СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ВРОЖДЕННЫХ ИНФЕКЦИЙ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF CONGENITAL INFECTIONS

Изобретение относится к области медицины, а именно - инфекционным болезням, и может быть использовано для прогнозирования риска развития врожденных инфекций на этапе первичного обследования беременных и разработки индивидуальных программ наблюдения.
Врожденные инфекции (далее - ВИ) - большая группа заболеваний, возбудители которых передаются от матери плоду в период пребывания его в полости матки (антенатально) и в ходе родов (интранатально).
В настоящее время известно около 50 инфекционных агентов, которые могут быть переданы от матери плоду с развитием ВИ. Однако истинная частота ВИ до сегодняшнего дня остается неизвестной в силу объективных трудностей их этиологической верификации, отсутствия определенных критериев определения самого случая ВИ.
Вместе с тем, по экспертным данным, частота ВИ весьма высока. Так, по оценкам экспертов Федеральной службой в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в РФ ежегодно регистрируется около 400 случаев врожденной краснухи (Методические указания 3.1.2.2356-08 «Эпидемиологический надзор за врожденной краснухой», введены в действие с 01.07.2008 г.). Тяжелый врожденный токсоплазмоз (далее - ВТ) встречается с частотой 1 случай на 1-8 тысяч родов (Robert-Gangneux F. Epidemiology of and diagnostic strategies for toxoplasmosis / Robert-Gangneux F., Dardy M. - L. // Clin. Microbiol. Rev. - 2012. - Vol.25, №2. - P.264-296.), т.е., только в СПб ежегодно может рождаться от 6 до 40 таких детей. Крайне высока частота врожденной цитомегаловирусной инфекции (далее - ЦМВИ), которая встречается у 1% новорожденных (Malm G. Congenital cytomegalovirus infections / Malm G, Engman M.L. // Semin. Fetal Neonatal. Med. - 2007. - Vol.12, №3. - P.154-159.). Сходные данные опубликованы по частоте врожденной инфекции вирусом простого герпеса человека (далее - ВПГ), парвовирусной инфекции (далее - ПВИ), врожденного хламидиоза, микоплазмоза (Лобзин Ю.В. Актуальные аспекты врожденных инфекций в России / Лобзин Ю.В., Васильев В.В., Скрипченко Н.В. и соавт./ Журнал инфектологии. -2010. - Т. 2, №2. - С.14-24; Giraudon I. Antenatal screening and prevalence of infection: surveillance in London, 2000-2007 / Giraudon I., Forde J., Maguire H. et al // Euro Surveill. - 2009. - Vol.14, №9. - P.8-12.).
ВИ характеризуются тяжестью течения и высокой частотой неблагоприятных исходов. Летальность при ВТ составляет 12%, врожденной ВПГ - до 90%, энтеровирусной инфекции - 80%, подостром склерозирующем панэнцефалите (следствие врожденной краснухи) - 100% (Лобзин Ю.В. Актуальные аспекты врожденных инфекций в России / Лобзин Ю.В., Васильев В.В., Скрипченко Н.В. и соавт./ Журнал инфектологии. - 2010. - Т.2, №2. - С.14-24).
Высокая частота, тяжесть течения, неблагоприятные исходы ВИ, развивающихся в результате передачи инфекции от матери плоду обусловили неоднократные попытки исследователей прогнозировать риск их развития на ранних сроках беременности по результатам обследования будущей матери.
В основе всех методик прогноза риска ВИ лежит известное положение о том, что этот риск является наибольшим (в среднем, около 50%) при первичном заражении во время беременности, в то время как при обострении во время беременности ранее приобретенного заболевания он (риск) не превышает 10%, чаще - 3-5% (Kishore J. Adverse reproductive outcome induced by Parvovirus B19 and TORCH infections in women with high-risk pregnancy / Kishore J., Misra R., Paisal A., Pradeep Y. // J Infect. Dev. Ctries. - 2011. - Vol.5, №12. - P.868-873.).
Соответственно, для оценки риска определяющим является ответ на вопрос о наличии/отсутствии у беременной инфекции и, при наличии, определение давности заражения. Для установления факта заражения чаще всего применяется определение специфических антител (как правило, Ig М и Ig G) к соответствующим микроорганизмам, а для оценки давности - дополнительно - авидность Ig G. Микробиологические исследования, полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР) применяются, как правило, для оценки наличия инфекционных агентов на слизистой оболочке родовых путей, что имеет несколько меньшее значение для развития ВИ (локальную инфекцию можно успешно лечить, передача плоду может реализовываться интранатально, когда иммунная система последнего уже более-менее функциональна) (Диагностика и профилактика заболеваний TORCH-комплекса: Учебн. пособие для врачей / В.В. Васильев, В.А. Неверов, Г.И. Кирпичникова, Мирошниченко И.Г., Мацко В.А., Воронина О.Л.; под ред. Ю.В. Лобзина. - СПб.: 2012. - ООО «Цифра-онлайн». - 51 с).
Известен ряд способов прогноза риска поражения плода при различных инфекциях.
Для оценки риска врожденной ЦМВИ с целью выявления беременных, не имеющих антител и/или имеющих специфические Ig М, первичное обследование проводят при постановке на учет. Для этих женщин рекомендуется проведение терапии специфическими иммуноглобулинами с выполнением кордоцентеза (через 7 недель после вероятного заражения или на 22 неделе гестации) и количественной ПЦР, так как данные исследования амниотической жидкости и ультразвуковые исследования недостаточно информативны.
При этом обязательное обследование на наличие антител к ЦМВИ рекомендуется беременным, перенесшим во время беременности гриппоподобное заболевание или имеющих УЗ-признаки патологии плода. Серологический мониторинг во время беременности считается целесообразным для женщин, работающих в детских учреждениях и тех, чьи дети такие учреждения посещают (Sampedro М.А. Diagnosis of congenital infection / Sampedro M.A., Martinez L.A., Teatino P.M., Rodriguez-Granger J. // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. - 2011. - Vol.29, Suppl 5. - P.15-20; Coll O. Guidelines on CMV congenital infection / Coll O., Benoist G., Ville Y., Weisman L.E. et al.; WAPM Perinatal Infections Working Group // J. Perinat. Med. - 2009. -Vol.37, №5. - P.433-445; Yinon Y. Screening, diagnosis, and management of cytomegalovirus infection in pregnancy / Yinon Y., Farine D., Yudin M.H. // Obstet. Gynecol. Surv. - 2010. - Vol.65, №11. - P.736-743.).
Во Франции на протяжении более 20 лет реализуется государственная программа профилактики ВТ, основанная на тотальном обследовании всех беременных на наличие антител классов Ig М и Ig G к токсоплазмам и определении авидности Ig G при принятии решения о сохранении данной беременности. Результаты обследования интерпретируются следующим образом:
- при отсутствии антител женщина не имеет иммунитета, нуждается в разъяснении мероприятий по предупреждению заражения и ежемесячном повторном определении указанных показателей;
- при отсутствии Ig М, наличии Ig G с авидностью выше 35%, полагают, что к моменту зачатия женщина уже имела иммунитет и риск врожденного токсоплазмоза у ее детей нет, в мониторинге она не нуждается;
- при наличии антител обоих классов рекомендуется определение авидности антител, повторное определение специфических Ig G через 2-3 недели (Robert-Gangneux F. Epidemiology of and diagnostic strategies for toxoplasmosis / Robert-Gangneux F., Dardy M. - L. // Clin. Microbiol. Rev. - 2012. - Vol.25, №2. - P.264-296.).
Отечественным аналогом предлагаемого изобретения является выделение среди беременных групп риска развития ВТ на основании оценки данных эпид. анамнеза (давность и интенсивность воздействия возможных факторов риска заражения токсоплазмам и) и первичного определения специфических Ig М и Ig G в сроке беременности до 10 недель (Лобзин Ю.В. Токсоплазмоз у беременных / Лобзин Ю.В., Тимченко В.Н., Васильева И.С.// Российский медицинский журнал. - 2001. - №4. - С.24-27.).
Первая группа - инфицирование Т. gondii до беременности: а) беременные с Ig М ниже 100% экстиции, количеством Ig G более 6 МЕ/мл при различном риске заражения; б) беременные с величиной экстинции Ig M-tox более 100%, количеством Ig G более 100 МЕ/мл и низким эпидемиологическим риском заражения.
Вторая группа - инфицирование Т. gondii во время данной беременности: беременные с величиной экстинции Ig М более 170%, количеством Ig G-tox более 100 МЕ/мл и высоким эпидемиологическим риском инфицирования.
Третья группа - инфицирование Т. gondii отсутствует: беременные с Ig М ниже 100% экстинции и Ig G - менее 6 МЕ/мл.
Четвертая группа - пациенты с другими сочетаниями результатов серологического обследования и данных эпидемиологического анамнеза.
При этом риск врожденного токсоплазмоза в первой группе отсутствует, во второй - имеется явно (первичное заражение во время беременности), в третьей - риск может возникнуть, если состоится заражение, а в четвертой - является неоднозначным, требуется повторное обследование.
Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения являются алгоритмы оценки результатов определения специфических антител и авидности Ig G, приведенные в работе Савичевой A.M. (Савичева A.M. Проблемы диагностики и терапии репродуктивно значимых инфекций / Савичева A.M. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2006. - Т. LV, №2. - С.76-84.).
По мнению автора, интерпретация результатов серологических реакций должна заключаться в следующем: наличие в крови специфических IgM-антител в отсутствии IgG-антител свидетельствует о ранней острой фазе заболевания и о необходимости начала лечения токсоплазмоза, или прерывания беременности при краснухе. Наличие специфических антител обоих классов говорит об острой инфекции в более поздней фазе. В этих случаях решение зависит от вида возбудителя, срока беременности и других обстоятельств, характеризующих ситуацию. Наличие у беременной лишь IgG-антител к токсоплазмозу, к краснухе говорит о состоянии иммунитета. Отсутствие антител обоих классов свидетельствует о том, что инфекции в прошлом не было, то есть имеется возможность первичного инфицирования во время беременности и возникновения внутриутробной инфекции плода со всеми ее особенностями и последствиями. Для таких беременных показаны повторные серологические исследования, чтобы проследить возникшую первичную инфекцию, особенно опасную для плода.
При выявлении ложноположительных Ig М автор рекомендует оценку динамики IgG в сыворотках крови, взятых с интервалом 10-14 дней, в частности, нарастание в 4 и более раз, служит подтверждением заболевания у матери. Особенно важно при наличии IgG-антител определение индекса авидности. Об инфекции, впервые возникшей во время беременности, свидетельствует определение низкоавидных IgG (ниже 30%). При этом об «инфекции в прошлом», по мнению автора, свидетельствует авидность выше 40%.
Однако данный способ (как и перечисленные выше), несмотря на попытку объединить в алгоритме несколько нозологических форм, обладает рядом недостатков. Во-первых, описательный характер алгоритмов, никак не связанный со сроками гестации при обследовании. Во-вторых, совершенно неясно, как автор различает положительные и ложноположительные Ig М. В-третьих, при реактивации ЦМВИ также будут выявляться специфические Ig М, a Ig G будут с высокой авидностью. Однако 75% детей с врожденной ЦМВИ заражаются именно в период реактивации инфекции у матери, а не при острой инфекции (непонятен подход автора к данной ситуации). В четвертых, как правило, речь идет об отдельных нозологических формах, токсоплазмозе, краснухе, а не о их совокупности.
Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности прогноза риска наиболее актуальных ВИ за счет комплексной оценки совокупности клинико-анамнестических данных и количественных параметров результатов лабораторных исследований при первичном обследовании беременных.
Это достигается тем, что результаты известных методов исследований, включающих определение количества специфических антител классов Ig М и Ig G в биологическом материале, согласно изобретению в качестве биологического материала используют мазок со слизистой оболочки цервикального канала при первичном обследовании в сроке до 12-й недели гестации, одновременно в мазках определяют количество антител Ig М и Ig G к вирусу краснухи, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V, токсоплазмам, вирусу простого герпеса 1 и 2 типов и величины авидности специфических Ig G к этим возбудителям, дополнительно в том же мазке определяют уровень секреторного неспецифического IgA методом РИФ к антигенам цитомегаловируса, хламидий, микоплазм, и генетического материала этих микроорганизмов методом ПЦР и при величине специфических антител к указанным возбудителям ниже порога чувствительности или величины специфических Ig М в 2 и более раз выше порога чувствительности, или наличии в слизистой оболочке цервикального канала элементарных телец хламидий, антигенов микоплазм, «ключевых клеток» цитомегаловирусной инфекции, инфекции вирусом простого герпеса при снижении уровня местного секреторного Ig А ниже lg32 прогнозируют группу высокого риска врожденной краснухи, цитомегаловирусной, парвовирусной инфекции, инфекции вирусом простого герпеса, токсоплазмоза, хламидиоза, микоплазмоза; при специфических Ig G к цитомегаловирусу и вирусу простого герпеса в количествах, превышающих порог чувствительности в сочетании с наличием в слизистой оболочке цервикального капала ретикулярных телец хламидий, антигенов микоплазм, отсутствием «ключевых клеток» цитомегаловирусной инфекции, инфекции вирусом простого герпеса, при уровне местного секреторного Ig А в пределах lg32-lg64 прогнозируют группу умеренного риска врожденных цитомегаловирусной инфекции, инфекции вирусом простого герпеса, хамидийной инфекции, микоплазмоза; при специфических Ig G к парвовирусу, вирусу краснухи, токсоплазмам в количествах более чем в 6 раз превышающих порог чувствительности соответствующих реакций, величине специфических Ig М ниже порога чувствительности реакций, отсутствии урогенитальных инфекций, уровне местного секреторного Ig А более lg64 прогнозируют группу низкого риска развития врожденной краснухи, парвовирусной инфекции, токсоплазмоза, хламидиоза, микоплазмоза.
Начиная с 2009 г., мы постоянно сталкивались с ситуациями, когда интерпретация результатов исследований, выполненная известными методами, представлялась крайне затруднительной в силу целого ряда факторов (отсутствие цифрового выражения результатов исследований, поздние сроки первичного обследования, недооценка анамнеза перенесенных заболеваний, фрагментарность обследования).
Указанные причины побудили к проведению многочисленных исследований, что позволило нам профессионально обнаружить совокупность ключевых факторов (новых, неочевидных) прогнозирования риска развития врожденных инфекций, указанных в отличительной части формулы изобретения.
Нами показано, что качественное определение специфических Ig М и Ig G, даже в сочетании с определением авидности Ig G, не позволяет достоверно оценивать давность инфицирования любым из указанных микроорганизмов, особенно, если первичное исследование проведено позже 12-й недели гестации.
Было показано, что для качественных исследований точность прогноза не превышает 45% (токсоплазмоз, ЦМВИ, ПВИ, ВПГ).
Доказано, что точность оценки риска ВИ значительно повышается при условии определения специфических антител количественными методами, особенно на ранних (до 12-й недели) сроках гестации.
Установлено (на основании обследования 101 беременной), что в том случае, если до 12-й недели гестации величина специфических IgM к вирусу краснухи, ЦМВИ, ПВИ, токсоплазмам не превышает величины оптической плотности (далее - ОП) контрольной положительной сыворотки тест-системы, величина специфических Ig G в 6 и более раз превышает порог чувствительности исследования, а в родовых путях отсутствуют признаки активного инфекционного процесса в сочетании с величиной неспецифического Ig А выше Lg 64 то, независимо от величины авидности, риск соответствующих ВИ является низким и не превышает 5% (заражение состоялось до беременности, имеется иммунитет). Точность прогноза в данном случае составляет 87-94% на уровне достоверности 95%.
Нами показано, что в тех случаях, когда величина специфических антител не превышает ОП контрольной сыворотки (для Ig М) и порога чувствительности реакции (для Ig G), а в мазках со слизистой оболочки цервикального канала не выявляются антигены микроорганизмов (методом РИФ) и их генетический материал (методом ПЦР), беременные являются группой риска острых инфекций и высокого риска ВИ. Это подтверждается тем, что в рамках нашего исследования у ранее неиммуных беременных в динамике документировано 2 случая острого токсоплазмоза (без реализации в ВИ на фоне медикаментозной профилактики), 5 случаев острой ЦМВИ (с формированием двух случаев врожденной ЦМВИ), 10 случаев острой ПВИ (одни случай врожденной инфекции).
Так же доказано, что в случаях, когда в родовых путях при первичном обследовании обнаруживаются признаки активного инфекционного процесса (выявляются элементарные тела хламидий, «ключевые» клетки ЦМВИ, инфекции ВПГ, антигены этих возбудителей и микоплазм в сочетании со снижением величины секреторного Ig А ниже Lg 32) риск ВИ значительно увеличивается, независимо от величин специфических антител и их авидности (по сравнению с ситуациями, когда указанные изменения в родовых путях отсутствуют, а величина Ig А превышает Lg32).
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Методом ИФА в венозной крови определяют специфические иммуноглобулины классов М (с расчетом коэффициента) и G (количественно) к токсоплазме, вирусам краснухи, простого герпеса 1/2 типов, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V, величину авидности иммуноглобулинов классов G к токсоплазме, вирусам простого герпеса 1/2 типов, ЦМВ, краснухи (учет результатов осуществляется на автоматическом микропланшетном фотометре).
Для исследования микробиоценоза слизистой цервикального канала используют культуральный метод посева на питательные среды, для выявления антигенов Chl. trachomatis, Мус. hominis в реакции иммунофлуоресценции - набор диагностических препаратов для постановки РИФ, выполняют цитобактериоскопическое исследование браш-мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе и Граму.
Методом ПЦР определяют ДНК Ureaplasma spp., Chlamydia trachomatis/Ureaplusma (Parvum и Urealyticum)/ Mycoplasma genitalium /Mycoplasma hominis, ЦМВ в слизистой цервикального канала; парвовируса B19V, цитомегаловируса в сыворотке крови с применением наборов реагентов для амплификации и/или обратной транскрипции и амплификации ДНК микроорганизмов.
После получения результатов лабораторного обследования беременную консультирует инфекционист (сбор текущих жалоб, анамнеза, особенно в отношении инфекций, способных передаваться от матери плоду, вакцинальный статус, течение предыдущих и текущей беременности, результаты лабораторных и инструментальных методов исследований и ряд других параметров; физикальный осмотр).
Разработанный способ прогнозирования риска ВИ апробирован у 80 беременных и 80 родившихся у них детей, наблюдавшихся в НИИ детских инфекций в 2010-2012 гг.
Приведенный способ прогнозирования риска ВИ может быть проиллюстрирован следующими примерами.
Пример №1. При первичном обследовании беременной в сроке гестации 8 недель величина Ig М к токсоплазмам составила 0,08 (в контрольной положительной сыворотке -1,14), Ig G - 250 МЕ/мл (порог чувствительности - 30 МЕ/мл). Специфические Ig М к вирусу краснухи 0,09 (контроль - 1,17), Ig G - 158 МЕ/мл (порог - 15 МЕ/мл), Ig М к ВПГ - 0,06 (контроль - 0,10), Ig G - 86 МЕ/мл (порог - 8 МЕ/мл), Ig М к ЦМВ - 0,07 (контроль - 0,09), Ig G - 96 МЕ/мл (порог - 10 МЕ/мл), Ig М к парвовирусу - 0,11 (контроль - 0,16), Ig G - 243 МЕ/мл (порог - 24 МЕ/мл). В родовых путях - нормоценоз, признаков инфекционного процесса не выявлено, РИФ ПЦР - отрицательны, величина секреторного Ig А=64Lg.
С учетом отсутствия специфических Ig М, наличия значительных количеств Ig G на раннем сроке гестации, нормоценоза родовых путей беременная относится к группе низкого риска ВИ, но нуждается в мониторинге (для своевременной диагностики возможной реактивации ЦМВИ, инфекции ВПГ).
Пример №2. Пациентка первично обследована на сроке гестации 11 недель. В сыворотке выявлены Ig G к T.gondii - 260 МЕ/мл (порог - 40 МЕ/мл), цитомегаловирусу (контроль = 0,1, исследуемая сыворотка =2,04), вирусу краснухи, ВПГ, парвовирусу (в количествах, превышающих пороги чувствительности реакции в 3-5 раз). Специфических Ig М (ко всем указанным микроорганизмам) не выявлено. ДНК ЦМВ в ПЦР (в крови, мазке со слизистой оболочки цервикального канала), ПЦР на парвовирус B19V (кровь) - отрицательны. В родовых путях методом ПЦР обнаружен геном ЦМВ, при микроскопии -«ключевые» клетки, в РИФ - антиген цитомегаловируса, величина секреторного Ig А=32Lg.
Учитывая наличие умеренных количеств Ig G и отсутствие Ig М к возбудителям с преимущественно трансплацентарной передачей, риск этих ВИ является на момент обследования низким. Однако наличие активного воспалительного процесса в родовых путях позволяет отнести беременную к группе умеренного риска ВИ (по ЦМВИ) и рекомендовать санацию с последующим контролем ее полноты.
Пример №3. При обследовании в сроке гестации 10 недель выявлено отсутствие антител классов Ig М и Ig G к парвовирусу, антител класса IgM к вирусу краснухи, ВПГ, цитомегаловирусу, токсоплазмам при наличии специфических Ig G к ним в количествах в 6-10 раз, превышающих пороги чувствительности соответствующих реакций. В родовых путях - нормоценоз, ПЦР, РИФ отрицательны, секреторный Ig А - 128Lg.
В данном случае беременная должна быть отнесена к группе высокого риска ВИ. учитывая отсутствие иммунитета к парвовирусу, для которого характерен легко реализующийся на практике воздушно-капельный механизм передачи.
В заключение следует отметить, что по экспертным данным экономический ущерб от врожденных инфекций в РФ может ежегодно составлять до 10 млрд. рублей. Реализация современного способа оценки риска ВИ позволит значительно сократить финансовые затраты общества и способствовать решению демографической проблемы.