СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АВЕНАНТРАМИДОВ В ОВСАХ
METHOD FOR INCREASING CONCENTRATION OF AVENANTHRAMIDES IN OAT GRAINS

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к авенантрамидам и, более конкретно, к способу увеличения концентрации авенантрамидов в овсах.
Овсы уникальны среди хлебных злаков в отношении их способности синтезировать и сохранять некоторые группы биологически активных фитохимических соединений, включая авенантрамиды, авенакозилаты, тритерпеновые сапонины (авенакозиды) и стероидные сапонины (авенацины).
Авенантрамиды представляют собой группу приблизительно из 30 различных алкалоидов N-ароилантраниловой кислоты общей формулы, изображенной на Фиг.1.
Авенантрамиды являются антиоксидантами и, как было показано, биодоступны для усвоения людьми и другими живыми существами, оказывая положительное воздействие на состояние сердечнососудистой системы in vivo.
Было показано, что в случае использования очищенных смесей, авенантрамиды являются биодоступными для усвоения хомяками и людьми, и действуют синергистически с витамином C, увеличивая сопротивляемость окислению LDL-холестерина (холестерина липопротеинов низкой плотности). В другом исследовании была определена фармакокинетика усвоения авенантрамидов у здоровых взрослых людей. При использовании рандомизированного, с контрольным плацебо, тройного перекрестного исследования с очищенными авенантрамидами, при двух уровнях оральной дозы, приблизительно 60 и 120 мг, авенантрамиды показали биодоступность и усиление противоокислительной защитной системы людей, в зависимости от дозы, согласно измерениям уровней глутатиона в плазме. Можно заключить, что для наблюдаемой биологической активности, пороговые уровни авенантрамидов приблизительно от 30 до 60 мг из поступающего с пищей исходного источника, такого как порция в 50 г отрубей овсяного зерна, потребовали бы овсяного продукта с содержанием всех авенантрамидов около 600-1,200 частей на миллион (чнм). Это - существенно более высокая концентрация, чем концентрации, зарегистрированные в настоящее время для существующих разновидностей овса или существующих овсяных продуктов.
Хорошо известно, что овсянка, изготовленная обычно в виде коллоидных суспензий, использовалась поверхностно в течение сотен лет при кожных заболеваниях, таких как экзема, аллергический дерматит, вызванный контактом с сумахом ядовитым, укусы насекомых, загар, и опоясывающий лишай, при которых воспаление, как известно, является главным виновником. В настоящее время авенантрамиды, в количестве около 10 чнм, составляют основной активный ингредиент во многих продуктах рынка средств личной гигиены и для ухода за животными во всем мире благодаря их поверхностной активности против раздражения, зуда и воспаления.
1
2
3
Авенантрамиды показали также профилактические противораковые свойства in vitro. Синтетический авенантрамид С (Фиг.1; n=1, R=OH, R=H, R=OH,) при около 40 чнм, как недавно было показано, in vitro ингибировал быстрое разрастание гладкомышечных клеток и образование оксида азота в культурах эмбриональных клеток стенки аорты как у крысы, так и у человека. В этой системе in vitro, при концентрациях от 4 до 20 чнм очищенная смесь авенантрамидов, из отрубей VAO-6, значительно уменьшала "адгезивность" этих клеток к окисленному LDL-холестерину и ингибировала образование провоспалительных сигнальных молекул, которые способствуют образованию артериальной бляшки на основе холестерина. Кроме того, недавно было найдено, что очищенные овсяные авенантрамиды, в особенности авенантрамид С, обладают противовоспалительной и противопролиферативной активностью в отношении клеточных линий рака толстой кишки при обработке на уровне около 20-50 чнм, но не имели никакого эффекта в случае линий нормальных клеток.
Авенантрамиды являются также мощными антиоксидантами in vitro. Было показано, что авенантрамиды являются ингибиторами определенных патогенных стадий атеросклероза (сердечнососудистого заболевания), главной причины заболеваемости и смертности в Западном обществе. При использовании культуры эпителиальных клеток аорты человека, как отдельные авенантрамиды, так и очищенные смеси овсяных авенантрамидов, экстрагированных из овсяных отрубей, показали противоатерогенную и противовоспалительную биологическую активность. Совсем недавно, механизм противовоспалительного действия авенантрамидов в однослойных культурах клеток аорты человека был приписан их ингибированию активации ядерного фактора кВ, посредством ингибиторного фосфорилирования IkB киназы и Iкк белков, ключевых факторов в инициировании, прогрессировании и осложнении атерогенеза.
Авенантрамиды присутствуют в имеющихся сортах овсяного зерна в концентрациях слишком низких, чтобы оказывать эти благоприятные воздействия. Если исходить из клинических данных, включающих человека, то эффективные минимальные уровни одноразовых доз должны были бы находиться в диапазоне 1000-3000 чнм антиоксиданта.
Однако, североамериканские и скандинавские разновидности покрытого овса обычно содержат от около 4 до около 150 чнм всех авенантрамидов, и эти уровни могут значительно различаться в зависимости от генотипа, окружающей среды, урожайного года и местоположения. Независимо от взаимосвязи генотипа/окружающей среды, содержание авенантрамидов во внешних слоях зерна всегда выше, чем его содержание в крахмальном эндосперме. Это указывает на то, что авенантрамиды локализуются прежде всего во фракции отрубей. Предшествующие усилия в области культивирования показывают, что их уровни могут быть увеличены вплоть до около 130% от начальных уровней в сухих зернах.
Уровни авенантрамидов в цельных зернах могут быть также увеличены посредством физиологических и/или механических процессов. Осолаживание представляет собой процесс замачивания и проращивания зерна злаковых, для того, чтобы изменить состав зерна для разнообразных конечных целей, который практиковался в течение многих тысячелетий. Например, процесс осолаживания приводит к разрушению сложных углеводов, липидов и белка, делая эти резервные источники Сахаров, жирных кислот и аминокислот, питательно более доступными, как для самого зерна, для дальнейшего развития растения из зародыша, так и для тех организмов, которые его потребляют.
Например, было показано, что общее количество авенантрамидов увеличивалось на 150% в течение 48 ч периода проращивания. Было также показано, что общее количество авенантрамидов увеличивалось в цельных овсяных зернах от около 90 до около 110 чнм, то есть происходило 27%-ное увеличение, в течение 10 ч замачивания в водопроводной воде при температуре 20°C. Увеличение уровней всех авенантрамидов зависело от времени и температуры. С увеличением температуры замачивания, уровни увеличивались на целых 50%, приблизительно до 75 чнм в течение 10 ч замачивания. Увеличение температуры выше 20°C, например до 40°C, или продление замачивания, например, до 48 ч, не приводили к дальнейшим увеличениям авенантрамидов. Только стимулирование насыщения водой сухих зерен приводит к увеличениям авенантрамидов, хотя уровни увеличиваются только незначительно, и не приводит к накоплению существенных количеств.
Из существующих исследований очевидно, что современные технологии для увеличения авенантрамидов посредством осолаживания не будут производить осоложенный продукт с достаточно высокими уровнями авенантрамидов, чтобы получить желаемые физиологические изменения свойств, представленные выше. Более того, поскольку процессы осолаживания/прорастания, которые вызывают эти увеличения, приводят также к проросшему семенному продукту с корешками, ростками и частично истощенными осоложенными зернами, особенно, если время осолаживания превышало 2 дня, то пророщенный продукт будет иметь ограниченное использование в любом дальнейшем применении сухого фракционирования/помола из-за присутствия корней, колеоптиля и других анатомических модификаций, связанных с проросшими зернами. Кроме того, существующие технологии были разработаны, главным образом, для покрытых овсов, которые приводили к пророщенному зерну с все еще прикрепленными чешуйками. Шелушение зерна до осолаживания механическими средствами, такими как ударное воздействие или шелушение сжатым воздухом, широко используемые в промышленности, также как вторичные процедуры "шлифовки", то есть удаление трихом, расположенных на внешней стороне овсяного зерна, могут серьезно поставить под угрозу целостность неповрежденного зерна, приводя к поврежденным зернам, что является нежелательным для осолаживания. Кроме того, шелушение и шлифование осоложенного продукта осложнены изменениями в мягкости и плотности осоложенного материала.
Проросшие овсяные зерна, содержащие корешки, ростки и частично истощенные зерна, также трудно измельчить в любые традиционные овсяные продукты, такие как геркулесовые хлопья, овсяные отруби или в овсяную муку, подходящие для введения в непосредственно потребляемые пищевые продукты или для введения в выпекаемые продукты в качестве ингредиента.
Кроме того, принимая во внимание уже наблюдаемые сильные воздействия генотипа/окружающей среды, возможность производства овсяного зерна с высоким содержанием авенантрамидов путем классических методов селекции представляет собой долгосрочное решение, достижение которого могло бы потребовать многих лет.
Поэтому, имеется необходимость в существенном увеличении концентрации авенантрамидов в овсяных зернах, так чтобы потенциальные благоприятные воздействия авенантрамидов, такие как улучшение сердечнососудистого здоровья, могли бы быть реализованы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ получения овсов с увеличенной концентрацией авенантрамидов, при котором овсы в состоянии покоя подвергаются ложному осолаживанию, что приводит к получению овсов с увеличенной концентрацией авенантрамидов без прорастания.
Предпочтительно, в случае, когда овсы не находятся в состоянии покоя, это состояние покоя индуцируется.
Предпочтительно, в случае, когда овсы не находятся в состоянии покоя, это состояние покоя углубляется.
Предпочтительно, овсы анаэробно замачиваются, чтобы индуцировать или углубить состояние покоя.
Предпочтительно, овсы нагреваются сухим теплом перед ложным осолаживанием, чтобы индуцировать состояние покоя.
Предпочтительно, овсы нагреваются сухим теплом от 30 до 40°C в течение от 48 до 72 ч, с последующим дальнейшим сухим нагреванием при температуре около 70°C в течение от 144 до около 168 ч.
Предпочтительно, овсы анаэробно замачиваются путем погружения овсов в воду при температуре от 4 до 40°C в течение от 12 до 18 ч.
Предпочтительно, овсы анаэробно замачиваются в воде, содержащей ион кальция.
Предпочтительно, овсы инкубируются при температуре в от 4 до 40°C в течение от 96 до 120 ч с целью ложного осолаживания.
Предпочтительно, овсы находятся в состоянии покоя, голозерные овсы.
Предпочтительно, увеличенная концентрация авенантрамидов в овсах составляет больше, чем 750 чнм на сухое вещество.
Предпочтительно, овсы подвергаются шелушению, когда овсы покрыты, и овсы находятся в состоянии покоя.
Предпочтительно, овсы сушатся до содержания остаточной влаги от около 3 до 10% от сухого вещества.
Предпочтительно, овсы анаэробно замачиваются до содержания влаги около 35%.
Предпочтительно, внешний отрубной компонент и остаточная крупа без отрубного компонента восстанавливаются, при использовании абразивного помола.
Предпочтительно, стертый отрубной компонент содержит от 3 до 30% начальной массы овсов перед абразивным помолом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Эти и другие особенности изобретения станут более очевидными из следующего описания, в котором сделана ссылка на приложенные чертежи.
На Фиг.1 показана общая структурная формула авенантрамидов.
На Фиг.2 показаны структуры отдельных авенантрамидов.
На Фиг.3 показан типичный профиль ВЭЖХ фракций авенантрамидов.
На Фиг.4 показаны этапы примерного осуществления способа увеличения концентрации авенантрамидов.
На Фиг.5 показано влияние температуры на общую концентрацию авенантрамидов, в обработанных теплом, анаэробно замоченных, голозерных овсах.
На Фиг.6 показан временной ход накопления авенантрамидов в овсах, не находящихся в состоянии покоя, во время ложного осолаживания при 37°C.
На Фиг.7 показано распределение общего количества авенантрамидов в неосоложенном зерне, определенное при сухом помоле, посредством системы Satake.
На Фиг.8 показано распределение общего количества авенантрамидов в зерне одного культурного сорта растения (VAO-48) после ложного осолаживания, определенное при сухом помоле, посредством системы Satake.
На Фиг 9 показано распределение общего количества авенантрамидов в зерне другого культурного сорта растения (VAO-22) после ложного осолаживания, определенное при сухом помоле, посредством системы Satake.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Теперь будет сделана подробная ссылка на некоторые специфические варианты осуществления изобретения, включая лучшие способы, рассмотренные изобретателями, для того чтобы выполнить изобретение. Примеры этих специфических вариантов осуществления показаны в сопровождающих чертежах. Не смотря на то, что изобретение описано в сочетании с этими специфическими вариантами осуществления, понятно, что при этом нет намерения ограничить изобретение описанными вариантами осуществления. Напротив, это предназначено для того, чтобы охватить альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в пределах сущности и объема изобретения, как определено приложенной Формулой изобретения. В следующем описании сформулированы многочисленные специфические детали, чтобы обеспечить полное понимание настоящего изобретения. Настоящее изобретение на практике может быть осуществлено без некоторых или без всех этих специфических деталей. В других примерах хорошо известные операции по процессу не были описаны подробно, чтобы чрезмерно не затенить настоящее изобретение.
В этом описании и приложенной Формуле изобретения, формы единственного числа включают множественные ссылки, если контекст ясно не диктует иначе. Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же самое значение, которое обычно понятно любому специалисту в данной области техники, к которой принадлежит это изобретение.
Настоящее изобретение было описано в отношении одного или более вариантов осуществления. Однако, для специалистов в данной области будет очевидно, что может быть сделан ряд изменений и модификаций без отступления от объема изобретения, который определен приложенной Формулой изобретения.
Обычный овес {Avena sativa) является разновидностью злакового зерна. Овес имеет разнообразное применение. Овес для потребления человеком используется для приготовления каши, зернового завтрака, печенья и закусок. В сельском хозяйстве один из наиболее популярных способов использования овса - это корм для домашнего скота. Овес составляет значительную часть пищевого рациона лошадей и регулярно используется также для питания крупного рогатого скота. Овес также используется в некоторых брендах собачьего и куриного корма. Овес выращивался в течение двух тысяч лет в различных регионах по всему миру. Прежде, чем потребляться в качестве пищи, овес использовался в медицинских целях, использование для которых все еще занимает почетное место. Выращивание овса в Европе было широко распространено, и овес составлял важную коммерческую сельскохозяйственную культуру, так как был главным пищевым продуктом для людей многих стран, включая Шотландию, Великобританию, Германию и Скандинавские страны.
Зерновые оболочки, то есть нижняя и верхняя цветковые чешуи, играют важную роль во время развития зерен. Зерновые оболочки снабжают развивающиеся зерна углеводами. Аминокислоты являются главным источником азота для развивающегося зерна, и главная часть его может быть внесена нижней и верхней цветковыми чешуями. Кроме того, будучи внешним покрытием, нижняя и верхняя цветковые чешуи могут защитить маленькие цветки и зерна от агрессивного воздействия болезнетворных микроорганизмов и насекомых.
Большая часть овсов, после сбора урожая, имеет чешуйки, прикрепленные к зернам. Есть также культурные сорта растений, например, VAO-48, которые являются голозерными, то есть чешуйки свободно прилегают к зерну и остаются в поле во время комбайнирования и уборки урожая.
Зрелые овсяные зерна, освобожденные от материнского растения в состоянии покоя, могут проявлять покой либо в качестве покрытых семян, либо на основе покоя зародыша, либо обоих, известный как первичный покой.
Термин "покой" предназначен, для описания состояния, в котором семенам временно препятствуют прорасти, даже при условиях окружающей среды, обычно благоприятных для прорастания. Эти условия могут быть сложной комбинацией воды, света, температуры, газов, механических ограничений, семенных оболочек, и гормональных структур. Покой семян был описан, например, в "Genetic and Molecular Control of Seed Dormancy, B. Li and M.E. Foley, Trends in Plant Science, (1997) Vol.2 (10), с.384-389, содержание которого включено здесь ссылкой.
Покой задерживает прорастание и дает время для распространения семян и предотвращает прорастание всех семян в одно и то же время. Регулирование времени прорастания защищает некоторые семена и рассаду от нанесения повреждений или гибели во время коротких периодов плохой погоды или от мигрирующих травоядных животных.
После периода "послеуборочного дозревания" и при благоприятных условиях окружающей среды, таких как свет, температура, влажность, зерна, не находящиеся в покое, подвергаются быстрой перемене, приводящей к началу прорастания.
Однако, частично или полностью при послеуборочном дозревании зерна, не находящиеся в покое, подвергнутые действию неблагоприятных условий окружающей среды, могут проявить индуцированное состояние покоя, известное как "вторичный покой".
Термин "вторичный покой" предназначен для описания состояния, когда некоторые семена, не находящиеся в состоянии покоя, и находящиеся в состоянии после покоя, подвергаются действию неблагоприятных для прорастания условий, таких как высокие температуры. Термин "покой" предназначен, чтобы включать любые семена в состоянии покоя, включая первичный покой, например, но не ограниченный покрытыми семенами, или истинным покоем зародыша; вторичный покой, например, но не ограниченный, химически вызванным, физически вызванным или вызванным любым другим фактором покоем, естественный вторичный покой; и любые другие формы покоя.
Многие садовые растения имеют семена, которые быстро прорастают, как только появится вода и будет достаточно тепло, хотя их дикие предки имели состояние покой. Эти культивированные растения испытывают недостаток в покое из-за поколений отборочного давления со стороны растениеводов и садовников, которые выращивали и хранили растения, у которых отсутствовало состояние покоя.
Наоборот, имеются культурные сорта растений, например, VAO-48 из овсяных семян, описанных ниже, которые были генетически отобраны, чтобы иметь длительный вторичный покой.
Когда овсы обрабатывают посредством замачивания и позволяют им прорасти, как практикуется во время типичного процесса осолаживания, хорошо известного специалистам в области осолаживания, уровни авенантрамидов в проросших сеянцах увеличиваются зависимым от времени образом, по сравнению с начальными уровнями авенантрамидов в сухих семенах. Польза осолаживания в течение короткого периода, для увеличения уровней авенантрамидов, ограничивается скромными увеличениями авенантрамидов, а удлиненные периоды осолаживания, например, 4-5 дней, дают в результате пророщенный зерновой продукт с более высокими уровнями авенантрамидов, но уменьшенной полезностью для обычного помола и операций рынков.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, большие количества авенантрамидов накапливаются посредством индукции вторичного покоя и ложного осолаживания, как описано ниже. Когда овсы во вторичном покое подвергаются процессу осолаживания, уровни авенантрамидов, к удивлению, могут быть резко увеличены вплоть до 25-35 раз, при том, что они даже не прорастают.
Другими словами использование вторичного покоя предсказуемым образом, чтобы создать условия, в которых не происходит прорастания, может изменить пищевую ценность цельных зерен, по сравнению с пророщенными зернами.
Во время замачивания и проращивания находящихся в покое овсов, вплоть до 6 дней, авенантрамиды продолжают вырабатываться, несмотря на то, что ни один из макроскопических визуальных показателей прорастания не наблюдается, например, радикальное появление чего-то нового, разветвление и вытягивание, колеоптиль и распространение поросли и рост в длину, и т.д. Эта обработка, при которой типичные процедуры осолаживания продолжаются, однако зерно в состоянии покоя не прорастает, в дальнейшем относится к "ложному осолаживанию".
Термин "ложное осолаживание" предназначен для того, чтобы описать обработку, подобную или идентичную техническим приемам осолаживания, которые практикуются специалистом в данной области. Однако, поскольку семена находятся в состоянии покоя, например во вторичном покое, семена, подвергнутые ложному осолаживанию, не прорастают.
Ложное осолаживание представляет новый технологический прием для изменения состава злаковых зерен вообще, и овсов в частности. Подавление прорастания овсов во время осолаживания дает в результате цельный продукт овсяного зерна с повышенным содержанием авенантрамидов, способствующий включению его в многообразную традиционную еду, корм и на рынки промышленного использования.
Метод количественного анализа авенантрамидов
Качественное и количественное определение авенантрамидов в составе овсяного продукта выполняли, как описано ниже. Образцы овсяного зерна, то есть семена, сушили в термостате при температуре 37°C до постоянной массы (приблизительно 48 ч) и хранили в вакуумных полиэтиленовых пакетах при температуре -20°C до анализа. Перед экстракцией семена измельчали, используя коммерческую кофемолку. Экстракцию и количественные анализы обычно выполняли, используя два повторных эксперимента.
Экстракция
b
b
К 75 мл кипящего окисленного 80% этанола (этанол: вода: ледяная уксусная кислота, 80:19.9:0.1 (по объему)), добавляли 10 г измельченного овсяного образца при энергичном перемешивании вместе с 5 мг дитионита натрия в качестве антиоксиданта. Смесь удаляли из тепла и позволяли охладиться в течение 20 мин при комнатной температуре при перемешивании. Все содержимое затем переливали в калиброванную стеклянную хроматографическую колонку, оборудованную фритованным диском. Суспензию оставляли стабилизироваться под действием силы тяжести, формирующей слегка уплотненный экстракционный слой (объем слоя=V мл) с прозрачным супернатантом. Супернатант сливали самотеком, и экстракционный слой элюировали 3×V окисленного 80%-ного этанола посредством "перколяционного экстрагирования", получая в результате прозрачный зеленовато-желтый элюат.
Очищение авенантрамидов посредством гидрофобного взаимодействия и абсорбционной хроматографии ароматических соединений:
b
b
Чтобы удалить липофильные компоненты из этого экстракта, добавляли хроматографические гранулы Octyl Sepharose™ CL 4-В (0,5 мл на экстрагированный г), и смесь, концентрировали до сухого состояния в вакууме при 40°C посредством ротационного выпаривания. Чтобы предотвратить окисление, к смеси добавляли дистиллированную воду, чтобы гарантировать, что авенантрамид был осажден во время высушивания. Высушенную смесь повторно суспендировали в окисленном 50%-ном этаноле (этанол: вода: ледяная уксусная кислота, 50:49.9:0.1 (по объему)) и количественно переносили в калиброванную стеклянную хроматографическую колонку, содержащую Octyl Sepharose™ CL 4-В, которая ранее была упакована под действием силы тяжести и предварительно уравновешена в окисленном 50%-ном этаноле (например, для 10 г образца, 25 мл, конечный объем слоя V=30 мл). Колонку затем элюировали 3×V окисленным 50%-ным этанолом. Объединенный элюат концентрировали в вакууме при 40°C посредством ротационного выпаривания, чтобы дать экстракт по существу свободный от липидов.
b
b
b
Чтобы удалить сапонины, флавоноидные гликозиды, растворимые в спирте белки и пептиды, свободные сахара, ароматические, органические и аминокислоты, концентрированный экстракт растворяли в небольшом объеме (около 3 мл окисленного 40%-ного этанола (этанол: вода: ледяная уксусная кислота, 40:59.9:0.1 (по объему)) на 10 г образца) и очищали посредством хроматографии, используя Sephadex™ LH-20. Раствор количественно переносили в калиброванную стеклянную хроматографическую колонку, содержащую Sephadex™ LH-20, которая ранее была упакована под действием силы тяжести и предварительно уравновешена в окисленном 40%-ном этаноле (например, для 10 г образца, конечный объем слоя V=25 мл). Сначала сапонины, свободные сахара, аминокислоты и т.д. удаляли посредством элюирования 2×V окисленного 40%-ного этанола. Абсорбированные авенантрамиды восстанавливали посредством элюирования 3×V окисленного 95%-ного этанола (этанол:вода:ледяная уксусная кислота, 95:4.9:0.1 (по объему)). Снова добавляли воду перед испарением вместе с 5 мг дитионита натрия, чтобы предотвратить окисление. Элюат концентрировали до сухого состояния в вакууме при 40°C посредством ротационного выпаривания, чтобы дать очищенную фракцию авенантрамидов.
Анализ фракции авенантрамидов методом ВЭЖХ
18
18
В первом методе очищенную фракцию авенантрамидов растворяли в 5 мл 50% этанола (этанол:вода, 50:50 (по объему)), фильтровали через 0.45 μм фильтр и анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образцы (10 ил) вводили, используя инжектор Rheodyne™, в сорбент C колонки для обращено-фазовой хроматографии (ODS Hypersil™ Cis, 5 μм, 4.6 мм ×250 мм), поддерживали температуру 25°C, используя CERA Column Cooler 250, оборудованный защитной колонкой C. Анализы методом ВЭЖХ выполняли, используя насос Thermo Separation Products (TSP) Spectra System P4000 и контролировали на 330 нм, используя спектральный сканирующий детектор TSP SpectraSystem™ UV3000 и программное обеспечение ChromQuest. Скорость потока поддерживали на уровне 0.8 мл в мин. Растворители для ВЭЖХ представляли собой A: метанол, B: вода и C: 5%-ная уксусная кислота. Градиент растворителя (% по объему) составлял 40А:55В:5С, линейно увеличиваясь до 50А:45В:5С в течение 40 мин, и линейно увеличиваясь до 80А:15В:5С в течение 15 мин, затем достигая 100А в течение 3 мин и удерживаясь в течение 3 мин. Градиент растворителя возвращали к исходному состоянию в течение 3 мин, позволяли уравновеситься в течение 4 мин. Пики всех основных авенантрамидов идентифицировали путем сравнения относительного времени удерживания и УФ спектров (контролировали от 240 до 380 нм) с аутентичными стандартами. Все второстепенные авенантрамиды идентифицировали только посредством ВЭЖХ-масс-спектрометрии.
Во втором методе систему растворителя первого метода изменяли следующим образом: Растворителями для ВЭЖХ были A: метанол, B: вода и C: 0.1 М фосфорная кислота. Градиент растворителя (% по объему) составлял 45А:45В:10С, линейно увеличиваясь до 60А:30В:10С в течение 55 мин, затем достигая 100А в течение 3 мин и удерживаясь в течение 3 мин. Градиент растворителя возвращали к исходному состоянию в течение 3 мин, позволяли уравновеситься в течение 4 мин.
18
18
В третьем в методе образцы (10 μл) инжектировали в сорбент C колонки для обращено-фазовой хроматографии (Zorbax Stable™ bond C, 3.5 μм, 4.6 мм ×150 мм), поддерживали температуру 30°C. Растворители для ВЭЖХ представляли собой A: метанол, B: вода и C: 0.5 М муравьиная кислота. Градиент растворителя (% по объему) составлял 45А:45В:10С, линейно увеличиваясь до 55А:35В:10С в течение 24 мин, и линейно увеличиваясь до 70А:20В:10С в течение 9 мин, затем достигая 95А:5С в течение 3 мин и удерживаясь в течение 3 мин. Градиент растворителя возвращали к исходному состоянию в течение 3 мин, позволяли уравновеситься в течение 3 мин.
ВЭЖХ масс-спектрометрический анализ фракции авенантрамидов Пики второстепенных авенантрамидов были идентифицированы посредством анализа ВЭЖХ-МС-МС с использованием масс-спектрометра Thermo Finnigan LCQ Advantage™, оборудованного детекторной системой с ультрафиолетовой диодной матрицей Surveyor™ HPLC-UV (условия ВЭЖХ: Hypersil™ ODS, 120, 5 μ, колонка 250 ×4.6-мм. ВЭЖХ УФ-контроль выполняли на 330 нм. Использовали ту же самую систему растворителя, как описано выше в первом методе, при скорости потока 0.8 мл в мину. Градиент растворителя (% по объему) составлял 40А:55В:5С, линейно увеличиваясь до 60А:35В:5С в течение 80 мин, и линейно увеличиваясь до 80А:15В:5С в течение 5 мин, затем достигая 100 A в течение 3 мин и удерживаясь в течение 3 мин. Градиент растворителя возвращали назад к исходному состоянию в течение 3 мин, позволяли уравновеситься в течение 3 мин. Условия МС МС:тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI, режим определения отрицательных ионов), напряжение питания: 4,5 кВ, капиллярное напряжение: 10 вольт, капиллярная температура: 300°C, поток газа через трубку: 80% полный, добавочный поток газа: 20% макс (Никакого расщепления потока).
Количественная оценка авенантрамидов
Отдельные авенантрамиды количественно оценивали путем определения площадей пика на 330 нм относительно внешнего стандарта аутентичного авенантрамида A и выражали как массовые эквиваленты авенантрамида A. Общее количество авенантрамидов рассчитывали посредством суммирования всех количеств отдельных авенантрамидов, рассчитанных как массовые эквиваленты авенантрамида A, и выражали в частях на миллион (чнм) эквивалентов авенантрамида A на основе сухого вещества.
Авенантамиды представляют собой группу из около 30 различных алкалоидов N-ароилантраниловой кислоты с общей формулой, изображенной на Фиг.1.
На Фиг.2 показаны структуры отдельных авенантрамидов, присутствующих как в осоложенных, так и в не осоложенных овсах.
На Фиг.3 показан типичный профиль ВЭЖХ фракций авенантрамидов из осоложенных овсов при использовании третьего метода, описанного выше, и с обозначениями, указанными на Фиг.2.
На Фиг.4 показаны этапы способа повышения концентрации авенантрамидов в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Если овсы не находятся в состоянии покоя 402, может быть индуцировано состояние вторичного покоя 404. В противном случае, овсы находятся в состоянии покоя, обычно естественного или индуцированного вторичного покоя.
Семена, находящиеся в состоянии вторичного покоя, могут утратить покой в течение какого-то промежутка времени, поэтому, даже если семена находятся в состоянии покоя, может быть включен необязательный этап, чтобы углубить состояние покоя 406.
Один не ограничивающий способ индуцировать или углубить вторичный покой представляет собой анаэробное гидрирование или тепловую обработку овсов.
Осолаживание обычно начинается с замачивания овсов в воде до тех пор, пока в овсах не будет достигнуто некоторое содержание влаги. Замачивание обычно осуществляется с аэрированными овсами, позволяя овсам получить дополнительный кислород.
Состояние покоя овсов может быть индуцировано 404 или углублено 406 посредством анаэробного замачивания. При анаэробном замачивании овсы обрабатываются теплом или гидрируются анаэробно, например, при температурах выше 30°C в течение от 12 до 18 ч.
Затем овсы подвергаются ложному осолаживанию 408, то есть осолаживнию в подобных или идентичных условиях, но без прорастания, например, при 23-37°C в течение от 96 до 120 часов. После ложного осолаживания овсы сушат 410, например, при температуре 35°C в течение от 24 до 48 ч перед хранением или дальнейшей обработкой.
Следующее изложение представляет собой не ограничивающие примеры, показывающие увеличение концентрации авенантрамидов, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Пример 1: Состояние покоя против состояния не покоя овсов. Образцы семян свежесобранного урожая в состоянии покоя, голозерного, посеянного голыми семенами овса селекционной линии (VAO-48), и образцы семян, не находящегося в покое, голозерного, посеянного голыми семенами овса селекционной линии (VAO-22, зарегистрированного в настоящее время как разновидность AC GEHL), осолаживали как описано ниже.
Приблизительно по 20 г семян от каждой селекционной линии быстро поверхностно стерилизовали посредством погружения в 1% водный раствор гипохлорита натрия в течение 20 мин при комнатной температуре с мягким перемешиванием, затем удаляли и тщательно промывали, чтобы удалить излишки раствора гипохлорита натрия. Семена затем проращивали в покрытых чашках Петри (150×15 мм) на дисках из влажной фильтровальной бумаги при комнатной температуре и при освещении рассеянным светом в течение 4 дней. Отдельный образец 20 г от каждой селекционной линии был отложен в качестве контрольного.
После четырех дней определяли скорости прорастания, этих двух образцов. Семена, включая как проросшие, так и не проросшие, затем удаляли и сушили в семясушилке при комнатной температуре в течение 2 дней. Средние скорости прорастания составили:
Голозерные, оголенные в состоянии покоя (VAO-48)
1%
Голозерные, оголенные не в состояние покоя (VAO-22)
75%
Общее содержание авенантрамидов этих двух образцов как до, так и после (ложного) осолаживания определяли, используя первый метод, описанный выше, и суммировали в Таблице 1.
Таблица 1
Накопление авенантрамидов в овсах в состоянии покоя и не покоя
Тип овса
Продукт
Всего авенантрамидов
% увеличения
Кратность увеличения
Состояние покоя
До осолаживания
77 чнм
После ложного осолаживания
534 чнм
590
6.9
Состояние не покоя
До осолаживания
54 чнм
После осолаживания
340 чнм
530
6.3
В таблице 1 показано, что овсы, находящиеся в покое, к удивлению, накапливали авенантрамиды во время периода ложного осолаживания.
Семена в состоянии покоя имеют морфологию такую же, как и исходный продукт, и в отличие от семян, не находящихся в состоянии покоя, были свободны от корешков, колеоптилей, и появляющихся листочков и проростков.
Пример 2: Влияние анаэробного замачивания и хранения семян в покое на состояние покоя.
Известно, что овсы в состоянии покоя со временем теряют свое состояние вторичного покоя в зависимости от условий хранения (например, уровня кислорода, температуры, содержания влаги). В частности, низкий уровень содержания кислорода продлевает состояние покоя и/или ингибирует прорастание. Также селекционерам овса и специалистам в области сохранения семенной зародышевой плазмы известно, что семена, которые хранятся при температуре ниже нуля (например, -20°С) могут сохранять большую часть своих генетически унаследованных свойств в течение долгого периода времени. Однако в реальности, для крупномасштабного процесса, такого как осолаживание, постоянное обеспечение овсов в состоянии покоя должно быть доступным на регулярной основе в течение всего года, вне зависимости от дорогостоящего хранения при низкой температуре, чтобы поддерживать в семенах состояние покоя. Поэтому, предпочтительно, продлить и углубить покой в овсах, находящихся в состоянии покоя, и индуцировать вторичный покой в овсах, не находящихся в состоянии покоя.
Семена находящегося в покое овса линии, используемой в Примере 1 (VAO-48), которые хранили в течение 3 недель при комнатной температуре, затем 1 неделю при температуре -20°C, погружали на разное время, вплоть до около 48 часов, в водопроводную воду, приблизительно при 23°C. В маломасштабном эксперименте семена распределяли в герметичные чашки Петри, полностью заполненные водой и запечатанные парафильмом (то есть анаэробное замачивание). После приблизительно 2, 4, 6, 8, 12, 24, и 48 ч семена удаляли и быстро сушили на воздухе в семясушилке при комнатной температуре. Семена затем поверхностно стерилизовали и осолаживали как описано выше, в течение четырех дней при комнатной температуре при освещении рассеянным светом. После четырех дней определяли скорость прорастания как описано выше.
В следующем эксперименте использовали большие количества семян, и анаэробное замачивание выполняли в герметичной конической колбе Эрленмейера, заполненной водопроводной водой и запечатанной парафильмом (Parafilm™). Эта "конусообразность" в верхней части колбы облегчает удаление остаточного воздуха и обеспечивает погружение семян ниже уровня воды. Результаты обоих экспериментов суммированы в Таблице 2.
Таблица 2
Влияние времени анаэробного замачивания на прорастание
Продолжительность
Чашка Петри
Колба Эрленмейера
замачивания
% прорастания после четырех дней
% прорастания после четырех дней
0.0 ч
48.5±4.5
35.5±3.5
2.0 ч
30.0±1.0
22.0±1.0
4.0 ч
16.5±2.5
10.5±5.5
6.0 ч
Нет данных
9.5±6.5
8.0 ч
6.0±2.0
2.5±0.5
11.75 ч
3.0±1.0
Нет данных
24.0 ч
19.5±9.5
Нет данных
47.5 ч
16.5±1.5
Нет данных
Было найдено, что просто при намокании или замачивании семян в течение ночи, приблизительно от 8 до 18 ч без воздействия воздуха скорость прорастания падает значительно, от около 50% без всякого замачивания до менее чем 10% после анаэробного замачивания. Это указывает на то, что прорастание может быть значительно уменьшено посредством анаэробного замачивания в течение от 8 до 18 ч. Дальнейшие эксперименты по оптимизации температуры замачивания показали, что температура от 30 до 32°C в течение 18 ч приводила в результате к подходящей скорости прорастания менее чем 3% прорастания (то есть >97% состояния покоя).
Чтобы проверить задержку признаков состояния покоя линии овса, находящегося в покое, после различных периодов хранения, эксперименты по прорастанию выполняли, используя образцы, хранящиеся при комнатной температуре в течение различных периодов времени, вплоть до 14 недель. В дополнение, дублирующие пробы дополнительно подвергали анаэробному замачиванию в течение ночи, быстро сушили на воздухе и затем проверяли на прорастание в подобных условиях. В обоих экспериментах с временным циклом семена проращивали в чашках Петри при комнатной температуре и при освещении рассеянным светом в течение четырех дней и рассчитывали скорости прорастания. Результаты обоих экспериментов показаны в Таблице 3.
Таблица 3
Влияние хранения и анаэробного замачивания на прорастание
Недели хранения при 23°C
Без замачивания % прорастания
Анаэробное замачивание при 32°C % прорастания
0
35.0±2.6
6.7±2.1
2
1.0±1.0
2.3±2.3
4
2.7±0.6
3.7±0.6
6
Нет данных
Нет данных
8
9.0±2.0
2.0±1.0
10
29.0±3.6
7.0±3.6
14
89.7±1.5
30.3±4.0
Состояние покоя линии овса, находящегося в покое, углубляется во время первых 8-10 недель хранения, затем значительно ослабевает так, что прорастает около 90% семян. Как и ожидалось, овсы, анаэробно замоченные в течение 16 ч, показали более глубокое состояние покоя после хранения в течение 8 недель или больше при комнатной температуре, чем соответствующие не замоченные образцы. Таким образом, состояние покоя овсов, которые постепенно теряют покой при хранении при комнатной температуре, может быть углублено и таким образом больше подходить для этого процесса.
Пример 3: Влияние предварительной тепловой обработки и анаэробного замачивания на состояние покоя и накопление авенантрамидов в голозерных овсах, не находящихся в состоянии покоя.
Существуют другие способы углубления и индуцирования состояния вторичного покоя. Не ограничивающий примерный способ углубления и индуцирования состояния покоя овсов представляет собой обработку овсов сухим теплом при температуре от 30 до 70°C в течение различных периодов времени, вплоть до 2 недель. Эта процедура обычно выполняется в две фазы: первая фаза включает температуры около 30°C в течение нескольких дней, чтобы понизить содержание влаги в семенах до около 3%, и сопровождается второй фазой с температурой около 70°C в течение вплоть до недели. Такая обработка была показана также для эффективного снижения образования на семенах плесени и бактериальных спор. При этом режиме семена не повреждаются, а в некоторых случаях скорость прорастания фактически увеличивается.
Семена (500 г) линии (VAO-2) голозерного овса, не находящегося в состоянии покоя, нагревали в конвекционной сушильной печи при температуре 37°C в течение 72 ч и затем при температуре 70°C в течение 144 ч. После охлаждения до комнатной температуры, обработанные теплом семена разделяли на две сокращенные пробы. Семена одной группы (5 повторов) анаэробно замачивали в течение 18 часов при температуре 32°C, семена другой группы замачивали не анаэробно (5 повторов). Семена обеих группы поверхностно стерилизовали, как описано выше, затем осолаживали в чашках Петри (150×50 мм) при освещении рассеянным светом при комнатной температуре в течение четырех дней. После осолаживания оценивали скорость прорастания семян (% проросших) и содержание авенантрамидов, используя первый метод, описанный выше, (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида А). Результаты суммированы в Таблице 4 (CO - стандартное отклонение).
Таблица 4
Влияние анаэробного замачивания на скорость прорастания и накопление авенантрамидов в предварительно обработанных теплом овсах, не находящихся в состоянии покоя, после четырех дней осолаживания
Обработка
% прорастани я (±CO)
Содержание авенантрамидов, (Эквиваленты авенантрамида А)
Авенантр А (чнм)
Авенантр В (чнм)
Авенантр С (чнм)
Всего Авенатр (чнм)
Не нагреты, не замочены
35.0±2.6
Нет данных
Нет данных
Нет данных
77
Нагреты, но не замочены
14.9±4.2
34.2
42.7
24.9
272.4
Нагреты и замочены
0.4±0
42.3
64.0
40.7
445.1
Как описано выше, как сухое нагревание овсов при двухфазной тепловой обработке, так и анаэробное замачивание в течение 18 ч, по отдельности снижали прорастание овсов во время осолаживания (то есть углубляли состояние покоя). Когда при совместном использовании тепловую обработку сопровождали анаэробным замачиванием, скорость прорастания снижалась практически до 0%, и семена оставались в состоянии покоя на протяжении четырех дней периода осолаживания. Кроме того, общее содержание авенантамидов за четыре дня "ложного осолаживания" овсов при совместных обработках тепловой и анаэробного замачивания повысилось от 77 чнм в начале до 445 чнм после ослаживания, представляя увеличение почти на 480% (в 5.8 раза), по сравнению с начальными значениями.
3
Замечено, что двухфазный процесс сухого нагревания для индуцирования состояния покоя не приводит к потере всхожести. Когда обработанные теплом овсы инкубировали в присутствии 100 чнм гиббереллина (например, GA) в течение 5 дней, наблюдали почти полное восстановление прорастания.
Пример 4: Влияние температуры на накопление авенантрамидов во время ложного осолаживания.
При традиционном осолаживании оптимальные температуры выбираются таким образом, чтобы максимально увеличить прорастание и сопутствующий гидролиз запасов крахмала в зерне до свободных Сахаров для последующей ферментации. Для этих целей оптимальные температуры обычно составляют ниже, чем около 25°C. Для исследования влияния температуры на накопление авенантрамидов выполняли ложное осолаживание при четырех различных температурах в темноте в течение четырех дней. Для сравнения ложное осолаживание проводили также при комнатной температуре при освещении рассеянным светом. Для этих исследований была использована разновидность голозерного овса, не находящегося в состоянии покоя, который был переведен в состояние покоя посредством предварительной тепловой обработки и анаэробного замачивания.
Для этого процесса выбрали четыре температуры 3°C, 23°C (комнатная тепература), 30°C и 37°C, и ложное осолаживание выполняли в темноте. Образец для сравнения осолаживали при 23°C при освещении рассеянным светом. Осолаживание при 3°C выполняли в лабораторном холодильнике и осолаживание при 30°C и 37°C выполняли в конвекционной печи с регулируемой температурой.
Использовали образец 50 г голозерных овсов AC Baton (AC Baton, скорость прорастания >95%). Семена подвергали тепловой обработке следующим образом: 72 часа при 37°C, затем около 144 ч при 70°C, как описано выше в Примере 3, быстро охлаждали до комнатной температуры (23°C), затем анаэробно замачивали в водопроводной воде при 32°C в течение 18 ч и сушили на воздухе в семясушилке в течение около четырех часов. Семена поверхностно стерилизовали, как описано выше, но только используя 0.25% водный раствор гипохлорита натрия, при комнатной температуре в течение 1 часа, затем разделяли на четыре сокращенные пробы и "ложно осолаживали" при четырех различных температурах в темноте в течение 96 ч, используя конвекционную печь с регулируемой температурой как в Примере 3.
После осолаживания оценивали скорость прорастания семян (% прорастания), семена сушили на воздухе в семясушилке при комнатной температуре в течение ночи и определяли содержание авенантрамидов посредством первого метода, описанного выше (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида А). Содержание трех основных авенантрамидов (авенантрамидов A, B и C), всех других авенантрамидов и общее количество авенантрамидов рассчитывали и сравнивали с соответствующими уровнями в неосоложенном продукте. Результаты суммированы в Таблице 5.
Таблица 5
Влияние температуры на накопление авенантрамидов в течение четырех дней ложного осолаживания овса (AC Baton), не находящегося в состоянии покоя
Обработка
% прораст ан(±CO)
Содержание авенантрамидов, (эквиваленты авенантрамида А)
Авенантр. A (чнм±CO)
Авенантр. B (чнм±CO)
Авенантр. C (чнм±CO)
Все другие (чнм±CO)
Общее Авенантр (чнм±CO)
Контроль н.
96.0±2*
(28.0±0.6)*
(29.4±0.3)*
(16.1±4.5)*
(40.6±3.1)*
(114.1±8.5)*
4 дня 3°C в темноте
0.0±0.0
31.1±0.2
38.2±0.2
22.4±0.5
50.6±3.2
142.2±4.1
4 дня 23°C в темноте
3.1±1.3
71.4±4.7
88.0±7.7
65.3±4.7
390.9±21.6
615.6±38.7
4 дня 30°С в темноте
Не обнаружен
106.3±0.7
178.1±1.9
150.2±6.5
751.7±42.7
1,186.3±51.7
4 дня 37°C в темноте
0.0±0.0
276.4
251.6
234.3
1,235.3
1,997.6
*Значения для % прорастания представляют скорость прорастания за четыре дня. Значения для авенатрамидов в скобках представляют уровни до осолаживания.
С точки зрения сравнения, в Таблице 5 показано, что уровни накопленных авенантрамидов А, В, С и всех других авенантрамидов увеличивались во время ложного осолаживания при увеличении температуры осолаживания. Самая низкая используемая температура (3°C) дала увеличение от 114 чнм в неосоложенном продукте до около 142 чнм после осолаживания (около 25% или в 1.25 раз), в то время как самая высокая температура (37°C) привела к общим уровням авенантрамидов почти 2,000 чнм (около 1,650% или в 17.5 раз). При использованном здесь режиме предварительной обработки, как высокие, так и низкие температуры немного уменьшали скорость прорастания.
Влияние температуры на общее накопление авенантрамидов в течение 96 часов ложного осолаживания при использовании не находящегося в состоянии покоя (>95% жизнеспособных семян) голозерного овса AC Baton, который был переведен в состояние покоя путем процедуры нагревания и анаэробного замачивания, показано на Фиг.5. Можно легко увидеть поразительное увеличение по сравнению с контрольными (то есть неосоложенными) семенами, показанное простым осолаживанием при температурах более высоких, чем температуры, используемые в большинстве процессов, практикуемых в области осолаживания (обычно от 10 до 25°C).
Пример 5: Влияние времени на накопление авенантрамидов в течение ложного осолаживания.
Для изучения временной зависимости накопления авенантрамидов в течение процесса ложного осолаживания, этот процесс выполняли в течение различных периодов, используя разновидность голозерного овса, не находящегося в состоянии покоя, и определяли уровни накопления авенантрамидов.
Использовали образец 120 г голозерных овсов AC Baton (AC Baton, скорость прорастания >95%). Семена подвергали тепловой обработке, как в Примере 3, быстро охлаждали до комнатной температуры (23°C), затем анаэробно замачивали в водопроводной воде при 32°C в течение 18 ч и сушили на воздухе в семясушилке в течение около четырех часов. Семена поверхностно стерилизовали, как описано в Примере 4, затем "ложно осолаживали" в темноте при 37°C в течение различных периодов времени в мелком желобе на влажных бумажных полотенцах, и покрывали алюминиевой фольгой. Скорость прорастания составляла менее чем 1% после четырех дней. После каждого периода осолаживания, представительную сокращенную пробу (приблизительно 30 г) семян удаляли, сушили при комнатной температуре (с принудительной подачей воздуха) в течение 4 ч, затем приводили к постоянной массе путем сушки при 37°C в течение ~40 ч и хранили при -20°C до анализа на содержание авенантрамидов посредством ВЭЖХ, используя первый метод, описанный выше (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида А), и сравнивали с неосоложенным продуктом. Результаты суммированы в Таблице 6 и показаны на Фиг.6.
Таблица 6
Временной ход накопления авенантрамидов во время "ложного осолаживания" не находящихся в состоянии покоя овсов AC Baton при 37°C
Время (ч)
Содержание Авенантрамдов, (Эквиваленты авенантрамида А)
Авентр. А (чнм±CO)
Авентр. В (чнм±CO)
Авентр. С (чнм±CO)
Все другие (чнм±CO)
Общее Авентр. (чнм±CO)
Контрольный (0)
(28.0±0.6)*
(29.4±0.3)*
(16.1±4.5)*
(40.6±3.1)*
(114.1±8.5)*
24
75.3±0.4
62.0±0.8
55.9±1.8
126.6±0.6
319.8±2.3
48
111.8±0.3
104.3±0.9
76.8±1.9
291.3±2.6
584.2±5.7
72
139.1±1.0
148.9±0.8
88.6±3.2
461.5±0.1
838.1±3.2
96
144.4±17.9
175.6±28.4
79.9±17.9
557.3±92.8
957.2±161.3
*3начения для авенантрамидов в скобках представляют уровни до осолаживания.
Из данных Таблицы 6 и Фиг.6 можно видеть, что уровень авенантрамидов A, B, C и общего количества авенантрамидов увеличился в зависимости от продолжительности периода ложного осолаживания, и временной ход увеличения имеет некоторый линейный характер вплоть до 3 дней и выравнивается к 4 дню. Общее накопление всех авенантрамидов за 4дня представляло увеличение приблизительно на 740% (в 8.4 раза) по сравнению с начальным значением.
Пример 6: Влияние ионов кальция при замачивании на накопление авенантрамидов во время ложного осолаживания находящегося в состоянии покоя овса VAO-48.
+2
+2
Чтобы проверить имеет ли какое-либо влияние присутствие иона кальция Ca во время фазы анаэробного замачивания на накопление авенантрамидов во время следующей фазы осолаживания, использовали ряд увеличивающихся концентраций Ca в воде для замачивания, и определяли содержание авенантрамидов после осолаживания.
2
2
Образцы 25 г голозерного, без трихом, овса VAO-48 в состоянии покоя анаэробно замачивали, либо в воде, либо в растворах с различной концентрацией USP (реагента фармацевтической чистоты) CaCl⋅(HO) при 35°C. После замачивания в течение 18 ч и воздушной сушки в семясушилке в течение около 4 ч, семена поверхностно стерилизовали, как описано выше, затем "ложно осолаживали", используя чашки Петри (150×50 мм) в темноте, при 30°C в термостате с контролируемой температурой в течение четырех дней. Скорость прорастания во всех случаях была ниже, чем 1% после четырех дней. После осолаживания семена удаляли, сушили при комнатной температуре (с принудительной подачей воздуха) в течение четырех часов, затем приводили к постоянной массе путем сушки при 37°C в течение ~40 ч и хранили при -20°C до анализа на содержание авенантрамидов, используя третий метод, описанный выше (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида А), и сравнивали с неосоложенным продуктом. Результаты суммированы в Табл. 7.
+2
+2
+2
+2
Как показано в Таблице 7, уровень отдельных авенантрамидов в неосоложенных семенах был очень низким, и общее содержание авенантрамидов перед осолаживанием составляло только около 32 чнм. После замачивания в воде без добавления иона кальция и четырех дней осолаживания при 30°C, уровни всех авенантрамидов были значительно выше, и общая концентрация авенантрамидов 439 чнм представляла приблизительно 13.7-кратное увеличение. С увеличением концентрации Ca в воде для замачивания, концентрация авенантрамидов в осоложенных зернах показала тенденцию к увеличению, при этом увеличение по сравнению с замачиванием без всякого добавления Ca составило от около 439 чнм до около 757 чнм при добавлении 1% Ca (приблизительно в 1.7 раза), и общее увеличение по сравнению с неосоложенными семенами при 1% Ca было приблизительно в 23.6 раза. Эти результаты показывают, что добавление Ca во время периода замачивания увеличивает последующее накопление авенантрамидов во время осолаживания.
Таблица 7
Влияние концентрации CaCl<sub>2</sub> во время анаэробного замачивания на накопление авенантрамидов во время ложного осолаживания VAO-48 при 30°C
Концентрация CaCl<sub>2</sub>, добавленного к воде для замачивания
Содержание авенантрамидов, (Эквиваленты авенантрамида А)
Авенантр. А (чнм±CO)
Авенантр. В (чнм±CO)
Авенантр. С (чнм±CO)
Все остальные (чнм±CO)
Общее Авенантр. (чнм±CO)
Не осоложенный
5.21±0.10
6.30±0.35
2.72±0.28
17.88±2.08
32.12±2.82
0%
32.4±1.8
103.9±7.4
63.5±8.9
239.2±26.4
438.9±44.5
0.05%
37.7±5.6
122.0±14.8
81.5±9.4
287.3±30.9
528.4±30.9
0.10%
27.2±11.4
113.4±5.8
75.7±4.6
251.4±10.4
467.7±32.1
0.50%
59.9±1.1
155.3±2.3
126.4±2.8
400.1±0.3
741.7±6.5
1.0%
68.7±3.3
149.0±8.2
138.1±4.0
401.1±15.4
757.0±30.9
Пример 7: Влияние высоких концентраций хлорида кальция при обработке замачиванием на накопление авенантрамидов во время ложного осолаживания овса VAO-22, не находящегося в состоянии покоя.
+2
В Примере 7 использовали голозерный, без трихом овес линии VAO-22, не находящийся в состоянии покоя, и более высокую концентрацию Ca в воде для замачивания.
2
2
2
Использовали образец 1,300 г селекционных семян овса VAO-22, голозерного, без трихом, не находящегося в состоянии покоя, (скорость прорастания после четырех дней 84%). Семена подвергали тепловой обработке, как в Примере 5. Образец 25 г использовали как контрольный, представляющий неосоложенные семена, и хранили при -20°C до анализа. Остальной продукт, обработанный теплом, анаэробно замачивали при 35°C, либо в 1.0%, либо 2.0% CaCl*(HO) в течение 18 часов и сушили на воздухе в семясушилке около четырех часов. Семена затем поверхностно стерилизовали, как описано выше, и "ложно осолаживали", в темноте, при 30°C в термостате с контролируемой температурой в течение четырех дней, используя чашки Петри (150×50 мм). После осолаживания семена удаляли, сушили при комнатной температуре (с принудительной подачей воздуха) в течение четырех часов, затем приводили к постоянной массе путем сушки при 37°C в течение ~40 часов и хранили при -20°C до анализа на содержание авенантрамидов посредством ВЭЖХ, используя третий метод, описанный выше (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида A), и сравнивали с неосоложенным продуктом. Результаты суммированы в Таблице 8.
2
2
2
2
2
2
2
Как можно видеть в Таблице 8, уровни отдельных авенантрамидов и их суммарный уровень в этой разновидности овсов увеличивались в течение четырех дней ложного осолаживания после замачивания в растворе CaCl при концентрациях как 1, так и 2%. Например, содержание авентранамида В увеличилось от 3.4 чнм до почти 80 чнм (на 2,240%; в 23.4 раза выше начального значения), когда его анаэробно замачивали в течение 18 часов в 1% растворе CaCl и ложно осолаживали в течение четырех дней при 30°C, в то время как в случае 2% раствора CaCl уровень достиг 103 чнм (на 2,930%; в 30.3 раза выше начального). Для авентранамида С соответствующие увеличения составили от 2.3 чнм до 65.2 чнм (на 2,735%; в 28.4 раза выше начального) для 1% раствора CaCl и до 100.1 чнм (на 4,252%; в 43.5 раза выше начального) для 2% раствора CaCl. Содержание других авенантрамидов увеличилось подобным образом, и общие уровни авенантрамидов представляли увеличение на 2,307% и 3,190% при 1% и 2% CaCl (в 24.1 и в 31.9 раза выше начального) соответственно. Данные этих двух примеров явно подтверждают повышающую роль CaCl в диапазоне концентраций, по меньшей мере, до 2%, добавляемого во время этапа анаэробного замачивания, соответственно на накопление и/или сохранение авенантрамидов в осоложенных овсах.
Таблица 8
Влияние концентрации CaCl<sub>2</sub> во время анаэробного замачивания на накопление авенантрамидов в течение ложного осолаживания VAO-22 при 30°C
Концентрация CaCl<sub>2</sub>, добавленного к воде для замачивания
Содержание авенантрамидов, (Эквиваленты авенантрамида А)
Авентр. А (чнм±CO)
Авентр. В (чнм±CO)
Авентр. С (чнм±CO)
Все остальные (чнм±CO)
Общее Авентр. (чнм±CO)
Не осоложенные
2.6±0.37
3.4±0.77
2.3±0.39
13.7±1.5
22.1±3.01
1.0%
27.0±0.22
79.7±0.26
65.2±0.26
360.1±2.4
532.0±3.16
2.0%
46.7±0.08
103.0±0.06
100.1±0.38
461.7±8.8
711.4±9.32
Пример 8: Влияние помола посредством системы Satake находящихся в покое овсов VAO 48, до и после ложного осолаживания на накопление авенантрамидов в сухих фракциях помола - отрубях и крупы без отрубных оболочек.
Как отмечали ранее, ложное осолаживание дает увеличение авенантрамидов в овсяном зерне, которое по большей части является по существу таким же как неосоложенное зерно, и поэтому может легко использоваться для переработки в отруби и продукт с удаленными отрубными оболочками посредством традиционного сухого абразивного помола, например, посредством помольной системы Satake.
Образец (~380 г) голозерного, без трихом, овса VAO-48 в состоянии покоя мололи, используя помольную систему Satake, чтобы выделить следующие последовательные фракции:
0-7% (по массе) фракция отрубей
7-15% (по массе) фракция отрубей
15-23% (по массе) фракция отрубей
>23% (по массе) крупа без отрубных оболочек.
Все фракции помола сразу же замораживали на льду и хранили при -20°C до анализа.
Дублирующие пробы не молотого цельного зерна и фракций после помола Satake анализировали на содержание авенантрамидов, посредством ВЭЖХ, используя первый метод, описанный выше, (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида A), и результаты суммировали в Таблице 9 и на Фиг.7.
Таблица 9
Уровни авенантрамидов в цельных семенах и фракциях абразивного помола Satake не осоложенных овсов VAO-48
Используемый неосоложенный продукт
Содержание авенантрамидов, (эквиваленты авенантрамида А)
Авентр. А (чнм±CO)
Авентр. В (чнм±CO)
Авентр. С (чнм±CO)
Все другие (чнм±CO)
Общее Авентр. (чнм±CO)
Цельные семена
8.5±0.7
9.9±1.1
2.3±0.6
21.1±1.0
41.9±3.4
0-7% фракция отрубей
23.0±0.2
25.3±1.5
7.0±2.2
110.0±12.1
165.3±16.0
7-15% фракция отрубей
10.5±0.7
13.5±0.7
7.3±0.3
23.6±1.9
54.9±0.2
15-23% фракция отрубей
7.1±0.5
9.1±0.6
2.0±0.1
15.2±0.7
33.4±0.3
>23% крупа без оболочек
4.4±0.2
5.2±0.5
1.3±0.1
8.3±0.2
19.2±0.5
Как показано в Таблице 9, содержание авенантрамидов в неосоложенных овсах VAO-48 в значительной мере варьировалось между фракциями. При этом, наиболее удаленный от центра слой отрубей (то есть 0-7%) показывал самые высокие уровни (почти в четыре раза уровня уровня в цельных зернах), которые уменьшались по направлению внутрь, в следующих фракциях отрубей. Оставшаяся крупа без отрубных оболочек, после того как удалили 23% зерна, имела самый низкий уровень авенантрамидов меньше, чем половина содержания авенантрамидов в целом зерне. Эта тенденция снижения содержания с удалением внешних слоев видна не только в общем содержании авенантрамидов, но, по большей части, также и в уровнях каждого из отдельных авенантрамидов.
Другой образец (377 г) того же продукта, который обрабатывали теплом, как в описанном выше Примере 5, и хранили при -20°C перед использованием, анаэробно замачивали в водопроводной воде при 35°C в течение 18 ч. Семена поверхностно стерилизовали, как в Примере 4, затем "ложно осолаживали" при 30°C в термостате с контролируемой температурой в течение четырех дней. Скорость прорастания после четырех дней во всех случаях была ниже, чем 1%. После осолаживания семена удаляли, сушили до постоянной массы при 37°C в термостате с контролируемой температурой и хранили при -20°C до помола. Следующие фракции помола Satake готовили как описано выше:
0-10.7% (по массе) фракция отрубей
10.7-20.6% (по массе) фракция отрубей
>20.6% (по массе) крупа без отрубных оболочек
Дублирующие пробы не молотых цельных зерен осоложенного овса и каждой из фракций помола анализировали на содержание авенантрамидов, посредством ВЭЖХ, используя второй метод, описанный выше, (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида A). Результаты суммировали в Таблице 10 и на Фиг.8.
Таблица 10
Уровни авенантрамидов в цельных семенах и фракциях абразивного помола Satake ложно осоложенных овсов VAO-48
Используемый продукт
Содержание авенантрамидов, (эквиваленты авенантрамида А)
Авентр. А (чнм±CO)
Авентр. В (чнм±CO)
Авентр. С (чнм±CO)
Все другие (чнм±CO)
Общее Авентр. (чнм±CO)
Цельное осоложенное зерно
186.1±10.6
324.8±19.2
303.2±22.0
1,056±64.1
1,870±116
0-10.7% фракция отрубей
335.8±11.0
564.7±13.5
425.7±24.1
2,506±168
3,832±219
10.7-20.6% фракция отрубей
286.3±10,1
468.9±16.7
444.3±23.1
1,744±60.3
2,943±110
>20.6% крупа без оболочек
117.3±11.7
209.8±15.7
210.9±26.5
589.7±63.8
1,128±118
Тенденция снижения уровней авенантрамидов с увеличением степени удаления оболочек была подобной для отдельно отобранных фракций, хотя видимая степень падения была менее разительной, чем в неосоложенных зернах, и относительное содержание промежуточного продукта отрубей и крупы с удаленными отрубными оболочками было пропорционально немного выше, чем подобных фракций в неосоложенном продукте. Общий уровень авенантрамидов, накопленных во фракции отрубей 0-10.7%, достигал такой величины как 3,832 чнм, представляя 2,218% (в 22.2 раза) увеличение по сравнению с подобной фракцией неосоложенного зерна и 91.5 кратное увеличение по сравнению с цельным неосоложенным продуктом.
Если фракции отрубей 0-10.7% и 10.7-20.6% объединяли для получения общей фракции 0-20.6% (то есть 20.6% от выработки продукта при помоле), то общая концентрация авенантрамидов в этом продукте составляла около 3,388 чнм.
Эти результаты показывают, что внешние слои зерна содержат самые высокие уровни всех авенантрамидов
Пример 9: Влияние помола Satake голозерного, без трихом, не находящегося в покое, овса VAO-22, до и после ложного осолаживания на накопление авенантрамидов во фракциях сухого помола - отрубях и в крупе с удаленными отрубными оболочками.
Хотя концентрация авенантрамидов во внешних слоях ложно осоложенных отрубей является высокой по отношению к уровням в цельных зернах, выход этих отрубей (от 7-10% от осоложенного зерна) является низким. Из-за строения зерна, имеющего характерную удлиненную форму и образованную в центре глубокую складку, чистое разделение отрубей и эндосперма ограничено. Выработка отрубей с минимальным загрязнением тканью эндосперма ограничивается слабым удалением оболочек и низким выходом фракции отрубей. Однако, голозерный, без трихом овес селекционной линии VAO-22, не имеющий состояния покоя, имеет короткое зерно и относительно неглубокую складку и похоже на пшеничное зерно по величине и конфигурации, что делает его более пригодным для абразивной помольной системы Satake.
Был использован другой образец продукта, использованного в Примере 7, голозерного, без трихом, не имеющего состояние покоя овса селекционной линии VAO-22, (84% скорость прорастания после четырех дней). Семена обрабатывали теплом, как в Примере 5. Образец 25 г, представляющий неосоложенные семена, использовали в качестве контрольного и хранили при -20°C до анализа.
Остальной продукт, обработанный теплом, анаэробно замачивали при 35°C, в водопроводной воде в течение 18 ч. Семена затем поверхностно стерилизовали, как описано в Примере 5, и "ложно осолаживали", в темноте, при 30°C в термостате с регулированием температуры в течение четырех дней. После осолаживания семена удаляли, сушили до постоянной массы при 37°C в термостате с регулированием температуры и хранили при -20°C до помола. Следующие фракции помола Satake готовили как описано выше:
0-10.1% (по массе) фракция отрубей
10.1-20.1% (по массе) фракция отрубей
>20.1% (по массе) крупа без отрубных оболочек
Дублирующие пробы не молотых цельных зерен осоложенного овса и каждой из фракций помола анализировали на содержание авенантрамидов, посредством ВЭЖХ, используя третий метод, описанный выше, (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида А), и сравнивали с неосоложенным продуктом. Результаты суммировали в Таблице 11 и на Фиг.9.
Таблица 11
Уровни авенантрамидов в цельных семенах и фракциях абразивного помола Satake ложно осоложенных овсов VAO-22
Используемый продукт
Содержание авенантрамидов, (эквиваленты авенантрамида А)
Авентр. А (чнм±CO)
Авентр. В (чнм±CO)
Авентр. С (чнм±CO)
Все другие (чнм±CO)
Общее Авентр. (чнм±CO)
Цельное неосоложенное зерно
7.3±0.6
10.1±0.3
7.7±2.3
16.6±1.6
41.7±4.1
Цельное осоложенное зерно
97.7±0.6
162±0.1
201.4±3.5
647.1±68.5
1,108±73
0-10.1% фракция отрубей
267.4±6.6
246.4±13.6
311.8±19.5
1,372±80
2,197±120
10.1-20.1% фракция отрубей
288.4±9.1
272.0±9.3
353.1±18.8
1,256±29
2,169±67
>20.1% крупа без оболочек
93.6±8.6
109.6±8.1
136.5±7.5
405.6±39.0
745.3±63
Общее содержание авенантрамидов в цельных осоложенных зернах, показанное в Таблице 11, увеличилось от около 42 чнм до около 1,100 чнм, представляя увеличение по сравнению с неосоложенными зернами около 2,560% (в 26.6 раза). Уровень авенантрамидов во фракции отрубей 0-10.1% увеличился почти до 2,200 чнм, представляя 5,170% увеличение (в 52.7 раза) авенантрамидов в этом продукте, по сравнению с уровнями в цельном неосоложенном зерне. Подобные увеличения видны также во фракции отрубей 10.1-20.1%, и если объединить эти две фракции для образования общей фракции 0-20,1% (при 20,1% выхода молотого продукта), получится общая концентрация авенантрамидов около 2,183 чнм.
Это ниже, чем аналогичные результаты, показанные в Таблице 10, полученные при использовании овсов VAO-48, но все еще представляют значительное увеличение авенантрамидов при выходе помола около 20%. Очевидно, однако, то что этот овес не имеет тенденции быстрого уменьшения содержания авенантрамидов в аналогичной промежуточной фракции помола, наблюдаемой для продукта VAO-48.
Также ясно из Примеров 8 и 9, что фракционирование при сухом абразивном помоле, такое как фракционирование, получаемое при помоле посредством системы Satake неосоложенных и ложно осоложенных, голозерных, без трихом овсов, может использоваться для производства смесей из отрубей с общими концентрациями авенантрамидов любых желаемых уровней, и таких высоких, как около 3,000 чнм, из продукта стой же самой степенью удаления оболочек, чтобы минимизировать изменения в составе других компонентов, таких как белок, β-глюкан, фитат и других, локализованных внутри зерна.
Пример 10: Накопление авенантрамидов в разновидностях покрытого не находящегося в покое овса после четырех дней ложного осолажиания при 30°C.
Несмотря на экономические преимущества использования разновидностей голозерного без трихом овса, существуют потенциальные применения технологии, когда включение шелухи в конечный продукт может быть оправдано, например, но не ограничиваясь, применение в кормах, промышленное фракционирование не для пищевых применений, когда удаление шелухи может оказаться не экономичным.
Осолаживание покрытых овсов с использованием технологии, разработанной в настоящем изобретении, приведет к продукту, в котором шелуха либо удаляется после осолаживания, либо еще присутствует в продукте. Попытки шелушить покрытые овсы и удалять волоски (трихомы) с помощью обычного шелушильного и полирующего оборудования приводят в некоторой степени к механическому повреждению зерен и последующим осложнениям во время процесса осолаживания.
Несмотря на это, делались попытки использовать покрытые овсы посредством осторожного шелушения коммерческих овсов и осолаживания, следуя тем же процедурам, которые описаны выше. В качестве альтернативы также испытывались цельные покрытые овсы, как описано ниже.
Использовали образец, приблизительно 500 г семян, покрытого экспериментального овса Jordan, не находящегося в состоянии покоя. Семена с чешуйками обрабатывали теплом, как в Примере 5, и поверхностно стерилизовали, как в Примере 5. Сокращенную пробу 80 г использовали в качестве контрольной, представляющей неосоложенные семена, и хранили при -20°C до анализа. Остальной, обработанный теплом продукт, анаэробно замачивали при 35°C в водопроводной воде в течение 18 ч. Семена затем поверхностно стерилизовали, как в Примере 5, используя 0,25% водный раствор гипохлорита натрия, при комнатной температуре в течение 1 ч и "ложно осолаживали" в темноте при 30°C в термостате с регулированием температуры в течение четырех дней. После осолаживания семена удаляли, сушили до постоянной массы при 37°C в термостате с регулированием температуры и хранили при -20°C. Дублирующие пробы цельных осоложенных овсов анализировали на содержание авенантрамидов посредством ВЭЖХ, используя третий метод, описанный выше (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида А) и сравнивали с неосоложенным продуктом.
Использовали образец 1,000 г покрытого не находящегося в состоянии покоя овса AC Goslin. Семена с чешуйками обрабатывали теплом, как в Примере 5, механически шелушили, используя маленький вальцовый шелушитель, чтобы избежать повреждения зерна, и поверхностно стерилизовали, как в Примере 5. Сокращенную пробу 25 г использовали в качестве контрольной, представляющей неосоложенные семена, и хранили при -20°C до анализа. Остальные семена анаэробно замачивали при 35°C в водопроводной воде в течение 18 ч, быстро сушили на воздухе в течение четырех часов в семясушилке при комнатной температуре и поверхностно стерилизовали, как в Примере 5, используя 0,25% водный раствор гипохлорита натрия при комнатной температуре в течение 1 ч. Семена затем "ложно осолаживали" в больших чашках Петри (150×15 мм) на влажных фильтровальных бумажных дисках при комнатной температуре и при освещении рассеянным светом в течение четырех дней. После осолаживания семена удаляли сушили в течение четырех дней в семясушилке и хранили при -20°C до анализа. Дублирующие пробы цельных осоложенных овсов анализировали на содержание авенантрамидов посредством ВЭЖХ, используя первый метод, описанный выше (μг эквивалентов авенантрамида А/г сухой массы=чнм авенантрамида A), и сравнивали с неосоложенным продуктом.
Результаты суммировали в Таблице 12.
Таблица 12
Уровни авенантрамидов в цельных покрытых овсах до и после четырех дней ложного осолаживания при 30°C
Используемый продукт
Содержание авенантрамидов, (эквиваленты авенантрамида А)
Авентр. А (чнм±CO)
Авентр. В (чнм±CO)
Авентр. С (чнм±CO)
Все другие (чнм±CO)
Общее Авентр. (чнм±CO)
Jordan Цельные неосоложенные семена, (чешуйки включены)
3.5±0.1
3.1±0.4
3.5±0.4
47.0±4.6
57.1±5.4
Jordan Цельные осоложенные семена, (чешуйки включены)
19.6±0.3
20.1±0.3
34.9±0.5
108.5±6.3
183.1±6.7
AC Goslin Цельные неосоложен ны е семена, (без чешуек)
31.7±1.1
35.4±1.3
33.3±7.7
56.8±3.4
157.2±13.4
AC Goslin Цельные осоложенные семена, (без чешуек)
24.1±0.5
30.0±0.7
31.8±5.2
101.6±3.6
187.4±1.8
Как можно видеть из Таблицы 12, неосоложенный неповрежденный образец с чешуйками имел общее содержание авенантрамидов около 57 чнм. Во время осолаживания в течение четырех дней при 30°C, семена накапливали авенантрамиды, составив в сумме 183.7 чнм, представляя увеличение около 220% по сравнению с неосоложенным образцом.