Структурно-функциональная характеристика фокального варианта синдрома клеток Сертоли (иммуногистохимический аспект)

Морфология. Патология

УДК 616.697-036.22

© 2016 Г. А. Демяшкин

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОКАЛЬНОГО ВАРИАНТА СИНДРОМА КЛЕТОК СЕРТОЛИ

Тотальный Сертоли-клеточный синдром (SCO-syndrome) часто путают с фокальными проявлениями основных признаков этого синдрома, то есть маскирующие под него признаки. При SCO-синдроме отмечается повреждения семенных канальцев, угрожающие нормальному функционированию клеток Сертоли, но при этом ещё можно получить единичные сперматозоиды, используя передовые репродуктивные технологии. Здесь, возможно, речь идёт о новом фенотипе SCO-синдроме, при котором на фоне нормальной гистархитектоники семенного канальца отмечается полное отсутствие половых клеток, но наличие зрелых клеток Сертоли и нормальных клеток Лейдига в перитубулярном пространстве. При втором подтипе: в нормальном структурированном семенном канальце выявляются клетки Сертоли и единичные сперматогонии. Кроме того, важно изучить синтетическую и трофическую функцию клеток Сертоли. Сустентоциты являются иммунонегативными для препубертатных маркеров дифференцировки: Цитокератин-18, антимюллеров гормон и М2А-антиген, но показывают положительное мечение для белков коннексина, виментина и частично гладкомышечного актина. Полное отсутствие половых клеток в сочетании с полностью дифференцированными зрелыми клетками Сертоли в этом случае находится в противоречии с известными подтипами SCO-синдрома и с существующей гипотезой о взаимной регуляции между клетками Сертоли и дифференцирующихся половыми клетками.

Ключевые слова: сперматогенез, клетки Сертоли, Vimentin, SMA, мужское идиопатическое бесплодие.

Введение. Сертоли-клеточный синдром (SCO-синдром) характеризуется азооспермией и полным отсутствием половых клеток в биоптате яичка с исключительным наличием только клеток Сертоли (del Castillo et al., 1947). Однако часто термин SCO-синдром, используется некорректно при описании для аналогичной морфологической картины: псевдо-SCO-синдром, где некоторые сперматозоиды все еще присутствуют [1]. В последнем случае поражение яичка вызывает лишь фокусные повреждения сперматогенеза, в то время как согласно данным del Castillo и др. (1947), гоноциты теряют свой путь во время миграции их из желточного мешка в половой валик. Ареалы псевдо-SCO-синдрома с резидуальным сперматогенезом чередуются с участками полной деструкцией сперматогенеза, связанные с незрелыми клетками Сертоли [14; 21].

Выявление даже небольших участков с сохранившимся сперматогенезом является достаточным для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) [15]. Тестикулярная экстракция сперматозоидов (TESE) в сочетании с ICSI позволяет мужчинам, даже с тяжелым поражением сперматогенеза, стать отцом генетически собственного ребенка [11; 13; 18; 20; 27]. На сегодняшний день прогнозирующие маркеры для успешного выявления активных сперматозоидов недостаточны [12; 25]. При этом изучение морфологии яичка увеличивает успех обнаружения зрелых половых клеток. В связи с этим изучение более надежных маркеров необходимо. Важно отличить классический SCO-синдром от маскирующих его форм.

Для этого важно изучить морфологию клеток Сертоли, используя современные методы гистологии, например, иммуногистохимию. Принимая во внимание светооптическую характеристику строения сустентоцитов, а также данные электронной микроскопии, можно сказать, что наиболее информативными маркерами для этих клеток являются белки элементов цито-скелета и межклеточных коммуникаций.

Виментин (Vimentin) MCV - аббревиатура для Mutated Citrullinated Vimentin (модифицированный цитрулинированный виментин) - белок массой 57-60 кДа является одним из пяти основных промежуточных филаментов в клетке. Данный элемент цитоскелета (филаменты) считается специфичным маркёром для саркомы и других мезенхимальных новообразований [26]. Последние данные указывают на наличие экспрессии виментина во многих типах карцином [26].

В тканях яичка виментин может использоваться для идентификации сустентоцитов [1]. Отдельные литературные источники указывают экспрессию виментина не только клетками Сертоли, но и в перитубулярных миоидных клетках и интерстициальных эндокриноцитах, в связи с чем, совместно с морфометрическими данными может служить маркёром азоспермии -синдрома клеток Сертоли [1].

SMA (Smooth muscle actin, гладкомышечный актин). Этот белок является маркёром глад-комышечных клеток и клеток, содержащих а-актин (например, в фибробластах) [4].

В яичке SMA экспрессирует в перитубулярных миоидных клетках вокруг извитых семенных канальцев, а также в гладких миоцитах кровеносных сосудов [16].

Материалы и методы. В качестве материала для исследования в работе использовали ткани яичек здоровых (контрольная группа) мужчин и биопсийный материал у лиц с патологией - идиопатическое бесплодие (клинически обоснованное).

Работа выполнена в трёх группах, учитывая уровень тестостерона (по Г.Г. Автандилову): I. - 100 мужчин первого периода зрелого возраста (22-35 лет) с нормальным сперматогенезом; II. - 100 мужчин пожилого возраста (61-74 года); III. - 100 мужчин первого периода зрелого возраста (22-35 лет) с идиопатическим бесплодием.

Объект исследования: во всех группах - правые семенники (яички) - биоптаты.

Фрагменты ткани и биоптаты яичек фиксировали погружением в фиксатор Буэна и заливали в парафин с использованием стандартных методик. Количество срезов на каждом стекле - по два. Впоследствии, участки (5 im) либо окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического исследования или использовали для иммуногистохимии (IHC).

Иммуногистохимия (ИГХ). Количество срезов на каждом стекле - по два. После депа-рафинизации и повторной гидратации парафиновых срезов, IHC проводили для следующих антигенов.

Для окрашивания виментином (Vimentin) и гладкомышечным актином (SMA) срезы подвергали воздействию 20 % уксусной кислоты в течение 15 с., блокировали 5 % бовиналь-ной сывороткой (BSA) в течение 30 мин и инкубировали с моноклональными анти-Vimentin и анти-SMA первичными антителами (1: 100; DAKO, Гамбург, Германия) в течение часа. Срезы затем подвергают воздействию второго антитела (анти-кроличьего IgG, 1: 100; DAKO). После аппликации каждого реактива стекла со срезами отмывали в 0,1 М растворе фосфатного буфера в сосуде с мешалкой. Для визуализации реакции добавляли на каждый срез 1-3 капли DAB-хромогена. Инкубировали от 30 секунд до 20 минут под контролем в микроскопе. Ядра клеток докрашивали гематоксилином и срезы заключали в «Aquatex».

Оценка иммуногистохимических реакций базировалась на интенсивности окрашивания и разделении иммунопозитивных (положительных) клеток согласно рекомендациям

D.J. Dabbs «Diagnostic immunohistochemistry (2006 г.)». Шкала интенсивности окрашивания: «-» - нет экспрессии (в < 1 % клетках в срезе); «+» - слабая экспрессия (в 1-10 % клетках в срезе); «++» - умеренная экспрессия (в 10-50 % клетках в срезе); «+++» - интенсивное окрашивание (в > 50 % клетках в срезе).

Для идентификации и дифференциации мужских половых клеток и клеток Сертоли в извитых семенных канальцах использовали метод отпечатков (рис. 1).

«

ъ >

V * % . - .

Рис. 1. Яичко. Отпечаток, по G.Giemsa, ><400. В центре - клетка Сертоли

Количественное содержание фолликулостимулирующего гормона (ФСГ, FSH), лютеини-зирующего гормона (ЛГ, LH) и ß-ингибина определяли в образцах человеческой сыворотки методом иммуноферментного анализа. Диапазон измерения: 0,8-50 мМЕ/мл. Чувствительность: 0,8 мМЕ/мл. Стандартизация: стандарты на основе человеческой сыворотки прокалиброваны по 2-му Международному стандарту ВОЗ IRP 78/549 [Fischbach F.T., Dunning M.B. A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests, 8th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2008: 1344 pp.]. Определение свободного тестостерона проводилось методом двойного (равновесного) диализа (единица измерения - мг/сутки) и методом радиоиммунологического анализа (единица измерения - нмоль/л).

Клиническое обоснование. Все исследуемые пациенты являются молодыми людьми в возрасте 22-35-ти лет. Они исследованы и соматически здоровы; 40 человек из 100 обследуемых спортивного телосложения, без вредных привычек. Из анамнеза заболевания следует, что у них после 2-х лет бездетности была обнаружена азооспермия (после длительного центрифугирования с положительной фруктозной и а-гликозидазой реакцией). Инфекционный анамнез не отягощён: соматических заболеваний, отягощающих сперматогенез, нет (например, эпидемический паротит) или врожденных аномалии не присутствовали. Обследованные молодые люди имеют нормальное сексуальное либидо и были сексуально очень активны.

Физическое обследование. Физическая экспертиза показала: оволосение на лобке по мужскому типу; мужской голос взрослого; высота 175-182 см и вес 68-84 кг. Локальное исследование: оба яичка в мошонке, обычных размеров (средний объем: справа - 18 мл, слева -20 мл), мягкие по консистенции и безболезненные; варикоцеле не обнаружено; семейный анамнез по поводу варикозного расширения вен не отягощён.

Лабораторные данные (средние показатели): сыворотка ФСГ - 9,8 МЕ/л (N: 5-15 МЕ/л), ЛГ - 5,5 МЕ/л (N: 1-9 МЕ/л), Р-ингибин - 150 пг/мл (N: 100-400 пг/мл), тестостерон -20 мг/26 нмоль/л (N: 10-20/12-33 нмоль/л); кариотип: 46, XY, Y-микроделеции отсутствуют. Спермограмма: 5 мужчин - аспермия; 12 мужчин - олигозооспермия; 72 мужчины - азооспермия; 8 мужчин - криптозооспермия; 2 мужчин - астенозооспермия; 1 мужчина - терато-зооспермия.

Результаты. Гистология. На уровне биопсии, яички при идиопатическом бесплодии демонстрируют свойства классического и неклассического вариантов SCO-синдрома с полным или частичным отсутствием половых клеток в семенных канальцах. Клетки Сертоли представлены зрелыми формами, прикреплены к базальной мембране, образуя тубулярные полости, и содержат хорошо выраженное ядро с четко видимым ядрышком (рис. 2).

При наличии в извитых семенных канальцах единичных локусов сперматогоний целесообразно говорить о фокальном варианте SCO-синдрома.

Иммуногистохимия. Во всех группах (1-я, II-я и III-я): нити белка промежуточных фила-ментов виментина, который, как известно, присутствует во всех состояниях дифференцирующихся клеток Сертоли, показали положительное мечение в цитоплазме этих клеток, расположенных в семенных канальцах, которые идентифицированы как клетки Сертоли. Уровень экспрессии маркёра Vimentin высокой степени отмечается во всех зрелых клетках Сертоли («+++») и средней степени в некоторых (около 20 % от общего числа) незрелых клетках («+»). Уровень экспрессии Vimentin в половых клетках - 0 %. (рис. 3). Белок SMA во всех исследуемых группах (I-я, II-я и III-я): слабая экспрессия отмечается в единичных спермато-гониях («-±»). В клетках Сертоли визуализируется слабое накопление маркера («±»). В других видах половых клеток, в клетках Лейдига, а также в перитубулярных клетках экспрессии SMA не обнаружено («-»). Хорошо выражена экспрессия SMA в миоидных клетках стенки семенных канальцев, образуя выраженный коричневый овод («+++»). Уровень экспрессии SMA в половых клетках - 5 % (рис. 4).

Рис. 2. Яичко, извитой семенной каналец при идиопатическом бесплодии (мужчина 22-35 лет); ИГХ с антителами к 8МЛ, окрашивание ядер гематоксилином, ><200. Л - миоидные клетки, О - сперматогония

Рис. 3. Яичко, извитой семенной каналец при идиопатическом бесплодии (мужчина 22-35 лет); ИГХ с антителами к УтеШт, окрашивание ядер гематоксилином, ><200. Клетка Сертоли: Л - цитоплазма, О - ядро

Рис. 4. Яичко, извитой семенной каналец при нормальном сперматогенезе (мужчина 22-35 лет); ИГХ с антителами к SMA, окрашивание ядер гематоксилином, ><200. Л - миоидные клетки, О - половые клетки

Обсуждение. Для клинициста имеет ключевое значение разделение на группы пациентов с идиопатическим бесплодием: в одну входят пациенты с тотальным SCO-синдромом, в другую - с фокальным вариантом SCO-синдромом. В первом случае шансы оплодотворения снижены до нуля, что не скажешь про второй случай, при котором проявляются мелкие очаги, по крайней мере, качественного сперматогенеза. При фокальном варианте SCO-синдроме резко возрастает вероятность зачатия через ICSI.

Разделение SCO-синдрома на два варианта целесообразно по ряду позиций: для корректного описания морфологической картины, а также при выборе тактики дальнейшего лечения таких мужчин. Несмотря на то, что при фокальном варианте в базальном отсеке извитого семенного канальца присутствуют лишь сперматогонии, необходимо продолжать дальнейшие изучение пролиферативной и апоптотичекой активности сохранившихся половых клеток.

По del Castillo и др. (1947) SCO-синдром характеризуется: а) полное отсутствие половых клеток в семенных канальцах; б) нормальные клетки Сертоли с обильной цитоплазмой; в) отсутствие гистологической дегенерации ткани яичка; г) снижение объёма яичек.

Морфологический анализ семенного канальца при бесплодии позволяет различать следующие типы клеток Сертоли: I - нормальные взрослые клетки с выраженным плотным крупным ядром, грубо треугольной формы с тремя ядрышками; II - незрелые клетки с круглыми, часто расположенными ядрами; III - дисгенетические клетки, похожие на незрелые спермато-гонии-А, с почти зрелой цитоплазмой и с менее развитыми органеллами; IV - инволюциони-рующие клетки, с редко расположенными ядрами и зрелой цитоплазмой, содержащей в изобилии липидные капли, остаточные органеллы и атипичные межклеточные коммуникации.

Выявление виментина в клетках Сертоли напрямую зависит от фаз созревания и дифференциации самой клетки. В то время как виментин постоянно присутствует в клетках Сертоли, то по литературным данным антигены Цитокератин-18, антимюллеров гормон и М2А-антиген не выявляются: от препубертата к половому созреванию и зрелости. Выраженная экспрессия вимен-тина свидетельствует о зрелых формах клетках Сертоли в семенном канальце [2; 6; 7].

Белки цитоскелета SMA и виментин демонстрирует положительную экспрессию во всех группах. Наличие F-актина в миоидных клетках перитубулярных участках яичка дополняет до сих пор имеющиеся данные о наличии этого белка у других млекопитающих, например, в

бычьих или овечьих семенниках [21; 23]. При этом следует учитывать о роли элементов цито-скелета в формировании гемато-тестикулярного барьера. Тем не менее, полученные результаты показывают, что начало экспрессии SMA в миоидных клетках, само по себе является маркёром гладкомышечной дифференцировки. Таким образом, выявление SMA можно считать маркёром нормального полового развития гонад, которые могли бы быть использованы в качестве параметра обследования мужчин (мальчиков) на разных этапах развития яичек.

Так как миоидные клетки находятся в тесном взаимодействии с клетками Сертоли [9, 10], то это является крайне важным для структурного формирования гемато-тестикулярного барьера. Перитубулярные миоидные клетки, как известно, стимулируют синтез клетками Серто-ли андроген-связывающего белка и трансферрина. Они продуцируют белок под названием P-мод-S, который, как было показано, является важным регулятором функции клеток Сертоли in vitro [8], и они также считаются весьма влиятельными в модуляции эффектов андрогенов на извитые семенные канальца, и, следовательно, на сам сперматогенез [16].

Клетки Сертоли являются стабильными неделящимися клетками. При нормальном сперматогенезе при световой микроскопии сустентоциты маскируются за большим количеством половых клеток; при бесплодии (SCO-синдроме) же, напротив, половые клетки отсутствуют и поэтому хорошо визуализируются только лишь клетки Сертоли. Поэтому часто употребляемый термин при микроскопическом описании мужского бесплодия «гиперплазия клеток Сертоли» является не корректным.

Формирование гемато-тестикулярного барьера является необходимой вехой в развитии яичек, это происходит во время второго или третьего года жизни. То есть наличие SMA говорит о завершении формирования структур гемато-тестикулярного барьера.

Наличие виментина в пресперматогониях даёт нам аналогичную информацию. Ранее сообщалось, что виментин использовался в качестве маркера пресперматогоний в овечьих семенниках [19; 24]. Мы в своём исследовании также отмечаем этот факт и дополняем тем, что содержание этого белка заметно снижается по мере прогрессирования сперматогенеза.

Вывод. Таким образом, степень экспрессии виментина и SMA коррелирует со стадией развития: стадия заселения семенного канальца половыми клетками. Это может обеспечить альтернативу оценке возраста, массы тела и длины тела в будущих анализах, направленных на выявление возможных негативных последствий радиоактивного поражения сперматогенеза.

Белок виментин можно использовать в качестве дополнительного дифференциального маркера для определения степени зрелости клеток Сертоли при фокальном SCO-синдроме.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Anniballo R, Ubaldi F, Cobellis L, Sorrentino M, Rienzi L, Tesarik J (2000) Criteria predicting the absence of spermatozoa in the Sertoli cell-only syndrome can be used to improve success rates of sperm retrieval. Hum Reprod 15:2269-2277.

2 Bergmann M, Behre HM, Nieschlag E (1994) Serum FSH and testicular morphology in male infertility. Clin Endocrinol 40:133-136.

3 Bergmann M (2003) Decreased protamine-1 transcript levels in testes from infertile men. Mol Hum Reprod 9:331-336.

4 The BioGenex Molecular Pathology Catalog 2014 - 2015, 245 c.

5 Bohring C, Krause W (1999) Serum levels of inhibin B in men with different causes of spermatogenetic failure. Andrologia 31:137-141.

6 Brehm R, Steger K (2005) Regulation of Sertoli cell and germ cell differentiation. Adv Anat Embryol Cell Biol 181:1-93.

7 Brehm R, Marks A, Rey R, Kliesch S, Bergmann M, Steger K (2002) Altered expression of connexins 26 and 43 in Sertoli cells in seminiferous tubules infiltrated with carcinoma-in-situ or seminoma. J Pathol 197:647-653.

8 Brehm R, Rey R, Kliesch S, Steger K, Marks A, Bergmann M (2006) Mitotic activity of Sertoli cells in adult human testis: an immunohistochemical study to characterize Sertoli cells in testicular cords from patients showing testicular dysgenesis syndrome. Anat Embryol 211:223-236. del Castillo EB, Trabucco A, De Labalze FA (1947) Syndrome produced by absence of germinal epithelium without impairment of Sertoli and Leydig cells. J Clin Endocrinol 7:493-502.

9 Chemes HE, Dym M, Fawcett DW, Javadpour N, Sherins RJ (1977) Patho-physiological observations of Sertoli cells in patients with germinal aplasia or severe germ cell depletion. Ultrastructural findings and hormone levels. Biol Reprod 17:108-123.

10 Craft I, Bennett V, Nicholson N (1993) Fertilizing ability of testicular spermatozoa. Lancet 342:864-865.

11 Devroey P, Liu J, Nagy Z, Goossens A, Tournaye H, Camus M, van Steirteghem A, Silber S (1995) Pregnancies after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 10:1457-1460.

12 Franke FE, Pauls K, Rey R, Marks A, Bergmann M, Steger K (2004) Differentiation markers of Sertoli cells and germ cells in fetal and early postnatal human testis. Anat Embryol 209:169-177.

13 Kahraman S, Ozgur S, Alatas C, Aksoy S, Tasdemir M, Nuhoglu A, Tasdemir I, Balaban B, Biberoglu K, Schoys-man R (1996) Fertility with testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in non-obstructive azoospermic men. Hum Reprod 11:756-760.

14 Maymon BB, Paz G, Elliot DJ, Hammel I, Kleiman SE, Yogev L, Hauser R, Botchan A, Yavetz H (2000) Maturation phenotype of Sertoli cells in testicular biopsies of azoospermic men. Hum Reprod 15:1537-1542. Nistal M, Jimenez F, Paniagua R (1990) Sertoli cell types in the Sertoli-cell-only syndrome: relationships between Sertoli cell morphology and aetiology. Histopathology 16:173-180.

15 Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC (1992) Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte. Lancet 340:17-18.

16 Schlegel PN (1999) Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod 14:131-135.

17 Sharpe RM, McKinnell C, Kivlin C, Fisher JS (2003) Proliferation and functional maturation of Sertoli cells, and their relevance to disorders of testis function in adulthood. Reproduction 125:769-784.

18 Silber SJ (2000) Microsurgical TESE and the distribution of spermatogenesis in non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 12:2278-2284.

19 Silber SJ, van Steirteghem A, Nagy Z, Liu Z, Tournaye H, Devroey P (1996) Normal pregnancies resulting from testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection for azoospermia due to maturation arrest. Fertil Steril 66:110-117.

20 Silber SJ, Nagy Z, Devroey P, Tournaye H, van Steirteghem AC (1997) Distribution of spermatogenesis in the testicles of azoospermic men: the presence or absence of spermatids in the testes of men with germinal failure. Hum Reprod 12:2422-2428.

21 Steger K, Rey R, Kliesch S, Louis F, Schleicher G, Bergmann M (1996) Immunohistochemical detection of immature Sertoli cell markers in testicular tissue of infertile men: a preliminary study. Int J Androl 19:122-128.

22 Steger K, Rey R, Louis F, Kliesch S, Behre HM, Nieschlag E, Hoepffner W, Bailey D, Marks A, Bergmann M (1999) Reversion of the differentiated phenotype and maturation block in Sertoli cells in pathologic human testis. Hum Reprod 14:136-143.

23 Steger K, Failing K, Klonisch T, Behre HM, Manning M, Weidner W, Hertle L, Bergmann M, Kliesch S (2001) Round spermatids from infertile men exhibit decreased protamine-1 and 2 mRNA. Hum Reprod 16:709-716.

24 Steger K, Fink L, Failing K, Bohle RM, Kliesch S, Weidner W, intracytoplasmic sperm injection for nonobstructive azoospermia: testicular histology can predict success of sperm retrieval. J Urol 161:112-116.

25 Tournaye H, Verheyen G, Nagy P, Ubaldi F, Goossens A, Silber S, van Steirteghem AC, Devroey P (1997) Are there any predictive factors for successful testicular sperm recovery in azoospermic patients? Hum Reprod 12:80-86.

26 Ulirsch J., Fan Ch., Knafl G., Ming Jing Wu, Coleman B., Perou Ch., Swift-Scanlan T. // Vimentin DNA methyla-tion predicts survival in breast cancer // Breast Cancer Research and Treatment. - 2013.- Vol. 137(2). P. 383-96.

27 Verheyen G, Vernaeve V, van Landuyt L, Tournaye H, Devroey P, van Steirteghem A (2004) Should diagnostic sperm retrieval followed by cryopreservation for later ICSI be the procedure of choice for all patients with nonobstructive azoospermia? Hum Reprod 19:2822-2830.

Статья принята в печать 23 декабря 2015 г.

Рецензент Гелашвили П.А., доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры морфологии и патологии Медицинского университета «Реавиз».