Генетическое разнообразие четного и нечетного поколений горбуши Oncorhynchusgorbuscha (Walbaum, 1792) реки Ола (Охотское море)

УДК 597.533.2

С.П. Пустовойт

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТНОГО И НЕЧЕТНОГО

ПОКОЛЕНИЙ ГОРБУШИ ONCORHYNCHUS GORBUSCHA

РЕКИ ОЛА

Рассмотрена генетическая изменчивость двух генов мтДНК горбуши р. Ола (Тауйская губа, Охотское море) с целью определения современного состояния ее биологического разнообразия. Исследование показало, что генетическое разнообразие фрагмента гена субъединица 1 цитохром-оксидазы с (COI) в выборке нечетного года (2015 г.) у горбуши было существенно выше, чем в выборке за 2016 г. Однако по нуклеотидным частотам фрагмента гена цитохром b генетическое разнообразие выше в выборке четного, 2016 г. по сравнению с выборкой нечетного года. Полученные данные указывают на существенные различия уровней генетического разнообразия между выборками нечетного и четного поколений горбуши р. Ола. Наиболее вероятным объяснением отмеченного факта является первостепенное влияние естественного отбора. Малочисленные поколения горбуши возникают под влиянием селективных факторов в период нереста и роста молоди в пресноводный этап жизненного цикла. Уменьшение численности поколения приводит к снижению уровня генетического разнообразия популяции горбуши.

Ключевые слова: горбуша, генетическое разнообразие, Охотское море, субъединица 1 цитохром-оксидазы с, цитохром b.

S.P. Pustovoit

GENETIC DIVERSITY OF EVEN AND ODD GENERATIONS OF PINK SALMON ONCORHYNCHUS GORBUSCHA (WALBAUM, 1792) FROM THE OLA RIVER

We studied the genetic variability of two mtDNA genes in the pink salmon from the Ola River (Taui Bay, Sea of Okhotsk) in order to determine the current state of its biological diversity. Cytochrome coxidase subunit I (COI) analysis showed that in the odd-year (2015) the genetic diversity of pink salmon was significantly higher than in 2016 (even-year). However, at the level of nucleotide frequencies in the cytochrome b gene, the genetic diversity was higher in the specimens collected in 2016 (even-year) compared to the odd-year (2015). Thus, our data indicated significant differences in the levels of genetic diversity between individuals from the odd and even generations of pink salmon from the Ola River. The most likely explanation might be the primary influence of natural selection. Small generations of pink salmon develop under the influence of selective factors during the spawning period and growth of juveniles during freshwater stage of their life cycle. Reduction in the number of generations leads to a decrease in the level of genetic diversity in the pink salmon populations.

Key words: pink salmon, genetic diversity, Sea of Okhotsk, cytochrome coxidase subunit I (COI), cytochrome b.

DOI: 10.17217/2079-0333-2017-42-77-83

Введение

Первые популяционно-генетические исследования азиатских популяций горбуши были выполнены группой генетиков под руководством Ю.П. Алтухова еще в 70-е годы прошлого века [1]. Указанные генетические исследования азиатских популяций базировались на методах биохимической генетики. Они показали, что одной из особенностей генетической структуры популяций горбуши оказались существенные различия между поколениями, обычно называемыми четными и нечетными. Данная особенность связана с двухлетним жизненным циклом горбуши, поскольку после нереста все производители погибают. Аналогичные генетические отличия между особями поколений четных и нечетных лет показаны и для популяций п-ва Камчатка и северного побережья Охотского моря [2-4].

В настоящее время активно начали развиваться генетические исследования с использованием генов митохондриальной ДНК (мтДНК) [5-10]. Поскольку все митохондрии в делящихся клетках организма происходят от митохондрий матери, то в ряду поколений передаются только гены мтДНК самки. Среди генов, содержащихся в геноме митохондрий, обычно исследуют гены субъединица 1 цитохром-оксидазы с (Cytochrome c oxidase subunit I, далее по тексту: COI) и ци-тохром b [11-12]. Кодируемые этими генами белки входят в так называемую дыхательную цепь митохондрий [13]. Входящие в эту цепь ферментативные комплексы осуществляют окислительное фосфорилирование, итогом которого является накопление энергии в фосфатных связях АТФ.

Горбуша является одним из важнейших объектов промысла на северном побережье Охотского моря [2]. Одной из особенностей биологии вида является двухлетний жизненный цикл, что обусловливает наличие в каждой нерестовой реке популяций четного и нечетного поколений. Несмотря на многолетнее изучение биологических и генетических особенностей отмеченных поколений, причины возникновения и сохранения резких отличий между их особями остаются дискуссионными.

Целью настоящей работы является получение первых сведений об уровнях генетического разнообразия в выборках горбуши четного и нечетного поколений в североохотоморской популяции р. Ола.

Материалы и методы

Горбуша была отловлена в устье р. Ола. Выбор данной популяции связан с тем, что в указанной реке размножается самое многочисленное стадо среди прочих, нерестующих в реках Та-уйской губы. Пробы мышц были отобраны в июле 2015 г. у 10 особей (нечетное поколение) и в июле 2016 г. у 16 особей (четное поколение). В четном поколении (2016 г.) нуклеотидная последовательность гена COI была определена у 15 особей. Пробы мышц фиксировали в 96%-ном этиловом спирте.

На данном этапе были исследованы два гена митохондриальной ДНК (мтДНК): СО I и цитохром b. Выделение ДНК и секвенирование было выполнено в компании «Синтол» (г. Москва) по стандартным методикам. Для проведения ПЦР -анализа использовали следующие олигонуклеотидные праймеры: FishF 1 (5'-TTCTCAACCAACCACAAAGACATTGG-3') и FishR1 (5' -TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3') для гена СО1 [14] и L15436 (5' -CCTGCTCGGACTTTAACCGAAACT-3') и H15149 (5' -GCICCTCARAATGAYATTTGTCCT-3') для гена цитохром b [6].

В исследованных сиквенсах нуклеотиды обозначены сокращенно: A - аденин, G - гуанин (пурины), C - цитозин, T - тимин (пиримидины) [15]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей и конструирование дендрограмм выполнили с использованием программы MEGA ver. 6.0 [16]. Нуклеотидное и гаплотипическое разнообразие определили при помощи программы DNaSP ver. 5.10.01 [17].

Результаты и обсуждение

Длина секвенированного участка фрагмента гена СО! составила 486 нуклеотидов. Полиморфные сайты указаны в табл. 1. Если взять сиквенс первой особи (0G-12015) за основной, то среди проб горбуши нечетного 2015 г. существует 6 транзиций (замена пурина на пурин, A ^ G, G ^ A) в положении № 141 и 5 транзиций в положении № 261. Другой тип транзиций (замена пиримидина на пиримидин, Т ^ С) выявлен в одном случае - у особи 0G-22015. Трансверсии (замены между пуринами и пиримидинами А ^ С, А ^ Т, Т ^ А) наиболее часты в положении № 411, единичны в положениях № 285, 351 и 413. Соотношение транзиций и трансверсий R = 11 / 5 = 2,2 указывает на то, что транзиции более частые, чем трансверсии.

Если среди пятнадцати исследованных особей четного года взять за точку отсчета нуклео-тидную последовательность первой особи 0G-12016, то полиморфный сайт найден только в положении № 396 - транзиция С ^ Т у особи 0G-122016.

Длина секвенированного участка фрагмента гена цитохром b составила 447 нуклеотидов. Наиболее изменчив сайт № 332: половина особей имела гуанин (G), половина - тимин (Т), то есть это трансверсия (G ^ T) (табл. 2). В положении № 227 три особи имели транзиции T ^ C. В двух других сайтах найдены транзиции A ^ G. В отличие от нуклеотидных последовательностей гена COI здесь не прослеживались замены, характерные для особей четного или нечетного года.

Таблица 1

Полиморфные сайты фрагмента гена COI четного и нечетного поколений горбуши Oncorhynchus gorbuscha реки Ола

№ Проба Позиция нуклеотида в сиквенсе

nt 141 nt 261 nt 285 nt 351 nt 396 nt 411 nt 413

1 OG-12015 A G T A C A T

2 OG-22015 G A C T

3 OG-42015 G A

4 0G-52015

5 0G-62015 G A T

6 0G-72015 G A T

7 0G-82015 G A C

8 0G-92015

9 0G-102015 G A

10 0G-112015

11 0G-12016 G A

12 0G-22016 G A

13 0G-32016 G A

14 0G-42016 G A

15 0G-52016 G A

16 0G-62015 G A

17 0G-72016 G A

18 0G-82016 G A

19 0G-92016 G A

20 0G-102016 G A

21 0G-112016 G A

22 0G-122016 G A T

23 0G-132016 G A

24 0G-142016 G A

25 0G-152016 G A

Примечание. В 2016 г. нуклеотидная последовательность гена СО1 была исследована у 15 особей.

Таблица 2

Полиморфные сайты фрагмента гена цитохром Ь четного и нечетного поколений горбуши Oncorhynchus gorbuscha реки Ола

№ Проба Позиция нуклеотида в сиквенсе

nt 227 nt 263 nt 332 nt 347

1 0G-CYTB-12015 T A G A

2 0G-CYTB-22015

3 0G-CYTB-32015

4 0G-CYTB-42015

5 0G-CYTB-52015

6 0G-CYTB-62015 T

7 0G-CYTB-72015

8 0G-CYTB-82015 T

9 0G-CYTB-92015 G

10 0G-CYTB-102015 T

11 0G-CYTB-12016

12 0G-CYTB-22016 T

13 0G-CYTB-32016 T

14 0G-CYTB-42016 T

15 0G-CYTB-52016 C T

16 0G-CYTB-62016

17 0G-CYTB-72015 C T

18 0G-CYTB-82016 C T

19 0G-CYTB-92016

20 0G-CYTB-102016 T

21 OG-CYTB-112016 T G

22 0G-CYTB-122016

23 0G-CYTB-132016

24 0G-CYTB-142016 T

25 0G-CYTB-152016 T

26 0G-CYTB-162016

Показатели генетического разнообразия указаны в табл. 3. По частотам нуклеотидов фрагмента гена COI имеются статистически значимые различия между выборкой четного и нечетного года, как по величинам гаплотипического разнообразия Hd (односторонний тест Стью-дента t = 8,34, p < 0,05), так и по величинам нуклеотидного разнообразия п (t = 19,26, p < 0,05). Таким образом, генетическое разнообразие гена COI в выборке за 2015 г. существенно выше, чем в выборке за 2016 г.

Таблица 3

Показатели генетического разнообразия фрагментов генов COI и цитохром b четного и нечетного поколений горбуши Oncorhynchus gorbuscha реки Ола

Год Ген Кол-во особей

2015 COI 10 6 0,012346 0,0044 ± 0,00020 0,844 ± 0,2905

2016 COI 15 1 0,000274 0,00027 ± 0,0000816 0,133 ± 0,02899

2015+2016 COI 25 7 0,014403 0,002373 ± 0,000109 0,627 ± 0,020327

2015 Цитохром b 10 3 0,00671 0,00149 ± 0,000025 0,600 ± 0,04128

2016 Цитохром b 16 3 0,00671 0,00213 ± 0,0000079 0,725 ± 0,01732

2015+2016 Цитохром b 26 4 0,00894 0,00198 ± 0,0000062 0,677 ± 0,01175

Примечание. т - количество сиквенсов, 5 - число полиморфных (сегрегирующих) сайтов, р5 - доля полиморфных сайтов в общем количестве нуклеотидов отсеквенированного фрагмента гена (р/п).

В отличие от этого, по нуклеотидным частотам фрагмента гена цитохром b генетическое разнообразие выше в выборке четного, 2016 г., по сравнению с выборкой нечетного года. Отмеченные различия статистически значимы как по величинам гаплотипического разнообразия (t = 2,78, p < 0,05), так и по величинам нуклеотидного разнообразия (t = 100, p < 0,05). В ранее проведенном исследовании генетического разнообразия гена цитохрома b в ряде североохото-морских популяций также отмечено, что в линии поколений четных лет уровень генетической изменчивости больше, чем в линии нечетных лет [6]. О причинах указанных различий в цитируемой работе ничего не сообщалось. Возможно, корректный анализ был затруднен странным составом выборок. Так, сравнивались три выборки разных лет из р. Ола и, например, единичная выборка из ручья о. Завьялова. Первая выборка характеризует крупнейшую горбушовую популяцию, воспроизводящуюся в реках Тауйской губы, а вторая - случайный набор особей в маленьком ручье, находящемся на пути нерестовой миграции рыбы при подходе к рекам Тауй-ской губы.

Рассмотренные гены различаются точностью дифференциации особей на выборки четного и нечетного годов. По нуклеотидным частотам гена COI, за исключением двух случаев, все особи распределились в два кластера - выборка четного и нечетного годов (рис. 1, а). Для гена ци-тохром b картина менее однозначная, поскольку особи четных и нечетных поколений не образуют отдельных друг от друга кластеров в дендрограмме и почти равномерно распределены в имеющихся кластерах (рис. 1, б).

Полученные данные указывают на существенные различия уровней генетического разнообразия между выборками нечетного и четного поколений горбуши р. Ола. Наличие таких генетических особенностей неудивительно, поскольку для горбуши характерно наличие двухлетнего жизненного цикла [18]. По этой причине в популяции каждой нерестовой реки сосуществуют две линии - не скрещивающиеся друг с другом поколения особей четного и нечетного годов. Следовательно, формирование генетического разнообразия у особей четных и нечетных поколений протекает в значительной степени независимо. Возникает вопрос: каким образом появились столь существенные генетические различия между особями рассматриваемых поколений?

По мнению специалистов Института общей генетики РАН, для возникновения существенных отличий между четными и нечетными поколениями первостепенно влияние генного дрейфа в период изначальной дифференциации поколений [1]. Благодаря «принципу основателя» возникшие генетические отличия сохранились в последующих поколениях. Очевидно, что отбору в этой гипотезе отводится роль фактора, сохраняющего возникшие в результате мутационного и неожиданного действия генетические отличия.

В.С. Кирпичников [19, 20] для объяснения возникновения двух поколений горбуши использовал преобладающее влияние дифференцирующего отбора. Суть этого метода заключалась в том, что отбор действовал в периоды существенного преобладания по численности какого-то поколе-

ния (четного или нечетного) по сравнению с другим. Малочисленное поколение могло возникнуть по причине катастрофических изменений условий обитания горбуши в конкретном году.

В жизненном цикле горбуши, как и других видов рода тихоокеанских лососей, характерно наличие пресноводного этапа (размножение производителей и рост молоди в реке) и морского этапа (нагульного). Наиболее вероятны фатальные изменения погодно-климатических условий в прибрежных участках материка, где протекают нерестовые реки. Резкое сокращение численности популяции из-за массовой гибели оплодотворенной икры и/или молоди могло быть вызвано неблагоприятным сочетанием температурного режима и гидрологии пресных вод. По нашему мнению, именно экологические условия пресноводного периода наиболее вероятны для объяснения катастрофического вымирания какого-либо поколения.

а

б

Рис. 1. Дендрограммы генетических различий (р-дистанции) по нуклеотидным последовательностям фрагмента гена СОI (а) и цитохром Ь (б) между особями четных (2016 г.) и нечетных (2015 г.) поколений горбуши Oncorhynchus gorbuscha р. Ола

В поддержку предположения о большей уязвимости пресноводного периода жизни по сравнению с морским можно привести недавнюю оценку факторов, влияющих на численность северо-охотоморских популяций горбуши. Авторы разбили жизненный цикл вида на три части: пресноводный, эстуарно-прибрежный и морской [21]. В частности, смертность молоди лососей в пресных водах зависит от водного режима, температуры воздуха, высоты снежного покрова, обсыхания и промерзания нерестилищ. Для эстуарно-прибрежного важен гидрологический режим прибрежных вод (например, ледовитость в июне), а также состояние кормовой базы. Рассмотренные авторами экологические факторы имели значение и ранее в начальный период эволюции вида.

Очень показательно снижение генетической изменчивости у потомков горбуши, выросшей из икры, собранной в р. Ола и подрощенной на рыбоводных заводах Белого моря [22]. Важным заключением является то, что величина сдвига в частотах аллозимных локусов не всегда совпадает для каждого из них. Авторы полагают, что за существенные изменения генетической структуры у интродуцированной горбуши в новых условиях обитания ответственны два фактора -естественный отбор и генетический дрейф.

Резкое снижение численности популяции обычно сопровождается существенным генетическим обеднением, то есть исчезновением особей с редкими вариантами генов. В случае правомерности этого теоретического положения в более многочисленной линии могло сохраниться

большее число генетических вариантов, в том числе и у исследованных нами генов мтДНК. Следовательно, более многочисленная линия поколений должна иметь большее генетическое разнообразие. По нашим данным генетическое разнообразие гена COI статистически значимо выше в выборке нечетного года по сравнению с четным. В силу высказанной гипотезы можно предположить, что периоды резких снижений численности особей из североохотоморских популяций случались прежде всего в линии поколений четного года. Гибель части оплодотворенной икры (содержащей митохондрии только самки) в неблагоприятных экологических условиях пресноводного периода снизило генетическую изменчивость прежде всего генов мтДНК, поскольку их наследование идет от самок к самкам. Наиболее вероятным является первостепенное влияние естественного отбора на генетическую структуру популяции горбуши, а не генетического дрейфа. Затем в возникших малочисленных поколениях могут измениться частоты генов, в том числе и из-за дрейфа.

Отличия в уровнях генетического разнообразия между поколениями, по нашему мнению, возникли уже после образования четной и нечетной линии горбуши, поскольку совпадающие гаплотипы имеются в нуклеотидных последовательностях обоих генов, особенно цитохрома b. Отсутствие потока генов между поколениями в силу упомянутых биологических особенностей вида сохраняет различия в последующие годы. Однако для проверки высказанной гипотезы необходимы дополнительные исследования популяций из разных участков ареала горбуши.

Литература

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. Популяционная генетика лососевых рыб. - М.: Наука. - 1997. - 288 С.

2. Голованов И.С., Марченко С.Л., Пустовойт С.П. Генетический мониторинг североохотоморских популяций горбуши // Цитология и генетика. - 2009. - Т. 43, № 6. - С. 18-27.

3. Пустовойт С.П. Основные итоги генетического мониторинга североохотоморских популяций горбуши (Oncorhynchus gorbuscha) // Вавиловский журнал генетики и селекции. -2011. - Т. 15, № 3. - С. 475-484.

4. Пустовойт С.П. Генетическое разнообразие НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (mMEP-2*) в азиатских популяциях горбуши (Oncorhynchus gorbuscha) // Вестник СевероВосточного государственного университета. - 2016. - Вып. 26. - С. 54-59.

5. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. - 2002. - Т. 38, № 9. - С. 1173-1195.

6. Бачевская Л.Т., Переверзева В.В. Изменчивость гена цитохрома b митохондриальной ДНК горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) из рек материкового побережья Охотского моря и острова Завьялова // Известия РАН. Серия биологическая. - 2013. - № 1. - С. 15-23.

7. Identifying Canadian freshwater fishes through DNA barcodes / N. Hubert, R. Hanner, E. Holm, N.E. Mandrak, E. Taylor, M. Burridge, D. Watkinson, P. Dumont, A. Curry, P. Bentzen, J. Zhang, J. April, L.Bernatchez // Plos One. - 2008. - Vol. 3, № 6. - P. e2490.

8. Mecklenburg C.W., Moller P.R., Steinke D. Biodiversity of arctic marine fish: taxonomy and zoogeography // Marine Biodiversity. - 2011. - Vol. 41, № 1. - P. 109-140.

9. Rasmussen R.S., Morrissey M.T., Hebert P.D. DNA barcoding of commercially important salmon and trout species (Oncorhynchus and Salmo) from North American // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2009. - Vol. 57, № 18. - P. 8379-8385.

10. Развитие заднежаберного моллюска Placida babai в искусственных условиях (Gastropoda, Opisthobranchia) / Т.А. Клочкова, Р.В. Ким, Г.Х. Ким // Вестник Камчатского государственного технического университета [Bulletin of the Kamchatka State Technical University]. -2017. - Вып. 39. - С. 55-64.

11. Гречко В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Генетика. - 2002. - Т. 38, № 8. - С. 1013-1033.

12. Шнеер В.С. ДНК-штрихкодирование видов животных и растений - способ их молекулярной идентификации и изучения биоразнообразия // Журнал общей биологии. - 2009. - Т. 70, № 4. - С. 296-315.

13. Основы молекулярной биологии клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, К. Хопкин, А. Джонсон, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Робертс, П. Уолтер. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. - 2015. -768 с.

14. Ivanova N.I., Dewaard J.R., Hebert P.D.N. An inexpensive, automation-friendly protocol for recovering high-quality DNA // Molecular Ecology Notes. - 2006. - Vol. 6, № 4. - P. 998-1002.

15. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. - 2009. - 256 C.

16. MEGA6: MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar // Molecular Biology and Evolution. - 2013. - Vol. 30. -P.2725-2729.

17. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. - 2009. - Vol. 26. - P. 1451-1452.

18. Лососевидные рыбы Северо-Востока России / И.А. Черешнев, В.В. Волобуев, А.В. Шес-таков, С.В. Фролов // Владивосток: Дальнаука. - 2002. - 496 c.

19. Кирпичников В.С. Состояние и задачи генетических исследований популяций горбуши // Генетика в аквакультуре. - Л.: Наука. - 1989. - С. 68-79.

20. Кирпичников В.С. Генетические исследования тихоокеанских лососей // Журнал общей биологии. - 1990. - Т. 51, № 1. - С. 15-35.

21. Волобуев В.В., Изергина Е.Е., Голованов И.С. Экология горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) Магаданского региона в пресноводный, эстуарный, начальный морской периоды жизни и основные факторы, определяющие ее выживаемость // Вестник СевероВосточного научного центра ДВО РАН. - 2017. - № 1. - С. 67-79.

22. Генетические изменения у горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) в ходе акклиматизации с бассейне Белого моря / Н.В. Гордеева, Е.А. Салменкова, Ю.П. Алтухов, А.А. Махров, С.П. Пустовойт // Генетика. - 2003. - Т. 39, № 3. - С. 402-412.

Информация об авторе Information about author

Пустовойт Сергей Павлович - Северо-Восточный государственный университет; 685000, Россия, Магадан; кандидат биологических наук, заведующий кафедрой биологии и химии; kafbio@svgu.ru

Pustovoit Sergey Pavlovich - North-Eastern State University; 685000, Russia, Magadan; Candidate of Biological Sciences, Head of Biology and Chemistry Chair; kafbio@svgu.ru