Исследование активности каталазы в тканях лягушки озерной Rana ridibunda при гипотермии и самосогревании

УДК 577.151.63

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В ТКАНЯХ ЛЯГУШКИ ОЗЕРНОЙ Rana ridibunda ПРИ ГИПОТЕРМИИ

И САМОСОГРЕВАНИИ

© 2004 г. Э.З. Эмирбеков, Н.Г. Магомедова, P.O. Мирская,

И. С. Мейланов, А.А. Эмирбекова

The seasonal distinctions were found between response to hypothermia (4-5°C) in different frog

tissues (braine, liver, kidney, heart and gastrocnemius muscles and erythrocytes). These differences

are caused by specificity of physiological functions and biochemical processes in various tissues.

Одной из важных компонент системы защиты клеток от свободных радикалов являются ферменты, катализирующие превращение свободных радикалов и активных форм кислорода в неактивные продукты [1].

Каталаза катализирует в клетках распад перекиси водорода (Н202) с образованием воды и молекулярного кислорода. Перекись кислорода образуется в клетках в результате различных реакций, диспропорционирования суперок-сидных радикалов в результате дыхания; ксантиноксидазной реакции; при окислении катехоламинов под действием моноаминоксидазы и т.д. [2, 3].

В разных тканях доминирующим источником Н202 являются различные химические процессы. Концентрация Н202 уменьшается в клетке не только в реакциях, катализируемых каталазой, но и в пероксидазной реакции. Поэтому активность каталазы в разных тканях отражает специфику, с одной стороны, физиологической функции, выполняемой данной тканью, а с другой стороны, особенность биохимических процессов, обеспечивающих эту физиологическую функцию.

При изменении температуры тела общий уровень метаболизма в тканях понижается, соответственно замедляются свободнорадикальные процессы. При этом активность ферментов антирадикальной защиты должна соответственно изменяться.

Цель данной работы - выяснение влияния температуры тела на активность каталазы в различных тканях озерной лягушки.

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на озерных лягушках (Rana ridibunda), отловленных в окрестностях г. Махачкала в летний (июнь - июль) и осенний (октябрь - ноябрь) периоды. Исследованы группы животных, подвергавшихся нормотермическому контролю с температурой тела 23-25°С (летом) и 18-20 °С (осенью); недельной гипотермии с температурой тела 4-5 °С; самосогреванию (18-20 °С).

Животных декапитировали, извлекали ткани мозга, печени, почки, икроножной мышцы, а также брали сыворотку крови. В гомогенатах ткани активность определяли по методу Королюк и др. [4]. Метод основан на способности Н202 образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Для определения активности каталазы в эритроцитах исходный гемолизат разводят таким образом, чтобы в пробе содержалось 30 мкг гемоглобина (НЬ).

Концентрацию последнего в исходной пробе определяли с помощью тест-набора гемоглобинцианидным методом.

Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиг-лобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.

Активность каталазы выражали в мкмолях Н202/мин на мг белка в тканях или мкмолях Н202/мин на мг НЬ в эритроцитах.

Количество белка определяли методом Лоури.

Статистическую обработку проводили с использованием компьютерной программы ЗМ^арЫсв. Различия считались достоверными при уровне значимости? < 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования приведены в табл. 1, 2. Из приведенных данных видно, что наибольшую активность каталаза проявляет в печени, так как именно в этом органе происходит детоксикация большинства ксенобиотиков и продуктов вторичного обмена. Она осуществляется в пероксисомах путем реакций пероксидации, в ходе которых и образуется значительное количество перекиси водорода. Поэтому в пероксисомах локализовано значительное количество каталазы клетки.

Таблица 1

Активность каталазы (мкмоль НгСЬ/мин на мг белка) в тканях озерной лягушки при гипотермии в летний период ________________(июнь - июль) (М ± т, п = 6)______________

Мозг Печень Почка Миокард Икроножная мышца Эритроциты

Контроль

М ± т 1,92 ± 0,02 803 ±21 137 ±3 17,2 ± 0,47 0,78 ± 0,03 104 ±2

Недельная гипотермия

М ± т 2,31 ±0,06 1108 ±24 182 ±5 21,6 ±0,3 0,14 ±0,01 75 ±3

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0,1 <0,001

Самосогревание

М ± т 1,77 ±0,06 950 ± 10 154 ± 2 19,4 ±0,5 0,54 ±0,02 100 ±4

Р <0,01 <0,001 <0,001 <0,01 <0,001 >0,1

Таблица 2

Активность каталазы

Мозг Печень Почка Миокард Икроножная мышца Эритроциты

Контроль

М ± т 3,1 ±0,17 988 ± 43 187 ±2 23,6 ± 0,43 0,92 ± 0,06 108 ±2

Р >0,1 <0,001 >0,1 >0,1 <0,05 >0,01

Недельная гипотермия

М ± т 2,6 ± 0,08 493 ± 15 96 ±6 21,8 ±0,36 0,17 ±0,03 91 ±3

Р

Самосогревание

М ± т 2,83 ± 0,06 1015 ±23 161 ±2 22,0 ± 0,97 0,64 ± 0,04 104 ±4

Р 0,17 0,61 0,004 0,18 0,004 0,37

Примечание. Здесь Р - достоверность различий по отношению к летнему контролю.

Высокая активность каталазы в эритроцитах обусловлена тем, что в них высока концентрация кислорода, железа и активность пентозофосфатного пути, дающего восстановительные эквиваленты. В результате этого в эритроцитах довольно интенсивно идет генерация супероксидного радикала, который инактивируется супероксиддисмутазой с образованием Н202. [3] Образующаяся Н202 разлагается под действием каталазы. Уровень активности каталазы отражает уровень одноэлектронного восстановления кислорода железом гемоглобина, поскольку митохондрий в эритроцитах нет.

Активность каталазы высока также в почках. Поскольку почки выполняют значительную осмотическую работу, для чего требуется значительное количество энергии, поставляемой митохондриями, то образование супероксид-ных радикалов в митохондриях почек должно коррелировать с интенсивностью энергетического обмена в них. Необходимо отметить, что на активность каталазы оказывает влияние изменение путей генера-ции антиоксидантного фермента в клетках в условиях эксперимента. Особенно это касается процессов детоксикации. Известно, что детоксикация ксенобиотиков осуществляется системой микросомального окисления с участием терминальной моноок-сигеназы - цитохрома Р-450, при этом генерируется до 75 % антиоксидантного фермента.

С другой стороны известно, что в клетках печени и почек каталаза участвует в окислении перекисью водорода различных субстратов (фенолов, муравьиной кислоты, формальдегидов, спиртов) [5].

Таким образом, высокая активность в почках обусловлена достаточно высокой скоростью процессов, происходящих в пероксисомах и митохондриях.

Другим важным субстратом пероксисом в клетках печени и почек являются жирные кислоты, которые служат источником энергии для клеток этих органов. Поэтому активность каталазы в пероксисомах определяется не только уровнем детоксикации, но и уровнем энергетического обмена.

Обращает на себя внимание довольно низкая активность каталазы в мозге, несмотря на высокий уровень окислительных процессов в нейронах. В нормально функционирующем мозге основным субстратом является глюкоза, а ксенобиотики в значительных количествах из крови в мозг не поступают [6].

Следовательно, активность пероксисом не должна быть высокой. А основная масса генерируемого супероксидного радикала обусловлена активностью дыхательной цепи митохондрий. Кроме того, свободные радикалы в мозге играют сигнальную роль и поэтому их количество должно быть жестко регулируемо. В митохондриях образующийся супероксидный радикал может реагировать с МЭ-радикалом с образованием пероксинитрита, который реагирует далее с С02 с образованием С03 и Ы02 радикалов. Они далее реагируют с НАДН, восстанавливаясь до углекислоты и нитрита [7].

Таким образом, супероксид может инактивироваться в мозге без образования Н202 внутри митохондрий вследствие высокой концентрации НАДН.

Низкая активность каталазы в мышце обусловлена низким уровнем окислительных процессов, поскольку основным источником энергии в работающей мышце является гликолиз. В отличие от скелетной мышцы интенсивность окислительных процессов в сердце значительно выше, следовательно, здесь и выше уровень Н202. Этому соответствует более высокий уровень активности каталазы.

При гипотермии активность каталазы в тканях изменяется (табл. 1). В мозге она возрастает на 20 %, в печени - на 38, в почках - на 33, в сердце - на 33 %. В икроножной мышце и эритроцитах активность каталазы снижается на 82 и 28 % соответственно.

При гипотермии уровень всех химических превращений замедляется, в том числе и свободнорадикальных. Поэтому увеличение активности каталазы в указанных тканях не может быть объяснено интенсификацией свободнорадикальных процессов. Известно, что свободные радикалы могут окислять различные группировки в молекуле фермента, поэтому при снижении интенсивности свободнорадикальных процессов возможна регенерация активной формы фермента за счет восстановителей, которых всегда достаточно много в клетке [8].

Уменьшение активности каталазы в скелетной мышце возможно обусловлено стимуляцией терморегуляторной активности в скелетной мускулатуре и соответственно окислительных процессов в ней. Так, в [9] показано, что при

5 °С в мышце лягушки регистрируется электрическая активность, напоминающая миограмму дрожи мышц у гомойотермов.

Снижение активности каталазы в эритроцитах, по-видимому, можно объяснить снижением скорости пентозофосфатного пути при низких температурах тела, вследствие чего уменьшается количество восстановительных эквивалентов в клетке и, следовательно, растет степень окисленности фермента, что ведет к снижению его активности.

В осенний период происходит изменение активности каталазы (ИАК) в тканях (табл. 2). В мозге активность фермента повышалась на 61 %, в печени - на 23, в почках - на 36, в миокарде - на 37, в икроножной мышце - на 18 % по сравнению с летним контролем. В эритроцитах статистически достоверных изменений по сравнению с летним контролем нет.

Эти изменения можно объяснить тем, что организм лягушки в этот период года подготавливается к гипобиозу и при этом уровень генерации свободных радикалов уменьшается, что ведет к повышению активности каталазы в связи с повышением восстановленности фермента.

Гипотермия осенних лягушек также вызывает ИАК в тканях. В мозге активность снижается на 14 %, в печени - на 50, в почках - на 79, в миокарде -на 8, в скелетной мышце - на 82, в эритроцитах - на 16 % по сравнению с осенним контролем.

Таким образом, изменения в мозге, печени, почках и сердце осенней лягушки противоположны реакции летних лягушек. В икроножной мышце и эритроцитах изменения имеют ту же направленность, что и для летних животных.

В рамках той модели, которая использована нами для интерпретации полученных результатов, следует предположить, что при гипотермии осенних лягушек происходит активация свободнорадикальных процессов во всех исследованных тканях.

Эффекты гипотермии осенью имеют противоположную направленность для мозга, печени, почки, сердца, но величины этих эффектов сохраняют тканевую специфичность.

При самосогревании летних и осенних лягушек после недельной гипотермии, несмотря на различную реакцию в тканях летом и осенью, активность каталазы изменяется в сторону контрольных значений, т.е. самосогревание приводит к изменениям, противоположным, вызванным гипотермией. Изменения, вызванные самосогреванием летом и осенью, в количественном отношении сходны. Эго говорит о том, что ИАК, вызванные недельной гипотермией, как у летних, так и у осенних лягушек обратимы, и уже простое повышение температуры тела (которое происходит за 15-40 мин в зависимости от времени года) вызывает ИАК в направлении контрольных значений.

Оценивая в целом активность каталазы в тканях лягушки при гипотермии летом и осенью, следует учитывать, что гипотермические состояния не являются для пойкилотермов стрессорными. И, следовательно, ИАК вряд ли несут на себе следы окислительного стресса в большинстве тканей. Обратимость этих изменений также свидетельствует в пользу этого предположения.

Литература

1. Кулинский В.И. II Соросовский образовательный журн. 1999. № 1. С. 2-7.

2. StoreyК.В. //Braz. J. Med. Biol. Res. 1996. Vol. 29. № 12. P. 1715-1733.

3. Fridovich I. II J. Exp. Biol. 1998. Vol. 201. P. 1203-1209.

4. КоролюкМА. и др. И Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.

5. Уайт А. и др. Основы биохимии. М., 1981.

6. Бредбери М. Концепция гемато-энцефалического барьера. М., 1983.

7. KirshM., De GrootH. ИFASEB J. 2001. Vol. 15. P. 1569-1574.

8. Kirkman H.N., Galiano S., Gaetan G.F. // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262.

P. 660-666.

9. Тимофеев H.H., Прокопьева Л.П. Нейрохимия гипобиоза и пределы криорезистентности организма. М., 1997.

Дагестанский государственный университет 20 марта 2004 г.