Способ оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств на экспериментальной модели клеточной линии HEK293
METHOD FOR EVALUATING TRANSPORT OF NEGATIVELY CHARGED DRUGS ON EXPERIMENTAL MODEL OF HEK293 CELL LINE

Изобретение относится к области фармации, фармакологии и молекулярной биологии, в частности к созданию экспериментальной модели клеточной линии для оценки транспорта отрицательно заряженных лекарственных средств (ЛС).
Лекарственная нефротоксичность является важной причиной скрининга ЛС и часто обнаруживается только на клинических стадиях исследования. Связано это с тем, что экстраполяция результатов доклинических исследований, в частности функциональной активности почечных транспортеров, на клинику на данный момент не имеет высокой степени предсказуемости. Поэтому на стадии доклинических исследований существует проблема поиска экспериментальной модели, которая должна наиболее правдоподобно отражать процессы in vivo, связанные с выведением почками ЛС посредством транспортеров.
Среди двух наиболее распространенных типов экспериментальных моделей, используемых в доклинических исследованиях: лабораторные животные и клеточные линии, последние начинают приобретать все большее распространение из-за того, что использование моделей лабораторных животных требует высокой квалификации персонала, имеет высокую стоимость исследования, а также создает проблемы этического характера. Клеточные линии лишены этих недостатков.
В частности, экспериментальная модель на основе клеточной линии должна показывать стабильный уровень экспрессии широкого спектра транспортеров и метаболических ферментов, которые действуют совместно при элиминации ЛС.
Аналогом заявляемого изобретения является патент RU 2677286 С1 «Способ оценки функциональной активности гликопротеина-р в гематоэнцефалическом барьере», сущность которого состоит в измерении транспорта маркерного субстрата фексофенадина на модели лабораторных животных. К недостаткам этого аналога следует отнести саму экспериментальную модель, так как опыты на лабораторных животных требуют высокой квалификации персонала, имеют высокую стоимость исследования, и результаты подобных экспериментов могут сильно различаться, также стоит учитывать проблемы этического характера.
Клеточная линия HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) является одной из наиболее распространенных экспериментальных моделей в научной практике. Она была получена из эмбриональных почек человека. Широко применяется в научных исследованиях благодаря простоте культивирования, а также хорошо подходит для трансфекции. Стоит отметить, что HEK293 является одной из клеточных линий, рекомендованных FDA (Food and Drug Administration) и EMA (European Medical Agency) для проведения доклинических исследований ЛС [Clinical drug interaction studies - cytochrome P450 enzyme- and transporter-mediated drug interactions guidance for industry, 2020 (URL: https://www.fda.gov/media/134581/download); CPMP/EWP/560/95/Rev. 1 Corr. 2. Guideline on the investigation of drug interactions, 2012 (URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-investigation-drug-interactions-revision-l_en.pdf]. Тем не менее, у этой клеточной линии есть ряд недостатков в отношении изучения транспорта, а именно: пониженный уровень экспрессии генов транспортеров, а также несоответствия в морфологии по сравнению с клетками эпителия проксимальных почечных канальцев.
Технической проблемой является поиск экспериментальной модели in vitro для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС, так как их транспорт является одним из факторов, определяющих их нефротоксические свойства.
Техническим результатом изобретения является оценка транспорта отрицательно заряженных ЛС.
Достижение технического результата обеспечивается благодаря следующим техническим решениям:
- трансфекция гена SLC22A6 при модификации клеточной линии HEK293 повышает уровень экспрессии гена SLC22A6, что позволяет повысить сродство транспортера органических анионов ОАТ1 к изучаемым ЛС - субстратам транспортера ОАТ1, таким образом, повысив чувствительность способа оценки, а также производить более точную оценку транспорта отрицательно заряженных ЛС;
- получение клеточной линии HEK293-ОАТ1 (т.е. экспериментальной модели клеточной линии HEK293, модифицированной путем трансфекции гена SLC22A6) со стабильным уровнем экспрессии гена SLC22A6;
- использование клеточной линии HEK293-ОАТ1 позволяет проводить оценку транспорта отрицательно заряженных ЛС in vitro;
- стабильный уровень экспрессии гена SLC22A6 позволяет получать схожие результаты в экспериментах по транспорту ЛС на протяжении длительного промежутка времени без необходимости проведения контроля уровня экспрессии.
В заявляемом изобретении способ оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС на экспериментальной модели клеточной линии HEK293 реализуется следующим образом.
Путем трансфекции гена SLC22A6 получают клеточную линию HEK293-ОАТ1 (экспериментальную модель клеточной линии HEK293, т.е. модифицированный клон клеточной линии HEK293) и используют ее для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС - субстратов транспортера ОАТ1. Для этого к полученной клеточной линии HEK293-ОАТ1 добавляют субстрат (лекарственное средство) и инкубируют. Далее выделяют тотальную РНК из клеток (исходных, то есть до внесения субстрата (лекарственного средства), а также после инкубации клеток с субстратом (лекарственным средством)). Проводят реакцию обратной транскрипции для получения кДНК, затем проводят полимеразную цепную реакцию (ПНР) со специфическими праймерами к гену SLC22A6. Далее проводят разделение полученных ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле и затем проводят измерение уровня экспрессии гена SLC22A6 по оптической плотности электрофореграмм. По уровню экспрессии гена SLC22A6 судят об активности кодируемого им транспортера ОАТ1. Сравнивают уровни экспрессии гена SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 до и после инкубации с ЛС - субстратами транспортера ОАТ1.
Существенными отличительными признаками заявляемого изобретения, достаточными для решения указанной технической проблемы и получения указанного технического результата, являются:
- возможность контролировать функциональное состояние клеточной линии HEK293-ОАТ1 по измерению уровня экспрессии гена SLC22A6, а также по изменению транспорта ЛС - субстратов транспортера ОАТ1 (оценивая транспорт ЛС косвенно - по уровню экспрессии гена SLC22A6);
- возможность оценки широкого спектра ЛС, обладающих следующими характеристиками: наличие в молекуле отрицательно заряженной группы, молекулярная масса 300-600 г/моль, возможно наличие гидрофобного участка;
- стабильная экспрессия гена SLC22A6, сохраняющаяся при длительном (более 20 пассажей) пассировании клеточной линии HEK293-ОАТ1;
- клеточная линия HEK293-ОАТ1 - более чувствительная экспериментальная модель для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС, выявляющая более широкий спектр ЛС в качестве субстратов ОАТ1 с расширенным диапазоном концентраций ЛС благодаря повышенному уровню экспрессии гена SLC22A6;
- возможность работы in vitro (без животных).
Краткое описание чертежей и иных материалов.
Рис. 1. Уровень экспрессии гена SLC22A6, нормализованный по гену β-actin, в исходной клеточной линии HEK293 и трансфецированной геном SLC22A6 клеточной линии HEK293-ОАТ1 (10-й пассаж).
Рис. 2. Схема лунки в планшете для эксперимента по транспорту флуоресцеина.
Рис. 3. Схема опыта по транспорту маркерного субстрата ОАТ1 - флуоресцеина (в секундах показано время экспозиции с флуоресцеином).
Рис. 4. Транспорт флуоресцеина клетками исходной клеточной линии HEK293 и клеточной линии HEK293-ОАТ1. Транспорт флуоресцеина выражен в количестве вещества, помноженном на массу общего клеточного белка в мкг и на время инкубации (10 мин).
Рис. 5. Схема эксперимента по влиянию транспорта цефалоспориновых антибиотиков на экспрессию гена SLC22A6.
Рис. 6. Экспрессия мРНК гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 при добавлении цефуроксима 50 мкг/мл 2 раза в сут на протяжении 4 сут (К - отрицательный контроль).
Рис. 7. Экспрессия мРНК гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 при добавлении цефтриаксона 70 мкг/мл 2 раза в сут на протяжении 4 сут (К - отрицательный контроль).
Рис. 8. Экспрессия мРНК гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 при добавлении цефепима 30 мкг/мл 2 раза в сут на протяжении 4 сут (К - отрицательный контроль).
Рис. 9. Уровень экспрессии гена SLC22A, нормализованный по гену β-actin, при пассировании клеточных линий HEK293 и HEK293-ОАТ1.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1. Получение клеточной линии HEK293-ОАТ1 (экспериментальной модели клеточной линии HEK293, т.е. модифицированного клона клеточной линии HEK293 путем трансфекции гена SLC22A6).
Проверка исходной клеточной линии HEK293 на генетическую чистоту
Для подтверждения генетической чистоты проводят анализ STR-локусов. Для анализа STR-фрагментов используют тест-систему COrDIS Plus (ООО «ГОРДИЗ»).
Культивирование
2
Клетки культивируют в культуральной среде - модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; «Gibco», США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят («HyClone», США), 50 ед./мл гентамицина («ПанЭко», Россия) и 0,1 мг/мл пирувата натрия («Santa Cruz», США) при 37°С, 5% СО и относительной влажности 80-85%. В экспериментах используют культуры в логарифмической стадии роста.
Трансфекция
Для увеличения уровня экспрессии гена SLC22A6 проводят трансфекцию с использованием коммерческих плазмид pDONR223. Для наработки и очистки вектора используют коммерческий набор «Invitrogen HiPure Plasmid Midiprep kit» (#K2100-04) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Для проведения трансфекции используют реагент «Lipofectamine 3000» также по протоколу, рекомендованному производителем. В качестве отрицательного контроля используют чистый вектор.
В результате получают модифицированный клон клеточной линии HEK293 - клеточную линию HEK293-ОАТ1, имеющую более высокий уровень экспрессии гена SLC22A6 по сравнению с исходной клеточной линией HEK293. Для подтверждения проводят сравнительное изучение экспрессии гена SLC22A6 в исходной и модифицированной клеточных линиях. Для этого проводят следующие процедуры.
Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
1. Выделение тотальной РНК
Тотальную РНК выделяют из клеток (исходных, то есть до внесения субстрата (лекарственного средства), а также после инкубации клеток с субстратом (лекарственным средством)). Выделение проводят методом фенол-хлороформной экстракции на основе реагента «PureZOL» (Biorad, #7326880) по протоколу, рекомендованному производителем.
2. Проведение реакции обратной транскрипции
Тотальную РНК, выделенную по пункту 1, используют в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции. Данную реакцию проводят с использованием фермента «RevertAid Н Minus» (ThermoFisher, #ЕР0451) по протоколу, рекомендованному производителем. Во всех экспериментах проводят контрольную реакцию с использованием воды в качестве отрицательного контроля. Реакцию обратной транскрипции проводят в термоциклере «Biometra Tone 96G» (Analytik Jena). В итоге получают кДНК.
3. Проведение полимеразной цепной реакции
Реакцию ПЦР проводят для всех изучаемых генов в объеме 20 мкл. В качестве матрицы используют к ДНК, полученную по пункту 2.
Состав реакционной смеси:
1. ПЦР-буфер (10X DreamTaq Green Buffer) - 2 мкл.
2. Смесь дезоксирибонуклеотидов (dNTP Mix, 2 mM each (#R0241)) - 2 мкл.
3. Прямой праймер, 0,5 ое/мл - 1 мкл.
4. Обратный праймер, 0,5 ое/мл - 1 мкл.
5. ДНК-полимераза DreamTaq Hot Start DNA Polymerase, 5 ед/мкл - 0,2 мкл.
6. Вода, очищенная от нуклеаз (#R0581) - 12,8 мкл.
7. к ДНК - 1 мкл.
Компоненты 1-6 смешивают для образования «мастер-микса», который разделяют на планируемые реакции. Последним добавляют компонент 7 -к ДНК изучаемых образцов.
Реакцию ПЦР проводят в термоциклере «Biometra Tone 96G» (Analytik Jena). Температурный режим ПЦР: начальная денатурация при 94°С в течение 2 мин; отжиг праймеров при 60°С, 30 с; синтез продукта при 72°С, 30 с; заключительная выдержка после прохождения циклов: 5 мин при 72°С. Количество циклов для референсного гена (β-actin) - 22-24; для изучаемого гена (SLC22A6) - 28-30 циклов. В качестве отрицательного контроля используют РНК вместо кДНК. При подборе последовательностей праймеров используют программу Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Последовательность полученных специфических праймеров представлена в Таблице.
4. Визуализация результатов методом электрофореза Нормирование экспрессии генов проводят по гену β-actin в качестве гена «домашнего хозяйства». ПЦР-продукты разделяют стандартным электрофоретическим методом при напряжении 150 В в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на 1xTBE-буфере. При анализе оптической плотности используют программу VisionWorks 8.20. По уровню экспрессии гена SLC22A6 судят об активности кодируемого им транспортера ОАТ1. Уровень экспрессии гена SLC22A6 в исходной клеточной линии HEK293 принимают за единицу. Сравнение уровней экспрессии гена SLC22A6 в исходной клеточной линии HEK293 и в клеточной линии HEK293-ОАТ1 показано на Рис.1. Уровень экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 выше, чем в исходной клеточной линии HEK293, что позволяет увеличить чувствительность данной экспериментальной модели к субстратам транспортера О ATI при оценке транспорта ЛС.
Пример 2. Измерение транспорта маркерного субстрата ОАТ1 - флуоресцеина.
Корелляцию между уровнем экспрессии гена SLC22A6 и функционированием кодируемого им транспортера ОАТ1 выявляют по измерению транспорта флуоресцеина. Флуоресцеин является субстратом транспортеров органических анионов, в частности ОАТ1, кроме того, благодаря флуоресценции его концентрацию можно легко измерить, что делает его удобным маркером функциональной активности транспортеров органических анионов. Флуоресцеин в данном примере используется в качестве структурного аналога лекарственного средства (который содержит ключевые функциональные группы для связывания с транспортером).
-5
Исходную клеточную линию HEK293 и клеточную линию HEK293-ОАТ1 культивируют в 12-луночных планшетах с мембранными вставками диаметром пор 0,4 мкм (Transwell, Costar) до образования плотного монослоя (Рис. 2). Флуоресцеин в конечной концентрации 1×10 М добавляют в базолатеральный отдел на следующие промежутки времени: 20 с, 40 с, 60 с, 80 с, 100 с, 120 с (Рис. 3). После каждого периода экспозиции с флуоресцеином клетки промывают 3-4 раза ледяным PBS-буфером для остановки транспорта до тех пор, пока флуоресцеин не определяется в промываемом буфере. Затем клетки лизируют в 1 мл 0,1% Triton-Х100 и измеряют флуоресценцию лизата на планшетном флуориметре «Chameleon V» («Hidex», Финляндия).
Нормирование производят по количеству общего белка, измеренного по Брэдфорду. Результаты показаны на Рис. 4. По концентрации флуоресцеина в клетках клеточной линии HEK293-ОАТ1 рассчитывают уровень его транспорта. Благодаря повышенному уровню экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1, количественные показатели транспорта флуоресцеина находятся на более высоком уровне по сравнению с таковыми в исходной клеточной линии HEK293, что делает клеточную линию HEK293-ОАТ1 более чувствительной экспериментальной моделью для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС, и позволяет выявлять более широкий спектр ЛС в качестве субстратов ОАТ1, а также проводить эксперименты в расширенном диапазоне концентраций ЛС.
Пример 3. Оценка транспорта субстрата ОАТ1 по уровню экспрессии гена.
Культивирование клеточной линии HEK293-ОАТ1 проводят согласно Примеру 2. В качестве субстратов ОАТ1 для эксперимента используют ЛС, имеющие анионный центр, а также молекулярную массу 300-600 г/моль. Под такие условия подходят β-лактамные антибиотики группы цефалоспоринов: цефуроксим, цефтриаксон и цефепим.
Каждый препарат (растворенный в культуральной среде) добавляют в базолатеральный отдел лунки 2 раза в сут на протяжении 4 сут в следующих концентрациях: 50 мкг/мл, 70 мкг/мл и 30 мкг/мл соответственно (Рис. 5). Для «отрицательного контроля» в базолатеральный отдел лунки добавляют культуральную среду. Уровень экспрессии гена SLC22A6 в «отрицательном контроле» показан на Рис. 6-8 (обозначен К).
Каждые сутки измеряют уровень экспрессии гена SLC22A6 согласно методике из Примера 1. Результаты эксперимента представлены на Рис. 6-8. Во всех случаях видно, что со временем при воздействии субстратов ОАТ1 уровень экспрессии гена SLC22A6 понижается. По динамике понижения уровня экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 можно косвенно судить о транспорте данного субстрата. Чем больше понижается уровень экспрессии гена SLC22A6, тем более активно переносится им данный субстрат. Если же падение уровня экспрессии гена SLC22A6 не наблюдается, то можно предположить либо низкий уровень сродства транспортера ОАТ1 к данному субстрату (изучаемому ЛС), либо полное отсутствие сродства. Исходная клеточная линия HEK293 с изначально низким уровнем экспрессии гена SLC22A6 не позволяет достоверно оценить сродство транспортера OATI к субстрату, именно поэтому для оценки транспорта отрицательно заряженных ЛС используют клеточную линию HEK293-ОАТ1 с высоким уровнем экспрессии гена SLC22A6, у которой сродство транспортера О ATI к субстратам (ЛС) выше.
Пример 4. Стабильность уровня экспрессии гена SLC22A6 при пассировании клеточных линий HEK293 и HEK293-ОАТ1.
Культивирование клеточных линий HEK293 и HEK293-ОАТ1 проводят аналогично Примеру 2. Культивирование обеих клеточных линий проводят до 20-го пассажа. На 4, 8, 14, 20 пассажах в обеих клеточных линиях проводят измерение уровня экспрессии гена SLC22A6 согласно Примеру 1. Результаты показаны на Рис. 9. При пассировании уровень экспрессии гена SLC22A6 в исходной клеточной линии HEK293 за 20 пассажей понижается более чем в 2 раза. В клеточной линии HEK293-ОАТ1 на протяжении 20 пассажей уровень экспрессии гена SLC22A6 остается на одном и том же уровне. Стабильность уровня экспрессии гена SLC22A6 в клеточной линии HEK293-ОАТ1 позволяет получать схожие результаты в экспериментах по транспорту ЛС на протяжении длительного промежутка времени без необходимости проведения контроля уровня экспрессии.