СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОГО МАСЛА
METHOD FOR DEFINITION OF TOTAL ANTIOXIDANT ACTIVITY OF VEGETABLE OIL

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способам оценки суммарной антиокислительной активности (АОА) антиоксидантов в составе растительных масел и может найти применение в медицинской и пищевой технологии.
Уровень техники
Процесс старения, возникновение и развитие широкого круга заболеваний (атеросклероза, гипертонии, ишемии, рака, катаракты и др.) сопровождаются активацией свободнорадикальных реакций перекисного окисления фосфолипидов клеточных мембран, приводящих к их деградации. Этому процессу противодействуют жирорастворимые антиоксиданты. Для поддержания необходимой концентрации в организме жирорастворимых антиоксидантов применяют содержащие их лекарственные препараты, биологически активные вещества, в том числе в виде пищевых продуктов или БАДов. Растительные масла являются природным источником жирорастворимых антиоксидантов (токоферолов, каротиноидов, ликопинов, полифенолов, флавоноидов и др.), поэтому их с успехом используют при антиоксидантной терапии. В состав растительных масел входят жирные кислоты, представляющие большую пищевую ценность. Жирные кислоты, особенно полиненасыщенные, склонны к окислению, а продукты окисления (перекиси, альдегиды) являются токсичными примесями, что делает пищевые продукты непригодными к употреблению. Природные антиоксиданты, входящие в состав растительных масел, предохраняют их от окисления. В связи с этим разработка простого и надежного способа определения концентрации антиоксидантов в растительном масле в виде экспресс-метода является актуальной.
Известен способ определения суммарной АОА биологически активных веществ (патент RU 2238554, 20.10.2004). Способ основан на электрохимическом окислении анализируемого и стандартного веществ в ячейке амперометрического детектора, усилении электрических сигналов, их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости. Недостатками известного способа являются использование только водных растворов анализируемого и стандартного веществ, то есть он неприемлем в случае жирорастворимых антиоксидантов.
Известен способ определения суммарной АОА биологически активных веществ, основанный на взаимодействии анализируемой пробы с перманганатом калия до обесцвечивания последнего (патент RU 2170930, 20.07.2001). Недостатком этого способа является необходимость осуществления трудоемкой стадии пробоподготовки (предварительное извлечений антиоксидантов этиловым спиртом из растительного сырья). Кроме того, в данном способе применяют метод титрования раствора перманганата калия анализируемой пробой - метод трудоемкий и не приемлемый при анализе большого числа проб.
+.
Наиболее близким к предлагаемому способу оценки АОА является способ определения АОА липофильных антиоксидантов, основанный на реакции восстановления антиоксидантом хромогенного радикала АБТС (Re R; Pellegrini N; Proteggente A; Pannala A; Yang M; Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Radio Biol Med 1999, Vol.26, P.1231-1237). Прототип имеет следующие недостатки. Во-первых, хромогенный радикал, полученный в условиях окисления АБТС (2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)) персульфатом калия, оказался нестабильным (наблюдается уменьшение оптической плотности его растворов при хранении более 3-4 часов). Во-вторых, измерения проводят после растворения липофильных антиоксидантов в этаноле, однако растительное масло в этаноле не растворяется, то есть требуется проведение стадии пробоподготовки - получение этанольных извлечений жирорастворимых антиоксидантов из растительного масла.
Сущность изобретения
+.
Технической задачей предлагаемого изобретения является: 1) использование для определения суммарной АОА растительного масла хромогенного радикала АБТС, образованного при ферментативном окислении АБТС; 2) подбор реакционной среды для растворения растительного масла и последующего проведения в ней реакции восстановления хромогенного радикала антиоксидантами растительного масла; 3) использование для оптических измерений серийного спектрофотометрического оборудования - планшетного фотометра (типа «Униплан», Россия).
+.
Поставленная техническая задача решается описываемым способом определения суммарной АОА растительного масла, который включает окисление АБТС лакказой (п-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2, фермент, относящийся к группе медьсодержащих оксидаз, окисляющих различные органические и неорганические субстраты с одновременным восстановлением молекулярного кислорода), в результате чего образуется хромогенный радикал АБТС, который в условиях реакционной смеси может храниться не менее 15 дней при комнатной температуре. Реакцию восстановления радикала антиоксидантами растительного масла проводят в н-бутанол-изопропанольном растворе при комнатной температуре в пластиковых 96-луночных планшетах. Показателем суммарной АОА служит величина уменьшения оптической плотности раствора, измеряемой на планшетном фотометре.
Сущность предлагаемого способа определения суммарной АОА заключается в следующем:
+.
1) к раствору растительного масла в н-бутаноле (проба) или к н-бутанолу без масла (контроль), помещенных в лунки 96-луночного планшета, добавляют изопропанол до 70% (v/v), перемешивают и затем вносят раствор хромогенного радикала АБТС, перемешивают, выдерживают 1-3 мин при комнатной температуре; 2) проводят измерение оптической плотности растворов при 450 или 750 нм на планшетном фотометре. Уменьшение значения оптической плотности пробы по отношению к контролю прямо пропорционально суммарной АОА растительного масла. Расчет концентрации антиоксидантов проводят по формуле в пересчете к стандартному антиоксиданту.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
+.
Пример 1. Получение хромогенного радикала АБТС.
+.
232 мг натрия уксуснокислого 2-водного растворяют в 1 мл дистиллированной воды, смешивают с 1 мл 10% уксусной кислоты, получают буферный раствор (pH=4,7). 219 мг АБТС растворяют в 4 мл дистиллированной воды, получают 0,1 М раствор АБТС. Реакцию окисления АБТС проводят следующим образом: смешивают 0,2 мл буферного раствора, 0,4 мл раствора АБТС и 9,4 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мкл фермента (100 ед./мл грибной LacCl/C2 Cerrena unicolor или бактериальной CotA Bacillus pumilus лакказы; за единицу активности принимают минимальное количество фермента, которое в течение 1 мин окисляет 1 мкмоль АБТС при комнатной температуре), инкубируют 30 мин при 50°C. АБТС окисляется в хромогенный радикал АБТС практически полностью.
Пример 2. Определение суммарной АОА растительного масла.
5 мг ретинола ацетата (полного трансретинола ацетата, витамина А ацетата) растворяют в 1 мл н-бутанола. 5-10 мкл полученного раствора смешивают с 50-55 мкл н-бутанола (конечный объем 60 мкл) и 140 мкл изопропанола в лунке 96-луночного планшета, перемешивают, добавляют 8 мкл раствора хромогенного радикала, перемешивают и инкубируют 1-3 мин при комнатной температуре. Далее проводят измерение оптической плотности раствора при 405 или 750 нм на планшетном фотометре (показание стандартного антиоксиданта). 0,1 г растительного масла растворяют в 1 мл н-бутанола. Затем разные аликвоты этого раствора смешивают в лунках 96-луночного планшета с н-бутанолом таким образом, чтобы конечный объем раствора в лунке был равен 60 мкл. Добавляют в каждую лунку по 140 мкл изопропанола, перемешивают, добавляют 8 мкл раствора хромогенного радикала, перемешивают и спустя 1-3 мин проводят измерение оптической плотности при 405 или 750 нм на планшетном фотометре (показание анализируемой пробы). При расчете количественной оценки суммарной АОА используют показания для лунки с таким разведением растительного масла, при котором оно составляет от 20 до 80% от показаний оптической плотности в контроле. За контроль принимают показания для лунки, раствор бутанола которой не содержит растительное масло (показание контроля). Количественно суммарную АОА в пересчете на стандартный антиоксидант (ретинола ацетат) рассчитывают согласно формуле
к
с
п
где A, А, A - оптическая плотность контроля, стандартного антиоксиданта и анализируемой пробы соответственно;
с
п
c
п
с, с, v, v - концентрации и объемы аликвот исходных растворов стандартного антиоксиданта и анализируемой пробы соответственно.
Пояснение к таблице
В таблице приводятся значения суммарной АОА в растительных маслах в пересчете на стандартный антиоксидант - ретинола ацетат (мг%).
Таблица
Метрологическая характеристика способа оценки суммарной антиокислительной активности растительного масла
Проба
Число измерений
Среднеарифметическое значение (мг%)
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации
Подсолнечное масло, рафинированное*
5
40,3
1,2
2,9
Подсолнечное масло, нерафинированное*
5
51,4
1,3
2,5
Льняное масло*
5
78,2
2,2
2,8
Масло шиповника **
5
92,5
3,4
3,7
Облепиховое масло**
5
289,8
4,5
1,5
* - измерения проводились при 405 нм
** - при 750 нм