Антибактериальные пептиды как альтернативное будущее терапии бактериальных инфекций

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПЕПТИДЫ

КАК АЛЬТЕРНАТИВНОЕ БУДУЩЕЕ ТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Резюме. В статье дается общая характеристика антимикробных пептидов. Также изложены различные аспекты взаимодействия АМП с клетками-мишенями и организмом-реципиентом и описаны основные направления исследований АМП, связанные с их эффектами на наиболее клинически значимые грамотрицательные микроорганизмы и бактериальные биопленки.

Ключевые слова: антибиотикорезистентность, антимикробные пептиды, антибактериальные препараты, грамотрицательные бактерии, грамположительные бактерии, бактериальные биопленки.

Олег Иванов,

старший научный сотрудник сектора метаболизма и функций белков растений Института экспериментальной ботаники НАН Беларуси, кандидат биологических наук

В мире регистрируется все больше фактов стремительного распространения штаммов патогенов, устойчивых к действию имеющихся в распоряжении врачей антибактериальных препаратов. По данным ВОЗ, от инфекций, связанных с устойчивыми к антибиотикам патогенными микроорганизмами, в мире ежегодно умирает по меньшей мере 80 тыс. человек, а лечение пациентов, инфицированных устойчивыми штаммами, создает дополнительную бюджетную нагрузку на национальные системы здравоохранения, которая оценивается для стран ЕС приблизительно в 7 млрд евро, а для США - до 33 млрд долл. ежегодно [1].

Такая же ситуация наблюдается и в Беларуси, где в последние 10 лет отмечается существенный рост мульти- и чрезвычайно резистентных нозокомиальных штаммов Klebsiella spp., Staphylococcus spp., P. aeruginosa, E. coli, доля которых среди клинических изолятов может достигать 70%. В ряде случаев это уже приводит к отказу от использования пенициллинов, цефалоспо-ринов I и II поколений, макролидов [2, 3].

Появление бактерий с множественной лекарственной устойчивостью создало острую потребность в разработке новых классов антибиотиков, отличных по механизму действия от уже существующих. Однако, несмотря на очевидную необходимость, крупные фармацевтические компании не проявляют серьезного интереса к поиску и разработкам антибактериальных препаратов нового типа действия вследствие своей низкой мотивированности, а отдают предпочтение в разработках лекарствам длительного применения, что экономически более выгодно. В итоге проблемой поиска новых антибиотиков занимаются в основном небольшие биотехнологические компании. Так, Cubist Pharmaceuticals запатентовала и внедрила в производство антибиотик нового класса циклических ли-попептидов - даптомицин (Cubicin), эффективный в отношении метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) и других грамположительных патогенных бактерий [4]. Завершаются клинические исследования еще более 10 антибактериальных пре-

паратов пептидной природы, структурно и по механизму действия отличных как от существующих антибиотиков, так и, в ряде случаев, друг от друга [5].

Относительно большое количество проходящих клинические испытания препаратов на основе антимикробных пептидов (AM^ объясняется значительным в последние годы интересом со стороны исследователей к этой группе соединений. Распространение множественной лекарственной устойчивости и требования рынка вынуждают вести поиск антибиотических субстанций, с одной стороны, эффективных в отношении устойчивых штаммов, а с другой - обладающих набором характеристик, которые препятствуют развитию резистентности к ним со стороны бактерий на протяжении как можно более длительного времени. Этим условиям в полной мере соответствуют природные, модифицированные и синтетические антимикробные пептиды (AM^, что объясняет бум публикаций (более 8QQQ ежегодно), посвященных их исследованиям.

AMП - это, как правило, катионные молекулы длиной 8-45 аминокислотных остатков. Для большинства AMП характерно высокое содержание основных (Lys, Arg, His) и неполярных гидрофобных аминокислотных остатков (чаще всего Ala, Ile, Leu, Val). Доля последних в молекуле пептида может составлять до 3Q-5Q%. Характер, соотношение и распределение заряженных, нейтральных, гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков в молекуле AMП определяют заряд, который обеспечивает взаимодействие пептида с поверхностью микробной клетки, и амфипатичность AMП (пространственное разделение гидрофильного и гидрофобного доменов молекулы), за счет чего пептиды способны внедряться в мембраны бактериальных клеток (а в ряде случаев и в клеточные мембраны различных эукариотических организмов - от простейших до млекопитающих) посредством взаимодействия с липидами, гидрофильно-гидрофобными по природе. Aминокислотная последовательность и аминокислотный состав AMП также определяют пространственную структуру этих пептидов и разнообразие механизмов, лежащих в основе их антимикробных эффектов.

Статус АМП

Традиционно под AMП понимают пептиды, которые, в отличие от классических пептидных антибиотиков, например ванкомицина, не являются вторичными метаболитами - их аминокислотная последователь-

ность закодирована в геноме и включает протеиноген-ные аминокислоты. Однако появление дизайнерских, полностью синтетических и не встречающихся в природе пептидов с высокой активностью требует расширительной трактовки понятия «антимикробный пептид»: природное или синтетическое соединение с соответствующей активностью и образованное, как правило, протеиногенными, в том числе модифицированными, аминокислотами.

АМП чрезвычайно широко распространены в природе. Анализ базы данных GenBank позволяет заключить, что в геномах различных организмов закодировано свыше 100 тыс. различных АМП [6]. При этом число тех, для которых хоть в какой-то степени подтверждена антибактериальная активность, немногим более 2,8 тыс. Информацию о таких пептидах можно найти в специализированных базах данных, например в The Antimicrobial Peptide Database (APD) [7], Collection of Anti-Microbial Peptides (CAMPR3) [8].

Единой системы классификации АМП пока не существует. Тем не менее широко принятым является их разделение на основе общности мотивов аминокислотных последовательностей (дефензины, тионины, кноттины, циклотиды, кателицидины и т.д.), а также -особенностей организации пространственной структуры АМП (а-спиральные, ß-складчатые, aß-смешан-ные, неструктурированные, (псевдо)циклические).

Специфичность АМП

Принадлежность к тому или иному структурному типу до некоторой степени определяет механизмы, лежащие в основе антимикробных эффектов АМП. Известные механизмы их действия на клетку можно разделить на 2 большие группы [9]. Первая объединяет все варианты прямого литического действия АМП, связанные с нарушением целостности клеточной мембраны, и ассоциирована с первичным взаимодействием молекул АМП с поверхностью мембраны с последующим встраиванием в нее гидрофобных участков пептидов. Это ведет к формированию мембранных пор и, как следствие, к лизису клетки. По такому типу действует большинство а-спиральных, а также некоторые ß-складчатые и циклические АМП (рисунок).

Вторая группа механизмов антимикробного действия АМП связана с более специфическими, внутриклеточными или внеклеточными мишенями и характерна для многих ß-складчатых, неструктурированных и циклических пептидов. Специфическими

74 НАУКА И ИННОВАЦИИ | №7 (18S) | Июль 2018 |

http:// in nos fe ra. by

Рисунок. Механизмы действия антимикробных пептидов. Источник: [23, с изменениями]

А - образование мембранных пор и мембранных каналов -для дермоцидина и РедШа; Б, В - взаимодействие 1_1_-37 человека с мембраной клетки с формированием тороидальных пор или согласно «ковровой модели»; Г, Д - рецептор-опосредованное связывание, при котором ингиби-руется работа иррР (ундекапренил-пирофосфатфосфатазы) - фермента, участвующего в биосинтезе клеточной стенки или АВС-транс-портеров,- для лактокоццина, энтероцина 1071 и гравицинов; Е - активизация аутолизинов посредством и Рер 5; Ж, З - подавление транскрипции и биосинтеза белка - для Мс^25, апидацинов, онокцинов и Вас7 соответственно. ВМ - внешняя мембрана; ВнМ - внутренняя мембрана; ПГ - пептидогликан; ЛТК - липотейхоевая кислота; МЛТ - транспортер мальтозы

мишенями в этих случаях являются ферменты биосинтеза РНК, белков, клеточной стенки, белки теплового шока, ферменты репарации ДНК или предшественник бактериальной клеточной стенки - липид II (см. рисунок). Часто активность АМП обеспечивается несколькими механизмами, что делает такие пептиды особенно привлекательными с точки зрения разработки препаратов со сниженной вероятностью развития к ним устойчивости со стороны патогенных бактерий [10]. Показательны в этом отношении примеры бычьего бактеницина 7 и пептидного фрагмента из лакто-феррина, лактоферрицина В, для которых выявлены более 40 внутриклеточных мишеней у некоторых гра-мотрицательных бактерий [11].

Неспецифичность мишеней АМП или сочетание одновременно нескольких вне- и/или внутриклеточных мишеней вкупе с относительно низкой селективностью этих пептидов ведет к ряду следствий.

Следствие первое. Клеточные мембраны бактерий обладают принципиально схожими особенностями строения. Ключевое значение имеют входящие в их состав в большом количестве анионные фосфолипи-ды, такие как фосфатидилглицерол, фосфатидилсе-рин, кардиолипин. В результате внешняя поверхность бактериальной мембраны в целом заряжена отрицательно (значительно сильнее, чем у эукариотических клеток), что обеспечивает электростатическое взаимодействие с катионными молекулами АМП. Дополнительный аттрагирующий эффект гарантирует на-

личие в клеточной стенке бактерий анионных групп различной природы (фосфатных в липополисахари-дах или гидроксильных в тейхоевых кислотах). В совокупности с относительно низкой селективностью и часто прямыми мембранолитическими эффектами это приводит к тому, что многие АМП ведут себя как соединения с широким спектром антимикробной активности. Достаточно отметить, что 885 АМП из более чем 2,8 тыс. пептидов базы данных APD проявляют одновременную активность в отношении либо широкого круга грамположительных или грамотри-цательных бактерий, либо видов из обеих этих групп и в дополнение часто - антифунгальную и противовирусные активности [7].

Второе следствие вытекает из того факта, что у многих АМП отсутствуют строгие молекулярные мишени, или же одновременно в клетке и/или на ее поверхности имеется несколько различных по природе мишеней. Теоретически это означает, что формирование резистентности со стороны микроорганизмов к таким пептидам должно быть затруднено в силу необходимости одновременного появления нескольких мутаций, обеспечивающих толерантность к конкретным АМП или группам АМП. Однако следует иметь в виду: если резистентность биохимически не запрещена, она рано или поздно сформируется [12]. Следовательно, необходимо искать или создавать такие соединения, сопротивляемость к которым будет формироваться в течение как можно более длительного

времени, что в конечном итоге определяет клинический и экономический смысл разработки каждого конкретного антибактериального препарата.

За время сосуществования микроорганизмов и АМП бактерии выработали несколько путей, благодаря которым они могут стать толерантными к отдельным АМП. Это и инактивация АМП посредством гиперпродукции внеклеточных пептидаз и протеаз, и распознавание АМП с последующим внеклеточным связыванием при помощи специфических белков или же активном выведении из клеток специфичными экспортерами, и, наконец, модификации клеточной стенки либо изменения липидного состава мембран клеток, что ведет к снижению аффинности внешних бактериальных оболочек к АМП в первом случае или к уменьшению мембранолитических эффектов данных пептидов во втором.

Как следствие, уже сейчас предлагается целый ряд природных или синтетических АМП, которые блокируют реализацию того или иного механизма резистентности к ним со стороны бактерий. По всей видимости, наиболее эффективный путь предотвращения развития толерантности или резистентности к конкретным АМП - поиск/создание молекул, реализующих в полной мере свой потенциал неспецифического действия, а именно таких пептидов, которые одновременно сочетают несколько антимикробных механизмов. Яркое подтверждение эффективности подобных АМП - 34-членный пептид низин, продуцируемый бактерией Lactococcus и применяемый как пищевой консервант на протяжении уже нескольких десятилетий. Низин обладает бактерицидной активностью в отношении многих грамположительных бактерий в наномолярных концентрациях и активирует несколько независимых механизмов: ингибирует биосинтез клеточной стенки бактерий за счет высокоаффинного связывания с предшественником клеточной стенки липидом II, обладает прямой мембранолитиче-ской активностью, активирует муромидазы, что приводит к преждевременному лизису межклеточных перегородок в бактериальных клетках [13]. Несмотря на длительную историю использования этого АМП, сообщения о формировании устойчивости к нему со стороны бактерий единичны. Очевидно, в случае с низином для микроорганизмов-мишеней все еще непреодолимым препятствием является одновременное приобретение нескольких мутаций, которые обеспечивают резистентность к данному пептиду и при этом не ухудшают общую выживаемость бактериальных клеток.

Существует консенсус о том, что природные АМП, имеющие одновременно несколько мишеней как на поверхности, так и внутри бактериальной клетки, распространены намного шире, чем считалось ранее [13]. Кроме того, такие пептиды могут быть созданы de novo за счет различных модификаций исходных пептидных шаблонов. Например, NZ 2114, улучшенная модификация плектазина - дефензина из гриба Pseudoplectania nigrella, обладает высокой эффективностью (сопоставимой с ванкомицином) в отношении широкого круга грамположительных бактерий. В отличие от исходной молекулы, мишенью которой является липид II, NZ 2114 обладает также прямым мембранолитическим действием, что выражается в сохранении эффективности этого АМП в отношении штаммов, мутантных по липиду II, то есть ванкомицинрезистентных [14].

Третье следствие - потенциальная токсичность АМП для организма-реципиента, которая становится причиной исключения ряда пептидов с высокой антимикробной активностью и широким спектром действия из предклинических или клинических исследований. Как правило, это связано с недостаточной селективностью молекул АМП при атаке клеточных мембран. При существенных различиях прока-риотических и эукариотических (речь идет в первую очередь о млекопитающих) клеточных мембран, что является базой для селективности АМП, значительную роль в цитотоксичности пептидов играет их ги-дрофобность. Гидрофобные пептиды способны взаимодействовать непосредственно с электростатически нейтральной мембраной клеток млекопитающих. В итоге чрезмерно гидрофобные пептиды токсичны как для бактериальных, так и для эукариотических клеток [15].

Критическим параметром, который определяет возможную цитотоксичность АМП, также является суммарный положительный заряд их молекул. Превышение им определенного уровня ведет к значительному возрастанию цитотоксичности АМП без существенного изменения антимикробных свойств. Таким образом, надлежащий баланс между зарядом и гидрофоб-ностью необходим для проявления пептидом максимальной антимикробной активности при минимальной токсичности. При улучшении природных аналогов или дизайне АМП de novo это достигается введением и/или заменой определенных аминокислотных остатков в соответствующих позициях аминокислотной цепи. Наиболее часто заряд молекул пептидов меня-

76 НАУКА И ИННОВАЦИИ | №7 (185) | Июль 2018 |

http://innosfera.by

ют введением или удалением Lys или Arg, протони-рованных в физиологических условиях, а гидрофоб-но-гидрофильный интерфейс изменяют введением или удалением гидрофобного Trp, позиция которого в аминокислотной последовательности важна также для увеличения стабильности молекулы и повышения проникающей способности АМП в бактериальную мембрану [15].

Эффективными подходами для повышения клеточной селективности являются также замена L-аминокислот молекул пептидов на соответствующие D-аналоги, введение в амфипатичные катионные АМП дисульфидных мостиков, снижающих спираль-ность и гидрофобность молекул. Циклизация пептидов при помощи дисульфидных связей также способна значительно усилить антимикробную активность и клеточную селективность [15].

При поиске природных АМП, модификации природных шаблонов или конструировании АМП de novo исследователи также стоят перед необходимостью отбора пептидов, которые одновременно с целевой антимикробной активностью обладали бы высокой стабильностью в физиологических условиях, что во многом обеспечивает терапевтический потенциал АМП как нового класса антибактериальных соединений.

Многие катионные АМП с высокой бактерицидной активностью in vitro (например, магаинины, ин-долицидины или бактенецины, для которых минимальная ингибирующая концентрация в отношении некоторых видов бактерий доходит до 1 мкг/мл) частично или полностью теряют свою активность при физиологических концентрациях NaCl, Mg2+, Ca2+ [16]. Тем не менее было предложено несколько путей повышения солеустойчивости АМП. Например, конъюгация одного из концов молекул АМП с гидрофобными аминокислотными остатками (предпочтение отдается Trp) обеспечивает сохранение их антимикробной активности и снижение цитотоксичности при высоких концентрациях солей [17]. Схожие эффекты достигаются при коньюгировании молекул АМП с одного из концов с в-нафтилаланином и через введение дисульфидной связи в определенные участки молекул, в том числе с образованием псевдоциклических пептидов [16, 18].

На продолжительность жизни и на активность АМП in vivo существенное влияние оказывают эндогенные протеазы организма-реципиента. Так, у человека наиболее опасными для молекул АМП являются трип-

син и химотрипсин, разрушающие пептидные связи молекул, которые образованы основными (Lys, Arg) и гидрофобными (Trp, Phe) аминокислотами, критически важными в обеспечении активности пептидов. Тем не менее циклизация, модификация обоих концов молекул пептида (для N-конца - ацетилирование, для С-конца - амидирование), замещение L-аминокислот на D-формы, коньюгирование с несколькими остатками Trp или ß-нафтилаланином снижают или полностью блокируют протеолитическую деградацию АМП протеазами и организма-реципиента, и бактериальными, секреция которых входит в число факторов, потенциально обеспечивающих резистентность микроорганизмов к АМП [15, 18].

Как видим, исследователи обязаны учитывать следующие требования при разработке антибактериальных препаратов на основе АМП: их эффективность должна быть сопоставима с традиционными антибиотиками в отношении чувствительных микроорганизмов, а АМП нужно иметь пролонгированный период жизни без формирования к ним резистентности, обладать низкой токсичностью и быть устойчивыми в физиологических средах реципиента.

Экономика АМП

Для успешного вывода на рынок антибиотиков на основе АМП недостаточно решения задач, лежащих только в плоскости описанных выше проблем. Весомый фактор, тормозящий выход этого класса антибактериальных препаратов на рынок,- финансовые издержки крупномасштабного производства, которые могут достигать 50-400 долл. за 1 г субстанции АМП по сравнению с менее чем 1 долл. за 1 г для традиционных антибиотиков [19]. Однако технологии не стоят на месте. Так, твердофазный синтез АМП представляет собой альтернативу для крупномасштабного производства пептидов. Согласно расчетам, если предприятие способно выпускать более 1 т субстанции пептида в год, стоимость производства может составлять менее 1 долл. за 1 г на 1 аминокислотный остаток, что сопоставимо с доходами от изготовления существующих антибиотиков [19]. По-видимому, основные надежды на производство относительно дешевых АМП стоит связывать с рекомбинантными технологиями. Например, компания Novozymes Inc. описала эффективную технологию продуцирования плектазина высокой степени чистоты в генетически модифицированном исходном продуценте P. nigrella, при которой себестои-

БИОЛОГИЯ

мость производства 1 г пептида снижается до 50 раз по сравнению с методами химического синтеза [20]. Как бы то ни было, в условиях постоянно растущего числа резистентных форм патогенных микроорганизмов чисто экономические соображения, ограничивающие усилия по разработке и внедрению новых антимикробных соединений, могут быть девальвированы перед угрозой оказаться в ситуации постантибиотической эры.

В силу специфики для АМП очерчивается потенциально широкая область применения. Исследования АМП проходят по всем направлениям оценки их терапевтического потенциала в отношении различных патогенных грамположительных и грамотрицатель-ных бактерий, грибов, вирусов, протист, для коррекции иммунного ответа на инфицирование (многие АМП, в первую очередь эндогенные для организма, демонстрируют иммуномодулирующую активность).

Текущие задачи медицины определяют основные направления исследований. Ситуация с распространением антибиотикорезистентных форм видится наиболее критичной для таких грамотрицательных бактерий, как Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, ряда энтеробактерий [21]. Соответственно, усилия многих групп исследователей сосредоточены на поиске/создании АМП, специфично действующих на данные микроорганизмы, а в большинстве лабораторий осуществляется скрининг исследуемых пептидов в отношении этих микроорганизмов. АМП способны намного эффективнее (в 10-1000 раз), чем традиционные антибиотики, уничтожать бактериальные биопленки, которые формируются на различных поверхностях как внутри организма, так и на медицинских изделиях и являются одной из основных причин нозокоми-альных инфекций [22].

В любом случае эти разработки во многом основаны на сформированных представлениях о взаимосвязи структуры и функции АМП, что позволяет отойти от классического скрининга разнообразных биообъектов для выявления пептидов с интересующей активностью и свойствами и использовать арсенал методов анализа in silico. Геномные, транскриптомные и протеомные данные, которые постоянно обновляются и накапливаются, а также разработанные инструменты компьютерного анализа и предсказания свойств АМП привели к тому, что этапы скрининга пептидов все больше выполняются в виртуальной среде. При этом не происходит и, видимо, в ближай-

шем будущем не произойдет отказа от классического выделения и последующего анализа набора случайных АМП из того или иного объекта. Существующие инструменты и небольшие размеры АМП также помогают успешно осуществлять de novo дизайн этих соединений либо использовать в качестве исходных шаблонов природные АМП, направленная замена аминокислотных остатков в которых дает возможность оптимизировать свойства исходных молекул. В совокупности с доступными технологиями синтеза пептидов это привело к тому, что значительная часть тестируемых сегодня АМП - синтетические молекулы, не встречающиеся в природе.

Компьютерный анализ позволяет максимально раскрыть потенциал АМП и интенсифицировать разработки пептидов, полностью удовлетворяющих критериям эффективности и безопасности. Вместе с тем мы всегда должны помнить, что формирование резистентности у бактерий представляет перманентную угрозу для любых антимикробных соединений. Применение новых антибактериальных соединений следует планировать очень тщательно, а не просто заменять одну форму антибиотиков другой без взвешенного регулирования. СИ

ЛИТЕРАТУРА

1. Аветисян Л. Р. Основные механизмы формирования эпидемически значимых госпитальных клонов бактерий / Л. Р. Аветисян, И. А. Шагинян, М. Ю. Чернуха // Успехи современной биологии. 2016. Т. 136, № 1. С. 41-52.

2. Соловей Н. В. Предикторы инфицирования чрезвычайно устойчивыми изолятами синегнойной палочки пациентов, госпитализированных в многопрофильные стационары / Н. В. Соловей, И. А. Карпов, Н. Н. Левшина // Медицинский журнал. 2013. № 2. С. 107-110.

3. Панкратова Ю. Ю. Микробиологический мониторинг в пульмонологическом отделении / Ю. Ю. Панкратова, В. М. Гриб, Р. В. Шумилова // Медицинский журнал. 2011. № 4. С. 114.

4. Rybak M.J. The efficacy and safety of daptomycin: first in a new class of antibiotics for Gram-positive bacteria / M. J. Rybak // Clin. Microbiol. Infect. 2006. Vol. 12. P. 24-32.

5. Antimicrobial peptides in clinical development: Peptide trends June 2016.Mode of access: http://www. bachem.com/service-support/newsletter/peptide-trends-june-2016/.

6. In silico identification of plant-derived antimicrobial peptides // Systems and Computational Biology -Molecular and Cellular Experimental Systems / M. C. Pestana-Calsa [et al.] 2011. Ch. 14. P. 251-272.

7. The Antimicrobial Peptide Database // http://aps.unmc.edu/AP/main.php.

8. CAMPR3 (Collection of Anti-Microbial Peptides) //http://www.camp3.bicnirrh.res.in/index.php.

9. Nguyen L.T. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action / L.T. Nguyen, E. F. Haney, H. J. Vogel // Trends Biotechnol. 2011. Vol. 29, N9. P. 464-472.

10. Challenges and future prospects of antibiotic therapy: from peptides to phages utilization / S. M. Mandal [et al.] // Front. Pharmacol. 2014. Vol. 5, N105. P. 1-12.

Полный список литературы размещен на сайте