СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ
COMPOUNDS AND COMPOSITIONS AS PROTEIN KINASE INHIBITORS

Перекрестные ссылки на родственные заявки
В данной заявке испрашивается приоритет в связи с временной заявкой на выдачу патента США №60/647606, зарегистрированной 25 января 2005 г. Указанная заявка включена в данное описание в полном объеме в качестве ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Область техники
Настоящее изобретение относится к новому классу соединений, фармацевтическим композициям, включающим такие соединения, и способам использования таких соединений для лечения или профилактики заболеваний или нарушений, связанных с аномальной или нерегулируемой активностью киназы, прежде всего заболеваний или нарушений, связанных с аномальной активацией киназ Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, Flt3 и b-Raf.
Предпосылки создания изобретения
Протеинкиназы относятся к многочисленному семейству белков, которые играют главную роль в регуляции множества клеточных явлений и поддерживают функционирование клетки. Такие киназы включают, без ограничения перечисленным, рецепторные тирозинкиназы, такие как рецепторная киназа фактора роста тромбоцитов (PDGF-R) и рецептор фактора роста фибробластов, FGFR3, нерецепторные тирозинкиназы, такие как киназа Abl и гибридная киназа BCR-Abl, и серинтреонинкиназы, такие как киназы b-RAF, SGK, MAP (например, МКК4, МКК6 и т.п.) и SAPK2α и SAPK2β. Аномальная активность киназы наблюдается при многих патологических состояниях, таких как доброкачественные и злокачественные пролиферативные заболевания и заболевания, связанные с аномальной активацией иммунной и нервной системы.
Новые соединения по настоящему изобретению ингибируют активность одной или более протеинкиназ, и, таким образом, ожидается, что такие соединения можно использовать для лечения связанных с киназами заболеваний.
Краткое описание сущности изобретения
Один объект настоящего изобретения относится к соединениям формулы I,
где
n равен 0, 1, 2, 3 и 4,
1
1
6
6
10
0
4
5
10
0
4
3
12
0
4
3
8
0
4
7
8
R выбирают из группы, включающей водород, C-Салкил, С-Сарил(С-С)алкил, С-Сгетероарил(С-С)алкил, С-Сциклоалкил(С-С)алкил, С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил и -XNRR,
1
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
7
8
7
7
8
7
9
6
10
0
4
5
10
0
4
3
12
0
4
3
8
0
4
1
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
причем любой арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей галоген, C-Салкил, галогензамещенный C-Салкил, C-Салкокси, галогензамещенный C-Салкокси, C-Салкилтио, галогензамещенный C-Салкилтио, -XNRR, -XNRXNRR, -XNRR, С-СарилС-Салкил, С-Сгетероарил(С-С)алкил, С-Сциклоалкил(С-С)алкил и С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил, причем любой арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей галоген, C-Салкил, галогензамещенный C-Салкил, гидроксизамещенный C-Салкил, C-Салкокси и галогензамещенный C-Салкокси, причем любой алкил в составе R необязательно включает метилен, замененный на атом О, где
1
6
7
8
1
6
7
8
9
6
10
0
4
5
10
0
4
3
12
0
4
3
8
0
4
Х каждый независимо выбирают из группы, включающей химическую связь и C-Салкилен, R и R независимо выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил, причем любой R и R необязательно включает метилен, замененный на атом О, a R выбирают из группы, включающей С-Сарил(С-С)алкил, С-Сгетероарил(С-С)алкил, С-Сциклоалкил(С-С)алкил и С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил,
2
1
6
R выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил,
3
1
6
R выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил,
4
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
R выбирают из группы, включающей галоген, C-Салкил, галогензамещенный C-Салкил, C-Салкокси, галогензамещенный C-Салкокси, C-Салкилтио и галогензамещенный C-Салкилтио,
15
5
6
5
6
R выбирают из группы, включающей -NRY(O)R и -Y(O)NRR, где
Y выбирают из группы, включающей С, S, S(O), Р и Р(O),
5
1
6
R выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил, а
6
6
10
5
10
3
12
3
8
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
6
10
0
4
5
10
0
4
3
12
0
4
3
8
0
4
3
8
0
4
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
R выбирают из группы, включающей С-Сарил, С-Сгетероарил, С-Сциклоалкил и С-Сгетероциклоалкил, причем указанный арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей галоген, C-Салкил, галогензамещенный C-Салкил, C-Салкокси, галогензамещенный C-Салкокси, C-Салкилтио, галогензамещенный С-Салкилтио, С-Сарил(С-С)алкил, С-Сгетероарил(С-С)алкил, С-Сциклоалкил(С-С)алкил, С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкокси и С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил, или арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей гидрокси, галоген, C-Салкил, галогензамещенный C-Салкил, гидроксизамещенный С-Салкил, C-Салкокси и галогензамещенный C-Салкокси, к N-оксидам, пролекарствам, защищенным производным, индивидуальным изомерам, смесям изомеров, фармацевтически приемлемым солям и сольватам (например, гидратам) указанных соединений.
Второй объект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая включает соединение формулы I или N-оксид, их индивидуальные изомеры, смеси изомеров или фармацевтически приемлемые соли указанных соединений в смеси с одним или более пригодных экципиентов.
Третий объект настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания млекопитающего, которое чувствительно к ингибированию активности киназы, прежде всего, к ингибированию активности киназы Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, Flt3 и b-Raf, что, в свою очередь, приводит к профилактике, подавлению или снижению интенсивности патологии и/или симптомов заболеваний, причем указанный способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его N-оксида производного, индивидуальных изомеров, смеси изомеров или фармацевтически приемлемых солей указанных соединений.
Четвертый объект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания животного, которое связано с активностью киназы, прежде всего, с активностью киназы Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, Flt3 и b-Raf, причем активность указанных киназ вызывает развитие патологии и/или симптомов заболевания.
Пятый объект настоящего изобретения относится к способу получения соединений формулы I и их N-оксидов, пролекарств, защищенных производных, индивидуальных изомеров, смеси изомеров и фармацевтически приемлемых солей указанных соединений.
Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Определения
1
4
Термин «алкил» означает группу или структурный элемент в составе других групп, такой как, например, галогензамещенный алкил и алкокси, с прямой или разветвленной цепью. С-Салкокси включает метокси, этокси и т.п. Галогензамещенный алкил включает трифторметил, пентафторэтил и т.п.
Термин «арил» означает моноциклическое или конденсированное ароматическое бициклическое кольцо, содержащее от 6 до 10 атомов углерода в цикле. Например, арил включает фенил или нафтил, предпочтительно фенил. Термин «арилен» означает двухвалентный радикал арильной группы.
Термин «гетероарил» означает арил, определенный выше, который содержит один или более гетероатомов в цикле. Например, гетероарил включает пиридил, индолил, индазолил, хиноксалинил, хинолинил, бензофуранил, бензопиранил, бензотиопиранил, бензо[1,3]диоксол, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, фуранил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пиразолил, тиенил и т.п.
3
10
Термин «циклоалкил» означает насыщенную или частично ненасыщенную, моноциклическую, конденсированную бициклическую или мостиковую полициклическую систему, содержащую указанное число атомов в цикле. Например, С-Сциклоалкил включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.
2
Термин «гетероциклоалкил» означает циклоалкил, определенный выше, в котором один или более атомов углерода в цикле заменены на остаток, выбранный из группы, включающей -О-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- или -S(O)-, где R означает водород,
1
4
3
8
С-Салкил или азотзащитную группу. Например, С-Сгетероциклоалкил, используемый в данном контексте для описания соединения по настоящему изобретению, включает морфолино, пирролидинил, пирролидинил-2-он, пиперазинил, пиперидинил, пиперидинилон, 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил и т.п.
Термин «галоген» предпочтительно означает хлор или фтор, а также бром или иод.
Термин «панель киназ» означает группу киназ, включающую киназы Abl (человека), Abl(T315I), JAK2, JAK3, ALK, JNK1α1, ALK4, KDR, Aurora-A, Lck, Blk, MAPK1, Bmx, MAPKAP-K2, BR, MEK1, CaMKII (крысы), Met, CDKl/циклинВ, p70S6K, CHK2, PAK2, CK1, PDGFRα, CK2, PDK1, c-kit, Pim-2, c-RAF, PKA(h), CSK, PKBα, cSrc, PKCα, DYRK2, Plk3, EGFR, ROCK-I, Fes, Ron, FGFR3, Ros, Flt3, SAPK2α, Fms, SGK, Fyn, SIK, GSK3β, Syk, IGF-1R, Tie-2, IKKβ, TrKB, IR, WNK3, IRAK4, ZAP-70, ITK, AMPK (крысы), LIMK1, Rsk2, Axl, LKB1, SAPK2β, BrSK2, Lyn (h), SAPK3, ВТК, МАРКАР-К3, SAPK4, CaMKIV, MARK1, Snk, CDК2/циклинА, MINK, SRPK1, CDК3/циклинЕ, MKK4(m), TAK1, CDK5/p25, MKK6(h), TBK1, CDK6/циклинD3, MLCK, TrkA, CDК7/циклинН/МАТ1, MRCKβ, TSSK1, CHK1, MSK1, Yes, CKld, MST2, ZIPK, c-Kit (D816V), MuSK, DAPK2, NEK2, DDR2, NEK6, DMPK, PAK4, DRAK1, PAR-1Bα, EphAl, PDGFRβ, EphA2, Pim-1, EphA5, PKBβ, EphB2, PKCβI, EphB4, PKCδ, FGFR1, PKCη, FGFR2, РКСθ, FGFR4, PKD2, Fgr, PKG1β, Flt1, PRK2, Hck, PYK2, HIPK2, Ret, IKKα, RIPK2, IRR, ROCK-II (человека), JNK2α2, Rse, JNK3, Rsk1(h), PI3-Kγ, PI3-Кδ и Р13-Кβ. Действие соединения по настоящему изобретению оценивают в отношении панели киназ (дикого типа и/или мутантных форм), и установлено, что они ингибируют активность по крайней мере одной киназы из указанной панели киназ.
Термин «мутантные формы киназы BCR-Abl» означает формы киназы, содержащие одну или несколько замен аминокислот по сравнению с киназой дикого типа. Мутации в последовательности киназы BCR-Abl приводят к изменению участков контактирования белка и ингибитора (например, гливек и т.п.), в большинстве случаев при этом происходит превращение из инактивированного в активное состояние, т.е. образуется конформация белка, с которой не связывается гливек. При клинических испытаниях было установлено, что набор мутаций, выявленных в связи с устойчивым фенотипом, медленно возрастает, но непрерывно в течение времени. Мутации происходят в четырех основных участках. Одна группа мутаций (G250E, Q252R, Y253F/H, E255K/V) включает аминокислоты, которые образуют фосфатсвязывающую петлю для АТФ (также известную под названием Р-петля). Вторая группа мутаций (V289A, F311L, T315I, F317L) была обнаружена в участке, связывающимся с гливеком и напрямую взаимодействующим с ингибитором за счет образования водородных связей или ван-дер-ваальсовских взаимодействий. Третья группа мутаций (М351Т, E355G) находится в непосредственной близости к каталитическому домену. Четвертая группа мутаций (H396R/P) располагается в петле активации, конформация которой является «молекулярным переключателем», отвечает за активацию/инактивацию киназы. Точечные мутации киназы BCR-ABL связаны с устойчивостью к гливеку, обнаруженной у пациентов CML и ALL, и включают мутации M224V, L248V, G250E, G250R, Q252R, Q252H, Y253H, Y253F, Е255К, E255V, D276G, Т277А, V289A, F311L, T315I, T315N, F317L, М343Т, М315Т, E355G, F359V, F359A, V379I, F382L, L387M, L387F, Н396Р, H396R, А397Р, S417Y, Е459К и F486S (положения аминокислот обозначены однобуквенным кодом, согласно информации в базе данных номер ААВ60394, и соответствуют киназе ABL тип 1а, см. статью Martinelli и др., Haematologica/The Hematology Journal, April, 90-4 (2005)). Если в контексте не указано иное, то Всr-Abl означает киназу дикого типа и ее мутантные формы.
Термин «лечить» и «лечение» означает способ снижения интенсивности заболевания и/или сопровождающих его симптомов.
Описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам лечения заболевания, связанного с киназами, прежде всего, такими как киназы Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, Flt3 и b-Raf. Например, лейкоз и другие пролиферативные заболевания, связанные с киназой BCR-Abl, можно лечить за счет ингибирования киназы BCR-Abl дикого типа и ее мутантных форм.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются соединения формулы I, характеризующиеся формулой Ia
где
m равно 0 и 1,
1
1
6
6
10
0
4
5
10
0
4
3
12
0
4
3
8
0
4
7
8
R выбирают из группы, включающей водород, C-Салкил, С-Сарил(С-С)алкил, C-Cгетероарил(С-С)алкил, С-Сциклоалкил(С-С)алкил, С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил и -XNRR,
1
1
6
7
8,
7
7
8
7
9
5
10
0
4
3
8
0
4
1
1
6
1
6
1
1
6
7
8
1
6
7
где любой арил, гетероарил, циклоалкил или гетероциклоалкил в составе Rнеобязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей С-Салкил, -XNRR -XNRXNRR, -XNRR, С-Сгетероарил(С-С)алкил и С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил, где любой гетероарил или гетероциклоалкил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей C-Салкил и гидроксизамещенный C-Салкил, где любой алкил в составе R необязательно включает метилен, замененный на атом О, а каждый Х независимо выбирают из группы, включающей химическую связь и C-Салкилен, R и R независимо выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил, причем любой метилен в составе R и
8
9
3
12
0
4
Rнеобязательно заменен на атом О, и R означает С-Сциклоалкил(С-С)алкил,
2
1
6
R выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил,
3
1
6
R выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил,
4
1
6
1
6
1
6
1
6
R выбирают из группы, включающей галоген, С-Салкил, галогензамещенный C-Салкил, C-Салкокси и галогензамещенный C-Салкокси,
5
5
L выбирают из группы, включающей -NRC(O)- и -C(O)NR-,
5
1
6
R выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил,
10
1
6
R означает галогензамещенный C-Салкил и
11
5
10
3
8
10
1
6
R выбирают из группы, включающей водород, галоген, С-Сгетероарил и С-Сгетероциклоалкил, где гетероарил или гетероциклоалкил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей гидрокси и C-Салкил.
1
1
1
2
3
5
4
В другом варианте осуществления настоящего изобретения R выбирают из группы, включающей водород, метил, изопропил, имидазолилпропил, пиперазинилпропил, пиридинил, диэтиламинопропил, гидроксиэтил, пиримидинил, морфолинопропил, фенил, циклопропил, морфолиноэтил, бензил и морфолино, где любой пиридинил, имидазолил, пиперазинил или пиримидинил в составе R необязательно замещен 1-3 радикалами, независимо выбранными из группы, включающей метил, метиламино, диметиламинометил, циклопропиламино, гидроксиэтиламино, диэтиламинопропиламино, пирролидинилметил, морфолино, морфолинометил, пиперазинилметил и пиперазинил, где любой морфолино и пиперазинил в составе R необязательно замещен радикалом, выбранным из группы, включающей метил, гидроксиэтил и этил, a R, R и R каждый означает водород и R означает метил.
10
11
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения m равно 0 и 1, R означает трифторметил и R выбирают из группы, включающей галоген, морфолинометил, пиперазинил, необязательно замещенный группой метил, этил или гидроксиэтил; означает пиперазинилметил, необязательно замещенный группой метил или этил, означает имидазолил, необязательно замещенный метилом, пирролидинилметокси и пиперидинил, необязательно замещенный гидроксигруппой.
Предпочтительные соединения по настоящему изобретению выбирают из группы, включающей [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(3-диэтиламинопропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-гидроксиэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(3-морфолин-4-илпропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(3-диэтиламинопропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-фениламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(2-гидроксиэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(3-диэтиламинопропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(3-морфолин-4-илпропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-[6-(4-этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(6-циклопропиламино-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-[6-(2-гидроксиэтиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-[6-(3-диэтиламинопропиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(2-метил-6-морфолин-4-илпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-гидроксиэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-морфолин-4-илэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-гидроксиэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-бензиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-морфолин-4-илэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-[6-(2-гидроксиэтиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(6-циклопропиламино-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-метил-6-морфолин-4-илпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-[6-(4-этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-[6-(3-диэтиламинопропиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-метил-6-метиламинопиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-[6-(2-гидроксиэтиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(6-циклопропиламино-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(2-метил-6-морфолин-4-илпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-[6-(4-этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-[6-(3-диэтиламинопропиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]-2-метилфенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]-2-метилфенил}амид 2-метиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]-2-метилфенил}амид 2-аминотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]-2-метилфенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-морфолин-4-илметил-3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-пиперазин-1-илметил-3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]фенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилфенилкарбамоил]фенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]фенил}амид 2-метиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-пиперазин-1-илметил-3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-пиперазин-1-илметил-3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-метиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-морфолин-4-илметил-3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-морфолин-4-илметил-3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-метиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, (5-{[1-трет-бутил-5-(4-метилпиперазин-1-илметил)-1Н-пиразол-3-карбонил]амино}-2-метилфенил)амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилфенилкарбамоил]фенил}амид 2-метиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилфенилкарбамоил]фенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, (5-{3-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-5-трифторметилбензоиламино}-2-метилфенил)амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[(5-трет-бутилтиофен-2-карбонил)амино]-2-метилфенил}амид 2-(2-морфолин-4-илэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[(5-трет-бутилтиофен-2-карбонил)амино]-2-метилфенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[(5-трет-бутил-2-метил-2Н-пиразол-3-карбонил)амино]-2-метилфенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{5-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]пиридин-2-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты, (5-{3-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-5-трифторметилбензоиламино}-2-метилфенил)амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(пиридин-3-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(3-имидазол-1-илпропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[(5-трет-бутил-2-метил-2Н-пиразол-3-карбонил)амино]-2-метилфенил}амид 2-(2-морфолин-4-илэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [5-(4-хлор-3-трифторметилбензоиламино)-2-метилфенил]амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[(1-трет-бутил-5-метил-1Н-пиразол-3-карбонил)амино]-2-метилфенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(пирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]фенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(6-метилпиридин-3-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-(2-морфолин-4-илэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-изопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилфенилкарбамоил)фенил]амид 2-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропиламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-пиперазин-1-илметил-3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, {5-[4-(4-этилпиперазин-1-илметил)-3-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(пиридин-2-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(4-морфолин-4-илметил-3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-циклопропиламинотиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-[6-(4-метилпиперазин-1-ил)пиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]пиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты, [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-[2-метил-6-(4-метилпиперазин-1-ил)пиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты и [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{4-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]пиридин-2-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты.
Применение в фармакологии
Соединения по настоящему изобретению модулируют активность киназ, и, таким образом, их можно использовать для лечения нарушений или заболеваний, при которых киназы принимают участие в развитии патологии и/или симптомов заболевания. Примеры киназ, активность которых ингибируется соединениями и композициями, описанными в настоящем описании, и в отношении которых используют способы, описанные в данном контексте, включают, без ограничения перечисленным, киназы Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, Flt3 и b-Raf.
Тирозинкиназа Абельсона (т.е. Abl, с-Abl) участвует в регуляции клеточного цикла, клеточного ответа на генотоксичный стресс и участвует в передаче информации об окружающей клетку среде через интегриновый сигнал. В основном, было установлено, что белок Abl выполняет сложные функции в качестве клеточного модуля, который интегрирует сигналы от различных внеклеточных и внутриклеточных источников и влияет на клеточный цикл и апоптоз. Тирозинкиназа Абельсона включает производные, такие как гибридный белок (онкопротеин) BCR-Abl с нарушенной активностью тирозинкиназы, или киназа v-Abl. Киназа BCR-Abl играет основную роль в патогенезе 95% случаев хронического миелолейкоза (CML) и в 10% случаев острого лимфоидного лейкоза. Продукт STI-571 (гливек) является ингибитором онкогенной тирозинкиназы BCR-Abl, который используют для лечения хронического миелолейкоза (CML). Однако некоторые пациенты на стадии недифференцируемого лейкоза CML являются устойчивыми к STI-571 из-за мутаций в киназе BCR-Abl. В настоящее время известно 22 мутации, причем основные мутации включают G250E, E255V, T315I, F317L и М351Т.
Соединения по настоящему изобретению ингибируют киназу abl, прежде всего киназу v-abl. Соединения по настоящему изобретению также ингибируют киназу BCR-Abl дикого типа и мутантные формы, и, таким образом, их можно использовать для лечения Bcr-abl-позитивного рака и опухолей, таких как лейкоз (прежде всего, хронический миелолейкоз и острый лимфоидный лейкоз, при которых проявляются особые механизмы апоптоза), а также влияют на подгруппу лейкозных стволовых клеток, и такие соединения можно использовать для очистки таких клеток in vitro после их удаления (например, после удаления костного мозга) и для повторной имплантации клеток после их очистки от раковых клеток (например, повторная имплантация очищенных клеток костного мозга).
PDGF (тромбоцитарный фактор роста) является распространенным фактором роста, который играет важную роль при нормальном росте, а также при патологической пролиферации клеток, такой как канцерогенез и заболевания клеток гладкой мускулатуры кровеносных сосудов, такие как, например, атеросклероз и тромбоз. Соединения по настоящему изобретению ингибируют активность рецептора PDGF (PDGFR), и, таким образом, их можно использовать для лечения опухолевых заболеваний, таких как глиомы, саркомы, опухоли предстательной железы и опухоли толстой кишки, молочной железы и яичника.
Соединения по настоящему изобретению можно использовать не только в качестве веществ, подавляющих опухоли, такие как, например, мелкоклеточный рак легких, но также в качестве агента для лечения доброкачественных пролиферативных заболеваний, таких как атеросклероз, тромбоз, псориаз, склеродерма и фиброз, для защиты стволовых клеток, например для снижения гемотоксичного влияния химиотерапевтических агентов, таких как 5-фторурацил, и для лечения астмы. Соединения по настоящему изобретению, прежде всего, можно использовать для лечения заболеваний, которые чувствительны к ингибированию рецепторной киназы PDGF.
Соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения нарушений, возникающих в результате трансплантации, такой как, например, аллогенная трансплантация, прежде всего, при отторжении ткани, такой как, прежде всего, облитеративный бронхиолит (ОB), т.е. хроническое отторжение аллогенных трансплантатов легкого. В отличие от пациентов, не страдающих ОB, у пациентов с ОB часто наблюдается повышенная концентрация PDGF в бронхоальвеолярной промывной жидкости.
Соединения по настоящему изобретению также являются эффективными для лечения заболеваний, связанных с миграцией клеток гладкой мускулатуры сосудов и пролиферацией (связанной в основном с PDGF и PDGF-R), таких как рестеноз и атеросклероз. Такое влияние и результат действия соединений по настоящему изобретению на пролиферацию или миграцию клеток гладкой мускулатуры сосудов in vitro и in vivo наблюдается после введения соединений по настоящему изобретению, а также при изучении влияния указанных соединений на загустевание сосудистой интимы после механической травмы in vivo.
Некоторые аномальные пролиферативные состояния, как было установлено, связаны с экспрессией белка raf и, таким образом, являются чувствительными к ингибированию экспрессии белка raf. Аномально высокий уровень экспрессии белка raf также вызывает трансформацию и аномальную пролиферацию клеток. Такие аномальные пролиферативные состояния, как было установлено, являются чувствительными к ингибированию экспрессии белка raf. Например, экспрессия белка c-raf влияет на аномальную пролиферацию клеток, так как в 60% всех клеточных линий карциномы легкого наблюдаются чрезвычайно высокие уровни мРНК c-raf и белка. Другие примеры аномальных пролиферативных состояний включают гиперпролиферативные нарушения, такие как рак, опухоли, гиперплазия, фиброз легких, ангиогенез, псориаз, атеросклероз и пролиферация клеток гладкой мускулатуры в кровеносных сосудах, такие как стеноз или рестеноз после ангиопластики. Путь передачи сигнала в клетке, который включает белок raf, также связан с воспалительными заболеваниями, характеризующимися пролиферацией Т-клеток (активация и рост Т-клеток), такими как, например, отторжение ткани трансплантата, эндотоксический шок и гломерулярный нефрит.
Киназа Flt3 входит в состав семейства рецепторных тирозинкиназ (RTK) типа III. Киназа Flt3 (киназа fms-подобная тирозинкиназа) также известна под названием киназа FLk-2 (эмбриональная киназа 2 печени). Аномальная экспрессия гена Flt3 была установлена у взрослого человека и детей с диагнозом лейкоз, такой как острый миелолейкоз (AML), AML, сопровождающийся трехлинейной миелодисплазией (AML/TMDS), острый лимфобластный лейкоз (ALL) и миелодиспластический синдром (MDS). Активирующие мутации рецептора Flt3 были выявлены приблизительно у 35% пациентов, страдающих от острого миелобластного лейкоза (AML), причем такие заболевания характеризуются неблагоприятным прогнозом. Наиболее распространенная мутация включает дупликацию в рамке в околомембранном домене, а еще у 5-10% пациентов выявлена точечная мутация (аспарагин 835). Обе мутации связаны с конститутивной активацией активности тирозинкиназы Flt3, что приводит к пролиферации и активации сигналов в отсутствие лиганда. Установлено, что пациенты, у которых выявлена мутантная форма рецептора, практически не поддаются лечению. Таким образом, существует множество доказательств, что гиперактивированная (мутантная) активность киназы Flt3 является причиной лейкоза и миелодиспластического синдрома человека. В связи с этим существует необходимость поиска новых ингибиторов рецептора Flt3 в качестве перспективных терапевтических средств для лечения пациентов, для которых современные способы лечения неэффективны, а также для которых ранее применяли неэффективные способы лечения и/или способ лечения с использованием трансплантации стволовых клеток.
Лейкоз, как правило, возникает вследствие приобретенного (ненаследственного) генетического повреждения ДНК незрелых гематопоэтических клеток в костном мозге, лимфатических узлах, селезенке или других органах кроветворной и иммунной системы. При таком заболевании наблюдается ускоренный рост и блокада созревания клеток, что приводит к накоплению клеток, названных «лейкобласты», которые не способны выполнять функции нормальных клеток крови, а также к отсутствию продуцирования нормальных клеток костного мозга, что приводит к дефициту эритроцитов (анемия), тромбоцитов и нормальных лимфоцитов. Властные клетки, как правило, образуются в костном мозге и развиваются в зрелые клетки крови, включающие приблизительно 1% всех клеток костного мозга. При заболевании лейкозом бластные клетки не развиваются должным образом и накапливаются в костном мозге. При остром миелолейкозе (AML) такие клетки называют миелобластами, а при остром лимфобластном лейкозе (ALL) такие клетки называют лимфобластами. Другой тип лейкоза включает смешанный лейкоз (MLL).
Термин «AML, сопровождающийся трехлинейной миелодисплазией (AML/TMDS)» означает обычную форму лейкоза, которая характеризуется дисгематопоэтической картиной, аналогичной картине при остром лейкозе, неэффективной индукционной химиотерапией и возможностью рецидива чистого миелодиспластического синдрома.
Термин «миелодиспластический синдром (MDS)» означает группу заболеваний крови, при которых происходит нарушение функции костного мозга, что приводит к дефициту числа здоровых клеток крови. По сравнению с лейкозом, при котором только один тип клеток крови образуется в больших количествах, при миелодиспластическом синдроме поражены некоторые, а иногда и все типы клеток крови. Каждый год в США зарегистрировано по крайней мере 10000 новых случаев. У одной трети пациентов с диагнозом MDS развивается острый миелолейкоз. В связи с этим такое заболевание иногда называют предлейкозом. Миелодиспластический синдром иногда также называют миелодиспластическим димиелопоэзом или олигобластным лейкозом, или вялотекущим лейкозом, при котором большое количество бластных клеток остается в костном мозге.
Миелодиспластический синдром, аналогично лейкозу, возникает при генетическом повреждении ДНК в отдельной клетке костного мозга. У пациентов, страдающих MDS, выявлены некоторые нарушения функции хромосом. Такие нарушения называют транслокациями, когда часть одной хромосомы отрывается и присоединяется к поврежденной части другой хромосомы. Такие же нарушения, как правило, наблюдаются при остром миелолейкозе. Однако MDS отличается от лейкоза тем, что все клетки крови пациента являются аномальными и образованы из одной и той же поврежденной стволовой клетки. У пациентов, страдающих лейкозом, костный мозг содержит смесь аномальных и здоровых клеток крови.
AML и прогрессирующие миелодиспластические синдромы в настоящее время лечат высокими дозами цитотоксических химиотерапевтических лекарственных средств, таких как цитозинарабинозид и даунорубицин. Такой тип лечения приводит к гематологической ремиссии у приблизительно 70% пациентов. Однако у более половины пациентов, у которых наблюдается ремиссия, затем наступает рецидив, несмотря на проведение химиотерапии в течение длительных периодов времени. Почти все пациенты, у которых не наблюдается ремиссия в начале лечения или у которых наблюдается рецидив заболевания, в конечном счете, умирают от лейкоза. Трансплантация костного мозга эффектитвна для 50-60% пациентов, перенесших операцию, но при этом только приблизительно одна треть всех пациентов, страдающих AML или MDS, способны перенести операцию трансплантации. В связи с этим существует острая необходимость в новых и эффективных лекарственных средствах для лечения пациентов, у которых не наблюдается ремиссия при лечении стандартными способами, у которых наблюдается рецидив и которые не способны перенести операцию трансплантации. Кроме того, включение новых эффективных лекарственных средств в стандартную терапию позволит усовершенствовать индукционную химиотерапию для всех пациентов.
Киназа FGFR3 входит в состав семейства структурно родственных рецепторных тирозинкиназ, кодируемых 4 различными генами. Специфические точечные мутации в различных доменах гена FGFR3 приводят к конститутивной активации рецептора и связаны с аутосомальными доминантными заболеваниями костной системы, множественной миеломой и с большинством видов рака мочевого пузыря и шейки матки (см. статью Cappellen и др.. Nature, т.23). Активирующие мутации в гене FGFR3 мыши и влияние на активированный FGFR3 приводят к образованию в хряще пластины роста, которая является причиной карликовости у мышей. Аналогичным образом, направленное разрушение гена FGFR3 приводит к чрезмерно быстрому росту длинных костей и позвоночника у мышей. Кроме того, от 20% до 25% клеток множественной миеломы содержит хромосомальную транслокацию t(4;14)(p16.3;q32.3) с точечными разрывами 4р16 центромера FGFR3 размером 50-100 кДа. В редких случаях в участке множественной миеломы были выявлены активирующие мутации FGFR3, предварительно наблюдаемые при заболеваниях костной системы, которые всегда сопровождаются указанной хромосомальной транслокацией. Недавно были выявлены соматические миссенс-мутации FGFR3 (R248C, S249C, G372C и К652Е) в множестве раковых клеток мочевого пузыря и в некоторых раковых клетках шейки матки, которые фактически являются идентичными активирующим эмбриональным мутациям, вызывающим летальную дисплазию, летальную карликовость в неонатальный период. Соединения по настоящему изобретению проявляют более высокую эффективность при лечении множественной миеломы по сравнению с современными способами лечения, а также при лечении рака мочевого пузыря без применения цистэктомии, изменяющей качество жизни, и при лечении рака шейки матки у пациентов, которым требуется сохранить фертильность.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения субъекта, страдающего любыми описанными выше нарушениями или заболеваниями и нуждающегося в таком лечении, причем указанный способ по настоящему изобретению включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества (см. ниже главу «Способы введения лекарственного средства и фармацевтические композиции») соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В любом указанном выше применении требуемая дозировка изменяется в зависимости от способа введения лекарственного средства, конкретного состояния, подлежащего лечению, и требуемого результата лечения.
Способы введения лекарственного средства и фармацевтические композиции
Как правило, соединения по настоящему изобретению вводят в терапевтически эффективном количестве любыми стандартными приемлемыми способами, известными в данной области техники, отдельно или в комбинации с одним или более терапевтических агентов. Терапевтически эффективное количество изменяется в широком диапазоне в зависимости от тяжести заболевания, возраста и состояния субъекта, эффективности используемого соединения и других факторов. Как правило, удовлетворительные результаты лечения достигаются при систематическом введении соединений в суточной дозе от приблизительно 0,03 мг/кг до 2,5 мг/кг массы тела. Указанная суточная доза для крупного млекопитающего, такого как, например, человек, составляет от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 100 мг, например, в виде разделенных дох до четырех раз в сутки или в форме с замедленным высвобождением лекарственного средства. Пригодные стандартные лекарственные формы для перорального введения включают от приблизительно 1 мг до 50 мг активного ингредиента.
Соединения по настоящему изобретению вводят в составе фармацевтической композиции любым стандартным способом, прежде всего энтеральным способом введения, например пероральным способом, например, в форме таблеток или капсул, или перентеральным способом введения, например, в форме инъекционных растворов или суспензий, местным способом введения, например, в форме лосьонов, гелей, мазей или кремов, или в форме, предназначенной для введения через нос, или в форме суппозитория. Фармацевтические композиции, включающие соединения по настоящему изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли в смеси по крайней мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, получают стандартным способом, таким как смешивание, гранулирование или нанесение покрытия. Например, композиции, предназначенные для перорального введения, включают таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент в смеси с а) разбавителями, такими как, например, лактоза, декстроза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза и/или глицин, б) замасливателями, такими как, например, оксид кремния, тальк, стеариновая кислота, ее магниевая или кальциевая соль и/или полиэтиленгликоль, и для получения таблеток также в смеси с в) связующими агентами, такими как, например, алюмосиликат магния, крахмальная паста, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон, при необходимости с г) дезинтегрирующими агентами, такими как, например, крахмалы, агар, альгиновая кислота или ее натриевая соль, или шипучие смеси, и/или с д) абсорбентами, красителями, ароматизаторами и подсластителями. Инъекционные композиции включают водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории получают из эмульсий или суспензий жиров.
Композиции стерилизуют и/или композиции включают адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты или эмульгаторы, ускорители растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферные вещества. Кроме того, композиции также включают другие терапевтически приемлемые вещества. Пригодные лекарственные средства, предназначенные для чрескожного введения, включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в смеси с носителем. Носитель включает абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители, предназначенные для повышения проницаемости лекарственного средства через кожу субъекта. Например, средства для чрескожного введения используют в форме повязки, включающей подложку, резервуар, содержащий соединение необязательно в смеси с носителями, необязательно перегородку, регулирующую скорость доставки соединения в кожу субъекта, на определенном заранее уровне в течение продолжительного периода времени и средство для закрепления устройства к коже. Используют также составы для введения лекарственных средств в матрикс. Пригодные составы для местного введения, такого как, например, введение на кожу и в глаза, предпочтительно включают водные растворы, мази, кремы или гели, известные в данной области техники. Такие составы также включают солюбилизаторы, стабилизаторы, агенты, повышающие концентрацию, буферные вещества и консерванты.
Соединения по настоящему изобретению вводят в терапевтически эффективном количестве в комбинации с одним или более терапевтических агентов (фармацевтические комбинации). Например, можно наблюдать синергетическое действие в смеси с другими иммуномодулирующими или противовоспалительными веществами, например, при использовании в комбинации с циклоспорином, рапамицином или аскомицином, или с их иммунодепрессантными аналогами, такими как, например, циклоспорин А (CsA), циклоспорин G, FK-506, рапамицин или аналогичные соединения, кортикостероиды, циклофосфамид, азатиоприн, метотрексат, бреквинар, лефлуномид, мизорибин, микофеноловая кислота, микофенолят мофетила, 15-деоксиспергуалин, иммунодепрессантные антитела, прежде всего моноклональные антитела против лейкоцитарных рецепторов, такие как, например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, В7, CD45, CD58 или их лиганды, или другие иммуномодулирующие соединения, такие как CTLA41g. При введении соединений по настоящему изобретению в сочетании с другими способами лечения дозы вводимых совместно соединений изменяются в зависимости от природы совместно вводимого соединения, от специфичности лекарственного средства, от состояния пациента, подлежащего лечению, и т.п.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим комбинациям, таким как, например, набор, включающий а) первый агент, который является соединением по настоящему изобретению, описанным в данном контексте, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и б) по крайней мере один дополнительный агент. Набор включает инструкции по его применению.
Термины «совместное введение», или «введение в виде смеси», или аналогичные термины, используемые в настоящем описании, означают введение выбранных терапевтических агентов одному пациенту и включают курсы лечения, при которых агенты необязательно вводят одним и тем же способом или необязательно в одно и то же время.
Термин «фармацевтическая комбинация», используемый в настоящем описании, означает продукт, который получают после смешивания более одного активного ингредиента, и включает фиксированные и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин «фиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, такие как, например, соединение формулы I и дополнительный агент, вводят пациенту одновременно в форме единой стандартной дозы. Термин «нефиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, такие как, например, соединение формулы I и дополнительный агент, вводят пациенту в виде различных лекарственных форм, одновременно, совместно или последовательно без определенных сроков введения, при этом такой способ введения обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Такой способ введения также включает комбинированную терапию, такую как, например, введение трех или более активных ингредиентов.
Способы получения соединений по настоящему изобретению
Настоящее изобретение также относится к способам получения соединений по настоящему изобретению. При проведении описанных реакций существует необходимость в защите реакционноспособных функциональных групп, таких как, например, гидрокси, амино, имино, тио или карбоксигрупп, для получения конечного продукта, включающего указанные группы, чтобы исключить нежелательное участие таких групп в реакциях при получении конечного продукта. Стандартные защитные группы применяют с использованием стандартных способов, например, см. книгу T.T.W.Greene и P.G.M.Wuts, «Protective Groups in Organic Chemistry», John Wiley and Sons (1991).
Соединения формулы I получают по следующей схеме I:
Схема I
1
2
3
4
5
6
где n, R, R, R, R, R и R определены в описании сущности изобретения. Соединение формулы I получают при взаимодействии соединения формулы 2 с соединением формулы 3 в присутствии пригодного растворителя (такого как, например, 1,3-диметил-2-имидазолидон или т.п.). Реакцию проводят при температуре от приблизительно 50°С до приблизительно 120°С в течение 12 ч до завершения реакции.
Подробные примеры синтеза соединения формулы I представлены в разделе Примеры ниже.
Другие способы получения соединений по настоящему изобретению
Соединение по настоящему изобретению получают в виде фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли при взаимодействии соединения в форме свободного основания с фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислотой. В другом варианте фармацевтически приемлемую основно-аддитивную соль соединения по настоящему изобретению получают при взаимодействии соединения в форме свободной кислоты с фармацевтически приемлемым неорганическим или органическим основанием.
В еще одном варианте соединения по настоящему изобретению в форме солей получают с использованием солей в качестве исходных материалов или промежуточных соединений.
Соединения по настоящему изобретению в форме свободной кислоты или основания получают из соответствующей основно-аддитивной или кислотно-аддитивной соли соответственно. Например, соединение по настоящему изобретению в форме кислотно-аддитивной соли превращают в соответствующее свободное основание при обработке пригодным основанием (таким как, например, раствор гидроксида аммония, гидроксида натрия и т.п.). Соединение по настоящему изобретению в форме основно-аддитивной соли превращают в соответствующую свободную кислоту при обработке пригодной кислотой (такой как, например, соляная кислота и т.п.).
Соединения по настоящему изобретению в неокисленной форме получают из N-оксидов соединений по настоящему изобретению при обработке восстановителем (таким как, например, сера, диоксид серы, трифенилфосфин, боргидрид лития, боргидрид натрия, трихлорид фосфора, трибромид фосфора или т.п.) в пригодном инертном органическом растворителе (таком как, например, ацетонитрил, этанол, водный диоксан или т.п.) при температуре от 0°С до 80°С.
Пролекарства соединений по настоящему изобретению получают способами, известными в данной области техники (см. статью Saulnier и др., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, т.4, с.1985 (1994)). Например, соответствующие пролекарства получают при взаимодействии немодифицированного соединения по настоящему изобретению с пригодным карбамилирующим агентом (таким как, например, 1,1-ацилоксиалкилкарбанохлоридат, пара-нитрофенилкарбонат или т.п.).
ье
Защищенные производные соединений по настоящему изобретению получают способами, известными в данной области техники. Подробное описание методик для введения защитных групп и их удаления представлено в книге Т.W.Greene, «Protecting Groups in Organic Chemistry», 3 изд., John Wiley and Sons, Inc., (1999).
Соединения по настоящему изобретению получают способами по настоящему изобретению в виде сольватов (таких как, например, гидраты). Гидраты соединений по настоящему изобретению получают перекристаллизацией из смеси водного/органического растворителя с использованием органических растворителей, таких как диоксин, тетрагидрофуран или метанол.
Соединения по настоящему изобретению получают в виде их индивидуальных стереоизомеров при взаимодействии рацемической смеси соединения с оптически активным разделяющим агентом с образованием пары диастереомеров, которые разделяют, а затем получают оптически чистые энантиомеры. При разделении энантиомеров используют ковалентные производные диастереомеров соединений по настоящему изобретению, предпочтительно диссоциирующие комплексы (такие как, например, кристаллические соли диастереомеров). Диастереомеры характеризуются различными физическими свойствами (такими как, например, температура плавления, температура кипения, растворимость, реакционная способность и т.п.), и, таким образом, их разделяют с учетом указанных различных свойств. Диастереомеры разделяют хроматографией или предпочтительно разделяют с использованием различий в растворимости. Затем получают оптически чистый энантиомер и разделяющий агент любыми стандартными способами, которые не приводят к рацемизации. Более подробное описание методик, пригодных для выделения стереоизомеров соединений из их рацемической смеси, представлено в книге Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, «Enantiomers, Racemates and Resolutions», John Wiley And Sons, Inc., (1981).
Таким образом, соединения формулы I получают способом, который заключается в том, что
(а) проводят реакции, показанные на схеме I и
(б) необязательно превращают соединение по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемую соль,
(в) необязательно превращают соединение по настоящему изобретению в форме соли в соединение по настоящему изобретению в свободной форме,
(г) необязательно превращают соединение по настоящему изобретению в неокисленной форме в фармацевтически приемлемый N-оксид,
(д) необязательно превращают N-оксид соединения по настоящему изобретению в его неокисленную форму,
(е) необязательно выделяют индивидуальный изомер соединения по настоящему изобретению из смеси изомеров,
(ж) необязательно превращают немодифицированное соединение по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемое пролекарство, и
(з) необязательно превращение лекарственной формы соединения по настоящему изобретению в его немодифицированную форму.
Получение исходных материалов не описано, так как известные соединения получают по известным методикам или их получение описано ниже в разделе Примеры.
Описанные выше превращения приведены только для иллюстрации способов получения соединений по настоящему изобретению, другие известные способы также можно использовать для получения соединений по настоящему изобретению.
Примеры
Следующие примеры приведены только для иллюстрации получения соединений по настоящему изобретению формулы I и не ограничивают объем и сущность изобретения.
Пример 1
[2-Метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(3-диэтиламинопропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты
4
3-Трифторметилбензоилхлорид (4,90 г, 31,0 ммоля) добавляли в перемешиваемый раствор 4-метил-3-нитроанилина (1,00 г, 6,57 ммоля) и триэтиламина (1,10 мл, 7,89 ммоля) при 0°С и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушили над MgSO и концентрировали при пониженном давлении, при этом получали неочищенный продукт, который растворяли в МеОН и в раствор добавляли 10% Pd/C. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь затем фильтровали через целит, а полученный фильтрат концентрировали при пониженном давлении, при этом получали N-(3-амино-4-метилфенил)-3-трифторметилбензамид в виде твердого вещества темно-серого цвета.
4
Гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (355 мг, 0,93 ммоля) добавляли в перемешиваемый раствор N-(4-метил-3-нитрофенил)-3-трифторметилбензамида (250 мг, 0,85 ммоля), 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (177 мг, 0,85 ммоля) и диизопропилэтиламина (0,59 мл, 3,4 ммоля) в ДМФА, полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOАс и промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия. Органический слой сушили над MgSO и концентрировали при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт очищали препаративной ЖХВР, при этом получали [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.
[2-Метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (25 мг, 52 мкмоля) растворяли в 3-(диэтиламино)пропиламине и полученную смесь перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Неочищенный продукт разбавляли ДМСО (1 мл) и очищали препаративной ЖХВР, при этом получали [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(3-диэтиламинопропиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты в форме трифторацетата. МС: m/z 534,4 (M+1).
1
6
Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ 9,67 (s, 1Н), 9,43 (ушир., 1Н), 8,35 (t, 1H), 8,29 (s, 1Н), 8,26 (d, 1Н), 7,96 (d, 1Н), 7,94 (s, 1Н), 7,80 (d, 1Н), 7,58 (d, 1Н), 7,25 (d, 1Н), 3,35 (q, 2H), 2,89 (m, 6H), 2,19 (s, 3Н), 1,93 (m, 2H), 1,20 (t, 6H).
Пример 2
[2-Метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты
4
4,6-Дихлор-2-метилпиримидин (5,05 г, 31,0 ммоля) в ДМФА добавляли в суспензию метилового эфира 2-аминотиазол-5-карбоновой кислоты (4,90 г, 31,0 ммоля) и NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 1,36 г, 34,1 ммоля) в ДМФА при 0°С и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия. Органический слой сушили над MgSO и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт кристаллизовали из МеОН, при этом получали метиловый эфир 2-(6-хлор-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты в виде твердого вещества белого цвета.
4 н. NaOH (15 мл) добавляли в перемешиваемый раствор метилового эфира 2-(6-хлор-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты (3,97 г, 14,0 ммоля) в МеОН и полученную смесь перемешивали при 60°С в течение 12 ч. Реакционную смесь нейтрализовали 1 н. НСl, полученный осадок отделяли фильтрованием и промывали МеОН, при этом получали 2-(6-хлор-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновую кислоту в виде твердого вещество белого цвета.
4
Гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (355 мг, 0,93 ммоля) добавляли в раствор 2-(6-хлор-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты (230 мг, 0,85 ммоля), N-(3-амино-4-метилфенил)-3-трифторметилбензамида (250 мг, 0,85 ммоля) и диизопропилэтиламина (0,59 мл, 3,4 ммоля) в ДМФА и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия. Органический слой сушили над MgSO и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали препаративной ЖХВР, при этом получали [2-Метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-(6-хлор-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты в виде твердого вещества белого цвета.
Избыток 2-пиперазин-1-илэтанола (100 мг) в 1,3-диметил-2-имидазолидиноне (0,2 мл) добавляли в перемешиваемый раствор [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амида 2-(6-хлор-2-метилпиримидин-4-иламино)тиазол-5-карбоновой кислоты (25 мг, 46 мкмолей) в 1,3-диметил-2-имидазолидиноне (0,2 мл) и полученную смесь перемешивали при 60°С в течение 4 ч. Неочищенный продукт разбавляли ДМСО (1 мл) и очищали препаративной ЖХВР, при этом получали [2-Метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амид 2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоновой кислоты в форме трифторацетата. МС: m/z 641,5 (M+1).
1
4
Н-ЯМР (400 МГц, MeOH-d): δ 8,26 (s, 1H), 8,20 (d, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,74 (t, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,31 (d, 1H), 6,20 (ушир., 1Н), 3,93 (dd, 2H), 3,50 (ушир., 8Н), 3,35 (dd, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,31 (s, 3H).
Пример 3
{5-[3-(4-Этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-гидроксиэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты
4
Гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (710 мг, 1,9 ммоля) добавляли в перемешиваемый раствор 4-метил-3-нитроанилина (259 мг, 1,7 ммоля), 3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензойной кислоты (514 мг, 1,7 ммоля) и диизопропилэтиламина (1,19 мл, 6,8 ммоля) в ДМФА и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия. Органический слой сушили над MgSO и концентрировали при пониженном давлении, при этом получали неочищенный продукт, который растворяли в МеОН и в раствор добавляли 10% Pd/C. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь затем фильтровали через целит, а фильтрат концентрировали при пониженном давлении, при этом получали N-(3-амино-4-метилфенил)-3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензамид.
4
Гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (355 мг, 0,93 ммоля) добавляли в перемешиваемый раствор N-(3-амино-4-метилфенил)-3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензамида (345 мг, 0,85 ммоля), 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (177 мг, 0,85 ммоля) и диизопропилэтиламина (0,59 мл, 3,4 ммоля) в ДМФА и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь разбавляли EtOAc и промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия. Органический слой сушили над MgSO и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали препаративной ЖХВР, при этом {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.
{5-[3-(4-Этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-бромтиазол-5-карбоновой кислоты (25 мг, 42 мкмоля) растворяли в этаноламине и полученную смесь перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Неочищенный продукт разбавляли ДМСО (1 мл) и очищали препаративной ЖХВР при этом получали {5-[3-(4-этилпиперазин-1-ил)-5-трифторметилбензоиламино]-2-метилфенил}амид 2-(2-гидроксиэтиламино)тиазол-5-карбоновой кислоты в форме трифторацетата. МС: m/z 577,5 (M+1).
1
4
Н-ЯМР (400 МГц, MeOH-d): δ 7,87 (s, 1Н), 7,77 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,51 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,24 (d, 1H), 4,50 (ушир., 2Н), 3,72 (m, 2H), 3,68 (ушир., 2H), 3,45 (m, 2H), 3,22 (ушир., 6Н), 2,23 (s, 3Н), 1,38 (t, 3H).
Соединения формулы I, представленные в таблице 1, получали аналогично тому, как описано в примерах, описанных выше, при использовании соответствующих исходных материалов.
Методы анализа
Соединения по настоящему изобретению оценивали по их способности селективно ингибировать пролиферацию клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-Abl (Ba/F3-p210), по сравнению с исходными клетками BaF3. Соединения, селективно ингибирующие пролиферацию трансформированных клеток BCR-Abl, оценивали по их антипролиферативной активности в отношении клеток Ba/F3, экспрессирующих Bcr-abl дикого типа или мутантные формы, выявленные у пациентов, устойчивых к гливеку (мутации G250E, E255V, T315I, F317L и M351T).
Кроме того, соединения оценивали по их способности ингибировать киназы Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, Flt3 и b-Raf.
Ингибирование клеточной пролиферации, зависимой от BCR-Abl (экспресс-метод)
В качестве клеточной линии использовали мышиную линию Ba/F3 клеток про-В, трансформированных кДНК BCR-Abl (Ba/F3-p210). Указанные клетки культивировали в среде RPMI/10% ЭТС (RPMI/ЭТС), содержащей 50 мкг/мл пеницилина, 50 мкг/мл стрептомицина и 200 мМ L-глютамин. Аналочным методом культивировали нетрансформированные клетки Ba/F3 при добавлении рекомбинантного IL3 мыши.
Ингибирование клеточной пролиферации, зависимой от BCR-Abl
mах
2
50
Клетки Ba/F3-p210 добавляли в лунки 96-луночного планшета ТС при плотности 15000 клеток в лунке. В каждую лунку добавляли по 50 мкл 2-кратных серийных разведений исследуемого соединения (С составляет 10 мкМ, в качестве положительного контроля использовали STI571). После инкубации клеток в течение 48 ч при 37°С и 5% СО в каждую лунку добавляли по 15 мкл реагента МТТ (фирмы Promega) и клетки инкубировали в течение еще 5 ч. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при 570 нм и величину IC, то есть концентрацию соединения, которая требуется для 50% ингибирования, рассчитывали по кривой зависимости ответной реакции от дозы.
Действие на распределение клеточных циклов
6
2
Клетки Ba/F3 и Ba/F3-p210 добавляли в лунки 6-луночного планшета ТС при плотности 2,5×10 клеток в лунке в 5 мл среды и добавляли исследуемое соединение при концентрации 1 или 10 мкМ (в качестве контроля использовали STI571). Клетки инкубировали в течение 24 ч или 48 ч при 37°С и 5% СО. 2 мл Клеточной суспензии промывали ФСБ, фиксировали в 70% EtOH в течение 1 ч и обрабатывали смесью ФСБ/ЕDТА/РНКаза А в течение 30 мин. Добавляли иодид пропидия (Cf составляет 10 мкг/мл) и интенсивность флуоресценции определяли методом проточной цитометрии в системе FACScalibur (BD Biosciences). Установлено, что исследуемые соединения по настоящему изобретению проявляют апоптотический эффект в отношении клеток Ba/F3/p210, но не индуцируют апоптоз исходных клеток Ba/F3.
Действие на автофосфорилирование BCR-Abl в клетках
5
mах
2
Уровень автофосфорилирования BCR-AbI определяли количественно методом ИФА по связыванию с использованием специфических антител против с-abl и антител против фосфотирозина. Клетки Ba/F3-p210 добавляли в лунки 96-луночного планшета ТС при плотности 2×10 клеток в 50 мкл среды в лунке. В каждую лунку добавляли по 50 мкл 2-кратных серийных разведений исследуемого соединения (С составляет 10 мкМ, в качестве положительного контроля использовали STI571). После инкубации клеток в течение 90 мин при 37°С и 5% СO клетки обрабатывали по 150 мкл охлажденного на льду буферного раствора для лизиса (50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ EGTA и 1% NP-40), содержащего ингибиторы протеаз и фосфатаз, в течение 1 ч. В лунки 96-луночного планшета optiplate с предварительно нанесенными специфическими антителами анти-abl, обработанного блокирующим буферным раствором, добавляли по 50 мкл клеточного лизата. Планшеты инкубировали в течение 4 ч при 4°С. После промывки буферным раствором TBS/твин 20 в лунки добавляли по 50 мкл конъюгата атител против фосфотирозина и щелочной фосфатазы и планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. После промывки буферным раствором TBS/твин 20 в лунки добавляли по 90 мкл люминисцентного субстрата и люминисценцию измеряли в системе Acquest (Molecular Devices). Исследуемые соединения по изобретению, которые ингибируют пролиферацию клеток, экспрессирующих BCR-Abl, ингибируют автофосфорилирование клеточной BCR-Abl в зависимости от дозы.
Действие на пролиферацию клеток, экспрессирующих мутантные формы Bcr-abl
50
Соединения по настоящему изобретению оценивали по их антипролиферативной активности в отношении клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-Abl дикого типа или мутантные формы BCR-Abl (мутации G250E, E255V, T315I, F317L и М351Т), которые проявляют устойчивость или пониженную чувствительность к STI571. Антипролиферативное действие указанных соединений на клетки, экспрессирующие мутантные BCR-Abl, и на не трансформированные клетки определяли, как описано выше. Величины IC для соединений, не проявляющих токсичность в отношении нетрансформированных клеток, рассчитывали с использованием кривой зависимости ответной реакции от дозы.
FGFR3 (Ферментативный метод анализа)
2
2
3
4
50
50
Киназную активность очищенной FGFR3 (Upstate) определяли в конечном объеме реакционной смеси 10 мкл, содержащей 0,25 мкг/мл фермента в буферном растворе для определения киназной активности (30 мМ трис-HCl, рН 7,5, 15 мМ MgCl, 4,5 мМ MnCl, 15 мкМ NaVO и 50 мкг/мл БСА) и субстраты (5 мкг/мл биотин-поли-ЕY(CIu, Туr) (CIS-US, Inc.) и 3 мкМ АТФ). Готовили два раствора: в каждую лунку 384-луночного планшета ProxiPlate (Perkin-Elmer) добавляли по 5 мкл первого раствора, содержащего фермент FGFR3 в растворе для определения киназы, и добавляли по 50 нл соединений, растворенных в ДМСО, затем по 5 мкл второго раствора, содержащего субстрат (поли-EY) и АТФ в буферном растворе для определения киназы. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали при добавлении 10 мкл смеси для детектирования HTRF, содержащей 30 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,5 М KF, 50 мМ ETDA, 0,2 мг/мл БСА, 15 мкг/мл стрептавидина-ХL665 (CIS-US, Inc.) и 150 нг/мл конъюгата антител против фосфотирозина и криптата (CIS-US, Inc.). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч, достаточной для взаимодействия стрептавидина с биотином, регистрировали разрешенные во времени сигналы флуоресценции в системе Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Величины IС рассчитывали методом анализа линейной регрессии ингибирования в процентах для каждого соединения при 12 концентрациях (разбавление 1:3 от 50 мкМ до 0,28 нМ). По данным указанного анализа соединения по изобретению характеризуются величиной IС в диапазоне от 10 нМ до 2 мкМ.
FGFR3 (Анализ с использованием клеток)
50
Соединения по изобретению оценивали по их способности ингибировать пролиферацию трансформированных клеток Ba/F3-TEL-FGFR3, которая зависит от активности киназы FGFR3 в клетках. Клетки Ba/F3-TEL-FGFR3 культивировали при плотности 800000 клеток/мл в суспензии в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС. Клетки добавляли в 50 мкл культуральной среды в лунки 384-луночного планшета при плотности 5000 клеток в лунке. Соединения по изобретению растворяли и разбавляли в ДМСО. Получали серийные разведения 1:3 в ДМСО при 12 концентрациях от 10 мМ до 0,05 мкМ. В лунки с клетками добавляли по 50 нл разбавленных соединений и смесь инкубировали в течение 48 ч в инкубаторе для культуральных клеток. Для регистрации восстанавливающей среды, образующейся при пролиферации клеток, к клеткам добавляли реагент AlamarBlue (Trek Diagnostic Systems) при конечной концентрации 10%. После инкубации в течение еще 4 ч при 37°С в инкубаторе для культуральных клеток флуоресцентные сигналы регистрировали при восстановлении реагента AlamarBlue (длина волны возбуждения 530 нм, испускания 580 нм) в системе Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Величины IC рассчитывали методом анализа линейной регрессии ингибирования в процентах для каждого соединения при 12 концентрациях.
FGFR3 и PDGFRβ (Анализ с использованием клеток)
Действие соединений по изобретению на клеточную активность FLT3 и PDGFRβ оценивали аналогичными методами, как описано для клеточной активности FGFR3, но при использовании вместо Ba/F3-TEL-FGFR3 киназ Ba/F3-FLT3-ITD и Ba/F3-Tel-PDGFRβ соответственно.
b-Raf (Ферментативный метод анализа)
Соединения по изобретению оценивали по их способности ингибировать активность киназы b-Raf. Анализ проводили в 384-луночном планшете MaxiSorp (Nunc) с черными стенками и прозрачным дном. В каждую лунку добавляли по 15 мкл субстрата IκBα, разбавленного в буферном растворе DPBS (1:750). Планшет инкубировали при 4° в течение ночи и промывали три раза буферным раствором TBST (25 мМ трис, рН 8,0, 150 мМ NaCl и 0,05% твин-20) с использованием устройства для промывки планшет EMBLA. Планшеты блокировали раствором Superblock (по 15 мкл в лунке) в течение 3 ч при комнатной температуре, промывали 3 раза буферным раствором TBST и сушили постукиванием. В каждую лунку добавляли по 10 мкл буферного раствора для анализа, содержащего 20 мкМ АТФ, затем по 100 нл или 500 нл соединения. В-Raf разбавляли в буферном растворе для анализа (1 мкл в 25 мкл) и в каждую лунку добавляли по 10 мкл разбавленного раствора b-Raf (0,4 мкг в лунке). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Киназную реакцию останавливали при промывке планшетов 6 раз раствором TBST. Антитела Phosph-IicBa (Ser32/36) разбавляли в растворе Superblock (1:10000) и в каждую лунку добавляли по 15 мкл. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи и промывали 6 раз раствором TBST. Конъюгат АР-козий антимышиный IgG разбавляли раствором Superblock (1:1500) и в каждую лунку добавляли по 15 мкл. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и промывали 6 раз раствором TBST. В каждую лунку добавляли по 15 мкл флуоресцентного субстрата Attophos АР (Promega) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Планшеты считывали в системе Acquest или Analyst GT с использованием программы для измерения интенсивности флуоресценции (длина волны возбуждения 455 нм, испускания - 580 нм).
B-Raf (Анализ с использованием клеток)
Соединения по изобретению оценивали по их способности ингибировать фосфорилирование МЕК в клетках А375. Клеточная линия A3 75 (АТСС) получена из ткани пациента с меланомой и включает мутацию V599E в гене В-Raf. Уровни фосфорилированной МЕК повышаются за счет мутации B-Raf. Клетки А375 в фазе от субконфлюентной до конфлюентной инкубировали в присутствии соединений в течение 2 ч при 37°С в среде, не содержащей сыворотку. Затем клетки промывали один раз холодным ФСБ и лизировали в буферном растворе для лизиса, содержащем 1% тритон X100. После центрифугирования супернатанты наносили на полиакриламидный гель и проводили электрофорез ПААГ-ДСН, а затем зоны переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны подвергали вестерн-блоттингу в присутствии антител anti-phospho-MEK (ser217/221, Cell Signaling). Количество фосфорилированной МЕК определяли по плотности зон phosphor-MEK на нитроцеллюлозной мембране.
Upstate KinaseProfiler (Радиоферментативный анализ связывания на фильтре)
2
2
32
32
Соединения по изобретению оценивали по их способности ингибировать индивидуальные киназы из специальной панели киназ. Соединения анализировали в двух повторах при конечной концентрации 10 мкМ по следующей общей методике. Следует учитывать, что состав буферного раствора для анализа киназы и субстраты изменяются в зависимости от различных киназ, включенных в панель Upstate KinaseProfiler. В пробирке эппендорф на льду смешивали буферный раствор для анализа киназы (2,5 мкл, 10х, содержащий при необходимости MnCl), активную киназу (0,001-0,01 Ед., 2.5 мкл), специфический пептид или поли(Glu4-Туr) (5-500 мкМ или 0,01 мг/мл) в буферном растворе для анализа киназы и буферный раствор для анализа киназы (50 мкМ, 5 мкл). Затем добавляли смесь Mg/АТФ (10 мкл, 67,5 (или 33,75) мМ MgCl, 450 (или 225) мкМ АТФ и 1 мкКи/мкл [γ-P]-АТФ (3000 Ки/ммоль) и реакционную смесь инкубировали при приблизительно 30°С в течение приблизительно 10 мин. Реакционную смесь наносили (по 20 мкл) на квадратики материала размером 2 × 2 см следующего типа: Р81 (фосфоцеллюлоза для положительно заряженных пептидных субстратов) или ватман №1 (для пептидного субстрата поли(Glu4-Tyr). Квадратики промывали 4 раза каждый раз в течение 5 мин 0,75% фосфорной кислотой и один раз ацетоном в течение 5 мин. Квадратики переносили в сцинцилляционные флаконы, добавляли 5 мл сцинцилляционной смеси и определяли включение Р (имп/мин) в пептидный субстрат на сцинцилляционном счетчике Beckman. Для каждой реакционной смеси рассчитывали процент ингибирования.
50
-10
-5
Соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли проявляют ценные фармакологические свойства, например, по данным анализа in vitro, как описано в данном контексте. Например, величина IС для соединений формулы I предпочтительно находится в диапазоне от 1×10 до 1×10 М, предпочтительно менее 150 нМ в отношении по крайней мере одной из следующих киназ: Abl, Всr-Аbl, FGFR3, PDGFRβ, b-Raf и Flt-3. Например,
50
(1) величина IC для [2-метил-5-(3-трифторметилбензоиламино)фенил]амида 2-[6-(4-этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты (пример 8) составляет 5 нМ, 2,29 мкМ, 12 нМ, 1,27 мкМ, 5 нМ и 5 нМ в отношении киназы дикого типа, G250E, E255V, T315I, F317L и М351Т Всr-аbl соответственно,
50
(2) величина IС для {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-тирфторметилбензоиламино]фенил}амида 2-[6-(4-этилпиперазин-1-ил)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты (пример 29) составляет 8 нМ и 570 нМ в отношении киназы дикого типа и T351I Bcr-Аbl соответственно,
50
(3) величина IС для {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-тирфторметилбензоиламино]фенил}амида 2-(2-метил-6-морфолин-4-илпиримидин-4-иламино)тиазол-a-карбоновой кислоты (пример 28) составляет 5 нМ в отношении PDGFRβ и
50
(4) величина IС для {2-метил-5-[3-(4-метилимидазол-1-ил)-5-тирфторметилбензоиламино]фенил}амида 2-[6-(2-гидроксиэтиламино)-2-метилпиримидин-4-иламино]тиазол-5-карбоновой кислоты (соединение 5) составляет 41 нМAв отношении Flt-3.
Процент ингибирования одной из следующих киназ: Abl, Bcr-Abl, FGFR3, PDGFRβ, b-Raf и Flt-3 соединениями формулы I при концентрации 10 мкМ предпочтительно составляет более 50%, предпочтительно более приблизительно 70%.
Следует понимать, что представленные в данном описании примеры и варианты осуществления изобретения даны только для иллюстрации изобретения и что для специалистов в данной области техники представляется очевидным, что возможны различные модификации и изменения, которые включены в объем и сущность изобретения, как определено в формуле изобретения. Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в данном контексте, включены в данное описание в качестве ссылок.