Новый полипептид и способ продуцирования IMP с его использованием
NOVEL POLYPEPTIDE AND A METHOD FOR PRODUCING IMP USING SAID POLYPEPTIDE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому варианту белка, обладающему активностью экспорта инозин-5'-монофосфата (IMP), к содержащему его микроорганизму и к способу получения IMP с использованием этого микроорганизма, и способу увеличения экспорта IMP с использованием этого микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
Инозин-5'-монофосфат (далее IMP), являющийся веществом на основе нуклеиновой кислоты, представляет собой промежуточное соединение в метаболическом пути нуклеиновой кислоты и используется во множестве областей, таких как продукты питания, лекарственные средства, различные медицинские применения и т.п. В частности, IMP широко используется в качестве добавки для пищевых приправ или пищевых продуктов наряду с гуанин-5'-монофосфатом (далее GMP). Хотя известно, что IMP сам по себе обеспечивает вкус мяса, также известно, что он усиливает вкус и запах мононатриевой соли глутаминовой кислоты (MSG) и таким образом привлекает внимание в качестве усиливающей вкус приправы на основе нуклеиновой кислоты.
Примеры способов получения IMP включают способ ферментативного расщепления рибонуклеиновой кислоты, экстрагированной из клеток дрожжей (публикация патента Японии №1614/1957), способ химического фосфорилирования инозина, продуцируемого путем ферментации (Agri. Biol. Chem., 36, 1511 и т.п.), способ культивирования микроорганизмов, которые могут непосредственно продуцировать IMP и выделять IMP в культуральный бульон и т.п. Среди этих способов наиболее часто используемым в настоящее время способом является способ с использованием микроорганизмов, способных непосредственно продуцировать IMP.
В то же самое время, поскольку ферменты не всегда демонстрируют оптимальные свойства, по природе относящиеся к активности, стабильности, субстратной специфичности в отношении оптических изомеров и т.п, которые требуются для промышленного применения, предпринимались различные попытки улучшить ферменты для того, чтобы соответствовать предполагаемому применению путем модификации их аминокислотных последовательностей и т.п. Среди этих попыток, несмотря на то, что рациональное конструирование и сайт-направленный мутагенез ферментов применялись для улучшения функции фермента, было показано, что во многих случаях эти попытки были неудачными, поскольку информация о структуре целевых ферментов не является достаточной или корреляция между структурой и функцией не является ясной, что препятствует их эффективному применению. Кроме того, ранее сообщали о способе улучшения активности фермента за счет попытки улучшить ферменты посредством направленной эволюции, предназначенной для отбора ферментов с желаемыми характеристиками из библиотеки модифицированных ферментов, сконструированных путем случайного мутагенеза генов ферментов.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Для получения IMP с высоким выходом с использованием способа непосредственного продуцирования IMP путем микробной ферментации, IMP должен беспрепятственно экспортироваться. Для выполнения этой задачи авторы настоящего изобретения открыли белок, вовлеченный в активность экспорта IMP, и также приложили множество усилий для увеличения продуцирования IMP. В результате они открыли варианты белка, обладающие активностью экспорта IMP, завершив тем самым настоящее изобретение.
Техническое решение
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полинуклеотид, кодирующий вариант белка по настоящему изобретению.
Еще одна задача описания настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вектор, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению.
Еще одна задача описания настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм, продуцирующий IMP, который содержит вариант белка и вектор по настоящему изобретению.
Еще одна задача описания настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения IMP, включающий культивирование микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению в среде и выделение IMP из микроорганизма или среды.
Еще одна задача описания настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ увеличения экспорта IMP, включающий усиление активности белка по настоящему изобретению, который обладает активностью экспорта IMP, в микроорганизма роде Corynebacterium по настоящему изобретению.
Для достижения вышеприведенных задач в аспекте описания настоящего изобретения предложен вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP.
Используемый здесь термин “белок, который экспортирует инозин-5'-монофосфат (IMP)” относится к белку, вовлеченному во внеклеточный экспорт IMP. Для задачи описания настоящего изобретения термин может быть использован взаимозаменяемо с белком, обладающим активностью, экспортирующей IMP, белком, экспортирующим IMP, белком, способным экспортировать IMP, белком, экспортирующим IMP и т.п; в частности, белок может экспрессироваться как ImpE, Более конкретно, ImpE1 или ImpE2, и еще Более конкретно, экспортирующий белок в соответствии с описанием настоящего изобретения может экспрессироваться как ImpE2, но экспрессия белка не ограничивается им. Дополнительно, белок может продуцироваться микроорганизмом рода Corynebacterium, и в частности Corynebacterium stationis, но микроорганизм не ограничивается им.
Белок может представлять собой белок, который включает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, или белок, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, но любая последовательность, обладающая той же самой активностью как белок, может быть включена без ограничения, и специалист в данной области техники может получить информацию о последовательности в GenBank NCBI (Национальный центр биотехнологической информации), представляющей собой хорошо известную базу данных. Дополнительно, белок в соответствии с описанием настоящего изобретения, который экспортирует IMP, может представлять собой белок, который включает аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%. Дополнительно, понятно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, мутацией, заменой или вставкой в части последовательности, также может быть включен в объем описания настоящего изобретения, также как и аминокислотная последовательность, имеющая описанную выше гомологию или идентичность и обладающая действием, соответствующим действию белка.
То есть, хотя в описании настоящего изобретения белок описан как “белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную конкретной SEQ ID NO” или “белок, состоящий из конкретной SEQ ID NO”, понятно, что белок имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой, консервативной заменой или добавлением некоторых аминокислот, также оказывается в объеме настоящего изобретения, а также белок, обладающий активностью, такой же или эквивалентной активности белка, который состоит из аминокислотной последовательности соответствующей SEQ ID NO. Например, до тех пор, пока белок обладает активностью, которая является такой же или эквивалентной активности варианта белка в соответствии с описанием настоящего изобретения, вышеприведенное выражение не исключает добавление последовательности выше или ниже относительно аминокислотной последовательности, которая не изменяет функцию белка, его мутацию, которая может возникать в природе, его молчащую мутацию или консервативную замену, и даже в случае такого добавления последовательности или мутации, понятно, что белок также относится к объему описания настоящего изобретения.
В описании настоящего изобретения “гомология” или “идентичность” относится к степени совпадения между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и может выражаться в процентах.
Термины “гомология” и “идентичность” часто используются взаимозаменяемо друг с другом.
Гомология или идентичность последовательности консервативных полинуклеотидных или полипептидных последовательностей могут быть определены при помощи стандартных алгоритмов выравнивания и могут быть использованы с штрафом за пропуск, устанавливаемым по умолчанию в используемой программе. По существу гомологичные или идентичные полинуклеотиды или полипептиды в общем могут гибридизоваться в условиях умеренной или высокой жесткости вдоль всей длины или по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% или выше от всей длины. Также в гибридизации рассматриваются полинуклеотиды, которые включают вырожденные кодоны вместо кодонов.
Обладают ли любые две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, может быть определено с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как программа “FASTA” (Pearson et al., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444: с использованием параметров по умолчанию в 2444). Альтернативно, они могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needleman в пакете EMBOSS ((EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более позние версии) (пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, и [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием BLAST или ClustalW от National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидных или полипептидных последовательностей могут быть определены путем сравнения информации о последовательностях с использованием, например компьютерной программы GAP (например, Needleman et al., (1970), J Mol Biol.48: 443), как опубликовано (например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482). В общем, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность в виде значения, получаемого путем деления количества одинаково выравненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать (1) однокомпонентную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения в соответствии с Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительно штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф за внесение пропуска в выравнивание 10 и штраф за удлинение пропуска 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски. Соответственно, используемый здесь термин “гомология” или “идентичность” относится к соответствию между последовательностями.
Используемый в описании настоящего изобретения термин “вариант” относится к полипептиду, который по консервативной замене и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, отличается от указанной последовательности, но сохраняет функции или свойства белка. Вариант отличается от идентифицированных последовательностей несколькими аминокислотными заменами, делециями или вставками. Такой вариант, как правило, может быть идентифицирован путем модификации одной аминокислоты полипептидной последовательности и оценки свойств варианта. То есть способности варианта белка могут быть увеличены, не изменены или уменьшены по сравнению со способностями нативного белка. Кроме того, некоторые модифицированные полипептиды могут включать модифицированные полипептиды, в которых одна или более чем одна группировка (например, N-концевая лидерная последовательность, трансмембранный домен и т.п.) удалена. Другие варианты могут включать варианты, в которых небольшой фрагмент удален с N- и/или C-конца зрелого белка. Используемый здесь термин “консервативная замена” относится к замене аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую схожими структурными и/или химическими свойствами. Вариант может иметь, например, одну или более чем одну консервативную замену при сохранении одной или более чем одной биологической активности. Такая аминокислотная замена может быть, как правило, осуществлена на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы. Например, положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; а отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; ароматические аминокислоты включают фенилаланин, триптофан и тирозин; и гидрофобные аминокислоты включают аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, глицин и триптофан.
Кроме того, вариант также может включать делецию или добавление аминокислот, которые обладают минимальными действиями на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая вовлечена в котрансляционный или посттрансляционный перенос белка. Полипептид также может быть конъюгирован с другой последовательностью или линкером для обеспечения идентификации, очистки или синтеза полипептида.
й
й
й
й
й
й
В частности, вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP, в соответствии с описанием настоящего изобретения, может представлять собой вариант белка, имеющий аминокислотную последовательность, в которой от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 123 аминокислоты, 243аминокислоты, 387 аминокислоты, 405 аминокислоты; 413 аминокислоты и 458аминокислоты, заменена на другую аминокислоту, но аминокислотная замена не ограничивается ими.
й
й
й
й
й
й
Например, вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP, в соответствии с описанием настоящего изобретения, может представлять собой вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP, который имеет от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 замену 123 аминокислоты на цистеин (т.е. F123C); замену 243 аминокислоты на валин (т.е. I243V); замену 387 аминокислоты на треонин (т.е. S387T); замену 405 аминокислоты на тирозин (т.е. F405Y); замену 413 аминокислоты на треонин (т.е. M413T); замену 458 аминокислоты на лизин (т.е. N458K); или их комбинацию, но аминокислотная замена не ограничивается ими. Более конкретно, вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP, может представлять собой белок, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 и 155, или аминокислотную последовательность, имеющую гомологию по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% или выше с этими аминокислотными последовательностями. Кроме того, понятно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность, в которой часть аминокислотной последовательности подвергнута делеции, модификации, замене или вставке, также может быть использован как белок в соответствии с описанием настоящего изобретения, если только эта аминокислотная последовательность имеет гомологию последовательности, описанную выше, и демонстрирует действие, эквивалентное действию вышеуказанных полипептидов.
й
й
й
й
Кроме того, вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP в соответствии с описанием настоящего изобретения, может представлять собой вариант белка, состоящий из аминокислотной последовательности, который дополнительно включает с N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 замену 2аминокислоты на другую аминокислоту, замену 64 аминокислоты на другую аминокислоту или их комбинацию. В частности, вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP, в соответствии с описанием настоящего изобретения, может представлять собой вариант белка, который дополнительно включает от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 замену 2 аминокислоты на изолейцин, замену 64 аминокислоты на глутаминовую кислоту или аспартат, или их комбинацию.
я
я
“Замена на другую аминокислоту” не ограничена, лишь бы только другая аминокислота представляла собой аминокислоту, отличающуюся от аминокислоты до замены. Например, когда 2 аминокислота с N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменена на другую аминокислоту, тогда другая аминокислота не ограничена, лишь бы только другая аминокислота представляла собой аминокислоту, отличающуюся от валина, и когда 64 аминокислота от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменена на другую аминокислоту, тогда другая аминокислота не ограничена, лишь бы только другая аминокислота представляла собой аминокислоту, отличающуюся от глицина.
В еще одном аспекте описания настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант белка в соответствии с описанием настоящего изобретения, или вектор, содержащий полинуклеотид в соответствии с описанием настоящего изобретения.
Используемый в описании настоящего изобретения термин “полинуклеотид” относится к полимеру из нуклеотидов, в котором мономеры нуклеотидов связаны в длинной цепи при помощи ковалентных связей, и имеет длину цепи ДНК или цепи РНК больше определенной.
В отношении полинуклеотида в соответствии с описанием настоящего изобретения, основываясь на вырожденности кодонов, понятно, что белки, которые состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 или 155, или полинуклеотиды, которые могут транслироваться в белки имеющие гомологию с вышеприведенными белками, также могут быть включены в объем описания настоящего изобретения. Например, полинуклеотид в соответствии с описанием настоящего изобретения может представлять собой полинуклеотидную последовательность, имеющую последовательность оснований в соответствии с SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156, и, более конкретно, может представлять собой полинуклеотид, состоящий из последовательности оснований в соответствии с SEQ ID NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 или 156. Кроме того, любая последовательность, которая кодирует белок, обладающий активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 или 155, определенная путем гибридизации в жестких условиях с зондом, который может быть получен из известной последовательности гена (например, последовательности, комплементарной всей или части вышеприведенной нуклеотидной последовательности), может быть включена без ограничения.
Термин “жесткие условия” относится к условиям, при которых становится возможной гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия в частности описаны в источниках (например, J. Sambrook et al., ранее). Например, эти условия могут включать осуществление гибридизации между генами, обладающими высокой гомологией, гомологией 40% или выше, в частности 90% или выше, конкретней 95% или выше, еще конкретней 97% или выше, и, в частности, 99% или выше, при отсутствии гибридизации между генами, имеющими гомологию меньше чем вышеприведенные гомологии; или для осуществления гибридизации один раз, в частности два или три раза, в обычных условиях отмывания для Саузерн гибридизации, составляющих 60°C, 1× SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности при концентрации соли и температуре, соответствующей 60°C, 0,1× SSC и 0,1% SDS, и более конкретно при 68°C, 0,1× SSC и 0,1% SDS.
Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарную последовательность, хотя ошибки спаривания между основаниями могут быть возможны в зависимости от жесткости гибридизации. Термин “комплементарный” используется для описания взаимосвязи между попарно гибридизуемыми нуклеотидными основаниями. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, описание настоящего изобретения также может включать выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные полноразмерной последовательности, а также по существу похожие последовательности нуклеиновых кислот.
m
В частности, полинуклеотиды, имеющие гомологию, могут быть обнаружены при величине T (температуры плавления) 55°C с использованием условий гибридизации, которые включают стадию гибридизации и использование описанных выше условий. Кроме того, величина Tm может составлять 60°C, 63°C или 65°C, но не ограничивается ими, и может быть подходящим образом скорректирована специалистом в данной области техники в соответствии с предполагаемой задачей.
Жесткость, подходящая для гибридизации полинуклеотидов, зависит от длины и комплементарности полинуклеотидов и связанных переменных, хорошо известных в области техники (смотри, Sambrook et al., ранее, 9.50 - 9.51 и 11.7 - 11.8).
В описании настоящего изобретения полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность белка, обладающего активностью экспорта IMP, может представлять собой ген impE2, и выражение полинуклеотид является таким, как описано выше.
В описании настоящего изобретения выражение полинуклеотид, кодирующий вариант белка, который обладает активностью экспорта IMP, также является таким, как описано выше.
Используемый в настоящем описании термин “вектор” относится к конструкции ДНК, включающей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в которой целевой белок функционально связан с подходящей контрольной последовательностью, таким образом, что целевой белок может экспрессироваться в подходящем хозяине. Контрольная последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен мРНК для связывания с рибосомой, и последовательность, контролирующую окончание транскрипции и трансляции. Этот вектор после трансформации в подходящую клетку-хозяин может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина.
Вектор, используемый в настоящем описании, может быть не ограничен конкретным образом при условии, что этот вектор является реплицируемым в клетке- хозяине, и он может быть сконструирован с использованием любого вектора, известного в области техники. Примеры вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора может быть использован pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.п; и в качестве плазмидного вектора может быть использован вектор на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и т.п.В частности, могут быть использованы векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.п.
В одном воплощении полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть заменен на модифицированный полинуклеотид (вариант) в хромосоме с использованием вектора для встраивания в хромосому в клетке. Встраивание полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено с использованием способа, известного в области техники, например путем гомологичной рекомбинации, но не ограничивается им. В частности, маркер селекции может быть дополнительно включен для подтверждения встраивания в хромосому. Маркер селекции используется для отбора трансформированной клетки, т.е. для подтверждения того, осуществлено ли встраивание целевой нуклеиновой кислоты, и могут быть использованы маркеры, способные обеспечить способные к отбору фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, потребность в питательных веществах, устойчивость к цитотоксическим агентам и экспрессия поверхностных белков. В условиях, когда обрабатывают агентами селекции, только клетки, способные экспрессировать маркеры селекции, могут выживать или проявлять другие фенотипические характеристики, и, таким образом, легко могут быть отобраны трансформированные клетки.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий IMP, который содержит вариант белка по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий указанный вариант белка, или вектор по настоящему изобретению. В частности, микроорганизм, содержащий вариант белка и/или полинуклеотид, кодирующий этот вариант белка, может представлять собой микроорганизм, полученный путем трансформации с использованием вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий указанный вариант белка, однако микроорганизм не ограничивается ими.
относится к процессу внедрения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, за счет этого обеспечивая экспрессию белка, кодируемую этим полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Для трансформированного полинуклеотида не имеет значения, встроен ли он в хромосому клетки-хозяина и находится в ней или находится вне хромосомы, при условии, что этот трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Полинуклеотид может быть встроен в любой форме при условии, что он может быть внедрен в клетку хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть внедрен в клетку хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все существенные элементы, требующиеся для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета обычно может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал прекращения транскрипции, домен связывания с рибосомом и сигнал прекращения трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме самореплицируемого экспрессионного вектора. Кроме того, полинуклеотид может быть внедрен в клетку-хозяина сам по себе и функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничивается этим.
Кроме того, используемый в настоящем описании термин “функционально связанный” относится к функциональной связи между промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок, т.е. конъюгата в соответствии с настоящим описанием, и вышеуказанной генной последовательностью.
Используемый в настоящем описании термин “микроорганизм, продуцирующий IMP” относится к микроорганизму, который в естественных условиях способен продуцировать IMP; или к микроорганизму, в который внедрена способность продуцировать или экспортировать IMP, родительский штамм которого в природе не способен продуцировать и/или экспортировать IMP В описании настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий IMP, может быть использован взаимозаменяемо с микроорганизмом, экспортирующим IMP, или микроорганизмом, обладающим активностью экспорта IMP.
Микроорганизм, продуцирующий IMP, представляет собой клетку или микроорганизм, который содержит вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP, или полинуклеотид, кодирующий этот вариант белка, или который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий этот вариант белка, и за счет этого способным экспрессировать этот вариант белка. Более конкретно, микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм рода Escherichia, микроорганизм рода Serratia, микроорганизм рода Erwinia, микроорганизм рода Enterobacteria, микроорганизм рода Salmonella, микроорганизм рода Streptomyces, микроорганизм рода Pseudomonas, микроорганизм рода Brevibacterium, микроорганизм рода Corynebacterium и т.п, и, в особенности, микроорганизм рода Corynebacterium.
Используемый в описании настоящего изобретения термин “микроорганизм, продуцирующий IMP, рода Corynebacterium” относится к микроорганизму рода Corynebacterium, который в естественных условиях способен продуцировать IMP, или способен продуцировать IMP за счет модификации. В частности, используемый в настоящем описании микроорганизм рода Corynebacterium, способный продуцировать IMP, относится к нативному штамму микроорганизма рода Corynebacterium, способному продуцировать IMP; или микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему усиленной способностью продуцировать IMP, полученному посредством встраивания гена, ассоциированного с продукцией IMP, или путем усиления или ослабления эндогенного гена, ассоциированного с продукцией IMP. Более конкретно, в настоящем описании микроорганизм рода Corynebacterium, способный продуцировать IMP, относится к микроорганизму рода Corynebacterium, который обладает улучшенной способностью продуцировать IMP за счет включения варианта белка, обладающего активностью экспорта IMP, или полинуклеотида, кодирующего этот вариант белка, или за счет трансформации вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий этот вариант белка. Термин “микроорганизм рода Corynebacterium с усиленной способностью продуцировать IMP” относится к микроорганизму рода Corynebacterium с улучшенной способностью продуцировать IMP по сравнению со способностью его родительского штамма до трансформации или способностью немодифицированного микроорганизма рода Corynebacterium. Термин “немодифицированный микроорганизм рода Corynebacterium” может относиться к нативному типу микроорганизма рода Corynebacterium, микроорганизму рода Corynebacterium, который не содержит вариант белка, способный экспортировать IMP, или микроорганизму рода Corynebacterium, который не трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант белка, способный экспортировать IMP.
В воплощении настоящего изобретения микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, у которого активность аденилосукцинатсинтетазы и/или IMP-дегидрогеназы дополнительно ослаблена.
В частности, микроорганизм в соответствии с описанием настоящего изобретения может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis и т.п., но микроорганизм не ограничивается ими.
В еще одном аспекте описания настоящего изобретения предложен способ получения IMP, включающий культивирование микроорганизма рода Corynebacterium в среде.
В частности, способ в соответствии с описанием настоящего изобретения может дополнительно включать стадию выделения IMP из микроорганизма в соответствии с описанием настоящего изобретения или среды в соответствии с описанием настоящего изобретения.
В вышеприведенном способе культивирование микроорганизма может быть осуществлено в периодическом процессе, непрерывном процессе, периодическом процессе с подпиткой и т.п., которые известны из уровня техники, но способ культивирования конкретно не ограничивается ими. В частности, в отношении условий культивирования pH культуры может быть доведен до подходящего pH (например, pH 5-9, в частности pH 6-8, и, более конкретно, при помощи подходящего основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты), и аэробное состояние культуры может поддерживаться путем введения в культуру кислорода или содержащей кислород газовой смеси. Температура культивирования, как правило, может находиться в диапазоне от 20°C до 45°C, и, в частности, от 25°C до 40°C, в течение, приблизительно от 10 до 160 часов, однако условия культивирования не ограничены ими. IMP, продуцируемый при помощи вышеприведенного культивирования, может быть секретирован в культуру или может сохраняться в клетках.
Кроме того, примеры источников углерода, используемых в культуральной среде, могут включать сахара и углеводы (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу); масла и жиры (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло); жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту); спирты (например, глицерин и этанол) и органические кислоты (например, уксусную кислоту), но не ограничены ими. Эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации, но не ограничены этим. Примеры источников азота, используемых в культуральной среде, могут включать азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной сок, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и т.п.Эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации, но не ограничены этим. Примеры источников фосфора, используемых в культуральной среде, могут включать дигидрофосфат калия, дикалия гидрофосфат, соответствующие натрийсодержащие соли и т.п, но не ограничены ими. Кроме того, в среде могут содержаться соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты, витамины и т.п, которые представляют собой важные вещества, способствующие росту.
В описании настоящего изобретения способ выделения IMP, продуцируемого на стадии культивирования, может быть осуществлен путем сбора IMP из культурального бульона с использованием подходящего метода, известного в области техники. Например, могут быть использованы такие методы, как центрифугирование, фильтрация, анионообменная хроматография, кристаллизация, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и т.п., и требуемый IMP может быть выделен из культуры или культивируемого микроорганизма с использованием подходящего метода, известного в области техники.
Кроме того, стадия выделения может включать способ очистки и может быть осуществлена с использованием подходящего способа, известного в области техники. Таким образом, выделяемый IMP может быть представлен в очищенной форме или в форме ферментативного бульона микроорганизма, содержащего IMP.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для продуцирования IMP, содержащая вариант белка по настоящему изобретению, который обладает активностью экспорта IMP, или полинуклеотид, кодирующий этот вариант белка.
Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать, без ограничения, структуру, способную делать полинуклеотид функциональным. В композиции по настоящему изобретению полинуклеотид может находиться в форме, в которой этот полинуклеотид включен в вектор для экспрессии функционально связанного гена в клетке хозяине, в которую он внедрен.
Кроме того, композиция дополнительно может включать любые подходящие эксципиенты, обычно используемые в композиции для продукции IMP (например, консерванты, увлажнители, суспендирующие агенты, буферы, стабилизирующие агенты или изотонические агенты), однако подходящий эксципиент не ограничен ими.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ увеличения экспорта IMP, включающий усиление активности варианта белка, который обладает активностью экспорта IMP, в микроорганизме рода Corynebacterium.
й
й
й
й
й
й
В еще одном аспекте описания настоящего изобретения предложен способ увеличения экспорта IMP, который включает усиление активности белка, состоящего из SEQ ID NO: 2, в микроорганизме рода Corynebacterium. В частности, усиление активности белка, состоящего из SEQ ID NO: 2, может быть осуществлено путем внедрения, применения или включения варианта белка, способного экспортировать IMP, где вариант белка состоит из аминокислотной последовательности, которая имеет от N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, замену 123аминокислоты на другую аминокислоту, замену 243 аминокислоты на другую аминокислоту, замену 387 аминокислоты на другую аминокислоту, замену 405 аминокислоты на другую аминокислоту; замену 413 аминокислоты на другую аминокислоту, замену 458 аминокислоты на другую аминокислоту, или их комбинации. Термины “белок, способный экспортировать IMP”, “вариант белка, способный экспортировать IMP”, и “микроорганизм рода Corynebacterium” являются такими, как описано выше.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение варианта белка по настоящему изобретению для увеличения экспорта IMP в микроорганизме рода Corynebacterium.
Благоприятные эффекты изобретения
IMP можно продуцировать с высоким выходом путем культивирования микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего IMP, с использованием варианта белка, который способен экспортировать IMP.
Подробное описание воплощения
Настоящее изобретение будет описано подробно далее. В то же время, каждое из описаний и типичных воплощений, раскрытых здесь, может применяться к другим соответствующим описаниям и примерам воплощений. То есть все из комбинаций различных факторов, раскрытых здесь, относятся к объему описания настоящего изобретения. Дополнительно, объем описания настоящего изобретения не должен ограничиваться приведенным ниже конкретным описанием.
Пример 1: Обнаружение белка, экспортирующего IMP
Библиотеку геномной ДНК Corynebacterium stationis ATCC6872 готовили для идентификации мембранных белков Corynebacterium, вовлеченных в экспорт IMP. Затем, поскольку штамм дикого типа Corynebacterium не может продуцировать IMP, или даже если он продуцирует IMP, то продуцирует лишь небольшое его количество, то получали штамм, происходящий из штамма ATCC6872, названный CJI0323, который способен продуцировать IMP, для идентификации способности продуцировать IMP. Полученный штамм CJI0323 подвергали скринингу мембранных белков, вовлеченных в экспорт IMP, с использованием библиотеки геномной ДНК штамма ATCC6872. Конкретная подробная информация об экспериментах является следующей.
Пример 1-1: Отбор продуцирующего IMP штамма CJI0323
Клетки ATCC6872 суспендировали в фосфатном буфере (pH 7,0) или цитратном буфере (pH 5,5) в концентрации от 107 клеток/мл до 108 клеток/мл для получения продуцирующего IMP штамма, являющегося производным ATCC6872, и клетки подвергали УФ (ультрафиолетовой) обработке и выдерживали при комнатной температуре или при 32°C в течение 20-40 минут для того, чтобы вызвать мутацию. Полученные в результате клетки дважды промывали 0,85% физиологическим раствором, и затем разбавляли и высевали на среду, которую готовили путем добавления обеспечивающего резистентность вещества в подходящей концентрации в минимальную среду, содержащую 1,7% агар, и после этого получали колонии. Каждую колонию культивировали в питательной среде и культивировали в среде для посева в течение 24 часов. После культивирования колоний в течение от 3 до 4 суток в ферментационной среде отбирали колонию, обладающую самыми высокими способностями к продукции IMP, накапливаемого в культуральной среде. В процессе приготовления штамма, способного продуцировать IMP в высокой концентрации, для того, чтобы обеспечить ауксотрофию по аденину, гуаниновую утечку, восприимчивость к лизоциму, устойчивость к 3,4-дигидропролину, устойчивость к стрептомицину, устойчивость к азетидинкарбоновой кислоте, устойчивость к тиапролину, устойчивость к азасерину, устойчивость к сульфогуанидину, устойчивость к норвалину и устойчивость к триметоприму, вышеприведенные способы осуществляли последовательно для каждого вещества. Наконец, в результате отобрали CJI0323, который продемонстрировал устойчивость к вышеприведенным веществам и превосходные способности продуцировать IMP. Степень устойчивости сравнивали между ATCC6872 и CJI0323, и результаты представлены в таблице 1 ниже.
[Таблица 1]
Характеристики
ATCC6872
CJI0323
Ауксотрофия по аденину
Отсутствие ауксотрофии
Ауксотрофия
Гуаниновая утечка
Отсутствие ауксотрофии
Допускающая утечку ауксотрофия
Восприимчивость к лизоциму
80 мкг/мл
8 мкг/мл
Устойчивость к 3,4-дигидропролину
1000 мкг/мл
3500 мкг/мл
Устойчивость к стрептомицину
500 мкг/мл
2000 мкг/мл
Устойчивость к азетидинкарбоновой кислоте
5 мг/мл
30 мг/мл
Устойчивость к тиапролину
10 мкг/мл
100 мкг/мл
Устойчивость к азасерину
25 мкг/мл
100 мкг/мл
Устойчивость к сульфогуанидину
50 мкг/мл
200 мкг/мл
Устойчивость к норвалину
0,2 мг/мл
2 мг/мл
Устойчивость к
20 мкг/мл
100 мкг/мл
триметоприму
2
4
2
4
- Минимальная среда: 2% глюкоза, 0,3% сульфат натрия, 0,1% KHSO, 0,3% KHPO, 0,3% сульфат магния, хлорид кальция (10 мг/л), сульфат железа (10 мг/л), сульфат цинка (1 мг/л), хлорид марганца (3,6 мг/л), L-цистеин (20 мг/л), пантотенат кальция (10 мг/л), тиамина хлоргидрат (5 мг/л), биотин (30 мкг/л), аденин (20 мг/л), гуанин (20 мг/л), pH 7,3
- Питательная среда: 1% петон, 1% мясной сок, 0,25% хлорин натрия, 1% дрожжевой экстракт, 2% агар, pH 7,2
- Среда для посева: 1% глюкоза, 1% пептон, 1% мясной сок, 1% дрожжевой экстракт, 0,25% хлорид натрия, аденин (100 мг/л), гуанин (100 мг/л), pH 7,5
- Ферментационная среда: 0,1% глутамат натрия, 1% хлорид аммония, 1,2% сульфат магния, 0,01% хлорид кальция, сульфат железа (20 мг/л), сульфат марганца (20 мг/л), сульфат цинка (20 мг/л), сульфат меди (5 мг/л), L-цистеин (23 мг/л), аланин (24 мг/л), никотиновая кислота (8 мг/л), биотин (45 мкг/л), тиамина хлоргидрат (5 мг/л), аденин (30 мг/л), 1,9% фосфорная кислота (85%), 2,55% глюкоза, 1,45% фруктоза.
Пример 1-2: Эксперименты по титру ферментации CJI0323
Среду для посева (2 мл) разливали в тестируемые пробирки (диаметр: 18 мм), которые затем автоклавировали и каждую из которых инокулировали ATCC6872 и CJI0323. Затем полученные в результате культуры культивировали при встряхивании при 30°C в течение 24 часов и затем использовали в качестве раствора посевной культуры. Ферментационную среду (29 мл) разливали в колбы Эрленмейера (250 мл) для встряхивания, автоклавировали при 121°C в течение 15 минут, и раствор посевной культуры (2 мл) инокулировали в нее и культивировали в течение 3 суток. Условия культивирования устанавливались следующими: 170 об./мин, 30°C и pH 7,5.
После завершения культивирования количество продуцируемого IMP измеряли при помощи HPLC (SHIMAZDU LC20A), и результаты культивирования представлены в таблице 2 ниже.
[Таблица 2]
Штамм
IMP (г/л)
ATCC6872
0
CJI0323
9,52
Штамм CJI0323 был назван Corynebacterium stationis CN01-0323. Этот штамм был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Korean Culture Center of Microorganisms (Корейском центре культур микроорганизмов) (KCCM) 7 ноября 2017 года. Кроме того, этому штамму был присвоен номер доступа KCCM12151P.
Пример 1-3: Обнаружение белков экспорта
Условия скрининга, демонстрирующие ингибирование роста штамма CJI0323, определяли путем дополнительного добавления IMP в минимальную среду, содержащую 1,7% агар. Плазмиды геномной библиотеки штамма ATCC6872 трансформировали в штамм CJI0323 путем электропорации (van der Rest et al. 1999), и отбирали те колонии, в которых ингибирование роста запускалось в условиях среды, дополненной избыточным количеством IMP. Из отобранных колоний получали плазмиды, и их анализировали при помощи метода секвенирования. В результате идентифицировали один тип мембранного белка, вовлеченного в запуск ингибирования роста в условиях, при которых добавляли избыточное количество IMP.
Этот один тип мембранного белка Corynebacterium идентифицировали на основании аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS транспортер). Этот мембранный белок известен как MFS транспортер, но его специфическая функция не была подтверждена, и кроме того, его функция в отношении экспорта IMP все еще неизвестна. В настоящем описании этот мембранный белок назван ImpE2(WT).
Пример 2: Идентификация ImpE1 и ImpE2
Пример 2-1: Подтверждение impE1 и impE2
Для исследования функций мембранного белка ImpE2 структуру гена с SEQ ID NO: 4 подтверждали в NCBI (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS транспортер). В результате было подтверждено, что исходный фрагмент длиной 7 п. о. (пар оснований) в ORF (открытая рамка считывания) в SEQ ID NO: 4 (impE2) перекрывается на 7 нуклеотидных оснований с другим геном (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795119, регулятор транскрипции), который расположен выше относительно impE2. Поскольку функция гена, расположенного выше относительно impE2, и белка, кодируемого этим геном, еще не подтверждена, в настоящем описании, этот белок был назван ImpE1(WT) (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3).
Пример 2-2: Получение вектора, дефектного по impE1 или impE2
Для подтверждения того, может ли делеция ImpE1 или ImpE2, которые вовлечены в запуск ингибирования роста, которое вызвано IMP, как установлено в примерах 1 и 2-1, в продуцирующем IMP штамме уменьшить его способность экспортировать IMP, были предприняты попытки получить векторы, дефектные по каждому из этих генов.
Генные фрагменты для получения векторов получали при помощи ПЦР с использованием геномной ДНК штамма ATCC6872 в качестве матрицы.
Более конкретно, ПЦР для impE1 осуществляли с использованием праймеров с SEQ ID NO: 5 и 6 и праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8; и ПЦР для impE2 осуществляли с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и 10 и праймеров с SEQ ID NO: 11 и 12 (таблица 3).
[Таблица 3]
SEQ ID NO
Праймер
Последовательность (от 5' до 3')
5
impE1 kop-1
GCTCTAGACGAGAAAGCTAAAGCCGGTGA
6
impE1 kop-2
GTTTTTAGCTACCATTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
7
impE1 kop-3
GCACGGGGTGTAACAATGGTAGCTAAAAACTCCACC
8
impE1 kop-4
GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACTC
9
impE2 kop-1
GCTCTAGACTTGGATGACCTGGTGGAAAA
10
impE2 kop-2
CTTGGAGAAAATTTCCTACCATTCCAGTCCTTTCGT
11
impE2 kop-3
GGACTGGAATGGTAGGAAATTTTCTCCAAGGGAAAT
12
impE2 kop-4
GGACTAGTGGATTGTGTTGACGCACGATG
65
impE1E2 kop-2
CTTGGAGAAAATTTCTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
66
impE1E2 kop-3
GCACGGGGTGTAACAGAAATTTTCTCCAAGGGAAAT
В частности, используемые праймеры получали на основе информации о гене Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279), зарегистрированном в NIH GenBank, и соседних с ним нуклеотидных последовательностях.
ПЦР осуществляли посредством исходной денатурации при 94°C в течение 5 минут; 25 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 52°C в течение 30 минут и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты; и окончательной полимеризации при 72°C в течение 5 минут.
ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием двух фрагментов гена impE1, которые амплифицировали с использованием праймеров с SEQ ID NO: 5 и 6 и праймеров с SEQ ID NO: 7 и 8, в качестве матриц, и в результате получали полинуклеотидную матрицу (1,8 т.п.о. (тысяч пар оснований)). Полученный генный фрагмент клонировали в линеаризованный вектор pDZ (Корейский патент №10-0924065 и Международная заявка на патент №2008-033001), который расщепляли ферментом рестрикции (XbaI) и лигировали с использованием лигазы T4, и, таким образом, получали вектор pDZ-ΔimpE1. Кроме того, полимерaзную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена impE2, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 9 и 10, и двух фрагментов гена impE2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 11 и 12, в качестве матриц, и в результате получали полинуклеотидную матрицу (1,7 т.п.о.). Полученный генный фрагмент расщепляли ферментами рестрикции XbaI и SpeI. Генный фрагмент клонировали с использованием лигазы T4 в линеаризованный вектор pDZ, который уже был расщеплен ферментом рестрикции (XbaI), и, таким образом получали вектор pDZ-ΔimpE2.
Пример 2-3: Получение векторов, дефектных по интегрированию impE1 и impE2
Поскольку гены impE1 и impE2, которые кодируют белки, вовлеченные в запуск ингибирования роста, которое вызвано IMP, перекрываются, существует потребность в одновременной регуляции обоих генов. Поэтому были осуществлены попытки получить вектор, дефектный как по impE1, так и по impE2.
Для ПЦР генов impE1 и impE2 использовали праймеры с SEQ ID NO: 5 и 65 и праймеры с SEQ ID NO: 66 и 12. Используемые праймеры получали на основе информации о гене Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279), зарегистрированной в NIH GenBank, и соседних с ним нуклеотидных последовательностях. ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена impE1, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 5 и 65, и двух фрагментов гена impE2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 66 и 12, в качестве матриц, и в результате получали полинуклеотидную матрицу (2,0 т.п.о.). Полученные генные фрагменты расщепляли XbaI и SpeI, соответственно. Генные фрагменты клонировали с использованием лигазы T4 в линеаризованный вектор pDZ, который уже был расщеплен ферментом рестрикции (XbaI), и, таким образом получали вектор pDZ-ΔimpE1E2.
Пример 2-4: Получение штаммов, дефектных по impE1 и impE2
Каждый из двух видов плазмид, полученных в примере 2-2, и один вид плазмиды, полученный в примере 2-3, трансформировали в штамм CJI0323 путем электропорации (с использованием метода трансформации, раскрытого в Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541-545). Штаммы, в которых вектор встраивался в хромосому посредством рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Генетический дефект в окончательно трансформированных штаммах подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 5 и 8, SEQ ID NO: 9 и 12 и SEQ ID NO: 5 и 12.
Отобранные штаммы были названы CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 и CJI0323_ΔimpE1E2. Кроме того, оценивали способности этих штаммов продуцировать IMP.
Среду для посева (2 мл) разливали в пробирки для тестирования (диаметр: 18 мм), которые затем автоклавировали, каждую из которых инокулировали CJI0323, CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 и CJI0323_ΔimpE1E2, культивировали при перемешивании при 30°C в течение 24 часов и использовали в качестве растворов посевных культур. Ферментационную среду (29 мл) разливали в колбы Эрленмейера (250 мл) для встряхивания и автоклавировали при 121°C в течение 15 минут.Затем раствор посевной культуры (2 мл) инокулировали в нее, и полученную в результате культуру культивировали в течение 3 суток. Условия культивирования устанавливались следующими: 170 об/мин, 30°C и pH 7,5.
После завершения культивирования количество продуцируемого IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты для культуры представлены в таблице 4 ниже.
[Таблица 4]
Штамм
IMP (г/л)
CJI0323
9,52
CJI0323_ΔimpE1
1,92
CJI0323_ΔimpE2
1,88
CJI0323_ΔimpE1E2
1,80
Количество IMP, накопленное в каждом штамме, сравнивали с количеством IMP для родительского штамма Corynebacterium stationis CJI0323. В результате обнаружено, что, как показано выше в таблице 4 выше, концентрации IMP в штаммах CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 и CJI0323_ΔimpE1E2 были снижены по сравнению с родительским штаммом на приблизительно 8 г/л в тех же самых условиях, что подтверждает то, что ImpE1 и ImpE2 представляют собой белки, вовлеченные в экспорт IMP.
Пример 3: Подтверждение нуклеотидных последовательностей impE1 и impE2 в продуцирующем IMP штамме CJI0323
В случае штамма CJI0323, продуцирующего IMP в высокой концентрации в примере 1, возможно, что этот штамм обладает улучшенной способностью экспортировать IMP, таким образом, чтобы продуцировать IMP в высокой концентрации. Соответственно, была предпринята попытка подтвердить присутствие какой-либо мутации в impE1 и impE2 в штамме CJI0323.
Хромосомную ДНК штамма CJI0323 амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции (далее “ПЦР”). Более конкретно, сначала ПЦР осуществляли путем повторения 28 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 1 минуты, отжига при 58°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 2 минут с использованием хромосомной ДНК штамма CJI0323 в качестве матрицы вместе с праймерами с SEQ ID NO: 13 и 14 (таблица 5), и таким образом амплифицировали фрагмент из приблизительно 2,8 т.п.о.
[Таблица 5]
SEQ ID NO
Праймер
Последовательность (от 5' до 3')
13
impE1E2 seqF
GAACGGAGTCATCTCCTTTGC
14
impE1E2 seqR
CCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
й
я
При анализе нуклеотидной последовательности с использованием тех же самых праймеров подтвердили, что 490 нуклеотид гена impE1 gene (т.е. g) заменен на “a” по сравнению с нуклеотидной последовательностью штамма дикого типа ATCC6872. Эта замена свидетельствует о существовании модификации, при которой 164 аминокислота в белке ImpE1 (т.е. глутаминовая кислота) заменена на лизин.
й
й
й
я
й
я
Кроме того, подтвердили, что 4 нуклеотид в гене impE2 (т.е. g) заменен на “a” (это означает, что 666 нуклеотид в гене impE1 (т.е. g) заменен на “a”) и 191 нуклеотид в гене impE1 (т.е. g) заменен на “a”. Эти замены свидетельствуют о мутациях, при которых 2 аминокислота белка ImpE2 (т.е. валин), которая соответствует 222 аминокислоте белка ImpE1, заменена на изолейцин; и 64 аминокислота белка ImpE2 (т.е. глицин) заменена на глутаминовую кислоту.
Нуклеотид impE1 штамма CJI0323 назван impE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 87), и соответствующий ему белок назван ImpE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 85), тогда как нуклеотид impE2 штамма CJI0323 назван impE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 88), и соответствующий ему белок назван ImpE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 86).
Пример 4: Восстановление мутаций в impE1 и impE2
Пример 4-1: Получение векторов для восстановления мутаций в impE1 или impE2
В примере 3 исследовали наличие какой-либо модификации в impE1 и impE2 в продуцирующем IMP штамме CJI0323. В результате подтвердили, что impE1 имеет одну мутацию и impE2 имеет две мутации. Поскольку штамм CJI0323 продуцирует IMP в высокой концентрации, весьма вероятно, что эта модификация представляет собой такую модификацию, которая может улучшать способность экспортировать IMP. Соответственно, после восстановления мутантных impE1 и impE2 до нативного дикого типа ImpE без мутации осуществили следующие эксперименты для подтверждения того, действительно ли открытые варианты белка обладают улучшенной способностью экспортировать IMP.
Для получения восстанавливающего вектора осуществляли ПЦР с использованием Corynebacterium stationis ATCC6872 в качестве матрицы.
Фрагмент гена impE1impE2, амплифицированного с использованием праймеров в соответствии с SEQ ID NOS: 89 и 90, обрабатывали ферментом рестрикции XbaI и клонировали в сайт рестрикции XbaI на векторе pDZ, и, таким образом получали pDZ- impE1E2(WT).
Пример 4-2: Получение векторов с единичной мутацией в impE1 или impE2
Плазмиду, полученную в примере 4-1, трансформировали в штамм CJI0323 путем электропорации (с использованием способ трансформации, раскрытого в Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541-545). Штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Восстановление мутации в окончательно трансформированных штаммах подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 89 и 90 с последующим анализом путем секвенирования нуклеотидов. Полученный штамм был назван CJI0323_impE1E2(WT).
Пример 5: Обнаружение мутаций в impE2
Среди трех видов мутаций, раскрытых в результатах в примере 3, отбирали мутацию, имеющую самую высокую способность экспортировать IMP, и осуществили следующий эксперимент для обнаружения мутаций, имеющих более высокую способность экспортировать IMP.
Пример 5-1: Отбор мутаций, имеющих самую высокую способность экспортировать IMP, среди мутаций impE1E2
Вектор с единичной мутацией E164K в генe ImpE1 получали с использованием нативного штамма дикого типа Corynebacterium stationis ATCC6872 в качестве матрицы вместе с праймерами с SEQ ID NO: 91 и 92 и праймерами с SEQ ID NO: 93 и 94. ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена E164K-1, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 91 и 92 и двух фрагментов гена E164K-2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 93 и 94, и, таким образом, получали матрицу с полинуклеотидом 1,8 т.п.о. Полученные фрагменты генов расщепляли при помощи XbaI и клонировали в линеаризованный вектор pDZ, который уже был расщеплен при помощи XbaI, с использованием лигазы T4, и таким образом получали вектор pDZ-impE1(E164K).
Вектор с единичной мутацией V2I в гене ImpE2 получали с использованием штамма ATCC6872 в качестве матрицы вместе с праймерами с SEQ ID NO: 91 и 95 и праймерами с SEQ ID NO: 96 и 94. ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена V2I-1, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 91 и 95, и двух фрагментов гена V2I-2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 96 и 94, и таким образом получали матрицу с полинуклеотидом 1,8 т.п.о. Полученные фрагменты генов расщепляли при помощи XbaI и клонировали в линеаризованный вектор pDZ, который уже был расщеплен при помощи XbaI, с использованием лигазы T4, и таким образом получали вектор pDZ-impE2(V2I).
Вектор с единичной мутацией G64E в гене ImpE2 получали с использованием штамма ATCC6872 в качестве матрицы вместе с праймерами с SEQ ID NO: 91 и 97 и праймерами с SEQ ID NO: 98 и 94. ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена G64E-1, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 91 и 97, и двух фрагментов гена G64E-2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 98 и 94, и таким образом получали матрицу с полинуклеотидом 1,8 т.п.о. Полученные фрагменты генов расщепляли при помощи XbaI и клонировали в линеаризованный вектор pDZ, который уже был расщеплен при помощи XbaI, с использованием лигазы T4, и таким образом получали вектор pDZ-impE2(G64E).
[Таблица 6]
SEQ ID NO
Праймер
Последовательность (от 5' до 3')
89
impE1E2 WT F
GCTCTAGAGAACGGAGTCATCTCCTTTGC
90
impE1E2 WT R
GCTCTAGACCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
91
impE1 164K-1
GCTCTAGACTTGGATGACCTGGTGGAAAA
92
impE1 164K-2
CTGGGGCGCGTTGTTTTTCAGGATGCTCCCGAAGACG
93
impE1 164K-3
AACAACGCGCCCCAGAATTGG
94
impE1 164K-4
GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACTC
95
impE2 V2I-2
TGGAGTTTTTAGCTATCATTCCAGTCCTTTCGTGTAA
96
impE2 V2I-3
TAGCTAAAAACTCCACCCCAA
97
impE2 G64E-2
CCGAAAATCATCTGCTCCAAAGAGCTCATCAGCATGG
98
impE2 G64E-3
GCAGATGATTTTCGGTTCCGC
Три вида плазмид, полученных в примере 4-2, трансформировали в штамм CJI0323_impE1E2(WT) путем электропорации (с использованием способа трансформации, раскрытого в Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541-545). Штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Внедрение мутации в окончательно трансформированные штаммы подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 13 и 14 с последующим анализом путем секвенирования нуклеотидов. Отобранные штаммы были названы CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I) и CJI0323_impE2(G64E).
Штаммы CJI0323_impE1(E164K), Corynebacterium stationis CJI0323_impE2(V2I) и Corynebacterium stationis CJI0323_impE2(G64E) были депонированы в соответствии с Будапештским договором в международном депозитарном органе Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) 2 ноября 2018 года, и им были присвоены номера KCCM12359P, KCCM12360P и KCCM12361P, соответственно.
Среду для посева (2 мл) разливали в тестируемые пробирки (диаметр: 18 мм), которые затем автоклавировали, каждую из которых инокулировали CJI0323_impE1E2(WT), CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I), и CJI0323_impE2(G64E), культивировали при встряхивании при 30°C в течение 24 часов и использовали в качестве растворов посевных культур. Ферментационную среду (29 мл) разливали в колбы Эрленмейера (250 мл) для встряхивания и автоклавировали при 121°C в течение 15 минут. Затем ее инокулировали растворами посевных культур (2 мл) и полученные в результате культуры культивировали в течение 3 суток. Условия культивирования устанавливались следующими: 170 об./мин, 30°C и pH 7,5.
После завершения культивирования количество продуцируемого IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты для культуры представлены в таблице 7 ниже.
[Таблица 7]
Штамм
IMP (г/л)
CJI0323
9,52
CJI0323_impE1E2(WT)
2,32
CJI0323_impE1(E164K)
2,57
CJI0323_impE2(V2I)
3,11
CJI0323_impE2(G64E)
3,27
В соответствии с представленным выше подтверждено, что каждый из трех видов мутаций, вовлечен в экспорт IMP, и что штамм CJI0323_impE2(G64E) демонстрирует наибольшую количественную продукцию IMP среди указанных трех видов мутаций.
Пример 5-2: Получение векторов для замещающей вставки аминокислот в место мутации impE2
й
Для подтверждения позиционной важности мутации impE2(G64E) среди репрезентативных трех видов мутаций с усиленной способностью продуцировать IMP, как идентифицировано в вышеприведенных результатах, получали вектор для внедрения мутации путем замещения 64 аминокислоты в аминокислотной последовательности impE2 на другую аминокислоту.
Процедура получения вектора для внедрения мутации ImpE2(G64E) является следующим.
На основе приведенных полинуклеотидных последовательностей выделяли хромосомные гены Corynebacterium stationis CJI0323, и фрагменты генов получали путем осуществления ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium stationis CJI0323 в качестве матрицы вместе с парами праймеров между праймером с SEQ ID NO: 15 и каждым из праймеров с SEQ ID NO: 16-33. ПЦР осуществляли путем исходной денатурации при 94°C в течение 5 минут; 20 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты; и окончательной полимеризации при 72°C в течение 5 минут. В результате получали 18 видов полинуклеотидов 1 т.п.о.
Затем выделяли хромосомные гены Corynebacterium stationis CJI0323, и фрагменты генов получали путем осуществления ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium stationis CJI0323 в качестве матрицы вместе с парами праймеров между праймером с SEQ ID NO: 34 и каждым из праймеров с SEQ ID NO: 32-52. ПЦР осуществляли путем исходной денатурации при 94°C в течение 5 минут; 20 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты; и окончательной полимеризации при 72°C в течение 5 минут. В результате получали 18 видов полинуклеотидов 1 т.п.о.
ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием двух фрагментов, полученных в соответствии с вышеприведенными результатами, в качестве матрицы, и таким образом получали 18 видов полинуклеотидов 2 т.п.н, используемых в качестве матриц. Полученные фрагменты генов расщепляли при помощи фермента рестрикции XbaI, лигировали с линеаризованным вектором pDZ, который уже был расщеплен ферментом рестрикции XbaI, трансформировали в E.coli DH5α, и трансформанты высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л).
Информация о последовательности праймеров, используемых для получения вектора, представлена в таблице 8 ниже.
[Таблица 8]
SEQ ID NO
Праймер
Последовательность (от 5' до 3')
15
XbaI-impE2 64 1F
GGGTCTAGAAAAGAGCTTAAGGCAGCTGCT
16
impE2 64-R 1R
GAAAATCATCTGGCGCAAAGAGCTCAT
17
impE2 64-H 1R
GAAAATCATCTGGTGCAAAGAGCTCAT
18
impE2 64-D 1R
GAAAATCATCTGGTCCAAAGAGCTCAT
19
impE2 64-K 1R
GAAAATCATCTGCTTCAAAGAGCTCAT
20
impE2 64-S 1R
GAAAATCATCTGGGACAAAGAGCTCAT
21
impE2 64-T 1R
GAAAATCATCTGGGTCAAAGAGCTCAT
22
impE2 64-N 1R
GAAAATCATCTGGTTCAAAGAGCTCAT
23
impE2 64-Q 1R
GAAAATCATCTGCTGCAAAGAGCTCAT
24
impE2 64-C 1R
GAAAATCATCTGGCACAAAGAGCTCAT
25
impE2 64-P 1R
GAAAATCATCTGTGGCAAAGAGCTCAT
26
impE2 64-A 1R
GAAAATCATCTGAGCCAAAGAGCTCAT
27
impE2 64-V 1R
GAAAATCATCTGGACCAAAGAGCTCAT
28
impE2 64-I 1R
GAAAATCATCTGGATCAAAGAGCTCAT
29
impE2 64-L 1R
GAAAATCATCTGCAGCAAAGAGCTCAT
30
impE2 64-M 1R
GAAAATCATCTGCATCAAAGAGCTCAT
31
impE2 64-F 1R
GAAAATCATCTGGAACAAAGAGCTCAT
32
impE2 64-Y 1R
GAAAATCATCTGGTACAAAGAGCTCAT
33
impE2 64-W 1R
GAAAATCATCTGCCACAAAGAGCTCAT
34
XbaI-impE2 64 2R
GGGTCTAGACGGTCAATGAAGTCTCAACGG
35
impE2 64-R 2F
ATGAGCTCTTTGCGCCAGATGATTTTC
36
impE2 64-H 2F
ATGAGCTCTTTGCACCAGATGATTTTC
37
impE2 64-D 2F
ATGAGCTCTTTGGACCAGATGATTTTC
38
impE2 64-K 2F
ATGAGCTCTTTGAAGCAGATGATTTTC
39
impE2 64-S 2F
ATGAGCTCTTTGTCCCAGATGATTTTC
40
impE2 64-T 2F
ATGAGCTCTTTGACCCAGATGATTTTC
41
impE2 64-N 2F
ATGAGCTCTTTGAACCAGATGATTTTC
42
impE2 64-Q 2F
ATGAGCTCTTTGCAGCAGATGATTTTC
43
impE2 64-C 2F
ATGAGCTCTTTGTGCCAGATGATTTTC
44
impE2 64-P 2F
ATGAGCTCTTTGCCACAGATGATTTTC
45
impE2 64-A 2F
ATGAGCTCTTTGGCTCAGATGATTTTC
46
impE2 64-V 2F
ATGAGCTCTTTGGTCCAGATGATTTTC
47
impE2 64-I 2F
ATGAGCTCTTTGATCCAGATGATTTTC
48
impE2 64-L 2F
ATGAGCTCTTTGCTGCAGATGATTTTC
49
impE2 64-M 2F
ATGAGCTCTTTGATGCAGATGATTTTC
50
impE2 64-F 2F
ATGAGCTCTTTGTTCCAGATGATTTTC
51
impE2 64-Y 2F
ATGAGCTCTTTGTACCAGATGATTTTC
52
impE2 64-W 2F
ATGAGCTCTTTGTGGCAGATGATTTTC
После отбора колоний, трансформированных вектором, в который встроен требуемый ген, получали плазмиды с использованием традиционно известного способа плазмидной экстракции. Информация о полученных плазмидах представлена в таблице 9 ниже.
[Таблица 9]
No.
Плазмида
1
pDZ-impE2 64R
2
pDZ-impE2 64H
3
pDZ-impE2 64D
4
pDZ-impE2 64K
5
pDZ-impE2 64S
6
pDZ-impE2 64T
7
pDZ-impE2 64N
8
pDZ-impE2 64Q
9
pDZ-impE2 64C
10
pDZ-impE2 64P
11
pDZ-impE2 64A
12
pDZ-impE2 64V
13
pDZ-impE2 64I
14
pDZ-impE2 64L
15
pDZ-impE2 64M
16
pDZ-impE2 64F
17
pDZ-impE2 64Y
18
pDZ-impE2 64W
Пример 5-3: Получение штаммов, в которых аминокислота в позиции 64 варианта (ImpE2) заменена на другую аминокислоту, и сравнение способности продуцировать IMP
18 видов плазмид, полученных в примере 3-1, трансформировали в штамм CJI0323. Штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Внедрение мутации в окончательно трансформированные штаммы подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 13 и 14 с последующим анализом путем секвенирования нуклеотидов. Наименования штаммов в соответствии с внедренными мутациями представлены в таблице 10 ниже.
[Таблица 10]
No.
Штамм
1
CJI0323::impE2(G64R)
2
CJI0323::impE2(G64H)
3
CJI0323:impE2(G64D)
4
CJI0323::impE2(G64K)
5
CJI0323::impE2(G64S)
6
CJI0323::impE2(G64T)
7
CJI0323::impE2(G64N)
8
CJI0323::impE2(G64Q)
9
CJI0323::impE2(G64C)
10
CJI0323::impE2(G64P)
11
CJI0323::impE2(G64A)
12
CJI0323::impE2(G64V)
13
CJI0323::impE2(G64I)
14
CJI0323:impE2(G64L)
15
CJI0323::impE2(G64M)
16
CJI0323::impE2(G64F)
17
CJI0323:impE2(G64Y)
18
CJI0323::impE2(G64W)
Штаммы культивировали тем же самым образом, как в примере 2, и анализировали концентрацию IMP, продуцируемую ими (таблица 11).
[Таблица 11]
Концентрация IMP, продуцируемого мутацией impE2 (г/л)
Штамм
Средняя концентрация IMP
CJI0323_impE1E2(WT)
2,32
CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)
4,24
CJI0323::impE2(G64R)
4,42
CJI0323::impE2(G64H)
5,14
CJI0323::impE2(G64D)
11,53
CJI0323::impE2(G64K)
8
CJI0323::impE2(G64S)
5,7
CJI0323::impE2(G64T)
5,52
CJI0323::impE2(G64N)
5,9
CJI0323::impE2(G64Q)
4,8
CJI0323::impE2(G64C)
5,9
CJI0323::impE2(G64P)
4,75
CJI0323::impE2(G64A)
4,58
CJI0323::impE2(G64V)
4,56
CJI0323::impE2(G64I)
5,89
CJI0323::impE2(G64L)
5,6
CJI0323::impE2(G64M)
4,3
CJI0323::impE2(G64F)
5,89
CJI0323::impE2(G64Y)
4,6
CJI0323::impE2(G64W)
4,76
й
я
й
я
В соответствии с представленным выше все модифицированные штаммы демонстрировали увеличение способности продуцировать IMP по сравнению со штаммом CJI0323_impE1E2(WT), и таким образом вновь подтверждено, что мутация 64 аминокислоты в impE2 представляет собой важный сайт, который обладает существенным действием на увеличение способности белка ImpE экспортировать IMP. В частности, в том случае, когда 64 аминокислота (т.е. глицин) заменена на отличную от нее аминокислоту (т.е. аспартат), тогда способность экспортировать IMP увеличивается на 172% по сравнению с штаммом CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I), у которого отсутствует мутация по 64 аминокислоте. Кроме того, было подтверждено, что в случае, когда 64 аминокислота (т.е. глицин) заменена на отличную от нее аминокислоту (т.е. аспартат), тогда способность продуцировать IMP улучшалась на 397% по сравнению с штаммом CJI0323_impE1E2(WT), который представлял собой штамм, восстановленный до штамма дикого типа, и на 20% по сравнению с штаммом CJI0323.
Пример 6: Библиотека мутации impE, полученная с использованием искусственного мутагенеза
Для получения варианта белка, обладающего улучшенной способностью экспортировать IMP, библиотеку векторов для первого кроссинговерного внедрения в хромосому готовили при помощи следующего способа.
В этой связи осуществили попытку провести ПЦР пониженной точности, допускающую ошибки, в отношении impE2 в штамме CJI0323::impE2(G64D), который, как было подтверждено, обладает наибольшей способностью экспортировать IMP в соответствии с результатами примера 5-3. Для внедрения мутации в аминокислотную последовательность в штамме CJI0323::G64D в позиции ниже относительно 64й аминокислоты в ней получали варианты гена impE (1,6 т.п.о.), в которых нуклеотидные замены внедряли случайным образом, начиная с 193 го нуклеотида в impE2 до приблизительно 130 п. о. ниже его. ПЦР пониженной точности, допускающую ошибки, осуществляли с использованием набора Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech), и фрагменты гена получали при помощи ПЦР с использованием геномной ДНК штамма CJI0323::impE2(G64D) в качестве матрицы вместе с парой праймеров с SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 (таблица 12).
[Таблица 12]
SEQ ID NO
Праймер
Последовательность (от 5' до 3')
53
impE lib F
CAGATGATTTTCGGTTCCGCTC
54
impE lib R
GACCGAGACAAAAACGCCAAACG
Мутации внедряли в амплифицированные фрагменты гена в количестве от 0 до 3,5 мутаций на 1 т.п.о. каждого фрагмента гена. ПЦР осуществляли путем исходной денатурации при 94°C в течение 5 минут; 30 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 60°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты и 36 секунд; и окончательной полимеризации при 72°C в течение 5 минут. В результате получали полинуклеотид 1,6 т.п.о.
Амплифицированный фрагмент гена лигировали в вектор pCR2.1-TOPO с использованием набора для клонирования pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), трансформированный в E.coli DH5α, и трансформанты помещали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Отбирали двадцать видов трансформированных колоний и из них получали плазмиды. После анализа полинуклеотидных последовательностей этих плазмид подтвердили, что мутации были внедрены в различные позиции с частотой 3,5 мутации/т.п.о. Отобрали приблизительно 20000 трансформированных колоний E.coli, и из них экстрагировали плазмиды. Полученная в результате библиотека была названа библиотека pTOPO_impE.
Пример 7: Отбор штаммов, в которые внедрены векторы библиотек и impE
Векторы библиотеки pTOPO_impE, полученные в примере 6, трансформировали путем электропорации в штамм CJI0323::impE2(G64D), способный продуцировать IMP в высокой концентрации, и трансформанты помещали на питательную среду, содеращую канамицин (25 мг/л). В результате получали 10000 колоний штаммов, в которые были внедрены модифицированные гены, и эти колонии были названы CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)1 - CJI0323::impE2(G64D)/pTOPO_impE(mt)10000.
- Питательная среда: 1% пептон, 1% мясной сок, 0,25% хлорид натрия, 1% дрожжевой экстракт, 2% агар, pH 7,2
- Среда для посева: 1% глюкоза, 1% пептон, 1% мясной сок, 1% дрожжевой экстракт, 0,25% хлорид натрия, аденин (100 мг/л), гуанин (100 мг/л), pH 7,5
- Ферментационная среда: 0,1% глутамат натрия, 1% хлорид аммония, 1,2% сульфат магния, 0,01% хлорид кальция, сульфат железа (20 мг/л), сульфат марганца (20 мг/л), сульфат цинка (20 мг/л), сульфат меди (5 мг/л), L-цистеин (23 мг/л), аланин (24 мг/л), никотиновая кислота (8 мг/л), биотин (45 мкг/л), тиамина хлоргидрат (5 мг/л), аденин (30 мг/л), 1,9% ортофосфорная кислота (85%), 2,55% глюкоза, 1,45% фруктоза.
Каждую из полученных 10000 колоний инокулировали в автоклавированную среду для посева (200 мкл), культивировали при встряхивании в 96-луночном планшете с глубокими лунками в микропланшетном шейкере (TAITEC) при 1200 об./мин при 30°C в течение 24 часов, и использовали в качестве раствора посевной культуры. Автоклавированную ферментационную среду (290 мкл) разливали в 96-луночный планшет с глубокими лунками и в них инокулировали раствор посевной культуры (200 мкл), и полученную в результате культуру культивировали при встряхивании в течение 72 часов в тех же самых условиях, как описано выше.
Для анализа количества IMP, продуцируемого в культуральном растворе, после завершения культивирования супернатант культурального раствора (3 мкл) переносили в 96-луночный УФ-планшет, в каждую лунку которого была дозирована дистиллированная вода (197 мкл). Затем полученную в результате культуру встряхивали при 25°C в течение 30 секунд с использованием микропланшетного шейкера (TAITEC), и поглощение при 270 нм измеряли с использованием спектрофотометра. При сравнении вышеприведенного поглощения с поглощением для штамма CJI0323::impE2(G64D) отобрали 50 колоний штаммов, демонстрирующих увеличение поглощения на 10% или выше. Другие колонии демонстрировали похожее или уменьшенное поглощение по сравнению с поглощением контроля.
Количество IMP, продуцированного в отобранных 50 штаммах, повторно подтверждали путем измерения их поглощения с использованием того же самого способа, и в результате отобрали четыре штамма, обладающие улучшенной способностью продуцировать IMP, по сравнению со способностью штамма CJI0323::impE2(G64D).
Пример 8: Подтверждение способности продуцировать IMP штаммами, отобранными из библиотеки мутации impE2
Для сравнения способности продуцировать IMP четырьмя штаммами, отобранными в примере 7, эти четыре штамма культивировали при помощи следующего способа, и анализировали компоненты получающихся в результате культуральных растворов.
Среду для посева (5 мл), которая была такой же, как в примере 2, разливали в автоклавированные тестируемые пробирки (диаметр: 18 мм) и культивировали при встряхивании при 30°C в течение 24 часов и использовали в качестве растворов посевных культур. Ферментационную среду (29 мл), которая была такой же, как в примере 2, разливали в колбы Эрленмейера (250 мл) для встряхивания, автоклавировали при 121°C в течение 15 минут. Затем растворы посевных культур (2 мл) инокулировали в нее, и получающиеся культуры культивировали в течение 4-5 суток. Условия культивирования устанавливались следующими: 170 об./мин, 30°C и pH 7,5. После завершения культивирования количество продуцированного IMP измеряли при помощи HPLC.
Среди этих пятидесяти штаммов отбирали четыре штамма, обладающие наибольшей способностью продуцировать IMP, и повторно осуществляли культивирование и анализ. Проанализированные концентрации IMP представлены в таблице 13 ниже.
[Таблица 13]
Концентрации IMP, продуцированного отобранными штаммами CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt) (г/л)
Штамм
Средняя концентрация IMP
CJI0323::impE2(G64D)
11,53
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-627
13,47
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-3605
12,96
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-6765
13,17
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-9997
12,70
В результате анализа концентрации IMP подтвердили, что концентрации IMP в четырех отобранных штаммах демонстрировали максимальное увеличение на 17% по сравнению с увеличением для контрольного штамма CJI0323::impE2(G64D).
Пример 9: Подтверждение мутации в ген е impE2 в отобранных штаммах с мутацией impE2
Для подтверждения мутаций, внедренных в ген impE2 четырех штаммов, отобранных в примере 8, анализировали полинуклеотидные последовательности мутаций impE2. Для определения этих полинуклеотидных последовательностей ПЦР осуществляли с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
Анализ осуществляли для каждой из полинуклеотидных последовательностей полученных выше модифицированных фрагментов гена impE2. Эти полинуклеотидные последовательности сравнивали с SEQ ID NO: 4 в impE2 (WT) или SEQ ID NO: 100 в impE2 (CJHB101::G64D), и в результате подтверждали аминокислотные последовательности модифицированного impE2. Информация о мутациях аминокислотных последовательностей в impE2 в отобранных штаммах представлена в таблице 14 ниже.
[Таблица 14]
Мутации аминокислот в impE2 в отобранных четырех штаммах
Штамм
Мутации аминокислот в impE2
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-627
impE2 (S387T, M413T, N458K)
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-3605
impE2 (F123C)
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-6765
impE2 (I243V)
CJI0323::impE2(G64D)/ptopO_impE(mt)-9997
impE2 (F405Y)
Пример 10: Получение векторов для внедрения хромосомы с мутациями impE2
Для подтверждения эффектов от применения мутаций impE2, которые были идентифицированы в примере 9, получали векторы, способные внедрять эти мутации impE2 в хромосому. Способ получения векторов был следующим.
Получали только векторы, включающие библиотеку мутаций, представленную в таблице 14, за исключением мутаций impE2(G64D). В частности, выделяли гены хромосом Corynebacterium stationis ATCC6872, и фрагменты генов получали при помощи ПЦР с использованием пар праймеров между праймером с SEQ ID NO: 56 и каждым из праймеров с SEQ ID NO: 57, 59, 61 и 63. ПЦР осуществляли путем исходной денатурации при 94°C в течение 5 минут; 20 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты; и окончательной полимеризации при 72°C в течение 5 минут с получением ПЦР фрагментов.
Фрагменты генов получали при помощи ПЦР с использованием каждой из хромосом четырех отобранных штаммов в качестве матрицы вместе с парами праймеров между праймером с SEQ ID NO: 55 и каждым из праймеров с SEQ ID NO: 58, 60, 62 и 64. ПЦР осуществляли путем исходной денатурации при 94°C в течение 5 минут; 20 циклов, состоящих из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты; и окончательной полимеризации при 72°C в течение 5 минут с получением ПЦР фрагментов.
ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием двух фрагментов, и полученные фрагменты гена расщепляли ферментом рестрикции (XbaI I). Получающиеся в результате фрагменты гена лигировали с использованием лигазы T4 в линеаризованный вектор pDZ (Корейский патент №10-0924065 и публикация международной патентной заявки №2008-033001), который уже был расщеплен ферментом рестрикции (XbaI), трансформировали в E.coli DH5α, и трансформанты высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л).
Для получения векторов с единичной мутацией для подтверждения эффектов единичных мутаций impE2 (S387T, M413T и N458K), в которые интегрированы три вида мутаций среди отобранных вариантов, ПЦР осуществляли с использованием штамма ATCC6872 в качестве матрицы вместе с парами праймеров между праймером с SEQ ID NO: 56 и каждым из праймеров с SEQ ID NO: 67, 69 и 71, и таким образом получали фрагменты гена. Затем ПЦР осуществляли с использованием штамма ATCC6872 в качестве матрицы вместе с парами праймеров между праймером с SEQ ID NO: 55 и каждым из праймеров с SEQ ID NO: 68, 70 и 72, и таким образом получали фрагменты гена. ПЦР с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием двух фрагментов, полученных выше, и полученные таким образом фрагменты гена расщепляли ферментом рестрикции (XbaI). Получающиеся в результате фрагменты гена лигировали с использованием лигазы T4 в линеаризованный вектор pDZ, который уже был расщеплен ферментом рестрикции (XbaI), трансформировали в E.coli DH5α, и трансформанты высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин.
[Таблица 15]
SEQ ID NO
Праймер
Последовательность (от 5' до 3')
55
impE mt - R
CATCTAGACCGAGACAAAAACGCCAAACG
56
impEW mt - 1
GCTCTAGACCGCGGATAACGTCGGCATTA
57
impEW ttk - 2
CATCCACCACAAAGCAAACGC
58
impEW ttk - 3
CTTTGTGGTGGATGACCCAGATGACCGTTGAGACTT
59
impEW C - 2
AAATGGAGATACCTGAGATGT
60
impEW C - 3
CAGGTATCTCCATTTGCGTTATTGGCTCGACGCTCG
61
impEW v - 2
GGCCGCAAAACCCATCCAGTC
62
impEW v - 3
ATGGGTTTTGCGGCCGTCGCAATCACGACCAGCACC
63
impEW y - 2
ATACAAGGAAGCGAACTCCGA
64
impEW Y - 3
TTCGCTTCCTTGTATACGGTGTCGGCTTGGGCTTTG
После отбора колоний, трансформированных вектором, в который внедрен желаемый ген, получали плазмиды с использованием обычного известного способа экстракции плазмид. Плазмиды были названы pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ- impE2(F123C), pDZ-impE2(I243V), pDZ-impE2(F405Y), pDZ-impE2(S387T), pDZ- impE2(M413T) и pDZ-impE2(N458K) в соответствии с мутацией, внедренной в impE2 каждой плазмиды.
Пример 11: Получение штаммом, в которые введена мутация impE2, на основе impE1, impE2 дикого типа и сравнение их способностей продуцировать IMP
Четыре вида векторов, полученных в примере 10 для внедрения новых мутаций (т.е. pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V) и pDZ- impE2(F405Y)), трансформировали путем двухстадийной рекомбинации гомологичных хромосом в штамм CJI0323_impE1E2(WT), в котором impE1E2 в Corynebacterium stationis CJI0323 (продуцирующий IMP штамм, полученный в примере 4) восстановлен до WT (дикого типа). Затем штаммы, в которых мутации impE2 внедрены в хромосому, отбирали путеманализа последовательности полинуклеотидов, и штаммы были названы CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V) и CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y), соответственно.
Штаммы Corynebacterium stationis CJI032_impE1E2(WT)_impE2(F123C), Corynebacterium stationis CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V) и Corynebacterium stationis CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y) были депонированы в соответствии с Будапештским договором в международном депозитарном органе Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) 2 ноября 2018 года, и им были присвоены номера KCCM12362P, KCCM12363P и KCCM12365P, соответственно.
Штаммы культивировали тем же самым образом, как в примере 7, и для них анализировали концентрации IMP. После 48 часов культивирования концентрации измеряли (таблица 16).
[Таблица 16]
Концентрация IMP, продуцируемого штаммами с внедренными мутациями impE2 (г/л)
Штамм
Средняя коцентрация IMP
CJI0323_impE1E2(WT)
2,32
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T, M413T, N458K)
3,35
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C)
2,62
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(I243V)
2,74
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F405Y)
2,90
В отношении концентрации IMP подтверждено, что эти четыре новых модифицированных штамма демонстрировали максимальное увеличение на 44% по сравнению с штаммом CJI0323_impE1E2(WT). Увеличение количества продуцируемого IMP вследствие мутаций белка ImpE в соответствии с настоящим изобретением может быть интерпретировано как весьма значительное.
Пример 12: Получение штаммов, в которые была внедрена мутация impE2, на основе CJI0323::impE2(G64D) и сравнение способности продуцировать IMP
Четыре вида векторов, полученных в примере 10 для внедрения новых мутаций (т.е. pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), и pDZ- impE2(F405Y)) трансформировали в штамм CJI0323_impE2(G64D) (т.е. продуцирующий IMP штамм) путем двухстадийной рекомбинации гомологичных названы CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C), CJI0323::impE2(G64D)_impEp(I243V) и CJI0323::impE2(G64D)_impE2p(F405Y), соответственно, в соответствии с внедренной мутацией impE2.
Штаммы культивировали тем же самым образом, как в примере 7, и анализировали концентрации IMP для них (таблица 17).
[Таблица 17]
Концентрация IMP, продуцируемого штаммами с внедренными мутациями impE2 (г/л)
Штамм
Средняя концентрация IMP
CJI0323::impE2(G64D)
11,53
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, M413T, N458K)
13,47
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C)
12,90
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V)
13,17
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F405Y)
12,70
В отношении концентрации IMP подтверждено, что эти четыре новых модифицированных штамма демонстрировали максимальное увеличение на 17% по сравнению с штаммом CJI0323::impE2(G64D). Увеличение количества продуцируемого IMP вследствие мутаций белка ImpE в соответствии с настоящим изобретением может быть интерпретировано как весьма значительное.
Затем семь видов векторов, полученных выше (т.е. pDZ-impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V), pDZ-impE2(F405Y), pDZ-impE2(S387T), pDZ-impE2(M413T) и pDZ-impE2(N458K)), по отдельности или в комбинации, трансформировали в штамм CJI0323_impE1E2(WT) или штамм CJI0323::impE2(G64D). Полученные штаммы были названы CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K), CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)) CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(M413T), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, F405Y, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K), CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, S387T, M413T, N458K), и CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K), и их способности продуцировать IMP измеряли тем же самым образом, как описано выше (таблица 18).
Штаммы Corynebacterium stationis CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T), Corynebacterium stationis CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T) и CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K) были депонированы в соответствии с Будапештским договором в международном депозитарном органе Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) 2 ноября 2018 года, и им были присвоены номера KCCM12364P, KCCM12366P, и KCCM12367P, соответственно.
[Таблица 18]
Концентрация IMP, продуцируемого штаммами с единичной мутацией impE2 и штаммами, в которые внедрены комбинированные мутации impE2 (г/л)
Штамм
Средняя концентрация IMP
CJI0323_impE1E2(WT)
2,32
CJI0323::impE2(G64D)
11,52
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(S387T)
2,7
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(M413T)
3,1
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(N458K)
3,0
CJI0323_impE1E2(WT)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)
4,7
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T)
12,94
CJI0323::impE2(G64D)_impE (M413T)
13,0
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(N458K)
13,1
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, M413T, N458K)
13,6
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(S387T, F405Y, M413T, N458K)
13,7
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, S387T, M413T, N458K)
13,82
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K),
14,0
CJI0323::impE2(G64D)_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)
14,27
В соответствии с представленным в вышеприведенных таблицах подтверждено, что единичные мутации (т.е. impE2(S387T), impE2(M413T) и impE2(N458K)) демонстрировали максимальное увеличение на 33,6% по сравнению с штаммом дикого типа, и все из штаммов с комбинацией новых мутаций демонстрировали максимальное увеличение на 102,5%. Кроме того, когда новую мутацию по отдельности внедряли в штамм CJI0323::impE2(G64D), тогда способность продуцировать IMP увеличивалась в соответствии с представленным в таблицах 17 и 18, в то время как, когда в штамм внедряли комбинацию мутаций, тогда штамм, как представлено, обладает более улучшенной способностью продуцировать IMP. В частности, когда как мутация штамма CJI0323::impE2(G64D), так и новая(ые) мутация(и) интегрированы в штамм, тогда способность продуцировать IMP увеличивалась приблизительно на 515% по сравнению с штаммом дикого типа, в то же самое время демонстрируя увеличение приблизительно на 24% по сравнению с штаммом CJI0323::impE2(G64D). Также подтверждено, что новые мутации, открытые в описании настоящего изобретения, как продемонстрировано, увеличивают способность продуцировать IMP даже посредством единичной мутации, и когда эти мутации вводят в комбинации, тогда способность продуцировать IMP дополнительно увеличивается.
Пример 13: Усиление impE2 на основе продуцирующих IMP штаммов
Пример 13-1: Получение штаммов, в которые внедрена мутация impE2, на основе продуцирующего IMP штамма
Для подтверждения влияния внедрения мутации impE2 в штамм получали штамм, продуцирующий IMP, в котором были ослаблены активности аденилосукцинатсинтетазы и IMP-дегидрогеназы, соответствующие метаболическому пути разрушения IMP в штамме ATCC6872. Инициирующий кодон был изменен путем замены первого основания с ‘a’ на ‘t’ в каждой нуклеотидной последовательности двух генов purA и guaB, которые кодируют два фермента. Штамм, в котором экспрессия двух генов была ослаблена в штамме ATCC6872, был назван CJI9088. Векторы pDZ- impE2(S387T, M413T, N458K), pDZ-impE2(F123C), pDZ-impE(I243V) и pDZ- impE2(F405Y), полученные в примере 10, трансформировали по отдельности или в комбинации в штамм CJI9088 путем электропорации. Затем штаммы, в которых векторы были внедрены в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру, и отбирали штаммы, в которые была внедрена модификация требуемого гена. Внедрение модификации в окончательно трансформированные штаммы подтверждали путем осуществления ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 13 и 14 с последующим анализом путем секвенирования нуклеотидов.
Оценивали способность полученных штаммов (т.е. CJI9088, CJI9088_impE2(S387T, M413T, N458K), CJI9088_impE2(F123C), CJI9088_impE2(I243V), CJI9088_impE2(F405Y) и CJI9088_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K) продуцировать IMP. После завершения культивирования количественную продукцию IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты представлены в таблице 19 ниже.
[Таблица 19]
Штамм
IMP (г/л)
CJI9088
0,52
CJI9088_impE2(S387T, M413T, N458K)
3,75
CJI9088_impE2(F123C)
0,94
CJI9088_impE2(I243V)
1,07
CJI9088_impE2(F405Y)
1,21
CJI9088_impE2(F123C, I243V, S387T, F405Y, M413T, N458K)
4,32
После подтверждения количества IMP, аккумулируемого в культуральной среде, было подтверждено, что эти штаммы демонстрировали увеличение продукции IMP по меньшей мере на 80% и максимальное увеличение на 730% по сравнению с родительским штаммом CJI9088. Соответственно, увеличение количества продуцируемого IMP вследствие мутаций белка ImpE в соответствии с описанием настоящего изобретения может быть интерпретировано как весьма значительное.
Исходя из вышеизложенного, специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, будет способен понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без модификации технических принципов или существенных характеристик настоящего изобретения. В этой связи раскрытые в настоящем описании типичные воплощения приведены только для иллюстративных целей и их не следует рассматривать, как ограничивающие объем настоящего изобретения. Наоборот, предполагается, что настоящее изобретение охватывает не только эти типичные воплощения, но также и различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.