Способ выделения сперматозоидов из эякулята пациентов с нарушением сперматогенеза для использования в программах экстакорпорального оплодотворения и/или криоконсервации
METHOD FOR ISOLATING SPERMATOZOA FROM THE EJACULATE OF PATIENTS WITH IMPAIRED SPERMATOGENESIS FOR USE IN IN VITRO FERTILIZATION AND/OR CRYOPRESERVATION PROGRAMS

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и клинической эмбриологии.
В структуре причин бесплодия в парах примерно половина случаев приходится на нарушение фертильности у мужчин. Одним из проявлений нарушения репродуктивной функции у мужчин является нарушение сперматогенеза, при котором может отмечаться резкое снижение концентрации сперматозоидов в эякуляте (сперме)  - олигозооспермия и криптозооспермия (единичные сперматозоиды в осадке  эякулята после центрифугирования).
Выделение единичных сперматозоидов из эякулята в тяжелых случаях олигозооспермии или при криптозооспермии в целях вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) может быть крайне затруднено и представляет существенную проблему. Существующие методы обработки эякулята в данных случаях могут быть неэффективны из-за крайне малого количества сперматозоидов, часто неподвижных. При невозможности выделения сперматозоидов из эякулята пациентам может быть рекомендовано использование спермы донора  или  хирургическое получение сперматозоидов из придатка и/или яичка [Вспомогательные репродуктивные технологии и искусственная инсеминация. Клинические рекомендации (протокол лечения) МЗ РФ 05.03.2019 №15-4/и/2-1908].
Существуют следующие способы обработки эякулята в целях выделения из него сперматозоидов для ВРТ [Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пятое издание. Всемирная организация здравоохранения. «Медико-генетический научный центр» РАН. Издательство «Капитал Принт», Москва, 2012].
1. Простое отмывание. Метод основан на центрифугировании эякулята в отмывочной среде. В результате осаждения эякулят отмывают от семенной плазмы, которую удаляют в виде супернатанта после центрифугирования, а все клеточные элементы (клетки эпителия и округлые клетки), неклеточные элементы (дебрис, желатиновые гранулы и т.п.), а также сперматозоиды, концентрируются в осадке (Фиг. 2). При достаточной концентрации сперматозоидов в сперме их выделение методом простого отмывания не представляет сложности и является рутинным методом. Однако в случаях тяжелой олигозооспермии или криптозооспермии единичные сперматозоиды могут залипать и теряться в объеме полученного осадка, а их последующий отбор для ВРТ может быть крайне затруднен или  невозможен.
2. Прямой метод swim-up. Метод основан на способности сперматозоидов выплывать из семенной жидкости  в отмывочную среду. Прямой метод swim-up может быть выполнен либо наслаиванием культуральной (отмывочной) среды на разжиженный эякулят, либо подслаиванием спермы под культуральную среду. Затем подвижные сперматозоиды перемещаются в культуральную среду. Эта процедура дает более низкое количество сперматозоидов, чем отмывание, но помогает отобрать их по подвижности. Метод применим к сперме с относительно нормальными характеристиками концентрации и подвижности сперматозоидов. В случаях выраженной олигозооспермии и криптозооспермии прямой метод swim-up неэффективен.
3. Отмывание в градиенте плотностей. При выполнении этого метода используют центрифугирование спермы в градиенте плотностей, содержащем коллоидные шарики, покрытые силаном, которые разделяют клетки по их плотности. Кроме того, подвижные сперматозоиды активно проникают через градиент и формируют небольшой осадок на дне пробирки. Полученный в результате центрифугирования в градиенте плотностей супернатант (надосадочную  жидкость) удаляют, а из образовавшегося под коллоидным слоем осадка отбирают сперматозоиды, которые  могут быть использованы при оплодотворении ооцитов или криоконсервированы. Метод не применим к выделению из спермы единичных сперматозоидов в случаях тяжелой олигозооспермии или криптозооспермии.
Таким образом, выбор способа выделения сперматозоидов из эякулята и его эффективность напрямую зависят от исходных параметров эякулята (Фиг. 1).
Известен способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины по патенту РФ 2526494 [МПК С12N 7/00, опубл. 20.08.2014 г.]. Способ предусматривает  отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы  и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах. Согласно изобретению сперму центрифигируют в градиенте плотности (Sil-Select Plus) при 300 g в растворах в течение 20 минут, затем удаляют супернатант. Осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируют пипеткой, добавляют среду для промывки спермы  FertiCult Flushing medium и центрифугируют при 300 g 10 минут, после чего удаляют супернатант до осадка. Далее осадок, содержащий сперматозоиды покрывают 2 мл  среды FertiCult Flushing medium, пробирку помещают в инкубатор на 80-90 минут, наиболее подвижные сперматозоиды передвигаются в среду, их аспирируют в объеме 0,7 мл.  Данный способ применим к обработке спермы и выделению из нее сперматозоидов отмытых от вируса и включает в себя комбинацию общепринятых методов обработки спермы: центрифугирование в градиенте плотности и простую отмывку с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка. Способ используется при обработке спермы с относительно нормальными характеристиками:  в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Способ не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности.
Известен способ подготовки спермы для внутриматочной инсеменации [патент РФ 2317072 МПК А61К 31/02, А61Р 15/08, опубл. 20.02.2008 г.] путем забора спермы, добавления физиологического раствора и двухкратного центрифугирования по 10 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования в полученную массу сперматозоидов вводят перфторан в соотношение 1:3, выдерживают в течение 3-5 минут,  проводят процедуру инсеминации.  В указанном способе использован метод простой отмывки спермы с последующим самостоятельным  всплытием подвижных сперматозоидов из осадка.  Способ применим к обработке спермы с относительно нормальными характеристиками:  в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Способ не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности.
Технической проблемой, решаемой предлагаемым изобретением, является выделение сперматозоидов, в том числе неподвижных и при их критически малом (единичном) количестве в случаях выраженной олигозооспермии или криптозооспермии из объема эякулята, когда другие методы обработки неэффективны, с возможностью их последующего использования для оплодотворения ооцитов и/или криоконсервации.
Технический результат состоит в получении (выделении) чистой фракции сперматозоидов (в том числе единичных) из спермы пациентов с выраженным нарушением сперматогенеза,  которые можно использовать для оплодотворения ооцитов методом внутрицитоплазматической инъекции в ооцит  и/или криоконсервации.
Для достижения вышеуказанного технического результата в способе  выделения сперматозоидов из эякулята пациентов с нарушением сперматогенеза отделение единичных сперматозоидов от других клеточных и неклеточных элементов  эякулята  осуществляют путем,  по меньшей мере, двух циклов центрифугирования, с отбором  для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, центрифугирование проводят при  200-350 g в течение 1-2 минут, при этом циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка.
В большинстве случаев циклы центрифугирования проводят после предварительной обработки эякулята методом простого отмывания от семенной плазмы в течение 1-3 последовательных циклов центрифугирования при 300-600 g в течение 5-10 минут. В случаях выраженной олигоспермии (снижение объема эякулята) предварительная отмывка эякулята от семенной плазмы не требуется.
Среднее количество последовательных циклов центрифугирования составляет от 3 до 8. При каждом последующем цикле параметры центрифугирования (центробежная сила и время) могут быть сохранены, а могут быть увеличены относительно первого цикла и/или предыдущего цикла, при этом центробежная сила находится в пределах 200-350 g, а время в пределах 1-2 минут. В частном случае выполнения изобретения центрифугирование проводят при 300 g в течение 1 минуты при объеме материала 8-12 мл.
Для концентрирования выделенной фракции сперматозоидов в минимальном объеме, полученный в последнем цикле супернатант центрифугируют  при 250-600 g в течение 5-15 минут.
Предложенный способ позволяет выделить из эякулята пациентов с нарушением сперматогенеза даже единичные мужские половые клетки и использовать их для оплодотворения, особенно при их критически малом количестве, когда общепринятые методы выделения могут быть неэффективными.
Предложенный способ основан на методе дифференциального центрифугирования, который ранее никогда не использовался при работе со спермой.
Дифференциальное центрифугирование - это метод выделения и очистки различных биологических объектов, таких как вирусы, клетки, субклеточные органеллы, белки и нуклеиновые кислоты, которые растворены или диспергированы в биологически релевантных растворителях [De Duve, C. Exploring cells with a centrifuge. Nobel Lecture. 1974, http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/ laureates/1974/duve-lecture.html].
Центрифугирование вызывает осаждение частиц, которые тяжелее растворителя. Исходный раствор обычно содержит многокомпонентную смесь частиц, которые различаются по размеру и плотности, а, следовательно, и по скорости их осаждения. Метод дифференциального центрифугирования позволяет выборочно осаждать интересующие компоненты в результате повторяющихся циклов центрифугирования - в центробежном поле все частицы (в данном случае - клетки) оседают по-разному: крупные быстрее мелких. На дне пробирки в результате центрифугирования образуется осадок или седимент частиц.  Жидкость над осадком называется супернатантом, из него можно собрать достаточно чистую фракцию самых маленьких частиц. Таким образом клетки, у которых имеется достаточная разница в размере и скорости седиментации, можно отделить друг от друга, при этом необходима определенная комбинация относительного центробежного ускорения и времени центрифугирования, эффективная для выделения компонентов данной клеточной смеси [Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (19 April 2018). «Centrifugation and Ultracentrifugation». Wilson and Walker's Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology: 424–453. doi:10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273].
Принцип дифференциального центрифугирования в изобретении впервые применяют к выделению сперматозоидов из эякулята. Сперматозоиды по массе меньше  других элементов, присутствующих в эякуляте, поэтому их можно эффективно отделить от них. В результате дифференциального центрифугирования при подобранном для данной клеточной суспензии экспериментальным путем режиме центрифугирования,  возможно получение верхней фракции (супернатанта), свободной от эпителиальных клеток, гранулоцитов, клеток сперматогенного эпителия и клеточного дебриса и неклеточных элементов, но  содержащей сперматозоиды.
Предложенный  дифференциальный подход в выделении мужских половых клеток значительно более эффективен (Фиг. 3) по сравнению с традиционным  методом  центрифугирования (простой отмывки) (Фиг. 2),  так как позволяет избежать осадка, в котором теряются или залипают сперматозоиды, что делает их последующее  выделение в ряде случаев невозможным ввиду их критически малого количества.
Изобретение поясняется следующими  материалами.
>
Фиг. 1. Методы обработки эякулята и их эффективность  при различных состояниях эякулята: А) при нормальной концентрации сперматозоидов 15 млн/мл; Б) при выраженной олигозооспермии; В) при криптозооспермии.
Фиг. 2. Осадок эякулята при криптозооспермии, полученный в результате обработки методом простого отмывания. Сперматозоиды отмечены стрелкой. Отбор сперматозоидов из осадка для оплодотворения затруднен или невозможен.
Фиг. 3. Сперматозоиды (отмечены стрелкой), выделенные из эякулята при криптозооспермии в результате дифференциального центрифугирования. Отбор сперматозоидов для оплодотворения возможен.
Способ получения единичных сперматозоидов из эякулята при нарушении сперматогенеза для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации, осуществляют следующим образом. Полученный эякулят в полном объеме помещают в пробирку для центрифугирования и доводят объем до 8-12 мл отмывочной средой для гамет человека на основе ХЕПЕС-буфера.  При необходимости предварительно осуществляют простое отмывание от семенной плазмы в течение 1-3 последовательных циклов центрифугирования при 300-600 g в течение 5-10 минут.  Полученный в результате простого отмывания осадок ресуспендируют в отмывочной среде в объеме 8-12 мл центрифугируют при заданных параметрах центробежной силы и времени при 200-350 g в течение 1-2 минут. Центробежная сила и время центрифугирования зависят от исходного объема образца, степени его контаминации. При выборе режима дифференциального центрифугирования для каждого случая учитывают, что сильно контаминированные образцы следует доводить отмывочной средой до большего объема (10-12 мл). Применение центробежной силы ниже 200 g и/или времени центрифугирования менее 1 минуты при объеме  является малоэффективным, так как отличные от сперматозоидов клеточные и неклеточные элементы не оседают в полной мере на дно пробирки;  применение центробежной силы выше 350 g и/или времени более 2 минут приводит к одновременному осаждению как всех клеточных и неклеточных элементов, так  и сперматозоидов, что не позволяет эффективно выделить чистую фракцию последних.
После каждого центрифугирования супернатант переносят в новую пробирку и повторно центрифугируют при исходных параметрах или при увеличенной центробежной силе  и/или увеличенном  времени в зависимости от кондиции образца, не выходя из установленных пределов для центробежной силы 200-350 g, времени 1-2 минуты.  Повторяющиеся раунды центрифугирования супернатанта осуществляют до момента отсутствия видимого осадка; количество раундов центрифугирования в среднем варьирует от 3 до 8 и зависит от исходной степени контаминации образца клеточными и неклеточными элементами, отличными от сперматозоидов. Полученный в результате последнего раунда центрифугирования супернатант представляет собой суспензию со сперматозоидами, которая может быть использована для оплодотворения ооцитов методом внутрицитоплазматической инъекции и/или криоконсервирована для отложенного использования в программе ЭКО.
С целью концентрирования в минимальном объеме, полученный в результате дифференциального центрифугирования супернатант, в котором содержатся сперматозоиды, но из которого удалена основная  масса других элементов, центрифугируют  при 250-600 g в течение 5-15 минут.  Полученный в результате концентрирования осадок представляет собой суспензию со сперматозоидами, которая может быть использована для оплодотворения ооцитов методом внутрицитоплазматической инъекции и/или криоконсервирована для отложенного использования в программе ЭКО.
Реализация предложенного способа подтверждена клиническими данными.
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ
Пример 1. Пациент С., 34 г. Криптозооспермия (единичные сперматозоиды в осадке эякулята после центрифугирования). При обработке эякулята методом простого отмывания ранее выделить сперматозоиды для ВРТ не удавалось.  Вместе с супругой, пациенткой С., вступили в протокол лечения бесплодием методом ЭКО с предварительным согласием на использование спермы донора. В день пункции фолликулов у Пациентки С. получен эякулят Пациента С. В нативном эякуляте сперматозоиды не обнаружены. После простого отмывания в осадке эякулята присутствуют единичные сперматозоиды (криптозооспермия). В результате дифференциального центрифугирования (6 раундов центрифугирования при 300 g в течение 1 минуты) с последующим концентрированием при 300 g в течение 10 минут выделены единичные сперматозоиды, проведено оплодотворение ооцитов Пациентки С. сперматозоидами супруга, Пациента С. методом внутрицитоплазматической инъекции.
Пример 2. Пациент У., 28 лет. Азооспермия, секреторная форма. В ходе подготовки к процедуре хирургического получения сперматозоидов из яичка назначена гормональная терапия. Через 10 недель терапии, на фоне назначенного лечения в эякуляте присутствуют сперматозоиды (1 на 10 полей зрения, х200, выраженная олигозооспермия). В результате дифференциального центрифугирования (2 раунда центрифугирования при 200 g в течение 1 минуты, 3 раунда при 300 g в течение 1 минуты, 1 раунд при 300 g в течение 2 минут в объеме 12 мл) с последующим концентрированием выделены сперматозоиды в достаточном для криоконсервации количестве, выполнена криоконсервация. Пациент У. вместе с супругой вступили в протокол лечения бесплодием методом ЭКО.  При отсутствии  сперматозоидов в эякуляте в день пункции фолликулов у супруги предполагалось использование криоконсервированных ранее сперматозоидов. В день пункции фолликулов у Пациентки У. получен эякулят Пациента У. В нативном эякуляте присутствуют сперматозоиды (1 на 10 полей зрения, х200, выраженная олигозооспермия). В результате дифференциального центрифугирования выделены единичные сперматозоиды, проведено оплодотворение ооцитов Пациентки У. методом внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидами супруга, Пациента У. Осуществляется хранение криоконсервированных ранее сперматозоидов.
Пример 3. Пациент Е., 32 г. Олигозооспермия (1 млн/мл). В связи с выраженным мужским фактором пациентам рекомендовано достижение беременности методом ЭКО. В день пункции фолликулов супруги получен эякулят Пациента Е. Отмечено резкое ухудшение характеристики эякулята - в нативном эякуляте сперматозоиды не обнаружены. После простого отмывания в осадке эякулята присутствуют единичные сперматозоиды (криптозооспермия) (Фиг. 2). В результате дифференциального центрифугирования (4 раунда центрифугирования при 250 g в течение 1 минуты, 2 раунда при 300 g в течение 1 минуты) с последующим концентрированием выделены единичные сперматозоиды (Фиг. 3), проведено оплодотворение ооцитов супруги сперматозоидами супруга, Пациента Е.