Интегральная оценка иммунитета и подходы к дифференцированной иммунокоррекции при невынашивании беременности

1 КАЗАХСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ IУНИВЕРСИТЕТ НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

УДК 618.396

А. М. Курманова, Л. С. Дзоз

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии г. Алматы, Казахстан

ИНТЕГРАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИММУНИТЕТА И ПОДХОДЫ К ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ ПРИ НЕВЫНАШИВАНИИ БЕРЕМЕННОСТИ

АННОТАЦИЯ

Изучен субпопуляционный состав лимфоцитов и активационных маркеров эндометрия. Материалом для иммунологического исследования служили биоптаты маточного эндометрия в секреторной фазе, полученные при гистероскопии. Установлено, что у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе на локальном уровне в эндометрии достоверно (Р<0,05) сниженным оказалось содержание С056+лимфоцитов. При этом выравниваются маркеры активации Н1_А-0К+ и С095+. Уровни экспрессии достоверно выше, чем в контрольной группе и С025+, а также выше сравнительно с показателями в 1-й группе. В качестве критерия для выбора вида иммунотерапии используют индекс С095+/С016+, при значениях которого менее 0,8 на фоне снижения СОЗ+, С04+ назначают индукторы интерферона, при 0,9-1,29 - препараты интерферона, более 1,3 - препараты интерлейкина-2.

Ключевые слова: привычное невынашивание беременности, интегральная оценка иммунитета.

Привычное невынашивание беременности, определяемое как две и более клинически обнаруженные потери беременности, случившихся до 20-й недельгестации, имеет место у 2-4% супружеских пар [1]. Важная роль в патогенезе прерывания беременности отводится иммунным механизмам. Считается, что высокая цитогоксическая активность натуральных киллеров (ЫК) в области фетоплацентар-ного комплекса приводит к гибели цитогрофоб-ласта. При спонтанных выкидышах происходит дефицит локальной децидуальной супрес-сорной активности, опосредуемой естественными супрессорными клетками, продуцирующими трансформирующий фактор роста-Ь,(ТФР-Ь,) [2]. В периферической крови содержание СП>16+С056+ повышено, а в эндометрии увеличен процент СО 16+ и уменьшен процент С056+, продуцирующих ТФР-Ь, [3]. В то же время в исследовании ОиепЬуБ. (1999) было показано, что у пациенток, страдающих привычным невынашиванием беременности, уровни СЭ4+, СЭ14+, СЭ16+, СЭ56+ и НЬА-ОЯ+-клеток в эндометрии были значительно выше, чем в контроле [4].

Персистенция в эндометрии бактериальных и вирусных инфекций является пусковым механизмом для разнонаправленных иммуно-

патологических реакций и служит основой для формирования различных нарушений репродуктивной функции, в том числе привычного невынашивания беременности. Поэтому комплексная оценка системного и локального иммунитета требует дальнейших исследований в плане понимания механизмов отторжения плода и выработки стратегии лечения.

Цель исследования - изучение субпо-пуляционного состава лимфоцитов периферической крови и эндометрия у пациенток с привычным невынашиванием беременности в анамнезе.

Материал и методы. Обследованы 75 пациенток с привычным невынашиванием беременности в анамнезе в возрасте 28,3±5,0 лет. В зависимости от уровня нарушения репродуктивной функции все женщины были разделены на 3 группы:

- 1 группа (98 чел.) - с ненарушенной репродуктивной функцией,

- 2 группа (42 чел.) - с невынашиванием беременности в анамнезе,

- 3 группа (24 чел.) - с бесплодием.

Контрольную группу составили 30 практически здоровых женщин.

У всех женщин, страдающих воспалительными заболеваниями гениталий, имелась та или

иная персистирующая инфекция. Диагноз бруцеллеза основывался на клинико-эпидемиоло-гических данных и подтверждался обнаружением специфических антител в реакциях Райта и Хаддлсона и/или с помощью внутрикожной аллергической пробы Бюрне, а также выявлением антиген-специфических лимфоцитов (ACJ1) бруцеллезной специфичности. Диагноз HBV- и HCV-инфекций верифицировался обнаружением в иммуноферментном анализе (ИФА) маркеров: HBsAg, antiHBcor-IgM или -IgG, HBeAg, antiHCV-total, antiHCV-cor, antiHCV -NS-2-3-4-5 и в полимеразной цепной реакции (ПЦР) - DNA и/или RNA. Диагноз урогени-тального хламидиоза подтверждался обнаружением специфических антител к Ch. trachomatis в ИФА и антигенов хламидий в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РПИФ).

Субпопуляционный анализ лимфоцитов периферической крови методом проточной ци-тометрии по методике, модифицированной ПИИ иммунологии МЗ РФ [4] на приборе «FacsCalibur» (BectonDickenson/США) с помощью моноклональных антител к поверхностным антигенам лимфоцитов (ИПО «Сорбент»/ Москва, РФ): зрелые Т-лимфоциты - CD3+, Т-хелперы - CD4+, цитотоксические лимфоциты CD8+, натуральные киллеры CD16+, CD56+, В-лимфоциты CD20+, молекулы адгезии CDllb+, маркеры ранней CD25+ и поздней активации CD95+, HLA-DR+.

У 20 женщин с невынашиванием беременности в анамнезе изучали субпопуляционный состав лимфоцитов и активационных маркеров эндометрия. Материалом для иммунологического исследования служили био-птаты маточного эндометрия в секреторной фазе, полученные при гистероскопии. В качестве контроля использовали показатели субпопуляций лимфоцитов эндометрия, полученного при удалении внутриматочного контрацептива у женщин с ненарушенной репродуктивной функцией. Выделение иммунокомпе-тентных клеток из ткани эндометрия проводили безферментативным способом. Фрагменты эндометрия помещали в контейнер «Medicon» (BectonDickenson/США), добавляли фосфатный буфер и измельчали в гомогенизаторе «Medimachine» (BectonDickenson/ США) в течение нескольких минут. Полученную клеточную суспензию центрифугировали

30 мин в градиенте плотности фиколл-верогра-фин (ё=1,078). Определяли содержание зрелых лимфоцитов СОЗ+, С04+, С08+, С016+, С1356+, маркеры ранней С132 5+ и поздней активации С1395+.

Результаты исследования и обсуждение. Данные, характеризующие особенности по-пуляционного состава лимфоцитов периферической крови при различных состояниях репродуктивной функции женщин, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов у женщин с воспалительными заболеваниями гениталий на фоне персистирующих инфекций

Показатель Контроль, п=30 1 группа, п=43 2 группа, п=32

Лимфоциты 37,0±7,33 45,6±5,6 47,7±9,2

CD3+ 54,8±3,19 64,6±6,6 39,9±15,3

CD4+ 39,9±3,25 38,4±5,6 29,5±8,3

CD8+ 23,9±2,78 23,5±4,8 21,5±6,5

CD16+ 10,9±2,64 6,1 ±2,5 21,5±5,3**

CD56+ 16,5±1,03 12,8±4,3 24,73±6,75

CD20+ 10,1+3,0 16,4±5,38 15,8±5,8

CD11b+ 10,8±2,2 - 17,75±3,8

CD95+ 6,8+1,1 8,0±6,9 15,25±4,21*

CD25+ 1,3+0,1 4,7±2,2** 12,5±3,17*

HLA-DR+ 5,3±0,63 8,9±2,0 15,92±4,10*

CD4+/CD8+ 1,7±0,2 1,3±0,6 1,65±0,8

* Различия с контролем достоверны при Р<0,05.

** Различия между 1 и 2 группой достоверны при Р<0,05.

Во второй группе больных (с невынашиванием беременности в анамнезе) по средним значениям показателей субпопуляций лимфоцитов достоверных отличий в сравнении с контрольной группой не выявлено. Но индивидуальные значения содержания субпопуляций лимфоцитов колебались в широких пределах. Иа фоне тенденции к снижению содержания зрелых лимфоцитов и Т-хелперов у 42,8 % пациенток регистрировалось резкое снижение содержания СС)3+-клеток и у 28,6 % - снижение С04+-клеток.

Разнонаправленность изменений наблюдалась также с показателями цитотоксических клеток, у 1/4 содержание С08+-лимфоцитов было сниженным и у 11,9% - повышенным. Содержание лимфоцитов имело тенденцию к повышению. Наблюдалась выраженная разба-лансировка показателей содержания натуральных киллеров. У 30,9 % пациенток уровень СО 16+ был повышен, а у 14,2 % - резко сни-

КАЗАХСКИЙ МЕДИЦИНСКИМ УНИВЕРСИТЕТ НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

жен. При этом у 20 % пациенток содержание другой популяции натуральных киллеров CD56+ было повышено более чем в 2 раза и у 21 % -резко снижено. Следует отметить, что повышенное содержание С016+лимфоцитов сопровождалось сниженным содержанием CD3+, СЭ4+клеток при нормальном уровне С08+лимфоцитов.

При анализе активационных маркеров установлено достоверное (Р<0,05) повышение относительного и абсолютного содержания С025+лимфоцитов по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы. Отмечалась тенденция к повышению раннего HLA-DR+ и позднего активационного маркера CD95+. При этом адекватное повышение их экспрессии наблюдалось только у 42,8 и 48,5 % женщин соответственно. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы адгезии (CDllb+), не отличалось от контроля, хотя и имело тенденцию к повышению.

В то же время регистрировалось снижение лимфоцитов экспрессирующих рецептор к Fc-IgG (CD56+), т. е. способных к антителоза-висимой клеточной цитогоксичности (АЗКЦ).

В большинстве случаев прерывание беременности опосредуют неантиген-специфические естественные киллеры и макрофаги. Coulam C.B. и соавт. [5| показали, что у женщин с привычным выкидышем выше содержание в крови CD56+CD16+, продуцирующих эмбриотоксические цитокины. Однако локальная продукция натуральных киллеров отличается от содержания в периферической крови. В эндометрии у пациенток с привычным выкидышем увеличивается содержание только классических С016+клеток, а содержание С056+клеток, продуцирующих трансформирующий фактор роста Ь^, уменьшается. Считается, что уменьшение содержания клеток данного фенотипа у женщин с привычными выкидышами может быть связано с изменением профиля экспрессии цитокинов и связанной с этой невозможностью снабжения зародыша соответствующей средой, содержащей факторы роста [6]. Функциональное состояние натуральных киллеров, т. е. экспрессия ими активационных маркеров, остается неизученным.

В связи с этим нами был изучен поиуля-ционный состав эндометрия женщин с невынашиванием беременности в анамнезе.Данные, характеризующие особенности популяционного

состава лимфоцитов эндометрия женщин с невынашиванием беременности в анамнезе, представлены в табл. 2. Установлено, что в группе женщин с невынашиванием беременности в анамнезе на локальном уровне в эндометрии достоверно (Р<0,05) сниженным оказалось содержание С056+лимфоцитов, что согласуется с данными литературы.

Таблица 2 Популяционный состав лимфоцитов эндометрия женщин с привычным невынашиванием беременности

Показатель, %

Контроль, п=20

Основная группа, п=20

CD3+

CD4+

CD8+

CD16+

CD56+

43,3±6,12 47,1±7,6 36,3±6,7 46,3±6,32 64,4±6,14

37,3±8,43 36,1±10,6 48,4±16,5 28,4±15,4 44,8±7,4*

*Различия с контролем достоверны при Р<0,05.

Огносительное содержание другой популяции естественных киллеров СО 16+ достоверно не отличалось от контроля, хотя имело тенденцию к снижению. Следует отметить тенденцию к снижению содержания СОЗ+, С04+ клеток по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы. Содержание ци-тотоксических СЭ8+клеток имело тенденцию к повышению, а в индивидуальных показателях был выраженный разброс, у 1/3 пациенток их содержание было в пределах контрольных значений и 1/3 - резко повышенным.

Анализ уровня экспрессии активационных маркеров (табл. 3) показал, что относительное содержание С025+лимфоцитов было достовер-

Таблица 3 Экспрессия активационных маркеров лимфоцитами эндометрия женщин с невынашиванием беременности

Показатель, % Контроль, п=20 Основная группа п=20

CD25+ 13,09± 1,21 4,33±1,47*

CD95+ 7,1±3,24 29,7±9,47*

CD4+CD25+ 1,13+0,35 0,53+0,36

CD8+CD25+ 1,62± 1,12 0,71+0,47

CD16+CD25+ 0,71 ±0,08 0,93±0,34

CD56+CD25+ 10,3+3,11 2,03±0,7*

CD4+CD95+ 1,31±0,7 2,32±1,38

CD8+CD95+ 1,17±0,46 6,68±4,5

CD16+CD95+ 2,09±1,4 3,22±2,54

CD56+CD95+ 1,18± 1,13 3,92±2,63

*Различия с контролем достоверны при Р< 0,05.

но (Р<0,05) сниженным по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы.

Следует отметить, что снижение ранней активации наблюдалось преимущественно в популяции С О 5 6+л и м ф о ц ит о в, что проявлялось достоверным (Р<0,05) снижением пула С13 5 6+С13 2 5+к л ет о к. Изучение экспрессии рецепторов к ИЛ-2 (С 1325) у отдельных субпопуляций лимфоцитов выявило тенденцию к снижению у С134+, С О8+л и м фонито в, к повышению - у С1316+клеток.

В то же время выявлено достоверное (Р<0,05) повышение клеток, готовых к апопто-зу (С1395+). При этом повышенная экспрессия рецептора С095+ была обнаружена у С134+, С08+клеток и натуральных киллеров, как СО 16+, так и С05 6+клеток.

У здоровых фертильных женщин тканевую интегрально сть эндометрия и защита от патогенных микроорганизмов обеспечиваются в основном популяцией активированных Т-кле-ток, продуцирующих ИНФ^. При этом естественные киллеры с фенотипом С056+СВ16-обладают слабой ЕК-подобной цитотоксической активностью.

Полученные результаты свидетельствуют, что на локальном уровне в эндометрии у женщин с привычным невынашиванием беременности постоянная стимуляция патогенными микроорганизмами приводит к снижению содержания С О 5 6+л и м ф о ц ит о в, снижению экспрессии ранних активационных маркеров и повышенной готовности клеток к апоптозу. При этом наблюдаются разнонаправленные изменения в содержании цитотоксических С О 8+л и м ф о пит о в.

Таким образом, при привычном невынашивании беременности инфекционного генеза наблюдается картина разнонаправленных изменений субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови. Это указывает на различные иммунологические механизмы формирования невынашивания беременности: повышение активности цитотоксических лимфоцитов С08+ и недостаточная или чрезмерная активность естественных киллеров. На локальном уровне в эндометрии у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе постоянная стимуляция патогенными микроорганизмами приводит к снижению содержания С О 5 6+л и м ф о пит о в, снижению экспрессии ранних активационных маркеров и повышенной готовности клеток к апоптозу.

При осложненном урогенитальном хлами-диозе носят дискретный характер: повышение уровня СО 16+ лимфоцитов ассоциируется с достоверно более высоким относительным и абсолютным количеством С1325+клеток и нормальным содержанием С133+, С134+ и С138+, повышенным уровня В-лимфоцитов. При нормальном/сниженном содержании СО 16+ наблюдается снижение СОЗ+ и С 134+лимфопитов. Исходное абсолютное содержание С016+клеток может служить критерием выбора метода иммунокоррекции: при высоком (>400x106/л) -целесообразно применение ИИБЖ, при низком (400x106/л) - предпочтительны препараты ре-комбинантных цитокинов - а-2Ь-ИНФ или ИЛ-2.

Разработка интегрального показателя, включающего уровень СО 16+ и С095+, создает предпосылки для подбора наиболее эффективных методов иммунокорригирующей терапии для каждого отдельного пациента [И.В.Волчек и соавт., 2002]. В связи с этим нами был предложен индекс С095+/ С016+, позволяющий повысить эффективность лечения посредством дифференцированного назначения иммуномоду-лятора, воздействующего на конкретный уровень иммунной системы.По мере прогресси-рования инфекции снижаются уровни иммуно-регуляторных субпопуляций лимфоцитов С133+, С04+. Уровень С1316+лимфопитов меняется от повышенного, отражающего активацию иммунной системы, до сниженного с увеличением доли апоптирующих лимфоцитов (С1395+), отражающего её истощение. Применение индекса С095+/С016+ позволяет учесть степень нарушения иммунной системы. Так, низкое его значение (менее 0,8) соответствует повышенному уровню С016+ лимфоцитов и низкому содержанию апоптирующих клеток. В этом случае целесообразно применение индукторов интерферона. Индекс 0,9-1,29 соответствует нормальному содержанию СО 16+ лимфоцитов и повышенному уровню апоптоза, что свидетельствует об истощении иммунокомпетентных клеток. И в этих условиях назначение препаратов интерферона преследует 2 задачи: во-пер-вых, заместительная терапия в условиях дефицита эндогенного интерферона; во-вторых, экзогенные интерферон усиливают синтез и секрецию эндогенных интерферонов всех классов, функциональную активность иммунокомпетентных клеток - Т-лимфоцитов, ГЧК-клеток и моноцитов/макрофагов. При значении индекса

1 КАЗАХСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ IУНИВЕРСИТЕТ НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

более 1,3, имеющего место при рецидивирующих инфекциях, в иммунной системе превалируют процессы апоптоза. В этих условиях для полноценной работы иммунной системы необходимо увеличить содержание иммунокомпе-тентных клеток не только качественно, но и количественно. Поэтому целесообразно назначение препаратов интерлейкина-2, который воздействует как на структурную (клеточную), так и на функциональную (регуляторную) составляющие иммунной системы. ИЛ-2 способствует дифференцировке ЫК-клеток в лимфокин-акти-

вированные киллерные клетки (ЛАК-клетки), отличающиеся высокой цитологической активностью и широким спектром действия.

Выводы

В качестве критерия для выбора вида иммунотерапии используют индекс С095+/ СО 16+, при значениях которого менее 0,8 на фоне снижения СОЗ+, СЭ4+ - назначают индукторы интерферона. При значении индекса, равном 0,9-1,29 назначают препараты интерферона, при значении индекса более 1,3 - препараты интерлейкина-2.

ЛИТЕРАТУРА

1 Clark G.F.. Oehninger S., Patankar M.S. et al. A role for glycoconjugates in human development: the human feto-embrionicdefence hypothesis // Hum. Reprod. - 1996. - Vol. 11. N 33. - P. 467-473.

2 Clark D.A., Lea R.G., Potior T. et al. Cytokines determining the success or failure of pregnancy// Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1991. - Vol. 656. - P. 524-536.

3 Coulam C.B., Clark D.A., Beer A.E. et al. Current clinical options for diagnosis and treatment of recurrent spontaneous abortion. Clinical Guidelines Recommendation committee for diagnosis and treatment of recurrent spontaneous abortion // AJR1. - 1997. - 38 (2). - P. 57-74.

4 Quenby S., Bates M., Doig T. et al. Pre-implantation endometrial leukocytes in women with recurrent miscarriage // Hum. Reprod. Vol. 14. - № 9. - P. 2386-2391.

5 Yamamoto Т., Tekahashi Y., Kase N., Mori H. Decidual NK cells in patients with recurrent abortion II AJRI. - 1998. - 40. - P. 274.

ТУЙ1Н

Бакылау топка Караганда CD16+ лимфоциттердщ саны жогарынаукастарда жандандырушы маркер-лердщ HLA-DR+ жэнеС095+ экспрессиясы кетержм болды, ал салыстырма топка Караганда С025+экспрессиясы - кетержю. CD3+, CD4+ лимфоциттер саны темен жэне CD95+/CD16+ индекс! 0,8-ден кем болгандаинтерферон индукторды, индекс! 0,9-1,29-га тец болганда-интерферон препараттарды, индекс! 1,3-тен артык кезде -интерлейкин-2 препараттарды колданган жен.

TyniHfli сездер: TyciK тастагандарлык, иммунитета интеграл ацыктау.

SUMMARY

It was found that in patients with high CD16+ lymphocytes level the activation markers HLA-DR+ and CD95+ expression levels are reliably higher than in the control group, and CD25+ expression levels are also higher compared to 1st group.CD95+/CD16+ index will be used, if its values are less than 0.8 on the background of CD3+, CD4+ decrease, interferon inductors will be prescribed, if the index value is 0.9 to 1.29 - interferon preparations, if the index value is more than 1.3 - interleukin-2 preparations.

Key words: noncarrying of pregnancy, integral evaluation of immunity.