КОМПОЗИЦИИ NEISSERIA MENINGITIDIS И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
NEISSERIA MENINGITIDIS COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING THEM

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается композиций Neisseria meningitidis и способов их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Neisseria meningitidis является грамотрицательной инкапсулированной бактерией, способной вызывать сепсис, менингит и смерть. N. meningitidis может разделяться приблизительно на 13 серогрупп (включая серогруппы А, В, С, Е29, Н, I, K, L, W-135, X, Y и Z) на основе химических и антигенных различий полисахаридных капсул. Болезнь обусловлена, главным образом, пятью из серогрупп (А, В, С, Y и W135).
Менингококковый менингит является тяжелым заболеванием, способным убивать детей и молодых взрослых людей за несколько часов, несмотря на наличие антибиотиков. Существует потребность в улучшенных иммуногенных композициях против менингококковых серогрупп А, В, С, Y и W135 и/или X.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для удовлетворения этой и других потребностей настоящее изобретение обеспечивает композиции Neisseria meningitidis и способы их применения.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158-185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159-186 SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185-254 SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 76, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.
В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из описанных авторами вариантов осуществления.
В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, нелирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, два конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы A; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, три конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства А.
В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства В.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А05.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А12.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А22.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В01.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В09.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В44.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В22.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В24.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А62.
В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.
В одном аспекте изобретение касается способа вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппы С у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.
В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппа Y у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.
В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis у млекопитающего, включая введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1A-1F: Вариантные нуклеиновокислотные последовательности Р2086.
Фиг. 2А-2С: Вариантные аминокислотные последовательности Р2086. Ствол Gly/Ser в N-концевом хвосте каждого варианта подчеркнут.
Фиг. 3: Структура белка ORF2086
Фиг. 4: Удаление N-концевого Cys в результате ведет к потере экспрессии в Е. coli.
Фиг. 5: Влияние длины ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидированного варианта ORF2086. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В01, представлена в SEQ ID NO: 35. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В44, представлена в SEQ ID NO: 36. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А05, представлена в SEQ ID NO: 37. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А22, представлена в SEQ ID NO: 38. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В22, представлена в SEQ ID NO: 39. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А19, представлена в SEQ ID NO: 40.
Фиг. 6: Высокий уровень экспрессии нелипидированного В09, несмотря на короткий ствол Gly/Ser. Первые две полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-делетированного варианта В09 до и после индукции. Третья и четвертая полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-положительного варианта В09 до и после индукции. Крайняя правая полоса представляет стандарт молекулярной массы. Аминокислотная последовательность, показанная под изображением, представлена в SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант А22, указанный на фигуре как "А22_001", представлена в последовательности SEQ ID NO: 42, показанной на фигуре под SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В22, указанный на фигуре как "В22_001", представлена в SEQ ID NO: 52. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В09, указанный на фигуре как "В09_004", представлена в SEQ ID NO: 53.
Фиг. 7: Оптимизация кодонов повышает экспрессию нелипидированных вариантов В22 и А22. Слева показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта В22 до (полосы 1 и 3) и после (полосы 2 и 4) индукции IPTG. Справа показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта А22 до (полоса 7) и после (полоса 8) индукции IPTG. Полосы 5 и 6 представляют стандарты молекулярной массы.
Фиг. 8А - 8Н: Вариантные нуклеиново- и аминокислотные последовательности Р2086
Фиг. 9А - 9В: Выравнивание последовательности выбранных вариантов дикого типа подсемейств А и В fHBP, обсуждаемых в Примерах 15-19. Следует заметить, что N-конец А62 является на 100% идентичным В09, а его С-конец является на 100% идентичным А22. Показанными последовательностями являются А05 (SEQ ID NO: 13); А12 (SEQ ID NO: 14); A22 (SEQ ID NO: 15); A62 (SEQ ID NO: 70); B09 (SEQ ID NO: 18); B24 (SEQ ID NO: 20); и консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 78).
ОПРЕДЕЛИТЕЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А04 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 3 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 4 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12-2 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 5 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 6 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В02 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 7 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В03 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 8 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 9 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 10 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В24 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 11 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А04, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А12, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В02, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В03, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 19 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 22 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2.
SEQ ID NO: 23 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2.
SEQ ID NO: 24 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 25 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 26 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 27 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 28 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 29 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 28.
SEQ ID NO: 30 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 31 представляет аминокислотную последовательность а Ствол Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 30.
SEQ ID NO: 32 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 33 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 34.
SEQ ID NO: 34 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 35 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 36 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 37 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 38 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 39 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 40 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А19, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 41 представляет аминокислотную последовательность для N-конца а N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 42 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 43 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pDK087 включает SEQ ID NO: 43.
SEQ ID NO: 44 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44. SEQ ID NO: 44 идентична SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 21 делетирован. SEQ ID 44 кодируется, например, SEQ ID NO: 43.
SEQ ID NO: 45 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован, и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ063 включает SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 46 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ064 включает SEQ ID NO: 46.
SEQ ID NO: 47 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ065 включает SEQ ID NO: 47.
SEQ ID NO: 48 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида pLA134 включает SEQ ID NO: 48.
SEQ ID NO: 49 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09. SEQ ID NO: 49 идентична SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 18 делетирован. SEQ ID 49 кодируется, например, последовательностью ДНК, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48.
SEQ ID NO: 50 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 50 кодируется, например, SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 51 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pLN056 включает SEQ ID NO: 51.
SEQ ID NO: 52 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 53 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 54 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 55 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 55 идентична SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 13 делетирован. SEQ ID NO: 55 кодируется, например, SEQ ID NO: 54.
SEQ ID NO: 56 представляет аминокислотную последовательность серино-глициновой последовательности повтора, как показано в Примере 7.
SEQ ID NO: 57 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01. SEQ ID NO: 57 идентична SEQ ID NO: 58, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 58 делетирован.
SEQ ID NO: 58 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 59 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В15, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 60 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В16, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 61 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на кодон для глицина.
SEQ ID NO: 62 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на глицин.
SEQ ID NO: 63 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на кодон для глицина.
SEQ ID NO: 64 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на глицин.
SEQ ID NO: 65 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (рЕВ042), кодирующую нелипидированный, непирувилированный полипептид А05.
SEQ ID NO: 66 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А12. SEQ ID NO: 66 идентична SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 14 делетирован. SEQ ID NO: 66 кодируется, например, SEQ ID NO: 67.
SEQ ID NO: 67 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида А12.
SEQ ID NO: 68 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22. SEQ ID NO: 68 идентична SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 15 делетирован. SEQ ID NO: 68 кодируется, например, SEQ ID NO: 69.
SEQ ID NO: 69 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида А22.
SEQ ID NO: 70 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis серогруппа В, 2086, вариант А62, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 71 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А62. SEQ ID NO: 71 идентична SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 70 делетирован.
SEQ ID NO: 72 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для SEQIDNO: 71.
SEQ ID NO: 73 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (pDK086) для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 74 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А29, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 75 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22. SEQ ID NO: 75 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 19 делетирован.
SEQ ID NO: 76 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05.
SEQ ID NO: 77 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 77 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 76 отсутствует.
SEQ ID NO: 78 представляет аминокислотную последовательность для консенсусной последовательности, показанной на ФИГ. 9А - 9В.
SEQ ID NO: 79 идентична SEQ ID NO: 78, за исключением того, что Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 78 отсутствует.
SEQ ID NO: 80 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 80 идентична SEQ ID NO: 20, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 20 делетирован.
SEQ ID NO: 81 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 81 идентична SEQ ID NO: 20, в которой остатки в позициях 1-3 SEQ ID NO: 20 делегированы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если нет иного определения, все применяемые авторами технические и научные термины имеют такие же значения, общепринятые среди специалистов в области, к которой относится это изобретение. Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, подобные или равноценные описываемым авторами, приемлемые способы и материалы описываются ниже. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничительные. Все публикации, патенты и другие упомянутые авторами документы включены путем ссылки в их полном объеме. Определения
Термин "антиген" в целом касается биологической молекулы, как правило, белка, пептида, полисахарида, липида или конъюгата, который содержит по меньшей мере один эпитоп, с которым может быть выборочно связано родственное антитело; или, в некоторых случаях, иммуногенного вещества, которое может стимулировать выработку антител или вызывать Т-клеточные иммунные реакции, или и то, и другое, в организме животного, включая композиции, вводимые путем инъекции или абсорбируемые организмом животного. Иммунная реакция может быть вызвана для всей молекулы или для одной или нескольких разных частей молекулы {например, эпитопа или гаптена). Этот термин может применяться по отношению к отдельной молекуле или к гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген распознается антителами, Т-клеточными рецепторами или другими элементами специфического гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин "антиген" включает все соответствующие антигенные эпитопы. Эпитопы данного антигена могут быть распознаны с применением любого количества способов картирования эпитопов, хорошо известных среди специалистов в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Например, линейные эпитопы могут определяться путем одновременного синтезирования большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и приведения пептидов в реакцию с антителами, пока пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие технологии известны специалистам в данной области и описываются, например, в Патенте США №4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Подобным образом конформационные эпитопы могут распознаваться путем определения пространственной конформации аминокислот, например, при помощи рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Кроме того, в контексте настоящего изобретения термин "антиген" также может применяться по отношению к белку, включающему модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (как правило, консервативного характера, хотя они могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-специфического мутагенеза или с применением конкретных процедур синтеза или при помощи генной инженерии, или же могут быть случайными, например, при мутации хозяев, вырабатывающих антигены. Кроме того, антиген может быть извлечен, получен или выделен из микроба, например, бактерии, или может быть целым организмом. Подобным образом определение также включает олигонуклеотид или полинуклеотид, экспрессирующий антиген, например, при иммунизации нуклеиновой кислотой. Также включаются синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 - Jul. 3, 1998).
Термин "консервативные" по отношению к аминокислотным замещениям может применяться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера задействованных остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, триптофан и метионин; к полярным/нейтральным аминокислотам относятся глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин; и к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления изменения консервативной аминокислоты меняют первичную последовательность полипептидов ORF2086, но не меняют функцию молекулы. При создании этих мутантов может учитываться индекс гидропатичности аминокислот. Значение индекса гидропатичности аминокислот в обеспечении интерактивной биологической функции на полипептиде в целом осознается специалистами в данной области (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1): 105 - 32). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими подобный индекс или показатель гидропатичности, и образуемый в результате полипептид все равно обладает подобной биологической активностью. Каждая аминокислота получает свой индекс гидропатичности на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Их показатели таковы: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3.9); и аргинин (-4,5).
Считается, что относительный гидропатический характер аминокислотного остатка определяет вторичную и третичную структуру образуемого в результате полипептида, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими, как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и т.п. Специалистам в данной области известно, что аминокислота может быть замещена другой аминокислотой, имеющей подобный индекс гидропатичности, и при этом может быть получен функционально равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтение отдается замещению аминокислот, индексы гидропатичности которых находятся в пределах +1-2, особенно предпочтительно - в пределах +/-1, и еще более предпочтительно - в пределах +/-0,5.
Консервативные аминокислотные замещения или вставки также могут осуществляться на основе гидрофильности. Как описывается в Патенте США №4,554,101, включенном в данное описание путем ссылки, наибольшая локальная средняя гидрофильность полипептида, определяемая гидрофильностью прилегающих к нему аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическими свойствами полипептида. В Патенте США №4,554,101 указывается, что аминокислотные остатки имеют следующие показатели гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5±1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Следует понимать, что аминокислота может быть замещена другой, имеющей подобный показатель гидрофильности, и при этом может быть получен биологически равноценный, в частности, иммунологически равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтительными являются замещения аминокислот, показатели гидрофильности которых находятся в пределах ±2; особенно предпочтительно - в пределах ±1; и еще более предпочтительно - в пределах ±0,5. Типичные замещения, при которых учитываются разные из вышеуказанных характеристик, хорошо известны специалистам в данной области, и к ним, помимо прочих, относятся: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.
Термин "эффективное иммуногенное количество" в контексте данного описания означает количество полипептида или композиции, включающей полипептид, которое является эффективным для вызывания иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Например, эффективное иммуногенное количество белка rLP2086 согласно этому изобретению означает количество, которое является эффективным при вызывании иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Конкретная "эффективная иммуногенная доза или количество" зависит от возраста, массы и медицинского состояния хозяина, а также от способа введения. Соответствующие дозы легко определяются специалистами в данной области.
Термин "ствол Gly/Ser" в контексте данного описания означает ряд остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys остатка белка, кодируемого ORF2086. В стволе Gly/Ser может существовать от 5 до 12 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Предпочтительно ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Стволы Gly/Ser вариантов Р2086 согласно настоящему изобретению представлены подчеркнутыми последовательностями на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 12-21). Как показано авторами, длина ствола Gly/Ser может влиять на устойчивость уровня экспрессии нелипидированного варианта Р2086. В типичном варианте осуществления эффект от влияния на длину ствола Gly/Ser сравнивают с показателями соответствующего варианта дикого типа.
Термин "иммуногенный" относится к способности антигена или вакцины к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосредованной, или обоих типов.
Термины "иммуногенное количество" или "иммунологически эффективное количество" или "доза", которых в контексте данного описания являются взаимозаменяемыми, в целом касаются количества антигена или иммуногенной композиции, достаточного для вызывания иммунной реакции, клеточной (Т-клетки) или гуморальной (В-клетки или антитело) реакции, или обоих типов, согласно измерениям с применением стандартных анализов, известных специалистам в данной области.
Термин "иммуногенная композиция" относится к фармацевтической композиции, содержащей антиген, например, микроорганизм или его компонент, причем композиция может применяться для вызывания иммунной реакции у субъекта. Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения человека, восприимчивого к инфекции N. meningidis, с введением иммуногенных композиций системным трансдермальным или мукозальным путем. Такое введение может включать инъекцию внутримышечным (i.m.), внутрибрюшинным (i.p.), внутрикожным (i.d.) или подкожным способами; нанесение в форме пластыря или другого трансдермального средства доставки; или путем мукозального введения через ротовую полость / пищеварительный, дыхательный или мочеполовой тракты. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция может применяться в производстве вакцины или при выработке поликлональных или моноклональных антител, которые могут применяться для пассивной защиты или лечения субъекта.
Оптимальное количество компонентов конкретной иммуногенной композиции определяют путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.
Термин "выделенный" означает, что материал удаляют из его первоначальной среды (например, естественной среды, если он встречается в природе, или из организма-хозяина, если это рекомбинантное образование, или переносят из одной среды в другую среду). Например, "выделенный" белок или пептид практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков клеточного или тканевого источника, из которого взят белок, или практически не содержит химических прекурсоров или других химических веществ в случае химического синтеза, или иным образом присутствует в смеси как компонент химической реакции. Согласно настоящему изобретению, белки могут быть выделены из бактериальных клеток или из клеточного дебриса, и, таким образом, они обеспечиваются в форме, применяемой в производстве иммуногенной композиции. Термин "выделенный" или "выделение" может включать очистку, включая, например, способы очистки белков, как описывается авторами. Выражение "практически не содержит клеточного материала" включает композиции полипептида или белка, в которых полипептид или белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантным путем. Таким образом, белок или пептид, который практически не содержит клеточного материала, включает композиции капсульного полисахарида, белка или пептида, включающие менее, чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1%, (сухой массы) примесного белка или полисахарида или другого клеточного материала. В случае получения полипептида / белка рекомбинантным путем он предпочтительно практически не содержит культуральной среды, т.е., культуральная среда составляет около 20%, 10% или 5% объема белковой композиции. В случае получения полипептида или белка путем химического синтеза он предпочтительно практически не содержит химических прекурсоров или других химических веществ, т.е., отделен от химических прекурсоров или других химических веществ, участвующих в синтезе белка или полисахарида. Соответственно, такие композиции полипептида или белка включают менее, чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (сухой массы) химических прекурсоров или соединений, отличных от нужных фрагментов полипептидов / белков или полисахаридов.
Термин "N-концевой хвост" в контексте данного описания относится к N-концевой части белка, кодируемого ORF2086, прикрепляющей белок к клеточной мембране. N-концевой хвост показан в нижней части боковой проекции структуры с Фигуры 3. N-концевой хвост, как правило, включает N-концевые 16 аминокислот белка, кодируемого ORF2086. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост представляет собой аминокислоты 1-16 любой з последовательностей SEQ ID NO: 12-21. Термин "ORF2086" в контексте данного описания означает открытую рамку считывания 2086 бактерий вида Neisseria. ORF2086 Neisseria, кодируемые из нее белки, фрагменты этих белков и иммуногенные композиции, включающие эти белки, известны специалистам в данной области и описываются, например, в документе WO 2003/063766 и в публикациях патентных заявок США №№ US 20060257413 и US 20090202593, включенных в данное описание путем ссылки в полном объеме.
Термин "Р2086" в целом касается белка, кодируемого ORF2086. Буква "Р" перед "2086" является аббревиатурой для белка ("protein"). Белки Р2086 согласно изобретению могут быть липидированными или нелипидированными. "LP2086" и "Р2086", как правило, означают липидированные и нелипидированные формы белка 2086, соответственно. Белок Р2086 согласно изобретению может быть рекомбинантным. Как правило, "rLP2086" и "rP2086" означают липидированные и нелипидированные формы рекомбинантного белка 2086, соответственно. "2086" также известен как фактор Н-связывающий белок (fHBP) благодаря его способности к связыванию с фактором Н.
Термин "фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель и/или носитель" в контексте данного описания охватывает любые и все растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающий абсорбцию агенты и т.п., совместимые с введением человеку и другим хозяевам - позвоночным. Как правило, фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель и/или носитель представляет собой разбавитель, наполнитель и/или носитель, утвержденный федеральным регулирующим органом, правительством штата или другим регулирующим органом, или занесенным в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею в качестве средства для применения на животных, включая человека и отличных от человека млекопитающих. Термин "разбавитель", "наполнитель" и/или "носитель" означает разбавитель, адъювант, наполнитель или основу, с которыми вводят фармацевтическую композицию. Такими фармацевтическими разбавителями, наполнителями и/или носителями могут быть стерильные жидкости, такие, как вода и масла, включая минеральные, животные, растительные или синтетические. Вода, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут применяться в качестве жидких разбавителей, наполнителей и/или носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящими фармацевтическими разбавителями и/или наполнителями являются крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и т.п. В случае необходимости композиция также может содержать небольшое количество увлажнителя, объемообразующего агента, эмульгаторов или рН-буферы. Эти композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, композиций с замедленным высвобождением и т.п. Примеры подходящих фармацевтических разбавителей, наполнителей и/или носителей описываются в публикации "Remington's Pharmaceutical Sciences", Е.W. Martin. Композиция должна соответствовать режиму введения. Подходящий разбавитель, наполнитель и/или носитель станет очевидным для специалиста в данной области и во многом зависит от пути введения.
"Защитная" иммунная реакция означает способность иммуногенной композиции к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосредованной, которая служит для защиты субъекта от инфекции. Обеспечиваемая защита не обязательно должна быть абсолютной, т.е., не требуется полное предотвращение или устранение инфекции, если наблюдается статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией субъектов, например, инфицированных животных, которым не вводили вакцину или иммуногенную композицию. Защита может ограничиваться уменьшением тяжести или замедлением возникновения симптомов инфекции. В целом "защитная иммунная реакция" должна включать вызывание повышение уровня антитела, специфичного к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая определенный уровень измеримых реакций функционального антитела на каждый антиген. В конкретных ситуациях "защитная иммунная реакция" может включать вызывание двукратного повышения уровня антитела или четырехкратного повышения уровня антитела, специфичного к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая определенный уровень измеримых реакций функционального антитела на каждый антиген. В некоторых вариантах осуществления опсонизирующие антитела коррелируют с защитной иммунной реакцией. Таким образом, защитная иммунная реакция может анализироваться путем измерения процента снижения численности бактерий в анализе бактерицидной активности сыворотки (SBA) или в опсоно-фагоцитарной пробе, например, как описано ниже. Такие анализы также известны специалистам в данной области. Для менингококковых вакцин, например, анализ SBA является общепринятым суррогатным средством защиты. В некоторых вариантах осуществления наблюдается снижение численности бактерий по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более по сравнению с численностью бактерий при отсутствии иммуногенной композиции.
Термины "белок", "полипептид" и "пептид" относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, это определение охватывает пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. Определение охватывает как белки полной длины, так и их фрагменты. Термины также включают модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (которые в целом носят консервативный характер, но могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, предпочтительно такие, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции у животного, которому вводят белок. Также включаются постэкспрессионные модификации, например, гликозилирование, ацетилирование, липидирование, фосфорилирование и т.п.
Авторами также описываются активные варианты и фрагменты раскрываемых полинуклеотидов и полипептидов. "Варианты" означают по сути подобные последовательности. В контексте данного описания "вариантный полипептид" означает полипептид, полученный из природного белка путем модификации одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце природного белка. Модификация может включать делецию (так называемое срезание) одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце природного белка; делеция и/или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких внутренних сайтах природного белка; или замещение одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах природного белка. Вариантные полипептиды сохраняют нужную биологическую активность природного полипептида, то есть, являются иммуногенными. Описываемый авторами вариант полипептидной или полинуклеотидной последовательности (т.е. SEQ ID NO: 1-25 или 39), как правило, имеет по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с контрольной последовательностью.
Термин "фрагмент" относится к части аминокислотной или нуклеотидной последовательности, включающей указанное количество смежных аминокислотных или нуклеотидных остатков. В конкретных вариантах осуществления описываемый авторами фрагмент полипептида может сохранять биологическую активность полипептида полной длины и, таким образом, быть иммуногенным. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность белка, и, таким образом, могут быть иммуногенными. В альтернативном варианте фрагменты полинуклеотида, используемые в качестве праймеров ПЦР, как правило, не сохраняют биологическую активность. Таким образом, описываемые авторами фрагменты нуклеотидной последовательности могут включать по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 смежных нуклеотидов или составлять полинуклеотид до полной длины. Описываемые авторами фрагменты полипептидной последовательности могут включать по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 425, 450, 475 или 500 смежных аминокислот или до полного количества аминокислот, присутствующих в полипептиде полной длины.
Термин "рекомбинантный" в контексте данного описания означает любой белок, полипептид или клетку, экспрессирующие нужный ген, получаемые с применением способов генной инженерии. Термин "рекомбинантный", применяемый по отношению к белку или полипептиду, означает полипептид, полученный путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Белки согласно настоящему изобретению могут быть выделены из природного источника или получены способами генной инженерии. "Рекомбинантная" в контексте данного описания также означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая, по причине ее происхождения или манипуляции, не ассоциирована с полным полинуклеотидом, с которым она ассоциируется в природе, или его частью. Термин "рекомбинантный", применяемый по отношению к клетке-хозяину, означает клетку-хозяин, которая включает рекомбинантный полинуклеотид.
Термин "субъект" означает млекопитающее, птицу, рыбу, пресмыкающееся или любое другое животное. Термин "субъект" также включает человека. Термин "субъект" также включает домашних животных. Неограничивающими примерами домашних животных могут быть: собаки, кошки, свиньи, кролики, крысы, мыши, песчанки, хомяки, морские свинки, хорьки, птицы, змеи, ящерицы, рыбы, черепахи и лягушки. Термин "субъект" также включает домашний скот. Неограничивающими примерами домашнего скота могут быть: альпака, бизон, верблюд, крупный рогатый скот, олени, свиньи, лошади, ламы, мулы, ослы, овцы, козы, кролики, северные олени, яки, куры, гуси и индюки.
Термин "млекопитающие" в контексте данного описания означает любое млекопитающее, например, человека, мышь, кролика, нечеловекообразных приматов. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим является человек.
Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые являются взаимозаменяемыми, относятся к фармацевтическим композициям, включающим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, вызывающую иммунную реакцию у субъекта.
Общее описание
Настоящее изобретение также выявляет ранее не выявленные трудности с экспрессией нелипидированных вариантов Р2086 и обеспечивает способы преодоления этих трудностей и их новые композиции. Хотя плазмидные последовательности, кодирующие нелипидированные варианты Р2086, обеспечивали сильную экспрессию нелипидированных вариантов, эти варианты были пирувилированными на N-концевом Cys. Пирувилирование исключает или уменьшает вероятность однородности процесса производства или однородность полипептидов. Авторами изобретения также было обнаружено, что делеция N-концевого Cys из нелипидированных вариантных последовательностей Р2086 позволяет избегать пирувилирования нелипидированных вариантов Р2086. Попытки преодоления пирувилирования путем делеции кодона для N-концевого Cys либо устраняли экспрессию, либо приводили к экспрессии нерастворимых вариантов. В альтернативном варианте удаление N-концевого Cys из нелипидированных вариантов Р2086 снижало экспрессию в некоторых вариантах. Однако неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что по меньшей мере непирувилированные нелипидированные варианты А05, А12, А22, А62, В01, В09, В22 и В44 могут быть экспрессированы, несмотря на делецию N-концевого цистеинового остатка. Как правило, эти полипептиды могут быть экспрессированы без дополнительных модификаций, помимо делеции Cys, в отличие от соответствующей нелипидированной последовательности дикого типа. См., например, Примеры 2 и 4. Кроме того, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что непирувилированные нелипидированные варианты являются иммуногенными и вырабатывают бактерицидные антитела.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает два способа преодоления или уменьшения вероятности возникновения этих трудностей, связанных с экспрессией нелипидированных вариантов. Однако настоящее изобретение предусматривает и дополнительные способы. Первый способ состоит в изменении длины ствола Gly/Ser в N-концевом хвосте, непосредственно после N-концевого Cys. Второй способ состоит в оптимизации кодонов в N-концевом хвосте. Однако настоящее изобретение предусматривает и оптимизацию дополнительных кодонов. Эти способы обеспечивают усиленную экспрессию растворимых нелипидированных вариантов Р2086. Например, в одном варианте осуществления усиленную экспрессию растворимых нелипидированных вариантов Р2086 сравнивают с экспрессией соответствующих нелипидированных вариантов дикого типа.
Выделенные полипептиды
Авторами изобретения неожиданно были открыты выделенные непирувилированные, нелипидированные полипептиды ORF2086. Авторы изобретения также неожиданно было открыто, что полипептиды являются иммуногенными и способными вызывать бактерицидную иммунную реакцию.
В контексте данного описания термин "непирувилированный" относится к полипептиду, не содержащему пирувата. Нелипидированные полипептиды ORF2086, содержащие пируват, обычно демонстрируют сдвиг массы +70 по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа. В одном варианте осуществления полипептид согласно изобретению не демонстрирует сдвига массы +70 по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом дикого типа при измерении путем масс-спектрометрии. См., например, Пример 10.
В другом варианте осуществления выделенный непирувилированный, нелипидированный полипептид ORF2086 включает делецию N-концевого цистеинового остатка по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом ORF2086 дикого типа. Термин "N-концевой цистеин" означает цистеин (Cys) на N-конце или в N-концевом хвосте полипептида. Более конкретно "N-концевой цистеин" в контексте данного описания означает N-концевой цистеин, в котором липопротеины LP2086 являются липидированными трипальмитоиловым липидным хвостом, как известно специалистам в данной области. Например, если взять любую из последовательностей SEQ ID NO: 12-21 в качестве контрольной последовательности, N-концевой цистеин располагается в позиции 1. В другом примере, если взять в качестве контрольной последовательности SEQ ID NO: 70, N-концевой цистеин располагается в позиции 1.
Термин "нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа" или "нелипидированный полипептид 2086 дикого типа" или "нелипидированный полипептид дикого типа" в контексте данного описания означает полипептид ORF2086, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности соответствующей зрелому липидированному полипептиду ORF2086, встречающемуся в природе. Единственное различие между нелипидированными и липидированными молекулами состоит в том, что нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа не липидирован трипальмитоиловым липидным хвостом в N-концевом цистеине.
Как известно специалистам в данной области, нелипидированная форма 2086 образуется белком, в котором отсутствует первоначальная лидерная последовательность, или лидерной последовательностью, замененной частью последовательности, которая не указывает сайт для ацилирования жирной кислотой в клетке-хозяине. См., например, заявку WO 2003/063766, включенную в данное описание путем ссылки в полном объеме.
Примерами нелипидированного ORF2086 могут быть не только вышеописанный нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа, но и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, в которой N-концевой Cys делетирован, и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, в которой N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другой пример нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys делетирован, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 44 (В44), SEQ ID NO: 49 (B09), SEQ ID NO: 55 (A05), SEQ ID NO: 57 (B01), SEQ ID NO: 58 (B01), SEQ ID NO: 62 (B22), SEQ ID NO: 64 (A22) и SEQ ID NO: 75 (B22). Другие примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 66 (А12), SEQ ID NO: 68 (A22) и SEQ ID NO: 71 (A62). Другие примеры включают SEQ ID NO: 80 (B24) и SEQ ID NO: 81 (B24). Дополнительные примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 77. В одном варианте осуществления нелипидированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, кодирующей соответствующий нелипидированный полипептид. Например, в типичном варианте осуществления нелипидированный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 71.
Примеры нелипидированного полипептида ORF2086 дикого типа включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, показанную на Фигуре 2, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60. Еще один пример нелипидированного полипептида ORF2086 дикого типа включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70. Эти типичные нелипидированные полипептиды ORF2086 дикого типа включают N-концевой Cys.
В контексте данного описания, например, "нелипидированный" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 44. "Нелипидированный дикого типа" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21. "Непирувилированный нелипидированный" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 44.
В качестве еще одного примера в контексте данного описания "нелипидированный" полипептид В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50. "Нелипидированный дикого типа" полипептид В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. "Непирувилированный нелипидированный" В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50.
В качестве еще одного примера в контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. Другой пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Дополнительный пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. Другой пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77. "Нелипидированный дикого типа" А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. "Непирувилированный нелипидированный" А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. Другие примеры "непирувилированного нелипидированного" А05 включают полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 делетирован; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; и SEQ ID NO: 77.
В контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 71. Другой пример нелипидированного полипептида А62 включает полипептид, имеющий SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70. "Непирувилированный нелипидированный" А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 71. Другой пример непирувилированного нелипидированного полипептида А62 включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Предпочтительно "непирувилированный нелипидированный" А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71.
В контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 66. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. "Непирувилированный нелипидированный" А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 66.
В контексте данного описания "нелипидированный" А22 полипептид включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 68. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. "Непирувилированный нелипидированный" А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 68. Предпочтительно "непирувилированный нелипидированный" А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68.
Термин "делеция" N-концевого Cys в контексте данного описания включает мутацию с делецией N-концевого Cys в отличие от последовательности нелипидированного полипептида дикого типа. Например, "делеция" N-концевого Cys означает удаление аминокислоты Cys из контрольной последовательности, например, из соответствующей последовательности дикого типа, что в результате ведет в уменьшению аминокислотного остатка по сравнению с контрольной последовательностью. Если нет иного описания термины "N-концевой Cys", "N-концевой Cys в позиции 1" и "Cys в позиции 1" являются взаимозаменяемыми.
В другом варианте осуществления N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Например, в типичном варианте осуществления N-концевой Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 12-21 включает замещение C-+G в позиции 1. См., например, SEQ ID NO: 62 по сравнению с SEQ ID NO: 19 (В22 дикого типа) и SEQ ID NO: 64 по сравнению с SEQ ID NO: 15 (А22 дикого типа). К типичным аминокислотам для замены N-концевого Cys относится любая отличная от Cys аминокислота, предпочтительно полярная незаряженная аминокислота, например, глицин. В предпочтительном варианте осуществления осуществляют замещение неконсервативным остатком к Cys.
Авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что экспрессия нелипидированных полипептидов ORF2086 с делецией N-концевого остатка Cys не приводит к обнаруживаемому пирувилированию при измерении при помощи масс-спектрометрии по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом ORF2086 дикого типа. Примерами непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 могут быть имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12 (А04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) и SEQ ID NO: 70 (A62), в которой цистеин в позиции 1 делетирован. Другой пример непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 (В01), в которой цистеин в позиции 1 делетирован. Дополнительные примеры выделенных непирувилированных, нелипидированных полипептидов ORF2086 включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. Еще один пример непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (В01). Еще один пример выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 77 (А05); полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76 (А05), в которой Cys в позиции 1 делетирован; и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76 (А05), в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие примеры непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 включают имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12 (А04), SEQ ID NO: 13 (А05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 58 (B01), SEQ ID NO: 16 (B02). SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) и SEQ ID NO: 70 (A62) в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный 2086 полипептид включает, по меньшей мере, приблизительно 250, 255 или 260 последовательных аминокислот и не более приблизительно 270, 269, 268, 267, 266, 265, 264, 263, 260, 259, 258, 257, 256 или 255 последовательных аминокислот. Любое минимальное значение может комбинироваться с любым максимальным значением в пределах диапазона. В более предпочтительном варианте полипептид включает, по меньшей мере, 254 или 262 последовательных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает не более 262 последовательных аминокислот. В других вариантах осуществления полипептид включает не более 254 последовательных аминокислот. В одном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, кодирующей соответствующий непирувилированный нелипидированный полипептид. Например, в типичном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный, нелипидированный полипептид ORF2086 кодируется нуклеотидной последовательностью, функционально связанной с экспрессирующей системой, причем экспрессирующая система способна экспрессироваться в бактериальной клетке. В типичном варианте осуществления нуклеотидная последовательность связана с регулирующей последовательностью, контролирующей экспрессию нуклеотидной последовательности.
Подходящие экспрессирующие системы, регулирующие последовательности и бактериальные клетки известны специалистам в данной области. Например, может применяться любой плазмидный вектор экспрессии, например, PET™ (Novogen, Madison Wis.) или PMAL™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.) при условии, что полипептид может экспрессироваться в бактериальной клетке. Предпочтительно применяют вектор PET™ для клонирования и экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli. В системе PET™ клонированный ген может быть экспрессирован под контролем фагового промотора 17. Типичными бактериальными клетками являются Pseudomonas fluorescens и, предпочтительно, Е. coli.
В одном аспекте изобретение касается непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086, получаемого описанным способом. Полипептид предпочтительно является выделенным. Изобретение также касается композиций, включающих непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, получаемый описанным способом. Композиция предпочтительно является иммуногенной композицией. Способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В еще одном варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессирующей системой, которая может быть экспрессирована в бактериальной клетке.
В одном варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 75. В другом варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. В другом варианте осуществления нуклеотидная последовательность выбрана из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 72. Предпочтительно бактериальной клеткой является Е. coli.
В09, В44, А05: В одном аспекте изобретение касается композиции, включающей первый выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49 (В09), и второй выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44 (В44). В предпочтительном варианте осуществления полипептиды являются иммуногенными. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает полипептид ORF2086 подсемейства А из серогруппы В N. meningitidis. Предпочтительно полипептид ORF2086 подсемейства А является непирувилированным нелипидированным полипептидом ORF2086 подсемейства А. В типичном варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой А05, примером которого может быть, например, SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. В другом типичном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид А05, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 делетирован; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; и SEQ ID NO: 77.
Полипептидные домены
В другом аспекте изобретение касается способа получения выделенного полипептида. Способ включает экспрессию в бактериальной клетке полипептида, который включает последовательность, имеющую более 90% идентичности с SEQ ID NO: 21, причем вышеупомянутая последовательность включает, по меньшей мере, один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21, или их комбинация, причем в полипептиде отсутствует N-концевой цистеин. Способ также включает очистку полипептида. Полученный таким способом полипептид включает непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. Предпочтительно, полипептид является иммуногенным. В предпочтительном варианте осуществления бактериальной клеткой является Е. coli.
Примеры полипептидов, которые включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, включают SEQ ID NO: 12 (A04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) и SEQ ID NO: 21 (B44). Предпочтительно цистеин в позиции 1 этих полипептидов делетирован. В другом варианте осуществления цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие типичные полипептиды включают SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 71. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 76. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 77. Дополнительные примеры включают SEQ ID NO: 80 (В24) и SEQ ID NO: 81 (B24).
В одном типичном варианте осуществления выделенная полипептидная последовательность также включает, по меньшей мере, один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 96-116 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 158-170 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 172-185 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 187-199 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 213-224 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 226-237 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 239-248 SEQ ID NO: 21 или их комбинация. Примеры полипептидов, которые включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, а также включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 96-116 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 158-170 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 172-185 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 187-199 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 213-224 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 226-237 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 239-248 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, включают SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) и SEQ ID NO: 21 (B44). Предпочтительно цистеин в позиции 1 этих полипептидов делетирован. Другие типичные полипептиды включают полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 62.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, полученного описанным авторами способом. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным нелипидированным полипептид. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, полученной описанным авторами способом.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды
В09: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 49, включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 46. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 46. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 47. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 48.
В одном аспекте изобретение касается плазмиды, включающей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 45, причем плазмида может экспрессироваться в бактериальной клетке. Подходящие экспрессирующие системы, регулирующие последовательности и бактериальные клетки известны специалистам в данной области, как описывается выше. Предпочтительно бактериальной клеткой является Е. coli.
В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50. В типичном варианте осуществления SEQ ID NO: 50 кодируется последовательностью SEQ ID NO: 45.
В44: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 44. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 44 включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 51. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 43. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 43.
А05: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 (А05), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 55 включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 73. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 65. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 54. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 65. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 73.
А12: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 (А12), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 66. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 66, включают SEQ ID NO: 67. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 67.
А22: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 (А22), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 68. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 68, включают SEQ ID NO: 69. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 69.
А62: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, причем первые 20 аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Предпочтительно полипептид включает аминокислотную последовательность, показанную в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71. Полипептид предпочтительно является нелипидированным и непирувилированным. В другом варианте осуществления полипептид является иммуногенным.
В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает фрагмент А62. Типичные фрагменты А62 включает любое количество смежных остатков из SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158-185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159-186 SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185-254 SEQ ID NO: 71.
В другом аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, при чем первые 20 аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Предпочтительно полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.
В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70 (А62), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 71. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 71, включают SEQ ID NO: 72. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 72.
Иммуногенные композиции
В предпочтительном варианте осуществления описанные авторами композиции, включающие выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, являются иммуногенными. Иммуногенные композиции, включающие белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria meningitidis, известны специалистам в данной области. Типичные иммуногенные композиции включают описываемые в документе WO 2003/063766 и Публикациях патентных заявок США US 20060257413 и US 20090202593, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Такие описанные авторами иммуногенные композиции включают белок, демонстрирующий бактерицидную активность и обозначенный как белок ORF2086, его иммуногенные части и/или его биологические эквиваленты. Белок ORF2086 означает белок, кодируемый открытой рамкой считывания 2086 вида Neisseria.
Белок может быть рекомбинантным белком или выделенным белком из природного вида Neisseria. Например, белки ORF2086 Neisseria могут быть выделены из бактериальных штаммов, например, относящихся к виду Neisseria, включая штаммы Neisseria meningitidis (серогрупп А, В, С, D, W-135, X, Y, Z и 29Е), Neisseria gonorrhoeae и Neisseria lactamica, а также могут быть иммуногенными частями и/или биологическими эквивалентами вышеупомянутых белков.
Белки ORF2086 включают белки 2086 подсемейства А и белки подсемейства В, их иммуногенные части и/или биологические эквиваленты. Белки 2086 подсемейства А и белки 2086 подсемейства В известны специалистам в данной области; см., например, вышеупомянутую публикацию Fletcher et al., 2004, и Murphy et al., J Infect Dis. 2009 Aug 1; 200(3): 379 - 89. См. также заявку WO 2003/063766, в которой раскрываются SEQ ID NO с 260 по 278 как представляющие аминокислотные последовательности, ассоциированные с белками 2086 подсемейства А. Кроме того, в документе WO2003/063766 описываются SEQ ID NO с 279 по 299 как представляющие аминокислотные последовательности, ассоциированные с белками 2086 подсемейства В. Документ WO 2003/063766 включается в данное описание путем ссылки в полном объеме. Белки ORF2086 или их эквиваленты и т.п. могут быть липидированными или нелипидированными. Предпочтительно белок ORF2086 не является липидированным. В альтернативном варианте иммуногенные композиции могут быть комбинациями липидированных и нелипидированных белков ORF2086.
В (одном) варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства А, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства А, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А04, А12, А62 или А22. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А12 или А22.
Комбинация полипептидов подсемейства А: В одном варианте осуществления композиция включает любую комбинацию полипептидов ORF2086 подсемейства А. Типичные комбинации полипептидов ORF2086 подсемейства А включают, например, А05 и А12; А05 и А22; А05 и А62; А12 и А62; А12 и А22; А22 и А62; А05, А12 и А22; А05, А12 и А62; А12, А22 и А62; и А05, А22 и А62. Предпочтительно полипептид ORF2086 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным.
В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В02, В03, В22, В24 или В09. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В22 или В09.
Комбинация полипептидов подсемейства В: В одном варианте осуществления композиция включает любую комбинацию полипептидов ORF2086 подсемейства В. Типичные комбинации полипептидов ORF2086 подсемейства В включают, например, В09 и В22; В22 и В44; В44 и В09; В01 и В09; В01 и В22; В01 и В44; и В09, В22 и В44; В09 и В24; В22 и В24; В24 и В44; В01 и В24; В02 и В24; В02 и В01; В02 и В09; В02 и В44; В01, В09 и В24; В01, В24 и В44.
В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Например, в некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой последовательности, выбранные из В44, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21; В02, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16; В03, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17; В22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19; В24, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; В01, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 58; или вариант В09, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию.
В более предпочтительном варианте иммуногенная композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид В09, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 или их комбинации. В одном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный вариант В09, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, непирувилированный нелипидированный В44, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает непирувилированный нелипидированный В09, имеющий последовательность SEQ ID NO: 49, непирувилированный нелипидированный В44, имеющий последовательность SEQ ID NO: 44, или их комбинацию.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, которая включает полипептид ORF2086 подсемейства В из серогруппы В N. meningitidis, причем полипептид является непирувилированным нелипидированным В44. В44 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 44. В одном варианте осуществления композиция также включает второй полипептид ORF2086 подсемейства В из серогруппы В N. meningitidis, причем второй полипептид является непирувилированным нелипидированным В09. В09 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 49. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция является вакциной.
В другом варианте осуществления композиция включает не более 3-х полипептидов ORF2086 подсемейства В. В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 2-х полипептидов ORF2086 подсемейства В.
В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 1, 2 или 3-х видов варианта ORF2086 подсемейства В. В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 1, 2 или 3-х видов варианта ORF2086 подсемейства А.
Композиции, включающие полипептид подсемейства В и полипептид подсемейства А: В одном варианте осуществления композиция также включает один или несколько полипептидов ORF2086 подсемейства А. В предпочтительном варианте осуществления композиция включает полипептид А05 подсемейства А. В более предпочтительном варианте полипептид А05 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция включает полипептид А62 подсемейства А. В более предпочтительном варианте полипептид А62 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным.
В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства А, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства А, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и выделенный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В более предпочтительном варианте иммуногенная композиция включает выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 подсемейства А и выделенный непирувилированный нелипидированный Полипептид ORF2086 подсемейства В.
Комбинации: предполагается любая комбинация полипептидов ORF2086. В одном варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один Полипептид подсемейства А при отсутствии полипептидов подсемейства В. Например, композиция включает только полипептиды подсемейства А. В другом варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один полипептид подсемейства В при отсутствии полипептидов подсемейства А. Например, композиция включает только полипептиды подсемейства А.
Иммуногенная композиция может включать любой полипептид подсемейства А или его комбинацию. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А04, А12 или А22. В другом варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А включает А62. В предпочтительном варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой А05, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13; А04, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12; А12, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14; или вариант А22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys делетирован, или любую их комбинацию. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А62. Например, иммуногенная композиция может включать полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 55 и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных Полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А12. Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А12 и А62.
Иммуногенная композиция может включать любой из полипептидов подсемейства В или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В02, В03, В22, В24 или В09. В предпочтительном варианте осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой В44, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21; В02, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16; В03, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17; В22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19; В24, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; или вариант В09, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09 и В44. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09 и В22. Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В22 и В44. Дополнительная типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09, В22 и В44.
В одном варианте осуществления композиция включает нелипидированный полипептид ORF2086 при отсутствии липидированного полипептида ORF2086. В другом варианте осуществления композиция включает нелипидированный полипептид ORF2086 и по меньшей мере один липидированный полипептид ORF2086.
В одном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 при отсутствии липидированного полипептида ORF2086. В другом варианте осуществления композиция включает липидированный полипептид ORF2086 и непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. Например, композиция может включать липидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76, и непирувилированный нелипидированный А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 77. Другая типичная композиция включает липидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76, и непирувилированный нелипидированный А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71. Дополнительная типичная композиция включает липидированный полипептид В01, имеющий последовательность SEQ ID NO: 58, и непирувилированный нелипидированный А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71.
Типичные комбинации: одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных нелипидированных полипептидов ORF2086 А05, В09, В22 и В44. Например, иммуногенная композиция может включать непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 подсемейства А А05 (SEQ ID NO: 55) и выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды ORF2086 подсемейства В В09 (SEQ ID NO: 49), В22 (SEQ ID NO: 75) и B44 (SEQ ID NO: 44).
Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А12 и выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В22 и В44. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А12, В09 и В44. Еще один пример включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А12, А62, В09 и В44. Еще один пример включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А12, А62, В09 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62 и В09. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62, В09 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А62 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А62, В09 и В44.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает белок подсемейства А и белок подсемейства В в соотношении 1:1. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любое из следующих соотношений полипептида подсемейства А с полипептидом подсемейства В: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; или 1:10. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любое из следующих соотношений полипептида подсемейства В с полипептидом подсемейства А: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; или 1:10.
Бактерицидные иммунные реакции
В одном аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против инфекции любой серогруппы N. meningitidis, такой, как серогруппа, выбранная из числа серогрупп А, В, С, Е29, Н, I, K, L, W-135, X, Y и Z. В предпочтительном варианте осуществления описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против инфекции из серогрупп А, В, С, W-135, Y и/или X.
В другом аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis. Композиции способны индуцировать бактерицидные антименингококковые антитела после введения млекопитающему и в предпочтительных вариантах осуществления могут индуцировать антитела, являющиеся бактерицидными против штаммов с соответствующими подсемействами. Дополнительная информация о бактерицидных реакциях представлена ниже. См., например, Примеры 6, 11, 12 и 13.
В одном варианте осуществления композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию против гетерологичного подсемейства серогруппы В N. meningitidis. Например, композиция, включающая нелипидированный полипептид подсемейства А, может вызывать бактерицидную иммунную реакцию против варианта N. meningitidis подсемейства А серогруппы В и/или против варианта N. meningitidis подсемейства В серогруппы В. См., например, Примеры 18-19.
В другом аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию против по меньшей мере одного из штаммов N. meningitidis серогруппы А, серогруппы В, серогруппы С, серогруппы W135 и/или серогруппы Y. В предпочтительном варианте осуществления композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию по меньшей мере против серогруппы В, серогруппы С и серогруппы Y N. meningitidis. См., например, Пример 21.
Бактерицидные антитела являются показателем защиты для человека, и доклинические исследования служат в качестве суррогата, и любая описанная авторами новая потенциально иммуногенная композиция должна вызывать выработку этих функциональных антител.
В09: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В09 и их иммуногенные композиции, вызывает выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В09, имеющий последовательность SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А или, предпочтительно, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В09 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13); варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта B16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. В типичном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид В09 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 11, Пример 12 и Пример 13.
В44: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В другом типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В44, имеющий последовательность SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 11. Кроме того, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции также могут вызывать выработку бактерицидных антител, которые связываются с вариантом В02 (SEQ ID NO: 16). См., например, Пример 12 и Пример 13. Кроме того, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции также могут вызывать выработку бактерицидных антител, которые связываются с вариантом В03 (SEQ ID NO: 17) и вариантом В15 (SEQ ID NO: 59). См., например, Пример 6.
В22: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В22 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В еще одном типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В22, имеющий последовательность SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В22 вызывает выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 13.
А05: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид А05 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 55, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А05 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A12 (SEQ ID NO: 14) или их комбинации. См., например, Пример 6 и 13.
А62: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 71, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Например, непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А12 (SEQ ID NO: 14), варианта A22 (SEQ ID NO: 15) и варианта A62 (SEQ ID NO: 70). В качестве еще одного примера, непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А29, варианта В09 и варианта В24. См., например, Примеры 18-19. В другом варианте осуществления непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В16.
А12: В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А12, имеющий последовательность SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 66 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А12 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A12 (SEQ ID NO: 14), варианта A62 (SEQ ID NO: 70), варианта A29, вариант B09. См., например, Примеры 18-19.
В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный А22 полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 68 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А22 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A62 (SEQ ID NO: 70), варианта A29. См., например, Примеры 18-19.
Способ вызывания выработки бактерицидных антител
В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе А N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе С N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе W135 N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе X N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе Y N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппам А, В, С, W-135, X и/или Y N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе В N. meningitidis. В типичном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis, ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis или их комбинации.
Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Примеры 18-19 и 22.
В предпочтительном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis. Выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают непирувилированный нелипидированный полипептид В44. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает непирувилированный нелипидированный полипептид В09. В типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 44, или их комбинация. В другом типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или их комбинацию. В еще одном типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для вызывания выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis, включает, по меньшей мере, один из непирувилированных нелипидированных полипептидов А05, А12 и А62. См., например, Пример 19.
В предпочтительном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis. Выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают непирувилированный нелипидированный полипептид А05. В предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает непирувилированный нелипидированный полипептид В44. См., например, Пример 6 и 13. В типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 44 или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или их комбинацию. В другом типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 77 (А05), SEQ ID NO: 44 (B44) или их комбинацию. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для вызывания выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis включает, по меньшей мере, один из непирувилированных нелипидированных полипептидов А05, А12 и А62. См., например, Примеры 18-19.
Когда типичную иммуногенную композицию, включающую по меньшей мере два непирувилированных нелипидированных полипептида ORF2086, как описывается выше, вводили млекопитающим, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что может возникать синергетическая бактерицидная иммунная реакция против серогруппы В Neisseria meningitidis по сравнению с иммуногенной композицией, включающей один соответствующий непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. См., например, Пример 19. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, первый непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, действующий синергетически с по меньшей мере вторым пирувилированным нелипидированным полипептидом ORF2086 для вызывания иммунной реакции против серогруппы В Neisseria meningitidis.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе С N. meningitidis. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y. Типичная иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А62 и а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе Y N. meningitidis. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактерицидных антител, специфичных к серогруппе X N. meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
Когда млекопитающему вводили типичную иммуногенную композицию, включающую четыре непирувилированных нелипидированных полипептида ORF2086 и конъюгат капсульного сахарида каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W135 и Y, как описывается выше, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что может быть вызвана синергетическая бактерицидная иммунная реакция по меньшей мере против серогрупп В, С и Y Neisseria meningitidis по сравнению с иммуногенной композицией, включающей полипептиды ORF2086, в которой конъюгаты капсульного сахарида отсутствуют, и по сравнению с иммуногенной композицией, включающей конъюгат капсульного сахарида каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W135 и Y, в которой полипептид ORF2086 отсутствует. См., например, Пример 22. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, один непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, действующий синергетически с по меньшей мере одним конъюгатом капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, С, W135 и Y для вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis. Вызванная иммунная реакция может быть направлена против по меньшей мере одной из серогрупп В, С и Y Neisseria meningitidis. Иммуногенная композиция может включать белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, полинуклеотиды или их эквиваленты в качестве единственного активного иммуногена в иммуногенной композиции. В альтернативном варианте иммуногенная композиция также может включать активные иммуногены, включая другие иммуногенные полипептиды видов Neisseria, или иммунологически активные белки одного или нескольких других микробных патогенов (к которым, помимо прочих относятся, например, вирус, прион, бактерия или грибок) или капсульный полисахарид. Композиции могут включать один или несколько нужных белков, фрагментов или фармацевтических соединений, необходимых для выбранного показания.
Настоящее изобретение предусматривает любую мультиантигенную или поливалентную иммуногенную композицию. Например, иммуногенная композиция может включать комбинации двух или более белков ORF2086, комбинацию белка ORF2086 с одним или несколькими белками Por А, комбинацию белка ORF2086 с полисахаридами и/или конъюгатами полисахаридов meningococcus серогруппы А, С, Y и W135, комбинацию белка ORF2086 с комбинациями meningococcus и pneumococcus или комбинацию любого из вышеупомянутых компонентов в форме, подходящей для нужного введения, например, для мукозального введения. Специалисты в данной области смогут легко составить такие мультиантигенные или поливалентные иммунологические композиции.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере два из конъюгатов. В другом варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, три из конъюгатов. Например, композиции могут включать сахариды из: серогрупп А и С; серогрупп А и W135; серогрупп А и Y; серогрупп С и W135; серогрупп W135 и Y; серогрупп А, С и W135; серогрупп А, С и Y; серогрупп A, W135 и Y; серогрупп С и W135 и Y. Предпочтение отдается композициям, включающим по меньшей мере один сахарид серогруппы С (например, С и Y).
В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и четыре конъюгата, например, конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
197
197
197
197
197
В предпочтительном варианте осуществления конъюгат является конъюгатом капсульного сахарида и белка-носителя. Подходящие белки-носители известны специалистам в данной области. Предпочтительно белок-носитель является бактериальным токсином, таким, как токсин дифтерии или столбняка, или их токсоидами или мутантами. В наиболее предпочтительном варианте белком-носителем является CRM. Например, в одном варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся (а) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы А N. meningitidis и (ii) CRM; (b) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы С N. meningitidis и (ii) CRM; (с) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы W135 N. meningitidis и (ii) CRM; и (d) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы Y N. meningitidis и (ii) CRM.
Капсульные сахариды серогрупп А, С, W135 и Y изучены и известны специалистам в данной области. Например, капсульный сахарид серогруппы A meningococcus является гомополимером (α 1→6)-связанного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата, с частичным О-ацетилированием в позициях С3 и С4. Ацетилирование в позиции С-3 может составлять 70-95%. Условия, применяемые для очистки сахарида, в результате могут приводить к де-О-ацетилированию (например, в основных условиях), однако применяются для удерживания ОАс в этой позиции С-3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) маннозаминовых остатков в сахаридах серогруппы А являются О-ацетилированными в позиции С-3. Ацетильные группы могут быть заменены блокирующими группами для предотвращения гидролиза, и такие модифицированные сахариды остаются сахаридами серогруппы А в рамках изобретения.
Капсульный сахарид серогруппы С является гомополимером (α 2→9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты). Большинство штаммов серогруппы С имеют О-ацетильные группы в позициях С-7 и/или С-8 сиаловокислотных остатков, но некоторые клинические изоляты не имеют этих О-ацетильных групп.
Сахарид серогруппы W135 является полимером дисахаридных единиц сиаловой кислоты - галактозы. Подобно сахариду серогруппы С, он обладает изменчивым О-ацетилированием, но в позициях 7 и 9 сиаловой кислоты. Структура записывается следующим образом: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.
Сахарид серогруппы Y подобен сахариду серогруппы W135, за исключением того, что повторяющаяся дисахаридная единица включает глюкозу вместо галактозы. Структура серогруппы Y записывается следующим образом: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→. Подобно серогруппе W135, он обладает изменчивым О-ацетилированием в позициях 7 и 9 сиаловой кислоты.
Сахариды, применяемые согласно изобретению, могут быть О-ацетилированы, как описывается выше, например, с такой же схемой О-ацетилирования, как та, что наблюдается в природных капсульных сахаридах, или же они могут быть частично или полностью де-О-ацетилированы в одной или нескольких позициях сахаридных колец, или они могут быть гипер-О-ацетилированы относительно природных капсульных сахаридов.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y, причем нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 включает, по меньшей мере, один из следующих компонентов: В44, В09, А05, В22, А12, А22, А62, В24, В16, В15, и В03. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 20, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 20, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком.
Настоящее изобретение также предусматривает режимы мультииммунизации, при которых любая композиция, применяемая против патогена, может комбинироваться с композициями согласно настоящему изобретению. Например, пациенту, помимо прочих, может вводиться иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению и другая иммунологическая композиция для иммунизации против папилломавируса человека (HPV), например, вакцина HPV GARDASIL, в рамках режима мультииммунизации. Специалисты в данной области легко смогут выбрать иммуногенные композиции для применения в связи с иммуногенными композициями согласно настоящему изобретению с целью разработки и реализации режимов мультииммунизации.
Полипептиды ORF2086, фрагменты и эквиваленты могут применяться в качестве компонента композиции иммуногенного конъюгата; в которой один или несколько белков или полипептидов конъюгированы с носителем с целью создания композиции, обладающей иммуногенными свойствами против нескольких серотипов или серотипов N. meningitidis, в частности, серогрупп менингококков, в частности, серогруппы В, и/или против нескольких болезней. В альтернативном варианте один из полипептидов ORF2086 может использоваться как белок-носитель для других иммуногенных полипептидов. Рецептирование таких иммуногенных композиций хорошо известно специалистам в данной области.
Иммуногенные композиции согласно изобретению предпочтительно включают фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавители и/или носитель. К подходящим фармацевтически приемлемым наполнителям, носителям и/или разбавителям относятся любые и все традиционные растворители, диспергаторы, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п. Подходящими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями и/или носителями являются, например, один или несколько компонентов, к которым относятся вода, солевой раствор, фосфатно-буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации.
Фармацевтически приемлемые наполнители, разбавители и/или носители также могут включать в малых количествах вспомогательные вещества, такие, как увлажняющие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, продлевающие срок хранения иди повышающие эффективность антитела. Приготовление и применение фармацевтически приемлемых наполнителей, разбавителей и/или носителей хорошо известно среди специалистов в данной области. Если какие-либо традиционные среды или носители не являются несовместимыми с активным ингредиентом, предусматривается их применение в иммуногенных композициях согласно настоящему изобретению.
Biotechniaues
PNAS
Иммуногенные композиции могут вводиться парентерально, например, путем инъекции, подкожно или внутримышечно, а также перорально или интраназально. Способы внутримышечной иммунизации описываются в публикациях Wolff et al. : 11(4): 474 - 85, (1991) и Sedegah et al.  Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994). Другие режимы введения, помимо прочих, предполагают, например, пероральные композиции, пульмональные композиции, суппозитории и трансдермальные аппликаторы. Пероральные композиции, помимо прочих, включают, например, такие традиционно применяемые наполнители, как отвечающие фармацевтическим требованиям маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Предпочтительно иммуногенную композицию вводят внутримышечно.
Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению также могут включать один или несколько дополнительных "иммуномодуляторов", которые являются агентами, нарушающими или изменяющими иммунную систему таким образом, что наблюдается либо повышающая регуляция, либо понижающая регуляция гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунитета. В одном конкретном варианте осуществления предпочтение отдается повышающей регуляции гуморальной и/или клеточно-опосредованной групп иммунной системы. Примерами некоторых иммуномодуляторов, помимо прочих, могут быть, например, адъювант или цитокин или ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанный в Патенте США №5,254,339.
Неограничивающими примерами адъювантов, которые могут применяться в вакцине согласно настоящему изобретению, могут быть адъювантная система RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие, как гидроксид алюминия, эмульсии типа масло в воде, эмульсии типа вода в масле, например, полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN, сапонин, Quil А или другая сапониновая фракция, монофосфорил-липид А и адъювант Авридин липид-амин. Неограничивающими примерами эмульсий типа масло в воде, применяемых в вакцине согласно изобретению, являются модифицированные композиции SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированный SEAM62 является эмульсией типа масло в воде, содержащей 5% (объем/объем) сквалена (Sigma), 1% (объем/объем) детергента SPAN 85 (ICI Surfactants), 0,7% (объем/объем) детергента polysorbate 80 (ICI Surfactants), 2,5% (объем/объем) этанола, 200 мкг/мл Quil А, 100 мкг/мл холестерина и 0,5% (объем/объем) лецитина. Модифицированный SEAM 1/2 является эмульсией типа масло в воде, содержащей 5% (объем/объем) сквалена, 1% (объем/объем) детергента SPAN 85, 0,7% (объем/объем) детергента polysorbate-80, 2,5% (объем/объем) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина.
К другим "иммуномодуляторам", которые могут быть включены в вакцину, относятся, например, один или несколько интерлейкинов, интерферонов или другие известные цитокины или хемокины. В одном варианте осуществления адъювант может быть производной циклодекстрина или полианионным полимером, таким, как описанные в патентах США 6,165,995 и 6,610,310, соответственно. Следует понимать, что применяемый иммуномодулятор и/или адъювант зависит от субъекта, которому вводят вакцину или иммуногенную композицию, пути инъекции и предусмотренного количества инъекций.
В некоторых вариантах осуществления адъювантом является сапонин. В некоторых вариантах осуществления концентрация сапонина составляет от 1 мкг/мл до 250 мкг/мл; от 5 мкг/мл до 150 мкг/мл; или от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация сапонина составляет приблизительно 1 мкг/мл; приблизительно 5 мкг/мл; приблизительно 10 мкг/мл; приблизительно 20 мкг/мл; приблизительно 30 мкг/мл; приблизительно 40 мкг/мл; приблизительно 50 мкг/мл; приблизительно 60 мкг/мл; приблизительно 70 мкг/мл; приблизительно 80 мкг/мл; приблизительно 90 мкг/мл; приблизительно 100 мкг/мл; приблизительно 110 мкг/мл; приблизительно 120 мкг/мл; приблизительно 130 мкг/мл; приблизительно 140 мкг/мл; приблизительно 150 мкг/мл; приблизительно 160 мкг/мл; приблизительно 170 мкг/мл; приблизительно 180 мкг/мл; приблизительно 190 мкг/мл; приблизительно 200 мкг/мл; приблизительно 210 мкг/мл; приблизительно 220 мкг/мл; приблизительно 230 мкг/мл; приблизительно 240 мкг/мл; или приблизительно 250 мкг/мл.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления белки согласно изобретению применяют в иммуногенной композиции для перорального введения, которая включает мукозный адъювант и применяется для лечения или профилактики инфекции N. meningitidis у человека. Мукозным адъювантом может быть токсин холеры; однако предпочтительно мукозные адъюванты, отличные от токсина холеры, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, включают нетоксичные производные голотоксина холеры, в которых субъединица А представляет собой мутагенизированный, химически модифицированный токсин холеры или подобные белки, получаемые путем модификации аминокислотной последовательности токсина холеры. Примером конкретного токсина холеры, который может быть особенно подходящим для приготовления иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению, может быть мутантный голотоксин холеры Е29Н, описываемый в опубликованной международной заявке WO 00/18434, включенной в данное описание путем ссылки в полном объеме. Они могут быть добавлены к полипептидам согласно настоящему изобретению или конъюгированы с ними. Такие же технологии могут применяться к другим молекулам с мукозными адъювантными свойствами или особенностями доставки, таким, как термолабильный токсин (LT) Escherichia coli.
Могут применяться и другие соединения с мукозной адъювантной активностью или доставкой, такие, как желчь; поликатионы, такие, как DEAE-декстран и полиорнитин; детергенты, такие, как додецилбензолсульфат натрия; липид-конъюгированные материалы; антибиотики, такие, как стрептомицин; витамин А; и другие соединения, которые изменяют структурную или функциональную целостность поверхности слизистой оболочки. К другим активным в слизистой оболочке соединениям относятся производные микробных структур, такие, как MDP; акридин и циметидин. Также могут применяться STIMULON™ QS-21, MPL и IL-12, как описывается выше.
Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут доставляться в форме ISCOMS (иммуностимулирующих комплексов), ISCOMS, содержащих СТВ, липосомы или инкапсулированных в такие соединения, как акрилаты или поли(DLлактид-ко-гликозид) для образования микросфер подходящего для адсорбции размера. Белки согласно изобретению также могут быть включены в масляные эмульсии.
Количество (т.е. доза) иммуногенной композиции, вводимой пациенту, может определяться в соответствии со стандартными технологиями, известными специалистам в данной области, с учетом таких факторов, как конкретный антиген, адъювант (при наличии), возраст, пол, вес, вид, состояние конкретного пациента и путь введения.
Например, доза для пациентов-подростков может включать по меньшей мере 0,1 мкг, 1 мкг, 10 мкг или 50 мкг белка ORF2086 Neisseria и не более 80 мкг, 100 мкг, 150 мкг или 200 мкг белка ORF2086 Neisseria. Возможны комбинации любого минимального значения и любого максимального значения для определения соответствующего диапазона.
Адъюванты
Иммуногенные композиции, описываемые авторами, также включают в некоторых вариантах осуществления один или несколько адъювантов. Адъювант является веществом, усиливающим иммунную реакцию при введении вместе с иммуногеном или антигеном. Многие цитокины или лимфокины обладают иммуномодулирующей активностью и, таким образом, могут использоваться в качестве адъювантов, включая, помимо прочих интерлейкины 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см., например, Патент США №5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы); интерфероны-α, β и γ; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (см., например, Патент США №5,078,996 и номер доступа АТСС 39900); макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF); и факторы некроза опухолей α и β.
К другим адъювантам, применяемым с описанными авторами иммуногенными композициями, относятся хемокины, включая, помимо прочих, МСР-1, MIP-1α, MIP-1β и RANTES; адгезивные молекулы, такие, как селектин, например, L-селектин, Р-селектин и Е-селектин; муциноподобные молекулы, например, CD34, GlyCAM-1 и MadCAM-1; представители семейства интегринов, такие, как LFA-1, VLA-1, Мас-1 и р150.95; представители надсемейства иммуноглобулинов, такие, как РЕСАМ, ICAM, например, ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3, CD2 и LFA-3; костимулирующие молекулы, такие, как В7-1, B7-2, CD40 и CD40L; факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервов, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, PDGF, BL-1 и фактор роста эндотелия сосудов; рецепторные молекулы, включая Fas, рецептор TNF, Fit, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Аро-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 и DR6; и Caspase (ICE).
Другими примерами адъювантов могут быть, помимо прочих, гидроксид алюминия; фосфат алюминия; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (3-О-деацилированный монофосфорил-липид A; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (соединение аминоалкилглюкозамина фосфата, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-ацетил-мурамил-L-теронил-D-изоглутамин (тре-MDP); N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, под названием нор-MDP); N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилоксиэтиламин) (CGP 19835А, под названием МТР-РЕ); и токсин холеры. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления адъювантом является QS-21.
Дополнительные типичные адъюванты включают нетоксичные производные токсина холеры, включая его субъединицу А, и/или конъюгаты или подвергнутые генной инженерии слияния полипептида N. meningitidis с токсином холеры или его субъединицей В ("СТВ"), термоинактивированный агрегат холерного энтеротоксина, грибковые полисахариды, включая шизофиллан, мурамилдипептид, производные мурамилдипептида ("MDP"), форболовые эфиры, термолабильный токсин Е. coli, блок-полимеры или сапонины.
Фосфат алюминия применяют в качестве адъюванта в клинических исследованиях 1-й фазы в концентрации до 0,125 мг/дозу, значительно ниже предела 0,85 мг/дозу, указанного в Своде федеральных постановлений США [610.15(a)]. Алюминийсодержащие адъюванты широко применяются в лечении людей для усиления иммунной реакции антигенов при внутримышечном или подкожном введении. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет от 0,125 мкг/мл до 0,5 мкг/мл; от 0,20 мкг/мл до 0,40 мкг/мл; или от 0,20 мкг/мл до 0,30 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет приблизительно 0,125 мкг/мл; приблизительно 0,15 мкг/мл; приблизительно 0,175 мкг/мл; приблизительно 0,20 мкг/мл; приблизительно 0,225 мкг/мл; приблизительно 0,25 мкг/мл; приблизительно 0,275 мкг/мл; приблизительно 0,30 мкг/мл; приблизительно 0,325 мкг/мл; приблизительно 0,35 мкг/мл; приблизительно 0,375 мкг/мл; приблизительно 0,40 мкг/мл; приблизительно 0,425 мкг/мл; приблизительно 0,45 мкг/мл; приблизительно 0,475 мкг/мл; или приблизительно 0,50 мкг/мл.
В предпочтительном варианте осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет от 0,125 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,20 мг/мл до 0,40 мг/мл; или от 0,20 мг/мл до 0,30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет приблизительно 0,125 мг/мл; приблизительно 0,15 мг/мл; приблизительно 0,175 мг/мл; приблизительно 0,20 мг/мл; приблизительно 0,225 мг/мл; приблизительно 0,25 мг/мл; приблизительно 0,275 мг/мл; приблизительно 0,30 мг/мл; приблизительно 0,325 мг/мл; приблизительно 0,35 мг/мл; приблизительно 0,375 мг/мл; приблизительно 0,40 мг/мл; приблизительно 0,425 мг/мл; приблизительно 0,45 мг/мл; приблизительно 0,475 мг/мл; или приблизительно 0,50 мг/мл.
Подходящими адъювантами, применяемыми для усиления иммунной реакции, также могут быть, помимо прочих, MPL™ (3-О-деацилированный монофосфорил-липид А, Corixa, Hamilton, МТ), описываемый в Патенте США №4,912,094. Также подходящими для использования в качестве адъювантов являются аналоги синтетического липида А или соединения аминоалкилглюкозамин фосфата (AGP) или их производные или аналоги от компании Corixa (Hamilton, МТ), а также описываемые в Патенте США №6,113,918. Одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил 2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529). Этот адъювант 529 рецептирован в водной форме (AF) или в форме устойчивой эмульсии (SE).
К другим адъювантам относятся мурамилпептиды, такие, как N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (тре-MDP), N-ацетил-нормурамил-1-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ); эмульсии типа масло в воде, такие, как MF59 (Патент США №6,299,884) (содержащие 5% сквалена, 0,5% polysorbate-80 и 0,5% SPAN 85 (необязательно содержащие различные количества МТР-РЕ) в форме субмикронных частиц, получаемых при помощи микрофлюидизатора, такого, как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) и SAF (содержащие 10% сквалена, 0,4% polysorbate-80, 5% PLURONIC-блокированного полимера L121 и тре-MDP, либо микрофлюидизированных в субмикронную эмульсию, либо перемешанных вихревым способом для образования эмульсии с большим размером частиц); неполный адъювант Фрейнда (IFA); соли алюминия (квасцы), такие, как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия; AMPHIGEN; авридин; L121/сквален; D-лактид-полилактид/гликозид; полиолы PLURONIC; убитые клетки Bordetella; сапонины, такие, как Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), описанные в Патенте США №5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанные в Патенте США №5,254,339 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis; бактериальные липополисахариды; синтетические полинуклеотиды, такие, как олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG (см., например, Патент США №6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), описанные в европейских патентах №№1,296,713 и 1,326,634; коклюшный токсин (РТ) или его мутант, токсин холеры или его мутант (см., например, Патенты США №№7,285,281, 7,332,174, 7,361,355 и 7,384,640); или термолабильный токсин (LT) Е. coli или его мутант, в частности, LT-K63, LT-R72 (см., например, Патенты США №№6,149,919, 7,115,730 и 7,291,588).
Способы получения нелипидированных антигенов Р2086
В одном аспекте изобретение касается способа получения непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086. Способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ORF2086, в которой N-концевой цистеин делетирован по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа, и нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессирующей системой, которая может быть экспрессирована в бактериальной клетке. К типичным полипептидам, получаемым этим способом, относится любой описанный авторами полипептид. Например, в предпочтительном варианте полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 делетирован по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа. В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. К дополнительным типичным полипептидам относится полипептид, имеющий аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. К дополнительным типичным полипептидам относится полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. Другие примеры включают SEQ ID NO: 80 (В24) и SEQ ID NO: 81 (B24). Способ также включает очистку полипептида.
В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способ получения растворимых нелипидированных антигенов Р2086, включающий этапы клонирования нуклеиновокислотной последовательности варианта ORF2086 в вектор экспрессии Е. coli без контрольной последовательности липидизации, преобразования бактерий Е. coli с вектором экспрессии ORF2086, включая экспрессию и выделение экспрессированного белка Р2086. В некоторых вариантах осуществления экспрессия вызывается IPTG.
В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys варианта ORF2086 делетирован. Примеры таких кодонов включают TGC. В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys варианта ORF2086 подвергают мутации путем точечного мутагенеза для образования кодона Ala, Gly или Val. В некоторых вариантах осуществления кодоны Ser и Gly добавляют к N-концевому хвосту варианта ORF2086 для продления ствола Gly/Ser непосредственно после N-концевого Cys. В некоторых вариантах осуществления общее количество остатков Gly и Ser в стволе Gly/Ser составляет по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11 или 12. В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys делетирован. В некоторых вариантах осуществления N-концевые 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков являются Gly или Ser.
В некоторых вариантах осуществления кодоны N-концевого хвоста нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют путем точечного мутагенеза. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют для приведения в соответствие N-концевому хвосту варианта В09. В некоторых вариантах осуществления кодоны N-концевого хвоста варианта ORF2086 оптимизируют путем точечного мутагенеза, таким образом, чтобы кодон, кодирующий пятую аминокислоту варианта ORF2086, был на 100% идентичным нуклеотидам 13-15 SEQ ID NO: 8, а кодон, кодирующий тринадцатую аминокислоту варианта ORF2086, был на 100% идентичным нуклеотидам 37-39 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 45 нуклеиновых кислот были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 1-45 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 42 нуклеиновых кислоты были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 4-45 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 39 нуклеиновых кислот были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 4-42 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает, по меньшей мере, одно аминокислотное замещение по сравнению с аминокислотами 1-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает два аминокислотных замещения по сравнению с аминокислотами 1-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает, по меньшей мере, одно аминокислотное замещение по сравнению с аминокислотами 2-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает два аминокислотных замещения по сравнению с аминокислотами 2-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замещения являются консервативными аминокислотными замещениями.
В некоторых вариантах осуществления кодоны нелипидированного варианта являются оптимизированными для усиления экспрессии. Оптимизация кодонов известна специалистам в данной области. См., например, Sastalla et al, Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099-2110 (2009) и Coleman et al, Science, vol. 320: 1784 (2008). В некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов включает приведение использования кодона аминокислотной последовательности в соответствие с частотой кодона выбранного организма-хозяина при включении и/или исключении конкретных последовательностей ДНК. В некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов также включает минимизацию соответствующей вторичной структуры мРНК для снижения помех трансляции. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост подвергнут оптимизации кодона, таким образом, чтобы он включал одну из последовательностей SEQ ID NO: 28, 30, 32 и 34. В некоторых вариантах осуществления ствол Gly/Ser подвергнут оптимизации кодона, таким образом, чтобы он включал любую из последовательностей SEQ ID NO: 28, 30, 32 и 34.
Для лучшего понимания данного изобретения далее представлены примеры. Примеры предназначены лишь для пояснения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Рецептирование иммуногенных композиций
В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции согласно изобретению также включают по меньшей мере один из компонентов, к которым относятся адъюванты, буферы, криопротекторы, соли, двухвалентные катионы, неионные детергенты, ингибиторы окисления свободными радикалами, разбавители или носители.
Иммуногенные композиции согласно изобретению также могут включать один или несколько консервантов в дополнение к множеству менингококковых белковых антигенов и конъюгатов капсульных полисахаридов - белков. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) требует, чтобы биологические продукты в многодозовых флаконах содержали консервант, лишь с несколькими исключениями. К вакцинным продуктам, содержащим консерванты, относятся вакцины, содержащие хлорид бензетония (сибирская язва), 2-феноксиэтанол (DTaP, НерА, Lyme, Polio (парентеральная)), фенол (Pneumo, Typhoid (парентеральная), Vaccinia) и тимеросал (DTaP, DT, Td, НерВ, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabies). Консерванты, утвержденные к применению в инъекционных медикаментах, включают, например, хлоробутанол, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, 2-феноксиэтанол, хлорид бензетония, хлорид бензалкония, бензойная кислота, бензиловый спирт, фенол, тимеросал и нитрат фенилртути.
Композиции согласно изобретению также могут включать один или несколько компонентов, к которым относятся буфер, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, криопротектор, такой, как сахар, и антиоксидант, такой, как акцептор свободных радикалов или комплексообразующий агент, или любую их множественную комбинацию. Выбор любого одного компонента, например, комплексона, может определять, требуется ли еще какой-либо компонент (например, акцептор). Готовая композиция, рецептированная для введения, должна быть стерильной и/или апирогенной. Специалист в данной области может эмпирическим путем определить, какие комбинации этих и других компонентов будут оптимальными для включения в содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению в зависимости от разных факторов, таких, как конкретные требуемые условия хранения и введения.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, которая является совместимой с парентеральным введением, включает один или несколько физиологически приемлемых буферов, выбранных из группы, к которой, помимо прочих, относятся Tris (триметамин), фосфат, ацетат, борат, цитрат, глицин, гистидин и сукцинат. В некоторых вариантах осуществления композицию буферируют до уровня рН в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,4.
В некоторых вариантах осуществления желательным может быть регулирование уровня рН иммуногенной композиции или препарата согласно изобретению. Уровень рН композиции согласно изобретению может регулироваться с применением стандартных технологий, известных специалистам в данной области. Уровень рН композиции может регулироваться до показателя от 3,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень рН композиции может составлять или может регулироваться до показателя от 3,0 до 6,0, от 4,0 до 6,0 или от 5,0 до 8,0. В других вариантах осуществления уровень рН композиции может составлять или может регулироваться до приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 5,8, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5 или приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень рН может составлять или может регулироваться до показателя в диапазоне от 4,5 до 7,5 или от 4,5 до 6,5, от 5,0 до 5,4, от 5,4 до 5,5, от 5,5 до 5,6, от 5,6 до 5,7, от 5,7 до 5,8, от 5,8 до 5,9, от 5,9 до 6,0, от 6,0 до 6,1, от 6,1 до 6,2, от 6,2 до 6,3, от 6,3 до 6,5, от 6,5 до 7,0, от 7,0 до 7,5 или от 7,5 до 8,0. В конкретном варианте осуществления уровень рН композиции составляет приблизительно 5,8.
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько двухвалентных катионов, включая, помимо прочих, MgCl, CaCl и MnCl в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 10 мМ, причем предпочтение отдается концентрации до приблизительно 5 мМ.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одну или несколько солей, включая, помимо прочих, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия и сульфат калия, присутствующих с ионной силой, которая физиологически приемлема для субъекта при парентеральном введении, и включенных в конечной концентрации для обеспечения выбранной ионной силы или осмолярности в готовой композиции. Конечная ионная сила или осмоляльность композиции определяется несколькими компонентами (например, ионами буферного(ых) соединения(й) и других небуферных солей. Предпочтительная соль, NaCl, присутствует в количестве до приблизительно 250 мМ, причем концентрацию солей выбирают таким образом, чтобы дополнять другие компоненты (например, сахара), чтобы конечная общая осмолярность композиции была совместима с парентеральным введением (например, внутримышечной или подкожной инъекцией) и способствовала долгосрочной устойчивости иммуногенных компонентов иммуногенной композиции в разных диапазонах температур. Бессолевые композиции выдерживают расширенные диапазоны одного или нескольких выбранных криопротекторов для поддержания нужного конечного уровня осмолярности.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько криопротекторов, выбранных, помимо прочих, из дисахаридов (например, лактозы, мальтозы, сахарозы или трегалозы) и полигидрокси-углеводородов (например, дульцита, глицерина, маннита и сорбита).
В некоторых вариантах осуществления осмолярность композиции составляет от приблизительно 200 мОсм/л до приблизительно 800 мОсм/л, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 250 мОсм/л до приблизительно 500 мОсм/л или от приблизительно 300 мОсм/л до приблизительно 400 мОсм/л. Бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 5% до приблизительно 25% сахарозы, предпочтительно - от приблизительно 7% до приблизительно 15% или от приблизительно 10% до приблизительно 12% сахарозы. В альтернативном варианте бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 3% до приблизительно 12% сорбита, предпочтительно - приблизительно от 4% до 7% или от приблизительно 5% до приблизительно 6% сорбита. Если добавляют соль, такую, как хлорид натрия, эффективный диапазон сахарозы или сорбита соответственно снижается. Эти и другие подобные показатели осмоляльности и осмолярности легко определяются специалистами в данной области.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов и/или комплексообразующих агентов. Разные акцепторы свободных радикалов и комплексоны известны специалистам в данной области и могут применяться для описываемых авторами композиций и способов применения. Примеры включают, помимо прочих, этанол, EDTA, комбинацию EDTA / этанола, триэтаноламин, маннит, гистидин, глицерин, цитрат натрия, инозит-гексафосфат, триполифосфат, аскорбиновую кислоту / аскорбат, янтарную кислоту / сукцинат, яблочную кислоту / малеат, десферал, EDDHA и DTPA и различные комбинации двух или более из вышеупомянутых соединений. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере может добавляться невосстанавливающий акцептор свободных радикалов в концентрации, которая эффективно повышает долгосрочную устойчивость композиции. Также в разных комбинациях могут добавляться один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов / комплексонов, такие, как акцептор и двухвалентный катион. Выбор комплексона определяет, требуется ли добавление акцептора.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, включая, помимо прочих, сложные эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбита, Polysorbate-80 (TWEEN 80), Polysorbate-60 (TWEEN 60), Polysorbate-40 (TWEEN 40) и Polysorbate-20 (TWEEN 20), алкиловые эфиры полиоксиэтилена, включая, помимо прочих, BRIJ 58, BRIJ 35, а также другие, такие, как TRITON Х-100; TRITON Х-114, NP40, SPAN 85 и серии PLURONIC неионных поверхностно-активных веществ (например, PLURONIC 121), причем предпочтительными компонентами являются Polysorbate-80 в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% (более предпочтительно - до приблизительно 0,25%) или Polysorbate-40 в концентрации от приблизительно 0,001% до 1% (более предпочтительно - до приблизительно 0,5%).
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению включает один или несколько дополнительных стабилизирующих агентов, подходящих для парентерального введения, например, восстановитель, включающий по меньшей мере одну тиольную (-SH) группу (например, цистеин, N-ацетилцистеин, восстановленный глутатион, тиогликолят натрия, тиосульфат, монотиоглицерин или их смеси). В альтернативном или необязательном варианте содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть дополнительно стабилизированы путем удаления кислорода из тары для хранения, защиты композиции от света (например, путем использования посуды из янтарного стекла).
th
Содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей или наполнителей, включая любой наполнитель, который сам по себе не вызывает иммунную реакцию. Подходящими наполнителями, помимо прочих, могут быть макромолекулы, такие, как белки, сахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза (Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19: 2118), трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие, как капли масла или липосомы). Такие разбавители, наполнители и/или носители хорошо известны специалистам в данной области. Фармацевтически приемлемые наполнители обсуждаются, например, в публикации Gennaro, 2000, Remington: The Science и Practice of Pharmacy, 20 edition, ISBN:0683306472.
Композиции согласно изобретению могут быть лиофилизированными или рецептированными в водной форме, т.е., в форме растворов или суспензий. Жидкие композиции в предпочтительном варианте могут вводиться непосредственно из фасованной формы и, таким образом, являются идеальными для инъекций без необходимости в восстановлении влагосодержания в водной среде, которое иначе требовалось бы для лиофилизированной композиции согласно изобретению.
Прямая доставка иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению в организм субъекта может выполняться путем парентерального введения (внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутривенно или в межклеточное пространство ткани); или путем ректального, перорального, вагинального, местного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, пульмонального или другого мукозального введения. В предпочтительном варианте осуществления парентеральное введение осуществляют путем внутримышечной инъекции, например, в бедро или плечо субъекта. Инъекцию выполняют через иглу (например, иглу для подкожных инъекций), однако в альтернативном варианте может применяться безыгольная инъекция. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл. Композиции согласно изобретению могут быть рецептированы в разных формах, например, для инъекций в форме жидких растворов или суспензий. В некоторых вариантах осуществления композицию рецептируют в форме порошка или аэрозоля для пульмонального введения, например, при помощи ингалятора. В других вариантах осуществления композиция может быть рецептирована в форме суппозитория или пессария, или для назального, ушного или глазного введения, например, в форме аэрозоля, капель, геля или порошка.
Оптимальное количество компонентов для конкретной иммуногенной композиции может определяться путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.
Упаковка и лекарственные формы
Иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть расфасованы в форме единичной дозы или в многодозовой форме (например, 2 дозы, 4 дозы или более). Для многодозовых форм обычно, хотя и не обязательно, предпочтение отдается флаконам перед предварительно заполненными шприцами. К подходящим многодозовым форматам помимо прочих, относятся: от 2 до 10 доз на вместилище при 0,1-2 мл на дозу. В некоторых вариантах осуществления доза составляет 0,5 мл. См., например, Международную патентную заявку WO 2007/127668, включенную в данное описание путем ссылки.
Композиции могут быть расфасованы в флаконы или другую подходящую тару для хранения или могут находиться в предварительно заполненных устройствах для доставки, например, одно- или многокомпонентных шприцах, которые могут поставляться с иглами или без них. Шприц обычно, но не обязательно, содержит единичную дозу содержащей консервант иммуногенной композиции согласно изобретению, хотя также предусматриваются многодозовые предварительно заполненные шприцы. Подобным образом флакон может включать единичную дозу, хотя в альтернативном варианте может включать несколько доз.
Объемы эффективных доз могут определяться традиционными способами, хотя типичная доза композиция для инъекций имеет объем 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления дозу рецептируют для введения человеку. В некоторых вариантах осуществления дозу рецептируют для введения взрослому человеку, подростку, ребенку преддошкольного или грудного возраста (т.е., не старше одного года) и в предпочтительных вариантах осуществления вводят путем инъекции.
Жидкие иммуногенные композиции согласно изобретению также являются подходящими для восстановления влагосодержания других иммуногенных композиций, присутствующих в лиофилизированной форме. Если иммуногенная композиция предназначена для такого немедленного восстановления влагосодержания, изобретение предусматривает комплект с двумя флаконами, двумя или более предварительно наполненными шприцами или одним или несколькими из тех и других, причем содержимое шприца используют для восстановления влагосодержания содержимого флакона перед инъекцией, или наоборот.
В альтернативном варианте иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению подвергают лиофилизации и восстановлению влагосодержания, например, с применением множества способов высушивания замораживанием, хорошо известных среди специалистов в данной области, для образования сухих частиц правильной (например, сферической) формы, таких, как микропеллеты или микросферы, обладающие характеристиками частиц, такими, как средний диаметр, которые могут выбираться и регулироваться путем изменения конкретных способов, применяемых для их изготовления. Иммуногенные композиции также могут включать адъювант, который необязательно может быть приготавливаться в форме отдельных сухих, правильной (например, сферической) формы частиц, таких, как микропеллеты или микросферы, или содержаться в них. В таких вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает комплект иммуногенной композиции, включающий первый компонент, включающий стабилизированную, сухую иммуногенную композицию, которая необязательно также включает один или несколько консервантов согласно изобретению и второй компонент, включающий стерильный, водный раствор для восстановления влагосодержания первого компонента. В некоторых вариантах осуществления водный раствор включает один или несколько консервантов и необязательно может включать по меньшей мере один адъювант (см., например, заявку WO 2009/109550 (включенную в данное описание путем ссылки).
В еще одном варианте осуществления тару для многодозового формата выбирают из одной или нескольких групп, к которым, помимо прочих, относятся общая лабораторная стеклянная посуда, колбы, мензурки, мерные цилиндры, ферментаторы, биореакторы, системы для инфузий, трубки, пакеты, банки, флаконы, крышки для флаконов (например, резиновые пробки, навинчивающиеся крышки), ампулы, шприцы, двух- или многокамерные шприцы, пробки шприцев, поршни шприцев, резиновые крышки, пластиковые крышки, стеклянные крышки, картриджи и одноразовые шприц-ручки и т.п. Вместилище согласно настоящему изобретению не ограничивается конкретным материалом и включает такие материалы, как стекло, металлы (например, сталь, нержавеющая сталь, алюминий и т.п.) и полимеры (например, термопласты, эластомеры, термопласты-эластомеры). В конкретном варианте осуществления вместилище подходящего формата представляет собой 5 мл стеклянный флакон Schott Туре 1 с бутиловой пробкой. Специалисту в данной области станет понятно, что список вышеизложенных форматов ни в коей мере не является исчерпывающим, а лишь служит в качестве рекомендации для специалиста в отношении различных форматов, доступных с точки зрения настоящего изобретения. Дополнительные форматы, предусмотренные для использования согласно настоящему изобретению, можно найти в опубликованных каталогах от поставщиков и производителей лабораторного оборудования, таких, как United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Экспериментальные процедуры
Сывороточный бактерицидный анализ
4
Яванских макаков (n=5/группу) внутримышечно иммунизировали белками rLP2086 или rP2086 (А+В), адсорбированными в AlPO. Яванские макаки представляют собой пример нечеловекообразных приматов. Животных вакцинировали на 0, 4 и 24 недели и титры ORF2086-специфического IgG и функционального антитела определяли на 0, 4, 6 и 26 недели. Титры ORF2086-специфического IgG в сыворотке определяли против rLP2086A и В.
Титры функционального антитела исследовали с применением сывороточного бактерицидного анализа (SBA) против штаммов Neisseria meningitidis, экспрессирующих LP2086, с последовательностями, гомологичными или гетерологичными содержащимся в вакцине.
650
Бактерицидные антитела сыворотки у макаков или кроликов, иммунизированных вакциной ORF2086, определяли с применением SBA с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов или иммунные сыворотки макаков подвергали термоинактивации для устранения внутренней активности комплемента и последовательно подвергали серии разведений 1:2 в PBS Дульбекко с Са2+ и Mg2+ (D-PBS) в 96-луночном микротитровальном планшете для испытания бактерицидной активности сыворотки против штаммов N. meningitidis. Бактерии, используемые для анализа, выращивали в среде GC, дополненной добавкой Келлогга (GCK), и наблюдали по оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечном показателе оптической плотности OD 0,50-0,55, разводили в D-PBS и к аналитической смеси добавляли 1000-3000 КОЕ с 20% комплементом человека.
Сыворотку человека без обнаружимой бактерицидной активности использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплементов испытывали на пригодность относительно каждого отдельного испытываемого штамма. Источник комплемента использовали лишь в том случае, если количество бактерий, выживших в контрольных образцах без добавления иммунных сывороток, составляло >75%. Требовалось десять уникальных источников комплементов для выполнения SBA, описываемых в данном исследовании.
2
2
После 30 мин инкубации при 37°С с 5% CO к реакционной смеси добавляли D-PBS и аликвоты переносили на микрофильтровальные планшеты, заполненные 50% среды GCK. Микрофильтровальные планшеты подвергали фильтрации, инкубировали в течение суток при 37°С с 5% CO и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Бактерицидные титры сыворотки определяли как интерполированное обратное разбавление сыворотки, которое приводило к 50% снижению КОЕ по сравнению с КОЕ в контрольных лунках без иммунных сывороток. Титр SBA определяют как обратное значение интерполированного разбавления испытываемой сыворотки, которое вызывает 50% снижение численности бактерий после 30 мин инкубации при 37°С. Склонность к цитолизу под действием иммунных сывороток ORF2086 устанавливали при наличии 4-кратного или более повышения титра SBA для иммунных сывороток ORF2086 по сравнению с соответствующим неиммунные сыворотки. Сыворотки, которые были отрицательными по отношению к анализируемому штамму в начальном разведении, относили к титру, соответствующему половине предела обнаружения для пробы (т.е., 4).
Пример 2: Клонирование и экспрессия нелипидированных вариантов ORF2086
Зрелую аминокислотную последовательность Р2086, соответствующую остаткам 27-286 из N. meningitidis штамма М98250771 (А05), первоначально получали путем ПЦР-амплификации из геномной ДНК. Прямой праймер, имеющий последовательность TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22), был соединен с 5' концом и содержал сайт NdeI для клонирования. Обратный праймер, имеющий последовательность CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC (SEQ ID NO: 23), был соединен с 3' концом гена и содержал терминирующий кодон TAG, за которым следовал сайт рестрикции BamHI. Амплифицированный фрагмент из 799 п.о. сначала клонировали в промежуточный вектор PCR2.1 (Invitrogen, Carlesbac, СА) Эту плазмиду расщепляли при помощи NdeI и BamHI и лигировали в вектор экспрессии рЕТ9а (Novagen, Madison, WI), который был расщеплен при помощи NdeI и BamHI. Образованный в результате вектор pLA100 (который включает SEQ ID NO: 54) экспрессировал зрелый Р2086 подсемейства А05 из штамма М98250771 без N-концевого цистеина (см. SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55), который присутствовал бы в липидированном белке. Штамм-хозяин BLR(DE3) Е. coli [F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3)] (Novagen) использовали для обеспечения экспрессии fHBP.
Такие же этапы клонирования применяли для получения N-концевых Cys-делетированных вариантов В02, В03, В09, В22, В24, В44, А04, А12 и А22. N-концевые Cys-содержащие варианты также получали тем де способом с применением прямых праймеров, которые также включали Cys кодон (например, первый кодон SEQ ID NO: 1-11). На основе представленных авторами последовательностей специалист в данной области сможет построить прямой и обратный праймеры для каждого из этих вариантов. Например, указанные ниже праймеры использовали для амплификации нелипидированного варианта В44 с последующим клонированием в рЕТ9а с применением NdeI и BlpI.
Результаты
Нелипидированные плазмидные последовательности были сильно экспрессированы, однако нелипидированные варианты белка были пирувилированы в N-концевом цистеиновом остатке. См. Примеры 8 и 9, в которых описывается, например, способ экспрессии последовательностей. Для преодоления этого пирувилирования N-концевой Cys кодон был делетирован. См., например, Пример 10. Однако делеция N-концевого Cys исключает экспрессию вариантов А22 и В22. См., например, Фигуру 4. Однако варианты А05, В01 и В44 все же были экспрессированы, несмотря на делецию N-концевого цистеинового остатка. См., например, SEQ ID NO: 13 (А05), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 35 (В01 N-конец) и SEQ ID NO: 21(B44), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. См., например, Фигуру 5. Кроме того, на экспрессию нелипидированного варианта В09 не влияла делеция N-концевого цистеинового остатка. См., например, Пример 4.
Пример 3: Влияние ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидированного варианта
Чтобы определить, почему варианты В44 А05, В01 и В44 экспресировались при отсутствии N-концевого Cys, а варианты А22 и В22 не экспрессировались, последовательности этих вариантов выравнивали. Варианты В44 А05, В01 и В44 имеют продленный ряд из 10 или 11 остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys (т.е., ствол Gly/Ser). Однако варианты А22 и В22 имели только ствол Gly/Ser, состоявший из 6 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser вариантов А22 и В22 был продлен вставкой дополнительных остатков Gly и Ser.
Длинные варианты ствола Gly/Ser получали с применением способов, описанных в Примере 2, используя прямые праймеры, кодирующие ствол Gly/Ser с 10 или 11 остатками Gly и Ser.
Варианты А22 и В22 N-концевого Cys-делетированного длинного ствола Gly/Ser (10-11 остатков Gly/Ser) демонстрировали повышенную экспрессию относительно вариантов А22 и В22 N-концевой Cys-делетированного короткого ствола Gly/Ser (6 остатков Gly/Ser). Однако эти уровни экспрессии все же были сниженными по сравнению с уровнями экспрессии вариантов А05, В01 и В44.
Пример 4: Оптимизация кодонов
На экспрессию нелипидированного варианта В09 не влияла делеция N-концевого цистеинового остатка (см. SEQ ID NO: 18, в которой цистеин в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49). См., например, Фигуру 6. Оценка последовательности варианта В09 продемонстрировала, что вариант В09 имеет ствол Gly/Ser, состоящий из 6 остатков Gly и Ser, подобный стволу Gly/Ser вариантов А22 и В22. Действительно, N-концевые хвосты вариантов В09 и А22 идентичны на уровне аминокислот. Однако N-концевые хвосты вариантов В09 и А22 (SEQ ID NO: 53 и 42, соответственно) отличаются на уровне нуклеиновых кислот двумя нуклеиновыми кислотами: нуклеиновыми кислотами 15 и 39 SEQ ID NO: 8. См., например, Фигуру 6. Первые 14 аминокислот N-концевого хвоста варианта В22 идентичны вариантам В09 и А22, и N-концевой хвост варианта В22 отличается только в 15-й аминокислоте. Нуклеиновые кислоты 1-42 варианта В22 идентичны нуклеиновым кислотам 1-42 варианта А22. Нуклеиновые кислоты 1-42 варианта В22 (см. SEQ ID NO: 52) идентичны нуклеиновым кислотам 1-42 варианта В09 (см. SEQ ID NO: 53), за исключением различий в нуклеиновых кислотах 15 и 39 при оптимальном выравнивании. Соответственно, вариант В22 отличается от варианта В09 в аминокислотах 15 и 39 SEQ ID NO: 8. В последнем предложении содержится опечатка, и правильно было бы указать, что вариант В22 отличается от варианта В09 в нуклеиновых кислотах 15 и 39 SEQ ID NO: 8.
Чтобы определить, влияют ли различия в нуклеиновых кислотах на уровень экспрессии варианта В09 по сравнению с вариантами А22 и В22, варианты А22 и В22 подвергали точечной мутации для включения нуклеиновых кислот 15 и 39 в соответствующие кодоны для Gly5 и Gly13. Включение этих молчащих мутаций нуклеиновых кислот значительно повышало экспрессию N-концевых Cys-делетированных вариантов А22 и В22 до уровня, подобного показателю N-концевого Cys-делетированного варианта В09. См., например, Фигуру 7. Соответственно, оптимизация кодонов для соответствия варианта В09 может повышать экспрессию N-концевых Cys-делетированных нелипидированных вариантов Р2086.
Дальнейший анализ нелипидированных вариантных последовательностей указывает на дополнительную оптимизацию кодонов в стволе Gly/Ser для улучшения экспрессии. Соответственно, дополнительные нелипидированные варианты строили с применением способа согласно Примеру 2 с использованием прямых праймеров, включающих такие кодон-оптимизированные последовательности. Прямые праймеры, используемые для получения оптимизированного ствол Gly/Sers включают любые из следующих последовательностей:
Пример 5: Оптимизация иммуногенной композиции
4
4
Рецептированные вакцины от ISCOMATRIX вызывали быструю иммунную реакцию, которая в результате приводила к снижению количества доз, необходимых для достижения более чем 4-кратного повышения скорости реакции, измеряемой с применением сывороточного бактерицидного анализа. Группы из пяти макаков-резусов подвергали иммунизации различными композициями двухвалентной нелипидированной вакцины rP2086. Вакцина включала непирувилированный нелипидированный вариант А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55, кодируемая SEQ ID NO: 54) и непирувилированный нелипидированный вариант В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 51). Единицы количества адъюванта следующие: AlPO составляет 250 мкг, ISCOMATRIX составляет от 10 до 100 мкг. Единицы количества адъюванта для AlPO, показанные в Таблицах 2-5, представлены в миллиграммах и, таким образом, указываются как 0,25 (мг) в отличие от 250 мкг.
4
4
Протокол иммунизации предусматривал 0, 4 и 24 нед. с кровопусканием на 0, 4, 6 и 26 неделях. Не наблюдалось повышения титров SBA после введения первой дозы ни в одной из групп. После введения второй дозы повышение титров SBA и количество респондеров, определяемое по 4-кратному повышению титра SBA относительно исходного показателя, наблюдалось для композиций, содержащих адъювант ISCOMATRIX. В Таблицах 2 и 3 представлены GMT SBA, наблюдаемые для штамма fHBP подсемейств А и В, соответственно. GMT SBA для композиций ISCOMATRIX были в 3-19 и 4-24 раза выше, чем наблюдаемые для композиции AlPO для штаммов подсемейств А и В, соответственно. Повышенные титры также наблюдались после введения третьей дозы для композиций ISCOMATRIX с повышением в 13-95 и 2-10 раз для штамма fHBP подсемейств А и В, соответственно, по сравнению с композицией AlPO. Анализ показателей ответа, определяемых по четырехкратному или большему повышению титра SBA относительно исходного показателя обнаружил подобную тенденцию (Таблицы 4 и 5).
Пример 6: Иммунологическая защита, обеспечиваемая липидированными и нелипидированными вариантами
4
Рекомбинантно экспрессированный нелипидированный вариант Р2086 (В44) обеспечивает широкую защиту, измеряемую по SBA против штаммов, представляющих различные варианты fHBP (от приблизительно 85% до приблизительно <92% ID) последовательностей LP2086. Эти показатели реакции получали для нелипидированной вакцины, рецептированной с AlPO. См. Таблицу 6, в которой представлены показатели реакции SBA на штамм MnB fHBP подсемейства В, вызванной двухвалентной вакциной fHBP. Нелипидированная вакцина (представленная знаком "-" под колонкой "липидирование") включала 1 мкг на белок непирувилированного нелипидированного варианта А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован) и непирувилированного нелипидированного варианта В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован).
В альтернативном варианте рекомбинантно экспрессированный нелипидированный вариант Р2086 (В44) вызывает большую иммунную реакцию, измеряемую по титру SBA, по сравнению с липидированным вариантом (В01) против штаммов, включающих подобные (>92% ID) и различные (<92% ID) последовательности LP2086. Более высокие показатели реакции (определяемые четырехкратным или большим повышением в титрах SBA относительно исходного показателя) наблюдали для вакцины, содержащей нелипидированный rP2086 В44 по сравнению с вакциной, содержащей липидированный rLP2086 В01 (Таблица 6).
Согласно Таблице 6, нелипидированный В44 является предпочтительным компонентом fHBP подсемейства В в композиции для обеспечения широкой защиты (например, через выработку бактерицидных антител) против многих вариантных штаммов LP2086.
Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что штаммы LP2086 варианта В09 имеют наименьшую вероятность положительных показателей реакции SBA в отношении гетерологичных (отличных от В09) полипептидов ORF2086. В частности, авторами изобретения было обнаружено, что LP2086 В09 является исключением с точки зрения аналитического штамма, против которого иммуногенная композиция А05/В44, описанная в Таблице 6 вызывала выработку бактерицидных антител. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению включает полипептид В09, в частности, в контексте композиции, включающей более одного полипептида ORF2086 подсемейства В. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция, которая включает нелипидированный В44, также может включать нелипидированный полипептид В09.
Пример 7: Оптимизация кодонов вариантов В44 и В09
Хотя показатели уровня экспрессии, достигаемые согласно представленным выше примерам, были во многих случаях достаточными, требовалась дальнейшая оптимизация, и приготавливали и испытывали экспрессионные последовательности Е. coli, включающие дополнительную оптимизацию кодонов по всей длине белка. Было обнаружено, что одна такая улучшенная последовательность для экспрессии отличного от цистеина белка В44 является нуклеиновокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43. Как показано в Примере 9, экспрессионная последовательность, содержащая SEQ ID NO: 43, продемонстрировала усиленную экспрессию по сравнению с показателем неоптимизированной последовательности дикого типа.
Экспрессия N-концевого Cys-делетированного белка В09 была улучшена путем применения смены кодона с вышеупомянутой оптимизированной последовательности В44 (SEQ ID NO: 43) на В09 (SEQ ID NO: 48). Для создания оптимизированных последовательностей В09 оптимизированную последовательность ДНК В44 (SEQ ID NO: 43) сначала сопоставляли с последовательностью ДНК аллеля В09 (SEQ ID NO: 48). Полная нелипидированная кодирующая последовательность аллеля В09 (SEQ ID NO: 48) была оптимизирована таким образом, чтобы отражать изменения кодона, наблюдаемые в оптимизированном аллеле В44 (SEQ ID NO: 43), всюду, где аминокислоты между В44 (SEQ ID NO: 44) и В09 (SEQ ID NO: 49) были идентичными. Последовательности кодонов в аллеле В09, соответствующие идентичным аминокислотам между аллелем В09 и аллелем В44, были изменены таким образом, чтобы отражать кодон, используемый в оптимизированной последовательности В44 (SEQ ID NO: 43). Последовательности кодонов для аминокислот, которые являются различными между В09 (SEQ ID NO: 49) и В44 (SEQ ID NO: 44), были неизменными в последовательности ДНК В09.
Кроме того, аминокислотная последовательность нелипидированного В44 (SEQ ID NO: 44) содержит два последовательных серино-глициновых повтора (S-G-G-G-G) (SEQ ID NO: 56) (см. также аминокислоты с 2 по 6 SEQ ID NO: 44) на ее N-конце, в то время как аллель В09 содержит только один серино-глициновый повтор на N-конце (см. аминокислоты с 2 по 6 и аминокислоты с 7 по 11 SEQ ID NO: 49). Два серино-глициновых повтора на N-конце В44 (аминокислоты с 2 по 6 и аминокислоты с 7 по 11 SEQ ID NO: 44) также имеют разную частоту использования кодона (см. нуклеотиды с 4 по 18 и нуклеотиды с 19 по 33 SEQ ID NO: 43), и различные комбинации оптимизированного серино-глицинового повтора В44 (например, либо нуклеотиды с 4 по 18 SEQ ID NO: 43, либо нуклеотиды с 19 по 33 SEQ ID NO: 43, или их комбинация) применяли к последовательности ДНК В09 (SEQ ID NO: 48, например, к нуклеотидами с 4 по 18 SEQ ID NO: 48) с целью исследования влияния на экспрессию рекомбинантного белка.
Строили три разных варианта оптимизированного В09: SEQ ID NO: 45 содержит оба серино-глициновых повтора (GS1 и GS2) (нуклеиновые кислоты с 4 по 33 SEQ ID NO: 43) из оптимизированного В44, SEQ ID NO: 46 содержит GS1 (нуклеиновые кислоты с 4 по 18 SEQ ID NO: 43) и SEQ ID NO: 47 содержит GS2 (нуклеиновые кислоты с 19 по 33 SEQ ID NO: 43). ДНК для всех из вышеупомянутых кодон-оптимизированных последовательностей химически синтезировали с применением стандартных для данной области химических способов. Полученную в результате ДНК клонировали в соответствующие плазмидные векторы экспрессии и испытывали на экспрессию в клетках-хозяевах Е. Coli, как описывается в Примерах 8 и 9.
Пример 8: Способ экспрессии ORF2086, вариант В09
Клетки Е. coli штамма K-12 (производные W3110 дикого типа (CGSC4474) с делециями в recA, fhuA и araA) преобразовывали плазмидой рЕВ063, которая включает SEQ ID NO: 45, pEB064, которая включает SEQ ID NO: 46, плазмидой pEB065, которая включает SEQ ID NO: 47, или плазмидой pLA134, которая включает SEQ ID NO: 48. Предпочтительные модификации штамма K-12 могут применяться для ферментации, но не требуются для экспрессии белков.
Клетки инокулировали в определенную среду с солями глюкозы. После 8 часов инкубации при 37°С применяли линейную подачу глюкозы и инкубацию продолжали в течение дополнительных 3 часов. К культуре добавляли изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ с последующей 12-часовой инкубацией при 37°С. Клетки собирали путем центрифугирования при 16000 × g в течение 10 минут и подвергали лизису путем добавления комплекта для лизиса клеток Easy-Lyse™ от Lienco Technologies (St. Louis, МО) и загрузочный буфер. Осветленные лизаты подвергали анализу на экспрессию В09 путем окрашивания Кумасси гелей SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга с количественным определением при помощи сканирующего денситометра. Результаты сканирующей денситометрии представлены ниже в Таблице 7:
Пример 9: Способ экспрессии ORF2086 варианта В44
Клетки Е. coli штамма В (BLR(DE3), Novagen) преобразовывали плазмидой pLN056, которая включает SEQ ID NO: 51. Клетки Е. coli штамма K-12 (производная W3110 дикого типа) преобразовывали плазмидой pDK087, которая включает SEQ ID NO: 43. Клетки инокулировали в определенную среду с солями глюкозы. После 8 часов инкубации при 37°С применяли линейную подачу глюкозы и инкубацию продолжали в течение дополнительных 3 часов. К культуре добавляли изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ с последующей 12-часовой инкубацией при 37°С. Клетки собирали путем центрифугирования при 16000 × g в течение 10 минут и подвергали лизису путем добавления комплекта для лизиса клеток Easy-Lyse™ от Lienco Technologies (St. Louis, МО) и загрузочный буфер. Супернатанты подвергали анализу на экспрессию В09 путем окрашивания Кумасси гелей SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга, с количественным определением при помощи сканирующего денситометра. Результаты сканирующей денситометрии представлены ниже в Таблице 8:
Пример 10: Пирувилирование
Представленный пример демонстрирует, что N-концевой цистеиновый остаток нелипидированных белков ORF2086 может стать пирувилированным при экспрессии, например, в E. coli.
Накопление гетерологичного белка во время образования вариантов А05 (SEQ ID NO: 13) и В44 (SEQ ID NO: 21) наблюдали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращением фаз (RP-HPLC). Это разделение осуществляли во взаимодействии с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром (QTOF-MS) для обеспечения средства наблюдения за образованием связанных с продуктом вариантов.
После экспрессии в E. coli В и/или клетках-хозяевах K-12 продукты, полученные в результате этих ферментаций подвергали процедуре очистки, во время которой наблюдали модификацию продукта. Деконволюция масс-спектров характеризовала варианты как демонстрирующие сдвиги масс +70 Да по сравнению с природными продуктами 27640 и 27572 Да для А05 и В44, соответственно.
В опубликованной литературе указывается, что сдвиг массы +70 Да ранее наблюдался в белках и объяснялся пирувилированием амино-концевого остатка.
Присутствие и расположение пируватной группы подтверждали с использованием данных масс-спектральной фрагментации (MS/MS). Данные показывали, что модификация происходила на амино-концевом цистеиновом остатке, т.е., аминокислоте в позиции 1 согласно А05 и В44. Для А05 процент пирувилированных полипептидов составлял приблизительно 30% по сравнению с общим количеством полипептидов А05 (SEQ ID NO: 13). Для В44 процент пирувилированных полипептидов составлял приблизительно 25% по сравнению с общим количеством полипептидов В44 (SEQ ID NO: 21).
Когда А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55) и варианты В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44), которые не содержат амино-концевого цистеина, очищали, обнаружимого пирувилирования (+70 Да) не наблюдалось.
Пример 11: Иммуногенность В09 и В44, отдельно и в комбинации
4
5-10 групп макаков-резусов подвергали иммунизации вариантом В09 (SEQ ID NO: 49, кодируемая SEQ ID NO: 48) или вариантом В44 (SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 43), или A05, B09 и B44 (SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 49, кодируемая SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 43, соответственно), рецептированным с 250 мкг AlPO на дозу. Обезьян вакцинировали внутримышечным путем на 0, 4 и 8 неделях с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации, как представлено в Таблице 9 и 10. Образцы сыворотки 0 и 12 недель анализировали в SBA против штаммов MnB с вариантами fHBP подсемейства А или подсемейства В. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра. Испытанный вариант В44 был оптимизированной последовательностью (SEQ ID NO: 43), и широкие показатели реакции, которые наблюдались в предыдущих исследованиях (см. таблицу выше), поддерживались для оптимизированной последовательности (Таблица 9) вакцины В44 отдельно или в комбинации с В09. Вакцина В09 отдельно (Таблица 10) также может вызывать широкие перекрестные иммунные реакции (Таблица 10).
4
Макаков-резусов (n=10) подвергали иммунизации внутримышечно на 0, 4 и 8 недели с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации, как показано в колонке «Вакцина» в композиции с 250 мкг AlPO. Образцы сыворотки 0 и 10 недель анализировали в SBA относительно штаммов MnB, перечисленных в таблице. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра.
Таблица 9 показывает, например, что композиция, включающая комбинацию непирувилированного нелипидированного В44, В09 и А05 демонстрирует большую перекрестную защиту против испытываемых вариантов по сравнению с перекрестной защитой от композиции, включающей только В44. С учетом результатов, показанных в данной заявке, включая, в частности, Таблицу 6 и Таблицу 9 вместе, композиции, включающие В44, В09 и А05, отдельно или в комбинации, представляют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, описываются композиции, включающие В44 и В09. Такая композиция предпочтительно также включает полипептид подсемейства А, в частности, А05.
4
Макаков-резусов (n=5) подвергали иммунизации внутримышечно на 0, 4 и 8 недели с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации как показано в колонке «Вакцина» в композиции с 250 мкг AlPO. Образцы сыворотки 0 и 10 недель анализировали в SBA относительно штаммов MnB, перечисленных в таблице. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра.
Пример 12: Иммунологическая защита, обеспечиваемая липидированными и нелипидированными вариантами последовательности
4
Двадцать самок новозеландских кроликов-альбиносов, 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River Canada, предварительно отбирали с применением цельноклеточного анализа ELISA и 10 животных прошли отбор для этого исследования на основе их низких фоновых титров против испытываемых штаммов, представляющих варианты fHBP В02 (SEQ ID NO: 16) и B44 (SEQ ID NO: 21) (Таблица 11). Группы из трех животных внутримышечно иммунизировали 100 мкг каждого белка, рецептированного с 50 мкг ISCOMATRIX на 0,5 мл дозу на 0, 4 и 9 недели (Таблица 12). Группу 1 вакцинировали нелипидированным В44 (SEQ ID NO: 44). Включали контрольную группу, которую вакцинировали липидированным В01, рецептированным с AlPO (250 мкг). Кроликов подвергали кровопусканию на 0, 4, 9 и 10 неделях. Отдельные образцы сыворотки 10-й недели подготавливали и анализировали с применением сывороточного бактерицидного анализа против многих штаммов менингококков серогруппы В из fHBP подсемейства В.
Протокол иммунизации: недели 0, 4, 9; протокол кровопускания: недели 0, 4, 9, 10 Сывороточный бактерицидный анализ (SBA): Сывороточный бактерицидный анализ (SBA) на основе микроколоний против многих штаммов менингококков серогруппы В (Таблица 13) проводили на отдельных образцах сыворотки. Человеческую сыворотку от доноров брали как источник комплемента для штамма, испытываемого при анализе. Опосредованные комплементом антителозависимые бактерицидные титры интерполировались и выражались как обратные показатели разбавления испытываемой сыворотки, убивающей 50% менингококковых клеток в пробе. Пределом обнаружения анализа был титр SBA 4. Титр SBA <4 получал номер 2. Рассчитывали и сравнивали повышение титров SBAA 2 4 раза в 10-недельных образцах сыворотки по сравнению с титрами до иммунизации.
Активность бактериального антитела в сыворотке, измеряемая в SBA представляет иммунологический имитатор защиты от менингококковой болезни. Способность иммунизации нелипидированным rfHBP к вызыванию выработки бактерицидных антител у кроликов определяли по SBA. SBA измеряет уровень антител в образцах сыворотки путем имитации опосредованного комплементом бактериального лизиса, который происходит естественным путем. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 10-й неделе, анализировали с использованием SBA против штаммов с В44 fHBP или В02 fHBP. Как показано в Таблице 13, через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя все образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против обоих испытываемых штаммов. (Таблица 13). У новозеландских кроликов нелипидированный В44 (SEQ ID NO: 44) был более иммуногенным, чем нелипидированный В01 против этих штаммов. Нелипидированный В44 (SEQ ID NO: 44), рецептированный с адъювантом iscomatrix, против этих штаммов давал титры, сравнимые с показателями липидированного В01, рецептированного с фосфатом алюминия. Образцы сыворотки кролика до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов.
Пример 13: Иммуногенность шести нелипидированных фактор Н-связывающих белков у новозеландских кроликов-альбиносов.
Группы из 5 кроликов подвергали иммунизации нелипидированными вариантами fHBP, как описано в Таблице 14. Вакцины вводили на 0, 4 и 9 неделях. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 0 и 10 неделях, подвергали анализу с использованием SBA против штаммов с гомологичными и гетерологичными последовательностями fHBP. Таблица 14 показывает процент респондеров после третьей иммунизации. Через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя) все образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против гомологичных штаммов, а также других испытываемых штаммов того же подсемейства fHBP. Образцы сыворотки кроликов до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов.
Пример 14:
>нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 55)
>pEB042 (SEQ ID NO: 65)
>нелипидированный А12 (SEQ ID NO: 66)
>pEB043 (SEQ ID NO: 67)
>нелипидированный A22 (SEQ ID NO: 68)
>pEB058 (SEQ ID NO: 69)
>А62 (SEQ ID NO: 70). GenBank: ACI46789.1
>нелипидированный A62 (SEQ ID NO: 71)
>pLA164(SEQ ID NO: 72)
>pDK086 (SEQ ID NO: 73)
>A29 (SEQ ID NO: 74)
>нелипидированный B22 (SEQ ID NO: 75)
>нелипидированный A05 (SEQ ID NO: 76) (pPW102)
>нелипидированный A05 (SEQ ID NO: 77)
>Консенсус (SEQ ID NO: 78)
>Консенсус (SEQ ID NO: 79)
Пример 15: Образование нелипидированных вариантов подсемейства А rP2086
Клонирование нелипидированных генов fHBP
Кодирующую последовательность нелипидированного белка А05 fHBP (SEQ ID NO: 55) сопоставляли с последовательностью В44 с оптимизированной экспрессией (SEQ ID NO: 43). В местах, где их аминокислоты были идентичными, кодон из В44 (SEQ ID NO: 43) использовали для замещения в гене А05. Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 65) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Рекомбинантный нелипидированный А12 fHBP (SEQ ID NO: 66) экспрессировали из рЕВ043 (SEQ ID NO: 67). Экспрессию аллеля А12 оптимизировали с применением технологий Blue Heron. Этот ген был оптимизирован с применением такого же процесса, как для А05 (рЕВ042). Кроме того, оптимизированные с применением Blue Heron амино-концевые кодоны В44 SGGGGSGGGG (аминокислотные остатки с 2 по 11 SEQ ID NO. 44) заменяли природные кодоны А12 SSGGGG (аминокислотные остатки с 1 по 6 SEQ ID NO: 66). Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 67) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Рекомбинантный нелипидированный А22 fHBP (SEQ ID NO: 68) экспрессировали из рЕВ058 (SEQ ID NO: 69). Этот ген был оптимизирован с применением такого же процесса, как для рЕВ042. Кроме того, оптимизированные с применением Blue Heron амино-концевые кодоны В44 SGGGG (аминокислотные остатки с 2 по 6 SEQ ID NO: 44) заменяли природные кодоны А22 SSGGGG (аминокислотные остатки с 1 по 6 SEQ ID NO: 68). Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 69) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Рекомбинантный А62 fHBP (SEQ ID NO: 71) экспрессировали из pLA164 (SEQ ID NO: 72). Аллель A62_002 из штамма 0167/03 подвергали ПЦР-амплификации с праймерами, содержащими сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 72) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Пример 16: Экспрессия, ферментация и очистка белков rP2086 подсемейства А экспрессионных штаммов Е. coli
BLR(DE3) Е. coli В recA-, трансформированный с использованием pLA164 (SEQ ID NO: 72), использовали для экспрессии А62 (SEQ ID NO: 71). Плазмиду pEB042 (SEQ ID NO: 65) преобразовывали в BD643 хозяина E. coli (W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA) для получения штамма BD660 для экспрессии А05 (SEQ ID NO: 55). Экспрессию А22 (SEQ ID NO: 68) осуществляли из штамма BD592, который состоит из плазмиды рЕВ058 (SEQ ID NO: 69), находящейся в BD559 хозяина (который также представляет W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA). И наконец, плазмиду рЕВ043 (SEQ ID NO: 67) преобразовывали в BD483 хозяина (W3110:DE3 ΔrecA) для получения штамма BD540 для экспрессии А12 (SEQ ID NO: 66).
Ферментация
600
600
600
Экспрессионные штаммы ферментировали в минимальной среде на основе глюкозы. Суточную заквасочную культуру инокулировали в десятилитровые ферментаторы, работающие при 37°С, аэрация 1 vvm с контролем каскада dO при 20%. Когда порция глюкозы исчерпывалась из среды (при ~OD=15), начинали ограничивающую линейную подачу глюкозы при 3,8 г/л/ч. Подачу продолжали до индукции 0,1 мМ IPTG и в течение последующего периода экспрессии белка. Для экспрессии А05 (SEQ ID NO: 55), штамм BD660 индуцировали при OD=25 и ферментацию продолжали в течение 7 часов после индукции (HPI). Экспрессии А22 (SEQ ID NO: 68) и А12 (SEQ ID NO: 66) из штаммов BD592 и BD540, соответственно, достигали путем индукции при OD=40 и ферментации в течение 24 HPI. В конце ферментации суспензию клеток собирали путем центрифугирования.
А62 (SEQ ID NO: 71)
Белки rP2086 получают как растворимые белки в цитоплазме штаммов Е. coli. Растворимый цитоплазматический экстракт обычно получают путем размораживания замороженных клеток, экспрессирующих конкретный вариант подсемейства А rP2086 в гипотоническом буфере (10 мМ Hepes-NaOH рН 7,4 с содержанием ингибиторов протеазы) и разрушения клеток в микрофлюидизаторе при ~20000 psi. РНКазу и ДНКазу добавляют для разложения нуклеиновых кислот и цитоплазматический экстракт собирают в виде супернатанта после центрифугирования с низкой скоростью для удаления любых неразрушенных клеток, а затем з высокой скоростью (≥100000 × g) для удаления мембран, стенок клеток и других крупных субклеточных компонентов.
2
Цитоплазматический экстракт подвергают дальнейшему осветлению путем последовательного регулирования до 25%, а затем 50% насыщенного сульфата аммония и удаления осажденного материала после каждого регулирования путем центрифугирования на низкой скорости. Низкомолекулярные ионные компоненты клеток затем удаляют путем адсорбирования rP2086 в 50% насыщенном сульфате аммония в буфере из 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, 1 мМ Na2EDTA на колонку гидрофобного взаимодействия (фенилсефарозу приобретали у GE Healthcare) с последующим элюированием rP2086 путем линейного снижения концентрации сульфата аммония до 0% с использованием буфера 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, 1 мМ NaEDTA. Большинство отрицательно заряженных белков затем удаляют путем регулирования содержащих rP2086 фракций до буфера прогона 10 мМ Tris-HCl, рН 8.6, 1 мМ Na2EDTA объединенных фракций через анионообменную колонку (ТМАЕ приобретали у EMD), уравновешенную тем же буфером. Затем rP2086 подвергают дальнейшей очистке путем хроматографии на керамическом гидроксиапатите (от BioRad) путем обмена буфера, содержащего rP2086, на 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, содержащего 1 мМ фосфата натрия, адсорбирующего белок в керамический гидроксиапатит, с дальнейшим элюированием с линейным градиентом фосфата натрия до 250 мМ при рН 7,4. Вышеперечисленные отдельные операции часто бывают достаточными для получения достаточного выхода представителей rP2086 подсемейства А. Однако, поскольку уровень экспрессии может колебаться в 10-кратных пределах при экспрессии rP2086 на нижнем конце диапазона или в случае необходимости в высокоочищенном rP2086 (при высокой концентрации для структурного определения ЯМР), добавляют следующие дополнительные отдельные операции: хроматофокусирование с последующей хроматографией на керамическом гидроксиапатите. Буфер, содержащий белок rP2086 с предыдущего гидроксиапатитного этапа меняют на 25 мМ Tris-ацетат, рН 8,3, и белок адсорбируют на колонку для хроматофокусирования РВЕ94 (от GE Healthcare), уравновешенную тем же буфером, а затем элюируют буфером полибуфер 94-ацетатом, рН 6. Белки rP2086 элюируются при ~pI, и фракции, содержащие белок, объединяют. Буфер содержащих rP2086 фракций затем меняют на 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, содержащий 1 мМ фосфата натрия, и адсорбируют и элюируют, как указано выше. Представители rP2086 подсемейства А, полученные с применением этого процесса, как правило, на >95% гомогенны согласно SDS-PAGE-анализу, чаще всего - на >99% гомогенны.
А05, А12 и А22 (SEQ ID NO: 55, 66 и 68, соответственно)
В конце ферментации суспензию клеток восстанавливают путем непрерывного центрифугирования и ресуспендируют до ~1/4 первоначального объема ферментации в 20 мМ Tris, 5 мМ EDTA, рН 6,0. Лизиса суспензии клеток достигают путем гомогенизации под высоким давлением (2 прогона, 4000-9000 psi). К гомогенату добавляют DADMAC до конечной концентрации 0,5%. Раствор перемешивают при 15-25°С в течение 60 минут, на протяжении которых образуется тяжелый осадок. Раствор осветляют путем непрерывного центрифугирования. Белки (А05, А12 и А22) очищают с применением двух этапов хроматографии с последующей окончательной заменой буфера. Уровень рН фугата регулируют до 5,5 и фугат подают на колонку GigaCap-S (СЕХ). Белок связывают со смолой, а затем элюируют с применением градиента хлорида натрия. К пулу с колонки СЕХ добавляют цитрат натрия до конечной концентрации 1,5 М и раствор подают на колонку Phenyl-650M (HIC). Белок связывают со смолой, а затем элюируют с применением ступенчатого градиента цитрата натрия. Пул HIC, содержащий очищенный белок, меняют на буфер готового лекарственного вещества путем диафильтрации. Применяют ультрафильтрационную кассету 5 кДа регенерированного ацетата целлюлозы. Заданная концентрация белка составляет 1,5-2,0 мг/мл. Диафильтрованный ретентат фильтруют через фильтр 0,2 микрона перед помещением в бутылки для хранения. Лекарственное вещество хранят при -70°С.
Пример 17: Сывороточный бактерицидный анализ
650
2
2
Титры функционального антитела исследовали с применением сывороточного бактерицидного анализа (SBA) против штаммов Neisseria meningitidis дикого типа или подвергнутых инженерии серогруппы В, экспрессирующих fHBP, с последовательностями, гомологичными или гетерологичными содержащимся в вакцине. Бактерицидные антитела сыворотки у кроликов, иммунизированных вакцинами rP2086, определяли, используя SBA с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов подвергали термоинактивации для устранения внутренней активности комплемента и последовательно подвергали серии разведений 1:2 в PBS Дульбекко с Са2+ и Mg2+ (D-PBS) в 96-луночном микротитровальном планшете для испытания бактерицидной активности сыворотки против штаммов N. meningitidis. Для комбинированных исследований подвергнутых инженерии штаммов соответствующие сыворотки смешивали в соотношении 1:1 перед описанными выше последовательными разведениями, таким образом, что эффективная концентрация каждого компонент составляла половину от той, которая была при испытании каждого в отдельности. Бактерии, используемые для анализа, выращивали в среде GC, дополненной добавкой Келлогга (GCK), и наблюдали по оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечном показателе оптической плотности OD 0,50-0,55, разводили в D-PBS и к аналитической смеси добавляли 1000-3000 КОЕ. Сыворотку человека без обнаружимой бактерицидной активности использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплементов испытывали на пригодность относительно каждого отдельного испытываемого штамма. Для изогенных штаммов одну сыворотку человека определяли и отбирали для SBA против всех изогенных штаммов. Источник комплемента использовали лишь в том случае, если количество бактерий, выживших в контрольных образцах без добавления иммунных сывороток, составляло >75%. После 30 минут инкубации при 37°С с 5% CO и перемешивания при 700 об/мин на вибростенде к реакционной смеси добавляли D-PBS и аликвоты переносили на микрофильтровальные планшеты, предварительно заполненные 50% среды GCK для штаммов дикого типа и 100% среды GCK для подвергнутых инженерии штаммов. Микрофильтровальные планшеты подвергали фильтрации, инкубировали в течение суток при 37°С с 5% CO и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Бактерицидные титры сыворотки определяли как интерполированное обратное разбавление сыворотки, которое приводило к 50% снижению КОЕ по сравнению с КОЕ в контрольных лунках без иммунных сывороток. Склонность к цитолизу под действием иммунных сывороток против rP2086 устанавливали при наличии 4-кратного или более повышения титра SBA для иммунных сывороток против rP2086 по сравнению с соответствующим неиммунные сыворотки. Сыворотки, которые были отрицательными по отношению к анализируемому штамму в начальном разведении, относили к титру, соответствующему половине предела обнаружения для пробы.
Пример 18: Иммуногенность нелипидированных вариантов белков rP2086 подсемейства А
4
Самок новозеландского кролика-альбиноса (2,5-3,5 кг), полученных от Charles River (Канада), использовали в двух исследованиях. Для первого исследования группы из 3 кроликов подвергали иммунизации с использованием 30 мкг или 3 мкг каждой из композиций fHBP липидированного А05 или нелипидированного А05. Для второго исследования пять кроликов / группу внутримышечно иммунизировали в правую заднюю конечность вариантами rP2086A в количестве 20 мкг/мл с добавлением 500 мкг/мл AlPO (0,5 мл/дозу / два места). Животных вакцинировали на 0, 4 и 9 неделях, подвергали кровопусканию на 0 и 6 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Титры специфического к LP2086 бактериального антитела определяли на 0, 6 и 10-й неделях.
Цель этих исследований состояла в моделировании сниженной реакции, которую наблюдали в иммунологически интактных популяциях, например, у новорожденных. Сначала сравнивали низкую и высокую дозу (30 vs 3 мкг каждого антигена на дозу) вакцин, содержащих липидированный А05 (SEQ ID NO: 13) или нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 55) (Таблицы 15А и 15В). Низкие дозы применяли таким образом, чтобы были различимы отличия в скорости реакции между вакцинами. Анализ SBA проводили с использованием двух наборов штаммов. Первый набор состоял из штаммов дикого типа, вызывающих инвазивную болезнь. Второй набор представлял подвергнутый генной инженерии штамм с тем же фоном и отличающийся только последовательностью fHBP, которая экспресировалась следующим образом: штамм N. meningitidis РМВ3556, экспрессирующий вариант В24 fHBP, подвергали инженерии, таким образом, чтобы его эндогенный ген fhbp был заменен на гены, кодирующие другие варианты fHBP. Последовательности строили таким образом, чтобы "включен" был только участок, кодирующий ORF, а окружающий генетический фон оставался интактным. Таким образом, анализ SBA с использованием этого набора позволял оценить реакционную способность против различных белков fHBP подсемейства А, экспрессируемых на одинаковом уровне и с одинаковым генетическим фоном, с использованием одного источника человеческого комплемента. Все штаммы имели уровень экспрессии fHBP выше порога, определяемого согласно публикации Jiang et al (2010). Как показано в Таблицах 15А и 15 В, и высокие, и низкие дозы липидированной А05-содержащей вакцины обеспечивали широкую защиту по разным генетически различным вариантам подсемейства А, в то время, как сниженная реакция наблюдалась при обеих дозах для вакцины, содержащей нелипидированный вариант А05. Таким образом, это непосредственное сравнение обнаружило, что, хотя нелипидированный вариант А05 обеспечивает перекрестную защиту по экспрессирующим подсемейство А штаммам, он не является настолько иммуногенным, как липидированный вариант, который с большей вероятностью образует естественную конфигурацию (Таблицы 15А и 15В).
Для следующего исследования уровень дозы повышали до 10 мкг для каждого нелипидированного варианта подсемейства А для оценки потенциала каждого в обеспечении широкой защиты против штаммов подсемейства А. Анализ SBA обнаружил, что все эти повышенные дозы сывороток кроликов, иммунизированных нелипидированными вариантами fHBP А05 (SEQ ID NO: 55), A62 (SEQ ID NO: 71), A12 (SEQ ID NO: 66) и A22 (SEQ ID NO: 68) индуцировали титры к штаммам дикого типа, экспрессирующим гомологичные и гетерологичные варианты подсемейства А, указывая, что все обеспечивали перекрестную защиту при этой низкой дозе в пределах подсемейства А. Таким образом, наблюдали, что вакцина N2C1 (А05) может генерировать антитела, способные убивать вариантные штаммы N1C2 (А22) и N2C2 (А12) и, подобным образом, вакцины из этих других групп могут убивать штаммы с противоположными вариантами. В этих условиях наблюдалось, что варианты А05 и А62 обеспечивали наивысшие показатели SBA-респондеров по штаммам (Таблица 16). Соответственно, демонстрируется защитный эффект по этим вариантам.
Таблицы 15А и 15В. Средние геометрические значения титров SBA против штаммов N. meningitidis группы В сывороток, взятых до и после (PD3=10 недель) иммунизации кроликов (n=3) с 30 или 3 мкг вакцин, содержащих липидированный или нелипидированный А05. Верхние строки (обозначение "штаммы дикого типа") Таблиц 15А и 15В представляют активность против клинических изолятов. Нижние строки (обозначение "изогенные штаммы") Таблиц 15А и 15В представляют активность против набора изогенных штаммов, которые были подвергнуты инженерии на основе исходного штамма N. meningitidis (РМВ3556), таким образом, чтобы весь ORF его эндогенного fHBP был заменен на варианты А05 (SEQ ID NO: 13), А22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) или A12 (SEQ ID NO: 14).
Таблица 16. Процент респондеров, демонстрирующих по меньшей мере 4-кратное повышение уровня SBA GMT относительно фона, из образцов 10-недельной сыворотки, взятой у кроликов, иммунизированных 10 мкг нелипидированных вариантов fHBP подсемейства А против штаммов, экспрессирующих варианты fHBP А05, А62, А12 или А22.
Перекрестная защита также наблюдалась для всех вариантов при применении набора изогенных штаммов, как описано выше, в повышенной дозе 10 мкг, с образцами сыворотки кроликов, иммунизированных вариантом А62 (SEQ ID NO: 71), демонстрирующими наибольшую перекрестную реактивность, с последующим применением антисывороток А05 (Таблица 17). Кроме того, образцы сыворотки кроликов, иммунизированных вариантом А62 (SEQ ID NO: 71) демонстрировали способность к реакции как с исходным штаммом РМВ3556, так и с переключенным штаммом В09 (Таблица 18), что указывало на то, что перекрестная реактивность распространяется на белки подсемейства В. Оказалось, что А62 состоит из доменов подсемейства А (А22) и подсемейства В (В09) (Фигура 9).
Таблица 17. Изогенные "переключенные" штаммы подвергали инженерии на основе исходного штамма N. meningitidis (РМВ3556), таким образом, чтобы весь ORF его эндогенного fHBP (вариант В24) был заменен на варианты А05 (SEQ ID NO: 13), A22(SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) или A12 (SEQ ID NO: 14). KA3011 является отрицательным контрольным штаммом (т.е., исходным РМВ3556, ген fhbp которого был делетирован). Среднегеометрические титры SBA (n=5) образцов сыворотки (взятых до или через 10 недель после иммунизации кроликов тремя дозами по 10 мкг нелипидированных вариантов fHBP подсемейства А) против этих штаммов показаны в верхних строках. Процент респондеров, демонстрирующих по меньшей мере 4-кратное повышение реакции относительно фона, показан в нижних строках.
Таблица 18. Среднегеометрические титры SBA образцов сыворотки (взятых до или через 10 недель после иммунизация кроликов (n=5) с 10 мкг нелипидированных белков подсемейства А (А62 (SEQ ID NO: 71); А05 (SEQ ID NO: 55); A12 (SEQ ID NO: 66); A22 (SEQ ID NO: 68)) против двух изогенных штаммов подсемейства В.
Пример 19: Оценка влияния комбинирования образцов сыворотки против нелипидированных белков подсемейства А на SBA
Комбинации сыворотки исследовали для оценки влияния на охват защиты. Испытывали пары образцов сыворотки до и после вакцинации для подтверждения отсутствия неспецифического цитолиза, вызванного в результате комбинирования сыворотки. Кратность повышения GM рассчитывали для отдельных образцов сыворотки и для комбинаций сыворотки по 4-м изогенным штаммам, которые представляли разнообразие в пределах подсемейства А. Обнаруживали кратное повышение для некоторых из испытанных комбинаций, что свидетельствовало о том, что охват защиты может быть расширен путем включения большего количества вариантов подсемейства А (Таблица 19). Оптимальными комбинациями являются А05 (SEQ ID NO: 55) с А62 (SEQ ID NO: 71) или A62 (SEQ ID NO: 71) с A12 (SEQ ID NO: 66) (Таблица 20).
Таблица 20. Кратность повышения для образцов сыворотки, испытываемых в комбинации по сравнению с каждым, испытываемым в отдельности (рассчитанная по Таблице 19).
Результаты, представленные выше в Примерах 18-19, показывают, что нелипидированные белки подсемейства А являются иммуногенными и могут обеспечивать защиту от инфицирования штаммами N. meningitidis с гомологичными или гетерологичными вариантами. Представленные здесь данные демонстрируют, что выбранные нелипидированные варианты подсемейства А сохраняют иммуногенность и обеспечивают перекрестную защиту от гетерологичных штаммов, хотя эти показатели реакции ниже, чем для липидированных вариантов. Авторами также было продемонстрировано, что антиген rP2086 А62 (SEQ ID NO: 71), имеющий подобие последовательности с подсемейством В (См., например, Фигура 9), может обеспечивать защиту от разных подсемейств, поскольку вакцина А62 (SEQ ID NO: 71) может убивать штаммы, экспрессирующие варианты В09 или В24 подсемейства В).
Представленные выше данные показывают, что нелипидированные варианты подсемейства А способны не только демонстрировать синергизм, наблюдаемый для комбинаций липидированных fHBP, но и могут обеспечивать защиту от вариантов подсемейства В.
Пример 20: Оценка иммуногенности комбинации фактор Н-связывающих белков и четырехвалентной вакцины менингококкового конъюгата у новозеландских кроликов-альбиносов
Исследование проводили на новозеландских кроликах-альбиносах, имеющих массу в пределах 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River, Канада (Таблица 21). Перед началом исследования 55 кроликов подвергали предварительному отбору на наличие антител с применением цельноклеточных анализов ELISA против штаммов А05 и В02. После отбора кроликов с относительно высокими титрами антитела (титры специфического IgG <350) вакцинировали внутримышечно в задние конечности, 0,5 мл в каждое место (1,0 мл на дозу, см. Таблицу 22) на 0, 4 и 9 неделях. Каждая группа включала три кролика. Кроликов подвергали кровопусканию на 0, 4, 6 и 9 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Подготавливали образцы сыворотки и образцы сыворотки 0 и 10 недель подвергали анализу на SBA. Конъюгатную менингококковую вакцину (MENVEO, конъюгатная менингококковая вакцина (Группы А, С, Y и W-135) олигосахарида дифтерии CRM197, Novartis), двухвалентный rLP2086 и четырехвалентный нелипидированный варианты и их комбинации изготавливали согласно Таблицам 23-26.
План исследования показан в Таблице 22.
Сведения о композиции
Нелипидированный четырехвалентный белок (В22, В09, А05 и В44) наблюдали на устойчивость в течение 6 часов при 2-8°С после комбинирования с MENVEO.
Пример 21: Сывороточный бактерицидный анализ (SBA)
Сывороточный бактерицидный анализ (SBA) на основе микроколоний против множественных менингококковых штаммов серогрупп В, С и Y (Таблица 27) проводили на отдельных образцах сыворотки. Человеческую сыворотку от доноров брали как источник комплемента для штамма, испытываемого при анализе. Опосредованные комплементом антителозависимые бактерицидные титры интерполировались и выражались как обратные показатели разбавления испытываемой сыворотки, убивающей 50% менингококковых клеток в пробе. Пределом обнаружения анализа был титр SBA 4. Титр SBA <4 получал номер 2. Рассчитывали и сравнивали повышение титров SBA ≥4 раза в 10-недельных образцах сыворотки по сравнению с титрами до иммунизации.
Пример 22: Иммуногенностькомбинации липидированных или нелипидированных фактор Н-связывающих белков и конъюгатной вакцины у новозеландских кроликов-альбиносов
Сывороточное бактериальное антитело представляет иммунологический имитатор защиты от менингококковой болезни. Вызывает ли иммунизация липидированными, нелипидированными rfHBP, четырехвалентными конъюгатными вакцинами, отдельно или в комбинации, выработку бактерицидных антител у кроликов, определяли по SBA. SBA измеряет уровень антител в образцах сыворотки путем имитации опосредованного комплементом бактериального лизиса, который происходит естественным путем. У человека титр SBA 1:4 считается обеспечивающим защиту; четырехкратное повышение титра в сравнении показателей до и после иммунизации также считается иммунологически релевантной иммунной реакцией. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 0 и 10 неделях, подвергали анализу на SBA против штаммов разных менингококковых серогрупп. Как показано в Таблице 28 (высокая доза) и 29 (низкая доза), через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя) четырехвалентные конъюгатные вакцины вызывали реакцию SBA только против испытываемых штаммов MnC и MnY. Все остальные образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против гомологичных штаммов, а также других испытываемых штаммов того же подсемейства fHBP, как в вакцинных композициях. Следует заметить, что иммунизация липидированными А05/В01 (SEQ ID NO: 13 и 58, соответственно) по отдельности в дозах по 30 мкг вызывала максимальную выработку бактерицидных антител против гомологичных штаммов, а также против других испытываемых штаммов обоих подсемейств fHBP (Таблица 28). Подобным образом иммунизация нелипидированными А05/В09/В22/В44 (SEQ ID NO: 55, 49, 75 и 44, соответственно) по отдельности также вызывала выработку бактерицидных антител против штаммов нескольких менингококковых серогруппа, даже несмотря на то, что титры SBA были в 3-15 раз ниже по сравнению с липидированной двухвалентной вакциной (Таблица 30). 100%-й показатель респондеров (≥4-кратное повышение титра SBA) достигался против всех штаммов различных серогрупп для липидированного fHBP, высокой дозы нелипидированного fHBP и всех комбинаций.
Образцы сыворотки кроликов до иммунизации не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Кроликов NZW (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 недели с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10
Образцы сыворотки кроликов до иммунизации не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Кроликов NZW (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 неделях с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10
Кроликов NZQ (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 неделях с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10
Липидированный fHBP вызывал более высокие титры SBA по сравнению с нелипидированным fHBP.
Липидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал в 3-15 раз более высокие титры SBA ко всем испытываемым штаммам менингококков В, С и Y. Нелипидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал в 4-23 раза более высокие титры SBA ко всем испытываемым штаммам менингококков В, С и Y (Таблицы 28-29).
Титрование дозы достигали с применением fHBP, конъюгатной вакцины или комбинаций
При более высокой дозе конъюгатной вакцины fHBP или их комбинации повышали реакцию SBA по сравнению с более низкой дозой (Таблицы 28-30). Одна доза конъюгатной вакцины для человека вызывала 2-8-кратное повышение титров SBA против штаммов менингококков С и Y по сравнению с одной десятой дозы конъюгатной вакцины. Липидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал 2-4-кратное повышение титров SBA против всех испытываемых штаммов по сравнению с 3 мкг на дозу. Нелипидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал 4-15-кратное повышение титров SBA против всех штаммов менингококков серогрупп В, С и Y по сравнению с 3 мкг на дозу.
Синергетические реакции SBA при комбинации fHBP и конъюгатных вакцин
4
4
Существует тенденция в сторону повышения реакций SBA против штаммов менингококков серогрупп С и Y при применении комбинации конъюгатной вакцины и fHBP по сравнению с применением любого из компонентов в отдельности с добавлением более низкой дозы липидированного или нелипидированного fHBP (Таблица 29). В данном исследовании функциональную активность против штаммов нескольких менингококковых серогрупп оценивали с использованием сыворотки новозеландских кроликов-альбиносов, иммунизированных рекомбинантным липидированным или нелипидированным fHBP в композиции с AlPO и конъюгатной вакциной отдельно или в комбинации. Кролики, получавшие конъюгатную вакцину, демонстрировали реакцию SBA только против штаммов менингококков серогрупп С и Y, но не штаммов серогруппы В. Липидированный или нелипидированный fHBP в композиции с AlPO вызывали выработку сывороточных антител, которые были бактерицидными против штаммов всех испытываемых менингококковых серогрупп.
4
Новозеландские кролики-альбиносы, получавшие три дозы липидированного или нелипидированного fHBP в композиции с AlPO, вырабатывали сывороточные антитела, которые были бактерицидными против испытываемых штаммов менингококков серогрупп В, С и Y. 100%-й показатель респондеров (≥ 4-кратное повышение титра SBA) достигался против всех испытываемых штаммов, за исключением низкодозовой нелипидированной группы.
Липидированный fHBP вызывал большие титры бактериального антитела по сравнению с нелипидированными формами. Явная реакция на дозу наблюдалась при липидированном или нелипидированном fHBP и конъюгатной вакцине отдельно или в комбинациях.
Существует тенденция в сторону повышения реакций SBA против штаммов менингококков серогрупп С и Y между конъюгатной вакциной и fHBP, в частности, при добавлении низких доз белков.
Пример 23: Оценка иммуногенности комбинаций нелипидированных фактор Н-связывающих белков у новозеландских кроликов-альбиносов
Исследования проводили на новозеландских кроликах-альбиносах весом 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River, Канада (Таблица 31). Кроликов вакцинировали внутримышечно в заднюю конечность, 0,5 мл в каждое место (1,0 мл на дозу, см. Таблицу 32) на 0, 4 и 9 неделях. Идентификационные номера последовательностей для каждого из исследованных антигенов представлены в Таблице 33. Использовали 10 кроликов на группу. Кроликов подвергали кровопусканию на 0 и 6 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Подготавливали образцы сыворотки и образцы сыворотки 0 и 10 недель подвергали анализу в SBA против ряда изолятов N. meningitidis.
В Таблице 34 представлены показатели иммунной реакции у кроликов на смеси нелипидированных белков fHBP по сравнению с иммунной реакцией на пару липидированных антигенов rLP2086-A05 и rLP2086-B01. Образцы сыворотки кролика до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Иммунная реакция представлена как процент животных в каждой экспериментальной группе, которые реагировали на соответствующие комбинации антигенов fHBP после третьей иммунизации с повышением титра SBA ≥4 раза. Анализ SBA осуществляли, используя заданные штаммы N. meningitidis, которые либо экспрессируют варианты fHBP, идентичные иммуногену вакцины (А05, А12), либо экспрессируют гетерологичные варианты fHBP (А22, В16, В24). Сравнительная идентичность аминокислотной последовательности варианта А22 fHBP имеет до 15% отличия от исследованных вариантов подсемейства А. Подобным образом сравнительная идентичность аминокислотной последовательности вариантов fHBP В16 и В24 имеет до 12% отличия от вариантов подсемейства В, включенных в качестве антигенов.
В группах кроликов, иммунизированных 10 мкг каждого испытываемого варианта rP2086, образцы сыворотки животных, получавших комбинацию А05 + А62 + В09 + В44, демонстрировали наивысший показатель бактерицидной реакции. Реакция SBA была несколько сниженной у животных, получавших только по 5 мкг той же смеси четырех нелипидированных вариантов fHBP. Другие 4-валентные группы антигенов fHBP в дозах 5 мкг проявляли себя так же, как и комбинация нелипидированных А05 + А62 + В09 + В44. Из испытанных 4-валентных комбинаций образцы сыворотки из экспериментальной группы, включавшей по 5 мкг нелипидированных вариантов fHBP А12 + А62 + В09 + В44, имели наилучшие показатели реакции SBA для выбранных анализируемых штаммов. Показатель реакции на пятивалентную нелипидированную комбинацию из А05 + А12 + А62 + В09 + В44 был несколько лучшим по сравнению с реакцией на любую из испытанных 4-валентных комбинаций.
--->
Список последовательностей
<110>  ПФАЙЗЕР ИНК.
АНДЕРСОН Аннализа Сибил
ХОЙСЕТ Сюзан Кэй
ДЖЕНСЕН Кэтрин Юте
РАППЕН Марк Е.
МОРАН Джастин Кейт
<120>  КОМПОЗИЦИИ NEISSERIA MENINGITIDIS И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  PC071917
<160>  81
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  780
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  1
tgcagcagcg gaggcggagg cggcggtgtc gccgccgaca tcggcacggg gcttgccgat       60
gcactaactg cgccgctcga ccataaagac aaaggtttga aatccctgac attggaagac      120
tccattcccc aaaacggaac actgaccctg tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa      180
gccggcgaca aagacaacag cctcaacacg ggcaaactga agaacgacaa aatcagccgc      240
ttcgacttcg tgcaaaaaat cgaagtggac ggacaaacca tcacactggc aagcggcgaa      300
tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac      360
aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc      420
ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc ggcgacaaag ccgagtatca cggcaaagca      480
ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg acctatacca tagattttgc cgccaaacag      540
ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc      600
gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc      660
gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc      720
tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag      780
<210>  2
<211>  786
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  2
tgcagcagcg gaagcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacagggctt       60
gccgatgcac taactgcgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg      120
gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact      180
ttcaaagtcg gcgacaaaga caacagtctc aatacaggca aattgaagaa cgacaaaatc      240
agccgcttcg actttgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc      300
ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa      360
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt      420
ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccagcg gcaaagccga gtatcacggc      480
aaagcattca gctccgacga tgccggcgga aaactgacct ataccataga ttttgccgcc      540
aaacagggac acggcaaaat cgaacacctg aaaacacccg agcagaatgt cgagcttgcc      600
tccgccgaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgccgtca ttttgggcga cacgcgctac      660
ggcagcgaag aaaaaggcac ttaccacctc gctcttttcg gcgaccgagc ccaagaaatc      720
gccggctcgg caaccgtgaa gataagggaa aaggttcacg aaatcggcat cgccggcaaa      780
cagtag                                                                 786
<210>  3
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  3
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa      300
cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc      360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc      420
ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac      480
ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc      540
gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat      600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact      660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag      720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag                      765
<210>  4
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  4
tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacattggtg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa      300
cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc      360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc      420
ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac      480
ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc      540
gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat      600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact      660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag      720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag                      765
<210>  5
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  5
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa      300
caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc      360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc      420
ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat      480
gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc      540
gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat      600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact      660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag      720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag                      765
<210>  6
<211>  792
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  6
tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg       60
cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca      120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga      180
actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa      240
atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag      300
agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag      360
caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc      420
gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat      480
cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc      540
gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac      600
ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc      660
ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag      720
gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc      780
gccaagcaat aa                                                          792
<210>  7
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  7
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa      300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag aacaagatcc agagcattcc      360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccggttcaaa atcggcgaca tagcgggcga acatacatct      420
tttgacaagc ttcccaaaga cgtcatggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac      480
gatgccggcg gaaaactgac ctatactata gattttgctg ccaaacaggg acacggcaaa      540
atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg      600
gatgaaaaac accatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaatcaaga cgagaaaggc      660
agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg      720
gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcaataa                   768
<210>  8
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  8
tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa      300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc      360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct      420
tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac      480
gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa      540
atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg      600
gatgaaaaac gccatgccgt tatcagcggt tccgtccttt acaaccaaga cgagaaaggc      660
agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg      720
gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa                   768
<210>  9
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  9
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa      300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca      360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct      420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac      480
gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa      540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg      600
gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc      660
agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg      720
gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa                   768
<210>  10
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  10
tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc      240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa      300
caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc      360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct      420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac      480
gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa      540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg      600
gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc      660
agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg      720
aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa                   768
<210>  11
<211>  792
<212>  ДНК
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  11
tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg       60
cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca      120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga      180
actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa      240
atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag      300
agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag      360
caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc      420
gacatagtgg gcgaacatac atcttttggc aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat      480
cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc      540
gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgccagaact caatgttgac      600
ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc      660
ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag      720
gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc      780
gccaagcaat aa                                                          792
<210>  12
<211>  259
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  12
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
20                  25                  30
Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu
35                  40                  45
Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys
50                  55                  60
Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu
85                  90                  95
Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val
100                 105                 110
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu
115                 120                 125
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
130                 135                 140
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
145                 150                 155                 160
Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165                 170                 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu
180                 185                 190
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
195                 200                 205
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
210                 215                 220
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
225                 230                 235                 240
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
245                 250                 255
Gly Lys Gln
<210>  13
<211>  261
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  13
Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20                  25                  30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35                  40                  45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly
50                  55                  60
Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile
85                  90                  95
Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala
100                 105                 110
Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp
115                 120                 125
Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu
130                 135                 140
His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile
165                 170                 175
Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr
180                 185                 190
Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu
195                 200                 205
Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu
210                 215                 220
Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile
225                 230                 235                 240
Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly
245                 250                 255
Ile Ala Gly Lys Gln
260
<210>  14
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  14
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100                 105                 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115                 120                 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130                 135                 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly
165                 170                 175
Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180                 185                 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195                 200                 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210                 215                 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225                 230                 235                 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250
<210>  15
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  15
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100                 105                 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115                 120                 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130                 135                 140
Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180                 185                 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195                 200                 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210                 215                 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225                 230                 235                 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250
<210>  16
<211>  263
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  16
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20                  25                  30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35                  40                  45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50                  55                  60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85                  90                  95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100                 105                 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
115                 120                 125
Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130                 135                 140
Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165                 170                 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180                 185                 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195                 200                 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210                 215                 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225                 230                 235                 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245                 250                 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210>  17
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  17
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg
115                 120                 125
Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
180                 185                 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  18
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  18
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
180                 185                 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  19
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  19
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180                 185                 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  20
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  20
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180                 185                 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  21
<211>  263
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  21
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20                  25                  30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35                  40                  45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50                  55                  60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85                  90                  95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100                 105                 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
115                 120                 125
Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130                 135                 140
Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165                 170                 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180                 185                 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195                 200                 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210                 215                 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225                 230                 235                 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245                 250                 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210>  22
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность: прямой праймер
<400>  22
tgccatatga gcagcggaag cggaag                                            26
<210>  23
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность: обратный праймер
<400>  23
cggatcccta ctgtttgccg gcgatgc                                           27
<210>  24
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность: прямой праймер
<400>  24
tttcttcccg ggaaggagat atacatatgt gcagcagcgg aggcggcgg                   49
<210>  25
<211>  38
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность: обратный праймер
<400>  25
tttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat                               38
<210>  26
<211>  46
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность: прямой праймер
<400>  26
tttcttcccg ggaaggagat atacatatga gcagcggagg cggcgg                      46
<210>  27
<211>  38
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность: обратный праймер
<400>  27
tttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat                               38
<210>  28
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  28
atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtgga                                 36
<210>  29
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  29
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10
<210>  30
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  30
atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt gga                                    33
<210>  31
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  31
Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10
<210>  32
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  32
atgagctctg gaggtggagg a                                                 21
<210>  33
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  33
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>  34
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  34
atgagcagcg ggggcggtgg a                                                 21
<210>  35
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  35
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20                  25
<210>  36
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  36
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20                  25
<210>  37
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  37
Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20                  25
<210>  38
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  38
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20
<210>  39
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  39
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20
<210>  40
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  40
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20
<210>  41
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<220>
<221>  ДРУГИЕ ОСОБЕННОСТИ
<222>  (15)..(15)
<223>  X является G или V
<400>  41
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Xaa
1               5                   10                  15
<210>  42
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  42
atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cgggg                       45
<210>  43
<211>  789
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  43
agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta       60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta      120
gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaacgtact      180
tttaaagccg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc      240
tcgcgttttg atttcattcg tcaaatcgaa gtagatggcc aacttattac attagaaagc      300
ggtgaattcc aagtatataa acaatcccat tcagcactta cagcattgca aaccgaacag      360
gtccaagact cagaacattc cggcaaaatg gtagctaaac gtcaattccg catcggtgac      420
attgtcggtg aacatacaag cttcggaaaa ttaccaaaag atgtgatggc gacctatcgc      480
ggtacggcat ttggatcaga tgatgcaggc ggtaaattaa cttatacaat tgactttgca      540
gcaaaacaag gacatggcaa aattgaacat ttaaaatctc ccgaacttaa cgtagatctc      600
gcagcagcag atattaaacc agatgaaaaa caccacgcag tcatttcagg ttcagtttta      660
tacaatcagg cagaaaaagg ttcgtactct ttaggtattt ttggcgggca agctcaagaa      720
gttgcaggta gcgcagaagt agaaacggca aatggcattc gtcacattgg gttagcggcg      780
aaacaataa                                                              789
<210>  44
<211>  262
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  44
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20                  25                  30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35                  40                  45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly
50                  55                  60
Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile
85                  90                  95
Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala
100                 105                 110
Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly
115                 120                 125
Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Glu
130                 135                 140
His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr
165                 170                 175
Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys
180                 185                 190
Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp
195                 200                 205
Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala
210                 215                 220
Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu
225                 230                 235                 240
Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile
245                 250                 255
Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210>  45
<211>  780
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  45
agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta       60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgcagtc gcttacctta      120
gatcagtctg tcaggaaaaa tgagaaactt aagttggcgg cgcaaggcgc tgaaaaaact      180
tatggaaacg gtgacagctt aaatacaggt aaactcaaaa atgataaagt ctcgcgtttt      240
gatttcattc gtcaaatcga agtagatggc aagcttatta cattagaaag cggtgaattc      300
caagtatata aacaatccca ttcagcactt acagcattgc aaaccgaaca ggtccaagac      360
tcagaagatt ccggcaaaat ggtagctaaa cgtcaattcc gcatcggtga cattgcgggt      420
gaacatacaa gcttcgacaa attaccaaaa ggcggcagtg cgacctatcg cggtacggca      480
tttggatcag atgatgcagg cggtaaatta acttatacaa ttgactttgc agcaaaacaa      540
ggacatggca aaattgaaca tttaaaatct cccgaactta acgtagagct cgcaaccgca      600
tatattaaac cagatgaaaa acgccacgca gtcatttcag gttcagtttt atacaatcag      660
gacgaaaaag gttcgtactc tttaggtatt tttggcgggc aagctcaaga agttgcaggt      720
agcgcagaag tagaaacggc aaatggcatt caccacattg ggttagcggc gaaacaataa      780
<210>  46
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  46
agctctggag gtggaggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg       60
gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg      120
aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac      180
agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa      240
atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa      300
tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc      360
aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc      420
gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat      480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt      540
gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat      600
gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg      660
tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa      720
acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa                      765
<210>  47
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  47
agcagcgggg gcggtggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg       60
gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg      120
aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac      180
agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa      240
atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa      300
tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc      360
aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc      420
gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat      480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt      540
gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat      600
gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg      660
tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa      720
acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa                      765
<210>  48
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  48
agcagcggag ggggcggtgt cgccgccgac atcggtgcgg ggcttgccga tgcactaacc       60
gcaccgctcg accataaaga caaaggtttg cagtctttaa cactggatca gtccgtcagg      120
aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac      180
agccttaata cgggcaaatt gaagaacgac aaggtcagcc gcttcgactt tatccgtcaa      240
atcgaagtgg acgggaagct cattaccttg gagagcggag agttccaagt gtacaaacaa      300
agccattccg ccttaaccgc ccttcagacc gagcaagtac aagactcgga ggattccggg      360
aagatggttg cgaaacgcca gttcagaatc ggcgacatag cgggcgaaca tacatctttt      420
gacaagcttc ccaaaggcgg cagtgcgaca tatcgcggga cggcgttcgg ttcagacgat      480
gctggcggaa aactgaccta tactatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc      540
gaacatttga aatcgcccga actcaatgtc gagcttgcca ccgcctatat caagccggat      600
gaaaaacgcc atgccgttat cagcggttcc gtcctttaca accaagacga gaaaggcagt      660
tactccctcg gtatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc ggaagtggaa      720
accgcaaacg gcatacacca tatcggtctt gccgccaagc agtaa                      765
<210>  49
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  49
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20                  25                  30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35                  40                  45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50                  55                  60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85                  90                  95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100                 105                 110
Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115                 120                 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130                 135                 140
Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu
180                 185                 190
Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195                 200                 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210                 215                 220
Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu
225                 230                 235                 240
Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250
<210>  50
<211>  259
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  50
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20                  25                  30
Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
35                  40                  45
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50                  55                  60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu
85                  90                  95
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
100                 105                 110
Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val
115                 120                 125
Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
130                 135                 140
Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165                 170                 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
180                 185                 190
Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg
195                 200                 205
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly
210                 215                 220
Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly
225                 230                 235                 240
Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala
245                 250                 255
Ala Lys Gln
<210>  51
<211>  789
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  51
agcagcggag gcggcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cgcggggctt       60
gccgatgcac taaccgcacc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg      120
gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaagaact      180
ttcaaagccg gcgacaaaga caacagtctc aacacaggca aactgaagaa cgacaaaatc      240
agccgcttcg actttatccg tcaaatcgaa gtggacgggc agctcattac cttggagagc      300
ggagagttcc aagtgtacaa acaaagccat tccgccttaa ccgcccttca gaccgagcaa      360
gtacaagact cggagcattc cgggaagatg gttgcgaaac gccagttcag aatcggcgac      420
atagtgggcg aacatacatc ttttggcaag cttcccaaag acgtcatggc gacatatcgc      480
gggacggcgt tcggttcaga cgatgccggc ggaaaactga cctacaccat agatttcgcc      540
gccaagcagg gacacggcaa aatcgaacat ttgaaatcgc cagaactcaa tgttgacctg      600
gccgccgccg atatcaagcc ggatgaaaaa caccatgccg tcatcagcgg ttccgtcctt      660
tacaaccaag ccgagaaagg cagttactct ctaggcatct ttggcgggca agcccaggaa      720
gttgccggca gcgcggaagt ggaaaccgca aacggcatac gccatatcgg tcttgccgcc      780
aagcaataa                                                              789
<210>  52
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  52
atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtg                       45
<210>  53
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  53
atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cgggg                       45
<210>  54
<211>  783
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеотидная последовательность
<400>  54
agcagcggaa gcggaagcgg aggcggcggt gtcgccgccg acatcggcac agggcttgcc       60
gatgcactaa ctgcgccgct cgaccataaa gacaaaggtt tgaaatccct gacattggaa      120
gactccattt cccaaaacgg aacactgacc ctgtcggcac aaggtgcgga aaaaactttc      180
aaagtcggcg acaaagacaa cagtctcaat acaggcaaat tgaagaacga caaaatcagc      240
cgcttcgact ttgtgcaaaa aatcgaagtg gacggacaaa ccatcacgct ggcaagcggc      300
gaatttcaaa tatacaaaca ggaccactcc gccgtcgttg ccctacagat tgaaaaaatc      360
aacaaccccg acaaaatcga cagcctgata aaccaacgct ccttccttgt cagcggtttg      420
ggcggagaac ataccgcctt caaccaactg cccagcggca aagccgagta tcacggcaaa      480
gcattcagct ccgacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ccatagattt tgccgccaaa      540
cagggacacg gcaaaatcga acacctgaaa acacccgagc agaatgtcga gcttgcctcc      600
gccgaactca aagcagatga aaaatcacac gccgtcattt tgggcgacac gcgctacggc      660
agcgaagaaa aaggcactta ccacctcgct cttttcggcg accgagccca agaaatcgcc      720
ggctcggcaa ccgtgaagat aagggaaaag gttcacgaaa tcggcatcgc cggcaaacag      780
tag                                                                    783
<210>  55
<211>  260
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  55
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
1               5                   10                  15
Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
20                  25                  30
Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr
35                  40                  45
Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp
50                  55                  60
Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr
85                  90                  95
Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val
100                 105                 110
Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser
115                 120                 125
Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His
130                 135                 140
Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165                 170                 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro
180                 185                 190
Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys
195                 200                 205
Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys
210                 215                 220
Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile
245                 250                 255
Ala Gly Lys Gln
260
<210>  56
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  56
Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>  57
<211>  259
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  57
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20                  25                  30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35                  40                  45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50                  55                  60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu
85                  90                  95
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
100                 105                 110
Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Val
115                 120                 125
Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
130                 135                 140
Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165                 170                 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
180                 185                 190
Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His
195                 200                 205
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly
210                 215                 220
Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly
225                 230                 235                 240
Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala
245                 250                 255
Ala Lys Gln
<210>  58
<211>  260
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  58
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20                  25                  30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35                  40                  45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
50                  55                  60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
85                  90                  95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr
100                 105                 110
Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met
115                 120                 125
Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr
130                 135                 140
Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165                 170                 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro
180                 185                 190
Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys
195                 200                 205
His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys
210                 215                 220
Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu
245                 250                 255
Ala Ala Lys Gln
260
<210>  59
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  59
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180                 185                 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  60
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  60
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180                 185                 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  61
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  61
ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa      300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca      360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct      420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac      480
gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa      540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg      600
gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc      660
agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg      720
gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa                   768
<210>  62
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  62
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180                 185                 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195                 200                 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210                 215                 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225                 230                 235                 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250                 255
<210>  63
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  63
ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa      300
caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc      360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc      420
ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat      480
gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc      540
gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat      600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact      660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag      720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtaa                      765
<210>  64
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  64
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100                 105                 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115                 120                 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130                 135                 140
Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180                 185                 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195                 200                 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210                 215                 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225                 230                 235                 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250
<210>  65
<211>  786
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  65
atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg aacaggatta       60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta      120
gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaaaaaact      180
tttaaagtcg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc      240
tcgcgttttg atttcgtgca aaaaatcgaa gtagatggcc aaaccattac attagcaagc      300
ggtgaattcc aaatatataa acaagaccat tcagcagtcg ttgcattgca aattgaaaaa      360
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gttccttcct tgtcagcggt      420
ttgggcggtg aacatacagc cttcaaccaa ttaccaagcg gcaaagcgga gtatcacggt      480
aaagcattta gctcagatga tgcaggcggt aaattaactt atacaattga ctttgcagca      540
aaacaaggac atggcaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agagctcgca      600
tccgcagaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgcagtca ttttgggtga cacgcgctac      660
ggcagcgaag aaaaaggtac ttaccactta gctctttttg gcgaccgagc tcaagaaatc      720
gcaggtagcg caaccgtaaa gataagggaa aaggttcacg aaattgggat cgcgggcaaa      780
caataa                                                                 786
<210>  66
<211>  258
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  66
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1               5                   10                  15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20                  25                  30
Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
35                  40                  45
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50                  55                  60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85                  90                  95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala
100                 105                 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115                 120                 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130                 135                 140
Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr
165                 170                 175
Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180                 185                 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195                 200                 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr
210                 215                 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225                 230                 235                 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245                 250                 255
Lys Gln
<210>  67
<211>  780
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  67
atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtggagttg cagcagacat tggagcagga       60
ttagcagatg cactgacggc accgttggat cataaagaca aaagtttgca gtcgcttacc      120
ttagatcagt ctgtcaggaa aaatgagaaa cttaagttgg cggcgcaagg cgctgaaaaa      180
acttatggaa acggtgacag cttaaataca ggtaaactca aaaatgataa agtctcgcgt      240
tttgatttca ttcgtcaaat cgaagtagat ggccaaacca ttacattagc aagcggtgaa      300
ttccaaatat ataaacaaaa ccattcagca gtcgttgcat tgcaaattga aaaaatcaac      360
aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgttcct tccttgtcag cggtttgggc      420
ggtgaacata cagccttcaa ccaattacca gacggcaaag cggagtatca cggtaaagca      480
tttagctcag atgatccgaa cggtaggtta cactattcca ttgactttac caaaaaacaa      540
ggatacggca gaattgaaca tttaaaaacg cccgaacaga acgtagagct cgcatccgca      600
gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgca gtcattttgg gtgacacgcg ctacggcggc      660
gaagaaaaag gtacttacca cttagccctt tttggcgacc gcgctcaaga aatcgcaggt      720
agcgcaaccg taaagataag ggaaaaggtt cacgaaattg ggatcgcggg caaacaataa      780
<210>  68
<211>  253
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  68
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser
20                  25                  30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35                  40                  45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50                  55                  60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85                  90                  95
Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys
100                 105                 110
Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe
115                 120                 125
Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro
130                 135                 140
Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His
165                 170                 175
Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala
180                 185                 190
Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly
195                 200                 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu
210                 215                 220
Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile
225                 230                 235                 240
Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250
<210>  69
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  69
atgagctctg gaggtggagg agttgcagca gacattggag caggattagc agatgcactg       60
acggcaccgt tggatcataa agacaaaagt ttgcagtcgc ttaccttaga tcagtctgtc      120
aggaaaaatg agaaacttaa gttggcggcg caaggcgctg aaaaaactta tggaaacggt      180
gacagcttaa atacaggtaa actcaaaaat gataaagtct cgcgttttga tttcattcgt      240
caaatcgaag tagatggcca acttattaca ttagaaagcg gtgaattcca aatatataaa      300
caagaccatt cagcagtcgt tgcattgcaa attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc      360
gacagcctga taaaccaacg ttccttcctt gtcagcggtt tgggcggtga acatacagcc      420
ttcaaccaat taccaagcgg caaagcggag tatcacggta aagcatttag ctcagatgat      480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt      540
gaacatttaa aaacacccga acagaacgta gagctcgcat ccgcagaact caaagcagat      600
gaaaaatcac acgcagtcat tttgggtgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggtact      660
taccacttag ctctttttgg cgaccgagct caagaaatcg caggtagcgc aaccgtaaag      720
ataagggaaa aggttcacga aattgggatc gcgggcaaac aataa                      765
<210>  70
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  70
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115                 120                 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130                 135                 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180                 185                 190
Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195                 200                 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210                 215                 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225                 230                 235                 240
Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250                 255
<210>  71
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  71
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20                  25                  30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35                  40                  45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50                  55                  60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85                  90                  95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100                 105                 110
Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115                 120                 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130                 135                 140
Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180                 185                 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195                 200                 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210                 215                 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225                 230                 235                 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250
<210>  72
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  72
atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta       60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc      120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc      180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt      240
caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa      300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc      360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct      420
tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac      480
gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaaacaggg acacggcaaa      540
atcgaacact tgaaaacacc cgagcaaaat gtcgagcttg cctccgccga actcaaagca      600
gatgaaaaat cacacgccgt cattttgggc gacacgcgct acggcggcga agaaaaaggc      660
acttaccacc tcgccctttt cggcgaccgc gcccaagaaa tcgccggctc ggcaaccgtg      720
aagataaggg aaaaggttca cgaaatcggc atcgccggca aacagtaa                   768
<210>  73
<211>  786
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность
<400>  73
atgtccagcg gttcaggcag cggcggtgga ggcgtggcag cagatatcgg aacaggttta       60
gcagatgctc tgacagcacc cttagatcac aaagacaaag gacttaaatc actgacattg      120
gaagattcta tctcgcaaaa tggtactctc actctttcag cccaaggcgc agaaaaaaca      180
tttaaagtag gcgataaaga taactcctta aatacaggta aattaaaaaa tgacaaaatc      240
tcacggtttg atttcgttca gaaaattgaa gtagatggac aaacgattac attagcaagc      300
ggcgaattcc aaatttataa acaagaccat tcagcagtag tagcattaca aatcgaaaaa      360
attaacaacc cggacaaaat tgattctctt attaaccaac gctcttttct cgtatcagga      420
cttggtggtg aacatacagc gtttaatcaa ctgccgtcag gaaaagcaga atatcatggt      480
aaagcatttt catcagacga cgcaggtggc aaactgacct atactattga ctttgcagca      540
aaacagggac atggaaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agaactggcc      600
tcagcagaat tgaaagctga tgaaaaatcc catgcagtaa ttttaggcga tacacgttac      660
ggtagcgaag aaaaaggtac atatcactta gctctttttg gcgatcgtgc tcaagaaatt      720
gctggttccg caacagttaa aatccgtgaa aaagtacatg aaatcggcat tgcaggtaaa      780
caataa                                                                 786
<210>  74
<211>  262
<212>  PRT
<213>  Neisseria meningitidis (группа B)
<400>  74
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20                  25                  30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn
35                  40                  45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala
50                  55                  60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr
85                  90                  95
Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser
100                 105                 110
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile
115                 120                 125
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly
130                 135                 140
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His
145                 150                 155                 160
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr
165                 170                 175
Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys
180                 185                 190
Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp
195                 200                 205
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
210                 215                 220
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
245                 250                 255
Gly Ile Ala Gly Lys Gln
260
<210>  75
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  75
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser
20                  25                  30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35                  40                  45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50                  55                  60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85                  90                  95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100                 105                 110
Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115                 120                 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130                 135                 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180                 185                 190
Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195                 200                 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210                 215                 220
Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu
225                 230                 235                 240
Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250
<210>  76
<211>  258
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  76
Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu
20                  25                  30
Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr
35                  40                  45
Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp
50                  55                  60
Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe
65                  70                  75                  80
Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85                  90                  95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala
100                 105                 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115                 120                 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130                 135                 140
Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
165                 170                 175
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180                 185                 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195                 200                 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr
210                 215                 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225                 230                 235                 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245                 250                 255
Lys Gln
<210>  77
<211>  257
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  77
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu
35                  40                  45
Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn
50                  55                  60
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser
85                  90                  95
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
100                 105                 110
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
115                 120                 125
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
130                 135                 140
Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
165                 170                 175
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
180                 185                 190
Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
195                 200                 205
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
210                 215                 220
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
225                 230                 235                 240
Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
245                 250                 255
Gln
<210>  78
<211>  255
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  78
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20                  25                  30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35                  40                  45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50                  55                  60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85                  90                  95
Gln Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu
100                 105                 110
Gln Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115                 120                 125
Phe Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130                 135                 140
Pro Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp
145                 150                 155                 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165                 170                 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180                 185                 190
Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195                 200                 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210                 215                 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225                 230                 235                 240
Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250                 255
<210>  79
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  79
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20                  25                  30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35                  40                  45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50                  55                  60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85                  90                  95
Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100                 105                 110
Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe
115                 120                 125
Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro
130                 135                 140
Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180                 185                 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195                 200                 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210                 215                 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225                 230                 235                 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245                 250
<210>  80
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  80
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20                  25                  30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35                  40                  45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50                  55                  60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85                  90                  95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln
100                 105                 110
Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115                 120                 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130                 135                 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165                 170                 175
Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180                 185                 190
Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195                 200                 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210                 215                 220
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys
225                 230                 235                 240
Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250
<210>  81
<211>  252
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая аминокислотная последовательность
<400>  81
Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr
20                  25                  30
Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln
35                  40                  45
Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys
50                  55                  60
Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu
65                  70                  75                  80
Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr
85                  90                  95
Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln
100                 105                 110
Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile
115                 120                 125
Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly
130                 135                 140
Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly
145                 150                 155                 160
Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly
165                 170                 175
Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala
180                 185                 190
Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser
195                 200                 205
Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe
210                 215                 220
Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val
225                 230                 235                 240
Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245                 250
<---