ВАКЦИННЫЙ АНТИГЕН БАБЕЗИОЗА СОБАК
CANINE BABESIOSIS VACCINE ANTIGEN

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, в частности, к бабезиозу собак. В частности, изобретение относится к полипептиду, являющемуся новым антигеном Babesia собак (CBA), или его фрагментам и к композициям, содержащим этот антиген, к нуклеиновым кислотам, кодирующим антиген, антителам к антигену и медицинским применениям этого антигена, фрагментов, антител или кодирующих нуклеиновых кислот. В частности, изобретение относится к использованию таких компонентов в вакцинах против Babesia собак.
Простейшие микроорганизмы рода Babesia являются передаваемыми клещами внутриэрицитарными паразитами отряда Piroplasmida в типе Apicomplexa. Виды Babesia разделяют на подклассы на основании нескольких критериев, в числе других по клещу-переносчику (клещам-переносчикам), содержащемуся в окружающей среде, который может переносить конкретные виды паразита Babesia. Клещ-переносчик, в свою очередь, определяет географическое распространение паразита и позвоночного хозяина, который является инфицированным.
Инфекция позвоночного хозяина паразитами Babesia вызывает заболевание бабезиоз, также называемое пироплазмозом, с широкой вариацией симптомов и тяжести, заболевание и его симптомы первые были описаны в 1904 году (Nuttall, J. Hyg. (Lond.) vol. 4, p. 219-257).
Для предотвращения бабезиоза используют несколько подходов, таких как, например, борьба с клещами. Этого достигают в основном обработкой хозяина, на котором питаются клещи, лекарственными средствами. Такие обработки включают растворы, наносимые орошением составы или парентеральные лекарственные средства, которые отпугивают или уничтожают клещей. Недостатками таких способов являются себестоимость таких обработок, которые, возможно, необходимо часто повторять, возможная токсичность лекарственного средства, возможные остатки лекарственного средства, содержащиеся в мясе или молоке мясомолочного скота, и появление устойчивости к лекарственному средству в популяции клещей. Аналогичные недостатки применимы к лечению на основе лекарственных средств животных, которые уже стали инфицированными Babesia.
Таким образом, альтернативой является профилактика или облегчение состояния бабезиоза посредством вакцинации животного-мишени, которое в этом случае является хозяином, на котором могут питаться клещи, и которое в результате может становиться инфицированным Babesia. В большинстве случаев такие вакцины содержат иммунологически эффективное количество антигенной молекулы из клеща или паразита Babesia в фармацевтически приемлемом носителе. Однако вследствие того, что паразит, такой как Babesia, представляет собой очень сложный организм, доказано, что крайне трудно определять отдельные антигены для вакцинации животного-мишени, которые обеспечивают возникновение иммунного ответа, который является быстрым, безопасным и эффективным. Фактически указанное представляет собой одну из наиболее сложных задач иммунопаразитологии в целом в настоящее время.
Паразиты Babesia могут инфицировать широкую группу позвоночных животных, но инфекции домашних млекопитающих и людей являются наиболее актуальными для ветеринарной практики и медицины. Хотя некоторые виды Babesia могут инфицировать животных, относящихся к собакам, наиболее преобладающие Babesia собак представляют собой для Европы: B. canis, и для региона к югу от Сахары и Южной Африки: B. rossi.
Раньше Babesia собак таксономически классифицировали как подвид B. canis, таким образом, как: B. canis canis и B. canis rossi и т.д., следуя предложению триноминальной системы номенклатуры (Uilenberg et al., 1989, Vet. Quart., vol. 1, p. 33-40). Однако в последние годы было описано все больше и больше видов Babesia у собак, и информацию получали на основании их жизненного цикла, их членистоногих переносчиком и характеристики их генетического материала. Это привело к понятию, что эти подвиды Babesia canis следует классифицировать, каждый, как соответствующий отдельный вид. Это описано у Schetters, 2005 (Trends in Parasitology, vol. 21, p. 179-184). Эту новую классификацию используют на всем протяжении настоящего описания.
B. canis и B. rossi представляют собой так называемые "крупные" виды Babesia собак, т.е. крупнее, чем радиус эритроцита. B. canis переносят клещи-переносчики рода Dermacentor, и B. rossi клещи рода Haemaphysalis. Паразиты B. rossi являются наиболее патогенными видами Babesia собак, паразиты B. canis являются несколько менее патогенными. Основные симптомы заболевания представляют собой анемию или иммунопатологию, похожую на малярию. Другие симптомы представляют собой почечную недостаточность, отек легких и общую реакцию шока. Животные, которые выздоравливают, могут страдать рецидивами в дальнейшем. Обзором, например, является работа Jacobson & Clark (1994, J. of S. Afr. Vet. Assoc., vol. 65, p. 134-145).
Главным образом вакцины предназначены для профилактики или снижения (уровня) инфекции микроорганизмом или заболевания, вызываемого инфекцией. Вакцины против бабезиоза собак были описаны ранее. Например, Ristic et al. (1988, в Babesiosis of domestic animals and man, ed. M. Ristic, p.163-189, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, ISBN: 0849349087) и Schetters et al. (1992, Par. Immunol., vol. 14, p. 295-305).
В этих вакцинах использовали растворимые антигены паразита (SPA), которые представляют собой экзоантигены паразита, которые выделяет паразит, или которые происходят из разрушаемых или погибающих паразитов. При получении in vivo, например, таком как описано Sibinovic et al. (1967, The J. of Parasitology, vol. 53, p. 919-923), эти антигены накапливаются в плазме инфицированных собак-хозяев, альтернативно, при получении in vitro они накапливаются в супернатанте культуры эритроцитов, в которой амплифицируют Babesia (Schetters et al., 1992, Parasite Immunology, vol. 14, p. 295-305). SPA из культуры B. canis использовали для защиты собак от инфекции, вызываемой тем же (т.е. гомологичным = из источника, изолята или штамма, который является таким же, как тот, что использовали в культурах для получения антигена SPA, содержащегося в вакцине) штаммом B. canis. Стоит отметить, что гомологичная вакцинация не являлась эффективной в отношении B. rossi: SPA из культуры паразитов B. rossi не обеспечивали защиту собак от вызываемых B. rossi инфекции и заболевания. Для этого была необходима смесь SPA из культур SPA B. canis и B. rossi, как описано в EP 691131, в таком случае собаки могли быть эффективно иммунизованы SPA, выделяемыми из культур B. rossi и B. canis, с добавлением сапонина в качестве адъюванта, и развивали защитный иммунный ответ против паразитов B. canis и B. rossi и эритроцитов, инфицированных паразитами.
MSD Animal Health оптимизировала получение SPA в культуре in vitro в промышленном масштабе в запатентованном способе получения вакцины на их основе: Nobivac Piro (Schetters et al., 1995, Parasitol. Today, vol. 11, p. 456-462). Однако культивирование in vitro или in vivo живых паразитов в промышленном применении имеет характерные недостатки, такие как необходимость всестороннего контроля для обеспечения качества и воспроизводимости продукта при значительной стоимости. Также может быть желательным уменьшение использования исходных веществ биологической природы, таких как кровь и сыворотка здоровых собак.
Дополнительный недостаток известных вакцин против Babesia на основе неочищенных SPA заключается в том, что они содержат остатки лизированных нормальных эритроцитов, которые сами могут вызывать аутоиммунный ответ против эритроцитов вакцинированного животного. В связи с этим существует острая необходимость в вакцине против бабезиоза собак, которая устраняет по меньшей мере некоторые из перечисленных выше недостатков.
Целью настоящего изобретения является получение антигенного компонента, который можно использовать для получения эффективной, безопасной и надежной вакцины для защиты от инфекции и/или заболевания, вызываемых паразитами Babesia собак, где компонент вакцины устранит недостатки классических вакцин на основе SPA и защитит не только от гомологичной, а также от гетерологичной инфекции паразитами Babesia.
Неожиданно обнаружено, что можно устранять недостатки известного уровня техники и можно достигать целей посредством конкретного выделенного полипептида, который можно использовать для получения вакцины для собак, которая является эффективной против инфекции паразитами Babesia и заболевания, которое она вызывает. Использование конкретного полипептида устраняет необходимость использовать неочищенную смесь растворимых (экзо-) антигенов паразита как в известных вакцинах против бабезиоза собак.
Очищенный и выделенный полипептид условно назван "антиген Babesia собак" (CBA), и обнаружено, что он принадлежит классу белковых антигенов CBA с представителями среди различных видов паразитов Babesia собак.
Различные полипептиды CBA имеют в целом рассчитанную молекулярную массу приблизительно 30 кДа (например, приблизительно от 29 до 33 кДа), относительно кислый pH (например, приблизительно 4,6-4,8) и содержат N-концевую сигнальную последовательность (например, приблизительно 16-18 аминокислот), которая соответствует тому факту, что полипептиды CAB активно секретируются Babesia после инфицирования эритроцита.
Обнаружено, что Babesia canis экспрессировала один антиген CBA, называемый в настоящем описании как CBA-1, тогда как B. rossi экспрессировала два гомолога CBA, обозначаемые в настоящем описании как CBA-2,1 и -2,2.
Члены этого нового класса антигенов Babesia являются частью консервативных областей аминокислотной последовательности, каждая из которых характеризует полипептиды CBA и отличает их от известных полипептидов.
Эти консервативные области последовательности предоставлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 1-5 (см. таблицу 1), и неожиданно выявлено, что они располагаются на N- и C-концах полипептида CBA, где N-концевая характеризующая область находится непосредственно после сигнальной последовательности. Центральная область полипептидов CBA является менее консервативной.
Первая их двух характеризующих областей полипептидов CBA представляет собой N-конец полипептида CBA из B. rossi, фактически последовательность является одной и той же для CBA-2,1 и CBA-2,2: MLLSNVSFPQPVSSVKLLEEY (SEQ ID NO:1).
При сравнении с известными полипептидами выявлено, что наибольшие совпадения с аминокислотами SEQ ID NO:1 имеют аминокислотную идентичность только 11 из 21 аминокислоты, которая представляет собой идентичность 52,3%.
Аналогично, вторую консервативную область последовательности: VLMVLTKCNLKMHVTEEQL (SEQ ID NO:3), представленную C-концом CBA-2,1, также сравнивали с известными полипептидами. Выявлено, что наибольшее совпадение имеют только 11 из 19 аминокислот, что представляет собой аминокислотную идентичность 57,9%.
В противоположность этому, идентичность аминокислотных последовательностей между соответствующими областями B. canis и B. rossi самих полипептидов CBA является значительно выше, более 68%, как представлено в таблице 2.
Таблица 1Список идентификаторов последовательностей, используемых в настоящем описании
SEQ ID NO:
Описание
1
Характеризующая область 1 вблизи N-конца CBA-2,1 и CBA-2,2 B. rossi
2
Характеризующая область 1 вблизи N-конца CBA-1 B. canis
3
Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-2,1 B. rossi
4
Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-2,2 B. rossi
5
Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-1 B. canis
6
Аминокислотная последовательность CBA-1 B. canis
7
Аминокислотная последовательность CBA-2,1 B. rossi
8
Аминокислотная последовательность CBA-2,2 B. rossi
9
Последовательность мРНК CBA-1 B. canis (как кДНК)
10
Последовательность мРНК CBA-2,1 B. rossi (как кДНК)
11
Последовательность мРНК CBA-2,2 B. rossi (как кДНК)
12
Геномная последовательность CBA-1 B. canis
13
Геномная последовательность CBA-2,1 B. rossi
14
Геномная последовательность CBA-2,2 B. rossi
15
Коровая а/к последовательность характеризующей области 1
Таблица 2Идентичность аминокислотных последовательностей между аминокислотными последовательностями характеризующих областей белков CBA различных видов Babesia собак
Аминокислотная последовательность
Характеризующая область 1: MLLSNVSFPQPVSSVKLLEEY
Характеризующая область 2: VLMVLTKCNLKMHVTEEQL
CBA-1 B. canis
16/21 (76,2%)
14/19 (73,7%)
CBA-2,1 B. rossi
21/21 (100%)
19/19 (100%)
CBA-2,2 B. rossi
21/21 (100%)
13/19 (68,4%)
Аналогично, характеризующая область 2 (SEQ ID NO:3) обнаружена у видов Babesia собак с идентичностью по меньшей мере 68%, тогда как лучший гомолог в общедоступных базах данных являлся идентичным не более 57%. Кроме того, при исследование в BLAST молекулы, содержащей обе области, не получено каких-либо совпадений.
Полипептиды, определяемые в настоящем описании, таким образом, характеризуются наличием области высокой гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью одной или обеих SEQ ID NO 1 и 2.
Таким образом, изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотных последовательностей более 53% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, и/или обладающей идентичностью аминокислотных последовательностей более 58% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, где указанный полипептид способен индуцировать иммунный ответ против паразитов Babesia собак и/или их продуктов или эффектов.
По изобретению "полипептид" относится к молекулярной цепи аминокислот. Полипептид не является конкретной длины, структуры или формы, при необходимости его можно модифицировать in vivo или in vitro, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием, фосфорилированием, пегилированием или изменениями пространственной укладки. В числе прочего белки, пептиды, олигопептиды входят в определение полипептида. Полипептид может быть биологического и/или синтетического происхождения.
Термин "выделенный" следует интерпретировать как выделенный из его естественной среды. Это также применимо к очистке полипептида CBA (или его кодирующей нуклеиновой кислоте) в композициях до количеств, которые являются больше количества других веществ в такой композиции, предпочтительно в намного большем количестве, таком что полипептид или нуклеиновая кислота составляет 70%, или 80%, или 90% или более от общей композиции. Предпочтительно полипептид или нуклеиновая кислота составляет 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или даже 99% от общей композиции.
Термин "идентичность аминокислотных последовательностей" следует интерпретировать как процент идентичных аминокислот в соответствующих положениях, когда два аминокислотные последовательности являются оптимально выровненными по всей их длине. Выравнивание можно проводить подходящим образом с использованием компьютерной программы, например, Blast или ClustalW с использованием параметров по-умолчанию.
Термин "способный индуцировать иммунный ответ" относится к способности полипептидов CBA по изобретению индуцировать иммунный ответ, который является эффективным против инфекции или заболевания, вызываемых паразитами Babesia собак. Такой эффективный иммунный ответ, например, представляет собой профилактику, предотвращение или улучшение состояния бабезиоза и/или паразитемии паразитов Babesia у собак.
Такой иммунный ответ может принимать различные формы и может действовать через различные ветви иммунной системы врожденного и/или приобретенного иммунитета, и может быть клеточного и/или гуморального типа. Существование или индукцию такого иммунного ответа можно детектировать хорошо известными способами и дополнительно способом, как описано в настоящем описании. Например, антитела к CBA можно детектировать, например, Elisa, посредством иммунофлуоресценции, иммуноблотингом и т.д. Клеточный иммунный ответ можно детектировать анализом активации лимфоцитов или посредством кожных реакций in vivo. Дополнительные способы включают наблюдение за симптомами иммунизированных пациентов или их физиологическими ответами, как правило, ассоциированными с инфекцией Babesia и заболеванием, такими как объем осажденных эритроцитов (также гематокритное число), количество инфицированных эритроцитов, размер селезенки и т.д., в дополнение к общим поведенческим шкалам.
В конечном итоге, полипептиды по изобретению (при применение в вакцине) способны предотвращать или снижать инфекцию и/или заболевание, вызываемое этой инфекцией, обусловленной инфекцией паразитами Babesia собак.
"Babesia собак" представляет собой паразита Babesia, который может инфицировать животное, являющееся собакой. Как правило, такие паразиты представляют собой Babesia canis, B. rossi, B. vogeli и B. gibsoni, а также описаны другие виды Babesia или ассоциированные с инфекциями собак (Uilenberg, 2006, Veterinary Parasitology, vol. 138, p. 3-10). В отношении точной таксономической классификации Babesia специалисту понятно, что она может изменяться со временем, т.к. новые представления приводят к реклассификации в новые или другие таксономические группы. Однако вследствие того, что характеристики и/или набор белков участвующего организма не изменяются, только их классификация, предполагают, что такие повторно классифицированные организмы входят в объем изобретения. "Собачьи" относятся ко всем (под)видам Canidae, в основном собакам, волкам и лисам, а также любым смешанным породам.
Кроме того, иммунологическая эффективность полипептида по изобретению против бабезиоза действует на различные виды Babesia различным образом, вакцинация может предотвращать паразитемию, а также заболевание от одного вида, но только противодействовать заболеванию от другого вида (см. например, Schetters et al., 1997, Parasitology, vol. 115, p. 485-493).
Авторы изобретения обнаружили, что не существует прямого способа выделения и характеристики полипептидов CBA по изобретению из неочищенных антигенных препаратов. В основном это обусловлено тем, что общепринятые способы являются не эффективными или не предоставляют необходимых данных. В результате существовала необходимость в применении нескольких адаптаций и не очевидных комбинаций известных способов для получения желаемых полипептидов. Например:
В качестве эффективной вакцины известной являлась только смесь экзоантигенов SPA: в обеих коммерческих вакцинах против Babesia, доступных на дату подачи настоящего изобретения, применяют неочищенную смесь экзоантигенов Babesia в качестве компонента вакцины. Также за многие десятилетия исследования бабезиоза собак еще не получено эффективной коммерческой вакцины на основе отдельных соединений. Таким образом, общепринято, что защита от бабезиоза, обеспечиваемая иммунизацией SPA собак, являлась обусловленной гетерогенным иммунным ответом, в который вовлечены многие антигены, и который нельзя приписывать отдельному белку. Этот факт разубедит любого специалиста в данной области приступать к исследованию отдельного вакцинного антигена.
Кроме того, отсутствие высокопродуктивных способов культивирования B. canis и B. rossi препятствует специалисту получать достаточные количества любого отдельного антигена Babesia для характеризации. Таким образом, хотя описаны общепринятые способы культивирования, существует необходимость в высокопродуктивном способе культивирования in vitro, который является собственностью заявителя, которым возможно получать достаточные количества белков Babesia для определения CBA в виде отдельных компонентов.
Также полипептид CBA по изобретению невозможно выделять непосредственно из SPA, т.к. SPA представляет собой неочищенную смесь многих различных компонентов из эритроцитов, из Babesia и из компонентов сыворотки животного, которая является необходимой для культивирования, до уровней 40% об./об.
Когда предпринимали попытку выделять CBA из окрашенных кумасси бриллиантовым голубым гелей полного SPA, это приводило к многочисленным неудачам, в основном вследствие того, что все фракции являлись сильно загрязненными белками сыворотки и гемоглобином из эритроцитов в культуре, а также большое количество полос от низкой до высокой молекулярной массы полностью препятствовало доступности любой одной полосы отдельного белка. Эксперименты, целью которых являлась очистка одностадийными способами, такими как аффинная хроматография с белком A, ионообменная хроматография и эксклюзионные колонки, являлись безуспешными. В дальнейшем удалось выделить CBA из SPA с использованием протокола сложной очистки, в котором применяют адаптированные способы культивирования и конкретную особенную комбинацию ряда последовательных способов разделения и осаждения.
В конечном итоге, этими способами получили достаточные количества полипептида CBA для дальнейшего анализа.
Однако не удалось визуализировать какой-либо выделенный полипептид CBA общепринятыми способами иммуноблотинга: авторы изобретения неожиданно обнаружили, что CBA является нераспознаваемым на иммуноблоте общего лизата паразита или из SPA ни стандартной антисывороткой от собак, иммунизированных SPA, ни антисывороткой от собак, которые являлись инфицированными Babesia. Это обусловлено тем, что количество CBA в SPA является слишком маленьким, или форма CBA в SPA является неподходящей для распознавания иммуноблотингом. Следует отметить, что CBA удалось определить только на иммуноблоте, когда авторы изобретения использовали сыворотку от собак, которых сначала многократно вакцинировали SPA, и затем экспериментально заражали Babesia, так называемая сыворотка после вакцинации и заражения.
Дополнительное ограничение заключалось в том, что необходимо получать такую сыворотку после вакцинации и заражения в очень конкретный период после заражения: между 6 сутками и 11 сутками. Для сыворотка, получаемой до или после этого периода, не удалось продемонстрировать слабую реактивность к полипептиду CBA с относительной молекулярной массой приблизительно 41 кДа.
В дальнейшем анализе, тот факт, что только N- и C-концы различных полипептидов CBA являлись консервативными, и, таким образом, совокупность (зрелых) полипептидов обладала небольшой консервативностью последовательности, вызывал значительное затруднение в определении соответствующего гена и последовательностей мРНК, кодирующих эти полипептиды в геноме Babesia. Кроме того, известны негеномные последовательности B. canis или B. rossi, так что эти геномы было необходимо секвенировать, анализировать возможные открытые рамки считывания и получать области вставок ПЦР. Для этого последнего этапа необходимо широкое применение вырожденных праймеров вследствие выявленных различий последовательностей в генах CBA.
В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1 и/или 2 составляет по меньшей мере 58%, предпочтительно по меньшей мере 59%, такую как 60% или 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 71%, 73%, 75% или 76%. В одном из вариантов осуществления полипептиды по изобретению отличаются тем, что они содержат аминокислотную последовательность, которая обладает идентичностью аминокислотных последовательностей более 58% с одной или более аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5.
По изобретению переходные фразы "содержащий" и "состоящий из" определяют область формулы изобретения в отношении того, что не перечисленные дополнительные компоненты или стадии, если таковые существуют, исключены из объема формулы изобретения.
Переходный термин "содержащий", который является синонимичным с "включающий" "состоящий" или "характеризующийся" является охватывающим или неограничивающим и не исключает дополнительных не перечисленных элементов или этапов способа.
Фраза "группа, состоящая из" является ограничивающим термином, который используют при составлении пункта формулы изобретения для обозначения "группы Маркуша", которая по своей природе является закрытой, и ее используют для различия или определения различных членов группы.
Переходная фраза "состоящий из" исключает любой элемент, этап или ингредиент, не описанный в пункте формулы изобретения.
Авторам изобретения в конечном итоге удалось получить полную аминокислотную последовательности ряда полипептидов CBA. Они предоставлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 6, 7 и 8.
При сравнении друг с другом для этих полноразмерных полипептидных последовательностей продемонстрирована замечательная консервативность их N- и C-концов с меньшей консервативностью в их основной центральной части, см. фиг.1. В кратком изложении, идентичность аминокислотных последовательностей между этими полными последовательностями является такой, как представлено в таблице 3.
При сравнении с известными полипептидами не удалось обнаружить значительных полноразмерных совпадений.
Таблица 3Идентичность аминокислотных последовательностей между полноразмерными аминокислотными последовательностями полипептидов CBA, описываемых в настоящем описании
% идентичности а/к последовательности
CBA-1 B. canis (SEQ ID NO:6)
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:7)
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:7)
29
×
CBA-2,2 B. rossi (SEQ ID NO:8)
35
43
Таким образом, в одном из вариантов осуществления полипептиды CBA по изобретению отличаются тем, что они обладают идентичностью аминокислотных последовательностей более 29% по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.
Процент идентичности для этого варианта осуществления следует рассчитывать для полной длины полипептида CBA как в SEQ ID NO:6, 7 или 8. Термин "более 29%" можно интерпретировать как по меньшей мере 30%, 32%, 35%, 39%, 43%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или даже более 98%.
Выявлено, что характеризующая область № 1 сама по себе содержит коровую последовательность, которая является полностью консервативной для полипептидов CBA из B. canis и B. rossi. Эта последовательность: PVSSVKLL (SEQ ID NO:15) обнаружена в любом известном полипептиде с идентичностью аминокислотных последовательностей 8/8 (100%), таким образом, она может служить для дополнительной характеристики полипептида CBA по изобретению.
Таким образом, в дополнительном предпочтительном варианте осуществления полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой PVSSVKLL (SEQ ID NO:15).
Предпочтительно последовательность SEQ ID NO:15 содержится в полипептид по изобретению в N-концевой области зрелого полипептида.
В одном из вариантов осуществления изобретение также относится к иммуногенному фрагменту полипептида по изобретению.
Такой иммуногенный фрагмент можно получать хорошо известным способом с использованием информации, предоставленной в настоящем описании. Например, получением триптического гидролизата полипептидов CBA и тестированием иммуногенности получаемых фрагментов. Или фрагменты можно синтезировать и тестировать, как в хорошо известном способе PEPSCAN (WO 84/003564, WO 86/006487 и Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, p. 3998-4002). Альтернативно, иммуногенные соответствующие области можно теоретически рассчитывать с использованием хорошо известных компьютерных программ. Иллюстративный пример эффективности применения этих способов опубликован Margalit et al. (1987, J. of Immunol., vol. 138, p. 2213-2229), которые описали показатель эффективности 75% при теоретическом расчете T-клеточных эпитопов.
Как хорошо известно, для того чтобы являться иммуногенными, полипептиды должны иметь минимальную длину, как правило 8-11 а/к для связывания с рецептором MHC I, и 11-15 н/к для связывания с рецептором MHC II (описано, например, Germain & Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, p. 403-450). Таким образом, по изобретению иммуногенный фрагмент полипептида по изобретению составляет по меньшей мере 8 аминокислот в длину.
Полипептидные фрагменты, которых еще не вызывают эффективный иммунный ответ, можно презентировать иммунной системе-мишени прикрепленными к или в виде молекулы носителя. Хорошо известные носители представляют собой бактериальные анатоксины, такие как столбнячный токсин или дифтеритный анатоксин, альтернативно, можно использовать KLH, BSA, или компоненты бактериальной клетки (выделяемые из) липида A и т.д. Также пригодными могут являться полимеры или другие частицы или повторяющиеся структуры, такие как вирусоподобные частицы и т.д. Связывание с молекулой носителя можно проводить известными в данной области способами с использованием химических или физических технологий.
Полипептиды CBA по изобретению или их иммуногенный фрагмент могут быть биологического или синтетического происхождения, и их можно получать выделением, очисткой, сборкой и т.д. Полипептиды можно выделять из in vivo или in vitro культур паразитов Babesia собак. Однако полипептиды получают более подходящим образом, способом рекомбинантной экспрессии посредством экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептиды или фрагмент.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, которая способна кодировать полипептид или его иммуногенный фрагмент по изобретению.
Понятие нуклеотидной последовательности, которая "способна кодировать" полипептид, хорошо известно в данной области и относится к центральной догме молекулярной биологии в отношении экспрессии генов и продукции белка: ДНК транскрибируется в РНК, и РНК транслируется в белок. Как правило, такая нуклеотидная последовательность, способная кодировать полипептид, называется открытой рамкой считывания (ORF), указывающей на то, что не содержится нежелательных стоп-кодонов, которые преждевременно завершат трансляцию белка рибосомой. Указанная нуклеотидная последовательность может представлять собой ген (т.е. ORF, кодирующую полный белок) или может представлять собой фрагмент гена. Она может быть природного или синтетического происхождения.
Изобретение предпочтительно относится к последовательности мРНК и геномной последовательности для ряда полипептидов CBA. Как указано, обнаружено, что геном B. rossi содержит два отдельных гена, кодирующих два различных варианта полипептида CBA, геном B. canis содержит только один ген CBA. Последовательности мРНК CBA (в виде кДНК) предоставлены в SEQ ID NO:9-11, и геномные последовательности CBA в SEQ ID NO:12-14 (см. таблицу 1).
Когда определяли и анализировали последовательности мРНК, выявили, что все соответствующие CBA гены содержат нетранслируемые области приблизительно 15-19% от полного гена. Хотя длины различных генов CBA отличаются, расположение и деление этих интронов являлось в высшей степени сходным, где все гены CBA содержат два интрона, расположенных приблизительно между номерами нуклеотидов от 170 и 200 и от 400 до 550 (см. таблицу 4 и фиг.2). Такая консервативная организация гена является дополнительной демонстрацией родства членов класса полипептидов CBA, определяемых в настоящем описании.
Таблица 4Расположение интронов в генах CBA
Ген CBA
Расположение интронов (номера нуклеотидов)
% от гена интрона
CBA-1 B. canis (SEQ ID NO:12)
170-203
408-550
15
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:13)
173-207
406-569
19
CBA-2,2 B. rossi (SEQ ID NO:14)
170-204
406-552
18
Гены CBA или предпочтительно соответствующие последовательности кДНК можно подходящим образом применять для различных целей, например, для экспрессии и получения полипептидов CBA по изобретению. Однако, как хорошо известно в данной области, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же белок. Это приводит к тому, что известно в молекулярной биологии как "качание" или "вырожденность генетического кода", где несколько кодонов или триплетов мРНК обуславливают присоединение одной и той же аминокислоты к цепи аминокислот, растущей на рибосоме при трансляции. Это наиболее распространено во втором и особенно в третьем основании каждого триплета, кодирующего аминокислоту. Это явление может приводить к гетерологичности приблизительно 30% двух различных нуклеиновых кислот, которые все еще кодируют один и тот же белок. Таким образом, две нуклеиновые кислоты, обладающие идентичностью нуклеотидной последовательности только приблизительно 70%, все еще могут кодировать один и тот же белок.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению обладает идентичностью нуклеотидной последовательности более 70% по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.
Как также хорошо известно, альтернативный путь характеристики нуклеотидной последовательности посредством уровня идентичности ее нуклеотидной последовательности является путем не посредством компьютерного анализа, а физическим измерением, подходящим образом такое измерение можно проводить анализом, тестирующим гибридизацию в условиях повышенной жесткости.
Таким образом, в альтернативном варианте осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению может гибридизоваться в жестких условиях по меньшей мере до одной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.
Термин "гибридизоваться" относится к процессу связывания (также называемого отжигом, или последовательность-специфическим спариванием оснований) между двумя цепями нуклеиновых кислот. В процессе гибридизации комплементарные области нуклеиновой кислоты-мишени и пробы находят друг друга, отжигаются и становятся связанными. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК при условии, что они являются одноцепочечными и развернутыми. В соответствующих условиях мишень и проба связываются посредством образования водородных мостиков между нуклеотидами A и T и между G и C.
Как правило, нуклеиновая кислота-мишень представляет собой более крупную молекулу ДНК (плазмиду, хромосому или геном) или (м)РНК, и проба, как правило, представляет собой ДНК (т.к. она является более стабильной, чем РНК), одноцепочечную и меньшего размера, чем мишень, например, от 50 до 5000 оснований.
"Жесткость" на практике определяют в основном как функцию концентрации солей и температуры, используемых для гибридизации, и стадий промывания в протоколе испытаний гибридизации. Ограничение жестких условий следует из формулы температуры плавления Tm Meinkoth & Wahl (1984, Anal. Biochem., vol. 138, p. 267-284):
Tm=[81,5°C+16,6(log M)+0,41(% GC)-0,61(% формамид)-500/л]-1°C/1% несоответствия
В этой формуле M представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процент нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, L представляет собой длину гибрида в парах оснований, и "несоответствие" представляет собой отсутствие идентичного совпадения.
Как хорошо известно, высокая концентрация соли и низкая температура представляют собой условия "низкой" жесткости, и низкая концентрация соли и высокая температура представляют собой высокую жесткость. Выбирая конкретную гибридизации и условия промывания, можно устанавливать определенный уровень жесткости, и таким образом определять минимальный уровень термостабильности, существование которой необходимо для дуплекса ДНК-ДНК (или РНК-ДНК), который образуется и сохраняется.
Стандартный буфер, используемый для установления жесткости, представляет собой буфер SSC (цитрат натрия в физиологическом растворе), где стандартный "20×" буфер SSC содержит 3 моль NaCl и 0,3 M цитрата в воде при pH 7. Таким образом, очень низкая жесткость представляет собой промывание в 20× SSC при комнатной температуре (3 M соли и 20°C), и более высокая жесткость представляет собой кипячение в дистиллированной воде (без соли и 100°C).
Это также подробно описано в руководствах, таких как Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986), pp. 75 78, и 84-87, Molecular Cloning, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982), pp. 387-389, и 2001.
По изобретению "жесткие условия" представляют собой такие условия, при которых нуклеотидная последовательность еще может гибридизоваться, если ее несоответствие нуклеотидной последовательности по изобретению составляет 30% или менее (т.е., если существует идентичность нуклеотидной последовательности более 70%). Более предпочтительно условия, при которых нуклеотидная последовательность, обладающая приблизительно 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью нуклеотидной последовательности, может оставаться гибридизованной с нуклеотидной последовательностью по изобретению.
Предпочтительно неограничивающий пример условий жесткой гибридизации по изобретение представляет собой гибридизацию в 2-6× SSC и 0,5% SDS при приблизительно 45°C с последующим одним или более промываниями (например, приблизительно от 5 до 30 минут каждое) в 0,5-2× SSC, 0,1% SDS при 45-65°C.
Нуклеотидную последовательность по изобретению можно подходящим образом использовать различными путями. Одним из примеров является использование для диагностических целей различными способами и технологиями, например, для детекции инфицирования хозяина-собаки паразитами Babesia.
Общепринятые нуклеотидные последовательности, такие как нуклеотидные последовательности по изобретению, подходящим образом обрабатывают в отношении вектора, такого как плазмида ДНК, обеспечивающая ее амплификацию, например, в бактериальных культурах, и их использование в ряде способов молекулярной биологии. Широкий спектр подходящих плазмидных векторов является коммерчески доступным.
Когда нуклеотидные последовательности по изобретению необходимо использовать для экспрессии полипептидов, необходимо, чтобы они находились в виде, который обеспечивает транскрипцию мРНК и трансляцию белка. В частности, необходимо предоставлять нуклеотидную последовательность с соответствующими регуляторными сигналами для инициации транскрипции и трансляции, например, являлась функционально связанной с промотором и стоп-кодоном, когда нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, или с хвостом поли-A, когда нуклеиновая кислота представляет собой мРНК.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность по изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность находится под контролем функционально связанного промотора.
Элементы термина "нуклеотидная последовательность […] под контролем функционально связанного промотора" все являются хорошо известными в данной области, "промотор" представляет собой регуляторный участок ДНК, который может инициировать транскрипцию РНК. Для обеспечения этого действия промотора необходимо, чтобы он "контролировал" участок ДНК, который может транскрибироваться, такой как ORF или ген. Элемент, являющийся "функционально связанным" с рамкой считывания, которая должна экспрессироваться, означает, что не содержится элементов последовательности между этими двумя элементами, которая бы препятствовала действию промоторов. Как правило, промотор расположен непосредственно перед старт-кодоном ATG ORF. Специалистам в данной области очевидно, что выбор промотора по изобретения включает любой эукариотический, прокариотический или вирусный промотор, способный управлять транскрипцией, при условии, что промотор является функциональным в используемой экспрессирующей системе.
Посредством нуклеиновой кислоты по изобретению можно проводить модификации встраиваемой нуклеотидной последовательности, например, вставки, делеции или мутации общепринятыми способами расщепления рестрикционными ферментами или полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Например, с целью улучшения уровня экспрессии, для очистки или детекции белка после экспрессии или для того, чтобы сделать полипептид более иммуногенным, можно добавлять дополнительные нуклеотидные последовательности. Это может приводить к тому, что конечная нуклеотидная последовательность, содержащаяся в нуклеиновой кислоте, является больше, чем последовательности, необходимые для кодирования полипептида CBA по изобретению. Также, когда такие дополнительные элементы встраивают в рамку считывания, они становятся неотъемлемой частью экспрессируемого полипептида CBA, такие слитые полипептиды также входят в объем изобретения.
Предпочтительно слитый полипептид по изобретению представляет собой такой, как описано в WO 2004/007525: посредством прикрепления гидрофобного пептида к коровому полипептиду, слитый полипептид более эффективно взаимодействует со свободным сапонином в качестве адъюванта. Описаны примеры таких гидрофобных пептидов для слияния, например, C-концевой участок комплементзависимого стимулятора гемолиза (CD55).
Нуклеиновую кислоту по изобретению подходящим образом можно использовать для так называемой "ДНК-вакцинации". В таком варианте осуществления нуклеиновую кислоту по изобретению вводят в мишень, где нуклеиновая кислота поглощается в клетках, содержащаяся нуклеотидная последовательность начинает экспрессироваться, и продуцируемый полипептид является презентированным иммунной системе-мишени, вырабатывающей иммунный ответ. ДНК можно вводить различными способами, и она может находиться в различных формах в виде голой ДНК или прикрепленной или инкапсулированной в носителе, например, золотые частицы.
Прямая вакцинация ДНК, кодирующей полипептид, является эффективной для многих различных белков, как описано, например, у Donnelly et al. (1993, The Immunologist, vol. 2, p. 20-26). Например, в области противопаразитарных вакцин защиту, например, от Plasmodium yoelli, получают ДНК-вакцинацией геном спорозоита P. yoelli (Hoffman S. et al., 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1529-1533), и защиту от Leishmania major получают ДНК-вакцинацией гена поверхностного гликопротеина gp63 L. major (Xu & Liew, 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1534-1536).
Нуклеиновую кислоту по изобретению также можно использовать предпочтительно для экспрессии и получения полипептида CBA или его иммуногенного фрагмента по изобретению. В рекомбинантных экспрессирующих системах для этой цели, как правило, применяют клетку-хозяина, культивируемую in vitro. Хорошо известными в данной области являются клетки-хозяева из экспрессирующих систем на основе бактериальной, дрожжевой, грибной клетки, клетки насекомого или позвоночного.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеотидную последовательность или нуклеиновую кислоту по изобретению.
Клетка-хозяин, которую необходимо использовать для экспрессии полипептида CBA по изобретению, может представлять собой клетку бактериального происхождения, например, от Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. или Caulobacter crescentus, возможно в комбинации с использованием выделяемых из бактерий плазмид или бактериофагов для экспрессии последовательности, кодирующей полипептид CBA. Клетка-хозяин также может быть эукариотического происхождения, например, клетки дрожжей в комбинации с молекулами специфических дрожжам векторов, или клетки высших эукариот, такие как клетки насекомых (Luckow et al., 1988, Biotechnology, vol. 6, p. 47-55), в комбинации с векторами или рекомбинантными бакуловирусами, или растительные клетки в комбинации, например, с векторами на основе Ti-плазмиды или векторами вирусов растений (Barton et al., 1983, Cell, vol. 32, p. 1033), или клетки млекопитающих, такие как клетки Hela, клетки китайского хомяка или клетки Мадин-Дарби почек собаки также с соответствующими векторами или рекомбинантными вирусами.
После таких экспрессирующих систем, экспрессирующие системы на основе растительной клетки или паразита являются привлекательными экспрессирующими системами. Экспрессирующие системы на основе паразита, например, описаны в French патентной заявке Франции номер 2714074. Экспрессирующие системы на основе растительной клетки для полипептидов для биологического применения, например, описаны Fischer et al. (Eur. J. of Biochem. 1999, vol. 262, p. 810-816) и Larrick et al. (Biomol. Engin. 2001, vol. 18, p. 87-94).
Экспрессию также можно проводить в так называемых не содержащих клеток экспрессирующих системах. Такие системы содержат все основные факторы для экспрессии соответствующей рекомбинантной нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, который функционирует в этой конкретной системе. Примеры представляют собой систему на основе лизата E. coli (Roche, Basel, Switzerland), или систему на основе лизата ретикулоцитов кролика (Promega corp., Madison, USA).
Эффективным путем экспрессии нуклеотидной последовательности или нуклеиновой кислоты по изобретению в клетке-хозяине или даже у животного является путь посредством их введения в носитель, который может проникать в клетки-хозяева или животное-хозяина. Носитель представляет собой живой рекомбинантный микроорганизм-носитель (LRCM), который может проникать в хозяина, не повреждая его.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к живому рекомбинантному микроорганизму-носителю, содержащему нуклеотидную последовательность или нуклеиновую кислоту по изобретению.
Такие живые рекомбинантные микроорганизмы-носители (LRCM) представляют собой, например, бактерии, паразитов, вирусы и дрожжевые клетки, их также можно использовать для инфицирования животного-хозяина. Репликация LRCM у животного-хозяина может представлять собой способ продуцирования полипептида или его фрагмента по изобретению, который затем можно выделять и использовать, например, для вакцинации или диагностических целей. Однако LRCM также подходящим образом можно использовать непосредственно для вакцинации, например, в качестве системы доставки полипептида или его фрагмента по изобретению животному-хозяину, и таким образом вакцинировать животное-хозяина. Этот путь презентирования иммунной системе хозяина может являться более эффективным, чем вакцинация в виде субъединичного белка с адъювантов, т.к. реплицирующийся микроорганизм является более близким к естественному пути инфицирования Babesia, и может походить на путь, которым полипептиды CBA или их иммуногенные фрагменты презентируются иммунной системе при естественной инфекции. Дополнительное преимущество LRCM заключается в их самовоспроизведении, таким образом, что для иммунизации необходимы только небольшие количества рекомбинантного носителя.
По изобретению подходящие LRCM представляют собой микроорганизмы, которые могут реплицироваться у животного, являющегося собакой, которые не являются (очень) патогенными для животного, и предпочтительно для которых доступны средства молекулярной биологии для их рекомбинации и обработки. Примеры представляют собой аттенуированные или непатогенные изоляты бактерий: Ehrlichia, Leptospira или Borrelia, паразитов: Leishmania или Neospora (предпочтительно как в WO 04/026903) или даже саму Babesia, или вирусы: парвовирус собак, вирус чумы, поксвирус, вирус гепатита, вирус парагриппа или вирус бешенства.
Для конструкции LRCM можно использовать хорошо известный способ гомологичной рекомбинации in vitro для стабильного введения нуклеиновой кислоты по изобретению в геном LRCM. Альтернативно, нуклеиновую кислоту также можно вводить в LRCM для транзиентной или эписомной экспрессии.
Как хорошо известно в данной области, эффект выбора определенной экспрессирующей системы представляет собой уровень посттрансляционного процессинга экспрессируемого белка, который применяют, например, прокариотическая экспрессирующая система не прикрепляет каких-либо сигналов гликозилирования к продуцируемому полипептиду, тогда как системы насекомых, дрожжей или млекопитающих прикрепляют N- и/или O-связанное гликозилирование увеличивающейся сложности. Соответствующий выбор представляет собой такой, что система обеспечивает наилучшее соотношение количества полипептида и иммунологической эффективности.
Полипептиды по изобретению или их фрагменты можно модифицировать во время или после трансляции, и это можно проводить биологически или синтетически. Примеры представляют собой гликозилирование или пегилирование. Конкретная предпочтительная модификация по изобретению представляет собой добавление так называемого GPI-якоря (гликозилфосфатидилинозитола), хорошо известной и высокоиммуногенной модификации некоторых экспрессируемых полипептидов паразитов.
Дополнительный аспект изобретения относится к выделенному антителу, которое может специфически связываться с полипептидом или его иммуногенным фрагментом по изобретению.
По изобретению "антитело" представляет собой иммуноглобулин или его иммунологически активную часть, например, фрагмент, которые еще содержат антигенсвязывающий участок, такой как одноцепочечное антитело или Fab, Fv, scFv, dAb или Fd-фрагмент, все хорошо известные в данной области.
Антитела характеризуются своей специфичностью, т.е. молекулой, с которой они связываются с такой силой, что их можно отличать от любого неспецифического или фонового связывания, как правило, посредством разбавления специфического антитела.
Специфические антитела, как правило, получают (гипер)иммунизацией животного-донора целевым полипептидом и сбором антител, получаемых из сыворотки животного. Хорошо известными донорами являются кролики и козы. Другой пример представляет собой кур, которые могут продуцировать высокие уровни антител в яичном желтке, так называемые IgY. Альтернативно, антитела можно получать in vitro, например, хорошо известной технологией моноклональных антител из культур иммортализованных B-лимфоцитов (гибридомных клеток), для которых известны системы получения в промышленном масштабе. Также антитела или их фрагменты могут сами экспрессироваться в рекомбинантной экспрессирующей системе посредством экспрессии клонированных генов тяжелой и/или легкой цепи Ig.
Такие антитела можно подходящим образом использовать для различных применений, в частности, диагностик и вакцинаций. Диагностики описаны в настоящем описании ниже. Использование антител в вакцинациях относится к так называемым пассивным вакцинам. В последнем случае антитела предпочтительно адаптированы так, чтобы соответствовать основным характеристикам антител у мишени, в этом случае антитела необходимо "канинизировать".
Предпочтительное применение полипептидов CBA, фрагментов и нуклеиновых кислот, кодирующих такие полипептиды или фрагменты, представляет собой их медицинское применение, в частности, для вакцинации.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к полипептиду или его иммуногенному фрагменту, нуклеотидной последовательности, нуклеиновой кислоте, живому рекомбинантному микроорганизму-носителю или антителу, все по изобретению, или к комбинации любых этих компонентов для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
В дополнительном аспекте изобретение относится к вакцине для собак против бабезиоза, содержащей полипептид или его иммуногенный фрагмент, нуклеотидную последовательность, нуклеиновую кислоту, живой рекомбинантный микроорганизм-носитель или антитело, все по изобретению, или комбинацию любых этих компонентов и фармацевтически приемлемый носитель.
Такие медицинские применения изобретения приводят к улучшению иммунитета собак, обеспечению профилактики, предотвращения или улучшения состояния бабезиоза и/или паразитемии паразитами Babesia у собак. Это продемонстрировано, с одной стороны, происхождением пептидов CBA, описываемых в настоящем описании, а именно из SPA, для которых хорошо известно, что они являются защитными с иммунологической точки зрения. В частности, это следует из подробного описания, как предоставлено в разделе "Примеры" в настоящем описании, в частности, эксперименте на животных и результатах анализа конкурентного связывания антител, как продемонстрировано посредством AlphaLisa.
Специалист в данной области может легко наблюдать различие, которое вызывает вакцина по изобретению у собаки-мишени, посредством наблюдения симптомов заболевания, как правило, вызываемых инфекцией Babesia, в частности анемии, и изменений объема осажденных эритроцитов или гематокритного числа, температуры, почечной функции, поведения и т.д.
Такая эффективность вакцины становится очевидной при сравнении вакцинированного и невакцинированного животного-мишени. В данной области хорошо известны способы оценки такой эффективности вакцины.
Например, паразитемию паразитами Babesia у хозяина можно легко определять посредством подсчета под световым микроскопом числа эритроцитов, которые содержат паразитов Babesia в мазке крови, как описано Jarra and Brown для малярии (1985, Parasite Immunol., vol. 7, p. 595-606). Для улучшенной видимости образец можно контрастно окрашивать, например, красителем Гимза.
Затем паразитемию можно представлять в виде процента инфицированных эритроцитов по сравнению с неинфицированными эритроцитами или можно представлять в виде общего числа инфицированных эритроцитов в фиксированном числе исследуемых эритроцитов. Их, в свою очередь, можно подсчитывать в сутки, или как нарастающий итог в течение продолжительности паразитемии, так называемой "паразитарной нагрузки".
10
5
По изобретению паразитемию выражают в виде паразитарной нагрузки, где Log значения количества инфицированных паразитом эритроцитов на 10 эритроцитов в суточных образцах крови, отбираемых из яремной вены, суммируют в течение периода времени, в который можно детектировать паразитов. Как правило, паразитемия Babesia возникает через от 3 до 14 суток после заражения с пиком через от 5 до 10 суток после заражения.
Конкретно вакцина по изобретению способна уменьшать паразитемию, вызываемую инфекцией B. rossi, вакцинированного животного-мишени более чем на 70%. Предпочтительно уменьшение паразитемии составляет 75, 80, 85, 90, 95, 97 или даже 100% в порядке предпочтения. Аналогично, вакцина по изобретению способна уменьшать признаки заболевания, вызываемого инфекцией B. canis более чем на 50%, предпочтительно более 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 или даже 100% в порядке предпочтения.
Альтернативно, симптомы заболевания, вызываемого инфекцией Babesia, можно выражать в клиническом балле, таким образом, что затем можно сравнивать эффект вакцинации в клинических баллах вакцинированных и невакцинированных животный-мишеней после инфекции. Специалист может составлять таблицы для ранжирования таких клинических баллов, например, как описано Schetters et al., 1994 (Vet. Parasitol., vol. 52, p. 219-233) для симптомов инфекции B. canis у собак.
Предпочтительно вакцина по изобретению способна уменьшать клинические баллы у вакцинированных хозяев, инфицированных Babesia на 50%, более предпочтительно на 60, 70, 80, 90 или даже 100% в порядке предпочтения.
Дополнительный предпочтительный эффект вакцинации, как описано по изобретению, заключается в предотвращении или снижении распространения инфекции Babesia в популяции собак, так называемого горизонтального распространения инфекции. Это обусловлено тем, что клещи, которые еще не являются инфицированными при питании на вакцинированных собаках с меньшей вероятностью станут инфицированными, и таким образом не будут быстро распространять инфекцию Babesia последующим собакам. Таким образом, это приводит к уменьшению распространенности Babesia у клещей-переносчиков определенной географической области, и в свою очередь, к меньшему переносу Babesia новым собакам-хозяевам. В этом варианте осуществления вакцина работает как вакцина, препятствующая переносу возбудителя.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению способна уменьшать распространенность Babesia у клещей-переносчиков географической области.
Способы определения распространенности Babesia у клещей-переносчиков хорошо известны в данной области, например, как описано Lewis et al. (1996, Vet. Paras., vol. 63, p. 9-16), или более современными способами с использованием обратного линейного блоттинга или PCR ткани клещей.
Для получения и применения вакцины и медицинского использования по изобретению, изобретение в дополнительном аспекте относится к способу получения вакцины по изобретению, где способ включает смешивание полипептида или его иммуногенного фрагмента, нуклеотидной последовательности, нуклеиновой кислоты, живого рекомбинантного микроорганизма-носителя или антитела по изобретению, или комбинации любых этих компонентов и фармацевтически приемлемого носителя.
В одном из вариантов осуществления способ по изобретению также включает экспрессию нуклеотидной последовательности или нуклеиновой кислоты по изобретению в рекомбинантной экспрессирующей системе, как описано выше.
В дополнительном аспекте изобретение относится к применению полипептида или его иммуногенного фрагмента, нуклеотидной последовательности, нуклеиновой кислоты, живого рекомбинантного микроорганизма-носителя или антитела по изобретению, или комбинации любых этих компонентов для получения вакцины против бабезиоза у собак.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу вакцинации собаки против бабезиоза, включающему стадию инокуляции указанных собак вакциной по изобретению.
Термин "вакцина" подразумевает наличие иммунологически эффективного количества полипептида или иммуногенного фрагмента по изобретению и наличие фармацевтически приемлемого носителя.
То, что составляет иммунологически эффективное количество вакцины по изобретению, зависит от желаемого действия и от конкретных характеристик вакцины, которую используют. Определение эффективного количества находится в компетенции специалиста-практика, например, посредством наблюдения за иммунным ответом после вакцинации или после заражения инфекцией, например, наблюдения за клиническими признаками заболевания мишени, серологическими параметрами или посредством повторного выделением патогена, и сравнением их с ответами, наблюдаемыми у невакцинированных животных.
Как правило, вакцина индуцирует иммунный ответ, который способствует предотвращению, улучшению состояния, уменьшению восприимчивости или лечению заболевания или нарушения, возникающего вследствие инфекции микроорганизмом. Защиту получают в результате введения (композиции, содержащей) одного или более антигенов, выделяемых из микроорганизма, такого как аттенуированного или убитого микроорганизма, и/или его субъединицы. Это приводит к тому, что у животного-мишени выявляют уменьшения числа или выраженности клинических признаков, вызываемых микроорганизмом. Это может являться результатом снижения колонизации или снижения скорости распространения инфекции микроорганизмом, приводящих к уменьшению числа или тяжести повреждений и эффектов, вызываемых микроорганизмом или ответом-мишени на него.
Предполагают, что "фармацевтически приемлемый носитель" способствует эффективному введению соединения без оказания (тяжелых) неблагоприятных воздействий на здоровье животного, которому его вводят. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой, например, стерильную воду или стерильный физиологический солевой раствор. В более сложных формах носитель может представлять собой, например, буфер, который может содержать дополнительные добавки, такие как стабилизаторы или консерванты. Более подробное описание и примеры, например, описаны в хорошо известном руководстве, например, таком как "Remington: the science и practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) и "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
В предпочтительном варианте осуществления соединения, используемые для получения вакцины по изобретению, не содержат сыворотку (без сыворотки животного), белок (без животного белка, но могут содержать другие компоненты, выделяемые у животного), соединения животного происхождения (ACF, не содержащие какого-либо компонента, выделяемого у животного); или даже "определенного химического состава" в порядке предпочтения.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению дополнительно содержит стабилизатор.
Как правило, вакцину смешивают со стабилизаторами, например, для защиты компонентов, подверженных деградации, от деградации, для увеличения срока хранения вакцины и/или для улучшения эффективности лиофилизации. В основном, стабилизаторы представляют собой крупные молекулы большой молекулярной массы, такие как липиды, углеводы или белки, например, сухое молоко, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, трегалоза, спермидин, декстран или поливинилпирролидон, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.
Предпочтительно стабилизатор не содержит соединений животного происхождения или даже имеет определенный химический состав, как описано в WO 2006/094974.
Также можно добавлять консерванты, такие как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения и/или гентамицин.
Например, для стабильности или экономичности антиген по изобретению может быть лиофилизированным. Как правило, это обеспечит длительное хранение при температурах выше нуля °C, например, при 4°C.
Специалистам в данной области известны способы лиофилизации, и оборудование для лиофилизации в различном масштабе является коммерчески доступным.
Таким образом, в более предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению отличаются тем, что указанные вакцины находятся в лиофилизированной форме.
Для восстановления лиофилизированной вакцинной композиции ее суспендируют в физиологически приемлемом разбавителе. Как правило, это проводят непосредственно перед применением для обеспечения наилучшего качества вакцины. Разбавитель может представлять собой, например, стерильную воду или физиологический солевой раствор. Разбавитель, который используют для восстановления вакцины, сам по себе может содержать дополнительные соединения, такие как адъювант. В более сложной форме он может быть суспендированным в эмульсии, как указано в EP 382271.
В одном из вариантов осуществления лиофилизированной вакцины, получаемой по изобретению, адъювант для вакцины поставляют отдельно от лиофилизата, содержащего оставшуюся часть вакцины, и предпочтительно он содержится в забуференном разбавителе. В этом случае лиофилизированная вакцина и специальная композиция разбавителя образуют набор из частей, которые совместно осуществляют настоящее изобретение.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления лиофилизированной вакцины по изобретению лиофилизированная вакцина содержится в наборе, состоящем по меньшей мере из двух типов контейнеров, где один контейнер содержит лиофилизированную вакцину, и один контейнер содержит водный разбавитель, содержащий буфер и адъювант сапонин.
Предпочтительно лиофилизированная вакцина находится в форме, как описано в EP 799613.
Вакцина по изобретению может дополнительно содержать так называемый "носитель". Носитель представляет собой соединение, к которому белки, белковые фрагменты, нуклеиновые кислоты или их части, кДНК, рекомбинантные молекулы, живые рекомбинантные носители и/или клетки-хозяева по изобретению прикрепляются, не являясь ковалентно связанными с ним. Такие носители представляют собой, в частности, биомикрокапсулы, микроальгинаты, липосомы, макрорастворы, гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфат или оксид алюминия, диоксид кремния, Kaolin и Bentonite, все известны в данной области.
Примером является носитель, в котором антиген частично встроен в иммуностимулирующий комплекс, так называемый ISCOM (EP 109942, EP 180564, EP 242380).
Кроме того, вакцина по изобретению может содержать одно или более подходящих поверхностно-активных соединений или эмульгаторов, например, Span или Tween.
Возраст, масса, пол, иммунологический статус и другие параметры собак, которые подлежат вакцинации, не являются критическими, хотя, очевидно, что благоприятно вакцинировать здоровых мишеней и вакцинировать как можно раньше для предотвращения любой полевой инфекции. Вследствие того, что инфекцию Babesia можно устанавливать уже в очень молодом возрасте, таким образом, вакцину по изобретению можно применять в первые 2 недели после рождения, однако необходимо учитывать содержание материнских антител в молозиво для эффективной вакцинации в молодом возрасте.
Индивидуумы-мишени для вакцинации по изобретению представляют собой собак, которые могут быть здоровыми или заболевшими, и могут являться серопозитивными или серонегативными к паразитам Babesia или к антителам к паразитам Babesia. Собака-мишень может быть любого возраста, в котором она является восприимчивой к вакцинации.
Вакцину по изобретению в равной степени можно использовать в качестве профилактического и в качестве терапевтического лечения, и она препятствует укоренению и/или прогрессированию инфекции Babesia или ее клинических признаков заболевания.
Вакцина по изобретению может эффективно служить в качестве первичной вакцинации, за которой в дальнейшем может следовать, и усиливать ее, вторичная вакцинация, например, классической инактивированной вакциной с добавлением адъювантов.
Схема применения вакцины по изобретению у собаки-цели может состоять из однократных или многократных доз, которые можно вводить в одно и то же время или последовательно способом, соответствующим дозированию и составу, и в таком количестве, которое будет иммунологически эффективным.
Протокол введения вакцины по изобретению идеально включать в существующие схемы вакцинации другими вакцинами для собак.
Вакцины по изобретению предпочтительно применяют в однократной годовой дозе.
Получение вакцины по изобретению проводят хорошо известным специалистам способом.
Такое получение вакцины, как правило, включает стадии смешивания и формулирования компонентов по изобретению с фармацевтически приемлемыми эксципиентами с последующим пропорциональным распределением в контейнеры подходящего размера. Различные стадии способа получения необходимо контролировать соответствующими тестами, например, иммунологическими тестами на качество и количество антигенов, микробиологическими тестами на стерильность и отсутствие посторонних веществ, и в конечном итоге, экспериментами на животных на эффективность вакцины и безопасность. Все они хорошо известны специалисту.
Вакцина по изобретению может находиться в любой форме, которая является подходящей для введения животным, являющимся собаками, и которая подходит для желаемого пути применения и желаемого действия.
Вакцина по изобретению может находиться в нескольких формах, например, в форме жидкости, геля, мази, порошка, таблетки или капсулы, в зависимости от желаемого способа применения у мишени. Предпочтительно вакцину по изобретению составляют в форме, подходящей для инъекции, таким образом, инъецируемой жидкости, такой как суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия. Как правило, такие вакцины получают стерильными.
Вакцины по изобретению можно вводить в количествах, содержащих от 0,1 до 1000 мкг полипептида или его фрагмента по изобретению. В принципе, можно использовать более низкие и более высокие дозы, предпочтительно используют от 50 до 250 мкг полипептида в дозе.
Вакцины по изобретению можно вводить в объеме, который соответствует собакам-мишеням, например, одна доза вакцины для собаки может составлять от 0,5 до 5 мл. Предпочтительно одна доза составляет от 1 до 3 мл.
Вакцину по изобретению можно вводить собакам-мишеням известными в данной области способами. Например, парентеральными путями введения, такими как через все пути инъекции в или через кожу, например, внутримышечно, внутривенно, интраперитонеально, внутрикожно, под слизистую или подкожно. Альтернативные пути введения, которые являются подходящими, представляют собой пути посредством местного применения в виде капель, спрея, геля или мази на эпителий слизистой оболочки глаза, носа, ротовой полости, ануса или влагалища, или на эпидермис наружного слоя кожи любой части тела, распылением в виде аэрозоля или порошка. Альтернативно, применение можно проводить через пищевой путь, объединяя с пищей, кормом или питьевой водой, например, в виде порошка, жидкости или таблетки, или введением непосредственно в ротовую полость в виде жидкости, геля, таблетки или капсулы, или в анус в виде суппозитория.
Предпочтительный путь введения представляет собой путь посредством внутримышечной или подкожной инъекции. Само собой разумеется, что оптимальный путь введения зависит от конкретного состава вакцины, который используют, и от конкретных характеристик собак-мишеней.
Вакцину по изобретению предпочтительно используют в виде маркерной вакцины, маркерная вакцина известна как вакцина, которая позволяет проводить различие между вакцинированными и инфицированными полевой инфекцией индивидуумами. Это определяют, например, детекцией панели антител, характерных для вакцины, которая отличается от панели антител, индуцированной инфекцией возбудителя дикого типа. Такое различие, например, получают, когда иммуногенный белок, содержащийся в или у микроорганизма дикого типа, не содержится в вакцине. Это можно подходящим образом детектировать посредством серологического анализа, такого как ELISA или иммунофлуоресцентный анализ.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению представляет собой маркерную вакцина.
Специалист в данной области способен дополнительно оптимизировать вакцину по изобретению. Как правило, это включает точную регулировку эффективности вакцины, таким образом, что она обеспечивает достаточную иммунную защиту. Это можно проводить подбором дозы вакцины или использованием вакцины в другой форме или другом составе, или подбором других компонентов вакцины (например, стабилизатора или адъюванта), или введением через другой путь.
Вакцина может дополнительно содержать другие соединения, такие как адъювант, дополнительный антиген, цитокин и т.д. Альтернативно, вакцину по изобретению можно предпочтительно объединять с фармацевтическим компонентом, таким как антибиотик, гормон или противовоспалительное лекарственное средство.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению отличается тем, что она содержит адъювант.
"Адъювант" представляет собой хорошо известный ингредиент вакцин, который в основном представляет собой вещество, которое стимулирует иммунный ответ у мишени неспецифическим образом. В данной области известно много различных адъювантов. Примеры адъювантов представляют собой полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин E, неионные блок-полимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, карбопол и пиран.
Кроме того, часто в качестве адъюванта используют пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, тафцин, и предпочтительно можно использовать минеральное масло, например, Bayol или Markol, растительные масла или их эмульсии и DiluvacForte.
Предпочтительный адъювант для вакцины по изобретению представляет собой сапонин, более предпочтительно Quil A. Адъювант сапонин предпочтительно содержится в вакцине по изобретению на уровне от 10 до 10000 мкг/мл, более предпочтительно от 100 до 500 мкг/мл. Сапонин и компоненты вакцины можно комбинировать в ISCOM (EP 109942, EP 180564, EP 242380).
Само собой разумеется, что другие способы добавления адъювантов, добавления соединений-носителей или разбавителей, эмульгирующих или стабилизирующих вакцину, также входят в объем изобретения. Такие введения добавок, например, описаны в хорошо известных руководствах.
Вакцина по изобретению можно предпочтительно объединять с другим антигеном.
Таким образом, в более предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению отличается тем, что она содержит дополнительный иммуноактивный компонент.
"Дополнительный иммуноактивный компонент" может представлять собой антиген, иммуностимулирующее вещество и/или вакцину, любой их них может содержать адъювант.
Дополнительный иммуноактивный компонент, когда находится в форме антигена, может состоят из любого антигенного компонента, представляющего интерес для человека или ветеринарии. Например, он может содержать биологическую или синтетическую молекулу, такую как белок, углевод, липополисахарид, нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый антиген. Также клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту или живой рекомбинантный микроорганизм-носитель, содержащий такую нуклеиновую кислоту, может представлять собой путь доставки нуклеиновой кислоты или дополнительного иммуноактивного компонента. Альтернативно, она может содержать фракционированный или убитый микроорганизм, такой как паразит, бактерия или вирус.
Дополнительный иммуноактивный компонент(-ы) может находиться в форме иммуностимулирующего вещества, например, хемокина, или иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, например, мотив CpG. Альтернативно, вакцину по изобретению можно саму добавлять в вакцину.
Например, вакцину по изобретению можно объединять с препаратом белка паразита субъединичной вакцины, не являющегося полипептидом по изобретению, для получения комбинированной субъединичной вакцины против паразитарной инфекции или ассоциированных клинических признаков заболевания.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению отличается тем, что дополнительный иммуноактивный компонент или нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный дополнительный иммуноактивный компонент, получают из микроорганизма, инфекционного для собак.
Преимущество такой комбинированной вакцины заключается в том, что она индуцирует иммунный ответ не только против Babesia, а также против других патогенов (собак), при этом необходима только однократная обработка животного для вакцинации, тем самым предотвращая излишний стресс для животного-мишени, а также затраты времени и трудовые затраты.
Примеры патогенов собак представляют собой следующие: Ehrlichia canis, Leishmania donovani-complex, Neospora caninum, парвовирус собак, вирус чумы собак, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa или bratislava, вирус гепатита собак, вирус парагриппа собак, вирус бешенства, Hepatozoon canis и Borrelia burgdorferi и виды Babesia и Theileria.
Полипептид, нуклеотидную последовательность и антитела по изобретению можно предпочтительно использовать для диагностических целей.
Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к диагностическому тестовому набору, содержащему полипептид или его иммуногенный фрагмент, нуклеотидную последовательность или антитело по изобретению.
Как правило, такие тесты основаны на Elisa или иммунофлуоресцентных способах.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к диагностическому тесту для детекции нуклеотидной последовательности Babesia собак с использованием нуклеотидной последовательности по изобретению. Нуклеотидную последовательность предпочтительно используют в анализе на основе ПЦР, и ее длина составляет от 10 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к диагностическому тесту для детекции антител к Babesia собак, где указанный тест содержит полипептид или его иммуногенный фрагмент по изобретению.
Например, полипептид CBA связан с твердофазным носителем, его инкубируют с образцом, который необходимо тестировать, отмывают и детектируют наличие связанных антител из тестируемого образца. Тестируемый образец, например, получают из биологических жидкостей собак.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к диагностическому тесту для детекции антигенного вещества Babesia собак, где тест содержит антитело к полипептиду (или его иммуногенному фрагменту) по изобретению.
Например, антитела к полипептиду CBA связаны с твердофазным носителем, его инкубируют с образцом, который необходимо тестировать, отмывают и детектируют наличие связанных полипротеинов из тестируемого образца. Тестируемый образец, например, получают из крови или ткани собак.
Согласно изобретению "диагностически тестовый набор" относится к набору для проведения способов диагностики по изобретению. Набор содержит один или более компонентов по изобретению: полипептид или его иммуногенный фрагмент, нуклеотидную последовательность или антитело в подходящей форме и контейнер необязательно с разбавителем, реагентом и/или инструкции, как проводить способ.
В одном из вариантов осуществления набор может содержать контейнер с множеством лунок, такой как планшет для микротитрования. Лунки контейнера можно обрабатывать, чтобы они содержали любой из компонентов по изобретению для применения в способе диагностики по изобретению.
Инструкции, необязательно содержащиеся в диагностическом наборе по изобретению, например, могут быть напечатаны на коробке, содержащей компоненты набора, могут содержаться на информационном листе в этой коробке или их можно просматривать или загружать с интернет веб-сайта дистрибьютора набора и т.д.
По изобретению диагностический набор также может представлять собой предложение на продажу указанных частей (касающиеся коммерческой продажи), например, на интернет веб-сайте, для комбинированного использования в анализе, включающем способы по изобретению.
Изобретение дополнительно описано в отношении следующих ниже неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: Получение
Стандартными способами экспрессировали полноразмерную кДНК каждой мРНК CBA в E. coli, и очищали полипептиды CBA для последующего применения и анализа.
Очищенные CBA-1 использовали для получения гибридомной клеточной линии стандартными способами. Клеточная линия называлась 7E6, и она экспрессировала специфическое моноклональное антитело к CBA-1.
Пример 2: Определение общего эпитопа CBA и конкурентного связывания со специфическими к SPA антителами
Поликлональные антитела получали от многократно вакцинированных SPA, а затем зараженных собак, как описано ранее (Schetters et al., 1996, Parasite Immunol., vol. 18, p. 1-6). Эти антитела использовали в так называемом способе AlphaLisa (Perkin Elmer) для исследования общих эпитопов.
Способ AlphaLisa обеспечивает детекцию антигенов, содержащих по меньшей мере два различных эпитопа, т.к. донорная и акцепторная гранула, каждая, несет различное антитело, распознающее различный эпитоп на антигене. В присутствии антигена донорная и акцепторная гранула сближаются до непосредственной близости так, что может возникать перенос энергии между гранулами. Это можно детектировать соответствующим детектором. В подробном описании, иммуноглобулин после вакцинаций и заражения подвергали биотинилированию стандартными способами. Затем его инкубировали в течение 60 минут с антигеном и акцепторными гранулами, которые покрывали небиотинилированным Ig после вакцинации и заражения. В этой смеси на акцепторных гранулах образуются комплексы с антигеном и биотинилированным Ig после вакцинации и заражения. На втором этапе добавляют покрытые стрептавидином донорные гранулы и инкубируют в течение 30 минут, которые взаимодействует с биотиновыми группами на комплексе акцепторных гранул. Уникальные свойства обоих типов гранул обеспечивают детекцию гранул, которые взаимодействуют друг с другом (посредством комплексов антиген-антитело), что является величиной концентрации антигена в образце.
Сначала анализировали, можно ли распознавать рекомбинантный полипептид CBA-1 B. canis в анализе AlphaLisa с использованием поликлональной сыворотки после вакцинации и заражения. Этим исследовали то, что содержит ли CBA-1 по меньшей мере два эпитопа, которые могут быть распознаны поликлональной антисывороткой.
В качестве отрицательного контроля в этих анализах использовали нерелевантный рекомбинантный антиген, экспрессируемый аналогичным образом в E. coli, HSP70 Mycobacterium paratuberculosis.
Положительный контроль и вещество сравнения представляли собой SPA из концентрированного супернатанта из in vitro культур соответствующих паразитических видов: B. canis или B. rossi.
Результаты демонстрировали, что рекомбинантная молекула CBA-1 B. canis являлась недетектируемой в двух отдельных анализах AlphaLisa с поликлональными антителами к SPA B. canis или SPA B. rossi. (фиг.3 и 4). Образец положительного контроля давал сильный сигнал в этих соответствующих анализах.
Это демонстрирует, что рекомбинантная молекула CBA-1 B. canis не содержит двух или более отдельных эпитопов на одной молекуле, где эпитопы распознавались бы антителами к SPA. Таким образом, рекомбинантный антиген CBA-1 B. canis не содержит эпитопа вообще или содержит только один эпитоп.
Аналогичные результаты получают, когда рекомбинантный полипептид CBA-2,1 B. rossi тестируют в анализе AlphaLisa B. canis или B. rossi. Это демонстрирует, что рекомбинантный полипептид CBA-2,1 B. rossi также не содержит двух или более отдельных эпитопов на одной молекуле. Аналогично, это означает, что рекомбинантный полипептид CBA-2,1 B. rossi не содержит эпитопа вообще или содержит только один эпитоп.
Для того чтобы провести различие между этими двумя вариантами, разработали анализ ингибирования AlphaLisa, подобный хорошо известному конкурентному Elisa, но в котором применяют технологию AlphaLisa двойной способности связывания.
Тест проводили для определения, способен ли рекомбинантный CBA-1 B. canis конкурировать с антигеном SPA сравнения за связывание с поликлональными антителами на донорных и акцепторных гранулах.
Результат являлся таким, что рекомбинантный полипептид CBA-1 B. canis фактически подавлял сигнал AlphaLisa в обоих анализах и фактически подавлял почти в количественном отношении, см. фиг.5 и 6.
В противоположность этому, рекомбинантный CBA B. rossi также был способен подавлять сигнал AlphaLisa в обоих анализах почти в количественном отношении (данные не показаны).
Заключение:
Полипептид CBA-1 содержит эпитоп, который распознает сыворотка после вакцинации и заражения против SPA B. canis и сыворотка против SPA B. rossi. Это же справедливо для CBA-2,1 B. rossi и, возможно, также для CBA-2,2.
Как определено в AlphaLisa, CBA-1 и CBA-2, которые содержат эпитоп, являются только (единственными) антигенами, которые были распознаны в неочищенном образце SPA B. canis и B. rossi, соответственно.
Принимая во внимание, что известно, что SPA связан с вакцинальной защитой, и что такая вакцинальная защита в значительной степени является антителоопосредованной, таким образом, тот факт, что полипептиды CBA могут специфически и очень эффективно конкурировать с иммунопротективными антигенами из образца SPA, означает, что полипептиды CBA сами являются иммунопротективными антигенами.
Также известно, что SPA B. canis в комбинации с SPA B. rossi является эффективным в гетерологичной вакцинации и защите против B. rossi, однако, т.к. не было показано, что CBA содержит два распознаваемых эпитопа, таким образом, выявлено, что CBA экспрессирует отдельный кросс-протективный эпитоп. Таким образом, CBA представляет собой гетерологичный иммунопротективный антиген против B. rossi и B. canis.
Пример 3: CBA защищает собак от гомологичного и гетерологичного заражения Babesia
Рекомбинантный антиген CBA Babesia тестируют на его способность защищать собак от гомологичного заражения инфекцией после первичной и вторичной вакцинации. Для оценки уровня защиты, собак заражали паразитами B. canis штамма A. Инокулят для заражения получали из крови инфицированной спленэктомированной собаки. Затем за собаками наблюдали в течение 14 суток после заражения инфекцией.
План исследования
Использовали две группы из 7 собак/группа. Пол и пометы равномерно распределяли в двух группах.
Одну группу вакцинируют 50 мкг/доза CBA, вторая группа служит в качестве контроля и не получает инъекций. Ко всем антигенам добавляют 250 мкг/дозу сапонина в качестве адъюванта. Через три недели группа 1 получает вторичную вакцинацию в основном тем же антигеном. Еженедельно отбирают образцы сыворотки для определения антител к антигенам B. canis штамма A и B. rossi с использованием антител Elisa. Через две недели после заключительной вакцинации собак заражают паразитами B. canis штамма A, которых получают у инфицированной собаки. В течение периода после заражения у животных ежесуточно наблюдают клинические признаки бабезиоза. Для определения объема осажденных эритроцитов и паразитемии ежесуточно отбирают образцы крови.
Тестируемые вещества
Сапонин Supersap получают от Desert King (Chile). Сапонин получают с 10 мМ буфером Sorenson pH 6,0 в концентрации 250 мкг/мл. Лиофилизированный антиген восстанавливают в растворе адъюванта. После восстановления антигена один мл раствора представляет собой однократную дозу.
Используют собак породы бигль обоих полов и в возрасте приблизительно 5-6 месяцев. Собак получают от коммерческого заводчика. Используют только здоровых животных. Животные не должны иметь в анамнезе бабезиоза или клинической бактериальной инфекции. Животные имеют индивидуальный номер, вытатуированный на ухе для обеспечения идентификации. Кроме того, животные оснащены транспондером для измерения изменений температуры тела. Собак кормят стандартным рационом, и они получают питьевую воду в неограниченном количестве.
Животных вакцинируют тестируемым препаратом посредством подкожной инъекции в заднюю часть шеи общепринятыми способами. Через три недели после первичной вакцинации проводят вторичную вакцинацию.
На сутки нуль, до вакцинации, у каждой собаки собирают 8 мл крови из яремной вены для получения сыворотки отрицательного контроля. Сыворотку хранят при ниже -15°C до анализа. С этой даты кровь собирают с интервалом в неделю в течение пяти недель для получения сыворотки. Сыворотку хранят при ниже -15°C до анализа. Титры антител к антигенам B. canis и B. rossi определяют общепринятыми способами, как описано на известном уровне техники.
Местные реакции на участке инъекции регистрируют с интервалом в 24 часа в течение продолжительности появления признаков или максимально в течение 5 суток. Характер местной реакции описывают как (количественный показатель): S=мягкая, H=тяжелая, O=отечная, W=теплая, P=болезненная.
Здоровую собаку породы бигль любого пола инфицируют 1 мл инфицированной B. canis крови, которую хранили в виде консервированной в жидком азоте. Одну ампулу консервированной крови извлекают из хранилища жидкого азота и сразу же переносят в транспортный контейнер с жидким азотом. Ампулу сразу же размораживают при 30-38°C непосредственно перед инъекцией спленэктомированной собаке-донору. Развитие паразитемии у собаки-донора оценивают по мазкам крови, получаемым из венозной крови, собираемой через сутки после инфекции до суток развития классической паразитемии. Образцы крови отбирают из яремной вены с использованием пробирок с CPDA (Greiner или сравнимые) для предотвращения коагуляции. Когда паразитемия является классической, собирают кровь (объем зависит от паразитемии) и дополнительно обрабатывают известными специалисту способами до получения инокулятов для заражения.
6
Всех собак инфицируют кровью от инфицированной спленэктомированной собаки-донора. Кровь отмывают средой для Babesia (Schetters et al., 1994, выше). Количество крови, содержащей 10 пораженных паразитами эритроцитов на мл, инъецируют внутривенно экспериментальным животным (1 мл/собака).
После заражения инфекцией всех экспериментальных животных ежесуточно обследуют на клинические признаки бабезиоза. Особое внимание уделяют поведению, размеру селезенки, размеру лимфоузлов, цвету слизистых оболочек рта и века и времени наполнения капилляров. Эти параметры оценивают в баллах согласно критериям, описанным у Schetters et al. 1994 (выше).
Гематокритную величину выражают в виде объема осажденных эритроцитов (PCV) образца венозной крови, отобранной из яремной вены (2 мл гепаринизированной крови/собака). Гематокритные капилляры наполняют гепаринизированной кровью и центрифугируют в гематокритной центрифуге (Hettich) в течение 5 минут при 10000 об./мин.
Объем осажденных эритроцитов определяют с использованием считывающего устройства для определения гематокрита.
Мазки получают из образца крови, которой собирают для определения гематокритного числа крови. Процент инфицированных эритроцитов определяют по мазкам крови, окрашенным растворами Май-Грюнвальда/Гимза.
Плазму собирают после заражения инфекцией. Ее получают из образца крови, который собирают для определения гематокритного числа. Образец хранят при температуре окружающей среды. Клетки осаждают центрифугированием (1500×g, 5 минут, 4°C), и отсасывают прозрачную плазму, и хранят при -20°C до использования.
Если указано после клинического осмотра, собаки получают лечение от бабезиоза внутримышечной инъекцией имидокарбом дипропионатом (0,6 мл карбезии, Schering-Plough Animal Health) в течение двух последующих суток.
Интерпретация результатов
Среднюю температуру тела (± стандартное отклонение) рассчитывают для каждой экспериментальной группы. Различия анализируют ANOVA. P-значения <0,05 считают статистически значимыми.
Местным реакциям присваивают числовое значение согласно следующей ниже таблице:
Балл
Описание
Значение
S, H или O
Мягкая, тяжелая, отечная
1
W
Теплая
1
P
Болезненная
1
Балл каждого животного суммируют и рассчитывают среднее значение каждой экспериментальной группы. Различия анализируют ANOVA. P-значения <0,05 считают статистически значимыми.
Титры антител к антигенам B. canis A и B. rossi определяют для каждой собаки. На основании этих титров антител рассчитывают титр активности.
По меньшей мере 80% животных в группах выживают до завершения эксперимент.
Пример 4: CBA-1 защищает собак от тяжелого заражения Babesia canis
Белок CBA-1 получали и проводили эксперимент вакцинация-заражение на собаках, в частности, как описано в примере 3. В кратком изложении:
4.1 Получение и рефолдинг белка CBA-1:
2
4
2
4
CBA-1 получали от бактерий E. coli с использованием E. coli штамма BL21(DE3), трансфицированных вектором pET-101, содержащим полноразмерную последовательность кДНК CBA-1 с C-концевой гексагистидиновой меткой, в ферментере объемом 3 литра, функционирующим в режиме периодических культур с подпиткой при 37°C. Основная среда представляла собой LB с фосфатным буфером (6 г/л NaHPO и 3 г/л KHPO), питательная среда содержала 10-кратный фосфатный буфер, 50% глюкозы и 5% экстракт дрожжей. Управление питающим насосом устанавливали на поддержание уровня растворенного кислорода при 40%. После подачи 50 мл подпитки добавляли IPTG (до конечной концентрации 1 мМ) для индукции экспрессии, и поддерживали культуру еще в течение 4 часов до сбора.
2
4
2
4
Сбор, 30 г (сырой масса) клеточной массы, разрушали в гомогенизаторе высокого давления (Emulsiflex™ от Avestin) в PBS при 1200 бар. Поручаемый лизат центрифугировали (10000×g в течение 20 минут) и отмывали осадок 3 раза в PBS с 1% Triton-X100. Вследствие того, что рекомбинантный CBA-1 содержался в виде нерастворенного вещества, его растворяли в буфере, содержащем 6 M мочевины, 50 мМ NaHPO и 300 мМ KCl при pH=8. Собранный рекомбинантный белок CBA-1 иммобилизовали 5 мл HisTrap на колонке для очистки, а также для рефолдинга, чтобы обеспечить презентирование конформационных эпитопов и удаление мочевины при сохранении белка растворенным. Применяли рефолдинг на колонке с использованием 50 объемов колонки градиентного буфера (509 мМ NaHPO, 300 мМ KCl, и содержащего в качестве окислительно-восстановительной пары 3 мМ/0,3 мМ окисленного/восстановленного глутатиона). Элюирование проводили в градиенте фосфат-KCl буфера, содержащего до 400 мМ имидазола. Отогнанные фракции выбирали посредством детекции содержания белка в УФ при 280 нм, и подтверждения способом гель-электрофорез SDS-PAGE. Соответствующие фракции объединяли.
Получаемый рекомбинантный белок CBA-1 составлял 20 мл при 250 мкг/мл (приблизительно 5 мг от общего белка) в элюирующем буфере. Чистота составляла более 85%, как определено SDS-PAGE и окрашиванием CBB.
4.2 Эксперимент вакцинации и заражения
Эксперимент вакцинации-заражения проводили, как описано в примере 3, за исключением того, что применяемую вакцинацию проводили повторно два раза через 3 и 6 недель после вакцинации вместо однократной вакцинации. Заражение проводили через 2 недели после последней вакцинации. Контроли не вакцинировали, т.к. в предшествовавшем исследовании было показано, что вакцинация даже одним адъювантом или смешенным с лизированными эритроцитами, не препятствует укоренению или прогрессированию заражения инфекцией.
4.2.1 Результаты
Общие результаты: измерения температуры включали в результаты клинических баллов. Коэффициент выживаемости составлял 100%, вследствие того, что любая собака с уровнем клинических баллов 2 или выше получала лечение Carbesia™ (имидокарб дипропионат) для препятствия инфекции и предотвращения дальнейшего заболевания. Местные реакции наблюдали как временные умеренные припухлости на участке инъекции, как и ожидалось вследствие применения сапонина в качестве адъюванта.
Наиболее наглядные результаты эффективного иммунного ответа против заражения инфекцией Babesia представляют собой: клинический балл, паразитарная нагрузка в мазках крови и уменьшение гематокритного числа у животных во время заражения. Для эксперимента вакцинации-заражения с использованием экспрессируемого E. coli белка CBA-1 эти результаты представлены в таблице 5 и на фиг.7, 8 и 9.
В таблице 5 представлены результаты этих трех основных параметров и для сравнения также представлены результаты более ранних исследований с использованием вакцины на основе неочищенных SPA, которая является коммерчески доступной как Nobivac Piro, результаты которых опубликованы Schetters et al., 2006 (Vet. Parasitol., vol. 138, p. 140-146).
Таблица 5Результаты наиболее важных параметров эксперимента вакцинации-заражения на собаках
Антиген
Максимальный клинический балл
Паразитарная нагрузка
Максимальное снижение PCV
CBA-1
1,3
3,5
46,6
sem
0,2
0,8
3,0
Невакцинированные контроли
2,7
7,2
57,1
sem
0,3
1,4
4,3
Nobivac Piro
2,8
8,9*
54,0
sem
0,7
0,9
4,0
Невакцинированные контроли
4,2
9,7*
64,6
sem
0,9
0,8
4,9
sem = стандартная ошибка среднего* = значения не отличающиеся достоверно
Клинический балл
Клинические баллы рассчитывали ранее описанным способом (Schetters et al. 1994 Vet. Parasitol. 52, 219-233). Максимальное значение клинических баллов, выявленных в эксперименте, представлено в таблице 5, тогда как на фиг.7 представлены средние значения, выявленные в группе за сутки.
Основные симптомы, наблюдаемые у невакцинированных контролей, которые обуславливали относительно высокие клинические баллы, представляли собой белый внешний вид слизистой оболочки и увеличенное время наполнения капилляров. Сделан вывод о том, что вакцинация CBA-1 приводила к значительному уменьшению клинического балла после заражения.
Паразитарная нагрузка
Паразитарную нагрузку рассчитывали как сумму суточных 10Log значений паразитемии, значение на 14 сутки после заражения (конец эксперимента) представлено в таблице 5.
Результаты демонстрируют значительное снижение паразитарной нагрузки у вакцинированных CBA-1 собак. Это ранее было невозможным с использованием вакцины по типу неочищенных SPA, и это значительно способствует уменьшению симптомов заболевания и времени выздоровления. Также это играет важную роль в уменьшении распространения заболевания клещами и, таким образом, другими собаками в окружающей среде. Результаты представлены на фиг.8.
Объем осажденных эритроцитов
Значения PCV представляют собой средние значения групп, которые выражены в виде процентных величин относительно значений на сутки 0 (до заражения). Максимальное снижение PCV представлено в таблице 5, т.к. не у всех собак выявляли наибольшее снижение PCV на одни и те же сутки.
Вакцинация CBA-1 значительно снижала гематокритное число, обусловленное заражением инфекцией B. canis. Результаты представлены на фиг.9.
4.3 Заключения
Как представлено в таблице 5 и на фиг.7-9 вакцинация рекомбинантным экспрессируемым белком CBA-1 была способна обеспечивать собак значительным уровнем иммунной защиты против инфекции паразитами Babesia canis, а также против симптомов заболевания, вызываемых ими. Эта защита значительно превосходила существующие коммерческие вакцины против Babesia собак.
Подписи к чертежам
Фиг.1: Выравнивание аминокислотной последовательности полипептидов CBA из Babesia canis и Babesia rossi. Две характеризующие области обведены рамкой, и предполагаемая сигнальная последовательность указана двойной стрелкой.
Фиг.2: Выравнивание нуклеотидных последовательностей мРНК CBA-1 (в форме кДНК, SEQ ID NO:9) и гена CBA-1 из генома B. canis (SEQ ID NO:12).
Фиг.3: Детекция AlphaLisa рекомбинантной молекулы CBA-1 B. canis. Детекцию проводили с использованием поликлональных антител, специфических к SPA B. canis.
Фиг.4: Детекция AlphaLisa рекомбинантной молекулы CBA-2 B. rossi. Детекцию проводили с использованием поликлональных антител, специфических к SPA B. rossi.
Фиг.5: Детекция ингибирующим AlphaLisa ингибирования рекомбинантным полипептидом CBA-1 B. canis связывания поликлональных антител, специфических к SPA B. canis, с антигеном сравнения SPA B. canis.
Фиг.6: Детекция ингибирующим AlphaLisa ингибирования рекомбинантным полипептидом CBA-1 B. canis связывания поликлональных антител, специфических к SPA B. rossi, с антигеном сравнения SPA B. rossi.
Фиг.7: Средний клинический балл, получаемый для группы в сутки (после заражения), со стандартной ошибкой среднего в эксперименте вакцинация-заражение на собаках.
Фиг.8: Результаты паразитарной нагрузки в эксперименте вакцинация-заражение.
Фиг.9: Результаты гематокрита (в виде объема осажденных эритроцитов, в % относительно суток 0 [до заражения]) в эксперименте вакцинация-заражение.