К вопросу изучения перекисного окисления липидов

К вопросу изучения перекисного окисления липидов

Р.С. Маханова, соискатель, Оренбургский ГУ

Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются свободнорадикальными и постоянно происходят в организме. Свободнорадикальное окисление нарушает структуру многих молекул. В белках окисляются некоторые аминокислоты. В результате разрушается структура белков, между ними образуются ковалентные «сшивки». Это активирует протеолитические ферменты в клетке, гидролизующие повреждённые белки. Активные формы кислорода легко нарушают и структуру ДНК. Неспецифическое связывание Fe2+ молекулой ДНК облегчает образование гидроксильных радикалов, которые разрушают структуру азотистых оснований. Наиболее подвержены действию активных форм кислорода жирные кислоты, содержащие двойные связи, расположенные через СН2-группу. Именно от этой СН2-группы свободный радикал (инициатор окисления) легко отнимает электрон, превращая липид, содержащий эту кислоту, в свободный радикал.

Уровень ПОЛ, например, липидов плазмы крови определяется, с одной стороны, процессами радикало- и перекисеобразования, а с другой — состоянием эндогенных систем анти-оксидантной защиты, поэтому оценка антиокис-лительной активности (АОА) этих систем имеет практическое значение [1, 2, 3, 4].

К ферментам, защищающим клетки от действия активных форм кислорода, относят суперок-сиддисмутазу каталазу и глутатионпероксидазу. Наиболее активны эти ферменты в печени, надпочечниках и почках, где содержание митохондрий, цитохрома Р45О и пероксисом особенно велико. Супероксиддисмутаза (СОД) превращает супероксидные анионы в пероксид водорода: 2О2- + 2Н+ ^ Н2О2 + О2.

Изоферменты СОД находятся и в цитозоле, и в митохондриях и являются первой линией защиты, потому что супероксидный анион образуется обычно первым из активных форм кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи.

СОД — индуцируемый фермент, т.е. синтез его увеличивается, если в клетках активируется перекисное окисление.

Пероксид водорода, который может инициировать образование самой активной формы ОН% разрушается ферментом каталазой:

2Н2О2 > 2Н2О + О2.

Каталаза находится в основном в перокси-сомах, где образуется наибольшее количество пероксида водорода, а также в лейкоцитах, где она защищает клетки от последствий «респираторного взрыва».

Глутатионпероксидаза — важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как он разрушает и пе-

роксид водорода, и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (Y-глутамил-цистеинилглицин). Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой две молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу:

Н2О2 + 2GSH > 2Н2О + G-S-S-G.

Окислённый глутатион восстанавливается глутатионредуктазой:

GS-SG + NADPH +

+ Н+ > 2GSH + NADP+.

Глутатионпероксидаза, которая восстанавливает гидропероксиды липидов в составе мембран, в качестве кофермента использует селен (необходимый микроэлемент пищи). При его недостатке активность антиоксидантной защиты снижается.

Рассмотрим витамины, обладающие анти-оксидантным действием.

Витамин Е (а-токоферол) — наиболее распространённый антиоксидант в природе — является липофильной молекулой, способной инактивировать свободные радикалы непосредственно в гидрофобном слое мембран и таким образом предотвращать развитие цепи перекисного окисления.

Различают восемь типов токоферолов, но а-токоферол наиболее активен. Витамин Е отдаёт атом водорода свободному радикалу пероксида липида (LOO^), восстанавливая его до гидропероксида (LOOH), и таким образом останавливает развитие ПОЛ (рис. 1).

Свободный радикал витамина Е, образовавшийся в результате реакции, стабилен и не способен участвовать в развитии цепи. Наоборот, радикал витамина Е непосредственно взаимодействует с радикалами липидных перекисей, восстанавливая их, а сам превращается в стабильную окислённую форму — токоферолхинон.

Витамин С (аскорбиновая кислота) также является антиоксидантом и участвует с помощью двух различных механизмов в ингибировании ПОЛ. Во-первых, витамин С восстанавливает окислённую форму витамина Е и поддерживает необходимую концентрацию этого антиоксиданта непосредственно в мембранах клеток. Во-вторых, витамин С, будучи водорастворимым и сильным восстановителем, взаимодействует с водорастворимыми активными формами кислорода — О2-, Н2О2, ОН и инактивирует их.

B-каротин, предшественник витамина А, также обладает антиоксидантным действием и ингибирует ПОЛ. Показано, что растительная диета, обогащённая витаминами Е, С, каротинои-дами, существенно уменьшает риск развития атеросклероза и заболеваний сердечно-сосудистой системы, подавляет развитие катаракты — помут-

нения хрусталика глаза, обладает антиканцерогенным действием. Имеется много доказательств в пользу того, что положительное действие этих компонентов пищи связано с ингибированием ПОЛ и других молекул и, следовательно, с поддержанием нормальной структуры компонентов клеток [2, 3].

Рис. 1

Механизм антиоксидантного действия витамина Е: витамин Е (а-токоферол) ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида; витамин Е превращается в стабильный, полностью окислённый токоферолхинон

Повышенный интерес исследователей к процессу перекисного окисления липидов (ПОЛ), его повреждающий потенциал и патогенетическая роль при различных заболеваниях требуют количественных методов, которые имели бы диагностическую информативность и соответствовали основным аналитическим критериям, таким, как точность, надёжность (достоверность), чувствительность и специфичность.

Большинство прямых подходов к оценке липидной пероксидации, количественное определение гидроперекисей липидов (первичных продуктов) трудно осуществить практически из-за их неустойчивой химической природы. Поэтому оценка липидной пероксидации, главным образом, основана на непрямых методах, с помощью которых анализируют вторичные или конечные продукты, образованные при превращении гидроперекисей, их метаболизме и разрушении.

При работе как с химическими системами, так и с биологическим материалом для определения гидроперекисей очень широко используется реакция с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). ТБК-тест основан на способности ТБК реагировать с малоновым диальдегидом (МДА), промежуточным продуктом этапа энзиматического окисления арахидоновой кислоты и конечным продуктом окислительной деградации липидов.

Две причины лежат в основе широкого использования этого теста для оценки липидной пероксидации. Между липидной пероксидацией и МДА существуют количественные взаимосвязи, и продукты, образованные при проведении ТБК-теста, свидетельствуют о присутствии и количестве липидных перекисей.

МДА (С3Н4О2) представляет собой низкомолекулярное соединение с ММ 72,07. МДА поглощает излучение в УФ области в кислой среде при длине волны 245 нм, в щелочной среде при длине волны 267 нм и не обладает собственной флуоресценцией. При нагревании и низких значениях рН МДА реагирует с нуклеофильными соединениями, давая различные продукты конденсации. Все эти реакции недостаточно селективны, так как в них могут вступать и другие низкомолекулярные альдегиды. При взаимодействии МДА с нуклеофилами образуются окрашенные продукты, имеющие более высокую молярную абсорбцию в видимой области спектра, чем имеет сам МДА в УФ. При этом в реакции МДА с ТБК образуется красный пигмент с самой высокой молярной абсорбцией, в 5—10 раз большей, чем МДА в УФ в области спектра.

Этот продукт, являясь пигментом, также обладает флуоресценцией. В то время как МДА образует окрашенные продукты при низком рН и нагревании (80—100 °С), флуоресцентные производные МДА могут возникнуть при нейтральных

рН без интенсивного нагревания (37 °С). Некоторые из них формируются при физиологических условиях в водной среде. В живых системах такие флуоресцирующие продукты образуются при взаимодействии МДА с макромолекулами, содержащими первичные аминогруппы, например, белков, фосфолипидов и нуклеиновых кислот. В результате этой реакции образуются поперечные сшивки между макромолекулами, что делает их токсичными, а также наделяет свойствами мутагенов и канцерогенов. Ковалентная модификация липопротеидов с МДА может играть роль в патогенезе атеросклероза. Анализ таких продуктов имеет диагностическое значе ние.

Существуют два больших класса аналитических методов для определения МДА: прямые методы, в которых анализируется МДА сам по себе, и непрямые методы оценки продуктов реакции МДА с другими соединениями, имеющими флуоресценцию, поглощение и другие свойства, которые можно зарегистрировать.

Один из основных подходов при прямых методах — ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрией. Этот метод — наиболее привлекательный прямой метод для анализа МДА с точки зрения специфичности и чувствительности, но он имеет свои особенности и технические трудности, связанные с корректной подготовкой проб, необходимостью постоянного применения свежих стандартов, наличием специального оборудования. Всё это ограничивает практическое применение данного метода.

Из непрямых методов наиболее распространённым стал метод с ТБК. Сложности применения этого метода состоят прежде всего в его неспецифичности. Даже в идеальных условиях эксперимента и анализа при образовании МДА из гидроперекисей липидов использование МДА, как количественного индекса, ограничено, поскольку его источником могут быть продукты разложения ДНК при её окислительном повреждении, а возможно, и других нелипидных молекул.

Тест с ТБК очень чувствителен. С его помощью можно улавливать наномолярные концентрации чистого МДА-стандарта. Другая трудность состоит в том, что ТБК реагирует и с другими соединениями с образованием красного пигмента при высокой температуре и низком рН (некоторые альдегиды, дезокси-сахара, сиаловые кислоты, гликозилированные белки). Спектрофотометрически невозможно определить образование 1 : 2 МДА:ТБК. Возможно, в условиях высокой температуры ТБК реагирует с МДА, образованным из гидроперекисей в процессе реакции. Это подтверждают опыты с добавлением в реакционную среду ионов переменных металлов (меди и железа).

При этом образование комплекса увеличивается за счёт разложения гидроперекисей. Аутоокисление липидов можно ограничить, добавляя в реакционную среду антиоксиданты или проводя реакцию в токе инертного газа. Тест с ТБК даёт информацию только о наличии веществ, реагирующих с ТБК, и не информирует об их составе и природе. Поэтому следует сочетать данный метод с другими маркерами липидной пероксидации [5, 6, 7].

Литература

1. Арчаков А.И. Успехи биологической химии. М.: Наука, 1971. 136 с.

2. Биохимия / под ред. чл.-корр. РАН, проф. Е.С. Северина. 5-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 768 с.

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.

4. Родионова Г.Б., Герасименко В.В. Методы физиологобиохимических исследований крови. Оренбург: Издательский центр ГНУ ВНИИМС, РАСХН, 2005. 148 с.

5. Гаврилов В.Б., Гаврилова А. Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов ПОЛ в сыворотке крови по тесту с ТБК // Вопросы медицинской химии. 1987. Т.ЗЗ. №1. С. 118-122.

6. Каган В.Е., Орлов В.Г., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов // Итоги науки и техники. Серия «Биофизика». 1986. Т. 18. 134 с.

7. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лабораторное дело. 1988. № 11. С. 41-43.