СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИСЛОЙНЫХ ВЕЗИКУЛ
METHOD FOR PRODUCING IMMOBILISED BILAYER VESICLES

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, биоаналитики и касается способа получения иммобилизованных бислойных везикул.
Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки твердой поверхности слюды водной суспензией специально приготовленных агрегатов бислойных липидных везикул, приводящей к формированию на поверхности липидного полислоя с включенными в него везикулами (О.Teschke, E.F. de Souza, Liposome structure imaging by atomic force microscopy: verification of improved liposome stability during adsorption of multiple aggregated vesicles, Langmuir, 2002, v.l8, p.6513).
Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем последовательной обработки стеклянной подложки бычьим сывороточным альбумином, олеил-O-полиэтиленгликолем и водной суспензией отрицательно заряженных везикул (US Patent №7501280, класс 435/325).
Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя (стекла с предварительно нанесенным липидным бислоем), содержащего привитые полимерные цепи олигонуклеотида 1, суспензией бислойных везикул в воде или водно-солевом растворе. В данном способе в качестве бислойных везикул используют везикулы, содержащие ковалентно связанный олигонуклеотид 2 комлементарный олигонуклеотиду 1 (Chiaki Yoshina-Ishii, Steven G. Boxer, Arrays of mobile tethered vesicles on supported lipid bilayers, J. Am. Chem. Soc., 2003, v.125, p.3696) - прототип.
Недостатками известного способа являются его сложность, заключающаяся в многостадийности процесса, требующей предварительной модификации поверхности носителя липидным бислоем (стадия 1), химической активации концевой 5'-дисульфидной группы олигонуклеотида 2 путем ее обработки избытком трис(2-карбокиэтил)фосфина (стадия 2) и модификации полученным соединением бислойных липидных везикул (стадия 3), а также необходимость проведения многократной очистки полупродуктов и конечного продукта.
Технической задачей изобретения является упрощение известного способа получения иммобилизованных бислойных везикул.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя, содержащего привитые полимерные цепи, суспензией бислойных везикул в воде или водно-солевом растворе в качестве носителя используют модифицированные твердые поверхности или модифицированные дисперсные частицы, содержащие по крайней мере один привитой катионный или анионный полимер с плотностью посадки полимера не менее 200 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности носителя, а в качестве бислойных везикул используют анионные или катионные везикулы, состоящие по крайней мере из одного амфифильного поверхностно-активного вещества и несущие поверхностный заряд противоположный по знаку заряду модифицированной полимером поверхности носителя.
Предлагаемый способ позволяет сохранять целостность иммобилизованных на поверхности бислойных везикул.
В предлагаемом способе в качестве носителя можно использовать модифицированные твердые поверхности, например стекло, слюду, полимерные пленки и т.д., и модифицированные дисперсные частицы, например полимерные микросферы, углеродные нанотрубки, силикатные наночастицы и т.д. Модификацию твердых поверхностей или дисперсных частиц осуществляют путем ковалентной иммобилизации (прививки) катионных или анионных полимеров по концевой группе на поверхности носителя. При других способах фиксации полимеров на твердых поверхностях или дисперсных частицах может происходить разрушение слоя везикул, иммобилизованных на поверхности носителя. Для прививки катионных или анионных полимеров на поверхность носителя можно использовать любой известный метод прививки, например, радикальную полимеризацию с переносом атома. Носитель можно использовать как в твердом виде, так и в виде суспензии в воде или водно-солевом растворе.
Плотность посадки полимера на поверхность носителя должна составлять не менее 200 привитых полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности носителя. При меньшей плотности посадки привитых цепей полимера может наблюдаться частичное либо полное разрушение иммобилизованных везикул.
В качестве бислойных везикул можно использовать бислойные везикулы, состоящие по крайней мере из одного амфифильного поверхностно-активного вещества, то есть вещества, в структуре которого имеются как гидрофильные, так и гидрофобные области. Гидрофобные области могут содержать, например, один, два или три алифатических радикала. Бислойные везикулы обязательно должны нести поверхностный заряд противоположный по знаку заряду модифицированной полимером поверхности носителя. При невыполнении этого условия предлагаемый способ не работает.
Обработку модифицированного полимером носителя суспензией бислойных везикул можно проводить в воде или водно-солевом растворе. Обработку можно осуществлять в широком интервале температуре, например от 5 до 90°С. Иммобилизация везикул на поверхности модифицированного полимером дисперсного носителя может сопровождаться образованием коагулирующего осадка, который может быть вновь переведен в коллоидную дисперсию путем добавления новой порции суспензии модифицированного носителя или бислойных везикул.
При обработке модифицированного полимером носителя суспензией бислойных везикул рН среды и концентрация соли в водно-солевом растворе могут варьироваться в широких пределах. Конкретные значения этих параметров выбирают с учетом состава везикул и химической природы привитых полимерных цепей.
Иммобилизованные на поверхности везикулы могут быть использованы в качестве контейнеров для инкапсулирования и контролируемого высвобождения различных веществ, например лекарств, пищевых добавок, катализаторов химических реакций и т.д.
Строение и состав конечных продуктов, получаемых с помощью предлагаемого способа, могут быть оценены и доказаны различными физико-химическими методами: лазерным электрофорезом, динамическим светорассеянием, флуоресценцией, электронной микроскопией, эллипсометрией, атомно-силовой микроскопией и проч.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1.
-2
-2
Бислойные везикулы со средним размером 50 нм получают в 10 М фосфатном буфере с рН 7 из смеси анионного кардиолипина и электронейтрального фосфатидилхолина методом озвучивания. Внутренний водный объем везикул заполняют 1 М раствором NaCl. Бислойные везикулы, иммобилизованные на поверхности дисперсного носителя, получают смешением 0.9 мл 3%-ной водной суспензии дисперсных частиц метилметакрилатного латекса диаметром 100 нм, содержащих привитые катионные цепи поли-2-метилпропеноилоксиэтилтриметиламмоний бромида с плотностью посадки 1000 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности частицы, с 0.1 мл 1%-ной водно-солевой суспензией бислойных везикул, заполненных раствором NaCl. Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут; продукт - частицы латекса с иммобилизованными везикулами - отделяют центрифугированием. Отсутствие поглощения в области λ=240-350 нм в надосадочной жидкости (супернатанте) указывает на отсутствие в ней везикул, то есть на количественное связывание везикул с частицами носителя. Целостность везикул контролируют, измеряя проводимость супернатанта и сравнивая ее с проводимостью 10 М фосфатного буферного раствора в отсутствии везикул. Совпадение результатов свидетельствует об отсутствии вытекания NaCl из везикул в окружающий раствор, то есть о том, что целостность везикул после их иммобилизации на поверхности носителя сохраняется. Методом криогенной просвечивающей электронной микроскопии показано, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.
Из примера видно, что предлагаемый способ обеспечивает количественную иммобилизацию везикул на поверхности модифицированных полимером дисперсных частиц и сохранение целостности иммобилизованных везикул. Конечный продукт может быть использован без дополнительной очистки.
Пример 2.
-2
-5
-2
Бислойные везикулы со средним размером 70 нм получают в 10М фосфатном буфере с рН 8 из смеси катионного диметилдицетиламмоний бромида и электронейтрального диолеоилфосфатидилхолина методом озвучивания. Внутренний водный объем везикул заполняют 10 М раствором флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеина (КФ). Бислойные везикулы, иммобилизованные на твердой поверхности, получают нанесением 0.1 мл 1%-ной суспензии бислойных везикул, заполненных КФ, на стеклянную пластинку размером 1 см × 1 см и толщиной 0.1 см, на поверхности которой были привиты анионные полимерные цепи полиакриловой кислоты с плотностью посадки 1500 полимерных цепей на один квадратный микрон поверхности пластинки. Пластинку с нанесенной суспензией везикул выдерживают при комнатной температуре и 100%-ной влажности в течение 7 минут; продукт -пластинку с иммобилизованными везикулами - промывают, опуская ее в 10 М фосфатный буферный раствор. Образование слоя везикул, иммобилизованных на поверхности пластинки, доказывают методами атомно-силовой микроскопии и эллипсометрии. За целостностью везикул следят, измеряя интенсивность флуоресценции пластинки с иммобилизованными везикулами. Атомно-силовая микроскопия показывает, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.
-2
Из примера видно, что предлагаемый способ обеспечивает иммобилизацию везикул на модифицированной полимером стеклянной пластинке и сохранение целостности иммобилизованных везикул. Конечный продукт получают однократным промыванием пластинки с иммобилизованными везикулами в 10 М буферном растворе.
Как следует из приведенных примеров, предлагаемый способ существенно упрощает известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул, а именно устраняет необходимость предварительной модификации поверхности носителя липидным бислоем, ковалентной модификации бислойных везикул полимером и проведения многократной очистки полупродуктов и конечного продукта.