СРЕДСТВО, ПРОЯВЛЯЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ
AGENT THAT DISPLAYS ANTITUMOR ACTIVITY

Изобретение относится к области медицины и касается расширения арсенала потенциальных противоопухолевых средств на основе комплекса оксованадия с органическим лигандом.
Микроэлемент ванадий рассматривается в настоящее время как важный регулятор роста, дифференцировки и гибели клеток. Ванадийсодержащие соединения представляют интерес и как потенциальные терапевтические агенты, поскольку многие из них проявляют инсулиноподобную [1] или противоопухолевую активность [2]. Для некоторых соединений оксованадия (IV), таких как бис(мальтолато)оксованадий (IV) и бис(ацетилацетонато)оксованадий (IV), являющихся эффективными инсулиномиметиками, описана и антипролиферативная активность в отношении целого ряда линий опухолевых клеток человека [3]. Исследования последних лет показали, что как неорганические соединения четырех- или пятивалентного ванадия, так и целый ряд его комплексов с органическими лигандами, в составе которых валентность ванадия изменяется от 3 до 5, обладают цитостатической активностью, подавляя рост опухолевых клеток in vitro и in vivo [4, 2, 5]. Так, соединения ванадия проявляют выраженный противоопухолевый эффект в отношении рака печени мыши, асцитной опухоли Эрлиха, карциномы молочной железы мыши [6], гепатомы Морриса [5], лейомиосаркомы крысы [7], некоторых линий опухолевых клеток человека [8-10]. Общим для различных соединений ванадия является их способность стимулировать апоптоз в неопластических клетках. Показано, что добавление в питьевую воду животным метаванадата аммония индуцирует апоптоз в неопластических клетках, не оказывая при этом никакого влияния на нормальные пролиферирующие клетки [11]. Комплекс 4-валентного ванадия (бис(4,7-диметил-1,10-фенантролин) сульфатооксованадий (IV))-метван намного более эффективно вызывает апоптоз лейкозных клеток от пациентов с различными формами лейкемии, чем такой стандартный химиотерапевтический агент, как винкристин. Кроме того, метван высокоэффективен в отношении резистентных к цисплатину линий клеток раковых опухолей яичников и тестикул [12, 9].
Исследования, проведенные на различных клеточных линиях, позволили сделать вывод о том, что соединения ванадия проявляют противоопухолевый эффект путем ингибирования тирозинфосфатаз, участвующих в передаче внутриклеточных сигналов. Этот эффект в конечном счете приводит к усилению апоптоза или к активации генов - супрессоров опухолей. Ингибирование фосфорилирования тирозина в белках, вызываемое соединениями ванадия, может также подавлять инвазию и метастазирование опухолевых клеток.
Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют говорить о том, что соединения ванадия могут проявлять (а) антипролиферативный эффект (т.е. подавлять скорость роста раковых клеток); (б) обладать цитотоксическим и (или) цитостатическим действием, обусловленным некрозом или апоптозом; (в) снижать инвазивный или метастатический потенциал малигнезированных клеток; (г) подавлять клеточную резистентность по отношению к химиотерапевтическим агентам [2].
Природа органического лиганда в молекуле ванадийсодержащего соединения во многом определяет его цитотоксическое (противоопухолевое) действие и в то же время цитотоксичность каждого конкретного соединения ванадия варьирует по отношению к различным видам опухолевых клеток. В этой связи актуальным является поиск новых эффективных и нетоксичных соединений ванадия, который продолжается в настоящее время во многих исследовательских центрах.
2
Известен билигандный комплекс ванадила с яблочной кислотой - бис(L-малато)оксованадий(IV) (VO(mal)) [Патент №2101287, 1998 г.], который прошел доклинические испытания в качестве гипогликемического агента [13].
Яблочная кислота, входящая в состав исследуемого комплекса, является естественным метаболитом и может стать дополнительным источником накопления энергии в клетке.
Сущность изобретения состоит в обнаружении противоопухолевой активности бис(L-малато)оксованадия (IV).
Целевое соединение бис(L-малато)оксованадий (IV) получают в 2 стадии взаимодействием L-яблочной кислоты (2 моля) с ванадилирующим агентом (ванадилацетатом) (1 моль) в водной среде, в результате чего образуется первичный ванадильный комплекс L-яблочной кислоты в смеси со свободной L-яблочной кислотой.
Реакционную смесь удалением воды переводят в твердофазное состояние, и полученный твердый раствор первичного ванадильного комплекса [(L-малато)оксованадия (IV)] в L-яблочной кислоте с целью получения целевого соединения бис(L-малато)оксованадия (IV) подвергают нагреванию при 105-115°С (Схема 1) при пониженном или атмосферном давлении.
Строение полученного комплекса подтверждено результатами элементного анализа, а также данными масс-спектрометрии.
Пример 1. Бис(L-малато)оксованадий (IV) (1).
В раствор 50,9 г (0,38 моль) L-яблочной кислоты в 250 мл воды вносят 35,2 г (0,19 моль) ацетата ванадила. Реакционную смесь перемешивают при 40-60°С до полного растворения осадка. Темно-голубой реакционный раствор упаривают досуха на роторном испарителе и полученный промежуточный темно-синий стекловидный продукт высушивают до постоянного веса в вакуум-эксикаторе. Высушенный продукт измельчают и нагревают в той же реакционной колбе на роторном испарителе при 105-115°С (температура в массе) в вакууме водоструйного насоса в течение 1-1,5 ч, процесс сопровождается выделением воды (5-7 г). Полученный бис(L-малато)оксованадий (IV) 1 представляет собой хрупкую темно-синюю пористую массу, выход 58-61 г (96-98%), содержит 1-2% свободной яблочной кислоты.
Бис(L-малато)оксованадий (IV) легко растворим в воде, слабо растворим метаноле и диметилсульфоксиде, почти не растворим в метаноле, не растворим в ацетоне.
8
10
11
Найдено, %: V 15,35; С 28,50; Н 3,32. Брутто-формула: CHOV.
Вычислено, %: V 15,30: С 28,84; Н 3,03.
Молекулярная масса (m/e) 333 (ионизация электроспреем).
20
Удельное оптическое вращение [α]-164° (вода), (вода, с 1,65).
Пример 2. Бис(L-малато)оксованадий (IV) (1).
Промежуточный продукт, полученный по методу А (1,0 г), нагревают при 97-100°С в течение 24-30 часов. Выход комплекса 0,93 г (99%), который идентичен по физико-химическим характеристикам продукту, полученному в примере 1.
2
2
4
В опытах in vitro исследовали влияние оксованадиевого комплека L-яблочной кислоты (VO(mal)) на рост нормальных фибробластов кожи человека, трансформированных вирусом фибробластов мыши NIH 3Т3, трансформированных вирусом клеток почки человека 293, клеток фибросаркомы мыши L 929, клеток феохромоцитомы крысы PC12 и карциномы печени человека HepG. Изучение цитотоксичности и противоопухолевой активности оксованадиевых комплексов проводили в сравнении с неорганическим соединением четырехвалентного ванадия -ванадилсульфатом (VOSO).
2
Культура клеток. Клетки PC12 и L929 были получены из Института морфологии человека и животных PAMH, клетки HepG - из Института канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, клетки NIH 3Т3 и 293 получены из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Нормальные фибробласты кожи человека были получены из Института ревматологии РАМН.
2
2
Клетки PC12 культивировали в среде RPMI 1640, клетки HepG, L929, NIH 3Т3 и 293 - в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, фибробласты кожи здорового человека в среде Игла с добавлением 20% бычьей сыворотки. Среды содержали 2 мМ L-глутамина и гентамицин в концентрации 50 мг/мл. Клетки культивировали в 48-луночных планшетах в СО-инкубаторе при 37°С до состояния плотного монослоя.
Цитотоксичность соединений ванадия изучали в интервале концентраций от 0,5 до 24 мкг/мл, используя МТТ-тест. Этот тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ образовывать кристаллы формазана из МТТ-реактива (3-[4,5-диметилтиа-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромида), позволяет точно определить число живых клеток.
2
2
2
2
4
Исследование действия различных концентраций VO(mal) на рост нормальных фибробластов кожи показало, что через 24 часа после добавление VO(mal) в концентрации от 0,5 до 6,0 мкг/мл жизнеспособность фибробластов не изменялась по сравнению с контролем. В то же время ванадилсульфат проявляет дозозависимое цитотоксическое действие, начиная с самой низкой концентрации (табл.1). Таким образом, VO(mal) не проявляет цитотоксичности по отношению к нормальным клеткам. Увеличение времени инкубации фибробластов в присутствии как VO(mal), так и VOSO приводит к некоторой стимуляции пролиферации.
2
2
4
При исследовании действия VO(mal) на клетки фибросаркомы L929 обнаружено дозозависимое уменьшение числа жизнеспособных клеток по сравнению с контролем, которое усиливается с увеличением времени инкубации. Через 72 часа культивирования VO(mal) в концентрации 6 мкг/мл подавляет рост клеток на 74%. Такой же эффект вызывает и VOSO (табл.2).
2
Клетки PC12 также чувствительны к цитотоксическому действию VO(mal), которое проявлялось уже через 24 часа инкубации (табл.3).
Для выяснения значения органического лиганда в проявлении цитотоксического действия был исследован также монокомплекс ванадила с яблочной кислотой (L-малатооксованадий) (IV) - VO(mal). Оказалось, что в отличие от биокомплекса VO(mal) во всех исследуемых концентрациях практически не влияет на рост клеток PC12 в течение 24 часов. Через 48 часов культивирования (табл.3) в присутствии монокомплекса наблюдается стимуляция роста этих клеток.
2
Дозозависимое снижение жизнеспособности в присутствии VO(mal) наблюдалось и для клеток NIH 3Т3 (табл.4).
2
2
2
Клетки HepG менее чувствительны к соединениям ванадия по сравнению с другими линиями трансформированных клеток. Так, цитотоксическое действие VO(mal) на клетки HepG проявляется только через 72 часа культивирования. При инкубации в течение 96 часов число клеток снижается на 40% по сравнению с контролем. Ванадилсульфат в той же концентрации уменьшает число живых клеток приблизительно на 30% только через 96 часов инкубации (табл.5). Эти клетки оказались резистентными к действию комплексов ванадила, в состав которых входят стериоизомеры яблочной кислоты: ванадильные комплексы D-яблочной кислоты (хирального антипода L-яблочной кислоты) и рацемической формы DL-яблочной кислоты (данные не приведены).
50
2
В табл.6 представлены значения IC для пяти линий трансформированных клеток. Из этих данных следует, что бискомплекс ванадила с яблочной кислотой эффективно подавляет рост клеток фибросаркомы (L929), феохромоцитомы (PC12) и трансформированных вирусом клеток почки человека (293). Менее чувствительными к цитотоксическому действию VO(mal) оказались трансформированные вирусом фибробласты мыши (NIH 3Т3). В то же время этот комплекс не проявляет цитотоксичности по отношению к нормальным клеткам (табл.1).
Известно, что соединения ванадия могут осуществлять антипролиферативное и цитотоксическое действие путем ингибирования синтеза ДНК (14), а также взаимодействия ДНК с факторами транскрипции (15).
Включение радиоактивного предшественника в ДНК.
14
6
4
Для исследования пролиферации клетки синхронизовали в ростовой среде, содержащей 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 24 часов, затем добавляли исследуемые соединения и С-тимидин. Через 24 часа после этого клетки промывали холодным раствором Хэнкса и обрабатывали в течение ночи ледяным фиксирующим раствором для того, чтобы убрать из клеток свободный радиоактивный предшественник синтеза ДНК. Затем измеряли число клеток после их окраски кристаллвиолетом, используя мультискан "LabSystems". Клеточный монослой лизировали в течение 12-ти часов 0.6 н. КОН, затем лизат нейтрализовали 1н. HClO. Радиоактивность измеряли стандартными радиометрическими методами, используя сцинтилляционную жидкость Брея. Результаты рассчитывали в имп./мин на 10 клеток и в % к контролю.
2
4
14
Результаты исследования по влиянию VO(mal) и VOSO на включение С-тимидина в ДНК свидетельствуют о том, что синтез ДНК в клетках L929 менее чувствителен к действию оксованадиевых соединений по сравнению с клетками PC12 и его подавление наблюдается только при высоких концентрациях (табл.6). Отметим, что в клетках HepG2, которые оказались на порядок менее чувствительными к цитотоксическому действию оксованадиевых соединений, чем другие линии трансформированных клеток (см. табл.7), ингибирования синтеза ДНК в этих условиях мы не наблюдали.
ЛИТЕРАТУРА
1. Badmaev V., Prakash S. and Majeed M. (1999) J. Alternat. Complement. Medicine, 5, 273-291.
2. Evangelou A.M. (2002) Crit. Rev. Oncol./Hematol., 42, 249-265.
3. U.S. Pat. №5,877,210, 02/03/1999.
4. Bishayee A., Oinam S., Basu M. and Chatterjiee M. (2000). Brain Cancer Res. Treatment, 63, 133-145.
5. Osinska-Krolicka I., Podsiadly H., Bukietynska K. et al (2004). J. Inorg. Biochem., 98, 2087-2998.
6. Thompson H.J., Chasteen N.D. and Meeker L.D. (1984). Carcinogenes, 5, 849-851.
7. Liasko R., Kabanos T. A., Karkabounas S. et al (1998). Antycancer Res., 18, 3609-3613.
8. Kopf-Maler P. (1994) Eur. J. Clin. Pharmacol., 47, 1-16.
9. Cruz O. J D., Uckun F.M. (2002). Expert Opin. Investig. Drugs, 11, 1829-1836.
10. Ray R.S., Rana В., Swami В. et al (2006) Chem. Biolog. Interact, 163, 239-247.
11. Ray R.S., Roy S, Ghosh S. et al (2004). Biochim. Biophys. Acta, 1675, 165-73.
12. Naria R.K, Chen C.L., Dong Y, Uckun F.M. (2001). Clin. Cancer Res., 7, 2124-33.
13. Патент РФ №2101287, 1998.
14. Hall I.H., Durham R.W, Tram M. et al. (2003). J Inorg. Biochem, 93, 125-131.
15. Lampronty I., Bianchi N., Borgatty M. et al. (2005). Oncol. Rep., 14, 9-15.
Таблица 1Оценка выживаемости нормальных фибробластов кожи человека в присутствии различных концентраций VO(mal)<sub>2</sub> и VOSO<sub>4</sub>
Концентрация соединения (мкг/мл)
Выживаемость клеток после 24-х часовой инкубации (% от контроля)*
VO(mal)<sub>2</sub>
VOSO<sub>4</sub>
0
100±2
100±2
0,5
107±10
76±8
1,0
105±8
69±6
1,5
104±8
66±7
3,0
101±9
65±5
6,0
98±8
58±6
*Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)
Таблица 2Оценка цитотоксичности VO(mal)<sub>2</sub> и VOSO<sub>4</sub> для клеток фибросаркомы L929
Концентрация соединения (мкг/ мл)
Жизнеспособность клеток (% от контроля)*
VO(mal)<sub>2</sub>Время инкубации (часы)
VOSO<sub>4</sub>Время инкубации (часы)
24
48
72
24
48
72
0
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
0,5
120±11
123±12
99±9
142±12
126±12
95±7
1,0
108±9
121±11
97±8
139±14
110±8
86±6
1,5
110±9
119±110
47±5
130±10
79±5
41±4
3,0
88±7
60±4
43±4
108±10
60±5
26±2
6,0
79±6
50±3
26±2
96±8
41±3
25±2
*Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)
Таблица 3Оценка цитотоксичности оксованадиевых комплексов L-яблочной кислоты для клеток феохромоцитомы PC12
Концентрация соединения (мкг/мл)
Жизнеспособность клеток (% от контроля)*
VO(mal)<sub>2</sub>
VO(mal)
VO(mal)<sub>2</sub>
VO(mal)
Время инкубации 24 часа
Время инкубации 48 часов
0
100±3
100±3
100±3
100±3
0,5
108±7
111±12
106±12
141±12
1,0
105±8
109±9
101±14
134±13
1,5
85±9
110±9
86±9
130±13
3,0
73±7
112±10
65±5
122±13
6,0
56±6
96±7
31±2
114±10
*Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)
Таблица 4Оценка цитотоксичности VO(mal)<sub>2</sub> и VOSO<sub>4</sub> для клеток NIH 3Т3
Жизнеспособность клеток (% от контроля)*
Концентрация соединения (мкг/мл)
VO(mal)<sub>2</sub>
VOSO<sub>4</sub>
48 час
72 час
48 час
72 час
0,5
117±10
122±11
112±9
121±13
1,5
-
102±9
-
99±10
3,0
59±6
56±4
65±6
53±6
6,0
53±5
45±4
56±5
41±4
24,0
42±5
25±3
37±3
25±3
*Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)
Таблица 5Оценка цитотоксичности VO(mal)<sub>2</sub> и VOSO<sub>4</sub> для клеток карциномы печени HepG<sub>2</sub>
Концентрация соединения (мкг/мл)
Жизнеспособность клеток (% от контроля)*
VO(mal)<sub>2</sub>Время инкубации (часы)
VOSO<sub>4</sub>Время инкубации (часы)
24
48
72
96
24
48
72
96
0
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
0,5
100±8
128±13
91±9
92±9
-
-
-
-
1,0
104±10
118±11
76±6
87±7
110±9
113±12
98±8
90±8
1,5
105±10
117±12
87±6
86±8
113±10
110±10
101±11
82±8
3,0
99±9
113±11
86±9
72±6
110±9
111±10
89±8
79±7
6,0
102±10
99±10
69±5
59±5
105±9
90±10
91±9
68±7
*Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)
Таблица 6Действие VO(mal)<sub>2</sub> и VOSO<sub>4</sub> на синтез ДНК в клетках L929 и РС12
Концентрация соединения (мкг/мл)
Включение <sup>14</sup>С тимидина в ДНК (% от контроля)
Клетки PC12
Клетки L929
Время инкубации (часы)
Время инкубации (часы)
VO(mal)<sub>2</sub>
VOSO<sub>4</sub>
VO(mal)<sub>2</sub>
VOSO<sub>4</sub>
72
96
72
96
72
96
72
96
0
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
100±1
-
3,0
88±8
59±5
96±8
90±8
-
-
-
6,0
70±7
34±3
66±7
58±6
-
-
-
-
12,0
-
-
-
-
76±6
-
104±7
-
24,0
-
-
-
-
68±6
-
63±5
-
Таблица 7Цитотоксическая активность VO(mal)<sub>2</sub> и VOSO<sub>4</sub> по отношению к различным линиям трансформированных клеток
IC<sub>50</sub> (мкМ)
Клетки
Ванадильные соединения
VO(mal)<sub>2</sub>
VOSO<sub>4</sub>
48 час
72 час
48 час
72 час
PC12
13,5
3,2
15,8
3,9
L929
18,0
4,2
15,0
5,1
293
18,1
-
-
-
NIH 3Т3
37,5
12,9
35,6
13,4
HepG<sub>2</sub>
-
45,0
-
83,0