СПОСОБ ВОСПРОИЗВОДСТВА МИКРОГЕЛЬМИНТОВ
MICROHELMINTH REPRODUCTION METHOD

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к воспроизводству микрогельминтов как биологических агентов для защиты растений от вредителей (колорадский жук, проволочники, озимая совка и др.) и болезней (фитофтора, галловые и цистообразующие нематоды и др.), разработки способов борьбы с патогенами, повышения плодородия почв, корма для мальков рыб и других водных животных, наработки антибиотиков, хищных нематофаговых грибов и в других практических целях.
Известно большое количество видов микрогельминтов поражающих насекомых. Многие из них пригодны для борьбы с колорадским жуком (таблица 1) /1, 2, 3, 6/ и другими вредителями (озимая совка, яблонная плодожорка, проволочники). На основе микрогельминтов разработаны биопрепараты для борьбы с вредителями - ДИПРИН, НЕМАБАКТ, ФИТОВЕРМ и др. /4, 5, 11/, антагонистические нематоды используют для подавления и вытеснения фитопатогенных нематод, многие виды почвенных сапрофитных микрогельминтов способствуют повышению плодородия, повышению урожайности растений и очистке почвы от патогенных микроорганизмов /8/, а также в качестве корма для факультативного нематофагового сапрофагового хищного гриба Артроботрис олигоспора (Arthrobotrys oligospora Fres.) /7/ используемого для борьбы с фитопатогенными нематодами. Однако наработка биопрепаратов сдерживается отсутствием надежных способов промышленного, поточного, круглогодичного, массового разведения микрогельминтов.
Целью изобретения является повышение производительности выращивания и расширение видового состава нарабатываемых микрогельминтов.
Цель изобретения достигается тем, что для повышения производительности выращивания и расширения видового состава нарабатываемых микрогельминтов выращивают в насекомых - хозяевах или без них с помощью автоматической линии на универсальных питательных средах, пригодных для выращивания насекомых и нематод.
Наиболее близким к заявляемому объекту техническим решением является способ получения энтомопатогенного биологического препарата ДИПРИН, включающий заражение гусениц озимой совки (Agrotis segetum Schift) нематодой (Pristionchus uniformis), сбор погибших насекомых, отлов в воду мигрирующих инвазивных личинок, концентрирование нематодной суспензии, ее консервацию и хранение до применения, который мы принимаем за прототип /9/.
Известный способ включает поточное круглогодичное разведение озимой совки, заражение гусениц, сбор погибших насекомых и культивирование в них нематод, сбор нематодной биомассы, концентрирование, стандартизация и хранение нематодной суспензии. В качестве садков для культивирования озимой совки используют вазоны для выращивания растений различного диаметра. Емкости устанавливают попарно одну над другой, стыкуя широкими отверстиями. В качестве корма для гусениц озимой совки используют морковь, пшеничные отруби, картофель и воду с добавлением витаминов - аскорбиновой и фолиевой кислот. Гусениц выращивают до IV-V возраста и затем инвазируют нематодами из расчета 50-100 личинок на гусеницу. Гибель насекомых от заражения наступает на 2 - 3-и сутки. Заражение осуществляют в чашках Петри по 10-20 особей в каждой. Инокулюм наносят в водном растворе на фильтровальную бумагу, которой выстилают донышки чашек Петри, прежде чем поместить туда гусениц. Погибших насекомых, инвазированных нематодами, раскладывают на платформы из перевернутых (меньшего размера) чашек Петри, обернутых фильтровальной бумагой, которые помещают в чашки большего диаметра с тонким слоем воды на дне. Воду с отловленными нематодами сливают ежедневно. На каждую платформу помещают 10-15 особей. Суспензию нематод отстаивают в течение суток, сливают супернатант и добавляют формалин в количестве 0,01%, после чего хранят в течение 1-1,5 года в холодильнике при температуре 4-5°С.
Недостатками указанного способа являются низкая производительнось и ограничение видового состава производимых микрогельминтов их пищевыми предпочтениями.
В предлагаемом нами способе технологический процесс осуществляется на автоматической линии, состоящей из: емкости для окукливания насекомых или сбора суспензии гельминтов 1, перфорированной крышки 2, воронки для воспроизводства насекомых и нематод 3, мелкоперфорированная крышка для перекрытия воронок 4, фильтровального вкладыша 5, сливного устройства 6, автомата для включения или отключения слива 7, распылительной трубки с форсунками для воды 8, автомата для включения или отключения распылителя воды 9, датчика - автомата для ограничения повышения объема суспензии и включения (или отключения) слива 10, датчика для включения или отключения распылителя воды 11, питательной среды 12, емкости для изготовленного препарата 13 (Фиг 1).
Универсальная среда для насекомых и нематод имеет следующий состав - мука из ботвы картофеля - 70%, картофельный крахмал - 20%, вода - остальное. Среду готовят следующим образом. Картофельную ботву сушат при температуре 70-80°С в течение 1-2 часов. Нужное количество компонентов отвешивают на технических весах, после чего заливают водой и смешивают в миксере в течение 3-5 минут.
Линия работает следующим образом: в отверстия крышки 2 расставляют воронки 3. В воронки 3 раскладывают выполненные из мягкой, ткани, сложенные в виде воронки фильтровальные вкладыши 5 и раскладывают питательную среду 12, которую используют как для выращивания насекомых - хозяев (личинки колорадского жука, гусеницы озимой совки) и для выращивания микрогельминтов как на насекомых -хозяевах (облигатные паразиты), так и на питательной среде (факультативные паразиты, сапрофиты). Для выращивания фитопатогенных нематод в воронки высаживают растения - хозяева (зерновые, картофель, свеклу и др.), заселенные воронки закрывают мелкоперфорированными крышками 4.
3
Для воспроизводства микрогельминтов воронки с насекомыми -хозяевами или без них инвазируют соответствующей маточной культурой (10 тыс.особей - около 10 см маточной суспензии).
3
Через каждые двое суток определяют количество нематод в среде, для чего берут соответствующую пробу (1-2 г) и подсчитывают количество микрогельминтов в поле зрения бинокуляра при одинаковом увеличении. При титре 1000 особей в 10 см включают распылитель воды 8, который автоматически отключается после заполнения воронок 4, после чего микрогельмины мигрируют в емкость для сбора суспензии 2. В дальнейшем автомат для включения или отключения распылителя воды 9 с помощью датчика 11, периодически включает и отключает распылитель воды 9, не допуская высыхания среды и перегоняя микрогельминты в емкость 2. После наполнения емкости 2 сливное устройство с помощью автомата для включения или отключения слива 10 микрогельминтную суспензию переливают в емкости для изготовленного препарата и используют по назначению.
При выращивании насекомых - хозяев после завершения развития и появлении первых куколок перфорированную крышку 2 снимают, а воронки 3 переворачивают, устанавливая на дно емкостей 2, после чего насекомые завершают окукливание и готовы для дальнейшего применения.
К микрогельминтам относятся микроскопические нематоды (класс Nematoda) и микроскопические черви из других систематических групп. Это - обширная группа микроскопических круглых червей. По широте распространения и количеству видов они занимают одно из первых мест в мире среди беспозвоночных животных и микроорганизмов.
При воспроизводстве соответствующих культур микрогельминтов следует обращать внимание на экологические особенности их жизни и питания в природе.
Для размножения сапрофитных (свободно живущих) видов микрогельминтов (в основном представителей семейства Тиленхиды (Tilenchidae), которые в обычных условиях питаются разлагающимися растительными остатками или сами способствуют их разложению, выделяя соответствующие ферменты) и факультативных (не обязательных) паразитов, которые в отсутствии жертвы могут питаться растительными и животными остатками (истребляют многие виды вредных беспозвоночных и зооспоры), а также хищных (свободно живущих) микрогельминтов (типичный представитель Мононхус папилата - Mononchus papillatus способный питаться личинками галловых и цистообразующих нематод и зооспорами фитофторы). В среде, такие микрогельминты находят для своего питания других микроскопических животных (простейшие, коловратки, подвижные зооспоры и др.) отчего можно использовать предлагаемую среду без внесения добавок.
Для размножения облигатных (питающихся исключительно жертвами - членистоногими хозяевами) паразитических микрогельминтов (типичные представители - Неоаплектана карпокапса (Neoaplectana carpocapsae Veizer и различные виды гетерорабдитид (Heterorhabditidae) и мермитид (Mermitidae) в среду для их выращивания надо периодически (раз в 2 недели) добавлять их членистоногих хозяев (личинки колорадского жука, проволочников, гусениц озимой совки и др.), которые также могут питаться предлагаемой средой.
Для размножения в научных целях (определение вирулентности штаммов, спектр растений хозяев и др.) фитопатогенных (поражающих растения) микрогельминтов - типичные представители стеблевая нематода (Ditylenchus destructor Thome, 1945, галловая нематода Meloidogyne incognita), золотистой картофельной цистообразующей нематоды (ЗКЦН) (гетеродера ростошиенза (Heterodera rostochiensis Wollenweber) и др. в среду следует добавлять нестандартные клубни картофеля (в случае размножения галловой, стеблевой или цистообразующей нематод картофеля) или засевать среду злаковыми культурами (овес, рожь, пшеница и др., которые развиваясь в среде через 1-2 недели дают корневую систему и готовы к инвазированию галловыми злаковыми нематодами.
Насекомых - хозяев (колорадский жук, проволочники, озимая совка и др.) выращивают на предлагаемой среде в отдельных воронках и периодически используют для подкормки облигатно паразитирующих микрогельминтов.
Источники информация
1. Абашкин О.В., Масюк Ю.А., Абросимов Д.В., Марьяновская М.В., Алексютина О.А. Черников В.И. Нематоды против колорадского жука. // Журнал Картофельная система. - 2013. №3 - 4. - С. 38-40.
2. Данилов Л.Г. Восприимчивость колорадского жука Leptinotarsae decemlineata Say, к заражению энтомопатогенными нематодами Neoaplectana carpocapsa штамм. «Agriotos» // Бюллетень ВИЗР, 1978, №44, с. 3-6.
3. Данилов Л.Г., Каверзнева Г.Д. Перспективы использования энтомопатогенных нематод в защите растений. // Обзор. - М.: ВНИИТЭИАГРОПРОМ. 1991. - 40 стр.
4. Данилов Л.Г., Павлюшин В.А., Айрапетян В.Г., Нащекина Т.Ю., Турицын В.С. Биологические препараты на основе энтомопатогенных нематод (Rhabditidae. Steinernematidae). // В кн.: Второй Всероссийский съезд по защите растений. Фитосанитарное оздоровление экосистем. Материалы съезда. Том 2. Санкт-Петербург. 2005. (600 стр. ). С. 37-38.
5. Зейрук В.Н., Черников В.И., Кукушкина Л.Н., Тихонова Л.В., Масюк Ю.А., Сычев А.Е. Защитное и биостимулирующее действие биопрепаратов на основе нематодно - бактериального комплекса биоудобрений, биостимуляторов и агротехнических приемов на состояние и урожайность картофеля. // В кн.; Первая Всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям. СП (Л). 2002. - С. -140-141.
6. Костина Л.Я., Макаров П.П., Масюк Ю.А., Черников В.И., Жиляева И.Н., Тихонова Л.В. Pristionchys uniformis var. Oz. - Новый для России вид почвенной нематоды, патогенной для колорадского жука. / В кн. Тезисы докладов Всероссийского съезда по защите растений. - Л.: 1995. - С. 327.
7. Мацкевич Н.В. Нематофаговые хищные грибы. // Защита растений. №8, - 1990. - Стр. 23-24.
8. Павлюшин В.А., Исси И.В., Воронина Э.Г., Митрофанов В.Б., Данилов Л.Г., Новикова И.И. Микробиологическая защита растений как неотъемлемый элемент фитосанитарной оптимизации агроэкосистем. // В кн.: Семьдесят лет ВИЗР. Ретроспектива исследований (методология, теория, практика). 1929-1999. Сборник научных трудов. СП. (Л). 1999. 316 стр. С. 146-162. /П01. /МЗРК04.
9. Тихонова Л.В., Бессонов А.С, Шестов А.Л., Писарев Б.А., Макаров П.П., Масюк Ю.А., Зейрук В.Н., Коноплев Г.К., Костина Л.Я., Вышинский Г.В., Туманов Л.Л., Трофименков В.Н. Способ получения энтомопатогенного препарата Диприн. // Патент на изобретение. РФ. №2128911. Кл. A01K 67/33. Б. И. 1999. №11.
10. Тихонова Л.В., Зейрук В.Н., Абашкин О.В., Кукушкина Л.Н., Масюк Ю.A., Марьяновская М.В., Черников В.И. Борьба с фитофторозом с помощью энтомопатогенных нематод. В кн.: Современная микология в России. Тезисы докладов Второго съезда микологов. Т. 2. М., - 2008. стр. 305
11. Тихонова Л.В., Зейрук В.Н., Масюк Ю.А., Абашкин О.В., Абросимов Д.B. Черников В.И., Овэс Е.В. Культивирование неоаплектан в различных насекомых - хозяевах. В кн.: Культурные растения для устойчивого сельского хозяйства в XXI веке (иммунитет, селекция, интродукция), том 1У. Часть. 1. К 100-летию академика ВАСХНИЛ и Россельхозакадемии М.С. Дунина. 2011. Стр. 454-459.