Способ подавления роста меланомы В16 у лабораторных животных
METHOD FOR SUPPRESSING THE GROWTH OF B16 MELANOMA IN LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к экспериментальной медицине, и может быть использовано для оптимизации схем лечения меланомы В16 у лабораторных животных, а именно для повышения выживаемости и уменьшения объема опухоли.
Так как злокачественный опухолевый процесс, оперативное вмешательство и развивающиеся в послеоперационном периоде осложнения приводят к значительной иммуносупрессии, одним из направлений, повышающих эффективность этиопатогенетической терапии в настоящее время является использование иммунотропных препаратов и разработка адекватных методов направленной иммунокоррекции в комплексной терапии.
Иммунотерапия представляет собой перспективный метод лечения злокачественных новообразований. В последние годы активно развивается иммунотерапия опухолей, направленная на ингибирование опухолевого роста и стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа организма. Непосредственным влиянием на иммунную систему обладает иммуномодулятор Галавит, активное вещество - аминодигидрофталазиндион натрия (химическая формула - 5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевая соль).
Препарат Галавит представляет собой натриевую соль аминофталазина. Показано, что Галавит воздействует на клетки моноцитарно-макрофагального ряда и увеличивает функциональную активность макрофагов [Иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства Галавита // Галавит. Клиническое использование и механизмы действия / Под ред член-корр РАМН Подколзина А.А., Гришаевой Т.И. - М.: Внешторгиздат, 2002. - С. 6-14].
Получены данные, характеризующие Галавит как потенциальный ингибитор метастазирования с патогенетической направленностью действия [Киселев С.М., Лабурдова Е.В., Козлов А.М. Влияние препарата Галавит на инвазивную активность опухолевых клеток // Российский биотерапевтический журнал. 2006. №3., С. 61-65].
Принимая во внимание способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда и их продуктов играть важную роль в противоопухолевом иммунном ответе, было изучено действие Галавита на опухолевый рост и метастазирование мышиной меланомы В16, а также на продолжительность жизни животных-опухоленосителей [Хохлов А.П., Калюжин О.В., Абидов М.Т. Влияние Галавита на рост и метастазирование мышиной меланомы В 16 // Галавит в эксперименте и клинике. - М.:1998. - С. 32.].
in vivo
Интересные данные получены  при изучении антиметастатической активности препарата. При введении 50 мкг Галавита 1 раз в 3 дня показано достоверное (р <0,05) снижение на 44% количества легочных метастазов на 28-ой день эксперимента [Коробкова Л.И., Вельшер Л.З., Германов А.Б., Гришина Т.И., Станулис А.И., Гене Г.П., Щепеляев Д.О., и Израилов Р.Е. // Роль иммуномодулятора Галавит в онкологической и хирургической практике" Российский биотерапевтический журнал, Т. 3, № 3, 2004, С. 87-92.].
К недостаткам очевидно можно отнести тот факт, что не было выявлено статистически значимых различий с контролем.
Наиболее близким к данному изобретению является способ снижения метастазирования меланомы В-16 (RU 2308096 C2, 10.10.2007г.) Для этого вводят инъекционный водный раствор натриевой соли 5-амино-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-1,4-диона внутрибрюшинно в дозе 40 мг соли/кг мыши один раз в сутки в течение 5 дней.
Недостатком данной работы является недостаточная информативность терапии. Не были выявлены результаты степени угнетения роста узла меланомы и продолжительности жизни мышей-опухоленосителей, что является важным фактором успешности лечения.
Задачей данного изобретения является разработка нового эффективного способа для увеличения продолжительности жизни и угнетения роста первичного узла меланомы мышей-опухоленосителей.
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для подавления роста злокачественных опухолей и повышения длительности жизни мышей-опухоленосителей путем введения аминодигидрофталазиндион натрия.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также как и в известном способе, животным вводят внутрибрюшинно инъекционный водный раствор аминодигидрофталазиндион натрия.
Особенностью заявляемого способа является то, что препарат вводят через 7 суток после трансплантации опухоли в дозе 5 мг/мышь 2 раза в неделю общим курсом 10 инъекций.
Сущность изобретения заключается в противоопухолевой активности внутрибрюшинного применения соединения аминодигидрофталазиндион натрия в эксперименте на мышах с трансплантированной возле позвоночника подкожно меланомой В16.
Изобретение поясняется подробным описанием, экспериментальными данными, таблицами и иллюстрацией, на которой изображено:
Фиг. 1 - диаграмма 100% выживаемости мышей в III группе при отсроченной терапии Галавитом.
Изобретение осуществляют следующим способом.
6
В эксперименте использованы мыши линии CBAxC57BL/6 (F1), которые содержались в стандартных пластиковых клетках на стандартном пищевом рационе. Все манипуляции с мышами выполняли в соответствии с требованиями нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы и гуманном отношении к животным [Euroguide on the accommodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes. London: FELASA, 2007].Ex vivo экспансированные клетки меланомы В16 инокулировали мышам около позвоночника на уровне бедра в количестве 10 кл/мышь в 100мкл физиологического раствора.
Через 7 суток после трансплантации опухоли, лабораторным животным для лечения меланомы В16, внутрибрюшинно вводят Галавит (соединение аминодигидрофталазиндион натрия) в дозе 5 мг/мышь 2 раза в неделю общим курсом 10 инъекций.
Экспериментальные данные, подтверждающие эффективность лечения меланомы В16.
Были сформированы следующие 3 группы по 10 мышей в каждой:
Группа 1. Контроль (подкожная трансплантация клеток меланомы В16).
Группа 2. Сразу после трансплантации опухоли животным внутрибрюшинно вводили Галавит в дозе 5мг/мышь два раза в неделю, всего 10 инъекций.
Группа 3. Через 7 суток после трансплантации опухоли животным внутрибрюшинно вводили Галавит в дозе 5мг/мышь два раза в неделю, всего 10 инъекций
2
Оценивали формирование опухолевого узла, интенсивность его роста (объем опухоли) на 10-90 сутки, выживаемость на 10-90 сутки и развитие отдаленных метастазов на фоне иммунотерапии препаратом Галавит. Результаты оценивали по χ (хи-квадрат)-критерию, а достоверность различий оценивали по t-критерию. Различия значений считали достоверными при p<0,05.
Установлено, что в группе контроля с 60-х по 90-е сутки наблюдали постепенное увеличение смертности мышей, 90-суточная выживаемость составила 70%. Во II группе 90-суточная выживаемость составила 30%, а в III группе при отсроченной терапии Галавитом наблюдали 100% выживаемость мышей (Фиг. 1).
В группе контроля опухолевые узлы начинали явно выявляться с 50-х суток. Во II группе при терапии Галавитом сразу с момента прививки опухолевых клеток были выявлены наиболее высокие темпы роста опухоли с 40 по 80 сутки. В III группе темпы роста опухоли при отсроченной терапии Галавитом были значительно ниже по сравнению с I и II группами (Таблица 1).
Таблица 1Темпы роста опухоли меланомы В16 лабораторных животных под влиянием соединения аминодигидрофталазиндион натрия
Группа
Объем опухоли, мм<sup>3 </sup>
Дни после перевивки
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Контроль(I группа)
1
16±2
166±24
307±40
748±97
1383±166
1597±233
2177±261
2957±384
5мг/мышь сразу(II группа)
3
279±39
334±50
1261±151
1946±253
2598±260
4501±585
5014±601
7495±824
5мг/мышь через неделю(III группа)
1
16±2
40±6
138±14
288±29
540±81
подавление
ТРО
Влияние аминодигидрофталазиндиона натрия на  роста опухоли (III группа) оценивали путем статистического сравнения объема опухолевых узлов в контрольной и подопытной группах при разных сроках наблюдения, по длительности задержки роста опухоли и индексу торможения роста (), рассчитанному по следующей формуле:
,
V
V
к
э
где  - средний объем опухолевых узлов в контрольной группе и  - средний объем опухолевых узлов в экспериментальной группе. Данные приведены в таблице 2.
усиление
ИР
Влияние аминодигидрофталазиндиона натрия на  роста опухоли (II группа) оценивали с применением индекса роста опухоли (), рассчитанного по следующей формуле:
,
V
V
к
э
где:  - средний объем опухолевых узлов в контрольной группе и  - средний объем опухолевых узлов в экспериментальной группе. Данные также приведены в таблице 2.
Таблица 2
Днипосле перевивки
Индекс роста опухоли, %(II группа)
Торможение роста опухоли, %(III группа)
50
160
98
60
87
97
70
182
91,4
80
130
86,8
90
153
81
При вскрытии животных на 90 сутки в контроле отмечено, что у трех из пяти выживших мышей при визуальном осмотре органов грудной и брюшной полостей были выявлены множественные метастатические узлы разных размеров. У 2-х мышей локализация метастазов у корня легких и в средостении, а у одной мышки - опухолевый узел с локализацией в районе мочевого пузыря. Во II группе при терапии галавитом сразу с момента прививки опухолевых клеток при вскрытии оставшихся в живых 3 мышей были выявлены метастатические узлы во внутренних органах грудной и брюшной полостях. При вскрытии в III группе лишь у одной из десяти выживших были метастазы различного размера в легких и средостении.
Проведенные исследования показали, что именно отсроченная на неделю (III группа) с момента прививки опухоли меланомы В 16 терапия аминодигидрофталазиндионом натрия в дозе 5 мг/мышь дважды в неделю (10 инъекций) оказала положительное влияние, значительно повышая показатели выживаемости и подавляя вероятность прививки опухоли на месте их трансплантации, а также развитие отдаленных метастазов. В то время как терапия аминодигидрофталазиндионом натрия сразу после прививки (II группа) дала отрицательную динамику, превосходящую по смертности и метастазированию даже контроль. Это связано вероятно с тем, что мгновенная терапия препаратом усилила действию опухолевых клеток, подстегнув их к росту.
Использование заявляемого способа позволит повысить выживаемость и уменьшить объем опухоли при лечении меланомы В16 у лабораторных животных в эксперименте.