Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro
METHOD FOR FORMATION OF MIXED BIOFILM OF PARADONTOPATHOGENIC ANAEROBIC BACTERIA IN VITRO

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и стоматологии, и предназначено для формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro.
Известно, что бактерии, находящиеся в составе микробных сообществ и, в частности, биопленок, становятся менее доступными для действия различных внешних факторов, включая антибиотики, пестициды, биоциды и др. Процесс роста и формирования биопленок зависит от характеристики раствора, свойств носителя, состава популяции микроорганизмов и разнообразия адгезивных механизмов при использовании различных поверхностей. В медицине, а в частности в стоматологии, формирование такого рода моделей является очень актуальной задачей для исследования различных способов воздействия на микробной биопленку в корневых каналах, так как модель эта сформирована в максимальном приближении к естественным условиям.
Известны способы формирования биопленки in vitro в аэробных (но не анаэробных) условиях, которые предполагают нанесение планктонных форм в виде бактериальной взвеси на пластиковые или стеклянные поверхности, погруженные в жидкую (полужидкую) питательную среду или на плотной питательной среде, погруженной в жидкую среду (двухфазная питательная среда).
Так, например, из уровня техники известен способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента, включающий формирование биопленок на твердом носителе, отличающийся тем, что биопленку создают на покровных стеклах, установленных наклонно под углом 10-12° к вертикальной оси в количестве 8-9 штук, которые помещают между витками пружинообразного приспособления, размещенного внутри емкости объемом 100 мл, затем емкость заполняют экспериментальной средой в объеме 40-50 мл до полного погружения покровных стекол, добавляют в емкость суспензию холерных вибрионов и инкубируют при конечной концентрации холерных вибрионов в n×108 КОЕ/мл с доведением до минимального порога чувствительности 0,1 КОЕ/мл при комнатной температуре (Патент РФ №2559546 от 10.08.2015).
Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы, включающий окрашивание сформировавшихся биопленок красителем с последующим экстрагированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом и оценкой интенсивности окрашивания спиртового раствора на фотометре, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют биологический субстрат - измельченные и простерилизованные натуральные почечные камни различной химической природы (Патент РФ №2461631 от 20.09.2012).
Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).
Известен способ оценки характера межмикробных взаимодействий, отличающийся тем, что тестируемые моно- и смешанные культуры микроорганизмов культивируют в лунках полистиролового планшета на LB-бульоне до формирования биопленки, осуществляют промывание сформированных биопленок, окрашивание в течение 45 мин в темноте красителем, в качестве которого используют 0,1% раствор генцианвиолета, трехкратное промывание биопленок с последующим высушиванием планшета, краситель элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок сравнивают с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии (Патент РФ №2448161, 20.04.2012).
Все эти способы моделирования не позволяют воссоздать анаэробные условия и потому не пригодны для изучения такой области стоматологической микробиологии, как внутрикорневая биопленка (эндопатогены), которая по современным данным является этиологическим фактором апикального периодонтита.
Весьма относительные условия анаэробиоза (отсутствия кислорода в среде) удалось создать при использовании полужидких редуцирующих сред, в частности пулированной слюны, на которой были получены моно- и мультивидовые биопленки, растущие на гидроксиапатите (Guggenheim В et al., 2009). Инновационные подходы в искусственной слюне разработали Peyyala R. с соавторами, которые применили подобные модели биопленок для демонстрации различий цитокинового и хемокинового ответов на различные бактериальные биопленки.
Однако во всех перечисленных способах моделирования биопленок отсутствует решение двух важнейших моментов, которые непосредственно связаны с патологией полости рта:
1. Биопленки в ротовой полости формируются при движении жидкой фазы, то есть в условиях текучей среды.
2. Возбудителями пародонтита являются анаэробные бактерии, а создание анаэробиоза не предусмотрено в предложенных моделях.
Одним из важнейших условий перехода планктонных бактерий из взвеси в биопленкообразующую колонию считается истощение среды. Однако в естественных природных условиях (в том числе, в организме человека) биопленка формируется в условиях омывания жидкими секретами, то есть в условиях текучих сред. Это обеспечивает дифференцировку клеточных слоев биопленки и постоянный приток питательных веществ и отток продуктов метаболизма. При патологии пародонта биопленка является смешанной (мультивидовой). Однако воссоздание этого условия было технически трудновыполнимо при попытке получения биопленки из анаэробных бактерий, ибо не удавалось обеспечить движение жидкости (питательной среды) в анаэростатах, используемых для культивирования анэробных бактерий, или создать необходимый температурный режим 37°С.
Так из уровня техники известен способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro (Патент РФ №2619169, 20.11.2015 г.), являющийся наиболее близким по технической сущности к предлагаемому нами способу и принятый нами за прототип.
6
8
Данный способ осуществляется следующим образом. Бактериальную взвесь из чистой культуры, разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий, до концентрации 10-10 КОЕ/мл помещать на подложку из полимерных материалов (метилметакрилат, полиуретан, триацетат или плотную агаровую питательную среду) в замкнутой емкости, которая помещается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который, в свою очередь, помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту при постоянной температуре культивирования биопленки 37°С; и при этом формирование смешанной биопленки осуществляется в несколько этапов, на начальном производится внесение микроба с высокой адгезивной активностью - Streptococcussanguinis с последующим культивированием 48 часов, на следующем этапе проводят внесение микроба-промежуточного колонизатора - Fusobacteriumnucleatum с культивированием 72 часа, и на заключительном этапе внесение микроба пародонтопатогена Porphyromonasgingivalis (или Aggregatibacteractinomycetemcomitans, или Tannerellaforsythia, или Prevotellaintermedia, или их комбинации) с последующим культивированием в течение 5 суток для получения смешанной биопленки.
Главным недостатком такого метода является отсутствие возможности исследовать эффективность способов хемомеханической обработки корневых каналов, так как все они нуждаются в воссоздании системы корневых каналов.
Таким образом, существует потребность в способе формирования смешанной биопленки эндопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro, лишенном вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом предлагаемого способа является максимально близкое воссоздание многовидовой смешанной бактериальной биопленки непосредственно в тканях зуба в среде, приближенной к условиям развития периодонтита in vivo с возможностью симуляции закрытости системы корневого канала in vivo при дальнейшем тестировании способов хемомеханической обработки на полученной модели. Возможности исследования воздействия на микробную биопленку, сформированную предлагаемым способом, очень широки, а их результаты являются достоверными, так как данная модель по сравнению с известными наиболее точно отражает развитие многовидовой биопленки непосредственно в условиях зубных тканей.
6
8
Для достижения указанного технического результата предлагается способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий in vitro, включающий внесение на подложку в замкнутой емкости бактериальной взвеси чистых культур Streptococcus sanguinis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis и их культивацию, при этом бактериальную взвесь разводят в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне BHI, до концентрации 10-10 КОЕ/мл, подложку помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который, в свою очередь, помещают в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в диапазоне 120 движений в минуту, при температуре 37°С с получением смешанной биопленки, отличающийся тем, что в качестве подложки выступают человеческие удаленные однокорневые зубы с минимальным размером 19 мм, сохраняемые в растворе 0,01% гипохлорита натрия непосредственно до проведения формирования биопленки, проводят стандартную подготовку корневого канала и измерение его длины для вхождения любого инструмента, позволяющую обрабатывать только канал, не выходя за его границы; зуб разделяют продольно через центр канала в щечно-язычном направлении, затем на стенку каждого канала бором наносят стандартизированные бороздки, имитирующие слепо оканчивающиеся апикальные каналы, от 1 до 4 мм от апекса зуба, размерами 0,3 мм в ширину, 0,4 мм в глубину и 0,4 мм в длину, по 3-5 бороздок с каждой стороны канала; на внешнюю поверхность зуба также наносят в таком же количестве насечки, имитирующие резорбцию корня во время прогрессирования апикального периодонтита; разделенные половинки зубов собирают заново, на кончик корня наносят шарик диаметром 4-5 мм из промышленного бюгельного воска, в качестве разделителя на зуб наносят тонкий слой стерильного глицерина, после чего зуб с воском укладывают в стоматологический оттискной материал из силикона, после застывания силикона полученную силиконовую форму освобождают от зуба, воск удаляют путем выпаривания, а полученную силиконовую форму используют для точного сопоставления половинок зуба перед началом тестирования способов хемомеханической обработки, разделенные половинки зуба промывают 17% ЭДТА в количестве 3 мл в течение 3-х минут и 10 мл солевым изотоническим раствором хлорида натрия в количестве 10 мл в течение 10 минут, в каждую половинку зуба вводят смесь культур биопленкообразующих штаммов в 5 мл среды, культивацию проводят в течение двух недель.
На фиг. 1-12 приведены основные этапы предлагаемого способа.
Фиг. 1-2. Стандартизация внешних и внутренних апикальных бороздок.
Фиг. 3. Воссоздание закрытой апикальной системы из стандартизированных половинок зуба: нанесение воска на апикальную часть зуба.
Фиг. 4. Вид сформированной апикальной части зуба, после выпаривания воска.
Фиг. 5. Сопоставленные половинки зуба в силиконовом блоке.
Фиг. 6. Методика проведения типической произвольной выборки изображений при проведении СЭМ: увеличение 15х. Место для учета результатов СЭМ образца было определено при малом увеличении (содержимое бороздок не видно).
Фиг. 7. Увеличение 500х, видны отверстия дентинных канальцев.
Фиг. 8. Культивирование смешанной микробной биопленки в условиях анаэробиоза и текучей жидкости: а - аппаратура для культивирования;
Фиг. 9. Микробная биопленка, покрывающая поверхность эмали и цемента зуба (тест с распространением роста на плотной питательной среде).
Фиг. 10. Поверхность в области бороздок в дентине зуба при увеличении 4000х сканирующего электронного микроскопа (СЭМ): поверхность дентина с устьями дентинных канальцев и бугристыми образованиями мантии биопленки.
Фиг. 11. Поверхность в области бороздок в дентине зуба при увеличении 7800х сканирующего электронного микроскопа (СЭМ): скопления микробных клеток биопленки трудно различной морфологии.
Фиг. 12. Поверхность в области бороздок в дентине зуба при увеличении 10000х сканирующего электронного микроскопа (СЭМ): отдельные микробные клетки биопленки кокковидной и бактероидной морфологии.
Способ осуществляют следующим образом.
Отбирают человеческие удаленные по показаниям однокорневые зубы. Выбирают именно однокорневые, поскольку у многокорневых зубов провести распилы в одном направлении невозможно. На примере одного корня можно воссоздать внутреннюю анатомию в полном объеме, так как она не изменяется в зависимости от количества корней в зубе и одинаково сложна во всех группах зубов. Выбирают зубы с минимальным размером 19 мм - это средняя топографическая длина корневых каналов. До проведения формирования биопленки по предлагаемому способу соответствующие вышеуказанным категориям зубы хранили в растворе 0,01% гипохлорита натрия (гипохлорит натрия указанной концентрации является слабым антисептическим раствором, позволяющим продезинфицировать зуб и подготовить к культивированию новых микроорганизмов, не давая рост собственных микроорганизмов зуба).
После извлечения зуба из раствора гипохлорита натрия приступают к стандартной подготовке корневого канала и измерению его длины для вхождения любого инструмента, позволяющей обрабатывать только канал, не выходя за его границы. После препарирования и создания доступа с помощью К-файла 10 размера определяют рабочую длину канала на 1 мм короче апикального отверстия, в среднем 18 мм, которую определяют дистанцией, когда кончик файла показывается из апикального отверстия. Для стандартизации исследования апикальной части зуба ее обрабатывали последовательно К-файлами до 20-ого размера, а затем вращающимися файлами MTWOVDW на всю рабочую длину.
Под стоматологическим микроскопом при помощи абразивного алмазного диска на внешней поверхности зуба наносят насечки, имитирующие резорбцию корня во время прогрессирования апикального периодонтита (Фиг. 1). Зуб распиливают продольно через центр канала в щечно-язычном направлении. Затем на стенку каждого канала бором наносят стандартизированные бороздки от 1 до 4 мм от апекса зуба 0,3 мм в ширину 0,4 мм в глубину и 0,4 мм в длину, по 3-5 бороздок с каждой стороны канала (Фиг. 2). Нанесенные таким образом бороздки имитируют латеральные каналы. Важно отметить, что кроме основных каналов существуют дополнительные, латеральные каналы. Они встречаются очень часто, обычно отходят под углом от основного канала. Латеральные каналы могут находиться на любом уровне и в любых морфологических группах зубов, могут встречаться и в области фуркации многокорневых зубов, но чаще всего встречаются в апикальной трети, чем и обоснован выбор этой области. Они могут заканчиваться слепо или сообщаться с периодонтом. Нами был выбран первый, наиболее часто встречающийся вариант. Эти участки делают их очень трудными для инструментальной обработки и дезинфекции и являются причиной персистирования инфекции. Поэтому очень важно все появляющиеся системы испытывать именно на моделях с воссозданием сложной анатомии.
Так как доказано, что биопленка существует как внутри корневого канала, так и на внешней его поверхности, усугубляя течение заболевания.
Разделенные половинки зубов собирают заново для воссоздания закрытой апикальной системы и на кончик корня наносят шарик (диаметром около 5 мм) из промышленного бюгельного воска (мы использовали Воск-02, фирма Стома, Россия), имитирующий апикальную зону. Это обусловлено тем, что в процессе воспаления за верхушкой образуется полость, которая мешает проникновению ирриганта в апикальную зону, поэтому нами принято решение с помощью воска (так как он подвержен легкому выпариванию) воссоздать эту зону в силиконе.
В качестве разделителя на зуб наносят тонкий слой стерильного глицерина (Liquidstrip, IvoclarVivadent, Швейцария) для облегчения процесса выпаривания воска и дальнейшего извлечения зуба из стоматологического оттискного материала. Силиконовую форму используют в дальнейшем для точного сопоставления половинок зуба перед началом тестирования способов хемомеханической обработки. Дополнительным плюсом глицерина является его водорастворимость и отсутствие масляной пленки.
Затем зуб с воском укладывают в стоматологический оттискной материал из силикона (мы использовали силикон Speedex, фирма Coltene, Швейцария). После застывания силикона полученную силиконовую форму освобождают от зуба, воск удаляют путем выпаривания для создания стандартизированной зоны. Силиконовая форма используется для точного восстановления разделенных половинок зуба, симуляции закрытости системы корневого канала in vivo и эффекта «газового замка» для сопротивления при применении ирриганта (Фиг. 3-5).
Получение смешанной микробной биопленки проводят с использованием стандартной смеси культур биопленкообразующих штаммов S. sanguis, F. nucleatum, P. gingivalis в условиях анаэробиоза по прототипу (Патент РФ №2619169, 20.11.2015 г.). Культивирование многовидовой биопленки в модификации предлагаемого способа для корневого канала зуба осуществляют следующим образом.
Для удаления смазанного слоя, образующегося после механической обработки корневых каналов, разделенные половинки зуба промывают 17% ЭДТА в количестве 3 мл в течение 3-х минут и 10 мл солевым изотонического раствора хлорида натрия в количестве 10 мл в течение 10 минут. В каждую половинку зуба вводят смесь культур биопленкообразующих штаммов Streptococcus sanguis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis в 5 мл сердечно-мозгового бульона (BHI; Difco) в чашке Петри диаметром 50 мм, помещают в микроанаэростат в анаэробной газовой среде (HimediaLabs, India). Культивирование осуществляют при температуре 37°С в автоматическом программируемом биокультиваторе (Interscience, USA), создающем движение жидкой питательной среды с частотой 120 возвратно-поступательных (качательных) движений в минуту в течение 2-х недель (Фиг. 8).
В апикальной (1-2 мм от рабочей длины), средней (2-3 мм от рабочей длины) и коронковой (3-4 мм от рабочей длины) третях были сделаны электронные микрофотографии (СЭМ) борозд и примыкающих участков снаружи, в каждой группе. Для нивелирования погрешностей СЭМ использовалась типическая произвольная выборка (ТПВ). Произвольность подразумевала предопределение места выборки в бороздках при малом увеличении (примерно 15-кратном), при этом детали были не видны, а затем приближение в центр этого участка при большем увеличении для снятия образца (Фиг. 6-7).
Для бактериологического контроля роста микробной биопленки половинку зуба с выращенной смешанной биопленкой помещали на питательную среду - 5% кровяной гемин-агар в анаэробных условиях, где наблюдался быстрый рост в случае наличия исходной биопленки в каналах (Фиг. 9).
Через 2 недели при соблюдении указанного режима культивирования наблюдали рост многовидовой биопленки, схожий с ростом in vivo, что подтверждала электронная микроскопия (СЭМ) при сильном увеличении от 4000 до 10000 раз (Фиг. 10, 11, 12).
Далее для достижения поставленных нами целей подготовленные предлагаемым способом зубы с многовидовой моделью биопленки использовались для исследования эффективности различных методов хемомеханической обработки зубов; проводился микробиологический контроль сохранившихся микроорганизмов и исследование с помощью сканирующего микроскопа.
Модель многовидовой биопленки, выращенной in vitro в однокорневых зубах с искусственными стандартизированными бороздками в апикальном канале, имитирующей эндодонтическую инфекцию, может быть использована для сравнительной оценки эффективности различных технологий удаления (эрадикации) бактериальной биопленки.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет максимально близко воссоздать многовидовую смешанную бактериальную биопленку непосредственно в тканях зуба в среде, приближенной к условиям развития периодонтита in vivo с возможностью симуляции закрытости системы корневого канала in vivo при дальнейшем тестировании способов хемомеханической обработки на полученной модели. Возможности исследования воздействия на микробную биопленку, сформированную предлагаемым способом, очень широки, а их результаты являются достоверными, так как данная модель по сравнению с известными наиболее точно отражает развитие многовидовой биопленки непосредственно в условиях зубных тканей.