ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ДЛЯ BCMA И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR BCMA AND THEIR USE

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент США с порядковым № 62/684628, поданной 13 июня 2018 года, и заявке на патент США с порядковым № 62/832991, поданной 12 апреля 2019 года, при этом содержание каждой из них включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 11 июня 2019 года, имеет название N2067-7155WO_SL.txt и размер 228604 байтов.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
В целом настоящее изобретение относится к применению иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), сконструированных с возможностью экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), для лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией белка, представляющего собой антиген созревания В-клеток (BCMA).
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антиген созревания В-клеток (BCMA) является представителем семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR), который экспрессируется на клетках линии B-клеток дифференцировки. Уровень экспрессии BCMA является наиболее высоким на поверхности терминально дифференцированных B-клеток. BCMA вовлечен в опосредование выживания плазматических клеток для поддержания долгосрочного гуморального иммунитета. Недавно было показано, что экспрессия BCMA связана с рядом видов рака, аутоиммунных нарушений и инфекционных заболеваний. Виды рака с повышенной экспрессией BCMA включают некоторые виды гематологического рака, такие как множественная миелома, лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома, различные виды лейкоза и глиобластому.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA, например, человеческий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен.
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен выделенный CAR, где CAR содержит домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA, например, человеческий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA), содержит одну или несколько (например, все три) определяющих комплементарность областей 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющих комплементарность областей 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющих комплементарность областей 3 тяжелой цепи (CDR3 HC) домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе, и/или одну или несколько (например, все три) определяющих комплементарность областей 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющих комплементарность областей 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющих комплементарность областей 3 легкой цепи (CDR3 LC) домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи, описанную в данном документе (например, в таблицах 2, 6 или 10), и/или вариабельную область легкой цепи, описанную в данном документе (например, в таблицах 2, 6 или 10). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности из таблиц 2, 6 или 10. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит scFv, описанный в данном документе (например, в таблицах 2, 6 или 10). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит последовательность CAR, раскрытую в данном документе (например, в таблицах 2, 6 или 10).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любой аминокислотной последовательности домена тяжелой цепи, связывающего BCMA, из перечисленных в таблицах 2-13 (или последовательности, характеризующуйся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательности, имеющей по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любой аминокислотной последовательности домена легкой цепи, связывающего BCMA, из перечисленных в таблицах 2-13 (или последовательности, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательности, имеющей по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC представляют собой последовательности CDR HC, перечисленные в таблицах 3-5 (например, в одной строке таблиц 3-5) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC представляют собой последовательности CDR LC, перечисленные в таблицах 3-5 (например, в одной строке таблиц 3-5) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45 и 84 соответственно (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 44, 45 и 46 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 44, 45 и 68 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 44, 45 и 76 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54, 55 и 56 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55 и 56 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52, 70 или 78 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VH, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 53, 71 или 79 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VL, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VL, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 62 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 52 и 61 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), (ii) SEQ ID NO: 70 и 61 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) или (iii) SEQ ID NO: 78 и 61 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 64, 72 или 80 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую scFv, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 65, 73 или 81 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66, 74 или 82 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 67, 75 или 83 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC представляют собой последовательности CDR HC, перечисленные в таблицах 7-9 (например, в одной строке таблиц 7-9) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC представляют собой последовательности CDR LC, перечисленные в таблицах 7-9 (например, в одной строке таблиц 7-9), (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 130 и 88 соответственно (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 86, 109 и 88 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 86, 109 и 88 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 95, 131 и 132 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 95, 96 и 97 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 95, 114 и 115 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 95, 114 и 97 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 86, 109, 88, 95, 114 и 115 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 86, 109, 88, 95, 114 и 97 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 93 или 112, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VH, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 260, 94 или 113 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 102, 118 или 124 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VL, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VL, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 261, 103, 119 или 125 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), (ii) SEQ ID NO: 112 и 118 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) или (iii) SEQ ID NO: 112 и 124 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105, 120 или 126, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую scFv, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 253, 106, 121 или 127 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 107, 122 или 128, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 259, 108, 123 или 129 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 258 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC представляют собой последовательности CDR HC, перечисленные в таблицах 11-13 (например, в одной строке таблиц 11-13) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC представляют собой последовательности CDR LC, перечисленные в таблицах 11-13 (например, в одной строке таблиц 11-13) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 179, 180 и 181 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 137, 138 и 139 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (ii) SEQ ID NO: 160, 161 и 162 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 147, 182 и 183 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 147, 148 и 149 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (ii) SEQ ID NO: 147, 170 и 171 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 137, 138, 139, 147, 148 и 149 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (ii) SEQ ID NO: 160, 161, 162, 147, 170 и 171 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 145 или 168, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VH, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 146 или 169 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 154 или 173, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VL, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VL, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 155 или 174 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 145 и 154 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) или (ii) SEQ ID NO: 168 и 173 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 156 или 175, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую scFv, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 157 или 176 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 158 или 177, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 159 или 178 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL соединены линкером, например, линкером, описанным в данном документе, где необязательно линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63 или 104, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен предусматривает трансмембранный домен белка, выбранного из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, соединен с трансмембранным доменом с помощью шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, 3 или 4, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую шарнирную область, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13, 14 или 15 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен и шарнирная область содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 202 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен и шарнирную область кодирует последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 254 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующаяся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен предусматривает первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе, где необязательно первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета, TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12 или CD66d. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первичный сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 20 или 21 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первичный сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 256 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен, описанный в данном документе, где необязательно костимулирующий сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен, полученный из молекулы MHC I класса, белка рецептора TNF, иммуноглобулиноподобного белка, рецептора цитокина, интегрина, сигнальной молекулы активации лимфоцитов (белка SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB (CD137), B7-H3, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB или лиганда, который специфично связывается с CD83. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую костимулирующий сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую костимулирующий сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 255 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен, полученный из 4-1BB, и функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета, где необязательно внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен)) и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен)), где необязательно внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10.
В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, предусматривающую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления CAR обладает одним или несколькими (например, 1, 2 или всеми) из следующих свойств: (i) CAR при экспрессии в клетке (например, T-клетке) активирует передачу сигнала с помощью NFAT в клетке в присутствии клеток, экспрессирующих BCMA, например, как измерено с помощью скринингового репортерного анализа с использованием клеток JNL, описанного в примере 1, например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1, со ссылкой на фиг. 1А или 1С; (ii) CAR при экспрессии в клетке (например, Т-клетке) индуцирует цитотоксичность клеток, экспрессирующих ВСМА, например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 со ссылкой на фиг. 3А; и (iii) CAR, при экспрессии в клетке (например, Т-клетке), индуцирует экспрессию цитокина (например, IFN-γ) в клетке в присутствии клеток, экспрессирующих BCMA, например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 со ссылкой на фиг. 3С.
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен домен, связывающий BCMA, содержащий, вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности CDR, раскрытые в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC представляют собой последовательности CDR HC, перечисленные в таблицах 3-5 (например, в одной строке таблиц 3-5) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC представляют собой последовательности CDR LC, перечисленные в таблицах 3-5 (например, в одной строке таблиц 3-5) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45 и 84 соответственно (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 44, 45 и 46 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 44, 45 и 68 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 44, 45 и 76 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 54, 55 и 56 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55 и 56 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52, 70 или 78 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VH, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 53, 71 или 79, или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VL, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VL, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 62 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 52 и 61 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), (ii) SEQ ID NO: 70 и 61 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) или (iii) SEQ ID NO: 78 и 61 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC представляют собой последовательности CDR HC, перечисленные в таблицах 7-9 (например, в одной строке таблиц 7-9) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC представляют собой последовательности CDR LC, перечисленные в таблицах 7-9 (например, в одной строке таблиц 7-9), (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 130 и 88 соответственно (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 86, 109 и 88 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 86, 109 и 88 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 95, 131 и 132 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 95, 96 и 97 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 95, 114 и 115 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 95, 114 и 97 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); (ii) SEQ ID NO: 86, 109, 88, 95, 114 и 115 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (iii) SEQ ID NO: 86, 109, 88, 95, 114 и 97 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 93 или 112, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VH, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 260, 94 или 113 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 102, 118 или 124 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VL, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VL, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 261, 103, 119 или 125 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), (ii) SEQ ID NO: 112 и 118 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) или (iii) SEQ ID NO: 112 и 124 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC представляют собой последовательности CDR HC, перечисленные в таблицах 11-13 (например, в одной строке таблиц 11-13) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC представляют собой последовательности CDR LC, перечисленные в таблицах 11-13 (например, в одной строке таблиц 11-13) (или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен)).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 179, 180 и 181 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 137, 138 и 139 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (ii) SEQ ID NO: 160, 161 и 162 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 147, 182 и 183 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 147, 148 и 149 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (ii) SEQ ID NO: 147, 170 и 171 соответственно, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 137, 138, 139, 147, 148 и 149 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен); или (ii) SEQ ID NO: 160, 161, 162, 147, 170 и 171 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более семи, шести или пяти модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 145 или 168, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VH, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 146 или 169 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 154 или 173, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VL, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую VL, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 155 или 174 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 145 и 154 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) или (ii) SEQ ID NO: 168 и 173 соответственно, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен).
В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена выделенная полипептидная молекула, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор выбран из ДНК-вектора, РНК-вектора, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит промотор EF-1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена клетка (например, a T-клетка или NK-клетка), содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе, CAR, описанный в данном документе, молекулу полипептида, описанную в данном документе, или вектор, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно экспрессирует ингибирующее средство, которое содержит первый полипептид, содержащий по меньшей мере часть ингибирующей молекулы, ассоциированной со вторым полипептидом, который содержит положительный сигнал от внутриклеточного сигнального домена, где необязательно ингибирующее средство содержит первый полипептид, содержащий по меньшей мере часть PD-1, и второй полипептид, содержащий костимулирующий домен, и первичный сигнальный домен.
В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ получения клетки, включающий трансдуцирование клетки (например, T-клетки или NK-клетки) вектором, описанным в данном документе. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ получения РНК-сконструированной клетки, включающий введение in vitro транскрибируемой РНК или синтетической РНК в клетку (например, T-клетку или NK-клетку), где РНК содержит молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, описанную в данном документе.
В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества клетки, описанной в данном документе. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включающий введение субъекту эффективного количества клетки, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой аутологичную Т-клетку или аллогенную Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, представляет собой (i) рак, или злокачественное новообразование, или предраковое состояние, выбранное из одного или нескольких из миелодисплазии, миелодиспластического синдрома или предлейкоза, или (ii) не связанное с раком показание, ассоциированное с экспрессией BCMA. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой гематологический рак или солидный рак. В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из острого лейкоза, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза ("BALL"), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза ("TALL"), острого лимфоидного лейкоза (ALL), хронического миелогенного лейкоза (CML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, бластной плазмоцитоидной дендритноклеточной неоплазии, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, плазмоцитоидной дендритноклеточной неоплазии, макроглобулинемии Вальденстрема, рака предстательной железы (например, кастрационнорезистентного или резистентного к терапии рака предстательной железы или метастатического рака предстательной железы), рака поджелудочной железы, рака легкого, нарушения пролиферации плазматических клеток (например, бессимптомной миеломы ("тлеющей" множественной миеломы или вялотекущей миеломы), моноклональной гаммапатии неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемии Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточной дискразии, солитарной миеломы, солитарной плазмоцитомы, экстрамедуллярной плазмоцитомы и множественной плазмоцитомы), системного амилоидоза в форме амилоидоза легких цепей или POEMS-синдрома (также известного как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром)) или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту второго терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор PD-1, где необязательно ингибитор PD-1 выбран из группы, состоящей из PDR001, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MEDI0680, REGN2810, TSR-042, PF-06801591 и AMP-224. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор PD-L1, где необязательно ингибитор PD-L1 выбран из группы, состоящей из FAZ053, атезолизумаба, авелумаба, дурвалумаба и BMS-936559. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор LAG-3, где необязательно ингибитор LAG-3 выбран из группы, состоящей из LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK-4280 и REGN3767. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор TIM-3, где необязательно ингибитор TIM-3 выбран из группы, состоящей из MBG453, TSR-022 и LY3321367. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор CTLA-4, где необязательно ингибитор CTLA-4 представляет собой ипилимумаб или тремелимумаб. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой полипептид интерлейкина-15 (IL-15), полипептид альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой полипептид интерлейкина-12 (IL-12). В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор mTOR, где необязательно ингибитор mTOR представляет собой RAD001 или рапамицин.
Домены, связывающие BCMA, раскрытые в данном документе, а также CAR, содержащие такие домены, связывающие BCMA, обладают улучшенными свойствами по сравнению с предыдущими доменами, связывающими BCMA, и CAR, содержащие их, например, увеличенной аффинностью связывания с BCMA, увеличенными уровнями экспрессии CAR в клетках (например, T-клетках или NK-клетках) и/или повышенной способностью опосредовать цитотоксичность и/или продуцирование цитокинов клетками (например, Т-клетками или NK-клетками).
Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту обычной квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже описываются подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие литературные источники, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предполагаются как ограничивающие. Заголовки, подзаголовки или пронумерованные или обозначенные буквами элементы, например, (a), (b), (i) и т. д., представлены исключительно для удобства прочтения. Использование заголовков или пронумерованных или обозначенных буквами элементов в данном документе не требует того, чтобы стадии или элементы проводились в алфавитном порядке, или того, чтобы стадии или элементы обязательно были отделены друг от друга. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1A-1H
. Анализ репортерного гена люциферазы Jurkat NFAT Luciferase (JNL) с помощью автоматической системы применяли для тестирования функции CAR для BCMA. Клоны CAR оценивали в анализе репортерного гена JNL в отношении антиген-зависимой активности. Клетки JNL, содержащие указанные клоны CAR, или нетрансдуцированные клетки JNL (UTD) совместно культивировали только со средой (фиг. 1G и 1H) или с линиями клеток-мишеней (KMS11 в качестве BCMA-положительной линии клеток (фиг. 1A и 1C) и NALM6 в качестве BCMA-отрицательной линии клеток (фиг. 1E и 1F)) при различных соотношениях, и активность люциферазы измеряли в виде интенсивности люминесценции. Клоны считались активными, когда интенсивность люминесценции в 2 раза превышала уровень клеток UTD в присутствии антиген-экспрессирующих клеток. Считывание люминесценции является прямым измерением стимуляции CAR. Фиг. 1B и 1D представляют собой графики, показывающие уровень экспрессии CAR ВСМА на клетках JNL, обнаруженный с помощью проточной цитометрии с использованием рекомбинантного (r)BCMA_Fc-AF647 человека. Платформа 1x или 2x указывала на 40000 клеток H293 или 80000 клеток H293, высеянных для продуцирования вируса.
Фиг. 2
. Уровень экспрессии CAR для BCMA на первичных Т-клетках человека. Клетки окрашивали реагентом rBCMA_Fc-AF647 человека и анализировали с помощью проточной цитометрии. Процентное количество CAR+ клеток и MFI показаны на графике для дня 5 и дня 9 культивирования клеток. Данные обобщены в таблице 17, которая включает титр вируса, достигнутый для соответствующих CAR.
Фиг. 3A-3C
. Способность Т-клеток, экспрессирующих указанные CAR, опосредовать лизис клеток и продуцирование цитокинов оценивали по отношению к линии клеток-мишеней KMS11, экспрессирующих люциферазу светлячков (KMS11-luc). Фиг. 3A: CAR-T-клетки совместно культивировали с клетками-мишенями KMS11-luc при указанных соотношениях E:T. % гибели клеток определяли по разнице в сигнале люциферазы между клетками-мишенями без эффекторных Т-клеток (контроль) и с эффекторными Т-клетками (экспериментальными), выраженной в виде процентной доли от контроля. UTD представляет собой нетрансдуцированные Т-клетки. Фиг. 3B: Фоновый уровень уничтожения наблюдали для BCMA-отрицательной линии NALM6. Фиг. 3C: IFNγ измеряли с помощью MSD в надосадочных жидкостях, собранных через 24 часа из этих систем совместного культивирования с соотношением Е:Т 2,5. Все данные выражены в виде среднего значения +/- стандартное отклонение.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Определения
Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту обычной квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Форма единственного числа относится к одному или нескольким (т. e. по меньшей мере одному) грамматическим объектам настоящей заявки. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или несколько элементов.
Подразумевается, что термин "приблизительно" в отношении измеряемой величины, такой как количество, временной промежуток и т. п., охватывает вариации на ± 20%, или в некоторых случаях на ± 10%, или в некоторых случаях на ± 5%, или в некоторых случаях на ± 1%, или в некоторых случаях на ± 0,1% от указанного значения, поскольку такие вариации являются допустимыми для осуществления раскрытых способов.
Композиции и способы по настоящему изобретению охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности или последовательности, практически идентичные или сходные с ними, например,последовательности, идентичные на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше указанной последовательности. В контексте аминокислотной последовательности термин "практически идентичная" используется в данном документе для обозначения первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество аминокислотных остатков, которые i) идентичны аминокислотным остаткам во второй аминокислотной последовательности после их выравнивания или ii) являются их консервативными заменами, вследствие чего первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или характеризоваться общей функциональной активностью, например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, характеризуются по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например,последовательностью, представленной в данном документе.
В контексте нуклеотидной последовательности термин "практически идентичная" используется в данном документе для обозначения первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, которые идентичны нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты после их выравнивания, вследствие чего первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, характеризующийся общей функциональной активностью, или кодируют полипептидный домен с общей структурой или полипептид с общей функциональной активностью, например, нуклеотидные последовательности, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например,последовательностью, представленной в данном документе.
Термин "вариант" относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с эталонной аминокислотной последовательностью или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой функциональный вариант.
Термин "функциональный вариант" относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с эталонной аминокислотной последовательностью или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью и способен проявлять один или несколько видов активности эталонной аминокислотной последовательности.
Используемый в данном документе термин "ВСМА" относится к антигену созревания В-клеток. BCMA (также известный как TNFRSF17, BCM или CD269) является представителем семейства рецепторов некроза опухоли (TNFR) и преимущественно экспрессируется на терминально дифференцированных B-клетках, например, B-клетках памяти и плазматических клетках. Его лиганд называют активатором B-клеток из семейства TNF (BAFF) и лигандом A, индуцирующим пролиферацию (APRIL). BCMA вовлечен в опосредование выживания плазматических клеток для поддержания долгосрочного гуморального иммунитета. Ген BCMA кодируется в хромосоме 16, продуцируя первичный мРНК-транскрипт длиной 994 нуклеотида (№ доступа в NCBI NM_001192.2), который кодирует белок из 184 аминокислот (NP_001183.2). Был описан второй антисмысловой транскрипт, происходящий из локуса BCMA, который может играть роль в регуляции экспрессии BCMA. (Laabi Y. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154). Были описаны дополнительные варианты транскрипта с неясной значимостью (Smirnova AS et al. Mol Immunol., 2008, 45(4):1179-1183). Была идентифицирована вторая изоформа, также известная как TV4 (идентификатор UniProt Q02223-2). Как используется в данном документе, "BCMA" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного BCMA дикого типа.
Термин "химерный антигенный рецептор" или, в качестве альтернативы, "CAR" относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, содержащей по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном документе "внутриклеточным сигнальным доменом"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR находятся в одной и той же полипептидной цепи, например, образуют химерный слитый белок. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях, например, как представлено в RCAR, описанном в данном документе.
В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-дзета). В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, полученных из по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, определенной ниже. В одном аспекте костимулирующая молекула выбрана из 41BB (т. е., CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR содержит необязательную лидерную последовательность на амино-конце (N-конце) слитого белка CAR. В одном аспекте CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антигенраспознающего домена, где лидерная последовательность необязательно отщепляется от антигенраспознающего домена (например, scFv) в ходе клеточного процессинга и локализации CAR в клеточной мембране.
CAR, содержащий антигенсвязывающий домен (например, scFv, однодоменное антитело или TCR (например, связывающий домен альфа-цепи TCR или связывающий домен бета-цепи TCR)), который нацеливается на конкретный опухолевый маркер X, где X может быть опухолевым маркером, описанным в данном документе, также называется XCAR. Например, CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на BCMA, называется CAR для BCMA. CAR может экспрессироваться в любой клетке, например, иммунной эффекторной клетке, описанной в данном документе (например, T-клетке или NK-клетке).
Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, которая действует путем передачи информации внутри клетки для регуляции клеточной активности посредством определенных сигнальных путей, образуя вторичные мессенджеры или функционируя в качестве эффекторов путем ответа на такие мессенджеры.
Используемый в данном документе термин "антитело" относится к последовательности белка или полипептида, полученной из молекулы иммуноглобулина, который специфично связывается с антигеном. Антитела могут являться поликлональными или моноклональными, многоцепочечными или одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами и могут быть получены из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут являться тетрамерными молекулами иммуноглобулинов.
Термин "фрагмент антитела" относится к по меньшей мере одной части интактного антитела или его рекомбинантных вариантов и относится к антигенсвязывающему домену, например, антигенраспознающей вариабельной области интактного антитела, достаточной для обеспечения распознавания и специфичного связывания фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают без ограничения Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, scFv-фрагменты антител, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (VL или VH), VHH-домены верблюдовых и полиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, такие как бивалентный фрагмент, содержащий два или более, например, два, Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области, или две или более, например, две, выделенные CDR или другие связанные эпитопсвязывающие фрагменты антитела. Фрагмент антитела также может быть включен в состав однодоменных антител, максиантител, миниантител, наноантител, внутриклеточных антител, диател, триател, тетрател, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Фрагменты антитела также могут быть привиты на остовы на основе полипептидов, таких как фибронектин III типа (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны миниантитела на основе полипептида фибронектина).
Термин "scFv" относится к слитому белку, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепи связаны друг с другом посредством короткого гибкого полипептидного линкера и способны экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида, и где scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он получен. Если не указано иное, то scFv, как используется в данном документе, может иметь вариабельные VL- и VH-области в любом порядке, например, по отношению к N-концу и С-концу полипептида scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL.
Термины "область, определяющая комплементарность" или "CDR", используемые в данном документе, относятся к последовательностям из аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Например, как правило, три CDR находятся в каждой вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3), и три CDR находятся в каждой вариабельной области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности указанной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда широко известных схем, в том числе описанных Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации "по Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации "по Chothia") или их комбинации. Согласно комбинированной схеме нумерации по Kabat и Chothia в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR по Kabat, CDR по Chothia или как тех, так и других.
Часть композиции на основе CAR по настоящему изобретению, содержащая антитело или фрагмент этого антитела, может существовать в различных формах, например, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется в виде части полипептидной цепи, в том числе, например, в виде фрагмента однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечного антитела (scFv) или, например, гуманизированного антитела (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен в композиции на основе CAR по настоящему изобретению включает в себя фрагмент антитела. В дополнительном аспекте CAR содержит фрагмент антитела, который включает в себя scFv.
Используемый в данном документе термин "связывающий домен" или "молекула антитела" (также называемый в данном документе связывающим доменом для мишени) относится к белку, например, к цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере последовательность одного вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "связывающий домен" или "молекула антитела" охватывает антитела и фрагменты антител. В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического антитела, например, она содержит множество последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом.
Термин "тяжелая цепь антитела" относится к большей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях, которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.
Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие каппа- (κ-) и лямбда- (λ-) цепи относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.
Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, создаваемому с применением технологии рекомбинантных ДНК, такому как, например, антитело, экспрессируемое в бактериофаговой или дрожжевой системе экспрессии. Термин также следует истолковывать как означающий антитело, которое было создано в результате синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, при этом данная молекула ДНК экспрессирует белковое антитело или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где последовательность ДНК или аминокислотная последовательность были получены с применением технологии рекомбинантных ДНК или аминокислотных последовательностей, доступной и широко известной в данной области техники.
Термин "антиген" или "Ag" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Такой иммунный ответ может предусматривать продуцирование антител либо активацию специфических иммунокомпетентных клеток или как то, так и другое. Специалисту в данной области будет понятно, что любая макромолекула, в том числе практически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Кроме того, антигены могут быть получены из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалисту в данной области будет понятно, что любая ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вызывает иммунный ответ, тем самым кодирует "антиген", как этот термин используется в данном документе. Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что антиген не должен кодироваться исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Очевидно, что настоящее изобретение включает без ограничения применение частичных нуклеотидных последовательностей более одного гена, и что эти нуклеотидные последовательности составлены в различных комбинациях для того, чтобы кодировать полипептиды, которые вызывают требуемый иммунный ответ. Более того, специалисту в данной области будет понятно, что антиген вообще не обязательно должен кодироваться "геном". Очевидно, что антиген может быть образован в результате синтеза, или может быть получен из биологического образца, или может представлять собой макромолекулу, отличную от полипептида. Такой биологический образец может включать без ограничения образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами.
Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, в том числе без ограничения, например, в виде уменьшения объема опухоли, уменьшения количества опухолевых клеток, уменьшения количества метастазов, увеличения ожидаемой продолжительности жизни, уменьшения пролиферации опухолевых клеток, уменьшения выживаемости опухолевых клеток или ослабления различных физиологических симптомов, ассоциированных с раковым состоянием. "Противоопухолевый эффект" также может проявляться в виде способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по настоящему изобретению в первую очередь предупреждать появление опухоли.
Термин "противораковый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, в том числе без ограничения, например, в виде уменьшения объема опухоли, уменьшения количества раковых клеток, уменьшения количества метастазов, увеличения ожидаемой продолжительности жизни, уменьшения пролиферации раковых клеток, уменьшения выживаемости раковых клеток или ослабления различных физиологических симптомов, ассоциированных с раковым состоянием. "Противораковый эффект" также может проявляться в виде способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител в первую очередь предупреждать появление рака. Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, в том числе без ограничения, например, в виде уменьшения объема опухоли, уменьшения количества опухолевых клеток, уменьшения пролиферации опухолевых клеток или уменьшения выживаемости опухолевых клеток. Термин "аутологичный" относится к любому материалу, полученному от того же индивидуума, которому он позднее должен быть повторно введен.
Термин "аллогенный" относится к любому материалу, полученному от другого животного того же вида, что и индивидуум, которому данный материал вводят. Говорят, что два или более индивидуума являются аллогенными по отношению друг к другу, если их гены в одном или нескольких локусах не являются идентичными. В некоторых аспектах аллогенные материалы от индивидуумов одного и того же вида могут быть достаточно непохожими генетически, чтобы происходило их антигенное взаимодействие.
Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.
Термин "аферез", используемый в данном документе, относится к признанному в данной области экстракорпоральному способу, при котором кровь донора или пациента отбирают у донора или пациента и пропускают через аппарат, который разделяет выбранные определенные составляющие компоненты, а остальную часть возвращают в кровоток донору или пациенту, например, посредством ретрансфузии. Таким образом, в контексте "образца, полученного путем афереза" подразумевают образец, полученный с использованием афереза.
Термин "рак" относится к заболеванию, которое характеризуется быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных видов рака описаны в данном документе и включают без ограничения рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легкого и т. п. Предпочтительные виды рака, лечение которых осуществляют с помощью способов, описанных в данном документе, включают множественную миелому, лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
Термины "опухоль" и "рак" используются в данном документе взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные опухоли и опухоли жидких тканей, например, диффузные или циркулирующие. Используемый в данном документе термин "рак" или "опухоль" включает предзлокачественные, а также злокачественные виды рака и опухоли.
Используемый в данном документе термин "полученный из" указывает на взаимосвязь между первой и второй молекулами. Это обычно относится к структурному сходству между первой молекулой и второй молекулой и не имеет дополнительного значения или не включает ограничение способа или источника в отношении первой молекулы, которая получена из второй молекулы. Например, в случае с внутриклеточным сигнальным доменом, который получен из молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет структуру CD3-дзета в достаточной мере для того, чтобы характеризоваться необходимой функцией, а именно способностью образовывать сигнал в подходящих условиях. Это не имеет дополнительного значения или не включает ограничение в отношении конкретного способа получения внутриклеточного сигнального домена, например, это не означает, что для обеспечения наличия внутриклеточного сигнального домена нужно начинать с последовательности CD3-дзета и удалять нежелательную последовательность или вводить мутации для получения внутриклеточного сигнального домена.
Фраза "заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA" охватывает без ограничения заболевание, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA), или состояние, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA), в том числе, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественное новообразование, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или показание, не связанное с раком, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA). Во избежание неоднозначности, заболевание, ассоциированное с экспрессией ВСМА, может включать состояние, ассоциированное с клеткой, которая в настоящее время не экспрессирует ВСМА, например, из-за того, что экспрессия ВСМА была подавлена, например, вследствие лечения молекулой, нацеливающейся на ВСМА, например, ингибитором ВСМА, описанным в данном документе, но которая в свое время экспрессировала ВСМА. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией ВСМА (например, ВСМА дикого типа или мутантного ВСМА), представляет собой гематологический рак. В одном аспекте гематологический рак представляет собой лейкоз или лимфому. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией ВСМА (например, ВСМА дикого типа или мутантного ВСМА), представляет собой злокачественное новообразование из дифференцированных плазматических В-клеток. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включает виды рака и злокачественные новообразования, в том числе без ограничения, например, один или несколько видов острого лейкоза, в том числе без ограничения, например, B-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("BALL"), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("TALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько видов хронического лейкоза, в том числе без ограничения, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Дополнительные виды рака или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включают в себя без ограничения, например, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную неоплазию, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, плазмоцитоидную дендритноклеточную неоплазию, макроглобулинемию Вальденстрема и "предлейкоз", который представляет собой разнообразную группу гематологических состояний, объединенных неэффективным образованием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т. п. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому или глиобластому. В ряде вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией ВСМА, включает нарушение пролиферации плазматических клеток, например, бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, виды плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром). Дополнительные заболевания, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включают без ограничения, например, атипичные и/или неклассические виды рака, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), например, рак, описанный в данном документе, например, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный или терапевтически резистентный рак предстательной железы или метастатический рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легкого.
C. neoformans
Состояния, не связанные с раком, которые ассоциированы с ВСМА (например, ВСМА дикого типа или мутантным ВСМА), включают вирусные инфекции; например, вызванные HIV, грибковые инфекции, например, вызванные ; аутоиммунное заболевание; например, ревматоидный артрит, системную красную волчанку (SLE или волчанку), пузырчатку обыкновенную и синдром Шегрена; воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит; аллоспецифический иммунный ответ, связанный с трансплантацией, нарушения, связанные с иммунитетом слизистых оболочек; и нежелательные иммунные ответы на биопрепараты (например, фактор VIII), при которых важен гуморальный иммунитет. В ряде вариантов осуществления показание, не связанное с раком, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает без ограничения, например, аутоиммунное заболевание (например, волчанку), воспалительные нарушения (аллергию и астму) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген, экспрессирует или в какое-либо время экспрессировала мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген, продуцирует опухолевый белковый антиген (например, дикого типа или мутантный), и при этом опухолевый белковый антиген может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген, в один момент времени продуцировала опухолевый белковый антиген на поддающихся выявлению уровнях, а затем по существу не продуцировала опухолевый белковый антиген на поддающихся выявлению уровнях.
Термин "консервативные модификации последовательности" относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их в значительной степени. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в уровне техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CAR по настоящему изобретению можно заменить другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененный CAR можно протестировать с использованием функциональных анализов, описанных в данном документе.
Термин "стимуляция" относится к первичному ответу, индуцируемому связыванием стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) со своим когнатным лигандом, за счет чего опосредуется событие передачи сигнала, такое как, без ограничения, передача сигнала с помощью комплекса TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать изменение экспрессии определенных молекул, как, например, подавление экспрессии TGF-β и/или реорганизацию структур цитоскелета и т. п.
Термин "стимулирующая молекула" относится к молекуле, экспрессируемой Т-клеткой, которая обеспечивает цитоплазматическую(цитоплазматические) сигнальную(сигнальные) последовательность(последовательности), регулирующую(регулирующие) первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом в по меньшей мере некоторых аспектах сигнального пути T-клетки. В некоторых вариантах осуществления ITAM-содержащий домен в CAR воспроизводит передачу сигнала от первичного TCR независимо от эндогенных комплексов TCR. В одном аспекте первичный сигнал инициируется, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой МНС, нагруженной пептидом, и приводит к опосредованию ответа Т-клеток, в том числе без ограничения пролиферации, активации, дифференцировки и т. п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая "первичным сигнальным доменом"), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры ITAM-содержащей первичной цитоплазматической сигнальной последовательности, которая является особенно применимой в настоящем изобретении, включают без ограничения последовательности, полученные из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI и CD66d, DAP10 и DAP12. В конкретном CAR по настоящему изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "APC" относится к клетке иммунной системы, такой как вспомогательная клетка (например, B-клетка, дендритная клетка и т. п.), которая представляет чужеродный антиген в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на своей поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с помощью своих T-клеточных рецепторов (TCR). АРС процессируют антигены и презентируют их Т-клеткам.
Используемый в данном документе термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к внутриклеточной части молекулы. В ряде вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Хотя может использоваться весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях отсутствует необходимость использовать всю цепь. В том случае, если используют усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую усеченную часть можно использовать вместо интактной цепи, при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, подразумевается, что термин "внутриклеточный сигнальный домен" включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи сигнала эффекторной функции.
Внутриклеточный сигнальный домен образует сигнал, который активирует иммунную эффекторную функцию клетки, содержащей CAR, например, CAR-T-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, у CAR-T-клетки, включают цитолитическую активность и хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов.
В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Иллюстративные первичные внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий внутриклеточный домен. Иллюстративные костимулирующие внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за костимулирующие сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае с CART первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность корецептора или костимулирующей молекулы.
Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают без ограничения последовательности, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12.
Термин "дзета" или, в качестве альтернативы, "дзета-цепь", "CD3-дзета" или "TCR-дзета" относится к CD247. Под номером доступа Swiss-Prot P20963 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности CD3-дзета человека. "Стимулирующий домен дзета" или, в качестве альтернативы, "стимулирующий домен CD3-дзета" или "стимулирующий домен TCR-дзета" относится к стимулирующему домену CD3-дзета или его варианту (например, молекуле, имеющей мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен дзета содержит остатки 52-164 из последовательности под номером доступа в GenBank BAG36664.1 или ее варианта (например, молекулы, имеющей мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен CD3-дзета" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 9 или 10, или ее вариант (например, молекулу, имеющую мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции).
Термин "костимулирующая молекула" относится к когнатному партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфично связывается с костимулирующим лигандом, за счет чего происходит опосредование костимулируемого ответа Т-клетки, такого как, без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от антигенных рецепторов или их лигандов, которые необходимы для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают без ограничения молекулу MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB и лиганд, который специфично связывается с CD83.
Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы.
Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которого он получен, или ее функциональный фрагмент.
Термин "4-1BB" относится к CD137 или представителю 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. Под номером доступа Swiss-Prot P20963 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности 4-1BB человека. "Кoстимулирующий домен 4-1BB" относится к костимулирующему домену 4-1BB или его варианту (например, молекуле, имеющей мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления "костимулирующий домен 4-1BB" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 7 или ее вариант (например, молекулу, имеющую мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции).
Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная клетка" относится к клетке, которая вовлечена в иммунный ответ, например, способствуя иммунному эффекторному ответу. Примеры иммунных эффекторных клеток включают Т-клетки, например, альфа/бета-Т-клетки и гамма/дельта-Т-клетки, В-клетки, естественные клетки-киллеры (NK), естественные T-клетки-киллеры (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.
Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная функция или иммунный эффекторный ответ" относится к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, которые усиливают иммунную атаку на клетку-мишень или способствуют ей. Например, иммунные эффекторные функция или ответ относятся к свойству T- или NK-клетки, которое способствует уничтожению или ингибированию роста или пролиферации клетки-мишени. В случае с Т-клеткой первичная стимуляция и костимуляция являются примерами иммунных эффекторных функции или ответа.
Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов.
Термин "кодирование" относится к свойству, присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, в ходе биологических процессов служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул, имеющих заданную последовательность нуклеотидов (т. е. рРНК, тРНК и мРНК) либо заданную последовательность аминокислот и биологические свойства, обусловленные ими. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если в результате транскрипции и трансляции мРНК, соответствующей этому гену, в клетке или другой биологической системе продуцируется белок. Как кодирующая нить, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в перечнях последовательностей, так и некодирующая нить, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут обозначаться как кодирующие белок или другой продукт данного гена или кДНК.
Если не указано иное, то "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК" может также включать интроны в той мере, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в каком-либо варианте содержать интрон(интроны).
Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, описанных в данном документе, эффективному для достижения конкретного биологического результата.
Термин "эндогенный" относится к любому материалу, полученному из организма, клетки, ткани или системы или продуцируемому внутри них.
Термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному в организм, клетку, ткань или систему или продуцируемому вне их.
Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления экспрессия включает трансляцию mRNA, введенной в клетку.
Термин "вектор для переноса" относится к композиции, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту и которую можно применять для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Из уровня техники известны многочисленные векторы, в том числе без ограничения линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, ассоциированные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор для переноса" включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Данный термин также следует толковать таким образом, что он дополнительно включает неплазмидные и невирусные соединения, которые содействуют переносу нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосома и т. п. Примеры вирусных векторов для переноса включают без ограничения аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т. п.
Термин "экспрессионный вектор" относится к вектору, который содержит рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности, контролирующие экспрессию, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которая должна экспрессироваться. Экспрессионный вектор содержит достаточное количество цис-действующих элементов для экспрессии; а другие элементы для экспрессии могут предоставляться клеткой-хозяином или в системе для экспрессии in vitro. Экспрессионные векторы включают все векторы, известные из уровня техники, в том числе космиды, плазмиды (например, "голые" или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), в состав которых включен рекомбинантный полинуклеотид.
Термин "лентивирус" относится к роду из семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов в том, что способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они в качестве векторов являются одним из наиболее эффективных способов доставки генов. Все из HIV, SIV и FIV являются примерами лентивирусов.
Термин "лентивирусный вектор" относится к вектору, полученному из по меньшей мере части генома лентивируса, в том числе, в частности, к самоинактивирующемуся лентивирусному вектору, представленному в Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинической практике, включают без ограничения, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и т. п. Неклинические типы лентивирусных векторов также являются доступными и известны специалисту в данной области.
Термин "гомологичный" или "идентичность" относится к идентичности последовательностей субъединиц у двух полимерных молекул, например, двух молекул нуклеиновой кислоты, таких как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или двух молекул полипептидов. Если положение субъединицы в обеих из двух молекул занимает одна и та же мономерная субъединица, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными по этому положению. Гомология между двумя последовательностями находится в прямой зависимости от числа совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях являются гомологичными, то эти две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) являются совпадающими или гомологичными, то эти две последовательности являются гомологичными на 90%.
"Гуманизированные" формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от человеческого. В большинстве случаев гуманизированные антитела и фрагменты данных антител представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), реципиента заменены остатками из CDR из вида, отличного от человека (донорного антитела), такого как мышь, крыса или кролик, обладающей требуемой специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки, не обнаруживаемые ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасных областей. С помощью этих модификаций можно дополнительно улучшить и оптимизировать функциональные характеристики антитела или фрагмента антитела. Как правило, гуманизированное антитело или фрагмент этого антитела будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все CDR-области соответствуют областям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все FR-области или их значительная часть представляют собой области с последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности см. в Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.
"Полностью человеческий" относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, где целая молекула имеет человеческое происхождение или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулина.
Термин "выделенный" означает измененный относительно природного состояния или извлеченный из него. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природных условиях присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", однако те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются "выделенными". Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут находиться в по существу очищенной форме или могут находиться в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин.
В контексте настоящего изобретения используются следующие сокращения для общераспространенных оснований нуклеиновых кислот. "А" относится к аденозину, "С" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "Т" относится к тимидину, и "U" относится к уридину.
Термин "функционально связанный" или "транскрипционный контроль" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в тех случаях, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут быть смежными друг с другом и, например, если необходимо соединить две области, кодирующие белок, находятся в одной и той же рамке считывания.
Термин "парентеральное введение" иммуногенной композиции включает, например, методики подкожной (s.c.), внутривенной (i.v.), внутримышечной (i.m.) или внутригрудинной инъекции, внутриопухолевого введения или инфузии.
Термин "нуклеиновая кислота," "молекула нуклеиновой кислоты," "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" означает дезоксирибонуклеиновые кислоты (DNA) или рибонуклеиновые кислоты (РНК) и их полимеры в одно- или двухнитевой форме. Если специально не ограничено, то данный термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают свойствами связывания, сходными со свойствами эталонной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются посредством механизма, сходного с механизмом для встречающихся в природе нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления "нуклеиновая кислота". "молекула нуклеиновой кислоты". "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" предусматривает производное или аналог нуклеотида/нуклеозида. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно охватывает ее варианты с консервативными модификациями (например, с заменами вырожденными кодонами, например, консервативными заменами), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, замены вырожденными кодонами, например, консервативные замены, можно осуществлять посредством образования последовательностей, в которых в третьем положении одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов произведена замена любым из канонических оснований и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не установлено ограничение на максимальное количество аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями. Используемый в данном документе термин относится как к коротким цепям, которые также, как правило, называются в уровне техники, например, пептидами, олигопептидами и олигомерами, так и к более длинным цепям, которые обычно называются в уровне техники белками, которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.
Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, которая необходима для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.
Термин "промоторная/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая необходима для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может являться коровой промоторной последовательностью, а в других случаях эта последовательность может также содержать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Например, промоторная/регуляторная последовательность может представлять собой последовательность, которая обеспечивает экспрессию продукта гена тканеспецифическим образом.
Термин "конститутивный промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке при большинстве или всех физиологических условиях клетки.
Термин "индуцируемый промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке по существу только в случае присутствия в клетке индуктора, который соответствует данному промотору.
Термин "тканеспецифический промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет ген, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке по существу только в том случае, если клетка является клеткой из того типа ткани, который соответствует данному промотору.
Термины "антиген, ассоциированный с раком" или "опухолевый антиген" взаимозаменяемо относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности раковой клетки полностью либо в виде фрагмента (например, в виде комплекса молекула MHC/пептид), и которая является применимой для предпочтительного нацеливания фармакологического средства на раковую клетку. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой маркер, экспрессируемый как нормальными клетками, так и раковыми клетками, например, маркер линии дифференцировки, например, CD19 на В-клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая в раковой клетке сверхэкспрессируется по сравнению с нормальной клеткой, например, характеризуется 1-кратной сверхэкспрессией, 2-кратной сверхэкспрессией, 3-кратной или большей сверхэкспрессией по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая синтезируется в раковой клетке ненадлежащим образом, например, молекулу, которая содержит делеции, добавления или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген будет экспрессироваться исключительно на клеточной поверхности раковой клетки, полностью или в виде фрагмента (например, в виде комплекса молекула MHC/пептид), и не будет синтезироваться или экспрессироваться на поверхности нормальной клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению включают CAR, содержащие антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который связывается с пептидом, презентируемым молекулой MHC. Обычно пептиды, полученные из эндогенных белков, заполняют карманы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) на CD8+ T-лимфоцитах. Комплексы молекул MHC I класса конститутивно экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. При раке комплексы вирусоспецифический и/или опухолеспецифический пептид/молекула MHC представляют собой уникальный класс мишеней клеточной поверхности для иммунотерапии. Были описаны TCR-подобные антитела, нацеливающиеся на пептиды, полученные из вирусных или опухолевых антигенов, связанные с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA)-A1 или HLA-A2 (см., например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело можно идентифицировать при скрининге библиотеки, такой как фаг-дисплейная библиотека scFv человека.
Термины "антиген, обеспечивающий поддержание опухоли" или "антиген, обеспечивающий поддержание рака" взаимозаменяемо относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности клетки, которая сама по себе не является раковой, но обеспечивает поддержание раковых клеток, например, путем способствования их росту или выживанию, например, устойчивости к иммунным клеткам. Иллюстративные клетки данного типа включают стромальные клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Антиген, обеспечивающий поддержание опухоли, сам по себе не обязательно играет роль в поддержании опухолевых клеток, при условии, что антиген присутствует в клетке, которая обеспечивает поддержание раковых клеток.
Термин "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", используемый применительно к scFv, относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как глициновые и/или сериновые остатки, используемые в отдельности или в комбинации, для связывания вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи друг с другом. В некоторых вариантах осуществления гибкий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10 (SEQ ID NO: 42). В некоторых вариантах осуществления гибкие полипептидные линкеры включают без ограничения (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 27) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 28). В другом варианте осуществления линкеры содержат множественные повторы (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 29). Также в объем настоящего изобретения включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в данный документ посредством ссылки.
Как используется в данном документе, 5'-кэп (также называемый РНК-кэпом, 7-метилгуанозиновым РНК-кэпом или РНК-кэпом m7G) представляет собой модифицированный гуаниновый нуклеотид, который добавляется к "переднему", или 5'-концу, эукариотической матричной РНК вскоре после начала транскрипции. 5'-кэп состоит из концевой группы, которая связана с первым транскрибированным нуклеотидом. Его присутствие является критически важным для распознавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа сопряжено с транскрипцией и происходит совместно с транскрипцией, так что каждое из этих событий влияет на другое. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой мРНК связывается с кэп-синтезирующим комплексом, ассоциированным с РНК-полимеразой. Этот ферментативный комплекс катализирует химические реакции, которые необходимы для кэпирования мРНК. Синтез протекает в виде многоступенчатой биохимической реакции. Кэпирующий фрагмент можно модифицировать для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как ее стабильность или эффективность трансляции.
Как используется в данном документе, "РНК, транскрибированная in vitro" относится к РНК, предпочтительно мРНК, которая была синтезирована in vitro. Обычно РНК, транскрибированная in vitro, образуется из вектора транскрипции in vitro. Вектор транскрипции in vitro содержит матрицу, используемую для образования РНК, транскрибированной in vitro.
Как используется в данном документе, "поли(А)" представляет собой последовательный ряд аденозиновых остатков, присоединенных путем полиаденилирования к мРНК. В предпочтительном варианте осуществления конструкции для транзиентной экспрессии длина поли(А) составляет от 50 до 5000 (SEQ ID NO: 30), предпочтительно более 64, более предпочтительно более 100, наиболее предпочтительно более 300 или 400. Последовательности поли(А) можно модифицировать химическим или ферментативным путем для модулирования функциональных свойств mRNA, таких как локализация, стабильность или эффективность трансляции.
Как используется в данном документе, "полиаденилирование" относится к ковалентной связи полиаденилилового фрагмента или его модифицированного варианта с молекулой матричной РНК. У эукариотических организмов большинство молекул матричной РНК (мРНК) являются полиаденилированными на 3'-конце. 3'-концевой поли(А)-хвост представляет собой длинную последовательность адениновых нуклеотидов (часто несколько сотен), добавленных к пре-мРНК под действием фермента полиаденилатполимеразы. У высших эукариот поли(А)-хвост добавляется к транскриптам, которые содержат определенную последовательность - сигнал полиаденилирования. Поли(А)-хвост и связанный с ним белок содействуют защите мРНК от разрушения экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре сразу после транскрипции ДНК в РНК, но дополнительно может также происходить позднее в цитоплазме. После завершения транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется наличием последовательности оснований AAUAAA вблизи сайта расщепления. После того, как мРНК была расщеплена, к свободному 3'-концу в сайте расщепления добавляются аденозиновые остатки.
Как используется в данном документе, "транзиентный" относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение периода нескольких часов, дней или недель, где период времени экспрессии является меньшим, чем период времени для экспрессии гена в случае, если он интегрирован в геном или содержится в стабильном плазмидном репликоне в клетке-хозяине.
Используемые в данном документе термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности пролиферативного нарушения или ослаблению одного или нескольких симптомов (предпочтительно одного или нескольких различимых симптомов) пролиферативного нарушения в результате введения одного или нескольких средств терапии (например, одного или нескольких терапевтических средств, таких как CAR по настоящему изобретению). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ослаблению по меньшей мере одного измеряемого физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, не обязательно различимого для пациента. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения физическим путем, например, посредством стабилизации различимого симптома, физиологическим путем, например, посредством стабилизации физического параметра, либо ими обоими. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или стабилизации размера опухоли или количества раковых клеток.
Термин "путь передачи сигнала" относится к биохимической взаимосвязи между различными молекулами-переносчиками сигналов, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Фраза "рецептор клеточной поверхности" включает молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.
Термин "субъект" предполагается как включающий живые организмы, у которых можно вызвать иммунный ответ (например, млекопитающих, человека).
Термин "по существу очищенная клетка" относится к клетке, которая по сути свободна от других типов клеток. "По существу очищенная клетка" также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно ассоциирована в своем встречающемся в природе состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к однородной популяции клеток. В других случаях данный термин просто относится к клетке, которая была отделена от клеток, с которыми она в природных условиях ассоциирована в своем природном состоянии. В некоторых аспектах клетки культивируют in vitro. В других аспектах клетки не культивируют in vitro.
Используемый в данном документе термин "терапевтический" означает лечение. Терапевтический эффект получают путем ослабления, подавления, ремиссии или устранения болезненного состояния.
Используемый в данном документе термин "профилактика" означает предупреждение или профилактическое лечение заболевания или болезненного состояния.
В контексте настоящего изобретения "опухолевый антиген", или "антиген, связанный с гиперпролиферативным нарушением", или "антиген, ассоциированный с гиперпролиферативным нарушением" относятся к антигенам, которые являются общими для конкретных гиперпролиферативных нарушений. В определенных аспектах антигены, связанные с гиперпролиферативным нарушением, по настоящему изобретению получены из раковых опухолей, включающих без ограничения первичную или метастатическую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, виды лейкоза, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почки и виды аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный или терапевтически резистентный рак предстательной железы или метастатический рак предстательной железы), рак яичника, рак поджелудочной железы и т. п., или нарушение пролиферации плазматических клеток (например, бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, виды плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром).
Термины "трансфицированный", или "трансформированный", или "трансдуцированный" относятся к процессу, в ходе которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая была подвергнута трансфекции, трансформации или трансдукции с помощью экзогенной нуклеиновой кислоты. Такая клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.
Термин "специфично связывается" относится к антителу или лиганду, которые распознают своего когнатного белкового партнера по связыванию (например, стимулирующую и/или костимулирующую молекулу на Т-клетке), присутствующего в образце, и связываются с ним, но при этом эти антитело или лиганд по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце.
Как используется в данном документе, "регулируемый химерный антигенный рецептор (RCAR)" относится к набору полипептидов, как правило, в простейших вариантах осуществления двух, которые, находясь в иммунной эффекторной клетке, наделяют клетку специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и образованием внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном документе "внутриклеточным сигнальным доменом"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, как определено в данном документе применительно к молекуле CAR. В некоторых вариантах осуществления полипептиды из набора в RCAR не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит димеризационный переключатель, который при наличии димеризующей молекулы может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), описанной в данном документе, например, в клетке, экспрессирующей RCAR (также называемой в данном документе "RCAR-X-клеткой"). В одном варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой T-клетку и называется RCAR-T-клеткой. В одном варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCAR-N-клеткой. RCAR может наделять клетку, экспрессирующую RCAR, специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и регулируемым образованием внутриклеточного сигнала или пролиферацией, что может оптимизировать иммуноэффекторное свойство клетки, экспрессирующей RCAR. В ряде вариантов осуществления клетка с RCAR по меньшей мере частично зависит от антигенсвязывающего домена в обеспечении специфичности в отношении клетки-мишени, которая содержит антиген, связываемый антигенсвязывающим доменом.
Используемый в данном документе термин "мембранный якорь" или "домен прикрепления к мембране" относится к полипептиду или фрагменту, например, к миристоильной группе, достаточному для заякоривания внеклеточного или внутриклеточного домена на плазматической мембране.
Используемый в данном документе термин "переключающий домен", например, в отношении RCAR, относится к объекту, обычно полипептидному объекту, который в присутствии димеризующей молекулы образует ассоциацию с другим переключающим доменом. Ассоциация приводит к функциональной связи первого объекта, связанного, например, слитого, с первым переключающим доменом, и второго объекта, связанного, например, слитого, со вторым переключающим доменом. Первый и второй переключающие домены в совокупности называются димеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, например, они являются полипептидами, имеющими одинаковую первичную аминокислотную последовательность, и в совокупности называются гомодимеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга, например, они являются полипептидами, имеющими разные первичные аминокислотные последовательности, и в совокупности называются гетеродимеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления переключатель является внутриклеточным. В ряде вариантов осуществления переключатель является внеклеточным. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, объект на основе FKBP или FRB, а димеризующая молекула представляет собой малую молекулу, например, рапалог. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, scFv, который связывает пептид myc, а димеризующая молекула представляет собой полипептид, его фрагмент или мультимер полипептида, например, лиганд myc или мультимеры лиганда myc, которые связываются с одним или несколькими scFv для myc. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, myc-рецептор, а димеризующая молекула представляет собой антитело или его фрагменты, например, антитело к myc.
Используемый в данном документе термин "димеризующая молекула", например, в отношении RCAR, относится к молекуле, которая способствует ассоциации первого переключающего домена со вторым переключающим доменом. В ряде вариантов осуществления димеризующая молекула не встречается у субъекта в природе или не встречается в концентрациях, которые могут привести к значительной димеризации. В ряде вариантов осуществления димеризующая молекула представляет собой малую молекулу, например, рапамицин или рапалог, например, RAD001.
Термин "низкая доза, усиливающая иммунный ответ" при использовании в отношении ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора mTOR, например, RAD001 или рапамицина, или каталитического ингибитора mTOR относится к дозе ингибитора mTOR, которая частично, но не полностью, ингибирует активность mTOR, например, согласно измерению по ингибированию активности киназы P70-S6. Способы оценивания активности mTOR, например, по ингибированию киназы P70-S6, обсуждаются в данном документе. Доза является недостаточной, чтобы вызвать полное подавление иммунитета, но достаточной для усиления иммунного ответа. В одном варианте осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к уменьшению количества PD-1-положительных Т-клеток и/или увеличению количества PD-1-отрицательных Т-клеток или увеличению соотношения PD-1-отрицательные Т-клетки/PD-1-положительные Т-клетки. В одном варианте осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к увеличению количества "необученных" Т-клеток. В одном варианте осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к одному или нескольким из следующего:
high
high
+
повышению экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62L, CD127, CD27 и BCL2, например, на Т-клетках памяти, например, на предшественниках Т-клеток памяти;
снижению экспрессии KLRG1, например, на Т-клетках памяти, например, на предшественниках Т-клеток памяти; и
high
high
+
увеличению количества предшественников Т-клеток памяти, например, клеток с любой из следующих характеристик или их комбинацией: повышенным уровнем CD62L, повышенным уровнем CD127, повышенным уровнем CD27, сниженным уровнем KLRG1 и повышенным уровнем BCL2;
где любое из изменений, описанных выше, происходит, например, по меньшей мере временно, например, по сравнению с субъектом, не получающим лечение.
Как используется в данном документе "рефрактерный" относится к заболеванию, например, раку, которое не отвечает на лечение. В ряде вариантов осуществления рефрактерный рак может быть устойчивым к лечению до или в начале лечения. В других вариантах осуществления рефрактерный рак может стать устойчивым в ходе лечения. Рефрактерный рак также называют устойчивым раком.
Как используется в данном документе, "рецидивирующий" или "рецидив" относится к возвращению или повторному появлению заболевания (например, рака) или признаков и симптомов заболевания, такого как рак, после периода улучшения или восприимчивости, например, после предшествующего лечения с помощью терапии, например, противораковой терапии. Начальный период восприимчивости может предусматривать падение уровня раковых клеток ниже определенного порога, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное появление может предусматривать возрастание уровня раковых клеток выше определенного порога, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Например, применительно к B-ALL повторное появление может предусматривать, например, повторное появление бластов в крови, костном мозге (> 5%) или любом экстрамедуллярном участке после достижения полного ответа. Полный ответ в данном контексте может предусматривать < 5% бластных клеток в BM. В более широком смысле в варианте осуществления ответ (например, полный ответ или частичный ответ) может предусматривать отсутствие выявляемого MRD (минимального остаточного заболевания). В одном варианте осуществления начальный период восприимчивости продолжается в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней; по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недель; по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 или 12 месяцев или по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 лет.
Диапазоны: во всем настоящем раскрытии различные аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов служит лишь для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее такие поддиапазоны, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т. д., а также отдельные числа в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, такой диапазон, как 95-99% идентичность, включает что-либо с 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью и включает такие поддиапазоны, как 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99% идентичность. Это применимо независимо от ширины диапазона.
Используемый в данном документе термин "система редактирования генов" относится к системе, например, одной или нескольким молекулам, которые управляют изменением, например, делецией, и осуществляют его в одной или нескольких нуклеиновых кислотах в сайте геномной ДНК, на которую нацеливается указанная система, или рядом с ним. Системы редактирования генов известны из уровня техники и более подробно описаны ниже.
Как используется в данном документе, вводимый "в комбинации" означает, что два (или более) различных средства для лечения доставляют субъекту в период, когда субъект страдает нарушением, например, два или более средства для лечения доставляют после того, как у субъекта было диагностировано нарушение, и до того, как нарушение было излечено или устранено или лечение было прекращено по другим причинам. В некоторых вариантах осуществления доставка одного средства для лечения по-прежнему происходит, когда начинается доставка второго, так что в отношении введения имеет место перекрывание. Это иногда упоминается в данном документе как "одновременная" или "параллельная" доставка. В других вариантах осуществления доставка одного средства для лечения заканчивается до начала доставки другого средства для лечения. В некоторых вариантах осуществления в любом из случаев лечение является более эффективным благодаря комбинированному введению. Например, второе средство для лечения является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдается при меньшем количестве второго средства для лечения, или второе средство для лечения снижает интенсивность симптомов в большей степени, чем наблюдалось бы при введении второго средства для лечения в отсутствие первого средства для лечения, или аналогичная ситуация наблюдается с первым средством для лечения. В некоторых вариантах осуществления доставка является такой, при которой снижение интенсивности симптома или другого параметра, связанного с нарушением, является большим, чем наблюдалось бы при доставке одного средства для лечения в отсутствие другого. Эффект двух средств для лечения может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или превышающим аддитивный. Доставка может быть такой, что эффект от первого доставленного средства для лечения все еще поддается выявлению при доставке второго.
Ниже описаны дополнительные подробности различных аспектов композиций и способов, представленных в данном документе. Дополнительные определения изложены по всему тексту настоящего описания.
Описание
В данном документе представлены композиции и способы применения для лечения заболевания, такого как рак с помощью клеток, которые экспрессируют химерный антигенный рецептор для BCMA (CAR), например, CART-BCMA.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке (например, иммунной эффекторной клетке, T-клетке или NK-клетке), сконструированной для экспрессии CAR, где CAR Т-клетки (например, "CART") или CAR NK-клетки проявляет противоопухолевое свойство. В одном аспекте клетка трансформирована с помощью CAR, и CAR экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления клетку (например, иммунную эффекторную клетку, T-клетку или NK-клетку) трансдуцируют вирусным вектором, кодирующим CAR. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может стабильно экспрессировать CAR. В другом варианте осуществления клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, T-клетка или NK-клетка) трансфицирована нуклеиновой кислотой, например, mRNA, cDNA, ДНК, кодирующей CAR. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может транзиентно экспрессировать CAR.
В одном аспекте в CAR по настоящему изобретению объединяют антигенсвязывающий домен специфического антитела с внутриклеточной сигнальной молекулой. Например, в некоторых аспектах внутриклеточная сигнальная молекула содержит без ограничения дзета-цепь CD3, сигнальные модули 4-1BB и CD28 и их комбинации. В одном аспекте антигенсвязывающий домен связывается с BCMA.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены композиции с CAR BCMA и их применение в лекарственных препаратах или способах лечения, среди прочих заболеваний, рака, или любого злокачественного новообразования, или аутоиммунных заболеваний, в которые вовлечены клетки или ткани, экспрессирующие BCMA.
В одном аспекте CAR по настоящему изобретению можно применять для устранения BCMA-экспрессирующих нормальных клеток, что, таким образом, применимо для использования в качестве клеточной кондиционирующей терапии перед трансплантацией клеток. В одном аспекте BCMA-экспрессирующая нормальная клетка представляет собой нормальную стволовую клетку, экспрессирующую BCMA, и клеточная трансплантация представляет собой трансплантацию стволовой клетки.
В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена клетка (например, T-клетка или NK-клетка), сконструированная для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), где CAR-T-клетки ("CART") или CAR-NK-клетки проявляет противоопухолевое свойство. Предпочтительный антиген представляет собой BCMA. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент антитела к BCMA человека. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент антитела к BCMA человека, содержащий scFv. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрен BCMA-CAR, который содержит человеческий домен, связывающий BCMA, и введен путем конструирования в клетку, например, T-клетку или NK-клетку, и способы их применения для адоптивной терапии.
В одном аспекте BCMA-CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный домен, выбранный из группы сигнального домена CD137 (4-1BB), сигнального домена CD28, сигнального домена CD3-дзета и любой их комбинации. В одном аспекте BCMA-CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен из одной или нескольких костимулирующих молекул, отличных от CD137 (4-1BB) или CD28.
Химерный антигенный рецептор (CAR)
В настоящем изобретении предусмотрен CAR (например, полипептид CAR), который содержит домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где указанный домен, связывающий BCMA, содержит определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC) любой из аминокислотных последовательностей домена тяжелой цепи, связывающего BMCA, перечисленных в таблицах 2-13. Домен, связывающий BCMA, CAR может дополнительно содержать определяющие комплементарность области 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющие комплементарность области 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющие комплементарность области 3 легкой цепи (CDR3 LC) любой из аминокислотных последовательностей домена легкой цепи, связывающего BMCA, перечисленных в таблицах 2-13.
В настоящем изобретении также предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, описанные в данном документе, например, кодирующие CAR, который содержит домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где указанный домен, связывающий BCMA, содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любой аминокислотной последовательности домена тяжелой цепи, связывающего BMCA, из перечисленных в таблицах 2-13. В некоторых вариантах осуществления кодируемый домен, связывающий BMCA, CAR может дополнительно содержать CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей домена легкой цепи, связывающего BMCA, перечисленные в таблицах 2-13.
В одном аспекте иллюстративные конструкции CAR для BCMA содержат необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнирную область, трансмембранный домен и внутриклеточный стимулирующий домен. Иллюстративная лидерная последовательность представлена под SEQ ID NO: 1. Иллюстративная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лидерную последовательность, представлена под SEQ ID NO: 12. Иллюстративная последовательность шарнирной области/спейсера представлена под SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5. Иллюстративная последовательность трансмембранного домена представлена под SEQ ID NO: 6. Иллюстративная последовательность внутриклеточного сигнального домена белка 4-1BB представлена под SEQ ID NO: 7. Иллюстративная последовательность внутриклеточного сигнального домена CD27 представлена под SEQ ID NO: 8. Иллюстративная последовательность домена CD3-дзета представлена под SEQ ID NO: 9 или 10. В определенных вариантах осуществления домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя единый слитый белок. В других вариантах осуществления домены находятся в отдельных полипептидах, как, например, в молекуле RCAR, описанной в данном документе.
Конструкция CAR может включать линкер Gly/Ser, имеющий одну или несколько из следующих последовательностей: GGGGS (SEQ ID NO: 25); охватывающих 1-6 повторяющихся звеньев "Gly Gly Gly Gly Ser", например, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27); GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 28); GGGS (SEQ ID NO: 29); или охватывающих 1-10 повторяющихся звеньев "Gly Gly Gly Ser", например, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 42).
В вариантах осуществления конструкция CAR содержит последовательность поли(A), например, последовательность, охватывающую 50-5000 или 100-5000 адениновых оснований (SEQ ID NO 30 и 33 соответственно) (например, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35), или последовательность, охватывающую 50-5000 тиминовых оснований (SEQ ID NO: 32) (например, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32). В качестве альтернативы, конструкция CAR может содержать, например, линкер, содержащий последовательность GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 43).
В определенных вариантах осуществления полноразмерная молекула CAR для BCMA содержит аминокислотную последовательность или кодируется нуклеотидными последовательностями R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-02, B61-10, Hy03 или Hy52, представленными в таблицах 2-13, или последовательность практически (например, на 95-99%) идентичную ей. В определенных вариантах осуществления молекула CAR для BCMA или антигенсвязывающий домен для BCMA содержит аминокислотную последовательность scFv R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-02, B61-10, Hy03 или Hy52, представленную в таблицах 2, 6 и 10, или последовательность, практически (например, на 95-99%) идентичную ей. В определенных вариантах осуществления молекула CAR для BCMA или антигенсвязывающий домен BCMA содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-02, B61-10, Hy03 или Hy52, представленной в таблицах 2, 6 и 10, или последовательность, практически (например, на 95-99%) идентичную ей. В определенных вариантах осуществления молекула CAR для BCMA или антигенсвязывающий домен BCMA содержит одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3) и/или содержит одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3) R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-02, B61-10, Hy03 или Hy52, представленных в таблицах 2-13, или последовательность, практически (например, на 95-99%) идентичную ей.
таблице 1
Последовательности из неограничивающих примеров различных компонентов, которые могут быть частью молекулы CAR, описанной в данном документе, перечислены в , где "а. к." обозначает аминокислоты, а "н. к." обозначает нуклеиновые кислоты, которые кодируют соответствующий пептид.
Таблица 1. Последовательности различных компонентов CAR
SEQ ID NO
Описание
Последовательность
SEQ ID NO: 11
Промотор гена EF-1(н. к.)
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
SEQ ID NO: 1
Лидерная последовательность (а. к.)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO: 12
Лидерная последовательность (н. к.)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
SEQ ID NO: 2
Шарнирная область CD8 (а. к.)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO: 13
Шарнирная область CD8 (н. к.)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
SEQ ID NO: 3
Шарнирная область Ig4 (а. к.)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
SEQ ID NO: 14
Шарнирная область Ig4 (н. к.)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
SEQ ID NO: 4
Шарнирная область IgD (а. к.)
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
SEQ ID NO: 15
Шарнирная область IgD (н. к.)
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT
SEQ ID NO: 6
Трансмембранный домен CD8 (а. к.)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO: 17
Трансмембранный домен CD8 (н. к.)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
SEQ ID NO: 7
Внутриклеточный домен 4-1BB (а. к)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO: 18
Внутриклеточный домен 4-1BB (н. к.)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
SEQ ID NO: 8
CD27 (а. к.)
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
SEQ ID NO: 19
CD27 (н. к.)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO: 9
CD3-дзета (а. к.)(с мутацией Q/K)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 20
CD3-дзета (н. к.)(с мутацией Q/K)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 10
CD3-дзета (а. к.)(Эталонная последовательность NM_000734.3 в NCBI)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 21
CD3-дзета (н. к.)(Эталонная последовательность NM_000734.3 в NCBI)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 36
Внутриклеточный домен CD28 (аминокислотная последовательность)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO: 37
Внутриклеточный домен CD28 (нуклеотидная последовательность)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO: 38
Внутриклеточный домен ICOS (аминокислотная последовательность)
T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L
SEQ ID NO: 39
Внутриклеточный домен ICOS (нуклеотидная последовательность)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
SEQ ID NO: 5
Шарнирная область/линкер GS (а. к.)
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 16
Шарнирная область/линкер GS (н. к.)
GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
SEQ ID NO: 40
Шарнирная область/линкер GS (н. к.)
GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGGGGTTCC
SEQ ID NO: 25
Линкер
GGGGS
SEQ ID NO: 26
Линкер
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-6, например, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 27
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 28
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 29
Линкер
GGGS
SEQ ID NO: 41
Линкер
(Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше
SEQ ID NO: 42
Линкер
(Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-10, например, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
SEQ ID NO: 43
Линкер
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
SEQ ID NO: 30
Поли(A)
(A)<sub>5000</sub>Эта последовательность может охватывать 50-5000 адениновых оснований.
SEQ ID NO: 31
Поли(T)
(T)<sub>100</sub>
SEQ ID NO: 32
Поли(T)
(T)<sub>5000</sub>Эта последовательность может охватывать 50-5000 тиминовых оснований.
SEQ ID NO: 33
Поли(A)
(A)<sub>5000</sub>Эта последовательность может охватывать 100-5000 адениновых оснований.
SEQ ID NO: 34
Поли(A)
(A)<sub>400</sub>Эта последовательность может охватывать 100-400 адениновых оснований.
SEQ ID NO: 35
Поли(A)
(A)<sub>2000</sub>Эта последовательность может охватывать 50-2000 адениновых оснований.
SEQ ID NO: 22
CAR для PD1 (а. к.)
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
SEQ ID NO: 23
CAR для PD-1 (н. к.)(ECD PD1 подчеркнут)
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc
SEQ ID NO: 24
CAR для PD-1 с сигнальной последовательностью (а. к.)(ECD PD1 подчеркнут)
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
Антигенсвязывающий домен CAR
В одном аспекте часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается на опухолевый антиген, например, на опухолевый антиген, описанный в данном документе. В одном аспекте CAR по настоящему изобретению содержит связывающий домен, который специфически связывает BCMA (например, BCMA человека).
Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, в том числе без ограничения моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, в том числе без ограничения однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) наноантитела верблюдовых, а также альтернативную каркасную структуру, которая, как известно из уровня техники, функционирует в качестве антигенсвязывающего домена, такую как рекомбинантный фибронектиновый домен и т. п.
Иллюстративный аминокислотные последовательности домена, связывающего BCMA, представлены в таблицах 2-13. В одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит антитело человека или фрагмент антитела человека. В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит одну или несколько (например, все три) CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC человеческого домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе (например, в таблицах 2-13) и/или одну или несколько (например, все три) CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC человеческого домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе (например, в таблицах 2-13). В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит VL человека, описанную в данном документе (например, в таблицах 2, 6 и 10), и/или VH человека, описанную в данном документе (например, в таблицах 2, 6 и 10). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой scFv, содержащий VL и VH аминокислотной последовательности из таблиц 2, 6 и 10. В одном варианте осуществления домен, связывающий BCMA, (например, scFv) содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности, представленной в таблицах 2, 6 и 10, или последовательность с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблиц 2, 6 и 10; и/или VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности, представленной в таблицах 2, 6 и 10, или последовательность с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблиц 2, 6 и 10.
Таблица 2. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA
SEQ ID NO
Название/описание
Последовательность
R1B6
SEQ ID NO: 44
HCDR1 (Kabat)
SYAMS
SEQ ID NO: 45
HCDR2 (Kabat)
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 46
HCDR3 (Kabat)
REWVPYDVSWYFDY
SEQ ID NO: 47
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 48
HCDR2 (Chothia)
SGSGGS
SEQ ID NO: 46
HCDR3 (Chothia)
REWVPYDVSWYFDY
SEQ ID NO: 49
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSYA
SEQ ID NO: 50
HCDR2 (IMGT)
ISGSGGST
SEQ ID NO: 51
HCDR3 (IMGT)
ARREWVPYDVSWYFDY
SEQ ID NO: 52
VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 53
ДНК VH
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 54
LCDR1 (Kabat)
RASQSISSYLN
SEQ ID NO: 55
LCDR2 (Kabat)
AASSLQS
SEQ ID NO: 56
LCDR3 (Kabat)
QQSYSTPLT
SEQ ID NO: 57
LCDR1 (Chothia)
SQSISSY
SEQ ID NO: 58
LCDR2 (Chothia)
AAS
SEQ ID NO: 59
LCDR3 (Chothia)
SYSTPL
SEQ ID NO: 60
LCDR1 (IMGT)
QSISSY
SEQ ID NO: 58
LCDR2 (IMGT)
AAS
SEQ ID NO: 56
LCDR3 (IMGT)
QQSYSTPLT
SEQ ID NO: 61
VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 62
ДНК VL
GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 64
scFv (VH-линкер-VL)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 65
ДНК scFv
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO: 66
Полная аминокислотная последовательность CAR
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 67
Полная последовательность ДНК CAR
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
R1F2
SEQ ID NO: 44
HCDR1 (Kabat)
SYAMS
SEQ ID NO: 45
HCDR2 (Kabat)
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 68
HCDR3 (Kabat)
REWWYDDWYLDY
SEQ ID NO: 47
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 48
HCDR2 (Chothia)
SGSGGS
SEQ ID NO: 68
HCDR3 (Chothia)
REWWYDDWYLDY
SEQ ID NO: 49
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSYA
SEQ ID NO: 50
HCDR2 (IMGT)
ISGSGGST
SEQ ID NO: 69
HCDR3 (IMGT)
ARREWWYDDWYLDY
SEQ ID NO: 70
VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 71
ДНК VH
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 54
LCDR1 (Kabat)
RASQSISSYLN
SEQ ID NO: 55
LCDR2 (Kabat)
AASSLQS
SEQ ID NO: 56
LCDR3 (Kabat)
QQSYSTPLT
SEQ ID NO: 57
LCDR1 (Chothia)
SQSISSY
SEQ ID NO: 58
LCDR2 (Chothia)
AAS
SEQ ID NO: 59
LCDR3 (Chothia)
SYSTPL
SEQ ID NO: 60
LCDR1 (IMGT)
QSISSY
SEQ ID NO: 58
LCDR2 (IMGT)
AAS
SEQ ID NO: 56
LCDR3 (IMGT)
QQSYSTPLT
SEQ ID NO: 61
VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 62
ДНК VL
GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 72
scFv (VH-линкер-VL)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 73
ДНК scFv
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO: 74
Полная аминокислотная последовательность CAR
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 75
Полная последовательность ДНК CAR
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
R1G5
SEQ ID NO: 44
HCDR1 (Kabat)
SYAMS
SEQ ID NO: 45
HCDR2 (Kabat)
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 76
HCDR3 (Kabat)
REWWGESWLFDY
SEQ ID NO: 47
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 48
HCDR2 (Chothia)
SGSGGS
SEQ ID NO: 76
HCDR3 (Chothia)
REWWGESWLFDY
SEQ ID NO: 49
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSYA
SEQ ID NO: 50
HCDR2 (IMGT)
ISGSGGST
SEQ ID NO: 77
HCDR3 (IMGT)
ARREWWGESWLFDY
SEQ ID NO: 78
VH
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 79
ДНК VH
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 54
LCDR1 (Kabat)
RASQSISSYLN
SEQ ID NO: 55
LCDR2 (Kabat)
AASSLQS
SEQ ID NO: 56
LCDR3 (Kabat)
QQSYSTPLT
SEQ ID NO: 57
LCDR1 (Chothia)
SQSISSY
SEQ ID NO: 58
LCDR2 (Chothia)
AAS
SEQ ID NO: 59
LCDR3 (Chothia)
SYSTPL
SEQ ID NO: 60
LCDR1 (IMGT)
QSISSY
SEQ ID NO: 58
LCDR2 (IMGT)
AAS
SEQ ID NO: 56
LCDR3 (IMGT)
QQSYSTPLT
SEQ ID NO: 61
VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 62
ДНК VL
GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 80
scFv (VH-линкер-VL)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 81
ДНК scFv
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG
SEQ ID NO: 82
Полная аминокислотная последовательность CAR
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 83
Полная последовательность ДНК CAR
GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
Таблица 3. CDR по Kabat иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA
Kabat
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
R1B6
SYAMS (SEQ ID NO: 44)
AISGSGGST YYADSVKG (SEQ ID NO: 45)
REWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 46)
RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54)
AASSLQS (SEQ ID NO: 55)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
R1F2
SYAMS (SEQ ID NO: 44)
AISGSGGST YYADSVKG (SEQ ID NO: 45)
REWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 68)
RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54)
AASSLQS (SEQ ID NO: 55)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
R1G5
SYAMS (SEQ ID NO: 44)
AISGSGGST YYADSVKG (SEQ ID NO: 45)
REWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 76)
RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54)
AASSLQS (SEQ ID NO: 55)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
Консенсусная последовательность
SYAMS (SEQ ID NO: 44)
AISGSGGST YYADSVKG (SEQ ID NO: 45)
REWX<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>WX<sub>7</sub>X<sub>8</sub>DY, где X<sub>1</sub> отсутствует или представляет собой V; X<sub>2</sub> отсутствует или представляет собой P; X<sub>3</sub> представляет собой W или Y; X<sub>4</sub> представляет собой G, Y или D; X<sub>5</sub> представляет собой E, D или V; X<sub>6</sub> представляет собой S или D; X<sub>7</sub> представляет собой L или Y; и X<sub>8</sub> представляет собой F или L (SEQ ID NO: 84)
RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54)
AASSLQS (SEQ ID NO: 55)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
Таблица 4. CDR по Chothia иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA
Chothia
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
R1B6
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SGSGGS (SEQ ID NO: 48)
REWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 46)
SQSISSY (SEQ ID NO: 57)
AAS (SEQ ID NO: 58)
SYSTPL (SEQ ID NO: 59)
R1F2
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SGSGGS (SEQ ID NO: 48)
REWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 68)
SQSISSY (SEQ ID NO: 57)
AAS (SEQ ID NO: 58)
SYSTPL (SEQ ID NO: 59)
R1G5
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SGSGGS (SEQ ID NO: 48)
REWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 76)
SQSISSY (SEQ ID NO: 57)
AAS (SEQ ID NO: 58)
SYSTPL (SEQ ID NO: 59)
Консенсусная последовательность
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SGSGGS (SEQ ID NO: 48)
REWX<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>WX<sub>7</sub>X<sub>8</sub>DY, где X<sub>1</sub> отсутствует или представляет собой V; X<sub>2</sub> отсутствует или представляет собой P; X<sub>3</sub> представляет собой W или Y; X<sub>4</sub> представляет собой G, Y или D; X<sub>5</sub> представляет собой E, D или V; X<sub>6</sub> представляет собой S или D; X<sub>7</sub> представляет собой L или Y; и X<sub>8</sub> представляет собой F или L (SEQ ID NO: 84)
SQSISSY (SEQ ID NO: 57)
AAS (SEQ ID NO: 58)
SYSTPL (SEQ ID NO: 59)
Таблица 5. CDR по IMGT иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA
IMGT
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
R1B6
GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49)
ISGSGGST (SEQ ID NO: 50)
ARREWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 51)
QSISSY (SEQ ID NO: 60)
AAS (SEQ ID NO: 58)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
R1F2
GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49)
ISGSGGST (SEQ ID NO: 50)
ARREWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 69)
QSISSY (SEQ ID NO: 60)
AAS (SEQ ID NO: 58)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
R1G5
GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49)
ISGSGGST (SEQ ID NO: 50)
ARREWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 77)
QSISSY (SEQ ID NO: 60)
AAS (SEQ ID NO: 58)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
Консенсусная последовательность
GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49)
ISGSGGST (SEQ ID NO: 50)
ARREWX<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>WX<sub>7</sub>X<sub>8</sub>DY, где X<sub>1</sub> отсутствует или представляет собой V; X<sub>2</sub> отсутствует или представляет собой P; X<sub>3</sub> представляет собой W или Y; X<sub>4</sub> представляет собой G, Y или D; X<sub>5</sub> представляет собой E, D или V; X<sub>6</sub> представляет собой S или D; X<sub>7</sub> представляет собой L или Y; и X<sub>8</sub> представляет собой F или L (SEQ ID NO: 85)
QSISSY (SEQ ID NO: 60)
AAS (SEQ ID NO: 58)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)
Таблица 6. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, полученных из В-клеток, связывающихся с BCMA
SEQ ID NO
Название/описание
Последовательность
PI61
SEQ ID NO: 86
HCDR1 (Kabat)
SYGMH
SEQ ID NO: 87
HCDR2 (Kabat)
VISYDGSNKYYADSVKG
SEQ ID NO: 88
HCDR3 (Kabat)
SGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 47
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 89
HCDR2 (Chothia)
SYDGSN
SEQ ID NO: 88
HCDR3 (Chothia)
SGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 90
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSYG
SEQ ID NO: 91
HCDR2 (IMGT)
ISYDGSNK
SEQ ID NO: 92
HCDR3 (IMGT)
GGSGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 93
VH
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 94
ДНК VH
CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGC
SEQ ID NO: 95
LCDR1 (Kabat)
TGTSSDVGGYNYVS
SEQ ID NO: 96
LCDR2 (Kabat)
DVSNRPS
SEQ ID NO: 97
LCDR3 (Kabat)
SSYTSSSTLYV
SEQ ID NO: 98
LCDR1 (Chothia)
TSSDVGGYNY
SEQ ID NO: 99
LCDR2 (Chothia)
DVS
SEQ ID NO: 100
LCDR3 (Chothia)
YTSSSTLY
SEQ ID NO: 101
LCDR1 (IMGT)
SSDVGGYNY
SEQ ID NO: 99
LCDR2 (IMGT)
DVS
SEQ ID NO: 97
LCDR3 (IMGT)
SSYTSSSTLYV
SEQ ID NO: 102
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL
SEQ ID NO: 103
ДНК VL
CAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG
SEQ ID NO: 104
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 105
scFv (VH-линкер-VL)
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL
SEQ ID NO: 106
ДНК scFv
CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG
SEQ ID NO: 107
Полная аминокислотная последовательность CAR
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 108
Полная последовательность ДНК CAR
CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACcaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg
B61-02
SEQ ID NO: 86
HCDR1 (Kabat)
SYGMH
SEQ ID NO: 109
HCDR2 (Kabat)
VISYKGSNKYYADSVKG
SEQ ID NO: 88
HCDR3 (Kabat)
SGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 47
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 110
HCDR2 (Chothia)
SYKGSN
SEQ ID NO: 88
HCDR3 (Chothia)
SGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 90
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSYG
SEQ ID NO: 111
HCDR2 (IMGT)
ISYKGSNK
SEQ ID NO: 92
HCDR3 (IMGT)
GGSGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 112
VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 113
ДНК VH
CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCT
SEQ ID NO: 95
LCDR1 (Kabat)
TGTSSDVGGYNYVS
SEQ ID NO: 114
LCDR2 (Kabat)
EVSNRLR
SEQ ID NO: 115
LCDR3 (Kabat)
SSYTSSSALYV
SEQ ID NO: 98
LCDR1 (Chothia)
TSSDVGGYNY
SEQ ID NO: 116
LCDR2 (Chothia)
EVS
SEQ ID NO: 117
LCDR3 (Chothia)
YTSSSALY
SEQ ID NO: 101
LCDR1 (IMGT)
SSDVGGYNY
SEQ ID NO: 116
LCDR2 (IMGT)
EVS
SEQ ID NO: 115
LCDR3 (IMGT)
SSYTSSSALYV
SEQ ID NO: 118
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVL
SEQ ID NO: 119
ДНК VL
CAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 120
scFv (VH-линкер-VL)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVL
SEQ ID NO: 121
ДНК scFv
CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG
SEQ ID NO: 122
Полная аминокислотная последовательность CAR
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 123
Полная последовательность ДНК CAR
CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
B61-10
SEQ ID NO: 86
HCDR1 (Kabat)
SYGMH
SEQ ID NO: 109
HCDR2 (Kabat)
VISYKGSNKYYADSVKG
SEQ ID NO: 88
HCDR3 (Kabat)
SGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 47
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSY
SEQ ID NO: 110
HCDR2 (Chothia)
SYKGSN
SEQ ID NO: 88
HCDR3 (Chothia)
SGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 90
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSYG
SEQ ID NO: 111
HCDR2 (IMGT)
ISYKGSNK
SEQ ID NO: 92
HCDR3 (IMGT)
GGSGYALHDDYYGLDV
SEQ ID NO: 112
VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 113
ДНК VH
CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCT
SEQ ID NO: 95
LCDR1 (Kabat)
TGTSSDVGGYNYVS
SEQ ID NO: 114
LCDR2 (Kabat)
EVSNRLR
SEQ ID NO: 97
LCDR3 (Kabat)
SSYTSSSTLYV
SEQ ID NO: 98
LCDR1 (Chothia)
TSSDVGGYNY
SEQ ID NO: 116
LCDR2 (Chothia)
EVS
SEQ ID NO: 100
LCDR3 (Chothia)
YTSSSTLY
SEQ ID NO: 101
LCDR1 (IMGT)
SSDVGGYNY
SEQ ID NO: 116
LCDR2 (IMGT)
EVS
SEQ ID NO: 97
LCDR3 (IMGT)
SSYTSSSTLYV
SEQ ID NO: 124
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL
SEQ ID NO: 125
ДНК VL
CAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 126
scFv (VH-линкер-VL)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL
SEQ ID NO: 127
ДНК scFv
CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG
SEQ ID NO: 128
Полная аминокислотная последовательность CAR
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 129
Полная последовательность ДНК CAR
CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
Таблица 7. CDR по Kabat иллюстративных молекул, полученных из B-клеток, связывающихся с BCMA
Kabat
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
PI61
SYGMH (SEQ ID NO: 86)
VISYDGSNKY YADSVKG (SEQ ID NO: 87)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95)
DVSNRPS (SEQ ID NO: 96)
SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97)
B61-02
SYGMH (SEQ ID NO: 86)
VISYKGSNKY YADSVKG (SEQ ID NO: 109)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95)
EVSNRLR (SEQ ID NO: 114)
SSYTSSSALYV (SEQ ID NO: 115)
B61-10
SYGMH (SEQ ID NO: 86)
VISYKGSNKY YADSVKG (SEQ ID NO: 109)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95)
EVSNRLR (SEQ ID NO: 114)
SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97)
Консенсусная последовательность
SYGMH (SEQ ID NO: 86)
VISYXGSNKY YADSVKG, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 130)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95)
X<sub>1</sub>VSNRX<sub>2</sub>X<sub>3</sub>, где X<sub>1</sub> представляет собой D или E; X<sub>2</sub> представляет собой P или L; и X<sub>3</sub> представляет собой S или R (SEQ ID NO: 131)
SSYTSSSXLYV, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 132)
Таблица 8. CDR по Chothia иллюстративных молекул, полученных из B-клеток, связывающихся с BCMA
Chothia
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
PI61
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SYDGSN (SEQ ID NO: 89)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98)
DVS (SEQ ID NO: 99)
YTSSSTLY (SEQ ID NO: 100)
B61-02
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SYKGSN (SEQ ID NO: 110)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98)
EVS (SEQ ID NO: 116)
YTSSSALY (SEQ ID NO: 117)
B61-10
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SYKGSN (SEQ ID NO: 110)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98)
EVS (SEQ ID NO: 116)
YTSSSTLY (SEQ ID NO: 100)
Консенсусная последовательность
GFTFSSY (SEQ ID NO: 47)
SYXGSN, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 133)
SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88)
TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98)
XVS, где X представляет собой D или E (SEQ ID NO: 134)
YTSSSXLY, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 135)
Таблица 9. CDR по IMGT иллюстративных молекул, полученных из B-клеток, связывающихся с BCMA
IMGT
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
PI61
GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90)
ISYDGSNK (SEQ ID NO: 91)
GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92)
SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101)
DVS (SEQ ID NO: 99)
SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97)
B61-02
GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90)
ISYKGSNK (SEQ ID NO: 111)
GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92)
SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101)
EVS (SEQ ID NO: 116)
SSYTSSSALYV (SEQ ID NO: 115)
B61-10
GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90)
ISYKGSNK (SEQ ID NO: 111)
GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92)
SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101)
EVS (SEQ ID NO: 116)
SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97)
Консенсусная последовательность
GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90)
ISYXGSNK, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 136)
GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92)
SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101)
XVS, где X представляет собой D или E (SEQ ID NO: 134)
SSYTSSSXLYV, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 132)
Таблица 18. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, на основе PI61
Идентификация
Последовательность белка
Последовательность ДНК (5'-3')
Сигнальный пептид
MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 1)
Atggccctccctgtcaccgctctgttgctgccgcttgctctgctgctccacgcagcgcgaccg (SEQ ID NO: 252)
VH PI61
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93)
CAGGTACAATTGCAGGAGTCTGGAGGCGGTGTGGTGCAACCCGGTCGCAGCTTGCGCCTGAGTTGTGCTGCGTCTGGATTTACATTTTCATCTTACGGAATGCATTGGGTACGCCAGGCACCGGGGAAAGGCCTTGAATGGGTGGCTGTAATTTCATACGATGGTTCCAACAAATACTATGCTGACTCAGTCAAGGGTCGATTTACAATTAGTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTTTATCTTCAAATGAATTCCCTTAGAGCAGAGGATACGGCGGTCTATTACTGTGGTGGCAGTGGTTATGCACTTCATGATGATTACTATGGCTTGGATGTCTGGGGGCAAGGGACGCTTGTAACTGTATCCTCT (SEQ ID NO: 260)
VL PI61
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL (SEQ ID NO: 102)
caatctgctctgactcaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagagtattaccataagttgcacggggacctctagcgatgtaggggggtataattatgtatcttggtatcaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgatctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtatcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatacggcgtcccttactattagcggattgcaagcagaagatgaggccgattactactgcagctcctatactagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactc (SEQ ID NO: 261)
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 104)
ScFv PI61
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL (SEQ ID NO: 105)
CaggtacaattgcaggagtctggaggcggtgtgGtgcaacccggtcgcagcttgcgcctgagttgtGctgcgtctggatttacattttcatcttacggaAtgcattgggtacgccaggcaccggggaaaggcCttgaatgggtggctgtaatttcatacgatggtTccaacaaatactatgctgactcagtcaagggtCgatttacaattagtcgggacaactccaagaacAccctttatcttcaaatgaattcccttagagcaGaggatacggcggtctattactgtggtggcagtGgttatgcacttcatgatgattactatggcttgGatgtctgggggcaagggacgcttgtaactgtaTcctctggtggtggtggtagtggtgggggaggcTccggcggtggcggctctcaatctgctctgactCaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagAgtattaccataagttgcacggggacctctagcGatgtaggggggtataattatgtatcttggtatCaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgAtctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtaTcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatAcggcgtcccttactattagcggattgcaagcaGaagatgaggccgattactactgcagctcctatActagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactc (SEQ ID NO: 253)
Трансмембранный домен и шарнирная область
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 202)
AcaacaacacctgccccgagaccgcctacaccaGccccgactattgccagccagcctctgagcctcAggcctgaggcctgtaggcccgcagcgggcggcGcagttcatacacggggcttggatttcgcttgtGatatttatatttgggctcctttggcggggacaTgtggcgtgctgcttctgtcacttgttattacactgtactgt (SEQ ID NO: 254)
4-1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 7)
AaacgcgggcgaaaaaaattgctgtatatttttAagcagccatttatgaggcccgttcagacgacgCaggaggaggacggttgctcttgcaggttcccagaagaggaagaagggggctgtgaattg (SEQ ID NO: 255)
CD3-дзета
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10)
CgggttaaattttcaagatccgcagacgctccaGcataccaacagggacaaaaccaactctataacGagctgaatcttggaagaagggaggaatatgatGtgctggataaacggcgcggtagagatccggagAtgggcggaaaaccaaggcgaaaaaaccctcagGagggactctacaacgaactgcagaaagacaaaAtggcggaggcttattccgaaataggcatgaagGgcgagcggaggcgagggaaagggcacgacggaCtgtatcaaggcctctcaaccgcgactaaggatAcgtacgacgccctgcacatgcaggccctgcctccgaga (SEQ ID NO: 256)
Полная конструкция CAR PI61
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 257)
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCTCTGTTGCTGCCGCTTGCTCTGCTGCTCCACGCAGCGCGACCGCAGGTACAATTGCAGGAGTCTGGAGGCGGTGTGGTGCAACCCGGTCGCAGCTTGCGCCTGAGTTGTGCTGCGTCTGGATTTACATTTTCATCTTACGGAATGCATTGGGTACGCCAGGCACCGGGGAAAGGCCTTGAATGGGTGGCTGTAATTTCATACGATGGTTCCAACAAATACTATGCTGACTCAGTCAAGGGTCGATTTACAATTAGTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTTTATCTTCAAATGAATTCCCTTAGAGCAGAGGATACGGCGGTCTATTACTGTGGTGGCAGTGGTTATGCACTTCATGATGATTACTATGGCTTGGATGTCTGGGGGCAAGGGACGCTTGTAACTGTATCCTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGGGGAGGCTCCGGCGGTGGCGGCTCTCAATCTGCTCTGACTCAACCAGCAAGCGTATCAGGGTCACCGGGACAGAGTATTACCATAAGTTGCACGGGGACCTCTAGCGATGTAGGGGGGTATAATTATGTATCTTGGTATCAACAACACCCCGGGAAAGCCCCTAAATTGATGATCTACGACGTGAGCAATCGACCTAGTGGCGTATCAAATCGCTTCTCTGGTAGCAAGAGTGGGAATACGGCGTCCCTTACTATTAGCGGATTGCAAGCAGAAGATGAGGCCGATTACTACTGCAGCTCCTATACTAGCTCTTCTACATTGTACGTCTTTGGGAGCGGAACAAAAGTAACAGTACTCACAACAACACCTGCCCCGAGACCGCCTACACCAGCCCCGACTATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTCAGGCCTGAGGCCTGTAGGCCCGCAGCGGGCGGCGCAGTTCATACACGGGGCTTGGATTTCGCTTGTGATATTTATATTTGGGCTCCTTTGGCGGGGACATGTGGCGTGCTGCTTCTGTCACTTGTTATTACACTGTACTGTAAACGCGGGCGAAAAAAATTGCTGTATATTTTTAAGCAGCCATTTATGAGGCCCGTTCAGACGACGCAGGAGGAGGACGGTTGCTCTTGCAGGTTCCCAGAAGAGGAAGAAGGGGGCTGTGAATTGCGGGTTAAATTTTCAAGATCCGCAGACGCTCCAGCATACCAACAGGGACAAAACCAACTCTATAACGAGCTGAATCTTGGAAGAAGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGGCGCGGTAGAGATCCGGAGATGGGCGGAAAACCAAGGCGAAAAAACCCTCAGGAGGGACTCTACAACGAACTGCAGAAAGACAAAATGGCGGAGGCTTATTCCGAAATAGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGAGGGAAAGGGCACGACGGACTGTATCAAGGCCTCTCAACCGCGACTAAGGATACGTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCGAGA (SEQ ID NO: 258)
Зрелый белок CAR PI61
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 107)
caggtacaattgcaggagtctggaggcggtgtggtgcaacccggtcgcagcttgcgcctgagttgtgctgcgtctggatttacattttcatcttacggaatgcattgggtacgccaggcaccggggaaaggccttgaatgggtggctgtaatttcatacgatggttccaacaaatactatgctgactcagtcaagggtcgatttacaattagtcgggacaactccaagaacaccctttatcttcaaatgaattcccttagagcagaggatacggcggtctattactgtggtggcagtggttatgcacttcatgatgattactatggcttggatgtctgggggcaagggacgcttgtaactgtatcctctggtggtggtggtagtggtgggggaggctccggcggtggcggctctcaatctgctctgactcaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagagtattaccataagttgcacggggacctctagcgatgtaggggggtataattatgtatcttggtatcaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgatctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtatcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatacggcgtcccttactattagcggattgcaagcagaagatgaggccgattactactgcagctcctatactagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactcacaacaacacctgccccgagaccgcctacaccagccccgactattgccagccagcctctgagcctcaggcctgaggcctgtaggcccgcagcgggcggcgcagttcatacacggggcttggatttcgcttgtgatatttatatttgggctcctttggcggggacatgtggcgtgctgcttctgtcacttgttattacactgtactgtaaacgcgggcgaaaaaaattgctgtatatttttaagcagccatttatgaggcccgttcagacgacgcaggaggaggacggttgctcttgcaggttcccagaagaggaagaagggggctgtgaattgcgggttaaattttcaagatccgcagacgctccagcataccaacagggacaaaaccaactctataacgagctgaatcttggaagaagggaggaatatgatgtgctggataaacggcgcggtagagatccggagatgggcggaaaaccaaggcgaaaaaaccctcaggagggactctacaacgaactgcagaaagacaaaatggcggaggcttattccgaaataggcatgaagggcgagcggaggcgagggaaagggcacgacggactgtatcaaggcctctcaaccgcgactaaggatacgtacgacgccctgcacatgcaggccctgcctccgaga (SEQ ID NO: 259)
Таблица 10. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA
SEQ ID NO
Название/описание
Последовательность
Hy03
SEQ ID NO: 137
HCDR1 (Kabat)
GFWMS
SEQ ID NO: 138
HCDR2 (Kabat)
NIKQDGSEKYYVDSVRG
SEQ ID NO: 139
HCDR3 (Kabat)
ALDYYGMDV
SEQ ID NO: 140
HCDR1 (Chothia)
GFTFSGF
SEQ ID NO: 141
HCDR2 (Chothia)
KQDGSE
SEQ ID NO: 139
HCDR3 (Chothia)
ALDYYGMDV
SEQ ID NO: 142
HCDR1 (IMGT)
GFTFSGFW
SEQ ID NO: 143
HCDR2 (IMGT)
IKQDGSEK
SEQ ID NO: 144
HCDR3 (IMGT)
ARALDYYGMDV
SEQ ID NO: 145
VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 146
ДНК VH
GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGC
SEQ ID NO: 147
LCDR1 (Kabat)
RSSQSLLDSDDGNTYLD
SEQ ID NO: 148
LCDR2 (Kabat)
TLSYRAS
SEQ ID NO: 149
LCDR3 (Kabat)
TQRLEFPSIT
SEQ ID NO: 150
LCDR1 (Chothia)
SQSLLDSDDGNTY
SEQ ID NO: 151
LCDR2 (Chothia)
TLS
SEQ ID NO: 152
LCDR3 (Chothia)
RLEFPSI
SEQ ID NO: 153
LCDR1 (IMGT)
QSLLDSDDGNTY
SEQ ID NO: 151
LCDR2 (IMGT)
TLS
SEQ ID NO: 149
LCDR3 (IMGT)
TQRLEFPSIT
SEQ ID NO: 154
VL
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 155
ДНК VL
GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 156
scFv (VH-линкер-VL)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 157
ДНК scFv
GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG
SEQ ID NO: 158
Полная аминокислотная последовательность CAR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 159
Полная последовательность ДНК CAR
GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
Hy52
SEQ ID NO: 160
HCDR1 (Kabat)
SFRMN
SEQ ID NO: 161
HCDR2 (Kabat)
SISSSSSYIYYADSVKG
SEQ ID NO: 162
HCDR3 (Kabat)
WLSYYGMDV
SEQ ID NO: 163
HCDR1 (Chothia)
GFTFSSF
SEQ ID NO: 164
HCDR2 (Chothia)
SSSSSY
SEQ ID NO: 162
HCDR3 (Chothia)
WLSYYGMDV
SEQ ID NO: 165
HCDR1 (IMGT)
GFTFSSFR
SEQ ID NO: 166
HCDR2 (IMGT)
ISSSSSYI
SEQ ID NO: 167
HCDR3 (IMGT)
ARWLSYYGMDV
SEQ ID NO: 168
VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 169
ДНК VH
GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGC
SEQ ID NO: 147
LCDR1 (Kabat)
RSSQSLLDSDDGNTYLD
SEQ ID NO: 170
LCDR2 (Kabat)
TLSFRAS
SEQ ID NO: 171
LCDR3 (Kabat)
MQRIGFPIT
SEQ ID NO: 150
LCDR1 (Chothia)
SQSLLDSDDGNTY
SEQ ID NO: 151
LCDR2 (Chothia)
TLS
SEQ ID NO: 172
LCDR3 (Chothia)
RIGFPI
SEQ ID NO: 153
LCDR1 (IMGT)
QSLLDSDDGNTY
SEQ ID NO: 151
LCDR2 (IMGT)
TLS
SEQ ID NO: 171
LCDR3 (IMGT)
MQRIGFPIT
SEQ ID NO: 173
VL
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 174
ДНК VL
GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG
SEQ ID NO: 63
Линкер
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 175
scFv (VH-линкер-VL)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 176
ДНК scFv
GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG
SEQ ID NO: 177
Полная аминокислотная последовательность CAR
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 178
Полная последовательность ДНК CAR
GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
Таблица 11. CDR по Kabat иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA
Kabat
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
Hy03
GFWMS (SEQ ID NO: 137)
NIKQDGSEK YYVDSVRG (SEQ ID NO: 138)
ALDYYGMDV (SEQ ID NO: 139)
RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147)
TLSYRAS (SEQ ID NO: 148)
TQRLEFPSIT (SEQ ID NO: 149)
Hy52
SFRMN (SEQ ID NO: 160)
SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 161)
WLSYYGMDV (SEQ ID NO: 162)
RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147)
TLSFRAS (SEQ ID NO: 170)
MQRIGFPIT (SEQ ID NO: 171)
Консенсусная последовательность
X<sub>1</sub>FX<sub>2</sub>MX<sub>3</sub>, где X<sub>1</sub> представляет собой G или S; X<sub>2</sub> представляет собой W или R; и X<sub>3</sub> представляет собой S или N (SEQ ID NO: 179)
X<sub>1</sub>IX<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>S X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>YYX<sub>8</sub>DSVX<sub>9</sub>G, где X<sub>1</sub> представляет собой N или S; X<sub>2</sub> представляет собой K или S; X<sub>3</sub> представляет собой Q или S; X<sub>4</sub> представляет собой D или S; X<sub>5</sub> представляет собой G или S; X<sub>6</sub> представляет собой E или Y; X<sub>7</sub> представляет собой K или I; X<sub>8</sub> представляет собой V или A; и X<sub>9</sub> представляет собой R или K (SEQ ID NO: 180)
X<sub>1</sub>LX<sub>2</sub>YYGMDV, где X<sub>1</sub> представляет собой A или W; и X<sub>2</sub> представляет собой D или S (SEQ ID NO: 181)
RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147)
TLSXRAS, где X представляет собой Y или F (SEQ ID NO: 182)
X<sub>1</sub>QRX<sub>2 </sub>X<sub>3</sub>FPX<sub>4</sub>IT, где X<sub>1</sub> представляет собой T или M; X<sub>2</sub> представляет собой L или I; X<sub>3</sub> представляет собой E или G; и X<sub>4</sub> представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 183)
Таблица 12. CDR по Chothia иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA
Chothia
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
Hy03
GFTFSGF (SEQ ID NO: 140)
KQDGSE (SEQ ID NO: 141)
ALDYYGMDV (SEQ ID NO: 139)
SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150)
TLS (SEQ ID NO: 151)
RLEFPSI (SEQ ID NO: 152)
Hy52
GFTFSSF (SEQ ID NO: 163)
SSSSSY (SEQ ID NO: 164)
WLSYYGMDV (SEQ ID NO: 162)
SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150)
TLS (SEQ ID NO: 151)
RIGFPI (SEQ ID NO: 172)
Консенсусная последовательность
GFTFSXF, где X представляет собой G или S (SEQ ID NO: 184)
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>SX<sub>5</sub>, где X<sub>1</sub> представляет собой K или S; X<sub>2</sub> представляет собой Q или S; X<sub>3</sub> представляет собой D или S; X<sub>4</sub> представляет собой G или S; и X<sub>5</sub> представляет собой E или Y (SEQ ID NO: 185)
X<sub>1</sub>LX<sub>2</sub>YYGMDV, где X<sub>1</sub> представляет собой A или W; и X<sub>2</sub> представляет собой D или S (SEQ ID NO: 181)
SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150)
TLS (SEQ ID NO: 151)
RX<sub>1</sub>X<sub>2</sub>FPX<sub>3</sub>I, где X<sub>1</sub> представляет собой L или I; X<sub>2</sub> представляет собой E или G; и X<sub>3</sub> представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 186)
Таблица 13. CDR по IMGT иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA
IMGT
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
Hy03
GFTFSGFW (SEQ ID NO: 142)
IKQDGSEK (SEQ ID NO: 143)
ARALDYYGMDV (SEQ ID NO: 144)
QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153)
TLS (SEQ ID NO: 151)
TQRLEFPSIT (SEQ ID NO: 149)
Hy52
GFTFSSFR (SEQ ID NO: 165)
ISSSSSYI (SEQ ID NO: 166)
ARWLSYYGMDV (SEQ ID NO: 167)
QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153)
TLS (SEQ ID NO: 151)
MQRIGFPIT (SEQ ID NO: 171)
Консенсусная последовательность
GFTFSX<sub>1</sub>FX<sub>2</sub>, где X<sub>1</sub> представляет собой G или S; и X<sub>2</sub> представляет собой W или R (SEQ ID NO: 187)
IX<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>SX<sub>5</sub>X<sub>6</sub>, где X<sub>1</sub> представляет собой K или S; X<sub>2</sub> представляет собой Q или S; X<sub>3</sub> представляет собой D или S; X<sub>4</sub> представляет собой G или S; X<sub>5</sub> представляет собой E или Y; и X<sub>6</sub> представляет собой K или I (SEQ ID NO: 188)
ARX<sub>1</sub>LX<sub>2</sub>YYGMDV, где X<sub>1</sub> представляет собой A или W; и X<sub>2</sub> представляет собой D или S (SEQ ID NO: 189)
QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153)
TLS (SEQ ID NO: 151)
X<sub>1</sub>QRX<sub>2</sub>X<sub>3</sub>FPX<sub>4</sub>IT, где X<sub>1</sub> представляет собой T или M; X<sub>2</sub> представляет собой L или I; X<sub>3</sub> представляет собой E или G; и X<sub>4</sub> представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 183)
В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC.
В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат
(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из
(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 54, CDR2 LC под SEQ ID NO: 55 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 56; и/или
(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:
(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 84;
(ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 46;
(iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 68; или
(iv) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 76.
В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат
(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC) из любой из следующих:
(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 131 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 132;
(ii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 96 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 97;
(iii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 114 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 115; или
(iv) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 114 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 97; и/или
(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:
(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 130 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88;
(ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 87 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88; или
(iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 109 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88.
В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат
(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC) из любой из следующих:
(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 182 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 183;
(ii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 148 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 149; или
(iii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 170 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 171; и/или
(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:
(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 179, CDR2 HC под SEQ ID NO: 180 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 181;
(ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 137, CDR2 HC под SEQ ID NO: 138 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 139; или
(iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 160, CDR2 HC под SEQ ID NO: 161 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 162.
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 84, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 46, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 68, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 76, 57, 58 и 59 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 85, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 51, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 69, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 77, 60, 58 и 56 соответственно.
4
В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит scFv, содержащий VH (например, VH, описанную в данном документе) и VL (например, VL, описанную в данном документе). В некоторых вариантах осуществления VH присоединена к VL посредством линкера, например, линкера, описанного в данном документе, например, линкера, описанного в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит линкер (Gly-Ser)n, где n равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.
В одном аспекте домен, связывающий BCMA, представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В одном аспекте домен, связывающий BCMA, представляет собой Fv, Fab, (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В одном аспекте антитела и их фрагменты по настоящему изобретению связываются c белком BCMA с аффинностью дикого типа или усиленной аффинностью.
В некоторых случаях scFv можно получить в соответствии со способом, известным из уровня техники (см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы scFv можно получить путем связывания VH- и VL-областей друг с другом с помощью гибких полипептидных линкеров.Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом.Длина линкера может сильно влиять на укладку и взаимодействие вариабельных областей scFv. В действительности, если используют короткий полипептидный линкер (например, длиной 5-10 аминокислот), то предотвращается укладка внутри одной цепи. Межцепочечная укладка также необходима для объединения двух вариабельных областей вместе с образованием функционального эпитопсвязывающего участка. Примеры ориентации и размера линкеров см., например, в Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикациях заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикациях согласно PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенных в данный документ посредством ссылки.
4
4
4
4
3
scFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислотных остатков между его VL- и VH-областями. Линкерная последовательность может содержать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит аминокислоты глицин и серин. В другом варианте осуществления линкерная последовательность содержит группы глициновых и сериновых повторов, таких как (GlySer)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой (GlySer) (SEQ ID NO: 27) или (GlySer)(SEQ ID NO: 28). При изменении длины линкера может сохраняться или усиливаться активность, что приводит к улучшению эффективности в исследованиях активности.
Трансмембранный домен
Что касается трансмембранного домена, в различных вариантах осуществления CAR можно разработать таким образом, чтобы он содержал трансмембранный домен, присоединенный к внеклеточному домену CAR. Трансмембранный домен может содержать одну или несколько дополнительных аминокислот, прилегающих к трансмембранной области, например, одну или несколько аминокислот, относящихся к внеклеточной области белка, из которого получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внеклеточной области), и/или одну или несколько дополнительных аминокислот, относящихся к внутриклеточной области белка, из которого получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внутриклеточной области). В одном аспекте трансмембранный домен представляет собой домен, ассоциированный с одним из остальных используемых доменов CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен можно выбрать или модифицировать с помощью аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков, например, чтобы свести к минимуму взаимодействия с другими элементами рецепторного комплекса. В одном аспекте трансмембранный домен способен к гомодимеризации с другим CAR на поверхности клетки, экспрессирующей CAR, например, CAR-T-клетки. В другом аспекте аминокислотную последовательность трансмембранного домена можно модифицировать или подвергнуть замене таким образом, чтобы свести к минимуму взаимодействия со связывающими доменами нативного партнера по связыванию, присутствующего в той же клетке, экспрессирующей CAR, например, CAR-T.
Трансмембранный домен может быть получен из природного либо из рекомбинантного источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. В одном аспекте трансмембранный домен способен передавать сигнал внутриклеточному(внутриклеточным) домену(доменам) всякий раз, когда CAR связался с мишенью. Трансмембранный домен, особенно применимый в настоящем изобретении, может включать по меньшей мере трансмембранную(трансмембранные) область(области), например, альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8-альфа, CD8-бета), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может включать по меньшей мере трансмембранную(трансмембранные) область(области) костимулирующей молекулы, например, молекулы MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфично связывается с CD83.
В некоторых случаях трансмембранный домен может быть присоединен к внеклеточной области CAR, например, антигенсвязывающему домену CAR, посредством шарнирной области, например, шарнирной области из белка человека. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область может представлять собой шарнирную область Ig (иммуноглобулина) человека, например, шарнирную область IgG4 или шарнирную область CD8a. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат (например, состоят из нее) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В одном аспекте трансмембранный домен содержит трансмембранный домен под SEQ ID NO: 6.
В одном аспекте шарнирная область или спейсер включают в себя шарнирную область IgG4. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 14.
В одном аспекте шарнирная область или спейсер включают в себя шарнирную область IgD. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO:15.
В одном аспекте трансмембранный домен может быть рекомбинантным, и в этом случае он будет содержать главным образом гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В одном аспекте на каждом конце рекомбинантного трансмембранного домена может находиться триплет из фенилаланина, триптофана и валина.
Короткий олиго- или полипептидный линкер длиной от 2 до 10 аминокислот необязательно может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматической областью CAR. Глицин-сериновый дублет представляет собой особенно подходящий линкер. Например, в одном аспекте линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления линкер кодируется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 16.
В одном аспекте шарнирная область или спейсер включают в себя шарнирную область KIR2DS2.
Цитоплазматический домен
Цитоплазматические домен или область CAR по настоящему изобретению содержат внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обычно отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был введен CAR.
Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR по настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторов, которые действуют совместно с инициированием передачи сигнала после вступления в контакт с антигенным рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, которая обладает такими же функциональными способностями.
Известно, что сигналы, образуемые при участии только TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и что также необходим вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клеток опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию посредством TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и теми, которые действуют антигеннезависимым образом, передавая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический домен, например, костимулирующий домен).
Первичный сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом либо ингибирующим образом. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM.
Примеры ITAM-содержащих первичных внутриклеточных сигнальных доменов, которые являются особенно применимыми в настоящем изобретении, включают домены TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI, DAP10, DAP12 и CD66d. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный домен ITAM, например, мутантный домен ITAM, который обладает измененной (например, повышенной или пониженной) активностью по сравнению с нативным доменом ITAM. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, оптимизированный и/или усеченный первичный внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM. В одном варианте осуществления первичный сигнальный домен содержит один, два, три, четыре или более мотивов ITAM.
Дополнительные примеры молекул, содержащих первичный внутриклеточный сигнальный домен, являющихся особенно применимыми в настоящем изобретении, включают молекулы DAP10, DAP12 и CD32.
Внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать первичный сигнальный домен, например, сигнальный домен CD3-дзета, в отдельности или в комбинации с любым(любыми) другим(другими) требуемым(требуемыми) внутриклеточным(внутриклеточными) сигнальным(сигнальными) доменом(доменами), применимым(применимыми) в качестве составной части CAR по настоящему изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать первичный сигнальный домен, например, часть дзета-цепи CD3, и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу поверхности клетки, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры такой молекулы включают молекулу MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NRG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфично связывается с CD83, и т. п. Например, было продемонстрировано, что костимуляция с помощью CD27 усиливает размножение, эффекторную функцию и выживание CAR-T-клеток человека in vitro и усиливает персистенцию и противоопухолевую активность T-клеток человека in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Внутриклеточные сигнальные последовательности в цитоплазматической части CAR по настоящему изобретению могут быть связаны друг с другом в случайном или установленном порядке. Короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот), необязательно может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления в качестве подходящего линкера может применяться глицин-сериновый дублет. В некоторых вариантах осуществления в качестве подходящего линкера может применяться одна аминокислота, например, аланин, глицин.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит два или более, например, 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов. В одном варианте осуществления два или более, например, 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов разделены линкерной молекулой, например, линкерной молекулой, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит два костимулирующих сигнальных домена. В некоторых вариантах осуществления линкерная молекула представляет собой глициновый остаток. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой аланиновый остаток.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1BB. В одном аспекте сигнальный домен 4-1BB представляет собой сигнальный домен под SEQ ID NO: 7. В одном аспекте сигнальный домен CD3-дзета представляет собой сигнальный домен под SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (CD3-дзета человека дикого типа).
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD27. В одном аспекте сигнальный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В одном аспекте сигнальный домен CD27 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 19.
В одном аспекте внутриклеточный сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте сигнальный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36. В одном аспекте сигнальный домен CD28 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 37.
В одном аспекте внутриклеточный сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен ICOS. В одном аспекте сигнальный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38. В одном аспекте сигнальный домен ICOS кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 39.
Конфигурации CAR
Полиспецифические CAR
В одном варианте осуществления CAR по настоящему изобретению представляет собой полиспецифический CAR. В некоторых вариантах осуществления полиспецифический CAR представляет собой биспецифический CAR. В некоторых вариантах осуществления биспецифический CAR содержит антигенсвязывающий домен который представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, на одном и том же белке (или субъединице мультимерного белка). В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы перекрываются. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы не перекрываются. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на разных антигенах, например, на разных белках (или на разных субъединицах мультимерного белка). В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые характеризуются специфичностью связывания с первым эпитопом, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые характеризуются специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит полуантитело, характеризующееся специфичностью связывания с первым эпитопом, и полуантитело, характеризующееся специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит полуантитело или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания с первым эпитопом, и полуантитело или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит scFv или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания с первым эпитопом, и scFv или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания со вторым эпитопом.
В определенных вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий домен, который представляет собой полиспецифическую (например,биспецифическую или триспецифическую) молекулу антитела. Протоколы создания молекул биспецифического или гетеродимерного антител известны из уровня техники, включая без ограничения, например, подход "выступ во впадину", как описано, например,в US 5731168; спаривание Fc с использованием направленного электростатического взаимодействия, как описано, например,в WO 09/089004, WO 06/106905 и WO 2010/129304; образование гетеродимеров путем конструирования доменов с обменом нитей (SEED), как описано, например,в WO 07/110205; обмен Fab-фрагментами, как описано, например,в WO 08/119353, WO 2011/131746 и WO 2013/060867; двойные конъюгаты антител, например,получаемые путем сшивания антител с созданием биспецифической структуры с помощью гетеробифункционального реагента, содержащего реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную сульфгидрильную группу, как описано, например,в US 4433059; детерминанты биспецифических антител, создаваемые путем рекомбинации полуантител (пары тяжелая-легкая цепь или Fab) из разных антител посредством цикла восстановления и окисления дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями, например,в US 4444878; трифункциональные антитела, например,три Fab'-фрагмента, сшитые с помощью реакционноспособных сульфгидрильных групп, как описано, например,в US5273743; биосинтетические связывающие белки, например,пары scFv, сшитых на С-концевых хвостах, предпочтительно посредством химической сшивки посредством дисульфидных связей или реакционноспособных аминогрупп, как описано, например,в US5534254; бифункциональные антитела, например,Fab-фрагменты с различной специфичностью связывания, димеризованные с помощью лейциновых "застежек" (например,c-fos и c-jun), заменивших константный домен, как описано, например,в US5582996; биспецифические и олигоспецифические моно- и олиговалентные рецепторы, например,VH-CH1-области двух антител (два Fab-фрагмента), связанные полипептидным спейсером между CH1-областью одного антитела и VH-областью другого антитела, обычно с ассоциированными легкими цепями, как описано, например,в US5591828; биспецифические конъюгаты ДНК-антитело, например,получаемые путем сшивки антител или Fab-фрагментов двухнитевым фрагментом ДНК, как описано, например,в US5635602; биспецифические слитые белки, например,экспрессионную конструкцию, содержащую два scFv с гидрофильным спиральным пептидным линкером между ними и полной константной областью, как описано, например,в US5637481; поливалентные и полиспецифические связывающие белки, например,димер полипептидов, имеющий первый домен со связывающей областью вариабельной области тяжелой цепи Ig и второй домен со связывающей областью вариабельной области легкой цепи Ig, как правило, называемые диателами (также охватываются структуры более высокого порядка для создания биспецифических, триспецифических или тетраспецифических молекул, как описано, например,US5837242; конструкции миниантител со связанными VL- и VH-цепями, дополнительно соединенными пептидными спейсерами с шарнирной областью антитела и СН3-областью, которые могут быть димеризованы с образованием биспецифических/поливалентных молекул, как описано, например,в US5837821; VH- и VL-домены, связанные коротким пептидным линкером (например,из 5 или 10 аминокислот) или вовсе не имеющие линкера, в любой ориентации, которые могут образовывать димеры с образованием биспецифических диател; тримеры и тетрамеры, как описано, например,в US5844094; нить из VH-доменов (или VL-доменов у представителей семейства), соединенных пептидными связями со сшиваемыми группами на С-конце, дополнительно ассоциированных с VL-доменами с образованием последовательно соединенных Fv (или scFv), как описано, например,в US5864019; и одноцепочечные связывающие полипептиды как с VH-, так и с VL-доменами, связанными пептидным линкером, объединенные в поливалентные структуры посредством нековалентной или химической сшивки с образованием, например,гомобивалентных, гетеробивалентных, тривалентных и тетравалентных структур с использованием формата как типа scFv, так и типа диатела, как описано, например,в US5869620. Дополнительные иллюстративные полиспецифические и биспецифические молекулы и способы их получения находятся, например, в US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1. Содержание вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
1
1
2
2
1
1
2
2
1
1
2
2
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
4
В каждом антителе или фрагменте антитела (например, scFv) в молекуле биспецифического антитела VH может находиться выше или ниже VL. В некоторых вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VH (VH) расположена выше их VL (VL), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VL (VL) расположена выше их VH (VH), так что молекула биспецифического антитела в целом имеет организацию VH-VL-VL-VH. В других вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VL (VL) расположена выше их VH (VH), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VH (VH) расположена выше их VL (VL), так что молекула биспецифического антитела в целом имеет организацию VL-VH-VH-VL. Линкер необязательно располагается между двумя антителами или фрагментами антител (например, scFv), например, между VL и VL, если конструкция имеет организацию VH-VL-VL-VH, или между VH и VH, если конструкция имеет организацию VL-VH-VH-VL. Линкер может представлять собой линкер, описанный в данном документе, например, линкер (Gly-Ser)n, где n равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Обычно линкер между двумя scFv должен иметь достаточную длину для предотвращения неправильного спаривания между доменами двух scFv. Линкер необязательно располагается между VL и VH первого scFv. Линкер необязательно располагается между VL и VH второго scFv. В конструкциях, которые имеют несколько линкеров, любые два или более линкера могут быть одинаковыми или разными. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления биспецифический CAR содержит VL, VH и необязательно один или несколько линкеров, организованных согласно описанному в данном документе.
В одном аспекте молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например, scFv, который характеризуется специфичностью связывания с BCMA, например, содержит scFv, описанный в данном документе, например, описанный в таблицах 2, 6 и 10 или содержит CDR легкой цепи и/или CDR тяжелой цепи из BCMA scFv, описанного в данном документе, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом на другом антигене. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с антигеном, экспрессируемым на клетках AML, например, антигеном, отличным от BCMA. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с CD123. В качестве другого примера вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с CLL-1. В качестве другого примера вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с CD34. В качестве другого примера вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с FLT3. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с рецептором фолиевой кислоты бета. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с антигеном, экспрессируемым на B-клетках, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a.
Химерный TCR
В одном аспекте антитела к BCMA и фрагменты антител по настоящему изобретению (например, таковые, раскрытые в таблицах 2, 6 и 10) можно пересадить на один или несколько константных доменов цепи Т-клеточного рецептора ("TCR"), например, альфа-цепи TCR или бета-цепи TCR, с созданием химерного TCR. Не ограничиваясь какой-либо теорией полагают, что химерные TCR будут передавать сигналы через комплекс TCR при связывании антигена. Например, BCMA scFv, раскрытый в данном документе, можно пересадить на константный домен, например, на по меньшей мере часть внеклеточного константного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена, цепи TCR, например, альфа-цепи TCR и/или бета-цепи TCR. В качестве другого примера фрагмент антитела к BCMA, например, VL-домен, описанный в данном документе, можно пересадить на константный домен альфа-цепи TCR и фрагмент антитела к BCMA, например, VH домен, описанный в данном документе, можно пересадить на константный домен бета-цепи TCR (или, в качестве альтернативы, VL-домен можно пересадить на константный домен бета-цепи TCR, и VH-домен можно пересадить на альфа-цепь TCR). В качестве другого примера CDR антитела к BCMA или фрагмента антитела, например, CDR антитела к BCMA или фрагмента антитела, описанных в таблицах 2-13, можно пересадить на альфа- и/или бета-цепи TCR для создания химерного TCR, который специфически связывается с BCMA. Например, раскрытые в данном документе LCDR можно пересадить на вариабельный домен альфа-цепи TCR, а раскрытые в данном документе HCDR можно пересадить на вариабельный домен бета-цепи TCR или наоборот. Такие химерные TCR можно получить с помощью способов, известных из уровня техники (например, Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74).
Дополнительный варианты осуществления
В одном аспекте описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может дополнительно содержать второй CAR, например, второй CAR, который содержит другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени (BCMA) или другой мишени (например, CD19, CD20 или CS-1 или других мишеней множественной миеломы, например, легкой каппа-цепи, CD138, антигена Y системы Льюис или CD38 (Garfall et al., Discovery Medicine, 2014, 17(91):37-46)). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который нацеливается на первый антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на второй, другой антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что размещение костимулирующего сигнального домена, например, 4-1BB, CD28, CD27 ICOS или OX-40, на первом CAR, и первичного сигнального домена, например, CD3-дзета, на втором CAR может ограничивать активность CAR клетками, в которых экспрессируются обе мишени. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR для BCMA, который включает домен, связывающий BCMA, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который нацеливается на антиген, отличный от BCMA (например, антиген, экспрессируемый на клетках лейкоза или лимфомы, например, CD19, CD20, CS-1, легкую каппа-цепь, CD139, антиген Y системы Льюиса или CD38), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR для BCMA, который включает домен, связывающий BCMA, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на антиген, отличный от BCMA (например, антиген, экспрессируемый на клетках лейкоза или лимфомы, например, CD19, CD20, CS-1, легкая каппа-цепь, CD139, антиген Y системы Льюис или CD38), и включает антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит CAR для BCMA, описанный в данном документе, и CAR, который нацеливается на CD19 (CAR для CD19).
В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит CAR для BCMA, описанный в данном документе, и ингибирующий CAR. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, обнаруживаемый на нормальных клетках, но не на раковых клетках. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета.
В некоторых вариантах осуществления в случае, если клетка, экспрессирующая CAR, содержит два или более различных CAR, то антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, в качестве фрагмента, например, scFv, который не ассоциирует с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например, антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы, в том числе молекулы, определяющие комплементарность области, которых являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают без ограничения вариабельные домены тяжелых цепей, связывающие молекулы, в природных условиях лишенные легких цепей, отдельные домены, полученные из традиционных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасные структуры, отличные от полученных из антител. Молекулы SDAB могут являться любыми молекулами, известными из уровня техники, или любыми однодоменными молекулами, которые будут известны в будущем. Молекулы SDAB могут быть получены из любых видов, в том числе без ограничения из мыши, человека, верблюда, ламы, миноги, рыбы, акулы, козы, кролика и быка. Этот термин также охватывает встречающиеся в природе молекулы однодоменных антител из видов, отличных от Camelidae и акул.
В одном аспекте молекулу SDAB можно получить из вариабельной области иммуноглобулина, обнаруживаемого у рыб, как, например, та, которая получена из изотипа иммуноглобулина, известного как новый антигенный рецептор (NAR), обнаруживаемого в сыворотке крови акулы. Способы получения однодоменных молекул, получаемых из вариабельной области NAR ("IgNAR") описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.
Согласно другому аспекту молекула SDAB представляет собой встречающуюся в природе однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелая цепь, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрыты, например, в WO 9404678 и Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448. В целях ясности этот вариабельный домен, полученный из молекулы тяжелой цепи, в природных условиях лишенной легкой цепи, именуется в данном документе как VHH или нанотело, чтобы отличать его от традиционного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такую молекулу VHH можно получить от видов Camelidae, например, от верблюда, ламы, дромадера, альпаки и гуанако. Другие виды, помимо Camelidae, могут вырабатывать молекулы тяжелых цепей, в природных условиях лишенные легкой цепи; такие VHH входят в объем настоящего изобретения.
Молекулы SDAB могут быть рекомбинантными, с пересаженными CDR, гуманизированными, камелизированными, деиммунизированными и/или образованными in vitro (например, отобранными с помощью фагового дисплея).
Также было обнаружено, что в клетках, имеющих множество встроенных в мембрану химерных рецепторов, содержащих антигенсвязывающий домен, взаимодействия между антигенсвязывающими доменами рецепторов могут быть нежелательными, например, поскольку они ингибируют способность одного или нескольких антигенсвязывающих доменов связываться с их когнатными антигенами. Соответственно, в данном документе раскрыты клетки, имеющие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия. Также в данном документе раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия, а также способы получения и применения таких клеток и нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого и указанного второго не встречающегося в природе встроенного в мембрану химерного рецептора, предусматривает scFv, а другой предусматривает отдельный VH-домен, например, отдельный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги, или отдельный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши.
В некоторых вариантах осуществления в заявляемом изобретении предусмотрены первый и второй CAR, где антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR не содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR представляет собой scFv, а другой не является scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит один VH-домен, например, отдельный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или отдельный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит VHH-домен верблюдовых.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит scFv, а другой предусматривает отдельный VH-домен, например, отдельный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или отдельный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR предусматривает scFv, а другой предусматривает нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит scFv, а другой предусматривает VHH-домен верблюдовых.
В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR, при наличии его на поверхности клетки, со своим когнатным антигеном существенно не снижается благодаря наличию указанного второго CAR. В некоторых вариантах осуществления связывание связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR со своим когнатным антигеном в присутствии указанного второго CAR составляет 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от связывания антигенсвязывающего домена указанного первого CAR со своим когнатным антигеном в отсутствие указанного второго CAR.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR, при наличии их на поверхности клетки, ассоциируют друг с другом в меньшей степени, чем в случае если бы они оба являлись антигенсвязывающими доменами scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домены указанного первого CAR и указанного второго CAR, ассоциируют друг с другом на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньше, чем в случае если бы они оба являлись антигенсвязывающими доменами scFv.
В другом аспекте описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может дополнительно экспрессировать другое средство, например средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, например, средство, описанное в данном документе. Ингибирующие молекулы, например, PD1, в некоторых вариантах осуществления могут снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В некоторых вариантах осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид, например, из ингибирующей молекулы такой как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета или фрагмент любого из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любого из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 41BB, CD27 ICOS или CD28, например, описанные в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, сигнальный домен CD28, описанный в данном документе, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В ряде вариантов осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, содержит переключающий костимулирующий рецептор, например, описанный, в WO 2013/019615, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. PD1 является ингибирующим представителем семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Было показано, что два лиганда PD1, PD-L1 и PD-L2 подавляют активацию Т-клеток при связывании с PD1 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 является широко распространенным при различных формах рака у человека (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Иммуносупрессию можно устранить путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.
В некоторых вариантах осуществления средство содержит внеклеточный домен (ECD) ингибирующей молекулы, например, белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD1), который может быть слит с трансмембранным доменом и внутриклеточными сигнальными доменами, такими как 41BB и CD3-дзета (также упоминается в данном документе как PD1 CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1, при применении в комбинациях с CAR для BCMA, описанным в данном документе, улучшает персистенцию клетки, экспрессирующей CAR, например, T-клетки или NK-клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой CAR на основе PD1, содержащий внеклеточный домен PD1, указанный подчеркиванием в SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность, представленную ниже (SEQ ID NO: 22).
В некоторых вариантах осуществления средство содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR на основе PD1, например, CAR на основе PD1, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты для CAR на основе PD1 представлена под SEQ ID NO: 23, при этом ECD PD1 подчеркнут.
В другом аспекте, в настоящем изобретении предусмотрена популяция клеток, экспрессирующих CAR, например, CAR-T-клеток или экспрессирующих CAR NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR, содержит смесь клеток, экспрессирующих различные CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или экспрессирующих CAR NK-клеток) может содержать первую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий другой домен, связывающий BCMA, например, домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, который отличается от домена, связывающего BCMA, в CAR, экспрессируемом первой клеткой. В качестве другого примера, популяция клеток, экспрессирующих CAR, может содержать первую клетку, экспрессирующую CAR, который содержит домен, связывающий BCMA, например, описанный в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который содержит антигенсвязывающий домен для мишени, отличной от BCMA (например, CD19, CD20, CS-1, легкая каппа-цепь, CD139, антиген Y системы Льюис или CD38). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR, включает первую клетку, экспрессирующую CAR, содержащий домен, связывающий BCMA, например, описанный в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на CD19 (CAR для CD19). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR включает, например, первую клетку, экспрессирующую CAR, который включает первичный внутриклеточный сигнальный домен и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который включает вторичный сигнальный домен.
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрена популяция клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, и вторая клетка экспрессирует другое средство, например, средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, в некоторых вариантах осуществления могут снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В некоторых вариантах осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид, например, из ингибирующей молекулы, такой как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета или фрагмента любого из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любого из них) и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 41BB, CD27, ICOS или CD28, например, описанный в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, сигнальный домен CD28, описанный в данном документе и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе).
В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы, включающие введение популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или экспрессирующих CAR NK-клеток), например, смеси клеток, экспрессирующих различные CAR, в комбинации с другим средством, например, ингибитор киназы, такой как ингибитор киназы, описанный в данном документе. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы, включающие введение популяции клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий антигенсвязывающий домен для ассоциированного с раком антигена, описанного в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую другое средство, например, средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, в комбинации с другим средством, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в данном документе.
CAR, содержащие рецепторы естественных клеток-киллеров (NKR)
В одном варианте осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, содержит один или несколько компонентов рецептора естественных клеток-киллеров (NKR), тем самым образуя NKR-CAR. Компонент NKR может представлять собой трансмембранный домен, шарнирный домен или цитоплазматический домен любого из следующих рецепторов естественных клеток-киллеров: иммуноглобулиноподобного рецептора клеток-киллеров (KIR), например, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 и KIR3DP1; рецептора естественной цитотоксичности (NCR), например, NKp30, NKp44, NKp46; семейства рецепторов иммунных клеток, являющихся сигнальными молекулами активации лимфоцитов (SLAM), например, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME и CD2F-10; Fc-рецептора (FcR), например, CD16 и CD64; и рецепторов Ly49, например, LY49A, LY49C. Молекулы NKR-CAR, описанные в данном документе, могут взаимодействовать с адапторной молекулой или внутриклеточным сигнальным доменом, например, DAP12. Иллюстративные конфигурации и последовательности молекул CAR, содержащих компоненты NKR, описаны в международной публикации № WO2014/145252, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Стратегии регуляции химерных антигенных рецепторов
Существует множество путей, которыми можно регулировать формы активности CAR. В некоторых вариантах осуществления регулируемый CAR (RCAR), в котором можно контролировать активность CAR, является желательным для оптимизации безопасности и эффективности терапии с помощью CAR. Например, индуцируемый апоптоз с использованием, например, каспазы, слитой с димеризационным доменом (см., например, Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683), можно применять в качестве защитного переключателя в терапии с помощью CAR по настоящему изобретению. В другом примере клетки, экспрессирующие CAR, могут также экспрессировать индуцируемую молекулу каспазы-9 (iCaspase-9), которая при введении лекарственного средства-димеризатора (например, римидуцида (также называемого AP1903 (Bellicum Pharmaceuticals) или AP20187 (Ariad)) приводит к активации каспазы-9 и апоптозу клеток. Молекула iCaspase-9 содержит химический индуктор димеризационного (CID) связывающего домена, который опосредует димеризацию в присутствии CID. Это приводит к индуцируемому и селективному истощению клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых случаях молекула iCaspase-9 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, отдельной от вектора(векторов), кодирующего(кодирующих) CAR. В некоторых случаях молекула iCaspase-9 кодируется той же молекулой нуклеиновой кислоты, что и вектор, кодирующий CAR. iCaspase-9 может обеспечивать безопасное переключение для избежания токсичности клеток, экспрессирующих CAR. См., например, Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. № NCT02107963; и Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83.
Альтернативные стратегии регуляции средства терапии CAR по настоящему изобретению включают использование малых молекул или антител, которые деактивируют или прекращают активность CAR, например, путем удаления клеток, экспрессирующих CAR, например, путем индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, могут также экспрессировать антиген, который распознается молекулами, способными индуцировать гибель клеток, например, ADCC или комплемент-индуцированную гибель клеток. Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, также могут экспрессировать рецептор, на который могут нацеливаться антитело или фрагмент антитела. Примеры таких рецепторов включают EpCAM, VEGFR, интегрины (например, интегрины ανβ3, α4, αΙ¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), представителей суперсемейства рецепторов TNF (например, TRAIL-R1 , TRAIL-R2), рецептор PDGF, рецептор интерферона, рецептор фолиевой кислоты, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1 a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE Рецептор, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/базиджин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR и их усеченные варианты (например, варианты, в которых сохраняются один или несколько внеклеточных эпитопов, но отсутствуют одна или несколько областей в цитоплазматическом домене). Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, также могут экспрессировать усеченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), у которого отсутствует способность к передаче сигнала, но сохраняется эпитоп, распознаваемый молекулами, способными индуцировать ADCC, например, цетуксимабом (ERBITUX), так что введение цетуксимаба индуцирует ADCC и последующее истощение популяции клеток, экспрессирующих CAR (см., например, WO2011/056894 и Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860). Другая стратегия предусматривает обеспечение экспрессии высококомпактного маркерного/"суицидального" гена, в котором объединены эпитопы-мишени обоих из антигенов CD32 и CD20 в клетках, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, которые связываются с ритуксимабом, что приводит к избирательному истощению популяции клеток, экспрессирующих CAR, например, посредством ADCC (см., например, Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287). Другие способы истощения популяции клеток, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, включают введение CAMPATH, моноклонального антитела к CD52, которое избирательно связывается со зрелыми лимфоцитами, например, клетками, экспрессирующими CAR, и направляет их на разрушение, например, посредством индукции ADCC. В других вариантах осуществления на клетку, экспрессирующую CAR, можно осуществлять избирательное нацеливание с помощью лиганда CAR, например, антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело может вызывать активность активность эффекторных клеток, например, формы активности ADCC или ADC, за счет чего обеспечивается снижение количества клеток, экспрессирующих CAR. В других вариантах осуществления лиганд CAR, например, антиидиотипическое антитело, может быть связан со средством, которое индуцирует уничтожение клеток, например, токсином, за счет чего обеспечивается снижение количества клеток, экспрессирующих CAR. В качестве альтернативы, молекулы CAR сами по себе могут быть представлены в такой конфигурации, при которой активность можно регулировать, например, путем включения или выключения, как описано ниже.
В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит набор полипептидов, как правило в простейших вариантах осуществления два, в которых компоненты стандартного CAR, описанного в данном документе, например, антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, разделены на отдельные полипептиды или компоненты. В некоторых вариантах осуществления совокупность полипептидов содержит димеризационный переключатель, который при наличии димеризующей молекулы может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. Дополнительное описание и иллюстративные конфигурации таких регулируемых CAR предусмотрены в данном документе и в международной публикации № WO 2015/090229, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В одном варианте осуществления RCAR содержит два полипептида или компонента: 1) внутриклеточный сигнальный компонента, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе, и первый переключающий домен; 2) антигенсвязывающий элемент, содержащий антигенсвязывающий домен, например, который нацеливается на опухолевый антиген, как описано в данном документе, и второй переключающий домен. Необязательно RCAR содержит трансмембранный домен, описанный в данном документе. В одном варианте осуществления трансмембранный домен может быть расположен на внутриклеточном сигнальном компоненте, на антигенсвязывающем компоненте или на обоих. (Если не указано иное, то при описании в данном документе компонентов или элементов RCAR порядок может быть таким, как предусмотрено, но также включены и другие порядки. Другими словами, в варианте осуществления порядок является таким, как изложено в тексте, но в других вариантах осуществления порядок может быть другим. Например, порядок элементов на одной стороне трансмембранной области может отличаться от примера, например, размещение переключающего домена относительно внутриклеточного сигнального домена может быть другим, например, обратным).
В одном варианте осуществления первый и второй переключающий домены могут образовывать внутриклеточный или внеклеточный димеризационный переключатель. В одном варианте осуществления димеризационный переключатель может представлять собой гомодимеризационный переключатель, например, если первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, или гетеродимеризационный переключатель, например, если первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга.
В ряде вариантов осуществления RCAR может содержать "мультипереключатель". Мультипереключатель может содержать домены, представляющие собой гетеродимеризационные переключатели или домены, представляющие собой гомодимеризационные переключатели. Мультипереключатель содержит множество, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, переключающих доменов отдельно в первом компоненте, например, антигенсвязывающем компоненте, и втором компоненте, например, внутриклеточном сигнальном компоненте. В одном варианте осуществления первый компонент может содержать множество первых переключающих доменов, например, основанных на FKBP переключающих доменов, и второй компонент может содержать множество вторых переключающих доменов, например, основанных на FRB переключающих доменов. В одном варианте осуществления первый компонент может содержать первый и второй переключающий домен, например, основанный на FKBP переключающий домен и основанный на FRB переключающий домен и второй элемент может содержать первый и второй переключающий домен, например, основанный на FKBP переключающий домен и основанный на FRB переключающий домен.
В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный компонент содержит один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен и один или несколько костимулирующих сигнальных доменов.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент может содержать один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов, например, один или несколько костимулирующих сигнальных доменов. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент содержит множество, например, 2 или 3 костимулирующих сигнальных доменов, описанных в данном документе, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40 и в вариантах осуществления первичный внутриклеточный сигнальный домен отсутствует. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент содержит следующие костимулирующие сигнальные домены в направлении от внеклеточного к внутриклеточному пространству: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB; или 4-1BB-CD28. В таких вариантах осуществления внутриклеточный связывающий компонент содержит домен CD3-дзета. В одном таком варианте осуществления RCAR содержит (1) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и два костимулирующих домена, а также первый переключающий домен; и (2) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий трансмембранный домен или домен прикрепления к мембране, и по меньшей мере один первичный внутриклеточный сигнальный домен и второй переключающий домен.
В одном варианте осуществления представлены RCAR, где антигенсвязывающий компонент не прикрепляется к поверхности CAR-клетки. Это дает возможность клетке, имеющей внутриклеточный сигнальный компонент, успешно соединяться с одним или несколькими антигенсвязывающими доменами без трансформации клетки последовательностью, которая кодирует антигенсвязывающий компонент. В таких вариантах осуществления RCAR содержит: 1) внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий первый переключающий домен, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен и первый переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен и второй переключающий домен, где антигенсвязывающий компонент не содержит трансмембранный домен или домен прикрепления к мембране, и необязательно не содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления RCAR может дополнительно содержать 3) второй антигенсвязывающий компонент, содержащий второй антигенсвязывающий домен, например, второй антигенсвязывающий домен который связывает антиген, отличный от того, который связывается антигенсвязывающим доменом; и второй переключающий домен.
Также в данном документе представлены RCAR, где антигенсвязывающий компонент обладает способностью к биспецифической активации и нацеливанию. В таком варианте осуществления антигенсвязывающий компонент может содержать множество, например, 2, 3, 4 или 5 антигенсвязывающих доменов, например, scFv, где каждый антигенсвязывающий домен связывается с целевым антигеном, например с отличными антигенами или тем же антигеном, например, по одним и тем же или отличным эпитопам на том же антигене. В одном варианте осуществления множество антигенсвязывающих доменов находятся в тандеме, и необязательно линкер или шарнирная область располагается между каждым из антигенсвязывающих доменов. Подходящий линкеры и шарнирные области описаны в данном документе.
В одном варианте осуществления представлены RCAR, обладающие конфигурацией, которая обеспечивает переключение пролиферации. В таком варианте осуществления RCAR содержит: 1) внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий необязательно трансмембранный домен или домен прикрепления к мембране; один или несколько костимулирующих сигнальных доменов, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40 и переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета, где антигенсвязывающий компонент не содержит переключающий домен или не содержит переключающий домен, который димеризуется с переключающим доменом на внутриклеточном сигнальном компоненте. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент не содержит костимулирующий сигнальный домен. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный компонент содержит переключающий домен из гомодимеризационного переключателя. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный компонент содержит первый переключающий домен гетеродимеризационного переключателя и RCAR содержит второй внутриклеточный сигнальный компонент, который содержит второй переключающий домен гетеродимеризационного переключателя. В таких вариантах осуществления второй внутриклеточный сигнальный компонент содержит те же внутриклеточные сигнальные домены, что и внутриклеточный сигнальный компонент. В одном варианте осуществления димеризационный переключатель является внутриклеточным. В одном варианте осуществления димеризационный переключатель является внеклеточным.
В любой из конфигураций RCAR, описанных в данном документе, первый и второй переключающие домены содержат основанный на FKBP-FRB переключатель, как описано в данном документе.
Также в данном документе представлены клетки, содержащие RCAR, описанный в данном документе. Любая клетка, которая сконструирована для экспрессии RCAR, может применяться в качестве RCARX-клетки. В одном варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой T-клетку и называется RCART-клеткой. В одном варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCAR-N-клеткой.
Также в данном документе представлены нуклеиновые кислоты и векторы, содержащие последовательности, кодирующие RCAR. Последовательности, кодирующие различные элементы RCAR, могут быть расположены в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например в одних и тех же плазмиде или векторе, например вирусном векторе, например лентивирусном векторе. В одном варианте осуществления (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий компонент, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный компонент, могут находиться в одной и той же нуклеиновой кислоте, например векторе. Продуцирование соответствующих белков может быть достигнуто, например, путем применения отдельных промоторов или путем применения продукта бицистронной транскрипции (что может приводить к продуцированию двух белков путем расщепления одного продукта трансляции или путем трансляции двух отдельных белковых продуктов). В варианте осуществления последовательность, кодирующая расщепляемый пептид, например последовательность P2A или F2А, располагается между (i) и (ii). В варианте осуществления последовательность, кодирующая IRES, например IRES EMCV или EV71, располагается между (i) и (ii). В этих вариантах осуществления (i) и (ii) транскрибируются в виде одной РНК. В варианте осуществления первый промотор функционально связывается с (i), и второй промотор функционально связывается с (ii) так, что (i) и (ii) транскрибируются в виде отдельных mRNA.
В качестве альтернативы, последовательность, кодирующая различные элементы RCAR, может быть расположена в разных молекулах нуклеиновой кислоты, например, в разных плазмидах или векторах, например, в вирусном векторе, например, в лентивирусном векторе. Например, (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий компонент, может находиться в первой нуклеиновой кислоте, например, в первом векторе, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный компонент, может находиться во второй нуклеиновой кислоте, например, во втором векторе.
Димеризационные переключатели
Димеризационные переключатели могут быть нековалентными или ковалентными. В нековалентном димеризационном переключателе димеризующая молекула обеспечивает нековалентное взаимодействие между переключающими доменами. В ковалентном димеризационном переключателе димеризующая молекула обеспечивает ковалентное взаимодействие между переключающими доменами.
Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue
В одном варианте осуществления RCAR содержит FKBP/FRAP или димеризационный переключатель, основанный на FKBP/FRB. FKBP12 (FKBP или FK506-связывающий белок) является широко распространенным цитоплазматическим белком, который служит в качестве исходной внутриклеточной мишени для рапамицина, представляющего собой иммуносупрессивное лекарственное средство, полученное из природного продукта. Рапамицин связывается с FKBP и с большим гомологом PI3K, представляющим собой FRAP (RAFT, mTOR). FRB является частью FRAP из 93 аминокислот, которая является достаточной для связывания комплекса FKBP-рапамицин (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) . Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
В ряде вариантов осуществления для переключателя, основанного на FKBP/FRAP, например FKBP/FRB, может применяться димеризующая молекула, например, рапамицин или аналог рапамицина.
Иллюстративная аминокислотная последовательность FKBP является следующей:
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 275)
В ряде вариантов осуществления переключающий домен FKBP может содержать фрагмент FKBP, обладающий способностью связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога. В некоторых вариантах осуществления переключающий домен FKBP содержит аминокислотную последовательность под:
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO: 276)
Аминокислотная последовательность FRB является следующей:
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 277)
Используемый в данном документе термин "переключатель, основанный на FKBP/FRAP, например FKBP/FRB" относится к димеризационному переключателю, содержащему: первый переключающий домен, который содержит фрагмент FKBP или его аналог, обладающий способностью связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, например, RAD001, и характеризуется по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью FKBP под SEQ ID NO: 275 или 276 или отличается не более чем 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотным остатком от указанной последовательности; и второй переключающий домен, который содержит фрагмент FKBP или его аналог, обладающий способностью связываться с FRB или его фрагментом или аналогом, в присутствии рапамицина или рапалога и характеризуется по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью FRB под SEQ ID NO: 277 или отличается не более чем 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотным остатком от указанной последовательности . В одном варианте осуществления RCAR, описанный в данном документе, содержит один переключающий домен, содержащий аминокислотные остатки, раскрытые под SEQ ID NO: 275 (или SEQ ID NO: 276), и один переключающий домен, содержащий аминокислотные остатки, раскрытые под SEQ ID NO: 277.
В ряде вариантов осуществления основанный на FKBP/FRB димеризационный переключатель содержит модифицированный основанный на FRB переключающий домен, который демонстрирует измененное, например, улучшенное, образование комплекса между основанным на FRB переключающим доменом, например, модифицированным основанным на FRB переключающим доменом, основанным на FKBP переключающим доменом и димеризующей молекулой, например, рапамицином или рапалогом, например, RAD001. В варианте осуществления модифицированный основанный на FRB переключающий домен содержит одну или несколько мутаций, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, выбранных из мутаций по аминокислотному(аминокислотномым) положению(положениям) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 и F2108, где аминокислота дикого типа в результате мутации заменяется любой другой встречающейся в природе аминокислотой. В варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию по E2032, где E2032 в результате мутации заменяется фенилаланином (E2032F), метионином (E2032M), аргинином (E2032R), валином (E2032V), тирозином (E2032Y), изолейцином (E2032I), например, SEQ ID NO: 278 или лейцином (E2032L), например, SEQ ID NO: 279. В варианте осуществления мутантный FRB содержит мутации по T2098, где T2098 в результате мутации заменяется фенилаланином (T2098F) или лейцином (T2098L), например, SEQ ID NO: 280. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию по E2032 и по T2098, где E2032 в результате мутации заменяется любой аминокислотой, и где T2098 в результате мутации заменяется любой аминокислотой, например, SEQ ID NO: 281. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию E2032I и T2098L, например, SEQ ID NO: 282. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию E2032L и T2098L, например, SEQ ID NO: 283.
Таблица 14. Иллюстративный мутантный FRB, характеризующийся повышенной аффинностью в отношении димеризующей молекулы.
<b>Мутантный FRB</b>
<b>Аминокислотная последовательность</b>
<b>SEQ ID NO:</b>
Мутантная форма E2032I
ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS
278
Мутантная форма E2032L
ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS
279
Мутантная форма T2098L
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS
280
Мутантная форма E2032, T2098
ILWHEMWHEGL<b><u>X</u></b>EASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDL<b><u>X</u></b>QAWDLYYHVFRRISKTS, где X представляет собой любой любой аминокислотный остаток
281
Мутантная форма E2032I, T2098L
ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS
282
Мутантная форма E2032L, T2098L
ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS
283
Другие подходящие димеризационные переключатели предусматривают основанный на GyrB-GyrB димеризационный переключатель, основанный на гиббереллине димеризационный переключатель, димеризационный переключатель на основе метки/связующего средства и димеризационный переключатель на основе галогеновой метки/SNAP-метки. В соответствии с указаниями, представленными в данном документе, такие переключатели и подходящие димеризующие молекулы будут очевидны специалисту обычной квалификации.
Димеризующая молекула
Связь между переключающими доменами активируется димеризующей молекулой. В присутствии димеризующей молекулы взаимодействие или связь между переключающими доменами обеспечивает передачу сигнала между полипептидом, ассоциированным, например слитым, с первым переключающим доменом, и полипептидом, ассоциированным, например слитым, со вторым переключающим доменом. В присутствии неограничивающих уровней димеризующей молекулы передача сигнала усиливается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 раз, например, при измерении в системе, описанной в данном документе.
Рапамицин и аналоги рапамицина (иногда называемые рапалогами), например, RAD001, могут применяться в качестве димеризующих молекул в основанном на FKBP/FRB димеризационном переключателе, описанном в данном документе. В одном варианте осуществления димеризующая молекула может быть выбрана из рапамицин (сиролимус), RAD001 (эверолимус), зотаролимуса, темсиролимуса, AP-23573 (ридафоролимус), биолимуса и AP21967. Дополнительные аналоги рапамицина подходящие для применения с основанными на FKBP/FRB димеризационными переключателями, далее описываются в разделе под названием "Виды комбинированной терапии" или в подразделе под названием "Комбинация с низкой повышающей иммунитет дозой ингибитора mTOR.".
Разделенный CAR
В некоторых вариантах осуществления в клетке, экспрессирующей CAR, используется разделенный CAR. Подход с разделенным CAR более подробно описан в публикациях WO2014/055442 и WO2014/055657, включенных в данный документ посредством ссылки. Вкратце, система разделенного CAR содержит клетку, экспрессирующую первый CAR, имеющий первый антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 41BB), и эта клетка также экспрессирует второй CAR, имеющий второй антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета). Когда клетка встречается с первым антигеном, то активируется костимулирующий домен, и клетка пролиферирует. Когда клетка встречается со вторым антигеном, то активируется внутриклеточный сигнальный домен, и запускается активность уничтожения клеток. Таким образом, клетка, экспрессирующая CAR, полностью активируется только в присутствии обоих антигенов. В ряде вариантов осуществления первый антигенсвязывающий домен распознает BCMA, например, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, и второй антигенсвязывающий домен распознает антиген, экспрессируемый на клетках острого миелоидного лейкоза, например, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 или рецептора фолиевой кислоты бета. В ряде вариантов осуществления первый антигенсвязывающий домен распознает BCMA, например, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, и второй антигенсвязывающий домен распознает антиген, экспрессируемый на B-клетках, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a.
Стабильность и мутации
Стабильность домена, связывающего BCMA, например, молекул scFv (например, растворимого scFv), можно оценить исходя из биофизических свойств (например, термической стабильности) традиционной контрольной молекулы scFv или полноразмерного антитела.
Улучшенная термическая стабильность домена, связывающего BCMA, например, scFv, впоследствии придается всей конструкции CART-BCMA, что приводит к улучшению терапевтических свойств конструкции CART-BCMA. Термическую стабильность домена, связывающего BCMA, например, scFv можно улучшить на по меньшей мере, приблизительно 2°C или 3°C по сравнению с традиционным антителом. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, например, scFv, характеризуется улучшенной на 1°C термической стабильностью по сравнению с традиционным антителом. В другом варианте осуществления домен, связывающий BCMA, например, scFv, характеризуется улучшенной на 2°C термической стабильностью по сравнению с традиционным антителом. В другом варианте осуществления scFv, характеризуется улучшенной на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15°C термической стабильностью по сравнению с традиционным антителом. Сравнения можно выполнять, например, между молекулами scFv, раскрытыми в данном документе, и молекулами scFv или Fab-фрагментами антитела, из которого были получены VH и VL scFv. Термическую стабильность можно измерить с применением способов, известных из уровня техники. Например, в некоторых вариантах осуществления Tm можно измерить. Способы измерения Tm и другие способы определения стабильности белков обсуждаются более подробно ниже.
Мутации в scFv (возникающие в результате гуманизации или направленного мутагенеза растворимого scFv) могут изменять стабильность scFv и улучшать общую стабильность scFv и конструкции CART33. Стабильность гуманизированного scFv можно сравнить со стабильностью scFv мыши с использованием измеряемых показателей, таких как Tm, температура денатурации и температура агрегации.
Способность к связыванию у мутантных scFv можно определить с помощью анализов, описанных в примерах.
В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, например, scFv, содержит по меньшей мере одну мутацию, возникающую в результате процесса гуманизации, благодаря чему мутантный scFv обеспечивает улучшенную стабильность для конструкции CART-BCMA. В другом варианте осуществления домен, связывающий BCMA, например, scFv, содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мутаций, возникающих в результате процесса гуманизации, благодаря чему мутантный scFv обеспечивает улучшенную стабильность для конструкции CART-BCMA.
Способы оценки стабильности белков
et al
et al
Стабильность антигенсвязывающего домена можно оценивать с помощью, например, нижеописанных способов. Такие способы позволяют определить несколько тепловых конформационных переходов с разворачиванием, при которых наименее стабильный домен либо разворачивается первым, либо ограничивает общий порог стабильности многодоменного элемента, который разворачивается совместно (например, многодоменный белок, который демонстрирует один конформационный переход с разворачиванием). Наименее стабильный домен можно идентифицировать с помощью нескольких дополнительных способов. Мутагенез может быть выполнен для определения того, какой домен ограничивает общую стабильность. Кроме того, анализ устойчивости к протеазам многодоменного белка может быть выполнен в условиях, при которых, как известно, наименее стабильный домен разворачивается сам по себе, посредством DSC или других спектроскопических способов (Fontana, ., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi . (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692). После идентификации наименее стабильного домена последовательность, кодирующая этот домен (или его часть), может применяться в способах в качестве исследуемой последовательности.
a) Термическая стабильность
Термическую стабильность композиций можно анализировать с помощью ряда неограничивающих биофизических или биохимических методик, известных из уровня техники. В определенных вариантах осуществления термическую стабильность оценивают с помощью аналитической спектроскопии.
Иллюстративным способом аналитической спектроскопии является дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC). При DSC используют калориметр, который является чувствительным к тепловому поглощению, которое сопровождает разворачивание большинства белков или белковых доменов (см., например Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Для определения термической стабильности белка образец белка вставляют в калориметр и температуру повышают до тех пор, пока Fab или scFv не развернется. Температура, при которой белок разворачивается, указывает на общую стабильность белка.
Другим иллюстративным способом аналитической спектроскопии является спектроскопия кругового дихроизма (CD). При CD-спектрометрии измеряют изменение оптической активности композиции в зависимости от повышения температуры. При спектроскопии кругового дихроизма (CD) измеряют различия в поглощении левосторонне поляризованного света и правосторонне поляризованного света, которые возникают из-за структурной асимметрии. Разупорядоченная или развернутая структура дает CD-спектр, значительно отличающийся от CD-спектра упорядоченной или свернутой структуры. CD-спектр отражает чувствительность белков к денатурирующим эффектам повышения температуры, а следовательно характеризует термическую стабильность белка (см. van Mierlo и Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000).
Другим иллюстративным аналитическим способом спектроскопии для измерения термической стабильности является флуоресцентная эмиссионная спектроскопия (см. van Mierlo и Steemsma, выше). Еще одним иллюстративным аналитическим способом спектроскопии для измерения термической стабильности является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (см., например, van Mierlo и Steemsma, выше).
Термическую стабильность композиции можно измерить биохимически. Иллюстративным биохимическим способом для оценивания термической стабильности является анализ термического воздействия. В ходе "анализа термического воздействия" композицию подвергают воздействию диапазона повышенных температур в течение заданного периода времени. Например, в некоторых вариантах осуществления исследуемые молекулы scFv или молекулы, содержащие молекулы scFv, подвергают действию повышенных температур, например в течение 1-1,5 часа. Затем активность белка анализируют с помощью подходящего биохимического анализа. Например, если белок представляет собой связывающий белок (например, scFv или scFv-содержащий полипептид), то активность связывания связывающего белка можно определить с помощью функционального или количественного ELISA.
E. coli
Такой анализ можно выполнять в формате высокопроизводительного скрининга и форматах с применением  и высокопроизводительного скрининга, раскрытых в примерах. Библиотеку домена, связывающего BCMA, например, вариантов scFv, можно создать с применением способов, известных из уровня техники. Экспрессию домена, связывающего BCMA, например, scFv, можно индуцировать, и домены, связывающие BMCA, например scFv, можно подвергнуть термической проверке. Подвергнутые воздействию исследуемые образцы можно анализировать в отношении связывания и те домены, связывающие BCMA, например, scFv, которые являются стабильными, можно получать в увеличенном количестве и дополнительно характеризовать.
et al
Термическую стабильность оценивают путем измерения температуры плавления (Tm) композиции с помощью любой из вышеупомянутых методик (например, методик аналитической спектроскопии). Температура плавления представляет собой температуру средней точки на кривой температурного перехода, где 50% молекул композиции находится в свернутом состоянии (см., например, Dimasi . (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692). В некоторых вариантах осуществления значения Tm для домен, связывающий BCMA, например, scFv составляют приблизительно40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. В некоторых вариантах осуществления значения Tm для IgG составляют приблизительно 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C.. В некоторых вариантах осуществления значения Tm для поливалентного антитела составляют приблизительно 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C.
C
Термическую стабильность также оценивают путем измерения удельной теплоты или теплоемкости (Ср) композиции с помощью аналитической калориметрической методики (например, DSC). Удельная теплота композиции представляет собой энергию (например, выраженную в ккал/моль), требуемую для того, чтобы повысить температуру 1 моля воды на 1°С. Большое значение Ср является признаком денатурированной или неактивной белковой композиции. Изменение теплоемкости (ΔCp) композиции измеряют путем определения удельной теплоты композиции до и после термического перехода. Термическую стабильность также можно оценить путем измерения и определения других параметров термодинамической стабильности, включая свободную энергию Гиббса разворачивания (ΔG), энтальпию разворачивания (ΔH) или энтропию разворачивания (ΔS). (ΔS). Один или несколько из вышеописанных биохимических анализов (например, анализ термического воздействия) применяют для определения температуры (т. е. значения T) при которой 50% композиции сохраняет свою активность (например, активность связывания).
Кроме того, мутации в домене, связывающем BCMA, например, scFv, изменяют термическую стабильность домена, связывающего BCMA, например, scFv, по сравнению с не подвергнутым мутации доменом, связывающим BCMA, например, scFv. При включении в конструкцию BCMA человеческого или гуманизированного домена, связывающего BCMA, например, scFv, например, гуманизированный scFv, обеспечивает термическую стабильность для всех конструкций CART, связывающихся с BCMA. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, например, scFv, содержит единичную мутацию, которая обеспечивает термическую стабильность домена, связывающего BCMA, например, scFv. В другом варианте осуществления домен, связывающий BCMA, например, scFv содержит несколько мутаций, которые обеспечивают термическую стабильность домена, связывающего BCMA, например, scFv. В некоторых вариантах осуществления несколько мутаций в домене, связывающем BCMA, например, scFv, обладают аддитивным эффектом в отношении термической стабильности домена, связывающего BCMA, например, scFv.
b) % Агрегации
Стабильность композиции можно определить путем измерения ее склонности к агрегации. Агрегацию можно измерить посредством многих неограничивающих биохимических и биофизических методик. Например, агрегацию композиции можно оценить с помощью хроматографии, например, эксклюзионной хроматографии (SEC). При SEC молекулы разделяются на основании их размера. Колонку наполняют полутвердыми микрогранулами полимерного геля, который пропускает через себя ионы и небольшие молекулы, но задерживает большие. В случае если белковую композицию наносят на вершину колонки, компактно свернутые белки (т. е. неагрегированные белки) распределяются в большем объеме растворителя, чем доступен для больших белковых агрегатов. Соответственно, большие агрегаты быстрее проходят через колонку, и таким способом смесь удается разделить или фракционировать на ее компоненты. Каждую фракцию можно оценить количественно (например, по рассеянию света) по мере ее выхода из геля. Соответственно, % агрегации композиции можно определить, сравнивая концентрацию фракции с общей концентрацией белка, нанесенного на гель. Стабильные композиции элюируются с колонки фактически в виде одной фракции и в профиле элюирования или хроматограмме выглядят в виде одного пика.
c) Аффинность связывания
et al.
et al
Стабильность композиции можно оценить путем определения ее аффинности связывания с мишенью. Из уровня техники известно большое количество способов определения аффинности связывания. В иллюстративном способе определения аффинности связывания используют поверхностный плазмонный резонанс. Поверхностный плазмонный резонанс представляет собой оптическое явление, позволяющее анализировать биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени путем детекции изменения концентрации белков в биосенсорной матрице, например с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Упсала, Швеция и Пискатауэй, Нью-Джерси). Дополнительную информацию см. в работах Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B.,  (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnnson, B., . (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR содержит аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности антигенсвязывающего домена, описанной в данном документе, и при этом антигенсвязывающий домен сохраняет требуемые функциональные свойства фрагментов антитела к BCMA, описанных в данном документе. В одном конкретном аспекте композиция CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В дополнительном аспекте фрагмент антитела предусматривает scFv.
В различных аспектах антигенсвязывающий домен CAR конструируют путем модификации одной или нескольких аминокислот в одной или обеих вариабельных областях (например, VH и/или VL), например, в одной или нескольких CDR-областях и/или в одной или нескольких каркасных областях. В одном конкретном аспекте композиция CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В дополнительном аспекте этот фрагмент антитела предусматривает scFv.
Специалисту обычной квалификации в данной области техники будет понятно, что антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы таким образом, что они различаются по аминокислотной последовательности (например, от дикого типа), но не по требуемой активности. Например, в белке могут быть выполнены дополнительные нуклеотидные замены, например, консервативные замены приводящие к аминокислотным заменам, например, консервативные замены по "не являющимся незаменимыми" аминокислотным остаткам. Например, не являющийся незаменимым аминокислотный остаток в молекуле может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом варианте осуществления цепь аминокислот может быть заменена структурно подобной цепью, которая отличается по порядку и/или составу представителей семейства боковых цепей, например, может быть выполнена консервативная замена, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь.
В уровне техники были определены семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, в том числе аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовый кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
"Процентная идентичность" применительно к двум или более нуклеиновым кислотам или полипептидным последовательностям относится к двум или более последовательностям, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются "по сути идентичными", если две последовательности имеют указанное процентное количество аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, идентичными на 60%, необязательно идентичными на 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% в указанном участке или, если не указано, по всей последовательности) при сравнении и выравнивании для достижения максимального соответствия в окне сравнения или указанном участке, при измерении с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или с помощью выравнивания вручную и визуальной проверки. Необязательно, идентичность существует в участке, длина которого составляет по меньшей мере, приблизительно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот) или более предпочтительно в участке, длина которого составляет 100-500 или 1000 или больше нуклеотидов (или 20, 50, 200 или больше аминокислот).
При сравнении последовательностей в типичном случае одна последовательность выступает в качестве референтной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При применении алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости устанавливают координаты подпоследовательностей, и устанавливают программные параметры алгоритма для анализа последовательностей. Можно использовать программные параметры по умолчанию или можно устанавливать альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает значения процентной идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью, исходя из программных параметров. Способы выравнивания последовательностей для сравнения широко известны из уровня техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для целей сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Смита-Уотермана, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, с помощью алгоритма выравнивания областей гомологии алгоритма Нидлмана-Вунша, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, с помощью способа поиска сходства Пирсона-Липмана, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, с помощью компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в составе пакета программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или с помощью выравнивания в ручном режиме и визуального осмотра (см., например, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).
Двумя примерами алгоритмов, которые являются подходящими для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны соответственно в Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; и Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным от Национального центра биотехнологической информации.
Процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями также можно определить с помощью алгоритма Миллера-Майерса, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), при использовании таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за продление гэпа, составляющего 12, и штрафа за открытие гэпа, составляющего 4. Кроме того, процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с применением алгоритма алгоритма Нидлмана-Вунша (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного на http://www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossom 62, либо матрицы PAM250, а также штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает модификации аминокислотной последовательности исходного антитела или фрагмента (например, scFv), в результате которых создаются функционально эквивалентные молекулы. Например, VH или VL домена, связывающего BCMA, например, scFv, содержащегося в CAR, можно модифицировать таким образом, чтобы они сохраняли по меньшей мере приблизительно 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность с исходной каркасной областью VH или VL домена, связывающего BCMA, например, scFv. Настоящее изобретение предусматривает модификации всей конструкции CAR, например, модификации одной или нескольких аминокислотных последовательностей различных доменов конструкции CAR, для создания функционально эквивалентных молекул. Конструкцию CAR можно модифицировать таким образом, чтобы она сохраняла по меньшей мере приблизительно 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность с исходной конструкцией CAR.
Конструкции нуклеиновых кислот, кодирующие CAR
В настоящем изобретении также представлены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие одну или несколько конструкций CAR, описанных в данном документе. В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты представлена в виде транскрипта, представляющего собой матричную РНК. В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты представлена в виде ДНК-конструкции.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий стимулирующий домен, например, костимулирующий сигнальный домен и/или первичный сигнальный домен, например дзета-цепь. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, или последовательность с 95-99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, соединен с трансмембранным доменом с помощью шарнирной области, например, шарнирной области, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую первичный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета, TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12 или CD66d. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, состоящей из молекулы MHC I класса, белков рецепторов TNF, иммуноглобулиноподобных белков, рецепторов цитокинов, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, который специфично связывается с CD83.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, содержащую лидерную последовательность под SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полипептида, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты.
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие необходимые молекулы, можно получать с применением рекомбинантных способов, известных из уровня техники, как, например, путем скрининга библиотек из клеток, экспрессирующих ген, путем получения гена из вектора, который, как известно, включает его, или путем непосредственного выделения из клеток и тканей, содержащих его, с применением стандартных методик. В качестве альтернативы, ген, представляющий интерес, может быть получен синтетическим путем, а не клонирован.
В настоящем изобретении также представлены векторы, в которые вставлена ДНК по настоящему изобретению. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долгосрочного переноса генов, поскольку они обеспечивают долгосрочную стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы обладают дополнительным преимуществом по сравнению с векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, заключающимся в том, что ими можно трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может содержать, например, промотор, сигнал упаковки (ψ), сайт связывания праймера (PBS), один или несколько (например, два) длинных концевых повторов (LTR) и трансген, представляющий интерес, например, ген, кодирующий CAR. В гамма-ретровирусном векторе могут отсутствовать структурные гены вирусов, такие как gag, pol и env. Иллюстративные гамма-ретровирусные векторы включают вирус лейкоза мышей (MLV), вирус некроза селезенки (SFFV) и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV), а также векторы, полученные из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713.
Nature Reviews Immunology
В другом варианте осуществления вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую требуемый CAR по настоящему изобретению, представляет собой аденовирусный вектор (A5/35). В другом варианте осуществления экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, можно достичь с помощью транспозонов, таких как "спящая красавица", CRISPR, CAS9 и нуклеаз с "цинковыми пальцами". См. ниже June et al. 2009, 9.10: 704-716, включенную в данный документ посредством ссылки.
Вкратце, экспрессия природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, как правило, достигается путем образования функциональной связи нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR или его части, с промотором и включения конструкции в состав экспрессионного вектора. Векторы могут подходить для репликации и интеграции у эукариот. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, применимые для регуляции экспрессии необходимой последовательности нуклеиновой кислоты.
Экспрессионные конструкции по настоящему изобретению также можно применять для иммунизации и генной терапии нуклеиновыми кислотами с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5399346, 5580859, 5589466, включенные в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В другом варианте осуществления в настоящем изобретении представлен вектор для генной терапии.
Нуклеиновую кислоту можно клонировать в векторы множества типов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включающий без ограничения плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животных и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессионные векторы, репликационные векторы, векторы для образования зондов и векторы для секвенирования.
Кроме того, экспрессионный вектор может предоставляться клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна из уровня техники и описана, например, в Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY и в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, применимые в качестве векторов, включают без ограничения ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит точку начала репликации, функционирующую в по меньшей мере одном организме, промоторную последовательность, подходящие сайты для рестрикционных эндонуклеаз и один или несколько селектируемых маркеров (например, WO 01/96584; WO 01/29058 и патент США № 6326193).
Для переноса генов в клетки млекопитающих был разработан целый ряд систем на основе вирусов. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген можно вставить в вектор и упаковать в ретровирусные частицы с помощью методик, известных из уровня техники. Затем рекомбинантный вирус можно выделить и доставить в клетки субъекта in vivo либо ex vivo. Из уровня техники известен целый ряд ретровирусных систем. В некоторых вариантах осуществления применяются аденовирусные векторы. Из уровня техники известен целый ряд аденовирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления применяют лентивирусные векторы.
Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области на 30-110 п. о. выше сайта начала, хотя было показано, что ряд промоторов также содержит функциональные элементы ниже сайта начала. Расстояние между промоторными элементами часто является гибким, так что промоторная функция сохраняется при инверсии элементов или их перемещении друг относительно друга. В промоторе гена тимидинкиназы (tk) расстояние между промоторными элементами можно увеличить до 50 п. о., прежде чем активность начнет снижаться. В зависимости от промотора оказывается, что отдельные элементы могут функционировать для активации транскрипции совместно либо независимо.
Примером промотора, который способен обеспечивать экспрессию трансгена CAR в Т-клетке млекопитающего, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a управляет экспрессией альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации-1, который отвечает за ферментативную доставку аминоацил-тРНК к рибосоме. Промотор EF1a широко использовался в экспрессионных плазмидах для млекопитающих, и было показано, что он эффективно управляет экспрессией CAR с трансгенов, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). В одном аспекте промотор EF1a содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO: 11.
Другим примером промотора является последовательность немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта промоторная последовательность является последовательностью сильного конститутивного промотора, способного управлять экспрессией любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней, на высоких уровнях. Однако можно также использовать последовательности других конститутивных промоторов, в том числе без ограничения раннего промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотора длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (HIV), промотора MoMuLV, промотора вируса лейкоза птиц, немедленно-раннего промотора вируса Эпштейна-Барр, промотора вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, без ограничения, промотор гена актина, промотор гена миозина, промотор гена фактора элонгации-1α, промотор гена гемоглобина и промотор гена креатинкиназы. Кроме того, настоящее изобретение не должно ограничиваться использованием конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть настоящего изобретения. Использование индуцируемого промотора обеспечивает наличие молекулярного переключателя, способного включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, если такая экспрессия требуется, или отключать экспрессию, если экспрессия не требуется. Примеры индуцируемых промоторов включают без ограничения металлотионеин-индуцируемый промотор, глюкокортикоид-индуцируемый промотор, прогестерон-индуцируемый промотор и тетрациклин-индуцируемый промотор.
Другим примером промотора является промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK). В ряде вариантов осуществления может быть необходим усеченный промотор гена PGK (например, промотор гена PGK с одной или несколькими, например, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 или 400, делециями нуклеотидов по сравнению с последовательностью промотора гена PGK дикого типа). Нуклеотидные последовательности иллюстративных промоторов гена PGK представлены ниже.
Промотор гена PGK WT
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQ ID NO: 190)
Иллюстративные усеченные промоторы гена PGK:
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG (SEQ ID NO: 198)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG (SEQ ID NO: 191)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG (SEQ ID NO: 192)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (SEQ ID NO: 193)
Вектор также может содержать, например, сигнальную последовательность, содействующую секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена бычьего гормона роста (BGH)), элемент, обеспечивающий возможность эписомальной репликации и репликации у прокариот (например, точку начала репликации SV40 и ColE1 или другие, известные из уровня техники), и/или элементы для обеспечения возможности осуществления отбора (например, ген устойчивости к ампициллину и/или маркер устойчивости к зеоцину).
Для оценки экспрессии полипептида CAR или его частей экспрессионный вектор, который должен быть введен в клетку, также может содержать селектируемый маркерный ген или репортерный ген либо их оба для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, в отношении которых стремились провести трансфекцию или инфицирование посредством вирусных векторов. В других аспектах селектируемый маркер может переноситься на отдельном фрагменте ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Применимые селектируемые маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т. п.
Репортерные гены используют для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценивания функциональных свойств регуляторных последовательностей. Как правило, репортерный ген представляет собой ген, который отсутствует или не экспрессируется в организме- или ткани-реципиенте и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется в некотором легко выявляемом свойстве, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена анализируют в подходящее время после введения ДНК в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены с помощью известных методик или приобретены коммерческим путем. Как правило, конструкцию с минимальной 5'-фланкирующей областью, демонстрирующую наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и использоваться для оценивания средств в отношении способности к модулированию транскрипции, управляемой промотором.
В некоторых вариантах осуществления вектор может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR. В некоторых вариантах осуществления второй CAR включаетантигенсвязывающий домен для мишени, экспрессируемой на клетках острого миелоидного лейкоза, такой как, например, CD123, CD34, CLL-1, рецептор фолиевой кислоты бета или FLT3; или для мишени, экспрессируемой на B-клетке, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, который специфично связывает первый антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфично связывает второй, другой, антиген и содержит внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую первый CAR для BCMA который содержит домен, связывающий BCMA, трансмембранный домен и костимулирующий домен и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который нацеливается на антиген, отличный от BCMA (например, антиген, экспрессируемый на клетках AML, например, CD123, CD34, CLL-1, рецептор фолиевой кислоты бета или FLT3; или антиген, экспрессируемый на B-клетке, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом варианте осуществления вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую первый CAR для ВСМА, который содержит домен, связывающий ВСМА, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфично связывает антиген, отличный от ВСМА (например, антиген, экспрессируемый на клетках AML, например, CD123, CD34, CLL-1, рецептор фолиевой кислоты бета или FLT3; или антиген, экспрессируемый на B-клетке, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a), и содержит антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен.
В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR для BCMA, описанный в данном документе, и нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибирующий CAR. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, обнаруживаемый на нормальных клетках, но не на раковых клетках, например, на нормальных клетках, которые также экспрессируют BCMA. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета.
В ряде вариантов осуществления вектор может содержать две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, например, CAR для BCMA, описанный в данном документе, и второй CAR, например, ингибирующий CAR или CAR, который специфично связывается с антигеном, отличным от BCMA (например, антигеном, экспрессируемым на клетках AML, например, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 или рецептором фолиевой кислоты бета; или антигеном, экспрессируемым на B-клетках, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a). В таких вариантах осуществления две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, кодируются одной молекулой нуклеиновой кислоты в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи. В этом аспекте два или более CAR могут, например, быть разделены одним или несколькими сайтами расщепления пептидов (например, сайтом саморасщепления или субстратом для внутриклеточной протеазы). Примеры сайтов расщепления пептидов включают следующие, в которых остатки GSG являются необязательными:
T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 194)
P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 195)
E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 196)
F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 197)
Способы введения генов в клетку и обеспечения их экспрессии в ней известны из уровня техники. Что касается экспрессионного вектора, то вектор можно легко ввести в клетку-хозяина, например, клетку млекопитающего, бактерии, дрожжей или насекомого, любым способом, известным из уровня техники. Например, экспрессионный вектор можно перенести в клетку-хозяина физическим, химическим или биологическим способом.
Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т. п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны из уровня техники. См., например, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY. Предпочтительным способом введения полинуклеотида в клетку-хозяина является трансфекция с использованием фосфата кальция.
Биологические способы введения полинуклеотида, представляющего интерес, в клетку-хозяина включают использование векторов на основе ДНК и РНК. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко применяемым способом вставки генов в клетки млекопитающего, например, человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I типа, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т. п. См., например, патенты США №№ 5350674 и 5585362.
Химические средства для введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, микрогранулы и липидные системы, в том числе эмульсии типа "масло в воде", мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Иллюстративной коллоидной системой для применения в качестве средства для доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). Из уровня техники доступны другие способы целенаправленной доставки нуклеиновых кислот, такие как доставка полинуклеотидов с помощью нацеливающихся наночастиц или другой подходящей системы доставки субмикронного размера.
В случае использования системы доставки, отличной от вирусной, иллюстративным средством для доставки является липосома. Для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (in vitro, ex vivo или in vivo) предполагается применение липидных составов. В другом аспекте нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с липидом. Нуклеиновая кислота, ассоциированная с липидом, может быть инкапсулированной в водной внутренней части липосомы, помещенной в липидный бислой липосомы, присоединенной к липосоме посредством связывающей молекулы, которая ассоциирована как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, захваченной в липосому, образовывать комплекс с липосомой, быть диспергированной в растворе, содержащем липид, смешанной с липидом, объединенной с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться в мицелле или образовывать комплекс с ней или иным образом быть ассоциированной с липидом. Композиции для ассоциации на основе липидов, липидов/ДНК или липидов/экспрессионного вектора не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в бислойной структуре, в виде мицелл или в "сжатой" структуре. Они также могут быть просто помещены в раствор, при этом по возможности образуют агрегаты, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут являться встречающимися в природе или синтетическими липидами. Например, липиды включают жировые капли, которые встречаются в природе в цитоплазме, а также класс соединений, который содержит длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.
Подходящие для применения липиды можно получить из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин ("DMPC") можно получить от Sigma, Сент-Луис, Миссури; дицетилфосфат ("DCP") можно получить от K & K Laboratories (Плейнвью, Нью-Йорк); холестерин ("Choi") можно получить от Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин ("DMPG") и другие липиды можно получить от Avanti Polar Lipids, Inc. (Бирмингем, Алабама). Исходные растворы липидов в хлороформе или хлороформе/метаноле можно хранить при температуре приблизительно -20°C. Хлороформ используется в качестве единственного растворителя, поскольку он испаряется легче, чем метанол. "Липосома" является общим термином, охватывающим различные одно- и мультиламеллярные липидные носители, образованные путем формирования замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как имеющие везикулярные структуры с фосфолипидной бислойной мембраной и внутренней водной средой. Мультиламеллярные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются самопроизвольно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самореорганизации перед образованием замкнутых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991, Glycobiology 5: 505-10). Однако также охватываются композиции, которые в растворе имеют структуры, отличные от нормальной везикулярной структуры. Например, липиды могут принимать вид мицеллярной структуры или просто существовать в виде неоднородных агрегатов липидных молекул. Также предполагаются комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.
Чтобы подтвердить присутствие последовательности рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине, можно выполнять различные анализы, независимо от способа, применяемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина, или иного воздействия ингибитора по настоящему изобретению на клетку. Такие анализы включают, например, "молекулярно-биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как Саузерн- и нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как выявление присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, с помощью иммунологических способов (ELISA и вестерн-блоттинга) или с помощью описанных в данном документе анализов для идентификации средств, находящихся в пределах объема настоящего изобретения.
В настоящем изобретении дополнительно представлен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR. В одном аспекте векторы CAR можно вводить путем прямой трансдукции в клетку, например,T-клетку или NK-клетку. В одном аспекте вектор представляет собой клонирующий или экспрессионный вектор, например,вектор, включающий без ограничения одну или несколько плазмид (например,экспрессионные плазмиды, клонирующие векторы, миникольца, минивекторы, двойные микрохромосомы), ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции. В одном аспекте вектор способен экспрессировать конструкцию CAR в Т-клетках или NK-клетках млекопитающих. В одном аспекте Т-клетка млекопитающего представляет собой Т-клетку человека. В одном аспекте NK-клетка млекопитающего представляет собой NK-клетку человека.
Трансфекция РНК
В данном документе раскрыты способы получения РНК, транскрибированной in vitro, кодирующей CAR. Настоящее изобретение также охватывает РНК-конструкцию, кодирующую CAR, которую можно вводить путем прямой трансфекции в клетку. Способ получения mRNA для применения в трансфекции может предусматривать обеспечение in vitro транскрипции (IVT) матрицы с помощью специально разработанных праймеров с последующим добавлением поли(А), чтобы получить конструкцию, содержащую 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность ("UTR"), 5'-кэп и/или участок внутренней посадки рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту, которая подлежит экспрессии, и поли(A)-хвост, как правило, длиной 50-2000 оснований (SEQ ID NO: 35). С помощью РНК, полученной таким образом, можно эффективно трансфицировать различные типы клеток. В одном аспекте матрица содержит последовательности для CAR.
В одном аспекте CAR, связывающийся с BCMA, кодируется матричной РНК (мРНК). В одном аспекте мРНК, кодирующую CAR, связывающийся с BCMA, вводят в иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку, для получения клетки, экспрессирующей CAR (например, CAR-T-клетки или NK-клетки, экспрессирующей CAR).
В некоторых вариантах осуществления РНК, транскрибированную in vitro, кодирующую CAR, можно вводить в клетку в форме транзиентной трансфекции. РНК получают путем транскрипции in vitro с применением матрицы, полученной посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК, представляющая интерес, из любого источника может быть непосредственно преобразована с помощью ПЦР в матрицу для синтеза мРНК in vitro с использованием соответствующих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может быть, например, геномная ДНК, плазмидная ДНК, фаговая ДНК, кДНК, синтетическая последовательность ДНК или любой другой подходящий источник ДНК. Требуемой матрицей для транскрипции in vitro является CAR по настоящему изобретению. Например, матрица для РНК, кодирующей CAR, содержит внеклеточную область, содержащую одноцепочечный вариабельный домен противоопухолевого антитела; шарнирную область, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен CD8a) и цитоплазматическую область, которая содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, содержащий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1BB.
В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть получена из встречающейся в природе последовательности ДНК из генома организма. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать некоторые или все из 5'- и/или 3'-нетранслируемых областей (UTR). Нуклеиновая кислота может содержать экзоны и интроны. В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека. В другом варианте осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека, содержащую 5'- и 3'-UTR. В качестве альтернативы, ДНК может представлять собой искусственную последовательность ДНК, которая обычно не экспрессируется у встречающегося в природе организма. Иллюстративная искусственная последовательность ДНК представляет собой последовательность, которая содержит части генов, лигированные друг с другом с образованием открытой рамки считывания, которая кодирует слитый белок. Части ДНК, лигированные друг с другом, могут быть получены из одного организма или из более чем одного организма.
ПЦР применяют для получения матрицы, предназначенной для транскрипции in vitro мРНК, которая применяется для трансфекции. Способы осуществления ПЦР хорошо известны из уровня техники. Праймеры для применения в ПЦР разрабатывают таким образом, чтобы они имели области, по существу комплементарные областям ДНК, подлежащей применению в качестве матрицы для ПЦР. Используемый в данном документе термин "по существу комплементарные" относится к последовательностям нуклеотидов, где большинство или все основания в последовательности праймера являются комплементарными, или одно или несколько оснований являются некомплементарными или несовпадающими. По существу комплементарные последовательности способны отжигаться или гибридизироваться с предполагаемой ДНК-мишенью в условиях отжига, используемых для ПЦР. Праймеры можно разрабатывать таким образом, чтобы они были по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры можно разрабатывать таким образом, чтобы обеспечить амплификацию части нуклеиновой кислоты, которая обычно транскрибируется в клетках (открытой рамки считывания), включающей 5'- и 3'-UTR. Праймеры также можно разрабатывать таким образом, чтобы обеспечить амплификацию части нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный домен, представляющий интерес. В некоторых вариантах осуществления праймеры сконструированы таким образом, чтобы обеспечить амплификацию кодирующей области cDNA человека, в том числе 5'- и 3'-UTR целиком или их частей. Праймеры, применимые для ПЦР, могут быть получены посредством способов синтеза, которые хорошо известны из уровня техники. "Прямые праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат область из нуклеотидов, по существу комплементарных нуклеотидам в ДНК-матрице, которые расположены выше последовательности ДНК, подлежащей амплификации. "Вышерасположенное" используется в данном документе для обозначения местоположения в 5'-направлении от последовательности ДНК, подлежащей амплификации, относительно кодирующей цепи. "Обратные праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат области из нуклеотидов, по существу комплементарных нуклеотидам в двухнитевой ДНК-матрице, которые расположены ниже последовательности ДНК, подлежащей амплификации. "Нижерасположенное" используется в данном документе для обозначения местоположения в 3'-направлении от последовательности ДНК, подлежащей амплификации, относительно кодирующей нити.
В способах, раскрытых в данном документе, может применяться любая ДНК-полимераза, применимая для ПЦР. Реагенты и полимераза являются коммерчески доступными из ряда источников.
Также можно использовать химические структуры, которые могут способствовать стабильности и/или эффективности трансляции. РНК предпочтительно содержит 5'- и 3'-UTR. В некоторых вариантах осуществления длина 5'-UTR составляет от одного до 3000 нуклеотидов. Длину последовательностей 5'- и 3'-UTR, которые подлежат добавлению к кодирующей области, можно изменять с помощью различных способов, включая без ограничения разработку праймеров для ПЦР, которые отжигаются с различными областями UTR. Используя данный подход, средний специалист обычной квалификации в данной области может модифицировать длину 5'- и 3'-UTR, необходимую для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибированной РНК.
5'- и 3'-UTR могут представлять собой встречающиеся в природе эндогенные 5'- и 3'-UTR для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В качестве альтернативы, последовательности UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, могут быть добавлены путем включения последовательностей UTR в прямой и обратный праймеры или с помощью любых других модификаций матрицы. Использование последовательностей UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, может быть применимым для модификации стабильности и/или эффективности трансляции РНК. Например, известно, что AU-богатые элементы в последовательностях 3'-UTR могут уменьшать стабильность мРНК. Следовательно, 3'-UTR могут быть выбраны или разработаны таким образом, чтобы они увеличивали стабильность транскрибированной РНК, исходя из свойств UTR, которые хорошо известны из уровня техники.
В некоторых вариантах осуществления 5'-UTR может содержать последовательность Козак из эндогенной нуклеиновой кислоты В качестве альтернативы, если 5'-UTR, которая не является эндогенной для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, добавляют с помощью ПЦР, как описано выше, консенсусная последовательность Козак может быть видоизменена путем добавления последовательности 5'-UTR. Последовательности Козак могут увеличивать эффективность трансляции некоторых РНК-транскриптов, но, по-видимому, они не являются необходимыми для обеспечения эффективной трансляции всех РНК. Требование наличия последовательностей Козак для многих мРНК известно из уровня техники. В других вариантах осуществления 5'-UTR может представлять собой 5'-UTR из РНК-содержащего вируса, РНК-геном которого является стабильным в клетках. В других вариантах осуществления можно использовать различные аналоги нуклеотидов в 3'- или 5'-UTR, чтобы воспрепятствовать разрушению мРНК под действием экзонуклеаз.
Для обеспечения синтеза РНК с ДНК-матрицы без необходимости клонирования гена промотор транскрипции должен быть присоединен к ДНК-матрице выше последовательности, подлежащей транскрипции. Если последовательность, которая функционирует в качестве промотора для РНК-полимеразы, добавляют к 5'-концу прямого праймера, то промотор для РНК-полимеразы включается в состав продукта ПЦР выше открытой рамки считывания, которая подлежит транскрипции. В одном предпочтительном варианте осуществления промотор представляет собой промотор для полимеразы Т7, описанный в другом разделе данного документа. Другие применимые промоторы включают без ограничения промоторы для РНК-полимераз Т3 и SP6. Консенсусные нуклеотидные последовательности для промоторов T7, T3 и SP6 известны из уровня техники.
В предпочтительном варианте осуществления мРНК имеет как кэп на 5'-конце, так и 3'-поли(А) хвост, которые определяют связывание с рибосомой, инициацию трансляции и стабильность мРНК в клетке. На кольцевой ДНК-матрице, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза продуцирует длинный конкатемерный продукт, который не подходит для экспрессии в эукариотических клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной на конце 3'-UTR, приводит к образованию мРНК нормального размера, которая не является эффективной для трансфекции эукариот даже в случае ее полиаденилирования после транскрипции.
На линейной ДНК-матрице РНК-полимераза фага Т7 может удлинять 3'-конец транскрипта за пределы последнего основания матрицы (Schenborn и Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva и Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
Традиционный способ интеграции отрезков поли(А)/(Т) в ДНК-матрицу представляет собой молекулярное клонирование. Однако последовательность поли(А)/(Т), интегрированная в плазмидную ДНК, может вызывать нестабильность плазмиды, поэтому плазмидные ДНК-матрицы, полученные из бактериальных клеток, зачастую сильно засорены делециями и другими аберрациями. Это приводит к тому, что процедуры клонирования являются не только трудоемкими и времязатратными, но зачастую и ненадежными. Поэтому способ, который позволяет конструировать ДНК-матрицы с 3'-отрезком поли(А)/(Т) без клонирования, является крайне желательным.
Сегмент поли(A)/(T) в транскрипционной ДНК-матрице можно получить в ходе ПЦР с применением обратного праймера, содержащего поли(T)-хвост, такой как хвост из 100 T (SEQ ID NO: 31) (размер может составлять 50-5000 T (SEQ ID NO: 32)) или после ПЦР с помощью любого другого способа, в том числе без ограничения лигирования или рекомбинации ДНК in vitro. Поли(А)-хвосты также обеспечивают стабильность РНК и уменьшают их разрушение. Как правило, длина поли(А)-хвоста положительно коррелирует со стабильностью транскрибированной РНК. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А)-хвоста составляет от 100 до 5000 аденозиновых остатков (SEQ ID NO: 33).
Поли(А)-хвосты РНК могут быть дополнительно удлинены после транскрипции in vitro путем использования поли(А)-полимеразы, такой как поли(А)-полимераза Е. coli (E-PAP). В некоторых вариантах осуществления увеличение длины поли(А)-хвоста от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов (SEQ ID NO: 34) дает в результате приблизительно двукратное увеличение эффективности трансляции РНК. Кроме того, присоединение различных химических групп к 3'-концу может увеличивать стабильность мРНК. Такое присоединение может включать присоединение модифицированных/искусственных нуклеотидов, аптамеров и других соединений. Например, в состав поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы могут быть включены аналоги ATP. Аналоги ATP могут дополнительно увеличивать стабильность РНК.
5'-кэп-структуры также обеспечивают стабильность молекул РНК. В предпочтительном варианте осуществления РНК, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, содержат 5'-кэп. Наличие 5'-кэпа обеспечивают с помощью методик, известных из уровня техники и описанных в данном документе (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
РНК, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, также могут содержать последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES). Последовательность IRES может быть любой вирусной, хромосомной или искусственно разработанной последовательностью, которая инициирует кэп-независимое связывание рибосомы с мРНК и содействует инициации трансляции. Могут быть включены любые растворенные вещества, подходящие для электропорации клеток, которые могут включать факторы, содействующие проникновению в клетку и жизнеспособности клеток, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества.
РНК можно вводить в клетки-мишени с помощью любого из ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают без ограничения электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Кельн, Германия), ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Бостон, Массачусетс) или Gene Pulser II (BioRad, Денвер, Колорадо), Multiporator (Eppendorf, Гамбург, Германия)), трансфекцию, опосредованную катионными липосомами, с применением липофекции, инкапсуляцию в полимеры, трансфекцию, опосредованную пептидами, или биобаллистические системы доставки частиц, такие как "генные пушки" (см., например, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).
Невирусные способы доставки
В некоторых аспектах можно применять невирусные способы для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в данном документе, в клетку, или ткань, или организм субъекта.
В некоторых вариантах осуществления невирусный способ включает применение транспозона (также называемого мобильным генетическим элементом). В некоторых вариантах осуществления транспозон представляет собой фрагмент ДНК, который может самостоятельно вставляться в определенное местоположение в геноме, например, фрагмент ДНК, который способен к саморепликации и вставке своей копии в геном, или фрагмент ДНК, который с помощью сплайсинга может быть вырезан из более длинной нуклеиновой кислоты и вставлен в другое место в геноме. Например, транспозон содержит последовательность ДНК, состоящую из инвертированных повторов, фланкирующих гены для транспозиции.
Иллюстративные способы доставки нуклеиновых кислот с помощью транспозона включают систему транспозонов "Спящая красавица" (SBTS) и систему транспозонов piggyBac (PB). См., например, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; и Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
SBTS содержит два компонента: 1) транспозон, содержащий трансген, и 2) источник фермента транспозазы. Транспозаза может транспонировать транспозон из плазмиды-носителя (или другой донорной ДНК) в целевую ДНК, такую как хромосома/геном клетки-хозяина. Например, транспозаза связывается с плазмидой-носителем/донорной ДНК, вырезает транспозон (в том числе трансген(трансгены)) из плазмиды и вставляет его в геном клетки-хозяина. См., например, Aronovich et al.,выше.
Иллюстративные транспозоны включают транспозон на основе pT2. См., например, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47 и Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные транспозазы включают транспозазу типа Tc1/mariner, например, транспозазу SB10 или транспозазу SB11 (гиперактивную транспозазу, которая может экспрессироваться, например, под контролем промотора цитомегаловируса). См., например, Aronovich et al.; Kebriaei et al. и Grabundzija et al., все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
Применение SBTS обеспечивает эффективную интеграцию и экспрессию трансгена, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в данном документе. В данном документе представлены способы получения клетки, например, T-клетки или NK-клетки, которая стабильно экспрессирует CAR, описанный в данном документе, например, с применением системы транспозонов, такой как SBTS.
В соответствии со способами, описанными в данном документе, в некоторых вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот, например, плазмиды, содержащие компоненты SBTS, доставляются в клетку (например, T- или NK-клетку). Например, нуклеиновую(нуклеиновые) кислоту(кислоты) доставляют с помощью стандартных способов доставки нуклеиновых кислот (например, плазмидной ДНК), например, с помощью описанных в данном документе способов, например, электропорации, трансфекции или липофекции. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит транспозон, содержащий трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит транспозон, содержащий трансген (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в данном документе), а также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент транспозазу. В других вариантах осуществления представлена система с двумя нуклеиновыми кислотами, например, система с двумя плазмидами, например, где первая плазмида содержит транспозон, содержащий трансген, а вторая плазмида содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент транспозазу. Например, первая и вторая нуклеиновые кислоты совместно доставляются в клетку-хозяина.
В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T- или NK-клетки, которые экспрессируют CAR, описанный в данном документе, получают с помощью комбинации вставки гена с помощью SBTS и генетического редактирования с помощью нуклеазы (например, нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), системы CRISPR/Cas или сконструированных мегануклеаз, представляющих собой реконструированные хоминг-эндонуклеазы).
В некоторых вариантах осуществления применение невирусного способа доставки делает возможным перепрограммирование клеток, например, Т- или NK-клеток, и прямую инфузию клеток в организм субъекта. Преимущества невирусных векторов включают без ограничения простоту и относительно низкую стоимость получения достаточных количеств, необходимых для популяции пациентов, стабильность при хранении и отсутствие иммуногенности.
Источники клеток
Перед размножением и генетической модификацией источник клеток, например, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), можно получить от субъекта. Термин "субъект" предполагается как включающий живые организмы, у которых можно вызвать иммунный ответ (например, млекопитающие). Примеры субъектов включают людей, собак, кошек, мышей, крыс и их трансгенные формы. Т-клетки можно получить из ряда источников, в том числе из мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатических узлов, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцита, плеврального выпота, ткани селезенки и опухолей.
В определенных аспектах настоящего изобретения можно использовать любое количество линий иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), доступных в данной области техники. В определенных аспектах настоящего изобретения Т-клетки можно получить из единицы крови, отобранной у субъекта, с применением любого количества методик, известных специалисту в данной области, таких как разделение с помощью Ficoll™. В одном предпочтительном аспекте клетки из циркулирующей крови индивидуума получают путем афереза. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, в том числе Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В одном аспекте клетки, собранные путем афереза, можно промыть, чтобы удалить фракцию плазмы крови и поместить клетки в соответствующий буфер или среду для последующих стадий обработки. В одном аспекте настоящего изобретения клетки промывают фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). В альтернативном аспекте в промывочном растворе отсутствует кальций и может отсутствовать магний или могут отсутствовать многие, если не все, двухвалентные катионы.
Начальные стадии активации в отсутствие кальция могут приводить к усиленной активации. Как будет очевидно для специалистов обычной квалификации в данной области, стадию промывания можно осуществлять с помощью способов, известных специалистам в данной области, как, например, с помощью полуавтоматической "проточной" центрифуги (например, устройства для обработки клеток Cobe 2991, CytoMate от Baxter или Cell Saver 5 от Haemonetics) в соответствии с инструкциями производителя. После промывания клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как, например, PBS, не содержащий Ca и не содержащий Mg, PlasmaLyte A или другой солевой раствор с буфером или без него. В качестве альтернативы, нежелательные компоненты из образца, полученного путем афереза, можно удалить, и клетки можно ресуспендировать непосредственно в культуральной среде.
et al
Clinical & Translational Immunology
Признано, что в способах применения можно использовать условия для культуральных сред, включающие человеческую сыворотку крови AB с концентрацией 5% или меньше, например, 2%, и использовать известные условия и составы культуральных сред, например, описанные в Smith ., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.
В одном аспекте Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса эритроцитов и истощения популяции моноцитов, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLLTM или посредством противоточного элютриационного центрифугирования. Конкретную субпопуляцию Т-клеток, такую как CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и/или CD45RO+ T-клетки, можно дополнительно выделить с помощью методик положительного или отрицательного отбора. Например, в одном аспекте Т-клетки выделяют путем инкубирования с микрогранулами, конъюгированными с антителами к CD3/CD28 (например, 3×28), такими как DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T, в течение периода времени, достаточного для положительного отбора требуемых Т-клеток. В одном аспекте период времени составляет приблизительно 30 минут. В дополнительном аспекте период времени находится в диапазоне от 30 минут до 36 часов или больше и включает все целочисленные значения в этом промежутке. В дополнительном аспекте период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В еще одном предпочтительном аспекте период времени составляет от 10 до 24 часов. В одном аспекте период времени инкубирования составляет 24 часа. Более длительное время инкубирования можно использовать для выделения Т-клеток в любой ситуации, при которой Т-клеток немного по сравнению с другими типами клеток, как, например, при выделении лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), из опухолевой ткани или у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Кроме того, при использовании более длительного времени инкубирования может увеличиваться эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Таким образом, просто сокращая или удлиняя время, в течение которого Т-клетки имеют возможность связываться с микрогранулами с антителами к CD3/CD28, и/или увеличивая или уменьшая соотношение микрогранул и Т-клеток (как описано дополнительно в данном документе), можно предпочтительно осуществлять положительный или отрицательный отбор субпопуляций Т-клеток в начале культивирования или в другие моменты времени в ходе процесса. Кроме того, путем увеличения или уменьшения соотношения антител к CD3 и/или антител к CD28 на микрогранулах или другой поверхности можно предпочтительно осуществлять положительный или отрицательный отбор субпопуляций Т-клеток в начале культивирования или в другие необходимые моменты времени. Специалисту в данной области будет понятно, что в контексте настоящего изобретения также можно использовать несколько циклов отбора. В определенных аспектах может быть желательно выполнить процедуру отбора и использовать "неотобранные" клетки в процессе активации и размножения. "Неотобранные" клетки также можно подвергнуть дополнительным циклам отбора.
Обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора можно осуществлять с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для клеток, подвергаемых отрицательному отбору. Один из способов представляет собой сортировку и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которых используется коктейль моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, подвергаемых отрицательному отбору. Например, для обогащения CD4+ клетками путем отрицательного отбора коктейль моноклональных антител обычно содержит антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В определенных аспектах может быть желательным обогащение регуляторными Т-клетками, которые обычно экспрессируют CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ и FoxP3+, или их положительный отбор. В качестве альтернативы, в определенных аспектах популяцию регуляторных Т-клеток истощают с помощью микрогранул, конъюгированных с антителом к СD25, или другого подобного способа отбора.
Способы, описанные в данном документе, могут включать, например, отбор конкретной субпопуляции иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, которая представляет собой популяцию клеток, истощенную по регуляторным Т-клеткам с истощением по CD25+ клеткам, с помощью, например, методики отрицательного отбора, например, описанного в данном документе. Популяция, истощенная по регуляторным Т-клеткам, предпочтительно содержит менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
В некоторых вариантах осуществления регуляторные T-клетки, например, CD25+ T-клетки, удаляют из популяции с помощью антитела к CD25 или его фрагмента, или CD25-связывающего лиганда IL-2. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD25 или его фрагмент, или CD25-связывающий лиганд конъюгированы с субстратом, например, микрогранулой или в ином случае, покрывают субстрат, например, микрогранулу. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD25 или его фрагмент, конъюгированы с субстратом, описанным в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления регуляторные T-клетки, например, CD25+ T-клетки, удаляют из популяции с помощью реагента для истощения по CD25 от Miltenyi™. В некоторых вариантах осуществления соотношение клеток и реагента для истощения по CD25 составляет 1e7 клеток на 20 мкл или 1e7 клеток на 15 мкл, или 1e7 клеток на 10 мкл, или 1e7 клеток на 5 мкл, или 1e7 клеток на 2,5 мкл, или 1e7 клеток на 1,25 мкл. В некоторых вариантах осуществления например, для истощения регуляторных Т-клеток, например, CD25+, используют более 500 миллионов клеток/мл. В дополнительном аспекте используют концентрацию клеток, составляющую 600, 700, 800 или 900 миллионов клеток/мл.
9
9
10
9
9
8
8
7
7
В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных эффекторных клеток, подлежащая истощению, содержит приблизительно 6×10 CD25+ T-клеток. В других аспектах популяция иммунных эффекторных клеток, подлежащая истощению, содержит от приблизительно 1×10до 1×10 CD25+ Т-клеток с включением любого целочисленного значения в данном промежутке. В некоторых вариантах осуществления популяция, истощенная по регуляторным T-клеткам, содержит 2×10регуляторных T-клеток, например, CD25+ клеток или меньше (например, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или меньше CD25+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления регуляторные T-клетки, например, CD25+ клетки, удаляют из популяции с помощью системы CliniMACS с набором трубок для истощения, таким как, например, трубки 162-01. В некоторых вариантах осуществления система CliniMACS работает с установленными параметрами истощения, например, такими как DEPLETION2.1.
REG
REG
REG
Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, полагают, что посредством снижения уровня отрицательных регуляторов иммунных клеток (например, уменьшения количества нежелательных иммунных клеток, например, T-клеток) у субъекта до афереза или в ходе изготовления клеточного продукта, характеризующегося экспрессией CAR, можно снизить риск рецидива у субъекта. Например, способы истощения популяции T-клеток известны из уровня техники. Способы уменьшения количества T-клеток включают без ограничения применение циклофосфамида, антитела к GITR (антитела к GITR, описанного в данном документе), реагента для истощения по CD25 и их комбинаций.
REG
REG
В некоторых вариантах осуществления способы изготовления включают снижение количества (например, истощение популяции) T-клеток до изготовления клетки, экспрессирующей CAR. Например, способы изготовления включают приведение образца, например, образца, полученного путем афереза, в контакт с антителом к GITR и/или антителом к CD25 (или его фрагментом или CD25-связывающим лигандом), например, для истощения популяции T-клеток до изготовленияклеточного (например, T-клеточного, NK-клеточного) продукта, характеризующегося экспрессией CAR.
REG
REG
В одном варианте осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью одного или нескольких видов терапии, которые обеспечивают снижение количества T-клеток, перед сбором клеток для изготовления клеточного продукта, характеризующегося экспрессией CAR, за счет чего обеспечивается снижение риска рецидива у субъекта при лечении с помощью клеток, экспрессирующих CAR. В одном варианте осуществления способы уменьшения количества T-клеток включают без ограничения введение субъекту одного или нескольких из циклофосфамида, антитела к GITR, реагента для истощения по CD25 или их комбинации. Введение одного или нескольких из циклофосфамида, антитела к GITR, реагента для истощения по CD25 или их комбинации может происходить до, во время или после инфузии клеточного продукта, характеризующегося экспрессией CAR.
В одном варианте осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью циклофосфамида перед сбором клеток для изготовления клеточного продукта, характеризующегося экспрессией CAR, за счет чего обеспечивается снижение риска рецидива у субъекта при лечении с помощью клеток, экспрессирующих CAR. В одном варианте осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью антитела к GITR перед сбором клеток для изготовления клеточного продукта, характеризующегося экспрессией CAR, за счет чего обеспечивается снижение риска рецидива у субъекта при лечении с помощью клеток, экспрессирующих CAR.
В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, подлежащая удалению, не представляет собой ни регуляторные Т-клетки, ни опухолевые клетки, а представляет собой клетки, которые в иных отношениях отрицательно влияют на размножение и/или функцию CART-клеток, например, клетки, экспрессирующие CD14, CD11b, CD33, CD15 или другие маркеры, экспрессируемые потенциально иммуносупрессорными клетками. В некоторых вариантах осуществления предполагается, что такие клетки удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками и/или опухолевыми клетками, или после указанного истощения, или в другом порядке.
Способы, описанные в данном документе, могут включать более одной стадии отбора, например, более одной стадии истощения. Обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора можно осуществлять, например, с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для клеток, подвергаемых отрицательному отбору. Один из способов представляет собой сортировку и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которых используется коктейль моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, подвергаемых отрицательному отбору. Например, для обогащения CD4+ клетками путем отрицательного отбора коктейль моноклональных антител может содержать антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8.
Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать удаление из популяции клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, который не включает в себя CD25, например, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, за счет чего обеспечивается получение популяции клеток, истощенной по регуляторным Т-клеткам, например, истощенной по CD25+ клеткам и истощенной по клеткам с опухолевым антигеном, которые подходят для экспрессии CAR, например, CAR, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например, CD25+ клетками. Например, антитело к CD25 или его фрагмент и антитело к опухолевому антигену или его фрагмент могут быть присоединены к одному и тому же субстрату, например, микрогрануле, который можно использовать для удаления клеток, или антитело к CD25 или его фрагмент или антитело к опухолевому антигену или его фрагмент могут быть присоединены к отдельным микрогранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других вариантах осуществления удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, и удаление клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, является последовательным и может происходить, например, в любом порядке.
Также представлены способы, которые включают удаление из популяции клеток, экспрессирующих ингибитор контрольной точки иммунного ответа, например, ингибитор контрольной точки иммунного ответа, описанный в данном документе, например, одного или нескольких из PD1+ клеток, LAG3+ клеток и TIM3+ клеток, за счет чего обеспечивается получение популяции, истощенной по регуляторным Т-клеткам, например, истощенной по CD25+ клеткам и истощенной по клеткам с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, например, истощенной по PD1+, LAG3+ и/или TIM3+ клеткам. Иллюстративные ингибиторы контрольных точек иммунного ответа включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В ряде вариантов осуществления ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой PD1 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие ингибитор контрольной точки иммунного ответа, удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например, CD25+ клетками. Например, антитело к CD25 или его фрагмент и антитело к ингибитору контрольной точки иммунного ответа или его фрагмент могут быть присоединены к одной и той же микрогрануле, которую можно использовать для удаления клеток, или антитело к CD25 или его фрагмент и антитело к ингибитору контрольной точки иммунного ответа или его фрагмент могут быть присоединены к отдельным микрогранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других вариантах осуществления удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, и удаление клеток, экспрессирующих ингибитор контрольной точки иммунного ответа, является последовательным и может происходить, например, в любом порядке.
В некоторых вариантах осуществления можно выбрать популяцию Т-клеток, которые экспрессируют один или несколько из IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, гранзима В и перфорина или других соответствующих молекул, например, других цитокинов. Способы скрининга в отношении клеточной экспрессии можно определить, например, с помощью способов, описанных в публикации согласно PCT № WO 2013/126712.
Для выделения необходимой популяции клеток путем положительного или отрицательного отбора можно изменять концентрацию клеток и поверхности (например, частиц, таких как микрогранулы). В определенных аспектах может потребоваться значительно уменьшить объем, в котором микрогранулы и клетки смешиваются друг с другом (например, увеличить концентрацию клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и микрогранул. Например, в одном аспекте используют концентрацию, составляющую 2 миллиарда клеток/мл. В одном аспекте используют концентрацию, составляющую 1 миллиард клеток/мл. В дополнительном аспекте используют более 100 миллионов клеток/мл. В дополнительном аспекте используют концентрацию клеток, составляющую 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном аспекте используют концентрацию клеток, составляющую от 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В дополнительных аспектах можно использовать концентрации, составляющие 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножения клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут характеризоваться слабой экспрессией антигенов-мишеней, представляющих интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки, или клетки из образцов, в которых присутствует много опухолевых клеток (например, лейкозной крови, опухолевой ткани и т. д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и может потребоваться их получение. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет проводить более эффективный отбор CD8+ Т-клеток, которые обычно характеризуются более слабой экспрессией CD28.
5
6
В связанном аспекте может потребоваться использование более низких концентраций клеток. Благодаря значительному разбавлению смеси Т-клеток и поверхности (например, частиц, таких как микрогранулы) взаимодействие между частицами и клетками сводится к минимуму. При этом отбираются клетки, которые экспрессируют необходимые антигены, подлежащие связыванию с частицами, в высоких количествах. Например, CD4+ T-клетки экспрессируют CD28 на более высоких уровнях и захватываются в слабых концентрациях более эффективно, чем CD8+ T-клетки. В одном аспекте используемая концентрация клеток составляет 5 X 10e6/мл. В других аспектах используемая концентрация может составлять от приблизительно 1 X 10/мл до 1 X 10/мл с включением любого целочисленного значения в этом промежутке.
В других аспектах клетки можно инкубировать на ротаторе в течение различных промежутков времени с различными скоростями при 2-10°C либо при комнатной температуре.
Т-клетки для стимуляции также можно замораживать после стадии промывания. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что стадия замораживания и последующего размораживания обеспечивает получение более однородного продукта за счет удаления гранулоцитов и в некоторой степени моноцитов из популяции клеток. После стадии промывания, на которой удаляют плазму крови и тромбоциты, клетки можно суспендировать в замораживающем растворе. Хотя многие замораживающие растворы и параметры для замораживания известны из уровня техники и будут применимыми в данном случае, один способ предусматривает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% человеческий сывороточный альбумин, или культуральных сред, содержащих 10% декстран 40 в 5% декстрозе, 20% человеческий сывороточный альбумин и 7,5% DMSO или 31,25% PlasmaLyte-А, 31,25% раствор с 5% декстрозой в 0,45% NaCl, 10% декстран 40 в 5% декстрозе, 20% человеческий сывороточный альбумин и 7,5% DMSO, или других подходящих сред для замораживания клеток, содержащих, например, Hespan и PlasmaLyte A, и затем клетки замораживают до -80°C со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе в резервуаре для хранения жидкого азота. Можно применять другие способы контролируемого замораживания, а также неконтролируемого замораживания немедленно при -20°C или в жидком азоте.
В определенных аспектах криоконсервированные клетки размораживают и промывают, как описано в данном документе, и оставляют на один час при комнатной температуре до активации с применением способов по настоящему изобретению.
В контексте настоящего изобретения также предусмотрен сбор образцов крови или продукта афереза у субъекта в период времени до того, как могут понадобиться размноженные клетки, описанные в данном документе. Ввиду этого источник клеток, подлежащих размножению, можно собирать в любой необходимый момент времени, и необходимые клетки, такие как иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, можно выделять и замораживать для последующего применения в терапии клетками, например, терапии Т-клетками, любого количества заболеваний или состояний, при которых будет благоприятной терапия клетками, например, терапия Т-клетками, такими как описанные в данном документе. В одном аспекте образец крови или материал, получаемый путем афереза, отбирают у в целом здорового субъекта. В определенных аспектах образец крови или материал, получаемый путем афереза, отбирают у в целом здорового субъекта, который имеет риск развития заболевания, но у которого заболевание еще не развилось, и клетки, представляющие интерес, выделяют и замораживают для последующего применения. В определенных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) можно размножать, замораживать и применять позднее. В определенных аспектах образцы собирают у пациента вскоре после диагностирования конкретного заболевания, описанного в данном документе, однако до проведения каких-либо видов лечения. В дополнительном аспекте клетки выделяют из образца крови или материала, получаемого путем афереза, у субъекта до осуществления любого количества соответствующих способов лечения, в том числе без ограничения лечения такими средствами, как натализумаб, эфализумаб, противовирусные средства, химиотерапия, лучевая терапия, иммуносупрессорные средства, такие как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антитела или другие иммунодеструктивные средства, такие как CAMPATH, антитела к CD3, цитоксан, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228 и облучение.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения, при котором у субъекта остаются функциональные Т-клетки. В данном отношении наблюдалось, что после определенных видов лечения рака, в частности видов лечения лекарственными средствами, которые повреждают иммунную систему, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты обычно восстанавливаются после лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности размножаться ex vivo. Аналогично, после манипуляций ex vivo с применением способов, описанных в данном документе, эти клетки могут находиться в состоянии, предпочтительном для улучшенного приживления и размножения in vivo. Таким образом, в контексте настоящего изобретения рассматривается сбор клеток крови, в том числе Т-клеток, дендритных клеток или других клеток гемопоэтической линии дифференцировки, во время этой фазы восстановления. Кроме того, в определенных аспектах можно использовать мобилизацию (например, мобилизацию с помощью GM-CSF) и режимы кондиционирования для создания у субъекта состояния, благоприятного для репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или размножения определенных типов клеток, особенно в течение определенного временного окна после терапии. Иллюстративные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в данном документе,, получают от субъекта, который получил низкую повышающую иммунитет дозу ингибитора mTOR. В одном варианте осуществления популяцию иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, подлежащих конструированию для экспрессии CAR, собирают спустя достаточное количество времени или после достаточного введения низкой дозы, усиливающей иммунный ответ, ингибитора mTOR так, чтобы уровень PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или соотношение PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, и PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, у субъекта или в материале, собранном у субъекта, по меньшей мере временно были повышены.
В других вариантах осуществления популяция иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, которые были сконструированы или будут сконструированы для экспрессии CAR, может быть обработана ex vivo путем приведения ее в контакт с таким количеством ингибитора mTOR, которое обеспечивает увеличение количества PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или обеспечивает увеличение соотношения PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, и PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток.
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки в популяции характеризуются дефицитом диацилглицеринкиназы (DGK). Клетки с дефицитом DGK включают клетки, которые не экспрессируют DGK в виде РНК или белка или характеризуются пониженной или ингибированной активностью DGK. Клетки с дефицитом DGK можно получить с помощью генетических подходов, например, путем введения средств для РНК-интерференции, например, siRNA, shRNA, miRNA, для снижения или предотвращения экспрессии DGK. В качестве альтернативы, клетки с дефицитом DGK можно получить путем обработки ингибиторами DGK, описанными в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки в популяции характеризуются дефицитом Ikaros. Клетки с дефицитом Ikaros включают клетки, которые не экспрессируют Ikaros в виде РНК или белка или характеризуются пониженной или ингибированной активностью Ikaros; клетки с дефицитом Ikaros можно получить с помощью генетических подходов, например, путем введения средств для РНК-интерференции, например, siRNA, shRNA, miRNA, для снижения или предотвращения экспрессии Ikaros. В качестве альтернативы, клетки с дефицитом Ikaros можно получить путем обработки ингибиторами Ikaros, например, леналидомидом.
В ряде вариантов осуществления Т-клетки в популяции характеризуются дефицитом DGK и дефицитом Ikaros, например, не экспрессируют DGK и Ikaros или характеризуются сниженной или ингибированной активностью DGK и Ikaros. Такие клетки с дефицитом DGK и Ikaros можно получить любым из способов, описанных в данном документе.
В одном варианте осуществления NK-клетки получают от субъекта. В другом варианте осуществления NK-клетки представляют собой линию NK-клеток, например, линию клеток NK-92 (Conkwest).
Аллогенный CAR
В ряде вариантов осуществления, описанных в данном документе, иммунная эффекторная клетка может представлять собой аллогенную иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку или NK-клетку. Например, клетка может представлять собой аллогенную Т-клетку, например, аллогенную Т-клетку, в которой отсутствует экспрессия функционального Т-клеточного рецептора (TCR), и/или лейкоцитарного антигена человека (HLA), например, HLA класса I и/или HLA класса II.
T-клетку, в которой отсутствует функциональный TCR, можно, например, сконструировать таким образом, чтобы она вообще не экспрессировала функциональный TCR на своей поверхности, сконструировать таким образом, чтобы она не экспрессировала одну или несколько субъединиц, которые образуют функциональный TCR (например, сконструировать таким образом, чтобы она не экспрессировала (или демонстрировала сниженную экспрессию) TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма, TCR-дельта, TCR-эпсилон и/или TCR-дзета), или сконструировать таким образом, чтобы она вырабатывала очень небольшое количество функционального TCR на своей поверхности. В качестве альтернативы, Т-клетка может экспрессировать существенно нарушенный TCR, например, посредством экспрессии мутантных или усеченных форм одной или нескольких субъединиц TCR. Термин "существенно нарушенный TCR" означает, что этот TCR не будет вызывать нежелательную иммунную реакцию у хозяина.
Т-клетку, описанную в данном документе, можно, например, сконструировать таким образом, чтобы она не экспрессировала функциональный HLA на своей поверхности. Например, Т-клетку, описанную в данном документе, можно сконструировать таким образом, чтобы экспрессия HLA, например, HLA I класса и/или HLA II класса, на поверхности клетки была подавлена. В некоторых аспектах, подавление экспрессии HLA можно осуществлять посредством снижения или устранения экспрессии бета-2-микроглобулина (B2M). В некоторых вариантах осуществления в Т-клетке может отсутствовать функциональный TCR и функциональный HLA, например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Модифицированные Т-клетки, в которых отсутствует экспрессия функционального TCR и/или HLA, можно получить любым подходящим способом, в том числе путем нокаута или нокдауна одной или нескольких субъединиц TCR или HLA. Например, можно предусмотреть нокдаун TCR и/или HLA в Т-клетке с помощью siRNA, shRNA, коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазы с "цинковыми пальцами" (ZFN).
В некоторых вариантах осуществления аллогенная клетка может представлять собой клетку, в которой не экспрессируется или экспрессируется на низких уровнях ингибирующая молекула, например, за счет любого способа, описанного в данном документе. Например, клетка может представлять собой клетку, в которой не экспрессируется или экспрессируется на низких уровнях ингибирующая молекула, например, молекула, которая может снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета. Ингибирование ингибирующей молекулы, например, путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать функциональные характеристики клетки, экспрессирующей CAR. В вариантах осуществления можно применять ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, dsRNA, например, siRNA или shRNA, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с "цинковыми пальцами" (ZFN), например, описанные в данном документе.
siРНК и shРНК для ингибирования TCR или HLA
В некоторых вариантах осуществления экспрессию TCR и/или экспрессию HLA можно ингибировать с помощью siRNA или shRNA, нацеливающихся на нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR и/или HLA, и/или ингибирующую молекулу, описанную в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета), в клетке, например, Т-клетке.
Экспрессия siRNA и shRNA в Т-клетках может быть достигнута с использованием любой традиционной системы экспрессии, например, такой как лентивирусная система экспрессии.
Иллюстративные shRNA которые подавляют экспрессию компонентов TCR, описаны, например, в публикации США № 2012/0321667. Иллюстративные siRNA и shRNA, которые подавляют экспрессию генов HLA I класса и/или HLA II класса, описаны, например, в публикации США № US 2007/0036773.
CRISPR для ингибирования TCR или HLA
Используемые в данном документе "CRISPR", или "CRISPR для TCR и/или HLA", или "CRISPR для ингибирования TCR и/или HLA" относится к набору коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами, или к системе, содержащей такой набор повторов. Используемый в данном документе "Cas" относится к CRISPR-ассоциированному белку. Система "CRISPR/Cas" относится к системе, полученной из CRISPR и Cas, которую можно применять для сайленсинга или осуществления мутации гена TCR и/или HLA и/или ингибирующей молекулы, описанной в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
et al.
BMC Bioinformatics
et al.
Science
et al.
Science
Встречающиеся в природе системы CRISPR/Cas находят примерно в 40% секвенированных геномов эубактерий и в 90% секвенированных геномов Archaea. Grissa  (2007)  8: 172. Эта система является типом прокариотической иммунной системы, которая обеспечивает устойчивость к чужеродным генетическим элементам, таким как плазмиды и фаги, и обеспечивает форму адаптивного иммунитета. Barrangou  (2007) 315: 1709-1712; Marragini ( 2008)  322: 1843-1845.
et al.
Nature
Система CRISPR/Cas была модифицирована с целью применения в редактировании генома (сайленсинга, усиления или изменения определенных генов) у эукариот, таких как мыши или приматы. Wiedenheft  (2012)  482: 331-8. Это достигается, например, путем введения в эукариотическую клетку плазмиды, содержащей специально сконструированный CRISPR и один или несколько подходящих Cas.
Последовательность CRISPR, иногда называемая локусом CRISPR, содержит перемежающиеся повторы и спейсеры. Во встречающихся в природе CRISPR спейсеры обычно содержат последовательности, чужеродные для бактерии, такие как плазмидная или фаговая последовательность; в системе CRISPR/Cas для TCR и/или HLA спейсеры получены из последовательности гена TCR или HLA.
et al.
Science
et al.
Biology Direct
Science
РНК из локуса CRISPR конститутивно экспрессируется и процессируется белками Cas в малые РНК. Они содержат спейсер, фланкированный последовательностью повтора. РНК направляют другие белки Cas для сайленсинга экзогенных генных элементов на уровне РНК или ДНК. Horvath  (2010)  327: 167-170; Makarova  (2006)  1: 7. Таким образом, спейсеры служат в качестве матриц для молекул РНК, аналогично siRNA. Pennisi (2013)  341: 833-836.
et al.
PLoS Comput. Biol.
et al.
Genome Biol.
et al.
J. Mol. Evol.
et al.
Microbiol.
Microbiol.
et al.
Trends. Genet
Science
Science
Поскольку они встречаются в природе у многих различных типов бактерий, точное расположение CRISPR и структура, функция и количество генов Cas и их продукт несколько различаются от вида к виду. Haft  (2005)  1: e60; Kunin  (2007)  8: R61; Mojica  (2005)  60: 174-182; Bolotin  (2005)  151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005)  151: 653-663; и Stern  (2010) . 28: 335-340. Например, белки Cse (подтип Cas, E. coli) (например, CasA) образуют функциональный комплекс Cascade, который процессирует транскрипты РНК CRISPR в спейсер-единицы повтора, которые сохраняет Cascade. Brouns et al. (2008)  321: 960-964. В других прокариотах Cas6 процессирует транскрипт CRISPR. Для основанной на CRISPR инактивации фагов у E. coli необходимы Cascade и Cas3, но не Cas1 или Cas2. Белки Cmr (модуль RAMP Cas) у Pyrococcus furiosus и других прокариот формируют функциональный комплекс с малыми РНК CRISPR, который распознает и расщепляет комплементарные целевые РНК. Более простая система CRISPR основывается на белке Cas9, который представляет собой нуклеазу с двумя активными сайтами разрезания, по одному на каждую нить двойной спирали. Объединение Cas9 и модифицированной РНК локуса CRISPR может применяться в системе для генного редактирования. Pennisi (2013)  341: 833-836.
Таким образом, система CRISPR/Cas может применяться для редактирования гена TCR и/или HLA (добавления или делеции пары оснований) или для введения преждевременного стоп-кодона, который таким образом обеспечивает снижение уровня экспрессии TCR и/или HLA. В качестве альтернативы можно использовать систему CRISPR/Cas, например РНК-интерференцию, обратимым образом отключая ген TCR и/или HLA. Например, в клетке млекопитающего РНК может направлять белок Cas к промотору TCR и/или HLA, стерически блокируя РНК-полимеразы.
Можно получить искусственные системы CRISPR/Cas, которые ингибируют TCR и/или HLA, с использованием технологии, известной из уровня техники, например, которая описана в публикации заявки на патент США № 20140068797 и Cong (2013) Science 339: 819-823. Также можно получить другие искусственные системы CRISPR/Cas, известные из уровня техники, которые ингибируют TCR и/или HLA, например, которые описаны в Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, патентах США №№ 8871445; 8865406; 8795965; 8771945; и 8697359.
TALEN для ингибирования TCR и/или HLA
"TALEN", или "TALEN для HLA и/или TCR", или "TALEN для ингибирования HLA и/или TCR" относится к эффекторной нуклеазе, подобной активаторам транскрипции, искусственной нуклеазе, которую можно применять для редактирования гена HLA и/или TCR и/или ингибирующей молекулы, описанной в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозина и TGF-бета), в клетке, например, T-клетке.
Nature Biotech
Science
Science
TALEN получают искусственно путем слияния ДНК-связывающего домена эффектора TAL с доменом расщепления ДНК. Можно сконструировать эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), для связывания любой необходимой последовательности ДНК, включая часть гена HLA или TCR. Путем объединения сконструированного TALE с доменом расщепления ДНК можно получить рестрикционный фермент, который является специфичным в отношении к любой необходимой последовательности ДНК, включая последовательности HLA или TCR. Затем их можно вводить в клетку, где они могут использоваться для редактирования генома. Boch (2011) . 29: 135-6; и Boch et al. (2009)  326: 1509-12; Moscou et al. (2009)  326: 3501.
TALE представляют собой белки, секретируемые бактериями рода Xanthomonas. ДНК-связывающий домен содержит повторяющуюся высококонсервативную последовательность из 33-34 аминокислот, за исключением 12-ой и 13-ой аминокислот. Эти две позиции сильно варьируют, демонстрируя сильную корреляцию с распознаванием специфичных нуклеотидов. Таким образом, они могут быть сконструированы так, чтобы связываться с требуемой последовательностью ДНК.
Nucl. Acids Res.
Nature Biotech
Nature Biotech
Science
Nature Methods
Nature Biotech.
J. Mol. Biol.
Чтобы получить TALEN, белок TALE сливают с нуклеазой (N), которая представляет собой эндонуклеазу FokI дикого типа или мутированную. Несколько мутаций в FokI были осуществлены для обеспечения возможности ее применения в TALEN; например, они улучшают специфичность или активность расщепления. Cermak et al. (2011)  39: e82; Miller et al. (2011) . 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) . 29: 731-734; Wood et al. (2011)  333: 307; Doyon et al. (2010)  8: 74-79; Szczepek et al. (2007)  25: 786-793; и Guo et al. (2010)  200: 96.
Nature Biotech.
Домен FokI функционирует как димер, что требует двух конструкций с уникальными ДНК-связывающими доменами для сайтов в целевом геноме с надлежащей ориентацией и расстоянием. Как количество аминокислотных остатков между ДНК-связывающим доменом TALE и доменом расщепления FokI, так и количество оснований между двумя отдельными сайтами связывания TALEN, по-видимому, являются важными параметрами для достижения высоких уровней активности. Miller et al. (2011)  29: 143-8.
TALEN для HLA или TCR может применяться внутри клетки для создания двухнитевого разрыва (DSB). Мутацию можно ввести в сайт разрыва, если репаративные механизмы неправильно репарируют разрыв посредством негомологичного соединения концов. Например, неправильная репарация может привести к мутации со сдвигом рамки. В качестве альтернативы, чужеродная ДНК может быть введена в клетку вместе с TALEN; в зависимости от последовательностей чужеродной ДНК и хромосомной последовательности, данный процесс можно применять для исправления дефекта в гене HLA или TCR или для введения такого дефекта в ген wt HLA или TCR, уменьшая тем самым экспрессию HLA или TCR.
Nature Biotech.
PLoS ONE
TALEN, специфические в отношении последовательностей в HLA или TCR, можно сконструировать с применением любого способа, известного из уровня техники, включая различные схемы с применением модульных компонентов. Zhang et al. (2011)  29: 149-53; Geibler et al. (2011)  6: e19509.
Нуклеаза с "цинковыми пальцами" для ингибирования HLA и/или TCR
"ZFN" или "нуклеаза с цинковыми пальцами" или "ZFN для HLA и/или TCR" или "ZFN для ингибирования HLA и/или TCR" относится к "нуклеазе с цинковыми пальцами", искусственной нуклеазе, которую можно применять для редактирования гена HLA и/или TCR, и/или ингибирующей молекулы, описанной в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Genetics Society of America
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Подобно TALEN, ZFN содержит домен нуклеазы FokI (или его производное), слитый с ДНК-связывающим доменом. В случае ZFN ДНК-связывающий домен содержит один или несколько "цинковых пальцев". Carroll et al. (2011)  188: 773-782; и Kim et al. (1996)  93: 1156-1160.
"Цинковый палец" представляет собой небольшой структурный мотив белка, стабилизированный одним или несколькими ионами цинка. "Цинковый палец" может содержать, например, Cys2His2 и может распознавать последовательность из примерно 3 п. о. Разные "цинковые пальцы" с известной специфичностью могут быть объединены с получением многопальцевых полипептидов, которые распознают последовательности из приблизительно 6, 9, 12, 15 или 18 п. о. Доступны различные методики отбора и модульной сборки для создания "цинковых пальцев" (и их комбинаций), распознающих специфичные последовательности, в том числе фаговый дисплей, дрожжевые одногибридные системы, бактериальные одногибридные и двухгибридные системы и клетки млекопитающих.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Как и TALEN, ZFN должен димеризоваться, чтобы расщепить ДНК. Таким образом, пара ZFN необходима для нацеливания на непалиндромные сайты ДНК. Два отдельных ZFN должны связывать противоположные нити ДНК с их нуклеазами, правильно расположенными на расстоянии друг от друга. Bitinaite et al. (1998)  95: 10570-5.
Также, подобно TALEN, ZFN может создавать двухнитевой разрыв в ДНК, который может создавать мутацию со сдвигом рамки при неправильной репарации, что приведет к снижению экспрессии и количества HLA и/или TCR в клетке. ZFN также можно использовать с гомологичной рекомбинацией для мутации в гене HLA или TCR.
Mol. Ther.
J. Mol. Biol.
ZFN, специфические в отношении последовательностей в HLA и/или TCR можно сконструировать с применением любого способа, известного из уровня техники. См., например, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Кровь 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008)  16: 1200-7; Guo et al. (2010)  400: 96; публикацию заявки на патент США 2011/0158957; и публикацию заявки на патент США 2012/0060230.
Экспрессия теломеразы
Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, полагают, что в некоторых вариантах осуществления для терапевтической Т-клетки характерна кратковременная персистенция в пациенте вследствие укороченных теломер в Т-клетке; соответственно, трансфекция гена теломеразы может приводить к удлинению теломер в Т-клетке и улучшить персистенцию Т-клетки в пациенте. См. Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Таким образом, в одном варианте осуществления иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка, характеризуется эктопической экспрессией субъединицы теломеразы, например, каталитической субъединицы теломеразы, например, TERT, например, hTERT. В некоторых аспектах настоящего изобретения представлен способ получения клетки, экспрессирующей CAR, предусматривающий приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например, TERT, например, hTERT. Клетку можно приводить в контакт с нуклеиновой кислотой перед приведением в контакт с конструкцией, кодирующей CAR, одновременно с этим или после этого.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток). В одном варианте осуществления способ предусматривает получение популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR; и приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT, в условиях, которые обеспечивают возможность осуществления экспрессии CAR и теломеразы.
В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, представляет собой ДНК. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, содержит промотор, способный управлять экспрессией субъединицы теломеразы.
В одном варианте осуществления hTERT имеет следующую аминокислотную последовательность с ID белка в GenBank AAC51724.1 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell, Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, стр. 785-795):
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 284)
В одном варианте осуществления hTERT имеет последовательность на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности под SEQ ID NO: 284. В одном варианте осуществления hTERT имеет последовательность под SEQ ID NO: 284. В одном варианте осуществления hTERT содержит делецию (например, размером не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) на N-конце, С-конце или на них обоих. В одном варианте осуществления hTERT содержит трансгенную аминокислотную последовательность (например, размером не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) на N-конце, C-конце или на них обоих.
Активация и размножение T-клеток
Т-клетки можно активировать и размножать, как правило, с применением способов, описанных, например, в патентах США №№ 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041 и публикации заявки на патент США № 20060121005.
Как правило, T-клетки по настоящему изобретению можно размножать путем приведения их в контакт с поверхностью, к которой присоединены средство, стимулирующее передачу сигнала, ассоциированного с комплексом CD3/TCR, и лиганд, стимулирующий костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать согласно описанному в данном документе, как, например, путем приведения их в контакт с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения их в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) совместно с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток применяют лиганд, который связывается со вспомогательной молекулой. Например, популяцию Т-клеток можно приводить в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Для стимуляции пролиферации CD4+ T-клеток либо CD8+ T-клеток можно применять антитело к CD3 и антитело к CD28. Примеры антитела к CD28 включают 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Безансон, Франция), и их можно применять, равно как и другие способы, общеизвестные из уровня техники (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
В определенных аспектах первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для Т-клетки можно обеспечивать с помощью различных протоколов. Например, средства, обеспечивающие каждый сигнал, могут находиться в растворе или быть связаны с поверхностью. В случае, если они связаны с поверхностью, средства могут быть связаны с одной и той же поверхностью (т. е. в "цис"-расположении) или с отдельными поверхностями (т. е. в "транс"-расположении). В качестве альтернативы, одно средство может быть связано с поверхностью, а другое средство может находиться в растворе. В одном аспекте средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, связано с клеточной поверхностью, а средство, обеспечивающее первичный сигнал активации, находится в растворе или связано с поверхностью. В определенных аспектах оба средства могут находиться в растворе. В одном аспекте средства могут находиться в растворимой форме, а затем их сшивают с поверхностью, такой как клетка, экспрессирующая Fc-рецепторы, или антитело или другое связывающее средство, которое будет связываться с данными средствами. В этом отношении см., например, публикации заявок на патент США №№ 20040101519 и 20060034810 в том, что касается искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPC), которые предполагаются для применения в активации и размножении Т-клеток в настоящем изобретении.
В одном аспекте два средства иммобилизованы на микрогранулах: либо на одной и той же микрогрануле, т. е. в "цис"-положении, либо на отдельных микрогранулах, т. е. в "транс"-положении. В качестве примера, средство, обеспечивающее первичный сигнал активации, представляет собой антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, а средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, представляет собой антитело к CD28 или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба средства совместно иммобилизованы на одной и той же микрогрануле в эквивалентных молекулярных количествах. В одном аспекте для размножения CD4+ T-клеток и роста T-клеток каждое антитело, связанное с микрогранулами, применяют в соотношении 1:1. В определенных аспектах настоящего изобретения используют такое соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, при котором наблюдается повышение интенсивности размножения Т-клеток по сравнению с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В одном конкретном аспекте наблюдается повышение в от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз по сравнению с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В одном аспекте соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, находится в диапазоне от 100:1 до 1:100 и включает все целочисленные значения в этом промежутке. В одном аспекте настоящего изобретения с частицами связано больше антител к CD28, чем антител к CD3, т. е. соотношение CD3:CD28 составляет меньше единицы. В определенных аспектах настоящего изобретения соотношение антител к CD28 и антител к CD3, связанных с микрогранулами, составляет более 2:1. В одном конкретном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 1:100. В одном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 1:75. В дополнительном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 1:50. В одном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 1:30. В одном предпочтительном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 1:10. В одном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 1:3. В еще одном аспекте используется соотношение антител к CD3:CD28, связанных с микрогранулами, составляющее 3:1.
Для стимуляции Т-клеток или других клеток-мишеней можно использовать соотношения частиц и клеток от 1:500 до 500:1 с включением любых целочисленных значений в этом промежутке. Как будет очевидно для специалистов обычной квалификации в данной области, соотношение частиц и клеток может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, микрогранулы небольшого размера могут связывать лишь немного клеток, тогда как более крупные микрогранулы могут связывать много клеток. В определенных аспектах для стимуляции Т-клеток также можно использовать соотношение клеток и частиц, находящееся в диапазоне от 1:100 до 100:1 и включающее любые целочисленные значения в этом промежутке, а в дополнительных аспектах соотношение составляет от 1:9 до 9:1 и включает любые целочисленные значения в этом промежутке. Соотношение частиц, связанных с антителами к CD3 и антителами к CD28, и Т-клеток, которое приводит к стимуляции Т-клеток, может варьироваться, как отмечено выше, однако определенные предпочтительные значения включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1 при этом одно предпочтительное соотношение составляет по меньшей мере 1:1 частиц на Т-клетку. В одном аспекте используется соотношение частиц и клеток, составляющее 1:1 или меньше. В одном конкретном аспекте предпочтительное соотношение частицы:клетки составляет 1:5. В дополнительных аспектах соотношение частиц и клеток может варьироваться в зависимости от дня стимуляции. Например, в одном аспекте соотношение частиц и клеток составляет от 1:1 до 10:1 в первый день, и после этого к клеткам ежедневно или раз в два дня добавляют дополнительные частицы в течение периода до 10 дней при конечных соотношениях от 1:1 до 1:10 (в расчете на количество клеток в день добавления). В одном конкретном аспекте соотношение частиц и клеток составляет 1:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют ежедневно или раз в два дня до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте соотношение частиц и клеток составляет 2:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют ежедневно или раз в два дня до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. Специалисту в данной области будет понятно, что для использования в настоящем изобретении может подходить множество других соотношений. В частности, соотношения будут варьироваться в зависимости от размера частиц, а также от размера и типа клеток. В одном аспекте наиболее типичные соотношения для использования составляют примерно 1:1, 2:1 и 3:1 в первый день.
В дополнительных аспектах настоящего изобретения клетки, такие как Т-клетки, объединяют с микрогранулами, покрытыми средством, микрогранулы и клетки впоследствии разделяют, а затем клетки культивируют. В альтернативном аспекте микрогранулы, покрытые средством, и клетки не разделяют перед культивированием, а культивируют вместе. В дополнительном аспекте микрогранулы и клетки вначале концентрируют путем приложения силы, такой как сила магнитного поля, что приводит к увеличению лигирования маркеров клеточной поверхности, за счет чего обеспечивается индукция стимуляции клеток.
4
9
В качестве примера, белки клеточной поверхности можно лигировать, обеспечивая возможность контакта парамагнитных микрогранул, к которым присоединены антитела к CD3 и антитела к CD28 (микрогранул 3 × 28), и Т-клеток. В одном аспекте клетки (например, от 10 до 10 T-клеток) и микрогранулы (например, парамагнитные микрогранулы DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T в соотношении 1:1) объединяют в буфере, например, PBS (без двухвалентных катионов, таких как кальций и магний). Специалистам обычной квалификации в данной области также будет очевидно, какую концентрацию клеток можно использовать. Например, клетка-мишень может очень редко встречаться в образце и составлять только 0,01% образца, или весь образец (т. е. 100%) может состоять из клетки-мишени, представляющей интерес. Соответственно, любое количество клеток находится в рамках настоящего изобретения. В определенных аспектах может потребоваться значительно уменьшить объем, в котором частицы и клетки смешиваются друг с другом (т. е. увеличить концентрацию клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и частиц. Например, в одном аспекте используют концентрацию, составляющую приблизительно 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов/мл, 8 миллиардов/мл, 7 миллиардов/мл, 6 миллиардов/мл, 5 миллиардов/мл или 2 миллиарда клеток/мл. В одном аспекте используют более 100 миллионов клеток/мл. В дополнительном аспекте используют концентрацию клеток, составляющую 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном аспекте используют концентрацию клеток, составляющую от 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В дополнительных аспектах можно использовать концентрации, составляющие 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножения клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут характеризоваться слабой экспрессией антигенов-мишеней, представляющих интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и в определенных аспектах может требоваться их получение. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет проводить более эффективный отбор CD8+ Т-клеток, которые обычно характеризуются более слабой экспрессией CD28.
В некоторых вариантах осуществления клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в данном документе, размножают, например, с помощью способа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в культуре в течение периода от нескольких часов (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 часов) до приблизительно 14 дней (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней). В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в течение периода от 4 до 9 дней. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в течение периода 8 дней или меньше, например, 7, 6 или 5 дней. В некоторых вариантах осуществления клетки, например, клетку с CAR для ВСМА, описанную в данном документе, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки являются более эффективными, чем те же самые клетки, размножаемые в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования. Эффективность можно определить, например, по различным Т-клеточным функциям, например, пролиферации, уничтожению клеток-мишеней, продуцированию цитокинов, активации, миграции или их комбинациям. В некоторых вариантах осуществления клетки, например, клетка с CAR для ВСМА описанный в данном документе, размножаемые в течение 5 дней, демонстрируют по меньшей мере одно-, двух-, трех- или четырехкратное увеличение числа удвоений количества клеток при стимуляции антигеном по сравнению с теми же клетками, размножаемыми в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования. В некоторых вариантах осуществления клетки, например, клетки, экспрессирующие CAR для BCMA, описанные в данном документе, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки демонстрируют более высокие уровни продуцирования провоспалительных цитокинов, например, уровни IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, размножаемыми в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования. В некоторых вариантах осуществления клетки, например, клетка с CAR для ВСМА, описанная в данном документе, размножаемые в течение 5 дней демонстрируют по меньшей мере одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти-, десятикратное или большее повышение уровней продуцирования провоспалительных цитокинов в пг/мл, например, уровней IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, размножаемыми в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования.
2
В одном аспекте настоящего изобретения смесь можно культивировать в течение периода, составляющего от нескольких часов (приблизительно 3 часов) до приблизительно 14 дней или имеющего любое целочисленное значение в часах в данном промежутке. В одном аспекте смесь можно культивировать в течение 21 дня. В одном аспекте настоящего изобретения микрогранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение приблизительно восьми дней. В одном аспекте микрогранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение 2-3 дней. Также могут потребоваться несколько циклов стимуляции, вследствие чего время культивирования Т-клеток может составлять 60 дней или больше. Условия, подходящие для культивирования Т-клеток, включают соответствующую среду (например, минимальную питательную среду, или среду RPMI 1640, или X-vivo 15 (Lonza)), которая может содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, в том числе сыворотку крови (например, фетальную бычью или человеческую сыворотку крови), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ и TNF-α или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области. Другие добавки для роста клеток включают без ограничения поверхностно-активное вещество, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среда может включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, OpTmizer с добавлением аминокислот, пирувата натрия и витаминов, бессывороточную либо дополненную соответствующим количеством сыворотки (или плазмы) крови или определенным набором гормонов и/или количеством цитокина(цитокинов), достаточным для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предназначены для инфузии субъекту. Клетки-мишени содержатся в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре (например, 37 °C) и атмосфере (например, воздух с 5% CO).
В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в подходящей среде (например, среды описанный в данном документе) содержащей один или несколько интерлейкинов, которые приводят к по меньшей мере 200-кратному (например, к 200-кратному, 250-кратному, 300-кратному, 350-кратному) увеличению количества клеток в течение 14-дневного периода размножения, например, согласно измерению с помощью способа, описанного в данном документе, такого как проточная цитометрия. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7 (например, IL-15 и IL-7).
В ряде вариантов осуществления способы, описанные в данном документе, например, способы изготовления клеток, экспрессирующих CAR, включают удаление регуляторных T-клеток, например, CD25+ T-клеток, из популяции клеток, например, с помощью антитела к CD25 или его фрагмента или CD25-связывающего лиганда IL-2. Способы удаления регуляторных Т-клеток, например, CD25+ Т-клеток, из популяции клеток описаны в данном документе. В ряде вариантов осуществления способы, например, способы изготовления, дополнительно включают приведение популяции клеток (например, популяции клеток, которая была истощена по регуляторным T-клеткам, таким как CD25+ T-клетки; или популяции клеток, которая ранее была приведена в контакт с антителом к CD25, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) в контакт с IL-15 и/или IL-7. Например, популяцию клеток (например, популяцию, которая ранее была приведена в контакт с антителом к CD25, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7.
В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид интерлейкин-15 (IL-15), полипептид альфа-субъединицу рецептора интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например, ex vivo. В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид IL-15, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например, ex vivo. В ряде вариантов осуществления клетку, описанную в данном документе, экспрессирующую CAR, приводят в контакт с композицией, содержащей комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например, ex vivo. В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей hetIL-15, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например, ex vivo.
В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей hetIL-15, в ходе размножения ex vivo. В одном варианте осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид IL-15, в ходе размножения ex vivo. В одном варианте осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей как полипептид IL-15, так и полипептид IL-15Ra, в ходе размножения ex vivo. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт приводит к выживанию и пролиферации субпопуляции лимфоцитов, например, CD8+ T-клеток.
Т-клетки, которые подвергались стимуляции в течение разных периодов времени, могут демонстрировать разные характеристики. Например, в типичных препаратах крови или продуктах афереза мононуклеарных клеток периферической крови популяция Т-клеток-хелперов (TH, CD4+) превосходит по числу популяцию цитотоксических Т-клеток или Т-клеток-супрессоров (TC, CD8+). Размножение Т-клеток ex vivo путем стимуляции рецепторов CD3 и CD28 приводит к получению популяции Т-клеток, которая до приблизительно дней 8-9 состоит главным образом из ТН-клеток, тогда как после приблизительно дней 8-9 популяция Т-клеток содержит все более многочисленную популяцию TC-клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения может быть преимущественной инфузия субъекту популяции Т-клеток, содержащей главным образом ТН-клетки,. Аналогично, если была выделена антигенспецифическая субпопуляция TC-клеток, то может быть целесообразным размножение этой субпопуляции в большей степени.
Кроме того, в ходе процесса размножения клеток в дополнение к маркерам CD4 и CD8 в значительной степени, но по большей части воспроизводимо, варьируются уровни других фенотипических маркеров. Таким образом, подобная воспроизводимость дает возможность адаптировать продукт на основе активированных Т-клеток для конкретных целей.
После конструирования CAR для BCMA можно применять различные анализы для оценивания активности молекулы, такой как, без ограничения, способность Т-клеток размножаться после стимуляции антигеном, устойчивое размножение Т-клеток при отсутствии повторной стимуляции и формы противораковой активности, в соответствующих моделях in vitro и животных моделях. Анализы для оценивания эффектов CAR для BCMA более подробно описаны ниже.
et al
in vitro
+
+
Анализ экспрессии CAR в первичных Т-клетках посредством вестерн-блоттинга можно применять для определения присутствия мономеров и димеров. См., например,Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Если очень коротко, T-клетки (смесь CD4 и CD8 T-клеток в соотношении 1:1), экспрессирующие CAR, размножают  в течение более 10 дней с последующим лизисом и SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. CAR, содержащие полноразмерный цитоплазматический домен TCR-ζ и эндогенную цепь TCR-ζ, выявляют с помощью вестерн-блоттинга с применением антитела к цепи TCR-ζ. Те же субпопуляции T-клеток применяют для анализа посредством SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях для обеспечения оценивания образования ковалентных димеров.
+
+
+
+
+
+
+
+
in vitro
et al
et al
Размножение CAR Т-клеток  после стимуляции антигеном можно измерить с помощью проточной цитометрии. Например, смесь CD4 и CD8 Т-клеток стимулируют с помощью aAPC с αCD3/αCD28, а затем трансдуцируют лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP под контролем промоторов, подлежащих анализу. Иллюстративные промоторы включают промоторы генов IE CMV, EF-1α, убиквитина С или фосфоглицераткиназы (PGK). Флуоресценцию GFP оценивают с помощью проточной цитометрии в день 6 культивирования в субпопуляциях CD4 и/или CD8 T-клеток. См., например,Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). В качестве альтернативы, смесь CD4 и CD8 Т-клеток стимулируют с помощью магнитных микрогранул, покрытых αCD3/αCD28, в день 0 и трансдуцируют с помощью CAR в день 1 с применением бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего CAR вместе с eGFP с использованием последовательности 2A для "проскока" рибосомы. После промывания культуры повторно стимулируют клетками, экспрессирующими BCMA, такими как линии клеток множественной миеломы или K562-BCMA. Экзогенный IL-2 добавляют в культуры раз в два дня из расчета 100 МЕ/мл. GFP Т-клетки подсчитывают с помощью проточной цитометрии с применением подсчета по микрогранулам. См., например,Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).
+
et al
Также можно измерять уровень устойчивости размножения CAR T-клеток при отсутствии повторной стимуляции. См., например,Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Вкратце, измеряют средний объем Т-клеток (фл) в день 8 культивирования с использованием счетчика частиц Multisizer III от Coulter, Cellometer Vision от Nexcelom или Scepter от Millipore после стимуляции магнитными микрогранулами, покрытыми αCD3/αCD28, в день 0 и трансдукции с помощью указанного CAR в день 1.
+
+
+
+
+
et al
Для измерения активности CART также можно использовать животные модели. Например, можно использовать ксенотрансплантатную модель с использованием ВСМА-специфичных CAR Т-клеток человека для лечения первичной множественной миеломы человека у иммунодефицитных мышей. См., например,Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Если очень коротко, то после развития MM мышей рандомизируют в группы лечения. Различные количества CAR-T-клеток для BCMA можно инъецировать иммунодефицитным мышам, несущим MM. Животных оценивают в отношении прогрессирования заболевания и опухолевой нагрузки с недельными интервалами. Кривые выживания для групп сравнивают с помощью логарифмического рангового критерия. Кроме того, также можно анализировать абсолютное количество CD4 и CD8 T-клеток в периферической крови через 4 недели после инъекции Т-клеток иммунодефицитным мышам. Мышам инъецируют клетки множественной миеломы и через 3 недели инъецируют Т-клетки, сконструированные для экспрессии CAR для ВСМА, например, с помощью бицистронного лентивирусного вектора, который кодирует CAR, связанный с eGFP. Перед инъекцией Т-клетки нормализуют до 45-50% вводимых GFP Т-клеток путем смешивания с ложнотрансдуцированными клетками и подтверждают с помощью проточной цитометрии. Животных оценивают в отношении лейкоза с интервалами в 1 неделю. Кривые выживания для групп, получавших CAR T-клетки, сравнивают с помощью логарифмического рангового критерия.
et al
ex vivo
+
+
+
Оценка клеточной пролиферации и продуцирования цитокинов была описана ранее,например, в Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Вкратце, оценку CAR-опосредованной пролиферации проводят в титрационных микропланшетах путем смешивания отмытых Т-клеток с клетками K562, экспрессирующими ВСМА, или другими клетками миеломы, экспрессирующими ВСМА, облученными гамма-излучением перед применением. Моноклональные антитела к CD3 (клон OKT3) и антитела к CD28 (клон 9.3) добавляют в культуры с клетками KT32-BBL, которые служат в качестве положительного контроля, для стимуляции пролиферации T-клеток, поскольку эти сигналы поддерживают долгосрочное размножение CD8 T-клеток . Т-клетки подсчитывают в культурах с помощью флуоресцентных микрогранул CountBright ™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и проточной цитометрии, как описано производителем. CAR Т-клетки идентифицируют по экспрессии GFP, при этом используют T-клетки, которые сконструированы с помощью лентивирусных векторов, экспрессирующих CAR, связанные с eGFP-2A. В случае с CAR+ Т-клетками, не экспрессирующими GFP, Т-клетки CAR+ выявляют с помощью биотинилированного рекомбинантного белка ВСМА и вторичного конъюгата авидин-РЕ. Экспрессию CD4+ и CD8 на Т-клетках также одновременно выявляют с помощью специфических моноклональных антител (BD Biosciences). Измерения уровней цитокинов проводят в надосадочных жидкостях, собранных через 24 часа после повторной стимуляции, с применением набора Cytometric Bead Array (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния) для определения цитокинов TH1/TH2 человека в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию оценивают с применением проточного цитометра FACSCalibur, и данные анализируют в соответствии с инструкциями производителя.
et al
Цитотоксичность можно оценивать с помощью стандартного анализа высвобождения 51Cr. См., например,Milone ., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Вкратце, клетки-мишени (например, линии K562, экспрессирующие ВСМА, и первичные клетки множественной миеломы) нагружают 51Cr (в виде NaCrO4, New England Nuclear, Бостон, Массачусетс) при 37°C в течение 2 часов при частом взбалтывании, дважды промывают в полной среде RPMI и высевают на титрационные микропланшеты. Эффекторные Т-клетки смешивают с клетками-мишенями в лунках в полной RPMI при варьирующихся соотношениях эффекторные клетки:клетки-мишени (E:T). Также готовят дополнительные лунки, содержащие только среду (спонтанное высвобождение, SR) или 1% раствор детергента Triton-X 100 (суммарное высвобождение, TR). После 4 часов инкубирования при 37°C из каждой лунки собирают надосадочную жидкость. Затем высвободившийся 51Cr измеряют с помощью счетчика гамма-частиц (Packard Instrument Co., Уолтем, Массачусетс). Каждое из условий осуществляют в по меньшей мере трех повторностях, и процентную величину лизиса вычисляют с помощью формулы: % лизиса = (ER - SR)/(TR - SR), где ER представляет собой среднее значение 51Cr, высвобождающегося при каждом экспериментальном условии.
et al
-/-
+
+
Для оценивания специфической миграции и пролиферации CAR в моделях на животных, несущих опухоль, можно использовать технологии визуализации. Такие анализы были описаны, например, в Barrett ., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Вкратце, мышам NOD/SCID/γc (NSG) или мышам c другим иммунодефицитом инъецируют IV клетки множественной миеломы с последующей инъекцией через 7 дней САRТ-клеток для ВСМА спустя 4 часа после электропорации с помощью конструкций CAR. Т-клетки подвергают стабильной трансфекции лентивирусной конструкцией для экспрессии люциферазы светлячка, и мышей подвергают визуализации для изучения биолюминесценции. В качестве альтернативы, терапевтическую эффективность и специфичность однократной инъекции CAR Т-клеток на ксенотрансплантатной модели множественной миеломы можно измерять следующим образом. Мышам NSG инъецируют клетки множественной миеломы, трансдуцированные для стабильной экспрессии люциферазы светлячка, а затем через несколько дней однократно инъецируют в хвостовую вену Т-клетки, подвергнутые электропорации с помощью CAR для BCMA. Животных подвергают визуализации в различные моменты времени после инъекции. Например, можно получить тепловые карты плотности фотонов для опухолей, положительных по люциферазе светлячка, у иллюстративных мышей в день 5 (за 2 дня до обработки) и в день 8 (через 24 часа после введения CAR PBL).
in vitro
in vivo
В качестве альтернативы или в комбинации со способами, раскрытыми в данном документе, раскрыты способы и композиции для одного или нескольких из выявления и/или количественного определения клеток, экспрессирующих CAR (например, или  (например, клинического мониторинга)); размножения и/или активации иммунных клеток и/или CAR-специфического отбора, которые предусматривают применение лиганда CAR. В одном иллюстративном варианте осуществления лиганд CAR представляет собой антитело, которое связывается с молекулой CAR, например, связывается с внеклеточным антигенсвязывающим доменом CAR (например, антитело, которое связывается с антигенсвязывающим доменом, например, антиидиотипическое антитело; или антитело, которое связывается с константной областью внеклеточного связывающего домена). В других вариантах осуществления лиганд CAR представляет собой молекулу антигена CAR (например, молекулу антигена CAR, описанную в данном документе).
in vitro
in vivo
В одном аспекте раскрыт способ выявления и/или количественного определения клеток, экспрессирующих CAR. Например, лиганд CAR можно применять для выявления и/или количественного определения клеток, экспрессирующих CAR,  или  (например, для клинического мониторинга клеток, экспрессирующих CAR, у пациента или введения доз пациенту). Способ включает:
получение лиганда CAR (необязательно меченого лиганда CAR, например, лиганда CAR, который содержит маркер, микрогранулу, радиоактивную или флуоресцентную метку);
получение клетки, экспрессирующей CAR (например, получение образца, содержащего клетки, экспрессирующие CAR, такого как изготовленный образец или клинический образец);
приведение клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR в условиях, при которых происходит связывание, за счет чего обеспечивается выявление уровня (например, количества) присутствующих клеток, экспрессирующих CAR. Связывание клетки, экспрессирующей CAR, с лигандом CAR можно выявлять с помощью стандартных методик, таких как FACS, ELISA и т. п.
В другом аспекте раскрыт способ обеспечения размножения и/или активации клеток (например, иммунных эффектoрных клеток). Способ включает:
получение клетки, экспрессирующей CAR (например, первой клетки, экспрессирующей CAR, или клетки, транзиентно экспрессирующей CAR);
приведение указанной клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR (например, лигандом CAR, описанным в данном документе), в условиях, при которых происходит размножение и/или пролиферация иммунных клеток, за счет чего обеспечивается получение популяции активированных и/или размноженных клеток.
in vitro
ex vivo
В определенных вариантах осуществления лиганд CAR присутствует на субстрате (например, является иммобилизованным на субстрате, например, не встречающемся в природе субстрате, или присоединенным к нему). В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой неклеточный субстрат. Неклеточный субстрат может представлять собой твердую подложку, выбранную из, например, планшета (например, титрационного микропланшета), мембраны (например, нитроцеллюлозной мембраны), матрицы, чипа или микрогранулы. В ряде вариантов осуществления лиганд CAR присутствует в субстрате (например, на поверхности субстрата). Лиганд CAR может быть иммобилизован на субстрате, присоединен к нему или ковалентно или нековалентно ассоциирован (например, сшит) с ним. В некоторых вариантах осуществления лиганд CAR присоединен (например, ковалентно присоединен) к микрогрануле. В вышеуказанных вариантах осуществления популяцию иммунных клеток можно размножать  или . Способ может дополнительно включать культивирование популяции иммунных клеток в присутствии лиганда молекулы CAR, например, с помощью любого из способов, описанных в данном документе.
В других вариантах осуществления способ обеспечения размножения и/или активации клеток дополнительно включает добавление второй стимулирующей молекулы, например, CD28. Например, лиганд CAR и вторая стимулирующая молекула могут быть иммобилизованы на субстрате, например, на одной или нескольких микрогранулах, за счет чего обеспечивается повышение интенсивности размножения и/или активации клеток.
В еще одном аспекте представлен способ отбора клетки, экспрессирующей CAR, или обогащения ей. Способ включает приведение клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR, описанным в данном документе; и отбор клетки на основании связывания с лигандом CAR.
В еще нескольких других вариантах осуществления представлен способ истощения популяции, снижения количества и/или уничтожения клеток, экспрессирующих CAR. Способ включает приведение клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR, описанным в данном документе; и нацеливание на клетку на основании связывания с лигандом CAR, за счет чего обеспечивается снижение количества и/или уничтожение клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления лиганд CAR связан с токсичным средством например, токсином или лекарственным средством, разрушающим клетки). В другом варианте осуществления антиидиотипическое антитело может обуславливать активность эффекторных клеток, например, формы активности ADCC или ADC.
Иллюстративные антитела к CAR, которые можно применять в способах, раскрытых в данном документе, описаны, например, в WO 2014/190273 и у Jena et al.,"Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838, содержание которых включено посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления молекула антиидиотипического антитела распознает молекулу антитела к CD19, например, scFv антитела к CD19. Например, молекула антиидиотипического антитела может конкурировать за связывание с mAb к CAR, специфичному к CD19, клона № 136.20.1, описанным в Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838; может содержать те же CDR (например, одну или несколько, например, все, из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 CH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL согласно определению по Kabat, определению по Chothia или согласно комбинации определений по Kabat и Chothia), что и mAb к CAR, специфичному к CD19, клона № 136.20.1; может содержать одну или несколько (например, 2) таких же вариабельных областей, что и в mAb к CAR, специфичному к CD19, клона № 136.20.1, или может содержать mAb к CAR, специфичному к CD19, клона № 136.20.1. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело получено в соответствии со способом, описанным в Jena et al. В другом варианте осуществления молекула антиидиотипического антитела представляет собой молекулу антиидиотипического антитела, описанную в WO 2014/190273. В некоторых вариантах осуществления молекула антиидиотипического антитела содержит те же CDR (например, одну или несколько, например, все, из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 CH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL), что и молекула антитела из WO 2014/190273, такая как 136.20.1; может содержать одну или несколько (например, 2) вариабельных областей молекулы антитела из WO 2014/190273 или может содержать молекулу антитела из WO 2014/190273, такую как 136.20.1. В других вариантах осуществления антитело к CAR связывается с константной областью внеклеточного связывающего домена молекулы CAR, например, как это описано в WO 2014/190273. В некоторых вариантах осуществления антитело к CAR связывается с константной областью внеклеточного связывающего домена молекулы CAR, например, константной областью тяжелой цепи (например, шарнирной областью CH2-CH3) или константной областью легкой цепи. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело к CAR конкурирует за связывание с моноклональным антителом 2D3, описанным в WO 2014/190273, имеет те же CDR (например, одну или несколько, например, все, из CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 CH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL), что и 2D3, или имеет одну или несколько (например, 2) вариабельных областей 2D3 или содержит 2D3, описанное в WO 2014/190273.
+
+
В некоторых аспектах и вариантах осуществления композиции и способы в данном документе оптимизированы для конкретной субпопуляции Т-клеток, например, как описано в заявке на патент США с регистрационным № 62/031699, поданной 31 июля 2014 г., содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления оптимизированные субпопуляции T-клеток проявляют повышенную персистенцию по сравнению с контрольной T-клеткой, например, T-клеткой другого типа (например, CD8 или CD4), экспрессирующей такую же конструкцию.
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления CD4 T-клетка содержит CAR, описанный в данном документе, при этом CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для CD4 T-клетки (например, оптимизированный для, например, приведения к ее повышенной персистенции), например, домен ICOS. В некоторых вариантах осуществления CD8 T-клетка содержит CAR, описанный в данном документе, при этом CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для CD8 T-клетки (например, оптимизированный для, например, приведения к ее повышенной персистенции), например, домен 4-1BB, домен CD28 или другой костимулирующий домен, отличный от домена ICOS. В некоторых вариантах осуществления CAR, описанный в данном документе, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, например, CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на BCMA, например, CAR из таблицы 2, 6 или 10).
В одном аспекте в данном документе описан способ лечения субъекта, например, субъекта, у которого имеется рак. Способ включает введение указанному субъекту эффективного количества:
+
CD4+
1) CD4 T-клетки, содержащей CAR (CAR),
который содержит:
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, например, антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на BCMA, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2, 6 или 10;
трансмембранный домен; и
внутриклеточный сигнальный домен, например, первый костимулирующий домен, например, домен ICOS; и
+
CD8+
2) CD8 T-клетки, содержащей CAR (CAR), который содержит:
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, например, антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на BCMA, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2, 6 или 10;
трансмембранный домен; и
внутриклеточный сигнальный домен, например, второй костимулирующий домен, например, домен 4-1BB, домен CD28 или другой костимулирующий домен, отличный от домена ICOS;
CD4+
CD8+
где CARи CAR отличаются друг от друга.
Способ необязательно дополнительно включает введение:
CD8+
3) второй CD8+ T-клетки, содержащей CAR (второй CAR), который содержит:
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает BCMA, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2, 6 или 10;
трансмембранный домен; и
CD8+
CD8+
внутриклеточный сигнальный домен, где второй CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен, отсутствующий в CAR, и необязательно не содержит сигнального домена ICOS.
Другие анализы, в том числе анализы, описанные в разделе "Примеры" в данном документе, а также анализы, которые известны из уровня техники, также можно применять для оценивания конструкций СAR для BCMA по настоящему изобретению.
Терапевтическое применение
Заболевания и/или нарушения, ассоциированные с ВСМА
В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией ВСМА. В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения заболевания, где часть опухоли является отрицательной по BCMA, а часть опухоли является положительной по BCMA. Например, CAR по настоящему изобретению является применимым для лечения субъектов, которые прошли лечение от заболевания, ассоциированного с повышенной экспрессией BCMA, где у субъекта, прошедшего лечение от заболевания с повышенными уровнями BCMA, проявляется заболевание, ассоциированное с повышенными уровнями BCMA. В ряде вариантов осуществления CAR по настоящему изобретению является применимым для лечения субъектов, которые прошли лечение от заболевания, ассоциированного с экспрессией BCMA, где у субъекта, прошедшего лечение от заболевания, связанного с экспрессией BCMA, проявляется заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA.
-4
-8
-5
-7
-6
-7
В некоторых вариантах осуществленияв настоящем изобретении предусмотрены способы лечения заболевания, при котором BCMA экспрессируется как на нормальных клетках, так и на раковых клетках, но на нормальных клетках он экспрессируется при более низких уровнях. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает проведение отбора CAR по настоящему изобретению, который связывает с такой аффинностью, которая позволяет CAR для ВСМА связывать и уничтожать раковые клетки, экспрессирующие ВСМА, но при этом уничтожать менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или меньше нормальных клеток, экспрессирующих ВСМА, что, например, определяют с помощью анализа, описанного в данном документе. Например, можно применять анализ уничтожения, такой как проточная цитометрия с использованием CTL с Cr51. В некоторых вариантах осуществления CAR для ВСМА имеет антигенсвязывающий домен, который характеризуется аффинностью связывания с KD в отношении антигена-мишени, составляющей от 10 M до 10 M, например, от 10 M до 10 M, например, от 10 M или 10 M. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен для ВСМА характеризуется аффинностью связывания, которая в по меньшей мере пять раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 50 раз, 100 раз или 1000 раз меньше, чем такая у эталонного антитела, например, антитела, описанного в данном документе.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему CAR для ВСМА, функционально связанный с промотором для экспрессии в иммунных эффекторных клетках млекопитающего, например, T-клетках или NK-клетках. В одном аспекте в настоящем изобретении представлена рекомбинантная иммунная эффектoрная клетка, например, T-клетка или NK-клетка, экспрессирующая CAR для BCMA, для применения в лечении опухолей, экспрессирующих BCMA, где рекомбинантная иммунная эффектoрная клетка (например, T-клетка или NK-клетка), экспрессирующая CAR для BCMA, называется клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клеткой для BCMA или NK-клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA). В одном аспекте клетка, экспрессирующая CAR для BCMA (например, CAR-T-клетка для BCMA или NK-клетка, экспрессирующая CAR для BCMA), по настоящему изобретению способна вступать в контакт с опухолевой клеткой с по меньшей мере одним CAR для BCMA по настоящему изобретению, экспрессируемым на ее поверхности, благодаря чему клетка, экспрессирующая CAR для BCMA (например, CAR-T-клетка для BCMA или NK-клетка, экспрессирующая CAR для BCMA), нацеливается на опухолевую клетку, и рост опухоли ингибируется.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста опухолевой клетки, экспрессирующей BCMA, включающий приведение опухолевой клетки в контакт с клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клеткой для BCMA или NK-клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению, так что клетка, экспрессирующая CAR для BCMA (например, CAR-T-клетка для BCMA или NK-клетка, экспрессирующая CAR для BCMA), активируется в ответ на антиген и нацеливается на раковую клетку, при этом рост опухоли ингибируется.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта. Способ включает введение субъекту клетки, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению, так что у субъекта осуществляется лечение рака. Примером рака, поддающегося лечению с помощью клетки, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению является рак, ассоциированный с экспрессией BCMA.
Настоящее изобретение включает тип клеточной терапии, при которой иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки) являются генетически модифицированными для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), и при этом клетку, экспрессирующую CAR для BCMA (например, CAR-T-клетку для BCMA или NK-клетку, экспрессирующую CAR для BCMA), вводят посредством инфузии реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная посредством инфузии клетка способна уничтожать опухолевые клетки у реципиента. В отличие от терапевтических средств на основе антител, CAR-модифицированные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, способны реплицироваться in vivo, что приводит в результате к долгосрочной персистенции, которая может обеспечивать устойчивый контроль опухоли. В различных аспектах клетки (например, T-клетки, NK-клетки), введенные пациенту, или их потомство персистируют у пациента в течение по меньшей мере четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, двенадцати месяцев, тринадцати месяцев, четырнадцати месяцев, пятнадцати месяцев, шестнадцати месяцев, семнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, девятнадцати месяцев, двадцати месяцев, двадцати одного месяца, двадцати двух месяцев, двадцати трех месяцев, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет после введения пациенту клетки (например, T-клетки или NK-клетки).
Настоящее изобретение также включает тип клеточной терапии, при которой иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) модифицированы, например, с помощью РНК, транскрибированной in vitro, таким образом, что они транзиентно экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), и иммунную эффекторную клетку (например, Т-клетку или NK-клетку) вводят посредством инфузии реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная посредством инфузии клетка способна уничтожать опухолевые клетки у реципиента. Таким образом, в различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), вводимые пациенту, присутствуют в течение менее одного месяца, например, в течение трех недель, двух недель, одной недели, после введения пациенту иммунной эффекторной клетки (например, Т-клетки или NK-клетки).
Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, полагают, что противоопухолевый иммунный ответ, вызываемый CAR-модифицированными иммунными эффекторными клетками (например, T-клетками или NK-клетками), может быть активным или пассивным иммунным ответом или, в качестве альтернативы, может быть обусловлен прямым или непрямым иммунным ответом. В одном аспекте иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), трансдуцированные с помощью CAR, демонстрируют секрецию специфических провоспалительных цитокинов и сильную цитолитическую активность в ответ на опухолевые клетки человека, экспрессирующие ВСМА, противодействуют ингибированию со стороны растворимого ВСМА, опосредуют неспецифический цитолиз и опосредуют регрессию развившейся опухоли у человека. Например, опухолевые клетки, не содержащие антиген, в гетерогенной области опухоли, экспрессирующей ВСМА, могут быть восприимчивы к непрямому разрушению иммунными эффекторными клетками, перенаправленными на ВСМА (например, Т-клетками или NK-клетками), которые ранее вступали в реакцию против соседних раковых клеток, положительных по антигену.
В одном аспекте полностью человеческие CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки) по настоящему изобретению могут представлять собой тип вакцины для иммунизации ex vivo и/или терапии in vivo у млекопитающего. В одном аспекте млекопитающее является человеком.
Что касается иммунизации ex vivo, то перед введением клетки млекопитающему осуществляют по меньшей мере одно из следующих действий in vitro: i) размножение клеток, ii) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в клетки или iii) криоконсервацию клеток.
Процедуры ex vivo хорошо известны из уровня техники и более подробно обсуждаются ниже. Вкратце, клетки выделяют от млекопитающего (например, человека) и генетически модифицируют (т. е. трансдуцируют или трансфицируют in vitro) с помощью вектора, экспрессирующего CAR, раскрытый в данном документе. CAR-модифицированную клетку можно вводить реципиенту-млекопитающему для обеспечения терапевтически благоприятного эффекта. Реципиентом-млекопитающим может быть человек, и CAR-модифицированная клетка может быть аутологичной по отношению к реципиенту. В качестве альтернативы, клетки могут быть аллогенными, сингенными или ксеногенными по отношению к реципиенту.
Процедуру размножения ex vivo гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, описанную в патенте США № 5199942, включенном в данный документ посредством ссылки, можно применять по отношению к клеткам по настоящему изобретению. Другие подходящие способы известны из уровня техники, поэтому настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным способом размножения клеток ex vivo. Вкратце, культивирование и размножение Т-клеток ex vivo включает: (1) сбор CD34+ гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников млекопитающего из отобранного материала периферической крови или эксплантатов костного мозга и (2) размножение таких клеток ex vivo. В дополнение к клеточным факторам роста, описанным в патенте США № 5199942, для культивирования и размножения клеток можно применять другие факторы, такие как Flt3-L, IL-1, IL-3 и лиганд c-kit.
В дополнение к применению клеточной вакцины с целью иммунизации ex vivo, в настоящем изобретении также представлены композиции и способы для иммунизации in vivo для вызывания иммунного ответа, направленного на антиген у пациента.
Как правило, клетки, активированные и размноженные так, как это описано в данном документе, можно использовать в лечении и предупреждении заболеваний, возникающих у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. В частности, CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по настоящему изобретению применяют в лечении заболеваний, нарушений и состояний, ассоциированных с экспрессией ВСМА. В определенных аспектах клетки по настоящему изобретению применяют в лечении пациентов с риском развития заболеваний, нарушений и состояний, ассоциированных с экспрессией ВСМА. Таким образом, в настоящем изобретении представлены способы лечения или предупреждения заболеваний, нарушений и состояний, ассоциированных с экспрессией ВСМА, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества CAR-модифицированных иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) по настоящему изобретению.
Blood
Blood
В одном аспекте клетки, экспрессирующие CAR (например, CAR-T-клетки или NK-клетки, экспрессирующие CAR), по настоящему изобретению можно применять для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак или злокачественное новообразование, или предракового состояния, такого как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз. В одном аспекте рак представляет собой гематологический рак. Состояния, связанные с гематологическим раком, представляют собой типы рака, такие как лейкоз и злокачественные лимфопролиферативные состояния, при которых поражаются кровь, костный мозг и лимфатическая система. В одном аспекте гематологический рак представляет собой лейкоз или гемобластоз. Примером заболевания или нарушения, ассоциированного с BCMA, является множественная миелома (также известная как MM) (см. Claudio et al., . 2002, 100(6):2175-86 и Novak et al., . 2004, 103(2):689-94). Множественная миелома, также известная как плазмоклеточная миелома или болезнь Калера, представляет собой рак, характеризующийся накоплением аномальных или озлокачествленных плазматических B-клеток в костном мозге. Часто раковые клетки внедряются в смежную кость, разрушая скелетные структуры, что вызывает болевые ощущения в костях и переломы. Большинство случаев миеломы также характеризуются продуцированием парапротеина (также известного как M-белки или миеломные белки), который представляет собой аномальный иммуноглобулин, продуцируемый в избытке вследствие клональной пролиферации озлокачествленных плазматических клеток. Уровни парапротеина в сыворотке крови, составляющие более 30 г/л, являются диагностическим критерием множественной миеломы в соответствии с диагностическими критериями Международной группы по изучению множественной миеломы (IMWG) (см.Kyle et al. (2009), Leukemia. 23:3-9). Другие симптомы или признаки множественной миеломы включают ухудшение функции почек или почечную недостаточность, очаги поражения костей, анемию, гиперкальциемию и неврологические симптомы.
Критерии для проведения различий между множественной миеломой и другими нарушениями пролиферации плазматических клеток были установлены Международной группой по изучению множественной миеломы (см.Kyle et al. (2009), Leukemia. 23:3-9). Должны удовлетворяться все три следующих критерия:
- клональные плазматические клетки костного мозга ≥ 10%;
- наличие моноклонального белка в сыворотке крови и/или моче (за исключением пациентов с истинной несекретирующей множественной миеломой);
- свидетельство поражения органов-мишеней, обусловленного лежащим в его основе нарушением пролиферации плазматических клеток, а именно:
ο гиперкальциемия: уровень кальция в сыворотке крови ≥ 11,5 мг/100 мл,
ο почечная недостаточность: уровень креатинина в сыворотке крови > 1,73 ммоль/л,
ο анемия: нормохромная, нормоцитарная с величиной уровня гемоглобина, которая на > 2 г/100 мл ниже нижней границы нормы, или с величиной уровня гемоглобина < 10 г/100 мл,
ο очаги поражения костей: очаги остеолитического поражения, тяжелая остеопения или патологические переломы.
Другие нарушения пролиферации плазматических клеток, которые можно лечить с помощью композиций и способов, описанных в данном документе, включают без ограничения бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, виды плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром).
см.
см.
Для стадирования множественной миеломы используют две системы стадирования: Международную систему стадирования (ISS)( Greipp et al. (2005), J. Clin. Oncol. 23 (15):3412-3420) и систему стадирования по Дьюри-Сэлмону (DSS) (Durie et al. (1975), Cancer 36 (3): 842-854). Две системы стадирования обобщенно представлены в таблице ниже.
Таблица 15. Системы стадирования, предназначенные для стадирования множественной миеломы
<b>Стадия</b>
<b>Международная система стадирования</b>
<b>Система стадирования по Дьюри-Сэлмону</b>
Критерии
Медианная выживаемость
Критерии
Медианная выживаемость*
<b>I</b>
Уровень β<sub>2</sub>M < 3,5 мг/л и уровень сывороточного альбумина ≥ 3,5 г/дл
62 месяца
Все из следующего:уровень гемоглобина > 10 г/дл,уровень кальция в сыворотке крови: нормальный или < 12 мг/дл,рентгенологическое исследование костей: нормальная структура или только 1 плазмоцитома,низкий уровень продуцирования моноклонального белка (IgG < 5 г/дл, IgA < 3 г/дл, белок Бенс-Джонса < 4 г/дл за 24 часа)
IA: 62 месяцаIB: 22 месяца
<b>II</b>
Ни стадия I, ни стадия III
44 месяца
Ни стадия I, ни стадия III
IIA: 58 месяцевIIB: 354 месяца
<b>III</b>
Уровень β<sub>2</sub>M ≥ 5,5 мг/л
29 месяцев
Одно или несколько из следующего:уровень гемоглобина < 8,5 г/дл,уровень кальция в сыворотке крови: нормальный или > 12 мг/дл,запущенные очаги остеолитического поражения,высокий уровень продуцирования моноклонального белка (IgG > 7 г/дл, IgA > 5 г/дл, белок Бенс-Джонса > 12 г/дл за 24 часа)
IIIA: 45 месяцевIIIB: 24 месяца
*Система стадирования по Дьюри-Сэлмону также включает классификацию с разбивкой на подклассы, в которой указано состояние функции почек. Обозначение "A" или "B" добавляют после номера стадии, где "A" обозначает относительно нормальную функцию почек (величина уровня креатинина в сыворотке крови < 2,0 мг/дл), а B обозначает аномальную функцию почек (величина уровня креатинина в сыворотке крови > 2,0 мг/дл).
см.
Третья система стадирования множественной миеломы называется пересмотренной Международной системой стадирования (R-ISS) ( Palumbo A, Avet-Loiseau H, Oliva S, et al. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 2015;33:2863-9, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Стадия I R-ISS включает стадию I ISS (уровень сывороточного β2-микроглобулина < 3,5 мг/л и уровень сывороточного альбумина ≥ 3,5 г/дл), отсутствие CA, соответствующих высокому риску [del(17p), и/или t(4;14), и/или t(14;16)], и уровень LDH в пределах нормы (меньше верхней границы нормального диапазона). Стадия III R-ISS включает стадию III ISS (уровень сывороточного β2-микроглобулина > 5,5 мг/л) и CA, соответствующих высокому риску, или высокий уровень LDH. Стадия II R-ISS включает все остальные возможные комбинации.
Ответы у пациентов можно определить согласно критериям IMWG 2016, раскрытым в Kumar S, Paiva B, Anderson KC, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. The Lancet Oncology;17(8):e328-e346, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В таблице 16 представлены критерии IMWG 2016 для оценки ответа.
Таблица 16.
Критерии IMWG для оценки ответа, включающие критерии для минимального остаточного заболевания (MRD)
Критерии ответа*
Критерии MRD IMWG (требуется полный ответ, который определен ниже)
Устойчивая MRD-отрицательность
MRD-отрицательность в костном мозге (по данным NGF или NGS или их обоих) и по данным визуализации, как определено ниже, подтверждаемая с интервалом не менее чем 1 год. Последующие оценки могут использоваться для дополнительного уточнения продолжительности статуса отрицательности (например, MRD-отрицательный статус в момент времени 5 лет)†
MRD-отрицательный статус по данным проточной цитометрии
Отсутствие фенотипически аномальных клональных плазматических клеток по данным NGF‡ в аспиратах костного мозга при использовании стандартной рабочей процедуры EuroFlow, предназначенной для выявления MRD при множественной миеломе (или валидированного эквивалентного способа) с минимальной чувствительностью 1 на 10<sup>5</sup> ядросодержащих клеток или выше
MRD-отрицательный статус по данным секвенирования
Отсутствие клональных плазматических клеток по данным NGS в аспирате костного мозга, в котором присутствие клона определяется менее, чем двумя идентичными ридами секвенирования, полученными после секвенирования ДНК аспиратов костного мозга с использованием платформы LymphoSIGHT (или валидированного эквивалентного способа) с минимальной чувствительностью 1 на 10<sup>5</sup> ядросодержащих клеток§ или выше
Визуализация и MRD-отрицательный статус
MRD-отрицательность, определенная посредством NGF или NGS, а также исчезновение каждого участка с повышенным захватом метки, обнаруженного на исходном уровне, или предшествующая PET/CT, или уменьшение до меньшего значения SUV для медиастинального пула крови, или уменьшение до меньшего значения, чем у окружающей нормальной ткани¶
Стандартные критерии ответа согласно IMWG||
Строгий полный ответ
Полный ответ, который определен ниже, с нормальным соотношением FLC** и отсутствием клональных клеток в биоптате костного мозга по данным иммуногистохимического исследования (соотношение κ/λ ≤ 4:1 или ≥ 1:2 κ и λ у пациентов c κ и λ соответственно после подсчета ≥ 100 плазматических клеток)††
Полный ответ
Отрицательная иммунофиксация в сыворотке крови и моче, и исчезновение любых плазмоцитом мягких тканей, и < 5% плазматических клеток в аспиратах костного мозга
Очень хороший частичный ответ
M-белок в сыворотке крови и моче, поддающийся выявлению с помощью иммунофиксации, но не с помощью электрофореза, или ≥ 90% снижение уровня M-белка в сыворотке крови и уровень М-белка в моче < 100 мг за 24 ч.
Частичный ответ
≥ 50% снижение уровня M-белка в сыворотке крови и снижение в течение 24 ч. уровня M-белка в моче на ≥ 90% или до < 200 мг за 24 ч.;если M-белок в сыворотке крови и моче не поддается измерению, то вместо критерия по уровню M-белка требуется ≥ 50% уменьшение разницы между уровнями вовлеченных и невовлеченных FLC;если M-белок в сыворотке крови и моче не поддается измерению и также не поддаются измерению в анализе свободные легкие цепи в сыворотке крови, то вместо уровня M-белка требуется ≥ 50% снижение количества плазматических клеток при условии, что процентная доля плазматических клеток в костном мозге на исходном уровне составляло ≥ 30%. В дополнение к этим критериям также требуется ≥ 50% уменьшение размера (SPD)§§ плазмоцитом мягких тканей, если они присутствуют на исходном уровне
Минимальный ответ
≥ 25%, но ≤ 49% снижение уровня сывороточного M-белка и снижение уровня M-белка в моче в течение 24 ч. на 50-89%. В дополнение к перечисленным выше критериям также требуется ≥ 50% уменьшение размера (SPD)§§ плазмоцитом мягких тканей, если они присутствуют на исходном уровне
Стабилизация заболевания
Не рекомендуется для использования в качестве показателя ответа; стабилизацию заболевания лучше всего описывать, приводя расчетные показатели времени до прогрессирования заболевания. Не соответствует критериям для полного ответа, очень хорошего частичного ответа, частичного ответа, минимального ответа или прогрессирования заболевания
Прогрессирование заболевания¶¶,||||
Любые один или несколько из следующих критериев:повышение на 25% от минимальной подтвержденной величины ответа в одном или нескольких из следующих критериев:уровень M-белка в сыворотке крови (абсолютное повышение должно составлять ≥ 0,5 г/дл);повышение уровня M-белка в сыворотке крови ≥ 1 г/дл, если наименьшая величина уровня M-компонента составляла ≥ 5 г/дл;уровень M-белка в моче (абсолютное повышение должно составлять ≥ 200 мг/24 ч.);у пациентов без поддающихся измерению уровней M-белка в сыворотке крови и моче - разница между уровнями вовлеченных и невовлеченных FLC (абсолютное повышение должно составлять > 10 мг/дл);у пациентов без поддающихся измерению уровней M-белка в сыворотке крови и моче и без поддающихся измерению уровней вовлеченных FLC - процентная доля плазматических клеток костного мозга независимо от исходного состояния (абсолютное повышение должно составлять ≥10%);появление нового(новых) очага(очагов) поражения, ≥ 50% увеличение от наиболее низкого значения SPD§§ > 1 очага, или ≥ 50% увеличение наибольшего диаметра предыдущего очага > 1 см по короткой оси;≥ 50% увеличение количества циркулирующих плазматических клеток (не менее 200 клеток на мкл), если это единственный показатель заболевания
Клинический рецидив
Клинический рецидив требует наличия одного или нескольких из следующих критериев:прямые признаки усугубления заболевания и/или нарушения функции органа-мишени (CRAB-симптомы), связанные с лежащим в их основе нарушением пролиферации плазматических клеток. Он не используется при расчете времени до прогрессирования или выживаемости без прогрессирования, но приводится как то, о чем можно сообщить по желанию или для использования в клинической практике;развитие новых плазмоцитом мягких тканей или очагов поражения костей (остеопорозные переломы не представляют собой прогрессирование);явственное увеличение размера существующих плазмоцитом или очагов поражения костей. Явственное увеличение определяется как увеличение на 50% (и ≥ 1 см), измеряемое последовательно по SPD§§ измеряемого очага поражения;гиперкальциемия (> 11 мг/дл);снижение уровня гемоглобина, составляющее ≥ 2 г/дл, не связанное с терапией или другими состояниями, не связанными с миеломой;повышение уровня креатинина в сыворотке крови на 2 мг/дл или больше от начала терапии, обусловленное миеломой;повышенная вязкость крови, связанная с парапротеином в сыворотке крови
Рецидив после полного ответа (следует использовать, только если конечной точкой является выживаемость без признаков заболевания)
Любые один или несколько из следующих критериев:повторное появление M-белка в сыворотке крови или моче по данным иммунофиксации или электрофореза;образование ≥ 5% плазматических клеток в костном мозге;появление любого другого признака прогрессирования (т. е. новых плазмоцитом, очагов остеолитического поражения или гиперкальциемии, см. выше)
Рецидив после установления MRD-отрицательного статуса (следует использовать, только если конечной точкой является выживаемость без признаков заболевания)
Любые один или несколько из следующих критериев:потеря MRD-отрицательного статуса (свидетельство наличия клональных плазматических клеток по данным NGF или NGS или положительный результат визуализирующего исследования на предмет рецидива миеломы);повторное появление M-белка в сыворотке крови или моче по данным иммунофиксации или электрофореза;образование ≥ 5% клональных плазматических клеток в костном мозге;появление любого другого признака прогрессирования (т. е. новых плазмоцитом, очагов остеолитического поражения или гиперкальциемии)
Для оценки MRD первый аспират костного мозга необходимо направлять для исследования MRD (но не для анализа морфологических характеристик), при этом данный образец должен быть взят за один прием в объеме не менее 2 мл (с получением достаточного количества клеток), но не более 4-5 мл, чтобы избежать гемодилюции. IMWG=Международная группа по изучению множественной миеломы. MRD=минимальное остаточное заболевание. NGF=проточная цитометрия нового поколения. NGS=секвенирование нового поколения. FLC=свободная легкая цепь. M-белок=миеломный белок. SPD=сумма произведений максимальных перпендикулярных диаметров измеренных очагов поражения. CRAB-симптомы=повышение уровня кальция, почечная недостаточность, анемия, очаги остеолитического поражения. FCM=проточная цитометрия. SUV<sub>max</sub>=максимальный стандартизированный показатель захвата. MFC=мультипараметрическая проточная цитометрия. <sup>18</sup>F-FDG PET=<sup>18</sup>F-фтордезоксиглюкоза PET. ASCT=трансплантация аутологичных стволовых клеток.*Все категории ответа требуют двух последовательных оценок, проводимых в любое время до начала любой новой терапии; в случае MRD отсутствует необходимость в двух последовательных оценках, но рекомендуется информация о MRD после каждого стадии лечения (например, после индукционной, высокодозовой терапии/ASCT, консолидирующей, поддерживающей терапии). Тесты в отношении MRD следует начинать только на момент предполагаемого полного ответа.Все категории ответа и MRD не требуют известных свидетельств прогрессирующих или новых очагов поражения костей, если были проведены рентгенографические исследования. Тем не менее, рентгенографические исследования не обязаны удовлетворять этим требованиям в отношении ответа, за исключением требования FDG-PET, если сообщается о MRD-отрицательном статусе при визуализации. † При сообщении об устойчивой MRD-отрицательности также должна быть упомянута применяемая методика (например, устойчивая MRD-отрицательность по данным проточной цитометрии, устойчивая MRD-отрицательность по данным секвенирования) ‡При проведении MFC костного мозга необходимо следовать руководству NGF (Paiva B, Gutierrez NC, Rosinol L, et al, Blood 2012; 119: 687-91). Эталонная методика NGF представляет собой восьмицветный подход с использованием двух пробирок, который был всесторонне валидирован. Подход с использованием двух пробирок повышает надежность, однородность и чувствительность благодаря сбору данных о большем количестве клеток. Восьмицветная технология широко доступна во всем мире, и методика NGF уже была освоена во многих лабораториях проточной цитометрии по всему миру. Полная восьмицветная методика является наиболее эффективной при использовании лиофилизированной смеси антител, что уменьшает погрешности, затраты времени и средств. Необходимо проводить оценку 5 миллионов клеток. Используемая методика FCM должна обладать чувствительностью обнаружения, составляющей по меньшей мере 1 на 10<sup>5</sup> плазматических клеток. §При анализе последовательностей ДНК из аспирата костного мозга должен применяться валидированный анализ, такой как LymphoSIGHT (Sequenta). ¶Критерии, используемые Zamagni и соавторами (Zamagni E, Nanni C, Mancuso K, et al. Clin Cancer Res 2015; 21: 4384-90), и группой экспертов (IMPetUs; итальянские критерии миеломы для использования в PET) (Usmani SZ, Mitchell A, Waheed S, et al. Blood 2013; 121: 1819-23; Nanni C, Zamagni E, Versari A, et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2015; 43: 414-21.). Положительные очаги поражения на исходном уровне были идентифицированы по присутствию очаговых участков повышенного захвата в костях при наличии или отсутствии какого-либо первичного очага поражения, идентифицированного с помощью СТ и присутствующего в по меньшей мере двух последовательных срезах. В качестве альтернативы, SUV<sub>max</sub>=2,5 в остеолитических участках согласно CT > 1 см или SUV<sub>max</sub>=1,5 в остеолитических участках согласно CT ≤ 1 см считали положительным результатом. Визуализация должна выполняться после того, как MRD-отрицательность была определена с помощью MFC или NGS. ||Получено из международных единых критериев ответа для множественной миеломы (Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS, et al, Leukemia 2006; 20: 1467-73). Определение и пояснение неполного ответа получены от Rajkumar и сотрудников (Rajkumar SV, Harousseau JL, Durie B, et al, Blood 2011; 117: 4691-95). Если единственной методикой оценки заболевания является уровень FLC в сыворотке крови: полный ответ можно определить как нормальное соотношение FLC в диапазоне от 0,26 до 1,65 в дополнение к критериям полного ответа, перечисленным ранее. Очень хороший частичный ответ у таких пациентов требует ≥90% уменьшения разницы между уровнями вовлеченных и невовлеченных FLC. Все категории ответа требуют двух последовательных оценок, проводимых в любое время до назначения любой новой терапии; все категории также не требуют каких-либо известных свидетельств прогрессирующих или новых очагов поражения костей или экстрамедуллярных плазмоцитом, если были проведены рентгенографические исследования. Рентгенографические исследования не требуются для удовлетворения данных требований в отношении ответа. Оценки костного мозга не требуют подтверждения. Каждая категория, за исключением категории стабилизации заболевания, будет считаться неподтвержденной до проведения подтверждающего теста. Дата первичного теста считается датой ответа для оценки изменяющихся во времени исходов, таких как продолжительность ответа. **Все рекомендации относительно клинического применения, касающиеся уровней FLC в сыворотке крови или соотношения FLC, основаны на результатах, полученных с помощью валидированного теста Freelite (Binding Site, Бирмингем, Великобритания). ††Присутствие/отсутствие клональных клеток под данным иммуногистохимического исследования определяется, исходя из соотношения κ/λ/L. Аномальное соотношение κ/λ по данным иммуногистохимического исследования требует не менее 100 плазматических клеток для анализа. Аномальное соотношение, отражающее присутствие аномального клона, составляет κ/λ > 4:1 или < 1:2. ‡‡Особое внимание следует уделять появлению другого моноклонального белка после лечения, особенно в группе пациентов, у которых был достигнут традиционный полный ответ, что часто связано с олигоклональным восстановлением иммунной системы. Данные полосы обычно исчезают со временем, и в некоторых исследованиях была установлена их связь с лучшим исходом. Кроме того, появление моноклонального IgGκ у пациентов, получающих моноклональные антитела, следует дифференцировать от терапевтического антитела. §§Измерения плазмоцитом должны быть произведены в CT-части PET/CT, или на MRI-снимках, или специально выделенных СТ-снимках, если это применимо. У пациентов с вовлечением только кожи очаги поражения кожи должны измеряться линейкой. Показатель размера опухоли будет определен с помощью SPD. ¶¶Сама по себе положительная иммунофиксация у пациента, ранее классифицированного как пациент, у которого был достигнут полный ответ, не будет считаться прогрессированием. С целью расчета времени до прогрессирования и выживаемости без прогрессирования пациентов, у которых был достигнут полный ответ и которые являются MRD-отрицательными, следует оценивать с использованием перечисленных критериев для прогрессирования заболевания. Критерии рецидива после полного ответа или рецидива после установления MRD следует использовать только при расчете выживаемости без признаков заболевания. ||||В том случае, если по усмотрению врача значение считается сомнительным результатом (например, при возможной лабораторной ошибке), это значение не будет учитываться при определении наименьшего значения.
Стандартное лечение множественной миеломы и ассоциированных заболеваний включает химиотерапию, трансплантацию стволовых клеток (аутологичную или аллогенную), лучевую терапию и другие средства лекарственной терапии. Лекарственные средства, часто используемые для лечения миеломы, включают алкилирующие средства (например, бендамустин, циклофосфамид и мелфалан), ингибиторы протеасом (например, бортезомиб), кортикостероиды (например, дексаметазон и преднизон) и иммуномодуляторы (например, талидомид и леналидомид или Revlimid) или их любую комбинацию. Лекарственные средства из группы бисфосфонатов также часто вводят в комбинации со стандартными средствами лечения MM для предупреждения потери костной ткани. Пациенты старше 65-70 лет в редких случаях являются кандидатами для трансплантации стволовых клеток. В некоторых случаях возможными вариантами лечения для пациентов младше 60 лет с субоптимальным ответом на первую трансплантацию являются двойные трансплантации аутологичных стволовых клеток. Композиции и способы по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с любым из назначаемых в настоящее время средств лечения множественной миеломы.
Blood
J Immunol.
Другим примером заболевания или нарушения, ассоциированного с BCMA, является лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома (см.Chiu et al., . 2007, 109(2):729-39; He et al., 2004, 172(5):3268-79).
Лимфома Ходжкина (HL), также известная как болезнь Ходжкина, представляет собой рак лимфатической системы, который происходит из белых кровяных клеток или лимфоцитов. Аномальные клетки, которые образуют лимфому, называются клетками Рида-Штернберга. При лимфоме Ходжкина происходит распространение рака из одной группы лимфатических узлов в другую. Лимфому Ходжкина можно подразделить на четыре патологических подтипа на основании морфологических характеристик клеток Рида-Штернберга и клеточного состава вокруг клеток Рида-Штернберга (что определяют путем биопсии лимфатических узлов): нодулярная склерозирующая HL, смешанно-клеточный подтип, богатая лимфоцитами или с лимфоидным преобладанием, с лимфоидным истощением. Иногда лимфома Ходжкина также может быть нодулярной лимфомой Ходжкина с лимфоидным преобладанием или может быть неуточненной. Симптомы и признаки лимфомы Ходжкина включают безболезненное увеличение лимфатических узлов в области шеи, подмышечных впадин или паха, лихорадку, ночную потливость, потерю веса, утомляемость, кожный зуд или боль в животе.
Неходжкинская лимфома (NHL) представляет собой группу разнообразных видов рака крови, которые включают любую разновидность лимфомы, отличную от лимфомы Ходжкина. Подтипы неходжкинской лимфомы классифицируют в основном по морфологическим характеристикам клеток, хромосомным аберрациям и поверхностным маркерам. Подтипы NHL (или NHL-ассоциированные виды рака) включают В-клеточные лимфомы, такие как, без ограничения, лимфома Беркитта, хронический лимфоцитарный В-клеточный лейкоз (B-CLL), пролимфоцитарный B-клеточный лейкоз (B-PLL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (DLBCL) (например, внутрисосудистая крупноклеточная B-клеточная лимфома и первичная медиастинальная B-клеточная лимфома), фолликулярная лимфома (например, лимфома из клеток центра фолликула, фолликулярная мелкоклеточная лимфома с расщепленными ядрами), волосатоклеточный лейкоз, B-клеточная лимфома высокой степени злокачественности (подобная лимфоме Беркитта), лимфоплазмоцитарная лимфома (макроглобулинемия Вальденстрема), мантийноклеточная лимфома, виды B-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны (например, внеузловая B-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны или лимфома из лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), узловая В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны и В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки), плазмоцитома/миелома, B-лимфобластный лейкоз/лимфома из клеток-предшественников (PB-LBL/L), первичная лимфома центральной нервной системы (CNS), первичная внутриглазная лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL); и виды T-клеточной лимфомы, такие как, без ограничения, анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), T-клеточная лимфома/лейкоз взрослых (например, "тлеющая", хроническая, острая и лимфоматозная), лимфангиома, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, виды T-клеточной лимфомы кожи (например, фунгоидный микоз, синдром Сезари и т. д.), внеузловая лимфома из T-клеток/естественных киллеров (назальный тип), Т-клеточная лимфома кишечника энтеропатического типа, лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов, T-лимфобластная лимфома/лейкоз из клеток-предшественников (T-LBL/L), T-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/пролимфоцитарный лейкоз (T-CLL/PLL) и неуточненная периферическая T-клеточная лимфома. Симптомы и признаки лимфомы Ходжкина включают безболезненное увеличение лимфатических узлов в области шеи, подмышечных впадин или паха, лихорадку, ночную потливость, потерю веса, утомляемость, кожный зуд, боль в животе, кашель или боль в груди.
Стадирование лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы является одинаковым и относится к степени распространения раковых клеток в организме. На стадии I клетки лимфомы присутствуют в одной группе лимфатических узлов. На стадии II клетки лимфомы присутствуют в по меньшей мере двух группах лимфатических узлов, но обе группы расположены с одной стороны диафрагмы или в одной части ткани или органа, а лимфатические узлы рядом с этим органом с той же стороны диафрагмы. На стадии III клетки лимфомы присутствуют в лимфатических узлах с обеих сторон диафрагмы или в одной части ткани или органа рядом с этими группами лимфатических узлов или в селезенке. На стадии IV клетки лимфомы обнаруживают в нескольких частях по меньшей мере одного органа или ткани, или клетки лимфомы присутствуют в органе и в лимфатических узлах с другой стороны диафрагмы. В дополнение к обозначению стадий римскими цифрами стадии также могут быть описаны буквами A, B, E и S, где A обозначает пациентов без симптомов, B обозначает пациентов с симптомами, E обозначает пациентов, у которых лимфома обнаружена в тканях вне лимфатической системы, а S обозначает пациентов, у которых лимфома обнаружена в селезенке.
Лимфому Ходжкина обычно лечат с помощью лучевой терапии, химиотерапии или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Наиболее распространенным средством терапии неходжкинской лимфомы является режим R-CHOP, который состоит из четырех различных химиотерапевтических препаратов (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизолон) и ритуксимаба (Rituxan). Другие средства терапии, обычно применяемые для лечения NHL, включают другие химиотерапевтические средства, лучевую терапию, трансплантацию стволовых клеток (аутологичную или аллогенная трансплантация костного мозга) или биологическую терапию, такую как иммунотерапия. Другие примеры биологических терапевтических средств включают без ограничения ритуксимаб (Rituxan), тозитумомаб (Bexxar), эпратузумаб (LymphoCide) и алемтузумаб (MabCampath). Композиции и способы по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с любым из назначаемых в настоящее время средств лечения лимфомы Ходжкина или неходжкинской лимфомы.
Blood
Также было установлено, что с экспрессией BCMA ассоциирована макроглобулинемия Вальденстрема (WM), также известная как лимфоплазмоцитарная лимфома (LPL) (см. Elsawa et al., . 2006, 107(7):2882-8). Ранее считалось, что макроглобулинемия Вальденстрема является родственной по отношению к множественной миеломе, но совсем недавно ее классифицировали как подтип неходжкинской лимфомы. WM характеризуется неконтролируемой пролиферацией В-клеточных лимфоцитов, что приводит к анемии и продуцированию избыточных количеств парапротеина или иммуноглобулина М (IgM), который сгущает кровь и приводит к синдрому повышенной вязкости крови. Другие симптомы или признаки WM включают лихорадку, ночную потливость, утомляемость, анемию, потерю веса, лимфаденопатию или спленомегалию, нечеткость зрения, головокружение, носовые кровотечения, кровоточивость десен, нетипичные кровоподтеки, нарушение функции почек или почечную недостаточность, амилоидоз или периферическую нейропатию.
Стандартное лечение WM заключается в химиотерапии, в частности ритуксимабом (Rituxan). Другие химиотерапевтические лекарственные средства, такие как хлорамбуцил (Leukeran), циклофосфамид (Neosar), флударабин (Fludara), кладрибин (Leustatin), винкристин и/или талидомид, можно применять в комбинации. Кортикостероиды, такие как преднизон, также можно вводить в комбинации с химиотерапией. Плазмаферез или замещение плазмы обычно применяют в ходе всего лечения пациента для облегчения некоторых симптомов посредством удаления парапротеина из крови. В некоторых случаях трансплантация стволовых клеток является вариантом лечения для некоторых пациентов.
Oncogene
PLoS One
Другим примером заболевания или нарушения, ассоциированного с BCMA, является рак головного мозга. В частности, было установлено, что с экспрессией ВСМА ассоциирована астроцитома или глиобластома (см.Deshayes et al, . 2004, 23(17):3005-12, Pelekanou et al., . 2013, 8(12):e83250). Астроцитомы представляют собой опухоли, которые возникают из астроцитов, представляющих собой тип глиальных клеток в головном мозге. Глиобластома (также известная как мультиформная глиобластома или GBM) является наиболее злокачественной формой астроцитомы и считается наиболее поздней стадией рака головного мозга (стадией IV). Существуют два варианта глиобластомы: гигантоклеточная глиобластома и глиосаркома. Другие виды астроцитомы включают ювенильную пилоцитарную астроцитому (JPA), фибриллярную астроцитому, плеоморфную ксантоастроцитому (PXA), дисэмбриопластическую нейроэпителиальную опухоль (DNET) и анапластическую астроцитому (AA).
Симптомы или признаки, ассоциированные с глиобластомой или астроцитомой, включают повышенное давление в головном мозге, головные боли, эпилептические припадки, потерю памяти, изменения в поведении, нарушение движения или потерю чувствительности на одной стороне тела, речевую дисфункцию, когнитивные нарушения, нарушения зрения, тошноту, рвоту и слабость в руках или ногах.
Хирургическое удаление опухоли (или резекция) является стандартным лечением для удаления как можно большей части глиомы без повреждения или с минимальным повреждением окружающей нормальной ткани головного мозга. Лучевая терапия и/или химиотерапия часто применяется после хирургического вмешательства для подавления и замедления рецидивирования заболевания, обусловленного любыми оставшимися раковыми клетками или сопутствующими очагами поражения. Лучевая терапия включает лучевую терапию всего головного мозга (традиционную дистанционную лучевую терапию), целенаправленную трехмерную конформную лучевую терапию и применение целенаправленно воздействующих радионуклидов. Химиотерапевтические средства, обычно применяемые для лечения глиобластомы, включают темозоломид, гефитиниб или эрлотиниб и цисплатин. Ингибиторы ангиогенеза, такие как бевацизумаб (Avastin), также обычно применяются в комбинации с химиотерапией и/или лучевой терапией.
Поддерживающее лечение также часто применяют для облегчения неврологических симптомов и улучшения неврологической функции и используют в комбинации с любым из средств терапии рака, описанных в данном документе. Основные поддерживающие средства включают противосудорожные средства и кортикостероиды. Таким образом, композиции и способы по настоящему изобретению можно применять в комбинации с любыми видами стандартного или поддерживающего лечения с целью лечения глиобластомы или астроцитомы.
C. neoformans
Заболевания и нарушения, не связанные с раком, но ассоциированные с экспрессией ВСМА, также можно лечить с помощью композиций и способов, раскрытых в данном документе. Примеры заболеваний и нарушений, не связанных с раком, ассоциированных с экспрессией BCMA, включают без ограничения вирусные инфекции, например, вызванные HIV; грибковые инфекции, например, вызванные ; синдром раздраженного кишечника; неспецифический язвенный колит и нарушения, связанные с иммунитетом слизистых оболочек.
CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки) по настоящему изобретению можно вводить отдельно либо в фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины, или популяциями клеток.
В настоящем изобретении представлены композиции и способы для лечения рака. В одном аспекте рак представляет собой гематологический рак, в том числе без ограничения гематологический рак, представляющий собой лейкоз или лимфому. В одном аспекте клетки, экспрессирующие CAR (например, CAR-T-клетки или NK-клетки, экспрессирующие CAR), по настоящему изобретению можно применять для лечения видов рака и злокачественных новообразований, таких как, без ограничения, например, виды острого лейкоза, в том числе без ограничения, например, B-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("BALL"), T-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("TALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько видов хронического лейкоза, в том числе без ограничения, например, хронический миелоидный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); дополнительные виды гематологического рака или гематологические состояния, в том числе без ограничения, например, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, бластная плазмоцитоидная дендритноклеточная неоплазия, лимфома Беркитта, диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома, фолликулярная лимфома, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточная или крупноклеточная фолликулярная лимфома, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфома, мантийноклеточная лимфома, лимфома из клеток маргинальной зоны, множественная миелома, миелодисплазия и миелодиспластический синдром, неходжкинская лимфома, плазмобластная лимфома, плазмоцитоидная дендритноклеточная неоплазия, макроглобулинемия Вальденстрема и "предлейкоз", который представляет собой разнообразную группу гематологических состояний, объединенных неэффективным образованием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т. п. Кроме того, заболевание, ассоциированное с экспрессией ВСМА, включает без ограничения, например, атипичные и/или неклассические виды рака, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, характеризующиеся экспрессией ВСМА.
В ряде вариантов осуществления композицию, описанную в данном документе, можно применять для лечения заболевания, включающего без ограничения нарушение пролиферации плазматических клеток, например, бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, виды плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром).
В ряде вариантов осуществления композицию, описанную в данном документе, можно применять для лечения заболевания, включающего без ограничения рак, например, рак, описанный в данном документе, например, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный или терапевтически резистентный рак предстательной железы или метастатический рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легкого.
В настоящем изобретении также предусмотрены способы ингибирования пролиферации или уменьшения популяции клеток, экспрессирующих BCMA, при этом способы включают приведение популяции клеток, экспрессирующих BCMA, в контакт с клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA (например, САRТ-клеткой для ВСМА или NK-клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA. В конкретном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования пролиферации или уменьшения популяции раковых клеток, экспрессирующих BCMA, при этом способы включают приведение популяции раковых клеток, экспрессирующих BCMA, в контакт с клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клеткой для BCMA или NK-клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования пролиферации или уменьшения популяции раковых клеток, экспрессирующих BCMA, способ содержащий приведение в контакт популяции раковых клеток, экспрессирующих BMCA, с клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA, (например, CAR-T-клеткой для BCMA или NK-клеткой, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA. В определенных аспектах клетка, экспрессирующая CAR для BCMA, (например, CAR-T-клетка для BCMA или NK-клетка, экспрессирующая CAR для BCMA) по настоящему изобретению обеспечивает снижение уровня, числа, количества или процентного количества клеток и/или раковых клеток на по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% у субъекта с миелоидным лейкозом или другим видом рака, ассоциированного с клетками, экспрессирующими BCMA, или в соответствующей животной модели по сравнению с отрицательным контролем. В одном аспекте субъект является человеком.
В настоящем изобретении также представлены способы предупреждения, лечения и/или контроля заболевания, ассоциированного с клетками, экспрессирующими BCMA (например, гематологического рака или атипичного рака, характеризующегося экспрессией BCMA), при этом способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, клетки, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующей CAR для BCMA), по настоящему изобретению, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA. В одном аспекте субъект является человеком. Неограничивающие примеры нарушений, ассоциированных с клетками, экспрессирующими ВСМА, включают вирусные или грибковые инфекции и нарушения, связанные с иммунитетом слизистых оболочек.
В настоящем изобретении также предусмотрены способы предупреждения, лечения и/или контроля заболевания, ассоциированного с клетками, экспрессирующими BCMA, способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, клетки, экспрессирующей CAR для BCMA, (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующей CAR для BCMA) по настоящему изобретению, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA. В одном аспекте субъект является человеком.
В настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения рецидива рака, ассоциированного с клетками, экспрессирующими BCMA, при этом способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, клетки, экспрессирующей CAR для BCMA, (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующей CAR для BCMA) по настоящему изобретению, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA. В одном аспекте способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки, экспрессирующей CAR для BCMA (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующей CAR для BCMA), описанной в данном документе, которая связывается с клеткой, экспрессирующей BCMA, в комбинации с эффективным количеством другого средства терапии.
Виды комбинированной терапии
Клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, можно применять в комбинации с другими известными средствами и видами терапии.
Клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить одновременно в одной и той же или отдельных композициях или последовательно. В случае последовательного введения клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, можно вводить первой, а дополнительное средство можно вводить вторым, или порядок введения может быть обратным.
Средство терапии с помощью CAR и/или другие терапевтические средства, процедуры или способы можно применять в течение периодов активного проявления нарушения или в течение периода ремиссии или менее активного проявления заболевания. Средство терапии с помощью CAR можно вводить перед другим средством для лечения, параллельно со средством для лечения, после средства для лечения или во время ремиссии нарушения.
При введении в комбинации средство терапии с помощью CAR и дополнительное средство (например, второе или третье средство) или все из них можно вводить в количестве или дозе, которые являются более высокими, более низкими или такими же по сравнению с количеством или дозой каждого средства, применяемого в отдельности, например, в качестве монотерапии. В определенных вариантах осуществления вводимые количество или доза средства терапии с помощью CAR, дополнительного средства (например, второго или третьего средства) или их всех являются более низкими (например, на по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50%), чем количество или доза каждого средства, применяемого в отдельности, например, в качестве монотерапии. В других вариантах осуществления количество или доза средства терапии с помощью CAR, дополнительного средства (например, второго или третьего средства) или их всех, которые дают требуемый эффект (например, лечение рака), являются более низкими (например, на по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50% более низкими), чем количество или доза каждого средства, применяемого в отдельности, например, в качестве монотерапии, необходимые для достижения того же терапевтического эффекта.
В дополнительных аспектах описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может применяться в схеме лечения в комбинации с хирургическим вмешательством, химиотерапией, облучением, иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными средствами, такими как CAMPATH, антитела к CD3 или другие средства терапии на основе антител, цитоксин, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, цитокины и облучение, пептидная вакцина, например, как описано в Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971.
В определенных случаях соединения по настоящему изобретению комбинируют с другими терапевтическими средствами, такими как другие противораковые средства, противоаллергические средства, средства против тошноты (или противорвотные средства), обезболивающие средства, цитопротекторные средства и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления первую клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, например, клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, описанную в данном документе, можно применять в комбинации со второй клеткой, экспрессирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления вторая клетка, экспрессирующая CAR, экспрессирует CAR, содержащий другой домен, связывающий BCMA, например, домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, который отличается от домена, связывающего BCMA, в CAR, экспрессируемом первой клеткой, экспрессирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления вторая клетка, экспрессирующая CAR, экспрессирует CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на антиген, отличный от BCMA (например, CD19, CD20, CS-1, легкая каппа-цепь, CD139, антиген Y системы Льюис или CD38). В некоторых вариантах осуществления первую клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, например, клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, описанную в данном документе, используют в комбинации со второй клеткой, экспрессирующей CAR, содержащий CAR для CD19. В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, описанную в данном документе, используют в комбинации с клеткой, экспрессирующей CAR для CD19, для лечения BCMA-ассоциированного рака, описанного в данном документе, например, множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления множественная миелома является CD19-отрицательной, например, имеющая подавляющее большинство (например, по меньшей мере 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 99,95%) неопластических плазматических клеток с CD19-отрицательным фенотипом, например, как было обнаружено с помощью проточной цитометрии, RT-PCR или с помощью как проточной цитометрии, так и RT-PCR. CAR для CD19 может быть эффективным даже в отношении CD19-отрицательной множественной миеломы. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, CAR для CD19 может воздействовать на небольшую, но важную CD19-положительную популяцию неопластических клеток, путем нацеливания на клетку, которая экспрессирует уровни CD19, которые падают ниже порога обнаружения анализов, описанных в данном документе, или путем нацеливания на клетку, не являющейся неопластической, которая поддерживает неопластические клетки. В ряде вариантов осуществления CAR для CD19 может удалять B-клетки, например, B регуляторные В-клетки.
Например, в некоторых вариантах осуществления первую описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, например, клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, например, клетку CD19, экспрессирующую CAR, получают в одной композиции и вводят одновременно. В другом варианте осуществления первая клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, например, клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, например, клетку CD19, экспрессирующую CAR, получают в отдельных композициях, и отдельные композиции вводят одновременно или последовательно. Когда клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, получают в отдельных композициях, клетку, экспрессирующую CAR для BCMA, можно вводить первой, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, можно вводить второй или порядок введения может быть обратным.
В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 представляет собой CAR для CD19, например, гуманизированный CAR для CD19, описанный в WO2014/153270, поданной 15 марта 2014 г. (которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте) или последовательность на по меньшей мере 95%, например, на 95-99% идентичную таковому. В некоторых вариантах осуществления конструкция CAR для CD19 представляет собой конструкцию CAR19, представленную в публикации согласно PCT WO2012/079000 (которая включена посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте) или последовательность на по меньшей мере 95%, например, на 95-99% идентичную таковой. В некоторых вариантах осуществления CD19-связывающий домен представляет собой scFv, описанный в WO2012/079000 или последовательность на по меньшей мере 95%, например, 95-99%, идентичную таковому.
В ряде вариантов осуществления первую клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту и вторую клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту. В ряде вариантов осуществления первая клетка, экспрессирующая CAR, содержит CAR (например, CAR для BCMA или CAR для CD19), содержащий костимулирующий домен CD27 и первичный сигнальный домен CD3-дзета (мутантного или дикого типа). В ряде вариантов осуществления вторая клетка, экспрессирующая CAR, содержит CAR (например, CAR для BCMA), содержащий костимулирующий домен 4-1BB и первичный сигнальный домен CD3-дзета (мутантного или дикого типа). Не желая ограничиваться теорией, в ряде вариантов осуществления первая клетка, экспрессирующая CAR, может быть менее токсичной, чем вторая клетка, экспрессирующая CAR, и применяться для сокращения опухоли.
В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR может использоваться в комбинации с химиотерапевтическим средством. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают антрациклин (например, доксорубицин (например, липосомальный доксорубицин)), алкалоид барвинка (например, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин), алкилирующее средство (например, циклофосфамид, декарбазин, мелфалан, ифосфамид, темозоломид), антитело к иммунным клеткам (например, алемтузумаб, гемтузумаб, ритуксимаб, тозитумомаб), антиметаболит (в том числе, например, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндезаминазы (например, флударабин)), ингибитор mTOR, агонист белка, родственного глюкокортикоид-индуцируемым TNFR (GITR), ингибитор протеасом (например, аклациномицин A, глиотоксин или бортезомиб), иммуномодулятор, такой как талидомид или производное талидомида (например, леналидомид).
Основные химиотерапевтические средства, рассматриваемые для применения в видах комбинированной терапии, включают анастрозол (Arimidex), бикалутамид (Casodex), сульфат блеомицина (Blenoxane), бусульфан (Myleran), бусульфан для инъекций (Busulfex), капецитабин (Xeloda), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin), кармустин (BiCNU), хлорамбуцил (Leukeran), цисплатин (Platinol), кладрибин (Leustatin), циклофосфамид (Cytoxan или Neosar), цитарабин, цитозинарабинозид (Cytosar-U), липосомальный цитарабин для инъекций (DepoCyt), дакарбазин (DTIC-Dome), дактиномицин (актиномицин D, Cosmegan), гидрохлорид даунорубицина (Cerubidine), липосомальный цитрат даунорубицина для инъекций (DaunoXome), дексаметазон, доцетаксел (Taxotere), гидрохлорид доксорубицина (Adriamycin, Rubex), этопозид (Vepesid), фосфат флударабина (Fludara), 5-фторурацил (Adrucil, Efudex), флутамид (Eulexin), тезацитибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевину (Hydrea), идарубицин (Idamycin), ифосфамид (IFEX), иринотекан (Camptosar), L-аспарагиназу (ELSPAR), лейковорин кальция, мелфалан (Alkeran), 6-меркаптопурин (Purinethol), метотрексат (Folex), митоксантрон (Novantrone), милотарг, паклитаксел (Taxol), феникс (иттрий-90/MX-DTPA), пентостатин, полифепрозан 20 с кармустином для имплантации (Gliadel), цитрат тамоксифена (Nolvadex), тенипозид (Vumon), 6-тиогуанин, тиотепу, тирапазамин (Tirazone), гидрохлорид топотекана для инъекций (Hycamptin), винбластин (Velban), винкристин (Oncovin) и винорелбин (Navelbine).
Противораковые средства, представляющие особый интерес для комбинаций по настоящему изобретению, включают антрациклины; алкилирующие средства; антиметаболиты; лекарственные средства, которые ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальциневрин или киназу p70S6 (FK506) или ингибируют киназу p70S6; ингибиторы mTOR; иммуномодуляторы; антрациклины; алкалоиды барвинка; ингибиторы протеасом; агонисты GITR; ингибиторы протеинтирозинфосфатазы; ингибитор киназы CDK4; ингибитор BTK; ингибитор киназы MKN; ингибитор киназы DGK или онколитический вирус.
Иллюстративные алкилирующие средства включают без ограничения азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены: урациловый иприт (Aminouracil Mustard, Chlorethaminacil, Demethyldopan, Desmethyldopan, Haemanthamine, Nordopan, Uracil nitrogen mustard, Uracillost, Uracilmostaza, Uramustin, Uramustine), хлорметин (Mustargen), циклофосфамид (Cytoxan, Neosar, Clafen, Endoxan, Procytox, Revimmune™), ифосфамид (Mitoxana), мелфалан (Alkeran), хлорамбуцил (Leukeran), пипоброман (Amedel, Vercyte), триэтиленмеламин (Hemel, Hexalen, Hexastat), триэтилентиофосфорамин, темозоломид (Temodar), тиотепу (Thioplex), бусульфан (Busilvex, Myleran), кармустин (BiCNU), ломустин (CeeNU), стрептозоцин (Zanosar) и дакарбазин (DTIC-Dome). Дополнительные иллюстративные алкилирующие средства включают без ограничения оксалиплатин (Eloxatin); темозоломид (Temodar и Temodal); дактиномицин (также известный как актиномицин-D, Cosmegen); мелфалан (также известный как L-PAM, L-сарколизин и фенилаланиновый иприт, Alkeran); алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen); кармустин (BiCNU); бендамустин (Treanda); бусульфан (Busulfex и Myleran); карбоплатин (Paraplatin); ломустин (также известный как CCNU, CeeNU); цисплатин (также известный как CDDP, Platinol и Platinol-AQ); хлорамбуцил (Leukeran); циклофосфамид (Cytoxan и Neosar); дакарбазин (также известный как DTIC, DIC и имидазолкарбоксамид, DTIC-Dome); алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen); ифосфамид (Ifex); преднумустин; прокарбазин (Matulane); мехлорэтамин (также известный как азотистый иприт, мустин и гидрохлорид мехлорэтамина, Mustargen); стрептозоцин (Zanosar); тиотепу (также известную как тиофосфамид, TESPA и TSPA, Thioplex); циклофосфамид (Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox, Revimmune) и бендамустин HCl (Treanda).
R
R
S
R
R
S
S
R
E
R
R
R
S
E
E
Z
S
S
R
S
d
транс
d
H
N
H
4,9
2
Иллюстративные ингибиторы mTOR включают, например, темсиролимус; ридафоролимус (ранее известный как деферолимус, (1,2,4)-4-[(2)-2-[(1,9,12,15,16,18,19,21, 23,24,26,28,30,32,35)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.0]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоциклогексилдиметилфосфинат, также известный как AP23573 и MK8669, и описанный в публикации согласно PCT № WO 03/064383); эверолимус (Afinitor или RAD001); рапамицин (AY22989, Sirolimus); симапимод (CAS 164301-51-3); эмсиролимус, (5-{2,4-бис[(3)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанол (AZD8055); 2-амино-8-[-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-]пиримидин-7(8)-он (PF04691502, CAS 1013101-36-4), а также внутреннюю соль -[1,4-диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицил-L-α-аспартил-L-серина (SEQ ID NO: 285), в форме внутренней соли (SF1126, CAS 936487-67-1) и XL765.
Иллюстративные иммуномодуляторы включают, например, афутузумаб (доступный от Roche); пегфилграстим (Neulasta); леналидомид (CC-5013, Revlimid); талидомид (Thalomid), актимид (CC4047) и IRX-2 (смесь цитокинов человека, содержащую интерлейкин-1, интерлейкин-2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступная от IRX Therapeutics).
Иллюстративные антрациклины включают, например, доксорубицин (Adriamycin и Rubex); блеомицин (Lenoxane); даунорубицин (гидрохлорид даунорубицина, дауномицин и гидрохлорид рубидомицина, Cerubidine); липосомальный даунорубицин (липосомальный цитрат даунорубицина, DaunoXome); митоксантрон (DHAD, Novantrone); эпирубицин (Ellence™); идарубицин (Idamycin, Idamycin PFS); митомицин C (Mutamycin); гелданамицин; гербимицин; равидомицин и дезацетилравидомицин.
Иллюстративные алкалоиды барвинка включают, например, тартрат винорелбина (Navelbine), винкристин (Oncovin) и виндезин (Eldisine)); винбластин (также известный как сульфат винбластина, винкалейкобластин и VLB, Alkaban-AQ и Velban) и винорелбин (Navelbine).
S
N
S
S
R
S
O
N
O
N
S
R
Иллюстративные ингибиторы протеасом включают бортезомиб (Velcade); карфилзомиб (PX-171-007, ()-4-метил--(()-1-((()-4-метил-1-(()-2-метилоксиран-2-ил)-1-оксопентан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)-2-(()-2-(2-морфолиноацетамидо)-4-фенилбутанамидо)-пентанамид); маризомиб (NPI-0052); цитрат иксазомиба (MLN-9708); деланзомиб (CEP-18770) и -метил--[(2-метил-5-тиазолил)карбонил]-L-серил--метил--[(1)-2-[(2)-2-метил-2-оксиранил]-2-оксо-1-(фенилметил)этил]-L-серинамид (ONX-0912).
IgV
IgV
H
H
2
2
2
2
2
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с флударабином, циклофосфамидом и/или ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с флударабином, циклофосфамидом и ритуксимабом (FCR). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL. Например, у субъекта имеется делеция в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах у субъекта не имеется del(17p). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется лейкозная клетка, содержащая мутацию в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (). В других вариантах осуществления у субъекта не имеется лейкозной клетки, содержащей мутацию в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (). В ряде вариантов осуществления флударабин вводят в дозе приблизительно 10-50 мг/м (например, приблизительно 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 или 45-50 мг/м), например, внутривенно. В ряде вариантов осуществления циклофосфамид вводят в дозе приблизительно 200-300 мг/м (например, приблизительно 200-225, 225-250, 250-275 или 275-300 мг/м), например, внутривенно. В ряде вариантов осуществления ритуксимаб вводят в дозе приблизительно 400-600 мг/м2 (например, 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/м), например, внутривенно.
IgV
IgV
H
H
2
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с бендамустином и ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL. Например, у субъекта имеется делеция в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах у субъекта не имеется del(17p). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется лейкозная клетка, содержащая мутацию в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (). В других вариантах осуществления у субъекта не имеется лейкозной клетки, содержащей мутацию в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (). В ряде вариантов осуществления бендамустин вводят в дозе приблизительно 70-110 мг/м2 (например, 70-80, 80-90, 90-100 или 100-110 мг/м2), например, внутривенно. В ряде вариантов осуществления ритуксимаб вводят в дозе приблизительно 400-600 мг/м2 (например, 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/м), например, внутривенно.
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и/или кортикостероидом (например, преднизоном). В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизоном (R-CHOP). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется DLBCL ограниченной стадии, отличная от массивной, (например, имеется опухоль, характеризующаяся размером/диаметром менее 7 см). В ряде вариантов осуществления субъект получает лечение с помощью облучения в комбинации с R-CHOP. Например, субъекту вводят R-CHOP (например, 1-6 циклов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов R-CHOP) с последующим облучением. В некоторых случаях субъекту вводят R-CHOP (например, 1-6 циклов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов R-CHOP) после облучения.
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с этопозидом, преднизоном, винкристином, циклофосфамидом, доксорубицином и/или ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с этопозидом, преднизоном, винкристином, циклофосфамидом, доксорубицином и ритуксимабом (EPOCH-R). В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с EPOCH-R с индивидуальным подбором дозы EPOCH-R (DA-EPOCH-R). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется B-клеточная лимфома, например, агрессивная B-клеточная лимфома с перегруппировкой Myc.
RS
H
2
2
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом и/или леналидомидом. Леналидомид (()-3-(4-амино-1-оксо 1,3-дигидро-2-изоиндол- 2-ил)пиперидин-2,6-дион) представляет собой иммуномодулятор. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом и леналидомидом. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется фолликулярная лимфома (FL) или лимфома из клеток мантийной зоны (MCL). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется FL, и он ранее не получал лечение с применением противораковой терапии. В ряде вариантов осуществления леналидомид вводят в дозе приблизительно 10-20 мг (например, 10-15 или 15-20 мг), например, ежедневно. В ряде вариантов осуществления ритуксимаб вводят в дозе приблизительно 350-550 мг/м (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м), например, внутривенно.
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с брентуксимабом. Брентуксимаб представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства, антитела к CD30 и монометилауристатина Е. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется лимфома Ходжкина (HL), например, рецидивирующая или резистентная HL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CD30+ HL. В ряде вариантов осуществления субъект перенес операцию по введению аутологичного трансплантата стволовых клеток (ASCT). В ряде вариантов осуществления субъект не перенес операцию по введению ASCT. В ряде вариантов осуществления брентуксимаб вводят в дозе приблизительно 1-3 мг/кг (например, приблизительно 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 или 2,5-3 мг/кг), например, внутривенно, например, каждые 3 недели.
2
2
2
2
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с брентуксимабом и дакарбазином или в комбинации с брентуксимабом и бендамустином. Дакарбазин представляет собой алкилирующее средство с химическим названием 5-(3,3-диметил-1-триазенил)имидазол-4-карбоксамид. Бендамустин представляет собой алкилирующее средство с химическим названием 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил]бутановая кислота. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется лимфома Ходжкина (HL). В ряде вариантов осуществления субъект ранее не получал лечение с применением противораковой терапии. В ряде вариантов осуществления возраст субъекта составляет по меньшей мере 60 лет, например, 60, 65, 70, 75, 80, 85 лет или больше. В ряде вариантов осуществления дакарбазин вводят в дозе приблизительно 300-450 мг/м (например, приблизительно 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425 или 425-450 мг/м), например, внутривенно. В ряде вариантов осуществления бендамустин вводят в дозе приблизительно 75-125 мг/м2 (например, 75-100 или 100-125 мг/м, например, приблизительно 90 мг/м), например, внутривенно. В ряде вариантов осуществления брентуксимаб вводят в дозе приблизительно 1-3 мг/кг (например, приблизительно 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 или 2,5-3 мг/кг), например, внутривенно, например, каждые 3 недели.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ингибитором CD20, например, антителом к CD20 (например, моно- или биспецифическим антителом к CD20) или его фрагментом. Иллюстративные антитела к CD20 включают без ограничения ритуксимаб, офатумумаб, окрелизумаб, велтузумаб, обинутузумаб, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), окаратузумаб и Pro131921 (Genentech). См., например, Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43.
В некоторых вариантах осуществления антитело к CD20 содержит ритуксимаб. Ритуксимаб представляет собой химерное моноклональное антитело IgG1 каппа мыши/человека, которое связывается с CD20 и вызывает цитолиз клетки, экспрессирующей CD20, например, описанной в www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL или SLL.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления ритуксимаб вводят внутривенно, например, в виде внутривенной инфузии. Например, каждая инфузия предусматривает приблизительно 500-2000 мг (например, приблизительно 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, или 1900-2000 мг) ритуксимаба. В некоторых вариантах осуществления ритуксимаб вводят в дозе, составляющей от 150 мг/м до 750 мг/м, например, приблизительно 150-175 мг/м, 175-200 мг/м, 200-225 мг/м, 225-250 мг/м, 250-300 мг/м, 300-325 мг/м, 325-350 мг/м, 350-375 мг/м, 375-400 мг/м, 400-425 мг/м, 425-450 мг/м, 450-475 мг/м, 475-500 мг/м, 500-525 мг/м, 525-550 мг/м, 550-575 мг/м, 575-600 мг/м, 600-625 мг/м, 625-650 мг/м, 650-675 мг/м или 675-700 мг/м, где м указывает площадь поверхности тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления ритуксимаб вводят с интервалом дозирования, составляющим по меньшей мере 4 дня, например, 4, 7, 14, 21, 28, 35 дней или больше. Например, ритуксимаб вводят с интервалом дозирования, составляющим по меньшей мере 0,5 недели, например, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 недель или больше. В некоторых вариантах осуществления ритуксимаб вводят в дозе и с интервалом дозирования, описанными в данном документе в течение периода времени, например, по меньшей мере 2 недель, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 недель или больше. Например, ритуксимаб вводят в дозе и с интервалом дозирования, описанными в данном документе в общей сложности с по меньшей мере 4 дозами на цикл лечения (например, по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или более дозами на цикл лечения).
В некоторых вариантах осуществления антитело к CD20 содержит офатумумаб. Офатумумаб представляет собой моноклональное антитело IgG1κ человека к CD20 с молекулярной массой примерно 149 кДа. Например, офатумумаб получают с применением трансгенной мыши и технологии гибридомы и экспрессируют и очищают из линии рекомбинантных клеток мыши (NS0). См., например, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; а также клиническое испытание с идентификационными номерами NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 и NCT01397591. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с офатумумабом. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL или SLL.
В некоторых вариантах осуществления офатумумаб вводят в виде внутривенной инфузии. Например, каждая инфузия предусматривает приблизительно 150-3000 мг (например, приблизительно 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, или 2800-3000 мг) офатумумаба. В ряде вариантов осуществления офатумумаб вводят при начальной дозировке приблизительно 300 мг, затем 2000 мг, например, для приблизительно 11 доз, например, в течение 24 недель. В некоторых вариантах осуществления офатумумаб вводят с интервалом дозирования, составляющим по меньшей мере 4 дня, например, 4, 7, 14, 21, 28, 35 дней или более. Например, офатумумаб вводят с интервалом дозирования, составляющим по меньшей мере 1 неделю, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 недель или больше. В некоторых вариантах осуществления офатумумаб вводят в дозе и с интервалом дозирования, описанными в данном документе в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 недели, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 недель или больше или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или больше или 1, 2, 3, 4, 5 лет или больше. Например, офатумумаб вводят в дозе и с интервалом дозирования, описанными в данном документе в общей сложности по меньшей мере в 2 дозах на цикл лечения (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, или больше доз на цикл лечения).
В некоторых случаях антитело к CD20 предусматривает окрелизумаб. Окрелизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к CD20, например, описанное в клинических испытаниях с идентификационными номерами NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570 и в Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87.
В некоторых случаях антитело к CD20 предусматривает велтузумаб. Велтузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к CD20. См., например, клиническое испытание с идентификационными номерами NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581 и Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55.
В некоторых случаях антитело к CD20 предусматривает GA101. GA101 (также называемое обинутузумаб или RO5072759) представляет собой гуманизированное и полученное с помощью гликоинженерии моноклональное антитело к CD20. См., например, Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; клинические испытания с идентификационными номерами NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 и NCT01414205; и www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.
В некоторых случаях антитело к CD20 предусматривает AME-133v. AME-133v (также называемое LY2469298 или окаратузумаб) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG1 к CD20 с повышенной аффинностью в отношении рецептора FcγRIIIa и повышенной антителозависимой клеточной цитотоксической (ADCC) активностью по сравнению с ритуксимабом. См., например, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; и Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403.
В некоторых случаях антитело к CD20 предусматривает PRO131921. PRO131921 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к CD20, сконструированное для обеспечения более эффективного связывания с FcγRIIIa и повышенной ADCC по сравнению с ритуксимабом. См., например, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; и Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46; а также клиническое исследование с идентификационным номером NCT00452127.
В некоторых случаях антитело к CD20 предустматривает TRU-015. TRU-015 представляет собой слитый белок, действующий в отношении CD20, полученный из доменов антитела к CD20. TRU-015 является меньшим, чем моноклональные антитела, однако сохраняет Fc-опосредованные эффекторные функции. См., например, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25. TRU-015 содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), связывающий CD20, связанный с шарнирной областью IgG1 человека, доменами CH2 и CH3, однако не содержит доменов CH1 и CL.
В некоторых вариантах осуществления антитело к CD20, описанное в данном документе, конъюгировано или иным образом связано с терапевтическим средством, например, химиотерапевтическим средством (например, цитоксаном, флударабином, ингибитором гистондеацетилазы, деметилирующим средством, пептидной вакциной, противоопухолевым антибиотиком, ингибитором тирозинкиназы, алкилирующим средством, ингибитором образования микротрубочек или антимитотическим средством), противоаллергическим средством, противотошнотным средством (или противорвотным средством), обезболивающим средством или цитопротекторным средством, описанными в данном документе.
N
H
H
b
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ингибитором B-клеточной лимфомы 2 (BCL-2) (например, венетоклаксом, также называемым ABT-199 или GDC-0199) и/или ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с венетоклаксом и ритуксимабом. Венетоклакс представляет собой малую молекулу, которая ингибирует антиапоптотический белок BCL-2. Структура венетоклакса (4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)--({3-нитро-4-[(тетрагидро-2-пиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2-(1-пирроло[2,3-]пиридин-5-илокси)бензамид) показана ниже.
2
В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется рецидивирующий CLL, например, субъекту ранее вводили средство противораковой терапии. В ряде вариантов осуществления венетоклакс вводят в дозе приблизительно 15-600 мг (например, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500 или 500-600 мг), например, ежедневно. В ряде вариантов осуществления ритуксимаб вводят в дозе приблизительно 350-550 мг/м2 (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м), например, внутривенно, например, раз в месяц.
Без ограничения какой-либо теорией считается, что в некоторых видах рака B-клетки (например, регуляторные В-клетки) могут подавлять T-клетки. Дополнительно полагается, что комбинация оксиплатина и средства, истощающего В-клетки, может снижать размер опухоли и/или устранять опухоли у субъекта. В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR (например, CAR для BCMA), вводят в комбинации со средством, истощающим В-клетки (например, клеткой CD19, экспрессирующей CAR, клеткой CD20, экспрессирующей CAR, ритуксимабом, окрелизумабом, эпратузумабом или белимумабом) и оксиплатином. В ряде вариантов осуществления раковая клетка может являться CD19-отрицательной или CD19-положительной; или BCMA-отрицательной или BMCA-положительной. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR (например, CAR для BCMA), вводят в комбинации со средством, истощающим В-клетки, и оксиплатином для лечения рака, например, рака, описанного в данном документе, например, солидного рака, например, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы или рака легкого.
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR (например, CAR для BCMA), может истощать B-клетки (например, B-клетки, имеющие фенотип, подобный плазматическим клеткам, например, который экспрессирует BCMA, CD19 и/или CD20) у субъекта. В ряде вариантов осуществления B-клетка может являться CD19-отрицательной или CD19-положительной; или BCMA-отрицательной или BMCA положительной. В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR (например, CAR для BCMA), вводят в комбинации с оксиплатином. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, которую вводят в комбинации с оксиплатином, применяют для лечения рака, например, солидного рака, например, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы или рака легкого. В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят в комбинации с онколитическим вирусом. В ряде вариантов осуществления онколитические вирусы способны избирательно реплицироваться в раковой клетке и вызывать ее гибель или замедление ее роста. В некоторых случаях онколитические вирусы не оказывают эффекта или оказывают минимальный эффект в отношении клеток, отличных от раковых. Онколитический вирус включает без ограничения онколитический аденовирус, онколитические вирусы простого герпеса, онколитические ретровирусы, онколитические парвовирусы, онколитический вирус осповакцины, онколитический вирус Синдбис, онколитический вирус гриппа или онколитический РНК вирус (например, онколитический реовирус, онколитический вирус болезни Ньюкасла (NDV), онколитический вирус кори или онколитический вирус везикулярного стоматита (VSV)).
В некоторых вариантах осуществления онколитический вирус представляет собой вирус, например, рекомбинантный онколитический вирус, описанный в US2010/0178684 A1, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный онколитический вирус содержит последовательность нуклеиновой кислоты (например, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты), кодирующей ингибитор иммунного или воспалительного ответа, например, описанный в US2010/0178684 A1, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный онколитический вирус, например, онколитический вирус NDV, содержит проапоптический белок (например, апоптин), цитокин (например, GM-CSF, интерферон гамма, интерлейкин 2 (IL-2), фактор некроза опухоли альфа), иммуноглобулин (например, антитело к фибронектину ED-B), опухолеассоцированный антиген, биспецифический адапторный белок (например, биспецифическое антитело или фрагмент антитела, направленные против белка HN NDV, и T-клеточный костимуляторный рецептор, такой как CD3 или CD28; или слитый белок на основе IL-2 человека и одноцепочечного антитела, направленного против белка HN NDV). См., например, Zamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления онколитический вирус представляет собой химерный онколитический NDV, описанный в US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1 или US 2014/0271677 A1, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В некоторых вариантах осуществления онколитический вирус включает условно-репликативный аденовирус (CRAd), который разработан для репликации исключительно в раковых клетках. См., например, Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27. В некоторых вариантах осуществления онколитический аденовирус представляет собой таковой, описанный в таблице 1 на странице 725 в Alemany et al., включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Иллюстративные онколитические вирусы включают без ограничения следующие:
онколитический аденовирус группы B (ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (см., например, клиническое исследование с идентификационным номером NCT02053220);
ONCOS-102 (ранее называемый CGTG-102), который представляет собой аденовирус, содержащий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (Oncos Therapeutics) (см., например, клиническое испытание с идентификационным номером NCT01598129);
VCN-01, который представляет собой генетически модифицированный онколитический аденовирус человека кодирующий гиалуронидазу PH20 человека (VCN Biosciences, S.L.) (см., например, клинические испытания с идентификационными номерами NCT02045602 и NCT02045589);
условно-репликативный аденовирус ICOVIR-5, который представляет собой вирус, полученный из аденовируса дикого типа человека серотипа 5 (Had5), который был модифицирован для избирательной репликации в раковых клетках с нарушенной регуляцией пути ретинобластома/E2F (Institut Català d'Oncologia) (см., например, клиническое испытание с идентификационным номером NCT01864759);
Celyvir, который содержит аутологические мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга (MSC), инфицированные ICOVIR5, онколитический аденовирус (Hospital Infantil Universitario  Мадрид, Испания/Ramon Alemany) (см., например, клиническое испытание с идентификационным номером NCT01844661);
CG0070, который представляет собой условно-репликативный онколитический аденовирус серотипа 5 (Ad5), в котором промотор E2F-1 человека регулирует экспрессию важных генов вируса E1a, за счет чего обеспечивается ограничение вирусной репликации и цитотоксичности в дефектных в отношении Rb-пути опухолевых клетках (Cold Genesys, Inc.) (см., например, клиническое испытание с идентификационным номером NCT02143804); или
DNX-2401 (ранее называемый Delta-24-RGD), который представляет собой аденовирус, который был сконструирован для избирательной репликации в дефектных в отношении пути ретинобластомы (Rb) клетках и для более эффективного инфицирования клеток, которые экспрессируют определенные связывающиеся с RGD интегрины (Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/DNAtrix, Inc.) (см., например, клиническое испытание с идентификационным номером NCT01956734).
В некоторых вариантах осуществления онколитический вирус, описанный в данном документе, вводят с помощью инъекции, например, подкожной, внутриартериальной, внутривенной, внутримышечной, интратекальной или интраперитонеальной инъекций. В ряде вариантов осуществления онколитический вирус, описанный в данном документе, вводят внутрь опухоли, трансдермально, трансмукозально, перорально, интраназально или посредством ингаляционного введения.
В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, вводят субъекту в комбинации с молекулой, которая обеспечивает уменьшение популяции Treg-клеток. Способы, которые обеспечивают уменьшение количества (например, приводят к истощению) TREG-клеток, известны из уровня техники и включают, например, истощение по CD25, введение циклофосфамида, модулирование функции GITR. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что снижение количества Treg-клеток у субъекта до афереза или до введения клетки, экспрессирующей CAR, описанной в данном документе, снижает количество нежелательных иммунных клеток (например, Treg) в микроокружении опухоли и снижает риск рецидива у субъекта. В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с молекулой, нацеливающейся на GITR и/или модулирующей функции GITR, такой как антагонист GITR и/или антитело к GITR, которые истощают популяцию регуляторных Т-клеток (Treg). В ряде вариантов осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, вводят субъекту в комбинации с циклофосфамидом. В некоторых вариантах осуществления GITR-связывающие молекулы и/или молекулы, модулирующие функции GITR (например, агонист GITR и/или антитело к GITR, приводящее к истощению Treg), вводят до введения клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления агонист GITR можно вводить до афереза клеток. В ряде вариантов осуществления циклофосфамид вводят субъекту до введения (например, до инфузии или повторной инфузии) клетки, экспрессирующей CAR, или до афереза клеток. В ряде вариантов осуществления циклофосфамид и антитело к GITR вводят субъекту до введения (например, инфузии или повторной инфузии) клетки, экспрессирующей CAR, или до афереза клеток. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак (например, солидный рак или гематологический рак, такой как множественная миелома, ALL или CLL). В одном варианте осуществления у субъекта имеется CLL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется множественная миелома. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется солидный рак, например, солидный рак описанный в данном документе. Иллюстративные агонисты GITR включают, например, слитые белки на основе GITR и антитела к GITR (например, бивалентные антитела к GITR), такие как, например, слитый белок на основе GITR, описанный в патенте США № 6111090, европейском патенте № 090505B1, патенте США № 8586023, публикациях согласно PCT №№ WO 2010/003118 и 2011/090754 или антитело к GITR, описанное, например, в патенте США № 7025962, европейском патенте № 1947183B1, патенте США № 7812135, патенте США № 8388967, патенте США № 8591886, европейском патенте № EP 1866339, публикации согласно PCT № WO 2011/028683, публикации согласно PCT № WO 2013/039954, публикации согласно PCT № WO2005/007190, публикации согласно PCT № WO 2007/133822, публикации согласно PCT № WO2005/055808, публикации согласно PCT № WO 99/40196, публикации согласно PCT № WO 2001/03720, публикации согласно PCT № WO99/20758, публикации согласно PCT № WO2006/083289, публикации согласно PCT № WO 2005/115451, патенте США № 7618632 и публикации согласно PCT № WO 2011/051726.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с ингибитором mTOR, например, ингибитором mTOR, описанным в данном документе, например рапалогом, таким как эверолимус. В некоторых вариантах осуществления ингибитор mTOR вводят до введения клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления ингибитор mTOR можно вводить до афереза клеток.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с агонистом GITR, например, агонистом GITR, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления агонист GITR вводят до введения клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления агонист GITR можно вводить до афереза клеток.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с ингибитором протеинтирозинфосфатазы, например, ингибитором протеинтирозинфосфатазы, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления ингибитор протеинтирозинфосфатазы представляет собой ингибитор SHP-1, например, ингибитор SHP-1, описанный в данном документе, такой как, например, стибоглюконат натрия. В некоторых вариантах осуществления ингибитор протеинтирозинфосфатазы представляет собой ингибитор SHP-2.
H
d
d
В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может применяться в комбинации с ингибитором киназы. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы является ингибитором CDK4, например, ингибитором CDK4, описанным в данном документе, например, ингибитором CDK4/6, таким как, например, гидрохлорид 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8-пиридо[2,3-]пиримидин-7-она (также называемый палбоциклибом или PD0332991). В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы является ингибитором BTK, например, ингибитором BTK, описанным в данном документе, таким как, например, ибрутиниб. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы является ингибитором mTOR, например, ингибитором mTOR, описанным в данном документе, таким как, например, рапамицин, аналог рапамицина, OSI-027. Ингибитор mTOR может являться, например, ингибитором mTORC1 и/или ингибитором mTORC2, например, ингибитором mTORC1 и/или ингибитором mTORC2, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор MNK, например, ингибитор MNK, описанный в данном документе, такой как, например, 4-амино-5-(4-фторанилино)-пиразолo [3,4-] пиримидин. Ингибитор MNK может являться, например, ингибитором MNK1a, MNK1b, MNK2a и/или MNK2b. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой двойной ингибитор PI3K/mTOR, описанный в данном документе, такой как, например, PF-04695102. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы является ингибитором DGK, например, ингибитором DGK, описанным в данном документе, таким как, например, DGKinh1 (D5919) или DGKinh2 (D5794).
R
S
H
H
N
H
трет
H
d
H
N
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор CDK4, выбранный из алоизина A; флавопиридола или HMR-1275, 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(3S,4R)-3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил]-4-хроменона; кризотиниба (PF-02341066; 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(2,3)-2-(гидроксиметил)-1-метил-3-пирролидинил]- 4-1-бензoпиран-4-она, гидрохлорида (P276-00); 1-метил-5-[[2-[5-(трифторметил)-1-имидазол-2-ил]-4-пиридинил]окси]--[4-(трифторметил)фенил]-1-бензимидазол-2-амина (RAF265); индизулама (E7070); росковитина (CYC202); палбоциклиба (PD0332991); динациклиба (SCH727965); N-[5-[[(5--бутилоксазол-2-ил)метил]тио]тиазол-2-ил]пиперидин-4-карбоксамида (BMS 387032); 4-[[9-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-5-пиримидо[5,4-][2]бензазепин-2-ил]амино]-бензойной кислоты (MLN8054); 5-[3-(4,6-дифтор-1H-бензимидазол-2-ил)-1H-индазол-5-ил]-N-этил-4-метил-3-пиридинметанамина (AG-024322); 4-(2,6-дихлорбензоиламино)-1H-пиразол-3-карбоновой кислоты N-(пиперидин-4-ил)амида (AT7519); 4-[2-метил-1-(1-метилэтил)-1-имидазол-5-ил]--[4-(метилсульфонил)фенил]- 2-пиримидинамина (AZD5438); и XL281 (BMS908662).
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор CDK4, например, палбоциклиб (PD0332991), и палбоциклиб вводят в дозе, составляющей приблизительно 50 мг, 60 мг, 70 мг, 75 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 105 мг, 110 мг, 115 мг, 120 мг, 125 мг, 130 мг, 135 мг (например, 75 мг, 100 мг или 125 мг) ежедневно в течение определенного периода времени, например, ежедневно в течение 14-21 дня 28-дневного цикла или ежедневно в течение 7-12 дней 21-дневного цикла. В некоторых вариантах осуществления вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов палбоциклиба.
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ингибитором циклинзависимой киназы (CDK) 4 или 6, например, ингибитором CDK4 или ингибитором CDK6, описанными в данном документе. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ингибитором CDK4/6 (например, ингибитором, который нацеливается как на CDK4, так и на CDK6), например, ингибитором CDK4/6, описанным в данном документе. В одном варианте осуществления у субъекта имеется MCL. MCL представляет собой агрессивный рак, который слабо отвечает на современные доступные средства терапии, т. е. по сути является неизлечимым. Во многих случаях MCL в клетках MCL экспрессируется циклин D1 (регулятор CDK4/6) (например, в результате хромосомной транслокации, затрагивающей гены иммуноглобулина и циклина D1). Таким образом, без ограничения какой-либо теорией, считается, что клетки MCL являются высокочувствительными к ингибированию с помощью CDK4/6 с высокой специфичностью (т. е. минимальным воздействием на нормальные иммунные клетки). Ингибиторы CDK4/6 в отдельности характеризовались некоторой эффективностью в лечении MCL, однако обеспечивали достижение лишь частичной ремиссии при высокой частоте рецидивов. Иллюстративный ингибитор CDK4/6 представляет собой LEE011 (также называемый рибоциклибом), структура которого показана ниже.
Без ограничения какой-либо теорией, считается, что введение клетки, экспрессирующей CAR, описанной в данном документе, с ингибитором CDK4/6 (например, LEE011 или другим ингибитором CDK4/6, описанным в данном документе) может обеспечивать достижение более высокой интенсивности ответа, например, с обеспечением более высокого процента пациентов с ремиссией и/или более низкого процента пациентов с рецидивом, например, по сравнению с ингибитором CDK4/6 в отдельности.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор BTK, выбранный из ибрутиниба (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; и LFM-A13. В предпочтительном варианте осуществления ингибитор BTK не снижает и не ингибирует киназную активность киназы, индуцируемой интерлейкином-2 (ITK), и выбран из GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; НМ-71224; СС-292; ONO-4059; CNX-774 и LFM-A13.
R
H
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор BTK, например, ибрутиниб (PCI-32765). В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, вводят субъекту в комбинации с ингибитором BTK (например, ибрутинибом). В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, вводят субъекту в комбинации с ибрутинибом (также называемым PCI-32765). Структура ибрутиниба (1-[(3)-3-[4-амино-3-(4-феноксифенил)-1-пиразолo[3,4-d]пиримидин-1-ил]пиперидин-1-ил]проп-2-ен-1-она) показана ниже.
В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL, мантийноклеточная лимфома (MCL) или мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома (SLL). Например, у субъекта имеется делеция в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах у субъекта не имеется del(17p). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется рецидивирующий CLL или SLL, например, субъекту ранее вводили средство противораковой терапии (например, ранее вводили одно, два, три или четыре средства предшествующей противораковой терапии). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется рефрактерный CLL или SLL. В других вариантах осуществления у субъекта имеется фолликулярная лимфома, например, рецидивирующая или рефрактерная фолликулярная лимфома. В некоторых вариантах осуществления ибрутиниб вводят в дозе, составляющей приблизительно 300-600 мг/день (например, приблизительно 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/день, например, приблизительно 420 мг/день или приблизительно 560 мг/день), например, перорально. В ряде вариантов осуществления ибрутиниб вводят в дозе, составляющей приблизительно 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 420 мг, 440 мг, 460 мг, 480 мг, 500 мг, 520 мг, 540 мг, 560 мг, 580 мг, 600 мг (например, 250 мг, 420 мг или 560 мг) ежедневно в течение некоторого периода времени, например, ежедневно в течение 21-дневного цикла или ежедневно в течение 28-дневного цикла. В некоторых вариантах осуществления вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов ибрутиниба. В некоторых вариантах осуществления ибрутиниб вводят в комбинации с ритуксимабом. См., например, Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675, представленную на 55-межегодном собрании и выставке ASH, Новый Орлеан, Луизиана, 7-10 декабря. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что при добавлении ибрутиниба усиливается пролиферативный ответ T-клеток и может происходить сдвиг фенотипа T-клеток от T-хелперов 2 типа (Th2) к T-хелперам 1 типа (Th1). Th1 и Th2 представляют собой фенотипы хелперных T-клеток, при этом Th1 и Th2 управляют различными путями иммунного ответа. Фенотип Th1 ассоциирован с провоспалительными ответами, например, для уничтожения клеток, таких как внутриклеточные патогены/вирусы или раковые клетки, или аутоиммунными ответами, поддерживающимися в течение длительного времени. Фенотип Th2 ассоциирован с накоплением эозинофилов и противовоспалительными ответами.
В некоторых вариантах осуществления способов, вариантов применения и композиций в данном документе ингибитор BTK представляет собой ингибитор BTK, описанный в международной заявке WO/2015/079417, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Например, в некоторых вариантах осуществления ингибитор BTK представляет собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль;
(I)
где,
R1 представляет собой водород, C1-C6алкил необязательно замещенный гидрокси;
R2 представляет собой водород или галоген;
R3 представляет собой водород или галоген;
R4 представляет собой водород;
R5 представляет собой водород или галоген;
или R4 и R5 присоединены друг к другу и обозначают связь, -CH2-, -CH2-CH2- , -CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH-; или -CH2-CH2-CH2-;
R6 и R7 обозначают независимо друг от друга H, C1-C6алкил, необязательно замещенный гидроксилом, C3-C6циклоалкил, необязательно замещенный галогеном или гидрокси или галоген;
R8, R9, R, R', R10 и R11 независимо друг от друга обозначают H или C1-C6алкил, необязательно замещенный C1-C6алкокси; или любые два из R8, R9, R, R', R10 и R11 вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, могут образовывать 3-6-членное насыщенное карбоциклическое кольцо;
R12 представляет собой водород или C1-C6алкил, необязательно замещенный галогеном или C1-C6алкокси;
или R12 и любой из R8, R9, R, R', R10 или R11 вместе с атомами, к которым они присоединены, могут образовывать 4-, 5-, 6- или 7-членное азациклическое кольцо, при этом кольцо может быть необязательно замещено галогеном, циано, гидроксилом, C1-C6алкилом или C1-C6алкокси;
n равняется 0 или 1; и
R13 представляет собой C2-C6алкенил, необязательно замещенный C1-C6алкилом, C1-C6алкокси или N, N-ди-C1-C6алкиламино; C2-C6алкинил, необязательно замещенный C1-C6алкилом или C1-C6алкокси; или C2-C6алкенилоксид, необязательно замещенный C1-C6алкилом.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор BTK формулы I выбран из: N-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-3-ил)окси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (E)-N-(3-(6-амино-5-((1-(бут-2-еноил)азетидин-3-ил)окси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-((1-пропиолоилазетидин-3-ил)окси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-((1-(бут-2-иноил)азетидин-3-ил)окси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(5-((1-акрилоилпиперидин-4-ил)окси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилакриламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (E)-N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилбут-2-енамидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилпропиламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (E)-N-(3-(6-амино-5-(2-(4-метокси-N-метилбут-2-енамидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилбут-2-инамидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(2-((4-амино-6-(3-(4-циклопропил-2-фторбензамидо)-5-фтор-2-метилфенил)пиримидин-5-ил)окси)этил)-N-метилоксиран-2-карбоксамида; N-(2-((4-амино-6-(3-(6-циклопропил-8-фтор-1-оксоизохинолин-2(1H)-ил)фенил)пиримидин-5-ил)окси)этил)-N-метилакриламида; N-(3-(5-(2-акриламидоэтокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-этилакриламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-(2-фторэтил)акриламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(5-((1-акриламидоциклопропил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(5-(2-акриламидопропокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(6-амино-5-(2-(бут-2-инамидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилакриламидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилбут-2-инамидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(3-(N-метилакриламидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(5-((1-акрилоилпирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(6-амино-5-((1-(бут-2-иноил)пирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-2-(3-(5-((1-акрилоилпирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6-циклопропил-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она; N-(2-((4-амино-6-(3-(6-циклопропил-1-оксо-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)пиримидин-5-ил)окси)этил)-N-метилакриламида; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(((2S,4R)-1-(бут-2-иноил)-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6-циклопропил-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-акрилоил-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(((2S,4S)-1-(бут-2-иноил)-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-фторпирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(6-амино-5-(((2S,4R)-1-(бут-2-иноил)-4-фторпирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-N-(3-(6-амино-5-((1-пропиолоилазетидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (S)-2-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6-циклопропил-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-она; (R)-N-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; (R)-N-(3-(5-((1-акрилоилпиперидин-3-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-акрилоил-3-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-цианопирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида; или N-(3-(5-(((2S,4S)-1-акрилоил-4-цианопирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамида.
Если не предусмотрено иное, химические термины, используемые выше при описании ингибитора BTK формулы I, используют в соответствии с их значениями, изложенными в международной заявке WO/2015/079417, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
R
R
S
R
R
S
S
R
E
R
R
R
S
E
E
Z
S
S
R
S
d
транс
d
H
N
H
4,9
2
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, выбранный из темсиролимуса; ридафоролимуса (1,2,4)-4-[(2)-2 [(1,9,12,15,16,18,19,21, 23,24,26,28,30,32,35)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23, 29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.0] гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексила диметилфосфината, также известного как AP23573 и MK8669; эверолимуса (RAD001); рапамицина (AY22989); симапимода; (5-{2,4-бис[(3)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанола (AZD8055); 2-амино-8-[-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метил-пиридо[2,3-]пиримидин-7(8)-она (PF04691502); и -[1,4-диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4-1-бензoпиран-2-ил)морфолин-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицил-L-α-аспартил-L-серина (SEQ ID NO: 285), внутренней соли (SF1126); и XL765.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например, рапамицин и рапамицин вводят в дозе, составляющей приблизительно 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг (например, 6 мг) ежедневно в течение периода времени, например, ежедневно в течение 21-дневного цикла или ежедневно в течение 28-дневного цикла. В некоторых вариантах осуществления вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов рапамицина. В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например, эверолимус и эверолимус вводят в дозе, составляющей приблизительно 2 мг, 2,5 мг, 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг, 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг, 15 мг (например, 10 мг) ежедневно в течение периода времени, например, ежедневно в течение 28-дневного цикла. В некоторых вариантах осуществления вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов эверолимуса.
d
d
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой ингибитор MNK, выбранный из CGP052088; 4-амино-3-(p-фторфениламино)-пиразолo[3,4-] пиримидина (CGP57380); церкоспорамида; ETC-1780445-2; и 4-амино-5-(4-фторанилино)-пиразолo[3,4-] пиримидина.
S
H
H
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации скомбинации с ингибитором фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) (например, ингибитором PI3K, описанным в данном документе, например, иделалисибом или дувелисибом) и/или ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с иделалисибом и ритуксимабом. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с дувелисибом и ритуксимабом. Иделалисиб (также называемый GS-1101 или CAL-101; Gilead) представляет собой малую молекулу, которая блокирует дельта-изоформу PI3K. Структура иделалисиба (5-фтор-3-фенил-2-[(1)-1-(7-пурин-6-иламино)пропил]-4(3)-хиназолинона) показана ниже.
Дувелисиб (также называемый IPI-145; Infinity Pharmaceuticals и Abbvie) представляет собой малую молекулу, которая блокирует PI3K-Δ,γ. Структура дувелисиба (8-хлор-2-фенил-3-[(1S)-1-(9H-пурин-6-иламино)этил]-1(2H)-изохинолинона) показана ниже.
IgV
IgV
H
H
2
2
В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CLL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется рецидивирующий CLL, например, субъекту ранее вводили средство противораковой терапии (например, ранее вводили антитело к CD20 или ранее вводили ибрутиниб). Например, у субъекта имеется делеция в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах у субъекта не имеется del(17p). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется лейкозная клетка, содержащая мутацию в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (). В других вариантах осуществления у субъекта не имеется лейкозной клетки, содержащей мутацию в гене вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется делеция в длинном плече хромосомы 11 (del(11q)). В других вариантах осуществления у субъекта не имеется del(11q). В ряде вариантов осуществления иделалисиб вводят в дозе приблизительно 100-400 мг (например, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375 или 375-400 мг), например, BID. В ряде вариантов осуществления дувелисиб вводят в дозе приблизительно 15-100 мг (например, приблизительно 15-25, 25-50, 50-75 или 75-100 мг), например, два раза в день. В ряде вариантов осуществления ритуксимаб вводят в дозе приблизительно 350-550 мг/м (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м), например, внутривенно.
AP26113
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ингибитором киназыанапластической лимфомы (ALK ). Иллюстративные ингибиторы киназы ALK включают без ограничения кризотиниб (Pfizer), церитиниб (Novartis), алектиниб (Chugai), бригатиниб (также называемый ; Ariad), энтректиниб (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (см., например, клиническое испытание с идентификационным № NCT02048488), CEP-37440 (Teva) и X-396 (Xcovery). В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется солидный рак, например, солидный рак, описанный в данном документе, например, рак легкого.
R
N
N
2
4
2
4
Химическое название кризотиниба представляет собой 3-[(1)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(1-пиперидин-4-илпиразол-4-ил)пиридин-2-амин. Химическое название церитиниба представляет собой 5-хлор--[2-изопропокси-5-метил-4-(4-пиперидинил)фенил]--[2-(изопропилсульфонил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин. Химическое название алектиниба представляет собой 9-этил-6,6-диметил-8-(4-морфолинoпиперидин-1-ил)-11-оксо-6,11-дигидро-5H-бензо[b]карбазол-3-карбонитрил. Химическое название бригатиниба представляет собой 5-хлор-N-{4-[4-(диметиламино)-1-пиперидинил]-2-метоксифенил}-N-[2-(диметилфосфорил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин. Химическое название энтректиниба представляет собой N-(5-(3,5-дифторбензил)-1H-индазол-3-ил)-4-(4-метилпиперазин-1-ил)-2-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)бензамид. Химическое название PF-06463922 представляет собой (10R)-7-амино-12-фтор-2,10,16-триметил-15-оксо-10,15,16,17-тетрагидро-2H-8,4-(метено)пиразолo[4,3-h][2,5,11]-бензоксадиазациклотетрадецин-3-карбонитрил. Химическая структура CEP-37440 представляет собой (S)-2-((5-хлор-2-((6-(4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил)-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5H-бензо[7]аннулен-2-ил)амино)пиримидин-4-ил)амино)-N-метилбензамид. Химическое название X-396 представляет собой (R)-6-амино-5-(1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси)-N-(4-(4-метилпиперазин-1-карбонил)фенил)пиридазин-3-карбоксамид.
транс
d
H
N
N
H
В некоторых вариантах осуществления ингибитор киназы представляет собой a двойной ингибитор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и mTOR, выбранный из 2-амино-8-[-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метил-пиридо[2,3-]пиримидин-7(8)-она (PF-04691502); -[4-[[4-(диметиламино)-1-пиперидинил]карбонил]фенил]-'-[4-(4,6-ди-4-морфолинил-1,3,5-триазин-2-ил)фенил]мочевины (PF-05212384, PKI-587); 2-метил-2-{4-[3-метил-2-оксо-8-(хинолин-3-ил)-2,3-дигидро-1-имидазо[4,5-c]хинолин-1-ил]фенил}пропанeнитрила (BEZ-235); апитолизиба (GDC-0980, RG7422); 2,4-дифтор-N-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида (GSK2126458); 8-(6-метоксипиридин-3-ил)-3-метил-1-(4-(пиперазин-1-ил)-3-(трифторметил)фенил)-1H-имидазо[4,5-c]хинолин-2(3H)-она малеиновой кислоты (NVP-BGT226); 3-[4-(4-морфолинилпиридо[3',2':4,5]фуро[3,2-d]пиримидин-2-ил]фенола (PI-103); 5-(9-изопропил-8-метил-2-морфолинo-9H-пурин-6-ил)пиримидин-2-амина (VS-5584, SB2343); и N-[2-[(3,5-диметоксифенил)амино]хиноксалин-3-ил]-4-[(4-метил-3-метоксифенил)карбонил]аминофенилсульфонамида (XL765).
et al
et al
et al
Также могут применяться лекарственные средства, которые ингибируют как кальцийзависимую фосфатазу кальцинейрин (циклоспорин и FK506), так и киназу p70S6, которая является важной для передачи сигнала, индуцированной фактором роста (рапамицин). (Liu ., Cell 66:807-815, 1991; Henderson ., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer ., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). В дополнительном аспекте композиции на основе клеток по настоящему изобретению можно вводить пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, Т-клеточной абляционной терапией с помощью химиотерапевтических средств, таких как флударабин, наружной дистанционной лучевой терапией (XRT), циклофосфамидом и/или антителами, такими как OKT3 или CAMPATH. В одном аспекте композиции на основе клеток по настоящему изобретению вводят после B-клеточной абляционной терапии, такой как средства, которые вступают в реакцию с CD20, например ритуксан. Например, в некоторых вариантах осуществления субъекты могут подвергаться стандартному лечению посредством высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В определенных вариантах осуществления после трансплантата субъекты получают инфузию размноженных иммунных клеток по настоящему изобретению. В дополнительном варианте осуществления размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с бисфосфонатом, например, памидронатом (Aredia); золедроновой кислотой или золедронатом (Zometa, Zomera, Aclasta или Reclast); алендронатом (Fosamax); ризедронатом (Actonel); ибадронатом (Boniva); клондронатом (Bonefos); этидронатом (Didronel); тилудронатом (Skelid); памидронатом (Aredia); неридронатом (Nerixia); ранелатом стронция (Protelos или Protos); и терипаратидом (Forteo).
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с кортикостероидом, например, дексаметазоном (например, Decadron), беклометазоном (например, Beclovent), гидрокортизоном (также известным как кортизон, гидрокортизона сукцинат натрия, гидрокортизона фосфат натрия и продаваемый под торговыми марками Ala-Cort, гидрокортизонфосфат, Solu-Cortef, Hydrocort Acetate и Lanacort), преднизолоном (продаваемым под торговыми марками Delta-Cortel, Orapred, Pediapred и Prelone), преднизоном (продаваемым под торговыми марками Deltasone, Liquid Red, Meticorten и Orasone), метилпреднизолоном (также известным как 6-метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолона натрий сукцинат, продаваемый под торговыми марками Duralone, Medralone, Medrol, M-Prednisol и Solu-Medrol); антигистаминными средствами, такими как дифенгидрамин (например, Benadryl), гидроксизин и ципрогептадин; и бронходилататорами, такими как агонисты бета-адренергического рецептора, альбутерол (например, Proventil) и тербуталин (Brethine).
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с иммуномодулятором, например, афутузумабом (доступным от Roche); пегфилграстимом (Neulasta); леналидомидом (CC-5013, Revlimid); талидомидом (Thalomid), актимидом (CC4047); и IRX-2 (смесь цитокинов человека, содержащую интерлейкин-1, интерлейкин-2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступную от IRX Therapeutics).
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с ингибитором протеасом, например,бортезомибом (Velcade); цитратом иксазомиба (MLN9708, CAS 1201902-80-8); данопревиром (RG7227, CAS 850876-88-9); иксазомибом (MLN2238, CAS 1072833-77-2); и (S)-N-[(фенилметокси)карбонил]-L-лейцил-N-(1-формил-3-метилбутил)- L-лейцинамидом (MG-132, CAS 133407-82-6).
S
R
H
f
N
c
H
d
N
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с рецептором фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), например, бевацизумабом (Avastin), акситинибом (Inlyta); бриваниба аланинатом (BMS-582664, ()-(()-1-(4-(4-фтор-2-метил-1-индол-5-илокси)-5-метилпирроло[2,1-][1,2,4]триазин-6-илокси)пропан-2-ил)2-аминопропаноатом); сорафенибом (Nexavar); пазопанибом (Votrient); сунитиниба малатом (Sutent); цедиранибом (AZD2171, CAS 288383-20-1); варгатефом (BIBF1120, CAS 928326-83-4); форетинибом (GSK1363089); телатинибом (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); апатинибом (YN968D1, CAS 811803-05-1); иматинибом (Gleevec); понатинибом (AP24534, CAS 943319-70-8); тивозанибом (AV951, CAS 475108-18-0); регорафенибом (BAY73-4506, CAS 755037-03-7); ваталаниба дигидрохлоридом (PTK787, CAS 212141-51-0); бриванибом (BMS-540215, CAS 649735-46-6); вандетанибом (Caprelsa или AZD6474); дифосфатом мотесаниба (AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-дигидро-3,3-диметил-1H-индол-6-ил)-2-[(4-пиридинилметил)амино]-3-пиридинкарбоксамидом, описанным в публикации согласно РСТ № WO 02/066470); довитинибом в форме дилактата (TKI258, CAS 852433-84-2); линфанибом (ABT869, CAS 796967-16-3); кабозантинибом (XL184, CAS 849217-68-1); лестауртинибом (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-диметилэтил)-2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-амино-1-((4-((3-метоксифенил)амино)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5-ил)метил)пиперидин-3-олом (BMS690514); -(3,4-дихлор-2-фторфенил)-6-метокси-7-[[(3aα,5β,6aα)-октагидро-2-метилциклопента[]пиррол-5-ил]метокси]- 4-хиназолинамином (XL647, CAS 781613-23-8); 4-метил-3-[[1-метил-6-(3-пиридинил)-1-пиразолo[3,4-]пиримидин-4-ил]амино]--[3-(трифторметил)фенил]-бензамидом (BHG712, CAS 940310-85-0); и афлиберцепт (Eylea).
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с антителом к CD20 или его конъюгатом, например,ритуксимабом (Riuxan и MabThera); и тозитумомабом (Bexxar); и офатумумабом (Arzerra), ибритумомабом тиуксетаном (Zevalin); и тозитумомабом.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с антиконвульсивным средством, например, антиконвульсивными средствами (противоэпилептическими или противосудорожными лекарственными средствами): альдегидами, например, паральдегидом; ароматическими аллиловыми спиртами, например, стирипентолом (Diacomit); барбитуратами, например, фенобарбитал (Luminal), метилфенобарбиталом (Mebaral), барбексаклоном (Maliasin), бензодиазепинами, например, клобазамом (Onfi), клоназепамом (Klonopin), клоразепатом (Tranxene и Novo-Clopate), диазепамом (Valium, Lembrol, Diastat), мидазоламом (Versed), лоразепамом (Ativan и Orfidal), нитразепамом (Alodorm, Arem, Insoma), темазепам (restoril, Normison), ниметзепамом (Erimin), бромидами, например, бромидом калия; карбаматами, например, фелбаматом (Felbatol); карбоксамидами, например, карбамазепином (Tegretol, Equetro), окскарбазепином (Trileptal, Oxcarb), ацетатом эсликарбазепина (Aptiom); жирными кислотами, например, вальпроатами (вальпроевой кислотой, вальпроатом натрия, дивалпроексом натрия), вигабатрином (Sabril), прогабидом (Gabren), тиагабином (Gabitril); производными фруктозы, например, топираматом (Topamax); GABA аналоги, например, gabapentin (Neurontin), прегабалином (Lyrica); гидантоинами, например, этотоином (Peganone), фенитоином (Dilantin), мефенитоином (Mesantoin), фосфенитоином (Cerebyx, Prodilantin); оксазолидиндионами, например, параметадионом (Paradione), триметадионом (Tridione); пропионатами, например, бекламидом (Choracon, Hibicon, Posedrine); пиримидиндионами, например, пиримидоном (Mysoline); пирролидинами, например, бриварацетамом, левитирацетамом, селектрацетамом (Keppra); сукцинимидами, например, этосуксимидом (Zarontin), фенсуксимидом (Milontin), месуксимидом (Celontin, Petinutin); сульфонамидами, например, ацетазоламидом (Diamox), сультиамом (Ospolot), метазоламидом (Neptazane), зонисамидом (Zonegran); триазинами, например, ламотриджином (Lamictal); мочевинами, например, фенетуридом, фенацемидом (Phenurone); валпромидами (амидными производными вальпроата), например, валпромидом (Depamide), валноктамидом; антагонистом рецептора AMPA, например, перампанелом (Fycompa).
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят субъекту в комбинации с ингибитором индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO). IDO представляет собой фермент, который катализирует разрушение аминокислоты L-триптофан до кинуренина. IDO сверхэкспрессируется при многих видах рака, например, при раке предстательной железы, колоректальном раке, раке поджелудочной железы, раке шейки матки, раке желудка, раке яичников, раке головы и раке легкого. pDC, макрофаги и дендритные клетки (DC) могут экспрессировать IDO. Без ограничения какой-либо теорией считается, что снижение уровня L-трипрофана (например, катализируемое IDO) приводит к возникновению иммуносупрессивного окружения в результате индуцирования анергии и апоптоза Т-клеток. Таким образом, без ограничения какой-либо теорией, считается, что ингибитор IDO может усиливать эффективность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в данном документе, например, посредством снижения подавления или гибели CAR-экспрессирующей иммунной клетки. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется солидная опухоль, например, солидная опухоль, описанная в данном документе, например, рак предстательной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак желудка, рак яичников, рак головы или рак легкого. Иллюстративные ингибиторы IDO включают без ограничения 1-метилтриптофан, индоксимод (NewLink Genetics) (см., например, клиническое исследование с идентификационными №№ NCT01191216; NCT01792050) и INCB024360 (Incyte Corp.) (см., например, клинические испытания с идентификационными №№ NCT01604889; NCT01685255).
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с модулятором супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). При многих солидных опухолях MDSC накапливаются на периферии и в месте локализации опухоли. Эти клетки подавляют Т-клеточные ответы, за счет чего затормаживается эффективность терапии с помощью клеток, экспрессирующих CAR. Без ограничения какой-либо теорией считается, что введение модулятора MDSC усиливает эффективность клетки, экспрессирующей CAR, описанной в данном документе. В варианте осуществления у субъекта имеется солидная опухоль, например, солидная опухоль, описанная в данном документе, например, глиобластома. Иллюстративные модуляторы MDSC включают без ограничения MCS110 и BLZ945. MCS110 представляет собой моноклональное антитело (mAb) к макрофагальному колониестимулирующему фактору (M-CSF). См., например, клиническое испытание с идентификационным номером NCT00757757. BLZ945 представляет собой низкомолекулярный ингибитор рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R). См., например, Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72. Структура BLZ945 показана ниже.
8
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с CART-клеткой, нацеливающейся на CD19 (например, CTL019, например, как описано в WO2012/079000, включенной в данный документ посредством ссылки). В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется острый миелоидный лейкоз (AML), например, CD19-положительный AML или CD19-отрицательный AML. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется CD19+ лимфома, например, CD19+ неходжкинская лимфома (NHL), CD19+ FL или CD19+ DLBCL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется рецидивирующая или резистентная CD19+ лимфома. В ряде вариантов осуществления средство противолимфомной химиотерапии вводят субъекту до введения (например, инфузии) CAR-T-клетки, нацеливающейся на CD19, одновременно с ним или после него. В примере средство противолимфомной химиотерапии вводят субъекту до введения CAR-T-клетки, нацеливающейся на CD19. Например, противолимфомная химиотерапия заканчивается за 1-4 дня (например, 1, 2, 3 или 4 дня) до инфузии CART-клетки, нацеливающейся на CD19. В ряде вариантов осуществления несколько доз CAR-T-клеток, нацеливающихся на CD19 вводят, например, как описано в данном документе. Например, однократная доза содержит приблизительно 5×10 CART-клеток, нацеливающихся на CD19. В ряде вариантов осуществления средство противолимфомной химиотерапии вводят субъекту до введения (например, инфузии) CAR-экспрессирующей клетки, описанной в данном документе, например, CAR-экспрессирующей клетки, не нацеливающейся на CD19, одновременно с ним или после него. В ряде вариантов осуществления CAR-T, нацеливающуюся на CD19, вводят субъекту до введения (например, инфузии), CAR-экспрессирующей клетки, не нацеливающейся на CD19, например, CAR-экспрессирующей клетки, не нацеливающейся на CD19, описанной в данном документе, одновременно с ней или после нее.
В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с клеткой, экспрессирующей CAR для CD19, например, CTL019, например, как описано в WO2012/079000, включенную в данный документ посредством ссылки, для лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией BCMA, например, рака, описанного в данном документе. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что введение клетки CD19, экспрессирующей CAR, в комбинации с клеткой, экспрессирующей CAR, улучшает эффективность описанной в данном документе клетки, экспрессирующей CAR путем целенаправленного воздействия на раковые клетки на ранней стадии дифференцировки, например, раковые стволовые клетки, за счет модулирования иммунного ответа, истощения регуляторных B-клеток и/или улучшения микроокружения опухоли. Например, клетка CD19, экспрессирующая CAR, нацеливающаяся на раковые клетки, которые экспрессируют маркеры на ранней стадии дифференцировки, например, раковые стволовые клетки и клетки, экспрессирующие CD19, при этом описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, нацеливается на раковые клетки, которые экспрессируют маркеры на поздней стадии дифференцировки, например, BCMA. Этот подход предварительного кондиционирования может повысить эффективность клетки, экспрессирующей CAR, описанной в данном документе. В таких вариантах осуществления, клетку CD19, экспрессирующую CAR, вводят до, одновременно или после введения (например, инфузии) описанной в данном документе клетки, экспрессирующей CAR.
В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, также экспрессирует CAR, нацеливающийся на CD19, например, CAR для CD19. В одном варианте осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанный в данном документе, и CAR для CD19 вводят субъекту для лечения рака, описанного в данном документе, например, AML. В одном варианте осуществления конфигурации одной или обеих молекул CAR содержат первичный внутриклеточный сигнальный домен и костимулирующий сигнальный домен. В другом варианте осуществления конфигурации одной или обеих молекул CAR содержат первичный внутриклеточный сигнальный домен и два или более, например, 2, 3, 4 или 5 или более, костимулирующих сигнальных домена. В таких вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, и CAR для CD19 может иметь такой же или другой первичный внутриклеточный сигнальный домен, такой же или другой костимулирующие сигнальные домены или такое же количество или другое количество костимулирующих сигнальных доменов. В качестве альтернативы, CAR, описанный в данном документе, и CAR для CD19 представлены в конфигурации в виде разделенного CAR, в котором одна из молекул CAR содержит антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 4-1BB), в то время как другая молекула CAR содержит антигенсвязывающий домен и первичный внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета).
В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующую клетку, описанную в данном документе, вводят субъекту в комбинации с полипептидом, представляющим собой интерлейкин-15 (IL-15), полипептидом, представляющим собой альфа-рецептор интерлейкина-15 (IL-15Ra), или комбинацией как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 представляет собой гетеродимерный связанный нековалентными связями комплекс IL-15 и IL-15Ra. hetIL-15 описан, например, в U.S. 8124084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413 и U.S. 2011/0081311, включенных в данный документ посредством ссылки. В ряде вариантов осуществления het-IL-15 вводят подкожно. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется рак, например, солидный рак, например, меланома или рак толстой кишки. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется метастатический рак.
В некоторых вариантах осуществления субъекту можно вводить средство, которое ослабляет или уменьшает тяжесть побочного эффекта, ассоциированного с введением клетки, экспрессирующей CAR. Побочные эффекты, ассоциированные с введением CAR-экспрессирующей клетки, включают без ограничения CRS и гематологический лимфогистиоцитоз (HLH), также называемый синдромом активации макрофагов (MAS). Симптомы CRS включают высокую температуру, тошноту, преходящую гипотензию, гипоксию и т. п. CRS может включать клинические системные признаки и симптомы, такие как лихорадка, усталость, анорексия, виды миалгии, виды артралгии, тошнота, рвота и головная боль. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны кожи, такие как сыпь. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта такие как тошнота, рвота и диарея. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны дыхательной системы, такие как тахипноэ и гипоксемия. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны сердечно-сосудистой системы, такие как тахикардия, "расширенное" пульсовое давление, гипотензия, повышенный сердечный выброс (ранний) и потенциально сниженный сердечный выброс (поздний). CRS может включать признаки и симптомы клинического свертывания крови, такие как повышенное содержание d-димера, гипофибриногенемия с кровотечением и без такового. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны почек, такие как азотемия. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны печени, такие как трансаминит и гипербилирубинемия. CRS может включать клинические признаки и симптомы со стороны нервной системы, такие как головная боль, изменения психического состояния, спутанность, делирий, затруднения с подбором слов или явная афазия, галлюцинации, тремор, дисметрия, нарушение походки и судороги.
Соответственно, способы, описанные в данном документе, могут предусматривать введение описанной в данном документе клетки, экспрессирующей CAR, субъекту и дополнительное введение одного или нескольких средств для контроля повышенных уровней растворимого фактора, образующегося в результате лечения с помощью клетки, экспрессирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления растворимый фактор, уровень которого повышен у субъекта, представляет собой одно или несколько из IFN-γ, TNFα, IL-2 и IL-6. В одном варианте осуществления повышенный фактор у субъекта представляет собой одно или несколько из IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 и фракталкина. Следовательно, средство, вводимое для лечения этого побочного эффекта, может представлять собой средство, которое нейтрализует один или несколько из этих растворимых факторов. В некоторых вариантах осуществления средство, которое нейтрализует одну или несколько из этих растворимых форм, представляет собой антитело или фрагмент антитела. Примеры таких средств включают без ограничения стероид (например, кортикостероид), ингибитор TNFα и ингибитор IL-6. Примером ингибитора TNFα является молекула антитела к TNFα, такая как инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол и голимумаб. Другим примером ингибитора TNFα является слитый белок, такой как этанерцепт. Низкомолекулярные ингибиторы TNFα включают без ограничения производные ксантина (например, пентоксифиллин) и бупропион. Примером ингибитора IL-6 является молекула антитела к IL-6, такая как тоцилизумаб (toc), сарилумаб, элсилимомаб, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 и FM101. В некоторых вариантах осуществления молекула антитела к IL-6 представляет собой тоцилизумаб. Примером ингибитора на основе IL-1R является анакинра.
В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят кортикостероид, такой как, например, метилпреднизолон, гидрокортизон, среди прочего.
В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят сосудосуживающее средство, такое как, например, норэпинефрин, дофамин, фенилэфрин, эпинефрин, вазопрессин или их комбинацию.
В одном варианте осуществления субъекту могут вводить жаропонижающее средство. В одном варианте осуществления субъекту могут вводить аналгезирующее средство.
В некоторых вариантах осуществления субъекту можно вводить средство, которое предотвращает миграцию клетки, экспрессирующей CAR для BCMA, в головной мозг, например, натализумаб (TYSABRI). Экспрессия BCMA, например его сплайс-варианта, была обнаружена в некоторых частях мозга, например, в мозжечке или продолговатом мозге. Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, предотвращение миграции клетой, экспрессирующих CAR для BCMA, в головной мозг является предпочтительным для предотвращения взаимодействия любых клеток, экспрессирующих CAR для BCMA, с тканью мозга, экспрессирующей BCMA или воздействия на нее.
В некоторых вариантах осуществления субъекту можно вводить средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, например, средство представляет собой ингибитор контрольной точки. Ингибирующие молекулы, например, белок запрограммированной смерти 1 (PD-1), в некоторых вариантах осуществления могут снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, вызывать иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета. Ингибирование ингибирующей молекулы, например, путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать функциональные характеристики клетки, экспрессирующей CAR. В ряде вариантов осуществления для подавления экспрессии ингибирующей молекулы в клетке, экспрессирующей CAR, можно применять ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, dsRNA, например, siRNA или shRNA, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с "цинковыми пальцами" (ZFN), например, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления ингибитор представляет собой shRNA. В одном варианте осуществления ингибирующая молекула ингибируется в клетке, экспрессирующей CAR. В этих вариантах осуществления молекула dsRNA, ингибирующая экспрессию молекулы, связана с нуклеиновой кислотой, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR. В ряде вариантов осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR вводят в комбинации с ингибитором ингибирующей молекулы, например, в комбинации с ингибитором контрольной точки, например, в комбинации с ингибитором PD1 и/или PD-L1. В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе вводят в комбинации с ингибитором PD1. В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, вводят в комбинации с ингибитором PD-L1.
G
,
Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA
R, et al
2) Science
M, et al
2) Nat. Biotechnol
В варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, функционально связана с промотором, например, промотором, полученным из H1 или U6, таким образом, что молекула dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, экспрессируется, например, в клетке, экспрессирующей CAR. См., например, Tiscornia."Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA," Chapter 3, в  (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp T. (200 296: 550-553; Miyagishi . (200. 19: 497-500. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, присутствует в том же векторе, например, лентивирусном векторе, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует компонент, например, все компоненты CAR. В таком варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, расположена в векторе, например, лентивирусном векторе, в направлении 5' или 3' по отношению к нуклеиновой кислоте, которая кодирует компонент, например, все компоненты CAR. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, может быть транскрибирована в том же или другом направлении, что и нуклеиновая кислота, которая кодирует компонент, например, все компоненты CAR. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, присутствует в отличном векторе, чем вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует компонент, например, все компоненты CAR В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует Т-клеточную функцию, временно экспрессируется в клетке, экспрессирующей CAR. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу dsRNA, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует Т-клеточную функцию, стабильно интегрируется в геном клетки, экспрессирующей CAR.
Ниже представлены примеры молекул dsRNA, применямых для ингибирования экспрессии молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, T-клеточную функцию, где молекула, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует T-клеточную функцию, представляет собой PD-1.
В некоторых вариантах осуществления ингибитором ингибирующего сигнала может быть, например, антитело или фрагмент антителакоторые связываются с ингибирующей молекулой. Например, средство может представлять собой антитело или фрагмент антитела которые связываются с PD1, PD-L1, PD-L2 или CTLA4 (например, ипилимумаб (также называемый MDX-010 и MDX-101 и представленный на рынке как Yervoy; Bristol-Myers Squibb; тремелимумаб (моноклональное антитело IgG2, доступное от Pfizer, ранее известное как тицилимумаб, CP-675,206). В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело или фрагмент антитела, которые связываются с TIM3. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с LAG3. В ряде вариантов осуществления средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, например, ингибитор ингибирующей молекулы, вводят в комбинации с алогенным CAR, например, аллогенным CAR, описанным в данном документе (например, описанным в разделе "Аллогенный CAR" в данном документе).
PD-1 является ингибирующим представителем семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Было показано, что два лиганда PD1, PD-L1 и PD-L2, подавляют активацию Т-клеток при связывании с PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 является широко распространенным при различных формах рака у человека (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Подавление иммунитета можно устранить путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1. Антитела, фрагменты антител и другие ингибиторы PD-1, PD-L1 и PD-L2 известны из уровня техники и могут применяться в комбинации с CAR по настоящему изобретению, описанными в данном документе. Например, ниволумаб (также называемый BMS-936558 или MDX1106; Bristol-Myers Squibb) представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело IgG4, которое специфически блокирует PD-1. Ниволумаб (клон 5C4) и другие человеческие моноклональные антитела, которые специфично связываются с PD1, раскрыты в US 8008449 и WO2006/121168. Пидилизумаб (CT-011; Cure Tech) представляет собой моноклональное гуманизированное антитело к IgG1k, которое связывается с PD-1. Пидилизумаб и другие гуманизированные моноклональные антитела к PD-1 раскрыты в WO2009/101611. Пембролизумаб (ранее известный как ламбролизумаб и также называемый MK03475; Merck) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4, которое связывается с PD1. Пембролизумаб и другие гуманизированные антитела к PD-1 раскрыты в US 8354509 и WO2009/114335. MEDI4736 (Medimmune) представляет собой моноклональное антитело человека, которое связывается с PDL1 и ингибирует взаимодействие лиганда с PD1. MDPL3280A (Genentech/Roche) представляет собой человеческое Fc-оптимизированное моноклональное антитело IgG1, которое связывается с PD-L1. MDPL3280A и другие моноклональные антитела к PD-L1 человека раскрыты в патенте США № 7943743 и публикации заявки на патент США № 20120039906. Другие средства, связывающиеся с PD-L1, включают YW243.55.S70 (вариабельные области тяжелой и легкой цепей показаны под SEQ ID NO 20 и 21 в WO2010/077634) и MDX-1 105 (также обозначаемое как BMS-936559, и, например, средства, связывающиеся с PD-L1, раскрытые в WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; например, раскрытый в WO2010/027827 и WO2011/066342) представляет собой растворимый рецептор на основе продукта слияния PD-L2 и Fc, который блокирует взаимодействие между PD-1 и B7-H1. Другие антитела к PD1 включают AMP 514 (Amplimmune), среди прочих, например, антитела к PD1, описанные в US 8609089, US 2010028330 и/или US 20120114649.
TIM-3 (T-клеточный иммуноглобулин 3) также осуществляет отрицательную регуляцию Т-клеточной функции, в частности, в секретирующих IFN-g CD4+ T-хелперных 1 и CD8+ T-цитотоксических 1 клетках, и играет основную роль в истощении T-клеток. Ингибирование взаимодействия между TIM3 и его лигандами, например, галектином-9 (Gal9), фосфатидилсерином (PS) и HMGB1, может повышать иммунный ответ. Антитела, фрагменты антител и другие ингибиторы TIM3 и их лиганды доступны из уровня техники и могут применяться в комбинации с CAR для CD19 или CAR для BCMA, описанными в данном документе. Например, антитела, фрагменты антител, малые молекулы или пептидные ингибиторы, которые нацеливаются на TIM3, связываются с доменом IgV TIM3 для ингибирования взаимодействия с его лигандами. Антитела и пептиды, которые ингибируют TIM3, раскрыты в WO2013/006490 и US20100247521. Другие антитела к TIM3 включают гуманизированные варианты RMT3-23 (раскрытые в Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551) и клон 8B.2C12 (раскрытый в Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). Биспецифические антитела, которые ингибируют TIM3 и PD-1, раскрыты в US20130156774.
например
например,
например
например
PLoS One
например
В некоторых вариантах осуществления средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, представляет собой ингибитор CEACAM (, ингибитор CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5). В одном варианте осуществления ингибитор CEACAM представляет собой молекулу антитела к CEACAM. Иллюстративный антитела к CEACAM-1 описаны в WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 и WO 2014/022332,  моноклональное антитело 34B1, 26H7 и 5F4; или их рекомбинантные формы, описанные, , в US 2004/0047858, US 7132255 и WO 99/052552. В других вариантах осуществления антитело к CEACAM связывается с CEACAM-5, как описано, , в Zheng et al. . 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146) или перекрестно реагирует с CEACAM-1 и CEACAM-5, как описано, , в WO 2013/054331 и US 2014/0271618.
см.
например
et al
J Immunol
J Immunol
Immunology
Cancer Immunol Immunother
Mol Cancer Ther
J Immunol
PLoS One
см. например
et al
Nature
см. например
et al
выше
например
Без ограничения какой-либо теорией считается, что молекулы клеточной адгезии, относящиеся к раково-эмбриональному антигену (CEACAM), такие как CEACAM-1 и CEACAM-5, опосредуют, по меньшей мере частично, ингибирование противоопухолевого иммунного ответа (, Markel . . 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. . 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. . 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. . 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. . 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. . 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. . 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529). Например, CEACAM-1 была описана в качестве гетерофильного лиганда TIM-3, а также она играет роль в опосредованной TIM-3 T-клеточной толерантности и истощении (, WO 2014/022332; Huang, . (2014)  doi:10.1038/nature13848). В ряде вариантов осуществления было показано, что совместное блокирование CEACAM-1 и TIM-3 усиливает противоопухолевый иммунный ответ в моделях трансплантата колоректального рака (, WO 2014/022332; Huang, . (2014), ). В других вариантах осуществления совместное блокирование CEACAM-1 и PD-1 снижает T-клеточную толерантность, как описано, , в WO 2014/059251. Таким образом, ингибиторы CEACAM можно применять с другими иммуномодуляторами, описанными в данном документе (например, ингибиторами PD-1 и/или TIM-3), для усиления иммунного ответа против рака, например, меланомы, рака легкого (например, NSCLC), рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака яичников и других видов рака, описанных в данном документе.
LAG3 (ген активации лимфоцитов 3 или CD223) представляет собой молекулу поверхности клетки, экспрессируемую на активированных T-клетках и B-клетках, которая, как было показано, играет роль в истощении CD8+ T-клеток. Антитела, фрагменты антител и другие ингибиторы LAG3 и его лигандов, доступны из уровня техники и могут применяться в комбинации с CAR для CD19 или CAR для BCMA, описанными в данном документе. Например, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) представляет собой моноклональное антитело, которое нацеливается на LAG3. IMP701 (Immutep) представляет собой антагонистическое антитело к LAG3, а IMP731 (Immutep и GlaxoSmithKline) представляет собой истощающее антитело к LAG3. Другие ингибиторы LAG3 включают IMP321 (Immutep), который представляет собой рекомбинантный слитый белок растворимой части LAG3 и Ig, который связывается с молекулами MHC класса II и активирует антигенпрезентирующие клетки (APC). Другие антитела раскрыты, например, в WO2010/019570.
В некоторых вариантах осуществления средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, может представлять собой, например, слитый белок, содержащий первый домен и второй домен, при этом первый домен представляет собой ингибирующую молекулу или ее фрагмент, а второй домен представляет собой полипептид, который ассоциирован с положительным сигналом, например, полипептидом, содержащим внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления полипептид, который ассоциирован с положительным сигналом, может содержать костимулирующий домен CD28, CD27, ICOS, например, внутриклеточный сигнальный домен CD28, CD27 и/или ICOS, и/или первичный сигнальный домен, например, CD3-дзета, например, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления слитый белок экспрессируется той же клеткой, которая экспрессирует CAR. В другом варианте осуществления слитый белок экспрессируется клеткой, например, например T-клеткой или NK-клеткой, которые не экспрессируют CAR для BCMA.
В некоторых вариантах осуществления средство, которое усиливает активность описанной в данном документе клетки, экспрессирующую CAR представляет собой miR-17-92.
В некоторых вариантах осуществления средство, которое усиливает активность CAR, описанного в данном документе, представляет собой цитокин. Цитокины обладают важными функциями, связанными с размножением, дифференцировкой, выживанием и гомеостазом T-клеток. Цитокины, которые можно вводить субъекту, получающему клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, включают IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 и IL-21 или их комбинацию. В предпочтительных вариантах осуществления вводимым цитокином является IL-7, IL-15 или IL-21 или их комбинация. Цитокин можно вводить один раз в день или более одного раза в день, например, два раза в день, три раза в день или четыре раза в день. Цитокин можно вводить в течение более одного дня, например, цитокин вводят в течение 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель. Например, цитокин вводят один раз в день в течение 7 дней.
В ряде вариантов осуществления цитокин вводят в комбинации с T-клетками, экспрессирующими CAR. Цитокин можно вводить одновременно или параллельно с T-клетками, экспрессирующими CAR, например, вводимыми в один и тот же день. Цитокин может быть получен в той же фармацевтической композиции, что и T-клетки, экспрессирующие CAR, или может быть получен в отдельной фармацевтической композиции. В качестве альтернативы цитокин можно вводить вскоре после введения T-клеток, экспрессирующих CAR, например, через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней после введения T-клеток, экспрессирующих CAR. В вариантах осуществления, в которых цитокин вводят в схеме дозирования, которая выполняется в течение более одного дня, первый день схемы дозирования цитокина может приходиться на тот же день, что и введение T-клеток, экспрессирующих CAR, или первый день схемы дозирования цитокина может быть через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней после введения T-клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления в первый день субъекту вводят T-клетки, экспрессирующие CAR, а со второго дня вводят цитокин один раз в день в течение следующих 7 дней. В предпочтительном варианте осуществления цитокин, подлежащий введению в комбинации с T-клетками, экспрессирующими CAR, представляет собой IL-7, IL-15 или IL-21.
В других вариантах осуществления цитокин вводят через некоторый период времени после введения клеток, экспрессирующих CAR, например, через по меньшей мере 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 10 недель, 12 недель, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или 1 год или больше после введения клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления цитокин вводят после оценки ответа субъекта на клетки, экспрессирующие CAR. Например, субъекту вводят клетки, экспрессирующие CAR, в соответствии с дозировкой и схемами, описанными в данном документе. Ответ субъекта на терапию с помощью клеток, экспрессирующих CAR, оценивают через 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 10 недель, 12 недель, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или 1 год или больше после введения клеток, экспрессирующих CAR, с применением любого из способов, описанных в данном документе, в том числе ингибирования роста опухоли, снижения циркулирующих опухолевых клеток или регрессии опухоли. Субъектам, у которых не проявляется достаточный ответ на терапию с помощью клетки, экспрессирующей CAR, можно вводить цитокин. Введение цитокина субъекту с недостаточно оптимальным ответом на терапию с помощью клеток, экспрессирующих CAR, эффективность клеток, экспрессирующих CAR или противораковую активность. В предпочтительном варианте вводимым цитокином после введения клеток, экспрессирующих CAR, является IL-7.
В некоторых вариантах осуществления T-клетки с CAR для ВСМА, описанные в данном документе можно использовать в комбинации с низкой повышающей иммунитет дозой ингибитора mTOR. В способах, описанных в данном документе, применяют низкие повышающие иммунитет дозы ингибиторов mTOR, дозы ингибиторов mTOR, например, аллостерических ингибиторов mTOR, включающих рапалоги, такие как RAD001. Введение низкой повышающей иммунитет дозы ингибитора mTOR (например, дозы, которая является недостаточной, чтобы полностью подавить иммунную систему, но достаточной для улучшения иммунной функции) может оптимизировать у субъекта функциональные характеристики иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или клеток, экспрессирующих CAR. Способы измерения ингибирования mTOR, дозировки, схемы лечения и подходящие фармацевтические композиции описаны в заявке на патент США № 2015/01240036, включенной в данный документ посредством ссылки. Для способов комбинирования T-клеток с CAR для BCMA с ингибитором mTOR см., например, абзацы [0826] - [0861] патента США 20160046724, включенного в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Способы и биомаркеры для оценивания эффективности CAR или пригодности образца
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценивания или мониторинга эффективности средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR (например, средства терапии на основе CAR для ВСМА), у субъекта (например, субъекта, у которого имеется рак, например, гематологический рак) или пригодности образца (например, образца, полученного путем афереза) для терапии с помощью CAR (например, терапии с помощью CAR для BCMA). Способ включает сбор данных о величине эффективности терапии с помощью CAR или пригодности образца, где указанная величина является показателем эффективности или пригодности средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR.
В ряде вариантов осуществления величина эффективности терапии с помощью CAR или пригодности образца, включает показатель одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или больше (всех) из следующего:
например
например
EFF
REG
(i) уровень или активность одного, двух, трех или более (, всех) из покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, молодых T-клеток (, молодых CD4-клеток или CD8-клеток или-гамма/дельта T-клеток) или ранних T-клеток памяти или их комбинации, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или образце изготовленного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);
например
например
EFF
REG
(ii) уровень или активность одного, двух, трех или более (, всех) из активированных T-клеток, активированных T-клеток, старых T-клеток (, старых CD4-клеток или CD8-клеток) или поздних T-клеток памяти или их комбинации, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или образце изготовленного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);
например
например
например
например
например
(iii) уровень или активность маркера истощения иммунных клеток, , одного, двух или более ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (например, PD-1, PD-L1, TIM-3 и/или LAG-3) в образце (например, образце, полученном путем афереза, или образце изготовленного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR). В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка имеет фенотип истощения, , совместно экспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, , совместно экспрессирует PD-1 и TIM-3. В других вариантах осуществления иммунная клетка имеет фенотип истощения, , совместно экспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, , совместно экспрессирует PD-1 и LAG-3;
(iv) уровень или активность CD27 и/или иммунных эффекторных клеток CD45RO- (например, CD27+CD45RO-), например, в популяции Т-клеток CD4+или CD8+в образце (например, образце, полученном путем афереза, или образце изготовленного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);
(v) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или более биомаркеров, выбранных из CCL20, IL-17a и/или IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM -3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1;
например
(vi) уровень или активность цитокинов (, качество репертуара цитокинов) в образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, например, в образце продукта на основе клетки, экспрессирующей BCMA; или
(vii) эффективность трансдукции клетки, экспрессирующей CAR, в образце полученного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, средство терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR, содержит множество (например, популяцию) иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих CAR, например, множество (например, популяцию) T-клеток или NK-клеток или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR, представляет собой средство терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR для BCMA.
В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов измерение одного или нескольких из (i) - (vii) получают из образца полученного путем афереза, взятого у субъекта. Образец афереза можно оценить перед инфузией или повторной инфузией.
В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в данном документе способов измерение одного или нескольких из (i) - (vii) получают из образца полученного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, например, образца продукта на основе клетки, экспрессирующей BCMA. Полученный продукт на основе клетки, экспрессирующей CAR, можно оценить перед инфузией или повторной инфузией.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, оценивание субъекта проводят до получения, во время или после получения средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR.
В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в данном документе способов измерение одного или нескольких из (i) - (vii) проводит оценивание профиля для одного или нескольких из следующего: экспрессия гена, проточная цитометрия или экспрессия белка.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, способ дополнительно включает идентификацию субъекта как отвечающего на лечение, не отвечающего на лечение, пациента с рецидивом или пациента без рецидива, на основе показателя одного или нескольких из (i) - (vii).
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, отвечающий на лечение (например, пациент с полным ответом), имеет или идентифицирован как имеющий более высокие уровень или активность одного, двух или более (всех) из GZMK, PPF1BP2 или "необученных" Т-клеток по сравнению с пациентом, не отвечающим на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокие уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или больше (например, всех) из IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, эффекторных T-клеток или регуляторных T-клеток по сравнению с пациентом, отвечающим на лечение.
В одном варианте осуществления пациент с рецидивом является пациентом, который имеет или идентифицирован как имеющий повышенный уровень экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4 или всех) из следующих генов по сравнению с пациентами без рецидива: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITM2C и HLA-DQB1 и/или сниженные уровни экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или всех) из следующих генов по сравнению с пациентами без рецидива: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1 и EIF1AY.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент с полным ответом на лечение имеет или идентифицирован как имеющий более высокое, например статистически значимое более высокое процентное количество CD8+Т-клеток по сравнению с контрольным значением, например, процентным количеством CD8+Т-клеток пациента, не отвечающего на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в настоящем документе, пациент с полным ответом имеет или идентифицирован как имеющий более высокое процентное количество иммунных эффекторных клеток CD27+CD45RO-, например, в популяции CD8 +, по сравнению с контрольным значением, например, количеством CD27+CD45RO иммунных эффекторных клеток пациента, не отвечающего на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент с полным ответом или пациент с частичным ответом имеет или идентифицирован как имеющий более высокое, например статистически значимое более высокое процентное количество CD4+Т-клеток по сравнению с эталонным значением, например, процентным количеством CD4+Т-клеток пациента, не отвечающего на лечение.
например
например
например
EFF
REG
EFF
REG
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент с полным ответом имеет или идентифицирован как имеющий, более высокое процентное количество одного, двух, трех или более (, всех) из покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, молодых T-клеток (, молодых CD4-клеток или CD8-клеток или гамма/дельта T-клеток) или ранних T-клеток памяти, или их комбинацию, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, молодых T-клеток (, молодых CD4-клеток или CD8-клеток) или ранних T-клеток памяти пациента, не отвечающего на лечение.
например
e.g
например
EFF
REG
EFF
REG
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение имеет или идентифицирован как имеющий, более высокое процентное количество одного, двух, трех или более (, всех) активированных T-клеток, активированных T-клеток, старых T-клеток (., старых CD4-клеток или CD8-клеток) или поздних T-клеток памяти, или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством активированных T-клеток, активированный T-клеток, старых T-клеток (, старых CD4-клеток или CD8-клеток) или поздних T-клеток памяти пациента, отвечающего на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокое процентное количество маркера истощения иммунных клеток, например,одного, двух или более ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (например, PD-1, PD-L1, TIM-3 и/или LAG-3). В некоторых вариантах осуществления пациент, не отвечающий на лечение имеет или идентифицирован как имеющий более высокое процентное количество иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих PD-1, PD-L1 или LAG-3 (например, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток) (например, CD4+ клеток и/или CD8+ T-клеток, экспрессирующих CAR) по сравнению с процентным количеством иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих PD-1 или LAG-3 от пациента, отвечающего на лечение.
например
например
В некоторых вариантах осуществления пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокое процентное количество иммунных клеток, имеющих фенотип истощения, , иммунных клеток, которые совместно экспрессируют по меньшей мере два маркера истощения, , совместно экспрессируют PD-1, PD-L1 и/или TIM-3. В других вариантах осуществления пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю иммунных клеток, имеющих фенотип истощения, например,иммунных клеток, которые совместно экспрессируют по меньшей мере два маркера истощения, например,совместно экспрессируют PD-1 и LAG-3.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю PD-1/PD-L1+/LAG-3+ клеток в популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, популяции BCMACAR+ клеток), по сравнению с пациентом, отвечающим на лечение (например, пациентом с полным ответом) средством терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент с частичным ответом на лечение имеет или идентифицирован как имеющий более высокие процентные доли PD-1/PD-L1+/LAG-3+ клеток в популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, популяции BCMACAR+ клеток), по сравнению с пациентом, отвечающим на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий PD1/PD-L1+ CAR+ клетки с фенотипом истощения и совместной экспрессией LAG3 в популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, популяции BCMACAR+ клеток).
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю PD-1/PD-L1+/TIM-3+ клеток в популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, популяции BCMACAR+ клеток), по сравнению с пациентом, отвечающим на лечение (например, пациентом с полным ответом).
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациенты с частичным ответом на лечение имеют или идентифицированы как имеющие более высокую процентную долю PD-1/PD-L1+/TIM-3+ клеток в популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, популяции BCMACAR+ клеток), по сравнению с пациентами, отвечающими на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, присутствие CD8+ CD27+ CD45RO- T-клеток в образце, полученном путем афереза, является положительным прогностическим фактором ответа субъекта на средство терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR (например, средство терапии с CAR для BCMA).
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, высокая процентная доля PD1+ CAR+ и LAG3+ или TIM3+ T-клеток в образце, полученном путем афереза, является неблагоприятным прогностическим фактором ответа субъекта на средство терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR (например, средство терапии с CAR для BCMA).
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, у пациента, отвечающего на лечение (например, пациента с полным или частичным ответом), имеется один, два, три или больше (или все) из следующих профилей:
(i) имеется большее количество CD27+ иммунных эффекторных клеток по сравнению с эталонной величиной, например, количеством CD27+ иммунных эффектoрных клеток у пациента, не отвечающего на лечение;
(ii) имеется меньшее количество CD8+ T-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, количеством CD8+ T-клеток у пациента, не отвечающего на лечение;
(iii) имеется меньшее количество иммунных клеток, экспрессирующих один или несколько ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, например, ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, выбранных из PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 или KLRG-1 или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, количеством иммунных клеток, экспрессирующих один или несколько ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, у пациента, не отвечающего на лечение; или
EFF
REG
EFF
REG
(iv) имеется более высокое количество одной, двух, трех, четырех или более (всех) из покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, "необученных" CD4+ клеток, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти или их комбинации по сравнению с эталонной величиной, например, количеством покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, "необученных" CD4+ клеток, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти у пациента, не отвечающего на лечение.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, уровень цитокинов или активность (vi) выбраны из одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или больше (или всех) из цитокинов CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFNγ, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 или TNFα или их комбинации. Цитокин может быть выбран из одного, двух, трех, четырех или больше (всех) из IL-17a, CCL20, IL2, IL6 или TNFa. В некоторых вариантах осуществления повышенные уровень или активность цитокина, выбранного из одного или обоих из IL-17a и CCL20, являются показателем повышенной восприимчивости или пониженного риска рецидива.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, эффективность трансдукции, составляющая 15% или выше в (vii) является показателем повышенной восприимчивости или пониженного риска рецидива.
В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, эффективность трансдукции, составляющая менее 15% в (vii) является показателем пониженной восприимчивости или повышенного риска рецидива.
В ряде вариантов осуществления пациент, отвечающий на лечение, пациент, не отвечающий на лечение, пациент с рецидивом или пациент без рецидива, идентифицированный с помощью способов, изложенных в данном документе, может быть подвергнут дополнительному оцениванию в соответствии с клиническими критериями. Например, пациент с полным ответом является субъектом или идентифицирован как субъект, у которого имеется заболевание, например, рак, у которого проявляется полный ответ на лечение, например, полная ремиссия. Полный ответ можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines или Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) и Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007) (оба из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), как описано в данном документе. Пациент с частичным ответом на лечение является субъектом или идентифицирован как субъект, у которого имеется заболевание, например, рак, у которого проявляется частичный ответ на лечение, например, частичная ремиссия. Частичный ответ можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines или критериев по Cheson, как описано в данном документе. Пациент, не отвечающий на лечение, является субъектом или идентифицирован как субъект, у которого имеется заболевание, например, рак, у которого не проявляется ответ на лечение, например, у пациента наблюдается стабилизация заболевания или прогрессирование заболевания. Пациента, не отвечающего на лечение, можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines или критериев по Cheson, как описано в данном документе.
В качестве альтернативы или в комбинации со способами, раскрытыми в данном документе, с учетом указанной величины осуществляется одно, два, три, четыре или больше из следующего:
введения, например, пациенту, отвечающему на лечение, или пациенту без рецидива, средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR;
введения измененных доз средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR;
изменения схемы или периода введения средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR;
введения, например, пациенту, не отвечающему на лечение, или пациенту с частичным ответом на лечение, дополнительного средства в комбинации со средством терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR, например, ингибитора контрольной точки иммунного ответа, например, ингибитора контрольной точки иммунного ответа, описанного в данном документе;
введения пациенту, не отвечающему на лечение, или пациенту с частичным ответом на лечение средства терапии, которое обеспечивает увеличение количества более молодых T-клеток у субъекта, перед проведением лечения с помощью средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR;
модификации способа изготовления средства терапии на основе клеток, экспрессирующих CAR, например, обогащения более молодыми T-клетками перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, или повышения эффективности трансдукции, например, у субъекта, идентифицированного как пациент, не отвечающий на лечение, или пациент с частичным ответом на лечение;
введения альтернативного средства терапии, например, пациенту, не отвечающему на лечение, или пациенту с частичным ответом на лечение, или пациенту с рецидивом; или,
REG
REG
в случае, если субъект является пациентом, не отвечающим на лечение, или пациентом с рецидивом или идентифицирован как такой пациент, уменьшения популяции T-клеток и/или уровня экспрессии генной сигнатуры T, например,посредством одного или нескольких из истощения по CD25, введения циклофосфамида, антитела к GITR или их комбинации.
В определенных вариантах осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью антитела к GITR. В определенном варианте осуществления субъект получает лечение с помощью антитела к GITR до инфузии или до повторной инфузии.
Способы доставки с помощью биополимеров
В некоторых вариантах осуществления одну или несколько клеток, экспрессирующих CAR, раскрытых в данном документе, можно вводить или доставлять субъекту посредством биополимерного каркаса, например, биополимерного имплантата. Биополимерные каркасы могут поддерживать или усиливать доставку, размножение и/или распространение клеток, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе. Биополимерный каркас содержит биосовместимый (например, который по существу не индуцирует воспалительный или иммунный ответ) и/или биоразлагаемый полимер, который может быть встречающимся в природе или синтетическим.
Примеры подходящих биополимеров включают без ограничения агар, агарозу, альгинат, альгинат/кальций-фосфатный цемент (CPC), бета-галактозидазу (β-GAL), (1,2,3,4,6-пентаацетил-a-D-галактозу), целлюлозу, хитин, хитозан, коллаген, эластин, желатин, комплекс коллагена и гиалуроновой кислоты, гидроксиапатит, сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата (PHBHHx), поли(лактид), поли(капролактон) (PCL), сополимер лактида и гликолида (PLG), полиэтиленоксид (PEO), сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA), полипропиленоксид (PPO), поливиниловый спирт (PVA), шелк, соевый белок и изолят соевого белка в отдельности или в комбинации с любой другой полимерной композицией в любой концентрации и в любом соотношении. Биополимер может быть дополнен или модифицирован молекулами, способствующими адгезии или миграции, например, пептидами, имитирующими коллаген, которые связываются с коллагеновым рецептором лимфоцитов, и/или стимулирующими молекулами для усиления доставки, размножения или функции, например, противораковой активности, клеток, которые подлежат доставке. Биополимерный каркас может быть инъецируемым, например, гелем или полутвердым веществом, или твердой композицией.
Nature Biotechnology
В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, высевают в биополимерный каркас перед доставкой субъекту. В ряде вариантов осуществления биополимерный каркас дополнительно содержит одно или несколько дополнительных терапевтических средств, описанных в данном документе (например, другую клетку, экспрессирующую CAR, антитело или малую молекулу), или средств, которые усиливают активность клетки, экспрессирующей CAR, например, встроенных в биополимеры каркаса или конъюгированных с ними. В ряде вариантов осуществления биополимерный каркас инъецируют, например, внутрь опухоли, или хирургическим путем имплантируют в опухоль или в непосредственной близости от опухоли так, чтобы это было достаточно для опосредования противоопухолевого эффекта. Дополнительные примеры биополимерных композиций и способов их доставки описаны в Stephan et al., , 2015, 33:97-101; и WO2014/110591.
Фармацевтические композиции и средства для лечения
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать клетку, экспрессирующую CAR, например, множество клеток, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный буферный солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор и т. п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатообразующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции по настоящему изобретению в одном аспекте составлены для внутривенного введения.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить с помощью способа, отвечающего требованиям к лечению (или предупреждению) заболевания. Количество и частота введения будут определяться такими факторами, как состояние пациента, а также тип и тяжесть заболевания пациента, хотя подходящие дозы могут быть определены с помощью клинических испытаний.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция практически не содержит загрязнителя, например, выбранного из группы, состоящей из эндотоксина, микоплазмы, репликационно-компетентного лентивируса (RCL), p24, нуклеиновой кислоты VSV-G, gag HIV, остаточных количеств микрогранул, покрытых антителами к CD3/антителами к CD28, антител мыши, смешанной человеческой сыворотки крови, бычьего сывороточного альбумина, бычьей сыворотки крови, компонентов культуральных сред, клеточных или плазмидных компонентов для упаковки векторов, бактерии и гриба, например, в ней отсутствуют его поддающиеся выявлению уровни. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой по меньшей мере бактерию, выбранную из группы, состоящей из Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes группы A.
4
9
5
6
В случае, если указано "иммунологически эффективное количество", "противоопухолевое эффективное количество", "количество, эффективное для ингибирования опухоли" или "терапевтическое количество", точное количество композиций по настоящему изобретению, подлежащих введению, может быть определено врачом с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, размере опухоли, степени инфицирования или метастазирования и состояния пациента (субъекта). В целом можно отметить, что фармацевтическую композицию, содержащую T-клетки, описанные в данном документе, можно вводить в дозе от 10 до 10 клеток/кг веса тела, в некоторых случаях от 10 до 10 клеток/кг веса тела, с включением всех целочисленных значений в пределах этих диапазонов. Композиции на основе Т-клеток можно также вводить несколько раз в этих дозах. Клетки можно вводить с помощью методик инфузии, которые являются общеизвестными в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).
В определенных аспектах может быть желательным вводить активированные T-клетки субъекту, а затем последовательно повторно брать кровь (или осуществлять аферез), активировать T-клетки из нее в соответствии с настоящим изобретением и проводить повторную инфузию данных активированных и размноженных T-клеток пациенту. Этот процесс можно осуществлять несколько раз каждые несколько недель. В определенных аспектах Т-клетки можно активировать из взятых образцов крови объемом от 10 куб. см до 400 куб. см. В определенных аспектах Т-клетки активируют из взятых образцов крови объемом 20 куб. см, 30 куб. см, 40 куб. см, 50 куб. см, 60 куб. см, 70 куб. см, 80 куб. см, 90 куб. см или 100 куб. см.
Введение рассматриваемых композиций можно осуществлять с помощью любого подходящего способа, в том числе аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, трансфузии, имплантации или трансплантации. Композиции, описанные в данном документе, можно вводить пациенту трансартериально, подкожно, внутрикожно, интратуморально, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, с помощью внутривенной (i.v.) инъекции или внутрибрюшинно. В одном аспекте композиции на основе T-клеток по настоящему изобретению вводят пациенту с помощью внутрикожной или подкожной инъекции. В одном аспекте композиции на основе клеток, экспрессирующих CAR (например, T-клеток или NK-клеток), по настоящему изобретению вводят посредством i.v. инъекции. Композиции на основе клеток, экспрессирующих CAR (например, T-клеток или NK-клеток), можно инъецировать непосредственно в опухоль, лимфатический узел или очаг инфекции.
В определенном иллюстративном аспекте субъекта можно подвергать лейкаферезу, при этом лейкоциты собирают, обогащают или истощают ex vivo для отбора и/или выделения клеток, представляющих интерес, например, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток). Такие изоляты иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) можно размножать с помощью способов, известных из уровня техники, и обрабатывать таким образом, чтобы можно было ввести одну или несколько конструкций CAR по настоящему изобретению, за счет чего обеспечивается создание клетки, экспрессирующей CAR (например, CAR-Т-клетки или NK-клетки, экспрессирующей CAR), по настоящему изобретению. Затем субъектов, нуждающихся в этом, можно подвергать стандартному лечению с помощью высокодозовой химиотерапии с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В определенных аспектах после трансплантации или параллельно с ней субъекты получают инфузию размноженных клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или CAR-NK-клеток), по настоящему изобретению. В дополнительном аспекте размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.
В ряде вариантов осуществления у субъекта осуществляют лимфодеплецию, например, перед введением одной или нескольких клеток, которые экспрессируют CAR, описанный в данном документе, например, CAR, связывающий ВСМА, описанный в данном документе. В вариантах осуществления лимфодеплеция предусматривает введение одного или нескольких из мелфалана, цитоксана, циклофосфамида и флударабина.
Доза вышеуказанных средств для лечения, подлежащих введению пациенту, будет варьироваться в зависимости от точной природы состояния, подлежащего лечению, и реципиента средства для лечения. Определение дозы для введения человеку можно осуществлять в соответствии с практикой, принятой в данной области техники. Доза CAMPATH, например, будет, как правило, находиться в диапазоне от 1 до приблизительно 100 мг для взрослого пациента, обычно при ежедневном введении в течение периода от 1 до 30 дней. Предпочтительная суточная доза составляет от 1 до 10 мг в день, хотя в некоторых случаях могут использоваться более высокие дозы, составляющие до 40 мг в день (описанные в патенте США № 6120766).
В одном варианте осуществления CAR вводят в иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки), например, с помощью транскрипции in vitro, и субъект (например, человек) получает начальное введение иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) по настоящему изобретению и одно или несколько последующих введений иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) по настоящему изобретению, где одно или несколько последующих введений осуществляют через менее чем 15 дней, например, через 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дня, после предыдущего введения. В одном варианте осуществления субъекту (например, человеку) осуществляют более одного введения иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) по настоящему изобретению в неделю, например, осуществляют 2, 3 или 4 введения иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) по настоящему изобретению в неделю. В некоторых вариантах осуществления субъект (например, субъект-человек) получает более одного введения иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) в неделю (например, 2, 3 или 4 введения в неделю) (что также называется в данном документе циклом) с последующим отсутствием введения иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) в течение недели, а затем субъекту осуществляют одно или несколько дополнительных введений иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) (например, более одного введения иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток) в неделю). В другом варианте осуществления субъект (например, субъект-человек) получает более одного цикла введения иммунных эффекторных клеток с CAR (например, T-клеток или NK-клеток), при этом период времени между каждыми двумя следующими друг за другом циклами составляет менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 дней. В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки с CAR (например, T-клетки или NK-клетки) вводят раз в два дня c 3 введениями в неделю. В некоторых вариантах осуществления CAR иммунные эффекторные клетки с CAR (например, T-клетки или NK-клетки) по настоящему изобретению вводят в течение по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или больше недель.
В одном аспекте клетки, экспрессирующие CAR для ВСМА (например, CAR-T-клетки для BCMA или NK-клетки, экспрессирующие CAR для ВСМА) получают с помощью лентивирусных вирусных векторов, таких как лентивирус. Клетки, экспрессирующие CAR (например, CAR-T-клетки или NK-клетки, экспрессирующие CAR), получают таким образом, что они будут характеризоваться стабильной экспрессией CAR.
В одном аспекте клетки, экспрессирующие CAR, например, CAR-T-клетки, получают с помощью вирусного вектора, такого как гамма-ретровирусный вектор, например, гамма-ретровирусный вектор, описанный в данном документе. CAR-T-клетки, полученные с помощью таких векторов, могут характеризоваться стабильной экспрессией CAR.
В одном аспекте клетки, экспрессирующие CAR (например, CAR-T-клетки или NK-клетки, экспрессирующие CAR), транзиентно экспрессируют векторы CAR в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней после трансдукции. Транзиентная экспрессия CAR может осуществляться благодаря доставке РНК CAR с помощью вектора. В одном аспекте РНК CAR вводят путем трансдукции в клетку, например, T-клетку или NK-клетку, с помощью электропорации.
Потенциальной проблемой, которая может возникать у пациентов, лечение которых осуществляют с помощью клеток, транзиентно экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR) (в частности, клеток, экспрессирующих CAR, несущий scFv мыши (например, CAR-T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR)), является анафилаксия после нескольких процедур лечения.
Не ограничиваясь данной теорией, полагают, что такая анафилактическая реакция может быть вызвана тем, что у пациента развивается гуморальный ответ на CAR, т. е. образуются антитела к CAR, имеющие изотип IgE. Считается, что в клетках пациента, продуцирующих антитела, происходит переключение класса с изотипа IgG (который не вызывает анафилаксии) на изотип IgE, если между воздействиями антигена существует перерыв продолжительностью от десяти до четырнадцати дней.
Если у пациента имеется высокий риск развития ответа с образованием антител к CAR в ходе курса терапии с помощью клеток с транзиентной экспрессией CAR (как, например, образующимися в результате трансдукций РНК), то перерывы между инфузиями клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), не должны продолжаться более десяти - четырнадцати дней.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение дополнительно подробно описано посредством ссылки на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры приведены лишь в целях иллюстрации и не предполагаются как ограничивающие, если не указано иное. Таким образом, настоящее изобретение никоим образом не следует истолковывать как ограниченное следующими примерами, а, наоборот, следует истолковывать как охватывающее все без исключения видоизменения, которые становятся очевидными как следствие идеи, приведенной в данном документе.
Без дополнительного описания предполагается, что специалист обычной квалификации в данной области техники может с использованием предыдущего описания и последующих иллюстративных примеров получать и применять соединения по настоящему изобретению и осуществлять на практике заявленные способы. Следующие демонстрационные примеры конкретно указывают на различные аспекты настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие каким-либо образом остальную часть настоящего раскрытия.
Пример 1. Характеристика in vitro CAR для BCMA человека
Набор полностью человеческих одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) клонировали в в лентивирусные векторы экспрессии CAR с CD3-дзета цепью и стимулирующими молекулами 4-1BB: R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-10, B61-02, Hy03 и Hy52. Первоначально конструкции подвергали скринингу с помощью автоматизированного анализа клеточных репортеров с последующим отбором оптимальных клонов на основе экспрессии на первичных Т-клетках, а также количества и качества эффекторных Т-клеточных ответов ("CAR-T для BCMA" или "CAR-T-клетки для BCMA") в ответ на экспрессирующие BCMA ("BCMA +" или "BCMA-положительные") мишени. Ответы эффекторных T-клеток включают без ограничения клеточное размножение, пролиферацию, удвоение, продуцирование цитокина и уничтожение целевых клеток или цитолитическую активность (дегрануляцию).
Создание лентивирусного CAR для BCMA
Все вышеуказанные кодирующие scFv лентивирусные векторы переноса использовали для получения геномного материала, упакованного в VSVg псевдотипированные лентивирусные частицы. ДНК лентивирусного вектора переноса, кодирующую CAR, смешивали с тремя компонентами упаковки VSVg, gag/pol и rev в комбинации с реагентом липофектамин для трансфекции клеток Lenti-X 293T (Clontech), с последующей заменой среды через 12-18 ч. Через 30 часов после замены среды среду собирали, фильтровали и хранили при -80°C.
JNL CAR для BCMA и скрининговый репортерный анализ с использованием клеток JNL с помощью автоматической системы
Для репортерного анализа лентивирус, кодирующий CAR для BCMA, создавали в клетках HEK293 при двух различных показателях плотности клеток (40000 клеток (1xH293) или 80000 клеток (2x H293)) в автоматизированном, мелкомасштабном режиме в 96-луночных планшетах, при этом содержащую вирус надосадочную жидкость собирали через 48 часов после трансфекции и использовали в свежем виде, без замораживания, для трансдукции линии репортерных Т-клеток Jurkat. Линия репортерных клеток Jurkat NFAT Luciferase (JNL) основывается на линии Т-клеток острого лейкоза Jurkat. Линию модифицировали для экспрессии люциферазы под контролем элемента ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Для трансдукции с CAR для BCMA 10000 клеток JNL/лунка 96-луночного планшета трансдуцировали с 50 мкл свежей надосадочной жидкости, содержащей отфильтрованный через фильтр 45 мкм вирус. Планшеты культивировали в течение 5 дней перед совместным культивированием с клетками-мишенями.
Для оценки функциональной способности CAR для BCMA to activate JNL клетки, совместно культивировали с целевыми раковыми клеткам при различных соотношениях эффекторных клеток и клеток-мишеней (соотношение E: T) для считывания их активации путем количественного определения экспрессии люциферазы. Оценивали основанные на scFv CAR R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-10, B61-02, Hy03 и Hy52. Клетки CD19 JNL с CAR использовали в качестве специфичного для мишени контроля, и только среда без клеток-мишеней служила в качестве отрицательного контроля.
Вышеупомянутые пятидневные трансдуцированные клетки JNL с CAR совместно культивировали с BCMA-положительной линией клеток множественной миеломы (MM) KMS11 или NALM6, линией клеток острого лимфоцитарного лейкоза, служившей в качестве BCMA-отрицательного контроля. Оставшиеся Т-клетки JNL с CAR оценивали в отношении экспрессии CAR для BCMA с помощью проточной цитометрии. Совместные культуры получали в 384-луночных планшетах при отношениях эффектора к мишени (E:T) 4:1, 2:1, 1:1 и 0,5:1 и инкубировали в течение 24 ч., после чего количественно определяли экспрессию люциферазы с помощью активированных CAR Т-клеток JNL с помощью Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, Мэдисон, Висконсин). Количество света, испускаемого из каждой лунки (люминесценция), было прямым считыванием активации JNL соответствующим CAR. Клетки JNL считались активированными, когда уровень люминесценции равнялся или более чем в два раза превышал уровень UTD-клеток. Линия клеток BCMA+KMS11 приводила к активации клеток JNL, экспрессирующих R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-10, B61-02, Hy03 и Hy52 (фигуры 1A и 1C). Ни один из CAR для ВСМА не продемонстрировал активации BCMA-отрицательной линией NALM6 (Фигуры 1E и 1F). Только среда без клеток-мишеней не активировала ни один из протестированных трансдуцированных JNL с CAR (фиг. 1G и 1H). Анализ FACS показал, что экспрессия BCMA-CAR в трансдуцированных JNL обнаруживалась в разной степени; CAR% обычно положительно коррелирует с активацией JNL клетками KMS11 в наиболее активных CART JNL (фиг. 1B и 1D).
Создание T-клеток с CAR для BCMA
6
2
Следующие 8 CAR были выбраны для анализа экспрессии, стабильности и эффективности CAR в первичных Т-клетках: R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-10, B61-02, Hy03 и Hy52. Т-клетки с CAR для BCMA получали, исходя из крови здоровых подвергнутых аферезу доноров, Т-клетки которых (CD4+и CD8+лимфоциты) были получены путем отрицательной селекции в отношении CD3+Т-клеток. Эти клетки активировали путем добавления гранул CD3/CD28 (Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28, Thermo Fisher Scientific) при отношении 1:3 (T-клетки к грануле) в T-клеточной среде (RPMI-1640, 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мM L-глутамина, 1x пенициллина/стрептомицина, 100 мкM не являющихся незаменимыми аминокислот, 1 мM пирувата натрия, 10 мM Hepes и 55 мкM 2-меркаптоэтанола). T-клетки культивировали при 0,5×10 Т-клеток в 1 мл среды на лунку 24-луночного планшета при 37°C, 5% CO. Через 24 часа, когда Т-клетки бластировали, Т-клетки трансдуцировали вирусом с CAR для BCMA при множественности заражения (MOI), составляющей 5. Т-клетки начинали делиться с паттерном логарифмического роста, который контролировали путем измерения количества клеток на мл, и Т-клетки разбавляли свежей средой каждые два дня, удаляли гранулы и собирали для дальнейших анализов на 9 день. Аликвоты Т-клеток окрашивали для измерения экспрессии CAR методом проточной цитометрии на 5 и 9 день на FACS Fortessa (BD). Все Т-клетки с CAR для BCMA были получены в производственных условиях исследовательского уровня (т.е. не клинического уровня).
Поверхностную экспрессию BCMA-CAR и ее стабильность оценивали путем измерения CAR% и MFI (средней интенсивности флуоресценции) на 5-й и 9-й день с использованием анализов проточной цитометрии окрашенных rBCMA_Fc-AF647 клеток (фиг. 2 и таблица 17). Экспрессия CAR для BCMA в конечном продукте на 9 день различается от конструкции к конструкции и составляет от 18% до 42,4%, а MFI - от 672 до 5238. Конструкции из полученных из PALLAS клонов R1F2, R1B6 и R1G5 и гибридомного клона Hy03 показали потерю CAR от ~ 30% до 50% с 5 по 9 день, в то время как PI61, B61-10 и -02, а также Hy52 были относительно стабильны с точки зрения процента экспрессии CAR, хотя все конструкции CAR показали снижение MFI с 5 по 9 день, что, вероятно, было связано с меньшим размером Т-клеток на стадии покоя на 9 день. Подсчет клеток культур Т-клеток с CAR показал, что не обнаружено обнаруживаемого отрицательного эффекта scFv человека, несущего CAR для BCMA, в отношении способности клеток нормально размножаться по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками ("UTD").
Таблица 17. Анализ экспрессии CAR
Конструкция CAR
Титр
CAR% на Т-клетках
CAR MFI на Т-клетках
День 5
День 9
День 5
День 9
R1B6
2,68E+08
40,0
27,4
24,420
2,367
R1F2
3,60E+08
48,8
22,7
4,716
672
R1G5
2,27E+08
52,0
30,7
29,113
5,238
PI61
1,71E+08
47,4
42,3
24,360
2,099
B61-10
7,06E+07
41,1
30,3
27,298
3,288
B61-02
8,16E+07
33,5
23,6
29,113
3,471
Hy03
4,96E+07
33,7
18,1
9,463
929
Hy52
7,03E+07
35,1
36,1
33,694
2,859
Оценивание функциональных свойств CAR для BCMA-перенаправленных T-клеток
Для оценки функциональных возможностей CAR-T-клеток для BCMA были созданы совместные культуры с BCMA-положительными и BCMA-отрицательными линиями рака. CAR-T-клетки размораживали, подсчитывали и культивировали совместно с клетками-мишенями для определения их способности к уничтожению и секреции цитокинов. Тестировали клоны CAR для BCMA R1B6, R1F2, R1G5, B61-02, B61-10, PI61, Hy03 и Hy52. Нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) использовали в качестве контрольных нецелевых Т-клеток.
Уничтожение CAR-T клеток осуществляли путем совместного культивирования CAR-T клеток с клетками-мишенями KMS11-Luc и NALM6-Luc при различных соотношениях E: T в течение 20 часов. Популяции CAR Т-клеток нормализовали до эквивалентного процентного количества CAR-положительных клеток перед посевом. Цитокин IFNγ измеряли в надосадочных жидкостях от 20-часовых совместных культур CAR-T-клеток с клетками-мишенями при соотношении эффекторных и целевых клеток 2,5: 1, используя Meso Scale Discovery (MSD; Гейтерсбург, Мэриленд), и для каждого цитокина рассчитывали результаты в пг/мл по известным стандартам. Все анализы выполняли в двух повторностях из одного источника донорских клеток. Данные по уничтожению показывают, что все клоны CAR для BCMA эффективно уничтожают раковые клетки KMS11 (фиг. 3A). Контрольная клетка-мишень NALM6 не была убита ни одним из этих BCMA-специфичных CAR (фиг. 3B). Также была протестирована способность этих CAR продуцировать IFN-γ при культивировании с KMS11 (фиг. 3C). CAR для BCMA R1F2, R1G5 и PI61 привели к образованию самых высоких количеств IFN-γ. Уровни цитокинов, продуцируемых CAR-T-клетками для BCMA после воздействия контрольных клеток NALM6, были низкими (ФИГ. 3C), что указывает на отсутствие неспецифической активации с помощью CAR для BCMA.
Выводы
Новые scFv связывающие BCMA тестировали в контексте CAR Т-клеток. Восемь CAR были проанализированы в репортерном анализе JNL, а также в первичных Т-клетках: R1B6, R1F2, R1G5, B61-02, B61-10, PI61, Hy03 и Hy52. Все восемь CAR-T-клеток демонстрировали целенаправленное уничтожение. Т-клетки, экспрессирующие R1F2, R1G5 или PI61, продуцировали самые высокие количества IFN-γ в присутствии клеток-мишеней. В целом, перенос CAR для ВСМА к первичным Т-клеткам индуцировал реактивность в отношении CAR для ВСМА, но не выявлял внецелевую функцию.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Раскрытия всех без исключения патентов, заявок на патент и публикаций, цитируемых в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Несмотря на то, что настоящее изобретение было раскрыто со ссылкой на конкретные аспекты, очевидно, что другие аспекты и видоизменения настоящего изобретения могут быть разработаны другими специалистами в данной области без отступления от фактической сущности и объема настоящего изобретения. Предполагается, что прилагаемую формулу изобретения следует истолковывать как включающую все такие аспекты и эквивалентные видоизменения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> NOVARTIS AG
<120> ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ДЛЯ BCMA И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> N2067-7155WO
<140>
<141>
<150> 62/832,991
<151> 2019-04-12
<150> 62/684,628
<151> 2018-06-13
<160> 285
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1                   5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 45
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 2
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1               5                   10                  15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20                  25                  30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35                  40                  45
<210> 3
<211> 230
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225                 230
<210> 4
<211> 282
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 4
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1               5                   10                  15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20                  25                  30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35                  40                  45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50                  55                  60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85                  90                  95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100                 105                 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115                 120                 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130                 135                 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165                 170                 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180                 185                 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195                 200                 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210                 215                 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225                 230                 235                 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260                 265                 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275                 280
<210> 5
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210> 6
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 6
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 7
<211> 42
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40
<210> 8
<211> 48
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 8
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1               5                   10                  15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20                  25                  30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35                  40                  45
<210> 9
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 9
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 10
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 11
<211> 1184
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 11
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt       60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg      120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa      180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa      240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt      300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg      360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg      420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg      480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt      540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg      600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc      660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg      720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg      780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat      840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct      900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc      960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg     1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga     1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc     1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga                      1184
<210> 12
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид"
<400> 12
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga       60
ccc                                                                     63
<210> 13
<211> 135
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 13
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg       60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg      120
gacttcgcct gtgat                                                       135
<210> 14
<211> 690
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 14
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc       60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag      120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac      180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc      240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa      300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag      360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc      480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg      540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag      600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg                                       690
<210> 15
<211> 847
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 15
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca       60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc      120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc      180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag      240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag      300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg      360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga      420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca      480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat      540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc      600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc      660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt      720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc      780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact      840
gaccatt                                                                847
<210> 16
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид"
<400> 16
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc                                        30
<210> 17
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид"
<400> 17
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc       60
accctttact gc                                                           72
<210> 18
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 18
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa       60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt      120
gaactg                                                                 126
<210> 19
<211> 123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 19
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc       60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc      120
tcc                                                                    123
<210> 20
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 20
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc       60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc      120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat      180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc      240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc      300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc                                336
<210> 21
<211> 336
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc       60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc      120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat      180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc      240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc      300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc                                336
<210> 22
<211> 373
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 22
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1               5                   10                  15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20                  25                  30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35                  40                  45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50                  55                  60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85                  90                  95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100                 105                 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115                 120                 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130                 135                 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165                 170                 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180                 185                 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195                 200                 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
210                 215                 220
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
225                 230                 235                 240
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
245                 250                 255
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260                 265                 270
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275                 280                 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
290                 295                 300
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
305                 310                 315                 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325                 330                 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
340                 345                 350
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
355                 360                 365
Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 23
<211> 1182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 23
atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga       60
ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg      120
gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc      180
tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc      240
gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa      300
ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg      360
acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg      420
gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg      480
cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg      540
actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct      600
gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg      660
gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc      720
aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa      780
accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc      840
gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac      900
cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg      960
cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg     1020
tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga     1080
gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag     1140
gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc                        1182
<210> 24
<211> 394
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro
20                  25                  30
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
35                  40                  45
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
50                  55                  60
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe
85                  90                  95
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
100                 105                 110
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser
115                 120                 125
Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
130                 135                 140
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala
165                 170                 175
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
180                 185                 190
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
195                 200                 205
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
210                 215                 220
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
225                 230                 235                 240
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
245                 250                 255
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
260                 265                 270
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
275                 280                 285
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
290                 295                 300
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
305                 310                 315                 320
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
325                 330                 335
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
340                 345                 350
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
355                 360                 365
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
370                 375                 380
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385                 390
<210> 25
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 26
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(30)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-6 повторяющихся
звеньев "Gly Gly Gly Gly Ser"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен и
предпочтительных вариантов осуществления"
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20                  25                  30
<210> 27
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 28
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 29
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5000
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> другой_признак
<222>  (1)..(5000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-5000 нуклеотидов"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен и
предпочтительных вариантов осуществления"
<400> 30
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 5000
<210> 31
<211> 100
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 31
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt       60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt                            100
<210> 32
<211> 5000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> другой_признак
<222>  (1)..(5000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-5000 нуклеотидов"
<400> 32
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt       60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1980
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2040
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2100
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2160
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2220
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2280
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2340
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2400
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2460
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2520
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2580
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2640
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2700
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2760
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2820
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2880
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2940
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3000
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3060
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4980
tttttttttt tttttttttt                                                 5000
<210> 33
<211> 5000
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> другой_признак
<222>  (1)..(5000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 100-5000 нуклеотидов"
<400> 33
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 5000
<210> 34
<211> 400
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> другой_признак
<222>  (1)..(400)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 100-400 нуклеотидов"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен и
предпочтительных вариантов осуществления"
<400> 34
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                            400
<210> 35
<211> 2000
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> другой_признак
<222>  (1)..(2000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-2000 нуклеотидов"
<400> 35
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 2000
<210> 36
<211> 41
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 36
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1               5                   10                  15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20                  25                  30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35                  40
<210> 37
<211> 123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 37
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc       60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc      120
tcc                                                                    123
<210> 38
<211> 35
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 38
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1               5                   10                  15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20                  25                  30
Val Thr Leu
35
<210> 39
<211> 105
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 39
acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga       60
gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta                      105
<210> 40
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид"
<400> 40
ggtggcggag gttctggagg tgggggttcc                                        30
<210> 41
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен и
предпочтительных вариантов осуществления"
<400> 41
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 42
<211> 40
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(40)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-10 повторяющихся
звеньев
"Gly Gly Gly Ser»
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен и
предпочтительных вариантов осуществления"
<400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20                  25                  30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35                  40
<210> 43
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 43
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210> 44
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 44
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210> 45
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 45
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 46
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 46
Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 47
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 47
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 48
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 48
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210> 49
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210> 50
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 50
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210> 51
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 51
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210> 52
<211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 53
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 53
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact      360
gtgtcctcc                                                              369
<210> 54
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 55
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 55
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 56
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 56
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 57
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 57
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 58
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 58
Ala Ala Ser
1
<210> 59
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 59
Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
1               5
<210> 60
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 60
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 61
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 62
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 62
gacattcaaa tgactcagtc cccgtcctcc ctctccgcct ccgtgggaga tcgcgtcacg       60
atcacgtgca gggccagcca gagcatctcc agctacctga actggtacca gcagaagcca      120
gggaaggcac cgaagctcct gatctacgcc gctagctcgc tgcagtccgg cgtcccttca      180
cggttctcgg gatcgggctc aggcaccgac ttcaccctga ccattagcag cctgcagccg      240
gaggacttcg cgacatacta ctgtcagcag tcatactcca cccctctgac cttcggccaa      300
gggaccaaag tggagatcaa g                                                321
<210> 63
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 64
<211> 250
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130                 135                 140
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
145                 150                 155                 160
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
165                 170                 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180                 185                 190
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
210                 215                 220
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
225                 230                 235                 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245                 250
<210> 65
<211> 750
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 65
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact      360
gtgtcctccg gtggtggtgg atcggggggt ggtggttcgg gcggaggagg atctggagga      420
ggagggtcgg acattcaaat gactcagtcc ccgtcctccc tctccgcctc cgtgggagat      480
cgcgtcacga tcacgtgcag ggccagccag agcatctcca gctacctgaa ctggtaccag      540
cagaagccag ggaaggcacc gaagctcctg atctacgccg ctagctcgct gcagtccggc      600
gtcccttcac ggttctcggg atcgggctca ggcaccgact tcaccctgac cattagcagc      660
ctgcagccgg aggacttcgc gacatactac tgtcagcagt catactccac ccctctgacc      720
ttcggccaag ggaccaaagt ggagatcaag                                       750
<210> 66
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130                 135                 140
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
145                 150                 155                 160
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
165                 170                 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180                 185                 190
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
210                 215                 220
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
225                 230                 235                 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
245                 250                 255
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
260                 265                 270
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
275                 280                 285
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
290                 295                 300
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
305                 310                 315                 320
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
325                 330                 335
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
340                 345                 350
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
355                 360                 365
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
370                 375                 380
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385                 390                 395                 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405                 410                 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420                 425                 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435                 440                 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450                 455                 460
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470
<210> 67
<211> 1419
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 67
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact      360
gtgtcctccg gtggtggtgg atcggggggt ggtggttcgg gcggaggagg atctggagga      420
ggagggtcgg acattcaaat gactcagtcc ccgtcctccc tctccgcctc cgtgggagat      480
cgcgtcacga tcacgtgcag ggccagccag agcatctcca gctacctgaa ctggtaccag      540
cagaagccag ggaaggcacc gaagctcctg atctacgccg ctagctcgct gcagtccggc      600
gtcccttcac ggttctcggg atcgggctca ggcaccgact tcaccctgac cattagcagc      660
ctgcagccgg aggacttcgc gacatactac tgtcagcagt catactccac ccctctgacc      720
ttcggccaag ggaccaaagt ggagatcaag accactaccc cagcaccgag gccacccacc      780
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca      840
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc      900
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag      960
cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact     1020
actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa     1080
ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct accagcaggg gcagaaccag     1140
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga     1200
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac     1260
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa     1320
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac     1380
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg                            1419
<210> 68
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 68
Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210> 69
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 69
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210> 70
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 71
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 71
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc      360
tcc                                                                    363
<210> 72
<211> 248
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130                 135                 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165                 170                 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210                 215                 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225                 230                 235                 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 73
<211> 744
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 73
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc      360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg      420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc      480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag      540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct      600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag      660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc      720
caagggacca aagtggagat caag                                             744
<210> 74
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130                 135                 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165                 170                 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210                 215                 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225                 230                 235                 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245                 250                 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260                 265                 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275                 280                 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290                 295                 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305                 310                 315                 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325                 330                 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340                 345                 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355                 360                 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370                 375                 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385                 390                 395                 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405                 410                 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420                 425                 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435                 440                 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450                 455                 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470
<210> 75
<211> 1413
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 75
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc      360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg      420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc      480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag      540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct      600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag      660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc      720
caagggacca aagtggagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct      780
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt      840
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg      900
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt      960
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa     1020
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc     1080
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctaccagc aggggcagaa ccagctctac     1140
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg     1200
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag     1260
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga     1320
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat     1380
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg                                  1413
<210> 76
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 76
Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 77
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 77
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 78
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 79
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 79
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc      360
tcc                                                                    363
<210> 80
<211> 248
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130                 135                 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165                 170                 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210                 215                 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225                 230                 235                 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 81
<211> 744
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 81
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc      360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg      420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc      480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag      540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct      600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag      660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc      720
caagggacca aagtggagat caag                                             744
<210> 82
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 82
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130                 135                 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165                 170                 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210                 215                 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly
225                 230                 235                 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245                 250                 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260                 265                 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275                 280                 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290                 295                 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305                 310                 315                 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325                 330                 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340                 345                 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355                 360                 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370                 375                 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385                 390                 395                 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405                 410                 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420                 425                 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435                 440                 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450                 455                 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470
<210> 83
<211> 1413
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 83
gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg       60
agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct      120
cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat      180
gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat      240
ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag      300
tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc      360
tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg      420
tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc      480
acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag      540
ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct      600
tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag      660
ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc      720
caagggacca aagtggagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct      780
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt      840
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg      900
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt      960
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa     1020
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc     1080
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctaccagc aggggcagaa ccagctctac     1140
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg     1200
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag     1260
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga     1320
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat     1380
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg                                  1413
<210> 84
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена=" "
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена=" "
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (7)..(7)
<223> /замена="Tyr" или "Asp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена="Asp" или "Val"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (9)..(9)
<223> /замена="Asp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (11)..(11)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (12)..(12)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(14)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 84
Arg Glu Trp Val Pro Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 85
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена=" "
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (7)..(7)
<223> /замена=" "
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (9)..(9)
<223> /замена="Tyr" или "Asp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (10)..(10)
<223> /замена="Asp" или "Val"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (11)..(11)
<223> /замена="Asp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (13)..(13)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (14)..(14)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(16)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 85
Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210> 86
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 86
Ser Tyr Gly Met His
1               5
<210> 87
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 87
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 88
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 88
Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1               5                   10
<210> 89
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 89
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1               5
<210> 90
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 90
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1               5
<210> 91
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 91
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1               5
<210> 92
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 92
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1               5                   10                  15
<210> 93
<211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 94
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 94
caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc       60
tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc      120
cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac      180
gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat      240
ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt      300
tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact      360
gtgtccagc                                                              369
<210> 95
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 95
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210> 96
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 96
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1               5
<210> 97
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 97
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val
1               5                   10
<210> 98
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 98
Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1               5                   10
<210> 99
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 99
Asp Val Ser
1
<210> 100
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 100
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr
1               5
<210> 101
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 101
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1               5
<210> 102
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 102
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 103
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 103
cagagcgcac tgactcagcc ggcatccgtg tccggtagcc ccggacagtc gattaccatc       60
tcctgtaccg gcacctcctc cgacgtggga gggtacaact acgtgtcgtg gtaccagcag      120
cacccaggaa aggcccctaa gttgatgatc tacgatgtgt caaaccgccc gtctggagtc      180
tccaaccggt tctccggctc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat tagcgggctg      240
caagccgagg atgaggccga ctactactgc tcgagctaca catcctcgag caccctctac      300
gtgttcggct cggggactaa ggtcaccgtg ctg                                   333
<210> 104
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 104
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 105
<211> 249
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln
130                 135                 140
Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys
145                 150                 155                 160
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr
165                 170                 175
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser
180                 185                 190
Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195                 200                 205
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210                 215                 220
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val Phe
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 106
<211> 747
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 106
caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc       60
tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc      120
cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac      180
gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat      240
ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt      300
tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact      360
gtgtccagcg gtggaggagg ttcgggcgga ggaggatcag gagggggtgg atcgcagagc      420
gcactgactc agccggcatc cgtgtccggt agccccggac agtcgattac catctcctgt      480
accggcacct cctccgacgt gggagggtac aactacgtgt cgtggtacca gcagcaccca      540
ggaaaggccc ctaagttgat gatctacgat gtgtcaaacc gcccgtctgg agtctccaac      600
cggttctccg gctccaagtc cggcaacacc gccagcctga ccattagcgg gctgcaagcc      660
gaggatgagg ccgactacta ctgctcgagc tacacatcct cgagcaccct ctacgtgttc      720
ggctcgggga ctaaggtcac cgtgctg                                          747
<210> 107
<211> 472
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln
130                 135                 140
Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys
145                 150                 155                 160
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr
165                 170                 175
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser
180                 185                 190
Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195                 200                 205
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210                 215                 220
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val Phe
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245                 250                 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260                 265                 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275                 280                 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290                 295                 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
305                 310                 315                 320
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
325                 330                 335
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
340                 345                 350
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
355                 360                 365
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
370                 375                 380
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
385                 390                 395                 400
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
405                 410                 415
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
420                 425                 430
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
435                 440                 445
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
450                 455                 460
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470
<210> 108
<211> 1416
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 108
caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc       60
tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc      120
cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac      180
gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat      240
ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt      300
tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact      360
gtgtccagcg gtggaggagg ttcgggcgga ggaggatcag gagggggtgg atcgcagagc      420
gcactgactc agccggcatc cgtgtccggt agccccggac agtcgattac catctcctgt      480
accggcacct cctccgacgt gggagggtac aactacgtgt cgtggtacca gcagcaccca      540
ggaaaggccc ctaagttgat gatctacgat gtgtcaaacc gcccgtctgg agtctccaac      600
cggttctccg gctccaagtc cggcaacacc gccagcctga ccattagcgg gctgcaagcc      660
gaggatgagg ccgactacta ctgctcgagc tacacatcct cgagcaccct ctacgtgttc      720
ggctcgggga ctaaggtcac cgtgctgacc actaccccag caccgaggcc acccaccccg      780
gctcctacca tcgcctccca gcctctgtcc ctgcgtccgg aggcatgtag acccgcagct      840
ggtggggccg tgcatacccg gggtcttgac ttcgcctgcg atatctacat ttgggcccct      900
ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt tcactcgtga tcactcttta ctgtaagcgc      960
ggtcggaaga agctgctgta catctttaag caacccttca tgaggcctgt gcagactact     1020
caagaggagg acggctgttc atgccggttc ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg     1080
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctc     1140
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga     1200
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac     1260
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc     1320
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc     1380
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg                               1416
<210> 109
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 109
Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 110
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 110
Ser Tyr Lys Gly Ser Asn
1               5
<210> 111
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 111
Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys
1               5
<210> 112
<211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 113
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 113
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc       60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc      120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac      180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat      240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc      300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc      360
gtgtcctct                                                              369
<210> 114
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 114
Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg
1               5
<210> 115
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 115
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Leu Tyr Val
1               5                   10
<210> 116
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 116
Glu Val Ser
1
<210> 117
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 117
Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Leu Tyr
1               5
<210> 118
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 118
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 119
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 119
cagagcgcgc tgactcagcc tgcctccgtg agcggttcgc cgggacagtc cattaccatt       60
tcgtgcaccg ggacctcctc cgacgtggga ggctacaact acgtgtcctg gtaccagcag      120
catcccggaa aggccccgaa gctgatgatc tacgaagtgt cgaacagact gcggggagtc      180
tccaaccgct tttccgggtc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat cagcgggctc      240
caggcagaag atgaggctga ctattactgc tcctcctaca cgtcaagctc cgccctctac      300
gtgttcgggt ccgggaccaa agtcactgtg ctg                                   333
<210> 120
<211> 254
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130                 135                 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165                 170                 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180                 185                 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195                 200                 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210                 215                 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245                 250
<210> 121
<211> 762
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 121
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc       60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc      120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac      180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat      240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc      300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc      360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga      420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc      480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg      540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg      600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc      660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc      720
gccctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tg                         762
<210> 122
<211> 477
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130                 135                 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165                 170                 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180                 185                 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195                 200                 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210                 215                 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr
245                 250                 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260                 265                 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275                 280                 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290                 295                 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
325                 330                 335
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
340                 345                 350
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
355                 360                 365
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
370                 375                 380
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
405                 410                 415
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
420                 425                 430
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
435                 440                 445
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
450                 455                 460
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470                 475
<210> 123
<211> 1431
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 123
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc       60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc      120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac      180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat      240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc      300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc      360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga      420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc      480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg      540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg      600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc      660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc      720
gccctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tgaccactac cccagcaccg      780
aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca      840
tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc      900
tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact      960
ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg     1020
cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa     1080
ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc cgcagcgcag atgctccagc ctaccagcag     1140
gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg     1200
gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa     1260
gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt     1320
atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc     1380
gccaccaagg acacctatga cgctcttcac atgcaggccc tgccgcctcg g              1431
<210> 124
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 124
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 125
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 125
cagagcgcgc tgactcagcc tgcctccgtg agcggttcgc cgggacagtc cattaccatt       60
tcgtgcaccg ggacctcctc cgacgtggga ggctacaact acgtgtcctg gtaccagcag      120
catcccggaa aggccccgaa gctgatgatc tacgaagtgt cgaacagact gcggggagtc      180
tccaaccgct tttccgggtc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat cagcgggctc      240
caggcagaag atgaggctga ctattactgc tcctcctaca cgtcaagctc caccctctac      300
gtgttcgggt ccgggaccaa agtcactgtg ctg                                   333
<210> 126
<211> 254
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130                 135                 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165                 170                 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180                 185                 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195                 200                 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210                 215                 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245                 250
<210> 127
<211> 762
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 127
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc       60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc      120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac      180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat      240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc      300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc      360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga      420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc      480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg      540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg      600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc      660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc      720
accctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tg                         762
<210> 128
<211> 477
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130                 135                 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165                 170                 175
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
180                 185                 190
Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
195                 200                 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210                 215                 220
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
225                 230                 235                 240
Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr
245                 250                 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260                 265                 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275                 280                 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290                 295                 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
325                 330                 335
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
340                 345                 350
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
355                 360                 365
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
370                 375                 380
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
405                 410                 415
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
420                 425                 430
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
435                 440                 445
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
450                 455                 460
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470                 475
<210> 129
<211> 1431
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 129
caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc       60
tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc      120
ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac      180
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat      240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc      300
tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc      360
gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga      420
ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc      480
attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg      540
taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg      600
cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc      660
agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc      720
accctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tgaccactac cccagcaccg      780
aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca      840
tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc      900
tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact      960
ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg     1020
cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa     1080
ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc cgcagcgcag atgctccagc ctaccagcag     1140
gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg     1200
gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa     1260
gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt     1320
atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc     1380
gccaccaagg acacctatga cgctcttcac atgcaggccc tgccgcctcg g              1431
<210> 130
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(17)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 130
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 131
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Glu"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (7)..(7)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(7)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 131
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1. 5
<210> 132
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена="Ala"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(11)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 132
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val
1               5                   10
<210> 133
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(6)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 133
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1               5
<210> 134
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Glu"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(3)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 134
Asp Val Ser
1
<210> 135
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Ala"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(8)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 135
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr
1               5
<210> 136
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(8)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 136
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1               5
<210> 137
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 137
Gly Phe Trp Met Ser
1               5
<210> 138
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 138
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210> 139
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 139
Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210> 140
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 140
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
1               5
<210> 141
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 141
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1               5
<210> 142
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 142
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Trp
1               5
<210> 143
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 143
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1               5
<210> 144
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 144
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210> 145
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 146
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 146
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg       60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca      120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac      180
gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac      240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt      300
gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagc            354
<210> 147
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 147
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu
1               5                   10                  15
Asp
<210> 148
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 148
Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
1               5
<210> 149
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 149
Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr
1               5                   10
<210> 150
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 150
Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210> 151
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 151
Thr Leu Ser
1
<210> 152
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 152
Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile
1               5
<210> 153
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 153
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210> 154
<211> 114
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 154
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                  25                  30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln
85                  90                  95
Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu
100                 105                 110
Ile Lys
<210> 155
<211> 342
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 155
gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc ctgcctgtga ctcccggaga accagcctcc       60
atttcctgcc ggtcctccca gtccctgctg gacagcgacg acggcaacac ttacctggac      120
tggtacttgc agaagccggg ccaatcgcct cgcctgctga tctataccct gtcataccgg      180
gcctcaggag tgcctgaccg cttctcggga tcagggagcg ggaccgattt caccctgaaa      240
atttcccgag tggaagccga ggacgtcgga ctgtactact gcacccagcg cctcgaattc      300
ccgtcgatta cgtttggaca gggtacccgg cttgagatca ag                         342
<210> 156
<211> 252
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130                 135                 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145                 150                 155                 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165                 170                 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180                 185                 190
Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210                 215                 220
Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser
225                 230                 235                 240
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245                 250
<210> 157
<211> 756
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 157
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg       60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca      120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac      180
gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac      240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt      300
gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc      360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc      420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc      480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac      540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca      600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc      660
cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg      720
attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaag                                756
<210> 158
<211> 475
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130                 135                 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145                 150                 155                 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165                 170                 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180                 185                 190
Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210                 215                 220
Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser
225                 230                 235                 240
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
245                 250                 255
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
260                 265                 270
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
275                 280                 285
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
290                 295                 300
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
325                 330                 335
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
340                 345                 350
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
355                 360                 365
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
370                 375                 380
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
385                 390                 395                 400
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
405                 410                 415
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
420                 425                 430
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
435                 440                 445
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
450                 455                 460
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470                 475
<210> 159
<211> 1425
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 159
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg       60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca      120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac      180
gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac      240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt      300
gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc      360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc      420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc      480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac      540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca      600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc      660
cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg      720
attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaagacca ctaccccagc accgaggcca      780
cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga      840
cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt      900
tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac      960
tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg     1020
cagactactc aagaggagga cggctgttca tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc     1080
tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc gcagatgctc cagcctacca gcaggggcag     1140
aaccagctct acaacgaact caatcttggt cggagagagg agtacgacgt gctggacaag     1200
cggagaggac gggacccaga aatgggcggg aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc     1260
ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa     1320
ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac ggactgtacc agggactcag caccgccacc     1380
aaggacacct atgacgctct tcacatgcag gccctgccgc ctcgg                     1425
<210> 160
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 160
Ser Phe Arg Met Asn
1               5
<210> 161
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 161
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 162
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 162
Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210> 163
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 163
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
1               5
<210> 164
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 164
Ser Ser Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210> 165
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 165
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg
1               5
<210> 166
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 166
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
1               5
<210> 167
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 167
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210> 168
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 169
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 169
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg       60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca      120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac      180
gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac      240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt      300
tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagc            354
<210> 170
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 170
Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser
1               5
<210> 171
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 171
Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile Thr
1               5
<210> 172
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 172
Arg Ile Gly Phe Pro Ile
1               5
<210> 173
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 173
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                  25                  30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85                  90                  95
Arg Ile Gly Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 174
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 174
gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc ctgcctgtga ctcccggaga accagcctcc       60
atttcctgcc ggtcctccca gtccctgctg gacagcgacg acggcaacac ttacctggac      120
tggtacttgc agaagccggg ccaatcgcct cagctgctga tctataccct gtcattccgg      180
gcctcaggag tgcctgaccg cttctcggga tcagggagcg ggaccgattt caccctgaaa      240
attaggcgag tggaagccga ggacgtcgga gtgtactact gcatgcagcg catcggcttc      300
ccgattacgt ttggacaggg tacccggctt gagatcaag                             339
<210> 175
<211> 251
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 175
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130                 135                 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145                 150                 155                 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165                 170                 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180                 185                 190
Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala
210                 215                 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile
225                 230                 235                 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245                 250
<210> 176
<211> 753
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 176
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg       60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca      120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac      180
gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac      240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt      300
tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc      360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc      420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc      480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac      540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcagctg ctgatctata ccctgtcatt ccgggcctca      600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaattagg      660
cgagtggaag ccgaggacgt cggagtgtac tactgcatgc agcgcatcgg cttcccgatt      720
acgtttggac agggtacccg gcttgagatc aag                                   753
<210> 177
<211> 474
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130                 135                 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
145                 150                 155                 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
165                 170                 175
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180                 185                 190
Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala
210                 215                 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile
225                 230                 235                 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala
245                 250                 255
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
260                 265                 270
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
275                 280                 285
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
290                 295                 300
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
305                 310                 315                 320
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
325                 330                 335
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
340                 345                 350
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
355                 360                 365
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
370                 375                 380
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
385                 390                 395                 400
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
405                 410                 415
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
420                 425                 430
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
435                 440                 445
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
450                 455                 460
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465                 470
<210> 178
<211> 1422
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 178
gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg       60
tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca      120
ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac      180
gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac      240
ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt      300
tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc      360
ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc      420
gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc      480
tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac      540
ttgcagaagc cgggccaatc gcctcagctg ctgatctata ccctgtcatt ccgggcctca      600
ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaattagg      660
cgagtggaag ccgaggacgt cggagtgtac tactgcatgc agcgcatcgg cttcccgatt      720
acgtttggac agggtacccg gcttgagatc aagaccacta ccccagcacc gaggccaccc      780
accccggctc ctaccatcgc ctcccagcct ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc      840
gcagctggtg gggccgtgca tacccggggt cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg      900
gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt      960
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag     1020
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc     1080
gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca gatgctccag cctaccagca ggggcagaac     1140
cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg     1200
agaggacggg acccagaaat gggcgggaag ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg     1260
tacaacgagc tccaaaagga taagatggca gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg     1320
gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag     1380
gacacctatg acgctcttca catgcaggcc ctgccgcctc gg                        1422
<210> 179
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(5)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 179
Gly Phe Trp Met Ser
1               5
<210> 180
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (9)..(9)
<223> /замена="Ile"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (12)..(12)
<223> /замена="Ala"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (16)..(16)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(17)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 180
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210> 181
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Trp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(9)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 181
Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210> 182
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена="Phe"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(7)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 182
Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser
1               5
<210> 183
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Met"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена="Ile"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена="Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена=" "
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(10)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 183
Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr
1               5                   10
<210> 184
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(7)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 184
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
1               5
<210> 185
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (1)..(1)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (2)..(2)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(6)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 185
Lys Gln Asp Gly Ser Glu
1               5
<210> 186
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (2)..(2)
<223> /замена="Ile"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена=" "
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(7)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 186
Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile
1               5
<210> 187
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (6)..(6)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(8)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 187
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Trp
1               5
<210> 188
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (2)..(2)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (4)..(4)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (7)..(7)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (8)..(8)
<223> /замена="Ile"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(8)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 188
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1               5
<210> 189
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (3)..(3)
<223> /замена="Trp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222>  (5)..(5)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(11)
<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,
не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях
для положений вариантов"
<400> 189
Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210> 190
<211> 521
<212> ДНК
<213> Неустановленное
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание незивестного:  последовательность промотора
гена PGK
<400> 190
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga      240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg      300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat      360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc      420
cgcggcgacg caaagggcct tggtgcgggt ctcgtcggcg cagggacgcg tttgggtccc      480
gacggaacct tttccgcgtt ggggttgggg caccataagc t                          521
<210> 191
<211> 221
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 191
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac g                          221
<210> 192
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 192
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga      240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg      300
ttccttggaa gggctgaatc cccg                                             324
<210> 193
<211> 422
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 193
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga      240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg      300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat      360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc      420
cg                                                                     422
<210> 194
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(3)
<223> /примечание="Данная область может присутствовать или может
не присутствовать
<400> 194
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1               5                   10                  15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 195
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(3)
<223> /примечание="Данная область может присутствовать или может
не присутствовать
<400> 195
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1               5                   10                  15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 196
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(3)
<223> /примечание="Данная область может присутствовать или может
не присутствовать
<400> 196
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 197
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> Сайт
<222>  (1)..(3)
<223> /примечание="Данная область может присутствовать или может
не присутствовать
<400> 197
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20                  25
<210> 198
<211> 118
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 198
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtg        118
<210> 199
<400> 199
000
<210> 200
<400> 200
000
<210> 201
<400> 201
000
<210> 202
<211> 69
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 202
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1               5                   10                  15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20                  25                  30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35                  40                  45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50                  55                  60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 203
<400> 203
000
<210> 204
<400> 204
000
<210> 205
<400> 205
000
<210> 206
<400> 206
000
<210> 207
<400> 207
000
<210> 208
<400> 208
000
<210> 209
<400> 209
000
<210> 210
<400> 210
000
<210> 211
<400> 211
000
<210> 212
<400> 212
000
<210> 213
<400> 213
000
<210> 214
<400> 214
000
<210> 215
<400> 215
000
<210> 216
<400> 216
000
<210> 217
<400> 217
000
<210> 218
<400> 218
000
<210> 219
<400> 219
000
<210> 220
<400> 220
000
<210> 221
<400> 221
000
<210> 222
<400> 222
000
<210> 223
<400> 223
000
<210> 224
<400> 224
000
<210> 225
<400> 225
000
<210> 226
<400> 226
000
<210> 227
<400> 227
000
<210> 228
<400> 228
000
<210> 229
<400> 229
000
<210> 230
<400> 230
000
<210> 231
<400> 231
000
<210> 232
<400> 232
000
<210> 233
<400> 233
000
<210> 234
<400> 234
000
<210> 235
<400> 235
000
<210> 236
<400> 236
000
<210> 237
<400> 237
000
<210> 238
<400> 238
000
<210> 239
<400> 239
000
<210> 240
<400> 240
000
<210> 241
<400> 241
000
<210> 242
<400> 242
000
<210> 243
<400> 243
000
<210> 244
<400> 244
000
<210> 245
<400> 245
000
<210> 246
<400> 246
000
<210> 247
<400> 247
000
<210> 248
<400> 248
000
<210> 249
<400> 249
000
<210> 250
<400> 250
000
<210> 251
<400> 251
000
<210> 252
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид"
<400> 252
atggccctcc ctgtcaccgc tctgttgctg ccgcttgctc tgctgctcca cgcagcgcga       60
ccg                                                                     63
<210> 253
<211> 747
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 253
caggtacaat tgcaggagtc tggaggcggt gtggtgcaac ccggtcgcag cttgcgcctg       60
agttgtgctg cgtctggatt tacattttca tcttacggaa tgcattgggt acgccaggca      120
ccggggaaag gccttgaatg ggtggctgta atttcatacg atggttccaa caaatactat      180
gctgactcag tcaagggtcg atttacaatt agtcgggaca actccaagaa caccctttat      240
cttcaaatga attcccttag agcagaggat acggcggtct attactgtgg tggcagtggt      300
tatgcacttc atgatgatta ctatggcttg gatgtctggg ggcaagggac gcttgtaact      360
gtatcctctg gtggtggtgg tagtggtggg ggaggctccg gcggtggcgg ctctcaatct      420
gctctgactc aaccagcaag cgtatcaggg tcaccgggac agagtattac cataagttgc      480
acggggacct ctagcgatgt aggggggtat aattatgtat cttggtatca acaacacccc      540
gggaaagccc ctaaattgat gatctacgac gtgagcaatc gacctagtgg cgtatcaaat      600
cgcttctctg gtagcaagag tgggaatacg gcgtccctta ctattagcgg attgcaagca      660
gaagatgagg ccgattacta ctgcagctcc tatactagct cttctacatt gtacgtcttt      720
gggagcggaa caaaagtaac agtactc                                          747
<210> 254
<211> 207
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 254
acaacaacac ctgccccgag accgcctaca ccagccccga ctattgccag ccagcctctg       60
agcctcaggc ctgaggcctg taggcccgca gcgggcggcg cagttcatac acggggcttg      120
gatttcgctt gtgatattta tatttgggct cctttggcgg ggacatgtgg cgtgctgctt      180
ctgtcacttg ttattacact gtactgt                                          207
<210> 255
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 255
aaacgcgggc gaaaaaaatt gctgtatatt tttaagcagc catttatgag gcccgttcag       60
acgacgcagg aggaggacgg ttgctcttgc aggttcccag aagaggaaga agggggctgt      120
gaattg                                                                 126
<210> 256
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 256
cgggttaaat tttcaagatc cgcagacgct ccagcatacc aacagggaca aaaccaactc       60
tataacgagc tgaatcttgg aagaagggag gaatatgatg tgctggataa acggcgcggt      120
agagatccgg agatgggcgg aaaaccaagg cgaaaaaacc ctcaggaggg actctacaac      180
gaactgcaga aagacaaaat ggcggaggct tattccgaaa taggcatgaa gggcgagcgg      240
aggcgaggga aagggcacga cggactgtat caaggcctct caaccgcgac taaggatacg      300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgcct ccgaga                                336
<210> 257
<211> 493
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 257
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85                  90                  95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr
115                 120                 125
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
145                 150                 155                 160
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
165                 170                 175
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
180                 185                 190
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
195                 200                 205
Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser
210                 215                 220
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
225                 230                 235                 240
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser
245                 250                 255
Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr
260                 265                 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275                 280                 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290                 295                 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305                 310                 315                 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325                 330                 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340                 345                 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355                 360                 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370                 375                 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405                 410                 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420                 425                 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435                 440                 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450                 455                 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465                 470                 475                 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 258
<211> 1479
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 258
atggccctcc ctgtcaccgc tctgttgctg ccgcttgctc tgctgctcca cgcagcgcga       60
ccgcaggtac aattgcagga gtctggaggc ggtgtggtgc aacccggtcg cagcttgcgc      120
ctgagttgtg ctgcgtctgg atttacattt tcatcttacg gaatgcattg ggtacgccag      180
gcaccgggga aaggccttga atgggtggct gtaatttcat acgatggttc caacaaatac      240
tatgctgact cagtcaaggg tcgatttaca attagtcggg acaactccaa gaacaccctt      300
tatcttcaaa tgaattccct tagagcagag gatacggcgg tctattactg tggtggcagt      360
ggttatgcac ttcatgatga ttactatggc ttggatgtct gggggcaagg gacgcttgta      420
actgtatcct ctggtggtgg tggtagtggt gggggaggct ccggcggtgg cggctctcaa      480
tctgctctga ctcaaccagc aagcgtatca gggtcaccgg gacagagtat taccataagt      540
tgcacgggga cctctagcga tgtagggggg tataattatg tatcttggta tcaacaacac      600
cccgggaaag cccctaaatt gatgatctac gacgtgagca atcgacctag tggcgtatca      660
aatcgcttct ctggtagcaa gagtgggaat acggcgtccc ttactattag cggattgcaa      720
gcagaagatg aggccgatta ctactgcagc tcctatacta gctcttctac attgtacgtc      780
tttgggagcg gaacaaaagt aacagtactc acaacaacac ctgccccgag accgcctaca      840
ccagccccga ctattgccag ccagcctctg agcctcaggc ctgaggcctg taggcccgca      900
gcgggcggcg cagttcatac acggggcttg gatttcgctt gtgatattta tatttgggct      960
cctttggcgg ggacatgtgg cgtgctgctt ctgtcacttg ttattacact gtactgtaaa     1020
cgcgggcgaa aaaaattgct gtatattttt aagcagccat ttatgaggcc cgttcagacg     1080
acgcaggagg aggacggttg ctcttgcagg ttcccagaag aggaagaagg gggctgtgaa     1140
ttgcgggtta aattttcaag atccgcagac gctccagcat accaacaggg acaaaaccaa     1200
ctctataacg agctgaatct tggaagaagg gaggaatatg atgtgctgga taaacggcgc     1260
ggtagagatc cggagatggg cggaaaacca aggcgaaaaa accctcagga gggactctac     1320
aacgaactgc agaaagacaa aatggcggag gcttattccg aaataggcat gaagggcgag     1380
cggaggcgag ggaaagggca cgacggactg tatcaaggcc tctcaaccgc gactaaggat     1440
acgtacgacg ccctgcacat gcaggccctg cctccgaga                            1479
<210> 259
<211> 1416
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 259
caggtacaat tgcaggagtc tggaggcggt gtggtgcaac ccggtcgcag cttgcgcctg       60
agttgtgctg cgtctggatt tacattttca tcttacggaa tgcattgggt acgccaggca      120
ccggggaaag gccttgaatg ggtggctgta atttcatacg atggttccaa caaatactat      180
gctgactcag tcaagggtcg atttacaatt agtcgggaca actccaagaa caccctttat      240
cttcaaatga attcccttag agcagaggat acggcggtct attactgtgg tggcagtggt      300
tatgcacttc atgatgatta ctatggcttg gatgtctggg ggcaagggac gcttgtaact      360
gtatcctctg gtggtggtgg tagtggtggg ggaggctccg gcggtggcgg ctctcaatct      420
gctctgactc aaccagcaag cgtatcaggg tcaccgggac agagtattac cataagttgc      480
acggggacct ctagcgatgt aggggggtat aattatgtat cttggtatca acaacacccc      540
gggaaagccc ctaaattgat gatctacgac gtgagcaatc gacctagtgg cgtatcaaat      600
cgcttctctg gtagcaagag tgggaatacg gcgtccctta ctattagcgg attgcaagca      660
gaagatgagg ccgattacta ctgcagctcc tatactagct cttctacatt gtacgtcttt      720
gggagcggaa caaaagtaac agtactcaca acaacacctg ccccgagacc gcctacacca      780
gccccgacta ttgccagcca gcctctgagc ctcaggcctg aggcctgtag gcccgcagcg      840
ggcggcgcag ttcatacacg gggcttggat ttcgcttgtg atatttatat ttgggctcct      900
ttggcgggga catgtggcgt gctgcttctg tcacttgtta ttacactgta ctgtaaacgc      960
gggcgaaaaa aattgctgta tatttttaag cagccattta tgaggcccgt tcagacgacg     1020
caggaggagg acggttgctc ttgcaggttc ccagaagagg aagaaggggg ctgtgaattg     1080
cgggttaaat tttcaagatc cgcagacgct ccagcatacc aacagggaca aaaccaactc     1140
tataacgagc tgaatcttgg aagaagggag gaatatgatg tgctggataa acggcgcggt     1200
agagatccgg agatgggcgg aaaaccaagg cgaaaaaacc ctcaggaggg actctacaac     1260
gaactgcaga aagacaaaat ggcggaggct tattccgaaa taggcatgaa gggcgagcgg     1320
aggcgaggga aagggcacga cggactgtat caaggcctct caaccgcgac taaggatacg     1380
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgcct ccgaga                               1416
<210> 260
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 260
caggtacaat tgcaggagtc tggaggcggt gtggtgcaac ccggtcgcag cttgcgcctg       60
agttgtgctg cgtctggatt tacattttca tcttacggaa tgcattgggt acgccaggca      120
ccggggaaag gccttgaatg ggtggctgta atttcatacg atggttccaa caaatactat      180
gctgactcag tcaagggtcg atttacaatt agtcgggaca actccaagaa caccctttat      240
cttcaaatga attcccttag agcagaggat acggcggtct attactgtgg tggcagtggt      300
tatgcacttc atgatgatta ctatggcttg gatgtctggg ggcaagggac gcttgtaact      360
gtatcctct                                                              369
<210> 261
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 261
caatctgctc tgactcaacc agcaagcgta tcagggtcac cgggacagag tattaccata       60
agttgcacgg ggacctctag cgatgtaggg gggtataatt atgtatcttg gtatcaacaa      120
caccccggga aagcccctaa attgatgatc tacgacgtga gcaatcgacc tagtggcgta      180
tcaaatcgct tctctggtag caagagtggg aatacggcgt cccttactat tagcggattg      240
caagcagaag atgaggccga ttactactgc agctcctata ctagctcttc tacattgtac      300
gtctttggga gcggaacaaa agtaacagta ctc                                   333
<210> 262
<400> 262
000
<210> 263
<400> 263
000
<210> 264
<400> 264
000
<210> 265
<400> 265
000
<210> 266
<400> 266
000
<210> 267
<400> 267
000
<210> 268
<400> 268
000
<210> 269
<400> 269
000
<210> 270
<400> 270
000
<210> 271
<400> 271
000
<210> 272
<400> 272
000
<210> 273
<400> 273
000
<210> 274
<400> 274
000
<210> 275
<211> 132
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 275
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ser Pro Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Val Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly
20                  25                  30
Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr
35                  40                  45
Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg
50                  55                  60
Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly
65                  70                  75                  80
Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu
85                  90                  95
Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile
100                 105                 110
Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu
115                 120                 125
Glu Thr Ser Tyr
130
<210> 276
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 276
Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys
1               5                   10                  15
Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly
20                  25                  30
Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met
35                  40                  45
Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln
50                  55                  60
Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu
85                  90                  95
Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Thr Ser
100                 105
<210> 277
<211> 93
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 277
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85                  90
<210> 278
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 278
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 279
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 279
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 280
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 280
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 281
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<220>
<221> MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223> Любая аминокислота
<220>
<221> MOD_RES
<222>  (78)..(78)
<223> Любая аминокислота
<400> 281
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 282
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 282
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 283
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 283
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 284
<211> 1132
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 284
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1               5                   10                  15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20                  25                  30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35                  40                  45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50                  55                  60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85                  90                  95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100                 105                 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115                 120                 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130                 135                 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145                 150                 155                 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165                 170                 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180                 185                 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195                 200                 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210                 215                 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225                 230                 235                 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245                 250                 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260                 265                 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275                 280                 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290                 295                 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305                 310                 315                 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325                 330                 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340                 345                 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355                 360                 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370                 375                 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385                 390                 395                 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405                 410                 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420                 425                 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435                 440                 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450                 455                 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465                 470                 475                 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485                 490                 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500                 505                 510
Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515                 520                 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530                 535                 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545                550                 555                 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565                 570                 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580                 585                 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595                 600                 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610                 615                 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625                 630                 635                 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645                 650                 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660                 665                 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675                 680                 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690                 695                 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705                 710                 715                 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725                 730                 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740                 745                 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755                 760                 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770                 775                 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785                 790                 795                 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805                 810                 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820                 825                 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835                 840                 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850                 855                 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865                 870                 875                 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885                 890                 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900                 905                 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915                 920                 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930                 935                 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945                 950                 955                 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965                 970                 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980                 985                 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn  Ile Tyr Lys Ile Leu  Leu Leu Gln
995                 1000                 1005
Ala Tyr  Arg Phe His Ala Cys  Val Leu Gln Leu Pro  Phe His Gln
1010                 1015                 1020
Gln Val  Trp Lys Asn Pro Thr  Phe Phe Leu Arg Val  Ile Ser Asp
1025                 1030                 1035
Thr Ala  Ser Leu Cys Tyr Ser  Ile Leu Lys Ala Lys  Asn Ala Gly
1040                 1045                 1050
Met Ser  Leu Gly Ala Lys Gly  Ala Ala Gly Pro Leu  Pro Ser Glu
1055                 1060                 1065
Ala Val  Gln Trp Leu Cys His  Gln Ala Phe Leu Leu  Lys Leu Thr
1070                 1075                 1080
Arg His  Arg Val Thr Tyr Val  Pro Leu Leu Gly Ser  Leu Arg Thr
1085                 1090                 1095
Ala Gln  Thr Gln Leu Ser Arg  Lys Leu Pro Gly Thr  Thr Leu Thr
1100                 1105                 1110
Ala Leu  Glu Ala Ala Ala Asn  Pro Ala Leu Pro Ser  Asp Phe Lys
1115                 1120                 1125
Thr Ile  Leu Asp
1130
<210> 285
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 285
Arg Gly Asp Ser
1
<---