ОЛИГОСАХАРИДНЫЙ ИНГРЕДИЕНТ
OLIGOSACCHARIDE INGREDIENT

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к олигосахаридному ингредиенту, обогащенному сиаловой кислотой, к пищевым продуктам, содержащим указанный олигосахаридный ингредиент, и к способам получения указанного олигосахаридного ингредиента.
Уровень техники
Известно, что человеческое молоко содержит большое количество неперевариваемых олигосахаридов. Фактически, неперевариваемые олигосахариды представляют собой третий по величине твердый компонент (после лактозы и липидов) в грудном молоке, с концентрацией 12-15 г/л в молозиве и 5-8 г/л в зрелом молоке. Олигосахариды человеческого молока очень устойчивы к ферментативному гидролизу, что говорит о том, что основные функции данных олигосахаридов могут проявляться независимо от их калорийности.
В течение последних двух десятилетий химические структуры олигосахаридов человеческого молока были исследованы с помощью ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Каждый индивидуальный олигосахарид основывается на комбинации глюкозы, галактозы, сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты), фукозы и/или N-ацетилглюкозамина с множеством разнообразных связей между ними, что приводит, таким образом, к огромному числу различных олигосахаридов в человеческом молоке - свыше 130 таких структур было идентифицировано к настоящему времени. Практически все из них имеют молекулу лактозы на восстановленном конце, тогда как конечное положение на невосстановленном конце занимает сиаловая кислота (если она присутствует).
Особый интерес представляет большое количество сиалированных олигосахаридов в человеческом молоке. Сиаловая кислота представляет собой сахар с каркасом из 9 углеродов, который является структурным и функциональным компонентом ганглиозидов мозга. Считается, что она играет существенную роль в передаче сигнала нервными клетками, в формировании памяти и в межклеточных связях. Исследования на крысятах показывают, что ранняя подкормка сиаловой кислотой повышает содержание сиаловой кислоты в ганглиозидах мозга и улучшает способность к обучению у имеющих полноценное питание и недоедающих животных и что эти изменения сохраняются в зрелом возрасте.
Материнское молоко рекомендуется всем младенцам. Однако в некоторых случаях кормление грудью не эффективно или не является благоприятным по медицинским причинам, или потому что мать предпочитает не кормить ребенка грудью. Детские смеси разработаны для таких ситуаций. Однако коровье молоко, обычно используемое в качестве основы коммерчески доступных детских смесей, имеет на много более низкое содержание сиализированных олигосахаридов по сравнению с человеческим молоком. По мере того как структура человеческого молока и функции его индивидуальных компонентов становятся более понятными, становится ясно, что может потребоваться повышение содержания сиаловой кислоты в детских смесях на основе коровьего молока.
Существует несколько источников сиаловой кислоты, включая свободную N-ацетилнейраминовую кислоту; сиалиллактозу, и другие сиалированные олигосахариды; ганглиозиды, содержащие сиаловую кислоту; и пептид казеиногликомакропептид. Казеингликомакропептид или CGMP является большим, обогащенным углеводами гидрофильным пептидом, который является C-концевой функциональной группой κ-казеина, из которого он может быть вырезан ферментативно или с помощью обработки кислотой. В заявке на патент США № 2005/0096295 предлагается повысить содержание сиаловой кислоты в детской смеси путем включения нового CGMP-ингредиента, обладающего повышенной концентрацией сиаловой кислоты. Этот ингредиент содержит более 60 мг сиаловой кислоты на грамм пептида по сравнению с 40-60 мг/г пептида в природном CGMP. Он может быть получен либо фракционированием с помощью анионной хроматографии либо частичным гидролизом с последующим фракционированием с помощью анионной хроматографии.
Однако сохраняется потребность в обеспечении другими компонентами, обогащенными сиаловой кислотой, которые могут быть использованы для обогащения детской смеси и других питательных композиций этим важным компонентом.
Сущность изобретения
n
m
Настоящее изобретение обеспечивает олигосахаридный ингредиент, содержащий гликокозилированные аминокислоты и пептиды, общей формулы RSac, где R является аминокислотным остатком. Sac является моносахаридом, выбранным из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение между 1 и 10 с той оговоркой, что если значение n равно 1, то R является остатком треонина или серина, а если n имеет значение между 2 и 10, то пептид содержит, по меньшей мере, один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4 и N-ацетилнейраминовая кислота составляет, по меньшей мере, 20 молярных % ингредиента.
Данный ингредиент является новым обогащенным сиаловой кислотой пищевым ингредиентом, который подходит для добавления к питательным композициям, таким как детская смесь, для повышения содержания сиаловой кислоты в композиции.
n
m
Изобретение дополнительно распространяется на способ получения олигосахаридного ингредиента, содержащего гликозилированные аминокислоты и пептиды, общей формулы RSac, где R является аминокислотным остатком. Sac является моносахаридом, выбранным из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение между 1 и 10 с той оговоркой, что если значение n равно 1, то R является остатком треонина или серина, а если n имеет значение между 2 и 10, то пептид содержит, по меньшей мере, один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4, и N-ацетилнейраминовая кислота составляет, по меньшей мере, 20 молярных % ингредиента, где способ содержит стадию гидролиза казеиногликомакропептида экзопротеазой и эндопротеазой для получения смеси свободных аминокислот и пептидов с длиной цепи от 2 до 10 и стадию нанофильтрации гидролизованой смеси для отбора фракции, обладающей молекулярной массой от 1000 до 2000 Дальтон.
Изобретение также охватывает пищевой продукт, содержащий описанный выше олигосахаридный ингредиент. Пищевой продукт является, необязательно, детским питанием или детской смесью, но также продукт может быть любой пищей или напитком, потребляемым детьми, младенцами или взрослыми. Потребление пищевого продукта, содержащего такой олигосахаридный ингредиент, может улучшить включение сиаловой кислоты в ганглиозиды мозга и таким образом улучшить связанные функции нейронов, такие как нейротрансмиссия.
Раскрытие изобретения
В настоящем описании следующие слова даны с определениями, которые должны быть приняты во внимание при чтении и интерпретации описания, примеров и формулы изобретения.
«CGMP» - казеиноглюкомакропептид, т.е. глюкомакропептид, который отщепляется от бычьего κ-казеина в результате действия фермента реннина.
«Детская смесь» - продукт питания, предназначенный для сбалансированного питания младенцев в течение первых четырех-шести месяцев жизни и для частичного питания в последующий период. Термин охватывает как начальную, так и усовершенствованную рецептуру.
«Сиаловая кислота» - N-ацетилнейраминовая кислота.
n
m
Изобретение обеспечивает олигосахаридный ингредиент, содержащий гликозилированные аминокислоты и пептиды, общей формулы RSac где R является аминокислотным остатком, Sac является моносахаридом, выбранным из группы, содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу, n имеет значение между 1 и 10 с той оговоркой, что если значение n равно 1, то R является остатком треонина или серина, а если n имеет значение между 2 и 10, то пептид содержит, по меньшей мере, один остаток треонина или серина, m имеет значение от 2 до 4 и N-ацетилнейраминовая кислота составляет, по меньшей мере, 20 молярных % ингредиента, а также обеспечивает пищевые продукты для детей и взрослых, содержащие такой олигосахаридный ингредиент.
Предпочтительно, если n имеет значение от 1 до 3, а m имеет значение 3 или 4. Ингредиент содержит, по меньшей мере, 20 молярных % сиаловой кислоты, как части сахаридной цепи, связанной с гидроксильной группой треонина или серина. Сиаловая кислота может стать частью цепи или может сама по себе быть заместителем моносахаридной единицы в цепи. Таким образом, олигосахаридный ингредиент может содержать следующие моносахариды:
Соединение
молярный %
N-ацетилгалактозамин (GalNAc)
15-25
галактоза (Gal)
15-25
N-ацетилнейраминовая кислота (NeuAc)
50-20
Олигосахаридный ингредиент может содержать от 15 до 25 молярных % смеси серина и треонина.
Олигосахаридный ингредиент может содержать следующие гликозилированные аминокислоты или пептиды: -
n
NeuAc-α-2,3-Gal-α-1,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-R
n
NeuAc-α-2,3-Gal-α-1,3-GalNAc-R
n
Gal-β-l,3-(CNeuAc-α-2,6-)-GalNAc-R
n
Gal-β-1,3-GalNAc-R
Олигосахаридный ингредиент согласно изобретению может быть получен гидролизом CGMP с помощью экзопротеазы и эндопротеазы для получения смеси свободных аминокислот и пептидов с длиной цепи от 2 до 10 и нанофильтрацией гидролизованой смеси для отбора фракции, обладающей молекулярной массой от 1000 до 2000 Дальтон.
Сам по себе CGMP является побочным продуктом сыроварения, в котором цельное молоко обрабатывается ферментом реннином для преципитации казеина. В этом процессе CGMP отщепляется от κ-казеина и остается в растворе вместе с сывороточными белками. Этот продукт известен как сладкая сыворотка. CGMP может быть отделен от сыворотки любым известным в данной области способом. Подходящий способ описан в Европейском Патенте № 986312.

Гидролиз может быть проведен с помощью подходящей комбинации ферментов. Одним из примеров коммерчески доступной системы ферментов с экзо- и эндопротеазной активностью является продукт с торговой маркой Flavourzyme, продаваемый подразделением «Novozymes» фирмы «Novo Nordisk».
Продукт процесса гидролиза является смесью свободных аминокислот, гликозилированного треонина и серина, гликозилированных пептидов, содержащих, по меньшей мере, один остаток треонина или серина, и негликозилированных пептидов, где пептиды обладают длиной цепи от 2 до 10 аминокислотных остатков. Данная смесь подвергается нанофильтрации для отделения и отбора фракции, с диапазоном молекулярных масс от 1000 до 2000 Дальтон. Эта фракция будет содержать олигосахаридный ингредиент изобретения.
В предпочтительном аспекте изобретения, описанный выше олигосахаридный ингредиент включается в пищевой продукт. В контексте настоящего изобретения, термин «пищевой продукт» охватывает любой годный к употреблению материал. Таким образом, это может быть продукт предназначенный для потребления людьми, в частности, детская смесь, смесь для последующего питания, детское питание, такое как детские крупы и т.п. В частности, олигосахаридный ингредиент согласно изобретению может быть включен в детские смеси, в смеси после года, в сухое молоко или в зерновые смеси.
Пищевой продукт может быть приготовлен любым подходящим способом известным в данной области, в соответствии с типом продукта, а олигосахаридный ингредиент по изобретению может быть добавлен к продукту на соответствующей стадии в процессе производства. Например, детская смесь может быть приготовлена смешиванием источника белков, любых углеводов, отличных от лактозы, и источника жиров в соответствующих пропорциях. При необходимости могут быть добавлены эмульгаторы. Витамины и минералы могут быть добавлены на данном этапе, но обычно добавляются позже для того, чтобы избежать термической деградации. Любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. могут быть растворены в источнике жира до смешивания. Затем для образования жидкой смеси может быть добавлена вода, предпочтительно подвергнутая обратному осмосу.
После этого жидкая смесь может быть обработана термически для уменьшения бактериального загрязнения. Например, жидкая смесь может быть быстро нагрета до температуры в диапазоне от около 80°С до около 110°С в течение от около 5 секунд до около 5 минут. Обработка может быть проведена вдуванием пара или с помощью теплообменника, например, с помощью пластинчатого теплообменника.
Затем жидкая смесь может быть охлаждена до температуры от около 60°С до около 85°С, например, с помощью мгновенного охлаждения. После этого жидкая смесь может быть гомогенизирована, например, в две стадии, при давлении от около 7 МПа до около 40 МПа в первой стадии, и от около 2 МПа до около 14 МПа во второй стадии. Далее гомогенизированная смесь может быть дополнительно охлаждена для добавления термочувствительных компонентов, таких как витамины и минералы. На данном этапе удобно стандартизовать pH и содержание сухих веществ в гомогенизированной смеси.
Гомогенизированная смесь переносится в подходящую сушилку, такую как распылительная сушилка или лиофилизатор, и превращается в порошок. Порошок должен иметь влажность меньше чем около 5 масс.%.
Олигосахаридный ингредиент согласно изобретению может быть добавлен напрямую в детскую смесь сухим перемешиванием, а в жидкость на стадии смешивания, о которой говорилось выше. В обоих случаях, следует понимать, что добавление ингредиента предполагает одновременное добавление определенного количества аминного азота и, следовательно, может возникнуть необходимость в коррекции содержания белка в детской смеси или, соответственно, в другом продукте, в который добавляется ингредиент, по усмотрению специалиста в данной области. Допустимое содержание белка и аминокислотный профиль детских смесей определены в законодательстве, например в Директиве Европейской комиссии 91/321/EEC от 14 мая 1991 года, и специалисту в данной области будет просто скорректировать содержание белка и аминокислотный профиль детской формулы, принимая во внимание дополнительный, введенный ингредиентом согласно изобретению аминный азот, а также дополнительное содержание треонина и серина.
Конечная концентрация олигосахаридного ингредиента в детском или младенческом питании или смеси может составлять от 0,2 до 4,0%, предпочтительно от 0,5 до 2,0 масс.% сухого вещества. Однако эти количества не могут рассматриваться как ограничивающие и должны быть адаптированы для целевой популяции, например, основываясь на массе и возрасте или здоровье ребенка или младенца. Предпочтительно, если смесь или пища, содержащие олигосахаридный ингредиент изобретения, даются ребенку при каждом приеме пищи.
Хотя предпочтение отдается пищевым продуктам-добавкам, специально направленным на питание детей и младенцев, также могут быть полезны пищевые продукты-добавки без определенного предназначения, или предназначенные для взрослой популяции. Например, олигосахаридный ингредиент согласно изобретению может быть включен в лечебные пищевые продукты и пищевые продукты для пожилых людей. Такие пищевые продукты могут включать йогурт, молоко, творог, сыр, ферментированное молоко, ферментированные продукты на основе молока, мороженое, продукты на основе ферментированных круп, или продукты на основе молока, среди прочего. Дополнительно, олигосахаридный ингредиент изобретения, пищевой продукт, такой как детская смесь, могут содержать один или несколько дополнительных олигосахаридов, которые добавляются отдельно.
Далее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на следующий пример.
Пример 1
Ниже приводится пример композиции детской смеси, содержащей олигосахаридный ингредиент по настоящему изобретению.
Питательное вещество
На 100 ккал
На литр
Энергия (ккал)
100
670
Белок (г)
1,83
12,3
Жир (г)
5,3
35,7
линолевая кислота (г)
0,79
5,3
α-линоленовая кислота (мг)
101
675
лактоза (г)
11,2
74,7
олигосахаридный ингредиент (г)
0,15
1
минеральные вещества (г)
0,37
2,5
Na (мг)
23
150
K (мг)
89
590
Cl (мг)
64
430
Ca (мг)
62
410
P (мг)
31
210
Mg (мг)
7
50
Mn (мкг)
8
50
Se (мкг)
2
13
Витамин A (мкг ед. ретинола)
105
700
Витамин D (мкг)
1,5
10
Витамин Е (мг ед. токоферола)
0,8
5,4
Витамин K1 (мкг)
8
54
Витамин C (мг)
10
67
Витамин B1 (мг)
0,07
0,47
Витамин B2 (мг)
0,15
1
Ниацин (мг)
1
6,7
Витамин В6 (мг)
0,075
0,5
Фолиевая кислота (мкг)
9
60
Пантотеновая кислота (мг)
0,45
3
Витамин B12 (мкг)
0,3
2
Биотин (мкг)
2,2
15
Холин (мг)
10
67
Fe (мг)
1,2
8
I (мкг)
15
100
Cu (мг)
0,06
0,4
Zn (мг)
0,75
5
Пример 2
50 г казеиногликомакропептида («Biopure GMP», Дависко, США) растворяли до 10% (масс./об.) в 500 мл деионизированной воды. Раствор нагревали до 40°С в течение 30 минут с аккуратным перемешиванием и рециркуляцией через лабораторную систему тангенциальной фильтрации («Millipore», США) с одним кассетным фильтром «Pellicon 1000 Da» при давлении на входе 1,2 бар и без давления ретентата.
Впоследствии добавляли аминопептидазу из Aspergillus oryzae («Flavourzyme 1000L», содержащий 1000 единиц аминопептидазы на грамм (LAPU/r, LAPU - Leucine Amino Peptidase Units), «Novozymes», Дания) до концентрации 3500 LAPU на 50 г белка. Через примерно 1 ч начинали диафильтрацию путем увеличения давления в ретентате до 3 бар при давлении на входе 3 бар. Через 5 часов фильтрацию останавливали и собирали ретентат. Лиофилизировали ретентат и 7 фракций пермеата, собранных во время процесса. Впоследствии определяли содержание сухих веществ (СВ) и сиаловой кислоты в каждой фракции. Содержание сиаловой кислоты измеряли после мягкого кислотного гидролиза и мечения с помощью DMB-метода (метода с дигидрохлоридом 1,2-диамино-4,5-метилендиоксибензена) и с помощью ВЭЖХ-анализа на обратнофазной колонке «Shodex С 18» с флюоресцентным детектором при использовании аутентичной NeuAc в качестве внешнего стандарта. В Таблице 1 показаны баланс массы и содержание сиаловой кислоты в начальном материале, во фракциях пермеата и в ретентате.
Таблица 1
масса (г)
NeuAc (% от сухих веществ)
выход (%)
обогащение
Начальный материал
50
7,5
100
1,00
пермеат 1
4,32
0,2
8,64
0,03
пермеат 2
3,1
0,2
6,2
0,02
пермеат 3
6,1
0,3
12,2
0,04
пермеат 4
4,29
1,4
8,58
0,18
пермеат 5
3,56
0,8
7,12
0,10
пермеат 6
2,8
0,4
5,6
0,05
пермеат 7
2,94
0,3
5,88
0,04
ретентат
22,6
14,4
45,2
1,92
Содержание галактозы и N-ацетилгалактозамина в ретентате определяли после кислотного гидролиза с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии на аналитической колонке «Dionex CarboPac PA1» с импульсным амперометрическим детектором. Вкратце, ретентат растворяли в воде и добавляли трифторуксусную кислоту до конечной концентрации 2 М. Раствор нагревали в течение 3 ч при 100°С, сушили в потоке азота и перерастворяли в воде. После фильтрации через 22 мкм фильтр тонкой очистки образец анализировали. Количественная оценка была сделана с помощью аутентичных галактозы и галактозамина (N-ацетилгалактозамин превращается в галактозамин в процессе обработки кислотой), которые использовали в качестве внешних контролей.
Конечный продукт из высушеного ретентата содержит 24,4 масс.% (NeuAc)2-Gal-GalNAc-Thr с вероятной, структурой NeuAc-α-2,3-Gal-β-l,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-треонин/пептид с 43 молярными % сиаловой кислоты, 20,5 молярными % галактозы, 18,4 молярными % N-ацетилгалактозамина и 18 молярными % треонина.