Участие факторов ангиогенеза в развитии наружного генитального эндометриоза

© П. Г. Кондратьева 2, УЧАСТИЕ ФАКТОРОВ АНГИОГЕНЕЗА В

Д. И. Соколов А. В. Колобов РАЗВИТИИ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО

И. М. Кветной 1, М. И. Ярмолинская 1, ЭНДОМЕТРИОЗА Н. Г. Солодовникова 2, Д. А. Ниаури 1, С. А. Сельков 1

1 НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург;

2 Санкт-Петербургский государственный университет: медицинский факультет, кафедра акушерства и гинекологии

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) — заболевание, сопровождающееся формированием очагов гетеротопического эндометрия на брюшине, пролиферацией эндотелиальных клеток и воспалительной реакцией. Целью нашего исследования явилась оценка роли VEGF и bFGF в развитии и прогрессировании НГЭ. Для этого мы проводили оценку концентрации VEGF и bFGF в перитонеальной жидкости и супернатантах, полученных при культивировании эндометриоидных гетеротопий, а также иммуногистохимическую оценку экспрессии указанных факторов

в эндометриоидных гетеротопиях больных наружным генитальным эндометриозом различной степени тяжести. Нами обнаружены повышенные концентрации VEGF в перитонеальной жидкости больных НГЭ по сравнению с перитонеальной жидкостью здоровых женщин, вместе с тем bFGF не определялся. В супернатантах, полученных при культивировании эндометриоидных гетеротопий, были обнаружены данные факторы, при этом концентрация bFGF была ниже концентрации VEGF. Иммуногистохимический анализ ткани гетеротопий подтвердил наличие в них ростовых факторов VEGF и bFGF. Таким образом, bFGF не попадает в перитонеальную жидкость и, по-видимому, участвует в контроле процессов ангиогенеза на локальном уровне, тогда как VEGF, наоборот, обладает выраженным системным действием на процессы ангиогенеза при НГЭ.

Ключевые слова: эндометриоз; хемокины; цитокины; воспаление; ангиогенез

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) является мультифакторным заболеванием, причинами которого могут быть нарушения ангиогенных, эндокринных, метаболических, иммунологических механизмов, генетические аномалии. Заболевание характеризуется способностью эндометрия сохранять свои свойства при попадании в брюшную полость. При этом стимулируется активность перитонеальных макрофагов и фибробластов. Активизированные макрофаги вырабатывают повышенное количество различных факторов, в том числе факторов роста, а повышенное количество фибробластов приводит к увеличению выраженности склеротических процессов и пролиферативных изменений сосудов внутри и вокруг эктопических очагов. Клетки эндометриоидных гетеротопий сами способны продуцировать хемоаттрактанты и ростовые факторы, что дополнительно привлекает иммунокомпетент-ные клетки (преимущественно активированные макрофаги и Т-лимфоциты) в перитонеальную полость и влечет за собой усиление воспалительных процессов наряду с усилением процессов ангиогенеза, что ведет к прогрессированию заболевания. Наиболее точно механизмы развития и прогрессирования НГЭ возможно установить, изучив патогенетическое звено на локальном уровне, непосредственно вблизи очагов эндометри-оза. Одними из главных факторов, обеспечивающих рост эндометриоидных гетеротопий, усиливающих процессы ангиогенеза, являются фактор роста эндотелия сосудов (VEGF — vas^lar endothelial growth factor) и основный фактор роста фибробластов (bFGF — basic fibroblast growth factor). В связи с этим целью нашего исследования явилась оценка роли этих факторов в развитии и прогрессировании НГЭ. Для этого мы проводили оценку концентрации VEGF и bFGF в перитонеальной жидкости и супернатантах, полученных при культивировании эндометриоидных гетеротопий, а также иммуно-гистохимическую оценку экспрессии указанных факторов в эндометриоидных гетеротопиях, полученных от больных НГЭ различной степени тяжести.

Материал и методы

Были обследованы 32 женщины репродуктивного возраста с НГЭ, среди них I-U степень тяжести НГЭ была установлена у 16 пациенток, у 16 женщин — III-IV степень тяжести НГЭ. Восемь женщин репродуктивного возраста, обратившихся

для проведения диагностической лапароскопии в рамках планирования беременности, без признаков эндометриоидной болезни и каких-либо других пролиферативных процессов, а также без выраженных воспалительных изменений органов брюшной полости и малого таза, составили группу контроля. Диагноз НГЭ установлен на основании эндоскопических данных и по результатам гистологического исследования. Степень тяжести НГЭ оценивалась по классификации R-AFS. Забор пе-ритонеальной жидкости осуществляли в процессе проведения лапароскопических операций.

Методика забора перитонеальной жидкости во время проведения лечебно-диагностической лапароскопии: после введения в брюшную полость эндовидеоскопа производился осмотр внутренних органов (брюшина, маточные трубы, матка и связочный аппарат матки, область Дугласова пространства). При визуализации эндометриоидных гетеротопий оценивалась степень тяжести НГЭ (распространенность эктопических очагов, глубина инвазии, цвет и характер очагов, наличие рубцовых и воспалительных изменений вокруг очагов). Затем в брюшную полость вводились малые троакары. Через один из них, до начала каких-либо хирургических манипуляций, вводилась хирургическая аспирационная трубка и устанавливалась в области Дугласова кармана. На конце трубки был закреплен стерильный одноразовый шприц, в который забиралась перитонеальная жидкость из Дугласова пространства и карманов брюшины. Далее в асептических условиях перитонеальная жидкость из стерильного шприца помещалась в стерильную вакуумную пробирку. Полученные образцы перитонеальной жидкости хранили до цитофлуориметрического анализа концентрации цитокинов при 20 °C. После забора перитонеальной жидкости производили иссечение «красных» очагов эндометриоза в области брюшины малого таза с последующим помещением образца в стерильный контейнер. Образцы «красных» очагов эндометриоза культивировали в лунках плоскодонного 24-луночного планшета (Sarstedt, Австрия) во влажной атмосфере с 5%-м СО2 при 37 °С в течение 24 часов в среде DMEM с добавлением 10%-й инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ICN, США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина, 2 мМ L-глютамина, HAT (ICN, США). После культивирования эксплантов собирали супернатанты и хранили до цитофлуоримет-рического анализа концентрации цитокинов при 20 °C. Образцы «красных» очагов эндометриоза после культивирования взвешивали, фиксировали раствором формалина, после чего проводили морфологическое описание и иммуногистохимичес-кий анализ.

Концентрацию факторов роста VEGF и bFGF в перитонеальной жидкости и в супернатантах, полученных после культивирования образцов «красных» очагов эндометриоза, определяли с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием тест-систем BD Cytometric Bead Array (BD, США) и проточного цитофлюориметра FACStrack (BD, США).

Морфологическое описание образцов «красных» очагов эндометриоза проводили с использованием парафиновых срезов, выполненных по стандартной гистологической схеме. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин.

Иммуногистохимический анализ проводили с использованием моноклональных мышиных антител к bFGF (1:50, Novocastra) и VEGF (1:20, BD Biosciences Pharmingen) согласно одноэтапному протоколу с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 7,6. В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий био-тинилированные антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины. Визуализацию проводили с применением комплекса авидина с биотинилиро-ванной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензиди-ном (Novocastra). Анализ полученных данных проводили при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400, компьютерной системы анализа микроскопических изображений и программы Морфология 4.0. Определяли площадь экспрессии факторов роста, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, выражаемое в процентах.

Для статистического анализа полученных данных использовали компьютерные программы Statistica v6.0 (М — среднее арифметическое, m — ошибка среднего, p — по t-критерию Стьюдента).

Результаты и их обсуждение

Нами установлено, что концентрация VEGF в перитонеальной жидкости больных НГЭ III-IV степени тяжести была достоверно выше, чем при I—II степени тяжести и в группе контроля (1264,9 ± 246,64 пг/мл, 470,26 ± 49,88 пг/мл и 379,7 ± 102,68 пг/мл соответственно). Методом проточной цитофлюорометрии нами была произведена оценка концентрации VEGF в супернатантах, полученных после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетерото-пий. При этом мы обнаружили высокий уровень продукции VEGF (1705,43 ± 299,6 пг/мл), что в пересчете на 1 мг ткани гетеротопии составило 77,82 ± 5,01 пг/мл (табл.). Полученные нами данные полностью совпадают с данными других ис-

Таблица

Схема индукции овуляции у больных нормогонадотропной формой аутоиммунного оофорита

Фактор роста Концентрация в перитонеальной жидкости, пг/мл Концентрация в супернатантах, полученных после культивирования «красных» эндометриоидных гетеротопий, М ± т

в 1 мл супернатанта в пересчете на 1 мг ткани

VEGF 867,6 ± 148,2 1705,43 ± 299,60 77,82 ± 5,01

bFGF не обнаружен 432,9 ± 59,9 15,05 ± 0,69

следователей. Принимая во внимание тот факт, что VEGF признан одним из основных факторов ангиогенеза, можно говорить об активности этого процесса при НГЭ любой степени тяжести.

Мы не обнаружили bFGF в перитонеальной жидкости больных НГЭ и здоровых женщин. Методом проточной цитофлюорометрии нами была произведена оценка концентрации bFGF в супернатантах, полученных после культивирования в среде «красных» эндометриоидных гетеротопий. Концентрация bFGF составила 432,9 ± 59,9 пг/мл, что в пересчете на 1 мг ткани гетеротопии составило 15,05 ± 0,69 пг/мл (см. табл.).

Таким образом, несмотря на секрецию bFGF клетками гетеротопий этот ростовой фактор не попадает в перитонеальную жидкость и, по-видимому, участвует в контроле процессов ангиогенеза на локальном уровне, тогда как VEGF, наоборот, обладает выраженным системным действием на процессы ангиогенеза при НГЭ. Для подтверждения полученных нами результатов необходимо отметить, что в работах по изучению опухолевого ангиогенеза было показано, что иммунонейтра-лизация bFGF при НГЭ не оказывала никакого эффекта на процессы ангиогенеза или эффект был незначителен [6]. В экспериментах с мышами исследователи показали, что bFGF изолированно практически не влияет на развитие сосудистых дефектов или восстановление сосудистой сети, и участвует в ангиогенезе, лишь находясь в активном состоянии, а при нахождении в связанной, неактивной форме не участвует в нем [4].

Для подтверждения полученных нами результатов, а также для оценки роли клеток эндометри-оидных гетеротопий в развитии эндометриоза мы провели их морфологическое описание, а также анализ экспрессии VEGF и bFGF в ткани гетеро-топий при помощи морфологического описания и иммуногистохимического анализа ткани гетеротопий. В своей работе мы исследовали «красные» очаги эндометриоза, так как именно эти гетеро-топии являются наиболее активными и, следовательно, продуцируют большее количество факто-

Рис. 1. Очаг эндометриоза, ><100

ров роста и цитокинов, чем «белые» (рубцовые) или «черные» очаги. Поэтому именно «красные» очаги эндометриоза представляют наибольший интерес для исследований [10]. Качественный анализ микроструктуры эндометриоидных гетеротопий показал, что очаги эндометриоза представлены железистой тканью (мелкие и крупные эндометриальные железы), умеренно отечной цитогенной стромой, представленной фиброблас-тами, единичными мононуклеарами (лимфоциты, макрофаги) и нейтрофилами. В ближайшем микроокружении эндометриоидных желез определяются множественные мелкие капилляры с периваскулярной инфильтрацией лимфоцитами, макрофагами, сегментоядерными нейтрофилами (рис. 1). Полученные нами данные сходны с имеющимися в литературе [1, 2].

Иммуногистохимический анализ экспрессии ростовых факторов VEGF и bFGF в «красных» очагах эндометриоза показал, что указанные факторы эндометриоидными гетеротопиями экспрессиру-ются неодинаково. Процент площади, занимаемой VEGF-позитивными клетками в ткани гетеротопии (7,9 ± 0,35), достоверно в 2 раза превышает таковой в сравнении с bFGF-позитивными клетками (4,38 ± 0,5, р < 0,01). При этом VEGF в ткани гетеротопий располагался диффузно и фиксировался в

Рис. 2. А — экспрессия VEGF в очаге эндометриоза, ><400; Б — экспрессия bFGF в очаге эндометриоза, *400

клетках эндотелия сосудов, железистого эпителия, плоского эпителия брюшины, а также в мононук-леарных лимфоцитах и макрофагах. Характер расположения bFGF был более локальным, и определялись точечные реакции в эндотелии сосудов, макрофагах и фибробластах (рис. 2).

Таким образом, морфологический и иммуно-гистохимический анализ «красных» очагов эндометриоза подтвердил полученные нами результаты о преимущественно системном действии VEGF и преимущественно локальном действии bFGF на процессы ангиогенеза при НГЭ.

Заключение

Регуляция ангиогенеза лежит в основе многих физиологических и патологических процессов. В ней участвуют различные факторы роста, провоспалительные цитокины и хемокины. VEGF является наиболее специфичным ростовым фактором для эндотелия сосудов [9, 12, 13]. Этот фактор регулирует выработку различных факторов роста, таких как bFGF, IGF, PDGF [8]. Провоспалительные цитокины IL-1 и IL-6 индуцируют экспрессию VEGF в клетках различных типов. Этот факт подтверждает гипотезу о том, что VEGF может являться медиатором ангиогенеза в воспалительных и неопластических процессах. VEGF индуцирует экспрессию антиапоптических белков Bcl-2, A1, XIAP эндотелиальными клетками [8]. Он обнаружен в эндометриоидных гетеро-топиях, в большей степени в «красных» очагах по сравнению с «черными», что обусловлено более выраженной васкуляризацией в них и свидетельствует об активности патологического процесса [7, 10]. Этот фактор присутствует и в эутопичес-ком эндометрии, играя важную роль в регуляции менструального цикла [12]. Количество VEGF повышено в лютеиновую фазу цикла, особенно у женщин с различными заболеваниями органов

малого таза, в том числе и воспалительными [11, 12]. У таких пациенток при ретроградном забросе крови во время менструации ангиогенез изначально усилен за счет секреции VEGF, что может способствовать имплантации фрагментов эндометри-оидной ткани в брюшной полости. bFGF является синергистом VEGF и также обладает мощным ан-гиогенным действием. В эксперименте было показано, что при НГЭ изолированная блокада только VEGF не привела к регрессу эктопических очагов, тогда как комбинированное ингибирующее воздействие на VEGF и bFGF оказывало выраженное антиангиогенное действие в очагах эндометриоза [3]. bFGF локализуется в базальных мембранах средних кровеносных сосудов; он секретируется гладкомышечными клетками, клетками эндометрия и эндотелиальными клетками. bFGF вызывает пролиферацию эндотелиальных и гладкомышеч-ных клеток [5]. Этот фактор индуцирует пролиферацию эндотелия и приводит к увеличению количества сосудов, а также контролирует выработку ферментов, способствующих вазодилята-ции. Однако было показано, что этот фактор в основном находится в экстрацеллюлярном матриксе в нерастворимой (неактивной) форме. Переход же в активную форму возможен при разрушении или повреждении экстрацеллюлярного матрикса [6].

Ангиогенез может считаться одним из ведущих процессов в патогенезе НГЭ. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что наиболее значимые процессы развития и прогрессиро-вания эндометриоза происходят не на системном уровне, а локально, непосредственно в брюшной полости. При этом действие VEGF направлено на индукцию и поддержание пролиферацион-ных процессов в брюшной полости, а действие bFGF направлено на локальное поддержание ан-гиогенеза и формирование очагов эктопического эндометрия.

Литература

1. Бобкова М. В. Клинико-морфологические особенности наружного генитального эндометриоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 1995.

2. Борисова Е. А. Клинико-морфологические особенности эндометриоза яичников: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 2004.

3. Combined inhibition of vascular endothelial growth factor, fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor, but not inhibition of VEGF alone, effectively suppresses angiogenesis and vessel maturation in endometriotic lesions. / Laschke M. W., Elitzsch A., Vollmar B. [et al.] // Hum. Reprod. — 2006. — Vol. 21, N 1. — P. 262-268.

4. Compensation by FGF1 does not account for the mild phenotypic defects observed in FGF2 null mice / Miller D. L., Ortega S., Bashayan O. [et al.] // Moll. Cell. Biol. — 2000. — Vol. 20. — P. 2260-2268.

5. Different basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor-antisense expression in eutopic endometrial stromal cells derived from women with and without endometriosis / Mihalich A., Reina M., Mangioni S. [et al] // J. Clin. Endocrin. Metab. — 2003. — Vol. 88. — P. 2853-2859.

6. Dennis P. A. Studies on the role of bFGF in vivo: inability of neutralizing antibodies to block tumor growth / Dennis P. A., Rifkin D. B. // J. Cell. Physiol. — 1990. — Vol. 144. — P. 84-98.

7. Expression of vascular growth factor and trombospondin-1 mRNA in patients with endometriosis / Tan X. J., Lang J. H., Liu D. Y. [et al.] // Fertil. Steril. — 2002. — Vol. 78. — P. 148-153.

8. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic sciense and clinical progress / Ferrara N. // Endoc. Rew. — 2004. — Vol. 25. — P. 581-611.

9. GuptaK. Angiogenesis: a curse or cure? / Gupta K., Zhang J. // Postgrad. Med. J. — 2005. — Vol. 81. — P. 236-242.

10. Higher activity by opaque endometriotic lesions than nonopaque lesions. / Khan K. N., Masuzaki H., Fujishita A. [et al]. // Acta. Obstet. Gynecol. Scand. — 2004. — Vol. 83, N 4. — P. 375-382.

11. Lin J. Effect of monocyte chemoattractant protein-1 and estradiol on the secretion of vascular endothelial growth factor

in endometrial stromal cells in vitro / Lin J., Gu Y. // Fertil. Steril. — 2005. — Vol. 84, N 6. — P. 1793-1796.

12. Smith S. K. Regulation of angiogenesis in the endometrium / Smith S. K. // Trends. Endocrinol. Metab. — 2001. — Vol. 12. — P. 147-151.

13. Taylor R. N. Angiogenic factors in endometriosis / Taylor R. N., Lebovic D. I., Mueller M. D. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2002. — Vol. 955. — P. 89-100.

Статья представлена Э. К. Айламазяном НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,

Санкт-Петербург

PARTICIPATION OF FACTORS OF AN ANGIOGENESIS IN DEVELOPMENT OF AN ENDOMETRIOSIS

Kondratteva P. G., Sokolov D. I., Kolobov A. V., Kvetnoy I. M., Jarmolinskaja M. I., Solodovnicova N. G., Niauri D. A., Selkov S. A.

Summary: Endometriosis is a pelvic pathological process, when endometriotic lesions require neovascularisation to establish, proliferate and invide inside the peritoneal cavity. We analyzed the role of main angiogenic factors VEGF and bFGF in peritoneal fluid and culture of red endometrial lesions of women with different stages of endometriosis. We have used the immunohistochemical staining of VEGF and bFGF in red endometriotic lesions. We have demonstrated elevated levels of VEGF in a peritoneal fluid of women with endometriosis, but we don't detected bFGF. We found that concentration of VEGF and bFGF in culture of endometriotic lesions was elevated and the VEGF levels were higher than FGF. The immunohistochemical analysis was detected available angiogenic factors in endometriotic lesions. In addition we speculate that FGF play role in the pathophysiology of endometriosis only on the local level, and VEGF play system role in progress of disease.

Key words: endometriosis; angiogenesis; VEGF; bFGF