Прогностическая роль молекулы адгезии лейкоцитов cd50 при лимфобластных лейкозах

© Коллектив авторов, 1999 УДК 616.155.392-037

Jl. Ю. Андреева, Е. Н. Шолохова, H. Н. Тупицын,

3. Г. Кадагидзе

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ МОЛЕКУЛЫ АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТОВ CD50 ПРИ ЛИМФОБЛАСТНЫХ ЛЕЙКОЗАХ

НИИ клинической онкологии

Дифференциальная диагностика гемобластозов и раннее прогнозирование рецидивов злокачественных заболеваний крови — необходимое условие достижения максимального лечебного эффекта. Значительная роль в исследованиях и классификации лейкозов принадлежит изучению диффе-ренцировочных антигенов гемопоэтических клеток. На основании различных типов экспрессии этих антигенов стало возможным выделить среди морфологически однородных типов лейкозов и лимфом иммунологические подварианты, имеющие различный прогноз и чувствительность к проводимой полихимиотерапии.

Особого внимания заслуживает изучение лейкозов из ранних гемопоэтических предшественников в силу их многочисленности и малой чувствительности к терапии.

До недавнего времени возможности выделения подклассов в данной группе были ограничены, так как стволовоклеточный антиген CD34 и общий антиген CD 10 являлись единственными маркерами, последовательно экспрессируемыми на подобных лимфобластах.

За последние годы получен целый ряд моноклональных антител к антигенам, экспрессирующимся на мембране ранних гемопоэтических предшественников, — HLA-DR, CD90, CD71, CD50, CD33, CD7, CD10, CD19 [7, 8, 10, И].

На основании современных знаний о последовательности этапов дифференцировки гемопоэтических предшественников в нормальном онтогенезе (CD34+ Ja- CD38 lin-, CD34+ Ja+ CD38” lin", CD34+ Ja+/_ CD38+/_ lin+) было выделено 5 подтипов стволовоклеточных лейкозов [1].

Вместе с тем следует учитывать и уровни экспрессии общелейкоцитарных антигенов. Показано, что экспрессия антигена CD45 нарастает по мере дифференцировки клеток. Данная закономерность прослежена на нормальных лимфоцитах, а также и при лейкозах. В этом случае уровни экспрессии антигена CD45 являются показателем зрелости лимфоцитов и степени их дифференцировки.

Важное значение в процессах развития ранних гемопоэтических предшественников имеют ростовые клеточные факторы: Г-КСФ (гранулоцитарный), ГМ-КСФ (грануло-цитарно-макрофагальный), лиганд c-kit, интерлейкин-3, интерлейкин-6; не менее важны взаимодействия клеток с микроокружением [4, 6]. Клеточные взаимодействия осуществляются молекулами адгезии лейкоцитов. Показано, что моноклональные антитела, характеризующие эти молекулы, существенно влияют на состояние лимфо- и ге-мопоэза in vitro [9]. Кроме того, адгезивные взаимодействия лейкоцитов определяют ход развития иммунного ответа при

L.Yu.Andreyeva, E.N.Sholokhova, N.N.Tupitsyn,

Z. G.Katagidze

THE PROGNOSTIC ROLE OF LEUKOCYTE ADHESION MOLECULE CD50 IN LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA

Institute of Clinical Oncology

Differential diagnosis and early prognosis of recurrence is a determinant condition of maximal therapeutic efficiency in hematology malignancy. Detection of differentiation antigens of hemopoietic cells plays a significant role in the leukemia study and classification. Several immunological subtypes with different prognosis and response to conventional chemotherapy have been distinguished in morphologically similar leukemias and lymphomas basing on different patterns of antigen expression.

Leukemia originating from early hemopoietic precursors is of especial importance due to the great variety of subtypes and low response to therapy it demonstrates.

Until recently there was but a limited possibility to distinguish subclasses in this disease group since stem cell antigen CD34 and common antigen CD 10 were the only markers expressed on such lymphoblasts.

Several monoclonal antibodies to membrane antigens of early hemopoietic precursors such as HLA-DR, CD90, CD71, CD50, CD33, CD7, CD10, CD19 [7,8,10,11] were generated quite recently.

Five stem cell leukemia subtypes were determined basing on the modem concept of the order of hemopoiesis precursor differentiation in normal ontogensis (CD34+ Ja- CD38 lin-, CD34+ Ja+ CD38- lin-, CD34+ Ja+/ CD38+/- lin+) [1].

However, the expression of common leukocytic antigens should also be taken into account. The expression of CD45 is found to grow as cell differentiation proceeds. This phenomenon is observed both on normal leukocytes and in leukemia. Thus, degree of CD45 expression is indicative of lymphocyte maturity and differentiation degree.

Cellular growth factors such as G-CSF (granulocytic), GM-CSF (granulocytic- macrophageal), ligand c-kit, inter-leukin-3, interleukin-6 play an important part in development of early hemopoiesis precursors, as well as cell interactions with its microenvironment [4,6]. The cellular interactions are mediated by leukocyte adhesion molecules. It is shown in vitro that monoclonal antibodies characterizing these molecules influence markedly lymphocyte status and hemopoiesis [9]. Besides, the leukocyte adhesion interactions determine development of immune response in various pathologies [2,3]. Cell adhesion molecules are a class of transmembrane proteins including selectins, cadherins, immunoglobulins and integrins. CD50 is a highly glycozylat-ed protein with a molecular weight 124 kilodalton belonging to the immunoglobulin family. Like CD45 this molecule is a common leukocytic antigen and shows no expression on non-

различных патологических процессах [2, 3]. Молекулы клеточной адгезии — это целый класс трансмембранных белков, включающий селектины, кадхерины, иммуноглобулины и интегрины. CD50 — представитель иммуноглобулинового семейства, высокогликозилированный протеин с мол. массой 124 кД. Эта молекула, как и CD45, является общелейкоцитарным антигеном и не экспрессируется на клетках неге-мопоэтической природы [3, 5]. По данным исследований последних лет, на моделях нормальных стволовых клеток CD34+ показано, что появление С050-антигена на клетках с фенотипом CD34+ la- CD38- — самый ранний признак ге-мопоэтической дифференцировки, кроме того, уровни экспрессии его могут варьировать при различных вариантах острого лимфобластного лейкоза.

Материалы и методы. Проведен анализ иммунологического фенотипа лимфоцитов и бластных клеток костного мозга у 136 больных острыми лимфобластными лейкозами.

Для выявления экспрессии антигенов применяли реакцию непрямой иммунофлюорссцснции с использованием панели моноклональных антител к следующим антигенам: линейно не рсстриктированным — HLA-DR, CD34, CD90, CD50, CD71, CD10; В-клеточным — CD19, CD22, CD37; Т-клсточным — CDla, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8; миеломоноцитарным — CD lib, CD13, CD15.

Для специфического связывания в качестве вторых антител применяли ФИТЦ-мсченныс Р(аЬ)2-фрагмснты мышиных иммуноглобулинов. Их же использовали в качестве контроля.

Анализ экспрессии антигенов проводили на проточном цитофлюоримс-тре FACScan. Положительной считали реакцию, при которой антиген определялся более чем на 20% клеток. Статистически материал обработан на компьютере с использованием программы Statgrafics.

Результаты. Изучена экспрессия молекулы CD50 с помощью моноклональных антител ИКО-бО на лимфоцитах и бластных клетках костномозгового пунктата у больных до проведения специфической терапии. Положительная реакция отмечена у 102 (75%) больных. Сравнивали CD50+-и СБ50_-группы по частоте выявления маркеров различных линий гемопоэтической дифференцировки (Т-, В-клеточ-ные, стволовые, миеломоноцитарные) (см. табл.). Частота выявления стволовоклеточных антигенов приблизительно одинакова в обеих группах сравнения. Таким образом, подтверждается факт экспрессии CD50 на самых ранних стадиях дифференцировки гемопоэтических клеток. Это подтверждается также тем, что уровни экспрессии CD50 не различались при стволовоклеточных и нестволовоклеточных лейкозах (44,6 ± 4,0%, п = 46; 39,6 ± 2,8%, п = 90;р = 0,3).

В то же время другой маркер незрелых гемопоэтических предшественников — молекула CD38 с достоверно более высокой частотой ассоциировала с экспрессией CD50 (76 и 50%; р = 0,009). Никакой связи молекулы CD50 с В-линейными лейкозными антигенами отмечено не было. Так, пан-В-кле-точный антиген CD 19 выявлялся с приблизительно одинаковой частотой в CD50+- и CD50 - группах (59,4 и 70,6% соответственно; р = 0,33). Также не выявлено достоверной разницы в частоте HLA-DR-положительных лейкозов в зависимости от наличия CD50. Однако HLA-DR-положительные случаи были несколько более частыми при появлении на клетках адгезивных молекул CD50 (77,5 и 61,8%; р = 0,11).

Интересно отметить, что общий антиген лейкозов CD 10 был достоверно более часто представлен при наличии на лейкозных лимфобластах молекулы CD50 (69,6 и 47,1%;

hemopoietic cells [3,5]. Recent study on normal stem CD34+ cells has showed that appearance of CD50 on cells with a phenotype CD34+ la- CD38 is an earliest sign of hemopoietic differentiation and degree of its expression may vary depending on type of acute lymphoblastic leukemia.

Materials and Methods. Immunological phenotyping of lymphocytes and bone marrow blasts was performed in 136 patients with acutc lymphoblastic leukemia. Antigen expression was detected by indirect immunofluorescence with a panel of monoclonal antibodies to the following antigens: non-lineage restricted HLA-DR, CD34, CD90, CD50, CD71, CD 10; B-cell CD 19, CD22, CD37; T-ccll CDla, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8; myelomonocytic CD lib, CD 13, CD 15.

FITC-conjugated F(ab)2 fragments of murine immunoglobulins were used as a second antibody in specific binding. The same fragments were used as control.

The antigen expression was analyzed by flow cytometry using a FACScan unit. Positive reactivity was defined as the presence of an antigen on more than 20% of cells. Statistical analysis of results was performed using the Statgraphics program package.

Results. CD50 expression on lymphocytes and blasts from bone marrow aspirates was studied with monoclonal antibody ICO-6O in the patients before specific treatment. Positive reactivity was detected in 102 (75%) patients. The CD50+ and CD50( groups were compared by prevalence of hemopoiesis differentiation lineage (T-, B-cell, stem, myelomonocytic) markers (see the table). Stem cell antigens were detected at similar frequency in both groups. This confirms that CD50 appears on hemopoietic cells at the earliest stages of differentiation. Another confirmation of this phenomenon is similar expression of CD50 in stem-cell and non-stem-cell leukemias (44.6+4.0%, «=46; 39.6±2.8%, «=90; /7=0.3).

Another marker of immature hemopoietic precursors, CD38, was detected significantly more frequently in association with CD50 (76 vi' 50%; /7=0.009). There was no relation between CD50 and B-lineage leukemia antigens. For instance, the pan-B-cell antigen CD 19 was encountered at a similar rate in the CD50+ and CD50( groups (59.4 vs 70.6%, respectively; /7=0.33).

There was no statistically significant correlation of HLA-DR and CD50 expression. Though, HLA-DR-positivity was found somewhat more frequently (77.5 vs 61.8%; /7=0.11) in CD50-positive cases.

Interestingly, that the common leukemia antigen CD 10 was expressed significantly more frequently in cases presenting with CD50-positive leukemic lymphoblasts (69.6 vs 47.1%; /)=0.01). This correlation is of clinical value since CD 10 expression in leukemia is associated with a better prognosis. For instance, children with CD 10-positive lymphoblastic leukemia demonstrate higher response to specific therapy, better survival and lower relapse rate. Thus, the presence of CD50 is also associated with a better disease prognosis. This finding is of practical importance because individual selection of chemotherapy regimens may be performed basing on detection of some markers (including CD 10).

T-cell characteristics of CD50+ and CD50- leukemias were studied by expression of a pan-T-cell antigen CD7. The rate of T-cell leukemia was low in the patients presenting with no CD50 expression, while being significantly higher in the CD50+ positive group (26.5%; p=0.03).

Таблица Table

Коэкспрессия дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека на молекуле адгезии лейкоцитов CD50 Coexpression of human leukocyte differentiation antigens and leukocyte adhesion molecule CD50

Антиген CD50+ CD50- Коэффициент значимости Достоверность/ корреляция

CD10 71/102 (69,6) 16/34 (47,1) 4,68 (5,62) 0,03/0,01

Ja HLA-DR 79/102 (77,5) 21/34 (61,8) 2,46 (3,22) 0,11/0,07

CD38 77/101 (76,2) 16/32 (50) 6,75 (7,95) 9,34- 10'3/4,79 • 10-3

CD7 27/102 (26,5) 3/34(8,8) 3,64 (4,61) 0,05/0,03

CD34 38/102 (37,3) 8/34 (23,5) 1,57 (2,14) 0,20/0,14

CD19 60/101 (59,4) 24/34 (70,6) 0,91 (1,35) 0,33/0,24

CD15 24/82 (29,3) 2/32 (6,3) 5,68 (6,92) 0,01/8,48 • 10-3

CD11b (GM1) 12/101 (11,9) 1/34 (2,9) 1,42(2,33) 0,12/0,23

Antigen CD50+ CD50- Coefficient of significance Significance with correlation taken into account

Примечание. В числителе — количество CD50+ случаев, в знаменателе — число больных. В скобках — процент.

Note. The numerals in the numerator show the number of CD50+/~ cases, the numerals in the denominator show the number of cases. Numbers In parentheses show percentage.

р = 0,01). Данная взаимосвязь существенна в силу того, что экспрессия СО 10-антигена при лейкозах связана с более благоприятным прогнозом. Так, при остром лимфобластном лейкозе у детей наличие СШО отмечено в группе больных, имеющих большую чувствительность к специфической терапии, большую выживаемость и меньшую частоту рецидивов. Следовательно, наличие СБ50 также связано с более благоприятным прогнозом. Данный факт представляет практический интерес, так как в настоящее время интенсивно изучаются иммунологические и биологические факторы прогноза у больных лейкозами, на основании ряда маркеров (в том числе и СОЮ) возможна индивидуализация химиотерапевтических программ.

Т-клеточные характеристики СЭ50+- и С050 -лейкозов оценивали по экспрессии пан-Т-клеточного антигена СОТ. При отсутствии С050 на бластных клетках частота Т-кле-точных лейкозов была низкой, в то же время в группе СБ50+ частота Т-клеточных лейкозов была достоверно выше (26,5%; р = 0,03).

Очень важным фактором прогноза при остром лимфобластном лейкозе является коэкспрессия на бластных клетках наряду с В-клеточными маркерами миеломоноцитар-ных антигенов.

Нами изучена экспрессия антигенов СЭ11Ь и СЮ 15, проявляющаяся на достаточно поздних этапах (начиная с мие-лобласта) миелоидной дифференцировки. Необходимость оценки данных молекул связана с тем, что при выявлении миелоантигенов на клетках острых лимфобластных лейкозов у детей (Seeger и др., Детский госпиталь Лос-Анджелеса) наблюдаются более короткие ремиссии и высокий процент рецидивов. У больных данной группы наиболее вероятно проведение аутологичной трансплантации костного мозга.

В нашей лаборатории установлено, что молекула СЭ11Ь, выявляемая моноклональными антителами ИКО-ГМ1, как

Coexpression of myelomonocytic antigens and B-cell markers on blasts is an important prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia.

We studied expression of antigens CD lib and CD 15 characteristic of rather late (beginning with myeloblasts) myeloid differentiation. The finding of these molecules is important because their presence in children with acute lymphoblastic leukemia suggests a shorter remission and a higher percentage of relapse (Seeger et al., Los Angeles Children Hospital). Such patients are more probable candidates for autologous bone marrow transplantation.

We found CD lib (as detected using ICO-GM1 antibody) and CD 15 to be expressed on cells about 5-fold more frequently in association with CD50. As concerns CD15 the difference was statistically significant (p=0.009; see the table).

Thus, the presence of CD50 correlates with expression of several markers having prognostic significance in acute lymphoblastic leukemia. More profound study is needed to evaluate the subtypes and antigen combinations detailing CD50-associated leukemia phenotypes. More so because there is a statistically significant relationship between expression of the leukocyte adhesion molecule CD50 and differentiation antigens having prognostic value in acute leukemia.

и молекула СО 15, примерно в 5 раз чаще выявлялась на клетках при одновременной коэкспрессии молекулы СБ50. Причем для СО 15 эти различия были статистически достоверными (р = 0,009; см. таблицу).

Таким образом, экспрессия молекулы С050 связана с выявлением целого ряда прогностически значимых маркеров при остром лимфобластном лейкозе. Для оценки

подвариантов и антигенных комбинаций, детализирующих С050-ассоциированные лейкозные фенотипы, потребуются углубленные исследования. Целесообразность этого подтверждается существованием достоверной связи экспрессии молекулы адгезии лейкоцитов CD50 с прогностически значимыми дифференцировочными антигенами клеток острых лейкозов.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Кадагидзе З.Г., Тупицын Н. Н., Заботина Т.Н. и др. II Вестн. ОНЦ РАМН. — 1996. — № 2. — С. 28.

2. De Fogerolles A. R. et al. И J. exp. Med.— 1991. — N 4.— P.

174, 253.

3. Dustin M. L., Shringer Т. A. II Ann. Rev. Immunol. — 1991. — Vol. 9. — P. 27.

© Коллектив авторов, 1998 УДК 616-006.04-085.322

Л. А. Седакова, Г. А. Фирсова, Е. М. Трещалина,

М. К. Мамедов, А. А. Нариманов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТА ИЗ КОРНЕЙ POLEMONIUM CORULEUM

ОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН,

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва, Республиканский онкологический научный центр Азербайджана, Баку

Экстракты из растений являются источником различных биологически активных веществ, в частности в онкологии. Многие выделенные из экстрактов алкалоиды, флавоноиды, гликозиды, терпеновые соединения, сапонины и др. послужили основой для создания лекарств, которые успешно применяются в качестве основных и симптоматических средств для лечения онкологических больных. Давно нашли свое применение в онкологии и готовые экстракты, например экстракт родиолы или элеутерококка, которые используются в качестве стимуляторов неспецифической резистентности для улучшения общего состояния больных [1,2,4—6].

В ОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН действует программа скрининга на противоопухолевую активность новых экстрактов из природных объектов, направленная на поиск полезных для онкологии препаратов. На I этапе новые экстракты проходят тестирование на противоопухолевую активность in vitro и in vivo для поиска активных противоопухолевых веществ в их составе. В рамках I этапа программы в 1996 г. на противоопухолевую активность in vivo изучен этанольный экстракт из корней Polemonium Coruleum L. (синюха голубая), полученных из ИТЭБ РАН. Основанием для изучения были результаты тестирования

4. Gunji Y., Nakamura М. et al. II Blood. — 1992. — Vol.

80. — P. 429.

5. Juan M, Vilella K. et al. II Eur. J. Immunol. — 1993 — Vol. 29, —P. 1508.

6. Miyake K., Weissman I., Greenberg J. S. // J. exp. Med. — 1991,— N3. — P. 173,599.

7. Olwens J., Lund-Johasen F.,Terstappen L. W. // Blood. — 1995. — Vol. 85, N 9. — P. 2402—2413.

8. Steen R., Tjonnfjord G. E., Egeland Т. II J. Haemat. —

1994, —N3—4. —P. 253.

9. Teixido J., Hemler М. E. et al. II J. clin. Invest. — 1992. — Vol. 90. — P. 358.

10. Terstappen L. W., Huang S. II Blood Cells. — 1994. — Vol. 20, N 1, —P. 45—61.

11. Van Epps D. E., Bender J., Lee W. et al. И Ibid. — N2—3. — P. 411—423.

Поступила 06. 10. 97/Submitted 06. 10. 97

L.A.Sedakova, G.A.Firsova, H.M.Treschalina, M.K.Mamedov, A.A.Narimanov

ANTITUMOR ACTIVITY SCREENING OF POLEMONIUM CORULEUM EXTRACT

N.N.Blokhin CRC, RAMS;

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, RAS, Moscow; Azerbaijan Republican Cancer Research Center, Baku.

Vegetable extracts are a source of various biologically active agents, in particular for oncology. Many natural extracts such as alkaloids, flavonoids, glycosides, turpen compounds, saponines etc. are a basic part of drugs successfully applied as causative and symptomatic therapy in cancer patients. Rhodiola and eleutherococcus extracts are widely used as enhancers of non-specific resistance to improve general condition of cancer patients [1,2,4].

The N.N.Blokhin CRC, RAMS, carries out an antitumor activity screening program aimed to find new natural extracts to be further used as cancer drugs. Stage I involves antitumor activity testing in vitro and in vivo to find active antitumor agents in the natural extracts. Study in vivo of ethanol extract from Polemonium Coruleum L. (supplied by ITEB) was performed within this program in 1996. Rationale for this study was the agent’s marked antiproliferative activity against human lymphoma, Chinese hamster fibroblasts and murine neuroblastoma discovered at the ITEB, RAS.

Materials and Methods. The tumor panel for in vivo screening consisted of 1 leukemia, 4 solid tumors of different origin such as lymphatic leukemia P-388 (P-388), sarcoma 180 (S-I80), breast adenocarcinoma Ca-755, melanoma B-16, Lewis lung epidermoid carcinoma (3LL). Three of these strains, i.e. S-180, B-16 and 3LL are used to test biological reaction