СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА "ОЛИПИФАТ"
METHOD OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE OLIPIFAT MANUFACTURE

Изобретение относится к технологии производства биологически активных веществ.
Известен способ производства биологически активного вещества, предусматривающий щелочной гидролиз-экстрагирование лигнинсодержащего сырья, окисление кислородсодержащим газом, отделение жидкой фазы, ее подкисление и отделение выпавшего осадка в качестве целевого продукта (RU 2141334 С1, 20.11.1999).
Недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта и длительность технологического процесса.
Техническим результатом изобретения является увеличение выхода целевого продукта и сокращение продолжительности технологического цикла.
Этот результат достигается тем, что в способе производства биологически активного вещества, предусматривающем щелочной гидролиз-экстрагирование лигнинсодержащего сырья, окисление кислородсодержащим газом, отделение жидкой фазы, ее подкисление и отделение выпавшего осадка в качестве целевого продукта, согласно изобретению окисление осуществляют в процессе щелочного гидролиза-экстрагирования путем барботирования кислородсодержащего газа через реакционную смесь.
Это позволяет сократить продолжительность технологического цикла за счет совмещения проведения двух технологических операций и увеличить выход целевого продукта за счет повышения равномерности гидролиза и окисления лигнинсодержащего сырья при перемешивании реакционной смели кислородсодержащим газом.
В предпочтительном варианте реализации предлагаемого способа гидролиз-экстрагирование и окисление осуществляют при температуре выше 100°С.
Это позволяет дополнительно интенсифицировать гидролиз и окисление и сократить продолжительность технологического цикла.
В этом случае целесообразно перед отделением жидкой фазы осуществлять охлаждение реакционной смеси до температуры ниже 100°С.
Это повышает безопасность и сокращает потери целевого продукта, предотвращая вскипание жидкой фазы и брызгоунос в процессе отделения жидкой фазы и ее подкисления.
В другом предпочтительном варианте осуществляют промывку отделенного осадка раствором кислоты.
Это позволяет повысить чистоту целевого продукта.
Способ реализуется следующим образом.
Лигнинсодержащее сырье суспендируют в растворе щелочи и барботируют через реакционную смесь кислородсодержащий газ, предпочтительно в герметичной емкости при температуре выше 100°С и при соответствующем давлении выше давления насыщенных паров реакционной смеси, соответствующего заданной температуре. Это обеспечивает одновременное протекание гидролиза и окисления лигнинсодержащего сырья и перемешивание реакционной смеси барботируемым газом, что ускоряет обновление поверхности контакта фаз и протекание массообменных процессов при значениях критерия Шервуда в интервале 4-8. В результате ускоряется как протекание химических реакций, так и экстрагирование, что сокращает продолжительность технологического процесса на величину больше продолжительности минимальной по времени из совмещенных операций и указывает на наличие синергизма совмещенных физических и химических воздействий на обрабатываемое сырье.
При реализации способа в соответствии с предпочтительным вариантом реакционную смесь охлаждают до температуры ниже 100°С, что исключает ее вскипание после сброса давления и брызгоунос целевого продукта.
Реакционную смесь разделяют на твердую и жидкую фазу известными методами, например декантированием. Жидкую фазу подкисляют и отделяют выпавший осадок известными методами, например фильтрованием. При реализации изобретения в соответствии с предпочтительным вариантом осадок промывают раствором кислоты. Выход целевого продукта при реализации описанной технологии составляет не менее 40%, а в наиболее близком аналоге около 30% в пересчете на сухое вещество.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта при сокращении времени технологического цикла.
Для подтверждения наличия у полученного продукта биологической активности его смешивали с пирофосфатом и растворяли с получением жидкого препарата для инъекций в соответствии с известными рекомендациями (WO 00/25005 А1, 25.05.2000). Результаты исследований полученного препарата под условным названием "Олипифат" приведены ниже в примерах.
Пример 1
Для изучения противовирусной активности препарата "Олипифат" использовали белых беспородных половозрелых мышей массой 18-20 г. Материал, содержащий ВГС, вводили животным анутрибрюшинным способом. Часть зараженных животных оставляли контрольными, часть животных оставляли неинфицированными вирусом гепатита С. Учитывая известные данные о том, что максимальная интерферониндуцирующая активность препаратов проявляется при использовании внутрибрюшинного способа введения, на 14-й день после заражения мышам вводили внутрибрюшинно раствор препарата "Олипифат" в дозе 100 мг на 1 кг веса животных в 0,2 мл на мышь. Первой группе животных препарат в дозе 100 мкг на 1 кг веса давали однократно, через 24 часа после введения "Олипифата" у животных забирали кровь для определения интерферона, и, кроме того, сыворотку крови, образцы печени, селезенки и головного мозга использовали для изучения маркеров ВГС инфекции: антигена ВГС, РНК ВГС и инфекционной активности вируса. Через одну неделю после введения препарата “Олипифат” те же органы и ткани мышей использовали для выявления маркеров ВГС инфекции. Второй группе животных “Олипифат” вводили двукратно с интервалом в 1 неделю. Через 24 часа после второго введения препарата пробы сыворотки крови отбирали для определения интерферона. Кроме того, в органах и тканях мышей определяли наличие инфекционного вируса, его РНК и антигенов через 24 часа и через 1 неделю после второго введения препарата “Олипифат”. В опыте использовали по 10 животных на каждый вариант опыта. Пробы сывороток крови, надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенатов ткани головного мозга, печени и селезенки, использовали для определения антигенов ВГС, РНК ВГС методом обратной полимеразной цепной реакции (ЩЕ ПЦР) и инфекционной активности вируса гепатита С. С этой целью инфекционную активность ВГС, содержащуюся в пробах, титровали в перевиваемых культурах клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Антиген ВГС в данных пробах изучали в реакции гемагглютинации, используя классический метод, описанный Clarke и Casals (1968).
Уровень интерферона в периферической крови определяли через 24 часа после введения препарата.
50
Определение интерферона проводили биологическим методом по защите культуры клеток мышиных фибробластов L929 от 100ЦПД вируса энцефаломиокардита мышей.
Были использованы высокочувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из лаборатории культур тканей ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл). Инфекционную активность ВГС учитывали по результатам титрования проб, полученных из органов и тканей зараженных мышей, как правило, на 6-8 день после инфекции, когда развивалось максимальное цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.
Полученные результаты приведены в виде таблицах 1-2.
Таблица 1
Изучение противовирусного эффекта препарата "Олипифат" на инфекцию, вызванную ВГС у мышей. Антиген ВГС, выявляемый в РГА
Органы и ткани животных
ВГС инфицированные мыши + “Олипифат”(100 мг на 1 кг веса)
Через 24 часа после однократного введения
Через 24 часа после 2-кратного введения
Через неделю после однократного введения
Через неделю после двукратного введения
Без препарата
Контрольная группа
сыворотка крови
78±7
56±8,5
144±14
70±8,7 (2,6)
180±44
13±9
(2,3)<sup>1</sup>
(3,2)
(1,25)
головной мозг
208±47
96±16
384±94
60±10
480±80
27±5
(2,3)
(5,0)
(1,25)
(8,0)
печень
336±108
272±87
438±111
240±40
720±174
40±0
(2,1)
(2,6)
(1,64)
(3,0)
селезенка
118±17,0
96±14
480±88
120±20
840±236
20±10
(7,0)
(8,75)
(1,75)
(7,0)
1 - Кратность снижения антигенной активности ВГС по сравнению с контрольной группой мышей.
Таблица 2
Влияние препарата "Олипифат" на инфекционную активность ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей
Органы и ткани животных
ВГС инфицированные мыши + “Олипифат” (100 мг на 1 кг веса)Титры вируса в Ig ТЦД50/мл
Через 24 часа после однократного введения
Через 24 часа после 2-кратного введения
Через неделю после однократного введения
Через неделю после двукратного введения
Без препарата
Контрольная группа
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
сыворотка крови
4,5
1,7
4,0
2,2
5,1
1,1
4,0
2,2
6,2
0
0
0
головной мозг
3,3
2,0
2,8
2,5
4,0
1,3
3,3
2,0
5,3
0
0
0
печень
5,5
1,5
4,7
2,3
5,4
1,4
5,6
1,4
7,0
0
0
0
селезенка
5,2
2,0
5,0
2,2
6,0
1,3
5,9
1,3
7,2
0
0
0
1 - инфекционные титры ВГС при титровании в культурах клеток СПЭВ (средниезначения)2 - Кратность снижения инфекционных титров ВГС по сравнению с данными в контрольной группе ВГС инфицированных животных
Следует отметить, что все животные, получившие внутрибрюшинно различные дозы препарата "Олипифат", были здоровы, сохраняли активность и жизнеспособность на всем протяжении наблюдения. Эти результаты могут свидетельствовать о безопасности внутрибрюшинного введения этих дозировок препарата. Задачи исследования противовирусной активности любого препарата на мышах, инфицированных вирусом гепатита С, усложняются тем, что животные, как правило, выживают после введения достаточно больших концентраций вируса. Поэтому регистрировать эффективность препарата по снижению заболеваемости или гибели мышей не представляется возможным. Однако нами получены данные, что в организме ВГС инфицированных мышей формируется персистенция ВГС в различных органах и тканях. О репликации ВГС в органах и тканях животных свидетельствуют данные титрования инфекционной и антигенной активности ВГС, содержащегося в сыворотке крови, печени, селезенке и в головном мозге мышей, а также по наличию РНК ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных животных. Вот почему эффективность любого препарата в отношении инфекции, вызванной ВГС в организме мышей можно судить по снижению концентрации вируса, вирусной РНК и его антигенов в органах и тканях зараженных животных по сравнению с контрольной группой ВГС инфицированных мышей, не получавших антивирусный препарат.
Изучение антигенной активности ВГС, содержащегося в пробах сывороток крови мышей, показало (табл.1), что препарат "Олипифат", введенный внутрибрюшинно мышам в дозе 100 мкг на 1 кг веса в 0,2 мл значительно влияет на снижение антигенной активности ВГС в органах и тканях зараженных животных. Уже через 24 часа после однократного введения препарата антигенная активность ВГС снижалась в среднем по органам в 2 раза, а в селезенке в 7 раз. Правда, через неделю после однократного введения препарата “Олипифат" титры антигенов ВГС повышались, и снижение концентрации антигена ВГС в среднем было в 1,5 раза. Двукратное введение препарата “Олипифат" позволило получить данные, свидетельствующие о том, что через 24 часа после повторного введения препарата содержание антигенов ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей в среднем почти в 5 раз снижалось по сравнению с концентрацией антигена в органах и тканях контрольной группы ВГС инфицированных мышей, не получавших препарат. Снижение антигена ВГС в организме животных сохранялось и в случае, когда органы и ткани мышей изучали через неделю после повторного введения препарата.
В то же время следует отметить, что способность препарата "Олипифат", введенного внутрибрюшинно мышам, во всех вариантах опытах не привело к полному исчезновению РНК ВГС, выявляемой в ОТ ПЦР в органах и тканях животных, что свидетельствует о необходимости проведения количественного метода ОТ ПЦР для оценки количественных различий РНК ВГС в органах и тканях зараженных животных.
В этой связи представляло интерес изучить инфекционную активность ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей. С этой целью пробы экстрактов органов животных титровали в культурах клеток СПЭВ. Полученные результаты представлены в табл.2.
Показано, что однократное введение препарата "Олипифат" через 24 часа после введения приводило к снижению титра вируса в органах мышей в среднем на 1,7 Ig. Через неделю после однократного введения препарата титры вируса в организме мышей в определенной мере восстанавливались, и снижение инфекционной активности ВГС составляло 1,3 Ig. Двукратное введение препарата "Олипифат" мышам через сутки после 2-го введения привело к снижению титров вируса на 2,3 Ig. Через 1 неделю после второго введения препарата снижение инфекционной активности ВГС в среднем составляло 1,7 Ig (табл.2). Данные титрования инфекционной активности ВГС полностью совпадают с результатами, полученными нами ранее при изучении антивирусной активности интерферона при инфекции, вызванной вирусом гепатита С вкультурах клеток.
У мышей, инфицированных вирусом гепатита С, интерферон в сыворотке крови не определялся. Внутрибрюшинное введение инфицированным мышам “Олипифата" индуцировало образование интерферона, уровень которого в крови достигал 60-40 ед./мл.
Уровень интерферона в крови инфицированных вирусом гепатита С мышей через 24 часа после второго введения препарата был примерно на таком же уровне. Таким образом, при введении препарата “Олипифат" мышам, инфицированным вирусом гепатита С, индуцируется синтез интерферона, уровень которого был таким же, как у неинфицированных мышей.
Пример 2.
В опытах на животных установлено, что “Олипифат" проявляет противоопухолевый эффект при внутримышечном введении в разовой дозе 100 мг/кг в режиме 3- или 5-кратного введения с интервалами 1-2 дня. Ингибирующее действие на опухоль не зависит от величины разовой и курсовой доз препарата и проявляется максимально при указанной дозе на мышах и крысах с перевитыми опухолями. Противоопухолевое действие "Олипифата" заключается в торможении роста перевиваемых солидных опухолей мышей и крыс на 73-95% в течение 7-14 дней. Это следующие опухоли: карцинома Эрлиха, меланома В-16, аденокарцинома молочной железы Са-755, карциносаркома Уокера и лимфосаркома Плисса. Препарат оказался малоэффективным при карциноме Льюис и не обнаружил противоопухолевого действия на лимфолейкозе Р-388.
Данные по изучению безвредности показали, "Олипифат" является малотоксичным препаратом. При однократном внутримышечном введении мышам линии SHK МПД=400 мг/кг, ЛД50=930 мг/кг. Кумулятивная токсичность препарата при ежедневном внутримышечном введении собакам не выявлена. Препарат не обладает пирогенным действием, не повреждает гемопоэз, не является аллергеном и не обладает гепато-, нефро-, нейро-, кардио- и гастроинтестинальной токсичностью. Лимитирующая токсичность "Олипифата" - местно-раздражающее действие (МРД), которое имеет видовую специфичность (более выражено на мелких животных и слабо - на собаках) и проявляется в виде болевого синдрома и отека с деструктивным компонентом. Лимитирующая токсичность препарата не зависит от дозы и концентрации вводимого раствора, но существенно снижается при использовании 0,5% новокаина.
Данные иммунологических исследований на животных, полученные в ГУ ВНИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН, показали, что применение “Олипифата” мышам с трансплантированной опухолью приводит к усилению иммунного ответа организма к повторной трансплантации любых опухолевых клеток (феномен адаптивного переноса, тест Вина). В соответствии с этим сделано заключение о том, что механизм противоопухолевого действия препарата “Олипифат" связан с коррекцией иммунологических реакций.
При проведении I фазы у 19-ти больных, которым “Олипифат" вводили внутримышечно в разовой дозе 50 мг (11,5 мг - основного и 38,5 - балластного вещества) на больного в 1,0 мл 5% раствора один раз в неделю в течение 6-12 недель, не было отмечено какой-либо системной токсичности. У некоторых больных наблюдали незначительную болезненность в месте введения без местно-воспалительной реакции.
При оценке объективного эффекта у одного больного с саркомой мягких тканей была отмечена регрессия менее 50% и у двух больных с диагнозами: рак коры надпочечников с метастазами в легкие и рак левой почки с метастазами в легкие - стабилизация процесса.
Во II фазе исследований в результате проведенного лечения у 92-х больных в двух отделениях ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и Городском онкологическом диспансере №1 г.Санкт-Петербурга, минимальный эффект был обнаружен в одном случае. У 16 больных наблюдали стабилизацию процесса (17%), в том числе стабилизацию более 8 недель - у 7-х больных (1%). Лимитирующих побочных эффектов "Олипифата" не выявлено.
В соответствии с выявленным иммуномодулирующим действием препарата "Олипифат" произведено изменение Протокола клинического изучения, в соответствии с которым для изучения противоопухолевого эффекта препарата "Олипифат" были выбраны больные с иммунозависимыми опухолями - диссеминированной меланомой и раком почки, у которых отмечено снижение показателей иммунитета в результате прогрессии опухолевого роста или предшествующего лечения. Для контроля иммунологического статуса пациентов под влиянием терапии "Олипифатом" было включено дополнительное иммунологическое обследование до, во время и после лечения.
Препарат "Олипифат" в разовой дозе 50 мг (11,5 мг - основного и 38,5 - балластного вещества) во всех исследовательских центрах вводили больным в следующем режиме: первый курс 3 раза в неделю в течение 2-х недель, перерыв в течение 2-х недель, второй и последующие курсы - аналогично первому. Всего больные получили по 2-4 курса препарата. Часть больных меланомой кожи в случае достижения длительной ремиссии в результате такого лечения получали поддерживающие инъекции препарата 1 раз в неделю в той же дозе. Данный режим позволял проводить лечение с максимальным удобством для пациентов, а также проводить динамическое изучение иммунного статуса у больных, как в процессе, так и после лечения.
Всего в исследование было включено 46 больных, в том числе 29 пациентов с диссеминированной меланомой кожи и 17 больных с диссеминированным раком почки. Одна больная с меланомой из отделения химиотерапии исключена из Протокола ввиду резкого ухудшения общего состояния, не связанного с применением препарата "Олдипифат". Из числа включенных в исследование больных подлежат оценке 45 пациентов, у 39 из которых изучен иммунный статус. Все больные, включенные в исследование, подписывали информированное согласие. Ранее все пациенты получали химио- и/или иммунотерапию различными схемами по поводу основного заболевания без эффекта, включая препарат альфа-интерферона, интерлейкин и противоопухолевые препараты.
Меланома кожи
Возраст: от 34 до 72-х лет, средний возраст 58 лет
- Женщин - 13 человека
- Мужчин - 16 человек
- Общий статус больных, оцениваемый по шкале ECOG, составил 0-3
- Локализация метастазов:
Лимфоузлы - 52%
Мягкие ткани - 45%
Легкие - 33%
Печени - 29%
Другие - 9%
Рак почки
- Возраст; от 47 до 73-х лет, средний возраст 64 года.
- Женщин - 14 человек
- Мужчин - 3 человека
- Общий статус больных, оцениваемый по шкале ECOG, составил 0-3
Локализация метастазов:
Лимфоузлы средостения - 1 (6%)
Забрюшинные л/узлы - 4 (24%)
Кости - 2 (12%)
Легкие - 10 (59%)
Печени - 2 (12%)
Другая почка - 2 (12%)
Радикальная нефрэктомия ранее выполнена у 12-ти (7%) больных, а у 5-ти (30%) - паллиативная нефрэктомия. Медиана времени до прогрессирования после нефрэктомии составила 31,5 месяцев. Ранее 16 пациентов получали терапию альфа-интерфероном, интерлейкином, тамоксифеном или фторафуром.
Эффективность лечения "Олипифатом" при диссеминированной меланоме оценена у 28 больных. Стабилизация процесса длительностью от 4 до 42+ месяцев (среднее значение 10,8+3,42 месяцев) наблюдалась у 12-ти больных (43%), прогрессирование процесса - у 16-ти больных.
Эффективность лечения "Олипифатом" при диссеминированном раке почки оценена у 17-ти больных. Полных и частичных регрессий не было. У 2-х больных с метастазами в кости и забрюшинных лимфоузлах отмечен минимальный эффект в рамках стабилизации процесса продолжительностью до 4-х месяцев, подтвержденный данными УЗИ и рентгенологического исследования. Суммарно минимальный эффект + стабилизация процесса отмечены у 8 из 17 пациентов (47%) длительностью от 4-х до 9+ месяцев (среднее значение 5,5±0,65 месяцев), у остальных 9 больных - прогрессирование заболевания.
Побочные явления при применении "Олипифата" отмечены у отдельных больных. Они проявлялись в виде кратковременной местной болезненности в области инъекции и не требовали медикаментозного вмешательства. Гематологической, негематологической или других видов токсичности при проведении лечения не отмечали ни у одного больного.
Таким образом, при лечении диссеминированной меланомы и рака почки в результате применения препарата "Олипифат" минимальный эффект + стабилизация процесса получен у 20 из 45 оцененных больных (44%), из них 12 из 28 больных с меланомой (43%) и 8 из 17 больных раком почки (47%). Средняя продолжительность ремиссии при лечении препаратом "Олипифат" составила от 5,5±0,65 месяцев при раке почки до 10,8±3,42 месяцев при диссеминированной меланоме.
Полученные результаты находятся в соответствии с современными представлениями о критериях оценки эффективности лечения больных со злокачественными опухолями по показателю стабилизации процесса. Возникающий при этом эффект длительного отсутствия прогрессирования заболевания без объективных изменений является единственным фактором длительной выживаемости и способен привести к выигрышу в сроках продления жизни пациентов. При этом незначительное изменение объема опухолевых поражений не играет определяющей роли. Доказано, что стабилизация болезни наравне с частичной регрессией является прогностическим фактором выживаемости, и что этот критерий может дать дополнительную выгоду при лечении пациентов. Для определенных опухолей (диссеминированная меланома, рак почки, немелкоклеточный рак легкого, опухоли поджелудочной железы и пр.) и/или для определенных видов лечения (таргетная терапия, вакцинотерапия, применение природных препаратов непрямого механизма действия и пр.) стабилизация болезни имеет прогностическое значение для выживаемости без признаков прогрессирования. При этом учитывается стабилизация длительностью не менее 4-х месяцев. Этот подход, как единственный ожидаемый эффект для нового природного препарата "Олипифат", не являющегося цитостатиком, использован при оценке эффективности лечения в данном исследовании.
Таким образом, при показанных выше технических преимуществах предлагаемый способ позволяет получить средство с широким спектром биологической активности.