Способ неинвазивного мониторинга состояния верхних дыхательных путей у телят
METHOD FOR NON-INVASIVE MONITORING OF THE UPPER RESPIRATORY TRACT IN CALVES

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для экспресс-диагностики воспалительного процесса верхних дыхательных путей у телят с целью мониторинга состояния животных и контроля эффективности лечения по составу легко летучей фракции носовой слизи.
Для прижизненной диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят в настоящее время используют комплекс клинических и лабораторных методов исследования [Шахов А.Г. Респираторные болезни телят / А.Г. Шахов, А.И. Ануфриев, С.М. Сулейманов, А.И. Золотарев, С.И. Першина // Комплексная экологически безопасная система ветеринарной защиты здоровья животных. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2000. - С. 163-186]. Диагностику респираторных болезней телят осуществляют комплексно на основании анализа эпизоотологических данных, клинических симптомов, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных (вирусологических, бактериологических, серологических, микологических и др.) исследований. При этом проводят:
- отбор и пересылку биологического  материала в специализированную лабораторию или научно-исследовательское учреждение;
- подготовку биологического материала для исследований;
- выделение возбудителей, антигенов и ретроспективную диагностику;
- при необходимости морфологические и биохимические исследования крови и гистологические исследования материала.
Клинические методы направлены на выявление изменений физиологических параметров организма: температуры тела, частоты сердечных сокращений и дыхательных движений, минутного объема дыхания и дыхательного объема (глубины дыхания), наличия хрипов, одышки, кашля, истечений из носовой полости. Лабораторные исследования (гематологические, иммунологические, биохимические) показателей крови - лейкограммы, скорости оседания эритроцитов, классов иммуноглобулинов, концентрации С-реактивного белка, интерлейкинов, дефензинов, содержания кортизола, антиоксидантов, продуктов пероксидации и др. - направлены на выявление воспалительного процесса в организме телят, однако все они неспецифичны и изменяются при воспалении любой локализации (бронхолегочное воспаление, омфалит, энтерит, гепатит и т.д.). Окончательный диагноз на инфекционный характер респираторной патологии у телят ставят на основании результатов комплексных лабораторных исследований носовых и трахеальных смывов, мокроты и бронхоальвеолярного лаважа с использованием вирусологических, бактериологических и молекулярно-генетических методов исследований.
Недостатками способа являются: инвазивность (травматичность) получения биологического материала (кровь, носовые и трахеальные смывы, бронхо-альвеолярный лаваж), значительные материальные и временные затраты (до 72 часов) на проведение исследований, возможность получения ложных отрицательных результатов, поскольку воспаление верхних дыхательных путей (бронхит, трахеобронхит) у телят часто имеет стертую клиническую картину и на ранних стадиях развития протекает бессимптомно, необходимость специального лабораторного оборудования и высококвалифицированного персонала.
Для диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят информативным является исследование конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) - органоспецифического биологического материала, получаемого неинвазивным путем [Золотарев А.И. Ранняя диагностика бронхита у новорожденных телят / А.И. Золотарев, А.Е. Черницкий, М.И. Рецкий, Л.И. Ефанова // Ветеринария. - 2013. - №3. - С.43-47].
В качестве прототипа выбран способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят по составу равновесной газовой фазы над пробами конденсата выдыхаемого воздуха. Для этого осуществляют сбор конденсат выдыхаемого воздуха и анализ равновесной газовой фазы над ним с применением детектирующего устройства типа «электронный нос» на основе массива из трех пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, на электроды которых нанесены пленки из ацетоновых растворов бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100) и хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) с массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг. Регистрацию в программе «электронного носа» максимальных сигналов массива пьезосенсоров за 60 с и расчет показателя воспаления (ПВ) по формуле:
БKC
где ΔF - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой БКС,
ТХ-100
ΔF - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой ТХ-100,
МУНТ
ΔF - наибольшее изменение частоты колебания пьезосенсора с пленкой МУНТ, диагностирование в органах дыхания у телят воспалительного процесса при значении ПВ больше 1,2±0,1. Использование изобретения позволит быстро диагностировать воспалительные процессы в органах дыхания у телят [Пат. RU 2564877  Способ неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в органах дыхания у телят /Черницкий А. Е., Кучменко Т. А., Шуба А. А., Рецкий М. И.]. Недостатком способа является необходимость сбора конденсата выдыхаемого воздуха в течение не менее 30 мин, значительное увеличение времени получения информации при необходимости повторного измерения, что ограничивает число исследуемых животных и снижает эффективность мониторинга в хозяйстве. Кроме того, процедура сбора конденсата выдыхаемого воздуха требует усилий от ветеринарного врача, в связи с необходимостью длительной фиксации животного, и неудобна при групповом содержании молодняка.
Техническая задача изобретения заключается в разработке способа мониторинга состояния верхних дыхательных путей у телят, в том числе новорожденных, позволяющего существенно упростить и повысить производительность мониторинга состояния верхних дыхательных путей и контроля эффективности лечения воспалительного процесса верхних дыхательных путей, снизить экономические и временные затраты на клинические и лабораторные исследования, анализ их результатов, сформировать базу данных и составить индивидуальную карту состояния животного по результатам.
Для решения технической задачи изобретения предложен способ мониторинга состояния верхних дыхательных путей у телят, включающий отбор стерильными ватными или ватно-марлевыми тампонами мазков из левого и правого носовых отверстий, помещение их в стерильные пробирки и перенесение к прибору «электронный нос» на основе пяти пьезосенсоров, с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, на электроды которых нанесены пленки из ацетоновых растворов полиэтиленгликольсукцината (ПЭГС), бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100), хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) и этанольной суспензии гидроксиапатита (ГА)  с массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, регистрацию в программе «электронного носа» сигналов сенсоров за 180 с, при этом проводят 80 с нагрузки массива путем выдерживания ячейки с открытым входом над тампоном и 120 с разгрузки без пробы поочередно для каждого образца, регистрируют в программном обеспечении площадь круговой диаграммы сигналов сенсоров и применяют этот критерий в качестве оценочного при мониторинге, при этом, если относительные различия площадей для левой и правой проб от одного животного превышают 20 %, это значит, что со стороны, дающей большие отклики, начинается/идет воспалительный процесс, уменьшение площадей круговых диаграмм сигналов сенсоров при проведении лечебных мероприятий для усредненной пробы связано с положительной динамикой (выздоровление), а увеличение более, чем на 20 % связано с развитием заболевания.
Способ мониторинга состояния верхних дыхательных путей у телят осуществляется следующим образом.
Для отбора мазков носовой слизи применяют стерильные ватные или ватно-марлевые тампоны на держателе, помещаемые в пробирки, и детектирующее устройство типа «электронный нос» [Кучменко, Т.А. Инновационные решения в аналитическом контроле: учебное пособие / Т.А. Кучменко. - Воронеж: Воронежская государственная технологическая академия, 2009, ISBN 978-5-89448-596-6, с. 26-62] на основе массива из 5 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, на электроды которых наносят пленки из ацетоновых растворов полиэтиленгликольсукцината (ПЭГС), бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100), хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) и этанольной суспензии гидроксиапатита (ГА)  с массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг (изменение массы покрытия на электродах пьезосенсоров, природы сорбентов, алгоритмов обработки аналитической информации ухудшает метрологические характеристики способа, способствует возрастанию доли ошибочных выводов). Подготовленное детектирующее устройство подключают к компьютеру и управляют программой, регистрирующей в режиме реального времени сигналы массива пьезосенсоров в виде хроночастотограмм. При обследовании телят с помощью детектирующего устройства типа «электронный нос» на наличие воспалительного процесса верхних дыхательных путей применяют открытую ячейку детектирования и используют следующий режим измерения: в течение 80 с выдерживают ячейку над тампоном (нагрузка) и в течение 120 с без пробы (разгрузка).  Регистрируют в программном обеспечении площадь круговой диаграммы сигналов сенсоров за все время измерения и применяют этот критерий в качестве оценочного при мониторинге и диагностике состояния.
При этом, если относительные различия площадей фигур круговых диаграмм сигналов сенсоров для проб из левой и правой носовых отверстий  для одного животного превышают 20 %, это значит, что со стороны, дающей большие отклики и, соответственно, площадь, начинается/идет воспалительный процесс, уменьшение площадей круговых диаграмм сигналов сенсоров при проведении лечебных мероприятий для усредненной пробы связано с положительной динамикой (выздоровлением), а увеличение более, чем на 20 % связано с развитием заболевания.
Способ мониторинга состояния верхних дыхательных путей у телят поясняется примерами.
Пример 1.
9
9
Теленок с инв. № 2676  в возрасте 9 дней. При первичном осмотре здоров со стороны дыхательной системы, температура тела 39,0 ºC, самопроизвольный и индуцированный кашель, хрипы и носовые истечения отсутствуют, клиническая оценка по шкале WI 3 балла [McGuirk S.M. Disease management of dairy calves and heifers / S.M. McGuirk // Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. – 2008. – Vol. 24. – Issue 1. – P. 139–153]. При лабораторном исследовании крови гематологические признаки воспаления отсутствуют (содержание лейкоцитов 6,6×10/л, нейтрофилов 3,7×10/л, ядерный нейтрофильный индекс сдвига 0,08), концентрация гаптоглобина в сыворотке крови повышена – 4,49 г/л, при ПЦР-исследовании трахеального смыва выделен геном аденовируса.
2
Для отбора мазков носовой слизи у теленка  применяли стерильные ватные тампоны на держателе, помещали в пробирку поочередно отобранную слизь слева и справа (усредненная проба). Предварительно готовили к анализу детектирующее устройство типа «электронный нос» на основе массива из 5 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, с пленками полиэтиленгликольсукцината (ПЭГС), бромкрезолового синего (БКС), тритона Х-100 (ТХ-100), фаз из многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) и гидроксиапатита (ГА). При обследовании применяли открытую ячейку детектирования и использовали следующий режим измерения: в течение 80 с выдерживают ячейку над тампоном (нагрузка) и в течение 120 с без пробы (разгрузка). Регистрировали в программном обеспечении площадь круговой диаграммы сигналов сенсоров за все время измерения и применяли этот критерий в качестве оценочного при мониторинге и диагностике состояния. Площадь фигуры круговой диаграммы в первой точке контроля составила 9900 ± 100 (погрешность измерения) Гц.
9
9
2
При повторном исследовании в возрасте 18 дней у теленка диагностированы ранние проявления трахеобронхита (индуцированный кашель при пальпации последнего трахеального кольца и после 30-ти секундного апноэ), температура тела в пределах нормы 38,6 ºC, самопроизвольный кашель, хрипы и носовые истечения отсутствуют, клиническая оценка по шкале WI 4 балла. Гематологические (содержание лейкоцитов в крови 12,0×10/л, нейтрофилов 6,4×10/л, ядерный нейтрофильный индекс сдвига 0,06) и биохимические (концентрация гаптоглобина в сыворотке крови 4,92 г/л) признаки воспаления подтверждают клинический диагноз. При ПЦР-исследовании трахеального смыва выделен геном аденовируса. Повторно в этой точке контроля отобрали слизь (усредненную пробу) и проанализировали с помощью прибора «электронный нос». Площадь фигуры круговой диаграммы для пробы составила 23 300 Гц.
Относительные различия площадей фигур круговых диаграмм сигналов сенсоров для проб в первой и второй точках контроля составляет значительно больше 20 %, что связано с развитием воспалительного процесса.
Из примера 1 видно, что при повторном исследовании через 9 дней у теленка наблюдалось ухудшение состояния, свидетельствующее о развитии трахеобронхита вирусной (аденовирус) этиологии, что адекватно отражают результаты анализа легко летучих соединений носовой слизи (усредненные пробы).
Пример 2.
9
2
Теленок с инв. № 2671 в возрасте 19 дней. При первичном осмотре: двусторонние серозные носовые истечения, гиперемия слизистой оболочки носовой полости, самопроизвольный кашель с выбросом мокроты, смешанная одышка, повышенная чувствительность трахеи при пальпации, при аускультации грудной клетки – влажные крупнопузырчатые хрипы, температура тела 40,1 ºC, клиническая оценка по шкале WI 8 баллов. При лабораторном исследовании крови – гематологические (лейкоцитоз 11,0×10/л и сдвиг лейкоцитарной формулы влево) и биохимические (содержание гаптоглобина в сыворотке крови 4,37 г/л) признаки воспаления. При ПЦР-исследовании трахеального смыва выделен геном аденовируса, при бактериологическом исследовании – E. coli сероварианта O142 и Ent. faecalis. На основании результатов клинических и лабораторных исследований у пациента диагностированы ринит и трахеобронхит вирусно-бактериальной этиологии. Начато этиотропное и симптоматическое лечение. Для отбора мазков носовой слизи у теленка  применяли стерильные ватные тампоны на держателе, помещали в пробирку поочередно отобранную слизь слева и справа (усредненная проба). Анализировали так, как указано в примере 1. Площадь круговой диаграммы сигналов сенсоров для этой пробы составила 15100 Гц.
9
При повторном исследовании через 9 дней у животного температура тела в норме 38,3 ºC, носовые истечения, самопроизвольный и индуцированный кашель после 30-ти секундного апноэ, а также хрипы отсутствуют, клиническая оценка по шкале WI 2 балла, из остаточных явлений обнаружен кашель при пальпации последнего трахеального кольца. Несмотря на явные клинические улучшения, у теленка сохраняются гематологические (лейкоцитоз 12,0×10/л и сдвиг лейкоцитарной формулы влево) и биохимические (содержание гаптоглобина в сыворотке крови 5,19 г/л) признаки воспаления.
2
Повторно в этой точке контроля отобрали слизь (усредненную пробу) и проанализировали с помощью прибора «электронный нос». Площадь фигуры круговой диаграммы сигналов сенсоров для пробы составила 11 185 Гц.
Относительные различия площадей фигур круговых диаграмм сигналов сенсоров для проб в первой и второй точках контроля составляет 26 %, что связано с улучшением состояния животного.
Из примера 2 видно, что при повторном исследовании через 9 дней этиотропной и симптоматической терапии у животного наблюдалось улучшение состояния, свидетельствующее о положительной динамике.
Пример 3.
9
9
2
Теленок с инв. № 2673 в возрасте 14 дней. При первичном осмотре: самопроизвольный кашель с выбросом мокроты, смешанная одышка, повышенная чувствительность трахеи при пальпации, при аускультации грудной клетки прослушиваются влажные крупнопузырчатые хрипы, носовые истечения отсутствуют, температура тела повышена до 40,4 ºC, клиническая оценка по шкале WI 6 баллов. При лабораторном исследовании крови содержание лейкоцитов в норме 5,8×10/л, нейтрофилов – 2,0×10/л, ядерный нейтрофильный индекс сдвига 0,06, концентрация гаптоглобина в сыворотке крови повышена 4,41 г/л. При ПЦР-исследовании трахеального смыва выделен геном аденовируса, при бактериологическом исследовании – E. coli сероварианта O142 и Ent. faecium. На основании результатов клинических и лабораторных исследований диагностирован трахеобронхит вирусно-бактериальной этиологии. Начато этиотропное и симптоматическое лечение. Для отбора мазков носовой слизи у теленка  применяли стерильные ватные тампоны на держателе, помещали в пробирку поочередно отобранную слизь слева и справа (усредненная проба). Анализировали так, как указано в примере 1. Площадь круговой диаграммы сигналов сенсоров для этой пробы составила 6850 Гц.
9
9
9
9
При повторном исследовании через 9 дней у животного температура тела (38,1 ºC) и частота дыхания (26 в минуту) в норме, носовые истечения отсутствуют, клиническая оценка по шкале WI снизилась до 3 баллов, но сохранился самопроизвольный кашель и влажные хрипы при аускультации грудной клетки. Несмотря на клинические улучшения, обнаружена отрицательная динамика лабораторных показателей (содержание лейкоцитов в крови увеличилось с 5,8×10/л до 8,4×10/л, нейтрофилов – с 2,0×10/л до 4,5×10/л, концентрация гаптоглобина в сыворотке крови повысилась с 4,41 г/л до 5,03 г/л). Прогноз болезни сомнительный.
2
Повторно в этой точке контроля отобрали слизь (усредненную пробу) и проанализировали с помощью прибора «электронный нос». Площадь фигуры круговой диаграммы сигналов сенсоров для пробы составила 6800 Гц.
Относительное различие площадей фигур круговых диаграмм сигналов сенсоров для проб в первой и второй точках контроля не превышает 1 % (менее 20 %), что связано со стабильностью состояния животного.
Из примера 3 видно, что состояние теленка через 9 дней лечения существенно не изменилось.
Из представленных примеров видно, что предлагаемый способ мониторинга состояния верхних дыхательных путей у телят по составу легко летучих соединений носовой слизи отличается высокой чувствительностью, простотой и надежностью, позволяет существенно упростить и повысить производительность мониторинга и контроля эффективности лечения воспалительного процесса верхних дыхательных путей, снизить экономические и временные затраты на клинические и лабораторные исследования, анализ их результатов, сформировать базу данных и составить индивидуальную карту состояния животного по результатам.