БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТРАНСГЕННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК И ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС

Область техники
Полезная модель относится к области генной инженерии растений, молекулярной биологии, биобезопасности, фитобиотехнологии и защите окружающей среды, в частности к устройству для выявления и идентификации типичных инсерций ДНК, используемых при генетической трансформации растений, в генетически модифицированном растительном материале и продуктах на его основе
Уровень техники
Известен (RU 2270254, опубликован 20.02.2006) биологический микрочип, представляющий собой микроматрицу с ячейками, одни из которых содержат иммобилизованные олигонуклеотиды-зонды, другие содержат олигонуклеотиды для контроля процедуры тестирования, а третьи содержат флуоресцентные красители для правильной ориентации биологического микрочипа при регистрации результатов, причем в качестве зондов использованы олигонуклеотиды, детектирующие 35S-npoMOTop, ген gus, промотор nos, ген nptll, терминатор ocs.
Недостатком данного микрочипа является малое число маркеров наличия трансгенного материала, т.к. значительная доля (до 30-50%) трансгенных растений создается с применением иных промоторов и терминаторов. Кроме того, использование фрагментов ДНК фитопатогенов как маркеров может приводить к ложно-позитивным результатам в случае, если исходные растения были заражены соответствующими вирусами и/или бактериями, с другой стороны также намечается отказ от применения в практике генетической инженерии растений регуляторных фрагментов ДНК из патогенных микроорганизмов.
Раскрытие полезной модели
Технический результат, на достижение которого направлена данная полезная модель, заключается в увеличении надежности определения наличия трансгенного материала в образце.
Для достижения данного технического результата в микрочип включены олигонуклеотиды-зонды, детектирующие помимо 35S-промотора, гена gus, промотора nos, гена nptll и терминатора ocs, также маркеры lectin, zein, bar, crylAb, EPSPS, +K и -К. Присутствие трансгенных последовательностей определяют с помощью гибридизации на 10 специально подобранных олигонуклеотидах-зондах, иммобилизованных на изготовленных для этой цели биологических микрочипах.
Предложенную полезную модель отличают наличие 10 новых олигонуклеотидов-зондов. Благодаря наличию этих зондов многократно повышается вероятность того, что трансгенная ДНК в образце будет выявлена, причем выявление трансгенного материала осуществляется в одном анализе.
Для обнаружения генетических детерминант трансгенности в растительном материале и продуктах на его основе, и одновременного определения вида трансгенного и не трансгенного растения (соя, кукуруза, картофель) с использованием олигонукпеотидного биологического микрочипа выполняют мультиплексную ПЦР с использованием специфичных праймеров, комплементарных последовательностям исследуемых генов и регуляторных элементов, с последующей гибридизацией этих фрагментов на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов.
Применение указанных праймеров позволяет амплифицировать фрагменты небольшого размера - около 100 п.о. - трансгенной ДНК, если таковая присутствует в геноме испытуемого источника. Получаемые одноцепочечные флуоресцентно меченые фрагменты ДНК способны вступать в специфическое гибридизационное взаимодействие с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе. Известный порядок расположения олигонуклеотидов на биологическом микрочипе дает возможность установить, какие именно маркерные гены и регуляторные элементы входят в состав трансгенной и не трансгенной ДНК. Разработанные условия гибридизации обеспечивают высокую степень дифференциации между теми ячейками биологического микрочипа, где произошла гибридизация, и теми, где специфических гибридов не возникло.
Дизайн праймеров и олигонуклеотидов обеспечивает абсолютную специфичность их взаимодействия с искомыми трансгенными и не трансгенными последовательностями ДНК. При этом иммобилизованный олигонуклеотид имеет иную последовательность, чем праймеры для амплификации, что исключает возможность гибридизации в ячейке какой-либо случайно амплифицированной
флуоресцентно меченой ДНК. Визуальная регистрация результатов гибридизации дополнена количественной регистрацией на основе специально приспособленной компьютерной программы, позволяющей точно определить степень превышения сигнала над уровнем фона.
Предложен также набор (измерительный комплекс), содержащий данный биологический микрочип и аппаратно-программный комплекс для анализа флуоресцентных изображений, получаемых на биологических микрочипах, позволяющий преобразовать флуоресценцию ячеек биологического микрочипа в цифровой формат, количественно определять флуоресцентный сигнал в любой точке биологического микрочипа, определять отношение флуоресцентного сигнала к фону в каждой ячейке биологического микрочипа и соответственно соотношение флуоресцентных сигналов в ячейках. В качестве такого аппаратно-программного комплекса может использоваться комплекс «Евробио-ВТО».
Принципиальная схема обнаружения фрагментов трансгенной ДНК
К выделенной из образца ДНК добавляют несколько пар праймеров, специфичных к консервативным областям маркерных генов и регуляторных участков ДНК, обычно используемых при трансформации растений. Проводят реакцию мультиплексной ПЦР в выбранном режиме. Накопление флуоресцентно меченых одноцепочечных ПЦР-продуктов достигается за счет избытка в каждой из пар одного из праймеров, содержащего на 5'-конце флуоресцентную метку. Полученные продукты ПЦР гибридизуют на биологическом микрочипе с иммобилизованными зондами, комплементарными последовательностям фрагментов детектируемых генов и/или регуляторных элементов.
Биологический микрочип представляет собой массив микроячеек гидрогеля, закрепленных на поверхности стекла. В ячейках иммобилизован набор олигонуклеотидов, гомологичных фрагментам трансгенных последовательностей ДНК. Каждая из ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид, причем иммобилизованные олигонуклеотиды имеют иную последовательность, чем праймеры на те же гены. Помимо этого, на биологическом микрочипе расположены ячейки с неспецифическими олигонуклеотидами, выполняющие роль отрицательного контроля гибридизации, а также ячейки, маркированные флуоресцентным красителем и предназначенные для правильной ориентации биологического микрочипа. Позиция на биологическом микрочипе всех
ячеек, как опытных, так и контрольных, строго детерминирована. Поверхность биологического микрочипа, на которой расположены микроячейки, закрыта пластиковьм корпусом гибридизационной камеры, которая вместе со стеклом образует замкнутое пространство, служащее для проведения гибридизации. Корпус камеры снабжен отогнутым краем для удаления камеры после проведения гибридизации и двумя отверстиями для внесения образца, которые герметизируются при помощи липкой ленты.
Изучаемые фрагменты ДНК образуют совершенные стабильные гибридизационные дуплексы только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами.
Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемые фрагменты ДНК могут формировать лишь нестабильные несовершенные дуплексы. Дифференциацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс, во много раз выше, чем в ячейке, где мог формироваться лишь несовершенный дуплекс. При этом детерминированный порядок расположения олигонуклеотидов в ячейках биологического микрочипа дает возможность установить, какие именно маркерные гены и регуляторные элементы входят в состав трансгенной ДНК. Результаты гибридизации могут быть интерпретированы однозначно как визуально, так и с помощью программы «Био-1», входящей в состав аппаратно-программного комплекса «Евробио-ВТО» для анализа флуоресцентных изображений, получаемых на биологических микрочипах.
Авторами предложен набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в таблице ниже, используемых в качестве праймеров для ПЦР, продукт которой используется при идентификации трансгенных последовательностей ДНК.
Предложенной полезной моделью является биологический микрочип, представляющий собой микроматрицу с ячейками, одни из которых содержат иммобилизованные олигонуклеотиды-зонды, другие - олигонуклеотиды для контроля на процедуру тестирования, третьи видовые участки генов не трансгенных растений, четвертые-флуоресцентные красители для правильной ориентации биологического микрочипа при регистрации результатов, отличающийся тем, что в качестве зондов использованы олигонуклеотиды, приведенные в представленной ниже Таблице, комплементарные фрагментам типичных маркерных и вспомогательных последовательностей ДНК, используемых при генетической
трансформации растений.
Идентификация трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе такого материала, включает стадии, на которых:
а) ПЦР проводят на препарате ДНК в виде мультиплексной реакции с получением флуоресцентно меченого продукта, при этом используют специфические пары праймеров, один из которых флуоресцентно мечен и присутствует в избытке по отношению ко второму немеченому праймеру;
б) результаты ПЦР анализируют с помощью гибридизации на биологическом микрочипе и
в) результаты анализа регистрируют с помощью алпаратно-программного комплекса, позволяющего отображать флуоресценцию ячеек биологического микрочипа на экране компьютера, количественно определять флуоресцентный сигнал в любой точке биологического микрочипа, определять отношение флуоресцентного сигнала к фону в каждой ячейке биологического микрочипа и соответственно соотношение флуоресцентных сигналов в ячейках.
Регистрация результатов гибридизации на стадии (в) может быть выполнена с помощью аппаратно-программного комплекса «Евробио-ВТО», который позволяет преобразовать полученные результаты в цифровом формате и производить последующую математическую обработку.
Кроме того, при необходимости усиления гибридизационного сигнала реакцию ПЦР на стадии (а) можно проводить в две стадии, сначала как симметричную мультиплексную ПЦР, а затем как асимметричную мультиплексную ПЦР с включением флуоресцентно меченых праймеров.
Предложенный биочип позволяет определить видовые гены растений и их трансгенные аналоги и увеличивает количество определяемых видов ДНК. Предложенный биочип позволяет существенно увеличить число детектируемых мишеней. Предложенные в качестве праймеров олигонуклеотиды позволяют анализировать существенно более деградированную ДНК. Регистрация результатов с помощью измерительный комплекса, содержащего предложенный биологический микрочип и аппаратно-программный комплекс «Евробио-ВТО» для преобразования полученных результатов в цифровом формате и произведения последующей математической обработки позволяет установить уровень интенсивности флуоресцентного сигнала в каждой ячейке и однозначно интерпретировать результаты гибридизации.
Краткое описание чертежей.
Фиг.1. Схема биологического микрочипа для идентификации трансгенных растительных объектов.
Фиг.2. Результат гибридизации на биологическом микрочипе. Обнаружение маркерных генов npt и gus, промоторов nos и 35S в образце ДНК из картофеля сорта Desiree.
Фиг.3. Результат гибридизации на биологическом микрочипе. Обнаружение маркерного гена npt, промотора nos, терминатора ocs в образце ДНК из трансгенного табака.
Фиг.4. Результат гибридизации на биологическом микрочипе. Обнаружение маркерного гена npt в образце ДНК из продукта питания.
Фиг.5. Результат гибридизации на биологическом микрочипе образца ДНК из нетрансформированного растения.
Осуществление полезной модели
Непосредственно перед испытанием готовят смесь в микропробирках для проведения мультиплексной ПЦР, в состав которой входят: реакционный буфер для ПЦР; смесь дезоксинуклеотид-трифосфатов в концентрации 200 мкМ каждого; несколько пар праймеров в количестве 5-10 пмолей для флуоресцентно меченых праймеров и 0,5-2 пмолей для немеченых праймеров; 12,5 единиц активности термостабильной Taq ДНК-полимеразы, а также испытуемая суммарная ДНК в количестве 1-3 мкг на пробу. Состав праймеров представлен в таблице ниже. Микропробирки помещают в программируемый термостат-термоциклер и проводят реакцию ПЦР в следующем режиме: денатурация при 95°С - 30 с (в первом цикле -5 мин), отжиг при 60(±5)°С - 30 с, элонгация при 72°С - 30 с (в последнем цикле - 5 мин), всего порядка 35-45 циклов.
Для проведения гибридизации аликвоту образца, полученного в результате ПЦР, смешивают с буфером гибридизации с доведением компонентов последнего до следующих концентраций: GuSCH -1 М, HEPES, рН 7,5-50 мМ, EDTA - 5 мМ. Полученную смесь помещают на биологический микрочип, герметично закрывают гибридизационной камерой и проводят гибридизацию при 37°С в течение 14-18 часов. После гибридизации биологический микрочип трижды ополаскивают дистиллированной водой при 25°С и высушивают.
Регистрацию гибридизационной картины осуществляют, используя
аппаратно-программный комплекс "Евробио-ВТО" с программой «Био-1».
Изготовление олигонуклеотидного биологического микрочипа для обнаружения маркерных генов и регуляторных участков ДНК, используемых при трансформации растений
Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе (типа 394 DNA/RNA synthesizer. Applied Biosystems, США) и содержат спейсер со свободной аминогруппой З'-Amino-Modifier С7 CPG 500 (Glen Research, США) для последующей иммобилизации в гель или 5′-Amino-Modifier C6 (Glen Research, США) для введения флуоресцентной метки. Введение флуоресцентной метки Су-5 («Биочип-ИМБ», Россия) осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.
50
Гелевые ячейки биологического микрочипа наносят на стеклянную подложку в виде капель с максимальной аккуратностью и воспроизводимостью с помощью роботов (Rubina A.Y. et al. Anal  Biochem., 2004, vol.325(1), pp.92-106). Каждая сформированная ячейка представляет собой полусферу диаметром 200-250 мкм и периодом около 300 мкм и содержит иммобилизованный олигонуклеотид-зонд, комплементарный последовательности гена или регуляторного элемента (промотора или терминатора), используемых при генетической модификации растений.
Структура биологического микрочипа
Биологический микрочип содержит десять иммобилизованных олигонуклеотидов-зондов, список которых представлен в таблице ниже, три маркерные точки для правильного позиционирования (захвата изображения), выполняемого программой «Био-1», и три ячейки, содержащие неспецифичные к исследуемым геномам олигонуклеотиды, выполняющие роль отрицательного контроля. Расположение иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидов показано на фиг.1. Последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов приведены в таблице ниже.
Регистрацию гибридизационной картины осуществляют, используя аппаратно-программный комплекс «Евробио-ВТО».
Интерпретация результатов гибридизации осуществляется путем сравнения интенсивности флуоресцентного сигнала в ячейках 35Sl, gusl, nosl, nptl, ocsl, bar, cry1, lecitin, zein, EPSPS с интенсивностью сигнала в ячейках NC (фиг.1),
служащих отрицательным контролем. Если отношение хотя бы одного из этих сигналов превышало пороговое значение, определяемое для каждой из анализируемых ячеек и задаваемое в программе «Био-1», то следует заключение о том, что исследуемый образец является трансгенным, т.е. содержит чужеродную ДНК.
Примеры
Пример 1
Анализ присутствия чужеродных последовательностей в ДНК из трансгенного картофеля.
ДНК из трансформированного картофеля сорта Desiree выделяли стандартным методом и использовали в описанной выше процедуре тестирования. Использовали праймеры и иммобилизованные олигонуклеотиды для маркерных генов npt II и gus, а также для промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, промотора nos и терминатора ocs агробактерии A.tumefaciens, а также bar, cry1, lecitin, zein, EPSPS.
Подготовка проб для проведения гибридизации на микрочипе методом мультиплексной ПЦР.
В 27 мкл ПЦР-смеси вносили 3 мкл раствора ДНК, выделенного из изучаемого образца. Состав ПЦР-смеси:
1×ПЦР-буфер: 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (рН 9.0 при 25°С), 0.1% Triton X-100 (Силекс, Россия)
2
2 мМ MgCl (Силекс, Россия)
200 мкМ каждого dNTP (Силекс, Россия)
12.5 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Силекс, Россия)
1 мкл смеси праймеров (таблица ниже).
Амплификацию проводили на программируемом термоциклере "Терцик" (ДНК-Технология, Россия) со следующим режимом: 95°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 30 с; 43 цикла (в первом цикле время денатурации увеличивали до 5 мин, в последнем - время достройки до 5 мин).
На фиг.2 представлена картина гибридизации на биологическом микрочипе флуоресцентно меченых продуктов ПЦР. Видно, что четыре ячейки дают сильный флуоресцентный сигнал, во много раз превышающий фоновую флуоресценцию ячеек отрицательного контроля NC. Флуоресцирующие ячейки содержат последовательности генов npt II и gus, а также промоторов 35S и nos. Ячейка, соответствующая терминатору ocs, а также bar, cry1, lecitin, zein, EPSPS,
сохранила фоновую флуоресценцию. Результат данного тестирования можно однозначно интерпретировать как положительный, т.е. выявляющий трансгенную природу данного растительного образца. Это же тестирование устанавливает, что в растительный геном внедрены маркерные гены npt II и gus, а также промоторы 35S и nos.
Пример 2.
Анализ присутствия чужеродных последовательностей в ДНК из трансгенного табака. Испытание проводили аналогично описанному в примере 1.
На фиг.3 представлена картина гибридизации на биологическом микрочипе флуоресцентно меченых продуктов ПЦР.
Видно, что три ячейки дают сильный флуоресцентный сигнал, во много раз превышающий фоновую флуоресценцию ячеек отрицательного контроля NC.
Флуоресцирующие ячейки содержат последовательности гена npt II, терминатора ocs, а также промотора nos. Ячейки, содержащие олигонуклеотиды, комплементарные фрагментам ocs и 35S, а также bar, cry1, lecitin, zein, EPSPS, сохранили фоновую флуоресценцию.
Результат данного тестирования можно однозначно интерпретировать как положительный, т.е. выявляющий трансгенную природу данного растительного образца.
Это же тестирование устанавливает, что в растительный геном внедрены ген npt II, а также промотор nos, терминатор ocs.
Пример 3.
Анализ присутствия чужеродных последовательностей ДНК из продукта питания (паштет "Популярный", Черкизовский завод). Испытание проводили аналогично описанному в примере 1. Картина гибридизации на биологическом микрочипе флуоресцентно меченых продуктов ПЦР представлена на фиг.4.
Флуоресцентный сигнал наблюдается только в ячейке, содержащей олигонуклеотид, комплементарный последовательности фрагмента гена npt II. Во всех остальных анализируемых ячейках биологического микрочипа интенсивность сигнала близка к значению интенсивности в ячейках отрицательного контроля. Следовательно, исследуемый продукт питания содержит генетически модифицированный растительный компонент, что устанавливается по наличию гена npt II.
Пример 4.
Анализ присутствия чужеродных последовательностей ДНК нетрансформированного растения. Испытание проводили аналогично описанному в примере 1. Картина гибридизации на биологическом микрочипе флуоресцентно меченых продуктов ПЦР представлена на фиг.5.
Результаты показывают, что ни одна из опытных ячеек не дает флуоресцентного сигнала, достоверно превышающего сигнал контрольных ячеек. Это свидетельствует о нетрансгенной природе испытуемой ДНК.
Главным преимуществом предлагаемого биочипа является одновременный анализ присутствия в испытуемой ДНК сразу большого числа различных генов и их регуляторных областей, обычно используемых при получении трансгенных растений. Это позволяет не только надежно дискриминировать трансгенные и нетрансгенные образцы ДНК, но и однозначно определить, какие конкретно маркерные гены присутствуют в трансгенном материале. При этом большое число детектируемых последовательностей не делает процедуру более сложной в исполнении, т.к. стадия ПЦР-амплификации фрагментов ДНК и стадия гибридизации на микрочипе выполняются в один прием. Большое число тестируемых последовательностей ДНК делает маловероятными ложноотрицательные результаты, т.к. вероятность обнаружить хотя бы один фрагмент чужеродной ДНК приближается здесь к 100%. Важно также то, что у трансгенных растений имеется, как правило, несколько разных встроенных в геном последовательностей. Поэтому в случае присутствия трансгенного материала в исходном образце флуоресцентный сигнал будет чаще всего наблюдаться сразу в нескольких ячейках с зондами, специфичными к различным мишеням, каждая из которых служит независимым подтверждением положительного результата тестирования, что снижает вероятность ложноположительных результатов.
Приведенные примеры иллюстрируют преимущества предлагаемой полезной модели, полученной благодаря освоению генной инженерией новых регуляторных участков ДНК и маркерных генов для создания трансгенных растений.
Для достижения высокой надежности предложенного биочипа дополнительно осуществлены следующие меры. Во-первых, иммобилизованные зонды соответствуют внутренней части амплифицируемых специфичных фрагментов ДНК-мишеней. Это исключает возможность неспецифической гибридизации какой-либо случайно амплифицированной ДНК. Во-вторых, в структуру биологического микрочипа введены ячейки, выполняющие роль отрицательного
контроля. В-третьих, длины амплифицируемых фрагментов ДНК составляют около 100 п.о., что дает возможность выявлять трансгенные последовательности даже в сильно деградированных до длин 150-200 н.о. образцах ДНК. Кроме того, в процессе тестирования каждой серии образцов предусмотрено использование положительного и отрицательного контролей сравнения - образцов ДНК, выделенной из охарактеризованных трансгенного и нетрансгенного растений.
Высокие чувствительность и специфичность биочипа обусловлены тем, что для идентификации объединены преимущества двух наиболее чувствительных и специфичных способов анализа генома: полимеразной цепной реакции (ПЦР) и специфической гибридизации. ПЦР увеличивает концентрацию искомых последовательностей ДНК в миллион и более раз, что вполне достаточно для достоверной и количественной детекции флуоресцентного сигнала.
5
6
-15
-14
Исходя из этого, для надежного выявления трансгенов в исходной ДНК достаточно наличия всего 10-10 одинаковых трангенных последовательностей, что соответствует примерно 1-10 фг, т.е. 10-10 г их ДНК. Подобная чувствительность соответствует одной из самых высоких для известных в настоящее время методов обнаружения трансгенов.
Компоненты для ПЦР могут быть приготовлены заранее в одной смеси, а сама реакция ПЦР занимает не более 1,5 часа. Гибридизация на биологическом микрочипе проходит без участия персонала и может проводиться и в нерабочее время, т.е. в течение ночи. Отмывка чипа после гибридизации и анализ флуоресценции ячеек на аппаратно-программном комплексе «Евробио-ВТО» требуют минимума трудовых затрат и могут быть проведены в течение минуты. Срок хранения биологических микрочипов с прогибридизовавшимся флуоресцентно меченым материалом составляет несколько лет, при этом повторная регистрация флуоресценции может быть проведена в любой момент. Комплекс «Евробио-ВТО» позволяет сохранять в памяти компьютера как изображения, так и цифровые    значения интенсивностей флуоресцентного сигнала.
Таким образом, удобство и быстрота тестирования, а также объективность анализа позволяют проводить испытание большого количества образцов ДНК параллельно в строго идентичных условиях, не требуя ни на одной из стадий высококвалифицированного персонала. При этом сохраняется сколь угодно долго возможность повторного анализа биологического микрочипа после гибридизации.
Название маркера
Название олигонуклеотида
Длина, и.о.
Назначение
Последовательность
Рабочая конц., мкМ
35S
GE-4-2 up
24
праймер ПЦР
5′ Р - GCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAG 3′
0,1
GE-6 lo
24
праймер ПЦР
5′ biotip - CATTGCGATAAAGGAAAGGCCATC 3′
0,1
H35-m up
34
иммобилизация
5′ Р - CATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTC 3
H35-m lo
34
Гибридиз., проверка
5′ biotip - AAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATG 3′
0.1
NOS
GE-7 up
26
праймер ПЦР
5′ Р - ACCCA′fCrCATAAATAACGTCATGCA 3
0,1
GE-6 lo
22
праймер ПЦР
5′ biotip - TGCCGGTCTTGCGATGATTATC 3
0,1
H37 up
40
иммобилизация
5′ Р -AATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTAC 3′
Ocs
GE-9 up
24
праймер ПЦР
5′ Р - AGATATGCGAGACGCCTATGATCG 3′
0,1
GE-9 lo
25
праймер ПЦР
5′ biotip - GCGGTAAGGATCTGAGCTACACATG 3′
0,1
H39 up
40
иммобилизация
5′ P - CATGATATTTGCTT1CAATTCTGTTG1GCACGTTGTAAAA 3′
NPTn
GE-14 up
24
праймер ПЦР
5′ P - CC TGTCATCTCACCTTGCTCCTGC 3′
0,1
GE-14 1o
21
праймер ПЦР
5′ biotip -CGATGTTTCGCTTGGTGGTCG 3′
0,1
H45 up
28
иммобилизация
5′ P - GGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTG 3′
GUS
GE-13 up
25
праймер ПЦР
5′ P - TCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTG 3′
0,1
GE-13 lo
25
праймер ПЦР
5′ biotip -CCAGCCATGCACACTGATACTCTTC 3′
0,1
H43 up
38
иммобилизация
5′ P - GGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACG 3′
H43 1o
38
Гибридиз., проверка
5′ biotin - CGTATTCGGTGATGATAATCGGCTGATGCAGTTTCTCC 3′
Lectin
Le7 up
22
праймер ПЦР
5′ P - CTCTTGGTCGCGCCCTCTACTC 3′
0,1
Le7 1o
23
праймер ПЦР
5′ biotin - GAGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG 3′
0,1
LeH7 up
30
иммобилизация
5′ P - TGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC 3′
Zein
Zel up
27
праймер ПЦР
5′ P - CTAGTGCCATTATTCCACAGTTCCTCC 3′
0,1
Zel lo
27
праймер ПЦР
5′ biotin - TGTATGGTTAGATGTGCCAAGGATTGT 3′
0,1
ZeH2 up
33
иммобилизация
5′ P - CGGCGAGCGTCTTACAACAACCAATTGCCCAAT 3′
bar
GE-15 up
20
праймер ПЦР
5′ P - GGCACGCAACGCCTACGACT 3′
0,1
GE-15 lo
21
праймер ПЦР
5′ biotin - GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC 3′
0,1
H46 up
32
иммобилизация
5′ P - TCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCA 3′
H46 1o
32
Гибридиз., проверка
5′ biotin - TGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGA 3′
cry1Ab
GE-16 up
25
праймер ПЦР
5′ P - AGCCAAGACCTCGAGATTTACCTGA 3′
0,1
GE-I6 lo
22
праймер ПЦР
5′ biotin - AGGAGAAGTGGTGGCTGTGGTG 3′
0,1
H47 up
30
иммобилизация
5′ P - CGTCAACGTGCCCGGTACTGGTTCCCTCTG 3′
H47 lo
30
Гибридиз., проверка
5′ biotin - CAGAGGGAACCAGTACCGGGCACGTTGACG 3′
EPSPS
GE-17 up
22
праймер ПЦР
5′ P - AATCCTCTGGCCTTTCCGGAAC 3′
0,1
GE-17 lo
23
праймер ПЦР
5′ biotin - TATTGATGACGTCCTCGCCTTCC 3′
0,1
H48 up
32
иммобилизация
5′ P - CAAGTCGATCTCCCACCGGTCCTTCATGTTCG 3′
H48 lo
32
Гибридиз., проверка
5′ biotin - CGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCGACTTG 3′
+K
P-GE-13 up
25
иммобилизация
5′ P - GAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGG 3′
-K
P-GE14-51 up (NC2)
21
иммобилизация
5′ P - CGACGACCATGCGACACATAG 3′
ZeH2 up
33
иммобилизация
5'P-CGGCGAGCGTCTTACAACAACCAATTGCCCAAT 3'
bar
GE-15 up
20
ПЦР
5'P-GGCACGCAACGCCTACGACT 3'
0,1
GE-15 lo
21
ПЦР
5'biotin-GTCCAGCTGCCAGAAACCCAC 3'
0,1
H46 up
32
иммобилизация
5'P-TCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCA 3'
H46 lo
32
Гибридиз., проверка
5'biotin-TGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGA 3'
crylAb
GE-16 up
25
ПЦР
5'P-AGCCAAGACCTCGAGATTTACCTGA 3'
0,1
GE-I6 lo
22
ПЦР
5'biotin-AGGAGAAGTGGTGGCTGTGGTG 3'
0,1
H47 up
30
иммобилизация
5'P-CGTCAACGTGCCCGGTACTGGTTCCCTCTG 3'
H47 lo
30
Гибридиз., проверка
5'biotin-CAGAGGGAACCAGTACCGGGCACGTTGACG 3'
EPSPS
GE-17 up
22
ПЦР
5'P-AATCCTCTGGCCTTTCCGGAAC 3'
0.1
GE-17 lo
23
ПЦР
5'biotin-TATTGATGACGTCCTCGCCTTCC 3'
0,1
H48 up
32
иммобилизация
5'P-CAAGTCGATCTCCCACCGGTCCTTCATGTTCG 3'
H48 lo
32
Гибридиз., проверка
5'biotin-CGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCGACTTG 3<sup>1</sup>
+K
P-GE-13 up
25
иммобилизация
5'P-GAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGG 3'
-K
P-GE14-51 up (NC2)
21
иммобилизация
5'P-CGACGACCATGCGACACATAG 3'