Изучение активности препарата Люромарин in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Изучение активности препарата Люромарин in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита

Н. В. КРЫЛОВА1, Г. Н. ЛЕОНОВА1, О. С. МАЙСТРОВСКАЯ1, А. М. ПОПОВ2, А. А. АРТЮКОВ2, Э. П. КОЗЛОВСКАЯ2

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток,

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток

In vitro Activity of Luromarin Against Tick-Borne Encephalitis Virus

N. V. KRYLOVA, G. N. LEONOVA, O. S. MAISTROVSKAYA, A. M. POPOV, A. A. ARTYUKOV, E. P. KOZLOVSKAYA

Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Vladivostok Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Ear-East Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok

Препарат Люромарин, выделенный из морской травы Zostera asiatica, не оказывает цитотоксическое действие в культуре клеток СПЭВ, характеризуется вирулицидными свойствами в отношении высокопатогенного штамма вируса КЭ и способностью подавлять продукцию этого вируса на ранних стадиях развития инфекции.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, розмариновая кислота, противовирусная активность.

Luromarin, extracted from the sea alga Zostera asiatica, showed no cytotoxic activity when incubated with the SPEV cell culture and was characterized by virulicidal properties against highly pathogenic strain of TBE virus and the ability to inhibit the virus replication at the early stages of the infection.

Key words: tick-borne encephalitis, rosmarinic acid, antiviral activity.

Терапия клещевого энцефалита (КЭ), как и других вирусных инфекций, до сих пор представляет собой сложную и до конца нерешённую проблему. В значительной степени это объясняется особенностями паразитизма вируса КЭ, поражающего геном клетки. В этой связи одним из важных требований, предъявляемых к антивирусным препаратам, является избирательное подавление репликации вируса без побочного действия на жизненные функции клеток хозяина. Низкая эффективность и высокая токсичность противовирусных препаратов, применяемых при лечении КЭ, определяют актуальность поиска новых более эффективных и малотоксичных препаратов, обладающих антивирусной активностью.

В Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН из морской травы Zostera asiatica был выделен препарат Люромарин, содержащий розмариновую кислоту и биофлавоноид — люте-олин. Ранее было установлено, что розмариновая кислота (РК) — растительный полифенол из Melissa officinalis и биофлавоноид лютеолин, входящий в состав многих растений, являются биологически активными веществами с разносто-

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 690087 Владивосток, ул. Сельская, 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН

ронним спектром действия [1—3]. Это вещество проявляло активность в отношении вирусов герпеса, гриппа, кори и ньюкаслской болезни [4, 5]. Кроме того, исследования J. Ghosh и соавт. [6], показали, что РК обладает высокой противовирусной активностью в отношении вируса японского энцефалита.

Целью настоящей работы явилось изучение активности in vitro нового препарата Люромарин, выделенного из Z.asiatica, в сравнении с существующим коммерческим препаратом розмариновой кислоты в отношении вируса КЭ.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали вирус КЭ дальневосточного субтипа, штамм Р-73, выделенный из мозга человека, умершего от КЭ с очаговой формой инфекции, с инфекционным титром 107 ТЦИД5о/0,2 мл.

Культура клеток. Для анализа противовирусной активности препаратов использовали клетки перевиваемой линии СПЭВ (клетки почек эмбриона свиньи), являющиеся высокочувствительными к вирусу КЭ. Клетки культивировали в 24-луночных пластиковых панелях с ростовой средой, состоящей из сред № 199 и RPMI (в равных соотношениях), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 мкг/мл гентамицина. Поддерживающая среда содержала 1% эмбриональной сыворотки.

Препараты:

— Люромарин — вещество, выделенное из Z.asiatica, содержит 95% розмариновой кислоты и 5% биофлавоноида — лютеолина;

-е-

Є

Вирулицидное действие препаратов в отношении вируса КЭ

Препараты Диапазон концентраций препаратов, мкг/мл Время экспозиции ВКЭ с препаратами, мин Титры вируса после экспозиции с препаратами, lg ТЦИД50/мл

Люромарин 1 + 1000 20 5,5+0,3 + 4,3+0,4*

60 4,8+0,5 + 3,5+0,2*

Розмариновая кислота (PKmMM) 1 + 1000 20 6,0+0,4 + 4,8+0,3

60 6,0+0,5 + 4,2+0,4*

Kонтроль (без препаратов) — 20 6,3+0,5

60 6,5+0,5

Примечание. * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05).

— коммерческая розмариновая кислота (РКкомм) производства фирмы «Sigma» (США);

— рибавирин — химиопрепарат (1-/3-Д-рибофурано-зил-4,3,4-триазол-3-карбоксамид) производства ЗАО «Вертекс», Санкт-Петербург.

Оценка цитотоксичности препаратов. В работе использовали односуточный монослой культуры клеток СПЭВ. Ростовую среду удаляли, вносили свежую поддерживающую среду, содержащую различные концентрации исследуемых препаратов, и помещали в СО2-инкубатор на 5 суток при температуре 37°С. Результаты учитывали по появлению цитодеструктивных изменений монослоя клеток. Контролем являлся монослой клеток, в который была внесена поддерживающая среда без препарата. В качестве показателя токсичности каждого препарата для данной культуры клеток служила максимально переносимая концентрация (МПК), которая составляет 1/2 максимальной концентрации препарата, не оказывающей на клетки токсичного действия (по данным прижизненного морфологического исследования и нарушения поглощения клетками витального красителя) [7].

Определение вирулицидного действия препаратов. Препараты в дозах 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл соединяли с вируссодержащим материалом (в соотношении 1:1) и инкубировали в течение 20 и 60 мин при 23—25°С. Затем клеточный монослой заражали смесью вируса с препаратом (в 10-кратных разведениях) и оставляли на 1 час при 37°С, после чего инокулят сливали, добавляли поддерживающую среду и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5 суток. Контролем являлась инфицированная культура клеток, не обработанная препаратами. Вирулицидный эффект испытуемых веществ оценивали по соотношению инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах.

Определение противовирусного действия препаратов. Монослой культуры клеток заражали 10-кратными разведениями вируса КЭ. Исследуемые вещества в различных концентрациях (опыт) или разводящую среду (контроль) вносили через 1 час после инфицирования клеток вирусом и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5 суток. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по соотношению инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах.

Основными критериями оценки эффективности веществ in vitro, согласно требованиям Фармакологического государственного комитета РФ [7], являлись: показатели снижения инфекционного титра вируса (A, lg) и химиотерапевтический индекс (ХТИ). За величину ХТИ принимали отношение максимально переносимой концентрации (МПК) к минимально эффективной вирусингибирующей концентрации (МЭК) — концентрации препарата, снижающей титр вируса не менее чем на 2 lg ТЦИД50 [8].

Все опыты проводили в троекратной повторности. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ GeoStat и Biostatistics (Version 4.03). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, если вероятность их тождества была меньше 5% (р<0,05).

Результаты и обсуждение

При исследовании цитотоксического действия препаратов на клетки СПЭВ было установлено, что максимально переносимая концентрация Люромарина и РКкомм составляет > 1000 мкг/мл, т. е. эти препараты практически не токсичны для используемой культуры клеток.

Важно было изучить способность исследуемых препаратов влиять непосредственно на внеклеточный вирус КЭ. Как видно из представленных в таблице данных, Люромарин обладает вирулицидной способностью и подавляет инфекционные свойства вируса КЭ, причем степень подавления инфекционной активности вируса была прямо пропорциональна концентрации и времени экспозиции препарата с вируссодержащим материалом. Люромарин уже в минимальных концентрациях (1 мкг/мл) оказывал прямое вирусингибирующее действие на вирус КЭ в отличие от РКкомм. Экспозиция максимальной концентрации Люромарина (1000 мкг/мл) с вирусом в течение 20 минут снижала титр вируса КЭ на 2,0 ^, а в течение 60 мин — на 3,0 ^ ТЦИД50 (р<0,05). В то же время при 20-минутной инкубации вируса с РКкомм в той же концентрации наблюдалось снижение титра вируса на 1,5 ^, а в течение 60 минут — на 2,3 ^ ТЦИД50 (см. таблицу).

Следующим этапом работы являлось исследование способности препаратов защищать инфицированные вирусом КЭ клетки СПЭВ от цитопа-тического действия. Для этого испытуемые препараты вносили в культуру клеток через 1 час и через 24 часа после заражения. Через 24 часа после заражения препараты не защищали клетки от ци-топатического действия вируса. И в дальнейшем мы оценивали влияние этих препаратов на начальные стадии взаимодействия вируса с клеткой через 1 час после инфицирования. Данные по изучению влияния препаратов на репродукцию вируса КЭ, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что применение исследуемых веществ приводит к статистически (р<0,05) и биологически (Д >2 ^) значимому подавлению накопления вируса. Установлено, что во всех исследованных концентрациях Люромарин подавлял накопление вируса на 3,5—4,0 ^ ТЦИД50/мл, а РКкомм — на 2,0—3,3 ^ по

-о-

e

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

5*

2

1

0

IftTh

Контроль Рибавирин Люромарин Рибавирин +

Люромарин

Рис. 1. Влияние препаратов на репликацию вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ.

сравнению с контролем. При этом противовирусная активность Люромарина была достоверно выше таковой РКкомм при низких концентрациях (10 и 1 мкг/мл). Минимально эффективная вирусин-гибирующая концентрация (МЭК) Люромарина в отношении вируса КЭ составила 0,1мкг/мл, ХТИ> 10000; МЭК и ХТИ РКкомм соответственно 10 мкг/мл и >1000. На этом основании можно сделать вывод о том, что исследуемые препараты на модели in vitro обладают выраженной противовирусной активностью.

Известно, что комбинированное использование противовирусных препаратов, имеющих различную химическую структуру и принципиально различный механизм действия, приводит к усилению антивирусного эффекта аддитивного или си-нергидного характера. Нами было изучено противовирусное действие сочетанного применения Люромарина и рибавирина — официнального противовирусного препарата, используемого при лечении многих вирусных инфекций, в том числе и при остром КЭ (рис. 2). Монопрепараты применялись в малых концентрациях (Люромарин — 1 мкг/мл, рибавирин — 31 мкг/мл), которые подавляли накопление вируса КЭ в культуре клеток в среднем на 2 lg ТЦИД50/мл по сравнению с контролем. Комбинированное использование рибавирина и люромарина (в соотношении 1:1) в указанных выше миниЛИТЕРАТУРА

1. Debersac P., Vernevaut M. F, Amiot M. J. et al. Effects of a water-soluble extract of rosemary and its purified component rosmarinic acid on xenobiotic-metabolizing enzymes in rat liver. Food Chem Toxicol 2001; 39: 2: 109—117.

2. van Kessel K P., Kalter E. S., Verhoef J. Rosmarinic acid inhibits external oxidative effects of human polymorphonuclear granulocytes. Agents Actions 1986; 17: 375—376.

3. Ueda H, Yamazaki C., Yamazaki M. Luteolin as an anti-inflammatory and anti-allergic constituent of Perillafrutescens. Biol Pharm Bull 2002; 25: 9: 1197—1202.

4. Dimitrova Z., Dimov B., Manolova N. et al. Antiherpes effect of Melissa officinalis L.extracts. Acta Microbiol Bulg 1993; 29: 65—72.

5. Herrmann E. C, Kucera L. S. Antiviral substances in plants of the mint family (labiatae). II. Nontannin polyphenol of Melissa officinalis. Proc Soc Exp Biol Med 1967; 124: 3: 869—874.

Рис. 2. Влияние Люромарина и рибавирина при мо-но- и комбинированном применении их на репликацию вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ.

мальных концентрациях подавляло репродукцию вируса КЭ на 4 ^ ТЦИД, т. е. эффект комбинации препаратов может быть оценен вполне положительно и носит аддитивный характер.

Таким образом, установлено, что максимально переносимая концентрация препарата Люромарин, выделенного из морской травы Z.asiatica, составила 1000 мкг/мл. Препарат проявляет вирули-цидное действие в отношении высокопатогенного штамма вируса КЭ, подавляя продукцию этого вируса на ранних стадиях развития инфекции.

Следует отметить, что Люромарин обладает более выраженной противовирусной активностью, чем РКкомм. Поскольку Люромарин состоит на 95% из розмариновой кислоты и на 5% из лютео-лина, то можно предположить, что его более высокая эффективность по сравнению с розмариновой кислотой обусловлена наличием в его составе био-флавоноида — лютеолина, который, по данным литературы, имеет широкий спектр биологической активности и обладает противовоспалительными и антиоксидантными свойствами [3, 9].

Результаты данного этапа исследований противовирусного действия Люромарина на культуре клеток говорят о целесообразности дальнейшего изучения этого препарата для его применения в комплексной терапии КЭ с офи-цинальными лечебными препаратами.

Ghosh J, Ghosh S., Saxena A., Basu A. Antiviral and anti-inflammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine model of Japanese encephalitis. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: 9: 3367-3370.

Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабрие-ва, М.: 2005.

Чижов Н. П., Носков Ф. С. Схема первичного отбора противовирусных препаратов. Молекулярная биология вирусов, химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций. Минск: 1974: 217—219.

Sroka Z, Fecka I., Cisowski W. Antiradical and anti-H2O2 properties of polyphenolic compounds from an aqueous peppermint extract. Z Naturforsch 2005; 60: 11—12: 826—832.

e-