ДВАЖДЫ АЦИЛИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ GLP-1
DOUBLE-ACYLATED GLP-1 DERIVATIVES

Область изобретения
Изобретение относится к производным глюкагон-подобного пептида 1 (GLP-1) и к его применению в фармацевтических целях, а именно к дважды ацилированным производным GLP-1, ацилированным в позициях 26 и 37, а также к их применению в фармацевтических целях.
Включение списка последовательностей посредством ссылки
Список последовательностей, озаглавленный как «Список последовательностей», является 584-байтным, созданным 17 ноября 2010 и включенным в данный документе посредством ссылки.
Уровень техники
26,34
Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p.1664-669 раскрывает производные GLP-1(7-37), которые дважды ацилированы на K - см. Таблицу 1.
26,34
WO 98/08871 раскрывает ряд производных GLP-1, включая некоторые дважды ацилированные на K, см. примеры 3, 7, 17, 24, 32, 33 и 36. Лираглутид, моноацилированное производное GLP-1 для введения один раз в день, которое выпущено на рынок в 2009 году Novo Nordisk A/S, также описано в WO 98/08871 (Пример 37).
26,37
WO 99/43706 раскрывает ряд моноацилированных и дважды ацилированных производных GLP-1, в том числе некоторые производные K (см. с.148-178).
37
WO 2005/027978 раскрывает ряд производных GLP-1, включая некоторые дважды ацилированные на одном и том же остатке, K, см. Примеры 8 и 9.
31
34
WO 2009/030738 раскрывает ряд производных GLP-1, в том числе один дважды ацилированный на K, Dap, см. Пример 37.
12,27
Journal of Controlled Release (2010), vol. 144, p.10-16 предусматривает ацилированные аналоги эксендина-4 и раскрывает, в частности, дважды ацилированный эксендин-4 (K-diLUA-Exendin-4) (LUA представляет собой лауриновую кислоту, С12).
WO 06/097537 раскрывает ряд производных GLP-1, включая семаглутид (Пример 4), моноацилированное производное GLP-1 для введения раз в неделю, который находится в стадии разработки в Novo Nordisk A/S.
Angewandte Chemie International Edition 2008, vol. 47, p.3196-3201 докладывает об открытии и описании класса производных 4-(p-йодофенил)масляной кислоты, которые предположительно демонстрируют стабильное нековалентное связывающее взаимодействие и с мышиным сывороточным альбумином (MSA), и с человеческим сывороточным альбумином (HSA).
Сущность изобретения
Изобретение относится к производным пептидов GLP-1.
Производные ацилированы на нативном лизине в позиции 26, а также на лизине, заменяющем нативный глицин в позиции 37. Боковые цепи являются альбумин-связывающими группировками. Они включают пролонгирующую группировку, предпочтительно выбранную среди двухосновных жирных кислот и жирных кислот с дистальной фенильной, фенокси- или тиофеновой группой, все могут быть замещенными. Карбоксильная группа жирной кислоты или двухосновной жирной кислоты ацилирована, возможно через линкер, на остатке лизина пептида GLP-1, предпочтительно на его эпсилон-аминогруппе. Пептид GLP-1 может быть аналогом GLP-1(7-37) (SEQ ID №1) с общим количеством до десяти различий аминокислот в сравнении с GLP-1(7-37), например, с одним или более чем одним добавлением, одним или более чем одним удалением, и/или одной или более чем одной заменой.
37
26
26
37
Более конкретно, изобретение относится к производному аналога GLP-1, который содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обоназначен как K, а второй остаток K обозначен как K; где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где каждая альбумин-связывающая группировка включает пролонгирующую группировку, выбранную среди Соединения (далее Соед.) 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; при условии, что когда пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 1, альбумин-связывающая группировка дополнительно содержит линкер формулы Соед. 5:
Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5; или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду или сложному эфиру.
Изобретение относится также к такому производному для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в лечении и/или профилактике всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания.
Изобретение относится также к промежуточным продуктам в форме пептидов GLP-1 и боковых цепей, которые являются релевантными для изготовления некоторых пептидов GLP-1 и производных изобретения.
Производные изобретения являются биологически активными. Помимо этого, либо в качестве альтернативы, они обладают пролонгирующим фармакокинетическим профилем. Помимо этого, либо в качестве альтернативы, они устойчивы к расщеплению желудочно-кишечными ферментами. Помимо этого, либо в качестве альтернативы, они обладают высокой биодоступностью. Эти свойства имеют важное значение в разработке следующего поколения соединений GLP-1 для подкожного, внутривенного и/или, в частности, перорального приема.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к производным пептидов GLP-1. Производные ацилированы на нативном лизине в позиции 26, а также на лизине, заменяющем нативный глицин в позиции 37. Боковые цепи являются альбумин-связывающими группировками. Они включают пролонгирующую группировку, предпочтительно выбранную среди двухосновных жирных кислот и жирных кислот с дистальной, или концевой, фенильной, тиофеновой или фенокси-группой, каждая из которых может быть замещенной. Карбоксильная группа жирной кислоты или двухосновной жирной кислоты ацилирована, возможно через линкер, на остатке лизина пептида GLP-1, предпочтительно на его эпсилон-аминогруппе. Пептид GLP-1 может быть аналогом GLP-1(7-37) (SEQ ID №1) с общим количеством до десяти различий аминокислот в сравнении с GLP-1(7-37), например, с одним или более чем одним добавлением, одним или более чем одним удалением, и/или одной или более чем одной заменой.
37
26
26
37
Более конкретно, в первом аспекте изобретение относится к производному аналога GLP-1, который содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных замен по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K, где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где каждая альбумин-связывающая группировка включает пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; при условии, что когда пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 1, альбумин-связывающая группировка дополнительно содержит линкер формулы Соед. 5:
Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5; или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду или сложному эфиру.
37
26
26
37
Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к производному аналога GLP-1, который содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных замен по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K, где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где каждая альбумин-связывающая группировка включает пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду или сложному эфиру.
37
26
26
37
Во втором аспекте изобретение относится к производному аналога GLP-1, который содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных замен по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K, где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где альбумин-связывающая группировка включает i) пролонгирующую группировку формулы Соед. 1:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*,
где x является целым числом в диапазоне 6-18; и ii) линкер формулы Соед. 5:
Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5;
или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду или сложному эфиру.
37
26
В третьем аспекте изобретение относится к производному аналога GLP-1, который содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных замен по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K;
26
37
при этом производное содержит две пролонгирующие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, через линкер, где удлиняющая группировка выбрана среди Соед. 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; и линкер содержит Соед. 5:
Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5; или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду или сложному эфиру.
Изобретение также относится к промежуточному продукту в форме аналога GLP-1, который включает следующие изменения по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1): (i) (8Aib, 31H, 34Q, 37K), (ii) (des7-8, 34R, 37K, 38E), (iii) (des7-8, 34R, 37K), (iv) (8Aib, 9G, 34R, 37K), (v) (8Aib, 23R, 34R, 37K), (vi) (31H, 34Q, 37K), (vii) (9Q, 34R, 37K); (viii) (30Е, 34R, 37K), (ix) (34R, 37K, 38G), (х) (34R, 36G, 37K), или (xi) (34R, 37K, 38E), или к фармацевтически приемлемой соли, амиду или эфиру любого из его аналогов.
Изобретение также относится к промежуточному продукту, включающему пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2c, Соед. 3b и Соед. 4b:
6
4
2
y
Соед. 2c: НООС-СН-O-(СН)-СО-PG
1
6
4
2
z
Соед. 3b: R-CH-(CH)-CO-PG
4
2
2
w
Соед. 4b: HOOC-CSH-(CH)-CO-PG,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, а w является целым числом в диапазоне 6-18, и *-CO-PG является активированным эфиром; где, возможно, дистальная *-СООН-группа пролонгирующей группировки, если она присутствует, функционирует как нереактивный эфир; или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду или сложному эфиру.
И, наконец, изобретение также относится к фармацевтическому применению аналогов и производных изобретения, в частности, к применению в лечении и/или профилактике всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания.
В дальнейшем, греческие буквы могут быть представлены их символами или соответствующим письменным именем, например: α = альфа, β = бета; ε = эпсилон, γ = гамма; ω = омега и т.д. Кроме того, греческая буква µ может быть обозначена "u", например, µl=ul, или µМ=uМ.
Звездочка (*) в химической формуле обозначает i) точку присоединения, ii) радикал и/или iii) неподеленный электрон.
Аналоги GLP-1
Термин «GLP-1-аналог» или «аналог GLP-1», используемый в данном документе, относится к пептиду, или соединению, представляющему собой вариант человеческого глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1(7-37)), последовательность которого включена в список последовательностей как SEQ ID №1. Пептид с последовательностью SEQ ID №1 также может быть обозначен как «нативный GLP-1».
В списке последовательностей первому аминокислотному остатку SEQ ID №1 (гистидину) присваивается №1. Тем не менее, в дальнейшем - в соответствии с установившейся практикой в данной области - это остаток гистидина называют №7, и последующие аминокислотные остатки пронумерованы соответственно, заканчивая глицином №37. Поэтому, как правило, в данном документе любая ссылка на номер аминокислотного остатка или номер позиции в последовательности GLP-1(7-37) является ссылкой на последовательность, начинающуюся с His в позиции 7 и заканчивающуюся Gly в позиции 37.
GLP-1-аналоги производных изобретения могут быть описаны посредством ссылки на i) номер аминокислотного остатка в нативном GLP-1(7-37), который соответствует аминокислотному остатку, который был модифицирован (например, соответствующей позиции в нативном GLP-1), и на ii) фактическую модификацию. Ниже приведены неограничивающие примеры подходящей номенклатуры аналогов.
37
Неограничивающий пример GLP-1-аналога производного изобретения является аналогом, который только изменен таким образом, что содержит первый остаток лизина в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37). Аминокислотная последовательность этого аналога в остальном идентична нативному GLP-1, и этот аналог может быть обозначен как K-GLP-1(7-37). Это обозначение представляет аминокислотную последовательность нативного GLP-1, где глицин в позиции 37 был заменен на лизин.
37
26
Этот GLP-1-аналог производного изобретения, кроме того, включает второй остаток лизина в позиции, соответствующей позиции 26 в GLP-1(7-37). Так как аминокислотная последовательность этого аналога в остальном идентична нативному GLP-1, то такой аналог по-прежнему обозначается как K- GLP-1(7-37), а K подразумевается ссылкой на нативный GLP-1(7-37), SEQ ID №1.
37
Соответственно, K- GLP-1(7-37) обозначает аналог GLP-1(7-37), в котором природный глицин в позиции 37 был заменен на лизин.
37
37
Термин «аналог K-GLP-1(7-37)» относится к аналогу GLP-1(7-37), который включает модификацию K и по меньшей мере одну дополнительную модификацию по сравнению с GLP-1(7-37).
37
26
GLP-1-аналог, являющийся частью производного изобретения, включает первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), а также не более десяти аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначается как K, а второй остаток K обозначается как K. Другими словами, это модифицированный пептид GLP-1(7-37), в котором количество аминокислотных остатков изменено по сравнению с нативным GLP-1(7-37) (SEQ ID №1). Эти изменения, или модификации, могут представлять собой, независимо, одну или более чем одну аминокислотную замену, добавление и/или удаление.
8
34
37
Другим неограничивающим примером аналога производного изобретения является [Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37), который обозначает аналог GLP-1(7-37), в котором аланин в позиции 8 был заменен на α-аминоизомасляную кислоту (Aib), лизин в позиции 34 был заменен на аргинин, и глицин в позиции 37 был заменен на лизин. Этот аналог может быть обозначен как (8Aib, R34, K37) GLP-1(7-37).
Дополнительным неограничивающим примером аналога производного изобретения является аналог, «который включает 34Е, 34Q или 34R», что относится к аналогу GLP-1, который содержит глутаминовую кислоту (Е), глутамин (Q) или аргинин (R) в позиции, соответствующей позиции 34 нативного GLP-1(SEQ ID №1), и который может включать другие модификации по сравнению с SEQ ID №1.
Еще одним неограничивающим примером аналога производного изобретения является аналог GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), который просто обозначается как «(8Aib, 31Н, 34Q, 37K)». Это обозначение относится к аналогу, который идентичен SEQ ID №1, за исключением этих четырех замен, т.е. к аналогу, в котором аланин в позиции 8 был заменен α-аминоизомасляной кислотой (Aib), триптофан в позиции 31 был заменен гистидином, лизин в позиции 34 был заменен глутамином, и глицин в позиции 37 был заменен лизином. Этот аналог не содержит других модификаций по сравнению с SEQ ID №1.
7
Еще одним неограничивающим примером аналога производного изобретения является аналог, содержащий des7 (или Des), который относится к аналогу GLP-1(7-37), в котором N-концевая аминокислота, гистидин, была удалена. Это аналог может быть обозначен как GLP-1(8-37).
7
8
Подобным образом, (des7+des8); (des7, des8); (des7-8); или (Des, Des), в связи с аналогом GLP-1(7-37), где может подразумеваться ссылка на GLP-1(7-37), относится к аналогу, в котором аминокислоты, соответствующие двум N-концевых аминокислотам нативного GLP-1, гистидину и аланину, были удалены. Этот аналог может быть обозначен как GLP-1(9-37).
7
8
8
Еще одним неограничивающим примером аналога производного изобретения является аналог, содержащий Imp, и/или (Aib или S), который относится к аналогу GLP-1(7-37), который, по сравнению с нативным GLP-1, включает замену гистидина в позиции 7 на имидазолпропионовую кислоту (Imp); и/или замену аланина в позиции 8 на α-аминоизомасляную кислотоу (Aib), или на серин.
7
8
8
Аналоги, «содержащие» определенные указанные модификации, могут включать дополнительные модификации по сравнению с SEQ ID №1. Два неограничивающих примера аналогов, которые включают Imp, и/или (Aib или S), и являются частью производных изобретения, представляют собой пептидные части Соед. 47 и Соед. 58.
7
8
34
37
38
9
34
37
38
Неограничивающими примерами аналога GLP-1(7-37), содержащего (des7+des8), Arg34, Lys37 и Glu38, являются следующие: [Des,Des,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-Glu-пептид и N-{2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)этилкарбамоил]-2-метилпропионил}[Arg,Lys]GLP-1(9-37) Glu-пептид. В последнем соединении дипептидный миметик N-конца нативного GLP-1(His-Ala) присоединен к новому N-концу, Glu 9, через амидную связь.
Подходящие His- или His-Ala-миметики, которые могут быть использованы в качестве своего рода заместителя удаленных N-концевых аминокислот, если таковые есть, содержат гетероциклические азотсодержащие ароматические кольцевые структуры, например, пиридин или имидазол. Предпочтительными His-или His-Ala-миметиками являются производные имидазола или пиридина, отличные от His и His-Ala, в одном воплощении с заместителем со свободной карбокси-группой, которая может образовывать амидную связь с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида. Термин «имидазол» относится к имидазолам как к классу гетероциклов с аналогичной кольцевой структурой, но различными заместителями, и, наоборот, для пиридина.
Как видно из приведенных выше примеров, аминокислотные остатки могут быть идентифицированы по их полному имени, их однобуквенному коду и/или их трехбуквенному коду. Эти три способа полностью эквивалентны.
Выражения «позиция эквивалентна» или «соответствующая позиция» могут быть использованы для описания места введения модификации в последовательность модифицированного GLP-1(7-37) со ссылкой на нативный GLP-1(7-37) (SEQ ID №1). Эквивалентные или соответствующие позиции, а также ряд модификаций можно легко вывести, например, путем простой рукописной записи и визуального контроля; и/или можно использовать стандартную программу для выравнивания белков или пептидов, такую как «align», которая является выравниванием по Нидлману-Вуншу. Алгоритм описан в Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48:443-453, и программу для выравнивания Myers and W. Miller "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. Для выравнивания могут по умолчанию быть использованы матрица весов выравнивания BLOSUM50 и идентичная матрица, и штраф на первый остаток в делеции может быть установлен на -12, или предпочтительно на -10, а штраф на дополнительные остатки в делеции на -2, или предпочтительно на -0,5.
Пример такого выравнивания приведен ниже, где последовательность №1 представляет собой SEQ ID №1, а последовательность №2 представляет собой ее аналог (des7-8, 34R, 37K, 38Е).
#1: GLP-1(7-37)
# 2: GLP-1(7-37)_Analogue
# Matrix: EBLOSUM62
# Gap_penalty: 10.0
# Extend_penalty: 0.5
# Length: 32
# Identity: 27/32 (84.4%)
# Similarity: 28/32 (87.5%)
# Gaps: 3/32 (9.4%)
# Score: 138.0
В случае неприродных аминокислот, таких как Imp и/или Aib, включенных в последовательность, или в случае His-Ala-миметиков, они с целью выравнивания могут быть заменены на X. При необходимости Х в дальнейшем может быть исправлен вручную.
Термин «пептид», например, используемый в контексте GLP-1-аналогов производных изобретения, относится к соединению, которое содержит ряд аминокислот, взаимосвязанных с помощью амидных (или пептидных) связей.
В частном воплощении пептид в значительной степени или в основном состоит из аминокислот, соединенных посредством амидных связей (например, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% по молярной массе). В другом частном воплощении пептид состоит из аминокислот, соединенных пептидными связями.
Пептиды изобретения содержат по меньшей мере пять конститутивных аминокислот, соединенных пептидными связями. В частных воплощениях пептид включает по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, более предпочтительно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 25, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 28 аминокислот.
В частном воплощении пептид состоит по меньшей мере из пяти конститутивных аминокислот, предпочтительно состоит по меньшей мере из 10, по меньшей мере из 15, по меньшей мере из 20, по меньшей мере 25, или наиболее предпочтительно состоит по меньшей мере из 28 аминокислот.
В дополнительном частном воплощении пептид а) состоит из или б) содержит i) 29, ii) 30, iii) 31 или iv) 32 аминокислоты.
В еще одном частном воплощении пептид состоит из аминокислот, соединенных пептидными связями.
Аминокислоты представляют собой молекулы, содержащие аминогруппу и карбоксильную группу, и, возможно, одну или более чем одну дополнительную группу, которые часто называют боковыми цепями.
Термин «аминокислота» включает протеогенные аминокислоты (кодируемые генетическим кодом, в том числе природные аминокислоты и стандартные аминокислоты), а также непротеогенные (не найденные в белках и/или не закодированные стандартным генетическим кодом) и синтетические аминокислоты. Таким образом, аминокислоты могут быть выбраны из группы протеиногенных аминокислот, непротеиногенных аминокислот и/или синтетических аминокислот.
8
Неограничивающими примерами аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, являются гамма-карбоксиглутаминовая кислота, орнитин и фосфосерин. Неограничивающими примерами синтетических аминокислот являются D-изомеры аминокислот, такие как D-аланин (в дальнейшем иногда сокращенный как «а», например, в «а8», который, соответственно, относится к D-Ala) и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляная кислота), β-аланин и дезаминогистидин (desH, альтернативное название имидазолпропионовой кислоты, сокращенно Imp).
В дальнейшем все аминокислоты, для которых не указан оптический изомер, будут пониматься как L-изомеры (если не указано иное).
GLP-1-производные и аналоги изобретения обладают GLP-1-активностью. Этот термин относится к способности связываться с GLP-1-рецептором и инициировать путь передачи сигнала, приводящий к инсулинотропному действию или другим физиологическим эффектам, известным в данной области. Например, аналоги и производные изобретения могут быть проверены на GLP-1-активность путем анализа, описанного в примере 50 данного документа.
GLP-1-производные
Термин «производное», используемый в данном документе в связи с GLP-1-пептидом или аналогом, означает химически модифицированный GLP-1-пептид или аналог, в котором один или более чем один заместитель был ковалентно присоединен к пептиду. Заместители могут быть отнесены к боковой цепи.
В частном воплощении боковая цепь способна образовывать нековалентные агрегаты с альбумином, что способствует циркуляции производных с током крови, а также обеспечивает эффект увеличения времени действия производного в связи с тем фактом, что агрегат GLP-1-производного и альбумина только медленно распадается, высвобождая активный фармацевтический ингредиент. Таким образом, заместитель, или боковая цепь, в целом предпочтительно относится к альбумин-связывающей группировке.
В частном воплощении боковая цепь имеет по меньшей мере 10 атомов углерода, или по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, или по меньшей мере 40 атомов углерода. В другом частном воплощении боковая цепь может также включать по меньшей мере 5 гетероатомов, в частности, кислород и азот, например, по меньшей мере 7, 9, 10, 12, 15, 17, или по меньшей мере 20 гетероатомов, например, по меньшей мере 1, 2 или 3 N-атома и/или по меньшей мере 3, 6, 9, 12, или 15 O-атомов.
В другом частном воплощении альбумин-связывающая группировка содержит часть, которая особенно подходит для связывания альбумина и, следовательно, замедления, и, соответственно, может быть названа пролонгирующей группировкой. Пролонгирующая группировка может находиться на противоположном конце альбумин-связывающей группировки по отношению к точке его прикрепления к пептиду или вблизи этого конца.
В еще одном частном воплощении альбумин-связывающая группировка включает часть между пролонгирующей группировкой и точкой прикрепления к пептиду, которая может быть названа линкером, линкерной группировкой, спейсером и т.д. Линкер может быть необязательным, и, следовательно, в этом случае альбумин-связывающая группировка может быть идентична пролонгирующей группировке.
В частных воплощениях альбумин-связывающая группировка и/или пролонгирующая группировка является липофильной и/или отрицательно заряженной при физиологическом значении рН (7,4).
Альбумин-связывающая группировка, пролонгирующая группировка или линкер могут быть ковалентно присоединены к остатку лизина пептида GLP-1 путем ацилирования. Дополнительная или альтернативная химия конъюгирования включает алкилирование, образование эфира или образование амида или связывание с остатком цистеина, например, с помощью малеимид- или галоацетамид-(например, бром-/фтор-/йод-) связывания.
В предпочтительном воплощении активный эфир альбумин-связывающей группировки, предпочтительно включающий пролонгирующую группировку и линкер, ковалентно связан с аминогруппой остатка лизина, предпочтительно его эпсилон-аминогруппой, с образованием амидной связи (это процесс именуется ацилированием).
Если не указано иное, то когда дается ссылка на ацилирование остатка лизина, следует понимать, что оно происходит на эпсилон-аминогруппе.
26
37
Производное, содержащее две пролонгирующие группировки, присоединенные к K и K, возможно через линкер, может быть названо производным, ацилированным дважды, или производным с двойным ацилированием на эпсилон-аминогруппах остатков лизина в позициях, соответствующих позициям 26 и 37 GLP-1(7-37), соответственно.
Для наших целей термины «альбумин-связывающая группировка», «пролонгирующая группировка» и «линкер» могут включать непрореагировавшие, а также прореагировавшие формы этих молекул. Либо ни одна из этих форм или другая форма имеется в виду, что становится ясно из контекста, в котором этот термин используется.
В одном аспекте каждая пролонгирующая группировка включает или состоит из пролонгирующей группировки, независимо выбранной среди Соед. 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18.
2
x
В одном воплощении *-(СН)-* относится к прямому или разветвленному, предпочтительно прямому, алкилену, где x является целым числом в диапазоне 6-18.
2
y
В другом воплощении *-(СН)-* относится к прямому или разветвленному, предпочтительно прямому, алкилену, где y является целым числом в диапазоне 3-17.
2
z
В третьем воплощении *-(CH)-* относится к прямому или разветвленному, предпочтительно прямому, алкилену, где z является целым числом в диапазоне 1-5.
2
w
В еще одном воплощении *-(CH)-* относится к прямому или разветвленному, предпочтительно прямому, алкилену, где w является целым числом в диапазоне 6-18.
В другом аспекте альбумин-связывающая группировка включает либо состоит из пролонгирующей группировки, выбранной среди двухосновных жирных кислот и жирных кислот с дистальной (концевой) фенильной или фенокси-группой, при этом обе могут быть замещенными. Дополнительные заместители фенильной и/или или фенокси-группы имеют молярную массу не более 150 Да, предпочтительно не более 125 Да, более предпочтительно не более 100 Да, еще более предпочтительно не более 75 Да, или наиболее предпочтительно не более 50 Да. Примеры заместителей включают, но не ограничиваясь ими, карбоксил, гидроксил, низший линейный или разветвленный С1-С5-алкил, такой как метил и третбутил, и галоген, такой как йод.
Для прикрепления к пептиду GLP-1 кислотная группа жирной кислоты или одна из кислотных групп двухосновной жирной кислоты формирует амидную связь с эпсилон-аминогруппой остатка лизина в пептиде GLP-1, предпочтительно с помощью линкера.
Термин «жирная кислота» относится к алифатическим одноосновным кислотам, имеющим от 4 до 28 атомов углерода, предпочтительно неразветвленным, и/или имеющим четное число атомов, которые могут быть насыщенными или ненасыщенными.
Термин «двухосновная жирная кислота» относится к жирным кислотам, описанным выше, но с дополнительной карбоксильной группой в позиции омега. Таким образом, двухосновные жирные кислоты являются дикарбоновыми кислотами.
2
n
6
4
2
m
6
4
2
p
1
1
В предпочтительном воплощении пролонгирующая группировка выбрана среди НООС-(СН)-СО-*, НООС-СН-O-(СН)-СО-* и R-CH-(CH)-СО-*, где n является целым числом в диапазоне 8-16, m является целым числом в диапазоне 7-17, p является целым числом в диапазоне 1-5, a R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да.
6
4
6
5
4
4
4
4
4
2
*
Номенклатура является такой, которая обычно используется в данной области, например, в приведенных выше формулах *-СООН, а также НООС-* относится к карбокси; *-СН-* к фенилену; *-СО-*, а также *-ОС-* к карбонилу (O=С<*); СН-О-* к фенокси; CHS или CSH к тиофену; и *-CSH-* к двойным радикалам любого из них (любому тиофенилену). В частных воплощениях ароматические структуры, такие как фенокси-, и фенилен-радикалы, могут находиться, независимо друг от друга, в орто-, мета- или пара-положении. В другом воплощении тиофениленовый двойной радикал может быть 2,3-, 2,4-, либо 2,5-.
1
Молярная масса (M) химического вещества (такого как группа R) представляет собой массу одного моля вещества. Молярная масса приводится в дальтонах, символ Да, с определением 1 Да = 1 г/моль.
u
4
9
4
9
Молярная масса может быть рассчитана из стандартных атомных масс и часто приведена в химических каталогах. Молярная масса соединения определяется суммой стандартных атомных масс атомов, которые образуют соединение, умноженной на константу молярной массы, M, равную 1 г/моль. Например, молекулярная масса третбутила (СН) составляет М (CH)=([4×12,01]+[9×1,008])×1 г/моль=57 Да.
Стандартные атомные массы опубликованы Международным союзом чистой и прикладной химии (IUPAC), а также перепечатаны в самых разнообразных учебниках, коммерческих каталогах, плакатах и т.д.
Как указывалось выше, GLP-1-производные данного изобретения являются дважды ацилированными, т.е. две альбумин-связывающие группировки ковалентно прикреплены к GLP-1-пептиду. Точками прикрепления являются нативный остаток лизина в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и остаток лизина, которым был заменен нативный глицин в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37).
В частном воплощении две альбумин-связывающие группировки (т.е. целые боковые цепи) являются подобными, предпочтительно в значительной степени идентичными, или, наиболее предпочтительно, идентичными.
В другом частном воплощении две пролонгирующие группировки являются подобными, предпочтительно в значительной степени идентичными, или, наиболее предпочтительно, идентичными.
В еще одном частном воплощении два линкера являются подобными, предпочтительно в значительной степени идентичными, или, наиболее предпочтительно, идентичными.
Термин «в значительной степени идентичны» включает отличия в идентичности, которые связаны с формированием одной или более чем одной соли, сложного эфира и/или амида; предпочтительно с формированием одной или более чем одной соли, метилового эфира и простого амида; более предпочтительно с формированием не более двух солей, метиловых эфиров и/или простых амидов; еще более предпочтительно с формированием не более одной соли, метилового эфира и/или простого амида; или наиболее предпочтительно с формированием не более чем одной соли.
В контексте химических соединений, таких как альбумин-связывающие группировки, пролонгирующие группировки и линкеры, сходство и/или идентичность можно определить с помощью любой подходящей компьютерной программы и/или алгоритма, известного в данной области.
Например, сходство двух пролонгирующих группировок, двух линкеров и/или двух целых боковых цепей может соответственно быть определено с помощью методики «молекулярных отпечатков пальцев». Методика молекулярных отпечатков представляет собой математический способ представления химической структуры (см., например Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger and Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003).
Примеры подходящих отпечатков включают, но не ограничиваясь ими, отпечатки UNITY, отпечатки MDL и/или отпечатки ECFP, такие как отпечатки пальцев ECFP_6 (ECFP означает методику отпечатков пальцев с расширенной способностью к взаимодействию).
В частном воплощении две пролонгирующие группировки, два линкера и/или две целые боковые цепи представлены в виде а) отпечатков пальцев ECFP_6, б) отпечатков пальцев UNITY; и/или в) отпечатков пальцев MDL.
Для вычисления сходства двух пальцев предпочтительно используют коэффициент Танимото и для а), и для б), и для в).
В частном воплощении, используется ли а), б) или в), две пролонгирующие группировки, два линкера и/или две целые боковые цепи, соответственно, имеют сходство по меньшей мере 0,5 (50%); предпочтительно по меньшей мере 0,6 (60%); более предпочтительно по меньшей мере 0,7 (70%) или по меньшей мере 0,8 (80%); еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9 (90%); или наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,99 (99%), например, сходство 1,0 (100%).
Отпечатки пальцев UNITY могут быть рассчитаны с помощью программы SYBYL (доступен от Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, МО 63144-2319 USA). Отпечатки пальцев ECFP_6 и MDL могут быть рассчитаны с использованием программы Pipeline Pilot (доступной от Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego, CA 92121, USA).
Для получения дополнительной информации, см., например, J. Соед. Inf. Model. 2008, 48, 542-549; J. Соед. Inf. Comput. Sci. 2004, 44, 170-178; J. Med. Соед. 2004, 47, 2743-2749; J. Соед. Inf. Model. 2010, 50, 742-754, а также SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection: Basic Chemistry User Guide, March 2008, SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection, 2008 - оба от Accelrys Software Inc., San Diego, US, и руководства http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf, и http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL.072505.pdf.
Пример подсчета сходства приведен ниже, где целая боковая цепь Соед. 23 была сравнена с его метиловым эфиром, а именно монометилэфиром глутаминовой линкерной группировки (Chem 23a):
Соед. 23a:
С использованием а) отпечатков пальцев ECFP_6 сходство составляло 0,798, с использованием б) отпечатков пальцев UNITY сходство составляло 0,957, и с использованием отпечатков пальцев MDL сходство составляло 0,905.
В случае двух одинаковых боковых цепей (альбумин-связывающих группировок) производные могут быть обозначены симметрично.
В частных воплощениях коэффициент сходства составлял по меньшей мере 0,80, предпочтительно по меньшей мере 0,85, более предпочтительно по меньшей мере 0,90, более предпочтительно по меньшей мере 0,95, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,99.
Каждый из двух линкеров производного изобретения может включать следующий первый линкерный элемент:
Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5.
В конкретном воплощении, когда k=1 и n=1, этот линкерный элемент может быть обозначен как OEG, или двойной радикал 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты, и/или он может быть представлен следующей формулой:
Соед. 5а:
2
2
2
2
2
*-NH-(СН)-O-(СН)-O-СН-СО-*.
В другом конкретном воплощении каждый линкер производного изобретения может также независимо включать второй линкерный элемент, предпочтительно двойной радикал Glu, такой как Соед. 6 и/или Соед. 7:
Соед. 6:
Соед. 7:
,
где двойной радикал Glu может быть включен p раз, где p является целым числом в диапазоне 1-3.
Соед. 6 может также относиться к гамма-Glu, или, сокращенно, gGlu, в связи с тем, что это гамма-карбоксильная группа аминокислоты глутаминовой кислоты, которая используется здесь для соединения с другим линкерным элементом, или может относиться к эпсилон-аминогруппе лизина. Как объяснялось выше, другой линкерный элемент может, например, быть другим остатком Glu, или OEG-молекулой. Аминогруппа Glu, в свою очередь, образует амидную связь с карбоксильной группой пролонгирующей группировки, или с карбоксильной группой, например, OEG-молекулы, если она присутствует, или с гамма-карбоксильной группой, например, другого Glu, если он присутствует.
Соед. 7 может также относиться к альфа-Glu, или, сокращенно, aGlu, или просто Glu, в связи с тем, что это альфа-карбоксильная группа аминокислоты глутаминовой кислоты, которая используется здесь для связывания с другим линкерным элементом или эпсилон-аминогруппой лизина.
Приведенные выше структуры Соед. 6 и Соед. 7 покрывают L-форму, а также D-форму Glu. В конкретных воплощениях Соед. 6 и/или Соед. 7 являются независимо друг от друга а) L-формой, или б) в D-формой.
В другом конкретном воплощении каждый линкер производного изобретения независимо может также включать следующий третий линкерный элемент:
Соед. 8:
2
q
2
*-NH-(CH)-CHR-CO-*,
2
2
где q является целым числом в диапазоне 2-12, a R является водородом (Н) или амином (NH).
2
q
В Соед. 8 группа *-(CH)-* может представлять собой прямой или разветвленный, предпочтительно прямой, алкилен, где q является целым числом в диапазоне 2-12.
В еще более конкретном воплощении линкер имеет а) от 5 до 41 атома С, и/или б) от 4 до 28 гетероатомов. Конкретные и неограничивающие примеры гетероатомов представляют собой N- и O-атомы. Н-атомы не являются гетероатомами.
Альтернативно, линкерная группировка, если она присутствует, имеет от 5 до 30 атомов С, предпочтительно от 5 до 25 атомов С, более предпочтительно от 5 до 20 атомов С, или наиболее предпочтительно от 5 до 17 атомов С. В дополнительных предпочтительных воплощениях линкерная группировка, если она присутствует, имеет от 4 до 20 гетероатомов, предпочтительно от 4 до 18 гетероатомов, более предпочтительно от 4 до 14 гетероатомов, или наиболее предпочтительно от 4 до 12 гетероатомов.
Альтернативно, линкер включает по меньшей мере одну молекулу OEG и/или по меньшей мере один остаток глутаминовой кислоты, или, вернее, соответствующие радикалы.
26
37
В частном воплощении каждый линкер состоит из одного Соед. 6 и двух Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер соединен на своем свободном амино-конце со свободной карбонильной группой в пролонгирующей группировке и на своем свободном карбонильном конце с эпсилон-аминогруппой K или K аналога GLP-1.
26
37
В другом конкретном воплощении каждый линкер состоит из двух Соед. 5 и одного Соед. 6, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер соединен на своем свободном амино-конце со свободной карбонильной группой в пролонгирующей группировке и на своем свободном карбонильном конце с эпсилон-аминогруппой K или K аналога GLP-1.
Производные изобретения могут существовать в различных стереоизомерных формах с одной и той же молекулярной формулой и последовательностью связанных атомов, но отличающихся только в трехмерной ориентации их атомов в пространстве. Стереоизомерия типичных производных изобретения указана в экспериментальной части, в названиях, а также в структурах с помощью стандартной номенклатуры. Если не указано иное, изобретение относится ко всем стереоизомерным формам заявленного производного.
Концентрация в плазме производных GLP-1 изобретения может быть установлена с помощью любого подходящего способа. Например, может быть использована LC-MS (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) или иммунологические анализы, такие как RIA (радиоиммуноанализ), ELISA (иммуноферментный сорбционный анализ) и LOCI (иммунологический анализ люминесценции кислородных каналов). Общие протоколы подходящих анализов RIA и ELISA можно найти, например, в WO09/030738 на стр.116-118. Предпочтительным анализом является анализ LOCI, описанный в примерах 52, 55 и 58 данного документа.
Фармацевтически приемлемая соль, амид или эфир
Производные, аналоги и промежуточные продукты изобретения могут находиться в форме фармацевтически приемлемой соли, амида или эфира.
3
2
4→
4
2
4
Соли, например, образуются в результате химической реакции между основанием и кислотой, например: NH+HSO(NH)SO.
Соль может быть основной солью, кислой солью, либо она может быть ни той, ни другой (т.е. нейтральной солью). Основные соли дают гидроксид-ионы в воде, а кислые соли дают ионы гидроксония.
Соли производных изобретения могут быть образованы с добавленными катионами или анионами, которые реагируют с анионными или катионными группами, соответственно. Эти группы могут быть расположены в пептидной группировке и/или в боковой цепи производных изобретения.
Неограничивающие примеры анионных групп производных изобретения включают свободные карбоксильные группы в боковой цепи, если таковые имеются, а также в пептидной группировке. Пептидная группировка часто включает свободную карбоксильную группу на C-конце, и также она может включать свободные карбоксильные группы на внутренних аминокислотных остатков, таких как Asp и Glu.
Неограничивающие примеры катионных групп в пептидной группировке включают свободную аминогруппу на N-конце, если она присутствует, а также любую свободную аминогруппу внутренних основных аминокислотных остатков, таких как His, Arg и Lys.
Эфир производных изобретения может быть сформирован, например, в результате реакции свободной карбоксильной группы со спиртом или фенолом, что приводит к замене по меньшей мере одной гидроксильной группы на алкокси- или арилокси-группу.
В образование эфира может быть вовлечена свободная карбоксильная группа на C-конце пептида и/или любая свободная карбоксильная группа в боковой цепи.
Амид производных изобретения может быть сформирован, например, в результате реакции свободной карбоксильной группы с амином или замещенным амином, или в результате реакции свободной или замещенной аминогруппы с карбоновой кислотой.
В образование амида может быть вовлечена свободная карбоксильная группа на С-конце пептида и/или любая свободная карбоксильная группа в боковой цепи, свободная аминогруппа на N-конце пептида и/или свободная или замещенная аминогруппа пептида в пептиде и/или боковой цепи.
В частном воплощении пептид или производное находится в форме фармацевтически приемлемой соли. В другом частном воплощении производное находится в форме фармацевтически приемлемого амида, предпочтительно с амидной группой на С-конце пептида. В еще одном частном воплощении пептид или производное находится в форме фармацевтически приемлемого эфира.
Промежуточные продукты
Один тип промежуточного продукта изобретения имеет форму GLP-1-аналога, который включает следующие модификации по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1): (i) (8Aib, 31H, 34Q, 37K); (ii) (des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii) (des7-8, 34R, 37K); (iv) (8Aib, 9G, 34R, 37K); (v) (8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi) (31H, 34Q, 37K); (vii) (9Q, 34R, 37K); (iix) (30Е, 34R, 37K); (ix) (34R, 37K, 38G); (x) (34R, 36G, 37K); или (xi) (34R, 37K, 38E); или его фармацевтически приемлемой соли, амида или сложного эфира.
Другой тип промежуточного продукта изобретения имеет форму альбумин-связывающей группировки или промежуточной боковой цепи, включающей пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2c, Соед. 3b и Соед. 4b:
6
4
2
y
Соед. 2c: НООС-СН-O-(СН)-СО-PG
1
6
4
2
z
Соед. 3b: R-CH-(CH)-CO-PG
4
2
2
w
Соед. 4b: HOOC-CSH-(CH)-CO-PG,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; где PG является защитной группой, предпочтительно *-CO-PG является активированным эфиром; где, возможно, другая (дистальная) *-СООН-группа пролонгирующей группировки, если она присутствует, предпочтительно также защищена, как известно в данной области, например, функционирует как нереактивный эфир; или ее фармацевтически приемлемой соли, амида или сложного эфира.
В частном воплощении промежуточная боковая цепь включает
а) пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; и
б) один или более чем один линкер, выбранный среди Соед. 5b, Соед. 6 и Соед. 7:
Соед. 5b:
Соед. 6а:
и/или
Соед. 7a:
,
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5; a PG является защитной группой; где, возможно, *-СООН-группа пролонгирующей группировки предпочтительно также защищена, как описано в данной области, предпочтительно функционирует как нереактивный эфир; или фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
В частном воплощении PG представляет собой группу, которая обратимо отдает соединение, например, пролонгирующую нереактивную группировку, и которая может быть удалена выборочно.
Неограничивающими примерами PG-групп являются -ОН или группы, функционирующие как активированный эфир, например, но не ограничиваясь ими, OPfp, OPnp и OSuc.
Другие подходящие активированные эфиры могут быть выбраны, например, в соответствии с учением М. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", 2nd ed., Springer Verlag, 1993.
Функциональные свойства
В первом функциональном аспекте производные изобретения обладают высокой активностью. Кроме того, или альтернативно, во втором функциональном аспекте они обладают длительным фармакокинетическим профилем. Кроме того, или альтернативно, в третьем функциональном аспекте они устойчивы к расщеплению желудочно-кишечными ферментами. Кроме того, или альтернативно, в четвертом функциональном аспекте они обладают высокой биодоступностью.
Биологическая активность (сила)
37
В соответствии с первым функциональным аспектом производные изобретения, а также конститутивные GLP-1-пептиды как таковые (например, K-GLP-1(7-37) или их аналоги), обладают биологической активностью, или силой.
В частном воплощении сила и/или активность относится к силе in vitro, т.е. к производительности в функциональном GLP-1-рецепторном анализе, больше, в частности, к возможности стимулировать образование цАМФ в клеточной линии, экспрессирующей клонированный человеческий GLP-1-рецептор.
Стимуляция образования цАМФ в среде, содержащей человеческий GLP-1-рецептор, предпочтительно может быть определена с помощью стабильно трансфицированной клеточной линии, такой как BHK467-12А (tk-ts13), и/или с помощью определения цАМФ в функциональном рецепторном анализе, например, на основании конкуренции между эндогенно образованным цАМФ и экзогенно добавленным биотин-меченым цАМФ, где цАМФ более предпочтительно захватывают с помощью специфического антитела, и/или где еще более предпочтительным является анализ AlphaScreen cAMP Assay, наиболее предпочтительно описанный в Примере 50.
50
50
Термин «половина максимальной эффективной концентрации» (EC) обычно относится к концентрации, которая вызывает реакцию, находящуюся посередине между базальной и максимальной, со ссылкой на кривую «доза-реакция». EC используется как мера активности соединения и представляет собой концентрацию, при которой наблюдается 50% максимального эффекта.
50
50
Можно установить, как описано выше, активность производных изобретения in vitro, и определить EC производного. Чем ниже EC, тем выше активность.
2
2
В частном воплощении среда имеет следующий состав (концентрации при окончательном анализе): 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ HEPES, 10 мМ MgCl, 6HO; 150 мМ NaCl, 0,01% Tween; 0,1% BSA, 0,5 мМ IBMX, 1 мМ АТР, 1 мкМ GTP, рН 7,4.
4
Альтернативной средой является: 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ EGTA, 1,5 мМ MgSO, 1,7 мМ АТР, 20 мМ GTP, 2 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), 0,01% Tween-20, pH 7,4.
50
В другом частном воплощении EC производного изобретения находится на уровне 3000 пМ или ниже, более предпочтительно ниже 2000 пМ, еще более предпочтительно ниже 1000 пМ, или наиболее предпочтительно ниже 500 пМ.
В другом конкретном воплощении производные изобретения являются активными in vivo, что можно определить, как известно в данной области, на любой подходящей животной модели, а также в клинических испытаниях.
Диабетическая db/db-мышь является одним из примеров подходящей животной модели, и на таких мышах можно определить in vivo также эффект снижения уровня глюкозы в крови, например, как описано в примере 53 или как описано в примере 43 WO09/030738.
Кроме того, или альтернативно, влияние на опосредованную глюкозой секрецию инсулина in vivo можно определить в фармакодинамических исследованиях на мини-свиньях (IVGTT), например, как описано в примере 55.
Кроме того, или альтернативно, влияние на потребление пищи in vivo можно определить в фармакодинамических исследованиях на свиньях, например, как описано в примере 56.
Замедление - рецепторное связывание/низкий и высокий альбумин
В соответствии со вторым функциональным аспектом производные изобретения являются пролонгированными.
Способность производных изобретения связываться с GLP-1-рецептором при низкой и высокой концентрации альбумина, соответственно, может быть определена, как описано в примере 51.
50
Как правило, связывание с GLP-1-рецептором при низкой концентрации альбумина должно быть как можно лучше, соответствуя низким значениям IC.
50
50
50
IC-значение при высокой концентрации альбумина является мерой влияния альбумина на связывание производного с GLP-1-рецептором. Как известно, производные GLP-1 также связываются с альбумином. Это, как правило, желательный эффект, который увеличивает их время жизни в плазме крови. Таким образом, значение IC при высоком альбумине, как правило, будет выше, чем значение IC при низком альбумине, соответствуя сниженному связыванию с GLP-1-рецептором, вызванному связыванием альбумина, конкурирующим со связыванием с GLP-1-рецептором.
50
50
50
50
50
50
Высокий коэффициент (значение IC (при высоком альбумине)/ значение IC (при низком альбумине)) может, таким образом, рассматриваться как признак того, что производное в данном случае хорошо связывается с альбумином (может иметь длительный период полувыведения), а также само по себе хорошо связывается с GLP-1-рецептором (значение IC (при высоком альбумине) большое, и значение IC (при низком альбумине) малое). С другой стороны, связывание с альбумином не всегда может быть желательным, либо связывание с альбумином может стать слишком сильным. Таким образом, желательные диапазоны IC (при низком альбумине), IC (при высоком альбумине) и соотношения при высоком/низком могут отличаться у разных соединений в зависимости от предполагаемого применения и обстоятельств такого применения, а также других свойств соединений, потенциально представляющих интерес.
50
В частном воплощении аффинность связывания GLP-1-рецептора (IC) в присутствии 0,005% HSA (низкий альбумин) ниже 1000,00 нм, предпочтительно ниже 600,00 нм, более предпочтительно ниже 100,00 нм, а наиболее предпочтительно ниже 50,00 нМ.
Подходящий анализ для определения рецепторного связывания при высокой и низкой концентрации альбумина описан в примере 51 данного документа.
Замедление - период полужизни in vivo у крыс
В соответствии со вторым функциональным аспектом производные изобретения являются пролонгированными. В частном воплощении замедление может быть определено как период полужизни (T½) in vivo у крыс после внутривенного введения. В дополнительных воплощениях период полужизни составляет по меньшей мере 4 часа, предпочтительно по меньшей мере 6 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 8 часов, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 10 часов.
Подходящий анализ для определения периода полужизни in vivo у крыс после внутривенного введения раскрыт в примере 58 данного документа.
Замедление - период полужизни in vivo у минисвиней
В соответствии со вторым функциональным аспектом производные изобретения являются пролонгированными. В частном воплощении замедление может быть определено как период полужизни (T½) in vivo у минисвиней после внутривенного введения. В дополнительных воплощениях период полужизни составляет по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 36 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 48 часов, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 60 часов.
Подходящий анализ для определения периода полужизни in vivo у крыс после внутривенного введения раскрыт в примере 54 данного документа.
Расщепление желудочно-кишечными ферментами
В соответствии с третьим функциональным аспектом производные изобретения являются стабильными, или стабилизированными, к расщеплению одним или более чем одним желудочно-кишечным ферментом.
Желудочно-кишечные ферменты включают, но не ограничиваясь ими, экзо- и эндопептидазы, например, пепсин, трипсин, химотрипсин, эластазы и карбоксипептидазы. Может быть проверена стабильность в отношении этих желудочно-кишечных ферментов в виде очищенных ферментов или в виде экстрактов из желудочно-кишечной системы.
В конкретном воплощении производное изобретения in vitro имеет период полужизни (T½) в экстракте тонкого кишечника крыс, разделенный на соответствующий период полужизни (T½) GLP-1(7-37), по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 1,0, более предпочтительно по меньшей мере 1,2, еще более предпочтительно по меньшей мере 2,0, еще более предпочтительно по меньшей мере 3,0, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 4,0. Другими словами, соотношение (SI) может быть определено для каждого производного, а именно как период полужизни in vitro (T½) данного производного в экстракте тонкого кишечника крысы, разделенный на соответствующий период полужизни (T½) GLP-1(7-37).
Подходящий анализ для определения периода полужизни in vitro у крыс после внутривенного введения раскрыт в примере 57 данного документа.
Пероральная биодоступность
В соответствии с четвертым функциональным аспектом производные изобретения имеют высокую пероральную биодоступность.
Пероральная биодоступность коммерческих производных GLP-1 является очень низкой. Пероральная биодоступность производных GLP-1 для внутривенного или подкожного введения, находящихся в стадии разработки, также низкая.
Соответственно, в данной области существует потребность производных GLP-1 с улучшенной биодоступностью. Такие производные могут быть подходящими кандидатами для перорального введения до тех пор, пока их эффективность в целом удовлетворительна, и/или до тех пор, пока их период полужизни также в целом удовлетворительный.
Авторы изобретения определили новый класс производных GLP-1, которые имеют неожиданно высокую биодоступность и, в то же время, удовлетворительную активность и/или период полужизни.
50
Кроме того, или альтернативно, эти производные имеют неожиданно высокую биодоступность и, в то же время, высокую аффинность связывания (т.е. низкое значение IC) по отношению к рецептору GLP-1 при низкой концентрации альбумина.
Эти функции имеют важное значение для получения низкой суточной пероральной дозы активного фармацевтического ингредиента, которая является желательной по разным причинам, в том числе, например, с точки зрения экономики производства, вопросов вероятной безопасности, а также вопросов удобного введения и охраны окружающей среды.
Вообще, термин «биодоступность» относится к доле вводимой дозы активного фармацевтического ингредиента (API), такого как производное изобретения, которое достигает системного кровотока без изменений. По определению, когда API вводят внутривенно, его биодоступность составляет 100%. Тем не менее, когда его вводят другими путями (например, перорально), его биодоступность уменьшается (из-за неполной абсорбции и метаболизма первого прохождения). Знания о биодоступности являются необходимыми при расчете доз для не внутривенных путей введения.
Абсолютная пероральная биодоступность сравнивает биодоступность (рассчитанную как площадь под кривой, или AUC) API в системном кровотоке после перорального приема, с биодоступностью того же API после внутривенного введения. Это фракция API, абсорбированная при не внутривенном введении, сравненная с соответствующим внутривенным введением того же API. Сравнение должно быть нормированным, если используются различные дозы; следовательно, каждый AUC корректируется путем деления соответствующей вводимой дозы.
График зависимости концентрации API в плазме от времени приведен и для перорального, и для внутривенного введения. Абсолютная биодоступность (F) является дозозависимой AUC перорального, разделенной на AUC внутривенного.
Производные изобретения имеют абсолютную пероральную биодоступность, которая выше, чем у а) лираглутида и/или б) семаглутида; предпочтительно по меньшей мере на 10% выше, более предпочтительно по меньшей мере на 20% выше, еще более предпочтительно по меньшей мере на 30% выше, или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 40% выше. Перед анализом пероральной биодоступности производные изобретения могут соответственно быть составлены, как известные в данной области пероральные составы изотонических соединений, например, с использованием одного или более чем одного состава, описанного в WO 2008/145728.
Был разработан анализ, описанный в примере 52, который оказался очень хорошим прогнозом биодоступности. В соответствии с этим анализом после непосредственного введения производного GLP-1 в просвет кишечника крыс определяют его концентрацию (экспозицию) в плазме крови и рассчитывают соотношение концентрации в плазме крови (пмоль/л) и концентрации дозированного раствора (мкмоль/л) за t=30 мин. Это соотношение является мерой кишечной биодоступности, и оно хорошо коррелирует с фактическими данными пероральной биодоступности.
Дополнительные частные воплощения производных изобретения описаны в разделах под названием «Частные воплощения» и «Дополнительные частные воплощения» перед экспериментальным разделом.
Технологические процессы
Производство пептидов, таких как GLP-1(7-37) и аналоги GLP-1, хорошо известно в данной области.
37
GLP-1-группировка производных изобретения (или ее фрагменты), такая как K-GLP-1(7-37) или ее аналог или фрагмент, может быть, например, получена путем классического пептидного синтеза, например, твердофазного пептидного синтеза с помощью химии t-Boc или Fmoc или других хорошо известных методик, см., например, Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, "Organic Synthesis on solid Phase", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, и "Fmoc Solid Phase Пептид Synthesis", Edited by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000.
Кроме того, или альтернативно, они могут быть получены с помощью рекомбинантных методик, а именно путем культивирования клетки-хозяина, которая содержит последовательность ДНК, кодирующую аналог, и способна экспрессировать пептид в подходящей питательной среде в условиях, позволяющих эккспрессию пептида. Неограничивающими примерами клеток-хозяев, пригодных для экспрессии этих пептидов, являются: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, а также клеточные линии млекопитающих ВНК или СНО.
Такие производные изобретения, которые включают неприродные аминокислоты и/или ковалентно присоединенный N-концевой моно- или дипептидный миметик, могут, например, быть получены, как описано в экспериментальной части. Или см., например, Hodgson et al: "The synthesis of peptids and proteins containing non-natural амино acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, no. 7 (2004), p.422-430; и WO 2009/083549 A1, озаглавленный "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".
Конкретные примеры способов получения ряда производных изобретения включены в экспериментальную часть.
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции, содержащие производное изобретения или его фармацевтически приемлемую соль, амид или эфир и фармацевтически приемлемый эксципиент, могут быть получены, как известно в данной области.
Термин «эксципиент» в широком смысле относится к любому компоненту, кроме активного терапевтического ингридиента(ов). Эксципиент может быть инертным веществом, неактивным веществом и/или не лечебным активным веществом.
Эксципиент может иметь различное назначение, например, выступать в качестве носителя, растворителя, вспомогательного средства для таблеток и/или улучшать введение и/или абсорбцию активного вещества.
th
Состав фармацевтически активных ингредиентов с различными эксципиентами известен в данной области, см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 19 edition (1995), и более поздние издания).
Неограничивающими примерами эксципиентов являются растворители, разбавители, буферы, консерванты, агенты, регулирующие тоничность, хелатирующие агенты и стабилизаторы.
Примеры составов включают жидкие составы, т.е. водные составы, содержащие воду. Жидкий состав может быть в виде раствора или в виде суспензии. Водный состав обычно содержит по меньшей мере 50% (по массе) воды, по меньшей мере 60%, 70%, 80% или даже по меньшей мере 90% (по массе) воды.
Альтернативно, фармацевтическая композиция может быть твердым составом, например, лиофилизированная или высушенная распылением композиция, которая может быть использована как таковая, или к которой врач или пациент добавляет растворитель и/или разбавитель перед применением.
рН водного состава может быть любым в пределах от рН 3 до рН 10, например, от примерно 7,0 до примерно 9,5 или от примерно 3,0 до примерно 7,0.
Фармацевтическая композиция может содержать буфер. Буфер может быть выбран, например, из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, натрия дигидрофосфата, натрия гидрофосфата, натрия фосфата, трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты и их смесей. Фармацевтическая композиция может содержать консервант. Консервант может быть выбран, например, из группы, состоящей из фенола, о-крезола, м-крезола, п-крезола, метил-п-гидроксибензоата, пропил-п-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, бутил-п-гидроксибензоата, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, хлорбутанола и тиомеросала, бронопола, бензойной кислоты, имидуреи, хлоргексидина, натрия дегидроацетата, хлорокрезола, этил-п-гидроксибензоата, бензетония хлорида, хлорфенезина (3п-хлорфенокси)-1,2-пропандиола) или их смесей. Консервант может присутствовать в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. Фармацевтическая композиция может включать изотонический агент. Изотонический агент может быть выбран из группы, состоящей из солей (например, хлорид натрия), сахаров или сахарных спиртов, аминокислот (например, глицина, гистидина, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина), алдитола (например, глицерола (глицерина), 1,2-пропандиола (пропиленгликоля), 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола), полиэтиленгликоля (например PEG 400) и их смесей. Могут быть использованы любые сахара, такие как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые гликаны, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, альфа и бета HPCD, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и натрий-карбоксиметилцеллюлозу. Сахарный спирт определяется как С4-С8-углеводород, имеющий по меньшей мере одну ОН-группу, и представляет собой, например, маннит, сорбит, инозит, галактитол, дульцитол, ксилитол и арабитол. В одном воплощении сахароспиртовой добавкой является маннит. Фармацевтическая композиция может включать хелатообразователь. Хелатообразователь может быть выбран, например, среди солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), лимонной кислоты и аспарагиновой кислоты и их смесей. Фармацевтическая композиция может включать стабилизатор. Стабилизатор может быть, например, одним или более чем одним ингибитором окисления, ингибитором агрегации, поверхностно-активным веществом и/или одним или более чем одним ингибитором протеаз. Неограничивающие примеры этих типов стабилизаторов раскрыты далее.
Термин «образование агрегатов» относится к физическому взаимодействию между полипептидными молекулами, которое приводит к образованию олигомеров, которые могут оставаться растворимыми, или больших видимых агрегатов, которые выпадают из раствора. Образование агрегатов полипептидом при хранении жидкой фармацевтической композиции может отрицательно влиять на биологическую активность этого полипептида, что приводит к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может привести к другим проблемам, таким как блокирование трубок, мембран или насосов, если фармацевтическую композицию, содержащую полипептид, вводят с использованием инфузионной системы.
Фармацевтическая композиция может включать некоторое количество аминокислотных оснований, достаточное для уменьшения формирования агрегатов полипептида при хранении композиции. Термин «аминокислотное основание» относится к одной или более чем одной аминокислоте (например, метионину, гистидину, имидазолу, аргинину, лизину, изолейцину, аспарагиновой кислоте, триптофану, треонину) или их аналогам. Любая аминокислота может находиться либо в свободной форме, либо в форме соли. Может присутствовать любой стереоизомер (например, L, D или их смесь) аминокислотного основания.
Метионин (или другая серная аминокислота или аминокислотный аналог) может быть добавлен для подавления окисления остатков метионина до метионинсульфоксида, когда полипептид, действующий в качестве терапевтического агента, представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере один остаток метионина, чувствительный к такому окислению. Может быть использован любой стереоизомер метионина (L или D) или их комбинации.
Фармацевтическая композиция может включать стабилизатор, выбранный из группы высокомолекулярных полимеров или низкомолекулярных соединений. Стабилизатор может быть выбран, например, из полиэтиленгликоля (например, PEG 3350), поливинилового спирта (PVA), поливинилпирролидона, карбокси-/гидроксицеллюлозы или их производных (например, НРС, HPC-SL, HPC-L и НРМС), циклодекстринов, серосодержащих веществ, таких как монотиоглицерин, тиогликолевая кислота и 2-метилтиоэтанол, а также различных солей (например, хлорида натрия). Фармацевтическая композиция может включать дополнительные стабилизирующие агенты, такие как, но не ограничиваясь ими, метионин и EDTA, которые защищают полипептид от окисления метионина, и неионогенные поверхностно-активные вещества, который защищают полипептид от агрегации, связанной с замораживанием-оттаиванием или механической деформацией.
Фармацевтическая композиция может включать одно или более чем одно поверхностно-активное вещество, предпочтительно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, или два различных поверхностно-активных вещества. Термин «поверхностно-активное вещество» относится к любым молекулам или ионам, которые содержат водорастворимую (гидрофильную) часть и жирорастворимую (липофильную) часть. Поверхностно-активное вещество может быть выбрано, например, из группы, состоящей из анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, неионогенных поверхностно-активных веществ и/или цвиттерионных поверхностно-активных веществ.
Фармацевтическая композиция может содержать один или более чем один ингибитор протеаз, такой как, например, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и/или бензамидинHCl.
Дополнительно, возможно, ингредиенты фармацевтической композиции включают, например, увлажняющие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, ионы металлов, масляные носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин) и/или цвиттерион (например, аминокислоту, такую как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин).
Кроме того, фармацевтическая композиция может быть составлена как известные в данной области составы инсулинотропных соединений для перорального введения, например, с использованием одного или более чем одно состава, описанного в WO 2008/145728.
Вводимая доза может содержать 0,01-100 мг производного, или 0,01-50 мг, или 0,01-20 мг, или 0,01-10 мг производного.
Производное может быть введено в форме фармацевтической композиции. Оно может быть введено пациенту, нуждающемуся в этом, в нескольких местах, например, в местах для местного введения, таких как кожа или слизистые оболочки; в местах, которые обходят абсорбцию, таких как артерия, вена или сердце; и в местах, которые предусматривают абсорбцию, например в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшную полость.
Путь введения может быть, например, язычным; подъязычным; буккальным; в рот; пероральным; в желудок; в кишечник; назальным; легочным, например, через бронхиолы, альвеолы, или с их сочетанием; парентеральным, эпидермальным; дермальным; трансдермальным; конъюнктивальным; уретральным; вагинальным; ректальным и/или окулярным. Композиция может быть композицией для перорального введения, и путь введения может быть пероральным.
Композиция может быть введена в нескольких лекарственных формах, например, как раствор, суспензия, эмульсия, микроэмульсия, множественная эмульсия, пена, бальзам, паста, пластырь, мазь, таблетка, таблетка с покрытием, жевательная резинка, средство для промывания, капсула, например, жесткая или мягкая желатиновая капсула, суппозиторий, ректальная капсула, капли, гель, спрей, порошок, аэрозоль, ингалятор, глазные капли, глазная мазь, раствор для промывания глаз, вагинальный пессарий, вагинальное кольцо, вагинальная мазь, раствор для инъекций, раствор, преобразующийся in situ, например, in situ гелеобразующий, загустевающий, преципитирующий и in situ кристаллизующийся; инфузионный раствор или имплантат. Композиция может быть таблеткой, возможно, с покрытием, капсулой или жевательной резинкой.
Композиция также может быть собрана с носителем лекарственного препарата или системой доставки лекарственного препарата, например, для улучшения стабильности, биодоступности и/или растворимости. В частном воплощении композиция может быть присоединена к такой системе через ковалентные, гидрофобные и/или электростатические взаимодействия. Целью такой рецептуры может быть, например, уменьшение неблагоприятных последствий, достижение хронотерапии и/или увеличение комплаентности с пациентом.
Композиция также может быть использована в составе систем доставки лекарственного препарата с контролируемым, продолжительным, замедленным, отложенным и/или медленным высвобождением.
Парентеральное введение может быть выполнено путем подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекции с помощью шприца, возможно с помощью шприца-ручки, или с помощью инфузионного насоса.
Композиция может быть введена через нос в форме раствора, суспензии или порошка; либо она может быть введена в легкие в форме жидкости или порошкового спрея.
Еще один вариантом является трансдермальное введение, например, путем безыгольной инъекции, с помощью пластыря, такого как ионофоретический пластырь, или через слизистую, например, буккальным путем.
Композиция может представлять собой стабилизированный состав. Термин «стабилизированный состав» относится к составу с повышенной физической и/или химической стабильностью, предпочтительно одновременно. Как правило, состав должен быть стабильным в течение времени применения и хранения (в соответствии с рекомендуемыми условиями применения и хранения) до истечения срока действия.
Термин «физическая стабильность» относится к тенденции полипептида формировать биологически неактивные и/или нерастворимые агрегаты в результате воздействия термо-механической нагрузки и/или взаимодействия с дестабилизирующими границами раздела и поверхностями (например, гидрофобными поверхностями). Физическую стабильность водного полипептидного состава можно оценить путем визуального осмотра и/или измерения мутности после воздействия механических/физических нагрузок (например, перемешивания) при различных температурах в течение различных периодов времени. Альтернативно, физическую стабильность можно оценить с помощью спектроскопического агента или зонда конформационного состояния полипептида, например, тиофлавина Т или зондов «гидрофобного участка».
Термин «химическая стабильность» относится к химическим (в частности, ковалентным) изменениям в структуре полипептида, приводящим к образованию химических продуктов деградации, потенциально имеющих сниженную биологическую активность и/или повышенный иммуногенный эффект по сравнению с интактным полипептидом. Химическую стабильность можно оценить, измеряя количество продуктов химической деградации в различные временные точки после воздействия различных условий окружающей среды, например, с помощью SEC-HPLC и/или RP-HPLC.
Лечение с помощью производного в соответствии с данным изобретением также может быть объединено с одним или более чем одним дополнительным фармакологически активным веществом, например, выбранным среди антидиабетических агентов, агентов против ожирения, агентов, регулирующих аппетит, антигипертензивных агентов, агентов для лечения и/или профилактики осложнений, возникающих в результате диабета, и агентов для лечения и/или профилактики осложнений, возникающих в результате ожирения или связанных с ним. Примерами таких фармакологически активных веществ являются инсулин, сульфонилмочевина, бигуаниды, меглитиниды, ингибиторы глюкозидазы, антагонисты глюкагона, ингибиторы DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторы печеночных ферментов, участвующих в стимуляции глюконеогенеза и/или гликогенолиза, модуляторы поглощения глюкозы, соединения, изменяющие липидный обмен, такие как антигиперлипидемические агенты, ингибиторы ГМГ-КоА (статины), желудочные ингибиторные полипептиды (аналоги GIP), соединения, снижающие потребление пищи, агонисты RXR и агенты, воздействующие на АТФ-зависимые калиевые каналы β-клеток; холестирамин, колестипол, клофибрат, гемфиброзил, ловастатин, правастатин, симвастатин, пробукол, декстротироксин, нетеглинид, репаглинид; β-блокаторы, такие как алпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторы АСЕ (ангиотензин-превращающего фермента), такие как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, и α-блокаторы, такие как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин; агонисты CART (кокаин- и амфетамин-регулируемого транскрипта), антагонисты NPY (нейропептиды Y), агонисты PYY, агонисты рецептора Y2, агонисты рецептора Y4, смешанные агонисты Y2/Y4-рецепторов, агонисты МС4 (меланокортина-4), антагонисты орексина, агонисты TNF (фактора некроза опухоли), агонисты CRF (кортикотропного рилизинг-фактора), антагонисты CRF-BP (белка, связывающего кортикотропный рилизинг-фактор), агонисты урокортина, β3-агонисты, оксинтомодулин и аналоги, агонисты MSH (меланоцит-стимулирующего гормона), антагонисты МСН (меланин-концентрирующего гормона), агонисты ССК (холецистокинина), ингибиторы обратного захвата серотонина, ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина, смешанные соединения серотонина и норадреналина, агонисты 5НТ (серотонина), агонисты бомбезина, антагонисты галанина, гормон роста, соединения, высвобождающие гормон роста, агонисты TRH (тиреотропного рилизинг-гормона), модуляторы UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонисты лептина, агонисты DA (бромокриптин, допрексин), ингибиторы липазы/амилазы, модуляторы RXR (ретиноидного Х-рецептора), агонисты TR β, антагонисты гистамина Н3, агонисты или антагонисты желудочного ингибиторного полипептида (GIP-аналоги), гастрин и аналоги гастрина.
Лечение с помощью производного в соответствии с этим изобретением также может быть объединено с хирургической операцией, которая влияет на уровень глюкозы и/или на липидный обмен, такой как бандажирование желудка или желудочное шунтирование.
Фармацевтические показания
Данное изобретение также относится к производным изобретения для применения в качестве лекарственного средства.
В конкретных воплощениях производное изобретения может быть использовано для следующих медицинских применений, при этом все предпочтительно касаются тем или иным образом диабета:
(i) профилактика и/или лечение всех форм диабета, таких как гипергликемия, сахарный диабет 2 типа, нарушение толерантности к глюкозе, сахарный диабет 1 типа, инсулиннезависимый диабет, MODY (диабет взрослого типа у молодых), гестационный диабет и/или снижение HbA1C;
(ii) задержка или предотвращение прогрессирования диабетического заболевания, например, прогрессирования сахарного диабета 2 типа, задержка прогрессирования нарушения толерантности глюкозы (IGT) в сахарный диабет 2 типа с необходимостью инсулина, и/или задержка прогрессирования сахарного диабета 2 типа без необходимости инсулина в сахарный диабет 2 типа с необходимостью инсулина;
(iii) улучшение функционирования β-клеток, например, снижение апоптоза β-клеток, усиление функции β-клеток и/или увеличение β-клеточной массы и/или восстановление чувствительности β-клеток к глюкозе;
(iv) профилактика и/или лечение когнитивных расстройств;
(v) профилактика и/или лечение расстройств пищевого поведения, таких как ожирение, например, за счет уменьшения потребления пищи, уменьшения массы тела, подавления аппетита, вызывания сытости; лечение или профилактика компульсивного переедания, булимии и/или ожирения, вызванного введением антипсихотического агента или стероидов, снижение моторики желудка и/или задержка опорожнения желудка;
(vi) профилактика и/или лечение осложнений диабета, таких как нейропатия, в том числе периферическая нейропатия; нефропатия; или ретинопатия;
(vii) улучшение параметров липидного обмена, например, профилактика и/или лечение дислипидемии, снижение общего уровня липидов в сыворотке крови, снижение уровня ЛПВП, снижение уровня мелких плотных ЛПНП, снижение уровня ЛПОНП, снижение уровня триглицеридов, снижение уровня холестерина, повышение уровня ЛПВП, снижение плазменных уровней липопротеина a (Lp(a)) в организме человека; ингибирование образования аполипопротеина а (аро(а)) in vitro и/или in vivo;
(viii) профилактика и/или лечение сердечно-сосудистых заболеваний, таких как синдром X; атеросклероз; инфаркт миокарда; ишемическая болезнь сердца; инсульт, ишемия головного мозга; раннее сердечное или раннее сердечнососудистое заболевание, такое как гипертрофия левого желудочка; ишемическая болезнь сердца; эссенциальная гипертензия; острое гипертоническое состояние; кардиомиопатия; сердечная недостаточность; толерантность к физической нагрузке; хроническая сердечная недостаточность; аритмия; сердечная аритмия; синкопе; атеросклероз; мягкая хроническая сердечная недостаточность; стенокардия; повторная окклюзия сердечного обхода; перемежающаяся хромота (облитерирующий атеросклероз); диастолическая дисфункция и/или систолическая дисфункция;
(ix) профилактика и/или лечение желудочно-кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника; тонкокишечный синдром, или болезнь Крона; диспепсия; и/или язвы желудка;
(х) профилактика и/или лечение критических заболеваний, например, лечение тяжелобольных пациентов, пациентов с критическим заболеванием полинефропатией (CIPNP) и/или потенциальных пациентов с CIPNP; профилактика критических заболеваний или развития CIPNP; профилактика, лечение и/или забота о пациентах с синдромом системного воспалительного ответа (SIRS); и/или профилактика или снижение вероятности развития у пациента бактериемии, септицемии и/или септического шока во время госпитализации; и/или
(xi) профилактика и/или лечение синдрома поликистоза яичников (PCOS).
В частном воплощении показание выбрано из группы, состоящей из (i)-(iii) и (v)-(viii), таких как показания (i), (ii) и/или (iii); или показание (v), показание (vi), показание (vii) и/или показание (viii).
В другом частном воплощении показание представляет собой (i). В другом частном воплощении показание представляет собой (v). В еще одном частном воплощении показание представляет собой (viii).
Следующие показания являются особенно предпочтительными: сахарный диабет 2 типа и/или ожирение.
Частные воплощения
Ниже приведены частные воплощения изобретения:
1. Производное аналога GLP-1,
37
26
который включает первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), а также не более десяти аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен K, а второй остаток K обозначен K,
26
37
где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где
альбумин-связывающая группировка включает пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18;
при условии, что когда пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 1, альбумин-связывающая группировка дополнительно содержит линкер формулы Соед. 5:
Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5;
или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
2. Производное по воплощению 1,
37
26
где аналог GLP-1 содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K,
26
37
где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где
каждая альбумин-связывающая группировка включает пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18;
или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
3. Производное по воплощению 2, где альбумин-связывающая группировка также содержит линкер.
4. Производное по воплощению 3, где линкер содержит: i) двойной радикал Glu; и/или ii) линкер формулы Соед. 5:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5.
5. Производное по воплощению 4, где двойной радикал Glu выбран среди Соед. 6 и/или Соед. 7:
Соед. 6:
Соед. 7:
;
предпочтительно Соед. 6.
6. Производное по воплощению 1,
37
26
где аналог GLP-1 содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K,
26
37
где производное содержит две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где
альбумин-связывающая группировка включает
i) пролонгирующую группировку формулы Соед. 1:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*,
где x является целым числом в диапазоне 6-18; и
ii) линкер, формулы Соед. 5:
,
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5;
или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
7. Производное по воплощению 1,
37
26
где аналог GLP-1 содержит первый остаток K в позиции, соответствующей позиции 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), второй остаток K в позиции, соответствующей позиции 26 GLP-1(7-37), и максимум десять аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37), где первый остаток K обозначен как K, а второй остаток K обозначен как K,
26
37
где производное содержит две пролонгирующие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, через линкер, где
пролонгирующая группировка выбрана среди Соед. 1, Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
2
x
Соед. 1: НООС-(СН)-СО-*
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; и
линкер содержит Соед. 5:
Соед. 5:
,
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5;
или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
8. Производное по любому из воплощений 1-7, где Соед. 5 является первым линкерным элементом.
9. Производное по любому из воплощений 1-8, где k составляет 1.
10. Производное по любому из воплощений 1-9, где n составляет 1.
11. Производное по любому из воплощений 1-10, где Соед. 5 включен m раз, где m является целым числом в диапазоне 1-10.
12. Производное по воплощению 11, где m является целым числом в диапазоне 1-6; предпочтительно в диапазоне 1-4; более предпочтительно m составляет 1 или 2; или наиболее предпочтительно m составляет 2.
13. Производное по любому из воплощений 11-12, в котором, когда m отличается от 1, элементы Соед. 5 соединены между собой с помощью амидной связи(ей).
14. Производное по любому из воплощений 1-13, в котором линкер состоит из одного или более чем одного элемента Соед. 5.
15. Производное по любому из воплощений 1-13, где линкер дополнительно содержит второй линкерный элемент; предпочтительно двойной радикал Glu, более предпочтительно выбранный среди Соед. 6 и/или Соед. 7:
Соед. 6:
Соед. 7:
;
наиболее предпочтительно Соед. 6.
16. Производное по воплощению 15, где двойной радикал Glu включен p раз, где p представляет собой целое число в диапазоне 1-3.
17. Производное по воплощению 16, где p составляет 1, 2 или 3, предпочтительно 1 или 2, или наиболее предпочтительно 1.
18. Производное по любому из воплощений 1-17, где двойной радикал Glu представляет собой радикал L-Glu или D-Glu, предпочтительно L-Glu.
19. Производное по любому из воплощений 16-18, где один или более чем один двойной радикал Glu и один или более чем один элемент Соед. 5 соединены между собой с помощью амидной связи(ей).
20. Производное по любому из воплощений 1-19, где линкер включает другой линкерный элемент, такой как третий линкерный элемент.
21. Производное по воплощению 20, где третий линкерный элемент представляет собой
2
q
2
Соед. 8: *-NH-(CH)-CHR-CO-*,
2
2
где q является целым числом в диапазоне 2-12, a R является водородом (Н), амином (NH) или низшим спиртом С1-С5.
22. Производное по воплощению 21, где q составляет 4, 6 или 10.
23. Производное по любому из воплощений 21-22, где Соед. 8 представляет собой радикал аминогексановой кислоты, аминооктановой кислоты, аминододекановой кислоты или лизина.
24. Производное по воплощению 23, где превращенная в радикал аминогруппа находится в эпсилон-позиции.
25. Производное по любому из воплощений 1-24, где линкер состоит из m молекул Соед. 5 и p молекул двойного радикала Glu.
26. Производное по воплощению 25, где (m,p) представляют собой (2,2), (2,1), (2,3), (4,1), (6,1), (1,0), (1,1), (1,2), (0,1) или (0,2); предпочтительно (2,1), (2,0), (1,0), (1,1), (0,1), или (0,2); более предпочтительно (2,1), (2,2) или (1,2); еще более предпочтительно (1,1) или (2,1); или наиболее предпочтительно (2,1).
27. Производное по любому из воплощений 25-26, где m элементов Соед. 5 и p двойных радикалов Glu соединены между собой с помощью амидных связей.
28. Производное по любому из воплощений 21-24, где линкер состоит из m молекул Соед. 5, p молекул двойного радикала Glu и Соед. 8.
29. Производное по воплощению 28, где (m,p) представляют собой (2,1) или (1,1); предпочтительно (2,1).
30. Производное по любому из воплощений 28-29, где m элементов Соед. 5, p двойных радикалов Glu и элемент Соед. 8 соединены между собой с помощью амидных связей.
31. Производное по любому из воплощений 1-30, где линкер и пролонгирующая группировка соединены с помощью амидной связи.
32. Производное по любому из воплощений 1-31, где линкер и аналог GLP-1 связаны между собой с помощью амидной связи.
26
37
33. Производное по воплощению 32, где линкер прикреплен к эпсилон-аминогруппе K или K.
34. Производное по любому из воплощений 1-33, где линкер имеет
(i) от 5 до 41 C-атомов; предпочтительно 5-17 С-атомов; например, 5, 6, 11, 12 или 17 С-атомов; например 5, 6 или 12 С-атомов, или 11, или 17 С-атомов; или, наиболее предпочтительно, 17 С-атомов; или
(ii) 5-30 С-атомов, предпочтительно 5-25 С-атомов, более предпочтительно 5-20 С-атомов, или, наиболее предпочтительно, 5-17 С-атомов.
35. Производное по любому из воплощений 1-34, где линкер имеет
(i) от 4 до 28 гетероатомов; предпочтительно от 4 до 12 гетероатомов; например, 4, 8 или 12 гетероатомов; более предпочтительно 8 или 12 гетероатомов; или, наиболее предпочтительно, 12 гетероатомов; или
(ii) от 4 до 20 гетероатомов, предпочтительно 4-18 гетероатомов, более предпочтительно 4-14 гетероатомов, или, наиболее предпочтительно, 4-12 гетероатомов.
36. Производное по воплощению 35, где гетероатомы являются N- и/или O-атомами.
37. Производное по любому из воплощений 34-36, где линкер имеет от 1 до 7 N-атомов; предпочтительно от 1 до 3 N-атомов; например, 1, 2 или 3 N-атома; например, 1 или 2 N-атома; или, наиболее предпочтительно, 3 N-атома.
38. Производное по любому из воплощений 34-37, где линкер имеет от 3 до 21 O-атомов; предпочтительно от 3 до 9 O-атомов; например, 3, 6 или 9 O-атомов; например, 3 или 6 O-атомов; или, наиболее предпочтительно, 9 O-атомов.
26
37
39. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из двух молекул Соед. 5, связанных амидной связью, и прикреплен на своем *-NH-конце к *СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
40. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из четырех молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи, и прикреплен на *-NH-конце к *СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
41. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из двух молекул Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе Kили K аналога GLP-1.
26
37
42. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из двух молекул Соед. 5 и одной молекулы Соед. 6, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на свободном *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
43. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из трех молекул Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на свободном *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
44. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
45. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6, одной молекулы Соед. 5 и одной молекулы Соед. 6, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
46. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6 и четырех молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
47. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6 и шести молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
48. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6 и одной молекулы Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
49. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 5, одной молекулы Соед. 6 и одной молекулы Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
50. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 7 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
26
37
51. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 5, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или Kаналога GLP-1.
26
37
52. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или Kаналога GLP-1.
26
37
53. Производное по любому из воплощений 1-38, где линкер состоит из двух молекул Соед. 6, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH-конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или Kаналога GLP-1.
2
26
37
54. Производное по любому из воплощений 1-53, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6, одной молекулы Соед. 8, где q предпочтительно составляет 10, R представляет собой Н, одной молекулы Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-МН конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
2
26
37
55. Производное по любому из воплощений 1-54, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6, одной молекулы Соед. 8, где q предпочтительно составляет 4, а R представляет собой Н, одной молекулы Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
2
26
37
56. Производное по любому из воплощений 1-55, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6, одной молекулы Соед. 8, где q предпочтительно составляет 6, R представляет собой Н, одной молекулы Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
2
26
37
57. Производное по любому из воплощений 15-18, где линкер состоит из одной молекулы Соед. 6, одной молекулы Соед. 8, где q предпочтительно составляет 4, R представляет собой MHz, одной молекулы Соед. 6 и двух молекул Соед. 5, соединенных через амидные связи и в указанной последовательности, при этом линкер прикреплен на *-NH конце к *-СО-концу пролонгирующей группировки, а на *-СО-конце к эпсилон-аминогруппе K или K аналога GLP-1.
58. Производное по любому из воплощений 1-57, где пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 1.
59. Производное по любому из воплощений 1-58, где x является четным числом.
60. Производное по любому из воплощений 1-59, где x является целым числом в диапазоне 8-16, например, 8, 10, 12, 14 или 16; или, предпочтительно, в диапазоне 10-14.
61. Производное по любому из воплощений 1-60, где x составляет 10, 12 или 14; предпочтительно 14; более предпочтительно 10; или, наиболее предпочтительно, 12.
62. Производное по любому из воплощений 1-61, где Соед. 1 представлена формулой Соед. 1а:
Соед. 1а:
,
где x имеет значение, указанное в в одном из воплощений 1-61.
63. Производное по любому из воплощений 1-57, где пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 2.
64. Производное по любому из воплощений 1-63, где y является нечетным числом.
65. Производное по любому из воплощений 1-64, где y является целым числом в диапазоне 7-17, например, 7, 9, 11, 13, 15 или 17; предпочтительно 7-15, таким как, например, 9, 11 или 15.
66. Производное по любому из воплощений 1-65, где y составляет 7, 8, 9, 11 или 15.
67. Производное по любому из воплощений 1-66, где y составляет 7, 9, 11 или 15.
68. Производное по любому из воплощений 1-67, где y составляет 7.
69. Производное по любому из воплощений 1-68, где y составляет 9.
70. Производное по любому из воплощений 1-69, где y составляет 11.
71. Производное по любому из воплощений 1-70, где y составляет 15.
72. Производное по любому из воплощений 1-71, где Соед. 2 представлена формулой Соед. 2а или Соед. 2b:
Соед. 2а:
Соед. 2b:
;
предпочтительно Соед. 2а;
где y имеет значение, указанное в любом из воплощений 1-71.
73. Производное по любому из воплощений 1-57, где пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 3.
74. Производное по любому из воплощений 1-73, где z является нечетным числом; предпочтительно составляет 3.
1
75. Производное по любому из воплощений 1-74, где R представляет собой группу с молярной массой не более 127 Да.
1
76. Производное по любому из воплощений 1-75, где R представляет собой группу с молярной массой в диапазоне 1-127 Да; предпочтительно 1-125 Да, более предпочтительно 1-100 Да, еще более предпочтительно 1-75 Да, или, наиболее предпочтительно, 1-50 Да.
1
77. Производное по любому из воплощений 1-76, где R представляет собой группу,
(ii) с молярной массой ниже 130 Да, предпочтительно ниже 100 Да, более предпочтительно ниже 75 Да, еще более предпочтительно ниже 60 Да, или, наиболее предпочтительно, ниже 50 Да; или
(iii) с молярной массой ниже 40 Да, предпочтительно ниже 30 Да, более предпочтительно ниже 20 Да, или. наиболее предпочтительно, ниже 15 Да.
1
78. Производное по любому из воплощений 1-77, где R представляет собой -Н.
1
79. Производное по любому из воплощений 1-78, где R представляет собой галогеновый радикал.
1
80. Производное по любому из воплощений 1-79, где R представляет собой -I.
1
81. Производное по любому из воплощений 1-80, где R представляет собой линейный или разветвленный С1-С5-алкил; предпочтительно С1-С4-алкил; более предпочтительно метил; или, наиболее предпочтительно, третбутил.
82. Производное по любому из воплощений 1-81, где Соед. 3 представлен формулой Соед. 3а:
Соед. 3а:
;
1
где R и z имеют значения, указанные в одном из воплощений 1-81.
83. Производное по любому из воплощений 1-57, где пролонгирующая группировка представляет собой Соед. 4.
84. Производное по любому из воплощений 1-83, где w является четным числом.
85. Производное по любому из воплощений 1-84, где w является целым числом в диапазоне 8-16; или, предпочтительно, в диапазоне 10-14.
86. Производное по любому из воплощений 1-85, где w составляет 10, 12 или 14; предпочтительно 14; более предпочтительно 10; или, наиболее предпочтительно, 12.
87. Производное по любому из воплощений 1-86, где Соед. 4 представлен формулой Соед. 4а:
Соед. 4а:
где w имеет значение, указанное в одном из воплощений 1-86.
88. Производное по любому из воплощений 1-87, где две пролонгирующие группировки существенно идентичны; например, идентичны по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%.
89. Производное по любому из воплощений 1-88, где две пролонгирующие группировки имеют сходство по меньшей мере 0,5; предпочтительно по меньшей мере 0,6; более предпочтительно по меньшей мере 0,7 или по меньшей мере 0,8; еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9; или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 0,99, например, сходство 1,0.
90. Производное по любому из воплощений 1-89, где два линкера являются практически идентичными; например, идентичными по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99%.
91. Производное по любому из воплощений 1-90, где два линкера имеют идентичность по меньшей мере 0,5; предпочтительно по меньшей мере 0,6; более предпочтительно по меньшей мере 0,7 или по меньшей мере 0,8; еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9; или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 0,99, например, идентичность 1,0.
92. Производное по любому из воплощений 1-91, где две альбумин-связывающие группировки, например, две боковые цепи, состоящие из пролонгирующей группировки и линкера, по существу идентичны, например, идентичны по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%.
93. Производное по любому из воплощений 1-92, где две альбумин-связывающие группировки, например, две боковые цепи, состоящие из пролонгирующей группировки и линкера, имеют сходство по меньшей мере 0,5; предпочтительно по меньшей мере 0,6; более предпочтительно по меньшей мере 0,7 или по меньшей мере 0,8; еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9; или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 0,99, например, сходство 1,0.
94. Производное по любому из воплощений 88-93, где две сравниваемые химические структуры представлены в виде отпечатков пальцев, таких как а) отпечатки пальцев ECFP_6; б) отпечатки пальцев UNITY; и/или в) отпечатки пальцев MDL, и где для каждого из а), б) и в) для расчета сходства, или идентичности, двух отпечатков пальцев предпочтительно используется коэффициент Танимото.
95. Производное по любому из воплощений 1-94, где
а) позиции, соответствующие позиции 37 и 26 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), и/или
б) количество аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQID №1)
идентифицируют путем рукописной записи и визуального контроля.
96. Производное по любому из воплощений 1-95, где
а) позиции, соответствующие позиции 37 и 26 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), и/или
б) количество аминокислотных замен по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1)
идентифицируют с использованием стандартной программы для выравнивания белка или пептида.
97. Производное по воплощению 96, где программа для выравнивания представляет собой выравнивание по Нидлману-Вуншу.
98. Производное по любому из воплощений 96-97, где используется матрица весов выравнивания по умолчанию и идентичная матрица по умолчанию.
99. Производное по любому из воплощений 96-98, где указанная матрица представляет собой BLOSUM62.
100. Производное по любому из воплощений 96-99, где штраф на первый остаток в делеции составляет -10 (минус десять).
101. Производное по любому из воплощений 96-100, где штраф на дополнительные остатки в делеции составляет -0,5 (минус ноль целых пять десятых).
102. Производное по любому из воплощений 1-101, где аналог не содержит остатки K, кроме первого и второго остатков K.
103. Производное по любому из воплощений 1-102, где аминокислотная модификация(и) имеется в одной или более чем одной позиции, соответствующей следующим позициям в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1): 7, 8, 9, 23, 30, 31, 34, 36, 37 и 38.
104. Производное по любому из воплощений 1-103, где аналог предпочтительно включает по меньшей мере две аминокислотные модификации по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1); при этом по меньшей мере две аминокислотные модификации предпочтительно находятся в каждой из позиций, соответствующих позиции 34 и 37 GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), и более предпочтительно являются такими, что аминокислота в позиции, соответствующей позиции 37, представляет собой K, а аминокислота в позиции, соответствующей позиции 34, не является K.
105. Производное по любому из воплощений 1-104, где аналог GLP-1 имеет C-концевой амид.
106. Производное по воплощению 105, где аминокислота в позиции, соответствующей позиции 34, представляет собой R или Q.
34
34
37
7
7
8
8
8
8
8
9
9
23
30
31
36
38
38
107. Производное по любому из воплощений 1-106, где аминокислотные модификации выбраны среди следующих: (R или Q), K, (Des или Imp), (D-Ala, Des, Aib, G или S), (Q или G), R, E, H, G и/или (Е или G).
34
34
37
7
7
8
8
9
9
23
30
31
36
38
38
108. Производное по любому из воплощений 1-107, где аминокислотные модификации выбраны среди следующих: (R или Q), K, (Des или Imp), (Desили Aib), (Q или G), R, Е, H, G и/или (Е или G).
34
34
37
109. Производное по любому из воплощений 1-108, где аналог включает (Rили Q) и K.
7
8
8
7
8
7
8
110. Производное по любому из воплощений 1-109, где аналог включает Imp, и/или (Aib или S), предпочтительно Imp и/или Aib, более предпочтительно Imp, или, наиболее предпочтительно, Aib.
38
38
38
111. Производное по любому из воплощений 1-110, где аналог включает Gили Е, предпочтительно Е.
9
9
112. Производное по любому из воплощений 1-111, где аналог включает Qили G.
36
113. Производное по любому из воплощений 1-112, где аналог включает G.
31
114. Производное по любому из воплощений 1-113, где аналог включает Н.
23
115. Производное по любому из воплощений 1-114, где аналог включает R.
7
8
116. Производное по любому из воплощений 1-115, где аналог включает des и/или des, предпочтительно оба.
117. Производное по любому из воплощений 1-116, где одна аминокислота была удалена в позиции, соответствующей позиции 7 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
118. Производное по любому из воплощений 1-117, где одна аминокислота была удалена в позиции, соответствующей позиции 8 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
119. Производное по любому из воплощений 1-118, где две аминокислоты были удалены в позициях, соответствующих позициям 7 и 8 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
120. Производное по любому из воплощений 1-119, которое является аналогом GLP-1(8-37) (аминокислоты 2-31 из SEQ ID №1), имеющим до десяти, девяти, восьми или шести аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
121. Производное по любому из воплощений 1-120, которое является аналогом GLP-1(9-37) (3-31 аминокислоты, соответственно, из SEQ ID №1), имеющим до десяти, девяти, восьми или шести аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
37
37
37
122. Производное по любому из воплощений 1-121, где аналог GLP-1 соответствует (a) K-GLP-1(7-37), (б) K-GLP-1(8-37), (в) K-GLP-1(9-37) или (г) аналогу одного из (а)-(в), имеющих до десяти, девяти, восьми или шести аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
123. Производное по любому из воплощений 1-122, где His-миметик, отличный от His, находится в позиции, соответствующей позиции 2 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
124. Производное по любому из воплощений 1-123, где His-Ala-миметик, отличный от His-Ala, находится в позиции, соответствующей позициям 7 и 8 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
125. Производное по любому из воплощений 123-124, где His-миметик или His-Ala-миметик включает а) имидазол; или б) пиридин.
126. Производное по воплощению 125, где имидазол является производным имидазола, которое включает *СО-конец для ковалентного связывания с *-NH N-концевой аминокислоты аналога через образование амидной связи.
127. Производное по воплощению 125, где пиридин является производным пиридина, которое включает *СО-конец для ковалентного связывания с *-NH N-концевой аминокислоты аналога через образование амидной связи.
128. Производное по любому из воплощений 125-127, где производное имидазола является монозамещенным.
129. Производное по любому из воплощений 125-127, где производное пиридина является монозамещенным.
130. Производное по любому из воплощений 125-129, где производное имидазола замещено группой, состоящей из карбоксильного радикала низшего алкила, имеющего от одного до шести атомов углерода.
131. Производное по любому из воплощений 125-129, где производное пиридина замещено группой, состоящей из карбоксильного радикала низшего алкила, имеющего от одного до шести атомов углерода.
132. Производное по любому из воплощений 130-131, где карбоксильный радикал выбран среди ацетила и прямого или разветвленного пропионила, бутирила, пентаноила; предпочтительно, является ацетилом.
133. Производное по любому из воплощений 1-132, где аминокислотный остаток в позиции, соответствующей позиции 8 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1) имеет 3Н-имидазол-4-ил-ацетил, присоединенный к его N-атому.
134. Производное по любому из воплощений 1-133, где аминокислотный остаток в позиции, соответствующей позиции 8 в SEQ ID №1, представляет собой аланин.
135. Производное по любому из воплощений 125-134, где имидазол замещен (метилкабамоил)-2-метил-пропионилом, (этилкарбамоил)-2-метил-пропионилом, (пропилкарбамоил)-2-метил-пропионилом или (бутилкарбамоил)-2-метил-пропионилом; предпочтительно (этилкарбамоил)-2-метил-пропионилом.
136. Производное по любому из воплощений 1-135, где аминокислотный остаток в позиции, соответствующей позиции 9 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), имеет {2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)-этилкарбамоил]-2-метил-пропионил}, присоединенный к его N-атому.
137. Производное по любому из воплощений 125-136, где пиридин замещен (метилкарбамоил)-2-метил-пропионилом, (этилкарбамоил)-2-метил-пропионилом, (пропилкарбамоил)-2-метил-пропионилом или (бутилкарбамоил)-2-метил-пропионилом; предпочтительно (метилкарбамоил)-2-метил-пропионилом.
138. Производное по любому из воплощений 1-137, где аминокислотный остаток в позиции, соответствующей позиции 9 в GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), имеет [2,2-диметил-3-оксо-3-(пиридин-2-илметиламино)пропаноил], присоединенный к его N-атому.
139. Производное по любому из воплощений 1-138, где аминокислотный остаток в позиции, соответствующей позиции 9 аналога GLP-1, является глутаминовой кислотой.
31
34
140. Производное по любому из воплощений 1-139, где аналог не содержит (Н и Q).
7
8
141. Производное по любому из воплощений 1-140, где аналог не содержит (des и des); и/или не содержит His-миметик, или His-Ala-миметик, определенный в любом из воплощений 116-140.
142. Производное по любому из воплощений 1-141, где аналог является аналогом GLP-1(7-37) или GLP-1(9-37).
143. Производное по любому из воплощений 1-142, где аналог предпочтительно включает следующие аминокислотные изменения, или модификации, по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1): i) (34R, 37K); ii) (8Aib, 34R, 37K); iii) (31Н, 34Q, 37K); iv) (des7, des8, 34R, 37K), и, возможно, 38Е; или v) (34R, 36G, 37K).
144. Производное по любому из воплощений 1-143, где аналог имеет не более девяти аминокислотных модификаций.
145. Производное по любому из воплощений 1-144, где аналог имеет не более восьми аминокислотных модификаций.
146. Производное по любому из воплощений 1-145, где аналог имеет не более семи аминокислотных модификаций.
147. Производное по любому из воплощений 1-146, где аналог имеет не более шести аминокислотных модификаций.
148. Производное по любому из воплощений 1-147, где аналог имеет не более пяти аминокислотных модификаций.
149. Производное по любому из воплощений 1-148, где аналог имеет не более четырех аминокислотных модификаций.
150. Производное по любому из воплощений 1-149, где аналог имеет не более трех аминокислотных модификаций.
151. Производное по любому из воплощений 1-150, где аналог имеет не более двух аминокислотных модификаций.
152. Производное по любому из воплощений 1-151, где аналог имеет по меньшей мере две аминокислотные модификации.
153. Производное по любому из воплощений 1-152, где аналог имеет по меньшей мере три аминокислотные модификации.
154. Производное по любому из воплощений 1-153, где аналог имеет по меньшей мере четыре аминокислотные модификации.
155. Производное по любому из воплощений 1-154, где аналог имеет по меньшей мере пять аминокислотных модификаций.
156. Производное по любому из воплощений 1-155, где аналог имеет по меньшей мере шесть аминокислотных модификаций.
157. Производное по любому из воплощений 1-156, где аналог имеет по меньшей мере семь аминокислотных модификаций.
158. Производное по любому из воплощений 1-157, где аналог имеет по меньшей мере восемь аминокислотных модификаций.
159. Производное по любому из воплощений 1-158, где аналог имеет по меньшей мере девять аминокислотных модификаций.
160. Производное по любому из воплощений 1-159, где аналог имеет по меньшей мере десять аминокислотных модификаций.
161. Производное по любому из воплощений 1-160, где аналог имеет одну аминокислотную модификацию.
162. Производное по любому из воплощений 1-161, где аналог имеет две аминокислотные модификации.
163. Производное по любому из воплощений 1-162, где аналог имеет три аминокислотные модификации.
164. Производное по любому из воплощений 1-163, где аналог имеет четыре аминокислотные модификации.
165. Производное по любому из воплощений 1-164, где аналог имеет пять аминокислотных модификаций.
166. Производное по любому из воплощений 1-165, где аналог имеет шесть аминокислотных модификаций.
167. Производное по любому из воплощений 1-166, где аналог имеет семь аминокислотных модификаций.
168. Производное по любому из воплощений 1-167, где аналог имеет восемь аминокислотных модификаций.
169. Производное по любому из воплощений 1-169, где аналог имеет девять аминокислотных модификаций.
170. Производное по любому из воплощений 1-170, где аналог имеет десять аминокислотных модификаций.
171. Производное по любому из воплощений 1-171, где модификации независимо представляют собой замены, добавления и/или удаления.
172. Производное по любому из воплощений 1-172, где модификации представляют собой замены.
173. Производное по любому из воплощений 1-173, где модификации представляют собой удаления.
174. Производное по любому из воплощений 1-174, где модификации представляют собой добавления.
175. Производное по любому из воплощений 1-174, где
а) позицию, соответствующую любой из указанных позиций GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), и/или
б) количество аминокислотных модификаций по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1)
идентифицируют путем рукописной записи и визуального контроля. 176. Производное по любому из воплощений 1-175, где
а) позицию, соответствующую любой из указанных позиций GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), и/или
б) количество аминокислотных замен по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1)
идентифицируют, как описано в одном из воплощений 96-101.
177. Соединение, выбранное среди следующих: Соед. 20, Соед. 21, Соед. 22, Соед. 23, Соед. 24, Соед. 25, Соед. 26, Соед. 27, Соед. 28, Соед. 29, Соед. 30, Соед. 31, Соед. 32, Соед. 33, Соед. 34, Соед. 35, Соед. 36, Соед. 37, Соед. 38, Соед. 39, Соед. 40, Соед. 41, Соед. 42, Соед. 43, Соед. 44, Соед. 45, Соед. 46, Соед. 47, Соед. 48, Соед. 49, Соед. 50, Соед. 51, Соед. 52, Соед. 53, Соед. 54, Соед. 55, Соед. 56, Соед. 57, Соед. 58, Соед. 59, Соед. 60, Соед. 61, Соед. 62, Соед. 63, Соед. 64, Соед. 65, Соед. 66, Соед. 67 и Соед. 68; или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
178. Соединение, характеризующееся его именем и выбранное из списка каждого из названий соединений примеров 1-49 данного документа, или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
179. Соединение по воплощению 178, которое представляет собой Соединение по воплощению 177.
180. Соединение по любому из воплощений 178 и 179, которое является производным любого из воплощений 1-176.
181. Производное по любому из воплощений 1-180, которое выбрано среди следующих:
(i)
ε26
ε37
34
36
37
N[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg,Gly,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 62:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Aib,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 58:
,
ε26
ε37
8
31
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,His,Gln,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 40:
,
ε26
ε37
9
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Gln,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 56:
,
ε26
ε37
8
34
37
N{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 21:
,
ε26
ε37
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[9-(4-карбоксифенокси)нонаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[9-(4-карбоксифенокси)нонаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 63:
,
ε26
ε37
8
31
34
37
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил][Aib,His,Gln,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 36:
,
ε26
ε37
31
34
37
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил], N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[His,Gln,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 55:
,
ε26
ε37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 51:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил], N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 44:
,
ε26
ε37
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептидил-Glu, и
Соед. 64:
;
(ii)
9
ε26
ε37
37
N-{2-[2-(1H-имидазол-4-ил)-этилкарбамоил]-2-метилпропионил}-N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg34,Lys]GLP-1(9-37)-пептид,
Соед. 46:
,
ε26
ε37
8
23
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Aib,Arg,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид,
Соед. 50:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 24:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-йодо-фенил)-бутириламино]-бутириламино}-этокси)-этокси]-ацетиламино}-этокси)-этокси]-ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-йодо-фенил)-бутириламино]-бутириламино}-этокси)-этокси]-ацетиламино}-этокси)-этокси]-ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид, и
Соед. 31:
;
(iii)
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 35:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 23:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил], N-[(S)-4-Карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 44:
,
ε26
ε37
8
34
37
N{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 21:
,
ε26
ε37
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид, и
Соед. 48:
;
(iv)
ε26
ε37
8
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси]этокси]ацетил}[Aib,Arg34,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 35:
,
ε26
ε37
8
34
37
N{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(3)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N{2-{2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид,
Соед. 21:
,
ε26
ε37
8
34
37
N[2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]], N-[2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид,
Соед. 29:
,
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-йодофенил)бутириламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(3)-4-карбокси-4-[4-(4-йодофенил)бутириламино]бутириламиноэтокси)этокси]ацетиламиноэтокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид, и
Соед. 31:
или фармацевтически приемлемые соли, амиды или сложные эфиры этих соединений.
182. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 62 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
183. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 40 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
184. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 21 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
185. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 55 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
186. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 51 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
187. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 44 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
188. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 46 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
189. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 31 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
190. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 35 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
191. Производное по воплощению 181, которое представляет собой Соед. 23 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир.
192. Производное по любому из воплощений 1-191, которое обладает активностью GLP-1.
193. Производное по воплощению 192, где активность GLP-1 относится к способности активировать человеческий рецептор GLP-1.
194. Производное по воплощению 193, где активацию человеческого рецептора GLP-1 измеряют в анализе in vitro как активность продукции цАМФ.
50
195. Производное по любому из воплощений 1-194, которое обладает силой, соответствующей EC
а) менее 10000 пМ, более предпочтительно менее 5000 пМ, еще более предпочтительно менее 4000 пМ, или, наиболее предпочтительно, менее 3000 пМ;
б) на уровне или менее 3000 пМ, предпочтительно менее 3000 пМ, более предпочтительно менее 2500 пМ, еще более предпочтительно менее 2000 пМ, или наиболее предпочтительно менее 1500 пМ;
в) менее 2000 пМ, предпочтительно менее 1000 пМ, более предпочтительно менее 800 пМ, еще более предпочтительно менее 600 пМ, или, наиболее предпочтительно, менее 500 пМ;
г) менее 400 пМ, предпочтительно менее 300 пМ, более предпочтительно менее 200 пМ, еще более предпочтительно менее 150 пМ, или, наиболее предпочтительно, менее 100 пМ;
50
д) менее 80 пМ, предпочтительно менее 60 пМ, более предпочтительно менее 50 пМ, еще более предпочтительно менее 40 пМ, или, наиболее предпочтительно, менее 30 пМ; или которое обладает силой, соответствующей ЕС,
50
50
50
50
50
е) которая в 10 раз меньше ЕС семаглутида, предпочтительно в 8 раз меньше ЕС семаглутида, более предпочтительно в 6 раз меньше EC семаглутида, еще более предпочтительно в 4 раза меньше ЕС семаглутида или, наиболее предпочтительно, в 2 раза меньше ЕС семаглутида;
50
50
50
50
50
ж) которая в 10 меньше ЕС лигарглутида, предпочтительно в 8 раз меньше ЕС Лигарглутида, более предпочтительно в 6 раз меньше EC лигарглутида, еще более предпочтительно в 4 раза меньше ЕС лигарглутида или, наиболее предпочтительно, в 2 раза меньше ЕС лигарглутида; или
50
50
50
50
50
з) которая меньше ЕС лигарглутида, предпочтительно меньше 0,8 ЕС лигарглутида, более предпочтительно меньше 0,6 ЕС лигарглутида, еще более предпочтительно меньше 0,5 EC лигарглутида или, наиболее предпочтительно, меньше 0,4 EC лигарглутида.
50
196. Производное по любому из воплощений 1-195, где сила определяется как ЕС для кривой «доза-реакция», показывающей дозозависимое образование цАМФ в среде, содержащей человеческий рецептор GLP-1, предпочтительно с использованием стабильно трансфицированных клеточных линий, таких как BHK467-12А (tk-ts13), и/или с использованием функционального анализа рецептора для определения цАМФ, например, на основе конкуренции между эндогенно образованным цАМФ и экзогенно добавленным биотин-меченым цАМФ, где анализируемую цАМФ более предпочтительно захватывают с помощью специфического антитела, и/или где еще более предпочтительным является анализ AlphaScreen cAMP Assay, наиболее предпочтительно описанный в примере 50.
50
50
197. Производное по любому из воплощений 1-196, для которого отношение [аффинности связывания рецептора GLP-1(IC) в присутствии 2,0% HSA (высокий альбумин) и аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA (низкий альбумин)] составляет:
а) по меньшей мере 0,5, предпочтительно по меньшей мере 1,0, более предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 20 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 30;
б) по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 60, еще более предпочтительно по меньшей мере 70 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 80;
в) по меньшей мере 90, предпочтительно по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 200, еще более предпочтительно по меньшей мере 300, еще более предпочтительно по меньшей мере 400, или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 500;
г) по меньшей мере 120, предпочтительно по меньшей мере 140, еще более предпочтительно по меньшей мере 160 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 180;
д) по меньшей мере 20% от отношения для семаглутида, предпочтительно по меньшей мере 50% от отношения для семаглутида, более предпочтительно по меньшей мере 75% от отношения для семаглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере равное отношению для семаглутида; или
е) по меньшей мере равно отношению для лираглутида, предпочтительно по меньшей мере в два раза больше отношения для лираглутида, более предпочтительно по меньшей мере в три раза больше отношения для лираглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере в 4 раза больше отношения для лираглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз больше отношения для лираглутида.
50
198. Производное по любому из воплощений 1-197, для которого аффинность связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA (низкий альбумин) составляет
а) меньше 1000,00 нМ, предпочтительно меньше 600,00 нМ, более предпочтительно меньше 100,00 нМ или, наиболее предпочтительно, меньше 50,00 нМ; или
б) меньше 20,00 нМ, предпочтительно меньше 10,00 нМ, более предпочтительно меньше 5,00 нМ, еще более предпочтительно меньше 2,00 нМ или, наиболее предпочтительно, меньше 1,00 нМ.
50
199. Производное по любому из воплощений 1-198, для которого аффинность связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 2,0% HSA (высокий альбумин) составляет
а) меньше 1100,00 нМ, предпочтительно на уровне 1000,00 нМ или меньше, более предпочтительно меньше 800,00 нМ или, наиболее предпочтительно, меньше 600 нМ; или
б) меньше 400,00 нМ, предпочтительно меньше 300,00 нМ, более предпочтительно меньше 200,00 нМ, еще более предпочтительно меньше 100,00 нМ или, наиболее предпочтительно, меньше 50,00 нМ.
125
200. Производное по любому из воплощений 1-199, где аффинность связывания рецептора GLP-1 измеряют путем вымещения I- GLP-1 с рецептора, предпочтительно с использованием SPA-связывающего анализа.
201. Производное по любому из воплощений 1-200, где рецептор GLP-1 получен с использованием стабильной трансфицированной клеточной линии, предпочтительно клеточной линии хомячка, более предпочтительно, клеточной линии почки детеныша хомячка, такой как BHK tk-ts13.
50
125
202. Производное по любому из воплощений 1-201, где значение IC определяется как концентрация, которая вытесняет 50% I-GLP-1 с рецептора.
203. Производное по любому из воплощений 1-202, которое имеет пероральную биодоступность, предпочтительно абсолютную пероральную биодоступность, которая выше, чем у семаглутида.
204. Производное по воплощению 203, биодоступность которого измеряют in vivo у крыс как присутствие в плазме после прямого введения в просвет кишечника.
205. Производное по любому из воплощений 1-204, для которого концентрация в плазме крови (пМ) производного, определяемая через 30 минут после введения раствора производного в тощую кишку крысы, разделенная на концентрацию (мкМ) введенного раствора (присутствие, корректируемое дозой, на 30 минуте), составляет по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 60, еще более предпочтительно по меньшей мере 70, еще более предпочтительно по меньшей мере 80 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100.
206. Производное по любому из воплощений 1-205, для которого концентрация в плазме крови (пМ) производного, определяемая через 30 минут после введения раствора производного в тощую кишку крысы, разделенная на концентрацию (мкМ) введенного раствора (присутствие, корректируемое дозой, на 30 минуте), составляет по меньшей 110, предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 130, еще более предпочтительно по меньшей мере 140, еще более предпочтительно по меньшей мере 150 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 160.
207. Производное по любому из воплощений 1-206, для которого концентрация в плазме крови (пМ) производного, определяемая через 30 минут после введения раствора производного в тощую кишку крысы, разделенная на концентрацию (мкМ) введенного раствора (присутствие, корректируемое дозой, на 30 минуте), составляет по меньшей мере 180, предпочтительно по меньшей мере 190, более предпочтительно по меньшей мере 200 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 210.
208. Производное по любому из воплощений 1-207, где производное GLP-1 испытывают в концентрации 1000 мкМ в смеси с 55 мг/мл капрата натрия.
209. Производное по любому из воплощений 1-208, где использовали крыс Sprague Dawley мужского пола, предпочтительно с массой тела по прибытии примерно 240 г.
210. Производное по любому из воплощений 1-209, где крыс лишали пищи примерно на 18 часов до начала эксперимента.
211. Производное по любому из воплощений 1-210, где крысам давали общую анестезию после периода без пищи и до введения производного в тощую кишку.
212. Производное по любому из воплощений 1-211, где производное вводили в проксимальную часть тощей кишки (10 см дистальнее от двенадцатиперстной кишки) или в среднюю часть кишки (50 см проксимальнее от слепой кишки).
213. Производное по любому из воплощений 1-212, где 100 мкл производного вводили в просвет тощей кишки через катетер с помощью шприца объемом 1 мл, а затем в просвет тощей кишки выталкивали 200 мкл воздуха с помощью другого шприца, который затем оставляли связанным с катетером для предотвращения обратного тока в катетер.
214. Производное по любому из воплощений 1-213, где в пробирки с EDTA собирали образцы крови (200 мкл) из хвостовой вены через требуемые промежутки времени, например, в моменты времени 0, 10, 30, 60, 120 и 240 минут, и центрифугировали 5 минут, 10000g, при 4°С в течение 20 минут.
215. Производное по любому из воплощений 1-214, где плазму (75 мкл) отделяли, немедленно замораживали и хранили при температуре -20°С до анализа на концентрацию производного в плазме.
216. Производное по любому из воплощений 1-215, где для анализа концентрации производного в плазме используется LOCI (иммунологический анализ люминесценции кислородных каналов).
217. Производное по любому из воплощений 1-216, которое является эффективным в снижении уровня глюкозы в крови in vivo у мышей db/db.
218. Производное по любому из воплощений 1-217, которое является эффективным в снижении массы тела in vivo у мышей db/db.
219. Производное по любому из воплощений 1-218, где мышам db/db вводят подкожно соответствующий диапазон доз производного GLP-1 и через соответствующие промежутки времени определяют глюкозу в крови и/или массу тела.
220. Производное по любому из воплощений 1-219, где доза производного GLP-1 составляет 0,3 нмоль/кг, 1,0 нмоль/кг, 3,0 нмоль/кг, 10 нмоль/кг, 30 нмоль/кг и 100 нмоль/кг, где кг относится к весу тела мыши.
221. Производное по любому из воплощений 1-220, где контрольной группе подкожно вводят носитель, предпочтительно в среде, в которой растворено производное GLP-1, например, со следующим составом: 50 мМ фосфат натрия, 145 мМ хлорид натрия, 0,05% Tween-80, pH 7,4.
222. Производное по любому из воплощений 1-221, где определяют уровень глюкозы в крови и/или взвешивают мышей в момент времени -½ ч (за полчаса до введения дозы (t=0)), и в моменты времени 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 и 96 часов.
223. Производное по любому из воплощений 1-222, где концентрацию глюкозы измеряют глюкозооксидазным способом.
224. Производное по любому из воплощений 1-223, где
50
(i) ED (массы тела (BW)) рассчитывается как доза, дающая повышение до половины максимального эффекта на дельта (например, уменьшение) BW через 24 часа после подкожного введения производного; и/или
50
(ii) ED (уровня глюкозы в крови (BG)) рассчитывается как доза, дающая повышение до половины максимального эффекта на AUC (площади под кривой) на дельта (например, уменьшение) BG через 8 часов после подкожного введения производного.
225. Производное по любому из воплощений 1-224, где существует сигмоидальное взаимоотношение «доза-реакция», предпочтительно с четким определением максимальной реакции.
226. Производное по любому из воплощений 1-225, которое имеет более длительный профиль действия, чем лираглутид.
227. Производное по воплощению 226, где замедление означает период полужизни in vivo у соответствующих видов животных, таких как мыши db/db, крысы, свиньи и/или, предпочтительно, минисвиньи, где производное вводят i) подкожно и/или, предпочтительно, ii) подкожно
228. Производное по любому из воплощений 1-227, где конечный период полужизни (T½) после внутривенного введения минисвиньям составляет
а) по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 36 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 48 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 60 часов;
б) по меньшей мере 7 часов, предпочтительно по меньшей мере 16 часов, более предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 30 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 40 часов;
в) по меньшей мере 44 часа, предпочтительно по меньшей мере 55 часов, более предпочтительно по меньшей мере 66 часов, более предпочтительно по меньшей мере 77 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 88 часов; или
г) по меньшей мере 0,2 от периода полужизни семаглутида, предпочтительно по меньшей мере 0,4 от периода полужизни семаглутида, более предпочтительно по меньшей мере 0,6 от периода полужизни семаглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8 от периода полужизни семаглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере столько же, сколько составляет период полужизни семаглутида.
229. Производное по воплощению 228, где минисвиньи являются геттингенскими минисвиньями мужского пола.
230. Производное по любому из воплощений 227-229, где возраст минисвиней составляет 7-14 месяцев, а вес, предпочтительно, 16-35 кг.
231. Производное по любому из воплощений 227-230, где минисвиньи размещены отдельно друг от друга и получают корм один или два раза в день, предпочтительно с соблюдением диеты SDS для минисвиней.
232. Производное по любому из воплощений 227-231, дозу которого вводят внутривенно по меньшей мере после двух недель акклиматизации.
233. Производное по любому из воплощений 227-232, где животных лишали пищи в течение примерно 18 часов перед введением дозы и в течение 4 часов после введения дозы, и обеспечивали им свободный доступ к воде в течение всего периода.
234. Производное по любому из воплощений 227-233, где производное GLP-1 растворяют в растворе с 50 мМ фосфатом натрия, 145 мМ хлоридом натрия, 0,05% Tween-80, pH 7,4 до подходящей концентрации, предпочтительно 20-60 нмоль/мл.
235. Производное по любому из воплощений 227-234, где внутривенное введение производного производят в объеме, соответствующем 1-2 нмоль/кг.
236. Производное по любому из воплощений 1-235, которое повышает стимулированную глюкозой секрецию инсулина у минисвиней.
237. Производное по воплощению 236, где минисвиньи являются геттингенскими минисвиньями мужского пола.
238. Производное по любому из воплощений 236-237, где возраст минисвиней составляет 7-14 месяцев.
239. Производное по любому из воплощений 236-238, где минисвиньи размещены отдельно друг от друга и получают корм один или два раза в день, предпочтительно корм для минисвиней SDS.
240. Производное по любому из воплощений 236-239, где одиночную дозу, возможно после периода с повышением дозы, вводят внутривенно или подкожно, в тонкую кожу за ухом.
241. Производное по любому из воплощений 236-240, где животных лишали пищи в течение примерно 18 часов перед введением дозы.
242. Производное по любому из воплощений 236-241, где анализируется базальная группа и ряд групп с выведенным дозами, соответствующими 2-6 различным уровням концентрации в плазме крови, где базальной группе а) вводили носитель, или б) ничего не вводили.
243. Производное по любому из воплощений 236-242, где концентрация в плазме крови составляет 3000-80000 пМ.
244. Производное по любому из воплощений 236-243, где выполняли одно-или двухчасовой внутривенный тест толерантности к глюкозе (IVGTT).
245. Производное по любому из воплощений 236-244, где 0,3 г/кг глюкозы давали внутривенно в течение 30 секунд и брали образцы в соответствующие моменты времени, например, в следующие моменты времени (t=0 соответствует болюсу глюкозы): -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 минут.
246. Производное по любому из воплощений 236-245, где определяют концентрацию в плазме производного, глюкозы и инсулина.
247. Производное по любому из воплощений 236-246, где концентрацию производного измеряют в момент времени t=0 мин и, возможно, в конце анализа (t=60 минут или t=120 минут).
248. Производное по любому из воплощений 236-247, где уровень глюкозы анализируют глюкозооксидазным способом.
249. Производное по любому из воплощений 236-248, где площадь под кривой инсулина (AUC инсулина) рассчитывают и используют как меру секреции инсулина.
250. Производное по любому из воплощений 236-249, где по меньшей мере одна их его концентраций, AUC инсулина, выше базальной AUC инсулина, предпочтительно составляет по меньшей мере 110% от нее, более предпочтительно по меньшей мере 120% от нее, еще более предпочтительно по меньшей мере 130% от нее или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 140% от нее.
251. Производное по любому из воплощений 1-250, которое приводит к снижению потребления корма у свиней по сравнению с контролем (предпочтительно с введением носителя, или без введения чего-либо);
возможно, потребление корма (0-24 ч) может составлять 90% или менее по сравнению с контролем, которому вводили носитель, предпочтительно 80% или менее, более предпочтительно 70% или менее, еще более предпочтительно 60% или менее, или, наиболее предпочтительно, 50% или менее;
где потребление корма (0-24 ч) относится к первым 24 часам после введения производного или носителя.
252. Производное по воплощению 251, где свиньи являются свиньями Ландрас Йоркшир Дюрок (LYD) женского пола.
253. Производное по любому из воплощений 251-252, где где возраст-свиней составляет 3 месяца, а вес, предпочтительно, 30-35 кг.
254. Производное по любому из воплощений 251-253, где животные помещены в группу на 1-2 недели для акклиматизации.
255. Производное по любому из воплощений 251-254, где в течение экспериментального периода животные помещены в индивидуальные загоны с утра понедельника до дневного времени в пятницу для измерения индивидуального потребления корма.
256. Производное по любому из воплощений 251-255, где животных кормят кормом для свиней (например, Svinefoder, Антонио) без ограничения количества.
257. Производное по любому из воплощений 251-256, где потребление корма контролируют путем записи веса корма каждые 15 минут, предпочтительно с использованием системы Mpigwin.
258. Производное по любому из воплощений 251-257, которое дозируют по 0,3, 1,0, 3,0, 10, или 30 нмоль/кг, предпочтительно растворяют в фосфатном буфере (50 мМ фосфата, 0,05% Tween-80, pH 8), более предпочтительно в концентрации 12, 40, 120, 400, или 1200 нмоль/мл.
259. Производное по любому из воплощений 251-258, где фосфатный буфер служит носителем.
260. Производное по любому из воплощений 251-259, где животным однократно подкожно вводят дозу производного или носителя (предпочтительно с объемом дозы 0,025 мл/кг) утром 1-го дня, а потребление корма измеряют в течение 4 дней после введения дозы.
261. Производное по любому из воплощений 1-260, у которого in vitro период полужизни (T½) в экстракте тонкого кишечника крыс, разделенный на соответствующий период полужизни (T½) GLP-1(7-37), составляет по меньшей мере 0,4, предпочтительно более 0,5, более предпочтительно более 1,0, еще более предпочтительно более 2,0, еще более предпочтительно более 3,0 или, наиболее предпочтительно, более 4,0.
262. Производное по любому из воплощений 1-261, у которого in vitro период полужизни (T½) в экстракте тонкого кишечника крыс, разделенный на соответствующий период полужизни (T½) GLP-1(7-37), составляет более 5,0, предпочтительно более 6,0, более предпочтительно более 7,0, еще более предпочтительно более 8,0, еще более предпочтительно более 9,0 или, наиболее предпочтительно, более 10,0.
263. Производное по любому из воплощений 261-262, где экстракт тонкого кишечника крысы получен так, как описано в примере 57, производное инкубируют в течение одного часа при температуре 37°С, концентрацию экстракта титруют так, что период полужизни GLP-1(7-37) находится в диапазоне 10-20 минут, например, 1,4 мкг/мл, полученные образцы анализируют путем UPLC и/или MALDI-TOF, и/или инкубацию и анализ проводят так, как описано в примере 57.
264. Производное по любому из воплощений 1-263, для которого отношение [периода полужизни (T½) in vitro в экстракте тонкого кишечника крысы к периоду полужизни (T½) GLP-1(7-37) in vitro в экстракте тонкого кишечника крысы] составляет по меньшей мере 0,5 от соответствующего отношения для семаглутида, предпочтительно является по меньшей мере в 2 раза больше, чем отношение для семаглутида, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше, чем отношение для семаглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз больше, чем отношение для семаглутида, или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 7 раза больше, чем отношение для семаглутида.
265. Производное по любому из воплощений 1-264, для которого отношение [периода полужизни (T½) в экстракте тонкого кишечника крысы к периоду полужизни (T½) GLP-1(7-37) в экстракте тонкого кишечника крысы] составляет по меньшей мере 0,1 от соответствующего отношения для лираглутида, предпочтительно по меньшей мере 0,4 от отношения для лираглутида, более предпочтительно по меньшей мере 0,8 от отношения для лираглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере 1,2 отношения для лираглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 1,5 отношения для лираглутида.
266. Производное по любому из воплощений 1-265, которое имеет период полужизни (T½) in vivo у крыс после внутривенного введения по меньшей мере 4 часа, предпочтительно по меньшей мере 6 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 8 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 10 часов.
267. Производное по любому из воплощений 1-266, которое имеет период полужизни (T½) in vivo у крыс после внутривенного введения по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 15 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 18 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 20 часов.
268. Производное по любому из воплощений 1-266, которое имеет период полужизни (T½) in vivo у крыс после внутривенного введения по меньшей мере 24 часа, предпочтительно по меньшей мере 26 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 30 часов.
269. Производное по любому из воплощений 266-268, где использовали крыс Sprague Dawley мужского пола с массой тела от 300 до 600 г.
270. Производное по любому из воплощений 1-269, которое имеет период полужизни (T½) in vivo у крыс после внутривенного введения по меньшей мере такой же, как период полужизни семаглутида, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше периода полужизни семаглутида, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше периода полужизни семаглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере 4 раза больше периода полужизни семаглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз больше периода полужизни семаглутида.
271. Производное по любому из воплощений 1-270, которое не является соединением Примеров 17, 21, 33, 34, 35 и 36; предпочтительно не является Соед. 36, Соед. 40, Соед. 52, Соед. 53, Соед. 54 и Соед. 55.
272. Производное по любому из воплощений 1-271, которое не является соединением Примеров 22, 23, 27 и 41, предпочтительно не является Соед. 41, Соед. 42, Соед. 46 и Соед. 60.
273. Производное Примера 19, предпочтительно Соед. 38.
274. Производное Примера 10, предпочтительно Соед. 29.
275. Промежуточный продукт в форме аналога GLP-1, который включает следующие модификации по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1):
(A) (i) (8Aib, 31Н, 34Q, 37K); (ii) (des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii) (des7-8, 34R, 37K); (iv) (8Aib, 9G, 34R, 37K); (v) (8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi) (31Н, 34Q, 37K); (vii) (9Q, 34R, 37K); (iix) (ЗОЕ, 34R. 37K); (ix) (34R, 37K, 38G); (x) (34R, 36G, 37K); или (xi) (34R, 37K, 38E);
где аналог предпочтительно выбран среди следующих аналогов GLP-1(7-37) (SEQ ID №1):
(В) (i-a) (8Aib, 31Н, 34Q, 37K); (ii-a) (des7-8, 34R, 37K, 38E); (iii-a) (des7-8, 34R, 37K); (iv-a) (8Aib, 9G, 34R, 37K); (v-a) (8Aib, 23R, 34R, 37K); (vi-a) (31Н, 34Q, 37K); (vii-a) (9Q, 34R, 37K); (iix-a) (30Е, 34R, 37K); (ix-a) (34R, 37K, 38G); (x-a) (34R, 36G, 37K); (xi-a) (34R, 37K, 38E); (xii-a) (7lmp, 34R, 37K); (xiii-a) (8Aib, 34R, 37K); и (xiv-a) (34R, 37K);
или фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир любого из аналогов (А) или (В).
276. Аналог по воплощению 275, где сравнение с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1) выполняют путем рукописной записи и визуального контроля.
277. Аналог по воплощению 275, где сравнение с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1) производят с использованием стандартной программы для выравнивания белков или пептидов.
278. Аналог по воплощению 277, где программой для выравнивания является выравнивание по Нидлману-Вуншу.
279. Аналог по любому из воплощений 277-278, где используется матрица весов выравнивания по умолчанию и идентичная матрица по умолчанию.
280. Аналог по любому из воплощений 277-279, где матрица весов выравнивания представляет собой BLOSUM62.
281. Аналог по любому из воплощений 277-280, где штраф на первый остаток в делеции составляет -10 (минус десять).
282. Аналог по любому из воплощений 277-281, где штраф на дополнительные остатки в делеции составляет -0,5 (минус ноль целых пять десятых).
283. Аналог по любому из воплощений 277-282, который обладает активностью GLP-1.
284. Аналог по воплощению 283, где активность GLP-1 определяют так, как описано в воплощениях 192-196.
285. Промежуточный продукт, включающий пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2c, Соед. 3b и Соед. 4b:
6
4
2
y
Соед. 2c: НООС-СН-O-(СН)-СО-PG
1
6
4
2
z
Соед. 3b: R-CH-(CH)-CO-PG
4
2
2
w
Соед. 4b: HOOC-CSH-(CH)-CO-PG,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, w является целым числом в диапазоне 6-18, a PG является защитной группой; где, возможно, дистальная *-СООН-группа пролонгирующей группировки, если она присутствует, предпочтительно также защищена; или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
286. Промежуточный продукт по воплощению 285, где *-CO-PG представляет собой i) *-COOH, или ii) активированный эфир.
287. Промежуточный продукт по воплощению 286, где активированный эфир представляет собой эфир п-нитрофенола; 2,4,5-трихлорфенола; N-гидроксисукцинимида; N-гидроксисульфосукцинимида; 3,4-дигидро-3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4-,5-хлор-8-оксихинолина; имида N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоновой кислоты; пентафторфенола; п-сульфотетрафторфенола; N-гидроксифталимида; 1-гидроксибензотриазола; 1-гидрокси-7-азабензотриазола; N-гидроксималеимида; 4-гидрокси-3-нитробензолсульфокислоты; или любые другие активированные эфиры, известные в данной области.
288. Промежуточный продукт по любому из воплощений 285-287, который содержит
а) пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, а w является целым числом в диапазоне 6-18; и
б) линкер, выбранный среди Соед. 5b, Соед. 6 и Соед. 7:
Соед. 5b:
Соед. 6а:
и/или
Соед. 7a:
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5; a PG является защитной группой; где, возможно, *-СООН-группа пролонгирующей группировки, если она присутствует, предпочтительно также защищена, как описано в данной области, предпочтительно функционирует как нереактивный эфир; или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
289. Промежуточный продукт по любому из воплощений 285-288, где линкер является таким, как определено в одном из воплощений 1-57.
290. Промежуточный продукт по любому из воплощений 285-289, где пролонгирующая группировка является такой, как определено в любом из воплощений 1-87.
291. Промежуточный продукт, содержащий, предпочтительно состоящий из
а) пролонгирующей группировки, выбранной среди Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18; и
б) линкера, содержащего Соед. 5b:
Соед. 5b:
,
где k является целым числом в диапазоне 1-5, и n является целым числом в диапазоне 1-5; a PG является защитной группой;
где, возможно, дистальная *-СООН-группа пролонгирующей группировки, если она присутствует, предпочтительно также защищена, как известно в данной области; предпочтительно образованием нереактивного эфира; более предпочтительно i) эфира со спиртом с объемной боковой цепью, например, эфира фенола, возможно замещенного, или ii) эфира алкила с разветвленной цепью, предпочтительно низшего алкила; наиболее предпочтительно защищенного как OtBu, OBz и т.п.; или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
292. Промежуточный продукт, предпочтительно по любому из воплощений 285-291, выбранный среди следующих:
Соед. 69:
;
Соед. 70:
;
Соед.71:
;
Соед.72:
;
Соед.73:
;
Соед. 74:
;
Соед. 75:
;
Соед. 76:
;
Соед. 77:
;
Соед. 78:
;
Соед. 79:
;
Соед. 80:
;
Соед. 81:
;
Соед. 82:
;
и
Соед. 83:
;
где, возможно, одна или более чем одна *-СООН-группа, предпочтительно дистальная *-СООН-группа пролонгирующей группировки, также является защищенной.
293. Производное по любому из воплощений 1-274 для применения в качестве лекарственного средства.
294. Производное по любому из воплощений 1-274 для применения в лечении и/или профилактике всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания.
295. Применение производного по любому из воплощений 1-274 в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания.
296. Способ лечения или профилактики всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечнососудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания путем введения фармацевтически активного количества производного по любому из воплощений 1-274.
297. Производное аналога GLP-1, который включает пролонгирующую группировку, выбранную среди Соед. 2, Соед. 3 и Соед. 4:
6
4
2
y
Соед. 2: НООС-СН-O-(СН)-СО-*
1
6
4
2
z
Соед. 3: R-CH-(CH)-CO-*
4
2
2
w
Соед. 4: HOOC-CSH-(CH)-CO-*,
1
где x является целым числом в диапазоне 6-18, y является целым числом в диапазоне 3-17, z является целым числом в диапазоне 1-5, R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да, a w является целым числом в диапазоне 6-18;
или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
298. Производное по воплощению 297, где аналог GLP-1 является таким, как определено в любом из воплощений 1-296.
299. Производное по любому из воплощений 297-298, где пролонгирующая группировка является такой, как определено в любом из воплощений 1-296.
300. Производное по любому из воплощений 297-299, которое также содержит линкер, предпочтительно такой, как определено в любом из воплощений 1-296.
Дополнительные частные воплощения
Ниже приведены дополнительные частные воплощения изобретения:
37
26
37
1
1
2
n
6
4
2
m
6
4
2
p
1. Производное аналога GLP-1, где аналог GLP-1 представляет собой K-GLP-1(7-37) или его аналог, имеющий до шести аминокислотных остатков, измененных по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1), при этом производное имеет две альбумин-связывающие группировки, присоединенные к K и K, соответственно, где альбумин-связывающая группировка содержит пролонгирующую группировку, выбранную среди НООС-(СН)-СО-, НООС-СН-O-(СН)-СО- и R-CH-(CH)-CO-, где n является целым числом в диапазоне 8-16, m является целым числом в диапазоне 7-17, p является целым числом в диапазоне 1-5, a R представляет собой группу с молекулярной массой не более 150 Да;
или его фармацевтически приемлемая соль, амид или сложный эфир.
2. Производное по воплощению 1, где n является четным числом.
3. Производное по воплощению 2, где n составляет 8, 10, 12, 14 или 16, предпочтительно 10, 12 или 14.
4. Производное по воплощению 1, где m является нечетным числом.
5. Производное по воплощению 4, где m составляет 7, 9, 11, 13, 15 или 17; предпочтительно 9, 11 или 15; наиболее предпочтительно 9.
6. Производное по воплощению 1, где p является нечетным числом.
7. Производное по воплощению 6, где p составляет 1, 3, 5, предпочтительно 3.
8. Производное по любому из воплощений 1 и 4-5, где СООН-группа находится в мета- или пара-положении, предпочтительно в пара-положении.
1
9. Производное по любому из воплощений 1-8, где R имеет молярную массу не более 130 Да, предпочтительно не более 100 Да, более предпочтительно не более 75 Да, еще более предпочтительно не более 60 Да или, наиболее предпочтительно, не более 50 Да.
1
10. Производное по любому из воплощений 1-9, где R имеет молярную массу не более 40 Да, предпочтительно не более 30 Да, более предпочтительно не более 20 Да и, наиболее предпочтительно, не более 15 Да.
1
11. Производное по любому из воплощений 1-10, где R выбран среди галогена и прямого или разветвленного алкила с 1-5 C-атомами.
1
12. Производное по любому из воплощений 1 и 6-7, где R представляет собой метил или третбутил.
1
13. Производное по воплощению 12, где R находится в пара-положении.
1
14. Производное по любому из воплощений 1 и 6-7, где R представляет собой -I.
1
15. Производное по воплощению 14, где R находится в пара-положении.
16. Производное по любому из воплощений 1-15, где аналог GLP-1 имеет не более пяти, предпочтительно не более четырех, более предпочтительно не более трех или, наиболее предпочтительно, не более двух аминокислотных изменений по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
17. Производное по любому из воплощений 1-16, где аналог GLP-1 имеет C-концевой амид.
18. Производное по любому из воплощений 1-16, где аналог GLP-1 имеет C-концевую -СООН-группу, или его фармацевтически приемлемая соль.
19. Производное по любому из воплощений 1-18, где аналог GLP-1 содержит по меньшей мере одно удаление по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
20. Производное по любому из воплощений 1-19, где одна или две аминокислоты были удалены на N-конце аналога GLP-1, так что аналог предпочтительно содержит des7, des8, или (des7+des8); более предпочтительно des7 или (des7+des8).
21. Производное по любому из воплощений 1-20, где аналог GLP-1 представляет собой аналог GLP-1(8-37) или GLP-1(9-37), имеющий до шести аминокислотных остатков, измененных по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
37
37
37
22. Производное по любому из воплощений 1-21, где аналог GLP-1 выбран среди следующих: (i) K-GLP-1(7-37), (ii) K-GLP-1(8-37), (iii) K-GLP-1(9-37) или (iv) аналога одного из (i)-(iii), имеющих до шести аминокислотных изменений по сравнению с GLP-1(7-37) (SEQ ID №1).
23. Производное по любому из воплощений 20-21 или 22(ii)-(iv), где His-миметик или His-Ala-миметик добавлен к новой N-концевой аминокислоте.
24. Производное по любому из воплощений 20-23, где производное имидазола со свободной карбоксильной группой ковалентно связано с N-концом, предпочтительно через образование амидной связи между свободной карбоксильной группой и N-концевой группой.
25. Производное по воплощению 24, где производное имидазола является монозамещенным имидазолом.
26. Производное по воплощению 25, где имидазол замещен карбоксильным радикалом низшего алкила, имеющим от одного до шести атомов углерода.
27. Производное по воплощению 26, где карбоксильный радикал выбран среди ацетила и прямого или разветвленного пропионила, бутирила, пентаноила; предпочтительно является ацетилом.
28. Производное по любому из воплощений 1-27, где аминокислотный остаток в позиции 8 аналога GLP-1 имеет 3Н-имидазол-4-ил-ацетил, присоединенный к его N-атому.
29. Производное по любому из воплощений 1-28, где аминокислотный остаток в позиции 8 аналога GLP-1 является аланином.
30. Производное по воплощению 25, где имидазол заменен (метилкарбамоил)-2-метилпропионилом, (этилкарбамоил)-2-метилпропионилом, (пропилкарбамоил)-2-метилпропионилом или (бутилкарбамоил)-2-метилпропионилом.
31. Производное по воплощению 30, где имидазол заменен (метилкарбамоил)-2-метилпропионилом, (этилкарбамоил)-2-метилпропионилом или (пропилкарбамоил)-2-метилпропионилом, предпочтительно (этилкарбамоил)-2-метилпропионилом.
32. Производное по любому из воплощений 1-31, где аминокислотный остаток в позиции 9 аналога GLP-1 имеет {2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)этилкарбамоил)-2-метил-пропионил}, прикрепленный к его N-атому.
33. Производное по любому из воплощений 1-32, где аминокислотный остаток в позиции 9 аналога GLP-1 является глутаминовой кислотой.
34. Производное по любому из воплощений 1-33, которое, в дополнение к 37K, содержит по меньшей мере одну из следующих замен: 8Aib; 31Н; 34Е, Q, R и/или 38Е.
35. Производное по воплощению 34, которое содержит 8Aib.
36. Производное по воплощению 34, которое содержит 34Е, 34Q или 34R; предпочтительно 34R.
37. Производное по воплощению 35, которое также содержит 34R.
38. Производное по воплощению 34, которое также содержит 31Н.
39. Производное по воплощению 35, которое также содержит 31Н и/или 34Q, предпочтительно одновременно.
40. Производное по воплощению 34, которое содержит 34R.
41. Производное по воплощению 34, которое содержит 38Е.
42. Производное по воплощению 37, которое также содержит 38Е.
43. Производное по любому из воплощений 1-42, в котором две альбумин-связывающие группировки похожи; предпочтительно в значительной степени идентичны; или, наиболее предпочтительно, идентичны.
44. Производное по любому из воплощений 1-43, в котором две пролонгирующие группировки похожи; предпочтительно в значительной степени идентичны; или, наиболее предпочтительно, идентичны.
45. Производное по любому из воплощений 1-44, в котором две альбумин-связывающие группировки и/или две пролонгирующие группировки в процентном отношении идентичны по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99%.
46. Производное по воплощению 45, где процент идентичности определяют с помощью моделирования данных с коэффициентом сходства Танимото и отпечатком пальцев ECFP_6 с расширенной возможностью взаимодействия.
47. Производное по любому из воплощений 1-46, в котором альбумин-связывающие группировки прикреплены к эпсилон-аминогруппе остатков лизина в позиции 26 и 37, соответственно, через амидные связи, возможно через линкерную группировку.
48. Производное по любому из воплощений 1-47, в котором альбумин-связывающая группировка содержит линкерную группировку, которая одним концом прикреплена через амидную связь к СО-группе пролонгирующей группировки, а другим концом присоединена через амидную связь к эпсилон-аминогруппе остатков лизина в позиции 26 и 37, соответственно.
49. Производное по любому из воплощений 47-48, в котором линкерная группировка имеет от 5 до 30 С-атомов, предпочтительно от 5 до 25 С-атомов, более предпочтительно от 5 до 20 С-атомов или, наиболее предпочтительно, от 5 до 17 С-атомов.
50. Производное по любому из воплощений 47-49, в котором линкерная группировка имеет от 4 до 20 гетероатомов, предпочтительно от 4 до 18 гетероатомов, более предпочтительно от 4 до 14 гетероатомов или, наиболее предпочтительно, от 4 до 12 гетероатомов.
51. Производное по воплощению 50, в котором гетероатомами являются N-и/или O-атомы.
52. Производное по любому из воплощений 47-51, в котором линкерная группировка выбрана среди следующих:
, , , , , ,  и .
53. Производное по любому из воплощений 47-52, в котором линкерная группировка включает по меньшей мере один радикал OEG и/или по меньшей мере один радикал Glu (глутаминовой кислоты).
54. Производное по воплощению 53, в котором линкер содержит один радикал OEG или один радикал Glu, гамма-карбоксильная группа которого предпочтительно формирует амидную связь с эпсилон-аминогруппой остатка лизина.
55. Производное по воплощению 53, в котором линкер состоит из двух радикалов OEG или двух радикалов Glu, при этом радикалы между собой соединены посредством амидных связей, и таким образом, предпочтительно, в случае двух радикалов Glu, гамма-карбоксильная группа одного Glu формирует амидную связь с эпсилон-аминогруппой остатка лизина, или (еще более предпочтительно «и») гамма-карбоксильная группа другого Glu формирует амидную связь с аминогруппой первого Glu.
56. Производное по воплощению 53, в котором линкер включает по меньшей мере один OEG-радикал и по меньшей мере один Glu-радикал, предпочтительно по одному каждого, при этом более предпочтительно карбокси-конец OEG-радикала формирует амидную связь с эпсилон-аминогруппой остатка лизина, и амино-концец OEG-радикала формирует амидную связь с гамма-карбоксильной группой Glu-радикала.
57. Производное по воплощению 56, в котором линкер состоит из одного Glu-радикала и двух OEG-радикалов, предпочтительно выбранных среди следующих: -Glu-OEG-OEG-, -OEG-Glu-OEG- и -OEG-OEG-Glu-, где аминогруппа крайнего левого радикала формирует амидную связь с protractor группировкой, а карбоксильная группа крайнего правого радикала формирует амидную связь с эпсилон-аминогруппой остатка лизина, преимущественно, в случае радикала Glu на правом конце, его гамма-карбоксильная группа задействована в амидной связи.
50
58. Производное по любому из воплощений 1-57, которое имеет силу (EC) на уровне или менее 3000 пМ, предпочтительно менее 3000 пМ, более предпочтительно менее 2500 пМ, еще более предпочтительно менее 2000 пМ или, наиболее предпочтительно, менее 1500 пМ.
50
59. Производное по любому из воплощений 1-58, которое имеет силу (ЕС) менее 1000 пМ, предпочтительно менее 800 пМ, более предпочтительно менее 600 пМ, еще более предпочтительно менее 400 пМ или, наиболее предпочтительно, менее 200 пМ.
50
60. Производное по любому из воплощений 1-59, которое имеет силу (ЕС) менее 180 пМ, предпочтительно менее 160 пМ, более предпочтительно менее 140 пМ, еще более предпочтительно менее 120 пМ или, наиболее предпочтительно, менее 100 пМ.
50
61. Производное по любому из воплощений 1-60, которое имеет силу (EC) менее 80 пМ, предпочтительно менее 60 пМ, более предпочтительно менее 50 пМ, еще более предпочтительно на уровне или менее 40 пМ или, наиболее предпочтительно, менее 30 пМ.
62. Производное по любому из воплощений 58-61, где сила определяется как стимуляция образования цАМФ в среде, содержащей человеческий рецептор GLP-1, предпочтительно с использованием стабильно трансфицированной клеточной линии, такой как BHK467-12А (tk-ts13), и/или с помощью определения цАМФ в функциональном рецепторном анализе, например, на основании конкуренции между эндогенно образованным цАМФ и экзогенно добавленным биотин-меченым цАМФ, где в анализе цАМФ более предпочтительно захватывают с помощью специфического антитела, и/или где еще более предпочтительным является анализ AlphaScreen cAMP Assay, наиболее предпочтительно такой, который описан в Примере 50.
50
63. Производное по любому из воплощений 1-62, сила которого (ЕС) в 10 раз меньше силы семаглутида, предпочтительно в 8 раз меньше силы семаглутида, более предпочтительно в 6 раз меньше силы семаглутида, еще более предпочтительно в 4 раза меньше силы семаглутида или, наиболее предпочтительно, в 2 раза меньше силы семаглутида.
50
64. Производное по любому из воплощений 1-63, сила (ЕС) которого в 10 раз меньше силы лираглутида, предпочтительно в 8 раз меньше силы лираглутида, более предпочтительно в 6 раз меньше силы лираглутида, еще более предпочтительно в 4 раза меньше силы лираглутида или, наиболее предпочтительно, в 2 раза меньше силы лираглутида.
50
65. Производное по любому из воплощений 1-64, сила (ЕС) которого меньше, чем сила лираглутида, предпочтительно меньше 0,8 от силы лираглутида, более предпочтительно меньше 0,6 от силы лираглутида, еще более предпочтительно меньше 0,5 от силы лираглутида или, наиболее предпочтительно, меньше 0,4 от силы лираглутида.
50
50
66. Производное по любому из воплощений 1-65, для которого соотношение [аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 2,0% сывороточного альбумина человека (HSA) и аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA] составляет по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 20, еще более предпочтительно по меньшей мере 30 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 40.
50
50
67. Производное по любому из воплощений 1-66, для которого отношение [аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 2,0% сывороточного альбумина человека (HSA) и аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA] составляет по меньшей мере 50, предпочтительно по меньшей мере 60, более предпочтительно по меньшей мере 70, еще более предпочтительно по меньшей мере 80 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90.
50
50
68. Производное по любому из воплощений 1-67, для которого отношение [аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 2,0% сывороточного альбумина человека (HSA) и аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA] составляет по меньшей мере 100, предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 140, еще более предпочтительно по меньшей мере 160, еще более предпочтительно по меньшей мере 180 или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 200.
50
125
69. Производное по любому из воплощений 1-68, где аффинность связывания рецептора GLP-1 (IC) измеряют путем вымещения I- GLP-1 с рецептора, при этом рецептор предпочтительно находится в форме мембран из стабильной клеточной линии, такой как BHK tk-ts13, трансфицированной человеческим рецептором GLP-1; и/или с использованием SPA-связывания, предпочтительно с использованием SPA-частиц, таких как SPA-бидсы из агглютинина зародышей пшеницы, при этом связывание наиболее предпочтительно проводят так, как описано в Примере 51.
50
50
70. Производное по любому из воплощений 1-69, для которого отношение [аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 2,0% сывороточного альбумина человека (HSA) и аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA] составляет по меньшей мере 20% от отношения для семаглутида, предпочтительно по меньшей мере 50% от отношения для семаглутида, более предпочтительно по меньшей мере 75% от отношения для семаглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере равно отношению для семаглутида.
50
50
71. Производное по любому из воплощений 1-70, для которого отношение [аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 2,0% сывороточного альбумина человека (HSA) и аффинности связывания рецептора GLP-1 (IC) в присутствии 0,005% HSA] равно отношению для лираглутида, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше отношения для лираглутида, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше отношения для лираглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере в 4 раза больше отношения для лираглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз больше отношения для лираглутида.
72. Производное по любому из воплощений 1-71, период полужизни (T½) in vitro которого в экстракте тонкого кишечника крыс, разделенный на соответствующий период полужизни (T½) GLP-1(7-37), составляет по меньшей мере 0,5, предпочтительно более 1,0, более предпочтительно более 2,0, еще более предпочтительно более 3,0 или, наиболее предпочтительно, более 4,0.
73. Производное по любому из воплощений 1-72, период полужизни (T½) in vitro которого в экстракте тонкого кишечника крыс, разделенный на соответствующий период полужизни (T½) GLP-1(7-37), составляет более 5,0, предпочтительно более 6,0, более предпочтительно более 7,0 или, наиболее предпочтительно, более 8,0.
74. Производное по любому из воплощений 72-73, где экстракт тонкого кишечника крысы получают так, как описано в примере 57, производное инкубируют в течение одного часа при температуре 37°С, концентрацию экстракта титруют так, что период полужизни GLP-1(7-37) находится в диапазоне от 10 до 20 минут, например, 1,4 мкг/мл, полученные образцы анализируют путем UPLC и/или MALDI-TOF, и/или инкубацию и анализ проводят так, как описано в примере 57.
75. Производное по любому из воплощений 1-74, для которого отношение [периода полужизни (T½) in vitro в экстракте тонкого кишечника крыс к соответствующему периоду полужизни (T½) in vitro GLP-1(7-37)] составляет по меньшей мере 0,5 от соответствующего отношения для семиглутида, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше отношения для семиглутида, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше отношения для семиглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз больше отношения для семиглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 7 раз больше отношения для семиглутида.
76. Производное по любому из воплощений 1-75, для которого отношение [периода полужизни (T½) в экстракте тонкого кишечника крыс к соответствующему периоду полужизни (T½) GLP-1(7-37)] составляет по меньшей мере 0,1 от соответствующего отношения для лираглутида, предпочтительно по меньшей мере 0,4 от соответствующего отношения для лираглутида, более предпочтительно по меньшей мере 0,8 от соответствующего отношения для лираглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере 1,2 от соответствующего отношения для лираглутида, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 1,5 от соответствующего отношения для лираглутида.
76. Производное по любому из воплощений 1-75, которое имеет период полужизни (T½) in vivo у крыс после внутривенного введения по меньшей мере 4 часа, предпочтительно по меньшей мере 6 часов, еще более предпочтительно по меньшей мере 8 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 10 часов.
77. Производное по любому из воплощений 1-76, период полужизни (T½) in vivo которого у крыс после внутривенного введения составляет по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 15 часов, более предпочтительно по меньшей мере 18 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 20 часов.
78. Производное по любому из воплощений 76-77, где использовали крыс Sprague Dawley мужского пола с массой тела от 300 до 600 г.
79. Производное по любому из воплощений 1-78, период полужизни (T½) in vivo которого у крыс после внутривенного введения является по меньшей мере таким же, как период полужизни семиглутида, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше периода полужизни семиглутида, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше периода полужизни семиглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере в 4 раза больше периода полужизни семиглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз больше периода полужизни семиглутида.
80. Производное по любому из воплощений 1-79, период полужизни (T½) in vivo которого у минисвиней после внутривенного введения составляет по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часов, более предпочтительно по меньшей мере 36 часов, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 60 часов.
81. Производное по воплощению 80, где минисвиньи являются геттингенскими минисвиньями мужского пола.
82. Производное по любому из воплощений 1-81, период полужизни (T½) in vivo которого у минисивней после внутривенного введения составляет по меньшей мере 0,2 от периода полужизни семиглутида, предпочтительно по меньшей мере 0,4 от периода полужизни семиглутида, более предпочтительно по меньшей мере 0,6 от периода полужизни семиглутида, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8 от периода полужизни семиглутида или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере является таким же, как период полужизни семиглутида.
83. Производное GLP-1, выбранное среди следующих:
ε26
ε37
8
37
(i) N-[2-(2-{2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg34,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(ii) N{2-[2-(-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
E37
8
34
37
(iii) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(iv) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(v) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(vi) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептидаамид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(vii) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(iix) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(ix) N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(х) N-[2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]], N-[2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xi) N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-карбокси-тридеканоиламино)этокси]этокси}ацетиламино)этокси]этокси}ацетил), N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-карбокситридеканоиламино)этокси]этокси}ацетиламино)этокси]этокси}ацетил)[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептидаамид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xii) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-йодофенил)бутириламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-йодофенил)бутириламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси}ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид.
;
ε26
ε37
8
34
37
(xiii) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(4-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(4-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xiv) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(3-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(3-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xv) N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xvi) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
31
34
37
(xvii) N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил][Aib,His,Gln,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(iixx) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-метилфенил)бутириламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-метилфенил)бутириламино]бутириламино}этокси)этокси]-ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(ixx) N-((S)-4-карбокси-4-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)-деканоиламино]бутириламино}бутирил), N-((S)-4-карбокси-4-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}бутирил)[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(хх) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-карбокси-4-[10-(3-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-карбокси-4-[10-(3-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
31
34
37
(xxi) N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,His,Gln,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
9
ε26
ε37
37
38
(xxii) N-{2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)этилкарбамоил]-2-метилпропионил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg34,Lys]GLP-1(9-37)Glu-пептид:
;
9
ε26
ε37
37
(xxiii) N-{2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)этилкарбамоил]-2-метилпропионил}-N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg34,Lys]GLP-1(9-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xxiv) N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xxv) N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил], N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
ε26
ε37
8
34
37
(xxvi) N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбокси-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид:
;
и
9
ε26
ε37
34
37
(xxvii) N-{2-[2-(1H-имидазол-4-ил)этилкарбамоил]-2-метилпропионил}-N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептид:
;
или фармацевтически приемлемая соль, амид, или эфир любого из производных (i)-(xxvii).
84. Производное по любому из воплощений 1-83 для применения в качестве лекарственного препарата.
85. Производное по любому из воплощений 1-83 для применения в лечении и/или профилактике всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания.
86. Применение производного по любому из воплощений 1-83 в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания.
87. Способ лечения или профилактики всех форм сахарного диабета и связанных с ним заболеваний, таких как пищевые расстройства, сердечнососудистые заболевания, желудочно-кишечные заболевания, диабетические осложнения, критические заболевания и/или синдром поликистоза яичников; и/или для улучшения параметров липидного обмена, улучшения функционирования β-клеток и/или для отсрочки или предотвращения прогрессирования диабетического заболевания путем введения фармацевтически активного количества производного по любому из воплощений 1-83.
Примеры
Эта экспериментальная часть начинается со списка сокращений, а за ним следует раздел, включающий общие способы синтеза и характеризации аналогов и производных изобретения. Затем следует ряд примеров, которые относятся к изготовлению частных производных GLP 1, и в конце включено несколько примеров, связанных с активностью и свойствами этих аналогов и производных (раздел, названный «Фармакологические способы»).
Примеры служат для иллюстрации изобретения.
Сокращения
В данном документе используются следующие сокращения, расположенные в алфавитном порядке:
Aib: аминоизомасляная кислот (α-аминоизомасляная кислота)
API: активный фармацевтический ингредиент
AUC: площадь под кривой
BG: уровень глюкозы в крови
BHK клетки почек детеныша хомячка
BW: масса тела
Bom: бензилоксиметил
Boc: трет-бутилоксикарбонил
BSA: бычий сывороточный альбумин
Bzl: бензил
Clt: 2-хлортритил
коллидин: 2,4,6-триметилпиридин
DCM: дихлорметан
Dde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этил
DIC: диизопропилкарбодиимид
DIPEA: диизопропилэтиламин
DMAP: 4-диметиламинопиридин
DMEM: среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM)
EDTA: этилендиаминтетрауксусная кислота
EGTA: этиленгликольтетрауксусная кислота
FCS: эмбриональная телячья сыворотка
Fmoc: 9-фторенилметилоксикарбонил
HATU: (O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат)
HBTU: (2-(1Н-бензотриазол-1-ил-)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат)
HEPES: 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
HFIP: 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол или гексафторизопропанол
HOAt: 1-окси-7-азабензотриазол
HOBt: 1-гидроксибензотриазол
HPLC: высокоэффективная жидкостная хроматография
HSA: человеческий сывороточный альбумин
IBMX: 3-изобутил-1-метилксантин
Imp: имидазолпропионовая кислота (также известная как дезаминогистидин, desH)
i.v. внутривенно
ivDde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил
IVGTT: внутривенный тест толерантности к глюкозе
LCMS: жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
LYD: Ландрас Йоркшир Дюрок
MALDI-MS: См. MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS: матрично-активированная лазерная десорбция/времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией
МеОН: метанол
Mmt: 4-метокситритил
Mtt: 4-метилтритил
NMP: N-метилпирролидон
OBz: бензоиловый эфир
OEG: 8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота
OPfp: пентафторфенокси
OPnp: паранитрофенокси
OSu: O-сукцинимидиловые эфиры (гидроксисукцинимидные эфиры)
OSuc: 2,5-диоксо-пирролидин-1-ил
OtBu: третбутиловый эфир
PBF: 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил
PBS: фосфатный буфер
PD: фармакодинамика
Pen/Strep: пенициллин/стрептомицин
PK: фармакокинетика
RP: обращенная фаза
RP-HPLC: обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
RT: комнатная температура
Rt: время удерживания
s.c.: подкожно
SD: стандартное отклонение
SEC-HPLC: гель-проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография
SEM: стандартная ошибка среднего
SPA: сцинтилляционный проксимальный анализ
SPPS: твердофазный синтез пептидов
tBu: трет-бутил
TFA: трифторуксусная кислота
TIS:триизопропилсилан
TLC: тонкослойная хроматография
Tos: тозилат (или пара-толуолсульфонил)
Tris: трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол
Trt: трифенилметил, или тритил
Trx: транексамовая кислота
UPLC: ультра высокоэффективная жидкостная хроматография
Способы получения
А. Общие способы
Этот раздел относится к способам твердофазного синтеза пептидов (способам SPPS, включая способы снятия защиты аминокислот, способы отщепления пептида от смолы, а также его очистки), а также способы обнаружения и характеризации полученного пептида (способы LCMS, MALDI и UPLC). Твердофазный синтез пептидов в некоторых случаях может быть улучшен за счет использования дипептидов, защищенных на дипептидной амидной связи группой, которая может быть расщеплена в кислой среде, такой как 2-Fmoc-окси-4-метоксибензил или 2,4,6-триметоксибензил, но не ограничиваясь ими. В случаях, когда в пептиде присутствуют серин или треонин, могут быть использованы псевдопролиновые дипептиды (доступные, например, от Novabiochem, см. также W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403). Используемые защищенные аминокислотные производные были стандартными Fmoc-аминокислотами (предоставляемыми, например, AnaSpec, IRIS или Novabiochem). N-концевая аминокислота была Вос-защищена на альфа-аминогруппе (например, Вос-His(Boc)-OH или Boc-His(Trt)-OH для пептидов с His на N-конце). Эпсилон-аминогруппа лизина в последовательности была защищена Mtt, Mmt, Dde, ivDde или Вое, в зависимости от пути присоединения альбумин-связывающей группировки и спейсера. Альбумин-связывающая группировка и/или линкер могут быть присоединены к пептиду либо путем ацилирования связанного со смолой пептида, либо путем ацилирования в растворе незащищенного пептида. В случае присоединения альбумин-связывающей группировки и/или линкера к защищенной пептидил-смоле, присоединение может быть модульным с использованием SPPS и соответственно защищенных блоков, таких как Fmoc-Oeg-OH (Fmoc-8-амино-3,6-диоксаокгановая кислота), Fmoc-Trx-OH (Fmoc-транексамовая кислота), Fmoc-Glu-OtBu, монотретбутиловый эфир октадекандиовой кислоты, монотретбутиловый эфир нонадекандиовой кислоты или третбутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты, но не ограничиваясь ими.
1. Синтез связанного со смолой пептида
Способ SPPS A
Способ SPPS А относится к синтезу защищенной пептидил-смолы с помощью Fmoc-химии на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433 (также обозначаемом как синтезатор АВ1433А) в масштабе 0,25 ммоль или 1,0 ммоль с использованием протоколов от производителя FastMoc UV, которые используют HBTU- или HATU-опосредованное связывание в NMP и УФ-контроль снятия защиты Fmoc-защитной группы.
Исходной смолой, используемой для синтеза амидов пептидов, была подходящая смола Rink-Amide (для амидов пептидов), а также либо подходящая смола Wang, либо подходящая хлортритиловая смола (для пептидов с карбокси С-концом). Подходящие смолы коммерчески доступны, например, от NovabioСоед.
Способ SPPS В
Способ SPPS В относится к синтезу защищенной пептидил-смолы с помощью Fmoc-химии на пептидном синтезаторе Liberty, основанном на микроволнах (СЕМ Corp., Северная Каролина). Подходящей смолой является предварительно загруженная смола Wang с низкой загрузкой, которую можно получить от Novabiochem (например, смола Wang Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой, 0,35 ммоль/г). Снятие защиты Fmoc проводили с помощью 5% пиперидина в NMP при 70 или 75°С. Химическая реакция связывания представляла собой DIC/HOAt в NMP. K смоле добавляли растворы аминокислоты/HOAt (0,3 М в NMP в молярном избытке в 3-10 раз), а затем такой же молярный эквивалент DIC (0,75 М в NMP). Например, следующее количество 0,3 М раствора аминокислоты/HOAt использовали для реакций связывания со следующими масштабами: масштаб/мл, 0,10 ммоль/2,5 мл, 0,25 ммоль/5 мл, 1 ммоль/15 мл. Время связывания и температура, как правило, составляли 5 минут и 70 или 75°С. Для реакций более крупного масштаба использовали большее время связывания, например, 10 минут. Гистидиновые аминокислоты связывали дважды при 50°С или четырежды, если предыдущая аминокислота была пространственно-затрудненной (например, Aib). Аргининовые аминокислоты связывали при комнатной температуре в течение 25 минут, затем нагревали до 70 или 75°С на 5 минут. Некоторые аминокислоты, такие как Aib, но не ограничиваясь ею, были «дважды связанными», что означает, что после первого связывания (например, в течение 5 минут при 75°С), смолу сливали, добавляли больше реагентов (аминокислоту, HOAt и DIC) и смесь снова нагревали (например, в течение 5 минут при 75°С). Когда была необходима химическая модификация боковой цепи лизина, лизин встраивали как Lys(Mtt). Группу Mtt удаляли путем промывания смолы с DCM и суспендирования смолы в чистом (неразбавленном) гексафторизопропаноле в течение 20 минут с последующим промыванием DCM и NMP. Химическую модификацию лизина производили либо путем ручного синтеза (см. способ SPPS D), либо в одном или более чем одном автоматизированном этапе на пептидном синтезаторе Liberty, как описано выше, с использованием соответственно защищенных блоков (см. Общие способы), возможно, включая мануальное связывание.
Способ SPPS D
Способ SPPS D относится к синтезу защищенной пептидил-смолы с помощью мануальной Fmoc-химической реакции. Обычно он используется для присоединения линкеров и боковых цепей к пептидному остову. Следующие условия использовали при масштабе синтеза 0,25 ммоль. Химическая реакция связывания представляла собой DIC/HOAt/коллидин в NMP в 4-10-кратном молярном избытке. Условиями связывания были 1-6 часов при комнатной температуре. Снятие защиты Fmoc проводили с помощью 20-25% пиперидина в NMP (3 раза по 20 мл, каждый по 10 минут) с последующим промыванием NMP (4 раза по 20 мл). Снятие защиты Dde или ivDde проводили с помощью 2% гидразина в NMP (2 раза по 20 мл, каждый по 10 минут) с последующим промыванием NMP (4 раза по 20 мл). Снятие защиты Mtt или Mmt проводили с помощью 2% TFA и 2-3% TIS в DCM (5 раз по 20 мл, каждый по 10 минут), с последующим промыванием DCM (2 раза по 20 мл), 10% метанолом и 5% DIPEA в DCM (2 раза по 20 мл) и NMP (4×20 мл), или путем обработки читым гексафторизопропанолом (5 раз по 20 мл, каждый по 10 минут), с последующим промыванием, как указано выше. Альбумин-связывающая группировка и/или линкер могут быть присоединены к пептиду либо путем ацилирования связанного со смолой пептида, либо путем ацилирования в растворе незащищенного пептида (см. пути, описанные ниже). В случае присоединения альбумин-связывающей группировки и/или линкера к защищенной пептидил-смоле, присоединение может быть модульным с использованием SPPS и соответственно защищенных блоков (см. Общие способы).
Присоединение к связанному со смолой пептиду - Путь I: Активированную (активный эфир или симметричный ангидрид) альбумин-связывающую группировку или линкер, например, моно-(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил) эфир октадекандиовой кислоты (Ebashi et al. EP511600, 4. молярных эквивалентов по отношению к связанному со смолой пептиду) растворяли в NMP (25 мл), добавляли к смоле и встряхивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали и смолу тщательно промывали NMP, DCM, 2-пропанолом, метанолом и диэтиловым эфиром.
Присоединение к связанному со смолой пептиду - Путь II: Альбумин-связывающую группировку растворяли в NMP/DCM (1:1, 10 мл). Добавляли активирующий реагент, такой как HOBt (4 молярных эквивалента по отношению к смоле), и DIC (4 молярных эквивалента по отношению к смоле), и раствор перемешивали в течение 15 минут. Раствор добавляли к смоле, и добавляли DIPEA (4 молярных эквивалента по отношению к смоле). Смолу встряхивали в течение 2-24 часов при комнатной температуре. Смолу промывали NMP (2 раза по 20 мл), NMP/DCM (1:1,2 раза по 20 мл) и DCM (2 раза по 20 мл).
Присоединение к связанному со смолой пептиду - Путь III: Активированную (активный эфир или симметричный ангидрид) альбумин-связывающую группировку или линкер, например, моно-(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил) эфир октадекандиовой кислоты (Ebashi et al. EP511600), 1-1,5. молярных эквивалента по отношению к связанному со смолой пептиду, растворяли в органическом растворителе, таком как ацетонитрил, THF, DMF, DMSO, или в смеси вода/органический растворитель (1-2 мл) и добавляли к раствору пептида в воде (10-20 мл) вместе с 10 молярными эквивалентами DIPEA. В случае защитных групп на альбумин-связывающем остатке, таких как трет-бутил, реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи и затем с выделенного сырьевого пептида снимали защиту. В случае третбутиловых защитных групп снятие защиты проводили путем растворения пептида в смеси трифторуксусной кислоты, воды и триизопропилсилана (90:5:5). Затем в течение 30 минут смесь выпаривали в вакууме и сырьевой пептид очищали с помощью HPLC, как описано ниже.
Способ SPPS Е
Способ SPPS E относится к пептидному синтезу с помощью Fmoc-химической реакции на пептидном синтезаторе Prelude Solid Phase Peptide Synthesiser от Protein Technologies (Tucson, AZ 85714, США). Подходящей смолой является предварительно загруженная смола Wang с низкой загрузкой, доступной от Novabiochem (например, смола Wang Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой, 0,35 ммоль/г). Снятие защиты Fmoc проводили с помощью 25% пиперидина в NMP 2 раза в течение 10 минут. Химическая реакиция связывания представляла собой DIC/HOAt/коллидин в NMP. К смоле добавляли растворы аминокислота/HOAt (0,3 М в NMP в молярном избытке в 3-10 раз), а затем такой же молярный эквивалент DIC (3 М в NMP) и коллидина (3 М в NMP). Например, следующее количество 0,3 М раствора аминокислота/HOAt использовали для реакций связывания со следующими масштабами: масштаб/мл, 0,10 ммоль/2,5 мл, 0,25 ммоль/5 мл. Время связывания, как правило, составляло 60 минут. Некоторые аминокислоты, такие как аргинин, Aib или гистидин, но не ограничиваясь ими, были «дважды связанными», что означает, что после первого связывания (например, в течение 60 минут), смолу сливали, добавляли больше реагентов (аминокислоту, HOAt, DIC и коллидин) и смесь снова оставляли для реакции (например, на 60 минут). Некоторые аминокислоты и производные жирных кислот, включая, но не ограничиваясь ими, Fmoc-Oeg-OH, Fmoc-Trx-OH, Fmoc-Glu-OtBu, монотретбутиловый эфир октадекандиовой кислоты, монотретбутиловый эфир нонадекандиовой кислоты или третбутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты, связывали в течение длительного времени, например, 6 часов. Когда была необходима химическая модификация боковой цепи лизина, лизин встраивали как Lys(Mtt). Группу Mtt удаляли путем промывания смолы с DCM и суспендирования смолы в гексафторизопропаноле/DCM (75:25) 3 раза в течение 10 минут с последующим промыванием DCM, 20% пиперидином и NMP. Химическую модификацию лизина производили либо путем мануального синтеза (см. способ SPPS D), либо в одном или более чем одном автоматизированном этапе на пептидном синтезаторе Prelude, как описано выше, с использованием соответственно защищенных блоков (см. Общие способы).
2. Отщепление пептида от смолы и очистка
После синтеза смолу промывали DCM и пептид отщепляли от смолы путем 2-3-часовой обработки TFA/TIS/водой (95/2,5/2,5 или 92,5/5/2,) с последующим осаждением диэтиловым эфиром. Пептид растворяли в подходящем растворителе (таком как, например, 30% уксусная кислота) и очищали путем стандартной RP-HPLC на колонке С18, 5 мкМ, используя ацетонитрил/воду/TFA. Фракции анализировали путем комбинации способов UPLC, MALDI и LCMS, и соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали.
3. Способы выявления и характеризации
Способы LCMS
Способ LCMS 1 (LCMS1)
Для определения массы образца после элюирования из системы HPLC серии Agilent 1200 использовали масс-спектрометр LC/MSD TOF Agilent Technologies (G1969A). Деконволюцию белкового спектра рассчитывали с помощью программного обеспечения для подтверждения белка Agilent.
Элюенты:
А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде
В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Колонка: Zorbax 5u, 300SB-C3, 4,8×50 мм
Градиент: 25%-95% ацетонитрил в течение 15 минут
Способ LCMS 2 (LCMS2)
Для определения массы образца после элюирования из системы HPLC серии Perkin Elmer 200 использовали масс-спектрометр Elmer Sciex API 3000.
Элюенты:
А: 0,05% трифторуксусная кислота в воде
В: 0,05% трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Колонка: Waters Xterra MS С-18 × 3 мм, внутренний диаметр 5 мкм
Градиент: 5%-90% ацетонитрил в течение 7,5 минут со скоростью 1,5 мл/мин
Способ LCMS 3 (LCMS3)
Для определения массы образца после элюирования из системы HPLC Waters Alliance НТ использовали масс-спектрометр Waters Micromass ZQ.
Элюенты:
А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде
В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Колонка: Phenomenex, Jupiter C4 50×4,60 мм, внутренний диаметр 5 мкм
Градиент: 10%-90% B в течение 7,5 минут со скоростью 1,0 мл/мин
Способ LCMS 4 (LCMS4)
LCMS4 проводили на установке, состоящей из системы UPLC Waters Acquity и масс-спектрометра LCT Premier XE от Micromass. Насос UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
А: 0,1% муравьиную кислоту в воде
В: 0,1% муравьиную кислоту в ацетонитриле
Анализ проводили при комнатной температуре, вводя соответствующий объем образца (предпочтительно 2-10 мкл) в колонку, который элюировали с градиентом А и В.
Условия UPLC, настройки детектора и настройки масс-спектрометра были следующими:
Колонка: Waters Acquity UPLC ВЕН, С-18, 1,7 мкм, 2,1 мм × 50 мм
Градиент: линейный 5% - 95% ацетонитрил в течение 4,0 мин (или 8,0 мин) со скоростью 0,4 мл/мин
Выявление: 214 нм (аналоговый выход с TUV (перестраиваемым УФ-детектором))
Режим ионизации MS: API-ES
Скан: 100-2000 а.е.м. (или 500-2000 а.е.м.), с шагом 0,1 а.е.м.
Способы UPLC и HPLC
Способ 05 В5 1
UPLC (способ 05_В5_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
4
3
4
3
А: 0.2 М NaSO, 0.04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5)
3
2
В: 70% СНСМ, 30% НО
Использовали следующий линейный градиент: от 60% А, 40% В до 30% А, 70% B в течение 8 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 05 В7 1
UPLC (способ 05_В7_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
4
3
4
3
А: 0,2 М NaSO, 0,04 М НРО, 10% CHCN (pH 3,5)
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 80% А, 20% В до 40% А, 60% B в течение 8 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 04 А2 1
UPLC (способ 04_А2_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
3
А: 90% HO, 10% СНСМ, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 90% А, 10% В до 60% А, 40% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 04 A3 1
UPLC (способ 04_А3_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
3
А: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 75% А, 25% В до 45% А, 55% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 04 А4 1
UPLC (способ 04_А4_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
3
А: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 65% А, 35% В до 25% А, 65% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 08 В2 1
UPLC (способ 08_В2_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
А: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA
Использовали следующий линейный градиент: от 95% А, 5% В до 40% А, 60% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 08 В4 1
UPLC (способ 08_В4_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
А: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA
Использовали следующий линейный градиент: от 95% А, 5% В до 95% А, 5% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 05 В10 1
UPLC (способ 05_В10_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С.
Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим:
2
4
3
4
3
А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5)
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 40% А, 60% В до 20% А, 80% B в течение 8 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 01 А4 2
2
3
2
UPLC (способ 01_А4_2): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters 600S, оснащенной детектором с диодной матрицей Waters 996. УФ-выявление на 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки Symmetry300 С18, 5 мкм, 3,9 мм × 150 мм, 42°С. Систему HPLC подключали к трем резервуарам с элюентом, содержащим: А: 100% HO, В: 100% CHCN, С: 1% трифторуксусную кислоту в HO. Использовали следующий линейный градиент: от 90% А, 5% В, 5% С до 0% А, 95% В, 5% С в течение 15 минут со скоростью потока 1,0 мл/мин.
Способ 09 В2 1
2
3
UPLC (способ 09_В2_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С. Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 95% А, 5% В до 40% А, 60% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 09 В4 1
2
3
UPLC (способ 09_В4_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С. Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 95% А, 5% В до 5% А, 95% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 05 В8 1
2
4
3
4
3
3
2
UPLC (способ 05_В8_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 40°С. Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим: А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (рН 3,5); В: 70% CHCN, 30% НО. Использовали следующий линейный градиент: от 50% А, 50% В до 20% А, 80% B в течение 8 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 10 В14 1
2
3
UPLC (способ 10_В14_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН ShieldRP18, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, 50°С. Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 70% А, 30% В до 40% А, 60% B в течение 12 минут со скоростью потока 0,40 мл/мин.
Способ 04 А6 1
2
3
2
UPLC (способ 04_А6_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters UPLC, оснащенной детектором двойного бэнда. УФ-выявление при 214 нм и 254 нм получали с помощью колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2.1 мм × 150 мм, 40°С. Систему UPLC подключали к двум резервуарам с элюентом, содержащим: 10 мМ Tris, 15 мМ сульфат аммония 80%, HO 20%, рН 7,3; В: 80% CHCN, 20% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 95% А, 5% В до 10% А, 90% B в течение 16 минут со скоростью потока 0,35 мл/мин.
Способ 01 В4 1
HPLC (способ 01_В4_1): RP-анализ выполняли с помощью системы Waters 600S, оснащенной детектором с диодной матрицей Waters 996. УФ-выявление получали с помощью колонки Symmetry С-18, 3,5 мкм, 3 мм × 150 мм. Колонку нагревали до 42°С и элюировали линейным градиентом 5-95% ацетонитрила, 90-0% воды и 5% трифторуксусной кислоты (1,0%) в воде в течение 15 минут со скоростью потока 1 мл/мин.
Способ MALDI-MS
Молекулярные массы определяли с помощью матрично-активированной лазерной десорбции и время-пролетной масс-спектрометрии с ионизацией с записью на Microflex или Autoflex (Bruker). Использовали матрицу альфа-циано-4-гидроксикоричной кислоты.
Способ NMR
Протонные спектры NMR записывали с помощью Brucker Avance DPX 300 (300 МГц) с тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги (δ), приведенные в ppm (частях на миллион), и структуры расщепления обозначены следующим образом: s, синглет; d, дублет; dd, дублет дублетов; dt, триплет дуплетов; t, триплет; tt, триплет триплетов; q, квартет; quint, квинтет; sext, секстет; m, мультиплет; и br=свободный.
В. Синтез промежуточных продуктов
1. Синтез моноэфиров жирных двухосновных кислот
Перегонка в течение ночи С12, С14, С16 и С18 двухосновных кислот с Вос-ангидридом, DMAP и трет-бутанолом в толуоле дает преимущественно трет-бутиловый моноэфир. Была получена смесь монокислоты, двухосновной кислоты и диэфира. Очистку осуществляли путем промывания, фильтрации через короткий кремниевый фильтр и кристаллизации.
2. Синтез 2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этиламина
Соед. 13:
Гистамин дигидрохлорид (20,47 г; 0,111 моль) и триэтиламин (48 мл, 0,345 моль) в абсолютном метаноле (400 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Этиловый эфир трифторуксусной кислоты (14,6 мл, 0,122 моль) в метаноле (30 мл) добавляли по каплям в течение 30 мин при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 3,5 часов при комнатной температуре, а затем выпаривали досуха в вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане (450 мл) и добавляли триэтиламин (31 мл, 0,222 моль). Затем постепенно добавляли тритилхлорид (34,1 г, 0,122 моль) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. В реакционную смесь вливали хлороформ (400 мл) и воду (600 мл). Водный слой отделяли и экстрагировали хлороформом (3 раза по 400 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом магния. Растворитель удаляли и бежевое твердое вещество растирали с гексанами (1000 мл). Суспензию фильтровали для получения 2,2,2-трифтор-N-[2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этил]-ацетамида в виде белого твердого вещества.
Выход: 45,54 г (91%).
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 8,44 (bs, 1 Н); 7,43 (s, 1 H); 7,41-7,33 (m, 9 H); 7,19-7,10 (m, 6 H); 6,65 (s, 1 H); 3,66 (q, J=5,9 Гц, 2 Н); 2,79 (t, J=5,9 Гц, 2 Н).
Полученный ранее амид (45,54 г, 0,101 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (1000 мл) и метаноле (1200 мл). Добавляли раствор гидроксида натрия (20,26 г, 0,507 моль) в воде (500 мл). Смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем концентрировали в вакууме. Остаток разделяли между хлороформом (1200 мл) и водой (800 мл). Водный слой экстрагировали хлороформом (3 раза по 400 мл). Органические слои объединяли и высушивали над безводным сульфатом магния. Испарение растворителя давало коричневое масло, которое сушили в течение 3 дней в вакууме с получением продукта, указанного в заглавии, в виде бежевого твердого вещества.
Выход: 32,23 г (90%).
Общий выход: 82%.
Температура плавления: 111-113°С.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,39 (d, J=1,3, 1 H); 7,38-7,32 (m, 9 H); 7,20-7,12 (m, 6 H); 6,61 (s, 1 H); 3,00 (t, J=6,6 Гц, 2 H); 2.70 (t, J=6,5 Гц, 2 H); 1,93 (bs, 2 H).
3. Синтез 2,2-диметил-N-[2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этил]-малоновой кислоты полуамида
Соед. 14:
Смесь кислоты Мельдрума (5,52 г, 38,3 ммоль), карбоната калия (26,5 г, 191 ммоль) и метилйодида (7,15 мл, 115 ммоль) в ацетонитриле (75 мл) нагревали при 75°С в запаянной пробирке в течение 7 часов. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли дихлорметаном (300 мл), фильтровали и фильтрат упаривали досуха в вакууме. Добавляли этилацетат (75 мл), гексаны (75 мл) и воду (50 мл) и разделяли фазы. Органический слой промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия (50 мл) и водой (50 мл); высушивали над безводным сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме с получением 2,2,5,5-тетраметил-[1,3]-диоксан-4,6-диона в виде белого твердого вещества.
Выход: 6,59 г (79%).
F
2
R (SiO, хлороформ/этилацетат, 98:2): 0,60.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 1,76 (s, 6 H);
Раствор 2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)этиламина (5,00 г, 14,2 ммоль), полученный, как описано выше, и триэтиламин (9,86 мл, 70,7 ммоль) в толуоле (80 мл) добавляли по каплям в течение более чем 50 минут в раствор описанного выше соединения диона (3,65 г, 21,2 ммоль) в толуоле (40 мл) при 75°С. Смесь перемешивали при этой температуре еще в течение 3 часов (до тех пор, пока исходный амин выявлялся на TLC), затем ее выпаривали досуха. Остаток растворяли в хлороформе (300 мл) и промывали 10% водным раствором лимонной кислоты (200 мл). Водную фазу экстрагировали хлороформом (2 раза по 60 мл); фазы хлороформа объединяли, сушили над безводным сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме. Остаток растирали с горячим хлороформом (140 мл); добавляли гексаны (70 мл) и перемешивали суспензию при комнатной температуре в течение ночи. Твердые вещества отфильтровывали, промывали смесью хлороформ/гексан (1:1, 2 раза по 50 мл) и высушивали в вакууме для получения продукта, указанного в заглавии.
Выход: 6,73 г (88%).
Температура плавления: 161-162°С.
F
2
R (SiO, хлороформ/метанол, 85:15): 0,40.
1
6
H
H NMR-спектр (300 МГц, DMSO-d, δ): 12,45 (bs, 1 H); 7,66 (t, J=5,1 Гц, 1 Н); 7,57-7,31 (m, 9 H); 7,26 (s, 1 H); 7,20-7,02 (m, 6 H); 6,66 (s, 1 H); 3,25 (m, 2 H); 2,57 (t, J=7,3 Гц, 2 Н); 1,21 (s, 6 H).
4. Синтез 4-(4-трет-бутилфенил)масляной кислоты
Соед. 15:
Порошок алюминия хлорида (80,0 г, 600 ммоль) добавляли порциями к встряхиваемой смеси трет-бутилбензола (40,0 г, 300 ммоль), ангидрида янтарной кислоты (26,7 г, 267 ммоль) и 1,1,2,2-тетрахлорэтана (100 мл). После того, как был добавлен весь хлорид алюминия, смесь выливали в смесь льда (500 мл) и концентрированной соляной кислоты (100 мл). Органический слой отделяли, промывали водой (500 мл) и растворитель удаляли. Твердый остаток растворяли в горячем 15% водном растворе карбоната натрия (1000 мл), фильтровали, охлаждали и осаждали кислоту соляной кислотой (закисленной до рН=1). Сырьевую кислоту отфильтровывали, сушили на воздухе и повторно кристаллизовали из бензола (500 мл) для получения 4-(4-трет-бутил-фенил)-4-оксомасляной кислоты в виде бесцветных кристаллов.
Выход: 36.00 г (58%).
Температура плавления: 117-120°С.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,93 (dm, J=8,3 Гц, 2 H); 7,48 (dm, J=8,3 Гц, 2 H); 3.30 (t, J=6,6 Гц, 2 H); 2,81 (t, J=6,6 Гц, 2 H); 1,34 (s, 9 H).
Смесь полученной ранее кислоты (36,0 г, 154 ммоль), гидроксида калия (25,8 г, 462 ммоль), гидразин-гидрата (20 мл, 400 ммоль) и этиленгликоля (135 мл) перегоняли в течение 3 часов, а затем перегоняли при температуре пара, повышенной до 196-198°С. После еще 14 часов перегонки смесь слегка остужали, а затем выливали в холодную воду (200 мл). Смесь подкисляли концентрированной соляной кислотой (до рН=1) и экстрагировали дихлорметаном (2 раза по 400 мл). Органические экстракты объединяли, сушили над безводным сульфатом магния, растворитель удаляли в вакууме, а остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60А, 0,060-0,200 мм; элюент: гексан/этилацетат 10:1-6:1), для получения продукта, указанного в заголовке, в виде почти белого твердого вещества.
Выход: 16,25 г (48%).
Температура плавления: 59-60°С.
F
2
R (SiO, этилацетат): 0,60.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,31 (dm, J=8,1 Гц, 2 H); 7,12 (dm, J=8,1 Гц, 2 H); 2,64 (t, J=7,6 Гц, 2 H); 2,38 (t, J=7,4 Гц, 2 H); 1,96 (m, 2 H); 1,31 (s, 9 H).
5. Синтез 2,2-диметил-N-(1-тритил-1Н-имидазол-4-илметил)малоновой кислоты полуамида
Соед. 16:
Гидрохлорид гидроксиламина (15,9 г, 229 ммоль) добавляли к раствору 4(5)-имидазолкарбоксальдегида (20,0 г, 209 ммоль) и карбоната натрия (12,1 г, 114 ммоль) в воде (400 мл) и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь выпаривали до 100 мл и охлаждали в ледяной бане. Твердые вещества отфильтровывали и фильтрат концентрировали до 40 мл. После охлаждения до 0°С получали другую часть кристаллов. Твердые вещества (23 г) смешивали и повторно кристаллизовали из этанола (примерно 160 мл) с получением имидазол-4(5)-карбальдегида оксима в виде бесцветных кристаллов.
Выход: 15,98 г (69%).
1
3
2
H
H NMR-спектр (300 МГц, ацетон-d+DO, δ): 7,78 (bs, 1 Н); 7,74 (d, J=0,9 Гц, 1 Н); 7.43 (s, 1 Н).
Ацетилхлорид (51,0 мл, 718 ммоль) добавляли по каплям к метанолу (670 мл) при 0°С в атмосфере аргона. Через 30 минут охлаждающую баню удаляли и добавляли указанный выше оксим (16,0 г, 144 ммоль), а затем палладий на угле (5% по массе, 6,1 г). Полученную смесь гидрировали при атмосферном давлении в течение 17 часов, затем фильтровали через целит и выпаривали растворитель, получая чистый 4-(аминометил)-имидазола дигидрохлорид в виде бесцветных кристаллов.
Выход: 23,92 г (98%).
1
2
H
H NMR-спекгр (300 МГц, DO, δ): 8,72 (s, 1 Н); 7,60 (s, 1 Н); 4,33 (s, 2 Н).
Указанный выше дигидрохлорид амина (18,9 г, 111 ммоль) и триэтиламин (93 мл, 667 ммоль) в метаноле (1000 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Этиловый эфир трифторуксусной кислоты (13,3 мл, 111 ммоль) в метаноле (30 мл) добавляли по каплям в течение 40 мин при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 18 часов при комнатной температуре, а затем выпаривали досуха в вакууме. Остаток растворяли в сухом дихлорметане (2000 мл) и добавляли триэтиламин (31 мл, 222 ммоль). Затем добавляли тритилхлорид (31,6 г, 113 ммоль) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. В реакционную смесь наливали хлороформ (1000 мл) и воду (1000 мл). Водный слой отделяли и экстрагировали хлороформом (2 раза по 300 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом магния. Растворитель удаляли и бежевое твердое вещество растирали с гексанами (1000 мл). Суспензию фильтровали, получая 2,2,2-трифтор-N-(1-тритил-1 Н-имидазол-4-илметил)ацетамид в виде белого твердого вещества.
Выход: 46,59 г (96%).
F
2
R (SiO, дихлорметан/метанол 95:5): 0,35.
1
6
H
H NMR-спектр (300 МГц, DMSO-d, δ): 9,77 (t, J=5,7 Гц, 1 Н); 7,47-7,34 (m, 9 Н); 7,33 (d, J=1,5 Гц, 1 Н); 7,13-7,03 (m, 6 Н); 6,80 (d, J=0,8 Гц, 1 Н); 4,25 (d, J=5,7 Гц, 2H).
Указанный выше амид (46,6 г, 107 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (600 мл) и этаноле (310 мл). Добавляли раствор гидроксида натрия (21,4 г, 535 ммоль) в воде (85 мл). Смесь перемешивали в течение 5 часов при комнатной температуре и затем концентрировали в вакууме. Остаток разделяли между хлороформом (1600 мл) и водой (800 мл). Водный слой экстрагировали хлороформом (4 раза по 200 мл). Органические слои объединяли и сушили над безводным сульфатом магния. Испарение растворителя давало (1-тритил-1H-имидазол-4-ил)метиламин в виде почти белого твердого вещества.
Выход: 36,30 г (100%).
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,38 (d, J=1,3, 1 H); 7,36-7,30 (m, 9 H); 7,18-7,10 (m, 6 H); 6,69 (m, 1 H); 3,77 (s, 2 H); 1,80 (bs, 2 H).
Раствор указанного выше амина (10,0 г, 29,5 ммоль) и триэтиламина (20,5 мл, 147 ммоль) в толуоле (220 мл) добавляли по каплям в течение 45 минут в раствор 2,2,5,5-тетраметил-[1,3]диоксан-4,6-диона (3,65 г, 21,2 ммоль) в толуоле (80 мл) при 75°С. Смесь перемешивали при этой температуре в течение еще 3 часов (до тех пор, пока исходный амин выявлялся в TLC), затем выпаривали досуха. Остаток растворяли в хлороформе (500 мл) и промывали 10% водным раствором лимонной кислоты (300 мл). Водную фазу экстрагировали хлороформом (100 мл); хлороформные фазы объединяли, промывали водой (150 мл), сушили над безводным сульфатом магния и растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на колонке (силикагель Fluka 60, дихлорметан/метанол от 98:2 до 9:1) и кристаллизовали из смеси хлороформ/гексан с получением целевого продукта в виде бежевых кристаллов.
Выход: 9,80 г (73%).
Температура плавления: 174-175°С.
F
2
R (SiO, хлороформ/метанол, 85:15): 0,35.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 8,45 (t, J=5,8 Гц, 1 H); 7,53 (s, 1 H); 7,40-7,28 (m, 9 H); 7,14-7,01 (m, 6 H); 6,84 (s, 1 H); 4,39 (d, J=5,8 Гц, 2 H); 1.44 (s, 6 H).
6. Синтез 3-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)пропиламина
Соед. 17:
Этил-3-(1-тритил-4-имидазолил)пропионат (93,0 г, 223 ммоль) в тетрагидрофуране/диэтиловом эфире (1:1, 100 мл) по каплям добавляли к суспензии алюмогидрида лития (17,0 г, 446 ммоль) в течение 1 часа. Смесь перегоняли в течение 3 часов, а затем обрабатывали водой (100 мл), 20% гидроксидом натрия (100 мл) и водой (100 мл) при охлаждении льдом/водой, фильтровали, и твердое вещество промывали тетрагидрофураном. Органическую фазу сушили над безводным карбонатом калия, фильтровали и выпаривали, получая 3-(1-тритил-4-имидазолил)пропанол в виде белого твердого вещества.
Выход: 68,0 г (82%).
Температура плавления: 127-129°С.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,40-7,24 (m, 10 Н); 7,17-7,06 (m, 6 H); 6,55 (s, 1 H); 3,72 (t, J=5,3 Гц, 2 H); 2,68 (t, J=6,6 Гц, 2 H); 1,86 (m, 2 H).
Метансульфонилхлорид (8 мл, 104 ммоль) добавляли по каплям к раствору вышеуказанного спирта (32,0 г, 86,8 ммоль) в дихлорметане (400 мл) и триэтиламине (15,5 мл) при 0°С в течение 1 часа. Смесь перемешивали без охлаждения в течение еще 1 часа, после чего промывали 5% бикарбонатом натрия и сушили над безводным сульфатом магния. Дихлорметан выпаривали при 30°С в вакууме и остаточный масляный мезилат использовали непосредственно в следующем этапе.
Выход: 31,2 г (80%).
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,37-7,30 (m, 10 H); 7,16-7,09 (m, 6 H); 6,58 (s, 1 H); 4,24 (t, J=6,3 Гц, 2 H); 2,96 (s, 3 H); 2,67 (m, 2 H); 2,10 (m, 2 H).
Смесь указанного выше мезилата (30,0 г, 67 ммоль), фталамида калия (18,0 г, 100 ммоль), йодида натрия (4,0 г, 26,7 ммоль) и диметилформамида (200 мл) перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, а затем обрабатывали водой (2 л) и бензолом (2 л). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и выпаривали растворитель, получая остаток, который повторно кристаллизовали из бензола, получая 1-тритил-4-(3-фталимидопропил)имидазол в виде белого твердого вещества.
Выход: 17,2 г (52%).
Температура плавления: 211-214°С.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,83 (m, 2 H); 7,72 (m, 2 H); 7,39-7,27 (m, 10 H); 7,18-7,07 (m, 6 H); 6,60 (d, J=0,9 Гц, 1 H); 3,72 (t, J=7,4 Гц, 2 H); 2,60 (t, J=7,5 Гц, 2Н); 1,99 (m, 2Н).
Указанное выше производное имидазола (26,6 г, 53,5 ммоль) растворяли в этаноле (300 мл) и тетрагидрофуране (150 мл) при 60°С, добавляли гидразин-гидрат (50 г, 1 моль) и раствор перегоняли в течение 6 часов, а затем нагревали до температуры 70°С на ночь. Твердое вещество отфильтровывали и фильтрат обрабатывали 25% водным раствором аммиака (2,5 л) и дихлорметаном (2,5 л). Органический слой сушили над безводным карбонатом калия и выпаривали, получая остаток, который очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (Fluka 60, хлороформ, насыщенный аммиаком/метанолом), получая целевое соединение в виде белого твердого вещества.
Выход: 14,2 г (72%).
Температура плавления: 112-113°С.
F
2
R (SiO, хлороформ, насыщенный аммиаком/метанолом 9:1): 0,30.
1
3
H
H NMR-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,37-7,28 (m, 10 H); 7,18-7,09 (m, 6 H); 6,53 (d, J=1,3 Гц, 1 H); 2,74 (t, J=6,9 Гц, 2 H); 2,59 (t, J=7,4 Гц, 2 H); 1,95 (bs, 2 H); 1,78 (m, 2H).
7. Синтез 2,2-диметил-N-[3-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)пропил]малоновой кислоты полуамида
Соед. 18:
2-хлортритилхлорид-смолу (2,3 г, 3,0 ммоль) помещали для набухания в DCM на 20 минут и фильтровали. Диметилмалоновую кислоту (2 экв; 6,0 ммоль; 793 мг) растворяли в DCM:DMF 1:1 (10 мл) и добавляли к смоле, затем добавляли DIPEA (6 экв; 18,0 ммоль; 3,14 мл) и DCM (10 мл). Смолу встряхивали в течение ночи при комнатной температуре. Смолу фильтровали и промывали DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1), DCM, NMP или DCM (2 раза по 25 мл каждого). Смолу помещали для набухания в DCM на 20 минут и фильтровали. Добавляли HOAt (3 экв; 9,0 ммоль; 1,23 г), DIC (3 экв; 9,0 ммоль; 1,40 мл) и DMF (25 мл) и смолу встряхивали в течение 90 минут при комнатной температуре. Смолу фильтровали и добавляли 3-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)пропиламин (1,8 экв; 5,40 ммоль; 1,84 г), DIPEA (4 экв; 6,0 ммоль; 2,09 мл) и DMF (10 мл). Смолу встряхивали в течение 2 дней. Смолу отфильтровывали и промывали NMP (5 раз по 20 мл) и DCM (10 раз по 20 мл). Добавляли 2,2,2-трифторэтанол/дихлорметан 1:1 (20 мл) к смоле и встряхивали в течение 2 часов. Смолу промывали 2,2,2-трифторэтанолом/дихлорметаном 1:1 (10 мл) и объединенные фильтраты собирали и концентрировали в вакууме, получая указанное в заголовке соединение.
Выход: 600 мг (41%).
LCMS4: m/z=482(M+1)
UPLC (способ 02_В4_4): Rt=8,07 мин
6
H
1Н NMR-спектр (300 МГц, DMSO-d, δ): 7,36-7,44 (9Н, m), 7,07-7,12 (6Н, m), 6,62 (1Н, s), 3,02-3,09 (2Н, q), 2,38-2,43 (2Н, t), 1,61-1,69 (2H, m), 1,26 (6Н, s).
8. Синтез 2,2-диметил-N-[3-(1-тритил-1H-имидазол-4-ил)пропил]малоновой кислоты полуамида
Синтез 2,2-диметил-N-пиридин-2-илметилмалоновой кислоты полуамида
Соед. 19:
Хлортритилхлорид-смолу (2,3 г, 3,0 ммоль) помещали для набухания в DCM на 20 минут и фильтровали. Диметилмалоновую кислоту (2 экв; 6,0 ммоль; 793 мг) растворяли в DCM:DMF 1:1 (10 мл) и добавляли к смоле, затем добавляли DIPEA (6 экв; 18,0 ммоль; 3,14 мл) и DCM (10 мл). Смолу встряхивали в течение ночи при комнатной температуре. Смолу фильтровали и промывали DCM:MeOH:DIPEA (17:2:1), DCM, NMP или DCM (2 раза по 25 мл каждого). Смолу помещали для набухания в DCM на 20 минут и фильтровали. Добавляли HOAt (3 экв; 9,0 ммоль; 1,23 г), DIC (3 экв; 9,0 ммоль; 1,40 мл) и NMP (25 мл), и смолу встряхивали в течение 90 минут при комнатной температуре. Смолу фильтровали и добавляли 2-(аминометил)пиридин (2 экв; 6 ммоль; 659 мг), DIPEA (4 экв; 6,0 ммоль; 2,09 мл) и NMP (10 мл). Смолу встряхивали в течение ночи. Смолу фильтровали и промывали NMP (5 раз по 20 мл) и DCM (10 раз по 20 мл). TFA/TIS/воду (95:2,5:2,5; 30 мл) добавляли к смоле и встряхивали в течение 1 часа, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения.
Выход: 600 мг (41%).
LCMS4: m/z=223(M+1)
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=1,79 мин
Б. Синтез соединений изобретения
Пример 1
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 20:
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP, и 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech) и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа двойного связывания на пептидном синтезаторе Liberty.
UPLC (способ 04_А3_1): 10,51 мин
4+
3+
LCMS4: m/z=1085,2 (M+4H), 1447,3 (М+3Н)
Пример 2
ε26
ε37
8
34
37
N{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 21:
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP, и 8-(9-фторенилметилоксикарбонил-амино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)-бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа двойного связывания на пептидном синтезаторе Liberty
UPLC (способ 04_А3_1): 7,19 мин
5+
4+
3+
LCMS4: m/z=978,5 (М+5Н), 1222,8 (М+4Н) 1630,1 (М+3Н)
Пример 3
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 22:
2
3
Способ изготовления: пептид синтезировали на смоле Lys(Mtt)-Wang с загрузкой 0,35 ммоль/г. Синтез проводили на пептидном синтезаторе Liberty, основанном на микроволнах, используя 5-минутное одиночное связывание с DIC/HOAt при температуре до 70°С, за исключением гистидина, который связывали в течение 20 минут при температуре до 50°С. Все аминокислоты были защищены стандартными защитными группами, за исключением лизинов, которые должны быть ацилированы (в данном случае Lys26), которые были защищены Mtt. Снятие защиты проводили с помощью 5% пиперидина в NMP при температуре 50°С в течение 3 минут. После того, как синтез был завершен, N-конец блокировали 10 эквивалентами Вос-карбоната и 10 эквивалентами DIPEA в течение 30 минут. Mtt-группы удаляли путем обработки чистым (неразбавленным) гексафторизопропанолом в течение 20 минут, и боковые цепи строили ступенчато на Liberty, используя тот же протокол, который описан выше, с использованием Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты, Fmoc-Glu-OBut и моно-трет-бутилового эфира гексадекандиовой кислоты. Пептид расщепляли с помощью TFA/воды/TIS (95:2,5:2,5) в течение 2 часов и выделяли путем осаждения диэтиловым эфиром. Сырьевой пептид очищали с помощью HPLC на 20 мм × 250 мм колонке с 5u или 7u C18 диоксида кремния. Пептид растворяли в 5 мл 50% уксусной кислоты, разводили HO до 20 мл и вводили в колонку, которую затем элюировали с градиентом 40-60% CHCN в 0,1% TFA со скоростью 10 мл/мин в течение 50 минут при 40°С. Содержащие петид фракции собирали и оценивали чистоту путем MALDI и UPLC. Очищенный пептид лиофилизировали после разбавления элюата водой.
Теоретическая молекулярная масса 4844,6 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 9,50 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 11,23 мин
Пример 4
ε26
ε27
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 23:
Способ изготовления: как в Примере 3, за исключением применения моно-трет-бутилового эфира тетрадекандиовой кислоты в боковой цепи.
Теоретическая молекулярная масса 4788,5 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 8,74 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 9,39 мин.
Пример 5
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 24:
Способ изготовления: как в Примере 3, за исключением применения моно-трет-бутилового эфира додекандиовой кислоты в боковой цепи.
Теоретическая молекулярная масса 4732,4 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 8,19 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 8,17 мин.
Пример 6
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид
Соед. 25:
Способ изготовления: как в Примере 3, за исключением того, что используемой смолой была Tentagel S RAM с загрузкой 0,24 ммоль/г, и Fmoc-Lys(Mtt) использовалась на обеих позициях 26 и 37.
Теоретическая молекулярная масса 4843,6 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 9,43 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 11,88 мин.
Пример 7
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид
Соед. 26:
Способ изготовления: как в Примере 6, за исключением применения моно-трет-бутилового эфира тетрадекандиовой кислоты в боковой цепи.
Теоретическая молекулярная масса 4787,5 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 8,72 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 9,98 мин.
Пример 8
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys)GLP-1(7-37)-пептида амид
Соед. 27:
Способ изготовления: как в Примере 6, за исключением применения моно-трет-бутилового эфира додекандиовой кислоты в боковой цепи.
Теоретическая молекулярная масса 4731,4 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 8,16 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 8,83 мин.
Пример 9
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид
Соед. 28:
Способ изготовления: как в Примере 7.
Теоретическая молекулярная масса 4497,2 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 8,85 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 10,27 мин.
Пример 10
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]], N-[2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутириламино]][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид
Соед. 29:
Способ изготовления: как в Примере 7.
Теоретическая молекулярная масса 4206,8 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 9,04 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 10,68 мин.
Пример 11
ε26
ε37
8
34
37
N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-карбокси-тридеканоиламино)этокси]этокси}ацетиламино)этокси]этокси}ацетил), N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-карбокси-тридеканоиламино)этокси]этокси}ацетиламино)этокси]этокси}ацетил)[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид
Соед. 30:
Способ изготовления: как в Примере 7.
Теоретическая молекулярная масса 4529,2 была подтверждена MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt 9,07 мин.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt 13,31 мин.
Пример 12
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-йодофенил)бутириламино]бутириламино}этокси)-этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-йодофенил)бутириламино]бутириламино}-этокси)-этокси]-ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 31:
Способ изготовления: способ SPPS В, 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), 4-(4-йодофенилмасляную кислоту (коммерчески доступную от Aldrich) и Fmoc-Glu-OtBu связывали с помощью SPPS способа D
UPLC (способ 04_А4_1): Rt=8,54 мин
UPLC (способ 01_А4_2): Rt=10,23 мин
LCMS4: Rt=2,4 мин, m/z=971(m/5) 1213 (m/44) 1617 (m/3)
Пример 13
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(4-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-Карбокси-4-[16-(4-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 32:
Способ приготовления: SPPS Способ В. Конечный продукт характеризуется с помощью аналитических UPLC и LC-MS с тем исключением, что этап покрытия ангидридом уксусной кислоты выполняли после связывания следующих аминокислот: Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 и Aib8 (2½ мин, 65°С и 1N уксусный ангидрид в NMP). Трет-бутиловый эфир 4-(15-карбоксипентадецилокси)бензойной кислоты можно получить, как описано в Примере 17 в WO07128817.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=11,272 мин.
UPLC (способ 05_В10_1): Rt=7,319 мин.
LCMS4: Rt=2.37 мин, m/z=5054,48. Рассчитанная MW=5056.82
Пример 14
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(3-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[16-(3-карбоксифенокси)гексадеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 33:
Изготовление трет-бутилового эфира 3-гидроксибензойной кислоты
Смесь 3-гидроксибензойной кислоты (55,0 г, 400 ммоль), ди-трет-бутилдикарбоната (178 г, 820 ммоль), перхлората магния (0,89 г, 4,0 ммоль) и сухого нитрометана (750 мл) перемешивали при температуре 40°С в течение 96 часов. Добавляли этилацетат (800 мл) и промывали органический слой 5% водным раствором бикарбоната натрия (1500 мл). Органический раствор сушили над безводным сульфатом магния и затем выпаривали в вакууме. Остаток применяли к колоночной хроматографии (силикагель Fluka 60, гексан/этилацетат 8:1), получая указанное в заголовке соединение в виде белого твердого вещества.
Выход: 9,07 г (12%)
Температура плавления: 94-96°С
H
1Н NMR-спектр (300 МГц, CDCl3, δ (dH)): 7,61-7,53 (m, 2 Н); 7,29 (t, J=8,1 Гц, 1 Н); 7,05 (m, 1 Н); 6,06 (bs, 1 Н); 1,59 (s, 9 Н).
Изготовление метилового эфира 16-бромгексадекановой кислоты
16-бромгексадекановую кислоту (6,0 г) растворяли в метаноле (35 мл), толуоле (100 мл) и триметилортоформате (20 мл), затем добавляли Amberlyst 15 от Fluka (1,4 г). Смесь перемешивали при 55°С в течение 16 часов. Смесь выпаривали досуха и высушивали в вакууме в течение 16 часов для получения 7,7 г. Остаток суспендировали в метаноле (примерно 50 мл) и перемешивали в течение примерно ½ часа. Amberlyst 15 отфильтровывали после перемешивания с DCM (30 мл) в течение ½ часа. Фильтрат концентрировали для удаления DCM, прозрачный раствор охлаждали и добавляли больше метанола (примерно 20 мл, общий объем примерно 40 мл). Сосуд охлаждали и осаждали больше кристаллов, и после перемешивания в течение 30 минут кристаллы отфильтровывали и промывали холодным МеОН. Белые кристаллы высушивали в вакууме, получая 5,61 г.
Изготовление трет-бутилового эфира 3-(15-метоксикарбонил-пентадецилокси)бензойной кислоты
2
3
Трет-бутиловый эфир 3-гидроксибензойной кислоты (1,79 г) растворяли в 75 мл MeCN, затем добавляли метиловый эфир бромгексадекановой кислоты (3,22 г) с последующим добавлением KCO (2,5 г). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 дней при 80°С. Реакционную смесь фильтровали. Фильтрат выпаривали, а остаток растворяли в 100 мл EtOAc, и слой EtOAc дважды промывали 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Органический слой сушили над МдЗОд, фильтровали и удаляли растворитель выпариванием, получая 4,165 г (98%).
Изготовление трет-бутилового эфира 3-(15-карбоксипентадецилокси)бензойной кислоты
4
Трет-бутиловый эфир 3-(15-метоксикарбонилпентадецилокси)бензойной кислоты (4,165 г) растворяли в 50 мл THF и 50 мл МеОН. Добавляли воду (10 мл) с последующим добавлением LiOH (0,565 г, 13,5 ммоль). Реакцию проводили в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривали и остаток растворяли в 150 мл EtOAc и добавляли 80 мл воды и 20 мл 1 N HCl. Слои разделяли и органический слой сушили над MgSO, фильтровали и растворитель удаляли выпариванием, получая белое твердое вещество (3,91 г, 97%).
Способ изготовления: Способ SPPS В и применение трет-бутилового эфира 3-(15-карбоксипентадецилокси)бензойной кислоты аналогичным образом, как в Примере 1. Конечный продукт характеризовали путем аналитической UPLC и LC-MS с тем исключением, что этап покрывания ангидридом уксусной кислоты выполняли после связывания следующих аминокислот: Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 и Aib8 (2 ½ мин, 65°C с 1 N уксусным ангидридом в NMP).
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=11,201 мин
UPLC (способ 05_В10_1): Rt=8,622 мин
LCMS4: Rt=2,37 мин, m/z=1011,88 (m/5); 1664,32 (m/4); 5053,28
Рассчитанная MW=5056,82
Пример 15
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)-этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 34:
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP, и 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с применением способа SPPS D.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=8,8 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=9,6 мин
LCMS4: 4598,0
Рассчитанная MW=4598,2
Пример 16
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[12-(3-карбоксифенокси)додеканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 35:
Способ приготовления: Способ SPPS В. Трет-бутиловый эфир 3-(11-карбоксиундецилокси)бензойной кислоты получали аналогичным образом, как описано для трет-бутилового эфира 3-(15-карбоксипентадецилокси)бензойной кислоты, с использованием 12-бромдодекановая кислоты. Конечный продукт характеризовали путем аналитической UPLC и LC-MS с тем исключением, что этап покрывания ангидридом уксусной кислоты выполняли после связывания следующих аминокислот: Trp31, Ala25, Tyr19, Phe12 и Aib8 (2 ½ мин, 65°C с 1N уксусным ангидридом в NMP)
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=9,449 мин
LCMS4: Rt=2,37 мин, m/z=m/z: 1011,88(m/4); 1264,32(m/3); 4942,24
Рассчитанная MW=4944,608
Пример 17
ε26
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]
ε37
8
31
34
37
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино) этокси]этокси)ацетил][Aib,His,Gln,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 36:
Способ изготовления: способ SPPS А, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP, и 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech) дважды связывали с Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловым эфиром 4-(9-карбоксинонилокси)-бензойной кислоты (изготовленным, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) с помощью способа SPPS А.
UPLC (способ 05_В5_1): Rt=4,95 мин (92%)
LCMS4: m/z=4011, рассчитанная=4011
Пример 18
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-метилфенил)бутириламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[4-(4-метилфенил)бутириламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 37:
Способ изготовления: способ SPPS В, 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), 4-(4-йодофенилмасляную кислоту (коммерчески доступную от ABCR) и Fmoc-Glu-OtBu связывали с помощью SPPS способа D.
UPLC (способ 01_В4_1): Rt=9,93 мин
LCMS4: Rt=2,44 мин, m/z=926(m/5) 1157(m/4) 1543(m/3)
Пример 19
ε26
ε37
8
34
37
N-((S)-4-карбокси-4-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}бутирил), N-((S)-4-карбокси-4-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}бутирил)[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 38:
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP, и Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа SPPS D.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=8,6 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=7,9 мин
LCMS4: 4565,0
Рассчитанная MW=4566,1
Пример 20
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-карбокси-4-[10-(3-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{4-карбокси-4-[10-(3-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 39:
Изготовление трет-бутилового эфира 3-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты
4
Трет-бутиловый эфир 3-гидроксибензойной кислоты (3 г) растворяли в ацетонитриле (50 мл). Добавляли метиловый эфир 10-бромдекановой кислоты от Aldrich (4,1 г) в ацетонитриле (20 мл) и промывали сосуд ацетонитрилом (30 мл). Добавляли карбонат калия и смесь перегоняли в атмосфере азота примерно в течение 18 часов. Реакционную смесь охлаждали и выпаривали досуха. Остаток растворяли в AcOEt (80 мл) и воде (30 мл) и экстрагировали. Водную фазу промывали AcOEt (30 мл) и объединенные органические фазы промывали водой (50 мл), насыщенным NaCl (30 мл) и сушили над MgSO и концентрировали фильтрат в вакууме, получая белое твердое вещество (5,8 г). Остаток растворяли в DCM (15 мл) и добавляли гептан (примерно 60 мл), раствор концентрировали примерно до 30 мл. После перемешивания в течение 30 минут кристаллы начинали формироваться, и раствор охлаждали льдом. Кристаллы отфильтровывали и промывали охлажденным гептаном, высушивали в вакууме, получая 4,13 г (71%) трет-бутилового эфира 3-(9-метоксикарбонилнонилокси)бензойной кислоты.
4
3
Кристаллы растворяли в THF (30 мл) и добавяли 1N NaOH (11 мл). Мутный раствор перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь концентрировали для удаления большей части THF, а оставшийся водный раствор экстрагировали с помощью AcOEt (50 мл). рН водного раствора доводили до 1-2 с помощью примерно 12 мл 1N HCI, и водную фазу экстрагировали с помощью AcOEt (25 мл). Объединенные органические фазы промывали водой, сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали, получая белое полутвердое кристаллическое вещество (3,97 г), LCMS2: 401 (М+23), H-NMR (400 МГц, CDCl): 7,56 (d, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,26-7,32 (m, 1H), 7,05 (dd, 1H),3,99 (t, 2Н), 2,35 (t, 2H), 1,75-1,82 (m, 2H), 1,62-1,65 (m, 2H), 1,59 (s, 9H), 1,42-1,47 (m, 2H), 1,33 (br, 8H).
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP, и 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 3-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа двойного связывания на пептидном синтезаторе Liberty
UPLC (способ 04_А4_1): 10,01 мин
UPLC (способ 08_В4_1): 8,81 мин
5+
4+
3+
LCMS4: m/z=978,5 (M+5H), 1222,8 (М+4Н), 1630,1 (М+3Н)
Пример 21
ε26
ε37
8
31
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib,His,Gln,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 40:
Способ изготовления: как в Примере 5.
Теоретическая молекулярная масса 4655,2 была подтверждена MALDI
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=7,72 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=5,70 мин
Пример 22
9
ε26
ε37
34
37
38
N-{2-[2-(1H-имидазол-4-ил)этилкарбамоил]-2-метилпропионил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{((S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg,Lys]GLP-1(9-37)Glu-пептид
Соед. 41:
Способ изготовления: способ SPPS В. 2,2-диметил-N-[2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этил]малоновой кислоты полуамид связывали в тех же условия связывания, что и для аминокислоты Aib. 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа SPPS D.
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=9,32 мин.
LCMS4: Rt=2,29 мин., m/z=1669 (m/3), 1252 (m/4), 1001 (m/5)
Пример 23
9
ε26
ε37
37
N-{2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)этилкарбамоил]-2-метилпропионил}-N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg34,Lys]GLP-1(9-37)-пептид
Соед. 42:
Способ изготовления: способ SPPS В. 2,2-диметил-N-[2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этил]малоновой кислоты полуамид связывали в тех же условия связывания, что и для аминокислоты Aib. 8-(9-фторенилметилоксикарбонил-амино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа SPPS D.
UPLC (способ 08_В4_1 (TFA)): Rt=8,81 мин
LCMS4: Rt=2,29 мин, m/z=1625 (m/3), 1219 (m/4), 975 (m/5)
Пример 24
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]бутириламино}этокси)этокси)ацетил}, N-{2-[2-(2-{(S)-4-Карбокси-4-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 43:
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP вручную, и 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и тетрадекандиовую кислоту связывали с помощью способа двойного связывания на пептидном синтезаторе Liberty. Теоретическую молекулярную массу подтверждали путем MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=8,6 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=9,7 мин
MALDI-MS: 4788
Пример 25
ε26
ε37
8
34
37
N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси]ацетиламино}бутирил], N-[(S)-4-карбокси-4-{2-[2-(2-[2-(2-{2-[(13-карбокситридеканоиламино)]этокси}этокси)ацетиламино]этокси)этокси] ацетиламино}бутирил][Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 44:
Способ изготовления: способ SPPS В, начиная со смолы Fmoc-Lys(Mtt)-Wang с низкой загрузкой. Fmoc-Lys(Mtt)-OH использовали в позиции 26, а Вос-His(Trt)-OH использовали в позиции 7. Mtt удаляли с HFIP вручную, и 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и тетрадекандиовую кислоту связывали с помощью способа двойного связывания на пептидном синтезаторе Liberty. Теоретическую молекулярную массу подтверждали путем MALDI-MS.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=8,8 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=10 мин
MALDI-MS: 4787
Пример 26
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбокси-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 45:
Способ изготовления: способ SPPS В, 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), 4-(4-трет-бутилфенил)масляную кислоту и Fmoc-Glu-OtBu связывали с помощью способа SPPS D.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=9,07 мин
LCMS4: Rt=2,29 мин, m/z=943 (m/5) 1179 (m/4) 1571 (m/3)
Пример 27
9
ε26
ε37
34
37
N-{2-[2-(1Н-имидазол-4-ил)-этилкарбамоил]-2-метилпропионил}-N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-трет-бутилфенил)бутириламино]-4-карбоксибутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептид
Соед. 46:
Способ изготовления: способ SPPS В. 2,2-диметил-N-[2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этил]малоновой кислоты полуамид связывали в тех же условия связывания, что и для аминокислоты Fmoc-Aib. 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и 4-(4-трет-бутилфенил)масляную кислоту связывали с помощью способа SPPS D.
UPLC (способ 04_А4_1): Rt=10,56 мин
LCMS4: Rt=2,40 мин. m/z=940 (m/5), 1174 (m/4), 1565 (m/3)
Пример 28
ε26
ε37
7
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Imp,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 47:
Способ изготовления: способ SPPS В
4+
3+
LCMS4: Rt: 2,22 мин, m/z: 4859,5; 1214,9 (М+4H); 1619,8 (М+3Н)
UPLC (способ: 08_В4_1): Rt=8,88 мин
UPLC (способ: 04_А3_1): Rt=9,28 мин
Пример 29
ε26
ε37
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 48:
Способ изготовления: способ SPPS В
UPLC (способ 05_В5_1): Rt=5,75 мин
UPLC (способ 08_В2_1): Rt=13,09 мин
LCMS4 (М/5)+1=976; (М/4)+1=1219; Точная масса=4874
Пример 30
ε26
ε37
8
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Aib,Gly9,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 49:
Способ изготовления: способ SPPS А
UPLC (способ 09_В2_1): Rt=13,20 мин
UPLC (способ 05_В5_1): Rt=6,05 мин
LCMS4: (М/5)+1=964; (М/4)+1=1204; Точная масса=4816
Пример 31
ε26
ε37
8
23
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Aib,Arg,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 50:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt=2,12 мин, m/z: 4916,0
UPLC (способ: 08_В2_1): Rt=12,59 мин
UPLC (способ: 04_А3_1): Rt=10,57 мин
Пример 32
ε26
ε37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]зтокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 51:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt=2,12 мин, m/z: 4774,4
UPLC (способ: 09_В2_1): Rt=12,87 мин
UPLC (способ: 04_А3_1): Rt=8,86 мин
Пример 33
ε26
ε37
31
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[His,Gln,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 52:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt:=1,92 мин, m/z: 4797,3; М/4: 1199,8; М/3: 1599,4
UPLC (способ: 09_В4_1): Rt=8,12 мин
UPLC (способ: 05_В8_1): Rt=2,03 мин
Пример 34
ε26
ε37
31
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[His,Gln,Lys]-GLP-1(7-37)-пептид
Соед. 53:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt=1,99 мин, m/z: 4697,0
UPLC (способ: 09_В2_1) R=12,20 мин
UPLC (способ: 05_В5_1): Rt=5,31 мин
Пример 35
ε26
ε37
31
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил](His,Gln,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 54:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt=1,89 мин, m/z: 4641,2
UPLC (способ: 09_В2_1): Rt=11,2 мин
UPLC (способ: 05_В5_1): Rt=4,00 мин
Пример 36
ε26
ε37
31
34
37
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил], N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил][His,Gln,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 55:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt: 1,97 мин, m/z: 4797.3; М/4: 1199,8; М/3: 1599,4
UPLC (способ: 09_В4_1): Rt=8,24 мин
UPLC (способ: 05_В8_1): Rt=2,88 мин
Пример 37
ε26
ε37
9
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Gln,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 56:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt=1,06 мин, m/z: 4873,3
UPLC (способ: 09_В2_1): Rt=13,18 мин
UPLC (способ: 05_В5_1): Rt=6,40 мин
Пример 38
ε26
ε37
30
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Glu,Arg34,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 57:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt=2,13 мин, m/z: 4932,7
UPLC (способ: 09_В2_1): Rt=13,39 мин
UPLC (способ: 04_А3_1): Rt=8,20 мин
Пример 39
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Aib,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 58:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt: 1,93 мин, m/z: 4832,4; М/4: 1208,5; М/3: 1611,0
UPLC (способ 09_В4_1): Rt=8,10 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=8,15 мин
UPLC (способ 05_В5_1): Rt=5,30 мин
Пример 40
ε26
ε37
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg34,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 59:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt: 1,92 мин, m/z: 4818,4; М/4: 1205,0; М/3: 1606,7
UPLC (способ 09_В4_1): Rt=8,06 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=8,02 мин
Пример 41
ε26
ε37
34
37
N{9}-[2,2-диметил-3-оксо-3-(пиридин-2-илметиламино)пропаноил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg,Lys]-GLP-1-(9-37)-пептид
Соед. 60:
Способ изготовления: способ SPPS В. 2,2-диметил-N-пиридин-2-илметилмалоновой кислоты полуамид связывали в тех же условия связывания, что и для 2,2-диметил-N-[2-(1-тритил-1Н-имидазол-4-ил)-этил]малоновой кислоты полуамида в предыдущих примерах. Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 4-(9-карбоксинонилокси)-бензойной кислоты (изготовленный, как описано в примере 25, этап 2 WO 2006/082204) связывали с помощью способа SPPS D.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=8,98 мин
LCMS4: Rt=2,23 мин. m/z=1624(m/3), 1218 (m/4)
Пример 42
ε26
ε37
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg34,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептидил-Gly
Соед. 61:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt: 2,05 мин, m/z: 4931,5; М/4: 1233,3; М/3: 1644,4
UPLC (способ 09_В4_1): Rt=8,52 мин
UPLC (способ 05_В5_1): Rt=5,18 мин
UPLC (способ 04_А3_1): Rt=9,24 мин
Пример 43
ε26
ε37
34
36
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg,Gly,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 62:
Способ изготовления: способ SPP3 В
LCMS4: Rt: 2,18 мин, m/z: 4775,3; М/4: 1194,5; М/3: 1592,4
UPLC (способ: 09_В4_1): Rt=9,01 мин
UPLC (способ: 04_А3_1): Rt=9,60 мин
UPLC (способ: 05_В5_1): Rt=5,88 мин
Пример 44
ε26
ε37
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[9-(4-карбоксифенокси)нонаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[9-(4-карбоксифенокси)нонаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg34,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 63:
Способ изготовления: способ SPPS В
LCMS4: Rt: 2,03 мин, m/z: 4846,4; М/4: 1212,3; М/3: 1616,1
UPLC (способ: 09_В4_1): Rt=8,27 мин
UPLC (способ: 05_В5_1): Rt=5,09 мин
Пример 45
ε26
ε37
8
34
37
N[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[13-(5-карбокситиофен-2-ил)тридеканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[13-(5-карбокситиофен-2-ил)тридеканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Aib,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 64:
Способ изготовления: способ SPPS В. 8-(9-фторенилметилоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановую кислоту (коммерчески доступную от Iris Biotech), Fmoc-Glu-OtBu и трет-бутиловый эфир 5-(12-карбоксидодецил)тиофен-2-карбоксильной кислоты связывали с помощью способа SPPS D на пептидном синтезаторе Liberty.
UPLC (способ 08_В4_1): Rt=9,87 мин
LCMS4: m/z=1651(m/3), 1239 (m/4), 991 (m/5)
Пример 46
ε26
ε37
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg34,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептидил-Glu
Соед. 65:
Способ изготовления: способ SPPS A
UPLC (способ 10_В14_1): Rt=6,54 мин
LCMS4: (М/5)+1=1001; (М/4)+1=1251; точная масса=5003,5
Пример 47
ε26
ε37
37
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-карбокситридеканоиламино)этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил], N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-карбокситридеканоиламино)этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил][Arg34,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 66:
Способ изготовления: способ SPPS В
UPLC (способ: 09_В4_1): Rt=8,76 мин
UPLC (способ: 04_А6_1): Rt=6,02 мин
LCMS4: Rt=2,12 мин. m/z: 4775; М/4=1194; М/5=955
Пример 48
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-карбокси-2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-2-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Aib,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 67:
Способ изготовления: способ SPPS В
UPLC (способ: 08_В2_1): Rt=13,193 мин
UPLC (способ:05_В5_1): Rt=6,685 мин
LCMS4: m/z: 4887; m/3:1630; m/4:1222; m/5:978
Пример 49
ε26
ε37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[8-(4-карбоксифенокси)октаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Arg34,Gly36,Lys37]-GLP-1-(7-37)-пептид
Соед. 68:
LCM34: Rt: 2,07 мин, m/z: 4719,2; M/4: 1180,5; М/3: 1573,7
UPLC (способ: 08_В4_1): Rt=8,45 мин
UPLC (способ: 05_В5_1): Rt=5,19 мин
Фармакологические способы
Пример 50: Активность in vitro
Цель этого примера заключается в проверке активности, или силы, производных GLP-1 in vitro.
Активности этих производных GLP-1 из Примеров 1-49 определяются, как описано ниже, т.е. как стимуляция образования циклического АМФ (цАМФ, сАМР) в среде, содержащей мембраны, экспрессирующие человеческий рецептор GLP-1.
Принцип
Очищенные плазматические мембраны из стабильно трансфицированной клеточной линии, BHK467-12А (tk-ts13), экспрессирующей человеческий рецептор GLP-1, стимулировали аналогом GLP-1 или рассматриваемым производным и измеряли активность продукции цАМФ с помощью набора для анализа AlphaScreenTM cAMP от Perkin Elmer Life Sciences. Основной принцип анализ AlphaScreen заключается в конкуренции между эндогенным цАМФ и экзогенно добавленным биотин-цАМФ. Захват цАМФ осуществляется с помощью специфического антитела, конъюгированного с акцепторными бусинами (бидсами).
Культура клеток и получение мембран
2
Стабильно трансфицированную клеточную линию и высоко экспрессирующие клоны отбирали для скрининга. Клетки выращивали в 5% CO в DMEM, 5% FCS, 1% Pen/Strep (пенициллин/стрептомицин) и 0,5 мг/мл маркера селекции G418.
Клетки с конфлюентностью приблизительно 80% промывали 2 раза PBS и собирали с помощью Versene (водного раствора тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты), центрифугировали 5 минут со скоростью 1000 об/мин и удаляли супернатант. Дополнительные этапы проводили на льду. Осадок клеток гомогенизировали в Ultrathurax в течение 20-30 секунд в 10 мл буфера 1 (20 мМ Na-HEPES, 10 мМ EDTA, рН=7,4), центрифугировали 15 минут со скоростью 20000 об/мин, а осадок ресуспендировали в 10 мл буфера 2 (20 мМ Na-HEPES, 0,1 мМ EDTA, pH=7,4). Суспензию гомогенизировали в течение 20-30 секунд и центрифугировали 15 минут со скоростью 20000 об/мин. Суспендирование в буфере 2, гомогенизацию и центрифугирование повторяли еще раз, и мембраны ресуспендировали в буфере 2. Определяли концентрацию белка и сохраняли мембраны при -80°С до использования.
Анализ проводили в ½ площади 96-луночных планшетов с плоским дном (Costar, кат. №3693). Конечный объем на одну лунку составлял 50 мкл.
Растворы и реагенты
Набор для анализа AlphaScreen cAMP от Perkin Elmer Life Sciences (кат. №: 6760625M), содержащий анти-цАМФ акцепторные бидсы (10 Ед/мкл), стрептавидиновые донорные бидсы (10 Ед/мкл) и биотинилированный-цАМФ (133 Ед/мкл).
2
2
Буфер AlphaScreen, рН=7,4: 50 мМ Трис-HCl (Sigma, кат. № Т3253), 5 мМ HEPES (Sigma, кат. № Н3375), 10 мМ MgCl, 6HO (Merck, кат. №5833); 150 мМ NaCl (Sigma, кат. № S9625), 0,01% Tween (Merck, кат. №822184). Следующие вещества были добавлены к буферу AlphaScreen перед использованием (указаны конечные концентрации): BSA (Sigma, кат. № А7906): 0,1%; IBMX (Sigma, кат. №15879): 0,5 мМ; АТР (Sigma, кат. № А7699): 1 мМ; GTP (Sigma, кат. № G8877): 1 мкМ.
цАМФ-стандарт (коэффициент разведения в анализе равен 5): раствор цАМФ: 5 мкл 5 мМ цАМФ-стока + 495 мкл буфера AlphaScreen.
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-6
-11
Были приготовлены серии подходящих разведении в буфере AlphaScreen и цАМФ-стандарта, а также аналога GLP-1 или анализируемого производного, например, следующие восемь концентраций соединения GLP-1: 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 и 10 М, а также серии, например, от 10 до 3×10 цАМФ.
Мембрана/Акцепторные бидсы
Использование hGLP-1/BHK 467-12А мембран; 6 мкг/лунка, что соответствует 0,6 мг/мл (количество мембран, используемое на лунку, может варьировать).
«Нет мембран»: акцепторные бидсы (конечная концентрация 15 мкг/мл) в буфере AlphaScreen
«6 мкг/лунка мембран»: мембраны+акцепторные бидсы (конечная концентрация 15 мкг/мл) в буфере AlphaScreen
Добавление 10 мкл «Нет мембран» к стандарту цАМФ (на лунку в двух повторах) и положительный и отрицательный контроли
Добавление 10 мкл «6 мкг/лунка мембран» к GLP-1 и аналогам (на лунку в двух/трех повторах)
Положительный контроль: 10 мкл «Нет мембран» + 10 мкл буфера AlphaScreen
Отрицательный контроль: 10 мкл «Нет мембран» + 10 мкл стокового раствора цАМФ (50 мкМ)
Так как бидсы чувствительны к прямому свету, любые манипуляции проводят в темноте (как можно более темном месте) или в зеленом свете. Все разведения осуществляют на льду.
Процедура
1. Приготовить буфер AlphaScreen.
2. Растворить и разбавить GLP-1/аналоги/стандарт цАМФ в буфере AlphaScreen.
3. Приготовить раствор донорных бидсов и инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
4. Добавить цАМФ/GLP-1/аналоги в планшет: 10 мкл на лунку.
5. Приготовить раствор мембрана/акцепторные бидсы и добавить в планшет: 10 мкл на лунку.
6. Добавить донорные бидсы: 30 мкл на лунку.
7. Обернуть планшет алюминиевой фольгой и инкубировать на шейкере (очень медленно) в течение 3 часов при комнатной температуре.
8. Рассчитать на AlphaScreen - каждый планшет предварительно инкубировать в AlphaScreen в течение 3 минут перед подсчетом.
Результаты
50
Значения ЕС [пМ] рассчитывали с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism (версия 5).
50
50
50
50
50
Была подтверждена активность всех производных in vitro. 43 производных имели высокую активность in vitro, соответствующую EC 2000 пМ или ниже; 42 производных были еще более активными, имея ЕС 1000 пМ или ниже; 35 производных были еще более активными, имея ЕС 500 рМ или ниже; 19 производных были еще более активными, имея ЕС 200 пМ или ниже; и 10 производных были еще более активными, имея ЕС 100 пМ или ниже.
26,34
50
Для сравнения, соединение №13 в таблице 1 Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p.1664-669 (GLP-1(7-37), ацилированное на K бис-С12-дикислотой) обладало активностью in vitro, соответствующей ЕС 1200 пМ.
50
50
При необходимости кратность изменения в связи с GLP-1 может быть рассчитана как EC (GLP-1)/ЕС (аналога) - 3693,2.
Пример 51: GLP-1 - рецепторное связывание
Целью данного эксперимента является изучение связывания производных GLP-1 с рецептором GLP-1 и того, как связывание потенциально влияет на присутствие альбумина. Оно проводится в эксперименте in vitro, как описано ниже.
125
50
Аффинность связывания производных GLP-1 из Примеров 1-49 с человеческим рецептором GLP-1 измеряли по их способности вытеснять I-GLP-1 с рецептора. Лираглутид и семаглутид были включены в качестве сравнительных соединений. Для того чтобы проверить связывание производных с альбумином, был проведен анализ с низкой концентрацией альбумина (0,005%, соответствующая остаточному количеству в трейсере), а также с высокой концентрацией белка (добавили 2,0%). Сдвиг в аффинности связывания, IC, является свидетельством того, что рассматриваемый пептид связывается с альбумином, и тем самым предсказывает потенциально пролонгированный фармакокинетический профиль рассматриваемого пептида на животных моделях.
Условия
Виды (in vitro): хомяк
Биологическая конечная точка: связывание с рецептором
Способ анализа: SPA
Рецептор: рецептор GLP-1
Клеточная линия: BHK tk-ts13
Культура клеток и очистка мембран
2
Для скрининга отбирали стабильно трансфицированную клеточную линию и высоко экспрессирующий клон. Клетки выращивали в 5% CO в DMEM, 10% FCS, 1% Pen/Strep (пенициллин/стрептомицин) и 1,0 мг/мл маркера селекции G418.
Клетки (с конфлюентностью приблизительно 80%) промывали 2 раза PBS и собирали с помощью Versene (водного раствора тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты), после чего их отделяли путем центрифугирования со скоростью 1000 об/мин в течение 5 минут. На последующих этапах клетки/осадок клеток по мере возможности должны находиться на льду. Осадок клеток гомогенизировали в Ultrathurax в течение 20-30 секунд в соответствующем количестве буфера 1 (в зависимости от количества клеток, например, в 10 мл). Гомогенизат центрифугировали 15 минут со скоростью 20000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфера 2 и повторно центрифугировали. Этот этап повторяли еще один раз. Полученный осадок ресуспендировали в буфере 2 и определяли концентрацию белка. Мембраны сохраняли при -80°С.
Буфер 1: 20 мМ Na-HEPES + 10 мМ EDTA, pH 7,4
Буфер 2: 20 мМ Na-HEPES + 0,1 мм EDTA, pH 7,4
Анализ связывания:
SPA:
125
125
2
2
Анализируемые соединения, мембраны, SPA-частицы и [I]-GLP-1(7-36)NH разводили в буфере для анализа. 25 мкл (микролитров) анализируемого соединения добавляли в Optiplate. Добавляли HSA (эксперимент с «высоким альбумином» с 2% HSA) или буфер (эксперимент с «низким альбумином» с 0,005% HSA) (50 мкл). Добавляли 5-10 мкг белка/образец (50 мкл), что соответствует 0,1-0,2 мг белка/мл (будет лучше оптимизировать для каждого препарата мембран). SPA-частицы (SPA-бидсы из агглютинина зародышей пшеницы, Wheatgerm agglutinin SPA beads, Perkin Elmer, № RPNQ0001) добавляли в количестве 0,5 мг/лунка (50 мкл). Инкубацию начинали с I-GLP-1(7-36)NH (конечная концентрация 0,06 нМ, соответствующая 49,880 DPM, 25 мкл). Планшеты запечатывали с помощью PlateSealer и инкубировали в течение 120 минут при 30°С со встряхиванием. Планшеты центрифугировали (1500 об/мин, 10 минут) и подсчитывали в Topcounter.
Аналитический буфер:
50 мМ HEPES
5 мМ EGTA
2
5 мМ MgCl
0,005% Tween-20
рН 7,4
HSA SIGMA A1653.
Расчеты
50
50
50
125
Значение IC считывали с кривой как концентрацию, которая вытесняет 50% I-GLP с рецептора, и определяли отношение [(IC/нМ) при высоком HSA]/[(IC/нМ) сверхнизком HSA].
50
Как правило, связывание рецептора GLP-1 при низкой концентрации альбумина должно быть как можно лучше, соответствуя низкому значению IC.
50
50
50
Значение IC при высокой концентрации альбумина является мерой влияния альбумина на связывание производного с рецептором GLP-1. Как известно, производные GLP-1 также связываются с альбумином. Это, как правило, является желаемым эффектом, который увеличивает их время жизни в плазме крови. Таким образом, значение IC при высоком альбумине, как правило, будет выше, чем значение IC при низком альбумине, соответствуя сниженному связыванию с рецептором GLP-1, вызванному конкурентным связыванием альбумина со связыванием с рецептором GLP-1.
50
50
50
50
Таким образом, высокий коэффициент (значение IC (при высоком альбумине)/значение IC (при низком альбумине)) может рассматриваться как признак того, что рассматриваемое производное хорошо связывается с альбумином (может иметь длительный период полужизни), а также само по себе хорошо связывается с рецептором GLP-1 (значение IC (при высоком альбумине) является высоким, а значение IC (при низком альбумине) является низким).
Результаты
50
50
Были получены следующие результаты, где «отношение» относится к [(IC/нМ) при высоком HSA]/[(IC/нМ) при низком HSA]):
Все, кроме двух производных, имели отношение больше 1,0; 40 производных больше 10; 34 производные больше 25; 22 производных больше 50; 12 производных больше 100; и 3 производных больше 250.
50
50
Кроме того, что касается IC (при низком альбумине), все производные имели IC (при низком альбумине) меньше 600 нМ; все, кроме одного, меньше 500 нМ; 46 производных меньше 100 нМ; 44 производных меньше 50,00 нМ; 34 производных меньше 10,00 нМ; 23 производных меньше 5,00 нМ; и 7 производных меньше 1,00 нМ.
50
50
Наконец, что касается IC (при высоком альбумине), все производные имели IC (при высоком альбумине) 1000,00 нМ или меньше; 46 производных меньше 1000,00 нМ, 39 производных меньше 500,00 нМ; 7 производных меньше 100,00 нМ; и 4 производных меньше 50,00 нМ.
Пример 52: Оценка пероральной биодоступности
Цель этого эксперимента заключается в оценке пероральной биодоступности производных GLP-1.
С этой целью изучали появление в плазме после прямого введения в просвет кишечника производных GLP-1 из Примеров 2, 15-17, 21, 25, 32, 36-39, 42-48 in vivo у крыс, как описано далее.
Производные GLP-1 анализировали в концентрации 1000 мкМ в растворе 55 мг/мл капрата натрия.
32 крысы линии Sprague Dawley мужского пола с массой тела по прибытии примерно 240 г были получены из Taconic (Дания) и назначены для различных видов обработки путем простой рандомизации, по 4 крысы в каждой группе. Крыс лишали пищи в течение примерно 18 часов до начала эксперимента и проводили общую анестезию (Hypnorm/Dormicum).
Производные GLP-1 вводили в тощую кишку либо в проксимальную часть (10 см дистальнее от двенадцатиперстной кишки), либо в среднюю часть кишки (50 см проксимальнее от слепой кишки). Катетер РЕ50 длиной 10 см вставляли в тощую кишку, направляли вперед по меньшей мере на 1,5 см в тощую кишку и закрепляли перед введением дозы с помощью лигатуры вокруг кишечника и катетера нитью 3/0 дистальнее среза, чтобы предотвратить утечку или перемещение катетера. Катетер помещали без шприца и иглы и вводили 2 мл физиологического раствора в брюшную полость, прежде чем закрыть разрез зажимами для ран.
100 мкл соответствующего производного GLP-1 вводили в просвет тощей кишки через катетер с помощью шприца объемом 1 мл. Затем с помощью другого шприца в просвет тощей кишки выталкивали 200 мкл воздуха, чтобы «промыть» катетер. Этот шприц затем оставляли связанным с катетером для предотвращения обратного тока в катетер.
Образцы крови (200 мкл) из хвостовой вены собирали в пробирки с EDTA через необходимые промежутки времени (обычно в моменты времени 0, 10, 30, 60, 120 и 240 минут) и центрифугировали 5 минут, 10000 g, при 4°С в течение 20 минут. Плазму (75 мкл) отделяли в пробирки Micronic, немедленно замораживали и хранили при температуре -20°С до анализа на концентрацию соответствующего производного GLP-1 в плазме с помощью LOCI (иммунологического анализа люминесценции кислородных каналов), в целом, как описано для определения инсулина Poulsen и Jensen в Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p.240-247. Донорные бидсы были покрыты стрептавидином, а акцепторные бидсы конъюгированы с моноклональным антителом, распознающим mid-/C-концевой эпитоп пептида. Другое моноклональное антитело, специфичное для N-конца, было биотинилированным. Три реагента объединяли с аналитом и формировали иммунокомплекс с двумя сайтами. При облучении комплекса из донорных бидсов высвобождались атомы синглетного кислорода, которые направлялись в акцепторные бидсы и вызывали хемилюминесценцию, которую измеряли на планшетном ридере Envision. Количество света было пропорционально концентрации соединения.
После забора крови крыс умерщвляли под наркозом и брюшную полость вскрывали для проверки правильности размещения катетера.
Средние (n=4) концентрации в плазме (пмоль/л) определяли в зависимости от времени. Отношение концентрации в плазме крови (пмоль/л) и концентрации в дозирующем растворе (мкмоль/л) рассчитывали для каждого введения дозы, и оценивали результаты для t=30 мин (через 30 минут после введения соединения в тощую кишку) (присутствие, корректируемое дозой, на 30 минуте) в качестве косвенного показателя кишечной биодоступности. Было показано, что скорректированное дозой появление достоверно коррелирует с фактической биодоступностью.
Были получены следующие результаты, где корректируемое дозой присутствие на 30 минуте относится к (концентрации в плазме крови через 30 минут после введения соединения в тощую кишку (пМ)), деленной на (концентрацию соединения в дозирующем растворе (мкМ)):
Все производные имели корректируемое дозой присутствие на 30 минуте выше 40; 17 имели выше 50; 14 имели выше 70; 11 имели выше 100; 6 имели выше 125; и 2 производных имели выше 150.
26,34
Для сравнения, соединение №13 в таблице 1 Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p.1664-669 (GLP-1(7-37), ацилированное на K бис-С12-дикислотой, имело корректируемое дозой присутствие на 30 минуте ниже 40, а корректируемое дозой присутствие на 30 минуте для семаглутида находилось в том же диапазоне ниже 40.
Пример 53: Влияние на уровень глюкозы в крови и вес тела
Цель исследования заключается в проверке влияния производных GLP-1 на содержание глюкозы в крови (BG) и массу тела (BW) при диабетических состояниях.
Производные GLP-1 из Примеров 2, 4-5, 17 и 29 анализировали в исследовании зависимости «доза-реакция» на мышиной модели диабета и ожирения (мышах db/db), как описано далее.
Пятьдесят мышей db/db (Taconic, Дания), которых с рождения кормили в соответствии с диетой NIH31 (NIH 31М Rodent Diet, коммерчески доступен от Taconic Farms, Inc., US, см. www.taconic.com NIH 31М), включали в исследование в возрасте 7-9 недель. Мыши получали свободный доступ к стандартному корму (например, Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Дания) и водопроводной воде и содержались при 24°С. После 1-2 недель акклиматизации в крови дважды оценивали базальный уровень глюкозы два дня подряд (т.е. в 9 часов утра). 8 мышей с самыми низкими значениями глюкозы в крови были исключены из экспериментов. На основании средних значений глюкозы в крови остальные 42 мыши были отобраны для дальнейших экспериментов и разделены на 7 групп (n=6) с соответствующим уровнем глюкозы в крови. Мышей использовали в экспериментах продолжительностью 5 дней до 4 раз. После последнего эксперимента мышей умерщвляли.
Семь групп обрабатывали следующим образом:
1: Носитель, подкожно
2: Производное GLP-1, 0,3 нмоль/кг, подкожно
3: Производное GLP-1,1,0 нмоль/кг, подкожно
4: Производное GLP-1, 3,0 нмоль/кг, подкожно
5: Производное GLP-1, 10 нмоль/кг, подкожно
6: Производное GLP-1, 30 нмоль/кг, подкожно
7: Производное GLP-1,100 нмоль/кг, подкожно
Носитель: 50 мМ фосфат натрия, 145 мМ хлорид натрия, 0,05% Tween-80, рН 7,4.
Производное GLP-1 растворяли в носителе до концентрации 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 и 17,0 нмоль/мл. Животным вводили подкожно дозу-объем 6 мл/кг (т.е. 300 мкл на 50 г мышь).
В день введения дозы уровень глюкозы в крови оценивали в момент времени -½ ч (8:30 утра), после чего мышей взвешивали. Производное GLP-1 вводили примерно в 9 часов утра (момент времени 0). В день введения дозы уровень глюкозы в крови оценивали в моменты времени 1, 2, 4 и 8 ч (10 часов утра, 11 часов утра, 13 часов дня и 17 часов дня).
В последующие дни уровень глюкозы в крови оценивали в моменты времени 24, 48, 72 и 96 ч после приема препарата (т.е. в 9 часов утра на 2, 3, 4, 5 дни). Каждый день после забора крови для анализа уровня глюкозы мышей взвешивали.
Мышей взвешивали по отдельности на цифровых весах.
Образцы для измерения уровня глюкозы в крови получали из капилляров на кончике хвоста мыши, находящейся в сознании. Кровь, 10 мкл, собирали в гепаринизированные капилляры и переносили в 500 мкл глюкозного буфера (системный раствор EKF, Eppendorf, Германия). Концентрацию глюкозы измеряли глюкозооксидазным способом (анализатор глюкозы Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Барлебен, Германия). Образцы хранили при комнатной температуре в течение 1 часа до анализа. Если анализ был отложен, образцы хранили при температуре 4°С в течение максимум 24 часов.
50
ED представляет собой дозу, которая приводит к половине максимального эффекта, в нмоль/кг. Это значение рассчитывается на основании способности производных снижать массу тела, а также способности снижать уровень глюкозы в крови, как описано ниже.
50
50
50
ED для массы тела рассчитывается как доза, дающая половину максимального эффекта на дельта BW в течение 24 часов после подкожного введения производного. Например, если максимальное снижение массы тела через 24 часа составляет 4,0 г, то ED массы тела будет такой дозой в нмоль/кг, которая приводит к снижению массы тела на 2,0 г через 24 часа. Эта доза (ED массы тела) может быть считана с кривой «доза-реакция».
50
ED для глюкозы в крови рассчитывается как доза, дающая половину максимального эффекта от AUC дельта BG в течение 8 часов после подкожного введения аналога.
50
Значение ED может быть вычислено, только если существует подходящее сигмоидальное отношение «доза-реакция» с четким определением максимального ответа. Таким образом, если это не так, то рассматриваемое производное повторно анализируют в другом диапазоне доз до тех пор, пока не получается сигмоидальное отношение «доза-реакция».
Были получены следующие результаты:
50
Анализируемые производные имели ожидаемое влияние на уровень глюкозы в крови, а также на массу тела (снижение в обоих случаях). Кроме того, была получена сигмоидальная кривая «доза-реакция», позволяющая рассчитывать значения ED для уровня глюкозы в крови и массы тела, соответственно, как описано выше.
Пример 54: Период полужизни у минисвиней
Целью данного исследования является определение замедления in vivo производных GLP-1 после внутривенного введения минисвиньям, т.е. увеличения времени действия. Это делается в фармакокинетическом (PK) исследовании, в котором определяют конечный период полужизни рассматриваемого производного. Период полужизни, как правило, означает период времени, который нужен, чтобы вдвое сократить определенную концентрацию в плазме крови, измеренную после начальной фазы распределения. В исследованиях использовали геттингенских минисвиней мужского пола, полученных от Ellegaard Gottingen Minipigs (Dalmose, Дания), примерно 7-14-месячного возраста, с весом примерно 16-35 кг. Минисвиньи были размещены отдельно друг от друга и получали корм один или два раза в день с соблюдением диеты SDS для минисвиней (Special Diets Services, Эссекс, Великобритания). После по меньшей мере двух недель акклиматизации каждому животному в верхнюю или нижнюю полую вену имплантировали постоянные центральные венозные катетеры. На 1 неделю животных оставляли для восстановления после операции, а затем использовали для повторных фармакокинетических исследований с соответствующим периодом вымывания между введениями доз.
Животных лишали пищи в течение примерно 18 часов перед введением дозы и по меньшей мере в течение 4 часов после введения дозы, но обеспечивали им свободный доступ к воде в течение всего периода.
Производные GLP-1 из Примеров 2, 4-5, 16-17, 25, 29 и 39 растворяли в 50 мМ фосфате натрия, 145 мМ хлориде натрия, 0,05% Tween-80, pH 7,4 до концентрации, как правило, 20-60 нмоль/мл. Внутривенные инъекции соединений (объем, соответствующий обычно 1-2 нмоль/кг, например 0,033 мл/кг) давали через один катетер, а образцы крови забирали в заданные моменты времени вплоть до 13 дня после введения дозы (предпочтительно через другой катетер). Образцы крови (например, 0,8 мл) собирали в буфер EDTA (8 мМ), а затем центрифугировали при 4°С и 1942G в течение 10 минут. Плазму пипетировали в пробирках Micronic на сухом льду и держали при -20°С до анализа на концентрацию в плазме соответствующего соединения GLP-1 с помощью ИФА, или аналогичного анализа на основе антител, или LC-MS. Индивидуальные плазменные профили «концентрация-время» анализировали с помощью некомпартментной модели WinNonlin v. 5.0 (Pharsight Inc, Маунтин-Вью, Калифорния, США), и определяли полученные конечные периоды полужизни (среднее гармоническое).
Результаты
Все, кроме одного анализируемого производного, имели период полужизни по меньшей мере 12 часов, шесть из них имели период полужизни по меньшей мере 24 часа, пять имели период полужизни по меньшей мере 36 часов, три имели период полужизни по меньшей мере 48 часов, два имели период полужизни по меньшей мере 60 часов.
Пример 55: Влияние на опосредованную глюкозой секрецию инсулина
Цель этого примера заключается в проверке влияния производных GLP-1 на опосредованную глюкозой секрецию инсулина.
Она проводилась на геттингенских минисвиньях с использованием внутривенного теста толерантности к глюкозе (IVGTT).
В исследованиях использовали геттингенских минисвиней мужского пола (Ellegaard Gottingen Minipigs A/S, Dalmose, Дания) в возрасте 7-14-месяцев. Животных помещали в отдельные загоны на весь период акклиматизации и экспериментов. После по меньшей мере двух недель акклиматизации каждому животному в верхнюю или нижнюю полую вену имплантировали постоянные центральные венозные катетеры. На 1 неделю животных оставляли для восстановления после операции, а затем использовали для повторных фармакокинетических исследований с соответствующим периодом вымывания между введениями доз.
Свиней кормили ограниченно 1-2 раза в день кормом для минисвиней SDS (Special Diets Services, Эссекс, Великобритания), но обеспечивали им свободный доступ к воде.
Влияние производных GLP-1 проверяли после введения однократной дозы или после периода с эскалацией дозы, чтобы избежать острых негативных последствий высоких доз. Производные GLP-1 вводили либо внутривенно, либо подкожно в тонкую кожу за ухом.
Для каждого анализируемого производного GLP-1 существовали обработанная носителем (или не обработанная) базальная группа и 2-6 групп с дозами GLP-1, соответствующими 2-6 различным уровням концентрации в плазме крови, которые обычно составляли примерно 3000-80000 пМ (n=5-8).
Для каждого производного GLP-1 проводили 1- или 2-часовой внутривенный анализ толерантности к глюкозе. Свиней лишали пищи в течение примерно 18 часов до начала эксперимента. Проверяли проходимость центральных венозных катетеров и брали два базальных образца крови. После забора образца в момент времени 0 внутривенно вводили 0,3 г/кг глюкозы (глюкоза 500 г/л, SAD) в течение 30 секунд и катетер промывали 20 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Образцы крови, как правило, брали в следующие моменты времени по отношению к болюсу глюкозы: -10, -5, 0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 минут, и после каждого забора крови катетер промывали 4 мл стерильного 0,9% NaCl с 10 Ед/мл гепарина. Образцы крови для определения концентраций в плазме инсулина, глюкозы и производного переносили в пробирки, покрытые EDTA. Пробирки хранили на льду в течение 1 часа до центрифугирования (4°С, 3000 оборотов в минуту, 10 минут), плазму пипетировали в пробирках Micronic на сухом льду и хранили при -20°С до анализа. В зависимости от периода полужизни концентрации производного GLP-1 в плазме крови измеряли при t=0 мин или при t=0 мин и в конце анализа (t=60 мин или t=120 мин). Уровень глюкозы анализировали глюкозооксидазным способом в соответствии с инструкциями производителя с 10 мкл плазмы в 500 мкл буфера (автоанализатор и растворы EBIO plus, Eppendorf, Германия). Уровень инсулина анализировали путем подходящего иммунометрического анализа (такого как LOCI, см., например, Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p.240-247). Концентрацию производных GLP-1 в плазме крови анализировали путем ИФА, или аналогичного анализа на основе антител, или LC-MS.
50
Для каждого исследования рассчитывали площадь под кривой инсулина (AUC инсулина) и использовали в качестве меры секреции инсулина. Группы с различными дозами сравнивали с соответствующей базальной группой/группой с носителем с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) или другого соответствующего статистического анализа. Также может быть рассчитан ЕС для AUC инсулина.
Пример 56: Влияние на потребление корма
Целью данного эксперимента является изучение влияния производных GLP-1 на потребление корма у свиней. Это делается в фармакодинамическом (PD) исследовании, как описано ниже, в котором потребление корма измеряется в 1, 2, 3 и 4 дни после введения одной дозы производного GLP-1 по сравнению с контрольной группой, в которой животным введен носитель.
Использовали свиней Ландрас Йоркшир Дюрок (LYD) женского пола, приблизительно 3-месячного возраста, весом примерно 30-35 кг (n=3-4 в группе). Животных помещали в группу на 1-2 недели на время акклиматизации к помещению для животных. В течение экспериментального периода животных помещали в индивидуальные загоны с утра понедельника до дневного времени пятницы для измерения индивидуального потребления корма. Животных кормили кормом для свиней (Svinefoder, Антонио) без ограничения количества в течение всего периода акклиматизации и экспериментов. Потребление корма контролировали путем записи веса корма каждые 15 минут. Использовали систему Mpigwin (Ellegaard Systems, Фоборг, Дания).
Производные GLP-1 растворяли в фосфатном буфере (50 мМ фосфат, 0,05% Tween-80, pH 8) в концентрациях 12, 40, 120, 400 или 1200 нмоль/мл, соответствующих дозам 0,3, 1, 3, 10 или 30 нмоль/кг. Фосфатный буфер служил носителем. Животным подкожно вводили одну дозу производного GLP-1 или носителя (объемная доза 0,025 мл/кг) утром 1-го дня, и потребление корма измеряли в течение 4 дней после введения дозы. В последний день каждого исследования, 4-й день после введения дозы, из сердца у анестезированных животных брали образец крови для измерения присутствия в плазме производного GLP-1. Затем животных умерщвляли путем внутрисердечной передозировки фенобарбитала. Плазменное содержание производных GLP-1 анализировали с помощью ИФА или аналогичного анализа на основе антител.
Потребление корма рассчитывали как среднее ± SEM потребление корма за 24 часа за 4 дня.
Статистическое сравнение 24-часового потребления корма в группе с введением носителя и в группе с введением производного GLP-1 за 4 дня проводили путем однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа или другого соответствующего статистического анализа, а затем теста Бонферрони.
Пример 57: Устойчивость к расщеплению кишечными ферментами
Целью данного эксперимента является изучение устойчивости к расщеплению кишечными ферментами. GLP-1(7-37) использовали в анализе в качестве стандарта.
Были проанализированы все соединения из Примеров, за исключением соединений из Примеров 4, 6, 8, 34-35 и 49.
Самые сильные протеолитические активности в кишечнике происходят из поджелудочной железы и включают сериновые эндопептидазы трипсин, химотрипсин, эластазу, а также несколько типов карбоксипептидазы.
Анализ с экстрактом тонкого кишечника крыс был разработан и использован, как описано далее.
Экстракт тонкого кишечника крыс
Тонкий кишечник получали от крыс и промывали 8 мл 150 мМ NaCl, 20 мМ Hepes, 7,4 рН. Раствор центрифугировали в течение 15 минут при 4600 об/мин в центрифуге Multifuge Heraeus 3 S-R с ротором 75006445. Супернатанты удаляли и фильтровали через мембрану Millipore Millex GV PVDF с размером пор 0,22 мкм. Фильтраты от нескольких животных объединяли, чтобы усреднить индивидуальные различия.
Содержание белка в полученных экстрактах определяли в анализе по Брэдфорду (см., например, Analytical Biochemistry (1976), vol. 72, p.248-254, и Analytical Biochemistry (1996), vol. 236 p.302-308).
Анализ расщепления
2,5 нмоль анализируемых производных инкубировали с экстрактом кишечника в объеме 250 мкл при 37°С в течение одного часа. Кишечные образцы анализировали в присутствии 20 мМ Hepes при рН 7,4. Концентрацию кишечного экстракта титровали в предварительных экспериментах таким образом, чтобы период полужизни (Т½) GLP-1(7-37) находился в пределах 10-20 минут. Экстракт тонкого кишечника использовали в концентрации 1,4 мкг/мл. Все компоненты, за исключением экстракта кишечника, смешивали и предварительно нагревали в течение десяти минут при 37°С. Сразу же после добавления экстракта кишечника брали образец 50 мкл и смешивали с таким же объемом 1% трифторуксусной кислоты (TFA). Далее образцы брали соответственно через 15, 30 и 60 минут.
Анализ образцов
Анализ UPLC
10 мкл образцов анализировали путем UPLC с помощью системы Waters Acquity на колонке ВЕН С18 1,7 мкм 2,1×50 мм и с градиентом от 30 до 65% 0,1% TFA и 0,07% TFA в ацетонитриле в течение 5 минут со скоростью потока 0,6 мл/мин. После вычитания базальной линии определяли интегралы пиков интактных соединений на HPLC-хроматограмме, записанной при длине волны 214 нм.
Анализ MALDI-TOF
1 мкл каждого образца наносили на мишень Bruker/Eppendorf РАС НССА 384 MALDI. Анализ проводили с помощью масс-спектрометра Bruker Autoflex для матрично-ассоциированной лазерной десорбции и ионизации - времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии с использованием заранее установленного способа «PAC_measure» с расширенным диапазоном выявления от 500 до 5000 Да и заранее установленного способа калибровки «PAC_calibrate».
Анализ данных
Интегралы пиков HPLC-хроматограмм отмечали на графике в зависимости от времени. Период полужизни соответствующего соединения рассчитывали путем подгонки данных с использованием программного обеспечения SigmaPlot 9.0 и уравнения для экспоненциального спада с двумя параметрами.
Для каждого анализируемого соединения относительный период полужизни (относительный Т½) рассчитывали как период полужизни (Т½) рассматриваемого соединения, разделенный на период полужизни (Т½) GLP-1(7-37), определяемый таким же образом.
Результаты
Относительный период полужизни известных соединений лираглутида и семаглутида составил 4,8 и 1,2, соответственно.
За исключением одного соединения, все производные GLP-1 изобретения, которые были проанализированы, имели относительный период полужизни по меньшей мере 1; тридцать один из них имел относительный период полужизни по меньшей мере 2; и десять из них имели относительный период полужизни по меньшей мере 5.
Пример 58: Фармакокинетика у крыс
Цель этого примера заключается в исследовании периода полужизни in vivo у крыс.
Фармакокинетические исследования in vivo на крысах проводили с 10 производными GLP-1 (соединения из данных Примеров 2, 4-5, 16-17, 25, 29, 36, 39 и 43) изобретения, как описано далее. Семаглутид был включен для сравнения. Крыс Sprague Dawley мужского пола одного и того же возраста с массой тела от 400 до 600 г получали от Taconic (Дания) и разделяли на группы путем простой рандомизации по массе тела, примерно по 3-6 крыс в каждой группе, так что все животные в каждой группе имели близкую массу тела.
Производные GLP-1 (примерно 6 нмоль/мл) растворяли в 50 мМ фосфате натрия, 145 мМ хлориде натрия, 0,05% Tween-80, pH 7,4. Внутривенные инъекции (1,0 мл/кг) соединений производили через катетер, имплантированный в правую яремную вену. Кровь отбирали из подъязычной вены в течение 5 дней после введения дозы. Образцы крови (200 мкл) собирали в EDTA буфер (8 мМ), а затем центрифугировали при 4°С и 10000G течение 5 минут. Образцы плазмы хранили при -20°С до анализа концентрации в плазме соответствующего соединения GLP-1.
Плазменные концентрации соединений GLP-1 определяли путем иммунологического анализа люминесценции кислородных каналов (LOCI), в целом, как описано для определения инсулина Poulsen и Jensen в Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p.240-247. Донорные бидсы были покрыты стрептавидином, а акцепторные бидсы конъюгированы с моноклональным антителом, распознающим mid-/C-концевой эпитоп пептида. Другое монокпональное антитело, специфичное для N-конца, было биотинилированным. Три реагента объединяли с аналитом и формировали иммунокомплекс с двумя сайтами. Облучение комплекса высвобождало из донорных бидсов атомы синглетного кислорода, которые направлялись в акцепторные бидсы и вызывали хемилюминесценцию, которую измеряли на планшетном ридере Envision. Количество света было пропорционально концентрации соединения.
Плазменные профили «концентрация-время» анализировали с помощью WinNonlin (v. 5.0, Pharsight Inc, Маунтин-Вью, Калифорния, США), а период полужизни (Т½) рассчитывали с использованием индивидуальных плазменных профилей «концентрация-время» от каждого животного.
Результаты
Период полужизни семаглутида составлял 4 часа.
Все десять производных изобретения, которые были проанализированы, имели период полужизни по меньшей мере 4 часа, все, кроме одного, имели период полужизни по меньшей мере 8 часов, семь из них имели период полужизни по меньшей мере 12 часов, шесть из них имели период полужизни по меньшей мере 16 часов, а три из них имели период полужизни по меньшей мере 24 часа.
Хотя некоторые особенности изобретения были проиллюстрированы и описаны в данном документе, многие модификации, замены, изменения и эквиваленты будут приходить на ум специалистам в данной области. Поэтому следует понимать, что формула изобретения предназначена для покрытия всех этих модификаций и изменений, которые находятся в пределах сущности изобретения.