Способ инкубации икры лососеобразных рыб в шестилуночных культуральных планшетах с использованием стимуляторов развития
METHOD FOR INCUBATION OF SALMONID FISH EGGS IN SIX-HOLE CULTURE PLATES USING DEVELOPMENT STIMULANTS

Нами апробирован способ инкубации икры в шестилуночных полистироловых планшетах без замены или с редкой заменой воды/раствора в течение всего периода инкубации (фиг. 1).
При раздельном размещении икринок по лункам планшета наполовину заполненных инкубационным раствором соблюдаются все условия, необходимые для нормального развития зародыша и обеспечиваются дополнительные преимущества, позволяющие облегчить уход и упростить контроль за процессом без ущерба для выживаемости эмбрионов. Основные принципиальные моменты, это:
- отсутствие необходимости регулярной смены воды/раствора, за счет низкого потребления кислорода и незначительного поступления метаболитов в окружающую среду;
- отсутствие контакта между индивидуальными икринками и, соответственно, отсутствие влияния микроорганизмов, развивающихся на неблагополучной или погибшей икре;
- отсутствие необходимости переносить икру в какие либо емкости на завершающем этапе эмбриогенеза, поскольку количества воды/инкубационного раствора в лунке планшета, с растворенным в ней кислородом, достаточно для временного существования предличинок и выклевывающихся зародышей.
Уровень техники
В России, как и в мировой практике, для улучшения продуктивности сельского хозяйства (растениеводства, птицеводства, животноводства) и в аквакультуре (рыборазведении) используют инкубаторы различного типа [1-19].
В ранее предложенных способах инкубации икру размещают в полупогруженном и погруженном состоянии на чашках Петри, в специальных емкостях, в термостатированных аквариумах в один слой или несколько слоев и обеспечивают циркуляцию и аэрацию воды. При этом терморегуляция обеспечивается за счет общего пониженного температурного режима холодильной установки.
Одним из неблагоприятных условий среды при разведении рыб является забор воды для инкубации икры из естественных водоемов.
Принципы и возможные технические решения, позволяющие инкубировать икру сиговых рыб в экспериментальных лабораторных условиях в замкнутой инкубационной системе с периодической или постоянной подменой части используемой воды хорошо описаны в работе С.М. Семенченко и Н.В. Смешливой [6]. Авторами предложены три способа, позволяющие осуществлять большое разнообразие исследовательских целей и задач при инкубации небольших порций икры: в чашках Петри, в термостатируемых аквариумах, в простейшей рециркуляционной установке, оснащенной инкубационными аппаратами небольшого объема, работающими по принципу аппарата Вейса. Описанные способы позволяют строго сохранять одинаковые условия инкубации при качественном разнообразии различных партий икры и наоборот, при исходном однообразии икры контролируемо поддерживать разные условия факторов среды, влияние которых оценивается. При необходимости постановки большого количества опытов с малочисленными партиями икры авторы предлагают инкубировать икру в чашках Петри в полупогруженном состоянии, когда за счет силы поверхностного натяжения воды/инкубационного раствора икра остается постоянно смоченной, а дыхание зародыша обеспечивается диффузией газов через микропленку воды. При таком способе на одной чашке инкубируется до 400 икринок сиговых рыб. Однако, описанный способ инкубации икры на чашках Петри требует регулярной (с интервалом в двое суток) замены воды/инкубационного раствора ручным способом для обеспечения удовлетворительного санитарного состояния среды, т.к. ее качество ухудшается за счет накопления продуктов обмена и развития неблагоприятной микрофлоры.
Температура воды играет основополагающую роль в регулировании физиологии рыб [19]. В работе Тэйлора Стюарта с соавторами при инкубации икры сиговых рыб в 24-луночных планшетах [14] главной целью было экспериментально оценить реакцию эмбрионов группы холодных стенотермических рыб (Salmonidae Coregoninae) на повышенные температуры инкубации. Данная работа показывает удобство использования культуральных планшетов для экспериментов с отдельными эмбрионами рыб (изучение эмбриогенеза, влияния на него различных факторов и пр.), для статистической обработки результатов анализа.
Нами предложены шестилуночные планшеты, размер лунок которых позволяют увеличить объем жидкости и выращивать отдельных эмбрионов широкого спектра рыб. Искусственно оплодотворенная икра представителей трех семейств лососеобразных рыб инкубировалась в присутствии синтетические стимуляторы развития.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом настоящего изобретения является отработанная методика инкубации небольших партий икры различных видов рыб (на примере представителей трех семейств лососеобразных рыб) в шеституночных культуральных планшетах, использование, которой позволяет:
- устранить неблагоприятные факторы (например, развитие сапролегнии и/или неблагоприятной микрофлоры, ведущих к гибели всей партии) при инкубации небольших количеств икры;
- увеличить скорость выклева (сократить время инкубации) и выживаемость эмбрионов рыб;
- повысить иммунитет эмбрионов;
- сократить объемы инкубируемой для получения рыб икры;
- снизить затраты на техническое обслуживание, устранение негативных факторов, лечение и профилактические мероприятия.
Техническим результатом так же является применение синтетического биологически активного вещества - стимулятора развития (CP). Для этого в процессе оплодотворения и инкубации оплодотворенной икры используют водный раствор арилхалькогенилацетатов трис(2-гидроксиэтил)аммония - «протатранов», с общей формулой:
2
2
2
3
-
+
ArXCHC(O)O⋅HN(CHCHOH),
2
где Ar = арил; X = халькоген (О, S, SO, SO, Se),
в частности, соединение формулы:
6
4
2
2
2
2
3
-
+
4-Cl-CHSOCHC(O)O⋅HN(CHCHOH).
6
4
2
2
2
2
3
-
+
Оплодотворенную икру на стадии глазка помещают на инкубацию в холодильную камеру. Инкубацию проводят в культуральных планшетах, в которых икра размещается по 1-3 икринки на лунку планшета и находится в погруженном состоянии в водном растворе арилхалькогенилацетата трис(2-гидроксиэтил)аммония, с химической формулой 4-Cl-CHSOCHC(O)O⋅HN(CHCHOH), с концентрацией не выше 0,0001%.
Протатраны указанных формул добавляют в водный раствор для инкубации икры рыб. Синтезированные авторами в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН соединения имеют уникальное трициклическое "атрановое", точнее, "протатрановое", строение [18].
Предложенный способ инкубации икры в шестилуночных планшетах с обработкой стимулятором развития (CP). Кроме ростстимулирующей активности, CP обладает также иммуностимулирующей активностью и способствует снижению смертности икринок. Впервые установлено, что при использовании шестилуночных культуральных планшетов и CP при искусственной инкубации икры лососеобразных рыб обеспечивается максимальная выживаемость икры без аэрации и с минимальными трудозатратами. Таким образом, данное техническое решение соответствует условиям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана инкубация икры сиговых рыб в шестилуночных культуральных планшетах:
а - модули планшетов, помещенные в холодильную установку; б - одиночный шестилуночный планшет; в - одиночный шестилуночный планшет с лунками, заполненными инкубационным раствором с на этапе выклева личинок.
Осуществление изобретения
Предложен оригинальный способ инкубации икры в экспериментальных целях и для выведения селекционных и опытных партий рыб. В шестилуночных культуральных планшетах с добавлением в инкубационный раствор стимуляторов развития предлагается осуществлять инкубацию икры лососеобразных рыб. Планшеты размещаются в холодильной установке как в единичном варианте, так и в виде модулей (фиг. 1а). Икра в планшетах должна находиться в погруженном состоянии.
Экспериментальные работы проводили в рамках фундаментальных научных исследований на базе уникальной научной установки «Экспериментальный пресноводный аквариумный комплекс байкальских гидробионтов» (ПАК), который является частью научно-технологической инфраструктуры Российской федерации и функционирует в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук (ЛИН СО РАН).
Возможность осуществления изобретения иллюстрируется приведенным ниже описанием проведенных работ. Полученные данные сведены в прилагаемые таблицы.
Пример 1. Результаты эксперимента по оплодотворению и развитию икры пеляди.
Материалом для данной работы послужила икра после искусственного оплодотворения диких производителей, отловленных в сетные ловушки рыбоводного пункта ООО "Байкальская рыба" на пути нерестовой миграции в река Белая (приток реки Ангара, вытекающей из озера Байкал). Зрелые половые продукты отбирали после выдерживания производителей в садках рыбоводного пункта до полного созревания. Оплодотворение и инкубация икры осуществлялись в байкальской воде с добавлением и без добавления стимулятора развития (CP). Обработка икры стимулятором развития (CP) и дальнейшая инкубация сокращает продолжительность эмбриогенеза (таблица 1) и увеличивает процент выживаемости эмбрионов (таблица 2).
28.10.2020 г. икру от нескольких "текучих" самок и самцов сцедили в отдельные пластиковые контейнеры, которые целиком погрузили в лед. В таком состоянии половые продукты хранили 2 суток, после чего икру оплодотворяли спермой нескольких самцов стандартным для лососевых рыб сухим методом. Оплодотворяли две порции икры (таблицы 1 и 2). Каждую порцию помещали в чашку Петри и тщательно смешивали с 25 мкл спермы без добавления жидкости. Далее в течении 7 мин добавляли небольшие объемы жидкости, до полного покрытия икры. После пятиминутного покоя троекратно осуществляли промывку и обесклеивание икры большим объемом жидкости в течении 45 мин и оставляли на 4 часа для набухания. Все процедуры проводили на ледяной бане. После набухания икру помещали на инкубацию в холодильную камеру в чашках Петри в полупогруженном состоянии, когда за счет силы поверхностного натяжения жидкости икра остается постоянно смоченной, а дыхание зародыша обеспечивается диффузией газов через микропленку жидкости [6]. Инкубацию на чашках осуществляли до стадии «глазка», после чего перемещали икринки в шестилуночные культуральные планшеты по 3 икринки в лунку в 5 мл жидкости, где продолжали инкубацию до вылупления личинки. % оплодотворенной икры (таблица 2) подсчитывали по количеству эмбрионов развившихся до стадии «глазка». % выживаемости определяли по количеству эмбрионов развившихся от стадии «глазка» до стадии свободного эмбриона (выклева).
Весь процесс инкубации проводили при 4°С. На протяжении всего эксперимента в первой порции жидкостью служила байкальская вода, во второй порции воду заменяли на 0,0001% раствор CP в байкальской воде. Продолжительность инкубации составила 127-164 дней с суммой тепла за этот период 636 - 784 градусо-дней (таблица 1).
Пример 2. Результаты эксперимента по оплодотворению и развитию икры радужной форели.
Материалом для данной работы послужила икра радужной форели после искусственного оплодотворения. Зрелые половые продукты сцеживались сразу после отлова из садков "текучих" производителей, искусственно выращенных на форелевом хозяйстве ООО "Иркутская форель", расположенной на р. Ангара в нижнем бьефе плотины Иркутской ГЭС. Оплодотворение и инкубация икры осуществлялись в байкальской воде с добавлением и без добавления стимулятора развития (CP). Обработка икры CP сокращает продолжительность эмбриогенеза (таблица 1) и увеличивает процент выживаемости эмбрионов (таблица 2).
Икру оплодотворяли 13.06.2021 г. смесью спермы нескольких самцов стандартным для лососевых рыб сухим методом [6]. Оплодотворяли две порции икры (таблицы 1 и 2). Каждую порцию помещали в чашку Петри и тщательно смешивали с 25 мкл спермы без добавления жидкости. Далее в течении 7 мин добавляли небольшие объемы жидкости, до полного покрытия икры. После пятиминутного покоя троекратно осуществляли промывку и обесклеивание икры большим объемом жидкости в течении 45 мин и оставляли на 4 часа для набухания. Все процедуры проводили на ледяной бане. После набухания икру помещали на инкубацию в холодильную камеру в чашках Петри в полупогруженном состоянии, когда за счет силы поверхностного натяжения жидкости икра остается постоянно смоченной, а дыхание зародыша обеспечивается диффузией газов через микропленку жидкости [6]. Инкубацию на чашках осуществляли до стадии "глазка" - начала пигментации глаз, после чего перемещали икринки в шестилуночные культуральные планшеты по одной икринке в лунку в 5 мл жидкости, где продолжали инкубацию до вылупления личинки. % оплодотворенной икры (таблица 2) подсчитывали по количеству эмбрионов развившихся до стадии "глазка". % выживаемости определяли по количеству эмбрионов развившихся от стадии "глазка" до стадии свободного эмбриона (выклева).
Весь процесс инкубации проводили при 10°С. На протяжении всего эксперимента в первой порции жидкостью служила байкальская вода, во второй порции воду заменяли на 0,0001% раствор CP в байкальской воде. Продолжительность инкубации составила 29-37 дней с суммой тепла за этот период 290-370 градусо-дней (таблица 1). Пример 3. Результаты эксперимента по оплодотворению и развитию икры сибирского хариуса.
Материалом для данной работы послужила икра после искусственного оплодотворения диких производителей, отловленных жаберными сетями на пути нерестовой миграции в р. Ангара выше плотины Иркутской ГЭС. Половые продукты отбирались после выдерживания отловленных рыб до полного созревания в проточной воде, закачиваемой из р. Ангара в бассейны рыбоводного завода, расположенного в пос. Бурдугуз (ООО "Байкальская рыба") на р. Ангара. Оплодотворение и инкубация икры осуществлялись в байкальской воде в присутствии стимулятора развития (CP). Обработка икры CP сокращает продолжительность эмбриогенеза (таблица 1) и увеличивает процент выживаемости эмбрионов (таблица 2).
26.06.2021 г. икру от нескольких "текучих" самок сцедили в пластиковые контейнеры, которые целиком погрузили в лед. Молоки от нескольких "текучих" вскрытых самцов протерли через газ-сито в пластиковые контейнеры, которые также целиком погрузили в лед. В таком состоянии половые продукты хранили 5 часов, после чего икру оплодотворяли смесью молок от нескольких самцов стандартным для лососевых рыб сухим методом [6]. Оплодотворяли две порции икры (таблицы 1 и 2). Каждую порцию помещали в чашку Петри и тщательно смешивали с 25 мкл спермы без добавления жидкости. Далее в течении 7 мин добавляли небольшие объемы жидкости, до полного покрытия икры. После пятиминутного покоя троекратно осуществляли промывку и обесклеивание икры большим объемом жидкости в течении 45 мин и оставляли на 4 часа для набухания. Все процедуры проводили на ледяной бане. После набухания икру помещали на инкубацию в холодильную камеру в чашках Петри в полупогруженном состоянии, когда за счет силы поверхностного натяжения жидкости икра остается постоянно смоченной, а дыхание зародыша обеспечивается диффузией газов через микропленку жидкости [6]. Инкубацию на чашках осуществляли до стадии "глазка" -начала пигментации глаз, после чего перемещали икринки в шестилуночные культуральные планшеты по одной икринке в лунку в 5 мл жидкости, где продолжали инкубацию до вылупления личинки. % оплодотворенной икры (таблица 2) подсчитывали по количеству эмбрионов развившихся до стадии "глазка". % выживаемости определяли по количеству эмбрионов развившихся от стадии "глазка" до стадии свободного эмбриона (выклева).
Весь процесс инкубации проводили при 10°С. На протяжении всего эксперимента в первой порции жидкостью служила байкальская вода, во второй порции воду заменяли на 0,0001% раствор CP в байкальской воде. Продолжительность инкубации составила 12-13 дней с суммой тепла за этот период 120-130 градусо-дней (таблица 1).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Biostimulants in agriculture / P. Brown, S. Saa // Front. Plant Sci. - 2015 - V. 6- P. 1-3;DOI: 10.3389/fpls.2015.00671.
2. The role of biostimulants and bioeffectors as alleviators of abiotic stress in crop plants / M. J. Van Oosten, O. Pepe, S. De Pascale, S. Silletti, A. Maggio // Chem. Biol. Technol. Agric.-2017.-4:5; DOI 10.1186/s40538-017-0089-5.
3. A.c. 1551308 СССР, МКИ A01K 61/00. Способ стимуляции развития гидробионтов / Фомовский М.А. и др.; Институт гидробиологии АН УССР. - №4451660/31-13; Заявл. 30.06.88; Опубл. 23.03.90. Бюл. №11.
4. Кеберлайн О.В. Влияние различных технологий обесклеивания икры на интенсивность зародышевого развития зеркального карпа в условиях промышленной технологии разведения / Кеберлайн О.В., Сахаров А.В., Макеев А.А. и др. // «Сибирский Вестник сельскохозяйственной науки».- Новосибирск, 03/2010.-С.63-70.
5. Stoimenovski, J. Enhanced membrane transport of pharmaceutically active protic ionic liquids [Text] / J. Stoimenovski, D.R. MacFarlane // Chem. Commun. - 2011. - V. 47. -P. 11429-11431; DOI: 10.1039/C6NJ03709G.
6. Семенченко С.М., Смешливая H.B. Инкубация икры сиговых рыб COREGONIDAE в лабораторных условиях/ Вестник рыбохозяйственной науки, Государственный научно-производственный центр рыбного хозяйства (Тюмень)/Том: 4, Номер: 4 (16),2017, стр. 4-13, ID: 35287796, ISSN: 2311-4274.
7. Черняев Ж.А. Воспроизводство сиговых рыб. Эколого-физиологические особенности размножения и. развития. М/Товарищество научных изданий КМК, Москва, 201, 329 с.
8. Черняев Ж.А. Основные принципы успешного осуществления инкубации икры сиговых на рыбоводном заводе (на примере опыта Большереченского рыбоводного завода) // Биология, биотехника разведения и состояние запасов сиговых рыб. - 2010, С. 277-281.
9. Смешливая Н.В., Семенченко С.М. Зависимость скорости дробления бластодиска зародышей сига-пыжьяна, тугуна и муксуна от температуры// Биология, биотехника разведения и состояние запасов сиговых рыб, 2010, С. 274-277.
10. Смешливая Н.В., Семенченко С.М. Взаимосвязь диаметра икры и размеров самок сиговых рыб Обь-Иртышского бассейна/ Биология, биотехника разведения и состояние запасов сиговых рыб, 2010, С. 271-274.
11. Сергиенко Л.Л. Биологические основы совершенствования заводского воспроизводства сиговых рыб: автореф....дис. канд. биол. наук. СПб., 1995. 19 с.
12. Эксперементальные аквариумные системы как основа для изучения физиолого-биохимических механизмов адаптации эндемичных гидробионтов. / О.Ю. Глызина, Л.В. Суханова, Ю.П. Сапожникова и др. // Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптации гидробионтов: материалы всерос. конф. (Борок, 22-27 сен. 2012 г. ), Борок, 2012. С 88-90.
13. Глызина О.Ю., Суханова Л.В., Адамович С.Н., Оборина Е.Н., Сапожникова Ю.П., Яхненко В.М., Тягун М.Л. Способ повышения жизнестойкости эмбрионов рыб в аквакультуре. Патент на изобретение №273483 5. Заявка №2020106330, Опубликовано: 23.10.2020 г. Правообладатель: ЛИН СО РАН; ИрИХ СО РАН. Федеральная служба по интеллектуальной собственности, 2020.
14. Stewart Т., Makinen М., Guillard С, Marjomaki Т., Lasne E., Karjalainen J., Stockwell J. Influence of warming temperatures on coregonine embryogenesis within and among species/ Hydrobiologia (2021) 848:4363-4385 https://doi.org/10.1007/sl0750-021-04648-0(0123456789().,-vol V) (01234567 89).
15. Методические указания по сбору и хранению икры сиговых рыб на временных рыбоводных пунктах, ее транспортировке и инкубации. М.: МИНРЫБХОЗ СССР, ИЭМЭЖ им. А.Н. Северцова АН СССР, ЦПАУ Главрыбвода. Изд-во: Типография ВИА имени В.В.Куйбышева. 1987. 50 с.
16. Патент №789063 RU, МПК А01К 61/00. Способ повышения жизнестойкости оплодотворенной икры молоди рыб / Чернышев В.И. и Тамбиев А.Х. - №2568164/28-13; Заявл. 09.01.78; Опубл. 23.12.80.
17. Патент №2028046 РФ, МПК А01К 61/00. Способ стимуляции развития рыб / Яковенко Е.Я. - №5007262/13; Заявл. 30.10.1991; Опубл. 09.02.1995.
18. Мирскова, А.Н. Протатраны - эффективные биостимуляторы для сельского хозяйства, биотехнологии и микробиологии / А.Н. Мирскова, С.Н. Адамович, Р.Г. Мирсков // Хим. интерес, устойч. развития. - 2016. - №24. - С. 713-729.
19. Семенченко С.М., Смешливая Н.В. Термотолерантность и терморезистентность сиговых рыб в эмбриогенезе // XII Съезд Гидробиологического общества при РАН: тезисы докладов. 16-20 сентября 2019 года г. Петрозаводск - г. Петрозаводск: КарНЦ РАН. - 2019. - С. 429 - 431.