ИЗОЛИРОВАННЫЙ ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 В КАЧЕСТВЕ ПРОБИОТИКА, УСИЛИВАЮЩЕГО ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ ОРГАНИЗМА, ПРОДУКТ И КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ УПОМЯНУТЫЙ МИКРООРГАНИЗМ, И ПРИМЕНЕНИЕ УПОМЯНУТОГО МИКРООРГАНИЗМА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, КОТОРОЕ УСИЛИВАЕТ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ
ISOLATED STRAIN OF MICROORGANISM Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 AS PROBIOTIC ENHANCING INNATE IMMUNITY OF ORGANISM, PRODUCT AND COMPOSITION CONTAINING SAID MICROORGANISM, AND USE OF SAID MICROORGANISM FOR PRODUCTION OF MEDICINAL PRODUCT THAT ENHANCES CELLULAR IMMUNITY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и применения в пищевой промышленности и медицине. Настоящее изобретение относится к штамму микроорганизма Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в качестве пробиотика, который продуцирует полиамины, монооксид азота и антиоксидантные соединения, улучшает барьерную функцию кишечника, иммунитет слизистой кишечника и клеточный иммунитет и индуцирует провоспалительные цитокины. Изобретение относится к его применению в составе продуктов для здорового питания, например, в молочных продуктах и фармацевтических препаратах, усиливающих врожденный иммунитет организма путем улучшения барьерной функции кишечника и усиления иммунитета слизистой кишечника и клеточного иммунитета.
Уровень техники
На протяжении последних десятилетий лактобациллы широко применяют в качестве пробиотиков в продуктах для здорового питания. Продукт может рассматриваться как предназначенный для здорового питания, если помимо соответствующих питательных компонентов он содержит какие-либо натуральные добавки (пре- или пробиотики), которые благоприятно воздействуют на одну или более заданную функцию в организме, или улучшая состояние здоровья и благополучия и/или снижая риск заболевания. Пробиотики являются живыми микроорганизмами, которые, при применении в соответствующих научно-обоснованных количествах, приносят пользу здоровью организма хозяина. Часто пробиотики используют для создания продуктов здорового питания. Пробиотическими продуктами могут быть как традиционные продукты питания (йогурт, творог, простокваша), так диетические добавки (лиофилизированные культуры микроорганизмов). Пробиотики часто используют для усиления защитной способности организма.
st
Усиление врожденного иммунитета организма приобрело важность в связи со старением населения и заболеваниями, связанными с иммунодефицитом (ВИЧ инфекция, иммуносупрессия, вызванная пересадкой тканей). Инфекции, нарушения метаболизма и онкогенные процессы чаще наблюдаются у пожилых людей (Hebuterne X., Gut changes attributed to ageing: effects on intestinal microflora. Curr. Opin. Clin. Nutr Metab Care, 2003; 6 (1):49-54; Wenzel, R.P., Health care - associated infections. Major issues in early years of 21century. Clin Inf. Dis., 2007; 45: S85-S88). Причиной всех названных заболеваний является снижение выраженности некоторых физиологических функций организма (Timiras, P.S. Physiology of aging: standards for age-related functional competence In: Comprehensive Human Physiology. Greger, R (edt)/ Windhorst, U (eds) Springer Verlag, 1996; pp 2391-2405). Старение рассматривается как понижение стрессоустойчивости и ослабление иммунного ответа. В первую очередь, это наносит ущерб количеству защитных клеток (лейкоциты, макрофаги, лимфоциты, тромбоциты), которые циркулируют в человеческом теле, и снижает активность фагоцитов, также снижая защитную функцию слизистой (Hebuterne X., Gut changes attributed to ageing: effects on intestinal microflora. Curr. Opin. Clin. Nutr Metab Care, 2003; 6 (1):49-54; Fang H., Intestinal microbiota of the elderly. In: Gastrointestinal Microbiology: The Intestinal Microbiota of Elderly Edited by A. Ouwehand and E. Vaughan 2006; pp 75-91).
Проницаемость кишечной слизи часто повышается на фоне хронического воспаления. Указанное состояние является основой для генерализации кишечной инфекции в результате аутоаллергических реакций и транслокации микробов. Микробные метаболиты играют существенную роль в целостности слизистой, например, короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), которые продуцируют молочнокислые бактерии в толстой кишке при богатой волокнами (вещества растительного происхождения) диете (Roy CC, Kien CL, Bouthillier L., Levy E. Short chain fatty acids: ready for prime time? Nutr. Clin. Pract., 2006; 21:351-366). Бутират, который вырабатывают эубактерии и клостридии, необходим для усиления барьерной функции слизистой, подобно влиянию обогащенности волокнами на микрофлору толстого кишечника, которое описано в нескольких исследованиях (O'Keefe SJD. Nutrition and colonic health: the critical role of the microbiota. There is strong evidence for the ability of diet to influence the colonic microbiota and cancer risk as measured by epithelial proliferation rate. Current Opin Gastoenterol. 2008; 24:51-58).
Для усиления барьера слизистой, помимо короткоцепочечных жирных кислот, необходимы также полиамины. Полиамины - это линейные насыщенные соединения, в которых аминокислоты расположены вдоль структуры. Путресцин, спермидин и спермин относятся к полиаминам (Larqué, M., Sabater-Molina, S. Zamora E. Biological significance of dietary polyamines. Nutrition 2007; 23(1):87-95). Полиамины получают из аминокислот орнитина и аргинина путем декарбоксилирования. Путресцин получают напрямую из орнитина, а аргинин в основном преобразуется в агмантин, который затем преобразуется в путресцин (Halaris A, Plietz, Agmatine: metabolic pathway and spectrum of activity in brain. CNS Drugs, 2007; 21:885-90). Диаминооксидаза метаболизирует путресцин в гамма-бутират, которая является молекулой, необходимой для метаболизма нейронов.
Помимо этого аргинин является источником монооксида азота (NO); система NOS-NO может обладать гиперемиязависимым защитным механизмом против вызванного стрессом повреждения слизистой кишечника (Brzozowski Т., Brzozowski, Konturek P., С., Sliwowski Z., Drozdowicz D., Burnat G., Pajdo R., Pawlik M., Bielanski W., Kato I., Kuwahara A., Konturek S.J. and Pawlik W.W. Gastroprotective action of orexin-A against stress-induced gastric damage is mediated by endogenous prostaglandins, sensory afferent neuropeptides and nitric oxide. Regul Pept 2008 in press).
Физиологическое действие полиаминов направлено на рост клеток и дифференциацию, регулирование иммунных клеток и воспалительной реакции; полиамины также обладают антиаллергическим, стимулирующим синтез белка, стабилизирующим структуру нуклеиновых кислот и контролирующим активность ферментов действием. Полиамины уменьшают образование язв кишечника и улучшают слизистую кишечника, таким образом снижая их проницаемость для макромолекул.
Полиамины обладают способностью вызывать апоптоз, избегая гиперпролиферацию эпителия, и разрушение первичных раковых клеток (Moinard С, Cynober L, De Bandt JP Polyamines: metabolism and implications in human disease. Clin Nutr., 2005; 24:184-197). Полиамины продуцируются эндогенно либо их активно выделяют из пищи. Получать полиамины с пищей особенно важно для пожилых людей, у которых понижена способность к синтезу полиаминов. Только 20% потребляемого путресцина всасывается в кровоток из кишечника, что сопровождается увеличением накопления ацетилированного путресцина, тогда как основную массу метаболизируют печень и энтероциты (Milovic V, Odera G, Murphy GM, Dowling RH Jejunal putrescine absorption and the pharmakokinetic/biotransformation of ingested putrescine in humans. Gut, 1997; 41: A63). Избыток путресцина, спермидина и спермина можно обнаружить в ацетилированной или окисленной форме (Seiler N Catabolism of polyamines. Amino Acids 2004; 26:217-233). Путресцин считается токсичным в концентрации 2000 мг/кг; однако путресцин и кадаверин могут усиливать токсический эффект тирамина и гистамина. Следовательно, общую токсичность полиаминов в пище принимают за >300 мг/кг (Larqué, М., Sabater-Molina, S. Zamora E. Biological significance of dietary polyamines. Nutrition 2007; 23(1):87-95).
При повреждении клеток эпителия выработку полиаминов клетками микрофлоры кишечника считают одним из компенсаторных механизмов для модификации иммунного ответа и регуляции апоптоза. Путресцин получают посредством нескольких анаэробов, Escherichia coli и лактобациллы. Лактобациллы составляют основную часть микрофлоры проксимального отдела толстой кишки (Marteau, P., Pochart, P., Dore, J., Bera-Maillet, С., Bemalier, A. and Corthier, G. Comparative study of bacterial groups within the cecal and fecal microbiota. Appl. Env. Microbiol. 2001; 67, 4939-4942). Лактобациллы производят полиамины путем декарбоксилирования аминокислот, особенно при высоких рН содержимого кишечника (Lonvaud-Funel A, Biogenic amines in wine: role of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Letters, 2001, 199:9-13). С другой стороны, штаммы Lactobacillus acidophilus используют путресцин и уменьшают запах лиц (WO 2008/019887, BASF AG).
Японская патентная заявка JP 2006191808 (Toyota Motor Corporation) описывает технологию выработки путресцина энтеробактерией. Патент Эстонии ЕЕ03597 (Probi АВ) описывает фармацевтическую композицию, которая содержит штаммы L.plantarum 299 и 299v вместе с аргинином для предупреждения транслокации кишечных микроорганизмов при повреждении печени. Эти штаммы L.plantarum родственны более чем на 70% (REA) по отношению к штамму L.plantarum 299 и способны колонизировать слизистую кишечника человека in vivo. Также в этом патенте отсутствует информация относительно конечных продуктов использования аргинина (путресцин, кадаверин, тирамин, накопление NO или усиление антиоксидантных свойств) посредством L.Plantarum, которые отвечают за вышеупомянутый эффект. Тесно связан с предыдущим патентом другой патент ЕЕ04097 (Probi АВ), который раскрывает штаммы L.plantarum 299v и 299, которые способны колонизировать слизистую благодаря манноза-специфичным адгезинам. Этот патент также не раскрывает полиамины или способность упомянутых штаммов L.plantarum вырабатывать NO.
Однако при ежедневном приеме аргинина в больших дозах (3,4 г/сут) наблюдают значительное накопление NO по сравнению с более низкими дозами (3,2 г/сут) (Jablakad A. Checinski P., Krauss H., Mickerbe M. Astcef J. The influence of 2 different doses of L-arginine oral supplementation on nitric oxide (N=9) concentration and total antioxidant status (TAS) in atherosclerotic patients. Clinical Research, 2004). Продемонстрировано, что Lactobacillus rhamnosus GG может усиливать выработку NO клетками эпителия кишечника либо через провоспалительные цитокины, и выявлено, что благотворные эффекты Lactobacillus rhamnosus GG могут быть вызваны выработкой NO макрофагами и клетками эпителия (Korhonen K, Reijonen TM, Remes K, Malmstrom K, Klaukka Т, Korppi M. Reasons for and costs of hospitalization for paediatric asthma: A prospective 1-year follow-up in a population-based setting. Pediatr Allergy Immunol 2001; 12:331-338). Продемонстрировано, что NO защищает слизистую от повреждении и избыточной проницаемости, возникшей после реперфузии (Payne D, Kubes P. Nitric oxide donors reduce the rise in reperfusion-induced intestinal mucosal permeability. Am J Physiol. 1993; 265 (1 Pt 1):G189-G195).
Патентная заявка США US 20060078595 (Friesland Brands B.V.) раскрывает способ, позволяющий избежать избыточную проницаемость кишечного барьера у новорожденных с помощью глутамата и его предшественников, а также полиаминов спермидина, спермина, путресцина при различных синдромах (недостаточность питания, аллергия, сепсис, транслокация микроорганизмов, эндотоксемия, вирусная диаррея). Источником глутамата служили Lactobacillus Reuteri (BIOGAIA).
Для лиц пожилого возраста существует всего несколько пробиотиков. Число лактобацилл в кишечнике у пожилых, регулярно потребляющих пробиотики, было выше по сравнении с теми, кто не потреблял пробиотики (Soovares, P., Salusaar L, Kolk H, Sepp E, Kullisaar T, Vihalemm Т, Zilmer M, Mikelsaar M. Kas soole laktobatsillide hulk ja söömisharjumused mõjutavad ateroskleroosi riski eakatel isikutel? Eesti Arst, 2007; 9:704). Пробиотики для пожилых людей обычно нацелены на уменьшение хронических воспалений с помощью подавления иммунитета и IL-10 - индуцирующих бактерий (бифидобактерии, Lactobacillus acidophilus), например, патентная заявка Эстонии ЕЕ200300351 (Valio Ltd.) раскрывает комбинацию бактерий (L.rhamnosus GG, L.rhamnosus DSM LC705 7061, Propionibacterium freudenreichii ssp. Shermani DSM7067 и Bifidobacterium infantist DSM 13642) и галактоолигосахаридов (ГОС) для улучшения общего состояния здоровья и стимуляции иммунной системы. Не предоставлено данных, какие именно компоненты иммунной системы были простимулированы, тем не менее из публикации следует, что лучшими стимуляторами TNF-альфа и IL-6 являются Lactobacillus GG и еще один штамм L.rhamnosus - Е509 (Miettinen M., Vupio-Varkila J, Varkila K. Production of TNF-alpha and interleukin-6 and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria. Infection & Immunity, 1996, 64:5403-5405).
Полиамин спермидин обладает способностью уменьшать воспаление. Продемонстрировано что спермидин, при добавлении к моноцитам человека, которые простимулировали липополисахаридами, эффективно уменьшает синтез TNF, IL-1, IL-6, и других провоспалительных цитокинов (Zang M, Caragine Т. Wong H et al. Spermine inhibits proinflammatory cytokine synthesis in human mononuclear cells: a counter regulatory mechanism, that restrains the immune response. J. Exp. Med., 1997, 185: 1759-1768). Матсумото и соавторы описали подавление синтеза провоспалительных цитокинов (Matsumoto M, Ohisshi H, Benno Y Impact of LKM512 yoghurt on improvement of intestinal environment of the elderly. FEMS immunol. Medical Microbiol, 2001; 31: 181-186). Избыточное подавление провоспалительных цитокинов может быть опасным, поскольку это угнетает активацию лимфоцитов и натуральных киллеров, действующих против раковых клеток. Bifidobacterium lactis LKM512 в составе йогурта, принимаемого пожилыми людьми, понижала гликопротеин гаптоглобулин, вызванный ответом острой фазы воспаления, благодаря IL-1, IL-6 и TNF-альфа, но прием пробиотика также сопровождался снижением мутагенности эпителиальных клеток кишечника. Кроме того, полиамины улучшают апоптоз в клетках эпителия, чтобы предотвратить гиперпролиферацию, которая является существенной предпосылкой для развития рака толстой кишки (Hamilton-Miller JMT, Probiotics and prebiotics in the elderly. Postgrad. Med., 2004; 80:447-451; Gill HS, Darragh AJ, Cross M. Optimizing immunity and gut function in the elderly. J. Nutr. Health Aging 2001, 5:60-91). Ввиду вышеупомянутых эффектов, потребление богатых полиаминами диет людьми пожилого возраста вызывает противоречия. В то же время, очевидно, что различные лактобактерии, включая виды и штаммы лактобацилл, различаются по своей способности индуцировать про- и противовоспалительные цитокины и неспецифический клеточный иммунный ответ. До настоящего времени не описано штаммов лактобацилл, которые были бы способны продуцировать полиамины в физиологически значимых количествах, которые бы обнаруживались в моче после употребления состава, образованного именно этим штаммом, и одновременно усиливать адаптивную активацию иммуноцитов благодаря IL-6.
Описан синтез провоспалительного цитокина IL-6 после 24-часовой стимуляции различными штаммами Bifidobacterium animalis и Lactobacillus rhamnosus (Miettinen M., Vuopio-Varkila J, Varkila K. Synthesis of human tumour necrosis factor alpha, interleukin-6 and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria. Infection and Immunity, 1996, 64:5403-5408). Во избежание избыточной продукции IL-6, важно наблюдать за такими воспалительными маркерами индукции IL-6, как число лейкоцитов (WBC) и концентрация С-реактивного белка в сыворотке крови (Kiecolt-Glaser JK, Preacher KJ, MacCallum RC et al. Chronic stress and age-related increases in the proinflammatory cytokine IL-6, PNAS, 2003; 100:9090-9095). Вышеперечисленное связано с сердечно-сосудистыми заболеваниями, артритом, диабетом второго типа, раком, периодонтальными заболеваниями, кахексией и ослаблением функций организма (Rose-John S., J. Scheller, G. Elson, and S. A. Jones. Interleukin-6 biology is coordinated by membrane-bound and soluble receptors: role in inflammation and cancer J. Leukoc. Biol., August 1, 2006; 80 (2): 227-236).
Lactobacillus plantarum - это широко распространенный представитель рода Lactobacillus. Упомянутый выше вид лактобацилл наблюдается на ферментированных растениях (кислая капуста, маринованные огурцы и силос), ферментированных молочных/мясных продуктах (сыр, салями), а также в желудочно-кишечном тракте человека (Bottazzi, V. Other fermented dairy products. Food and feed production with microorganisms. Biotechnology. Verlag Chemie, Weinhein, Ed. Reed G. 1983, 5:315-364; Hammes, W. P., Weiss, N., Holzapfel, W. The genera Lactobacillus and Carnobacterium. The Procaryots. Springer-Werlag, Heidelberg, New York, Eds. Balows A., Trupes H.S., Drowkin M., Schleifer K-H., 1992; 2: 1535-1594; Xanthopoulos, V., Hatzikamari, M., Adamidis, Т., Tsakalidou, E., Tzanteakis, N., Litopoulou-Tzanteaki, E. Heterogeneity of Lactobcillus plantrum isolates from Feta cheese througout ripening. J. Appl. Microbiology 2000, 88: 1056-1064). Lactobacillus plantarum способна изменять свой метаболизм в зависимости от условий окружающей среды.
Пробиотик Lactobacillus plantarum имеется в пробиотических продуктах питания, а также в пищевых добавках (например, Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843, Probi AB, Швеция, пробиотическая торговая марка Skånemejeriers' ProViva, или как один из компонентов бактериальной смеси VSL#3 (VSL Pharmaceuticals, Inc. USA). WO 2007/108764 (Probac AB) раскрывает механизм действия штаммов Lactobacillus plantarum, способных усиливать иммунотолерантность при аутоиммунной глютеновой болезни. Корейские патентные заявки KR 20020072913 и KR 20050080630 раскрывают смесь лактобацилл, к которым также относится Lactobacillus plantarum, по крайней мере, одна из фракций ее цитоплазмы или сам штамм способны ингибировать линии клеток рака желудка и толстой кишки.
Существует несколько противоречивых точек зрения на сыр как носитель пробиотиков. Внедрение лактобацилл, полученных от человека, в продукты питания, не основанные на молоке, и с длительным периодом созревания, может быть затруднительным (Gardiner, G, Ross, R. P, Collins, J. H, Fitzgerald, G, Stanton. C. Development of a probiotic cheddar cheese comprising human derived Lactobacillus paracasei strains, Appl. Environ. Microbiol, 1998, 64,. 6: 2192-2199; Madkor, S., A., Tong, P.S., El Soda, M. Ripening of Cheddar cheese with attenutaed adjunct cultures of Lactobacilli. J. Dairy Sci. 1999; 1684-1691). При этом, основа сыра, богатая жиром и белком, лучше, чем другие молочные продукты (кефир, йогурт), защищает пробиотические штаммы во время продвижения по желудочно-кишечному тракту. С помощью Lactobacillus fermentum ME-3 (DSM 14241) (патент Эстонии ЕЕ04580, патент РФ RU 2284354, патент США US 6190879) произведены противомикробные и антиоксидантные сыры. Патент США US 6190879 раскрывает микроорганизм рода Streptomyces для производства трансглютаминазы и способ включения путресцина в казеин при производстве сыра.
Европейский патент ЕР 1064857В1 (Snow Brand Milk Products Co Ltd., 2004) раскрывает способы производства веществ, включая путресцин с лактобациллами, бифидобактерии и пропионобактерии, из сыра Гауда ультрафильтрацией молока. Эти способы представляют собой либо полимеразные реакции для включения путресцина в состав казеина, либо наоборот очистку этих соединений, уже образованных в молоке, ультрафильтрацией; при этом упомянутые способы отличаются от данного, описанного в настоящем изобретении, при котором путресцин, образованный лактобактериями в молоке для производства сыра, через 30 дней после созревания все еще остается в сыре. Описаны различные нестартовые лактобактерии (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus curvatus), способные получать энергию для пролиферации из орнитина (орнитин высвобождается из аргинина казеина молока) после истощения запасов углеводов (Laht T.-M., Kask S., Elias P., Adamberg K., Paalme Т. Role of arginine in the development of secondary microflora in Swiss-type cheese. Int. Dairy Journal, 2002, 12: 831-840).
Таким образом, до сих пор не описано ни одного вида/штамма лактобактерий, культура которых в продуктах питания производит NO и, дополнительно, полиамины в физиологически значимых количествах, причем такие полиамины, которые могут обнаруживаться в моче после употребления этого штамма в составе продукта питания (сыр) или композиции, и которая способна регулировать посредством полиаминов апоптоз эпителия кишечника и увеличивать число лимфатических фолликуллов слизистой и моноцитов крови, регулируя состояние слизистой посредством NO и антиоксидантных соединений, и усиливать активацию иммунных клеток, в частности, активацию макрофагов через центральный интерлейкин.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к новому изолированному штамму микроорганизмов Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в качестве пробиотика, его функциональных свойств, продукта питания (например, сыра) и композиции, содержащих вышеуказанный микроорганизм, и применению вышеуказанного микроорганизма в производстве лекарственных средств, усиливающих клеточный иммунитет. L.plantarum Inducia DSM 21379 продуцирует полиамины из орнитина и глутамата, монооксид азота (NO) - из аргинина, обладает антиоксидантным действием, и с помощью продуцированных полиаминов, монооксида азота и антиоксидантных соединений улучшает барьерную функцию кишечника, увеличивает число иммунных клеток в крови и индуцирует синтез цитокинов для усиления естественной защиты организма.
-2
-7
Штамм Lactobacillus plantarum DSM 21379, который является предметом исследования, был изолирован из образца кала здорового ребенка в ходе сравнительного исследования микрофлоры эстонских и шведских детей. Штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 был изолирован путем посева растворов кала здоровых годовалых эстонских детей (10-10 в фосфатном буфере с 0,04% тиогликолевой кислотой; рН 7,2). Растворы посеяли на свежеприготовленную среду MRS-агара и культивировали при температуре 37°С в микроаэробных условиях. Штамм, являющийся предметом исследования, был изолирован в соответствии с морфологической характеристикой колоний и отнесен к Lactobacillus sp. Предварительная и более точная идентификация последовала, как описано далее.
Тот факт, что штамм микроорганизма происходит из кишечного тракта здорового ребенка, доказывает его GRAS-статус ("в целом признан безопасным"), т.е. то, что этот штамм микроорганизмов безопасен для организма человека и подходит для перорального приема.
Культурально-морфологические характеристики были выявлены после культивирования на MRS-агаре и в MRS-бульоне (OXOID). Клетки Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 являются грамм-положительными неспорообразующими палочками правильной формы, встречающимися по отдельности, парами или короткими цепочками.
Физиологические и биохимические характеристики
2
2
2
MRS-бульон являлся подходящим для культивирования штамма в течение 24-48 часов в микроаэробных условиях, после чего в бульоне наблюдался рост с равномерным помутнением. После выращивания в течение 48 часов при 37°С в микроаэробных условиях (атмосфера CO/O/N: 10/5/85) на чашках с MRS-агаром колонии диаметром 2-2,5 мм, округлой формы, куполообразные, белые, гладкие и цельные.
Оптимальной температурой для роста является 37°С; он также усиливается при 15°С и 45°С. Оптимальный рН среды для роста - 6,5.
Штамм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 является каталазо и оксидазо-отрицательным, факультативно гетеро-ферментативным, не образующим газа из глюкозы, не гидролизует аргинин.
Штамм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 был идентифицирован на основании биохимической активности с помощью набора API 50CHL System (bioMérieux, France) как Lactobacillus plantarum (совпадение с типовым штаммом: наивысшее, ID - 99.9%, Т индекс - 0,81) и молекулярной идентификации методом ITS-PCR (полимеразная цепная реакция внутренне транскрибируемого спейсера). Сравнение с референтным штаммом Lactobacillus plantarum ATCC 14917 подтвердило предварительную идентификацию с помощью API 50CHL.
Профиль утилизации углеводов Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, согласно API CHL 50, следующий. Положительная реакция на: рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, манит, сорбит, α-метил-D-маннозид, α-метил-D-глюкозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, трегалозу, мелезитозу, β-генциобиозу, D-туранозу, глюконат. Слабо реагирует с крахмалом.
Отрицательная реакция на L-арабинозу, глицерат D-рафинозы, эритрол, D-арабинозу, D-ксилозу, L-ксилозу, β-метилксилозид, L-сорбозу, рамнозу, дульцит, инозит, инулин, гликоген, ксилит, D-ликсозу, D-тагатозу, D-фукозу, L-фукозу, D-арабит, L-арабит, 2-кетоглюконат, 5-кетоглюконат.
Согласно набору тестов API ZYM (bioMérieux, Франция) Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 обладает лейцин ариламидазной, валин ариламидазной, кисло-фосфатазной, нафтол-AS-BI-фосфогидролазной, α-глюкозидазной, β-глюкозидазной активностью, и ацетоиновой активностью. Обнаружена слабая реакция на валин ариламидазу, нафтол-AS-BI-фосфогидролазу, β-галактозидазу, цистин ариламидазу, эстеразу (С4), эстеразу (С8), N-ацетил-β-глюкозаминидазу.
Молекулярная идентификация Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21379 была подтверждена полимеразной цепной реакцией внутренне транскрибируемого спейсера (ITS-PCR). Характер исчерченности изолятов был визуально сопоставлен с характером исчерченности референтного штамма Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (Фиг.1).
Способ. Идентификация штамма была подтверждена (ITS-PCR) полимеразной цепной реакцией внутренне-транскрибируемого спейсера в сравнении с референтным штаммом Lactobacillus plantarum ATCC 14917.
Экстракция ДНК из изолятов Lactobacillus была проведена с помощью растворов лизоцима (Serva, Швеция; 20 мг/мл), мутанолизина (Sigma; 0.5 мг/мл) и протеиназы K (Fermentas, Литва; 14,6 мг/мл).
2
Амплификацию ДНК проводили в реакционном объеме 50 мкл, содержащем 1×Taq полимеразного буфера (Fermentas, Литва), 1,5U Taq полимеразы (Fermentas), 0,5 мкМ каждого праймера (16S-1500F и 23S-32R; DNA Technology AS), 200 мкМ дезоксинуклеозида трифосфата (Amersham Pharmacia Biotech, Германия), 2 мМ MgCl и 2 мкл экстрагированной ДНК. Далее продукт PCR подвергли рестрикции при помощи Taq I рестрикционного фермента (Fermentas Литва). Фрагменты ДНК разделили электрофорезом (1,5 часа, 100 Вольт) в 2% агарозном геле в 1×TBE [трис(гидроксиметил)аминометан-борат/динатрия этилендиамин тетраацетат] буфере. Характер исчерченностей визуализировали и визуально сравнили с референтным штаммом L.plantarum ATCC 14917.
Lactobacillus plantarum Inducia зарегистрирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH 16.04.2008 под регистрационным номером DSM 21379.
Профиль импульсного гель-электрофореза (PFGE)
600
Способ. Для проведения импульсного гель-электрофореза (PFGE) штаммы лактобактерий выращивали в MRS-бульоне при 37°С в течение 24 часов. Клетки отмыли в SE-буфере (75 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, рН=7,4), оптическую плотность суспензии клеток довели до 1,5 (OD). Экстракцию ДНК проводили в ЕС-буфере (50 мМ EDTA (рН 8,5), 0,5% лаурилсаркозин-натрия, 0,2% дезоксихолата-натрия, 2 мг/мл лизоцима, 10U мутанолизина), за которым следовал буфер, содержащий раствор протеиназы K 1 мг/мл (100 мМ EDTA-1% саркозил-0,2% дезоксихолат, рН 8,0). Лизированные образцы отмыли в ТЕ-буфере и разрезали до 2 мм, которые экстрагировали в течение ночи с ферментом 50U Not I (Bio-Rad). Электрофорез проводили на CHEF-DR II (Bio-Rad) в течение 22 часов при 14°С. Характер исчерченности наблюдали в УФ-излучателе (Фиг.2).
Устойчивость к антибиотикам
Способ. Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 испытывали с помощью полосок с антибиотиком из E-test (AB Biodisk, Solna). MIC (минимальная ингибирующая концентрация) определяли в соответствии с предложенными Европейской Комиссией (EUC) эпидемиологическими порогами.
Таблица 1
Антибиотикорезистентность Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
Антибиотик
МИК* (мкг/мл)
МИК* (мкг/мл)
Антибиотикорезистентность, пороговые концентрации EUC MIC* (мкг/мл)
L.plantarum Inducia DSM 21379
Контрольный штамм L.plantarum DSM 21380
Ампициллин
0.19
0.25
4
Гентамицин
1
1.5
64
Стрептомицин
6
16
64
Эритромицин
0.25
0.19
4
Клиндамицин
0.016
0.032
2
Тетрациклин
6
8
32
Хлорамфеникол
2
2
8
Ципрофлоксацин
32
32
4
* минимальная ингибирующая концентрация
Исследование антибиотикочувствительности in vitro показало, что Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 не устойчива против большинства наиболее важных антимикробных препаратов. Обнаружена слегка повышенная MIC для ципрофлоксацина, обнаруженная в пределах диапазона у диких штаммов, описанных ранее (Vankerckhoven V, Huys G, Vancanneyt M, Vael С, Klare I, Romond M-B,. Entenza J M, Moreillon P, D. Wind R, Knol J, Wiertz E, Pot В., Vaughan E. E, Kahlmeter G, Goossens H. Biosafety assessment of probiotics used for human consumption: recommendations from the EU-PROSAFE project. Trends in Food Science & Technology 2008; 19:102e114). Следовательно, нельзя предсказать горизонтальную передачу генов антибиотикочувствительности Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 при применении штамма в качестве пробиотика.
Противомикробная активность
Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 in vitro на среде MRS-агара проявили антагонистическую активность против нескольких кишечных патогенов (Таблица 2).
Таблица 2
Противомикробная активность Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в отношении патогенов и нестартерных лактобацилл на среде модифицированного MRS-агара (зона ингибирования роста патогена, мм)
Патоген
Зона ингибирования роста, мм
Нестартерные лактобактерии (НСЛАБ)
2,67±3,4
Listeria monocytogenes
22,7±2,4
Yersinia enterocolitica
11,2±2,7
Salmonella enteritidis
22,1±1,9
S.typhimurium
20,8±2,8
Shigella sonnei
24,0±0,1
Escherichia coli
23,0±1,4
Enterobacter sakazakii
18,1±1,8
Campylobacter jejuni
12,0±7,6
Самой высокой противомикробной активностью in vitro при посеве на плотную питательную среду (противомикробный эффект метаболитов) Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 обладает в отношении Е.coli, затем следует ингибирование роста Salmonella sp., Shigella и Listeria. Самая низкая противомикробная активность определена в отношении прочих лактобактерий (НСЛАБ).
Функциональные свойства
Профиль метаболитов
2
9
Способ. Профиль метаболитов Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 определяли методом газовой хроматографии (Hewlett-Packard 6890) после инкубирования в микроаэробной среде в течение 24 часов и 48 часов (Таблица 2). Штамм L.plantarum выращивали на MRS-агаре в течение 48 часов микроаэробно (10% СО). Суспензию (стандарт мутности 10 КОЭ/мл McFarland 4.0) культуры лактобактерий приготовили в растворе 0,9% NaCl. 1,0 мл этой суспензии перенесли на 9 мл МРС бульона. Концентрацию метаболита определяли с помощью капиллярной колонки HP-INNOWax (15 м × 0,25 мм; 0,15 мкм). Температурная программа колонки была 60°С 1 мин, 20°С/мин 120°С 10 мин; детектор (FID) 350°С.
2
2
Электрохимические замеры НО проводили на интактных клетках возрастом 24 часа в 500 мкл MRS бульона с помощью анализатора свободных радикалов Apollo 4000 (WPI, Берлин, Германия) и электродов типа ISO-HPO2 и ISO-NOP.
2
2
Сигналы электрода ISO-HPO2 регистрировали в течение 5-7 минут. Вычисляли среднюю интенсивность сигнала. Каждое экспериментальное значение измерили в 4 независимых параллелях, и каждую параллель замеряли дважды. Концентрацию HO рассчитали по методу стандартных калибровочных кривых по интенсивности сигнала электродов.
Таблица 3
Концентрация уксусной кислоты, молочной кислоты и янтарной кислоты (мкМ/л), выработанных Lactobacillus plantarum DSM 21379 Inducia в MRS бульоне при микроаэробном культивировании в течение 24 и 48 часов и концентрации H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (мкг/мл) интактных клеток
Уксусная кислота
Молочная кислота
Янтарная кислота
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (мкг/мл)
24 ч
48 ч
24 ч
48 ч
24 ч
48 ч
Интактные клетки 24 ч
L.plantarum Inducia DSM 21379
2,1
2,4
133,3
186,6
0,6
0,6
288,9±175,8
Контрольный штамм L.plantarum DSM 21380
1,4
1,7
112,2
129,2
0,6
0,6
196,4±128,8
2
2
В сравнении с контролем, Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 производит значительные количества уксусной кислоты, молочной кислоты и HO, которые необходимы для трофики слизистой толстой кишки.
Общая антиоксидантная активность Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
600
9
-1
Способ. Для определения ТАА и TAS клеток микроорганизма штамм L.plantarum Tensia инкубировали в MRS бульоне (Oxoid, Великобритания) в течение 24 часов при 37°С. Клетки микроорганизма собрали центрифугированием (1500 оборотов в минуту, в течение 10 минут) при 4°С, осадок промыли изотоническим раствором (4°С) и суспендировали в 1,15% KCl (Sigma, США). Плотность суспензии OD составила 1,1×10 бактериальных клеток мл). Общую антиоксидантную активность (ТАА) оценивали, используя тест линоленовой кислоты (LA-тест) (Kullisaar, Т, Songisepp, Mikelsaar M, Zilmer, K, Vihalemm, Т, Zilmer, M. British J of Nutrition. Antioxidant probiotic fermented milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human. 2003, 90, 1, 449-456), и общий антиоксидантный статус измерили промышленным набором (TAS, Randox Laboratories Ltd., Великобритания).
Таблица 4.
Общая антиоксидантная активность (ОАА) и общий антиоксидантный статус (ОАС) Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
Штамм
ТАА (%)
TAS (мкМ/л)
L.plantarum Inducia DSM 21379
26±1,2
0,13±0,04
L.plantarum DSM 21380
22±5
0,05±0,02
Выработка монооксида азота (NO)
Способ. Измерения выработки монооксида азота проводили на интактных клетках возрастом 24 часа в 500 мкл MRS бульона с помощью анализатора свободных радикалов Apollo 4000 (WPI, Берлин, Германия) и электродов типа ISO-NOP. Сигналы электрода регистрировали в течение 5-7 минут. Вычисляли среднюю интенсивность сигнала. Каждое экспериментальное значение измерили в 4 независимых параллелях, и каждую параллель измеряли дважды. Концентрацию NO рассчитали методом стандартных калибровочных кривых по интенсивности сигнала электродов.
Таблица 5
Концентрация NO (мкМ) produced by Lactobacillus plantarum DSM 21379
Номер штамма
Концентрации NO (мкМ)
L.plantarum DSM 21379
2,7±1,2
L.plantarum DSM 21380
2,6±0,8
L.coprophilus
2,1±1,1
L.plantarum
2,1±0,9
L.paracasei ssp paracasei штамм №1
1,3±0,8
L.paracasei ssp paracasei штамм №2
1,8±0,9
L.paracasei ssp paracasei штамм №3
2,8±1,6
L.buchneri
2,0±1,1
Выработка полиаминов Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 in vitro
9
Способ. Штаммы микроорганизма суспендировали в физиологическом растворе согласно стандарту мутности McFarlandi (10 КОЕ/мл) и по 0,5 мл суспензии каждого штамма посеяли на среду декарбоксилирования (поп 4,5 мл) и инкубировали при 37°С в течение 4 дней (Bover-Cid and Holzapfel W.H. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int J food Microbiol 1999; 53, (1); 33-41(9)).
Для обнаружения ВА 200 мкл среды подвергли деривации для GC анализа модифицированным способом Наковича (Nakovich, L. Analysis of biogenic amines by GC/FID and GC/MS. Thesis, Virginia polytechnic institute, USA. 2003).
GC анализ проводили на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System с капиллярной колонкой HP-5 19091J-413 (30 м × 0,32 мм; 0, 25 мкм) при 160°С 1 мин, 20°С/мин 280°С 15 мин; и детектором (FID) 300°C.
Таблица 6
Выработка полиаминов in vitro в среде декарбоксилирования (Arena, M.E. and Manca de Nadra, М.С.Biogenic amine production by Lactobacillus. J Appl Microbiol, 2001; 90; 158-162)
Образец
Полиамины (мкг/мл) и биогенные амины
Аргинин
Глутамин
Лизин
Орнитин
Гистидин
Путресцин
Кадаверин
Путресцин
Кадаверин
Путресцин
Кадаверин
Путресцин
Кадаверин
Кадаверин
L.plantarum Inducia DSM 21379
0
0,4
1,2
0,5
0
0,4
1,9
0
0
L.plantarum DSM 21379
0
0
0
0
0
0,3
0,5
0,6
0
Штамм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 способен производить кадаверин из аргинина и путресцин как из глутамина, так и из орнитина. Однако контрольный штамм был способен продуцировать путресцин в малых количествах только из орнитина (Фиг.3). Следы кадаверина обнаружили как в контрольном штамме, так и у Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379. Выработка гистамина не обнаружена (Таблица 6).
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Молекулярная идентификация штамма посредством ITS-PCR
1. L.plantarum Inducia DSM 21379.
2. L.plantarum DSM 21380
3. L.plantarum CRL 972 (ATCC 14917)
М- 100 bp маркер (Fermentas).
Фиг.2. Молекулярные «отпечатки пальцев» L.plantarum Inducia DSM 21379 в сравнении с контрольным штаммом L.plantarum (профиль гель-электрофореза в пульсирующем поле, PFGE).
1. Маркер PFG Lambda Ladder (New England Bio Labs Inc.)
2. L.plantarum DSM 21380 (контроль)
3. L.plantarum DSM 21379.
Фиг.3. Выработка полиаминов посредством L.plantarum DSM 21379 in vitro на среде декарбоксилирования (Arena, M.E. and Manca de Nadra, M.C. Biogenic amine production by Lactobacillus. J Appl Microbiol, 2001; 90; 158-162) (а) из орнитина (b) из глутамина.
Фиг.4. Выработка полиаминов Lactobacillus plantarum DSM 21379 в сыре (обнаружена согласно способу Nakovich, L. Analysis of biogenic amines by GC/FID and GC/MS. Thesis, Virginia Polytechnic Institute, USA. 2003).
Фиг.5a, 5b, 5с. Виды лактобактерий в группе L. plantarum Inducia DSM 21379 методом кластерного UPMAG анализа Пирсона.
Субъекты №3, 6, 9, 11, 14, 15, 19, 20, 22, 23, 24 и 25.
Четыре образца: при наборе (1), после потребления пробиотического сыра (2), после периода «вымывания» (3) и после потребления контрольного сыра (4).
Фиг.6. IL-6 и моноциты крови
2
2
Положительная корреляция между IL-6 и моноцитами крови в последнем (IV) образце - r=0,653, р=0,029, n=11. Модель линейной регрессии подтвердила корреляцию (R=0,405, Radj=0,338,=0,035).
Осуществление изобретения
Пример 1. Достижение необходимого (оптимального) числа жизнеспособных Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в продуктах питания
Опыт с эстонским сыром
8
Способ. Микроорганизм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 добавили к молоку для сыроделия молочного кооператива E-Piim (доза посева 3×10 КОЕ/емкость) и молоко подвергли сычужному свертыванию (25 мин). Сычужную закваску разрезали (25 мин), нагрели (34°С 15 мин), обсушили (25 мин), спрессовали, обезводили (1 час), засолили в рассоле (12°С; 20% NaCl; pH 4,7) на 20 часов, обезводили и обсушили (8 часов), упаковали в полиэтилен и выдерживали при 12°С по меньшей мере 4 недели.
Таблица 7
Развитие микрофлоры в сыре, содержащем Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379.
Образец
Сыр, содержащий L. plantarum Inducia DSM 21379
Контрольный сыр
День 14
День 21
День 30
День 14
День 21
День 30
Общее количество
8×10<sup>8</sup>
4×10<sup>8</sup>
10<sup>10</sup>
2×10<sup>8</sup>
3×10<sup>8</sup>
2×10<sup>8</sup>
Lactobacillus sp
5×10<sup>8</sup>
2×10<sup>8</sup>
10<sup>10</sup>
10<sup>5</sup>
-
3×10<sup>3</sup>
L.plantarum
5×10<sup>8</sup>
2×10<sup>8</sup>
10<sup>10</sup>
-
-
3×10<sup>3</sup>
Кокки
3×10<sup>8</sup>
2×10<sup>8</sup>
10<sup>9</sup>
2×10<sup>8</sup>
3×10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
Спорообразующие микроорганизмы
-
-
10<sup>3</sup>
-
10<sup>7</sup>
10<sup>8</sup>
L.casei
-
-
-
10<sup>5</sup>
.
-
Пример 2. Выработка Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 полиаминов в продуктах питания
Способ. Образцы сыра экстрагировали (к 10 г сыра прибавили 20 мл 50% раствора метанола и инкубировали при 45°С в течение 1 часа, охладили до 30°С и центрифугировали) и 200 мкл верхнего слоя подвергли деривации для GC анализа модифицированным способом Наковича (Nakovich, L. 2003 Analysis of biogenic amines by GC/FID and GC/MS) на отделении микробиологии Университета Тарту.
GC анализ проводили на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System, с капиллярной колонкой HP-5 19091J-413 (30 м × 0,32 мм; 0,25 мкм). Температурная программа колонки 160°С 1 мин, 20°С/мин 280°С 15 мин; и детектор (FID) 350°C (Фиг.4).
Выработку путресцина и тирамина отнесли к следующему: в различных партиях в сравнении с сыром-контролем содержание путресцина увеличивалось в 3-11 раз, и содержание тирамина, соответственно, в 2-5 раз.
Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 принадлежит к факультативно гетероферментативной группе лактобактерий и, следовательно, содержание тирамина в сырах было значительно ниже, чем в штаммах группы OHEL. С другой стороны, содержание путресцина было выше.
Таблица 8
Биогенные амины и полиамины в Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в сравнении с контрольными сырами из промышленных контрольных испытаний
Образец
Количество жизнеспособных микроорганизмов штамма, включенных в сыр (КОЕ/г), на день 3-4 после изготовления.
Амины (мг/кг)
Количество жизнеспособных микроорганизмов L.Plantarum Tensia DSM 21379 в выдержанном сыре
Тирамин
Путресцин
Кадаверин
L.plantarum Inducia DSM 213 79,1. Партия
3×10<sup>8</sup>
4,83
20,28
0
2×10<sup>7</sup>
Control cheese1. Партия
-
2,31
1,82
0
-
L.plantarum Inducia DSM 21379,2. Партия
3,3×10<sup>7</sup>
13,57
24,67
0
2×10<sup>6</sup>
Control cheese2. Партия
-
2.63
6.64
0
-
Допустимая концентрация тирамина в пище, например в сыре, составляет 200 мг/кг (Karovicova and Kohajdova. Biogenic amines in food. Chem pap.2005; 59 (1); 70-79; Larqué, M., Sabater-Molina, S.Zamora E.Biological significance of dietary polyamines. Nutrition 2007; 23(1): 87-95). Тирамин считают токсичным в концентрации 1000-8000 мг/кг.
Путресцин считают токсичным при обнаружении в организме в концентрациях 2000 мг/кг массы тела и общая токсичность полиаминов составляет >300 мг/кг в продукте питания (Larqué, M., Sabater-Molina, S.Zamora E.Biological significance of dietary polyamines. Nutrition 2007; 23(1): 87-95).
Употребив 100 г сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, субъект получает примерно 3 мг путресцина. Таким образом, в случае человека весом 70 кг, концентрация доходит до 50 мкг/кг, которые не проявляют токсического действия.
Пример 3. Усиление защитной способности слизистой кишечника пищей, содержащей Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
8
В экспериментальной модели с NIH мышами 3 группы мышей питались различными сырами в течение 30 дней (контрольный сыр без добавок, сыр, содержащий Lactobacillus plantarum штамм Inducia DSM 21379 2×10KOE/г).
Сыр давали мышам ночью (обычное время бодрствования для мышей), 4,4 г/на мышь, ежедневно, и без ограничения ad libitum обычный коммерческий корм. Съеденное количество сыра составило 3,5-4,2 г/за ночь.
Мыши оставались в хорошем состоянии, не было обнаружено изменений в мехе и пищеварении. Употребление сыра вызвало увеличение веса тела: вес тела в начале исследования составлял 22,9-29,8 г, и в конце исследования прибавка в весе составила 2-6,1 г. Мышей умерщвили переломом шейных позвонков в день 30. При вскрытии транслокации лактобактерии или другой микрофлоры в кровь или органы не обнаружено.
Таблица 9
Общее количество лактобактерий в кале, подвздошной кишке и толстой кишке
Образец
Контрольная группа (употребляли сыр без L.plantarum Inducia DSM 21379)
Испытуемая группа (употребляли сыр, содержащий L.plantarum Inducia DSM 21379)
Образцы кала
День 0
6,7
7,6
День 10
8,0
8,3
День 15
7,0
8,0
Подвздошная кишка
3,0-7,1/5,95*
6,3-7,7/6,95*
Толстая кишка
4,4-7,3/6,65*
6,9-7,8/7,45*
* t-критерий Стъюдента p=0,001
С посевом из подвздошной кишки и толстой кишки мышей, употреблявших Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, общее количество лактобактерий оказалось значительно повышенным как в подвздошной кишке, так и в толстой кишке.
Образцы ткани печени, селезенки, подвздошной кишки и толстой кишки зафиксировали в формалине и заключили в парафин. Срезанные микротомом образцы ткани окрасили гематоксилин-эозином.
В органах (печень и селезенка) не было обнаружено морфологических изменений, что доказывает безопасность Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379.
В подвздошной кишке оценивали количество и состояние слизистой кишечника, количество бокаловидных клеток и клеток Панета и образование фолликулов и множественные диффузные скопления лимфоцитов.
В толстой кишке особое внимание уделили многочисленным бокаловидным клеткам, содержащим поверхностный эпителий, и свойствам лимфатической ткани в соединительной ткани слизистой.
Таблица 10
Патолого-морфологическая оценка органов мышей после употребления сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
Группа мышей
Печень
Селезенка
Подвздошная кишка
Толстая кишка
L.plantarum Inducia DSM 21379-содержащий сыр, употребленный мышами
Гиперемия 6/10*
ii
Лимфатические фолликулы 6/10*
Лимфатические фолликулы 8/10*
Control cheese consumed animals
Гиперемия 3/10*
Гиперемия 1/10
Лимфатические фолликулы 3/10*
Лимфатические фолликулы 4/10*
* p<0,05
Употребление сыра, содержавшего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, в течение 1 месяца усилило гиперемию печени и значительно индуцировало лимфатические фолликулы (иммуноциты) подвздошной кишки и толстой кишки мышей в сравнении с контрольными мышами. Эти результаты относят к усилению защитной способности слизистой кишечника и функций печени.
Пример 4. Исследование клинических показателей крови здоровых добровольцев, употреблявших пищу, содержащую Lactobacillus plantarum DSM 21379, и увеличения процентного содержания Lactobacillus plantarum в кишечной микрофлоре
Клиническое исследование на здоровых добровольцах оценивало влияние употребления продуктов, содержащих путресцин, NO и антиоксидантные соединения, вырабатываемые Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 (эстонский сыр) на 1) безопасность для потребителя; 2) показатели гуморального и клеточного иммунитета крови; 3) действие на кишечную микрофлору; 4) и метаболиты в моче, для обнаружения возможных улучшающих здоровье воздействий.
Группы исследования состояли из здоровых добровольцев как мужчин, так и женщин (М/Ж 4/8) в возрасте 20-48 лет. В качестве критериев для исключения выбрали диабет, глюкозу и гликогемоглобин HbA1c в сыворотке крови. Исследование было осуществлено рандомизированным, «двойным-слепым», перекрестным изучением. Исследование началось с 3-недельного употребления исследуемого сыра. Добровольцы употребляли исследуемый сыр в течение 3 недель. После 2-недельного периода вымывания добровольцев на следующие 3 недели перевели на употребление контрольного сыра.
7
Содержание Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в 30 перезревших испытуемых сырах составило 6×10 КОЕ/г.
Перед употреблением испытуемый сыр инкубировали с Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в течение 30 дней при 12°С. Контролем служил обычный эстонский сыр типа Эдам, не содержащий Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379.
Исследование было рандомизированным, «слепым», перекрестным, плацебо-контролируемым. Исследование началось с 3-недельного употребления исследуемого сыра с последующим 2-недельным периодом вымывания, после которого контрольный сыр употребляли в течении 3 недель. Доза 50 г/день.
Результаты
1) Безопасность
Участники исследования не сообщали о дискомфорте, боли в животе или о других негативных симптомах. После исследования сыра на добровольцах показатели системных маркеров воспаления (U-CRP, высокочувствительный CRP и лейкоциты) не изменились и были в пределах нормальных значений.
Употребление сыра с пробиотиком Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 не вызвало изменений в количестве белых кровяных телец (лейкоцитарной формуле) (Таблица 11). Также не обнаружено изменений в показателях основного маркера аллергии IgE в сравнении с периодом до исследования.
Употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 как не оказало отрицательного воздействия на функции почек и печени организма, так и не затронуло соответствующие показатели (ASAT, ALAT альбумин, креатинин сыворотки крови).
Таким образом, употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum DSM 21379, здоровыми добровольцами не вызывает системного воспаления, аллергической сенсибилизации и не наносит вреда жизненно важным органам.
2) Кишечная микрофлора
Способ. Микробную ДНК выделили из сыра с помощью QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) и амплифицировали с помощью праймеров Uni-515-GC-rev (ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-GC), Lab-159-f (GGAAACAGA/GTGCTAATACCG) (Heilig HG, Zoetendal EG, Vaughan ЕЕ, Marteau P, Akkermans, ADL, de Vos WM, /et al./ Molecular diversity of /Lactobacillus/ ssp. and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. /Appl Envir Microbiol /2002; 68: 114-123). Затем продукт PCR разделили DGGE электрофорезом в геле, содержащем 30-60% акриламида, с помощью техники Dcode™ System (Bio-Rad, Hercules, Калифорния). Гели проанализировали на программном обеспечении BioNumerics 2.5 (Applied Maths, Бельгия) согласно корреляции Пирсона (Fromin, N.; Hamelin, J.; Tarnawski, S.; Roesti, D.; Jourdain-Miserez, K.; Forestier, N.; Teyssier-Cuvelle, S.; Gillet, F.; Aragno, M.; Rossi, P. Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGE) fingerprinting patterns Environmental Microbiology 2002; 4 (11), 634-643) (Fig.5a, 5b, 5c).
Результаты
У 5 человек из 12 употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, изменило структуру распределения лактобактерий в кале. У 3 человек из 5 эти изменения остались неизменными даже через 2 недели после завершения исследования.
Таким образом, употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, воздействует на состав лактофлоры кишечника человека.
3) Гуморальные и клеточные параметры сыворотки крови
2
2
Выяснилось, что сыр, содержащий Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, стимулирует накопление цитокина IL-6 в добровольцах, что указывает на стимуляцию клеточного иммунитета. Это открытие было подтверждено повышением моноцитов крови в конце исследования (р=0,015), тогда как показатели клеток крови были в пределах нормальных значений. После завершения употребления сыра появилась положительная корреляция между IL-6 и моноцитами крови (r=0,653, р=0,029, n=11). Линейная регрессионная модель подтвердила корреляцию (R=0,405, R корр = 0,338, = 0,035) (Фиг.6).
Улучшение показателей клеточного иммунитета согласуется с результатами на модели животных, описанными выше, где употребление Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 существенно стимулировало Пейеровы бляшки, то есть лимфатические фолликулы кишечника. В этих фолликулах происходит взаимодействие компонентов иммунной системы. Провоспалительные цитокины, включающие индукцию IL-6, играют важную роль в активации лимфоцитов типа ТН1 против бактерий, через которые макрофаги, то есть моноциты крови, активируются по принципу обратной связи. Вследствие этого моноциты крови также вырабатывают IL-6.
Увеличение доли клеточного иммунитета объясняется также подавлением гуморального ответа, например некоторым снижением выработки антител (IgA, IgG), которые, тем не менее, остаются в пределах нормальных значений.
Таблица 11
Иммунологические показатели крови после употребления сыра, содержащего пробиотик Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
Показатель иммунитета
При наборе
Конец исследования
Значения P
Нормальные значение и единицы and units
Высокочувствительный CRP
1,9±1,6
3,3±2,7
1,0
<5 мг/л
Количество лейкоцитов ×10<sup>9</sup>
6,3±1,7
6,9±1,6
0,116
4-10×10<sup>9</sup>/л
Лимфоциты
2,3±0,5
2,2±0,4
0,878
0,8-2,9×10<sup>9</sup>/л
Моноциты
0,55±0,17
0,64±0,15
0,032
0,15-0,75×10<sup>9</sup>/л
Цитокин IL-6
2,7±1,0
3,8±1,7
0,020
<3,4 нг/л
Антитела IgA
2,5±0,9
2,3±0,8
0,009
0,7-4,0 г/л
Антитела IgM
1,3±0,5
1,3±0,5
0,776
0,4-2,3 г/л
Антитела IgG
12,9±3,2
12,4±3,0
0,017
7,0-16 г/л
Антитела IgE
19,6±21,2
21,4±25,9
0,232
<85 kU/L
4) Метаболиты в моче
Для оценки содержания биогенных аминов до употребления пробиотика и эффективности периода стабилизации использовали утреннюю мочу и метод газовой хроматографии.
Способ: образцы мочи подвергли деривации с пропилхлороформатом для GC анализа модифицированным методом Угланда (Ugland HG; Krough M, Rasmussen KE: Aqueous alkylchloroformate derivatization and solid-phase microextraction: determination of amphetamines in urine by capillary gas chromatography. J Chromatography В Biomed Sci Appl 1997; 701: 29-38).
GC анализ проводили на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System (Hewlett Packard, Avondale, PA, США) с капиллярной колонкой HP-5 19091J-433 (30 м × 0,25 мм; 0,25 мкм). Температурная программа колонки 150°С 1 мин, 20°С/мин 280°С в течение 5 мин; и детектор (FID) 250°C. Концентрация биогенных аминов рассчитывалась по нмоль/моль креатинина.
Таблица 12
Содержание полиаминов и биогенных аминов в утренней моче (нмоль/моль креатинина) потребителей пробиотического сыра
Пробиотический сыр, содержащий L.plantarum Inducia
Контрольный сыр (без Lactobacillus plantarum
Значения Р, двусторонний
BL1срдн. ± ст.откл. диапазон (медиана)
PROсрдн. ± ст.откл. диапазон (среднее)
BL2срдн. ± ст.откл. диапазон (среднее)
PLсрдн.± ст.откл. диапазон (среднее)
критерии СтьюдентаBL1 vs PRO / BL2 vs PL
Put
0,064±0,072
0,082±0,058
0,043±0,044
0,044±0,060
0,432/0,432
0-0,191 (0,077)
0-0,126
0-0,216
0-0,191
(0,033)
(0,031)
(0,030)
acPut
0,606±0,559
1,087±1,451
0,796±0,689
0,635±0,291
0,021/0,850
0,307-5,049
0,068-2,167
0,154-1,219
0,151-2,104 (0,435)
(0,447)
(0,600)
(0,594)
DAP
0,079±0,092
0,059±0,089
0,056±0,089
0,117±0,142
0,411/0,195
0-0,216 (0)
0-0,253 (0)
0-0,418
0-0,249
(0,055)
(0,055)
acSpd
0,251±0,227
0,384±0,198
0,354±0,210
0,425±0,260
0,089/0,464
0,043-0,686
0,085-0,668
0,065-0,831
0-0,813
(0,384)
(0,304)
(0,396)
(0,232)
Cad
0,066±0,123
0,069±0,162
0,067±0,093
0,044±0,085
1,0/0,540
0-0,569 (0)
0-0,293
0-0,228 (0)
His
0,231±0,226
0,387±0,524
0,211±0,364
0,478±0,684
0,910/0,250
0-1,401 (0,122)
0-1,229 (0)
0-2,093
Tyr
0,153±0,161
0,101±0,132
0,093±0,096
0,212±0,285
0,167/0,149]
0-0,427 (0,050)
0-0,257
0-1,035
Put - петресцин, acPut - N-ацетилпутресцин,DAP - 1,3-диаминопропан, acSpd - N-8-ацетилспермидин, Cad - кадаверин; His - гистамин Tyr - тирамин.
Содержание полиаминов (путресцин, ацетилпутресцин и ацетилспермидин) в моче увеличилось после употребления пробиотического сыра, содержащего L.plantarum Inducia DSM 21379. Выявлена значительная корреляция (R=0,383, p<0,01, n=48) между содержанием ацетилпутресцина и ацетилспремидина в моче добровольцев.
В то же время содержание в моче всех полиаминов, включая, путресцин, ацетилспермидин и ацетилспермин, так же как и биогенных аминов, осталось в пределах нормальных значений.
Штамм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 способен вырабатывать путресцин in vitro так же, как и в сыре. Употребление пробиотического сыра с Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 повысило содержание ацетилпутресцина в моче участников исследования.
Ацетилпутресуин представляет собой обезвреженное соединение, повышенное содержание которого свидетельствует о выработке путресцина Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в желудочно-кишечном тракте добровольцев, либо о всасывании и метаболизме дополнительных количеств путресцина, поглощенного с сыром. С другой стороны, это указывает на успешную адаптационную реакцию организма на контакт с излишними количествами путресцина путем экскреции его с мочой в ацетилированной форме.
2
2
Иммуностимулирующее действие путресцина, выработанного Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, подтверждено корреляцией между цитокином крови IL-6 и числом макрофагов (моноцитов), что в данном случае может считаться активацией макрофагов. Это открытие, упомянутое совместно с HO, необходимо для защиты организма против чужеродных клеток (микроорганизмы, клетки рака).
Физиологические дозы путресцина, попадающие в пищеварительный тракт из-за Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, могли бы, теоретически, усилить регенерацию эпителия слизистой кишечника и апоптоз старых клеток, таким образом избегая гиперпролиферации эпителия. Эти механизмы обеспечивают барьерную функцию слизистой кишечника и защищают от проникновения аллергенов.
Употребление сыра с Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 через IL-6 регулирует количество и активность моноцитов крови, и обнаружение которого вместе с лимфатическими фолликулами (стимулирование носителей клеточного иммунитета), продемонстрированное на экспериментальных животных, улучшает барьерную функцию слизистой кишечника и поддерживает защитную иммунную функцию организма.
Пример 5. Исследование клинических показателей крови добровольцев, употребляющих йогурт, Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379
Задачей клинического исследования (рандомизированное, перекрестное, плацебо-контролируемое, двойное-слепое клиническое исследование, международный регистрационный номер ISRCTN68198472) было оценить безопасность и действие йогурта, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, на кишечную микрофлору здоровых добровольцев.
Субъекты и методы
6
7
8
9
Участниками были 27 здоровых добровольцев обоего пола (М/Ж 10/17, 29,2±9,3 года). Для исключения скрытого диабета в сыворотке крове измерили глюкозу и гликогемоглобин (HbAlc). Исследуемый йогурт содержал штамм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 (5×10-10 клеток микроорганизма/мл). Контролем служил йогурт без добавки пробиотика. Исследование началось с 3-недельного употребления исследуемого йогурта с последующим 2-недельным периодом вымывания, после чего участники употребляли контрольный йогурт в течение 3 недель. Суточная доза составила 10-5×10клеток микроорганизма.
Показатели гуморального и клеточного иммунитета сыворотки
Обнаружено, что йогурт, содержащий Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, индуцировал хемотаксический белок (МХБ, р=0,016) в сыворотке добровольцев, влияющий на стимулирование гуморальной составляющей иммунной системы. Это открытие имеет положительную корреляцию с повышением IL-10 (r=0,583; р=0,009).
Рост показателей гуморального иммунитета согласовался с результатами, полученными за трехнедельное употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum DSM 21379 Inducia, как описано выше.
Таблица 13
Содержание (пг/мл) цитокинов в сыворотке крови добровольцев во время исследования
Пробиотический йогурт
Контрольный йогурт
Значения РBL1 vs PRO / BL2 vs PL
BL1
PRO
BL2
PL
INFγ
2,9±4,3
3,8±4,2
3,7±3,6
1,9±1,8
0,084/0,107
TNFα
4,6±3,2
5,0±2,6
4,0±1,4
3,8±1,2
0,225/0,376
VEGF
158,8±15,8
157±120,4
152,2±106,8
163,0±157,7
0,465/0,841
МСР
218,4±98,1
251,3±145,1
256,2±142,2
230,8±116,7
0,016/0,156
EOF
54,8±57,6
53,4±38,4
53,2±56,5
52,0±45,1
0,679/0,353
VEGF - фактор роста эндотелия сосудов
МСР - моноцитный хемотаксический белок
EGF - эпидермальный фактор роста
Таким образом, употребление йогурта, содержащего Inducia, активировало моноцитный хемотаксический белок, что показывает повышенную иммунную активность.
После употребления йогурта, содержащего Lactobacillus plantarum Inducia, содержание ацетилированного путресцина в утренней моче пациентов увеличилось.
Содержание ацетилированного путресцина коррелировало (r=0,439, р=0,037) с ростом количества спермидина в утренней моче пациентов.
Эти результаты согласуются с результатами клинического исследования пробиотического сыра. В то же время концентрации обоих полиаминов, вклающих путресцин и ацетилированный путресцин, так же, как и биогенных аминов, в утренней моче остались в пределах нормальных значений.
Таблица 14
Содержание полиаминов и биогенных аминов в утренней моче субъектов, употребляющих пробиотический йогурт (нмоль/моль креатинина)
Пробиотический йогурт
Контрольный йогурт
Значения РBLI vs PRO / BL2 vs PL
BL1
PRO
BL2
PL
Put
0,084±0,170
0,032±0,060
0,033±0,039
0,029±0,036
0,069/0,776
acPut
0,275±0,231
1,015±1,816
0,349±0,240
0,538±0,719
0,002/0,160
DAP
0
0,038±0,109
0,005±0,017
0,064±0,200
0,181/0,059
Spd
0,168±0,081
0,221±0,147
0,188±0,117
0,64±0,269
0,218/0,377
Cad
0
0
0±0,001
0,001±0,005
He применимо  / 1,0
Tyr
0
0
0
Не применимо
Put - петресцин, acPut - N-ацетилпутресцин, DAP - 1,3-диаминопропан, acSpd - N-8-ацетилспермидин, Cad - кадаверин; Tyr - тирамин
Пример 6. Выработка Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в лиофилизированной форме.
Способ. Микроорганизм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 в лиофилизированной форме был получен следующим образом. Штамм Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 засеяли из исходной культуры в биореактор Bioflo 415 (New Brunswick Scientific) и культивировали при 37°С в течение 24 часов в среде MRS. Показатель рН среды поддерживался 6.25. Когда бактериальная культура достигла максимума массовой плотности, содержимое реактора было откачано в высокоскоростную лабораторную центрифугу Z 41 (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH). Биомасса была выделена из среды при 20 000 оборотах в минуту, извлечена из цилиндра центрифуги в стерильных условиях и смешана с крирпротектором (2% снятого молока и 5% сахарозы). Биомасса с криопротектором была высушена в вакууме (лиофильная сушилка Christ Delta 2-24 LSC, John Morris Scientific) в течение промежутка от 24 до 48 часов.
Лиофилизимрованная биомасса была извлечена в стерильных условиях из ванночек и измельчена в порошок. Лиофилизированная бактериальная культура была упакована в чистые закрытые контейнеры и оставлена на хранение при температуре от -18°С до -25°С. Для того чтобы получить желаемое количество жизнеспособных клеток, в качестве наполнителя была добавлена пищевая лактоза или микрокристаллическая целлюлоза.