Способ получения профилактического продукта из черноморских водорослей рода Cystoseira (варианты)
METHOD FOR OBTAINING PROPHYLACTIC PRODUCT FROM BLACK SEA ALGAE OF GENUS CYSTOSEIRA (OPTIONS)

Изобретение относится к области пищевой и фармацевтической промышленности и позволяет получить лечебно-профилактический продукт из бурых водорослей.
Фукоксантин - основной пигмент бурых, золотистых и диатомовых водорослей, его вклад в общую продукцию каротиноидов в природе составляет более 10%. Этот пигмент связан с некоторыми белками и вместе с хлорофиллом а образует Фк-Сhl а-белковые комплексы в тилакоидах, где он улавливает свет и осуществляет перенос энергии (Caron L., et al. J. Mol. Evol. 1996, 43(3), 270-280). Фк обладает выраженной фармакологической активностью, в частности проявляет антиоксидантное, цитостатическое, гипотензивное и антидиабетическое действие (Mikami К. et al. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14(7), 13763-13781). В последние годы появилось много работ, указывающих на активность фукоксантина при профилактике раковых заболеваний [Hosokawa М. et al. Bio-functions of marine carotenoids. Foods Sci. Biotechnol. 2009. V. 18. Р. 1-11]. Фукоксантин также используют в качестве терапевтического агента для лечения и профилактики злокачественных образований, связанных с вирусами [US 200801525, 17.01.2008]. Перспективность применения этого соединения в составе медицинских препаратов подтверждается наличием большого числа публикаций, так как в отличие от синтетических аналогов данное соединение обладает пониженной токсичностью (Peng et al., 2011). Фукоксантин, экстрагированный из бурой водоросли Undaria pinnatiflda, проявил активность в профилактике и лечении рака печени. Также пигмент проявляет активность в борьбе с ожирением и обладает противовоспалительным действием [Maeda Н., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 332, 392-397; CA 2609454 (A1), 30.11.2006]. Прием фукоксантина в количестве 0,6 ммоль или 5 г водоросли в день оказывает профилактическое действие против раковых заболеваний и позволяет бороться с ожирением.
Источником фукоксантина в Черном море являются массовые виды бурых водорослей рода Cystoseira. Высокая общая биомасса этих водорослей делает этот вид перспективным объектом для промышленного использования. В настоящее время разработано большое количество технологий переработки бурых водорослей с получением разных типов лечебно-профилактических добавок и биологически активных веществ.
Известен способ переработки бурых водорослей с получением продукта с содержанием фукоксантина, в котором сырье 4 раза экстрагируют 96% этиловым спиртом при комнатной температуре с получением экстрактов 1-4 [RU 2399298 (С1), 20.09.2010]. Каждый из экстрактов концентрируют до небольшого объема и к каждому добавляют гексановый растворитель и воду для разделения смеси на водно-спиртовую и гексановую фазы. Процедуру извлечения гексановым растворителем для каждого концентрата повторяют дважды. Далее гексановые фазы объединяют и концентрируют с получением хлорофиллов. Водно-спиртовые фазы объединяют и добавляют хлороформ и воду. Затем отбирают нижнюю хлороформную фазу, дополнительно промывают ее дважды водой и концентрируют с получением фукоксантина. Недостатки способа состоят в том, что в способе применяется дорогостоящий не пищевой растворитель (гексан), и способ отличает продолжительность и трудоемкость.
Известен способ получения из бурых водорослей масляного экстракта, содержащего фукоксантин [WO/2007/049786], где на первом этапе бурую водоросль подвергают термической обработке, на втором получают масляный экстракт при повторной тепловой обработке с применением органических растворителей. Из полученного масляного продукта может быть выделен фукоксантин с применением колоночной хроматографии на силикагеле и частично разложившийся хлорофилл. Недостатком является использование в способе органических растворителей, также то, что термическая обработка может привести к снижению концентрации фукоксантина в конечном продукте.
В качестве прототипа выбран способ получения лечебно-профилактического продукта из цистозиры [UA 86671, 10.01.2014], где высушенные водоросли заливают 96% этиловым спиртом в соотношении 1:1. Смесь экстрагируют 3 дня при комнатной температуре, далее спиртовой экстракт разбавляют 1:1 дистиллированной водой и оставляют суспензию при температуре 5-7°С на 3 дня. После фильтрации осадок заливают спиртом в соотношении 1:10. Недостаток известного способа заключается в том, что при заливке высушенной водоросли цистозиры теряется до 50% фукоксантина, кроме того, процесс получения продукта достаточно длительный и громоздкий.
В основу изобретения поставлена задача усовершенствования технологии выделения фукоксантина из черноморских бурых водорослей-макрофитов рода Cystoseira.
Техническим результатом заявленного способа является повышение концентрации фукоксантина в конечном продукте, упрощение способа его получения вследствие того, что заявляемый способ позволяет учитывать особенности используемого сырья.
Технический результат достигается тем, что сырьем для получения лечебно-профилактического продукта являются свежесобранные водоросли, а также водоросли после штормовых выбросов, которые экстрагируются 96% этиловым спиртом в течение 4-5 часов в соотношении 1:3 при температуре 35-40°С, с получением экстракта. Экстракт заливается дистиллированной водой в соотношении 3:2, а через 24 часа выпавший осадок отфильтровывается и растворяется в этиловом спирте в соотношении 1:1. У свежесобранной водоросли сырьем служит весь таллом. Продукт также можно получить из штормовых выбросов, не находившихся под прямыми солнечными лучами, собранными не позже чем через 5-7 часов после шторма. Применение в качестве сырья свежесобранных водорослей, а также водорослей после штормовых выбросов, отвечает всем поставленным задачам.
При использовании в качестве сырья свежесобранных ветвей цистозиры возрастом 2-3 месяца водоросли экстрагируются 96% этиловым спиртом в соотношении 1:3 при комнатной температуре, через 5 часов полученный экстракт сливается, а водоросли повторно заливают 96% этиловым спиртом в соотношении 1:2 и через 4-5 часов полученные экстракты объединяются. Далее по заявленной методике: к экстрактам добавляется дистиллированная вода в соотношении 3:2, а через 24 часа выпавший осадок отфильтровывается и растворяется в этиловом спирте в соотношении 1:1. Было установлено, что концентрация фукоксантина в ветвях цистозиры возрастом 2-3 месяца в 1,5-2 раза выше [Ryabushko V.I. et al. 2014, J. Black Sea/Mediter. E., 20(2), 108-113]. Однако сбор водоросли цистозиры, достигшей возраста 2-3 мес,  - процесс достаточно сложный и требующий значительных временных затрат.
После растворения отфильтрованного осадка в этиловом спирте 1:1 по массе получается препарат с содержанием фукоксантина до 5%. Продукт представляет собой жидкость темно-красного цвета с характерным запахом водоросли цистозиры и готов к употреблению.
Новым в предлагаемом способе является то, что в заявляемой технологии учтены условия сбора водоросли, а также возрастные особенности цистозиры и можно получать повышенную концентрацию фукоксантина в готовом продукте. Значения количественных параметров заявляемого способа, режимы и условия экстрагирования экспериментально установлены авторами в оптимальных границах достижения технического результата.
1
13
В качестве стандарта использовался фукоксантин, полученный после перекристаллизации в системе хлористый метилен/гексан. По данным ВЭЖХ, он состоит на 94% из транс-изомера и на 6% из цис-изомера, полученный нами фукоксантин был охарактеризован методами ядерного магнитного резонанса (Н, С) и спектроскопии в УФ- и видимой области.
Пример 1
1 кг свежесобранной цистозиры (Cystoseira sp.) промывали 2 раза дистиллированной водой для освобождения от песка, солей и эпифитов, при соотношении по массе 1:2. Продукт экстрагировали в течение 4-5 часов 3 л 96% этилового спирта. Экстракцию вели при температуре 35-40°С. Далее водоросли удаляли и к полученному экстракту (≈2,8 л) добавляли 2 л дистиллированной воды, через 24 часа выпавший осадок отфильтровывали и растворяли в этиловом спирте 1:1 по массе, в зависимости от объема последнего получали продукт с различными концентрациями фукоксантина, от 1 до 5%. В настоящем примере содержание фукоксантина в конечном продукте (≈80 мл) составило 30-50 мг на 100 г сырой массы водоросли.
Пример 2
1 кг штормовых выбросов цистозиры, собранных в течение 6 часов после шторма, не в солнечный день (под действием солнечных лучей идет интенсивное разрушение фукоксантина), промывали 2 раза дистиллированной водой для освобождения от песка, солей и эпифитов. Продукт экстрагировали в течение 4-5 часов 3 л 96% этилового спирта. Экстракцию вели при температуре 35-40°С. Далее водоросли удаляли и к полученному экстракту (≈2,8 л) добавляли 2 л дистиллированной воды, через 24 часа выпавший осадок отфильтровывали и растворяли в этиловом спирте 1:1 по массе. Содержание фукоксантина в конечном продукте (≈80 мл) составило 30-50 мг на 100 г сырой массы водоросли.
Пример 3
К 100 г ветвей свежесобранной (1-2 часа после сбора) цистозиры (Cystoseira sp.) возраста 2-3 месяца, предварительно промытых дистиллированной водой для удаления песка, солей и эпифитов, высушенных между листами фильтровальной бумаги и измельченных до размера 0,5-1 см, добавляли 300 мл 96% этилового спирта при комнатной температуре, через 5 часов экстракт сливали и добавляли новую порцию спирта (200 мл). Через 4-5 часов экстракты объединяли (общий объем экстракта порядка 450 мл), добавляли 300 мл дистиллированной воды. Через 24 часа выпавший осадок отфильтровывали, растворяли в этиловом спирте 1:1 по массе и получали спиртовой продукт (≈50 мл) с содержанием фукоксантина порядка 65 мг на 100 г сырой массы водоросли. Концентрация пигмента выше при проведении экстракции в течение 1-2 часов после сбора водоросли. Полученный спиртовой экстракт также обогащен хлорофиллами, полифенольными соединениями, макро- и микроэлементами, в том числе и йодом.