СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИИ СПИННОГО МОЗГА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD OF TREATING SPINAL ISCHEMIA IN EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для лечения смоделированной ишемии спинного мозга биологического объекта.
Известен способ лечения заболеваний спинного мозга, сопровождающихся нарушениями двигательных функций, путем электростимуляции его электродами, установленными выше и ниже уровня поражения, при этом, один электрод подводят к спинному мозгу эпи-субдурально, а другой имплантируют в спинномозговой корешок (см. патент RU №2140798, М.кл. A61N 1/36, опубл. 10.11.1999 г.).
Известный способ обеспечивает восстановление как проводящих путей, так и корешково-сегментарного аппарата спинного мозга при его электростимуляции.
При расположении верхнего электрода эпи-субдурально, а нижнего в спинномозговом корешке, электростимуляции подвергаются как центральные нейроны, так и корешково-сегментарный аппарат (периферический нейрон) на всем протяжении процесса, что способствует скорейшему образованию новых межнейронных связей и в конечном итоге улучшению неврологических функций.
Однако известный способ осуществляется лишь после оперативного удаления основного процесса, приведшего например к миелорадикулоишемии. Кроме того, известный способ достаточно сложен и травматичен, требует большого внимания и точности выполнения манипуляций. Так для его выполнения требуется произвести имплантацию долгосрочного электрода в один из спинномозговых корешков, вовлеченных в патологический процесс, осуществить пункцию дуральной манжеты корешка с помощью специального устройства для имплантации электрода в корешки, ввести электрод под дуральную манжету корешка на глубину до 1-2 см проксимально по направлению к спинному мозгу, подвести второй электрод к спинному мозгу эпи-субдурально выше уровня поражения, либо непосредственно через операционную рану, фиксируя его к коже узловым швом, либо - при большой распространенности процесса - пункционным способом через люмбальную иглу.
Известный способ длителен, так как для получения положительного эффекта от лечения требует выполнения электростимуляции в течение 10-30 дней, подключая верхний электрод к выходу "катод", а нижний - к выходу "анод". Подбор параметров стимуляции осуществляют, добиваясь ритмических сокращений мышц в зоне поражения.
Известен способ лечения ишемии спинного мозга, в том числе и на экспериментальных объектах, выбранный в качестве ближайшего аналога, заключающийся во введении биологическому объекту терапевтической дозы эффективного количества эритропоэтина, где первую дозу эритропоэтина вводят после 6 часов после наступления случая ишемии, последующую вторую дозу эритропоэтина вводят в течение от 8 до 24 часов после первой дозы, третью дозу вводят в течение 20-60 часов после наступления случая ишемии и где каждую вводимую дозу эритропоэтина выбирают из диапазона от 2500 до 5000 МЕ/кг (см. патент №2341284, М.кл. А61К 38/18; A61P 9/10, опубл. 20.12.2008 г.).
В известном способе используются разнообразные пути введения эритропоэтина, в частности внутривенно, подкожно, внутримышечно или интраперитонеально.
Однако, как указывают сами создатели известного способа, ни время введения первой дозы рекомбинантного эритропоэтина человека - через 6 часов после наступления случая ишемии, ни его доза в количестве 5000 МЕ/кг, не способствует значительному уменьшению размера ишемии и не приводят к увеличению функциональной оценки процесса восстановления субъекта после случая ишемии, данная оценка для указанной выше дозы и времени составляет 46%, что свидетельствует о недостаточной эффективности известного способа лечения.
Таким образом, техническим результатом, на решение которого направлено заявляемое изобретение, является значительное повышение эффективности способа лечения ишемии спинного мозга в эксперименте.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе лечения ишемии спинного мозга в эксперименте, включающем трехкратное введение внутрибрюшинно рекомбинантного эритропоэтина человека, при котором второе и третье его введение осуществляют соответственно через 24 и 48 часов после действия, приведшего к возникновению ишемии спинного мозга, при этом количество однократно вводимого рекомбинантного эритропоэтина человека составляет 5000 МЕ/кг, согласно изобретению первую дозу данного препарата вводят через 4-6 часов после действия, приведшего к возникновению ишемии спинного мозга, и дополнительно через 30-60 минут после введения первой дозы рекомбинантного эритропоэтина человека осуществляют диффузное чрескожное облучение зоны, расположенной в проекции очага ишемии спинного мозга биологического объекта, увеличенной на 1-2 см с конца, расположенного выше зоны повреждения, при этом облучение осуществляют инфракрасным лазерным излучением диодного лазера с длиной волны 890 нм мощностью 2 Вт в непрерывном режиме в течение 3-х минут с расстояния 3-4 см от поверхности биологического объекта в зоне воздействия, перемещая световод вдоль зоны воздействия со скоростью 5 мм сек, при этом движение световода вдоль зоны воздействия осуществляют по спирали.
Заявителем экспериментально установлено, что именно более ранний по сравнению с ближайшим аналогом, срок начала введения первой дозы рекомбинантного эритропоэтина человека, осуществление диффузного чрескожного облучения инфракрасным лазерным излучением зоны, расположенной в проекции очага ишемии спинного мозга биологического объекта, увеличенной на 1-2 см с конца, расположенного выше зоны повреждения, позволяет в значительной степени повысить эффективность лечения ишемии головного мозга.
При этом, заявителем экспериментально установлено, что наиболее предпочтительным сроком введения первой дозы рекомбинантного эритропоэтина человека являются срок через 4-6 часа после действия, приведшего к возникновению ишемии, а наиболее предпочтительными параметрами лазерного излучения при этом являются использование инфракрасного лазерного излучения диодного лазера с длиной волны 890 нм мощностью 2 Вт в непрерывном режиме и осуществление воздействия в течение 3-х минут с расстояния 3-4 см от поверхности биологического объекта в зоне воздействия, при этом предпочтительной зоной облучения является зона, расположенная в проекции очага ишемии спинного мозга биологического объекта, увеличенная на 1-2 см с конца, расположенного выше зоны повреждения.
Заявителями также экспериментально установлено, что наибольшей эффективности способ достигает при скорости перемещении световода вдоль зоны воздействия, равной 5 мм сек, причем при осуществлении движение световода вдоль зоны воздействия по спирали.
Способ осуществляется следующим образом.
Эксперимент проводился на 48 беспородных половозрелых крысах-самках весом 160-200 грамм. Животных содержали в условиях смешанного освещения, постоянного доступа к стандартному комбинированному корму и воде в индивидуальных клетках.
Моделирование ишемии головного мозга осуществляли следующим образом. Наркотизировали введением раствора золитила внутримышечно в дозе 30 мг/кг.
Транзитная модель ишемии пояснично-крестцового отдела спинного мозга создавали наложением клипсы на брюшную аорту, ниже отхождения почечных артерий, экспозицией 10 минут. Подход к брюшной аорте осуществляли забрюшинным доступом.
Остальной группе животных (n=36) после моделирования ишемии спинного мозга через 4-6 часов внутрибрюшинно вводили первую дозу рекомбинантного эритропоэтина человека (ЭПОКРИН 2000 ME) из расчета 5000 ME на 1 кг животного по международному протоколу. Через 30-60 минут после первого введения рекомбинантного эритропоэтина человека проводят диффузное чрескожное (накожное) облучение зоны, расположенной в проекции очага ишемии спинного мозга биологического объекта, увеличенной на 1-2 см с конца, расположенного выше зоны повреждения инфракрасным диодным лазером с длиной волны 890 нм, мощностью 2 Вт в непрерывном режиме. Время экспозиции 3 минуты с расстояния 3-4 см от поверхности тела биологического объекта в зоне воздействия. При этом, световод перемещали вдоль зоны воздействия со скоростью 5 мм сек, а движение световода вдоль зоны воздействия осуществляли по спирали.
Введение рекомбинантного эритропоэтина человека проводили трехкратно каждому животному внутрибрюшинно через 4-6 часов, 24 часа и 48 часов после действия, приведшего к возникновению ишемии головного мозга (после моделирования ишемии). Количество однократно вводимого рекомбинантного эритропоэтина человека 5000 МЕ/кг веса животного по международному стандарту.
Контрольную группу составляли животные, которым осуществлялось только трехкратное введение рекомбинаторного эритропоэтина по 5000 ME на кг каждому животному внутрибрюшинно через 2-4 часа, 24 часа и 48 часов. Контрольной группе животных не осуществляли диффузное чрескожное (накожное) облучение проекции головного мозга биологического объекта, в области локализации ишемии, увеличенной на 1-2 см с конца, расположенного выше зоны повреждения,
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 3-ий, 7-е, 14-е и 30-е сутки.
У животных, выведенных из эксперимента, извлекался пояснично-крестцовый отдел позвоночника со спинным мозгом, участок бедренного нерва, участок тонкого кишечника, делались мазки костного мозга. Препараты спинного мозга маркировались и фиксировались в 10% растворе формалина. Далее препараты заливались в парафиновые блоки из которых изготавливались серийные срезы. Окраска срезов проводилась гематоксилином и эозином для обзорной микроскопии, для изменения миелиновых волокон использовалась окраска по методу Бильшовского.
Исследования гистологических препаратов проводились на микроскопе «Leica DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа изображения «ДиаМорф Cito-W», (Россия, Москва).
Для объективизации параметров морфологических изменений, кроме описательных, использовались следующие счетные признаки:
- размеры очага поражения (в мкм с пересчетом в мм);
- количество капилляров на условной единице площади;
- количество поврежденных нейронов на условной единице площади;
- количество неповрежденных нейронов на условной единице площади;
- количество глиоцитов на условной единице площади.
Статистическая обработка цифровых данных проводилась методом вариационной статистики с определением среднеквадратичного отклонения δ, средней ошибки сравниваемых величин M1, M2, коэффициента достоверности t и доверительной вероятности p с помощью программы Excel 8.0 из пакета Microsoft Office 97. Различия считали достоверными при p<0,05.
При гистологическом изучении срезов поясничного утолщения спинного мозга у крыс контрольной группы, которым после наступления ишемии вводили только рекомбинантный эритропоэтин, без чрескожного лазерного облучения, отмечались следующие особенности: на всех сроках исследования размеры очага повреждения и количество неповрежденных нейронов были значительно меньше, а содержание глиоцитов и капилляров на условной единице площади больше - по сравнению с группой животных без лечения ишемии спинного мозга.
При совместном действии лазерного облучения с заявленными параметрами и введением рекомбинантного эритропоэтина человека, на всех сроках наблюдения отмечено значительное большее уменьшение размера очага повреждения и поврежденных нейронов, существенное увеличение числа капилляров и глиоцитов в зоне ишемии по отношению к группе животных, которым для лечения ишемии вводили только рекомбинантный эритропоэтин.
Пример 1. Биологический объект: крыса, вес 200 грамм. Первую дозу рекомбинантного эритропоэтина человека в количестве
5000 МЕ/кг вводили внутрибрюшинно через 4 часа после начала моделирования ишемии. Вторую дозу вводят через 24 часа, третью - через 48 часов. Через 30 минут после первого введения рекомбинантного эритропоэтина человека осуществляли диффузное чрескожное (накожное) облучение биологического объекта инфракрасным лазерным излучением диодным лазером в непрерывном режиме вдоль зоны, расположенной в проекции очага ишемии спинного мозга биологического объекта, увеличенной на 1 см с конца, расположенного выше зоны повреждения, перемещая световод вдоль зоны воздействия со скоростью 5 мм сек, и осуществляя движение световода вдоль зоны воздействия по спирали. Режимы лазерного воздействия: длина волны 890 нм, мощность 2 Вт, непрерывный режим, экспозиция 3 минуты. Расстояние от поверхности тела биологического объекта в зоне воздействия 4 см. Животное выведено из эксперимента через 3 суток. Отмечено существенное уменьшение размера очага повреждения и содержания неповрежденных нейронов, увеличение числа капилляров и глиоцитов в зоне ишемии по отношению к аналогичному сроку исследованного животного после введения только рекомбинантного эритропоэтина.
Пример 2. Биологический объект: крыса, 150 г. Описание эксперимента соответствует примеру 1. Животное выведено из эксперимента на 7 сутки. Отмечены сходные, но более выраженные изменения в зоне ишемии по отношению к животному из примера 1.
Пример 3. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 1. Животное выведено из эксперимента на 14 сутки. Отмечены сходные, но более выраженные изменения в зоне ишемии по отношению к животному из примера 1 и 2.
Пример 4. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 1. Животное выведено из эксперимента на 30 сутки. Отмечены сходные, но более выраженные изменения в зоне ишемии по сравнению с исследованным животным из примера 1-3.
Пример 5. Биологический объект: крыса, вес 190 грамм. Первую дозу рекомбинантного эритропоэтина человека в количестве 5000 МЕ/кг вводили внутрибрюшинно через 5 часов 55 минут после начала моделирования ишемии. Вторую дозу вводят через 24 часа, третью - через 48 часов. Через 60 минут после первого введения рекомбинантного эритропоэтина человека осуществляли диффузное чрескожное облучение зоны, расположенной в проекции очага ишемии спинного мозга биологического объекта, увеличенной на 2 см с конца, расположенного выше зоны повреждения проекции спинного мозга биологического объекта, инфракрасным лазерным излучением диодного лазера. Режимы лазерного воздействия: длина волны 890 нм, мощность 2 Вт, экспозиция 3 минуты. Расстояние от поверхности тела биологического объекта в зоне воздействия - 3 см. Скорость перемещения световода - 5 мм/сек. Перемещение световода вдоль зоны воздействия - по спирали. Животное выведено из эксперимента через 3 суток. Отмечено значительно существенное уменьшение размера очага повреждения и содержания неповрежденных нейронов, увеличение числа капилляров и глиоцитов в зоне ишемии по отношению к аналогичному сроку исследованного животного после введения только рекомбинантного эритропоэтина.
Пример 6. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 5. Животное выведено из эксперимента на 7 сутки. Отмеченные изменения соответствуют примеру 2.
Пример 7. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 5. Животное выведено из эксперимента на 14 сутки. Отмеченные изменения соответствуют примеру 3.
Пример 8. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 5. Животное выведено из эксперимента на 30 сутки. Отмеченные изменения соответствуют примеру 4.
Пример 9. Контрольная группа. Биологический объект: крыса, вес 200 грамм. Первую дозу рекомбинантного эритропоэтина человека в количестве 5000 МЕ/кг вводили внутрибрюшинно через 4 часа после начала моделирования ишемии. Вторую дозу вводят через 24 часа, третью - через 48 часов. Животное выведено из эксперимента на 3-и сутки. Отмечено значительно меньшее уменьшение очага повреждения, менее значительное содержание глиоцитов, капилляров и неповрежденных нейронов по сравнению с группой животных, которым вводили рекомбинантный эритропоэтин в сочетании с накожным лазерным облучением для животных, выведенных из эксперимента на 3-и сутки.
Пример 10. Контрольная группа. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 9. Животное выведено из эксперимента на 7 сутки. Отмечены сходные морфологические изменения в очаге ишемии, описанные в примере 9, по отношению к основной группе.
Пример 10. Контрольная группа. Биологический объект: крыса, 200 г. Описание эксперимента соответствует примеру 9. Животное выведено из эксперимента на 14 сутки. Отмечены сходные изменения в очаге ишемии, описанные в примере 9, по сравнению с основной группой.
Пример 11. Контрольная группа. Биологический объект: крыса, 160 г. Описание эксперимента соответствует примеру 9. Животное выведено из эксперимента на 30 сутки. Отмечены сходные изменения в очаге ишемии, описанные в примере 9, по отношению к основной группе.