СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ С ДИАТОМИТОМ ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР ОТ БОЛЕЗНЕЙ
METHOD FOR PRODUCING LIQUID BACTERIAL BIOPHARMACEUTICALS WITH DIATOMITE FOR PROTECTING CROPS FROM DISEASES

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к созданию жидких биологических средств защиты растений на основе живых бактериальных агентов и природного кремнийсодержащего минерала диатомита.
Известно, что применение биологически препаратов (биофунгицидов) на основе различных микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности относится к числу наиболее перспективных направлений в защите растений от различных болезней [1]. Наиболее часто в качестве микроорганизмов для создания биофунгицидов используются бактерии, которые обладают способностью выделять различные антибиотики, специфические вещества сидерофоры, а также имеют иные механизмы подавления развития возбудителей болезней сельскохозяйственных культур [2]. На основе таких бактериальных биологических агентов создано большое количество жидких бактериальных биологических препаратов, в том числе с добавлением различных компонентов.
Известен жидкий биологический препарат Фитоспорин на основе бактерии Bacillus subtilis 26Д (патент РФ №№2129375, опубл. 27.04.1999 г.) [3], представляющий собой культуральную жидкость с добавлением в качестве стабилизатора препарата Гуми, представляющего собой препарат на основе гуматов. К недостаткам данного подхода можно отнести то, что используемый в качестве стабилизатора препарат Гуми требует дополнительных затрат на свое получение и производства, что влияет на стоимость конечного продукта.
Известен способ получения жидких биологических препаратов с фунгицидной активностью на основе штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens (ВКПМ: В-12464) на питательной среде, содержащей в качестве питательной основы отходы или побочные продукты спиртовой или пивоваренной промышленности (патент РФ №2647569, опубл. 16.03.2018 г.) [4]. К недостаткам данного способа относится отсутствие в конечном продукте веществ, играющих роль в минеральном питании растений.
Известен биопрепарат для защиты растений от болезней (Патент РФ №2478290, опубл. 10.04.2013) [5], который получают путем культивирования штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 на питательной среде на основе отходов зернового производства и добавления после окончания процесса культивирования в препарат гуматов в количестве 1,0 об.%. К недостаткам данного способа можно отнести то, что при производстве гуматов достаточно трудно поддерживать постоянный химический состав, что может влиять на эффективность применения полученных таким способом препаратов.
В последнее время все большее внимание в системе удобрений сельскохозяйственных культур уделяется кремнию, который играет важную роль в обмене веществ растений, а также в процессах устойчивости растений к стрессам, в том числе к болезням и вредителям [6]. Было установлено положительное влияние кремниевых удобрений на урожайность культурных растений [7]. В качестве источников кремния для растений могут выступать различные природные минералы, в том числе и диатомит, представляющий собой морские осадочные породы, на основе останков диатомовых водорослей. Частицы диатомита обладают высокой пористостью, содержат до 80-90% диоксида кремния, а также фосфор и калий, которые также как кремний имеют важное значение для питания растений [8]. Применение диатомитов для внесения в почву и обработки семян показало высокую эффективность [9]. Известно, что кремнийсодержащие вещества оказывает положительное влияние и на развитие бактерий, в том числе биологических агентов биофунгицидов [10]. В связи с этим, были предприняты попытки производства биопрепаратов с добавлением диатомита.
Известен способ получения сухого биопрепарата на основе бактерии Bacillus amyloliquefaciens (Патент РФ №2528058, опубл. 10.09.2014) [11], при котором предполагается смешение культуральной жидкости штамма с носителем в виде мелкодисперсных гранул диатомита в соотношении по объему 1:3 с последующим высушиванием. Недостатком данного способа являет то, что получаемый препарат сильно пылит и не может быть использован с применением стандартных распылителей для опрыскивателей в виду опасности их засорения.
Известен способ получения жидких инсектицидов на основе диатомита и воды с добавлением одной или нескольких добавок (патент WO 2013/055773 А1, приоритет 10.10.2012) [12], который позволяет использовать полученную суспензию для опрыскивания сельскохозяйственных культур, при этом указывается, что после высыхания на поверхности растений остается тонкий слой минерала, повреждающий покровы вредителей. Недостатком данного способа является то, что он не предназначен для использования совместно с бактериальными агентами, т.к. предполагает использование специальных добавок, потенциально опасных для микроорганизмов.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа получения эффективных жидких биофунгицидов, при применении которых будет обеспечено снижение развития болезней растений, повышение урожайности сельскохозяйственных культур.
Технический результат достигается тем, что при производстве биопрепаратов на основе различных групп бактерий (спорообразующих бактерий рода Bacillus и ризосферных бактерий рода Pseudomonas) дополнительно добавляется порошок диатомита, а в качестве стабилизатора суспензии используется желатин.
2
4
2
2
4
4
2
4
4
2
Способ получения биофунгицида заключается в следующем. В жидкую питательную среду (среда ВМ содержащая 7,6 г/л KHРО⋅3НO, 3 г/л KНРO, 1 г/л (NH)SO и 0,2 г/л MgSO⋅7НO) добавляется измельченный порошок диатомита (фракция получена путем прохода порошка диатомита через сита 0,5 мм) из расчета 10 г на 1 л среды. В качестве стабилизатора для повышения эффективности контроля фитопатогенов и увеличения урожайности сельскохозяйственных культур, использовался желатин из расчета 10 г на 1 л среды. Полученную среду автоклавировали и инокулировали бактериальными штаммами: Bacillus mojavensis PS 17 (бациллы) и Pseudomonas fluorescens WCL5365 (Псевдомонас). Колбы с микроорганизмами помещали в шейкер-инкубатор при Т=27°С и 150 об/мин на 2 дня. Полученные биопрепараты представляли собой стабильную суспензию.
Пример 1. Определение влияния диатомита и желатина на выживаемость бактериальных биоагентов
Спустя сутки из полученных биопрепаратов, а также препаратов без добавления диатомита отбирались пробы, которые помещались на твердую среду КВ для подсчета КОН. Результаты оценки представлены в таблице 1.
Результаты оценки показали, что добавление в культуральную жидкость диатомита приводит к росту величины КОЭ для обоих бактериальных биологических агентов биопестицидов.
Пример 2. Оценка пригодности препаратов для опрыскивания
Для проверки того, насколько препарат пригоден для опрыскивания, использовали лабораторную установку, на которой устанавливались щелевые наконечники (распылители) опрыскивателей с диаметром отверстий 1 мм, 0,5 мм и 0,3 мм. При этом создавалось давление в 2 атм. Оценку проводили в течение 1 часа работы установки. Результаты представлены в таблице 2. При этом визуально оценивалась степени прохождения суспензии и засорение наконечников твердыми частицами.
Таким образом, полученные жидкие препараты с диатомитом пригодны для использования методом опрыскивания.
Пример 3. Определение сохранности биоагентов в препаратах с диатомитом при хранении
Готовые жидкие препараты поместили в темное место на 6 месяцев при комнатной температуре (21-25°С). Через 1 день, 2 недели, 1, 3 и 6 месяцев в препаратах определяли численность биоагентов (величину КОЭ на 1 мл препарата) (табл. 3).
В проведенных исследованиях было показано, что живые бактериальные биоагенты в полученных препаратах, даже при комнатной температуре, сохраняются в течение 6 месяцев. Причем максимальное падение КОЭ происходит в первые две недели, а затем снижение численности шло более низкими темпами.
Пример 4. Проверка фунгицидных свойств препаратов с содержанием диатомита
Семена пшеницы сорта Агата обрабатывали жидкими препаратами. Обработку семян изучаемыми препаратами проводили в норме 1 л/т. Контролем служили семена, обработанные стерильной водой. Обработанные семена помещали в чашки Петри с твердой средой Чапека (по 20 семян в каждую чашку в 4 повторностях), а затем в термостат на 7 суток при Т=26°С. Через 7 суток определяли зараженность семян различными фитопатогенными организмами (табл. 4).
Результаты оценки показали, биопрепараты на основе бактериальных агентов и диатомита обладают выраженной фунгицидной активностью в отношении фузариозной инфекции (снижение зараженности в 3 раза), а также подавляют гельминтоспориозную инфекцию. В отношении альтернариоза, активность была только у препарата с Pseudomonas fluorescens WCL 5365
Пример 5. Результаты полевых опытов. Объект исследований - озимая пшеница сорта Скипетр
Схема опыта:
1. Контроль - без обработки.
2. Стандартный биофунгицид (Бактофит), 0,5 л/га.
3. Bacillus mojavensis PS17 с диатомитом, 1 л/га.
4. Pseudomonas fluorescens WCL 5365 с диатомитом, 1 л/га.
2
2
Общая площадь делянки - 5,5 м, учетная - 5,0 м. Повторность в опыте - четырехкратная. Агротехнология возделывания озимой пшеницы - общепринятая для зоны Предкамья Республики Татарстан. Опрыскивание проводили в фазу колошения. Расход рабочей жидкости - 200 л/га. Погодные условия 2020 года были благоприятными для роста и развития озимой пшеницы.
Результаты оценки показали, что изучаемые препараты, практически не уступали по своей эффективности стандартному биофунгициду в отношении септориоза колоса и «черни колоса», а по отношению фузариоза колоса показали даже большую эффективность.
Использование препаратов с диатомитом способствует достоверному росту урожайности, как в сравнении с контролем, так и с показателями для стандартного биофунгицида.
Список использованной литературы
1. Захаренко В.А. Биотехнологии и защита растений // Защита и карантин растений. - 2015. - №11. - С. 3-8.
2. Whipps, J.М. Biological control agents in plant disease control / J.M. Whipps, M. McQuilken // Disease Control in Crops: Biological and Environmentally Friendly Approaches. - Blackwell Publishing Ltd, 2009. - P. 27-61.
3. Байгузина Ф.А., Штроман Г.А., Менликеев М.Я., Алсынбаев М.М., Каверин В.В., Кузнецова Т.Н., Байгузина С.Н. Патент РФ №2129375 С1 на изобретение БИОПРЕПАРАТ ФИТОСПОРИН ЖИДКИЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ. Опубл.: 27.04.1999 г.
4. Егоршина А.А., Лукьянцев М.А., Зиганшин Д.Д., Сагдеева К.Р., Ажермачев И.А., Бадрутдинов Н.В. Патент РФ №2647569 С1 на изобретение БИОПРЕПАРАТ ФИТОСПОРИН ЖИДКИЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ. Опубл.: 16.03.2016 г. Бюл. №8.
5. Сираева З.Ю., Захарова Н.Г. Патент РФ №2478290 С2 на изобретение БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ И ПОЧВЕННОГО ПЛОДОРОДИЯ. Опубл.: 10.04.2013 г. Бюл. №10.
6. Матыченков В.В. Влияние кремниевых удобрений на растения и почву / В.В. Матыченков, Е.А. Бочарникова, Я.М. Аммосова // Агрохимия. - 2002. - №2. - С. 86-93.
7. Куликова А.Х. Влияние высококремнистых пород как удобрений сельскохозяйственных культур на урожайность и качество продукции / А.Х. Куликова // Агрохимия. - 2010. - №7. - С. 18-25.
8. Надольский O.К. Диатомиты, трепелы и опоки Ульяновской области / O.К. Надольский // Краеведческие записки. - 1958. - Вып. II. - С. 319-328.
9. Куликова А.Х. Диатомиты в сельском хозяйстве / А.Х. Куликова, Т.Ю. Сушкова, А.Г. Ариткин // Техника и оборудование для села. - 2011. - №3. - С. 16-17.
10. Al-Garni, S.М.S., Khan М.А. & Bahieldin A. Plant growth-promoting bacteria and silicon fertilizer enhance plant growth and salinity tolerance in Coriandrum sativum // Journal of Plant Interactions. - 2018. - Vol. 14:1. - p. 386-396.
11. Азизбекян P.P., Кузнецова Н.И., Кузин A.M., Николаенко M.A. Патент РФ №2528058 C1 на изобретение ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНЫМ И БАКТЕРИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЗЕРНОВЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ. Опубл.: 10.09.2014 г., Бюл. №25.
12. Sumulong, S. et al. WO 2013/055773 A1. LIQUID INSECTICIDE INCLUDING DIATOMACEOUS EARTH. Приоритет 10.10.2012.