УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ МУТАГЕНЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ-ОПОСРЕДОВАННОГО ВВЕДЕНИЯ МУТАГЕННЫХ НУКЛЕИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ В РАСТИТЕЛЬНЫЕ ПРОТОПЛАСТЫ

1. Способ направленного изменения дуплексной акцепторной ДНК-последовательности в протопласте растительной клетки, включающий объединение дуплексной акцепторной ДНК-последовательности с донорным мутагенным нуклеиновым основанием, где дуплексная акцепторная ДНК-последовательность содержит первую ДНК-последовательность и вторую ДНК-последовательность, которая комплементарна первой ДНК-последовательности, и где донорное мутагенное нуклеиновое основание включает по меньшей мере одну ошибочную пару по отношению к дуплексной акцепторной ДНК-последовательности, которую необходимо изменить, предпочтительно, по отношению к первой ДНК-последовательности, где способ дополнительно включает стадию введения мутагенного нуклеинового основания в протопласты клеток с использованием полиэтиленгликоль (ПЭГ)-опосредованной трансформации.
2. Способ по п.1, где мутагенное нуклеиновое основание представляет собой мутагенное одноцепочечное нуклеиновое основание.
3. Способ по п.1, где мутагенное нуклеиновое основание включает LNA-замены, которые представляют собой по меньшей мере один нуклеотид, удаленный из ошибочной пары-мишени, и, необязательно, по меньшей мере 3, 4 или 5 нуклеотидов, удаленных из 5'- и 3'-концов мутагенного нуклеинового основания.
4. Способ по п.1, где мутагенное нуклеиновое основание включает пропиновые замены.
5. Способ по п.1, где акцепторную ДНК берут из геномной ДНК, линейной ДНК, искусственных хромосом млекопитающих, бактериальных искусственных хромосом, дрожжевых искусственных хромосом, растительных искусственных хромосом, ядерной хромосомной ДНК, хромосомной ДНК органелл, эписомной ДНК.
6. Способ по п.1 для изменения клетки, коррекции мутации путем восстановления дикого типа, индуцирования мутации, инактивации фермента путем нарушения кодирующей области, модификации биоактивности фермента путем изменения кодирующей области, модификации белка путем нарушения кодирующей области.
7. Способ улучшения эффективности направленного мутагенеза в растительных протопластах, включающий стадию ПЭГ-опосредованной трансформации.
8. Способ по п.7, где улучшение составляет по меньшей мере 10-кратное улучшение по сравнению с трансформацией на основе электропорации.
9. Способ по пп.7 и 8, где мутагенное нуклеиновое основание представляет собой мутагенное одноцепочечное нуклеиновое основание.
10. Способ по п.7, где мутагенное нуклеиновое основание включает LNA-замены, которые представляют собой по меньшей мере один нуклеотид, удаленный из ошибочной пары-мишени, и, необязательно, по меньшей мере 3, 4 или 5 нуклеотидов, удаленных из 5'- и 3'-концов олигонуклеотида.
11. Способ по п.7, где мутагенное нуклеиновое основание включает пропиновые замены.
12. Способ по п.7, где акцепторную ДНК берут из геномной ДНК, линейной ДНК, искусственных хромосом млекопитающих, бактериальных искусственных хромосом, дрожжевых искусственных хромосом, растительных искусственных хромосом, ядерной хромосомной ДНК, хромосомной ДНК органелл, эписомной ДНК.
13. Способ по п.7, для изменения клетки, коррекции мутации путем восстановления дикого типа, индуцирования мутации, инактивации фермента путем нарушения кодирующей области, модификации биоактивности фермента путем изменения кодирующей области, модификации белка путем нарушения кодирующей области.