Набор для дифференциальной диагностики заболеваний
KIT FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF DISEASES

Изобретение относится к области медицинских исследований методами проточной цитометрии или иммунофлуоресцентного анализа с применением суспензионных микрочипов. Данное изобретение предназначено для мультипараметрической дифференциальной диагностики нескольких различных заболеваний как в режиме ручного использования, так и с возможностью автоматизации процесса диагностики и разделения исследуемых аналитов. Областью применения является лабораторная диагностика инфекционных заболеваний, а также научные исследования, направленные на поиск новых диагностических мишеней для обнаружения бактериальных и вирусных патогенов.
Известен микроноситель и способ его получения, описанный в патенте США [1]. В известном изобретении, ядро микроносителя покрывается полимерными слоями на основе кремния, между которыми наносятся слои квантовых точек и магнитных наночастиц, причем расстояние между слоями, содержащими квантовые точки (флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы) различных цветов, или магнитные наночастицы, подбирается таким, чтобы блокировать перенос энергии между ними, что в свою очередь позволяет добиться точного спектрального кодирования. Суммарная толщина промежуточных полимерных слоев, между флуоресцентными нанокристаллами разных цветов и магнитными наночастицами определяется либо количеством слоев, либо толщиной каждого отдельного слоя. Поверхность микроносителя может быть функционализирована биологическими распознающими молекулами для направленной доставки или специфического связывания с различными аналитами. Кроме того, следует отметить, что микроноситель может иметь полую структуру, например, для инкапсулирования лекарственных препаратов или иных биологически активных соединений. Также следует отметить, что несмотря на то, что предложенный микроноситель позволяет проводить одновременное мультиплексное определение различных маркеров заболеваний и проводить прецизионное флуоресцентное кодирование, он не позволяет проводить дифференциальную очистку или разделение различных маркеров, так как несмотря на наличие в составе носителя магнитных наночастиц, различные популяции в составе микроносителя являются одинаковыми с точки зрения их поведения во внешнем магнитном поле и пространственное разделение различных популяций в составе микроносителя только на основе их магнитных свойств невозможно.
В качестве прототипа выбрана тест-система на основе суспензионных микрочипов, способ получения которой описан в патенте [2]. В известном изобретении для создания суспензионных микрочипов на основе флуоресцентно кодированных микросфер, для придания микросферам флуоресцентных свойств и обеспечения флуоресцентного кодирования, микросферы покрыты слоями флуоресцентных нанокристаллов различных цветов, причем между слоями флуоресцентных нанокристаллов различных цветов нанесены слои положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов. Количество полиэлектролитных слоев различных зарядов не менее трех и выбрано таким образом, чтобы расстояние между соседними слоями флуоресцентных нанокристаллов разного цвета было таким, что обеспечивает блокирование перенос энергии между нанокристаллами различных цветов. При этом на поверхности микросфер расположены биологические распознающие молекулы, связывающие маркеры заболеваний. Для детекции используются комплексы, состоящие из биологических распознающих молекул, конъюгированных с флуоресцентной меткой, возбуждаемой на одной длине волны с применяемыми для флуоресцентного кодирования нанокристаллами. К недостаткам описанной тест-системы стоит отнести невозможность проведения дифференциального разделения отдельных аналитов, а также невозможность ее использования в виде таких классических тест-систем, как, например, иммунофлуоресцентный анализ (ИФА).
Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является расширение функциональных возможностей магнитных флуоресцентных микросфер, диагностических наборов, а также тест-систем, созданных на их основе, за счет дополнительной возможности проведения дифференциального разделения аналитов в магнитном поле, что позволяет проводить последующее дополнительное изучение очищенных аналитов, для более детального анализа заболевания или его возбудителя, с целью последующего эффективного выбора лечения методами персонализированной медицины.
Технический результат достигается тем, что набор для дифференциальной диагностики заболеваний, включающий популяции оптически кодированных микросфер, оболочка которых содержит один и более слоев флуоресцентных нанокристаллов, причем слой, содержащий флуоресцентные нанокристаллы одного цвета, отделен тремя и более слоями противоположно заряженных полиэлектролитов от слоя, содержащего флуоресцентные нанокристаллы другого цвета, при этом на поверхности каждой популяция микросфер, обладающих заданным оптическим кодом, иммобилизованы биологические распознающие молекулы, способные специфически связывать заданные маркеры заболеваний и/или патогенные биологические агенты; кроме того, набор включает детектирующие комплексы, состоящие из биологических распознающих молекул, способных специфически связывать заданные маркеры заболеваний и/или патогенные биологические агенты, конъюгированных с флуоресцентными метками, спектр поглощения которых совпадает со спектром поглощения флуоресцентных нанокристаллов, примененных для оптического кодирования микросфер, а спектр эмиссии флуоресцентного излучения отличается от спектра эмиссии флуоресцентных нанокристаллов, и дополнен тем, что в состав набора включены дополнительные популяции микросфер, полиэлектролитные слои которых состоят из полиэлектролитов, обладающих амфотерными свойствами, причем количество и состав слоев из полиэлектролитов с амфотерными свойствами различны между популяциями микросфер с различными оптическими кодами, кроме того все популяции микросфер в наборе содержат один и более слоев, содержащих магнитные наночастицы.
Применение полиэлектролитов, которые обладают амфотерными свойствами, в составе слоев оболочки микросфер позволяет проводить стимул-управляемое разрушение этих слоев. При этом включенные в состав этих слоев магнитные наночастицы будут высвобождаться, в результате чего микросферы будут терять магнитные свойства. Таким образом, заранее предусмотрев необходимость того, что какие-либо из обнаруженных аналитов в случае их обнаружения нуждаются в более детальном изучении другими методами, например, ПЦР, секвенированием или хроматографией, которые требуют получения аналитов в чистом виде, полиэлектролитные слои популяций микросфер, биологические распознающие молекулы на поверхности которых связывают данные аналиты, изготавливаются из полиэлектролитов с амфотерными свойствами. При этом, внешним стимулом, позволяющим отделить различные аналиты, служит изменение рН буферного раствора, в котором происходит анализ, так как измение рН приводит к изменению заряда амфотерных полиэлектролитов, а при нарушении электростатического взаимодействия, стабилизирующего полиэлектролитные слои, происходит их разрушение и потеря магнитных свойств заданных популяций микросфер, что в свою очередь позволяет проводить дифференциальное разделение различных аналитов в магнитном поле.
2
2
Существует первый частный случай, в котором в качестве флуоресцентных нанокристаллов используют полупроводниковые нанокристаллы состава PbS/CdS/ZnS, CuInS/ZnS, AgS.
Существует второй частный случай, когда в качестве магнитных наночастиц используют ферромагнитные или супер-парамагнитные наночастицы размерами от 1 до 100 нанометров, или ансамбли таких наночастиц.
Существует третий частный случай, когда слои магнитных наночастиц и флуоресцентных нанокристаллов разных цветов, расположены на расстояние не менее 10 нм друг от друга.
Существует четвертый частный случай, в котором для обеспечения расстояния не менее 10 нм между слоями магнитных наночастиц и флуоресцентных нанокристаллов разных цветов, нанесены чередующиеся слои положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов.
Существует пятый частный случай, где в качестве отрицательно заряженных полиэлектролитов применены поликислоты и/или соли этих поликислот, а в качестве положительно заряженных полиэлектролитов применены полиоснования и/или соли этих полиоснований.
Существует шестой частный случай, в котором для обеспечения расстояния не менее 10 нм, между слоями магнитных наночастиц и флуоресцентных нанокристаллов разных цветов, нанесены слои полиэлектролитов с амфотерными свойствами.
Существует седьмой случай, где в качестве полиэлектролитов с амфотерными свойствами используют высокомолекулярные соединения, содержащие кислотные и основные группы.
Существует частный случай, в котором в качестве биологических распознающих молекул применены биологические распознающие молекулы, связывающие маркеры антропонозных и/или антропозоонозных инфекционных заболеваний.
На фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая конкретный, пример компонентов набора для дифференциальной диагностики двух заболеваний, состоящего из двух типов популяций микросфер и двух типов детектирующих комплексов. Цифрами обозначены следующие элементы: микросфера из первой популяции, оболочка которой состоит из противоположно заряженных полиэлектролитов - 1; биологические распознающие молекулы, связывающие первый заданный маркер - 2; слой положительно заряженных полиэлектролитов - 3; слой отрицательно заряженных полиэлектролитов - 4; слой, содержащий флуоресцентные нанокристаллы - 5; слой, содержащий магнитные наночастицы - 6; флуоресцентный краситель - 7; биологические распознающие молекулы, связывающие первый заданный маркер, конъюгированные с флуоресцентным красителем (7) - 8; микросфера из второй популяции, оболочка которой состоит из полиэлектролитов с амфотерными свойствами - 9; биологические распознающие молекулы, связывающие второй заданный маркер - 10; слои полиэлектролитов, обладающих амфотерными свойствами - 11; слой, содержащий флуоресцентные нанокристаллы - 12; слой, содержащий магнитные наночастицы - 13; биологические распознающие молекулы, связывающие второй заданный маркер, конъюгированные с флуоресцентным красителем (7) - 14.
Принцип работы набора для дифференциальной диагностики заболеваний поясняется на примере детекции маркеров вируса иммунодефицита человека и маркеров туберкулеза в образце биологической жидкости человека. Для этого применяют набор, состоящий из четырех видов популяций микросфер: микросферы, покрытые слоями положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов (поли-виниламин и полиакриловая кислота, соответственно), в состав которых включены флуоресцентные нанокристаллы (максимум флуоресценции при 550 нм), обеспечивающие условный флуоресцентный код 1, и магнитные наночастицы, а на поверхности микросфер из этой популяции иммобилизованы антитела к липоарабиноманнану, арабиногалактан-миколат пептид глюкановому комплексу, и антитела 9d8 IgG3, которые эффективно связывают клетки возбудителя туберкулеза М. Tuberculosis; микросферы из второй популяции покрыты слоями полиэлектролитов, обладающих амфотерными свойствами (поли-диалиламин-малеиновая кислота - полистиролсульфонат (ПДААМК-ПСС) и поли-диалиламин-малеиновая кислота - поли-диметилдиаллиламмонийхлорид (ПДААМК-ПДМДААХ)), в состав которых включены флуоресцентные нанокристаллы (максимум флуоресценции при 500 нм), обеспечивающие условный флуоресцентный код 2 и магнитные наночастицы, несут на своей поверхности антитела к ВИЧ первого типа; микросферы из третьей популяции покрыты слоями полиэлектролитов, обладающих амфотерными свойствами (ПДААМК-ПСС и ПДААМК-ПДМДААХ), в состав которых включены флуоресцентные нанокристаллы (максимум флуоресценции при 590 нм), обеспечивающие условный флуоресцентный код 3 и магнитные наночастицы, несут на своей поверхности антитела к ВИЧ второго типа; микросферы из четвертой популяции покрыты слоями полиэлектролитов, обладающих амфотерными свойствами (ПДААМК-ПСС и ПДААМК-ПДМДААХ), в состав которых включены флуоресцентные нанокристаллы (максимум флуоресценции при 630 нм), обеспечивающие условный флуоресцентный код 4 и магнитные наночастицы, несут на своей поверхности антитела к ESAT6 - антигену, который секретируется из клеток М. tuberculosis. Кроме того, в набор входят детектирующие комплексы - флуоресцентный краситель (изотиоцианат флуоресцеина), конъюгированный с антителами, аналогичными иммобилизованным на поверхности микросфер, связывающими исследуемые аналиты. Образец биологической жидкости смешивают с популяциями микросфер и детектирующими комплексами и инкубируют 1 час при комнатной температуре в режиме легкого покачивания на шейкере, в результате чего образуются иммунокомплексы структуры «микросфера-аналит-детектирующий комплекс». Данная смесь анализируется на проточном цитометре, в соответствии с инструкцией по эксплуатации к прибору, в режиме коллекции проанализированного образца. В результате получается статистическая картина, характеризующая количественное соотношение исследуемых аналитов в биологическом образце. Затем проанализированный образец помещается в магнитный штатив где проходит смена буферного раствора на ацетатный буфер с рН 4,8. В данном буферном растворе оболочка микросфер с амфотерными полиэлектролитами распадается, и аналиты и соответствующие детектирующие компоненты высвобождаются в раствор, после чего удаляются пипеткой. Оставшиеся в пробирке комплексы, содержащие клетки М. tuberculosis, промываются один раз аналогичным буферным раствором, после чего в пробирке остаются клетки М. tuberculosis очищенные от других исследуемых аналитов, и готовые для других молекулярных исследований.
Предложенный набор для дифференциальной диагностики заболеваний позволяет расширить функциональные возможности и область применения магнитных флуоресцентно кодированных микросфер, а также диагностических наборов и тест-систем на их основе, за счет возможности их применения для разделения и очистки отдельных аналитов для дальнейшего анализа. Это особенно важно для использования подобных решений не только в суспензионных тест-системах, например, на основе проточной цитометрии, но также их применения в классических системах, подобных ИФА-анализу, что позволяет снизить стоимость анализа, за счет отказа от дорогостоящего оборудования. Кроме того, возможность дифференциального выделения аналитов для последующего более детального анализа крайне востребована в подходах персонализированной медицины, для молекулярного анализа особенностей заболевания и подбора наиболее эффективного лечения.
Источники информации
1. Нао Yan, Qiangbin Wang, Yan Liu. Quantum Dot Barcode Structures and Uses Thereof. Патент США US 20090297448 Al
2. Суханова A.B., Билан P.C., Терехин B.B., Набиев И.Р. Способ получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для детекции маркеров заболеваний. Патент РФ RU 2 638 787 С1.