Технология получения пептидного модуля на основе гидролизата белка сои

УДК 612.398

Технология получения пептидного модуля

на основе гидролизата белка сои

С. Н. Зорин, канд. биол. наук; В. К. Мазо, д-р биол. наук, профессор; И. С. Воробьева, канд. биол. наук; В. М. Воробьева, канд. техн. наук Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва В. А. Асафов, канд. техн. наук

Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности, Москва

Создание новых специализированных пищевых продуктов (СПП) с заданным химическим составом направлено на обеспечение эффективной профилактики и диетотерапии ряда алиментарно-зависимых заболеваний. Одним из ключевых этапов в алгоритме разработки СПП является научно обоснованный выбор функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ), обладающих заданным физиологическим действием. Среди различных технологических подходов, направленных на получение ФПИ с доказанной эффективностью, перспективным представляется ферментативный гидролиз пищевых белков с последующей микрофильтрационной и нанофильтрационной обработкой. Получаемые таким образом пептидные смеси (пептидные модули) обладают высокой биологической ценностью, сниженной анти-генностью, т. е. потенциально более низкой аллергенностью, улучшенными физико-химическими и органо-лептическими свойствами по сравнению как со свободными аминокислотами, так и белками, вследствие более высокой растворимости.

Среди различных пищевых белков наибольшие традиции применения для диетической коррекции и профилактики нарушений липидного обмена и связанных с ним сердечнососудистых заболеваний, ожирением, артериальной гипертензией, сахарным диабетом 2 типа и метаболическим синдромом имеют белки сои в виде высокоочищенных изоля-тов с содержанием белка более 80% [1-3]. Использование современных технологий переработки соевых бобов позволяет выделить белковый

компонент с максимальным сохранением нативного набора аминокислот при одновременном удалении так называемых антиалиментарных веществ: ингибиторов протеолитиче-ских ферментов, лектинов, уреазы, липоксигеназы и др. Клинические наблюдения и экспериментальные исследования in vivo подтверждают наличие гиполипидемических и ги-похолестеринемических свойств ферментативных гидролизатов соевых белков [4-9].

Отсутствие свободных аминокислот и короткоцепочечных пептидов в пептидных смесях, получаемых ферментативным гидролизом соевого белка с последующей нанофиль-трационной мембранной обработкой, позволяет расширить ассортимент пищевых продуктов, в том числе инстантных функциональных напитков для коррекции рациона питания лиц с нарушениями липид-ного обмена. Изоляты белков сои (ИБС) зарубежных компаний широко представлены на российском рынке продуктов переработки сои, однако, ферментативные гидролизаты белков сои (ФГБС) практически отсутствуют и отечественной пищевой промышленностью не выпускаются.

Цель исследований - разработка технологии получения в лабораторных условиях ферментолизата белка сои и наработка опытной партии в полупромышленных условиях.

В качестве исходного сырья для получения гидролизата использовали ИБС «Supro XT 220D IP» (США) с добавленным стабилизированным фосфатом кальция. Содержание белка в ИБС - не менее 80%, кальция -не менее 2,75%, фосфора - не менее

1,9%. Гидролиз осуществляли с использованием ферментного препарата «Панкреатин» из панкреатической железы свиньи («SICHUAN BIOSYN PHARMACEUTICAL Со», КНР, активность 2,25 Eur. u/mg).

В лабораторных условиях проводили гидролиз 5%-ного раствора ИБС-Supro панкреатином при весовых соотношениях белок/фермент 50:1 и 20:1 (по сухим веществам), термостатируя реакционную смесь при температуре (50±1) °С и постоянном перемешивании. Значение рН реакционной среды поддерживали в диапазоне 7,4-7,6, используя 5,0%-ный раствор смеси KOH/NaOH (2:1). Максимальное время гидролиза составило 5 ч. Через 1, 3 и 5 ч отбирали пробы для проведения хромато-графического анализа. По окончании реакции фермент инактивировали нагреванием смеси до температуры 75 °С в течение 15 мин. Полученные образцы осветляли центрифугированием при 3000 мин-1 в течение 20 мин (центрифуга «BECKMAN J-6B», США) и лиофильно высушивали (ли-офильная сушилка ЛС 500, РФ).

Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе водорастворимой части полученных образов анализировали методом эксклюзи-онной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Су-пероза 12 (1,6*50 см) (Pharmacia, Швеция), предварительно откали-брованной по стандартным глобулярным водорастворимым белкам производства SERVA, элюент 0,2 М хлористый натрий, скорость элюи-рования 2,0 мл/мин, длина волны проточного УФ-детектора UV-1280 нм. Хроматограммы интегрировали весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Содержание общего азота в образцах определяли методом Кьельдаля [10], массовую долю влаги - по ГОСТ 9404-88 [11] Осмоляльность растворов гидролизатов измеряли криоско-пическим методом по ГОСТ Р 555782013 [12] на миллиосмометре - крио-скопе термоэлектрическом «МТ-5-01» (ОАО НПП «Буревестник», РФ).

В табл. 1 приведены результаты количественного определения молекулярно-массового распределения (ММР) белково-пептидных фракций в составе ФГБС-Supro в различные интервалы времени гидролиза.

При ферментолизе в течение 3 ч содержание низкомолекулярной

Таблица 1

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций ферментативного гидролизата соевого белка

Диапазон молеку- Содержание фракции (%) при соотношении

Номер фракции белок / фермент 50:1 белок / фермент 20:1

лярных масс, кД продолжительность гидролиза, ч

1 3 5 1 3 5

1 >272 1,1 5,4 2,0 1,9 1,3 1,3

2 272-72,9 1,6 1,3 1,0 2,8 1,0 0,9

3 72,9-29,0 3,3 1,2 1,1 2,0 0,8 0,7

4 29,0-14,6 8,1 4,6 4,6 4,7 4,1 2,8

5 14,6-8,0 19,6 17,5 15,0 16,3 15,0 14,2

6 8,0-4,1 24,0 23,2 25,5 26,4 30,0 25,5

7 4,1-1,6 20,8 21,2 20,2 20,7 21,5 22,4

8 <1,6 21,6 25,7 30,7 25,4 26,4 32,3

а б

Рис. 1. Эксклюзионные хроматограммы ферментативного гидролизата соевого белка до и после нанофильтрации: а - ФГИБС-Бирго до нанофильтрации; б - ФГИБС-Бирго после нанофильтрации

Таблица 2

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в гидролизатах соевого белка, полученных в полупромышленных условиях, до и после

нанофильтрации

Номер фракции Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракции, %

до нанофильтрации после нанофильтрации

1 >272 0,0 0,0

2 272-72,9 0,0 0,0

3 72,9-29,0 0,9 0,9

4 29,0-14,6 4,3 6,8

5 14,6-8,0 14,7 20,6

6 8,0-4,1 28,6 36,9

7 4,1-1,6 22,1 21,7

8 <1,6 29,4 13,1

фракции короткоцепочечных пептидов и свободных аминокислот в составе ФГИБС-Бирго (фракция № 8, молекулярная масса менее 1,6 кД) составило 25,7 и 26,4% при соотношении белок/фермент 50:1 и 20:1 соответственно. При увеличении времени ферментолиза до 5 ч соответствующие значения были также близки между собой и равны 30,7

и 32,3%. Лиофильно высушенные образцы полученных гидролизатов полностью и быстро растворялись в воде. Значения осмоляльности растворов гидролизатов, полученных при 5-часовом ферментоли-зе, были очень близки для соотношений белок/фермент 50:1 и 20:1 и равны 35 и 38 ммоль/кг соответственно.

Содержание белка (по Кьельдалю) в лабораторных образцах при 5 ч гидролиза было одинаковым и составляло (77,1±3,9) и (77,8±3,9) %. для соотношений белок/ фермент 50:1 и 20:1 соответственно. Выход по белковому азоту относительно исходного ИБС на последней стадии в обоих случаях составил более 85 %.

Выработка опытной партии гидролизата соевого белка, предназначенного для дальнейшего использования в экспериментальных исследованиях, была проведена в полупромышленных условиях Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности (Москва). Гидролиз проводили на установке, состоящей из диспергатора марки Я9-ОРП, работающего по принципу роторно-пульсационного аппарата со встроенным центробежным насосом, резервуара марки Я1-ОСВ с мешалкой и терморубашкой вместимостью 1000 л. К 150 л 5,0%-ного водного раствора ИБС при перемешивании добавляли 150 г панкреатина (соотношение белок/ фермент 50:1). Гидролиз проводили при температуре 50...52 °С в течение 3 ч при постоянном перемешивании, после чего продукт пастеризовали при температуре 75 °С в течение 20 мин. Сушку полученного гидролизата проводили на распылительной сушильной установке «Ниро Атомайзер» (Дания) производительностью 20 кг испаренной влаги в час при температуре воздуха на входе в сушильную башню 160.165 °С, на выходе - 80.85 °С. Полученный продукт представляет собой тонкодисперсный порошок светло-кремового цвета, влажностью 9,5%, хорошо растворимый в воде, удовлетворительного вкуса с легким горько-соленым привкусом и характерным запахом, осмоляльность 1%-ного раствора 32 ммоль/кг.

Для снижения горечи и осмоляльности в лабораторных условиях проводили нанофильтрацию полученного гидролизата на нанофильтраци-онной установке производства «Вла-дисарт», Россия (после микрофильтрационной очистки через мембрану 0,45 мкм на установке «МИНИТАН», США) с диализом и сбором высокомолекулярной фракции. В результате нанофильтрации осмоляльность гидролизата снизилась до 26 ммоль/кг, горечь практически исчезла.

На рисунке приведены эксклюзионные хроматограммы гидролизата ИБС-Бирго, полученного в промыш-

ленных количествах в экспериментальном цехе института (исходного и после нанофильтрации). В табл. 2 приведены результаты их интегрирования.

Анализируя полученные данные, можно констатировать, что гидроли-заты соевого белка, полученные в лабораторных и полупромышленных условиях, по содержанию пептидных фракций практически одинаковы. Специфические вкус и запах, характерные для всех белковых гидролиза-тов, могут быть нивелированы путем использования в составе конечного продукта других ингредиентов, в том числе вкусо-ароматических.

В результате проведенных исследований разработана технология получения ферментативного гидролизата соевого белка, отработаны параметры процесса получения пептидного модуля. Технология апробирована в полупромышленных условиях, полученный продукт по органолептическим, физико-химическим показателям, содержанию пептидных фракций соответствует лабораторным образцам и может быть использован в качестве белкового ингредиента при создании специализированных пищевых продуктов для больных с различными алиментарно-зависимыми заболеваниями.

ЛИТЕРАТУРА

1. Allison, D. B. A novel soy-based meal replacement formula for weight loss among obese individuals: a randomized controlled clinical trial/D. B. Allison [et all] // Eur. J. Clin. Nutr. - 2003. - V. 57. -P. 514-522.

2. Deibert, P. Weight loss without losing muscle mass in pre-obese and obese subjects induced by high-soy-protein diet/P. Deibert [et all] // Int. J. Obes. Relat Disord. - 2004. - V. 28. - P. 13491352.

3. Zhang, Xi-Mei. Soy Protein Supplementation Reduces Clinical Indices in Type 2 Diabetes and Metabolic Syndrome/ Xi-Mei Zhang, Yun-Bo Zhang, Mei-Hua Chi // Yonsei Med. J. - 2016. -May. - V. 57 (3). - P. 681-689.

4. Aoyama, T. Effect of soy and milk whey protein isolates and their hydrolysates on weight reduction in genetically obese mice / T. Aoyama [et all] // Biosci., Biotechnol., Biochem. - 2000. -V. 64. - P. 2594-2600.

5. Tsuyoshi Goto. Soluble soy protein peptic hydrolysate stimulates adipocyte

differentiation in 3T3-L1 cells/Tsuyoshi Goto, Mori Ayaka, Nagaoka Satoshi // Mol. Nutr. Food Res. - 2013. -V. 57. - issue 8. -P. 1435-1445.

6. Yun-Ho Lin MD. Soybean Protein Hydrolysate Improves Plasma and Liver Lipid Profiles in Rats Fed High-Cholesterol Diet./Yun-Ho Lin MD, Jiun-Rong Chen // Journal of the American College of Nutrition. - 2007. - V. 26. - № 5. - Р. 416-423.

7. Ji-Young Choi. Differential Effects of Powdered Whole Soy Milk and Its Hydrolysate on Antiobesity and Antihyperlipidemic Response to High-Fat Treatment in C57BL / 6N Mice// dx.doi.org/ Ji-Young Choi., Jong-Eun Jeon, Se-Young Jang, Yong-Jin Jeong, Seon-Min Jeon, Hae-Jin Park, Myung-Sook Choi //10.1021/jf1027944 |. 2011, 59, 2584-2591

8. Claessens, M. Saris The effect of different protein hydrolysate/ carbohydrate mixtures on postprandial glucagon and insulin responses in healthy subjects/M. Claessens [et all] // European Journal of Clinical Nutrition. - 2009. - V. 63. - P. 48-56.

9. Morifuji, M. Comparison of Different Sources and Degrees of Hydrolysis of Dietary Protein: Effect on Plasma Amino Acids, Dipeptides, and Insulin Responses in Human Subjects/M. Morifuji [et all] // J. Agric. Food Chem. - 2010. - Aug. 11;58 (15):8788-97. doi: 10.1021/jf101912n.

10. Тутельян, В. А. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов/В. А. Тутельян, И. М. Ску-рихин. - М.: Медицина, 1998. - 340 с.

11. ГОСТ 9404-88. Мука и отруби. Метод определения влажности. - М.: Стандартинформ, 2007. - 4 с.

12. ГОСТ Р 55578-2013. Продукты пищевые специализированные. Метод определения осмоляльности. - М: Стан-дартинформ, 2014. - 8 с.

REFERENCES

1. Allison, D. B. et al. A novel soy-based meal replacement formula for weight loss among obese individuals: a randomized controlled clinical trial. Eur. J. Clin. Nutr.,

2003, vol. 57, pp. 514-522.

2. Deibert P. et al. Weight loss without losing muscle mass in pre-obese and obese subjects induced by high-soy-protein diet. Int. J. Obes. Relat Disord.,

2004, vol. 28, pp. 1349-1352.

3. Zhang Xi-Mei, Zhang Yun-Bo, Chi Mei-Hua Soy Protein Supplementation Reduces Clinical Indices in Type 2 Diabetes and Metabolic Syndrome. Yonsei Med. J., 2016, May, vol. 57 (3), pp. 681-689.

4. Aoyama T. et al. Effect of soy and milk whey protein isolates and their hydrolysates on weight reduction in genetically obese mice. Biosci., Biotechnol., Biochem., 2000, vol. 64, pp. 2594-2600.

5. Tsuyoshi Goto, Mori Ayaka, Nagaoka Satoshi Soluble soy protein peptic hydrolysate stimulates adipocyte differentiation in 3T3 L1 cells. Mol. Nutr. Food Res., 2013, vol. 57, issue 8, pp. 1435-1445.

6. Yun-Ho Lin MD, Jiun-Rong Chen Soybean Protein Hydrolysate Improves Plasma and Liver Lipid Profiles in Rats Fed High-Cholesterol Diet. Journal of the American College of Nutrition, 2007, vol. 26, no. 5, pp. 416-423.

7. Ji-Young Choi., Jong-Eun Jeon, Se-Young Jang, Yong-Jin Jeong, Seon-Min Jeon, Hae-Jin Park, Myung-Sook Choi Differential Effects of Powdered Whole Soy Milk and Its Hydrolysate on Antiobesity and Antihyperlipidemic Response to High-Fat Treatment in C57BL/6N Mice. dx.doi.org . 10.1021/jf1027944. 2011, 59, 2584-2591.

8. Claessens M. et al. Saris The effect of different protein hydrolysate/ carbohydrate mixtures on postprandial glucagon and insulin responses in healthy subjects. European Journal of Clinical Nutrition, 2009, vol. 63, pp. 48-56.

9. Morifuji M. Comparison of Different Sources and Degrees of Hydrolysis of Dietary Protein: Effect on Plasma Amino Acids, Dipeptides, and Insulin Responses in Human Subjects. J. Agric. Food Chem., 2010, Aug. 11;58 (15):8788-97. doi: 10.1021/jf101912n.

10. Tutel'yan V. A., Skurikhin I. M. Rukovodstvo po metodam analiza kachestva i bezopasnosti pishchevykh produktov [Guide to methods for analyzing food quality and safety]. Moscow, Meditsina Publ., 1998. 340 p.

11. GOST 9404-88. Flour and bran. Method for determination of humidity. Moscow, Standardinform, 2007. 4 p.

12. GOST R 55578-2013. Specialized food products. Method for determining osmolality. Moscow, Standartinform, 2014. 8 p.

Технология получения пептидного модуля на основе гидролизата белка сои

Ключевые слова

нанофильтрация; соевый белок; специализированный пищевой продукт; ферментативный гидролиз

Реферат

В последние годы с целью диетической коррекции и профилактики нарушений липидного обмена и связанных с этим алиментарно-зависимых заболеваний широко используют белки растительного происхождения, среди которых лидером является соевый белок в виде высокоочищенных изолятов с содержанием белка более 80%. Клинические наблюдения и экспериментальные исследования in vivo подтверждают наличие гиполипиде-мических и гипохолестеринемических свойств ферментативных гидролизатов соевых белков. Разработана технология получения в лабораторных условиях ферментолизата белка сои, получена опытная партия в полупромышленных условиях. Работа проводилась в ФИЦ питания и биотехнологии (Москва) и Всероссийском научно-исследовательском институте молочной промышленности (Москва). В качестве исходного сырья использовали изолят соевого белка «Supro XT 220D IP» (США) в виде 5%-ного раствора, ферментативный гидролиз осуществляли при температуре 50.52 °С с применением панкреатина из поджелудочной железы свиньи, при весовых соотношениях белок/фермент 50:1 и 20:1 (по сухим веществам). Продолжительность гидролиза составила 5 ч, пробы для оценки молекулярно-массового распределения пептидов методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления отбирали через 1, 3 и 5 ч. Содержание низкомолекулярной фракции короткоцепочечных пептидов и свободных аминокислот с молекулярной массой менее 1,6 кД при ферментолизе в течение 3 ч и соотношении белок/фермент 50:1 и 20:1 составило 25,7 и 26,4% соответственно; при увеличении времени ферменто-лиза до 5 ч соответствующие значения составляли 30,7 и 32,3%. Лиофильно высушенные гидролизаты полностью растворялись в воде при значении осмоляльности от 35 до 38 ммоль/кг. Разработанная технология получения гидролизата соевого белка была апробирована в полупромышленных условиях. Гидролиз проводили при температуре 50.52 °С в течение 3 ч, гидролизат пастеризовали при температуре 75 °С в течение 20 мин и высушивали на распылительной сушильной установке. Для снижения горечи и осмоляльности в лабораторных условиях проводили нанофиль-трацию полученного гидролизата с диализом и сбором высокомолекулярной фракции. В результате нанофильтрации осмоляльность гидролизата снизилась до 26 ммоль/кг, горечь практически исчезла. По содержанию пептидных фракций, органолептическим, физико-химическим показателям гидролизат соевого белка, полученный в полупромышленных условиях, соответствует лабораторным образцам и может использоваться в качестве белкового модуля при создании специализированных пищевых продуктов для больных с алиментарно-зависимыми заболеваниями.

Авторы

Зорин Сергей Николаевич, канд. биол. наук, Мазо Владимир Кимович, д-р биол. наук, профессор, Воробьева Ирина Сергеевна, канд. биол. наук, Воробьева Валентина Матвеевна, канд. техн. наук Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14, zorin@ion.ru; mazo@ion.ru; vorobiova@ion.ru; vorobiova_vm@ion.ru

Асафов Владимир Александрович, канд. техн. наук Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности, 115093, Москва, ул. Люсиновская, д. 35, корп. 7, vasafov@mail.ru

The technology of producing the peptide of the module on the basis of the hydrolysate of soy protein

Key words

nanofiltration; soy protein; specialty food; enzymatic hydrolysis

Abstracts

In recent years, for the purpose of dietary correction and prevention of lipid metabolism disorders and associated alimentary-dependent diseases, vegetable proteins are widely used, among which the leader is soy protein in the form of highly purified isolates with a protein content of more than 80%. Clinical observations and experimental studies in vivo confirm the presence of hypolipidemic and hypocholesterolemic properties of enzymatic hydrolysates of soy proteins. The purpose of the study was to develop a technology for obtaining soybean fermentolysate in laboratory conditions and the production of experimental quantity under semi-industrial conditions. The work was carried out by the specialists of the FGBUN «FIC of nutrition and biotechnology» (Moscow) and the FGBNU «Russian Research Institute of Dairy Industry» (Moscow). Soy protein isolate «Supro XT 220D IP» (USA) was used as a raw material in the form of a 5% solution, enzymatic hydrolysis was carried out at a temperature of (50-52) °C with the use of pancreatin from the pancreas of pig, at weight ratios of protein/enzyme 50:1 and 20:1 (based on dry substances), the duration of hydrolysis was 5 hours, samples for the estimation of the molecular weight distribution of peptides by high pressure liquid chromatography were selected after 1, 3 and 5 hours. The content of the low molecular weight fraction of short-chain peptides and free amino acids with a molecular weight less than 1.6 kD in fermentolysis for 3 hours and a protein /enzyme ratio of 50: 1 and 20:1 were 25,7% and 26,4 %, respectively, with an increase in fermentolysis time of up to 5 h, the corresponding values Were 30,7% and 32,3%. Lyophilized dried hydrolysates completely dissolved in water, the osmolality values were from 35 to 38 mmol/kg. The developed technology for obtaining soy protein hydrolyzate was tested in semi-industrial conditions. Hydrolysis was carried out at a temperature of (50-52) °C for 3 hours, the hydrolyzate was pasteurized at a temperature of 75 ° C for 20 minutes and dried on a spray dryer. To reduce the bitterness and osmolality in the laboratory, nanofiltration of the obtained hydrolyzate with dialysis and collection of the high-molecular fraction was carried out. As a result of nanofiltration, the hydrolyzate osmolality decreased to 26 mmol/kg, bitterness was practically absent. According to the content of peptide fractions, organoleptic, physicochemical parameters, soy protein hydrolyzate obtained under semi-industrial conditions corresponds to laboratory samples and can be used as a protein module when creating specialized food products for patients with alimentary-dependent diseases.

Authors

Zorin Sergey Nikolaevich, Candidate of Biological Science, Mazo Vladimir Kimovich, Doctor of Biological Science, Professor, Vorobyova Irina Sergeevna, Candidate of Biological Science, Vorobyova Valentina Matveevna, Candidate of Technical Science Federal Research Center for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 2/14, Ustyinsky Proezd, Moscow, 109240, zorin@ion.ru; mazo@ion.ru; vorobiova@ion.ru; vorobiova_vm@ion.ru Asafov Vladimir Alexandrovich, Candidate of Technical Science All-Russian Research Institute of Dairy Industry, 35, bldg. 7, Lyusinovskaya St., Moscow, 115093, vasafov@mail.ru