НОВЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ ИЗ ENTACMAEA QUADRICOLOR И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
NOVEL FLUORESCENT PROTEINS FROM ENTACMAEA QUADRICOLOR AND METHOD OF OBTAINING SAID PROTEINS

Ссылки на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США, серийный номер 60/761807, поданной 25 января 2006 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Область изобретения
Настоящее изобретение относится, в основном, к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на флуоресцентные белки.
Уровень техники
in vivo
Флуоресцентные белки, включая зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров  в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616): 87-91.
Флуоресцентные белки - это белки, которые способны к флуоресценции при облучении светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.
Aequorea aequorea
A. victoria
A. victoria
GFP гидромедузы  (синоним ) был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет. кДНК, кодирующая  GFP, была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2): 229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP самостоятельно образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открывают широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологии в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.
GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).
Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств GFP и для получения GFP-реактивов, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Были разработаны новые версии GFP, такие как ДНК "гуманизированного" GFP, белковый продукт которого имеет повышенный синтез в клетках млекопитающих (Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Один такой гуманизированный белок, мутантный вариант GFP, представляет собой "усиленный зеленый флуоресцирующий белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синими, циановыми и желто-зелеными спектральными вариантами GFP.
Anthozoa
Anthozoa
Однако, несмотря на широкое использование GFP, другие флуоресцентные белки со свойствами, сходными или отличными от GFP, были бы полезны в данной области, в частности, белки с новыми спектрами или большей интенсивностью флуоресценции. В 1999 г., гомологи GFP были клонированы из не биолюминесцентных видов  (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из  обладали большим спектральным разнообразием, включая циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцирующие хромопротеины (CP) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10): 953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5): 841-850). Сегодня GFP-подобные белки включают более 120 флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности по аминокислотной последовательности.
Кристаллическая структура GFP дикого типа и GFP S65T мутанта была разрешена и проявила, что третичная структура GFP представляет собой бочонок (Ormo et al., 1996, Science 273: 1392-1395; Yang, et al., 1996, Nature Biotech 14: 1246-1251). Этот бочонок состоит из бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Было подтверждено сделанное ранее предположение (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218), что хромофор формируется путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков. Все протестированные GFP-подобные белки имеют такую же бета-бочку, как GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787).
Полезность флуоресцентных белков как инструмента молекулярной биологии делает востребованным поиск других флуоресцентных белков, с другими или улучшенными свойствами по сравнению с известными флуоресцентными белками. Таким образом, востребовано получение новых флуоресцентных белков, которые проявляют свойства, недоступные у известных флуоресцентных белков, а также кодирующих их ДНК.
Сущность изобретения
Entacmaea quadricolor
Entacmaea quadricolor
Настоящее изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих новый флуоресцентный белок из  (EqFP578) и его функциональные мутанты, то есть EqFP578-подобные белки. В некоторых воплощениях указанная нуклеиновая кислота может быть выделена из . В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по настоящему изобретению получена методами генной инженерии.
Entacmaea quadricolor
В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют флуоресцентный белок дикого типа из  как в SEQ ID NO: 02 (EqFP578). Пример нуклеотидной последовательности показан в SEQ ID NO: 01.
В некоторых воплощениях обеспечивается выделенная нуклеиновая кислота, которая имеет последовательность, специфически гибридизующуюся с определенной частью или с целой комплементарной цепью SEQ ID NO: 01.
В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют флуоресцентный белок, который содержит аминокислотную последовательность, которая по существу сходна или идентична последовательности белка EqFP578 (SEQ ID NO: 02). Соответственно, выделенные нуклеотидные последовательности, кодирующие природные аллельные варианты SEQ ID NO: 01, также входят в рамки настоящего изобретения.
В некоторых воплощениях указанные нуклеиновые кислоты кодируют функциональные мутанты EqFP578, которые имеют по существу сходные или измененные биохимические или спектральные характеристики по сравнению с EqFP578 дикого типа.
В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют мутантные белки, которые содержат аминокислотную последовательность, по существу такую же, как последовательность EqFP578 (SEQ ID NO: 02), и отличаются от EqFP578 (SEQ ID NO: 02) по крайней мере одной аминокислотной заменой.
В предпочтительных воплощениях указанная аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из R32G и S131P; указанный мутантный флуоресцентный белок имеет улучшенный фолдинг при 37°C по сравнению с EqFP578. В предпочтительных воплощениях указанный мутант содержит обе эти замены.
in vivo
В предпочтительных воплощениях указанный мутант также содержит другие фолдинговые мутации, например, выбранные из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K. Эти мутации улучшают фолдинг белка и скорость созревания хромофора, приводя к более быстрому образованию флуоресцентного сигнала .
В других предпочтительных воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют полученный с помощью методов генной инженерии флуоресцентный белок, имеющий модифицированную N- и/или C-концевую часть вне хромофорного домена EqFP578, где указанный белок проявляет уменьшенную способность к агрегации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях модифицированный N-конец содержит замену K6T, и C-концевой - замену R231S. В некоторых воплощениях модифицированный N-конец также содержит дополнительную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из MGEY и MGED.
in vivo
В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок, который содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из R155E, Q159D, S173N, F192V, F194Y, где указанный функциональный флуоресцентный белок имеет уменьшенную способность к олигомеризации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок также содержит замену N122R, которая еще сильнее уменьшает склонность белка к олигомеризации. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок содержит все указанные замены и также содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K, где эти замены улучшают сворачиваемость (фолдинг) белка и повышают интенсивность флуоресценции .
В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок, который содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H197R, S158G, N143S, N143H, N143F и N143Y, где указанный функциональный флуоресцентный белок имеет измененные спектры испускания и возбуждения флуоресценции, чем соответствующий белок дикого типа.
Примеры молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, которые кодируют полученные с помощью методов генной инженерии функциональные мутанты EqFP578, включают SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 или кодируют SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода или гибридизуются с ними, также входят в рамки настоящего изобретения.
В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты по настоящему изобретению.
В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные белки по настоящему изобретению, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше.
Entacmaea quadricolor
В некоторых воплощениях функциональные флуоресцентные белки по настоящему изобретению включают аминокислотную последовательность, которая по существу такая же или идентичная последовательности флуоресцентного белка дикого типа из , имеющего SEQ ID NO: 02 (EqFP578). Белки, представляющие интерес, включают EqFP578 дикого типа и его мутанты, которые имеют по существу сходные или измененные биохимические и/или спектральные свойства по сравнению с EqFP578 дикого типа.
В предпочтительных воплощениях указанная аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из R32G и S131P; указанный мутантный флуоресцентный белок имеет улучшенный фолдинг при 37°C по сравнению с EqFP578. В предпочтительных воплощениях указанный мутант содержит обе эти замены.
in vivo
В предпочтительных воплощениях указанный мутант также содержит другие фолдинговые мутации, например, выбранные из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K. Эти мутации улучшают сворачиваемость (фолдинг) белка и скорость созревания хромофора, приводя к более быстрому образованию флуоресцентного сигнала .
В других предпочтительных воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии флуоресцентный белок имеет модифицированную N- и/или C-концевую часть вне хромофорного домена EqFP578, при этом указанный белок проявляет уменьшенную способность к агрегации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях модифицированный N-конец содержит замену K6T, и C-концевой - замену R231S. В некоторых воплощениях модифицированный N-конец также содержит дополнительную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из MGEY и MGED (SEQ ID NO: 17 и 18, соответственно).
in vivo
В некоторых воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок по настоящему изобретению содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из R155E, Q159D, S173N и F192V, при этом указанный функциональный флуоресцентный белок имеет уменьшенную способность к олигомеризации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок также содержит замену N122R, которая еще сильнее уменьшает склонность белка к олигомеризации. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок содержит все указанные замены и также содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K, где эти замены улучшают сворачиваемость (фолдинг) белка и повышают интенсивность флуоресценции .
В некоторых воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок по настоящему изобретению содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H197R, S158G, N143S, N143H, N143F и N143Y, при этом указанный функциональный флуоресцентный белок имеет измененные спектры испускания и возбуждения флуоресценции, чем соответствующий белок дикого типа.
Примеры флуоресцентных белков, представляющих интерес, включают SEQ ID NO: 02, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16.
Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты или векторы или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению.
Кроме того, обеспечиваются антитела, специфически связывающие белки по настоящему изобретению или их фрагменты.
Краткое описание фигур
Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.
Фиг.1 показывает множественное выравнивание EqFP578 дикого типа и его мутантов.
Фиг.2 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции EqFP578 дикого типа.
Фиг.3 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта EqFP578m1.
Фиг.4 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта M1-602.
Фиг.5 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта M1-637.
Фиг.6 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта M1-mono1.
Фиг.7 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта nrM181-5 (до фотоконверсии).
Подробное описание изобретения
Entacmaea quadricolor
Entacmaea quadricolor
Если подвести итог вышеуказанному, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют флуоресцентный белок EqFP578 из  и его мутанты, а также на белки, кодируемые этими нуклеиновыми кислотами. Молекулы нуклеиновых кислот, представляющие интерес, выделены из  или получены методами генной инженерии. Белки, представляющие интерес, включают флуоресцентные белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Также представляют интерес белки, сходные по существу, или мутанты к указанным белкам. Также обеспечиваются клетки-хозяева, стабильные клеточные линии и трансгенные организмы, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот. Кроме того, обеспечиваются антитела, специфичные к белкам по настоящему изобретению.
Указанные белковые и нуклеотидные композиции применяются во многих различных приложениях и методах, в частности, в приложениях мечения клеток, клеточных органелл или белков. Также указанные белковые и нуклеотидные композиции применяются в методах тестирования активности промоторов в различных условиях. Наконец, обеспечиваются наборы для их использования в таких методах и приложениях.
Определения
Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам по настоящему изобретению, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.
Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок" означает белок, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство этих белков представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации двух или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки по настоящему изобретению не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.
Aequorea victoria
Как здесь используется, термин "GFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из , включая варианты GFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей флюоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа GFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).
Как здесь используется, термин "EGFP" относится к мутантному варианту GFP, имеющему две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., 1995, Nature 373: 663-664).
Термин "гуманизированный" относится к изменению нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка, сделанной для оптимизации генетического кода кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих (Yang et al., 1996, Nucleic Acids Research 24: 4592-4593).
Entacmaea quadricolor
Как здесь используется, термин “EqFP578” относится к нуклеиновой кислоте и флуоресцентному белку дикого типа из , который имеет нуклеотидную и аминокислотную последовательность, показанные в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно.
Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.
Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены, и/или удалены (делетированы), и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков по настоящему изобретению. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Как здесь используется, "гомология" - это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.
Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности “по существу сходны” или “по существу такие же”, как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранной для сравнения области. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или, по крайней мере, 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также по существу сходны. Для целей настоящего изобретения длина сравниваемых последовательностей флуоресцентных белков будет в основном, по крайней мере, 160 аминокислот; предпочтительно, по крайней мере, 200 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина сравниваемых последовательностей будет в основном, по крайней мере, 480 нуклеотидов; предпочтительно, по крайней мере, 600 нуклеотидов.
Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.
Как здесь используется, термин "подобные флуоресцентные белки" относится к флуоресцентным белкам, которые имеют по существу сходную аминокислотную последовательность при сравнении с референсным флуоресцентным белком. В основном, подобный флуоресцентный белок при сравнении с последовательностью референсного флуоресцентного белка имеет продолжительную последовательность длиной, по крайней мере, 160 аминокислот, которая обладает, по крайней мере, 85% идентичностью с референсным флуоресцентным белком.
Как здесь используется, термин "EqFP578-подобный белок" относится к EqFP578 дикого типа с SEQ ID NO: 2 и его функциональным мутантам, например тем, которые имеют аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Как здесь используется, термин "EqFP578-подобная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует EqFP578-подобный белок (например, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15). Как здесь используется, EqFP578-подобный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по существу сходна или идентична последовательности EqFP578 (SEQ ID NO: 02). Термин "EqFP578-подобный белок" и "EqFP578-подобная нуклеиновая кислота" также относится к укороченным и удлиненным вариантам EqFP578 или его мутантов и кодирующим их нуклеиновым кислотам.
Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания флуоресцентных белков, означает, что белок имеет пригодные для использования спектры возбуждения и испускания флуоресценции (то есть обладает детектируемой флуоресценцией).
Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, pH и температурной стабильности, и другим подобным свойствам.
Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или “спектральные свойства" относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресценции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница в любом из этих свойств между EqFP578 дикого типа и его мутантами применима. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например, интенсивность флуоресценции при определенной длине волны или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.
(-2)
(-1)
(-4)
(-1)
Как здесь используется, "скорость созревания" относится к скорости формирования зрелого флуоресцентного белка (то есть флуоресцентного белка, способного продуцировать флуоресценцию) после трансляции. Скорость созревания можно охарактеризовать полупериодом созревания. Было показано, что созревание флуоресцентного белка включает две стадии: (i) фолдинг белка, что означает формирование белковых бета-слоев с центральной альфа-спиралью, содержащей аминокислоты, которые будут формировать хромофор. Эта стадия обычно характеризуется константой скорости примерно 10s или полупериодом от нескольких секунд до десятков секунд; (ii) созревание хромофора, когда белковая цепь подвергается циклизации и дегидратации. Эта стадия обычно характеризуется константой скорости примерно 10s или полупериодом длиной в несколько минут. Таким образом, эта более медленная стадия является лимитирующей в созревании зеленого флуоресцентного белка (Reid BG, Flynn GC. Biochemistry. 1997 V. 36(22), PP. 6786-6791).
Как здесь используется, "агрегация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). "Агрегацию" следует отличать от "олигомеризации". В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например, с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации (т.е. превращают тетрамеры в димеры или мономеры или димеры в мономеры).
Как здесь используется, "олигомеризация" относится к склонности или способности экпрессированного белка формировать комплексы (олигомеры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например, в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на "способность" белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, тримеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях, хотя, как здесь описано, флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, pH, нежели pH при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации, могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация, или иным способом известным в данной области.
Термин "функционально связанный" или ему подобный при описании слитых белков относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, флуоресцентный белок по настоящему изобретению может быть слит с представляющим интерес партнером слияния. В этом случае слитый белок сохраняет флуоресцентные свойства этого флуоресцентного белка, а представляющий интерес полипептид сохраняет его первоначальную биологическую активность. В некоторых воплощениях настоящего изобретения активность как флуоресцентного белка, так и белка, представляющего интерес, может быть снижена по сравнению с активностями изолированных белков. Такие слитые белки также находят применение в рамках настоящего изобретения.
Как здесь используется, термин "специфически гибридизуется" относится к ассоциации между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот или в достаточной степени комплементарными последовательностями, что разрешает такую гибридизацию в предопределенных условиях, обычно использующимися в данной области (иногда используется термин "по существу комплементарный").
Ссылка на нуклеотидную последовательность "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательностью в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
Как здесь используется, нумерация аминокислотных остатков и замен соответствует нумерации аминокислотных остатков в последовательности EqFP578 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Для мутантных белков позиция аминокислотного остатка или замены может быть определена с помощью белкового выравнивания (фиг.1).
Молекулы нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный белок EqFP578, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и его мутанты. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие укороченные или удлиненные варианты EqFP578 и его мутантов, также находятся в рамках настоящего изобретения.
Entacmaea quadricolor
Специфические молекулы нуклеиновой кислоты, представляющие интерес, включают молекулы, кодирующие следующие флуоресцентные белки: красный флуоресцентный белок из , имеющий последовательность SEQ ID NО: 2; и его мутанты с оптимизированными свойствами: фолдинг при 37°C, уменьшенная способность к агрегации и/или олигомеризации, и измененные спектральные характеристики. Аминокислотные последовательности этих мутантов показаны в SEQ ID NО: 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Примеры специфических мутантных нуклеиновых кислот по настоящему изобретению показаны в SEQ ID NО: 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15.
Каждый из этих специфических типов молекул нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, раскрывается более детально ниже в экспериментальной части.
Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК, такую как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин “кДНК” относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности представляют собой экзоны и 5' и 3' некодирующие области.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный белок, могут быть синтезированы из подходящих нуклеозидтрифосфатов или выделены из биологических источников. Оба метода основаны на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот (например, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16) или информации о нуклеотидной последовательности (например, SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15) дает возможность получить выделенные молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода, может быть синтезировано. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.
nd
Синтетические олигонуклеотиды могут быть получены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкции могут быть очищены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом, могут быть. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР.
Cnidaria
Anthozoa
Zoantharia
Actiniaria
Actiniidae
Entacmaea quadricolor
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентные белки по настоящему изобретению, могут быть также клонированы из биологических источников из типа , предпочтительно из класса , более предпочтительно из подкласса , более предпочтительно из отряда  и даже более предпочтительно из семейства , например, из .
Entacmaea quadricolor
in vitro
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляет собой ДНК (или кДНК) молекулу, содержащую открытую рамку считывания, которая кодирует флуоресцентный белок из  по настоящему изобретению и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессирования флуоресцентного белка согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки по настоящему изобретению. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах  или в клетках или организмах, находящихся в среде, отличной от той, в которой они находятся в естественных условиях.
in vitro
Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высокосходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей, таких как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторной области. Такие специальные замены могут быть произведены  с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.
Нуклеиновая кислота, кодирующая EqFP578-подобный полипептид, аминокислотная последовательность которого является мутантной, производной, вариантом или аллельным вариантом последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, также обеспечивается настоящим изобретением. Нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид, может иметь более чем 60% гомологии с кодирующей последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, более чем примерно 70% гомологии, более чем примерно 80% гомологии, более чем примерно 90% гомологии или более чем примерно 95% гомологии.
Нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид или его фрагмент, может быть выделена любым из многих известных методов. Фрагмент кДНК по настоящему изобретению может использоваться как гибридизационный зонд против библиотеки кДНК из целевого организма в условиях высокой строгости. Зонд может быть большим фрагментом или одним или несколькими короткими вырожденными праймерами. Нуклеиновые кислоты, имеющие сходство последовательности, могут быть детектированы гибридизацией в условиях высокой строгости, например, при 50°С или выше (например, 60°С или 65°С), 50% формамид, 0,1×SSC (15 мM хлорид натрия/1,5 мM натрия цитрат), 0,1% SDS. Нуклеиновые кислоты, имеющие области по существу идентичные с референсной последовательностью, например, аллельные варианты, генетически-измененные варианты нуклеиновых кислот и т.д., связываются с референсной последовательностью в гибридизационных условиях высокой строгости. Используя зонды, в частности меченые зонды их ДНК последовательности, можно выделить подобные нуклеотидные последовательности.
in vivo
Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая подверженную ошибкам ПЦР (error-prone PCR), перетасовку (shuffling), олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез , кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генное реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственную перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацилсодержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радиоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации. В некоторых воплощениях флуоресцентные белки, кодируемые мутантными или производными нуклеиновыми кислотами, имеют те же самые флуоресцентные или биохимические свойства как флуоресцентный белок дикого типа. В других воплощениях мутантные или производные нуклеиновые кислоты кодируют флуоресцентные белки с измененными свойствами.
Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки по настоящему изобретению. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Как здесь используется, термин "гуманизированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США № 5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой. Примеры вырожденных вариантов, представляющих интерес, описаны более подробно в экспериментальной части, ниже.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие укороченные и удлиненные варианты EqFP578 и его мутантов, также входят в рамки настоящего изобретения. Как здесь используется, эти варианты белков содержат аминокислотные последовательности EqFP578-подобного белка с измененными C-, N- или обоими концами. В удлиненных вариантах C- или N-конец белка может содержать дополнительные аминокислотные остатки. В укороченных вариантах один или несколько (обычно до 8, чаще до 7 и преимущественно до 5) аминокислотных остатков могут быть удалены из последовательности или заменены на любые другие аминокислотные остатки. Такие модификации не изменяют по существу флуоресцентные свойства белков, но могут облегчать белковый фолдинг в клетке-хозяине, снижать способность к агрегации или модулировать другие биохимические свойства белков, например, полупериод распада. В некоторых воплощениях эти модификации не изменяют биохимические свойства белка. Все виды модификаций и мутаций, указанные выше, осуществляются на уровне нуклеиновой кислоты.
Молекулы нуклеиновых кислот по изобретению могут кодировать весь или часть заявленного белка. Двух- и одноцепочечные фрагменты могут быть получены из последовательности ДНК путем химического синтеза олигонуклеотидов в соответствии со стандартными способами, энзиматической рестрикцией, амплификацией ПЦР и т.д. В основном, фрагменты ДНК будут иметь размер по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно 18 нуклеотидов или приблизительно 25 нуклеотидов и могут быть по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов. В некоторых воплощениях заявленные молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь размер приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700 нуклеотидов или более. Заявленные нуклеиновые кислоты могут кодировать фрагменты заявленных белков или полноразмерные белки; например, заявленные нуклеиновые кислоты могут кодировать полипептиды приблизительно из 25 аминокислот, приблизительно из 50, приблизительно из 75, приблизительно из 100, приблизительно из 125, приблизительно из 150, приблизительно из 200 аминокислот вплоть до полной длины белка.
Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть фланкированы одним или несколькими нуклеотидами, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые белки, включающие белок по настоящему изобретению, или их фрагменты, которые ниже рассматриваются более детально.
in vivo
Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д. последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и много таких векторов доступны коммерчески. Для приготовления конструкции полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией , обычно присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных хромогенных или флуоресцентных белков или слитых белков на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии генный продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В экспрессионном векторе указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Методы получения кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистом, квалифицированным в данной области.
Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки по настоящему изобретению, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).
Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.
Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот по изобретению, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.
Также обеспечиваются короткие фрагменты ДНК заявленных нуклеиновых кислот, которые применяются как праймеры для ПЦР, гибридизационные скрининговые зонды и т.д. Длинные фрагменты ДНК применяются для получения кодируемых полипептидов, как ранее описано. Однако для использования в геометрических реакциях амплификации, таких как геометрическая ПЦР, используется пара коротких фрагментов ДНК, то есть праймеров. Точная последовательность праймера не является критической для изобретения, но для большинства применений праймеры будут гибридизоваться с заявленной последовательностью в условиях строгости, как известно в данной области. Предпочтительно выбрать пару праймеров, которые дадут продукт амплификации по меньшей мере приблизительно из 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 100 нуклеотидов и могут простираться на полную последовательность нуклеиновой кислоты. Алгоритмы отбора последовательностей праймеров обычно известны и доступны в коммерческих пакетах программ. Праймеры для амплификации гибридизуются с комплементарными цепочками ДНК и будут затравлять встречные реакции амплификации.
Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР, с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например, нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-зондами, иммобилизованными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью, указывает на экспрессию гена в образце.
Белки
Entacmaea quadricolor
Также обеспечиваются в соответствии с заявленным изобретением флуоресцентные белки, производные и мутанты из них, включая полноразмерные белки и их части или фрагменты. Также обеспечиваются варианты природного белка из  (SEQ ID NO: 2), где такие варианты - белки, гомологичные или по существу сходные природному белку, и мутанты природного белка, как описано подробнее ниже.
Заявленные белки флуоресцентны, то есть обладают способностью к детектируемой флуоресценции. Во многих воплощениях заявленные белки обладают красной или дальне-красной флуоресценцией, то есть они имеют максимум возбуждения флуоресценции в диапазоне от приблизительно 450 нм до 700 нм, обычно от приблизительно 470 нм до 650 нм и чаще всего от приблизительно 500 до 600 нм, например, от 550 до 595 нм; тогда как максимум эмиссии заявленных белков лежит в диапазоне от приблизительно 530 до 700 нм, обычно от приблизительно 550 нм до 670 нм и чаще всего от приблизительно 560 до 650 нм, например, от 574 до 637 нм. В других воплощениях заявленные белки имеют максимум возбуждения флуоресценции в диапазоне от приблизительно 350 до 500 нм, обычно от приблизительно 370 нм до 450 нм и чаще всего от приблизительно 390 до 420 нм, например, 400 нм; тогда как максимум эмиссии заявленных белков лежит в пределах от приблизительно 400 до 530 нм, обычно от приблизительно 420 нм до 510 нм, например 470 нм.
Заявленные белки обычно имеют максимальный коэффициент экстинкции в диапазоне от приблизительно 30000 до 150000 и обычно от приблизительно 6000 до 120000, например, от 90000 до 120000.
Заявленные белки обычно различаются по длине от приблизительно 150 до 300 аминокислот и обычно от приблизительно 200 до 300 аминокислотных остатков, и обычно имеют молекулярную массу в диапазоне приблизительно от 15 до 35 кДа, обычно приблизительно от 17,5 до 32,5 кДа.
В некоторых воплощениях заявленные белки являются яркими, где под яркими понимается то, что флуоресцентные белки могут быть обнаружены обычными способами (например, визуальный скрининг, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, FACS приборами и т.д.). Яркость флуоресценции специфических флуоресцентных белков определяется их квантовым выходом, умноженным на максимальный коэффициент зкстинкции и деленным на 1000. В некоторых воплощениях заявленные белки обладают яркостью флуоресценции в диапазоне от приблизительно 10 до 90, обычно приблизительно от 40 до 80 и чаще всего приблизительно от 50 до 75.
В некоторых воплощениях заявленные белки - фотоактивируемые, фотогасимые или фотопереключаемые, то есть они меняют флуоресцентные свойства при облучении светом определенной длины волны и интенсивности. Например, они проявляют синюю флуоресценцию (с испусканием приблизительно 440-500 нм) до облучения и красную флуоресценцию (с испусканием приблизительно 540-650 нм) после облучения ультрафиолетовым светом (например, приблизительно 400 нм). В некоторых воплощениях эти белки могут обладать красной флуоресценцией до облучения, которая уменьшается под действием облучения (например, УФ- или синим светом). В других воплощениях эти белки могут быть нефлуоресцентными (хромогенными) до, но флуоресцентными после облучения УФ- или синим светом.
В некоторых воплощениях заявленные белки укладываются быстро после экспрессии в клетке-хозяине. Под быстрым укладыванием понимается то, что белки достигают своей третичной структуры, которая обеспечивает их флуоресцентное свойство, за короткий период времени. В этих воплощениях белки укладываются в течение периода времени, который в общем случае не превышает приблизительно 48 ч, обычно не превышает приблизительно 24 ч и чаще не превышает приблизительно 12 ч (например, полупериод укладки может быть 3 часа).
Entacmaea quadricolor
Cnidaria
Anthozoa
Zoantharia
Actiniaria
Actiniidae
Специфические белки, представляющие интерес, включают красный флуоресцентный белок EqFP578 из  из типа , предпочтительно из класса , более предпочтительно из подкласса , более предпочтительно из отряда  и более предпочтительно из семейства  (SEQ ID NO: 2); и его функциональные мутанты.
in vivo
in vitro
Мутанты могут сохранять свойства белков дикого типа (например, природных) или могут иметь биологические свойства, отличные от форм белков дикого типа. Термин “биологические свойства” белков по настоящему изобретению относится, но не лимитирован, спектральными свойствами, такими как максимум возбуждения флуоресценции, максимум испускания, максимальный коэффициент экстинкции, яркость (например, по сравнению с референсным белков) и подобные; биохимическими свойствами, такими как  и/или  стабильность (например, полупериод); скорость созревания, склонность к агрегации и склонность к олигомеризации и другими подобными свойствами (по сравнению с референсным белков). Мутации включают единичные аминокислотные замены, делеции и инсерции одной или нескольких аминокислот, укорочение или удлинение N-конца, укорочение или удлинение C-конца и тому подобное.
Мутанты могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе "молекулы нуклеиновых кислот" выше. Примеры обеспечивают общие приемы и использование стандартных способов, так что специалисты, квалифицированные в данной области, могут легко получить большой ряд дополнительных мутантов и проверить, было ли изменено биологическое (например, биохимическое, спектральное и т.д.) свойство. Например, флуоресцентная интенсивность может быть измерена с использованием спектрофотометра при различных длинах волн возбуждения.
Представляющие интерес белки могут быть также модифицированы с использованием стандартных методов, включая РНК-редактирование, химические модификации, модификации после трансляции и после транскрипции и т.п. Например, производные белков, представляющие интерес, могут быть получены методами, такими как измененное фосфорилирование или гликозилирование, или ацетилирование, или липидирование, или различными типами расщепления при созревании и т.п.
В некоторых воплощениях указанные мутанты содержат, по крайней мере, одну аминокислотную замену, которая улучшает сворачивание (фолдинг) белка при 37°C, где указанная замена выбрана из группы, состоящей из R32G и S131P. В предпочтительных воплощениях указанный мутант содержит обе эти замены.
В некоторых воплощениях указанные мутанты также содержат, по крайней мере, одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K, где указанные фолдинговые замены усиливают сворачивание (фолдинг) белка и созревание хромофора при 37°C.
В некоторых воплощениях указанные мутанты имеют модифицированные N- и/или C-концевую часть и содержат, по крайней мере, одну замену из K6T и R231S или обе, где указанные замены уменьшают способность мутанта к агрегации по сравнению с соответствующим белком дикого типа.
В некоторых воплощениях указанный мутант является удлиненным вариантом EqFP578, содержащим дополнительную N-концевую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из MGEY (SEQ ID NO: 17) или MGED (SEQ ID NO: 18), где указанная аминокислотная последовательность уменьшает способность мутанта к агрегации.
in vivo
В некоторых воплощениях представляющий интерес функциональный флуоресцентный мутант содержит, по крайней мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из R155E, Q159D, S173N, F192V и F194Y, где указанный мутант имеет сниженную способность к олигомеризации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительном воплощении указанный функциональный флуоресцентный белок также содержит замену N122R, которая еще сильнее уменьшает способность белка к олигомеризации. В предпочтительном воплощении указанный мутант содержит все указанные замены и также содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K, где эти замены улучшают сворачивание и интенсивность флуоресценции белка .
В некоторых воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок по настоящему изобретению содержит, по крайней мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H197R, S158G, N143S, N143H, N143F или N143Y, где указанный функциональный флуоресцентный белок имеет измененные спектры возбуждения и испускания флуоресценции по сравнению с белком дикого типа.
Специфические мутанты, представляющие интерес, включают полученные с помощью методов генной инженерии функциональные флуоресцентные белки, включающие аминокислотную композицию SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16, и обсуждаются более детально в экспериментальной части, ниже.
Также обеспечиваются белки, которые по существу сходны с указанными выше специфическими белками, где "по существу сходны" означает, что эти белки имеют аминокислотную последовательность, идентичную последовательности исходного белка, по крайней мере, приблизительно на 85% идентичности, обычно, по крайней мере, приблизительно 90% и чаще, по крайней мере, приблизительно 95%, (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности).
Белки по настоящему изобретению присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они выделены из естественной среды или рекомбинантны. Белки по настоящему изобретению могут находиться в выделенном состоянии, что означает, что белки по существу свободны от других белков и других биологических молекул, присутствующих в естественной среде, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин “по существу свободны” в этом случае означает, что меньше, чем 70%, обычно меньше, чем 60% и чаще меньше, чем 50% композиции, содержащей выделенный белок, представляют собой некоторые другие биологические молекулы, чем встречающиеся в природе. В некоторых воплощениях белки присутствуют в по существу очищенной форме, где "по существу очищенная форма" означает очищенная по меньшей мере на 95%, обычно по меньшей мере на 97% и чаще по меньшей мере на 99%.
Также обеспечиваются фрагменты белков, встречающихся в природе, также как мутантных и производных белков, описанных выше. Биологически активные фрагменты и/или фрагменты, соответствующие функциональным доменам, и т.п. представляют определенный интерес. Фрагментами, представляющими интерес, являются полипептиды, которые обычно имеют размер по меньшей мере приблизительно 30 аминокислот, обычно по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75 или 100 аминокислот и могут быть размером 300 аминокислот или более, но обычно не будут превышать размера приблизительно 250 аминокислот, где фрагмент будет иметь участок аминокислот, который является одинаковым с заявленным белком, размером по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, и обычно по меньшей мере приблизительно 45 аминокислот, и во многих воплощениях по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот. В некоторых воплощениях заявленные полипептиды имеют размер приблизительно 25 аминокислот, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 200 или приблизительно 250 аминокислот, вплоть до полного размера белка. В некоторых воплощениях белковый фрагмент сохраняет все или по существу все специфические свойства белка дикого типа.
Entacmaea quadricolor
Заявленные белки и полипептиды могут быть получены из природных источников или искусственно синтезированы. Например, белки дикого типа могут быть получены из биологических источников, которые экспрессируют белки, например, из , как было указано выше. Заявленные белки могут также быть получены искусственным путем, например, экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка, представляющего интерес, в соответствующем хозяине, как описано выше. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, афинной хроматографии и т.п.
Entacmaea quadricolor
Entacmaea quadricolor
Также обеспечиваются слитые белки, включающие белок по настоящему изобретению, или его фрагменты, слитый, например, с последовательностью, обеспечивающей быструю деградацию, последовательностью внутриклеточной локализации (например, сигнал локализации в ядре, сигнал локализации в пероксисомах, сигнал локализации в аппарате Гольджи, сигнал локализации в митохондрии и т.д.), сигнальный пептид или любой белок или полипептид, представляющий интерес. Слитые белки могут содержать, например, заявленный в изобретении флуоресцентный белок и второй полипептид (“партнер слияния”), слитый в рамке на N-конец и/или C-конец флуоресцентного белка. Партнеры слияния включают, но не ограничены, полипептиды, которые могут связывать антитела, специфические к партнеру слияния (например, эпитопные метки), антитела или их связывающие фрагменты, полипептиды, которые обеспечивают каталитическую функцию или вызывают клеточный ответ, лиганды или рецепторы или их миметики и т.п. В таких белках слияния, в общем случае партнер слияния естественно не связан с флуоресцентной белковой частью слитого белка и обычно не является флуоресцентным белком из  по настоящему изобретению; то есть он не находится в организмах .
Также обеспечиваются антитела, которые специфически связываются с флуоресцентным белком по настоящему изобретению. Подходящие антитела могут быть получены с использованием способов, известных в данной области. Например, поликлональные антитела могут быть получены, как описано в (Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), и моноклональные антитела могут быть получены, как описано в (Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3rd edition, (1996) Academic Press). Химерные антитела, включая гуманизированные антитела, также как одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fv, F(ab')2 и Fab, также представляют интерес.
Трансформанты
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы для получения трансформантов, включая трансгенные организмы или сайт-специфичные генные изменения в клеточных линиях. Трансгенные клетки, заявленные в изобретении, содержат одну или несколько нуклеиновых кислот, заявленных по настоящему изобретению, в качестве трансгена. Для целей изобретения любая приемлемая клетка-хозяин может быть использована, включая прокариотические (например, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus и т.д.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенный организм, заявленный по изобретению, может быть прокариотическим или эукариотическим организмом, включая бактерии, цианобактерии, грибы, растения и животные, в которых одна или больше клеток организма содержат гетерогенную нуклеиновую кислоту, заявленную по изобретению, введенную посредством вмешательства человека, такими способами, как технологии трансгеноза, которые известны в данной области.
Выделенная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть введена в хозяина способами, известными в данной области, например, инфицированием, трансфекцией, трансформацией или трансконъюгацией. Способы переноса молекулы нуклеиновой кислоты (то есть ДНК) в такие организмы широко известны и обеспечиваются в ссылках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
В одном воплощении трансгенный организм может быть прокариотическим организмом. Способы трансформации прокариотических хозяев хорошо описаны в данной области (например, см. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).
В другом воплощении трансгенными организмами могут быть грибы, например дрожжи. Дрожжи широко используются как носители для экспрессии гетерогенного гена (например, см. Goodey et al. Yeast biotechnology, D. R. Berry et al., eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp. 401-429) и King et al. Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G. T. Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp. 107-133). Несколько типов дрожжевых векторов доступны, включая интегративные векторы, которые требуют рекомбинации с геномом хозяина для их поддержки, и автономно реплицирующиеся плазмидные векторы.
Другой организм хозяина является животным. Трансгенные животные могут быть получены трансгенными способами, известными в данной области и обеспечиваются в ссылках, таких как Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000). Например, трансгенные животные могут быть получены гомологичной рекомбинацией, где изменяется эндогенный локус. Альтернативно конструкция нуклеиновой кислоты включается случайным образом в геном. Векторы для устойчивого включения включают плазмиды, ретровирусы и другие животные вирусы, YAC и т.п.
in vitro
Нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку непосредственно или опосредованно, введением в предшественника клетки, путем намеренной генетической манипуляции, такой как микроинъекция или инфицирование рекомбинантным вирусом или рекомбинантным вирусным вектором и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классическое скрещивание или оплодотворение , а предпочтительно является направленным на введение рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в хромосому, или они могут являться внехромосомными реплицирующими ДНК.
Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации будут содержать по меньшей мере часть нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, где ген имеет желательную генетическую модификацию(ии) и включает области гомологии с целевым локусом. Конструкциям ДНК для произвольного включения не обязательно содержать область гомологии с медиатором рекомбинации. Легко могут быть включены маркеры для положительной и отрицательной селекции. Способы получения клеток, имеющих целевые генные модификации, через гомологическую комбинацию известны в данной области. Для различных способов трансфекции клеток млекопитающих см. Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537.
Для эмбриональных стволовых (ЭС) клеток могут быть использованы ЭС клеточные линии, или эмбриональные клетки могут быть получены непосредственно от хозяина, такого как мышь, крыса, морская свинка и т.д. Такие клетки выращиваются на подходящем фибропласт-питающем слое или в присутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF). Трансформированные ЭС или эмбриональные клетки могут быть использованы для получения трансгенных животных, с помощью подходящего способа, описанного в данной области.
Трансгенные животные могут быть любыми животными, не относящимися к человеку, включая млекопитающее, не относящееся к человеку (например, мышь, крыса), птицу или амфибию и т.д., и использованы в функциональном исследовании, скрининге лекарственного средства и т.п. Характерные примеры использования трансгенных животных включают те, которые описаны ниже.
Также могут быть получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах США №№ 5767367, 5750870, 5739409, 5689049, 5689045, 5674731, 5656466, 5633155, 5629470, 5595896, 5576198, 5538879, 5484956, раскрытия которых включены в настоящее описание ссылкой. Способы получения трансгенных растений также рассмотрены в Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp. 275-295 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) 719 p.
Например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки, могут использоваться для получения трансгенного хозяина. После сбора клеток или тканей экзогенная ДНК, представляющая интерес, вводится в растительные клетки, при этом известен для такого введения ряд различных способов. При наличии выделенных протопластов возникает возможность для введения через ДНК-опосредованные протоколы передачи гена, включая инкубацию протопластов с очищенной ДНК, такой как плазмида, содержащая целевую экзогенную последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, PEG или PLO); или электропорацию протопластов в присутствии выделенной ДНК, включающей целевую экзогенную последовательность. Протопласты, которые успешно включили экзогенную ДНК, затем отбираются, выращиваются в каллус и, в конечном счете, в трансгенное растение при контакте с подходящими количествами и отношениями стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокины.
Другие подходящие способы получения растения могут использоваться, такие как применение "генной пушки" или Agrobacterium-опосредованная трансформация, которые доступны для квалифицированных специалистов в данной области.
Способы применения
Флуоресцентные белки по настоящему изобретению (так же, как другие описанные выше компоненты, заявленные в изобретении) находят применение в ряде различных приложений. Например, они могут использоваться в способах мечения, при анализе или детекции биологической молекулы, клетки или органеллы клетки. Характерные применения для каждого из этих типов белков будут описаны ниже, причем применения, описанные здесь, являются только иллюстративными и никоим образом не предназначены для ограничений применения белков по настоящему изобретению, по данному описанию.
in vivo
В предпочтительном воплощении, относящемся к способу мечения биологической молекулы, клетки или органеллы клетки, заявленные белки находят применения как метки  (или молекулы-репортеры) в анализах молекулярной и клеточной биологии. Методы, представляющие интерес, включают, но не ограничены, анализ экспрессии гена, белковую локализацию и ко-локализацию, анализ белок-белковых взаимодействий, взаимодействий белка и нуклеиновой кислоты, взаимодействий нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой, анализ клеточной локализации и локализации органелл клетки, анализ взаимодействий органелл клетки и т.д. Флуоресцентные белки по настоящему изобретению находят применение как метки биомолекулы или метки органелл клетки в живых и фиксированных клетках, как маркеры слияния клеток или органелл, как маркеры интеграции клетки или органеллы, как маркеры трансфекции (например, как метки для отбора трансфицированных клеток, содержащих вектор экспрессии, кодирующий по меньшей мере один флуоресцентный белок по изобретению), как пробы, работающие в режиме реального времени при около физиологических концентрациях, и т.д.
Кроме того, заявленные белки могут применяться в методах анализа генной экспрессии (например, активности промотора). Иными словами, они находят применения для выявления и/или измерения уровня экспрессии представляющего интерес белка или полипептида в биологическом материале. Этот метод включает: i) введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую флуоресцентный белок по настоящему изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана и находится под контролем регуляторной последовательности, которая управляет экспрессией целевого белка или полипептида, представляющего интерес; ii) экспрессию упомянутой нуклеиновой кислоты при соответствующих условиях; и iii) определение флуоресцентного испускания флуоресцентного белка как способа измерения уровня экспрессии белка, представляющего интерес.
В частности, заявленные белки находят применение для выявления и/или измерения уровня экспрессии и/или локализации представляющего интерес белка или полипептида в биологическом материале. Этот метод включает: i) введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую флуоресцентный белок по настоящему изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты слита с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок или полипептид, и функционально связана и находится под контролем регуляторной последовательности, которая управляет экспрессией целевого белка или полипептида, представляющего интерес; ii) культивирование клеток в условиях, подходящих для экспрессии белка, представляющего интерес; и iii) определение флуоресцентного испускания флуоресцентного белка как способа измерения уровня экспрессии/локализации белка, представляющего интерес.
Целевые применения включают использование заявленных белков в методах флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). В этих способах заявленные белки служат донором и/или акцепторами в комбинации со вторым флуоресцентным белком или красителем, имеющим подходящие спектры возбуждения/испускания флуоресценции; другими флуоресцентными красками, такими как кумарин и его производные, 7-амино-4-метилкумарин и аминокумарин; красителями для живых тканей; каскадный голубой; или флуоресцеином и его производными, такими как флуоресцеинизотиоцианат и Орегонский зеленый; родаминовыми красителями, такими как Техасский красный, тетраметилродамином, эозинами и эритрозинами; циановыми красителями, такими как Су3 и Су5; макроциклическими хелатами лантоноидных ионов, такими как квантовый краситель; и хемилюминесцентными красителями, такими как люцеферазы, включая описанные в патентах США №№ 5843746, 5700673, 5674713, 5618722, 5418155, 5330906, 5229285, 5221623, 5182202, раскрытия которых включены в настоящее описание путем ссылки.
2+
Отдельные примеры того, что в FRET приложениях используются заявленные флуоресцентные белки, включают, но не ограничены, обнаружением белок-белковых взаимодействий в двугибридной системе млекопитающих, таких как димеризация фактора транскрипции, мультимеризация мембранных белков, образование мультибелковых комплексов; функционированием в составе биосенсоров для множества различных событий, где пептид или белок ковалентно связывают FRET флуоресцентную комбинацию, включая заявленные флуоресцентные белки, и связанный пептид или белок, представляющий собой, например, специфический субстрат для расщепления каспазой; пептид, который подвергается конформационному изменению после получения сигнала, что увеличивает или уменьшает FRET, такой как РКА регулирующий домен (цАМФ-сенсор), сайт фосфорилирования (например, сайт фосфорилирования в пептиде, или пептид, способный специфически связывать фосфорилированный/дефосфорилированный домен другого белка), или пептид, имеющий Са связывающий домен. Кроме того, применения флуоресцентного резонансного переноса энергии или FRET, в которых белки по настоящему изобретению находят применение, включают, но не ограничены, описанные в патентах США №№ 6008373, 5998146, 5981200, 5945526, 5945283, 5911952, 5869255, 5866336, 5863727, 5728528, 5707804, 5688648, 5439797, раскрытия которых включены в настоящее описание посредством ссылки.
Флуоресцентные белки по настоящему изобретению находят применение в методах обнаружения влияния испытуемого вещества на регуляцию экспрессии и/или транслокации одного или более целевых белков в клетке. Альтернативно они находят применение в способе обнаружения экспрессии целевого белка и одновременной активности последовательности, регулирующей экспрессию, в ответ на испытуемое вещество. Флуоресцентные белки находят также применение в методах сравнения активности двух или более последовательностей, регулирующих экспрессию в клетке, в ответ на испытуемое вещество. Такие методы могут быть выполнены при наличии и при отсутствии испытуемого вещества, влияние которого на процесс должно быть измерено.
Флуоресцентные белки по настоящему изобретению также находят применение в приложениях, включающих автоматический скрининг множества клеток, экспрессирующих флуоресцентные репортерные группы, с использованием микроскопического отображения и электронного анализа. Скрининг может использоваться для открытия лекарственных средств и в области функциональной геномики, где заявленные белки используются как маркеры целых клеток для обнаружения изменений в многоклеточной реорганизации и миграции, например, в образовании многоклеточных канальцев (формирование кровеносного сосуда) эндотелиальными клетками, миграции клеток сквозь систему Fluoroblok Insert (Becton Dickinson Co.), заживлении раны или отрастании нейрона. Скрининг может также быть использован, если белки по настоящему изобретению используются как маркеры, слитые с пептидами (такими как целевые последовательности) или белками, которые обнаруживают изменения во внутриклеточной локализации как индикатор клеточной активности, например, в сигнальной трансдукции, такие как киназы и факторы транскрипции при стимуляции. Примеры включают протеинкиназу С, протеинкиназу А, факторы транскрипции NFkB и NFAT; белки клеточного цикла, такие как циклин А, циклин В1 и циклин Е; расщепление протеазой с последовательным перемещением расщепленного субстрата, фосфолипиды с маркерами для внутриклеточных структур, такими как эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, митохондрии, пероксисомы, ядро, нуклеоли, плазматическая мембрана, гистоны, эндосомы, лизосомы или микротрубочки.
Белки по настоящему изобретению также могут использоваться в скрининге с высоким содержанием для обнаружения совместной локализации других флуоресцентных слитых белков с маркерами локализации, как индикаторы перемещений внутриклеточных флуоресцентных белков/пептидов или только как маркеры. Примеры применений, включающих автоматический скрининг множества клеток, в которых заявленные флуоресцирующие белки находят применение, включают патент США № 5989835 и заявки WO 0017624, WO 00/26408, WO 00/17643 и WO 00/03246, раскрытия которых включены в настоящее описание посредством ссылки.
Флуоресцентные белки по настоящему изобретению также находят применение в высокопроизводительных скрининговых анализах. Заявленные флуоресцентные белки представляют собой стабильные белки с периодами полураспада больше, чем 24 часа. Также обеспечиваются дестабилизированные варианты заявленных флуоресцентных белков с уменьшенными периодами полураспада, которые могут использоваться как репортеры транскрипции для открытия лекарственного средства. Например, белок, заявленный в изобретении, может быть слит с предполагаемой протеолитической сигнальной последовательностью, производной из белка с более коротким периодом полураспада, таким как PEST последовательность из гена орнитиндекарбоксилазы мыши, с последовательностью, индуцирующей деградацию циклина В1 из мыши, или убиквитина, и т.д. Для описания дестабилизированных белков и векторов, которые могут быть использованы для получения того же, см. например, Патент США № 6130313, раскрытие которого включено в настоящее описание посредством ссылки. С использованием дестабилизированных вариантов заявленных флуоресцентных белков для скрининга лекарственных средств могут быть обнаружены промоторы в сигнальных путях трансдукции, такие как, например, API, NFAT, NFkB, Smad, STAT, p53, E2F, Rb, myc, CRE, ER, GR и TRE и т.п.
Заявленные белки могут использоваться как вторичные мессенджерные детекторы, путем слияния заявленных белов со специфичными доменами, такими как РКС-гамма Са-связывающий домен, РКС-гамма DAG-связывающий домен, SH2 домен или SH3 домен, и т.д.
Секретируемые формы заявленных белков, которые, в свою очередь, могут использоваться в ряде различных применений, могут быть получены слиянием лидерных последовательностей с заявленными белками.
Заявленные белки также находят использование в флуоресцентно-активируемой клеточной сортировке (FACS). В таких применениях заявленный флуоресцирующий белок используется для мечения популяции клеток, и полученная меченая популяция клеток затем подвергается сортировке в устройстве для сортировки клеток, активированных флуоресценцией, как известно в данной области. Способы FACS описаны в патентах США №№ 5968738 и 5804387, раскрытия которых включены в настоящее описание посредством ссылки.
in vivo
Заявленные белки также находят применение как метки  в трансгенных животных. Например, экспрессия заявленного белка может обуславливаться тканеспецифичными промоторами, где такие методы находят применение в исследованиях для генной терапии, таких как тестирование эффективности трансгенной экспрессии, среди других применений. Типичное применение флуоресцирующих белков у трансгенных животных, которое поясняет такие применения, находится в WО 00/02997, раскрытие которого включено в настоящее описание посредством ссылки.
Дополнительные применения белков по настоящему изобретению включают использование в качестве маркеров для введения в клетки или животных и при калибровке в количественных измерениях; в качестве маркеров или репортеров в кислородных биосенсорных приборах для контроля клеточной жизнеспособности; в качестве маркеров или меток для животных, домашних животных, игрушек, пищи и т.п.
Заявленные флуоресцентные белки также находят применение в анализах протеазного расщепления. Например, анализы инактивированной расщеплением флуоресценции могут быть осуществлены с использованием заявленных белков, где заявленные белки содержат протеазо-специфичную последовательность расщепления. При расщеплении флуоресцентного белка активированной протеазой флуоресценция резко уменьшается вследствие разрушения функционального хромофора. Описанный выше анализ может быть подготовлен для различных типов протеаз, таких как каспазы и другие.
Заявленные белки также могут использоваться в анализах для определения фосфолипидного состава в биологических мембранах. Например, целевые белки, которые допускают связывание со специфическими фосфолипидами для локализации/визуализации в модели фосфолипидного распределения в биологических мембранах, наряду с допускающими колокализацию мембранными белками в специфических фосфолипидных очагах, могут быть ассоциированы с заявленными белками в слитых белках (или любым другим видом ковалентной или нековалентной модификации заявленных белков).
2+
Заявленные флуоресцентные белки также находят применение как биосенсоры, источники циркулярно-пермутированных флуоресцентных белков и биосенсоров из них. Методы изготовления и использования циркулярно-пермутированных флуоресцентных белков описаны в Nagai et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, V. 98(6), pp. 3197-3202, Nagai et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2004, V. 101(29), pp. 10554-10559, Filippin et al., J. Biol Chem., 2003, V. 278(40), pp. 39224-34 и патентах США №№ 6469154 и 6699687, раскрытия которых включены в настоящее описание посредством ссылки. Биосенсоры, такие как Са-ионный индикатор, рН индикатор, индикатор фосфорилирования, или индикатор других ферментативных активностей или индикатор ионов, таких как магний, натрий, калий, хлорид и галогенид-ионы, могут быть использованы в прокариотических и эукариотических клетках. Способы использования флуоресцентных белков в качестве биосенсоров также включают таковые, описанные в патентах США №№ 5972638; 5824485 и 5650135 (так же, как и ссылки, цитированные там), раскрытие которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Антитела, заявленные в изобретении, описанные выше, также находят использование во множестве применений, включая дифференцирование заявленных белков от других флуоресцентных белков.
Наборы
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением наборы для использования при осуществлении одного или нескольких вышеописанных применений. В предпочтительных воплощениях наборы могут использоваться для мечения биологической молекулы. Наборы обычно включают белок по изобретению или нуклеиновую кислоту, его кодирующую, предпочтительно с элементами для экспрессии заявленных белков, например, конструкция, такая как вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую заявленный белок.
Следующие примеры предлагается в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Entacmaea quadricolor
Клонирование кДНК, кодирующей красный флуоресцентный белок из
Entacmaea quadricolor
E. coli
Entacmaea quadricolor
Anemonia sulcata
4
Для поиска флуоресцентного белка из  была использована стратегия скрининга экспрессионной кДНК библиотеки в . Небольшой фрагмент (примерно 1 мм длиной) щупальца  (Eukaryota; Metazoa; Cnidaria; Anthozoa; Zoantharia; Actiniaria; Nynantheae; Actiniidae; Entacmaea), который обладал красной флуоресценцией, был использован для приготовления тотальной РНК. Тотальная РНК была выделена с помощью набора реактивов NucleoSpin RNA II kit (Clontech). Амплифицированный образец кДНК был приготовлен с помощью набора реактивов SMART cDNA amplification kit (Clontech) и клонирован в PCR-Script вектор (Stratagene). Приблизительно 5×10 рекомбинантных клонов были проскринированы визуально с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. В результате был идентифицирован новый красный флуоресцентный белок, названный EqFP578 (или eqFP578, SEQ ID NO: 1 и 2). Флуоресцентный белок имел примерно 76% идентичности аминокислотной последовательности с другим флуоресцентным белком Entacmaea quadricolor (GenBank Id AAN05449) и 64% идентичности аминокислотной последовательности с нефлуоресцентным красным белком asCP562 из  (GenBank Id AAG41206).
Пример 2
Характеризация EqFP578 (SEQ ID NO: 1, 2)
E. coli
Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты EqFP578 была получена, как описано в примере 1, и клонирована в экспрессирующий вектор pQE30 (Qiagen), так что рекомбинантный белок содержал шесть гистидиновых остатков на N-конце. После экспрессии в  белок был очищен с помощью металл-аффинной смолы TALON (Clontech) и охарактеризован.
-1
-1
-1
-1
Белок имеет пики возбуждения/испускания флуоресценции на 552 и 578 нм, соответственно (фиг.2). Очищенный белок имеет коэффициент молярной экстинкции 102000 Mсм и квантовый выход флуоресценции 0,54. Для определения коэффициента молярной экстинкции концентрация зрелого хромофора была определена. Белок был денатурирован в щелочных условиях в равном объеме 2M NaOH. В этих условиях DsRed-подобные хромофоры (в том числе хромофор EqFP578) конвертируются в GFP-подобные хромофоры, которые поглощают при 446 нм с коэффициентом молярной экстинкции 44000 Mсм (Ward, W. W., Bioluminescence and Chemiluminescence (1981), Academic Press, 235-242). Спектр поглощения нативного и денатурированного EqFP578 был измерен. Коэффициент молярной экстинкции для нативного белка был рассчитан на основании поглощения денатурированного белка. Для определения квантового выхода флуоресценцию EqFP578 сравнивали с флуоресценций DsRed2 в количестве с той же поглощающей способностью и квантовым выходом 0,55.
По результатам гель-фильтрации было показано, что EqFP578 представляет собой димерный белок. Очищенный белок (~1 мг/мл) был нанесен на колонки с Sephadex-100 (0,7×60 см) и смыт 50 мМ фосфатным буфером (pH 7,0), содержащим 100 мМ NaCl. EGFP, HcRed1 и DsRed2 (Clontech) были использованы как стандарты мономерного, димерного и тетрамерного белка, соответственно. Дополнительно склонность к образованию тетрамеров была выявлена, когда рекомбинантный очищенный EqFP578 использовали для гель-фильтрации в концентрации приблизительно 10 мг/мл.
Пример 3
Получение мутантов EqFP578
В каждом случае для ненаправленного мутагенеза использовали набор реактивов Diversity PCR Random Mutagenesis kit (CLONTECH) в условиях, оптимальных для получения 5-6 мутаций на 1000 п.о.
E. coli
Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты EqFP578 дикого типа была получена, как описано в примере 1. Для усиления экспрессии в клетках млекопитающих авторы использовали следующую стратегию: 1 - случайный мутагенез был использован для поиска белка с увеличенной скоростью созревания и укладки; 2 - кодирующая последовательность была "гуманизирована"; 3 - дополнительный случайный мутагенез был предпринят для дальнейшего повышения скорости созревания и яркости белка в  при 37°C. В результате был получен мутант EqFP578, названный EqFP578m1 (SEQ ID NO: 3, 4), с генетическим кодом, оптимизированным для экспрессии в клетках млекопитающих и содержащим шесть аминокислотных замен по сравнению с EqFP578 дикого типа: R32G, T68A, L79F, L110F, S131P и L138R.
-1
-1
Рекомбинантный EqFP578m1 был приготовлен, очищен и охарактеризован, как описано в примере 2 для EqFP578 дикого типа. Флуоресцентные свойства мутанта похожи, но не идентичны свойствам EqFP578 дикого типа. Он имеет пики возбуждения/испускания флуоресценции на 553 и 574 нм, соответственно (фиг.3). Очищенный белок имеет коэффициент молярной экстинкции 104000 Mсм и квантовый выход флуоресценции 0,65. Как и EqFP578 дикого типа, EqFP578m1 - димер.
in vivo
in vitro
in vivo
E. coli
Хотя EqFP578m1 не агрегирует, будучи экспрессированным , он формирует агрегаты  согласно данным гель-электрофореза. Это свойство потенциально ограничивает применимость белка для получения стабильных клеточных линий и трансгенных животных. Для снижения способности к агрегации нуклеиновая кислота, кодирующая белок, была подвергнута дополнительным модификациям, которые увеличивали локальный негативный заряд (то есть концентрацию негативно-заряженных аминокислотных остатков) на C- и N- концах белка. В частности, аминокислоты на C- и N- концах были заменены для уменьшения локального позитивного заряда, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза были сделаны замены K6T и R231S. Кроме того, дополнительная аминокислотная последовательность (MGEY) была добавлена на N-конец белка. Случайный мутагенез полученной нуклеиновой кислоты привел к дополнительной фолдинговой мутации K188R, которая обеспечивала более быстрое возникновение флуоресцентного сигнала , как было показано при экспрессии белка в штамме XL-1Blue . Нуклеотидная и аминокислотная последовательности неагрегирующего мутанта, названного M1-NA, показаны в SEQ ID NO: 5, 6, соответственно.
(-1)
(-1)
in vitro
Рекомбинантный M1-NA был приготовлен, очищен и охарактеризован, как описано в примере 2 для EqFP578 дикого типа. Согласно результатам гель-фильтрации M1-NA является димерным белком при концентрации 1 мг/мл. Флуоресцентные свойства M1-NA такие же, как у EqFP578m1. M1-NA - яркий флуоресцентный белок, характеризующийся пиками возбуждения/испускания флуоресценции при 553/574 нм. Квантовый выход флуоресценции M1-NA =0,67, коэффициент молярной экстинкции (при 553 нм) =92000 Mсм. Согласно результатам гель-электрофореза M1-NA не образует агрегаты . Он также не образует сколько-нибудь видимых агрегатов при экспрессии в эукариотических клетках, как было показано для HeLa и 293T клеточных линий.
in vivo
E. coli
Также с помощью случайного мутагенеза был получен вариант EqFP578m1 (M1-602), имеющий сдвинутые в красную область спектры возбуждения/испускания флуоресценции. По сравнению с EqFP578m1 он имеет замену N143S, обеспечивающую сдвиг в красную область спектров возбуждения/испускания флуоресценции. Случайный мутагенез также принес замены F110L, I115L, R138L, G152S и F174L, которые улучшали фолдинг и созревание хромофора, приводя к более быстрому возникновению флуоресцентного сигнала , как было показано при экспрессии в штамме XL-1Blue . Как и для M1-NA, N- и C-концы M1-602 были модифицированы с помощью замен K6T и R231S и добавления дополнительной N-концевой аминокислотной последовательности (MGED). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности M1-602 белка показаны в SEQ ID NO: 7, 8, соответственно.
(-1)
(-1)
Рекомбинантный M1-602 был приготовлен, очищен и охарактеризован, как описано в примере 2 для EqFP578 дикого типа. Его характеристики: пики возбуждения/испускания флуоресценции - при 574/602 нм (см. спектры на фиг.4). Квантовый выход флуоресценции M1-602 =0,35, коэффициент молярной экстинкции (при 574 нм) =74400 Mсм. Согласно результатам гель-фильтрации M1-602 является димерным белком при концентрации 1 мг/мл.
Мутант с еще более смещенными в красноволновую область спектрами возбуждения/испускания флуоресценции, названный M1-637, был получен с помощью сайт направленного мутагенеза остатков H197 и G158 на основании нуклеиновой кислоты, кодирующей белок M1-602. По сравнению с M1-602 M1-637 содержит замены H197R и G158S, которые обеспечивают сдвиг спектра флуоресценции в дальне-красную область спектра. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности M1-637 белка показаны в SEQ ID NO: 9, 10, соответственно.
Рекомбинантный M1-637 был приготовлен, очищен и охарактеризован, как описано в примере 2 для EqFP578 дикого типа. M1-637 - дальне-красный флуоресцентный белок, характеризующийся пиками возбуждения/испускания флуоресценции при 591/637 нм (см. спектры на фиг.5). Согласно результатам гель-фильтрации, M1-637 является димерным белком при концентрации 1 мг/мл.
Благодаря превосходным характеристикам EqFP578 и его мутанты, описанные выше, представляют интерес для создания мономерного яркого красного флуоресцентного белка с полезными свойствами. Доступность кристаллической структуры eqFP611 (Petersen et al., 2003, J Biol Chem v. 278: pp. 44626-44631), близкого гомолога eqFP578, позволила авторам выявить аминокислотные остатки, ответственные за димеризацию и слабую тетрамеризацию eqFP578 и его мутантов. Параллельный сайт-направленный мутагенез нескольких важных аминокислотных остатков, ответственных за димеризацию через так называемый “вторичный” или “гидрофильный” интерфейс, то есть R155E, Q159D, S173N, F192V и F194Y, был осуществлен на нуклеиновой кислоте, кодирующей белок EqFP578m1. В то же время для оптимизации сворачивания и созревания мономерного белка был использован случайный мутагенез на целой кодирующей последовательности белка, при этом ключевые позиции вторичного интерфейса были зафиксированы праймерами. Для ингибирования минорной димеризации через “первичный' (“гидрофобный”) интерфейс также была добавлена замена N122R, которая была описана как блокирующая эффективную тетрамеризацию eqFP611 (Wiedenmann et al., 2005, J Biomed Opt v. 10: p. 14003).
E. coli
Плохо созревающий красный флуоресцентный белок, полученный после первого раунда мутагенеза, был проверен с помощью гель-фильтрации, и было показано, что он является мономером. Это показало, что введенные мутации уменьшили димеризацию. Далее, несколько дополнительных раундов случайного мутагенеза были проведены для оптимизации сворачиваемости (фолдинга) белка и его созревания при 37°C. После каждого раунда библиотеки скринировали в экспрессионной системе  с помощью флуоресцентного стереомикроскопа Olympus SZX-12, с набором фильтров TRITC. От 10 до 20 наиболее ярких клонов было отобрано и проверено секвенированием. Только те варианты белка, которые содержали ключевые замены во вторичном интерфейсе, были отобраны для дальнейшей работы. У 5-10 выбранных вариантов сравнивали квантовый выход флуоресценции, коэффициент молярной экстинкции и фотостабильность. Завершенность созревания красного хромофора была проверена по измерению спектров поглощения. Окончательный вариант, M1-mono1, был мономерным красным флуоресцентным белком с пиками возбуждения/испускания флуоресценции при 555/584 нм (фиг.6). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности M1-mono1 белка показаны в SEQ ID NO: 11, 12, соответственно.
E. Coli,
Кроме того, два циановых белка было получено на основе M1-mono1. Нуклеиновая кислота, кодирующая M1-mono1, была использована для сайт-направленного и последующего случайного мутагенеза. Полученные плазмиды, кодирующие мутантные флуоресцентные белки, были трансфицированы в  и наиболее яркие циановые варианты были отобраны. Первый, nrM181-5, содержит замены N143H и R67K, которые приводят к циановой флуоресценции хромофора и способности белка к фотоконверсии к красную флуоресцентную форму. По сравнению с M1-mono1 nrM181-5 также содержит замены R42K, C172A, V216M и R220K, которые усиливают созревание хромофора и сворачивание белка. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности nrM181-5 белка показаны в SEQ ID NO: 13, 14, соответственно.
Рекомбинантный nrM181-5 был приготовлен, очищен и охарактеризован, как описано в примере 2 для EqFP578 дикого типа. nrM181-5 представляет собой циановый флуоресцентный белок, характеризующийся пиками возбуждения/испускания флуоресценции при 400/470 нм (см спектры на фиг.7). Согласно результатам гель-фильтрации nrM181-5 является мономерным белком при концентрации 1 мг/мл. Белок способен к фотоконверсии в красную флуоресцентную форму в ответ на облучение фиолетовым светом.
Второй белок Cyan-2-1 содержит замены N143F и H197Y, которые приводят к циановой флуоресценции хромофора белка. Cyan-2-1 также содержит замены E36G и F53V, которые улучшают его сворачиваемость и созревание хромофора. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности Cyan-2-1 белка показаны в SEQ ID NO: 15, 16, соответственно.
Рекомбинантный Cyan-2-1 был приготовлен, очищен и охарактеризован, как описано в примере 2 для EqFP578 дикого типа. Cyan-2-1 представляет собой циановый флуоресцентный белок, характеризующийся пиками возбуждения/испускания флуоресценции при 400/470 нм. Согласно результатам гель-фильтрации Cyan-2-1 является мономерным белком при концентрации 1 мг/мл. Белок не способен к фотоконверсии в красную флуоресцентную форму в ответ на облучение фиолетовым светом.
Пример 4
Приготовление поликлональных антител
E. coli
Кодирующая область нуклеиновой кислоты EqFP578m1 была получена, как описано в примере 3, и клонирована в экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen), так что рекомбинантный белок содержал шесть гистидиновых остатков на N-конце. После экспрессии в  белок был очищен с помощью металл-аффинной смолы TALON (Clontech) в денатурирующих условиях. Кролики были иммунизированы и дополнительно обрабатывались четыре раза с месячными периодами рекомбинантными полипептидами, эмульгированными в адъюванте Фрейнда. После 10 или 11 дней после каждой обработки отбирали кровь животных. Поликлональная антисыворотка была проверена на рекомбинантном белке с помощью ELISA и вестерн-иммуноблотингом.
Пример 5
Мечение клеток и органелл млекопитающих с помощью мутантов EqFP578
Для флуоресцентного мечения эукариотических клеток кодирующие последовательности EqFP578m1, M1-NA, M1-602, M1-637, M1-mono1, nrM181-5 и Cyan-2-1, полученные, как описано выше в примере 3, были клонированы в pEGFP-N1 вектор (Clontech) между сайтами рестрикции AgeI и BglII (вместо кодирующей последовательности EGFP). Клеточные линии HeLa, 293T и Phoenix были временно трансфицированы полученными векторами с помощью реагента LipofectAMINE (Инвитроген) и протестированы через 20 часов после трансфекции. Для визуализации клеток использовали флуоресцентный микроскоп Olympus CK40, оборудованный CCD камерой (DP-50, Olympus). В каждом случае экспрессия белка во всех клеточных линиях приводила к яркой флуоресценции без видимой агрегации. Флуоресценция легко детектировалась через 20 часов после трансфекции.
Для проверки белков в составе химерных конструкций с сигналами внутриклеточной локализации, сигнал локализации в митохондриях (MTS) VIII субъединицы цитохром С оксидазы человека был клонирован в N1-векторы, полученные как описано выше. Трансфекция клеток HeLa привела к эффективной транслокации белка в митохондрии клеток-хозяев. В каждом случае яркая флуоресценция легко детектировалась через 24 часа после трансфекции. Видимой агрегации белка не наблюдалось.
Пример 7
Мечение белков с помощью мутантов EqFP578
Кодирующие последовательности EqFP578m1, M1-NA, M1-602, M1-637, M1-mono1, nrM181-5 и Cyan-2-1, полученные, как описано выше в примере 3, были клонированы в pEGFP-C1 вектор (Clontech) взамен кодирующей последовательности EGFP. Кодирующие последовательности партнеров слияния (цитоплазматический бета-актин человека, фибрилларин и белок bid) были функционально связаны с последовательностями мутантов EqFP578, указанными выше, путем клонирования последовательностей партнеров слияния в полилинкер C-векторов в рамке с кодирующими последовательностями флуоресцентных белков. Векторы были трансфицированы в клетки HeLa. В каждом случае распределение флуоресценции соответствовало ожидаемой картине распределения партнера слияния в клетке. Яркая флуоресценция была ясно видна через 24 часа после трансфекции.
Однако в случае EqFP578m1, M1-NA, M1-602, M1-637, аномальное распределение флуоресцентного сигнала наблюдалось в клетках-хозяевах, когда в качестве партнера слияния использовали альфа-тубулин. С другой стороны, слитые белки, включающие M1-mono1, nrM181-5 и Cyan-2-1 и альфа-тубулин, показывали ожидаемое распределение флуоресцентного сигнала, подтверждая мономерную природу этих белков.
Все публикации и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно введена посредством ссылки. Цитирование любой публикации приводится в соответствии с контекстом и интерпретацией по настоящему изобретению и не должно истолковываться как признание любой такой публикации прототипом данного изобретения.