ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ БИБЛИОТЕКИ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Способ определения субпопуляции клеток, имеющей биологический признак, причем способ включает:
(a) обеспечение библиотеки секвенирования одиночных клеток,
причем библиотека секвенирования содержит множество модифицированных целевых нуклеиновых кислот,
при этом модифицированные целевые нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере одну индексную последовательность;
(b) анализ библиотеки секвенирования с помощью прицельного секвенирования для определения индексных последовательностей, которые присутствуют на той же модифицированной целевой нуклеиновой кислоте, что и биологический признак,
причем индексные последовательности, связанные с биологическим признаком, представляют собой маркерные индексные последовательности;
(c) изменение библиотеки секвенирования для получения подбиблиотеки,
при этом подбиблиотека содержит увеличенное представительство модифицированных целевых нуклеиновых кислот, содержащих маркерные индексные последовательности, по сравнению с другими модифицированными целевыми нуклеиновыми кислотами, присутствующими в библиотеке секвенирования, которые не содержат маркерную индексную последовательность;
(d) определение нуклеотидной последовательности модифицированных целевых нуклеиновых кислот, содержащих маркерную индексную последовательность.
2. Способ по п. 1, в котором библиотека секвенирования одиночных клеток содержит нуклеиновые кислоты из множества образцов.
3. Способ по п. 2, в котором множество образцов содержит (i) образцы одной и той же ткани, полученной из разных организмов, (ii) образцы разных тканей из одного организма или (iii) образцы разных тканей из разных организмов.
4. Способ по п. 1, в котором на стадии (b) определяют более одной маркерной индексной последовательности.
5. Способ по п. 1, в котором комбинаторная библиотека секвенирования одиночных клеток содержит целевые нуклеиновые кислоты, представляющие весь геном клеток или ядер или подгруппу генома.
6. Способ по п. 5, в котором подгруппа генома содержит целевые нуклеиновые кислоты, представляющие транскриптом, доступный хроматин, ДНК, конформационное состояние или белки клеток или ядер.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором изменение предусматривает обогащение модифицированных целевых нуклеиновых кислот, содержащих маркерные индексные последовательности.
8. Способ по п. 7, в котором обогащение включает способ на основе гибридизации.
9. Способ по п. 8, в котором способ на основе гибридизации включает гибридный захват, амплификацию или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR) (d)Cas9.
10. Способ по любому из п. 9, в котором изменение предусматривает истощение модифицированных целевых нуклеиновых кислот, которые не содержат маркерных индексных последовательностей.
11. Способ по п. 10, в котором истощение предусматривает способ на основе гибридизации.
12. Способ по п. 11, в котором способ на основе гибридизации включает гибридный захват, амплификацию или CRISPR (d)Cas9.
13. Способ по п. 1, в котором биологический признак включает нуклеотидную последовательность, указывающую на видовой тип.
14. Способ по п. 13, в котором видовой тип включает вид клетки.
15. Способ по п. 14, в котором биологический признак включает нуклеотиды субъединицы 16s, субъединицы 18s или нетранскрипционную область ITS.
16. Способ по п. 1, в котором биологический признак включает нуклеотидную последовательность, указывающую на класс клеток.
17. Способ по п. 16, в котором класс клеток имеет паттерн экспрессии, эпигенетический паттерн, рекомбинацию иммунных генов или их комбинацию.
18. Способ по п. 17, в котором эпигенетический паттерн содержит метку метилирования, паттерн метилирования, доступную ДНК или их комбинацию.
19. Способ по п. 1, в котором биологический признак включает нуклеотидную последовательность, указывающую на состояние или риск заболевания.
20. Способ по п. 19, в котором состояние или риск заболевания включает вариантную последовательность ДНК, вариантный паттерн экспрессии или вариантный эпигенетический паттерн, который коррелирует с заболеванием.
21. Способ по п. 20, в котором вариантная последовательность ДНК содержит по меньшей мере один однонуклеотидный полиморфизм.
22. Способ по п. 21, в котором вариантный паттерн экспрессии предусматривает экспрессию биомаркера.
23. Способ по п. 22, в котором вариантный эпигенетический паттерн включает метку метилирования, паттерн метилирования.
24. Способ по п. 1, в котором модифицированные целевые нуклеиновые кислоты содержат связный индекс по меньшей мере 2 специфических для компартмента индексных последовательностей, причем между 2 индексными последовательностями имеется не более 6 нуклеотидов.
25. Способ по п. 24, в котором связный индекс присутствует на каждом конце модифицированных целевых нуклеиновых кислот.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором длина связного индекса составляет по меньшей мере 55 нуклеотидов.
27. Способ по любому из пп. 24-26, в котором на модифицированных целевых нуклеиновых кислотах присутствует одна копия связного индекса.
28. Способ по любому из пп. 24-26, в котором на модифицированных целевых нуклеиновых кислотах присутствуют две копии связного индекса.
29. Способ по п. 1, в котором множество модифицированных целевых нуклеиновых кислот из библиотеки секвенирования представляет по меньшей мере 100 000 различных клеток или ядер.
30. Способ по п. 1, в котором обеспечение комбинаторной библиотеки секвенирования одиночных клеток включает:
обработку образца для получения библиотеки, причем образец представляет собой метагеномический образец, полученный из организма.
31. Способ по п. 30, в котором организм представляет собой млекопитающее.
32. Способ по п. 30 или 31, в котором метагеномический образец содержит ткань, предположительно содержащую симбиотический или патогенный микроорганизм.
33. Способ по п. 32, в котором микроорганизм является прокариотическим или эукариотическим.
34. Способ по любому из пп. 30, 31 или 33, в котором метагеномический образец содержит образец микробиома.
35. Способ по п. 1, в котором обеспечение комбинаторной библиотеки секвенирования одиночных клеток включает обработку образца для обеспечения библиотеки, причем образец получен из организма.
36. Способ по п. 35, в котором организм представляет собой млекопитающее.
37. Способ по п. 35, в котором первичный источник нуклеиновых кислот из образца содержит РНК.
38. Способ по п. 37, в котором РНК предусматривает мРНК.
39. Способ по п. 35, в котором первичный источник нуклеиновых кислот из образца содержит ДНК.
40. Способ по п. 39, в котором ДНК предусматривает геномную ДНК всей клетки.
41. Способ по п. 40, в котором геномная ДНК всей клетки содержит нуклеосомы.
42. Способ по п. 35, в котором первичный источник нуклеиновых кислот из образца содержит бесклеточную ДНК.
43. Способ по п. 35, в котором образец содержит раковые клетки.
44. Способ по п. 1, в котором обеспечение комбинаторной библиотеки секвенирования одиночных клеток включает получение библиотеки методом комбинаторного индексирования одиночных клеток, выбранным из секвенирования транскриптома одиночных ядер, секвенирования транскриптома одиночных клеток, секвенирования транскриптома одиночных клеток и хроматина, доступного транспозонам, полногеномного секвенирования одиночных ядер, секвенирования одиночных ядер хроматина, доступного транспозонам, секвенирования эпитопа одиночных клеток, sci-HiC и sci-MET.
45. Способ по п. 44, в котором обеспечение включает обеспечение из каждой клетки или ядра двух разных комбинаторных библиотек секвенирования одиночных клеток.
46. Способ по п. 45, в котором две разные комбинаторные библиотеки секвенирования одиночных клеток выбраны из метода комбинаторного индексирования одиночных клеток, выбранного из секвенирования транскриптома одиночных ядер, секвенирования транскриптома одиночных клеток, секвенирования транскриптома одиночных клеток и хроматина, доступного транспозонам, полногеномного секвенирования одиночных ядер, секвенирования одиночных ядер хроматина, доступного транспозонам, sci-HiC и sci-MET.
47. Способ по п. 1, дополнительно включающий выполнение процедуры секвенирования для определения нуклеотидных последовательностей для нуклеиновых кислот.
48. Способ получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или клеток, причем способ включает:
(a) обеспечение множества ядер или клеток, причем ядра или клетки содержат нуклеосомы;
(b) приведение множества ядер или клеток в контакт с транспосомным комплексом, содержащим транспозазу и универсальную последовательность, причем приведение в контакт дополнительно включает условия, подходящие для встраивания универсальной последовательности в нуклеиновые кислоты ДНК, что приводит к образованию двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих универсальную последовательность;
(d) распределение множества ядер или клеток в первое множество компартментов,
причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток;
(e) процессинг молекул ДНК в каждой подгруппе ядер или клеток для создания индексированных ядер или клеток,
причем процессинг предусматривает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой подгруппе ядер или клеток, индексной последовательности, специфичной для первого компартмента, с получением индексированных нуклеиновых кислот, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
при этом процессинг предусматривает лигирование, достройку праймера, гибридизацию, амплификацию или их комбинацию; и
(g) объединение индексированных ядер или клеток для получения объединенных индексированных ядер или клеток.
49. Способ по п. 48, в котором обеспечение включает обеспечение множества ядер или клеток во множестве компартментов, причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток, причем приведение в контакт предусматривает приведение каждого компартмента в контакт с транспосомным комплексом, и при этом способ дополнительно включает объединение ядер или клеток после приведения в контакт с образованием объединенных ядер или клеток.
50. Способ по п. 48, в котором обеспечение включает подвергание ядер химической обработке с образованием ядер с истощенными нуклеосомами и сохранением при этом целостности выделенных ядер.
51. Способ по п. 48, дополнительно включающий:
распределение объединенных индексированных ядер или клеток, содержащих индексированные ядра или клетки, во второе множество компартментов,
причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток;
процессинг молекул ДНК в каждой подгруппе ядер или клеток для получения ядер или клеток с двойным индексированием,
причем процессинг предусматривает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой подгруппе ядер или клеток, индексной последовательности, специфичной для второго компартмента, с получением нуклеиновых кислот с двойным индексированием, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
при этом процессинг предусматривает лигирование, достройку праймера, гибридизацию, амплификацию или их комбинацию;
объединение ядер или клеток с двойным индексированием для получения объединенных ядер или клеток с двойным индексированием.
52. Способ по п. 51, дополнительно включающий:
распределение объединенных ядер или клеток, содержащих ядра или клетки с двойным индексированием, в третье множество компартментов,
причем каждый компартмент содержит подгруппу ядер или клеток;
процессинг молекул ДНК в каждой подгруппе ядер или клеток с образованием ядер или клеток с тройным индексированием,
причем процессинг предусматривает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой подгруппе ядер или клеток, индексной последовательности, специфичной для третьего компартмента, с получением нуклеиновых кислот с тройным индексированием, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
при этом процессинг предусматривает лигирование, достройку праймера, гибридизацию, амплификацию или их комбинацию;
объединение ядер или клеток с тройным индексированием для получения объединенных ядер или клеток с тройным индексированием.
53. Способ по любому из пп. 48, 51 или 52, в котором стадия распределения включает разведение.
54. Способ по любому из пп. 48, 51 или 52, в котором компартмент содержит лунку, микрожидкостный компартмент или каплю.
55. Способ по п. 48, в котором компартменты из первого множества компартментов содержат от 50 до 100 000 000 ядер или клеток.
56. Способ по п. 51, в котором компартменты из второго множества компартментов содержат от 50 до 100 000 000 ядер или клеток.
57. Способ по п. 52, в котором компартменты из третьего множества компартментов содержат от 50 до 100 000 000 ядер или клеток.
58. Способ по п. 48, в котором приведение в контакт включает приведение каждой подгруппы в контакт с двумя транспосомными комплексами, причем один транспосомный комплекс содержит первую транспозазу, содержащую первую универсальную последовательность, а второй транспосомный комплекс содержит вторую транспозазу, содержащую вторую универсальную последовательность, при этом приведение в контакт дополнительно включает условия, подходящие для встраивания первой универсальной последовательности и второй универсальной последовательности в нуклеиновые кислоты ДНК, приводящего к образованию двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих первую и вторую универсальные последовательности.
59. Способ по любому из пп. 48, 49 или 50, в котором добавление специфичной для компартмента индексной последовательности включает двухстадийный процесс добавления к нуклеиновым кислотам нуклеотидной последовательности, содержащей универсальную последовательность, и последующее добавление специфичной для компартмента индексной последовательности к нуклеиновым кислотам.
60. Способ по п. 48, дополнительно включающий получение индексированных нуклеиновых кислот из объединенных индексированных ядер или клеток с образованием, таким образом, библиотеки секвенирования из множества ядер или клеток.
61. Способ по п. 49, дополнительно включающий получение нуклеиновых кислот с двойным индексированием из объединенных ядер или клеток с двойным индексированием с образованием, таким образом, библиотеки секвенирования из множества ядер или клеток.
62. Способ по п. 50, дополнительно включающий получение нуклеиновых кислот с тройным индексированием из объединенных ядер или клеток с тройным индексированием с образованием, таким образом, библиотеки секвенирования из множества ядер или клеток.
63. Способ по любому из пп. 60-62, дополнительно включающий:
обеспечение поверхности, содержащей множество сайтов амплификации,
причем сайты амплификации содержат по меньшей мере две популяции присоединенных одноцепочечных захватных олигонуклеотидов, имеющих свободный 3’-конец, и
приведение поверхности, содержащей сайты амплификации, в контакт с фрагментами нуклеиновой кислоты, содержащими одну, две или три индексных последовательности, в условиях, подходящих для получения множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельного фрагмента, содержащего множество индексов.
64. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, включающий:
(a) обеспечение множества образцов, причем каждый образец содержит множество клеток или ядер, при этом множество клеток или ядер каждого образца находится в одном или более отдельных компартментах;
(b) приведение множества ядер или клеток в контакт с транспосомным комплексом, содержащим транспозазу и универсальную последовательность, и при условии, что транспосомный комплекс не содержит индексной последовательности, причем приведение в контакт дополнительно предусматривает условия, подходящие для встраивания универсальной последовательности в нуклеиновые кислоты;
(c) добавление первой индексной последовательности к нуклеиновым кислотам каждого отдельного компартмента;
(d) объединение клеток или ядер разделенных компартментов;
(e) распределение клеток или ядер во множество компартментов; и
(f) добавление второй индексной последовательности к нуклеиновым кислотам множества компартментов.
65. Способ по п. 64, в котором первую индексную последовательность, вторую индексную последовательность или их комбинацию добавляют путем лигирования, достройки праймера, гибридизации, амплификации или их комбинации.
66. Способ по п. 64 или 65, в котором стадии (d)-(e) повторяют для добавления третьей или более индексных последовательностей к клеткам или ядрам множества компартментов.
67. Способ по любому из пп. 64 или 65, в котором множество ядер или клеток зафиксированы.
68. Способ по любому из пп. 64 или 65, дополнительно включающий амплификацию индексированных нуклеиновых кислот после стадии (c) или стадии (f).
69. Способ по любому из пп. 64 или 65, дополнительно включающий стадию (g) объединения нуклеиновых кислот из множества компартментов и определения последовательности нуклеиновых кислот.
70. Способ по п. 64, дополнительно включающий выполнение процедуры секвенирования для определения нуклеотидных последовательностей для нуклеиновых кислот.
71. Способ секвенирования одиночной клетки или ядра, включающий:
(a) уникальное индексирование нуклеиновых кислот каждой клетки или ядер в образце с образованием таким образом индексированной библиотеки для каждой клетки или ядра;
(b) использование биологического признака для определения одной или более интересующих индексированных библиотек со стадии (a);
(c) обогащение интересующих индексированных библиотек со стадии (b) с образованием таким образом обогащенной библиотеки; и
(d) секвенирование обогащенной библиотеки со стадии (c).
72. Способ по п. 71, в котором библиотеки происходят от ДНК, РНК или белка клеток или ядер.
73. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором биологический признак представляет собой ДНК, РНК или белок или их комбинацию.
74. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором уникальная индексация на стадии (а) включает связывание по меньшей мере двух различных индексов с нуклеиновыми кислотами клеток или ядер.
75. Способ по п. 74, в котором по меньшей мере два различных индекса представляют собой связный индекс.
76. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором обогащенная библиотека получена посредством позитивного обогащения.
77. Способ по п. 76, в котором позитивное обогащение предусматривает амплификацию.
78. Способ по п. 76, в котором позитивное обогащение предусматривает захватный агент.
79. Способ по п. 76, в котором позитивное обогащение предусматривает твердую подложку.
80. Способ по п. 76, в котором обогащенная библиотека получена посредством негативного обогащения.
81. Способ по любому из пп. 71 или 72, в котором определение интересующей индексированной библиотеки на стадии (c) предусматривает секвенирование индексов.
82. Способ секвенирования одиночной клетки или ядра, включающий:
(a) обеспечение образца, причем образец содержит множество ядер или клеток;
(b) связывание первого индекса на каждом ядре или клетке в образце;
(c) разделение образца на множество компартментов;
(d) связывание второго индекса на каждом ядре или клетке из множества компартментов;
(e) объединение множества компартментов;
(f) секвенирование объединенных компартментов;
(g) определение комбинации первого и второго индексов, связанных с биологическим признаком;
(h) обогащение биологического признака из объединенных компартментов с использованием идентифицированной комбинации первого и второго индексов со стадии (g).
83. Набор, содержащий:
(a) множество транспосомных комплексов, причем каждый транспосомный комплекс содержит транспозазу и транспозонную последовательность, при этом транспозонная последовательность не индексирована;
(b) первое множество индексных олигонуклеотидов, причем первое множество индексных олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды, имеющие по меньшей мере две разные последовательности; и
(c) фермент лигазу для применения с индексными олигонуклеотидами.
84. Набор по п. 83, дополнительно содержащий второе множество индексных олигонуклеотидов, причем второе множество индексных олигонуклеотидов содержит олигонуклеотид, имеющий последовательности, отличающиеся от первого множества индексных олигонуклеотидов.
85. Набор по п. 83, дополнительно содержащий третье множество индексных олигонуклеотидов, причем третье множество индексных олигонуклеотидов содержит олигонуклеотид, имеющий последовательности, отличающиеся от первого множества индексных олигонуклеотидов и второго множества индексных олигонуклеотидов.