СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОСАХАРИВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ
METHOD FOR ENZYMATIC SACCHARIFICATION OF LIGNOCELLULOSE MATERIALS

Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получать из лигноцеллюлозных материалов растворимые углеводы в мономерной форме, которые могут быть использованы для дальнейшей переработки в биоэтанол, биобутанол и другие продукты микробиологического синтеза.
Клеточная стенка лигноцеллюлозных материалов состоит из трех основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Целлюлоза, гемицеллюлоза являются наиболее важными источниками сахаров.
Целлюлоза - главная составляющая клеточных стенок высших растений. Вместе с сопровождающими ее веществами она играет роль каркаса, несущего основную механическую нагрузку. По химической природе целлюлоза - линейный полисахарид, построенный из элементарных звеньев ангидро-D-глюкозы. Степень полимеризации природной целлюлозы может составлять более 10 тысяч мономерных единиц. Целлюлоза имеет сложную надмолекулярную структуру, возникающую в результате упорядочения молекул. Такая специфичная организация морфологической структуры целлюлозы обеспечивает ее устойчивость при воздействии значительных механических нагрузок. Целлюлоза также весьма устойчива к действию кислот, ферментов и микроорганизмов. Природная целлюлоза представляет собой композиционный материал с кристаллической матрицей и аморфными наполнителями, гемицеллюлозой и лигнином.
Сложность процесса конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол заключается в том, чтобы превратить устойчивую целлюлозу в глюкозу. Последняя, как известно. легко усваиваются микроорганизмами, в частности сбраживается дрожжами в этанол.
Гемицеллюлозы - полисахариды, входящие в состав клеточной стенки растительной ткани наряду с целлюлозой и лигнином, представляют собой разветвленные полимеры различного строения, основными мономерными единицами гемицеллюлоз являются галактоза, глюкоза, манноза, ксилоза, арабиноза, уроновые кислоты.
Гемицеллюлозы отличаются от целлюлозы лучшей растворимостью в щелочных растворах и способностью легче гидролизоваться слабыми растворами кислот. Степень полимеризации у гемицеллюлоз, как правило, ниже. чем у целлюлозы. Моносахаридные остатки обычно соединены β-1,4-связями, причем часто имеются боковые связи другого типа. Главным компонентом гемицеллюлоз является ксилоза (50-70% мономерных звеньев), основной класс гемицеллюлоз - ксиланы.
Лигнины - аморфный поперечно сшитый фенольный полимер, который может составлять 30% от массы растительного сырья. Лигнины не перерабатываются микроорганизмами, способными к образованию этанола, и не используются в производстве этанола.
Клеточные стенки растений состоят из целлюлозных волокон, покрытых слоем гемицеллюлоз. Эти слои погружены в матрицу лигнина. Диаметр целлюлозных макроволокон около 1-4 мкм. Природный композит с подобной структурой обладает высокой механической прочностью и химической инертностью.
Очевидным следствием, вытекающим из строения клеточных стенок, является то, что для успешного осахаривания лигноцеллюлозного сырья в низкомолекулярные углеводы необходимо для начала уменьшить размер частиц лигноцеллюлозных материалов до клеточного уровня, расслоить клеточные стенки, аморфизовать кристаллические участки целлюлозы разупорядочить надмолекулярную структуру углеводных полимеров клеточных стенок, а лишь затем гидролизовать полимерные углеводные цепочки до мономолекулярных углеводов.
Химические превращения, позволяющие разупорядочить надмолекулярную структуру клеточных стенок и увеличить реакционную способность биомассы, как правило, осуществляются при воздействии крепких кислот или щелочей, окислительной или высокотемпературной делигнификации, при обработке сверхкритическими жидкостями или органическими экстрагентами, ультразвуковой обработке, тонком механическом размоле, экструдировании. Совмещение данных видов предобработки лигноцеллюлозного сырья с последующей стадией ферментативного гидролиза позволяет успешно гидролизовать полимерные углеводы до моносахаридов.
Так, в патенте US 7,709,042 лигноцеллюлозные материалы (солому злаковых культур, траву) предварительно замачивали в жидкости и обрабатывали на специально сконструированных V-образных валках для удаления водоэкстрагируемых веществ и разволокнения структуры стеблей сырья. Затем разволокненный материал измельчали до частиц размерами 30-400 мм и гидролизовали кислотой при повышенной температуре.
Недостатком такого метода является то, что предложенная авторами обработка на V-образных валках может лишь незначительно изменить (разволокнить) структуру стеблей. Супрамолекулярная структура клеточных стенок при этом остается прежней и реакционная способность полимерных углеводов практически не увеличивается. Также к недостаткам можно отнести то, что в процессе отжимки и вальцевания образуется большое количество водных стоков, содержащих среди неиспользуемых в дальнейшем водорастворимых веществ некоторое количество углеводов, пригодных для гидролиза. Гидролиз кислотой при повышенной температуре также не является экологически чистым и энергоэффективным по сравнению с современными методами ферментативного осахаривания.
В патенте CN 1015144348 (А) авторы предлагают осуществлять предварительную обработку соломы перегретым паром и сжатым воздухом. Недостатком подобной технологии является высокое потребление энергии для получения перегретого пара и сжатого воздуха. Кроме того, создание дешевых и эффективных крупномасштабных проточных установок, работающих по такому принципу, на настоящий день затруднено по техническим причинам.
В патенте US 5,498,766 для ускорения гидролиза используется обработка суспензии лигноцеллюлозной биомассы в режиме микрокавитации. Суспензия подается в устройство, состоящее из ротора и статора. При вращении ротора происходят множественные разрывы сплошности в жидкости и образуются так называемые кавитационные пузырьки. При схлопывании кавитационных пузырьков наблюдается локальное повышение давления и температуры, образующих турбулентные потоки. Сдвиговые напряжения, возникающие в сырье при попадании в турбулентные потоки разволокняют структуру стеблей лигноцеллюлозных материалов и частично разупорядочивают структуру клеточных стенок.
К отрицательным свойствам данного метода можно отнести то, что большая часть энергии расходуется на перемешивание суспензии ротором и лишь незначительная доля идет на образование кавитационных пузырьков. Следовательно, для эффективного протекания последующего гидролиза полимерных углеводов необходимо длительное время обрабатывать суспензии в циклическом режиме до достижения приемлемого степени разупорядочения клеточных стенок.
Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является процесс осахаривания концентрированной биомассы описанный в патенте US №7,807,419 В2 (от 5 октября 2010).
В техническом решении по прототипу проводят предобработку лигноцеллюлозной биомассы, приводящую к ее измельчению. Предобработка проводится или путем химической обработки кислотами, щелочами, окислительными реагентами, или экстракцией органическими растворителями, или различными видами механической обработки (дробление, размол, разрезание), или обработкой ультразвуком, или микроволновым излучением. После предобработки биомассу обрабатывают ферментами, проявляющими гидролизующую активность по отношению к целлюлозе, гемицеллюлозе, крахмалу, при необходимости добавляют пептидазы, липазы, лигниназы и ферулоил эстеразы. Гидролиз проводят при pH 4-10, температуре 20-80°C, содержании твердой фазы в реакционном объеме 24-38 масс.%, и времени проведения гидролиза до 7 дней. В ходе протекания гидролиза периодически вносят в реакционную смесь дополнительные порции лигноцеллюлозного сырья, необработанного или предобработанного, и проводят операции дополнительного уменьшения размера частиц биомассы с помощью механических аппаратов или воздействия ультразвуком.
Недостатком известного технического решения является неполная степень механической активации углеводных полимеров лигноцеллюлозного сырья, позволяющая разупорядочить структуру лигноцеллюлозного сырья только на уровне волокон, и использование для предобработки агрессивных, экологически и взрывопожароопасных химических реагентов и органических растворителей. Это приводит к тому, что лигноцеллюлозное сырье гидролизуется с пониженными скоростями и недостаточно полно, приходится дополнительно проводить операции по уменьшению размеров частиц, использовать более высокие температуры и времена протекания процессов. Перечисленные недостатки отрицательно влияют на экономическую эффективность технического решения по прототипу.
Задачей данного изобретения является создание простого и экономически эффективного способа осахаривания лигноцеллюлозных материалов, позволяющего за меньшее время, при более низких температурах и при более полном использовании углеводов, входящих в состав лигноцеллюлозных материалов, получать раствор растворимых углеводов без использования агрессивных и экологически- и взрывопожароопасных реагентов.
2
Поставленная задача решается благодаря заявляемому способу ферментативного осахаривания лигноцеллюлозных материалов, включающему предобработку лигноцеллюлозного сырья, добавление ферментных препаратов с гидролизующей активностью по отношению к целлюлозе, гемицеллюлозе, крахмалу, белкам, последующий ферментативный гидролиз с получением раствора углеводов, отличающемуся тем, что лигноцеллюлозное сырье с содержанием лигнина 3-35%, после стадии предобработки дополнительно обрабатывают в мехактиваторах планетарного, роликового, вибрационного или виброцентробежного типа, обеспечивающих ускорение мелющих тел 50-450 м/с и время пребывания в зоне обработки 0,4-15 мин, кроме того, дополнительно на стадии ферментативного гидролиза, протекающего при температуре 50-65°C, концентрации ферментных препаратов 0,5-10 масс.%, концентрации твердой фазы 10-40 масс.% в течение 1-6 суток, каждые 0,5-5 часов проводят операцию удаления гелеобразного олигосахаридного слоя с реагирующих лигноцеллюлозных частиц.
Предпочтительно первичную предобработку лигноцеллюлозного сырья проводят при помощи ножевых мельниц, дезинтеграторов или дисмембраторов до размера частиц 0,5-3 мм.
Предпочтительно ферментативный гидролиз проводят с использованием ферментных препаратов «Целлолюкс-А», «Амилолюкс-А», «Глюколюкс-А» и «Протосубтилин г3х» или их смесей.
Предпочтительно удаление гелеобразного олигосахаридного слоя с реагирующих лигноцеллюлозных частиц проводят при помощи аппаратов, способных создавать в рабочем объеме неравномерности гидродинамических потоков обрабатываемой суспензии и тем самым очищать и регенерировать поверхность частиц суспензии.
При механической предобработке лигноцеллюлозных материалов в указанных условиях происходит постепенное механическое разрушение тканей и клеток, активация лигноцеллюлозы с образованием реакционноспособного полупродукта. Так, в результате первичной предобработки происходит разрушение биомассы на частицы размером 0,5-3 мм, пригодные для дальнейшей механической активации в специально подобранных аппаратах. Дополнительно проводимая, по сравнению с прототипом, стадия механической активации в аппаратах планетарного, роликового, вибрационного или виброцентробежного типа позволяет измельчать лигноцеллюлозные материалы до размеров отдельных клеток и клеточных стенок, аморфизовать кристаллические участки целлюлозы, расслаивать клеточные стенки и разупорядочивать надмолекулярную структуру полимеров. Перечисленные процессы приводят к повышению проницаемости частиц сырья по отношению к ферментам и повышению их реакционной способности при последующем ферментативном гидролизе.
Ферментативный гидролиз активированной лигноцеллюлозной биомассы проводят с применением ферментных препаратов «Целлолюкс-А», «Амилолюкс-А», «Глюколюкс-А» и «Протосубтилин г3х» или их смесей с гидролизующей активностью по отношению к целлюлозе, гемицеллюлозе, крахмалу, белкам при pH 4-6, контролируемом стандартным буферным раствором, состоящим из 3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды. Ферментные препараты добавляют к лигноцеллюлозной биомассе в количестве 0,5-10 масс.% Концентрация твердой фазы при ферментативном гидролизе составляет 10-40 масс.% Температура 50-65°С, продолжительность гидролиза 1-6 суток. Гидролиз прекращают при достижении 95% (от теоретически возможного) выхода водорастворимых углеводов. Использование смесей различных ферментных препаратов позволяет комплексно воздействовать на структурные компоненты лигноцеллюлозного сырья. При этом суммарный эффект от смешения нескольких ферментных препаратов не является суммой эффектов от каждого ферментного препарата, а наблюдается неочевидный синергетический эффект, позволяющий незначительной добавкой какого-либо компонента смеси значительно и непропорционально введенной дозе повышать скорость гидролиза.
В ходе ферментативного гидролиза на поверхности частиц лигноцеллюлозной биомассы образуется гелеобразный слой промежуточных продуктов реакции - олигосахаридов. Данный слой препятствует эффективному массообмену поверхности частиц с окружающим раствором, что выражается в замедлении диффузии ферментов из раствора к поверхности и обратно, а также в накоплении продуктов реакции в приповерхностном слое и ингибировании дальнейшего протекания гидролиза. Для удаления образующегося гелеобразного слоя с поверхности частиц предлагается использовать аппараты, способные создавать в рабочем объеме неравномерности гидродинамических потоков обрабатываемой суспензии и тем самым очищать и регенерировать поверхность частиц суспензии. При прохождении сквозь подобные аппараты, в объеме суспензии создаются вихревые потоки, удаляющие (смывающие) с поверхности лигноцеллюлозных частиц гелеобразный слой и обновляющие поверхность частиц для сорбции новой порции ферментов. Преимущества данной обработки по сравнению со стадией уменьшения размеров частиц по прототипу является большая экономическая эффективность. Обработка суспензии в аппаратах с подобным принципом действия не меняет размер частиц и лишь удаляет слой промежуточных продуктов, что требует меньших затрат энергии, чем измельчение частиц в жидкой фазе по прототипу.
Проведенный патентный поиск не выявил аналогичных способов ферментативного осахаривания лигноцеллюлозных материалов, поэтому сделан вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Совокупность существенных признаков заявляемого способа в исследованных публикациях также не выявлена, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа осахаривания лигноцеллюлозных материалов критерию «изобретательский уровень».
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1
2
Высушенные до влажности 10 масс.% лигноцеллюлозные материалы с содержанием лигнина 3-10% измельчают в ножевой мельнице марки «Retsch SM2000» или аналогичной до достижения частицами размеров 1,5-3 мм. Затем измельченную биомассу активируют в проточном активаторе роликового, вибрационного или виброцентробежного типа, обеспечивающем ускорение мелющих тел 50 м/с и время пребывания в зоне обработки 0,4 мин.
Механически активированную биомассу смешивают с 0,5 масс.% ферментативного препарата «Целлолюкс-А» (производство ПО «СИББИОФАРМ», г.Бердск) с гидролизующей активностью по отношению к целлюлозе (2000 ед./г), гемицеллюлозе (8000 ед./г). крахмалу (до 20 ед./г). К смеси добавляют буферный раствор (3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды) с рН 4-6 до концентрации твердой фазы 10 масс.% и проводят ферментативный гидролиз в течение 6 суток при температуре 50°С. Каждые 5 часов проводят операцию удаления гелеобразного слоя с поверхности частиц.
Для лигноцеллюлозных материалов с содержанием лигнина 3-10% оптимальным аппаратом предварительного измельчения являются ножевые мельницы.
2
Во время последующей механической активации при ускорении мелющих тел менее 50 м/с не обеспечивается достаточная разупорядоченность супрамолекулярной структуры клеточных стенок лигноцеллюлозной биомассы, что снижает эффективность последующего ферментативного гидролиза. Применение обработки менее 0,4 минут не обеспечивает необходимой степени разрушения клеток растений и накопления механической энергии. Понижение температуры ферментативного гидролиза ниже 50°С отрицательно сказывается на скорости протекания гидролиза, а проведение процесса менее чем за 6 суток не обеспечивает оптимальной степени превращения. Понижение концентрации твердой фазы менее 10 масс.% не целесообразно из экономических соображений, так как связано с дальнейшей необходимостью удаления лишнего объема воды. Проведение стадий удаления гелеобразного слоя с поверхности частиц реже, чем через каждые 5 часов экономически неэффективно, так как приводит к значительному замедлению процесса гидролиза.
Пример 2
2
Высушенные до влажности 10 масс.% лигноцеллюлозные материалы с содержанием лигнина 10-20% измельчают в дисмембраторе марки «ДС-400» или аналогичном до достижения частицами размеров 1-2 мм. Затем измельченную биомассу активируют в проточном активаторе роликового, вибрационного или виброцентробежного типа. обеспечивающем ускорение мелющих тел 400 м/с и время пребывания в зоне обработки 10 минут.
Механически активированную биомассу смешивают с 5 масс.% ферментативного препарата «Целлолюкс-А» (производство ПО «СИББИОФАРМ», г.Бердск) с гидролизующей активностью по отношению к целлюлозе (2000 ед./г), гемицеллюлозе (8000 ед./г), крахмалу (до 20 ед./г). К смеси добавляют буферный раствор (3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды) с рН 4-6 до концентрации твердой фазы 20 масс.% и проводят ферментативный гидролиз в течение 3 суток при температуре 55°С. Каждые 3 часа проводят операцию удаления гелеобразного слоя с поверхности частиц.
2
Для лигноцеллюлозных материалов с содержанием лигнина 10-20% оптимальным аппаратом предварительного измельчения является дисмембратор. При последующей механической активации ускорение мелющих тел 400 м/с и время обработки 10 минут достаточно для разупорядочения структуры клеточных стенок лигноцеллюлозных материалов с содержанием лигнина 10-20%. Повышение температуры ферментативного гидролиза до 55°С, количества фермента до 5%, периодичности удаления гелеобразного слоя до одного раза в каждые 3 часа позволяет более эффективно проводить ферментативный гидролиз и снизить время его протекания до 3 суток. Повышение концентрации твердой фазы до 20% позволяет гидролизовать за один акт большее количество лигноцеллюлозного материала.
Пример 3
2
Высушенные до влажности 10 масс.% лигноцеллюлозные материалы с содержанием лигнина 20-35% измельчают в дезинтеграторе «DESI-16» до достижения частицами размеров 0,5-1 мм. Затем измельченную биомассу активируют в проточном активаторе роликового, вибрационного или виброцентробежного типа, обеспечивающем ускорение мелющих тел 450 м/с и время пребывания в зоне обработки 15 минут.
Механически активированную биомассу смешивают с 10 масс.% суммы ферментативных препаратов «Целлолюкс-А», «Амилолюкс-А», «Глюколюкс-А» и «Протосубтилин г3ч» (производство ПО «СИББИОФАРМ», г.Бердск) с суммарной гидролизующей активностью по отношению к целлюлозе (600 ед./г). гемицеллюлозе (2700 ед./г), крахмалу (до 530 ед./г) и белкам (2770 ед./г). К смеси добавляют буферный раствор (3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды) с рН 4-6 до концентрации твердой фазы 40 масс.% и проводят ферментативный гидролиз в течение 1 суток при температуре 65°С. Каждые 0,5 часа проводят операцию удаления гелеобразного слоя с поверхности частиц.
2
Для сильнолигнифицированных материалов с содержанием лигнина 20-35% оптимальным аппаратом предварительного измельчения является дезинтегратор. При последующей механической активации необходимо, ввиду большей механической прочности сырья, обусловленной высоким содержанием лигнина, увеличить ускорение мелющих тел до 450 м/с и время обработки до 15 минут. При ферментативном гидролизе высоколигнифицированного сырья целесообразно использовать смеси нескольких ферментных комплексов в количестве 10 масс.%, температуру ферментативного гидролиза 65°С. Проведение удаления гелеобразного слоя чаще, чем раз в 30 минут нецелесообразно ввиду того, что  при малых временах между каждой операцией регенераций поверхности молекулы ферментов не успевают сорбироваться на частицах и наработать новый гелеобразный слой промежуточных олигосахаридов. Повышение концентрации твердой фазы свыше 40% неэффективно из-за большой вязкости суспензии и невозможности эффективного перемешивания.
Пример 4
Осуществляется в условиях примера 1-3. В качестве механического активатора используют планетарную мельницу АГО-2, позволяющую получать в лабораторных условиях небольшие партии продукта для научных исследований и отработки технологических стадий.
Технический результат
Изобретение позволяет более полно использовать углеводы, входящие в состав лигнинсодержащих материалов более экологичным и экономически эффективным способом.
По сравнению с прототипом заявляемое техническое решение позволяет проще и с большими выходами проводить ферментативное осахаривание лигноцеллюлозных материалов. Применение в заявленном способе дополнительной механической активации лигноцеллюлозных материалов в мехактиваторах планетарного, роликового, вибрационного или виброцентробежного типа позволяет разрушить растительные клетки, а также расслоить клеточные стенки, аморфизовать кристаллические участки целлюлозы, разупорядочить надмолекулярную структуру полимеров клеточных стенок. Это приводит к увеличению проницаемости клеточных стенок для ферментов, возрастанию скорости гидролиза, позволяет сократить продолжительность ферментативного гидролиза, энергетические затраты. Проведение операции удаления гелеобразного олигосахаридного слоя с реагирующих лигноцеллюлозных частиц позволяет поддерживать скорость процесса гидролиза на первоначальном уровне. На фиг.1 показано влияние удаления гелеобразного слоя на ход кинетической кривой процесса гидролиза. Отчетливо видно возобновление процесса гидролиза с прежней скоростью после проведения удаления гелеобразного слоя.
Перечисленные выше достоинства заявленного способа делают его более экономически эффективным, чем способ по прототипу.