Способ дезинвазии против ооцист кокцидий лисиц и песцов
METHOD FOR DISINVASION AGAINST OOCYSTS OF COCCIDIA OF FOXES AND POLAR FOXES

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно протозоологии, и может быть использовано в звероводческих хозяйствах для профилактики кокцидиозов лисиц и песцов.
Кокцидиозы - протозойные заболевания лисиц, песцов, рысей, нутрий и других плотоядных, вызываемые простейшими семейства Eimeriidae подсемейства Eimeriinae и Isosporinae с родами Eimeria, Isospora и другими. Возбудители данного заболевания локализуются в эпителиальных клетках слизистой оболочки тонкого отдела кишечника. Цикл биологического развития кокцидий характеризуется тремя стадиями: спорогония, шизогония и гаметогония. Экзогенная стадия развития кокцидий происходит во внешней среде и называется спорогония. Эндогенные стадии развития кокцидий, которые совершаются в эпителиальных клетках кишечника, называются шизогония и гаметогония. Животные, зараженные кокцидиями, выделяют во внешнюю среду с фекалиями ооцисты этих паразитических простейших, которые покрыты плотной защитной оболочкой. После выделения во внешнюю среду ооцисты сразу не могут заразить других животных, поскольку им необходимо пройти процесс созревания или спорогонию при оптимальной температуре, необходимой влажности и доступе кислорода [1,2]. За время споруляции в ооцисте рода Eimeria формируется 4 спороцисты и в каждой из них по 2 спорозоита, а у представителей рода Isospora образуются 2 спороцисты, каждая из которых содержит 4 спорозоита. Прошедшие споруляцию ооцисты становятся инвазионными и они способны заражать восприимчивых животных, в организме которых происходит развитие эндогенных стадий. У лисиц паразитируют 8 видов кокцидий: Isospora vulpina, I. canivelocis, I. bigemina, I. buriatica, I. pavlodarica, I. rivolta, I. triffitti и Eimeria vulpes. А у песцов 6 видов: I. vulpina, I. canivelocis, I. buriatica, I. pavlodarica, I. triffitti и Eimeria imantonica [5]. В зависимости от вида ооцисты имеют овальную, яйцевидную, круглую или эллипсовидную форму, величиной от 8 до 45 мкм. Оболочка у них двухслойная, гладкая серого или желто-зеленого цвета, которая истончается на одном из полюсов и образует микропиле.
Основным источником инвазии являются больные и переболевшие кокцидиозом животные, а факторами передачи инвазии служат загрязненные ооцистами объекты внешней среды - шеды, клетки для животных, территория, инструменты по уходу за животными, обслуживающий персонал и др. передача инвазии в неблагополучных фермах происходит путем прямого и непрямого контакта с зараженными животными. Среди молодняка пушных зверей вспышки кокцидиозов частот отмечают в подсосный период в силу различных стрессов, при нарушении нормальной физиологии и общей резистентности [2, 5].
При кокцидиозах пушных зверей весьма часто имеет место снижение их продуктивности, которое диктует необходимость совершенствования мер борьбы с инвазией, поэтому разработка способов дезинвазии против ооцист кокцидий лисиц и песцов является актуальной проблемой [3, 6].
Среди известных средств, которые используют для дезинвазии против эндогенных стадий кокцидий пушных зверей необходимо отметить 2%-ную эмульсию ортохлорфенола, 7%-ный раствор аммиака, 10%-ный раствор однохлористого йода, 4%-ный раствор едкого натрия, который должен иметь температуру не ниже 80°С [3]. Тем не менее по эффективности отмеченные средства дезинвазии не устраивают запросы ветеринарной практики.
Исходя из отмеченного и особой устойчивости ооцист кокцидий во внешней среде, эффективное средство против них возможно создать, применяя несколько активных компонентов и вспомогательных веществ -синергистов
Определенный интерес для борьбы с экзогенной стадией кокцидий представляют бензалкония хлорид и формальдегид. Первый из отмеченных является высокоэффективным дезинфицирующим средством для наружного применения, эффективен в отношении хламидий, трихомонад и других паразитических простейших. Второй из упомянутых - формальдегид, известен как высокоэффективный антисептик, данное средство вызывает денатурацию белков, в том числе и содержащихся в ооцистах кокцидий. При их совместном применения против ооцист кокцидий пушных зверей они оказывают синергетическое действие на объект, а используемые вспомогательные компоненты - поверхностно активные вещества, обеспечивают очитку клеток для зверей, пола, шедов, технологического оборудования от биозагрязнений, образуют тонкую пленку на поверхности ооцист, облегчая доступ и равномерно распределяют ДВ по поверхности.
В задачу наших исследований входило разработать эффективный способ дезинвазии против ооцист кокцидий лисиц и песцов доступными средствами, пригодными для применения ручным способом, а также используя для обработки средства малой механизации, при этом не повреждая обрабатываемое технологическое оборудование.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства дезинвазии против ооцист кокцидий лисиц и песцов был использован составленный нами комплексный препарат «Изодез», имеющий следующий состав: действующие вещества - бензалкония хлорид 6%, формальдегид 7%, вспомогательные компоненты - неионовые поверхностно-активные вещества 20%, вода до 100%.
Из доступных заявителю источников информации не известна указанная совокупность существующих признаков, позволяющих получать указанный технический результат, поэтому заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».
Заявителю не известны средства аналогичного назначения, в которых были раскрыты отличительные признаки заявляемого изобретения с получением от использования его в какой-либо совокупности признаков указанного технического результата. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Доказательства промышленной применимости приводятся в следующих примерах.
Примеры конкретного исполнения Пример 1. Приготовление рабочих растворов, разведений культуры кокцидий лисиц и песцов и осуществление лизис-теста с разной концентрацией препарата «Изодез»
Отмеченные исследования по обозначенной проблеме проводили в лаборатории ФГБНУ «Всероссийский НИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина» (г. Москва).
Рабочий раствор с разными концентрациями комбинированного препарата «Изодез» готовили в условиях лаборатории следующим образом. Использовали чистые четыре стеклянные колбы на 1 л и наливали по 500 мл дистиллированной воды и в первые три из них добавляли по 50; 60 и 70 г бензалкония хлорида, размешивали стеклянной палочкой и через 10 минут добавляли по 70 мл формальдегида, размешивали и оставляли на 20 минут. Затем во все колбы добавляли по 200 мл поверхностно активного вещества, размешивали и объем доводили до 1 литра путем добавления дистиллированной воды, тщательно размешивали в течение 10 минут и оставляли на 20 минут. Раствор был готов к применению по истечении отмеченного времени. В четвертую колбу к 500 мл воды добавляли 50 г фенола, размешивали, объем доводили до 1 литра, снова размешивали и раствор был готов к применению.
Для сбора ооцист кокцидий использовали свежие фекалии от зараженных лисиц и песцов, которые исследовали в условиях лаборатории флотационным методом Фюллеборна. Поверхностную пленку из стаканов с пробой снимали паразитологической петлей и собирали в чашки Петри с дистиллированной водой. Собранный материал трижды промывали дистиллированной водой, концентрировали путем центрифугирования, культивировали в термостате при 26°С в течение 7 дней и хранили отдельно от лисиц и песцов. При разведении культуры ооцист кокцидий использовали дистиллированную воду, их количество в 1 мл подсчитывали под микроскопом.
При проведении лизис-теста использовали ранее приготовленные растворы дезинфектантов и дистиллированную воду (контроль) по отдельности, при этом их поместили по 50 мл в 100 мл колбы и добавили по 20 мл раствора с ооцистами кокцидий лисиц и песцов в концентрации 1000 ооцист/мл. После чего эти колбы ставили на вибростолик со скоростью вращения 100 об/мин на 2 часа. Затем содержимое из колбы выливали в пластиковую бутылку с завинчивающейся крышкой объемом 1 литр. Колбу с остатком раствора ополаскивали несколько раз и сливали в пластиковую бутылку и объем доводили до 1000 мл. Бутылку переворачивали три раза для лучшего смешивания и оставляли при комнатной температуре (23±2°С) на 24 часа. По истечении времени раствор из бутылки сливали до отметки 30 мл, осадок переливали в новую емкость объемом 100 мл, бутылку ополаскивали несколько раз с использованием дистиллированной воды, доведя объем до 50 мл.
Пример 2. Биопроба по экспериментальному заражению щенят лисиц и песцов для установления эффективности препарата «Изодез»
Испытание проводили в условиях звероводческого хозяйства «Салтыковское» Московской области в июле-августе 2017 г. на 30 щенятах лисиц и 30 щенятах песцов 2-месячного возраста, свободных от кокцидий и корма их не содержали препараты против паразитических простейших. Для контроля концентрации ооцист кокцидий лисиц и песцов (1000 ооцист/мл) в совей работе использовали камеру Мак Мастера и микроскоп МБС. Культуры ооцист кокцидий разбавляли дистиллированной водой с таким расчетом, чтобы было возможно ввести 2 мл суспензии каждому щенку лисиц и песцов с общим количеством ооцист кокцидий 2000 экз./голову. Перед назначение инвазионного материала всех щенят подвергали клиническому обследованию, индивидуальному взвешиванию и по принципу аналогов разделили как песцов, так и лисиц на шесть групп по 5 животных в каждой.
Щенятам первой, второй и третьей групп задавали по 2 мл суспензии ооцист кокцидий, обработанной 5; 6 и 7%-ми растворами препарата «Изодез», внутрь при помощи мини-зонда. Четвертой группе щенят задавали по 2 мл суспензии ооцист кокцидий, обработанной 5%-м раствором фенола (базовый препарат). Щенята пятой группы получали по 2 мл суспензии, содержащей ооцист в количестве 1000 экз./мл, и служили зараженным контролем. Щенята шестой группы получали по 2 мл дистиллированной воды и служили «чистым контролем».
Щенята всех шести групп лисиц и шести групп песцов за время опыта находились в аналогичных условиях содержания и имели одинаковый рацион. Вели ежедневные клинические наблюдения за щенятами в течение всего периода опыта: за общим состоянием, их поведением, приемом корма и воды, водимыми физиологическими изменениями.
Для установления ооцист кокцидий в фекалиях от щенят каждой группы отдельно с 6-е по 12-е сутки ежедневно собирали все фекалии путем размещения клеенчатой пленки под клеткой опытных и контрольных животных. Собранный биоматериал взвешивали, добавляли воду до объема 500 г, смешивали смесителем в течение 5-7 минут. Для дальнейших исследований пробы отбирали из каждой группы в количестве 50 г, которые консервировали путем добавления 4%-ного раствора бихромата калия и доводили до однородной массы путем размешивания миксером, затем переносили в пластиковые емкости с завинчивающейся крышкой и хранили в холодильнике при+4°С.
Ооцист кокцидий в фекалиях щенят лисиц и песцов определяли комбинированным методом Дарлинга, а их количество подсчитывали с использованием камеры Мак Мастера.
Эффективность проведенной дезинвазии при назначении разных концентраций препарата «Изодез», а также 5%-ной концентрации базового препарата фенола определяли, исходя из процента снижения выделения ооцист кокцидий после воздействия на них отмеченных выше препаратов и концентраций по сравнению с щенятами зараженного контроля, которым давали по 2000 ооцист/голову.
Следует отметить, что кормление и условия содержания опытных и контрольных щенят всех групп за время испытания были одинаковые. Содержали щенят в клетках по 5 голов с табличкой с указанием начала и окончания опыта, которые размешались в шедах на высоте 90 см от земли.
Общее состояние опытных щенят лисиц и песцов после назначения суспензии ооцист кокцидий, обработанной разными концентрациями препарата «Изодез», рекомендованной дозой фенола, а также чистой культурой ооцист кокцидий, оценивали по данным клинических наблюдений и они показали наличие определенного угнетенного состояния, щенята были малоактивны, забивались в кучу в закрытой части клетки, что, скорее всего, было обусловлено стрессом при их отлове и даче внутрь инвазионного материала. Осложнений при назначении внутрь суспензии с ооцистами кокцидий и после него не отмечено. По данным общеклинических наблюдений со второго дня после начала опыта щенята, получавшие суспензию ооцист кокцидий, обработанную разными препаратами и их концентрациями, чистой культурой ооцист и контрольные не отличались друг от друга.
Проведенные по определению ооцист кокцидий в фекалиях опытных щенят, собранных с 6-е по 12-е сутки после дачи обработанной дезинфектантами суспензии, исследования показали их наличие в определенном количестве, но не во всех группах. В первой опытной группе лисицы, которые получали суспензию ооцист кокцидий, обработанную 5%-ной концентрацией препарата «Изодез», в фекалиях ооцист кокцидий находили через 2; 3 и 5 суток в количестве 3; 5 и 7 экз., что составляет 0,5; 0,83 и 1,2 на камеру и средний показатель в одной камере за период исследований составил 0,36. Количество ооцист в 1 г фекалий составило 72, что в проценте от контроля - 7,06. Отсюда, интенсэффективность «Изодеза» в 5%-ной концентрации или процент снижения количества ооцист после воздействия на них препаратом составила 92,6% (табл.1).
У щенят лисиц второй и третьей групп, которым давали суспензию ооцист кокцидий, обработанную 6 и 7%-ной концентрацией «Изодеза», при исследовании проб фекалий ни в одном случае ооцист не находили, что дает нам основание отметить 100%-ную эффективность «Изодеза» в отмеченных концентрациях против ооцист кокцидий щенят лисиц.
У щенят четвертой группы после дачи суспензии ооцист кокцидий, обработанной 5%-ной концентрацией фенола (базовый препарат), ооцист в фекалиях находили во все сроки исследований в количестве от 1,2 до 3,0 в камере, а средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 1,8. Количество ооцист в 1 г фекалий по этой группе равнялось 360, что составляет 35,3% от контроля. Отсюда, интенсэффективность фенола в 5%-ной концентрации против ооцист кокцидий щенят составила 64,7%.
Щенята лисиц пятой контрольной группы, получавшие 2000 ооцист на голову, во все сроки исследований с фекалиями выделяли ооцист кокцидий в количестве от 3,8 до 6,5 в камере и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 5,1. Количество ооцист в 1 г фекалий по этой группе составило 1020 и данный показатель нами использовался как исходный при расчете процента снижения количества ооцист или интенсэффективность испытанных в опыте препаратов.
Щенята шестой группы, которые получали дистиллированную воду без ооцист, служили незараженным контролем и вовсе сроки исследований оставались свободными от инвазии.
По щенятам песцов следует отметить, что в первой группе, которые получали суспензию ооцист кокцидий, обработанную 5%-ной концентрацией препарата «Изодез» ооцист кокцидий в фекалиях находили через 1 и 4 суток в количестве 3 и 5 экз., что составляет 0,5 и 0,83 на камеру и средний показатель в одной камере за период исследований составил 0,19. Количество ооцист в 1 г фекалий составило 38, что в проценте от контроля -3,3. Отсюда, ИЭ «Изодеза» в 5%-ной концентрации против ооцист кокцидий у щенят песцов или процент снижения количество ооцист после воздействия на них препаратом составила 96,7%.
У щенят песцов второй и третьей групп, получавших суспензию ооцист кокцидий, обработанную 6 и 7%-ной концентрацией «Изодеза», при исследовании проб фекалий во все сроки ооцист кокцидий не находили и делаем заключение о 100%-ной ИЭ препарата против ооцист кокцидий.
У щенят песцов четвертой группы базовый препарат фенол 5%-ный обеспечил 84,5%-ную ИЭ.
У щенят песцов пятой контрольной группы средний показатель в одной камере составил 5,8, а количество ооцист в 1 г фекалий - 1160 экз.
Интенсэффективность использованных в своей работе дезинфектантов или процент снижения количества ооцист устанавливали по следующей формуле:
где
ИЭ - интенсэффективность препарата, %;
Кок - количество ооцист у щенят лисиц и песцов контрольной группы;
Код - количество ооцист у щенят лисиц и песцов, получавших обработанные дезинфектантом ооцисты.
Используя полученные в опыте нами данные, определяли интенсэффективность (ИЭ) «Изодеза» в 5%-ной концентрации против ооцист кокцидий щенят лисиц.
Против ооцист кокцидий щенят песцов ИЭ «Изодеза» в 5%-ной концентрации составила:
В концентрациях 6 и 7% «Изодез» против ооцист кокцидий щенят лисиц и песцов показал 100%-ную ИЭ.
Взятый нами в качестве базового препарата фенол 5%-ный показал против ооцист кокцидий щенят лисиц 64,7%-ную ИЭ, против ооцист кокцидий щенят песцов 84,5%-ную ИЭ.
Пример 3. Производственное испытание эффективности «Изодеза» против ооцист кокцидий лисиц и песцов
Эффективность «Изодеза» 6%-ного против ооцист кокцидий лисиц и песцов в производственном испытании устанавливали опытным путем с искусственной закладкой ооцист кокцидий на контрольные площадки по сравнению с базовым препаратом фенолом 5%-ным при экспозиции 2 часа.
2
2
2
Испытание проводили в условиях ранее отмеченного звероводческого хозяйства Московской области в августе-сентябре 2017 года. В шеде №2 по договоренности с ветслужбой хозяйства предварительно проводили чистку и дезинфекцию участка пола и были выбраны три площадки по 1 м. Площадки имели ровную поверхность для исключения подтека раствора после дезинвазии и были отделены друг от друга пластиковыми рейками. Проводили копроскопическое исследование молодняка лисиц и песцов, устанавливали их зараженность кокцидиями, от зараженных животных брали повторные пробы фекалий, собирали ооцист, культивировали, готовили культуру и необходимое для опыта разведение. На первом этапе испытания на каждую площадку равномерно наносили с помощью малого пульверизатора по 10000 ооцист кокцидий в разведении с 50 мл дистиллированной водой и оставили на 20 минут для пропитывания площадки. Затем на первую опытную площадку наносили «Изодез» 6%-ный при норме 0,5 л на 1 м и экспозиции 2 часа. На вторую опытную площадку наносили раствор фенола 5%-ного при норме 0,5 л на 1 м и экспозиции 2 часа. Третья площадка была контрольная и препарат для дезинвазии не наносили.
Соблюдая отмеченную экспозицию, из всей поверхности каждой площадки брали смывы, используя кисточку и дистиллированную воду. Собранный смыв переносили в пластиковую бутылку, объем доводили до 1000 мл, перемешивали 3 раза и оставляли при комнатной температуре (+23°С) на 24 часа. Затем сливали до отметки, оставляя 30 мл раствора с ооцистами кокцидий и дезинфектантом «Изодез», который использовали для биопробы на щенятах лисиц и песцов 2,5-3-месячного возраста. Щенятам первой группы (5 лисиц и 5 песцов) давали по 2 мл суспензии ооцист кокцидий, обработанной на первой площадке 6%-ным раствором «Изодеза». Щенятам второй группы (5 лисиц и 5 песцов) назначали суспензию кокцидий, обработанную базовым препаратом фенолом. Щенята третьей группы получали ооцисты кокцидий без воздействия на них каким-либо дезинфектантом.
Оценку общего состояния опытных щенят после дачи им суспензии ооцист кокцидий, обработанной растворами «Изодеза» и фенола, а также чистой культурой ооцист кокцидий, проводили совместно с ветслужбой хозяйства по данным ежедневных клинических наблюдений в течение 10 дней.
Как показали проведенные наблюдения, в течение 24 часов после назначения у щенят первой и второй групп было угнетенной состояние, они были малоактивны, забивались в угол закрытой части клетки, редко подходили к кормушке. Видимо, все это было вызвано стрессом, обусловленным отловом и заражением путем назначения ооцист кокцидий. При назначении суспензии ооцист и после него осложнений не было. Через 24 часа после назначения суспензии ооцист кокцидий, обработанной «Изодезом», фенолом и «чистой» культурой ооцист, щенята разных групп практически не отличались друг от друга.
После назначения ооцист кокцидий фекалии от разных групп щенят собирали с 6-е по 12-е сутки и при их исследовании были выделены ооцисты, но их количество заметно отличалось.
Полученные результаты показали, что у щенят первой группы, которым давали суспензию ооцист, обработанную 6%-ным раствором «Изодеза», ооцист кокцидий в фекалиях находили во все сроки исследований в количестве от 2 до 5 экз., а среднее количество в одной камере за все исследования составило 0,57. Количество ооцист в 1 г исследуемой пробы фекалий составило 114 экз., что в проценте от зараженного контроля 5,04% (табл.2). Затем устанавливали интенсэффективность «Изодеза» 6%-ного или процент снижения ооцист кокцидий лисиц и песцов после воздействия на них препаратом, которая составила 94,9%.
У щенят второй группы, которым назначали суспензию, обработанную 5%-ным раствором фенола (базовый препарат), ооцист в камере находили во все сроки исследований в количестве от 10 до 21 экз., а среднее количество в одной камере за все исследования составило2,8. Количество ооцист в 1 г фекалий 560 экз., что в проценте от зараженного контроля 24,8%. Отсюда, интенсэффективность фенола в 5%-ной концентрации или процент снижения количество ооцист кокцидий после воздействия на них препаратом и она составила 75,2%.
Щенята третьей контрольной группы, которым задавали по 2000 ооцист/голову во все сроки исследований с фекалиями выделяли ооцисты кокцидий в количестве от 41 до 73 экз., а средний показатель в одной камере за период исследований составил 11,3 экз. Количество ооцист кокцидий в 1 г фекалий по контрольной группе животных составило 2260 и данный показатель мы использовали как исходный при расчете снижения количества ооцист или интенсэффективность использованных в производственном испытании препаратов «Изодез» и фенол.
2
Результаты, полученные при производственном испытании «Изодеза» 6%-ного в дозе из расчета 0,5 л на 1 м, при экспозиции 2 часа, свидетельствуют о высокой эффективности испытанного средства для дезинвазии против ооцист кокцидий лисиц и песцов, интенсэффективность составила 94,9%, а эффективность базового препарата фенола 5%-ного равнялась 75,2%.
Источники информации:
1. Акбаев М.Ш., Василевич Ф.И., Водянов А.А. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М., 2008. - 776 с.
2. Вершинин И.И. Кокцидиозы животных и их дифференциальная диагностика. - Екатеринбург, 1996. - 264 с.
3. Методические рекомендации по борьбе с эймериозами и изоспорозами животных. - М., 1994, РАСХН. - 30 с.
4. Сафиулин Р.Т., Шаповалов А.В. Рекомендации по борьбе с кокцидиозами (эймериоз, изоспороз) пушных зверей // Труды ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина. - М., 2005. - Т. 41. - С. 463-478.
5. Сафиуллин Р.Т., Мусатов М.А. Паразитарные болезни пушных зверей, средства и методы их лечения. - М., 2009. - 152 с.
6. Черепанов А.А. Методические рекомендации по испытанию средств дезинвазии в ветеринарии. - М., 1999. - 16 с.