Композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос
COMPOSITION FOR STIMULATING HAIR GROWTH AND PREVENTING HAIR LOSS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Данная заявка испрашивает приоритет заявки на патент Кореи No. 10-2019-0039708, поданной в Корейское ведомство интеллектуальной собственности 04.04.2019. полное содержание которой включено сюда посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащей новый пептид, полученный из белка Wnt, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
2. Уровень техники
Волос - это твердое конусообразное волокно, состоящее из плотно соединенных и кератинизированных эпителиальных клеток, и примерно от 100000 до 150000 волос образуется в волосяных фолликулах черепа, и было известно, что число волосяных фолликулов определено при рождении, и они не образуются дополнительно после рождения. Каждый волос представлен в определенной фазе цикла: анаген, на которой волос растет; катаген, на которой его рост останавливается и волосяная луковица уменьшается; и телоген, на которой дермальная папилла начинает функционировать или формировать новый волос, что таким образом приводит к выпадению старого волоса, и волос растет и выпадает вследствие повторения этого цикла. Этот цикл повторяется с периодичностью от трех до шести лет, варьируя от 3-5 лет у мужчин и 4-6 лет у женщин. Известно, что в норме в сутки выпадает в среднем 50-70 волос, и волосы в фазах анагена, катагена и телогена составляют примерно 88%, 1% и 11% от общего количества волос, соответственно.
Термин «алопеция» относится к симптому, при котором по меньшей мере 100 волос выпадает в сутки, число волос в фазе анагена уменьшается, и число волос в фазах катагена и телогена увеличивается. По мере прогрессирования выпадения волос доля волос в фазе телогена быстро увеличивается, и доля волос в фазе анагена уменьшается соответственно. Выпадение волос обычно может включать наследственную андрогенную алопецию (облысение), гнездную алопецию, стригущий лишай, связанный с грибковыми инфекциями, телогеновую алопецию, трихотилломанию, нарушение роста волос и им подобное. Чаще всего выпадение волос включает облысение (алопеция по мужскому типу), алопецию по женскому типу, гнездную алопецию и телогеновую алопецию и так далее.
Причины выпадения волос различны. Генетические факторы и мужские гормоны, андрогены, считают важными факторами облысения, и некоторые алопеции по женскому типу рассматривают как вызванные такой же причиной как и алопеции по мужскому типу, но есть различия в клинической картине. Считают, что гнездная алопеция вызвана аутоиммунными заболеваниями. Телогеновая алопеция представляет собой временную потерю волос, которая происходит после серьезного физического или психологического напряжения, такого как эндокринные заболевания, недостаток питательных веществ, прием лекарственных препаратов, роды, лихорадка и хирургическое вмешательство, и происходит путем выпадения волос вследствие перехода в фазу телогена части волос, которые не прошли стадию роста.
В настоящее время есть только два одобренных FDA продукта для лечения выпадения волос: Финастерид и Миноксидил. Финастерид, который представляет собой средство от алопеции по мужскому типу, ингибирует выпадение волос путем использования механизма ингибирования 5α-редуктазы, фермента, который превращает мужские гормоны в дигидротестостерон (DHT), фактор, индуцирующий выпадение волос, в качестве агента для лечения выпадения волос у мужчин. Миноксидил ингибирует выпадение волос путем увеличения кровотока в области черепа. Однако постоянно сообщают о некоторых побочных эффектах, связанных с этими лекарственными средствами, и также о том, что их лечебное действие является временным и ограниченным. Выпадение волос вызывает комбинация факторов, не только одна причина, и устранение нескольких причин не может полностью вылечить ее.
Соответственно, в западной и восточной медицине были проведены различные научные исследования, посвященные проблеме выпадения волос, и были испробованы различные способы лечения. Были проведены исследования натуральных продуктов, стероидов, аутоиммунной супрессии и так далее, и были выполнены исследования с использованием лазерной терапии, применения аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы, дермароллера или стволовых клеток и так далее. Однако эти способы лечения также не позволили приблизиться комплексно к устранению причин выпадения волос различной природы, а не протестированные научными методами медицинские процедуры имеют недостаток, связанный с их недостаточной эффективностью с учетом их стоимости. Следовательно, есть насущная необходимость в разработке нового лекарственного средства против выпадения волос, эффективность которого доказана научным путем, и более экономично с точки зрения цены.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача настоящего изобретения заключается в предоставлении пептида для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос.
Другая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении косметической композиции для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос.
Третья задача настоящего изобретения заключается в предоставлении фармацевтической композиции для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос.
Четвертая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении оздоровительной пищевой композиции для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос.
Для достижения вышеописанной цели в настоящем изобретении предложен пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
Также в настоящем изобретении предложена косметическая композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащая пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
Дополнительно в настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащая пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
Дополнительно в настоящем изобретении предложена оздоровительная пищевая композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащая пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показаны результаты анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии нового пептида-1 (Wnt-1, SEQ ID NO: 1) и пептида-2 (Wnt-2, SEQ ID NO: 2), которые получены из белка Wnt.
На Фиг. 2 показан эффект стимуляции роста клеток полидезоксирибонуклеотидом (PDRN) с использованием клеток дермальной папиллы и представлены их микроскопические изображения.
На Фиг. 3 показан эффект стимуляции роста клеток Wnt-1 или Wnt-2 с использованием: (А) кератиноцитов, (Б) фибробластов и (В) клеток дермальной папиллы и представлены их микроскопические изображения.
На Фиг. 4 показан эффект стимуляции роста клеток (A) Wnt-1+PDRN или (Б) Wnt-2+PDRN с использованием кератиноцитов и представлены их микроскопические изображения.
На Фиг. 5 показан эффект стимуляции роста клеток Wnt-1+Wnt-2+PDRN с использованием клеток дермальной папиллы и представлены их микроскопические изображения.
На Фиг. 6 показан эффект увеличения активности р-катенина под действием: (А) PDRN, (Б) Wnt-1, Wnt-2, Wnt-1 и Wnt-2, (В) Wnt-1 и Wnt-2 с использованием клеток дермальной папиллы.
На Фиг. 7 показан эффект увеличения активности с-тус под действием: (A) PDRN, (Б) Wnt-1, Wnt-2, Wnt-1+Wnt-2, Wnt-1+PDRN, Wnt-2+PDRN, Wnt-1+Wnt-2+PDRN с использованием клеток дермальной папиллы.
На Фиг. 8 показан эффект роста волос под действием Wnt-1+Wnt-2+PDNR с использованием лишенных волос мышей С57 ВГ/6.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что новые пептиды, полученные из белков Wnt (Wnt-1 или/и Wnt-2), полидезоксирибонуклеотиды или их смеси, активируют сигнальную систему Wnt для увеличения секреции и активности β-катенина и для стимуляции роста кератиноцитов, фибробластов и клеток дермальной папиллы, которые важны для формирования корня волоса, и для индукции дифференцировки волос в фазе анагена, и выполнили настоящее изобретение.
Соответственно в настоящем изобретении предложен пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
Пептид может быть ацетилирован по N-концу аминокислотной последовательности.
Пептид может представлять собой пептид, полученный из белка Wnt. Пептид, полученный из белка Wnt, представляет собой пептид, выполняющий функцию, сходную с таковой природного белка Wnt, и связывается с рецептором для выполнения функции, такой как функция фактора роста.
Этот пептид может предупреждать выпадение волос и стимулировать рост волос.
Также в настоящем изобретении предложена косметическая композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащая пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
Пептид может быть ацетилирован по N-концу аминокислотной последовательности.
Пептид может представлять собой пептид, полученный из белка Wnt. Пептид, полученный из белка Wnt, представляет собой пептид, который выполняет функцию, сходную с таковой природного белка Wnt, и связывается с рецептором для выполнения функции, такой как функция фактора роста.
Полидезоксирибонуклеотид выделяют из семенников рыбы, и рыба может быть выбрана из группы, состоящей из лосося, форели, сельди, сайды и трески, но не ограничиваясь ими.
Полидезоксирибонуклеотид может иметь среднюю молекулярную массу 350-2000 кДа.
Дополнительно композиция увеличивает секрецию β-катенина для стимуляции роста кератиноцитов, фибробластов и клеток дермальной папиллы и увеличивает экспрессию с-myc, тем самым предупреждая выпадение волос и стимулируя рост волос.
Композиция может быть изготовлена в виде композиции, выбранной из группы, состоящей из тоника для волос, кондиционера для волос, эссенции для волос, лосьона для волос, питательного лосьона для волос, шампуня для волос, ополаскивателя для волос, средства для лечебного ухода за волосами, крема для волос, питательного крема для волос, увлажняющего крема для волос, крема для массажа волосистой части головы, воска для волос, аэрозоля для волос, маски для волос (hair pack), питательной маски для волос (hair nutrition pack), мыла для волос, очищающей пены для волос, масла для волос, агента для высушивания волос, защитного средства для волос, краски для волос, агента для завивки волос, осветлителя для волос, геля для волос, средства для блеска волос (hair glaze), средства для укладки волос, лака для волос, увлажнителя для волос, мусса для волос и спрея для волос, но не ограничиваясь ими.
Когда композиция по настоящему изобретению представляет собой косметическую композицию, косметическая композиция может включать, дополнительно к активному ингредиенту, традиционные вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы, растворители, витамины, пигменты и ароматизаторы, и носители. Кроме того, косметическая композиция может дополнительно включать усилитель всасывания через кожу для усиления эффекта.
Когда композиция по настоящему изобретению представляет собой косметическую композицию, препарат косметической композиции может быть получен в форме любой композиции, обычно получаемой в данной области техники, например косметическая композиция может представлять собой лосьон для лица, эмульсию, лосьон для кожи, тоник, лосьон, эссенцию, солнцезащитное средство, крем, основу для макияжа, базу, порошок, пакет, гель, мазь, пластырь, патч, шампунь, увлажнитель, спрей, средство для снятия макияжа и очиститель и так далее, но не ограничиваясь ими.
Когда композиция представляет собой пасту, крем или гель, в ней можно использовать животный жир, растительное масло, воск, парафин, крахмал, трагакант, производное целлюлозы, полиэтиленгликоль, силикон, бентонит, диоксид кремния, тальк или оксид цинка и им подобное, в качестве компонента-носителя.
Когда композиция представляет собой порошок или спрей, в ней можно использовать порошок лактозы, талька, диоксида кремния, гидроксида алюминия, силиката кальция или полиамида, в качестве компонента-носителя, и в частности спрей может дополнительно включать пропеллент, такой как хлорфторуглеводород, пропан/бутан или диметиловый эфир.
Когда композиция представляет собой раствор или эмульсию, растворитель, солюбилизатор или эмульгирующий агент используют в качестве компонента-носителя, например воду, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутил гликоле вое масло, алифатический сложный эфир глицерина, полиэтиленгликоль или сложные эфиры жирных кислот и сорбитана.
Когда композиция представляет собой суспензию, в ней можно использовать жидкие растворители, такие как вода, этанол или пропиленгликоль, суспендирующие средства, такие как этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтиленовые сложные эфиры сорбитола и полиоксиэтиленовые сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар или трагакант, в качестве компонента-носителя.
Также в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащая пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
Пептид может быть ацетилирован по N-концу аминокислотной последовательности.
Когда композиция по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, для введения она может включать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или растворитель дополнительно к активному ингредиенту, описанному выше. Носитель, эксципиент и растворитель могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, полив инилпирролид он, воду, метилгидробензоат, пропилгидробензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в форме композиций для перорального введения, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы или аэрозоли, препараты для наружного применения, суппозитории или стерильные растворы для инъекций, согласно соответствующим традиционным способам. Более подробно, при изготовлении, композиция может быть получена путем использования растворителей или эксципиентов, таких как уплотнители (fillers), наполнители (bulking agents), связывающие вещества, смачивающие агенты, средства для улучшения распадаемости и поверхностно-активные вещества, которые обычно используют. Твердые препараты для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и им подобное, но не ограничиваясь ими. Такие твердые препараты могут быть получены путем смешивания по меньшей мере одного эксципиента, такого как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза, желатин и так далее, дополнительно к активному ингредиенту. Дополнительно к простым эксципиентам можно использовать смазывающие вещества, такие как стеарат магния, тальк. Они могут быть получены путем добавления различных эксципиентов, таких как увлажнители, подсластители, отдушки, консерванты и им подобные дополнительно к жидкостям или жидкому парафину для перорального использования. Композиции для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, агенты для лиофильной сушки. В качестве неводных растворителей и суспензий можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, инъецируемые сложные эфиры, такие как этилолеат и им подобные. В качестве основания для суппозитория можно использовать витепсол (witepsol), макрогол (macrogol), твин 61, масло какао, лаурин (laurinum), глицеринизированный желатин и им подобное.
Подходящие дозировки фармацевтических композиций по настоящему изобретению варьируют в зависимости от состояния и массы пациента, тяжести заболевания, формы лекарственного средства и времени, но могут быть подходящим образом выбраны специалистом в данной области техники, и следовательно суточная доза композиции составляет предпочтительно от 0,001 мг/кг до 50 мг/кг, и ее можно вводить за один раз или делить на несколько приемов по необходимости.
В настоящем изобретении предложена оздоровительная пищевая композиция для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос, содержащая пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, полидезоксирибонуклеотид или их смесь в качестве активного ингредиента.
Пептид может быть ацетилирован по N-концу аминокислотной последовательности.
Когда композиция по настоящему изобретению представляет собой оздоровительную пищевую композицию, она может включать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), ароматизаторы, такие как синтетические ароматизаторы и натуральные ароматизаторы и так далее, красители и наполнители (сыр, шоколад и так далее), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные уплотнители, агенты для подведения рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты, карбонизаторы, используемые в газированных напитках, и им подобное. Кроме того, она может содержать мякоть для получения натуральных фруктовых соков, искусственных фруктовых соков и овощных напитков. Эти компоненты можно использовать независимо или в комбинации. Дополнительно оздоровительная функциональная пищевая композиция может быть в форме любого одного из мяса, колбасы, хлеба, шоколада, конфеты, легкой закуски, кондитерского изделия, пиццы, лапши, жевательной резинки, мороженого, супа, напитка, чая, функциональной воды, напитка, спирта и витаминного комплекса.
Дополнительно оздоровительная функциональная пищевая композиция может дополнительно включать пищевую добавку, и ее пригодность в качестве пищевой добавки определяется стандартами для приемлемого компонента в соответствии с Общими Положениями и Общими способами тестирования Корейского Кодекса Пищевых добавок (General Regulations and General Test Methods of Korean Food Additives Codex), одобренным Министерством по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (Ministry of Food and Drug Safety), если не указано иное.
Примеры компонентов, опубликованные в вышеупомянутом Корейском Кодексе Пищевых добавок, включают химические синтетические вещества, такие как кетоны, глицин, цитрат калия, никотиновую кислоту и коричную кислоту и им подобное, натуральные добавки, такие как экстракт хурмы, экстракт солодки, кристаллическая целлюлоза, краситель сорго красный и гуаровая камедь и им подобное, смешанные препараты, такие как препарат L-глутамата натрия, щелочные агенты для лапши, композиция консервантов и композиция красителей на основе каменноугольной смолы (tar color formulation) и им подобное.
В настоящее время содержание композиции по настоящему изобретению, добавленной в пищу во время изготовления композиции функционального здорового питания, может быть увеличено или уменьшено по необходимости.
Здесь и далее будут детально описаны примеры для облегчения понимания настоящего изобретения. Однако следующие примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не ограничивают объем настоящего изобретения. Воплощения настоящего изобретения предложены для более полного объяснения настоящего изобретения специалистам в данной области техники.
Пример 1: Получение новых пептидов, полученных из белка Wnt
Для получения нового пептида, полученного из белка Wnt, по настоящему изобретению, было исследовано семейство белков Wnt, и функция каждой части белка Wnt была предсказана с использованием программы BlastP. Среди них исследовали потенциальное связывание с рецепторными белками, и аминокислотная последовательность предсказанного сайта была оптимизирована для выбора и конструирования пептида по настоящему изобретению.
Пептид был синтезирован компанией Peptron. Желаемый пептид синтезировали твердофазным способом Fmoc в автоматическом синтезаторе пептидов (PeptrEX-R48), и синтезированный пептид отделяли от смолы. Пептид выделяли без примесей и анализировали обращено-фазовой HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan) с использованием аналитической обращенно-фазовой колонки "Shiseido capcell рак С18". Пептид представлен аминокислотной последовательностью из Таблицы 1 ниже, и N-конец аминоксилотной последовательности ацетилирован (Фиг. 1).
Пример 2: Анализ роста клеток с помощью полидезоксирибонуклеотидов
2
Клетки дермальной папиллы (Promocells) культивировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО с использованием среды DMEM (Среда Игла, модифицированная по Дульбекко), содержащей 10% телячьей сыворотки крови (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина.
3
2
Клетки получали путем обработки культивированных клеток трипсином/ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и затем измеряли число клеток с использованием гемоцитометра. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в количестве 3×10 клеток/200 мкл/лунка и затем стабилизировали в течение по меньшей мере 4 часов. После этого среду удаляли, разводили в среде DEME, так чтобы концентрация полидезоксирибонуклеотида (PDRN) составила 50, 100, 200 мкг/мл, и затем обрабатывали клетки и культивировали в течение 72 часов в инкубаторе при 37°С, 5% СО.
Затем клетки извлекали, обрабатывая их трипсином/ЭДТА, и затем измеряли число клеток с помощью гемоцитометра. Скорость роста клеток анализировали, рассчитывая процентные соотношения относительно контрольной группы без обработки PDRN.
В результате, как показано на Фиг. 2, было подтверждено, что скорость роста клеток дермальной папиллы увеличивается по мере увеличения концентрации PDRN для обработки.
Пример 3: Анализ роста клеток под действием пептидов, полученных из Wnt
Для подтверждения изменения формы и скорости пролиферации клеток кератиноциты Т0020001 (AddexBio), фибробласты (АТСС) и клетки дермальной папиллы культивировали в среде DMEM, содержащей 10% телячьей сыворотки крови и 1% пенициллина/стрептомицина.
Затем клетки извлекали путем обработки культивируемых клеток трипсином/ЭДТА, и число клеток измеряли с помощью гемоцитометра. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в количестве 3×10 клеток/200 мкл/лунка и стабилизировали в течение по меньшей мере 4 часов.
2
После этого среду удаляли, разводили средой DEME, так чтобы концентрация пептидов Wnt (Wnt-1, Wnt-2) составляла 10, 100, 1000 и 10000 нг/мл и затем обрабатывали ею клетки и культивировали в течение 72 часов в инкубаторе при 37°С, 5% СО. Затем клетки изучали под микроскопом для анализа морфологии и скорости роста клеток.
В результате, как показано на Фиг. 3, для кератиноцитов по мере увеличения концентрации пептида Wnt-1 скорость роста клеток увеличивалась, и концентрация пептида Wnt-2 100 нг/мл демонстрировала самую высокую скорость роста клеток (Фиг. 3А). Дополнительно действие на рост фибробластов проявлялось при концентрации пептида Wnt-1 10 нг/мл и похожие скорости роста клеток наблюдались при более высоких концентрациях, в то время как никакого изменения не наблюдалось для пептида Wnt-2 по сравнению с контрольной группой (Фиг. 3Б). Наконец, как пептид Wnt-1, так и пептид Wnt-2 вызывали самую высокую скорость роста клеток дермальной папиллы при 100 нг/мл (Фиг. 3В).
Пример 4: Анализ роста клеток при обработке пептидом Wnt в сочетании с PDRN
3
2
Как в Примере 1 клетки дермальной папиллы высевали в 96-луночные планшеты в количестве 3×10 клеток/200 мкл/лунка и стаблизировали в течение по меньшей мере 4 часов. После этого среду удаляли, разводили средой DEME, так чтобы концентрация полидезоксирибонуклеотида (PDRN, BR Pharm Co. Ltd.) составила 25, 50, 100 мкг/мл и пептида Wnt-1+пептид Wnt-2 - 0,1 мкг/мл (каждый по 0,05 мкг/мл), и затем обрабатывали ею клетки и культивировали в течение 72 часов в инкубаторе при 37°С, 5% СО.
После этого клетки извлекали, обрабатывая их трипсином/ЭДТА, и затем подсчитывали число клеток с помощью гемоцитометра. Скорость роста клеток анализировали путем расчета процентных соотношений относительно контрольной группы без обработки PDRN.
В результате, как показано на Фиг. 5, когда обработку выполняли в сочетании с PDRN, скорость роста клеток увеличивалась, и также при увеличении концентрации PDRN для обработки скорость роста клеток дермальной папиллы увеличивалась, по сравнению с обработкой только Wnt-1+Wnt-2.
Пример 5: Анализ экспрессии β-катенина и с-myc
4
2
Как в Примере 1 клетки дермальной папиллы стабилизировали в течение по меньшей мере 4 часов после посева в 6-луночные планшеты в количестве 4×10клеток/лунка. После этого среду удаляли и клетки обрабатывали PDRN, пептидом Wnt-1 и пептидом Wnt-2 в различных концентрациях по отдельности или в комбинации и инкубировали в течение 72 часов в инкубаторе при 37°С, 5% CO.
Затем клетки лизировали путем добавления лизирующего буфера (1 М Трис-HCl, 0,5 М ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 100 мМ PMSF) в каждую лунку, и количество белка оценивали с использованием набора ВСА (бицинхониновая кислота). 20 мкг белка вносили в лунки 10% SDS-полиакриламидного геля и проводили электрофорез при 125В. Белки, разделенные электрофорезом, переносили на мембрану PVDF (поливинилиденфторид) (Immonobilon-P transfermembrane) путем электрофореза при 50 мА в течение 120 минут с использованием буфера для переноса (20% метанол, 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицин).
Для предупреждения неспецифического связывания мембраны блокировали 5% нежирным снятым молоком и затем проводили реакцию при 4°С в течение 12 часов с первичными антителами (β-катенин, c-myc, Santa Cruz Biotechnology, Inc), разведенными 1:1000 в растворе TTBS (137 мМ Трис-Cl, рН 7,4; 20 мМ NaCl; 0,05% Tween-20). После этого мембрану промывали три раза TTBS и проводили реакцию со вторичными антителами (IgG против антител кролика, конъюгированными с HRP (пероксидаза хрена)), разведенными 1: 2000 при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем мембрану промывали три раза TTBS и затем экспрессию белка подтверждали на рентгеновской пленке с использованием набора для диагностики ECL.
В результате, как показано на Фиг. 6, когда обработку выполняли комбинацией Wnt-1+Wnt-2, экспрессия р-катенина увеличивалась по сравнению с обработкой только Wnt-1 или Wnt-2, и когда дополнительно обрабатывали PDRN, было подтверждено, что экспрессия β-катенина увеличивалась зависимым от концентрации образом.
Дополнительно, как показано на Фиг. 7, экспрессия c-myc увеличивалась с увеличением концентрации PDRN, взятой для обработки, и при обработке Wnt в сочетании с PDRN, было подтверждено, что экспрессия c-myc увеличивалась.
Пример 6: Анализ эффекта стимуляции роста волос при обработке пептидом Wnt в сочетании с PDRN у мышей C57BL/6
Для анализа эффекта стимуляции роста волос при обработке пептидом Wnt (Wnt-1+Wnt-2) в сочетании с PDRN проводили эксперименты по росту волос in vivo с использованием мышей C57BL/6, которых наиболее часто используют для тестирования роста волос.
Самок мышей C57BL/6 возрастом семь недель (Orient Bio Co., Ltd.) с похожей относительно друг друга массой подвергали экспериментам в возрасте 8 недель после акклиматизации в течение 1 недели при 25°С и 50% влажности. Мышь помещали в эксикатор, содержащий эфир, подвергали анестезии в течение 1 минуты и удаляли волосы со спины мыши кремом для удаления волос. Пептид Wnt (Wnt-1+Wnt-2, 5 мкг/мл или 15 мкг/мл) и PDRN (2,5 мг/мл или 7,5 мг/мл) применяли трансдермально в области спины, начиная с суток удаления волос, и 200 мкл образца наносили один раз в сутки. После применения в течение 15 суток делали фотографии для подтверждения степени роста волос путем проверки изменения цвета на месте нанесения. 3% Миноксидил использовали в качестве положительного контроля и фосфатный буфер использовали в качестве отрицательного контроля.
В результате, как показано на Фиг. 8, в группе, получавшей обработку пептидом Wnt (Wnt-1+Wnt-2) в сочетании с PDRN, сильно увеличивался рост волос по сравнению с группой отрицательного контроля и проявлялся эффект роста волос близкий к уровню положительного контроля.
Согласно настоящему изобретению полученные из белка Wnt пептиды, полидезоксирибонуклеотиды или их смеси увеличивают секрецию β-катенина и усиливают рост кератиноцитов, фибробластов и клеток дермальной папиллы, представляющих собой клетки, образующие волос, путем активации клеток и активации пути передачи сигнала для стимуляции сигнальной системы роста волос и предупреждения выпадения волос и стимуляции роста волос, и следовательно полученные из белка Wnt пептиды, полидезоксирибонуклеотиды или их смеси, оказывающие вышеуказанное действие, можно использовать в качестве косметической композиции, фармацевтической композиции или оздоровительной пищевой композиции для предупреждения выпадения волос или стимуляции роста волос.
Как подробно описано выше в определенных разделах настоящего изобретения специалистам в данной области техники очевидно, что эти конкретные описания представляют собой только предпочтительные воплощения, и объем настоящего изобретения не ограничен ими. Соответственно, по существу объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Объем настоящего изобретения представлен приложенной формулой изобретения, и следует понимать, что все изменения или модификации, следующие из значения и объема данной формулы изобретения, и их эквиваленты включены в объем настоящего изобретения.
--->
<110>    BR PHARM Co.,Ltd.
<120>    Composition for preventing hair loss or promoting hair growth
<130>    OP-2019-0048
<160>    2
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    10
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Wnt-1
<400>    1
Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asp Gln Phe
1               5                  10
<210>    2
<211>    10
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Wnt-2
<400>    2
Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Tyr His
1               5                  10
<---