Способ диагностики тяжёлой формы течения ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR SEVERE FORM OF THE EBV-ASSOCIATED INFECTIOUS MONONUCLEOSIS

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, касается способа диагностики инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ-ИМ), с помощью молекулярно-генетических маркеров и может быть использовано для диагностики тяжелой формы течения ВЭБ-ИМ.
Инфекционный мононуклеоз является серьезной эпидемической и клинической проблемой. Связано это с повсеместной распространенностью самого частого этиологического агента - вируса Эштейна-Барр (ВЭБ). ВЭБ обладает выраженным тропизмом к В-лимфоцитам, где происходит его размножение, Т-клеткам и клеткам лимфоидных образований, способствует пролиферации пораженных клеток. Из-за незавершенности иммунного ответа вирус получает возможность персистировать в организме пожизненно. По разным данным, носителями ВЭБ являются 90-99% взрослого населения, при этом первичное инфицирование чаще всего происходит в детском и подростковом возрасте. В 25-75% случаев ВЭБ-инфекция сопровождается развитием симптомокомплекса инфекционного мононуклеоза различной степени тяжести. Тяжелая форма течения ВЭБ-ИМ может приводить к развитию хронической активной ВЭБ-инфекции и возникновению осложнений, в частности, аутоиммунных и злокачественных лимфопролиферативных заболеваний [Fu Q., Не С., Мао Z. Epstein-Barr virus interactions with the Bcl-2 protein family and apoptosis in human tumor cells// J. Zhejiang Univ. Sci. B.-2013. Vol. 14. №1.- P. 8-24.; Pender M.P. CD8+ T-cell deficiency, Epstein-Barr virus infection, vitamin D deficiency, and steps to autoimmunity: a unifying hypothesis//Autoimmune dis. -2012. Vol. 2012. - P. 189096.], при этом имеются сведения о летальных исходах вследствие разрыва селезенки, стеноза гортани и поражения центральной нервной системы [Инфекционные болезни у детей: учебник для педиатрических факультетов медицинских вузов / под ред. проф. В.Н.Тимченко. - 3-е изд., испр. и доп.- Спб.: СпецЛит, 2008.- С. 228.]. Риск развития тяжелой формы ВЭБ-ИМ зависит от многих факторов, включая индивидуальные особенности пациента: иммунный статус, генетическую предрасположенность, возраст [McAulay K.А., Higgins C.D., Macsween K.F., Lake A., Jarrett R.F., Robertson F.L., Williams H., Crawford D.H. HLA class I polymorphisms are associated with development of infectious mononucleosis upon primary EBV infection // J. Clin. Invest.- 2007. Vol. 117. №10. - P. 3042-3048.; Worth A.J.J., Houldcroft C.J., Booth C. Severe Epstein-Barr virus infection in primary immunodeficiency and the normal host//Br. J. Haematol. - 2016.- Vol. 175. №4. - P. 559-576.]. Своевременная диагностика формы течения заболевания обеспечивает назначение адекватного лечения и предупреждение неблагоприятных последствий.
На сегодняшний день тяжесть течения ВЭБ-ИМ определяют по результатам неспецифических лабораторных тестов, таких как общий и биохимический анализ крови, инструментальное измерение размера лимфатических узлов и др., степени выраженности клинических симптомов, длительности их сохранения, развитию осложнений и сопутствующих заболеваний. Молекулярные механизмы возникновения тяжелой формы ВЭБ-ИМ до конца не изучены, а специфические тесты, позволяющие превентивно оценить риск ее возникновения, отсутствуют.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа диагностики тяжелой формы течения ВЭБ-ИМ.
Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение точности диагностики тяжелой формы течения ВЭБ-ИМ, а также прогнозирование рисков возникновения тяжелой формы течения ВЭБ-ИМ за счет совокупности специфических молекулярно-генетических маркеров риска развития тяжелой формы ВЭБ-ИМ.
Технический результат достигается тем, что в лейкоцитах периферической крови пациентов с ВЭБ-ассоциированным инфекционным мононуклеозом детектируют экспрессию мРНК SF1.NM_201995, XIAP.NM_001167 и генов BCL2L11, BIRC3, CELF6 и при снижении уровня экспрессии мРНК SF1.NM_201995, XIAP.NM_001167 и генов BCL2L11, BIRC3 на фоне повышения уровня экспрессии гена CELF6 диагностируют тяжелую форму течения заболевания.
Молекулярно-генетические маркеры риска развития тяжелой формы ВЭБ-ИМ представляют собой гены, регулирующие апоптоз, пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток, поскольку известно, что тяжелое течение заболевания сопровождается развитием выраженного лимфопролиферативного синдрома, возникающего вследствие дисбаланса в системе пролиферация-апоптоз, нарушением механизмов Т- и NK-клеточного иммунного ответа, развитием неконтролируемых цитотоксических и воспалительных реакций [Houldcroft C.J., Kellam P. Host genetics of Epstein-Barr virus infection, latency and disease// Rev. Med. Virol.-2015. Vol. 25. №. 2. - P. 71-84.; Worth A.J.J., Houldcroft C.J., Booth C. Severe Epstein-Barr virus infection in primary immunodeficiency and the normal host// Br. J. Haematol. - 2016. Vol. 175. №4. - P. 559-576.].
На сегодняшний день накоплен значительный объем знаний о способности ВЭБ регулировать апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток. Известно, что первичная острая ВЭБ-инфекция сопровождается пролиферацией пораженных В-лимфоцитов, а в условиях in vitro и их иммортализацией [Price A.M., Luftig М.А. Dynamic Epstein-Barr virus gene expression on the path to B-cell transformation // Adv. Virus Res. - 2014. Vol. 88. - P. 279-313.].
При анализе транскриптома инфицированных В-клеток наблюдали изменение экспрессии групп генов, регулирующих митоз, клеточный цикл и р53-зависимый апоптоз. На более поздних стадиях развития заболевания происходила индукция генов-участников NF-kB-сигнальных путей и NF-kB-зависимых генов [Price A.M., Tourigny J.P., Forte E., Salinas R.E., Dave S.S., Luftig M.A. Analysis of Epstein-Barr virus-regulated host gene expression changes through primary B-cell outgrowth reveals delayed kinetics of latent membrane protein 1-mediated NF-κВ activation // Journal of Virology. - 2012. Vol. 86. №20. - P. 11096-11106.]. Похожие результаты получены при анализе генной экспрессии в суммарном пуле всех иммунокомпетентных клеток периферической крови пациентов с ВЭБ-ИМ: наиболее активно экспрессирующиеся гены принадлежали к функциональной группе регуляторов клеточного цикла и участников интерферон типа I-зависимого ответа [Dunmire S.K., Odumade О.А., Porter J.L., Reyes-Genere J., Schmeling D.O., Bilgic H., Fan D., Baechler E.C., Balfour H.H. Jr., Hogquist K.A. Primary EBV infection induces an expression profile distinct from other viruses but similar to hemophagocytic syndromes// PLoS One. - 2014. - Vol. 9. №1. - P.e85422c.].
В соответствии с изобретением молекулярно-генетические маркеры риска развития тяжелой формы течения ВЭБ-ИМ относятся к двум функциональным группам: регуляторы апоптоза (BCL2L11, BIRC3, XIAP) и факторам сплайсинга пре-мРНК (CELF6, SF1).
Продукт гена BCL2L11 (BCL2 like 11, ВАМ, BIM, BOD), связываясь с другими белками семейства BCL2 на мембране митохондрий, обусловливает высвобождение цитохрома С и запуск митохондриального пути апоптоза. Известна способность ВЭБ подавлять экспрессию BCL2L11 в пораженных В-лимфоцитах, что обусловливает их выживание, усиленную пролиферацию и возможное злокачественное перерождение [Wood C.D., Veenstra Н., Khasnis S., Gunnel A., Webb H.M., Shannon-Lowe C, Andrews S., Osborne C.S., West M.J. MYC activation and BCL2L11 silencing by a tumour virus through the large-scale reconfiguration of enhancer-promoter hubs // eLife. - 2016. Vol. 5. - P. e18270.]. Описанный эффект связан с воздействием вирусных нуклеарных протеинов EBNA3A и EBNA3C, реализуется на ранних стадиях инфекции и не требует LMP-1-зависимой активации NF-kB [Fitzsimmons L., Воусе A.J., Wei W., Chang С, Croom-Carter D., Tierney R.J., Herold M.J., Bell A.I., Strasser A., Kelly G.L., Rowe M. Coordinated repression of BIM and PUMA by Epstein -Barr virus latent genes maintains the survival of Burkitt lymphoma cells // Cell Death Differ. - 2018. Vol. 25. №. 2. - P. 241-254.; Price A.M., Dai J., Bazot Q., Patel L., Nikitin P.A., Djavadian R., Winter P.S., Salinas C.A., Barry A.P., Wood K.C., Johannsen E.C., Letai A., Allday M.J., Luftig M.A. Epstein-Barr virus ensures В cell survival by uniquely modulating apoptosis at early and late times after infection// eLife. - 2017. Vol. 6. - P. e22509.]. Снижение экспрессии гена BCL2L11 создает предпосылки для ингибирования митохондриального пути апоптоза и усиления экспансии пораженных вирусом иммунокомпетентных клеток.
Продукты других маркерных генов - BIRC3 и XIAP - обладают схожей способностью подавлять апоптоз, связываясь с адаптерами для рецептора фактора некроза опухоли TRAF-1 и TRAF-2. Дополнительно BIRC3 (baculoviral IAP repeat containing 3, AIP1, API2, MIHC) является регулятором неканонического пути активации NF-kB. Снижение экспрессии BIRC3 при хроническом лимфолейкозе является плохим диагностическим признаком, поскольку сопровождается индукцией экспрессии NF-kB-зависимых генов и пролиферацией злокачественных клеток [Asslaber D., Watch N., Leisch M., Qi Y., Maeding N., Hufnagl C, Jansko В., Zaborsky N., Villunger A., Hartmann T.N., Greil R., Egle A. BIRC3 expression predicts CLL progression and defines treatment sensitivity via enhanced NF-κВ nuclear translocation // Clin. Cancer Res. - 2018. Vol. 25. №6. - P. 1901-1912.].
Продукт гена XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis, BIRC4, PI3, XLP2) -многофункциональный белок, участвующий в реализации антибактериального иммунитета и подавлении IL-1-индуцированного апоптоза в клетках иммунной системы. Мутации гена, приводящие к снижению его экспрессии, являются одной из причин развития X-сцепленного лимфопролиферативного синдрома - наследственного расстройства иммунной системы с широким спектром клинических проявлений [Worth A.J.J., Houldcroft C.J., Booth С.Severe Epstein-Barr virus infection in primary immunodeficiency and the normal host//Br. J Haematol. -2016. Vol. 175. №4. - P. 559-576.]. У пациентов с лимфопролиферативным синдромом развивается аномальный ответ на ВЭБ-инфекцию, сопровождающийся усилением цитотоксической активности и активационно-индуцированного апоптоза ВЭБ-специфических иммунных клеток [Lopez-Granados Е., Stacey М., Kienzler А.-K., Sierro S., Willberg С.В., Fox С.Р., Rigaud S., Long H.M., Hislop A.D., Rickinson A.B., Patel S., Latour S., Klenerman P., Chapel H. A mutation in X-linked inhibitor of apoptosis (G466X) leads to memory inflation of Epstein-Barr virus-specific T cells // Clin Exp Immunol. - 2014. Vol. 178. №3. - P. 470-482.; Rigaud S.,  M.-C, Lambert N., Pasquier В., Ateo V., Soulas P., Galicier L., Le Deist F., Rieux-Laucat F., Revy P., Fischer A., de Saint Basile G., Latour S. XIAP deficiency in humans causes an X-linked lymphoproliferative syndrome // Nature.-2006. Vol. 444. №7115.-P. 110-114.].
Белок CELF6 (CUGBP Elav-like family member 6, BRUNOL6) экспрессируется преимущественно в тканях почек, головного мозга, сердца и печени, а в клетках крови представлен в незначительном количестве [Ladd A.N., Nguyen H.N., Malhorta K., Cooper A. CELF6, a member of the CELF family of RNA-binding proteins, regulates muscle-specific splicing enhancer-dependent alternative splicing // J. Biol. Chem. - 2004. Vol. 279. №17. - P. 17756-17764.], а повышение его экспрессии в крови может свидетельствовать как об активации нехарактерных для лейкоцитов крови механизмов сплайсинга пре-мРНК, так и о возникновении полиорганных поражений с вовлечением сердечно-сосудистой, выделительной, центральной и периферической нервной систем.
Фактор SF1 (splicing factor 1, ВВР, МВВР, ZFM1) участвует в ранней сборке сплайсосомы и выборе альтернативных сайтов сплайсинга [Corioni М., Antih N., Tanackovic G., Zavolan M., Kramer A. Analysis of in situ pre-mRNA targets of human splicing factor SF1 reveals a function in alternative splicing// Nucleic Acids Res. - 2011. Vol. 39. №5. - P. 1868-1879.]. Высокий уровень экспрессии SF1 характерен для клеток костного мозга, лимфатических узлов, селезенки. Транскрипт SF1.NM_201995 отличается от «основного» варианта мРНК SF1 отсутствием сегментов в 3'-нетранслируемом регионе и кодирующей части, что приводит к сдвигу рамки считывания и трансляции более короткого протеина с иной последовательностью аминокислот на С-конце. Длина С-конца SF1 влияет на его взаимодействие с другими компонентами сплайсосомы и обуславливает селекцию сайта сплайсинга [Arning S.,  P., Bilbe G.,  A. Mammalian splicing factor SF1 is encoded by variant cDNAs and binds to RNA // RNA. -1996. Vol. 2. №8. - P. 794-810.; Caslini C., Spinelli O., Cazzaniga G., Golay J., De Gioia L., Pedretti A., Breviario F., Amaru R., Barbui Т., Biondi A., Introna M., Rambaldi A. Identification of two novel isoforms of the ZNF162 gene: a growing family of signal transduction and activator of RNA proteins// Genomics. - 1997. Vol. 42. №2. - P. 268-277.]. Выбор сайта сплайсинга определяет долю представленности различных транскриптов одного гена в клетке, тем самым регулируя функцию гена [Филатова Е.Н., Уткин О.В. Роль некодирующих изоформ мРНК белок-кодирующих генов в регуляции генной экспрессии // Генетика. - 2018. - Т. 54, №8. - С. 1-10.].
Сущность способа поясняется примерами.
Пример 1. В исследование вошли дети и подростки в возрасте 6-17 лет с диагнозом «острый инфекционный мононуклеоз». С помощью коммерческих тест-систем «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-VCA-IgG», «ВектoHHV-6-IgG», «ВектоЦМВ-IgM», «ВектоЦМВ-IgG» производства «Вектор-Бест» (Россия) в образцах сыворотки крови пациентов определяли наличие специфических антител к ВЭБ, герпесвирусу человека 6 типа (ВГЧ6) и цитомегаловирусу (ЦМВ); с применением коммерческого набора для ПЦР в реальном времени «АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL» (ЦНИИЭ, Россия) - наличие ДНК вирусов. На основании результатов тестирования отбирали пациентов с инфекционным мононуклеозом, образцы сыворотки крови которых содержали антитела и ДНК к ВЭБ, но не к двум другим герпесвирусам (группа ВЭБ-ИМ, n=27, средний возраст 12 лет). Контроль составили образцы периферической крови, полученные от практически здоровых доноров сопоставимого возраста и пола (группа НОРМ, n=50, средний возраст 11 лет).
Определение уровня экспрессии маркерных мРНК и генов. Анализ относительных уровней экспрессии мРНК SF1.NM_201995, XIAP.NM_001167 и генов BCL2L11, BIRC3, CELF6 провели с помощью технологии биочипов. В качестве материала использовали лейкоцитарную фракцию периферической крови, выделенную с применением раствора «Гемолитик» (ЦНИИЭ, Россия). Пул тотальной РНК выделяли с помощью набора «МАГНО-сорб» (ЦНИИЭ, Россия) и концентрировали смесью фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Обратную транскрипцию тотальной РНК и амплификацию кДНК проводили с применением набора «Mint cDNA synthesis kit» («Евроген», Россия), при этом 3'-олиго-Т-праймер заменяли на содержащий Т7 промотор-олиго-Т-праймер («ДНК-синтез», Россия). Полученную кДНК транскрибировали с использованием Т7 РНК-полимеразы («Thermo Scientific», ЕС), при этом добавляли биотинилированные УТФ («ДНК-синтез», Россия). Полученную меченую РНК гибридизовали на ДНК-биочип собственного дизайна, выполненного на базовой платформе «CustomArray Inc.» (США), содержащий набор зондов к детектируемым мРНК и генам, селекцию которых осуществляли согласно описанному ранее алгоритму [Солнцев Л.А., Старикова В.Д., Сахарнов Н.А., Князев Д.И., Уткин О.В. Стратегия подбора зондов для изучения совокупности мРНК участников рецептор-опосредованного сигналинга апоптоза // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №3. - С. 515-524.]. Считывание сигнала гибридизации целевой РНК на соответствующий зонд биочипа производили амперометрическим способом с применением устройства и программного обеспечения «ElectraSense» («CustomArray Inc.», США). Полученный сигнал рассматривали как относительный уровень экспрессии гена или транскрипта.
Провели сравнение уровней экспрессии мРНК SF1.NM_201995, XIAP.NM_001167 и генов BCL2L11, BIRC3, CELF6 у пациентов с ВЭБ-ИМ и здоровых доноров. Выявлено, что у пациентов с тяжелой формой течения ВЭБ-ИМ наблюдается снижение уровня экспрессии мРНК SF1.NM_201995, XIAP.NM_001167 и генов BCL2L11, BIRC3, на фоне повышения уровня экспрессии гена CELF6. Тяжесть течения заболевания подтверждали наличием клинических симптомов: интоксикация (100%), катар верхних дыхательных путей (100%), регионарный лимфаденит (95,5%), гепатомегалия (80,9%), затрудненное носовое дыхание (76,4%), аденоидит (50,9%), ангина (37,3%), экзантема (15,5%), спленомегалия (41,8%), кардиальный синдром (40,0%) и результатами лабораторных исследований: повышение уровня трансаминаз АсАт и АлАт (в 3-6 раз по сравнению с донорами), содержание в крови атипичных мононуклеарных клеток (более 20%). Результаты представлены в таблице 1.
Пример 2. Провели сравнение уровней экспрессии молекулярно-генетических маркеров в соответствии с изобретением в группах пациентов с тяжелой формой течения ВЭБ-ИМ разного пола.
Пример 3. Провели сравнение уровней экспрессии молекулярно-генетических маркеров в соответствии с изобретением в группах пациентов с тяжелой и среднетяжелой формой ВЭБ-ИМ. Результаты представлены в таблице 3.
Проведенные исследования подтвердили, что снижение уровней экспрессии мРНК SF1.NM_201995, XIAP.NM_001167 и генов BCL2L11 и BIRC3 на фоне возрастания уровня экспрессии гена CELF6 специфичны для тяжелой формы ВЭБ-ИМ, не проявляются при инфекции средней тяжести и не зависят от пола пациентов.