ПОДДАЮЩИЕСЯ РЕГУЛЯЦИИ ПО ТИПУ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ СИНТЕТИЧЕСКИЕ ГЕНЫ, КАССЕТЫ ОБЛАСТЕЙ-МИШЕНЕЙ УЗНАВАНИЯ ЗАТРАВКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Синтетический ген, содержащий:
полинуклеотид, содержащий кодирующую область, кодирующую представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, и одну или более регуляторных областей;
где полинуклеотид дополнительно содержит один или более фрагментов нуклеиновой кислоты, каждый из которых содержит область узнавания затравки, идентифицированную как участок связывания для эндогенной мкРНК, и 5’-фланкирующую последовательность и 3’-фланкирующую последовательность, соседние с указанной областью узнавания затравки;
где указанные один или более фрагментов нуклеиновой кислоты вставлены в регуляторную область указанного полинуклеотида, таким образом, что экспрессия указанных представляющих интерес белка или нуклеиновой кислоты, когда указанный синтетический ген доставляют в клетку, экспрессирующую эндогенную мкРНК, уменьшается, по сравнению с экспрессией представляющих интерес белка или нуклеиновой кислоты, когда синтетический ген, не содержащий эти один или более фрагментов нуклеиновой кислоты, доставляют в клетку, экспрессирующую эндогенную мкРНК.
TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX,
MECP2, SLC6A1, FOXG1, AKT3
2. Синтетический ген по п.1, где кодирующая область, кодирующая представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, содержит кодирующую область гена, выбранного из или их активных фрагментов.
MECP2
3. Синтетический ген по п.1, где кодирующая область, кодирующая представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, содержит кодирующую область гена или его активного фрагмента.
4. Синтетический ген по любому из пп. 1-3, где области узнавания затравки, и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с одной или несколькими мкРНК, выбранными из miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p или любой их комбинации.
5. Синтетический ген по любому из пп. 1-3, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с мкРНК miR-9-5p, miR-26-5p miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p и let-7-5p.
6. Синтетический ген по любому из пп. 1-3, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с мкРНК miR-690, miR-451a и let-7-5p.
7. Синтетический ген по любому из пп. 1-6, где область узнавания затравки имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 10 нуклеотидов.
8. Синтетический ген по любому из пп. 1-6, где область узнавания затравки имеет длину от приблизительно 6 до приблизительно 8 нуклеотидов.
9. Синтетический ген по любому из пп. 1-6, где каждая из 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей, соседних с областью узнавания затравки, имеет длину от приблизительно 9 до приблизительно 13 нуклеотидов.
10. Синтетический ген по любому из пп. 1-6, где каждая из 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей, соседних с областью узнавания затравки, имеет длину 11 нуклеотидов.
11. Синтетический ген по любому из пп. 1-6, где полинуклеотид содержит по меньшей мере две области узнавания затравки, и области узнавания затравки отделены посредством от приблизительно 7 до приблизительно 40 нуклеотидов.
12. Синтетический ген по п.11, где по меньшей мере две области узнавания затравки отделены посредством от приблизительно 20 до приблизительно 25 нуклеотидов.
13. Синтетический ген по п.11, где по меньшей мере две области узнавания затравки отделены посредством 22 нуклеотидов.
14. Синтетический ген по любому из пп. 11-13, где полинуклеотид содержит 3-8 областей узнавания затравки.
15. Синтетический ген по любому из пп. 1-14? где области узнавания затравки, и фланкирующие 3’- и 5’-последовательности, соседние с областями узнавания затравки, содержат нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO:1.
16. Синтетический ген по любому из пп. 1-14, где области узнавания затравки, и фланкирующие 3’- и 5’-последовательности, соседние с областями узнавания затравки содержат нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO:2.
17. Вектор, содержащий синтетический ген по любому из пп. 1-16.
18. Вектор по п.17, где вектор представляет собой плазмиду, вирусный вектор, экспрессирующую кассету, трансформированную клетку или наночастицу.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая синтетический ген по любому из пп. 1-16 или вектор по п.17 или 18 и фармацевтически приемлемый носитель.
20. Кассета полинуклеотида-мишени для обеспечения зависимой от дозы ингибирующей обратной связи для синтетического гена, содержащая один или более фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащие область узнавания затравки, идентифицированную как участок связывания для эндогенной мкРНК, и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности, соседние с указанной областью узнавания затравки.
21. Кассета полинуклеотида-мишени по п.20, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с одной или несколькими мкРНК, выбранными из miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p или любой их комбинации.
22. Кассета полинуклеотида-мишени по п.20, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с мкРНК miR-9-5p, miR-26-5p miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p и let-7-5p.
23. Кассета полинуклеотида-мишени по п.20, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с мкРНК miR-690, miR-451a и let-7-5p.
24. Кассета полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-23, где область узнавания затравки имеет длину от приблизительно 5 до приблизительно 10 нуклеотидов.
25. Кассета полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-23, где область узнавания затравки имеет длину от приблизительно 6 до приблизительно 8 нуклеотидов.
26. Кассета полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-25, где каждая из 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей, соседних с областью узнавания затравки, имеет длину от приблизительно 9 до приблизительно 13 нуклеотидов.
27. Кассета полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-25, где каждая из 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей, соседних с областью узнавания затравки, имеет длину 11 нуклеотидов.
28. Кассета полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-27, где области узнавания затравки, и фланкирующие 3’- и 5’-последовательности, соседние с областями узнавания затравки, содержат нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO:1.
29. Кассета полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-27, где области узнавания затравки, и фланкирующие 3’- и 5’-последовательности, соседние с областями узнавания затравки, содержат нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO:2.
30. Способ получения синтетического гена, содержащего полинуклеотид, содержащий кодирующую область, кодирующую представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, и одну или более регуляторных областей, включающий стадию вставки кассеты полинуклеотида-мишени по любому из пп. 20-29 в регуляторную область синтетического гена.
31. Способ получения синтетического гена по любому из пп. 1-16, включающий стадии:
вставки одного или более фрагментов нуклеиновой кислоты, каждый из которых содержит область узнавания затравки, идентифицированную как участок связывания для эндогенной мкРНК, и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности, соседние с указанной областью узнавания затравки, в регуляторную область полинуклеотида, содержащего кодирующую область, кодирующую представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, и одну или более регуляторных областей.
TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX,
MECP2, SLC6A1, FOXG1, AKT3
32. Способ по п.31, где кодирующая область, кодирующая представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, содержит кодирующую область гена, выбранного из или их активных фрагментов.
MECP2
33. Способ по п.31, где кодирующая область, кодирующая представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, содержит кодирующую область гена или его активного фрагмента.
34. Способ по любому из пп. 31-33, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с одной или несколькими мкРНК, выбранными из miR-690, miR-124-3p, miR-451a, miR-9-5p, miR-26-5p, miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p, let-7-5p/98-5p, miR-29-3p, miR-338-3p, miR-98-5p, miR-7-5p, miR-494-3p или любой их комбинации.
35. Способ по любому из пп. 31-33, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с мкРНК miR-9-5p, miR-26-5p miR-23-3p, miR-218-5p, miR-27-3p и let-7-5p.
36. Способ по любому из пп. 31-33, где области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности связываются с мкРНК miR-690, miR-451a и let-7-5p.
37. Способ по п.31, дополнительно включающий стадии:
скрининга мкРНК с увеличением экспрессии, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота экспрессированы в клетке, по сравнению с тем, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота не экспрессированы;
идентификации области узнавания затравки, и 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей для одной или более мкРНК, имеющих увеличенную экспрессию; и
получения фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего указанные область узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующие последовательности, подлежащего вставке в регуляторную область указанного полинуклеотида.
38. Способ идентификации одной или более областей узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей, подлежащих вставке в синтетический ген, включающий стадии:
идентификации областей узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей для одной или более мкРНК, имеющих увеличенную экспрессию, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота экспрессированы в клетке, по сравнению с тем, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота не экспрессированы в клетке; и
вставки указанной области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующих последовательностей в регуляторную область синтетического гена, содержащего полинуклеотид, содержащий кодирующую область, кодирующую представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, и одну или более регуляторных областей.
39. Способ по п.38, дополнительно включающий стадию:
скрининга набора данных для нуклеиновой кислоты по подтвержденной или предположительной области узнавания затравки и 5’- и 3’-фланкирующим последовательностям.
40. Способ по п. 38 или 39, дополнительно включающий стадию:
идентификации мкРНК с увеличенной экспрессией, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота экспрессированы в клетке, по сравнению с тем, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота не экспрессированы в клетке.
41. Способ по любому из пп. 38-40, дополнительно включающий стадию:
скрининга набора данных для нуклеиновой кислоты по мкРНК с увеличенной экспрессией, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота экспрессированы в клетке, по сравнению с тем, когда представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота не экспрессированы в клетке.
42. Способ по любому из пп. 38-41, дополнительно включающий стадии:
экспрессии представляющих интерес белка или нуклеиновой кислоты в клетке;
сбора мкРНК из клетки; и
расчета уровней экспрессии указанных мкРНК, когда указанные представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота экспрессированы в клетке, по сравнению с тем, когда указанные представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота не экспрессированы в клетке, таким образом, создания набора данных для нуклеиновой кислоты указанных мкРНК.
43. Способ по любому из пп. 39, 41 или 42, где набор данных для нуклеиновой кислоты представляет собой набор данных для 3’-UTR.
TCF4, UBE3A, DYRK1A, MEF2C, NSD1, ZEB2, MBD5, RPS6KA3, ATRX,
SLC6A1, FOXG1, AKT3, MECP2
44. Способ по любому из пп. 38-43, где представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота являются продуктом транскрипции или трансляции гена, выбранного из или их активных фрагментов.
MECP2
45. Способ по любому из пп. 38-43, где представляющие интерес белок или нуклеиновая кислота представляют собой продукт транскрипции или трансляции гена или его активного фрагмента.
46. Способ доставки синтетического гена субъекту, включающий введение субъекту синтетического гена по любому из пп. 1-16, вектора по п.17 или 18, или фармацевтической композиции по п.19 с обеспечением, таким образом, доставки синтетического гена субъекту.
47. Способ лечения заболевания, ассоциированного с аномальной экспрессией эндогенного гена или экспрессией мутантного белка, кодированного эндогенным геном, включающий введение синтетического гена по любому из пп. 1-16, вектора по п.17 или 18, или фармацевтической композиции по п.19, кодирующих представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, кодируемые эндогенным геном, с обеспечением, таким образом, лечения заболевания.
48. Способ по п.46 или 47, где субъект представляет собой человека.
49. Способ по любому из пп. 46-48, где субъект имеет нарушение или подвержен риску развития зависимого от дозы гена нарушения интеллектуальных способностей.
50. Способ по любому из пп. 46-48, где субъект имеет нарушение или подвержен риску развития нарушения, выбранного из группы, состоящей из синдрома Ретта, синдрома дупликации MeCP2, синдрома Ангельмана, dup15Q, гаплонедостаточности DYRK1A, синдрома Дауна, синдрома гаплонедостаточности MEF2C, dup5Q14,3, синдрома Сотоса, обратного синдрома Сотоса, синдрома Х-сцепленной альфа-талассемии с ограниченными интеллектуальными способностями, дупликации Xq13.2q21.1, синдрома Коффина-Лоури, дупликации Xp22.12, синдрома Питта-Хопкинса, синдрома Мовата-Вильсона, трипликации 2q22.3, дупликации 2q23.1, микроделеции 2q23.1, синдрома FOXG1, синдрома Веста, синдрома мегалэнцефалии-полимикрогирии-полидактилии-гидроцефалии, дупликации AKT3, синдрома Дузе, дупликации SLC6A1 и трисомии 18.
51. Способ по любому из пп. 46-50, где субъект имеет синдром или подвержен риску развития синдрома Ретта или синдрома дупликации MeCP2.
52. Способ по любому из пп. 46-51, где синтетический ген, вектор или фармацевтическую композицию доставляют способом доставки, выбранным из группы, состоящей из энтерального, парентерального, интратекального, интрацистернального, интрацеребрального, интравентрикулярного, интраназального, внутриушного, интраокулярного, периокулярного, ректального, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного, перорального, подъязычного, подкожного и чрескожного.
53. Способ по любому из пп. 46-51, где синтетический ген доставляют внутривенно.
54. Способ по любому из пп. 46-51, где синтетический ген доставляют интра-CSF.
55. Способ по пп. 46-54, дополнительно включающий генетический нокдаун эндогенного гена, кодирующего представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, у субъекта.
MECP2.
56. Способ по п.55, где эндогенный ген представляет собой
57. Способ лечения заболевания, ассоциированного с аномальной экспрессией эндогенного гена или экспрессией мутантного белка, кодированного эндогенным геном, у субъекта, включающий генетический нокдаун эндогенного гена в клетке субъекта и введение синтетического гена по любому из пп. 1-14, вектора по п.15 или 16 или фармацевтической композиции по п.17, кодирующих представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту, кодируемые эндогенным геном, с обеспечением, таким образом, лечения заболевания.
58. Способ по п.57, где заболевание представляет собой синдром Ретта, синдром дупликации MeCP2, синдром Ангельмана, dup15Q, гаплонедостаточность DYRK1A, синдром Дауна, синдром гаплонедостаточности MEF2C, dup5Q14,3, синдром Сотоса, обратный синдром Сотоса, синдром Х-сцепленной альфа-талассемии с ограниченными интеллектуальными способностями, дупликацию Xq13.2q21.1, синдром Коффина-Лоури, дупликацию Xp22.12, синдром Питта-Хопкинса, синдром Мовата-Вильсона, трипликацию 2q22.3, дупликацию 2q23.1, микроделецию 2q23.1, синдром FOXG1, синдром Веста, синдром мегалэнцефалии-полимикрогирии-полидактилии-гидроцефалии, дупликацию AKT3, синдром Дузе, дупликацию SLC6A1 и/или трисомию 18.