СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ НАНОЧАСТИЦ
METHOD OF DETERMINING CONCENTRATION OF NANOPARTICLES

Изобретение относится к области нано- и биомедицинских технологий, в частности к созданию неразрушающего способа определения концентрации наночастиц на основе технологии оптического зондирования с помощью низкокогерентного оптического томографа. Изобретение предназначено для определения наночастиц в растворе или биоткани, что необходимо для создания технологии эффективного разрушения раковых клеток с помощью лазерного фототермолиза опухоли с плазменно-резонансными наночастицами, калибровки чувствительности различных биосенсоров на основе биоконъюгатов с золотыми или серебряными наночастицами.
Известен способ определения концентрации золотых наночастиц в жидкости (воде), включающий измерение массы золотых частиц в фиксированном объеме путем испарения воды, взвешивания агрегированных наночастиц и определения концентрации наночастиц при условии, что известен объем одной наночастицы, измеренный с помощью электронного микроскопа, и все наночастицы одинаковы (Sarah L. Westcott, Steven J. Oldenburg, Т. Randall Lee and Naomi J. Halas. Formation and Adsorption of Clusters of Gold Nanoparticles onto Functionalized Silica Nanoparticle Surfaces. Langmuir, 1998, 14, 5396-5401).
Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков:
1. Способ является разрушающим;
2. Частицы могут быть структурно-неоднородными, например состоять из оболочек и ядер различных материалов; для этого случая способ труднореализуем;
3. Предполагается, что все частицы имеют одинаковую форму и размер.
Известен оптический способ определения концентрации золотых наночастиц в суспензии, включающий измерение оптической плотности А образца в кювете толщиной l от длины волны и определение концентрации из соотношения
В случае сферических частиц
где: С есть оптическое сечение экстинкции (коэффициент поглощения и рассеяния), зависящее от длины волны, формы частиц, показателя преломления;
Q - коэффициент экстинкции для сферических частиц; (Н.Г.Хлебцов, В.А.Богатырев, Л.А.Дыкман, Б.Н.Хлебцов. Плазменно-резонансные наночастицы для биодиагностики и медицины. Российские нанотехнологии. 2007, т.2, №3-4, с.69-86).
Однако данный способ содержит ряд недостатков:
1. Для определения концентрации наночастиц необходим расчет или дополнительное измерение оптического сечения экстинкции С, которое определяется коэффициентом поглощения и трудноопределяемого коэффициента рассеяния.
2. Для расчета концентрации наночастиц необходимо знание о размерах одной наночастицы, ее внутреннем строении, при этом, например, для нанооболочек возможно получение информации о структуре только на основе измерений на электронном сканирующем микроскопе в процессе агрегации для оценки степени пористости нанооболочки.
3. Спектральное положение плазменного резонанса слабочувствительно к размеру наночастиц только для однородного материала (например, изменение диаметра золотых наносфер от 3-х до 300 нм сдвигает максимум плазменного резонанса на 20 нм, в то время как нанооболочек в зависимости от ее толщины плазменный резонанс может на сотни нм - от 530 до 1200 нм), при этом величина оптической плотности сильно зависит, по крайней мере, от двух параметров: концентрации и структуры одной наночастицы.
4. При больших концентрациях наночастиц на значении оптической плотности должно сказываться многократное рассеяние на наночастицах, а также образование кластеров вследствие адгезии наночастиц.
9
6
6
В медицинской диагностической практике используется цитологический метод определения концентрации клеточных форменных образований (эритроцитов - характерный размер 6-8 микрон при концентрации 5·10/мл; тромбоцитов - средний размер 3-4 микрона, концентрация 300·10/мл; лейкоцитов - 15-30 микрон, концентрация 6·10/мл) с помощью камеры Горяева, представляющей собой плоскую горизонтальную кювету с фиксированной глубиной (100 микрон), при этом подсчитывается число соответствующих клеток в фиксированном объеме, используя световой микроскоп, работающий в отраженном или в проходящем свете (Г.И.Козинец и др. Клетки крови и костного мозга. М.: МИА. 2004, с.189-202).
Однако данный способ не позволяет определить концентрацию наночастиц, так как в световом микроскопе, работающем в отраженном или в проходящем свете, наночастицы не наблюдаются. Пространственное разрешение светового микроскопа ограничено минимальным размером фокального пятна, которое вследствие волновых свойств света ограничено длиной волны (минимально полмикрона в видимой области), что существенно больше типичных пространственных размеров наночастиц (1-300 нм).
Известен способ наблюдения наночастиц с размером 50-400 нм с помощью темнопольного светового микроскопа (Prashant К. Jain, Ivan Н. El-Sayed and Mostafa A. El-Sayedl. Au nanoparticles targeted cancer. Nanotoday, 2007, v.2, №1, p.18-29).
Однако такой способ позволяет наблюдать рассеянное каждой наночастицей оптическое излучение с пространственным размером, определяемым разрешением микроскопа, при этом используются остросфокусированное излучение и не представляется возможным определение концентрации наночастиц в объеме, так как при фиксированном пространственном положении фокуса не контролируется, на какой глубине находятся различные наночастицы. Основной недостаток данного способа даже для оценки концентрации связан с тем, что в методе темнопольной микроскопии должны использоваться тонкие слои жидкости с наночастицами - толщиной менее сотни микрон (технология приготовления образца следующая: на предметное стекло капают несколько микролитров раствора наночастиц и накрывают покровным стеклом). Однако вследствие эффектов поверхностного натяжения, наночастицы скапливаются на границе образца, что делает практически невозможным определение концентрации наночастиц в объеме.
Наиболее близким к предлагаемому способу является оптический способ определения концентрации микрочастиц в жидкости, включающий облучение лазерным пучком прозрачного капилляра, внутри которого протекает раствор с микрочастицами, измерение оптического импульсного излучения, возникающего вследствие рассеяния на каждой частице, и определение концентрации частиц в растворе по суммарному числу продетектированных рассеянных оптических импульсов в единицу времени и объему протекшей за это время через капилляр жидкости (Грехов В.А., Пахомов Л.М. Волоконно-оптическая система измерения концентрации инертных частиц. ПТЭ 2000, №6, с.113-116).
Однако данный способ содержит ряд недостатков
1. Способ позволяет определение концентрации микрочастиц диаметром от 50-500 мкм;
6
-3
2. Способ имеет ограниченный диапазон измерения концентраций. При используемой в установке скорости прокачки 10 м/с и минимальном времени измерения 10 мкс анализируемое число частиц не превышает 10/см;
3. Численные оценки показывают возникновение больших технических сложностей при попытке применения данного способа для определения концентрации наночастиц вследствие необходимости прокачки раствора через нанокапилляр и соответственно возможности измерения только малых концентраций наночастиц, при этом для анализа 1 микролитра раствора наночастиц должно потребоваться не менее часа при условии, что лазерный пучок фокусируется в микронную область.
Задачей настоящего изобретения является определение концентрации наночастиц в растворе, возможность определения пространственного распределения наночастиц в объеме, а также динамики поведения наночастиц при исследовании процессов диффузии или агрегации и оседания.
Технический результат заключается в расширении диапазона определения концентрации наночастиц, обеспечении возможности измерения наночастиц различных типов (сфер, эллипсоидов, кубиков, стержней, оболочек) размером от десятка до сотен нанометров.
c
c
c
2
Поставленная задача решается тем, что в способе определения концентрации наночастиц, включающем зондирование объемной среды, содержащей наночастицы, оптическим излучением с помощью низкокогерентного томографа, измерение размера фокального пятна зондирующего пучка D, длины продольной когерентности ΔL и определение объема когерентности ΔV=πD ΔL/4, получение цифрового двумерного изображения, каждый пиксел которого пропорционален интенсивности обратноотраженного излучения из объема когерентности, путем сканирования зондирующего пучка по двум поперечным координатам при фиксированной продольной оптической длине в опорном плече интерферометра томографа либо одной из поперечных координат зондирующего пучка и продольной координаты в опорном плече, добиваются дискретного изображения путем фиксированного разведения раствора с наночастицами, выделяют площадь на двумерном изображении S, определяют концентрацию наночастиц в единице объема V по числу отражающих пикселей с интенсивностью, превышающей уровень шума из выделенной площади, а выделенный объем V определяется произведением площади S на длину когерентности или на размер фокального пятна в зависимости от режима сканирования.
c
9
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлена блок-схема установки для измерения концентрации наночастиц в объеме с помощью низкокогерентного волоконно-оптического сканирующего томографа; на фиг.2 - экспериментально измеренная зависимость продольной функции когерентности излучателя оптического томографа, позволяющей определить длину продольной когерентности ΔL; на фиг.3 - двумерная зависимость интенсивности обратно-отраженного оптического сигнала от кюветы толщиной 1 мм с раствором золотых нанооболочек при концентрации 10/лм, на фиг.4 - результаты, аналогичные фиг.3 при 4-кратном двойном разведении (в 16 раз) концентрации золотых нанооболочек, где:
1 - суперлюминесцентный диод;
2 - одномодовый волоконно-оптический Х разветвитель;
3 - измерительный канал волоконно-оптического интерферометра;
4 - XY сканер поперечного смещения зондирующего оптического пучка;
5 - длиннофокусная оптическая система;
6 - анализируемая кювета с наночастицами;
7 - персональный компьютер;
8 - фотоприемник;
9 - смесительный канал волоконно-оптического интерферометра;
10 - опорный канал волоконно-оптического интерферометра;
11 - оптико-механическая система продольного сканирования и модуляции по Z координате.
Устройство состоит из низкокогерентного волоконно-оптического сканирующего интерферометра (оптический томограф), содержащего суперлюминесцентный диод (SLD) 1, одномодовый волоконно-оптический Х разветвитель 2 с измерительным каналом 3 и опорным каналом 10, а также со смесительным каналом 9. Устройство содержит XY-сканер поперечного смещения зондирующего оптического пучка 4, длиннофокусную оптическую систему 5 и анализируемую кювету с наночастицами 6. Устройство имеет оптико-механическую систему продольного сканирования и модуляции 11 оптической длины по Z координате. Устройство содержит фотоприемник (PhD) 8 с электронным усилителем и аналого-цифровым преобразователем, сигнал с которого поступает на персональный компьютер 7.
Способ осуществляется следующим образом.
с
c
c
В соответствии с фиг.1 непрерывное оптическое излучение суперлюминесцентного диода 1 вводится в одномодовый волоконно-оптический Х разветвитель 2 интерферометра, после оптического деления в разветвителе Х часть оптического излучения поступает в измерительный канал 3, где с помощью XY сканера 4 осуществляется поперечное сканирование пучка по Х и Y координате, а длиннофокусная оптическая система 5 формирует определенное фокальное пятно размером D в анализируемой кювете 6. С помощью управляющего сигнала с персонального компьютера 7 осуществляется поперечное сканирование пучка в анализируемой кювете 6 с наночастицами. Оптическое излучение, обратноотраженное из анализируемой кюветы 6, измеряется только из объема определяемого объемом когерентности ΔV, который соответствует размеру (площади) фокального пятна D, умноженной на длину продольной когерентности ΔL излучателя. Это излучение смешивается с обратноотраженным оптическим излучением опорного канала 10, который состоит из оптико-механической системы сканирования и модуляции 11 по Z координате. Оптико-механическая система продольного сканирования и модуляции 11 оптической длины содержит перестраиваемую оптическую линию задержки и отражатель (плоское зеркало), укрепленный на пьезокорректоре, с помощью которого осуществляется модуляция оптической длины при подаче сигнала перестройки и модуляции с персонального компьютера 7. Интерферирующие оптические поля с двух каналов 3 и 10 на выходе волоконно-оптического смесительного канала 9 детектируются с помощью фотодетектора 8, фототок которого пропорционален произведению оптических полей опорного 10 и измерительного 3 каналов. Сигнал интерференции оптических полей измеряется при поперечном сканировании оптического пучка с помощью XY-сканера 4 и модуляции оптической длины в опорном канале 10. Для каждой поперечной настройки оптического пучка в измерительном канале измеряется интенсивность отраженного света только из объема когерентности, определяемой поперечным размером фокального пятна D и длиной продольной когерентности ΔL.
Длина продольной когерентности оптического излучателя определяется спектральной шириной зондирующего излучения Δλ, в частности шириной спектра суперлюминесцентного диода, и для гауссовской линии излучения имеет вид
где: λ - длина волны центра линии излучения.
c
При этом концентрация определяется числом пикселей с интенсивностью, превышающей уровень шума, который определяется интенсивностью отражения от прозрачного раствора без наночастиц (вода, физиологический раствор), из выделенной площади S=ΔX·ΔY при сканировании по поперечным координатам, а объем V равен площади S, умноженной на длину продольной когерентности ΔL при фиксированной настройке оптической длины в оптической линии задержки или выделенной площади S=ΔX·ΔZ, умноженных на размер фокального пятна D при сканировании по одной поперечной и одной продольной координате.
c
На фиг.2 представлена измеренная зависимость интенсивности низкокогерентного оптического излучения суперлюминисцентного «диода от изменения длины при сканировании оптической длины в опорном канале 10 волоконно-оптического интерферометра 3, осуществляющего зондирование поверхности зеркала в измерительном канале. Измеренная корреляционная функция оптического поля излучателя или функция продольной когерентности позволяет экспериментально определить длину продольной когерентности ΔL как длину, соответствующую уменьшению интенсивности сигнала интерференции вдвое.
9
-5
6
2
c
Экспериментальные тестовые измерения концентрации наночастиц, типичные для используемых в нанотехнологиях, представлены на фиг.3-4. Концентрация золотых нанооболочек с плазменным резонансом в области 800 нм, измеренной методом оптической плотности, составляла величину порядка 10 частиц в миллилитре. На фиг.3 представлена двумерная зависимость интенсивности отраженного оптического сигнала из объема кюветы толщиной 1 мм с раствором в воде плазменно-резонансных золотых нанооболочек толщиной 15 нм и ядром из оксида кремния SiO диаметром 140 нм, при этом сканирование осуществлялось по одной поперечной координате ΔХ (ось абсцисс) и продольной ΔZ (на фиг.3 ось ординат). Объем когерентности в измерениях с помощью низкокогерентного оптического томографа ОСТ-3 фирмы «Carl Zeiss» определяется размером фокального пятна с диаметром, составляющим 20 микрон, и длиной когерентности, равной ΔL=10 микрон, при зондировании излучением суперлюминисцентного диода с длиной волны 820 нм. На Фиг.3 видна пространственная неравномерность плотности пикселей и соответственно наночастиц в кювете, а также в разных пикселах наблюдается различная интенсивность отраженного оптического сигнала, что говорит о попадании в объем когерентности более одной частицы. Чувствительность метода по уровню отраженного оптического сигнала достигает 50 dB (уровень шума соответствует коэффициенту отражения 10). Типичная величина отражения одной золотой плазменно-резонансной наночастицей, порядка 0.001 от величины зондирующего излучения, что превышает уровень шума на два порядка. Полученная двумерная картина распределения наночастиц в объеме измеряется в течение 0,3 сек, а число пикселей может может превышать 10, поэтому время измерения одного пиксела менее 1 мкс, что позволяет исследовать динамические процессы агрегации и диффузии наночастиц.
7
9
На фиг.4 представлена двумерная зависимость интенсивности отраженного оптического сигнала от кюветы с наночастицами при 16-кратном разведении или 4-кратном двойном разведении. Расчеты показали, что в двумерной области ΔZ=1 мм и ΔХ=100 микрон наблюдается в среднем 125 частиц, что соответствует концентрации 6,25·10, тогда в соответствии с предлагаемым способом неразведенная концентрация составляет N=10 золотых нанооболочек в миллилитре.
12
2
9
c
c
с
Предлагаемый способ обладает потенциально большим диапазоном измерения концентрации. При условии, что концентрация наночастиц в растворе составляет величину N=10 в миллилитре, то при равномерном распределении частиц среднее расстояние между частицами будет составлять один микрон и тогда в типичный объем когерентности, определяемой размером фокального пятна 10 микрон, и длиной когерентности 10 микрон ΔV=πD ΔL/4 попадает более тысячи частиц. Такой уровень концентрации наночастиц невозможно определить предлагаемыми оптическими методами при условии, если не разводить анализируемый раствор. Если уровень концентрации составляет величину N=10/мл, то при равномерном распределении частиц среднее расстояние между частицами будет составлять 10 микрон и тогда в типичный объем когерентности ΔV попадает в среднем одна частица. В этом случае при пространственном сканировании излучения, например, по поперечным координатам X, Y при фиксированной продольной длине ΔZ каждый пиксел несет информацию об интенсивности отраженного сигнала от каждой наночастицы и при равномерном пространственном распределении наночастиц получаем двумерную картину со сплошной одинаковой интенсивностью на всей анализируемой площади. В реальном случае вследствие броуновского движения в объем когерентности может попасть две и более частицы, тогда величина отраженного сигнала отдельных пикселей возрастает. Таким образом, можно определять наличие кластеров из наночастиц и пространственную неравномерность по глубине или по поперечной координате.
6
3
При концентрации наночастиц N=10/мл, то при равномерном распределении частиц среднее расстояние между частицами будет составлять 100 микрон. При типичной поперечной длине сканирования в несколько миллиметров необходимо просканировать по глубине 10 сканов, чтобы получить точную информацию о числе наночастиц в одном миллилитре. Оценки показывают, что минимально определяемая концентрация наночастиц будет составлять N=10/мл, при этом среднее расстояние между наночастицами будет составлят 1 мм и необходимо проводить 100 сканов по глубине, чтобы найти одну частицу в миллилитре.