НЕТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОСТЕЙШИХ ИЗ РОДА WILLAERTIA В КАЧЕСТВЕ ФУНГИСТАТИКА И/ИЛИ ФУНГИЦИДА
NON-THERAPEUTIC USE OF PROTOZOA OF WILLAERTIA GENUS AS FUNGISTATIC AND/OR FUNGICIDE

Техническая область изобретения
Настоящее изобретение относится к применению простейших рода Willaertia, в частности, Willaertia magna, в качестве фунгистатика и/или фунгицида.
Предшествующий уровень техники, к которому относится изобретение
Грибки (дрожжи и плесень) ответственны за многочисленные заболевания, которые поражают растения, животных и людей.
По этой причине были разработаны многочисленные фунгициды для уничтожения грибков или ограничения их развития и, следовательно, для лечения и/или предотвращения заболеваний, вызываемых грибками.
С другой стороны, использование этих соединений часто не является оптимальным, как с точки зрения эффективности, так и с точки зрения токсичности для человека или окружающей среды.
Действительно, массовое применение пестицидов или химических антимикотических средств в сельском или несельскохозяйственном секторе вызывает многочисленные проблемы со здоровьем и экологией. С точки зрения окружающей среды наблюдается перекрестное загрязнение почв и грунтовых вод молекулами, содержащимися в фитосанитарных продуктах. Эти загрязнители могут быть причиной нарушений в загрязненных экосистемах в силу их потенциального токсикологического воздействия на нецелевые организмы. В дополнение к экологическим рискам, опасности, связанные с применением и воздействием пестицидов, также были хорошо продемонстрированы и являются предметом предупреждения Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Что касается лечения микозов, необходимо обеспечить антимикотическое соединение, которое не токсично для человека. Кроме того, массовое применение этих соединений приводит к появлению штаммов, устойчивых к этим продуктам. Эволюция популяций приводит к снижению эффективности продуктов, что может привести к полной потере эффективности.
Таким образом, повышение осведомленности об экологических рисках и рисках для здоровья, вызванных массовым применением химических пестицидов, способствовало в течение нескольких лет развитию спроса на антимикотические продукты природного происхождения, токсикологическое и экологическое воздействие которых слабее. Эти продукты, которые менее вредны для человека и окружающей среды, также имеют преимущество в виде упрощенного использования, поскольку они выигрывают от снижения регулирования.
Таким образом, существует значительная потребность в разработке новых природных фунгицидных композиций широкого спектра действия, которые являются как эффективными, так и простыми в применении, и затраты на производство которых контролируются.
Было бы также целесообразно, чтобы такие композиции могли воздействовать на споры, чтобы иметь оптимальную эффективность.
Сущность изобретения
В этом контексте авторы изобретения совершенно неожиданно продемонстрировали, что простейшие рода Willaertia и, в частности, простейшие вида амеб Willaertia magna в живой форме и/или в мертвой форме и/или в форме клеточного лизата, обладают фунгистатической и/или фунгицидной активностью, в частности, воздействуя на споры.
Первым аспектом настоящего изобретения является нетерапевтическое применение простейших рода Willaertia, например, вида Willaertia magna, в живой или мертвой форме и/или в форме клеточного лизата, в качестве фунгистатика и/или фунгицида.
Вторым аспектом настоящего изобретения является применение простейших рода Willaertia, например, вида Willaertia magna, в живой и/или мертвой форме и/или в форме клеточного лизата, для их применения в качестве антимикотического лекарственного средства.
Третий аспект настоящего изобретения представляет собой фитофармацевтический продукт, содержащий эффективное количество простейших вида Willaertia magna, в живой и/или мертвой форме и/или в форме клеточного лизата.
Четвертый аспект представляет собой фармацевтический продукт, содержащий эффективное количество простейших вида Willaertia magna, в живой и/или мертвой форме и/или в форме клеточного лизата.
Согласно настоящему раскрытию, простейшие из рода Willaertia, в частности, из рода Willaertia magna, в живой и/или мертвой форме и/или в форме клеточного лизата могут применяться для профилактики или лечения.
Простейшие вида Willaertia magna в живом или мертвом виде могут использоваться отдельно или преимущественно в сочетании с другими простейшими, в частности, простейшими рода амеб Solumitris, простейшими церкозоями рода Cercomonas или простейшими церкозоями рода Paracercomonas.
Предпочтительно, простейшие, используемые в контексте настоящего раскрытия, соответствуют штамму Willaertia magna, депонированному 21 августа 2006 г. под номером PTA-7824 в ATCC, или штамму Willaertia magna, депонированному 21 августа 2006 г. под номером PTA-7825 в ATCC, эти два штамма были первоначально депонированы от имени НАЦИОНАЛЬНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА (CNRS) [Французский национальный центр научных исследований] - 3 rue Michel Ange - 75794 PARIS CEDEX 16/France и UNIVERSITE LYON 1 CLAUDE BERNARD – 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 – 69622 VILLEURBANNE Cedex/France. Указанные депонированные штаммы также описаны в публикации международной заявки РСТ WO2008/043969.
При использовании в контексте настоящего раскрытия, термины «растение» и «растения» обозначают одинаково цельные растения и части, выделенные из этих растений, такие как листья, плоды, цветы, зерна, семена, ствол, корни, стебли.
При использовании в контексте настоящего раскрытия, термин «грибок» относится к одноклеточным или многоклеточным грибкам, включая дрожжи и плесень, в форме спор или в форме мицелия.
При использовании в контексте настоящего раскрытия, термин «фитофармацевтический продукт» обозначает состав или смесь веществ, которые предназначены:
- для защиты растений от одного или нескольких вредных организмов;
- и/или для предотвращения действия организмов-вредителей растений;
- и/или для оказания воздействия на жизненные процессы растений (если они не являются питательными веществами);
- и/или для обеспечения сохранности растительных продуктов.
При использовании в контексте настоящего раскрытия, термин «живая форма» обозначает метаболически активную вегетативную форму простейших.
При использовании в контексте настоящего раскрытия, термин «мертвая форма» обозначает метаболически неактивную форму простейших, которая была инактивирована механическим, физическим, термическим или химическим процессом, например, осмотическим шоком, тепловым шоком, ультразвуком или, например, при механическом воздействии типа центрифугирования. «Мертвая форма» может включать цельные мертвые клетки микроорганизма или клеточный лизат, или смесь цельных мертвых клеток и клеточного лизата. Лизат обычно обозначает материал, полученный в результате разрушения или растворения биологических клеток в результате явления типа лизиса клеток, что вызывает высвобождение внутриклеточных биологических компонентов, естественно содержащихся в клетках рассматриваемого микроорганизма. Для целей настоящего изобретения термин «мертвая форма» используется без различия для обозначения мертвых клеток Willaertia, цельного лизата, полученного лизисом Willaertia, или только его фракции.
Различие между живыми клетками, мертвыми клетками и лизатом, в частности, может быть проведено с помощью микроскопического наблюдения с окрашиванием с использованием метки нежизнеспособности, такой как трипановый синий (CAS: 72-57-1), которая маркирует мертвые клетки.
Нетерапевтическое применение, в частности, имеет множество применений:
- для борьбы с размножением паразитических грибков растений, предпочтительно при лечении грибковых заболеваний винограда, зерновых, картофеля, плодовых деревьев и огородных культур, еще более предпочтительно при лечении грибковых заболеваний, выбранных из настоящей мучнистой росы винограда, ложной мучнистой росы винограда, септориоза злаков и фузариозного заболевания, сетчатой пятнистости злаков, ложной мучнистой росы картофеля и альтернариоза, парши яблони, склеротиниоза рапса и овощных культур, и их комбинаций;
- для дезинфекции сетей (кроме градирен) сооружений по очистке воздуха;
- для борьбы с грибковыми загрязнениями и/или образованием грибковых биопленок в пищевых продуктах, оборудовании для переработки/производства пищевых продуктов, заводах по переработке/производству пищевых продуктов, поверхностях, которые контактируют с пищевыми продуктами;
- для борьбы с грибковыми загрязнениями и/или образования грибковых биопленок в косметических продуктах, на оборудовании для трансформации/производства косметических продуктов, на фабриках по трансформации/производстве косметических продуктов, поверхностях, контактирующих с косметическими продуктами.
Применение в качестве антимикотического лекарственного средства находит конкретное применение при лечении инфекций, вызванных грибками, выбранными из Aspergillus, Candida, U. botrytis, A.niger, P.variotii, A.alternata и их комбинации, предпочтительно Candida, даже более преимущественно Candida albicans.
Изобретение также находит применение при лечении нозокомиальных заболеваний, вызванных грибками, в частности, респираторных патологий.
Предпочтительно простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой или мертвой форме (в частности, в форме клеточного лизата) или смесь живых и мертвых форм, используются для борьбы с грибком, выбранным из отдела Ascomycota, более предпочтительно из класса Sordariomycetes, Eurotiomycetes, Dothideomycetes, Saccharomycetes, Leotiomycetes, Oomycetes и их комбинации, еще более предпочтительно из родов Botrytis, Erysiphe, Fusarium, Penicillium, Plasmopara, Phytophthora, Chaetomium, Trichoderma, Aspergillus, Alternaria, Candida, Ulocladium, Epicoccum и Cladosporium более предпочтительно из класса Sordariomycetes, Eurotiomycetes, Dothideomycetes, Saccharomycetes, Leotiomycetes, Oomycetes и их комбинации, а более предпочтительно из B. cinerea, E. necator, F. solani, C. globosum, P. chrysogenum, P. expansum, P. viticola, P. infestans, T. viride, T. harzianum, A. fumigatus, A. alternata, A. flavus, P. variotii, A. niger, C. albicans, U. botrytis, E. nigrum, B. cinerea, P. roqueforti, C. cladosporioides, E. chevalieri, A. pullulans и их комбинации.
В одном конкретном воплощении простейшие вида Willaertia magna используются в живой форме или в мертвой форме (в частности, в форме лизата клеток) или в виде смеси живых и мертвых форм. В одном конкретном воплощении используемая смесь содержит 50% или более простейших в мертвой форме, в частности, в форме клеточного лизата, например, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более простейших в мертвой форме (по отношению к количеству общих простейших до инактивации), в частности, в форме клеточного лизата.
В одном конкретном воплощении простейшие из вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с грибковыми заболеваниями, поражающими растения. Предпочтительно растения выбирают из трав, двудольных, однолетних, двухлетних и многолетних растений, овощных растений или собираемых овощей, плодовых растений или деревьев или собираемых фруктов, зерновых, масличных растений, белковых растений, деревянистых растений и особенно выбирают из растений или продуктов, полученных из картофеля, свеклы, сахарного тростника, табака, винограда, пшеницы, рапса, ячменя, риса, кукурузы, сорго, проса, сои, бобов, помидоров, огурцов, салата, клубники, яблони, груши, цитрусовых, банана, ананаса, персика, абрикоса, вишни, ореха и фундука.
В одном конкретном воплощении простейшие из вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с грибками, воздействующими на поверхности, материалы, элементы оборудования и/или системы вентиляции.
В одном конкретном воплощении простейшие из вида Willaertia magna в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с грибками, влияющими на здоровье человека или животных.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, применяются для борьбы с F. solani, при лечении грибковых заболеваний растений (злаков и кукурузы).
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов используются для борьбы с C. globosum при лечении грибковых заболеваний растений, предпочтительно поражающих злаки или рис, или для лечения загрязнения продуктов на основе целлюлозы, таких как бумага и строительные материалы.
В другом конкретном воплощении простейшие из вида Willaertia magna в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с P. viticola при лечении грибковых заболеваний растений, предпочтительно поражающих лозу.
В другом конкретном воплощении простейшие из вида Willaertia magna в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с P. infestans при лечении грибковых заболеваний растений, предпочтительно поражающих картофель.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов используются для борьбы с плесенью рода Penicillium, такой как P. chrysogenum, рода Aspergillus, такой как Aspergillus niger, или рода Cladosporium, такой как Cladosporium cladosporioides, для обработки загрязнений среды внутренних пространств, таких как стены, материалы, элементы оборудования и системы вентиляции и т.д.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм, и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с T. viride и/или T. harzianum для обработки загрязнений пищевых продуктов и среды внутренних пространств, такой как стены, материалы, элементы оборудования и системы вентиляции и т.д.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм, и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с A. fumigatus для лечения нозокомиальных заболеваний, в частности, респираторных патологий.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, используемые для борьбы с A. alternata, при лечении грибковых заболеваний растений, предпочтительно раннего гниения картофеля, или для лечения кожных поражений, микозов и инфекций верхних дыхательных путей у людей.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм, и/или форм клеточных лизатов используются для борьбы с P. variotii при лечении грибковых загрязнений и/или образования грибковых биопленок в пищевых продуктах, предпочтительно зерновых, или для лечения микозов, пневмонии, синусита у людей.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой форме или мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм, и/или форм клеточных лизатов, используются для борьбы с A. niger при лечении грибковых загрязнений и/или образования грибковых биопленок в пищевых продуктах, средах внутренних пространств, таких как стены, материалы, элементы оборудования и системы вентиляции и т.д., или при лечении микозов внутреннего уха или аспергиллеза легких у людей.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой или мертвой форме используются для борьбы с C. albicans для лечения микозов у людей.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой или мертвой форме используются для борьбы с U. botrytis при лечении грибковых заболеваний растений, лечения грибковых загрязнений и/или образование грибковых биопленок в пищевых продуктах и для лечения онихомикозов.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой или мертвой форме используются для борьбы с E. nigrum или A. pullulans при лечении грибковых загрязнений и/или образования грибковой биопленки в пищевых продуктах или косметике или загрязнения среды внутренних пространств, таких как стены, материалы, оборудование и системы вентиляции и т. д.
В другом конкретном воплощении простейшие из рода Willaertia, в частности, вида Willaertia magna, в живой или мертвой форме используются для борьбы с A.flavus, P. roqueforti, B. cinerea, C. cladosporioides или E. chevalieri при обработке грибковых загрязнений и/или образований грибковых биопленок в пищевых продуктах или косметике.
Настоящее раскрытие также относится к фитофармацевтической композиции, содержащей эффективное количество простейших вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточного лизата.
В одном конкретном воплощении фитофармацевтическая композиция содержит эффективное количество простейших вида Willaertia magna в форме клеточного лизата.
В одном конкретном воплощении фитофармацевтическая композиция также содержит один или несколько рецептурных агентов, в частности, воду, и, при необходимости, один или несколько дополнительных активных адъювантов.
В одном конкретном воплощении фитофармацевтическая композиция представляет собой композицию, имеющую твердую сухую композицию, предпочтительно в дегидратированной или лиофилизированной форме. Фитофармацевтическая композиция в сухом виде предназначена для восстановления растворителем для разведения перед применением, для готовности к применению. Растворителем для восстановления предпочтительно является вода.
В другом конкретном воплощении фитофармацевтическая композиция представляет собой композицию, имеющую концентрированную жидкую композицию. Фитофармацевтическая композиция в концентрированной жидкой форме предназначена для разбавления разбавляющим растворителем перед применением так, чтобы она была готова к применению. Разбавляющим растворителем предпочтительно является вода.
В другом конкретном воплощении фитофармацевтическая композиция представляет собой композицию, имеющую жидкую композицию, которая непосредственно готова к применению.
Описанная выше фитофармацевтическая композиция в конечной готовой к употреблению форме может наноситься на растения различными способами и в соответствии с различными программами обработки. В частности, фитофармацевтическую композицию можно наносить до или после сбора урожая на листья, почву, цветы, ветви, стебли, ствол, корни и/или плоды. Фитофармацевтическая композиция предпочтительно наносится путем распыления. Фитофармацевтическую композицию также можно наносить в виде смеси с другими фитофармацевтическими продуктами, с удобрениями, с поливом воды или тому подобным.
В нетерапевтических целях простейшие вида Willaertia magna в живом или мертвом состоянии могут непосредственно приводится в контакт с деталями оборудования для переработки/производства и поверхностями, которые контактируют с пищевыми продуктами или косметикой, или обрабатываемыми растениями. Обработку можно проводить, например, путем распыления, например, в форме водного аэрозольного раствора. Таким образом, такие простейшие могут также использоваться в сочетании с другими дезинфицирующими и/или пестицидными средствами.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество простейших вида Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, в качестве антимикотиков и фармацевтически приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция может, в частности, представлять собой повязку, содержащую активное вещество, припарку, лекарственный пластырь, гель, пасту, лосьон, пену, масло, эмульсию, водный раствор, водную суспензию, крем, мазь, порошок или спрей для нанесения на кожу или слизистые оболочки.
Для применения в качестве противогрибкового лекарственного средства простейшие, в частности, виды Willaertia magna, в живой форме или в мертвой форме, или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых форм и/или форм клеточных лизатов, могут наноситься местно на поражения кожи или слизистых оболочек (например, в форме крема, мази, спрея или порошка для нанесения на кожу или слизистые оболочки, обычно на влагалищные или анальные слизистые оболочки).
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество простейших в качестве антимикотиков и фармацевтически приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция может, в частности, представлять собой повязку, содержащую активное вещество, припарку, лекарственный пластырь, гель, пасту, лосьон, пену, масло, эмульсию, водный раствор, водную суспензию, крем, мазь, порошок или спрей для нанесения на кожу или слизистые оболочки.
Другим объектом настоящего изобретения является способ борьбы с пролиферацией грибков, за исключением способов лечения, применяемых к организму человека или животного, включающий стадию приведения простейших вида Willaertia magna в живой форме или в мертвой форме или в форме клеточного лизата, или в виде смеси живых форм и/или мертвых и/или клеточных лизатов, в контакте с указанными грибками.
Описание чертежей
Фиг. 1. Влияние амеб на прорастание B. cinerea. Тесты в микропланшете в присутствии спор B. cinerea без амеб. Наблюдение после 24 ч инкубации. Чувствительные штаммы: B05.10 и M421. Устойчивый штамм: M426. (фунгицид, ингибирующий дыхание).
Фиг. 2. Влияние амеб на прорастание B. cinerea. Тесты в микропланшете в присутствии спор B. cinerea + 500 амеб в среде MC и спор B. cinerea. Чувствительные штаммы: B05.10 и M421. Устойчивый штамм: M426 (фунгицид, ингибирующий дыхание). 50 000 амеб в среде MC. Наблюдение после 24 ч инкубации.
Фиг. 3. Влияние культуральной среды (МС) на прорастание чувствительных штаммов B. cinerea. Тесты в микропланшете в присутствии спор B. cinerea + культуральная среда (MC). Чувствительные штаммы: B05.10 и M421. Наблюдение после 24 ч инкубации.
Примеры
Примеры, приведенные ниже, позволяют проиллюстрировать изобретение, но не являются ограничивающими по природе.
Пример 1. Анализ кПЦР грибковой ДНК взаимодействий грибок–Willaertia на 19 штаммах
Тесты взаимодействия на 19 штаммах грибков (таблица 1) проводили путем приведения спор в контакт с амебой «Willaertia magna» с идентификационным номером PTA-7824 в соотношении амеба/спора = 10 амеб/спору в 24-луночном планшете.
В первом планшете споры отдельно каждого штамма инкубировали в одинаковых условиях (в 2 мл MEAc). После трехчасового контакта раствор центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость затем удаляли и осадок забирали в 200 мкл для выделения ДНК.
Для тестов в течение 24 часов, проводимых во второй чашке, надосадочную жидкость непосредственно удаляли из лунки через 24 часа и «смеси спор-амеб» забирали в 200 мкл для выделения ДНК. Мониторинг под микроскопическим наблюдением проводился на каждой стадии. Извлечение ДНК проводили на образцах (200 мкл) с использованием набора «NucleoSpin plant II - Macherey-Nagel» в соответствии с инструкциями производителя после стадии измельчения с мелким песком.
Амплификацию кПЦР ДНК только грибков и комплексов Willaertia-грибки проводили на приборе CFX96-Biorad. Количественное определение проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 5 мкл ДНК, праймеры (300 нМ) и 10 мкл SybrGreen-Mix. Была использована следующая программа: стадия денатурации при 95°С в течение 10 минут с шагом амплификации при «95°С в течение 15 секунд + 60°С в течение 1 минуты» в течение 35 циклов.
Тесты, проведенные на 19 штаммах грибков, проводили в соответствии с протоколом, подтвержденным на предыдущей стадии. Перед началом молекулярного анализа планшеты наблюдали под микроскопом. Результаты представляют собой кривые кПЦР, полученные в трех повторах для каждого условия (споры-3 ч, споры-24 ч, спора-амеба 3 ч и спора-амеба 24 ч). С учетом того, что в анализе кПЦР использовались универсальные праймеры, ряд грибков P.chrysogenum использовали для приблизительной оценки количества ДНК, амплифицированного для каждого теста. Эти данные позволяют оценить переход от стадии споры к мицелию в контроле без амебы, а также степень ингибирования прорастания в присутствии амеб.
Результаты и заключение: таблица 1. Разница в амплификации кПЦР между тестами, проводимыми только на спорах (разница между 3 и 24 часами) и спорами, подвергнутыми взаимодействию с амебами после 24-часового контакта. ΔCq (3 ч-24 ч): разница в количестве циклов между спорами в 3 ч и 24 ч. Cq (T24 ч-Willaertia24 ч): разница в количестве циклов между спорами в отдельности (T24 ч) и в присутствии амеб (Амебы 24 ч) после 24 ч инкубации.
Штамм
ΔCq (3 ч-24 ч)
ΔCq (T24 ч-Willaertia 24 ч) *
F. solani
3,3
-4,1
C. globosum
7,6
-3,8
P. chrysogenum
8,4
-7,0
T. viride
13,3
-12,9
T. harzianum
9,3
-8,7
A. fumigatus
7,4
-8,7
A.alternata
3,4
-3,3
A.flavus
4,5
-9,3
P. variotii
6,2
-6,6
A.niger
8,92
-9,63
C. albicans
10,7
-3,3
U. botrytis
4,0
-5,0
E. nigrum
0,1
-4,6
B. cinerea
4,9
-6,2
C. herbarum
0,9
-0,8
P. roqueforti
6,4
-13
C. cladosporioides
12,0
-11,1
E. chevalieri
1,9
-4,5
A. pullulans
7,7
-7,1
* Значения ΔCq (T24 ч-Willaertia24 ч) являются отрицательными, поскольку значения Cq, соответствующие тестам «грибок-амеба 24 ч» (низкая грибковая биомасса), превышают значения контрольных тестов для 24 ч (высокая биомасса).
Анализ кПЦР позволил количественно определить биомассу грибка и выделить стадии развития грибков и показать фунгистатический и/или фунгицидный эффект на 19 обработанных штаммах с очень значительными различиями. Разница в количестве циклов Cq между двумя тестами с амебами и без них очень значительна и в некоторых случаях превышает 10 циклов. Эти результаты отражают присутствие очень низкой грибковой биомассы в присутствии амеб после 24 ч инкубации после ингибирования прорастания спор. Разница между стадией спор в 3 ч и мицелием, развившимся после 24 ч, четко прослеживается по разнице в амплификации между спорами в 3H и 24H на тестируемых штаммах. Результаты кПЦР прекрасно отражают визуальные наблюдения, выполненные под микроскопом при разработке этого протокола.
Пример 2. Изучение влияния Willaertia magna на рост Botrytis cinerea
Принцип. Проведенные тесты основаны на тестах, используемых в лаборатории для оценки эффективности обычных фунгицидных молекул. Влияние амебы Willaertia magna (штамм ATCC PTA-7824) на прорастание спор B. cinerea анализировали путем приведения различных концентраций амеб в контакт со спорами грибка. После 24 часов инкубации прорастание спор B. cinerea в присутствии амебы сравнивали с контролем без амеб.
Протокол. Штаммы B. cinerea поддерживали в культуральной среде (на основе овсяных хлопьев) при переменном дневном УФ-освещении (12 ч/12 ч) при 21°C. Штаммы имеют фенотипы, чувствительные или устойчивые к фунгициду, принадлежащему ингибиторам клеточного дыхания. Контролями протестированных штаммов являются: штамм B05.10 (чувствительный), M421 (чувствительный, выделенный в полевых условиях) и M426 (устойчивый, выделенный в полевых условиях).
2
4
Чтобы проверить влияние амебы Willaertia magna на прорастание конидий B. cinerea, споры грибка инкубировали с различными концентрациями амеб. В 96-луночном планшете 500 спор B. cinerea приводили в контакт с 5×10 и 5×10 амебами на лунку в конечном объеме 50 мкл. Тестируемые амебы готовили в культуральной среде (МС).
Следующие контроли также готовили в тех же условиях.
Споры B. cinerea в жидкой культуральной среде YBA:
- споры B. cinerea в культуральной среде (MC)
- споры B. cinerea с фунгицидом, ингибирующим дыхание
Каждое условие проверяли в трех повторах. Планшеты инкубировали в темноте при 21°С в течение 24 или 48 часов. Прорастание конидий B. cinerea наблюдали под инвертированным микроскопом, и для каждого состояния делали серия фотографий.
Результаты и заключение. Наблюдение за спорами после 24 ч позволило продемонстрировать замедление прорастания грибка при высоких концентрациях амеб. Независимо от штамма B. cinerea, этот эффект гораздо более заметен, когда грибок контактирует с количеством амеб, образующих конфлуентный слой (фиг. 2). При более низких соотношениях (500 амеб) эффект менее заметен по сравнению с контролем (фиг. 1 и фиг. 2). Штамм B05.10 является коллекционным штаммом, и он менее энергичный/живой. По сравнению со штаммами дикого типа (взятыми в полевых условиях), для развития требуется больше времени. Культуральная среда (MC) сама по себе не влияет на рост грибка, культуральная среда даже, по-видимому, стимулирует прорастание спор B. cinerea (фиг. 3).
Эти результаты показывают эффективность Willaertia magna в отношении прорастания B. cinerea в условиях эксперимента с наблюдаемым качественным эффектом дозы.
Пример 3. Эффективность Willaertia magna на ложной мучнистой росе винограда (P. viticola)
Принцип. Тесты проводили на молодых растениях Каберне Совиньон. Каждую группу растений обрабатывали в контрольных условиях с помощью насоса-распылителя. После обработки растений тестируемыми растворами проводили преднамеренное заражение растений ложной мучнистой росой. После 7-10 дней инкубации оценивали серьезность заболевания, чтобы оценить эффективность различных продуктов в отношении серьезности заболевания на необработанных растениях.
Протокол
Черенки растений сорта Каберне Совиньон получали в теплице (температура 15-30°C), и для изучения каждого условия испытаний формировали шесть групп по шесть растений.
9
Клетки Willaertia magna культивировали в культуральной среде до получения искомой концентрации 9×10 клеток на литр.
Тестировали различные образцы
1. Отрицательный контроль, состояние 1: без обработки.
2. Контроль среды, условие 2: разбавляющая среда
3. Фунгицид, условие 3: Willaertia magna в культуральной среде
4. Фунгицид, условие 4: образец из условия 3, разведенный в разбавляющей среде
5. Фунгицид, условие 5: образец условия 3 подвергается механическому воздействию, чтобы убить клетки Willaertia. Образец пропускали под давлением через практически закрытый клапан с сильным вакуумом с помощью насоса, что приводило к гибели некоторых клеток и лизису некоторых мертвых клеток. Полученный образец наблюдали под микроскопом с меткой нежизнеспособности (трипановый синий) для подсчета оставшихся живых клеток (не помеченных трипановым синим)
6. Фунгицид, условие 6: образец условия 4 помещали в условия механического стресса для того, чтобы убить клетки Willaertia. Образец пропускали под давлением через практически закрытый клапан с сильным вакуумом с помощью насоса, что приводило к гибели некоторых клеток и лизису некоторых мертвых клеток. Полученный образец наблюдали под микроскопом с меткой нежизнеспособности (трипановый синий) для подсчета оставшихся живых клеток (не помеченных трипановым синим).
7. Положительный контроль, условие 6: бордоская смесь, эквивалентная 3 кг/га.
Каждый образец наносили на одну из групп из шести растений путем распыления на все растение.
Через 24 часа суспензию спорангов P. viticola распыляли на нижнюю поверхность листьев. Затем растения инкубировали при 24 ± 5°С, освещали в течение 14 часов в день в отдельных камерах при влажности, благоприятной для развития заболевания. Через 7-10 дней проводили оценку эффективности фунгицида при каждом условии для каждого растения и каждой стадии листьев. Оценка основана на визуальном наблюдении за грибковым поражением, состоящим из двух элементов: площадь зараженной поверхности и интенсивность споруляции. Используется шкала от 0 до 100% (с шагом 5%); каждый лист наблюдается индивидуально. Эффективность рассчитывали по следующей формуле: эффективность = 100 × [(NT-T) / NT] (NT - средняя степень атаки на необработанные растения, а T - средняя степень атаки на обработанные растения). Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Условия тестов и результаты эффективности
Условие
Обработка с помощью:
Концентрация Willaertia magna
Объем распыления (мл)
Средняя степень поражения ложной мучнистой росой
Фунгицидная эффективность
1
Отрицательный контроль: без обработки
0
175
56,3%
0%
2
Контроль: разбавляющая среда Willaertia magna
0
160
55,0%
2,2%
3
9,02×10<sup>9</sup> живых Willaertia magna/литр в культуральной среде
9,02×10<sup>9</sup> живых Willaertia magna/литр
190
1,3%
97,8%
4
Условие 3, разведенное в среде для разведения Willaertia magna
2,80×10<sup>9</sup> живых Willaertia magna/литр
200
2,5%
95,6%
5
Состояние 3 + механическая инактивация
По меньшей мере, 80% мертвых клеток по сравнению с условием 3
175
1,3%
97,8%
6
Состояние 4 + механическая инактивация
По меньшей мере 96% мертвых клеток по сравнению с условием 4
185
30,0%
46,7%
7
Положительный контроль: бордоская смесь (эквивалент 3 кг/га)
0
180
0,0%
100%
Результаты и заключение: На необработанных растениях тяжесть заболевания высока (56,3%). Эта величина также высока (55%) после распыления разбавляющей среды.
У растений, обработанных Willaertia magna, в живой форме наблюдается очень небольшое количество заболеваний: заражение P. viticola составляет от 2,5 до 1,3% площади поверхности листьев (по сравнению с 56% для необработанного отрицательного контроля). То есть эффективность более 95%, близкая к эффективности эталонного фунгицида (бордоская смесь при 3 кг/га), которая позволяет полностью контролировать ложную мучнистую росу с эффективностью 100% (без атаки ложной мучнистой росой).
Небольшое количество заболеваний наблюдалось у растений, обработанных Willaertia magna в мертвой форме, инактивируемых механическим воздействием при прохождении через насос и клапан с сильным вакуумом: заражение P. viticola составляло от 30% до всего лишь 1,3% поверхности площадь листьев (по сравнению с 56% для необработанного отрицательного контроля).
В заключение необходимо отметить, что Willaertia magna в живом и мертвом состоянии обеспечивает высокую активность против ложной мучнистой росы винограда в экспериментальных условиях.