Способ прогнозирования эффективной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с множественной миеломой
METHOD FOR PREDICTING EFFECTIVE MOBILISATION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS IN PATIENTS WITH MULTIPLE MYELOMA

Способ прогнозирования эффективной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) у пациентов с множественной миеломой, отличающийся тем, что устанавливается прогностически значимая концентрация цитокинов, секретируемых культурой мезенхимальных клеток стромы костного мозга, коррелирующая с выходом ГСК в периферическую кровь. Изобретение относится к области медицины и касается прогнозирования эффективной мобилизации ГСК.
Костный мозг - орган, в котором сосуществуют и функционально взаимодействуют друг с другом два различных типа клеток - гемопоэтические и мезенхимальные стромальные клетки. ГСК являются предшественниками всех форменных элементов периферической крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и пр.). При этом в костном мозге гемопоэтические клетки-предшественники находятся в кроветворных нишах, сформированных из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), поддерживающих функционирование ГСК. Костномозговая строма регулирует кроветворение как локально (в кроветворных нишах), так и дистанционно, продуцируя цитокины и ростовые факторы (интерлейкины 1, 4, 6, трансформирующий фактор роста β и т.д.).
Высокодозная химиотерапия с трансплантацией ГСК с успехом используется в лечении пациентов с заболеваниями системы крови. Для этих целей ГСК могут быть выделены из двух источников - костного мозга или периферической крови Выделение ГСК из периферической крови требует предварительной их мобилизации (стимуляции выхода из костномозговых ниш в кровеносное русло). В настоящее время остается ряд нерешенных вопросов, в частности, невозможность заготовки достаточного количества ГСК, отсутствие единого мнения об оптимальном способе мобилизации стволовых клеток перед проведением трансплантации у пациентов с онкогематологическими заболеваниями.
6
Известны два основных подхода к мобилизации стволовых клеток: введение пациенту гранулоцитарных колониестимулирующих факторов (Г-КСФ) в монорежиме, а также Г-КСФ в сочетании с химиотерапией. Препараты Г-КСФ с целью мобилизации ГСК используют, как правило, в дозах 10 мкг/кг веса пациента, подкожно, ежедневно, в течение 5 дней. Проведение аферезов ГСК начинают при числе CD34+ клеток более 0,01×10 в 1 мл периферической крови [1].
В качестве прототипов использованы работы О.В. Федык [1] и А.Ю. Попова [2], в которых в качестве прогностических факторов, ассоциированных с количеством заготовленных гемопоэтических предшественников, рассмотрены возраст пациентов - доноров аутологичных ГСК, вариант основного заболевания, количество предшествующих циклов химио- и лучевой терапии. Существенным недостатком прототипов является то, что не рассмотрены критерии, позволяющие еще до начала мобилизации ГСК прогнозировать их конечное содержание в периферической крови и трансплантационном материале.
Изобретение направлено на решение проблемы прогнозирования количества мобилизованных в периферическую кровь ГСК в зависимости от функционального состояния стромы костного мозга доноров.
Изобретение обеспечивает повышение эффективности процесса заготовки ГСК за счет использования экспериментально установленных контрольных количественных параметров - содержания ряда цитокинов, продуцируемых МСК костного мозга. Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной технологии, и может быть использовано в процессе получения ГСК.
ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СПОСОБА
4
2
Способ осуществляют следующим образом. Объектом исследования являются МСК костного мозга пациентов с множественной миеломой (n=15). Медиана возраста больных составила 61 год (42-65 лет). Пациенты получили однотипную индукционную терапию до начала мобилизации ГСК (4-6 курсов VCD). Миелоэксфузию выполняли до начала мобилизации ГСК. Выделение ядерных клеток костного мозга производили путем фракционирования на градиенте плотности «Lympholyte» (ρ=1,077 при температуре 22°C, «Cedarlane Laboratories Ltd», США). МСК культивировали в полной питательной среде, содержащей следующие компоненты: среду αМЕМ («StemCells», Канада), богатую тромбоцитами плазму (4%), гепарин 2 Ед/мл («Sigma», США), L-глутамин 2 мМ («StemCells», Канада). Плотность первичного посева составляла 5-10×10 миелокариоцитов на см. МСК культивировали в СОг-инкубаторе Sanyo-5AC («Sanyo», Япония) в атмосфере 5% углекислого газа при температуре 37°C. Полную замену питательной среды производили каждые 4-5 сут. Культивирование осуществляли до достижения культурой МСК степени покрытия площади флакона 90-95%, после чего в супернатантах первичных культур МСК определяли уровень интерлейкинов (ИЛ) 1β, 2, 6, 12, фактора некроза опухоли α (ФНОα), трансформирующего фактора роста β (TGFβ) методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов АО «Вектор-Бест», Россия (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНОα) и Invitrogen («Thermo Fisher Scientific», США; ИЛ-12 и TGF β).
2
Мобилизацию ГСК в периферическую кровь пациентов с множественной миеломой осуществляли путем проведения курса винорельбина в дозе 35 мг/м площади поверхности тела однократно с последующим назначением препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (10 мкг/кг подкожно, ежедневно, в течение 5 дней). Мониторинг уровня ГСК в периферической крови осуществляли ежедневно после введения Г-КСФ. Количество ГСК определяли по экспрессии на их поверхности маркера CD34 согласно протоколу ISHAGE, методом проточной цитометрии с использованием лазерного проточного цитофлуориметра «FACS Canto II» («Becton Dickinson», США).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России (клеточных технологий, клеточной и молекулярной иммунологии). Результаты анализа уровня продукции цитокинов мезенхимальными клетками и количества ГСК в периферической крови пациентов представлены в таблице 1.
Количество CD34+ клеток в периферической крови больных ММ варьировало в пределах 5-75 клеток/мкл (медиана - 22). Продукция цитокинов мезенхимальными клетками колебалась в диапазоне: ИЛ-1β - 0,632 - 0,653 (медиана - 0,642), ИЛ-2 - 0,366-0,490 (медиана - 0,389), ИЛ-6 - 71,52 - 132,72 (медиана - 95,12), ИЛ-12 - 0.06 - 0.416 (медиана - 0,136), ФНОα - 0,095 - 0,765 (медиана - 0,165), TGF β - 1,28 - 16,97 (медиана - 1,89) пг/мл/сут.
Для определения корреляции между количеством CD34+ клеток в 1 мкл периферической крови пациентов и концентрацией цитокинов в супернатанте культуры МСК костного мозга рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (r): для ИЛ-1β r составил минус 0,17, ИЛ-2 - 0,22, ИЛ-6 - 0,02, ИЛ-12 - 0,78, ФНОα - 0,84, TGFβ - минус 0,21. Обнаружена прямая корреляционная зависимость между уровнями ИЛ-12 и ФНОα и числом мобилизированных ГСК. Кроме того, проведен анализ мобилизации ГСК у пациентов с ММ в зависимости от уровня продукции ИЛ-12 и ФНОα МСК костного мозга (таблица 2).
При продукции мезенхимальными клетками ИЛ-12 более 0,136 пг/мл/сут, а ФНОα более 0,165 пг/мл/сут наблюдали достоверно большее количество ГСК, мобилизованных в периферическую кровь (критерий Манна-Уитни, р=0,02). Таким образом, концентрации ИЛ-12 и ФНОα в супернатантах культур МСК можно считать факторами прогноза эффективной мобилизации ГСК в периферическую кровь у пациентов с множественной миеломой.
Новизна данного технического решения заключается в использовании количественных величин цитокинсекретирующей способности мезенхимальных клеток костного мозга пациентов с множественной миеломой, которые позволяют прогнозировать уровень ГСК, мобилизованных в периферическую кровь.
Литература
1. Высокодозная химиотерапия и аутологичная трансплантация у пациентов с лимфомами и множественной миеломой: всем ли удается получить достаточное количество периферических стволовых кроветворных клеток? / Федык О.В., Саржевский В.О., Мельниченко В.Я., Дубинина Ю.Н. [и др.] // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н И. Пирогова. - 2018. - Т. 13, №3. - С 67-71.
2. Факторы прогноза эффективности получения аутологичных клеток-предшественников гемопоэза для последующей трансплантации после высокодозной химиотерапии Обзор литературы и собственные данные / А.Ю. Попов, Н.В. Жуков, С.В. Миненко, Л.Ю Андреева, В.В. Птушкин // Онкогематология. - 2008. - №3. - С. 34-44.