ПРЕПАРАТ ДЛЯ МЕСТНОГО НАНЕСЕНИЯ НА КОЖУ, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИЗВОДНОЕ ФЛАВАНОНА
PREPARATION FOR LOCAL APPLICATION ON SKIN, WHICH CONTAINS FLAVANON DERIVATIVE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к препарату для местного нанесения на кожу, и более конкретно, к препарату для местного нанесения на кожу, содержащему производное флаванона. Настоящее изобретение также относится к способу усиления способности фибробласта к продукции коллагена. Далее, настоящее изобретение относится к способу скрининга вещества, имеющего ранозаживляющий эффект.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Кожа состоит из ороговевающего слоя, эпидермиса, базальной мембраны и дермы. Считается, что структура дермы имеет значительное влияние на свойства "кожи", которое обычно может быть обнаружено. Также считается, что одним из важных компонентов дермы являются коллагены, которые имеют значительное влияние на свойства эластичности и прочего. Коллагены дермы включают в себя коллаген I, коллаген III, коллаген IV, коллаген V, коллаген VII, и подобные, и имеют их собственные важные функции. Эти коллагены образуются из проколлагена, продуцируемого фибробластами (см., например, непатентный документ 1, непатентный документ 2 и непатентный документ 3). Уменьшение способности к продукции коллагенов (включая проколлаген) фибробластами, как также известно, имеет место из-за старения и повреждения, вызываемых УФ-лучами, и является ответственным за нарушение функции кожи. Другими словами, важным фактором восстановления функции кожи является восстановление способности фибробласта к продукции коллагенов после повреждения.
Внешний вид человека изменяется с возрастом и обнаруживает признаки старения. Один из таких признаков представляет собой образование морщин на коже, и основной задачей косметических препаратов является предотвращение образования таких признаков. Считается, что один из эволюционных механизмов образования морщин может включать в себя разрушение структуры пучков коллагеновых волокон дермы или нарушение такой структуры. Иногда, разрушение или нарушение структуры пучков коллагеновых волокон дермы ведет к частичной потере самих пучков коллагеновых волокон дермы. Часть кожи в этом состоянии может иметь структуру, подобную той, которую имеет раненая кожа и обычно обозначается термином "большая морщина". Как известно, терпены, такие как монотерпен или тритерпен, или их производное, применяются для восстановления пучков коллагеновых волокон дермы для исправления разрушения или нарушения структуры пучков коллагеновых волокон дермы (см., например, патент 1). В добавление, также известно, что некоторые из растительных экстрактов имеют корректирующее действие на пучки коллагеновых волокон дермы (см., например, патент 2 и патент 3). Среди растительных экстрактов экстракт Hypericum, как известно, является превосходным в отношении корректирующего действия на пучки коллагеновых волокон дермы (см., например, патент 4). Эти терпены и экстракты эффективны для усиления способности фибробласта к продукции коллагена и, если пучки коллагеновых волокон локализованы вокруг, они могут достраивать пучки коллагеновых волокон вдоль такого пучка волокон. Однако, эти вещества не могут создавать пучки коллагеновых волокон удовлетворительно в случае, когда сами пучки коллагеновых волокон дермы присутствуют в недостаточном количестве и отсутствуют вокруг фибробластов. Следовательно, вышеупомянутые терпены и экстракты не могут удовлетворительно ускорять коррекцию пучков коллагеновых волокон в сегменте, в котором отсутствуют пучки коллагеновых волокон, таком как большая морщина. Следовательно, существует проблема, состоящая в том, что не может быть достигнут достаточный эффект улучшения в отношении вышеупомянутого симптома.
В добавление, кожа представляет собой как важную ткань для защиты живого тела, так и орган дыхания, таким образом, любой дефект кожи будет представлять опасность как для защитного механизма, так и дыхательной функции живого тела. Таким образом, существует подтвержденная теория, что потеря одной трети эпидермиса при повреждающих ожогах или подобном ведет к опасности для жизни. В этом контексте, в течение многих лет имеется спрос на развитие технологии для быстрой регенерации поврежденного сегмента кожи. Вещества с ранозаживляющим действием, которые известны в технике, включают в себя, например, экстракт Curcuma и лактоферрин (см., например, патент 5 и патент 6). Однако любое из этих веществ имеет недостаточный эффект регенерации кожной ткани, так как нет корректирующего действия на структуру пучков коллагеновых волокон дермы. В таких обстоятельствах, в качестве веществ для заживления раны для активации роста клеток и усиления их продуктивности по коллагену, были исследованы инулины (см., например, патент 7), гидролизаты коллагена (см., например, патент 8), лактоферины (см., например, патент 6) и так далее. Ранозаживляющее действие этих веществ было подтверждено через активность в регенерации кожной ткани или экспрессии РНК ферментов, или подобном, включенных в пролиферативную активность фибробластов. Однако какое-либо явление, явно ведущее к действительному регенерированию кожи посредством действия этих веществ, вообще не наблюдалось. Далее, в отношении этих веществ, вообще не наблюдалось какое-либо влияние на реконструкцию поврежденной части живого тела, например, при недостатке структуры пучков коллагеновых волокон, вызываемом раной.
Таким образом, не было найдено вещество, имеющее достаточный эффект на регенерацию ткани, улучшение морщин, заживление раны, и так далее, в ткани живого тела с частью, поврежденной при потере структуры пучков коллагеновых волокон, или подобным нарушениям.
С другой стороны, фаррерол представляет собой соединение, имеющее флавононовую структуру и, как известно, содержится в различных растениях, и уже известен способ его синтеза (см., например, патент 9, патент 10, и патент 11). Однако технология для включения его в препарат для местного нанесения на кожу совершенно не была известна. Кроме того, какое-либо корректирующее действие на пучки коллагеновых волокон дермы и эффект ускорения заживления раны совершенно не были известны.
Далее, исследование совместного культивирования показало, что действие кератиноцитов может вызывать улучшение способности фибробласта к продукции коллагена (см., например, непатентный документ 4). Однако какое-либо вещество, влияющее на кератиноциты в направлении усиления способности фибробласта к продукции коллагена, не было известно.
С другой стороны, в отношении способности фибробласта к продукции коллагена, любое из вышеупомянутых веществ для заживления раны, такое как инулины, гидролизаты коллагена и лактоферрины, было исследовано в качестве вещества для усиления способности фибробласта к продукции коллагена. Однако улучшение в способности фибробласта к продукции коллагена является необходимым, но не достаточным условием для ускорения заживления раны. По состоянию на сегодняшний день, существует вещество, неэффективное в отношении ускорения заживления раны, даже имеющее способность улучшать продукцию коллагена.
В добавление, способ скрининга эффективности ускорения заживления раны также предполагает тестирование миграционной активности фибробластов (см., например, непатентный документ 5). В этом способе коллагеновый гель получают с применением фибробластов и затем создают в нем дефектный сегмент, с последующим измерением миграции фибробластов в дефектный сегмент. Однако улучшение миграционной способности фибробластов представляет собой необходимое, но не достаточное, условие для ускорения заживления раны. Следовательно, существует компонент без какого-либо действия на ускорение заживления раны, даже если он исследован по отношению к миграционной способности фибробластов.
Другими словами, эти способы скрининга не пригодны для обнаружения вещества, имеющего как эффект улучшения способности фибробласта к продукции коллагена, так и эффект улучшения миграционной способности фибробластов, которая требуется для ускорения заживления раны. В таких обстоятельствах, имеется потребность в развитии технологии получения вещества, имеющего превосходный эффект ускорения заживления раны.
[Патент 1] JP 2002-104921A
[Патент 2] JP 2002-29988A
[Патент 3] JP 2002-29987A
[Патент 4] JP 2002-29986A
[Патент 5] JP 11-199461A
[Патент 6] JP 07-196529A
[Патент 7] JP 2004-501176A
[Патент 8] JP 2003-137807A
[Патент 9] WO 02/092110
[Патент 10] EP 122053A
[Патент 11] JP 58-21678A
[Непатентный документ 1] Keene et al., J. Cell. Biol., 104, 611-621 (1987)
[Непатентный документ 2] Shimizu et al., Lab. Invest., Jun., 76(6), 753-63 (1997)
[Непатентный документ 3] Vazquez F. et al, Maturitas, 25, 209-15 (1996)
[Непатентный документ 4] Eming S.A. et al., Hum. Gene Ther., 9(4), 529-39 (1998)
[Непатентный документ 5] Roman O'Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27(2), 266-270 (2004)
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к препарату для местного нанесения на кожу, имеющей превосходное корректирующее действие на поврежденную структуру пучков коллагеновых волокон дермы (в дальнейшем, также просто обозначаемую как "пучки коллагеновых волокон"). В частности, настоящее изобретение относится к технологии ускорения заживления раны на поврежденной области кожи, например, на большой морщине или ране, путем усиления способности живого тела к регенерации ткани, которая представлена, например, способностью фибробласта к продукции коллагена, или подобному, в дерме.
Далее, настоящее изобретение относится к технологии регенерации кожной ткани. В частности, настоящее изобретение относится к технологии для усиления способности фибробласта к продукции коллагена путем воздействия на кератиноциты.
Далее, настоящее изобретение относится к способу скрининга вещества, имеющего превосходный эффект ускорения заживления раны.
Авторы настоящего изобретения искали вещество, которое может быть включено в препарат для местного нанесения на кожу, имеющее эффекты усиления способности фибробласта к продукции коллагена и ускорения заживления раны, и в конечном итоге обнаружили, что производные флаванона, такие как фаррерол, может оказывать превосходное действие в этом отношении. Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что производные флаванона могут влиять на кератиноциты в отношении усиления способности фибробласта к продукции коллагена. Далее, авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение, установив, что косметические средства, содержащие производные флаванона, имеют превосходные эффекты улучшения состояния морщин и препараты для местного нанесения на кожу, содержащие производные флаванона, имеют превосходное действие по ускорению заживления раны.
В добавление, авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение, установив, что вещество, имеющее эффект ускорения заживления раны, может быть эффективно подвергнуто скринингу путем тестирования корректирующего действия на пучки коллагеновых волокон в способе с использованием модели раны кожи, в процессе поисков вещества, имеющего активность ускорения заживления раны.
Таким образом, настоящее изобретение описано ниже.
[1] Во-первых, изобретение относится к препарату для местного нанесения на кожу (в дальнейшем также обозначаемой как "препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению"), содержащей производное флаванона, представленное следующей общей формулой (1), и/или его соль.
Общая формула (1)
В общей формуле (1), R1, R2, R3, R4 и R5, каждый независимо, представляют собой атом водорода или алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода.
Производное флаванона предпочтительно представляет собой фаррерол.
Фаррерол
-6
Далее, в предпочтительном варианте осуществления, препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению содержит экстракт Hypericum erectum, Guttiferae, содержащий от 10до 0,1% по массе производного флаванона и/или его соли.
В добавление, препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может быть применена для нормализации структуры кожи. В частности, она предпочтительно применяется для коррекции поврежденных пучков коллагеновых волокон дермы. Далее, препарат предпочтительно применяется для облегчения регенерации поврежденной области кожи и закрытия поврежденной области регенерированной тканью и излечение раны. Кроме того, ее также предпочтительно применять для усиления активности кератиноцитов для повышения способности фибробласта к продукции коллагена.
[2] Во-вторых, изобретение относится к применению производного флаванона, представленному общей формулой (1), и/или его соли, при приготовлении препарата для местного нанесения на кожу.
[3] В-третьих, изобретение относится к способу нормализации структуры кожи, предусматривающему введение в кожу препарата для местного нанесения на кожу, который содержит производное флаванона, представленное общей формулой (1), и/или его соль.
В вышеупомянутом втором и третьем аспектах изобретения, предпочтительные варианты производного флаванона и предпочтительное применение препарата для местного нанесения на кожу являются такими же, как и в первом аспекте изобретения.
[4] В-четвертых, изобретение относится к способу усиления действия кератиноцитов для увеличения способности фибробласта к продукции коллагена, где способ включает введение производного флаванона, представленного общей формулой (1), и/или его соли, в условиях совместного существования картиноцитов с фибробластами.
Предпочтительный вариант производного флаванона является таким же, как и в первом аспекте изобретения.
Введение может представлять собой чрескожное введение. Более конкретно, производное флаванона и/или его соль предпочтительно содержится в препарате для местного нанесения на кожу и затем наносится на кожу.
[5] В-пятых, изобретение относится к способу скрининга вещества, имеющему ранозаживляющее действие, где способ включает:
культивирование нормальных фибробластов животного в присутствии тестируемого вещества;
приготовление коллагенового геля путем добавления раствора коллагеновой среды к полученной культуре;
культивирование фибробластов в коллагеновом геле в присутствии тестируемого вещества;
образования поврежденной области в коллагеновом геле;
культивирование фибробластов в условиях совместного существования коллагенового геля, имеющего поврежденную область, с тестируемым веществом;
и наблюдения степени заполнения или восстановления поврежденной области в течение культивирования (в дальнейшем также обозначается как "способ скрининга по настоящему изобретению").
Далее, в способе скрининга по настоящему изобретению, тестируемое вещество, имеющее эффект ускорения заживления раны, может быть протестировано путем проведения сравнения между степенью заполнения или восстановления поврежденной области в присутствии тестируемого вещества и степенью заполнения или восстановления поврежденной области в отсутствие тестируемого вещества.
В особенности, когда степень заполнения или восстановления поврежденной области в присутствии тестируемого вещества является большей, чем степень заполнения или восстановления поврежденной области в отсутствие тестируемого вещества, можно считать, что тестируемое вещество имеет эффект ускорения заживления раны.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 представляет собой диаграммы, иллюстрирующие результаты, полученные в Примере 1, в котором диаграмма 1 представляет зависимость между числом дней инкубации и числом клеток в отсутствие обработки гепарином, диаграмма 2 представляет зависимость между числом дней инкубации и числом клеток при наличии обработки 0,01%-гепарином.
Фиг. 2 представляет собой группу фотографий поведения фибробластов, наблюдаемом в модели заживления раны согласно Примеру 2.
Фиг. 3 представляет собой группу фотографий, характеризующих построение пучков коллагеновых волокон, наблюдаемое в Примере 3.
Фиг. 4 представляет собой группу фотографий состояния поврежденной области коллагенового геля, наблюдаемое в Примере 6.
Фиг. 5 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую результаты, полученные в эксперименте 1 Примера 9, в котором величины оптической плотности (450 нм) представлены в виде величины отклика на добавление растворов фаррерола соответствующих концентраций.
Фиг. 6 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую результаты, полученные в эксперименте 2 Примера 9, в котором скорости роста кератиноцитов представлены в виде величины отклика на добавление растворов фаррерола соответствующих концентраций.
Фиг. 7 представляет собой серию фотографий вида кератиноцитов, наблюдаемого в эксперименте 2 Примера 9.
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую результаты, полученные в эксперименте 3 Примера 9, в котором количество полученного проколлагена представлено в виде величины отклика на добавление растворов фаррерола соответствующих концентраций.
Фиг. 9 представляет собой серию фотографий состояния поврежденной области коллагенового геля, наблюдаемое в Примере 11.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
(A) Производное флаванона и его соль, применяемые в настоящем изобретении
Производное флаванона, которое может быть применено по настоящему изобретению, представляет собой любое из соединений, представленных общей формулой (1).
В общей формуле (1), R1, R2, R3, R4 и R5, каждый независимо, представляют собой атом водорода или алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода.
По меньшей мере один из R1, R2 и R4 предпочтительно представляет собой атом водорода, и, в частности, все из трех заместителей предпочтительно представляют собой атомы водорода. Примеры алкильной группы включают в себя метильную группу, этильную группу, пропильную группу и бутильную группу. Из них, в частности, метильная группа является предпочтительной.
Далее, по меньшей мере один из R3 и R5 предпочтительно представляет собой алкильную группу, имеющую 1-4 атома углерода, и в частности, оба из заместителей предпочтительно представляют собой алкильные группы, имеющие 1-4 атома углерода. Примеры алкильной группы включают в себя метильную группу, этильную группу, пропильную группу и бутильную группу. Из них, метильная группа является более предпочтительной. В частности, как R3, так и R5 предпочтительно представляют собой метильные группы.
Примеры таких производных флаванона включают в себя фаррерол, метилфаррерол и диметилфаррерол.
Производные флаванона могут быть синтезированы из известных соединений согласно JP 58-21678A. В добавление, они также присутствуют в растениях, таким образом, они могут быть также выделены и очищены из растительных экстрактов. Фаррерол, одно из соединений, представленное общей формулой (1), может быть выделен и очищен из экстракта растения Hypericum erectum, Guttiferae. Пример способа его получения будет описан ниже. Нет необходимости говорить, что, когда производное флаванона растительного происхождения, и/или его соль, содержится в препарате для местного нанесения на кожу, как описано далее, может быть также применен экстракт, содержащий заданную концентрацию производного флаванона, и/или его соли, достаточную для достижения желаемого эффекта.
Пример получения 1
13
10 л 80% Водного раствора этанола добавляли к 1 кг высушенной надземной части Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae) и затем кипятили с обратным холодильником в течение 4 часов при перемешивании. После охлаждения, нерастворимый остаток удаляли фильтрованием и затем концентрировали под уменьшенным давлением с последующей лиофильной сушкой. В результате получали 51 г аморфного вещества. Этот продукт диспергировали в воде, помещали в DIAION HP20, промывали потоком 5 л воды и 5 л 50% водного раствора этанола, в такой последовательности, и смывали 99% этанолом. Полученный элюат фракционировали. Затем фракции, полученные таким образом, далее подвергали тонкослойной хроматографии и HPLC для контроля их содержания, с целью совместного объединения фракций, включающих то же отдельное вещество. С другой стороны, фракции, включающие два или более компонента, очищали далее, подвергая их хроматографии повторно. Полученную фракцию, содержащую один компонент, исследовали на его действие в отношении реконструкции пучков коллагеновых волокон. Затем структуру отдельного компонента из фракции, обнаруживающей такое сильное действие, идентифицировали с применением ЯМР на протонах, элементного анализа, масс-анализа, и C-ЯМР. В результате, компонент представлял собой фаррерол с выходом 3,2 мг. В добавление, около 0,006% по массе фаррерола было включено в продукт, извлеченный растворителем, который получали из материала, экстрагированного 80% водным раствором этанола.
Предпочтительные примеры соли производного флаванона включают в себя, без ограничения, если они являются физиологически приемлемыми, соли щелочного металла, такие как соль натрия и соль калия; соли щелочноземельного металла, такие как соль кальция и соль магния; соли органического амина, такие как аммониевая соль, соль триэтиламина, соль триэтаноламина и соль моноэтаноламина; соли основных аминокислот, такие как соль лизина и аргинат.
Вышеупомянутое производное флаванона и его соль имеют эффект ускорения способности фибробластов к реконструкции структуры пучков коллагеновых волокон дермы. Более конкретно, производное флаванона позволяет фибробластам мигрировать в любую область на одном уровне, где не присутствует коллагеновое волокно и одновременно увеличивает способность фибробласта к продукции коллагена как такового, таким образом корректируя пучки коллагеновых волокон в поврежденной области ткани. Далее, заживление раны может быть ускорено путем ускорения регенерации кожной ткани в поврежденной области кожи и усиления способности регенерирующей ткани закрывать поврежденную область.
(B) Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению
Характерным признаком препарата для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению является наличие производного флаванона и/или его соли. Например, препарат может содержать производное флаванона и/или его соль в виде растительного экстракта. Производное флаванона может предпочтительно представлять собой фаррерол. Предпочтительно, препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может включать в себя экстракт Hypericum erectum, содержащий фаррерол.
Как описано выше, производное флаванона и его соль имеют эффект коррекции структуры пучков коллагеновых волокон дермы. Таким образом, препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может быть применен для нормализации структуры кожи. Фраза "нормализация структуры кожи" здесь относится к меньшей степени нарушения структур эпидермиса, дермы и подкожного жира, которые образуют кожу. Более конкретно, например, он включает в себя коррекцию поврежденной структуры пучков коллагеновых волокон дермы. Фраза "коррекция поврежденной структуры пучков коллагеновых волокон дермы" здесь относится к построению структуры пучков коллагеновых волокон дермы в области, где структура пучков коллагеновых волокон дермы является нарушенной. Фраза "структура пучков коллагеновых волокон дермы является нарушенной" обозначает, что структура пучков коллагеновых волокон не может быть сохранена в нормальном виде. Например, она включает в себя следующее: пучок коллагеновых волокон становится тонким и слабым, количество коллагеновых волокон становится небольшим, коллагеновые волокна разрываются или пучков коллагеновых волокон не хватает. Далее, фраза "нормализация структуры кожи" также включает в себя регенерацию поврежденной области кожи. Она также включает в себя восстановление поврежденной области и ускорение закрытия поврежденной области регенерированной тканью, что способно предотвращать попадание инфекции через поврежденную область и восстанавливать защитный механизм и дыхательную функцию кожи. Здесь фраза "дефект кожи" обозначает поврежденное состояние структуры кожи, где, например, образовались шероховатость кожи, морщины и рана. Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению является особенно пригодным для заживления раны. Далее, фраза "нормализация структуры кожи" также подразумевает, что активность кератиноцитов к повышению способности фибробласта к продукции коллагена усилена.
Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может применяться без любого специфического ограничения до тех пор, пока наружно наносится на кожу. Примеры препарата для местного нанесения включают в себя косметические средства, содержащие псевдо-лекарства, кожные препараты для наружного применения и наружно наносимые дерматологические составы. Из них, особенно предпочтительно наносить косметические средства и кожные препараты для наружного применения. Например, косметические средства являются предпочтительными для улучшения состояния морщин и небольшой шероховатости кожи. В частности, косметические средства предпочтительно применять для восстановления пучков коллагеновых волокон дермы при расстройстве, вызванном старением под действием света, и для регенерации структуры пучков коллагеновых волокон дермы, поврежденных ранением, или при сильном повреждении действием света. В противоположность этому, кожные препараты для наружного применения предпочтительны для создания улучшения при сильной шероховатости кожи и для заживления раны.
Дозированная форма препарата для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению не ограничена специально и может быть любой из дозированных форм, которая может быть выбрана из традиционных препаратов для местного нанесения на кожу в зависимости от предполагаемого применения. Предпочтительные примеры дозированных форм косметических средств включают в себя дозированную форму, обычно применяемую для основного ухода за кожей, такую как лосьон, молочко, эссенция, крем и тампон. В добавление, предпочтительные примеры дозированных форм препаратов для местного нанесения на кожу включают в себя мазь, лосьон, крем, молочко и эссенцию.
-6
-4
Содержание производного флаванона и/или его соли в препарате для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, которое может быть установлено в зависимости от нанесения, цели и способа введения препарата для местного нанесения на кожу, предпочтительно составляет 1×10% по массе и, более предпочтительно, 1×10% по массе в качестве нижнего предела. Верхний предел предпочтительно составляет 1% по массе и, более предпочтительно, 0,1% по массе.
-6
-4
Далее, особенно в случае препаратов для местного нанесения на кожу, применяемых для заживления раны, содержание производного флаванона и/или его соли может составлять предпочтительно от 1×10 М и, более предпочтительно, 1×10 М в качестве нижнего предела и предпочтительно 1 М и, более предпочтительно, 0,1 М в качестве верхнего предела.
-6
-5
Далее, когда растительный экстракт, содержащий производное флаванона и/или его соль, содержится в препарате для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, предпочтительно применение экстракта с увеличенной концентрацией производного флаванона и/или его соли путем очистки производного флаванона и/или соли. Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению не включает препарат для местного нанесения на кожу, применяемый для коррекции пучков коллагеновых волокон дермы, содержащий неочищенный экстракт Hypericum erectum и не содержащий дополнительного производного флаванона, и/или его соли, отличного от производного, изначально включенного в экстракт. Растительный экстракт, который может быть применен в препарате для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, может предпочтительно представлять собой экстракт с увеличенной концентрацией фаррерола, полученный путем очистки растительного экстракта Hypericum erectum. Концентрация производного флаванона и/или его соли в растительном экстракте составляет от 10 до 0,1% по массе и, более предпочтительно, от 10 до 0,01% по массе. В случае применения такого растительного экстракта, содержание растительного экстракта в препарате для местного нанесения на кожу предпочтительно составляет от 0,001 до 10% по массе и, более предпочтительно, от 0,01 до 1% по массе. Здесь содержание растительного экстракта является синонимичным его содержанию в продукте, выделяемым растворителем.
6
6
6
2
12
15
Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может содержать необязательные компоненты, применяемые обычно в препарате для местного нанесения на кожу, также как существенные компоненты. Предпочтительные примеры такого необязательного компонента включают в себя: масла/воски, такие как масло австралийского ореха, масло авокадо, зерновое масло, оливковое масло, рапсовое масло, кунжутное масло, касторовое масло, подсолнечное масло, хлопковое масло, масло жожоба, кокосовое масло, пальмовое масло, жидкий ланолин, восстановленное кокосовое масло, восстановленное масло, растительный воск, отвержденное касторовое масло, пчелиный воск, канделильский воск, карнаубский воск, воск туи, животный воск, восстановленный животный воск, отвержденный ланолин и воск жожоба; углеводороды, такие как жидкий парафин, сквалан, пристан, озокерит, парафин, церезин, вазелин и микрокристаллический воск; высшие жирные кислоты, такие как олеиновую кислоту, изостеариновую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, бегеновуб кислоту и ундециленовую кислоту; высшие спирты, такие как цетиловый спирт, стеариловый спирт, изостеариловый спирт, бегеновый спирт, октилдодеканол, миристиловый спирт, ицетостеариловый спирт; синтетические эфирные масла, такие как цетилизооктаноат, изопропилмиристат, гексилдецилизостеарат, диизопропиладипат, ди-2-этилгексилсебацинат, цетиллактат, диизостеарилмалат, этиленгликоль-ди-2-этилгексаноат, неопентилгликольдикарат, ди-2-гептилундеканоат глицерина, три-2-этилгексаноат глицерина, три-2-этилгексаноат триметилолпропана, триметилолпропантриизостеарат и пентаэритрол тетра-2-этилгексаноат; кремниевое масло, такое как цепные полисилоксаны, такие как диметилполисилоксан, метилфенилполисилоксан и дифенилполисилоксан; циклические полисилоксаны, такие как октаметилциклотетрасилоксан, декаметилциклопентасилоксан и додекаметилциклогексансилоксан; модифицированные полисилоксаны, такие как амино-модифицированный полисилоксан, полиэфирный модифицированный полисилоксан, алкил-модифицированный полисилоксан и модифицированный фтором полисилоксан; анионные поверхностно-активные вещества, такие как жирнокислотные мыла (такие как лаурат натрия и пальмитат натрия), лаурилсульфат калия и алкилсульфатный эфир триэтаноламина; катионные поверхностно-активные вещества, такие как хлорид стеарил триметиламмония, хлорид бензалкония и оксид лауриламина; амфотерные поверхностно-активные вещества, такие как основанные на имидазолине амфотерные поверхностно-активные вещества (такие как динатриевая соль 1-карбоксиэтилокси-2-кокоил-2-имидазолинийгидроксида), основанные на бетаине поверхностно-активные вещества (такие как алкильный бетаин, амидный бетаин и сульфобетаин), и ацилметилтаурин; неионные поверхностно-активные вещества, такие как жирнокислотные эфиры сорбита (такие как моностеарат сорбита и сесквиолеат сорбита), жирнокислотные эфиры глицерина (такие как моностеарат глицерина), пропиленгликолевые жирнокислотные эфиры (такие как моностеарат пропиленгликоля), производные отвержденное касторовое масло, алкиловый эфир глицерина, POE-жирнокислотные эфиры сорбита (такие как POE-моноолеат сорбита и моностеарат полиоксиэтиленсорбита), POE-жирнокислотные эфиры сорбита (такие как POE-сорбит монолаурат), POE жирнокислотные эфиры глицерина (такие как POE-моноизостеарат глицерина), POE-жирнокислотные эфиры (такие как моноолеат полиэтиленгликоля и POE-дистеарат), POE-алкильные простые эфиры (такие как POE2-октилдодецильный простой эфир), POE-алкилфенильные простые эфиры (такие как POE-нонилфенильный простой эфир), плюроновые типы, POE/POP-алкильные простые эфиры (такие как POE/POP2-децилтетрадецильный простой эфир), тетроновые типы, POE-касторовое масло/производные отвержденного касторового масла (такие как POE-касторовое масло и POE-отвержденное касторовое масло), жирнокислотный эфир сахарозы и алкилгликозиды; полиосновные спирты, такие как полиэтиленгликоль, глицерин, 1,3-бутиленгликоль, эритрит, сорбит, ксилит, маннит, пропиленгликоль, дипропиленгликоль, диглицерин, изопернгликоль, 1,2-пентандиол, 2,4-гександиол, 1,2-гександиол и 1,2-октандиол; увлажняющие компоненты, такие как пирролидонкарбоксилат натрия, лактат и лактат натрия; тонкодисперсные включения, такие как слюда, тальк, каолин, синтетическая слюда, карбонат кальция, карбонат магния, кремниевый ангидрид (оксид кремния), оксид алюминия и сульфат бария, чьи поверхности могут быть обработаны; неорганические пигменты, такие как красный оксид железа, желтый оксид железа, черный оксид железа, оксид кобальта, ультрамарин синий, железный синий, оксид титана и оксид цинка, чьи поверхности могут быть обработаны; перламутровые реагенты, такие как слюдяной титан, фольга чешуи рыбы и оксохлорид висмута, чьи поверхности могут быть обработаны; органические красители, такие как Красный №202, Красный №228, Красный №226, Желтый №4, Голубой №404, Желтый №5, Красный №505, Красный №230, Красный №223, Оранжевый №201, Красный №213, Желтый №204, Желтый №203, Голубой №1, Зеленый №201, Пурпурный №201 и Красный №204, которые могут быть лакированы; органические тонкодисперсные включения, такие как полиэтиленовый порошок, полиметил метакрилат, порошок нейлона, и органополисилоксановый эластомер; основанный на пара-аминобензоате абсорбент ультрафиолетового света; основанный на антранилате абсорбент ультрафиолетового света; основанный на салицилате абсорбент ультрафиолетового света; основанный на циннамате абсорбент ультрафиолетового света; основанный на бензофеноне абсорбент ультрафиолетового света; основанный на сахаре абсорбент ультрафиолетового света; абсорбенты ультрафиолетового света, такие как 2-(2'-гидрокси-5'-трет-октилфенил)бензотриазол, и 4-метокси-4'-трет-бутилдибензоилметан; низшие спирты, такие как этанол и изопропанол; витамины, такие как витамин A или их производные; витамины типа B, такие как гидрохлорид витамина B, трипальмитат витамина B, диоктаноат витамина B, витамин B или его производные, витамин B, и витамин B или его производные; витамины Е-типа, такие как α-токоферол, β-токоферол, γ-токоферол, и ацетат витамина E, типы витамина D, витамина H, пантотеновую кислоту, пантетеин, и пирролохинолинхинон; и антибактериальные агенты, такие как феноксиэтанол.
Из них, необязательный компонент, содержащийся в кожных препаратах для местного нанесения для ускорения заживления раны, особенно предпочтительно представляет собой любой из компонентов, эффективных для регенерации кожной ткани, поврежденной раной. Более конкретно, может быть особенно предпочтителен оптический компонент, антибиотик для предотвращения микробной инфекции, такой как пенициллин, фрадиомицин, тетрациклин, или их соль, стерилизатор, такой как акринол или изодин, или подобные. Альтернативно, подавитель рубцевания, такой как траниласт, также является предпочтительным. Содержание любого из этих компонентов, эффективное для регенерации кожной ткани, предпочтительно составляет от 0,1 до 10% по массе.
Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может быть получен путем переработки производного флаванона и/или его соли и оптического компонента традиционным способом.
В добавление, употребление препарата для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению может быть модифицировано в зависимости от применения, дозированных форм, места нанесения, симптома и так далее.
(C) Способ усиления действия кератиноцитов для увеличения способности фибробласта к продукции коллагена
Характерным признаком способа усиления действия кератиноцитов к увеличению способности фибробластов к продукции коллагена по настоящему изобретению (в дальнейшем также обозначаемое как "способ по настоящему изобретению") является введение производного флаванона, представленного общей формулой (1), и/или его соли, в присутствии как кератиноцитов, так и фибробластов.
Производное флаванона и/или его соль применяются в способе по настоящему изобретению, следуя описанию (A) выше. Производное флаванона и/или его соль имеют активность в отношении увеличения способности фибробласта к продукции коллагена путем воздействия на кератиноциты.
Значение термина "коллагены" концептуально включает в себя как коллаген, так и проколлаген, который является предшественником коллагена.
Фраза "в присутствии как кератиноцитов, так и фибробластов" обозначает состояние, в котором эти клетки сосуществуют друг с другом in vitro или in vivo. Например, in vitro, такое состояние может быть получено путем совместного культивирования этих клеток. В противоположность этому, in vivo, такое состояние может быть найдено в коже, содержащей эпидермис и дерму.
-8
-7
-3
-5
Введение производного флаванона и/или его соли может быть проведено, например, путем смешения производного флаванона и/или его соль с культуральной средой для совместного культивирования кератиноцитов и фибробластов. В этом случае, количество (дозировка) смесь предпочтительно составляет 10 М и, более предпочтительно, 10 М в качестве нижнего предела и предпочтительно 10 М и, более предпочтительно, 10 М в качестве верхнего предела в терминах их концентрации в среде.
Далее, способ введения in vivo может представлять собой чрескожное введение. Способ чрескожного введения не является специально ограниченным, поскольку он обычно применяется, но предпочтителен способ нанесения препарата для местного нанесения на кожу, содержащего производное флаванона и/или его соль. Препарат для местного нанесения на кожу, который может быть применен в способе по настоящему изобретению, представляет собой препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, как описано выше и предпочтительный вариант его изготовления также осуществляется, как описано выше.
(D) Способ скрининга по настоящему изобретению
Характерным признаком способа скрининга по настоящему изобретению является то, что нормальные фибробласты животного культивируют в присутствии тестируемого вещества, раствор коллагеновой среды добавляют к полученной культуре для получения коллагенового геля, фибробласты в коллагеновом геле культивируют в присутствии тестируемого вещества, затем в коллагеновом геле образуют поврежденную область и фибробласты культивируют таким образом, что коллагеновый гель с поврежденной областью сосуществует с тестируемым веществом, степень заполнения или восстановления поврежденной области наблюдается в процессе культивирования.
Нормальный фибробласт животного, применяемый в способе скрининга по настоящему изобретению, не является специально ограниченным, если он обычно применяется в исследовании. Предпочтительные примеры животное включают в себя мышь, крысу, кролика и человека. Из них, человек является особенно предпочтительным, поскольку имеются незначительные различия среди животных образцов. Нормальные фибробласты являются нераковыми клетками, имеющими способность образовывать упорядоченный коллагеновый гель. Такие нормальные фибробласты могут быть получены из слизистой рта, кожи, или подобного, или может быть получена и применена их первичная культура. Альтернативно, является коммерчески доступной исследованная культура линии клеток и может быть применен такой коммерческий продукт. Коммерческий продукт является предпочтительным, например, продукт, получаемый как "Normal Human Skin Fibroblast (Primary Culture)", производимый Sanko Junyaku Co., Ltd., и "Normal Human Fibroblast", производимый Kurabo Co., Ltd.
Отметим, что, в дальнейшем, нормальные фибробласты этих животных также кратко обозначаются как «фибробласты».
Предпочтительно, чтобы фибробласты предварительно культивировались заранее до соответствующего числа клеток и затем подвергали последующему культивированию. Предварительное культивирование может быть проведено в общих условиях культивирования для культуры клеток, например, где культуральная среда, такая как DMEM (производимая GIBCO) добавляется и применяется с 10% FBS, и клетки затем инкубируют при 37°C под потоком 5% диоксида углерода газ до тех пор, пока рост клеток наблюдается до 60 до 90% полноты заполнения. Клеточный кластер, полученный путем предварительного культивирования, предпочтительно разбивается на индивидуальные клетки в присутствии 0,01-0,1% трипсина, с получением клеточной суспензии. В этом случае, наличие этилендиаминтетраацетата с трипсином является более предпочтительным.
3
2
5
2
Для культивирования фибробластов в присутствии тестируемого вещества способ добавления тестируемого вещества не является специально ограниченным. Тестируемое вещество может быть заранее добавлено к среде, добавлено одновременно с засеванием клетками, или добавлено после клеток, засеваемых и затем культивируемых в течение соответствующего времени. Предпочтительно, способ может представлять собой способ, в котором клетки засевают на планшет первыми и затем культивируют в среде, свободной от тестируемого вещества, с последующим замещением среды питательной средой, содержащий тестируемое вещество. Добавленное тестируемое вещество может иметь любую концентрацию. Предпочтительно, культивирование проводится с применением сред, содержащих различные концентрации тестируемого вещества, для тестирования эффективного количества тестируемого вещества. В добавление, число клеток фибробластов, примененное в культуре, не является специально ограниченным и может быть установленным по размеру культурального планшета. Например, число клеток предпочтительно может устанавливаться от 10/см до 10/см. Культивирование может быть проведено в нормальных условиях способом, аналогичным предварительному культивированию. Время выдерживания культуры не является специально ограниченным, пока число клеток может увеличиваться до соответствующего числа, так что оно может, например, составлять от около 3 до 5 дней, стереотипно. В течение периода, если требуется, среда может быть замещена питательной средой.
Более конкретно, например, суспензию клеток, полученную путем разрыва предварительно культивированных фибробластов на индивидуальные клетки, засевали на планшеты и затем культивировали в течение около 24 часов, с последующим добавлением раствора тестируемого вещества с различными концентрациями. Культивирование предпочтительно проводили в течение от 3 до 5 дней.
Затем получали коллагеновый гель путем добавления раствора коллагеновой среды к культуре фибробластов, полученной, как описано выше. Количество добавленного раствора коллагеновой среды и концентрация коллагена в растворе коллагеновой среды не являются специально ограниченными, пока они находятся в пределах диапазона, допустимого для дисперсии фибробластов в коллагеновом геле. Примененный раствор коллагеновой среды может представлять собой, например, раствор, полученный путем смешения от 0,3 до 0,8% по массе раствор коллагена тип-I, DMEM-среды, 100 до 300 мМ HEPES, 2-4% по массе раствора бикарбоната натрия, водного 0,05-0,15 н раствора гидроксида натрия, FBS, и воды в соотношении около 4:4:2:2:1:2:3. Количество раствора добавленной коллагеновой среды может быть определено так, чтобы, например, отношение раствора коллагеновой среды к культуре фибробластов составляло от 8 до 10 частей по массе к 1-2 частям по массе.
Затем фибробласты в полученном коллагеновом геле культивировали в присутствии тестируемого вещества. Другими словами, коллагеновый гель, полученный как описано выше, помещали в среду, содержащую тестируемое вещество, таким образом образуя суспензию культуры фибробластов в коллагеновом геле.
Концентрация тестируемого вещества в среде, применяемой в культуре, может соответствовать концентрации среды, примененной в культуре фибробластов в присутствии тестируемого вещества. Время выдерживания культуры может контролироваться в зависимости от степени восстановления коллагенового геля. Более конкретно, культивирование предпочтительно проводили до тех пор, пока около 1/5 до 1/10 восстановление размера геля достигалось относительно его размера в момент приготовления гель с добавлением коллагенового раствора. Время выдерживания культуры может стандартно составлять от 3 до 5 дней.
Затем создавали поврежденную область в восстановленном коллагеновом геле. Поврежденная область представляла собой сегмент, где в части коллагена пробивали отверстие и сохраняли в полом виде. Вид и размер поврежденной области не является специально ограниченным до тех пор, пока она пригодна для наблюдения изменения вида. Например, центральная часть восстановленного коллагенового геля может быть перфорирована до круглой формы, что приводит к выемке тороидального вида. Методика перфорирования может использовать, например, одноразовый перфоратор для биопсии с диаметром от 1 до 5 мм.
Способ получения такой модели поврежденного коллагенового геля впервые описан в Roman O'Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27(2), 266-270 (2004).
Затем коллагеновый гель, снабженный поврежденной областью, помещали в среду тестируемого вещества, и затем фибробласты культивировали в коллагеновом геле. Планшет, применяемый для культивирования, может выбираться в зависимости от размера полученного коллагенового геля. Например, если коллагеновый гель имеет диаметр от около 2 до 7 мм, может быть выбран 6-луночный планшет. В добавление, коллагеновый гель предпочтительно фиксируется на дне лунки. Фиксация коллагенового геля может быть проведена путем, например, прикапывания коллагенового раствора на центральную часть лунки и инкубирования коллагенового геля на ней в течение 15 минут при 37°C. Концентрация тестируемого вещества в среде может соответствовать концентрации в среде, примененной при культивировании вышеупомянутых фибробластов в присутствии тестируемого вещества. Применяемые условия культивирования могут также представлять собой обычные условия, точно как в случае вышеупомянутых условий культивирования. Период культивирования (то есть период наблюдения), без ограничения, типично составляет от 5 до 20 дней.
В течение культивирования, как описано выше, наблюдалась степень заполнения или восстановления поврежденной области коллагенового геля. Путем записи результатов наблюдения, может быть определено действие тестируемого вещества в направлении реконструкции коллагена. Например, вид поврежденной области может быть объективно зафиксирован с применением фотографирования. Необязательно, эти фотографии могут быть сравнены и измерены путем конвертирования их в вид цифрового изображения. Более конкретно, когда степень заполнения или восстановления вышеупомянутой поврежденной области в присутствии тестируемого вещества больше, чем степень восстановления в отсутствие тестируемого вещества, может быть установлено, что вышеупомянутое тестируемое вещество имеет эффект ускорения заживления раны. В добавление, степень заполнения или восстановления может быть исследована, так что оценка, или подобное, применяется для замены степени заполнения или восстановления цифровым значением. Например, когда объем вышеупомянутой поврежденной области в присутствии тестируемого вещества составляет 85% или менее и предпочтительно 50% или менее от объема в отсутствие тестируемого вещества, может быть установлено, что вышеупомянутое тестируемое вещество имеет эффект ускорения заживления раны.
Таким образом, эффект ускорения заживления раны тестируемого вещества может быть исследован посредством такого способа, становится возможно удалить любое вещество, которое только ускоряет миграцию фибробластов и не усиливает продукцию коллагена фибробластами или любое вещество, которое только усиливает продукцию коллагена фибробластами и не ускоряет миграцию (движение) фибробластов. Следовательно, может быть более эффективно найдено любое вещество, эффективное в качестве ранозаживляющего средства.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Корректирующее действие фаррерола на пучки коллагеновых волокон дермы было подтверждено экспериментом in vitro. Другими словами, с учетом того факта, что, когда фибробласты культивируются в коллагеновом геле в среде, содержащей гепарин, коллагеновые волокна, получаемые из клеток, являются поврежденными и прочные пучки коллагеновых волокон не могут быть получены, степень восстановления при повреждении коллагенового волокна была исследована путем добавления фаррерола для совместного нахождения с системой, содержащей гепарин. Методики будут описаны ниже.
<Применяемые клетки и реагенты>
Нормальные фибробласты человека (Kurabo)
DMEM, с 10% FBS (GIBCO)
WST-8/1-Метил-PMS (Комплект для подсчета клеток Kit-8: Dojindo laboratories)
Фаррерол растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и затем применяли.
Токсичность фаррерола исследовали в MTT-исследовании и затем получали дозу фаррерола, добавленную к системе, содержащей гепарин.
<Протокол>
3
1. Фибробласты растили до 80% полноты заполнения, диспергировали в среде 0,05% Трипсин/ЭДТА. Дисперсант высевали на 96 луночном планшете при концентрации 3×10 клеток/лунку.
2. Через 24 часа фаррерол установленной концентрации добавляли к соответствующим лункам в объеме 10 мл/лунку (n=8).
3. WST-8/1-Метил-PMS добавляли к соответствующим лункам в объеме 10 мл/лунку через 24 часа, 48 часов и 72 часа после добавления фаррерола, затем инкубировали при 37°C в течение 4 часов.
4. Оптическую плотность измеряли при рабочей длине волны 450 нм и реперной длине волны 650 нм.
<Результаты>
-6
-7
-7
Цитотоксичность не могла быть подтверждена как значительная при любой из рабочих концентраций. В противоположность этому, было подтверждено, что добавление фаррерола может усиливать клеточную пролиферацию. В частности, клеточная пролиферация усиливалась, при концентрациях фаррерола 10 мл/мл-DMEM, 5×10 мл/мл-DMEM, и 10 мл/мл-DMEM, так что последующий тест продукции коллагена проводили с применением эти трех концентраций.
На основании указанных результатов было исследовано действие фаррерола усиливать продукцию коллагена с применением системы, содержащей гепарин.
<Применяемые клетки и реагенты>
Нормальные фибробласты человека (Kurabo)
ГЕПАРИН (SIGMA: H-3149)
DMEM (GIBCO)
FBS
<Протокол>
1. Фибробласты растили до полноты заполнения в среде с 10% FBS и затем диспергировали путем обработки трипсином с последующим центрифугированием.
2
3
2
2. Супернатант удаляли и затем фибробласты повторно суспендировали в DMEM, с 10% FBS, с последующим высеванием фибробластов на 12-луночный планшет (4,5 см/лунку) при концентрации 3×10 клеток/см.
2
3. Через 4 часа после высевания клеток супернатант DMEM удаляли и замещали средой DMEM с 0,4% FBS с последующей 72 часовой инкубацией в условиях предотвращения пролиферации клеток (37°C, 5% CO).
-6
-7
-7
4. DMEM с 0,4% FBS удаляли, затем замещали средой DMEM, с 10% FBS для завершения остановки пролиферации клеток. В этой методике условия культивирования представляли собой 10% FBS-DMEM, 0,1% гепарин/10% FBS-DMEM, и 1,0% гепарин/10% FBS-DMEM (каждый n=3) для исследования влияния гепарина. Далее, приготовляли среды с добавленным фарреролом при концентрациях 10 мл/мл-DMEM, 5×10 мл/мл-DMEM и 10 мл/мл-DMEM соответственно.
<Результаты>
Результаты представлены в графической диаграмме на фиг. 1. Диаграмма 1 представляет эффект клеточной пролиферации, когда каждая из концентраций раствора фаррерола добавлена к среде в условиях отсутствия гепарина и диаграмма 2 представляет эффект в условиях наличия гепарина. Любое из диаграмм показывает, что в группе с добавлением фаррерола имеется тенденция усиления пролиферации клеток по сравнению с контролем, группой с добавленным ДМСО. Таким образом, было найдено, что фаррерол имеет эффект усиления роста фибробластов.
Пример 2
Эксперимент выше подтверждает, что фаррерол имеет эффект усиления пролиферации клеток. В добавление, для подтверждения влияния фаррерола на способность фибробластов к движению "модель заживления раны", полученную путем перфорирования трехмерного коллагенового геля одноразовым перфоратором для биопсии, применяли в сравнении между группой с добавлением фаррерола и группой без добавления фаррерола, по отношению к поведению фибробластов в области раны.
<Применяемые клетки и реагенты>
Нормальные фибробласты человека (Kurabo)
DMEM, с 10% FBS (GIBCO)
3
Раствор коллагеновой среды (0,5% тип-I коллаген: 5×DMEM: 200 мМ HEPES: 2,2% NaHCO: 0,1 н NaOH: FBS: вода смешивали в отношении 4:4:2:2:1:2:3)
Одноразовый перфоратор для биопсии (3,0 мм в диаметре наконечника)
<Протокол>
1) Культуру фибробластов, полученную по протоколу 4 Примера 1, и раствор коллагеновой среды смешивали совместно при соотношении 1:9 (по объему) и затем суспензию культивировали в 10%-FBS-среде в течение 1 недели.
2) Когда размер коллагенового геля уменьшался от размера в момент времени при получении путем добавления раствора коллагеновой среды до размера около 1/5-1/10, центральную часть геля перфорировали одноразовым перфоратором для биопсии с диаметром 3 мм.
2
3) Приготовляли 6-луночный планшет и 15 мкл раствора коллагена затем капали на центр лунки. Затем в лунку помещали перфорированный трехмерный коллагеновый гель и инкубировали в течение 10 минут (37°C, 5% CO).
4) Когда капли коллагена отверждались и трехмерный коллагеновый гель присоединялся к дну лунки, добавляли 10% FBS-DMEM, 0,1% гепарин/10% FBS-DMEM, и 1,0% гепарин/10% FBS-DMEM в объеме 3 мл/лунку.
-6
5) Далее группу с содержанием 10 мл/мл-DMEM фаррерола добавляли к каждой культуре, были получены условия (4).
<Результаты>
Наблюдали поведение фибробластов через 24 часа после получения "модели заживления раны". На фиг. 2 представлены фотографии фибробластов, произведенные для области раны, перфорированной одноразовым перфоратором для биопсии. По отношению к неполной среде 10% FBS-DMEM, наблюдались тенденция к более длинному расстоянию передвижения фибробластов и более активному клеточному движению в группе с добавленным фарреролом, по сравнению с группой без добавления фаррерола. В противоположность этому, относительно среды 0,1% гепарин/10% FBS-DMEM и 1,0% гепарин/10% FBS-DMEM, нет различия в клеточном движении между группой с добавленным фарреролом и группой без добавления фаррерола, движение в каждой из них предотвращается действием гепарина.
Следовательно, результаты показывают, что фаррерол не ингибирует влияние гепарина на способность фибробластов к движению, но прямо действует на фибробласты, усиливая способность клеток к движению.
Пример 3
Следующие методики применяли для исследования того, имеет ли фаррерол эффективность в предотвращении подавляющего эффекта добавленного гепарина на построение пучков коллагеновых волокон. Результаты представлены на фиг. 3. Было найдено, что фаррерол предотвращает подавляющий эффект гепарина на построение пучков коллагеновых волокон и оказывает корректирующее действие на пучки коллагеновых волокон дермы.
<Протокол>
3
Раствор коллагена получали путем приготовления смеси 0,5% коллаген типа I: 5×DMEM: 200 мМ HEPES: 2,2% NaHCO:0,1 н NaOH:FBS:вода в соотношении 4:4:2:2:1:2:3 (проводили при охлаждении).
↓
Низший слой раствора коллагена получали путем смешения раствора коллагена с водой в соотношении 9 к 1.
↓
Низший слой раствора коллагена распределяли в соответствующие лунки 48-луночного планшета в объеме 100 мкл/лунку.
↓
2
Отверждение проводили в CO инкубаторе (около 15 минут).
↓
NHDF получали согласно стандартной методике.
(Клетки разделяли друг от друга клеточным ситом).
↓
5
Число клеток измеряли (Трипан синий) и затем приводили к концентрации 1×10 клеток/мл.
↓
Раствор коллагена смешивали с клеточной суспензией в соотношении 9 к 1 (по объему) и затем распределяли в соответствующие лунки в объеме 300 мкл/лунку.
4
Для предотвращения неровного диспергирования клеток, операцию проводили при прерывистом перемешивании (1×10клеток/мл в конечном итоге).
↓
2
Клетки оставляли стоять в течение 4 часов в CO инкубаторе.
↓
Гель отделяли от внутренней стенки лунки инъекционной иглой, не останавливая восстановления геля.
↓
Добавление среды 1,8% Гепарин/10% FBS-DMEM проводили в объеме 500 мкл/лунку (конечная концентрация 1% гепарина на лунку).
↓
Фаррерол (растворенный в ДМСО) добавляли в объеме 0,9 мкл/лунку (1000-кратное разбавление).
↓
2
Инкубацию проводили в CO инкубаторе (5 дней).
↓
Получали образец для наблюдения SEM.
Пример 4
Согласно составу, описанному ниже, получали косметические средства (эссенции), которые представляют собой наружные составы для кожи по настоящему изобретению. А, В и С нагревали до 80°С, В постепенно добавляли к А при перемешивании для эмульгирования и затем добавляли С для нейтрализации, с последующим перемешиванием при охлаждении. В результате получали эссенцию 1. Подобную операцию проводили для получения Сравнительного Примера 1, в котором фаррерол в эссенции 1 был замещен этанолом.
Таблица 1
Компоненты
% по массе
А
Сквалан
5
Бегеновый эфир POE (20)
1
Бегеновый спирт
2
Сесквистеарат сорбита
1,5
Бегеновая кислота
0,5
В
1,3-бутандиол
8
1,2-гександиол
4
Феноксиэтанол
0,5
"Carbopol 1382"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
"Pemulen TR-1"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
Вода
57,1
0,1% раствор фаррерола в этаноле
0,1
С
Гидроксид калия
0,1
Вода
20
Суммарно
100
<Пример тестирования 1>
Используя две группы по 5 пациентов, всего 10 участников (возрастом от 40 до 50 лет) подвергали в течение 8 недель тесту на нанесение эссенции 1, полученной как описано выше, и косметических средств Сравнительного Примера 1. Эти косметические средства применялись дважды: каждое утро и на ночь каждый день; получали точные копии уголков глаз до и после тестового нанесения. При освещении светом с углом наклона 45°С, тени, образуемые морщинами, переносились на картинки из микроскопа и затем переводились в цифровой формат для получения соотношений площадей теней в поле зрения, с последующим получением их средней величины для группы. Результаты приведены в таблице 2. Таки образом, как было найдено, косметические средства (эссенции), которые представляют собой препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, обладают превосходным эффектом улучшения состояния морщин.
Образец
Среднее соотношение площадей затенения (%)
До теста
После теста
Эссенция 1
6,8±2,3
3,3±0,9
Сравнительный Пример 1
7,1±2,8
5,7±1,6
Пример 5
<Пример тестирования 2>
Эссенцию 2, которая представляет собой препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, получали согласно следующему составу способом, аналогичным способу для эссенции 1. Его исследовали способом, описанным в Примере тестирования 1. Следовательно, был подтвержден эффект, что соотношение площадей морщин изменяется от 8,2±3,2% до теста до 3,9+1,1% после теста.
Таблица 3
Компоненты
% по массе
А
Сквалан
5
Бегеновый эфир РОЕ (20)
1
Бегеновый спирт
2
Сесквистеарат сорбита
1,5
Бегеновая кислота
1,5
В
0,5
1,3-бутандиол
8
1,2-гександиол
4
Феноксиэтанол
0,5
"Carbopol 1382"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
"Pemulen TR-1"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
Вода
57,1
0,001% раствор фаррерола в этаноле
0,1
С
Гидроксид калия
0,1
Вода
20
Суммарно
100
Пример 6
-5
-6
-7
-6
С применением "модели дефектной кожной ткани с раной", в которой поврежденная область получена путем перфорирования коллагенового геля, была исследована эффективность фаррерола по отношению к усилению тканевой регенерации поврежденной области. Методики будут описаны ниже. Результаты представлены на фиг. 4. На фигуре было найдено, что уменьшение размера перфорированного отверстия очевидно ускоряется при конечной концентрации фаррерола 10 M или 10 M, но ускорение восстановления становится неясным при концентрации 10 M. Следовательно, было найдено, что нижний предел концентрации фаррерола предпочтительно составляет 10 M в препарате для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению.
5
2
1) Нормальные фибробласты человека растили до 80% полноты заполнения, диспергировали в среде 0,05% Трипсин/ЭДТА. Фибробласты высевали при плотности клеток 3×10 клеток/25 см.
-5
-6
-7
2) Через 24 часа среду замещали средой с добавленным фарреролом (10 M, 10 M или 10 M в конечной концентрации) и ДМСО, с последующим культивированием в течение 4 дней.
-5
-6
-7
-5
-6
-7
3) Получали коллагеновый гель путем добавления раствора коллагеновой среды к культуре, полученной культивированием в каждом из условий способом, аналогичным способу Примера 2. Полученный коллагеновый гель затем культивировали в суспензии в течение 1 недели в той же среде, как среда условий культивирование по (2). Фибробласты, культивированные в среде с 10 M, 10 M и 10 M фаррерола в (2), после приготовления коллагенового геля культивировали в среде с 10 M, 10 M и 10 M фаррерола соответственно.
4) Когда размер коллагенового геля уменьшался по сравнению с размером в момент времени получения путем добавления раствора коллагеновой среды до размера около 1/5-1/10, центральную часть геля перфорировали в форме тороида одноразовым перфоратором для биопсии с диаметром 3 мм. В результате получали "модель раны".
5) Подготовляли 6-луночный планшет и 5 мкл коллагена, затем прикапывали на центральную часть лунки. Затем коллагеновый гель модели раны распределяли там и инкубировали при 37°C в течение 15 минут.
6) Когда коллаген, добавленный по каплям, отверждался и гель присоединялся ко дну лунки, добавляли 3 мл среда с тем же состоянием, как состояние (3), с последующим культивированием в качестве "модели дефектной кожной ткани с раной". Затем, процесс закрытия области раны коллагенового геля наблюдали визуально.
Пример 7
Согласно составу, описанному ниже, приготовляли косметические средства (эссенции), которые представляют собой препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению. А, В и С нагревали до 80°С, В постепенно добавляли к А при перемешивании для эмульгирования, затем добавляли С для нейтрализации, с последующим перемешиванием при охлаждении. В результате получали эссенцию 3. Подобную операцию проводили для получения Сравнительного Примера 2, в котором фаррерол в эссенции 3 заменен на этанол.
Таблица 4
Компоненты
% по массе
А
Сквалан
5
Бегеновый эфир РОЕ (20)
1
Бегеновый спирт
2
Сесквистеарат сорбита
1,5
Бегеновая кислота
0,5
В
1,3-Бутандиол
8
1,2-Гександиол
4
Феноксиэтанол
0,5
"Carbopol 1382"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
"Pemulen TR-1"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
Вода
57,1
Материал, экстрагированный с 80% водным раствором этанола в Примере Получения 1
0,1
С
Гидроксид калия
0,1
Вода
20
Суммарно
100
<Пример тестирования 3>
С применением эссенции 3 и Сравнительного Примера 2 был исследован на участниках эксперимента эффект ускорения тканевой регенерации поврежденной области с раной. Зачищенный штамп размещали на средней части верхней части руки участника эксперимента и эпидермис удаляли скальпелем для получения трех фрагментов 1 мм × 1 мм. Эссенцию 3 наносили на один фрагмент один раз в день в течение 5 дней от дня удаления эпидермиса. Сравнительный Пример 2 наносили на другой фрагмент один раз в день в течение 5 дней от дня удаления эпидермиса, и один оставшийся фрагмент не подвергали обработке. Наблюдение проводили через 1 неделю и 2 недели после нанесения для определения степени тканевой регенерации на поврежденной области. Результаты представлены в таблице 5. Следовательно, эссенция 3, препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, как было найдено, имеет превосходный эффект ускорения тканевой регенерации поврежденной области. Кроме того, образования шрама совершенно не наблюдалось.
Таблица 5
Образец
Наблюдение результата через 1 неделю
Наблюдение результата через 2 недели
Эссенция 1
Большинство поврежденных областей восстановились
Нет различий с нормальными областями
Сравнительный пример 1
Корка присутствует и остается частичный дефект
Большинство поврежденных областей восстановились
Необработанный
Корка присутствует и остается частичный дефект
Большинство поврежденных областей восстановились
Пример 8
<Пример тестирования 4>
Согласно составу, описанному ниже, препарат 1 для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению, приготовляли способом, аналогичным способу согласно Примеру 7. Проводили ту же оценку, как в тестовом Примере 3. В результате, препарат показал превосходный эффект ускорения регенерации дефектной кожной ткани даже при одновременном присутствии с антибиотическим соединением.
Таблица 6
Компонент
% по массе
А
Сквалан
5
Бегеновый эфир РОЕ (20)
1
Бегеновый спирт
2
Сесквистеарат сорбита
1,5
Бегеновая кислота
0,5
В
1,3-бутандиол
8
1,2-гександиол
4
Феноксиэтанол
0,5
"Carbopol 1382"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
"Pemulen TR-1"
0,1
(Алкил-модифицированный карбоксивинильный полимер, производимый Goodrich Corporation)
Вода
56,1
Сульфат фрадиомицина
1
Материал, экстрагированный 80% водным раствором этанола в Примере Получения 1
0,1
С
Гидроксид калия
0,1
Вода
20
Суммарно
100
Пример 9
Влияние фаррерола на кератиноциты исследовали согласно следующим методикам.
<Эксперимент 1: оценка цитотоксичности фаррерола на кератиноциты>
[Применяемые клетки и реагенты]
Нормальные кератиноциты эпидермиса человека (производимые Kurabo Co., Ltd.)
Среда Humedia KG2 (производимая GIBCO Co., Ltd.)
WST-8/1-Метил-PMS (Комплект для подсчета клеток Kit-8: Dojindo laboratories)
[Приготовление образца]
-2
Образец фаррерола получали путем разбавления ДМСО 10 M фаррерола, растворенного в ДМСО, для регулировки его концентрации.
[Протокол]
3
3
1) Нормальные кератиноциты эпидермиса человека растили до 80% полноты заполнения, диспергировали в среде 0,05% Трипсин/ЭДТА. Дисперсию высевали на 96 луночный планшет при концентрации 3×10 клеток/лунку и 6×10 клеток/лунку.
2) Через 24 часа образец фаррерола с установленной концентрацией добавляли к соответствующим лункам в объеме 100 мкл/лунку (n=8).
3) WST-8/1-Метил-PMS добавляли к соответствующим лункам в объеме 10 мкл /лунку через 24 часа и 48 часов после добавления образца фаррерола, и затем инкубировали при 37°C в течение 4 часов.
4) Измеряли оптическую плотность (величина OD) при рабочей длине волны 450 нм и реперной длине волны 650 нм.
<Результаты>
3
-5
3
Результаты оценки с MTT представлены на графической диаграмме на Фиг. 5. Она показывает, что величина OD увеличивается в зависимости от концентрации фаррерола. Величина OD, для 3×10 клеток/лунку через 24 часа, 10 М фаррерола, показывает величину в два или более раз более высокую, чем величина контроля, в случае ДМСО. Через 48 часов также регистрируется величина в 1,7 раз более высокая, чем величина в случае ДМСО. Однако число клеток являлось небольшим и их величина OD имеет тенденцию быть низкой, так что воспроизводимость результатов подтверждена применением двойного ряда высеянных клеток, 6×10 клеток/лунку. В результате, может быть получен почти равный результат.
С другой стороны, визуальная оценка не дает ощущения, что пролиферация клеток в группе с добавленным фарреролом ускоряется по сравнению с группой с добавленным ДМСО.
<Эксперимент 2: Влияние фаррерола на пролиферацию клеток кератиноцитов (прямое исследование)>
[Применяемые клетки и реагенты]
Нормальные кератиноциты эпидермиса человека (производимые Kurabo Co., Ltd.)
Среда Humedia KG2 (производимая GIBCO Co., Ltd.)
[Протокол]
3
1) Среду нормальных кератиноцитов эпидермиса человека получали при плотности клеток 6×10 клеток/мл и затем ее 1 мл аликвоты высевали на 96 луночном планшете, соответственно.
2) Через 24 часа удаляли супернатант из соответствующих лунок и затем добавляли к каждой из лунок 1 мл среды с добавленным образцом фаррерола с концентрацией, установленной разбавлением ДМСО.
3) Через 24 часа, 48 часов и 72 часов после добавления образца клетки диспергировали со средой 0,05% Трипсин/ЭДТА и их число затем измеряли счетчиком клеток крови. Таким способом в Эксперименте 1 оценку для WST-8 применяли в качестве индикатора числа клеток. Так как такой способ предоставлен для непрямой оценки числа клеток путем действия на дегидразы в митохондриях, настоящее исследование прямо измеряет число клеток.
[Результаты]
-5
-6
-7
-5
Результаты подсчета клеток представлены на фиг. 6. Диаграмма представляет скорость пролиферации клеток, когда число клеток в контроле (группа с добавлением ДМСО) определено как 100%. По сравнению с контролем, скорость пролиферации клеток имеет тенденцию к ингибированию при наличии зависимости от концентрации. Скорость пролиферации клеток в 10 M-группе с добавленным фарреролом ингибировалась до 75,1±5,2% через 24 часа. В добавление, по отношению к другим концентрациям, скорости пролиферации клеток удерживались при 75,5±5,8% при 10 M и 77,1±8,6% при 10 M. Через 48 часов, 10 M-группа с добавленным фарреролом показывала скорость пролиферации около 71,9±16,6%. Однако при любой концентрации, меньшей, чем вышеупомянутая концентрация, регистрировалась почти та же скорость пролиферации, как скорость в контрольной группе. В добавление, не имелось изменения в виде клетки (Фиг. 7). То есть результаты прямой оценки не совпадали с теми непрямыми оценками числа клеток в случае WST-8. В результате, подразумевалось, что фаррерол может ускорять реакцию цикла лимонной кислоты в митохондриях кератиноцита. Таким образом, ожидается, что эффект NADH, образующегося в ходе реакции цикла лимонной кислоты, также может ускорять последующую стадию реакции, реакцию окислительного фосфорилирования. В результате, показано, что генерирование ATP, обеспечивающего источник энергии в клетке или емкость метаболической энергии, может быть ускорено.
<Эксперимент 3: Исследование непрямого влияния на фибробласты, через кератиноциты эпидермиса>
[Краткое содержание]
Для обнаружения того, может ли иметь место, или нет, взаимодействие между кератиноцитами эпидермиса и фибробластами, или любое действие фаррерола на фибробласты в совместной культуре, проводили оценку с измерением количества полученного проколлагена. Способ основан на способе, описанном в Eming SA et al., Hum. Gene. Ther., 9 (4), 529-39 (1998).
[Применяемые клетки и реагенты]
Нормальные кератиноциты эпидермиса человека (производимый Kurabo Co., Ltd.)
Среда Humedia KG2 (производимая Kurabo Co., Ltd.)
Нормальные фибробласты человека (производимые Kurabo Co., Ltd.)
DMEM (производимый GIBCO Co., Ltd.)
Комплект PIP EIA (производимый TAKARA BIO INC.)
[Протокол]
1) Кератиноциты эпидермиса
4
День 1: клетки высевали на 24-луночный планшет при плотности клеток 3×10 клеток/лунку.
-6
-7
-8
День 6: планшет, промытый PBS и средой, затем замещали средой DMEM + 2% FBS, с последующим добавлением фаррерола (10 M, 10 M, 10 M, ДМСО).
День 7: собирали супернатант культуры.
2) Фибробласты
4
День 3: клетки высевали на 24-луночный планшет при плотности клеток 2,5×10 клеток/лунку.
День 7: планшет промывали PBS и затем добавляли супернатант культуры (900 мкл) кератиноцитов эпидермиса, с последующим культивированием в течение 48 часов.
День 9: планшет промывали PBS и свободной от сыворотки DMEM и среду затем замещали 500 мкл свободной от сыворотки DMEM, с последующим культивированием в течение 2 часов. Супернатант культуры собирали и количество проколлагена в центрифугированном супернатанте (15000 об/мин, 5 с) затем измеряли посредством способа, описанного ниже.
[Количественное определение количества полученного проколлагена]
1) После добавления 100 мкл раствора стандартных антител к каждой из лунок планшета, полученный ранее стандартный раствор PIP при каждой из концентраций (320, 160, 80, 40, 20 и 10 мкл/мл; тестируемое вещество разбавляли DMEM) и 20 мкл тестируемого образца добавляли к каждой лунке двух рядов посредством микропипетки с последующим инкубированием при 37°C в течение 3 часов (первая реакция).
2) Реакционный раствор удаляли, и лунки затем промывали средой PBS четыре раза. Затем добавляли 100 мкл раствора субстрат (TMBZ) к каждой лунке с применением пипетки с восемью наконечниками, с последующим инкубированием при комнатной температуре (20-30°C) в течение 15 минут (вторая реакция).
3) Затем добавляли 100 мкл останавливающего раствора к каждой лунке в порядке добавления раствора субстрата для остановки реакции и затем смешанной лунке.
4) Стандартная кривая получалась путем нанесения на график величин оптической плотности при длине волны 450 мм, при этом величину оптической плотности среды принимали в качестве нулевого уровня. Затем PIP-концентрацию считывали из соответствующей оптической плотности тестируемого вещества.
[Результаты]
Результаты представлены на фиг.8. Количество проколлагена увеличивается значительно в зависимости от концентрации фаррерола. С другой стороны, другая система, в которой проводили оценку способом добавления фаррерола во время культивирования фибробластов и затем добавляли супернатант культуры кератиноцитов эпидермиса, не показала большого изменения в количестве полученного проколлагена. Из этого факта следует, что действие фаррерола на фибробласты, прямо увеличивающее продукцию проколлагена, может быть незначительным. Следовательно, можно считать, что фаррерол действует на кератиноциты эпидермиса и кератиноциты эпидермиса ускоряют способность фибробластов усиливать продукцию коллагенов. Этим способом способность фибробласта к продукции коллагена может быть изменена путем применения кератиноцитов в системе совместной культуры. Так, например, по отношению к трехмерной культуре кожи или подобному, способ является применимым к изменению свойств трехмерной кожи до желаемых свойств.
Пример 10
Содержащий фаррерол препарат для местного нанесения на кожу (косметические средства: лосьон) получали согласно составу, описанному ниже. Рецептурированные компоненты смешивали и растворяли при комнатной температуре для получения лосьона. Количество проколлагена, образующегося в дерме кожи, может быть увеличено путем чрескожного введения лосьона в кожу мыши или человека, что приводит к увеличению количества коллагена в дерме. Это так, поскольку в коже кератиноциты находятся совместно с фибробластами.
Таблица 7
Компоненты
% по массе
1,3-бутандиол
5
1,2-пентандиол
2
1,2-гександиол
3
Глицерин
5
Феноксиэтанол
0,5
Экстракт Hypericum erectum из Примера Получения 1
0,001
Вода
89,499
Суммарно
100
Пример 11
<Получение тестируемого вещества>
В качестве тестируемого вещества для скрининга, приготовляли экстракт Hypericum erectum. 10 л 80% водного раствора этанола добавляли к 1 кг высушенной надземной части Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae) и затем кипятили с обратным холодильником в течение 4 часов при перемешивании. После охлаждения нерастворимый остаток удаляли фильтрованием и затем концентрировали под уменьшенным давлением с последующей лиофильной сушкой. В результате получали 51 г аморфного вещества. Этот продукт диспергировали в воде, помещали в DIAION HP20, промывали потоком 5 л воды и 5 л 50% водного раствора этанола, в такой последовательности, и смывали 99% этанолом. Полученную элюированную фракцию фракционировали. Затем фракции, полученные таким образом, далее подвергали тонкослойной хроматографии и HPLC для контроля их содержания, с целью совместного объединения фракций, включая то же отдельное вещество. С другой стороны, фракции, включающие два или более компонента, очищали далее, подвергая их хроматографии повторно. В результате были получены семь фракций, содержащих один компонент.
<Пример проведения скрининга>
Фракции, содержащие по одному компоненту, полученные как описано выше, предоставляли в качестве тестируемых веществ и эффект каждого тестируемого вещества на создание коллагена затем исследовали для поиска вещества с ранозаживляющим эффектом. Специальные методики будут описаны ниже.
13
С применением "модели раны", которую предоставляет поврежденная область, образуемой путем перфорирования коллагенового геля, содержащего фибробласты животного, может наблюдаться степень заполнения или восстановления поврежденной области в присутствии тестируемого вещества. Методики проводятся следующим образом. Структура тестируемого вещества одиночного компонента с наивысшей степенью заполнения или восстановления поврежденной области, по сравнению с остальными тестируемыми веществами, исследовали методами ЯМР на протонах, масс-спектрометрическим анализом, C-ЯМР и идентифицировали как фаррерол. Этим способом выход фаррерола из вышеупомянутого экстракта составил 3,2 мг. Содержание фаррерола в продукте, выделяемом растворителем в экстракт действием 80% водного раствор этанола, составляет около 0,006% по массе.
-5
-6
-7
-5
-6
-7
-6
Далее, конечную концентрацию фаррерола приводили к любой из 10 M, 10 M и 10 M и затем наблюдали степень восстановления поврежденной области при каждой концентрации. Результаты представлены на фиг. 9. Из фигуры было найдено, что восстановление перфорированного отверстия (поврежденной области) несомненно ускоряется при конечной концентрации фаррерола 10 М или 10 М, но ускорение восстановления при 10 М является нечетким. Следовательно, эффект фаррерола ускорять построение коллагена может создавать эффект ускорения заживления раны, когда применяется по меньшей мере 10 М фаррерола. Таким образом, согласно способу скрининга по настоящему изобретению, также может быть достигнута эффективная концентрация тестируемого вещества с эффектом ускорения заживления раны.
<Методики>
5
2
4
2
1) Нормальные фибробласты человека выращивали до 80% полноты заполнения при предварительном культивировании, диспергированные в 0,05% Трипсин/ЭДТА. Фибробласты затем высевали на планшет при плотности клеток 3×10 клеток/25 см(1×10 клеток/см).
-5
-6
-7
2) После культивирование в течение 24 часов, среду замещали средой с добавленным фарреролом (10 M, 10 M или 10 М в конечный концентрация) и ДМСО, с последующим культивированием в течение 4 дней.
-5
-6
-7
-5
-6
-7
3) Коллагеновый гель получали путем добавления раствора коллагеновой среды к полученной культуре способом, аналогичным способу Примера 3. Фибробласты в коллагеновом геле культивировали с применением среды, примененной в (2). Концентрация тестируемого вещества в среде соответствовала концентрации среды (2). То есть фибробласты, культивированные в среде с фарреролом с конечными концентрациями 10 M, 10 M и 10 М в (2), культивировали в среде с фарреролом с конечными концентрациями 10 M, 10 M и 10 М соответственно, после приготовление коллагенового геля.
4) После культивирования в течение 1 недели размер коллагенового геля восстанавливался по сравнению с размером в момент времени получения путем добавления раствора коллагеновой среды до размера около 1/5-1/10. Затем центральную часть коллагенового геля перфорировали с получением тороидальной формы выемки действием одноразового перфоратора для биопсии диаметром 3 мм. В результате получали "модель раны".
5) Приготовляли 6-луночный планшет и 5 мкл коллагенового раствора, затем капали на центральную часть лунки. Затем устанавливали коллагеновый гель модели раны и инкубировали при 37°C в течение 15 минут, позволяя коллагеновому гелю присоединиться на дно лунки.
6) Затем добавляли 3 мл той же среды, как среда в (2), к каждой из лунок и фибробласты в вышеупомянутом коллагеновом геле затем культивировали в течение 7 дней. В течение культивирования процесс закрытия области раны коллагенового геля наблюдали визуально.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Препарат для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению является применимым для косметических средств, терапии кожи для местного нанесения и так далее. В добавление, заживлению раны может способствовать применение препарата для местного нанесения на кожу по настоящему изобретению.
Далее, по отношению к трехмерной культуре кожи или подобному может быть применен способ усиления способности фибробласта к продукции коллагена для генерации искусственной кожи путем коррекции свойств трехмерной кожи до желаемых свойств.
Вещество с эффектом ускорения заживления раны, пригодное для кожных препаратов местного нанесения, может быть протестировано с применением способа скрининга по настоящему изобретению.