Технологии иммунотерапии лимфоцитами с искусственными антигенными химерными рецепторами (car) в онкологии

Раздел - обзоры

Технологии иммунотерапии лимфоцитами с искусственными антигенными химерными рецепторами (CAR) в онкологии

Шишкин А.М., Иванов А.В., Боженко В.К.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, г. Москва 117997, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86

Резюме: Терапия лимфоцитами с химерными антигенными рецепторами является активно развивающимся разделом иммунотерапии злокачественных опухолей. В обзоре рассмотрены принципы создания химерных рецепторов и рассмотрен опыт их клинического применения.

Ключевые слова: CAR, TCR, T-лимфоциты, адоптивная иммунотерапия, трансфекция, опухолевые антигены

The technologies of lymphocyte's immunotherapy with artificial chimerical antigen receptors in oncology.

A.M. Shishkin, A.V. Ivanov, V.K. Bozhenko.

Federal state budgetary institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR) 86 Profsoyuznaya str., Moscow, Russia, 117997. Abstract

Lymphocyte's therapy with chimerical antigen receptors is actively developing direction of cancer immunotherapy. The review analyzes the principles of the chimerical receptors and studies the experience of their clinical application.

Keywords: Lymphocyte's therapy with chimerical antigen receptors, TCR, adoptive immunotherapy, transfection, neoantigens.

Информация об авторах

Шишкин Александр Михайлович - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории

иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий в онкологии

Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории

иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий в онкологии

Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, руководитель отдела

молекулярной биологии и экспериментальной терапии

Оглавление

Введение

Терапия Т-лимфоцитами с химерным антигенным рецептором

Механизмы цитотоксического действия Т-лимфоцитов

Подходы к построению химерного антигенного рецептора Т-лимфоцитов.

Методы внесения генетического материала в Т-лимфоциты для создания химерного

антигенного рецептора

Антигены для химерных антигенных рецепторов

Проблемы и подходы клинического использования Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами

Результаты клинического применения терапии с использованием CAR Т-лимфоцитов

Заключение

Список литературы

Введение

Несмотря на продолжающееся развитие традиционных методов лечения злокачественных опухолей - хирургического, радиологического и химиотерапии, эффективность изолированного применения этих методов имеет принципиальные ограничения, обусловленные, прежде всего, такими фундаментальными свойствами опухоли как инвазия и метастазирование. В наибольшей степени это сказывается при лечении на поздних стадиях развития опухоли.

В связи с этим, особую актуальность приобретает развитие новых методов терапии на основе современных достижений иммунологии, молекулярной биологии и генетики.

В основу любого метода терапии опухолей, за исключением хирургического и, отчасти, радиологического положен принцип воздействия на опухоль за счет отличий опухолевых клеток от нормальных клеток организма. Тем самым, предполагается минимизировать негативное влияние на нормальные ткани с эффективным поражением ткани опухоли. В идеале предполагается, что метод лечения будет воздействовать только на клетки опухоли (таргетная терапия). Одним из интенсивно развивающихся направлений противоопухолевой терапии является иммунотерапия, одним из разделов которой является адоптивная иммунотерапия на основе химерных Т-клеточных рецепторов (CAR), направленных к специфичным опухолевым антигенам.

Перспективность применения иммунологических методов лечения обуславливается тем, что именно иммунная система должна осуществлять надзор за постоянством макромолекулярного состава организма. Однако опухоль развивается из собственных клеток организма и в связи с этим не является иммунологически чужеродной. Исключения составляют вирус-индуцированные опухоли. Кроме того, в процессе развития опухоль приобретает многие черты, позволяющие ей ускользать от иммунного надзора, такие как снижение продукции главного комплекса гистосовместимости и секреция иммуносупрессорных факторов (Чикилева и др., 2012; Титов и др., 2014).

В то же время, в результате опухолевой прогрессии происходит накопление мутаций в клетках опухоли, и происходит появление новых мутантных макромолекул, являющихся мишенями для компонентов иммунной системы. В пользу важной роли иммунной системы в развитии опухоли может говорить феномен спонтанной регрессии опухоли. Наиболее часто он наблюдается у пациентов с нейробластомой, почечноклеточной карциномой, меланомой, при лимфомах и лейкозах. Одним из наиболее важных механизмов спонтанной регрессии опухоли считается иммунологический

Терапия CAR-лимфоцитами относится к адоптивной (от англ. adoptive - приемный) иммунотерапии (также, как и ЛАК- и ОИЛ- терапия). Адоптивная терапия основана на

извлечении клеток иммунной системы из организма, их модификации с целью приобретения ими противоопухолевых свойств, последующего наращивания и реинфузии пациенту.

Терапия Т-лимфоцитами привлекательна тем, что именно цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты являются главным эффекторным звеном в адаптивном иммунном ответе на несущие чужеродные антигены клетки организма. Но выделение и наработка нативных специфических Т-лимфоцитов представляется непростой задачей. Кроме того, для цитотоксического действия CD8+ T-лимфоцитов необходимо наличие на поверхности лизируемых клеток молекул главного комплекса гистосовместимости, чья продукция снижена во многих злокачественных опухолях.

Этих недостатков лишена терапия цитотоксическими Т-лимфоцитами с химерными Т-клеточными рецепторами. Продукция химерных рецепторов достигается генно-инженерными методами и позволяет получить in vitro большой объем однородных Т-лимфоцитов с заданной специфичностью. Для распознавания клеток-мишеней эти Т-лимфоциты не нуждаются в присутствии молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC-I). При этом входящие в состав CAR структуры нормального T-клеточного рецептора позволяют запускать те же механизмы активации и цитотоксичности, что и при связывании с мишенью обычного рецептора. Введение дополнительных компонентов в структуру рецептора дает возможность повысить стабильность получаемых лимфоцитов и увеличить синтез ими цитокинов, стимулирующих иммунный ответ (Emtage et al., 2008). Однако распознавание CAR мишеней, не связанных с MHC-I, означает невозможность использовать в качестве целевого антигена химерного рецептора внутриклеточных антигенов. Использование CAR возможно только против поверхностных опухолевых антигенов. В то же время, в отличие от нормальных Т-клеточных рецепторов, CAR способны распознавать антигены небелковой природы (углеводы, ганглиозиды, протеогликаны и др.) (Maher, 2012; Bonifant et al., 2016).

Т-клеточный рецептор

Основная задача CAR - это использовать цитотоксический потенциал клетки, заменив собой нормальный Т-клеточный рецептор. Т-клеточный рецептор (TCR - T-cell receptor) находится на поверхности зрелых Т-лимфоцитов. Рецептор состоит из двух аминокислотных цепей и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Цепи имеют сходное строение и могут принадлежать к двум классам: а и ß или у и 5. На одном Т-лимфоците могут присутствовать только рецепторы одного класса в количестве 30 - 40 тысяч единиц. Более 95% зрелых Т-лимфоцитов имеют рецептор aßTCR. Рецептор состоит из внеклеточного участка, трансмембранной части, содержащей 10-12 аминокислотных остатков и цитоплазматической части из 3-5 аминокислотных остатков. Внеклеточный участок состоит из двух доменов. В вариабельных доменах представлены 4 каркасных участка относительно постоянного состава и 3 гипервариабельных (Ярилин, 2010).

Эффекторным звеном TCR-рецептора является димер Z-цепи (CD247), связанный с цитоплазматической частью рецептора (Brownlie, Zamoyska, 2013). Иногда вместо Z-цепи присутствует n-цепь, являющаяся продуктом альтернативного сплайсинга того же гена. В этом случае цепи составляют гетеродимер. Частота гетеродимера составляет около 10% от общего числа рецепторов. Обе цепи имеют небольшой экстрацеллюлярный участок, связанный дисульфидной связью, трансмембранный фрагмент, состоящий из 22 аминокислотных остатков и длинную цитоплазматическую часть, содержащую 112 аминокислотных остатков. Цитоплазматическая часть содержит 3 участка ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), играющих важную роль в передаче сигнала в клетках иммунной системы (Ярилин, 2010).

Вместе с TCR-рецептором на поверхности Т-лимфоцитов присутствуют молекулы CD3, образующие с TCR-рецептором TCR-CD3 комплекс. Именно в составе комплекса TCR способен обеспечивать передачу сигнала внутрь клетки (Cronin, Penninger, 2007). CD3 состоит из цепей трех видов: у, 5 и 8. Внеклеточные части цепей принадлежат к

суперсемейству иммуноглобулинов, но включают только константные домены. Внутренние части молекул содержат, также как и Z-цепи, мотив ITAM, что свидетельствует об их участии в передаче сигнала внутрь клетки. T-клеточный рецептор образует комплексы с димерами цепей CD35/s и CD3y/s и с димером Z-цепи. Только в таком составе Т-клеточный рецептор является функционально активным (Call et al., 2002).

В то же время, в распознавании Т-клеточным рецептором антигена участвуют и другие рецепторы Т-лимфоцитов. Основная роль этих корецепторов заключается в повышении сродства комплекса TCR-CD3 к антигену (Cronin, Penninger, 2007). Корецепторы связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости, в составе которого презентируются распознаваемые Т-клеточным рецептором антигены. Такими корецепторами являются CD4 и CD8. Их участие в связывании антигена повышает сродство связывания на два порядка. Кроме того, они участвуют в передаче внутриклеточного сигнала через лимфоцит-специфическую протеин тирозин киназу (Lck) (Chen, Flies, 2013). Они не могут быть представлены на одной и той же клетке зрелого Т-лимфоцита, а характеризуют разные субпопуляции Т-лимфоцитов: CD4 присутствуют на поверхности Т-хелперов, а CD8 на цитотоксических лимфоцитах (Podojil, Miller, 2009). CD4 и CD8 не являются исключительно маркерами Т-лимфоцитов, а синтезируются также рядом клеток миелоидного ряда. Ими связываются разные молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC): CD8+ клетки связывают MHC-I, представленный на всех клетках организма, а CD4+ связывают MHC-II, представленный на антигенпрезентирующих клетках, главным образом, дендритных клетках. И CD8, и CD4 относятся к суперсемейству иммуноглобулинов.

Другим корецептором комплекса TCR-CD3 является гомодимер CD28. Внеклеточный участок представлен вариабельным доменом, относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов. Молекула содержит также цитозольный и трансмембранный участки (Evans et al., 2005). CD28 представлен на большинстве Т-клеток. Его содержит более 90% человеческих CD4+ Т-лимфоцитов и более 50% CD8+ T-лимфоцитов. Общее содержание

CD28 на поверхности Т-клеток составляет около 60 тыс. молекул (Acuto, Michel, 2003). Костимуляция CD28 комплекса CD3TCR усиливает активацию Т-клеток и стимулирует выработку ряда интерлейкинов, таких как интерлейкин-2, интерферон-гамма и интерлейкин-4 (Cheng et al., 2011). CD80 и CD86 - два структурно гомологичных лиганда CD28, экспрессирующихся на поверхности антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки. Их взаимодействие с CD28 необходимо для выполнения его корецепторной функции. В отсутствие CD28 происходит недостаточная активация Т-клеток, приводящая к неполноценному иммунному ответу. Кроме того, стимуляция CD28 приводит к увеличению экспрессии анти-апоптотического белка BCL-X и подавлению экспрессии проапоптотического фактора p73, что, в отсутствие CD28, может приводить к ингибированию клеточного цикла Т-лимфоцитов и к гибели клетки (Acuto, Michel, 2003). Механизмы цитотоксического действия Т-лимфоцитов

Зрелые цитотоксические Т-лимфоциты CD8+ распознают поверхностные антигены белковой природы, связанные с главным комплексом гистосовместимости MHC-I. Молекулы MHC-I находятся на поверхности всех ядросодержащих клеток организма. Распознаваемые антигены имеют преимущественно внутриклеточное происхождение и презентируются MHC-I в виде коротких фрагментов в 8-10 аминокислотных остатков, располагающихся в антигенсвязывающей полости молекулы MHC-I. В ходе взаимодействия с лизируемой клеткой зрелый цитотоксический лимфоцит образует контакт, называемый иммунологическим синапсом. В формировании синапса принимают участие молекулы интегринов и комплекс содержащейся на поверхности Т-лимфоцита молекулы CD2 и молекулы CD58, встречающейся на поверхности большинства клеток. Для осуществления образования плотного контакта необходимы ионы магния. Внутри синапса располагается комплекс TCR-CD8 с молекулой MHC-I, содержащей в антигенсвязывающей полости распознаваемый антиген. Под влиянием этих процессов происходит поляризация цитотоксического Т-лимфоцита и перестройка его цитоскелета. Центросомы смещаются и

фиксируются на плазматической мембране в месте расположения иммунологического синапса (Jenkins, Griffiths, 2010). В результате иммунологический синапс принимает вид микрополости, окруженной клеточными контактами. Внутрь полости за счет экзоцитоза происходит секреция связанных с сетью микротрубочек клетки секреторных лизосом, содержащих молекулы перфорина и гранзимов. Перфорин является аналогом компонента комплемента C9. В присутствии ионов кальция он проникает в мембрану клетки-мишени за счет гидрофобной части молекулы, называемой мембранатакующим комплексом перфорина. В мембране происходит полимеризация 12-18 молекул перфорина, вследствие чего образуется трансмембранная пора диаметром 10-20 нм (Mace et al., 2014). Собственная мембрана цитотоксической клетки является недоступной для действия перфорина. В формировании невосприимчивости участвуют молекулы катепсина B и cFLIP (FLICE-like inhibitory protein), локализованные на мембране цитотоксического Т-лимфоцита. Через образовавшуюся пору в клетку-мишень проникают молекулы гранзимов и гранулизинов. Существует несколько типов гранзимов, из которых более распространены типы A и B. Наиболее из них важен тип B, поскольку нокаут гена гранзима A у мышей не приводит к существенному снижению цитотоксических свойств Т-лимфоцитов (Russell, Ley, 2002). Гранзимы являются сериновыми протеазами. Основная их роль при проникновении в клетку заключается в активации каспаз, в частности каспазы 3, запускающей апоптоз (Chowdhury, Lieberman, 2008). Также существуют и параллельные пути активации апоптоза. Так, гранзим В, воздействуя на фактор Bid (BH3 Interacting Domain Death Agonist), способен, в конечном итоге, запускать митохондриальный путь апоптоза (Trapani, Smyth, 2002; Hoves et al., 2010). Гранулизин также способен вызывать апоптоз клетки мишени как по каспаз-зависимому, так и по каспаз-независимому пути (Gamen et al., 1998).

Другим механизмом индукции апоптоза клетки-мишени является FAS-лиганд зависимый механизм. Fas-лиганд (FasL) является гомотримерным белком, экспрессируемым на поверхности цитотоксических Т-лимфоцитов, и относящимся к суперсемейству фактора

некроза опухоли (TNF - tumor necrosis factor). Поверхностный клеточный рецептор FAS (или FasR, CD95) синтезируется на поверхности большинства клеток организма (Waring, Müllbacher, 1999). Усиление его экспрессии происходит при опухолевой трансформации клетки.

Взаимодействие Fas-лиганда и Fas-R приводит к рекрутированию цитоплазматической (C-концевой) частью Fas-лиганда молекулы FADD (Fas Associated Via Death Domain) и образованию гибель-индуцирующего сигнального комплекса (DISC). N-терминальный регион молекулы FADD является критическим для фиксации молекулы прокаспазы-8. Непосредственно после фиксации, молекула прокаспазы-8 путем протеолиза переходит в свою активную форму - каспазу-8, которая в дальнейшем инициирует каспазный каскад, приводящий к протеолизу многих жизенно-важных белков клетки и запуску апоптоза. Другим путем является расщепление белка Bid, переводящее его в форму t-Bid, что приводит к активизации митохондриального пути активации апоптоза (Kavurma, Khachigian, 2003). После активации в клетке-мишени апоптоза Т-лимфоцит освобождается и способен осуществлять свою цитотоксическую функцию в отношении других клеток. Таким образом, цитотоксический Т-лимфоцит способен активировать апоптоз клетки мишени с использованием различных механизмов. Наличие нескольких механизмов особенно важно, потому что в клетках опухоли часто повреждены многие пути активации апоптоза. Помимо апоптотического механизма цитотоксического действия Т-лимфоцитов есть данные и о возможности гибели клетки-мишени по некротическому пути за счет перфорации мембраны (Сащенко, 1997).

Подходы к построению химерного антигенного рецептора Т-лимфоцитов

Первоначально химерные антигенные рецепторы (CAR - chimeric antigen receptor) отражали в своей структуре нормальные рецепторы Т-лимфоцитов. Соответственно, они включали внеклеточную антиген-распознающую часть, передаточный фрагмент и цитоплазматическую эффекторную часть (Curran et al., 2012). Внеклеточная антиген-

распознающая часть может быть представлена нормальными двуцепочечными антигенсвязывающими фрагментами антител - Fab-фрагментами, но чаще состоит из одноцепочечных вариабельных фрагментов иммуноглобулинов scFv (single-chain Fv) -объединенных в одну полипептидную цепь с помощью короткого полипептидного линкера вариабельными фрагментами тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Вопрос об использовании одноцепочечных вариабельных фрагментов антител (scFv-фрагментов), или полноценных антител в качестве распознающей части химерного антигенного рецептора подробно изучался в работе (Nolan et al., 1999). Исследование показало сходные свойства обоих типов рецепторов в отношении проявления ими цитотоксических свойств к клеткам-мишеням и в отношении уровня продуцируемых ими цитокинов.

Аффинность CAR должна быть достаточной для контакта с клеткой- мишенью для запуска специфических иммунных реакций цитотоксического Т-лимфоцита - формирования иммунологического синапса, выделения цитотоксических факторов и, в конечном итоге, апоптоза клетки-мишени. Эти соображения ведут к поиску высокоаффинных рецепторов. Так в работе Parkhurst с коллегами (Parkhurst et al., 2009), аффинность рецептора искусственно повышалась точечными заменами аминокислотных остатков в молекуле рецептора. С другой стороны, висследовании Eshhar (Eshhar, 1997) показано, что возможно чрезмерное связывание эффекторных клеток с клетками мишенями. Как указывалось выше, каждый цитотоксический лимфоцит способен оказывать цитотоксический эффект в отношении многих опухолевых клеток. Чрезмерное связывание с клеткой мишенью может затруднять высвобождение лимфоцита и, тем самым, снижать эффективность проводимой терапии. На настоящий момент не существует способа определения достаточной аффинности распознающей части Т-клеточных рецепторов на этапе их конструирования. Другим подходом является формирование внешнего фрагмента химерного рецептора из лигандов различных клеточных рецепторов. Примерами являются лигандный полипептид к рецептору эндотелиального фактора роста (anti-VEGFR2), интегрин-связывающий пептид

(anti-avß6), герегулин (anti-Her3/4 рецептор) и интерлейкин-13 мутеин (anti-IL13 рецептор) (Curran et al., 2012). Также показана антиопухолевая активность химерного рецептора, содержащего в качестве распознающей части NKG2D-рецептор - рецептор к стресс-индуцируемым белкам, а в качестве эффекторной - CD3Z-^m (Zhang et al., 2005).

Большинство химерных антигенных рецепторов между антиген-распознающим и трансмембранным доменами имеют шарнирный участок. Это придает рецептору большую гибкость и повышает доступность для связывания, выводя антиген-распознающую часть рецептора за пределы гликокаликса Т-лимфоцитов. Примерами внеклеточных шарнирных регионов могут служить домены иммуноглобулинов, такие как Fc-фрагмент антител, иммуноглобулинподобные домены, полученные из внеклеточных фрагментов CD8a, CD28, TCRß-цепи, NKG2D. Различные спейсерные регионы, при похожих в остальном структурах химерных рецепторов, могут приводить к заметным различиям в секреции цитокинов и цитотоксических свойствах Т-клеток (Patel et al., 1999). Кроме того, они могут влиять на взаимодействие между CAR-инженерными Т-лимфоцитами и другими элементами иммунной системы (Hombach, Abken, 2010).

Трансмембранный компонент химерного антигенного рецептора, как правило, происходит из гомо или гетеродимерных мембранных белков, таких как CD4, CD8, CD28, Z-цепи (CD247) или гамма-цепи Fc-рецептора иммуноглобулина E - FcsRIy. Отдельный случай представляет собой химерный иммунорецептор, содержащий в качестве распознающей части NKG2D, непосредственно соединенный с Z-цепью (Cartellieri et al., 2010).

Внутриклеточный домен химерного антигенного рецептора может также быть представлен в нескольких формах. Первоначально (т.н. химерные рецепторы первого поколения) он состоял или из нормального эффекторного звена Т-клеточного рецептора - Z-цепи (CD247) или из гамма-цепи Fc-рецептора иммуноглобулина E - FcsRIy. Сигнальную функцию осуществлял ITAM-мотив (мотив активации иммунных рецепторов на основе тирозина), который фосфорилируется по тирозину после связывания рецептором антигена и

запускает каскад внутриклеточных реакций. Z-цепь содержит три ITAM-мотива и является предпочтительной для химерного рецептора, по сравнению с FcsRIy, содержащим один ITAM-мотив, что было продемонстрировано в экспериментах in vivo (Haynes et al., 2001). В исследованиях на лабораторных животных была показана значительная редукция опухоли или ее иррадиация на таких моделях как В-клеточная лимфома, карцинома кишечника, erb2-позитивные карциномы, рак простаты, рак яичника, медуллобластома и глиома (Cartellieri et al., 2010). В то же время, одной только активации CD3TCR комплекса недостаточно для формирования полноценного иммунного ответа. Происходит незначительное увеличение пролиферации и субоптимальная продукция цитокинов. Согласно превалирующей двусигнальной модели активации Т-лимфоцитов, необходим костимулирующий сигнал от взаимодействия CD28-B7 в дополнение к сигналу от комплекса CD3-TCR (Gool et al., 1996). В связи с этим были предприняты попытки разработки химерных антигенных рецепторов лимфоцитов второго поколения.

Естественным подходом являлось совмещение в мономолекулярном химерном рецепторе в сигнальной части одновременно цитоплазматического домена молекулы CD28 и Z-цепи или FcsRIy (Savoldo et al., 2011). Показано, что активация такого мономолекулярного рецептора приводит к пролиферации лимфоцитов, выработке цитокинов независимо от экзогенной стимуляции CD28-B7. Также повышается выработка антиапоптотических факторов и возрастает цитотоксическая активность (Kowolik et al., 2006).

Другими возможными элементами химерного антигенного рецептора являются молекулы ICOS (CD278), OX40 (CD134), 4-1BB (CD137), CD27, DAP10, 2B4 (CD244) и тирозинкиназы семейства Src, такие как Lck (Sadelain et al., 2013).

ICOS является корецептором активации иммунных Т-лимфоцитов. Лиганд ICOS -молекула B7h находится на поверхности B-лимфоцитов и антигенпрезентирующих клеток. По аминокислотному составу молекула ICOS на 19% гомологична молекуле CD28. Роль ICOS в регуляции иммунного ответа продемонстрирована на ICOS-дефицитных мышах.

Показано, что в отсутствие ICOS нарушена активация и дифференцировка Т-лимфоцитов и снижается выработка активированными Т-лимфоцитами интерлейкина-4 (Dong et al., 2001).

OX40 (CD134), 4-1BB (CD137) и CD27 относятся к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли. Их экспрессия наблюдается в первично активированных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах. Костимулирующий сигнал OX40 повышает интенсивность пролиферации и выживаемость Т-лимфоцитов, способствуя клональной экспансии как эффекторных клеток, так и клеток памяти (Croft et al., 2009; Milone et al., 2009). Костимулирующий сигнал 4-1BB также повышает интенсивность пролиферации и выживаемость Т-лимфоцитов, увеличивает их цитолитическую активность, повышает уровень экспрессии ими цитокинов (Imai et al., 2004). Аналогичным образом влияет костимуляция CD27. Показано также возрастание противоопухолевого эффекта опухоль-цитотоксических Т-лимфоцитов (Song et al., 2012).

DAP 10 и DAP 12 принадлежат к трансмембранной части рецептора NKG2D, экспрессирующегося на поверхности естественных киллеров и CD8+ клеток. На последних он играет роль костимулирующей молекулы, усиливающей активирующий сигнал. DAP10 и DAP 12 отвечают за передачу сигнала внутрь клетки, являясь функциональным аналогом Z-цепи или FcsRIy. Отличительной чертой DAP 10 является отсутствие в его структуре ITAM мотива. Вместо этого в его составе присутствует другой сигнальный фрагмент: тирозин -любая аминокислота-аспарагин-метионин. Таким образом, DAP10 активирует другие сигнальные пути, отличные от активированных эффекторными молекулами, содержащими ITAM мотив. Активация DAP 10 приводит к выработке ряда цитокинов - интерлейкина-2, интерлейкина-7 и интерлейкина-15. Высокая продукция последнего приводит к активизации и усилению цитотоксических свойств Т-лимфоцитов (Gazzar et al., 2013).

2B4 (CD244) известен как рецептор естественных киллеров. Тем не менее, он содержится на поверхности ряда других клеток иммунной системы, в частности, на CD8+ Т-лимфоцитах и у5 T-лимфоцитах. 2B4 взаимодействует в процессе иммунного ответа с CD48,

причем может выступать медиатором как активирующего, так и ингибирующего сигнала (Waggoner, Kumar, 2012).

Киназы семейства Src, такие как Lck (лимфоцит-специфическая протеин тирозин киназа) участвуют в передаче внутриклеточного сигнала от Т-клеточного рецептора. Фосфориляция ITAM-мотивов в составе CD3- Z-цепи запускает каскад реакций, ведущий к активации лимфоцита и выработке цитотоксической реакции. Содержащийся на лимфоцитах CD45 осуществляет положительный контроль активации киназ семейства Src. Src- киназы играют критическую роль в проксимальной трансдукции сигнала от Т-клеточного рецептора (Palacios, Weiss, 2004; Rossy et al., 2013).

К химерным антигенным рецепторам третьего поколения принято относить мономолекулярные рецепторы, содержащие более одного дополнительного костимулирующего домена. При этом исходили из того, что включение дополнительных костимулирующих молекул должно способствовать увеличению выживания полученных Т-лимфоцитов, продукции ими цитокинов и повышения устойчивости к иммунносупрессивным факторам, вырабатываемых опухолью (Sadelain et al., 2013).

Методы внесения генетического материала в Т-лимфоциты, для создания химерного антигенного рецептора

Для получения Т-лимфоцитов с CAR необходимо внести генетический материал рецептора или непосредственно в геном лимфоцита или в виде плазмиды или РНК в цитоплазму и добиться экспресии и синтеза рецептора. При этом требуется соблюдение ряда условий. Прежде всего, лимфоциты не могут трансфецироваться in vivo, необходимо предварительное их выделение. Часто требуется активация пролиферации для наработки достаточного количества Т-лимфоцитов. После внесения генетического материала должна осуществляться экспозиция ex vivo для продукции CAR и реинфузия лимфоцитов пациенту. Обычно используются аутологические лимфоциты. Принципиальным является способ

доставки генетического материала в Т-лимфоцит. Традиционно, для этой цели используются вирусные векторы. Речь идет о модифицированных вирусных частицах, в которых значительная часть генома замещена на переносимый генетический материал. Такие векторы не способны размножаться in vivo и заражать соседние клетки.

Довольно редко применяются для этой цели аденовирусы. Аденовирусы содержат линейную двуцепочечную ДНК и в нередуцированном виде способны к самостоятельной репродукции в клетке. Они могут доставлять генетический материал как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки. Аденовирусы обладают значительной емкостью и могут переносить большое количество генетического материала. К их недостаткам относятся относительная сложность удаления генов, отвечающих за синтез белков, необходимых для репродукции аденовируса и вызываемый ими иммунный ответ. Аденовирусы активируют как гуморальное, так и клеточное звено иммунитета, что может вызывать нежелательную иммунную реакцию как на уровне целого организма, так и направленную против трансфецированных клеток. Тем не менее, существуют опыты успешного применения этой методики в модельных экспериментах in vivo (Wong, Levy, 2000).

Наиболее часто для генетической модификации Т-лимфоцитов используются ретровирусные векторы, в том числе полученные из гамма-ретровирусов и лентивирусов. Это небольшие, РНК-содержащие вирусы. Путем обратной транскрипции происходит встраивание вектора и переносимого генетического материала непосредственно в геном клетки-мишени, что обеспечивает их постоянную экспрессию. Как правило, используются векторы, полученные из вируса мышиного лейкоза и вируса-1 иммунодефицита человека. Ретровирусы обладают значительной емкостью и могут переносить до 8 тысяч пар нуклеотидов генетического материала. В основном, ретровирусы способны заражать только делящиеся клетки. К достоинствам лентивирусов относится также их способность проникать как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки и низкая иммуногенность. К сожалению, в отношении покоящихся Т-лимфоцитов это правило не действует. Завершение обратной

транскрипции, ядерного импорта, и последующей интеграции лентивирусов в геном, не не происходит в этих клетках, если они не активированы с помощью Т-клеточного рецептора и/или воздействия цитокинов (Verhoeyen et al., 2009). При этом, активация с помощью Т-клеточного рецептора является менее предпочтительной, так как существенным образом изменяет иммуннокомпетентность Т-лимфоцитов, ведет к изменению популяционного состава и влияет на жизнеспособность трансфецируемых клеток. Использование для активации цитокинов, таких, как интерлейкин-2 и интерлейкин-7 позволяет эффективно осуществить перенос генов с помощью лентивирусного вектора с сохранением функционального репертуара Т-лимфоцитов (Verhoeyen et al., 2009).

Другой опасностью при работе с гамма-ретровирусными и лентивирусными векторами является их способность вызывать инсерционный мутагенез и активацию онкогенов в гемопоэтических клетках-предшественниках (Kustikova et al., 2009; Riviere et al., 2012). Недавние исследования показывают, что, в отличие от гемопоэтических стволовых клеток, зрелые Т-клетки обладают высокой устойчивостью к подобной трансформации. На сегодняшний день трансформацию зрелых Т-клеток с помощью гамма-ретровирусных и лентивирусных векторов можно считать безопасной с точки зрения возможной онкогенности этих воздействий (Newrzela et al., 2011).

Во многих работах отмечена чрезмерно длительная циркуляция в кровотоке лентивирусно-трансдуцированных CAR Т-лимфоцитов. Лимфоциты в больших количествах встречаются в крови пациентов от нескольких месяцев до года, продолжая продукцию цитокинов, что говорит о возможных опасностях применения данного метода (Hsu et al., 2007). Для преодоления этого эффекта предлагается включение в геном трансдуцированных с помощью лентивирусных конструкций лимфоцитов специальных суицидальных генов, сокращающих их выживание в условиях in vivo (Quintarelli et al., 2007).

Альтернативным подходом к генетической модификации Т-лимфоцитов являются невирусные методы трансфекции, такие как электропорация. Суть метода заключается в

образовании пор в мембране под воздействием импульсного электрического воздействия. Через эти поры происходит проникновение генетического материала внутрь клетки.

Для генетической модификации методом электропорации может использоваться матричная РНК, кодирующая молекулу химерного Т-клеточного рецептора или плазмиды, содержащие промоторы для инициации трансляции и соответствующие гены CAR.

Использование м-РНК ведет к кратковременной продукции рецептора, ограничивающейся промежутком в 1-2 недели. Экспрессия плазмидных генов наблюдается более продолжительное время (Yoon et al., 2009; Barrett et al., 2011).

Эффективность процесса электропорации сравнима с лентивирусной доставкой генетической информации, а простота и доступность этого метода намного выше (Boissel et al., 2012). Относительная кратковременность продукции CAR, с одной стороны, требует при проведении терапии опухоли множественных вливаний Т-клеточного препарата, с другой стороны позволяет точнее контролировать дозу, не допуская накопления цитотоксических лимфоцитов до уровня, когда массовая продукция цитокинов приводит к значительному системному осложнению, т.н. «цитокиновому шторму». Кроме того, при дробном введении Т-лимфоцитов проще отслеживать и контролировать реакцию со стороны нормальных тканей и своевременно прервать терапию при возникновении недопустимых осложнений (Sadelain et al., 2013).

Антигены для химерных антигенных рецепторов

В то время как Т-клеточные рецепторы способны распознавать как поверхностные антигены, так и внутриклеточные антигены, презентируемые ими в составе MHC-I, химерные Т-клеточные рецепторы могут распознавать только поверхностные антигены. В то же время, они являются независимыми от презентации антигенов в составе главного комплекса гистосовместимости. Это особенно важно, так как многие опухоли обладают сниженной экспрессией молекул MHC-I или протеосомальным процессингом антигенов, что

позволяет им уклоняться от иммунного воздействия цитотоксических Т-лимфоцитов. Также преимуществом CAR является возможность создавать их распознающие части не только для белковых молекул, но также и для гликопротеинов и гликолипидных структур (Sadelain et al., 2013) .

В таблице 1 представлен список ряда антигенных мишеней для химерных Т-клеточных рецепторов (Maher, 2012).

Таблица 1. Антигенные мишени для химерных Т-клеточных рецепторов (Maher,

2012)

Целевой антиген Опухоли Природа антигена

CD19 B-клеточные Белок

CD20 B-клеточные Белок

CD22 B-клеточные Белок

k light chain B-клеточные Белок

CD30 Ходжкинские и неходжкинские лимфомы Белок

CD33 Миелоидные опухоли Белок

CD123 Миелоидные опухоли Белок

CD38 B-клеточные Белок

ROR1 B-клеточные Белок

ErbB2 Различные, включая остеосаркому, РМЖ, РПЖ, медуллобластому, глиобластому Белок

ErbB3/4 Различные Белок

Различные ErbB димеры Различные Белок

EGFr vIII Различные Белок

РЭА Различные, включая рак легкого, гастроинтестинальные, РМЖ Белок

EGP2 Различные Белок

EGP40 Опухоли кишечника Белок

Mesothelin Различные Белок

TAG72 Гастроинтестинальные опухоли Углевод

PSMA Рак простаты Белок

NKG2D-лиганды Различные Белок

B7-H6 Различные Белок

IL-13 рецептор а2 Различные Белок

MUC1 РМЖ, рак яичника Гликозилированны й протеин

MUC16 Рак яичника Гликозилированны й протеин

CA9 Почечноклеточная карцинома Белок

GD2 Нейробластома, саркома Юинга Ганглиозид

GD3 Меланома Ганглиозид

HMW-MAA Меланома Протеогликан

CD171 Нейробластома Белок

Lewis Y Различные Углевод

G250/CAIX Почечноклеточная карцинома Белок

HLA-A1 MAGE A1 Меланома Белок-пептидный комплекс

HLA-A2 NY-ESO-1 Различные Белок-пептидный комплекс

PSCA Рак простаты Белок

Фолат рецептор-а Рак яичника и другие Белок

CD44v6 Различные Белок

CD44v7/8 Рак шейки матки Белок

а vß 6 интегрин Различные Белок

8H9 Различные Белок

NCAM Нейробластома Белок

VEGF рецепторы Различные Белок

5T4 Различные Белок

Фетальный AChR Рабдомиосаркома Белок

NKG2D лиганды Различные Белок

CD44v6 Различные Белок

Из таблицы 1 видно, что предлагаемый сейчас спектр антигенов для CAR охватывает многие виды опухолей и антигены различной природы. В то же время, эти антигены не являются строго специфичными для опухоли. Так, CD 19 содержится на нормальных B-лимфоцитах (но не на клетках предшественницах) (Brentjens et al., 2010). Терапия анти-CD19 CAR приводит к снижению B-лимфоцитов крови, что оправдывается клиническим противоопухолевым эффектом.

CAIX (карбоксиангидраза-IX) в повышенном количестве экспрессируется в клетках почечноклеточной карциномы, но экспрессируется также в небольших количествах нормальным почечным эпителием и клетками эпителия желчных протоков, что приводит к выраженной в той или иной степени гепатотоксичности (Lamers et al., 2006).

Экспрессия ErbB2 (Her2) из семейства рецептора эпидермального фактора роста повышается при многих опухолях, коррелируя со степенью их злокачественности. ErbB2 является популярной мишенью CAR-терапии при агрессивных формах рака молочной железы. Тем не менее, молекулы ErbB2 встречаются на поверхности и других клеток

организма, в частности, в эпителиальных клетках легких, что может приводить при терапии анти- ErbB2 Т-лимфоцитами к респираторному дистресс-синдрому (Morgan et al., 2010).

Одним из способов преодоления токсического действия Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами является принцип двойного таргетирования. Так, при использовании Т-лимфоцитов специфичных к клеткам с совместной экспрессией ErbB2 и MUC1 был показан выраженный противоопухолевый эффект. Это показывает перспективность данной технологии и возможность тестирования ее в клинике (Wilkie et al., 2012).

Проблемы и подходы клинического использования Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами

Важную роль в снижении противоопухолевого эффекта Т-лифоцитов, несущих CAR, играет собственная иммунная система организма и, прежде всего, т.н. Т-регуляторные клетки. Количество Т-регуляторных клеток часто увеличено в крови и опухолевых биопсиях онкологических больных (Allan, Hafler, 2004). Механизм их супрессирующего воздействия до сих пор не совсем ясен, но известно, что ими продуцируются растворимые иммунносупрессирующие факторы такие как TGFß, IL-10 и IL-35.

Т-регуляторные клетки подавляют функции Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллеров. Их уровень часто коррелирует с плохим клиническим исходом заболевания (Curiel et al., 2004).

Для преодоления ингибирующих эффектов Т-регуляторных клеток обычно используют предшествующую химиотерапию, сопровождающуюся лимфодеплецией. Для этой цели в основном применяют алкилирующий агент циклофосфамид (Moschella et al., 2011).

Другим возможным подходом к увеличению специфической активности Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами является применение цитокинов.

Наиболее часто использовалось введение интерлейкина-2. Было показано, что интерлейкин-2 в низких дозах повышает выживаемость CAR Т-лимфоцитов в кровотоке и их антиопухолевую активность (Till et al., 2008).

В то же время, интерлейкин-2 токсичен в высоких дозах и действует также стимулирующе и на Т-регуляторные клетки. В качестве альтернативных цитокинов были предложены интерлейкин-7, интерлейкин -15, интерлейкин-12, интерлейкин-21. Было показано, что в присутствии интерлейкина-7 происходит селективное увеличение роста и противоопухолевой активности CAR Т-лимфоцитов в присутствии полнофункциональных Т-регуляторных клеток (Perna et al., 2014).

Наиболее перспективным представляется генетическая модификация CAR Т-лимфоцитов, направленная на эндогенную продукцию цитокинов или повышающая выработку рецепторов к ним. Прежде всего, при этом подходе наблюдается значительно меньший уровень цитокинов в крови, и поэтому снижается общая токсичность, свойственная цитокинам. Кроме того, при миграции CAR Т-лимфоцитов в опухоль изменяется их микроокружение в опухолевой ткани, что ведет к повышению их выживаемости и усилению цитотоксических свойств, а также к рекрутированию других клеток иммунной системы (Hoyos et al., 2010). Так, применение Т-лимфоцитов, модифицированных для продукции интерлейкина-12, показало, что происходит увеличение цитотоксических функций Т-лимфоцитов и естественных киллеров за счет увеличения продукции перфорина и гранзимов, относительно нечувствительное к эффектам регуляторных Т-клеток (Pegram et al., 2012). Кроме того, происходила активация клеток врожденного иммунитета, таких как естественные киллеры и макрофаги. Был также отмечен антиангиогенный эффект интерлейкина-12. Высокая активность CAR Т-лимфоцитов позволила обойтись без иммунноподавляющей химиотерапии (Chmielewski et al., 2011; Pegram et al., 2012).

Отдельным вопросом при применении терапии CAR Т-лимфоцитами является клеточная субпопуляция, выбранная для их получения. В норме цитотоксическими

свойствами обладают CD8+ клетки и естественные киллеры, не имеющие Т-клеточных рецепторов. Как показывают проведенные работы, для генетической модификации подходят все популяции Т-лимфоцитов, включая CD4+ клетки, NKT клетки, у/5 Т-клетки и даже естественные киллеры. При этом, свойства полученной популяции несколько отличаются от популяции, полученной из CD8+ клеток, цитокиновым профилем и цитотоксическими свойствами (Carpenito et al., 2009).

Как уже указывалось, используемые ныне химерные Т-клеточные рецепторы не являются строго специфическими для опухолевой ткани. В связи с этим может возникать токсический эффект по принципу «трансплантат против хозяина». В некоторых случаях, как это имеет место при B-клеточной аплазии при лечении анти-CD19 CAR Т-лимфоцитами лимфопролиферативных заболеваний, это не слишком тяжелое осложнение, которое купируется введением иммуноглобулинов. Но иногда токсический эффект CAR Т-лимфоцитов является препятствием к их клиническому использованию. Все определяется правильностью выбранной мишени и допустимым уровнем наблюдаемых осложнений (Sadelain et al., 2013).

Другой серьезной проблемой, связанной с применением CAR Т-лимфоцитов является т.н. «цитокиновый шторм». Он связан с массовой продукцией цитокинов большими массами противоопухолевых Т-лимфоцитов. Симптоматика «цитокинового шторма» заключается, прежде всего, в повышении температуры и гипотензии, что может приводить к полиорганной недостаточности (Kochenderfer et al., 2012). Купирование его заключается в применении стероидов, вазопрессоров и поддерживающей терапии в условиях отделения интенсивной терапии. В последнее время также нашло применение использование антител против TNF-a (инфликсимаб) и антител против рецептора интерлейкина-6 (тоцилизумаб) или монотерапия тоцилизумабом (Dotti et al., 2014).

В отличие от многих обычных лекарственных индуцированных побочных эффектов, эта токсичность, связанная с «цитокиновым штормом» не может управляться путем простого

уменьшения дозировки лекарственного средства, так как число пролиферирующих Т-клеток будет увеличиваться в количестве и, в конечном итоге, может достичь критического уровня. Профилактикой «цитокинового шторма» является дробное введение Т-лимфоцитов, использование короткоживущих популяций лимфоцитов, как это происходит при применении лимфоцитов, трансфецированных плазмидами (Sadelain et al., 2013).

Результаты клинического применения терапии с использованием CAR Т-лимфоцитов

Все поколения CAR демонстрировали цитотоксичность относительно выбранных антигенных мишеней в опытах in vitro. Тем не менее, клинические испытания показали значительные различия в терапевтических свойствах. В целом, применение лимфоцитов, несущих CAR первого поколения, показало их низкую эффективность, несмотря на некоторые достигнутые успехи. Так обнадеживающие результаты были получены в исследовании эффективности CD3Z CAR в отношении GD2-ганглиозида у детей с метастатической нейробластомой (Pule et al., 2008). В качестве носителя рецептора использовались или активированные Т-лимфоциты, или специфичные к вирусу Эпштейн-Бар цитотоксические лимфоциты. Основная мысль исследования заключалось в том, что поскольку Эпштейн-Бар это латентный вирус и заражение им протекает часто бессимптомно, это может поддерживать выживание соответствующих лимфоцитов in vivo. Лимфоциты обоих типов с идентичным CAR вводились в равных дозах. Специфичные к вирусу Эпштейн-Бар цитотоксические лимфоциты наблюдались in vivo в больших количествах, тем не менее, через 6 недель обе популяции спадали в кровотоке до нуля. Четверо из 8 пациентов имели признаки некроза опухоли или регрессии до устойчивой полной ремиссии. Не наблюдалось никаких побочных эффектов терапии.

Наиболее показательно, для сравнения эффективности, применение нескольких поколений однотипных CAR. Так в одном случае, пациенту с неходжкинской лимфомой вводились Т-лимфоциты с CAR первого и второго поколений. Обе популяции

персистировали в кровотоке, однако зоны опухоли достигали только клетки с рецепторами второго поколения (Savoldo et al., 2011).

В связи с низкой эффективностью CAR первого поколения, в настоящее время для клинических испытаний применяются в основном CAR второго и третьего поколений. Их сравнительная эффективность остается дискуссионной. В любом случае, для обоих типов рецепторов продемонстрирована терапевтическая эффективность (Wilkie et al., 2008).

Наибольшее число проводимых сейчас работ по использованию CAR Т-лимфоцитов посвящено лечению лимфопролиферативных заболеваний, для которых этот вид терапии оказался наиболее эффективным.

Так, в работе Kochenderfer с соавторами (Kochenderfer et al., 2012) проводились клинические испытания Т-лимфоцитов с химерным антигенным рецептором второго поколения у пациентов с хроническим лимфолейкозом и фолликулярной лимфомой. Рецептор содержал анти-CD19 распознающую часть и комплекс CD28-Z-^m. Перед введением CAR Т-лимфоцитов пациентам была проведена химиотерапия циклофосфамидом и флударабином. Через три часа после введения CAR Т-лимфоцитов пациенты получали внутривенно инфузию интерлейкина-2. У всех пациентов на момент зачисления в протокол наблюдалось прогрессирование заболевания, несмотря на 4 курса противоопухолевой терапии. У 4 из 8 пролеченных CAR Т-лимфоцитами пациентов наблюдалась объективная ремиссия в течение свыше полугода, у одного свыше года и у одного полная ремиссия. На фоне терапии один пациент умер от гриппа, и у 4 зарегистрировано выраженное снижение B-лимфоцитов. У 6 пациентов наблюдались в крови циркулирующие анти-CD19 клетки в течение трех недель, у двоих этот период достигал 180 дней.

Клинические испытания рецептора третьего поколения освещены в работе Till с коллегами (Till et al., 2012) . В исследовании участвовали 4 пациента с неходжкинской лимфомой. Химерный рецептор состоял из анти-CD20 распознающей части, CD4 трансмембранной, CD28 и СВ137(4-1BB) внутриклеточных костимулирующих доменов и

CD3Z эффекторной части. Для получения несущих рецептор Т-лимфоцитов из крови пациентов выделялась мононуклеарная фракция и, после активации, через 4 дня трансфицировалась электропорацией плазмидой, содержащей генетический материал рецептора. Пациенты получали циклофосфамид за два дня до начала инфузии Т-клеток. CAR Т-лимфоциты вводились серией из 3 инфузий, через день. После инфузии пациентам проводилась низкодозная терапия интерлейкином-2. Лечение хорошо переносилось, хотя у одного пациента развились переходные инфузионные симптомы. На момент публикации два пациента находились без прогрессирования заболевания 12 и 24 месяцев. У одного пациента наблюдалась объективная частичная ремиссия и рецидив на 12 месяц после инфузии.

В отношении солидных опухолей достигнутые успехи терапии при помощи CAR-лимфоцитов менее значительны (Zhang et al., 2016).

Для лечения 19 пациентов с HER2-позитивными опухолями (преимущественно остеосаркомой) применялись лимфоциты с рецептором 2го поколения, содержащего в своем составе CD28 и Z-цепь (Ahmed et al., 2015). Четыре пациента имели стабилизацию заболевания на период от 12 недель до 14 месяцев. Медиана выживаемости составила 10,3 месяца. У трех пациентов было произведено удаление опухолевых узлов, в которых наблюдался более чем 90% некроз.

В исследовании Hammarstrom (Hammarstrom, 1999) использовались два типа Т-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами. Часть была сконструирована из активированных Т-лимфоцитов, а часть - из специфичных к вирусу Эпштейн-Бар цитотоксических клеток. Лимфоциты были предназначены для лечения нейробластомы и содержали в качестве распознающей части молекулу специфичную к дисиалоганглиозиду (GD2). В исследовании участвовали 11 пациентов с активной стадией заболевания. У 3 из 11 пациентов была достигнута полная ремиссия. Уровень CAR Т-лимфоцитов в крови пациентов отмечался более 6 недель.

В настоящее время продолжается поиск средств, позволяющих добиться увеличения эффективности терапии лимфоцитами с химерными антигенными рецепторами. По данным National Institutes of Health сейчас в мире проводится около 150 клинических испытаний новых CAR к самым разным поверхностным антигенам опухолей. По-прежнему, основная часть исследований посвящена лимфопролиферативным заболеваниям, но примерно 30% работ сфокусировано на солидных опухолях (нейробластома, рак молочной железы, рак легкого и др.). Еще больше исследований находятся на доклинической стадии, и публикуемые результаты позволяют рассчитывать на значительный прогресс в этом ещё новом направлении противоопухолевой терапии. Заключение

Терапия Т-лимфоцитами с химерными антигенными рецепторами является активно развивающимся разделом иммунотерапии злокачественных опухолей.

Успехи, достигнутые современной молекулярной биологией и иммунологией, позволяют конструировать все новые эффективные виды химерных рецепторов к различным поверхностным опухолевым антигенам. Уже достигнутые клинические результаты применения данного метода показывают перспективность его использования в онкологии.

Список литературы

1. Грицай А.Н., Барановский Д.А., Киселевский М.В., Гуляева И.Л. Адоптивная иммунотерапия интерлейкином-2 и лимфокин- активированными киллерами у больных злокачественными новообразованиями женской репродуктивной системы. Опухоли женской репродуктивной системы. 2014. №. 4. С. 71-73.

2. Сащенко Л.П. Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфокин-активированных киллеров: автореферат дис. ... доктора биологических наук: 03.00.03, 03.00.25. Ин-т биологии гена РАН. Москва. 1997.

3. Титов К.С., Демидов Л.В., Шубина И.Ж. и др. Технологии клеточной иммунотерапии в лечении больных со злокачественными новообразованиями. Вестник Российского государственного медицинского университета 2014. №. 1. С. 42-47.

4. Чикилева И.О., Шубина И.Ж., Киселевский М.В. Влияние регуляторных Т-клеток на функциональную активность натуральных киллеров при иммунотерапии злокачественных опухолей. Вестник РАМН 2012. №. 4. С. 60-64.

5. Ярилин А.А. Иммунология - М.: ГЭОТАР-Медиа 2010.

6. Acuto O., Michel F. CD28-mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR signaling. Nature Reviews Immunology. 2003. V. 3. P. 939-951.

7. Agraharkar M.L., Cinclair R.D., Kuo Y., et al. Risk of malignancy with long-term immunosuppression in renal transplant recipients. Kidney International. 2004. V. 66. P. 383-389.

8. Ahmed N., Brawley V.S., Hegde M., et al. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) -Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for the Immunotherapy of HER2-Positive Sarcoma. Journal of Clinical Oncology 2015. V. 33. N. 15. P. 1688-1696.

9. Allan C., Hafler D.A. Suppressor T cells in human diseases. J Exp Med. 2004. V. 200. P. 273-6.

10. Barrett D.M., Zhao Y., Liu X., et al. Treatment of advanced leukemia in mice with mRNA engineered T cells. Human Gene Therapy. 2011. V. 22. N. 12. P. 1575-1586.

11. BoisselL., Betancur M., Lu W., et al. Comparison of mRNA and lentiviral based transfection of natural killer cells with chimeric antigen receptors recognizing lymphoid antigens. Leuk Lymphoma. 2012. V. 53. N. 5. P. 958-65.

12. Bonifant Ch.L., Jackson H.J., Brentjens R.J., Curran KJ. Toxicity and management in CAR T-cell therapy [Электронный ресурс]. Molecular Therapy - Oncolytics 2016. V. 3. URL: http://dx .doi.org/10.1038/mto.2016.11

13. Brentjens R., Yeh R., Bernal Y., et al. Treatment of Chronic Lymphocytic Leukemia With Genetically Targeted Autologous T Cells: Case Report of an Unforeseen Adverse Event in a Phase I Clinical Trial. Molecular Therapy. 2010. V. 18. N. 4. P. 666-668.

14. Brownlie R.J, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nature Reviews Immunology. 2013. V. 13. P. 257-269.

15. Call ME, Pyrdol J, Wiedmann M, Wucherpfennig KW. The organizing principle in the formation of the T cell receptor-CD3 complex. Cell. 2002. V. 111. N. 7. P. 967-79.

16. Carpenito C., Milone M.C., Hassan R. Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. PNAS. 2009. V. 106. N. 9. P. 3360-3365.

17. Cartellieri M., Bachmann M., Feldmann A., et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of cancer [Электронный ресурс]. J Biomed Biotechnol. 2010. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2010/956304

18. Chen L., Flies D.B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co-inhibition. Nature Reviews Immunology. 2013. V. 13. P. 227-242.

19. Cheng J., Montecalvo A., Kane L.P. Regulation of NF-kB induction by TCR/CD28. Immunol. Res. 2011. V. 50(2-3). P. 113-117.

20. Chmielewski M., Kopecky C., Hombach A.A., Abken H. IL-12 release by engineered T cells expressing chimeric antigen receptors can effectively muster an antigen-independent macrophage response on tumor cells that have shut down tumor antigen expression. Cancer Research. 2011. V.

71. N. 17. P. 5697-5706.

21. Chowdhury D., Lieberman J. Death by a Thousand Cuts: Granzyme Pathways of Programmed Cell Death. Annu Rev Immunol. 2008. V. 26. P. 389-420.

22. Croft M., So T., Duan W., Soroosh P. The significance of 0X40 and 0X40L to T-cell biology and immune disease. Immunol Rev. 2009. V. 229. N. 1. P. 173-191.

23. Cronin S.J., Penninger J.M. From T-cell activation signals to signaling control of anti-cancer immunity. Immunol. Rev. 2007. V. 220. P. 151-168.

24. Curiel T.J., Coukos G., Zou L., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 2004. V. 10. P. 942949.

25. Curran K.J., Pegram H.J., Brentjens R.J.Chimeric antigen receptors for T cell immunotherapy: current understanding and future directions. J Gene Med. 2012. V. 14. N. 6. P. 405415.

26. Dong Ch., Juedes F.E., Temann A., et al. ICOS co-stimulatory receptor is essential for T-cell activation and function. Nature. 2001. V. 409. P. 97-101.

27. Dotti G., Gottschalk S., Savoldo B., Brenner M.K. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol Rev. 2014. V. 257. N. 1. P. 107-126.

28. Emtage P.C., Lo A.S., Gomes E.M., et al. Second-generation anti-carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation-induced cell death, proliferate on tumor contact, secrete cytokines, and exhibit superior antitumor activity in vivo: a preclinical evaluation. Clin Cancer Res. 2008. V. 14. N. 24. P.8112-8122.

29. Eshhar Z. Tumor-specific T-bodies: towards clinical application. Cancer Immunol Immunother. 1997. V. 45. N. 3-4. P. 131-136.

30. Evans E.J., Esnouf R.M., Sancho R., et al. Crystal structure of a soluble CD28-Fab complex. Nat. Immunol. 2005. V. 6. N. 3. P. 271-279.

31. Gamen S., Hanson D.A., Kaspar A., et al. Granulysin-induced apoptosis. I. Involvement ofat

least two distinct pathways. J. Immunol. 1998. V. 161. P. 1758-1764.

32. Gazzar A., Groh V., Spies T. Immunobiology and Conflicting Roles of the Human NKG2D Lymphocyte Receptor and Its Ligands in Cancer. Journal of Immunology. 2013. V. 191. N. 4. P. 1509-1515.

33. Gool S.W., Vandenberghe P., Boer M., Ceuppens J.L. CD86 and CD40 provide accessory signals in a multiple-step T-Cell activation model. Immunological Reviews. 1996. N. 153. P. 47-83.

34. Hammarstrom S. The carcinoembryonic antigen CEA family:structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues. Cancer Biology. 1999. V. 9. P. 67 -81.

35. Haynes N.M., Snook M.B., Trapani J.A., et al. Redirecting mouse CTL against colon carcinoma: superior signaling efficacy of single-chain variable domain chimeras containing TCR-Z vs FcsRI-y. Journal of Immunology. 2001. V. 166. N. 1. P. 182-187.

36. Hombach A.A., Abken H. Adoptive immunotherapy with genetically engineered T cells: modification of the IgG1 Fc spacer domain in the extracellular moiety of chimeric antigen receptors avoids off-target activation and unintended initiation of an innate immune response. Gene Therapy. 2010. V. 17. N. 10. P. 1206-1213.

37. Hoves S., Trapani J.A., Voskoboinik I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. Journal of Leukocyte Biology. 2010. V. 87. N. 2. P. 237-243.

38. Hoyos V., Savoldo B., Quintarelli C., et al. Engineering CD19-specific T lymphocytes with interleukin-15 and a suicide gene to enhance their anti-lymphoma/leukemia effects and safety. Leukemia. 2010. V. 24. N. 6. P. 1160-1170.

39. Hsu C., Jones S.A., Cohen C.J., et al. Cytokine-independent growth and clonal expansion of a primary human CD8+ T-cell clone following retroviral transduction with the IL-15 gene. Blood. 2007. V. 109. P. 5168-5177.

40. Imai C., Mihara K., Andreansky M., et al. Chimeric receptors with 4-1BB signaling capacity provoke potent cytotoxicity against acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2004. V. 18. N. 4. P. 676-684.

41. Jenkins M.R., Griffiths G.M. The synapse and cytolytic machinery of cytotoxic T cells. Curr Opin Immunol. 2010. V. 22. N. 3. P. 308-313.

42. Kavurma M.M., Khachigian L.M. Signaling and transcriptional control of Fas ligand gene expression. Cell Death and Differentiation. 2003. V. 10. P. 36-44.

43. Klebanoff CA, Acquavella N, Yu Z, Restifo NP. Therapeutic cancer vaccines: are we there yet? Immunol Rev. 2011. V. 239. N. 1. P. 27-44.

44. Kochenderfer J.N., Dudley M.E., Feldman S.A., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 2012. V. 119. P. 2709-2720.

45. Kowolik C.M., Topp M.S., Gonzalez S., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 2006. V. 66. N. 22. P. 10995-11004.

46. Kustikova O.S., Schiedlmeier B., Brugman M.H., et al. Cell-intrinsic and vector-related properties cooperate to determine the incidence and consequences of insertional mutagenesis. Mol Ther. 2009. V. 17. P. 1537-1547.

47. Lamers C.H., Sleijfer S., Vulto A.G., et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J Clin Oncol. 2006. V. 24(13). P. 20-22.

48. Mace E.M., Dongre P., Hsu H.T., et al. Cell biological steps and checkpoints in accessing NK cell cytotoxicity. Immunology and Cell Biology. 2014. V. 92. P. 245-255.

49. Maher J. Immunotherapy of Malignant Disease Using Chimeric Antigen Receptor Engrafted T Cells [Электронный ресурс]. ISRN Oncology. 2012. V. 2012. URL: http://dx.doi.org/10.5402/2012/278093

50. Milone M.C., Fish J.D., Carpenito C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther. 2009. V. 17. P. 1453-1464.

51. Morgan R.A., Yang J.C., Kitano M., et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol Ther. 2010. V. 18. N. 4. P. 843-851.

52. Moschella F., Valentini M., Aricd E., et al. Unraveling cancer chemoimmunotherapy mechanisms by gene and protein expression profiling of responses to cyclophosphamide. Cancer Research. 2011. V. 71. N. 10. P. 3528-3539.

53. Newrzela S., Cornils K., Heinrich T., et al. Retroviral insertional mutagenesis can contribute to immortalization of mature T lymphocytes. Molecular Medicine. 2011. V. 17. N. 11. P. 12231232.

54. Nolan K.F., Yun C.O., Akamatsu Y., et al. Bypassing immunization: optimized design of "designer T cells" against carcinoembryonic antigen (CEA)-expressing tumors, and lack of suppression by soluble CEA. Clin Cancer Res. 1999. V. 5. N. 12. P. 3928-3941.

55. Palacios E.H., Weiss A. Function of the Src-family kinases, Lck and Fyn, in T-cell development and activation. Oncogene. 2004. V. 23. P. 7990-8000.

56. Papac R.J. Spontaneous regression of cancer: possible mechanisms. In Vivo. 1998. V. 12(6). P. 571-578.

57. Parkhurst M.R., Joo J., Riley J.P., et al. Characterization of genetically modified T-cell receptors that recognize the CEA: 691-699 peptide in the context of HLA-A2.1 on human colorectal cancer cells. Clin Cancer Res. 2009. V. 15. N. 1. P. 169-80.

58. Patel S.D., Moskalenko M., Smith D., et al. Impact of chimeric immune receptor extracellular protein domains on T cell function. Gene Therapy. 1999. V. 6. N. 3. P. 412-419.

59. Pegram H.J., Lee J.C., Hayman E.G., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 2012. V. 119. N. 18. P. 41334141.

60. Perna S.K., Pagliara D., Mahendravada A., et al. Interleukin-7 Mediates Selective Expansion of Tumor-redirected Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) without Enhancement of

Regulatory T-cell Inhibition. Clin Cancer Res. 2014. V. 20. N. 1. P. 131.

61. Podojil J.R., Miller S.D. Molecular mechanisms of T-cell receptor and costimulatory molecule ligation/blockade in autoimmune disease therapy. Immunol Rev. 2009. V. 229. N. 1. P. 337-355.

62. Pule M.A., Savoldo B., Myers G.D., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nature Medicine. 2008. V. 14. N. 11. P. 1264-1270.

63. Quintarelli C., Vera J.F., Savoldo B. Co-expression of cytokine and suicide genes to enhance the activity and safety of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Blood. 2007. V. 110. N. 8. P. 2793-2802.

64. Riviere I., Dunbar C.E., Sadelain M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 2012. V. 119. P. 1107-1116.

65. Rossy J., Owen D.M., Williamson D.J., et al. Conformational states of the kinase Lck regulate clustering in early T cell signaling. Nat Immunol. 2013. V. 14. N. 1. P. 82-89.

66. Russell J.H., Ley T.J. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol. 2002. V. 20. P. 323-370.

67. Sadelain M., Brentjens R., Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 2013. V. 3. N. 4. P. 388-398.

68. Savoldo B., Ramos C.A., Liu E., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest. 2011. V. 121. P. 1822-1826.

69. Song D.G., Ye Q., Poussin M., et al. CD27 costimulation augments the survival and antitumor activity of redirected human T cells in vivo. Blood. 2012. V. 119. N. 3. P. 696-706.

70. Till B.G., Jensen M.C., Wang J., et al. Adoptive immunotherapy for indolent non-Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma using genetically modified autologous CD20-specific T cells. Blood. 2008. V. 112. N. 6. P. 2261-2271.

71. Till B.G., Jensen M.C., Wang J., et al. CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and 4-1BB domains: pilot clinical trial results. Blood. 2012. V. 119. N. 17. P. 3940-3950.

72. Trapani JA, Smyth MJ. Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway. Nat Rev Immunol. 2002. V. 2. N. 10. P. 735-747.

73. Verhoeyen E., Costa C., Cosset F.L. Lentiviral vector gene transfer into human T cells. Methods Mol Biol. 2009. V. 506. P. 97-114.

74. Waggoner S.N., Kumar V. Evolving role of 2B4/CD244 in T and NK cell responses during virus infection. Front Immunol. 2012. V. 3. P. 377.

75. Waring P., Mullbacher A. Cell death induced by the Fas/Fas ligand pathway and its role in pathology/ Immunol Cell Biol. 1999. V. 77. N. 4. P. 312-317.

76. Wilkie S., Picco G., Foster J. Retargeting of human T cells to tumor-associated MUC1: the evolution of a chimeric antigen receptor. J Immunol. 2008. V. 180. N. 7. P. 4901-4909.

77. Wilkie S, Schalkwyk MC, Hobbs S, et al. Dual targeting of ErbB2 and MUC1 in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered to provide complementary signaling. journal of clinical immunology. 2012. V. 32. N. 5. P. 1059-1070.

78. Wong C.P., Levy R. Recombinant adenovirus vaccine encoding a chimeric T-cell antigen receptor induces protective immunity against a T-cell lymphoma. Cancer Res. 2000. V. 60. N. 10. P. 2689-2695.

79. Yoon S.H., Lee J.M., Cho H.I., et al. Adoptive immunotherapy using human peripheral blood lymphocytes transferred with RNA encoding Her-2neu-specific chimeric immune receptor in ovarian cancer xenograft model. Cancer Gene Therapy. 2009. V. 16. N. 6. P. 489-497.

80. Zhang H., Ye Zl., Yuan Zg., et al. New Strategies for the Treatment of Solid Tumors with CAR-T Cells. Int J Biol Sci 2016. V. 12. N. 6. P. 718-729.

81. Zhang T., Lemoi B.A., Sentman C.L. Chimeric NK-receptor-bearing T cells mediate antitumor immunotherapy. Blood. 2005. V. 106. N. 5. P. 1544-1551.