Фармацевтическая композиция на основе аутобиокомпонентов мочи человека для трансдермального применения с лечебной или косметической целью
PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED ON HUMAN URINE AUTOBIOCOMPONENTS FOR TRANSDERMAL APPLICATION FOR THERAPEUTIC OR COSMETIC PURPOSES

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, фармацевтике, а также дерматовенерологии и косметологии. Предназначено для индивидуального лечения или применения в косметологических целях аутобиокомпонентов, объединенных в фармацевтическую композицию, полученных из индивидуальной мочи, которые после очистки и концентрирования применяются путем трансдермального введения тому же человеку, из мочи которого они получены. Состав фармацевтической композиции и соотношение аутобиокомпонентов соответствуют физиологическому составу биологической жидкости и максимально безопасен при применении. Каждый из аутобиокомпонентов фармацевтической композиции обладает доказанным целенаправленным, а также сочетанным и потенцирующим действием, что повышает эффективность их применения.
Островоспалительные и хронические заболевания кожи, а также процессы, сопровождающие ее индуцированное или хронологическое старение, несмотря на различие этиологических факторов их возникновения и специфических, отличных между собой проявлений патогенеза, представляют общую, эволюционно сформированную реакцию организма. Закономерность и последовательность ответных реакций на острую или хроническую агрессию зависит от множества факторов, из которых одной из основных является степень адаптативных возможностей организма, основанных в свою очередь, на генетических, или хронологически сформированных, но индивидуальных особенностях каждого индивидуума. В значительной степени, вышесказанное касается, тех состояний, когда временной фактор имеет определяющее влияние на формирование, скорость нарастания и степень необратимых изменений, устранение которых на современном этапе развития медицинской науки невозможно. Напротив, своевременное и адекватное лечение или профилактические действия могут радикально изменить или приостановить течение неблагоприятных процессов. В конечном итоге, успех в лечении и коррекции патологического состояния в значительной степени зависит от адекватной оценки степени воздействия на организм совокупности негативных факторов, а также возможностью управления и использования естественно сформированных защитных механизмов самого организма.
Нам представляется, что развитие подхода, основанном на биологическом, и еще лучше аутобиологическом пути реализации достижений медицинской науки в биотехнологии и фармацевтике позволит максимально эффективно добиться успешных результатов. Основанием для таких предпосылок служит то, что в процессе эволюции, были созданы природные вещества, максимально приемлемые для организма, совокупность свойств которых находится в тесном балансе окружающих структур метаболизма и не нарушает их координацию. Напротив, появление новых и перспективных аналогов естественных биологических активных веществ организма, на современном этапе развития медицины, не позволяет с уверенностью судить как о ранних разнонаправленных эффектах, так и отдаленных последствиях их применения. С этих позиций, развитие возможности использования биологических активных аутокомпонентов с лечебной и восстановительной целью и способов их применения для устранения негативных состояний заслуживает внимания и имеет, несомненно, перспективное значение.
Одним из наиболее известных и изученных направлений практического использования биологических веществ является трансфузиология, где получение и переливание цельной крови или ее компонентов с целью коррекции различных патологических состояний является рутинным процессом. Напротив, применение аутогемотрансфузии крови или ее компонентов имеет строго специфическое назначение, предназначено для общей стимуляции иммунитета и не носит узконаправленный характер коррекции конкретных иммунобиологических нарушений. Относительная безопасность и очевидные недостатки аутогемотрансфузии стимулировали разработку и внедрение новых способов применения аутокомпонентов, в основу подавляющего большинства которых также был заложен общий принцип воздействия на иммунобиологические процессы, как в локальном, так и в общем метаболизме организма. Примером такого применения аутобиокомпонентов (АБК) является метод, получивший название «Плазмолифтинг», основанный на получении и подкожном ведении взвеси разрушенных аутотромбоцитов с целью лечения и в косметологии. Несмотря на видимые эффекты в ранние сроки после процедуры плазмолифтинга, отдаленные последствия его применения представляются чрезвычайно опасными, прежде всего из-за высокого доказанного риска возникновения онкологических заболеваний (38, 39). Перечень подобных попыток применения аутокомпонентов достаточно широк, однако, по нашему мнению, это потенциально опасный путь, требующий продолжения исследований, а также строгого контроля и учета реальных отдаленных последствий.
Наиболее безопасным может быть локализованное трансдермальное применение высокоактивных биологических АБК, не обладающих иммуномодулирующим действием, без их непосредственного инъекционного введения. В этом контексте, принципиально новым и наиболее предпочтительным направлением является выделение АБК из индивидуальной мочи человека, с последующим их очищением от нежелательных веществ, концентрированием и целенаправленным локальном применении в виде фармацевтической композиции (ФК) в естественном, физиологическом составе и соотношении с лечебной и/или косметологической целью тому же человеку, из мочи которого они выделены. Важно отметить, что ФК, основанная на АБК, соответствующих естественному составу биологических жидкостей организма, максимально безопасна и не несет риска аутоиммунных реакций, свойственных и описанных при ином другом способе применения АБК. При этом каждый из АБК в ФК выполняет как сочетанное, так и целенаправленное, доказанное биологическое действие на конкретные структуры кожи. Более того, концентрат каждого из предварительно очищенных АБК оказывает несопоставимо больший эффект по сравнению с исходным продуктом, который содержит также и нежелательные вещества.
Заявляемое изобретение представляет ФК на основе АБК мочи человека для трансдермального применения с лечебной или косметической целью.
Обоснование состава ФК на основе АБК мочи человека и способа ее применения с лечебной или косметической целью. Обоснование составлено по трем основным критериям, а именно:
1. Обоснование разработанного принципа применения АБК, выделенных из мочи человека.
2. Обоснование способа получения ФК из АБК.
3. Обоснование способа применения АБК.
Согласно п. 1 ФК создана на основе выделенных из индивидуальной мочи человека высокоочищенного концентрата биосовместимых и биоактивных АБК. Каждый из АБК ФК обладает доказанным биологическим действием, использование которого в комбинации с другими АБК обеспечивает сочетанное и потенцирующее действие, необходимое для получения лечебного или косметического эффекта при применении тому же человеку, из мочи которого они были выделены.
Каждый из выделенных АБК из индивидуальной мочи человека очищен от нежелательных веществ, сконцентрирован, применяется трансдермально в виде ФК в естественном, физиологическом составе и соотношении с другими АБК ФК.
Цель создания ФК - получение индивидуальной, биосовместимой ФК, состоящей из нескольких АБК в естественной, физиологической для индивидуального человека пропорции, а именно: аутогормонального концентрата, матрицы на основе высокоочищенного аутопротеогликана и аутогликозаминогликана, проводников в виде комплекса ауто-жирных кислот, комплекса аутоаминокислот, аденозилметионина, а также биоактивных мочевых аутотрипептидов, которые применяются в виде аппликаций с целью целенаправленного действия на интрадермальные кструктуры кожи для получения лечебного или косметического эффекта тому же человеку, у которого они были выделены.
ФК состоит из не менее шести АБК. Состав АБК следующий:
Первый АБК - один из фармакологически приемлемых АБК или его фармакологически приемлемых производных представляет собой группу протеогликанов и гликозаминогликанов, которая включает, по меньшей мере, хондроитинсульфаты и кератансульфаты, применяется в виде биогеля для создания объема, в котором удерживаются другие АБК ФК на поверхности кожи. Этот АБК представляет концентрат высокоочищенных протеогликанов и гликозаминогликанов, полученных из индивидуальной мочи самого пациента по способу, описанному в патенте РФ №2621311 «Способ получения протеогликана» (3).
1. Обоснование получения ГАГ и ПГ в качестве АБК ФК.
Одним из перспективных направлений в медицине и косметологии является получение и применение биоадаптивных высокополимерных веществ из доступных природных биологических продуктов, конкретно из мочи человека. Наиболее пригодными для этих целей являются протеогликаны (ПГ) и гликозаминогликаны (ГАГ), которые содержатся в моче человека в значительных количествах. Эти высокополимерные вещества обладают уникальными свойствами, прежде всего по способности удерживать воду в своей структуре в соотношении 1:100 и более, не обладают иммуногенностью, токсичностью, не имеют групповых различий и могут применяться без ограничений при лечении людей, имеющих разные группы крови или другие изоантигенные системы. Важной особенностью ПГ-ГАГ является их полная биосовместимость.
ПГ - это общее название, относящееся к гликопротеину с разнообразными типами структуры и обычно состоящему из одного корового белка с по меньшей мере с двумя и более ковалентно присоединенных линейных полисахаридных цепей (4). ПГ является комплексным соединением, однако поскольку соединение полисахаридной цепи и корового белка имеет слабую силу связывания, они имеют тенденцию к легкому отделению друг от друга. По этой причине выделение или очистка ПГ являются чрезвычайно тонким процессом требующим максимально щадящего проведения отделения на всех этапах. Это требование подразумевает исключение процедур, повреждающих структуру ПГ, в частности высокоскоростного центрифугирования, а также фильтрации через мелкопористый фильтр, не говоря уже об ультрафильтрации и ультрацентрифугировании. Таким образом, обычные способы не подходят для выделения ПГ из-за сложных или ручных действий.
Полисахаридные цепи ГАГ чрезвычайно гидрофильны, вследствие чего они удерживают большое количество воды и даже в очень низких концентрациях образуют гидратированный гель. Это свойство еще более усиливает высокая плотность отрицательных зарядов, которые притягивают осмотически активные катионы. Такой гидрофильный эффект растворов ГАГ способствует поддержанию онкотического давления в сосудисом русле и давления во внутриклеточном матриксе.
В аспекте предлагаемого изобретения можно выделить основные функции ПГ-ГАГ:
1. Основной компонент межклеточного матрикса;
2. Обеспечивают гидрофильность межклеточного матрикса
3. Влияют на клеточную миграцию;
4. Участвуют в процессах синтеза коллагена, эластина.
5. Образуют межклеточные контакты;
В настоящее время выделяют шесть основных видов ПГ: гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, кератансульфаты, дерматансульфаты, гепарин и гепарансульфаты. В аспекте предлагаемого изобретения, наибольшее интерес представляют следующие:
1. Гиалуроновая кислота - находится во многих органах и тканях. Участвует в образовании агрегатов ПГ. Повторяющаяся дисахаридная единица в гиалуроновой кислоте состоит из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Известно, что гиалуроновая кислота, которая является самым крупным полисахаридом из всех ГАГ, содержит 20-30 тысяч дисахаридных звеньев и высокую молекулярную массу - до 15 млн. дальтон, представляет гидрофильное соединение, одна молекула которого может удерживать 200-500 молекул воды (1).
2. Хондроитинсульфаты самые распространенные ГАГ в организме человека. Они содержатся в хряще, сухожилиях, связках, артериях, роговице глаза. Хондроитинсульфаты являются важным составным компонентом агрекана - основного ПГ хрящевого матрикса. В организме человека встречаются 2 вида хондроитинсульфатов: хондроитин-4-сульфат и хондроитин-6-сульфат. Они построены одинаковым образом: из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамин-4-сульфата или N-ацетил-D-галактозамин-6-сульфата соответственно.
3. Кератансульфаты - наиболее гетерогенные ГАГ. Отличаются друг от друга по суммарному содержанию углеводов и распределению в разных тканях. Они содержат остаток галактозы и N-ацетил-D-галактозамин-6-сульфат. Входят в состав роговицы глаза, хрящей, межпозвоночных дисков.
4. Дерматансульфаты - характерены для кожи, кровеносных сосудов, сердечных клапанов, менисков, межпозвоночных дисков. Повторяющаяся дисахаридная единица - L-идуроновая кислота и N-ацетил-D-галактозамин-4-сульфат.
5. Гепарин - важный компонент противосвертывающей системы крови. Синтезируется тучными клетками. Наибольшие количества гепарина обнаруживаются в легких, печени и коже. Дисахаридная единица состоит из D-глюкуронат-2-сульфата и N-ацетилглюкозамин-6-сульфата.
6. Гепарансульфат - входит в состав ПГ базальных мембран. Структура дисахаридной единицы такая же как и у гепарина, но содержит больше N-ацетильных групп.
В межклеточном матриксе присутствуют различные по размерам группы ПГ. Среди них очень крупные - например: агрекан и ворсикан, а также так называемые малые ПГ, например: декорин, бигликан, фибромодулин, люмикан, перлекан. Эти ПГ имеют небольшой коровый белок, к которому присоединены одна или две цепи ГАГ (11).
Соединительная ткань обладает возможностью самовосстановления и ремоделирования двух основных компонентов соединительной ткани - коллагена и ПГ. При повреждении соединительной ткани воспроизводство коллагена и ПГ существенно возрастет по сравнению с нормальными количествами.
Старение кожи клинически характеризуется морщинами, вялостью и кожистым внешним видом. Эти симптомы старения причинно связаны с гистологическими и ультраструктурными изменениями соединительной ткани дермы. Изменения включают как ферментативную деградацию, так и снижение синтеза коллагена de novo, что вызывает преждевременное сморщивание кожи. Качественные возрастные изменения структуры гиалуроновой кислоты, ПГ и коллагена приводят к дегидратации гидрофильных структур кожи, снижению содержания фиксированной воды и, как следствие, к понижению упругости кожи. Кроме того, влияние других факторов, таких как экзогенные ксенобиотики, постоянное или длительное воздействие физических факторов влияет на регенеративную способность дермальных фибробластов (66).
Изучение физико-химических, иммунологических и биохимических свойств полученных биопрепаратов на основе ПГ и ГАГ позволяет утверждать, что они имеют высокую и сверхвысокую степени очистки, в интервале от 10 до 100000 раз и соответствуют требуемым параметрам. Одновременно с этим было установлено, что полученные высокополимерные глюкурониды представлены в форме мономеров, с молекулярным весом в пределах 64 кДа, в виде димеров с молекулярным весом в пределах 150 кДа, и более крупных структур с молекулярным весом в пределах 450-500 кДа. По составу они на 80% представлены кератансульфатами и хондроитинсульфатами, а также ГАГ. Указанные выше высокополимерные глюкурониды являются базовыми, основными в количественном содержании компонентами практически всех клеток и тканей организма человека и млекопитающих и, в полной мере, соответствуют требованиям максимальной биодаптивности.
Известна терапевтическая композиция для защиты, лечения и восстановления соединительной ткани у млекопитающих и способ лечения соединительной ткани у млекопитающих путем введения композиции (46). Композиция включает глюкозамин и предпочтительно хондроитинсульфат и дополнительно включает аскорбат марганца, который катализирует выработку коллагена и ПГ из глюкозамина и хондроитинсульфата. Согласно п. 1 формулы описанного выше изобретения терапевтическая композиция предназначена для лечения и восстановления соединительной ткани у млекопитающих и содержит терапевтические количества глюкозамина и его солей в сочетании с хондроитинсульфатом и растворимыми солями марганца, которые применяются для стимулирования выработки ПГ и коллагенов для лечения и восстановления соединительной ткани.
Известен патент (47), в котором описана композиция для защиты, лечения и восстановления, а также для уменьшения воспаления соединительной ткани у млекопитающих и способ лечения соединительной ткани у млекопитающих путем введения композиции, которая включает S-аденозилметионин (SAM) и компонент, выбранный из аминосахара или его солей (например, глюкозамина) или гликозаминогликанов (например, солей хондроитина), или их смесей, или фрагментов. При этом доза ГАГ составляет от 15 до 30000 мг.
Недостатками приведенных выше аналогов является то, что они все получены из ксеногенного материала и их применение у человека способно вызывать нежелательные эффекты, требующие лечебного вмешательства.
Известно, что глюкуроновая кислота (ГК) в гепатоцитах вступает в реакции коньюгации с широким спектром эндогенных веществ, появляющихся в плазме крови. Образующиеся при этом парные кислоты представляют эфиры ГК с такими соединениями как билирубин, креатинин, индикан, скатол, фенол, адреналин, женские, мужские половые и другие стероидные гормоны и многими другими веществами различного строения. Образование прочной ковалентной связи обеспечивает устойчивость комплекса ГК к деградации под действием большинства ферментных систем, и в таком виде беспрепятственно проходит через выделительные системы организма. При этом, выделяясь с мочой, глюкурониды не подвергаются восстановлению и десорбции в этой среде. Таким образом, в моче доминируют ГАГ и ПГ, представляющие коньюгаты ГК с эндогенными метаболитами.
С этих позиций, выделение ГАГ или ПГ из мочи с целью их повторного введения в организм в качестве биокомпонентов лишено смысла и неприемлемо ввиду реального потенцирования интоксикации при их применении.
Ситуация радикально изменяется, если выделенные из мочи ПГ или ГАГ предварительно очистить от токсических метаболитов, разрушив эфирную связь. Известно, что целый ряд соединений способен целенаправленно и избирательно разрушить эфирную связь без участия ферментных систем. Одной из эффективных реакций является гидролиз щелочами, который сопровождается деструкцией эфирной связи и отделением присоединенного ранее метаболита от ГК. Образованная соль ГК с щелочным соединением, в частности щелочным металлом, теряет растворимость и выпадает в осадок.
Этот процесс технологически управляем и может способствовать восстановлению ГК в структуре ГАГ или ПГ. Естественно предположить, что вновь полученный, реактивируемый и очищенный от посторонних примесей продукт можно использовать как высокоэффективное, полностью биосовместимое природное вещество, пригодное даже для парентерального применения.
Разработанный ранее нами способ восстановления активности ГАГ - ПГ, выделенных из мочи человека и не содержащих ЭТМ, описан в патенте (3) состоит из нескольких этапов, которые заключаются в следующем:
Этапы получения и восстановления комплекса (ГАГ-ПГ) - ЭТМ.
1. Выделение (осаждение) комплекса (ГАГ-ПГ) - ЭТМ.
2. Щелочной гидролиз эфирной связи ГК-ЭТМ с образованием нерастворимой соли щелочного металла с ГК.
3. Отделение осадка соли ГК от ЭТМ.
4. Восстановление соли ГК с получением растворимой формы ГАГ-ПГ.
5. Концентрация геля ГАГ-ПГ для применения.
Предложенный в заявляемой ФК первый компонент - один из фармакологически приемлемых АБК или его фармакологически приемлемых производных представляет собой группу ПГ и ГАГ, которая включает, по меньшей мере, хондроитинсульфаты и кератансульфаты, применяется для создания объема аутобиогеля, в котором удерживаются другие компоненты фармацевтической композиции на поверхности кожи.
Второй фармакологически приемлемый АБК или его фармакологически приемлемые производные представляет собой группу жирных кислот (ЖК) производных деканоевой кислоты, преимущественно в сульфурированном состоянии, которая включает, по меньшей мере: деканоевую, гидроксидеканоевую, оксоундекановую, 3-гидроксидодекановую, тетракозодеканоевую, гидроксипентадеканоевую кислоты. Этот АБК применяется в качестве проводника для содействия проникновению других АБК фармацевтической композиции в интрадермальные структуры кожи, а также для оказания протекторного действия на фосфолипидную основу мембраны клеток.
Натриевые и калиевые соли высших ЖК являются эффективными поверхностно-активными веществами и используются в качестве мыл. В пищевой промышленности ЖК зарегистрированы в качестве пищевой добавки Е570 как стабилизатор пены, глазирователь и пеногаситель, что дает основания рассматривать ЖК как безопасный для местного применения класс веществ.
Известно, что вышеперечисленные ЖК оказывают воздействие на поверхность кожи, а также на верхние слои эпидермиса, поскольку они проходят через роговой слой. Эффективность косметического и/или фармацевтического действия ЖК, проникающего в верхние слои эпидермиса усиливается на фоне увеличения их концентрации (45).
Тиоловые соединения, такие как цистеин, таурин, коэнзим А непосредственно вовлечены в процессы метаболизма ЖК. Сульфурирование гидрофобных ЖК с участием тиоловых соединений приводит к их модификации и радикальному изменению свойств, которые проявляются в том, что сульфурированные ЖК проявляют протекторное действие на фосфолипидную основу мембраны клеток, в отличие от повреждающего действия гидрофобных ЖК (43, 45).
Одной из проблем непосредственного использования т.н. коротких пептидов является преодоление ими клеточных мембран для проникновения внутрь клетки. Один из подходов решения этой проблемы заключается в прикрепление к пептидам при их синтезе соединений, которые способствуют их проникновению в клетку. Среди протекторов наиболее часто используют ЖК, в том числе, такие как деканоевая кислота (49). Использование проводникового эффекта ЖК приведено в патенте (13), где описана композиция вакцины для трансдермального или трансмукозального введения для индукции клеточного иммунитета, при лечении рака. Вакцина содержит: (i) антиген и (ii) фармакологически приемлемую органическую кислоту или ее фармакологически приемлемую соль в качестве первого стимулятора индукции клеточного иммунитета. Далее в формуле изобретения уточняется, что органическая кислота или ее фармакологически приемлемая соль представляет собой органическое соединение, имеющее карбоксильную группу, или органическое соединение, имеющее сульфогруппу, или его фармакологически приемлемую соль. Более того, органическая кислота или ее фармакологически приемлемая соль представляет собой ЖК, выбранную из группы, состоящей из деканоевой кислоты, лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, изостеариновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и олеиновой кислоты, или молочной кислоты, салициловой кислоты, лимонной кислоты, метансульфоновой кислоты. Описанное выше изобретение предложено для специфического лечения рака и не предназначено для применения в косметологии или для лечения кожных заболеваний. При этом, оно предполагает трансдермальное или трансмукозальное введение.
Описано применение с лечебной целью крема «Физиогель» для восстановление поврежденного гидролипидного слоя эпидермиса при атопическом дерматите (атопическая экзема, диффузный нейродермит, конституциональная экзема - хроническое воспалительное заболевание кожи с рецидивирующим течением)». В состав крема входят фосфолипиды и церамиды, идентичные эссенциальным липидам кожи. Крем «Физиогель» с Дерма-Мембранной Структурой содержит следующие компоненты по INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients): вода, каприлик/каприк-триглицерид, глицерин, пентиленгликоль, масло кокоса, гидрированный лецитин, масло карите, гидроксиэтилцеллюлоза, сквалан, карбомер натрия, ксантиновая камедь, карбомер, церамид-3. Установлена клиническая эффективность применяемой композиции. Автор утверждает, что при использовании крема «Физиогель» сухая кожа, склонная к атопии, становится гладкой и увлажненной, повышается и ее эластичность, достигается надежный увлажняющий эффект, что дает основания к применению в дерматологической практике (9).
ЖК широко применяются в косметологии, что обусловлено выраженным биологически активным действием при местном применении на кожу лица и тела. Из технической литературы известно, что ациклические карбоновые кислоты, начиная с масляной кислоты, считаются жирными. В косметологии описано применение мазей, кремов, содержащих ЖК. Известен увлажняющий крем с олигосахаридами, жирными кислотами, маслами, витаминами А, Е и липидами тутового шелкопряда, который выпускается под брендом «Christina Silk». Предназначен для увлажнения и восстановления липидного барьера кожи в качестве ЖК в креме.
Приведенный краткий анализ доступной технической литературы с целью обоснования целесообразности применения ЖК, в том числе деканоевых кислот позволяет считать обоснованным участие в составе предлагаемой композиции, по меньшей мере, деканоевой кислоты или ее производных.
Третий фармакологически приемлемых АБК или его фармакологически приемлемые производные представляет собой группу пептидов, которая включает, по меньшей мере ди-, три, тетрапептиды. При этом группу трипептидов представляют гомомерные гомодетные трипептиды с аминокислотной последовательностью CDY, WTM, HKM, PTF и GHL. Эти биологически активные вещества, обладают доказанным стимулирующие действием на активацию метаболизма в интрадермальных структурах кожи.
Открытие натрийуремических пептидов (НУП), и результаты интенсивных исследований за последние годы, позволяют рассматривать это направление, как одно из прорывных медицинских технологий для лечения широкого спектра кожных заболеваний, а также в косметологии.
При изучения эффектов НУП было установлено, что их вызывает пептид, секретируемый мышечными клетками предсердий (32). Наиболее употребительным стал термин - «предсердный натрийуретический пептид» (ANP).
Очень близкий по строению пептид со схожими биологическими свойствами был экстрагирован из ткани мозга - он был назван мозговым натрийуретическим пептидом (brain natriuretic peptide - BNP) (71).
Выявлен еще и натрийуремический пептид С-типа (C-type natriuretic peptide - CNP), структурно близкий к двум предыдущим (72).
Для образования активных молекул - ANP, BNP или CNP требуется предварительный узконаправленный протеолиз их предшественников, какими являются пре-про-субстанции. В ходе посттрансляционного процессинга вначале из пре-про-пептида образуется про-пептид. На примере про-ANP и про-BNP установлено, что они или их фрагменты обладают биологической активностью (48). Дальнейшее протеолитическое расщепление приводит к образованию биологически активных пептидов ANP, BNP, CNP.
Установлено влияние ANP/BNP на проницаемость кровеносных и лимфатических микрососудов кожи и жировой клетчатки за счет усиления проницаемости гликокаликса эндотелиоцитов (74). Эти пептиды регулируют рост и миграцию эндотелиоцитов, играющих основную роль в формировании структуры сосудов (51, 54). При этом, усиление проницаемости эндотелия вызывают в отдельности как ANP, так и BNP (34). CNP также участвует в регуляции микрососудистой проницаемости, увеличивая ее за счет модификации структуры гликокаликса эндотелиоцитов (36). ANP/BNP подавляют выработку коллагеновых волокон и синтез матрикса, за счет чего снижают пролиферативную и функциональную активность фибробластов (73). Считается, что этот пептид принимает участие в противовоспалительных реакциях, подавляет клеточную пролиферацию и фиброз (65), способствует ослаблению дифференцировки и миграции фибробластов. Результаты исследований позволяют сделать принципиальные для практической реализации выводы:
1. ANP и BNP повышают проницаемость эндотелия. Это приводит к усилению проницаемости гликокаликса эндотелиоцитов в кровеносных и лимфатических микрососудах разных тканей в том числе кожи, жировой клетчатки.
2. ANP уменьшает тонус гладкой мускулатуры артерий, ANP/BNP подавляют рост, пролиферативную и функциональную активность фибробластов, выработку коллагеновых волокон и синтез матрикса.
3. CNP способствует уменьшению воспалительной реакции, подавляя клеточную пролиферацию, дифференцировку и миграцию фибробластов и развитие фиброза.
4. CNP подавляет экспрессию генов коллагенов I и III типов.
Одним из актуальных направлений является изучение биологических эффектов регуляторных пептидов. Известно, что в плазме крови свободная форма ANP, BNP, CNP быстро теряет свою биологическую активность и, как правило, в течение 2-3 минут для ANP/CNP и 20-30 мин для BNP происходит их полная инактивация. Напротив, про- и особенно, пре-формы НУП, вне плазмы крови сохраняют способность к активации биологической активности длительное время, но только в случае отсутствия контакта с плазменными протеазами. К их числу относятся пептиды, которые определяются в моче вследствие экскреции из органов и крови. Другие, второстепенные факторы, также способствующие деградации, оказывают существенно меньшее действие и их эффект, может быть снижен в процессе технологического выделения НУП.
Неожиданно обнаружено, что выделенные нами из мочи человеческие пептиды являются преимущественно гомодетными три-пептидами, основные из них представлены композицией: CDY, WTM, НКМ и PTF с произвольной неустановленной аминокислотной последовательностью. Для удобства изложения эти пептиды объединены в группу мочевых трипептидов непочечного происхождения (МТП). Исследования аминокислотной последовательности МТП установили различия в аминокислотном составе: Эти сведения представлены на таблице 1.
Учитывая определенные сложности, существующие в верификации индивидуальных химических и биологических свойств каждого из трипептидов этой группы, нами изучены сочетанные комплексные свойства всей группы МТП и, прежде всего, их локальное действие, в том числе влияние на репаративные процессы в неповрежденной и патологически измененной коже. Предварительный обзор литературных источников, посвященных изучению биологического действия других известных трипептидов показал следующее.
Одним их наиболее изученных пептидов с доказанным выраженным репаративным эффектом является человеческий пептид GHL, открытый в 1973 году (57). В процессе изучения GHL было установлено его действие на течение локальных репаративных процессов, которое проявлялось в непосредственном влиянии на различные клеточные популяции кожи, основные тканеобразующие вещества и метаболизм индивидуальных веществ, определяющих направление регенеративных и восстановительных процессов в неповрежденной и патологически измененной коже. Стимулирующий эффект GHL на синтез коллагена фибробластами in vitro, проявляется при минимальных концентрациях и не зависит от количества клеток в культуре. Аминокислотная последовательность GHL идентична α2-цепи коллагена I типа, что позволяет предположить, что именно коллаген является исходным местом нахождения GHL, откуда он освобождается под влиянием протеаз. Установлено, что GHL селективно стимулирует синтез сульфатированных гликозаминогликанов - внеклеточного дерматансульфата и связанного с клеточным монослоем гепарансульфата, поскольку влияния GHL на синтез гиалуроновой кислоты не наблюдается (29). GHL ускоряет образование соединительной ткани и накопление межклеточного вещества, оказывая стимулирующее влияние на заживление ран и вялотекущих язв (76). Аналогичный эффект был ранее установлен для пептидов, которые образуются вследствие протеолиза других белков, в частности альбумина, миелина, иммуноглобулинов, гемоглобина. В большинстве тканей 30-90% всех известных пептидов являются фрагментами а- или b-субъединиц гемоглобина (50).
-9
Репаративные эффекты GHL проявляются преимущественно в малых концентрациях, в диапазоне на уровне единиц и даже десятых долей наномоля (10М), и могут быть связаны с непосредственным действием пептида на клетки кожи.
Можно предположить, что локальное действие GHL и других подобных пептидов не затрагивает или только опосредованно влияет на иммунные процессы в организме, поскольку по большинству исследованных показателей выраженной иммуностимулирующей активности GHL в условиях кожных ран не выявлено.
Необходимо отметить, что комбинация составляющих GHL аминокислот (глицин + гистидин + лизин) также стимулировала заживление кожных ран. Однако было установлено, что при введении в отдельности, глицин и гистидин не влияли на заживление кожных ран, тогда как введение лизина ускоряло регенерацию. Репаративное действие при введении композиции всех трех аминокислот и лизина подтверждалось морфологическими исследованиями раневых срезов. По сравнению с контрольной группой животных, у крыс, получавших композицию трех отдельных аминокислот, отмечается уменьшение отека в области раны, выражено снижение плотности клеточного инфильтрата за счет меньшего количества лимфоцитов и макрофагов, а так же преобладание зрелых фибробластов над незрелыми, что свидетельствует о более благоприятном течении процессов регенерации. Полученные данные показывают, что эффекты GHL могут быть связаны с лизином, образующимся в результате протеолиза пептида (10). Дальнейшие исследования обнаружили сильное сродство GHL к меди, за счет образования комплекса Gly-His-Lys - Си (GHL-Cu) (62).
При изучении влияния модифицированного ионами меди пептида - GHL-Cu в кожных ранах было установлено, что этот пептид усиливает синтез коллагена I типа и одновременно распад старого коллагена (68). Также было установлено, что GHL-Cu регулирует перестройку структуры кожи (ее ремоделирование), активируя металлопротеиназы - ферменты, отвечающие за разрушение компонентов внеклеточного матрикса дермы. Кроме того, GHL-Cu способствует ускорению роста клеток, миграции в зону раневого повреждения эндотелиальных клеток, а также иммунных факторов, стимулирующих процессы регенерации (61).
Местное введение GHL-Cu в область раны стимулирует синтез коллагена и гликозаминогликанов, в частности дерматансульфата и хондроитинсульфата, а также повышает уровень двух других протеогликанов - биглюкана и декорина, который участвуют в формировании однородных упругих фибрилл на основе коллагена (69).
Одним из важнейших направлений изучения биологического действия пептидов является исследования их проницаемости через неповрежденную кожу и создание последующих разнообразных локальных метаболических эффектов. Прежде всего, это касается дерматологии и косметологии, где целесообразность применения этих веществ для стимуляции регенеративных, репаративных, противовоспалительных процессов неоспорима. С этих позиций важно отметить, что локальность воздействия пептидов выгодно отличается от других биологически активных веществ, таких как иммуномодуляторы, иммуносупрессоры, а также широкой и разнообразной группы гормональных препаратов синтетического или природного происхождения, которые оказывают влияние на иммунную систему и метаболизм всего организма.
В отношении GHL было установлено, что его металл-модифицированная форма GHL-Cu проникает через неповрежденный роговой слой эпидермиса, существенно изменяя метаболизм, в частности, в сторону повышения уровня коллагена до 70%, от исходного (28).
Восстановление функционального состояния поврежденных клеток кожи, в частности, фибробластов, является важнейшим фактором, влияющим на эффективность омолаживающего и репаративного воздействия пептидов. Установлено, что GHL является активным модулятором функционального состояния поврежденных клеток кожи, в частности, фибробластов (60).
Показано влияние GHL на ускорение синтеза коллагена и стимуляцию уровня антиоксидантов в вялотекущих хронических ранах и язвах, вызванных тяжелыми соматическими заболеваниями, в частности сахарным диабетом (58).
Результаты исследования пептидов как веществ с выраженным и целенаправленным биологическим эффектом создают основу их широкого применения в современной косметологии.
В обширных обзорах литературы, посвященной одному из пепидов - GHL выделены наиболее востребованные для практической медицины и косметологии свойства, основные из которых реализуются в: репаративном, антиоксидантном, регенеративном, противовоспалительном, омолаживающем, фотозащитном эффектах (22, 58, 59).
В косметологии применение GHL основано на том, что он подтягивает дряблую кожу и улучшает эластичность, плотность и упругость кожи, уменьшает тонкие линии и морщины, уменьшает фотоповреждения и гиперпигментацию и увеличивает пролиферацию кератиноцитов. Антиоксидантная и противовоспалительная активность GHL делает его применение перспективным в солнцезащитной косметике за счет подавления воспаления и уменьшения окислительного стресса, а также в защите кожи от УФ-индуцированного старения (61).
Известно изобретение относящееся к биотехнологии, согласно которому белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, получают из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных с-х животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности путем ее гомогенизации в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза, неионных детергентов, солюбилизаторов при рН 5,2-8,5. Полученный гомогенат центрифугируют и фильтруют. Белки отделяют на хроматографической колонке с анионообменным носителем. Полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации. Комплекс включает отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа. Комплекс характеризуется максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм. Фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, полинуклеотиды в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый разбавитель (17).
Известна фармацевтическая композиция, состоящая из гормона и пептида, включающего, по меньшей мере, один аминокислотный остаток основного характера и по меньшей мере один аминокислотный остаток кислотного характера, для использования в соответствии с данным изобретением может быть пептидом, содержащим вплоть до 20 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 3 до 6 аминокислотных остатков, таких как 3 или 4 аминокислотных остатка (например, Lys-Gly-Asp-Ser). В соответствии с одним аспектом изобретения аминокислотные остатки основного и кислотного характера более коротких пептидов разделяются 1 или 2 аминокислотными остатками. Пептиды предпочтительно включают остатки встречающихся в природе альфа-аминокислот. Аминокислота (кислоты) может быть L или D аминокислотой (кислотами) или их смесью. "Аминокислотными остатками кислотного характера" являются, например, Glu или Asp, и "аминокислотными остатками основного характера" являются, например, Lys (6).
Биологическая активность олигопептидов обусловливает многообразие их функций. В настоящее время доказано, что многие олигопептиды обладают геропротекторными и адаптогенными свойствами. Пептиды принимают участие в поддержании равновесия между тремя основными клеточными процессами - пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом клеток (25).
Известные свойства высокой проницаемости клеточных биомембран для многих ди- и трипептидов позволяют объяснить высокую биологическую активность и рассматривать возможность их применения для создания мощного целевого эффекта путем активации локального клеточного и сосудистого метаболизма, без существенного влияния на основные системы гомеостаза человека.
Четвертый фармакологически приемлемый АБК или его фармакологически приемлемые производные представляет группу стероидных гормонов, которая включает, по меньшей мере: эстрадиол, кортизол, кортизон, тестостерон, прогестерон.
Из существующего в настоящее время уровня техники известно содержание в моче чрезвычайно широкого спектра биологически активных гормональных веществ. Некоторые из них успешно используются в медицине и косметологии, прежде всего, как гормональные препараты.
Большинство известных способов получения природных гормонов основано на применении мочи животных или человека, в качестве наиболее биологически совместимого исходного продукта.
Практически все способы выделения гормонов требуют предварительной очистки сырья и их концентрации.
Подавляющее большинство известных способов выделения гормонов, используют технические средства, причем в большинстве своем разнообразные хроматографические с применением гелей или адсорбентов, а также ультрафильтрацию, центрифугирование и пр.
В зависимости от поставленных целей при выделении гормональных веществ, приоритет применения того или иного технического средства остается выбором исполнителя, однако общая тенденция к использованию их в технологическом процессе имеет общие критерии, прежде всего такие как: безопасность и чистота конечного продукта, максимально возможная производительность и минимализация этапов технологического процесса, доступность технических средств и комплектующих, а также экономическая эффективность и себестоимость конечного продукта.
Большая часть известных способов разработана с учетом выделения преимущественно стероидных гормонов, как наиболее востребованных в современной медицине и косметологии, а также в силу достаточно больших возможностей получения исходного продукта, в том числе мочи.
Классификация стероидных гормонов выделяет две основные группы, которые отличаются по источнику их происхождения: гормоны коркового слоя надпочечников - кортикостероиды и гормоны половых желез - гонадостероиды. В свою очередь, кортикостероиды также разделяются на две подгруппы. Одна из них представлена глюкокортикоидами, такими как: кортизон, кортизол, деоксикортизол.
Вторую подгруппу составляют минералокортикоиды, такие как: дезоксикортикостерон, кортикостерон, альдостерон.
Гонадостероиды представлены тремя подгруппами, среди которых выделены гестогены, такие как: прегненолон, прогестерон, аллопрегненолон. Вторую подгруппу составляют андрогены: андростендиол, тестестерон, дегидротестестерон. Третью подгруппу представляют эстрогены: эстрон, эстрадиол, эстриол. Кроме этого, к стероидам относят соединения растительного происхождения, обладающие ценными фармакологическими свойствами: стероидные алкалоиды, гликозиды дигиталиса (сердечные гликозиды) и стероидные сапонины.
Несмотря на то, что в настоящее время разработан полный синтез основных стероидных гормонов, востребованный спрос природных гормонов остается чрезвычайно высоким. С этим связаны и определяются интенсивные поиски способов оптимизации получения природных гормонов из растительного и биологического сырья. С этих позиций, моча представляет идеальный, наиболее доступный и постоянно возобновляемый источник практически всех гормонов животного происхождения.
В моче содержится природная смесь гормонов, в частности стероидных гормонов, которая представлена преимущественно в конъюгированной форме, например, в виде натриевой соли полуэфира серной кислоты. Содержание конъюгированных гормонов (рассчитываемое для сульфата эстрогенов) может составлять от 0,3 до 1 мас. % в пересчете на массу сухого вещества.
Известна фармацевтическая композиция, содержащая пролактин и способы ее применения (41). Изобретение относится к композиции, содержащей пептидный гормон гипофиза (пролактин, PRL) отдельно и в комбинации с аскорбиновой кислотой (витамином С) или с аскорбатом, чтобы улучшить внешний вид и восстановить и сохранить кожу и сохранить и восстановить работоспособность физиологических структур, в которых соединительная ткань и ее составляющие играют главную роль. Авторы изобретения делают акцент на то, что предлагается новый способ и композиция, в которых введение соответствующих количеств PRL увеличивает прочность на растяжение кожи при одновременном уменьшении или задержке созревания указанной кожи путем уменьшения общего количества поперечных связей коллагена и доли невосстанавливаемых поперечных связей и уменьшая количество присутствующего коллагена типа III. Этот вывод подразумевает, что лечение ран PRL может ввести в процесс заживления элемент регенерации ткани, что приводит к заживлению ткани и возможности избежать рубцовой гипертрофии.
Недостатком данного изобретения, является то, что заявляемые преимущества не подтверждаются данными его применения на коже человека. В примерах приводятся описания экспериментов на крысах и птицах при введении пролактина овец. К сожалению, и то, что действие этого патента прекращено 2020-03-21, и дальнейшей информации, подтверждающей его применение, нами не найдено.
Известно изобретение, которое относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим гормон роста или производное гормона роста и аминокислоту, выбранную из группы Asp, Ile, Val, Leu или His, или производное гистидина или пептид, включающий по меньшей мере одну аминокислоту основного характера и по меньшей мере одну аминокислоту кислотного характера, и неионогенный детергент, например полисорбат или полоксамер. Изобретение также относится к способу получения этих композиций и к способу лечения, который предусматривает их использование. Согласно описанию фармацевтическая композиция, содержащая гормон роста или производное гормона роста и аминокислоту, выбранную из группы Asp, Ile, Val или Leu, гистидин или производное гистидина, или пептид, включающий по меньшей мере один аминокислотный остаток основного характера и по меньшей мере один аминокислотный остаток кислотного характера, и неионогенный детергент, где количество пептида, или Asp, Il, Val, Leu или His или производного гистидина составляет от около 0.01 до около 10 мг на мг GH, обнаруживает высокую устойчивость против деамидирования и агрегации. Стабильность продукта позволяет хранить и транспортировать его в лиофилизованном состоянии или в виде растворенного препарата (6).
Известна жидкая композиция, содержащая лютеинизирующий гормон или его вариант, его применение, форма представления, способ его приготовления и фармацевтическая композиция (64). Изобретение относится к жидким фармацевтическим составам лютеинизирующего гормона. Композиции предназначена для для одноразового или мультидозового введения через кожу инвазивным способом и предусматривает внутримышечное, внутривенное, артериальное, подкожное введение.
Известно изобретение «Очищенный фолликулостимулирующий гормон, фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции», (2), согласно которому фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), имеющий α-субъединицу гонадотропина и β-субъединицу из 111 аминокислот, выделен из климактерической мочи. ФСГ свободен от лютеинирующего гормона, имеет активность не менее 6200 международных единиц ФСГ на мг лиофилизированного порошка, гликозилирован. Выделенный ФСГ использован в фармацевтической композиции, пригодной для подкожного введения. Показано, что человеческий ФСГ может быть выделен из концентрата постклимактерической мочи с такой степенью чистоты, что является совершенно свободным даже от следовых количеств лютеинизирующего гормона и других мочевых белков.
Известно изобретение, относящееся к биотехнологии, согласно которому белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, получают из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных с-х животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности путем ее гомогенизации в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза, неионных детергентов, солюбилизаторов при рН 5,2-8,5. Полученный гомогенат центрифугируют и фильтруют. Белки отделяют на хроматографической колонке с анионообменным носителем. Полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации. Комплекс включает отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа. Комплекс характеризуется максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм. Фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, полинуклеотиды в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый разбавитель (17).
Обобщая выборочно подобранные выше представленные данные можно утверждать, что имеющиеся в настоящее время доказанные положительные результаты применения гормонов как в индивидуальном порядке, так и в фармацевтических композициях позволяют рассматривать их применение как научно обоснованное и целесообразное.
Пятый из фармакологически приемлемых АБК или его фармакологически приемлемых производных представляет собой группу аминокислот, которая включает, по меньшей мере, цистеин, аспарагин, тирозин, триптофан, гистидин, лизин, метионин, пролин, фенилаланин и треонин. Этот АБК применяется в качестве донора веществ, необходимых для обеспечения стимулированных другими компонентами фармацевтической композиции метаболических процессов в интрадермальных структурах кожи.
Композиция, описанная ниже, эффективна для лечения и ослабления дегенеративных воспалительных процессов в тканях и для ускорения заживления ран, вызванных травмой или хирургическим вмешательством. Для предотвращения воспалительного заболевания или, после того как лечение сняло такое воспалительное состояние, композицию подходящим образом модифицируют путем замены глюкозамина или другого противовоспалительного сахара или аминосахара аминокислотой, обладающей противовоспалительным действием. Эта замена противовоспалительной аминокислоты на глюкозамин или другой противовоспалительный сахар или аминосахар также может быть осуществлена в композициях, используемых для ускорения заживления ран в соответствии с настоящим изобретением. Для этого цистеин является предпочтительным, поскольку он обладает бактерицидным действием против Streptococcus mutans, а также обладает противовоспалительным действием. Другие подходящие аминокислоты включают креатин, креатинин, L-триптофан, валин, аланин, глицин, глутамин, аспарагиновую кислоту и S-метилцистеин, а также сложные эфиры, производные N-бензолсульфонила и аналоги диазометилкетона и хлорметилкетона N их - тозильные производные и тому подобное. Jain et al., Agents and Actions, 11,3 (1981); Gualano et al., Pharmacol. Res Commun., Jul. 1983, 15 (7), p. 683-96; Thomas et al., J. Pharmacol., Feb. 74, 26 (2), p. 151-2; Borne et al., J. Med. Chem., Dec. 72, 15 (12), p. 1325-6; Hall et al., J. Pharm. Sci., Dec. 1980, 69 (12), p. 1451-2; Kwapiszewski et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.), 1979, 27 (6), c. 729-31. Другие подходящие аминокислоты включают креатин, креатинин, L-триптофан, валин, аланин, глицин, глутамин, аспарагиновую кислоту и S-метилцистеин, а также сложные эфиры, производные N-бензолсульфонила и аналоги диазометилкетона и хлорметилкетона N их - тозильные производные и тому подобное. Jain et al., Agents and Actions, 11,3 (1981); Gualano et al., Pharmacol. Res Commun., Jul. 1983, 15 (7), p. 683-96; Thomas et al., J. Pharmacol., Feb. 74, 26 (2), p. 151-2; Borne et al., J. Med. Chem., Dec. 72, 15 (12), p. 1325-6; Hall et al., J. Pharm. Sci., Dec. 1980, 69 (12), p. 1451-2; Kwapiszewski et al., Arch. Immunol. Ther. (цит из Л.Ф. Мейснер. Способ ускоренного заживления ран. Патент США 4772591. 04/16/1986. (14)
Известно изобретение, которое относится к ФК, содержащим аминокислоту, выбранную из группы Asp, Ile, Val, Leu или His, или производное гистидина или пептид, включающий по меньшей мере одну аминокислоту основного характера и по меньшей мере одну аминокислоту кислотного характера, и неионогенный детергент, например полисорбат или полоксамер. Изобретение также относится к способу получения этих композиций и к способу лечения, который предусматривает их использование. Согласно описанию ФК, содержащая гормон роста или производное гормона роста и аминокислоту, выбранную из группы Asp, Ile, Val или Leu, гистидин или производное гистидина, или пептид, включающий по меньшей мере один аминокислотный остаток основного характера и по меньшей мере один аминокислотный остаток кислотного характера, для использования в соответствии с данным изобретением может быть пептидом, содержащим вплоть до 20 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 3 до 6 аминокислотных остатков, таких как 3 или 4 аминокислотных остатка (например, Lys-Gly-Asp-Ser). В соответствии с одним аспектом изобретения аминокислотные остатки основного и кислотного характера более коротких пептидов разделяются 1 или 2 аминокислотными остатками. Пептиды предпочтительно включают остатки встречающихся в природе альфа-аминокислот. Аминокислота (кислоты) может быть L или D аминокислотой (кислотами) или их смесью. "Аминокислотными остатками кислотного характера" являются, например, Glu или Asp, и "аминокислотными остатками основного характера" являются, например, Lys. (6). Входящие в состав пептидов аминокислоты также могут регулировать процессы пролиферации и апоптоза клеток (21). Шестой из фармакологически приемлемых АБК или его фармакологически приемлемых производных представляет собой - аденозил-метионин. Этот компонент применяется на основании доказанного стимулирующего действия на метаболизм в интрадермальных структурах кожи. Адеметионин (SAM) международное название внутренней соли гидроксида (S)-5'-[(3-амино-3-карбоксипропил) метилсульфонио]-5'-дезоксиаденозина, синоним S-аденозил-L-метионин. SAM вовлечен в разнообразные процессы метаболизма организма (5, 35). Установлено, что SAM участвует в реакциях трансметилирования, транссульфирования и аминопропилирования (30). Реакции трансметилирования являются важным этапом синтеза фосфолипидов,прежде всего фосфосфатидилхолина. Все клеточные мембраны имеют типичное строение и преимущественно состоят из фосфолипидов, из которых 80-90% представлены фосфатидилхолином (16). Помимо структурной функции, фосфолипиды участвуют в процессах деления и дифференцировке клетки, стимулируют активность различных ферментных систем. Нарушение транссульфирования приводит к дефициту важнейшего клеточного антиоксиданта глутатиона (75). В свою очередь, недостаток глутатиона, снижает устойчивость клеток к повреждающему действию свободных радикалов, которые постоянно образуются в процессе метаболизма. Кроме того, SAM служит предшественником других тиоловых соединений, таких как цистеин, таурин, коэнзим А. Сульфурирование гидрофобных ЖК с участием таких тиоловых соединений приводит к их модификации, заключающейся в том, что сульфурированные кислоты, в отличие от повреждающего действия гидрофобных ЖК проявляют протекторное действие на фосфолипидную основу мембраны клеток (43). Реакции аминопропилирования с участием SAM, сопровождают синтез полиаминов, которые активно вовлечены в процессы пролиферации и регенерации клеток. Образующиеся полиамины типа путресцина, спермина и спермидина, обладают анальгезирующим и противовоспалительным свойствами (52). Антивозрастное действие SAM обусловлено тем, что трансметилирование приводит к биотрансформации белков и нуклеиновых кислот кожи, которые активируют метаболизм эпидермальных клеток, что стимулирует их регенерацию. Наряду с этим, сочетанное увеличение уровня метилированнных фосфолипидов повышает текучесть мембран клеток, что в совокупности способствует замедлению процесса старения кожи.
-6
-4
Существующие в настоящее время препараты на основе SAM показали высокую эффективность и безопасность в клинических испытаниях. (19, 53). В России субстанция адеметионина не выпускается. Недостатки препаратов на основе SAM проявляются в дороговизне препарата, но главное, в химической нестабильности, за счет постепенного распада действующего вещества, что ограничивает их срок хранения и применения (16). В связи с этим в ФК для стабилизации SAM применяют в форме солей, такие как: цитрат, тартрат, малат или аскорбат, или с сильными минеральными кислотами, или с органическими сульфоновыми кислотами, предпочтительной солью является сульфат п-толуолсульфоната или дисульфат ди-п-толуолсульфоната. Также в качестве стабилизаторов были предложены соли с полианионами и на основе хитозана (44, 26). Замедление старения путем поддержания оптимальной текучести мембран клеток кожи, способствует активации локального метаболизма. Влияние SAM на повышение текучести мембран эпидермальных клеток кожи человека установлено (70). Результаты экспериментов с использованием флуоресцентного маркера показали, что SAM в молярной концентрации от 10 до 10 снижает вязкость мембраны на 10-25%.
Известна ФК для защиты, лечения и восстановления, а также для уменьшения воспаления соединительной ткани у млекопитающих и способ лечения соединительной ткани у млекопитающих путем введения композиции (45). ФК включает SAM и компонент, выбранный из аминосахара или его солей (например, глюкозамина), или гликозаминогликанов, (например, солей хондроитина), или их смесей, или фрагментов. ФК необязательно включает марганец, который способствует выработке соединительной ткани матрикса. Композиция также необязательно включает доноры метила или кофакторы донора метила, такие как витамин В12, витамин В6, фолиевая кислота, диметилглицин или триметилглицин. Недостатком способа является инвазивность его применения, а также обширный компонентный состав, усложняющий и удорожающий процесс изготовления ФК, а также повышающий риск побочных реакций.
В настоящее время известно, что SAM противодействует старению кожи, придавая ей приятный внешний вид и упругость. В этом аспекте известен патент (44), в котором описывается фармацевтическая композиция, включающая SAM, применяемая против старения кожи. В описании раскрывается способ лечения кожи для противодействия старению, который заключается в использовании SAM или одной из его солей в сочетании с косметически или фармацевтически приемлемым носителем. Согласно описанию, в этих композициях SAM предпочтительно используют в форме соли и, если необходимо, смешивают со стабилизатором, таким как маннит, лактоза, мальтоза или циклодекстрин, предпочтительным стабилизатором является маннит. Когда используют смесь SAM с солью-стабилизатором, предпочтительной смесью является адеметионин дисульфат и ди-п-толуолсульфонат- маннит в соотношении от 3:1. Косметические композиции по известному изобретению могут также содержать адъюванты, такие как насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, содержащие от 1 до 18 атомов углерода, которые могут быть или не быть замещены гидроксильной группой, или соль щелочного металла указанных жирных кислот. Недостатком способа является инвазивность его применения, предусматривающая иньекционный путь введения, а также вынужденное добавление разнообразных стабилизаторов SAM, которые снижают биосовмесимость препарата и увеличивают риск развития побочных реакций.
Приведенный выше краткий перечень уже известных и доказанных основных свойств SAM служит убедительным основанием для его практического использования в предлагаемой нами фармацевтической композиции, конкретно для целенаправленного действия на интрадермальные структуры кожи для активации в них метаболических процессов. Предусмотренное применение SAM в течение непродолжительного времени после его выделения, очистки и концентрации, преимущественно в интервале 10-12 часов, способствует существенному сохранению биологической активности и обеспечивает максимальную эффективность его действия без применения экзогенных стабилизаторов.
Аналогом является изобретение, которое относится к фармацевтическим композициям, содержащим гормон роста или производное гормона роста и аминокислоту, выбранную из группы Asp, Ile, Val, Leu или His, или производное гистидина или пептид, включающий по меньшей мере одну аминокислоту основного характера и по меньшей мере одну аминокислоту кислотного характера, и неионогенный детергент, например полисорбат или полоксамер (6). Изобретение также относится к способу получения этих композиций и к способу лечения, который предусматривает их использование. Согласно описанию фармацевтическая композиция, содержащая гормон роста или производное гормона роста и аминокислоту, выбранную из группы Asp, Ile, Val или Leu, гистидин или производное гистидина, или пептид, включающий по меньшей мере один аминокислотный остаток основного характера и по меньшей мере один аминокислотный остаток кислотного характера, и неионогенный детергент, где количество пептида, или Asp, Il, Val, Leu или His или производного гистидина составляет от около 0.01 до около 10 мг на мг GH, обнаруживает высокую устойчивость против деамидирования и агрегации. Стабильность продукта позволяет хранить и транспортировать его в лиофилизованном состоянии или в виде растворенного или повторно растворенного препарата. Пептид, включающий по меньшей мере один аминокислотный остаток основного характера и по меньшей мере один аминокислотный остаток кислотного характера, для использования в соответствии с данным изобретением может быть пептидом, содержащим вплоть до 20 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно от 3 до 6 аминокислотных остатков, таких как 3 или 4 аминокислотных остатка (например, Lys-Gly-Asp-Ser). В соответствии с одним аспектом изобретения аминокислотные остатки основного и кислотного характера более коротких пептидов разделяются 1 или 2 аминокислотными остатками. Пептиды предпочтительно включают остатки встречающихся в природе альфа-аминокислот. Аминокислота (кислоты) может быть L или D аминокислотой (кислотами) или их смесью. "Аминокислотными остатками кислотного характера" являются, например, Glu или Asp, и "аминокислотными остатками основного характера" являются, например, Lys.
Недостатком этого изобретение является, подтвержденная самим автором, нестабильность одного из компонентов композиции - гормона роста, которая приводит к его деградации и агрегации. С целью предотвращения этого процесса в композицию дополнительно вводится стабилизатор, каким является одна или несколько аминокислот, или пептид, а также неионогенный детергент. Подобный состав композиции практически исключает не только ее парентеральное и пероральное применение, но и предполагает сомнительную биосовместимость при местном применении.
Заявляемая ФК на основе АБК и способ ее применения лишены указанных выше недостатков. Техническим решением является новый принцип создания ФК и технологический процесс обработки индивидуальной мочи одного человека путем получения из нее, очистки и концентрации основных АБК для последующего трансдермального применения этому же человеку с лечебной или восстановительной целью.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения раскрываем состав заявляемой фармацевтической композиции и способ ее трансдермального применения.
Индивидуальную мочу, в общем объеме 1 литр направляли на обработку в специализированное производство общества с ограниченной ответственностью «Медико-Биологические Системы», Российская Федерация, г. Ижевск (ООО «МБС»), которое любезно предоставило эту возможность. Обработка мочи включала следующие операции:
1. Предварительная очистка мочи от надмолекулярных соединений, таких как форменные элементы, бактерии, слизь, денатурированные белковые агрегаты, мочевые соли.
2. Получение гормонального концентрата, очистка от нежелательных компонентов, концентрирование.
3. Получение протеогликанов и гликозаминогликанов, включает: выделение, очистку и концентрирование.
4. Получение комплекса жирных кислот, пула мочевых пептидов, комплекса аминокислот, аденилметионина, включает: выделение, очистку, концентрирование.
В конечном итоге в ООО «МБС» получали три высокоочищенные и концентрированные фракции, которые использовали для получения индивидуальной фармацевтической композиции. Состав фракций следующий:
1. Фракция 1 (Ф1) - представлена группой АБК в виде ПГ и ГАГ со степенью очистки, в среднем 99,86±6,2,%. Общий объем фракции - 10 мл. Состав фракции приведен на таблице 2.
Состав фракций в исследуемых образцах исходного продукта показывает присутствие ГАГ в виде хондроитинсульфата С, хондроитинсульфатов А+В (I - фракция), кератансульфата (II - фракция), гепарансульфата, гепарина (III - фракция).
Результаты исследований образцов исходного продукта показывают, что основная часть углеводных компонентов и их производных (аминосахара, ди- и моносахариды, комплексы с глюкуроновой кислотой), характерны для структурных единиц протеогликанов, и это согласуется с данными таблицы №2, отражающими качественный и количественный состав ГАГ.
2. Фракция 2 (Ф2). Общий объем фракции составляет 10 мл, включает следующие группы АБК:
2.1. ЖК представлены преимущественно деканоевой кислотой и ее производными и включают, по меньшей мере: деканоевую, гидроксидеканоевую, оксоундекановую, 3-гидроксидодекановую, тетракозодеканоевую, гидроксипентадеканоевую кислоты. Общее содержание жирных кислот составляет до 87% состава фракции.
Нами проведено изучение количественного содержания и качественного состава ЖК в моче 22 человек. В эту группу вошли 12 мужчин и 10 женщин. Задачами этих исследований было установление стабильности присутствия заявляемых АБК у различных индивидуумов, а также установление границ разброса показателей количественного содержания и соотношения АБК. Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что количественное содержание предлагаемых ЖК и их соотношение между другими АБК композиции отражают естественный физиологический состав ЖК и естественное физиологическое соотношение, присущее каждому в отдельности, индивидууму, у которого они выделены, очищены, сконцентрированы и применены. Установлено, что закономерность соотношения между основными изученными компонентами у всех обследуемых лиц сохраняется стабильно.
2.2. Пептиды (до 11% состава фракции). Состав фракции представлен олигопептидами малого размера (ди-, три и тетрапептидами), при этом при выборочном анализе спектров олигопептидов обнаруживаются только гомомерные гомодетные пептиды, однако в виду присутствия аминокислотных остатков цистеина и ЖК допускается присутствие гетеродетных пептидов. Основную массу пептидов малого размера составляют трипептиды, которые включают, по меньшей мере:
2.2.1. CDY-трипептидид (цистеин-аспарагин-тирозин).
2.2.2. PTF-трипептид с произвольной неустановленной аминокислотной последовательностью (пролин, треонин, фенилаланин).
2.2.3. WTM-трипептид (триптофан-треонин-метионин).
2.2.4. HKM-трипептид (гистидин-лизин-метионин).
2.2.5. GHL-трипептид (глицин-гистидин-лизин).
2.3. Аминокислоты (до 1,8% состава фракции). Состав аминокислот фракции включает, по меньшей мере: цистеин, аспарагин, тирозин, пролин, треонин, фенилаланин, триптофан, гистидин, лизин, метионин, глицин.
2.4. Аденозилметионин (SAM), до 0,2% состава фракции.
Примечание. Результаты исследований, представленных в пп. 2.1., 2.2, 2.3., 2.4. (за исключением п. 2.2.5.) выполнены и любезно предоставлены специализированной лабораторией Фонда перспективных исследований, г. Москва, Российская Федерация.
Биологическая активность выделенных компонентов фракций Ф1 и Ф2 была изучена на мелких лабораторных животных при моделировании острой механической и ожоговой травмы. Результаты экспериментальных исследований показали, что сочетанное применение фракций Ф1 и Ф2 способствует существенному ускорению регенеративных процессов, снижению степени реактивного воспаления, более быстрому, по сравнению с контрольной группой животных, уменьшению размеров раны. Побочные реакции, которые могли сопровождать применение фракций Ф1 Ф2 при субъективном и объективном контроле у экспериментальных животных не выявлены.
Фракция 3. Представляет АБК, в виде аутогормонального концентрата, основу которого составляют стероидные гормоны, включает, по меньшей мере: эстрадиол, прогестерон, тестостерон, кортизол, кортизон.
Предпосылкой и обоснованием к его применению явились данные научно-технической литературы и результаты наших исследований, которые показали присутствие вышеперечисленных гормонов в моче человека, причем их содержание в концентрате, полученном путем вымораживания из мочи увеличивалось в среднем, в 20-40 раз. Эти данные позволили обоснованно получить и использовать гормональный концентрат для создания целенаправленного эффекта за счет комбинации концентрированных гормональных компонентов мочи.
Аутогормональный концентрат для исследований и приготовления ФК из индивидуальной мочи одного человека любезно предоставлялся ООО «Медико-Биологические Системы», г. Ижевск, РФ, в жидком состоянии по 1 мл в стеклянных ампулах. В процессе выделения и обработки аутогормонального концентрата с целью его очистки от нежелательных компонентов, удалялись пигменты, нативные и денатурированные белки, фосфолипиды, липопротеиды высокой и низкой плотности (соответственно ЛПВП и ЛПНП). Количество всех вышеперечисленных нежелательных компонентов после очистки снижалось до нерегистрированных значений. Эти сведения представлены в таблице 3.
Это имеет важное значение для полного устранения риска иммунологических реакций, присущих аналогам и прототипу. Оптическая плотность гормонального концентрата (в % от исходного) после очистки возрастала до 92%. Изучение удельного веса образцов гормонального концентрата показало, что удельный вес гормонального концентрата составляет, в среднем, 033,8±3,7, при значениях исходной мочи, в среднем 1010,9±4,8 (р<0,05).
Для получения сухого остатка полученный гормональный концентрат и исходная моча сушились в сушильном шкафу при 100°С в течение 18 часов для полного удаления влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка проводилось на цифровых весах (GF-400, фирма "A&D Corp. Тайвань"). В итоге из 100 мл гормонального концентрата после сушки было получено 1,251 гр. сухого вещества, что составляет в процентном соотношении - 1,25%. Итоговое взвешивание сухого остатка из 100 мл исходной мочи установило 1,116 гр. сухого остатка, что составляет в процентном отношении 1,2%. Сопоставление результатов взвешивания сухого остатка в пересчете на сопоставимые значения в 1 литр, вес сухого остатка в гормональном концентрате соответствует 0,24 гр. В этом случае, при сравнении с весом сухого остатка исходной мочи, также в пересчете на 1 литр, вес ее сухого остатка составляет 11 гр., что более чем в 45,8 раз больше веса сухого остатка гормонального концентрата, полученного из 1 литра мочи. Проведенные расчеты показывают, что процесс очистки приводит к существенному, практически 46 кратному снижению доли веществ, составляющих нежелательные компоненты сухого остатка.
Результаты изучение веса и состава сухого остатка в исходной моче, прошедшей процесс очистки и гормонального концентрата, представлены в таблице 4.
Основное количество, гормональных веществ, составляющих от 80% до 90% от их общего содержания в исходной моче, находится в аутогормональном концентрате.
Проведенные исследования содержания 4 различных стероидных гормонов в исходной моче, а также в гормональном концентрате показали существенные различия их содержания. Качественный и количественный состав аутогормонального концентрата, представленный на таблице 5 показывает, что содержание, по крайней мере, четырех исследованных гормонов в исходной моче и после выделения гормонального концентрата отличаются в сторону существенного повышения их концентрации, в среднем в 20-40 раз. Уровень эстрадола в аутогормональном концентрате (полученном из обычной мочи) превысил 90000 пг/мл и при исходных значениях 5805,1±324,4 пг/мл был практически в 15 раз выше показателей в исходной моче. Аналогично этому уровень кортизол а при исходных значениях 430,9±26,4 мкг/сутки, в аутогормональном концентрате превысил 8000 мкг/сутки.
Результаты исследования содержания других гормонов, таких как: тестостерон и прогестерон показали, что их концентрация в аутогормональном концентрате также существенно выше таковой, определяемой в исходной моче.
Выделенный и очищенный аутогормональный концентрат из индивидуальной мочи человека любезно предоставлялся ООО «МБС» г. Ижевск, РФ. Срок обработки каждой порции мочи, объемом 1 литр составляет предпочтительно, не более 12 часов. Объем аутогормонального концентрата, полученный из 1 литра индивидуальной мочи составляет, предпочтительно, 1 мл.
Предпочтительный количественный состав АБК в заявляемой фармацевтически приемлемой композиции (с учетом добавленного аутогормонального концентрата в объеме 1 мл) на 20 мл общего объема следующий:
1. АБК1, представляющий ПГ и ГАГ - 49%.
2. АБК 2, представляющий группу жирных кислот - 43,5%.
3. АБК 3, представляющий группу пептидов - 5,5%.
4. АБК 4, представляющий группу аминокислот - 1,8%.
5. АБК 5, представляющий аденозилметионин - 0,2%.
6. АБК 6, представляющий группу стероидных гормонов - 1%.
Соотношение каждого из АБК в каждой пробе индивидуальной мочи различное, и зависят от многих внешних и внутренних факторов, в основном, таких как: индивидуальные генетические особенности метаболизма организма, возраст, пол, качественный и количественный состав пищи, и др.
Существенным отличительным признаком и преимуществом заявляемой композиции является то, что общие закономерности состава индивидуальных АБК мочи, выделенных у одного человека, отражают существующий на момент выделения физиологический баланс этих АБК у этого человека, и являются наиболее приемлемым физиологичным составом для применения этому же человеку в незначительном по срокам временном интервале.
В связи с этим, формирование состава ФК дополнительными биологически активными веществами экзогенного или ксерогенного происхождения не проводили. Использовали только естественный состав, который присутствовал на момент забора в индивидуальной моче конкретного человека без изменений.
Соотношение АБК в ФК формировали с учетом соотношения АБК в исходной моче до очистки. Таким образом, основным критерием АБК являлось их исходное, физиологическое для конкретного человека, соотношение, которое сохраняли в ФК.
Результаты проведенных нами многочисленных и разносторонних исследований качественного состава и количественного соотношения АБК ФК установили высокий разброс индивидуальных показателей большинства АБК, достигающий 37%. В связи с этим признано нецелесообразным создавать ФК в соотношении, одинаковом для всех лиц, независимо от индивидуальных особенностях соотношений АБК у каждого из них. Напротив, оказалось предпочтительным готовить ФК без каких-либо изменений, с максимальным сохранением индивидуального, исходного физиологического состава и соотношения отдельных АБК ФК.
Важно отметить, что несмотря на то, что каждый из заявляемых АБК фармацевтической композиции обладает доказанным биологическим действием, применение только одного компонента не сможет обеспечить заявляемого действия. Это связано с тем, что каждый в отдельности АБК выполняет строго специфические биологические функции. Например, введение только АБК 5 - включающего группу аминокислот, ограничено тем, что он не может самостоятельно пройти через неповрежденный роговой слой кожи без проводника (ЖК) и тем самым реализовать биологический эффект за счет участия в синтезе субстратов, необходимых для активации локального метаболизма в клетках кожи или межклеточном матриксе. Напротив, введение только АБК 2, представляющего группу ЖК также не сможет активировать метаболизм в клетках кожи или межклеточном матриксе, поскольку в фармацевтической композиции он выполняет узкоспецифическую функцию проводника и не предназначен для других целей. Таким образом очевидно, что эффективность биологического действия заявляемой фармацевтически приемлемой композиции может быть реализована только при сочетанном применении всех заявляемых АБК, каждый из которых выполняет узкоспецифические функции, которые обеспечивают реализацию также узкоспецифических, но других функций АБК фармацевтической композиции. Важно добавить, что только совокупность различных функций АБК позволяет получить общий суммарный и потенцирующий эффект от применения состава заявляемой фармацевтической композиции.
Обоснование трансдермального пути применения ФК.
В настоящее время трансдермальный путь доставки (ТДП) лекарственных веществ (ЛВ) находит широкое распространение и является одним из инновационных направлений современной медицинской фармацевтики и косметологии. (63). ТПД обеспечивает альтернативный способ применения препаратов, поскольку традиционные пероральный или парентеральный пути введения менее эффективны, прежде всего, из-за их нестабильности в желудочно-кишечном тракте и вероятности разрушения в детоксикационных системах печени. Трансдермальные способы доставки ЛВ прогрессивно развиваются, поскольку нашли широкое применение из-за простоты употребления, высокой безопасности и эффективности (8). ТДП предусматривает доставку ЛВ через кожу в системный кровоток с терапевтически прогнозируемой дозой и скоростью (37). В большинстве случаев для ТПД используют принцип пассивной миграции ЛВ через кожу, основанный на их диффузии в градиенте концентраций через полупроницаемую мембрану, какой является кожа (15, 23). Процесс ТПД заключается в том, что ЛВ или группа веществ, диффундируют через роговой слой и эпидермис, затем постепенно достигают дермы, где остаются и/или попадают в систему микроциркуляции, которая выносит ЛВ в эндокорпоральный контур кровообращения.
Одним из обязательных условий реализации ТПД является обеспечение эффективного прохождения ЛВ через неповрежденную кожу, конкретно через роговой слой. В случае ТПД это решается применением веществ, обладающими свойствами проводников, которые позволяют свободно проходить через липидную составляющую рогового слоя как самостоятельно, так и в комплексе с другими, как правило, гидрофобными веществами, не обладающими проводниковым эффектом. В большинстве случаев ЛВ, предназначенные для ТПД, объединены в разнообразные композиции, в которых четко предусмотрены функции веществ, обладающих проводниковым эффектом, и веществ, непосредственно оказывающих лечебное действие в локальном сегменте или масштабах организма. Для сохранения максимально возможного временного интервала применения ЛВ разработаны разнообразные варианты их защиты, предусматривающие, прежде всего, устойчивость к преждевременному испарению ЛВ с поверхности кожи или их высыхание. Известно применение с этой целью различных пленкообразных носителей (ПОН) животного, растительного или искусственного происхождения. Каждый из перечисленных групп ПОН в большей или меньшей степени имеет положительные и отрицательные особенности применения, однако основной критерий безопасности и биодоступности в большей степени принадлежит природным веществам, которые являются физиологичными для конкретного индивидуума. На современном состоянии уровня техники известно применение природных ПОН, таких как: коллаген, желатин, эластин, хитозан, а также некоторых растительных веществ в виде пектинов, альгинатов, агар-агара, декстрина. Большое распространение получили ПОН из природных полимеров-коллагена и хитозан, а также их композиции. Известны «Коллахит ФА» на основе коллаген-хитозанового комплекса с включением антисептика фурагина калия и анестетика анилокаина; «Коллахит Ш» - на основе коллаген-хитозанового комплекса с включением антисептика растительного происхождения шиконина (27). В настоящее время имеется множество публикаций о различных составах ТДП, активные составляющие которых представлены группами с различным фармакологическим действием, такими как: гормоны, химиотерапевтические препараты, антимикробные и антисептические средства, иммунномодуляторы, антиоксиданты и др. Несмотря на отсутствие в доступных нам источников сведений о ПГ и ГАГ в качестве ПОН, можно допустить их состоявшееся применение с этой целью, или попытки применения. В этой связи следует отметить, что любой ксерогенный ПОН, особенно выделенный из продуктов переработки беспозвоночных, а также рыб, специфических органов и тканей крупного рогатого скота, даже при их аппликационном применении несут высокий риск ранних и отстроченных местных и общих реакций с иммунодоминирующим компонентом. Это создает необходимость тщательного подбора лекарственных средств для трансдермального применения. В любом случае сведений, о применении ПГ-ГАГ как аутобиокомпонентов (АБГ), выделенных из индивидуальной мочи человека в качестве ПОН для фармацевтической композиции с целью применения этому же человеку, в доступной нам технической литературе или других источников мы не встретили.
ТДП лекарственных веществ имеет несколько преимуществ, из которых основными являются быстрое начало действия ЛВ, отсутствие инактивации или снижения активности лекарственных средств в результате негативного воздействия на них в желудочно-кишечном тракте и печени. Не меньшее значение имеет экономичность, поскольку при локальном применении существенно снижается объем неиспользованного или дезактивированного ЛВ, как правило, не менее чем в 100 раз (18). Это позволяет существенно повысить доступность ТДП и его себестоимость. Недостатки ТДП преимущественно связаны с тем, что для начала реализации действия лекарственного препарата, по сравнению с инъекционными формами, необходимо относительно больше времени. Следует добавить, что формирование эффективной ФК напрямую связано с выбором не менее эффективного и безопасного вещества с проводниковым эффектом, обеспечивающего свободный транспорт ЛВ в кожу.
Из существующего в настоящее время уровня техники известны и изучены важные морфологические и функциональные аспекты кожи. Для обоснования целесообразности формирования ФК конкретного компонентного состава необходимо остановиться на известных сведениях о строении кожи. Известна классификация основных слоев кожи, которая выделяет эпидермис, дерму и подкожно-жировую клетчатку. В свою очередь, эпидермис представляет верхний наружный слой кожи млекопитающих, в том числе человека, состоит из базального, шиповатого, зернистого, блестящего и рогового слоев.
Базальный слой (нижний) образован делящимися клетками призматического эпителия располагается на базальной мембране, среди которых есть пигментные клетки - меланоциты - содержащие пигмент меланин, определяющий цвет кожи. Через базальную мембрану из сосудов дермы осуществляется питание и выведение продуктов метаболизма из эпидермиса. Шиповатый слой образуют клетки с цитоплазматическими шипообразными выростами, которые отделяют клетки друг от друга, создавая межклеточное пространство, необходимое для питания верхних слоев эпидермиса. В шиповатом слое присутствуют клетки Лангерганса, которые выполняют секреторную и иммуномодулирующую функцию за счет синтеза многих, уже изученных факторов. Делящиеся клетки шиповатого и базального слоев составляющие ростковый слой, называют стволовыми клетками кожи. Зернистый слой сравнительно тонкий, состоит из уплощенных, вытянутых и расположенных параллельно поверхности кожи клеток, в цитоплазме которых определяются зерна кератогиалина. Ороговение достигает максимума в зернистом слое, где клетки погибают и превращаются в корнеоциты.
Блестящий слой образуют плоские, безъядерные клетки, заполненные белком элеидином, который является промежуточным продуктом превращения кератогиалина в роговое вещество - кератин. Блестящий слой образует плотный и эффективный гидрофобный барьер с роговым слоем. Роговой слой, наружный, образован многослойным ороговевающим эпителием, состоящим из мертвых уплощенных, прочно связанных друг с другом корнеоцитов. Внутри этих клеток находятся корнеодесмосомы, представляющие высокомолекулярные белковые структуры, которые соединяют кератиноциты в сеть. Присутствующие также немногочисленные длинноцепочечные молекулы, называемые церамидами, обеспечивают прочное связывание липидных слоев, расположенных между корнеоцитами. Эти структуры обеспечивают высокую стабильность свойств компонентов и всего рогового слоя. Метаболизм в роговом слое кожи играет важную роль в биологической защите организма благодаря действию различных ферментов, в том числе гидролаз, которые гидролизуют триглицериды на ди- и моноглицериды, а также глицерин и жирные кислоты. Протеазы, обеспечивают поступление аминокислот для поддержания состава т.н. натурального увлажняющего фактора, который является эффективным естественным поглотителем свободных радикалов.
Для ТДП роговой слой является фокусной поверхностью, где конкретно реализуется проводниковый эффект, от эффективности которого зависит степень насыщения нижележащих слоев кожи лекарственным веществами.
Липофильные вещества проникают в более глубокие слои кожи в основном через внутриклеточный липидный бислой и структуры корнеодесмосом. Наибольшей проникающей способностью обладают липофильные вещества с молекулярной массой до 500 кДа. Например, стероидные гормоны, относящиеся к липофильным соединениям, самостоятельно проникают через роговой слой и оказывают локальное действия на внутриклеточные структуры кожи. Это не относится к аминокислотам, коротким пептидам или церамидам, большая часть которых относится к гидрофобным веществам. С помощью липосом, полученных из фосфатидилхолина осуществляется трансферт лекарственных или косметических средств через эпидермис в более глубокие слои кожи. Аналогичным этому, липофильные нанодисперсии ускоряют проникновение липофильных агентов (24).
Известен патент (20), в котором описана титруемая система трансдермальной доставки лекарства, включающего эффективную дозу антитромботического средства, такого как тирофибан, или фармацевтически приемлемой его соли. Доза доставляемого лекарства пропорциональна размеру применяемого пластыря и достигает 60-85% ингибирования тромбоцитов. Система позволяет осуществлять индивидуализированное лечение пациентов. Также предложены способы лечения различных нарушений, когда желательно ингибирование тромбоцитов. Система трансдермальной доставки может доставлять пациенту лекарство в течение пролонгированного периода времени. Недостатки заключаются в том, фармацевтическая композиция не способна пассивно диффундировать через гибкую основу, для чего дополнительно включен усилитель для просачивания или проникновения в кожу. Помимо этого состав фармацевтической композиции не предназначен для применения в дерматологии или косметологии.
Известны исследования ТДП применения эстрогенов. Показано что чрезкожное введение эстрогенов не связано с повышением риска рака молочной железы, тромбофилии и ассоциировано с гораздо меньшим риском со стороны желудочно-кишечного тракта. Гелевая форма чрескожной ЗГТ не приводит к раздражению кожи, характерному для использования пластырей.
Доказано, что трансдермальная заместительная гормональная терапия моноэстрогенами в климактерическом периоде обладает большим профилем безопасности по сравнению с пероральным приемом при применении в течение длительного времени. При этом эффективность терапии сопоставима. Это позволяет авторам утверждать, что и у женщин репродуктивного возраста, которым нужен короткий курс терапии, лечение эстрогенами путем трансдермального введения будет эффективно и безопасно, как и при длительной терапии (7).
2
Известен патент (12), в котором описано применение фармакологического средства, а именно пластыря для трансдермального введения. Сущность изобретения состоит в том, что трансдермальный пластырь представляет собой матриксную систему и включает подкладочный слой, матриксный слой и светонепроницаемое защитное покрытие при следующем соотношении компонентов; 6,72 мас. % субстанции гипоксена, 15,11 мас. % раствора натрия метабисульфита в пропиленгликоле, из которых 0,067 мас. % приходится на натрия метабисульфит, а также 56,0 мас. % спирта этилового 95% и 22,17 мас. % ПВП K30. Пластырь предназначен для чрескожного введения гипоксена. Площадь пластыря 25 см. Предложенный пластырь, используемый для лечения и профилактики хронических заболеваний, позволяет избежать проблем, связанных с пероральным приемом, улучшает комплаентность пациентов, позволяет длительное время поддерживать постоянство концентрации гипоксена, удобен с целью применения в комбинированной терапии. Недостатки заключаются в том, что способ не рассчитан на применение для дерматологии или косметологии, требует промышленного производства пластыря. Предусматривает использование химически активных веществ.
Известно биологическое действие аутокрови на стимуляцию защитных сил организма человека. В связи с этим известен способ аутогемотерапии, предусматривающий подкожное или внутримышечное введение пациенту собственной крови, взятой из вены. Аутогемотерапия применялась в дерматологической практике в начале 1900-х годов. Классическая аутогемотерапия предполагает подкожное или внутримышечное введение пациенту его собственной свежей венозной крови, не подвергнутой каким-либо воздействиям и не смешанной с какими-либо веществами. Реализация способа заключается в том, что кровь из вены вводят глубоко внутримышечно в верхний наружный квадрант ягодицы.
Наряду с классической аутогемотерапией существуют варианты введения аутокрови, подвергнутой различным химическим или физическим воздействиям. В частности, известно применение предварительного замораживания крови перед введением, облучение рентгеновскими или ультрафиолетовыми лучами. Как разновидность аутогемотерапии применялась аутогемотерапия с предварительно озонированной кровью (31).
Основываясь на известных результатах, указывающих на иммуномодулирующую эффективность после применения озонирования и ультрафиолетовой аутогемотерапии, можно считать, что этот метод имеет определенную клиническую значимость, однако в настоящее время механизм его действия еще недостаточно изучен. Также вероятно, что разнообразные изменения метаболизма, вызываемые озоном и ультрафиолетом, вряд ли будут действовать конкретно только на желаемые молекулы-мишени, что означает существование рисков побочных осложнений (67).
Недостаток способа заключается в том, что дерматологи прекратили использование аутогемотерапии из-за отсутствия каких-либо доказательств ее эффективности. Проведенные систематические обзоры применения аутогемотерапии при таких проявлениях как крапивница и экзема показали, что аутогемотерапия не имеет каких-либо серьезных побочных эффектов, а незначительные побочные эффекты кратковременны и сходны с инъекциями плацебо. Эффективность аутогемотерапии в целом статистически не отличается от инъекций плацебо или отсутствия лечения. Результаты исследований клинической эффективности аутогемотерапии при лечении дерматологических заболеваний, таких как крапивница, акне и экзема дают основания считать, что аутогемотерапия не более эффективна, чем инъекции физиологического раствора (33).
Известен способ мезотерапии. Термин мезотерапия был введен французским врачом Мишелем Пистором, который предложил внутрикожные инъекции прокаина в мезодерму. Заметное улучшение состояния кожи после курса иньекций послужило основанием для широкого применения в косметологии для омоложения кожи. Мезотерапия широко применяется при лечении сосудистой, иммунной и нервной систем, при восстановлении опорно-двигательного аппарата.
Компонентная смесь, вводимая внутрикожно при проведении мезотерапии состоит из витаминов, различных лекарственных средств, органических кислот, экстрактов растительного или животного происхождения, минеральных компонентов, а также микроколичеств гиалуроновой кислоты (1-2 мг одноразово). Действие этого состава направлено на восстановление клеточного матрикса.
Известен способ одной из разновидностей мезотерапии - биоревитализации, который предложил итальянский врач А. Ди Пьетро, обнаруживший стимуляцию репаративных процессов кожи после внутрикожного введения гиалуроновой кислоты. В настоящее время этот метод нашел применение в косметологии для создания эффекта омоложения кожи. Способ предусматривает применение гелей с высоким содержанием гиалуроновой кислоты, которая является активным и основным компонентом вводимого препарата в сочетании с минимальным количеством вспомогательных веществ. Считается, что биоревитализация создает быстрый, но не стойкий эффект гидратации кожи, способствует активации синтеза собственной гиалуроновой кислоты, увеличивая этим объем заполнения межклеточного пространства дермы.
Известен способ плазмолифинга, который предусматривает стимулирование регенерационных процессов в тканях путем иньекционного применения препарата, производимого из собственной крови пациента. Этот метод можно рассматривать как вариант биомезотерапии, при котором для лечения используются собственные биоматериалы пациента. Заявляется, что метод обеспечивает биосовместимость и практически исключает возможность возникновения аллергических реакций. Производителем также утверждается, что плазмолифтинг является наиболее нетоксичным и безопасным способом управления процессом регенерации тканей, основанным исключительно на внутренних ресурсах организма. Согласно описанию, процедура осуществляется путем забора у пациента венозной крови в объеме 10-20 мл. Кровь помещается в пробирку, содержащую антикоагулянт и сепарационный гель. Далее на лабораторной центрифуге кровь делится на фракции: клеточную составляющую (эритроциты, лейкоциты), плазму, богатую тромбоцитами (около 1 млн/мкл), и плазму, бедную тромбоцитами (менее 150 тыс./мкл). В целях безопасности в полученный препарат запрещено вносить любые другие компоненты, витамины или каким-либо другим способом модифицировать его. Кожу обрабатывают антисептиком и в случае гиперчувствительности обезболивают кремом. Методом микроинъекций богатую тромбоцитами плазму вводят внутрь проблемных зон. Плотность уколов составляет примерно один укол на каждые 2 кв. см кожи. В завершение процедуры проблемные участки повторно обрабатывают антисептическим средством. Продолжительность процедуры составляет 40-50 минут. Курс составляет от двух до четырех процедур с перерывами в две-три недели.
Недостатки мезотерапии, биоревитализации и плазмолифтинга:
1. Все три способы инвазивны с сопутствующими возможными осложнениями.
2. Процедура болезненна и вызывает психологический дискомфорт пациентов.
3. Все три способа имеют возрастные ограничения. Возраст пациентов для проведения мезотерапии рекомендован с 25 лет. При проведении биоревитализации с 35 лет.
4. Изменение состояния кожи после мезотерапии происходит достаточно медленно. Морщины, акне и пигментные пятна исчезают постепенно и на срок не более 3 месяцев. Частые рецидивы при акне. Эффект после полного курса процедур наблюдается преимущественно, при ранних морщинах. Для гиперпигментации видимый положительный эффект составляет не более полгода.
5. Мезотерапия проводится аппаратным и ручным методом.
6. Мезотерапия проводится курсом процедур, в среднем это 8-10 сеансов через каждые 5-7 дней. После основного курса назначаются поддерживающие процедуры с периодичностью сначала 2, а потом 1 раз в месяц.
7. Биоревитализация предполагает более глубокое введение препарата, в местах инъекций остаются припухлости.
8. Биоревитализация предполагает 3-4 сеанса процедур с временным интервалом от 6 до 9 месяцев. Эффект в значительной мере связан с конкретным препаратом, его качеством и количеством вводимой гиалуроновой кислоты.
™
Наиболее близкой к заявляемому изобретению, взятая за прототип, является крем-сыворотка Plasmolifting и способ ее применения. В основе крема сыворотки Плазмолифтинг Plasmolifting™ лежит технология CellularFriendlyTech, предусматривающая предварительное получение венозной крови, ее обработку для получения индивидуальной тромбоцитарной аутоплазмы, на основе которой создается композиция из других, дополнительных компонентов. Состав компонентов включает:
1. Короткие пептиды, обеспечивающие проникновение веществ в различные слои кожи и активирующие внеклеточный матрикс.
2. Факторы роста, стимулирующие процессы регенерации тканей.
3. Аминокислоты, которые проникая в дерму стимулируют метаболические процессы и выработку необходимых организму белков.
Согласно рекламному описанию биологическое действие крема-сыворотки способствует: повышению тургора кожи; стимуляции процессов физиологической регенерации; активации клеточного метаболизма; нормализации водного и кислородного обмена; повышению местного иммунитета кожи и устойчивости клеток к воздействию токсинов; регуляции тканевого и клеточного метаболизма.
™
Также согласно рекламному описанию, клинические результаты показывают: сокращение глубины поверхностных морщин; улучшение цвета лица; уменьшение выраженности гиперпигментации; уменьшение выраженности куперозов и снижение гиперчувствительности кожи, обусловленной, в первую очередь, низким иммунным статусом; уменьшение отеков под глазами; устранение сухости губ, характерной для хронических хейлитов; снижение реактивности и зуда кожи. Результатами применения крема Plasmolifting становятся улучшение цвета лица, повышение степени увлажненности, эластичности и тургора тканей, исчезновение мелких рубцов, образовавшихся в результате различных кожных заболеваний, сокращение количества и глубины морщин.
Недостатки вышеописанного прототипа следующие.
1. Несоответствие в описании действия дополнительных компонентов крема. Конкретно, по имеющейся научно-технической информации в настоящее время не доказана возможность самостоятельного проникновения аминокислот через неповрежденные слои кожи.
2. Отсутствие данных об источнике происхождения дополнительных компонентов крема и способе их получения. Это имеет чрезвычайно важное значение, поскольку сведения об источнике происхождения связаны с возможностью запрета их применения в качестве лечебного препарата.
™
3. Применение крема-сыворотки Plasmolifting как лечебного препарата не разрешено на территории РФ, и связано с тем, что крем содержит дополнительные биокомпоненты, применение которых с лечебной целью требует получения Регистрационного удостоверения, которое, в свою очередь, не может быть выдано без проведения обязательных предклинических и клинических испытаний.
4. Инвазивность метода, требующая внутривенного доступа и забора аутоплазмы.
5. Опасность инфицирования при заборе плазмы у пациента, ее обработки вне организма и внутрикожном введении (в случае применения метода плазмолифтинга).
6. Выборочное упоминание о влиянии присутствующих в препарате факторов роста, некорректно, поскольку оно не затрагивает более 150 основных, уже известных биологически активных веществ и факторов, которые выделяются при разрушении тромбоцитов в процессе плазмолифтинга и оказывают, в том числе, и существенное негативное действие (37, 39, 40, 42, 55, 56).
™
™
7. Основным существенным недостатком применения плазмолифтинга или крема - сыворотки Plasmolifting является установленное в настоящее время иммунодепрессивное влияние продуктов разрушенных аутотромбоцитов на состояние иммунной системы организма. В работах (40, 55, 56) показано, что после активации тромбоциты дегранулируют, высвобождая многочисленные факторы и биологически активные липиды в кровоток. Этот процесс, с одной стороны облегчает регенерацию кожи, однако с другой стороны, подавляет опосредованное тромбоцитами иммунное распознавание и элиминацию раковых клеток, что создает возможность их фиксации в эндотелии, способствует их выживанию и распространению, а также развитию вторичных поражений и метастазированию. Существенные доказательства, подтверждающие это мнение, основаны на том, что Р-селектин из гранул разрушенных тромбоцитов опосредует метастазирование опухоли (37, 39, 42). Таким образом, воздействие продуктов искусственного разрушения аутотромбоцитов представляет реальную опасность развития в отдаленном периоде онкологических проявлений и в настоящее время применение плазмолифтинга или крема - сыворотки Plasmolifting представляется нежелательным и опасным до проведения полноценных разносторонних исследований.
Анализ приведенных выше данных позволяет сделать вывод о несомненной перспективности и потенциально высокой эффективности ТДП для создания целенаправленного локального лечебного или косметического эффекта. Практически все существующие способы применения ТДП основаны на использовании химических веществ не биологического происхождения для создания проводникового и лечебного эффекта. Сведений о безопасном применении АБК для ТДП в доступной нам патентной и технической литературе не выявлено. Между тем, по нашему мнению, использование АБК выводит ТДП на качественно новый уровень применения этих веществ или группы веществ, для существенного повышения уровня метаболизма в конкретных структурах кожи с лечебной или косметической целью.
Заявляемый способ трансдермального применения фармацевтической композиции на основе АБК заключается в следующем.
Индивидуальная моча человека, полученная не более чем в течение 12 часов с момента забора, передается на обработку в специализированное производства, где она очищается от мочевых солей, средне и крупномолекулярных нежелательных веществ, а также надмолекулярных соединений, включающих бактерии, форменные элементы, слизь, агрегаты денатурированных белков и др. Перед обработкой отбирается не менее 10 мл мочи для определения основных стероидных гормонов. После этого моча обрабатывается для осаждения основных заявляемых компонентов, таких как ПГ-ГАГ, ЖК, пептиды, стероидные гормоны, аденозилметионин, аминокислоты. Эти компоненты очищаются, концентрируются и проходят стерилизацию. Компоненты после заключительных операций фасуются в виде геля в стерильную тару, конкретно в стеклянные пенициллиновые флаконы объемом не менее 40 мл. Допускается для фасовки другая одноразовая тара, которая обеспечивает стерильность, безопасность хранения и транспортировки, а также удобная в применении. Готовые компоненты фасуются в естественном, физиологическом соотношении (как в исходной моче) и в следующем составе: ПГ-ГАГ, ЖК, пептиды, аминокислоты и аденозилметионин, а также аутогормональный концентрат в количестве 5 мл (из 1 л. исходной мочи). Флакон герметически упаковывается, маркируется и выдается заказчику. В лице заказчика предполагается конкретный человек, из мочи которого получены АБК. Этому человеку, эти АБК будут применены непосредственно только ему с лечебной или косметической целью.
Лечебная или косметическая процедура проводится не более чем в течение 12 часов с момента окончательного изготовления ФК. Для изготовленной индивидуальной ФК из АБК предусматривается ТДП ее применения, предпочтительно в специализированном учреждении, предназначенном для выполнения и применения этого способа. Также предпочтительным является дополнительное использование технических средств, способствующих активному процессу ТДП, путем применения ультразвуковых, лазерных, световых или других безопасных источников для стимуляции или потенцирования трансдермального переноса веществ. Процедура ТДП выполняется предпочтительно с интервалом 5 дней, предпочтительно курсом из 5 процедур.
Существенными отличительными признаками заявляемого изобретения являются:
1. Применение биологически активных АБК с доказанным действием в соотношении и составе, которые являются индивидуальными и физиологическими для каждого конкретно человека, из мочи которого они выделены, очищены, концентрированы и введены трансдермально тому же человеку с лечебной или косметической целью.
2. Применение высокоочищенных АБК.
3. Применение концентрированных АБК.
4. Применение мочевых очищенных, концентрированых аутопептидов для стимуляции метаболизма в дерме.
5. Применение очищенных, концентрированых стероидных аутогормонов для стимуляции метаболизма в дерме.
6. Применение ФК в различной комбинации для получения максимального лечебного или восстановительного эффекта и одновременного предотвращения риска нежелательного эффекта путем уменьшения концентрации или полного удаления из фармацевтической композиции одного или нескольких АБК.
7. Полное исключение риска аутоиммуносенсибилизации, иммуносупрессии.
8. Полное исключение риска осложнений, вызванных бактериальной флорой и (или) вирусной инфекцией.
9. Безинвазивность способа за счет трансдермального применения АБК ФК к требующим коррекции внутренним структурам кожи для получения максимального лечебного или восстановительного эффекта.
10. Получение сочетанного и потенцирующего эффекта при применении АБК заявляемой ФК.
11. Снижение возрастного барьера применения способа.
12. Безопасность и практически постоянная доступность исходного сырья для получения АБК ФК.
Биоадаптивная ФК на основе естественных ПГ-ГАГ, олигопептидов, аденозилметионина, аутогормонов, аминокислот и ЖК способствует регенерации кожи, обновлению тканей путем активации метаболизма клеток кожи и экстрацеллюлярного матрикса, а также микрососудов.
Трансдермальное применение ФК предусмотрено путем использования АБК, одни из которых являются естественными проводниками биологически активных АБК через неповрежденный роговой слой кожи, а вторые непосредственно влияют на метаболизм клеток кожи и межклеточный матрикс.
Исходя из состава компонентов ФК и известных свойств каждого из ее компонентов, ее применение показано при разнообразных нарушениях метаболизма кожи и тканей, и будет эффективно для любого типа кожи, а также для таких типов кожи как: жирная кожа, чувствительная кожа, кожа век, увядающая кожа, комбинированная кожа, сухая кожа, нормальная кожа, для кожи тела, проблемная кожа.
Примеры реализации изобретения
Пример 1.
Женщина М., 52 лет обратилась с просьбой выделить из ее мочи АБК, очистить и концентрировать их и передать ей назад в стерильном виде. Моча в количестве 1 литр, в замороженном состоянии до -10С принята и передана в специализированное предприятие для выполнения заказа. После обработки мочи, включающей этапы предварительной очистки и дальнейшего фракционирования в асептических условиях, с целью выделения АБК был получен их состав в следующем процентном соотношении: ПГ-ГАГ (51%); ЖК, представленные преимущественно деканоевой кислотой и ее производными, включающие, по меньшей мере: деканоевую, гидроксидеканоевую, оксоундекановую, 3-гидроксидодекановую, тетракозодеканоевую, гидроксипентадеканоевую кислоты, общее содержание которых составило (38%); олигопептиды, включающие, по меньшей мере, трипептиды с аминокислотной последовательностью: CDY, WTM, HKM, PTF и GHL (9%); аденозинлметионин (0,1%); аминокислоты, включающие, по меньшей мере: цистеин, аспарагин, тирозин, пролин, треонин, фенилаланин, триптофан, гистидин, лизин, метионин, глицин (1,9%). Дополнительно к этим АБК добавлен аутогормональный концентрат, количество которого составило 1% от общего объема вышеперечисленных АБК. В самом аутогормональном концентрате количественный состав индивидуальных гормонов представлен на таблице 6 был следующий:
Консистенция выделенных АБК отличалась между собой по физическим свойствам, а именно:
1. ПГ-ГАГ представляли концентрированный полупрозрачный, с матовым оттенком биогель, без запаха.
2. ЖК, олигопептиды, аминокислоты и аденозилметионин представляли пастообразный продукт белого цвета, без запаха.
3. Аутогормональный концентрат представлял собой жидкость светло-коричневого цвета со слабым запахом этилового спирта.
После смешивания всех АБК, ФК по консистенции представляла концентрированный, густой биогель белого цвета с кремовым, слегка желтоватым оттенком без запаха, причем значение рН указанной ФК находится в диапазоне 6-5,7. Выделенный из индивидуальной мочи очищенный и концентрированный конечный продукт в асептических условия, в количестве 20 гр. расфасован в стерильную стеклянную емкость объемом 50 мл и передан заказчику. Время, затраченное на приготовление ФК из индивидуальной мочи по индивидуальному заказу составило 24 часа. В дальнейшем, ж-на М., обратилась в специализированный косметический салон с просьбой провести трансдермальное введение предоставленной от нее индивидуальной ФК, из ее же АБК. В косметическом салоне произведено трансдермальное введение АБК на коже лица и шеи равномерным слоем с экспозицией в течение 30 минут и последующим смывом остатков АБК теплой водой и высушиванием лица феном без применения салфеток. Всего было проведено 4 процедуры в течение 4 последующих дней. В вышеописанном примере трансдермальное введение АБК было пассивным, без применения физических способов, ускоряющих процесс их доставки через роговой слой в более глубокие слои кожи. ФК нанесенная на кожу, легко распределяется, разжижаясь, не вызывая ощущения ни клейкости, ни скатывания.
Субъективный опрос непосредственно в ходе и после проведения трансдермального введения АБК не выявил каких-либо жалоб, указывающих на дискомфорт или нежелательные ощущения в местах проведения процедуры. Сравнительное сопоставление данных осмотра кожи лица и шеи до и через 14 дней после применения ФК из АБК показало улучшение цвета лица, повышение степени увлажненности. Заметно уменьшилась гиперпигментация, улучшилась эластичность, объемная плотность и упругость кожи, уменьшилось количество тонких линий и глубина мелких морщин. На шее более подтянута кожа.
Пример 2.
Применение АБК ФК для стимуляции коллаген-синтетической функции фибробластов кожи крыс. Цель исследований состояла в изучении соотношения коллагена I и III типа в коже крыс без и после трансдермального применения компонентов ФК.
Материал и методы. Исследуемые группы из 24 животных разделены на 2 группы: 12 крыс составили первую, контрольную группу. Остальных 12 крыс объединили в группу, которым произведено трансдермальное применение ФК. Для этого у фиксированных животных на предварительно выбритую лобно-затылочную область головы в диаметре 20 мм наносилась ФК в заявляемом составе и соотношении компонентов в виде 1 мл концентрированного геля. После экспозиции геля в течение 30 минут, гель смывали теплым физиологическим раствором и животных освобождали от фиксации. Аналогично этому процедуры повторяли на 2, 3, 4 и 5 дни. Биопсию проводили на 7 сутки после начала применения ФК.
Исследование соотношения коллагена I и III типов в коже крыс обеих групп проведено с использованием поляризационной микроскопии. Срезы окрашивали красителем PicroSirius Red с последующим использованием поляризационного микроскопа Altami Polar 2 при увеличении ×250 и ×400. Микропрепараты фотографировали с использованием цифровой окулярной камеры Altami 3 Мрх. Определение соотношения I и III типов коллагена (CI/III ТК) проводили на основании известных данных о различиях в восприятии окраски, конкретно для коллагена I типа красного цвета, а для коллагена III типа - зеленого цвета. Для объективной оценки CI/III ТК использовали ПО комплекса Altami Studio 3.0 и ImageJ 1,47а. Полученные абсолютные значения красного и зеленого цветов гистограммы переводилим в относительные значения.
Статистический анализ выполняли с использованием программы Microsoft Excel 2010. После проверки выборки на нормальность распределения вычислялась средняя арифметическая величина (М) и стандартное отклонение средней арифметической (m). Данные выражали как М±m с указанием количества экспериментов (N). Проверка достоверности различий осуществлялась по критерию Стьюдента (t-критерий). Математическая обработка морфометрических данных гистологических срезов проводилась с использованием метода непараметрической статистики (U-критерий Манна-Уитни для малых выборок).
При исследовании гистологических препаратов кожи у крыс 1 группы было установлено, что среднее содержание коллагена I и III типов составляет соответственно 53,74±1,64% и 46,26±1,72%. CI/III ТК в коже у крыс этой группы составило 1,16±0,1. Исследование коллагена I и III типов в коже у животных во второй группе установило значения соответственно 69,3±1,54% и 39,7±1,52%, a CI/III ТК - 2,25±0,27. Результаты исследований показали, что применение компонентов ФК в заявляемом соотношении и составе оказывают стимулирующее действие на коллаген-синтезирующую функцию фибробластов кожи крыс, что проявляется в существенном изменении СМИ ТК за счет увеличения коллагена I типа (р<0,05). При микроскопии во второй группе отмечены тонкие, немногочисленные пучки коллагена вдоль мембран фибробластов с преобладанием окрашенных волокон коллагена I типа. При этом форма мембран фибробластов и количество зубцов на них не изменилось. В контрольной группе этих особенностей не отмечено.
Предполагаемое изобретение было объяснено в приведенном выше описании в соответствии с приведенными примерами, не ограничивающими объем настоящего изобретения. Следует считать, что все варианты, включающие приведенную ниже формулу изобретения, находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Литература
1. Б. Альбертс, Д. Брей, Д. Льюис, М. Рэфф, К. Робертс, Д. Уотсон. Молекулярная биология клетки. Т. 3, издат. Мир, 1978, 297 с.
2. Д. Арпай, С. Серани, А. Сирна, С. Вилла. Очищенный фолликулостимулиющий гормон, фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции Pat. US 205012 С2. 1987-06-26.
3. Б.И. Асатуров. Способ получения протеогликана. Патент RU пр. от 09 декабря 2015 г.
4. Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия. 3 издание. Издат. Медицина, 2008, 704 с.
5. А.О. Буеверов. Адеметионин: биологические функции и терапевтические эффекты // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2001. - №3. - С. 16-20.
6. С. Бъерн, Х.Х. Серенсен, П. Лангбалле, С.М. Ларсен, К. Эббехей, Б.Л. Хансен (DK). Фармацевтическая композиция, содержащая гормон роста, аминокислоту и неионогенный детергент. Патент RU 2236250. 24.04.1997.
7. О.А. Громова, И.Ю. Торшин, О.А. Лиманова, А.Н. Громов, Н.В. Керимкулова. Сравнительное исследование доказательной базы эффективности и безопасности применения пероральной и трансдермальной форм заместительной гормональной терапии эстрогенами у женщин в различные возрастные периоды. Проблемы репродукции. 2013, 6, с. 86-96.
8. Б.А. Жубанов, Е.О. Батырбеков, P.M. Искаков. Полимерные материалы с лечебным действием. - Алматы: Комплекс, 2000. - 220 с.
9. Д.А. Кассирова. Применение крема с Дерма-Мембранной Структурой при атопическом дерматите. Регулярные выпуски «РМЖ» №12 от 03.06.2010 стр. 777. Рубрика: Дерматология.
10. А.А. Курцева, М.Ю. Смахтин, А.В. Иванов, А.В. Беседин. Влияние аминокислот, составляющих пептид глицил-гистидил-лизин, на регенерацию кожных ран и функцию нейтрофилов. // Курский научно-практический вестник. Человек и его здоровье. - 2008. - №3. - С. 5-10.
11. В.В. Лелевич. Биологическая химия. / Изд. ГрГМУ. 2009, с. 71.
12. С.О. Лосенкова, Э.Ф. Степанова, В.Е. Новиков. Трансдермальный пластырь. Патент RU 2445084. 2010.04.07.
13. Й. Маеда, К. Окубо, Д. Асари, А. Окадзаки, Т. Сисидо, и др. Композиция вакцины для трансдермального или трансмукузального введения. Патент RU 2687026 C2 от 2013.02.05.
14. Л.Ф. Мейснер. Способ ускоренного заживления ран. Патент США 4772591. 04/16/1986.
15. П.Г. Мизина и др. Введение лекарственных веществ через кожу-достижения и перспективы (обзор) // ВЕСТНИК ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. - с. 176-183.
16. А.В. Морозов. Разработка способа получения двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой. Журнал «Фундаментальные исследования». - 2013. - №11 (часть 6) - С. 1203-1206.
17. А.Б. Назаренко, М.А. Соколов. Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе. Pat. WO 2012166006 А9. 2011-05-30.
18. Осиков М.В., Симонян Е.В., Григорьева Г.П., Саедгалина О.Т., Ножкина Н.Н. Трансдермальные гидроколлоидные покрытия - перспективное направление локальной иммунокоррекции при термической травме. // Фундаментальные исследования. - 2014. - №10-8. - С. 1632-1639.
19. С.Д. Подымова. Адеметионин: фармакологические эффекты и клиническое применение препарата // Рос. мед. жур - 2010. - Т. 18, №13. - С. 800-806.
20. Д.Р. Томас, Д.Д. Раймер, А.Д. Фризен. Трансдермальный фармацевтический препарат и введение тирофибана. Патент RU 2539398 C2.
21. Н.И. Чалисова, Лесняк В.В., Ноздрачев А.Д. Протекторное влияние аминокислот и олигопептидов при сочетанном действии с цитостатиком в культуре лимфоидной ткани // Докл. АН. 2009. Т. 434. №5. С. 57-61.
22. О.И. Чернышева, И.И. Бобынцев. Биологические эффекты пептида GLY-HIS-LYS. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №11 (часть 4) - С. 688-692.
23. Фостер Линн. Нанотехнологии. Наука, инновации и возможности. 2006. ISBN: 978-5-94836-161-1, 0-13-192756-6.
24. В.Х. Хавинсон, Линькова Н.С., Умнов Р.С., Червякова Н.А. Пептидергическая регуляция функций нервной и иммунной системы при старении // Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. 2013. Т. 8. №2. С. 697-698.
25. Р.Ф. Хеберт. Стабильные соли S-аденозил-1-метионина. Pat. US 6635615. от 1999.11.17.
26. В.И. Чуешов. Промышленная технология лекарств. Т 2 - X.: МТК - Книга; Издательство НФАУ, 2002. - 716 с.
27. С.Г. Шаповалов. Современные раневые покрытия в комбустиологии // ФАРМиндекс-Практик. - 2005. - Вып. 8. - С. 38-46.
28. А.А. Abdulghani, S. Sherr, S. Shirin, G. Solodkina, E.M. Tapia, A.B. Gottlieb. Effects of topical creams containing vitamin C, a copper-binding peptide cream and melatonin compared with tretinoin on the ultrastructure of normal skin - A pilot clinical, histologic, and ultrastructural study. Disease Manag Clin Outcomes. 1998. - Vol. 1. - P. 136-141.
29. M.R. Ahmed, S.H. Basha, D. Gopinath, R. Muthusamy, R. Jayakumar. Initial upregulation of growth factors and inflammatory mediators during nerve regeneration in the presence of cell adhesive peptide-incorporated collagen tubes. Journal of the Peripheral Nervous System. - 2005. - Vol. 10. - №1. - P. 17-30.
30. G. Bianci. et al. Glutation kinetics in normal man and in patients with liver cirrhosis // J. Hepatol. - 1997. - Vol. 26, №3. - P. 606-613.
31. B. Biedunkiewicz, L. Tylicki, T. Nieweglowski, S. Burakowski, B. Rutkowski. Clinical efficacy of ozonated autohemotherapy in hemodialyzed patients with intermittent claudication: an oxygen-controlled study // The International Journal of Artificial Organs. - 2004-1. - T. 27, v. 1. - P. 29-34.
32. De Bold AJ, Flynn TG. Cardionatrin I - a novel heart peptide with potent diuretic and natriuretic properties. Life Sci. 1983; 33(3):97-100.
33. D.D. Brewer. A Systematic Review of Autohemotherapy as a Treatment for Urticaria and Eczema. // Cureus. - 2014-12-09. - T. 6, v. 12.
34. D. Bruegger, Jacob M, Rehm M, Loetsch M, Welsch U, Conzen P, Becker BF. Atrial natriuretic peptide induces shedding of endothelial glycocalyx in coronary vascular bed of guinea pig hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 289(5):H1993-H1999. doi: 10.1152/ajpheart.00218.2005/
35. D.J. Carpenter. St. John's wort and S-adenosyl methionine as «natural» alternatives to conventional antidepressants in the era of the suicidality boxed warning: what is the evidence for clinically relevant benefit? / // Altem. Med. Rev. - 2011. - Vol. 16, №1. - P. 17-39.
36. Cataliotti A, Giordano M, De Pascale E, Giordano G, Castellino P, Jougasaki M, Costello LC, Boerrigter G, Tsuruda T, Belluardo P, Lee SC, Huntley B. CNP production in the kidney and effects of protein intake restriction in nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 2002;283(3):F464-F472. doi: 10.1152/ajprenal.003 72.2001/
37. F. Cilurzo, Gennari CG, Minghetti P. Adhesive properties: a critical issue in transdermal patch development // Expert Opin Drug Deliv. - 2012. - №9(1). - P. 33-45.
38. David G. Menter, Stephanie C. Tucker, Scott Kopetz, Anil K. Sood, John D. Crissman, and Kenneth V. Honn. Platelets and cancer: a casual or causal relationship: revisited. Cancer Metastasis Rev. Author manuscript; available in PMC 2014 Oct 15. Published in final edited form as: Cancer Metastasis Rev. 2014. Mar; 33(1): 231-269. doi: PMCID: PMC4186918 NIHMSID: NIHMS631259 PMID: 24696047.
39. F. Dammacco, Vacca A, Procaccio P, Ria R, Marech I, Racanelli V. Cancer-related coagulopathy (Trousseau's syndrome): review of the literature and experience of a single center of internal medicine. Clinical and Experimental Medicine. 2013;13(2):85-97.
40. A.K. Dilly, Ekambaram P, Guo Y, Cai Y, Tucker SC, Fridman R, et al. Platelet-type 12-lipoxygenase induces MMP9 expression and cellular invasion via activation of PI3K/Akt/NF-kappaB. International Journal of Cancer. 2013; 133(8): 1784-1791.
41. G. Goodman. Pharmaceutical compositions containing prolactin and methods for the use thereof. Pat. US 5162303. 10.04.1990.
42. McEver RP. Selectin-carbohydrate interactions during inflammation and metastasis. Glycoconjugate Journal. 1997;14(5):585-591.
43. S. Ian Gan, M. de Jongh, M. Kapla. Modafmil in the treatment of debilitating fatigue in primary biliary cirrhosis: a clinical experience // Dig. Dis. Sci. - 2009. - Vol. 54, №10. - P. 2242-2246.
44. G. Le Fur. M. Bousquet, E. Crisafulli, M. Sabadie. Composition and use of ademetionine against ageing of the skin. Pat. US 4956173A. Prior. 1987-11-25.
45. R.-M. Handjani, A. Ribie. Composition for the cosmetic and/or pharmaceutical treatment of the upper layers of the epidermis by topical application to the skin, and corresponding preparation process. Pat. US 6203802B. 1994-02-14.
46. R.W. Henderson. Глюкозамин, хондроитин и марганцевая композиция для защиты и восстановления соединительной ткани. Патент США 5364845. Приор, от 03.31.1993.
47. R.W. Henderson, Т. Hammad. Aminosugar, glycosaminoglycan, and S-adenosylmethionine composition for the treatment and repair of connective tissue. US Patent 6271213 от 02.07.1997.
48. Т. Igaki, Itoh H, Suga SI, Hama N, Ogawa Y, Komatsu Y, Yamashita J, Doi K, Chun TH, Nakao K. Effects of intravenously administered C-type natriuretic peptide in humans: comparison with atrial natriuretic peptide. Hypertens Res. 1998;21(1):7-13.
49. N. Ihohara, L.Ding, S.Chen, G.Nunez. Hara-Kiri? A novel regulator of cell death, encodes a protein that activates apoptosis and interacts selectively with survival-promoting proteins Bcl-2 and Bcl-xl//EMBO J.-1997. - Vol. 16. - P. 1686-1694.
50. V.T. Ivanov, A.A. Karelin, O. N. Yatskin. Generation of peptides by human erythrocytes: Facts and artifacts. Biopolymers. 2005, 80, 332-346.
51. M. Kuhn. Endothelial actions of atrial and B-type natriuretic peptides. Br J Pharmacol. 2012;166(2):522-531.
52. C.S. Lieber. S-Adenosylmethionine: molecular, biological, and clinical aspects - an introduction / C.S. Lieber, L. Packer // Am. J. Clin. Nutr. - 2002. - Vol. 76, №5. - P. 1148-1150-1989. - Vol. 24, №4. - P. 407-415.
53. J.M. Mato et al. S-adenosylmethionine in alcoholic liver cirrhosis: a randomized, placebo-controlled, double-blind, multicenter clinical trial // J. Hepatol. - 1999. - Vol. 30, №3. - P. 1081-1089.
54. M. Kuhn. Endothelial actions of atrial and B-type natriuretic peptides. Br J Pharmacol. 2012;166(2):522-531.
55. V. Kyriazi, Theodoulou E. Assessing the risk and prognosis of thrombotic complications in cancer patients. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2013;137(9):1286-1295.
56. F. Lindenmeyer, Legrand Y, Menashi S. Upregulation of MMP-9 expression in MDA-MB231 tumor cells by platelet granular membrane. FEBS Letters. 1997;418(1-2): 19-22.
57. L. Pickart. A tripepeptide in human serum that promotes the growth of hepatoma cells and the survival of normal hepatocytes. San Francisco, Calif, USA: University of California; 1973. Ph.D. thesis. P. 143.
58. L. Pickart. The human tripeptide GHK (Glycyl-L-Histidyl-L-Lysine), the copper switch and the treatment of the degenerative conditions of aging. In Anti-Aging Therapeutics Volume 11, Ed. By Klatz R. and Goldman R. Chicago, IL, USA: American Academy of Medicine, 2009. - P. 301-302.
59. L. Pickart. The human tri-peptide GHK and tissue remodeling. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. - 2008. - Vol. 19. - №8. - P. 969-988.
60. L. Pickart, J.H. Freedman, W.J. Loker. Growth-modulating plasma tripeptide may function by facilating copper uptake into cells. Nature. - 1980. - Vol. 288. - №5792. - P. 715-717.
61. L. Pickart, J.M. Vasquez-Soltero, A. Margolina. GHK Peptide as a Natural Modulator of Multiple Cellular Pathways in Skin Regeneration. Biomed Res Int. 2015; 2015:648108. doi: 10.1155/2015/648108. Epub 2015 Jul 7.
62. L. Pickart, A. Margolina. Regenerative and Protective Actions of the GHK-Cu Peptide in the Light of the New Gene Data. Biomed Res Int. 2015;2015:648108. doi: 10.1155/2015/648108. Epub 2015 Jul 7.
63. Ritesh Kumar and Anil Philip. Modified Transdermal Technologies: Breaking the Barriers of Drug Permeation via the Skin // Tropical Journal of Pharmaceutical Research. - March 2007. - №6 (1). - P. 633-644.
64. A. Del Rio, F. Samaritani, J. Richard, R.  contendo  luteinizante (lh) ou uma variante do mesmo, seu uso, sua forma de , processo para a sua  Pat. BRP10818324B1.2007-11-01.
65. A.S. Rocha, Kudo LH. Atrial peptide and cGMP effects on NaCl transport in inner medullary collecting duct. Am J Physiol. 1990;259(2 Pt 2):F258-F268.
66. K.  J W Fischer. Role of the Extracellular Matrix in Extrinsic Skin Aging. Hautarzt, 62 (8), 591-7 Aug 2011. PMID: 21681543. DOI: 10.1007/s00105-011-2133-x.
67. A. Sheikhi, M. Azarbeig, H. Karimi. Autohemotherapy in chronic urticaria: What could be the autoreactive factors and curative mechanisms? // Annals of Dermatology. - 2014-8. - T. 26, v.4. - P. 526-527.
68.  Y. Wegrowski, Y. Bontemps, F.X. Maquart. Expression of glycosaminoglycans and small proteoglycans in wounds: modulation by the tripeptide-copper complex glycyl-L-Histidyl-L-lysine-Cu(2+).J Invest Dermatol. - 2000. - Vol. 115. - №6. - P. 962-968.
69.  A., Emonard H., Hornebeck W., Maquart F.X. The tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ stimulates matrix metalloproteinase-2 expression by fibroblast cultures. Life Sci. - 2000. - Vol. 22. - №67. - P. 2257-2265.
70. Shnitzkym et al. J. Biol. Chem. 1974, 249, 2652-2657.
71. T. Sudoh, Minamino N, Kangawa K, Matsuo H. C-type natriuretic peptide (CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun. 1990;168(2):863-870.
72. Y. Suematsu, Miura SI, Goto M, Matsuo Y, Arimura T, Kuwano T, Imaizumi S, Iwata A, Yahiro E, Saku K. LCZ696, an angiotensin receptor-neprilysin inhibitor, improves cardiac function with the attenuation of fibrosis in heart failure with reduced ejection fraction in streptozotocin-induced diabetic mice. Eur J Heart Fail. 2016. doi: 10.1002/ejhf.47419.
73. V.L. Tucker, Simanonok KE, Renkin EM. Tissue-specific effects of physiological ANP infusion on blood-tissue albumin transport. Am J Physiol. 1992;263(4 Pt 2):R945-R953.
74. S. Ueda, Minamino N, Aburaya M, Kangawa K, Matsukura S, Matsuo H. Distribution and characterization of immunoreactive porcine C-type natriuretic peptide. Biochem Biophys Res Commun. 1991; 175(3):759-767.
75. G. Vendemiale. Effects of oral S-adenosyl-L-methionine on hepatic glutathione in patients with liver disease / G. Vendemiale // Scand. J. Gastroenterol.
76. Y. Wegrowski., F.X. Maquart, J.P. Borel. Stimulation of sulfated glycosaminoglycan synthesis by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+. Life Sci. - 1992. - Vol. 51. - №13. - P. 1049-1056.