СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ БИОРЕЗОРБИРУЕМЫХ ФИБРОИНОВЫХ ПЛЕНОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТАКРИЛИРОВАННОГО ЖЕЛАТИНА
METHOD FOR FORMATION OF BIORESORBABLE FIBROIN FILMS USING METACRYLATED GELATINE

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Более подробно изобретение относится к области создания биорезорбируемых, биосовместимых, фотоотверждаемых композитных пленок на основе метакрилированного желатина и водного раствора фиброина шелка Bombyx mori, предназначенных для тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Уровень техники
Невозможно переоценить роль биодеградируемых биосовместимых материалов во многих современных областях трансплантологии, регенеративной медицины и в научных исследованиях [Biomaterial-based scaffolds-current status and future directions. Garg T, Goyal AK. Expert Opin Drug Deliv. 2014, 11(5): 767-89; Natural and synthetic biodegradable polymers: different scaffolds for cell expansion and tissue formation. Asti A, Gioglio L. Int J Artif Organs. 2014, 37(3): 187-205]. По происхождению их можно разделить на природные материалы, такие как коллаген, гиалуроновая кислота, альгинаты, а также синтетические полимеры, например полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры и композитные материалы. В настоящее время из биосовместимых материалов уже создан обширный спектр конструкций различной формы и предназначения, в том числе скаффолдов в виде пористых матриксов, пленок, гидрогелей, микрочастиц, трубок, электроспининговых волокон, повязок и др. Однако активное развитие технологий современной 3D-печати позволяет создавать изделия с большим разнообразием геометрических форм, а также точно контролируемой внутренней структурой, соответствующей строению внеклеточного матрикса тканей организма. Одним из наиболее перспективных направлений применительно к тканевой инженерии является лазерная стереолитография. При использовании стереолитографии формирование изделия происходит послойно. Каждый слой вычерчивается лазером согласно данным, заложенным в трехмерной цифровой модели. Облучение лазером приводит к полимеризации и затвердеванию материала в точках, на которые направляется луч, что обеспечивает пространственно-контролируемое фотоотверждение жидкой смеси. Эта технология позволяет создавать трехмерные структуры с разрешением порядка микрометров. Однако для данного метода существует серьезное ограничение, так как помимо оптимальных показателей, таких как биосовместимость, нетоксичность, способность к биорезорбции и биодеградации, используемый материал должен также обеспечивать возможность фотоотверждения. Сочетание высокой механической прочности, эластичности, термостабильности, способности к контролируемому биологическому разложению с образованием нетоксичных метаболитов, возможности получения водных растворов и присутствия легкодоступных химических групп для функциональных модификаций, позволяют создавать изделия, содержащие не только фиброин в чистом виде, но и композитные материалы на его основе, содержащие компоненты внеклеточного матрикса и его производные, в том числе желатином [Silk fibroin in tissue engineering. Kasoju N, Bora U. Adv Healthc Mater. 2012, 1(4): 393-412]. В этом контексте фиброин шелка тутового шелкопряда Bombyx mori обладает высоким потенциалом для применения в методе стереолитографии. Введение в состав фиброиновых конструкций гидрофильного желатина, содержащего различные сигнальные последовательности в своей структуре, в том числе RGD, может усилить адгезию клеток к его поверхности, повысить гидрофильность и регенеративный потенциал скаффолдов. Являясь материалом природного происхождения, желатин обладает высокой биосовместимостью и низкой иммуногенностью. Кроме того, возможность получения водного раствора метакрилированной формы данного материала делает его чрезвычайно удобным для использования в лазерной стереолитографии. Низкая стабильность изделий из метакрилированного желатина в водных растворах и их недостаточная механическая прочность ограничивают его применение, однако комбинация с фиброином шелка позволяет устранить эти недостатки при сохранении всех положительных качеств.
Таким образом изделия, изготовленные на основе водных растворов метакрилированного желатина и фиброина путем фотоотверждения, перспективны для применения в реконструктивной, заместительной и регенеративной медицине, трансплантологии. Использование таких изделий может совершить прорыв в лечении целого ряда социально-значимых заболеваний, таких как остеоартирит, остеопороз, заболевания сердечно-сосудистой системы, патологии кишечника, включая онкологические заболевания.
Таким образом, разработка изделий, полученных при помощи стереолитографического метода, является чрезвычайно актуальной и очень перспективной задачей.
Существует несколько близких аналогов настоящего изобретения. Согласно патенту, RU 2443805 "Способ получения пленки на основе фиброина шелка для изготовления контактных линз", пленки изготавливают путем растворения фиброина шелка в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле и последующим смешением с растворенным также в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле полиметилметакрилатом. Также в публикациях WO 2014123761 А1 «Photoactive silk protein and fabrication of silk protein structures using photolithography», WO 2010057142 A2 «Surface modification of silk fibroin matrices with poly(ethylene glycol) useful as antiadhesion barriers and antithrombotic materials» пленки готовят растворением фиброина в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле. Наряду с 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанолом, в публикации WO 2014123761 A1 «Photoactive silk protein and fabrication of silk protein structures using photolithography» в качестве растворителей использовали трифторэтанол, смесь LiCl/DMSO. Данные органические растворители являются токсичными для живых организмов, в том числе для человека. Кроме того, в современных 3D-принтерах для лазерной стереолитографии используются чернила на одной основе. Поэтому использование воды в качестве растворителя является более целесообразным.
Также имеются аналоги на основе желатина и его производных: WO 2012164032 А1 «Crosslinked gelatin hydrogels», ЕР 2574349 A1 «Therapeutic use of gelatin hydrogels with a gel-sol transition at body temperature», WO 2013040559 Al «Fabrication of gelatin hydrogel sheet for the transplantation of corneal endothelium». Несмотря на низкую стоимость реактивов, легкость получения пленок из метакрилированного желатина, такие изделия представляют собой гидрогель и соответственно обладают недостаточными механическими свойствами, плохо сохраняют фиксированную форму в физиологических условиях, обладают высокой скоростью биодеградации, изменение которой возможно лишь путем химических модификаций, снижающих биосовместимость материала. Все перечисленные недостатки ограничивают область применения конструкций из метакрилированного желатина и возможность создания сложных трехмерных каркасов заданной формы.
Раскрытие изобретения
Задачей группы изобретений является создание нового биорезорбируемого, биосовместимого, фотоотверждаемого изделия в виде композитных пленок на основе метакрилированного желатина и водного раствора фиброина шелка Bombyx mori, предназначенных для тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Поставленная задача решается способом получения биорезорбируемого, биосовместимого, фотоотверждаемого изделия в виде композитных пленок на основе метакрилированного желатина и водного раствора фиброина шелка Bombyx mori, включающим следующие стадии:
а) метакрилирование желатина путем растворения навески сухого желатина в К-фосфатном буфере (pH 7) при перемешивании на водяной бане (48-52°C) из расчета 90-110 мг/мл, добавления к раствору желатина 48-52 мл/л метакрилового ангидрида (МА), инкубации смеси желатина и МА при перемешивании в течение 2-3 ч при 48-52°C, охлаждения смеси до комнатной температуры, внесения К-фосфатного буфера (pH 7) до увеличения объема смеси в 1,9-2,1 раза, удаления непрореагировавшего ангидрида метакриловой кислоты и дополнительных побочных продуктов путем диализа против дистиллированной воды в течение 70-80 часов, проводя 15-20 смен диализа и последующего замораживания полученного раствора (не менее 6 часов при -68 - -90°C) и лиофилизации;
2
2
5
2
б) подготовка водного раствора фиброина шелка, путем растворения фиброина в смеси CaCl:CHOH:HO при молярном соотношении компонентов смеси, обеспечивающем растворение в ней фиброина, в течение 5-7 часов при нагревании до 70°C±5°C и последующего диализа против воды, доведение полученного раствора водой до концентрации 20-45 мг/мл, при этом фиброина берут в количестве 100-150 мг/мл смеси;
в) подготовка смеси для фотоотверждения путем растворения лиофилизированного метакрилированного желатина в водном растворе фиброина при перемешивании на водяной бане (48-52°C) из расчета 45-55 мг/мл и внесения в полученную смесь 0,4-1 мг/мл фотоинициатора Irgacure 2959;
г) фотоотверждение смеси, полученной на стадии в), путем облучения УФ-светом (240-300 нм) в течение 3-6 часов;
д) индукция перехода молекул фиброина из α-спиралей и статистического клубка в β-слои путем высушивания фотоотвержденных композиций при комнатной температуре в течение 10-14 часов и последующей обработки 96% этанолом в течение 6-10 часов.
Предпочтительно водный раствор фиброина берут с концентрацией 30-45 мг/мл.
Техническим результатом, достигаемым заявленной группой изобретений, является получение биорезорбируемой фиброиновой пленки, характеризующейся стабильной структурой и сохранением формы при физиологических условиях, что позволяет ее использовать в существующих фотополимерных 3D-принтерах (SLA-принтеры). Кроме того, способ характеризуется простотой, возможностью использования недорогого и доступного сырья, что в сочетании с уникальными свойствами позволит создать доступный конкурентоспособный продукт и занять лидирующие позиции в данной области. А также предлагаемый способ получения биорезорбируемого, биосовместимого, фотоотверждаемого изделия в виде композитных пленок на основе метакрилированного желатина и водного раствора фиброина шелка Bombyx mori с использованием технологии 3D-печати может позволить получить конструкции с заданной структурой как в виде пленок, обладающих предопределенным микрорельефом поверхности, так и сложных трехмерных структур на основе компьютерных моделей.
В предлагаемом изобретении может использоваться фиброин шелка каркасной нити пауков, фиброин шелка тутового шелкопряда и других видов шелкопрядов, фиброин рекомбинантного шелка, а также искусственные аналоги шелка.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежом, где представлены гистограмма (А) и изображения (Б) и (В), использованные для подсчета количества клеток, на 1 (Б) и 3 (В) день культивирования, и характеризующие биосовместимость in vitro серии пленок на основе фотоотверждаемых композиций с различным содержанием фиброина шелка (3-4.5%). А-Увеличение общего количества клеток на исследуемых пленках; Б-В - Ядра клеток выявлены SYBR Green. Изображения получены методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием объектива CFI Plan Fluor 10x/0,3.
Осуществление изобретения
2
Получение водного раствора фиброина шелка осуществляли с использованием Нитей хирургических нестерильных 100% натуральный шелк, произведенных по ГОСТ 396-84 (Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 396-84, наличие сертификата соответствия №0302120, гарантии производителя, срок годности, условия хранения по ГОСТ 396-84, сертификат соответствия), растворяя навеску в смеси dHO, кальция хлористого (х.ч., о.с.ч., ГОСТ 450-77; Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 3885-73, наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид) и спирта этилового ректификованного 96% (ГОСТ 5962-67). Метакрилирование желатина производили путем растворения навески сухого желатина (ГОСТ 23058-89) в К-фосфатном буфере (pH 7) и добавления к раствору желатина метакрилового ангидрида (Sigma-Aldrich, CAS номер: 760-93-0; наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид), инкубации смеси желатина и метакрилового ангидрида, внесения К-фосфатного буфера (pH 7) до увеличения объема смеси в 1,9-2,1 раза, удаления непрореагировавшего ангидрида метакриловой кислоты и дополнительных побочных продуктов путем диализа против дистиллированной воды и лиофилизации полученного раствора. Смесь для фотоотверждения получали путем растворения лиофилизированного метакрилированного желатина в водном растворе фиброина и внесения в полученную смесь коммерчески доступного фотоинициатора Irgacure 2959 (Sigma-Aldrich, CAS номер: 106797-53-9). Фотоотверждение полученной смеси производили при помощи УФ-света. С целью индукции перехода молекул фиброина из α-спиралей и статистического клубка в β-слои фотоотвержденные композиции высушивали при комнатной температуре и последующей обработке 96% этанолом (ГОСТ 5962-67).
3
Все перечисленные выше процедуры осуществлялись с использованием следующего оборудования: Система очистки воды Elix 70, «Millipore» (Франция, система включает: картридж предварительной очистки Progard TL, картридж обратного осмоса, модуль Elix; производительность 70 л/час при температуре 7-30°С, рабочее давление 0,7-1,0 МПа, 220 В, 50 Гц, габариты (ШГВ): 662×441×733 мм, 56 кг); Резервуар для сбора очищенной воды SDS 200, «Millipore» (Франция, объем 200 л), Весы электронные RV 1502, «OHAUS» (США, (1500,00±0,01) г, 220 В, 50 Гц); Шкаф вытяжной 1200 ШВМкв (Россия, ООО «ЛаМО» макс, мощность подключаемых приборов 3,5 кВт, 220 В, габариты (ШГВ): 1280×750×2400 мм); Холодильник бытовой Атлант МХМ 1707-02 (Минск, Белоруссия, емкость камеры холодильника 175 л, температура от 0°С до 10°С, емкость мороз, камеры 115 л, температура минус 18 до минус 24°С, 220 В, 50 Гц); Центрифуга MiniSpin, «Eppindorf», (Германия, скорость вращения 13400 об/мин, ротор F-45-12-11, 12×1,5/2 мл, 220 В, 70 Вт, габариты (ВГШ): 122×240×226 мм, 4,3 кг); Баня водяная BWT-U/20, Biosan (Латвия, ванна из н/ж стали объем 20 л. Диапазон регулирования температуры от 30°C до 100°C, точность поддержания температуры ±0,1°C, внутренняя циркуляция, внутр. размеры ванны: 300×320×140 мм, габариты: 345×550×290 мм, 11 кг, 220 В, 50 Гц, 1 кВт); Лиофильная сушилка SubliMate FDL-5L8, «Esco» (США, емкость по льду 5,0 кг, производительность по воде 7,0 л/сутки, температура конденсора -90°C, конденсор из нержавеющей стали, дискретность считывания датчиков - 0,001 мбар, вес, кг - 72); Вакуумный насос RV5, «Edwards» (скорость откачки 5,8 м/час, предельный вакуум 0,002 мбар); Лампа люминесцентная ртутная ЛБ 30-1Э, «Narva» (Эстония, напряжение 96 В, мощность 30 Вт, световой поток 2020 лм, время горения 7500 ч, тип цоколя G13d).
Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Специалист в данной области техники понимает, что данные примеры не являются ограничивающими группу изобретений.
Пример 1. Получение биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток в область заживления и регенерации ран.
1. Подготовка рабочих растворов:
1.1. Подготовка раствора 1.
2
5
2
Готовят раствор хлорида кальция в смеси этанола и воды. Молярное соотношение компонентов CaCl:HOH:HO 1:2:8.
1.2. Подготовка раствора 2.
Готовят навеску шелка из расчета 150 мг на 1 мл раствора 1 и переносят в емкость с раствором 1. Инкубируют в течение часов на водяной бане при 70°C. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 15500 об/мин и супернатант диализуют против дистиллированной воды, проводя 6 смен диализа. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 13400 об/мин и определяют концентрацию фиброина по оптической плотности при 280 нм. Доводят раствор до концентрации фиброина 20 мг/мл и используют на стадии 1.4.
1.3. Подготовка раствора 3.
Готовят 10% раствор желатина: 10 г желатина растворяли в 100 мл К-фосфатного буфера (pH 7) при перемешивании на водяной бане (50°C). Затем добавляют 5 мл метакрилового ангидрида (МА). Реакционную смесь инкубируют при перемешивании в течение 2 ч при 50°C. Затем смесь охлаждают, после чего разбавляют еще в 2 раза К-фосфатным буфером и диализуют против дистиллированной воды для удаления непрореагировавшего ангидрида метакриловой кислоты и дополнительных побочных продуктов. Диализ проводят до полного исчезновения запаха МА в течение 72 часов, проводя не менее 15 смен. После диализа раствор ацилированного желатина замораживают при -70°C, лиофилизируют и используют на стадии 1.4.
1.4. Подготовка раствора 4.
Метакрилированный желатин из расчета 50 мг/мл растворяют в водном растворе фиброина с концентрацией 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл и 45 мг/мл (см. фиг. 1А). В полученные смеси преполимеров метакрилированного желатина и фиброина шелка добавляют фотоинициатор Irgacure 2959 из расчета 0,4 мг/мл. Полученный раствор используют на стадии формирования пленок.
2. Формирование пленок с использованием метода стереолитографии.
2.1. Фотоотверждение.
Фотоотверждение проводят, облучая раствор 4 УФ-светом с использованием лампы мощностью 30 Вт в течение 3 часов.
2.2 Высушивание на воздухе.
Полученные на стадии 2.1 гидрогели высушивают при комнатной температуре в течение ночи.
2.3 Инкубация пленок в 96% спирте этиловом и перевод пленок в воду.
Полученные на стадии 2.2 полуфабрикаты обрабатывают 96% этанолом в течение 6 часов. Затем полученные пленки переводят в воду путем последовательного внесения в 96% этанол дистиллированной воды из расчета 5% каждые 15 минут. Хранят в 70% спирте при +4°C.
Полученные композиции на основе метакрилированного желатина и водного раствора фиброина шелка Bombyx mori были опробованы на 3D-принтере, в результате были сформированы стабильные фотоотвержденные конструкции, сохраняющие свою форму при физиологических условиях.
Пример 2. Проведение исследований биосовместимости полученных пленок in vitro.
Исследование биосовместимости полученных композиций in vitro проводили по оценке способности этих субстратов обеспечивать адгезию и пролиферацию клеток мышиных фибробластов 3Т3 и поддерживать их жизнеспособность.
2
2
2
Для сравнительных исследований адгезии и пролиферации фибробластов на поверхности полученных фотоотверждением экспериментальных образцов серии композиций на основе метакрилированного желатина с фиброином и известными фиброинжелатиновыми пленками (ФЖ), полученными методом полива, использовали подсчет количества клеток на 1 и 3 дни культивирования с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Образцы пленок переносили из 70% этанола в среду ДМЕМ и инкубировали 1 час при 37°C в атмосфере 5% CO, затем заменяли среду на свежую и повторяли часовую инкубацию, после чего переносили образцы в полную культуральную среду, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), и инкубировали еще 1 час. В это время готовили суспензию фибробластов мыши 3Т3 из расчета 12000 кл/мл. Переносили образцы пленок в лунки 24-луночной плашки и вносили по 1 мл суспензии фибробластов. Культивировали фибробласты мыши 3Т3 на пленках в течение 3 суток. Через 1 и 3 суток образцы фиксировали 4% параформальдегидом, ядра клеток выявляли с помощью SYBR Green. Получали по 10 изображений с каждого образца, используя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Nikon Eclipse Ti-E с конфокальным модулем Al (Nikon Corporation, Япония). Возбуждение флуоресценции проводили лазером 488 нм, детекцию - в диапозоне 500-550 нм. Таким образом исследовали по 15 мм каждого образца. Затем проводили подсчет ядер на 1 мм, используя программное обеспечение Nis Elements. В качестве контроля использовали фиброин-желатиновые пленки, полученные методом кастинга из водного раствора полимеров. Результаты представлены на фигуре 1.
По результатам подсчета количества клеток на 1 и 3 сутки культивирования фибробластов мыши 3Т3 на поверхности пленок из композиций на основе метакрилированного желатина, содержащих 3-4,5% фиброина шелка, видно, что все исследованные образцы поддерживают адгезию и пролиферацию фибробластов в указанном промежутке времени. Кроме того, клетки на поверхности экспериментальных образцов как на первые, так и на 3 сутки культивирования имели характерную для фибробластов веретеновидную форму.
Важно отметить, что в течение 7 дней культивирования клеток на поверхности пленок из композиций на основе метакрилированного желатина, содержащих 3-4,5% фиброина шелка, все образцы сохраняли свою форму и не разрушались при механическом воздействии.
Таким образом, полученные изделия обеспечивают возможность адгезии и пролиферации клеток, участвующих в процессах регенерации тканей, что делает возможным их применение в регенеративной медицине и биоинженерии.