Генотипирование по генам GPI//а и протромбина пациентов с дислипидемиями, страдающих гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца

потока крови. Изолированное увеличение ТКИМ, без наличия атеросклеротических бляшек было у 12% при НС и у 16% при ИМ. Процент стенозирования сонных артерий определялся как отношение диаметра артерии в зоне максимального сужения к диаметру непораженного сегмента сосуда (табл. 4).

Заключение. Нарушение ЭЗВД выявляется как при нестабильной стенокардии, так и при инфаркте миокарда, но при инфаркте миокарда в два раза чаще наблюдается вазоконстрик-ция. Степень и тяжесть атеросклеротического поражения периферических сосудов более выражена у больных инфарктом миокарда. Результаты исследования обосновывают необходимость проведения у больных нестабильной стенокардией активной вторичной медикаментозной профилактики, направленной на нормализацию нарушенной ЭЗВД и на атеросклеротический процесс, что позволит предупредить инфаркт миокарда.

Литература

1. Балахонова Т.В. и др. // Тер. архив.- 1998.- №4.- С. 15.

2. Бувальцев В.И. // Междунар. мед. ж.- 2001.- №3.- С. 202.

3. Бувальцев В.И. и др. // Клиническая фармакология и терапия.- 2002.- №11.- С. 30-32.

4. Гельцер Б.И. и др. // Кардиол.- 2004.- №4.- С. 24-28.

5. Затейщиков Д.А.. и др. // Кардиол.- 2000.- №6.- С. 14.

6. КарповЮ.А.. и др. // РМЖ.- 2003.- Т.11, №19.- С. 1041.

7. Celemajer D.S. et al. // Lancet.-1992.- Vol.340, №8828.-P. 1111-1115.

FEATURES OF DEFEAT OF VESSELS AND ENDOTELIAL INFRINGEMENTS AT VARIOUS FORMS OF ISCHEMIC CORONARY DISEASE

O.V. KOSTENKO Summary

Results of examination of 50 patients with an unstable angina and 50 patients with a Myocardial Infarction are discussed in this paper. Research of endothelial function was performed to all patients. The condition of peripheral vessels was determined. The comparative analysis of the received results was carried out.

Key wards: endothelial function, unstable angina

УДК 616-005.4

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПО ГЕНАМ ОР111а И ПРОТРОМБИНА ПАЦИЕНТОВ С ДИСЛИПИДЕМИЯМИ, СТРАДАЮЩИХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ И ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

Т.Ю. ЗОТОВА*, Е.Н. КАСАПОВА**, Г.И. МЯНДИНА**, В.А. ФРОЛОВ*

Одним из наиболее важных факторов риска развития ишемической болезни сердца (ИБС), гипертонической болезни (ГБ) и других сердечно-сосудистых осложнений являются нарушения липидного обмена. Для оценки нарушений липидного обмена и вероятности развития атеросклероза повсеместно используют определение у больных уровня общего холестерина и триглицеридов сыворотки крови, определение концентраций в сыворотке липопротеидов очень низкой, низкой и высокой плотности (ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП), их соотношения, называемого «индексом атерогености» (ИА):

ИА= (ЛПНП + ЛПОНП)/ЛПВП Как полагают, процесс атерогенеза начинается при значении ИА выше 3.0-3.1 [2, 3]. Целевые уровни общего холестерина и ЛПНП незначительно различаются согласно американским и европейским рекомендациям: В США они определены как 5.2 ммоль/л и 2.6 ммоль/л, а в Европе - как 5.0 ммоль/л и 3.0 ммоль/л соответственно [2]. С целью снижения риска осложнений, связанных с ИБС и ГБ сердца, и уровня смертности от сердечнососудистых заболеваний необходимо проводить коррекцию

Кафедра патологической физиологии РУДН. Москва, 117198, ул. Миклу-$р-Маклая, д.8.Медицинский факультет

Кафедра биологии и общей генетики РУДН. Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, д.8.Медицинский факультет

дислипидемических состояний. Одними из наиболее эффективных гиполипидемических средств являются препараты класса статинов. Статины вызывают наиболее выраженное снижение уровня общего холестерина и ЛПНП, однако, наряду с эффективностью и удобством в применении, отмечается высокая стоимость препаратов этой группы и наличие ряда побочных эффектов (боль в мышцах, иногда сопровождающаяся их атрофией, снижение памяти, ослабление иммунных функций [3]), сдерживающих применение статинов в широкой медицинской практике. В этих условиях при оценке выбора лекарственных средств становится важным использование каких-либо дополнительных критериев, выделяющих среди больных с гиперлипидемиями группу, нуждающуюся в более интенсивном наблюдении и терапии, в том числе статинами. Достижения молекулярной генетики позволяют изучать молекулярно-генетические механизмы формирования сложных признаков, в том числе мультифакториаль-ных заболеваний, к которым относятся атеросклероз, гипертония, ИБС и другие. Один из подходов к изучению развития мульти-факториальных заболеваний связан с выявлением генов-кандидатов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез.

Интегрины, являясь поверхностными рецепторами клетки, обеспечивают взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом и друг с другом, а так же участвуют в процессах свертывания крови, перемещения клеток в зону воспаления, имплантации и эмбрионального развития, метастазирования опухолевых клеток и процессах апоптоза [4, 5]. Интегрины состоят из а-субъединиц (известно 16 классов) и р-субъединиц (известно 8 классов). Вступая в нековалентное взаимодействие, а- и р-субъединицы образуют гетеродимеры, тем самым обеспечивая существование интегриновых комплексов с разной специфичностью. Гликопро-теиновая р-субъединица типа III, подтипа «а» (GPIIIa) представлена двумя аллельными формами: PLA1 и PLA2. Средняя частота встречаемости в популяции аллеля PLA2 гена GPIIIa для населения Европы составляет около 14%. Аллель PLA2 отличается заменой тимидилового нуклеотида на цитидиловый в позиции 196 мРНК GPIIIa, что приводит к замене пролина на лейцин в позиции 33 транслируемого белка [6, 7]. Носительство аллеля PLA2 является причиной генетической предрасположенности к ряду заболеваний, в числе которых венозные и артериальные тромбозы, коронарный кардиосклероз, наследственная тромба-стения Гланцманна, поздний гестоз и задержка развития плода, некоторые опухолевые заболевания [4, 8-10].

Нарушения в системе свертывания крови приводят к тромбоэмболическим (ТЭ) и сердечно-сосудистым заболеваниям. Протромбин (коагуляционный фактор II) является одним из главных компонентов системы свертывания крови, в ходе ферментативного расщепления которого образуется тромбин. Данная реакция является первой стадией образования кровяных сгустков. Мутация гена протромбина G20210A характеризуется заменой гуанина (G) на аденин (A) в позиции 20210. Увеличение экспрессии мутантного гена приводит к повышению уровня протромбина в 1,5-2 раза по сравнению с нормой. Мутация наследуется по аутосомно-доминантному типу, тромбофилия возникает даже у гетерозиготного носителя мутантного гена, и таким образом, генотип G/A является показателем риска развития тромбозов и инфаркта миокарда [12]. Знание генотипических характеристик пациента позволит не только оценить риск развития угрожающих жизни состояний, но и правильно определить способы их профилактики и лечения, а так же возможности применения тех или иных лекарственных препаратов.

Цель работы - анализ распределения аллельных вариантов гена GP-IIIa среди пациентов с дислипидемиями и изучение возможности использования генетической предрасположенности, определяемой аллелем PLA2, как критерия для определения первоочередных групп риска по развитию сердечно-сосудистых осложнений (ИБС, ГБ) у данной категории больных; анализ распределения полиморфизма G20210A гена протромбина у больных дислипидемиями, страдающих ИБС и ГБ.

Контингент больных. Обследовались пациенты с дисли-пидемиями (в группу включались пациенты с уровнем общего холестерина >5.0 ммоль/л и/или индексом атерогенности >3), имеющие при поступлении в стационар диагнозы: ИБС и/или артериальная гипертензия. Пациенты выписывались на амбулаторное лечение в удовлетворительном состоянии: в отсутствии ангиозных приступов и со стабильной гемодинамикой. При

подборе базовой антигипертензивной терапии целевой уровень артериального давления был <140/90 мм рт ст. С этой целью применялась монотерапия антигипертензивными препаратами основных групп или, при необходимости, проводилась комбинированная терапия препаратами нескольких групп.

Материалы и методы исследования. Получение ДНК-матрицы. В качестве ДНК-матрицы использовали геномную ДНК, полученную из клеток периферической крови с использованием набора «Цитолизин» (Россия) по прилагаемой к набору методике или сухую каплю крови на бумажном носителе (ватман 3ММ, Англия). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием термоциклера «Trepsona» (Биометра, Германия) и «ДНК-технология» (Россия). Подбор праймеров для амплификации ДНК-мишени проводили на основе программы «Primer 3» (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/cgi) с использованием нуклеотидной последовательности гена GPIIIa (acc. M32672), приведенной в базе данных Genbank.

GpIIIL - 1375 (5') gct cca atg tac ggg gta aa

GpIIIR - 1759 (5') ctc ctc aga cct cca cct tg

Концентрацию и температуру отжига синтезированных праймеров определяли по спектру поглощения образцов при длине волны 260 нм с использованием компьютерной программы «Концентрация олигонуклеотидов, учитывающей строение олигонуклеотида». Адрес в Internet http://www.humgen.siobc.ras.ru. Инкубационные пробы содержали (25 мкл): праймеры по 1 мкл 10 мкМ (1,5 о.е./мл), 2,5 мкл рестрикционного буфера 10х («Бион», Россия), MgCl до концентрации 3,5 мМ, 2,5 мкл смеси dNTP 10х, 20 нг ДНК-матрицы, 0,5 ед. Taq-полимеразы. Программа ПЦР состояла из 35 циклов: 94°С - 40 с, 60°С - 30 с, 72°С - 90 с. После амплификации пробы осаждали 3 объемами этанола в течение ночи и собирали центрифугированием в течение 10 мин. при 10 тыс. g. Длина продукта амплификации полиморфного участка гена GPIIIa составляет 384 п.н. Для выявления мутаций G20210A гена протромбина (коагуляционного фактора II) использовались аллель-специфические праймеры AS-P-WT (5'-CCATAGCACTGGGAGCATTGAGGATC-3') и AS-P-MT (5'-GTTCCGCACGCCTGAATAGCACTGGGAGCATTGAGGGTT-3'), а также общий праймер P-F (5'-

GTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAA-3'). В результате реакции с праймерами AS-P-WT и P-F образуется продукт длиной 174 п.н., а в реакции с праймерами AS-P-MT и P-F - 187 п.н. Реакционная смесь включала в себя 20 пмоль общего обратного праймера, 10 пмоль праймера AS-P-WT и 8 пмоль праймера AS-P-MT. Амплификация велась при условиях: 95°С - 2 мин, 30 циклов (94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с), 72°С - 5 мин.

Обработка ДНК рестрикционной эндонуклеазой Mspl. Содержимое пробы растворяли в воде до объема рестрикционной смеси 100 мкл, в которую вводили 5 ед. рестриктазы Mspl («Promega», США). После инкубирования смеси в течение 1,5 ч при 37° С добавляли 9 мкл 5М NaCl и 300 мкл этанола. Смесь выдерживали 12 часов при -20°С, цетрифугировали в течение 10 мин. при 10 тыс. g. и удаляли супернатант. Осадок растворяли в 15 мкл буфера для нанесения на полиакриламидный гель.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Аллели PL1 и PLA2 идентифицировали на основе анализа длин рестрикционных фрагментов ДНК. После обработки эндонуклеазой MSPI полноразмерного продукта участка гена GPIIIa (длина 384 п.н.) рестрикционные фрагменты ДНК аллеля PLA1 имеют размер 295 н.п. и 83 н.п. и 6 п.н.; фрагменты аллеля PLA2 имеют размер 175 п.н., 120 п.н. и 83 п.н. и 6 п.н. Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) при 20мА и 250V в течение 1 часа, гель окрашивали азотнокислым серебром по стандартной методике. В качестве маркера использовали плазмиду pUCI8, обработанную рестриктазой Mspl (размер фрагментов ДНК составляет от 501 до 34 п.н.). При анализе мутаций гена протромбина разделение продуктов амплификации проводили электорофорезом в 1.5% агарозном геле. В качестве матриц использовались образцы ДНК, гомозиготные по нормальному аллелю гена протромбина. Полученные данные подвергали обработке с использованием пакета программ STATISTICA 6.0, StatSoft, США. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию «Obs/Exp», достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты. Были обследованы 92 человека с дислипиде-миями

в возрасте от 40 до 71 года (средний возраст - 53.05 года). В группе исследовалось аллельное распределение гена ОРІІІа, частота заболеваемости ишемической болезнью сердца и гипертонической болезнью. Выраженность гипертонической болезни оценивалась по максимальным цифрам систолического артериального давления (1 степень: 140-160 мм рт ст; 2 степень: 160180 мм рт ст; 3 степень: >180 мм рт ст), а также по объему анти-гипертензивной терапии, применяемой у каждого пациента. Многие лекарственные средства способны вызывать появление или обострить уже имеющихся гиперлипидемических расстройств. При подборе антигипертензивной терапии лицам с дислипидемиями использовались ингибиторы-АПФ (диротон), антагонисты кальция (верапамил), индапамид и селективный р-адреноблокатор бисопролол (конкор). В терапии ИБС использовались по показаниям препараты нитратов (кардикет). При исследовании аллельного распределения гена ОРІІІа в этой группе больных не были выявлены гомозиготы по аллелю РЬД2. Гомозиготы по аллелю РЬД1 и гетерозиготные генотипы РЬД1/РЬД2 соотносились как 63% и 37% соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Основные показатели контингента больных в зависимости от их генотипа

Показатель PLA1/A1 PLA1/A2

1.Количество пациентов,

2.Средний возраст, (годы) 53.20 54.69

3. Уровень холестерина, (ммоль/л) 6.43 6.38

4.Индекс атерогенности 3.48 3.30

5.Частота ИБС

6.Частота осложнений ИБС

7. Артериальная гипертензия

Сокращения: ОИМ - острый инфаркт миокарда в анамнезе.МА - мерцательная аритмия, постоянная или пароксизмальная форма

Среди гомозигот по аллелю РЬД1 средний уровень общего холестерина крови составил 6.43 ммоль/л, средний индекс атеро-генности составил 3.48. ИБС в этой группе наблюдалась у 28 пациентов (48.2%), в том числе осложненная инфарктом миокарда и/или нарушением ритма по типу МА - у 10 (37%). Среди гетерозигот РЬД1/А2 средний уровень общего холестерина крови составил 6.38 ммоль/л, средний индекс атерогенности - 3.30. ИБС была у 20 пациентов (58.8%), в том числе - осложненная инфарктом миокарда и/или нарушением ритма по типу МА - у 14 (70%). Результаты исследования представлены в табл. 1.

ГБ страдали 48 человек (83%) в группе гетерозигот РЬД1/Д1, из них: гипертония 1 степени - 14 чел (29%), гипертония 2 степени - 14 чел (29%), гипертония 3 степени - 20чел (42%). В группе гетерозигот РЬД1/Д2 ГБ наблюдалась у 34 чел. (100%), в том числе: 1степени - 8 чел (23.6%), 2 степени - 6 чел (17.6%), 3 степени - 20 чел (58.8%). Результаты показаны на рис.

% Распространенность артериальной гипергенвии у гомо- и гетерозигот no гену GP3A Q 59

2 Степень артериальной гипертензии 3

Рис. Выраженность артериальной гипертензии у гомо- и гетерозигот по гену ОР111а: 1 степень артериальной гипертензии: АД=140-160/90 мм рт ст.; 2 ст. - АД=160-180/90 мм рт.ст.; 3 ст. - АД>180/90 мм рт. ст.

При подборе антигипертензивной терапии достигался уровень артериального давления <140/90 мм рт ст. С этой целью применялась монотерапия антигипертензивными препаратами основных групп или, при необходимости, проводилась комбинированная терапия. Помимо числа комбинируемых групп препара-

тов учитывались применяемые суточные дозировки антигипер-тензивных средств (в % от максимальной суточной терапевтической дозы). Надо отметить, что анализировались дозы препаратов, используемые на момент выписки из стационара для амбулаторного лечения, т.е. рассматривался объем базовой длительной амбулаторной терапии, необходимой для поддержания стабильной гемодинамики на уровне АД< 140/90 мм рт. ст. При этом часть пациентов - с симптоматической пароксизмальной артериальной гипертензией - не нуждалась после выписки из стационара в длительном приеме антигипертензивных препаратов. Результаты представлены в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Объем антигипертензивной базовой терапии (постоянный прием) в процентах от максимальной терапевтической суточной дозы в группах гетеро- и гомозигот по гену ОРШа

Группа препаратов PLА1/А1

Ингибиторы-АПФ (100%= диротон 10мг/сут) 31,56% 72,44%

Диуретики (100%= арифон 2.5 мг/сут) 46,05% 84,70%

ß-блокаторы (100%= конкор 10мг/сут) 14,34% 30,14%

Блокаторы Са-каналов (100%= верапамил 80мг х2р/сут) 15,14% 7,14%

Таблица 3

Количество антигипертензивных препаратов основных групп, используемых в комбинации при подборе базовой терапии артериальной гипертензии, % от общего числа пациентов в группе гомо- и гетерозигот по ОРІІІа

Число групп препаратов

0 (симптоматическая АГ, не требующая постоянного приема антигипертензивных препаратов) 0

Одна группа 27,60 29,61

Две группы 43,14 20,32

Три группы 11,85 37,14

Четыре группы 0 16,04

аллеля 20210А гена протромбина является у больных с дислипидемиями генетическим фактором риска не для развития ишемической болезни сердца и артериальной гипертензии как таковых. Данные аллели определяют осложненное нестабильное течения этих заболеваний. У больных с дислипидемиями аллели PLA2 гена GPIIIa и 20210А гена протромбина сопряжены с большей частотой осложнений, эти больные требуют многокомпонентной терапии и больших доз препаратов, относящихся к различным группам антигипертензивных средств, а также большей продолжительности лечения для стабилизации артериального давления. Таким образом, носители аллеля PLA2 гена GPIIIa представляют собой генетически детерминированную группу больных, требующих более активной, продолжительной и многокомпонентной антигипертензивной терапии. Определение генотипа гена GPIIIa и гена протромбина у лиц с дислипидемиями может быть использовано как дополнительный критерий в прогнозировании тяжести течения сердечно-сосудистых заболеваний, в оценке риска возможных осложнений, в решении вопроса об объеме базисной антигипертензивной и кардиотропной терапии, а также целесообразности применения гиполипидемических средств.

Литература

1. Гурвич И.Н..П СПИД, рак и общ. здор.- 2005.- T.9.— C.72-83.

2. Thompson G.R. Handbook of Hyperlipidaemia.- G.B..: Current Science 1994.- 258 p.

3. Либов И.А., Гультикова О.С. // Моск. мед. ж.- 2001.— № 12.- C. 14-15.

4. Радзинский В. и др. //Акушерство и гинекология.- 2003.-№10.- С. 23 - 26.

5. Мяндина Г.И. и др. //Вестник РУДН.- Сер. Медицина-2006.- №2(34).- С.14-18 .

6.Lansa F. et al. //J Biol Chem.- 1994.- Vol. 61.- P.812-814.

7 .Newman PJ. et al. //J Clin Invest.- 1989.- Vol. 83.-P. 1778-1781.

8. Weiss D. et al. // N. Engl. J.- 1996, Vol.334.- P. 1990-996.

9 .Ridker P.M. et al. // N. Engl. J.- 1997.-Vol.349.- P.385-388.

10. Beer J.H., Pederiva S. // J. Neural Transm.- 2000.-Vol. 107.- P. 266-272.

11. Терещенко С.Н, Акимова О.С..// Сердце.- 2002.- Т.1.-

C.180.

12. Redondo M. et al. // Arteriosclerosis, Thrombosis., and Vascular Biology.- 1999.- Vol.19.- P. 1020-1025.

Таблица 4

Результаты генотипирования по дефектному аллелю гена протромбина G2G21GA

ALLELIC DISTRIBUTION OF GPIIIA GENE AMONG DISLIPIDAEMIA PATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION AND CORONARY HEART DISEASE.

T.YU. ZOTOVA, E.N. KASAPOVA, G.I. MYANDINA,

V.A. FROLOV

Показатель Гомозоготы по мутантному аллелю 20210A/A Гетерозиготы 20210A/G Гомозиготы по нормальному аллелю 20210G/G

1.Число чел.

2.Уровень холестерина, ммоль/л 5.10 5.29 6.05

3.Индекс атерогенности 3.9 3.48 3.23

4.Частота ИБС,% 1

5. Частота осложнений ИБС

6. Частота ГБ

7. Среднее значение степени гипертонии 2.33 2.0 2.06

В той же группе пациентов с дислипидемиями, описанной выше, проводилось генотипирование по дефектному аллелю гена протромбина G20210A. Обследованы 61 человек, среди которых: гомозоготы по дефектному аллелю G20210A/A составляли 3 человека (5%), гетерозиготы G20210A/G составляли 4 человека (6.5%), гомозиготы по нормальному аллелю G20210G/G составили 54 человека (88.5%). Причем наличие в геноме дефектного аллеля гена протромбина G20210А утяжеляет течение ИБС, вызывает увеличение частоты осложнений ИБС, таких как нарушения ритма и ОИМ. Результаты показаны в табл. 4.

Заключение. В результате данного исследования выявлено, что наличие в генотипе аллеля PLA2 гена интегрина GPIIIa и

Summary

As well known presence of defective integrin receptors is the reason of serious diseases such as coronary atherosclerosis and coronary heart disease. The distribution of gene region coding type III p-subunit of GPIIIa glycoprotein end gene region coding protrombin among dislipidaemia patients genomes was described in current paper. The correlation between presences of defective PLA2 alleles, defective G20210A alleles and higher probabilities of coronary heart disease and arterial hypertension for such patients was demonstrated here. As was shown dislipidaemia patients with defective PLA2 alleles can be characterized with higher risk of complication of coronary heart disease and arterial hypertension and require additional medical treatments.

Key words: dislipidaemia, coronary heart disease