СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ UGT1A1*6/*28 В ПРОМОТЕРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА UGT1A1
METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY POLYMORPHISM UGT1A1*6/*28 IN PROMOTER REGION OF UGT1A1 GENE

Предложенный способ относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетике, и может быть использован для определения генотипа человека по полиморфизму UGT1A1*6/*28 в промотерной области гена UGT1A1 с отнесением исследуемого образца к гетерозиготе или гомозиготе по диагностируемому аллельному варианту (генотипы 6ТА/6ТА, 6ТА/7ТА7, 7ТА/7ТА).
Фармакогенетическое тестирование с целью прогноза развития токсических и побочных эффектов при проведении лекарственного лечения является одним из активно развивающихся направлений в ДНК-тестировании и постепенно занимает свое место во многих клинических рекомендациях по лечению злокачественных новообразований. Разработка и внедрение способа тестирования полиморфного варианта в гене UGT1A1, одобренного FDA (Food and Drug Administration) и включенного в рекомендации ESMO (European Society of Clinical Oncology) для прогнозирования токсичности химиотерапии при лечении ряда злокачественных новообразований, является одним из приоритетных направлений в фармакогенетическом тестировании.
Ген UGT1A1 кодирует фермент уридиндифосфатглкуронозил трансферазу I и ответственен за развитие синдрома Жильбера (OMIM 143500). Своевременная диагностика данного состояния, основанная на определение числа тандемных повторов в промотерной области гена UGT1A1, необходима для профилактики преходящей гипербилирубинемии и осложнений, ассоциированных с приемом ряда лекарственных препаратов.
Широко распространен способ определения генотипа человека по полиморфизму UGT1A1*6/*28 в промотерной области гена UGT1A1, основанный на применении специфичных праймеров с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью электрофореза в полиакриламидных гелях (http://www.tapotili.ru/topotili-kits.html).
Недостатки: недостаточная чувствительность, трудоемкость, потребность подтверждения секвенированием по Сэнгеру.
Другим известным способом является определение первичной последовательности промотерной области гена UGT1A1 методом секвенирования по Сэнгеру (UGT1A1 sequence variants associated with risk of adult hyperbilirubinemia: A quantitative analysis / Chen Zh., Su D., Ai L. Et al. // Gene. - V. 552. - 2014. - P. 32-38).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования.
Известен способ генотипирования вариантов аллелей *28 и *6 гена человека UGT1A1 с помощью метода пиросеквенирования (UGT1A1 Pyro, Qiagen, Германия).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.
Известен способ UGT1A1-тестирования, основанный на ПЦР с использованием аллель-специфичных зондов (UGT1A1 Genotyping Kit, EntroGen, США).
Недостатки: высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.
Известен способ определения индивидуальной чувствительности к иринотекану с помощью генотипирования аллельных вариантов гена UGT1A1 методом гибридизации на биологическом микрочипе (INFINITI UGT1A1, Autogenomics Inc, США).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.
Известен способ определения полиморфизмов в промотерной области гена UGT1A1 при синдроме Жильбера, основанный на проведении ПЦР в режиме реального времени и детекции результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM) (Minucci, A. Rapid UGT1A1 (TA)(n) genotyping by high resolution melting curve analysis for Gilbert's syndrome diagnosis / Minucci A., Concolino P., Giardina B. et al. // Clin. Chim. Acta. - 2010. - V. 411. - P. 246-249). Данный способ взят нами за прототип.
Недостатки: возможность применения только в европейской популяции.
Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по полиморфизму UGT1A1*6/*28  в промотерной области гена UGT1A1, ответственного за развитие токсических побочных эффектов при назначении ряда химиотерапевтических препаратов, а также ассоциированного с развитием синдрома Жильбера, который позволяет диагностировать полиморфизм UGT1A1*6/*28 в генотипе человека независимо от национальной (популяционной) принадлежности.
Задача решается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов к фрагменту промотерной области гена UGT1A1 с искомым полиморфным вариантом и оптимизации ПЦР с помощью адаптированного оригинального буфера для Taq-полимеразы.
Техническим результатом заявляемого изобретения является то, что оно позволяет диагностировать полиморфизм UGT1A1*6/*28 в генотипе человека независимо от национальной (популяционной) принадлежности, а также широкая доступность и высокая чувствительность при низкой стоимости исследования. Реакционные смеси включают специфичные оригинальные последовательности олигонуклеотидов, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей.
Технический результат достигается путем подбора специфичных оригинальных олигонуклеотидных последовательностей, оптимизации условий проведения ПЦР с использованием оригинального состава буфера для Taq-полимеразы, отработки технических условий для проведения HRM-анализа.
Последовательность специфичных оригинальных олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательностей олигонуклеотидов.
Копия перечня последовательностей олигонуклеотидов, представленная на машиночитаемом носителе, идентична перечню последовательностей олигонуклеотидов в печатной форме.
Используются последовательности специфичных оригинальных олигонуклеотидов:
SEQ ID NO 1; SEQ ID NO 2.
Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: дизайн олинуклеотидов, строго комплементарных целевой последовательности ДНК, в которой не встречаются какие-либо полиморфные варианты с частотой минорного аллеля выше 0,01% (MAF <0.01).
4
2
4
Состав буфера для Taq-полимеразы: Трис-HCl 67 mM, (NH)SO166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7;
- Режим проведения ПЦР:
0
1 этап: денатурация при t=95С в течение 5 мин
2 этап: 50 циклов ПЦР
0
- денатурация при t=95 С в течение 15 сек
0
- отжиг олигонуклеотидов: при t=58 С в течение 15 сек
0
- элонгация при t=72С в течение 40 сек
0
3 этап: элонгация при t=72 в течение 2 мин.
0
0
4 этап: плавление продуктов ПЦР при t=72 - 95C
0
0
5 этап: охлаждение и хранение при t=95 - 12 C.
0
Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется как во время отжига олинуклеотидов на каждом цикле ПЦР, так и при плавлении продуктов ПЦР с частотой 45 на 1C.
Изобретение иллюстрируется фигурой, на которой представлено графическое изображение образцов ДНК с различными генотипами по аллельному варианту UGT1A1*28/*6.
Изобретение иллюстрируется примерами 1 - 3.
Пример 1.
Ф.И.О.: Пациент Т.
Возраст: 1984 г.р. (33 г.)
Диагноз: Сr. восходящего отдела ободочной кишки.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - определение структуры промотерной области гена UGT1A1 (2q37), кодирующего фермент уридиндифосфатглкуронозил трансферазы I, ассоциированного с развитием синдрома Жильбера (OMIM 143500) и чувствительностью к иринотекану.
Результат: при анализе ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, динуклетидный тандемный повтор в промотерной части гена UGT1A1 представлен гомозиготным генотипом UGT1A1*6/*6: 6ТА/6TA (c.61-6799_61-6798TA  NM_205862.1; rs8175347).
Заключение: Данный генотип является нормой и не ассоциирован с токсичностью при использовании таких лекарственных препаратов, как иринотекан, рифампицин, толбутамид и парацетамол.
Пример 2.
Ф.И.О.: Пациент П.
Возраст: 1950 г.р. (68 л.)
Диагноз: Cr. правого легкого.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - определение структуры промотерной области гена UGT1A1 (2q37), кодирующего фермент уридиндифосфатглкуронозил трансферазы I, ассоциированного с развитием синдрома Жильбера (OMIM 143500) и чувствительностью к иринотекану.
Результат: при анализе ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, динуклетидный тандемный повтор в промотерной части гена UGT1A1 представлен гетерозиготным генотипом UGT1A1*6/*28: 6ТА/7TA (c.61-6799_61-6798TA  NM_205862.1; rs8175347).
Заключение: Гетерозиготный полиморфизм *28 6ТА/7ТА в гене уридиндифосфат-глюкоронозилтрансферазы предполагают повышенную частоту побочных эффектов (гематотоксичность и гепатотоксичность) при использовании иринотекана в моно- и комбинированной c препаратами платины ПХТ. От применения средних доз выраженность гематологических токсических эффектов незначительная, от высоких доз - выраженная. Имеются данные, что при гетерозиготном генотипе в меньшей степени, чем при гомозиготном, у индивидов может наблюдаться нарушение метаболизма таких лекарственных веществ, как парацетамол, рифампицин и толбутамид.
Рекомендуется:
1) динамическое наблюдение:
- биохимический анализ крови (определение общего и непрямого билирубина в плазме);
- определение активности ферментов (АЛТ, АСТ), щелочной фосфатазы;
- определение альбуминовой фракции;
2) для профилактики нежелательных лекарственные реакций  - индивидуальный подбор дозы лекарственных препаратов.
Пример 3.
Ф.И.О.: Пациентка Т.
Возраст: 1987 г.р. (31 г.)
Диагноз: Первично-множественные злокачественные новообразования: Cr. нисходящего отдела ободочной кишки. Состояние после хирургического лечения в 2015 г. Cr. прямой кишки, mts в яичник. Состояние в процессе комбинированного лечения.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - определение структуры промотерной области гена UGT1A1 (2q37), кодирующего фермент уридиндифосфатглкуронозил трансферазы I, ассоциированного с развитием синдрома Жильбера (OMIM 143500) и чувствительностью к иринотекану.
Результат: при анализе ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, динуклетидный тандемный повтор в промотерной части гена UGT1A1 представлен гомозиготным генотипом UGT1A1*28/*28: 7ТА/7TA (c.61-6799_61-6798TA NM_205862.1; rs8175347).
Заключение: Генотип UGT1A1*28 7ТА/7TA, ассоциирован с наличием у пациентки синдрома Жильбера (OMIM 143500) - наследственной негемолитической неконьюгированной доброкачественной гипербилирубинемией с аутосомно-рецессивным типом наследования, характеризующийся увеличением общего билирубина в плазме крови за счет непрямой фракции до 20-50 (в некоторых случаях до 100) мкмоль/л на фоне стрессовых ситуаций, инфекционных заболеваний и физической нагрузки.
Гомозиготный полиморфизм *28 7ТА/7ТА в гене уридиндифосфат-глюкоронозилтрансферазы предполагает повышенную частоту побочных эффектов (гематотоксичность и гепатотоксичность) при использовании иринотекана в монорежиме и в комбинации c препаратами платины. У пациентов - носителей гомозиготного генотипа может наблюдаться нарушение метаболизма таких лекарственных веществ, как парацетамол, рифампицин и толбутамид.
Рекомендуется:
1) динамическое наблюдение:
- биохимический анализ крови (определение общего и непрямого билирубина в плазме);
- определение активности ферментов (АЛТ, АСТ), щелочной фосфатазы;
- определение альбуминовой фракции;
2) для профилактики НЛР - индивидуальный подбор дозы лекарственных препаратов.
Перечень последовательностей олигонуклеотидов
<110> FSBI “N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology” of the Ministry of Health of the Russian Federation.
<120> Cпособ определения генотипа человека по полиморфизму UGT1A1*6/*28 в промотерной области гена UGT1A1.
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS2
<210> SEQ ID NO 1
<211> LENGTH: 23
<212> TYPE: PCR-primer
<213> ORGANISM: Human
<400> SEQUENCE: 1
GAC ACA GTC AAA CAT TAA CTT GG 23
<210> SEQ ID NO: 2
<211> LENGTH: 19
<212> TYPE: PCR-primer
<213> ORGANISM: Human
<400> SEQUENCE: 2
AGA GGT TCG CCC TCT CCT A 19