Флуориметр

Полезная модель относится к системам для гидробиологических исследований и предназначена для мониторинговой и экспериментальной работы in situ с фотосинтезирующими микроорганизмами (фитопланктоном) пресноводных и морских экосистем, в частности она может быть использована для обнаружения антропогенного загрязнения акваторий по специфическим изменениям формы кривых индукции и релаксации быстрой флуоресценции и кривых индукции замедленной флуоресценции хлорофилла живых клеток фитопланктона, взвешенных в пробе воды.
Известен способ и устройство для его осуществления [патент на изобретение RU2354958] для флуориметрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных микроорганизмов. Измерительная камера устройства имеет ось радиальной симметрии для возможности размещения большого количества источников возбуждающего света и увеличения отношения сигнал/шум. В центре камеры на ее оси размещен образец в стационарной проточной или съемной цилиндрической кювете. Вокруг кюветы радиально симметрично расположены источники возбуждающего света с длиной волны 400…500 нм, излучение каждого из которых направлено в центр измерительной камеры. Детектор (фотоэлектронный умножитель) расположен на оси измерительной камеры и принимает от кюветы с образцом излучение быстрой флуоресценции на длине волны более 680 нм.
Короткими (5 мкс) импульсами возбуждающего света, которые следуют с темновыми промежутками не менее 50 мс, устройство повторно измеряет и усредняет значения базового уровня флуоресценции хлорофилла Fo в условиях, приближенных к темноте. Затем длинным импульсом возбуждающего света с продолжительностью 1 мс…1 с устройство регистрирует кривую индукции быстрой флуоресценции хлорофилла с временным разрешением 1…10 мкс. Известное устройство обладает достаточной чувствительностью для регистрации сигналов быстрой флуоресценции хлорофилла от живых клеток фитопланктона при содержании хлорофилла в пробе от 0.01 мкг/л, однако оно не предназначено для измерения кривых релаксации быстрой флуоресценции хлорофилла.
Известен «fast repetition rate» (FRR) флуориметр [патент на изобретение US5426306] для измерения in situ флуоресценции (быстрой) и определения фотосинтетических параметров фитопланктонных организмов. Прибор выполнен в виде герметичного погружаемого устройства, содержит источник мощных импульсов возбуждающего света на газоразрядной лампе-вспышке, вспомогательный измеритель энергии возбуждающих вспышек - фотодиод, приемник флуоресценции хлорофилла - фотоэлектронный умножитель, программируемый контроллер, и блоки усиления, оцифровки и хранения сигналов. Измерение кривой индукции быстрой флуоресценции хлорофилла осуществляется при помощи серии коротких (1…2 мкс) возбуждающих импульсов, следующих с постоянной заранее заданной частотой в диапазоне 10…250 кГц. Для повышения отношения сигнал/шум применяется синхронное детектирование импульсов флуоресценции. Известный флуорометр имеет возможность регистрации кривых индукции и релаксации быстрой флуоресценции хлорофилла в природных водоемах.
Известна лабораторная система регистрации индукции и релаксации флуоресценции (быстрой) хлорофилла [A chlorophyll fluorescence induction and relaxation system for the continuous monitoring of photosynthetic capacity in photobioreactiors / T. Antal, I. Konyukhov, A. Volgusheva et al. // Physiologia Plantarum. — 2018.], которая использует импульсный FRR-протокол для возбуждения и синхронного детектирования флуоресценции. Вместо газоразрядной лампы-вспышки установка имеет стабильный светодиодный источник возбуждающих импульсов с длиной волны 450 нм. Детектором флуоресценции служит кремниевый фотодиод. Управление прибором, хранение данных, их обработка и отображение возложено на внешний персональный компьютер. Работа известной системы описана в указанном источнике на примере эксперимента с плотными суспензиями клеток водорослей (более 1000 мкг/л хлорофилла «а»), где в системе установлена проточная кювета малого оптического пути (2 мм), ввиду чего невозможно оценить реальные возможности этой системы по параметрам сигнал/шум на образцах с содержанием хлорофилла «а» менее 1 мкг/л.
Все указанные выше устройства не имеют в кюветном отделении мешалки, что не позволяет проводить автоматизированное накопление и усреднение зашумленных сигналов от образцов воды с содержанием хлорофилла «а» менее 1 мкг/л. Кроме того, известные устройства не предназначены для измерения кривых индукции замедленной флуоресценции хлорофилла, которые в ряде случаев оказываются более чувствительными, чем параметры быстрой флуоресценции, к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.
Наиболее близким из известных технических решений к описываемому устройству является серийно выпускаемый прибор M-PEA-2 (флуориметр с функциями измерения светопоглощения P700 и задержанной флуоресценции хлорофилла, Hansatech) [брошюра по флуориметру M-PEA-2 – https://labinstruments.ru/equipment-fluorimetry-dlya-izmereniya-fluorestsentsii-khlorofilla/m-pea-2#pdf], предназначенный для работы с листьями высших растений и концентрированными суспензиями одноклеточных водорослей и цианобактерий. В известном приборе возбуждение молекул хлорофилла осуществляется мощными синими светодиодами в соответствии с импульсным FRR-протоколом [Kolber Z. S., Prášil O., Falkowski P. G. (1998). Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochim. Biophys. Acta 1367, 88–106.], а синхронное детектирование быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла обеспечивается двумя независимыми фотоприемниками, сигналы от которых фиксируются устройством выборки-хранения в различные моменты времени относительно начала и окончания генерации возбуждающего импульса. В момент генерации возбуждающих импульсов p-i-n фотодиодом измеряется быстрая флуоресценция хлорофилла (БФХ), а в промежутках между возбуждающими импульсами лавинным фотодиодом измеряется замедленная флуоресценция хлорофилла (ЗФХ). Последовательность отчетов (выборок) сигнала быстрой флуоресценции и последовательность отчетов сигнала замедленной флуоресценции, которые записываются в память прибора в ответ на одну и ту же последовательность возбуждающих импульсов представляют собой кривые индукции быстрой и замедленной флуоресценции, соответственно.
Главный недостаток известного прибора заключается в малой чувствительности детекторов БФХ и ЗФХ и невозможности по этой причине проводить измерения кривых индукции БФХ и ЗФХ на образцах природного фитопланктона. Его измерительная камера не приспособлена к размещению образца природной воды. Кроме того известный прибор не обеспечивает измерение кривых релаксации быстрой флуоресценции хлорофилла. Также известный прибор требует регулировку чувствительности детекторов сигналов при смене природного образца на лабораторный.
Технической задачей предлагаемого флуориметра является повышение точности измерений и увеличение чувствительности к небольшим изменениям фотосинтетической активности клеток фитопланктона, которые происходят под действием естественных и антропогенных факторов среды. Также задачей является обеспечение возможности проведения измерений без регулировки чувствительности детекторов сигналов от природной воды и от лабораторных культур.
Повышение чувствительности в канале БФХ достигается применением кюветы большого объема (не менее 20 мл) и малошумящего усилителя постоянного тока с каскадом, уменьшающим влияние паразитной емкости фотодиода на выходной шум усилителя.
Повышение чувствительности в канале ЗФХ достигается применением кюветы большого объема, использованием фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и отказом от использования механического затвора, обычно устанавливаемого перед ФЭУ, в пользу оригинальной схемы электронного управления усилением ФЭУ. Отсутствие затвора позволяет приблизить фотокатод ФЭУ ближе к источнику сигнала (кювете), а меньшее время переключения электронной схемы управления усилением позволяет детектировать наиболее интенсивные микросекундные компоненты затухания ЗФХ.
Дополнительное уменьшение (до 10 раз) амплитуды высокочастотных шумов (теплового и дробового) в каналах ЗФХ и БФХ достигается автоматическим проведением повторных измерений без замены образца с последующим усреднением сигналов. Для этого в измерительной камере предусмотрена магнитная мешалка.
Повышение точности измерения кривых индукции и релаксации БФХ в присутствии естественного фона флуоресценции растворенных в воде органических веществ (гумусовых и фульвовых кислот) достигается повышением стабильности интенсивности возбуждающего излучения за счет применения светодиодов с низким тепловым сопротивлением кристалл-подложка (2 К/Вт), их монтажом на радиаторах и питанием импульсами тока повышенной стабильности от источников тока, управляемых напряжением, которые защищены от воздействия электромагнитных помех со стороны других электронных блоков экранами 6
Повышение точности измерений достигается использованием стационарной кюветы установленной на уплотнительном кольце вместо использования съемной кюветы. Данная мера существенно улучшает его характеристики при работе с предельно низким содержанием хлорофилла в пробах. Это происходит за счет исключения выпадения конденсата на наружных стенках кюветы, исключения появления царапин и прочих загрязнений на наружных стенках кюветы, исключения случайных поворотов кюветы и в результате – высокой воспроизводимости уровня фона пустого кюветного отделения при смене образцов.
Возможность измерений без регулировки чувствительности детекторов сигналов от природной воды и от лабораторных культур обеспечивается использованием вспомогательного преобразователя напряжения, который подаёт повышенное питающее напряжение +37 В на усилители постоянного тока.
Для решения технической задачи предлагается флуориметр, состоящий из корпуса в котором располагается кювета, с двух сторон от которой диаметрально противоположно расположены светодиоды, источники тока, светофильтры, коллиматоры, а перпендикулярно линии светодиодов расположен фотодиод с усилителем постоянного тока и коротковолновым граничным светофильтром, а также в корпусе расположена плата сигнального процессора, содержащая микроконтроллер, к которому подключен универсальный последовательный приемопередатчик, соединённый через микросхему защиты от статического электричества с внешним разъёмом, причём диаметрально противоположно фотодиоду расположен фотоэлектронный умножитель с усилителем постоянного тока, коротковолновым граничным светофильтром и высоковольтным делителем напряжения, плата сигнального процессора содержит резистивный сумматор, соединённый с усилителями постоянного тока и аналого-цифровым преобразователем, который соединён с микроконтроллером, при этом кювета имеет объём не менее 20 мл и является стационарной, установленной в корпусе через уплотнительное кольцо, под кюветой расположена магнитная мешалка, подключенная через понижающий импульсный преобразователь напряжения к микроконтроллеру, каждый усилитель постоянного тока выполнен малошумящим с каскадом, светодиоды имеют тепловое сопротивление кристалл-подложка около 2 К/Вт и смонтированы на радиаторах, каждый источник тока управляется напряжением, полученным от формирователя образцовых импульсов напряжения, который со светодиодом и источником тока защищены электростатическим экраном, а высоковольтный делитель напряжения подключен в свою очередь к источнику постоянного высокого напряжения и микроконтроллеру.
Дополнительно фотодиод с усилителем постоянного тока и фотоэлектронный умножитель с усилителем постоянного тока и высоковольтным делителем напряжения защищены электростатическим экраном.
Кроме того усилители постоянного тока подключены к микроконтроллеру через повышающий импульсный преобразователь напряжения.
Блок-схема описываемой полезной модели показана на фиг. 1.
Поперечное сечение установленной кюветы показано на фиг. 2.
Временные диаграммы интенсивности возбуждающего света и измерение индукции и релаксации БФХ без регистрации ЗФХ показаны на фиг. 3.
Временные диаграммы интенсивности возбуждающего света, напряжения на высоковольтном делителе, а также БФХ и ЗФХ в виде импульсов фототока показаны на фиг. 4.
Устройство состоит из следующих элементов:
1. Корпус.
2. Светодиод.
3. Источник тока, управляемый напряжением (ИТУН).
4. Формирователь импульсов.
5. Радиатор.
6. Электростатический экран.
7. Длинноволновой граничный светофильтр.
8. Коллиматор.
9. Фотодиод.
10. Усилитель постоянного тока (УПТ).
11. Фотоэлектронный умножитель (ФЭУ).
12. Высоковольтный делитель напряжения.
13. Коротковолновой граничный светофильтр.
14. Кювета.
15. Магнитная мешалка.
16. Источник постоянного высокого напряжения.
17. Высоковольтный кабель.
18. Плата сигнального процессора.
19. Резистивный сумматор.
20. Аналого-цифровой преобразователь (АЦП).
21. Микроконтроллер.
22. Универсальный последовательный приемопередатчик.
23. Понижающий импульсный преобразователь напряжения.
24. Повышающий импульсный преобразователь напряжения.
25. Микросхема защиты от статического электричества.
26. Внешний разъём.
27. Уплотнительное кольцо.
Корпус 1 выполнен из токопроводящего материала, например дюралюминия.
Светодиод 2 имеет длину волны 448 нм и рабочий ток 1000 мА.
Формирователь импульсов 4 формирует образцовые импульсы напряжения прямоугольной формы.
Электростатический экран 6 гальванически соединён с корпусом 1.
Длинноволновой граничный светофильтр 7 может быть выполнен из стекла марки СЗС-22 для подавления длинноволновых  компонент в спектре светодиодов 2.
Коллиматор 8 выполнен на двух сферических линзах.
2
Фотодиод 9 является кремниевым p-i-n фотодиодом или группой параллельно включённых фотодиодов (в реализованном экземпляре имеющими суммарную площадь 23 мм).
Усилитель постоянного тока 10 выполнен трансимпендансным малошумящим с верхней граничной частотой 400 кГц (-3 дБ).
Фотоэлектронный умножитель 11 выполнен с мультищелочным фотокатодом.
Высоковольтный делитель напряжения 12 выполнен с быстродействующей схемой управления усилением ФЭУ 11.
Коротковолновой граничный светофильтр 13 выполнен из двух стекол марки ПС-8 и КС-17 для подавления коротковолнового возбуждающего излучения (448 нм), рассеянного образцом в направлении фотодетекторов.
Кювета 14 имеет ёмкость не менее 20 мл и выполнена цилиндрической из прозрачного материала (например, акрила или стекла) со светонепроницаемой крышкой.
Магнитная мешалка 15 имеет привод (бесколлекторный двигатель постоянного тока), который установлен под кюветой 14.
Источник постоянного высокого напряжения 16 (-500 В, 1 мА) подключается через 12-вольтовый сетевой адаптер в осветительную сеть напряжением 220 В или в автономном (полевом) варианте – к 12-вольтовой аккумуляторной батарее (на фигуре не показаны).
Высоковольтный кабель 17 выполнен с герметичным вводом в корпус 1.
Резистивный сумматор 19 выполнен с активным буферным выходным каскадом.
Универсальный последовательный приемопередатчик 22 представляет собой USB-устройство, создающее в операционной системе внешнего персонального компьютера виртуальный последовательный порт.
Понижающий импульсный преобразователь напряжения 23 имеет характеристики +3,5 В 200 мА и выполнен с внешним логическим управлением.
Повышающий импульсный преобразователь напряжения 24 имеет характеристики +37 В 200 мА и выполнен с внешним логическим управлением.
Внешний разъём 26 является разъёмом для подключения внешнего USB-кабеля.
Практически все электронные компоненты получают электрическое питание от +5 В шины питания USB-интерфейса внешнего персонального компьютера – непосредственно (ИТУН 3, формирователь импульсов 4, микроконтроллер 21, микросхема 22), через дополнительные DC-DC преобразователи (+3.5 В на привод магнитной мешалки 15 и +37 В на УПТ 10) или линейный стабилизатор напряжения (+2.5В на АЦП 20). Питание высоковольтного делителя напряжения 12 приходит от источника 16, без которого устройство полностью сохраняет работоспособность в части регистрации кривых индукции и релаксации БФХ.
Описываемая полезная модель работает следующим образом. Образец природной воды, содержащий в себе клетки фитопланктона, помещают в кювету 14, которая установлена стационарно в корпусе 1 через уплотнительное кольцо 27. Далее образец подвергается импульсному световому облучению светодиодами 2. Индуцированное возбуждающим светом излучение быстрой флуоресценции хлорофилла и излучение замедленной флуоресценции хлорофилла детектируется фотодиодом 9 и ФЭУ 11, соответственно, под прямым углом к направлению распространения возбуждающего света.
Источником возбуждающего света служат два синих светодиода 2, включение и выключение которых происходит синхронно. Светодиоды 2 установлены диаметрально противоположно относительно цилиндрической кюветы 14. Длинноволновые компоненты излучения светодиодов 2, попадание которых в измерительную камеру крайне нежелательно, подавляются длинноволновыми светофильтрами 7. Расходящийся поток излучения каждого светодиода 2 собирается коллиматором 8 в направленный пучок диаметром меньше, чем диаметр кюветы 14. В реализованном образце диаметр пучка составил около 2,5 см, что с одной стороны обеспечивает захват как можно большего числа клеток фитопланктона в пробе, а с другой стороны – создаёт необходимую плотность потока фотонов для постепенного насыщения процессов фотосинтеза в клетках фитопланктона, что необходимо для записи кривых индукции быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла.
-2
-1
-2
-1
Суммарная интенсивность возбуждающего света в кюветном отделении в режиме непрерывного свечения светодиодов  2 - 15000 мкмоль·м·с, а учетом импульсной модуляции при измерениях кривых индукции БФХ и ЗФХ - не менее 1000 мкмоль·м·с.
Помимо большой мощности светового излучения от светодиодов 2 требуется высокая стабильность генерируемых световых импульсов по амплитуде. Дестабилизирующими факторами в данном случае являются нестабильность питающего напряжения на USB-шине компьютера, изменение КПД светодиодов 2 при их разогреве и изменение прямого напряжения на p-n переходе светодиодов 2, которое также происходит при их разогреве во время интенсивной и продолжительной работы при записи кривых индукции быстрой и замедленной флуоресценции. Во флуориметре увеличение стабильности амплитуды возбуждающих световых импульсов достигается применением светодиодов 2 с низким тепловым сопротивлением кристалл-подложка (2 К/Вт), их монтажом на радиаторах 5 и питанием импульсами тока повышенной стабильности.
Импульсы тока прямоугольной формы вырабатываются по логическим командам на включение и выключение от микроконтроллера 21. При этом вначале логические импульсы поступают от микроконтроллера 21 на формирователь импульсов 4 с амплитудой 200 мВ, а затем сформированные импульсы напряжения преобразуются ИТУН 3 в импульсы тока с амплитудой 1000 мА. Светодиод 2, ИТУН 3 и формирователь импульсов 4 защищены от воздействия электромагнитных помех со стороны других электронных блоков экранами 6.
Во время генерации импульса возбуждающего света светодиодами 2 образец испускает БФХ в спектральной области 670…800 нм. Некоторая доля этого излучения после прохождения через коротковолновой граничный светофильтр 13 попадает на фотодиод 9 и преобразуется им в электрический ток (фототок). Фототок поступает на вход УПТ 10 и преобразуется им в пропорциональное выходное напряжение. Динамический диапазон УПТ 10 расширен в сторону перегрузки за счет использования повышенного питающего напряжения +37 В, которое поступает на УПТ 10 от вспомогательного преобразователя напряжения 24. Фотодиод 9 и УПТ 10 защищены от воздействия электромагнитных помех со стороны других электронных блоков экранами 6.
3
5
По окончанию импульса возбуждающего света излучение БФХ спадает за время порядка 1 нс, однако образец продолжает испускать в спектральной области 670…800 нм в сотни раз более слабое свечение ЗФХ. Некоторая доля этого излучения после прохождения через красный граничный светофильтр 13 попадает на фотокатод ФЭУ 11 и преобразуется им в электрически ток – катодный ток. Катодный ток усиливается внутри ФЭУ 11 в 10…10 раз в режиме высокой чувствительности. Фототок поступает на вход УПТ 10 и преобразуется им в пропорциональное выходное напряжение.
Выходные напряжения УПТ 10 передаются на плату сигнального процессора 18 для дальнейшего преобразования в числовую форму в аналого-цифровом преобразователе 20. Так как сигналы БФХ и ЗФХ разделены во времени, то они могут быть переданы на одноканальный АЦП 20 после выполнения аналоговой операции суммирования, которая происходит в резистивном сумматоре 19.
3
4
Излучение БФХ, которое попадает на фотокатод ФЭУ 11 во время действия возбуждающих световых импульсов, может повредить ФЭУ 11, находящийся в режиме высокой чувствительности (усиления). Поэтому, на момент генерации возбуждающих импульсов и в течение всего времени бездействия прибора ФЭУ 11 переключается микроконтроллером 21 в режим низкой чувствительности, в котором внутреннее усиление ФЭУ снижено в 10…10 раз. Благодаря этому ФЭУ 11 также выдерживает открытие затемненной измерительной камеры при смене образцов в кювете 14. Внутренне усиление ФЭУ 11 регулируется величиной высокого напряжения, приложенного к его диодной системе. Высоковольтное питание ФЭУ 11 поступает по кабелю 17 от источника 16, а переключение ФЭУ 11 из режима низкой чувствительности в режим высокой чувствительности осуществляется микроконтроллером 21 посредством высоковольтного делителя напряжения 12 с электронной схемой управления усилением. УПТ 10, ФЭУ 11 и высоковольтный делитель напряжения 12 защищены от воздействия электромагнитных помех со стороны других электронных блоков экраном 6.
Флуориметр работает только при его подключении к внешнему персональному компьютеру через внешний разъем 26 посредством USB-кабеля. Губительные для электронных блоков флуориметра разряды статического электричества, проникающие в проводники USB-кабеля при взятии его в руки или в момент подключении USB-кабеля к компьютеру, шунтируются на заземляющий проводник кабеля микросхемой защиты 25. Согласованная работа отдельных электрических компонентов флуориметра обеспечена микроконтроллером 21, расположенным на плате сигнального процессора 18. Микроконтроллер 21 также взаимодействует с управляющей программой, исполняемой в операционной системе компьютера на момент подключения устройства, получая от нее команды изменения настроек, команды включения и отключения привода магнитной мешалки 15 и команды на запуск измерений кинетических кривых быстрой и замедленной флуоресценции. Передача управляющих команд с компьютера на микроконтроллер 21 и передача результатов измерений от микроконтроллера 21 на компьютер происходит через универсальный последовательный приёмо-передатчик  22.
Основное назначение микроконтроллера 21 – обеспечение четкого контроля по времени исполнения определенной последовательности действий:
-включения и выключения светодиодов 2;
-переключения ФЭУ 11 из режима низкой чувствительности в режим высокой чувствительности и обратно в высоковольтном делителе напряжения 12;
-передачи команд запуска аналого-цифрового преобразования на АЦП 20 в соответствии с протоколом измерения сигналов БФХ и ЗФХ и своевременное чтение данных с АЦП 20.
АЦП 20 (выполненный, например 16-битным малошумящим) позволяет без изменения чувствительности детекторов охватить весь природный диапазон по содержанию хлорофилла «а» 0,05…100 мкг/л. Уровень высокочастотного шума, поступающего на вход АЦП 20 от УПТ 10 приведен к уровню нескольких младших разрядов АЦП 20 (от пика до пика). Это даёт возможность использовать технологию повторного сэмплирования для увеличения эффективной разрядности АЦП 20, для уменьшения уровня дифференциальной нелинейности АЦП 20 и в итоге – для надежной регистрации слабых сигналов с амплитудой на уровне 5…10 младших разрядов АЦП 20.
Флуориметр поддерживает два разных режима измерений, которые отличаются друг от друга временной схемой управления возбуждающим светом, управления чувствительностью ФЭУ 11 и управления АЦП 20. Далее по тексту эти схемы управления будут названы протокол 1 и протокол 2.
Протокол 1 предназначен для измерения кривых индукции и релаксации БФХ. В этом режиме ФЭУ 11 не используется, и все время пребывает в режиме низкой чувствительности. В наиболее полном варианте (фиг. 3) измерение начинается с кратковременного (1…2 секунды) перемешивания образца в кювете 14, для чего микроконтроллер 21 включает источник питания 23 привода магнитной мешалки 15. После остановки магнитной мешалки 15 управляющая программа выдерживает паузу, необходимую для полной остановки движения клеток фитопланктона в кювете 14 (около 20 секунд). Далее происходит определение базового уровня БФХ – так называемой величины Fo [Kolber Z. S., Prášil O., Falkowski P. G. (1998). Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochim. Biophys. Acta 1367, 88–106.] – при помощи нескольких импульсов возбуждающего света длительностью 4 мкс. Частота следования световых импульсов на этой фазе измерений равна 0.5 Гц (фиг. 3, левая область диаграмм). При такой малой частоте следования квантовый выход БФХ не изменяется во времени, а повторная регистрация одного и того же уровня БФХ используются в дальнейшем для усреднения и увеличения точности определения Fo в присутствии шумов.
Выходной сигнал от УПТ 10 фотодиода 9 также представляет собой вид одиночных импульсов, форма которых близка к прямоугольной (кривая «Интенсивность БФХ» на фиг. 3). По командам от микроконтроллера 21 АЦП 20 делает выборку сигнала на «верхушке» каждого импульса БФХ и еще одну выборку сигнала в течение 6 мкс после окончания каждого импульса БФХ. Полезный сигнал БФХ вычисляется как разница этих двух выборок. Такое детектирование полностью устраняет влияние сдвига УПТ 10 по постоянному току, в том числе за счет наличия темнового тока фотодиода 9, а также устраняет влияние всех компонент ЗФХ. Если они и вносят какой-то вклад в общий световой поток, принимаемый фотодиодом 9, то они не успевают релаксировать за 6 мкс после отключения возбуждающего света (интервал между двумя выборками напряжения) и при вычислении разности дают ноль.
-2
-1
-2
-1
Чтобы измерить кривую индукции БФХ микроконтроллер скачком увеличивает частоту следования возбуждающих световых импульсов от 0.5 Гц до 100 кГц. Амплитуда импульсов (15000 мкмоль·м·с) и их продолжительность (4 мкс) не изменяются. Эта фаза измерений показана на временных диаграммах фиг. 3 в средней области. С учетом темновых промежутков между возбуждающими импульсами средняя плотность потока квантов при измерении кривой индукции БФХ по протоколу 1 составляет 6000 мкмоль·м·с:
средн
-2
-1
-2
-1
PFD= 15000 мкмоль·м·с 4 мкс/(4 мкс+6 мкс)= 6000 мкмоль·м·с.
Данные об амплитуде БФХ передаются на персональный компьютер в режиме реального времени индукции через каждые 200 мкс и сохраняются в его оперативной памяти.
Затем флуориметр записывает кривую релаксации БФХ. Для этого используется фиксированная последовательность из 18 импульсов возбуждающего света (4 мкс), интервал между которыми увеличивается в геометрической прогрессии. Последовательность схематично показана в правой части временных диаграмм на фиг. 3. Общая длина кривой релаксации 20 с.
-2
-1
-2
-1
Протокол 2 предназначен для одновременного измерения кривых индукции БФХ и ЗФХ и показан на фиг. 4. Фаза измерения базового уровня флуоресценции Fo здесь не предусмотрена. Для записи кинетических кривых индукции БФХ и ЗФХ использована последовательность импульсов возбуждающего света одинаковой амплитуды (15000 мкмоль м с) и следующих с постоянной частотой 5 кГц (интервал 200 мкс). Продолжительность импульсов возбуждающего света 12,5 мкс. С учетом темновых промежутков между возбуждающими импульсами средняя плотность потока квантов при измерении кривой индукции БФХ и ЗФХ по протоколу 2 составляет 1000 мкмоль·м·с:
средн
-2
-1
-2
-1
PFD= 15000 мкмоль·м·с 12.5 мкс/200 мкс ≈ 1000 мкмоль·м·с.
Процесс импульсного возбуждения синхронизирован с периодическим переключением ускоряющего напряжения на диодах ФЭУ 11 (кривая «Напряжение на высоковольтном делителе ФЭУ» на фиг. 4). Соотношение интенсивности БФХ и ЗФХ, а также работа схемы управлении усилением ФЭУ таковы, что в каждый конкретный момент времени выходной сигнал одного из детекторов (или БФХ, или ЗФХ) близок к нулю. Импульсы флуоресценции, принятые фотодиодом 9 (БФХ) и принятые ФЭУ 11 (ЗФХ), показаны на отдельных диаграммах на фиг. 4 (кривые «БФХ» и «ЗФХ», соответственно).
АЦП 20 делает выборку сигнала на «верхушке» каждого импульса БФХ и еще одну выборку сигнала в течение 6 мкс после спада каждого импульса БФХ. Полезный сигнал БФХ вычисляется как разница этих двух выборок. Амплитуда сигнала ЗФХ вычисляется также как разница двух уровней напряжения, пришедших на АЦП: первого - в режиме высокого усиления ФЭУ и второго – в режиме низкого усиления ФЭУ перед началом следующего импульса возбуждения. Данные об амплитуде БФХ и ЗФХ передаются на персональный компьютер в режиме реального времени индукции через каждые 200 мкс и сохраняются в памяти компьютера.
В случае низкого отношения сигнал/шум кривые индукции БФХ и ЗФХ могут быть измерены на одной и той же пробе фитопланктона повторно до 100 раз с соблюдением интервалов темновой адаптации. Для проведения таких длительных серий в автоматическом режиме используются магнитная мешалка 15.
Технический результат состоит в повышении точности измерений и снижении трудоёмкости получения данных. Существенно (в десятки раз) увеличена чувствительность канала ЗФХ в сравнении с прототипом. Также обеспечивается возможность использования флуориметра, обладающего высокой чувствительностью к естественным и антропогенным факторам среды, в экологическом мониторинге.