Ультраструктурные аспекты изучения влияния рекомбинантных штаммов холерного вибриона на организм биомодели

I Физиолого-биохимический механизм регистрируемых эффектов ауторегуляции заключается, по-видимому, в том, что в условиях снижения энерготрат (по завершении стационарной фазы развития) переживающая популяция бактерий переключает свой метаболизм на менее энергопродуктивный - 'гликолитический путь, усиливая одновременно метаболический (аденилатный) контроль за дыхательной активностью клеток.

Таким образом, представленные в работе результаты свидетельствуют о том, что исследование ауторегуляции дыхательной активности Y. pestis является информативным способом оценки физибло-гического (функционального) состояния бактерий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Головлев E.JI., Головлева JI.А. //Микробиология. - 2000. - Т. 69, №2. - С. 149-162. - 2. Голубинский Е.П., Рублев Б.Д., Кирдеев В.К. // Вопр. мед. химии. 1971. - Т. 16, № 5. - С. 512-515. - З.Канчух А.А., Голубинский Е.П., Иванова B.C. // Биохимия. - 1973. - Т. 38, № 2. - С. 246-249. - 4. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 5.’Лукьянова Л.Д., Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. - М.: Наука, 1982. - 302 с. - 6.;Лу-коянова М.А., Тихонова Г.В. // Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия. - М.: ВИНИТИ, 1982. - № 17. - С. 33-74. -

7. Мартынов Н.В., Чеботарев Е.В., Лебединский

В. А. и др. // Журн. микробиол. - 1990. - № 12. - С. 19-21. -

8.Минкевич И.Г., Ерошин В.К. // Усп. совр. биол. -1976. - Т. 82, № 1. - С. 103-116.-9. Пименов Е.В., Дармов И.В., Бывалов А. А. и др. //Журн. эволюционной биохим. и физиол. - СПб: Наука, 2004. - Т. 40, №2. - С. 180-186. -10. Руководство по изучению биологического окисления

полярографическим методом / Под ред. Г.М.Франка. - М.: Наука, 1973. - 11. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды / Пер. с англ. Под ред. В.П.Скулачева. - М.: Мир, 1979. - 12. Burstein С., Tiankova L., Kepes А. //Eur. J. Biochem. - 1979. -N94. -С. 387-392. - 13. Chance В., Williams GЯ. II Adv. Enzymol.- 1956. - N 17. - C. 65-134. -14. Plate C.A. // Microbiology. - 1979..- P. 58-61. - 15. Tsu-chiya Т., Rosen B.P. // FEBS Lett. - 1980. - Vol. 120, N 1. -P. 128-130.

E.V.Chebotaryov, E.V.Pimenov, A.A.Byvalov, M.K.Bakulin, A.V.Kozhemyako

Autoregulation of Respiratory Activity in Yersinia pestis

Microbiology Research Institute, RF MD, Kirov; Physiology Institute, Komi Research Center of the Urals Department of RAS, Syktyvkar; Vyatka State University, Kirov

The polarographic techniques were used to substantiate the possibility of in vitro modeling of an autoregulated succession of metabolic conditions in Yersinia pestis bacterial cells (analogous to isolated mitochondria) by adding microconcentrations of glucose into the cultivation medium. The authors offer the index of "metabolic respiratory control" (MRC) which is estimated according to the polarogram to characterize the degree of energy-dependent autoregulation of Y. pestis respiratory function, and is numerically calculated as a ratio of bacteiial breathing rate in the active state (condition 3) to that in the "rest" state (condition 4). Two Y. pestis populations, a developing and a surviving ones, were used to demonstrate the possibility of assessing physiologic conditions of bacteria on the basis of respiratory autoregulation parameters.

Key words', plague pathogen (Yersinia pestis), glucose oxidation, autoregulation of respiratory activity, respiratory control, polarography.

Поступила 30.30.05.

ПАТОГЕНЕЗ, ИММУНОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА

УДК 616:932:576.8

С.А.Бугоркова, Л.ФЛиванова, И.М.Кобкова, Т.В.Бугоркова, Н.П.Коннов, О.С.Кузнецов,

Н.И.Смирнова

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА НА ОРГАНИЗМ БИОМОДЕЛИ

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

: Проведено изучение влияния рекомбинантных штаммов холерного вибриона 01- и 0139-серогрупп на ультраструктуру клеток кишечника биомодели для оценки их безопасности. Отличия, выявленные при исследовании улырамикроскопических изменений у животных экспериментальных групп, позволили в определенной мере охарактеризовать особенности реакции клеток макроорганизма на рекомбинантный штамм 0139-серо-группы. Применение ультрамикроскопического анализа изменений в клетках подопытных животных при изучении рекомбинантных штаммов, предлагаемых в качестве вакцинных, на этапах авторских исследований в определенной степени способствует решению проблемы оценки значимости тех или иных нарушений, выявляе-; мых при световой микроскопии* и позволяет дифференцировать процессы адаптации и компенсации от патологий в организме биомодели.

! Ключевые слова\ рекомбинантные штаммы* холерные вибрионы, электронная микроскопия, адаптационная реакция.

До тех пор пока существует угроза завоза и и экономические потери государствам, не утратит

распространения холеры, и эта инфекция в любое своей актуальности проблема разработки средств ее

время может вызывать неожиданные эпидемиче- специфической профилактики. Перспективными

ские осложнения, нанося значительные социальные препаратами для иммунопрофилактики холеры ос-

таются живые оральные вакцины [10, 15].

Сложившаяся в девяностые годы прошлого века эпидемиологическая ситуация по холере, связанная с появлением бенгальских штаммов, обусловила необходимость разработки новых холерных вакцин [12, 15]. Для вибрионов 0139-серогруппы характерно наличие иных поверхностных антигенов (0139-антигена, полисахаридной капсулы), что затрудняет при проведении авторских исследований комплексную оценку реактогенности разрабатываемых на их основе рекомбинантных штаммов.

Идеальный препарат для специфической профилактики заболеваний должен быть не только безопасен, но и высокоэффективен [9]. Изучение этих характеристик у противохолерных препаратов при доклинических испытаниях предусматривает использование экспериментальных животных. Для преодоления естественной резистентности у биомоделей при создании достаточно напряженного иммунитета приходится вводить относительно большие дозы вакцинирующих препаратов и увеличивать кратность их инокуляции, что, возможно, далеко не безразлично для макроорганизма. Важнейшей задачей современных исследований является направленный поиск тестов, позволяющих характеризовать механизмы физиологической адаптации и компенсации организма экспериментальных животных до появления патологических изменений [4, 5]!

Успешному решению этой задачи способствует сочетание методов световой микроскопии с ультра-структурным анализом, который позволяет выявлять ранние изменения клеток по состоянию их органелл. При исследовании холерных рекомбинантных штаммов в первую очередь следует оценивать функциональную активность призматического эпителия кишечника и состояние эпителия, ассоциированного с лимфоидной тканью последнего (пейеровы бляшки) как основного барьера на пути холерного вибриона.

Цель настоящей работы - изучение влияния рекомбинантных штаммов холерных вибрионов на ультраструктуру клеток кишечника биомодели для оценки их безопасности.

Материалы и методы

Исследование выполнено на взрослых кроликах породы шиншилла массой 2,5-3 кг (6 животных). Часть животных 3-кратно перорально иммунизировали штаммом 0139-серогруппы Vibrio cholerae КМ 182, содержащем рекомбинантные плазмиды с про-тективными антигенами - В-субъединицы холерного токсина и адгезина CFA/I, в дозе 5Ю10КОЕ [6]. Другая часть кроликов была однократно иммунизирована рекомбинантным штаммом 01-серогруппы V. cholerae КМ 184 в дозе 5Ю10КОЕ, который по результатам государственных испытаний, предложен в качестве препарата сравнения при доклинических исследованиях новых штаммов, перспективных в качестве вакцинных [2]. Для сравнения группу кроликов заражали токсигенным штаммом холерных вибрионов Р16064 в дозе Ю9КОЕ. Материал забирали от кроликов, умерщвленных хлороформом: у вакцинированных животных на 14-й день после последней иммунизации, а у зараженных на 1-2-й день наблюдения. Если у зараженных токси-генными холерными вибрионами кроликов имели

место видимые характерные для холерной инфекции изменения со стороны кишечника и внутренних органов, то у иммунизированных животных таковых не наблюдали. Для электронно-микроскопического исследования забирали материал (тонкий, толстый кишечник, пейеровы бляшки) размером 1 мм3 и фиксировали его в 2,5 % растворе глутаральдеги-да, с последующей дофиксацией в 1 % растворе осмиевой кислоты. Затем после обезвоживания и заливки материала в эпон 812 готовили срезы на ультрамикротоме ЬКВ 8800. Готовые срезы контрастировали на сетках уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу [14] и изучали в электронном микроскопе ШМ-7 А при инструментальном увеличении 3000-14800. Часть материала в виде полутон-ких срезов на стекле использовали для выполнения стандартной реакции иммунофлуоресценции с экспериментальной серией диагностического препарата Иммуноглобулины диагностические холерные 0139 флуоресцирующие кроличьи сухие, любезно предоставленного Е.Г.Абрамовой и препарата Иммуноглобулины диагностические холерные флуоресцирующие сухие. Срезы просматривали в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ РП011 при увеличении 1300.

Результаты и обсуждение

Ни один экспериментальный процесс в организме биомодели не проходит без изменений на клеточном уровне, но степень выраженности таковых зависит от силы воздействия.

Ультраструктурный анализ выявленных изменений у животных группы сравнения показал, что в условиях попадания в кишечник взрослого кролика вирулентных холерных вибрионов 0139-серогруппы в указанной дозе эпителиоциты претерпевали изменения в виде очагового укорочения или утолщения микроворсинок на апикальной части клеток. У отдельных микроворсинок эпителиоцитов тонкого кишечника отмечено незначительное пузыреоб-разование (рис. 1, а), которое, как правило, сопровождается усилением поглощения клеткой воды, что, в конечном счете, и ведет к ее гидропической дистрофии. На развитие у животных этой группы ультрамикроскопических признаков страдания эпителиальной выстилки кишечника указывало образование большого количества вакуолей в цитоплазме энтероцитов, участки очагового просветления и гомогенизации последней, наличие гиперсекретирую-щих бокаловидных клеток с разрывом цитоплазматической мембраны и выбросом секрета в просвет кишки. В районе локального разрушения мембран клеток кишечного барьера обнаруживали групповые скопления микробов или единичные микробные клетки, относительно плотно прилегающие к зоне разрушенных цитоплазматических мембран клеток (рис. 1, б, в). Принадлежность микробов к холерным вибрионам подтверждена при люминесцентной микроскопии аналогичных срезов кишечника. Чаще микробные клетки встречались в подвздошном отделе тонкого кишечника. В эпителиоцитах тонкого кишечника, кроме того, наблюдали отек кариоплазмы, отдельные клетки собственной пластинки слизистой оболочки кишечника находились в состоянии парциального некроза. Клеточные органоиды в

Рис. 1. Ультраструктурные изменения в клетках кишечника взрослых кроликов после введения вирулентных холерных вибрионов штамма Р 16064: а - образование пузырей на апикальной поверхности микроворсинок эпителиоцита подвздошного отдела тонкого кишечника, х 4000; б - холерный вибрион в слое кишечной слизи, х 6000; в - холерный вибрион вблизи активно секретирующей бокаловидной клетки, участки просветления и гомогенизации цитоплазмы клеток кишечного эпителия, фрагментация микроворсинок, х 5000; . г - образование миелиноподобных структур в клетках собственной пластинки слизистой оболочки тонкого кишечника, х 6000

таких клетках были в состоянии вакуолизации. Встречались области изменения плазмолеммы и мембран органелл клеток в виде образования «миелиноподобных структур», возникновение которых чаще всего связывают с нарушением процессов пе-рекисного окисления липидов (рис. 1, г).

У животных, иммунизированных рекомбинантными штаммами холерного вибриона (01- и 0139-серогрупп), изменений по характеру и степени выраженности, подобных описанным выше, не отмечалось. Но и у животных экспериментальных групп регистрировали признаки изменения функционального состояния клеток эпителия кишечника и его стромы. Наблюдали некоторое усиление функциональной активности ядер эпителиоцитов и лимфоцитов в виде диффузного расположения хроматина в ядре и увеличение числа ядерных пор (рис. 2, а). Встречались единичные клетки с резкой конденсацией хроматина, рассматриваемые нами как клетки с пониженной функциональной активностью, но в процентном отношении количество таковых не превышало 0,01 % (х 3000). Цитоплазма апикального отдела бокаловидных клеток у этих животных была растянута муцигеновыми капельками сферической или овальной формы, различной электронной плотности, апикальная поверхность клеток лишена мик-роворсинок, что характерно для клеток в стадии секреции, редко встречались молодые ..бокаловидные клетки в состоянии накопления секрета. Среди отдельных клеток кишечника кроликов, иммунизированных штаммом V. с1го1егае КМ 182, отмечали некоторую гипертрофию органелл, в частности,/цитоплазматической сети, что может свидетельствовать об) определенном напряжении синтетических внутриклеточных функций. Это можно рассматривать, как адаптацию организма на клеточном уровне к новому функциональному состоянию. Но в кишечнике экспериментальных групп также встречались клетки с явлениями вакуолизации органелл, что соответствует состоянию дистрофии, описывае-

мой при световой микроскопии, хотя степень выраженности и частота встречаемости таких клеток значительно ниже, чем у животных, зараженных вирулентными холерными вибрионами. У животных, иммунизированных рекомбинантными штаммами, достаточно часто встречались иммунные лимфоциты с крупным ядром, краевым расположением хроматина, крупным ядрышком и несколько увеличенным количеством лизосом в цитоплазме (рис. 2, б). Причем наличие таковых в кишечнике кроликов, которым вводили штамм V. ско1егае КМ 182, было несколько больше, чем на введение штамма холерных вибрионов КМ 184. А вот зрелые плазматические клетки и лимфоплазмобласты в состоянии умеренной функциональной активности чаще встречались среди клеток кишечника животных, иммунизированных штаммом 01-серогруппы. В цитоплазме клеток эпителия, ассоциированного с лимфоидной тканью пейеровой бляшки, обнаруживались пищеварительные вакуоли.

Несмотря на общую схожесть и относительную доброкачественность изменений, выявляемых на введение биомоделям рекомбинантных штаммов холерных вибрионов 01- и 0139-серогрупп, которые на основании обнаруженных ультрамикроскопических изменений клеток можно отнести к компенсаторным реакциям макроорганизма, нельзя не отметить некоторые особенности, связанные с инокуляцией холерных вибрионов штамма V. сШегае КМ 182. В подвздошной кишке кроликов, иммунизированных этим штаммом, при электронной микроскопии наблюдали единичные микробные клетки, принадлежность которых к холерным вибрионам была подтверждена при люминесцентной микроскопии, а вот в кишечнике животных, которым были инокулированы холерные вибрионы 01-группы штамма КМ 184, ни в одном случае холерные вибрионы не обнаружены. В

Рис. 2. Ультраструктурные изменения в клетках кишечника взрослых кроликов на 14-е сутки после иммунизации рекомбинантными штаммами холерных вибрионов 01- и 0139-серогрупп: а - функционально активное ядро эпителиальной клетки кишечника кролика, иммунизированного холерными вибрионами рекомбинантного штамма КМ 184. х 10000; б - эозинофильный гранулоцит в собственной пластинке слизистой оболочки подвздошного отдела кишечника кролика, иммунизированного холерными вибрионами рекомбинантного штамма КМ 182. х 2600; в - иммунный лимфоцит в кишечнике животного, иммунизированного холерными вибрионами штамма КМ 182. х 6000; г - клетка, в цитоплазме которой находятся фагоцитированные включения бактериальной природы. Кролик иммунизирован холерными вибрионами штамма КМ 182. х 6000

слизистой оболочке кишечника животных, иммунизированных рекомбинантным штаммом 0139-серо-группы, довольно часто обнаруживали эозинофильные гранулоциты в состоянии накопления секрета (рис. 2, в), встречались гистиоциты с фагоцитированными включениями в цитоплазме, содержащими микробные клетки, по морфологии идентичные холерным вибрионам (рис. 2, г). Среди клеток пейеро-вой бляшки часто встречались большие гранулярные лимфоциты, так называемые нейроэндокринные элементы [11].

Эпителий желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) -это первая линия защиты на пути холерного вибриона и по его состоянию можно судить о нарушении клеточного и, соответственно, тканевого гомеостаза, что, в конечном счете, сводится к оценке гомеостаза макроорганизма [1]. Заражение вирулентными холерными вибрионами штамма Р16064 вызывает интенсификацию процессов везикулообразо-вания, появление миелиноподобных структур, локальное разрушение мембран клеток, что свидетельствует о сильном мембранотропном действии этого патологического агента. У кроликов, иммунизированных рекомбинантными штаммами холерных вибрионов 01- и 0139-серогрупп, в клетках, несмотря на усиление активности функциональных систем, сохраняется равновесие между процессами синтеза и распада, что свидетельствует о доброкачественности происходящих в них изменений и, следовательно, об определенной клеточной адаптации к воздействию этими агентами.

Отличия, выявленные при исследовании ульт-рамикроскопических изменений у животных экспериментальных групп, позволили в определенной мере охарактеризовать особенности реакции клеток макроорганизма на рекомбинантный штамм 0139-серогруппы. Факт длительного пребывания холерных вибрионов не 01-группы в макроорганизме, отмеченный рядом авторов [3, 7], подтверждается обнаружением (14-е сутки после инокуляции) холерных вибрионов 0139-серовара в слое кишечной слизи у подопытных животных. Возможно длительным пребыванием антигенного материала в кишечнике кроликов, иммунизированных рекомбинантным штаммом холерных вибрионов 0139-серогруппы, можно объяснить инфильтрацию слизистой и собственной пластинки слизистой оболочки кишечника значительным количеством эозинофильных грануло-цитов в стадии активного синтеза. Длительное пребывание бактерий и последующая их гибель в кишечнике привитых животных - основная причина риска развития эндотоксикоза [7, 13]. Не исключено, что этим и объясняется умеренное мембранотропное действие рекомбинантного штамма холерных вибрионов 0139-серогруппы. Накопление иммунных лимфоцитов, активация больших гранулярных лимфоцитов в пейеровых бляшках у этих животных может свидетельствовать о начале формирования реакций гиперчувствительности замедленного типа при использовании 3-кратной схемы иммунизации. А преобладание среди клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника лимфоцитов по отношению к зрелым плазматическим клеткам наводит на мысль о несколько ином механизме формирования иммунного ответа при использовании реком-

бинантного штамма холерных вибрионов 0139-серогруппы или его временной отсрочке.

Таким образом, ультрамикроскопический анализ изменений в клетках подопытных животных при изучении рекомбинантных штаммов, предлагаемых в качестве вакцинных, на этапах авторских исследований в определенной степени способствует решению проблемы оценки значимости тех или иных нарушений, выявляемых при световой микроскопии, и позволяет дифференцировать процессы адаптации и компенсации от патологии. Такой методический подход открывает широкие перспективы взаимосвязанного анализа систем разных уровней интеграции в условиях воздействия на организм биомодели исследуемых препаратов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Адамов А.К. Иммунология холеры. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1981. - 319 с. - 2. Анисимова Т.И., Дроздов И.Г., Щуковская Т.Н. и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы: Сб. матер, пробл. комиссии, по сан-эпид. охране террит. РФ. - Ростов-н/Д, 2002. - Вып. 15. - С. 108-109,- 3. Баймуратов М.М., Седина С.Г., Чума-ченко В.Д. и др. // Акт. вопр. эпидемиол., профилакт. и диагн. особо опасных инф. - Ставрополь, 1989. - Ч 1. - С. 14-15. -

4. Белов Л.Г. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1994. -Вып. 5 (75). - С. 191-196. - 5.Бугоркова С.А., Задумина

С.Ю., Исупов И.В. и др. // Пробл. особо опасных инф. -Саратов, 2003. - Вып. 86. - С. 108-116. - 6.Кобкова И.М., Ливанова Л.Ф., Осин А.В., Смирнова Н.И. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004. - Вып. 1 (87). - С. 45-47. -7.Левкович А.А., Квасов Е.М., Текнеджан В.Г. и др. // Сб. науч. тр. - Новороссийск, 1994. - Вып. 1. - С. 127— 128.- 8. Ледванов М.Ю., Смирнов Г.Б., Наумов А.В. и др. // Иммунол. и специф. профилакт. особо опасных инф. -Саратов, 1993. - С. 180-181. - 9. Медуницын Н.В. // Эпидемиол. и инф. бол. - 2002. - № 4. - С. 52-56. - 10. Приоритетные направления научных исследований, предпринимаемых в целях создания вакцин против диарейных болезней: меморандум совещ. ВОЗ // Бюл. ВОЗ. - 1991. - Т. 69, № 6. - С. 19-28. - 11. Райхлин Н.Т., Кветной И.М., Осадчук М. А. APUD-система (общепатологические и онкологические аспекты). - Обнинск, 1993. - Ч. 2. - С. 110. - 12. Farfan М., Min-ina-Galbis D., Fuste М.С. et al. II J. Bacteriol. - 2001. -Vol. 184, N5. - P. 1304-1313. - 13. Holmgren J., Svenner-holm A.-M. //Scand. J. Inf. Dis. - 1990. - Vol. 76. - P. 47-53. -14. Reynolds E.S. //J. Cell Biology. - 1963. - Vol. 17. - P. 208-212. - 15. Weekly Epidemiol. Record. - 2001. - Vol. 76, N 16. -P. 117-124.

5.A.Bugorkova, L.F.Livanova, I.M.Kobkova, N.P.Konnov, O.S.Kouznetsov,

N.I.Smimova

Ultrastructural Aspects of Investigations into the Effects of Recombinant Vibrio cholerae Strains upon a Biologic Model Organism

Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov

The influence of recombinant Vibrio cholerae strains serogroups 01 and 0139 on the ultrastructure of intestinal cells of a biomodel was studied with the aim of assessing their safety. The differences found in ultramicro-scopic studies of the changes in a group of experimental animals made it possible, at least partially, to characterize the peculiarities of host cells' response to the recombinant strain 0139 serogroup. Application, at the stages of authors' investigations, of the ultramicroscopic analysis to study the alterations in the cells of test animals while estimating the recombinant strains, offered as candidates for vaccine preparations, would, to a certain degree, facilitate the decision of the problem of assessing the significance of various disorders detected by the light microscopic studies, permitting the adaptation and compensation processes to be differentiated from pathologic ones in the host biomodel organism.

Key words: recombinant strains, cholera vibrios, electronic microscopy, adaptation reaction.

Поступила 10.03.05.