной пластинки плаценты, приходящейся на фибронектин, равном 20% или менее, а индекса экспрессии молекул CD68 макрофагами равном 2,90 у.е. или более диагностируют отслойку плаценты. Способ осуществляется следующим образом. Послед непосредственно после родов помещают в емкость с физиологическим раствором, в котором он находится не более 10-20 минут. Материал, а именно базальную децидуальную оболочку, для иммуногистохимического исследования забирают из зоны границы отслойки в виде кусочков 10×10×3 мм и фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 12-24 часов (Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань: Титул, 2004. - 456 с.). Иммуногистохимическую реакцию осуществляют на парафиновых срезах. Последовательно осуществляют депарафинацию в ксилоле и дегидратацию в спиртах парафиновых срезов, расположенных на предметных стеклах, обработанных поли-b-лизином фирмы Thermo Scientific "Polisine Slides", и помещают в 0,02 М PBS буфер. Демаскировку антигена осуществляют путем двукратного кипячения в цитратном буфере (рН 6,0) в СВЧ-печи при мощности 650 Вт в течение 10-15 минут, охлаждают, промывают в PBS буфере и осуществляют реакцию. Эндогенную пероксидазу блокируют 1% раствором перекиси водорода и помещают в PBS буфер. Затем инкубируют с первичными антителами в рабочем разведении 30 минут во влажной камере при комнатной температуре и промывают в трех сменах PBS буфера. Для разведения первичных антител используют раствор Dako Antibody Diluent with Background Reducing Components (код S3022). Визуализацию комплексов антиген-антитело осуществляют стрептавидин-биотиновым пероксидазным методом при помощи системы детекции LSAB2 System, HRP («Dako RELL™ EnVision™», Германия, код K5007). Инкубируют срезы с биотинилированными вторичными антителами во влажной камере и промывают в трех сменах фосфатно-солевого буфера. Инкубацию со стрептавидин-пероксидазным комплексом завершают окрашиванием DAB-хромогеном с докрашиванием гематоксилином Майера. На последних этапах после дегидратации помещают срезы под покровное стекло. Контроль неспецифического окрашивания осуществляют замещением первичных антител 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина, а также исключением вторичных антител.
Для проведения иммуногистохимического исследования в качестве первичных антител используют моноклональные мышиные антитела к человеческому CD68 (клон PG - M1, Dako, рабочее разведение 1:50, Германия), поликлональные кроличьи антитела к человеческому фибронектину (Daco Cytomation, рабочее разведение 1: 400). С целью исключения вероятности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов каждое иммуногистохимическое исследование проводят с постановкой положительного и отрицательного контроля. Отрицательный контроль исключал неспецифическое окрашивание препаратов. На контрольный срез наносят разбавитель антител не содержащий первичных антител. Положительный контроль подтверждал специфичность поставленной иммуногистохимической реакции с данными антителами.
Экспрессию маркеров в препаратах изучают с помощью микроскопа "Micros MS-300 (ХР)" (Австрия), оценивают полуколичественным способом в баллах/плюсах: 0 (-) - отрицательный результат, 1 (+) - слабое или минимальное окрашивание, 2 (++) - умеренное окрашивание структур, содержащих маркер, 3 (+++) - выраженное или максимальное окрашивание структур. Индивидуальные оценки по каждому микропрепарату суммируют для последующего расчета индекса экспрессии.
Результаты иммуногистохимической реакции оценивают в 10 полях зрения микроскопа при увеличении × 400, в ста клетках в препарате (Tavassoli F.A. Pathology of the Breast. - 2-nd et. - New York, 1999.) Индекс экспрессии изучаемых факторов подсчитывают по формуле
где ИЭ - индекс экспрессии;
i - показатель интенсивности окрашивания, полученный путем сложения показателей интенсивности всех окрашенных структур в баллах (от 0 до 3-х);
P(i) - процент структур, окрашенных с разной интенсивностью (процент позитивных клеток).
Результат читается в условных единицах (у.е.).
Удельную площадь фибронектина в базальной пластинке плаценты рассчитывают в 5 полях зрения при четырехсоткратном увеличении путем наложения на изображение стоточечной сетки. Удельную площадь рассчитывают по формуле
, где а - количество точек в сетке, приходящихся на фибронектин-позитивные структуры; А - общее количество точек в сетке (100). Результат читается в процентах (Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Автандилов Г.Г. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.).
Иммуногистохимическое исследование структур плацентарной ткани проводили в группе сравнения и основной одновременно и в идентичных условиях.
При значении ИЭ молекул CD68 макрофагами равном 2,90 у.е. или более, а удельной площади фибронектина равном 20% или менее диагностируют преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.
Пример 1. Беременная Л., 34 года. Клинический диагноз: 1 преждевременные роды в 34 недели в головном предлежании. Хроническая внутриутробная гипоксия плода. Фетоплацентарная недостаточность. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Миома матки. Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты. Дородовое кровотечение 100 мл. Кесарево сечение в нижнем сегменте матки.
Заключение по плаценте: плацента III триместра беременности (34 недели). Гипоплазия плаценты III степени, аномалия формы - дополнительная долька. Очаговая гипоплазия вартонова студня в зоне прикрепления канатика. Плацента окруженная ободком. Гипоплазия, склероз и гиповаскуляризация терминальных ворсин. Микоплазменный базальный очаговый децидуит, продуктивный виллузит, амниохорионит, эндомезоваскулит сосудов стволовых и промежуточных ворсин. Нарушение маточно-плацентарного кровообращения в виде гематомы в зоне отслойки, очаговая апоплексия. Многочисленные петрификаты в базальной децидуальной оболочке, строме прилежащих к базальной пластинке ворсин. Интервиллезный стаз в центральных отделах. Вариант диссоциированного нарушения развития хориона. Признаки дисплазии соединительной ткани в сосудах. Адаптивные и компенсаторные процессы - очаговая гиперплазия терминальных ворсин, пролиферация цитотрофобласта. Очаговая отслойка плаценты (острая плацентарная недостаточность) на фоне хронической субкомпенсированной плацентарной недостаточности.
При иммуногистохимическом исследовании плаценты удельная площадь фибронектина в базальной децидуальной оболочке 19%, а индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами равен 3,30 у.е. Диагностирована преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, т.е. клинический диагноз подтвержден морфологически.
Пример 2. Беременная С., 32 года. Клинический диагноз: 5 преждевременные роды в головном предлежании плода при беременности 35 недель. Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Рубец на матке после 3 операций кесарево сечение. Анемия I ст. Нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу. Поперечное надлобковое чревосечение, кесарево сечение в нижнем сегменте матки. Иссечение и прошивание спаек.
Заключение по плаценте: плацента III триместра беременности (34-35 недели). Гипоплазия вартонова студня, перекруты пуповины. Плацента, окруженная ободком. Диффузный лимфоцитарный амниохорионит внеплацентарных оболочек, лейко-лимфоцитарный базальный децидуит, плацентарный амниохорионит в сочетании с иммунным воспалением. Нарушение созревания в хорионе по типу промежуточных незрелых ворсин. Нарушения маточного кровообращения в виде острого геморрагического инфаркта с тромбозом в зоне очаговой прогрессирующей отслойки. Адаптивные и компенсаторные процессы - синцитиальные почки и гиперплазия терминальных ворсин. Острая плацентарная недостаточность на фоне хронической субкомпенсированной плацентарной недостаточности с декомпенсацией.
При иммуногистохимическом исследовании плаценты удельная площадь фибронектина в базальной децидуальной оболочке 16%, а индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами составил 2,90 у.е. Диагностирована преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, т.е. клинический диагноз подтвержден морфологически.
Пример 3.
Беременная Б., 26 лет. Клинический диагноз: 3 преждевременные роды в 27 недель. Преэклампсия тяжелой степени. Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, дородовое кровотечение. Хроническая внутриутробная гипоксия плода. Анемия II степени. Хронический пиелонефрит в стадии ремиссии. Антенатальная гибель плода. Кесарево сечение в нижнем сегменте матки.
Заключение по плаценте: плацента III триместра беременности (27 недель) с признаками вирусного воспаления в виде лимфоцитарного хориоамнионита, интервиллузита, базального децидуита и нарушениями кровообращения в виде нодулярной ишемии, крупноочаговой апоплексии, крупноочаговой отслойки, петрификатами в зоне отслойки, хронического геморрагического инфаркта, псевдоинфарктов. Гипоплазия плаценты II степени. Адаптивные и компенсаторные процессы - формирование синцитиальных почек. Острая плацентарная недостаточность на фоне субкомпенсированной хронической.
При иммуногистохимическом исследовании плаценты удельная площадь фибронектина в базальной децидуальной оболочке 14%, а индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами составил 3,42 у.е. Диагностирована преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, т.е. клинический диагноз подтвержден морфологически.
Пример 4.
Беременная Т., 32 лет. Клинический диагноз: 2 преждевременные роды при беременности 36-37 недель в головном предлежании плода. Рубец на матке после операции кесарево сечение.
Клинически и при визуальном осмотре отслойка плаценты не выявлена.
При иммуногистохимическом исследовании плаценты удельная площадь фибронектина в базальной децидуальной оболочке 20%, а индекс экспрессии молекул CD68 макрофагами составил 3,15 у.е. Диагностирована микроотслойка плаценты.
При более детальном гистологическом исследовании последа, после дополнительной вырезки материала, была выявлена микроотслойка плаценты.
Заключение по плаценте: плацента III триместра беременности (36-37 недель). Вирусный базальный и париетальный децидуит. Поствоспалительный склероз ряда промежуточных и терминальных ворсин. Формирование псевдоинфарктов. Очаговая микроотслойка. Адаптивные и компенсаторные процессы - очаговое полнокровие терминальных ворсин, гиперплазия синцитиальных почек. Острая плацентарная недостаточность на фоне субкомпенсированной хронической недостаточности.
Таким образом, клинический и патологоанатомический диагнозы дополнены и уточнены после иммуногистохимического исследования.
Преимущества способа
1. Является объективным и достоверным методом морфологической диагностики преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, вызванной воспалением.
2. В диагностике используются специфические иммуногистохимические маркеры воспаления, которые способствуют точному определению причины преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты.
3. Повышает качество гистологического заключения, позволяет диагностировать в том числе микроотслойку нормально расположенной плаценты даже если данная патология не диагностирована клинически.
4. Заявленный способ высокоинформативен и прост в оценке результатов.
5. Использование предлагаемого способа позволит врачам (патологоанатомам и акушерам-гинекологам) использовать необходимую информацию для разработки и совершенствования подходов к оформлению гистологического заключения по плаценте, оказания помощи женщинам в послеродовом периоде и при дальнейшем планировании беременности у пациенток, имеющих в анамнезе преждевременную отслойку нормально расположенной плаценты.