Динамическая архитектура клетки. Нерешенные проблемы

Ю. М. Васильев

ДИНАМИЧЕСКАЯ АРХИТЕКТУРА КЛЕТКИ. НЕРЕШЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ

НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Разбираются молекулярные механизмы изменений цитоскелета нормальной и опухолевой клетки, определяющие ее движения. Рассматриваются возможные механизмы полимеризации актина и движений актиновых микрофиламентов, функция фокальных контактов с матриксом, механизмы поляризации движений клетки и механизмы морфологической трансформации в канцерогенезе.

Ключевые слова: микротрубочки, микрофиламенты, активный край, поляризация, канцерогенез.

The paper analyzes molecular mechanisms of changes in normal and neoplastic cytoskeleton relevant to cell movements. Possible mechanisms of actin polymerisation and actin microfilament movements, function of focal contacts with matrix, mechanisms of cell polarization movements and mechanisms of morphology transformation in carcinogenesis are considered.

Keywords: microtubules, microfilaments, active edge, polarization, carcinogenesis.

За последние годы наши представления о клетке резко изменились в двух планах. Во-первых, клетка из мешка, заполненного жидкостью, в которой плавают мембранные ор-ганеллы, превратилась в сложную архитектурную конструкцию из фибрилл разных типов — микрофиламентов, микротрубочек, промежуточных филаментов. Во-вторых, оказалось, что эта архитектурная конструкция динамична — все ее компоненты непрерывно движутся, распадаются и создаются заново, меняют местоположение и молекулярный состав. Такой уникальной конструкции нигде, кроме как в клетке, не существует. Выявление этих новых принципов организации, естественно, поставило перед исследователями множество новых задач. Здесь я попытаюсь сформулировать несколько таких задач, возникающих сегодня при изучении движущихся в культуре нормальных и опухолевых клеток.

Активный край и фокальные контакты

Тканевые клетки движутся, выбрасывая, прикрепляя и сокращая разные варианты псевдоподий — плоские ламел-лоподии, нитевидные филоподии и шаровидные лобоподии. Ту часть клеточного края, где идет образование псевдоподий, называют активным краем. Эта область заполнена актино-выми микрофиламентами, и в ней идет непрерывная полимеризация таких микрофиламентов из мономеров актина. Своеобразная древовидная полимеризация микрофиламентов вблизи внешней границы активного края, участвующие

© Васильев Ю. М., 2003 УДК 576.3/.7

в ней и контролирующие ее компоненты уже хорошо изучены (см., например, статью [2]). Вместе с тем процессы в активном крае отнюдь не ограничиваются полимеризацией актина.

Сложную картину этих процессов продемонстрировали видеосъемки А. Верховского и А. Ю. Александровой (личное сообщение), сделанные при помощи нового метода визуализации движений актина. Оказалось, что в активном крае существуют две зоны, разделенные четкой границей: наружная зона, где микрофиламенты движутся к центру быстро и беспорядочно, и внутренняя зона, где микрофиламенты соединяются с молекулами миозина и образуют хорошо организованные пучки и арки, медленно движущиеся к центру. Границу между внешней и внутренней зоной определяют и меняют инициальные фокальные контакты с матриксом на субстрате. Фокальные контакты — сложные белковые структуры, которые снаружи, через интегриновые рецепторы мембраны, связаны с белками матрикса, а изнутри, через ряд промежуточных белков, — с концами актиновых микрофиламентов. Инициальные фокальные контакты возникают заново лишь в наружной зоне активного края. При возникновении такого контакта граница между наружной и внутренней зоной смещается наружу, включая этот контакт. Эти наблюдения ставят совершенно новый вопрос: какова роль фокальных контактов в организации движений актина? Как эти контакты преобразуют неорганизованный клубок микрофиламентов в наружной зоне в организованные связанные с миозином пучки? Актин и миозин в этих пучках непрерывно движутся от фокальных контактов внутрь. Это заставляет думать, что преобразование актина в фокальных контактах не происходит однократно, но идет

непрерывно. Какова молекулярная основа этого преобразования? Мы пока ничего об этом не знаем. Речь идет о каком-то новом процессе, об активной функции фокальных контактов.

Поляризованная и неполяризованная клетка.

Взаимодействия микротрубочек и микрофиламентов

Активным может быть лишь часть края клетки или весь периметр этого края. В первом случае клетка поляризована по переднезадней оси (не путать с вертикальной поляризацией эпителия, о которой здесь речи нет). Она вытянута и может перемещаться по субстрату вдоль этой оси. Типичный представитель этой группы — культивируемый фибробласт.

Представитель второй группы клеток, где активен весь периметр, — культивируемый дисковидный эпителиоцит.

Поляризованные фибробласты и неполяризованные эпителиоциты различаются и по организации фибрилл. У фибробласта пучки актиновых микрофиламентов прямые и идут вдоль оси клетки внутрь от активного края; навстречу им от околоядерной области идут микротрубочки. У эпи-телиоцита актиновый пучок круговой, а микротрубочки расположены в центральной части цитоплазмы внутрь от кругового пучка. Разной структуре соответствует и разное поведение. Так, одиночный эпителиоцит, в отличие от одиночного фибробласта, не может направленно двигаться по субстрату, его функция — соединяться с другими эпителио-цитами в пласты.

Что определяет описанные два типа организации? Мы сейчас уже кое-что знаем о механизмах поляризации фибробласта.

Направление такой поляризации задают внешние факторы (например, фибриллы матрикса или хемотаксичес-кие градиенты растворенных в среде молекул); по-види-мому, эти факторы влияют на эффективность образования и прикрепления псевдоподий на активном крае. Однако для стабилизации («запоминания») направления поляризации, заданного извне, необходима работа внутриклеточной системы микротрубочек. Наши последние опыты показывают, что микротрубочки обеспечивают поляризацию и вытягивание клетки сами по себе, без участия системы актиновых микрофиламентов [5]. Эти сократимые пучки лишь ограничивают вытягивание, стимулируемое микротрубочками. Равновесие между зависимым от микротрубочек вытягиванием и зависимым от актомиозина сокращением определяет среднюю длину вытянутой клетки [1; 4]. К сожалению, мы еще плохо понимаем, как микротрубочки стабилизируют вытягивание. Возможно, на концах микротрубочек выделяется какой-то белок, стимулирующий полимеризацию актина и образование псевдоподий [6]. Это предположение требует проверки.

Еще менее понятны механизмы, определяющие форму эпителиоцита. Кое-что здесь дали наши эксперименты [5] с веществом ¥-27632 — ингибитором Шю-киназы, ферментом, повышающим активность легкой цепи миозина; в итоге У-27632 резко снижает сократимость актин-миозиновых структур и вызывает исчезновение пучков микрофиламентов. В частности, в опытах с эпителиоцитами этот ингибитор вызывал исчезновение кругового пучка, и концы микротрубочек из центральной части клетки устремлялись наружу,

к краям клетки, вызывая образование клеточных отростков и, в итоге, резкое вытягивание, поляризацию этой клетки. Таким образом, по-видимому, у эпителиоцита, как и у фибробласта, микротрубочки индуцируют вытягивание клетки, а сократимые актин-миозиновые структуры препятствуют этому вытягиванию, поддерживают неполяризованную форму клетки. Круговой пучок актина может даже физически препятствовать росту микротрубочек, но это не обязательное условие сохранения дисковидной формы эпителиоцитом: клетки некоторых эпителиальных линий сохраняют такую форму, хотя видимого пучка у них нет.

Все эти соображения не отвечают, однако, на главный вопрос: почему одни клетки имеют эпителиальную неполяризованную организацию, а другие — поляризованную, фиб-робластоподобную?

В чем различия микротрубочек у клеток этих типов? Что происходит с организацией клетки, когда клетки одного типа превращаются в клетки другого типа (так называемая эпите-лиомезенхимальная трансформация)? Кажется, мы уже на пороге решения этого вопроса, но сегодня он еще неясен.

Механизмы морфологической трансформации в канцерогенезе

Многостадийный канцерогенез включает целую серию генетических изменений соматических клеток, которые вызываются мутациями многих онкогенов и генов-супрессоров. Важной частью этой эволюции являются изменения, приводящие к морфологической трансформации — генетически обусловленной перестройке организации клеток. У культивируемых фибробластов эта трансформация выражается в уменьшении размеров активного края и связанной с ним ламеллы, уменьшении размеров и числа фокальных адгезий и уменьшении числа актиновых пучков.

У эпителиоцитов трансформация тоже выражается в уменьшении размеров активного края; в этом случае активным перестает быть весь периметр и клетка из дисковидной становится поляризованной, фибробластоподобной.

Какие процессы лежат в основе этих изменений формы? Здесь можно высказать лишь некоторые предположения. Морфометрические данные (М. А. Харитонова, личное сообщение) показывают, что средняя длина клетки при трансформации не снижается, иногда даже увеличивается, несмотря на уменьшение общей площади. Отсюда следует, что и эпителиоцит, и фибробласт при трансформации не теряют способности удлиняться, но их способность расширяться на субстрате латерально резко снижается.

Этот простой результат указывает на то, что при трансформации скорее меняются не микротрубочки, отвечающие за удлинение, но система активного края, ответственная за поляризацию и организацию актиновых структур, в том числе пучков актомиозина и фокальных адгезий. Проведенные нами измерения псевдоподиальной активности на краю клеток показали, что после трансформации, вызванной онкогеном Ras, тотальная активность в отсутствие микротрубочек снижается в 4 раза [3]. В присутствии микротрубочек такая трансформированная клетка поляризуется и ее активный край резко сужается.

Можно думать, что при трансформации клетка понижает способность формировать активный край, а следовательно

(см. первую часть статьи), и способность делать псевдоподии и фокальные адгезии, а также и способность этих адгезий организовывать актин-миозиновые пучки. Каков молекулярный механизм этих изменений? Здесь весьма вероятна роль малых ГТФаз группы Rho (CDC42, Rae и Rho), которые контролируют разные стороны динамики актомиозина.

При трансформациях, вызванных онкогеном Ras, активность этих белков меняется, но всегда ли эти изменения однозначны, мы пока не знаем. Неясно, какие именно изменения экспрессии генов группы Rho ответственны за морфологическую трансформацию.

Как мы уже упоминали, ингибирование Rho-киназы, одной из мишеней белка Rho, делает эпителиоциты поляризованными, уменьшает число и размеры фокальных адгезий, а также ведет к полному исчезновению актин-миозиновых пучков. Эти изменения очень похожи нате, которые наблюдаются при Ras-индуцированной трансформации тех же клеток. Значит ли это, что изменения Rho-киназы играют центральную роль при морфологической трансформации? В этом надо разбираться.

ЛИТЕРА ТУРА

Харитонова М. А., Левина Э. М., Ровенский Ю. А. Цитоскелетный контроль регуляции длины клеток// Онтогенез. — 2002. — Т. 33, №1. -С. 50-59.

2. Borisy G. G., Svitkina Т. М. Actin machinery: pushing the envelope // Cure. Opin. Cell Biol. - 2000, - Vol. 12. - P. 104-112.

3. Oloushankova N. A., Krendel M. F., Sirotkin V. A., Bonder E. М., FederH. H., Vasiliev J. М., Gelfand I. M. Dynamics of active lamellae in cultured epithelial cells: effects of expression of exogenous N-ras oncogene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995. — Vol. 92. —

P. 5322—5325.

4. Levina E. М., Kharitonova M. A., Rovensky Y. A., Vasiliev J. M. Cytoskeletal control of fibroblast length: experiments with linear strips of substrate //J. Cell Sci. — 2001. — Vol. 114. — P. 4335—4341.

5. Omelchenko Т., Vasiliev J. М., Gelfand I. М., FederH. H., Bonder E. M. Mechanisms of polarization of the shape of fibroblasts and epithelio-cytes: Separation of the roles of mierotubijles and Rho-dependent actin-myosin contractility// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2002. — Vol. 99. - P. 10 452-10 457.

6. Wittmann Т., Waterman-Storer С. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? // J. Cell Sci. — 2001. — Vol. 114. — P. 3795-3803.