СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
METHOD FOR IDENTIFICATION AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF ASCORBIC ACID

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья (ЛРС), изделий пищевой, химической и косметологической отраслей промышленности по содержанию аскорбиновой кислоты, и может быть использовано в фармацевтической, химической и косметологической отраслях промышленности.
В настоящее время тонкослойная хроматография (ТСХ) в фармацевтическом анализе применяется для оценки подлинности и чистоты аскорбиновой кислоты в субстанции и в лекарственных формах [1-10]. ТСХ, обладая всеми преимуществами хроматографических методов, находит широкое применение ввиду своей экспрессности, доступности, достаточной чувствительности, селективности и простоте выполнения анализа. Тем более, что разработанные в последнее десятилетие новые неподвижные фазы, оборудование для нанесения проб, новые методы элюирования пластинок и количественного определения с использованием сканирующих денситометров способны обеспечить более низкое разрешение, лучшее детектирование и воспроизводимость результатов качественного и количественного хроматографического анализа.
f
Известен способ определения аскорбиновой кислоты на приборе «Денситометр Сорбфил», оснащенном компьютерной обработкой данных [3], заключающийся в хроматографировании пробы на силикагелевых пластинках с люминофорным содержанием в системе ацетон - спирт метиловый - уксусная кислота (3:1:1). Условия разделения хроматограммы: температура 20-22°C, насыщение камеры парами подвижной фазы в течение 20-30 мин. Для обнаружения аскорбиновой кислоты на хроматограмме в способе используется детектирование в УФ-свете. (254 нм). Аскорбиновая кислота обнаруживается в виде темного пятна на ярко-зеленом флюоресцирующем фоне. Данный способ не лишен недостатков. Во-первых, детектирование зон при помощи УФ-света затрудняет сканирование хроматограмм и приводит к получению больших ошибок в результатах количественного определения. Во-вторых, способ не может быть использован для определения аскорбиновой кислоты в сложных многокомпонентных объектах исследования, так как УФ-свет не является специфичным детектором зон аскорбиновой кислоты (табл. 1), что может приводить к обнаружению других посторонних веществ на хроматограммах с близкими значениями величины R. Кроме того, в способе в состав элюента входит высокотоксичный растворитель - метанол, пары которого негативным образом отражаются на здоровье специалистов, выполняющих определение по данной методике, что также можно отнести к недостаткам данного способа - аналога.
f
f
f
Известен способ определения аскорбиновой кислоты на приборе «Видеоденситометр Сорбфил», оснащенном компьютерной обработкой данных, в траве бурды плющевидной [1], заключающийся в хроматографировании пробы на силикагелевых пластинках «Sorbfil ПТСХ-П-В» в системе н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1). Для обнаружения аскорбиновой кислоты на хроматограмме в способе используется 0,01 М водный раствор серебра нитрата. Аскорбиновая кислота обнаруживается в виде темно-серых пятен на белом фоне. Данный способ характеризуется недостатками. Детектирование зон при помощи водных растворов приводит к растворению и частичному отслоению слоя силикагеля от подложки пластины, поэтому не рекомендуется использовать водные детектирующие реагенты для обработки хроматограмм [11]. Во-вторых, в способе на хроматограммах получают зоны аскорбиновой кислоты величиной R=0,75, тогда как оптимальным для практической ТСХ является интервал значений R от 0,3 до 0,6 [11]. Способ не может быть использован для определения аскорбиновой кислоты в сложных многокомпонентных объектах исследования, так как серебра нитрат не является специфичным детектором зон аскорбиновой кислоты (табл. 1), реагируя со всеми веществами, способными окисляться, что может приводить к обнаружению других посторонних веществ на хроматограммах с близкими значениями величины R, а также завышению результатов анализа. Интенсивность окраски зон на хроматограммах после проявления нестабильна во времени и изменяется под воздействием солнечного света, что также сказывается на точности определения. Следует также отметить, что чувствительность обнаружения аскорбиновой кислоты на порядок ниже, чем в предлагаемом способе (табл. 1). Кроме того, в способе в качестве проявителя используется очень дорогостоящий и нестойкий серебра нитрат, что значительно повышает стоимость одного анализа, а следовательно, также является недостатком данного способа - прототипа.
В научно-фармацевтической, медицинской и патентной литературе способов, позволяющих проводить определение подлинности, степени чистоты и количественного содержания аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей и отделения аскорбиновой кислоты от других биологически активных веществ (в том числе других органических кислот) с применением ТСХ, не обнаружено.
Задача изобретения: состоит в разработке способа определения подлинности, степени чистоты и количественного содержания субстанции аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей аскорбиновой кислоты с другими биологически активными веществами и стандартизации лекарственных препаратов, лекарственного растительного сырья, изделий пищевой, химической и косметологической промышленностей по содержанию аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной ТСХ.
f
f
Технический результат - повышение точности, а также возможность одновременного определения подлинности, степени чистоты и количественного определения аскорбиновой кислоты, разделения сложных смесей и отделения аскорбиновой кислоты от других биологически активных веществ в одно- и многокомпонентных лекарственных препаратах, биологически активных добавках, лекарственном растительном сырье, изделиях пищевой, химической и косметологической промышленности достигается тем, что навеску исследуемого препарата растворяют в воде или этаноле с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» 5×10 см с алюминиевой подложкой ПТСХ-А-А в системе растворителей состава: этилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15) с последующим детектированием хроматограмм 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты (субстанция, монокомпонентные лекарственные формы) или 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (многокомпонентные лекарственные препараты, биологически активные добавки, лекарственное растительное сырье). Оптимальный объем пробы - 2 мкл спиртового раствора с содержанием аскорбиновой кислоты 2 мг/мл. Причем время насыщения камеры парами элюента составляет 20 мин, время элюирования - 35 мин, а время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t≥80°С - 3-5 мин. Сразу же после проявления хроматографических зон пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1 и 2) обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». В результате получают треки в координатах R - интенсивность (фиг. 3). Величина R аскорбиновой кислоты составляет 0,43±0,02. Содержание аскорбиновой кислоты (с, мкг) в пробе, нанесенной на хроматограмму, можно рассчитать по формуле 1 (в случае анализа многокомпонентных лекарственных препаратов, биологически активных добавок, лекарственного растительного сырья) и 2 (в случае анализа субстанции, монокомпонентных лекарственных форм):
где S - значение площади хроматографической зоны на хроматограмме, вычисленное с помощью компьютерной программы «Sorbfil Videodensitometer».
Изобретение проиллюстрировано графиками, чертежами, схемами, таблицами, где в таблице 1 представлена характеристика детектирующих реагентов для определения аскорбиновой кислоты в тонком слое сорбента. На фиг. 1 изображена калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов (0,15-0,45%) аскорбиновой кислоты (проявитель - 0,2% спиртовой раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия): 1-3 мкг; 2-4 мкг; 3-5 мкг; 4-6 мкг; 5-7 мкг; 6-8 мкг; 7-9 мкг. Объем пробы 2 мкл. Фиг. 2. демонстрирует вид калибровочной хроматограммы с серией стандартных растворов (0,05-0,40%) аскорбиновой кислоты (проявитель - 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты): 1-1 мкг; 2-2 мкг; 3-3 мкг; 4-4 мкг; 5-5 мкг; 6-6 мкг; 7-8 мкг. Объем пробы 2 мкл. На фиг. 3 дана аналоговая кривая стандартного раствора аскорбиновой кислоты. На фиг. 4 представлен градуировочный график для определения содержания аскорбиновой кислоты в области концентраций (0,15-0,45%). Проявитель - 0,2% спиртовой раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. На фиг. 5 изображен градуировочный график для определения содержания аскорбиновой кислоты в области концентраций (0,05-0,30%). Проявитель - 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты. Фиг. 6 демонстрирует вид хроматограммы извлечения из листьев крапивы двудомной после проявления 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (1-3 мкл; 2-5 мкл и 3-10 мкл извлечения). Вид хроматограммы извлечения из свежих плодов облепихи крушиновидной после проявления 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (1-10 мкл; 2-20 мкл извлечения) представлен на фиг. 7. В таблице 2 приведены результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в извлечениях из лекарственного растительного сырья. Метрологическая оценка предложенной в способе методики представлена в табл. 3 (на примере плодов облепихи крушиновидной).
Способ идентификации и количественного определения глутаминовой кислоты реализуется следующим образом.
f
Навеску исследуемого препарата растворяют в воде или этаноле с последующим хроматографированием с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» 5×10 см с алюминиевой подложкой ПТСХ-А-А в системе растворителей состава: этилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15) с последующим детектированием хроматограмм 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты (субстанция, монокомпонентные лекарственные формы) или 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (многокомпонентные лекарственные препараты, биологически активные добавки, лекарственное растительное сырье). Оптимальный объем пробы - 2 мкл спиртового раствора с содержанием аскорбиновой кислоты 2 мг/мл. Причем время насыщения камеры парами элюента составляет 20 мин, время элюирования - 35 мин, а время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t≥80°С - 3-5 минут. Сразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 1 и 2) обрабатывают известной компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» В результате получают треки в координатах R - интенсивность (фиг. 3). Установлены линейные зависимости между содержанием аскорбиновой кислоты и площадью хроматографической зоны (фиг. 4 и 5) в диапазоне изучаемых концентраций (0,15-0,45% - проявитель - 0,2% спиртовой раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия; и 0,05-0,40% - проявитель - 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты). По полученным результатам были построены градуировочные графики, иллюстрирующие эту зависимость (фиг. 4 и 5).
f
Данный способ позволяет не только получать на хроматограммах четкие зоны аскорбиновой кислоты округлой формы с оптимальным значением величины R, но и проводить разделение сложных смесей аскорбиновой кислоты с другими биологически активными веществами, а также оценивать ее количественное содержание в образцах.
Использование двух калибровочных кривых в способе позволяет значительно расширить область его применения. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов аскорбиновой кислоты и построенный на ее основе график зависимости площади зоны от концентрации вещества в пробе (фиг. 5) при использовании в качестве проявителя 5% раствора ФМК может использоваться в контроле качества субстанции и монокомпонентных лекарственных форм витамина С. Данный реагент не является специфическим для аскорбиновой кислоты и на хроматограммах проявляет и другие зоны сопутствующих веществ, что снижает качество картины разделения и затрудняет обработку полученных изображений. Однако, ввиду большей чувствительности ФМК (табл. 1), возможно определять количественное содержание витамина С в образцах с низким его содержанием или работать с более разбавленными растворами, исключая процедуру концентрирования растворов.
Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов аскорбиновой кислоты и построенный на ее основе график зависимости площади зоны от концентрации вещества в пробе (фиг. 4) при использовании в качестве проявителя 0,2% спиртового раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, может использоваться в контроле качества лекарственного растительного сырья, многокомпонентных лекарственных препаратов, биологически активных добавок, изделиях пищевой, химической и косметологической промышленности. Данный реагент является специфическим для аскорбиновой кислоты и на хроматограммах не проявляет другие зоны сопутствующих веществ. Это позволяет работать с водными извлечениями из лекарственного растительного сырья, которые содержат целый комплекс биологически активных веществ, и селективно определять содержание аскорбиновой кислоты в образце.
Ошибка в определении концентрации аскорбиновой кислоты будет уменьшаться с увеличением «а» в уравнении y=ax+в, следовательно, применение градуировочного графика для определения содержания аскорбиновой кислоты, где а=12467 (фиг. 5) приводит к более точным результатам по сравнению с результатами, полученными по графику, представленному на фиг. 4, где а=9233,6. Наличие в регрессионном уравнении коэффициентов b, отличных от нуля и равных 1550,1 и 5460,2 говорит о постоянной систематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фона пластины на оценку яркости окрашенной хроматографической зоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».
-6
-7
Способ позволяет проводить определение подлинности, степени чистоты и количественного содержания субстанции аскорбиновой кислоты и стандартизировать лекарственные препараты, лекарственное растительное сырье, изделия пищевой, химической и косметологической промышленностей по содержанию аскорбиновой кислоты и отличается достаточной чувствительностью (2·10 г при проявлении пластин 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия и 4·10 г при проявлении пластин раствором фосфорномолибденовой кислоты), экономичностью, доступностью и экспрессностью.
Способ иллюстрируется следующими конкретными примерами.
Пример 1. Разработанный способ идентификации и количественного определения витамина С был апробирован на лекарственном растительном сырье листьев крапивы двудомной.
Получение извлечения: Около 5,0 г (точная навеска) измельченных листьев крапивы двудомной с размером частиц 1,0-0,5 мм помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 58 мл воды (с учетом коэффициента водопоглощения сырья) и выдерживают в течение 10 мин на кипящей водяной бане, затем охлаждают 45 мин, фильтруют через несколько слоев марли, отжимая ЛРС, и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Доводят объем извлечения водой до метки и перемешивают. Полученную суммарную вытяжку в количестве 3, 5 и 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа. Высота пробега элюента 8-9 см. Вид хроматограммы представлен на фиг. 6. Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 6) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в извлечении из листьев крапивы двудомной представлены в табл. 2.
Пример 2. Разработанный способ идентификации и количественного определения витамина С был апробирован на лекарственном растительном сырье плодов облепихи крушиновидной свежих.
Получение извлечения: Около 5,0 г (точная навеска) плодов облепихи разминают и помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 50 мл воды и выдерживают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, затем охлаждают в течение 10 мин, фильтруют через несколько слоев марли, отжимая ЛРС, и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Доводят объем извлечения водой до метки и перемешивают. Полученную суммарную вытяжку в количестве 10 и 20 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом. Высота пробега элюента 8-9 см. Вид хроматограммы представлен на фиг. 7. Сразу же после проявления хроматограмм пластины сканируют с помощью планшетного сканера EPSON PERFECTION 2480 PHOTO (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (фиг. 7) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в извлечении из плодов облепихи крушиновидной представлены в табл. 2.