Дифференциация возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого видов

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТУБЕРКУЛЕЗА БЫЧЬЕГО И ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ВИДОВ

© 2013 Нуратинов Р.А., Месробян Н.Х.*, Вердиева Э.А.**

Дагестанский государственный университет

*

Дагестанский государственный технический университет Прикаспийский зональный НИВИ

Описан простой и легкий в исполнении способ, позволяющий дифференцировать микобактерии бычьего и человеческого видов, выделенные из биоматериалов и объектов внешней среды.

The authors of the article describe a simple and easy-to-performance way to differentiate Mycobacteria of the bovine and of the human species, emitted from biological materials and environmental objects.

Ключевые слова: микобактерии, идентификация, дифференциация, таксономия, диагностика.

Keywords: Mycobacteria, identification, differentiation, taxonomy, diagnosis.

В целях определения видовой принадлежности микобактерий

приходится использовать целый комплекс биохимических исследований. Эти исследования основаны на различиях в ферментативной активности

микобактерий различных видов, а также на изучении их физиологии.

Рекомендуют определение

принадлежности культур микобактерий к туберкулезному комплексу, их идентификацию до вида лучше осуществлять по следующему спектру признаков: способности образования

никотиновой кислоты, роста на среде с ТСН, нитратредуктазной активности, амидазной активности и т. д. Известно, что для идентификации микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов применяется ниациновая проба, основанная на том, что микобактерии туберкулеза человеческого вида выделяют значительно больше

никотиновой кислоты, чем все остальные микобактерии. Также

известно, что М.1иЬегеи1о818 синтезирует

4-17 мкг/мг никотиновой кислоты (в пересчете на один мг сухой массы).

Для определения ниацина используют несколько методик. Наиболее удобным считают ниациновый тест в различной модификации [2].

Существует метод, согласно которому идентифицируемую культуру

выращивают на яичной среде Левенштейна-Йенсена в течение 5 недель и более (чтобы получить достаточно обильный рост). В пробирку с ростом культуры вносят один мл 5-процентного раствора хлорамина Б и один мл 1процентного раствора калия цианида. Результат учитывают через 10-15 мин. Появление канареечно-желтого

окрашивания жидкости в пробирке соответствует положительному

результату. Если жидкость окрасилась в бледно-желтый цвет или не изменила окраски, следует добавить оба реактива в половинном объеме. В некоторых случаях можно получить усиления окраски.

Одним из недостатков данного метода является использование в ходе идентификации раствора

сильнодействующего яда (цианид К), на хранение и использование которого необходимо иметь специальное разрешение соответствующих

организаций. Кроме того, длительная инкубация идентифицируемой культуры и дополнительная работа в боксе создают препятствия для широкого применения этого метода в практических условиях.

Метод определения

никотинамидазной активности основан на том, что некоторые виды микобактерий способны дезаминировать никотинамид с выделением аммиака, который улавливается с помощью метода Русселя. Хорошо выросшую, в течение 56 недель культуру со среды Левенштейна-Йенсена переносят на стенку пробирки, на дно которой наливают один мл М/15 раствора фосфатного буфера (РН 7,2). Культуру тщательно растирают и доводят до густоты суспензии 20 мг/мл (предварительно взвешивают). В стерильные пробирки наливают по 0,5 мл дистиллированной воды (контроль).

Пробирки помещают в термостат при 370С на 24 часа. Кроме того, при каждом опыте ставится амидоконтроль. Далее определяют наличие аммиака.

Положительную никотинамидазную реакцию дают M. tuberculosis, а отрицательную - M. bovis.

Для идентификации микобактерий используют также методы, основанные на изучении состава и количественного содержания некоторых клеточных

липидов. Установлено, что с этой целью можно применять данные тонкослойной хроматографии (ТСХ). Если отношение освобождающейся при пиролизе миколовых кислот жирной кислоты С26 к образующейся при этом же процессе

кислоте С24 составляет 2-8, то делается вывод о соответствии

идентифицируемого штамма M. tuberculosis, поскольку у других

микобактерий это соотношение на порядок ниже [1].

Громоздкость метода и широкие пределы допускаемой ошибки в

сочетании с необходимостью иметь специальное оборудование ограничивают возможности применения данного метода в условиях практических лабораторий.

Исследователи рекомендуют

использовать специфические реакции клеточного иммунитета (кожные реакции с сенситинами) для идентификации

микобактерий [4].

Существует метод, основанный на способности микобактерий усваивать различные углеводороды (ароматические, длинноцепочечные н-алканы,

газообразные, ненасыщенные н-алканы с разветвленной цепью), что

рассматривается в качестве родового признака данных микроорганизмов. Притом различные виды микобактерий преимущественно усваивают

определенные индивидуальные н-алканы, имеющие разное количество углеродных атомов (С - атомов) в цепи. Например, установлено, что M. рhlei, M. smeqmatis и M. fortuitum хорошо растут на средах с индивидуальными н-алканами,

содержащими в цепи от Q2 до CJ7 [3].

Принцип, на котором основан способ дифференциации видов микобактерий заключается в том, что в присутствии смеси н-алканов в среде рост микобактерия отдельного вида может стимулироваться, не оказывая

существенного влияния или подавляя рост микобактерий других видов.

Однако этот способ также не лишен недостатков и недоработок.

Исследователи не ставили задачу идентификации M. tuberculosis и M. bovis. Идентифицировали штаммы

быстрорастущих атипичных

микобактерий, которые хорошо

культивируются на целом ряде сред, используемых в бактериологии и без добавления н-алканов, в частности на синтетических средах при данном способе. Субъективность оценки результатов (без сравнительного контроля) и невозможность определения вида микобактерий, малая эффективность не позволяют использовать этот способ в практических условиях.

В связи с изложенным разработка простого и эффективного способа дифференциации человеческого и бычьего видов возбудителей туберкулеза является одной из важных задач фтизиобактериологии.

Поставленная цель достигается путем выращивания определяемого возбудителя туберкулеза на яичной питательной среде АФ-1 с добавлением перед стерилизацией жидкого углеводорода тридекана в количестве одной капли на 4 мл среды. На этой среде возбудитель туберкулеза бычьего вида растет обильнее, примерно на 20-50%, а человеческого вида на 2040% хуже, что очень четко заметно при параллельном выращивании в сравнении с ростом на этой среде без добавления указанного алкана (контроль).

Для проведения сравнительных исследований приготовили

модифицированную нами среду Финн II (под условным названием АФ1). Модификация заключается в замене дорогостоящего натрия L-глутамината дешевым и доступным гликоколом в том же количестве. Солевые компоненты растворяли в половинном количестве дистиллированной воды и добавляли такое же количество картофельного экстракта. Перед стерилизацией среду разделяли на 3 части: одна часть служила контролем, во вторую добавляли смесь н-алканов и в третью - тридекан из расчета одна капля на 4 мл среды.

В пробирки с диаметром 20 мм разливали по 12-13 мл среды и свертывали при 850С 30 мин. Для посева из культур M.tuberculosis и M.вovis готовили суспензию с содержанием 100 тыс. микробных тел в одном мл. Посев производили бактериологической петлей с диаметром ушка 3 мм. Всего засеяли 60 пробирок (по 30 пробирок каждой культуры).

Динамика роста микобактерий отражена в таблице.

Таблица

Рост микобактерий бычьего и человеческого видов на среде АФ 1 с добавлением тридекана________________

Штаммы Рост на среде Рост на среде АФ

№ мико- АФ 1 с 1 без тридекана

п/п бактерий тридеканом

баллах)

ММиЬегсиЫэ

1 255 3 5

2 11448 11 13

3 9688 14 17

4 9912 8 15

5 9782 19 19

V.bovis

1 ЦВ-1 25 20

2 Казб.-18 17 13

3 622 6 2

4 Марк. -17 13 10

5 О -113 16 10

Из таблицы видно, что стимуляция роста M. вovis происходила в одинаковой степени как при добавлении смеси нормальных алканов, так и тридекана. Данная статистика оказалась

достоверной.

Рост М.1;иЬегси1о818 после добавления смеси н-алканов был выше на 5-6%, но статистическая обработка этих данных показала недостоверность разницы, а тридекан достоверно угнетал рост микобактерий этого вида.

Как видно, используя среду АФ1 с индивидуальным н-алканом-тридекан, создается возможность дифференциации M.tuberculosis от M. вovis без дополнительных исследований, что не удается сделать при посеве этих культур на чистую среду или при использовании смеси н-алканов в виде жидкого парафина.

Приведем несколько примеров осуществления предлагаемого способа.

Пример 1. Лабораторные штаммы M. вovis и M.tuberculosis высевали на среду АФ1 с добавлением 2 капель тридекана в одну пробирку. На каждую культуру брали по 5 пробирок. Посевы инкубировали при температуре 37-380С в течение 30 дней. Оценку росту давали визуально по восьмибалльной системе. При этом общая сумма баллов роста M.вovis составляла 37 (при контроле -

22,5), а M.tuberculosis - 18,3 (при

контроле - 23,5).

Пример 2. Штаммы M. вovis и M.tuberculosis высевали на среду АФ1 с добавлением 3 капель тридекана в одну пробирку. Для посева каждой культуры

брали по 5 пробирок. Посевы инкубировали при температуре 37-380С в течение 30 дней. Оценку росту давали визуально по восьмибалльной системе. При этом общая сумма баллов роста M. вovis составляла 37,5 (при контроле -

22.5), а M.tuberculosis - 16,25 (при

контроле - 23,5).

Пример 3. Штаммы M. вovis и M. tuberculosis высевали на среду АФ 1 с добавлением 3 капель тридекана в одну пробирку. Для посева каждой культуры брали по 5 пробирок. Посевы инкубировали при температуре 37-380С в течение 30 дней. Оценку росту давали визуально по восьмибалльной системе. При этом общая сумма баллов роста M. вovis составляла 37 (при контроле -

22.5), а M.tuberculosis - 16 (при

контроле - 23,5).

Способность роста микобактерий на средах, содержащих н-алканы, находит и теоретическое обоснование. Характерная

для них гидрофобная клеточная стенка, содержащая высокомолекулярные

миколовые кислоты, обеспечивает

клеткам возможность поглощения н-алканов из среды путем пассивной

диффузии. Известно, что часть

составляющих компонентов

углеводородокисляющего ферментного комплекса входит в состав дыхательной цепи, а концевая оксидаза (цитохром З -450, или цитохром О) индуцируется субстратом [3].

Как показывают наши наблюдения, не все виды микобактерий одинаково

хорошо способны расти на средах, содержащих н-алканы. В то же время для некоторых из них наличие в среде даже одного индивидуального н-алкана может ингибировать рост. Подавление роста определенного вида микобактерий на средах, содержащих индивидуальные н-алканы, может быть использовано для дифференциации видов микобактерий.

Примечания

1. Андреев Л. В., Склифас А. К. О хемотаксономических аспектах липидного обмена бактерий // Биохимия и биофизика микроорганизмов. Горький, 1977. С. 3-9. 2. Зыков М. П., Ильина Т. Б. Потенциально патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов. М. : Медицина, 1978. 174 с. 3. Нестеренко О. А., Квасников Е. И., Ногина Т. М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев : Наукова думка, 1985. 333 с. 4. Hyman I. S., Chaparas S. D. A comparative studi of the “rhodochrous” complex and related taxa by delayed-tipe skin reactions on gvinea pigs and by poliacrilamide gel electrophoresis // J. Gen. Microbiol, 1977. V. 100. № 2. Р. 363-371.

Статья поступила в редакцию 13.03.2013 г.