СРЕДСТВО ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ФЕНОЛА
PHENOL DECOMPOSITION AGENT

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для разложения токсичных органических соединений, в частности для разложения фенола.
Фенол - одно из токсичных ароматических соединений.
Существует два принципиально различных способа очистки сточных вод от фенолов - это химический и микробиологический.
Химические методы очистки требуют наличия специального оборудования, реактивов и т.д.
Например, метод очистки сточных вод от фенола электрогидравлическим воздействием высоковольтного короткоимпульсного электрического разряда [патент RU 2326055, C02F 1/48, 8.10.2008] требует специальное оборудование, позволяющее получать электрический разряд в 25-30 кВ и включающее источник импульсов, систему охлаждения и термоизоляции. Кроме того, обеззараживание проводится в присутствии перекиси водорода, которая является сильным окислителем и опасна в концентрированном виде.
Процесс озонирования водно-фенольных сточных вод (Тенишев Ю.С. Проблема очистки сточных термальных вод от фенолов. - М.: Мингазпром, 1982. - 35 с.) требует строгого контроля за рН и вреден для персонала из-за присутствия озона.
Очистка от фенолов с помощью связывания сорбентами (см. Тенишев Ю.С. Проблема очистки сточных термальных вод от фенолов. - М.: Мингазпром, 1982. - 35 с.), требует регенерации носителя при высоких температурах (700-800°С) и биохимической доочистки воды.
Биологическая очистка сточных вод не требует сложного оборудования, ее эффективность зависит, в основном, от максимальных концентраций токсиканта, к которым устойчив штамм-деструктор и которые не приводят к ингибированию процесса биоразложения.
Известен штамм бактерий Serratia marcescens В-1248 [патент RU 2074254, C12N 1/20, 27.02.1997], осуществляющий деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола.
Недостатком описываемого штамма является низкая концентрация фенола, который разлагается данным штаммом. Авторы приводят пример с концентрацией до 100 мг/л фенола для неиммобилизованой и 0,75 г/л для иммобилизованной культуры. Другой недостаток способа деструкции фенола с использованием известного штамма - большая длительность процесса деградации (7 сут) и иммобилизации данной культуры на носителе (17 дней).
Известен штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens ВКПМ В-6489, осуществляющий деградацию фенола [патент RU2077575, C12N 1/20, 20.04.1997]. Он использовался для разложения фенола в концентрации 75 мг/л.
Недостаток этого штамма - также длительное предварительное культивирование перед использованием его для очистки.
Наиболее близким по техническому решению к изобретению является штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204 - деструктор фенола, окисляющий в иммобилизованном состоянии на биофильтре фенол в высоких концентрациях (1,5-2,0 г/л) при более низкой температуре (15-20°С) [патент RU 2201446, C12N 1/20, 27.03.2003]. Штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204 устойчив в длительном непрерывном процессе, не нуждается в дополнительных факторах роста.
Недостатком данного штамма является его неспособность осуществлять деструкцию фенола за один этап, биофильтр с использованием Aureobacterium saperdae 6-204 является многоуровневым, на каждом из пяти уровней которого происходит 10-кратная убыль фенола.
Задачей изобретения является получение штамма-деструктора фенола, способного осуществлять эффективное разложение фенола в высоких концентрациях за один этап.
Задача решается тем, что предлагается штамм бактерий Rhodococcus opacus 1G, способный к разложению фенола.
Штамм бактерий Rhodococcus opacus 1G депонирован во Всероссийской коллекции культур микроорганизмов и хранится под номером ВКМ Ас 2546 D.
Штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546 D выделен методом накопительных культур из почв, загрязненных нефтью, в районе г.Самара.
Штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D обладает следующими свойствами.
Культурально-морфологические свойства штамма: неподвижный актиномицет, грамположительный, аэробный, основные сахара в составе клеточной стенки - арабиноза и галактоза. На богатой среде образует колонии светло-розового цвета. На минеральной агаризованной среде с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии образует мелкие, практически бесцветные колонии.
Физиолого-биохимические свойства штамма: аэроб, температурный оптимум +30°С до +37°С, оптимум рН нейтральный или слегка щелочной: 7-8, каталазоположительный, не требует для роста тиамина, хорошо растет на стандартных лабораторных средах. На минеральной среде в качестве ростовых субстратов использует маннозу, D-галактозу, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, бензоат, п-гидроксибензоат, п-толуилат, п-крезол, фталат, терефталат, дизельное топливо, ацетат, бутират, этанол, цитрат, изопропанол, ацетамид, анисовую и феруловую кислоты. Не растет на минеральных средах с L-рамнозой, D-целлобиозой, L-серином, L-аланином, L-аспаргином, нафталином, монохлорфенолами, 2,4-ди-, 2,3,5- и 2,4,5-трихлорфенолами.
Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D отличается от известных штаммов-бактерий, являющихся деструкторами фенола.
При хранении на агаризованной среде с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии штамм длительное время сохраняет жизнеспособность. Способность разлагать фенол не исчезает при пересевах на неселективных средах.
В неиммобилизованном состоянии он способен разлагать фенол в концентрациях, равных 0.75 г/л.
Штамм легко иммобилизируется на носителях различного типа. Иммобилизация клеток приводит к увеличению концентраций фенола, разлагаемых данным штаммом, до 2.2 г/л.
Деградация фенола проходит с образованием пирокатехина и его последующим орто-расщеплением. Установлено, что ключевой фермент этого пути - пирокатехин 1,2-диоксигеназа - характеризуется высокой избирательностью к субстрату - пирокатехину. Афинность к фенолу и замещенным фенолам и бензоатам у этого фермента низкая, что указывает на перспективность использования штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546D для очистки стоков от фенольных загрязнений.
Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546D способен к росту на феноле. На чертеже показан рост штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546 D на феноле (г/л): 1-0.3, 2-0.5, 3-0,75, 4-1,0.
545
Из данных, представленных на чертеже, понятно, что при росте штамма штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на феноле продолжительность лаг-фазы составляет около 6 ч. При концентрации фенола 0.3 г/л фенол полностью исчезает менее чем за 12 часов, максимальная величина оптической плотности D равняется 0.35 о.е. Это говорит о способности штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D эффективно разлагать умеренно-высокие концентрации токсиканта за короткий период времени. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония).
545
d
При концентрации субстрата 0.5 г/л культура достигает максимальной величины D 0.5 за 14 часов. Удельная скорость роста (µ) равняется 0.05. Время удвоения (t) - 1.4 ч. За 14 ч инкубации культура использует практически весь субстрат. Дополнительное внесение субстрата в тех же количествах через 6-8 ч голодания сопровождается дальнейшим ростом культуры без какой-либо задержки.
545
При концентрации фенола 0.75 г/л максимальное значения D достигается за 20 ч и равняется 0.7 о.е.
Рост при более высоких концентрациях фенола отсутствует.
545
Тем не менее, дробное внесение фенола (по 0.25-0.5 г/л) приводит к росту культуры до D 0.8-1.0 о.е., суммарное потребление субстрата увеличивается до 2 г/л.
Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D разлагает фенол как в виде нативных, так и в виде иммобилизованных клеток.
Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D может быть иммобилизован на поликапроамидном волокне или на вспененном вермикулите.
В таблице показано влияние типа носителя на биодеградативную способность штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D.
Из данных таблицы можно сделать вывод о том, что поликапроамидное волокно является лучшим носителем для иммобилизации данного штамма, нивелируя отрицательное влияние фенола.
Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Разложение фенола клетками предлагаемого штамма
2
4
2
4
4
2
3
4
4
3
4
2
Для культивирования штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546 D используют минеральную среду следующего состава (г/л): NaHPO 0.73; КНРО 0.35; MgSO×7HO 0.1; NaHCO 0.25; MnSO 0.002; NHNO 0.75; FeSO×7HO 0.02.
Культуру для посевного материала выращивают в колбах объемом 750 мл с рабочим объемом 200 мл на минеральной среде с фенолом (0.2 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. Клетки выращивают при перемешивании на качалке при 220 об/мин до плотности 0.5-0.7 оптических единиц, при этом проводят дробное внесение фенола (по 0.2 г/л) по мере его потребления.
Данный пример подтверждает, что штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D способен использовать фенол в качестве единственного источника углерода и энергии при культивировании в жидкой среде.
Пример 2. Разложение фенола иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на поликапроамидном волокне
545
Для иммобилизации клеток штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на поликапроамидном волокне используют суспензию клеток с D 0.648 о.е.
200 мл этой суспензии добавляют к 2.5 г волокна, вносят 0.2 г/л фенола и инкубируют при перемешивании 24 ч. Неиммобилизованные клетки отмывают стерильной средой. Фенол добавляют в трех концентрациях: 0.5, 1.0 и 1.5 г/л. В качестве контроля используют носитель с 200 мл среды, указанной в Примере 1, содержащей 0.5 г/л фенола.
При всех концентрациях токсиканта получают 100% убыль фенола иммобилизованными клетками за 24 часа инкубации. Убыль в контрольном варианте (носитель и фенол в среде) не происходит.
Из данного примера можно сделать вывод, что штамм легко иммобилизуется, при этом в два раза увеличиваются концентрации токсиканта, которые не ингибируют метаболическую активность штамма.
Пример 3. Разложение фенола иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на вспененном вермикулите
Процесс проводят, как описано в Примере 2, используя в качестве носителя для иммобилизации 5 г вспененного вермикулита. Получают 100% убыль фенола иммобилизованными клетками, взятого в концентрации 0.5 и 1 г/л за 24 часа и 1.5 г/л - за 48 часов.
Из данных примеров 2 и 3 следует, что штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D можно иммобилизовать на различных носителях.
Пример 4. Разложение фенола иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D в условиях проточного культивирования.
Процесс ведут в колонке объемом 600 мл, заполненной поликапроамидным волокном с иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D, в которую снизу подают воздух, сверху, в противоток - минеральную среду, содержащую фенол.
Концентрацию фенола в подаваемой на колонку среде варьируют с 0.5 г/л до 2.2 г/л. Скорость протока увеличивается с 18 мл/ч до 25 мл/ч. Система активно функционирует в течение 20 дней при колебаниях температуры от 18 до 24°С. Фенол в стоке отсутствует.
Из данного примера следует, что штамм бактерий Rhodococcus opacus BKM-Ac-2546 D относится к лучшим культурам бактерий, способных разлагать фенол в высоких концентрациях.
Таким образом, показано, что предлагаемый штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D обеспечивает разложение фенола как нативными клетками, так и иммобилизованными при его концентрациях от 0.5 до 2.2 г/л, что в 2.9 (для иммобилизованной культуры) и 5 (для нативных клеток) раз больше, чем у известного штамма бактерий Serratia marcescens В-1248.
Разложение 2.2 г/л фенола штаммом бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D происходит за один этап, что отличает его от известного штамма бактерий Aureobacterium saperdae 6-204, работающего в пятиуровневом биофильтре.
Влияние типа носителя на биодеградативную способность штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D
Концентрация фенола, г/л
Длительность полного разложения фенола при иммобилизации клеток на
Количество добавок фенола при иммобилизации клеток на
Поликапроамидное волокно
Вермикулит
Поликапроамидное волокно
Вермикулит
0.5
24
24
7
7
1.0
24
24
7
7
1.5
24
48
7
4