Способ идентификации гриба Heterobasidion annosum
METHOD OF IDENTIFYING HETEROBASIDION ANNOSUM FUNGUS

Изобретение относится к области лесного хозяйства, в частности, к способам измерения, использующим микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты, и может быть использовано в лесной промышленности при идентификации патогенного гриба Heterobasidion annosum.
Heterobasidion annosum (корневая губка) - видовой комплекс патогенных белогнилостных древесных грибов, вызывающих корневую и прикорневую гниль у хвойных и лиственных пород в Северном полушарии. Ежегодные потери лесоуправителей оцениваются в миллиарды долларов из-за гибели деревьев, снижения урожайности и гниения древесины (Pathogens, 2019, V. 8, №3, Р. 156).
Болезнь хвойных насаждений характеризуется гнилью корневых систем и прогрессирующим усыханием деревьев. Возбудитель заболевания обитает повсеместно в хвойных и лиственных насаждениях вне зависимости от их состояния. Гриб беспрепятственно распространяется на живые деревья только при серьезных нарушениях в биогеоценозе, возникших в результате влияния природных и антропогенных факторов, в том числе ошибок в лесохозяйственной деятельности (часто при выращивании монокультур на нелесных землях) (Рекомендации по защите лесов от корневой губки в лесах Европейской части России. МПР РФ, ВНИИЛМ. Пушкино, 2001. 9 с). При усилении антропогенного влияния на экосистемы темпы развития корневой губки увеличиваются.
В настоящее время разрабатываются принципы и методики профилактики и лечения заболеваний растений, вызываемых данным патогеном. Проведенные финансовые анализы показали эффективность обработки пней в относительно здоровых древостоях с высоким содержанием споров Heterobasidion annosum на всей территории Финляндии. Кроме того, качество обработки пней оказывает существенное влияние на рентабельность вместе с ценой, уплачиваемой за гнилую древесину (Forest Policy and Economics, 2019, V. 105, P. 1-9). Данные методики осуществляются также и в России (Рекомендации по защите лесов от корневой губки в лесах Европейской части России. МПР РФ, ВНИИЛМ. Пушкино, 2001. 9 с). Возникает необходимость мониторинга и прогноза пространственно-временных рисков инфицирования при высококачественной обработке культи.
Известны способ определения вирулентности, агрессивности и патогенности корневой губки (Заявка на изобретение РФ №96115783; МПК A01G 7/00; опубл. 27.01.1999) и способ оценки санитарного и лесопатологического состояния лесных площадей на наличие корневых патогенов (Пат.РФ №2619987; МПК A01G 23/00; опубл. 28.04.2017), которые основаны на опосредованном анализе морфологических проявлений заражения растений грибом-патогеном - учете приживаемости черенков, сохранности, появления на них мицелия (ризоморф) и (или) плодовых тел опенка. Для анализа распространения корневой губки предлагается использовать формулу расчета, в которой учитываются общая условная фаутность на 1 дерево, коэффициент категорий очагов усыхания, фактический сырорастущий запас восприимчивой породы и другие коэффициенты.
Недостатком данных способов является невозможность видовой идентификации возбудителя, в частности гриба Heterobasidion annosum, в растениях.
Известен способ определения грибковых патогенов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Пат.РФ №2161196; МПК C12N 1/14, C12Q 1/68, C12N 15/80, A01N 63/04, С12Р 19/34; опубл. 27.12.2000), позволяющий идентифицировать широкий круг инфекции грибной природы и включающий выделение ДНК из растительного субстрата, проведение амплификации ПЦР в реальном времени, заключающейся в денатурации ДНК, присоединении праймеров и элонгации цепи ДНК. Для этого на основе ДНК в области внутреннего транскрибирующегося спейсера (ITS) гена рибосомной РНК конструируются праймеры, специфичные различным патогенным грибам. Последовательности ITS-ДНК из различных патотипов видов или родов патогенов могут быть разными для различных представителей видов или родов. Если определить ITS-последовательности патогена, то эти последовательности могут быть сопоставлены с другими ITS-последовательностями. Таким образом, из ITS-последовательностей могут быть получены праймеры. Праймеры, основанные на этих последовательностях, могут применяться для идентификации конкретных представителей патогенов в ходе полимеразной цепной реакции в растительных образцах. Принят за прототип.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокоспецифичного и оперативного способа идентификации гриба Heterobasidion annosum.
Технический результат заключается в разработке высокочувствительного (чувствительность способа составляет не менее 1 пг ДНК Heterobasidion annosum) и быстрого (в течение 2-3 часов в зависимости от способа выделения ДНК из растительного субстрата или мицелия гриба) способа анализа присутствия гриба Heterobasidion annosum.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации гриба Heterobasidion annosum, на основе ПЦР, включающем выделение ДНК из растительного субстрата или мицелия гриба, проведение амплификации ПЦР в реальном времени, заключающейся в денатурации ДНК, присоединении праймеров и элонгации цепи ДНК, согласно изобретению, при проведении амплификации ПЦР используют праймеры: прямой SEQ ID NO: 1 GAATATCGTGCAAGGTTG и обратный SEQ ID NO: 2 CGAAGAGTTTGTGAGAAG, а также TaqMan зонд SEQ ID NO: 3 FAM-CGCGGCTCGGAAGGGGTCAAAAGAACCC-BHQ1, при этом используют следующие температурные циклы: 1 цикл - температура 94°C в течение 5 мин. и 44 цикла - поочередно температура 94°C в течение 20 с и температура 59°С в течение 60 с, причем логарифмическое повышение уровня флюоресценции до 38 цикла в канале FAM амплификатора свидетельствует о наличии гриба Heterobasidion annosum в анализируемом образце.
На фиг. 1 представлены кривые амплификации (канал FAM) ПЦР в реальном времени.
Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК, включающего гены 18S рРНК, 5.8S рРНК и 28S рРНК и межгенные участки ITS1 и ITS2 для гриба Heterobasidion annosum. Установлены консервативные участки для данной таксономической группы, которые позволяют разработать способ идентификации гриба на основе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда, который представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. При проведении ПЦР гибридизованный с ДНК зонд расщепляется ДНК-полимеразой (вследствие ее экзонуклеазной активности), и высвобождается флуоресцентная метка. Таким образом, наблюдается повышение уровня флуоресценции.
Способ идентификации гриба Heterobasidion annosum с помощью проведения ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зонда реализуется следующим образом.
1. Производят сбор биологического материала (растения, растительные остатки, мицелий гриба). Для анализа используют не более 1 г биологического материала.
2. Производят выделение ДНК из биологического материала. Выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов («Био-Силика», «ДНК-технологии», «Qiagen», «Zymo Research)) и др.), так и методами органической экстракции с использованием ЦТАБ буфера.
3. Проводят амплификацию ПЦР в реальном времени, заключающуюся в денатурации ДНК, присоединении праймеров и элонгации цепи ДНК. При этом используют следующие температурные циклы: 1 цикл - температура 94°C в течение 5 мин. и 44 цикла - поочередно температура 94°С в течение 20 с и температура 59°С в течение 60 с.
Используют следующие праймеры и зонд:
прямой праймер SEQ ID NO: 1 GAATATCGTGCAAGGTTG;
обратный праймер SEQ ID NO: 2 CGAAGAGTTTGTGAGAAG;
TaqMan зонд SEQ ID NO: 3 FAM-CGCGGCTCGGAAGGGGTCAAAAGAACCC-BHQ1.
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР, который содержит нуклеотидные полиморфизмы, характерные только для гриба Heterobasidion annosum, с которыми взаимодействует TaqMan зонд.
4. Если наблюдается логарифмическое повышение уровня флуоресценции до 38 цикла в канале FAM амплификатора, это означает, что анализируемый образец содержит гриб Heterobasidion annosum.
Пример.
После предварительного выделения ДНК из 12 образцов растений (табл. 1) была проведена амплификация ПЦР в реальном времени (фиг. 1).
В двух пробах (№1 и №5) наблюдалось логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора до 38 цикла, при этом в других пробах (№№2-4 и №№6-12) не наблюдалось повышения флуоресценции, на основании чего был сделан вывод, что образцы №1 и №5 содержали гриб Heterobasidion annosum.
Предлагаемый способ идентификации гриба Heterobasidion annosum является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих амплификатор в реальном времени, центрифугу и сопутствующие реактивы и расходные материалы.