Флуоресцентный анализатор биочипов

Полезная модель относится к медицинской технике, в частности к аналитическим приборам в медицине, а именно к устройству, предназначенному для регистрации изображений флуоресцентных биочипов при возбуждении флуоресценции на длинах волн 520 и 633 нм и последующего измерения интенсивности флуоресценции полученных изображений.
В настоящее время на рынке диагностических приборов представлены различные анализаторы биочипов, предлагаемые известными компаниями-производителями аналитических приборов для медицины, например, Innopsys, PerkinElmer, Roche, CapitalBio, Arrayit, Hewlett Packard и другими, в том числе компаниями из Российской Федерации.
Назначением выпускаемых анализаторов биочипов является проведение медицинских исследований, заключающихся в одновременной диагностике нескольких различных параметров (например, уровня концентрации белковых биомаркеров или определение присутствия определенных фрагментов ДНК в биоматериале: в сыворотке крови, буккальном эпителии, слюне, назофарингеальном мазке или других биологических субстанциях). Биочипы (биологические микрочипы) представляют собой биохимические структуры, размещенные на предметных стеклах для микроскопии, с помощью которых можно проводить анализ специфических взаимодействий биологических макромолекул нескольких видов одновременно [1].
При изготовлении биочипа с использованием роботизированных систем на твердую подложку в виде предметных стекол для микроскопии наносятся в матричном порядке массивы биологических молекул (антител, олигонуклеотидных зондов или других). При этом каждому виду и каждой концентрации биологических молекул соответствует область поверхности одинаковой площади и формы, которую называют спотом, размеры такой области находятся в диапазоне от 100 до 500 мкм (в зависимости от типа биочипа), а на поверхности подложки формируется задаваемая изготовителем структура их расположения - «субэррей» [2]. Взаимодействие исследуемого аналита с иммобилизованными на биочипе молекулами детектируется по интенсивности флуоресцентного сигнала, получаемого от спотов. В качестве флуорофоров для биочипов используют различные виды химических соединений, в данном случае, полиметиновые метки Cyanine 3 (Cy3) и Cyanine 5 (Cy5). В качестве объектов исследования (аналитов) разрабатываемого анализатора могут выступать белки (пептиды, антитела), молекулы ДНК или РНК, поли- и олигосахариды, и даже клетки животных или растений, специфически взаимодействующих с биологическими молекулами, матричным образом иммобилизованными на некой подложке [3].
По способу размещения пробы для исследования анализаторы биочипов, в основном, подразделяются на системы, которые используют предметные стекла для микроскопов и различные варианты планшетов с лунками (биочипы в формате иммунологического планшета).
Ключевым элементом флуоресцентного анализатора биочипов является фотоприемное устройство, которое регистрирует величину светового потока флуоресценции и определяет схему построения прибора. Как известно, в результате флуоресценции излучаются предельно малые световые потоки, поэтому для создания анализатора биочипов применяют следующие виды фотоприемников: фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), высокочувствительный линейный фотоприемник (CCD или CMOS) или высокочувствительный матричный CMOS. Существующие на рынке коммерческие анализаторы биочипов выпускаются как в виде лабораторного исполнения, так и в виде исполнения для больших клиник и лабораторных центров, которые дополнительно оснащают устройствами автоматической загрузки слайдов или планшетов. В качестве примеров реализации анализаторов биочипов можно привести следующие устройства: InnoScan 710 производства компании Innopsys (Франция), ScanArray Express производства компании PerkinElmer (США), SpotLight™ 2 производства компании Arrayit (США) и LuxScan 10K производства компании CapitalBio (Китай). В приборах InnoScan 710, ScanArray Express и LuxScan 10K используется технология сканирования биочипов с регистрацией флуоресценции с помощью ФЭУ. Приборы InnoScan 710 и ScanArray Express обеспечивают высокую чувствительность измерений, но минимальное время анализа составляет 3–5 минут, а цена 30-50 тыс. долларов. SpotLight™ 2, в котором регистрация флуоресценции осуществляется видеокамерой, имеет недостаточно высокую чувствительность и малую область регистрации.
Наиболее близким к заявляемому устройству является анализатор биочипов [4], содержащий держатель образца и осветитель для возбуждения флуоресценции. Данное устройство включает в себя лазерные источники возбуждения люминесцентного излучения и волоконно-оптическую систему распределения излучения лазеров, устройство регистрации изображения образца (CMOS-камеру), двухполосный блокирующий фильтр для получения флуресцентного изображения образца и оптическую систему для формирования флуоресцентного изображения образца в плоскости фотоприемника. Осветитель для возбуждения флуоресценции содержит кольцевую опору, в которой по ее окружности расположены концы волокон волоконно-оптической системы для равномерного распределения излучения лазеров, при этом волоконно-оптическая система включает в себя несколько жгутов оптических волокон, так что каждому лазеру соответствует один жгут волокон, причем каждый жгут со стороны, обращенной в сторону образца, когда он установлен в держатель, разделен на отдельные волокна, а концы волокон от разных лазеров расположены по окружности кольцевой опоры с чередованием и ориентированы в сторону анализируемого образца, когда он установлен в держатель, под острым углом к оси этой кольцевой опоры. Указанное устройство позволяет увеличить равномерность освещенности разных участков биочипа при его освещении различными лазерами за счет возможности освещения образца возбуждающим светом с разных сторон при использовании индивидуальных лазеров или любой комбинации лазеров. Данное техническое решение (патент RU2510959) принято за прототип.
Недостатком прототипа (патент RU2510959) является ограничение по размеру снимка, обусловленное размерами фоточувствительной области фотоприемника. Таким образом, в устройстве, принятом в качестве прототипа, размер поля в плоскости исследуемого объекта ограничен требованиями к разрешающей способности и количеством элементов разложения (пикселов) фотоприемника.
Техническая проблема заключается в необходимости разработки высокоэффективного и экономичного анализатора биочипов с расширенными функциональными возможностями.
Технический результат состоит в обеспечении возможности перемещения держателя образцов с установленным в него биочипом.
Технический результат достигается тем, что во флуоресцентном анализаторе биочипов, включающем корпус, на котором установлен держатель образца, осветитель с лазерными источниками возбуждения излучения, двухполосный блокирующий интерференционный фильтр, проекционный объектив, CMOS-камеру, согласно полезной модели, держатель образца установлен на подвижной площадке, обеспечивающей возможность перемещения образца относительно других элементов анализатора, таких как осветитель, объектив и CMOS-камера.
В предпочтительном варианте реализации полезной модели подвижная площадка оснащена электроприводом, а в наиболее предпочтительном варианте подвижная площадка представляет собой моторизированный транслятор с шагом 1 мм и разрешением на полном шаге 5 мкм.
Заявляемое устройство поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена схема анализатора.
Флуоресцентный анализатор биочипов включает корпус 1, в нижней части которого (внутри) расположена подвижная площадка 2. Подвижная площадка 2 предпочтительно оснащена электроприводом (не показан на чертеже) и представляет собой моторизированный транслятор с шагом 1 мм и разрешением на полном шаге 5 мкм. На подвижной площадке 2 расположен, с возможностью перемещения относительно других элементов анализатора (за счет подвижной площадки 2), держатель образцов 3. Также внутри корпуса 1 расположен осветитель 4 с лазерными источниками света для возбуждения флуоресцентного излучения. Вблизи осветителя 4 предпочтительно расположены дополнительные светодиоды подсветки 5. Внутри корпуса 1 выше осветителя 4 над держателем образцов 3 и, соответственно, над подвижной площадкой 2 установлен двухполосный интерференционный фильтр 6. Также внутри корпуса 1 над двухполосным интерференционным фильтром 6 расположен объектив 7, над которым расположена CMOS-камера 8 (КМОП). Подвижная площадка 2, осветитель 4, светодиоды подсветки 5, объектив 7 и CMOS-камера 8 соединены с помощью соответствующих кабелей и разъемами с внешним модулем управления (не показан на чертеже), как правило, с компьютером. Также возможно исполнение устройства портативным, с установкой всех органов управления и источника питания внутри корпуса 1. Конструкция устройства обеспечивает возможность сканирования всей площади биочипа, расположенного на держателе образцов 3, за счет его перемещения на подвижной площадке 2 в линейном направлении.
При использовании вышеприведенной конструкции дополнительные светодиоды 5 позволяют получать изображения колориметрических биочипов, не производя механического перемещения двухполосного интерференционного фильтра 6, а также проводить считывание двухмерных баркодов, не производя механического перемещения двухполосного интерференционного фильтра 6.
Заявляемое устройство работает следующим образом.
Анализатор включают через подключенный к нему компьютер или аналогичный интерфейс управления. Флуоресцентный биочип помещают на держатель образцов 3, закрепленный на подвижной площадке 2. Затем включается осветитель 4 с лазерными источниками возбуждения флуоресцентного излучения, или дополнительные светодиоды подсветки 5 белого света, применяемые для получения колориметрических изображений биочипов, и проводится быстрое сканирование всего предметного стекла (биочипа). Далее необходимая область биочипа помещается в поле зрения матричной CMOS-камеры 8. После этого включаются лазерные источники излучения (осветитель) 4, возбуждающие флуоресценцию, и регулируется их мощность. После выполненных действий, возбуждающее флуоресценцию излучение падает на исследуемую область биочипа, расположенную непосредственно под объективом 7 фотоприемника, в соответствии со схемой, представленной на фиг. 1. Оптическая система из CMOS-камеры 8 и объектива 7 позволяет захватить в поле зрения 4 «субэррея» (зону 25×25 мм), и при этом возбуждающее флуоресценцию излучение, отраженное от поверхности биочипа, не попадает на матрицу фотоприемного устройства (CMOS-камеры) в результате блокирования фильтром 6.
Далее устанавливают параметры CMOS-камеры 8, необходимые для регистрации изображения, такие как время экспозиции видеокамеры (чем больше величина времени накопления используется, тем более слабые интенсивности флуоресценции становится возможным зарегистрировать) и коэффициент усиления видеокамеры (также позволяет регистрировать малые значения интенсивности флуоресценции, однако в отличие от использования большого времени выдержки добавляется шум, создаваемый самой видеокамерой). Помимо этого, для улучшения соотношения сигнал/шум используются методы статистической обработки изображений, в частности, функции «суммирования и усреднения регистрируемого изображения» - при этом полезный сигнал остается неизменным, а уровень флуктуирующего шума понижается; «нормировка на неоднородность освещения» необходима для устранения влияния возможных неоднородностей распределения энергии излучения лазерных диодных модулей (осветителя) 4 при съемке изображения; «вычитание темнового тока» - для исключения влияния геометрического шума CMOS-камеры 8. Выбранные настройки могут быть сохранены в виде предустановок для удобства постоянного использования.
После вышеперечисленных действий начинается процесс сканирования биочипа. В том случае, если необходимо получить изображения конкретного участка биочипа, производится регистрация данной области и полученное изображение проходит дальнейшую обработку в ПО для анализа интегральной интенсивности излучения флуоресценции спотов. Для получения изображения всего флуоресцентного биочипа производится процесс механического сканирования, при котором последовательно регистрируется несколько отдельных кадров (в используемой оптической системе от 4 до 8 в зависимости от количества пар исследуемых «субэрреев»), и далее ПО создает цельное изображение из полученных кадров путем их сшивки, которое в дальнейшем анализируется для получения результатов обработки и расчета интенсивности. Это обеспечивается за счет перемещения держателя образцов 3 на подвижной подложке 2. В предпочтительном варианте полезной модели для этого используют электропривод моторизированного транслятора, а именно привод плавно перемещает площадку с держателем образцов 3 от одной позиции регистрации изображения к другой в линейном направлении, обеспечивающем полное сканирование биочипа, расположенного на держателе образцов 3. Сшивка фрагментов изображения биочипа производится с точностью до долей пикселя, а значение интенсивности флуоресценции в зоне сшивки интерполируется математическими процедурами, содержащимися в ПО.
По результатам анализа полученного изображения флуоресцирующего биочипа, исходя из принципа соответствия концентрации биомолекул в аналите значению уровня флуоресценции (среднему значению интенсивности излучения пикселов в споте), рассчитываются данные о содержании меченных флуорофором биомолекул аналита в пробе, а также отображаются графики зависимости интенсивности флуоресценции спотов от концентрации содержания меченных флуорофором биомолекул.
Дополнительно в разработанном флуоресцентном анализаторе была реализована функция распознавания штрих-кода (баркода) сканируемого биочипа. В частности, при наличии двухмерного кода на образце происходит его автоматическое декодирование, в ходе которого выключается возбуждающее флуоресценцию излучение, включаются светодиоды подсветки 5, область с двухмерным кодом располагается в поле зрения CMOS-камеры 8 и производится считывание занесенной туда информации.
Заявляемое устройство поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Было проведено экспериментальное исследование эффективности работы флуоресцентного анализатора биочипов. Для этого был собран образец заявляемого устройства без моторизованного транслятора. На держатель образца был установлен лабораторный макет биочипа, состоящий из 16-ти идентичных субэрреев, каждый из которых содержал флуоресцирующие элементы (споты), представляющие собой ковалентно закрепленные на поверхности антитела, меченные молекулами Cy3 и Cy5, детектируемые анализатором. Каждый из субэрреев имел размерность 4×8 спотов (4 строки по 8 спотов в каждой). В первой и третьей строке были нанесены антитела, меченные Cy3, во второй и четвертой – меченные Cy5. Был проведен этап подготовки и сканирования биочипа согласно вышеописанной методике. При этом в ходе сканирования было сделано 5 снимков (25×25 мм), которые в дальнейшем при обработке были объединены в одно изображение, представляющее собой полноразмерный флуоресцентный снимок биочипа. Время сканирования всего биочипа с разрешением, позволяющим получить полноразмерное изображение поверхности биочипа, составило 110 с. Результат сканирования позволял проводить дальнейший корректный количественный анализ интенсивности регистрируемой флуоресценции спотов (определять относительные значения флуоресценции).
Пример 2.
В соответствии с Примером 1 было проведено дополнительное экспериментальное исследование эффективности работы флуоресцентного анализатора биочипов. Для этого, как и в примере 1, был собран образец заявляемого устройства, конструкционно отличающегося от указанного в Примере 1 наличием моторизованного транслятора. На держатель образца был также установлен флуоресцентный биочип, идентичный используемому в Примере 1. Дальнейшие этапы подготовки и сканирования биочипа были проведены согласно вышеописанной методике. Аналогичным образом в ходе сканирования было сделано 5 снимков (25×25 мм), которые в дальнейшем при обработке были объединены в единое изображение. Время сканирования при этом составило 75 с. Рассчитанные затем регистрируемые сигналы интенсивности флуоресценции достоверно не отличались от сигналов, рассчитанных в Примере 1.
Конструкционные изменения, обусловленные установкой электропривода, обеспечивают сокращение времени сканирования биочипа размерностью 25×75 мм (в полноразмерном режиме в целом на 35 с, что существенно позволяет повысить производительность анализатора).
Список литературы
1. Мирзабеков, А.Д. Применение матричных биочипов с иммобилизованной ДНК в биологии и медицине / А.Д. Мирзабеков, Д.В. Прокопенко, В.Р. Чечеткин // Информационные медико-биологические технологии. - 2002. - М.: ГЭОТАР-МЕД.
2. Маркелов, М.Л. Технологии микрочипов - новые возможности в диагностике болезней человека / М.Л. Маркелов, Г.А. Шипулин, В.И. Покровский // Терапевтический архив. - 2008. - №4. - С. 79-85.
3. Nakaya, H.I. Concepts on microarray design for genome and transcriptome analyses / H.I. Nakaya, E.M. Reis, S. Verjovski-Almeida // Nucleic Acids Hybridization Modern Applications. - 2007.
4. Устройство для анализа люминесцирующих биологических микрочипов: патент RU2510959, Российская Федерация, заявка RU2011127411, заявл. 03.02.2010, опубл. 10.04.2014.