Разработка и валидация методики количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс с использованием ВЭЖХ-УФ

Разработка и валидация методики количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс с использованием ВЭЖХ-УФ

Грибакина О.Г., Шевченко Р.В., Колыванов Г.Б., Литвин А.А.,

Бочков П.О., Бойко С.С., Жердев В.П.

ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Резюме. Разработана методика количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс. Анализ проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Методика линейна в диапазоне 100-5000 нг/мл. Процент извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови составил 86,88 %. Нижний предел обнаружения составил 100 нг/мл.

Ключевые слова: ГИЖ-298; количественное определение; высокоэффективная жидкостная хроматография; плазма крови

Для цитирования:

Грибакина О.Г., Шевченко Р.В., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., Бочков П.О., Бойко С.С., Жердев В.П. Разработка и валидация методики количественного определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс с использованием ВЭЖХ-УФ // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2019. - № 2. -С.41-45. DOI: 10.24411/2587-7836-2019-10046.

Development and validation of the quantification of GIZH-298, possessing in the rat blood plasma by HPLC-UF

Gribakina OG, Shevchenko RV, Kolyvanov GB, Litvin AA, Bochkov PO, Boyko SS, Zherdev VP FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow

Resume. The technique of quantitative determination of a new compound GIZH-298 in the rat blood plasma was developed and validated. Analysis was performed by HPLC-UV. The method was linear in the range of 100-5000 ng/ml. Recovery of GIZH-298 was 86,88 %. Limit of detection was 100 ng/ml. Keywords: GIZH-298; rat blood plasma; HPLC-UV; quantification

For citations:

Gribakina OG, Shevchenko RV, Kolyvanov GB, Litvin AA, Bochkov PO, Boyko SS, Zherdev VP. Development and validation of the quantification of GIZH-298, possessing in the rat blood plasma by HPLC-UF. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2019;2:41-45. (In Russ). DOI: 10.24411/2588-0519-2019-10046.

Введение

Эпилепсия является одним из самых распространённых неврологических заболеваний, по данным ВОЗ, заболеваемость которой в разных странах варьирует от 4 до 10 случаев на 1 000 человек [1]. До настоящего времени в России нет отечественных эффективных противоэпилептических препаратов (ПЭП), почти все препараты этой группы производятся за рубежом и имеют высокую стоимость. В связи с этим поиск новых высокоэффективных и малотоксичных отечественных ПЭП является актуальной задачей [2].

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» синтезировано новое производное оксима 4-бензоилпиридина — ГИЖ-298 (оксалат О-(2-мор-фолиноэтил)оксим 4-бензоилпиридина). Это соединение обладает противосудорожной активностью, устраняя первично-генерализованные судороги в тестах антагонизма с максимальным электрошоком и коразолом у грызунов в дозах 0,5—100 мг/кг внутрибрюшинно. ЛД50 после внутрибрюшинного введения для соединения ГИЖ-298 составляет 316 мг/кг (мыши). Таким образом, ГИЖ-298 имеет большую терапевтическую широту [3].

Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики количественного опреде-

ления ГИЖ-298 в плазме крови крыс для последующего изучения его экспериментальной фармакокинетики.

Материалы и методы

Структурная фомула фармацевтической субстанции ГИЖ-298 (оксалат О-(2-морфолиноэтил)оксима 4-бензоилпиридина) представлена на рис. 1.

Рис. 1. Структурная формула ГИЖ-298

Производитель: ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва. Серия — 10.10.18. Использованы следующие растворители и реактивы: вода ультрачистая «LiChrosolv», «Merck», ФРГ; аммония ацетат «Merck», ФРГ; кислота муравьиная 85 % «Acros Organics», РФ; метанол «LiChrosolv», «Merck», ФРГ; эфир диэтиловый ОАО «МедХимпром», РФ.

Исследование выполнено на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Beckman Coulter» (США). Помпа — «Beckman System Gold 127 Solvent Module» и ультрафиолетового детектора — «Beckman Gold 166». Детектирование соединения проводили при длине волны 258 нм.

Условия хроматографического анализа ГИЖ-298 представлены в табл. 1.

Таблица 1

Условия хроматографического анализа ГИЖ-298 в плазме крови

Параметр Значение

Колонка Phenomenex Luna 5U С8, 250 4,6мм, 5мкм

Температура 25 °С

Режим элюирования Изократический

Состав подвижной фазы Ацетатный буфер

Скорость потока 1,0 мл/мин

Длина волны 258 нм

Тип детектирования Ультрафиолетовый детектор

Объём, вводимой пробы 200 мкл

Время удерживания ГИЖ-298 7,8—8,3 мин

Время анализа 10 мин

В настоящей методике матрицей для приготовления калибровочных стандартов служила плазма крови крыс с массой тела 180-220 г, полученных из питомника Филиал «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская обл. Образцы крови получали методом декапитации интактных животных. Плазму крови получали центрифугированием образцов цельной крови при 3 500 об/мин в течение 10 мин. Образцы плазмы крови крыс хранили при температуре —50 °C.

Пробоподготовка. Для пробоподготовки образцов для анализа использовали метод жидкость-жидкостной экстракции. Образцы плазмы крови, хранящиеся в морозильной камере, размораживали при комнатной температуре. К образцам плазмы крови объёмом 0,5 мл с целевыми концентрациями добавляли 0,1 мл 2 М раствора КОН и перемешивали на механическом вихревом встряхивателе «Vbrtex». К полученному раствору добавляли 10 мл эфира диэтилового и помещали на

горизонтальный встряхиватель на 20 мин. После чего смесь замораживали при —50 °С в течение 15 мин, отделяли органический слой и упаривали в токе азота при 40 °С на водяной бане. Перед началом анализа сухой остаток растворяли в 0,5 мл подвижной фазы.

Приготовление сток-раствора (матричногораствора). Матричный раствор ГИЖ-298 (100 мкг/мл) готовили растворением в метаноле точной навески (0,0100 г) ГИЖ-298 в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Приготовление калибровочных стандартов. Использовали калибровочные стандарты ГИЖ-298 с концентрациями 100, 250, 500, 750, 1 000, 2 500 и 5 000 нг/мл.

Калибровочные стандарты для валидации были приготовлены путём последовательного разбавления матричного раствора водой дистиллированной. Диапазон концентраций ГИЖ-298 выбирался исходя из концентраций, ожидаемых в исследовании экспериментальной фармакокинетики.

Концентрации ГИЖ-298 в анализируемых пробах определяли методом абсолютной калибровки.

Результаты и обсуждения

Валидацию методики проводили в соответствии с «Руководством по валидации аналитических методик для производителей лекарств» [4]. В приведённых выше условиях время удерживания ГИЖ-298 в среднем составило около 8,0 мин (рис. 2б).

Селективность. Для определения селективности были протестированы 6 образцов биологической матрицы (плазма крови) на возможность создания помех потенциально мешающими веществами (эндогенные компоненты плазмы крови, метаболиты, продукты деструкции и др.).

На рис. 2 представлены типичные хроматограммы интактной плазмы крови крыс (а) и экстракта плазмы крови, содержащего 100 нг/мл ГИЖ-298 (б). Из рис. 2 видно, что потенциально мешающие вещества не оказывают влияния на анализ ГИЖ-298.

Рис. 2а. Хроматограмма интактной плазмы крови

МММСШИ1

Рис. 2б. Хроматограмма плазмы крови, содержащей 100 нг/мл ГИЖ-298

Линейность и чувствительность. Калибровочная кривая построена с использованием 7 калибровочных стандартов, охватывающих ожидаемый диапазон концентраций ГИЖ-298 в плазме крови крыс (100— 5 000 нг/мл).

Самый низкий стандарт на калибровочной кривой соединения ГИЖ-298, равный 100 нг/мл, был принят в качестве предела количественного определения, т. к. были выполнены следующие условия:

• Показания стандарта на нижнем пределе количественного определения (НПКО) были не менее чем в 5 раз выше показаний пробы интактной плазмы крови. Значение стандарта на уровне НПКО поддавались определению и были дискретными и воспроизводимыми с точностью 14,76 % (не превышающей 20 %), и воспроизводимостью 99,16 % (входящей в диапазон 80—120 %).

• Предел обнаружения ГИЖ-298 был равен 100 нг/мл.

• Зависимость величины хроматографического пика от концентрации ГИЖ-298 калибровочных стандартов в области измерения методики была линейной в рассматриваемом диапазоне концентраций.

Для описания изучаемой зависимости использовалась линейная аппроксимация типа y = a + b х х. Данная зависимость признана приемлемой, поскольку коэффициент корреляции для всех 3 калибровок был выше 0,99.

Параметры калибровочных кривых (коэффициенты уравнения и коэффициенты корреляции) представлены в табл. 2.

Для оценки прецизионности результатов построены 3 калибровочные кривые и проведён обратный расчёт концентраций используемых стандартов по всем кривым и определены статистические характеристики.

Прецизионность результатов с учётом критериев приемлемости достигается во всем используемом интервале концентраций (табл. 3).

Критерии приемлемости по калибровочным стандартам:

Таблица 2

Параметры калибровочных кривых ГИЖ-298 в плазме крови

крыс

Калибровочная кривая Участок, отсекаемый от оси абсцисс

1 -1,240312 0,12401 0,9975

2 -1,64862 0,12066 0,9999

3 -3,32199 0,11881 0,9931

1. Отклонения нижнего стандарта кривой от теоретической концентрации не более 20 %;

2. Отклонения всех остальных стандартов не более 15 %;

3. Не менее 75 % ненулевых стандартов, включая нижний и верхний калибровочный стандарт должны удовлетворять вышеуказанным требованиям; все значения, которые не попадают в эти пределы, можно не учитывать, при условии, что они не изменяют установленную линейную модель.

Как видно из данных табл. 3 отклонения нижнего стандарта кривой от теоретической концентрации составило 0,84 %, т. е. менее 20 %. Отклонения всех остальных стандартов были менее 15 %, что также удовлетворяет критериям приемлемости.

Таблица 3

Концентрации стандартов ГИЖ-298, рассчитанные по уравнениям калибровочных кривых

№/№ калибро- вочной кривой Стд. A 100 Стд. B 250 Стд. C 500 Стд. D 750 Стд. E 1000 Стд. F 2500 Стд. H 5000

1 85,57 225,83 488,67 747,00 854,90 2488,91 5111,16

2 97,25 226,50 528,75 778,16 995,91 2486,08 5032,08

3 114,66 284,16 589,08 813,33 932,33 2044,50 5151,58

X 99,16 245,50 535,5 779,50 927,71 2339,83 5098,27

SD 14,64 33,49 50,54 33,19 70,62 255,77 60,78

CV % 14,76 13,64 9,41 4,26 7,61 10,93 1,19

% от теоретического 0,84 1,8 7,1 3,93 7,23 6,40 1,96

Правильность и воспроизводимость внутри одной аналитической серии

Правильность и воспроизводимость внутри одной аналитической серии оценивались по результатам параллельных анализов образцов контроля качества (КК) с концентрациями ГИЖ-298: 100, 250, 1 000 и 2 500 нг/мл. Каждый образец КК определялся в 6 повторностях. Расчёт концентраций образцов КК проводился по калибровочной кривой, полученной в составе той же аналитической серии. Данные по правильности и достоверности определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс внутри одной серии представлены в табл. 4 и удовлетворяли следующим критериям

«ММЮИШШ

Таблица 4

Правильность и воспроизводимость определения соединения ГИЖ-298 в плазме крови крыс внутри одного аналитического

цикла

№/№ калибровочной кривой КК А

102,00 244,58 956,50 2215,42

112,50 253,25 938,58 2148,75

2 59,50 278,33 891,57 2531,50

105,83 249,66 799,50 2513,75

104,5 176,91 842,25 2246,42

103,75 198,33 803,00 2372,83

X 98,01 233,51 871,90 2338,11

SD 19,21 38,01 67,61 160,48

CV% 19,60 14,93 7,75 6,86

% от теоретического 1,99 6,59 12,81 6,47

приемлемости: воспроизводимость — среднее значение концентрации образца КК не должно превышать 15 % от теоретической величины, за исключением значения на уровне нижнего количественного предела, где допускается отклонение не выше 20 %; правильность — C.V. % значений концентраций каждого образца КК не должен превышать 15 %, за исключением значений НПКО, где этот параметр не должен быть выше 20 % [4].

Степень извлечения

Степень извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови определялась путём сравнения площадей хроматографических пиков образцов КК (принимались за 100 %) с площадями пиков тех же проб, которые подвергались процедуре пробоподготовки. Измерения каждого уровня концентрации стандартов (низкий — 100, средний — 1 000 и высокий — 5 000 нг/мл) проводили в трёх повторениях. Установлено, что процент извлечения ГИЖ-298 из плазмы крови составил 86,88 %.

Стабильность препарата после пробоподготовки

Для оценки стабильности ГИЖ-298 в плазме крови использовались образцы ГИЖ-298 250 и 1 000 нг/мл, которые хранились при комнатной температуре и дневном свете после пробоподготовки в течение 8 ч. Далее проводили анализ образцов вместе со свежеприготов-

Таблица 5

Краткосрочная стабильность ГИЖ-298 после пробоподготовки и хранения при комнатной температуре в течение 8 ч

Калибровочная Образцы после пробоподготовки Свежеприготовленные образцы

кривая 250 нг/мл 1000 нг/мл 250 нг/мл 1000 нг/мл

259,25 942,42 228,33 986,58

226,33 1068,83 242,25 951,91

2 244,08 956,66 272,83 965,83

255,25 964,83 235,83 976,42

260,58 967,58 254,00 969,17

243,83 929,83 241,83 952,33

X 248,22 971,69 245,85 967,04

SD 12,96 49,67 15,69 13,57

CV% 5,22 5,11 6,38 1,40

Разница, % 0,95 0,47

ленными образцами в составе одной аналитической серии. Рассчитанные концентрации ГИЖ-298 после хранения при комнатной температуре сравнивали со средними значениями концентраций препарата в свежеприготовленных образцах КК. Полученные значения должны были удовлетворять критерию приемлемости, т. е. разница между результатами анализа до и после хранения не должна превышать 15 %.

Из данных табл. 5 следует, что концентрации ГИЖ-298 после хранения при комнатной температуре в течение 8 ч удовлетворяют критерию приемлемости.

Заключение

Проведена валидация аналитической методики количественного определения ГИЖ-298 в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. Нижний предел количественного определения ГИЖ-298 составил 100 нг/мл. Точность и прецизионность результатов анализа с учётом критериев приемлемости соблюдались во всем интервале исследуемых концентраций (100—5 000 нг/мл). При комнатной температуре пробы стабильны после пробоподготовки на протяжении 8 ч. Образцы плазмы крови можно разводить в два раза.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Грибакина Оксана Геннадьевна

ORCID ID: 0000-0002-4604-4346 SPIN код: 6266-8161

к. б. н., н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Gribakina Oxana

ORCID ID: 0000-0002-4604-4346 SPIN code: 6266-8161

Candidate of Biological Sciences, Research Officer of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow

Шевченко Роман Владимирович

ORCID ID: 0000-0003-4646-7733 SPIN код: 1844-6202

к. м. н., н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Колыванов Геннадий Борисович

ORCID ID: 0000-0002-2571-0047 SPIN код: 2538-8639

д. б. н., в. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Литвин Александр Алексеевич

ORCID ID: 0000-0002-2818-3457 SPIN код:6193-5770

д. б. н., в. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Бочков Павел Олегович

ORCID ID: 0000-0001-8555-5969 SPIN код: 5576-8174

к. б. н., с. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Бойко Светлана Семёновна

ORCID ID: 0000-0003-2177-2010 SPIN код: 4176-8921

к. б. н., с. н. с. лаборатории фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Жердев Вдадимир Павлович Автор, ответственный за переписку

e-mail: zherdevpharm@mail.ru ORCID ID: 0000-0003-2710-7134 SPIN код: 2213-9592

д. м. н., профессор, заведующий лабораторией фармакокинетики ФГБНУ «Научноисследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва

Shevchenko Roman

ORCID ID: 0000-0003-4646-7733 SPIN code: 1844-6202

Candidate of Medical Sciences, Research Officer of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow

Kolyvanov Gennadiy

ORCID ID: 0000-0002-2571-0047 SPIN code: 2538-8639

Doctor of Biological sciences, Leading researcher of the laboratory of pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow

Litvin Alexander

ORCID ID: 0000-0002-2818-3457 SPIN code: 6193-5770

Doctor of Biological sciences, leading researcher of the laboratory of pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow

Bochkov Pavel

ORCID ID: 0000-0001-8555-5969 SPIN code: 5576-8174

Candidate of Biological Sciences, Senior Research Officer of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow

Boyko Svetlana

ORCID ID: 0000-0003-2177-2010 SPIN code: 4176-8921

Candidate of Biological Sciences, Senior Research Officer of laboratorypharmacokinetics FSBI «Zakusov institute ofPharmacology», Moscow

Zherdev Vladimir Corresponding author

e-mail: zherdevpharm@mail.ru ORCID ID: 0000-0003-2710-7134 SPIN code: 2213-9592

MD, professor, Head of laboratory pharmacokinetics FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow

Литература / References 1 2

1. Who.int [internet]. World Health Organization. Режим доступа: http:// www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/.

2. Гайдуков Игорь Олегович. Поиск веществ с противосудорожной активностью среди производных оксимов 3- и 4-бензоилпиридина: автореферат дисс. канд. биол. наук: 14.03.06/ Гайдуков Игорь Олегович. — М.: 2018. — 23 с. [Gajdukov IO. The search for compounds with the anticonvulsant activity of derivatives of oximes 3- and 4-benzoylpyridine. Autoabstract diss. candidate of biological sciences: 14.03.06/ Gajdukov Igor Olegovich. Moscow: 2018. (In Russ).].

3. Жмуренко Л.А, Мокров Г.В., Неробкова Н.Л., и др. Новое производное оксимов 4-бензоилпиридинов ГИЖ-298, обладающее противосудорожной активность // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2017. - № 1. - С. 22-26. [Zhmurenko LA, Mokrov GV, Nerobkova NL, et al. Novel 4- benzoylpyridine oxime derivative GIZH-298 with aticonvuisant activity. Farmakokinetika i Farmakodinamika. 2017;1:22-26. (In Russ).].

4. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств / под ред. В.В. Береговых - М.: Литтерра, 2008. - 132 с. [Validaciya analiticheskih metodik dlya proizvoditelej lekarstv. Ed. By VV Beregovyh. Moscow: Litterra. 2008. (In Russ).].