СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОЛИБДЕНОВОЙ НЕФРОПАТИИ И ПРОТЕИНУРИИ У КРЫС
METHOD FOR PREVENTION OF EXPERIMENTAL MOLYBDENUM NEPHROPATHY AND PROTEINURIA IN RATS

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия молибдата аммония на функциональное состояние почек.
Молибден является эссенциальным микроэлементом, участвующим в различных физиологических процессах организма, однако его поступление в токсических дозах вызывает различные патологические состояния (Авцин А.П., Левина Э.Н., 1991; Израэльсон З.И., 1963; FairhallL etal., 1963). Молибден имеет особенность накапливаться в различных растениях, чем создает условия для его попадания в организм животных и человека в количествах, превышающих суточную потребность человека. Избыточное поступление молибдена в организм приводит к молибденовой интоксикации, при которой поражаются различные органы и системы.
Длительные клинические и экспериментальные исследования указывают на взаимодействие между некоторыми тяжелыми металлами и кальцием. Эти взаимодействия осуществляются на клеточном и молекулярном уровнях, где металл способен замещать кальций, вытеснять его из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт [Peraza M.А., Ayala Fieiro F., Barber D.S., Casarez E. RaelL. T. Effectsofmicronutrientsonmetaltoxi city. / Environmental Health Perspectives. - February, 1998. - Vol. 106. - Supplement 1].
B условиях истощения запасов кальция отмечается активация трансмембранного переноса металлов [Стародумов В.Л. Дефицит нутриентов как возможное условие развития интоксикации, вызванной воздействием малых доз свинца. / Гигиена и санитария. - 2003. - №3. - С. 60-62].
В эксперименте на крысах показано, что на фоне интоксикации ацетатом свинца и сульфатом кадмия применение кальция способствует снижению всасывания, накоплению металлов в организме и уменьшают нефротоксическое действие на почки (Ахполова В.О. 2012; Хадарцева М.П. 2012).
С развитием промышленности экосистема все более загрязнена различными ксенобиотиками, в связи с чем большой интерес представляет вопрос разработки новых способов профилактики поступления и выведение тяжелых и цветных металлов.
С этой целью используют различные детоксиканты (тиоловые соединения - унитиол, сукцимер, тиосульфат натрия, различные комплексоны - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин, α-пеницилламин и др.). Наряду с терапевтическим эффектом они могут вызывать различные побочные эффекты: расстройства желудочно-кишечного тракта, аллергические реакции, лейкопению, тромбоцитопению и др. (М.Д. Машковский, 2002, 237 с.; ВИДАЛЬ, 2002, 307). В тоже время они способны выводить из организма микроэлементы и такие жизненно важные ионы, как железо, кальций и др. (Дубищев А.В., 1994; Elias М.М., GirardiG. P., 1991), вызывать нарушение обменных процессов, что затрудняет их длительное профилактическое применение. Это объясняет необходимость изыскания новых средств для лечения и профилактики токсического действия молибдена, обеспечивающих постоянный баланс эссенциальных микроэлементов и витаминов и в тоже время обладающих равномерной и мягкой выделительной активностью.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ лечения и профилактики интоксикации тяжелыми металлами у животных, включающий применение комплексообразующего лекарственного средства - длительное и профилактическое применение ксидифона (Патент RU 2366415, опубликованный 10.09.97. Бюл. №25, заявка 2008112298/13 от 02.04.2008, A61K 31/663, A61P 39/00, авторы Рыжов А.А., Карпенко Л.Ю.). В данном способе применяется препарат «Хелавит» для профилактики в суточной дозе 0,2-0,4 мл на 10 кг живой массы перорально с кормом при постоянном применении; для лечения в суточной дозе 0,6-0,8 мл на 10 кг живой массы в течение месяца. Препарат добавляют в корм и перемешивают. В случае обитания животных в зоне, загрязненной тяжелыми металлами, используют профилактическую дозировку 0,2-0,4 мл на 10 кг живой массы перорально с кормом при постоянном применении. В случаях острого отравления хелавит применяют в дозе 0,6-0,8 мл на 10 кг живой массы в течение месяца.
Общим недостатком известных препаратов является их достаточно высокая нефро- и гепатотоксичность. При длительном использовании препаратов ускоряется выведение с мочой кальция и таких важных микроэлементов, как железо, цинк, медь, что ухудшает общие биохимические характеристики крови, нарушается обмен веществ.
Это объясняет необходимость изыскания новых средств для лечения и профилактики токсического действия молибдена, обеспечивающих постоянный баланс эссенциальных микроэлементов и витаминов и в тоже время обладающих равномерной и мягкой выделительной активностью.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа уменьшения нефротоксичности молибдата аммония у экспериментальных животных.
Решение этой задачи обеспечивает снижение токсического действия молибдена при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем создания экспериментальной гиперкальциемии, оказывающей протекторную роль.
Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ профилактики экспериментальной молибденовой нефропатии и протеинурии у крыс имеет следующие особенности: введение молибдата аммония на фоне экспериментальной гиперкальциемии и имеет следующие признаки: введение молибдата аммонияна на фоне экспериментальной гиперкальциемии, для создания гиперкальциемии используют препарат «Аквадетрим», вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 3000 МЕ/100 г в течение 30 дней, а через 14 дней от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно молибдат аммония в дозировке 50 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 15 дней.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что впервые применяют препарат «Аквадетрим» для профилактики молибденовой нефропатии. Для создания гиперкальциемии вводят препарат «Аквадетрим», вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 3000 МЕ/100 г в течение 30 дней, а через 14 дней от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно молибдат аммония в дозировке 50 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 15 дней.
Введение молибдата аммония на фоне экспериментальной гиперкальциемии приводит к снижению проявлений токсической нефропатии. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики экспериментальной молибденовой нефропатии и протеинурии у крыс, включающего введение молибдата аммония на фоне экспериментальной гиперкальциемии, в качестве препарата, вызывающего гиперкальциемию, применяют «Аквадетрим», молибдат аммония вводят в дозе 50 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легковоспроизводимом способе уменьшения токсического действия молибдена, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом.
С целью создания экспериментальной гиперкальциемии «Аквадетрим» вводят через атравматичный зонд в желудок в количестве 0,2 мл (3000 ME) на 100 г массы крысы в течение 30 дней, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемая дозировка кальцитриола вызывает повышение уровня кальция в крови интактных животных до 2,67±0,056 ммоль/л (фоновые значения - 2,16±0,041). Для получения токсического вещества молибдат аммония растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 25 мг молибдена (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы инъецируют 0,2 мл токсического раствора. Раствор молибдата аммония вводят подкожно в дозировке 50 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 15 дней двум группам животных (№1, №2), причем группе №2 металл начинают вводить параллельно с кальцитриолом с 15 дня эксперимента.
По истечении времени эксперимента (30 дней) исследуют функциональное состояние почек, что включает определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), экскреции натрия, калия, кальция, белка. Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивают с контролем (группа №1) и фоновыми показателями интактной группы.
Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксируют в 10% нейтральном формалине, после чего подвергают заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином. Изучение срезов и фотографии получены при помощи микроскопа PrimoStarzeizzc цифровой камеры AxioCamERc 5s.
Сущность способа подтверждается результатами гистологического исследования, где на фиг. 1 в опытной группе №1 с изолированным введением металла отмечается расширение мочевых пространств (а), сморщивание клубочка (б), а также гиалиново-капельная дистрофия (в) и некроз эпителия почечных канальцев (в).
На фиг. 2 морфологическое исследование почек в группе №2 выявляет относительную сохранность ткани клубочка (а), хотя отмечается дистрофия эпителия почечных канальцев (б) и очаги лимфогистиоцитарной инфильтрации (в), свидетельствующие об активации иммунокомпетентных клеток, что способствует регенерации ткани почек.
Пример.
Одной группе крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г ежедневно подкожно вводили молибдат аммония в дозировке 50 мг/кг в течение 15 дней. Второй группе животных каждый день внутрижелудочно вводился «Аквадетрим» в дозировке «Аквадетрим» 3000 МЕ/100 г в течение 30 дней, причем с 15 дня одновременно с подкожным введением раствора молибдата аммония. По окончании эксперимента исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярности мочи.
Содержание Na и K в моче и плазме определяли методом пламенной фотометрии с помощью пламенного анализатора жидкостей ПФА-378, концентрацию кальция, креатинина, белка определяли спектрофотометрически (PV 1251С) с помощью наборов "Кальций-Арсеназо-Агат", "Креатинин-Агат", ООО "Агат-Мед" (г. Москва, Россия). Результаты обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента с использованием программы Prism 5.0 и Excel.
Результаты исследования показали, что у крыс с изолированным введением молибдата аммония (группа №1) происходило достоверное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза относительно значений интактной группы животных спустя 16 дней эксперимента, несмотря на уменьшение скорости клубочковой фильтрации, что было обусловлено значительным снижением канальцевой реабсорбции воды. В случае сочетания молибденовой интоксикации с экспериментальной гиперкальциемией (группа №2) тоже отмечалось увеличение диуреза за счет снижения канальцевой реабсорбции, так как скорость клубочковой фильтрации не отличалась от показателей фоновых животных.
У животных, получавших металл подкожно (группа №1), достоверно повышалась экскреция белка относительно фоновых значений. В сочетанной модели цифры протеинурии были не столь высокими (табл. 1).
Таким образом, можно сделать вывод, что формирование хронической молибденовой интоксикации на фоне экспериментальной гиперкальциемии, вызванной введением аквадетрима, характеризуется менее выраженной картиной протеинурией.