ДНК-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена Bacillus anthracis
DNA-STRUCTURE ENCODING MODIFIED VERSION OF PROTECTIVE ANTIGENE BACILLUS ANTHRACIS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биоинженерии, в частности к усовершенствованию метода получения протективного антигена Bacillus anthracis – основного антигена, необходимого для создания средств вакцинопрофилактики и диагностики сибиреязвенной инфекции у человека и животных.
Предметом изобретения является фрагмент последовательности гена PAG из B. anthracis 55-ВНИИВВиМ в составе интегративной генетической конструкции pWP-SW (находится под контролем промотора гена WprA, кодирующего субтилизин клеточной стенки Bacillus subtilis; содержит также терминатор транскрипции гена WprA и маркер лекарственной устойчивости к спектиномицину). Особенностью гена PAG в составе конструкции pWPag201-SW по сравнению с аналогичными конструкциями, содержащими ген PAG дикого типа, является наличие у закодированного продукта, соответствующего изолированному первому домену полноразмерного белка PAG, собственного секреторного лидера. Наличие этого элемента, а также удачный выбор точки искусственной терминации трансляции PAG позволили добиться эффективной секреции продукта во внеклеточное пространство с образованием устойчивого к протеолизу, растворимого и высокоиммуногенного продукта.
Штамм, несущий конструкцию pWPag201-SW, пригоден в качестве продуцента искусственного производного проективного антигена, соответствующего его первому домену, с целью его очистки in vitro. Такой белок может быть использован при изготовлении тест-систем серологической детекции антител к PAG и прототипов вакцин. Живая споровая культура, несущая конструкцию pWPag201-SW, может быть непосредственно использована в качестве вакцинной субстанции по аналогии со споровой культурой аттенуированного штамма B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, как это описано в патенте РФ №2191599 [1]. В отличие от технического решения, описанного в патенте РФ №2321628 [2], заявляемое решение основано на использовании генетически стабильной интегративной конструкции вместо автономно реплицирующейся плазмиды на основе нестабильного репликона pUB110. Конструкция pWPag201-SW (Фиг.1) введена в геном полностью непатогенного штамма B. subtilis AJ73, что позволяет использовать штамм для введения in vivo без риска потери конструкции или ее неконтролируемого распространения во внешней среде.
Уровень техники
3
50
Известен Патент РФ №2181294 [3], описание изобретения содержит информацию об использовании для приготовления сухой формы комбинированной сибиреязвенной вакцины протективного антигена, получаемого из микробной культуры B. anthracis штамма-продуцента 55/5, выборе эффективной среды высушивания и лиофилизации препарата. Изобретение позволяет увеличить срок хранения вакцины (до 4 лет) и расширить температурный режим хранения (до+25°С в течение месяца) при доставке вакцины потребителю. Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления жидкой комбинированной сибиреязвенной вакцины (патент РФ 2115433 [4]), содержащей сорбированный на носителе протективный антиген (ПА) и споры B. anthracis вакцинного штамма СТИ-1. Содержание компонентов в одной прививочной человеко-дозе (0,5 см) вакцины следующее: спор – 40-60 млн, ПА – 30-40 среднеэффективных иммунизирующих доз (ИД) для белых мышей [5], гидроокиси алюминия - не более 2,5 мг. Общим существенным признаком с заявляемым способом является использование в жидкой комбинированной вакцине спор B. anthracis штамма СТИ-1. Недостатком прототипа изобретения, указанным авторами, является относительно непродолжительный срок хранения (до 2-х лет) и необходимость в течение всего времени хранения, в том числе и при ее транспортировании, использовать температуры от 0 до плюс 4°С. Увеличение сроков хранения жидкой комбинированной вакцины, а также изменение температурного режима при хранении или транспортировании сопровождается ослаблением защитных свойств вакцины за счет снижения иммуногенности ПА и жизнеспособности спор (споры и ПА находятся в препарате в физиологическом растворе без стабилизатора и в большей степени подвержены отрицательному воздействию факторов внешней среды, в том числе и температурным колебаниям).
Известен Патент РФ №2115433 [4], использует в качестве прототипа известный способ получения адсорбированной сибиреязвенной вакцины (anthrax vaccine adsorbed - далее адсорбированная вакцина), производимую Michigan Departament of Public Health (Lansing, Michigan 48909) по лицензии №99 (руководство по применению "Anthrax vaccine adsorbed"). В отличие от прототипа, описанная вакцина представляет собой жидкий препарат, содержащий следующие компоненты: протективный антиген Bacillus anthracis (РА), получаемый при культивировании бескапсульного штамма сибиреязвенного микроба в синтетической среде. Вакцина используется следующим образом. Выполняется первичная иммунизация, включающая три подкожные инъекции по 0,5 мл вакцины с интервалом в две недели и затем три дополнительных подкожных инъекции по 0,5 мл вакцины через 6, 12 и 18 мес.При формировании иммунитета рекомендуется выполнять ежегодно по одной бустерной подкожной инъекции по 0,5 мл. Недостатком адсорбированной вакцины является сложная схема ее применения и низкая защитная эффективность. Последнее обусловлено тем, что действие адсорбированной вакцины направлено лишь на предотвращение заключительного этапа инфекционного процесса - поражения макроорганизма токсичными продуктами сибиреязвенного микроба. Создание антитоксического иммунитета защищает от клинических проявлений заболевания, однако не исключает развития начальных стадий инфекционного процесса - колонизации B. anthracis в области входных ворот и инвазии во внутреннюю среду организма. Низкая защитная эффективность адсорбированной вакцины обусловливает необходимость многократной вакцинации - отсюда и сложная схема применения такой вакцины.
Общим существенным признаком с заявляемой вакциной является использование в качестве одного из иммуногенов протективного антигена B. anthracis. Адсорбированная вакцина, производимая Michigan Department of Public Health, является коммерческим препаратом, разрешенным для использования в США и ряде других стран.
9
9
8
8
7
7
Наиболее близкой к заявляемой является вакцина сибиреязвенная СТИ живая сухая (далее - живая вакцина). Вакцина представляет собой взвесь живых спор бескапсульного сибиреязвенного штамма СТИ в 30% глицерине (Инструкция по применению вакцины сибиреязвенной СТИ живой сухой). Первоначально она выпускалась Предприятием по производству бактерийных препаратов Тбилисского НИИ вакцин и сывороток (380042, Тбилиси, ул. Готца 3) в виде лиофилизированного препарата, содержащего 4×10 - 5×10 живых спор на ампулу. Непосредственно перед использованием препарат подлежал разведению в 30% растворе глицерина. Вакцинация проводилась двумя способами: накожным (плановая вакцинация) и подкожным безыгольным (по эпидемическим показаниям). Первичная иммунизация проводилась двукратно с интервалом в 21 день, ревакцинация - через год однократно. Одна накожная прививочная доза требовала введения от 4×10 до 5×10, одна подкожная от 4×10 до 5×10 живых спор. Доза для ревакцинации та же, что и при первичном применении. Недостатком живой вакцины является длительный латентный период и период нарастания (до 3 - 4 недель) и относительно короткий период высокой специфической резистентности, что проявляется "пробоем" иммунитета в первые 5-14 суток и через 3 месяца после иммунизации (среди всех заболевших сибирской язвой от 6,4 до 27,7% составляли люди, ранее привитые живой вакциной [6]). Указанные недостатки обусловлены тем, что формирование поствакцинального иммунитета после применения живой вакцины связано с колонизацией, размножением и последующей диссеминацией по лимфатическим путям микробов вакцинного штамма. Наряду с этим, живая вакцина обеспечивает формирование специфического иммунитета, воздействующего в первую очередь на начальные этапы инфекции (антибактериальный иммунитет), и в случае генерализации процесса недостаточно эффективно предотвращает токсические эффекты, наблюдаемые на заключительной стадии заболевания. Общим существенным признаком с заявляемой вакциной является использование в качестве одного из иммуногенов живых спор B. anthracis штамма СТИ. Вакцина сибиреязвенная СТИ живая сухая - коммерческий препарат, разрешенный для использования в СССР. Задачей изобретения является создание в короткие сроки высокой и длительно сохраняющейся специфической невосприимчивости к возбудителю сибирской язвы. Поставленная задача решается благодаря тому, что вакцина сибиреязвенная, содержащая споры бескапсульного вакцинного штамма B. anthracis СТИ, дополнительно содержит ПА сибиреязвенного микроба. ПА сибиреязвенного микроба может быть сорбирован на носителе и/или находиться в простой смеси со спорами вакцинного штамма B. anthracis. Соотношение компонентов в одной прививочной дозе коммерческого варианта вакцины следующее:
1. живых спор Bacillus anthracis СТИ - 40 - 60 млн,
50
2. ПА сибиреязвенного микроба - 30 - 40 ИД,
3. геля гидроокиси алюминия не более - 2,5 мг,
50
50
где ИД - среднеэффективная иммунизирующая единица для белых мышей (ИД см. [5]).
Доза для иммунизации людей содержится в 0,5 мл предложенной вакцины. Первичная иммунизация проводится один раз в год подкожно. Сопоставляя значения показателей косвенных тестов и уровни защищенности против подкожного и аэрогенного заражения вирулентными культурами сибиреязвенного микроба, определенные на экспериментальных животных, с динамикой клеточных и гуморальных показателей специфической резистентности у людей, можно предположить, что напряженный иммунитет после однократного применения заявляемой сибиреязвенной вакцины обеспечивает защиту от развития инфекции не менее, чем у 80-90% привитых. Прочный иммунитет формируется к 7-10 суток и сохраняется в течение 6 месяцев, а через 9-12 месяцев определяется примерно у 50-70% вакцинированных. Наряду с этим, высокий уровень специфической резистентности после однократного применения живой вакцины (прототип) развивается к 21 суткам у 55-65%, сохраняется до 4 месяцев у 30-40%, до 6 месяцев - у 15-20% и до 9-12 месяцев - лишь у 5-10% привитых. После введения адсорбированной вакцины-аналога иммунитет формируется к 7-10 суток у 70-80% и сохраняется до 4 месяцев только у 10-15% вакцинированных.
Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно:
1. Полноценный иммунитет против сибирской язвы предполагает наличие специфической защищенности против агрессивного воздействия спор, вегетативных клеток (антибактериальный иммунитет) и экзотоксина (антитоксический иммунитет) - что достигается в заявленном изобретении сочетанием обоих антигенных компонентов в одном вакцинном препарате и проявляется высокой и длительно сохраняющейся специфической невосприимчивостью к заражению возбудителем сибирской язвы.
2. Короткие сроки формирования специфической невосприимчивости обусловлены действием на иммунную систему макроорганизма ПА, тогда как использование только живых спор вакцинного штамма B. anthracis предполагает длительный латентный период в иммунном ответе на их введение.
По утверждениям авторов, изобретение позволяет:
- повысить безопасность персонала, работающего в эпидемических очагах сибирской язвы и в лабораторных условиях.
- сократить расходы на иммунизацию людей и животных.
- проводить иммунизацию на фоне антибактериальной терапии сибирской язвы.
9
3
Известен патент РФ №2191599 [1]. Изобретение основано на использовании в качестве прототипа способа получения вакцины для профилактики некробактериоза рогатого скота, содержащая в равных объемных соотношениях инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из местных эпизоотических культур возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина (Патент RU 1816348 [7]). Ассоциированная вакцина содержит адсорбированный на гидроокиси алюминия инактивированный формалином экзотоксин лейкоцидин, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией 5,0-5,5×10 спор/мл в физиологическом растворе, 1 М раствор метабисульфита натрия и масляный адъювант.Компоненты вакцины содержатся в сбалансированном соотношении. Экзотоксин лейкоцидин представляет собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа. Он получен из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ. Ассоциированную вакцину вводят однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2-0,4 см. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза является высокоэффективным препаратом, способным защитить животных одновременно от сибирской язвы и некробактериоза, и по иммуногенности превосходит составляющие ее моновакцины.
-1
-1
-1
Известен Патент РФ №2340356 [8], содержит описание методики получения очистки протективного антигена B. antracis, в частности, культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия. При этом бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма. После окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации. Способ обеспечивает стабильное получение нативного сибиреязвенного протективного антигена с активностью в РДП более 100 ЕА·мл, а также сокращение времени и стадий получения стерильного концентрированного протективного антигена с активностью в РДП не менее 200 ЕА·мл. Изобретение позволяет воспроизводимо получать нативный ПА с активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле более 100 ЕА·мл, сократить время и количество технологических стадий получения стерильного концентрированного ПА.
7
3
Патент РФ №2480237 [9] описывает методику изготовления комбинированной вакцины из известных компонентов (суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,2)×10- в 1 см физиологического раствора - 1,0-1,2 и инактивированного формалином лейкоцидина (экзотоксин F. necrophorum) массой 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum «0-1» ВИЭВ с содержанием белка 5,5-6 мг %, адсорбированный 12-15% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%, предварительно суспендированной в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6) с добавлением в качестве адъюванта геля сапонина, необходимого для продления срока защитного действия вакцины до одного года.
Известен действующий отечественный патент РФ №2444570 [10]. В нем описан способ получения рекомбинантной вакцины, предусматривающий создание химерных белков или ДНК, экспрессирующих гены этих химерных белков, состоящих из трех или более функциональных частей. Эти части являются действующим веществом вакцины и представлены антигеном патогенного микроорганизма, лигандом для TLR-рецепторов и лигандами для рецепторов, проводящих сигнал через ITAM-мотив. Химерные белки напрямую используют в качестве вакцины для иммунизации человека и животных. Для вакцин, представляющих собой ДНК, кодирующую химерный белок, в качестве носителя используют рекомбинантные аденовирусные частицы и/или плазмидную ДНК.
Известен патент РФ №2321628 [2] описан рекомбинантный штамм В. anthracis СТИ тпа-1 (pub110pa-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба. Штамм получен путем трансформации штамма В. anthracis СТИ тпа-1 (pub110pa-1) плазмидой pUB110PA-1. Он депонирован в ГК патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ-96. По утверждениям авторов, штамм характеризуется стабильностью гибридного репликона и высоким уровнем продукции протективного антигена - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.
Известны также действующие на территории РФ и в других странах мира иностранные патенты на создание вакцин против сибирской язвы, например патент US 8409590 [11]. Основной частью формулы является описание метода изготовления субстанции в виде сухого порошка, содержащего протективный антиген B. anthracis, хитозан и поликлональные сывороточные антитела к ПА. Субстанция предназначена для введения через слизистые оболочки и предназначена преимущественно для индукции «секреторного» иммунитета.
Известен Патент US 8383359 [12] описывается метод количественной оценки Т-лимфоцитов, специфичных к летальному антигену B. anthracis. Изобретение направлено на создание метода точной количественной оценки эффективности новых вакцин против сибирской язвы, что свидетельствует об актуальности работ в этом направлении с точки зрения правительственных экспертов США.
В патенте US 8394387 [13] описан дефектный по споруляции рекомбинантный штамм B. anthracis, накапливающий большие количества протективного антигена (PA) с повышенной протеолитической устойчивостью, предназначенный для иммунизации человека и животных. Наличие этой разработки свидетельствует о том, что правительственные эксперты США считают допустимым по соображениям безопасности использование живых рекомбинантных штаммов B. anthracis для создания вакцин для защиты как человека, так и животных. Основную проблему на этом пути они усматривают в необходимости повышения иммуногенности РА, для чего они предлагают его мутантный вариант. Предлагаемое в рамках ПНИ решение по созданию ВПЧ, несущих РА, представляется равно безопасным по сравнению с описанным в патенте US 8394387, однако, позволяющим добиться существенно большего повышения иммуногенности.
Имеется патент US 8404820 [14], описывающий полную структуру антитела человека, обладающего способностью к нейтрализации РА B. anthracis.
Характеризуя активность зарубежных компаний-разработчиков вакцин против сибирской язвы на территории РФ, целесообразно обратить внимание на действующий патент РФ №2270865 [15]. Разработан способ получения иммуногенного полипептида, вызывающего иммунный ответ, обеспечивающий защиту от инфекции B. anthracis. Предложенный иммуногенный полипептид содержит от одного до трех доменов полноразмерного протективного антигена (РА) из В. anthracis или их варианты, и, по меньшей мере, один из указанных доменов является доменом 1 или доменом 4 из РА или его вариантом. Данные варианты иммуногенного полипептида, а также полноразмерный РА продуцируются в результате экспрессии в E.coli. Также предложен вектор для экспрессии в бактериальных клетках, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый выше иммуногенный полипептид. Разработан способ предупреждения инфекции, вызванной В. anthracis за счет введения достаточного количества иммуногенного полипептида. Предложена также вакцина для предупреждения инфекции, вызываемой В. anthracis, содержащая эффективное количество иммуногенного полипептида и подходящий носитель.
К этому же числу можно отнести патент РФ №2288272 [16]. В патенте описан метод получения протективного антигена В. anthracis опытно-промышленного уровня. Разработана технология культивирования рекомбинантного штамма E.coli в лабораторных ферментерах с подпиткой (фидингом). Штамм получен на базе плазмиды pQE30. Денатурированный мочевиной рекомбинантный РА, имеющий на N-конце 6His-таг, очищают с помощью металлоаффинной хроматографии.
Раскрытие изобретения
1) Фрагмент ДНК, содержащий промотор гена WprA получают с помощью ПЦР с праймерами Wpr141 и WPR201, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. subtilis AJ73, размер продукта 935 п.н. Продукт обрабатывают с помощью двойной рестрикции XhoI и SphI и лигируют с ДНК векторной плазмиды pQE30 (Invitrogen), предварительно расщепленной XhoI и SphI. Проводят трансформацию E.coli TG1, отбирают колонии, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 930 п.н. при контрольной рестрикции по XhoI и SphI.
2) Фрагмент ДНК, соответствующий гену PAG получают с помощью ПЦР с праймерами PAG201 и PAG3, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, размер продукта 525 п.н. Продукт обрабатывают с помощью двойной рестрикции Eco32.I и KpnI и лигируют с ДНК плазмиды pQE30-WprA, полученной на предыдущей стадии конструирования, предварительно расщепленной Eco32.I и KpnI. Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают ампициллин-устойчивые колонии, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 520 п.н. при контрольной рестрикции Eco32.I и KpnI.
3) Фрагмент ДНК, содержащий терминатор гена WprA получают с помощью ПЦР с праймерами WPR1.1 и Wpr2, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. subtilis AJ73, размер продукта 150 п.н. Продукт обрабатывают с помощью двойной рестрикции PstI и SacI и лигируют с ДНК плазмиды pBlueScript-KS+(Stratagene). Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают ампициллин-устойчивые колонии, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 1020 п.н. при контрольной рестрикции PstI и SacI.
4) Фрагмент размером 770 п.н., соответствующий маркеру устойчивости к спектиномицину с собственным промотором и терминатором транскрипции, получают путем обработки рестриктазой PstI плазмидной ДНК конструкции pSG1154 (Lewis P.J., Marston A.L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 1999 Feb 4; 227(1): 101-110). Его и лигируют с ДНК плазмиды pBS-WprA, полученной на предыдущей стадии конструирования, предварительно расщепленной PstI. Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают колонии с двойной устойчивостью к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл и спектиномицину в концентрации 75 мкг/мл. Проверяют наличие в плазмиде вставки ожидаемого размера 770 п.н. при контрольной рестрикции PstI. Предпочтительно использовать клоны, содержащие вставку маркера устойчивости к спектиномицину в ориентации, соответствующей ходу транскрипции гена LacZ (отличительный признак – образование единственного фрагмента 4420 п.н. при контрольной рестрикции EcoRI).
5) Фрагмент длиной 2060 п.н., содержащий терминатор транскрипции гена WprA и маркерный ген Spc, экстрагируют из конструкции pBS-Spc-WprA, подвергая ее двойной рестрикции EcoR32.1 и Ecl136.II. Очищенный путем элюции из агарозного геля продукт лигируют с ДНК конструкции pQE30-WprA-PAG, расщепленной рестриктазой PvuII. Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают колонии с двойной устойчивостью к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл и спектиномицину в концентрации 75 мкг/мл. Проверяют наличие в плазмиде вставки ожидаемого размера 480 п.н. при контрольной рестрикции EcoRI. Отбирают клоны, содержащие вставку маркера устойчивости к спектиномицину в ориентации, обратной ходу транскрипции гибридного гена WprA-PAG.
6) Полученная конструкция получает обозначение pWPag201-SW (Фиг.1), SEQ ID NO 1.
ДНК конструкцию pWPag201-SW используют для введения в штамм B. subtilis AJ73 методом химической трансформации по Спицайзену, как описано ранее (Anagnostopoulos C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. - 1961. - V. 81. - P. 741-746.). Отбор трансформантов проводят на агаризованной среде LB (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, NaCl 0,5%, 2% бактоагара), содержащей 75 мкг/мл спектиномицина.
Краткое описание графических изображений
Фиг.1. Схема функциональных элементов конструкций pWPag201-SW (SEQ ID NO 1), предназначенной для введения в клетки B. subtilis гена PAG, кодирующего изолированный домен 1 полноразмерного белка из B. anthracis с секреторным лидером. Конструкция содержат промотор WprA, терминатор WprA, ген PAG из B. anthracis 55-ВНИИВВиМ (SEQ ID NO 2), маркер устойчивости к спектиномицину из конструкции pSG1154. Поддержание конструкции в E.coli осуществляется за счет элементов из состава стандартного вектора pQE30 (Invitrogen): репликона плазмиды pMC16 и гена β-лактамазы (детерминанта устойчивости к ампициллину).
Фиг.2. Идентификация продукта модифицированного гена PAG в культуральной жидкости B. subtilis AJ73, несущей конструкцию pWPag201-SW, методом иммуноблоттинга с антителами против протективного антигена B. anthracis 55-ВНИИВВиМ (производства ФКП «Орловская биофабрика»). На дорожки геля нанесены: молекулярно-массовый стандарт PageRuler (MBI Fermentas (Литва)), дорожки 1 и 2 - суммарные белки культуральной жидкости нерекомбинантного штамма B. subtilis AJ73, дорожка 3 - культуральная жидкость нерекомбинантного штамма B. subtilis AJ73 pWPag201-SW.
Осуществление изобретения
1. Генноинженерное конструирование
Штамм B. subtilis AJ73 получают из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, где он депонирован под номером ВКПМ B-5036. Для выделения ДНК из биомассы штамма используют 1,5 мл культуры, полученной выращиванием на жидкой среде LB (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, NaCl 0,5%) при интенсивной аэрации при 37°С.выделяют ДНК с помощью набора Проба-ГС (ДНК-технология, Москва) согласно инструкции производителя, растворяя полученный препарат в 50 мкл деионизованной воды. В качестве матрицы для проведения ПЦР используют 1 мкл препарата геномной ДНК. Реакцию проводят в 30 мкл, используя по 10 пмоль каждого из двух праймеров Wpr141  и WPR201 . Продукт размером 935 п.н. очищают путем нанесения-десорбции на стеклянное молоко с применением набора GenJet (MBI Fermentas, Литва) и растворяют в 30 мкл деионизованной воды. 10 мкл препарата отбирают для двойной рестрикции XhoI/SphI и лигируют с ДНК вектора pQE30 (Invitrogen) в стандартных условиях. Лигазной смесью проводят трансформацию E.coli TG1, трансформанты высевают на среду с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Отбирают ампициллин-резистентные колонии. Полученная конструкция получает обозначение pQE30-WprA.
Для выделения ДНК из биомассы штамма B. anthracis 55-ВНИИВВиМ используют вакцину сухую сибиреязвенную производства Федерального казенного предприятия «Орловская биофабрика». К лиофилизированному препарату из вскрытой ампулы добавляют 1 мл деионизованной воды, тщательно суспендируют пипетированием, отбирают 100 мкл и выделяют ДНК с помощью набора Проба-ГС (ДНК-технология, Москва) согласно инструкции производителя, растворяя полученный препарат в 50 мкл деионизованной воды. В качестве матрицы для проведения ПЦР используют 1 мкл препарата геномной ДНК. Реакцию проводят в 30 мкл, используя по 10 пмоль каждого из двух праймеров PAG201 (GGGATATCatatgaaaaaacgaaaagtgtt) и PAG3 (GGGGTAccagcacttgtacttcgcttt).
Продукт размером 525 пн очищают путем нанесения-десорбции на стеклянное молоко с применением набора GenJet (MBI Fermentas, Литва) и растворяют в 30 мкл деионизованной воды. 10 мкл препарата отбирают для двойной рестрикции Eco32.I/KpnI и лигируют с ДНК вектора pQE30-WprA (Invitrogen) в стандартных условиях. Лигазной смесью проводят трансформацию E.coli TG1, трансформанты высевают на среду с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Отбирают ампициллин-резистентные колонии. Полученная конструкция получает обозначение pQE-WprA-PAG.
Вспомогательную конструкцию, содержащую терминатор гена WprA и маркер устойчивости к спектиномицину Spc с собственным промотором и терминатором, получают на основе вектора pBlueScript-KS+(Stratagene) (pBSks+), после чего переносят оба элемента на репликон вектора pQE30, несущего промотор гена WprA и модифицированный вариант гена PAG.
Для этого фрагмент ДНК, содержащий терминатор гена WprA, получают с помощью ПЦР с праймерами WPR1.1 и Wpr2, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. subtilis AJ73 (ВКПМ B-5036), размер продукта 1600 п.н. Продукт обрабатывают рестриктазами PstI (расщепляет природный сайт внутри кодирующей области гена WprA) и SacI (вводится в составе праймера Wpr2). Рестрикционную смесь, не разделяя на фрагменты, лигируют с ДНК плазмиды pBlueScript-KS+(Stratagene). Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, высевая трансформанты на среду с ампициллином в концентрации 100 мкг/мл и X-gal в концентрации 20 мкг/мл. После инкубации чашки Петри с агаризованной средой в течение 20 часов при 37°С, отбирают ампициллин-устойчивые колонии белого цвета, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 1020 п.н. при контрольной рестрикции PstI и SacI.
С целью введения в конструкцию pBSks-WprA маркера устойчивости к спектиномицину, ген лекарственной устойчивости получают в виде фрагмента размером 770 п.н. путем обработки рестриктазой PstI плазмидной ДНК конструкции pSG1154 (Lewis P.J., Marston A.L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 1999 Feb 4; 227(1): 101-110). Его лигируют с ДНК плазмиды pBS-WprA, полученной на предыдущей стадии конструирования, предварительно расщепленной PstI.
Поскольку маркер Spc содержит собственный промотор и терминатор транскрипции, и вводится в лигирование в виде фрагмента с одноименными (симметричными) концами, образованными рестриктазой PstI, возможно его встраивание в вектор в обеих ориентациях. Кроме того, большая часть вектора при лигировании замыкается в кольцо, не захватывая вставку. Однако, для дальнейшего применения пригоден вариант конструкции только с одной ориентацией вставки, в которой кодирующие области гена WprA и Spc расположены конвергентно. С учетом этого, лигазную смесь используют для трансформации E.coli TG1, после чего высевают трансформанты на агаризованную полноценную среду LB, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и спектиномицин в концентрации 75 мкг/мл. Проверяют наличие в плазмиде вставки ожидаемого размера 770 п.н. при контрольной рестрикции PstI и отсутствие фрагмента при рестрикции EcoRI.
На заключительном этапе конструирования из плазмиды pBSks-Spc-WprA извлекают полноразмерную вставку, содержащую как маркер Spc, так и транскрипционный терминатор гена WprA. Для этого ее подвергают двойной рестрикции эндонуклеазами EcoR32.I и Ecl136.II, дающими тупые концы. Вставку размером 2060 п.н. экстрагируют элюцией из агарозного геля и лигируют с плазмидной ДНК конструкции pQE-WprA-PAG, расщепленной PvuII, также образующей тупой конец. Сайт рестриктазы PvuII в составе конструкции pQE-WprA-PAG расположен за пределами полилинкера ниже терминатора фага Т5, происходящего из базового коммерческого вектора pQE30. Таким образом, в случае вcтройки фрагмента Spc-WprA на базе pQE30 в прямой ориентации терминатора WprA относительно его промотора образуется интегративная конструкция, обладающая двумя плечами для гомологичной рекомбинации с хромосомой B. subtilis. Эти плечи фланкируют маркер лекарственной устойчивости к спектиномицину, что дает возможность селектировать на антибиотикосодержащей среде клоны, содержащие конструкцию в хромосоме (репликон pQE30 (pMC16) не поддерживается в B. subtilis и других видах бацилл).
С учетом этого на последней стадии конструирования отбирают клоны E.coli, обладающие способностью расти на плотной полноценной среде с содержанием спектиномицина 75 мкг/мл (уровень спонтанной устойчивости E.coli к этому антибиотику 30-40 мкг/мл). Отбор необходимой ориентации вставки проводят за счет контрольной рестрикции плазмидной ДНК клонов рестриктазой EcoRI: целевые клоны дают фрагменты размером 480 п.н. и 6680 п.н.
2. Получение рекомбинантных штаммов B. subtilis
Введение ДНК конструкции pWPag201-SW в клетки B. subtilis AJ73 проводится методом химической трансформации по Спицайзену с отбором трансформантов на полноценной среде, содержащей 75 мкг/мл спектиномицина. Для проведения трансформации ДНК конструкции pWPag201-SW препаративно выделяют из клеток E.coli TG1. В трансформации она используется в кольцевой форме в количестве 2-5 мкг на одну реакцию. Полученные штаммы-трансформанты учитывают через 48 часов после инкубации на полной среде при 37°С. Их однократно пассируют на полноценной среде со спектиномицином для удаления клеток штамма дикого типа, не несущего конструкции. После этого по 10 клонов, несущих каждую конструкцию, тестируют на способность к продукции целевого белка PAG путем высева на среду LB, не содержащую антибиотика. Учет результатов проводят после культивирования штамма при +37°С в течение 20 часов.
3. Исследование уровня накопления целевого продукта – белка PAG в среде культивирования рекомбинантных штаммов, несущих конструкцию pWPag201-SW
3.1 Получение посевной культуры.
В микробиологическую пробирку объемом 20 мл, содержащую 3 мл жидкой среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl) микробиологической петлей засевают материал отдельной колонии B. subtilis AJ73 (pWPag201-SW), полученной на плотной среде LB без добавления антибиотика. Культивирование ведут при+37°С в течение 16 часов.
3.2 Получение рабочей культуры.
30 мкл посевной культуры вносят в 3 мл среды LB. Культивирование ведут при +37°С в течение 20 часов.
3.3 Сбор биомассы.
Биомассу рабочих культур собирают центрифугированием в при 9 тыс. G в течение 3 мин. 1 мл супернатанта каждой культуры осаждают, добавляя 100 мкл насыщенного раствора трихлоруксусной кислоты с последующей инкубацией при +4°С в течение 30 мин и центрифугированием при 9 тыс. G в течение 5 мин. Супернатант тщательно удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок промывают 50% водным раствором ацетона (200 мкл на полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл), центрифугируют при 9 тыс. G в течение 2 мин., супернатант тщательно удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок подсушивают на воздухе при 37°С в течение 5 мин.
В качестве отрицательного контроля используют нерекомбинантный штамм B. subtilis AJ73, с культуральной жидкостью которого проводят операции, идентичные культуральной жидкости рекомбинантных штаммов.
3.4 Выявление рекомбинантного продукта конструкции pWPag201-SW методом иммуноблоттинга.
2
2
Осажденные ТХУ препараты секреторной фракции культуральной жидкости B. subtilis AJ73 (pWPag201-SW) растворяют в 20 мкл буфера Лэммли (трис, 3 г; глицин 14,2, 1% SDS), содержащего 1% свежевнесенного β-меркаптоэтанола, денатурируют образцы прогреванием при 98°С в течение 5 мин и осветляют центрифугированием при 9 тыс. G в течение 2 мин. По 10 мкл каждого образца тестируют, нанося на дорожки 12,5% денатурирующего ПААГ, с последующим диск-электрофорезом и полусухим переносом на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C. Визуализацию иммуноблоттинга проводят с помощью лошадиных поликлональных антител, полученных при трехкратной иммунизации сухой сибиреязвенной вакциной производства ФКП «Орловская биофабрика» в разведении 1:5000 раз в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2). Связанные на мембране антитела визуализируют с помощью конъюгата белка А с пероксидазой (Имтек (Москва). В качестве хромогенного субстрата используют 0,02% 3,3’-диаминобензидин (Sigma) в присутствии 0,01% HO. Для определения молекулярной массы белков используют стандарт PageRuler (MBI Fermentas (Литва)). Результаты типичного определения представлены на Фиг.2. Масса иммуноположительного продукта (дорожка 3) соответствует ожидаемой и равна 35 кДа. Аналогичный иммуноположительный продукт в культуральной жидкости нерекомбинантного штамма B. subtilis AJ73 (дорожки 1 и 2) не выявляется.
Источники информации
1. Караваев Ю.Д., Селиверстов В.В., Мельник Н.В. и др. Ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных // Патент РФ №2191599. Опубл. 27.10.2002.
2. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Кудрявцева О.М. Рекомбинантный штамм Bacillus anthracis СТИ ТПА-1 (pUB110pa-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Патент РФ №2321628. Опубл. 10.04.2008.
3. Кожухова В.В., Пименова Е.В., Сероглазова В.В. и др. Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины // Патент РФ №2181294. Опубл. 20.04.2002.
4. Садовой Н.В., Кравец И.Д., Селиваненко Г.М. и др. Вакцина сибиреязвенная комбинированная // Патент РФ №2115433. Опубл. 20.07.1998.
5. Дербин М.И., Садовой Н.В., Тарумов B.C., Гарин Н.С. Сравнительное изучение гуморального противосибиреязвенного иммунитета у привитых живой и химической вакцинами // Иммунология. 1982. №3. С.49–52.
6. Бургасов П.Н., редактор. Патоморфогенез сибирской язвы. М.: Медицина; 2002. 240 с.
7. Караваев Ю.Д., Семенова И.Н., Мусаев А.Р., Панюков Н.А. Вакцина для профилактики некробактериоза рогатого скота // Патент РФ №1816348. Опубл. 20.08.1995.
8. Шевцов А.Н., Лобастов В.С., Боровской Д.В. и др. Способ получения сибиреязвенного протективного антигена // Патент РФ №2340356. Опубл. 10.12.2008.
9. Мельник Н.В., Соболев В.В., Захарченко О.С.и др. Ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных // Патент РФ №2480237. Опубл. 27.04.2013.
10. Щербинин Д.Н., Тутыхина И.Л., Верховская Л.В. и др. Способ получения рекомбинантной вакцины // Патент РФ №2444570. Опубл. 10.03.2012.
11. Susan Wimer-Mackin. Anthrax antigens and methods of use // Патент США 8409590. Опубл. 02.04.2013.
12.  Frucht D.M., Fang H. Use of lymphocytes to measure anthrax lethal toxin activity // Патент США 8383359. Опубл. 26.02.2013.
13. Leppla S.H., Rosovitz M.J., Robbins J.B. et al. Recombinant modified Bacillus anthracis protective antigen for use in vaccines // Патенте США 8394387. Опубл. 12.03.2013.
14. Keler T., Lowy I., Vitale L.A. et al. Human monoclonal antibodies against Bacillus anthracis protective antigen // Патент США 8404820. Опубл. 26.03.2013.
15. Уильямсон Э.Д., Миллер Д., Уолкер Н.Дж. и др. Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против Bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной Bacillus anthracis // Патент РФ №2270865. Опубл. 27.02.2006.
16. Бхатнагар Р., Вахид С.М., Чаухан В. Высокие уровни конститутивного продуцирования защитного антигена сибирской язвы // Патент РФ №2288272. Опубл. 27.11.2006.