Влияние верапамила на процесс перитонеального спайкообразования в эксперименте

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Скальский С.В.

Омская государственная медицинская академия,

г. Омск

ВЛИЯНИЕ ВЕРАПАМИЛА НА ПРОЦЕСС ПЕ1 СПАЙКООБРАЗОВАНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Объектом изучения в исследовании служили спайки между листками брюшины. Цель исследования - экспериментальное ex vivo и in vivo доказательство наличия у лекарственных средств группы блокаторов медленных кальциевых каналов плейотропных дозозависимых эффектов в отношении функциональной активности фибробластов. Спаечный процесс моделировался однократным инъекционным внутрибрюшинным введением стерильной аутокрови экспериментальным животным (кролики, белые крысы). Профилактическое внутрибрюшинное введение верапамила сопровождалось достоверным (р < 0,01) снижением общего количества спаек (до 0,22 ± 0,04 на одно животное) с явным преобладанием висцеро-париетальной локализации. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием внутриб-рюшинного введения верапамила в качестве способа профилактики перитонеального спайкообразования и позволяют разработать и внедрить способ интраоперационной профилактики перитонеального спайкообразования блокатором медленных кальциевых каналов верапамилом у пациентов гинекологического и камбустиологического профиля.

Ключевые слова: верапамил; брюшина; спайкообразование; эксперимент; фибробласты.

Skalskiy S.V.

Omsk State Medical Academy, Omsk

INFLUENCE OF VERPAMIL ON EXPERIMENTAL PERITONEAL ADHESION

Research purpose - experimental ex vivo and in vivo evidence of presence of pleiotropic dose-dependent effects in respect to functional activity of fibroblasts in slow calcium channels inhibitors. Adhesion process was simulated by a single intraperito-neal injection of sterile autoblood to the experimental animals (rabbits and white rats). Prophylactic intraperitoneal administration of verapamil was accompanied by significant (p < 0,01) decrease of the adhesions total number (up to 0,220 ± 0,04 per animal) with evident predominance of visceroparietal localization. The data obtained are experimental justification for intraperitoneal injection of verapamil as a preventive method against peritoneal adhesions and allow developing and implementing intraoperative preventive method of peritoneal adhesions formation prevention by verapamil, a slow calcium channels inhibitor, in gynecological and combustiological patients.

Key words: verapamil; peritoneum; adhesions formation; experiment; fibroblasts.

РИТОНЕАЛЬНОГО

Используемые в настоящее время методы профилактики образования и рецидива послеоперационных спаек (ПОС) способны либо оперативно ликвидировать уже сформированные со-единительно-тканные образования, либо замедлить их возникновение [1, 2]. В первом случае возникает опасность рецидива, во втором — хронизация процесса. Инициирующие механизмы спайкообразования, в частности, активность клеточных и гуморальных факторов резистентности, исходом активации которых является, по сути, образование спаек, в качестве объектов фармакологической регуляции не рассматривались.

Разработке современных эффективных методов профилактики ПОС в немалой степени препятствует отсутствие адекватной экспериментальной модели процесса их формирования. Существуют модели экспериментального перитонита бактериальной этиологии, исходом которого является спаечный процесс в брюшной полости [3]. Адекватная универсальная модель внутрибрюшинного спайкообразования должна базироваться на представлении о ключевой роли фибрина в составе перитонеальной жидкости и фибробластов, презентированных в тканях либо миг-

рировавших в очаг повреждения, как определяющих биохимических и морфологических факторах процесса образования ПОС [4]. Функциональная активность фибробластов регулируется клетками микроокружения с участием цитокинов и ионизированного Са2+ в качестве вторичного мессенджера. Хорошо изучена группа лекарственных средств, имеющих основным фармакодинамическим эффектом снижение концентрации Са2+ в цитоплазме активно функционирующих клеток — блокаторы медленных кальциевых каналов (БМКК) или кальциевые антагонисты [5]. В литературе имеются немногочисленные данные о наличии у БМКК фармакологических эффектов, реализуемых модификацией функциональной активности фибробластов и, соответственно, структуры формирующейся соединительной ткани [6]. Исследований использования БМКК для профилактики перитонеального спайкообразования после оперативных вмешательств на органах брюшной полости проведено не было.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использованы 44 половозрелых кролика-самца массой тела 2500-3200 г и 163 самца беспородных белых крыс массой тела 180-200 г. Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755) и методи-

Корреспонденцию адресовать:

СКАЛЬСКИЙ Сергей Викторович. 644043, г. Омск, ул. Ленина, д. 12.

Тел.: 8 (3812) 24-79-27; + 7-913-601-22-11 E-mail: sergscalskiy@mail.ru

ОКОшщна Medicine

в Кузбассе

T. 11 № 3 2012 15

ческими рекомендациями по выведению животных из эксперимента «Эвтаназия экспериментальных животных» (М., 1985).

Объектом изучения служили спайки между листками брюшины. Спаечный процесс моделировался однократным инъекционным внутрибрюшинным введением стерильной аутокрови из расчета 1 % массы тела (патент на изобретение № 2260854 по заявке № 2003134120 от 24.11.2003 г.). Для профилактики образования соединительно-тканных спаек вводили верапамил (водный раствор 0,25 % верапамила в ампулах по 2 мл) одновременно с повреждающим фактором (аутокровью) однократно внутрибрюшин-но в дозе 0,001 г на 1 кг массы тела (заявка на изобретение № 2003134121 от 24.11.03 г.). Соединитель-но-тканные спайки, иссеченные через 7-10 суток, подвергались макро- и микроскопическому анализу с использованием стандартных морфометрических методик. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная микроскопия с изучением общего плана строения ткани) и пикрофуксином по ван Гизону (выявление коллагеновых волокон).

В клеточном осадке перитонеальной жидкости оценивали макрофагальную трансформацию мононук-леарных клеток в культуре лейкоцитов. В надоса-дочной жидкости определяли содержание фактора некроза опухолей альфа (ФНО или TNFa) и интер-лейкина-1р (ИЛ-1Р или ^-1р) твердофазным имму-ноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента стандартным набором реагентов; содержание оксипролина и гиалуроновой кислоты по карбазольной реакции Дише в модификации Шараева П.Н.

В отдельной серии острых опытов на белых беспородных крысах-самцах изучали дозозависимость вли-

яния внутрибрюшинного введения верапамила на уровни систолического, диастолического и среднего артериального давления, периферическое сосудистое сопротивление и показатели сердечного выброса в течение 4 часов после инъекции. Диапазон исследуемых доз — 0,1; 0,2; 0,4мг/кг массы тела животного. За оптимальную дозу, используемую в дальнейшем для внутрибрюшинного введения в основной серии экспериментов (для профилактики спайкообразования), принималась максимально переносимая доза, не вызывавшая значимых и достоверных изменений кардио- и гемодинамики. Минимально достаточным для получения достоверных данных было принято число экспериментальных животных в каждой серии, равное 12. Распределение экспериментальных животных по разделам исследования и группам представлено в таблице 1.

Биометрический анализ полученных данных осуществляли с использованием пакета STATISTICA-6.1 и MS Excel в среде Windows XP.

Анализ характера распределения полученных данных осуществляли построением гистограмм с последующей проверкой на нормальность по критерию Шапиро-Уилки. Построение нормальных вероятностных графиков (графики «вероятность-вероятность» для нормального распределения) позволило в дальнейшем применять параметрические статистики. Средние выборочные значения количественных признаков приведены в тексте в виде M ± SE, где M — среднее выборочное, SE — стандартная ошибка среднего [Мерков А.М., 1974; Лапач С.Н., 2000; Голева О.П., 2001]. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным 0,05. При этом значения p могли ранжироваться по 3 уровням достигнутых статистически значимых различий: p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001.

Таблица 1

Распределение экспериментальных животных по разделам исследования

Раздел исследований Группа Количество экспериментов Вид животного

Моделирование внутрибрюшинного Аутокровь 22 Кролик

спайкообразования Аутокровь 48 (50)* Крыса

Профилактика внутрибрюшинного Аутокровь + верапамил 22 Кролик

спайкообразования Аутокровь + верапамил 50 Крыса

Оценка кардио- и Без верапамила, исходно 27 Крыса

гемодинамических эффектов верапамила в зависимости от дозы С верапамилом в дозе 0,1 мг/кг: через 15 мин через 2 часа через 4 часа 20 Крыса

С верапамилом в дозе 0,2 мг/кг: через 15 мин через 2 часа через 4 часа 20 (23)* Крыса

С верапамилом в дозе 0,4 мг/кг: через 15 мин через 2 часа через 4 часа 23 Крыса

Примечание: * в скобках указано общее количество животных, включенных в эксперимент, за скобками - количество выживших.

Сведения об авторах:

СКАЛЬСКИЙ Сергей Викторович, канд. мед. наук, доцент, зав. кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии, ГБОУ ВПО «ОмГМА» Минздравсоцразвития России, г. Омск, Россия. Е-таіІ: sergscalskiy@mail.ru

16 T. 11 № 3 2G12 MedicLn^ OMSurnia

inKuzbass вК^бага

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Профилактическое внутрибрюшинное введение верапамила сопровождалось достоверным (р < 0,01) снижением общего количества спаек (до 0,22 ± 0,04 на одно животное) с явным преобладанием висцеро-париетальной локализации. Отсутствие спаек у большинства животных в основной экспериментальной группе характеризует снижение реактивности брюшины при воздействии на нее верапамила. Единичные спайки представляли собой фибринозные наложения без коллагеновых волокон. У немногочисленных животных с 2-3 спайками в брюшной полости встречались единичные, хаотично расположенные коллагеновые волокна. На поверхности спаек находилось небольшое количество мезотелиоцитов. Клеточный состав представлен лимфоцитами, гистиоцитами, фиб-робластами. Уменьшение под влиянием верапамила числа перитонеальных спаек, возникавших как исход аутогемоперитонеума, является основным интегративным показателем действия препарата на кол-лагенсинтезирующую функцию фибробластов.

Введение верапамила одновременно с моделированием аутогемоперитонеума предотвращало чрезмерную активацию клеток моноцитарно-макрофагаль-ного ряда перитонеальной жидкости. Сопоставление показателей макрофагальная трансформация моноцитов (МТМ) в группах экспериментальных животных без лечения и на фоне введения варапамила показало, что количество моноцитов перитонеальной жидкости, способных к трансформации в макрофаги, при профилактическом введении препарата было в 2 раза ниже, чем в группе сравнения, и составило в среднем 37,9 ± 2,6 % (р < 0,01). Исследование уровней ФНО-а и ИЛ-1 в группах сравнения выявило, что введение верапамила предотвращало повышение содержания данных цитокинов, останавливая наработку ФНО-а в среднем на уровне 104,1 ± 42,2 пг/л (р < 0,01), ИЛ-1 — 3,3 ± 1,2 пг/л (р < 0,01), что было, соответственно, в 2 и 3 раза ниже, чем в экспериментальной группе без лечения. Таким образом, под действием верапамила происходила нормализация активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов, модулирующих коллагенсинтезирующую функцию перитонеальных фибробластов, что внесло свой вклад в предотвращение перитонеального спайкообразования. Это подтверждается также наличием прямой корреляционной связи между долей трансформированных моноцитов и спаек в брюшной полости (г > 0,6; р < 0,01). Биохимические маркеры образования соединительной ткани также претерпевали существенные изменения при профилактическом введении верапами-ла: отмечалось достоверное снижение содержания оксипролина и гиалуроновой кисло-

ты в перитонеальной жидкости к 7-10 суткам после моделирования аутогемоперитонеума (табл. 2).

Выявлен более низкий коэффициент корреляции между исследуемыми биохимическими показателями и числом перитонеальных спаек у животных, подвергшихся воздействию верапамила. Это может быть объяснено дискретностью показателя, характеризующего интенсивность спайкообразования (число спаек, а не их масса, площадь), и потому — преобладанием его нулевых (незначимых) значений у большинства экспериментальных животных группы. Несмотря на невысокий коэффициент корреляции можно заключить, что в условиях нашего опыта уровни оксипролина и гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости кроликов характеризовали выраженность анаболической активности фибробластов и ее снижение под действием верапамила. На основании наших исследований можно сделать вывод, что ан-типролиферативная и антианаболическая активность верапамила при внутрибрюшинном введении в отношении перитонеальных фибробластов реализуется угнетением их двигательной, пролиферативной и метаболической активности, а также подавлением функциональной (цитокин-продуцирующей и фагоцитарной) активности клеток микроокружения, прежде всего — моноцитарно-макрофагального ряда. Классический БМКК недигидропиридинового ряда вера-памил оказывает прямое воздействие на активность фибробластов, клеточную и гуморальную регуляцию их функций, эффективно профилактирует процессы внутрибрюшинного спайкообразования. Полученные данные могут служить экспериментальной базой для разработки фармакологических методов профилактики послеоперационного спайкообразования в клинике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эффективность интраперитонеального введения БМКК верапамила для профилактики спайкообразо-вания определяется как прямым воздействием БМКК верапамила на перитонеальные фибробласты и клет-

Таблица 2

Изменение биохимических показателей функции перитонеальных фибробластов кроликов под действием верапамила

Оксипролин, мкмоль/л Гиалуpоновая кислота, ммоль/л

Параметры без веpапамила с веpапамилом без веpапамила с веpапамилом

Cpеднее 7,57 6,58 1,01 0,82

t-value 8,79 8,17

df 36 36

P 1,71E-10 1,01E-09

n 19 19 19 19

CKO ± 0,36 0,34 0,09 0,04

F-ratio 1,15 4,71

p 0,77 0,002

Information about authors:

SKALSKIY Sergey Viktorovich, candidate of medical sciences, head of pharmacology and clinical pharmacology chair, Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia. E-mail: sergscalskiy@mail.ru

ОКОицина Medicine

в Кузбассе

T. 11 № 3 2012 17

ки их микроокружения, оптимизируя их функциональную активность с приведением её в соответствие с возможностями микроциркуляторного русла, так и опосредованным влиянием — уменьшением выраженности тканевой гипоксии и метаболического ацидоза в зоне повреждения брюшины. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием

внутрибрюшинного введения верапамила в качестве способа профилактики перитонеального спайкообра-зования и позволяют разработать и внедрить способ интраоперационной профилактики перитонеального спайкообразования блокатором медленных кальциевых каналов верапамилом у пациентов хирургического и гинекологического профиля.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Савельева, Г.М. Настоящее и будущее эндоскопической хирургии в гинекологии /Г.М. Савельева, Г.Н. Бреусенко, Л.М. Капиушева //Эндоскопия и альтернативные подходы в хирургическом лечении женских болезней: Матер. междунар. конгр. - М., 2001. - С. 24-29.

2. Di Zerega, G.S. Use of adhesion prevention barriers in pelvic reconstructive and gynecologic surgery /G.S. Di Zerega //Pelvic surgery: adhesion formation and prevention. - Springer-Verlag, New York Inc., 1997. - С. 188-211.

3. Состояние системы нейтрофильных фагоцитов в модели экспериментального перитонита /Е.А. Чагина, С.А. Комогорцева, Е.Н. Олесик и др. //Современные наукоемкие технологии. - 2005. - № 10. - С. 69-69.

4. Кулаков, В.И. Оперативная гинекология - хирургические энергии: рук-во /В. И. Кулаков. - М.: Медицина, Антидор, 2000. - 860 с.

5. Pahor, M. Health outcomes associated with calcium antagonists compared with other first-line antihypertensive therapies: a meta-analysis of rando-

mized controlled trials /M. Pahor, B. Psaty, M. Alderman //Lancet. - 2000. - № 356. - С. 1949-1954.

6. Ranganathan, S. Effect of calcium-blocking drugs on lysosomal function in human skin fibroblasts /S. Ranganathan, R.L. Jackson //Biochem. Phor-

macol. - 1984. - № 8. - Р. 15.

If

18 T. 11 № 3 2012 MedicLn^ OMSuima

inKuzbass вК^бага