Способ моделирования возрастной макулярной дегенерации с применением фототоксического эффекта
METHOD FOR AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION MODELING USING PHOTOTOXIC EFFECT

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно - к офтальмологии и касается моделирования возрастной макулярной дегенерации.
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) характеризуется необратимым прогрессирующим поражением центральной фотоактивной зоны сетчатки и является одной из нозологических форм, наиболее часто вызывающих потерю зрения среди населения развитых стран мира.
На начальном этапе заболевание проявляется макулярными друзами - внеклеточными отложениями между мембраной Бруха и пигментным эпителием. В дальнейшем развивается либо географическая атрофия (ГА) макулы, либо хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) с последующим фиброзом. Центральное зрение постепенно теряется, при этом периферическое зрение остается. Следуя международной классификации болезней, диагноз ВМД ставится пациентам старше 50 лет (Bird А.С., Therapeutic targets in age-related macular disease. J Clin Invest. 2010 Sep; 120(9):3033-3041).
Моделирование патологических процессов и различных заболеваний является важнейшим инструментом исследователей, позволяющим выявлять их патогенетическую структуру и механизмы формирования.
Известно, что видимый свет, являясь носителем зрительной информации, одновременно может выступать и как фактор, провоцирующий дегенеративные изменения сетчатки (Н.В. Чистякова, Н.Ю. Даль, Ю.С. Астахов Влияние света на состояние сетчатки и здоровье в целом: миф или реальность? Офтальмологические ведомости. Т. IV №3. 2011).
Однако остается неисследованным вопрос о действии синего спектра освещения на ретинальный пигментный эпителий. В последнее время интерес к этой проблеме резко вырос в связи с появлением современных светодиодных и ксеноновых источников освещения с повышенным излучением в синей области видимого спектра, вызывающих опасения из-за непредсказуемых отдаленных последствий их использования.
Возрастная макулярная дегенерация характеризуется как структурными, так и функциональными изменениями глаза. Структурные (морфологические) изменения проявляются появлением друз, Рубцовыми изменениями, хориоидальной неоваскуляризацией. Функциональные изменения характеризуются снижением центральной остроты зрения.
Наибольшее распространение в экспериментальной медицине получили модели, основанные на различного рода травматическом воздействии на сетчатку, вызывающем структурные изменения.
Известен способ моделирования возрастной макулярной дегенерации путем травматического повреждения центральной области сетчатки до разрушения пигментного эпителия под контролем офтальмологического микроскопа. (Патент РФ на изобретение 2480844).
Недостатком способа является сложность дозирования интенсивности воздействия и травматического повреждения, при котором развивается острое посттравматическое воспаление, тогда как в основе ВМД лежит хронический процесс.
Ближайшим аналогом изобретения является способ моделирования возрастной макулярной дегенерации (П.П. Зак, А.В. Зыкова, Н.Н. Трофимова, Э.Н. Эскина, М.А. Островский «Экспериментальная модель ускоренного старения сетчатки: японский перепел coturnix japonica». Сенсорные системы. 2012; 26(1): 3-10), включающий облучение синим светодиодом (λмакс=450 нм) (LED450) в фотоповреждающей (сублетальной) для сетчатки дозе - 4 Дж/см2 поверхности роговицы что достигалось при 40-минутной экспозиции. Облучение глаз выполняли на интактных животных при «ручной» фиксации головы птицы по отношению к световому потоку и расширенных веках. Эффекты фотоповреждения оценивали спустя сутки в сравнении с парным необлученным глазом.
Недостатками способа является то, что он основан на фототоксическом воздействии и поглощении излучения всеми структурами глаза, и, соответственно, их изменения могут вызвать формирование других патологий глаза, таких как кератопатия, катаракта и т.д.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа моделирования сухой формы возрастной макулярной дегенерации, основанного на комплексном лазер-индуцированном воздействии и фототоксическом повреждении сетчатки у кроликов породы шиншилла.
Техническим результатом изобретения является снижение послеоперационного воспаления, направленность фотоповреждающего воздействия только на сетчатку, что позволяет исключить формирование других патологий глаза.
Предложенный способ моделирования возрастной макулярной дегенерации позволяет получить модель, основанную на сочетании слабокоагулирующего (субпорогового) лазерного и светового воздействия ксеноновым светом, что обеспечивает достижение технического результата.
Кроме того, данный способ отличается простотой регулировки интенсивности и продолжительности воздействия повреждающих факторов. Методика апробирована на 27 половозрелых кроликах-самцах породы шиншилла весом 2800-3300 грамм.
Способ осуществляется следующим образом:
Животным проводилось хирургическое вмешательство в стерильных условиях под операционным микроскопом Opton (Германия). За 10-15 минут перед началом оперативного вмешательства выполнялись трехкратные инсталляции мидримакса. Операцию выполняли под местной анестезией (инсталляции в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина) и наркозом. Животных вводили в наркоз растворами «Золетил 100» (Франция) в дозе 10 мг/кг и Ксилазин (Нидерланды) в дозе 5 мг/кг внутримышечно. Осуществляли прокол склеры иглой калибром 25G на 10 и 2 часах в 4 мм от лимба (проекция периферических отделов сетчатки), затем после извлечения иглы интравитреально вводили лазерный наконечник офтальмологического фотокоагулятора Vitra (Quantel Medical, Франция) твердотельного зеленого лазера с диодной накачкой 532 нм, 15-45 коагулятов наносились в центральной зоне сетчатки (интактной от зоны оперативного вмешательства) до появления слабо-желтого пятна, отступя 1 диаметр диска зрительного нерва от диска зрительного нерва в заданном режиме: диаметр пятна 150 мкм, скважность 150, мощность 80-100 мВТ. Диаметр повреждения - 1ДЗН, затем эту зону обрабатывали светом с помощью световода с ксеноновой лампой офтальмологической микрохирургической системы Stellaris PC (Bausch + Lomb, Ирландия) 25 Лм в течение 10 минут. Для предупреждения инфицирования послеоперационной раны после хирургического вмешательства всем кроликам субконъюнктивально вводили раствор гентамицина и дексаметазона в дозе 3 мг/кг и 0.2 мг/кг соответственно. В последующие 10 дней в конъюнктивальную полость закапывали раствор ципрофлоксацина 0,3% и дексаметазон 0,1% 4 раза в день. В послеоперационном периоде и весь период наблюдения выраженной воспалительной реакции не наблюдалось, оптические среды сохранялись прозрачными, в том числе и хрусталик. Изменения наблюдались в зоне воздействия на сетчатке. Для гистологической оценки экспериментальной модели возрастной макулярной дегенерации животные выводились из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу МинВуза СССР №724 от 13.11.1984) на 30, 60, 90-е сутки после проведенного вмешательства. Энуклеированные глазные яблоки фиксировали в забуференном нейтральном 10% формалине, выделенную центральную часть сетчатки готовили для морфологического исследования. Глаз энуклеировали и выделяли заднюю полусферу, содержащую сетчатку. Использовали фиксацию в 10% растворе забуференного формалина при комнатной температуре. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5-6 мкм изготавливали на ротационном микротоме МПС-2. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике. Изучение полученных тканей сетчатки осуществлялось на светооптическом уровне с последующим анализом и микрофотографированием при помощи цифровой фотокамеры Canon IXUS 800 IS (Япония).
Способ поясняется следующими примерами
Пример 1
9 кроликам, самцам породы шиншилла, весом 2900-3300 г, под наркозом, проводилось хирургическое вмешательство в стерильных условиях под операционным микроскопом Opton (Германия). За 10-15 минут перед началом оперативного вмешательства выполнялись трехкратные инсталляции мидримакса. Операцию выполняли под местной анестезией (инсталляции в конъюнктивальную полость 0,4% раствора инокаина) и наркозом. В наркоз вводили растворами «Золетил 100» (Франция) в дозе 10 мг/кг и Ксилазин (Нидерланды) в дозе 5 мг/кг внутримышечно. Осуществляли прокол склеры иглой калибром 25G на 10 и 2 часах в 4 мм от лимба, затем после извлечения иглы интравитреально вводили лазерный наконечник твердотельного зеленого лазера с диодной накачкой 532 нм, 15 коагулятов наносили в центральной зоне сетчатки до появления слабо-желтого пятна, отступя 1 диаметр диска зрительного нерва (ДЗН) от ДЗН с заданными параметрами: диаметр пятна 150, скважность 150, мощность 80-100 мВТ. Диметр повреждения 1ДЗН, затем эту зону обрабатывали светом с помощью световода с ксеноновой лампой 25 Лм в течение 10 минут. Для предупреждения инфицирования послеоперационной раны после хирургического вмешательства всем кроликам субконъюнктивально вводили раствор гентамицина и дексаметазона в дозе 3 мг/кг и 0.2 мг/кг соответственно. В последующие 10 дней в конъюнктивальную полость закапывали раствор ципрофлоксацина 0,3% и дексаметазон 0,1% 4 раза в день. В послеоперационном периоде воспалительной реакции глазного яблока не наблюдалось. Оптические среды сохранялись прозрачными. Для гистологической оценки экспериментальной модели возрастной макулярной дегенерации животные (по 3 кролика) выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения животных в наркоз на 30-е, 60-е, 90-е сутки после проведенного вмешательства. Энуклеированные глазные яблоки фиксировали в забуференном 10% формалине, выделенную центральную часть сетчатки готовили для морфологического исследования. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5-6 мкм изготавливали на ротационном микротоме МПС-2. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике. Изучение полученных тканей сетчатки осуществлялось на светооптическом уровне с последующим анализом и микрофотографированием при помощи цифровой фотокамеры Canon IXUS 800 IS (Япония).
На фиг. 1 изображен фрагмент макулярной области сетчатки глаза кролика. Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. При малом увеличении (×100). Стрелками показаны формирующиеся друзы, признаков развитого воспалительного процесса не наблюдается.
Формирование друз характеризует ранние проявления макулярной дегенерации.
Пример 2
9 кроликам, самцам породы шиншилла, весом 2900-3300 г, под наркозом (пример 1), проводилось хирургическое вмешательство в стерильных условиях под операционным микроскопом Opton (Германия). Осуществляли прокол склеры иглой калибром 25G на 10 и 2 часах в 4 мм от лимба, затем после извлечения иглы интравитреально вводили лазерный наконечник твердотельного зеленого лазера с диодной накачкой 532 нм, 30 коагулятов наносили в центральной зоне сетчатки до появления слабо-желтого пятна, отступя 1 диаметр диска зрительного нерва от диска зрительного нерва с заданными параметрами: диаметр пятна 150, скважность 150, мощность 80-100 мВТ. Диметр повреждения 1ДЗН, затем эту зону обрабатывали светом световодом с ксеноновой лампой 25 Лм в течение 10 минут. Послеоперационное ведение животного как в примере 1. В послеоперационном периоде воспалительной реакции глазного яблока не наблюдалось. Оптические среды сохранялись прозрачными.
Для гистологической оценки экспериментальной модели возрастной макулярной дегенерации по 3 кролика выводили из эксперимента на 30-е, 60-е, 90-е сутки после проведенного вмешательства. Морфологическое изучение полученных тканей сетчатки осуществлялось на светооптическом уровне с последующим анализом и микрофотографированием при помощи цифровой фотокамеры Canon IXUS 800 IS (Япония).
На фиг. 2 изображен Участок макулярной области сетчатки глаза кролика эксперимента. Фиксация: 10% раствор формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. При среднем увеличении (×200).
а - слой палочек и колбочек с поврежденными аксонами фоторецепторных клеток
б - нарастающая пигментная дистрофия и деструкция палочек и колбочек.
Структурные признаки, показанных изменений сетчатки, соответствуют выраженному ограничению воспалительного процесса.
Данные изменения характерны для развития сухой формы макулодистрофии.
Пример 3
9 кроликам, самцам породы шиншилла, весом 2900-3300 г, под наркозом (подготовка как в примере 1), проводилось хирургическое вмешательство в стерильных условиях под операционным микроскопом Opton (Германия). Осуществляли прокол склеры иглой калибром 25G на 10 и 2 часах в 4 мм от лимба, затем после извлечения иглы интравитреально вводили лазерный наконечник твердотельного зеленого лазера с диодной накачкой 532 нм, 45 коагулятов наносили в центральной зоне сетчатки до появления слабо-желтого пятна, отступя 1 диаметр диска зрительного нерва от диска зрительного нерва с заданными параметрами: диаметр пятна 150, скважность 150, мощность 80-100 мВт. Диметр повреждения 1ДЗН, затем эту зону обрабатывали светом световодом с ксеноновой лампой 25 Лм в течение 10 минут. Послеоперационное ведение экспериментального животного как в примере 1. В послеоперационном периоде воспалительной реакции глазного яблока не наблюдалось. Оптические среды сохранялись прозрачными.
Для гистологической оценки экспериментальной модели возрастной макулярной дегенерации по 3 кролика выводили из эксперимента на 30-е, 60-е, 90-е сутки после проведенного вмешательства. Морфологическое изучение полученных тканей сетчатки осуществлялось на светооптическом уровне с последующим анализом и микрофотографированием при помощи цифровой фотокамеры Canon IXUS 800 IS (Япония).
На фиг. 3 изображен фрагмент макулярной области сетчатки глаза кролика. Фиксация: 10% раствор формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. При среднем увеличении (×200).
а - отек и деструкция наружного ядерного слоя (тела фоторецепторных клеток)
б - отек и дискомплексация пигментного слоя (на границе с хориокапиллярным слоем сосудистой оболочки глаза)
Динамика прогрессирования деструктивных изменений сетчатки не коррелирует со значимым объемом воспалительного процесса.
Данные изменения характерны для экссудативной формы макулярной дегенерации.