Способ определения свободно-радикального окисления в модельной системе
METHOD FOR DETERMINING FREE RADICAL OXIDATION IN MODEL SYSTEM

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к лабораторным способам определения скорости перекисного окисления липидов, и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности растительного сырья, в частности, для разработки способов лечения окислительного стресса у животных.
В настоящее время считается, что целый ряд патологий и патологических состояний сопровождается развитием окислительного стресса, характеризующегося патологически высоким уровнем свободнорадикального окисления и снижением ниже нормы антиоксидантной защиты.
Для изыскания средств и разработки способов антиоксидантной защиты на их основе необходимо убедиться в их антиоксидантной активности, для чего используются модельные системы перекисного окисления липидов.
Известны модельные системы перекисного окисления липидов (ПОЛ), уровень свободнорадикального окисления в которых определяют по показателю малонового диальдегида (МДА). Изучение антиоксидантной активности химических соединений проводят с использованием в качестве субстрата ПОЛ липосомальных дисперсий, приготовленных инжекторным способом. Для получения липосом в основном используют яичный лецитин [Зайцев В.Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантного действия лекарственных препаратов. Дисс. к-та биол. наук. - Волгоград. - 2001. - С. 104] и соевый лецитин [Ярован Н.И., Комиссарова Н.А. Разработка препаратов с антиоксидантной защитой для птиц на основе сабельника болотного (Comarum palustre L.), Вестник ОрелГАУ - 2014. - С. 36-40].
Наиболее близким техническим решением к заявляемому решению является способ оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.), заключающийся в определении антиоксидантной активности в водных настоях сабельника болотного по снижению уровня свободнорадикального окисления, который определяют по уровню малонового диальдегида (МДА) методом взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой в модельной системе перекисного окисления липидов, представленной полученными из лецитина липосомами (патент РФ №2535139) [1].
В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.
Недостатком использования известных модельных систем являются длительность окисления липосом и недостаточная точность определения уровня свободнорадикально окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА).
Кроме того, недостаточно изученным остается вопрос о возможности использования лецитинов различного происхождения в системе перекисного окисления липидов.
Образцы лецитина сои содержат большее количество триглицеридов, свободных жирных кислот и фосфатидилэтаноламина, однако меньшее количество фосфатидных кислот и фосфатидилхолина, чем лецитин подсолнечника, играющего определяющую роль в перекисном окислении липидов (НИИ медико-биологических проблем ГУ «ДМА» МОЗ Украины. Днепропетровск ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины», Киев BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 1, 2014) [2].
Жирные кислоты триацилглицеринов нейтрального масла, содержащегося в соевых лецитинах, более ненасыщенны по сравнению с жирными кислотами триацилглицеринов нейтрального масла, содержащегося в подсолнечных лецитинах, а жирные кислоты, содержащиеся в фосфолипидах соевых лецитинов, более насыщенны по сравнению с жирными кислотами, содержащимися в фосфолипидах подсолнечных лецитинов (Корнена Е.П. Химический состав, строение и свойства фосфолипидов подсолнечных и соевых масел. Дис. … д-ра техн. наук. Краснодар, 1987. 386 с. ) [3].
Задачей предлагаемого способа является уменьшение времени окисления липосом и повышение точности определения свободнорадикально окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА) за счет уточнения условий проведения основных этапов анализа и использования лецитина из подсолнечника.
Техническим результатом изобретения является повышение чувствительности и точности определения концентрации малонового диальдегида.
Поставленная задача и указанный технический результат достигаются благодаря тому, что в способе получения модельной системы на основе лецитина из подсолнечника для определения свободнорадикального окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА), включающем получение 10% спиртового раствора лецитина, из 0,25 мл полученного раствора лецитина и 5 мл дистиллированной воды инжекционным способом готовят суспензию липосом, в полученную суспензию липосом добавляют 0,2 мл 0,05 н. соляной кислоты и впрыскивают 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода, нагревают при температуре 38°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Дополнительное введение кислоты в суспензию липосом объясняется необходимостью подкисления среды, поскольку процессы окисления в липосомах наиболее активно протекают в более кислой среде, что способствует большему образованию свободных радикалов и позволит сократить на 30 часов (по сравнению с прототипом) проведение анализа.
Окисление суспензии липосом проводят при температуре 38°C с целью повышения скорости протекания процесса.
Перед проведением исследования на фотоэлектроколориметре пробы подвергают центрифугированию для получения прозрачных растворов с целью повышения точности анализа.
Данная система позволяет проводить широкомасштабные исследования растительного сырья на антиоксидантную активность и повышает точность определения.
Реализация способа состоит в следующем: готовят 2 модельные системы перекисного окисления липидов: контрольную (1) - на основе соевого лецитина и опытную (2) - на основе лецитина из подсолнечника.
Пример
Экспериментальные исследования проводились в химических лабораториях ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный Университет».
Готовились 2 модельные системы перекисного окисления липидов: 1 - на основе соевого лецитина и 2 - на основе лецитина из подсолнечника (с добавлением кислоты, проведением окисления суспензии липосом при повышении температуры до 38°C с одновременным перемешиванием и центрифугированием перед фотоэлектроколориметрированием).
1 система - на основе соевого лецитина.
1 этап. Приготовление липосом. Для приготовления 10% раствора лецитина вводили лецитина в 5 мл 96%-го спирта, нагревали до 30-40°С и интенсивно перемешивали до однородного состояния. Липосомы готовили инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-ного раствора лецитина.
2
2
Окисление липосом. В приготовленную суспензию липосом впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода (НО) и нагревали при температуре 37°С в течение 6 часов. Далее 2 суток выдерживали при комнатной температуре.
2 этап. Определение концентрации МДА в модельной системе. В модельную систему к 0,5 мл суспензии липосом добавляли 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Нагревали 15 минут на кипящей водяной бане, после чего исследовали полученный раствор на фотоколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды.
В модельной системе перекисного окисления липидов исследовали уровень свободнорадикального окисления липидов по показателю МДА, МДА определяли по реакции с ТБК.
2 система - на основе соевого лецитина.
1 этап. Приготовление липосом. Для приготовления 10% раствора лецитина вводили лецитин в 5 мл 96%-го спирта, нагревали до 30-40°С и интенсивно перемешивали до однородного состояния. Липосомы готовили инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-го раствора лецитина. Далее в суспензию липосом добавляли 0,2 мл 0,05 и соляной кислоты с целью достижения оптимальной для протекания реакции пероксидации кислотности (рН).
2
2
Окисление липосом. В приготовленную суспензию липосом модельной системы впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекиси водорода (НО) и нагревали при температуре 38°С в течение 30 мин при постоянном интенсивном перемешивании.
2 этап. Определение концентрации МДА в модельной системе. В контрольную модельную систему к 0,5 мл суспензии липосом добавляли 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Нагревали 5 минут на кипящей водяной бане с последующим охлаждением в ледяной воде в течение 5 мин, после чего пробы подвергали центрифугированию в течение 5 мин при 9000 об/мин и исследовали полученный раствор на фотоколориметре. Оптическую плотность измеряли при 532 нм против дистиллированной воды с использованием кюветы с толщиной рабочего слоя 5 мм.
Результаты определения уровня перекисного окисления липидов в известной и предложенной модельных системах представлены в таблице.
Полученные результаты показали, что в предлагаемом способе уменьшается время окисления липосом и повышается точность определения уровня свободнорадикально окисления по концентрации малонового диальдегида (МДА) за счет уточнения условий проведения основных этапов анализа.