СПОСОБ РАЗЛОЖЕНИЯ ГЛИАДИНА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МУКИ, НЕ СОДЕРЖАЩЕЙ ГЛЮТЕНА
METHOD FOR DECOMPOSITION OF GLIADINE FOR PRODUCTION OF GLUTEN-FREE FLOUR

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам производства муки без глютена, а более конкретно, к способу разложения глиадина для получения муки без глютена.
Предпосылки создания изобретения
Глютеновая болезнь представляет собой генетическое расстройство иммунной системы, которое вызывается потребленим глютена, то есть, белка, содержащегося в пшенице, во ржи и в ячмене. Глютен плохо переваривается в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта человека. Глютен состоит из двух компонентов, глиадина и глютенина. Глиадин растворяется в спирте и содержит наибольшее количество компонентов, которые являются токсичными для людей с глютеновой болезнью (Green, P-H-R- and Cellier, C. 2007. Celiac disease. N. Engl. J. Med.; 357:1731-1743).
Когда пациент с глютеновой болезнью принимает какую-либо пищу, содержащую глютен, его иммунная система реагирует по механизму, вызывающему повреждение или разрушение кишечных ворсинок, а следовательно, питательные вещества, присутствующие в пище, не всасываются, что приводит к мальабсорбции. Симптомы глютеновой болезни варьируются в зависимости от возраста пациента, при этом, у детей наиболее часто наблюдаются диарея, вздутие живота, рвота и потеря массы тела, в то время как у взрослых, преобладающими симптомами являются железодефицитная анемия, усталость, боль в костях, артрит, остеопороз и т.п.
До недавнего времени, глютеновая болезнь считалась редким заболеванием, но в настоящее время, она является одной из наиболее распространенных непереносимостнй каких-либо веществ, которая встречается у каждого 1 из 150 новорожденных во всем мире, и, по оценкам специалистов, только 9% из них диагностируются. Согласно статистическим данным, предоставленным Национальным Институтом Медицинских наук и питания Сальвадора Зубирана, только в Мексике выявлено приблизительно 2,6 миллионов человек с риском развития глютеновой болезни.
В настоящее время, единственным приемлемым лечением глютеновой болезни является соблюдение безглютеновой диеты в течение всей жизни. Согласно Пищевому Кодексу, пища считается безглютеновой, если концентрация в ней глютена составляет менее 20 м.д. Однако, это имеет негативные последствия для питания, такие как снижение потребления полисахаридов и, следовательно, снижение потребления энергии, уменьшение кишечной микробиоты, полезной для здоровья человека, и увеличение количества присутствующих условно-патогенных бактерий. Полезная микробиота кишечника, которая была снижена в результате безглютеновой диеты, негативно влияет на иммуностимулирующую активность, а поэтому, продуцирование противовоспалительных соединений снижается.
Следовательно, существует потребность в безглютеновых продуктах, которые были бы приемлемы для пациентов с глютеновой болезнью, и, соответственно, позволили бы пациентам улучшить свое питание за счет большего разнообразия пищевых продуктов.
Одним из важнейших продуктов в ежедневном рационе человека является хлеб, приготовленный, в основном, из пшеничной муки. Свойства пшеничного теста зависят, главным образом, от глютеновых белков. В последние годы, для улучшения качества этих белков или их разложения применяются различные методы обработки, что позволяет приготавливать хлебобулочные изделия, которые могут употребляться людьми с глютеновой болезнью.
Lactobacillus
Недавно разработанным средством для улучшения качества хлеба является производство заквасок. Такое тесто приготовливают из смеси муки и воды, которая сбраживается дрожжами и молочнокислыми бактериями (LAB), обычно принадлежащими к роду . Было обнаружено, что LAB, используемые для сбраживания и приготовления закваски, позволяют модифицировать глютен во время выпечки хлеба, что позволяет удалять фракции белка, токсичные для пациентов с глютеновой болезнью. Одна из наиболее вредных белковых фракций для людей, страдающих таким заболеванием, является фракция глиадина, которая может быть также удалена с использованием LAB.
Applied and environmental microbioiogy, 70(2),
Trends in Food Science & Technology, 16(1),
Food microbiology, 24(2),
Во время сбраживания, протеолитическая система LAB высвобождает низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, которые стимулируют метаболическую активность микроорганизмов, что способствует улучшению формирования вкуса и снижению содержания аллергенных пептидов, и подает большие надежды пациентам с глютеновой болезнью, которые особенно чувствительны к фракции глиадина. Проведенные исследования по выпеканию хлеба из теста на закваске показали, что LAB обладают способностью гидролизовать фракцию глиадина пшеницы в определенных условиях обработки (при длительной и полужидкой ферментации) (Di Cagno, R., De Angelis, M., Auricchio, S., Greco, L., Clarke, C., De Vincenzi, M., & Minervini, F. (2004). Хлеб на закваске, приготовленный из пшеничной и нетоксичной муки, и хлеб, приготовленный на закваске с добавлением отобранных лактобацилл, допускается к употреблению пациентами с кишечной спру.  1088-1096; Gobbetti, M., De Angelis, M., Corsetti, A., & Di Cagno, R. (2005). Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bacteria.  57-69; Gobbetti, M., Rizzello, C. G., Di Cagno, R., & De Angelis, M. (2007). Sourdough lactobacilli and celiac disease,  187-196).
Однако, не все молочнокислые бактерии могут снижать остаточную концентрацию глютена до доз, которые могут быть усваиваться пациентами с непереносимостью глютена (пациентами с глютеновой болезнью), а поэтому необходимо выбрать тип LAB и найти подходящую их комбинацию.
Протеазы также способны разлагать глютеновые фракции. А поэтому, протеазы используются для улучшения гидролиза глютена.
Applied and environmental microbiology, 73(14),
В работе Rizzello, C. G., De Angelis, M., Di Cagno, R., Camarca, A., Silano, M., Losito, I., ... & Gianfrani, C. (2007) Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease,  4499-4507, смеси некоммерческих штаммов лактобацилл (ранее отобранных на основе их способности гидролизовать глиадины) с протеазами грибов в различных комбинациях были использованы в заквасках для устранения токсичности пшеничной муки при относительно длительной ферментации. Было отмечено, что кинетика гидролиза лактомациллами была очень эффективной при гидролизе альбуминов, глобулинов и глиадинов, но 20% глютенинов все же оставалось в закваске.
Bifidobacteria
Аналогичным образом, в публикации заявки на патент США 2008/0131556 описана смесь по меньшей мере шести коммерчески доступных видов LAB и/или . Эту смесь можно использовать для приготовления заквасок. При добавлении к этим составам достаточного количества микробных протеаз, обычно используемых для выпечки хлебобулочных изделий, глютен разлагается, но не в достаточной степени, поскольку ферментированная закваска имеет концентрацию глютена приблизительно 200 м.д., что может быть неприемлемым для употребления в пищу пациентами с глютеновой болезнью. Кроме того, смесь, которая обеспечивает такое разложение, является многокомпонентной, так как необходимо использовать большое количество видов, и при использовании большего количества видов LAB может наблюдаться большая степень разложения глиадинов.
В публикации Международной заявки WO 2010/073283 раскрывается смесь, содержащая два типа LAB в комбинации с одной или более протеазами грибов. Используемые LAB представляют собой штаммы, специально разработанные для повышения степени разложения глютена. Посредством указанной комбинации LAB и протеаз в определенных количествах и при определенных условиях реакции, следвые количества глиадина и глютенина были уменьшены до такой степени, что они не могли быть детектированы, и была достигнута остаточная концентрация глютена менее 20 м.д. По окончании процесса разложения глютена получают муку без глютена, которую используют для выпекания хлебобулочных изделий. Однако, в этом случае, проблема состоит в том, что используемые микроорганизмы не являются коммерчески доступными.
Кроме того, в публикации Международной заявки WO 2014/072758 также показано микрокапсулированное бактериальное сообщество для разложения глютена в заквасках. Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно позволяет решить проблемы при приготовлении инокулята, если это необходимо, снижает риски контаминации и повышает жизнеспособность молочнокислых бактериальных культур, что способствует повышению эффективности разложения глютена в пшеничном тесте, но, как и в предыдущем случае, это требует использования специфических микроорганизмов, адаптированных к процессу сбраживания.
Было установлено, что бактериальные культуры, уже известные и используемые специалистами для разложения глютена, имеют определенные недостатки, такие как необходимость использования сложных смесей LAB (по меньшей мере из шести видов), в случае коммерчески доступных штаммов, или, скорее, необходимость использования специально отобранных и полученных штаммов, что влечет за собой необходимость активации, репродуцирования, промывки и добавления суспензионной культуры (инокулята) в тесто, и требует ежедневного приготовления теста и высокоспециализированной обработки, во избежание контаминации; а также сохранения активности на той же стадии роста, в подходящем соотношении между видами LAB и в достаточном количестве, что представляет скрытый риск контаминации и, наконец, требует обработки теста с помощью микрокапсулированных инокулятов, что подразумевает проведение дополнительных стадий в процессе выпекания хлебобулочных изделий.
Кроме того, в том случае, когда хлебопекарная мука может быть получена в качестве конечного продукта, то для этого необходимо использовать в высокой степени специфические бактериальные сообщества, которые, как указывалось ранее, требуют активации, размножения и промывки культур. Другим недостатком культур такого типа является то, что они требуют проведения очень сложного процесса обработки, что означает значительное увеличение стоимости производства муки и делает его нецелесообразным.
Таким образом, в настоящее время необходимо разработать способ разложения глиадина, который был бы эффективным, позволял бы использовать коммерчески доступные микроорганизмы, и с помощью которого можно было бы получить муку с очень низким содержанием глиадинов и, следовательно, глютена.
Цель изобретения
Принимая во внимание проблемы и недостатки упомянутого выше уровня техники, целью настоящего изобретения является разработка способа разложения глиадинов в муке для выпечки хлеба посредством ферментативного гидролиза и микробного сбраживания.
Сущность изобретения
Способ разложения глиадина в муке для выпечки хлеба согласно изобретению позволяет решить проблемы и устранить вышеупомянутые недостатки.
Настоящее изобретение относится к способу разложения глиадина в муке для выпечки хлеба, включающему: стадию смешивания муки с водой; по меньшей мере одну стадию ферментативного гидролиза для разложения глиадина из смеси, полученной на стадии смешивания; по меньшей мере одну стадию сбраживания смеси, полученной на стадии ферментативного гидролиза с использованием по меньшей мере одного микроорганизма в условиях регулируемого рН; и стадию сушки с получением муки, не содержащей глиадина.
Описание чертежей
На фигуре 1 показана хроматограмма муки, обработанной посредством 5-часового протеолиза и молочнокислого сбраживания.
На фигуре 2 показана хроматограмма муки, обработанной посредством 10-часового протеолиза и молочнокислого сбраживания.
L. johnsonii
На фигуре 3 показана хроматограмма муки, обработанной посредством сбраживания под действием  в течение 24 часов.
На фигуре 4 показана хроматограмма муки, обработанной посредством протеолиза с использованием HT Proteolytic 200 в течение 10 часов.
На фигуре 5 показана хроматограмма муки, обработанной посредством протеолиза с использованием Harizyme G в течение 10 часов.
На фигуре 6 показана хроматограмма муки, обработанной посредством 5-часового протеолиза, молочнокислого сбраживания и протеолиза с использованием протеазы HT Proteolitic 200 в течение 5 часов.
L. sanfranciscensis
На фигуре 7 указана концентрация глиадина в муке, сбраживаемой под действием .
L. brevis
На фигуре 8 указана концентрация глиадина в муке, сбраживаемой под действием .
Bacillus amyloliquefaciens
На фигуре 9 указана концентрация глиадина в муке, сбраживаемой под действием .
На фигуре 10 указана концентрация L-тирозина во время ферментативного протеолиза с использованием протеазы N-1000.
На фигуре 11 указана концентрация L-тирозина во время ферментативного протеолиза с использованием протеазы HT Proteolitic 200.
На фигуре 12 показана жидкостная хроматограмма муки, обработанной способом, включающим две стадии ферментативного гидролиза и две стадии сбраживания.
Подробное описание изобретения
Как указывалось ранее, разложение фракций глютена, особенно глиадинов, является очень важным для приготовления продуктов, подходящих для пациентов с глютеновой болезнью. В процессе поиска решения этой проблемы было обнаружено, что общее разложение глиадина, содержащегося в хлебопекарной муке, достигается применением способа, состоящего по меньшей мере из одной стадии ферментативного гидролиза и по меньшей мере одной стадии сбраживания с использованием лактобацилл.
Наблюдалось, что процесс подкисления среды, который происходит при обработке муки путем сбраживания и ферментативного гидролиза, негативно влияет на степень разложения глиадина в муке, что обусловлено ингибированием действия микроорганизмов и ферментов. А поэтому, для приготовления муки с оптимальным разложением глиадинов необходимо не только тщательно отбирать бактериальные сообщества и условия реакции, но также каждый из этих процессов должен осуществляться в определенном порядке, который оптимизирует активность микроорганизмов и позволяет избежать ферментативного ингибирования.
Таким образом, способ разложения глиадина в муке для выпечки хлеба согласно изобретению позволяет решить проблемы и устранить недостатки, упомянутые выше.
В соответствии с вышеизложенным, настоящее изобретение относится к способу разложения глиадина в муке для выпечки хлеба, включающему: стадию смешивания муки с водой; по меньшей мере одну стадию ферментативного гидролиза для разложения глиадина из смеси, полученной на стадии смешивания; по меньшей мере одну стадию сбраживания смеси, полученной на стадии ферментативного гидролиза с использованием по меньшей мере одного микроорганизма в условиях регулируемого рН; и стадию сушки с получением муки, не содержащей глиадина.
Мука для выпечки хлеба обладают всеми подходящими свойствами для изготовления хлебобулочных изделий. Она характеризуется высоким содержанием глютена, что позволяет такой муке обладать хорошей водопоглощающей способностью, слипаемостью, вязкостью и эластичностью. Некоторыми примерами муки для выпечки хлеба является мука, полученная из пшеницы, ржи, ячменя, овсянки и пшеницы сорта тритикале.
Первая стадия указанного способа включает смешивание муки для выпечки хлеба с водой.
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, ферменты грибов предпочтительно используют на стадии ферментативного гидролиза. Более предпочтительными являются ферменты  и/или . Указанные ферменты предпочтительно присутствуют в отношении 1:1, и эти ферменты добавляют к смеси в отношении от 0,01 до 0,1% по массе суспензии. Стадию ферментативного гидролиза предпочтительно проводят при температуре от 35°C до 37°C при постоянном перемешивании. Время гидролиза предпочтительно составляет от 4 до 8 часов. На этой первой стадии достигается разложение приблизительно 88% глиадина, присутствующего в исходной муке.
2
3
Как указывалось ранее, в результате ферментативного гидролиза, среда имеет тенденцию к подкислению, и известно, что активность фермента имеет тенденцию к снижению при кислотном pH. А поэтому, в необязательном варианте осуществления изобретения, после завершения стадии гидролиза осуществляют коррекцию рН. Предпочтительно, чтобы рН составлял от 6,5 до 8. Для осуществления указанной коррекции pH добавляют основание, предпочтительно, KCO в количестве, достаточном для достижения требуемого pH.
В процессе описанной стадии гидролиза достигается гидролиз глиадина и расщепление пептидов-мишеней, присутствующих в молекулах глютена. Пептиды и аминокислоты, образующиеся в процессе ферментативного гидролиза, могут эффективно разлагаться некоторыми LAB. А поэтому, следующая стадия способа разложения глиадина представляет собой стадию сбраживания смеси, полученной на стадии ферментативного гидролиза, с использованием по меньшей мере одной LAB в условиях регулируемого рН.
Bacillus amyloliquefaciens, Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus helveticus
3
9
Что касается стадии сбраживания, то в предпочтительном варианте осуществления изобретения, ее проводят с использованием  или их смесей в качестве микроорганизмов. Используемый микроорганизм предпочтительно добавляют в смесь в количестве от 10 до 10 КОЕ/г муки. Предпочтительно, стадию сбраживания проводят при температуре от 36°C до 38°C и в течение периода от 4 до 8 часов. На упомянутой стадии сбраживания может быть достигнуто разложение еще 10% исходных глиадинов, а остальная мука содержит приблизительно 2% глиадинов.
2
3
Как и на стадии гидролиза, во время проведения стадии сбраживания наблюдается значительное снижение pH, а поэтому, в необязательном варианте осуществления изобретения, проводят вторую коррекцию pH. Предпочтительно, pH составляет от 6,5 до 8.Для осуществления указанной коррекции pH добавляют основание, предпочтительно, KCO в количестве, достаточном для достижения требуемого pH.
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Для разложения оставшихся 2% глиадинов может быть осуществлена вторая стадия гидролиза. Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, вторую стадию ферментативного гидролиза проводят, предпочтительно, с использованием ферментов грибов. Более предпочтительными являются ферменты  и/или . Указанные ферменты предпочтительно присутствуют в отношении 1:1, и эти ферменты добавляют к смеси в отношении от 0,02 до 0,08% по массе суспензии. Вторую стадию ферментативного гидролиза предпочтительно проводят при температуре от 35°C до 37°C при постоянном перемешивании. Время гидролиза предпочтительно составляет от 2 до 4 часов.
Bacillus amyloliquefaciens, Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus helveticus
Bacillus amyloliquefaciens
Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus reuterii
Lactobacillus helveticus
3
9
Кроме того, после второй стадии гидролиза может быть проведена вторая стадия сбраживания для достижения максимально возможного разложения глиадинов. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, вторую стадию сбраживания смеси, полученной на второй стадии ферментативного гидролиза, осуществляют с использованием по меньшей мере одного микроорганизма в условиях регулируемого рН. Предпочтительно, вторую стадию сбраживания осуществляют с использованием  или их смесей в качестве микроорганизмов. Предпочтительно, используют смесь  и по меньшей мере двух лактобацилл, выбранных из: и. Предпочтительно, микроорганизмы присутствуют в отношении 1:1:1. Предпочтительно, микроорганизмы добавляют в смесь в количестве от 10 до 10 КОЕ/г муки. Предпочтительно, вторую стадию сбраживания проводят при температуре от 35°C до 37°C при постоянном перемешивании и в течение периода времени от 4 до 12 часов.
И наконец, для получения конечного продукта, который может быть использован для выпекания хлебобулочных изделий, этот способ включает дополнительную стадию сушки для получения муки, не содержащей глиадина.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, стадия сушки представляет собой процесс сушки распылением. Предпочтительно, при сушкераспылением, входящий воздух имеет температуру от 150°C до 180°C, а выходящий воздух - от 70°C до 90°C.
Для лучшего понимания настоящего изобретения, ниже представлены примеры, которые приводятся лишь в иллюстративных целях для полного раскрытия предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, однако, при этом не подразумевается, что не существует каких-либо других не проиллюстрированных вариантов, которые могли бы быть реализованы на практике, исходя из изложенного выше подробного описания изобретения.
Пример 1
Было проведено несколько исследований для наблюдения за разложением глиадина различными способами.
9
Lactobacillus brevis
Lactobacillus sanfranciscensis
В первом исследовании был проведен способ, состоящий из стадии протеолиза и стадии сбраживания. Для этого исследования получали суспензию «мука в воде», и указанную суспензию выдерживали при постоянном перемешивании при температуре 37°C. Для стадии протеолиза добавляли 1 г фермента HT Proteolytic на 1 кг муки и оставляли для гидролиза на 5 часов. Затем, на стадии сбраживания добавляли 10 КОЕ лактобацилл и , и эту стадию проводили в течение 9 часов.
Во втором исследовании, предыдущий анализ повторяли, но время ферментативного протеолиза было изменено с 5 до 10 часов.
9
L. johnsonii
В третьем исследовании осуществляли сбраживание, для которого была приготовлена суспензия «мука в воде», и к указанной суспензии было добавлено 10 КОЕ . Суспензию выдерживали при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 24 часов.
Четвертое исследование состояло из стадии протеолиза, для которого была приготовлена суспензия из 33,3 г муки и 130 мл воды, а затем к этой суспензии добавляли 1 г фермента HT Proteolitic 200 на 1 кг муки. Указанную суспензию выдерживали при постоянном перемешивании при 37°C в течение 10 часов.
В пятом исследовании осуществляли стадию протеолиза, для которого была приготовлена суспензия из 33,3 г муки и 130 мл воды, а затем к указанной суспензии добавляли 1,2 г фермента Harizyme G на 1 кг муки. Указанную суспензию выдерживали при постоянном перемешивании при 37°C в течение 10 часов.
По окончании каждого эксперимента, муку анализировали с помощью жидкостной хроматографии. Результаты представлены в Таблице 1. На каждой из фигур 1-5, жидкостная хроматограмма муки Hoja de Plata обозначена буквой «А», а хроматограмма муки, обработанной каждым из способов исследования согласно изобретению, обозначена буквой «B». Кроме того, положение хроматограммы, где показано содержание анализируемого глиадина, обозначено кружком на каждой фигуре.
Таблица 1
Эксперимент
Результат
Хроматограмма
Протеолиз в течение 5 часов и молочнокислое сбраживание
Наблюдалось значительное снижение фракций глиадина, хотя и с неполным разложением
Фигура 1
Протеолиз в течение 10 часов и молочнокислое сбраживание
Наблюдалось значительное разложение глиадина, однако, снижение составляло лишь 20% по сравнению с предыдущей обработкой посредством протеолиза
Фигура 2
Сбраживания под действием <i>L. johnsonii</i> в течение 24 часов
Наблюдалось снижение фракций глиадина, однако, было детектировано увеличение числа пептидов с более высокой молекулярной массой
Фигура 3
Протеолиз с использованием HT Proteolitic 200 в течение 10 ч.
Наблюдалось значительное снижение глиадина, а также снижение пептидов с более высокой молекулярной массой, детектируемых в предыдущих экспериментах
Фигура 4
Протеолиз с использованием HT Harizyme G в течение 10 ч.
Наблюдался профиль, очень похожий на профиль стандартной муки Hoja de Plata, что указывало на минимальное разложение глиадина
Фигура 5
Из результатов, представленных в Таблице 1 и на соответствующих чертежах, можно сделать вывод, что наиболее эффективные процессы разложения глютена наблюдались в том случае, когда после протеолиза проводили стадию молочнокислого сбраживания.
Пример 2
Был проведен анализ для наблюдения за разложением глиадина способом, включающим 5-часовую стадию протеолиза с использованием фермента N1000; стадию сбраживания с использованием лактобацилл; и дополнительную стадию протеолиза с использованием HT Proteolitic 200.
9
Lactobacillus brevis
Lactobacillus sanfranciscensis
Для этого анализа был проведен первый эксперимент, в котором была приготовлена суспензия «мука в воде», и к указанной суспензии добавили 0,4 г фермента N-1000 на 1 кг муки. Суспензию выдерживали при постоянном перемешивании в течение 5 часов при температуре 37°C. Затем добавляли 10 КОЕ  и  и выдерживали при постоянном перемешивании в течение 9 часов при температуре 37°C. И наконец, добавляли 1 г фермента HT Proteolitic 200 на 1 кг муки, и суспензию выдерживали при постоянном перемешивании в течение 5 часов при температуре 37°C.
Этот эксперимент повторяли, за исключением того, что время второго протеолиза составляло до 10 часов.
В указанном эксперименте была получена хроматограмма, представленная на фигуре 6, где хроматограмма муки Hoja de Plata в различных концентрациях обозначена буквой «A», а хроматограмма муки, обработанной способом согласно изобретению, обозначена буквой «B». На той же самой фигуре, положение хроматограммы, где показано содержание глиадина в анализируемой муке, обозначено кружком.
На фигуре 6 видно, что после проведения всех стадий этого способа, разложение глиадина могло составлять приблизительно до 75 м.д. На фигуре 6 также показано, что результаты первого эксперимента очень похожи на результаты второго эксперимента.
Пример 3
9
L. brevis
L. sanfranciscensis
B. amyloliquefaciens
L. sanfranciscensis
L. brevis
B. amyloliquefaciens
Было осуществлено три способа сбраживания. В каждом способе приготовливали суспензию «мука-в-воде», и к указанной суспензии добавляли 10 КОЕ микроорганизма. В первом эксперименте, микроорганизмом является ; во втором эксперименте был выбран микроорганизм ; а в третьем эксперименте был выбран . Каждое сбраживание продолжалось в течение 24 часов при 37°C при постоянном перемешивании. Затем разложившийся глиадин количественно оценивали с помощью жидкостной хроматографии. Результаты представлены на фигуре 7 для , на фигуре 8 для  и на фигуре 9 для . На этих фигурах, линии «А» означают стандартный глиадин, а линия «В» означает концентрацию глиадина в муке, сбраживаемой каждым из этих микроорганизмов.
B. amyloliquefaciens
Как видно на этих фигурах, наилучшим микроорганизмом для разложения глиадина является .
Пример 4
Было проведено исследование для определения рабочего времени, необходимого для проведения ферментативного гидролиза. В этом исследовании, высвобождение тирозина количественно оценивали в процессе проведения двух способов гидролиза глютена пшеницы, каждый из которых проводили с использованием различных протеаз. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы определить время гидролиза, необходимое для достижения стационарного состояния тирозина, то есть, время, когда он прекращает продуцироваться.
В этих экспериментах, содержание тирозина в суспензиях муки количественно определяли в процессе гидролиза через каждые 15-30 минут. В первом эксперименте использовали суспензию 4,3 г муки в 130 мл воды, и к указанной суспензии добавляли 0,4 г протеазы N-1000. Во втором эксперименте использовали суспензию 4,3 г глютена в 130 мл воды, и к указанной суспензии добавляли 1 г протеазы Proteolitic 200 HT.
Полученные результаты представлены на фигуре 10 для протеазы N-1000 и на фигуре 11 для протеазы Proteolitic 200 HT, соответственно. На этих фигурах показана зависимость концентрации тирозина от времени, и ясно видно, что средняя концентрация тирозина в этих суспензиях достигает стационарного состояния в промежутке времени гидролиза от 4 до 8 часов.
Пример 5
Анализ проводили в условиях, эквивалентных условиям, упомянутым в предыдущих примерах, для определения концентрации глиадина, присутствующего в муке после обработки способом разложения глиадина согласно изобретению.
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens
L. brevis
L. delbrueckii
В этом исследовани приготавливали суспензию «мука в воде», и эта суспензия была сначала обработана путем проведения стадии ферментативного гидролиза с использованием ферментов ENZECO PROTEASE FNP и ENZECO FUNGAL PROTEASE, а затем, путем проведения стадии сбраживания с использованием , после чего проводили другую стадию ферментативного гидролиза с использованием протеаз ENZECO PROTEASE FNP и ENZECO FUNGAL PROTEASE, и, наконец, проводили второе сбраживание с использованием  в комбинации с  и . Все стадии проводили при 37°C при постоянном перемешивании.
Образцы гидролизованной муки получали методом квартования. Для каждой реплики отбирали 200 мг образца и помещали в пробирки Falcon со стеклянным шариком для улучшения экстракции.
Экстракцию белка осуществляли путем трехкратной промывки 70% раствором этанола. Каждую промывку осуществляли путем добавления 3 мл раствора этанола к образцу и в пробирки, содержащие стеклянные шарики, после чего содержимое перемешивали в течение одного часа в роторном инкубаторе со скоростью 70 об/мин. После центрифугирования образца, его ресуспендировали в растворителе путем вихревого перемешивания. Растворимую часть в растворителе декантировали после центрифугирования пробирки в течение 10 минут при 2500 об/мин, и наконец, экстракт помещали в другую пробирку Falcon, где три промывки объединяли.
3 мл экстракта каждого образца фильтровали через 0,22 мкм-мембрану для определения концентрации глиадина с помощью ВЭЖХ.
Экстракты образцов подвергали ВЭЖХ при температуре 50°C с использованием двух подвижных фаз, где первый названный раствор А состоял из смеси 99% воды и 1% воды с 0,001% трифторуксусной кислоты. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,6 мл/мин в градиенте 27% B → 50% B в течение первых 20 минут, и наконец, 50% B → 75% B в течение периода времени до 30 минут, и после введения образца, промывку Фазой А осуществляли в течение 10 минут. 100 мкм образца или фазы А вводили во время анализа и соответственно промывали. Пептидные сигналы на 210 нм детектировали на УФ-детекторе, как показано на фигуре 12, где жидкостная хроматограмма стандартной муки обозначена буквой «А», а жидкостная хроматограмма муки, обработанной описанным способом, обозначена буквой «B».
На фигуре 12 видно, что фракции, соответствующие различным глиадинам (скорость потока (RF) от 12 до 17 минут), явно исчезали в образцах муки, обработанной способом согласно изобретению.
В соответствии с вышеуказанным, для специалиста в данной области очевидно, что предпочтительный вариант способа разложения глиадина в муке для выпечки хлеба, как показано выше, приводится лишь в иллюстративнях целях и не должен рассматриваться как ограничение настоящего изобретения, и специалист в данной области может внести в него множество изменений, при условии, что они не будут выходить за рамки принципов согласно изобретению.
В соответствии с этим, настоящее изобретение включает все варианты, которые могут быть очевидны для специалиста исходя из концепций настоящего изобретения, и соответствуют нижеследующей формуле изобретения.