Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и инфильтрирующих опухоль у больных плоскоклеточным раком головы и шеи

© Коллектив авторов, 2019

Заботина Т.Н., Черткова А.И., Циклаури В.Т., Короткова О.В., Захарова Е.Н., Табаков Д.В., Борунова А.А., Панчук И.О., Задеренко И.А., Мудунов А.М., Кадагидзе З.Г.

Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и инфильтрирующих опухоль у больных плоскоклеточным раком головы и шеи

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115230, г. Москва, Россия

Иммунная система играет важную роль в развитии, формировании и прогрессировании плоскоклеточного рака головы и шеи (ПКРГШ), в связи с чем актуальным является сравнение исходного состояния системного и локального иммунитета и ассоциации субпопуляционного состава лимфоцитов с распространенностью процесса и выживаемостью больных ПКРГШ. Материал и методы. У 29 первично операбельных больных ПКРГШ до оперативного лечения методом проточной цитометрии проводили иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови (ПК) и лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО).

Результаты. Показано, что у больных с ранними стадиями ПКРГШ в ПК наблюдалось повышение доли НК-клеток, СБ16+Рейотт+- и СВ11Ъ+-лимфоцитов, а также цитотоксического потенциала (ЦТП) СБ8+-клеток. У пациентов с Ш-1У стадиями заболевания повышалось количество активированных СБ25+-лимфоцитов и снижалось соотношение Т-клетки-эффекторы/регуляторные Т-клетки (Тэфф/Г^) в отличие от группы сравнения. У умерших пациентов, в отличие от выживших, была повышена доля регуляторных СВ4+СВ25+СБ127-/1сга,-Т-клеток (Treg) и снижена величина соотношения ТэффЛ^. У выживших пациентов был повышен ЦТП СБ8+-лимфоцитов и увеличена доля СБ8+Рег1отт11в11-лимфоцитов. В составе ЛИО отмечалось значительное повышение по сравнению с периферической кровью супрессорных СБ4+- и СБ8+-популяций Т-клеток. Выявлены также повышение по сравнению с периферической кровью доли СБ8+- и СБ4+-Т-клеток, экспрессирующих ингибиторный рецептор РБ-1, а также высокая экспрессия РБ-Ь1 и РБ-Ь2 на опухолевых клетках. Заключение. Полученные результаты указывают на необходимость одновременного изучения иммунных клеток периферической крови и клеток, инфильтрирующих опухолевую ткань.

Для корреспонденции

Заботина Татьяна Николаевна

доктор биологических наук заведующая централизованным клинико-лабораторным отделом НИИ клинической онкологи! ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Москва, Россия E-mail: tatzabotina@yandex.ri http://orcid.org/0000-0001-7631-569S

Ключевые слова: плоскоклеточный рак головы и шеи; лимфоциты периферической крови; лимфоциты, инфильтрирующие опухоль; эффекторные лимфоциты; регуляторные лимфоциты

Статья поступила 16.03.2019. Принята в печать 16.04.2019.

Для цитирования: Заботина Т.Н., Черткова А.И., Циклаури В.Т., Короткова О.В., Захарова Е.Н., Табаков Д.В., Борунова А.А., Панчук И.О., Задеренко И.А., Мудунов А.М., Кадагидзе З.Г Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и инфильтрирующих опухоль у больных плоскоклеточным раком головы и шеи. Иммунология. 2019; 40 (3): 10-19. doi: 10.24411/0206-4952-2019-13002.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Zabotina T.N., Chertkova A.I., Tsiklauri V.T., Korotkova O.V., Zaharova E.N., Tabakov D.V., Borunova A.A., Panchuk I.O., Zaderenko I.A., Mudunov A.M., Kadagidze Z.G.

Features of peripheral blood lymphocytes and tumor infiltrating lymphocytes subpopulations in patients with squamous cell head and neck cancer

N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, 115230, Moscow, Russia

For correspondence

Zabotina Tatiana N. - Dr.Sci, PhD, Head of Centralized Clinical and Laboratory Department, Research Institute of Clinical Oncology, N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, Moscow, Russia E-mail: tatzabotina@yandex.ru http://orcid.org/0000-0001-7631-5699

The immune system plays an important role in the development, formation and progression of squamous cell carcinoma of the head and neck. Therefore, the study of the baseline state of systemic and local immunity and of the link of lymphocyte subpopulation composition with prevalence of the process and survival of patients is relevant.

Material and methods. Immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes (PB) and lymphocytes infiltrating the tumor (TILs) by flow cytometry was carried out in 29 primary operable patients suffering squamous cell carcinoma of the head and neck prior to surgical treatment.

of Centralized Clinical and Laboratory Department, Research Institute of Clinical Oncology, N.N. Blokhin National Medical Research Centre of Oncology, Moscow, Russia E-mail: tatzabotina@yandex.ru http://orcid.org/0000-0001-7631-5699

Results. In patients with early stages of disease there was an increase in the percentage of NK-cells, For correspondence

CD16+Perforin+- and CD11b+-lymphocytes, as well as cytotoxic potential of CD8+-cells. The number Zabotina latiatw N - DrSd, PliD, Head of activated CD25+-lymphocytes was increased in patients with stages III-IV and the ratio of the Teff/Treg was decreased versus group of comparison. The percentage of regulatory CD4+CD25+CD127-/low-T-cells (Treg) was increased and the value of the Teff/Treg ratio was reduced in dead patients in contrast with survivors. Cytotoxic potential of CD8+-cells and CD8+Perforinhigh-lymphocytes was elevated in living patients. The composition of TILs showed a significant increase of suppressor CD4+- and CD8+-T-cell populations compared with PB. There was also an increase in the percentage of CD8+- and CD4+-T-cells expressing the inhibitory receptor PD-1 compared with PB, and a high expression PD-L1 and PD-L2 on tumor cells.

Conclusion. Results indicate that simultaneous study of immune cells of peripheral blood and cells infiltrating tumor tissue is necessary.

Keywords: squamous cell head and neck cancer; peripheral blood lymphocytes; tumor infiltrating lymphocytes; effector lymphocytes; regulatory lymphocytes

Received 16.03.2019. Accepted for publication 16.04.2019.

For citation: Zabotina T.N., Chertkova A.I., Tsiklauri V.T., Korotkova O.V., Zaharova E.N., Tabakov D.V., Boruno-va A.A., Panchuk I.O., Zaderenko I.A., Mudunov A.M., Kadagidze Z.G. Features of peripheral blood lymphocytes and tumor infiltrating lymphocytes subpopulations in patients with squamous cell head and neck cancer. Immunologiya. 2019; 40 (3): 10-9. doi: 10.24411/0206-4952-2019-13002.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Злокачественные опухоли головы и шеи - группа опухолевых заболеваний, включающих рак различных отделов глотки и гортани, а также околоносовых пазух, полости рта (губы, десны, язык, дно полости рта, твердое нёбо и слизистая оболочка щек). Рак полости рта (РПР) является одним из 10 наиболее распространенных в мире злокачественных опухолей. Во многих случаях его диагностируют на поздних стадиях (Ш-1У), что значительно ухудшает прогноз заболевания. Постановка диагноза на ранних стадиях РПР значительно повышает эффективность лечения. В 90% случаев РПР определяется как плоскоклеточная карцинома с различным уровнем дифференцировки и склонностью к мета-стазированию в лимфатические узлы. Наиболее частые локализации опухоли - язык, дно полости рта и нижняя губа [1]. В России по уровню заболеваемости рак полости рта и глотки занимает 9-е место среди других злокачественных новообразований у мужчин и 18-е - у женщин [2]. Ключевую роль в развитии, формировании и прогрессировании ПКРГШ играет иммунная система [3]. Показано, что инфильтрация опухоли иммунными клетками может являться благоприятным прогностическим фактором. Имеются сообщения о том, что при высокой инфильтрации ПКРГШ лимфоцитами, эффективность химиорадиотерапии выше, чем при низком содержании лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО) [4, 5]. С другой стороны, по данным различных авторов, ПКРГШ входит в число наиболее иммуно-супрессивных опухолей человека. Иммуносупрессия обеспечивается как растворимыми, так и клеточными факторами, способствующими прогрессивному росту опухоли и быстрому рецидиву заболевания [6-8].

Учитывая значимое влияние иммунной системы на развитие ПКРГШ, и то, что данная форма рака характеризуется отсутствием специфических биомаркеров [1],

актуальным является изучение показателей исходного состояния иммунной системы и их ассоциации с распространенностью процесса и выживаемостью больных ПКРГШ.

Цель - определить основные показатели системного и локального врожденного и адаптивного иммунитета у больных ПКРГШ до лечения и установить их связь со стадией заболевания и выживаемостью пациентов.

Задачи:

1. Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (ПК) у больных ПКРГШ до лечения в отличие от группы сравнения.

2. Определить взаимосвязь субпопуляционного состава лимфоцитов ПК со стадией заболевания.

3. Выявить взаимосвязь субпопуляционного состава лимфоцитов ПК с выживаемостью пациентов.

4. Исследовать субпопуляционный состав лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО), у больных ПКРГШ до лечения.

Материал и методы

Пациенты. В исследование включены больные ПКРГШ (п = 29; 14 женщин и 15 мужчин). У 18 пациентов диагностирован рак языка, у 9 - рак слизистой оболочки полости рта и у 2 - первично-множественное злокачественное образование (ПМЗО) слизистой оболочки полости рта. Средний возраст пациентов составил 43,5 года (от 15 до 84 лет). Все пациенты получили хирургическое лечение с последующей радио- и химиотерапией. Период наблюдения составил 36 мес. За это время умерли 11 больных. Группы сравнения составили здоровые доноры соответствующего пола и возраста (п = 77). Все пациенты дали информированное согласие на проведение иммунологического обследования.

Иммунологические исследования. Лимфоциты выделяли из периферической крови и образцов опухолевой ткани, полученной при оперативном вмешательстве. В полученной из опухолевой ткани клеточной суспензии определяли процентное содержание ЛИО. Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Субпопуляционный состав лимфоцитов ПК и ЛИО определяли методом проточной цитофлуориме-трии на 5-параметровом проточном цитофлуориметре аналитического типа FACSCalibur производства компании BectonDickinson (США). Применяли 2-, 3- и 4-цвет-ное окрашивание клеток с использованием панели моноклональных антител к поверхностным маркерам Т- и В-лимфоцитов, NK- и NKT-клеток, активированных лимфоцитов, регуляторных Т-клеток (CD3, CD4, CD8, CD28, CD11b, HLA-DR, CD25, CD16, CD56, CD19, CD127) и к внутриклеточному перфорину (Perforin) (BD Biosciences, BekmanCoulter). Проводили дополнительное гейтирование CD45+CD8+-лимфоцитов для определения CD8+CD11bCD28- и CD8+CD11b+CD28-клеток в составе CD8+-популяции. Цитотоксический потенциал (ЦТП) CD 16+- и CD8+-лимфоцитов оценивали как долю (в %) Perforin-позитивных клеток в составе соответствующей популяции. У части больных определяли экспрессию PD-L1 и PD-L на опухолевых клетках.

Статистический анализ данных. Статистически результаты обрабатывали с помощью программы Statistka 7.0. Анализ вида распределения показателей проводили с помощью критерия Шапиро-Уилка (n < 50) или Колмогорова и Смирнова (n > 50). Статистическую значимость различий между группами при распределении, отличном от нормального хотя бы у одной из групп, оценивали по непараметрическому двустороннему U-критерию Манна-Уитни (U). В этом случае показатели в обеих группах представлены в виде медианы (Me) и квартилей (25 и 75 процен-тили). При нормальном распределении показателей использовали /-критерий Стьюдента (St), результаты представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения: x (s). Взаимосвязь между показателями определяли с помощью корреляционного анализа Спирмена (коэффициент корреляции р). Уровень статистической значимости - 0,05.

Результаты

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов ПК показало, что до лечения у больных ПКРГШ в целом по группе обнаруживаются некоторые отклонения от группы сравнения основных показателей адаптивного и врожденного иммунитета (табл. 1). Отмечалось статистически значимое снижение общего количества Т-клеток и их основных популяций: CD3+CD4+-и CD3+CD8+-Т-лимфоцитов. В то же время количество CD3 -CD16+CD56+-NK-клеток было повышено. В составе CD8+-лимфоцитов ПК пациентов, как и в контрольной группе, основную долю составляли цитотоксические клетки-эффекторы (CD8+CD11b+CD28). Процент регу-

ляторных СБ8+СБ11Ъ-СБ28-- и СВ4+СВ25+СБ127-/1от'-Т-лимфоцитов не отличался от группы сравнения. Цитотоксический потенциал СБ8+-лимфоцитов был повышен по сравнению с нормой, а СБ 16+-лимфоцитов не отличался от группы сравнения (см. табл. 1). Так как СВ8+Рейогт+-лимфоциты могут включать в свой состав Т-, КК- и ККТ-клетки, был проведен корреляционный анализ взаимосвязи СВ8+Регйэгт+-клеток с соответствующими популяциями. Отмечалась статистически значимая положительная корреляция количества СВ8+Рейогт+-лимфоцитов как с цитотоксиче-скими СВ8+СВ11Ъ+СБ28--Т-лимфоцитами (р = 0,487; р = 0,007), так и с СВ3+СВ16+СБ56+-МКТ-клетками (р = 0,456; р = 0,013). Определение уровня экспрессии перфорина на СБ8+-лимфоцитах больных ПКРГШ (СВ8+РейоппЫ811 и СВ8+Рег&пп1о,Т) показало, что количество СВ8+РейоппЫ811-клеток составляло 8,9% (4,1 и 12,1%), а СБ8+Рейогт1от' (Ь) - 7,9% (5,4 и 9,2%); ра-ь = 0,557. Корреляционный анализ выявил положительную корреляцию СВ8+РейоппЫ811-клеток с СБ3+СБ8+-Т-лимфоцитами (р = 0,522; р = 0,004) и ККТ-клетками (р = 0,624; р = 0,000), а СБ8+Рейогт1от' - с СВ3СБ8+-КК-клетками (р = 0,540; р = 0,003). У пациентов также обнаружено повышение процента лимфоцитов, экс-прессирующих маркер СБ11Ь. Определение величины соотношения количества клеток эффекторной популяции лимфоцитов СБ3+СБ8+ с количеством регуляторных СБ4+-Т-клеток в ПК (СВ3+СБ8+/СВ4+СВ25+СВ127-/1°- -Тэфф/Тге8) показало, что у пациентов этот показатель составлял 2,7 (1,9 и 4,1), а в группе сравнения - 3,6 (2,7 и 4,8). Различие было статистически значимым :р=0,024. Количество СВ4+РБ-1+-иСВ8+РБ-1+-лимфоцитов не отличалось от контрольных значений (см. табл. 1).

Изучение зависимости субпопуляционного состава лимфоцитов ПК от стадии заболевания выявило определенные различия в отклонениях показателей от контроля между группами больных с ранними (1-11 стадии -группа А; п = 16) и поздними (Ш-1У стадии - группа B; п = 13) стадиями ПКРГШ. При этом у пациентов с 1-11 стадиями отклонения от группы сравнения были значительно более выражены, чем у пациентов с Ш-1У стадиями (табл. 2). Только у больных с ранними стадиями ПКРГШ (группа А) наблюдалось статистически значимое повышение процента СБ8+СБ28+-лимфоцитов; СВ3-СВ16+СБ56+-ЫК-клеток; СБ16+-клеток, экс-прессирующих перфорин (СБ16+-РегГогт+), СБ11Ь+-лимфоцитов, а также ЦТП СБ8+-клеток и снижение величины соотношения СБ4/СБ8. Количество СБ3+-Т-клеток было снижено в обеих группах, но в группе А снижение было обусловлено уменьшением числа СБ3+СБ4+-Т-клеток, а в группе В - СБ3+СБ8+-Т-лимфоцитов. В группе В также было снижено общее количество СБ8+-клеток и повышена доля лимфоцитов, экспрес-сирующих активационный маркер СБ25. Определение соотношения Тэфф/Тге8 показало, что у пациентов с ранними стадиями заболевания этот показатель не отличался от группы сравнения, в то время как у больных

Таблица 1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных плоскоклеточным раком головы и шеи

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови,% je(s)* или Me (квартили)** Р

пациенты

CD3+ 66,9

CD3+CD4+ 33,0

CD3+CD8+ 22,2

CD3-CD8+ 8,6

CD8+ 34,5

CD3+HLA-DR+ 7,1

HLA-DR+ 15,0

CD3-CD16+CD56+ 18,3

CD3+CD16+CD56+ 12,3

CD3-CD19+ 4,5

CD8+CD28+ 12,0

CD8+CD28- 23,4

CD4+CD25+ 7,5

CD25+ 16,4

CD11b+ 34,9

CD8+CD16+ 13,6

CD16+Perform+ 18,0

ЦТП CD16+ 94,2

CD8+Perforin+ 18,4

ЦТП CD8+ 57,5

CD4+CD25+CD127-/low 7,2

CD8+CD11b+ CD28- 56,5

CD8+CD11b+ CD28+ 4,4

CD8+CD11b- CD28- 7,6

CD8+CD11b- CD28+ 26,4

CD4+CD279+ 12,4

CD8+CD279+ 10,0

Примечание. Здесь и в табл. 2-4: * х(я) - среднее значение (стандартное отклонение); ** - медиана (25 и 757т).

с поздними стадиями он был статистически значимо снижен в отличие от группы сравнения. Количество СБ4+РБ-1+- и СВ8+РБ-1+-лимфоцитов не отличалось от контрольных значений (см. табл. 2).

Иммунофенотипирование лимфоцитов ПК также выявило значительные различия в процентном содержании клеток некоторых популяций между группами выживших (группа С; п = 18) и умерших в течение периода наблюдения пациентов (группа Б; п = 11) (табл. 3). Общее количество СБ3+-Т-клеток было снижено в отличие от группы сравнения только у больных в группе Б в результате снижения количества обеих популяций Т-клеток: СБ3+СБ4+ и СБ3+СБ8+. В группе С количество СБ3+-Т-клеток не отличалось от группы сравнения, была снижена только доля СБ3+СБ8+-Т-клеток. Только в группе Б наблюдалось повышение количества СВ3-СБ16+СБ56+-МК-клеток, СБ25+- и СБ8+СБ16+-лимфоцитов по сравнению с группой сравнения. В то же время у живых

пациентов был повышен ЦТП СБ8+-клеток и доля СБ11Ъ+-лимфоцитов, в то время как в группе Б эти показатели не отличались от группы сравнения. Процент регуляторных СБ4+СВ25+СВ127/1°*-Т-клеток до лечения был повышен только у умерших больных (см. табл. 3). Наиболее значительные различия между группами С и Б касались таких показателей, как доля активированных СБ25+-лимфоцитов (р = 0,027), СВ8+СБ16+-клеток (р = 0,09), ЦТП СБ8+-лимфоцитов р = 0,033) и количества регуляторных СВ4+СВ25+СБ127/1°*-Т-клеток (р = 0,007). Определение соотношения Тэфф/Л^ отдельно у живых (группа С) и умерших (группа Б) пациентов выявило, что этот показатель статистически значимо снижен в отличие от группы сравнения только у больных группы Б: 1,9 (0,96 и 3,3) и 3,6 (2,7 и 4,8) соответственно; р = 0,021. Этот показатель у больных группы С не отличался от группы сравнения: 3,4 (2,5 и 4,3) (см. табл. 3). Также установлено, что у выжив-

Примечание. п - число больных, у которых данный показатель определялся.

Таблица 2. Зависимость субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови от стадии заболевания

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови, % л;(в)* или Ме (квартили)** Р1-3 Р23

стадия заболевания группа сравнения

1-11

СБ3+ 62,6

СБ3+СБ4+ 28,6

СБ3+СБ8+ 24,9

СБ8+ 37,3

СВ3-СБ16+СБ56+ 18,6

СБ8+СБ28+ 15,5

СБ25+ 14,7

СБ16+Рег!опп+ 22,1

ЦТП СБ8+ 59,2

СБ4/СБ8 0,7

СБ11Ъ+ 40,0

СБ3+СБ8+/Тге8 3,4

СБ8+СБ279+ 9,9

СБ4+СБ279+ 9,4

ших пациентов количество СВ8+РегЮппЫ811-лимфоцитов было статистически значимо выше, чем у умерших больных [9,8% (6,8 и 15,8) и 3,9% (1,9 и 9,1) соответственно; р = 0,013]. Различий между группами по количеству СВ8+РегЮпп1о*-лимфоцитов не отмечалось [6,7% (5,4 и 8,9) и 8,3% (5,1 и 12,8) соответственно; р = 0,175]. Количество СБ4+РБ-1+ и СБ8+РБ-1+-лимфоцитов не отличалось от контрольных значений.

Изучение субпопуляционного состава ЛИО показало, что в составе ЛИО превалировали СБ3+-Т-клетки, а также их основные популяции СБ3+СБ4+- и СБ3+СБ8+-Т-лимфоциты (табл. 4). В то же время отмечалось значительное снижение процентного содержания клеток врож-

денного иммунитета (КК- и ККТ-лимфоцитов) по сравнению с ПК. Выявлен также значительно более низкий процент как СБ 16+-, так и СБ8+РегЮгт+-лимфоцитов и снижение ЦТП этих популяций клеток, особенно ЦТП СБ8+-клеток. Содержание СВ8+РегЮппЫ811-клеток и СБ8+РегЮгт1о*-клеток в составе ЛИО: [5,4% (0,6 и 7,6)] и [1,7% (0,5 и 2,3)] соответственно было ниже, чем в ПК: СБ8+Рег1огтЫ811-клеток - 8,9% (4,1 и 12,1%), СВ8+Рейопп1от'-клеток - 7,9% (5,4 и 9,2%). Значительные различия наблюдались также в процентном содержании СВ8+СБПЪ+СВ28- и СБ8+СВПЪСВ28--Т-клеток в составе СБ8+-лимфоцитов ПК и ЛИО. В ПК доля СБ8+СБ11Ъ+СБ28--клеток почти в 8 раз пре-

Таблица 3. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови; связь с выживаемостью больных плоскоклеточным раком головы и шеи

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови, % л (в)* или Ме (квартили)** Р1-3 Р2-3

выжившие пациенты

СБ3+ 69,4

СБ3+СБ4+ 34,6

СБ3+СБ8+ 20,7

СВ3-СБ16+СБ56+ 17,4

СБ25+ 14,3

СБ8+СБ16+ 9,8

СБ11Ъ+ 36,4

ЦТП СБ8+ 62,8

СВ4+СВ25+СБ127-/1от' 6,4

СБ3+СБ8+/Тге8 3,4

Таблица 4. Различия субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль

Субпопуляции лимфоцитов, % Me (квартили)*

кровь

CD3+ 66,9

CD3+CD4+ 32,5

CD3+CD8+ 20,7

CD3-CD8+ 8,6

CD8+ 34,5

CD3+HLA-DR+ 7,1

HLA-DR+ 15,0

CD3-CD16+CD56+ 18,3

CD3+CD16+CD56+ 12,7

CD3-CD19+ 4,5

CD8+CD28+ 12,0

CD8+CD28- 23,7

CD4+CD25+ 7,5

CD25+ 16,4

CD8+CD16+ 13,6

CD16+Perforin+ 18,0

ЦТП CD16+ 94,2

CD8+Perforin+ 17,4

ЦТП CD8+ 60,9

CD4+CD25+CD127-/low 7,2

CD8+CD11b+CD28- 59,6

CD8+CD11b-CD28- 7,6

CD8+CD279+

CD4+CD279+

CD273

CD274

Cytokeratin - 10,0

вышала долю СВ8+СВ11Ъ-СБ28--лимфоцитов, а для ЛИО это соотношение составило 0,16 (см. табл. 4, см. рисунок). Процентное содержание регуляторных СВ4+СВ25+СБ127 /1°*-Т-клеток в составе ЛИО было выше, чем в ПК (см. табл. 4, см. рисунок). Соотношение Тэфф/Гге§ составило для ЛИО 2,2 (1,5-3,8), в ПК - 2,7 (1,9-4,1). В опухолевой ткани доля СБ8+-и СБ4+-Т-клеток, экспрессирующих РБ-1, была значительно выше, чем в ПК. Значительный процент опухолевых клеток экспрессировал также ингибиторные лиганды СБ274 (РБ-Ь1) и СБ273 (РБ-Ь2). Процент клеток, экспрессирующих данные маркеры, представлен в табл. 4.

Обсуждение

В настоящей работе проводилось одновременное определение показателей системного (лимфоциты ПК) и локального иммунитета (ЛИО) у больных ПКРГШ до лечения. Исследование субпопуляционного состава

Median; Box: 25-75%; Whisker: 5-95%

Регуляторные CD4+CD25+CD127-/low- и CD8+CD11b-CD28--T-клетки и цитотоксические CD8+CD11b+CD8--лимфоциты в периферической крови и опухолевой ткани. Медиана, % и 25-75%о и 5-95°/«,; А - CD4+CD25+CD127-/'™; Б - CD8+CD11b+CD28-; В - CD8+CD11b-CD28-.

лимфоцитов ПК выявило, что у больных раком слизистой оболочки полости рта и раком языка в целом по группе наблюдаются отклонения ряда показателей системного иммунитета от нормы. Отмечалось статистически значимое снижение процента СБ3+-Т-лимфоцитов и их популяций (СБ3+СБ4+ и СБ3+СБ8+) и повышение процента естественных киллеров (СВ3-СБ16+СБ56+). Можно предположить, что снижение процента Т-клеток в ПК связано с их перемещением в опухолевую ткань, а повышение количества НК-клеток, возможно, имеет компенсаторный характер. У пациентов также отмечалось повышение процента лимфоцитов, экспрес-сирующих маркер СБ11Ь. По данным ряда авторов, дифференцировка СБ8+-Т-лимфоцитов в эффектор-ные (цитотоксические) клетки характеризуется приобретением СБ 11Ь+-фенотипа, и СВ8+СВ11Ъ+СБ28--Т-лимфоциты представляют собой клетки-эффекторы с высокой цитотоксической активностью [9-11]. Что касается НК-клеток, СБ11Ь+-популяция обладает высокой цитолитической активностью, в то время как у НК-клеток, не экспрессирующих СБ11Ь, цитотокси-ческая активность практически отсутствует [12]. Таким образом, повышение процента СБ 11Ь+-лимфоцитов в ПК является благоприятным фактором. Медиана ЦТП СБ16+-лимфоцитов превышала 90% и соответствовала контрольному значению. Установлено также, что, хотя общее количество СБ8+-лимфоцитов у пациентов не отличалось от группы сравнения, процент РейЪпп+-клеток в их составе (ЦТП) был повышен. Так как СБ8+-лимфоциты, экспрессирующие Рейопп, могут входить в состав Т-, МК- и МКГ-клеток, был проведен корреляционный анализ связи СВ8+Рейопп+-клеток с соответствующими популяциями. Результаты корреляционного анализа показали, что повышение ЦТП СБ8+-лимфоцитов, обнаруженное у пациентов, могло быть обусловлено цитотоксическими СБ8+СБ11Ъ+СБ28-Т-клетками, а также СВ3+СВ16+СБ56+-МКГ-клетками. При этом высокий уровень экспрессии перфорина (СБ8+РейЬгшЫ811) ассоциировался с СБ3+СБ8+-Т- и МКГ-клетками, а низкий (СБ8+Рейогт1от') с СВ3 СБ8+-МК-клетками. Таким образом, в ПК больных ПКРГШ обнаруживаются клетки эффекторного звена иммунитета, которые могут участвовать в противоопухолевом иммунном ответе. С другой стороны, на фоне снижения процента СБ3+СБ4+-Т-лимфоцитов в ПК отмечалась тенденция к увеличению количества регуляторных СВ4+СВ25+СБ127-/1°*-Т-клеток. Так, соотношение доли эффекторных СВ3+СБ8+-клеток с количеством регу-ляторных СВ3+СВ8+/СВ4+СВ25+СБ127-/1°*-Т-клеток (Тэфф/Гге8) у пациентов было статистически значимо снижено в отличие от группы сравнения [2,7 (1,9 и 4,1) и 3,6 (2,7 и 4,8) соответственно; р = 0,024]. Полученные результаты совпадают с данными К. СЫката1Би и со-авт. [13], которые обнаружили повышение количества регуляторных Т-клеток на фоне снижения процента циркулирующих СБ3+СБ4+-Т-лимфоцитов у больных ПКРГШ. Дополнительный корреляционный анализ, проведенный в настоящем исследовании, выявил сла-

бую статистически значимую ассоциацию повышения числа Гге8 с уменьшением количества СБ3+СБ4+-Т-клеток (р = -0,376; р = 0,044), что также может указывать на тенденцию к повышению содержания Гге8 в составе СБ3+СБ4+-Т-лимфоцитов у больных ПКРГШ. В группе сравнения подобная тенденция не отмечалась (р = 0,112; р = 0,350). Количество СБ4+РБ-1+- и СБ8+РБ-1+-лимфоцитов ПК в целом по группе не отличалось от группы сравнения. Остальные показатели также были в пределах контрольных значений.

Зависимость исходных показателей системного иммунитета от стадии заболевания, т. е. от увеличения степени распространенности опухолевого процесса (группа А - 1-11 стадии и группа В - Ш-1У стадии), выявило, что увеличение опухолевой нагрузки организма сопровождалось изменениями системного иммунитета. У пациентов с 1-11 стадиями ПКРГШ отмечалось повышение процента СБ8+СБ28+-, СБ11Ь+-, МК- и СБ16+РейЬгт+-лимфоцитов, а также ЦТП СБ8+-клеток в отличие от группы сравнения, что в определенной степени может указывать на реакцию иммунной системы на опухоль на ранних стадиях ее развития. На поздних стадиях заболевания все эти показатели снижались до нормы или до значений ниже нормы, включая общее число СБ8+-лимфоцитов и количество СБ3+СБ8+-Т-клеток, которые у больных группы А были в пределах контрольных значений. У пациентов с Ш-1У стадиями также отмечалось повышение доли СБ3+СБ4+-Т-клеток и лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер СБ25, что, возможно, указывает на развитие воспалительного процесса. Общее количество Т-клеток было снижено у пациентов обеих групп, но в группе А оно было связано со снижением доли СБ3+СБ4+Т-клеток, а в группе В - СБ3+СБ8+-Т-лимфоцитов. Снижение числа СБ3+СБ8+-Т-лимфоцитов у пациентов с Ш-1У стадиями ПКРГШ привело к снижению величины соотношения Тэфф/Гге8, что может означать увеличение значимости регуляторных Т-клеток при прогрессировании заболевания. Таким образом, обнаруженные в данной работе значительные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов ПК в зависимости от стадии ПКРГШ могут указывать на наличие системного противоопухолевого иммунного ответа на ранних стадиях заболевания и снижение его активности в процессе опухолевого роста.

Изучение состояния иммунной системы при злокачественных опухолях в первую очередь направлено на определение связи показателей иммунитета с выживаемостью пациентов. В настоящем исследовании иммунофенотипирование лимфоцитов ПК до лечения выявило значительные различия в процентном содержании клеток некоторых популяций между группами живых (группа С) и умерших в течение периода наблюдения пациентов (группа Б). В результате снижения количества клеток обеих популяций Т-лимфоцитов: СБ3+СБ4+ и СБ3+СБ8+, у больных в группе Б было снижено общее количество СБ3+-Т-клеток в отличие от группы сравнения. В группе С был снижен только процент СВ3+СБ8+-Т-клеток и общее количество СБ3+-Т-

клеток не отличалось от группы сравнения. В отличие от группы сравнения в группе Б наблюдалось повышение количества клеток врожденного иммунитета: СВ3-СВ16+СБ56+-КК-клеток и СВ8+СБ16+-лимфоцитов. У выживших пациентов в отличие от группы сравнения наблюдалось повышение ЦТП СБ8+-клеток и доли СБ11Ъ+-лимфоцитов. Процентное содержание активированных СБ25+-лимфоцитов, СБ8+СБ16+-клеток и регуляторных СВ4+СВ25+СБ127-/1о,т-Т-клеток в ПК было статистически значимо выше у умерших пациентов по сравнению с выжившими больными. В то же время у выживших пациентов ЦТП СБ8+-лимфоцитов, процент СВ8+Рейогты811-лимфоцитов (СБ3+СБ8+-Т-клеток-эффекторов) и СБ11Ъ+-клеток, а также соотношение Тэфф/Тге8 были статистически значимо выше, чем у умерших больных. Это может указывать на то, что у выживших больных до лечения отмечалось повышение активности эффекторного звена противоопухолевого иммунитета. Следует отметить также, что повышение до лечения ЦТП СБ8+-лимфоцитов, процента СБ11Ъ+-клеток и снижение величины соотношения Тэфф/Тге8 отмечалось как у живых пациентов, так и на ранних стадиях заболевания, что может указывать на положительное значение этих показателей при ПКРГШ. Процент СБ25+-клеток был повышен до лечения как у умерших больных, так и при Ш-1У стадиях заболевания, что, возможно, как говорилось выше, связано с развитием воспаления и может иметь неблагоприятное значение. Значимыми популяциями, подавляющими противоопухолевый иммунный ответ, являются регуляторные Т-клетки. Снижение соотношения Тэфф/Тге8 обнаружено на поздних стадиях заболевания и у умерших больных. К тому же количество Тге8 до лечения у умерших пациентов было выше, чем в группе сравнения и у живых пациентов. В дополнительном исследовании мы обнаружили также, что из 10 пациентов со значениями Тге8, превышающими норму, умерли 7 (70%), а из 19 больных со значениями в пределах или ниже нормы умерли 4 (21%). Для анализа различия частот в группах использовали двусторонний точный критерий Фишера. Различие между группами было статистически значимым: р = 0,017. В клинических исследованиях разных авторов было продемонстрировано повышение количества Тге8 в ПК и в опухолевой ткани при ПКРГШ. Авторы предполагают, что эта популяция клеток вносит значимый вклад в иммуносупрессивное опухолевое микроокружение при ПКРГШ [14-16]. В настоящем исследовании до лечения в целом по группе не обнаружено повышения Тге8 в ПК пациентов с ПКРГШ, однако увеличение числа этих клеток ассоциировалось с поздними стадиями заболевания и с повышенной смертностью пациентов. Следовательно, можно предположить, что повышение доли регуляторных Т-клеток в ПК до лечения является неблагоприятным прогностическим фактором.

Анализ опухолевого микроокружения у больных с различными злокачественными новообразованиями, включая ПКРГШ, показал, что значительное число солидных опухолей имеет Т-клеточный фенотип. Высокий процент Т-клеток (медиана - 89,3%, в ПК - 66,9%) и их

популяций, обнаруженный в настоящем исследовании в опухолевой ткани, согласуется с этим утверждением. Полученные в настоящем исследовании результаты показали, что в опухолевой ткани в составе CD8+ ЛИО был значительно повышен процент CD8+CD28CD11b-лимфоцитов по сравнению с ПК (см. рисунок). Показано, что почти все CD28--Т-клетки являются CD1 lb-позитивными [17] и экспериментальные исследования продемонстрировали, что экспрессия CD 11b на CD8+-Т-лимфоцитах ассоциируется с приобретением ими цитотоксической активности [10]. По данным A. Caruso и соавт. [18], Т-клетки, которые не экспрессируют молекулу CD11b (CD8+CD28CD11b ), играют важную роль в развитии иммунодефицита у ВИЧ-инфицированных пациентов. Показано также, что CD8+-Т-клетки, не экс-прессирующие после активации ни CD 11b- ни CD28-молекулы, способны проявлять супрессорную активность [19]. Повышение доли этих клеток в составе CD8+-ЛИО сочеталось со значительным снижением доли CD8+CD11b+CD28--цитотоксических клеток-эффекторов, количество которых в ПК не отличалось от группы сравнения (см. рисунок).

Данные о прогностической значимости Treg ЛИО при ПКРГШ противоречивы. Имеются сообщения как о благоприятном, так и о неблагоприятном значении этих клеток для исхода заболевания при данной форме опухоли [20, 21]. В настоящем исследовании обнаружено, что доля регуляторных CD4+CD25+CD127-/low-Т-клеток в опухоли была значительно выше, чем в ПК (см. рисунок). А. Lechner и соавт. [22] также обнаружили повышение числа регуляторных CD25+/CD127--Т-клеток в опухолевой ткани по сравнению с ПК у больных ПКРГШ. H.B. Jie и соавт. [23] продемонстрировали, что частота регуляторных CD4+FOXP3+CD25high-Т-клеток, экспресси-рующих ингибиторные рецепторы CTLA-4, TIM-3 и PD-1 и иммуносупрессивные молекулы LAP и CD39, была повышена в опухолевой ткани, а не в ПК, и их супрессорная активность была выше, чем у циркулирующих Treg.

На фоне высокого процента Т-клеток в составе ЛИО процентное содержание практически всех остальных определявшихся в работе популяций лимфоцитов было значительно ниже, чем в ПК. Ранее подобная закономерность была обнаружена нами и при раке молочной железы, раке яичников, меланоме, в том числе и при ПКРГШ [24]. В настоящее время стало очевидно, что ключевую роль в ускользании опухоли от иммунологического надзора играет взаимодействие ингибиторных рецепторов Т-клеток

и CD4+CD279+-(PD-1)-T-^eTOK в опухолевой ткани была повышена по сравнению с ПК. Значительная доля опухолевых клеток экспрессировала также ингибитор-ные лиганды CD274 (PD-L1) и CD273 (PD-L2).

Заключение

В настоящее время исследованию корреляции количества ЛИО и их популяций с прогнозом заболевания уделяется значительное внимание. Иммуносупрессия в опухолевом микроокружении обеспечивается как растворимыми, так и клеточными факторами, поддерживающими прогрессивный рост опухоли и быстрый рецидив заболевания [6-8]. Высокая доля как CD4+-, так и CD8+-регуляторных Т-клеток, резко сниженная доля цитотоксических CD8+CD11b+CD28-Т-лимфоцитов, клеток врожденного иммунитета, снижение ЦТП CD8+- и CD16+-лимфоцитов,

Литература

1. Rivera C. Essentials of oral cancer. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015; 8 (9): 11 884-94. URL: www.ijcep.com /ISSN:1936-2625/IJCEP0012234.

2. Стандартизованные показатели онкоэпидемиологической ситуации 2016 г. Евразийск. онкол. журн. 2018; 6 (2): 49-62.

3. Schoenfeld J.D. Immunity in head and neck cancer. Cancer Immunol. Res. 2015; 3 (1): 12-7. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0205.

4. Balermpas P., Michel Y., Wagenblast, J., Seitz O. et al. Tumor-infiltrating lymphocytes predict response to definitive chemoradiotherapy in head and neck cancer. Br. J. Cancer 2014; 110: 501-9. doi: 10.1038/ bjc.2013.640.

5. Nasman A., Romanitan M., Nordfors C., Grun N. et al. Tumor infiltrating CD8+ and Foxp3+ lymphocytes correlate to clinical outcome and human papillomavirus (HPV) status in tonsillar cancer. PLoS One. 2012; 7: e38711. doi: 10.1371/journal.pone.0038711.

6. Economopoulou P., Agelaki S., Perisanidis C., Giotakis E.I. et al. The promise of immunotherapy in head and neck squamous cell carcinoma. Ann. Oncol. 2016; 27 (9): 1675-85. doi: 10.1093/annonc/mdw226.

7. Ferris R.L., Whiteside T.L., Ferrone S. Immune escape associated with functional defects in antigen-processing machinery in head and neck cancer. Clin. Cancer Res. 2006; 12 (13): 3890-5. doi: 10.1158/1078-0432. CCR-05-2750.

8. Jie H.B., Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M. et al. Intratumoral regulatory T cells upregulate immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients. Br. J. Cancer. 2013; 109: 2629-35. doi: 10.1038/bjc.2013.645.

9. Fiorentini S., Licenziati S., Alessandri G., Castelli F. et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+ T lymphocytes with phenotype and function of both naive/memory and effector cells. J. Immunol. 2001; 166 (2): 900-7.

10. McFarland H.I., Nahill S.R., Maciaszek J.W., Welsh R.M. CD11b (Mac-1): a marker for CD8+ cytotoxic T cell activation and memory in virus infection. J. Immunol. 1992; 149 (4): 1326-33. PMID:1500720.

11. Christensen J.E., Andreasen S.O., Christensen J.P., Thomsen A.R. CD11b expression as a marker to distinguish between recently activated effector CD8(+) T cells and memory cells. Int. Immunol. 2001; 13 (4): 593-600. PMID:11282998.

12. Fu B., Tian Z., Wei H. Subsets of human natural killer cells and their regulatory effects. Immunology. 2014; 141 (4): 483-9. doi: 10.1111/ imm.12224.

13. Chikamatsu K., Sakakura K., Whiteside T.L., Furuya N. Relationships between regulatory T cells and CD8+ effector populations in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 2007; 29 (2): 120-7. doi: 10.1002/hed.20490.

14. Schaefer C., Kim G.G., Albers A., Hoermann K. et al. Characteristics of CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral circulation of patients with head and neck cancer. Br. J. Cancer. 2005; 92: 913-20. doi: 10.1038/sj.bjc.6602407.

обнаруженные в настоящем исследовании, согласуются с данными различных авторов о том, что ПКРГШ входит в число наиболее иммуносупрессивных опухолей человека. Повышение, по сравнению с ПК, доли СБ8+- и СБ4+-Т-клеток, экспрессирующих ингибиторный рецептор РБ-1, а также высокая экспрессия на опухолевых клетках РБ-Ь1 и РБ-Ь2 подтверждают это положение. Отсутствие различий в субпопуляционном составе ЛИО в зависимости от стадии заболевания и между выжившими и умершими пациентами также может указывать на иммуносупрессивное состояние локального иммунитета.

Полученные в данном исследовании результаты подтверждают, что наиболее полная информация о состоянии противоопухолевого иммунного ответа у онкологических пациентов может быть получена только при одновременном изучении иммунных клеток ПК и клеток, инфильтрирующих опухолевую ткань.

15. Lau K.M., Cheng S.H., Lo K.W., Lee S.A. et al. Increase in circulating Foxp3+CD4+CD25high regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients. Br. J. Cancer. 2007; 96: 617-22. doi: 10.1038/ sj.bjc.6603580.

16. Strauss L., Bergmann C., Szczepanski M., Gooding W. et al. A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+ T cells secreting interleukin-10 and transforming growth factor-beta1 mediates suppression in the tumor microenvironment. Clin. Cancer Res. 2007; 13 : 4345-54. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-0472.

17. Yamada H., Martin P.J., Bean M.A., Braun M.P. et al. Monoclonal antibody 9.3 and anti-CD11 antibodies define reciprocal subsets of lymphocytes. Eur. J. Immunol. 1985, 15: 1164. doi: 10.1002/ eji.1830151204.

18. Caruso A., Fiorentini S., Licenziati S., Alessandri G. et al. Expansion of rare CD8+ CD28- CD11b- T cells with impaired effector functions in HIV-1-infected patients. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2000; 24 (5): 465-74. PMID:11035618.

19. Freedman M.S., Ruijs T.C., Blain M., Antel J.P. Phenotypic and functional characteristics of activated CD8+ cells: a CD11b-CD28-subset mediates noncytolytic functional suppression. Clin. Immunol. Immunopathol. 1991; 60 (2): 254-67.

20. Bron L., Jandus C., Andrejevic-Blant S., Speiser D.E. et al. Prognostic value of arginase-II expression and regulatory T-cell infiltration in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J. Cancer. 2013; 132 (3): 85-93. doi: 10.1002/ijc.27728.

21. Tabachnyk M., Distel L.V., Büttner M., Grabenbauer G.G. et al. Radiochemotherapy induces a favourable tumour infiltrating inflammatory cell profile in head and neck cancer. Oral Oncol. 2012; 48 (7): 594-601. doi: 10.1016/j.oraloncology.2012.01.024.

22. Lechner A., Schlößer H., Rothschild S.I., Thelen M. et al. Characterization of tumor-associated T-lymphocyte subsets and immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2017; 8 (27): 44 418-33. doi: 10.18632/oncotarget.17901.

23. Jie H.B., Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M. et al. Intratumoral regulatory T cells upregulate immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients. Br. J. Cancer. 2013; 109: 2629-35. doi: 10.1038/bjc.2013.64575.

24. Заботина Т.Н., Короткова О.В., Борунова А. А., Табаков Д.В. и др. Многопараметровое исследование иммунофенотипа лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль у онкологических больных. Рос. онкол. журн. 2016; 21 (1-2): 51-4.

25. Chow L.Q.M., Haddad R., Gupta S., Mahipal A. et al. Antitumor activity of pembrolizumab in biomarker-unselected patients with recurrent and/or metastatic head and neck squamous cell carcinoma: results from the phase Ib KEYN0TE-012 expansion cohort. J. Clin. Oncol. 2016; 34 (32): 3838-45. doi: 10.1200/JCO.2016.68.1478.

References

1. Rivera C. Essentials of oral cancer. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015; 8 (9): 11 884-94. URL: www.ijcep.com /ISSN:1936-2625/IJCEP0012234.

2. Standardized indicators of the oncoepidemiological situation in 2016. Evraziyskiy onkologicheskiy zhurnal. 2018; 6

3. Schoenfeld J.D. Immunity in head and neck cancer. Cancer Immunol. Res. 2015; 3 (1): 12-7. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0205.

4. Balermpas P., Michel Y., Wagenblast, J., Seitz O., et al. Tumor-infiltrating lymphocytes predict response to definitive chemoradiotherapy in head and neck cancer. Br. J. Cancer 2014; 110: 501-9. doi: 10.1038/ bjc.2013.640.

5. Nasman A., Romanitan M., Nordfors C., Grun N., et al. Tumor infiltrating CD8+ and Foxp3+ lymphocytes correlate to clinical outcome and human papillomavirus (HPV) status in tonsillar cancer. PLoS One. 2012; 7: e38711. doi: 10.1371/journal.pone.0038711.

6. Economopoulou P., Agelaki S., Perisanidis C., Giotakis E.I., et al. The promise of immunotherapy in head and neck squamous cell carcinoma. Ann. Oncol. 2016; 27 (9): 1675-85. doi: 10.1093/annonc/ mdw226.

7. Ferris R.L., Whiteside T.L., Ferrone S. Immune escape associated with functional defects in antigen-processing machinery in head and neck cancer. Clin. Cancer Res. 2006; 12 (13): 3890-5. doi: 10.1158/1078-0432. CCR-05-2750.

8. Jie H.B., Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M., et al. Intratumoral regulatory T cells upregulate immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients. Br. J. Cancer. 2013; 109: 2629-35. doi: 10.1038/bjc.2013.645.

9. Fiorentini S., Licenziati S., Alessandri G., Castelli F., et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+ T lymphocytes with phenotype and function of both naive/memory and effector cells. J. Immunol. 2001; 166 (2): 900-7.

10. McFarland H.I., Nahill S.R., Maciaszek J.W., Welsh R.M. CD11b (Mac-1): a marker for CD8+ cytotoxic T cell activation and memory in virus infection. J. Immunol. 1992; 149 (4): 1326-33. PMID:1500720.

11. Christensen J.E., Andreasen S.O., Christensen J.P., Thomsen A.R. CD11b expression as a marker to distinguish between recently activated effector CD8(+) T cells and memory cells. Int. Immunol. 2001; 13 (4): 593-600. PMID:11282998.

12. Fu B., Tian Z., Wei H. Subsets of human natural killer cells and their regulatory effects. Immunology. 2014; 141 (4): 483-9. doi: 10.1111/ imm.12224.

13. Chikamatsu K., Sakakura K., Whiteside T.L., Furuya N. Relationships between regulatory T cells and CD8+ effector populations in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 2007; 29 (2): 120-7. doi: 10.1002/hed.20490.

14. Schaefer C., Kim G.G., Albers A., Hoermann K., et al. Characteristics of CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral

circulation of patients with head and neck cancer. Br. J. Cancer. 2005; 92: 913-20. doi: 10.1038/sj.bjc.6602407.

15. Lau K.M., Cheng S.H., Lo K.W., Lee S.A., et al. Increase in circulating Foxp3+CD4+CD25high regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients. Br. J. Cancer. 2007; 96: 617-22. doi: 10.1038/ sj.bjc.6603580.

16. Strauss L., Bergmann C., Szczepanski M., Gooding W., et al. A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+ T cells secreting interleukin-10 and transforming growth factor-beta1 mediates suppression in the tumor microenvironment. Clin. Cancer Res. 2007; 13: 4345-54. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-0472.

17. Yamada H., Martin P.J., Bean M.A., Braun M.P., et al. Monoclonal antibody 9.3 and anti-CD11 antibodies define reciprocal subsets of lymphocytes. Eur. J. Immunol. 1985, 15: 1164. doi: 10.1002/ eji.1830151204.

18. Caruso A., Fiorentini S., Licenziati S., Alessandri G., et al. Expansion of rare CD8+ CD28- CD11b- T cells with impaired effector functions in HIV-1-infected patients. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2000; 24 (5): 465-74. PMID:11035618.

19. Freedman M.S., Ruijs T.C., Blain M., Antel J.P. Phenotypic and functional characteristics of activated CD8+ cells: a CD11b-CD28-subset mediates noncytolytic functional suppression. Clin. Immunol. Immunopathol. 1991; 60 (2): 254-67.

20. Bron L., Jandus C., Andrejevic-Blant S., Speiser D.E., et al. Prognostic value of arginase-II expression and regulatory T-cell infiltration in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J. Cancer. 2013; 132 (3): 85-93. doi: 10.1002/ijc.27728.

21. Tabachnyk M., Distel L.V., Büttner M., Grabenbauer G.G., et al. Radiochemotherapy induces a favourable tumour infiltrating inflammatory cell profile in head and neck cancer. Oral Oncol. 2012; 48 (7): 594-601. doi: 10.1016/j.oraloncology.2012.01.024.

22. Lechner A., Schlößer H., Rothschild S.I., Thelen M., et al. Characterization of tumor-associated T-lymphocyte subsets and immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2017; 8 (27): 44 418-33. doi: 10.18632/oncotarget.17901.

23. Jie H.B., Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M., et al. Intratumoral regulatory T cells upregulate immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients. Br. J. Cancer. 2013; 109: 2629-35. doi: 10.1038/bjc.2013.64575.

24. Zabotina T.N., Korotkova O.V., Borunova A.A., Tabakov D.V., et al. Multiparameter investigation of immunophenotype of tumor infiltrating lymphocytes in cancer patients. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal. 2016; 21

25. Chow L.Q.M., Haddad R., Gupta S., Mahipal A., et al. Antitumor activity of pembrolizumab in biomarker-unselected patients with recurrent and/or metastatic head and neck squamous cell carcinoma: results from the phase Ib KEYNOTE-012 expansion cohort. J. Clin. Oncol. 2016; 34 (32): 3838-45. doi: 10.1200/JCO.2016.68.1478.