Изменчивость субфракций гистона h1, изоферментные спектры аскорбатпероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы листовой ткани Nicotiana tabacum L. различной степени дифференцированности

2. Алиев Д.А., Акпаров З.И. Растительные генетические ресурсы Азербайджана // Известия НАНА. Серия биол. наук. - 2002. - № 11-6. - С. 16-22.

3. Аскеров А.М. Таксономоческий обзор видов рода Astragalus (Fabaceae) Азербайджана // Бот. журн. - 1991. - Т. 76, № 11. - С. 1607-1612.

4. Аскеров А.М. Высшие растения Азербайджана. - Баку: Элм, Т. I, 2005. - 248 с.; Т. II, 2006. - 246 с.; Т. III, 2008. - 244 c.

5. Брежнев Д.Д., Коровина О.Н. Дикие сородичи культурных растений флоры СССР. - М.: Колос, 1980. - 376 с.

6. Гроссгейм А.А. Растительные богатства Кавказа. - М.: Изд-во Моск. об-ва испыт. природы, 1952. - 671с.

7. Флора Азербайджана. - Баку: Изд-во АН Азерб. ССР. - Т. I, 1950. - 370 с.; Т. II, 1952. - 317 с.; Т. III, 1952. - 406 с.; Т. IV, 1953. - 401 с.; Т. V, 1954. - 579 с.; Т. VI, 1955. - 539 с.; Т. VII. - 646 с.; Т. VIII. -688 c.

8. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. - М.: Колос, 1971. - 752 с.

9. Карягин И.И. Флора Абшерона. - Баку: Изд-во АН Азерб. ССР, 1952. - 439 с.

10. Красная Книга Азербайджана. - Баку: Ишыг, 1989. - 544 с

11. Культурная флора СССР. - Т. 1, М.-Л.: Сельхозгиз, 1935. - 434 с.; - Т. 2. - М.-Л.: Сельхозгиз, 1936. - 447 с.; Т. 3. - М.: Колос, 1975. - 364 с.; - Т. 4. - М.-Л.: Сельхозгиз, 1937. - 675 с.

12. Мусаев С.Г. Злаки Азербайджана. - Баку: Элм, 1991. - 421 с.

13. Редкие и исчезающие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране. - Л.: Наука, 1981. - 261 с.

14. Флора Европейской части СССР. - Л.: Наука, 1994. - Т. VII. - 428 с.

15. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). - СПб.: Мир и семья, 1995. - 992 с.

Рекомендовано к печати к.б.н. КрайнюкЕ.С.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ СУБФРАКЦИЙ ГИСТОНА Н1, ИЗОФЕРМЕНТНЫЕ СПЕКТРЫ АСКОРБАТПЕРОКСИДАЗЫ, КАТАЛАЗЫ И СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ЛИСТОВОЙ ТКАНИ NICOTIANA TABACUM L. РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОСТИ

О.Г. ЛЕНЬКО; О.В. ЧИЖИК, кандидат биологических наук Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси, Минск, Республика

Беларусь

Введение

ДНК-связывающие белки играют ключевую роль в процессах репликации, рекомбинации и генетической экспрессии. Прежде всего это белки, ответственные за поддержание структуры ДНК -гистоны и негистоновые белки. Коровые гистоны (белки, образующие нуклеосомы) консервативны. В то же время гистон Н1, не являющийся коровым гистоном, меняет свою структуру сравнительно легко. Особенностью этого гистона является наличие субфракций. Известно, что субфракции гистона Н1 существенно различаются по физическим свойствам, а также по способности конденсировать хроматин [8].

Соотношение субфракций непостоянно. Оно может быть различным в разных типах клеток, зависит от физиологического состояния организма, его органов и тканей. Изменение субфракционного состава гистона Н1 может оказать мягкий эффект на процессы развития и дифференцировки. Таким образом, изменение субфракционного состава гистона Н1 можно рассматривать как маркерные элементы ряда процессов развития растений. Исходя из этого, особый интерес представляет изучение соотношения субфракций гистона в тканях различной степени дифференцированности.

Существуют различные методы, позволяющие маркировать изменчивость генетического материала. Наиболее доступным способом одновременной оценки изменчивости структурных генов и соответствующего ей полиморфизма отдельных биохимических систем является метод анализа генетически детерминированного полиморфизма белков [1].

Оценку экспрессии генов растений на разных этапах дифференцировки проводили, анализируя изоферментные спектры каталазы, пероксидазы, аскорбатпероксидазы (АПО) и супероксиддисмутазы (СОД), выступающие как маркерные ферменты ряда процессов развития

растений. Антиоксидантные ферменты кодируются целым семейством генов с различной регуляцией и локализацией, их субстраты могут выступать в роли сигнальных молекул, вследствие чего в клетках выявляется ряд изоформ.

Объекты и методы исследования

Исследовали изоферментные спектры ферментов каталазы, супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы из общей фракции легкорастворимых белков ткани листа N. tabacum L. разной степени дифференцированности: 1) эксплант листа; 2) первичный каллус, полученный из экспланта листа на среде для каллусогенеза; 3) длительно культивируемый каллус, полученный в ходе многократных пассажей (72 пассажа) первичного каллуса.

Для анализа использовали листья 40-дневных растений табака, выращенных в колбах в стерильных условиях на 'Л среде Мурасиге и Скуга (МС) при температуре 22-25°С, освещенности 35 клк. и 16-часовом фотопериоде. Образование первичного каллуса индуцировали переносом эксплантов листа на среду МС, содержащую 1 мг/л ИУК и 0,1 мг/л БАП, с последующим пассированием каллусов на этой же среде.

Гистон Н1 экстрагировали из растительного материала по методу Johns' [5] с модификациями. Разделение гистонов проводили в щелочной электрофоретической системе с додецилсульфатом натрия (SDS) по методу U.K. Laemmli [6]. Для электрофореза использовали 5%-ный концентрирующий и 14%-ный разделяющий полиакриламидный гель.

После электрофореза гель фиксировали в 15%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ), окрашивали 0,1%-ным Кумасси R-250, отмывали и центрифугировали. Цифровое изображение обрабатывали с использованием компьютерной программы Phoretix 1D.

Экстракцию изоформ каталазы, супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы вели по методу Сафоновых [2]. Все операции по получению белкового препарата, содержащего антиоксидантные ферменты, проводили при +4°С. Содержание белка в образцах определяли по Bredford [4]. В каждой отдельной точке эксперимента образцы уравнивались по белку. Электрофоретическое разделение изоформ каталазы, супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы проводили в 7,5% ПААГ в нативной щелочной системе. Изоформы каталаз выявляли методом Woodbury et al. [9]. Активность изоформ супероксиддисмутазы выявляли методом Beauchamp, Fridovich [3]. Электрофорез аскорбатпероксидаз проводили в тех же условиях, что и для каталазы, но с модификациями Mittler, Zilinskas [3].

Результаты и обсуждение

В ходе эксперимента изучено содержание субфракций гистона Н1 в дифференцированных и дедифференцированных тканях табака. Линкерный гистон в тканях табака может быть представлен шестью субфракциями: две (Н1А и Н1В) главные (мажорные) и четыре минорные (Н1С, H1D,H1E и H1F) [7]. На рис. 1 приведены электрофореграммы гистонов из тканей табака различной степени дифференцированности. Для листовой ткани были выявлены шесть субфракций, а для дедифференцированных тканей табака нулевого и 72 пассажей - по пять фракций для каждой ткани. Для дедифференцированной ткани табака нулевого и 72 пассажей общими были субфракции с молекулярными массами белка 20 и 25 кДа. В листовой ткани данные субфракции не были обнаружены. Так как электрофоретический спектр гистонов - генетически детерминированный признак, то можно предположить, что эти субфракции выступают в роли белкового маркера дедифференцированной ткани табака. Субфракция с Мм белка 21 кДа была выявлена как в ткани листа, так и в дедифференцированной ткани нулевого пассажа, однако в тканях длительного пассирования не обнаружена (рис. 1).

Полученные результаты показали, что количество наблюдаемых изоформ СОД в дедифференцированных тканях снизилось. Изоформа СОД с Rf 0,55 была обнаружена во всех исследуемых образцах, тогда как изоформы с Rf 0,47 и 0,59 были характерны только для дифференцированной ткани, что позволяет считать эти изоформы маркерами полностью дифференцированных тканей табака (рис. 2 в, г, д).

В ходе эксперимента было установлено, что процессы дедифференцировки сопровождаются значительным снижением активности каталазы. На этапе нулевого и длительно пассируемого каллуса активность каталазы не выявляется используемыми нами методами. На этапе полностью

дифференцированной ткани табака была выявлена только одна изоформа каталазы с Яг 0,12, которая в свою очередь может являться маркером дифференцированной ткани табака (рис. 2 е).

111 1 ...... 1

28620| |26278] 1 . 2431 21015| |17939] ¡] 1162251

1 ! ..... I1

29943 24928 2. 1132121 19441|

№ ! 1!

[25434 |23 'Л 1 20187| "19] ¡150851

Рис. 1. Разделение гистонов в щелочной электрофоретической системе с додецилсульфатом натрия (8Б8) у табака: 1 - ткань листа; 2 - каллус 72 пассажа; 3 - каллус нулевого пассажа

е

Рис. 2. Зимограммы изоформ антиоксидантных ферментов тканей табака различной степени дифференцировки: а, б - зимограммы изоформ АПО: а - ткань листа; б - каллус нулевого пассажа; в, г, д - зимограммы изоформ СОД: в - ткань листа; г - каллус нулевого пассажа; д - каллус 72 пассажа; е - зимограмма каталазы общей клеточной фракции ткани

листа табака

Показано, что экспрессия аскорбатпероксидазы с 0,69 и 0,71 характерна для тканей табака с различной степенью дифференцировки. В свою очередь, изоформу АПО с 0,47 обнаруживали только в дифференцированных тканях, что позволяет считать ее маркерной изоформой АПО дифференцированных тканей табака. При этом в экспланте листа инициация каллусогенеза индуцировала активность новых изоформ с 0,34 и 0,43, что позволяет им претендовать на роль молекулярных маркеров каллусогенеза в табаке. Истинными маркерами процессов дедифференцации клеток табака служат изоформы с 0,1; 0,65; 0,74 и 0,75, обнаруживаемые только в длительно культивируемом каллусе табака (рис. 2 а, б).

Выводы

Таким образом установлено, что: 1) субфракции гистона Н1 с Мм белка 20 и 25 кДа -маркерные белки дедифференцированной ткани табака; 2) изменение изоферментного спектра каталазы, СОД и АПО связано с реализацией генетической программы дедифференциации клеток

табака; 3) АПО с Rf0,1; 0,65; 0,74 и 0,75 - маркерные ферменты дедифференциации клеток табака; 4) экспрессия СОД с Rf 0,47 и 0,59, каталазы с Rf 0,12 и АПО с Rf 0,47 - это особенность полностью дифференцированных тканей листа табака; 5) изоформы СОД с Rf 0,55 и АПО с Rf 0,69 и 0,71 не имеют четкой функции в реализации программы дедифференцировки тканей табака.

Список литературы

1. Кубрак С.В., Юренкова С.И. Белковые спектры стебля как метаболические маркеры у льна-долгунца // Докл. Нац. АН Беларуси. - 2001. - Т. 45, № 1. - С. 79-82.

2. Сафонов В.И. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в полиакриламидном геле // Биохимические методы в физиологии растений: Сб. ст. - М.: Наука, 1971.

- С. 113-119.

3. Beauchamp C. Superoxide dismutase // Analytical Biochemistry. - 1971. - Vol. 44. - P. 276287.

4. Bredford M.M. A rapid sensitive method for the action of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein - dye binding // Analytical Biochemistry. - 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

5. Johns E.W. Studies on histones. 7. Preparative methods for histone fractions from calf thymus // Biochemical Journal. - 1964. - Vol. 92. - P. 55-59.

6. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

7. Prymakowska-Bosak M., Przewloka M. Linker Histones Play a Role in Male Meiosis and the Development of Pollen Grains in Tobacco // The Plant Cell. - 1999. - Vol. 11. - P. 2317-2329.

8. Widom О. Chromatin structure: Linking structure to function with histone H1 // Current Biology.

- 1998. - Vol. 8. - P. 788-791.

9. Woodbury W. An improved procedure using ferricyanide for detecting catalase isozymes // Analytical Biochemistry. - 1971. - Vol. 44. - P. 301-305.

Рекомендовано к печати к.б.н. Палий А.Е.

М1НЛИВ1СТЬ К1ЛЬК1СНИХ ОЗНАК ТЮТЮНУ I МАХОРКИ В ЗАЛЕЖНОСТ1 В1Д УМОВ

ВИРОЩУВАННЯ

О.1. САВ1НА, доктор ыльськогосподарських наук;

Т.В. ВАСИЛ1В, кандидат альськогосподарських наук;

К.А. ШЕЙДИК, О.О. МАТ1СГА Закарпатський шститут АПВ УААН

Вступ

Махорку i тютюн в Укра!ш почали вирощувати ще на початку 17 столотя. Сюди махорка була завезена з Захщно! Свропи та Азп. Таким чином, сформувалося велике рiзноманiття сорив махорки, як характеризуются спшьними ознаками. Проте цей матерiал дуже цшний для навчального процесу, теоретично-практичних дослщжень та виробничих потреб. Зараз ряд сор^в не можливо знайти навгть у колекщях. У 1940 р. махорка займала 110 тис. гектарiв земль Махорку вирощували як на державних полях так i на селянських упддях для власного використання. Вщтод^ майже до 20-го ст. махорка устшно конкурувала з тютюном, вiдрiзняючись смаком та запахом.

Базова, навчальна та ознакова колекцп тютюну i махорки формуються в Закарпатському шститут АПВ з 1991 року. Детальний опис особливостей формування сортотитв тютюну в СРСР вщтворений працями Псарево! О.М. [1] в 1969 р., Рубан Е.В., 1ваново! Т.З. та рядом шших учених [2] в 1982 р. при аналiзi особливост формування ознак сортотитв та сор^в тютюну св^ово! колекцп. Зараз важливо детально оцшити сортотипи тютюну та !х сорти, яю культивуються в Укра!ш, проанатзувати штродуковану колекщю, адже тривалий перешв !х призводить до адаптацл в умовах середовища зi значною змшою основних продуктивних ознак. Значних змш зазнали зразки штродукованих сор^в при доборi та пересiвi !х у рiзних клiматичних умовах останнiх рокiв. За останш роки Закарпатська область перенасичена вологою, що негативно вiдображуeться на формотворчш особливостi посухостiйких рослин.

Мета дано! роботи - закласти сортозразки з особливо цшними ознаками для формування втизняно! колекцп тютюну i махорки. Таку роботу неможливо провести без визначення алгоритму