СПОСОБЫ И ШТАММЫ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ САРЦИНАКСАНТИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

1. Способ продуцирования сарцинаксантина или его производного, включающий введение в клетку-хозяина и экспрессию в ней одной или более чем одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей активность в пути биосинтеза сарцинаксантина, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:37, или ее часть;
(2) нуклеотидную последовательность с по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO:37 или ее часть; или
(3) нуклеотидную последовательность, комплементарную (1) или (2).
2. Способ по п.1, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:26, или ее часть;
(2) нуклеотидную последовательность с по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO:26 или ее часть; или
(3) нуклеотидную последовательность, комплементарную (1) или (2).
3. Способ по п.1, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует путь биосинтеза сарцинаксантина.
4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию выделения сарцинаксантина или его производного из клетки-хозяина.
5. Способ по п.1, включающий введение в клетку-хозяина и экспрессию в ней:
(a) одной или более чем одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие один или более чем один белок, способный синтезировать флавуксантин; и
50
(b) одной или более чем одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие один или более чем один белок, имеющий активность Cкаротиноид-γ-циклазы или вносящий в нее вклад, где указанный один или более чем один белок (b) способен катализировать преобразование флавуксантина в сарцинаксантин.
6. Способ по п.5, где указанная клетка-хозяин представляет собой ликопин-продуцирующую клетку-хозяина, предпочтительно, где указанная ликопин-продуцирующая клетка-хозяин способна продуцировать ликопин на уровнях по меньшей мере 0,5 мг/г CDW (сухой массы клеток), более предпочтительно, где ликопин-продуцирующая клетка-хозяин содержит плазмиду pAC-LYC.
7. Способ по п.6, где указанный один или более чем один белок (а) способен катализировать преобразование ликопина в флавуксантин.
8. Способ по п.7, где указанный один или более чем один белок имеет активность ликопин-элонгазы.
9. Способ по п.5, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты (b) содержит:
50
1) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу Cкаротиноид-γ-циклазы и содержащую:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:2 или в ее части, или которая является вырожденной по отношению к ней, или которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:12 или 2; или
(2) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий всю аминокислотную последовательность или часть аминокислотной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO:13 или 3, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:13 или 3; и
50
2) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу Cкаротиноид-γ-циклазы и содержащую:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:14 или 4 или в ее части, или которая является вырожденной по отношению к ней, или которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:14 или 4; или
(2) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий всю аминокислотную последовательность или часть аминокислотной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO:15 или 5, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:15 или 5.
10. Способ по п.5, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты (а) содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:10, 6 или 7 или в ее части, или которая является вырожденной по отношению к ней, или которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:10, 6 или 7; или
(2) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий всю аминокислотную последовательность или часть аминокислотной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO:11, 8 или 9, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:11, 8 или 9.
11. Способ по п.5, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую весь белок или часть белка, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO:11, 13 и 15, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:11, 13 или 15.
12. Способ по п.11, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, который при экспрессии в ликопин-продуцирующей клетке-хозяине вместе с каждым из других указанных белков приводит к тому, что по меньшей мере 91% суммарных продуцируемых каротиноидов составляет сарцинаксантин, или молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности.
13. Способ по п.11, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, который при экспрессии в ликопин-продуцирующей клетке-хозяине вместе с каждым из других указанных белков приводит к продуцированию сарцинаксантина на уровне по меньшей мере 150 мкг/г сухой массы клеток (CDW).
14. Способ по п.1, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO:10, 12 и 14;
(2) нуклеотидную последовательность, которая является вырожденной по отношению к последовательности любой из SEQ ID NO:10, 12 или 14;
(3) нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO:10, 12 или 14;
(4) нуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:10, 12 или 14 или нуклеотидной последовательности, которая является вырожденной по отношению к ней; или
(5) нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из (1)-(4), указанных выше.
15. Способ по п.14, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий активность ликопин-элонгазы и аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:11 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:11, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) аланин в положении 8;
(b) валин в положении 88;
(c) валин в положении 158;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:11, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:10, или часть ее варианта, или ее комплемент.
50
16. Способ по п.14, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вносит вклад в активность Cкаротиноид-γ-циклазы и который имеет аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:13 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:
13, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) валин в положении 44;
(b) валин в положении 64;
(c) глицин в положении 103;
(d) аргинин в положении 104;
(e) пролин в положении 111;
(f) глицин в положении 117;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:13, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:12, или часть ее варианта, или ее комплемент.
50
17. Способ по п.14, где указанная одна или более чем одна молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вносит вклад в активность Cкаротиноид-γ-циклазы и который имеет аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:15 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:15, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) остаток глицина в положении 100;
(b) остаток глицина в положении 103;
(c) остаток пролина в положении 107;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:15, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:14, или часть ее варианта, или ее комплемент.
18. Способ по п.1, включающий введение в указанную клетку-хозяина дополнительной молекулы нуклеиновой кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует фермент, способный гликозилировать сарцинаксантин.
19. Способ по п.18, где указанная дополнительная молекула нуклеиновой кислоты кодирует crtX из М.luteus или его функциональный эквивалент, предпочтительно, где нуклеиновая кислота содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:33 или 16 или в ее части или которая является вырожденной по отношению к ней, или нуклеотидную последовательность с по меньшей мере 70%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO:33 или 16;
(2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO:33 или 16 в нежестких условиях связывания 6 × SSC/50% формамид при комнатной температуре и при отмывке в условиях высокой жесткости, например, 2 × SSC, 65°C, где SSC представляет собой 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,2; или
(3) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий всю аминокислотную последовательность или часть аминокислотной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO:34 или 17, или содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:34 или 17.
20. Способ по п.19, где указанная дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий активность сарцинаксантингликозилазы и аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:34 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:34, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) гистидин в положении 62;
(b) серин в положении 109;
(c) аргинин в положении 129;
(d) аланин в положении 138;
(e) аргинин в положении 248;
(f) пролин в положении 251;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:34, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:33, или часть ее варианта, или ее комплемент.
21. Способ по п.1, где экспрессия одной или более чем одной указанной молекулы нуклеиновой кислоты является индуцибельной.
22. Способ по любому из пп.1-21, где указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, в частности, бактерию.
23. Способ по п.22, где указанная бактерия выбрана из Escherichia sp., Salmonella, Klebsiella, Proteus, Yersinia, Azotobacter sp., Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Agrobacterium sp., Alcaligenes sp., Bordatella sp., Haemophilus influenzae, Methylophilus methylotrophus, Rhizobium sp., Thiobacillus sp. и Clavibacter sp., предпочтительно, где клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli или клетку Corynebacterium glutamicum.
24. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая всю нуклеотидную последовательность или часть нуклеотидной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO:37, или состоящая из нее, или которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:37, где молекула кодирует один или более чем один белок, имеющий активность в биосинтезе сарцинаксантина, и где любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть SEQ ID NO:37 или которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:37, кодирует белки, способные синтезировать сарцинаксантин по существу на таком же уровне, как белки, кодируемые SEQ ID NO:37, при экспрессии в клетке-хозяине.
25. Молекула нуклеиновой кислоты по п.24, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит всю нуклеотидную последовательность или часть нуклеотидной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO:26, или состоит из нее, или которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:26, где молекула кодирует один или более чем один белок, имеющий активность в биосинтезе сарцинаксантина, и где любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть SEQ ID NO:26 или которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:26, кодирует белки, способные синтезировать сарцинаксантин по существу на таком же уровне, как белки, кодируемые SEQ ID NO:26, при экспрессии в клетке-хозяине.
26. Молекула нуклеиновой кислоты по п.24 или 25, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую весь белок или часть белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:11, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:11, и где указанная нуклеотидная последовательность кодирует ликопин-элонгазу с эффективностью преобразования ликопина в флавуксантин по меньшей мере 30% при экспрессии в клетке-хозяине, или молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности.
27. Молекула нуклеиновой кислоты по п.26, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:10;
(2) нуклеотидную последовательность, которая является вырожденной по отношению к последовательности SEQ ID NO:10;
(3) нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:10;
(4) нуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:10 или нуклеотидной последовательности, которая является вырожденной по отношению к ней; или
(5) нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из (1)-(4), указанных выше.
28. Молекула нуклеиновой кислоты по п.24, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую весь белок или часть белка, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO:11, 13 и 15, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:11, 13 или 15, и где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, который при экспрессии в ликопин-продуцирующей клетке-хозяине вместе с каждым из других указанных белков приводит к тому, что по меньшей мере 91% суммарных продуцируемых каротиноидов составляет сарцинаксантин, или молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности.
29. Молекула нуклеиновой кислоты по п.24, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую весь белок или часть белка, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO:11, 13 и 15, или аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:11, 13 или 15, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, который при экспрессии в ликопин-продуцирующей клетке-хозяине вместе с каждым из других указанных белков приводит к продуцированию сарцинаксантина на уровне по меньшей мере 150 мкг/г сухой массы клеток (CDW).
30. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 или 29, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO:10, 12 и 14;
(2) нуклеотидную последовательность, которая является вырожденной по отношению к последовательности любой из SEQ ID NO:10, 12 или 14;
(3) нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO:10, 12 или 14;
(4) нуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO:10, 12 или 14 или нуклеотидной последовательности, которая является вырожденной по отношению к ней; или
(5) нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из (1)-(4), указанных выше.
31. Молекула нуклеиновой кислоты по п.30, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий активность ликопин-элонгазы и аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:11 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:11, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) аланин в положении 8;
(b) валин в положении 88;
(c) валин в положении 158;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:11, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:10, или часть ее варианта, или ее комплемент.
50
32. Молекула нуклеиновой кислоты по п.30, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вносит вклад в активность Cкаротиноид-γ-циклазы и который имеет аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:13 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:13, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) валин в положении 44;
(b) валин в положении 64;
(c) глицин в положении 103;
(d) аргинин в положении 104;
(e) пролин в положении 111;
(f) глицин в положении 117;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:13, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:12, или часть ее варианта, или ее комплемент.
50
33. Молекула нуклеиновой кислоты по п.30, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вносит вклад в активность Cкаротиноид-γ-циклазы и который имеет аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:15 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:15, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) остаток глицина в положении 100;
(b) остаток глицина в положении 103;
(c) остаток пролина в положении 107;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:15, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:14, или часть ее варианта, или ее комплемент.
34. Молекула нуклеиновой кислоты по п.24, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую весь белок или часть белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:34, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:34, и где указанная нуклеотидная последовательность кодирует фермент сарцинаксантингликозилазу, активность которого приводит к продуцированию как моно-, так и диглюкозидов сарцинаксантина при экспрессии в клетке-хозяине, или молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности.
35. Молекула нуклеиновой кислоты по п.34, где указанная часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты содержит:
(1) нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:33;
(2) нуклеотидную последовательность, которая является вырожденной по отношению к последовательности SEQ ID NO:33;
(3) нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO:33;
(4) нуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:33 или нуклеотидной последовательности, которая является вырожденной по отношению к ней; или
(5) нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из (1)-(4), указанных выше.
36. Молекула нуклеиновой кислоты по п.35, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий активность сарцинаксантингликозилазы и аминокислотную последовательность, которая представлена во всей SEQ ID NO:34 или в ее части, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:34, где указанная аминокислотная последовательность содержит одно или более чем одно из следующих:
(a) гистидин в положении 62;
(b) серин в положении 109;
(c) аргинин в положении 129;
(d) аланин в положении 138;
(e) аргинин в положении 248;
(f) пролин в положении 251;
или нуклеотидную последовательность, представляющую собой комплемент любой вышеуказанной последовательности, где номера положений указаны по отношению к SEQ ID NO:34, предпочтительно, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO:33, или часть ее варианта, или ее комплемент.
37. Вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.24-36.
38. Выделенный белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.24-36.
39. Штамм Micrococcus luteus, депонированный под номером DSM 23579 в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (DSMZ)), или его мутант или модифицированный штамм, который продуцирует сарцинаксантин или его производное.