Результативность получения ооцитов коров при различных временных режимах трансвагинальной пункции фолликулов

doi: 10.24411/0235-2451-2020-10212 УДК 591.391.1:591.158.1

Результативность получения ооцитов коров при различных временных режимах трансвагинальной пункции фолликулов*

Р. Ю. ЧИНАРОВ, В. А. ЛУКАНИНА, Г. Н. СИНГИНА, Н. П. ТАРАДАЙНИК

Федеральный научный центр животноводства - ВИЖимени академика Л. К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

Резюме. Для прижизненного получения яйцеклеток крупного рогатого скота используют трансвагинальную УЗИ-ассистированную пункцию фолликулов - Ovum-Pick-Up (OPU). Исследования проводили с целью определить влияние кратности сессий OPU на количество и качество ооцитов, получаемых от коров симментальской породы. Работу выполняли на половозрелых телках симментальской породы в возрасте от 16 до 19 месяцев (n = 4) с естественным половым циклом. Фолликулы аспирировали один (1/w) или два раза (2/w) в неделю. Для каждого режима использовали одних и тех же животных-доноров. При OPU-сессиях в режиме 1/w аспирировали 228 фолликулов, 2/w - 224 фолликула. Из них извлекли по 140 ооцит-кумулюсных комплексов, или 61,4 ± 5,9 % и 62,1 ± 6,3 % соответственно. В среднем от каждого донора получали 4,4 ооцита за сессию. Доля OPU-ооцитов хорошего качества с нормальной морфологией при выполнении процедуры в режиме 1/w составила 53,6 ± 3,0 % от общего количества извлеченных, 2/w - 65,7 ± 4,0 %, что достоверно выше в 1,23 раза. Доли ооцитов, находившихся через 24 ч созревания на стадии MII мейоза (74,7 ± 2,4 % и 73,3 ± 5,6 % соответственно), и ооцитов с признаками апоптотических изменений (9,8 ± 3,3 и 8,0 ± 3,1 % соответственно) по группам достоверно не различалась. Кратность OPU-сессий не влияла на степень дробления эмбрионов (в среднем 63,5 %) и их развитие до стадии бластоцисты (в среднем 16,7 %). Выполнение процедуры OPU дважды в неделю позволяет получать от телок симментальской породы посредством технологии in vitro в 2,46 раза больше эмбрионов в стадии бластоцисты, чем при ее однократном выполнении.

Ключевые слова: Ovum-Pick-Up, ооциты коров, созревание, получение эмбрионов in vitro, симментальская порода коров.

Сведения об авторах: Р. Ю. Чинаров, младший научный сотрудник (e-mail: roman_chinarov@mail.ru); В. А. Луканина, младший научный сотрудник; Г. Н. Сингина, кандидат биологических наук, зав. лабораторией; Н. П. Тарадайник, кандидат биологических наук, главный специалист.

Для цитирования: Результативность получения ооцитов коров при использовании различных временных режимов трансвагинальной пункции фолликулов / Р. Ю. Чинаров, В. А. Луканина, Г. Н. Сингина и др. // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т. 34. № 2. С. 57-60. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10212.

*Исследования выполнены при поддержке Минобрнауки России, тема № 0445-2019-0030.

The effectiveness of obtaining cows' oocytes at various time modes of transvaginal follicular puncture

R. Yu. Chinarov, V. A. Lukanina, G. N. Singina, N.P. Taradaynic

Federal Scientific Center of Animal Husbandry - Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos.Dubrovitsy,

60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

Abstract. Transvaginal ultrasound-assisted follicular puncture - Ovum-Pick-Up (OPU) - is used for intravital production of cattle ova. The purpose of our studies was to determine the effect of the multiplicity of OPU sessions on the number and quality of oocytes obtained from cows of Simmental breed. The work was performed on sexually mature heifers of Simmental breed aged from 16 to 19 months (n = 4) with a natural sexual cycle. Follicle aspiration was performed once (1/w) or twice (2/w) per week. The same donor animals were used for each regimen. During OPU sessions in the 1/w mode, 228 follicles were aspirated; in the 2/w mode, 224 follicles were aspirated. From them 140 oocyte-cumulus complexes were extracted, or (61.4 ± 5.9)% and (62.1 ± 6.3)%, respectively. On average, 4.4 oocytes per session were received from each donor. When performing the procedure in 1/w mode, the proportion of good quality oPu oocytes with normal morphology was (53.6 ± 3.0)% of the total number recovered; in 2/w mode, it was (65.7 ± 4.0)%, which is significantly higher - 1.23 times. In 24 hours of maturation, the fractions of oocytes at the stage of MII meiosis ((74.7 ± 2.4)% and (73.3 ± 5.6)%, respectively) and oocytes with the signs of apoptotic changes ((9.8 ± 3.3)% and (8.0 ± 3.1)%, respectively) did not significantly differ among groups. The multiplicity of OPU sessions did not affect the degree of embryo fragmentation (63.5% on average) and their development up to the blastocyst stage (16.7% on average). The OPU procedure twice a week made it possible to obtain 2.46 times more embryos in the blastocyst stage through in vitro technology from heifers of Simmental breed compared to the case it was performed once a week. Keywords: Ovum-Pick-Up; oocytes of cows; maturation; obtaining embryos in vitro; Simmental breed of cows. Author details: R. Yu. Chinarov, junior research fellow (e-mail: roman_chinarov@mail.ru); V. A. Lukanina, junior research fellow; G. N. Singina, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory; N. P. Taradaynic, Cand. Sc. (Biol.), main specialist.

For citation: Chinarov RYu, Lukanina VA, Singina Gn, et al. [The effectiveness of obtaining cows' oocytes at various time modes of transvaginal follicular puncture]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(2):57-60. Russian. doi: 10.24411/0235-24512020-10212.

а ля прижизненного получения яйцеклеток от самок крупного рогатого скота применяют технологию трансвагинальной пункции фол-в - Оуит-Рюк-ир (ОРи) [1, 2]. Процедура ОРи включает эпидуральную анестезию, позиционирование яичников через прямую кишку, визуализацию фолликулов с использованием трансвагинального УЗИ-зонда и аспирацию фолликулярной жидкости, содержащей ооциты [3]. Она не препятствует нор-

мальным циклам воспроизводства и не оказывает негативного влияния на фертильность коров-доноров даже при регулярном проведении более года.

Извлекаемые OPU-ооциты способны к эмбриональному развитию в условиях in vitro [4, 5]. При использовании этой технологии выход эмбрионов и степень стельности у одних и тех же доноров выше, чем в случае получения эмбрионов in vivo (классическая технология множественной овуляции и

пересадки эмбрионов, MOET) [6]. Ее применяют при реализации таких передовых генетических методов, как эмбриональная селекция [7] и геномное редактирование [8].

Содержание коров-доноров очень затратно, поэтому важно знать факторы, способствующие повышению извлечения ооцитов хорошего качества от одной коровы-донора за определенный период времени, и, как следствие, увеличению выхода эмбрионов в стадии бластоцисты. Кроме того, извлечение из одного донора за сеанс большего количества ооцитов, пригодных для созревания, оплодотворения и культивирования in vitro, позволяет снизить материальные затраты на семя в расчете на один эмбрион, что особенно важно при использовании дорогостоящего сексированного семени [9].

В качестве одного из таких факторов рассматривают временной режим или кратность проведения сессий OPU. Для извлечения фолликулов процедуру OPU проводят дважды (2/w) или один раз в неделю (1/w); реже один раз в две недели (1/2w) [1, 2].

При режиме 2/w количество аспирированных фолликулов, извлеченных ооцитов и эмбрионов в стадии бластоцисты, полученных на 7-й день культивирования, как правило, больше [1, 2, 4]. Это обусловлено увеличением частоты фолликулярных волн, задержкой эстрального цикла, созревания фолликулов и овуляции. Животные, подвергающиеся OPU в режиме 2/w, вступают в парафи-зиологическое состояние, при котором фолликулярные волны независимы от эстрального цикла [10]. Доминантный фолликул не развивается, так как все видимые фолликулы аспирируются в процессе OPU.

При проведении OPU в режиме 1/w в большинстве случаев развивается доминантный фолликул, что приводит к регрессии и вырождению субординатных фолликулов. Присутствие доминантного фолликула снижает компетенцию ооцитов, полученных из субординарных фолликулов, к развитию in vitro, даже на относительно поздних стадиях доминирования [11].

Показано, что временной режим влияет на потенцию отобранных ооцитов к развитию при их использовании в качестве цитопластов для клонирования [12]. Это обусловлено положительной связью интервалов между сеансами OPU и степенью атрезии популяции фолликулов. Поскольку на характер фолликулярных волн оказывают воздействие индивидуальные особенности и порода коров, необходим подбор оптимальных режимов проведения OPU для животных различных пород с учетом условий кормления и содержания. Кроме того, в связи с тем, что проведение OPU в режиме 2/w связано с повышенной нагрузкой на оператора, увеличение его кратности с 1/w до 2/w оправданно только при заметном росте количества извлекаемых OPU-ооцитов хорошего качества, пригодных для получения эмбрионов in vitro.

Цель работы - изучить влияние временных режимов проведения OPU на количество и качество ооци-

тов, получаемых от коров симментальской породы.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили на половозрелых телках симментальской породы в возрасте от 16 до 19 мес (n = 4) с естественным половым циклом. Аспирацию фолликулов осуществляли в режиме один (1/w) или два (2/w) раза в неделю. Для каждого временного режима использовали одних и тех же животных-доноров. Результативность оценивали по количеству и качеству ооцитов, а также по их компетентности к созреванию и эмбриональному развитию in vitro.

Пункцию фолликулов выполняли с использованием OPU-системы для крупного рогатого скота (Minitube, Германия), включающей в себя ультразвуковой сканер SSD Pro Sound 2, конвекциональ-ный секторный зонд, вакуумный насос и держатель зонда. Аспирацию проводили иглой диаметром 1,2 мм и длиной 75 мм, соединенной силиконовым шлангом с 50 мл флаконом. В качестве аспираци-онной жидкости использовали фосфатно-солевой раствор Дюльбеко с добавлением 10 % FCS, 18 МЕ/ мл гепарина и 50 мг/мл гентамицина. Аспираты от каждого донора фильтровали индивидуально, после чего под стереомикроскопом искали и оценивали ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК). Выделенные ОКК разделяли на две группы: хорошего качества (с нормальной морфологией, пригодные для культивирования in vitro) и с признаками дегенерации (не пригодные для культивирования in vitro). Для завершения созревания ооциты хорошего качества культивировали в 500 мкл модифицированной среды ТС-199 в течение 24 ч [13].

У части зрелых ооцитов (n = 52) анализировали степень созревания (достижение метафазы второго деления (MII) мейоза) и апоптотические изменения методом TUNEL с использованием набора «In Situ Cell Death Detection Kit» (Fluorescein, Roche Diagnostics), согласно инструкции компании-производителя. С целью локализации хромосом ооциты окрашивали раствором DAPI (1 мкг/мл). Микрофотографирование и оценку препаратов выполняли под микроскопом Axio Imager M2 (Carl Zeiss, Германия) с флуоресцентной приставкой с использованием программы Zenpro. Степень апоптоза определяли по доле TUNEL-позитивных ооцитов на стадии MII от общего числа MII-ооцитов.

Для оценки способности к эмбриональному развитию созревшие ооциты (52 шт. в группе 1/w и 63 шт. в группе 2/w) оплодотворяли in vitro заморожено-оттаянным семенем одного быка в среде Fert-TALP [14]. Перед оплодотворением гранулы с замороженной спермой оттаивали и обрабатывали методом «swim-up» с использованием среды Sperm-TALP, содержащей 1 мМ пирувата натрия, 6 мг/мл БСА [14]. Фракцию активных сперматозоидов добавляли в чашки со средой и созревшими ооцитами в конечной концентрации 1,5 х 106 сперматозоидов на 1 мл. Через 18...20 ч совместного культивирования ооциты

Таблица. Влияние временного режима OPU на количество и качество выделенных ооцит-кумулюсных комплексов

Временной режим OPU Число фолликулов, n Выделено ОКК, %

всего1 в том числе хорошего качества2

1 раз в неделю (1/w) 2 раза в неделю (2/w) 228 224 61,4 ± 5,9 62,1 ± 6,3 53.6 ± 3,0 65.7 ± 4,0*

'доля выделенных ОКК от общего числа аспирированных фолликулов; 2доля ОКК хорошего качества от общего числа выделенных ОКК; *различия между сравниваемыми группами значимы при р < 0,05.

Рис. 1. Ооцит-кумулюсные комплексы, выделенные из фолликулов коров методом трансвагинальной аспирации (увеличение 200*): А - хорошего качества с нормальной морфологией; Б - с признаками дегенерации.

3

отмывали от сперматозоидов и клеток кумулюса, переносили на среду развития эмбрионов и культивировали до стадии бластоцисты.

Морфологическую оценку эмбрионов осуществляли под стереомикроскопом Nikon (Япония) при увеличении 200* на 2 день (доля раздробившихся ооцитов) и 7 день (выход бластоцист) после опло-

дотворения ооцитов. Для изготовления препаратов, эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, фиксировали в 4 % растворе параформальдегида, подвергали процедуре пермеабилизации в 0,5 % растворе Triton Х-100 и окрашивали DAPI, после чего переносили на сухое обезжиренное стекло для анализа. Цитологические препараты исследовали с использованием флуоресцентной световой микроскопии на микроскопе Axiovert 40 CFL (Carl Zeiss, Германия)при увеличении 400*.

Статистическую обработку данных проводили методом однофакторного дисперсионного анализа при помощи программы Sigma Stat. Данные выражали как средние значения ± стандартные ошибки. Достоверность различий сравниваемых средних

значений оценивали с использованием критерия Тьюки.

Результаты и обсуждение. У 4 телок симментальской породы аспирировали 452 фолликула, из которых выделили 280 ооцит-кумулюсных комплексов (ООК). Влияния изучаемых временных режимов проведения OPU на степень извлечения ОКК и количество выделенных ооцитов от индивидуальных доноров не обнаружено. В среднем от одного донора за сессию получали 4,4 ооцита.

При проведении OPU в режиме 2/w доля ООК хорошего качества, с нормальной морфологией и пригодных для культивирования in vitro (рис. 1), извлекаемых за одну сессию, возрастала, по сравнению с вариантом 1/w, в 1,23 раза (р < 0,05, см. табл.), что согласуется с результатами других авторов [4]. Следовательно, при режиме 2/w доля полученных ООК хорошего качества в целом будет в 2,46 раза выше, чем при режиме 1/w.

Цитологический анализ не выявил влияния кратности сессий OPU на завершение ядерного созревания. Доля ооцитов на стадии MII мейоза через 24 ч созревания была сходной в обеих группах: при 2/w- 73,3 ± 5,6 %, при 1/w - 74,7 ± 2,4 %. Также не обнаружено различий между группами по доле ооцитов с признаками апоптотических изменений: 8,0 ± 3,1 % и 9,8 ± 3,3 %, соответственно.

Количество раздробившихся ооцитов и выход бластоцист (рис. 2) не имели значимых различий между группами: в среднем величины этих показателей составляли соответственно 63,5 и 16,7 %. Полученные эмбрионы на стадии бластоцисты содержали в среднем 70,6 ядер, что позволяет оценивать их как пригодные для дальнейшего использования (замораживания и/или трансплантации реципиентам).

1 раз в неделю 2 раза в неделю

Кратность проведения сессий OPU

Рис. 2. Влияние интервалов между сессиями трасвагинальной аспирации на способность OPU-ооцитов коров к эмбриональному развитию in vitro: - доля раздробившихся ооцитов, от общего количества осемененных ооцитов; LI - доля эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, от общего количества осемененных ооцитов.

Выводы. Исследования не выявили заметного влияния кратности сессий OPU (1 или 2 раза в неделю) на извлечение ооцитов у половозрелых телок симментальской породы: в среднем от каждого донора было получено 4,4 ооцита за сессию. Показано достоверное повышение в 1,23 раза (p < 0,05) доли OPU-ооцитов хорошего качества с нормальной морфологией, пригодных для получения эмбрионов in vitro, при выполнении процедуры в режиме

2/w, по сравнению с 1/w. С учетом кратности проведения процедуры разница составила 2,46 раза. Не установлено различий в степени дробления эмбрионов (в среднем 63,5 %) и их развитии до стадии бластоцисты (в среднем 16,7 %) в зависимости от частоты сессий OPU. С учетом результатов исследований оптимальным режимом проведения OPU для телок симментальской породы следует считать 2 раза в неделю.

Литература.

1. Boni R. Ovum pick-up in cattle: A 25 years retrospective analysis // Animal Reproduction. 2012. Vol. 9. No. 3. Pp. 362-369.

2. Transvaginal ultrasound guided Ovum Pick-up (OPU) in cattle / M. Qi, Y. Yao, H. Ma, et al. // J. Biomim. Biomater. Tissue. Eng. 2013. Vol. 18. Pp. 118. doi:10.4172/1662-100X.1000118.

3. Bols P. E. J., Stout T. A. E. Transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval (OPU: Ovum Pick-Up) in cows and mares// Ed.: Niemann H., Wrenzycki Ch. Animal Biotechnology 1: Springer International Publishing AG, part of Springer Nature. 2018. Рр. 209-233. doi: 0.1007/978-3-319-92327-7.

4. Ovum pick-up, in vitro embryo production, and pregnancy rates from a large-scale commercialprogram using Nelore cattle (Bosindicus) donors / J. H. F. Pontes, F. A. Melo Sterza, A. C. Basso, et al.// Theriogenology. 2011. Vol. 75. Pp. 1640-1646. doi: 10.1016/j.theriogenology.2010.12.026.

5. Трансвагинальная аспирация фолликулов и способность OPU-ооцитов коров к эмбриональному развитию в условиях in vitro / Г. Н. Сингина, В. Гавличек, Н. П. Тарадайник и др. // Молочное и мясноескотоводство. 2019. № 6. C. 17-19. doi: 10.33943/MMS.2019.6.39670.

6. Comparison of embryo yield and pregnancy rate between in vivo and in vitro methods in the same Nelore (Bosindicus) donor cows / J. H. F. Pontes, I. Nonato-Junior, B. V. Sanches, et al. // Theriogenology. 2009. Vol. 71. Pp. 690-697. doi: 10.1016/j. theriogenology.2008.09.031.

7. A novel discipline in embryology - animal embryo breeding / B. Wu, L. Zan, F. Quan, et al.// New Discoveries in Embryology: InTech, 2015. doi: 10.5772/61299.

8. Zinovieva N. A., Volkova N. A., Bagirov V. A. Genome editing: Current state of research and application to animal husbandry //Applied Biochemistry and Microbiology. 2019. Vol. 55. No. 7. Pp. 711-721. doi: 10.1134/S000368381907007X.

9. Оценка эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro с использованием спермы, разделенной по полу / Г. Н. Сингина, Т. Е. Тарадайник, Е. Н. Шедова и др. // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 12. С. 95-97.

10. Potential use of Ovum Pick-Up for embryo production and breeding in cattle / T. A. M. Kruip, R. Boni, Y. A. Wurth, et al. // Theriogenology. 1994. Vol. 42. Pp. 675-683.

11. Effect of different stages of the follicular wave on in vitro developmental competence of bovine oocytes / P. J. M. Hendriksen, W. N. M. Steenweg, J. C. Harkema, et al. // Theriogenology. 2004. Vol. 61. Pр. 909-920.

12. Different intervals of ovum pickup affect the competence of oocytes to support the preimplantation development of cloned bovine embryos / L. J. Ding, H. B. Tian, J. J. Wang, et al.// Mol. Reprod. Dev. 2008. Vol. 75. Pp. 1710-1715.

13. Способность ооцитов коров к эмбриональному развитию при созревании в разных системах двухфазного культивирования / Г. Н. Сингина, И. Ю. Лебедева, Е. Н. Шедова и др. // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т. 52. № 4. C. 772-784. doi: 10.15389/agrobiology.2017.4.776rus.

14. Получение эмбрионов in vitro методом межвидового оплодотворения яйцеклеток коров (Bos taurus) семенем зубра (Bison bonasus) / Г. Н. Сингина, В. А. Багиров, С. С. Данч и др. // Сельскохозяйственная биология. 2016. Т. 51. № 6. С. 824-829. doi: 10.15389/agrobiology.2016.6.824rus.

References

1. Boni R. Ovum pick-up in cattle: A 25 years retrospective analysis. Animal Reproduction. 2012;9(3):362-9.

2. Qi M, Yao Y, Ma H, et al. Transvaginal ultrasound guided Ovum Pick-up (OPU) in cattle. J. Biomim. Biomater. Tissue. Eng. 2013;18:118. doi:10.4172/1662-100X.1000118.

3. Bols PEJ, Stout TAE. Transvaginal Ultrasound-Guided Oocyte Retrieval (OPU: Ovum Pick-Up) in Cows and Mares. In: Niemann H, Wrenzycki Ch, editors. Animal Biotechnology 1. Springer International Publishing AG, part of Springer Nature; 2018. p. 209-33. doi: 0.1007/978-3-319-92327-7.

4. Pontes JHF, Melo Sterza FA, Basso AC, et al. Ovum pick-up, in vitro embryo production, and pregnancy rates from a large-scale commercialprogram using Nelore cattle (Bosindicus) donors. Theriogenology. 2011;75:1640-6. doi: 10.1016/j. theriogenology.2010.12.026.

5. Singina GN, Gavlichek V, Taradainik NP, et al. [Transvaginal aspiration of follicles and the ability of cow OPU oocytes to embryo development in vitro]. Molochnoe i myasnoeskotovodstvo. 2019;(6):17-9. doi: 10.33943/MMS.2019.6.39670. Russian.

6. Pontes JHF, Nonato-Junior I, Sanches BV, et al. Comparison of embryo yield and pregnancy rate between in vivo and in vitro methods in the same Nelore (Bosindicus) donor cows. Theriogenology. 2009;71:690-7. doi: 10.1016/j. theriogenology.2008.09.031.

7. Wu B, Zan L, Quan F, et al. A novel discipline in embryology - animal embryo breeding. New Discoveries in Embryology: InTech; 2015. doi: 10.5772/61299.

8. Zinovieva NA, Volkova NA, Bagirov VA. Genome editing: Current state of research and application to animal husbandry. Applied Biochemistry and Microbiology. 2019;55(7):711-21. doi: 10.1134/S000368381907007X.

9. Singina GN, Taradainik TE, Shedova EN, et al. [Evaluation of the effectiveness of obtaining in vitro cattle embryos using semen divided by sex]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2015;29(12):95-7. Russian.

10. Kruip TAM, Boni R, Wurth YA, et al. Potential use of Ovum Pick-Up for embryo production and breeding in cattle. Theriogenology. 1994;42:675-83.

11. Hendriksen PJM, Steenweg WNM, Harkema JC, et al. Effect of different stages of the follicular wave on in vitro developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 2004;61:909-20.

12. Ding LJ, Tian HB, Wang JJ, et al. Different intervals of ovum pickup affect the competence of oocytes to support the preimplantation development of cloned bovine embryos. Mol. Reprod. Dev. 2008;75:1710-5.

13. Singina GN, Lebedeva IYu, Shedova EN, et al. [The ability of cow oocytes to embryonic development upon maturation in different biphasic cultivation systems]. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2017;52(4):772-84. doi: 10.15389/ agrobiology.2017.4.776rus. Russian.

14. Singina GN, Bagirov VA, Danch SS, et al. [In vitro embryo production by interspecific fertilization of bovine eggs (Bos taurus) by bison semen (Bison bonasus)]. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2016;51(6):824-9. doi: 10.15389/ agrobiology.2016.6.824rus. Russian.