ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ БЕЛКА Е ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В ГОМОГЕНАТЕ КЛЕЩА

Полезная модель относится к устройствам для иммунохроматографического определения вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) для экспресс-диагностики наличия ВКЭ в гомогенате клеща и может быть использована в здравоохранении, биотехнологии и иммунологии.
Заявляемая тест-система предназначена для одностадийного выявления in vitro ВКЭ в гомогенате клеща. Она служит вспомогательным средством при исследовании гомогената клещей на содержание ВКЭ и предназначена для использования специалистами здравоохранения в клинических лабораториях, поликлиниах и стационарных лечебно-профилактических учреждениях; аптеках; сельских учреждениях здравоохранения (ФАПы); страховых компаниях.
Объектом патентования является аналитическая иммунохроматографической тест-системы для одноэтапного определения антигена - поверхностного структурного белка Е вируса клещевого энцефалита в измельченной и гомогенизированной массе иксодового клеща (тест-стрип). Указанный белок является консервативным и менее изменчивым в процессе мутации вируса, что обеспечивает надежность анализа клещей на вирус КЭ. Стрип-диагностика - современное и интенсивно развивающееся направление быстрой бесприборной качественной или полуколичественной диагностики разнообразных заболеваний человека по анализу биологических жидкостей. Анализ основан на новейших методиках иммунохроматографии и сухой цветной химии.
Среди разработанных в мире иммунохроматографических тест-систем отсутствует анализ на наличие ВКЭ в клеще или крови человека.
Известны эспресс тест-системы для иммунохроматографического определения антител IgG (CN, 101363864, МПК G01N 33/545, опубл. 2009.02.11) и IgM (CN, 101363866, МПК G01N 33/545, опубл. 2009.02.11) к вирусу японского энцефалита в образцах, разработанные китайской компанией BEIJING ZHUANGDI НАОНЕ BIOMEDI. Тест-системы содержат иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка. Подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми antihuman моноклональными антителами, специфичными к антителам IgG или IgM к вирусу японского энцефалита, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые antihuman моноклональные антитела и контрольная полоса.
Однако данные тест-системы не позволяют выявлять поверхностный белок Е вируса клещевого энцефалита в гомогенате клеща. Причем выше описанные стрипы состоят из конструктивных элементов, обеспечивающих анализ образцов крови, т.е. на подложке вначале расположена фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца, а затем подушка для нанесения конъюгата. Фильтрационная подушка обеспечивает удаление из жидкого образца форменных элементов крови, а затем жидкий образец проходит подушку для нанесения конъюгата, в которой образуется иммунный комплекс «антиген-антитело». Однако такая конструкция стрипа обеспечивает недостаточное время образования иммунного комплекса.
В предлагаемой конструкции стрипа исследуемый жидкий образец в виде гомогената клеща, в отличие от образца крови, не требует столь тщательной очистки жидкого образца от посторонних компонентов, что позволяет разместить зону приема образца и полосу конъюгата на одной подушке, а фильтрационная подушка обеспечивает более продолжительное время контакта жидкого образца с конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными антителами специфичными к белку Е вируса клещевого энцефалита.
Из источников патентной информации не обнаружены иммунохроматографические экспресс-тесты для выявления поверхностного белка Е вируса КЭ в гомогенате клеща.
Известны средство (тест-система) и способ экспресс-диагностики клещевого энцефалита (КЭ) путем выявления антигена вируса КЭ иммуноферментным анализом крови (патент РФ №2217758, МПК G01N 33/569, опубл. 27.11.2003 г.), Забор крови проводят у лиц с укусом клеща, кровь берут из вены в объеме 5-10 мл в пробирку с раствором гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, отстаивают в течение 50-60 мин при 23-25°С или в течение 25-30 мин при 35-37°С, отбирают лейкоцитарную взвесь из верхнего слоя пробы, отмывают ее рабочим раствором, лейкоцитарную массу осаждают центрифугированием 10 мин при 1500 об/мин, при этом исследование проводят в день забора крови и по наличию в лейкоцитарной массе специфических антигенов диагностируют клещевой энцефалит.
Недостатком указанных средства и способа является то, что определение антигена вируса КЭ производится в образце крови пациента, что не позволяет установить сразу после укуса клеща является ли он носителем вируса КЭ и предпринять соответствующие. превентивные меры.
По назначению наиболее близким аналогом (прототипом) является средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита (патент РФ №2247991, МПК G01N 33/569, опубл. 10.03.2005 г.). Средство содержит подложку (предметное стекло), на которой сформирована реакционная зона путем нанесеня исследуемого материала в виде субстрата или его разведения в количестве 15-20 мкл и равного количества реагента для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита. Реагент содержит 2%-ный коагглютинирующий состав, полученный путем сенсибилизации 10%-ной стафилококковой субстанции с высокоочищенным и высокоавидным иммуноглобулином против клещевого энцефалита. Способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита с использованием средства-прототипа включает нанесение на подложку (предметное стекло) исследуемого материала в виде субстрата или его разведения в количестве 15-20 мкл, добавление равного количества средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоочищенным и высокоавидным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательно перемешивании путем покачивания предметного стекла и через 2-7 мин визуально определяют по феномену коагглютинации наличие и/или количество антигена вируса клещевого энцефалита. Положительным результатом предлагаемого способа считают коагглютинацию на +3 +2. За титр антигена (1 коагглютинирующая единица - КОАЕ) принимают его последнее разведение, давшее интенсивную коагглютинацию (на +2).
Недостатком указанного средства для экспресс-диагностики антигена вируса (поверхностного белка Е) клещевого энцефалита в субстрате гомогената клеща является неудобство проведения реакции коагглютинации (смешивание жидких реагентов на предметном стекле, титрование образцов и т.д.) а также необходимость оценки полученных результатов анализа квалифицированным специалистом (визуальное определение по феномену коагглютинации), которое не сопровождается существенным изменением цвета исследуемого субстрата и, тем более, полуколичественная оценка полученных результатов.
Техническим результатом является упрощение экспресс-диагностики белка Е вируса клещевого энцефалита в гомогенате клеща без привлечения квалифицированного персонала.
Указанный технический результат достигается тем, что в тест-системе для иммунохроматографической экспресс-диагностики белка Е вируса клещевого энцефалита в гомогенате клеща, содержащей подложку для проведения реакции взаимодействия «антиген-антитело», согласно полезной модели, на подложке последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости подушка для нанесения жидкого исследуемого образца и конъюгата, фильтрационная подушка, пористая хроматографическая мембрана и абсорбционная подушка, причем, подушка для нанесения исследуемого образца и конъюгата имеет зону приема исследуемого жидкого образца в виде гомогената клеща и поперечную полосу из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к поверхностному белку Е вируса клещевого энцефалита, адсорбированных в теле указанной подушки, расположенную после зоны приема жидкого исследуемого образца по ходу движения последнего под действием капиллярных сил, а в теле пористой хроматографической мембраны, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы вторых моноклональных мышиных антител, специфичных к поверхностному белку Е вируса клещевого энцефалита и контрольная полоса, содержащая сухие адсорбированные частицы кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши.
В качестве первых моноклональных мышиных антител, специфичных к поверхностному белку Е вируса клещевого энцефалита она содержит моноклональные мышиные антитела 14D5, а в качестве вторых моноклональных мышиных антител - моноклональные мышиные антитела 1В1.
В качестве кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши она содержит адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).
Тест-система снабжена корпусом, представляющим собой иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которого размещены подложка, подушка для нанесения жидкого исследуемого образца и конъюгата, фильтрационная подушка, пористая хроматографическая мембрана и абсорбционная подушка.
2
Подушка для нанесения образца и конъюгата выполнена из целлюлоза или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна с размером пор 20-25 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см.
2
Фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона с толщиной слоя 600-650 мкм и объемом пор 55-57 мкл/см.
Пористая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона,, или нейлона с толщиной слоя 125-155 мкм и
Абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна с толщиной слоя 400-450 мкм.
Подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала с толщиной слоя. 230-270 мкм.
Указанные технические элементы тест-системы позволяют просто и надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста.
На фиг.1 приведена схема внешнего вида тест системы, выполненной в виде иммунологической планшеты, а на фиг.2 - схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете.
Тест-система для проведения иммунохроматографического анализа содержит иммунологическую планшету 1 с овальным окном 2 для внесения образца и прямоугольным окном 3 для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты 1 размещены подложка 4, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены с сохранением капиллярной проводимости подушка 5 для нанесения жидкого исследуемого образца и конъюгата, фильтрационная подушка 6, пористая хроматографическая мембрана 7 и абсорбционная подушка 8.
2
Подушка 5 для нанесения образца и конъюгата выполнена из целлюлоза или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна с размером пор 20-25 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см.
2
Фильтрационная подушка 6 выполнена из пористого материала полисульфона с толщиной слоя 600-650 мкм и объемом пор 55-57 мкл/см.
Пористая хроматографическая мембрана 7 выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона,, или нейлона с толщиной слоя 125-155 мкм.
Абсорбционная подушка 8 выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна с толщиной слоя 400-450 мкм.
Подложка 4 выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала с толщиной слоя .230-270 мкм.
Подушка 5 для нанесения исследуемого образца и конъюгата имеет зону 9 приема исследуемого жидкого образца в виде гомогената клеща и поперечную полосу 10 из сухих частиц конъюгата коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами 14D5, специфичными к поверхностному белку Е вируса клещевого энцефалита, адсорбированных в теле указанной подушки 5, расположенную после зоны 9 приема жидкого исследуемого образца по ходу движения последнего под действием капиллярных сил. В теле пористой хроматографической мембраны 7, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса 11, содержащая сухие адсорбированные частицы вторых моноклональных мышиных антител 1В1, специфичных к поверхностному белку Е вируса клещевого энцефалита и контрольная полоса 12, содержащая сухие адсорбированные частицы моноспецифичных поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши (RAM).
Конструкция иммунологической планшеты 1 обеспечивает контакт подушек 5 и 6, пористой мембраны 7 и абсорбционной подушки 8 друг с другом и позволяет образцу, свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил.
В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы.
Таблица 1.
Характеристика материалов тест-системы
Наименование элемента тест-системы
состав материалов
характеристики материалов
Подушка 5 для нанесения образца и конъюгата
целлюлоза или стеклянное микроволокно; или полиэфирное микроволокно;
- размер пор 22 мкм;
- абсорбционная емкость 55 мг/см<sup>2</sup>;
- высвобождение конъюгата (спустя 90 сек) 89%;
Фильтрационная подушка 6
пористый материал из полисульфона
- толщина слоя 628 мкм;
- объем пор 56,8 мкл/см<sup>2</sup>;
Пористая хроматографическая мембрана 7
нитроцеллюлоза или полиэфирсульфон, или нейлон, или поливинилиденхлорид на полистирольной подложке
- толщина слоя мембраны 125-155 мкм;
- толщина подложки 100 мкм;
- скорость потока образца 110-165 сек/40 мм;
Абсорбционная подушка 8
пористый материал из хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозное волокно
- толщина слоя 429 мкм;
- сухой вес 12,4 мг/см<sup>2</sup>;
Подложка 4 для ламинирования
белый полистирол или акриловый адгезивный материал.
- толщина подложки 254 мкм +/-10%;
Заявляемая тест-система работает следующим образом.
Вносимый образец гомогената клеща впитывается подушкой 5, маркер образца взаимодействует с конъюгатом первого моноклонального антитела 14D5, нанесенным на подушку 5 и связывается с конъюгатом. В результате образуется окрашенный иммунный комплекс «антиген-антитело». Далее при прохождении фильтрационной подушки 6 происходит дальнейшее связывание маркера ВКЭ с антителами и дополнительная очистка раствора от возможных примесей гомогената, который помимо фрагментов клеща, может содержать элементы крови человека, к которому он присосался. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль хроматографической мембраны 7, пересекает тестовую полосу 11 и взаимодействует с иммобилизованными на указанной тестовой полосе 11 вторыми моноклональными мышиными антителами 1B1. В результате при наличии ВКЭ в образце крови выше порогового значения тестовая полоса 11 окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит ВКЭ в концентрации выше пороговой, тестовая полоса 11 остается не окрашенной. Далее не связавшийся на тестовой полосе 11 конъюгат движется далее вдоль хроматографической мембраны 7 и неизбежно взаимодействует с иммобилизованными на контрольной полосе 12 моноспецифичными поликлональными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши (RAM). В результате контрольная полоса 12 также окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса). Контрольная полоса 12 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия ВКЭ в образце крови.
Результаты определяются визуально в течение 5-30 минут. При положительном результате тестирования появляются две окрашенные полосы - тестовая и контрольная. Интенсивность цвета контрольной и тестовой полос может быть различной.
При отрицательном результате появляется только одна полоса 12 - контрольная. Если контрольная полоса 12 не проявилась, результаты теста считаются недействительными.
Данные исследований, подтверждающие достижение технического результата. Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение 10-20 минут определить наличие антигенов.
Качество работы теста и, соответственно показатели чувствительности и специфичности, зависят от качества используемых в тесте моноклональных антител и индивидуальных особенностей исследуемого маркера.
Так по результатам исследования на 100 представленных образцов гомогенатов клеща с использованием заявляемой конструкции теста имеются следующие диагностические показатели, представленные в таблице 2.
Таблица 2.
Биохимические показатели заявляемой тест-системы
Наименование
Единица измерения
Диапазон допустимых значений
Аналитическая чувствительность (минимальная достоверно выявляемая концентрация белка Е в гомогенате)
нг/мл
1,0
Время достижения устойчивых показателей, при внесении минимальной достоверно выявляемой концентрации белка Е
мин
25, не более
Диагностическая чувствительность (для клещей после укуса человека)
%
95, не менее
Специфичность
%
94, не менее
Было проведено исследование с целью сравнения результатов заявленной тест-системы и результатов стандартной тест-системы (качественный иммуноферментный анализ на белок Е), которая используется для проверки клещей в клинических лабораториях Сибирского региона (ВектоВКЭ-антиген, ЗАО “Вектор-Бест”, г.Новосибирск). Исследовано 100 «голодных» не присосавшихся клещей, собранных весной 2011 года в Новосибирской области и результаты приведены в таблице 3. Из этих предварительных данных можно заключить, что чувствительность экспресс-теста (производства ООО НПО “БиоТест”) не уступает чувствительности набора ВектоВКЭ-антиген.
Клещей гомогенизировали замораживанием в жидком азоте с последующим растиранием в порошок и ресуспендированием в лизирующем буфере.
Таблица 3.
Сравнение результатов качественного иммунохроматографического экспресс-теста на вирус клещевого энцефалита (производства ООО “БиоТест”, г.Новосибирск) и результатов качественного иммуноферментного анализа ВектоВКЭ-антиген (производства ЗАО “Вектор-Бест”).
Иммунохроматографический экспресс-тест (ООО “БиоТест”)
Иммуноферментный анализ (ЗАО “Вектор-Бест”)
Положительных клещей
8
7
Отрицательных клещей
92
93
Таким образом, из выше изложенного видно, что заявляемые конструктивные элементы тест-системы позволяют просто и надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста.