Применение современных лабораторных методов в эпидемиологическом мониторинге за энтеровирусными инфекциями

Т. Д. Шмакова

ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ ЗА ЭНТЕРОВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ

Карагандинский областной центр санитарно-эпидемиологической экспертизы

В настоящее время энтеровирусные инфекции являются одной из актуальнейших проблем вирусологии, что обусловлено заметной и многоликой ролью их возбудителей в структуре патологии человека [2, 4]. Система эпидемиологического надзора за энтеровирусной группой инфекций предусматривает не только изучение распространенности энтеровирусов среди населения, но и контроль за циркуляцией возбудителей этих инфекций во внешней среде. Так, мониторинг за циркуляцией энтеровирусов в сточных водах дает основание для характеристики их серологических типов, циркулирующих среди населения, а обнаружение доминирующих типов энтеровирусов должно служить основанием для своевременного проведения профилактических мероприятий и построения эпидемиологических прогнозов на ближайший период [1, 5].

Лабораторная идентификация возбудителей энтеровирусных инфекций включает в себя несколько методов - вирусологический, серологический и молекулярно-биологический. Наиболее часто используемым является вирусологический метод, направленный на выделение из клинического материала (кровь, фекалии, ликвор) энтеровирусов на культурах чувствительных клеток. Серологические методы направлены на выявление маркеров энтеровирусных инфекций (1дМ и 1дА) в сыворотке крови больных. К числу наиболее старых, но актуальных серологических методов относится выявление вируснейтрализу-ющих противовирусных антител в реакции нейтрализации, 4-кратное и более нарастание титра считается диагностически значимым. Таким образом, обнаружение и идентификация энтеровирусов в материале от больного и в объектах внешней среды - довольно сложный и трудоемкий процесс.

В последнее время широко используются молекулярно-биологические методы исследования, которые направлены на выявление генетического материала энтеровирусов, в том числе по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) со стадией обратной транскрипции. В случае позитивной ПЦР-диагностики для окончательной идентификации вирусов необходимо проведение вирусологического исследования на клеточных культурах [4].

Цель работы - изучение частоты обнаружения отдельных штаммов энтеровирусов от больных и из объектов внешней среды (сточных вод, вод открытых водоемов и питьевой воды), различными методами идентификации возбуди-

телей энтеровирусных инфекций

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования на энтеро-вирусы являлись фекалии и сыворотка крови от больных, пробы из объектов внешней среды (сточные воды, воды открытых водоемов, питьевой воды).

В период с июня по ноябрь 2011 г. на эн-теровирусы были обследованы 105 больных. Пробы фекалий (2 пробы от каждого больного) забирались в первые 7 дней от начала заболевания (но не позднее 14 дней) с интервалом 24-48 ч. Парные сыворотки крови брались у больных дважды - в 1 и 4 нед. заболевания.

Пробы сточных вод были взяты из общих канализационных стоков г. Караганды, Темиртау, Абая, Сарани, Шахтинска. Отбор проб сточных вод проводился планово 1 раз в мес., всего было исследовано 60 проб.

Пробы воды открытых водоемов (70 проб) и пробы питьевой воды (8) отбирали и обрабатывали в соответствии с методическими рекомендациями.

Вирусологический метод использовался для выделения и идентификация вирусов из фекалий на культуре клеток. В настоящее время, согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), для выделения энтеровирусов используют 2 линии перевиваемых клеточных культур - RD (клеток рабдосаркомы человека) и HEp-2 (клеток эпидермальной карциномы человека). Обе линии клеточных культур являются высокочувствительными к полиовирусу. Обычно полиовирус и вирус Коксаки В хорошо размножается в клетках HEp-2; большинство вирусов ЕСНО, некоторые штаммы вирусов Коксаки А и полиовирусы - в клетках RD [4].

В реакции нейтрализации энтеровирусы идентифицировали с помощью диагностических типоспецифических иммунных сывороток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД50, смешивали в равном объеме с диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1-2 ч при температуре +37 С°, смесь вводили в культуры клеток. Иммунная сыворотка, которая предотвращала развитие цито-патогенного эффекта, указывала на тип вируса.

Для серологической диагностики исследовали парные сыворотки крови. В реакции нейтрализации определяли титр антител к аутоштамму возбудителя. Диагностически значимым считали сероконверсию или 4-кратный и больший подъем титра антител.

ПЦР-диагностика (определение РНК вируса) проводилась в режиме реального времени на оборудовании Rotor Gene-6000 (Corbett). Выделение ДНК/РНК проводили с использованием коммерческих наборов «Рибо-Сорб». Обратную транскрипцию проводили с помощью набора реагентов «Реверта L». Амплификацию ПЦР в режиме реального времени выполняли с использованием тест системы «АмплиСенс-Enterovirus» (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

За 2011 г. по сравнению с предыдущим годом в Карагандинской области число больных с неврологической симптоматикой с диагнозами серозный менингит, неврит лицевого нерва, эн-теровирусная инфекция увеличилось в 1,8 раза.

На энтеровирусы были обследованы 105 больных, госпитализированных в Областную инфекционную больницу г. Караганды, с диагнозами серозного менингита (92 больных), неврита лицевого нерва (6 больных), энтеровирусной инфекции (7 больных).

Первоначально все пробы фекалий от больных исследовались ПЦР-методом для выявления РНК энтеровирусов. В результате исследований в 66 пробах (или в 63% от числа исследованных проб) от больных серозным менингитом выявлена РНК энтеровируса.

В дальнейшем при вирусологическом исследовании на культуре клеток в 25% проб были изолированны 22 штамма энтеровирусов. Чаще всего типировались вирусы группы Коксаки В -19 штаммов (в 86%), значительно реже обнаруживались вирусы ECHO группы (2 штамма) и аденовирусы (1 штамм).

При изучении контаминации энтеровиру-сами объектов окружающей среды (сточных вод, воды открытых водоемов, питьевой воды) были исследованы ПЦР-методом 138 проб, из них в 36% выявлена РНК энтеровирусов. Чаще всего РНК энтеровирусов обнаруживались в пробах сточных вод - из 60 проб положительные результаты оказались в 49 (82%) пробах. В пробах воды открытых водоемов и питьевой воды РНК эн-теровирусов обнаружены не были. Параллельно пробы воды исследовались и вирусологическим методом. При этом лишь в 35% от общего числа проб сточных вод (по сравнению с исследованием ПЦР-методом) были положительными. Был выделен 21 штамм энтеровирусов: более половины составляли штаммы вирусов группы Коксаки В (11 штаммов или 52,4% от числа выделенных штаммов), доля вирусов ECHO группы составила 28,5% или 6 штаммов, в единичных случаях выделялись вирусы полиомиелита и аденовирусы (по 2 штамма). В пробах воды открытых водоемов и питьевой воде энтеровирусы не обнаруживались.

Следует отметить, что положительная ПЦР отмечалась в 2,3-2,5 раза чаще, чем положительные результаты при вирусологическом методе исследования (63% против 25% при исследовании фекалий от больных и 82% против 35% при исследовании проб воды). Поскольку ПЦР является более чувствительным методом для диагностики энтеровирусных инфекций: он идентифи-

цирует возбудителя по минимальному количеству РНК даже если в пробе, взятой на анализ, содержится несколько молекул РНК возбудителя.

Таким образом, по результатам проведенных исследований установлено, что основным резервуаром энтеровирусов во внешней среде являются фекалии и загрязняемые ими хозяйственно-бытовые сточные воды. Доминирующими типами выделяемых от больных и сточных вод энтеровирусов являются вирусы группы Коксаки В и вирусы ECHO.

Вирусологический метод в диагностике энтеровирусных инфекций является, безусловно, ведущим. Однако данный метод является трудоемким, длительным (до 28 дней) и не всегда заканчивается успешно. Внедрение в практику диагностики энтеровирусных инфекций полимераз-ной цепной реакции, обладающей рядом преимуществ перед вышеуказанным методом, а именно: высокой специфичностью, чувствительностью и быстротой исполнения (вся диагностика от момента сдачи материала до получения результата занимает 1-2 дня), позволяет избежать рутинной работы.

Проведение параллельных лабораторных исследований на энтеровирусы методом ПЦР с последующей «расшифровкой» положительных результатов вирусологическим методом дает наиболее полное представление об этиологической структуре энтеровирусной инфекции в патологии человека, что позволяет рационально организовать и проводить эпидемиологический надзор за энтеровирусной инфекцией.

Обнаружение РНК энтеровирусов в пробах воды, особенно в пробах сточных вод, может быть использовано для проведения оперативного мониторинга за энтеровирусными инфекциями.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бабенко С.В. Эпидемиологические особенности распространения энтеровирусных инфекций в промышленных регионах. Университетская клиника; 2008: 1: 95-99.

2. Бочарова Е.Ф. Энтеровирусная инфекция: новые аспекты.Н.: Наука; 1990: 224.

3.Ребриков Д.В. ПЦР «в реальном времени»: М.: БИНОМ; 2009: 223.

4. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. Глобальная программа по вакцинам и иммунизации. Расширенная программа иммунизации. Всемирная Организация Здравоохранения, Женева; Москва; 1998.

5. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Всемирная Организация Здравоохранения. 2003 г.

Поступила 16.04.2012 г.

T. D. Shmakova

APPLICATION OF MODERN LABORATORY METHODS IN THE EPIDEMIOLOGICAL MONITORING OF ENTEROVIRAL INFECTION

According to the author, conducting parallel laboratory tests for enteroviruses by PCR, followed by «decoding» the positive results of virological method gives a more complete understanding of the etiological structure of enterovirus infections in human pathology, which allows you to efficiently organize and conduct surveillance of enterovirus infection.

Т. Д. Шмакова

ЭНТЕРОВИРУСТЫ ИНФЕКЦИЯЛАРРА ЭПИДЕМИОЛОГИЯЛЬЩ МОНИТОРИНГ КЕЗ1НДЕ КАЗ1РГ1 ЗАМАНРЫ ЗЕРТХАНАЛЬЩ ТЭС1ЛДЕРД1 КОЛДАНУ

Автордыч пiкiрiнше, энтеровирустарра ПЦР эдiсiмен одан api вирусологиялык тэсiлмен «ашу» жолымен оч нэтижелеpдi катар зертханалык зерттеу жYpгiзу адам патологиясындары энтеровирустык инфекцияныч этиологиялык курылымы туралы барынша толык тYCiнiк беpедi. Бул энтеровирустык инфекцияра эпидемиологиялык кадаралауды тиiмдi уйымдастыру мен етшуге мYмкiндiк тудырады.

Е. Ж. Отаров, Е. Г. Туяцбаев, К. О. Текебаев

ХРИЗОТИЛ-АСБЕСТ 9НД1Р1С1 Ж¥МЫСШЫЛАРЫНЬЩ ЖАСЫНА БАЙЛАНЫСТЫ ДЕНСАУЛЫК ЖАРДАЙЫН ГИГИЕНАЛЬЩ БАРАЛАУ

КР ДСМ Караганды мемлекеттiк медицина университетi

6ндiрiс жардайындары жумысшылардыч денсаулырына вндiрiстiк-кэсiптiк, элеуметпк-тур-мыстык жэне де баска факторлардыч эсерiн айрактап беретiн кврсеткiштердiч бiрi - уакытша ечбекке жарамсыздык бойынша сыркат-танушы-лык (УЕЖ) болып саналады. Сочры уакыттары УЕЖ туындататын сыркаттанушылыктыч калып-тасуында ечбек жардайыныч медициналык-сани-тарлык кызмет кврсету сапасын жэне баска да факторлардыч рвлiн аныктау максатында жумысшылардыч сыркаттанушылырын теречiрек зерттеу ерекше мачызды орынра шыкты. Бул сыркаттанушылык кврсеткiшi коршаран ортадары кандай да болмасын кез-келген жайсыз кубы-лыстарра байланысты вз курамы мен дечгейш тез взгертiп отырады [1].

Ашык кен орындарындары жумысшылардыч сыркаттанушылырына шачныч жорары деч-гейi жэне жайсыз микроклимат, шу мен дiрiлдiк жорары дечгешмен кешендi тYPде елеулi эсер ететiнi айтылран жэне де УЕЖ бойынша сыркат-танушылырыныч сипаты мен дечгешне вндiрiстiк факторлардыч ткелей эсерi бар екендiгi айкын-далран [2].

6ндiрiстегi ечбек ететiн жумысшылардыч аурушачдылырына сырткы ортаныч факторлары-ныч тiкелей эсер ететiндiгi аныкталынран [3, 4].

Елiмiздегi тау-кен внеркэсiбi жумысшы-ларыныч ечбек жардайы, олардыч арзасына внд^ рiстiк факторлардыч эсерi ерекшелктер^ч мэсе-лелерi ралымдардыч квптеген рылыми ечбек-терiнде жарык кврген. Бiрак та сочры жылдары

хризотил-асбест кеын ашык эдiспен вндiретiн кэ-сторындар жумысшыларыныч ечбек жардайла-рын, олардыч организм^е кешендi вндiрiстiк факторлардыч эсерш зерделеу бойынша жYр-гiзiлген рылыми зерттеулердiч аздыры байкалады.

ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ЭД1СТЕР1

«Костанай минералы» АК жумысшылары-ныч УЕЖ бойынша сыркаттанушылык дечгейше жэне сипатына ечбек жардайыныч эсер ету деч-гейiн баралау жэне талдау максатында 3 вндiрiс-тiк-кэсiби топ курылды. Бакылау тобына жыл бойы жумыс жасаран энергетикалык-шаруашы-лык, кYзет бвлiмi, санитарлык жэне вндiрiстiк лаборатория, электрмен жвндеу цехы, техни-калык байкау бвлiмi жумысшылары (300 адам) енгiзiлдi. Олар вндiрiстiч жарымсыз факторлары-мен аз жанасады жэне эсер етушi факторлардыч каркындылыры айтарлыктай жорары емес.

Бiрiншi непзп топты байыту кешенi цехта-рыныч жумысшылары (917 адам) кураса, екiншi негiзгi топка тау-транспорты мекемесi мен темiр-жол транспорты мекемесiнiч квлк жYргiзушiлерi мен жумысшылары (1085 адам) курады. Аталран топтары жумысшылардыч ечбек жардайыныч ерекше сипаттамасы болып шектеулi руксат етш-ген дечгейден (ШРЕД) 40 дБ жорары каркынды шу, шектеулi руксат етiлген концентрациядан (ШРЕК) 8 есе асатын курамында хризотилдi асбесттiч талшыктары мен асбесттiч шачы бар ластанран ауа, вндiрiстегi жеткшказ жарыктан-дыру, микроклимат факторларыныч ауыткуы, жу-мыс ауысымы динамикасында хризотилдi асбест кенiн кайта вчдеу бойынша эртYрлi вндiрiс YPДiс-терi кезшдеп ечбек жардайыныч кернеулiгi мен ауырлыры болып табылады.

Жыл бойы жумыс жасаран жумысшы-лардыч аурушачдылык кврсетюштер^ч 20052007 жж орташа кврсеткiштерi алынды.

ЗЕРТТЕУ НЭТИЖЕЛЕР1

Жас кврсеткш бойынша бакылау тобында-ры УЕЖ бойынша сыркаттанушылык кврсетюш-терi жас топтар все жорарылайтындыры 1-шi кестеде бертген. Бакылау тобында 50 жас жэне одан жорары жастарылар арасында УЕЖ бойынша