Метод изучения влияния новых соединений на активность натрий/водородного обменника

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. При анализе заболеваемости с временной утратой трудоспособности у операторов и почтальонов выявлены высокие показатели числа дней нетрудоспособности с тенденцией нарастания у более стажи-рованных работниц. В группах женщин со стажем работы до 10 лет эти показатели соответствуют градации «выше среднего», в группах со стажем работы более 10 лет — градации «высокие».

2. Существует профессиональная обусловленность ряда хронических заболеваний, по данным углубленного медицинского осмотра. В группе операторов наиболее высокая степень профессиональной обусловленности отмечалась у болезней органов зрения (очень высокая), болезней системы кровообращения (высокая). В группе почтальонов наибольшая степень профессиональной обусловленности отмечалась у болезней костно-мышечной системы (высокая).

3. У женщин работниц почтовой связи выявлена высокая степень реализации профессионального риска с увеличением стажа работы: у операторов — болезней органов зрения в 1,7 раза, сердечно-сосудистых заболеваний в 1,6 раза; у почтальонов — болезней костно-мышечной системы в 1,9 раза, болезней системы кровообращения в 1,3 раза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Измеров И. Ф., Денисов Э. И., Молодкина Н. И., Родионова Г. К. // Медицина труда и промышленная экология. — 2001. — № 12. — С. 1—7.

2. Малькова И. Ю., Меркулова Л. И., Ушакова И. Н. // Гигиена окружающей и промышленной среды. — 2002. — № 4. — С. 71—73.

3. Никитина В. И., Захарченко М. Г., Вишнякова Е. А. // Медицина труда и промышленная экология. — 2002. — № 9. — С. 27—31.

4. Радионова Г. К., Жаворонок Л. Г. Профессиональный риск здоровья работников: Руководство под ред. Н. Ф. Из-мерова, Э. И. Денисова — М.: Тровант, 2003. — С. 374—387.

5. Руководство Р 2.2.2006 — 05. Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса.

6. СаН ПиН 2.2.2/ 2.4.1340-03 Гигиенические требования к персональным электронно-вычислительным машинам и организации работы.

7. Файфутдинова Л. М. // Медицина труда и промышленная экология. — 2004. — № 34. — С. 37—54.

Контактная информация

Гаврикова Светлана Юрьевна — аспирант кафедры гигиены и экологии ВГМУ, врач функциональной диагностики МУЗ «Городская клиническая больница № 1 им. С. З. Фишера» г. Волжского, e-mail: svetlanagavrikova@yandex.ru

УДК 612.111.7:54-45:616-005.4

МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА АКТИВНОСТЬ НАТРИЙ/ВОДОРОДНОГО ОБМЕННИКА

Н. A. Гурова, A. A. Спасов, A. С. Питерсен

Кафедра фармакологии ВолгГМУ

Описан метод изучения активности Na+/H+-обменника на тромбоцитах кролика. Показано, что амилорид дозозависимо ингибирует Na+ZH+обмен. Рассчитана величина IC50. Данный метод может быть использован для скрининга новых противоишемических соединений.

Ключевые слова: №+/И+-обменник, тромбоциты, амилорид.

METHOD OF STUDYING THE EFFECT OF NEW COMPOUNDS ON THE ACTIVITY

OF THE SODIUM / HYDROGEN EXCHANGER

N. A. Gurova, A. A. Spasov, A. S. Pitersen

A method of investigating Na+/H+ exchange activity on rabbit platelets was described. It was shown that amiloride inhibits the Na+/H+ exchanger, and IC50 was calculated. This method can be used for screening of new antiischemic compounds. Key words: the Na+/H+ exchanger, platelets, amiloride.

В основе генеза повреждения кардиомиоцитов целого ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы лежит закисление внутриклеточной среды и развитие «кальциевого парадокса» [4, 5]. Эти изменения, обусловленные различными этиологическими фактора-

ми, приобретают важное патогенетическое значение и нередко являются определяющими для прогноза заболевания. В связи с этим естественным является стремление оказать корригирующее влияние на нарушенный метаболизм кардиомиоцитов [1—3].

70

Выпуск 2 (38). 2011

Известно, что pH внутриклеточной среды регулируется целым рядом ионных обменников, таких как Na+/ Н+-обменник, Na+/НCO3-симnорт и другие [5]. В частности, Na+/H+ обменники (NHE) составляют группу интегральных мембранных белков, экспрессируемых во всех тканях организма, которые осуществляют трансмембранный обмен ионов Na+ на ионы Н+ [4—6]. В настоящее время девять различных типов Na+/H+ белков-обменников были клонированы из тканей млекопитающих (NHE-1-NHE-9) [6, 7, 9]. Они различаются по аминокислотному составу, тканевой специфичности, механизмам внутриклеточной регуляции.

Одним из сарколеммных белков, вовлеченных в регулирование внутриклеточного pH в кардиомиоците, является NHE-1. Эта изоформа локализуется преимущественно в плазматической мембране миокарда, а также в тромбоцитах и эритроцитах [7, 9]. При физиологическом pH он имеет низкую активность. При возникновении внутриклеточного ацидоза во время ишемии происходит накопление внутриклеточных протонов, которые выводятся из клеток через сарколеммный NHE-1 в обмен на вход ионов Na+. Возрастание внутриклеточного содержания ионов Na+, в свою очередь, активирует 3Na+/Ca2+-реверсионный oбмен через сарколемму, инициируя вход ионов Са2+ в кардиомиоциты. Возникает «Са2+-перегрузка» [4, 5, 6, 7, 9]. Реперфузия усугубляет повреждение, возникшее во время ишемии. Во время реперфузии концентрация внеклеточных протонов быстро снижается, формируется большой градиент вне/внутриклеточных протонов, что ведет к росту уровня кальция и реперфузионным аритмиям, контрактурам кардиомиоцитов, некрозу.

Уменьшение повреждающего действия чрезмерной активации NHE-1 обеспечит кардиопротекторное действие его ингибиторов. Первоначально это было подтверждено карциопротекторными эффектами неспецифического ингибитора Na+/H+ обмена амилорида и его производными, а впоследствии с помощью новых гуанидиновых производных, таких как карипорид, сабипорид, KR-32511, KR-32570 и KR-33028 [4, 5, 7]. Результаты экспериментальных исследований этих соединений позволяют предположить, что их использование в клинике может быть новой стратегией защиты миокарда от повреждений, вызванных ишемией и реперфузией [5, 6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Опробирование метода изучения влияния соединений на активность NHE-1 на тромбоцитах кролика.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Образцы крови забирали из краевой вены уха кролика в пробирку, содержащую 3,8 % цитрата натрия в соотношении 1:10. Для получения плазмы, богатой тромбоцитами (ПБогТ), кровь центрифугировали при 1000 оборотах в минуту в течение 12 минут. Для получения плазмы, бедной тромбоцитами (ПБедТ), остаток образца крови центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 20 минут.

В основу метода были положены подходы, предложенные Rosskopf D., et al. (1991) [10] и Kusumoto K. (2002) [8], основанные на изменении светопропускания при изменении формы тромбоцита.

В контрольной серии экспериментов к 200 мкл ПБогТ для снижения внутриклеточного рН добавляли 600 мкл раствора пропионата натрия (в ммоль/л: Na пропионат 135, HEPES 20, CaCI2 1, MgCI2 1, глюкоза 10; pH 6,7; t = 37 оС). При этом происходит активация NHE-1, увеличение притока натрия, связанное с выделением цитозольного H+, ведущее к отеку (сферуля-ции) тромбоцита в результате аккумуляции воды в цитоплазме. При этом наблюдается облегчение светопропускания. Для контроля изменения светопропускания в условиях физиологических рН использовали ПБедТ.

Изменение формы тромбоцитов регистрировали по изменению уровня светопропускания с помощью лазерного агрегометра «БИОЛА-220 ЛА», Россия.

Для подтверждения правильности методического подхода нами был изучен амилорид (SIGMA), известный неселективный ингибитор NHE-1, в диапазоне концентраций 10-7—10-5 моль/л. Препарат (10 мкл) добавляли в кювету с ПБогТ (200 мкл) за 3—5 минут до добавления раствора пропионата натрия, инкубировали при температуре 37 оС и постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (1000 оборотов в минуту).

Величина IC50 амилорида была рассчитана с помощью регрессионного анализа зависимости между log концентрации и активностью обменника. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. (StatSoft, США) и Excel 2007 (MS Office XP, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В контрольной серии экспериментов при добавлении к 600 мкл ПБедТ изменение светопропускания наблюдалось в среднем на 30—40 % от исходного уровня калибровки. При добавлении 600 мкл буфера, содержащего натрия пропионат, подобные изменения достигали 60—70 %. При добавлении Na-пропионатного буфера к ПБогТ, предварительно инкубированной с амилоридом, происходило снижение уровня светопропускания по отношению к исследованиям только с буфером. Это свидетельствует о том, что амилорид ингибирует NHE и уменьшает вероятность сферуляции тромбоцитов.

В ходе проведенного исследования было показано дозозависимое угнетение активности NHE при использовании амилорида в диапазоне концентраций 10-7—10-5 моль/л. Рассчитана величина IC50, которая составила 1,23*10-6 моль/л. Регрессионное уравнение и величина парного коэффициента корреляции (R2) представлены на рис. Полученные данные сопоставимы с литературными данными (база данных EMBL-EBI, 2010).

Выпуск 2 (38). 2011

71

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

Lg концентрации

Рис. Расчет величины IC50 амилорида по влиянию на активность Na+Л-Г-обменника тромбоцитов кролика

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При активации NHE-1 с помощью натрия пропионата происходит сферуляция тромбоцитов, что регистрируется по изменению светопропускания. Соединение амилорид ингибирует активность данного обменника и препятствует изменению формы тромбоцитов. Предложенная методика может быть использована для скрининга новых противоишемических соединений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Васильев А. П., Стрельцова Я. Я., Сенаторов Ю. Я. // Клиническая медицина. — 2004. — № 4. — С. 59—62.

2. Перфилова В. Н., Тюренков И. Н. // Вестник ВолГМУ. — 2005. — Т. 1, № 13. — С. 30—33.

3. Перфилова В. Н., Тюренков И. Н. // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2005. — № 5. — С. 68—71.

4. Писаренко О. И. // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. — 2004. — № 9 (90). — C. 1103—1110.

5. Писаренко О. И. // Кардиология. — 2005. — № 9. — C. 62—72.

6. Fliegel L. // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. — 2008. — № 44. — Р 228—237.

7. Kim J., et al. // European Journal of Pharmacology. — 2007. — № 567. — Р 131—138.

8. Kusumoto K., et al. // British Journal of Pharmacology. — 2002. — № 135. — Р 1995—2003.

9. Mackenzie E., Fliegel M., Fliegel L. // Can. J. Physiol. Pharmacol. — 2006. — № 8. — Р 1081—1091.

10. Rosskopf D., et. al. // Journal of Hypertension. — 1991. — Vol. 9. — Р 231—238.

Контактная информация

Спасов Александр Алексеевич — заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, д. м. н., профессор, зав. кафедрой фармакологии, проректор ВолгГМУ по учебно-воспитательной работе с зарубежными студентами и международной деятельности, (8442) 94-24-23, 97-15-34, farm@vlpost.ru

УДК 615.21:547.466.3+616.831-005.4-092.9

ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ОСТРОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

Е. В. Волотова, Д. В. Куркин, И. Н. Тюренков, А. А. Литвинов

Кафедра фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ

При острой ишемии головного мозга у крыс, вызванной двухсторонней окклюзией общих сонных артерий, новое производное гамма-аминомасляной кислоты — соединение РГПУ-189 — оказывало выраженное церебропротектив-ное действие, сопоставимое с кавинтоном и превосходящее фенибут, пирацетам, аминалон.

Ключевые слова: ишемия головного мозга, производные гамма-аминомасляной кислоты, церепротекция, фенибут, кавинтон, пирацетам, аминалон.

CEREBROPROTECTIVE EFFECTS OF DERIVATIVES OF GABA IN ACUTE ISCHEMIA OF RATS BRAIN

E. V. Volotova, D. V. Kurkin, I. N. Tyurenkov, A. A. Litvinov

A new derivative of GABA, RGPU-189 compound, has a marked cerebroprotective effect comparable to cavinton and superior to phenibut, piracetam, aminalon in acute cerebral ischemia induced in rats by 2-sided occlusion of common carotid arteries.

Key words: cerebral ischemia, GABA derivatives, cerebroprotective, phenibut, cavinton, piracetam, aminalon.

Среди причин преждевременной смертности веду- ства, среди которых доминирующее положение принад-щие позиции занимают цереброваскулярные расстрой- лежит ишемическим поражениям головного мозга [2, 3].

72

Выпуск 2 (38). 2011