Клеточные и молекулярные механизмы неоваскуляризации глиом больших полушарий головного мозга и перспективы антиангиогенной стратегии

клеточные и молекулярные механизмы

неоваскуляризаиии глиом больших полушарий головного мозга и перспективы антиангиогенной стратегии

Юрий Грачев,

ведущий научный сотрудник нейрохирургического отдела РНПЦ неврологии и нейрохирургии, кандидат медицинских наук

Первичные нейроэпителиальные опухоли (глиомы) больших полушарий головного мозга составляют 1,5% всех опухолей человека. Продолжительность жизни пациентов после обнаружения глиомы редко превышает 5 лет, а наиболее злокачественной глиобластомы или ана-пластической астроцитомы - 18 месяцев. В Республике Беларусь заболеваемость глиомами больших полушарий головного мозга достигает 7 случаев на 100 тыс. населения. Данные новообразования обладают инфильтративным ростом и не имеют четких границ, поэтому хирургическое удаление всех опухолевых клеток практически неосуществимо. Адьювант-ная терапия только незначительно увеличивает выживаемость пациентов с глиомами, так как инвазивные клетки весьма устойчивы к лучевому воздействию и цитостатикам. Клональная селекция адаптирует опухолевые клетки к гипоксии, но

они все же погибают при недостаточном поступлении кислорода и питательных веществ. Выживают лишь те популяции, которые мигрируют в новую среду обитания, используя энергию анаэробного гликолиза, или инициируют неоваскуляри-зацию. Однако метастазирование глиом за пределы ЦНС происходит крайне редко из-за наличия гематоэнцефалического барьера, а повышение плотности микрососудов в пилоцитарных астроцитомах и олигодендроглиомах не является доказательством их малигнизации. Предположение, что ангиогенез начинается, когда количество опухолевых клеток не менее нескольких миллионов, а размеры новообразования более 1-2 мм в диаметре, не подтвердилось. Новая капиллярная сеть in vivo начинает формироваться уже на 6-7-е сутки после имплантации опухолевых клеток глиобластомы. В этом случае суммарное количество опухолевых

клеток не превышает нескольких тысяч. Очевидно механизм неоваскуляризации по типу «порочного круга» (пролиферация - гипоксия - ангиогенез, затем вновь пролиферация и опять гипоксия) существует только в высокодифферен-цированных глиомах. В глиобластомах (grade IV) он больше напоминает процесс васкуляризации плаценты у беременных или формирование кардиогенных сосудов у эмбриона. В глиобластомах в перива-скулярном пространстве вновь формирующихся сосудов всегда присутствуют эмбриональные белки (CD31, CD34, CD44, CD105) и клетки - предшественницы эндо-телиоцитов. Кроме того, в глиобластомах плотность микрососудов гораздо выше, чем в олигодендроглиомах, астроцитомах (grade II) и даже в анапластических астро-цитомах (grade III), несмотря на то что они тоже имеют области с выраженной гипоксией. Возможно, в высокодиффе-

ренцированных глиомах недостаточный уровень насыщения тканей кислородом корректирует баланс митотической активности с апоптозом, и поэтому структура эндотелиоцитов не изменяется [1]. Несмотря на то что каждая глиома имеет свой неповторимый сосудистый рисунок, можно выделить два основных варианта: классический и деформированный. При первом размеры новообразования увеличиваются с повышением плотности микрососудов. Деформированная сосудистая сеть коррелирует с высоким темпом неоваскуляризации и не соответствует размерам новообразования. Причем некоторые параметры, в частности наличие или отсутствие гломерулоидных структур, являются прогностическими факторами неблагоприятного течения заболевания. Процесс неоваскуляризации условно состоит из двух периодов. В первом, «ава-скулярном», опухолевые клетки инфильтрируют стенки нормальных сосудов и как бы «механически» разрывают плотные и адгезивные соединения эндотелиоцитов. Последние, утратив связи между собой и перицитами базальной мембраны, продвигаются в зону гипоксии. Во втором, «ангиогенном», периоде рекрутируются различные клеточные фенотипы, участвуют ростовые факторы, рецепторы, белки внеклеточного матрикса (ВКМ), а также ферменты и их тканевые ингибиторы (Т1МР/РА1) [2]. Эта непосредственная па-ракринная и аутокринная стимуляция эн-дотелиальных клеток также модулируется циркулирующими в плазме крови молекулами высокоаффинных тирозинкиназных рецепторов или низкоаффинных гепарин-сульфатных протеогликанов. Ангиогенный период непродолжительный. Особенно хорошо процесс формирования новых сосудов просматривается в хирургических биоптатах глиобластом. Вначале стенка сосудистого трубчатого ростка состоит из одного слоя многоядерных эндотелиаль-ных клеток. Позже появляются перициты, а затем фибробласты и актинпозитивные клетки, что указывает на функциональную зрелость микрососудов. На этом завершающем этапе митотическая и локомоторная активность эндотелиоцитов понижается. Во вновь сформированных микрососудах базальная мембрана непрочная, поэтому

возникают деформации сосудов, нарушается кровоток и происходит перфузия крови в ткань опухоли. Множественные кровоизлияния придают глиобластомам «пестрый» вид.

Установлено, что в ремоделировании предшествующей сосудистой сети глиомы участвуют ангиопоэтины (Ang-1, Ang-2), лиганды тирозинкиназного рецептора (Tie-2) эндотелиальных клеток. У трансгенных мышей с делецией Tie-2 или «нокаутом» гена, кодирующего Ang-1, наблюдаются пороки развития сердечно-сосудистой системы и гибель на 9-10-й день эмбрионального развития. Ang-1/Tie-2 активизируют сигнальный путь PI3K/AKT и киназу фокальной адгезии, что одновременно усиливает митотическую активность и перемещение эндотелиальных клеток. Ang-2 антагонист Ang-1, поэтому он может заблокировать Tie-2. На переднем фронте инвазии эти ангиопоэтины работают в кооперации. Вокруг зоны некроза выявляется только Ang-2, который, возможно, уменьшает адгезию эндотели-альных клеток и перицитов, тем самым способствуя их миграции [3]. Опухолевые, эндотелиальные и многие другие клетки, помимо ангиопоэтинов, продуцируют еще один проангиогенный фактор - ангиоге-нин (ANG), одноцепочечный полипептид из семейства рибонуклеаз. У пациентов с глиобластомами в плазме крови повышен уровень ANG, который обладает ферментативной активностью. Рецептор ANG - белок актин, фосфорилирует тканевой плазминоген, инициируя образование плазмина. В свою очередь, плазмин вызывает деградацию различных компонентов базальной мембраны и облегчает движение эндотелиальных клеток. Мутации гена ANG (14q 11-13) являются непосредственной причиной аномальной гиперплазии кровеносных сосудов в таком семейно-наследственном заболевании, как атаксия-телеангиоэктазия, однако в глиобластомах неоваскуляризация обусловлена активностью инозитолсодер-жащих фосфолипидов или вовлечением молекулярных каскадов типа Notch [4, 5]. В зоне гипоксии всегда присутствуют ангиостатины, которые участвуют в эндо-телиально-зависимой регуляции свертывающей системы крови (тромбомодулин,

фактор фон Виллебранда, фибриноген, плазминоген и др.). Ангиостатины вызывают тромбообразование, облитерацию сосудов, что еще больше усугубляет гипоксию. Ангиостатин и эндостатин инги-бируют пролиферацию эндотелиальных клеток, а тромбоспондин (TSP-1), их подвижность. В первичных глиобластомах экспрессия тромбоспондин (TSP-1) снижена из-за делеции хромосомы 10q23.3, где расположен ген-супрессор PTEN, а во вторичных - из-за инактивации p53 [6, 7]. Таким образом, определить ключевую молекулу белка, инициирующую ангиогенез, или найти мишень для таргетной терапии не удалось. Сегодня известны только потенциальные стимуляторы и ингибиторы ангиогенеза, а также «триггер» - фактор, индуцированный гипоксией (HIF-1). Однако гетеродимеры HIFIa и HIFIß в условиях нормоксии не обнаруживаются, так как, связываясь с белком von Hippel-Lindau, разрушаются гидроксилазой аспарагина. HIF1, накапливаясь при гипоксии, стимулирует продукцию мощного митогена эндотелиальных клеток - vascular endothelial growth factor (VEGF) - и повышает активность оксиредуктина, который препятствует денатурации эндоплазматических белков. К тому же HIF1 усиливает транскрипцию генов эритропоэтина, трансфер-рина, эндотелина, церулоплазмина, аль-долазы, энолазы, лактатдегидрокиназы, циклооксигеназы, фосфоглицераткиназы, фосфофруктокиназы и многих других ферментов [8]. Эти ферменты не только стимулируют ангиогенез, но и повышают адаптацию опухолевых клеток к гипоксии. Все же главным и доминирующим ангио-генным стимулом по-прежнему считается VEGF. Он первоначально рассматривался как более сильный, чем гистамин, фактор сосудистой проницаемости (VPF). Гоми-зиготная потеря одной аллели гена VEGF взывает гибель мышей на 11-12-й день эмбрионального развития из-за дисплазии сердечно-сосудистой системы. В клеточных линиях глиобластом выключение его сенсорного компонента (Ньюфаундленд-JB) блокирует ангиогенез.

Особенно высокое содержание VEGF отмечено вокруг некроза и псевдопал-лисадах. Сведения о содержании VEGF в спинномозговой жидкости и крови у

пациентов с глиомами остаются противоречивыми [9]. Фактор роста плаценты (PLGF) и тромбоцитарный (PDGF) являются изоформами VEGF, а их возможным источником, помимо опухолевых и эндо-телиальных клеток, могут быть тромбоциты. Существует несколько подсемейств тирозинкиназных рецепторов VEGF: основные - VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (Flk-1/KDR), а Neuropilin-1,-2 (NRP-1,-2) -дополнительные. Вышеперечисленные лиганды и их рецепторы, опосредованные ras/raf/MAPK, стимулируют деление эндотелиальных клеток и активизируют антиапоптотические белки. В глиобласто-мах de novo 50-кратное увеличение VEGF связывают с усилением/амплификацией/ мутацией EGFR, во вторичных повышение VEGF - с инактивацией p53, альтерациями MDM2, p14ARF или делециями на хромосоме 17p. Однако вышеперечисленные молекулярно-генетические изменения и хромосомные абберации могут стимулировать как секрецию VEGF, так и синтез или стабилизацию HIF-1. В местах эндоте-лиальной пролиферации выявляются два представителя многочисленного семейства фактора роста фибробластов (FGF): кислый (FGFa) и основной (FGFb), которые по своей структуре почти на 50% гомологичны VEGF. FGFb - активатор ферментов урокиназного типа (uPA), преобразующих плазминоген в плазмин, в свою очередь последний активизирует коллагеназу [11]. Однако и этот молекулярный каскад контролируется полипептидами из семейства серпионов (PAI 1-2), гепаран-сульфат-ными протеоглюканами (Glypican-1) или тканевыми активаторами плазминогена (tPA), выполняющими роль защитника ВКМ от инвазии эндотелиальных клеток. Соотношение тканевого tPA с uPA/uPAR служит индикатором скорости неоваску-ляризации. При выключении гена uPAR в клеточных линиях глиобластом или ксено-трансплантатах капиллярная гиперплазия затормаживалась. В глиомах уровень uPA, tPA PAI-1, PAI-2, Glypican-1 постоянно изменяется, хотя всегда превалируют защитники стромы опухоли от саморазрушения [12]. Инсулинопобный фактор роста (IGF) также на 42% гомологичен VEGF. IGF может взаимодействовать с VEGFR-1, тем самым способствуя связыванию VEGF

с VEGFR-2. Фактор роста или «скутер» гепатоцитов (HGF/SF) рассеивает эндоте-лиальные клетки. Нейтрализация его рецептора (c-MET) останавливает движение зндотелиоцитов.

Трансформирующий фактор роста (TGF-1), продуцируемый Т-лимфоцитами, макрофагами, тромбоцитами, воздействует почти на все клетки организма, поскольку его рецептор встречается у большинства из них. GF-1 активизирует p15 INK4B в Smad3-зависимом сигнальном пути, что вызывает остановку клеточного цикла в фазе G1. В глиобластомах этот ген утрачен, и поэтому преобладает влияние митогена PDGF-В. Кроме того, TGF-b и фактор роста соединительной ткани (CTGF/CCN2/CXCL1-2) связываются с ин-тегринами, которые распознают аминокислотную последовательность (Arg-Gly-Asp) белков ВКМ и эндоцитоплазматические участки цитоскелета. Таким образом, TGF-b модулирует адгезию эндотелиаль-ных клеток ко многим белкам ВКМ и корректирует скорость их движения. Кроме того, TGF-1 отвечает за дифференцировку клеток-предшественниц в перициты, стабилизируя стенку вновь формирующихся микрососудов [13, 14].

В глиобластомах опухолевые клетки и макрофаги продуцируют также фактор некроза опухоли (TNF), который в низких концентрациях стимулирует, а в высоких блокирует ангиогенез [15]. Под влиянием всех вышеперечисленных ростовых факторов «мелкие» со скудной цитоплазмой эндотелиальные клетки предшествующих сосудов увеличиваются в размерах, становятся диплоидными, делятся и мигрируют.

Для перемещения необходимо свободное пространство, поэтому в ремоде-лировании предшествующей сосудистой сети участвуют ферменты, разрушающие ВКМ. Основную работу выполняют проте-азы, содержащие металлы с переменной валентностью (MMP). Они синтезируются в неактивной проформе, но при гипоксии мезенхимальные и стволовые клетки их активизируют, а сами трансформируются в эндотелиоциты, фибробласты или выполняют функцию перицитов. При этом активность T-лимфоцитов снижается, лейкоциты в периваскулярной области

начинают продуцировать интерлейкины, стимулирующие активность промоторного сайта VEGF [16, 17]. В результате постоянного прикрепления-отсоединения и деления эндотелиальных клеток идет реконструкция «верхушки» сосуда. Однако в стенках вновь сформированных сосудов очень мало перицитов и нет стабилизации капиллярного русла. При этом структурная и функциональная неполноценность сосудистой сети не препятствует пери-васкулярной диссеминации опухолевых клеток, которая с усугублением гипоксии усиливается. У лабораторных животных подавление неоваскуляризации в индуцированных глиомах уменьшало размеры опухоли, однако количество микроскоплений опухолевых клеток вокруг первичного очага и на отдалении увеличивалось [18]. Мишенями антиангиогенной стратегии были VEGF, HIF, FGF, HGF, ФНО и многие другие факторы или их рецепторы. Во внеклеточных доменах VEGFR-2, 3 имеются Ig-подобные участки, поэтому синтезированы моноклональные антитела, нейтрализующие VEGF. Антитела представляли биоконструкцию человеческих каркасных и мышиных комплементарных участков (bevacizumab, коммерческое название «Авастин»). Был создан также фантом экстрацеллюлярных доменов VEGFR с IgG1 человека. Эти препараты в ксенотрансплантатах вызывали регресс сосудов, однако in vitro (U87) подобный эффект отсутствовал, что подтверждало блокирование ими только паракринного VEGF. На этом основании в 2009 г. FDA (США) одобрило использование «Ава-стина» для лечения глиобластом, а Европейское медицинское агентство (EMA) потребовало проведения дополнительных испытаний, потому что снижение внутри-опухолевого кровотока хотя и усугубляет гипоксию, одновременно стимулирует процесс анаэробного гликолиза в опухолевых клетках. Происходит селекция наиболее злокачественного «подвижного» фенотипа, резистентного к проапоптоти-ческим цитостатикам. Без выключения этого механизма антиангиогенная стратегия себя не оправдывает. Кроме того, авастин вызывает побочные реакции и тяжелые осложнения (рвота, диарея, кровотечение, сепсис, тромбофлебит,

инфаркт миокарда, инсульт и многие другие). [19, 20]. Для нейтрализации FGF, hGf использовали талидомид (Lenalidomide) или антитела (AMG 102) к рецептору c-MET. Они также заметного влияния на выживаемость пациентов с глиомами не оказали. Мишенями таких препаратов, как Vatalinib, Sorafenib, Cediranib, были внутриклеточные АТФ-связывающие домены различных сигнальных белков, однако конечный терапевтический результат оставался прежним. Не доказана эффективность антагонистов интегрина avb3-avb5 (Oilengitide), ингибиторов MMP (маримастат) [20]. После хирургического удаления первичного очага новообразования интенсивность продолженного первично-множественного роста глиом может усиливаться. Данный факт, возможно, тоже связан с усиленной продукцией ростовых факторов во время заживлении операционной раны или с тем, что про-ангиогенные молекулы разрушаются в глиоме в течение нескольких минут, а их ингибиторы на протяжении многих часов, что позволяет последним накапливаться и временно блокировать пролифератив-ный рост метастатических скоплений инвазивных клеток - феномен вторичной противоопухолевой устойчивости органов и тканей (concomitant antitumoral resistance - OAR). В ответ сторонники ан-тиангиогенной стратегии приводят такой аргумент, при подавлении эндотелиаль-ной гиперплазии барьерная функция ГЭБ нивелируется, следовательно, облегчается проникновение цитостатиков в глиому. Конечно, адресная и быстрая доставка проапоптотических химиопрепаратов может эффективно противодействовать селекции агрессивного «подвижного» клона опухолевых клеток и маглинизации глиом больших полушарий головного мозга. К сожалению, это предположение не подтверждено клиническими наблюдениями.

Для преодоления хронической гипоксии и сохранения пролиферативного роста в глиомах функционирует механизм неоваскуляризации. Формирование новой сосудистой сети и ее стабилизация контролируются множеством факторов, которые увеличивают плотность микрососудов или противодействуют этому. В полушариях головного мозга на отдалении

от первичного очага новообразования продуцируются ингибиторы ангиогенеза, временно задерживающие мультифокаль-ный метастатический опухолевый рост глиобластом. Антиангиогенная терапия, уменьшая кровоснабжение опухоли, усугубляет гипоксию и одновременно усиливает миграцию опухолевых клеток.

Баланс вазоактивных пептидов, несомненно, изменяется после хирургического удаления опухоли, что предполагает исследование ангиогенного профиля в раннем послеоперационном периоде и его коррекцию.

Статья поступила в редакцию 23.05.2012 г.

Summary

To overcome the chronic hypoxia and save proliferative growth in gliomas functioning mechanism of neovascularization. Formation of a new vascular network and its stabilization are controlled by many factors, which increase the density of microvessels or counteract it. In the hemispheres of the brain at a distance from the primary tumor growths produced angiogenesis inhibitors, temporarily delaying multifocal metastatic tumor growth of glioblastomas. Antiangiogenic therapy, reducing the blood supply to tumors, exacerbates hypoxia also increases the migration of tumor cells. The balance of vasoactive peptides undoubtedly change after surgical removal of the tumor, which involves the study of angiogenic profile in the early postoperative period and its correction.

Литература

1. Kaur B., Tan C., Brat D.J. et al. Genetic and hypoxic regulation of angiogenesis in gliomas. J Neurooncol 2004, 70: 229-243.

2. Crocker M., Ashley S., Giddings I., et al. Serum angiogenic profile of patients with glioblastoma identifies distinct tumor subtypes and shows that TIMP-1 is a prognostic factor Neuro Oncol 2011, 1, 13: 99-108

3. Koga K., Todaka T., Morioka M, et al. Expression of angiopoietin-2 in human glioma cells and its role for angiogenesis. Cancer Res 61: 6248-6254, 2001.

4. Woods S.A., McGlade C.J., Guha A. Phosphatidylinositol 3-kinase and MAPK/ERK kinase 1/2 differential regulate expression of vascular endothelial growth factor in human malignant astrocytoma cells. Neuro-oncol 2002, 4: 242-252.

5. Stockhausen M.T., Kristoffersen K., Poulsen H. S. The functional role of Notch signaling in human gliomas. Neuro-oncol 2010 12(2)199-211.

6. Brat D.J., Van Meir, E.G. Vaso-occlusive and prothrombotic mechanisms associated with tumor hypoxia, necrosis, and accelerated growth in glioblastoma. Lab Invest 2004, 84, 397-405.

7. Naganuma H., Satoh E., Asahara T. et al. Quantification of thrombospondin-1 secretion and expression of avb3 and a3b1 integrins and syndecan-1 as cell-surface receptors for thrombospondin-1 in malignant glioma cells. Neuro-Oncol ogy, 2004. 70: 309-317.

8. Dery M.A., Michaud M.D., Richard D.E. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators. Int J Biochem Cell Biol 37: 535-540, 2005.

9. Takano S., Yoshii Y., Kondo S. et al. Concentration of vascular endothelial growth factor in the serum and tumor tissue of brain tumor patients. Cancer Res 1996, 56(9): 2185-2190.

10. Maity A., Pore N., Lee J. et al. Epidermal growth factor receptor transcriptionally upregulates vascular endothelial growth factor expression in human glioblastoma cells via a pathway involving phosphatidylinositol 3-kinase and distinct from that induced by hypoxia. Cancer Res 2000, 60(20): 5879-5886.

11. Schmidt N.O., Westphal M., Hagel C. et al. Levels of vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor/scatter factor and basic fibroblast growth factor in human gliomas and their relation to angiogenesis. Int J Cancer 1999, 84(1): 10-18.

12. Qiao D., Meyer K., Mundhenke C. et al. Heparan sulfate proteoglycans as regulators of fibroblast growth factor-2 signaling in brain endothelial cells. Specific role for glypica n-1 in glioma angiogenesis. J Biol Chem 2003, 278(18): 16045-16053.

13. Schmidt N.O., Westphal M., Hagel C. et al. Levels of vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor/scatter factor and basic fibroblast growth factor in human gliomas and their relation to angiogenesis. Int J Cancer 1999, 84(1): 10-18.

14. Guo P., Hu B., Gu W. et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. Am J Pathol 2003, 162: 1083-1093.

15. Nabors L.B., Suswam E., Huang Y. et al. Tumor necrosis factor alpha induces angiogenic factor upregulation in malignant glioma cells: a role for RNA stabilization and HuR. Cancer Res 2003, 63: 4181-4187.

16. Nolan D., Ciarrocchi A., Mellick A. et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization. Genes Dev. 2007; 21: 1546-58.

17. Loeffler S., Fayard B., Weis J. et al: Interieukin-6 induces transcriptional activation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in astrocytes in vivo and regulates VEGF promoter activity in glioblastoma cells via direct interaction between STAT3 and Sp1. Int J Cancer, 2005 115: 202-213.

18. Lamszus K., Kunkel P., Westphal M. Invasion as limitation to antiangiogenic glioma therapy. Acta Neurochir Suppl 2003, 88: 169-177.

19. Norden A.D., Young G.S., Setayesh K. et al. Bevacizumab for recurrent malignant gliomas: efficacy, toxicity, and patterns of recurrence. Neurology 2008; 70:779-87.

20. Keunen O., Johanson M., Oudin A. VEGF treatment reduces blood supply and increases tumor cell invasion in glioblastoma Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108(9): 3749-3754.