Варианты иммунного реагирования при раке почки

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

в противоопухолевом иммунитете играет клеточный иммунный ответ, ключевыми участниками которого являются Т-лимфоциты. Т-лимфоциты экспрессируют ддифференци-ровочные антигены, которые объединены в кластеры диф-ференцировки (CD). Субпопуляции CD-клеток различны по функциям, стадиям развития и активации Т-лимфоцитов и могут служить иммунологическими маркерами онкогене-за, в том числе и рака молочной железы (РМЖ).

Цель и задачи. Определение соотношения лимфоцитов разных популяций, выбранных в качестве предполагаемых иммунологических маркеров, установление взаимосвязи между уровнем содержания этих клеток в периферической крови и стадией опухоли в молочных железах.

Материалы и методы. Исследовали венозную кровь 95 пациенток ГБУЗ «Республиканский Онкологический Диспансер» (г. Петрозаводск), имеющих гистологически подтвержденный РМЖ: ст. I — 20, ст. II — 30, ст. III — 45. В качестве контроля использовали кровь 30 небеременных женщин, сопоставимых по возрасту, данным анамнеза и не имеющих онкологических заболеваний. Субпопуляции мононуклеарных клеток периферической крови выявляли методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител, специфичных к диффе-ренцировочным антигенам (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD95) (Sigma, США). Оценивали относительное количество CD-позитивных клеток от общего числа лимфоцитов. Для сравнения выборок использовали непараметрический U-критерий Уилкоксона—Манна—Уитни.

Результаты. Согласно результатам иммунофенотипи-рования клеток периферической крови ст. I РМЖ характеризовалась статистически значимым повышением относительного количества CD16-клеток: 17,06±0,74, по сравнению с контрольной группой (13,15±0,94). Одновременно происходило снижение относительной численности CD3 и CD4-клеток (от 62,74±1,98 контроля до 53,65±1,20 и от 39,94±2,79 контроля до 34,05±0,77 соответственно), и повышение уровня CD8-клеток (до 36,17±0,84 против 31,98±1,62 контроля), что отражается на соотношении CD4+/CD8+ и свидетельствует о наличии хелперного дефекта. По мере развития опухоли, начиная со II стадии, у больных отмечалось прогрессирование иммунодефицитного состояния: относительное количество CD3 и CD4-клеток достоверно снижалось. Содержание CD4+CD25+, напротив, в крови увеличивалось: 8,01±0,11 для больных III стадией РМЖ. У здоровых женщин данный показатель составил 4,11±0,48. Содержание CD20-клеток в крови оставалось без изменения. Количество CD95-лимфоцитов достоверно повышалось по мере прогрессирования опухоли.

Заключение. Не смотря на то, что изменение соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов дает только ориентировочные выводы, в первую очередь, акцентируя внимание на прогрессировании онкопатологии, использование Т-лимфоцитов в качестве дополняющих диагностических и прогностических иммунологических маркеров при раке молочной железы позволит повысить точность постановки диагноза и эффективность лечения, основываясь на индивидуальном иммунологическом «портрете» пациентки.

Исследование проведено в рамках выполнения государственного задания Минобрнауки России, проект 6.5111.2017/БЧ.

ВАРИАНТЫ ИММУННОГО РЕАГИРОВАНИЯ ПРИ РАКЕ ПОЧКИ

Борисов А.Г., Савченко А.А., Кудрявцев И.В., Модестов А.А., Тоначева О.Г., Мошев А.В.

Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера, Красноярск, Россия

Механизмы нарушения противоопухолевого иммунитета многообразны и связаны в конечном итоге с невозможность распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Стратификация больных в подгруппы со сходными показателями иммунного реагирования является важнейшим шагом в реализации индивидуального подхода к лечению онкологических больных.

Цель. Используя кластерный анализ, описать варианты иммунного реагирования у больных почечноклеточ-ным раком (ПКР) и дать характеристику течения заболевания в этих группах.

Обследовано 63 больных ПКР в возрасте 40-55 лет проходивших лечение в КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер имени А.И. Кры-жановского». Диагноз у всех больных верифицирован гистологически. В качестве контрольной группы были обследованы 78 практически здоровых людей аналогичного возрастного диапазона. Исследование фенотипа лимфоцитов крови проводили методом проточной цито-метрии на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, USA). Использовалось пятицветное иммунофе-нотипирование по панелям: CD3/CD4/CD8/CD45/CD25 и CD3/CD19/CD16+56/CD45/HLA-DR. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларацией (2013 г.). Кластеризацию осуществляли методом одиночной связи (Single linkage). Число кластеров определяли на основании вычисления величин Евклидовых расстояний между среднегрупповыми величинами.

При изучении иммунологических данных обнаружено большая вариабельность иммунологических показателей, несмотря на то, что у больных ПКР определяется лимфопения за счет снижение числа Т-, NK- и NKT-лимфоцитов, при индивидуальном анализе практически у 45% больных не выявлены отклонения от нормы.

Последующий кластерный анализ основных иммунологических показателей позволил выделить четыре кластера, определенных нами как варианты иммунного ответа. Первый с увеличением числа клеток врожденного иммунитета и прежде всего, нейтрофилов выявлен в 4,76%. Второй с увеличением числа цитотоксических Т-лимфоцитов и иммуноглобулинов класса G диагностирован в 19,05% случаев. Третий со снижением иммуноглобулинов, нейтрофилов и Т-лимфоцитов — иммунодефи-цитный в 31,75%. Наиболее распространенным оказался ареактивный вариант (44,44%), иммунологические показатели которого у больных ПКР не выходили за контрольный диапазон. Анализируя особенности клинического течения в этих группах установлено, что только у больных ПКР T1-2N0M0, встречался вариант иммунного реагирования с активацией врожденного иммунитета. Помимо этого у больных этой группы диагностировались варианты с активацией адаптивного иммунитета (19,35%), иммуно-дефицитный (32,26%) и ареактивный (38,71%). У больных ПКР T3N0M0 так же в 2/3 случаях диагностировался им-мунодефецитный (21,05%) и ареактивный (47,37%) вариант иммунного реагирования и в 31,58% случаях активация адаптивного иммунитета. У больных ПКР T3-4N0-1M1

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

выявлен только иммунодефицитный и ареактивный вариант реагирования соответственно 46,15 и 53,85%

Таким образом, установлено, что показатели, характеризующие различные звеньев иммунной системы при ПКР, характеризуются значительным разнообразием значений. Использование кластерного анализа позволило выделить у больных ПКР 4 иммунотипа, определяемых различным состоянием врожденного и адаптивного иммунитета. Эти иммунотипы можно рассматривать как различные патогенетические варианты течения ПКР. Неблагоприятными при этом является иммунодефицитный и, несмотря на нетяжелое течение, — ареактивный иммунотип. Иммуноти-пы с активацией адаптивного и врожденного иммунитета являются наиболее благоприятными. Стратификация пациентов при ПКР по иммунотипам может лечь в основу при назначении иммунотропных препаратов, так как позволит повысить эффективность лечения больных ПКР и реализует персонифицированные подходы к диагностике и лечению нарушений функции иммунной системы.

УЧАСТИЕ CD4+CD39+Т-КЛЕТОК В ФОРМИРОВАНИИ ИММУННОЙ СУПРЕССИИ У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ

Жулай Г.А.1, Олейник Е.К.1, Чуров А.В.1, Кравченко П.Н.1, Романов А.А.2, Олейник В.М.1

1ФГБУНИнститут биологии Карельского научного центра РАН, Петрозаводск, Россия 2 ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер», Петрозаводск, Россия

В настоящее время в онкоиммунологии уделяется особое место изучению молекулы эктонуклеозидтри-фосфат дифосфогидролазы-1 (ENTPD1, CD39). CD39 совместно с CD73 участвует в генерации внеклеточного аденозина, оказывающего иммуносупрессорное действие через А2А-рецепторы и способствующего развитию опухоли. Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных типов злокачественных новообразований, однако роль аденозин-A2AR иммуносупрес-сорного механизма в его развитии до конца не изучена.

Цель. Оценка роли СD4+Т-клеток, экспрессиру-ющих CD39, в формировании иммунной супрессии у больных КРР.

Материалы и методы. Обследовано 42 больных КРР и 30 здоровых доноров. Уровень мРНК CD39, CD73, A2AR определяли методом ПЦР в реальном времени. Проведен анализ фенотипов клеток периферической крови, а также опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ), выделенных из клинических образцов опухолевой ткани (n = 5). Лимфоциты крови анализировали до начала терапии. Экспрессию CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD127, FoxP3, CD39 оценивали методом проточной ци-тометрии. Достоверность различий между группами рассчитывали по критерию Манна—Уитни при уровне значимости р < 0,05, для выявления и оценки характера связи между признаками использовали коэффициент корреляции Спирмена. Данные представлены в виде M±SD.

Результаты. Для оценки активации аденозин-А2АЯ иммуносупрессорного механизма у больных КРР определяли уровень мРНК генов CD39, CD73, A2AR. Показано, что у больных КРР содержание мРНК CD39 в лейкоцитах увеличивается в процессе развития заболевания, тогда как для CD73 значительных различий по сравнению с контролем не найдено. Наряду с этим для больных с поздними

Онкоиммунология и гемобластозы Cancers and hematological malignancies

стадиями КРР (Ш-ГУ ст.) отмечено повышение экспрессии мРНК A2AR, что может свидетельствовать об активации аденозин-A2AR иммуносупрессорного механизма.

На поздних стадиях развития КРР (Ш-ГУ ст.) наблюдалось накопление периферических CD4+CD39+T-клеток. Среди ОИЛ количество этих клеток было в 4 раза выше (р < 0,05), чем в крови тех же больных. Увеличение числа CD39+ клеток среди ОИЛ наблюдалось и в популяции СD3+CD4-Т-клеток. При этом доля CD4-CD39+ клеток была выше в опухолевой ткани.

В работе проводили анализ популяционного состава периферических лимфоцитов для определения связи с CD4+CD39+Т-клетками у больных КРР. Были отмечены изменения, вероятно, свидетельствующие о развитии вторичного иммунодефицита, особенно в отношении Т-лимфоцитов. У больных КРР по сравнению с контролем снижено число В-лимфоцитов, как на начальных стадиях развития заболевания, так и на поздних (р < 0,05). В отношении №К-клеток у больных КРР достоверных различий по сравнению с контролем не выявлено. Изменения количества CD3+Т-лимфоцитов отмечены для больных с Ш-ГУ стадиями КРР. На всех стадиях развития КРР наблюдалось пониженное число CD4+Т-хелперов (р < 0,05) и активированных CD4+CD25+Т-клеток (р < 0,05), а также повышенное количество CD8+ЦТЛ (р < 0,05). В результате оценки связи изменений в популяционном составе лимфоцитов и CD4+CD39+Т-клеток у больных КРР обнаружена отрицательная корреляция между количеством CD3+CD4+T-хелперов и числом CD4+CD39+T-клеток (г = -0,60, р = 0,0003), а также между CD3-CD19+В-клеток и CD4+CD39+T-клеток (г = -0,40, р = 0,044).

Важную роль при канцерогенезе играет субпопуляция регуляторных CD4+Т-клеток (Т^). В крови больных КРР при анализе CD4+CD25+CDШlo<'- Tгegs наблюдали усиление уровня экспрессии молекулы CD39. Экспрессия CD39 у Т^-клеток увеличивается уже на начальных этапах (1-11 ст.) развития опухоли (55,24±4,2%) по сравнению с контролем (41,16±3,1%; р < 0,05) и достигает максимальных значений у больных с более поздними стадиями КРР (67,95±3,1%; с контролем р < 0,001, с 1-11 стадиями р < 0,05). Тогда как клетки с фенотипом не характерным для CD4+CD25- и CD4+CD25+Т-клетки, не отличались такой закономерностью. Кроме того, у больных КРР обнаружена положительная корреляция между экспрессией СD39 и транскрипционного фактора FoxP3 на СD4+Т-клетках (г = 0,47, р < 0,006). Среди ОИЛ CD4+CD25hi Tгeg-клетки также отличались от циркулирующих в периферической крови более высокой экспрессией эктонуклеотидазы CD39. Повышенная экспрессия этой молекулы наблюдалась и у нерегуляторных клеток с фенотипами CD4+CD25- и CD4+CD25+. Кроме того, при оценке связи экспрессии молекулы CD39 на Tгeg-клетках с уровнем мРНК A2AR, в крови больных КРР обнаружена положительная корреляция (г = 0,45, р < 0,05).

Заключение. Таким образом, повышенный уровень экспрессии молекулы CD39 как на периферии, так и среди ОИЛ, а также изменение мРНК A2AR лейкоцитов могут говорить об активации аденозин-A2AR иммуносупрессорного механизма у больных КРР. Полученные результаты, возможно, свидетельствуют об участии и важной роли Т^-клеток в этом механизме.

Финансовая поддержка: РФФИ (проект № 16-3400970), бюджетная тема № 0221-2014-0040.