ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ СИАЛИЛИРОВАННЫХ САХАРИДОВ

1. Способ ферментативного получения сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты, включающий стадии
a) предоставления по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки, которая содержит
(1) путь биосинтеза сиаловой кислоты, содержащий глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу;
(2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты; и
(3) гетерологичную сиалилтрансферазу;
b) культивирования по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки в ферментационном бульонее и в условиях, позволяющих получать указанный сахарид, содержащий по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты; и возможно
c) извлечения указанного сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты.
2. Генетически модифицированная микробная клетка для ферментативного получения сахарида, содержащего по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты, где генетически модифицированная микробная клетка содержит:
(1) синтетический путь биосинтеза сиаловой кислоты, содержащий глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу;
(2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты; и
(3) гетерологичную сиалилтрансферазу;
3. Способ по п. 1 или генетически модифицированная микробная клетка по п. 2, где путь биосинтеза сиаловой кислоты дополнительно содержит a) N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазу и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу; и/или b) N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразу и N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазу.
4. Способ по любому из пп. 1-3 или генетически модифицированная микробная клетка по п. 2 или 3, где генетически модифицированная микробная клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в SEQ ID NO 91;
2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO 92;
3) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99%, с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид, который представлен в SEQ ID NO 91;
4) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99%, с одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 92;
5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и
6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5).
5. Способ по любому из пп. 1-4 или генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 2-4, где генетически модифицированная микробная клетка содержит гетерологичную сиалилтрансферазу, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из
1) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая представлена в любой из SEQ ID NO: 1-33;
2) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая имеет сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с любой из аминокислотных последовательностей, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-33; и
3) фрагментов любого из полипептидов из (1) и (2).
6. Способ по любому из пп. 1-5 или генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 2-5, где генетически модифицированная микробная клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит и экспрессирует нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-33;
2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 34-66;
3) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-33;
4) нуклеотидных последовательностей, имеющих сходство последовательностей, составляющее по меньшей мере 80%, с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-66;
5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и
6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5).
7. Способ по любому из пп. 1-6 или генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 2-6, где акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамина, галактозы, N-ацетилгалактозамина, лактозы, лактулозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, мелибиозы, раффинозы, лакто-N-триозы II, 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-галактозиллактозы, 6'-галактозиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, 3-фукозил-6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы I и лакто-N-неофукопентаозы V.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где ферментационный бульон содержит по меньшей мере один источник углерода, и по меньшей мере один источник углерода предпочтительно выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, глицерина и их комбинаций.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где по меньшей мере одну генетически модифицированную микробную клетку культивируют в отсутствие и/или без добавления одного или более чем одного из: глюкозамина, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и N-ацетилнейраминовой кислоты.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где сахарид, содержащий по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты, выбран из группы, состоящей из 3'-сиалилгалактозы, 6'-сиалилгалактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы I, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы II.
11. Применение генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 2-7 для получения сиалилированного сахарида в способе ферментации с применением цельных клеток.
12. Сиалилированный сахарид, где указанный сиалилированный сахарид получен способом по любому из пп. 1-10 или путем применения генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 2-7.
13. Применение сиалилированного сахарида по п. 12 для приготовления пищевой композиции.
14. Пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один сиалилированный сахарид, предпочтительно по меньшей мере один сиалилированный олигосахарид, который получен способом по любому из пп. 1-9 или с использованием генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 2-7.
15. Пищевая композиция по п. 14, где пищевая композиция выбрана из группы, состоящей из лекарственных, фармацевтических композиций, смеси для грудных детей и пищевых добавок.