Способ анализа дифференциально метилированных геномных участков в биологических образцах костного мозга и крови детей с острым миелоидным лейкозом

1. Способ анализа аномально метилированных геномных участков в биологических материалах  пациентов  с острым миелоидным лейкозом путем  выявления  метилирования, при котором  проводят выделение образцов  геномной ДНК  из биологического материала  пациента с добавлением экстракционного буфера и протеиназы K, после добавления экстракционного буфера и протеиназы K последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа,  затем осаждают ДНК 2,5 объемами холодного 96% этанола, выдерживают образец 30 мин при температуре - 70°C, после чего образцы растворенной ДНК центрифугируют 15 мин с ускорением 12000 g,  высушивают осадок ДНК на воздухе и растворяют в 200 мкл ТЕ pH 8.0,  причем  в  отношении выделенных образов геномной ДНК последовательно осуществляют гидролиз метилчувствительной эндонуклеазой рестрикции,  после чего  подвергают  амплификации, используя для этого метилчувствительную  полимеразную цепную  реакцию с  праймерами:
5’-ggc-ggg-acc-ggc-gag-cag-tag-c-3’, 5’-aag-cca-ggc-gca-cca-ccc-gga-c-3’, 5’-ggg-cgc-gct-cac-ctc-gga-cag-g-3’, 5’-tcc-cca-tcc-cgc-gga-ccc-ctc-c-3’, 5’-cgg-cgc-gct-caa-agc-caa-gcc-g-3’, 5’-cac-acc-cca-ggc-gct-gcc-ctc-c-3’,  5’-gcg-gcc-ggg-agg-gag-ttg-tcg-g-3’, 5’-gcg-gag-gct-act-gag-gcg-gcg-g-3’, 5’-gac-gcc-gct-acc-tca-gcc-gcc-g-3’, 5’-tgg-ccc-gca-ggg-cgg-taa-gtg-c-3’, 5’-ggg gct cgg gtg cct gag atc g-3’, 5’-ggg cgg gct ccg gaa cag tgt c-3’, 5’-gtc gcc cgc ccc ggg aaa gga c-3’, 5’-gca ggg gcc ctt ggg ggt cag g-3’, 5’-ccc agg ctg cgc ggt ttc ccg a-3’, 5’-cgt tct cgc ctc cag ccc cgc c-3’, 5’-agc gct ggg tgc ggg gtt tcg g-3’, 5’-gcg gag gct act gag gcg gcg g-3’, 5’-cgg gcg cca gcg act cac cct c-3’, 5’-ggc ggc ctt ctc cag gcg gtg g-3’, 5’-gcg agg agt gaa ggt ttc ag-3’, 5’-gga aac acg ggt agt tcc aa-3’, 5’-ccc ata ccc acc agt acc ac-3’, 5’-gtc ctt gcc tcc cat ctt ct-3’, 5’-gat agg ggg aag ggt gaa ag-3’, 5’-gat tag ccg aag cca caa ac-3’, 5’-aga agg ccg cga act tga ac-3’, 5’-tat ggc gat ttt gcc ctg tg-3’, 5’-cag ccc gct cgg tat tat ga-3’, 5’-gca aca gcg gag gct act ga-3’, а для детекции  аномального метилирования  фрагментов ДНК, полученных в результате метилчувствительной  полимеразной цепной реакции с праймерами, производят  визуализацию  продуктов полимеразной цепной реакции в полиакриламидном геле.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят выделение образца геномной ДНК из биологического материала пациента из группы:  венозная кровь или гомогенизированный костный мозг.
3. Способ по любому из пп.1,2, отличающийся тем, что  визуализацию метилирования проводят  разделением  фрагментов ДНК  методом  аналитического  вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле,  с последующей окраской нитратом серебра.
4. Способ по любому из пп.1,2, отличающийся тем, что для проведения амплификации метилчувствительной полимеразной цепной реакцией производят разделение образца на три части  с образованием трех  пулов,  каждый  из  которых  подвергают амплификации метилчувствительной  полимеразной цепной  реакцией с  одной  из  групп праймеров:
2
4
2
4
- Пул 1: 100 нг ДНК, 2,6 мМ MgCl, 68 мМ Tris-HCl, 16,8 мМ (NH)SO, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 0,1 мг/мл BSA, 3 мкл DMSO, по 2 мкл каждого 2,5мМ dNTP, по 0,5 мкл 10 пмоль прямого (F) и обратного (R) праймеров ABCG4_F: 5’-ggc-ggg-acc-ggc-gag-cag-tag-c-3’, ABCG4_R: 5’-aag-cca-ggc-gca-cca-ccc-gga-c-3’; DLK2_F: 5’-ggg-cgc-gct-cac-ctc-gga-cag-g-3’, DLK2_R: 5’-tcc-cca-tcc-cgc-gga-ccc-ctc-c-3’; SOX8_F: 5’-cgg-cgc-gct-caa-agc-caa-gcc-g-3’, SOX8_R: 5’-cac-acc-cca-ggc-gct-gcc-ctc-c-3’; CTRL_RESTR_P1_SNRK_F: 5’-gcg-gcc-ggg-agg-gag-ttg-tcg-g-3’, CTRL_RESTR_P1_SNRK_R: 5’-gcg-gag-gct-act-gag-gcg-gcg-g-3’; CTRL_POS_CUX1_P1_F: 5’-gac-gcc-gct-acc-tca-gcc-gcc-g-3’; CTRL_POS_CUX1_P1_R:   5’-tgg-ccc-gca-ggg-cgg-taa-gtg-c-3’, деионизованной воды до 25 мкл;
2
4
2
4
- Пул 2: 100 нг ДНК, 0,6 мМ MgCl, 68 мМ Tris-HCl, 16,8 мМ (NH)SO, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 0,1 мг/мл BSA, 3 мкл DMSO, по 2 мкл каждого 2,5мМ dNTP, по 0,5 мкл 10 пмоль прямого (F) и обратного (R) праймеров GSGL1_F: 5’-ggg gct cgg gtg cct gag atc g-3’, GSGL1_R: 5’-ggg cgg gct ccg gaa cag tgt c-3’; CXCL14_F: 5’-gtc gcc cgc ccc ggg aaa gga c-3’, CXCL14_R: 5’-gca ggg gcc ctt ggg ggt cag g-3’; TMEM176A/TMEM176B_F: 5’-ccc agg ctg cgc ggt ttc ccg a-3’, TMEM176A/TMEM176B_R: 5’-cgt tct cgc ctc cag ccc cgc c-3’; CTRL_RESTR_P3_SNRK_F: 5’-agc gct ggg tgc ggg gtt tcg g-3’, CTRL_RESTR_P3_SNRK_R: 5’-gcg gag gct act gag gcg gcg g-3’; CTRL_POS_P3_CUX1_F: 5’-cgg gcg cca gcg act cac cct c-3’; CTRL_POS_P3_CUX1_R:   5’-ggc ggc ctt ctc cag gcg gtg g-3’, деионизированной воды до 25 мкл.;
2
4
2
4
- Пул 3: 100 нг ДНК, 2,6 мМ MgCl, 68 мМ Tris-HCl, 16,8 мМ (NH)SO, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 0,1 мг/мл BSA, 3 мкл DMSO, 2 мкл β-меркаптоэтанола, по 2 мкл каждого 2,5мМ dNTP, по 0,5 мкл 10 пмоль прямого (F) и обратного (R) праймеров F-EGFLAM: 5’-gcg agg agt gaa ggt ttc ag-3’, R-EGFLAM: 5’-gga aac acg ggt agt tcc aa-3’; F-TMEM200B: 5’-ccc ata ccc acc agt acc ac-3’, R-TMEM200B: 5’-gtc ctt gcc tcc cat ctt ct-3’; F-CLDN7: 5’-gat agg ggg aag ggt gaa ag-3’, R-CLDN7: 5’-gat tag ccg aag cca caa ac-3’; CTRL_POS_P4_CUX1_F: 5’-aga agg ccg cga act tga ac-3’, CTRL_POS_P4_CUX1_R: 5’-tat ggc gat ttt gcc ctg tg-3’; CTRL_RESTR_P4_SNRK_F : 5’-cag ccc gct cgg tat tat ga-3’; CTRL_RESTR_P4_SNRK_R: 5’-gca aca gcg gag gct act ga-3’, деионизированной воды до 25 мкл.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что для осуществления метилчувствительной  полимеразной цепной реакции  с  праймерами  каждый из пулов прогревают при 95ºС в течение 5 мин, добавляют 2,5 ед. термостабильной Taq-полимеразы, и проводят 33 цикла с параметрами: денатурация: 95ºС - 1 мин; отжиг: 63ºС – 45 c; элонгация: 72ºС - 30 с, осуществляют финальную инкубацию  при 72ºС в течение 10 мин с последующей визуализацией системы маркеров дифференциального метилирования ДНК в  полиакриламидном геле.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в отношении пула 1 производится мультиплексная МЧ-ПЦР для праймеров «ABCG4, DLK2, SOX8» с использованием внутренних контролей, «pUC/MspI» – маркер молекулярной массы, «k-» отрицательный контроль, «k+» - контрольный образец, «CUX1» - внутренний контроль на наличие амплификации, «SNRK» - внутренний контроль на полноту рестрикции.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что в отношении пула 2 производится мультиплексная МЧ-ПЦР для праймеров «CXCL14, GSGL1, TMEM176A/ TMEM176B», реакции проведены с использованием внутренних контролей, «pUC/MspI» – маркер молекулярной массы, «k-» отрицательный контроль, «k+» - контрольный образец, «CUX1» - внутренний контроль на наличие амплификации, «SNRK» - внутренний контроль на полноту рестрикции.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что в отношении пула 3 производится мультиплексная МЧ-ПЦР для праймеров «CLDN7, EGFLAM, TMEM200B» с использованием внутренних контролей, «pUC/MspI» – маркер молекулярной массы, «k-» отрицательный контроль, «k+» - контрольный образец, «CUX1» - внутренний контроль на наличие амплификации, «SNRK» - внутренний контроль на полноту рестрикции.