СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ПНЕВМОФИБРОЗА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
MEANS FOR PNEUMOFIBROSIS PREVENTION AND TREATMENT AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

Изобретение относится к медицине, а именно пульмонологии, а также фармацевтической промышленности и биотехнологии, и предназначено для получения средства, обладающего антифибротической активностью, которое может быть использовано для профилактики и лечения пневмофиброза.
Пневмофиброз включает в себя гетерогенную группу легочных расстройств, характеризующихся прогрессирующей и необратимой деструкцией архитектуры альвеолярного эпителия, вызванной образованием рубцов, что приводит к нарушению газообмена и в конечном итоге к смерти от дыхательной недостаточности. Идиопатический пневмофиброз - наиболее тяжелая форма пневмофиброза с неизвестной этиологией, хотя описаны различные потенциальные факторы риска, такие как курение, генетические факторы, вирусные инфекции, радио- и химиотерапия, воздействие окружающей среды и др. Медикаментозная терапия при пневмофиброзе разделяется на противовоспалительную терапию, антифиброзную терапию и терапию, направленную на устранение нежелательных симптомов. В действующем в настоящее время Руководстве по диагностике и ведению идиопатического пневмофиброза [Raghu G., Rochwerg B., Zhang Y. et al. An Official ATS/ERS/JRS/ALAT Clinical Practice Guideline: Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. An Update of the 2011 Clinical Practice Guideline. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2015, Vol. 192, №2, P. e3-19], разработанном под эгидой Европейского респираторного общества, Американского торакального общества, Японского респираторного общества и Латиноамериканской торакальной ассоциации, даются научно обоснованные рекомендации но лечению пациентов и подчеркивается, что в настоящее время невозможно сделать однозначный выбор в пользу какой-либо одной медикаментозной терапии для идиопатического пневмофиброза.
Среди средств для антифиброзной терапии могут использоваться лекарственные средства на основе гиалуронидазы, поскольку этот фермент препятствует образованию коллагеновых волокон и является наиболее универсальным средством воздействия на соединительную ткань. Однако препараты на основе нативной гиалуронидазы малоэффективны. При парентеральном пути введения они быстро инактивируются ингибиторами сыворотки крови. Кроме этого эти препараты термолабильны, требуют длительного курса лечения, и при их применении возможно развитие аллергических реакций у пациента [Самцов А.В., Лучина Е.Н. Клинический опыт применения препаратов на основе гиалуронидазы: комплексная терапия Рубцовых деформаций кожи. Экспериментальная и клиническая дерматокосметология, 2012, №6, С. 33-37].
Гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза (далее - ГЭБНА) - фермент из семейства гиалуронидаз. Специфическая активность нативной ГЭБНА заключается в расщеплении гиалуроновой кислоты на низкомолекулярные фрагменты. Известно, что ГЭБНА препятствует гибели клеток альвеолярного эпителия и развитию пневмофиброза у мышей, однако ее концентрация в тканях легкого из-за воздействия протеолитических ферментов быстро уменьшается, что приводит к прогрессии фиброза легких. Задача защиты фермента от действия ингибиторов сыворотками крови решается путем его связывания с высокомолекулярными инертными носителями.
В клинической практике в настоящее время используется препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани [патент RU 2112542, МПК A61 38/43, опубл. 10.06.1998], который содержит конъюгат фермента гиалуронидаза с высокомолекулярным синтетическим носителем полиоксидоний, молекулярная масса которого 40000-100000 Да. К недостаткам этого препарата можно отнести отсутствие тканевой кумуляции, в том числе и в тканях легких.
Наиболее близкой к заявляемому средству является иммобилизированная на полиоксиэтилене нативная тестикулярная ГЭБНА, полученная с помощью электронно-лучевого синтеза и обладающая антифибротической активностью [патент RU 2409669, МПК C12N 11/08, опубл. 20.01.2011]. Недостаток данного способа заключается в том, что в процессе иммобилизации на полиоксиэтилене ГЭБНА подвергается воздействию ионизирующего излучения, и это приводит к частичному ее разрушению. Тем не менее, данное средство является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату: иммобилизированная на полиоксиэтилене нативная тестикулярная ГЭБНА обладает высокой эффективностью в условиях экспериментальной модели необратимого фиброза мышей при введении в терапевтическом режиме [Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Ермакова Н.Н. и др. Антифибротические эффекты иммобилизированной гиалуронидазы при повторяющихся травмах альвеолярного эпителия блеомицином. Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2013, Т. 155, №4, С. 499-503]. Однако недостаток данного средства заключается в том, что при его введении в профилактическом режиме на мышиной модели частично обратимого фиброза, эффективность не так значительна.
Технический результат, достигаемый данным изобретением, заключается в создании средства для профилактики и лечения пневмофиброза и разработке способа получения этого средства, при котором исключено ионизирующее воздействие на сам фермент.
Заявленный технический результат достигается в средстве для профилактики и лечения пневмофиброза, полученном путем облучения раствора триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена ионизирующим излучением и последующим добавлением к облученному раствору гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы и стабилизатора и представляющем прозрачный раствор, обладающий специфической активностью гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы от 50 до 150 УЕ/мл, с величиной pH от 4,5 до 7,5, мутнеющий при термостатироваиии выше 30°C и вновь становящийся прозрачным при охлаждении до температуры от 15 до 25°C. Заявленный технический результат достигается также в способе получения заявляемого средства, включающем облучение раствора триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена с концентрацией от 0,25 до 8,00% ионизирующим излучением (потоком ускоренных электронов или гамма-излучением) в дозе от 0,25 до 2,00 Мрад и последующее добавление к облученному раствору гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы до концентрации от 50 до 200 УЕ/мл, и растворимого в воде неорганического стабилизатора. В качестве растворителя используют очищенную воду или водные буферные растворы, обеспечивающие поддержание pH от 4,5 до 7,5. В качестве триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена используют полимер с нижней критической температурой растворения от 30 до 40°C (например, Pluronic L31 производства фирмы BASF, Германия), в качестве гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы используют нативную бычью тестикулярную гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу (например, производства ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург, Россия), а в качестве стабилизатора - хлористый натрий в концентрации 0,9%. В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов, полученный любым доступным способом, например в промышленном импульсном линейном ускорителе ИЛУ-10. В целях хранения к полученному раствору заявляемого средства может быть добавлен консервант (предпочтительно вещество, не проявляющее поверхностно-активные свойства и не содержащее атомы тяжелых металлов, например бензоат натрия) до концентрации в растворе не более 0,1%, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив и фасовку в стерильную упаковку в стерильных условиях, например во флаконы. Заявляемое средство используют в виде раствора.
Отличие заявляемого средства от прототипа заключается в том, что по сравнению с прототипом заявляемое средство:
- эффективно при применении не только в терапевтическом, но и в профилактическом режиме: на модели частично обратимого пневмофиброза мышей при профилактическом режиме введения статистически достоверно снижает уровень коллагена 1 типа, гидроксипролина, гиалуроновой кислоты и общего коллагена до уровня интактного контроля;
- более эффективно препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия и фиброзу в легочной ткани: содержание соединительной ткани в легких мышей на модели частично обратимого пневмофиброза на 21 сутки исследования при профилактическом режиме введения заявляемого средства составляет 1,17±0,05% против 2,16±0,18% для иммобилизированной на полиоксиэтилене тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы, при терапевтическом режиме введения эти показатели составляют 1,83±0,09% и 2,29±0,17% соответственно;
- более эффективно разрушает профибротический матрикс гиалуронана, снижает активность синтеза коллагена и отложения фибротических масс в легочной ткани, при этом отмечается значительное уменьшение содержания соединительной ткани в паренхиме легких: при курсовом введении заявляемого средства на модели необратимого пневмофиброза содержание соединительной ткани в легких мышей на 21 сутки эксперимента составляет 2,41±0,09% против 2,91±0,32% при курсовом введении иммобилизированной на полиоксиэтилене тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Кроме того, заявляемое средство получено способом, при котором:
- исключено облучение ГЭБНА ионизирующим излучением, что способствует сохранению активности фермента, уменьшению технологических потерь и снижению себестоимости продукта;
- в качестве высокомолекулярного полимера-носителя используют блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена, который в силу своих физико-химических свойств позволяет заявляемому средству кумулироваться в легких и проходить через эпителий дыхательных путей и альвеол;
- в качестве стабилизатора конечной формы продукта используют хлористый натрий, разрешенный к применению в фармацевтических средствах, в концентрации 0,9%, что соответствует концентрации в физиологическом растворе и обеспечивает минимальное раздражающее воздействие на эпителий дыхательных путей.
Заявляемое средство позволяет увеличивать время действия ГЭБНА без потери эффективности за счет связывания с инертным носителем, защищающим ее от денатурирующего воздействия протеаз и ингибиторов и обеспечивающим сохранение фармакологической активности без повышения дозы и частоты введения. Антифибротическое действие заявляемого средства показано на модели блеомицин-индуцированного частично обратимого и необратимого пневмофиброза мышей при введении в профилактическом и терапевтическом режимах.
Блеомицин относится к группе цитостатиков. Основное токсическое действие блеомицин оказывает на легкие: вызывает пневмонию, фибротические изменения в паренхиме легких и субплевральное рубцевание аналогичное человеческому заболеванию, поэтому модель токсического пневмофиброза, вызванная интратрахеальным введением блеомицина, наиболее широко применяется в экспериментах по изучению патогенеза и поиску возможных способов лечения фиброзных заболеваний легких. Однако в условиях однократной интратрахеальной инсталляции блеомицина вызываемый пневмофиброз частично обратим, в связи с чем на экспериментальных животных, получавших блеомицин однократно, невозможно изучение аспекта медленного и необратимого прогрессирования заболевания. Необратимый пневмофиброз (в том числе идиопатический пневмофиброз) развивается в силу многократно повторяющихся (циклических) травм альвеолярного эпителия. В основе животной модели циклического повреждения легкого выступает многократное интратрахеальное введение блеомицина с помощью интубации трахеи. Гистологические показатели легких при многократном введении блеомицина более коррелирует с человеческим идиопатическим пневмофиброзом, чем однократная инсталляция цитостатика. В связи с вышеизложенным при изучении антифибротического действия заявляемого средства было использовано 2 модели экспериментального пневмофиброза.
1. Модель частично обратимого пневмофиброза
Частично обратимый пневмофиброз моделируют однократным интратрахеальным введением раствора блеомицина мышам из расчета 80 мкг блеомицина сульфата (Blenoxane; « Paulo», Бразилия) в 30 мкл физиологического раствора на одно животное. Контрольным животным в аналогичных условиях вводят эквивалентный объем физиологического раствора (группа контроля). Для сравнения используют интактных животных (группа интактного контроля).
Специфические эффекты заявляемого средства исследовали в сравнении с иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент", г. Новосибирск) и нативной тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (ООО Самсон-Мед, г. Санкт-Петербург, Россия). Препараты вводили интраназально, ежедневная доза препаратов составляла 8 УЕ.
Препараты испытывали в двух режимах - профилактическом и терапевтическом. Профилактический режим: введение препаратов проводят в фазу становления воспалительной реакции (ежедневно с 1-х по 5-е сутки после введения блеомицина). Терапевтический режим: введение препаратов проводят в фазу отложения фибротических масс в паренхиме легких (ежедневно с 10-х по 20-е сутки после введения блеомицина).
2. Модель необратимого пневмофиброза
Для моделирования необратимого пневмофиброза в первые сутки эксперимента раствор блеомицина вводят мышам интратрахеально из расчета 80 мкг блеомицина в 30 мкл физиологического раствора на мышь, далее - в 7, 14, 21, 28-е сутки эксперимента раствор блеомицина вводят интраназально из расчета 80 мкг блеомицина в 15 мкл физиологического раствора на мышь. Контрольным животным в аналогичных условиях вводят эквивалентный объем физиологического раствора (группа контроля). Для сравнения используют интактных животных (группа интактного контроля).
Специфические эффекты заявляемого средства исследовали в сравнении с иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент", г. Новосибирск) и нативной тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (ООО Самсон-Мед, г. Санкт-Петербург, Россия). Препараты вводили интраназально в терапевтическом режиме (на 10-20-е сутки эксперимента), ежедневная доза препаратов составляла 8 УЕ.
2
Исследования легких проводили на 3, 7, 14, 21-е сутки опыта на модели частично обратимого пневмофиброза и на 21, 40, 60-е сутки опыта на модели необратимого пневмофиброза. Эвтаназию мышей осуществляли передозировкой CO, после чего изучали морфологическую картину легких.
Для проведения гистологических исследований стандартно обработанные легкие мышей окрашивали по Ван-Гизону на соединительную ткань. С помощью компьютерного графического анализа на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь коллагеновых волокон в ткани легкого. Затем вычисляли долю этих показателей от стандартной площади среза.
™
Уровни коллагена I типа, гидроксипролина и гиалуроновой кислоты определялись методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителя (Cusabio Biotech CO., Ltd, China). Чувствительность ИФА для гидроксипролина>1,95 нг/мл, для гиалуроновой кислоты>15,6 пг/мл и для коллагена I типа>0,039 нг/мл. Общий коллаген определяли с помощью стандартной кривой Sircol анализа (Biocolor Ltd, UK) в соответствии с инструкциями изготовителя, предел обнаружения: 1,0 мкг/100 мкл.
Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Уилкоксона.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. 2% водный раствор Pluronic L31 облучают потоком ускоренных электронов в дозе 0,5 Мрад на импульсном линейному ускорителе ИЛУ 10. В облученный раствор вносят хлористый натрий до концентрации 0,9% и нативную бычью тестикулярную ГЭБНА до концентрации 100 УЕ/мл, перемешивают при комнатной температуре, добиваясь полного растворения, и получают готовое средство, представляющее собой прозрачный раствор слабокоричневого цвета без осадка и посторонних включений, с pH от 4,5 до 7,5, обладающий специфической активностью ГЭБНА 100 УЕ/мл, становящийся мутным при термостатировании выше 30°C и вновь становящийся прозрачным при охлаждении до температуры от 15 до 25°C. Готовое средство подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив и фасовку в стерильные флаконы в стерильных условиях.
Прозрачность и цветность раствора определялась визуально, pH - иотенциометрически, специфическая активность - прямой гидролитической реакцией полученного средства с гиалуроновой кислотой.
In vivo специфическое действие заявляемого средства было изучено на мышиных моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза.
1. Модель частично обратимого пневмофиброза мышей
На модели частично обратимого пневмофиброза у мышей при окрашивании легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань в интерстиции альвеол отмечается прогрессирующее разрастание соединительной ткани: на 7 сутки эксперимента соединительная ткань располагается в основном периваскулярно и перибронхиально, на 14, 21 сутки наблюдается диффузное распространение фибротических масс, на 21 сутки эксперимента содержание коллагеновых волокон наибольшее и составляет 4,12±0,14% от площади ткани легкого (табл. 1).
Интраназальное введение заявляемого средства в профилактическом режиме препятствует отложению коллагена в ткани легких у мышей. При окрашивании легкого по Ван-Гизону в легких больных животных, получавших препарат в профилактическом режиме, наблюдается уменьшение площади отложения фиброзных масс по сравнению с контролем. Эффективность заявляемого средства при профилактическом режиме введения выше эффективности иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА. Таблица 1 показывает, что при введении животным заявляемого средства в профилактическом режиме площадь коллагеновых волокон уменьшается до уровня интактного контроля, а при введении в терапевтическом режиме - уменьшается в 2,25 раза (p=0,0037). Антифибротическая активность заявляемого средства также значительно превосходит активность иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативной ГЭБНА.
Уровни коллагена I типа, гидроксипролина, гиалуроновой кислоты и общего коллагена определялись в гомогенатах легких методом ИФА на 21 сутки эксперимента, когда наблюдается наибольшее уменьшение количества фибротических масс в легких под влиянием заявляемого средства. Результаты представлены в таблице 2: выявлено снижение под влиянием заявляемого средства уровней коллагена I типа на 36,6%, гидроксипролина на 36,3%, гиалуроновой кислоты на 34,2% и общего коллагена (на 41,1%) по сравнению с контролем (таблица 2), при этом иммобилизированная на полиоксиэтилене ГЭБНА снижает только уровень гидроксипролина и не влияет на уровень коллагена 1 типа, гиалуроновой кислоты и общего коллагена, а нативная ГЭБНА не изменяет эти показатели.
Результаты морфологических исследований и ИФА показывают, что при частично обратимом фиброзе заявляемое средство препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия и развитию пневмофиброза. Эффективность заявляемого средства значительно превосходит активность иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативной ГЭБНА.
2. Модель необратимого пневмофиброза мышей
При изучении специфической активности заявляемого средства на модели необратимого пневмофиброза у мышей показано, что интраназальное введение заявляемого средства в терапевтическом режиме препятствует повреждению легких, при этом отмечается значительное уменьшение содержания соединительной ткани в паренхиме легких (табл. 3). В этих условиях иммобилизированная на полиоксиэтилене и нативная ГЭБНА оказывают более слабое влияние на количество фибротических масс в паренхиме легких. К 60-м суткам эксперимента погибают 30% животных из контрольной группы, а также получавших иммобилизированную на полиоксиэтилене и нативную ГЭБНА. При лечении заявляемым средством все животные выживают.
Таким образом, заявляемое средство эффективно в условиях необратимого пневмофиброза при терапевтическом режиме. Антифибротическая активность препарата превосходит иммобилизированную на полиоксиэтилене и нативную ГЭБНА. Это позволяет оценивать заявляемое средство как новый и перспективный инструмент для лечения пневмофиброза.
Пример 2. Заявляемое средство получали так же, как в примере 1, при этом концентрация водного раствора Pluronic L31 составляла 4%.