ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ HPV 58 L1 В ДРОЖЖАХ
OPTIMISED EXPRESSION OF HPV 58 L1 IN YEAST

В основном настоящее изобретение относится к профилактике и/или лечению папилломавирусной инфекции человека (HPV). Более конкретно настоящее изобретение относится к синтетическим полинуклеотидам, кодирующим белок L1 HPV58, и к рекомбинантным векторам и хозяевам, содержащим указанные полинуклеотиды. Это изобретение также относится к HPV58 вирусоподобным частицам (VLP), где VLP получают посредством экспрессии рекомбинантных LI или LI и L2 HPV58 в клетках дрожжей и их применению в вакцинах и фармацевтических композициях для профилактики и лечения HPV инфекций.
Предпосылки изобретения
et al
in situ
et al
Существует более 80 типов вирусов папилломы человека (HPV), многие из которых связаны с широким спектром биологических фенотипов, от доброкачественных пролиферативных разрастаний до злокачественных карцином (для обзора см. McMurray ., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33(2001)). HPV6 и HPV11 представляют собой типы, наиболее часто связанные с доброкачественными разрастаниями, незлокачественной остроконечной кондиломой и/или слабовыраженной дисплазией генитальной или дыхательной слизистых оболочек. HPV16 и HPV18 представляют собой типы с высокой степенью риска, наиболее часто связанные с  и инвазивными карциномами шейки матки, влагалища, вульвы и анального канала. Более 90% карцином шейки матки связаны с инфекциями HPV16, HPV18 или менее распространенными онкогенными типами HPV31, -33, -45, -52 и -58 (Schiffman ., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). Наблюдение, что ДНК HPV обнаруживают в более чем в 90% случаев карцином шейки матки представляет серьезное эпидемиологическое доказательство, что HPV вызывают карциному шейки матки.
Вирусы папилломы представляют собой небольшие (50-60 нм) вирусы, безоболочечные ДНК-содержащие вирусы икосаэдрической формы, кодирующие до восьми ранних и двух поздних генов. Открытые рамки считывания (ORF) вирусных геномов обозначают от E1 до E7 и L1 и L2, где «E» обозначает ранний и «L» обозначает поздний. L1 и L2 кодируют белки вирусного капсида, тогда как гены E ассоциированы с такими функциями, как вирусная репликация и трансформация клеток.
Белок L1 представляет собой основной белок капсида и имеет молекулярную массу 55-60 кДа. Белок L2 представляет собой минорный белок капсида. Иммунологические данные свидетельствуют о том, что большая часть белка L2 в капсиде вируса располагается с внутренней стороны от белка L1. Оба белка и L1 и L2 у различных папилломавирусов высококонсервативны.
Экспрессия белка L1 или сочетания белков L1 и L2 в дрожжах, клетках насекомых, клетках млекопитающих или бактерий приводит к самосборке вирусоподобных частиц (VLP) (для обзора см. Schiller and Roden, в Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). VLP являются морфологически сходными с аутентичными вирионами и способны индуцировать высокие титры нейтрализующих антител при введении животным или людям. Они представляют собой безопасную альтернативу применению живого вируса при разработке вакцины к HPV, так как VLP не содержат потенциально онкогенного вирусного генома (для обзора см. Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). По этой причине гены L1 и L2 идентифицировали как иммунологические мишени для развития профилактических и терапевтических вакцин против инфекции и заболевания HPV.
Разработке и внедрению вакцины к HPV препятствовали трудности, связанные с получением высоких уровней экспрессии капсидных белков в успешно трансформированных организмах хозяев, ограничивающие продукцию очищенного белка. Таким образом, несмотря на идентификацию нуклеотидных последовательностей дикого типа, кодирующих белки L1 HPV, таких как белок L1 HPV58, было бы очень желательно разработать быстро возобновляемый источник незрелого белка L1 HPV, который использует кодирующие L1 HPV58 нуклеотидные последовательности, оптимизированные для экспрессии в планируемой клетке-хозяине. Кроме того, было бы полезно получать большие количества VLP L1 HPV58 с иммунными свойствами нативных белков для применения в разработке вакцин.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам для установления или повышения иммунитета к белковым продуктам, экспрессируемым генами L1 HPV58. Конкретно, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим белок L1 HPV58, где полинуклеотиды кодон оптимизированы для высокого уровня экспрессии в дрожжевой клетке. Кроме того, настоящее изобретение относится к HPV58 вирусоподобным частицам (VLP), где указанные VLP получают посредством экспрессии рекомбинантных LI или Ll и L2 HPV58 в дрожжевых клетках, и в нем описано применение HPV58 VLP в фармацевтических композициях и вакцинах для профилактики и/или лечения рака, ассоциированного с HPV.
Настоящее изобретение относится к синтетическим молекулам ДНК, кодирующим белок L1 HPV58. Кодоны синтетических молекул сконструированы таким образом, чтобы применять кодоны предпочтительно в дрожжевой клетке. Синтетические молекулы можно применять в качестве источника белка L1 HPV58, способного к самосборке в VLP. Указанные VLP можно применять в вакцине на основе VLP.
Иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой молекулу синтетической нуклеиновой кислоты, кодирующую белок L1 HPV58, как указано в SEQ ID №: 2, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов с кодонами, оптимизированными для высокого уровня экспрессии в дрожжевой клетке. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеотидов, как указано в SEQ ID №: 1 (обозначенная здесь "последовательность L1 58 R").
Также изобретение относится к рекомбинантным векторам и рекомбинантным прокариотическим и эукариотическим клеткам-хозяевам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые по всему этому описанию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку.
Настоящее изобретение также относится к способу экспрессии белка L1 HPV58 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (a) введение в дрожжевую клетку-хозяина вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV58; и (b) культивирование дрожжевых клеток-хозяев в условиях, допускающих экспрессию указанного белка L1 HPV58.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV58 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (a) введение в дрожжевую клетку-хозяина вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV58, где молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу с кодонами, оптимизированными для оптимальной экспрессии в дрожжевой клетке-хозяине; и (b) культивирование дрожжевых клеток-хозяев в условиях, допускающих экспрессию указанного белка L1 HPV58.
По предпочтительным вариантам осуществления этого аспекта изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеотидов, как указано в SEQ ID №: 1.
Это изобретение также относится к продуцируемым в дрожжевых клетках HPV58 вирусоподобным частицам (VLP), способам продукции VLP HPV58 и способам применения VLP HPV58.
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis
Schizosaccharomyces pombe.
По предпочтительному варианту осуществления изобретения дрожжи выбирают из группы, состоящей из: и
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой VLP HPV58, где VLP получают посредством экспрессии рекомбинантных L1 HPV58 или L1 и L2 HPV58 в дрожжевой клетке.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой VLP HPV58, включающую в себя белок L1 HPV58, полученный посредством кодон-оптимизированного гена L1 HPV58. В иллюстративном варианте осуществления данного аспекта изобретения ген L1 HPV58 с оптимизированными кодонами содержит последовательность нуклеотидов, как указано в SEQ ID №: 1.
Данное изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа у животного, включающему в себя введение животному вирусоподобных частиц HPV58. По предпочтительному варианту осуществления VLP HPV58 продуцируются посредством гена с оптимизированными кодонами.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ профилактики или лечения ассоциированного с HPV рака шейки матки, включающий в себя введение млекопитающему вакцины, содержащей VLP HPV58. По предпочтительному варианту осуществления этого аспекта изобретения VLP HPV58 продуцируются в дрожжах.
Настоящее изобретение также относится к вакцине, содержащей вирусоподобные частицы (VLP) HPV58, где VLP HPV58 продуцируются в дрожжах.
По альтернативному варианту осуществления этого аспекта изобретения вакцина, кроме того, содержит VLP, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV. По меньшей мере, одним дополнительным типом HPV может являться любой представляющий интерес тип HPV, включающий в себя любой описанный в способе тип HPV или определенный далее тип HPV. По предпочтительному варианту осуществления тип HPV представляет собой тип, ассоциированный с клиническим фенотипом, таким как разрастания или рак шейки матки. Кроме того, по предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 и HPV68.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим вирусоподобные частицы HPV58 и фармацевтически приемлемый носитель, где VLP HPV58 продуцируются в дрожжах. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим VLP HPV58 и VLP, по меньшей мере, одного дополнительного типа HPV. По предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 и HPV68.
Как применяют по всему описанию и в прилагаемой формуле изобретения, единственные числа включают в себя форму множественного числа, если из контекста явно не следует иначе.
Как применяют по всему описанию и в прилагаемой формуле изобретения, употребляют следующие определения и аббревиатуры:
Термин «промотор» относится к сайту узнавания на цепи ДНК, с которой связывается РНК-полимераза. Промотор формирует с РНК-полимеразой комплекс инициации для инициации и управления транскрипционной активностью. Комплекс можно модифицировать посредством активирующих последовательностей, называемых «энхансеры» или «прилегающие активирующие последовательности», или ингибирующих последовательностей, названных «сайленсеры».
Термин «вектор» относится к некоторым средствам, посредством которых фрагменты ДНК можно вводить в организм хозяина или ткань хозяина. Существуют различные типы векторов, включающие в себя плазмиды, вирусы (включая аденовирусы), бактериофаги и космиды.
Термин «кассета» относится к нуклеотидной или генной последовательности, которую следует экспрессировать из вектора, например, нуклеотидная или генная последовательность, кодирующая белок L1 HPV58. Обычно кассета содержит генную последовательность, вставленную в вектор, который, по некоторым вариантам осуществления, предоставляет регуляторные последовательности для экспрессии нуклеотидной или генной последовательности. По другим вариантам осуществления нуклеотидная или генная последовательность предоставляет регуляторные последовательности для ее экспрессии. По дополнительным вариантам осуществления, вектор предоставляет некоторые регуляторные последовательности, и нуклеотидная или генная последовательность предоставляет другие регуляторные последовательности. Например, вектор может предоставлять промотор для транскрибирования нуклеотидной или генной последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность предоставляют последовательность терминации транскрипции. Регуляторные последовательности, которые можно предоставлять посредством вектора, включают в себя в качестве не ограничивающих примеров энхансеры, последовательности терминации транскрипции, акцепторные и донорные последовательности сплайсинга, интроны, последовательности связывания рибосом и дополнительные поли(A) последовательности.
Определения «последовательность дикого типа L1 58» и «последовательность wt L1 58» относятся к последовательности L1 HPV58, указанной здесь, как SEQ ID №: 3. Хотя последовательность дикого типа L1 HPV58 описана ранее, нередко находят незначительные вариации последовательностей между ДНК, полученными из клинических изолятов. Таким образом, репрезентативную последовательность дикого типа L1 58 выделяют из клинических образцов, для которых ранее показано, что они содержат ДНК HPV58 (см. пример 1). Последовательность дикого типа L1 58 применяют в качестве контрольной последовательности для сравнения с описанными здесь последовательностями L1 58 с оптимизированными кодонами (см. фиг.1).
Определения «L1 HPV58 R» и «L1 58 R» относятся к описанной здесь примерной синтетической нуклеотидной последовательности L1 HPV58 (SEQ ID №: 1), где последовательность перестраивают таким образом, чтобы она содержала кодоны, предпочтительные для высокого уровня экспрессии дрожжевой клеткой.
Термин «эффективное количество» означает, что введено достаточное количество композиции вакцины для получения адекватных уровней полипептида, чтобы вызвать иммунный ответ. Специалист в данной области поймет, что этот уровень может варьировать.
«Замена консервативных аминокислот» относится к замещению одного аминокислотного остатка другим химически сходным аминокислотным остатком. Примеры таких консервативных замен представляют собой: замену одного гидрофобного остатка (изолейцина, лейцина, валина или метионина) на другой; замену одного полярного остатка на другой полярный остаток того же заряда (например, аргинин на лизин; глутаминовую кислоту на аспарагиновую кислоту).
Термин «млекопитающие» относится к любым млекопитающим, включая человека.
«VLP» означает(ют) вирусоподобную частицу или вирусоподобные частицы.
«Синтетический» означает, что ген L1 HPV58 разработали таким образом, что он содержит последовательность нуклеотидов, не являющуюся такой же, как последовательность нуклеотидов, представленная в указанном встречающемся в природе гене дикого типа L1 HPV58 (58 LI wt, SEQ ID №: 3). Как установлено выше, представленные здесь синтетические молекулы содержат предпочтительную для экспрессии дрожжевыми клетками последовательность кодонов. Представленные здесь синтетические молекулы кодируют такие же аминокислотные последовательности, как ген дикого типа L1 HPV58 (SEQ ID №: 2).
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показано выравнивание последовательности, сравнивающее замененные нуклеотиды в синтетическом гене L1 HPV58 по настоящему изобретению (SEQ ID №: 1, указана как «L1 58 R») (см. пример 2). Эталонная последовательность представляет собой последовательность дикого типа L1 58 (SEQ ID №: 3, указана как «L1 58 wt»; см. пример 1). Замененные нуклеотиды указаны в соответствующем положении. Нуклеотидный номер содержится в скобках. Идентичные нуклеотиды в перестроенной последовательности L1 58 указаны точками.
На фиг.2 показаны перестроенная синтетическая двухцепочечная нуклеиновая кислота L1 HPV58, а сверху однобуквенная аминокислотная последовательность. Нуклеотидный номер указан слева.
На фиг.3 показан нозерн-блоттинг транскриптов L1 HPV58 wt и L1 58 R (см. пример 4). Блоттинг выполняли со смесью одинаковых количеств меченых DIG проб ДНК L1 HPV58 wt и L1 58 R. Общее количество подвергавшейся электрофорезу РНК на дорожку указано. Стрелка справа указывает предсказанный размер полноразмерного транскрипта L1 58.
На фиг.4 показан вестерн-блоттинг белков L1 HPV58 wt (58) и L1 58 R (58R). В качестве стандарта включили L1 HPV16 (16). Десять, пять и два с половиной микрограмм общего дрожжевого белкового экстракта подвергали денатурации и вносили в гель, содержащий 10% SDS. Белок L1 HPV58 определяли с применением абсорбированной на дрожжах козьей поликлональной антисыворотки к L1 trpE-HPV31, которая перекрестно связывает L1 58 и L1 16. Маркерная молекулярная масса указана в кДа слева.
На фиг.5 изображены количество (нг) захваченных и определенных посредством ELISA интактных VLP L1 HPV58 на микрограмм общего дрожжевого белка (см. пример 7). Приведены результаты двух экспериментов, проведенных в дуплетах. Экспрессия VLP L1 HPV58 wt (черный и серый прямоугольники) составила 36 нг/мкг общего дрожжевого белка. Экспрессия VLP L1 HPV58 R (белый и заштрихованный прямоугольники) перестроенного дрожжевого L1 58 с оптимизированными кодонами приблизительно в 2-3 раза выше, чем экспрессия L1 HPV58 wt, и достигает 95 нг/мкг общего дрожжевого белка в эксперименте № 2.
На фиг.6 показан репрезентативный образец VLP HPV58, составленных из описанных здесь белковых молекул HPV58 L1 R, визуализированных посредством трансмиссионной электронной микроскопии (см. пример 8). Черта изображает приблизительно 100 нм.
Подробное описание изобретения
Большинство карцином шейки матки связаны с инфекциями конкретными онкогенными типами папилломавирусов человека (HPV). Настоящее изобретение относится к композициям и способам для установления или повышения иммунитета к белковым продуктам, экспрессируемым генами онкогенных типов HPV. Конкретно, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим L1 HPV58, где у полинуклеотидов кодоны оптимизированы для высокого уровня экспрессии в дрожжах. Настоящее изобретение также относится к HPV58 вирусоподобным частицам (VLP), получаемым у дрожжей и описывает применение указанных полинуклеотидов и VLP в фармацевтических композициях и вакцинах для профилактики и/или лечения рака, ассоциированного с HPV.
et al.
Описана нуклеотидная последовательность дикого типа L1 HPV58 (Genbank инвентарный номер № NC_001443, см. Kirii  Virology 185(1): 424-427 (1991)). Настоящее изобретение относится к синтетическим молекулам ДНК, кодирующим белок L1 HPV58. Синтетические молекулы по настоящему изобретению содержат последовательность кодонов, где, по меньшей мере, некоторые из кодонов заменили с использованием кодонов, предпочтительных для высокого уровня экспрессии, в дрожжевой клетке. Синтетические молекулы можно применять в качестве кодирующей последовательности для экспрессии белка L1 HPV58, способного к самосборке в VLP. Указанные VLP можно применять в вакцине на основе VLP для предоставления эффективной иммунопрофилактики против папилломавирусной инфекции посредством нейтрализующего антитела и опосредованного клетками иммунитета. Такие вакцины на основе VLP также полезны для лечения уже установленных HPV инфекций.
Экспрессия VLP HPV в дрожжевых клетках предлагает преимущества, являющиеся экономически выгодными и легкоадаптируемыми к наращиванию больших количеств в ферментерах. Кроме того, геном дрожжей можно быстро изменять для гарантии отбора рекомбинантных, трансформированных дрожжей с повышенным потенциалом роста и экспрессии. Однако многие белки L1 HPV, включающие в себя L1 HPV58, экспрессируются в дрожжевых клетках на более низких уровнях, чем это желательно для коммерческого масштаба.
Таким образом, настоящее изобретение относится к последовательностям генов L1 HPV58, «оптимизированным» для высокого уровня экспрессии в клеточном окружении дрожжей.
E. coli
E. coli
E. coli
«Триплетный» кодон из четырех возможных нуклеотидных оснований может существовать более чем в 60 вариантах форм. Так как эти кодоны кодируют только 20 различных аминокислот (а также инициацию и терминацию транскрипции), некоторые аминокислоты могут быть кодированы одним или более кодоном, явление, известное как вырожденность генетического кода. По не совсем понятным причинам, альтернативные кодоны неравномерно представлены в эндогенной ДНК различных типов клеток. Действительно, полагают, что существует непостоянная природная иерархия или «предпочтение» определенных кодонов в определенных типах клеток. В качестве одного примера аминокислота лейцин соответствует любому из шести кодонов ДНК, включающих в себя CTA, CTC, CTG, CTT, TTA и TTG. Полный анализ частот использования кодона генома для микроорганизмов показал, что эндогенная ДНК  обычно содержит кодирующий лейцин кодон CTG, в то время как ДНК дрожжей и слизистой плесени чаще всего включает в себя кодирующий лейцин кодон TTA. В свете такой иерархии полагают, что вероятность получения высоких уровней экспрессии богатого лейцином полипептида посредством хозяина  будет зависеть в некоторой степени от частоты использования кодона. Например, вероятно, что богатый кодонами TTA ген будет низкоэкспрессирован в , тогда как богатый CTG ген, по-видимому, будет высокоэкспрессирован у данного хозяина. Сходным образом, предпочтительным кодоном для экспрессии богатого лейцином полипептида в дрожжевых клетках-хозяевах является TTA.
Значение феномена предпочтения кодона для способов рекомбинантных ДНК является очевидным, а феномен может служить для объяснения многих предыдущих неудач в получении высоких уровней экспрессии экзогенных генов в успешно трансформированных организмах-хозяевах - менее «предпочтительный» кодон может быть многократно представлен во вставленном гене, и механизм для экспрессии клетки-хозяина, возможно, не работает эффективно. Этот феномен означает, что синтетические гены, сконструированные для включения запланированных предпочитаемых клетками-хозяевами кодонов, представляют оптимальную форму чужеродного материала для осуществления экспрессии рекомбинантных белков. Таким образом, один из аспектов по данному изобретению представляет собой ген L1 HPV58 с оптимизированными кодонами для высокого уровня экспрессии в дрожжевой клетке. По предпочтительному варианту осуществления данного изобретения обнаружили, что применение альтернативных кодонов, кодирующих такую же белковую последовательность, может снимать ограничения на экспрессию белков L1 HPV58 дрожжевыми клетками.
Saccharomyces cerevisiae
По данному изобретению сегменты гена L1 HPV58 конвертировали в последовательности с идентично транслируемыми последовательностями, но с применением альтернативных кодонов, как описано у Sharp and Cowe (Synonymous Codon Usage in . Yeast 7: 657-678 (1991)), которая включена сюда в качестве ссылки. В общих чертах, принцип состоит в идентификации кодонов в последовательности дикого типа, которые обычно не связаны с высокоэкспрессированными генами дрожжей, и замещение их оптимальными кодонами для высокой экспрессии в дрожжевых клетках. Затем новую последовательность гена проверяют на образованные такими заменами кодонов нежелательные последовательности (например, последовательности «ATTTA», случайное образование участков узнавания сплайсинга интронов, нежелательных участков рестрикционных ферментов, высокого содержания GC, присутствия сигналов терминации транскрипции, узнаваемых дрожжами и т.д.). Нежелательные последовательности элиминируют посредством замещения имеющихся кодонов различными кодонами, кодирующими ту же аминокислоту. Затем сегменты синтетических генов тестируют на повышенную экспрессию.
Описанные выше способы применяли для создания сегментов синтетического гена L1 HPV58, получая ген, содержащий кодоны, оптимизированные для высокого уровня экспрессии. Хотя указанная выше процедура предоставляет описание способа конструирования генов с оптимизированными кодонами для применения в вакцинах против HPV, специалист в данной области поймет, что подобной эффективности вакцины или повышенной экспрессии генов можно достичь посредством незначительных изменений способа или посредством незначительных изменений в последовательности.
Таким образом, настоящее изобретение относится к синтетическому полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеотидов кодирующую белок L1 HPV58, или биологически активному фрагменту или мутантной форме белка L1 HPV58, полинуклеотидной последовательности, содержащей оптимизированные для экспрессии в дрожжевой клетке-хозяине кодоны. Указанные мутантные формы белка L1 HPV58 включают в себя в качестве неограничивающих примеров: замены консервативных аминокислот, укорочения на N-конце, укорочения на карбоксильном конце, делеции или добавления. Любой такой биологически активный фрагмент и/или мутант кодирует белок либо фрагмент белка, который, по меньшей мере, в значительной степени воспроизводит иммунологические свойства белка L1 HPV58, как указано в SEQ ID №: 2. Синтетические полинуклеотиды по настоящему изобретению кодируют молекулы мРНК, экспрессирующие функциональный белок L1 HPV58, так что являются полезными в разработке терапевтической или профилактической вакцины к HPV.
Один из аспектов данного изобретения представляет собой молекула нуклеиновой кислоты с оптимизированными кодонами, кодирующая белок L1 HPV58, как указано в SEQ ID №: 2, указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, как указано в SEQ ID №: 1.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам и рекомбинантным прокариотическим и эукариотическим клеткам-хозяевам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, описанные по всему этому описанию. По предпочтительному варианту осуществления этого изобретения клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку-хозяина.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Current Protocols in Molecular Biology
Yeast Genetics
A Laboratory Course Manual
Синтетическую ДНК HPV58 или ее фрагменты, сконструированные посредством описанных здесь способов, можно рекомбинантно экспрессировать посредством молекулярного клонирования в экспрессирующий вектор, содержащий пригодный промотор и другие соответствующие регуляторные элементы транскрипции и трансфецированный в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева для получения рекомбинантного L1 HPV58. Способы для таких манипуляций полностью описаны у Sambrook et al. (; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989); , Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988); : , Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990)), которые полностью включены сюда в качестве ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV58 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (a) введение вектора, содержащего кодирующую белок L1 HPV58 нуклеиновую кислоту, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование дрожжевых клеток-хозяев в условиях, допускающих экспрессию указанного белка L1 HPV58.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV58 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (a) введение вектора, содержащего кодирующую белок L1 HPV58 нуклеиновую кислоту, в дрожжевую клетку-хозяина; где молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу с оптимизированными кодонами для оптимальной экспрессии в дрожжевых клетках-хозяевах; и (b) культивирование дрожжевых клеток-хозяев в условиях, допускающих экспрессию указанного белка L1 HPV58.
Кроме того, данное изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV58 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (a) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, как указано в SEQ ID №: 1 в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование дрожжевых клеток-хозяев в условиях, допускающих экспрессию указанного белка L1 HPV58.
S. cerevisiae
GAL10, GAL7, ADH1, TDH3
PGK
S. cerevisiae ADH1
GAL1
ADH1
Синтетические гены по настоящему изобретению можно собирать в экспрессирующую кассету, содержащую последовательности, сконструированные для обеспечения эффективной экспрессии белка L1 HPV58 в клетке-хозяине. Предпочтительно кассета содержит синтетический ген со связанными последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию, функционально связанными с ним, такими как промотор и терминирующие последовательности. По предпочтительному варианту осуществления промотор представляет собой промотор  GAL1, хотя специалист в данной области поймет, что можно применять любой из ряда других известных дрожжевых промоторов, таких как промоторы  или , или другие промоторы эукариотических генов. Предпочтительный терминатор транскрипции представляет собой терминатор , хотя также можно применять другие известные терминаторы транскрипции. Особенно предпочтительным является сочетание промотора и терминатора .
Кроме того, данное изобретение относится к выделенному и очищенному полипептиду L1 HPV58, содержащему аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №: 2.
Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses
Biophys. J.
Еще один аспект данного изобретения представляет собой HPV58 вирусоподобные частицы (VLP), полученные посредством экспрессии в дрожжевой клетке рекомбинантных генов L1 HPV58 или Ll и L2, способам получения HPV58 VLP и способам применения HPV58 VLP. VLP способны к самосборке, когда L1, основной белок капсида папилломавирусов человека и животных, экспрессирован в дрожжах, клетках насекомых, клетках млекопитающих или бактерий (для обзора см. Schiller and Roden, in ; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). Морфологически неотличимые HPV VLP также можно получать посредством экспрессии сочетания капсидных белков L1 и L2. VLP состоят из 72 пентамеров L1 в Т=7 икосаэдрической структуре (Baker et al.,  60(6): 1445-56 (1991)).
J. Virol.
Proc. Natl. Acad. Sci.
J. Clin. Virol.
VLP морфологически сходны с аутентичными вирионами и способны индуцировать высокие титры нейтрализующих антител при введении животному. Иммунизация VLP кроликов (Breitburd et al., 69(6): 3959-63 (1995)) и собак (Suzich et al.,  USA 92(25): 11553-57 (1995)) продемонстрировала индукцию нейтрализующих антител и защиту против экспериментальной папилломавирусной инфекции. Кроме того, так как VLP не содержат потенциально онкогенного вирусного генома и способны к самосборке при экспрессии с одного гена, они представляют безопасную альтернативу применению живого вируса при разработке вакцины к HPV (для обзора см. Schiller and Hidesheim,  19: 67-74 (2000)).
Таким образом, настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам, содержащим рекомбинантный белок L1 или рекомбинантные белки LI и L2 HPV58, где рекомбинантный белок экспрессирован в дрожжевой клетке.
Saccharormyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis и Schizosaccharomyces pombe.
Как указано выше, по предпочтительному варианту осуществления изобретения VLP HPV58 получают в дрожжах. По дополнительному предпочтительному варианту осуществления дрожжи выбирают из группы, состоящей из:
Еще один аспект данного изобретения представляет собой VLP HPV58, содержащие белок L1 HPV58, продуцированный с гена L1 HPV58 с оптимизированными кодонами. По предпочтительному варианту осуществления данного аспекта изобретения ген L1 HPV58 с оптимизированными кодонами включает в себя последовательность нуклеотидов, как указано в SEQ ID №: 1.
Еще один аспект данного изобретения представляет собой способ получения VLP HPV58, включающий в себя: (a) трансформацию дрожжей молекулой рекомбинантной ДНК, кодирующей белок L1 HPV58 или белки Ll и L2 HPV58; (b) культивирование трансформированных дрожжей в условиях, допускающих экспрессию молекулы рекомбинантной ДНК, для продукции рекомбинантного белка HPV58; и (c) выделение рекомбинантного белка HPV58 для получения VLP HPV58.
По предпочтительному варианту осуществления данного аспекта изобретения дрожжи трансформируют геном L1 HPV58 с оптимизированными кодонами для получения VLP HPV58. По особенно предпочтительному варианту осуществления ген L1 HPV58 с оптимизированными кодонами содержит последовательность нуклеотидов, как указано в SEQ ID №:1.
Данное изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа у животного, предусматривающему введение животному вирусоподобных частиц HPV58. По предпочтительному варианту осуществления VLP HPV58 получают с гена с оптимизированными кодонами.
Еще один аспект данного изобретения представляет собой способ профилактики и/или лечения рака шейки матки, ассоциированного с HPV, включающий в себя введение млекопитающему содержащей VLP HPV58 вакцины. По предпочтительному варианту осуществления данного аспекта изобретения VLP HPV58 получают в дрожжах.
Данное изобретение также относится к содержащей вирусоподобные частицы (VLP) HPV58 вакцине.
По альтернативному варианту осуществления данного аспекта изобретения вакцина дополнительно содержит VLP, по меньшей мере, одного дополнительного типа HPV. По предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV выбирают из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 и HPV68.
По предпочтительному варианту осуществления данного аспекта изобретения вакцина дополнительно содержит VLP HPV16.
По еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения вакцина дополнительно содержит VLP HPV16 и VLP HPV18.
По еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения вакцина дополнительно содержит VLP HPV16, VLP HPV11, VLP HPV16 и VLP HPV18.
Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим вирусоподобные частицы HPV58. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим вирусоподобные частицы HPV58 и VLP, по меньшей мере, одного дополнительного типа HPV. По предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV выбирают из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 и HPV68.
Композиции вакцин по настоящему изобретению можно применять по отдельности в соответствующих дозах, допускающих оптимальное ингибирование инфекции HPV58 с минимальной потенциальной токсичностью. Кроме того, желательным может быть совместное введение или последовательное введение других средств.
Количество вирусоподобных частиц, вводимых в вакцинного реципиента, зависит от иммуногенности продукта экспрессированного гена. Обычно иммунологически или профилактически эффективную дозу приблизительно от 10 мкг до 100 мкг, и предпочтительно от 20 мкг до 60 мкг VLP, вводят прямо в мышечную ткань. Также предусматривают подкожную инъекцию, внутрикожное введение, чрескожное внедрение и другие способы введения, такие как внутрибрюшинная, внутривенная или ингаляционная доставка. Также предусматривают, что можно выполнять повторные иммунизации. Также предпочтительно парентеральное введение, такое как внутривенное, внутримышечное, подкожное и другие способы введения с адъювантами, такими как квасцы или алюминиевый адъювант Merck, одновременно с подкожным или парентеральным введением вакцины по данному изобретению.
Все указанные здесь публикации включены в качестве ссылки с целью описания и сообщения способов и материалов, которые можно применять в связи с настоящим изобретением. Ничего здесь не следует понимать как признание того, что изобретение не имеет право на противопоставление такому описанию на основании предшествующего изобретения.
Имея предпочтительные варианты осуществления изобретения со ссылкой на сопровождающие чертежи, необходимо понимать, что изобретение не ограничено точно такими вариантами осуществления, и что в них можно проводить различные изменения и модификации при помощи специалиста в данной области, не отступая от возможностей или смысла изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.
Следующие ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.
Пример 1
Определение репрезентативной последовательности L1 HPV58
L1 HPV58 F
3'11 BgIII
Последовательность L1 HPV58 была описана ранее (Genbank инвентарный номер № NC_001443). Однако нередко находят незначительные вариации последовательности между ДНК, полученными из клинических изолятов. Для определения репрезентативной последовательности дикого типа L1 HPV58, ДНК выделяли из трех клинических образцов, содержащих, как показано ранее, ДНК HPV58. Последовательности L1 HPV58 амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (GWH) с применением Taq ДНК полимеразы и следующих праймеров:  5'-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAG-3' (SEQ ID №: 4)и 58  5'-GAGAT CTGTGTAAGTACCACAACAATTA-3'(SEQ ID №: 5). Амплифицированные продукты подвергали электрофорезу в агарозных гелях и визуализировали посредством окрашивания бромистым этидием.
E. Coli
Полосы L1 ≈1500 п.н. вырезали, а ДНК очищали с применением Geneclean Spin Kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). Затем ДНК лигировали в клонирующий вектор TA pCR2.1 (Invitrogen). TOP10F'  трансформировали лигазной смесью и высевали на агар LB с ампициллином совместно с IPTG и X-gal для бело/голубой селекции колоний. Чашки переворачивали и инкубировали в течение 16 часов при 37°C. Для экстракции плазмидной ДНК применяли минипреп.
Чтобы продемонстрировать присутствие гена L1 в плазмидах, проводили расщепление рестрикционными эндонуклеазами. Фрагменты рестрикции изучали посредством электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Секвенирование ДНК выполняли на плазмидах, содержащих клонированные вставки L1 из каждого из трех клинических изолятов. Для того чтобы определить референсную последовательность для последующей оптимизации, нуклеотидную и транслированную аминокислотные последовательности из каждого клона сравнивали с опубликованными последовательностями L1 HPV58. Анализ последовательностей трех клинических изолятов показал, что нет идентичной последовательности в последовательностях Genbank. Клон № 4 pCR2.1 L1 HPV58 выбрали для того чтобы он служил репрезентативной последовательностью L1 HPV58, и равнозначно здесь называют как «последовательность дикого типа L1 58» или «последовательность 58 wt» (SEQ ID №: 3, см. фиг.1). Последовательность L1 58 wt содержала пять точечных мутаций: две приводящие к заменам аминокислот и три молчащие точечные мутации. Точечные мутации, приводящие к изменениям аминокислот по отношению к последовательности L1 HPV58 Genbank, локализованы в нуклеотиде 372 (A->T), заменяя аминокислоту 124 с лейцина на фенилаланин, и в нуклеотиде 897 (A->G), заменяя аминокислоту 299 с изолейцина на метионин. Три молчащие точечные мутации локализованы в нуклеотидах 774 (A->G), 792 (T->C) и 999 (G->A).
Bam
Bam
Bam
E. coli
Saccharomyces cerevisiae
5'58 BamHI
3'Bam58
Последовательность дикого типа L1 58 амплифицировали посредством ПЦР с применением Taq полимеразы и следующих ниже праймеров, добавляющих удлинения с участком распознавания HI:  5'-GGGATCCCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3' (SEQ ID №: 6) и  5'-GGGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA-3' (SEQ ID №: 7). Конечные продукты ПЦР визуализировали посредством электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Вырезали полосу ≈1500 п.н. и очищали ДНК с применением набора Geneclean. Затем ПЦР продукт лигировали в pCR2.1 и трансформировали клетки TOP10F' лигазной смесью. Выбирали белые колонии и культивировали в среде LB с ампициллином, встряхивая при 37°C в течение 16 часов. Для экстракции плазмидной ДНК применяли минипреп. Для освобождения гена L1 HPV58 из векторных последовательностей, выполняли расщепления рестрикционной эндонуклеазой HI. Расщепленную ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле и изучали посредством окрашивания бромистым этидием. Полосу L1 очищали с применением набора Geneclean и лигировали в дефосфорилированную, расщепленную HI pGAL110. Клетки DH5α  трансформировали лигазной смесью. Для скрининга вставки L1 HPV58 в правильной ориентации, плазмидную ДНК из колоний амплифицировали посредством ПЦР. Для подтверждения последовательности и ориентации вставок проводили секвенирование ДНК. Выбрали единственный клон и обозначили pGAL110-HPV 58L1 № 10. Получали максипреп из выбранного клона ДНК. Клетки  делали компетентными посредством образования сферопластов при помощи глузулазы (glusulase) и трансформировали pGAL110-HPV 58L1 № 1. Дрожжевую трансформирующую смесь вносили в верхний сорбит агар
Leu(-) на чашки сорбит агар Leu(-) и инкубировали перевернутыми в течение 3-5 суток при 30°C. Колонии собирали и сеяли штрихами для выделения на чашках с сорбит агаром Leu(-). Затем выделенные колонии растили в 5 мл 5 X Leu(-) Ade(-) сорбита с 1,6% глюкозы и 4% галактозы во вращающихся культуральных тубах при 30°C для индукции транскрипции и экспрессии белка L1 58.
Пример 2
Оптимизация кодонов дрожжей
Предпочтительные дрожжевые кодоны описаны (Sharp, Paul M and Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomycescerevisiae YEAST 7: 657-678(1991)). Экспрессия белка L1 HPV58 wt детектируема, однако, для получения повышенной экспрессии ген L1 HPV58 перестроили с применением предпочтительных дрожжевых кодонов. Перестроенная последовательность L1 58, включающая в себя последовательности оптимизированных кодонов дрожжей, содержит 404 нуклеотидных замен по сравнению с последовательностью L1 58 wt. Конечную последовательность обозначают здесь как «L1 58 R» (R = перестроенная, см. фиг.1). Транслированная аминокислотная последовательность L1 58 R не изменилась. На фиг. 2 показаны нуклеотидная (SEQ ID №: 1) и аминокислотная (SEQ ID №: 2) последовательности L1 HPV58 R. Указанная перестроенная последовательность обеспечивает повышенную экспрессию L1 HPV58, являющуюся значительным достижением по сравнению с диким типом для применения в разработке вакцин (см. пример 4).
Pfu
Применяемая стратегия для получения оптимизированного гена представляет собой конструирование длинных перекрывающихся смыслового и антисмыслового олигомеров, перекрывающих ген, заменяя нуклеотиды предпочтительными для дрожжей последовательностями кодонов, в то же время сохраняя аминокислотную последовательность. Эти олигомеры применяли вместо матричной ДНК в реакции ПЦР с  полимеразой. Дополнительные праймеры для амплификации конструировали и применяли для амплификации перестроенных последовательностей с матричных олигомеров.
Оптимальные условия для амплификации являются специфичными для фрагментов, однако, наиболее применима программа, аналогичная 95°C в течение 2 минут (денатурация), за которой следует 35 циклов 95°C в течение 1 минуты (денатурация), 55°C в течение 1 минуты (отжиг), 72°C в течение 3-5 минут (элонгация), затем конечная элонгация при 72°C в течение 10 минут и хранение при 4°C. Продукты ПЦР изучали посредством электрофореза в агарозном геле. Полосы соответствующего размера вырезали, а ДНК очищали из геля. Затем амплифицированные фрагменты применяли в качестве матриц для сборки перестроенного гена L1 HPV58 из 1497 нуклеотидов.
Bam
5'Bam 58 Rebuild
3'Bam 58 Rebuild
После перестройки ген L1 HPV58 из 1497 нуклеотидов очищали из геля и лигировали в вектор pCR Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). После лигирования клетки TOP10 трансформировали лигазной смесью. Колонии растили в LB с канамицином, и получали плазмидную ДНК из колоний посредством способов минипреп. Плазмидную ДНК секвенировали для подтверждения желательных изменений в виде перестройки L1 58. Для добавления к обоим концам удлинений HI L1 58 R (перестроенную) повторно амплифицировали с pCR-Blunt-58 L1 R со следующими праймерами:  5'-GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGAC C-3' (SEQ ID №: 8) и  5'-GGATCCTTACTTCTTGACCTTC-3' (SEQ ID №: 9).
Bam
Bam
E. coli
Амплифицированный продукт L1 очищали из геля с применением набора Geneclean и клонировали в pCR2.1 (Invitrogen). Клетки TOP10 трансформировали плазмидой pCR2.1. Белые колонии культивировали в среде LB с ампициллином, встряхивая при 37°C в течение 16 часов. Для выделения плазмидной ДНК применяли минипрепы. Выполняли расщепление рестрикционной эндонуклеазой HI для освобождения гена L1 HPV58 из векторных последовательностей. Расщепленную ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле и изучали посредством окрашивания бромистым этидием. Полосу L1 очищали с применением набора Geneclean и лигировали в дефосфорилированную, расщепленную HI pGAL110. Клетки DH5α  трансформировали лигазной смесью.
Saccharomyces cerevisiae
600
Полученные колонии скринировали посредством ПЦР на вставку L1 HPV58 в правильной ориентации. Получали максипреп ДНК. Последовательность и ориентацию подтверждали посредством профилей рестрикционных расщеплений и секвенирования ДНК. Выбранный клон обозначили pGAL110-HPV 58L1R № 17. Клетки  делали компетентными посредством образования сферопластов и трансформировали pGAL110-HPV 58L1R № 17. Трансформированные дрожжи вносили в верхний сорбит агар Leu(-) на чашки сорбит агар Leu(-) и инкубировали с переворачиванием в течение 3-5 суток при 30°C. Колонии собирали и сеяли штрихами для клонального выделения на чашках с сорбит агаром Leu(-). Затем выделенные колонии растили в 5 мл 5 X Leu(-) Ade(-) сорбита с 1,6% глюкозы и 4% галактозы во вращающихся культуральных тубах при 30°C для индукции транскрипции и экспрессии белка L1. Через 48 часов объем культуры, эквивалентный количеству клеток при OD = 10, осаждали, супернатант удаляли, а осадки замораживали и хранили при -70°C.
Пример 3
Получение РНК
260
260/280
Клеточные осадки трансформированных дрожжевых клеток, индуцированных к экспрессии L1 HPV58 или L1 HPV58 R посредством галактозной индукции, размораживали на льду, суспендировали в 0,8 мл реагента Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. В виалу добавляли одну пятую от объема хлороформа. Затем ее энергично встряхивали в течение 15 секунд для перемешивания, и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут. Затем 5 минут центрифугировали при 13 тыс. об/мин, верхнюю фазу собирали и переносили в новую виалу. Добавляли 0,4 мл изопропанола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Для осаждения РНК выполняли центрифугирование при 13 тыс. об/мин в течение 10 минут. Супернатант отбирали, осадок РНК отмывали 75% этанолом и повторяли центрифугирование. Супернатант отбирали и осадку РНК позволяли подсохнуть на воздухе в течение 15 минут, после чего суспендировали в воде без РНКаз. Для определения концентрации РНК в образце выполняли спектрофотометрию с применением допущения, что значение A 1=40 мкг/мл РНК, когда A равно 1,7-2,0.
Пример 4
Анализ нозерн-блоттингом
Заливали 1,1% агарозный гель с формальдегидом. Пять и десять микрограмм РНК смешивали с денатурирующим буфером (конечные концентрации: 6% формальдегида, 50% формамида и 0,1 x MOPS) и нагревали при 65°C в течение 10 минут. Добавляли одну десятую от объема геля загрузочного буфера, и образец вносили в гель. Электрофорез проводили при 75 вольтах в 1 x буфере MOPS в течение ≈3 часов. Гель отмывали в течение 60 минут в 10 x SSC.
РНК переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) посредством капиллярного действия в течение 16 часов в 10 x SSC. Затем РНК фиксировали на нейлоновой мембране посредством применения перекрестно связывающего Stratagene UV Stratalinker auto-crosslink function (Stratagene, La Jolla, CA). После фиксирования нейлоновую мембрану высушивали на воздухе.
Применяли The Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I (Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) для мечения последовательностей ДНК L1 58 wt и L1 58 R DIG, применяемым в качестве смеси зондов для определения транскриптов L1 58 wt и L1 58 R на нозерн-блоттинге. Прегибридизацию, гибридизацию и иммунологическую проявку с применением конъюгированных с щелочной фосфатазой антител к DIG выполняли в соответствии с рекомендациями производителя. В кратком изложении, прегибридизацию блота проводили при 37°C в течение 30 минут при слабом покачивании. Денатурацию смеси зондов проводили посредством нагревания до 95°C в течение 5 минут и остановки на льду. Добавляли смесь зондов к гибридизационному раствору и покрывали мембрану в течение 4 часов при 44,6°C при слабом покачивании. Затем гибридизационный раствор удаляли, а блот дважды отмывали в течение 5 минут в 2 x SSC с 0,1% SDS при комнатной температуре, с последующей дополнительной отмывкой при 65°C с 0,5 x SSC и 0,1% SDS. Затем блот блокировали в течение 30 минут, и в течение 30 минут наносили конъюгированные с щелочной фосфатазой антитела к DIG при разведении 1:5000. Блот отмывали, а присутствие РНК, связанной с зондом, определяли посредством определения NBT/BCIP субстрата щелочной фосфатазы, конъюгированной с антителами, связавшими DIG.
Предварительный анализ экспрессии дрожжами L1 58 wt предполагал, что проходила транскрипция и трансляция полноразмерного функционального L1 HPV58; однако, уровень экспрессии должен был быть повышенным, если последовательность перестраивали с предпочтительными для дрожжей последовательностями кодонов. Перестроенную последовательность L1 58 конструировали для исключения любых возможных участков преждевременной терминации транскрипции, чтобы обеспечить устойчивую транскрипцию. Анализ нозерн-блоттингом транскрипта L1 58 R показал образование повышенных количеств полноразмерных транскриптов по сравнению с результатами, наблюдаемыми для L1 58 wt (фиг.3).
Пример 5
Экспрессия белка L1 HPV58
600
2
4
Замороженные осадки дрожжевых клеток индуцированных галактозой культур, эквивалентные количеству клеток при OD=10, размораживали на льду и суспендировали в 300 мкл буфера PC (100 мМ NaHPO и 0,5 M NaCI, pH 7,0) с 2 мМ PMSF. В концентрации ≈0,5 г/пробирку добавляли обработанные кислотой 0,5 мм стеклянные бусы. Пробирки встряхивали в течение 3 раз по 5 минут при 4°C с интервалом в 1 минуту. Добавляли 7,5 мкл 20% TritonX100 и повторяли стадию встряхивания в течение 5 минут при 4°C. Пробирки помещали в лед на 15 минут с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 4°C. Супернатант переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку, помеченную как общий дрожжевой белковый экстракт, проставляли дату и хранили при -70°C.
Пример 6
Анализ вестерн-блоттингом
Общий дрожжевой белковый экстракт от двадцати выделенных дрожжевых колоний для каждой конструкции L1 58 анализировали посредством вестерн-блоттинга для подтверждения экспрессии белка L1 58 после индукции галактозой.
Десять, пять и два с половиной микрограмм общего дрожжевого белкового экстракта изолятов репрезентативных L1 58 wt и L1 58 R смешивали с загрузочным буфером SDS-PAGE и нагревали в 95°C в течение 10 минут. В качестве положительного контроля включили белок 16 L1, который приблизительно равен 55 кДа, а также общий дрожжевой белковый экстракт без L1 HPV в качестве отрицательного контроля (данные не показаны).
Белки загружали в 10% SDS-PAGE гель и подвергали электрофорезу в буфере Tris-Glycine. После белкового разделения белки подвергали вестерн переносу из геля на нитроцеллюлозу, и блокировали блот в 1 x разбавляющем буфере (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) в течение 1 часа при комнатной температуре при покачивании. Блот отмывали три раза и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 часов с абсорбирующей дрожжи козьей сывороткой к L1 trpE-HPV31, дающей перекрестную реакцию с белками L1 HPV16 и HPV58. Затем блоты отмывали три раза и инкубировали в течение 1 часа с конъюгированными антителами против антител козы с HRP при разведении 1:2500. Снова отмывали блоты три раза и применяли субстратное определение NBT/BCIP (Kirkegaard and Perry Laboratories). Иммунореактивные белки определяли в качестве пурпурных полос на блоте.
Во всех случаях белок L1 58 определяли на нитроцеллюлозе в качестве различной иммунореактивной полосы, соответствующей приблизительно 55 кДа (фиг.4). Интенсивность полос L1 58 R проявлялась сильнее полосы L1 58 wt, обозначая повышенную экспрессию L1 58, обеспеченную оптимизацией дрожжевыми кодонами.
Пример 7
Анализ ELISA
Чтобы продемонстрировать экспрессию VLP L1 58, часть общего дрожжевого белкового экстракта L1 58 wt и L1 58 R анализировали посредством ELISA. Дрожжевые клетки, экспрессирующие L1 HPV58 wt и L1 HPV58 R растили посредством ряда способов, включающих в себя культуры во вращающихся пробирках, во встряхиваемых колбах и ферментерах. Дрожжевые клетки лизировали, а белковые экстракты подготавливали к определению количества вирусоподобных частиц (VLP) L1 HPV58, синтезированных на микрограмм от общего белка. Конструировали сандвич ELISA, чтобы продемонстрировать экспрессию VLP L1 HPV58.
Для связывания интактных VLP L1 58, обнаруженных в дрожжевых белковых экстрактах, применяли очищенные G-белковые H582C3.F7 (F7) моноклональные антитела (мАт). F7 специфично узнают конформационный эпитоп VLP L1 HPV58. Несвязанные белки отмывали, а применяли еще одни конформационно специфичные мАт к VLP L1 HPV58 H586E11.F4 (F4) в качестве детекционных антител. Точно конформационно правильные VLP L1 HPV58 связывались, а применение конъюгированных с HRP мышиных антител к IgG2b и субстрата TMB способствовало определению.
2
4
Конкретно F7 применяли для покрытия в течение ночи при 4°C дна Immulon 4 HBX 96-луночных планшетов. Планшеты отмывали три раза с ФСБ и 0,05% Tween 20 с последующим блокированием блокирующим раствором (PBS + 0,05% Tween 20 + 1% BSA). Планшеты отмывали три раза, а антигены (общие лизаты дрожжевых клеток, растворенные в блокирующем растворе до 12,5 мкг/мл) вносили в ряд A в дуплетах. Референсные стандарты очищенных VLP L1 HPV58 вносили в колонки 3 и 4 ряда A при 206 нг/мл в 12,5 мкг/мл общего дрожжевого белка. Затем референсные и опытные образцы последовательно двукратно разводили в каждой колонке. Через три часа инкубации при комнатной температуре избыток антигена удаляли посредством аспирации, а планшеты отмывали три раза. Конформационно специфичные мАт F4 разводили в блокирующем растворе и вносили в каждую лунку на один час при комнатной температуре. Планшеты отмывали три раза, и конъюгированные с HRP мышиные IgG2b антитела разводили в блокирующем растворе и вносили на 1 час при комнатной температуре. Планшеты отмывали, и для определения комплексов конъюгированных антител с HRP вносили на 5 минут TMB (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Реакцию детекции останавливали внесением 2 М HS0. Измеряли планшеты при длине волны 450 нм, а концентрацию VLP L1 HPV58 определяли посредством сравнения с референсными стандартами в нг VLP/мкг общего белка.
На фиг.5 показано сравнение количества определенных VLP/мкг общего белка дрожжей, экспрессирующих L1 HPV58 wt и L1 HPV58 R в двух независимых экспериментах. При оптимизации дрожжевых кодонов уровни экспрессии VLP L1 HPV58 повышены в 2-3 раза.
Пример 8
Трансмиссионная электронная микроскопия
Чтобы продемонстрировать, что белки L1 58 фактически способны к самосборке с образованием пентамерных-L1 капсомеров, в свою очередь самостоятельно собирающиеся в вирусоподобные частицы, частично очищенный белковый экстракт L1 58 R подвергали трансмиссионной электронной микроскопии (ЭМ).
Дрожжи растили в условиях мелкомасшатбного культивирования и осаждали. Полученные осадки подвергали обработке для очистки. Осадок и очищенные дрожжевые экстракты анализировали посредством иммуноблоттинга, чтобы продемонстрировать экспрессию и сохранение в течение процедуры очистки белка L1. Затем очищенные дрожжевые экстракты подвергали центрифугированию через 45%-сахарозную подушку, а полученный осадок суспендировали в буфере для анализа посредством трансмиссионной ЭМ.
Изображение, представляющее синтезированные VLP L1 58, показано на фиг.6. Диаметр сферических частиц в данном неочищенном образце колеблется от 30 до 60 нм с некоторыми частицами, показывающими регулярное расположение капсомеров.