Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей

Вестник ДВО РАН. 2006. № 6

Т.А.КУЗНЕЦОВА, Н.Н.БЕСЕДНОВА, А.М.УРВАНЦЕВА, И.Ю.БАКУНИНА, Т.Н.ЗВЯГИНЦЕВА, Н.Н.ДРОЗД, В.А.МАКАРОВ

Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей

Исследованы иммуномодулирующие и антикоагулянтные свойства и оценена взаимосвязь между структурой и функцией фукоиданов - сложных сульфатированных полисахаридов, выделенных их бурых водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и Laminaria japonica. Установлено, что исследуемые фукоиданы различаются между собой молекулярными массами, строением главной цепи и степенью сульфатирования. Показано, что данные фукоиданы обладают стимулирующим действием в отношении гуморальных и клеточных факторов иммунитета и проявляют антикоагулянтную активность как in vitro, так и при парентеральном введении экспериментальным животным. Количественные различия в проявлениях этих видов активности связаны с индивидуальными структурными особенностями фукоиданов.

Comparative investigation of biological activity of fucoidans from brown seaweeds. T.A.KUZNETSOVA,

N.N.BESEDNOVA (Recearch Institute of Epidemiology and Microbiology, RAMS, Vladivostok); A.M.URVANTSEVA,

I.Y.BAKUNINA, T.N.ZVYAGINTSEVA (Pacific Institute ofBioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok); N.N.DROZD, V.A.MAKAROV (Gematology Recearch Center, RAMS, Moscow).

Immunomodulation and anticoagulant activity, as well as correlation between structure and function of fucoidans - sulphated polysaccharides, obtained from brown seaweeds Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Laminaria japonica, is investigated. It is found that fucoidans differ from each other by molecular weight, structure of the main chain and sulfate content. The studued fucoidans produce a stimulating effect on humoral and cellular factors of immunity, and show a^^ag^la^ activities both in vitro, and in parenteral administration to experimental animals. Quantitative differences in the revealed activities are determined by individual structural characteristics of fucoidans.

Фукоиданы - сложные сульфатированные полисахариды, выделяемые преимущественно из бурых водорослей, основным моносахаридным звеном которых является L-фукоза. Параметры, по которым различаются фукоиданы в зависимости от вида водоросли или условий ее произрастания, - это молекулярная масса (от 10 до 1000 кДа), моносахаридный состав (помимо фукозы в их структуре могут присутствовать галактоза, ксилоза, манноза, арабиноза, рамноза, рибоза, глюкуроновая кислота), положение и содержание сульфатов (могут иметь 0-2 остатка серной кислоты в остатках фукозы), а также тип связи между остатками фукозы (а-(1^3), (1^2), (1^-4) либо их сочетание) и структура боковых цепей [4]. Известно, что структурные особенности фукоиданов зависят от вида бурой водоросли и места ее обитания [21, 22].

Выяснение взаимосвязи между структурой и биологической активностью фукоиданов в настоящее время является важной, но малоизученной проблемой. Следует отме-

КУЗНЕЦОВА Татьяна Алексеевна - кандидат медицинских наук, БЕСЕДНОВА Наталия Николаевна - академик РАМН (НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток), УРВАНЦЕВА Анжела Михайловна, БАКУНИНА Ирина Юрьевна - кандидат химических наук, ЗВЯГИНЦЕВА Татьяна Николаевна - доктор химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток), ДРОЗД Наталья Николаевна - кандидат биологических наук, МАКАРОВ Владимир Александрович - доктор медицинских наук (Гематологический научный центр РАМН, Москва).

Работа выполнена в рамках интеграционного проекта СО РАМН-ДВО РАН «Новые иммуномодуляторы на основе морских природных соединений, включая их производные, для создания БАД и лекарственных препаратов» № 05-П-СМ-05-007 при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 06-04-48540-а) и программы ФХБ РАН.

тить, что большинство исследователей приводят данные о биологической активности нативных фукоиданов, детали структуры которых, как правило, если и установлены, то лишь частично в силу своей сложности. Четкое установление структуры в сочетании с заданной биологической активностью является необходимым условием для разработки на основе фукоиданов как лекарственных средств, так и препаратов для научно-исследовательских целей.

Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование иммуномодулирующей и антикоагулянтной активности фукоиданов, выделенных из бурых водорослей Fucus evanescens (I), Laminaria cichorioides (II) и L. japonica (III), а также выяснение влияния степени сульфатирования полисахарида и присутствия полифенолов в препарате на вышеназванные свойства фукоиданов.

Фукоиданы были выделены из свежезаготовленных водорослей по методу [21]. Фу-коидан из Fucus evanescens освобождали от недиализуемых полифенолов по методу [2]. Содержание сульфатных групп в образцах полисахаридов определяли по турбодиметри-ческому методу [8] и рассчитывали как процент от навески соответствующего полисахарида. Десульфатирование фукоидана проводили по методу [7].

Исследование влияния фукоиданов на гуморальный иммунный ответ мышей (СВАхС57ВL/6)F1 при условии парентерального введения до иммунизации в дозе 5 мг/кг изучали по числу антителообразующих клеток (АОК) к эритроцитам барана (ЭБ) по методу [11] и титрам гемолизинов (ГЛ) и гемагглютининов (ГА), выявляемых в серологических реакциях. Сравнительное исследование влияния фукоиданов на реакции, опосредованные Т-клетками, было проведено на модели индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) у мышей линии (СВАхС57ВL/6)F1 [12]. Каждый из исследуемых препаратов вводили до сенсибилизации животных ЭБ в дозе 5 мг/кг однократно подкожно.

Воздействие фукоиданов на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов исследовали по их способности к адгезии на пластик и активности кислородзависимых микробицидных систем в спонтанном НСТ-тесте [3].

Концентрации фукоиданов при внесении в культуру нейтрофильных лейкоцитов перитонеального экссудата белых беспородных мышей составляли 10, 50 и 100 мкг/мл, время инкубирования 30 мин при 37°С. Результаты исследования адгезивной активности регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 650 нм и 492 нм, а результаты НСТ-теста - по уровню оптической плотности, измеряемой при 540 нм.

Антикоагулянтную активность фукоиданов исследовали in vitro на бедной тромбоцитами плазме, полученной от здоровых доноров. Фукоиданы вносили в плазму в концентрации от 1 до 1000 мкг/мл плазмы. Изучали следующие параметры коагулограммы: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) с использованием реагентов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия) [1]. Удельную антитромбиновую (аПа) активность фукоиданов исследовали по методу [18], а удельную аХа активность - по методу [20] с использованием антитромбина человека, фактора Ха человека, бычьего тромбина, хромогенных субстратов для тромбина S-2238 и для фактора Ха^-2222 фирмы «Dade Вehring» (Германия). Показателем аПа и аХа активности исследуемых образцов являлось изменение оптической плотности раствора за 1 мин при 405 нм, выраженное в ЕД/мг . Для калибровочной кривой использовали 5-й международный стандарт нефракционированного гепарина (при измерении aIIa активности) и 1-й международный стандарт низкомолекулярного гепарина (при измерении аХа активности). Рассчитывали отношение показателей аХа/aIIa, которое свидетельствует о перспективности использования препарата в качестве антикоагулянта и не должно быть ниже 1,5.

При оценке фармакодинамических параметров гемостаза мышам линии BАLB/c фу-коиданы I и II вводили внутрибрюшинно в дозах 5 мг/кг и оценивали динамику общих

параметров коагулограммы (в АПТВ- и ТВ-тестах). Смесь образцов плазмы крови получали от 10-15 животных через 15, 30, 60 и 180 мин после введения препаратов. Крысам-самцам линии Wistar эти препараты вводили в яремную вену в дозах 5 и 10 мг/кг и проводили определение антикоагулянтной активности плазмы животных в разные интервалы времени после введения (5-180 мин).

Для сравнительной оценки активности фукоиданов в отношении всех показателей рассчитывали ИС (отношение показателя активности в опыте к таковому в контроле).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Ехсе1, достоверность различий оценивали по ^критерию Стьюдента, критическое значение уровня значимости принимали равным 5%.

Структурный анализ исследуемых фукоиданов показал, что они различаются между собой молекулярными массами, строением главной цепи и степенью сульфатирования (см. таблицу).

Структурные характеристики образцов фукоиданов

Фукоидан Fuc:SO42-, моль/моль Молекулярная масса, кДа Моносахаридный состав, мольный %

Fuc Xyl Man Glc Gal

I l:O,8 2O-4O 9O З 2 O 5

I, ОСЕ l:O,9 1O-4O 98 2 O O O

I, ДС l:O,3 5-lO 76 9 6 З 6

II 1:1,8 4O-8O lOO O O O O

III l:l 3O-4O 7O 4 8 З l5

Примечание. ДС - частично десульфатированный, ОСВ - полностью освобожденный от фенолов.

Выход фукоидана из F. evanescens составляет 15%, из L. richorioides - около 10 %, из L. japonica - 3%.

Введение фукоиданов оказывало стимулирующее влияние на антителообразование к ЭБ, что выражалось в статистически значимом увеличении числа АОК в селезенке и титров сывороточных антител (ГА и ГЛ). Фукоиданы II и III проявили более высокую стимулирующую активность в отношении гуморальных факторов иммунитета по сравнению с I.

При исследовании влияния на реакцию ГЗТ к ЭБ у мышей установлено, что фукоиданы из различных видов водорослей усиливают интенсивность этой реакции, что свидетельствует об их стимулирующем влиянии на Т-клеточный иммунный ответ. Статистически значимых различий в эффектах фукоиданов из разных водорослей на реакцию ГЗТ не выявлено.

Фукоиданы из разных видов водорослей стимулировали функциональную (бактерицидную) активность нейтрофилов. Отмечено, что с увеличением дозы препаратов показатели НСТ-теста возрастали. Статистически значимые различия по отношению к контролю выявлены под влиянием фукоиданов I, II и III в концентрации 50 и 100 мкг/мл. Наибольшую активность в этом тесте показал фукоидан III из L. japonica с максимальным при концентрации 100 мкг/мл индексом стимуляции показателей НСТ-теста, равным 2,9. Однако статистически значимых различий в эффектах фукоиданов из трех видов водорослей на показатели НСТ-теста in vitro не выявлено.

Для исследования влияния сульфатов на изучаемые биологические эффекты нами были получены препараты частично десульфатированного (ДС) и полностью освобожденного от полифенолов (ОСВ) фукоидана I. Результаты сравнительных испытаний активности модифицированных фукоиданов по сравнению с исходным приведены на рис. 1. Все образцы проявляли активность в НСТ-тесте и обладали адгезивной активностью in vitro, что

Рис. 1. Влияние образцов фукоидана из F. evanescens на показатели НСТ-теста и адгезивной активности нейтро-фильных лейкоцитов in vitro

свидетельствует о прямом мембрано-тропном эффекте исследованных образцов. У фукоидана ОСЕ отмечена более высокая, а у фукоидана ДС более низкая активность по сравнению с исходным образцом (рис. l).

Tаким образом, фукоиданы из F. еvanescens, L. richorioides и L. japonica обладают иммуностимулирующим действием, усиливая гуморальные и клеточные факторы иммунитета и оказывая дозозависимое стимулирующее влияние на показатели функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов.

Исследование антикоагулянтной активности под влиянием фукоиданов in vitro показало дозозависимое пролонгирование времени свертывания крови в AПTВ-, ПЕ- и TВ-тестах, в большей степени оказываемое препаратом II.

Через l5 мин после введения фукоиданов показатели времени свертывания крови у мышей BALB/c были максимальны и возрастали в AПTВ-тесте в среднем в З-4 раза и в тромбо-тесте - в 5-6 раз по отношению к исходному уровню, при этом статистически значимых различий в эффектах фукоиданов I и II не отмечено. После инъекции препарата I время свертывания в AПTВ-тесте возвращалось к норме по истечении 1 ч, а препарата II - через З ч (рис. 2).

При внутривенном введении крысам фукоиданов I и II выявлено усиление антикоагулянтной активности плазмы животных с увеличением дозы. При этом после введения фукоидана I наблюдали достаточную для терапевтического эффекта aIIa активность плазмы крыс (до 2,5 ЕД/мл) и небольшую аХа активность (до 0,З ЕД/мл), а в отношении образца II - до З,1 и 0,95 ЕД/мл соответственно. Длительность эффекта на aIIa активность плазмы составила З ч (срок наблюдения) для обоих препаратов, на аХа активность - 5 мин для фукоидана I и З ч для фукоидана II.

Следует отметить, что, несмотря на большее соотношение активностей аХа/aIIa для фукоидана I, сила и длительность антикоагулянтного эффекта у образца II больше. Это объясняется различием удельной антитромбиновой активности образцов (у фукоидана II она в 2 раза больше, чем у I) при практически одинаковых ингибиторных активностях по отношению к фактору Ха.

Рис. 2. Елияние фукоиданов (I и II) на показатели AПTВ-теста (вверху) и TВ-теста (внизу) у мышей BALB/c in vivo. Ось ординат - время свертывания плазмы, с

Таким образом, фукоиданы из F. evanescens и L. dchorioides проявляют антикоагулянт-ную активность как in vitro, так и при парентеральном введении экспериментальным животным и способны ингибировать факторы IIa (тромбин) и Ха.

Как показано рядом исследователей, молекулярная масса (М. м.) наиболее активных фукоиданов находится в диапазоне 30-100 кДа, при этом установлена тенденция: чем меньше М. м., тем выше эта активность [10, 17]. Нативные фукоиданы имеют ограничение для применения в медицине вследствие высокой М. м., а также наличия остаточных протеинов, что несет риск иммунных осложнений. Но в целом авторы считают, что разные фракции фукоиданов имеют свой оптимум М. м. для проявления этой активности. М. м. полученных нами биологически активных фукоиданов находится именно в этих пределах - 30-80 кДа.

Большинством исследователей также установлено, что биологическая активность фу-коиданов возрастает с увеличением содержания сульфатов, имеет значение и расположение сульфатных групп в молекуле [6, 15]. Изучаемые нами фукоиданы (I и III) имеют среднюю, а фукоидан II - высокую степень сульфатирования. По-видимому, количественные различия в антикоагулянтном действии образцов фукоиданов (более высокая антикоагу-лянтная активность II по сравнению с I), а также более выраженная адгезивная активность нейтрофильных лейкоцитов под влиянием исходного фукоидана I по сравнению с десуль-фатированным образцом объясняются разной степенью сульфатирования фукоиданов, а также различным типом гликозидных связей в них.

Освобожденный от полифенолов фукоидан проявляет наибольшую адгезивную активность, что свидетельствует об экранирующем эффекте полифенолов для проявления фу-коиданом из F. еvanescens мембранотропной активности.

Кроме того, препараты полисахаридов содержат примеси недиализуемых полифе-нольных соединений, главным образом высокомолекулярных флоротаннинов, которые сами являются биологически активными веществами. Наиболее известны антиоксидантная и бактерицидная активности полифенолов [13, 14]. Полифенолы бурых водорослей, в связи со способностью избирательно инактивировать действие ингибиторов плазми-на плазмы крови - а2-макроглобина и а2-плазминного ингибитора, рассматривают как потенциальные препараты для лечения тромбозов [9], а также как перспективные для лечения ревматизма, аллергии, атеросклероза, рака и воспаления [19]. Флоротаннины бурых водорослей являются ингибиторами фосфолипаз, липоксигеназ и циклооксиге-наз, которые участвуют в синтезе биорегуляторов патогенеза ряда заболеваний. Таким образом, присутствие флоротаннинов может влиять на биологическую активность образцов полисахаридов.

Помимо этого известно, что биологическая активность фукоиданов находится в зависимости от моносахаридного состава [5, 16]. Основным их структурным компонентом является фукоза. Определяемые в минорных количествах в составе препарата II галактоза, манноза, ксилоза, по-видимому, не оказывали существенного влияния на показатели анти-коагулянтной активности.

Таким образом, фукоиданы, полученные нами из разных видов бурых водорослей, оказывают стимулирующее влияние на гуморальный и клеточный иммунный ответ, функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов и обладают антикоагулянтной активностью, что открывает перспективы их практического использования в медицинской практике в качестве иммуномодулирующих и антикоагулянтных средств. Количественные различия в проявлениях этих видов активности связаны с индивидуальными структурными особенностями. Полученные результаты предполагают дальнейшее исследование взаимосвязи между структурой и функцией фукоиданов.

1. Балуда Е.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д., Кузник Б.И. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Хомск, 1980. З1З с.

2. Урванцева A^., Бакунина И.Ю., Ким Н.Ю., Исаков Е.Е., Глазунов Е.П., Звягинцева ТН. Еыделение очищенного фукоидана из природного комплекса с полифенолами и его характеристика // Химия раст. сырья. 2004. № З. С. 15-24.

3. Хаитов Р.М., Пинегин Б.Е., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: ЕНИРО, 1995. 219 с.

4. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiology. 200З. Vol. 1З, N 6. Р. 29-40.

5. Blondin С., ^aubet F., Nardella A., Sinquin С., Jozefonvicz J. Relationships between chemical characteristics and anticomplementary activity of fucans // Biomaterials. 1996. Vol. 17. P. 597-60З.

6. Boisson-Vidal С., ^aubet F., ^evolot L., Sinquin С., Theveniaux J., Millet J., Sternberg С., Mulloy B., Fischer A.M. Relationship between antithrombotic activities of fucans and their structure // Drug Devel. Res. 2000. Vol. 51. Р. 216-224.

7. ^izhov A.O., Dell A., Morris H.R., Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifant’ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of fucoidan from the brown seaweed ^orda filum // Carbohydr. Res. 1999. Vol. З20, N 1. Р. 108-119.

8. Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymatic and non-enzymatic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. J. 1961. Vol. 78, N 2. Р. З12-З19.

9. Fukuyama Y., Kodama M., Miura I., Kinzyo Z., Kido M., Mori H., Nakayama Y., Takahashi M. Structure of an anti-plasmin inhibitor, eckol, isolated from the brown alga Ecklonia kurome Okamura and inhibitory activities of its derivatives on plasma plasmin inhibitors // ^em. Pharm. Bull. 1989. Vol. З7, N 2. P. З49-З5З.

10. Grauffel V., Kloareg B., Mabeau S., Durand P., Jozefonvicz J. New natural polysaccharides with potent anti-thrombic activity: fucans from brown algae // Biomaterials. 1989. Vol. 10. Р. З6З-З68.

11. Jerne N.K., Nordin F.N. Plaque formation in agar by single antibody-producing cell // Science. 196З. Vol. 40. P. 405-407.

12. Lagrange P.E., Mackaness G.B., Miller T.E. Influence of dose and route of antigen injection on the immunological induction of T-cells // G. Exp. Med. 1974. Vol. 1З9, N З. P. 528-542.

13. Nagayama K., Iwamura Y., Shibata T., Hirayama I., Nakamura T. Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome // J. of Antimicrob. ^emother. 2002. Vol. 50, N 6. P. 889-89З.

14. Nakamura T., Nagayama K., Uchida K., Tanaka R. Antioxidant activity of phlorotannins isolated from the brown alga Eisenia bicyclis // Fisher. Sci. 1996. Vol. 62, N 5. P. 92З-926.

15. Nishino T., Nagumo T. Anticoagulant and antithrombin activities of oversulfated fucans // Carbohydr. Res. 1992. Vol. 229. Р. З55-З62.

16. Nishino T., Nagumo T. Sugar constituens and blood-anticoagulant activities of fucose-containing sulfated polysaccharides in nine brown seaweed species // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1987. Vol. 61. Р. З61-З6З.

17. Nishino T., Aizu Y, Nagumo T. The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity // Thromb. Res. 1991. Vol. 64. Р. 72З-7З1.

18. Pletcher С., Cunningham M., Nelsestuen G. Kinetic analysis of various heparin fractions and heparin substitutes in the thrombin inhibition reaction // Biochim. Biophys. Acta. 1985. Vol. 8З8, N 1. P. 106-11З.

19. Shibata T., Nagayama K., Tanaka R., Yamaguchi K., Nakamura T. Inhibitory effects of brown algal phlorotannins on secretory phospholipase A2s, lipoxygenases and cyclooxygenases // J. Appl. Phycol. 200З. Vol. 15. P. 61-66.

20. Walenga J.M., Fareed J. Preliminary biochemical and pharmacologic studies on a chemically synthesized pentasaccharide // Semin Thromb Hemost. 1985. Vol. 11, N 2. P. 89-99.

21. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L., Gorbach V.I., Urvantseva A.M., Kiseleva M.I., Isakov V.V. Water-soluble polysaccharides of some brown algae of the Russian Far-East. Structure and biological action of low-molecular mass polyuronans // J. Exp. Marine. Biol. Ecol. 2005. Vol. З20. P. 12З-1З1.

22. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., ^izhov A.O., Krupnova T.N., Sundukova E.V., Isakov V.V. Water-soluble polysaccharides of some Far-Eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. Marine Biol. Ecol. 200З. Vol. 294, iss. 1. P. 1-1З.