Анализ хромосомных аномалий и стуктурных изменений плаценты при неразвивающейся беременности после применения вспомогательных репродуктивных технологий

АНАЛИЗ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ И СТУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТИ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Н.В. Александрова, Е.А. Дубова, О.А. Доронина, А.И. Щеголев

ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, Москва Россия, 117997, Москва, ул. Академика Опарина, 4

С помощью цитогенетического и иммуногистохимического исследования проанализирован абортивный материал пациенток с неразвивающейся беременностью после применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Произведено сравнение полученных результатов с самопроизвольной беременностью. Выявлено, что частота хромосомных аномалий при индуцированной беременности достоверно не превышает аналогичный показатель при самопроизвольной беременности. Гистологическое исследование соскобов полости матки у пациенток с нормальным кариотипом эмбриона показало однотипные изменения эндометрия и ворсин плаценты как при спонтанной, так и индуцированной неразвивающейся беременности. Однако уровень экспрессии PPAR и индекс пролиферации (Ki-67) в клетках ворсинчатого и вневорсинчато-го трофобласта при неразвивающейся беременности (независимо от способа достижения беременности) несколько выше по сравнению с прогрессирующей беременностью.

Ключевые слова: неразвивающаяся беременность, трофобласт.

Частота невынашивания беременности в структуре репродуктивных потерь составляет 15-20%, из них на 1 триместр приходится 75-80% наблюдений. К этиологическим факторам относят экстрагенитальные заболевания, состояние органов репродуктивной системы, гормональный фон, а также инфекции, лекарственные препараты и другие факторы. С помощью цитогенетического анализа установлено, что ведущей причиной прерывания беременности в 1 триместре является хромосомная патология, на долю которой приходится примерно 60% наблюдений [1].

В настоящее время особую актуальность занимают вопросы потери беременности после применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2]. Важная роль в формировании фетоплацентарного комплекса принадлежит рецепторам активации пролиферации пероксисом (peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs) [3]. Последние представляют собой группу ядерных рецепторных белков, которые действуют как факторы транскрипции для регуляции экспрессии генов, участвующих в процессах деления, диф-ференцировки и метаболизма клеток [4]. В плаценте экспрессируются все три известных изотипа PPAR, при этом PPARy экспрессируется главным образом на клетках трофобласта, что указывает на его особую роль в дифференцировке и функционировании трофобласта [5]. Согласно одним исследованиям процедура ИКСИ увеличивает частоту анеуплоидий и абераций по половым хромосомам,

формирующихся de novo [6, 7], в связи с чем рекомендуется перед переносом эмбрионов проводить процедуру предимплантационной диагностики (ПГД) [8]. Существует ряд публикаций, указывающих на отсутствие риска врожденных аномалий или больших аномалий развития как после ИКСИ [9], так и после традиционной программы ЭКО [10]. Полученные противоречивые результаты исследований свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения данной проблемы.

Материалы и методы: в исследование включены 154 пациентки с неразвивающейся беременностью в сроке 6-12 недель гестации. Группу контроля составили 34 пациентки с прогрессирующей спонтанной беременностью, сопоставимые по возрасту и анамнезу с исследуемыми группами, обратившиеся для проведения медицинского аборта.

Абортивный материал был получен путем инструментального удаления плодного яйца от пациенток с подтвержденным диагнозом неразвивающейся беременности.

В изучаемую группу были включены 87 пациенток с неразвивающейся индуцированной беременностью. В 47 (54,0%) наблюдениях беременность наступила в результате ЭКО, в 40 (46,0%) наблюдений - с применением технологии ИКСИ. В 27 наблюдениях (67,5%) ИКСИ проведено в связи с патозооспермией (преимущественно астенотератозооспермией). Группу контроля составили 67 пациенток с неразвивающейся самопроизвольной беременностью на сроке 6-12 недель гестации. Изучаемая и контрольная группы были сопоставимы по возрасту и анамнезу.

Для цитогенетического исследования использовали «прямой» метод анализа кариотипа (некультивированных) спонтанно делящихся клеток цитотрофоб-ласта хориона [11].

Полученные результаты: _хромосомные нарушения эмбриона выявлены у 46 пациенток (52,3%) изучаемой группы и 32 женщин (47,8%) - в контрольной. Результаты кариотипирования абортусов (табл. 1) показали, что наиболее частой хромосомной аномалий в подгруппах ЭКО и ИКСИ являлась анеуплоидия по аутосомам - 21 (91,3%) и 19 наблюдений (82.6%) соответственно. Трисомия диагностировалась в большинстве наблюдений. Преобладающим типом нарушения кариотипа оказалась трисомия: в группе ЭКО трисомия 22 хромосомы -5 наблюдений (21,7%), 16 хромосомы - 6 (26%), 15 хромосомы - 2 (8,7%), 4 хромосомы - 2 (8,7%). В группе ИКСИ - 6 наблюдений (26%), 5 (21,7%), 3 (13%), 2 (8,7%) соответственно. Остальные хромосомные аномалии представлены в табл. 1.

Среди нормального кариотипа превалировал женский кариотип 61% по сравнению с мужским 39%.

Частота нарушений по половым хромосомам (моносомия 45, ХО) составила в группе ЭКО и ИКСИ 2 (8,7%) и 3 (13%) соответственно. В группе ИКСИ с патозооспермией хромосомные аномалии встречались в 1,72 раз чаще, чем в группе ИКСИ без патозооспермии (p = 0.003, ОР = 1,32, 95% ДИ =1,092-2,141).

Анализ распределения частоты неразвивающейся беременности в зависимости от срока беременности показал, что большинство наблюдений приходится на срок 6-10 недель гестации при любом способе достижения беременности (ЭКО - 55%, ИКСИ- 60%, спонтанная беременность - 52%).

Корреляционный анализ для наиболее часто встречающихся трисомий (22 и 16). Между частотой трисомии 16 и сроком беременности выявлена достоверная отрицательная корреляционная зависимость (г = -0,52, р<0,05) и недостоверная - для трисомии 22 (г = -0,47, р>0.05), при этом между трисомией 22 и возрастом матери отмечена достоверная положительная корреляция (г=0,38, р<0,05).

Таблица 1

Структура хромосомных аномалий в обследуемых группах

Изучаемая группа

Хромосомная патология число наблюдений/ срок число наблюдений/ срок

процент гестации процент гестации

Трисомии

По 22 хромосоме 11/23,9 7-10 6/19 6-9

По 16 хромосоме 11/23,9 6-10 7/22 7-11

По 15 хромосоме 5/10,9 7-9 3/9,5 9-10

По 13 хромосоме - - 2/6,25 6-10

По 12 хромосоме - - 2/6,25 6-11

По 10 хромосоме - - 1/3 7-8

По 9 хромосоме 3/6,5 6-9 - -

По 8 хромосоме 1/2,2 7-8 1/3 6-7

По 7 хромосоме 1/2,2 7-8 2/6,25 6-8

По 4 хромосоме 4/8,7 6-11 - -

Сочетанная трисомия 1/2,2 7-8 2/6,25 5-6

по 16 и 21 хромосомам

Триплоидии 69ХХУ 2/4,3 6-11 2/6,25 6-9

Тетраплоидии 92, ХХХХ 2/4,3 7-9 1 /3 6-7

92, ХХХУ

Моносомия 5/10,9 6-11 2/6,25 6-9

45, ХО

У пациенток с нормальным кариотипом было проведено гистологическое и иммуногистохимическое изучение плаценты. Во всех наблюдениях контрольной группы имела место полноценная гестационная перестройка спиральных артерий матки. Для неразвивающейся беременности характерны диффузный фиброз стромы и облитерация сосудов ворсин, небольшие депозиты кальция в области базальной мембраны трофобласта и строме ворсин, а также перивор-синчатые отложения фибриноида. В децидуальной ткани встречались участки некроза и кровоизлияний, а также небольшие скопления лимфоцитов и плазматических клеток.

При иммуногистохимическом анализе на препаратах контрольной группы экспрессия РРARy отмечается только в ядрах клеток ворсинчатого (рис. 1) и вневорсинчатого трофобласта (см. рис. 1). При этом количество иммунопози-тивных клеток цитотрофобласта ворсин в 10 раз превышает таковое в структурах вневорсинчатого трофобласта (4% против 0,4%, р<0,01) и не зависит от срока гестации (6-11 недель).

Рис. 1. Уровень экспрессии PPAR (а) и индекс пролиферации (б) клеток ворсинчатого (ЦТВ) и вневорсинчатого трофобласта (ВВТ) плацент при аборте, неразвивающейся беременности и неразвивающейся беременности после ЭКО

В наблюдениях неразвивающейся беременности отмечается значительное увеличение уровня экспрессии PPARy во вневорсинчатом трофобласте (рис. 2, в) и выраженное в меньшей степени повышение в клетках цитотрофобласта ворсин (рис. 2, г). Наиболее высокие показатели отмечаются при замершей физиологической (спонтанной) беременности: уровень PPAR во вневорсинчатом трофобласте превышает контрольные цифры в 19,3 раза (р<0,01) и в цитотрофоб-ласте - на 112,5% (р<0,01). При неразвивающейся беременности в группе ЭКО также отмечаются высокие уровни PPARy, превышающие контрольные значения соответственно в 17,7 раза и на 75,8% (р<0,01). Однако они несколько меньше соответствующих показателей первой группы: на 17,3% (р<0,05) в ци-тотрофобласте и на 8,6% (р>0,05) в клетках вневорсинчатого трофобласта.

Следует отметить, что в контрольной группе процессы пролиферации выражены в большей степени в ткани вневорсинчатого трофобласта, о чем свидетельствует экспрессия Ю-67 (86,1% по сравнению с ворсинчатым трофобла-стом - 64,7% клеток) (см. рис. 2). При неразвивающейся спонтанной беременности уровень пролиферации клеток превышал показатели группы контроля: на 8,4% во вневорсинчатом трофобласте (см. рис. 2) и 5,1% в ворсинчатом цито-трофобласте (см. рис. 2) (р>0,05). При неразвивающейся беременности после ЭКО, напротив, отмечается снижение показателей пролиферации клеток: на 16,2 и 14,1% (р<0,05) в ворсинчатом и вневорсинчатом трофобласте соответственно.

Обсуждение полученных результатов.

Согласно результатам нашей работы, достоверные различия в аномальном кариотипе при индуцированной и спонтанной беременности отсутствуют. Однако стоит отметить, что при беременности после ИКСИ эти показатели несколько выше, чем в группе традиционного ЭКО.

В большинстве работ, посвященных ранним репродуктивным потерям, крайне редко выявляются трисомии по хромосомам 1 и 19, а самыми частыми оказываются трисомии 16 и 22 [12, 13], что и отмечено в нашей работе.

д

Рис. 2. Экспрессия PPARy (а-г) и Ki-67 (д, е) в клетках вневорсинчатого трофобласта и цитотрофобласта ворсин плаценты при аборте (а, б, д) и неразвивающейся беременности (в, г, е). Иммунопероксидазный метод, х400.

е

Установлено, что риск хромосомной патологии у плода положительно коррелирует с возрастом матери. В нашем исследовании выявлено достоверное влияние возраста матери на частоту трисомий 22-й хромосомы у плода.

Важным показателем, отражающим величину генетического груза в популяции, является соотношение полов. Соотношение полов у спонтанных абортов варьирует от 1,32 до 0,34. Соотношение женских и мужских кариотипов в на-

шем исследовании соотносится как 1:7:1, при выявлении аномального кариоти-па соотношение мужского и женского пола составляло 1:1, что в целом согласуется с данными, представленными ранее. Так, в частности, соотношение полов среди аномального кариотипа составило в группе традиционного ЭКО 0,8, в группе ИКСИ - 0,85 и в контрольной группе - 0,77.

Наиболее часто встречалась трисомия по аутосомам во всех трех группах, при этом их частота была примерно одинаковой. И все же анеуплоидия по половым хромосомам диагностировалась чаще при беременности после ИКСИ по сравнению с традиционным ЭКО, что согласуется с другими авторами.

Ряд исследований указывают на более высокую частоту аномалий половых хромосом у мужчин с нарушенным сперматогенезом. Установлено, что у мужчин с бесплодием при наличии нормального кариотипа и аномальном сперматогенезе увеличен риск формирования сперматозоида с анеуплоидий, что особенно актуально в отношении половых хромосом. Результаты указанных исследований согласуются с увеличением частоты аномалий половых хромосом в группе ИКСИ. В нашей работе аномалии половых хромосом в группе ИКСИ встречались в 1,5 раз чаще, чем в группе ЭКО. Однако до конца не установлено действительно ли увеличение частоты аномалий половых хромосом обусловлено непосредственно технологией ИКСИ. В предыдущих работах ряд авторов отмечают, что хромосомные аномалии чаще регистрируются при более выраженных степенях нарушения сперматогенеза, чем за счет самой процедуры ИКСИ. Мы проанализировалии группу ИКСИ в зависимости от отсутствия или наличия па-тозооспермии. В последнем случае хромосомные диагностировались в 1,72 раза чаще.

Полученные нами результаты иммуногистохимического исследования в целом согласуются с данными литературы, свидетельствующими о положительной экспрессии PPARy в клетках ворсинчатого и вневорсинчатого трофоб-ласта плаценты человека на ранних сроках гестации. В экспериментах на самках мышей установлено, что блокирование PPARy приводит к необратимой остановке процессов дифференцировки трофобласта и соответственно нарушению васкуляризации плаценты. Более того, выраженность инвазии цитотрофоб-ласта обратно пропорциональна степени активации PPARy, данный эффект носит дозозависимый характер. При инактивации PPARy и PPARb/d у самок мышей наблюдалось прерывание беременности на сроках, когда плацента начинает выполнять метаболическую функцию. В свою очередь, стимуляция PPARy блокирует инвазию трофобласта и приводит к нарушению процессов диффе-ренцировки ворсинчатого трофобласта.

Таким образом, установлено, что при неразвивающейся беременности после ВРТ частота хромосомных аномалий достоверно не превышает аналогичный показатель при самопроизвольной беременности. Однако после ИКСИ, выполненной в связи выраженным нарушением сперматогенеза. частота аномалий половых хромосом при неразвивающейся индуцированной беременности выше, чем при спонтанной беременности и после процедуры ЭКО. Наличие 2 и более неразвивающихся беременностей после ВРТ диктует необходимость проведе-

ния предимплантационной диагностики с помощью FISH метода, что может снизить риска неразвивающейся беременности в дальнейшем. Установлено, что экспрессия PPAR в клетках трофобласта у пациенток с неразвивающейся беременностью и нормальным кариотипом эмбриона выше по сравнению с прогрессирующей беременностью, что свидетельствует о нарушении соотношения между процессами пролиферации и дифференцировки. Тем не менее отсутствие достоверной разницы в экспрессии маркеров пролиферации в клетках трофоб-ласта при индуцированной и самопроизвольной беременности свидетельствует об отсутствии специфических нарушений в процессах имплантации и плацен-тации после использования ВРТ.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Акушерство: Национальное руководство / Под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.

[2] Радзинский В.Е., Оразмурадов А.А. Ранние сроки беременности // Status praesens. -2009. - С. 136-151.

[3] Радзинский В.Е., Ордиянц И.М., Оразмурадов А.А. Женская консультация. - 3-е изд. - М.: ГЭОТАР-МЕДИА, 2009.

[4] Репродуктивное здоровье: Учеб. пособ. / Под ред. В.Е. Радзинского. - М.: РУДН, 2011.

[5] Assisted Reproductive Technology Success Rates National Summary and Fertility Clinic Reports, 2008

[6] Fournier T., Thùrond P., Handschuh K., Tsatsaris V., Evain-Brion D. PPARgamma and early human placental development // Curr Med Chem. - 2008. - № 15(28). - С. 3011-24.

[7] Bensinger, S.J., Tontonoz P. Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors // Nature. - 2008. - № 454. - С. 470-477

[8] Schaiff W.T., Barak Y., Sadovsky Y. The pleiotropic function of PPAR gamma in the placenta // Mol Cell Endocrinol. - 2006. - № 249. - С. 10-15.

[9] Bettio D.A. V., Levi Setti P.E. Chromosomal abnormalities in miscarriages after different assisted reproduction precedures // Placenta. - 2008. - № 29. - S. 126-128.

[10] Kushnir V.A., Frattarelli J.L. Aneuploidy in abortuses following IVF and ICSI // J Assist Reprod Genet. - 2009. - № 26(2-3). - С. 93-97.

[11] Martnez M.C., Mndez C., Ferro J., Nicols M., Serra V., Landeras J. Cytogenetic analysis of early nonviable pregnancies after assisted reproduction treatment // Fertil Steril. -2010. - № 93(1). - P. 289-292.

ANALYSES OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES AND PLACENTA MORPHOLOGY IN WOMEN WITH PREGNANCY LOSS AFTER ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES

N.V. Aleksandrova, Е.А.Dubova, О.А.Doronina, A.H.Shchegolev

Federal State Budget Institution "Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology" Ministry of Healthcare and Social Development of the Russian Federation 4, Oparina str., Moscow, 117997, Russia

We evaluated cytogenetic and immunohistochemistry results of first trimester pregnancy loss after assisted reproductive treatment (ART). The data were compared to spontaneous conception. The risk of chromosomal abnormalities in ART group was the same as in spontaneous pregnancy group. Histological examination of abortuses and normal karyotype of embryos revealed equal transformations of endometrium and chorions in pregnancy loss after IVF and spontaneous conception. But level of PPAR expression and Ki-67 in villous and extravillous trophoblast in cases of pregnancy loss (independently on the way of conception) is higher in comparison with spontaneous progressive pregnancy.

Key words: pregnancy loss, trophoblast.