Терапевтическое действие иммуномодулирующего пептида TEKKRRETVEREKE в экспериментальной модели индуцированного язвенного колита у мышей

© Коллектив авторов, 2019

Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И.

Терапевтическое действие иммуномодулирующего пептида TEKKRRETVEREKE в экспериментальной модели индуцированного язвенного колита у мышей

ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, Москва, Россия

В модели экспериментального язвенного колита, индуцированного сульфатом декстрана (DSS-колит) у лабораторных мышей, исследовали лечебное действие синтетического тетрадекапептида TEKKRRETVEREKE (действующее вещество иммуномодулирующего препарата гепон). Было показано, что экспериментальная терапия тетрадекапептидом достоверно снижает клинические проявления болезни: потерю веса, индекс активности болезни и патоморфологические проявления в толстом кишечнике. При анализе клеточного состава воспалительного инфильтрата толстой кишки методом проточной цитометрии установлено, что экспериментальная терапия тетрадекапептидом уменьшает количество нейтрофилов и моноцитов в ткани кишки. При этом содержание регуляторных Т-клеток в ткани кишки возрастает. Количественная оценка интенсивности транскрипции мРНК генов, связанных с воспалением, в ткани толстого кишечника при индуцированном экспериментальном колите у мышей показала, что экспериментальная терапия тетрадекапептидом снижает активность генов провоспалительных цитокинов il-6, il-ip, tnf-a, но не влияет на транскрипцию гена противовоспалительного цитокина tgf-fil. Полученные данные свидетельствуют, что иммуномодулирующий те-традекапептид TEKKRRETVEREKE оказывает выраженный лечебный эффект при индуцированных язвенно-деструктивных поражениях кишечника у лабораторных мышей.

Ключевые слова: воспалительные заболевания кишечника; неспецифический язвенный колит; проточная ци-тофлюориметрия; цитокины; иммуномодулирующий тетрадекапептид

Статья поступила 11.03.2018. Принята в печать 16.05.2018.

Для цитирования: Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Терапевтическое действие иммуномодулирующего пептида TEKKRRETVEREKE в экспериментальной модели индуцированного язвенного колита у мышей. Иммунология. 2019; 40 (1): 15-26. doi: 10.24411/0206-4952-2019-11002.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullaukhanov R.I.

Therapeutic effect of the immunomodulating peptide TEKKRRETVEREKE in the experimental model of induced ulcerative colitis in mice

NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, 115522, Moscow, Russia

In the model of experimental ulcerative colitis induced by dextran sulfate (DSS-colitis) in laboratory mice, the therapeutic effect of the synthetic tetradecapeptide TEKKRRETVEREKE (the active substance of the immunomodulating drug Gepon) was studied. It has been shown that tetradecapeptide therapy significantly reduces the clinical manifestations of the disease: weight loss, disease activity index and pathological manifestations in the large intestine. The cellular composition of the inflammatory colon infiltrate by flow cytometry analyzing has been established that experimental tetradecapeptide therapy reduces the number of neutrophils and monocytes in the intestinal tissue. In this case, the number of regulatory T-cells in the intestinal tissue increases. Quantification of the mRNA of genes associated with inflammation in colon tissue of the mice with induced experimental colitis showed that tetradecapeptide therapy reduces the activity of the genes of proinflammatory cytokines il-6, il-ip, tnf-a, but does not affect the transcription of the anti-inflammatory cytokine tgf-fil. The obtained data indicate that the immunomodulating tetradecapeptide TEKKRRETVEREKE has a pronounced therapeutic effect in induced ulcerative-destructive bowel lesions in laboratory mice.

Keywords: IBD; DSS-colitis; intestinal inflammation; Flow cytometry; cytokines; Gepon

Received 11.03.2018. Accepted 16.05.2018.

For citation: Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullaukhanov R.I. Therapeutic effect of the immunomodulating peptide TEKKRRETVEREKE in the experimental model of induced ulcerative colitis in mice. Immunologiya. 2019; 40

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Для корреспонденции

Атауллаханов Равшан Иноятович -доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail:

ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409

For correspondence

Ataullakhanov Ravshan I. - MD, PhD, Professor, Head of the Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Moscow, Russia E-mail:

ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409

Болезнь Крона и неспецифический язвенный колит являются основными широко распространенными воспалительными заболеваниями кишечника (IBD -Inflammatory bowel disease), характеризуются хроническим воспалением желудочно-кишечного тракта с чередующимися периодами рецидивов и ремиссий, требуют длительного фармакологического и/или хирургического лечения [1]. Изъязвление слизистой оболочки кишечника, обусловленное чрезмерно интенсивным хроническим воспалением, является основной особенностью IBD [2], схожие поражения наблюдаются при радиационных поражениях кишечника, возникающих при терапии опухолей, а также при хроническом ишемическом энтерите [3].

Разработка новых вариантов лечения с известным механизмом действия и высокой эффективностью является актуальной задачей.

В отечественной клинической практике при лечении язвенного колита успешно применяется иммуно-модулятор гепон. При лечении гепоном дистальных форм неспецифического язвенного колита, устойчивого к стандартному лечению противовоспалительными препаратами, наблюдалось существенное улучшение клинической картины у 70% больных [4]. Успешное применение данного препарата отмечено при лечении язв слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и толстого кишечника [4, 5]. Однако, несмотря на успешное применение препарата гепон в клинической практике для лечения деструктивных и эрозивно-язвенных воспалительных заболеваний, механизмы заживляющего действия препарата оставались неизвестными.

Модель экспериментального колита у мышей C57BL/6, индуцированного натриевой солью сульфата декстрана (DSS), является популярной и адекватной моделью для поиска и тестирования новых методов лечения IBD [6]. DSS-индуцированный колит вызывает клинические изменения, характерные для воспалительных заболеваний кишечника: потеря веса, диарея, повреждение слизистой с образованием язв. Макро- и микроскопические изменения включают укорочение толстого отдела кишечника, инфильтрацию нейтрофилами, разрушение кишечных крипт, гиперплазию бокаловидных клеток, фиброз и изъязвление [6-8]. Патогенез DSS-индуцированного колита рассматривается как следствие разрушения эпителиального барьера, снижение пролиферации эпителиальных клеток и повышение проницаемости эпителиального барьера, вызванных нарушениями плотных контактов между эпителиальными клетками [9, 10]. Это приводит к проникновению антигенов содержимого кишечника в ткань и развитию мощного локального воспаления при участии резидентных иммунных клеток, таких как макрофаги [11, 12]. Это в свою очередь способствует миграции лейкоцитов в очаг поражения, опосредованной медиаторами воспаления [13].

Клетки врожденного иммунитета: нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги и дендритные клетки, - являются первой линией иммунной защиты -

они обеспечивают иммунные реакции на повреждение и/или проникновение патогенов [14].

Ранними участниками воспалительной реакции в ткани кишки являются нейтрофилы, а инфильтрация слизистой оболочки кишки полиморфно-ядерными лейкоцитами - это одна из характерных особенностей IBD [15], она связана с активным воспалением. Нейтро-филы определяют патогенез IBD с помощью различных механизмов: активное разрушение эпителиального слоя и прилежащих тканей путем окислительного и про-теолитического повреждения [16] и поддержание воспаления через синтез провоспалительных медиаторов, таких как цитокины TNF-a, ИЛ-1а, ИЛ-12, MIF, ИЛ-17, хемокины, ростовые факторы GM-CSF, M-CSF, G-CSF, медиаторы воспаления семейства HNP и гранулярные энзимы - эластаза, азуроцидин, липокалин [17]. Вместе с тем современные исследования функциональной активности инфильтрата кишки при IBD и в животных моделях указывают на геторогенность популяции и способности нейтрофилов и моноцитов выступать в качестве регуляторов воспаления через продукцию цито-кина TGF-P, а также синтез аргиназы [18, 19].

Макрофаги составляют наибольшую популяцию лейкоцитов в здоровой кишке и выполняют важнейшую функцию поддержания кишечного гомеостаза, включая фагоцитоз и деградацию микроорганизмов и апоптоти-ческих клеток ткани, а также синтез медиаторов, контролирующих обновление эпителия [20]. В зависимости от функциональных характеристик и спектра секретируе-мых цитокинов макрофаги подразделяют на классически активированные провоспалительные макрофаги М1 и альтернативно активированные иммунорегуляторные макрофаги М2 [12, 21]. В то же время часть исследователей рассматривает эти типы макрофагов как различные функциональные состояния [14, 22]. В здоровой ткани кишки макрофаги проявляют состояние анергии, не производят провоспалительные цитокины, однако они способны к активному фагоцитозу и выполняют функции «мусорщиков» [23]. Однако при патологии функциональные характеристики макрофагов изменяются. Так, было показано, что у пациентов с болезнью Крона макрофаги кишки производят большое количество провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-23 и TNF-a и влияют на увеличение синтеза IFN-y Т-клетками [24]. В другом исследовании было показано, что у больных с болезнью Крона нарушена секреция провоспалитель-ных цитокинов макрофагами, полученными из моноцитов периферической крови в ответ на стимуляцию E. coli и агонистами TLRs (toll-like receptors - рецепторы распознавания образов патогенов) [25].

Предшественниками макрофагов в кишке являются моноциты Ly6Chi/CCR2+ как в здоровой кишке, так и при воспалении, однако при воспалении снижается количество резидентных тканевых макрофагов фенотипа MHCIIhi/CX3CR1hi и увеличивается количество провоспалительных макрофагов MHCIIhi/CX3CR1int, отвечающих на стимуляцию TLR [26].

Дендритные клетки в кишке представляют собой гетерогенную популяцию [27]. Основная функция этих клеток состоит в мониторинге окружающей микросреды, захвате антигенов и реализации последующих иммунных событий, связанных с воспалительным ответом или иммунотолерантностью. Эта двойная функция дендритных клеток реализуется через взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета [27]. В здоровой кишке дендритные клетки отвечают за поддержание гомеостаза через взаимодействие с эпителиальными клетками и под действием стромального лимфопроте-ина (thymic stromal lymphopoietin - TSLP) поляризуют Т-клетки по ThZ-пути [28]. При воспалительных заболеваниях кишечника наблюдается радикальное снижение уровня экспрессии мРНК TSLP клетками кишечного эпителия, что в свою очередь приводит к изменению функционального состояния дендритных клеток и способствует развитию воспаления [28]. Также при язвенном колите и болезни Крона наблюдается повышение уровней TLR2 и TLR4, коактивационных молекул CD40 и продукции цитокинов ИЛ-12 и ИЛ-6 в дендритных клетках кишечника в сравнении со здоровым контролем, что отражает активированное состояние, связанное с воспалением [29].

Эозинофилы кишки могут составлять до 30% мие-лоидных клеток в ткани здоровой кишки, они являются важными участниками поддержания гомеостаза [26]. Миграция эозинофилов в ткань кишки определяется хемотаксисом CCR3 CCL11 (эотаксин 1) [30] и взаимодействием a4p7 интегрина с MAdCAM1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1) [31]. Наибольшее количество эозинофилов присутствует в двенадцатиперстной кишке, более того, эозинофилы присутствуют в кишке плода, и их количество увеличено или соответствует норме у мышей в стерильных условиях, что свидетельствует как об их важной регуляторной роли в норме, так и об участии в воспалительных реакциях [32]. Недавние исследования указывают на участие эозинофилов в переключении IgA в пейеровых бляшках и поддержании пула ^А+-плазматических клеток, CD103+-дендритных клеток и FOXP3+-регуляторных T-клеток в ткани кишки. Участие эозинофилов в поддержании гомео-стаза в ткани кишки может быть связано с их способностью к производству цитокина TGF-P [33].

Адаптивный иммунитет выполняет важную функцию контроля и реализации воспалительных реакций в ответ на патогены, а также принимает участие в поддержании гомеостаза в кишечнике. Эффекторные Т-клетки являются пластичной популяцией, и направление их дифференцировки определяется внешними стимулами микроокружения [34], в том числе в патогенезе IBD [14]. Адаптация к потребностям организма при изменении условий, таких как возраст, диета, ксенобиотики или микроорганизмы, обусловливает иммунный гомеостаз, тогда как нарушение контроля этих реакций приводит к необратимым изменениям и развитию хронического воспаления и аутоиммунных реакций [35]. Регуляторные Т-клетки необходимы для развития

иммунной толерантности к антигенам и аутоантигенам, что является, несомненно, важной функции поддержания гомеостаза в барьерных тканях, таких как слизистая кишечника [36]. Нарушения функций регуляторных Т-клеток приводят к развитию аутоиммунных и хронических воспалений, включая IBD [37]. Т-регуляторные клетки обнаруживаются в слизистой оболочке кишки, их количество увеличивается при воспалении, а в мышиной модели колита регуляторные Т-клетки подавляют развитие воспаления [38]. Роль регуляторных Т-клеток в патогенезе IBD до конца не определена [37]. В активной фазе воспаления при IBD количество регу-ляторных Т-клеток в периферической крови уменьшается [39], однако в ткани кишки эта популяция численно увеличивается и проявляет иммуносупрессивные свойства in vitro [39]. Предполагается, что их регуляторный потенциал недостаточен для контроля воспаления при IBD и это позволяет рассматривать патогенез IBD как следствие нарушения супрессорных функций [40]. Ряд стратегий терапевтических подходов направлен на усиление функций регуляторных Т-клеток, в том числе на применение клеточной терапии регуляторными Т-клетками при воспалительных заболеваниях кишечника [41]. Это находит подтверждение в том, что блокирование TNF увеличивает количество регуляторных Т-клеток у детей с болезнью Крона [42], увеличивает иммуносупресивные функции этих клеток [43], а также уменьшает апоптоз CD4+/FoxP3+-Т-клеток в слизистой оболочке больных в активной фазе IBD [44].

В развитии и регуляции воспаления в ткани кишки задействовано большое количество цитокинов, ростовых факторов и других растворимых медиаторов [45]. Роль отдельных молекул и их взаимодействие с клеточными мишенями, а также сигнальные пути, задействованные в этих процессах, являются целью большого количества исследований и предметом для поиска новых лекарственных препаратов для лечения IBD [45]. Ключевая роль TNF-a в развитии патогенеза воспалительных заболеваний кишечника хорошо описана [46], увеличение продукции этого цитокина в ткани кишки при воспалении показана для большинства животных моделей, а также для пациентов с IBD. Повышение продукции этого цитокина описано для моноцитов, макрофагов, фибробластов, T-клеток [47], гранулоцитов [48]. Активация сигнальных каскадов TNF при колите приводит к плейотропным провоспалительным эффектам, включающим направленную миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, усиленный ангиогенез, гибель клеток Панета, увеличение синтеза металлопротеиназ мио-фибробластами, активацию макрофагов и эффекторных Т-клеток, а также прямое повреждение эпителиальных клеток через активацию киназы MLCK [45, 49, 50]. Другим ключевым медиатором воспаления кишечника при IBD является цитокин ИЛ-lß, для патогенеза воспалительных заболеваний кишечника характерно локальное и системное повышение уровня этого цитокина. Основными продуцентами этого цитокина при воспалении кишечника являются моноциты, макрофаги и нейтрофилы,

а также клетки эпителия и фибробласты. Связывание рецептора этого цитокина запускает активацию NF-kB сигнального пути, что приводит к выработке спектра провоспалительных цитокинов, таких как TNF-a, ИЛ-6, ИЛ-12 [45]. Выработка этого цитокина эпителиальными клетками повышает инфильтрацию нейтрофилов и моноцитов в ткань кишки при воспалении. Цитокин ИЛ-6 в ткани кишки синтезируется макрофагами, фи-бробластами и Т-клетками. Этот цитокин активирует белки острой фазы, Т-клетки и защищает от апоптоза, индуцирует пролиферацию эпителия [45]. Цитокин TGF-ß играет особую роль в кишечнике, это опосредовано его широким диапазоном действия и вовлеченности во многие процессы, в том числе обновление эпителия, пролиферацию эпителиальных и мезенхи-мальных компонентов кишечной стенки, а также мощную иммунорегуляторную активность, необходимую для развития толерантности и поддержания гомеостаза [51]. При IBD описано увеличение продукции TGF-ß в ткани кишки, а также развитие фиброза кишки [52]. Предполагается, что снижение регуляторной функции TGF-ß, несмотря на высокий уровень продукции, связано с нарушением сигнальных механизмов SMAD-пути. Так, было показано, что при IBD возрастает количество ингибирующей субъединицы SMAD7, что приводит к нарушению сигналинга и снижению экспрессии целевых генов [53].

Данная работа посвящена изучению лечебного эффекта иммуномодулирующего тетрадекапептида TEKKRRETVEREKE в экспериментальной модели язвенно-деструктивного колита у лабораторных мышей. Влияние препарата изучено на уровне псевдоклинических проявлений язвенного колита (диарея, кровавый стул, потеря веса), патоморфологических изменений кишечника (укорочение толстой кишки, макроскопические язвы, рубцовые стриктуры кишечника), а также клеточных и молекулярных характеристик воспалительной реакции в ткани толстой кишки.

Методика

Мыши - самцы C57BL/6 в возрасте 8-10 нед (21-23 г) содержались в стандартных условиях вивария, были распределены случайным образом в группы по 15 животных.

Декстран-индуцированный колит получали пе-роральным введением 2,5% раствора сульфата дек-страна [DSS (M.W. 35-50 kDa, Cat N 160110, MP Boimedicals, LLC, France)] в питьевой воде в 1-5-й, 11-16-й дни в поилках постоянно, в соответствии с рекомендованными протоколами [7, 54, 55]. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с правилами работы с животными, утвержденными комиссией по этическому отношению к животным ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Одновременно с началом первого цикла декстрана вводили тетрадекапептид внутрибрюшинно каждые 48 ч в дозе 50 мкг/мышь, контрольная группа получала аналогичный объем растворителя (рис. 1, А). Индекс активности

болезни (disease activity index - DAI) оценивали для каждой мыши ежедневно на основании описанных протоколов для этой модели [55, 56]. DAI оценивали для каждой мыши ежедневно, исходя из трех параметров: потери веса, консистенции стула и ректального кровотечения. Каждый параметр оценивали по 4-балльной шкале от 0 до 4, баллы для каждого показателя суммировали, максимальное значение индекса соответствует 12. Наличие скрытой крови в фекалиях определяли бензидиновой реакцией, как описано в протоколах [57]. На 9-й и 19-й дни эксперимента проводили анализ морфологических и иммунологических изменений в ткани кишки без лечения и с лечением тетрадекапептидом.

Выделение мононуклеарных клеток из ткани кишки мыши. Вскрывали брюшную полость, кишку отсекали по вхождению тонкой в слепую, перерезали лобковую кость (os pubis) и извлекали прямую кишку. Фотографировали кишку на белой бумаге с линейкой. Отсекали слепую кишку и переносили кишку в чистую чашку Петри (10 см) на льду в холодный PBS. Зажимали конец прямой кишки плоским пинцетом и промывали шприцем с иглой содержимое кишечника 20 мл холодного PBS. Переносили промытую кишку в новую чашку Петри (10 см) с 5 мл холодного PBS, разрезали кишку вдоль ножницами (на холоду), раскрывали и скальпелем разрезали вдоль на 2 равные части. Половину переносили в отдельную пробирку на 1,5 мл с 0,5-1 мл RNA later (Qiagen, Германия, Кат. № 1018187), и оставляли при 4 °С на 16 ч, затем хранили при -20 °С (см. описание ПЦР). Вторую половину кишки переносили в чашку Петри (6 см) с 5 мл HBSS c 5 мМ EDTA и 1 мМ ß-mercaptoethanol при 37 °С (pre-digestion solution), разрезали ножницами на кусочки 0,5 мм, собирали в пробирку на 50 мл. Остатки из чашки Петри смывали 5 мл буфера и ставили горизонтально на шейкер (качалку, высокие обороты) на 20 мин при 37 °С. Откручивали 5 мин 1200 об/мин, убирали супернатант и отмывали 30 мл 1xHBSS 10 мин 1200 об/мин. Измельчали скальпелем на более мелкие кусочки (1 мм) и помещали в 4 мл раствора коллагеназ в среде RPMI [коллагеназа I типа - 0,2 мг/мл (Кат. № C0130, Sigma), коллагеназа IV типа - 1 мг/мл (Кат. № 17104, Gibco)], содержащий ДНКазу I - 0,02 мг/мл (D4527-10KU, Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Пробирку с раствором ферментов и тканью ставили горизонтально на шейкер (качалку, высокие обороты) на 1 ч при 37 °С. После инкубации суспензию переносили в новую пробирку на 50 мл, добавляли 15 мл PBS/BSA (0,5%), пипетировали и пропускали через нейлоновое ситечко для ткани на 100 мкм, промывая ситечко 15 мл PBS/BSA. Затем откручивали 15 мин при 1500 об/мин 4 °С, суспензию разводили в 10 мл PBS/BSA и пропускали через ситечко на 70 мкм, откручивали 10 мин, 1500 об/мин при 4 °С. Выливали супернатант и осадок рессуспендировали в 300 мкл PBS/BSA. После чего проводили окрашивание суспензии клеток антителами.

Проточная цитофлюориметрия. Из суспензии клеток отбирали пробу 30 мкл и разводили 1:1 в растворе антител. Использовали 2 набора антител. Смесь антител № 1 включала CD45-Alexa Fluor 4SS (1:1000), CD3e-PE-CF594 (1:500), I-A/I-E-APC/Cy7 (1:1000), CD4-PerCP/Cy5.5 (1:1000), CDSa-Brilliant Violet 510 (1:1000); CD62L-PE (1:1000); CD44-PE/Cy7 (1:1000); CD25-APC (1:1000) смесь антител № 2 включала CD45-Alexa Fluor 4SS (1:1000), CDllb-Brilliant Violet 510 (1:1000), Ly-6^PE (1:1000), CDllc-PE/Dazzle594 (1:1000), Ly-6G-PE/Cy7 (1:1000), F4/S0-APC (1:1000), I-A/I-E-APC/Cy7 (1:1000). Все антитела производства Biolegend, США. Суспензию клеток с антителами инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Затем клетки отмывали в 1 мл холодного буфера 10 мин, 1200 об/мин при 4 "C. Супернатант удаляли и осадок рессуспендировали в 400 мкл холодного буфера, содержащего DAPI (1,25 мкг/мл) и калибровочные шарики 104/мл (Fluorospheres 2% bright, размер 10.15 мкм, Epics division of coulter corp, HiaLeah, США), и анализировали на проточном цитофлуориме-тре FACS Aria II.

На первом этапе выделяли популяцию CD45+ живых клеток в канале DAPI и CD45, потом исключали агрегаты клеток, затем по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию отсекали дебрис, далее выделяли отдельные популяции в соответствии с их фенотипом, как это описано в протоколах [5S-62]. Популяцию нейтрофилов определяли как Ly6G+hi/Ly6cint/F4/S0-/llb+, популяцию моноцитов Ly6G-/Ly6chi/F4/S0-, популяцию макрофагов CDllb+/Ly6C-/Ly6G-/F4/S0+/SSClD, популяцию эо-зинофилов, несущих различные катионные гранулы, определяли как CDllb+/Ly6C-/Ly6G-/F4/S0+/ SSChi; в популяции CD3+-клеток выделяли CD4+-и CD8+-T-клетки, популяцию T-регуляторных клеток определяли из CD4+ как CD44+hi/CD62L-/CD25+hi. В каждом образце просчитывали 0,6—1,0^10 событий. Анализ данных проводили в программах FACS-Diva 6 (BD Biosciences) и Cytobank.

Подсчет клеток. Для подсчета абсолютного количества клеток в образце в канале прямого и бокового светорассеяния выделяли область калибровочных шариков и клеток, определяя их количество в проанализированном образце. Далее вычисляли концентрацию исследуемой популяции клеток (X млн/мл) в образце по формуле (1):

X =

ACV2 BV1 '

где А - количество проанализированных клеток исследуемого образца, единиц; VI - объем суспензии клеток исследуемого образца с антителами, мкл; В - количество проанализированных калибровочных шариков в образце, единиц; С - концентрация калибровочных шариков в исходной суспензии, млн/мл; VI - объем добавляемого раствора с калибровочными шариками, мкл.

Зная концентрацию клеток в исследованном образце и объем всего образца, рассчитывали абсолютное количество клеток отдельных популяций в кишке.

ПЦР в режиме реального времени. Выделение РНК из ткани кишки проводили, используя набор для выделения РНК РНК-экстран (Синтол, Россия), согласно инструкции производителя. Кратко: '/2 кишки после выделения помещали в пробирку с 1 мл RNA-later (Qiagen, Германия, Кат. № 1018187) и оставляли при 4 °С на ночь, затем хранили при -20 °С. Перед выделением ткань доставали из пробирки стерильным пинцетом, фильтровальной бумагой убирали остатки жидкости и немедленно переносили в фарфоровую чашку с жидким азотом, ткань размельчали фарфоровым пестиком, по необходимости доливая жидкий азот, чтобы она не размораживалась. После размельчения ткани до пудры срезанным носиком или обратным концом срезанной пастеровской пипетки, охлажденной предварительно в азоте, образец переносили в пробирку с 600 мкл RTL-буфера [RNeasy mini kit (Qiagen, Германия, Кат. № 74104)] (пробирки предварительно взвешивали с точностью до 0,001 г). Пробирку интенсивно встряхивали на вортексе, чтобы весь образец был лизирован. После этого образец взвешивали. Далее шприцом на 5 мл и иголкой 22G гомогенизировали образец до однородного состояния. В новую пробирку переносили 10-20 мкг образца, добавляли лизи-рующий буфер с гуандин-изотиоционатом (набор для выделения РНК «РНК-экстран» («Синтол», Россия), прогревали 15 мин при 65 °С. Далее выделяли РНК согласно протоколу («Синтол»), осадок растворяли в 40 мкл mQ, обработанной ингибитором рибонуклеаз - диэ-тилпирокарбонатом DEPC (diethyl pyrocarbonate). После выделения РНК, дополнительно проводили обработку ДНКазой, используя коммерческий набор (Кат. № EN0521, Thermo Scientific). Для этого к 40 мкл раствора нуклеиновых кислот добавляли 4 мкл 10х буфера для ДНКазы с MgCl2 и 4 мкл ДНКазы 1 ед/мкл, инкубировали 30 мин при 37 °С. После чего проводили переосаждение РНК в присутствии хлорида лития, согласно существующему протоколу [63]. К раствору РНК на льду добавляли 152 мкл mQ, свободной от РНКаз и ДНКаз, и 20 мкл 8М LiCl, инкубировали на льду в течение 2 ч, осаждали центрифугированием 30 мин при 14 000 об/мин, 4 °С, убирали супернатант. Осадок растворяли в 200 мкл mQ, добавляли 20 мкл 8М LiCl, повторно инкубировали на льду в течение 2 ч, осаждали центрифугированием 30 мин при 14 000 об/мин, 4 °С, убирали супернатант. Осадок растворяли в 200 мкл mQ, добавляли 20 мкл 3М ацетата Na и 400 мкл этанола (96,6%), инкубировали 30 мин при -20 °С, осаждали центрифугированием 30 мин при 14 000 об/мин, 4 °С, убирали супернатант. Осадок промывали 70% этанолом 10 мин при 14 000 об/мин, 4 °С, убирали супернатант и РНК растворяли в 20 мкл mQ, обработанной DEPC. Реакцию обратной транскрипции проводили в 50 мкл, используя коммерческий набор (Кат. № ОТ-1, Синтол, Россия), согласно инструкции произ-

водителя. Перед проведением обратной транскрипции выполняли отжиг праймеров 5 мин при 65 °С. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали Random-primers, 15 ОЕ/мл Random6 (2 мкл на 20 мкл раствора РНК). После отжига образец немедленно помещали на лед, после охлаждения добавляли 20 мкл 2,5х буфера для обратной транскрипции и 2 мкл раствора ревертазы (50 е.а./мкл). Реакцию осуществляли в термостате «Гном» (ДНК-Технология, Россия), 40 мин при 40 °С и 10 мин при 95 °С. После реакции обратной транскрипции к 50 мкл исходного образца добавляли 150 мкл mQ. В реакцию ПЦР добавляли 5 мкл кДНК, для каждой системы генов реакцию ставили в дублях. ПЦР в режиме реального времени проводили в 25 мкл (в реакцию добавляли 14 pM каждого праймера, 3 pM зонда, 2,5 е.а. SynTaq ДНК-полимераза, концентрация MgCl2 2,5мМ, DNTPs - 0,25 мМ). Для детекции флуоресценции использовали специфичные зонды Taq-man с меткой FAM. Последовательности праймеров и зондов приведены в табл. 1.

Амплификацию проводили на приборе «DTprime-4» («ДНК-технология», Россия), программа включала прогрев и инактивацию блокирующих полимеразу антител при 94 °C (5 мин) и температурное циклиро-вание: 94 °C (10 сек), 62 °C (20 сек) и 72 °C (5 сек) (40 циклов). На каждом цикле при 62 °C осуществлялась автоматическая детекция флуоресценции в канале FAM. Значение экспрессии мРНК каждого исследованного гена вычисляли относительно гена в-actin, используя метод AACp [64, 65].

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism v.6. Для экспериментального колита сравнивали группы с лечением и без лечения с использованием ^/-критерия Манна-Уитни.

Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов

Результаты

Терапия тетрадекапептидом снижает индекс активности болезни и патологические изменения толстой кишки в модели язвенного колита. Экспериментальная схема исследования приведена на рис. 1, А. В течение первого цикла индуцированного декстраном колита (1-5-й дни) начальные признаки развития заболевания наблюдали у отдельных мышей на 3-й день (положительная реакция в тесте на скрытую кровь в фекалиях, понос), на 4-5-й день у всех мышей наблюдали признаки развития колита: потерю веса, ректальное кровотечение, диарею. Как следует из анализа динамики индекса активности болезни, представленного на рис. 1, В (кривая динамики без лечения - DSS), пик развития признаков колита констатировали на 6-е сутки. При повторном цикле применения декстрана (11-16-й дни) наблюдали возобновление признаков колита. При терапии тетрадекапеп-тидом в первом цикле применения DSS картина развития заболевания была схожей с группой без лечения, и достоверных различий в потере веса между группами не обнаружено (рис. 1, Б). Лечение тетрадекапептидом при повторном цикле колита значительно сокращало потерю веса и способствовало быстрому восстановлению массы тела животных, тогда как в группе без лечения потеря веса продолжалась до 16-го дня и восстановления не было (рис. 1, Б). Достоверные различия в DAI были обнаружены на 7, 18 и 19-й дни. Смертность животных не отличалась в группах с лечением и без лечения - составила 25%.

Можно констатировать, что положительное влияние терапии тетрадекапептидом на течение DSS-колита статистически значимо проявлялось в фазе восстановления после второго цикла применения DSS (17-18-й дни) и характеризовалось нормализацией показателей

Название гена Последовательность олигонуклеотидов 5'-3' Код последовательности в базе NCBI

И-1в (forward) caaccaacaagtgatattctccatg (reverse) gatccacactctccagctgca (probe) FAM-ctgtgtaatgaaagacggcacacccacc-RTQ NM_008361.4

il6 (forward) gaggataccactcccaacagacc (reverse) aagtgcatcatcgttgttcataca (probe) FAM- cagaattgccattgcacaactcttttctca -RTQ NM_031168.2

tnf-a (forward) catcttctcaaaattcgagtgacaa (reverse) tgggagtagacaaggtacaaccc (probe) FAM- cacgtcgtagcaaaccaccaagtgga -RTQ NM_013693.3

tgf-Pl (forward) tgacgtcactggagttgtacgg (reverse) ggttcatgtcatggatggtgc (probe) FAM-ttcagcgctcactgctcttgtgacag-RTQ NM_011577

в-actin (forward) agagggaaatcgtgcgtgac (reverse) caatagtgatgacctggccgt (probe) FAM-cactgccgcatcctcttcctccc-RTQ NM_007393

Терапевтическое действие иммуномодулирующего пептида TEKKRRETVEREKE 21

веса, восстановлением нормального функционирования кишечника (отсутствие диареи) и снижением индекса активности болезни.

Морфологические изменения толстого отдела кишечника исследовали на 9-й и 19-й дни развития колита. На рис. 1, Г представлены фотографии толстого отдела кишечника и слепой кишки, полученные после вскрытия животных на 19-й день наблюдений. Как следует из графика сравнения среднего значения длины толстой кишки по группам (рис. 1, Д), при колите наблюдается существенное укорочение кишки как после первого цикла декстрана (6,7 ± 0,2 см), так и после второго (6,8 ± 0,3 см) относительно контрольной группы (9,2 ± 0,4 см). Экспериментальная терапия тетрадекапептидом уменьшает укорочение кишки, вызванное колитом: так, длина кишки в группе леченых животных составила 7,6 ± 0,6 и 8,5 ± 0,9 см после первого и второго циклов отравления сульфатом декстрана, соответственно. Как следует из графика, пред-

ставленного на рис. 1, Д, после второго цикла отравления Б88 терапия тетрадекапептидом достоверно уменьшает укорочение кишки, вызванное колитом. Важно отметить, что толстая кишка у мышей с нелеченым Б88-колитом пуста, комочков проходящей пищи нет, т. е. толстый кишечник поражен настолько, что его функционирование полностью нарушено. Напротив, у мышей с В88-колитом, получавших лечение тетрадекапептидом, в кишечнике наблюдаются сформированные фекалии, как и в кишечнике интактных контрольных животных. Иначе говоря, лечение тетрадекапептидом мышей с Б88-колитом восстановило функционирование толстого кишечника.

Экспериментальная терапия тетрадекапептидом изменяет состав клеточных популяций в воспалительном инфильтрате в ткани толстой кишки в модели язвенного колита. Через 9 и 19 дней после начала индукции Б88-колита у экспериментальных

э

2,5% Б88

2,5% Б88

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

J к i к J к к к к к к ' Т ' к J к к

тетрадекапептид, внутрибрюшинное введение, 50 мкг/мышь

Э

-5-10-15-20-

-Б88

Б88 + тетрадекапептид

0 5 10 15

Время наблюдения, дни

Контроль

Б88-колит

%

10

8 -

б

я 6 -т

^

о

н

ш 4 -я 1 т

8 0

-Б88

Б88 + тетрадекапептид

Б88 2,5%

Б88 2,5%

20

0 2 4 ' 6 1 8 1 10 1 12 1 14 ' 161 18 20 Время наблюдения, дни

э

11 1 10 -

я

И 9

¡3 9 1 и к а

я 8 1

я 1

7 -6

] Контроль I Б88

Б88 + тетрадекапептид

I

г-Ч ""

9-й день

19-й день

Рис. 1. Схема получения экспериментального язвенного колита (А) и влияние терапии тетрадекапептидом в модели колита на потерю веса (Б), индекс активности болезни (В) и макроскопические изменения кишки (Г) после одного цикла назначения Б88 (9-й день) и после двух циклов (19-й день) в группах без лечения и при терапии тетрадекапептидом; анализ длины толстого отдела кишечника при экспериментальном колите в группе без лечения и при терапии тетрадекапептидом (Д) На графиках представлено среднее по группам (± st.de*>.); * -р < 0,05.

а 2-

*

*

Таблица 2. Результаты ЕАСБ-анализа клеточного состава популяций в ткани кишки в модели колита и при экспериментальной терапии тетрадекапептидом

Популяция клеток Контроль

Средние значения числа клеток на кишку

СП45+-лейкоциты 235945± 93320 2081621± 402858 1408969 ± 657093 1974985± 498795 1174303* ± 188737

ЬубО+-нейтрофилы 3011 ± 791 252733 ± 163439 56480 ± 60361 139666± 89720 60127* ± 22245

Ьу6С+-моноциты 14149± 5421 267182 158132 77897 ± 61361 190801± 95844 80740* ± 7948

Р4/80+№Сь-макрофаги 11782± 3205 101376 ± 82049 Нет данных 111829± 49462 65620 ± 24166

Е4/80+/8БСк'-эозинофилы 4705 ± 2489 49590 ± 36040 Нет данных 53494 ± 49279 29558± 10386

СП4+-Т-клетки 41115± 20788 145303 ± 41976 100717 ± 35690 151424± 46737 143377± 52024

СП8+-Т-клетки 29669 ± 9756 90680 ± 23239 62224 ± 28802 38488 ± 15409 77974 ± 39323

СВ4+СВ62-СБ25+-регуляторные Т-клетки 1674 ± 795 13427± 6913 13128± 5051 6775 ± 2665 12856* ± 5604

Примечание. В таблице приведены средние значения по группе (М ± т); * - достоверные различия в группе с лечением тетрадекапептидом относительно группы без лечения.

мышей, получавших и не получавших лечение те-традекапептидом, мы изучили состав клеточных популяций в иммунном инфильтрате в ткани толстой кишки. Методом проточной цитометрии исследовали содержание СБ45+-лейкоцитов, Ьубв+-нейтрофилов, ЬубС+-моноцитов, Р4/80+-макрофагов, эозинофилов, СБ4+-Т-клеток, СБ8+-Т-клеток и СВ4+СБб2-СБ25+-регуляторных Т-клеток. Среднее значение абсолютного количества каждой проанализированной популяции в ткани толстой кишки приведено в табл. 2.

В модели язвенного колита наблюдали существенное увеличение количества СБ45+-лейкоцитов в ткани кишки (рис. 2, А). Абсолютное количество СБ45+-клеток в ткани кишки в контрольной группе составило 0,2 ± 0,09 млн, а при воспалении, вызванном Б88, это значение увеличилось на порядок и составило 2,1 ± 0,4 млн на 9-й день и 2,0 ± 0,4 млн на 19-й день. Увеличение числа СБ45+-лейкоцитов в ткани кишки при терапии тетрадекапептидом было меньше в 1,5-2 раза по сравнению с группой без лечения и составило 1,4 ± 0,6 млн и 1,2 ± 0,2 млн на 9-й и 19-й дни соответственно. Отличия в группах с лечением и без лечения на 19-й день были статистически значимыми.

Было установлено, что при экспериментальном колите в ткани кишки увеличивается абсолютное количество всех проанализированных клеток: нейтрофилов,

моноцитов, макрофагов, эозинофилов, CD4+- и CD8+-Т-клеток (см. табл. 2).

При исследовании популяций T-клеток обнаружено, что при колите увеличивается инфильтрация ткани как эффекторными CD4+-T-клетками, так и цитотоксиче-скими СD8+-Т-клетками; терапия тетрадекапептидом не оказывала влияния на количественное содержание этих клеточных популяций (см. табл. 2).

Установлено, что при экспериментальном колите увеличивается абсолютное содержание популяции регуляторных Т-клеток в ткани кишки в обеих временных точках наблюдения. На 19-й день наблюдения количество регуляторных Т-клеток было достоверно выше в группе, получавшей терапию тетрадекапептидом, по сравнению с группой без лечения (рис. 2, Б).

Абсолютное количество Ьубв+-нейтрофилов в толстой кишке интактных мышей составило 3,0 ± 0,7 тыс. клеток, тогда как у мышей с DSS-колитом это значение увеличивалось до 140,0 ± 89 тыс. на 19-й день наблюдения. Лечение тетрадекапептидом снижало количество Ьубв+-нейтрофилов в воспаленной кишке вдвое - до 60,1 ± 22 тыс. клеток на кишку (p < 0,05) (рис. 2, В). Абсолютное количество моноцитов (Ly6C+) в контрольной кишке составило 14,1 ± 5,4 тыс. клеток, при колите увеличивалось до 190,8 ± 95,8 тыс. на 19-й день наблюдений, а при лечении тетрадекапептидом достоверно

э

13 3,0^104

т S

¡3 2,0^ 104

1,0-104

Количество CD45*-клеток в кишке

_*_

«те»

I т I

Количество регуляторных Т-клеток в кишке ,_*_,

g 10 000=| (N g

Q и C ео

D

О it

D C

1000

X

I I ï Ï

Э

ô §

100 000-

10 000 =

1000

Количество нейтрофилов в кишке

цЕ*

I

su

H ч и «

Î

S

SU

H ч и 'К

1 000 000-

100 000-

10 000=

1000

Количество моноцитов в кишке

I

с а

аД

н ч и «

•Ï

с а

аД

н ч

И «

Рис. 2. Абсолютное количество СБ45+-лейкоцитов (А), регуляторных Т-клеток (Б), ЬубО+-нейтрофилов (В) и ЬубС+-моноцитов (Г) в ткани кишки при развитии экспериментального колита и влияние терапии тетрадекапептидом (ТДП); * - р < 0,05

0

*

е1 000 000 ч

(p < 0,05) снижалось до 80,7 ± 7,9 тыс. клеток на кишку (рис. 2, Г). Для макрофагов и эозинофилов было обнаружено увеличение абсолютного количества клеток при индуцированном колите, однако при лечении тетраде-капептидом изменения этих показателей не наблюдали (см. табл. 2).

Представленные данные свидетельствуют о том, что терапия тетрадекапептидом достоверно уменьшала инфильтрацию ткани кишки Ly6G+-нейтрофилами и Ly6C+-моноцитами. Одновременно при лечении тетрадекапептидом у мышей с DSS-индуцированным колитом повышалось содержание регуляторных Т-клеток в ткани толстой кишки. Это указывает на то, что при терапии тетрадекапептидом у мышей с тяжелым деструктивным колитом наблюдается уменьшение интенсивности воспалительных реакций в кишке.

Экспериментальная терапия тетрадекапептидом снижает уровень провоспалительных цитокинов в ткани кишки, но не влияет на экспрессию противовоспалительных цитокинов при DSS-индуцированном колите. При развитии экспериментального колита, индуцированного сульфатом декстрана, в ткани кишки происходило значительное увеличение продукции провоспалительных медиаторов. Основными цитокинами, связанными с воспалительными процессами в ткани кишки, являются ИЛ-iß, ИЛ-6, TNF-a. На 9-й и 19-й дни после начала отравления мышей сульфатом декстрана относительная экспрессия мРНК гена il-1ß в стенке пораженной колитом толстой кишки увеличивалась в 11,6 ± 1,3 (p < 0,05) и 17,9 ± 2,4 (p < 0,05) раза соответственно, по сравнению с уров-

нем продукции этого цитокина в ткани толстой кишки здоровых мышей. Аналогично в стенке воспаленной кишки у мышей с DSS-колитом интенсивность транскрипции il-6 в указанные дни была в 47 ± 10 (p < 0,05) и 30 ± 13 (p < 0,05), tnf-a - в 2,4 ± 0,6 (p < 0,05) и 2,8 ± 0,4 (p < 0,05) раза выше, чем в ткани толстой кишки интактных мышей (рис. 3, А-В).

Одновременно с усиленной продукцией провоспа-лительных медиаторов повышалась и интенсивность транскрипции гена противовоспалительного фактора tgf-ß1 и была выше, чем в толстой кишке здоровой мыши в 2,5 раза (p < 0,05) (рис. 3, Г).

Инъекционное введение тетрадекапептида мышам, у которых индуцировали DSS-колит, приводило к существенному снижению продукции факторов воспаления в ткани толстой кишки. Под влиянием терапии тетрадекапептидом на 9-й и 19-й дни соответственно интенсивность транскрипции мРНК гена il-1ß снизилась в 1,7 и в 6,1 раза (p < 0,05), il-6 - в 3,8 и 5,6 раз (p < 0,05), tnf-a - в 1,6 и в 1,7 раза (p < 0,05) (рис. 3).

Интенсивность продукции мРНК противовоспалительного цитокина tgf-ß1 при лечении тетрадекапепти-дом имела тенденцию к снижению, но достоверного отличия от контроля (без лечения тетрадекапептидом) не достигала (рис. 3, Г).

Обсуждение

Индукция экспериментального колита сульфатом дек-страна моделирует развитие воспаления в ткани кишки и вызывает в ней ряд характерных для колита макроскопических и микроскопических изменений [11, 66].

Э

-Л

и §

и

Рч О 2 &

я

г &

25 -I

20 -

15 -

10 -

5 -

Э

И и

9-й день

« 4-

3-

2-

1 -

19-й день

э

I

Рч

8

60 -

40 -

20 -

$ о

и 8

8 я

Контроль Б88

Б88 + тетрадекапептид

9-й день

19-й день

3-

2-

1-

9-й день

19-й день

9-й день

19-й день

Рис. 3. Изменение относительной экспрессии мРНК генов (А), Ив (Б), Ы/-а (В), (Г) в ткани кишки при развитии экспериментального колита на 9-й и 19-й дни и влияние терапии тетрадекапептидом на уровень исследованных генов. Приведено среднее по группе, * -р < 0,05.

0

0

0

0

В нашей работе было установлено, что терапия тетрадекапептидом в модели индуцированного язвенного колита существенно уменьшает клинические проявления болезни, снижает потерю веса животных, уменьшает укорочение длины кишки и интенсивность воспалительного процесса. Было установлено, что наиболее выраженный терапевтический эффект проявляется при втором цикле отравления сульфатом декстрана. Первый цикл затравки Б88 моделирует острую фазу деструктивного воспалительного процесса в кишечнике, тогда как последующее повторное введение Б88 моделирует хроническую стадию воспаления [67].

Индуцированное Б88-воспаление сопровождается инфильтрацией миелоидных и лимфоидных клеток в ткань кишки. Согласно нашим экспериментальным данным, представленным в данной работе, наибольшее увеличение наблюдается в инфильтрирующих популяциях гранулоцитов, моноцитов и макрофагов. Это согласуется с описанием патологических изменений в кишке, характерных для данной модели колита. Так, в ряде работ было показано, что инфильтрация нейтро-филов и эозинофилов в ткань кишки является важной фазой индукции воспаления и развития колита [68, 69]. Также было отмечено, что нейтрофилы играют важную роль в разрушении ткани кишки и образовании изъязвлений [68, 70]. Хорошо известны механизмы этого процесса и факторы, влияющие на инфильтрацию [71].

Развитие острого воспаления является активным процессом, для подавления которого необходимо инги-бировать рекрутирование лейкоцитов в очаг воспаления и удалить лейкоциты из воспаленного участка путем

апоптоза и дальнейшего фагоцитоза макрофагами. Механизмы, лежащие в основе этих процессов, активно изучаются с позиций разработки терапевтических препаратов для контроля воспаления в ткани кишки [72]. Известно, что после первого цикла индуцированного колита, после стадии восстановления, вторая фаза активации колита также приводит к новой волне инфильтрации ткани кишки гранулоцитами и моноцитами [70]. В нашей работе исследованы изменения клеточного состава популяций лейкоцитов кишки в фазе восстановления, т. е. после отмены воздействия сульфатом декстрана и снижения развития показателей клинического проявления болезни. Судя по клинической картине развития заболевания, представленной в работе, восстановление в группе с терапией тетрадекапептидом происходит быстрее. Снижение продукции провоспали-тельных цитокинов в ткани кишки и отсутствие изменений в синтезе противоспалительных цитокинов, а также снижение инфильтрации в ткань кишки популяций клеток, ассоциированных с воспалением: гранулоцитов, эозинофилов, макрофагов, моноцитов, - свидетельствуют о терапевтическом действии тетрадекапептида ТЕКК^ЯЕТУЕКЕКЕ в модели экспериментального колита. Улучшение клинических показателей в оба исследованных периода восстановления после действия сульфата декстрана позволяет предполагать, что заживление пораженных участков кишки при терапии тетра-декапептидом происходит быстрее. Причем после второго цикла декстрана при начале развития хронического воспаления терапия тетрадекапептидом проявляет наиболее выраженный эффект.

Литература/References

1. Molodecky N.A., Soon I.S., Rabi D.M., Ghali W.A. et al. Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review. Gastroenterology. 2012; 142 (1): 46-54.e42.

2. de Mattos B.R.R., Pereira M., Garcia G., Nogueira J.B. et al. Inflammatory Bowel Disease : An Overview of immune mechanisms and biological treatments. Mediators Inflamm. 2015; 2015: 493012.

3. Kramer M.W., von Klot C.A., Kabbani M., Kabbani A.R. et al. Long-term bowel disorders following radial cystectomy: an underestimated issue? World J Urol. 2015; 33 (10): 1373-80.

4. Малахова Н.С., Пичугин А.В., Халиф И.Л., Атауллаханов Р.И. Применение иммуномодулятора Гепон для лечения неспецифического язвенного колита. Фарматека. 2005; 6 (101): 105-8. [Malakhova N.S., Pichugin A.V., Caliph I.L., Ataullakhanov R.I. The use of immunomodulator Gepon for the treatment of ulcerative colitis. Farmateka. 2005; 6 (101): 105-8. (in Russian)]

5. Лазебник Л.Б., Звенигородская Л.А., Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В. и др. Иммуномодулятор «Гепон» у больных пожилого возраста с эрозивно-язвенными поражениями гастро-дуоденальной зоны. РМЖ. 2004; 12 (23): 1349-52. [Lazebnik L.B., Zvenigorod L.A., Ataullakhanov R.I., Pichugin A.V. et al. Immunomodulator «Gepon» in elderly patients with erosive and ulcerative lesions of the gastroduodenal zone. Russkiy meditsinskiy zhurnal. 2004; 12 (23): 1349-52. (in Russian)]

6. Melgar S., Karlsson L., Rehnström E., Karlsson A. et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 2008; 8 (6): 836-44.

7. Chassaing B., Aitken J.D., Malleshappa M., Vijay-Kumar M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 2014; 104: 15.25.1-14.

8. Suzuki K., Sun X., Nagata M., Kawase T. et al. Analysis of intestinal fibrosis in chronic colitis in mice induced by dextran sulfate sodium. Pathol. Int. 2011; 61 (4): 228-38.

9. Kitajima S., Takuma S., Morimoto M. Changes in colonic mucosal permeability in mouse colitis induced with dextran sulfate sodium. Exp. Anim. 1999; 48 (3): 137-43.

10. Randhawa P.K., Singh K., Singh N., Jaggi A.S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Korean J. Physiol. Pharmacol. 2014; 18 (4): 279-88.

11. Whittem C.G., Williams A.D., Williams C.S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (DSS). J. Vis. Exp. 2010; 35: 6-8.

12. Lean Q.Y., Eri R.D., Randall-Demllo S., Sohal S.S. et al. Orally administered enoxaparin ameliorates acute colitis by reducing macrophage-associated inflammatory responses. PLoS One. 2015; 10 (7): 1-24.

13. Lukacs N.W., Strieter R.M., Chensue S.W., Widmer M. et al. TNF-alpha mediates recruitment of neutrophils and eosinophils during airway inflammation. J. Immunol. 1995; 154 (10): 5411-7.

14. de Souza H.S.P., Fiocchi C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2015; 13 (1): 13-27.

15. Saverymuttu S.H., Peters A.M., Lavender J.P., Chadwick V.S. et al. In vivo assessment of granulocyte migration to diseased bowel in Crohn's disease. Gut. 1985; 26 (4): 378-83.

16. Kucharzik T., Walsh S.V., Chen J., Parkos C.A. et al. Neutrophil transmigration in inflammatory bowel disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junction proteins. Am. J. Pathol. 2001; 159 (6): 2001-9.

17. Brazil J.C., Louis N.A., Parkos C.A. The role of polymorphonuclear leukocyte trafficking in the perpetuation of inflammation during inflammatory bowel disease. Inflamm. Bowel Dis. 2013; 19 (7): 1556-65.

18. Ostanin D.V., Kurmaeva E., Furr K., Bao R. et al. Acquisition of antigen-presenting functions by neutrophils isolated from mice with chronic colitis. J. Immunol. 2012; 188 (3): 1491-502.

19. Kurmaeva E., Bhattacharya D., Goodman W., Omenetti S. et al. Immunosuppressive monocytes: possible homeostatic mechanism to restrain chronic intestinal inflammation. J. Leukoc. Biol. 2014; 96 (3): 377-89.

20. Mowat A.M., Agace W.W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat. Rev. Immunol. 2014; 14 (10): 667-85.

21. Wynn T.A., Chawla A., Pollard J.W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 2013; 496 (7446): 445-55.

22. Martinez F.O., Gordon S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000 Prime Rep. 2014; 6: 13.

23. Smythies L.E., Sellers M., Clements R.H., Mosteller-Barnum M. et al. Human intestinal macrophages display profound inflammatory anergy despite avid phagocytic and bacteriocidal activity. J. Clin. Invest. 2005; 115 (1): 66-75.

24. Kamada N., Hisamatsu T., Okamoto S., Chinen H. et al. Unique CD14 intestinal macrophages contribute to the pathogenesis of Crohn disease via IL-23/IFN-gamma axis. J Clin Invest. 2008; 118

(6): 2269-80.

25. Smith A.M., Rahman F.Z., Hayee B., Graham S.J. et al. Disordered macrophage cytokine secretion underlies impaired acute inflammation and bacterial clearance in Crohn's disease. J Exp Med 2009; 206 (9): 1883-97.

26. Bain C.C., Scott C.L., Uronen-Hansson H., Gudjonsson S. et al. Resident and pro-inflammatory macrophages in the colon represent alternative context-dependent fates of the same Ly6Chi monocyte precursors. Mucosal Immunol. 2013; 6 (3): 498-510.

27. Rescigno M., Di Sabatino A. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 2009; 119 (9): 2441-50.

28. Rimoldi M., Chieppa M., Salucci V., Avogadri F. et al. Intestinal immune homeostasis is regulated by the crosstalk between epithelial cells and dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6 (5): 507-14.

29. Hart A.L., Al-Hassi H.O., Rigby R.J., Bell S.J. et al. Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2005; 129 (1): 50-65.

30. Mishra A., Hogan S.P., Lee J.J., Foster P.S. et al. Fundamental signals that regulate eosinophil homing to the gastrointestinal tract. J. Clin. Invest. 1999; 103 (12): 1719-27.

31. Brandt E.B., Zimmermann N., Muntel E.E., Yamada Y. et al. The alpha4bbeta7-integrin is dynamically expressed on murine eosinophils and involved in eosinophil trafficking to the intestine. Clin. Exp. Allergy. 2006; 36 (4): 543-53.

32. Lampinen M., Waddell A., Ahrens R., Carlson M. et al. CD14+CD33+ myeloid cell-CCL11-eosinophil signature in ulcerative colitis. J. Leukoc. Biol. 2013; 94 (5): 1061-70.

33. Chu V.T., Beller A., Rausch S., Strandmark J. et al. Eosinophils promote generation and maintenance of immunoglobulin-A-expressing plasma cells and contribute to gut immune homeostasis. Immunity. 2014; 40 (4): 582-93.

34. Murphy K.M., Stockinger B. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances. Nat. Immunol. 2010; 11 (8): 674-80.

35. O'Connor W., Zenewicz L.A., Flavell R.A. The dual nature of T(H)17 cells: shifting the focus to function. Nat. Immunol. 2010; 11 (6): 471-6.

36. Harrison O.J., Powrie F.M. Regulatory T cells and immune tolerance in the intestine. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5

(7): a018341.

37. Mayne C.G., Williams C.B. Induced and natural regulatory T cells in the development of inflammatory dowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2013; 19 (8): 1772-88.

38. Mottet C., Uhlig H.H., Powrie F. Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+ regulatory T cells. J. Immunol. 2003; 170 (8): 3939-43.

39. Maul J., Loddenkemper C., Mundt P., Berg E. et al. Peripheral and intestinal regulatory CD4+ CD25(high) T cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2005; 128 (7): 1868-78.

40. Huibregtse I.L., van Lent A.U., van Deventer S.J.H. Immunopathogenesis of IBD: insufficient suppressor function in the gut? Gut. 2007; 56 (4): 584-92.

41. Kelsen J., Agnholt J., Hoffmann H.J., Romer J.L. et al. FoxP3+CD4+CD25+ T cells with regulatory properties can be cultured from colonic mucosa of patients with Crohn's disease. Clin. Exp. Immunol. 2005; 141 (3: 549-57.

42. Ricciardelli I., Lindley K.J., Londei M., Quaratino S. Anti tumour necrosis-a therapy increases the number of FOXP3+ regulatory T cells in children affected by Crohn's disease. Immunology. 2008; 125 (2): 178-83.

43. Valencia X., Stephens G., Goldbach-Mansky R., Wilson M. et al. TNF downmodulates the function of human CD4+CD25hi T-regulatory cells. Blood. 2006; 108 (1): 253-61.

44. Veltkamp C., Anstaett M., Wahl K., Moller S. et al. Apoptosis of regulatory T lymphocytes is increased in chronic inflammatory bowel disease and reversed by anti-TNF treatment. Gut. 2011; 60 (10): 1345-53.

45. Neurath M.F. Cytokines in inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 2014; 14 (5): 329-42.

46. van Dullemen H.M., van Deventer S.J.H., Hommes D.W., Bijl H.A. et al. Treatment of Crohn's disease with anti-tumor necrosis factor chimeric monoclonal antibody (cA2). Gastroenterology. 1995; 109 (1): 129-35.

47. Strober W., Fuss I.J., Blumberg R.S. The immunology of mucosal models of inflammation. Annu. Rev. Immunol. 2002; 20 (1): 495-549.

48. McDermott A.J., Higdon K.E., Muraglia R., Erb-Downward J.R. et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-a signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 2015; 144 (4): 704-16.

49. Di Sabatino A., Pender S.L.F., Jackson C.L., Prothero J.D. et al. Functional modulation of Crohn's disease myofibroblasts by antitumor necrosis factor antibodies. Gastroenterology. 2007; 133 (1): 137-49.

50. Atreya R., Zimmer M., Bartsch B., Waldner M.J. et al. Antibodies against tumor necrosis factor (TNF) induce T-cell apoptosis in patients with inflammatory bowel diseases via TNF receptor 2 and intestinal CD14+ macrophages. Gastroenterology. 2011; 141 (6): 2026-38.

51. Li M.O., Flavell R.A. TGF-beta: a master of all T cell trades. Cell. 2008; 134 (3): 392-404.

52. Valatas V., Filidou E., Drygiannakis I., Kolios G. Stromal and immune cells in gut fibrosis: the myofibroblast and the scarface. Ann. Gastroenterol. 2017; 30 (4): 393-404.

53. Monteleone G., Kumberova A., Croft N.M., Mckenzie C. et al. Blocking Smad7 restores TGF- ß 1 signaling in chronic inflammatory bowel disease. J. Clin. Invest. 2001; 108 (4): 523-6.

54. Aharoni R., Kayhan B., Brenner O., Domev H. et al. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. Pharmacology. 2006; 318 (1): 68-78.

55. Kim J.J., Shajib M.S., Manocha M.M., Khan W.I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced model of IBD. J. Vis. Exp. 2012; 60: 1-7.

56. Cooper H.S., Murthy S.N., Shah R.S., Sedergran D.J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 1993; 69 (2): 238-49.

57. Hughes A. A simplified benzidine test with an evaluation of some faecal occult blood tests. Br. Med. J. 1952; 2 (4791): 970-5.

58. Zindl C.L., Lai J.-F., Lee Y.K., Maynard C.L. et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013; 110 (31): 12 768-73.

59. Krajina T., Leithäuser F., Möller P., Trobonjaca Z. et al. Colonic lamina propria dendritic cells in mice with CD4+ T cell-induced colitis. Eur. J.Immunol. 2003; 33 (4): 1073-83.

60. Koscsö B., Bogunovic M. Analysis and purification of mouse intestinal dendritic cell and macrophage subsets by flow cytometry. Curr. Protoc. Immunol. 2016; 8: 14.39.1-14.

61. Makita S., Kanai T., Nemoto Y., Totsuka T. et al. Intestinal lamina propria retaining CD4+CD25+ regulatory T cells is a suppressive site of intestinal inflammation. J. Immunol. 2007; 178 (8): 4937-46.

62. Guo Z., Jang M.H., Otani K., Bai Z. et al. CD4+CD25+ regulatory T cells in the small intestinal lamina propria show an effector/memory phenotype. Int. Immunol. 2008; 20 (3): 307-15.

63. Viennois E., Chen F., Laroui H., Baker M.T. et al. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res. Notes. 2013; 6: 360.

64. Bustin S., Benes V., Nolan T., Pfaffl M.W. Quantitative real-time RT-PCR - a perspective. J. Mol. Endocrinol. 2005; 34 (3): 597-601.

65. Stahlberg A., Kubista M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Rev. Mol. Diagn. 2014; 14 (3): 323-31.

66. Lin Y., Yang X., Yue W., Xu X. et al. Chemerin aggravates DSS-induced colitis by suppressing M2 macrophage polarization. Cell Mol. Immunol. 2014; 11 (4): 355-66.

67. Breynaert C., Dresselaers T., Perrier C., Arijs I. et al. Unique gene expression and MR T2 relaxometry patterns define chronic murine dextran sodium sulphate colitis as a model for connective tissue changes in human Crohn's disease. PLoS One. 2013; 8 (7): e68876.

68. Bento A.F., Leite D.F.P., Claudino R.F., Hara D.B. et al. The selective nonpeptide CXCR2 antagonist SB225002 ameliorates acute experimental colitis in mice. J. Leukoc. Biol. 2008; 84 (4): 1213-21.

69. Albert E.J., Duplisea J., Dawicki W., Haidl I.D. et al. Tissue eosinophilia in a mouse model of colitis is highly dependent on TLR2 and independent of mast cells. Am. J. Pathol. 2011; 178 (1): 150-60.

70. Bento A.F., Leite D.F.P., Marcon R., Claudino R.F. et al. Evaluation of chemical mediators and cellular response during acute and chronic gut inflammatory response induced by dextran sodium sulfate in mice. Biochem. Pharmacol. 2012; 84 (11): 1459-69.

71. Fournier B.M., Parkos C.A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Mucosal Immunol. 2012; 5 (4): 354-66.

72. El Kebir D., Filep J.G. Targeting neutrophil apoptosis for enhancing the resolution of inflammation. Cells. 2013; 2 (2): 330-48.