Устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках
APPARATUS FOR TESTING THE EFFECTIVENESS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES ON CELLS

Изобретение относится к области биохимии и биофизики, и касается устройства, которое может быть использовано для тестирования эффективности биологически активных веществ на биологических объектах - единичных клетках, группах клеток и тканях в условиях in vitro, in vivo или ex vivo, а также выяснения механизма их действия.
Известно устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках in vitro, включающее блок для локальной контролируемой подачи, содержащий одноканальный нанокапилляр, используемый для подачи биологически активного вещества - капсаицина к клеткам, блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток, а также блок для измерения реакции клеток на введенный капсаицин, представляющий собой флуоресцентный микроскоп.(Babakinejad В. et al. Local delivery of molecules from a nanopipette for quantitative receptor mapping on live cells //Analytical chemistry. - 2013. - T. 85. - №. 19. - C. 9333-9342).
Известное устройство содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как наличие у устройства блока локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающего нанокапилляр, блока позиционирования нанокапилляра, блока сканирования поверхности клеток, а также блока для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество.
Известно устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на кардиомиоцитах in vitro, включающее блок для локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, содержащий одноканальный нанокапилляр, используемый для подачи биологически активных веществ (изопротеренола, селективных блокаторов β-1, β-2 адренорецепторов) к Т-канальцам и гребням клетки (cell crest), блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток, а также блок для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество, представляющий собой флуоресцентный микроскоп (Nikolaev V. О. et al. β2-adrenergic receptor redistribution in heart failure changes cAMP compartmentation // Science. - 2010. - T. 327. - №. 5973. - C. 1653-1657).
Известное устройство содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как наличие у устройства блока локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающего нанокапилляр, блока позиционирования нанокапилляра, блока сканирования поверхности клеток, а также блока для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество.
Наиболее близким к заявляемому является известное устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках, содержащее блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающий нанокапилляр, блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток и блок для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество (оптическими методами) (патент США US9598281 В2, МПК B82Y 15/00 (2011.01) - прототип).
Данное устройство дает возможность оценивать эффективность биологически активных веществ по крайней мере на одной клетке, например, на клетке из клеточной линии человека HeLa, находящейся в питательной среде.
Однако, использование известного устройства для тестирования на клетках, подверженных деформации в естественных условиях (механочувствительных клетках), например, на кардиомиоцитах, миоцитах, эндотелиальных клетках, нейронах может привести к получению недостоверных (некорректных) результатов, поскольку достоверные результаты могут быть получены только в условиях функционирования клеток, приближенных к реальным, в которых они находятся в деформируемом (сокращенном) состоянии. Из научно-технической литературы известно, что механическое напряжение, создаваемое клеткой, или внешнее, способно оказывать влияние на процессы клеточного деления, на регулирование транскрипции, а также на запуск дифференцировки (Engler A. J. et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification //Cell. - 2006. - T. 126. - №. 4. - C. 677-689.) Если механочувствительные клетки не подвергать деформации и вводить на их поверхность либо внутрь их биологически активное вещество, то неизбежно может возрасти вероятность получения недостоверного результата при проведении эксперимента по тестированию эффективности. Также для определения эффективности биологически активных веществ необходимо измерять механические свойства объектов, поскольку определенные вещества могут повлиять на клеточные структуры, ответственные за механические свойства клеток (Ballan N. et al. Single-Cell Mechanical Analysis of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Drug Testing and Pathophysiological Studies // Stem cell reports. - 2020. - T. 15.-№. 3.- C. 587-596.).
Кроме того, известно, что в случае кардиомиоцитов биологически активные вещества необходимо вводить не в любую часть кардиомиоцита, а только в содержащиеся на его поверхностные структуры, например, в Т-канальцы (T-tubules), Z-линии (Z-groove), на гребни клетки (Nikolaev V. О. et al. (32-adrenergic receptor redistribution in heart failure changes cAMP compartmentation //Science. - 2010. - Т. 327. - №. 5973. - С. 1653-1657). Также следует отметить, что введение биологически активных веществ на внешнюю поверхность кардиомиоцита малоэффективно.
Данное устройство содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как наличие в устройстве блока локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающего нанокапилляр, блока позиционирования нанокапилляра, блока сканирования поверхности клеток и блока для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество (оптическими методами).
Недостатками известного устройства является то, что оно позволяет проводить изучение биологических объектов, находящихся только в статическом состоянии, и не дает возможность достоверно определять эффективность биологически активных веществ на индивидуальных (единичных) клетках, находящихся в естественных условиях их существования, когда клетка подвержена деформации, а также не дает возможности для внешнего физико-химического воздействия на клетки, например, для моделирования патологического процесса или активации биологически активных веществ.
Техническая задача изобретения заключается в разработке устройства для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках in vitro, in vivo или ex vivo, лишенного вышеуказанных недостатков.
Технический результат изобретения состоит в повышении достоверности определения эффективности биологически активных веществ по отношению к механочувствительным клеткам.
Были проведены эксперименты с различными устройствами, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках, содержащее блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающий нанокапилляр, блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток и блок для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество, устройство дополнительно содержит блок для измерения и/или осуществления деформации клеток. Кроме того, устройство может дополнительно содержать блок для внешнего физико-химического воздействия на клетки.
Предлагаемое устройство является новым и не описано в научно-технической литературе.
Известно устройство для целевого поиска лекарственных средств и/или разработки лекарственных средств, а также для определения кардиотоксичности химического соединения, включающее подложку, несущую деформируемый блок, обеспечивающий внеплоскостную деформацию, который содержит первый деформируемый слой, второй деформируемый слой и многоэлектродную структуру, прослоенную между первым и вторым деформируемыми слоями. При этом второй деформируемый слой содержит приклеенный к нему трафарет кардиомиоцитов и контейнер для жидкости, в котором содержится раствор вещества для воздействия на кардиомиоциты. Данное устройство не содержит нанокапилляра и не позволяет локально контролируемо подавать раствор химического соединения на поверхностные структуры единичных клеток (патент RU 2524134, 2010). Следует отметить, что хотя данное устройство и содержит блок, обеспечивающий деформацию исследуемого объекта, но в данном техническом решении ничего не сказано о том, что данный блок используется для повышения достоверности определения эффективности биологически активных веществ по отношению к механочувствительным клеткам.
Предлагаемое устройство может быть использовано для тестирования эффективности различных биологически активных веществ, например таких, как обезболивающие препараты, противораковые препараты, кардиологические препараты, антибиотики и т.д. на биологических объектах. При этом биологические активные вещества могут включать в себя малые молекулы, метаболиты клеток, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, пептиды, аминокислоты, красители, водорастворимые полимеры, наночастицы, антитела и т.д., но не ограничиваются ими. При этом биологически активные вещества могут вводится как в чистом виде, так и в виде их растворов в подходящем растворителе. В качестве тестируемых объектов могут быть использованы различные индивидуальные (единичные) клетки живых организмов, в том числе человека, например, кардиомиоциты, миоциты, нейроны, эндотелиальные клетки, и т.д., а также совокупности клеток (ткани), например, различные ткани, такие как мышечная, сердечная, нервная, находящаяся в мышечных волокнах, и т.д. При использовании в качестве объектов клеток они могут быть как прокариотами, так и эукариотами, также для экспериментов могут использоваться растительные клетки. При этом объекты не должны быть твердыми и должны позволять вводить внутрь себя нанокапилляр в случае внутриклеточного введения биологически активного вещества. Необходимо отметить, что все клетки для обеспечения их жизнестойкости должны находиться в питательной среде, например, в DMEM F12, MEM, RPMI-1641.
В предлагаемом техническом решении в качестве объектов могут выступать клетки и ткани, извлеченные из органов живых организмов с какой-либо патологией, например, из сердца, которое перенесло инфаркт миокарда.
Предложенное устройство, также как и известное устройство, выбранное в качестве прототипа, обязательно должно содержать блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества на поверхность или внутрь биологического объекта, включающий нанокапилляр. Наличие в предложенном блоке нанокапилляра необходимо для локальной подачи исследуемого вещества как на поверхность, так и внутрь клетки без повреждения ее мембраны. Если вместо нанокапилляра использовать капилляр больших размеров, например, 10 мкм, то введение тестируемого биологически активного вещества в объект без повреждения мембраны объекта окажется невозможным. Следует отметить, что используемый нанокапилляр может содержать как один канал, так два и более изолированных друг от друга каналов. При этом количество каналов, находящихся внутри нанокапилляра, может быть как четным, так и нечетным.
Вышеуказанные капилляры могут быть изготовлены, например, из стекла, кварца, полимеров и т.д. Также в каждом из каналов может по всей длине находится стеклянный филамент (стеклянная нить) для обеспечения наиболее эффективного заполнения наноканалов жидкостью. В данном техническом решении внутренний диаметр нанокапилляров может составлять, например, 1-100 нанометров (им). Внешний диаметр таких капилляров должен не превышать размер микрообъекта, и также может варьироваться в широких пределах, например, 10-100 нм. Типичная длина острия нанокапилляра обычно не превышает 10 микрометров (мкм) и может варьироваться в зависимости от решаемой задачи. Ввиду того, что в данном техническом решении все каналы находятся внутри нанокапилляра, то эти каналы сами фактически являются наноканалами.
Размеры нанокапилляров определяются в соответствии с конкретной задачей и зависят от изучаемого объекта. Методика получения таких капилляров описана в научно-технической литературе (Rodolfa К. Т. et al. Nanoscale pipetting for controlled chemistry in small arrayed water droplets using a double-barrel pipet //Nano letters. - 2006. - T. 6. - №. 2. - C. 252-257), и данные капилляры коммерчески доступны (Sutter, США; WPI, США). Если в предлагаемом техническом решении будут использованы нанокапилляры, содержащие два и более канала, то это позволит одновременно и/или последовательно вводить в клетку два и более различных биологически активных вещества, например, исследовать такие пары как, стимулятор и ингибитор, выявлять наличие синергетического эффекта у различных биологически активных веществ при их введении в клетку и т.д.
Использование не менее двух каналов, содержащих различные вводимые вещества, позволяет в ходе одного эксперимента последовательно или одновременно вводить на поверхность или внутрь микрообъекта несколько интересующих экспериментатора веществ. При этом введение нескольких веществ можно осуществлять через один наноканал, находящийся в нанокапилляре, либо путем введения каждого вещества через свой отдельный наноканал.
Положение нанокапилляра при локальной подаче биологически активного вещества относительно плоскости подложки, на которой расположен биологический объект, может быть любое, например, угол между нанокапилляром и плоскостью может быть равен 0-180°.
Осуществлять контролируемую подачу можно, например, путем создания повышенного давления в нанокапилляре или путем приложения разности потенциалов, если биологически активное вещество несет заряд, а также использовать, например, комбинацию вышеописанных способов.
В случае контролируемой подачи путем создания повышенного давления в канале нанокапилляра, каждый канал может быть подключен к системе, обеспечивающей приложение положительного или отрицательного давления.
Данный блок также может быть дополнительно подключен к программируемому устройству, например, к компьютеру, для ввода пользователем вручную координат расположения нанокапилляра для локального введения. Заданное местоположение может быть как внутри клетки, так и снаружи ее. Если предложенное устройство не будет содержать вышеописанного блока, то оно станет неработоспособным.
Устройство также содержит блок позиционирования нанокапилляра, который позволяет контролируемо подводить нанокапилляр на различное расстояние от поверхности клетки, а также проникать в клетку на различную необходимую глубину для локальной контролируемой доставки биологически активных веществ к компартментам клетки. Контролировать положение конца нанокапилляра относительно клетки можно, например, используя принцип сканирующего ион-проводящего микроскопа (СИПМ), измеряя ионный ток, проходящий через нанокапилляр. Для этого внутрь нанокапилляра, по крайней мере один канал которого заполнен электролитом, например, фосфатным буфером с добавлением NaCl (НФСБ), помещают серебряную проволоку, покрытую хлоридом серебра, при этом электрод сравнения опускают в раствор электролита, в котором находится клетка. При подаче потенциала на нанокапилляр измеряют ионный ток с помощью усилителя, например, MultiClamp 700 В (Axon Instruments, США) с коэффициентом усиления 1 мВ/пА. По мере приближения конца нанокапилляра к клетке, либо к любой твердой поверхности, ионный ток, протекающий через отверстие нанокапилляра, будет уменьшаться. Падение тока может выступать в качестве сигнала обратной связи для управления положением нанокапилляра относительно поверхности. Таким образом, контролируя ионный ток, можно определить точное положение нанокапилляра относительно поверхности и управлять им, располагаясь на поверхности или внутри биологического объекта.
Стоит отметить, что данный блок может обладать функцией, обеспечивающей грубое позиционирование нанокапилляра, с помощью либо моторизированных сервоприводов, либо механических ручных винтов с микрометровой точностью, а также может содержать пьезоактуаторы для позиционирования нанокапилляра с более высокой точностью.
Обработку полученного сигнала от усилителя проводят с помощью аналого-цифрового преобразователя (АЦП), например, Axon Digidata 1550 (Axon Instruments, США) и программного обеспечения для сбора данных. С целью изоляции от внешних электромагнитных полей система сканирования может быть экранируема камерой Фарадея. Вся установка, кроме управляющих модулей, преимущественно может располагаться на антивибрационном столе. Если предложенное устройство не будет содержать вышеописанного блока, то оно также утратит работоспособность.
Предлагаемое устройство также содержит блок сканирования поверхности биологического объекта. Необходимость такого сканирования обусловлена тем, что при использовании биологического объекта, например, кардиомиоцита, биологическое активное вещество необходимо локально подавать в определенные поверхностные структуры (Т-канальцы, Z-линии), определить местонахождение которых на поверхности клеток без сканирования клетки невозможно. (Nikolaev V. О. et al. (32-adrenergic receptor redistribution in heart failure changes cAMP compartmentation //Science. - 2010. - T. 327. - №. 5973. - C. 1653-1657).
Работа данного блока основана на принципе работы СИПМ, который является одним из типов сканирующей зондовой микроскопии, позволяющей получать топографию поверхности живых клеток с высоким разрешением. Метод основан на сканировании с помощью нанокапилляра поверхности клетки и использовании падения ионного тока, протекающего внутри нанокапилляра, при подведении нанокапилляра к поверхности в качестве сигнала обратной связи с целью регулирования расстояния от поверхности до кончика нанокапилляра. Данный блок включает в себя пьезоактуаторы, позволяющие контролировать положение образца при сканировании в плоскости, образованной осями XY, емкостные датчики и контроллер, управляющий всей системой. В качестве пьезоактуатора преимущественно может выступать модель S-316.10 с наклонным наконечником (Physik Instrumente, Германия), который обеспечивает сканирование в плоскости XY и установлен на торце пьезопривода, например, P-725.CDD Fast PIFOC (Physik Instrumente, Германия) с ходом 20 мкм по оси Z. При полном угле наклона пьезоакутуатора 1200 мкрад и длине пипетки 50 мм можно легко получить изображение размером 40×40 мкм в плоскости XY. Если предложенное устройство не будет содержать вышеописанного блока, то оно также утратит работоспособность.
Предложенное техническое решение обязательно должно содержать блок для измерения реакции клеток и тканей на введенное биологически активное вещество. Данный блок включает в себя флуоресцентный микроскоп, который содержит источник света, например, ртутную лампу с набором возбуждающих фильтров, оптический микроскоп, например, Nikon Eclipse Ti2, детекторы, регистрирующие флуоресценцию от возбуждения источником света, а также систему получения и обработки полученных изображений. Оптический микроскоп может быть как инвертированным, так и прямым. Также в качестве данного блока может выступать лазерный конфокальный микроскоп, либо его разновидности, необходимые для получения изображений в более высоком разрешении. Если устройство не будет содержать вышеуказанный блок, то оно станет неработоспособным.
Также стоит отметить, что поскольку устройство содержит блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, блок позиционирования нанокапилляра и блок сканирования поверхности клеток, то данное устройство дает возможность для проведения записи активности ионных каналов клетки с помощью нанокапилляра, например, натриевых или кальциевых (Bhargava A. et al. Super-resolution scanning patch clamp reveals clustering of functional ion channels in adult ventricular myocyte //Circulation research. - 2013. - Т. 112. - №. 8. - С. 1112-1120.).
В отличие от прототипа предложенное устройство дополнительно содержит блок (модуль) для деформации биологических объектов, особенно таких как кардиомиоциты, миоциты, эндотелиальные клетки и т.д. Данный блок включает в себя два симметричных модуля (ступени), установленных друг напротив друга и расположенных на общей платформе. Данные модули осуществляют грубое позиционирование с целью выбора исследуемой клетки.
Каждый модуль содержит пьезоактуатор на основе, например, кристалла ниобата лития, диапазон смещения которого достаточен для деформации отдельных клеток или тканей, при этом положение каждого модуля в плоскости XY с целью грубого позиционирования нанокапилляра для дальнейшего закрепления клетки возможно контролировать с помощью ручных механических или автоматических моторизированных приводов. С пьезоактуатором соединен держатель, в который вставляется стеклянная пипетка или стержень, изготовленный, например, из полимерных или углеродных материалов. После выбора клетки кончики стержней прикрепляются к ней биосовместимым клеем. Биологический объект фиксируют с помощью специального биосовместимого клея к стеклянной пипетке или волокну. Биосовместимый клей для фиксации клеток коммерчески доступен (MyoTak, IonOptix). В качестве фиксирующих клеев для биологических объектов могут выступать любые биосовместимые типы клеев, предназначенные для работы с клетками.
Также в качестве способов закрепления биологических объектов могут выступать различные устройства для их удерживания, расположенные на концах стержней, например микропинцеты, оптические пинцеты, при этом биологические объекты можно фиксировать с помощью двух нанокапилляров, находящихся непосредственно вблизи границ биологического объекта, прикладывая к ним отрицательное давление.
После закрепления биологический объект с помощью пьезоэлектрических приводов подвергают деформации, например сжатию или растяжению. Предел отклонения каждого из приводов может быть различным и составлять, например, 10-1000 мкм, точность позиционирования нанокапилляра может быть также различной и составлять, например, менее 5-10 нм.
Контроль за степенью деформации осуществляют с помощью персонального компьютера (ПК), при этом режим и степень деформации биологического объекта могут быть различны, например, можно изменять амплитуду и частоту прикладываемого механического напряжения к клеткам.
Для измерения силы, создаваемой биологическим объектом, например, кардиомиоцитом, с достаточной чувствительностью, быстротой реакции и стабильностью используют преимущественно оптические датчики, однако возможно использование пьезорезистивных датчиков. Также косвенно можно определять силу сокращения, используя метод обработки видеоизображений.
Датчик силы способен измерять силу, например, в диапазоне 0,001-100 микроньютон (мкН) с разрешением 1 наноньютон (нН). В качестве индикатора силы используют отклонение кантилевера, который закреплен к одному из держателей клетки, при этом изгиб кантилевера измеряют с помощью лазерной интерферометрии, например, с помощью интерферометра типа Фабри-Перо. Лазерный свет подают на кантилевер через стандартное оптическое волокно диаметром, например, 50-150 мкм. Свет, отраженный от границы раздела волокна с жидкостью и от кантилевера, проходит обратно через одно и то же оптическое волокно к его дистальному концу, создавая интерференционный сигнал, амплитуда которого зависит от положения кантилевера.
Перед началом эксперимента длину волны лазера настраивают так, чтобы интерферометр находился в состоянии, где синус, описывающий амплитуду интерференционного сигнала, имеет максимальную производную. При этом жесткость изготовленных зондов может быть различной, например 5-100 ньютон (Н)/м, что соответственно повлияет на разрешающую способность. Например, для кантилевера, используемого для этих экспериментов, жесткость была равна 50 Н/м, разрешение по силе составило 50 нН в диапазоне 5 мкН. Дрейф базовой линии составлял <0,1 мкН / мин при постоянной температуре.
Если предложенное устройство не будет содержать вышеописанного блока, то технический результат будет недостижим.
Предложенное техническое решение может также содержать блок для внешнего физико-химического воздействия (стимуляции) на клетки, например, механического, электромагнитного, магнитного, электрического, температурного, химического (действие веществ) и т.д. Данный блок необходим для внешнего воздействия на клетки, например, для моделирования патофизиологического процесса, для активации биологического активного вещества или для быстрой смены состава раствора, в котором осуществляется проведение эксперимента.
Данный блок может включать в себя несколько сменных насадок, позволяющих проводить внешнее воздействие на биологические объекты, систему позиционирования сменных зондов, а также подключаемый к ПК модуль управления, контролирующий и обеспечивающий взаимодействие всех систем в данном блоке внешнего физико-химического воздействия на биологические объекты.
Для механических воздействий в качестве сменной насадки может быть использован нанокапилляр, с помощью которого осуществляют прокол мембраны клетки (механическую стимуляцию), либо клетку можно деформировать потоком жидкости, исходящей из отверстия нанокапилляра, при подаче на него положительного давления. Для электромагнитных воздействий используют гибкое оптическое волокно микрометрового диаметра, подключенное к источнику света. Стоит отметить, что некоторые биологически активные вещества чувствительны к некоторым видам электромагнитного воздействия, поэтому для достоверной оценки их эффективности необходимо применять данный вид воздействия, например, ультрафиолетовое, инфракрасное, видимое излучение и др. Для температурных воздействий можно использовать нагревательный элемент микрометровых размеров, включающий в себя термопару, подключенную к блоку управления для контроля заданной температуры. Для быстрой смены состава раствора можно использовать, например, сменную трубку, опущенную в среду, в которой проводят эксперимент и с помощью приложения к пей положительного либо отрицательного давления, осуществлять либо подачу раствора с другим биологическим активным веществом, либо забор раствора из камеры для проведения эксперимента. Все сменные зонды могут быть расположены, как в области локальной контролируемой подачи, так и в другой области клетки и их положение регулируется с помощью системы позиционирования.
Следует отметить, что предлагаемое устройство универсально и дает возможность тестировать эффективность биологически активных веществ на клетках как в условиях только их деформации, или деформации и физико-химического воздействия на клетку, так и в ее отсутствии.
Преимущества предложенного устройства иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1 (контрольный, по прототипу)
В опыте используют устройство, содержащее блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающий нанокапилляр, содержащий два изолированных друг от друга канала, блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток и блок для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество.
Блок локальной подачи включает в себя двухканальный нанокапилляр, подключенный к насосу, обеспечивающему приложение давления внутрь капилляра величиной в 50 кПа.
Двуканальный нанокапилляр изготавливают из двухканальных кварцевых капилляров с наружным диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 0,90 мм (Sutter Instrument, США), затем капилляр вытягивают с помощью лазерного пуллера Р-2000 (Sutter Instrument, США.) с целью получения нанокапилляров с внутренним диаметром каждого канала 50 нм. Для заполнения каналов в нанокапилляре используют иглу для шприца MicroFil (World Precision Instruments, США). Один канал был заполнен водным раствором биологически активного вещества - изопротеренола (стимулятора), второй был заполнен водным раствором другого биологически активного вещества - верапамила (ингибитор), после чего нанокапилляр был подключен к системе, контролирующей давление в нанокапилляре. Стоит отметить, что подачу вещества в каждом канале осуществляют отдельно друг от друга. Блок локальной контролируемой подачи обеспечивает увеличение давления внутри капилляра с целью высвобождения вещества.
2+
В качестве объекта исследования в примере были выбраны клетки кардиомиоцитов (in vitro). Выделение кардиомиоцитов левого желудочка взрослых крыс было выполнено с помощью перфузии Лангендорфа от взрослых самцов крыс линии Sprague-Dawley весом 150-250 г. Сердца были извлечены и перфузированы по Лангендорфу сначала раствором Тироде в течение 5 мин, далее тем же раствором с низким содержанием ионов Са в течение 5 мин и после чего в течение 10 мин раствором, содержащим 1 мг/мл коллагеназы и 0,6 мг/мл гиалуронидазы. После этого сердца были удалены из перфузионной системы, левый желудочек был вырезан, разрезан на более мелкие части и повторно суспендирован в растворе фермента, содержащем только коллагеназу. После чего был подвержен встряхиванию в течение 30 мин. Полученная суспензия клеток была отцентрифугирована и оставлена в буферном растворе без ферментов при комнатной температуре. Далее клетки были культивированы в среде Ml99 (Gibco, США) с добавлением таурина 5 мМ, карнитина 5 мМ, креатина 5 мМ, 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, 100 мМ аскорбата натрия и 100 мМ пенициллина/стрептомицина.
Перед проведением эксперимента кардиомиоцит был зафиксирован в блоке для деформации клеток с помощью биосовместимого клея МуоТак и помещен в буфер Хэнкса для дальнейших измерений. В данном примере закрепленный кардиомиоцит не деформируют, а только измеряют силу его сокращений в нерастянутом состоянии. Для измерения силы сокращения кардиомиоцитов в качестве индикатора было использовано отклонение кантилевера, который закреплен на одном из держателей клетки, при этом изгиб кантилевера был определен с помощью стандартной процедуры, используя интерферометр типа Фабри-Перо.
Стимуляция кардиомиоцитов была проведена следующим образом. Нанокапилляр был подведен к кардиомиоциту на расстоянии 100 нм от его поверхности, после чего, используя блок сканирования поверхности, поверхность кардиомиоцита была отсканирована с целью получения топографии ее поверхности. Далее по полученной топографии образца нанокапилляр был подведен к Т-канальцам кардиомиоцитов и далее с помощью системы локальной контролируемой подачи в течение 1 мин было подано содержимое первого канала объемом 137 пиколитров (пкл), заполненного водным раствором изопротеренола (стимулятора) с концентрацией 10 мкмоль/л, прикладывая к каналу положительное давление 50 кПа.
0
Результаты опыта показаны на Фиг. 1, у которой ось абсцисс соответствует продолжительности времени в мин, а ось ординат показывает степень увеличения силы сокращения кардиомиоцита F, относительно первоначальной силы его сокращения F. На Фиг. 1 стрелкой 1 показан момент начала введения водного раствора изопротеренола, после подачи которого сила сокращения кардиомиоцитов возросла на 45%.
Спустя 3 мин после введения стимулятора в тоже место в течение 1 мин с помощью системы локальной контролируемой подачи был введен водный раствор ингибитора верапамила с концентрацией 5 мкмоль/л объемом 137 пкл, момент введения которого показан на Фиг. 1 стрелкой 2. Стоит отметить, что при введении данного биологически активного вещества сила сокращения (растяжения) кардиомиоцитов снизилась на 39%, и практически стала равна начальным значениям.
Пример 2 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках, которое дополнительно включает блок для деформации клеток, с помощью которого биологический объект подвергают растяжению на 10%.
0
Результаты опыта показаны на Фиг. 2, у которой ось абсцисс соответствует продолжительности времени в мин, а ось ординат показывает степень увеличения силы сокращения кардиомиоцита F, относительно первоначальной силы его сокращения F, стрелкой 1 показан момент начала введения изопротеренола (стимулятора).
Опыт показал, что при растяжении кардиомиоцита до введения изопротеренола сила его сокращения увеличивается на 48%, и при введении такого же объема раствора изопротеренола, что и в примере 1, измеряемая сила сокращения кардиомиоцита возрастает на 90% от начальных значений.
При введении такого же объема водного раствора ингибитора верапамила, что и в примере 1, момент начала введения которого показан стрелкой 2, сила сокращения кардиомиоцитов снизилась на 51%, что не соответствует начальным значениям силы сокращения кардиомиоцитов.
Таким образом, опыт показал, что сила сокращения кардиомиоцитов в растянутом и недеформированном положениях отличается друг от друга, и результаты тестирования биологически активного вещества верапамила без предварительной деформации недостаточно достоверны.
Пример 3 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако второй канал нанокапилляра заполняют водным раствором верапамила с более высокой концентрацией 20 мкмоль/л.
0
Результаты опыта показаны на Фиг. 3, у которой ось абсцисс соответствует продолжительности времени в мин, а ось ординат показывает степень увеличения силы сокращения кардиомиоцита F, относительно первоначальной силы его сокращения F. Моменты начала введения изопротеренола и верапамила на Фиг. 3 обозначены стрелками 1 и 2, соответственно.
Опыт показал, что при введении большего количества верапамила, сила сокращения (растяжения) кардиомиоцитов снизилась на 87%, и практически стала равна начальным значениям.
Сравнение результатов опыта, описанных в примерах 1-3, показывает, что при растяжении предварительно деформированных кардиомиоцитов для уменьшения силы их сокращения, обусловленной введения стимулятора, необходимо введение большего количества верапамила (Пример 3). Поскольку кардиомиоциты в реальных условиях находятся под воздействием деформации, то для них верапамил, влияющий на силу сокращения, необходимо вводить в существенно большем количестве в сравнении со случаем, когда клетка кардиомиоцита была предварительно недеформирована (Пример 1). Поэтому подбор дозы лекарственного вещества верапамила необходимо осуществлять в условиях функционирования клеток, близких к реальным, т.е. когда кардиомиоцит подвергается механической нагрузке. Таким образом, наиболее достоверна оценка эффективности дозы лекарственного вещества на кардиомиоцитах, находящихся в растянутом состоянии.
Из этого следует, что предлагаемое устройство действительно повышает достоверность тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках.
Пример 4 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 3, однако используют четырехканальный нанокапиляр, где биологический объект сжимают на 3%. Первый канал заполнен водным раствором с концентрацией 10 мкмоль/л изопротеренола, второй канал нанокапилляра заполнен водным раствором с концентрацией 2,5 мкмоль/л верапамила, третий канал заполнен водным раствором с концентрацией 10 мкмоль/л верапамила, четвертый канал заполнен водным раствором верапамила с концентрацией 20 мкмоль/л.
0
На Фиг. 4 подписи на оси абсцисс соответствуют концентрациям растворов верапамила, которые подают через разные наноканалы, цифрой «0» описано измерения без воздействия водного раствора верапамила, ось ординат показывает степень увеличения силы сокращения кардиомиоцита F, относительно первоначальной силы его сокращения F. Опыт показал, что при введении одинакового объема раствора верапамила, но разной концентрации, сила сокращения (растяжения) кардиомиоцитов варьируется (Фиг. 4). Таким образом, показано, что с помощью четырехканального нанокапилляра возможно подбирать дозировку лекарственного средства при нахождении кардиомиоцита в условиях, приближенных к реальным.
Пример 5 (по изобретению)
В опыте используют устройство, содержащее блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающий нанокапилляр, содержащий два изолированных друг от друга канала, блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток, блок для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество и блок для деформации клеток.
Блок локальной подачи включает в себя двухканальный нанокапилляр, изготовленный из двухканалыюго боросиликатного капилляра с наружным диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 0,90 мм (Sutter Instrument, США), затем капилляр был вытянут с помощью лазерного пуллера Р-2000 (Sutter Instrument, США.) с целью получения нанокапилляров с внутренним диаметром каждого канала 100 нм. Каналы в нанокапилляре были заполнены иглой для шприца MicroFil (World Precision Instruments, США). Один канал был заполнен водным раствором 6-карбокси-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата (DCFDA), второй был заполнен водным раствором партенолида, после чего нанокапилляр был подключен к системе, контролирующей потенциал в нанокапилляре. Для этого нанокапилляр был вставлен в специальный держатель с серебряной проволокой, покрытой хлоридом серебра, которая контактировала с раствором внутри нанокапилляра. Стоит отметить, что подача вещества в каждом канале осуществлялась отдельно друг от друга. Блок локальной контролируемой подачи обеспечивал изменение потенциала внутри капилляра с целью высвобождения вещества.
В качестве объекта исследования были выбраны клетки скелетной мышечной ткани - миоциты. Мышцы от самцов крыс в возрасте 9-11 мес выделяют из короткого сгибателя пальцев. После эвтаназии животных мышцы были собраны и помещены в 4 мг/мл раствор коллагеназы А. После инкубации при 37°С в течение 2 ч мышцы были обработаны для высвобождения отдельных волокон, которые затем были зафиксированы на подложке в течение 24 ч после выделения.
Перед проведением эксперимента выбранный миоцит был зафиксирован в блоке для деформации клеток с помощью биосовместимого клея MyoTak и помещен в буферный раствор Хэикса для дальнейших измерений.
Нанокапилляр был подведен к поверхности миоцита на расстояние 100 нм, после чего, используя блок сканирования поверхности, поверхность миоцита была отсканирована с получением изображения топографии поверхности. Далее по полученной топографии образца, нанокапилляр был подведен к выбранному месту и был осуществлен прокол мембраны клетки, после чего с помощью системы локальной контролируемой подачи в течение 2 мин было подано содержимое первого канала, заполненного водным раствора DCFDA (вещество, позволяющее визуализировать активные формы кислорода внутри клетки (АФК)) с концентрацией 20 мкмоль/л, прикладывая напряжение в системе равное -1 В. Объем введенного раствора составил 245 пкл. После подачи DCFDA нанокапилляр был выведен из клетки и спустя 5 мин закрепленный миоцит был деформирован с помощью протокола динамического синусоидального растяжения (изменение длины (амплитуды) 8 мкм с частотой 1 Гц) и была измерена интенсивность флуоресценция окисленной формы DCFDA под действием АФК при длине волны 533 нм. Спустя 5 мин на поверхности клетки на расстоянии 100 нм от нее в течение 2 мин вводили содержимое второго канала - водный раствор 5 мкмоль/л биологически активного вещества партенолида объемом 245 пкл.
Результаты опыта показаны на Фиг. 5, у которой оси абсцисс соответствует время, измеряемое в секундах, оси ординат соответствуют абсолютные единицы интенсивности флуоресценции, стрелкой 3 обозначен момент начала введения раствора DCFDA, стрелкой 4 обозначен момент начала введения раствора партенолида. При растяжении миоцита интенсивность флуоресценции возросла на 3 единицы флуоресценции, что вызвано увеличением АФК под действием растяжения миоцитов, после добавления партенолида интенсивность флуоресценции уменьшилась и стала равна начальным значениям, что свидетельствует об уменьшении АФК внутри клеток (Фиг. 5).
Пример 6 (по прототипу)
Опыт проводят аналогично примеру 5, однако биологический объект не подвергают предварительной деформации (растяжению). При этом второй канал был заполнен водным раствором партенолида с меньшей концентрацией 1 мкмоль/л.
Результаты опыта показаны на Фиг. 6, у которой оси абсцисс соответствует время, измеряемое в секундах, оси ординат соответствуют абсолютные единицы интенсивности флуоресценции, стрелкой 3 обозначен момент начала введения раствора DCFDA, стрелкой 4 обозначен момент начала введения раствора партенолида. Опыт показал, что при отсутствии растяжения и при добавлении DCFDA интенсивность флуоресценции окисленной формы DCFDA изменилась на 1,5 единицы интенсивности флуоресценции, и после введения значительно меньшей концентрации водного раствора партенолида уровень флуоресценции снизился до первоначального значения.
Сравнение результатов, описанных в примерах 5 и 6, показывает, что при растяжении миоцитов для уменьшения АФК необходимо введение большего количества раствора партенолида. Поскольку миоциты в реальных условиях находятся под воздействием деформации, то для них партенолид, влияющий на образование АФК, необходимо вводить в существенно большем количестве в сравнении с покоящейся клеткой.
Поэтому подбор дозы лекарственного вещества необходимо осуществлять в условиях функционирования клеток, близких к реальным, т.е. когда миоцит подвергается механической нагрузке. Таким образом, наиболее достоверна оценка эффективности дозы лекарственного вещества на миоцитах, находящихся в растянутом состоянии.
Из этого следует, что предлагаемое устройство действительно повышает достоверность тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках.
Пример 7 (по изобретению)
В опыте используют устройство, содержащее блок локальной контролируемой подачи биологически активного вещества, включающий нанокапилляр, содержащий три изолированных друг от друга канала, блок позиционирования нанокапилляра, блок сканирования поверхности клеток, блок для измерения реакции клеток на введенное биологически активное вещество и блок для деформации клеток.
2+
Блок локальной подачи включает в себя трехканальный нанокапилляр, который изготовлен из трехканального алюмосиликатного стеклянного капилляра с наружным диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,6 мм, затем капилляр вытягивался с помощью лазерного пуллера Р-2000 (Sutter Instrument, США.) с целью получения нанокапилляров с внутренним диаметром каждого канала 55 нм. Каналы в нанокапилляре заполняли иглой для шприца MicroFil (World Precision Instruments, США). Один канал был заполнен водным раствором Fluo-4 AM (краситель, чувствительный к ионам Са), второй был заполнен раствором верапамила, третий канал был заполнен водным раствором бепридила, после чего нанокапилляр был подключен к системе, контролирующей давление в нанокапилляре. Стоит отметить, что подача вещества в каждом канале осуществляли отдельно друг от друга. Блок локальной контролируемой подачи обеспечивал изменение потенциала внутри капилляра с целью высвобождения вещества.
2+
2+
В качестве объекта исследования были выбраны срезы ткани свободной стенки левого желудочка сердца крысы (ex vivo). Срезы ткани левого желудочка, содержащие трабекулярную сеть, вырезали и немедленно переносили в насыщенный кислородом буфер Кребса-Хенселейта, содержащий 20 ммоль/л моноксима бутандиона и 10 ммоль/л таурина при 4°С. Трабекулы <1,5 мм диаметром и примерно 8 мм длиной прикрепляли к концам стеклянных волокон системы деформации клеток с помощью шелковой нити №7/0 (Medline) и переносили их в чашку для измерений, содержащую буфер Кребса-Хенселейта, затем отмывали от моноксим бутандиона. Растяжение контролировали периодически в течение следующих 45 мин перед применением протокола активного растяжения, при этом ткань предварительно деформировали с частотой 0,5 Гц и амплитудой 15 мкм После того, как значения напряжений в состоянии покоя стали стабильными на расстоянии 2 мкм от поверхности ткани в течение 15 мин вводили содержимое из канала - водный раствор Fluo-4 AM, объемом 10 нанолитров (нл) Далее уменьшали расстояние между нанокапилляром и поверхностью ткани вплоть до 500 нм. Спустя 5 мин после подачи Fluo-4 AM ткань деформировали с помощью протокола динамического синусоидального растяжения (изменение длины 8 мкм с частотой 1 Гц) и измеряли при длине волны 520 нм флуоресценцию при связывании Fluo-4 AM с ионами Са . Спустя 5 мин на поверхность клетки на расстоянии 100 нм от нее в течение 2 мин вводили содержимое второго канала - водный раствор верапамила с концентрацией 1 мкмоль/л объемом 250 пкл, и также измеряли флуоресценцию от комплекса Fluo-4 AM и ионов Са.
2+
С помощью системы позиционирования нанокапилляр подводили к соседней клетке в ткани и спустя 5 мин на поверхность клетки на расстоянии 100 нм от нее в течение 2 мин вводили содержимое второго канала - водный раствор бепридила с концентрацией 3 мкмоль/л объемом 250 пкл, и также измеряли флуоресценцию от комплекса Fluo-4 AM и ионов Са.
Результаты опыта показаны на Фиг. 7, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием в абсолютных единицах интенсивности флуоресценции, по оси абсцисс цифрой 5 обозначено состояние ткани при растяжении, цифрой 6 обозначено обозначено состояние ткани после введения водного раствора верапамила с концентрацией 1 мкмоль/л при растяжении, цифрой 7 обозначено состояние ткани после введения водного раствора бепридила с концентрацией 3 мкмоль/л при растяжении.
При первичном введении раствора верапамила интенсивность флуоресценции снижается по сравнению с начальным состоянием на 30%, далее после введения бепридила рядом с другой выбранной клеткой, интенсивность флуоресценции падает на 52%, что связано с блокировкой кальциевых каналов.
Опыт показал, что при наличии по крайней мере двух капилляров возможно осуществлять быстрое тестирование биологически активных веществ на соседних клетках в ткани, подверженной растяжению и сравнить их эффективность между собой.
Пример 8 (по прототипу)
Опыт проводят аналогично примеру 7, однако биологический объект не подвергают деформации (растяжению).
Результаты опыта представлены на Фиг. 8, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием в абсолютных единицах флуоресценции, по оси абсцисс цифрой 8 обозначено состояние ткани без растяжении, цифрой 9 обозначено состояние после введения водного раствора 1 мкмоль/л верапамила, цифрой 10 обозначено состояние после введения водного раствора 3 мкмоль/л бепридила. Опыт показал, что при отсутствии растяжения интенсивность флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с ионами кальция после введения верапамила и бепридила достоверно не различается.
Сравнение результатов, описанных в примерах 7 и 8, показывает, что при растяжении ткани стенки левого желудочка крысы из двух лекарственных веществ можно выбрать одно более эффективное, поскольку в опыте между ними есть достоверные отличия. Однако при тестировании эффективности лекарств на нерастянутой ткани невозможно выбрать наиболее эффективное вещество, поскольку клетки ткани находится в условиях, отличных от живого организма. Поэтому выбор и сравнение лекарственных веществ на биологическом объекте необходимо осуществлять в условиях функционирования, близких к реальным, т.е. когда ткань подвергается механической нагрузке. Таким образом, предлагаемое устройство повышает достоверность оценки эффективности биологически активного (лекарственного) вещества на ткани, находящейся в растянутом состоянии.
Пример 9 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках включает в себя блок для внешнего физико-химического воздействия на клетки и ткани, где в качестве внешнего физико-химического воздействия выбрана механическая стимуляция мембраны потом жидкости с использованием нанокапилляра, к внутреннему каналу которого приложено положительное давление 100 кПа.
В примере первый канал заполнен водным раствором биологически активного вещества - колхицина с концентрацией 30 мкмоль/л, второй канал заполнен раствором другого биологически активного вещества - карбонил цианид м-хлорфенил гидразина (СССРН) с концентрацией 45 мкмоль/л.
Перед проведением эксперимента кардиомиоцит был выдержан в растворе Fluo-4AM с концентрацией 5 мкмоль/л в течение 1 ч, промыт буферным раствором Хэнкса, зафиксирован в блоке для деформации клеток с помощью микропинцетов и помещен в буферный раствор Хэнкса для дальнейших измерений.
В отличие от примера 2, в качестве измеряемой реакции клеток на биологически активное вещество выступала интенсивность флуоресценции комплекса Fluo-4AM с ионами кальция.
Результаты опыта представлены на Фиг. 9, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием в абсолютных единицах флуоресценции, по оси абсцисс цифрой 11 обозначено нормальное состояние клеток при растяжении и при приложении внешнего механического воздействия перпендикулярно плоскости кардиомиоцита, цифрой 12 обозначено состояние клеток после введения водного раствора колхицина с концентрацией 30 мкмоль/л объемом 220, цифрой 13 обозначено состояние клеток после введения водного раствора СССРН с концентрацией 45 мкмоль/л объемом 312 пкл.
Опыт показал, что при внешнем гидростатическом давлении интенсивность флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с ионами кальция после введения колхицина (стимулятора) пкл возрастает на 32%, что свидетельствует об увеличении концентрации ионов кальция, после добавления CCCPFI (ингибитора), концентрация снижается на 15%.
Пример 10 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 9, однако биологический объект не подвергают внешнему механическому воздействию с помощью потока жидкости, используя блок для внешнего физико-химического воздействия на клетки.
Результаты опыта представлены на Фиг. 10, у которой на оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием в абсолютных единицах флуоресценции, по оси абсцисс цифрой 14 обозначено нормальное состояние клеток при растяжении и при приложении внешнего механического воздействия перпендикулярно плоскости кардиомиоцита, цифрой 15 обозначено состояние клеток после введения водного раствора 30 мкмоль/л колхицина, цифрой 16 обозначено состояние клеток после введения водного раствора 45 мкмоль/л СССРН.
Опыт показал, что при отсутствии внешнего физического гидростатического давления интенсивность флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с ионами кальция после введения колхицина (стимулятора) возрастает на 20%, что свидетельствует об увеличении концентрации ионов кальция, после добавления СССРН (ингибитора), снижается до начальных значений.
Сравнение результатов, описанных в примерах 9 и 10, показывает, что при внешнем физическом воздействии потоком жидкости на Т-канальцы кардиомиоцита для уменьшения концентрации ионов кальция необходимо большее количество СССРН, который влияет на содержание ионов кальция, чем в случае отсутствия внешнего воздействия потоком жидкости (механическое воздействие, перпендикулярное плоскости кардиомиоцита). Поэтому подбор дозы биологически активного вещества СССРН необходимо осуществлять в условиях функционирования клеток, близких к реальным, т.е. когда кардиомиоцит подвергается не только продольному растяжению, но и механическому воздействию, перпендикулярному его плоскости. Таким образом, наиболее достоверна оценка эффективности дозы СССРН на кардиомиоцитах, находящихся не только под продольным растяжением, но и под внешним механическим воздействием перпендикулярным плоскости кардиомиоцита.
Таким образом, наличие в устройстве дополнительного блока для внешнего физико-химического воздействия на клетки еще более повышает достоверность оценки эффективности биологически активного (лекарственного) вещества на ткани.
Пример 11 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 7, однако устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках дополнительно включает в себя блок для внешнего физико-химического воздействия на клетки, где в качестве внешнего физического воздействия выбрана электрическая стимуляция, параметры которой включают в себя 6,6 В/см, 1 Гц продолжительность 2 миллисекунды. Срезы ткани предварительно выдерживают в растворе Fluo-4AM с концентрацией 5 мкмоль/в течение 30 мин с последующим промыванием буферным раствором Хенкса. Для локальной подачи биологически активных веществ используют двухканальный нанокапилляр, один канал которого заполнен водным раствором биологического активного вещества - верапамила (ингибитора) с концентрацией 1 мкмоль/л, другой канал заполнен водным раствором другого биологически активного вещества нифедипина (ингибитора) с концентрацией 3 мколь/л.
Результаты опыта показаны на Фиг. 11, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием в абсолютных единицах флуоресценции, цифрой 17 обозначено состояние ткани до электрической стимуляции, цифрой 18 обозначено состояние ткани после электрической стимуляции, цифрой 19 обозначено состояние ткани после введения водного раствора верапамила объемом 350 пкл со стимуляцией, 20 обозначено состояние ткани после введения водного раствора нифедипина объемом 350 пкл со стимуляцией. При введении раствора верапамила интенсивность флуоресценции снижается по сравнению с начальным состоянием на 12%, далее после введения нифедипина рядом с другой выбранной клеткой, интенсивность флуоресценции падает на 35%, что связано с блокировкой кальциевых каналов.
Пример 12 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 11, однако биологический объект не подвергается электрической стимуляции.
Результаты опыта представлены на Фиг. 12, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием в абсолютных единицах флуоресценции, цифрой 17 обозначено состояние ткани без стимуляции, цифрой 21 обозначено состояние ткани после введения водного раствора верапамила с концентрацией 1 мкмоль/л объемом 350 пкл без стимуляции, цифрой 22 обозначено состояние ткани после введения водного раствора нифедипина с концентрацией 3 мкмоль/л объемом 350 пкл без стимуляции.
Опыт показал, что при отсутствии электрической стимуляции интенсивность флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с ионами кальция после введения верапамила и нифедипина достоверно не различается.
Сравнение результатов, описанных в примерах 11 и 12, показывает, что при дополнительной электрической стимуляции ткани стенки левого желудочка крысы из двух лекарственных веществ - верапамила, нифедипина можно выбрать одно более эффективное, поскольку в опыте между ними есть достоверные отличия. Однако при тестировании эффективности лекарств на нестимулированной ткани невозможно выбрать наиболее эффективное вещество, поскольку клетки ткани находится в условиях, отличных от живого организма. Поэтому выбор и сравнение лекарственных веществ на биологическом объекте необходимо осуществлять в условиях функционирования, близких к реальным, т.е. когда ткань подвергается не только механической, но и электрической стимуляции. Таким образом, наличие в устройстве дополнительного блока для внешнего физико-химического воз/действия на клетки еще более повышает достоверность оценки эффективности лекарственного вещества на ткани
Пример 13 (по изобретению)
2
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако устройство для тестирования эффективности биологически активных веществ на клетках дополнительно включает в себя блок для внешнего физико-химического воздействия на клетки, где в качестве внешнего воздействия выбрана стимуляция клеток светом с длиной волны 670 нм и мощностью 50 мВатт/см, передаваемым с использованием оптоволокна.
Перед проведением эксперимента кардиомиоцит был выдержан в водном растворе красителя диацетата 4-амино-5-метиламино-2,7 -дифторфлуоресцеина (ДАФ) с концентрацией 5 мкмоль/л в течение 20 мин, промыт буферным раствором Хэнкса, зафиксирован в блоке для деформации клеток и помещен в буферный раствор Хэнкса для дальнейших измерений.
В отличие от примера 2, в качестве измеряемой реакции на биологически активное вещество выступала интенсивность флуоресценции в абсолютных единицах флуоресценции ДАФ после взаимодействия с оксидом азота NO, образующемся при стимуляции светом. В опыте используют одноканальный нанокапилляр, который содержит водный раствор биологически активного вещества N-монометил-b-аргинин ацетата (L-NMMA) с концентрацией 75 мкмоль/л. Объем введения составил 525 пкл.
Результаты представлены на Фиг. 13, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции комплекса Fluo-4 AM с кальцием, цифрой 23 обозначено состояние клеток при растяжении без воздействии света, цифрой 24 обозначено состояние клеток при растяжении при воздействии света, цифрой 25 обозначено состояние клеток при растяжении после введения раствора L-NMMA с концентрацией 75 мкмоль/л со стимуляцией светом.
Опыт показал, что при стимуляции светом интенсивность флуоресценции ДАФ возрастает на 46%, что свидетельствует об увеличении концентрации N0, после добавления L-NMMA она снижается до начальных значений.
Пример 14 (по изобретению)
Опыт проводят аналогично примеру 13, однако биологический объект воздействию света не подвергается.
Результаты опыта представлены на Фиг. 14, у которой по оси ординат приведены значения интенсивности флуоресценции ДАФ в абсолютных единицах флуоресценции, цифрой 23 обозначено состояние ткани без стимуляции, цифрой 26 обозначено состояние клеток при растяжении после введения раствора L-NMMA со стимуляцией светом,
Опыт показал, что при отсутствии воздействия светом после введения L-NMMA интенсивность флуоресценции ДАФ незначительно различаются друг от друга.
Сравнение результатов, описанных в примерах 13 и 14, показывает, что при дополнительной стимуляции электромагнитным воздействием (светом) кардиомиоциты способны образовывать оксид азота N0, что является моделированием патологического процесса в клетке. Однако, при тестировании эффективности лекарств на нестимулированных светом клетках невозможно определить эффективность вещества. При этом при стимуляции светом, моделируя патологический процесс, возможно определение наиболее эффективного биологического активного вещества. Таким образом, наличие в устройстве дополнительного блока для внешнего физико-химического воздействия на клетки еще более повышает достоверность оценки эффективности лекарственного вещества на клетке.
Из приведенных примеров видно, что предлагаемое устройство действительно повышает достоверность определения эффективности биологически активных веществ. Наличие в устройстве дополнительного блока для внешнего физико-химического воздействия на клетки еще в большей степени повышает достоверность определения эффективности биологически активных веществ.