Способ получения флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума для выявления возбудителей риккетсиозов и коксиеллезов, флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум и его применение
METHOD FOR PRODUCING A FLUORESCENT IMMUNOGLOBULIN DIAGNOSTIC AGENT FOR DETECTING PATHOGENS OF RICKETTSIOSES AND COXIELLOSES, FLUORESCENT IMMUNOGLOBULIN DIAGNOSTIC AGENT AND APPLICATION THEREOF

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и медицинской микробиологии и касается способа получения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi, или C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы для обнаружения и идентификации возбудителей эпидемического вшивого сыпного тифа или крысиного сыпного тифа, или коксиеллеза в материалах различного биологического и небиологического происхождения.
Предшествующий уровень техники
Этиологическими агентами эпидемического или вшивого сыпной тифа и болезни Брилля-Цинссера являются R.prowazekii, возбудителем крысиного эндемического блошиного сыпного тифа - R.typhi, а возбудителем коксиеллеза - C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы.
Первоначально эти возбудители были классифицированы на основании морфобиологических и иммунологических признаков как представители Rickettsiaceae, порядок Rickettsiales, род Rickettsia.
AL
Dumler S., Walker D.H., Class I. Order II. Rickettsiales Gieszczykiewicz, 1939, 25 emend.
,
nd
Dumler, Barbet, Bekker, Dasch, Palmer, Ray. Rikihisa and Rurangirwa. 2001, 2156. Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology, 2 ed.,Vol 2. The Proteobacteria. Pt C:The alfa-, beta-, delta-, and epsilonproteobacteria, eds Brenner D.J., Krieg N.R., Stanley J.T., Garrity G.M. New York, Springer, 2005, P.96.
Позднее, на основании фенотипических характеристик при проведении анализа гена 16S рибосомальной PHK классификация риккетсий была пересмотрена. В результате проведенного анализа возбудитель С.burnetii был перемещен из семейства Rickettsiaceae в семейство Coxillaceae, порядок Legionellales, класс Gammaproteobacteria, филы Proteobacteria, род Coxiella. Однако, изучением коксиеллеза, по-прежнему, занимаются риккетсиологи.
Thompson C.C. et al. Microbial genomic taxonomy. BMC Genomics, 2013, 14, Р.913.
Все три возбудителя относятся ко II группе патогенности в соответствии с Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28 ноября 2013 г. N 64 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)».
R.prowazekii и R.typhi по морфологическим, биологическим, генетическим, антигенным и иммунологическим свойствам близки между собой. Такого рода близость возбудителей нашла отражение и в сходстве клинических проявлений болезней, что затрудняет и делает практически невозможной клиническую дифференциацию этих заболеваний без соответствующих эпидемиологических данных и дополнительных методов исследования, таких как: биологические пробы или иммунологические исследования по выявлению возбудителей и их антигенов.
Необходимость дифференциации этих возбудителей важна с эпидемиологической точки зрения, так как противоэпидемические мероприятия при указанных инфекциях коренным образом различаются.
Возбудитель эпидемического сыпного тифа циркулирует в цепи человек-вошь-человек и, следовательно, противоэпидемические мероприятия направлены на выявление и устранение зараженных R.prowazekii вшей и экстренную госпитализацию больных сыпным тифом.
Циркуляция возбудителя при крысином сыпном тифе осуществляется в цепи крыса (мышь) - блоха - крыса (мышь). Исходя из этого, профилактика заключается в дератизации и дезинсекции в помещениях, где обитают зараженные R.typhi крысы и их инфицированные эктопаразиты.
В природных очагах возбудителем коксиеллеза - C.burnetii естественно заражены дикие животные, птицы и паразитирующие на них клещи. Такая полиадаптивность C.burnetii способствует вовлечению в эпидемиологический процесс домашних животных, являющихся одним из основных источников заражения человека. Для диагностики особенно важное значение имеет фазовая изменчивость коксиелл, отличающихся, главным образом, антигенными свойствами. В природных естественных условиях коксиеллы находятся в I-й фазе, а при длительном культивировании в лабораторных условиях в иной среде обитания (куриные эмбрионы, культура клеток) коксиеллы переходят во II-ю фазу.
Самым достоверным методом диагностики эпидемического сыпного тифа, болезни Брилля-Цинссера, блошиного сыпного тифа, коксиеллеза считается обнаружение возбудителя инфекции и его идентификация.
Для этой цели применялись и применяются следующие микробиологические и иммунологические методы: классический метод биологических проб (биопроб) с последующей идентификацией серологическими методами, метод иммунофлуоресценции (МФА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакции связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА).
Выбор серологического метода детекции риккетсий обуславливается такими факторами как специфичность, чувствительность, экспрессность.
Классический метод биопроб.
Точное распознавание возбудителей эпидемического сыпного тифа и крысиного блошиного сыпного тифа и коксиеллеза обеспечивается путем выделения возбудителя от больных людей или животных, или их эктопаразитов с помощью классического метода биопроб с последующей идентификацией возбудителей.
С этой целью у больных, по возможности в раннем периоде инфекции, берут кровь из вены или используют суспензии эктопаразитов и вводят в брюшную полость морским свинкам-самцам в дозе 3-5 мл. Появление у морских свинок лихорадки в сопровождении со скротальной реакцией при наличии заселенных возбудителями клеток в соскобах с влагалищных оболочек яичек указывает на наличие заболевания крысиным сыпным тифом или эпидемическим сыпным тифом, или коксиеллезом. Для уточнения возбудителя выделяют возбудители из органов и тканей животных с последующей идентификацией серологическими методами, используя РА, РСК или МФА.
Метод биопроб относится к высокочувствительным, специфичным и достоверным тестам.
К недостаткам метода следует отнести длительность наблюдения за животными (в среднем 10 дней), вскрытие животных для извлечения биологического материала с последующей идентификацией возбудителя серологическими методами.
В настоящее время метод биопроб не утратил своего диагностического значения и применяется в специализированных лабораториях для идентификации известных и вновь возникающих инфекций риккетсиозной этиологии.
Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. М., Медицина, 1972, С.495.
Методы иммунофлуоресценции.
Метод иммунофлуоресценции (МФА) применяется как для научных целей для получения данных о морфологии, репродукции, антигенной специфичности и внутриклеточном паразитизме риккетсий и коксиелл, так и в лабораторной практике для обнаружения риккетсий и коксиелл в разных субстратах.
МФА обладает высокой чувствительностью, специфичностью, экспресностью и воспроизводимостью. Позволяет проводить прямую идентификацию корпускул риккетсий и коксиелл в микст-материалах: в тканях, клетках и их дериватах, секретах и экскретах и других материалах.
Недостатки МФА связаны с наведенной неспецифической (неспецифическая адсорбция конъюгата) и специфической (наличие в конъюгатах гетерологичных антител или перекрестно-реагирующих антител) флуоресценцией, а также с невозможностью обнаружения растворимых антигенов.
Для обнаружения риккетсий и их антигенов применяют прямой и непрямые варианты МФА.
Прямой метод флуоресцирующих антител.
В основе прямого метода флуоресцирующих антител (пМФА) лежит специфическое взаимодействие меченых антител непосредственно с гомологичным антигеном, фиксированным на предметном стекле.
Препарат флуоресцирующих антител представляет собой высушенную лиофильным методом фракцию иммуноглобулинов гипериммунной сыворотки, к которым химическим путем присоединен флуорохром (например, изотиоцианат флуоресцеина).
Прямая обработка мазков-отпечатков из инфицированных объектов эпидемиологического обследования (переносчики, образцы инфицированной внешней среды), а также живых биологических систем (мазков-отпечатков инфицированных органов и тканей, клеток культуры тканей, куриных эмбрионов) позволяет быстро обнаруживать возбудителя риккетсиозов и коксиеллеза.
Метод специфичен, методически прост, менее трудоемок и наиболее экономичен по сравнению с непрямыми модификациями.
Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск, УрО АН СССР,1988, с. 176.
3
Чувствительность пМФА ниже, чем в непрямой модификации МФА. Выявляемость возбудителя и его корпускулярных антигенов колеблется в пределах 100 - 500×10 - клеток в 1 мл.
Гольдин Р.Б. Иммунолюминесцентный анализ в изучении и диагностике вирусных инфекций и риккетсиозов. Иммунолюминесценция в медицине. 1977, М., Медицина, С. 80-144.).
К недостаткам пМФА относится наведенная неспецифическая флуоресценция гетерологичных структур микст-материала объекта исследования (фона препарата), обусловленная флуоресцирующими антителами. Поэтому для обнаружения риккетсий и коксиелл в материалах различного биологического и небиологического происхождения флуоресцирующие иммуноглобулины необходимо применять в сочетании с контрастирующим реагентом - бычьим альбумином, меченым родамином.
Носков Ф.С., Болдасов В.К., Гольдин Р.Б., Ермаков Н.В., Волкова Л.А. и др. Контрастный способ иммунофлуоресцентного выявления аденовирусов в культуре клеток почки морской свинки. Вопр. вирусол., 1965, №5, С. 613-618.
Smith C., Marshall G., Eveland W. Use of contrasting fluorescent dyed as counterstrain in fixed tissue preparation. Proc.Soc.Exp.Biol. Med., 1958, V.102, P. 179-181.
Кроме того, для применения пМФА необходимо иметь флуоресцирующие антитела к каждому виду антигена, что ограничивает применение пМФА.
Следует отметить, что использование флуоресцирующих иммуноглобулинов группы сыпного тифа (групповые антитела) или рода коксиелл не позволяет проводить дифференциацию R.prowazekii, R.typhi, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы по причине наличия перекрестно-реагирующих и группоспецифических антител в препарате.
Из этого вытекает необходимость в приготовлении видоспецифических флуоресцирующих антител, что позволит повысить чувствительность и специфичность метода.
Непрямой метод флуоресцирующих антител (выявление антигена).
В основе непрямого метода флуоресцирующих антител (нМФА) лежит специфическое взаимодействие фиксированного на предметном стекле гомологичного антигена с комплементарными иммуноглобулинами немеченой иммунной сыворотки, которая в дальнейшем специфически реагирует с флуоресцирующими антивидовыми иммуноглобулинами.
Отмечено, что при использовании нМФА достаточно иметь лишь несколько препаратов антивидовых флуоресцирующих антител (против иммуноглобулинов человека, мыши, кролика и др.), но, по-прежнему, остается необходимость иметь диагностические немеченые иммунные сыворотки к каждому искомому антигену.
К достоинствам нМФА относится его универсальность, поскольку с его помощью возможна не только идентификация искомых антигенов, но и выявление, и титрование комплементарных к нему антител. По данным литературы, нМФА при выявлении антигена намного (в 10-12 раз) чувствительнее пМФА.
В отличие от прямого МФА непрямой МФА трехкомпонентный, двухэтапный, более трудоемкий, менее экономичный и требует большего времени для проведения исследования.
Недостатком нМФА является возрастание числа диагностических ошибок при обнаружении антигенов в биологических объектах. Это вызвано неспецифической сорбцией флуоресцирующего конъюгата на денатурированных клетках, детрите и других органических примесях в объектах биологического и небиологического материала (наведенная неспецифическая флуоресценция). Для нивелирования этой флуоресценции необходимо применять еще один этап - контрастирование бычьим альбумином, меченым родамином.
19
2,
Негативным моментом является и наличие на наружной мембране риккетсиальных клеток антигенных структур, перекрестно-реагирующих с общими антигенными эпитопами других возбудителей группы риккетсиозов, а также наличием антигенов, общих с антигенными структурами других микробов, таких как: Proteus OX, Proteus OX которые реагируют с гомологичными иммунными сыворотками. Эти реакции с гетерологичными антителами еще более затрудняют интерпретацию специфического окрашивания.
Для устранения перекрестных реакций необходимо использовать в качестве иммунных сывороток специфические антитела, свободные от перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител, а также высокоспецифичные флуоресцирующие конъюгаты.
Гольдин Р.Б. Иммунолюминесцентный анализ в изучении и диагностике вирусных инфекций и риккетсиозов. Иммунолюминесценция в медицине. 1977, М., Медицина, С 80-144.
РНГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом
В основу РНГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом (ИЭД) положена агглютинация специфических риккетсиозных или коксиеллезных антител, адсорбированных на поверхности эритроцитов барана, в присутствии гомологичных антигенов. С применением ИЭД по стандартной методике появилась возможность быстрого обнаружения возбудителей и их антигенов в различных субстратах.
4
6
Реакция одноэтапная, двухкомпонентная, технологически простая в постановке, экономичная, причем стабильность используемых диагностикумов обеспечивает воспроизводимость результатов. Главное ее достоинство - высокая чувствительность и, по этому показателю она близка к иммуноферментному, и радиологическому методам. Пороговая чувствительность РНГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом (ИЭД) при выявлении антигенов соответствует 5×10 - 1×10 микробных тел в 1 мл.
Левина Е.Н. Метод иммунофлуоресценции в бактериологии. Иммунолюминесценция в медицине. 1977, М., Медицина, С. 46-71.
Барбан П.С., Мисенжников А.В. Сравнительное изучение некоторых современных методов быстрого обнаружения риккетсий Провачека в переносчике. Микробиология. 1974, №2, С. 17-20.
Недостатком реакции является появление неспецифических реакций, обусловленных взаимодействием перекрестно-реагирующих антител и гетерологичных антител сенситина с другими групповыми антигенами и с белками субстрата антигенов.
С целью элиминации неспецифических реакций для сенсибилизации эритроцитов следует использовать чистые или адсорбированные специфические антитела с высокой константой связывания.
Твердофазный иммуноферментный метод для выявления антигена (ИФА).
Метод основан на специфическом взаимодействии антигена, иммобилизованного на носителе с гомологичным антителом, с последующим его связыванием с антивидовыми антителами, конъюгироваными с ферментом, последние в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывают окрашенный продукт, количество которого определяют спектрофотометрически.
ИФА трехэтапный и многокомпонентный метод. Широкое применение метода обусловлено его возможностью исследования значительного количества сывороток и автоматической регистрацией результатов.
Шпынов С.Н. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки и обоснование ее применения в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом, Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н., Омск, 1999. С. 1-23.
Метод отличает достаточная чувствительность - обычно достаточно присутствия растворимого антигена в концентрации I нг/мл.
Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Е.М.Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. М., Высшая школа,1991. С. 288.
К недостаткам ИФА относится неоднозначная сорбционная способность планшетов, недостаточная емкость непористых материалов, наличие в иммунных сыворотках перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител и возможность элюции части адсорбированных антигенов с носителя в процессе промывок, вследствие чего ухудшаются чувствительность, точность и воспроизведение результатов анализа.
Иммунохроматографический индикаторный элемент (ИЭ).
ИЭ построен в формате «сэндвич» с использованием мультимембранного композита, состоящего из аналитической мембраны с присоединенными подложками разного вида. Для проведения исследований в аналитической зоне на мембрану наносили раствор специфических антител к риккетсиям Бернета, меченых наночастицами золя золота, а в контрольную зону- антитела козы против иммуноглобулинов кролика. Затем мультимембранный композит помещали в пластиковую оправу с круглыми отверстиями для нанесения образца и прямоугольным отверстием для считывания результатов реакции. Суспензию риккетсий Бернета наносили на подложку для впитывания образца, которая в силу капиллярных сил смывала с конъюгатной подложки специфический конъюгат. При этом происходило взаимодействие риккетсий Бернета с мечеными специфическими антителами с образованием иммунного комплекса, который задерживался на аналитической мембране и проявлялся в виде окрашенной в красно-вишневый цвет линии. Не связавшиеся иммунный комплекс и конъюгат продвигались по аналитической мембране до контрольной зоны, где образовывался окрашенный иммунный комплекс антивидовых антител с конъюгатом. Если в образце риккетсии Бернета отсутствовали, то окрашенная линия в аналитической зоне не образовывалась.
6
В результате проведенных исследований были разработаны ИЭ для выявления риккетсий Бернета с чувствительностью 1×10 м.к./мл и временем анализа - 20 мин. ИЭ специфичен также по отношению к риккетсиям Провачека, антигенным комплексам риккетсий Провачека и риккетсий Сибирика в концентрации 8 АЕ/мл. Разработанные ИЭ могут быть использованы для экспресс-индикации риккетсий Бернета на различных стадиях лабораторного исследования.
Регистрацию аналитического эффекта проводили как визуально, так и с помощью отечественного видеоцифрового анализатора иммунохроматограмм «Рефлеком» (ООО «Синтеко-Комплекс), внесенного в государственный реестр средств измерений России. Прибор регистрировал величину окрашивания аналитической и контрольной зон ИЭ в условных единицах. Измерения для каждой концентрации микробных клеток и отрицательных контролей проводили пятикратно, вычисляли среднее арифметическое и определяли погрешность измерения с использованием коэффициентов Стьюдента (tp=2,78 при n=5) с 95% надежностью.
Башарова Л.А., Ярков СП., Третьяков С.И., Злобин В.Н. Создание индикаторных иммунохроматографических элементов для выявления риккетсий Бернета. Проблемы особо опасных инфекций, 2013, №4, 80. С. 79-81.
Преимущества метода: короткое время анализа, отсутствие дополнительных технологических операций, визуальная и/или приборная регистрация, которые позволяют рассматривать иммунохроматографический метод выявления риккетсий Бернета как один из вариантов выявления этих микроорганизмов в полевых условиях, при мониторинге объектов окружающей среды.
Ограничивающими факторами применения этого метода в практических лабораториях является наличие во флуоресцирующих иммуноглобулинах гетерологичных антител к среде культивирования, выявление только корпускулярных антигенов, дорогостоящий флуорохром - наночастицы коллоидного золота, сложность постановки и учета результатов реакции ИЭ при инструментальном исследовании.
Флуоресцентный Резонансный Перенос Энергии.
(Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)).
Быстрое, высокочувствительное и селективное обнаружение патогенных бактерий чрезвычайно важно для правильной диагностики и лечения. Большинство современных методов обнаружения бактерий являются трудоемкими и могут обнаруживать только один бактериальный патоген в одном анализе. Разработан метод чувствительного мультиплексного мониторинга бактериальных патогенов в течение 30 мин с использованием многоцветных FRET (fluorescence resonance energy transfer) кремнеземных NPs (наночастиц). Варьируя соотношение трех тандемных красителей, коэнкапсулированных в НЧ, были получены НЧ, которые излучают уникальные цвета при возбуждении одной длиной волны. Когда эти НПВ конъюгировали с моноклональными антителами, специфичными для патогенных бактерий, а затем были инкубированы с небольшими концентрациями бактерий, при этом было достигнуто одновременное и чувствительное обнаружение нескольких бактериальных мишеней.
Недостатком метода является сложность получения меченых наночастиц разного цвета флуоресценции, использование дорогостоящей аппаратуры и реагентов (моноклональные антитела).
Wang L.,  Zhao Wenjun,  O’Donoghue M., Tan W. Fluorescent nanoparticles for multiplexed bacteria monitoring. Bioconjug Chem Mart-Apr 2007, 18(2). С.297-301.
Мультиплексный анализ ИФА+МФА.
Наиболее близким к предлагаемому способу по технологической сущности является ИФА+МФА в формате мультиплексного анализа.
При этой разновидности ИФА+МФА органические полимеры или неорганические материалы (магноиммуносорбенты, полистироловые
микросферы, микрошарики, латексы и др.) применяют в качестве матрицы для сорбции аналитов (антигенов, антител, синтетических пептидов, олигонуклеотидов и др.).
Способ осуществляется следующим образом: окрашивают флуорофорами, например, полистироловые микросферы 5,6 мкм; затем присоединяют связующие аналиты (олигонуклеопротеиды, антитела, пептиды и др.); добавляют суспензии микросфер к исследуемым образцам (плазма, сыворотка, кровь и др.); добавляют детектирующий агент и флуоресцентную метку (смесь стрептовидина и фикоэритрина). Во время измерения в проточной ячейке анализатора Luminex в проточной жидкости каждая микросфера подвергается облучению двумя лазерами (зеленым и красным) с разной длиной волны и флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорофорами, регистрируется фотодетекторами прибора. Таким образом, анализируется одновременно тип микросферы и наличие (концентрация) искомого аналита на соответствующем типе частиц.
Недостатком способа является наличие гетерологичных антител в препаратах, необходимость создания программы исследования и длительная расшифровка результатов, использование специального дорогостоящего оборудования и труднодоступных полистироловых микроплат, многоэтапность метода, а также потеря времени на сенсибилизацию микросфер, внесение реагентов. Этот метод высокочувствителен, высокотехнологичен, но пригоден только для крупных специализированных эпидемиологических центров, а не для клинической лабораторной практики. Важным ограничивающим моментом также является наличие в препаратах перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител.
Wang L. et al. Nanoparticles for multiplex diagnostics and imaging. Nanomedicine. 2006, V. 1, №4. P. 413-426.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение группы флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов, а именно флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii или флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi, или флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к С.burnetii I фазы, или флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума С.burnetii II фазы, применение которых обеспечивает выявление и дифференциацию возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы в исследуемых образцах при сохранении высокой чувствительности и специфичности.
9
Технический результат достигается за счет того, что создан способ получения группы флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы, заключающийся в том, что приготавливают флуоресцирующую матрицу путем нанесения на матрицу флуоресцентной метки, затем присоединяют к ней с помощью связующего реагента аналиты, отличающийся тем, что в качестве матрицы используют формалинизированные лактобактерии с концентрацией не менее 1×10 клеток/мл, а в качестве флуоресцентной метки используют неорганические флуорохромы, при этом в качестве аналитов используют антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii, или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы, которые соединяют посредством связующего реагента с каждой флуоресцирующей матрицей и получают конечные продукты - флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы, при этом антителосодержащие иммуноглобулины получают из соответствующих иммунных сывороток R.prowazekii или R.typhi, C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы путем их выделения сочетанными методами: осаждением нейтральными солями, гель-фильтрацией, удалением перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител, при этом для каждой вновь выделенной серии антителосодержащих иммуноглобулинов, перед их соединением с флуоресцирующей матрицей, эмпирически подбирают оптимальную сенсибилизирующую дозу в диапазоне 0,1-0,5 мг/мл. Причем в качестве связующего реагента флуоресцирующей матрицы с антителосодержащими иммуноглобулинами используют танин в объемном соотношении флуоресцирующей матрицы и раствора танина 1:1, или используют раствор водорастворимого карбодиимида в объемном соотношении флуоресцирующей матрицы и раствора водорастворимого карбодиамида 1:1. В качестве неорганических флуорохромов используют изотиоцианат флуоресцеина или нанокристаллы в виде полупроводниковых коллоидных частиц разной флуоресценции. При этом удаление перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител проводят флуоресцирующими антигенными диагностикумами к R.prowazekii или к R.typhi или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы. Особенность способа заключается в том, что каждую флуоресцирующую матрицу после соединения с соответствующими антителосодержащими иммуноглобулинами инкубируют в течение 60 мин при температуре 37°C. При этом каждый флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум из группы, представляет собой 1% взвесь флуоресцирующих формалинизированных лактобактерий, ковалентно связанных посредством связующего реагента с антителосодержащими иммуноглобулинами R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы.
Применяют созданные флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы для дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы, которая необходима для специфической оценки активности вакцин, а также для изучения объектов эпидемиологического обследования, которыми являются инфицированные органы и ткани животных, или образцы инфицированной внешней среды, или переносчики эпидемического вшивого сыпного тифа, или эндемического блошиного сыпного тифа, или Q лихорадки в реакции взаимодействия исследуемых возбудителей с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы.
При этом способ дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы, заключается в постановке реакции взаимодействия возбудителей в исследуемых образцах с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы и дальнейшем анализе и регистрации результатов с помощью детектирующего оборудования. При этом способ дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы заключается в том, что реакцию взаимодействия возбудителей в исследуемых образцах с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы проводят как реакцию флуоресцентной микроагглютинации, при этом на 4-х предметных стеклах с 8-ю лунками на каждом, расположенных на подложках, в семь лунок вносят исследуемые образцы по п. 9., а в 8-ю лунку- очищенную воду, затем во все лунки первого стекла добавляют созданный флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум к R.prowazekii по пп. 1 и 7, а во все лунки 2-го предметного стекла - созданный флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум к R.typhi по пп. 1 и 7, во все лунки 3-го предметного стекла - созданный флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум к C.burnetii I фазы по пп. 1 и 7, во все лунки 4-го предметного стекла - созданный флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум к C.burnetii II фазы по пп. 1 и 7, затем ингредиенты реакции перемешивают путем постукивания по подложке, после чего подложки со стеклами помещают во влажную камеру с температурой 37°C на 60 мин, затем предметные стекла высушивают и анализируют с помощью детектирующего оборудования, в качестве которого используют иммерсионный объектив флуоресцентного микроскопа, при этом оценку результатов проводят по двухкрестовой системе, после чего регистрируют на каком предметном стекле из четырех с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами и с исследуемыми образцами наблюдается положительная реакция, таким образом, определяя какой возбудитель R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы находится в исследуемом образце, при этом документирование осуществляют путем сохранения предметных стекол с содержимым или путем сохранения фото с микроскопа на USB-носителе.
Другой способ дифференциации заключается в том, что реакцию взаимодействия исследуемых образцов с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы проводят как реакцию взаимодействия антителосодержащих иммуноглобулинов R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы, иммобилизованных в лунках планшетов, с гомологичными возбудителями исследуемых образцов с последующим выявлением присоединенных возбудителей при помощи флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов, в качестве индикаторных реагентов, с последующей регистрацией результатов реакции с помощью детектирующих устройств, для чего используют стрипы разборных планшетов для иммунофлуориметрического анализа, в которых иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii или R.typhi или C.burneti I фазы или C.burneti II фазы, а для контроля флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов по пп. 1 и 7 на спонтанную агглютинацию применяют чистые стрипы, причем для проведения реакции используют 5 стрипов по 8 лунок, в четырех из которых с 1-й по 8-ю иммобилизованы последовательно антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii, R.typhi; C.burneti I фазы, C.burneti II фазы, а 5-ый контрольный стрип используют чистым, затем вносят исследуемые образцы во все лунки с 1-й по 4-ю каждого из 7 горизонтальных рядов стрипов последовательно, то есть 7 исследуемых образцов, а в лунки 8-го горизонтального ряда 4-х стрипов последовательно с 1-й лунки по 4-ю вносят возбудители R.prowazekii, R.typhi; C.burneti I фазы, C.burneti II фазы, при этом во все лунки с 1-й по 8-ю 5-го стрипа вносят очищенную воду, после чего планшет со стрипами закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37°C на 60 мин при периодическом перемешивании и по истечении этого времени планшет со стрипами промывают, затем во все лунки стрипов с 1-го по 4-й вносят последовательно флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к R.prowazekii, к R.typhi, к C.burnetii I фазы, к C.burneti II фазы, а в каждые две лунки 5-го контрольного стрипа вносят флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы последовательно к R.prowazekii, затем в следующие две лунки флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к R.typhi, после чего к C.burnetii I фазы, и после этого к C.burneti II фазы, после чего планшет со стрипами закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37°C на 60 мин при периодическом перемешивании, затем планшет промывают подсушивают и анализируют, при этом флуоресценция возникает в той лунке, в которой находится возбудитель R.prowazekii, или R.typhi; или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы, в исследуемом образце, и в лунке стрипа появляется флуоресценция, причем интенсивность свечения выявляют и регистрируют с помощью детектирующего оборудования, которым является специальный аппаратно-программный комплекс-флуориметр.
Еще один способ дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы заключается в том, что реакцию взаимодействия исследуемых образцов с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или к C.burnetii II фазы проводят как реакцию взаимодействия молекулярных зондов - антителосодержащих иммуноглобулинов R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы, иммобилизованных в гелевых микроячейках биочипов, с гомологичными возбудителями исследуемого образца и с последующим выявлением и регистрацией образовавшегося комплекса с использованием флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов в качестве индикаторных реагентов с последующей регистрацией результатов реакции с помощью детектирующих устройств, для чего берут необходимое количество биочипов с гелевыми микроячейками, при этом количество необходимых гелевых микроячеек определяют числом молекулярных зондов, а также количеством используемых флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов, при этом каждая гелевая микроячейка содержит иммобилизованные внутри молекулярные зонды - антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы, причем для исследования одного образца отбирают 8 биочипов, проводят внесение исследуемого образца на биочипы, а постановку реакции на биочипах осуществляют в 2 этапа: сначала на гелевые микроячейки биочипов 1, 2, 3, 4, внутри которых находятся иммобилизованные антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы наносят исследуемый образец, а на контрольные гелевые микроячейки биочипов 5, 6, 7, 8, внутри которых находятся иммобилизованные антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы, наносят - раствор хлорида натрия, после чего биочипы помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 60 мин при температуре 37°C, по истечении этого времени биочипы промывают дистиллированной водой трехкратно в течение 1 мин и высушивают, при этом на втором этапе проводят внесение на высушенные биочипы флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов по пп. 1 и 7, а именно: во все гелевые микроячейки биочипов 1 и 5 флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к R.prowazekii; - во все гелевые микроячейки биочипов 2 и 6 - флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к R.typhi; во все гелевые микроячейки биочипов 3 и 7 - флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к C.burneti I фазы, во все гелевые микроячейки биочипов 4 и 8 флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы C.burneti II фазы, затем все биочипы после внесения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 60 мин при температуре 37°C, после чего биочипы промывают и высушивают, при этом при наличии возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы в исследуемом образце, они взаимодействуют с соответствующими флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами и антителосодержащими иммуноглобулинами в зондах, после чего в гелевой микроячейке биочипа появляется флуоресценция, при этом интенсивность свечения гелевых микроячеек биочипа выявляют и регистрируют с помощью детектирующих устройств, которыми являются специальные аппаратно-программные комплексы анализаторов, таким образом, получают данные о наличии в исследуемом образце гомологичных возбудителей, причем при применении биочипов один исследуемый образец тестируется на несколько возбудителей одновременно, при этом каждый последующий образец исследуется аналогичным способом.
Краткое описание фигур
На фигуре 1
представлена схема получения флуоресцирующей матрицы
А - матрица - формалинизированные лактобактерии.
В - флуоресцентная метка.
С - флуоресцирующая матрица.
На фигуре 2
схематично показано соединение флуоресцирующей матрицы со связующим реагентом.
С - флуоресцирующая матрица.
D - связующий реагент.
Е - флуоресцирующая матрица со связующим реагентом.
На фигуре 3
схематично представлено получение флуоресцирующего диагностикума.
Е - флуоресцирующая матрица со связующим реагентом.
F - антителосодержащий иммуноглобулин.
G - флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум.
На фигуре 4
изображена иммунограмма антителосодержащих иммуноглобулинов, выделенных из иммунной сыворотки сочетанными методами: осаждением нейтральными солями, гель-фильтрацией, удалением перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител.
А - иммунная сыворотка кролика:
1 - альбумин,
2 - бета-глобулин,
3 - альфа-глобулин,
4 - гамма-глобулин.
В5 - антителосодержащие иммуноглобулины.
На фигуре 5
представлено выявление возбудителей R.prowazekii, R.typhi, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы с помощью флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi, или к C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы (ФИД) в реакции флуоресцентной микроагглютинации.
A1 - положительная реакция ФИД к R.prowazekii с возбудителем R.prowazekii и В1, С1, D1 - отрицательные реакции с возбудителями R.typhi, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы и в контроле на спонтанную агглютинацию.
В2 - положительная реакция ФИД к R.typhi с возбудителем R.typhi и A2, C2, D2 - отрицательные реакции с возбудителями R.prowazekii, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы и в контроле на спонтанную агглютинацию.
С3 - положительная реакция ФИД к C.burnetii I фазы с возбудителем C.burnetii I фазы и A3, B3, D3 - отрицательные реакции с возбудителями R.prowazekii, R.typhi, и C.burnetii II фазы и в контроле на спонтанную агглютинацию.
D4 - положительная реакция ФИД к C.burnetii II фазы с возбудителем C.burnetii II фазы и A4, B4, С4 - отрицательные реакции с возбудителями R.prowazekii, R.typhi, и C.burnetii I фазы и в контроле на спонтанную агглютинацию.
A5, B5, C5, D5 - контроль ФИД на спонтанную агглютинацию.
На фигуре 6А
представлено обнаружение R.prowazekii и R.typhi с помощью флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi.
А - отрицательный контроль флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii на спонтанную агглютинацию.
В - положительная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii с возбудителем R.prowazekii.
С - отрицательная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii с возбудителем R.typhi.
D - отрицательный контроль флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi на спонтанную агглютинацию.
E - положительная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi c возбудителем R.typhi.
F - отрицательная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi c возбудителем R.prowazekii.
На фигуре 6 В
представлено выявление возбудителей C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы с помощью флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к C.burnetii I фазы и к C.burnetii II фазы.
А - отрицательная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii I фазы на спонтанную агглютинацию.
В - положительная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii I фазы с возбудителем C.burnetii I фазы.
С - отрицательная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii I фазы с возбудителем C.burnetii II фазы.
D - отрицательная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii II фазы на спонтанную агглютинацию.
E - положительная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii II фазы c возбудителем C.burnetii II фазы.
F - отрицательная реакция флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii II фазы c возбудителем C.burnetii I фазы.
На фигуре 7
представлен принцип взаимодействия флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума с возбудителями, находящимися в исследуемых образцах.
G - флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум.
Н - исследуемые образцы с гомологичными возбудителями R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы.
K - взаимодействие флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума с возбудителями, находящимися в исследуемых образцах.
На фигуре. 8
представлен принцип распределения ингредиентов в стрипах планшета для иммунофлуориметрического анализа (ИФлА) для постановки реакции.
На фигуре изображены стрипы разборного планшета для ИФлА, в которых в вертикальных лунках стрипов 1, 2, 3, 4 иммобилизованы последовательно антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii, R.typhi, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы.
В лунках стрипа 5 показано для контроля на спонтанную агглютинацию распределение в каждые две лунки последовательно флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов (ФИД).
Фигуры в лунках горизонтальных рядов - A, B, C, D, E, F, G обозначают порядок нанесения исследуемых образцов.
В лунках 8-го горизонтального ряда Н - поставлен контроль ФИД со стандартными возбудителями R.prowazekii, R.typhi, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы.
На фигуре 9
схематично изображен принцип взаимодействия антителосодержащих иммуноглобулинов с возбудителями на биочипах и проявление реакции флуоресцирующим иммуноглобулиновым диагностикумом
9А. Положительный результат анализа.
1 - Антителосодержащий иммуноглобулин, иммобилизованный на биочипе.
2 - Гомологичный возбудитель в исследуемом образце.
3 - Флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум.
4 - Комплекс антителосодержащего иммуноглобулина с гомологичным возбудителем и флуоресцирующим иммуноглобулиновым диагностикумом.
9В - Отрицательный результат анализа.
1 - Антителосодержащий иммуноглобулин, иммобилизованный на бичипе.
5 - Гетерогенный возбудитель в исследуемом образце.
3 - Флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум.
Комплекс не образовался: 1 - антителосодержащий иммуноглобулин, иммобилизованный на биочипе остался, а 5 и 3 - были удалены при промывании.
На фигуре10.
схематическое изображение постановки реакции на биочипах.
10А и 10 В - восемь биочипов каждый с 4-мя гелевыми микроячейками, в которых иммобилизованы молекулярные зонды- антителосожержащие иммуноглобулины R.prowazekii, R.typhi, C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы.
С - исследуемый образец..
G - 0,9% раствор хлорида натрия.
H, I, J, K - флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы (ФИД): Н - ФИД к R.prowazekii, I - ФИД к R.typhi,
J - ФИД к C.burnetii I фазы, K - ФИД к C.burnetii II фазы.
Раскрытие изобретения
Созданные флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы могут быть использованы для специфической оценки активности вакцин, а также изучения объектов эпидемиологического обследования, которыми являются инфицированные органы и ткани животных, или образцы инфицированной внешней среды, или переносчики эпидемического сыпного тифа, или эндемического блошиного сыпного тифа, или Q лихорадки в реакции взаимодействия
блошиного сыпного тифа, или Q лихорадки в реакции взаимодействия возбудителей с комплементарными флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами с регистрацией результатов реакции с помощью аппаратно-программных анализаторов.
Флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы могут быть использованы в практике клинико-диагностических лабораторий учреждений Минздрава РФ и Центров Роспотребнадзора для обнаружения возбудителей эпидемического сыпного тифа и эндемического сыпного тифа и коксиеллеза при эпидемиологическом обследовании.
Способ приготовления флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов состоит из следующих этапов
1. Получение флуоресцирующей матрицы.
1.1.Формалинизация лактобактерий.
1.2. Флуоресцентная метка лактобактерий.
1.3.Получение флуоресцирующей матрицы со связующим реагентом.
2. Получение очищенных антителосодержащих иммуноглобулинов.
2.1. Выделение иммуноглобулинов из иммунных сывороток путем осаждения нейтральными солями, в частности, сернокислым аммонием.
2.2. Удаление солей сернокислого аммония из антителосодержащей фракции иммуноглобулинов методом гель-фильтрации.
2.3. Удаление из антителосодержащей фракции иммуноглобулинов перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител методом адсорбции.
3. Приготовление флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов.
3.1.Сенсибилизация флуоресцирующей матрицы адсорбированными антителосодержащими иммуноглобулинами.
3.2. Получение флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi, или к С.burnetii I фазы, или С.burnetii II фазы
Пример 1.
1.Получение флуоресцирующей матрицы.
Получение флуоресцирующей матрицы проводили по нижеизложенному способу.
1.1. Формалинизация лактобактерий.
В качестве матрицы использовали лактобактерии, выделенные из препарата «Лактобактерин» (производство «Микроген» Пермское НПО «Биомед») путем трехкратного центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С с целью удаления защитной среды для высушивания.
9
Полученные осадки лактобактерий ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2, в полученную биомассу лактобактерий добавляли нейтральный формалин до конечной концентрации 10% и выдерживали 10 дней при температуре 6 - 8°С. Осаждение формалинизированной биомассы проводили путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С.Промывание биомассы проводили дважды в 0,9% растворе хлорида натрия при 2500 об/мин в течение 25 мин. Осадок ресуспендировали в рабочем растворе - 0,9% раствора хлорида натрия - 70%, карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,0 - 30% до концентрации 1×10 клеток/мл.
Получили формалинизированную взвесь лактобактерий.
1.2.Флуоресцентная метка лактобактерий.
9
В качестве метки использовали неорганические флуорохромы - изотиоцианат флуоресцеина или нанокристаллы в виде полупроводниковых коллоидных частиц разного цвета флуоресценции. В описываемом опыте для окрашивания к полученной взвеси формалинизированных лактобактерий добавляли флуоресцентный краситель - изотиоцианат флуоресцеина из расчета 2 мг на 1×10 лактобактерий.
Конъюгацию смеси проводили в течении 18 часов при температуре 23°С при постоянном перемешивании (фиг. 1).
9
-6
Аналогичным образом проводили метку с использованием нанокристаллов в виде полупроводниковых коллоидных частиц разного цвета флуоресценции, за исключением того, что на 1×10 клеток/мл формалинизированных лактобактерий добавляли 10 ml нанокристаллов с концентрацией 5,4×10.
По истечении времени конъюгации проводили осаждение флуоресцирующей матрицы и отмывание ее от непрореагировавшего флуорохрома путем 3-хкратного осаждения методом центрифугирования в 0,9% растворе хлорида натрия при 2500 об/мин в течение 25 мин. и осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия.
Получили 1% взвесь флуоресцирующей матрицы, которую хранили при температуре 6-8° С.
1.3.Получение флуоресцирующей матрицы со связующими реагентами (фиг. 2).
В качестве связующего реагента использовали гидролизованные танины (сложные эфиры галловой кислоты или родственных ей дигалловой и тригалловой кислот с многоатомным спиртом - глюкозой) или водорастворимые карбодиимиды (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride).
1
Для танизации 2 мл 1%-ной взвеси флуоресцирующей матрицы осаждали и осадок промывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия рН 7,0 два раза путем центрифугирования в течение 25 мин при 2500 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,2. Затем к объему отмытой флуоресцирующей матрицы добавляли равный объем раствора танина в концентрации 1:20000 на 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2, смесь оставляли на 15 мин при температуре 23°С при периодическом перемешивании. Осаждение взвеси проводили путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23° С.Промывание взвеси проводили трижды в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7, 0 при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе рН 6,4.
Получение флуоресцирующей матрицы c активированными группами с использованием водорастворимого карбодиимида (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) проводили аналогичным способом, за исключением того, что к объему отмытой флуоресцирующей матрицы добавляли равный объем раствора карбодиимида в концентрации 1:2000.
Получили взвесь флуоресцирующей матрицы со связующим реагентом (фиг. 2).
Пример 2. Получение очищенных антителосодержащих иммуноглобулинов.
2.1. Выделение иммуноглобулинов из иммунных сывороток путем осаждения нейтральными солями, в частности, сернокислым аммонием (фиг. 4).
Выделение иммуноглобулиновой антителосодержащей фракции к R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы проводили из стандартных иммунных сывороток методом двухкратного солевого фракционирования сернокислым аммонием при 34% насыщении.
К одному объему кроличьей сыворотки приливали ½ объема очищенной воды и по каплям, при постоянном перемешивании, добавляли рассчитанное (до 34% насыщения) количество насыщенного раствора сернокислого аммония.
Формула расчета:
4
2
4
(NH)SO=(А+В) х34
100-34 ; где
А - объем исходной сыворотки,
В - объем очищенной воды, равный половине объема сыворотки,
34 - необходимый процент насыщения сыворотки сернокислым аммонием.
Смесь выдерживали 60 мин при температуре 23°С, периодически перемешивая. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 2500 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок регидратировали в очищенной воде до объема исходной сыворотки. При втором высаливании к полученному объему добавляли насыщенный раствор сернокислого аммония, объем которого рассчитывали по формуле:
4
2
4
(NH)SO=Ах34
100-34 ; где
А - объем регидратированной сыворотки.
Смесь, периодически перемешивая, выдерживали в течение 60 мин при температуре 23°С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 2500 об/мин в течение 25 мин. Осадок растворяли в забуференном 0,9% растворе хлорида натрия, взятом в объеме, равном 0, 1 объема сыворотки.
Получили раствор иммуноглобулинов, который подлежал освобождению от солей сернокислого аммония.
2.2. Удаление солей сернокислого аммония из антителосодержащей фракции иммуноглобулинов методом гель-фильтрации..
Полученный раствор иммуноглобулинов освобождали от сернокислого аммония методом гель - фильтрации на колонке, заполненной сефадексом G-25 medium. Белок собирали по пробе с сульфосалициловой кислотой, отсутствие сернокислого аммония контролировали с помощью реактива Несслера.
Чистоту полученного иммуноглобулина контролировали с помощью постановки иммуноэлектрофореза в агаре.
Иммуноэлектрофорез иммунных сывороток к R.prowazekii или R.typhi или С.burnetii I фазы или С.burnetii II фазы, выделенных из них иммуноглобулинов осуществляли по модифицированному методу Grabar P., Williams C.A. 1% агаре фирмы «Merk», используя веронал-мединаловый буферный раствор рН 8,6 с ионной силой 0,05. В лунки, вырезанные в слое агара, вносили исследуемые образцы и проводили электрофорез при напряжении 40 В в течение 2,5 час.По окончании указанной процедуры в вырезанные траншеи вносили сыворотки против белков сыворотки кролика и инкубировали во влажной камере в течение 48 час.Результат оценивали визуально.
Grabar P., Williams C.A. Methode permettant l’etude conjuguee des proprieties electrophoretigues d’un meiange de proteins. Application au serumsanguin. Biochim. Biophys. Acta. 1953.V.10. №1. P. 193-194.
В работу отбирали иммуноглобулины, не содержащие альбумина и имеющие одну линию преципитации в зоне гамма- глобулинов.
Получили раствор очищенной антителосодержащей фракции иммуноглобулинов, не содержащий солей сернокислого аммония.
2.3. Удаление из антителосодержащей фракции иммуноглобулинов перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител методом адсорбции.
Удаление из антителосодержащей фракции иммуноглобулинов перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител проводили с помощью адсорбентов - флуоресцирующих антигенных диагностикумов R.prowazekii или R.typhi, или С.burnetii I фазы, или С.burnetii II фазы, приготовленных, как указано в патенте №2728340 от 20.12.2019 г.
Для получения флуоресцирующих антигенных диагностикумов по способу, указанному в патенте, использовали лиофилизированные корпускулярные антигены R.prowazekii или R.typhi, или С.burnetii I фазы, или С.burnetii II фазы.
Для этого содержимое ампул ресуспендировали в буферном растворе (10mM трис-HCl, 0,5 М хлорид натрия, 10% изопропанола, рН 7,5) и обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора Soni Prep150 Plus (Великобритания) при частоте 23 кГц и амплитуде 112 шестикратно по 5 мин. Осаждение неразрушенных клеток проводили путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин, при температуре 23°С. Для выделения из полученного дезинтеграта активного белково-липополисахаридного комплекса использовали хроматограф Akta Explorer 10 (Швеция). Фракционировали дезинтеграт с колонки (размером 10×300 мм) в буферном растворе (10mM трис-HCl, 0,5 М хлорид натрия, 10% изопропанола, рН 7,5).
Отбирали первую серологически активную фракцию БЛПС-комплекса и посредством связующего реагента(танина) соединяли с флуоресцирующей матрицей. Инкубацию смеси проводили при температуре 43°С в течение 60 мин. при периодическом перемешивании. По истечении времени инкубации взвесь осаждали при 2500 об/мин в течение 25 мин, осадок отмывали от непрореагировавшего БЛПС-комплекса путем двукратного осаждения методом центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин, при температуре 23°С. Осадок ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида до конечной концентрации 1%. Хранили при температуре 6-8°С.
Для удаления перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител из антителосодержащей фракции иммуноглобулинов методом адсорбции предварительно подбирали оптимальную адсорбирующую дозу диагностикума.
Оптимальную адсорбирующую дозу флуоресцирующих антигенных диагностикумов подбирали эмпирически в диапазоне от 0,1 до 0,5 мл на 0,1 мл очищенных иммуноглобулинов. Выбранную дозу флуоресцирующих антигенных диагностикумов вносили в раствор иммуноглобулинов, выдерживали в течение 30 мин при периодическом перемешивании и удаляли из раствора иммуноглобулинов путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин.
Полученные адсорбированные антителосодержащие иммуноглобулины оценивали на иммунофлуоресцентную активность в нМФА, используя в качестве индикатора флуоресцирующие иммуноглобулины против иммуноглобулинов кролика (фиг. 4).
Получили раствор очищенных антителосодержащих иммуноглобулинов R.prowazekii или R.typhi, или С.burnetii I фазы, или С.burnetii II фазы.
Пример 3.
Приготовление флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов.
3.1. Сенсибилизация флуоресцирующей матрицы адсорбированными антителосодержащими иммуноглобулинами.
Для этого к объему флуоресцирующей матрицы добавляли равный объем раствора адсорбированных антителосодержащих иммуноглобулинов, взятых в эмпирически подобранной концентрации, и инкубировали при температуре 37°C в течение 60 мин при периодическом перемешивании каждые 15 мин.
3.2. Получение флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов (фиг. 3).
По истечении времени инкубации, для удаления непрореагировавших антителосодержащих иммуноглобулинов, взвесь центрифугировали в течение 25 мин при 2500 об/мин, а к осадку добавляют 10 мл в 0,9% раствора хлорида натрия рН 7,0 и однократно отмывали в 10-кратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия. Отмытый осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,0 до конечной концентрации 1% и хранили при температуре 6-8°С. Получали 1% взвесь флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi, или к С.burnetii I фазы, или к С.burnetii II фазы.
Пример 4.
Получение и применение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума R.prowazekii.
Получение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii проводили в соответствии с изложенными выше этапами технологического процесса.
В качестве матрицы использовали лактобактерии, выделенные из препарата «Лактобактерин» путем трехкратного центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С для удаления защитной среды для высушивания.
9
Полученный осадок лактобактерий ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2 до исходного объема, в полученную биомассу лактобактерий добавляли нейтральный формалин до конечной концентрации 10% и выдерживали 10 дней при температуре 6 - 8°С. Осаждение взвеси проводили путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Промывание взвеси проводили трижды в 0,9% растворе хлорида натрия рН 7, 0 при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Осадок ресуспендировали в рабочем растворе - 0,9% раствора хлорида натрия - 70%, карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,0 - 30% до концентрации 1×10 клеток /мл.
9
9
-6
Для метки флуорохромом лактобактерий применяли неорганический флуоресцентные краситель - изотиоцианат флуоресцеина. В описываемом опыте для метки к полученной взвеси формалинизированных лактобактерий добавляли флуоресцентный краситель - изотиоцианат флуоресцеина из расчета 2 мг на 1×10 лактобактерий. Конъюгацию смеси проводили в течении 18 часов при температуре 23°С при постоянном перемешивании. Аналогичным образом проводили метку нанокристаллами, при этом на 1×10 клеток /мл формалинизированных лактобактерий добавляли 10 ml нанокристаллов с концентрацией наночастиц 5,4×10.
По истечении времени конъюгации проводили осаждение взвеси флуоресцирующей матрицы и отмывание ее от непрореагировавшего флуорохрома путем 3-хкратного осаждения методом центрифугирования в 0,9% растворе хлорида натрия при 2500 об/мин в течение 25 мин, а осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия до конечной концентрации 1%.
Получали 1% взвесь флуоресцирующей матрицы, которую хранили при температуре 6-8° С.
1
В качестве связующего реагента использовали раствор танина на 0,9% растворе хлорида натрия рН 7,2. Для этого 2 мл взвеси флуоресцирующей матрицы осаждали и осадок промывали путем центрифугирования в течение 25 мин при 2500 об/мин в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия рН 7,0 два раза. Осадок ресуспендировали в 2 мл 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,2. Затем к 2 мл отмытой флуоресцирующей матрицы добавляли 2 мл раствора танина в концентрации 1:20000, смесь оставляли на 15 мин при температуре 23°С при периодическом перемешивании. По истечении времени проводили осаждение взвеси путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С.Удаление несвязавшегося танина из взвеси проводили путем трехкратного промывания осадков 0,9% раствором хлорида натрия рН 7, 0 при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 23°С. Осадок ресуспендировали в 2 мл фосфатного буферного раствора рН 6,4.
Получали 2 мл флуоресцирующей матрицы со связующим реагентом.
Для получения антителосодержащих иммуноглобулинов использовали стандартные иммунные сыворотки для РНГА, полученные путем иммунизации кроликов Rickettsia prowazekii, штамм «Брейнль». К 20 мл сывороток добавляли 10 мл очищенной воды и по каплям вносили 15,45 мл насыщенного раствора сернокислого аммония рН 7,2 при постоянном перемешивании. Смесь выдерживали 60 мин при температуре 23°С, периодически перемешивая. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 2500 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок регидратировали в 20 мл очищенной воды и повторно выделяли иммуноглобулины. При втором высаливании к 20 мл раствора иммуноглобулинов добавляли 10,3 мл насыщенного раствора сернокислого аммония. Смесь, периодически перемешивая, выдерживали в течение 60 мин при температуре 23°С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 2500 об/мин в течение 25 мин. Осадок иммуноглобулинов растворяли в 2,0 мл забуференного 0,9% раствора натрия хлорида.
Освобождение иммуноглобулинов от сернокислого аммония проводили методом гель-фильтрации на колонке размером 2×15 см, заполненной сефадексом G-25 medium. Белок собирали по пробе с сульфосалициловой кислотой, отсутствие сернокислого аммония контролировали с помощью реактива Несслера. Получали 2,3 мл раствора иммуноглобулинов с концентрацией белка 21 мг/мл.
О полном удалении альбумина и чистоте полученного иммуноглобулина судили по данным иммуноэлектрофореза в агаре.
В работу отбирали антителосодержащие иммуноглобулины, не содержащие альбумина и имевшие по данным иммунофореза в агаре одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Адсорбцию полученных антителосодержащих иммуноглобулинов от перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител осуществляли с помощью флуоресцирующих антигенных диагностикумов R.typhi, приготовленных, как указано в этапе 2.3. Оптимальную дозу адсорбента подбирали эмпирически. Для этого в ряд пробирок с 0,1 мл 1% раствора антителосодержащих иммуноглобулинов добавляли флуоресцирующий антигенный диагностикум R.typhi в диапазоне от 0,1 до 0,5 мл. Смесь выдерживали 30 мин и затем подвергали центрифугированию при 2500 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой очищенные антителосодержащие иммуноглобулины, проверяли на полноту удаления перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител, а также на видоспецифическую иммунофлуоресцентную активность с антигенами R.prowaztkii и R.typhi в нМФА.
Иммуноглобулины к R.prowazekii, очищенные методом адсорбции флуоресцирующим антигенным диагностикумом R.typhi в нМФА не реагировали с R.typhi, что указывало на полную адсорбцию перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител.
Характеристика выделенного антителосодержащего иммуноглобулина к R.prowazekii: концентрация белка антителосодержащего иммуноглобулина колебалась в пределах от 20 до 25 мг/мл. Специфическая активность по данным нМФА составляла с антигеном R.prowazekii 1:320-1:640, с антигеном R.typhi - 1: 2,5 - 1: 5.
Выделенные фракции антителосодержащих иммуноглобулинов, по данным иммуноэлектрофореза, не содержали альбумина, были однородны и давали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Полученные антителосодержащие иммуноглобулины к R.prowazekii с помощью связующего реагента соединяли с флуоресцирующей матрицей.
Соединение флуоресцирующей матрицы со связующими реагентами c адсорбированными иммуноглобулинами осуществляли следующим образом (фиг. 2 и 3).
К 2 мл флуоресцирующей матрицы со связующим реагентом добавляли 2 мл раствора антителосодержащего иммуноглобулина с концентрацией белка 0, 2 мг/мл и инкубировали при температуре 37°C в течение 60 мин при периодическом через 15 мин перемешивании. По истечении времени инкубации взвесь центрифугировали в течение 25 мин при 2500 об/мин и осадок взвеси промывали 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,0. После чего получали конечную концентрацию флуоресцирующих диагностикумов равную 1% и хранили при температуре 6-8° С.
Получили 1% взвесь флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii. Конечный продукт - флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум R.prowazekii, который хранили при температуре 6-8°С, для длительного хранения диагностикум стабилизировали методом лиофильного высушивания.
Результаты опытов по применению созданного флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii для дифференциации возбудителей R.prowazekii и R.typhi приведены в таблице №1 и 2.
Пример 5.
Получение и применение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума R.prowazekii с использованием в качестве флуоресцентного красителя нанокристаллов.
Получение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii проводили в соответствии с изложенным выше примером 4, с той лишь разницей, что в качестве флуорохрома использовали нанокристаллы в виде полупроводниковых коллоидных частиц.
Приготовленный флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум к R.prowazekii на основе нанокристаллов не отличался по биохимическим и иммунофлуоресцентным характеристикам от флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii, полученного в примере 4.
Пример 6.
Получение и применение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi.
Получение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi проводили в соответствии с изложенными в примере 4 этапами технологического процесса, за исключением иммунных сывороток, из которых получали антителосодержащие иммуноглобулины и адсорбента. В данных опытах использовали стандартные иммунные сыворотки, полученные путем иммунизации кроликов R.typhi, штамм «Исаханян». Выделение иммуноглобулинов из сыворотки проводили как описано в примере 4.
В работу отбирали антителосодержащие иммуноглобулины, которые по данным иммунофореза в агаре образовывали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Адсорбцию антителосодержащих иммуноглобулинов от перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител осуществляли с помощью флуоресцирующих антигенных диагностикумов к R.prowazekii, приготовленных, как указано в этапе 2.3.
Оптимальную дозу адсорбента подбирали эмпирически как приведено в примере 4.
Антителосодержащие иммуноглобулины проверяли на полноту удаления перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител, а также на видоспецифическую иммунофлуоресцентную активность с антигенами R. prowaztkii и R.typhi в нМФА.
Антителосодержащие иммуноглобулины к R.typhi,очищенные методом адсорбции флуоресцирующим антигенным диагностикумом R.prowazekii в нМФА не реагировали с R.prowazekii, что указывало на полную адсорбцию перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител.
Характеристика антителосодержащего иммуноглобулина к R.typhii: концентрация белка иммуноглобулина колебалась в пределах от 20 до 23 мг/мл. Специфическая активность по данным нМФА составляла с антигеном R.typhi 1:160 - 1:320, с антигеном R.prowazekii - 1:2,5-1:5. Выделенные фракции антителосодержащих иммуноглобулинов, по данным иммуноэлектрофореза, не содержали альбумина, были однородны и давали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Полученные антителосодержащие иммуноглобулины к R.typhi с помощью связующего реагента - танина соединяли с флуоресцирующей матрицей по методике, указанной в примере 4 и получали 1% взвесь флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума R.typhi.
Конечный продукт - флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум R.typhi хранили при температуре 6-8°С, для длительного хранения препарат стабилизировали методом лиофилизации.
Результаты опытов по применению флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi для дифференциации возбудителей R.prowazekii и R.typhi приведены в таблице 1 и 2.
Пример №7
Получение и применение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к С.burnetii I фазы.
Получение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к С.burnetii I фазы проводили в соответствии с изложенными в примере 4 этапами технологического процесса, за исключением иммунных сывороток, из которых получали антителосодержащие иммуноглобулины и адсорбента.
В данных опытах использовали стандартные иммунные сыворотки, полученные путем иммунизации кроликов С.burnetii I фазы, штамм «Грита». Выделение иммуноглобулинов из сыворотки проводили как описано в примере 4.
В работу отбирали антителосодержащие иммуноглобулины, которые по данным иммунофореза в агаре образовывали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Адсорбцию антителосодержащих иммуноглобулинов от перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител осуществляли с помощью флуоресцирующих антигенных диагностикумов C.burnetii I фазы, приготовленных, как указано в этапе 2.3.
Оптимальную дозу адсорбента подбирали эмпирически как приведено в примере 4.
Антителосодержащие иммуноглобулины проверяли на полноту удаления перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител, а также на видоспецифическую иммунофлуоресцентную активность с антигенами C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы в нМФА.
Антителосодержащие иммуноглобулины к R.typhi,очищенные методом адсорбции флуоресцирующим антигенным диагностикумом C.burnetii II фазы в нМФА не реагировали с C.burnetii II фазы, что указывало на полную адсорбцию перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител.
Характеристика антителосодержащего иммуноглобулина к C.burnetii I фазы: концентрация белка иммуноглобулина колебалась в пределах от 20 до 23 мг/мл. Специфическая активность по данным нМФА составляла с антигеном C.burnetii I фазы 1:160 - 1:320, с антигеном C.burnetii II фазы - 1:2,5 Выделенные фракции антителосодержащих иммуноглобулинов, по данным иммуноэлектрофореза, не содержали альбумина, были однородны и давали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Полученные антителосодержащие иммуноглобулины к C.burnetii I фазы с помощью связующего реагента - танина соединяли с флуоресцирующей матрицей по методике, указанной в примере 4 и получали 1% взвесь флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума C.burnetii I фазы.
Конечный продукт - флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум C.burnetii I фазы хранили при температуре 6-8°С, для длительного хранения препарат стабилизировали методом лиофилизации.
Результаты опытов по применению флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума C.burnetii I фазы к для дифференциации возбудителей C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы приведены в таблице 3.
Пример 8
Получение и применение флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к С.burnetii II фазы.
Получение иммуноглобулинового диагностикума к флуоресцирующего С.burnetii II фазы проводили в соответствии с этапами технологического процесса, изложенными в примере 4, за исключением иммунных сывороток, из которых получали антителосодержащие иммуноглобулины и адсорбента.
В данных опытах использовали стандартные иммунные сыворотки, полученные путем иммунизации кроликов С.burnetii II фазы, штамм «Грита». Выделение иммуноглобулинов из сыворотки проводили как описано в примере 4.
В работу отбирали антителосодержащие иммуноглобулины, которые по данным иммунофореза в агаре образовывали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Адсорбцию антителосодержащих иммуноглобулинов от перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител осуществляли с помощью флуоресцирующих антигенных диагностикумов C.burnetii I фазы, приготовленных, как указано в этапе 2.3.
Оптимальную дозу адсорбента подбирали эмпирически, как приведено в примере 4.
Антителосодержащие иммуноглобулины проверяли на полноту удаления перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител, а также на видоспецифическую иммунофлуоресцентную активность с антигенами C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы в нМФА.
Антителосодержащие иммуноглобулины к R.typhi,очищенные методом адсорбции флуоресцирующим антигенным диагностикумом C.burnetii I фазы в нМФА не реагировали с C.burnetii I фазы, что указывало на полную адсорбцию перекрестно-реагирующих и гетерологичных антител.
Характеристика антителосодержащего иммуноглобулина к C.burnetii II фазы: концентрация белка иммуноглобулина колебалась в пределах от 20 до 23 мг/мл. Специфическая активность по данным нМФА составляла с антигеном C.burnetii II фазы 1:160 - 1:320, с антигеном C.burnetii I фазы - 1:2,5 Выделенные фракции антителосодержащих иммуноглобулинов, по данным иммуноэлектрофореза, не содержали альбумина, были однородны и давали одну линию преципитации в зоне гамма-глобулинов сыворотки (фиг. 4).
Полученные антителосодержащие иммуноглобулины к C.burnetii II фазы с помощью связующего реагента - танина соединяли с флуоресцирующей матрицей по методике, указанной в примере 4 и получали 1% взвесь флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума C.burnetii II фазы.
Конечный продукт - флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум C.burnetii II фазы хранили при температуре 6-8°С, для длительного хранения препарат стабилизировали методом лиофилизации.
Результаты опытов по применению флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума C.burnetii II фазы к для дифференциации возбудителей C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы приведены в таблице 3.
Пример 9.
Способ применения в реакции флуоресцентной микроагглютинации (РФМА) флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для обнаружения R.prowazekii или R.typhi или C.burneti II фазы или C.burneti II фазы.
Все полученные флуоресцирующие диагностикумы использовали для проведения в одноэтапной реакции флуоресцентной микроагглютинации (РФМА).
В основе РФМА лежит специфическое взаимодействие флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов непосредственно с гомологичными антигенами исследуемых образцов на предметном стекле. С этой целью в лунки предметных стекол вносили исследуемые образцы и добавляли флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум. Взаимодействие антигена с антителами происходило в течение 60 мин при температуре 37°C во влажной камере. По истечении этого времени препараты высушивали при комнатной температуре, просматривали и оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10х).
9.1. Постановка реакции.
Применение созданных флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы для специфической оценки активности вакцин, а также изучения объектов эпидемиологического обследования, которыми являются инфицированные органы и ткани животных, или образцы инфицированной внешней среды, или переносчики эпидемического вшивого сыпного тифа, или эндемического блошиного сыпного тифа, или Q лихорадки в реакции взаимодействия антигенов с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами с регистрацией результатов с помощью аппаратно-программных анализаторов.
Для этого необходимое количество предметных стекол с лунками размещали на пластиковых подложках с бортиками (крышка от планшетов для иммунологических реакций).
Внесение испытуемых и контрольных образцов исследуемых материалов.
На 4-х предметных стеклах с 8-ю лунками исследовали семь разных испытуемых образцов, а 8-ую лунку использовали для контроля диагностикума.
Для этого на 4-х предметных стеклах в 7 лунок вносили по 5 ml семь разных испытуемых материалов, а в 8-ю лунку вносили 5 ml очищенной воды. Затем во все лунки первого предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii, а во все лунки второго предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.typhi, а во все лунки третьего предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к С.burnetii I фазы, а во все лунки четвертого предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к С.burnetii II фазы.
9.2. Условия взаимодействия ингредиентов.
Ингредиенты реакции перемешивали путем осторожного постукивания по пластиковой подложке. Затем подложки с предметными стеклами помещали во влажную камеру при температуре 37°C на 60 мин. Взаимодействие специфических антител с флуоресцирующими диагностикумами происходило во влажной камере. По истечении времени подложки с препаратами доставали из влажной камеры и высушивали в термостате или при комнатной температуре 23°С. Высохшие препараты оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10 х).
9.3. Регистрация и интерпретация результатов.
Учет результатов вели либо визуально, либо с помощью фотодокументирования на основе оценки интенсивности специфического свечения и наличия агглютинатов, просматривая под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10х), не менее 10 полей зрения (детектирующее оборудование). О наличии в исследуемом материале возбудителей указывало образование агглютинатов и отсутствие агглютинатов в контроле.
Оценку результатов проводили по двухкрестовой системе:
- положительный результат - все просмотренные поля зрения заполнены агглютинатами разной величины и изолированными мечеными корпускулами; отрицательный результат - во всех просмотренных полях наблюдаются изолированные меченые корпускулы.
Результаты исследований антигенов в РФМА были задокументированы при фотографировании препаратов во флуоресцентном микроскопе и выведены на экран персонального компьютера и сохранены на USB-носителе.
Пример 10
Способ применения в реакции флуоресцентной микроагглютинации флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации R.prowazekii или R.typhi.
Флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к R.prowazekii или к R.typhi применяли для дифференциации возбудителей в реакции флуоресцентной микроагглютинации (РФМА) как раздельно, так и вместе. Оба флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикума использовали в постановке РФМА (фиг. 6А).
В основе РФМА лежит специфическое взаимодействие флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов непосредственно с гомологичными возбудителями исследуемых образцов на предметном стекле (фиг. 7). С этой целью в лунки предметных стекол вносили исследуемые образцы и добавляли флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум. Взаимодействие возбудителя с антителами происходило в течение 60 мин при температуре 37°C во влажной камере. По истечении этого времени препараты высушивали при комнатной температуре, просматривали и регистрировали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100х, окуляр 10х).
Постановка реакции
Применяли созданные флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы для дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, для специфической оценки активности сыпнотифозной вакцины, а также изучения объектов эпидемиологического обследования, которыми являются инфицированные органы и ткани животных, или образцы инфицированной внешней среды, или переносчики эпидемического вшивого сыпного тифа, или эндемического блошиного сыпного тифа, в реакции взаимодействия антигенов с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами с регистрацией результатов с помощью аппаратно-программных анализаторов.
Для этого необходимое количество предметных стекол с лунками размещали на пластиковых подложках с бортиками (крышка от планшетов для иммунологических реакций).
Внесение испытуемых и контрольных образцов исследуемых материалов.
На 2-х предметных стеклах с 8-ю лунками исследовали семь разных испытуемых образцов, а 8-ую лунку использовали для контроля диагностикума.
Для этого на 2-х предметных стеклах в 7 лунок вносили по 5 ml семь разных испытуемых материалов, а в 8-ю лунку вносили 5 ml очищенной воды. Затем во все лунки первого предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii, а во все лунки второго предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.typhi.
Условия взаимодействия ингредиентов
Ингредиенты реакции перемешивали путем осторожного постукивания по пластиковой подложке. Затем подложки с предметными стеклами помещали во влажную камеру при температуре 37°C на 60 мин. Взаимодействие специфических антител с флуоресцирующими диагностикумами происходило во влажной камере. По истечении времени подложки с препаратами доставали из влажной камеры и высушивали в термостате или при комнатной температуре 23°С. Высохшие препараты оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100х, окуляр 10х).
Регистрация и интерпретация результатов
Учет результатов вели либо визуально, либо с помощью фотодокументирования на основе оценки интенсивности специфического свечения и наличия агглютинатов, просматривая под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100х, окуляр 10х), не менее 10 полей зрения (детектирующее устройство). О наличии в исследуемом материале возбудителей указывало образование агглютинатов и отсутствие агглютинатов в контроле.
Оценку результатов проводили по двухкрестовой системе:
- положительный результат - все просмотренные поля зрения заполнены агглютинатами разной величины и изолированными мечеными корпускулами; отрицательный результат - во всех просмотренных полях наблюдаются изолированные меченые корпускулы.
Результаты исследований возбудителей в РФМА были задокументированы при фотографировании препаратов во флуоресцентном микроскопе и выведены на экран персонального компьютера и сохранены на USB-носителе.
Пример 11.
Способ применения в реакции флуоресцентной микроагглютинации флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы.
Полученные флуоресцирующие диагностикумы применяли для проведения в одноэтапной реакции флуоресцентной микроагглютинации (РФМА) как раздельно, так и вместе (фиг. 6В).
В основе РФМА лежит специфическое взаимодействие флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов непосредственно с гомологичными антигенами исследуемых образцов на предметном стекле. С этой целью в лунки предметных стекол вносили исследуемые образцы и добавляли флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум. Взаимодействие возбудителя с антителами происходило в течение 60 мин при температуре 37°C во влажной камере. По истечении этого времени препараты высушивали при комнатной температуре, просматривали и оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100х, окуляр 10х).
Постановка реакции
Применение созданных флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации возбудителей C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы для специфической оценки активности вакцины против Q лихорадки, а также изучения объектов эпидемиологического обследования, которыми являются инфицированные органы и ткани животных, или образцы инфицированной внешней среды, или переносчики Q лихорадки в реакции взаимодействия возбудителей с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами с регистрацией результатов с помощью аппаратно-программных анализаторов.
Для этого необходимое количество предметных стекол с лунками размещали на пластиковых подложках с бортиками (крышка от планшетов для иммунологических реакций).
Внесение испытуемых и контрольных образцов исследуемых материалов.
На 2-х предметных стеклах с 8-ю лунками исследовали семь разных испытуемых образцов, а 8-ую лунку использовали для контроля диагностикума.
Для этого на 2-х предметных стеклах в 7 лунок вносили по 5 ml семь разных испытуемых материалов, а в 8-ю лунку вносили 5 ml очищенной воды. Затем во все лунки первого предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к С.burnetii I фазы, а во все лунки второго предметного стекла добавляли по 5 ml флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к С.burnetii II фазы.
Условия взаимодействия ингредиентов.
Ингредиенты реакции перемешивали путем осторожного постукивания по пластиковой подложке. Затем подложки с предметными стеклами помещали во влажную камеру при температуре 37°C на 60 мин. Взаимодействие специфических антител с флуоресцирующими диагностикумами происходило во влажной камере. По истечении времени подложки с препаратами доставали из влажной камеры и высушивали в термостате или при комнатной температуре 23° С. Высохшие препараты оценивали под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10 х).
Регистрация и интерпретация результатов.
Учет результатов вели либо визуально, либо с помощью фотодокументирования на основе оценки интенсивности специфического свечения и наличия агглютинатов, просматривая под иммерсионным объективом флуоресцентного микроскопа (объектив 100 х, окуляр 10 х), не менее 10 полей зрения. О наличии в исследуемом материале возбудителей указывало образование агглютинатов и отсутствие агглютинатов в контроле.
Оценку результатов проводили по двухкрестовой системе:
- положительный результат - все просмотренные поля зрения заполнены агглютинатами разной величины и изолированными мечеными корпускулами
- отрицательный результат - во всех просмотренных полях наблюдаются изолированные меченые корпускулы.
Результаты исследований возбудителей в РФМА регистрировали и были задокументированы при фотографировании препаратов во флуоресцентном микроскопе (детектирующее устройство) и выведены на экран персонального компьютера и сохранены на USB-носителе.
Пример 12
Способ применения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi или C.burneti I фазы или C.burneti II фазы в иммунофлуориметрическом анализе.
В основе метода лежит взаимодействие антителосодержащих иммуноглобулинов, иммобилизованных в лунках планшетов, с гомологичными возбудителями исследуемых образцов с последующим определением присоединенных возбудителей при помощи флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов (фиг. 8).
Для проведения иммунофлуориметрического анализа использовали стрипы разборных планшетов для иммунофлуориметрического анализа, в которых иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii или R.typhi, или C.burneti I фазы, или C.burneti II фазы. Для контроля флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов на спонтанную агглютинацию применяли чистые стрипы.
12.1. Постановка реакции
Для постановки реакции брали 5 стрипов по 8 лунок в каждом, представляющих собой вставки в разборный планшет.
В лунках стрипов были иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины:
-в лунках 1-го стрипа иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii;
- в лунках 2-го стрипа иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины R.typhi;
- в лунках 3-го стрипа иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины C.burneti I фазы;
- в лунках 4-го стрипа иммобилизованы антителосодержащие иммуноглобулины C.burneti II фазы;
- 5-ый контрольный стрип использовали чистым.
Стрипы были помещены в рамку планшета, при этом каждый горизонтальный ряд лунок с 1-й по 8-ю каждого из 5-и стрипов обозначен последовательно латинскими буквами: A, B, C, D, E, F, G, Н по вертикали, а каждый стрип по горизонтали обозначен цифрами: 1, 2, 3, 4, 5.
Из исследуемых образцов готовили 10% суспензии на 0,9% растворе хлорида натрия.
Постановку иммунофлуориметрического анализа проводили в два этапа.
I-й этап.Внесение в лунки каждого горизонтального ряда исследуемых образцов.
Вносили 7 исследуемых образцов во все лунки с 1-й по 4-ю каждого из 7-и горизонтальных рядов стрипов последовательно:
- в лунки ряда А1, А2, А3, А4 вносили по 100 мкл первого исследуемого образца;
- в лунки ряда В1, B2, B3, B4 вносили по 100 мкл второго исследуемого образца;
- в лунки ряда С1, C2, C3, C4 вносили по 100 мкл третьего исследуемого образца;
- в лунки ряда D1, D2, D3, D4 вносили по 100 мкл четвертого исследуемого образца;
- в лунки ряда E1, E2, E3, E4 вносили по 100 мкл пятого исследуемого образца;
- в лунки ряда F1, F2, F3, F4 вносили по 100 мкл шестого исследуемого образца;
- в лунки ряда G1, G2, G3, G4 вносили по 100 мкл седьмого исследуемого образца.
9
В лунки 8-го горизонтального ряда Н 4-х стрипов последовательно с 1-й по 4-ю лунки вносили суспензии стандартных возбудителей: R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы в разведении 1:10 (при концентрации 2×10 клеток /мл).
А именно:
- в лунку горизонтального ряда Н1 вносили 100 мкл суспензии возбудителя R.prowazekii;
- в лунку Н2 вносили 100 мкл суспензии возбудителя R.typhi;
- в лунку Н3 вносили 100 мкл - суспензии возбудителя C.burneti I фазы;
- в лунку Н4 вносили 100 мкл суспензии C.burneti II фазы.
Во все вертикальные лунки с 1-й по 8-ю 5-го стрипа вносили по 100 мкл очищенной воды.
После этого планшет со стрипами закрывали крышкой и помещали в термостат при температуре 37°C на 60 мин при периодическом перемешивании каждые 15 мин. По истечении этого времени планшет доставали и стрипы промывали путем внесения в каждую лунку по 200 мкл 0,9% раствора хлорида натрия с добавлением 5% фосфатного буфера рН 7,2 трижды по 3 мин для удаления непрореагировавших ингредиентов.
На данном этапе произошло взаимодействие гомологичных эпитопов возбудителя с иммобилизованными антителосодержащими иммуноглобулинами.
II этап.Внесение в лунки стрипов флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов.
Во все 8 лунок каждого стрипа с 1-й по 8-ю вносили последовательно флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы (ФИД) R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы:
- во все 8 лунок 1-го стрипа вносили по 200 мкл ФИД к R.prowazekii;
- во все 8 лунок 2-го стрипа вносили по 200 мкл ФИД к R.typhi;
- во все 8 лунок 3-го стрипа вносили по 200 мкл ФИД к C.burnetii I фазы;
- во все 8 лунок 4-го стрипа вносили по 200 мкл ФИД к C.burneti II фазы;
- в каждые 2-е лунки контрольного 5-го контрольного стрипа вносили 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii, затем в следующие 2-е лунки 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi, после чего 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii I фазы, после этого 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burnetii II фазы для оценки спонтанной агглютинации.
Так, в лунки A5, B5 вносили по 200 мкл ФИД к R.prowazekii;
- в лунки С5, D5 вносили по 200 мкл ФИД к R.typhi;
- в лунки E5, F5 вносили по 200 мкл ФИД к C.burneti I фазы;
- в лунки G5, H5 вносили по 200 мкл ФИД к C.burneti II фазы.
После внесения ФИД планшет со стрипами закрывали крышкой и помещали в термостат при температуре 37°C на 60 мин при периодическом перемешивании каждые 15 мин. По истечении этого времени планшет доставали и стрипы промывали путем внесения в каждую лунку по 200 мкл 0,9% раствора хлорида натрия с добавлением 5% фосфатного буфера рН 7,2 трижды по 3 мин для удаления непрореагироваших ингредиентов. Стрипы подсушивали и анализировали и регистрировали.
12.2. Регистрация и интерпретация результатов
На втором этапе в случае связывания возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы с антителосодержащими иммуноглобулинами в каждом исследуемом образце их эпитопы взаимодействуют с гомологичными соответствующими флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами и в лунке стрипа появляется флуоресценция. Интенсивность свечения лунок стрипа регистрировали с помощью детекторных устройств, которыми являются специальные аппаратно-программные комплексы-анализаторов, которые и выдавали данные о присутствии в исследуемом образце гомологичных возбудителей.
Применение флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов с целью дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II в иммунофлуориметрическом анализе позволяет тестировать сразу с 4-мя флуоресцирующими ммуноглобулиновыми диагностикумами каждый из 7-и исследуемых образцов.
Пример 13.
Способ применения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов для дифференциации R.prowazekii или R.typhi или C.burneti I фазы или C.burneti II фазы на биологических чипах.
В основе реакции лежит специфическое взаимодействие молекулярных зондов - антителосодержащих иммуноглобулинов, иммобилизованных в гелевых микроячейках биочипов, с гомологичными возбудителями с последующим проявлением образовавшегося комплекса с помощью флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов (фиг. 9, 10А и 10 В)
13.1 Постановка реакции
Отбирали необходимое количество биочипов с гелевыми микроячейками. Количество необходимых гелевых микроячеек в каждом биочипе для постановки основной реакции определяли числом молекулярных зондов, а количество биочипов определяли числом используемых флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов. Для исследования одного образца использовали 8 биочипов: 4 биочипа (I) для постановки опыта с исследуемыми образцами и 4-е биочипа (II) для постановки контроля флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов на спонтанную агглютинацию (фиг. 10А и 10 В).
Каждый из 8-ми биочипов содержал 4-е гелевые микроячейки с молекулярными зондами - иммобилизованными антителосодержащими иммуноглобулинами: R.prowazekii - в первой гелевой ячейке, R.typhi, - во второй, C.burneti I фазы - в третьей, C.burneti II фазы - в четвертой.
Из исследуемого образца готовили 10% суспензию (v/v) на 0,9% растворе хлорида натрия. Далее суспензию вносили на все гелевые микроячейки биочипов с 1-го по 4-й, при этом внесение проводили с помощью автоматических дозаторов на 200 мкл.
Постановку реакции на биочипах осуществляли в 2 этапа.
1-й этап.Нанесение исследуемого образца на гелевые микроячейки биочипов.
На каждый биочип с гелевыми микроячейками, внутри которых находятся молекулярные зонды - иммобилизованные антителосодержащие иммуноглобулины: R.prowazekii, R.typhi, C.burneti I фазы, C.burneti II фазы наносили исследуемый образец.
Схема постановки опыта на 1-м этапе включала:
- нанесение на гелевые микроячейки биочипов с 1-го по 4-й - по 200 мкл исследуемого образца;
Для постановки контроля флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов на спонтанную агглютинацию использовали аналогичные биочипы контрольные (II) с гелевыми микроячейками, внутри которых находились молекулярные зонды - иммобилизованные антителосодержащие иммуноглобулины R.prowazekii, R.typhi, C.burneti I фазы, C.burneti II фазы.
Постановка контроля на I-м этапе включала нанесение на гелевые микроячейки биочипов с 5-го по 8-й по 200 мкл 0,9% раствора хлорида натрия. Осуществление постановки проводилась следующим образом:
После этого все биочипы помещали во влажную камеру и инкубировали в течение 60 мин при температуре 37°C. По истечении этого времени биочипы промывали дистиллированной водой трехкратно в течение 1 мин и высушивали.
II этап.Внесение на высушенные биочипы флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов.
Для проведения II этапа на опытные (I) и контрольные (II) биочипы наносили соответствующие флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы.
На все гелевые микроячейки биочипов 1-й и 5-й вносили по 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.prowazekii;
- на все гелевые микроячейки биочипов 2-й и 6-й вносили по 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к R.typhi;
-на все гелевые микроячейки биочипов 3-й и 7-й вносили по 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума к C.burneti I фазы;
- на все гелевые микроячейки биочипов 4-й и 8-й вносили по 200 мкл флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума C.burneti II фазы.
Все биочипы после внесения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов помещали во влажную камеру и инкубировали в течение 60 мин при температуре 37°C. По истечении этого времени биочипы промывали дистиллированной водой трехкратно в течение 1 мин и высушивали и анализировали.
13.2. Регистрация и интерпретация результатов.
На втором этапе в случае связывания возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetii II фазы исследуемого образца с молекулярными зондами - антителосодержащими иммуноглобулинами, эпитопы возбудителей взаимодействовали с гомологичными соответствующими флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами и в лунке стрипа появлялась флуоресценция (фиг. 9А).
В постановке с контрольными образцами флуоресценция не наблюдалась, в связи с отсутствием гомологичного возбудителя (фиг. 9B).
Интенсивность свечения гелевых микроячеек биочипа с содержимым регистрировали с помощью детектирующего оборудования, в качестве которого использовали специальные аппаратно-программные комплексы анализаторов, с их помощью получали отчет о присутствии в исследуемом образце гомологичных возбудителей.
Таким образом, применение биочипов с целью дифференциации возбудителей R.prowazekii или R.typhi, или C.burnetii I фазы, или C.burnetiiII фазы позволяет тестировать один исследуемый образец сразу с 4-мя флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами одновременно.
Пример 14.
Сравнительная оценка результатов непрямого метода флуоресцирующих антител (нМФА) и реакции флуоресцентной микроагглютинации (РФМА) с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами.
Исследование проводили с исследуемыми образцами, корпускулярными и растворимыми возбудителями (антигенами) R.prowazekii и R.typhi.
Результаты одной типичной серии опытов по исследованию коммерческих возбудителей (антигенов) с использованием флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов R.prowazekii и R.typhi представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1Исследование коммерческих возбудителей (антигенов) риккетсий группы сыпного тифа с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.typhi и R.prowazekii
Исследуемыевозбудители(антигены)
Серии возбудителей (антигенов)
Обратные величины титров антигенов риккетсий в исследуемом материале
ФИД кR.prowa-zekii
ФИД к R.typhi
нМФА с поливалентной сывороткой
R.prowaze-kii
R.typhi
Корпускулярныевозбудители(антигены)R.prowazekii
24
128
-
128
128
27
256
-
128
64
43
64
-
256
128
46
32
-
64
64
52
128
-
512
256
Растворимыевозбудители(антигены)R.prowazekii
1522354555
1024
-
-
-
2048
-
-
-
1024
-
-
-
4096
-
-
-
2048
-
-
-
Корпускулярныевозбудители(антигены)R.typhi(экспериментальные серии)
13
-
256
256
128
23
-
128
128
64
37
-
64
256
128
47
-
128
64
64
2
-
512
512
256
Растворимыевозбудители(антигены)R.typhi
11
-
2048
-
-
16
-
1024
-
-
25
-
512
-
-
33
-
1024
-
-
42
-
2048
-
-
Иммуноглобули-ны к R.prowazekii (положительный контроль)
титр 1:256
Титр1:128
Иммуноглобу лины к R.typhi (положительный контроль)
титр 1:128
Титр1:256
Как видно из представленных в таблице 1 данных, изучаемые разные серии коммерческих возбудителей (антигенов) R.prowazekii и R.typhi содержали оба вида антигенов, что было показано в нМФА с поливалентной сывороткой к риккетсиям группы сыпного тифа. При постановке реакции флуоресцентной микроагглютинации с флуоресцирующим иммуноглобулиновым диагностикумом к R.prowazekii положительные результаты наблюдались только с возбудителями (антигенами) R.prowazekii и отсутствовали с возбудителями (антигенами) R.typhi. Напротив, в реакции флуоресцентной микроагглютинации с флуоресцирующим иммуноглобулиновым диагностикумом к R.typhi положительные результаты были выявлены только с R.typhi и отсутствовали с R.prowazekii.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что приготовленные по заявляемому способу флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы обеспечивают четкую дифференциацию риккетсий группы сыпного тифа.
Следующим этапом исследований явилось изучение возможности применения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi, для идентификации риккетсий в различных материалах биологического происхождения.
Для идентификации риккетсий группы сыпного тифа применяли материалы, приготовленные из корпускулярных возбудителей (антигенов), ово- и тканевых культур риккетсий и энтомологической культуры R.prowazekii и R.typhi.
Для выявления корпускулярных и растворимых антигенов риккетсий, приготовленных непосредственно их исследуемого материала (куриные эмбрионы, лабораторные животные, переносчики) предварительно готовили 5-10% суспензии.
Результаты дифференциации риккетсий в различных источниках накопления показаны в таблице 2.
Из данных, представленных в таблице 2 видно, что исследованные материалы различного биологического происхождения содержат возбудители (антигены) как R.prowazekii, так и R.typhi, о чем свидетельствуют положительные результаты (интенсивность флуоресценции 3+) в нМФА с поливалентной сывороткой группы сыпного тифа.
В объектах, содержащих R.prowazekii, при применении флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii наблюдали агглютинацию (положительный результат), а при применении флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов R.typhi- отрицательные реакции.
Обратная картина наблюдалась при исследовании объектов, содержащих R.typhi. В этих материалах различного происхождения положительные результаты были получены при постановке реакции с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами к R.typhi, а при применении флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii отрицательные реакции.
Результаты этих исследований указывают на возможность проведения четкой идентификации R.prowazekii или R.typhi с помощью приготовленных флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi.
Таблица 2Дифференциация R.prowazekii и R.typhi в различных риккетсиесодержащих материалах с флуоресцирующими иммуноглобулиновыми диагностикумами (ФИД)к. R.prowazekii и к R.typhi
Исследуемый риккетсиесодержащий материал
Наличие иммунофлуоресцентной специфической реакции в риккетсиесодержащих материалах с
Интенсивность флуоресценции риккетсий в нМФА с поливалентной сывороткой группы сыпного тифа
ФИД R.prowazekii
ФИД R.typhi
возбудитель R.prowazeki
возбудитель R.typhi
Корпускулярный возбудитель R.prowazekii
+
-
3+
3+
РастворимыйвозбудительR.prowazekii
+
-
3+
3+
Овокультура R.prowazekii
+
-
3+
3+
Энтомологическая культура R.prowazekii
+
-
3+
3+
Корпускулярный возбудител R.typhi
-
+
3+
3+
РастворимыйвозбудительR.typhi
-
+
3+
3+
Овокультура R.prowazekii
-
+
3+
3+
Селезенки белых мышей, зараженных R.typhi
-
+
3+
3+
Желточная оболочка неинфицированная
-
-
-
-
Эмульсия селезенки неинфицированная
-
-
-
-
Взвесь из вшей интактных
-
-
-
-
Обозначения: «+» наличие риккетсий,
«-» отсутствие риккетсий
«3+» интенсивность свечения риккетсий в нМФА
Исследования дифференцирующей способности флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы проводили на возбудителях (антигенах) C.burnetii разной фазовой изменчивости.
Таблица 3Оценка дифференцирующей способности флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы
Исследуемый материал
Результаты реакции флуоресцентной микроагглютинации с
флуоресцирующим иммуноглобулиновым диагностикумом к C.burnetii I фазы
флуоресцирующим иммуноглобулиновым диагностикумом к C.burnetii II фазы
Корпускулярный возбудитель С.burnetii I фазы
+
-
Корпускулярный возбудитель С.burnetii II фазы
-
+
Овокультура С.burnetii II фазы
-
+
Тестикулярный возбудитель С.burnetii I фазы
+
-
Вакцина Ку М-44
-
+
Как представлено в таблице 3, флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к C.burnetii I фазы взаимодействуют с корпускулярным возбудителем (антигеном) C.burnetii I фазы и тестикулярным возбудителем (антигеном) C.burnetii I фазы и не реагируют с возбудителем (антигеном) C.burnetii II фазы, полученными из разных биологических материалов. Напротив, флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы к C.burnetii II фазы в реакции флуоресцентной микроагглютинации положительно реагируют с возбудителями (антигенами) C.burnetii II фазы и показывают отрицательный результат с возбудителями (антигенами) C.burnetii I фазы. Полученные данные свидетельствуют о четкой дифференцирующей способности возбудителей C.burnetii I фазы и C.burnetii II фазы в реакции флуоресцентной микроагглютинации с помощью флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы.
Применение данных диагностикумов в производстве коксиеллезной вакцины, позволит отследить процесс перехода C.burnetii I фазы в C.burnetii II фазы и оценить эффективность вакцинного препарата.
Таким образом, установлена четкая дифференцирующая способность разработанных флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi или C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы при индикации возбудителей в материалах различного биологического происхождения.
Все приведенные примеры подтверждают, что поставленная задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, а именно, разработка флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов к R.prowazekii или к R.typhi или C.burnetii I фазы или C.burnetii II фазы на основе адсорбированных иммуноглобулинов и использование их для внутривидовой дифференциации риккетсий группы сыпного тифа и коксиелл в реакции флуоресцирующей микроагглютинации (РФМА) при сохранении высокой чувствительности и специфичности за счет адсорбции сенситина от перекрестно-реагирующих и гетерологичных антигенов и увеличения числа активных видоспецифических антительных детерминант на поверхности флуоресцирующей матрицы, решена.
Предложенный вариант применения флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов в реакции флуоресцентной агглютинации был дополнен использованием их в других серологических методах: иммунофлуориметрическом анализе и биологических чипах в качестве индикаторных систем для обнаружения риккетсий и коксиелл, связанных с иммобилизованными антителосодержащими иммуноглобулинами.
Все приведенные примеры подтверждают, что поставленная техническая задача решена.
Технический результат и эффект достигался за счет использования в качестве матрицы флуоресцирующих лактобактерий, а в качестве активного вещества адсорбированных антителосодержащих иммуноглобулинов, соединением последних посредством связующего реагента с флуоресцирующей матрицей с образованием корпускуляризованных форм, что ведет к повышению специфичности и чувствительности, стандартности флуоресцирующих иммуноглобулиновых диагностикумов, проведении диагностики в формате одноэтапной реакции флуоресцентной микроагглютинации, сокращении времени проведения анализа за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов анализа (фиксирование препаратов, многоэтапность, внесение реагентов на разных этапах постановки и удаление непрореагировавших ингредиентов путем промывания мазков), а также повышения специфичности реакции за счет отсутствия наведенной неспецифической и специфической флуоресценции.
Кроме того, отмечена техническая простота способов дифференциации, стабильность и стандартность используемых препаратов, что обеспечивает надежную воспроизводимость результатов и возможность работы вне постоянной связи с риккетсиологической лабораторией.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры также подтверждают возможность промышленного применения данного изобретения.
Перечень сокращений
Биочип - биологический чип
ИФА - твердофазный иммуноферментный метод
ИЭД - иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум
ИЭ - иммунохроматографический индикаторный элемент
ИФлА - иммунофлуориметрический анализ
МФА - метод флуоресцирующих антител
нМФА - непрямой метод флуоресцирующих антител
пМФА - прямой метод флуоресцирующих антител
пМФАг - прямой метод флуоресцирующих антигенов
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота
РСК - реакция связывания комплемента
РФМА - реакция флуоресцентной микроагглютинации
ФИД - флуоресцирующие иммуноглобулиновые диагностикумы
ФИТЦ - изотиоцианат флуоресцеина
C.burnetii- Coxiella burnetii
FRET - флуоресцентный резонансный перенос
R.prowazekii - Rickettsia prowazekii
R.typhi - Rickettsia typhi
Список литературы
1.Thompson C.C. et al. Microbial genomic taxonomy. BMC Genomics 2013;14:913.doi10.1186/1471-2164-14-913.
AL
nd
2. Dumler S., Walker D.H., Class I. Order II. Rickettsiales Gieszczykiewicz 1939,25 emend. Dumler, Barbet, Bekker, Dasch, Palmer, Ray, Rikihisa and Rurangirwa 2001, 2156 // Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.2 ed. Vol 2: The Proteobacteria. Pt. C:The alfa-, beta-, delta-, and epsilonproteobacteria / eds D.J. Brenner, N.R. Krieg, J.T. Stanley, G.M. Garrity. New York: Springer,2005.P.96.
3. «Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28 ноября 2013 г. N 64 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13. «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)».
4.Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. », М., 1972. 495 с.
5. Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. «Иммунофлуоресцентный анализ», Свердловск: УрО АН СССР,1988, с. 176.
4. Р.Б. Гольдин. Иммунолюминесцентный анализ в изучении и диагностике вирусных инфекций и риккетсиозов. В кн: Иммунолюминесценция в медицине. 1977 М. Медицина. с 80-144.
5. Носков Ф.С., Болдасов В.К., Гольдин Р.Б., Ермаков Н.В., Волкова Л.А. Контрастный способ иммунофлуоресцентного выявления аденовирусов в культуре клеток почки морской свинки. Вопр. вирусол. 1965. №5. с. 613-618.
6. Smith C., Marshall G., Eveland W. Use of contrasting fluorescent dyed as counterstrain in fixed tissue preparation. Proc.Soc.Exp.Biol. Med., 1958.v.102. p.179-181.
7. Левина Е.Н. Метод иммунофлуоресценции в бактериологии. В кн: Иммунолюминесценция в медицине. 1977 М. Медицина. с 46-71.
8. Барбан П.С., Мисенжников А.В. Сравнительное изучение некоторых современных методов быстрого обнаружения риккетсий Провачека в переносчике. Ж.микробиол. 1974.№2.с 17-20.
9. Шпынов С.Н. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки и обоснование ее применения в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом. - Омск.1999.Автореф. дисс.на соискание уч. Степени к.м.н. стр. 1-23. Ru2410698 С1.27.01.2011.
10. А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б,Б, Дзантиев, Е.М. Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: выс9ая школа.1991.288 с.
11. Башарова Л.А., Ярков С.П., Третьяков С.И., Злобин В.Н. Создание индикаторных иммунохроматографических элементов для выявления риккетсий Бернета. Проблемы особо опасных инфекций 2013. №4. 80.с.79-81.
12.Wang L. et al. Nanoparticles for multiplex diagnostics and imaging, Nanomedicine, 2006. V. 1, №4, р. 413-426
13. Wang L., Zhao Wenjun., O’Donoghue M., Tan W. Fluorescent nanoparticles for multiplexed bacteria monitoring. Bioconjug Chem Mar-Apr 2007;18(2):297-301)
14. Приказ МЗ РФ от 26.11.1998 г №312 «Об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом» с приложениями 1 и 2 - МУ «Выявление больных эпидемическим сыпным тифом или болезнью Брилля-Цинссера», МУ « Клиника, диагностика и лечение эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля-Цинссера».