ОДНОДОМЕННЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКУ GP ВИРУСА ЭБОЛА ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ЛИХОРАДКИ ЭБОЛА
SINGLE-DOMAIN ANTIBODIES TO EBOLA VIRUS GP PROTEIN FOR IMMUNOTHERAPY OF EBOLA FEVER

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вирусологии. Созданы мономерные и олигомеризованные однодоменные антитела, связывающееся с белком GP вируса Эбола и обладающее нейтрализующей активностью, предложено применение таких антител для профилактики и терапии инфекции млекопитающих, вызванной вирусом Эбола,
Предшествующий уровень техники
Вирус Эбола, являющийся этиологическим агентом геморрагической лихорадки Эбола, является одним из самых высоковирулентных инфекционных агентов, способным поражать животных и человека. Вирус Эбола вызывает лихорадку и геморрагический синдром с очень тяжелым течением заболевания и летальностью достигающей 90%. Несмотря на то, что этот вирус является эндемичным для стран африканского континента, его скорость распространения чрезвычайно высока, что вызывает угрозу, в том числе для населения развитых стран. Текущая вспышка в Западной Африке (первые случаи заболевания были зарегистрированы в марте 2014 г.) является самой крупной и сложной вспышкой заболевания со времени обнаружения этого вируса в 1976 году. В ходе этой вспышки заболели и умерли больше людей, чем во всех остальных вспышках вместе взятых. Она также распространялась и распространяется между странами, начавшись в Гвинее и перекинувшись через сухопутные границы в Сьерра-Леоне и Либерию, воздушным транспортом (только 1 пассажир) в Нигерию и наземным транспортом (1 пассажир) в Сенегал. 8 августа 2014 г. генеральный директор ВОЗ объявила эту вспышку чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs103/ru/). События, связанные с эпидемией в 2014-2015 годах, показали, что геморрагическая лихорадка Эбола является общемировой проблемой здравоохранения и национальной безопасности.
Патогенез заболевания, вызываемого вирусом Эбола, характеризуется быстрой иммуносупрессией и острым системным воспалением, приводящим к множественным поражениям внутренних органов, септическому шоку и смерти. Поскольку вирус способен инфицировать клетки различных органов и тканей, в том числе макрофаги, фибробласты, эндотелиальные клетки и гепатоциты, то это приводит к его быстрому размножению в организме (1, 2). Важнейшую роль в механизме проникновения вируса в различные клетки играет поверхностный гликопротеин вируса - GP EBOV. С участием GP EBOV происходит процесс инвазии вируса в клетки (3). Поэтому именно GP EBOV в настоящее время является основной мишенью для разработки профилактических и терапевтических средств направленного действия. Стоит отметить, что белок GP EBOV вируса 2014-2015 года отличается от белков предшествующих вирусов, так как содержит в своей аминокислотной последовательности минимум 18 аминокислотных замен (4). Существует острая потребность в создании средств терапии, которые обладали бы эффективностью и широкой специфичностью относительно изолятов вируса Эбола различных годов.
Многообещающим подходом экстренной терапии геморрагической лихорадки Эбола является пассивная иммунизация. В процессе пассивной иммунизации с помощью препаратов на основе антител в организме пациента создается временный искусственный иммунитет, обладающий направленным специфическим действием. Действующими веществами таких препаратов являются антитела и их различные производные. Опыт, полученный при применении антител для терапии заболеваний (не только инфекционных), показал, что подобные препараты достаточно безопасны, эффективны, биодоступны, а также могут быть использованы в различных фармакологических композициях и при различных способах введения.
Одно из перспективных направлений изучения рекомбинантных антител - это исследование однодоменных антител, которые являются VHH-фрагментами неканонических антител. Как известно, неканонические антитела образуются, наряду с каноническими антителами, в организме животных семейства верблюдовых и некоторых хрящевых рыб. Принципиальной особенностью их структуры является отсутствие легких цепей иммуноглобулинов (5). Таким образом, неканонические антитела представляют собой гомодимеры укороченных тяжелых цепей. Антиген-связывающий сайт сформирован только за счет вариабельных доменов тяжелых цепей и имеет отличную от канонических антител пространственную структуру, что позволяет ему взаимодействовать со скрытыми эпитопами антигенов. Данные особенности строения неканонических антител позволяют без потери специфических свойств изолировать VHH-фрагмент (домен неканонических антител, который формирует антиген-связывающий сайт), который и является однодоменным антителом. Размер этих фрагментов составляет 14-18 кДа, что обуславливает их способность быстро проникать в различные ткани и органы, но при этом быстро выводиться из организма при отсутствии целевого антигена. Высокая степень гомологии однодоменных антител с IgG3 человека снижает риск образования VHH-нейтрализующих антител. Более того, за счет одноцепочечной природы неканонических антител, нуклеотидная последовательность, кодирующая VHH-фрагмент, может быть легко использована для различных генно-инженерных модификаций, что позволяет получать однодоменные антитела нужной специфичности с использованием технологии фагового дисплея, модифицировать их последовательности на уровне гена, а также создавать как про-, так и эукариотические продуценты. Считают, что однодоменные антитела лишены ряда недостатков канононических антител, но при этом сохраняют все свойства иммуноглобулинов, необходимые для взаимодействия с антигеном. Лидер в области разработки лекарств на основе однодоменных антител - бельгийская биофармацевтическая компания Ablynx, также являющаяся правообладателем товарного знака «nanobody», который широко используется в научной среде для обозначения однодоменных антител и подчеркивает как их малый размер, так и высокие константы взаимодействия с антигенами (Kd обычно составляет 0,1-1000 nM) (http://www.ablynx.com/).
Полным эквивалентом термина «однодоменное антитело» для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», «NANOBODY», «VHH» а также «наноантитело» и «однодоменное наноантитело». Известно, что первые попытки лечения геморрагической лихорадки Эбола связаны с использованием канонических антител.
Первый опыт пассивной иммунизации для терапии инфекции, вызванной вирусом Эбола, был получен в 1995. Во время эпидемии в Заире, 9-и пациентам с подтвержденным диагнозом и выраженными симптомами было проведено переливание конвалесцентной сыворотки, содержащей специфические антитела. В результате 8 из 9 пациентов выжили (12% летальных исходов), тогда как уровень летальности эпидемии составлял 81% (6). Тем не менее, все пациенты, помимо переливания, получали и другие средства терапии, поэтому окончательный вклад антител в выздоровление установить невозможно. Дальнейшая разработка данного подхода не перспективна, поскольку связана с отбором крови у больных людей.
Известен и другой подход. Зараженным вирусом Эбола макакам вводили гипериммунную поликлональную лошадиную сыворотку. Несмотря на то, что наблюдалось уменьшение выраженности симптомов лихорадки, выживаемость не отличалась от контрольной группы (7). Авторы предполагают, что положительный результат может быть получен при изменении количества и схемы введения сыворотки. В дальнейших исследованиях удалось показать, что многократное введение больным вирусом Эбола макакам гомологичных поликлональных IgG, полученных из гипериммунной сыворотки макак того же вида, приводит к положительному результату (8). Основываясь на этих данных, фармацевтическая компания Fab'entech (Франция) при поддержке ВОЗ, в 2014 году начала разработку противоэбольной лошадиной сыворотки. В настоящее время ведутся in vitro испытания полученного продукта (http://www.fabentech.com/products/ebola-fbh-002-uk/). К очевидным недостаткам препаратов подобного типа можно отнести высокую вероятность серьезных побочных эффектов, иммуногенность самого препарата, что ограничивает возможность его многократного введения, а также низкую степень очистки и риск контаминации другими патогенами. Производство сыворотки напрямую связано с лошадьми, и количество препарата зависит от количества животных, более того, возможны значительные вариации в биологической активности препарата, полученного из разных партий. Также неясным остается вопрос об использовании гетерологичных сывороток, поскольку отсутствуют опубликованные данные, свидетельствующие об их эффективности в экспериментах in vivo.
Известна разработка, в которой использовали рекомбинантное моноклональное антитело, специфически связывающееся с GP EBOV, полученное путем селекции методом фагового дисплея из клеток крови пациента, пережившего эпидемию 1995 года. Данное антитело, которое назвали KZ52, показало свою эффективность в испытаниях in vitro и in vivo на модели экспериментальной инфекции, вызванной вирусом Эбола у морских свинок. (9). Тем не менее, при испытаниях на обезьянах, зараженных вирусом Эбола, не наблюдалось разницы в выживаемости между опытными и контрольными группами (10). Известна разработка, в которой терапию проводили смесью двух химерных моноклональных антител к GP EBOV канонической структуры, при этом выжило только одно из 3 животных. Однако дополнительные исследования показали низкий уровень вводимых антител в сыворотке погибших животных (11). Эффективность данной смеси антител могла бы быть увеличена за счет улучшения фармакодинамических показателей, но дальнейшие исследования не проводились.
Научные исследования показали, что ситуация с получением специфических к GP EBOV моноклональных антител канонической структуры не однозначна, поскольку такие иммуноглобулины могут оказывать как протективное действие, так и потенциировать проникновение вируса Эбола в клетки. Данный негативный эффект действия канонических антител связан с наличием в их структуре Fc - домена иммуноглобулина (12). Поэтому, в случае вируса Эбола, наиболее перспективным направлением является разработка препаратов на основе укороченных рекомбинантных антител, не содержащих Fc-фрагментов. В настоящее время не известны работы по созданию укороченных рекомбинантных антител без Fc-фрагментов, специфически взаимодействующих с GP EBOV, но имеются работы, в которых подобные антитела успешно получены на другие белки вируса Эбола.
Известна разработка американских авторов, в которой созданы однодоменные антитела против вируса Эбола. Технически получение однодоменных антител проводили с использованием синтетической библиотеки генов лам, без использования животных. Несмотря на распространенность данного подхода, он имеет ряд недостатков, главным из которых является отсутствие стадии аффинного созревания антител, которая проходит in vivo в организме иммунизированного животного. Более того, эти однодоменные антитела специфически взаимодействуют с белком NP EBOV, который, как отмечают авторы, имеет диагностическое значение, но не выступает в качестве мишени для терапевтического воздействия (13). В другой разработке, также американских авторов, описано получение акульих однодоменных антител, путем селекции из иммунной библиотеки. Однако эти однодоменные антитела, специфичные к белку NP EBOV, не обладают терапевтическим потенциалом и могут быть использованы только для диагностики (14). В настоящее время не известны разработки для терапии геморрагической лихорадки Эбола, в основе которых были бы однодоменные антитела против GP EBOV. B качестве аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести препарат Zmapp™, как наиболее близкий к заявляемому по специфичности и способу использования.
Наиболее успешные результаты терапии геморрагической лихорадки Эбола были получены при использовании коктейлей из 3 моноклональных антител канонической структуры против GP EBOV. Опубликованы данные об in vivo эффективности на модели инфекции вирусом Эбола приматов для трех таких коктейлей - Zmab (15) и МВ-003 (16), а также их комбинированный вариант Zmapp™ (состоит из 2 антител из состава Zmab и 1 из МВ-003) (17). Эти смеси обеспечивают до 100% защиты при введении животным после заражения вирусом Эбола. В качестве продуцента этих антител используется N.benthamiana (табак), что позволяет говорить авторам этого технического решения об экономичности способа получения и высокой производительности. Несмотря на это первая фаза клинических испытаний препарата была отложена из-за недостаточного количества доз (http://www.mappbio.com/zmapinfo.pdf). Также, во время последней эпидемии, Zmapp™ был введен 7 зараженным людям, 2 из которых все же умерли, несмотря на то, что получали помимо антител еще и целый ряд препаратов и процедур (http://www.biospace.com/News/ebola-clinical-trials-big-name-players-in-the/350579
#sthash.2YngWsYx.dpuf). Тем не менее, Zmapp™ ™ пока является наиболее разработанным кандидатным препаратом для терапии гемморрагической лихорадки Эбола. Zmapp™ производится фармацевтической компанией LeafBio (компания входит в состав Марр Biopharmaceuticals) при поддержке правительств США и Канады (18).
Недостатками прототипа являются:
- недостаточная терапевтическая эффективность;
- антитела, входящие в состав Zmapp™, представляют собой канонические иммуноглобулины, то есть в состав их константного домена входят Fc фрагменты, которые, являясь биологически активными доменами, могут вступать во взаимодействие с различными рецепторами на поверхности клеток, тем самым потенциируя способность вируса проникать в клетки в условиях in vivo;
- антиген, связывающий сайт антител, имеет каноническое строение, что обуславливает формирование плоской антиген-распознающей поверхности, тем самым ограничивая возможность взаимодействия таких антител со скрытыми эпитетами GP EBOV;
- сложность получения препаративных количеств, связанная с продукцией антител Zmapp™ в растениях, что является плохо масштабируемой технологией, не позволяющей в короткие сроки обеспечить достаточное количество доз препарата;
- имеются спорные данные об эффективности применения препарата Zmapp™ у больных людей;
- заявленная эффективная доза препарата Zmapp™ составляет 50,0 мг/кг, что является большим количеством белка и при системном введении может вызывать серьезные побочные эффекты, вплоть до развития анафилактического шока. При этом клинических испытаний по безопасности данного препарата не проводилось;
Таким образом, в настоящее время существует острая потребность в получении и разработке специфических антител для профилактики и терапии геморрагической лихорадки Эбола, которые путем связывания с белком GP EBOV оказывают блокирующее действие на механизм проникновения вируса в клетки и развитие заболевания.
Раскрытие изобретения
Сущность настоящего изобретения заключается в создании однодоменных антител и их олигомеров, которые эффективно связывают GP EBOV и нейтрализуют вирус Эбола и могут быть использованы для иммунотерапии лихорадки Эбола.
Техническая задача решается за счет того, что получены однодоменные и олигомерные антитела, содержащие антигенсвязывающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, на основе которых созданы композиции, предназначенные для профилактики и лечения инфекции млекопитающих, вызванной вирусом Эбола.
Краткое описание чертежей.
Для более ясного понимания заявленного изобретения, а также для демонстрации его особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание и ссылки на фигуры чертежей.
На фиг. 1 продемонстрирован уровень антител, специфических к GP EBOV, в сыворотке крови иммунизированной альпаки (Lama pacos). Определение проведено с помощью ИФА.
На фиг. 2 продемонстрирована электрофореграмма ампликонов последовательностей однодоменных антител.
На фиг. 3 продемонстрирован титр рекомбинантных бактериофагов.
На фиг. 4 продемонстрированы нуклеотидные последовательности предлагаемых антигенсвязывающих фрагментов SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, обозначенных как aEv1, aEv2, aEv3, aEv4, aEv5, aEv6, aEv7, aEv8, aEv9, aEv10 соответственно.
На фиг. 5 продемонстрирована очистка однодоменных антител методом аффинной хроматографии.
На фиг. 6 представлены график показаний поверхностного плазменного резонанса и таблица констант взаимодействия однодоменных антител с GP EBOV.
На фиг. 7 продемонстрирована элекрофореграмма олигомеров однодоменных антител.
На фиг. 8 представлена в виде таблицы in vitro вируснейтрализующая активность созданных антител.
На фиг. 9 представлена в виде таблицы in vivo вируснейтрализующая активность созданных антител при профилактической схеме иммунотерапии инфекции, вызванной вирусом Эбола.
На фиг. 10 представлена в виде таблицы in vivo вируснейтрализующая активность созданных антител при лечебной схеме иммунотерапии инфекции, вызванной вирусом Эбола.
Для более ясного понимания заявленного изобретения, а также для демонстрации его особенностей и преимуществ описано получение, отбор, характеристика, очистка однодоменных антител специфических к GP EBOV. Показано, что полученные однодоменные антитела обладают способностью связывать белок GP EBOV и вируснейтрализующей активностью in vitro, защищают от заражения и развития инфекции in vivo. Также показано, что полученные однодоменные антитела могут быть олигомеризованы с сохранением специфических и нейтрализующих свойств.
Чтобы получить однодоменные антитела, специфические к GP EBOV, осуществляли иммунизацию альпаки рекомбинантным аденовирусом 5 серотипа, продуцирующим белок GP EBOV. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к GP EBOV антител в сыворотке крови животного. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, для иммунизации можно использовать различные схемы введения и различный антигенный материал (например, белок GP EBOV или инактивированный вирус Эбола или псевдотипированные белком GP EBOV вирусы или любые генетические вектора, экспрессирующие белок GP EBOV или любые комбинированные варианты антигенного материала), обеспечивающие присутствие в организме иммунизируемого животного белка GP EBOV.
Для получения библиотеки ампликонов последовательностей однодоменных антител использовали кДНК, полученную из РНК мононуклеарных клеток переферической крови. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей однодоменных антител.
Для селекции методом фагового дисплея использовали паннинг на антигене - GP EBOV. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг на вирусных частицах, паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей.
Для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела, использовали секвенирование. Было определено 10 индивидуальных последовательностей, кодирующих специфические однодоменные антитела к GP EBOV. Нуклеотидные последовательности представлены на фиг. 4. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности однодоменных антител, специфических к GP EBOV.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к GP EBOV, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать GP EBOV. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к GP EBOV, могут быть модифицированы путем присоединения различных белков, белковых доменов и тэгов, таких, например, как НА-тэг, Flag-тэг, GST-тэг, GFP белок, RFP белок, биотин и другие.
Олигомеризованные однодоменные антитела к GP EBOV были получены с использованием изолейцинового зиппера. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения олигомеризацию однодоменных антител возможно проводить, например, с использованием Fc-фрагментов или любых других доменов, обеспечивающих гомо- и гетероолигомеризацию.
Для продукции однодоменных антител к GP EBOV использовали E.coli. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Характеристику полученных однодоменных антител к GP EBOV проводили путем определения констант реакции связывания с антигеном, а также путем определения вируснейтрализующей активности in vitro.
Показан профилактический и лечебный эффект однодоменных антител к GP EBOV при введении животным. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для терапии и профилактики возможно использование однодоменных антител, олигомеризованных однодоменных антител, а также любых их сочетаний. Также специалистам в данной области известно, что однодоменные антитела могут быть использованы в сочетании с различными веществами, не оказывающими влияния на механизм связывания однодоменных антител с GP EBOV, при этом все возможные смеси и сочетания попадают под объем настоящего изобретения.
Примеры осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами, однако эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема данного изобретения во всех отношениях
Пример 1. Получение иммунной библиотеки кДНК однодоменных антител альпаки
9
Для индукции экспрессии клетками иммунной системы специфических антител альпаку (Lama pacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали 3 раза с промежутками в 21 день. В качестве иммуногена использовали суспензию 10 рекомбинантных аденовирусных частиц 5 серотипа, несущих экспрессионную кассету с геном, кодирующим белок GP EBOV 2014-2015 года (rAd5-CMV-GP EBOV). rAd5-CMV-GP EBOV был получен по системе AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene, США) согласно протоколу производителя системы. Последовательность нуклеотидов, кодирующая белок GP EBOV, была взята из международной базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=GP+Ebola) и синтезирована таким образом, чтобы нести на концах последовательности сайтов рестрикции для клонирования согласно AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene, США). Для контроля формирования специфического иммунного ответа методом ИФА определяли титр специфических к белку GP EBOV антител в сыворотке крови (фиг. 1). Титр сыворотки после иммунизации составил 1/16000. После последней иммунизации, спустя 7 дней отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК со случайными праймерами и ревертазой SuperScriptIII (Invitrogene, США). На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции. Электрофореграммы ПЦР-продуктов представлены на фиг. 2. Полученные ампликоны являются иммунной библиотекой кДНК однодоменных антител альпаки.
Пример 2. Получение библиотеки рекомбинантных бактерифагов
12
Полученный ПЦР-продукт гидролизовали рестриктазами и клонировали в фагмидный вектор pHEN, гидролизованный по тем же сайтам. Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток E.coli (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника M13KO7 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы-производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Титр препарата определяли методом подсчета трансдуцирующих единиц (фиг. 3). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 10 трансдуцирующих единиц на мл суспензии.
Пример 3. Селекция и определение последовательности специфических однодоменных антител
11
Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого рекомбинантный белок GP EBOV иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 10 рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток E.coli TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 10 индивидуальных последовательностей. Предлагаемые нуклеотидные последовательности представлены на фиг. 4.
Пример 4. Продукция и очистка однодоменных антител
Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на Ni-аффинном сорбенте с использованием хроматографической системы ActaStart, согласно протоколу фирмы-производителя (General Electric, Швеция). Хроматограмма очистки представлена на фиг. 5. Данный пример демонстрирует простоту и эффективность продукции и очистки однодоменных антител в бактериальной системе экспрессии. Таким образом были получены очищенные препараты однодоменных антител. Одинаковые результаты были получены для всех 10 однодоменных антител.
Пример 5. Определение констант взаимодействия однодоменных антител
Константы взаимодействия (KD) однодоменных антител определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный белок GP EBOV ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученных однодоменных антител. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Biaevaluation (General Electric, Швеция). Эти данные представлены в таблице 1 (фиг. 6). Аналогичные результаты были получены для всех 10 однодоменных антител. Полученные данные демонстрируют высокие значения констант реакций всех полученных однодоменных антител с GP EBOV (KD составляют от 187,0 рМ до 713,0 нМ), что свидетельствует о высокой аффинности связывания однодоменных антител с GP EBOV.
Пример 6. Получение, продукция и очистка олигомеров однодоменных антител
Для создания олигомеров однодоменных антител, их нуклеотидные последовательности были клонированы в экспрессионный вектор pMAL-c5X-ILZ, который содержит в рамке считывания гена последовательность мальтоз-связывающего белка, а также последовательность изолейцинового зиппера (ILZ). Изолейциновый зиппер детерминирует образование олигомеров. Полученные экспрессионные вектора были трансформированы в клетки E.coli штамма BL21, экспрессия была индуцирована путем добавления 1,0 мкМ IPTG (Хеликон, Россия). Спустя 4 часа из бактериальной массы выделяли олигомеризованные однодоменные антитела на амилоз-аффинном сорбенте с помощью хроматографической системы ActaStart согласно протоколу фирмы-производителя (General Electric, Швеция). Затем удаляли мальтоз-связывающий белок протеолизом с использованием фактора Xa (NEB, Великобритания). Олигомеры однодоменных антител были проанализированы методом электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях (фиг. 7). Одинаковые результаты были получены для всех 10 однодоменных антител. Данные демонстрируют получение, продукцию и очистку олигомеров однодоменных антител.
Пример 7. Оценка in vitro нейтрализующей активности предлагаемых антител
Как известно, псевдотипирование широко используется в работе с особо опасными вирусными инфекциями. Этот метод использован для проверки вируснейтрализующей активности полученных однодоменных антител и их олигомерных форм. Для этих целей создан псевдотипированный белком GP EBOV рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (rVSV-GP EBOV). Для проведения исследования 100 бляшкообразующих единиц (БОЕ) rVSV-GP EBOV инкубировали с однодоменными антителами и их олигомерами в течение 1 часа. В качестве контролей использовали rVSV-GP EBOV без добавления однодоменных антител (обозначен K1), а также инкубацию rVSV-GP EBOV с однодоменными антителами, не связывающимися с GP EBOV (обозначен K2). После 1 часа инкубации пробы добавляли к эукариотическим клеткам линии VERO. Спустя 24 часа проводили подсчет количества БОЕ. Данные приведены в таблице 2 (фиг. 8). Аналогичные результаты были получены для всех 10 однодоменных антител, их олигомеров и возможных коктейлей. В экспериментах выявлено значительное снижение (более чем на 50% по сравнению с контролями) количества БОЕ в образцах, к которым были добавлены однодоменные антитела, их олигомеры или коктейли, что свидетельствует об их вируснейтрализующей активности.
Пример 8. Оценка профилактического эффекта предлагаемых антител in vivo
2
Для проведения экспериментов по применению однодоменных антител для профилактической схемы иммунотерапии был использован rVSV-GP EBOV. Мышам линии BALB/c вводили интраперитонеально по 10,0 мг/кг однодоменных антител, или их олигомерных форм, или коктейль однодоменных антител. В качестве контроля использовали введение животным физиологического раствора. Спустя 2 часа животным вводили интраперитонеально по 100 БОЕ rVSV-GP EBOV. Через 48 часов животных усыпляли в СО камере (19,20), вскрывали и собирали перитонеальные смывы, которые использовали для выделения ДНК и анализа наличия rVSV-GP EBOV методом ПЦР. Оценку проводили полуколичественным методом, основанным на сравнении количества ПЦР-продукта относительно ПЦР-продукта, полученного при амплификации ДНК из 100 БОЕ rVSV-GP EBOV: («+++» - более 1000 БОЕ rVSV-GP EBOV; «++» - примерно 100-1000 БОЕ rVSV-GP EBOV; «+» - менее 100 БОЕ rVSV-GP EBOV; «-» - отсутствие ПЦР-продукта). Данные приведены в таблице 3 (фиг. 9). Аналогичные результаты были получены для всех 10 однодоменных антител, их олигомеров и возможных коктейлей. В экспериментах выявлено значительное снижение количества ДНК rVSV-GP EBOV в образцах, полученных от животных, которым вводили однодоменные антитела, или их олигомеры или коктейли, что свидетельствует об их профилактическом эффекте.
Пример 9. Оценка лечебного эффекта предлагаемых антител in vivo.
2
Для проведения экспериментов по применению однодоменных антител для терапевтической схемы иммунотерапии был использован rVSV-GP EBOV. Мышам линии BALB/c вводили интраперитонеально 100 БОЕ rVSV-GP EBOV. Согласно выбранным временным точкам этим же животным интарперитонеально вводили по 10 мг/кг однодоменных антител, или их олигомерные формы, или коктейль однодоменных антител, введение повторяли каждые 24 часа. В качестве контроля использовали введение животным физиологического раствора. Через 48 часов мышей усыпляли в СО камере (19, 20), вскрывали и собирали перитонеальные смывы, затем вырезали печень, кишечник и селезенку. Органы замораживали в жидком азоте и гомогенизировали при помощи стерильных пестиков. Гомогенаты органов использовали для выделения ДНК и анализа наличия rVSV-GP EBOV методом ПЦР. Оценку проводили полуколичественным методом, основанным на сравнении количества ПЦР-продукта относительно ПЦР-продукта, полученного при амплификации ДНК из 100 БОЕ rVSV-GP EBOV: («+++» - более 1000 БОЕ rVSV-GP EBOV; «++» - примерно 100-1000 БОЕ rVSV-GP EBOV; «+» - менее 100 БОЕ rVSV-GP EBOV; «-» - отсутствие ПЦР-продукта). Данные приведены в таблице 4 (фиг. 10). Аналогичные результаты были получены для всех 10 однодоменных антител, их олигомеров и возможных коктейлей. В экспериментах выявлено значительное снижение количества ДНК rVSV-GP EBOV в образцах, полученных от животных, которым вводили однодоменные антитела, их олигомеры или коктейли, что свидетельствует об их лечебном эффекте.
Таким образом, созданные однодоменные антитела обладают способностью связывать белок GP EBOV, обладают вируснейтрализующей активностью in vitro и защищают от заражения и развития инфекции in vivo. Также показано, что полученные однодоменные антитела могут быть олигомеризованы с сохранением специфических и нейтрализующих свойств. Для иммунотерапии, т.е. для профилактики и лечения лихорадки Эбола, возможно использование как однодоменных антител, так и олигомеризованных однодоменных антител или любых их сочетаний, а также могут быть использованы в различных фармакологических композициях. Предлагаемые антитела могут быть использованы в сочетании с различными веществами, не оказывающими влияния на механизм связывания однодоменных антител с GP EBOV.
Список литературы
1. Hunt CL, Lennemann NJ, Maury W. Filovirus entry: a novelty in the viral fusion world. Viruses. 2012 Feb; 4(2):258-75. doi: 10.3390/v4020258. Epub 2012 Feb 7. Review. PubMed PMID: 22470835; PubMed Central PMCID: PMC3315215.
2. Martines RB, Ng DL, Greer PW, Rollin PE, Zaki SR. Tissue and cellular tropism, pathology and pathogenesis of Ebola and Marburg viruses. J Pathol. 2015 Jan; 235(2): 153-74. doi:10.1002/path.4456. Review. PubMed PMID: 25297522.
3. Falasca L, Agrati C, Petrosillo N, Di Caro A, Capobianchi MR, Ippolito G, Piacentini M. Molecular mechanisms of Ebola virus pathogenesis: focus on cell death. Cell Death Differ. 2015 Aug; 22(8): 1250-9. doi: 10.1038/cdd.2015.67. Epub 2015 May 29. Review. PubMed PMID: 26024394; PubMed Central PMCID: PMC4495366.
4. Jun SR, Leuze MR, Nookaew I, Uberbacher EC, Land M, Zhang Q, Wanchai V, Chai J, Nielsen M, Trolle T, Lund O, Buzard GS, Pedersen TD, Wassenaar TM, Ussery DW. Ebolavirus comparative genomics. FEMS Microbiol Rev. 2015 Jul 14. pii: fuv031. [Epub ahead of print] Review. PubMed PMID: 26175035.
5. Gibbs WW. Nanobodies. Sci Am. 2005 Aug; 293 (2): 78-83.
6. Mupapa K, Massamba M, Kibadi K, Kuvula K, Bwaka A, Kipasa M, Colebunders R, Muyembe-Tamfum JJ. Treatment of Ebola hemorrhagic fever with blood transfusions from convalescent patients. International Scientific and Technical Committee. J Infect Dis. 1999 Feb; 179 Suppl 1:S18-23. PubMed PMID: 9988160.
7. Jahrling PB, Geisbert J, Swearengen JR, et al. Passive immunization of Ebola virus-infected cynomolgus monkeys with immunoglobulin from hyperimmune horses. Arch Virol Suppl. 1996; 11:135-140.
8. Postexposure antibody prophylaxis protects nonhuman primates from filovirus disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109(13):5034-5039. Provided the seminal observation that it is possible to protect nonhuman primates from filovirus disease by passive administration of antibody. In this study, polyclonal antibody was used.
9. Maruyama T, Rodriguez LL, Jahrling PB, et al. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. J Virol. 1999; 73(7):6024-6030.
10. Oswald WB, Geisbert TW, Davis KJ, et al. Neutralizing antibody fails to impact the course of Ebola virus infection in monkeys. PLoS Pathog. 2007; 3(1):e9.
11. Marzi A, Yoshida R, Miyamoto H, et al. Protective efficacy of neutralizing monoclonal antibodies in a nonhuman primate model of Ebola hemorrhagic fever. PLoS ONE. 2012; 7(4):e36192. Demonstrates that a cocktail of as few as two monoclonal antibodies can provide partial protection against filovirus challenge.
12. Takada A, Feldmann H, Ksiazek TG, Kawaoka Y. Antibody-dependent enhancement of Ebola virus infection. J Virol. 2003 Jul; 77(13):7539-44. PubMed PMID: 12805454; PubMed Central PMCID: PMC164833.; Takada A, Kawaoka Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Rev Med Virol. 2003 Nov-Dec; 13(6):387-98. Review. PubMed PMID: 14625886.
13. Sherwood LJ, Hayhurst A. Ebolavirus nucleoprotein C-termini potently attract single domain antibodies enabling monoclonal affinity reagent sandwich assay (MARSA) formulation. PLoS One. 2013; 8(4):e61232. doi: 10.1371/journal.pone.0061232. Epub 2013 Apr 5. PubMed PMID: 23577211; PubMed Central PMCID: PMC3618483.
14. Flajnik MF, Dooley H. The generation and selection of single-domain, v region libraries from nurse sharks. Methods Mol Biol. 2009; 562:71-82. doi: 10.1007/978-l-60327-302-2_6. PubMed PMID: 19554288.
15. Qiu X, Audet J, Wong G, et al. Sustained protection against Ebola virus infection following treatment of infected nonhuman primates with ZMAb. Scientific Reports. 2013; 3:3365. doi:10.1038/srep03365.
16. Pettitt J, Zeitlin L, Kim do H, Working C, Johnson JC, Bohorov O, Bratcher B, Hiatt E, Hume SD, Johnson AK, Morton J, Pauly MH, Whaley KJ, Ingram MF, Zovanyi A, Heinrich M, Piper A, Zelko J, Olinger GG. Therapeutic intervention of Ebola virus infection in rhesus macaques with the MB-003 monoclonal antibody cocktail. Sci Transl Med. 2013 Aug 21; 5(199):199ra113. doi: 10.1126/scitranslmed.3006608.PubMedPMID: 23966302.
17. Qiu X, Wong G, Audet J, Bello A, Fernando L, Alimonti JB, Fausther-Bovendo H, Wei H, Aviles J, Hiatt E, Johnson A, Morton J, Swope K, Bohorov O, Bohorova N, Goodman C, Kim D, Pauly MH, Velasco J, Pettitt J, Olinger GG, Whaley K, Xu B, Strong JE, Zeitlin L, Kobinger GP. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with Zmapp™. Nature. 2014 Oct 2; 514(7520):47-53. doi:10.1038/nature13777. Epub 2014 Aug 29. PubMed PMID: 25171469; PubMed Central PMCID: PMC4214273.
18. McCarthy M. US signs contract with Zmapp™ maker to accelerate development of the Ebola drug. BMJ. 2014 Sep 4;349:g5488. doi: 10.1136/bmj.g5488. PubMed PMID:25189475.
19. H.H. Каркищенко, С.В. Грачев. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям. г. Москва: изд-во Профиль, 2010.
20. KM Conlee, ML Stephens, AN Rowan and LA King. Carbon dioxide for euthanasia: concerns regarding pain and distress, with special reference to mice and rats. Lab Anim 2005 39: 137.