Изучение способности лигнанов лимонника китайского к чрескожной проницаемости в эксперименте

2. Горчаков, В.Н. Морфологические методы исследования сосудистого русла. - Новосибирск: СО РАМН, 1997. - 440 с.

3. Иммуногенез и лимфоток (структурно-функциональные основы) / под ред. В.М. Петренко, А.В. Борисова, Г.И. Лобова. - СПб.: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2003. - Вып. 3. - С. 34-36.

4. Чумаков, В.Ю. Гистоструктура капсул регионарных лимфатических узлов тощей кишки овец / В.Ю. Чумаков, Е.Л. Безрук // Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных: материалы международной научной конференции. -Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 2003. - С. 112-113.

5. Морфофункциональная характеристика капсулы регионарных лимфатических узлов некоторых млекопитающих / В.Ю. Чумаков [и др.] // Успехи современного естествознания. - 2004. - № 8. - С. 82-83.

6. Чумаков, В.Ю. Структурные особенности лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных при спонтанном уролитиазе и в условиях лимфотропной антибиотикотерапии: монография / В.Ю. Чумаков, Е.Ю. Складнева. - Абакан: Хакасское книжное издательство, 2010. - 124 с.

7. Чумаков, В.Ю. Регионарные лимфатические узлы некоторых органов кролика: учебное пособие для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 11801.65 - Ветеринария. - Черногорск: Изд-во ООО «Риц», 2011. - 29 с.

8. Чумаков, В.Ю. Миоциты стенки лимфатических сосудов сердца и органов головной кишки кролика / В.Ю. Чумаков, П.П. Ша-лаумов, А.В. Захаров // Вестник КрасГАУ. - 2012. - №5 (68).

9. Привес, М.Г. Анатомия человека. - М.: Медицина, 1985. - 454 с.

10. Ганцев, Ш.Х. Новое к теории метастазирования рака и подходам к его лечению // Креативная хирургия и онкология. - 2010. -№ 4. - С. 5-11.

11. Коненков, В.И. Лимфология / В.И. Коненков, Ю.И. Бородин, М.С. Любарский. - Новосибирск: Манускрипт, 2012. - 1100 с.

12. Aloisi F. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases / F. Aloisi, R. Pujol-Borrell // Nat. Rev. Immunol. - 2006. -Vol. 6. -P. 205-217.

13. Synthesis of artificial lymphoid tissues with immunological function / Y. Kobayashi, T. Watanabe // Trends in Immunology. - 2010. -Vol. 31. - P. 422-428.

14. Шабад Л.М., Блох М.М. Новый перевиваемый штамм саркомы крыс М1/ Л.М. Шабад, М.М. Блох // Бюллетень экспериментальной биологии. - 1947. - Т. 24. - №10. - С. 4.

УДК 615.451.16 + 615.454 + 615.071 © Ю.А. Морозов, 2016

Ю.А. Морозов

ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ЛИГНАНОВ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО К ЧРЕСКОЖНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

ФГБОУ ВО «Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова», г. Владикавказ

В работе приводятся результаты исследований по установлению возможности лигнанов - основной группы биологически активных веществ, содержащихся в лекарственном растительном сырье лимонника китайского, - к чрескожной проницаемости в экспериментах in vitro (диализ через «переживающую» кожу белых крыс) и in vivo (аппликации модельного трансдермального пластыря на выстриженные участки тела белых крыс). В качестве объектов исследований были выбраны суммарные фитопрепараты, представляющие собой СО2-экстракты, полученные сверхкритической экстракцией из семян, корневищ с корнями, ветвей и листьев лимонника китайского. С помощью метода газовой хроматографии с масс-селективным детектором во всех исследуемых биообъектах (диализат; плазма крови, печень, почки и головной мозг крыс) зарегистрировано присутствие схизандрина, доминирующего по содержанию и биологической роли среди всех лигнанов лимонника китайского. В диализате найдены и другие представители лигнанов: у-схизандрин и гомизин А, а также лимонен - вещество, способствующее активации переноса лекарственных средств через целостные кожные покровы.

Ключевые слова: лимонник китайский, схизандрин, трансдермальные терапевтические системы.

Yu. A. Morozov

THE STUDY OF THE ABILITY OF LIGNANS OF SCHIZANDRA CHINENSIS TO PERCUTANEOUS PERMEABILITY IN THE EXPERIMENT

The work presents the results of research on establishment of possibility of lignans - a major group of biologically active substances contained in various herbal medicinal raw materials of Schizandra chinensis - to cutaneous permeability in experiments of in vitro (the dialysis through «experiencing» the skin of white rats) and in vivo (application of a model transdermal plaster to white rats on the shaven body sites). As objects of research the total herbal remedies were chosen, which represents a CO2-extracts received by supercritical extraction from seeds, rhizomes with roots, branches and leaves of the Schizandra chinensis. Using the method of gas chromatography with mass-selective detector all the studied biological objects (dialysate; blood plasma, liver, kidney and cerebrum of rats) revealed the presence of schizandrin, the dominant among all lignans of Schizandra chinensis by content and biological roles. In the dialysate other representatives of lignans have been found: y-schizandrin and gomisin A, as well as lemonem - the substance promoting activation of transfer of medicines through complete integuments.

Key words: Schizandra chinensis, schizandrin, transdermal therapeutic system.

Лигнаны - это димерные соединения фенольной природы, состоящие из двух фе-нилпропановых фрагментов (С6-С3), связанных между собой Р-углеродными атомами боковых цепей. Термин «лигнаны» впервые введен У.Н. Хоуорсом в 1936 году.

В настоящее время известно более 200

представителей этой группы. Разнообразие лигнанов обусловлено наличием различных заместителей в бензольных кольцах и характером связи между ними, а также степенью насыщенности боковых цепей и степенью окисления Р-углеродных атомов. В состав ароматических колец входит не менее двух

кислородных заместителей: гидроксилов, ме-токсилов, метилендиоксигрупп.

Классификация лигнанов, предложенная К. Фрейденбергом с соавторами (1961), основана на строении углеродного скелета и выделяет следующие группы: производные дибен-зилбутана (кислота гваяретовая, кубенин), производные дибензоциклооктадиена (схи-зандрины), производные дибензилбутиролак-тона (арктиин), производные 2,6-дифенил-тетрагидрофурофурана (сирингарезинол и его гликозид - элеутерозид Е, сезамин), производные 1 -фенилтетрагидронафталин-2,3-бутиро-лактона (подофиллотоксин) и флаволигнаны, имеющие более сложную структуру (С6-С3-С6-С3-С6; силибин, силидианин, силикристин). Обнаружены и другие соединения лигнанов, в том числе с кумаринами, флавонами и ксанто-нами. По физико-химическим свойствам лиг-наны, как правило, представляют собой твердые бесцветные или окрашенные кристаллические вещества, хорошо растворимые в спирте, хлороформе, жирных и эфирных маслах. Многие лигнановые соединения обладают ценными фармакологическими свойствами: противоопухолевыми, стимулирующими и адаптоген-ными, антигеморрагическими, противомик-робными, гепатозащитными [1,2].

При тщательном изучении инструкции по применению противоопухолевого препарата Кондилин, основным действующим веществом которого является подофиллотоксин -лигнан, выделенный из корневищ с корнями подофилла щитовидного (Podophyllum peltatum L.) семейства барбарисовых (Berberidaceae), обращают на себя внимание сведения о возможном наличии данного биологически активного вещества (БАВ) в сыворотке крови при местном применении, что в свою очередь подразумевает его чрескожное проникновение [3].

В литературе встречаются данные о способности и других представителей из группы лигнанов проникать через целостные кожные покровы. Так, Е.А. Мориной (2010) разработаны составы и предложена технология получения трансдермальных терапевтических систем (ТТС) на основе флаволигнанов плодов расторопши пятнистой (Silybum mari-anum (L.) Gaertn) семейства астровых (Aster-aceae Dumort): силимарина (суммы флаволиг-нанов: силибина, силидианина, силикристи-на), силикристина и их липосомных форм [4].

Учеными Самарского государственного медицинского университета, в частности П.Г. Мизиной, теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены технология и составы

пролонгированных аппликационных ЛФ на основе растительных фенилпропаноидов [5].

В качестве фармакологически активных фитосубстанций для ТТС нам интересны лигнаны схизандринового ряда, являющиеся основными действующими биологически активными веществами (БАВ) лимонника китайского (Schisandra chinensis Turcz. (Baill.)) семейства лимонниковых (Schisan-draceae). Выбор объекта обусловлен его научной и практической значимостью. Лимонник китайский - мощный адаптоген, имеющий разнообразный фитосостав и в соответствии с этим широкий диапазон возможностей использования в медицине, в том числе спортивной. И в то же время официальных лекарственных форм (ЛФ), кроме традиционной настойки, он практически не имеет.

Следует отметить, что на высвобождение лекарственного вещества (ЛВ) из транс-дермального пластыря и на преодоление им кожного барьера влияет множество факторов, связанных с физико-химическими свойствами ЛВ, со свойствами вспомогательных веществ и материалов, образующих пластырь, и с индивидуальными особенностями кожи. Для трансдермального переноса без использования дополнительного химического, механического или физического воздействий лекарственные субстанции должны отвечать целому ряду избирательных свойств [6, 7].

Так, доминирующие лигнаны лимонника китайского: схизандрин, у-схизандрин и гомизин А - имеют приемлемые для ТТС значения молекулярного веса 432,51; 400,19 и 416,51 соответственно.

Сотрудниками ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации» приводятся результаты изучения фармакокинетики схизандрина на крысах при пероральном введении масляного экстракта семян лимонника китайского, полученного ими по оригинальной технологии с использованием роторно-пульсацион-ного аппарата. Авторы делают заключение о коротком периоде полувыведения и невысоком значении показателя среднего времени удерживания схизандрина [8].

Схизандрин - это малотоксичное БАВ, проявляющее фармакологическую активность при достаточно невысоких дозировках.

Все вышеперечисленное делает актуальным вопрос о продолжении исследований в области разработки оптимальных составов и рациональной технологии получения ТТС на основе природных фенилпропаноидов - лиг-нанов лимонника китайского.

Целью данной работы явилось изучение способности лигнанов, содержащихся в лекарственном растительном сырье (ЛРС) лимонника китайского, к чрескожной проницаемости в экспериментах in vitro и in vivo.

Материал и методы

В литературе приводятся данные о содержании лигнанов в достаточном количестве не только в традиционно используемых плодах и семенах, но и в других видах ЛРС лимонника китайского [9]. Таким образом, объектами наших исследований являлись СО2-экстракты семян, корневищ с корнями, ветвей и листьев лимонника китайского.

Используемое в работе растительное сырье лимонника китайского выращено и заготовлено в ООО «Специализированное сельскохозяйственное предприятие «Женьшень»« (Россия, Брянская область, Унечский район, д. Пески). Для данного вида сырья нами проведен полный фармакогностический анализ: изучены товароведческие показатели, фито-химический и элементный состав, подтверждающий его пригодность для использования в качестве ЛРС [10].

Суммарные фитопрепараты были получены в условиях производственного участка ООО «Научно-исследовательский центр экологических ресурсов «ГОРО»« (Россия, г. Ростов-на-Дону). Сверхкритическая экстракция проводилась с использованием установки КОЭРС1; время экстракции составило 60 мин.; давление в экстракторе - 300 атм.; температура в экстракторе - 60 С. Выход продукта из семян, корневищ с корнями, ветвей и листьев составил 8,94, 4,87, 2,00, 2,60% соответственно.

Полученный СО2-экстракт из семян представляет собой густую маслянистую жидкость от беловато-желтого до буровато-желтого цвета; остальные экстракты - светло-желтую пастообразную массу. Всем фитопро-дуктам был присущ приятный запах характерный для лимонника китайского.

Экспериментальные исследования по изучению чрескожной проницаемости лигна-нов проводили на 30 крысах-самцах линии Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО «СевероОсетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова» при фиксированном световом режиме, со свободным доступом к пище и воде. Вес животных к началу эксперимента составил 270-300 г, возраст - 5-6 месяцев.

Трансдермальную проницаемость in vitro изучали с использованием метода диализа через мембрану по общепринятой методике. В качестве мембраны использовали «пе-

реживающую» кожу лабораторных животных (предварительно выстриженную, изолированную от животных после эвтаназии с помощью СО2-камеры) герметично закрепляемую на одно из отверстий диализной стеклянной трубки. Диализной средой служил 0,9 % раствор натрия хлорида для инфузий (ОАО НПК «Эском», Россия), дозированный в количестве 40 мл в химический стакан. Перемешивание осуществляли магнитной мешалкой (ПЭ 6100, ТУ 3615-009-23050963-98, Россия) при скорости перемешивания приемного раствора 120±1 об/мин. В ходе эксперимента система термостатировалась (ES-4620 НПО «Экрос», Россия) при температуре 35°±1 °С. Исследуемые экстракты в количестве 0,2 г наносились равномерным тонким слоем на мембраны. Параллельно проводили холостой диализ (без образцов экстрактов) через «переживающую» кожу лабораторных животных (n=2).

Для проведения исследований in vivo нами были сконструированы модельные пластыри площадью 10 см2, имеющие все составные части трансдермального пластыря матричного типа. Экстракты в количестве 0,2 г наносились тонким слоем на аккуратно выстриженные участки боковой поверхности туловища крыс, покрывались непроницаемой пленкой-подложкой и плотно фиксировались к коже липкой лентой (в случае СО2-экстракта семян лимонника китайского последний для предупреждения растекания по коже предварительно наносился на марлевую салфетку). На время экспозиции животных помещали в индивидуальные отсеки клетки с перегородками (n=2).

Учитывая данные, приведенные в работе [11], о том, что роговой слой (главный барьер на пути трансдермальной проницаемости ЛВ) кожи хвоста крыс хорошо развит и отличается значительной толщиной, и, опираясь на сведения, приведенные в [12], нами проведены исследования трансдермальной проницаемости лигнанов на модели крысиных хвостов in vivo. Эксперимент проводили посредством помещения животных в специально изготовленные для этого индивидуальные клетки размером 6^21^6 см, безболезненно максимально ограничивающие движения крыс и имеющие выводное отверстие для хвоста. Через данное отверстие хвост на 2/3 своей длины помещался в пробирку с исследуемыми СО2-экстрактами, закрепленную ниже на штативе (n=2).

Во всех трех экспериментах экспозиция продолжалась 24 часа. После чего в диализной среде (опыты in vitro), сыворотке крови, почках, печени, головном мозге (опыты in

vivo) после соответствующей пробоподготов-ки проводили обнаружение лигнанов с помощью квадрупольного хромато-масс-спектрографа фирмы «Agilent Technologies» 5860/5973 (США). Установление структуры лигнанов проводили по масс-спектрам с помощью компьютерной базы данных NIST08.

Результаты и обсуждение

В исследуемых образцах диализата для всех испытуемых экстрактов семян, корневищ

с корнями, ветвей, листьев обнаружены схи-зандрин и гомизин А; для образцов СО2-экстракта семян в диализате также обнаружен у-схизандрин и лимонен, которые отсутствовали в других экстрактах (рис. 1, 2).

Согласно результатам исследований in vivo во всех без исключения образцах - сыворотки крови, почек, печени и головного мозга - были зарегистрированы пики, характерные для схизандрина (рис. 3, 4).

; V , X >>

иF ÍSÍ 11 D Illa

пи »i

И ЕЯ' I \

So ¡4 t?5fl 1300 USO

г» trt » «С 1«

М М DI)

«ÍJ та 15577 4351 «»____

чэ но йв м> ия ие

Рис. 1. Масс-хроматограмма и масс-спектры анализируемого образца диализата

н на 41 не а ед шл :Г и к м

Рис. 2. Масс-хроматограмма и масс-спектры анализируемого образца диализата

5И<

Flu ЕЛ hW

™ Hit!

ML* fa 4]

MU) им ми

«s?.i р y¡i\ su] tas i w ÍW

«о мэ не

««ившнсшн»»

Рис. 3. Масс-хроматограмма и масс-спектры анализируемого образца сыворотки крови

TIC: OfitB C'dalem

120000 110000 icooooj soooo

BOOOO 70000 60000 50000' 40000; 30000| 200001 10000

24.80 24.90 2500

Sean 3516 (24 6Q0 irin]: OPltB.DUaie ra (>3592) (-;

ft

-ю и м ни 1дд ид iso iflo ии 220 з4о гвд ж эм зк 340 аео ао «а 4?о лт

Рис. 4. Масс-хроматограмма и масс-спектры анализируемого образца печени

Заключение

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о возможности трансдермальной проницаемости in vitro и in

vivo схизандрина, что позволяет в дальнейшем проводить исследования по разработке трансдермальных лекарственных форм на основе лимонника китайского.

Сведения об авторе статьи:

Морозов Юрий Алексеевич - к.фарм.наук, доцент кафедры технологии лекарственных форм и организации фармацевтического дела ФГБОУ ВО «Северо-Осетинский государственный университет имени К.Л. Хетагурова». Адрес: 362025, г. Владикавказ, ул. Ватутина, 44-46. E-mail: moroz52@yandex.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия: учебник / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2007. - 656 с.

2. Минина, С.А. Химия и технология фитопрепаратов: учебное пособие / С.А. Минина, И.Е. Каухова. - М.: ГЭОТАР-Медиа,

2009. - 560 с.

3. Лекарственные препараты в России: справочник Видаль. - М.: Видаль Рус, 2015. - 1480 с.

4. Морина, Е.А. Разработка трансдермальных лекарственных форм флаволигнанов: автореф. дисс... канд. фармац. наук. - М.,

2010. - 23 с.

5. Мизина, П.Г. Теоретическое и экспериментальное обоснование создания аппликационных лекарственных форм на основе растительных фенилпропаноидов / П.Г. Мизина // Фармация. - 2003. - № 3. - С. 36.

6. Трансдермальные терапевтические системы доставки лекарственных веществ / А.Е. Васильев [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 2001. - Т 35, N° 11. - С. 29-42.

7. Биосовместимые материалы: учеб пособ. / под ред. В.И. Севастьянова, М.П. Кирпичникова. - М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство»«, 2011. - 544 с.

8. Фармакокинетика схизандрола А на крысах при введении масляного экстракта лимонника / М.В. Карлина [и др.] // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2014. - № 1 (6). - С. 126-131.

9. Садтарова, Ф.Ш. Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов и семян лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.]: дис.... канд. фармац. наук. - Курск, 2009. - 158 с.

10. Морозов, Ю.А. Изучение элементного состава и числовых показателей надземных и подземных органов лимонника китайского / Ю.А. Морозов, М.С. Макиева, Е.В. Морозова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 4. URL: http://www.science-education.ru/127-21015 (дата обращения: 31.07.2015).

11. Гистофармакологические исследования кожи (наш опыт) / В.И. Ноздрин [и др.]. - М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды», 2006. - 376 с.

12. Децина, А.Н. Теория мягких косметологических воздействий. Современная косметология. / А.Н. Децина. - Новосибирск: ГУП РПО СО РАСХН, 2001. - 505 с.