Трансфекция клеток НЕК293 и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека in vitro плазмидами с помощью высокомолекулярного полиэтиленимина

вреждения не просто физиологическим раствором, а стерильной питательной средой. Внутри такого раствора-биореактора создаются условия для выращивания биоискусственных органов. Итак, в растворе-биореакторе, где находится поврежденный сегмент конечности, одновременно выращивается графт. При этом матрица биоискусственной части восстанавливаемого органа плотно взаимодействует с раневой поверхностью. Матрица может иметь различную форму, структуру и состав, и даже наращиваться и собираться в ходе восстановления органа, сразу или постепенно воспроизводя его форму. Эта же матрица является индуктором и проводником репаративной регенерации «по каркасу», в первую очередь для сосудов и нервов из дна раны, обеспечивая интеграцию тканеинженерной конструкции сразу с началом и параллельно ее формированию. Проблема интеграции и васкуляризации трехмерных тканеинженерных конструкций актуальна и в данном случае решается не префабрикацией или использованием принципа трехкомпонентной клеточной культуры, создания артифициальных микрососудистых собственных сосудистых сетей децелюллированной ткани и т.д., а иным путем. Это новая технология восстановления органов эффективна за счет объединения параллельно идущих и взаимно потенцирующих друг друга процессов: репаративной регенерации по каркасу и восполнения травматического дефекта поврежденного органа биоискусственной составляющей, выращиваемой непосредственно на ране.

Н.В. Кудряшова 1, И.И. Салафутдинов 1,

И.Г. Мустафин а, P.P. Исламов а,

А.А. Ризванов 1 а Трансфекция клеток НЕК293 и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека in vitro плазмидами с помощью высокомолекулярного полиэтиленимина

1 ФГАОУВПО «Казанский [Приволжский} федеральный университет», Казань, Россия

2 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия nkudryashova@gmail.com

N.V. Kudryashova, l.l. Salafutdinov, I.G. Mustafin,

R.R. Islamov, A.A. Rizvanov

Transfection of НЕК2ЭЗ and human multipotential mesenchymal stromal cells in vitro with plasmids using high molecular weight polyethyleneimine

В настоящее время большое значение уделяют стимуляции регенеративных процессов в организме. Одно из перспективных направлений — разработка методов генно-клеточной терапии. В основе подхода лежит генетическая модификация клеток in vitro и ex vivo для коррекции генетического дефекта или для повышения экспрессии рекомбинантных терапевтических биомолекул. Затем генетически модифицированные клетки могут быть трансплантированы пациенту для лечения широкого спектра дегенеративных и ишемических заболеваний. Применение плазмидных экспрессионных векторов — один из наиболее биологически безопасных подходов для генетической модификации клеток. Основной недостаток плазмид — низкая эффективность трансфекции и высокая стоимость химических транс-фекционных препаратов. Кроме того, трансфекционные препараты зачастую обладают выраженной цитотоксичностью. Отдельную проблему представляет низкая

эффективность трансфекции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК).

Полиэтиленимины (polyethyleneimine, РЕП — нано-размерные положительно заряженные (катионные) частицы, состоящие из синтетического полимера — продукта полимеризации этиленимина. PEI способны конденсировать нуклеиновые кислоты и эффективно проникать внутрь клетки. Для трансфекции клеток чаще всего применяют низкомолекулярные PEI (например 25 ООО кДа). Однако низкомолекулярные PEI обладают относительно высокой цитотоксичностью по сравнению с высокомолекулярными PEI. Кроме того, на сегодняшний день недостаточно исследован вопрос применения высокомолекулярных PEI для трансфекции стволовых клеток человека, в частности ММСК.

Задачи исследования: оценить эффективность трансфекции клеток НЕК293 и ММСК плазмидами, экспрессирующими репотерные белки LacZ (р-галак-тозидаза) и GFP (зелёный флуоресцентный белок), с помощью высокомолекулярного PEI.

Материал и методы. Работу проводили в ламина-ре 2 класса биологической защиты. Клетки НЕК293 культивировали на среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров FBS и пенициллина/стрептомицина. Культуру ММСК получали методом эксплантации из зачатков зубов мудрости подростков и поддерживали в питательной среде —МЕМ с добавлением 10% FBS и пенициллина/стрептомицина. В работе использовали PEI с молекулярной массой 60 ООО кДа (Acros Organics). Трансфекционный реагент TurboFect (Fermentas) использовали в качестве контроля в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. В качестве репотерных генетических конструкций использовали плазмиды pEGFP-N2 (Clontech), кодирующую ген зелёного флуоресцентного белка GFP, и pAAV-LacZ, р

GFP проводили с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Анализ экспрессии LacZ проводили на планшетном спектрофотометре по уровню накопления продуктов гидролиза о-нитро-р

Результаты и обсуждение. В работе использовали соотношения PEI к плазмидной ДНК (мпмг) 0,5:1, 0,5:2, 1:1 и2:2. Показано, что экспрессия LacZ в клетках НЕК293 при трансфекции с помощью PEI составила приблизительно 50% от уровня экспрессии в клетках, трансфицированных TurboFect. В то же время уровень экспрессии LacZ в МСК, трансфицированных PEI (в соотношении 1:1) или TurboFect, значительно не различались. Таким образом, показано, что высокомолекулярный PEI способен конденсировать плазмид-ную ДНК с последующей трансфекцией клеток НЕК293 и ММСК. В дальнейшем мы планируем продолжить работы по оптимизации режимов трансфекции ММСК препаратами на основе высокомолекулярных PEL

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010