Способ подготовки проб материала для идентификации вида нематод методом MALDI TOFF Biotyper
METHOD OF PREPARING SAMPLES OF MATERIAL FOR IDENTIFICATION OF NEMATODE SPECIES BY MALDI TOFF BIOTYPER METHOD

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается способа подготовки проб паразитарных патогенов, в данном случае нематод (Ascaris, Dirofilaria) для их идентификации методом MALDI TOFF Biotyper (MALDI: матрично-активированная лазерная десорбция / ионизация (TOFF - time of flight - анализатор пролетного времени).
Протеомные исследования (определение возбудителя на основе анализа его белкового спектра) являются относительно новым направлением лабораторной диагностики инфекционных болезней. Отечественных аналогов использования масс-спектрометрических профилей нематод для диагностики паразитозов в доступной литературе не обнаружено.
Первые исследования потенциала MALDI TOFF для изучения белкового профиля гельминтов с неустановленным геномом были предприняты в 2007 году специалистами Бразилии [1]. В дальнейшем этот метод был применен с целью дифференциации белков протосколексов многокамерного эхинококка [2]. Также, корейскими специалистами изучались изменения белкового профиля клеток холангиокарциномы, обработанных экскреторносекреторными антигенами Clonorchis sinensis [3]. Кроме того проводились исследования по дифференциации белковых профилей мужских и женских особей возбудителя японского шистосомоза [4]. Данный метод показал свою эффективность в качестве способа быстрой диагностики нематод, паразитирующих на сельскохозяйственных культурах [5].
«Золотым стандартом» диагностики дирофиляриоза человека является морфологическая идентификация гельминтов, удаленных при хирургическом вмешательстве. Однако в случае повреждения нематоды в процессе ее извлечения диагностическая значимость дан-ного метода значительно снижается.
Одним из важных составляющих данного метода является подготовка проб материала для проведения исследования.
Известен способ получения соматического антигена D.immitis [6], при котором гельминтов помещают в физиологический раствор в соотношении 1:10, измельчают в ступке на холоде до получения однородной массы, проводят экстрагирование белков в течении 24 часов в этом же растворе при 4°С на магнитной мешалке, по окончании экстрагирования гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин на холоде, осадок удаляют, а супернатант фракционируют гель-хроматографией на колонке 16×70 см. В данном способе для получения антигена использовали половозрелых самок гельминтов D.immitis, от собак. Антиген, полученный по данному способу, обладал видоспецифичностью, но при этом имел достаточно высокий процент ложноотрицательных результатов (16%).
Известен способ идентификации микроорганизмов с помощью Bruker. Этот способ позволяет идентифицировать возбудителей бактериальных инфекционных процессов. Для проведения MALDI-TOFF MS (масс-спектрометр) крови и/или мочи к биоматериалу с целью удаления клеток добавляют лизис буфер из набора MALDI Sepsityper (Sepsitvper - название тест системы) (Bruker Daltonics), затем отмывочный буфер, в целях дополнительной очистки проводят дополнительно отмывку 96% этанолом и бидистилированной водой. Далее, для улучшения качества спектра, проводят экстракцию в 70% муравьиной кислоте с последующим наслоением 50% ацетонитрила. В качестве матрицы наносят СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) и помещают в масс-спектрометр для анализа. Профили масс белка объектов исследования получают с использованием Microflex LT MALDI TOFF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением Flex Control (Bruker Daltonics) и Maldi Biotyper, (Biotyper - название аппарата), визуализируют с помощью программного обеспечения Flex analysis 3.3 (Bruker Daltonics). Способ позволяет получить белковые профили бактерий, освобожденных от других примесей, в том числе клеток крови [7].
Однако, до настоящего времени данный метод не применялся с целью получения белковых профилей паразитарных патогенов.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому изобретению является Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria immitis. [8]. Представленный способ включает механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, при этом для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С. Представленное изобретение позволяет получить антиген с высокими показателями чувствительности и специфичности и может быть использовано в диагностике дирофиляриоза у людей и животных.
(См. патент России №2525688, кл. МПК С07К 39/00; опубл. 20.08.2014.)
Недостатком данного способа является то, что при проведении матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации (MALDI-TOFF MS) биологического материала, полученного в результате данного способа пробоподготовки, не удалось получить четких и идентичных белковых профилей дирофилярий.
Целью изобретения является: разработка способа пробоподготовки нематод для идентификации видового состава методом MALDI TOFF Biotyper с высокой степенью специфичности.
В предлагаемом способе используется только головной конец половозрелых и неполовозрелых нематод рода Ascaris и Dirofilaria. В связи с тем, что именно здесь содержатся железистые клетки пищевода стихоциты (наименее дифференцированные и являющиеся общими для каждого вида нематод).
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение профилей масс белка объектов исследования с высокими показателями чувствительности и специфичности, что может быть использовано в диагностике паразитарных инвазий людей и животных.
Поставленная задача решается тем, что способ подготовки проб материала для видовой идентификации нематод методом MALDI TOFF Biotyper, включающий механическую, ультразвуковую гомогенизацию особи, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости для последующей идентификации отличается от прототипов тем, что: для гомогенизации используется только головной конец нематод; биоматериал предварительно обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия; биоматериал предварительно помещают в 0,9% р-р NaCl. При этом получают четкие масс-спектрометрические протеомные профили с использованием набора MALDI Sepsityper в программе Flex control и MALDI TOFF Biotyper с программным обеспечением «blood culture project» (программма исследования культур в крови) и осуществляют построение графиков с использованием программного продукта Flex Analisis, позволяющих проводить видовую идентификацию дирофилярий и аскаридат.
Предлагаемый способ проиллюстрирован следующими материалами.
На фиг. 1 представлена таблица, показывающая соотношение реагентов для подготовки проб биоматериала к исследованию MALDI-TOFF Biotyper.
На фиг. 2 представлен график, иллюстрирующий пример 1 (в опис.) к методу согласно источнику [8]. Белковые профили D.immitis (слева) и D.repens (справа). Пробивали в ручном режиме.
На фиг. 3 представлен график, иллюстрирующий пример 2 (в опис.) к методу согласно источнику [7]. Белковые профили D.immitis (слева) и D.repens (справа).
На фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий полученный результат при использовании патентуемого метода пробоподготовки. Белковые профили D.immitis (слева) и D.repens (справа).
На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий полученный результат при использовании патентуемого метода пробоподготовки. Белковые профили A. Suum (слева) и А. Lumbricoides (справа).
Способ включает следующие этапы:
Подготовка гомогенизата нематод. Особь многократно отмывают в 0,9% растворе NaCl и помещают на 24 часов в 0,9% раствор NaCl с добавлением 100 ед./мл феноксиме-тилпенициллина (пенициллин V) и 100 мкг/мл стрептомицина. Отделяют головной конец нематоды длиной 2 см и помещают его в стерильный 0,9% раствор NaCl в соотношении 1:3 (масса паразита: объем изотонического раствора). Полученную массу подвергают заморозке при -18°С в течение 30 минут. Механическую гомогенизацию замороженного материала проводят на ледяной бане до получения жидкой массы с последующим повторным замораживанием. Данный этап выполняется 5 кратно. Полученную биомассу помещают в пробирки типа эппендорф, которые помещают в замороженный 70% спирт и проводят ультразвуковую гомогенизацию при 70 кГц в течение 30 секунд пятикратно.
В полученную биомассу добавляют 200 мкл лизис буфера из набора MALDI Sepsityper, перемешивают на аппарате Vortex. Центрифугируют 2 минуты в режиме 13000 об/мин. Удаляют супернатант. Суспендируют осадок в промывочном буфере пипеттированием. Центрифугируют 2 минуты на 13000 об/мин. Далее суспендируют осадок в 300 мкл деионизированной воды и 900 мкл этанола. В соответствии с приведенной таблицей (см. фиг. 1) добавляют определенное количество 70% муравьиной кислоты и ацетонитрила в пробирку и перемешивают. Отбирают 1 мкл супернатанта, наносят на точку мишени MALDI. После высушивания на воздухе экстракт покрывают 1 мкл раствора матрицы СНСА (α-Cyano-4-hydroxycirmamicacid) и дают полностью высохнуть при комнатной температуре.
Проводят идентификацию в приборе MALDI Biotyper в соответствии с инструкцией к прибору и авторской методикой.
Пример №1. Использование при гомогенизации дирофилярий 0,25 М водного раствора сахарозы и 10 мкл муравьинной кислоты и 10 мкл ацетонитрила. Работа проводилась в программе Flex control и MALDI Biotyper с программным обеспечением «normal project».
Брались 10 D.immitis и 10 D.repens. Гельминтов гомогенизировали в 0,25 М водном растворе сахарозы в соотношении 1:3. Замораживали при - 18°С, проводили механическую гомогенизацию 5 ти кратно из замороженного состояния на ледяной бане, ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд в пяти цикла при 0 С. 1 мл образовавшейся после ультразвуковой гомогенизации биомассы отбирали в эппендорф. Для лизиса клеток добавляли лизис буфер из набора MALDI Sepsityper и встряхивали на вортексе 10 секунд. После чего центрифугировали при 13000 об/ мин. в течение 2 минут. Удаляли надосадочную жидкость. Осадок суспендировали в промывочном буфере пипеттированием. Повторно центрифугировали при 13000 об/ мин. в течение 2 минут. Убирали надосадочную жидкость, добавляли 900 мкл 96% этанола и 300 мкл бидистилированной воды. Встряхивали на вортексе 10 секунд. Центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Убирали надосадочную жидкость. Для улучшения качества спектра добавляли в полученный биоматериал (7,5±2,5 мкл) 10 мкл 70% муравьиной кислоты (фиг. 1 табл.). Затем в пробирку добавляли 10 мкл 50% ацетонитрила (см табл 1). Встряхивали на вортексе 10 секунд. Гомогенат центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Один μ1 супернатанта образца наносили на стальную пластину (Bruker Daltonics) в двух последовательностях. Мишень сушили в течение нескольких минут (5-15) при комнатной температуре. Затем на каждый образец наносили μ1 матрицы СНСА (α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid), просушивали и помещали в масс-спектрометр для анализа. Профили масс белка гомогенизатов получали с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (Bruker Daltonics) визуализировали с помощью программного обеспечения Flex analysis 3.3 (Bruker Daltonics). Работа проводилась в программе Flex control и MALDI BiotyperRTC с программным обеспечением «normal project».При построении графиков в Flex Analisis получили большое количество фиксируемых шумов и нечеткие протеиновые пики. Построение масс-спектрометрических профилей проводили в ручном режиме. Различия между видами D.immitis и D.repens по графикам выявить не удалось (фиг. 2).
Пример №2. Использование при гомогенизации дирофилярий изотонического раствора натрия хлорида, 20 мкл муравьиной кислоты и 20 мкл ацетонитрила. Работа проводилась в программе Flex control и MALDI Biotyper с программным обеспечением «normal project».
Брались 5 D.immitis и 5 D.repens. Гельминтов гомогенизировали в изотоническом растворе натрия хлорида в соотношении 1:3. Замораживали при -18°С, проводили механическую гомогенизацию 5ти кратно из замороженного состояния на ледяной бане, ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд в пяти циклах при 0 С. Образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации биоматериал отбирали по 1 мл в эппендорф. Для лизиса клеток добавляли лизис буфер из набора MALDI Sepsityper Kit-50 (Bruker Daltonics) и встряхивали на вортексе 10 секунд. Суспендировали осадок в промывочном буфере пипеттированием. Для улучшения качества спектра добавляли 20 мкл экстракции 70% муравьиной кислоты. Затем в пробирку добавляли 20 мкл 50% ацетонитрила (фиг. 1. табл.). Гомогенаты центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Один μ1 супернатанта образца наносили на стальную пластину (Bruker Daltonics) в двух последовательностях. Мишень сушили в течение нескольких минут (5-15) при комнатной температуре. Затем на каждый образец наносили μ1 матрицы СНСА (α-Суаnо-4-hydroxycinnamicacid), просушивали и помещали в масс-спектрометр для анализа. Профили масс белка гомогенизатов получали с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (Bruker Daltonics) визуализировали с помощью программного обеспечения Flex analysis 3.3 (Bruker Daltonics). (рис. 3). Работа проводилась с программным обеспечением «normal project» При построении графиков в Flex Analisis получили незначительное количество фиксируемых шумов и нечеткие протеиновые пики. Различия между видами D.immitis и D.repens по графикам выявить не удалось (фиг. 3).
Пример №3. Использование при гомогенизации дирофилярий изотонического раствора натрия хлорида, 20 мкл муравьиной кислоты и 20 мкл ацетонитрила. Работа проводилась в программе Flex control и MALDI BiotyperRTC с программным обеспечением «blood culture project)).При построении графиков в Flex Analisis.
Брались 5 D.immitis и 5 D.repens. Гельминтов гомогенизировали в изотоническом растворе натрия хлорида в соотношении 1:3. Замораживали при -18°С, проводили механическую гомогенизацию 5-ти кратно из замороженного состояния на ледяной бане, ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд в пяти цикла при 0 С. Образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации биоматериал отбирали по 1 мл в эппендорф. Для лизиса клеток добавляли лизис буфер из набора MALDI Sepsityper Kit-50 (Bruker Daltonics) и встряхивали на вортексе 10 секунд. Суспендировали осадок в промывочном буфере пипетированием. Для улучшения качества спектра добавляли 20 мкм экстракции 70% муравьиной кислоты. Затем в пробирку добавляли 20 мкл 50% ацетонитрила (см. табл. 1). Гомогенаты центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Один μ1 супернатанта образца наносили на стальную пластину (Bruker Daltonics) в двух последовательностях. Мишень сушили в течение нескольких минут (5-15) при комнатной температуре. Затем на каждый образец наносили μ1 матрицы СНСА (α-Суаnо-4-hydroxycinnamicacid), просушивали и помещали в масс-спектрометр для анализа. Профили масс белка гомогенизатов получали с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (Bruker Daltonics) визуализировали с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (Bruker Daltonics) (pиc. 3). Работа проводилась в программе Flex control и MALDI Biotyper RTC с программным обеспечением «blood culture project».При построении графиков в Flex Analisis. В связи с тем, что использовался изотонический раствор хлорида натрия и другая программа, были получены четкие сопоставимые результаты (фиг. 4.)
На графике появились различия между D.immitis и D.repens.
Пример №4. Использование при гомогенизации аскаридат изотонического раствора натрия хлорида, 20 мкл муравьиной кислоты и 20 мкл ацетонитрила. Работа проводилась в программе Flex control и MALDI Biotyper RTC с программным обеспечением «blood culture project». При построении графиков в Flex Analisis.
Брали 10 молодых, неполовозрелых аскарид: 5 A. lumbricoides отошедших естественным путем у пациентов клиники 5 A. suum, выделенных из кишечника свиней на бойнях. Для проведения MALDI-TOF MS анализа гельминтов отмывали в изотоническом растворе хлорида натрия, с добавлением 100 ед./мл феноксиметилпенициллина (пенициллин V) и 100 мкг/мл стрептомицина, гомогенизировали механически и ультразвуком. Для лизиса клеток добавляли лизис буфер из набора MALDI Sepsityper Kit-50 (Bruker Daltonics) и встряхивали на вортексе 10 секунд. Суспендировали осадок в промывочном буфере пипеттированием. Для улучшения качества спектра добавляли 20 мкм экстракции 70% муравьиной кислоты. Затем в пробирку добавляли 20 мкл 50% ацетонитрила (см. табл. 1). Гомогенаты центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Один μ1 супернатанта образца наносили на стальную пластину (Bruker Daltonics) в двух последовательностях. Мишень сушили в течение нескольких минут (5-15) при комнатной температуре. Затем на каждый образец наносили 1 μ1 матрицы СНСА (α-Суаnо-4-hydroxycinnamicacid), просушивали и помещали в масс-спектрометр для анализа. Профили масс белка гомогенизатов получали с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (Bruker Daltonics) визуализировали с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (Bruker Daltonics). Работа проводилась в программе Flex control и MALDI BiotyperRTC с программным обеспечением «blood culture project». При построении графиков в Flex Analisis. В связи с тем, что использовался изотонический раствор хлорида натрия с добавлением 100 ед./мл феноксиметилпенициллина (пенициллин V) и 100 мкг/мл стрептомицина и другая программа, были получены хорошие результаты с другими видах гельминтов. Представленное изобретение позволяет идентифицировать нематод с высокой степенью точности (фиг. 5).
Список использованной литературы
1.  IR, Neves-Ferreira AG, Valente RH, Mota EM, Lenzi HL, Perales J. Improved protein identification efficiency by mass spectrometry using N-terminal chemical de-rivatization of peptides from Angiostrongylus costaricensis, a nematode with unknown genome. J Mass Spectrom. 2007, 42(6):781-92.
2. Wang Y, Cheng Z, Lu X, Tang C. Echinococcus multilocularis: Proteomic analysis of the protoscoleces by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Exp Parasitol. 2009, 123(2):162-7.
3. Pak JH, Moon JH, Hwang SJ, Cho SH, Seo SB, Kim TS. Proteomic analysis of differentially expressed proteins in human cholangiocarcinoma cells treated with Clonorchis sinensis excretory-secretory products. (J. Cell Biochem. 2009, 108(6): 1376-88.
4. Yuan SS, Xing XM, Liu JJ, Huang QY, Yang SQ, Peng F. Screening and identification of differentially expressed proteins between adult female and male worms of Schistosoma japonicum. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2009 Aug; 43(8):695-9.2009 Aug; 43(8):695-9.
5. Ahmad F, Gopal J, Wu HF. Rapid and highly sensitive detection of single nematode via direct MALDI Mass Spectrometry. Talanta. 2012,93:182-5.
6. Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией // Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 2007. - С8
7. Buchan B.W., К.М. Riebe, N.A. Ledeboer. Comparison of the MALDI Biotyper system using Sepsityper specimen processing to routine microbiological methods for identification of bacteria from positive blood culture bottles. J Clin Microbiol, 2012 50(2): p. 346-52.
8. Патент на изобретение №2525688 Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria immitis, 23.06.2014 Нагорный С.А., Васерин Ю.И. Криворотова Е.Ю.