Способ прогнозирования течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки T1N0M0 при размерах первичной опухоли в пределах 1 см
METHOD FOR PREDICTION OF MODERATELY DIFFERENTIATED ENDOMETRIOID UTERINE BODY T1N0M0 CARCINOMA COURSE IN CASE OF PRIMARY TUMOUR SIZE WITHIN 1 cm

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, онкологии, гинекологии, и может быть использовано для прогноза течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки T1N0M0 и последующего обоснования целесообразности адьювантной терапии.
В течение последних лет активно изучаются различные молекулярные маркеры, такие как циклооксигеназы (СОХ-2, СОХ-1), муцины (MUC-1, MUC-2), рецепторы эстрогенов (ER) и прогестерона (PR), антиген Ki-67, онкобелок HER2/neu при самой распространенной разновидности рака тела матки эндометриоидной аденокарциноме (см. интернет-ресурс: http://cyberleninka.ru/article/n/molekulyarnye-markery-raka-sheyki-i-tela-matki-kak-prognosticheskie-faktory#ixzz3stSZ3Dsp). Белок Ki-67 относится к семейству ядерных белков и отражает участие клеток в процессах пролиферации.
Высокая степень экспрессии Ki-67 свидетельствует о неблагоприятном прогнозе у больных раком тела матки (см. «Молекулярные маркеры рака шейки и тела матки как прогностические факторы», Кайрбаев М.Р., Чингисова Ж.К., Кукубасов Е.К., Клиническая медицина Казахстана, №3 (29), 2013, ст. 42-46).
Белок топоизомераза 2 альфа (Topoisomerase IIα, (ТОР2альфа)) представляет собой фермент, который контролирует и определяет топологические состояния ДНК во время транскрипции и репликации, с ним связывают развитие лекарственной резистентности при химиотерапии опухолей.
Известно применение маркера Ki-67 для повышения точности прогнозирования пятилетней выживаемости без прогрессирования у больных раком почечной лоханки и мочеточника после радикального хирургического лечения (см. патент RU №2281698 С1, МПК А61В 10/00, G01N 33/53 «Способ прогнозирования пятилетней выживаемости без прогрессирования у больных раком почечной лоханки и мочеточника после радикального хирургического лечения», опубл. 20.08.2006, Бюл. №23). Авторы изобретения в биоптате подсчитывают количество Ki-67 антиген-положительных клеток в не менее чем пятнадцати полях зрения и определяют индекс пролиферации, рассчитывая его среднее, минимальное и максимальное значения, рассчитывают показатель пятилетней выживаемости без прогрессирования рака (S) по формуле: S=0,38×Кi-67M+0,02×Ki-67Min-0,24×Ki-67Max, где Ki-67Min - минимальное значение индекса пролиферации Ki-67 после исследования 15 полей зрения, Ki-67Max - максимальное значение индекса пролиферации Ki-67 после исследования 15 полей зрения, Ki-67M - среднее значение индекса пролиферации Ki-67 после исследования 15 полей зрения. При значениях S<22 прогнозируют пятилетнюю выживаемость без прогрессирования рака. Однако, на наш взгляд, предлагаемый авторами способ оценки неспецифичен для эндометриоидных карцином тела матки.
2
2
Также из патентных источников известно использование маркеров Ki-67 и топоизомеразы 2 альфа (Topoisomerase IIα) для прогнозирования общей выживаемости больных с лейомиосаркомой тела матки I-II стадии (см. заявка на изобретение №2013140844/15 «Способ прогнозирования общей выживаемости больных с лейомиосаркомой тела матки I-II стадии», приоритет от 04.09.2013, дата публикации заявки: 10.04.2015. Бюл. №10). Способ включает в себя определение степени злокачественности, размера опухоли и проведение иммуногистохимического определения экспрессии маркера Ki 67. Сущностью способа является то, что определяют стадию FIGO после экстирпации матки с придатками, степень злокачественности по FNCLCC и дополнительно проводят иммуногистохимические исследование уровня экспрессии маркеров BrdU, CD31, Topoisomerase IIα, HSP70, исследование рецепторного статуса опухоли на эстрогены и прогестерон; плоидометрию; гистохимическое исследование ядрышковых организаторов (AgNORs) опухолевых клеток и эндотелия на степень зрелости сосудов опухоли; определяют плотность микроциркуляторного русла перитуморозной зоны опухоли и рассчитывают прогностическую значимость каждого параметра по формуле с вычислением клинико-морфо-биомолекулярного показателя (КМБП): КМБП=Х1+Х2+Х3…+Х12, где X - это клинико-морфологические и биомолекулярные параметры, а характеристики и значения экспрессии исследованных параметров выражают в баллах: Х1 - (ПМЦР) перитуморозной зоны до 62,4 в 2 мм - 0 баллов, более 62,4 в мм - 9 баллов; Х2 - плоидность ядер до 9,4 с - 0, более 9,4 с - 9 баллов; Стр.: 1 RU 2013140844 A, RU 2013140844 А; Х3 - число AgNORs ядер до 22,1 - 0 баллов, более 22,1 - 3 балла; Х4 - экспрессия BrdU до 6,3% - 0 баллов, более 6,3% - 3 балла; Х5 - зрелые сосуды опухоли 0 баллов, незрелые сосуды опухоли 3 балла; Х6 - степень злокачественности по FNLCC G1 - 0 баллов, G2 - 2 балла, G3 - 3 балла; Х7 - реакция HSP70 цитоплазматическая, ядерно-цитоплазматическая - 0 баллов, реакция HSP70 ядерно-ядрышковая - 3 балла; Х8 - экспрессия Ki-67 до 16,2% - 0 баллов, более 16,2% - 3 балла; Х9 - интенсивность Topoisomerase II +, ++ - 0 баллов, +++ - 3 балла; X10 - рецепторный статус (по РП) позитивный - 0 баллов, негативный - 3 балла; X11 - стадия FIGO I - 0 баллов, II - 3 балла; X12 - размер опухоли до 7 см - 0 баллов, более 7 см - 3 балла; и в зависимости от суммы баллов прогнозируют общую выживаемость больных с ЛМС: I группа - от 0 до 20 баллов с благоприятным прогнозом, II группа - от 21 до 40 баллов с относительно неблагоприятным (промежуточным) прогнозом, III группа - более 40 баллов с неблагоприятным прогнозом.
Критерии выбора метода адьювантной специальной терапии у нерепродуктивных больных раком тела матки T1N0M0 G2 эндометриоидной аденокарциномы основываются на площади поражения опухолью не более 1 см и глубины инвазии до  стенки матки, что не отражает биологических потенций самой опухоли (см. Диагностика и лечение злокачественных новообразований. М., 2013 г., 413 с.).
Также известно применение топоизомеразы 2 альфа в качестве прогностического биомаркера в химиотерапии рака (см. Human topoisomerase II alpha as a prognostic biomarker in cancer chemotherapy. Интернет-ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26482620). Значения экспрессии топоизомеразы 2 альфа помогают в диагностике рака и в прогнозе прогрессирования заболевания, общей выживаемости пациентов и позволяют рассчитать ответ на терапию.
Из других литературных источников известно использование топоизомеразы 2 альфа как предиктора эффективности адъювантной химиотерапии при раке эндометрия (см. интернет-ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26588239). Авторами установлено, что у больных с гиперэкспрессией топоизомеразы 2 альфа можно прогнозирвать худший прогноз по сравнению с теми, у кого не наблюдается экспрессии топоизомеразы 2 альфа.
Известна роль таких показателей как ER, PR, C-ErbB-2 и Ki-67 в развитии карциномы эндометрия и их соотношение с клинико-морфологическими особенностями (интернет-ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26434913). Аномальная экспрессия ER, PR, C-erbB2 и Ki-67 может играть важную роль в злокачественной трансформации и дифференциации клеток эндометрия, поэтому их совместное обнаружение может быть важным и иметь большое значение для прогноза карциномы эндометрия.
Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение точности и информативности прогноза течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином матки, позволяющего обосновать целесообразность и объем адъювантной терапии.
Технический результат достигают тем, что при размерах первичной опухоли в пределах 1 см определяют клетки опухоли матки, экспрессирующие Ki-67, топоизомеразу 2 альфа, рассчитывают коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 и при значении коэффициента менее или равно 0,8 прогнозируют благоприятный исход без проведения адъювантной терапии, а при значении коэффициента более 0,8 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания и рекомендуют проведение адъювантной терапии.
Выбор в качестве маркеров эндометриоидных карцином матки таких белков, как Ki-67, топоизомеразы 2 альфа обусловлен их ролью в определении пролиферативной, митотической активности опухолевой ткани.
Выбранный нами набор белков позволил оценить биологические потенции умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки T1N0M0 в зависимости от уровня коэффициента соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 менее или равно 0,8 или более 0,8.
В таблице 1 представлены результаты сравнительного исследования иммуногистохимических маркеров рецепторов к белку пролиферации Ki-67, топоизомеразе 2 альфа в срезах умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки у 20 пациенток при коэффициенте соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 менее или равно 0,8 (1 группа) и у 20 пациенток с умереннодифференцированными аденокарциномами при коэффициенте соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 более 0,8 (2 группа).
При сравнении результатов исследования между двумя группами пациенток обнаружено, что у пациенток первой группы индекс пролиферации Ki-67 составил не более 20% ядер клеток, отмечался низкий уровень активности топоизомеразы 2 альфа (не более 10% ядер клеток), коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 составил не более 0,8.
Во второй группе пациенток с эндометриодными карциномами тела матки имелось повышение уровня пролиферативной активности опухоли Ki-67 (80-90%), гиперэкспрессия топоизомеразы 2 альфа (65-75%), коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 составил более 0,8.
Подобных иммуногистохимических исследований при комплексной иммуногистохимической оценке умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки в доступной нам научно-медицинской и патентной литературе не встречалось.
Сравнительный анализ известных способов комплексной оценки предлагаемого нами способа позволяет выявить его новизну и отличия от известных.
Новизна способа комплексной иммуногистохимической оценки умереннодифференцированных эндометриоидных карцином эндометрия заключается в определении коэффициента соотношения маркеров топоизомераза 2 альфа/Ki-67 с целью повышения точности и информативности прогноза течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином матки, что, в свою очередь, обосновывает необходимость проведения профилактической адъювантной терапии.
Предлагаемый нами способ оценки осуществляют следующим образом.
1. После хирургического удаления матки, из ткани опухоли готовили стандартные блоки, 2 парафиновых среза толщиной 3-5 микрон по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов. Два среза использовали для проведения иммуногистохимической реакции с маркерами Ki-67, топоизомеразы 2 альфа.
Последовательность этапов проведения реакции с каждым из маркеров совпадала.
2. Иммуногистохимическое исследование по оценке экспрессии Ki-67, топоизомеразы 2 альфа проводили по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводили обработку срезов в цитратном буфере [рН 6,0] в течение 30 минут при 95°С на водяной бане.
3. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°С. В качестве первичных антител при оценке экспрессии Ki-67 топоизомеразы 2 альфа использовали мышиные моноклональные антитела к данным маркерам (фирма производитель DAKO Corp).
4. Для визуализации реакции антиген-антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+[DAKO Corp].
5. Затем срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.
6. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение ×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.
Показано, что у пациенток с умереннодифференцированными эндометриоидными карциномами тела матки T1N0M0 имелись два типа иммуногистохимических изменений Ki-67, топоизомеразы 2 альфа и их соотношения (менее или равно 0,8 и более 0,8).
У пациенток первой группы в опухолях матки индекс пролиферации Ki-67 составил не более 20% ядер клеток, низкий уровень активности топоизомеразы 2 альфа (не более 10% ядер клеток), коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 составил не более 0,8.
У пациенток второй группы в опухолях матки отмечалось значительное повышение уровня пролиферативной активности опухоли Ki-67 (80-90%), гиперэкспрессия топоизомеразы 2 альфа (65-75%), коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 составил более 0,8.
Приводим клинические примеры использования способа
Пример 1. Больная X., 1964 года рождения, с верифицированным на догоспитальном этапе диагнозом: рак тела матки (эндометриоидная карцинома) T1N0M0, оперирована по стандартной методике: пангистерэктомия, тазовая лимфаденэтомия.
Макроскопически первичная опухоль располагалась в верхнем сегменте матки и по протяженности не превышала в диаметре 1,0 см.
Послеоперационное морфологическое исследование выявило наличие G2 эндометриоидной карциномы в виде трубчатых структур, выстланных атипическими железистым эпителием; глубина инвазии опухоли в миометрий до  толщины стенки матки; в удаленных лимфатических узлах метастазов опухоли не обнаружено.
Ядерный индекс в опухолевых железах составил не более 0,4. Индекс пролиферации Ki-67 составил 18%, экспрессия топоизомеразы 2 альфа 10%, коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 составил 0,55, что позволило установить низкие агрессивные потенции G2 эндометриоидной аденокарциномы у данной больной и не проводить пациентке превентивную адъювантную лучевую терапию. Подобная тактика не протоворечит стандарту лечения больных с T1N0M0G2 эндометриоидной аденокарциномы.
Срок наблюдения пациентки 29 месяцев без признаков рецидива и метастазов.
Пример 2. Больная Ж., 1968 года рождения с верифицированным амбулаторно диагнозом: рак тела матки T1NxM0, прооперирована в объеме пангистерэктомии, тазовой лимфаденэтомии.
Макроскопически опухоль располагалась в области дна, размерами 0,8×1,1 см.
Послеоперационное патогистологическое исследование выявило наличие G2 эндометриоидной аденокарциномы с инвазией менее 50% толщины стенки матки; лимфатические узлы интактны. Ядерный индекс в опухолевых железах составил более 0,7; индекс пролиферации Ki-67 составил 65%, а экспрессия топоизомеразы 2 альфа 70%, коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа / Ki-67 составил 1,07 - более 0,8 референтного значения.
Несмотря на небольшие размеры первичной опухоли, инвазию в миометрий менее  толщины стенки матки, отсутствия метастатического поражения тазовых лимфоузлов, что соответствовало T1N0M0 распространенности рака эндометрия, приняв во внимание агрессивный вариант G2 эндометриоидной аденокарциномы - больной проведена превентивная адъювантная лучевая терапия по стандартной методике.
Больная наблюдается 34 месяца без признаков рецидивов и метастазов.
Подобным способом был уточнен прижизненный диагноз 40 больным раком тела матки T1N0M0.
Разработанный способ определения агрессивного поведения умерееннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки T1N0M0 при размерах первичной опухоли в пределах 1 см является промышленно применимым. С помощью этих прогностических факторов можно прогнозировать течение заболевания и планировать лечебные мероприятия.