ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ МИКРОБНОЙ БИОТРАНСФОРМАЦИИ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
IMMOBILISED BIOCATALYST FOR MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF STEROID COMPOUNDS

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам (ИБК) на основе клеток микроорганизмов, помещенных в гелевый носитель, а также к процессам получения продуктов микробиологического синтеза или трансформации с использованием иммобилизованных биокатализаторов, в данном случае - к получению фармакологически значимых стероидов.
Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в фармацевтической промышленности, поскольку достаточно большое число природных и полусинтетических стероидных соединений применяется при производстве многочисленных фармпрепаратов для современной медицинской практики, в том числе и на основе модифицированных стероидов (например, галогенированных производных, в частности, фторированных кортикоидов: триамцинолона, дексаметазона, бетаметазона, флуоцинолона, мометазона, флутиказона и др.), обладающих высокой антиаллергической, противошоковой, противовоспалительной, канцеролитической и другими видами активности [М.Д.Машковский «Лекарственные средства», Москва «Медицина», 1993 г., стр. 665]. Получение подобных соединений осуществляется микробиологической модификацией фитостеринов, источником сырья для выделения которых служат отходы деревообрабатывающей, сельскохозяйственной и пищевой промышленности, доступные в неограниченном количестве. При этом интермедиатами в синтезе высокоактивных противовоспалительных и антиаллергических стероидных производных являются 17-кетоандростаны: андростендион, андростадиендион и 9α-гидроксиандростендион, которые регио- и стереоселективно можно производить из фитостеринов с помощью определенных штаммов микроорганизмов [W.F.Wang; C.G.Zhang; B.Li. New microbiological transformations of steroids by Streptomyces virginiae IBL-14 // Environ. Sci. Techn. (2009) V.43 (15) 363-365; В.А.Андрюшина, H.E. Войшвилло, К.Н.Габинская, Т.С.Савинова, Т.С.Стыценко, К.Г.Скрябин, Ю.Э. Бартошевич, А.Г.Домрачева. Способ получения АД из стеринов растительного и животного происхождения или их производных. // Евразийский Патент №003019, 12.26.2002].
Большинство стероидных лекарственных препаратов, используемых в настоящее время в медицине и ветеринарии, представляет собой структурные модификации природных соединений, по сравнению с которыми модифицированные производные обладают более высокой биологической активностью и меньшими побочными эффектами. В синтезе многих препаратов используется способность микроорганизмов с высокой специфичностью осуществлять нужную трансформацию стероидных молекул заданной структуры, не требующую предварительной защиты имеющихся функциональных групп, и в экологически чистых условиях. Более того, такие трансформации стероидов, как гидроксилирование, в частности гидроксилирование в положение С9 полициклической системы стероидной молекулы, химическим способом в промышленных масштабах практически не осуществимы [A.Zaks, D.R.Dodds. Application of biocatalysis and biotransformations to the synthesis of pharmaceuticals // Drug Discov. Today (1997) V.2 (12) 513-531; H.L.Holland. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts // Steroids (1999) V.64 (3) 178-186; R.Breslow, J.Jan, S.Belvedere. Catalytic hydroxylation of steroids by cytochrome P-450 mimics hydroxylation at C-9 with novel catalysts and steroid substrates. // Tetrahedron Lett. (2002) V.43 (3) 363-365]. Интерес к 9α-гидрокси-стероидам обусловлен тем, что они используются в качестве исходных продуктов для синтеза 11β-гидрокси-9α-галоид-стероидов ряда прегнана, обладающих высокой антиаллергической, противошоковой и противовоспалительной активностью, например таких, как триамцинолон, дексаметазон, синафлан и др. [Н.В.Родина, В.А.Андрюшина, Т.С.Стьщенко, Т.П.Турова, З.В.Баслеров, А.Н.Пантелеева, Н.Е.Войшвилло. Введение 9α-гидрокси-группы в андрост-4-ен-3,17-дион с помощью нового штамма актинобактерии. // Прикл. биохим. микробиол. (2009) Т. 45 (4) 1-7]. Эти вещества могут быть использованы как самостоятельные физиологически активные соединения, так и в качестве интермедиатов при синтезе новых препаратов.
Собственно биотрансформация фитостеринов в целевое производное с помощью обладающих требуемой ферментативной активностью свободных клеток является очень сложным и длительным процессом ввиду низкой растворимости стероидных субстратов и соответствующих продуктов в водных средах, что сильно мешает транспорту данных веществ в клетку и из нее. При этом реакционная система гетерофазна и многокомпонентна, она представляет собой суспензию клеток и образующегося со временем клеточного дебриса, частиц кристаллического субстрата и in situ кристаллизующегося продукта в сложной по составу буферной среде, что по окончании процесса требует удаления компонентов биомассы и многостадийной очистки конечного продукта. В результате клетки работают лишь однократно, большой процент полученного ценного вещества теряется безвозвратно во время его выделения. Поэтому перспективным приемом повышения технологичности процесса микробной биотрансформации является использование клеток в иммобилизованном состоянии, что позволяет упростить операции по выделению целевого вещества и удлинить сроки продуктивного функционирования биомассы [А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. // 2-е изд., МГУ, Москва, 1994, 288 с.].
Однако когда при биотрасформации стероидных субстратов используют иммобилизованные клетки, то возникает проблема абразивного износа материала носителя, поскольку в реакторах с перемешиванием кристаллы субстрата и продукта действуют на носитель как частицы твердого абразива, поэтому необходим адекватный выбор материала носителя. Хотя разработки по иммобилизации клеток, применяемых для биотрансформации стероидных субстратов, ведутся уже достаточно давно, с 70-х годов прошлого века, многие сложности с носителями еще окончательно не преодолены. В частности, для бактерий Arthrobacter globiformis, обладающих способностью к дегидрированию стероидных соединений, описаны различные варианты иммобилизации с использованием таких носителей, как полиакриламидный гель [G.K.Skryabin, K.A.Koscheenko. Immobilization of living microbial cells in polyacrylamide gel // Meth. Enzymol. (1978) V. 135B, 198-216], альгинатные гели [Г.В.Суходольская, Н.Г.Винокурова, С.А.Гулевская, К.А.Кощеенко, Г.К.Скрябин. Конструирование носителей на основе природных полисахаридов для клеток Arthrobacter globiformis с 1,2-стероиддегидрогеназной активностью.// Прикл. биохим. микробиол. (1991) Т.27 (4) 514-521], фотосшиваемые полимеры [K.Somomoto, M.D.M.Hoq, A.Tanaka, S.Fukui. Growth of Curvularia lunata cells, and steroid 11-beta-hydroxylation by the entrapped mycelia // J. Ferment. Techn. (1981) V.59 (6) 465-469] и др.
Известен иммобилизованный биокатализатор (ИБК), представляющий собой клетки бактерии Arthrobacter globiformis ИБФМ 193, включенные в частицы полиакриламидного геля [А.Ю.Аринбасарова, К.А.Кощеенко, В.А.Андрюшина, Г.С.Гриненко, Г.К.Скрябин. Способ получения 1,2-дегиро-производных кортикостероидов // Пат.РФ №1830949 (1988); C12P 33/00; Б.И. №19 (1995)]. С помощью такого ИБК в сочетании с использованием β-циклодекстрина (солюбилизирующий агент) и определенных аминокислот (агентов, снижающих трансмембранный потенциал), растворенных в культуральной среде, удается при трансформации гидрокортизона в преднизолон заметно повысить исходную концентрацию субстрата и поднять эффективность его дегидрирования по сравнению с процессом на свободных клетках, т.е. улучшить технологичность подобной биотрасформации. Такое техническое решение обеспечивает достаточно продолжительное функционирование ИБК в случае работы с однофазными жидкими культуральными средами, но не с гетерогенными суспензиями малорастворимых субстратов, поскольку главным недостатком используемого носителя - полиакриламидного геля - является его низкая абразивная устойчивость в таких условиях [Н.С.Егоров, А.В.Олескин, В.Д.Самуилов. «Биотехнология» Учебное пособие для вузов в 8-ми книгах. Под редакцией Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. Книга 1. Проблемы и перспективы. М.: Высшая школа, 1987. С. 159]. Например, при гетерофазной биотрансформации стероидных субстратов потери ИБК на основе клеток, включенных в полиакриламидный гель, достигают 15-20% за цикл [А.Ю.Аринбасарова. Трансформация гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193. Дисс.канд. биол. наук, Пущино, 1985 г., стр. 15]. Кроме того, для приготовления такого ИБК используется токсичный мономер - акриламид, что существенно ухудшает санитарно-гигиенические показатели процесса в целом.
Включение обладающих стероид-трансформирующей активностью клеток в такую нетоксичную гелевую матрицу, как часто применяемый для иммобилизации микробных клеток Ca-альгинатный гидрогель, позволяет при формировании ИБК исключить использование вредных веществ. Известен ИБК на основе включенных в Ca-альгинат клеток Arthrobacter globiformis, при использовании которого для 1,2-дегидрирования гидрокортизона в трансформационную среду вводят до 10 ммоль/л хлорида кальция, чтобы сохранялась целостность ионотропного геля [Г.В.Суходольская, Н.Г.Винокурова, С.А.Гулевская, К.А.Кощеенко, Г.К.Скрябин. Конструирование носителей на основе природных полисахаридов для клеток Arthrobacter globiformis с 1,2-стероиддегидрогеназной активностью. // Прикл. биохим. микробиол. (1991) Т.27 (4) 514-522]. Необходимость использования кальцийсодержащих сред при работе с подобными гелевыми носителями и с соответствующими ИБК, где клетки включены в такой гель, является их недостатком, поскольку сильно ограничивает круг жидких сред, в которых подобные биокатализаторы могут функционировать в течение достаточно длительного времени, т.е. для иммобилизованных биокатализаторов, у которых функцию носителя выполняет Ca-альгинатный гель, характерна малая универсальность в отношении состава рабочей среды. Так, например, в ходе проверки авторами заявляемого технического решения операционной стабильности ИБК на основе биомассы актинобактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632, включенных в гранулы Ca-альгинатного гидрогеля (получены традиционным для данного носителя методом), было найдено, что в трансформационной среде (кукурузно-глюкозная среда, содержащая гидрокортизон) очень быстро в течение нескольких часов частицы носителя теряли свою целостность и распадались, вследствие обмена ионов кальция из геля на ионы натрия и калия из среды, вызывая тем самым солюбилизацию ИБК.
Известен ИБК для биотрансформации стероидов, представляющий собой клетки бактериального штамма Arthrobacter globiformis ИБФМ 193, включенные в сферические гранулы абразивно- и ионно-устойчивого носителя - криогеля поливинилового спирта (ЛВС) [В.В.Фокина, А.Ю.Аринбасарова, А.Л.Зубов, В.И.Лозинский, К.А.Кощеенко. Дегидрирование стероидных субстратов бактериальными клетками Arthrobacter globiformis 193, включенными в криогель поливинилового спирта.// Прикл. биохим. микробиол. (1995) Т.31 (2) 213-219]. С помощью такого ИБК при проведении 1,2-дегидрирования гидрокортизона, метилгидрокортизона и прогестерона осуществляют превращение субстрата в гетерофазной системе «жидкость - клетки - малорастворимый стероид», где ИБК сохраняет целостность и может быть использован в нескольких последовательных циклах получения соответствующих стероидных дегидропроизводных [V.Fokina, N.Susina, A.Arinbasarova, A.Zubov, V.Lozinsky, K.Koshcheenko. Immobilization of Arthrobacter globiformis 193 cells into PVA cryogel. Dehydrogenation of steroid substrates. // In: "Immobilized Cells: Basics and Applications". R.H.Wijffels, R.M.Buitelaar, C.Bucke, J.Tramper eds., Elsevier Sci. B.V., Amsterdam e.a., 1996, Р. 90-97]. Однако при этом для улучшения растворимости субстрата и повышения скорости дегидрирования было необходимо вводить в исходную культуральную среду определенное количество органического растворителя, например, до 10% метилового спирта, что в случае масштабирования процесса является негативным моментом ввиду высокой токсичности данного солюбилизатора стероидов.
4
Известен ИБК, применяемый в процессах биотрансформации стероидных субстратов, где механическую прочность носителя на основе криогеля ПВС дополнительно повышают, подвергая систему в ходе включения клеток в криогель гамма-облучению, приводящему к радиационной сшивке полимерных цепей ПВС [N.Naim, N.Z.Adham, Н.А.Еl-Rehim, A.A.El-Hady. Prednisolone production using Pseudomonas fluoresceins cells immobilized with polymer carrier produced by radiation polymerization. // Proc. Biochem. (2003) V.38 (9) 1083-1089]. Однако 1,2-дегидрогеназная активность иммобилизованных клеток в таком ИБК низкая, что является следствием бактерицидного действия облучения [А.А.Еl-Hady, H.A.El-Rehim. Production of prednisolone by Pseudomonas oleovorans cells incorporated in radiation crosslinked hydrogels. // J.Biomed. Biotechnol. (2004) V.4 (4) 219-226]. Наиболее близким к заявляемому техническому решению по природе используемого носителя иммобилизованных клеток является принимаемый за прототип ИБК, содержащий клетки культуры актинобактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, включенные в криогель ПВС при соотношении компонентов (мас.%): клетки (на сухое вещество) - 1, поливиниловый спирт - 10, водная фаза - 89 [Н.В.Карпова-Родина, В.А.Андрюшина, В.В.Ядерец, А.В.Дружинина, Т.С.Стыценко, Б.Л.Шаскольский, В.И.Лозинский, Лью Дык Хи, Н.Е.Войшвилло. Трансформация Δ-3-кето-стероидов свободными и иммобилизованными клетками актинобактерии Rhodococcus erythropolis II Прикл. биохим. микробиол. (2011) Т. 47 (4) 429-435]. Данный биокатализатор позволяет осуществлять 9α-гидроксилирование субстратов андростанового и прегнанового ряда, в частности проводить гидроксилирование андростендиона в семи последовательных циклах продолжительностью по 22-24 ч каждый с получением 9α-гидрокси-андростендиона с выходом до 98%.
Данный биокатализатор-прототип имеет следующие недостатки. Во-первых, клетки Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, включенные в криогель ПВС, осуществляют трансформацию исходного субстрата с высоким выходом практически чистого конечного продукта на протяжении, как указывалось выше, не более 7-9 последовательных циклов, а далее выход продукта прогрессивно снижается и содержание примеси нетрансформированного исходного субстрата повышается, что приводит к необходимости осуществления дополнительных операций по очистке целевого вещества. Во-вторых, для проведения трансформации клетками Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, включенными в криогель ПВС, используется питательная среда, способствующая образованию эмульсии и усложняющая процесс выделения целевого продукта. В-третьих, применение такого ИБК позволяет эффективно, т.е. регио/стереоселективно, осуществлять процесс биотрансформации лишь при невысоких (не более 4 г/л) нагрузках стероидного субстрата, поэтому производительность соответствующего биотрасформационного процесса также невысокая.
Все это отрицательно сказывается на экономических показателях производства стероидных производных с использованием данного иммобилизованного биокатализатора, который не обеспечивает достаточно хорошей технологичности процесса в целом.
Задачей предлагаемого технического решения является разработка высокопродуктивного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток стероидтрансформирующих микроорганизмов, способных в иммобилизованном состоянии в течение большого числа последовательных циклов с высоким выходом целевого продукта осуществлять стерео/региоселективную биотрансформацию соответствующих стероидных субстратов при повышенной их исходной концентрации.
Указанная задача решается тем, что заявляемый иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений содержит обладающие 1,2-дегидрогеназной активностью клетки актинобактерий, относящихся к виду Pimelobacter simplex, включенные в матрицу криогеля поливинилового спирта при следующем соотношении компонентов (мас.%): клетки - 1-5 (на сухое вещество), поливиниловый спирт - 7-20; водная фаза - до 100.
В состав заявляемого ИБК в качестве каталитически активного действующего начала входят обладающие 1,2-дегидрогеназной активностью клетки актинобактерий, относящиеся к виду Pimelobacter simplex. Использование именно таких клеток, концентрация которых в ИБК найдена экпериментально, обусловлено высокой стероид-1,2-дегидрогеназной активностью актинобактерий Pimelobacter simplex. Поскольку клетки этого вида ранее не использовались в иммобилизованном состоянии для биотрансформации стероидов, то не была очевидной их длительная работоспособность при иммобилизации включением в матрицу криогеля ПВС из-за возможного негативного влияния криогенного воздействия, которому подвергается суспензия микроорганизмов в растворе ПВС при формировании таких ИБК. Так, например, при разработке заявляемого ИБК было обнаружено, что включение в криогель ПВС клеток другой культуры, а именно Culvularia lunata, которые в свободном состоянии также обладали высокой стероид-трансформирующей активностью, приводило к получению биокатализатора, фактически работоспособного только в первом цикле биотрансформации субстрата, а далее наблюдалось прогрессивное снижение активности иммобилизованных клеток.
Таким образом, подтверждается неочевидность предлагаемого технического решения, т.к. достижение целей заявляемого изобретения сочетанием относящихся к виду Pimelobacter simplex клеток и использование криогеля ПВС в качестве носителя при их иммобилизации до выполнения соответствующих исследований не было однозначно вытекающим из уровня знаний в этой области.
Нижний предел концентрации клеток в заявляемом составе ИБК определяется тем, что при использовании меньшей чем 1 мас.% концентрации биомассы в расчете на сухой вес клеток получаемый иммобилизованный биокатализатор обладает заметно меньшей стероид-трансформирующей активностью, а верхний предел концентрации клеток определяется тем, что при использовании их концентрации больше 5 мас.% (на сухой вес) происходит неполное включение всех клеток, введенных в исходную смесь с раствором полимера, в формирующийся криогель ПВС и затем наблюдается их вымывание при помещении полученных гранул в культуральную среду для проведения биотрансформации стероидных субстратов. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.
Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогеля ПВС, формируемого при замораживании-оттаивании раствора данного полимера [В.И.Лозинский. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Успехи химии (1998) Т.67 (7) 641-655], обусловлено высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками материала такого носителя, в частности его высокой абразивной устойчивостью и стабильностью в жидких средах разного состава.
Концентрация ПВС в составе заявляемого ИБК также найдена экспериментально. Нижний предел содержания поливинилового спирта определяется тем, что при меньшей чем 7 мас.% концентрации этого гелеобразующего полимера заметно снижаются физико-механические характеристики иммобилизованного биокатализатора, а при более чем 20 мас.% содержании ПВС сильно повышается вязкость исходной системы, используемой для приготовления иммобилизованного биокатализатора, что затрудняет равномерное диспергирование биомассы в такой среде, а также в случае необходимости приготовления ИБК в воде сферических гранул существенно усложняет процесс гранулирования.
Получение биомассы клеток каждого конкретного микроорганизма для последующего включения в матрицу гелевого носителя проводится с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками используемого штамма.
После получения клеток их диспергируют в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что в результате приводит к образованию полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки обладающего стероид-трансформирующей активностью микроорганизма.
В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами [В.И.Лозинский, Е.С.Вайнерман, С.В.Рогожин. Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов. // А.с. СССР №1400071 (1986); Б.И. №20 (1988)] может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается либо в соответствующей форме, либо гранулируется с помощью специального устройства, например криогрануляционных установок [В.И.Лозинский, А.Л.Зубов. Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем. // Пат. РФ №2036095 (1992); Б.И. №15 (1995); В.И.Лозинский, А.Л.Зубов. Устройство для формирования гранул. // Пат. РФ №2104866 (1996); Б.И. №5 (1998)].
Осуществление процесса биотрансформации соответствующего стероидного субстрата с помощью заявляемого ИБК проводят в реакторе с перемешиванием, куда вносят трансформационную среду в смеси с субстратом и необходимое количество ИБК. Ход процесса контролируют с использованием известных приемов, например с помощью тонкослойной хроматографии. По окончании каждого цикла целевой продукт, накопленный в трансформационной среде, выделяют и очищают известными приемами (например, с помощью экстракции, различных видов хроматографии, перекристаллизацией, и др.).
Такой иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений и такое сочетание признаков, как обладающие высокой стероид-1,2-дегидрогеназной активностью клетки актинобактерий, относящихся к виду Pimelobacter simplex, включенные в матрицу именно криогеля ПВС, а также заявляемый качественный и количественный состав заявляемого ИБК, позволяющие в течение большого числа последовательных циклов осуществлять с высоком выходом целевого продукта стерео/регио-селективную биотрансформацию соответствующих стероидных субстратов при повышенной их исходной концентрации, ранее известны не были и являются новыми, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».
Ниже приводится типичный пример реализации заявляемого технического решения, остальные примеры суммированы в таблице, а приводимая ниже диаграмма содержит следующую информацию:
Фиг.1. Конверсия гидрокортизона в преднизолон в последовательных циклах применения ИБК по примеру 1 (исходная концентрация субстрата - 4 г/л).
Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток актинобактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 для осуществления биотрансформации гидрокортизона.
2
4
Клетки бактерии P. simplex ВКПМ Ас-1632 выращивают на агаровой кукурузно-глюкозной среде (КГС) следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 15.0, глюкоза -10.0, KHPO - 1.0, агар-агар - 25 г/л, pH - 6.8-7.2. Клетки с агара пересевают в жидкую КГС и выращивают культуру в течение 70-72 ч. Полученный посевной материал переносят в свежую КГС и осуществляют культивирование в течение 24 ч. Биомассу, выделенную из культуральной жидкости центрифугированием при 3000 g, используют затем для иммобилизации.
При получении ИБК к 90 г 11,1%-ного водного раствора ПВС прибавляют 10 г суспензии клеток актинобактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 с концентрацией сухих веществ 20% и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1-2 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Патенту РФ №2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -15°C, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание гранул проводят при 4°C в течение 6 ч и промывают стерильным физиологическим раствором. Получают 98,7 г гранул криогеля ПВС, содержащего клетки, включенные в гелевую матрицу. Приготовленный таким образом ИБК имеет следующий состав (мас.%): клетки актинобактерий - 2 (на сухой вес), поливиниловый спирт - 10; водная фаза - до 100.
Полученные гранулы инкубируют в среде КГС в течение 24 ч, отделяют от питательной среды с помощью мелкоячеистого сита, суспендируют в 1.8% водном растворе β-циклодекстрина, содержащем 4 г/л гидрокортизона, и помещают на качалку для проведения трансформации. Окончание процесса определяют с помощью ТСХ. После завершения цикла трансформации гранулы отделяют от среды, промывают физиологическим раствором и используют в следующем цикле биотрансформации гидрокортизона. Отделенную водную фракцию трижды экстрагируют этилацетатом до полного извлечения стероида. Экстракт упаривают в вакууме. Сухой остаток промывают эфиром и сушат. С 98%-ным выходом получают преднизолон (т.пл. 230-231°C) с 98%-ным содержанием основного вещества.
Аналогично осуществляют все последующие циклы трансформации, используя ту же самую партию ИБК. В случае невозможности осуществления следующего цикла после окончания предыдущей трансформации гранулы помещают в физиологический раствор и хранят при 4°C. При исходной концентрации субстрата 4 г/л проводят 31 цикл трансформации гидрокортизона. Средняя продолжительность трансформации составляет 30-120 мин. При общем времени использования ИБК 30 суток, время трансформации - 18 ч. В 15 циклах (5-20) выход преднизолона составляет более 98% (фиг.1).
Таким образом, заявляемое изобретение приводит к техническому результату, имеющему следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:
1. Заявляемый ИБК позволяет осуществлять многократное (не менее 30 циклов) его использование без потери активности, в то время как в случае прототипа - не более 9 циклов.
2. Заявляемый ИБК позволяет проводить трансформацию при повышенных нагрузках стероидного субстрата, а именно до 20 и выше г/л (в прототипе - 4 г/л).
3. При использовании заявляемого ИБК упрощается схема выделения и очистки целевого продукта, так как используемая культура Pimelobacter simplex позволяет проводить трансформацию просто в водном растворе, в то время как в случае ИБК-прототипа и аналогов необходимо использование многокомпонентной питательной среды (в частности, КГС), в которой имеет место образование стойкой эмульсии, сильно затрудняющей выделение целевого продукта и тем самым снижающей его выход из-за потерь в ходе очистки.
4. При использовании заявляемого ИБК выделенный целевой продукт получается достаточно высокого качества и практически не требует последующей очистки, т.к. его характеристики соответствуют требованиям, предъявляемым к стероидным фармацевтическим субстанциям.
5. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала - криогеля поливинилового спирта, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет варьировать форму гранул биокатализатора и использовать его в различных реакторах, в том числе и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно увеличивает скорость массообменных биокаталитических процессов. Как результат, заявляемое изобретение позволяет получить ИБК, обладающий существенно улучшенными (по отношению к аналогам) характеристиками, а именно ИБК стабилен на протяжении многократных (30 и более) циклов функционирования в среде, содержащей микрокристаллы стероидных веществ, вызывающих интенсивный абразивный износ (деструкцию) носителей иммобилизованных клеток на основе других известных полимерных гелей.
6. В отличие от процесса биотрансформации стероидов с использованием известного ИБК (аналог), где требовалось введение в рабочую среду токсичного метанола, в случае применения заявляемого ИБК в этом нет необходимости, т.е. заявляемое техническое решение позволяет улучшить санитарно-гигиенические показатели процесса биотрансформации в целом. Тем не менее, если все же такой солюбилизирующий агент будет нужен в случае очень плохо растворимых в воде стероидных субстратов, то и это, как показали проверочные эксперименты, возможно, т.к. в присутствии добавок метанола заметного снижения активности клеток в составе ИБК не происходило.
Таблица примеров
№ примера
Биомасса Pimelobacter simplex
Носитель иммобилизованных клеток
Процесс биотрансформации
Штамм
Содержание в ИБК<sup>*)</sup>
Содержание ПВС в ИБК<sup>*)</sup>
Форма носителя
Исходная концентрация субстрата (г/л)
Число циклов
УВ<sup>**)</sup> %
1
Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632
2
10
Гранулы 1-2 мм
4
31
90,6 (95,9)
2
-“-
4
8,5
Гранулы 2,5-4 мм
10
25
90,4 (94,1)
3
-“-
5
7
Цилиндры 2×5 мм
20
20
90 (93,4)
4
Pimelobacter simplex №93 (коллекция Центра "Био-инженерия» РАН)
1
20
Гранулы 2,5-4 мм
2
12
87 (88,1)
5
-“-
3,4
12,6
Кубики 5×5 мм
4
15
86 (87,8)
6
Pimelobacter simplex sp.
1,7
14,3
Гранулы 3-4 мм
2
10
86,8
7
-“-
2,5
16
Цилиндры 3×4 мм
4
9
86
<sup>*)</sup>В расчете на сухой вес компонента
<sup>**)</sup> УВ - усредненный выход целевого продукта в расчете на 1 цикл (в скобках - усредненный выход целевого продукта в расчете на 1 цикл за 10 лучших циклов).