Способ снижения воспалительной гиперактивации нейтрофилов
METHOD FOR REDUCING INFLAMMATORY HYPERACTIVATION OF NEUTROPHILS

Изобретение относится к медицине, а именно к анестезиологии, реаниматологии и клинической фармакологии, и может быть использовано для лечения больных с патологическими состояниями, при которых наблюдается синдром системного воспалительного ответа (ССВО) после обширных операций, оперативных вмешательств с использованием аппарата искусственного кровообращения, сочетанной травмы, тяжелого сепсиса и септического шока, синдрома ишемии-реперфузии тканей при инсульте и инфаркте миокарда, при сахарном диабете, метастазировании опухолей, отеке легкого и остром респираторном дистресс-синдроме, ожоговой болезни и др. Способ позволяет снизить активность нейтрофилов, уменьшить воспалительные процессы, профилактировать или уменьшить степень выраженности полиорганной недостаточности, сократить сроки лечения и увеличить выживаемость больных при критических состояниях.
Уровень техники
Для пациентов с критическими состояниями актуальным является купирование системного воспалительного ответа.
Известен ряд способов, предусматривающих использование фармацевтических препаратов для решения задачи купирования ССВО. К ним относятся в частности:
- лекарственное средство, направленное на купирование ССВО, содержащее мг: дифосфопиридиннуклеотид 0,3-100 и инозин 40,0-1200, а также ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, преимущественно лизиноприл 2,5-100, и сердечный гликозид, преимущественно дигоксин 0,07-0,3 (RU2280455);
- способ и фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения синдрома системной воспалительной реакции, включающий частичный ингибитор фактора VIII, такой как моноклональное антитело, применимый для предотвращения и/или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из ССВО, сепсиса, септического шока, образования тромбов в микрососудистой сети и диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови в организме млекопитающего, частично подавляя образование тромбина (Method and pharmaceutical composition for preventing and/or treating systemic inflammatory response syndrome EP1222929);
- способ лечения ССВО, включающий введение стабилизатора тучных клеток (Methods of treating cytokine release syndrome WO2020051322);
- лекарственное средство для профилактики или лечения синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), включающее ингибитор цитокинового шторма, имеющее HRG в качестве активного ингредиента (Cytokine storm inhibitor WO 2016104436);
- использование мезенхимальных стволовых клеток для лечения ССВО (Uses of mesenchymal stem cells AU2015268704);
- терапевтическое или профилактическое средство для лечения или предотвращения ССВО, которое содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, такую же или практически такую же, как аминокислотная последовательность N-концевого домена пентраксина 3, способного связываться к гистону с образованием полипептидного агрегата или его фармакологически приемлемой соли (Agent for treating or preventing systemic inflammatory response syndrome US2015299277).
Использование указанных выше фармацевтических препаратов для решения задачи купирования ССВО не позволяет достичь лечебного эффекта заявляемого изобретения, поскольку в них не определена роль нейтрофилов, клеток врожденного иммунитета, которые играют важнейшую роль в развитии, регуляции и разрешении воспаления. Иммунный ответ на повреждение тканей или инфекцию начинается с секреции нейтрофилами провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, что направлено на удаление повреждающего агента и восстановление гомеостаза.
В то же время известны способы ксеионотерапии, включающие использование ингаляционной терапии ксеноном или газовыми смесями, содержащими ксенон.
Известен способ аутоанальгезии ксенон-кислородной смесью, заключающийся в том, -что пациенту предлагают самостоятельно вдыхать ксенон-кислородную смесь в соотношении ксенона к кислороду в об. % от 30:70 до 50:50 до купирования болевого синдрома. (RU 2271815). Результатом использования данного способа является выраженный анальгетический эффект при сохранении сознания, что, в свою очередь, способствует нормализации гемодинамики, функции нейроэндокринной системы, нормализации метаболических процессов, за счет улучшения доставки кислорода в ткани в условиях ксеноновой вазоплегии.
Недостатками известного способа, не позволяющими достичь лечебного эффекта заявляемого изобретения, является его использование только при адекватном состоянии пациента, что препятствует использованию метода в случае бессознательного состояния пациента; также целью такого использования является аналгезия, а не купирование системного воспалительного ответа и отсутствие влияния на активность нейтрофилов. Применение ксенона в соответствии с известным способом не регламентировано по продолжительности и оптимальному сроку назначения, что может привести к неоднозначным, несопоставимым и непредсказуемым результатам.
Известен также способ ксенонотерапии общесоматических заболеваний, который может быть использован при проведении профилактики, лечения и реабилитации широкого спектра соматических заболеваний человека (RU 2305565). Для этого осуществляют периодическую ингаляцию смеси кислорода с инертным газом ксеноном при соотношении (50:50)-(30:70) об. %. Каждую ингаляцию проводят 2 раза в сутки -утром и вечером в течение 7-10 суток. При этом содержание ксенона в смеси повышают со вторых-третьих суток, увеличивая длительность ингаляции от 3-5 мин в первые двое суток до 7-15 мин в последующие сутки. Способ позволяет восстановить регуляторные функции органов и систем в целом, от ЦНС до регионального уровня, путем активации компенсаторных возможностей организма за счет создания режима устойчивой постксеноновой неспецифической общесоматической реакции организма вследствие применения разработанного режима периодических ингаляций смесью ксенона и кислорода.
Недостатком данного способа, не позволяющими достичь лечебного эффекта заявляемого изобретения, является использование его в плановой медицине, а, следовательно, невозможность использования этой методики в случае возникновения ССВО, Более того, способ направлен на регуляторные функции органов и систем и не может в данном режиме воздействовать на активность нейтрофилов и выраженность системного воспаления.
Известны другие примеры терапевтического использования ксенона или газовых композиций, содержащих ксенон, путем ингаляции. К ним относятся:
- использование ксенона для предотвращения или лечения неврологических последствий септического шока, (Use of xenon to prevent or treat the neurological consequences of a septic shock WO 2014057179).
- газовые смеси, содержащие ксенон и аргон в низкой концентрации в качестве защитного средства органа, в частности, нейрозащитного средства (Gas mixtures containing xenon and argon at low concentration as organ protectant, in particular neuroprotectant WO 2019008015).
Перечисленные выше известные способы терапии ксеноном также не имеют отношения к решению поставленной задачи - снижения воспалительной гиперактивации нейтрофилов, сопровождающей ССВО.
Способов снижения воспалительной гиперактивации нейтрофилов у пациентов с критическими состояниями путем лечебного наркоза газовой смесью, содержащей ксенон, в доступной авторам информационной базе данных не обнаружено.
Раскрытие сущности изобретения
Заявляемое изобретение направлено на снижение провоспалительной активности нейтрофилов у пациентов с критическими состояниями, сопровождающейся развитием системного воспалительного ответа за счет коррекции спонтанного апоптоза нейтрофилов и уменьшения способности нейтрофилов к провоспалительной активации вследствие уменьшения экспрессии CD11b и CD66b на их поверхности.
Поставленная задача решается тем, что коррекция активации нейтрофилов у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом, а также снижение экспрессии CD11b и CD66b на поверхности нейтрофилов и оптимизация апоптоза нейтрофилов достигаются путем ингаляционного введения ксенона в дозе 30 об. % в течение 60 минут.
Согласно современным представлениям, нейтрофилы - это достаточно короткоживущие лейкоциты: после выхода из костного мозга среднее время жизни нейтрофилов составляет 4-5 дней. В течение этого времени нейтрофилы выходят из костного мозга, созревают и стареют. Старение нейтрофилов сопровождается увеличением экспрессии рецептора хемокинов CXCR4, что приводит к миграции нейтрофилов обратно в костный мозг, печень и другие органы, где они подвергаются апоптозу и фагоцитируются макрофагами. Апоптоз - крайне важный и сложно регулируемый этап в жизненном цикле нейтрофилов, поскольку слишком быстрая и массовая смерть нейтрофилов приведет к нейтропении и подверженности организма инфекциям, а излишне долгая жизнь - наоборот, может вызвать затяжное и слабо контролируемое воспаление.
Инертный газ ксенон влияет на наиболее значимые и чувствительные маркеры системного воспалительного ответа, которыми являются молекулы CD11b и CD66b, находящиеся во внутриклеточных гранулах нейтрофилов. CD11b взаимодействует с рецепторами ICAM-1 на эндотелиальных клетках, что обеспечивает адгезию нейтрофилов и последующую их миграцию через эндотелиальный барьер к очагу воспаления [Parkos, A. Interaction of Neutrophils With Epithelial Cells: Lessons From the Intestine / A. Parkos, P. Colgan, J.L. Madara // J Am Soc Nephrol. - 1994. -Vol.5, №2. - P. 138-152].
Сущность заявляемого способа состоит в том, что при воздействии ксенона наблюдается снижение экспрессии CD11b и CD66b на поверхности мембраны нейтрофилов, следствием чего является снижение избыточной активности нейтрофилов (гипервоспаление) у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом. Таким образом, лечебный эффект достигается за счет оптимизации воспалительной активности нейтрофилов и восстановления их способности к спонтанному апоптозу.
Активация нейтрофилов - одна из стадий развития воспаления, при которой под действием внешних сигналов у нейтрофилов наблюдаются морфологические и физиологические изменения (уплощение, дегрануляция, миграция, секреция цитокинов, окислительный взрыв и другие). Чувствительными маркерами активации и дегрануляции являются молекулы CD11b и CD66b, которые находятся во внутриклеточных гранулах нейтрофилов [Schmidt, Т. CD66b overexpression and homotypic aggregation of human peripheral blood neutrophils after activation by a gram-positive stimulus / T. Schmidt, J. , T. , K. Brandenburg, A.L. Reiners, J. Zinserling, N. Schnitzler // J. Leukoc. Biol. - 2012. - Vol.91, №5. - P. 791-802. DOI: 10.1189/jlb.0911483 Muller, K.A. Leukocyte activation in sepsis; correlations with disease state and mortality / K.A. Muller, J.E. Tulleken, J.G. Zijlstra, W. Sluiter, J. Hermans et al // Intensive Care Med. - 2000. - Vol.26, №7. - P. 883-892].
Преимуществом заявляемого способа, по сравнению с известными, является лечебное воздействие наркоза газовой смесью в составе: ксенон - 30 об. %, кислород - не более 40 об. %, остальное - азот, по закрытому контуру на наркозном аппарате «КСЕНА» позволяющее нивелировать влияние патогенных факторов в виде чрезмерной активации нейтрофилов на фоне системного воспалительного ответа.
Для экспериментальной оценки противовоспалительных свойств ксенона использован апробированный в практической медицине режим воздействия [Буров Н.Е., Потапов В.Н., Макеев Г.Н. Ксенон в анестезиологии: Клинико-экспериментальные исследования / М.: Пульс, 2000 г. - 291 с. - ISBN 5-93486-006-2 Молчанов И.В., Николаев Л.Л Применение ксенона в медицине. (Материалы международной научно-практической конференции Кишинев республика Молдова ст.12-13 2019 т)].
Указанный терапевтический эффект был обнаружен авторами заявляемого способа на примере максимально приближенном к клинической картине возникновения гиперактивации нейтрофилов у пациентов с критическими состояниями путем инкубации взвеси нейтрофилов с липополисахаридом (ЛПС) в дозе 200 нг/мл в течение 22 часов в питательной среде.
Заявляемый способ снижения воспалительной гиперактивации нейтрофилов с помощью ингаляционного введения ксенона в дозе 30 об. % в течение 60 минут имеет высокую практическую значимость, поскольку клиницисты в своей работе могут рассчитывать на коррекцию гиперактивации нейтрофилов у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом. Более того, предложенный способ можно успешно использовать при проведении неотложных мероприятий в условиях машин скорой медицинской помощи.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена диаграмма, отражающая изменение уровня экспрессии CD1 lb и CD66b нейтрофилами в результате действия ЛПС 200 нг/мл и ксенона.
На фиг. 2 представлена диаграмма, отражающая результаты исследования действия ЛПС 200 нг/мл до наркоза ксеноном и после наркоза ксеноном (60 минут 30 об. %) на уровень апоптоза и некроза нейтрофилов человека.
Описание процедуры эксперимента
В эксперименте было использовано 20 образцов сыворотки крови от 10 практически здоровых доноров (10 образцов сыворотки крови забирали у доноров до ингаляции ксенона и 10 образцов сыворотки крови забирали у этих же доноров после ингаляции ксенона). Здоровым добровольцам в условиях стационара был проведен сеанс ингаляционной анестезии газовой смесью, содержащей ксенон по закрытому контуру на наркозном аппарате «КСЕНА» (ксенон - 30 об. %, кислород - не более 40 об. %, остальное - азот). Длительность анестезии у всех пациентов составила 60 минут. Течение анестезии во всех случаях было гладким, гемодинамика пациентов стабильная.
Используемая авторами схема эксперимента in vitro общепринята на сегодняшний день и предусматривает активацию нейтрофилов ЛПС (компонентом клеточной стенки грамм-отрицательных бактерий) в дозе 200 нг/мл, которая оценивается по уровню экспрессии молекул CD11b и CD66b. Выбранная модель в полной мере моделирует процессы, происходящие в организме пациента с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом, т.е. является адекватной моделью, предусматривающей достижение заявленного технического результата, обусловленного ингаляцией ксенона.
Нейтрофилы здоровых доноров после ингаляционной анестезии газовой смесью, содержащей ксенон, продолжительностью 60 минут были выделены по следующей методике: гепаринизированную венозную кровь смешивали с 5% раствором декстрана Т-500 (Pharmacosmos, Дания) в PBS в соотношении 4:1 (т.е. до конечной концентрации декстрина 1%) и оставляли при комнатной температуре на 30 минут для пассивного осаждения эритроцитов. Верхний слой плазмы (обогащенный лейкоцитами и лишенный эритроцитов) наслаивали на Фиколл (ПанЭко, Россия) с плотностью 1.077 г/мл и центрифугировали при комнатной температуре при 400g, 30 минут в центрифуге с отключенным режимом торможения. Затем удаляли супернатант и все дальнейшие процедуры проводили на льду и с использованием охлажденных растворов. Удаление примесных эритроцитов проводили с помощью ресуспендирования осадка в 2 мл деионизованной стерильной воды в течение 45 секунд, а затем добавляли 2 мл 2-х кратного PBS для восстановления тоничности. Центрифугировали при 200g, +4°С, 10 минут. Осажденные нейтрофилы промывали PBS и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI-1640+10% FBS). Чистоту популяции нейтрофилов (95%) оценивали по прямому и боковому светорассеиванию с помощью проточной цитометрии.
Активацию нейтрофилов (дегрануляцию) оценивали по увеличению на поверхности клеток молекул CD lib, CD66b (компоненты мембран специфических, желатиназных и четвертичных гранул) после инкубации их с ЛПС в дозе 200 нг/мл в течение 30 минут при 37°С, затем добавляли 2,5 мкл антител к CD lib, CD66b, CD63 конъюгированных с флуоресцентным красителем FITC (ThermoFisher, США), и оставляли на 30 минут во льду. Затем анализировали не менее 50 тысяч клеток с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter CytoFLEX.
2
Уровень апоптоза и некроза нейтрофилов оценивали по окраске аннексии V- положительных и пропидий иодид-отрицательных клеток по следующей методике. Нейтрофилы доноров инкубировали с ЛПС в дозе 200 нг/мл в течение 22 часов при 37°С в увлажненном CCh-инкубаторе. Затем клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 минут и ресуспендировали осадок в 70 мкл буфера (10 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl, pH=7,4). К каждой пробе добавляли 2,5 мкл аннексина V, конъюгированного с флуоресцентным красителем FITC (ThermoFisher, США), и оставляли на 25 минут при +37°С. Далее добавляли иодид пропидия до конечной концентрации 5 мкг/мл, инкубировали еще 5 минут, после чего анализировали не менее 50 тысяч клеток с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter CytoFLEX.
В проведенном эксперименте уровень экспрессии CD11b на поверхности интактных нейтрофилов здоровых доноров до ингаляции ксенона принимали за 100% относительно уровня флуоресценции. Провоспалительная стимуляции ЛПС в дозе 200 нг/мл в среднем в 4,5 раза (р<0,001) увеличивала экспрессию CD1 lb на поверхности ранее интактных нейтрофилов. После наркоза ксеноном 30 об. % в течение 60 минут и стимуляции ЛПС в дозе 200 нг/мл экспрессия CD11b на поверхности нейтрофилов увеличивалась только в 1,8 раза (р<0,05 - при сравнении с группой, где проводили стимуляцию ЛПС, но не проводили ингаляцию ксенона).
Таким образом установлено что ингаляция ксенона в дозе 30 об. % в течение 60 минут более, чем в 2 раза (р<0,05) снижает способность нейтрофилов к провоспалительной активации.
Уровень экспрессии CD66b на поверхности интактных нейтрофилов (здоровые доноры до ингаляции ксеноном) авторами также был принят за 100% относительного уровня флуоресценции. Провоспалительная стимуляции ЛПС в дозе 200 нг/мл в среднем в 1,9 раза (р=0,02) увеличивала экспрессию CD66b на поверхности нейтрофилов (фиг. 1). Совместное действие наркоза ксеноном 30 об. % в течение 60 минут и стимуляция нейтрофилов ЛПС в дозе 200 нг/мл статистически незначимо влияло на экспрессию CD1 lb на поверхности нейтрофилов (р=0,09).
Таким образом ингаляция ксенона в дозе 30 об. % в течение 60 минут более, чем в 2 раза (р<0,05) снижала способность нейтрофилов к провоспалительной активации.
Результаты исследования действия ЛПС 200 нг/мл до наркоза ксеноном и после наркоза ксеноном (60 минут 30 об. %) на уровень апоптоза и некроза нейтрофилов человека показали, что спонтанный апоптоз нейтрофилов через 22 часа после выделения составляет 56,7% (фиг. 2). Добавление в среду инкубации нейтрофилов ЛПС в дозе 200 нг/мл уменьшало количество нейтрофилов, которые подвергались спонтанному апоптозу до 22,4%. Таким образом, апоптоз нейтрофилов под влиянием ЛПС уменьшался на 60% (р<0,05), что в клинических условиях способствует генерализации воспаления, а также его бесконтрольному течению.
Ингаляция ксенона в дозе 30 об. % в течение 60 минут почти в 2 раза - до 41% увеличивала спонтанный апоптоз нейтрофилов (р<0,05). Результаты исследования четко показали, что использование ЛПС резко снижает спонтанный апоптоз нейтрофилов и способствует формированию условий для поддержания воспаления, а применение ксенона оказывает противовоспалительный эффект и приводит к разрешению воспаления.
Таким образом, ингаляция ксенона в дозе 30 об. % в течение 60 минут предотвращая чрезмерную активацию нейтрофилов и корректируя их апоптоз, обладает противовоспалительным эффектом, способствуя снижению вероятности развития системной воспалительной реакции у больных при критических состояниях.