Планарный наноструктурированный сенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса для усиления комбинационного рассеяния света тромбоцитов человека и способ его получения
PLANAR NANOSTRUCTURED SENSOR BASED ON SURFACE PLASMON RESONANCE TO ENHANCE RAMAN LIGHT SCATTERING OF HUMAN PLATELETS AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

2
Изобретение относится к области физики, а именно к оптике, и представляет собой устройство - наноструктурированный оптический сенсор, основанный на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, используемый для усиления сигнала комбинационного рассеяния света тромбоцитов (до порядков 10) раз. Изобретение может быть использовано в физике, медицине, биофизике.
Известны работы, являющиеся предпосылками заявляемого изобретения. Нижеприведенные примеры составляют часть предпосылок заявляемого изобретения и/или раскрывают методики, которые можно применять к некоторым аспектам заявляемого изобретения.
2
В частности, в работе (Dasary S. S. R. et al. Gold nanoparticle based label-free SERS probe for ultrasensitive and selective detection of trinitrotoluene //Journal of the American Chemical Society. - 2009. - T. 131. - №. 38. - C. 13806-13812) предложен метод обнаружения ряда взрывчатых веществ в низких концентрациях. Проблема детектирования заключается в неодостаточной степени повторяемости сигнала ГКР, а также в подборе рабочей концентрации вещества, т.к. следы аналита могут быть как рассеяны в воздухе в малой концентрации, так и содержаться в больших концентрациях и не давать разрешенного спектра. Некоторые из наиболее часто встречаемых взрывчатых веществ, таких как тринитротолуол, гексоген и пентаэритриттетранитрат, имеют очень низкое давление паров, и, как следствие, низкий предел обнаружения. Интенсивные исследования тринитротолуола показали, что данное вещество дает низкий уровень спектрального сигнала и демонстрирует высокую чувствительность к средствам усиления сигнала ГКР. В частности, в работе [Bertone J. F., Spencer K. M., Sylvia J. M. Fingerprinting CBRNE materials using surface-enhanced Raman scattering //Chemical, Biological, Radiological, Nuclear, and Explosives (CBRNE) Sensing IX. - International Society for Optics and Photonics, 2008. - T. 6954. - C. 69540J] приведена методология применения гидроксида натрия для обработки средств усиления спектрального сигнала, созданных на основе золота. Однако в данном способе в работе используется источник лазерного излучения - 100 Вт, что очень высоким значением мощности, которое может нести угрозу повреждения образца. Указанные изобретения применяются для исследования сложных, обладающих низкой интенсивностью рассеяния соединений, таких как бактериальная клетка. Как уже было отмечено, главной особенностью спектроскопии ГКР является присутствие НЧ металла (например, золото и серебро) в контакте с аналитом, в том числе помещение НЧ и аналита на полученную литографиче-сим методом поверхность для возбуждения поверхностного плазмонного-поляритонного резонанса при лазерном воздействии в целях усиления сигнала КР анализируемой молекулы. Применение спектроскопии ГКР обеспечивает быструю и надежную идентификацию соединений в области «отпечатка пальца»; в перспективе спектроскопия ГКР может выступать мощным аналитическим инструментом для точного, специфичного и повторяемого анализа структуры молекул [Tripp R. A., Dluhy R. A., Zhao Y. Novel nanostructures for SERS biosensing //Nano Today. - 2008. - T. 3. - №. 3. - C. 31-37]. Спектроскопия ГКР применяется для безметочного молекулярного анализа и может быть использована для определения широкого спектра соединений. Так, эффект ГКР может применяться для анализа ДНК [Kneipp К. et al. Detection and identification of a single DNA base molecule using surface-enhanced Raman scattering (SERS) //Physical Review E. - 1998. - T. 57. - №. 6. - C. R6281], лекарственных препаратов [Stokes R. J. et al. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy as a sensitive and selective technique for the detection of folic acid in water and human serum //Applied spectroscopy. - 2008. - T. 62. - №. 4. - C. 371-376], пищевых добавок [Lin M. et al. Detection of melamine in gluten, chicken feed, and processed foods using surface enhanced Raman spectroscopy and HPLC //Journal of food science. - 2008. - T. 73. - №. 8], клеток и спор [Alexander Т. A., Le D. M. Characterization of a commercialized SERS-active substrate and its application to the identification of intact Bacillus endospores //Applied optics. -2007. - T. 46. - №. 18. - C. 3878-3890]. Основными проблемами вышеобозначенных работ являются низкая повторяемость регистрируемого сигнала гигантского комбинационного рассеяния, а также технологическая сложность изготовления подобных структур. Стоит отметить работу [Barkur S., Chidangil S. Surface-enhanced Raman spectroscopy study of red blood cells and platelets //Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. - 2019. - T. 37. - №. 4. - C. 1090-1098], в которой с помощью коммерческих решений для усиления сигнала комбинационного рассеяния света проводится диагностика модельного аналита (красителя родамина 6Ж), а также компонентов крови человека. Показано достижение увеличение интенсивности рассеяния света до 10 раз.
Известно изобретение «Подложка для биочипа и способ ее изготовления» (патент RU №2 411 180, 2011 г., G01N 33/48), содержащее сходный с используемым в заявленном способе принцип выбора и конструирования устройства, состоящего из поверхности и наночастиц благородных металлов (Ag, Au, Pt).
Недостатком данного изобретения является как сложность изготовления конструкции, так и использование фотохромного или фототерморефрактивного стекла. Известно, что стекло, в отличие от титана дает существенно больший паразитный сигнал флуоресценции и рассеяния, наличие которого сильно затрудняет выделение эффективного сигнала аналита. Такая конструкция крайне неудобна для использования с наночастицами платины, имеющими пик плазмонного поглощения в области 200-240 нм, в то время как стекло, в отличие от кварца не является оптически прозрачным в ультрафиолетовой области.
12
14
За прототип выбрано изобретение «Оптический датчик с многослойной плазмонной структурой для усовершенствованного обнаружения химических групп посредством SERS. (Патент RU №2361193 С2). Изобретение включает в себя оптический сенсор для использования с лазерным пучком возбуждения в видимом или ближнем инфракрасном диапазоне и детектор на основе спектроскопии комбинационного рассеяния, для обнаружения наличия химических групп в аналите, нанесенном на датчик. Датчик располагается на подложке в виде плазмон-резонансного зеркала, сформированного на чувствительной поверхности подложки. На подложку нанесен слой плазмон-резонансных частиц. Над слоем частиц размещен слой оптически прозрачного диэлектрика толщиной до 40 нм, разделяющий зеркало и слой частиц. Слой частиц обладает следующими характеристиками: А) периодической матрицей плазмон-резонансных частиц, имеющих покрытие, способное связывать молекулы аналита. Б) однородные размеры и формы частиц в выбранном диапазоне размеров 50-200 нм. В) регулярное периодическое расстояние между частицами, меньшее длины волны лазерного пучка возбуждения. Форма частиц может быть варьируема: сфероиды, стержни, цилиндры, нанопроволоки, трубки, тороиды или другие формы, которые, в случае однородности, могут располагаться с регулярной периодичностью. Данное устройство способно обнаруживать аналит с коэффициентом усиления считываемого сигнала комбинационного рассеяния до 10-10. Подложка данного изобретения выполнена на основе серебра, золота или алюминия и имеет толщину слоя 30-500 нм. Нанесенные частицы имеют размер в пределах 50-150 нм и могут быть сформированы из серебра, золота или алюминия целиком или в виде частиц, имеющих оболочку, сформированную из этих металлов.
10
12
12
Изобретение включает в себя способ обнаружения химических групп в аналите с коэффициентом усиления 10-10. При осуществлении способа на практике, молекулы аналита связываются с плазмон-резонансными частицами в слое частиц оптического датчика вышеописанного типа, чувствительная поверхность облучается лазерным пучком в видимом или ближнем инфракрасном диапазоне, и спектр комбинационного рассеяния, обусловленный облучением, регистрируется. Способ может быть полезен для обеспечения коэффициента усиления, по меньшей мере, 10, и, таким образом, позволяет обнаруживать химические группы в одной или малом количестве молекул аналита. Способ позволяет анализировать спектр комбинационного рассеяния при мощности облучающего пучка 1-100 мкВт.
10
12
Несовершенство данного изобретения заключается в технологической сложности изготовления подобного сенсора, что также обуславливает его высокую стоимость. Другим недостатком сенсора является низкая повторяемость сигнала гигантского комбинационного рассеяния, обусловленная высокими порядками усиления комбинационного рассеяния света 10-10, которое зависит от расположения зон усиления электромагнитного поля («горячих зон») для частиц несферических форм, используемых в данном решении. Третьим недостатком является низкий диапазон мощности облучающего пучка, поскольку для детекции рамановского рассеяния от слаборассеивающих веществ (как например элементы крови человека), при использовании мощностей такого порядка, необходим детектор исследовательского класса на основе CCD-матрицы. Это ограничивает применение данного изобретения как в лабораторной диагностике для слаборассеивающих веществ, так и в портативных решениях и полевых условиях.
3
Задачей заявляемого изобретения является создание эффективной биосовместимой конструкции для регистрации сигнала усиленного комбинационного рассеяния (до порядков 10) электромагнитным полем плазмонов, генерируемых под действием когерентного лазерного излучения на его поверхности, конструкции позволяющей усиливать сигнал комбинационного рассеяния от слаборассеивающих сред - тромбоцитов человека.
Поставленная задача решается тем, что оптический сенсор с плазмонной структурой для получения разрешенного сигнала тромбоцитов человека является наноструктурированной титановой поверхностью, содержащей слой наночастиц, согласно изобретению, включает в наноструктурированную титановую пластину, на поверхности которого находится слой наночастиц золота размером 20-80 нм.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения оптического сенсора с плазмонной структурой для получения разрешенных спектров тромбоцита человека, создают наноструктурированную плазмонную структуру, содержащую слой наночастиц, согласно изобретению, на слой представляющий из себя титановую поверхность с периодической структурой, размером 1 на 1 см, на которую наносят, а затем термически высушивают при температуре 60-100°С в течение 30 минут гидрозоль наночастиц золота размером 20-80 нм в количестве 2 мл.
Созданный заявляемым способом оптический сенсор с плазмонной структурой позволяет получать повторяемый сигнал усиленного комбинационного рассеяния света от аналита, произведя, таким образом, его детекцию и последующее определение химического состава.
Заявленный способ основан на создании структуры с использованием эффекта поверхностного плазмонного резонанса и последующей чувствительной детекции аналита, которое начинается с математического моделирования такой поверхности FDTD методом, при котором проводилось моделирование программной среде Lumerical, необходимое для расчетов электромагнитных возмущений вблизи такой поверхности. Для этого выбиралась титановая планарная поверхность, на которую, на равном расстоянии были нанесены золотые частицы размером 20-80 нм. После чего, в рабочей области проводилось облучение поверхности р-поляризованной электромагнитной волной при стандартных условиях и рассчитывалось эффективное усиление электромагнитного поля в «горячих точках». Методом моделирования был установлен максимум плазмонного поглощения титана и золотых частиц, оптимальные размеры сферических золотых наночастиц, которые находились в максимуме 40-80 нм (Фиг. 1).
На Фиг 1. показано пространственное распределение напряженности электромагнитного поля для титановой поверхности с нанесенными наночастицами золота (Б) размером 1000 на 1000 нм.
2
Анодированные титановые поверхности были созданы с использованием пластин титана толщиной 0,1 мм, для которых проводилось анодирование на установке, включающей в себя источник постоянного тока и гальваническую ванну, в которую погружались титановые электроды, принципиальная схема которого изображена на Рисунке 2. В качестве электролита был использован водный раствор KOH (5%). Анодирование проводили при различных режимах плотности тока j=1; 2; 4; 7 mA/cm и различном времени анодирования. Поверхность титана после анодирования принимала желтый, темно-синий, синий и голубой цвета в результате формирования оксидной пленки нанометровой толщины. На данные поверхности далее были нанесены наночастицы. На Фиг. 2. показана схема процесса анодирования титановой пластины
Абляционные наночастицы золота, диаметром до 100 нм были синтезированы методом фемтосекундной лазерной абляции золотой пластины в дистиллированной воде на установке ТЕТА-Х, (AVESTA, Россия) (длительность импульсов 280 фс, частота 25 кГц) при различной энергии лазерного излучения. Для получения наночастиц с размером 20-100 нм энергия лазера варьировалась в диапазоне Е=10-25 мкДж. Объем воды в кювете с мишенью составлял 1,2 мл, толщина слоя растворителя над золотой поверхностью - 1 мм.
-1
-1
-1
Время абляции составляло 4 минуты. Кювета с образцом помещалась на вращающуюся систему позиционирования, таким образом, чтобы в процессе абляции лазерный пучок фокусировался в новом месте пластины. Наночастицы, полученные в кювете, в результате абляции, впоследствии помещались в колбу, а процедура синтеза повторялась, пока объем полученных частиц не составлял 5 мл. Таким образом, была отработана методика получения наночастиц различного радиуса в зависимости от энергии фемтосекундного лазера. Осаждение абляционных наночастиц золота на титановые шероховатые поверхности проводили следующим образом: титановая подложка погружалась в раствор наночастиц золота, далее выпариванием водного коллоидного раствора золота при температуре 60°С в течении 40 минут происходило осаждение наночастиц на поверхность. Затем были подготовлены тромбоциты человека, путем сбора свежей венозной крови у здоровых добровольцев и пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями в вакуумную пробирку, содержащей ЭДТА (пробирки K2EDTA BD Vacutainer), и центрифугированием при 60 g в течение 15 минут, чтобы отделить богатую тромбоцитами плазму. Затем плазму отделяли от остальных фракций и повторно центрифугировали на скорости 1500g в течение 15 минут, после чего повторно отделяли супернатант. Для опытов использовали центрифугу Eppendorf 5702R с охлаждением. После пробоподготовки образцы немедленно передавались для исследований методом SERS-спектроскопии. Для получения разрешенных спектров использовался спектрометр Centaur U HR с решеткой выбранной решеткой монохро-матора 1200 шт/мм, обеспечивающей спектральное разрешение 2,5 см. В процессе реализации выработанной методики съемки образцы тромбоцитов помещались на модифицированные золотом титановые поверхности. Оптимальным объемом образца был выбран объем 5 мкл, после помещения которого на поверхность производилось его высушивание в течение 5 минут при комнатной температуре, после чего образец помещался на держатель микроскопа. Оптимальным источником возбуждения для регистрации спектров тромбоцитов являлся твердотельный лазер DPSS 532 нм. Лазерный луч фокусировался на образце вручную с помощью USB-видеокамеры и механической системы позиционирования. Оптимальный размер лазерного пятна составлял 1×15 мкм при мощности лазера 35 мВт. Оптимальное время регистрации сигнала составляло 70 секунд. Для каждого образца снималось три повтора, после чего спектр арифметически усреднялся. Спектры комбинационного рассеяния регистрировали разрешенный спектр тромбоцитов человека в диапазоне волновых чисел «отпечатка пальца» в диапазоне от 400 см до 1800 см. По результатам детекции и записи сигнала комбинационного рассеяния света, усиленного с помощью заявленного изобретения проводилась последующая идентификация составляющих спектрального состава с помощью спектральных библиотек. Предложенное устройство, посредством индуцирования эффекта плазмонного резонанса и усиления сигнала комбинационного рассеяния аналита вследствие этого, позволило успешно идентифицировать химическую структуру вещества.