Исследование свойств коллагенсодержащих продуктов при ферментативной модификации белковых рыб

УДК 577.152.3

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩИХ ПРОДУКТОВ ПРИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ РЫБ

С.В. Старостина; С.В. Леваньков; М.А. Чернова;

Н.Г. Тунгусов; Н.В. Костюк; А.А. Попков; А.Г. Щинова, Дальрыбвтуз, Владивосток

Исследованы процессы модификации мышечных белков рыб ферментами трансглутаминазами. Показана возможность

использования коллагена в пищевых и кормовых продуктах в составе гибридных белков с высокой биологической ценностью.

Значительную долю продуктов функционального питания

составляет продукция, содержащая коллаген теплокровных животных и гидробионтов. Однако эффективность введения коллагена в состав белковых продуктов значительно ограничена его низкой термостабильностью и слабой интеграцией в структуру белковых гелей. Расширить возможность использования коллагена в технологиях пищевых или кормовых продуктов позволяют биотехнологии,

основанные на различных способах биохимической модификации мышечных белков, приводящей к изменению их структурномеханических, биохимических и биофизических свойств.

Наиболее перспективным направлением разработки технологий коллагенсодержащих белковых продуктов является использование специфических ферментов-структурообразователей - трансглутаминаз (кФ 2.3.3.13), в ряду которых фактор свертываемости крови (фактор ХШа) наиболее значим с практической точки зрения. Важными в биохимической модификации белков являются реакции поперечного сшивания белков, протекающие с образованием амидной связи между остатками глутамина и лизина, реакции включения аминов (переамидирования), деамидирования и гидролиза АТФ и ГТФ.

Для модельных экспериментов нами использовались мышечная ткань минтая, чешуя лососевых (нерки) в качестве источника коллагена, дефибринированная свиная кровь, стабилизированная антикоагулянтами.

Исследования сравнительной активности мышечных белков минтая в трансглутаминазной реакции проводили методом включения флуоресцирующего низкомолекулярного реагента -

монодансилкадаверина (МДК нМ реагента/мг белка в час).

Для минимизации процессов образования межцепочечных сшивок использовали растворы белков с низкой концентрацией (до 0,05 мг/л).

Результаты тестирования белков представлены на следующей диаграмме (рис. 1).

СИ саркоплазматические белки НИ миофибриллярные белки НИ белки стромы

Рис. 1. Активность белков в реакциях с участием трансглутаминаз в зависимости от рН среды

Модельные эксперименты показали изменения активности белков в реакции включения аминов в зависимости от рН. Для саркоплазматических белков максимум активности наблюдали при рН 7,4-7,5, для миофибриллярных - при рН 7,0-7,2. Белки стромы проявляли максимальную активность при рН 6,8-7,0, при этом показывали максимальную активность для всех групп мышечных белков.

Реакцию полимеризации под действием трансглутаминазы проводили при следующих параметрах: продолжительность процесса от одного до шести часов, температура - 25 °С. Реакцию останавливали быстрым нагревом реакционной смеси до 93-95 °С на водяной бане.

Доля продуктов полимеризации составляла 10-15 % от общего количества белка, вовлеченного в реакцию. Только для белков стромы образования поперечно-сшитых структур не наблюдалось.

Полученные результаты позволяют рассчитывать на положительный результат при биосинтезе гибридных структур, в качестве матрицы для которых рационально использовать белки стромы, а в качестве «прививок» комплекс саркоплазматических или миофибриллярных белков.

Эксперименты по включению МДК позволили установить, что если практически все саркоплазматические белки мышц являются хорошим субстратами для трансглутаминаз, то среди миофибриллярных белков наибольшая активность отмечалась для тяжелых цепей миозина (МТЦ), актина, а также первой и третьей легких миозиновых цепей (рис. 2).

Для тропонинов и тропомиозина продукты реакции образовывались в следовых количествах даже после обработки цепей

в течение

6 ч при 37 °С.

Вероятно, что при планировании биосинтеза гибридных белков наиболее активно интегрироваться в коллагеновую матрицу будут белки, проявившие большое сродство к МДК.

Однако при этом наблюдали

образование гибридных белков, основу которых составлял миозин.

Наибольшее сродство к миозину проявили актин, легкие цепи миозина и саркоплазматическая креатинкиназа.

При этом соединительно-тканные белки практически не образовывали ни

полимерных, ни гибридных продуктов.

Этим объясняется тот факт, что в условиях трансглутаминазной реакции увеличение доли коллагена всего до 56 % в белковой смеси проводит к образованию хрупких структур с низкими показателями прочности и высокими адгезионными

характеристиками, которые практически не изменяются при увеличении доли коллагена до 15 %. Такой подход позволяет получать пастообразную продукцию типа паст и паштетов, а также пищевые эмульсии.

Соединительно-тканный белок коллаген проявлял высокую активность в реакции с низкомолекулярными аминами, однако варьирование условий процесса (температура, кислотность, ионная сила раствора, время процесса и т.п.), проведение реакции в условиях кинетического или термодинамического контроля не приводили к образованию димеров даже для частично гидролизованных коллагеновых цепей.

Попытка изменить условия процесса изменением свойств поверхности коллагеновых фибрилл (иммобилизацией на диоксиде кремния, на силикагеле, насыщенном ионами кальция) почти на 30 % увеличивала сродство коллагена к МДК, однако продукты полимеризации обнаружены не были. Это открывает хорошую перспективу для использования в качестве катализатора трансглутаминазу крови (фибринстабилизирующий фактор, фактор свертываемости крови, фактор XШа) для реакции образования гибридных белков. Трансглутаминаза крови - белок плазмы крови,

Рис. 2. Миофибриллярные белки. Диск-ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле концентрацией 10-12,5 %: а - окраска Coomasi Blu R-250;

б - после обработки МДК в присутствии трансглутаминазы

который стабилизирует образовавшийся фибрин, т.е. участвует в образовании прочных межмолекулярных связей в фибрин-полимере:

фактор XIII

фибриноген тр°мбин »- фибрин-мономв^~фаКТОр Х111а’ Са» фибрин-полимер фибрин-пептиды

При использовании фактора XШа крови, как было установлено, наиболее оптимальным условиям для химической иммобилизации саркоплазматических и миофибриллярных белков на коллагене является температура 30-35 °С, удельная активность трансглутаминазы 0,1-0,6 ед/мл крови при эквимолярном соотношении реагентов. Существенными факторами, определяющими доли иммобилированных белков в гибриде, являются время процесса и кислотность. Наиболее удобно было наблюдать образование гибридных белков методом ультрафиолетовой флуоресценции (УФФ) (рис. 3).

Рис. 3. УФФ-спектр гибрида, полученного при иммобилизации саркоплазматических белков на коллагене

Полимерную природу белка подтверждает сигнал при длине волны эмиссии Лех = 262 нм - сигнал эксимеров, сложных, различных по своей природе белков, когда возбуждение одного из них вызывает эмиссию, спектр которой накладывается на спектр поглощения другого белка, эмиссия которого и наблюдается в виде сигнала при Лех = 360 нм.

Важно, что максимум естественной флюоресценции белковых составляющих гибрида находится при Лех = 336 нм, что соответствует сохранению ими нативных конформаций и свидетельствует об отсутствии делокализованных конформационных изменении при синтезе гибрида.

Для получения реструктурированной продукции более приемлем метод биохимической модификации в условиях термодинамического контроля процесса. При этом с помощью регулирования активности трансглутаминазы и манипулирования процессами самосборки и гибридизации удается получить белковые гели с широким диапазоном реологических характеристик. Это позволяет без существенных различий в показателях пищевой и энергетической ценности продукции получать функциональные продукты для широкого круга потребителей.

Однако введение в состав белковой смеси дополнительных количеств коллагена практически нивелировало различия реологических характеристик белковых гелей, получаемых в условиях кинетического и термодинамического контроля.

Модельные эксперименты на изолированных мышечных белках позволили установить, что эффективность образования прочных связей миофибриллярных белков с коллагеном зависит от соотношения времен процессов диссоциации (образования белкового золя) и структурирования (образования геля), которые легко регулируются скоростью увеличения температуры при тепловой обработке. Анализ изменения динамических реологических характеристик - модуля сохранения и модуля потерь - позволил установить, что в условиях термодинамического контроля процесса в зависимости от скорости нагревания можно добиться получения гелей с тем же диапазоном реологических характеристик, но с содержанием коллагена в белковой смеси до 20 %. Так, прочность и эластичность камабоко из фарша минтая с содержанием коллагена 20 % практически в точности соответствует характеристикам продуктов на основе немодифицированного фарша минтая.

Сопоставление динамики изменения реологических характеристик белковых смесей с качественным и количественным составами продуктов иммобилизации мышечных белков на волокнах коллагена при термообработке в диапазоне температур образования золей позволило сделать вывод, что наилучшая воспроизводимость результатов достигается тогда, когда количество интегрированных в коллаген белков пропорционально их содержанию в нативной мышце. В свою очередь, это достигается оптимизацией температурного режима и введением в белковую смесь диссоциирующих агентов.

Нами установлено, что степень связывания водорастворимых белков с коллагеном под действием трансглутаминазы не влияет на конечные показатели прочностных и вязкостных характеристик гелей. Полученные нами данные позволяют предположить, что иммобилизация субъединиц саркоплазматических белков на коллагене препятствует их олигомеризации, а значит, не влияет на их способность интегрироваться в структуру гелей при достижении температуры гелеобразования.

Оценку пищевой или питательной ценности гибридов проводили методом биотестирования с использованием инфузории Те^аИутепа рупЮпТЛБ.

Результаты представлены на диаграмме (рис. 4).

1-5 - белки, полимеризованные трансглутаминазой;

6-7 - не обработанные ферментом белки;

1, 6 - миофибриллярные;

2, 7 - саркоплазматические;

3 - коллаген;

4 - миофибриллярные белки, иммобилизованные на коллагене;

5 - саркоплазматические белки, иммобилизованные на коллагене.

Рис. 4. Количество спродуцированных клеток в пересчете на 1 г белка

На основании полученных данных сделаны следующие выводы:

- ферментативная модификация мышечных белков рыб позволяет регулировать свойства белковых продуктов и увеличивать в них долю коллагена;

- в присутствии трансглутаминазы коллаген является эффективным материалом для получения гибридных белков;

- фактор Х111а катализирует образование гибридных белковых систем на основе коллагена и продукты данной реакции имеют столь же высокие показатели биотестирования, как и исходные белки.

Библиографический список

1. Рыб. хоз-во. 1977. № 2. С. 72-73.

2. Николаев В.А. Изменение структурно-механических свойств пищевых продуктов. М.: Экономика, 1964. 170 с.

3. Биофизика. 1970. Т. 15. Вып. 6. С. 965-972.

4. Шелудько Н.С. Исходные экстракты в методах выделения сократительных белков // Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. Л.: Наука, 1978. С. 23-40.

5. Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 3. С. 327-337.