Способ оценки константы диссоциации органических соединений методом капиллярного электрофореза
METHOD FOR ASSESSING THE DISSOCIATION CONSTANT OF ORGANIC COMPOUNDS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS

Настоящее изобретение относится к области анализа небиологических материалов физическими и химическими методами с помощью электрических, электрохимических или магнитных средств, конкретно, путем электрофореза.
Одной из основных характеристик кислот и оснований в растворах является константа диссоциации, рК. Ее значение определяет силу электролита в данном растворителе.
Многие лекарственные вещества органической природы являются слабыми кислотами либо основаниями, и их константа диссоциации может служить количественным показателем, с помощью которого можно предварительно оценивать фармакологическую активность веществ. Это связано с тем, что такие биохимические процессы, как всасываемость лекарственного препарата, проницаемость его к местам физиологического действия, образование комплекса «биологически активное вещество - рецептор», то есть процессы, определяющие проявление фармакологического эффекта, во многом зависят от кислотно-основных свойств лекарственных соединений. Поэтому задача разработки способа оценки константы диссоциации органических соединений является актуальной.
Известны различные методы определения константы диссоциации, например, прямое применение кондуктометрии, поскольку константа диссоциации связана с концентрацией раствора и проводимостью законом Оствальда [Химический энциклопедический словарь, главный редактор И.Л. Кнунянц [Текст]: Москва «Советская энциклопедия», 1983, 791 с.].
Известны методы косвенного определения константы диссоциации, например, нетрадиционное применение капиллярного электрофореза путем исследования зависимости эффективной подвижности органического соединения от рН среды.
Зависимость эффективной подвижности исследуемого органического соединения от рН среды может быть полезна не только для оценки ионного состава, но и для определения константы диссоциации исследуемого органического соединения. Такое применение было теоретически и экспериментально обосновано Бекерсом, Эверертсом и Акерманом в 1990 году [Beckers J.L. Determination of absolute mobilities, pK values and separation numbers by capillary zone electrophoresis. Effective mobility as a parameter for screening [Текст] / J.L. Beckers, F.M. Everaerts, M.T. Ackermavs // Journal of Chromatography, 537. - 1991. - P. 407-428.]. Суть способа заключается в том, что если с использованием внешнего маркера электроосмотического потока измерены эффективные подвижности соединения в двух различных электролитических системах с разными значениями рН, причем степень диссоциации, а, следовательно, и эффективные подвижности, различаются значительно, то можно рассчитать значения константы диссоциации, pK. В работе показано хорошее согласование расчетных значений константы диссоциации для ряда исследованных кислот методом капиллярного электрофореза с известными справочными значениями. Данный способ является ближайшим из аналогов предлагаемого изобретения.
Недостаток данного способа заключается в необходимости использования внешнего маркера электроосмотического потока, окиси мезитила, которая раздражает кожу и обладает наркотическим действием [Химический энциклопедический словарь, главный редактор И.Л. Кнунянц [Текст]: Москва «Советская энциклопедия», 1983, 791 с.].
Задача настоящего изобретения заключается в совершенствовании способа определения константы диссоциации методом капиллярного электрофореза.
Решение поставленной задачи при исключении необходимости введения внешнего постороннего вещества-маркера в аналитическую матрицу предполагает технический результат, заключающийся в повышении объективности и достоверности получаемых результатов.
Поставленная задача решается тем, что в способе оценки константы диссоциации органических соединений методом капиллярного электрофореза с использованием ультрафиолетового (УФ) детектирования путем определения зависимости эффективной подвижности исследуемого органического соединения по отношению к маркеру от рН среды, выбора двух различных электролитических систем с разными значениями рН, в которых эффективные подвижности, различаются значительно, и расчета значения константы диссоциации, pK, согласно предлагаемому способу, растворители, полярный ацетон или неполярный бензол, одновременно используют в качестве маркера электроосмотического потока и растворителя анализируемого соединения.
Если исследуемое органическое соединение не растворяется в ацетоне или в бензоле, используют смесевой растворитель, состоящий из двух компонентов, одним из которых является растворитель, подходящий для растворения соединения, а вторым - растворитель-маркер, ацетон или бензол, в объемном соотношении, например, 1:1.
При разработке предлагаемого технического решения были проведены следующие теоретические и экспериментальные исследования. На фиг. 1 приведена принципиальная схема прибора капиллярного электрофореза.
Основными определяемыми параметрами капиллярного электрофореза являются время миграции и электрофоретическая подвижность иона.
Электрофоретическая подвижность μ определяется как скорость движения частицы, деленная на напряженность электрического поля:
где v - скорость идеализированной сферической частицы, м/с;
Е - напряженность электрического поля, В/м.
c
d
м
Учитывая, что Е=U/L, а скорость движения частицы v=L /t, то
2
где μ - электрофоретическая подвижность, м/В⋅с;
d
c
L и L - длина капилляра от точки ввода пробы до детектора и суммарная длина капилляра, соответственно, м;
U - рабочее напряжение, В;
м
t - время миграции частицы, с.
эоп
эоп
эоп
м
экс
При наличии в системе электроосмотического потока (ЭОП) его электрофоретическую подвижность, μ, можно рассчитать по выражению (2), используя соответствующие экспериментальные данные для маркера электроосмотического потока. В отличие от μ электрофоретическую подвижность частицы, μ, нельзя определить непосредственно из электрофореграммы, поскольку время миграции частицы, t, в этом случае представляет собой сумму времен миграции собственно частицы и маркера электроосмотического потока. Из эксперимента можно найти так называемую общую подвижность, μ, которая выражается (при положительной скорости ЭОП)
экс
эоп
эф
Зная из эксперимента μ и μ, можно легко рассчитать эффективную подвижность частицы, μ
Таким образом, зная время миграции нейтральных молекул маркера и исследуемого образца, можно рассчитать эффективную подвижность, которая является более объективным параметром качественного анализа, чем время миграции и экспериментально определяемая подвижность. В определении эффективной подвижности главным моментом является правильная оценка ЭОП.
Согласно литературным данным, в качестве маркеров, нейтральных веществ, можно использовать: бензиловый спирт [Фомин А.Н. Исследования по применению электрофореза на бумаге и капиллярного электрофореза при анализе азотсодержащих соединений основного характера в биологических объектах [Текст]: дис. … докт. фарм. наук / Фомин Анатолий Николаевич. - Пермь, 2012. - 309 с.], ацетон, бензол, кротоновый альдегид, оксид мезитила, парацетамол [Beckers J.L. Determination of absolute mobilities, pK values and separation numbers by capillary zone electrophoresis. Effective mobility as a parameter for screening [Текст] / J.L. Beckers, F.M. Everaerts, M.T. Ackermavs // Journal of Chromatography, 537. - 1991. - P. 407-428.].
При выборе маркера ЭОП авторы руководствовались следующими соображениями: возможность использования ацетона, бензола, метанола, воды и в качестве маркеров, и в качестве растворителей позволит решить сразу две задачи: и растворения исследуемого образца, и надежного определения подвижности. Это возможно потому, что эти вещества, не содержащие хромофорных групп, при УФ диодно-матричном детектировании не будут представлять на электрофореграмме преобладающий по величине пик, несмотря на их преобладающее количество в пробе. Дополнительно в качестве маркеров нами были рассмотрены парацетамол и глутаровый альдегид.
В работе использовали прибор капиллярного электрофореза Agilent 3D СЕ (фирмы Agilent, США), полый кварцевый капилляр с немодифицированной поверхностью длиной 72 см, внутренним диаметром 50 мкм, гидродинамический ввод анализируемого вещества. Рабочее напряжение - 25 кВ, фоновый электролит - боратный буфер (рН=9,2), гидродинамический ввод пробы - при давлении 30 мбар в течение 5 с, детектирование - в диапазоне длин волн от 195 до 260 нм.
Результаты исследования возможных маркеров ЭОП представлены в таблице 1. В таблице приведены химические формулы, электрофореграммы и значения эффективной подвижности ЭОП, рассчитанные по выражению (2). Приведены и статистические характеристики: повторяемость и воспроизводимость параметра удерживания и рассчитанной по нему подвижности. Как видно из приведенных электрофореграмм, метанол, вода и глутаровый альдегид имеют неустойчивые фореграммы с шумами и провалами, в то время как ацетон, бензол и парацетамол выходят симметричными пиками с близкими значениями удерживания.
Повторяемость для ацетона, бензола и метанола в сериях из 10 анализов, оцененная относительным среднеквадратичным отклонением, не превышает 3%, поэтому может служить характеристикой стабильности ЭОП и готовности системы к работе. Воспроизводимость была оценена аналогично по всем анализам в течение от 1 до 2 месяцев работы с использованием данного боратного буфера, и относительное среднеквадратичное отклонение не превышает 8%, что позволяет использовать эти вещества в качестве маркеров ЭОП.
В таблице 1 приведены также полные спектры поглощения в УФ области для всех исследованных соединений. Большинство из них имеют характерные максимумы, что позволяет легко идентифицировать их. Характеристикой возможных маркеров может служить и отношение величин сигналов (площадей пиков) на характерных длинах волн. Оценена воспроизводимость отношения площадей на характерных длинах волн для всех исследованных маркеров, кроме воды и глутарового альдегида. Относительное среднеквадратичное отклонение этого параметра также не превышает 10%.
Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о возможности использования растворителей: ацетона, бензола, метанола и воды, - в качестве маркеров электроосмотического потока. Однако наиболее надежными маркерами, характеризующимися стабильной формой электрофоретического пика без «провалов» в отрицательную область, следует признать полярный ацетон и неполярный бензол.
При изучении влияния рН электролита на ионный состав органических кислот и оснований для создания рН в диапазоне от 3,60 до 5,60 использовали ацетатный буфер; для создания рН 6,86 и 9,18 - фиксаналы фосфатного и боратного буферов.
В качестве маркера электроосмотического потока и растворителя всех исследуемых кислот и оснований использовали ацетон. Характеристикой изменения ионного состава раство-ров органических кислот и оснований являются зависимости их эффективных подвижностей, рассчитанных по экспериментальным данным времени миграции по выражениям (2, 4), от значений рН, приведенные на фиг. 2, где 1 - α-нафтиламин; 2 - дифениламин; 3 - аминобензойная кислота; 4 - бензойная кислота; 5 - 2,4-динитрофенол.
Как видно на фиг. 2, для всех исследованных соединений наблюдается уменьшение эффективной подвижности ионов с увеличением рН электролита. Органические кислоты: бензойная и 2,4 динитрофенол, - имеют отрицательные значения эффективной подвижности, как и следовало ожидать, то есть, их анионы детектируются позже маркера-ацетона. Однако в случае аминобензойной кислоты, содержащей в своем составе аминогруппу, кроме кислотной -СООН группы, при значении рН, равном 3,60, имеет положительную эффективную подвижность, то есть как катион детектируется раньше маркера-ацетона, а при более высоких значениях рН она детектируется по аниону, имея отрицательную эффективную подвижность. В случае органических оснований: дифениламина и α-нафтиламина, - последний в диапазоне рН от 3,60 до 5,00 детектируется по катиону, имея положительные значения эффективной подвижности, и по аниону при рН выше 5,00. А дифениламин во всем исследованном диапазоне рН от 3,60 до 5,00 детектируется по аниону, проявляя отрицательную эффективную подвижность.
Таким образом, исследования изменения эффективной подвижности органических соединений в зависимости от изменения рН электролита методом капиллярного электрофореза позволяют оценить возможный ионный состав в конкретных условиях, то есть оценить направление диссоциации соединения.
Полученная зависимость эффективной подвижности от рН среды может быть полезна не только для оценки ионного состава, но и для определения константы диссоциации исследуемого органического соединения.
Согласно теоретическому и экспериментальному обоснованию Бекерса, Эверертса и Акермана [Beckers J.L. Determination of absolute mobilities, pK values and separation numbers by capillary zone electrophoresis. Effective mobility as a parameter for screening [Текст] / J.L. Beckers, F.M. Everaerts, M.T. Ackermavs //Journal of Chromatography, 537. - 1991. - P. 407-428.], уравнение диссоциации слабой одноосновной кислоты можно представить следующим образом:
HZ
Константа термодинамического равновесия при условии, что коэффициент активности γ=1, может быть выражена:
Следовательно, константа диссоциации как отрицательный логарифм константы термодинамического равновесия может быть выражена:
эф
с
эф
с
Поскольку μ=α⋅μ, где α - степень диссоциации; μ, μ - эффективная подвижность и ионная подвижность при эквивалентной концентрации,
Подстановка выражения (8) в (7) позволяет получить выражение для расчета рK через значения электрофоретических подвижностей:
Если известны эффективные подвижности для двух различных электролитических систем, имеем:
с
Выражение (10) позволяет рассчитать μ, а далее по выражению (9) можно рассчитать значение константы диссоциации исследуемой кислоты.
Используя полученные экспериментальные данные по изменению эффективной подвижности от рН среды в условиях без внешнего маркера электроосмотического потока, нами была сделана попытка для трех исследованных одноосновных кислот рассчитать значения их константы диссоциации. Результаты расчета приведены в таблице 2 в сравнении с известными справочными данными [Волков А.И. Справочник по аналитической химии [Текст] / А.И. Волков, И.М. Жарский. Минск: Букмастер, 2015. - 320 с.].
Аналогичные расчеты могут быть сделаны и для органических оснований.
Так, в таблицу 2 включены результаты расчета константы диссоциации α-нафтиламина при диссоциации по основному характеру. Как видно из приведенных данных, результаты расчетов для кислот и основания согласуются со справочными данными, что подтверждает возможность использования растворителя, например, ацетона, в качестве маркера ЭОП для оценки констант диссоциации исследуемых органических веществ.
Выбор полярного ацетона и неполярного бензола в качестве наиболее удобных маркеров электроосмотического потока предполагает, что исследуемое вещество растворяется в этих растворителях-маркерах. Однако не все вещества растворяются в ацетоне или в бензоле, поэтому необходимо было рассмотреть вопрос использования смесевого растворителя, одним из компонентов которого является ацетон или бензол. То есть, исследуемое соединение необходимо растворить в подходящем растворителе, например, в воде, а полученный раствор разбавить, например, вдвое, ацетоном или бензолом, и анализировать полученный раствор.
При этом нужно быть уверенным в том, что разбавление исходного раствора не повлияет на эффективную подвижность исследуемого вещества. Для этого были проведены исследования по оценке влияния разбавления исходного раствора бензойной кислоты в ацетоне на относительное время миграции и эффективную подвижность бензойной кислоты, таблица 3.
-2
3
Как видно из приведенных данных, в диапазоне концентраций от 1,0⋅10 до 1,0 мг/см наблюдается линейная зависимость площади электрофоретического пика от концентрации, но при этом относительное время миграции и рассчитанная по экспериментальным данным эффективная подвижность аниона бензойной кислоты остаются неизменными. Это предполагает возможность разбавления исходной пробы в подходящем для нее растворителе, например, вдвое, растворителем-маркером, ацетоном или бензолом. При этом важно, чтобы растворитель пробы и растворитель-маркер смешивались друг с другом в любом соотношении без образования двух отдельных фаз.
Согласно диаграмме смешиваемости растворителей [Садек П. Растворители для ВЭЖХ. Перевод с англ. к.х.н. А.А. Горбатенко и Е.И. Ревиной [Текст] / П. Садек. - М: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. - 704 с.], ацетон смешивается с большинством полярных, в том числе с водой, и неполярных растворителей, кроме предельных углеводородов и циклогексана. Бензол смешивается со всеми растворителями, кроме воды. Таким образом, использование смесевого растворителя, одним из компонентов которого является растворитель-маркер (ацетон или бензол), позволит надежно определять эффективную подвижность исследуемого соединения, а, следовательно, и оценивать константу диссоциации, в любом подходящем для растворения соединения растворителе.
Пример осуществления способа
При исследовании влияния рН среды на эффективную подвижность во всех экспериментах применялась единая технология подготовки капилляра, включающая последовательную промывку его в течение 10 мин каждым свеженалитым в виалки раствором сперва дистиллированной воды, затем 1,0 N гидроокиси натрия, затем 0,1 N гидроокиси натрия. Перед вводом пробы капилляр в течение 5 мин промывался свежим рабочим буферным раствором. Не допускалось повторное использование промывочных растворов при последующих анализах. Для дальнейших расчетов использовали результаты первого или второго после полной промывки капилляра ввода исследуемого соединения.
Буферные растворы для диапазона рН от 3,6 до 5,6 готовились на основе ледяной уксусной кислоты и ацетата натрия в соответствии с таблицей 4 [Досон Р, Эллиот Д, Эллиот У, Джонс К. Справочник биохимика. - Москва: Мир, 1991. - С. 357. - 544 с.], и значения рН контролировались с помощью рН-метра (НМ Digital РН-200 (герметичный рН-метр, термометр, °С).
Буферные растворы с рН, равным 6,86 и 9,18, готовились из соответствующих фиксаналов фосфатного и боратного буферов [ГОСТ 8.135-74. рН-метрия. Фиксаналы для приготовления образцовых буферных растворов 2-го разряда.].
Анализ проводили на полом капилляре диаметром 50,0 мкм, общей длины 64,5 см (рабочая длина 56,0 см). Температура термостата капилляра - 25°С, напряжение - (+30,0 кВ), использовали гидродинамический ввод при давлении 30,0 mbar в течение 6 с. Регистрировали время миграции частиц как время от момента ввода пробы до максимума электрофоретического пика на фореграмме.
Анализируемые вещества растворяли либо в ацетоне, либо в бензоле, которые использовали и в качестве маркера электроосмотического потока. В таблице 5 приведены экспериментальные результаты исследования бензойной кислоты в буферных системах с различными значениями рН.
Экспериментальные данные, полученные предлагаемым способом при использовании растворителя ацетона в качестве маркера электроосмотического потока, согласуются с экспериментальными данными, полученные способом, ближайшим из аналогов, при использовании внешнего маркера, окиси мезитила, таблица 6 [Beckers J.L. Determination of absolute mobilities, pK values and separation numbers by capillary zone electrophoresis. Effective mobility as a parameter for screening [Текст]/ J.L. Beckers, F.M. Everaerts, M.T. Ackermavs // Journal of Chromatography, 537. - 1991. - P. 407-428.].
Далее, согласно предлагаемому техническому решению, выбирают область значений рН, в которой наблюдаются существенные изменения эффективной подвижности. Как видно из данных, приведенных в таблице 6, это область значений рН от 3,6 до 4,6. Именно в кислой среде для бензойной кислоты наблюдается значительное изменение степени диссоциации, а, следовательно, и эффективной подвижности ионов. Отрицательные ионы кислоты при низких значениях рН показывают маленькую эффективную подвижность (не полностью ионизированы частицы), возрастающую с увеличением рН среды.
a
В выбранной области значений рН, используя выражения (9) и (10), было рассчитано значение pK, отрицательного десятичного логарифма константы диссоциации бензойной кислоты, равное 4,38 (см. таблица 2).
Таким образом, показано, что можно использовать растворители, ацетон и бензол, в качестве маркера электроосмотического потока при оценке константы диссоциации органических соединений методом капиллярного электрофореза с УФ детектированием, исключая необходимость введения внешнего маркера, что способствует упрощению анализа за счет исключения необходимости использования внешнего маркера, окиси мезитила, обладающей раздражающим кожу и наркотическим действием, и повышению достоверности получаемых результатов. Кроме того экспериментально показана (таблица 5) возможность использования при необходимости смесевого растворителя.