Цитокиновая регуляция экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 и продукции хемокина IL-8 эндотелиальными клетками

Медицинская иммунология 2000, Т. 2, № 1, стр 25-33 © 2000, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

ЦИТОКИНОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ АДГЕЗИОННЫХ МОЛЕКУЛ ICAM-1 И ПРОДУКЦИИ ХЕМОКИНА IL-8 ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

Соколов Д.И., Кузнецова С.А., Котов А.Ю.*, Симбирцев А.С.*, Барышников А.Ю#., Полосухина Е.Р.#, Шейкин Ю.А.,Фрейдлин И.С.

*Институт экспериментальной медицины РАМН, ГНЦ НИИ особочистых биопрепаратов, Санкт-Петербург; *Онкологический Научный Центр им.Н.Н.Блохина, Москва.

Резюме. При воспалении и иммунном ответе эндотелиальные клетки становятся мишенями действия провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Активированные ЭК сами способны синтезировать хемокин IL-8 и экспрессировать адгезионные молекулы, в частности, ICAM-1. Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение секреции IL-8 и экспрессии ICAM-1 (CD54) эндотелиальными клетками перевиваемой человеческой линии - ECV304, инкубированными в присутствии отдельных цитокинов и различных их сочетаний. Клетки линии ECV304 отвечали на инкубацию с TNF-a трехкратным усилением секреции IL-8 и двукратным усилением экспрессии ICAM-1. При совместном действии с TNF-a IFN-y по-разному модулировал его стимулирующие эффекты в отношении ЭК: усиливал стимуляцию экспрессии ICAM-1 и ослаблял стимуляцию секреции IL-8. GM-CSF уменьшал стимулирующие эффекты провоспалительных цитокинов на экспрессию ICAM-1 и секрецию IL-8 клетками ECV304. Эффекты противовоспалительного цитокина IL-10 оказались альтернативными в отношении секреции IL-8 и экспрессии ICAM-1 клетками ECV304: он снижал стимулирующее действие провоспалительных цитокинов на секрецию IL-8, но существенно усиливал стимулирующее действие провоспалительных цитокинов на экспрессию ICAM-1. Обсуждаются кооперативные эффекты цитокинов на ЭК и возможности использования перевиваемой линии ECV304 для изучения участия ЭК в воспалении и иммунном ответе.

Ключевые слова: цитокины, адгезионные молекулы, эндотелиальные клетки

Sokolov D., Kouznetsova S., Kotov A., Simbirtsev A., Baryshnikov A., Polosuchina E., Cheikine I., Freidlin I. CYTOKINE REGULATION OF ADHESION MOLECULE ICAM-1 EXPRESSION AND CHEMOKINE IL-8 PRODUCTION BY ENDOTHELIAL CELLS

Abstract. In inflammation and immune response endothelial cells

Адрес для переписки:

Фрейдлин Ирина Соломоновна - член-корр. РАМН, д. м. н., профессор, руководитель отдела иммунологии НИИ экспериментальной медицины РАМН

197376, Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, 12, тел. (812) 234-29-29; факс: (812) 234-94-89. e-mail: immun@immun.iem.ras.spb.ru.

Введение

Эффективность воспалительного ответа определяется активностью рекрутирования фагоцитирующих клеток в очаг инфекции или воспаления. Контакт с возбудителем является сигналом секреции моноцитами/макрофагами провоспалительных цитокинов, в том числе - TNF-a. Аутокринная стимуляция макрофагов и паракринная стимуляция естественных киллеров сопровождается продукцией и секрецией цитокинов, среди которых есть как про-воспалительные (IFN-y, GM-CSF), так и противовоспалительные: IL-4, IL-10 [20, 48]. Мишенями действия всех перечисленных цитокинов становятся эндотелиальные клетки (ЭК) кровеносных сосудов [6, 7, 22, 29]. На ЭК выявлены рецепторы для многих цитокинов, включая интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухолей-a (TNF-a), интерферон-Y (IFN-y), ростовые факторы. Активированные ЭК сами способны к синтезу ряда цитокинов, в том числе хемокина - IL-8 [18, 33, 42,46]. Взаимодействие лейкоцитов с ЭК опосредовано адгезионными молекулами, экспрессия которых на ЭК регулируется цитокинами. Среди адгезионных молекул, экспрессируемых ЭК, особое место занимают межклеточные адгезионные молекулы (ICAM), принадлежащие к суперсемейству иммуноглобулинов [6, 28, 29, 31, 39].

Данные о влиянии разных цитокинов и их сочетаний на ЭК весьма противоречивы. Отчасти это объясняется широким варьированием индивидуальных особенностей первичных культур человеческих эндотелиальных клеток вены пупочного канатика (HUVEC), на модели которых выполнено большинство исследований. Перевиваемая линия ECV304 человеческих ЭК получена как результат спонтанной трансформации HUVEC при длительном культивировании [44, 45]. По своим основным характеристикам перевиваемая линия ECV304 близка к исходным HUVEC, но обеспечивает более высокую воспроизводимость результатов исследований ЭК при условии максимальной стандартизации культивирования клеток.

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение секреции IL-8 и экспрессии ICAM-1 (CD54) эндотелиальными клетками перевиваемой человеческой линии - ECV304, инкубированными в присутствии отдельных цитокинов и различных их сочетаний.

Материалы и методы

Цитокины. В работе использовали рекомбинантные препараты человеческих цитокинов TNF-a -“Рефнолин”

(“Schering-Plough”), рекомбинантный человеческий IL-4 (“Sigma”, США), рекомбинантный человеческий IL-10 (“Sigma”, США).

Клетки. В работе использовали перевиваемую линию ECV304 человеческих эндотелиальных клеток. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (“Биолот”, С.-Петербург), 50 мкг/мл сульфата ген-тамицина (АО “Самсон”, С.-Петербург), 2 мМ L-глутамина (“ICN”, США), 20 мМ HEPES (“ICN”, США). Для культивирования использовали пластиковые флаконы объемом 50 мл (“Sarstedt”, Австрия). Пересев клеток осуществляли путем обработки монослоя смесью 0,25% растворов трипсина и версена (“Биолот”, С.-Петербург) в соотношении 1:3.

Накануне опыта производили пересев клеток ECV304, часть полученной клеточной суспензии тщательно ресуспендировали в культуральной среде и помещали в лунки плоскодонного 96-луночно-го планшета (“Sarstedt”, Австрия) в концентрации 3х104 клеток на лунку и культивировали во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С для получения однородного монослоя. На следующий день к эндотелиальным клеткам, не меняя культуральной среды, добавляли цитокины и их комбинации, после чего культивирование продолжали в течение 24-48 часов. После окончания инкубации собирали образцы культуральных жидкостей и замораживали (-20°С) для последующего определения количества IL-8 при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). Монослои клеток в 96-луночном планшете использовали для определения поверхностной экспрессии ICAM-1 при помощи модификации иммуноферментного анализа (клеточный ИФА).

Фиксация ЭК. После инкубации клетки линии ECV304 фиксировали, внося в каждую лунку по 100 мкл 0,05% раствора глутаральдегида (“Reanal”, Венгрия), приготовленного на забуференном физиологическом растворе (рН=7,2). Затем клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и отмывали один раз в 150 мкл забуференно-го физиологического раствора (рН=7,2), содержащего 0,05% твин-20 (“Serva”, Германия).

Клеточный ИФА. Для оценки степени поверхностной экспрессии адгезионной молекулы ICAM-1 использовали модификацию иммуноферментного анализа, подробно описанную нами ранее [1]. Зафиксированные клетки инкубировали в течение 1 часа во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в присутствии мышиных моноклональных антител (клон ICO-184), специфичных к CD54/ICAM-1 (НПЦ МедБиоСпектр, г.Москва). Затем клетки отмывали пять раз забуференным физиологическим раствором (рН=7,2), содержащим 0,05% твин-20, после чего в каждую лунку добавляли поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши, меченые пероксида-зой хрена (НИИ вакцин и сывороток, С.-Петербург).

После инкубации в течение 1 часа во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С и 5-кратной отмывки забуференным физиологическим раствором (рН=7,2), содержащим 0,05% твин-20, проводили дополнительную инкубацию в течение пяти минут в темноте с 100 мкл субстрат-хромогенной смеси, состоящей из 1 мг ортофенилендиамина (“Sigma”, США) в 1 мл цитрат-фосфатного буфера (рН=5), содержащем 0,06% перекиси водорода. Цветную реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл 1М серной кислоты. Оптическую плотность учитывали с помощью автоматического спектрофотометра (“SLT-Spectra”, Австрия) при длине волны 492 нм. Экспрессию ICAM-1 на клетках ECV304 выражали в единицах оптической плотности. Средние значения оптической плотности в контрольных лунках принимали за фон и вычитали из всех остальных значений оптической плотности.

Количественное определение уровня IL-8 в на-досадочных жидкостях культур клеток определяли с помощью ИФА,используя стандартные комерчес-кие наборы (“Цитокин”, С.-Петербург), и выражали в пг/мл.

Статистическую обработку полученных данных проводили с вычислением критерия Стью-дента, используя компьютерную программу STATISTICA 5.0.

Результаты

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что перевиваемая линия ЕСУ304 человеческих эндотелиальных клеток характеризуется довольно высокими уровнями спонтанной секреции ^-8 (1.416+230 пг/мл) и конститутивной экспрессии 1САМ-1 (0,812+0,062). Сопоставление с литературными данными показывает, что по активности секреции ^-8 эти клетки не уступают HUVEC, а по уровню экспрессии 1САМ-1 даже превосходят HUVEC.

Как и HUVEC, клетки линии ECV304 отвечали на инкубацию с Т№-а (400 ЕД/мл) усилением секреции ^-8 - количество ^-8 в культуральной жидкости увеличивалось в три раза по сравнению с уровнем спонтанной секреции. Другой провоспалитель-ный цитокин - №N-7 (400 ЕД/мл) не вызывал изменений секреции ^-8 клетками линии ECV304, что согласуется с данным, полученным на HUVEC [18, 30, 51]. При инкубации клеток линии ECV304 в присутствии смеси цитокинов TNF-а и №N-7 в течение 24 часов количество ^-8 в культуральных жидкостях оказалось достоверно ниже, чем при индукции секреции этого цитокина одним Т№-а (рис. 1).

При тех же условиях инкубации клеток ECV304 TNF-a усиливал экспрессию 1САМ-1 более чем в два раза по сравнению с исходным уровнем. №N-7 вызывал значительно менее выраженное, но статистически достоверное увеличение экспрессии 1САМ-1.

:

Рис. 1. Влияние TNF-a, ^N-7 и их смеси на секрецию ^-8 клетками линии ЕОТ304.

На оси ординат концентрация ^-8 в пг/мл. За ноль принят спонтанный уровень секреции ^-8.

В отличие от влияния на секрецию ^-8, смесь цитокинов TNF-a и №N-7 аддитивно усиливала экспрессию ІСАМ-1 (рис. 2), что согласуется с данными, полученными на НЦУЕС [30, 39, 37, 46].

Инкубация клеток линии ECV304 в присутствии различных концентраций GM-CSF от 10 до 1000 ЕД/ мл не вызывала достоверного изменения изученных параметров. Повышение концентрации GM-CSF до 2000 ЕД/мл вызвало статистически достоверное угнетение спонтанной секреции ^-8. Среди изученных сочетаний этого ростового фактора с провоспали-тельными цитокинами только сочетание GM-CSF с №N-7 оказывало статистически достоверное ингибирующее действие на секрецию ^-8 клетками ECV304 (рис. 3). Нам не удалось выявить какого-либо самостоятельного влияния GM-CSF на экспрессию ІСАМ-1 на клетках ECV304. При сочетании этого ростового фактора с провоспалительными ци-токинами он вызывал статистически достоверное снижение стимулирующих эффектов TNF-a и смеси TNF-a+IFN-7 на экспрессию ІСАМ-1 на клетках ЕСУ304 (рис. 4).

1

і

тар

Ff. -"Г. F

Рис. 2. Влияние TNF-a, ^N-7 и их смеси на экспрессию ІСАМ-1 клетками линии ЕОТ304.

На оси ординат оптическая плотность, отражающая уровень экспрессии ICAM-1. За ноль принят спонтанный уровень экспрессии ICAM-1.

Рис. 3. Влияние GM-CSF и его сочетания с ^N-7 на секрецию ^-8 клетками линии ЕОТ304.

На оси ординат концентрация ^-8 в пг/мл. За ноль принят спонтанный уровень секреции ^-8.

Противовоспалительный цитокин ^-4 не оказывал никакого действия ни на секрецию ^-8, ни на экспрессию 1САМ-1 клетками ECV304, ни на эффекты провоспалительных цитокинов при совместном с ними использовании, что согласуется с данными литературы, касающимися других ЭК [18, 37, 47].

Противовоспалительный цитокин ^-10 самостоятельно не ингибировал секрецию ^-8, а в концентрации 200 нг/мл при 48-часовой инкубации даже вызывал статистически достоверный прирост секреции ^-8, никак не влияя на экспрессию 1САМ-1 на клетках ЕСУ304 (рис.5, 6).

^-10 в сочетании с №N-7 при 24-часовой инкубации вызывал снижение стимулирующего эффекта №N-7 на экспрессию 1САМ-1 на клетках линии ЕСУ304 (рис. 5).

Для изучения вариантов кооперативных эффектов ^-10 с провоспалительными цитокинами проводили преинкубацию клеток линии ECV304 в течение 24 часов в присутствии различных концентраций ^-10, затем вносили TNF-a, №N-7 или их смесь и продолжали инкубацию в течение 24 часов или наоборот - преинкубировали клетки в течение 24 часов в присутствии Т№-а, №N-7 или их смеси, а затем вносили ^-10 на 24 часа. В случае преинку-

Рис. 4. Влияние GM-CSF и его сочетаний с TNF-a, ^N-7 и их смесью на экспрессию ІСАМ-1 клетками линии ЕСУ304.

На оси ординат оптическая плотность, отражающая уровень экспрессии ІСАМ-І.За ноль принят спонтанный уровень экспрессии ІСАМ-1.

С-О

Рис. 5. Влияние ^-10 и его сочетаний с TNF-a, IFN-Y и их смесью на экспрессию 1САМ-1 клетками линии ЕСТ304.

На оси ординат оптическая плотность, отражающая уровень экспрессии 1САМ-1. За ноль принят спонтанный уровень экспрессии 1САМ-1.

бации клеток с ^-10 (100-200 нг/мл) наблюдали статистически достоверные приросты стимулирующего действия TNF-a и его смеси с №N-7 на экспрессию 1САМ-1 (рис. 5).

В случае преинкубации клеток с ^-10 в концентрации 100 нг/мл наблюдали статистически достоверное снижение стимулирующего действия TNF-a и его смеси с №N-7 на секрецию ^-8. Статистически достоверное снижение стимулирующего секрецию ^-8 действия смеси провоспалительных цито-кинов наблюдали и в случае введения ^-10 после преинкубации клеток со смесью (рис. 6).

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что перевиваемая линия человеческих эндотелиальных клеток ECV304 очень близка к исходным клеткам HUVEC по поверхностному фенотипу, способности спонтанно секретировать хемоки-ны и отвечать на индуцирующие воздействия про-воспалительных цитокинов.

РДІПІ

-

4&:о

ї&=Сі

30:0

амо

ю:о

4:0

Рис. 6. Влияние ^-10 и его сочетаний с TNF-a и его смесью с ^N-7 на секрецию IL-8 клетками линии ЕОТ304.

На оси ординат концентрация 1Ь-8 в пг/мл. За ноль принят спонтанный уровень секреции ^-8.

яг ге в * IL .1I

Г

ЭК разной тканевой локализации, выделенные из разных источников, таких как вена пупочного канатика, крайняя плоть, высокий эндотелий венул, эндотелий гломерул почек, эндотелий синовиальной сумки и другие, и разных уровней дифференциров-ки существенно различаются по чувствительности к действию разных цитокинов: провоспалительных, противовоспалительных, ростовых факторов [2, 4, 5, 14, 17, 18, 37, 43, 52, 56, 38]

Наиболее популярными клеточными линиями для изучения роли ЭК в процессах воспаления, иммунного ответа и ангиогенеза являются: первичная культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека (HUVEC - Human umbilical vein endothelial cells) [23, 53] и перевиваемая линия ECV-304, которая представляет собой спонтанно трансформированную культуру HUVEC [44, 45].

HUVEC широко используются в качестве модельной системы ЭК, максимально приближенной к естественным условиям организма, но их выделение и культивирование сопряжены с рядом трудностей: высокий риск контаминации фибробласта-ми и/или гладкомышечными клетками и инфицирования вирусами гепатита В и вирусами иммунодефицита человека при получении; потребность в экзогенных ростовых факторах, особых субстратах для культивирования (фибронектин, желатин), кофакторах (аскорбиновая кислота, гепарин), высоких концентрациях сыворотки; низкая скорость пролиферации (удвоение популяции происходит за 92 часа) и сравнительно короткий жизненный цикл. Для получения клеток в достаточном количестве их приходится собирать от нескольких доноров, в результате чего клеточная популяция получается гетерогенной, что затрудняет интерпретацию результатов [21]. В связи с этими недостатками проводился поиск других “модельных” линий ЭК, одной из таких линий является ECV-304 [25]. Эта линия не столь требовательна к условиям культивирования, является более стабильной по экспрессии различных поверхностных и секретиру-емых молекул. Экспрессия тромбомодулина, рецептора витронектина (CD51), секреция ингибитора активатора плазминогена I (PAI-I) и эндотелина являются типичными “эндотелиальными” характеристиками этой линии [21, 24]. Линия ECV-304 использовалась для изучения ангиогенеза, клеточной миграции, секреции цитокинов, трансдукции сигнала фактора роста эндотелия сосудов (VEGF -vascular endothelial growth factor) [24].

HUVEC и ECV304 имеют ряд общих характеристик, но имеют и существенные различия. У этих клеток в отсутствие стимуляции определяется разный репертуар поверхностных молекул. Так, с помощью моноклональных антител было выявлено, что только HUVEC экспрессируют CD34, CD109, CD140b, CD143 [31]. И те, и другие клетки харак-

теризуются низким базовым уровнем экспрессии CD142 (tissue factor, TF), которая усиливается под действием TNF-a с максимумом через 4-6 часов, но возвращается к базальному уровню через 16 часов после стимуляции [36]. И на тех, и на других клетках обнаружена экспрессия молекул CD49b, CD49c, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD105, CD141 (тром-бомодулин), CDw145, CDw146, CDw147, HLAI. Различия в условиях культивирования клеток (количество пассажей, используемая культуральная среда, концентрация сыворотки, степень зрелости монослоя и др.) приводят к фенотипическим различиям в экспрессии поверхностных молекул на клетках как первичной, так и перевиваемой клеточной линии [31]. Е-селектин не определяется на не-стимулированных HUVEC, однако обработка ЛПС в течении 4 часов индуцировала его экспрессию на HUVEC, а на ECV-304 этот селектин не определялся ни до, ни после стимуляции [12, 21, 32]. По одним данным VCAM-1 экспрессируется на покоящихся клетках в обоих случаях, и инкубация с ЛПС в течении 4-24 часов приводит к усилению его экспрессии в обоих случаях [21]. По данным других авторов, на ECV-304 не было обнаружено VCAM-1, но выявлены ICAM-1 и CD36 [12]. Монослой клеток HUVEC более активно по сравнению с монослоем ECV-304 захватывает и метаболизи-рует модифицированные (ацетилированные) ли-попротеиды низкой плотности через скевенджер рецептор [21, 44, 45].

Несмотря на вышеперечисленные отличия линии ECV304 от HUVEC по морфологическим, фенотипическим и функциональным характеристикам, использование этой перевиваемой линии оправдано стандартными характеристиками, не изменяющимися от пассажа к пассажу, как это было показано в случае постепенного снижения экспрессии CD34 на HUVEC [9, 15].

Полученные нами с использованием линии ECV304 результаты свидетельствуют в пользу того, что TNF-a является универсальным ститмулятором для ЭК, усиливающим не только экспрессию адгезионных молекул, но и секрецию хемокинов ЭК. Ранее было показано, что TNF-a в синергизме с IL-10 индуцировал продукцию IL-6, IL-8, GM-CSF, MCP-1 эндотелиальными клетками коронарных артерий или легочной артерии человека и HUVEC [41]. У клеток линии ECV304 также была выявлена способность отвечать на воздействие TNF-a продукцией IL-8 [9], что полностью согласуется с полученными нами результатами. Неоднократно была показана способность TNF-a повышать экспрессию на поверхности эндотелиальных клеток разного происхождения адгезионных молекул: ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, он способен также индуцировать секрецию IL-8, MCP-1, IL-1, IL-6, GM-CSF, простогландинов, PGI2, leukemia inhibitory factor, PDGF, GRO, NO [5, 18, 2(5,

33, 37, 40, 42, 46, 47, 51, 54].

Полученные нами данные сравнительного исследования влияния разных цитокинов на клетки ECV304 показали, что IFN-y отличается от TNF-a менее выраженным стимулирующим действием, к тому же только в отношении экспрессии ICAM-1. При совместном действии с TNF-a IFN-y по-разному модулировал его стимулирующие эффекты в отношении ЭК: усиливал стимуляцию экспрессии ICAM-1 и ослаблял стимуляцию секреции IL-8.

Разное модулирующее действие IFN-y на эффекты TNF-a было описано и другими авторами при изучении экспрессии разных адгезионных молекул и цитокинов у ЭК. Так, например, IFN-y усиливает действие TNF-a на секрецию молекул семейства RANTES и IL-8 клетками HUVEC [27] или эндотелиальными клетками кожи [18, 27]. Синергизм этих цитокинов также описан в отношении цитотоксичес-кой активности макрофагов, продукции активных радикалов кислорода, изменения уровня экспрессии адгезионных молекул на различных типах клеток [13,

16, 19, 27, 34]. IFN-y выступает в качестве синергис-та TNF-a при стимуляции экспрессии CD40 на поверхности клеток линии THP-1 [16], экспрессии МНС-1, ICAM-1, ELAM-1 на поверхности HUVEC. Обработка HUVEC интерфероном-у усиливает ингибирующее действие TNF-a на экспрессию CD34 [9]. С другой стороны, предобработка HUVEC интерфе-роном-у ингибирует индуцированную TNF-a поверхностную экспрессию Е-селектина, что приводит к снижению адгезии нейтрофилов к этим клеткам [30].

В литературе рассматриваются разные возможные механизмы кооперативных эффектов TNF-a и IFN-y. Одним из механизмов служит усиление интерферо-ном-у экспрессии рецепторов к TNFa и, наоборот, усиление фактором некроза опухолей-a экспрессии рецепторов к IFN-y [13, 27]. Другим уровнем синергизма или антагонизма могут служить внутриклеточные события, связанные с передачей сигнала активации от цитокиновых рецепторов [22, 27].

Ранее другими исследователями было показано, что при действии in vitro на тканевые срезы GM-CSF вызывает усиление экспрессии ICAM-1 на ЭК гломерул почек [37]. В отличие от этого, нам не удалось выявить какого-либо самостоятельного влияния GM-CSF на экспрессию ICAM-1 на клетках ECV304, а при сочетании его с провоспалительны-ми цитокинами он уменьшал их стимулирующие эффекты на экспрессию ICAM-1 на клетках ECV304. На культуре эндотелиоцитов микрососудов кожи человека было показано отсутствие влияния GM-CSF на экспрессию ICAM-1, в то время как IL-1a, IL-1 в и TNF-a в значительной степени стимулировали экспрессию этой адгезионной молекулы [10]. По некоторым данным, на клетках линии HUVEC вообще отсутствует рецептор GM-CSF [57]. Угнетающее действие проявил этот ростовой

фактор в отношении спонтанной секреции ^-8 клетками ECV304, более выраженным было снижение секреции ^-8 после инкубации клеток ECV304 со смесью GM-CSF и ^N-7.

Противовоспалительный цитокин ^-10 не только не ингибировал секрецию ЭК ^-8, но даже слегка ее усиливал в случае более длительной инкубации с ним клеток. Вместе с тем, ^-10 отчетливо ингибировал стимулирующее действие провоспалительных цитокинов на секрецию ^-8. Не влияя на экспрессию ІСАМ-1 самостоятельно, ^-10 существенно усиливал стимулирующее действие провоспалительных цитокинов на экспрессию ІСАМ-1.

В литературе встречаются весьма противоречивые данные относительно влияния ^-10 на ЭК. Одни исследователи утверждают, что ^-10 никак не влияет на ЭК и даже высказывают предположение об отсутствии рецепторов ^-10 у этих клеток [27, 41]. Другие исследователи, наоборот, показывают, что ^-10 имеет стимулирующий эффект, например, в отношении поверхностной экспрессии Е-селектина и внутриклеточной экспрессии мРНК для этой адгезионной молекулы у HUVEC и эндотелиальных клеток кожи, что ведет к увеличению адгезии к ним клеток линии HL-60. Кроме того, было показано, что предобработка ЭК вены пупочного канатика интерлейкином-10 ведет к снижению индуцированной экспрессии ІСАМ-1, VCAM-1, а также к снижению индуцированной продукции этими клетками ^-6 и ^-8 [52]. Предобработка HUVEC ^-10 или ^-4 в значительной степени ингибировала Т№-а-, ^-10- или ЛПС-сти-мулированную экспрессию ^-8 этими клетками [8]. По данным других исследователей инкубация HUVEC с ^-4 и ^-10 не влияла на высвобождение ими ^-8, однако подобная инкубация в присутствии ЛПС вызывала в 3 раза более сильную секрецию ^-

8, чем инкубация только в присутствии ЛПС [11]. Клетки линии HUVEC, подверженные действию у-излучения, активировались, что проявлялось стимуляцией продукции ^-6 и ^-8 и усилением экспрессии ІСАМ-1. Последущая обработка этих клеток ^-4 снижала продукцию ими ^-8 и, в незначительной степени ^-6, не влияя на повышенную экспрессию ІСАМ-1; обработка же ^-10 значительно снижала повышенную продукцию как ^-6, так и ^-8 [50].

Нами было показано, что ^-4 в различных концентрациях не изменяет эффектов TNF-a и №N-7 в отношении экспрессии ІСАМ-1. Нам не удалось показать какого-либо влияния ^-4 на экспрессию ІСАМ-1 у клеток линии ECV304. По поводу влияния ^-4 на эндотелиальные клетки вены пупочного канатика у разных исследователей также нет единого мнения. Так, одни исследователи не обнаружили никакого самостоятельного влияния ^-4 на эти клетки [37], а другие говорят о его ингибирующем действии в отношении конститутивной экспрессии ІСАМ-1 [46]. С другой стороны, несмотря

зо

на то, что IL-4 считается противовоспалительным цитокином, он способен индуцировать экспрессию VCAM-1 на HUVEC [55]. Также было показано, что IL-4 не способен влиять на изменение уровня мРНК IL-8 у HUVEC [46], что согласуется с полученными нами данными. Однако есть данные, что IL-4 ингибирует экспрессию ICAM-1 на HUVEC, стимулированную IL-1, IFN-y или TNF [47].

В последнее время в литературе все чаще встречаются указания на стимулирующую роль IL-10, IL-4 по отношению к различным событиям провоспали-тельного характера, и, наоборот, IFN-y способен ингибировать эффекты провоспалительных цитокинов. Так, например, было показано, что IL-10 способен усиливать экспрессию VCAM-1 на HUVEC в присутствии активированных форболмиристатацетатом моноцитов периферической крови [14] или усиливать экспрессию Е-селектина на HUVEC [52]. IL-4 в комбинации с TNF-a, IL-1 или IFN-y увеличивал адге-зивность HUVEC для Т-лимфоцитов, усиливая экспрессию VCAM-1 [47]. IL-4 способен индуцировать значительные уровни экспрессии внутриклеточной мРНК и секреции белка моноцитарного хемотакти-ческого протеина-1 у HUVEC [18].

Среди полученных нами результатов обращают на себя внимание следующие: секрецию IL-8 клетками линии ECV304, индуцированную TNF-a, ингибировал не только противовоспалительный ци-токин IL-10, но и провоспалительный цитокин IFN-y. С другой стороны, противовоспалительный цитокин IL-10, как и провоспалительный IFN-y, существенно усиливал стимулирующее действие TNF-a на экспрессию ICAM-1. Возможно, ингибирующий или стимулирующий характер действия IL-10 зависит от особенностей клеток-мишеней. Так, ранее была выявлена разница эффектов IL-10, который ингибировал продукцию цитокинов (IL-6, MCP-1) мононуклеарными фагоцитами, но ампли-фицировал продукцию тех же цитокинов эндотелиальными клетками [41]. Ростовой фактор GM-CSF некоторыми исследователями причисляется к про-воспалительным на основании его стимулирующего действия на функции мононуклеарных фагоцитов. Полученные нами результаты свидетельствуют о превалировании ингибирующих эффектов GM-CSF в отношении ЭК. Все это свидетельствует о постепенном “размывании” грани между понятиями “провоспалительные” и “противовоспалительные” цитокины.

Работа поддержана Грантом РФФИ №97-0448889.

Список литературы:

1. Кузнецова С.А., Косицкая Л.С., Соколов Д.И., Фрейдлин И.С., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю. Использование иммуноферментного анализа для

оценки экспрессии адгезионных молекул на эндотелиальных клетках // Медицинская иммунология. -1999. - № 5. - С.71-74.

2. Abot S.E., Kaul A., Stevens C.R., Blake D.R. Isolation and culture of synovial microvascular endothelial cells: characterization and assessment of adhesion molecule expression // Arthritis and Rheumatism. - 1992. - Vol. 35, №4 - P.401-406.

3. Aggarwal B., Pocsik E. Cytokines: from clone to clinic // Archives Biochemistry and Biophysics. - 2000.

- Vol.292. - P.335 -345.

4. Arnman V., Stemme S., Rymo L., Risberg B. Interferon-y modulates the fibrinolytic response in cultured human endothelial cells // Tromb. Research. -1995. - Vol.77, №5 - P.431-40.

5. Baumhueter S., Singer M.S., Henzel W., Hemmerich S., Renz M., Rozen S.D., Lasky L.A. Binding of L-selectin to the vascular sialomucin CD34 // Science. - 1993. - Vol.262 - P.436-438.

6. Bevilacqua M. Endothelial cell-leukocyte adhesion molecules. // Annu.Rev.Immunol. - 1993. -Vol.11 - P.767-773.

7. Biron C., Gazzinelly R. Effects of IL-12 on immune responses to microbial infections: a key mediator in regulating disease outcome // Current Oppinion in Immunology. - 1995. - Vol.7. - P.485-496.

8. Chen C.C., Manning A.M. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokine-induced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells // Cytokine. - 1996. - Vol.8, №1 - P.58-65.

9. Delia D., Lampugnani M.G., Resnati M., Dejana E., Aiello A., Soligo D., Pierotti M.A., Greaves M.F. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro // Blood.

- 1993. - Vol.81, №4 - P.1001-1008.

10. Detmar M., Tenorio S., Hettmannsperger U., Ruszczak Z., Orfanos C.E. Cytokine regulation of proliferation and ICAM-1 expression of human dermal microvascular endothelial cells in vitro // J. Invest. Dermatol. - 1992. - Vol.98, №2 - P.147-153.

11. De Beaux A.C., Maingay J.P., Ross J.A., Fearon K.C., Carter D.C. Interleukin-4 and interleukin-10 increase endotoxin-stimulated human umbilical vein endothelial cell interleukin-8 release // J. Interferon Cytokine Res. - 1995. - Vol.15, №5 - P.441-445.

12. Dobbie M.S., Hurst R.D., Klein N.J., Surtees R.A.H. Upregulation of intercellular adhesion molecule-1 expression on human endothelial cells by TNF-a in an in-vitro model of the blood-brain barrier // Brain Research. - 1999. - Vol.830. - P.330-336.

13. Doukas J., Pober J.S. IFN-y enhances endothelial activation induced by tumor necrosis factor but not interleukin-1 // Journal of Immunology. - 1990. -Vol.145, №6 - P.1727-1733.

14. Downing L.J., Strieter R.M., Kadell A.M., Wilke C.A., Austin J.C., Hare B.D., Burdick M.D., Greenfield LJ, Wakefield T.W. IL-10 regulates thrombus-induced

зі

vain wall inflammation and thrombosis. // Journal of Immunology. - 1998. - Vol.161. - P.1471-1476.

15. Fina L., Molgaard H.V., Robertson D., Bradley N.J, Monadhan P., Delia D., Sutherland D.R., Baker M.A., Greaves M.F. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells // Blood. - 1990. - Vol.75, №12

- P.2417-2426.

16. Francisco J.A., Kiener P.A., Moran-Davis P., Letbetter J.A., Siesall P.A. Cytokine activation sensitizes human monocytic and endothelial cells to the cytotoxic effects of an anti-CD40 immunotoxin // Journal of Immunology. - 1996. - Vol.157, №4 - P.1652-1658.

17. Gamble J.R., Khew-Goodall Y., Vadas M.A. Transforming growth factor-beta inhibits expression E-selectin by human endothelial cells // Journal of Immunology. - 1993. - Vol.150, №10 - P.4494-4503.

18. Goebeler M., Yoshimura T., Toksoy A., Ritter U., Brocker E.B., Gillitzer R. The chemokine repertoire of human dermal microvascular endothelial cells and its regulation by inflammatory cytokines // Journal of Investigative Dermatology. - 1997. - Vol.108, №4 -P.445-451.

19. Golding S., Emery P, Young S.P. Tenidap-modulated proinflammatory cytokine activation of monocyte cell line // Journal of Immunology. - 1995. -Vol.154 - P.5384-5390.

20. Harnett M. Antigen receptor signalnalling: from the membrain to the nucleus // Journal of Immunology.

- 1994. - Vol.15 - P.1-5.

21. Hughes S.E. Functional characterization of the spontaneously transformed human umbilical vein cell line ECV 304: use in an in vitro model of angiogenesis // Experimentall cell research. - 1996. - Vol.225. - P.171-185.

22. Jaattela M. Biologic activities and mechanisms of action of tumor necrosis factor-a/cachectin // Journal of Laboratory Investigation. - 1991. - Vol.64, №6 - P.724.

23. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minik C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria // Journal of Clinical Investigation. - 1973. - Vol.52. - P.2745-2756.

24. Kiessling F., Kartenbeck J., Haller C. Cell-cell contacts in the human cell line ECV304 exhibit both endothelial and epithelial characteristics // Cell Tissue Research. - 1999. - Vol.297. - P.131-140.

25. Lidington E.A., Moyes D.L., McCormack A.M., Rose M.L. A comparison of primary endothelial cells and endothelial cell lines for studies of immune interactions // Transpl. Immunol. - 1999. - Vol.7, №4 - P.239-246.

26. Lopez-Pedrera C., Jardi M., Ingles-Esteve J., Munoz-Canoves P., Dorado G. Characterization of tissue factor expression on the human endothelial cell line ECV304 // American Journal of Hematology. -1997. - Vol.56, №2 - P.71-78.

27. Marfain-Koka A., Devergue O., Gorgone G., Portier A., Schall T.J., Galanaud P., Emilie D. Regulation of the production RANTES chemokine by

endothelial cells. Synergistic induction by IFN-y plus TNF-a and inhibition by IL-4 and IL-13 // Journal of Immunology. - 1995. - Vol.154, №4 - P.1870-1878.

28. Mason J.C., Haskard D.O. The clinical importance of leucocyte and endothelial cell adhesion molecules in inflammation // Vascular Medicine Review. - 1994. - Vol.5. - P.249-275.

29. Meershaert V., Furie M.B. The adhesion molecules used by monocytes for migration across endothelium include CD11a/CD18, CD11b/CD18 and VLA-4 on monocytes and ICAM-1, VCAM-1 and other ligands on endothelium // Journal of Immunology. -1995. - Vol.154, №8 - P.4099-4112.

30. Merlose J., Tsurushita N., Liu G., Berg E.L. IFN-Y inhibits activation-induced expression of E- and P-selectin on endothelial cells // Journal of Immunology.

- 1998. - Vol.161. - P.2457-2464.

31. Mutin M., Dignat-George F., Sampol J. Immunologic phenotype of cultured endothelial cells: quantitative analysis of cell surface molecules // Tissue Antigens. - 1997.- Vol.50. - P. 449-458.

32. Munro J.M., PoberJ.S., Cotran R.S. Recruitment of neutrophils in the local endotoxin response: association with de novo endothelial expression of endothelial leukocyte adhesion molecule-1 // Lab. Invest. - 1991. - Vol.64, №2 - P.295-299.

33. Paleolog E.M., Delasalle S.A.J., Buurman W.A., and Feldman M. Functional activities of receptors for tumor necrosis factor-a on human vascular endothelial cells // Blood. - 1994. - Vol.84, №8 - P.2578-2590.

34. Pirila L., Heino J. Altered integrin expression in rheumatoid synovial lining type B cells: in vitro cytokine regulation of a1b1, a6b1 and avb5 integrins // Journal of Rheumatology. - 1996. - Vol.23, №10 - P.1691-1698.

35. Ramasamy S., LipkeD.W., Meclain C.J., Hennig B. Tumor necrosis factor reduces proteoglycan synthesis in culture endothelial cells // Journal of Cellular Physiology. - 1995. - Vol.162, №1 - P.119-126.

36. Reverdiau P., Jarousseau A.C., Thibault G., Khalfoun B., Watier H., Lebranchu Y., Bardos P., Gruel Y. Tissue factor activity of syncytiotrophoblast plasma membranes and tumoral trophoblast cells in culture // Thromb. Haemost. - 1995 - Vol.31. - P.49-54.

37. Savage C.O.S., Brooks C.J., Adu D., Richards G., Howie AJ. Cell adhesion molecule expression within human glomerular and kidney organ culture // Journal of Pathology. - 1997. - Vol.181, №1 - P.111-115.

38. Schwachula A., Riemann D., Kehlen A., Langner. Characterization of the immunophenotype and functional properties of fibroblast-like synoviocytes in comparison to skin fibroblasts and umbilical vein endothelial cells //J. Immunobiology. - 1994. - Vol.190, №1-2 - P.67-92.

39. Shang X.-Z., Lang B.J., Issekutz A.C. Adhesion molecule mechanisms mediating monocyte migration through synovial fibroblast and endothelium barriers: role for CD11/CD18, very late antigen-4, (CD49d/

з2

CD29), very late antigen-5 (CD49e/CD29) and vascular cell adhesion molecule-1 (CD106) // Journal of Immunology. - 1998. - Vol.160. - P.467-474.

40. Simionescu M., Simionescu N. Proatherosclerotic events: pathobiochemical changes occuring in the arterial wall before monocyte migration // The FASEB Journal.

- 1993. - Vol.7. - P.1359.

41. Sirony M., Munoz C., Pollicino T., Sibony A., Sciacca F.L., Bernascony S., Vecchi A., Colotta F., Mantovani A. Divergent effects of interleukin-10 on cytokine production by mononuclear phagocytes and endothelial cells // European Journal of Immunology. -1993. - Vol.23, №10 - P.2692-2695.

42. Strieter R.M., Koch A.E., Antony V.B., Fick R.B., Standiford T.J., Kunkel C.L. The immunopathology of chemotactic cytokines: the role of interleukine-8 and monocyte chemoattractant protein-1 // Journal of Laboratory Clinical Medicine. - 1994. - Vol.123, №2 -P.183-197.

43. Szekanecz Z., Shah M.R., Pearce W.H., Koch A.E. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and soluble ICAM-1 (sICAM-1) production by cytokyne-activated human aortic endothelial cells: a possible role for ICAM-1 and sICAM-1 in atherosclerotic aortic aneurysms // Journal of Clinical Experimental Immunology. - 1994. - Vol.98, №2 - P.337-343.

44. Takahashi R., Sawasaki Y. Letter to editor.Human endothelial cell line, ECV304, produces pro-urokinase // In Vitro Cell Dev.Biology. - 1991. - Vol.27A. - P.766-768.

45. Takahashi R and Sawasaki Y. Rare spontaneously transformed human endothelial cell line provides useful research tool // In Vitro Cell Dev.Biology - 1992. - Vol.28A - P.380-382.

46. Thornhill M.H., Haskard D.O. IL-4 regulates endothelial cell activation by IL-1, tumor necrosis factor or IFN-y // Journal of Immunology. - 1990. - Vol.145, №3 - P.865-872.

47. Thornhill M.H., Wellicom S.M., Mahiouz D.C., Lanchbury J.S.S., Kyang-aung U., Hascard D.O. Tumor necrosis factor combines with IL-4 or IFN-y to selectively enhance endothelial cell adhesiveness for T-cell //Journal of Immunology. - 1991. - Vol.146, №2 - P.592-598.

48. Tomasi T. The discovery of secretory IgA and the mucosal immune system // Immunology Today. -1992. - Vol.13 - P.416-421.

49. Van den Berg R.H., Faber-Krol M.C., Sim R.B., Daha M.R. The first subcomponent of complement, C1q, triggers the production of IL-8, IL-6 and monocyte chemoattractant peptide-1 by human umbilical vein endothelial cells // Journal of Immunology. - 1998. -Vol.161 - P.6924-6930.

50. Van der Meeren A., Squiban C., Gourmelon P., Lafont H., Gaugler M.H. Differential regulation by IL-4 and IL-10 of radiation-induced IL-6 and IL-8 production and ICAM-1 expression by human endothelial cells // Cytokine. - 1999. - Vol.11, №11 -P.831-838.

51. Villarette L.H., Remick D.G. Nitric oxide regulation of IL-8 expression in human endothelial cells // Biochemistry and Biophysical Research Communications.

- 1995. - Vol.211, №2 - P.671-676.

52. Voara R., Romero L.I., Karasek M.A. Interleukin-10 induces E-selectin on small and large blood vessel endothelial cells // Journal of Experimental Medicine. - 1996. - Vol.184, №3.

53. Warren J.B. Large vessel endothelial isolation // The endothelium: an introduction to current research. Wiley-Liss. - 1990. - P.263-272.

54. Weber C., Negrescu E., Pietsh A., Fraukenberger M., Zieglerheitbrock H.M.L., Sies W., Weber P.C. Inhibitors of protein tyrosine kinase suppress TNF-stimulated induction of endothelial cell adhesion molecules // Journal of Immunology. - 1995. - Vol.155, №1 - P.445-451.

55. Weigel G., Bertalanffy P., Dubsky P., Griesmacher A., Wolner E. Mycophenolic acid influences T helper 2 (Th2) cytokine induced expression of intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) on human endothelial cells // Clin. Chem. Lab. Med. -1999. - Vol.37, №3 - P.253-257.

56. Wheller S.K., Perretti M. Dexamethasone inhibits cytokine-induced intercellular adhesion molecule-1 up-regulation on endothelial cell lines // European Journal of Pharmacology. - 1997. - Vol.331, №1 - P.65-71.

57. Yong K., Cohen H., Khwaja A., Jones H.M., Linch D.C. Lack of effect of granulocyte-macrophage and granulocyte colony-stimulating factors on cultured human endothelial cells // Blood. - 1991. - Vol.77, №8

- P.1675-1680.

поступила в редакцию 18.02.2000 принята к печати 28.02.2000