СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЗАЩИТНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ ПОСЛЕ ТРАНСПОРТИРОВКИ, ДЛИТЕЛЬНОГО ИЛИ НЕПРАВИЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ
METHOD FOR RECOVERY OF ACTIVITY OF PROTECTIVE BIOLOGICS AFTER TRANSPORTATION, LONG-TERM OR IMPROPER STORAGE

Изобретение относится к области экологии, биотехнологии и сельского хозяйства и может использоваться при применении защитных биопрепаратов на растениях, культивируемых как в открытом, так и защищенном грунтах.
Биопрепараты, содержащие грибные, бактериальные клетки, а также их метаболиты, используются в различных областях сельского хозяйства для увеличения продуктивности, усиления устойчивости растений к неблагоприятным условиям обитания, подавления патогенной микрофлоры. При ряде достоинств (таких как экологическая безопасность, восстановление почвенного плодородия, повышение иммунитета растений, простота применения и т.д.), у биопрепаратов отмечают существенный недостаток - значительная потеря активности вследствие возникновения неблагоприятных условий в процессе транспортировки, длительного или неправильного хранения. Биологические препараты имеют ограниченный срок действия, инактивируются повышенной температурой и интенсивным светом, весьма чувствительны к условиям внешней среды [1-3]. Даже при соблюдении требований производителя, активность препаратов через несколько месяцев может стать в 1,5-6 раз ниже нормы. Это приводит к снижению эффективности использования защитных биопрепаратов, вынуждает увеличивать нормы их внесения, что экономически невыгодно.
Патентный поиск и обзор научной литературы показал, что неизвестны методы использования квазимонохроматического света (KMC) для восстановления активности защитных биопрепаратов после длительного или неправильного хранения.
Целью изобретения является восстановление активности защитных биопрепаратов после транспортировки, длительного или неправильного хранения.
Способ осуществляется следующим образом. После транспортировки, длительного или неправильного хранения защитных биопрепаратов из них готовят рабочие растворы, которые подвергают воздействию квазимонохроматического света в диапазоне длин волн 633…710 нм в течение 15…960 секунд.
7
Пример 1. Препарат Алирин Б на основе живых клеток бактерий Bacillus subtilis хранился 12 месяцев при температуре 7…10°С в упаковке, у которой была нарушена герметичность. Инструкция производителя гарантирует биологическую активность препарата не менее 6×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл рабочего раствора в течение 36 месяцев хранения при температуре -30…+30°С в невскрытой упаковке. Число КОЕ у препарата, хранившегося 1 год после нарушения герметичности упаковки, снизилось на 28,0% по сравнению с препаратом, который находился в невскрытой упаковке (3112500±96500 и 4375000±245000 соответственно).
Из препарата, хранившегося в упаковке с нарушенной герметичностью, приготовили согласно рекомендациям производителя 0,06%-ный рабочий раствор, который залили в прозрачный стеклянный сосуд и подвергли воздействию KMC длиной волны 633 нм в течение 15…960 секунд. После облучения рабочий раствор выдержали в термостате 2 часа при температуре +22…24°С. Затем суспензией клеток бактерий В. subtilis засевали поверхность агаризированной питательной среды Сабуро. Инкубирование проводили в термостате в течение 24 часов при температуре 37°С и по количеству образовавшихся колоний рассчитывали число КОЕ на 1 мл исходного рабочего раствора. Обработка KMC способствовала повышению биологической активности бактерий. В среднем по всем режимам облучения число КОЕ в 1 мл рабочего раствора составило 4542693±235405. При оптимальной длительности облучения 30 с число КОЕ достигало 5179200±646553 (фигура 1), т.е. в 1,7 раза больше, чем до облучения.
8
7
8
6
5
5
Пример 2. Препараты Пралин, Алирин Б (на основе В. subtilis) и Витаплан (Pseudomonas fluorescens) с гарантированным производителем числом КОЕ 5×10, 6×10 и 1×10 соответственно, хранили при температуре 7…10°С и влажности воздуха 60% в течение 24 месяцев после временного нарушения герметичности упаковки. Через 24 месяца хранения оценивали реальную активность по числу КОЕ. Наибольшее снижение активности (в 75 раз) отмечено у препарата Алирин Б, у которого число КОЕ в 1 мл в рабочего раствора составило 0,8×10. В рабочих растворах Пралина и Витаплана число КОЕ было в 25 и 14 раз меньше значения, заявленного производителем, что составило 2×10 и 7,3×10 соответственно.
Из этих препаратов приготовили суспензию живых клеток бактерий с концентрацией рабочих растворов в соответствии с рекомендациями производителя, залили в прозрачный стеклянный сосуд и подвергали воздействию KMC длиной волны 633 нм в течение 15, 30, 60, 120, 240 и 960 секунд. После облучения данные рабочие растворы выдержали в термостате без освещения при температуре +22…24°С в течение 2 часов. Суспензией клеток бактерий засевали поверхность агаризированной питательной среды Сабуро. Инкубирование проводили в термостате в течение 24 часов при температуре 37°С и по количеству образовавшихся колоний рассчитывали число КОЕ на 1 мл рабочего раствора. Облучение препаратов Пралин, Алирин Б и Витаплан KMC оказалось эффективным для восстановления биологической активности бактерий после длительного хранения (фигура 2).
Пример 3. Препарат Гамаир на основе микроорганизмов В. subtilis подвергали воздействию высокой температуры (+50°С) в течение 24 часов при влажности 10% (искусственное моделирование неправильного хранения). Инструкция производителя гарантировала высокую биологическую активность препарата в течение 36 месяцев хранения при температуре -30…+30°С в упаковке без нарушения герметичности. Из исходного (контроль) и ингибированного повышенной температурой (опытный вариант) препаратов приготовили рабочие растворы (концентрация 0,06%). Полученные суспензии клеток В. subtilis высевали на агаризированную питательную среду Сабуро точкой в центр чашек Петри. Анализ результатов позволил установить, что через 24 часа после воздействия температуры +50°С происходит ингибирование жизнеспособности бактериальных клеток. В опытном варианте отмечено снижение активности роста колоний на 11,5% по сравнению с контролем (фигура 3).
Суспензию ингибированного повышенной температурой препарата Гамаир заливали в прозрачный стеклянный сосуд и подвергали воздействию KMC длиной волны 633 нм в течение 60…480 секунд. Обработанный рабочий раствор препарата выдерживали в термостате без освещения при температуре +22…24°С в течение 2 часов. Затем производили посев суспензии клеток В. subtilis на поверхность агаризированной питательной среды Сабуро точкой в центр чашек Петри. После 24 часов инкубирования в термостате без освещения при температуре +37°С оценивали способность к росту бактериальных колоний. Обработка препарата Гамаир KMC способствовало восстановлению активности микроорганизмов после воздействия повышенных температур. Объем биомассы колоний увеличился в среднем на 9,3%, лучшие результаты отмечались при длительностях воздействия KMC 120 и 240 секунд - на 18,1% и 22,0% соответственно.
2
Пример 4. Бактерии P. fluorescens из препарата Витаплан, хранившегося в течение 24 месяцев после нарушения герметичности упаковки при температуре 7…10°С, высевали на картофельно-глюкозную агаризированную питательную среду точкой в центр чашек Петри. Полученные колонии исходной площади 5±2 мм подвергали воздействию KMC с длинами волн 661 нм и 710 нм в течение 120 секунд. Сразу после облучения чашки Петри помещали в термостат, где бактерии культивировались при температуре +24°С в течение 48 часов. Влияние KMC оценивали по площади колоний (фигура 4). Следует отметить, что обработка KMC усиливала скорость роста бактерии из препарата Витаплан на обоих длинах волн KMC: в 1,3 раза - на длине волны 710 нм и в 1,7 раза - 661 нм.
Пример 5. У биопрепаратов Пралин и Фитоспорин М (на основе В. subtilis) после транспортировки и последующего хранения с нарушением герметичности упаковки в течение 24 месяцев оценивали способность к увеличению числа жизнеспособных клеток под влиянием воздействия KMC с длиной волны 633 нм и 661 нм.
Из препаратов Пралин и Фитоспорин М были приготовлены суспензии клеток бактерии 0,001% и 0,1% соответственно, которые заливали в прозрачные сосуды и подвергали воздействию KMC длиной волны 633 нм и 661 нм в течение 60, 120, 240 и 960 секунд. Через 2 часа инкубирования суспензий в термостате при температуре +22…24°С их высевали в чашки Петри на поверхность авизированной питательной среды Сабуро. Через 24 часа культивирования в термостате без освещения при температуре +37°С оценивали число КОЕ в 1 мл рабочего раствора. Обработка KMC оказалась результативной в случае потери биологической активности препаратов Пралин и Фитоспорин М в процессе хранения. Активность обработанных препаратов увеличивалась в 1,5 и 3,2 раза, соответственно (таблица).
Таким образом, воздействие KMC на бактерии защитных биопрепаратов в диапазоне длин волн от 633 до 710 нм в течение 15…960 секунд способствует повышению их активности, снизившийся после транспортировки, длительного или неправильного хранения.
Заявленный способ повышает активность защитных биопрепаратов, что при их практическом использовании будет способствовать развитию органического земледелия.
Литература
1. Агротехнологические основы создания усовершенствованных форм микробных биопрепаратов для земледелия/ А.П. Кожемяков, Ю.В. Лактионов, Т.А. Попова и др. // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 50. С. 369-376.
2. Курилова Д.А. Хранение лабораторных образцов микробиопрепарата против фузариоза сои на основе штамма 14-3 Pseudomonas chlororaphis в препаративной форме «жидкая культура // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем: материалы международной научно-практической конференции. 2016. Вып. 9. С. 251-253.
3. Саламатова Ю.А., Минаева О.М., Акимова Е.Е. Эффективность хранения ряда бактериальных препаратов в жидкой форме // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2010. №1 (9). С. 20-28.