Сохранение и размножение земляники (Fragaria x ananassa Duch. ) биотехнологическими методами

Fruit weight was correlated neither with achene number per berry nor with flesh mass per achene, but was correlated with the combination of these traits (R = 0.92), inherited independently. 'Feierverk' passes on high achene numbers, but its progenies still have intermediate quantities, while low flesh weight per achene was strictly inherited, which resulted in smaller fruit. The other cultivars did not pass on the trait as steadily. Plants of 'Feierverk' produce oblong flattened berries with many achenes and low flesh mass per achene. The genes are likely to be linked to genes driving fruit shape, seed mass etc.; yet such links may be broken. Some seedlings from crosses between 'Rubinovy Kulon' and 'Festivalnaya' formed very large fruit, combining numerous achenes with high flesh weight per achene.

Conclusions

Genes through processes running in plants drive habits and peculiarities of plant development, which directly or indirectly influence on yield component values. The chief habits and traits affecting yield components are following: 1) dormancy of axillary buds; 2) type of plant branching and development; 3) conditions to begin initiation of inflorescences and its further control; 4) specific inflorescence number per branch crown; 5) inflorescence type; 6) fruit shape; 7) amount of pistils (subsequent achenes) per flower; 8) specific flesh weight per achene.

Modifying effects should be expected from genes driving various physiological processes, connected with: 1) duration and depth of winter dormancy; 2) tolerance to freezing in different terms during overwintering; 3) time of flowering and maturing; 4) tolerance to late spring frosts; 5) reaction to environmental conditions.

References

1. Faedi W., Mourgues F., Rosati C. Strawberry breeding and varieties: situation and perspectives // Acta Hort. - 2002. - Vol. 567. - P. 51-59.

2. Griffing B. Concept of general and specific combining ability in relation to diallel crossing systems // Austr. J. Biol. Sci. - 1956. - Vol. 9. - P. 463-493.

3. Hancock J.F., Scott D.H., Lawrence F.J. Strawberries // Fruit Breeding. Vine and Small Fruits. -New York: John Wiley & Sons, 1996. - Vol. 2. - P. 419-471.

4. Ogoltsova T.P., Bayanova L.V. Kombinacionnye sposobnosti pyati sortov zemlyaniki po nekotorym komponentam urozhainosti // Nauka - proizvodstvu. Orel: Orlovskoye otd. Priokskogo knizhnogo izd-va, 1981. - Vol. 12. - P. 37-50.

5. Pustovalova S.V. Biologicheskiye osobennosti morphogeneza u razlichnykh sortov zemlyaniki v SSSR / Avtoref. dis. ... kand s.-k. nauk. - Michurinsk, 2001. - 22 p.

6. Shokaeva D.B. The influence of plant development peculiarities and environmental conditions on fruiting and yield height of differing short-day strawberry genotypes // Environmentally Friendly Fruit Growing. Fruit Science. - Tartu: 2005. - Vol. 222. - P. 117-123.

7. Shokaeva D. Important features of strawberry genotypes and peculiarities of inheritance // Sodininkyste ir darzininkyste. - 2007. - Vol. 26, № 3. - P. 102-114.

8. Shokaeva D.B. Injuries induced in different strawberry genotypes by winter freeze and their effect on subsequent yield // Plant Breeding. - 2008. - Vol. 127, № 2. - P. 197-202.

9. Watkins R., Spangelo L.P.S. Genetic components from full, half, and quarter diallels for the cultivated strawberry // Can. J. Genet. Cytol. - 1971. - Vol. 113, № 4. - P. 515-521.

Рекомендовано к печати к.б.н. Комар-Темной Л.Д.

БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

СОХРАНЕНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ ЗЕМЛЯНИКИ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

И.Ю. КОВАЛЬЧУК, кандидат сельскохозяйственных наук;

З.Р. МУХИТДИНОВА, кандидат биологических наук;

ТТ. ТУРДИЕВ

Институт биологии и биотехнологии растений, Алматы, Казахстан

Введение

Земляника (Fragaria x ananassa Duch.) - одна из самых распространённых ягодных культур в Казахстане. В связи с острым дефицитом поливных земель в регионе площади полевых коллекций этой

культуры сокращаются, и ценные, но временно невостребованные сорта уничтожаются. Поэтому необходимо сохранить и поддерживать коллекцию этой исключительно важной коммерческой культуры. Для сохранения многих вегетативно размножаемых растений используются биотехнологические методы криоконсервации в жидком азоте, при этом неограниченно долго сохраняется жизнеспособность, регенерационный потенциал и генетическая стабильность исходного материала. За последнее время методы криоконсервации успешно развивались и применялись ко многим видам растений во всем мире [8]. Разработанные стандартные методы [4, 8, 9] получили достаточно широкое распространение. Для криоконсервации многих ягодных культур, включая культурные сорта и дикие разновидности земляники, использовалось контролируемое программное замораживание, методы PVS2 витрификации, инкапсуляции-дегидратации и витрификации-дегидратации [1, 2, 5-7]. В результате было сохранено много различных видов и сортов растений. Стандартные методы криоконсервации хорошо зарекомендовали себя, однако они требуют модификации и оптимизации при изменении лабораторных условий. В Казахстане до настоящего времени коллекция земляники содержалась лишь в полевых условиях, криобанка не существовало.

Данные исследования были проведены с целью усовершенствования технологии введения в асептическую культуру in vitro, клонального микроразмножения и разработки биотехнологии криоконсервации изолированных тканей перспективных сортов земляники для создания национального криобанка Казахстана.

Объекты и методы исследования

В эксперименте использовались 22 интродуцированных, перспективных сорта земляники из коллекции Помологического сада Института плодоводства и виноградарства Казахстана.

Исходными эксплантами служили сегменты усов и розеток земляники с пазушными почками, изолированные в период активного роста. Оптимизацию способа введения земляники в культуру in vitro осуществляли путём подбора стерилизующих агентов, их концентраций и экспозиций. Для стерилизации растительного материала использовали стерилизующие агенты: диохлор, содержащий в качестве действующего вещества натриевую соль дихлоризоциануровой кислоты, сулему (HgCl2) и перекись водорода (Н2О2). Для культивирования использовали среду Мурасиге и Скуга (МС) с различными концентрациями регуляторов роста: 6-бензиламинопурин (БАП), Р-индолил-3-масляная кислота (ИМК) и гиббереловая кислота (ГК). Микрорастения культивировали при 16-часовом фотопериоде, интенсивности освещения 25 цто1 m'V1 и температуре 24°С.

Изучали влияние продолжительности холодовой акклиматизации (ХА) пробирочных растений на восстановление роста криосохраненных меристем, способы замораживания, состав восстановительных сред оптимальных для регенерации эксплантов, режимы вывода тканей из состояния глубокого охлаждения и регенерации из них целых растений.

Акклиматизацию побегов земляники проводили в течение 1 -6 недель в климатической камере (Lab-Line Environette, Melrose Park, IL, США) при чередующемся режиме: 8 час, 22°С, интенсивность освещения 10 цто1 m'V1, затем 16 час., 1°С, отсутствие освещения.

Испытывали 3 метода криоконсервации в жидком азоте:

1) витрификация с прекультивированием на среде с 0,3 М сахарозой. Метод, предложенный Matsumoto T. и Sakai A. для предобработки [6] был изменен, вычлененные апикальные меристемы с 3-4 листовыми примордиями (в дальнейшем меристемы) для ХА, прекультивировали в течение 2 сут. в условиях ХА на среде МС с 0,3 М сахарозой, а не 3 сут. при 25°С в рекомендованном методе. Размораживание образцов было проведёно в водной бане при температуре 45°C в течение 1 мин., затем 1 мин. в воде, при 22°C.

2) витрификация с прекультивированием на среде с 5% ДМСО. Эта техника витрификации была разработана для меристем Ribes [5]. Вычлененные меристемы были прекультивированы в течение 2 сут. в условиях ХА на среде МС, содержащей 5% ДМСО. Размораживание образцов было выполнено так же, как в первом методе криоконсервации.

3) инкапсуляция-дегидратация. Использовали метод, разработанный J. Dereuddre и др. [3] и модифицированный M. Reed [7]. Вычлененные меристемы для ХА были помещены в альгинат (3%-ный альгинат в жидкой среде МС с 0,75 М сахарозой). Альгинатные шарики полимеризировали в насыщаемом растворе хлорида кальция. Размораживание криопробирок проводили при комнатной температуре в течение 20 мин. Верхушки побегов в альгинатных шариках повторно гидратировали в жидкой среде МС в течение 5 мин.

Меристемы после размораживания помещали на питательную среду для восстановления

роста.

Результаты и обсуждение

Для проведения исследований по криоконсервации необходимо иметь в достаточном количестве асептические растения идентичные исходной форме, которые можно получить путём клонального микроразмножения. Необходимым является подбор питательных сред для восстановления меристем после криоконсервации. Для введения в условия in vitro были испытаны стерилизующие агенты и их концентрации, уничтожающие сапрофитную микрофлору, а также состав питательных сред для пролиферации. Проведенные исследования показали, что кончики усов земляники эффективно стерилизовать 0,1% HgCl2 с экспозицией 5-7 мин с последующей обработкой в 3% Н2О2 в течение 10-20 мин или 1% деохлором - 8 мин, затем 3% Н2О2 - 10-12 мин Причём время обработки зависело от вводимого в асептическую культуру сорта.

Для введения в культуру in vitro земляники была определена оптимальная среда МС, содержащая 0,5 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 0,2 мг/л ГК, 1,0-1,5 мг/л АС, 30 г/л сахарозы. Лучшей для микроразмножения оказалась среда МС, содержащая удвоенное количество NaFe EDTA, 0,3 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 0,2мг/л ГК, 30 г/л сахарозы. Подобрана эффективная восстановительная среда для меристем после криоконсервации - среда МС, содержащая 0,3 мг/л БАП, 0,2 мг/л ГК, 1,5 мг/л АС, 30 г/л сахарозы.

Известно, что для успешного криозамораживания меристем необходима предварительная холодовая акклиматизация растений, что приводит к запуску природных механизмов устойчивости растений к холодной погоде [8]. В ходе экспериментов по криосохранению определено, что жизнеспособность меристем земляники после криосохранения в значительной степени зависит от акклиматизации к холоду. У не акклиматизированных растений земляники сорта Свит Чарли выживали лишь единичные меристемы. Холодовая акклиматизация в течение одной недели не оказывала существенного влияния на выживаемость. Две недели ХА улучшали регенерацию растений до 37,3%. Увеличение продолжительности ХА до 3 недель приводило к резкому увеличению жизнеспособности (76,7%) меристем этого сорта. Через 4 недели акклиматизации регенерационная способность возросла незначительно, а в последующие недели понемногу снижалась. После 6 недель ХА жизнеспособность меристем уменьшилась до 76,1%. То есть эффективная продолжительность холодовой акклиматизации для земляники составила от 3 до 6 недель. Однако целесообразно проводить акклиматизацию не более 3-4 недель (табл.).

Таблица

Влияние холодовой акклиматизации на регенерацию растений из меристем земляники сорта Свит Чарли после криозамораживания методом инкапсуляции-дегидратации

Неделя акклиматизации Количество жизнеспособных меристем, шт. Регенерация, %

до замораживания после замораживания

0 58 3 5,2

1 55 4 7,3

2 51 19 37,3

3 60 46 76,7

4 60 47 78,3

5 49 38 77,6

6 46 34 76,1

Для установления оптимального метода замораживания в жидком азоте нами использованы стандартные методики: две модификации метода витрификации и метод инкапсуляции-дегидратации. Исследование проводили на 2 сортах земляники: Адди и Редгонтлит. В проводимых экспериментах сорт Адди имел лучшее восстановление жизнеспособности после замораживания в жидком азоте по сравнению с сортом Редгонтлит. Восстановление роста у обоих сортов после жидкого азота было значительней при использовании метода инкапсуляции-дегидратации. Криоконсервация двумя другими методами была менее успешной, и восстановление жизнеспособности у обоих сортов земляники не превышало 55% (рис. 1). Однако

жизнеспособность меристем во всех изучаемых методах были достаточно высокой для длительного хранения, так как регенерация превышала 40% - минимальный порог, требуемый для безопасного криохранения растительного материала [7].

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Методы криоконсервации

И сорт Адди  сорт Редгонтлит,шт

Рис. 1. Регенерация побегов земляники после криозамораживания различными методами

На основе проведённых исследований для длительного хранения земляники применён оптимальный метод - инкапсуляции-дегидратации. На длительное криосохранение в дьюары с жидким азотом помещены меристемы 22 сортов земляники: Адди, Редгонтлит, Свит Чарли, Динамовка, Украинка, Заря, Зeнга Зенгана, Кардинал, Трубадур, Джевел, Юни, Зенга Тигайга, Золушка, Надежда, Дочь Пурпуровой, Полли, Кохана, Фракунда, Sumos, Lord, Super Festion, Marilva Machat. Криопробирки с образцами сортов, сохранённых в жидком азоте, являются основой криогенной коллекции гермоплазмы земляники в Казахстане.

Выводы

Результаты исследований показывают, что генетические ресурсы земляники могут быть надёжно сохранены в жидком азоте, как резерв полевой и in vitro коллекций. Все образцы заморожены оптимальным методом - инкапсуляции-дегидратации. Сохраненные двадцать два сорта земляники в дьюарах с жидким азотом - начало создания криогенной коллекции в Казахстане.

Список литературы

1. Высоцкая О.Н. Криосохранение меристем земляники садовой (Fragaria х ananassa) с помощью метода витрификации // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: Матер. VIII Международной конференции. Саратов, 9-13 сентября 2003 г. - Саратов, 2003. - С. 354-355.

2. Пат. 2220563 Российская Федерация, МПК7 А 01 Н 4/00 Способ криосохранения меристем, изолированных из земляники садовой (Fragaria L.) in vitro / Высоцкая О.Н., Попов А.С.; Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева. - № 2002113550/13; заявл. 24.052002, опубл. 10.01.2004, Бюл. № 1.

3. Dereuddre J., Scottez C., Arnaud Y., Duron M. Resistance of alginate-coated axillary shoot tips of pear tree (Pyrus communis L. cv. Beurre Hardy) in vitro plantlets to dehydration and subsequent freezing in liquid nitrogen // C. R. Acad. Sci. Paris. - 1990. - N 310. - P. 317-323.

4. Engelmann F., Gonzalez Arnao M.T., Wu Y., Escobar R.H. Development of Encapsulation Dehydration // Plant Cryopreservation: A Practical Guide / Reed B.M. (Ed). - New York: Springer Science + Business Media LLC, 2008. - P. 59-76.

5. Luo J., Reed B.M. Abscisic acid-responsive protein, bovine serum albumin, and proline pretreatments improve recovery of in vitro currant shoot-tip meristems and callus cryopreserved by vitrification // Cryobiology. - 1997. - N 34. - P. 240-250.

6. Matsumoto T., Sakai A. Cryopreservation of grape in vitro-cultured axillary shoot tips by three-step vitrification // Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm. Current Research Progress and Application / Engelmann F., Takagi H. (Eds). - Rome: Japan International Research Center for Agricultural Sciences and International Plant Genetic Resources Institute, 2000. - Р. 424-425.

7. Reed B. M. Implementing cryogenic storage of clonally propagated plants // CryoLetters. - 2001. - N 22. - P. 97-104.

8. Reed B.M. Cryopreservation of Temperate Berry Crops // Plant Cryopreservation: A Practical Guide. - New York: Springer Science + Business Media LLC, 2008. - P. 333-364.

9. Sakai A., Hirai D., Niino T. Development of PVS-Based Vitrification and Encapsulation-

Vitrification Protocols // Plant Cryopreservation: A Practical Guide. - New York: Springer Science + Business Media LLC, 2008. - P. 33-58.

Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.

ЭМБРИОКУЛЬТУРА МАСЛИНЫ ЕВРОПЕЙСКОЙ

С В. ШЕВЧЕНКО, доктор биологических наук; 1В.А. ШОЛОХОВА I Л.Ф. МЯЗИНА

Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Маслина европейская - Olea europaea L., относится к роду Olea L. семейства Oleaceae Lindl., включающему около 30 родов и 600 видов. Это относительно небольшое семейство имеет много полезных растений, наиболее ценным из которых считается O. europaea. Первые упоминания об использовании оливкового масла O. europaea встречаются в египетских текстах II в. до н.э. В настоящее время культура O. europaea распространена практически во всех субтропических странах (в Греции, Испании, Турции, Алжире, Тунисе, Италии, Франции и др.) [2].

В Крым O. europaea была завезена греческими колонистами, позже - генуэзцами, и ее культура процветала до XV в. Затем наступил некоторый упадок, и только с начала XIX в. усилиями сотрудников Никитского ботанического сада началась работа по возрождению данной культуры и ее селекции [1, 7, 12, 13]. O. europaea хорошо адаптировалась к условиям ЮБК, и свидетельством тому является факт, что в коллекции НБС имеется древний экземпляр, насчитывающий, по мнению греческого ученого, профессора А. Rubos (из устной беседы), не менее 1000 лет, а по всему Южному берегу Крыма от Фороса до Алушты разбросаны отдельные 100-150-летние рощи и насаждения. С целью создания новых отечественных сортов маслины в селекции широко используются интродуцированные сорта и полученные на их основе формы [4, 12, 13]. Однако селекционная работа с этой культурой затруднена вследствие довольно большого количества дефективных цветков [1, 10, 19], длительного прорастания семян из-за недоразвитости зародышей, позднего вступления растений в плодоношение. В связи с этим целью данной работы явилось выявление возможностей и поиск путей ускорения селекционного процесса маслины с применением различных методов: отбора, межсортовой гибридизации и эмбриокультуры.

Объекты и методы исследований

Для исследований были взяты перспективные межсортовые гибриды 8-ми комбинаций скрещивания и опылены пыльцой 8 сортов и гибридов. В качестве исходных материнских форм были использованы сорта Кореджоло, Скороспелая, Манита, гибриды Мелколистная х Никитская, Кореджоло х Асколано, Мелколистная х Тифлисская, в качестве отцовских - сорта Никитская, Аппетитная, Консервная, Асколано, Крымская Превосходная, Никитская 2 и Калиниот. Пыльца сорта Калиниот была нами обработана рентгеновскими лучами в дозах 100 и 300 Гр.

Зародыши полученных в результате гибридизации семян помещали в культуру in vitro на модифицированную питательную среду Уайта.

Результаты и обсуждение

Известно, что семена маслины в зависимости от сорта, формы и т.д. обычно прорастают 2-3 года, а в связи с тем, что в большинстве своем это очень сложные гибриды, селекционная работа с ними весьма затруднительна. Например, форма 14/31 - это межсортовой гибрид Кореджоло х Асколано, 11/37 - это гибрид сортов Мелколистная х Тифлисская, 6/8 - гибрид Мелколистая х Никитская, и т.д.

Нами в результате изучения 15 сортов и 64 гибридов были отобраны рано созревающие, урожайные межсортовые гибриды, перспективные для дальнейшей селекции: 5/4, 5/6, 5/8, 5/10, 5/12, 6/6, 6/8, 6/9 (Мелколистная х Никитская) 14/17, 14/19 (Кореджоло х Асколано) 15/23 (Кореджоло х Никитская) и 1/31 (сеянец Кореджоло). С учетом полезных признаков и на основании анализа зрелой пыльцы также были отобраны сорта и формы для использования их в качестве отцовских (Никитская, Асколано, Крымская Превосходная и др). Полученные гибридные семена были включены в дальнейшую работу. Поскольку, согласно классификации М.Г. Николаевой [5, 6], семена O. europaea обладают экзогенным и эндогенным органическим покоем, для ускорения