КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ, ОБЛЕГЧЕНИЯ СИМПТОМОВ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОДЕРЖАЩАЯ PEDIOCOCCUS INOPINATUS
COMPOSITION FOR PREVENTION, RELIEF OF SYMPTOMS, OR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES, CONTAINING PEDIOCOCCUS INOPINATUS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики, облегчения симптомов или лечения нейродегенеративного заболевания, которая содержит бактерии Pediococcus inopinatus, к культуре этих бактерий, лизату, пульверизованному (распыленному) продукту, продукту ферментации или экстракту бактерий.
Уровень техники
Нейродегенеративные заболевания относятся к дегенеративным заболеваниям, которые возникают по мере старения, в частности, старения головного мозга. Нейродегенеративные заболевания могут классифицироваться в зависимости от основных симптомов и поражённой части головного мозга. Типичными примерами являются болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Хотя известно, что нейродегенеративные заболевания вызываются нейродегенерацией, обусловленной старением, и агрегацией белков под влиянием генетических факторов и факторов окружающей среды, которые приводят к гибели нервных клеток, точная причина ещё не известна.
Болезнь Паркинсона является вторым по распространённости нейродегенеративным заболеванием после болезни Альцгеймера. Сообщается, что примерно 1% населения в возрасте 50 лет или старше страдает этим заболеванием. Основными симптомами болезни Паркинсона являются тремор, ригидность, замедленность движений, нестабильность осанки и другое. Это хроническая болезнь, вызываемая дефицитом нейромедиатора, называемого дофамином, в головном мозге. Дофамин продуцируется нервными клетками в чёрной субстанции головного мозга. Нервные клетки чёрной субстанции сложным образом связаны с двигательной областью коры головного мозга и другими различными частями головного мозга. Болезнь Паркинсона вызывается дефицитом дофамина, который представляет собой вещество, секретируемое для регуляции функции базальных ганглиев в чёрной субстанции.
Основными симптомами болезни Паркинсона являются 1) общая замедленность движений (брадикинезия), 2) тремор в состоянии покоя, 3) мышечная ригидность, 4) утрата постурального (связанного с положением тела) рефлекса, 5) патологическое положение (осанка) тела, 6) феномен застывания при ходьбе и др.
Доступные в настоящее время методы лечения болезни Паркинсона включают медикаментозную терапию, хирургическое лечение, физиотерапию и др. При медикаментозной терапии в большинстве случаев применяются лекарственные препараты, которые повышают истощённый уровень дофамина в головном мозге, препятствуют или замедляют разрушение нервных клеток, нейтрализуя дисбаланс в нейромедиаторах, вызванный дефицитом дофамина, и контролируют другие симптомы, такие как депрессия и др. Например, для лечения болезни Паркинсона применяются лекарственные препараты, заменяющие дофамин, такие как L-DOPA, или лекарственные препараты, которые воздействуют на дофаминовый рецептор. Однако действие этих лекарственных препаратов ограничено в том смысле, что они направлены только на контроль симптомов, поскольку трудно регенерировать мёртвые нервные клетки, и в том, что длительное медикаментозное лечение приводит к серьёзным побочным эффектам, таким как непроизвольные движения (дискинезия), рвота и др. Поэтому разработка препарата, который облегчает симптомы и обеспечивает нейропротекторный эффект с гарантированной безопасностью, является неизбежностью.
В частности, недавно появилось сообщение, что изменение микробиоты кишечника, наблюдаемое у пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, патофизиологически связано с прогрессированием заболевания. Более того, установлено, что трансплантация фекальной микробиоты (FMT) животной модели болезни Паркинсона приводила к нейропротекторному эффекту как следствию регуляции нейровоспаления (непатентный документ 1).
На фоне этого в настоящее время ведутся исследования по профилактике и лечению болезни Паркинсона с использованием молочнокислых бактерий. Однако такие молочнокислые бактерии, которые напрямую могут влиять на симптомы атаксии (расстройство координации движений) при болезни Паркинсона, за исключением запоров, до настоящего времени не обнаружены. Таким образом, существует потребность в молочнокислых бактериях, способных облегчить или лечить симптомы атаксии, вызываемой болезнью Паркинсона.
Ссылки на известный уровень техники
Непатентный документ: 1) Xin Fang, Microbial treatment: the potential application for Parkinson's disease [Лечение бактериями: потенциальное применение для лечения болезни Паркинсона], Neurological Sciences, 2018.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Настоящее изобретение направлено на получение композиции для профилактики, облегчения симптомов или лечения нейродегенеративного заболевания, которая содержит Pediococcus inopinatus, культуры этих бактерий, лизат, пульверизованный (распыленный) продукт, продукт ферментации или экстракт этих бактерий в качестве активного компонента.
Техническое решение
Авторы настоящего изобретения приложили максимум усилий, чтобы найти пробиотический штамм, обладающий терапевтическим эффектом в отношении нейродегенеративных заболеваний. В результате ими было обнаружено, что штамм Pediococcus inopinatus, выделенный из кимчи (корейское блюдо из квашеных овощей (пекинской капусты) с большим количеством приправ), при прямом введении не только подавлял нейровоспаление, но и облегчал симптомы атаксии в мышиной модели болезни Паркинсона.
Штамм Pediococcus inopinatus согласно настоящему изобретению является, в частности, штаммом Pediococcus inopinatus, происходящим из кимчи; конкретнее – штаммом WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus, точнее – штаммом WIKIM27 с номером доступа KCCM12653P бактерий Pediococcus inopinatus, хотя он не ограничивается только перечисленным.
Штамм Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению является грамположительным, факультативным анаэробом, который может расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Он не образует спор, не обладает подвижностью и имеет сферическую форму.
Штамм Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению обладает общим пробиотическим действием и иммуностимулирующим действием молочнокислых бактерий как пробиотик. Хорошо известно, что молочнокислые бактерии рода Pediococcus проявляют пробиотическое и иммуностимулирующее действие.
В настоящем изобретении под 'пробиотиками' понимаются как живые организмы, которые благотворно влияют на здоровье, улучшая микробную среду в кишечнике животных, включая человека. Пробиотики – это живые организмы, обладающие пробиотической активностью; они могут благотворно влиять на микробиоту кишечника хозяина при потреблении последним как единичного штамма, так и нескольких штаммов в форме сухих или ферментированных препаратов.
В частном примере осуществления настоящее изобретение предлагает композицию, содержащую Pediococcus inopinatus, культуру этих бактерий, лизат, их пульверизованный (распыленный) продукт, продукт ферментации или экстракт бактерий.
Pediococcus inopinatus, содержащиеся в композиции по настоящему изобретению, могут быть в форме живого пробиотика или убитого пробиотика и также могут быть сухими или лиофилизированными. Подходящие виды молочнокислых бактерий для разного рода композиций и способы получения последних хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, бактерии Pediococcus inopinatus могут культивироваться с использованием известной жидкой или плотной среды; штамм может культивироваться вместе с дополнительными компонентами, а затем ферментироваться; штамм может экстрагироваться органическим растворителем либо клеточная мембрана штамма может подвергаться лизису или гомогенизации (лизат), хотя указанное не ограничивается только перечисленным.
В одном конкретном примере осуществления изобретения композиция может быть композицией, содержащей штамм WIKIM27 (номер доступа KCCM12653P) бактерий Pediococcus inopinatus.
В другом конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей живой или убитый (инактивированный) штамм WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus.
В ещё одном конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей культуру, лизат, продукт ферментации или экстракт штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus.
Настоящее изобретение предлагает пробиотическую композицию, содержащую бактерии Pediococcus inopinatus, культуру этих бактерий, лизат, пульверизованный продукт, продукт ферментации или экстракт бактерий. Пробиотическая композиция настоящего изобретения может использоваться для профилактики, лечения или облегчения симптомов желудочно-кишечных заболеваний животных, в том числе человека. 'Животное' включает, в частности, крупный рогатый скот (коров), лошадей и свиней. 'Желудочно-кишечные заболевания' включают вирусную инфекцию и воспалительное заболевание кишечника. Например, они включают инфекционную диарею, гастроэнтерит, воспалительное заболевание кишечника, синдром нейрогенного колита, синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке, энтерокинетическую диарею и другие заболевания, вызываемые патогенными микроорганизмами (E. coli, Salmonella, Clostridium и другими), хотя весь перечень не ограничивается только перечисленным.
В частности, пробиотическая композиция по настоящему изобретению может вводиться перорально. Хотя вводимая доза может варьироваться в зависимости от конкретного желудочно-кишечного заболевания, тяжести заболевания, возраста, пола, этнической группы, цели лечения или профилактики и другого; в большинстве случаев взрослому человеку можно вводить от 10 миллионов до 100 миллиардов бактерий в сутки.
Настоящее изобретение предлагает композицию для усиления иммунитета, которая содержит бактерии Pediococcus inopinatus, культуру этих бактерий, лизат, пульверизованный продукт, продукт ферментации или экстракт бактерий. Хорошо известно, что молочнокислые бактерии рода Pediococcus обладают пробиотическим эффектом и иммуностимулирующим действием.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает пищевую композицию для улучшения памяти, улучшения когнитивной способности, увеличения мышечной силы или улучшения двигательной способности, которая содержит бактерии Pediococcus inopinatus, культуру этих бактерий, лизат, пульверизованный продукт, продукт ферментации или экстракт бактерий в качестве активного компонента.
Приведенное выше описание Pediococcus inopinatus применимо также к пищевой композиции.
В одном конкретном примере осуществления изобретения композиция может быть композицией, содержащей штамм WIKIM27 (номер доступа KCCM12653P) бактерий Pediococcus inopinatus.
В другом конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей живой или убитый штамм WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus.
В ещё одном конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей культуру, лизат, продукт ферментации или экстракт штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus.
В контексте настоящего изобретения "улучшение памяти" и "улучшение когнитивной способности" относятся к эффекту восстановления провалов в памяти, расстройства памяти или сниженной когнитивной способности, вызванных атрофией мозга и разрушением нервных клеток мозга вследствие физической усталости, недосыпания, чрезмерного потребления алкоголя, деменции и др., путём контролирования вредных веществ, которые повреждают нервные клетки мозга, или путём регулирования нейромедиаторов в мозге. Память относится к способности мозга получать информацию, хранить её и при необходимости восстанавливать в памяти.
В настоящем изобретении “улучшение мышечной силы” и “улучшение двигательной способности” относятся к эффекту улучшения сниженной двигательной способности в результате ослабления мышц, вызванного различными заболеваниями, возрастными гормональными изменениями, ожирением, алкоголизмом, курением и другими факторами, путём регулирования энергообмена. Мышечная сила относится к максимальному усилию, которое мышца способна моментально развить для преодоления некоторого сопротивления (массы или силы), а двигательная способность относится к способности выполнять упражнение с использованием мышечной силы.
Если композиция настоящего изобретения используется в качестве пищевой композиции, то пищевая композиция может представлять собой функциональный диетический продукт, приправу, напиток, батончик и др. В дополнение к этому, пищевая композиция, содержащая штамм в качестве активного ингредиента, может быть напитком, таким как кисломолочный напиток и др. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает стартовую закваску для запуска молочнокислого брожения, которая содержит Pediococcus inopinatus или культуру этих бактерий.
Пищевая композиция согласно настоящему изобретению может быть получена с использованием подходящего для диетического питания и физиологически приемлемого адъюванта в дополнение к активному компоненту. Адъювант может включать функциональный наполнитель (эксципиент), разрыхлитель, подсластитель, связующее вещество, агент-покрытие, способствующий набуханию агент, смазывающее вещество, скользящее вещество (глидант), ароматизатор и др.
Пищевая композиция может быть преобразована в фармацевтическую композицию для введения внутрь путём добавления одного или более диетически приемлемого носителя в добавление к активному компоненту, описанному выше.
Например, для композиции в форме таблетки или капсулы активный ингредиент может использоваться в комбинации с пероральным, нетоксичным, фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и др. И, при желании или необходимости, можно также включить сюда подходящий связующий агент, смазывающее вещество, разрыхлитель или краситель. Подходящий связующий агент включает натуральный сахар, крахмал, желатин, глюкозу или β-лактозу, кукурузный подсластитель; натуральную или синтетическую камедь, такую как камедь акации, трагакант, либо олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и др., хотя весь перечень не ограничивается только названными здесь. Разрыхлитель включает крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и др., хотя весь перечень не ограничивается только перечисленным здесь. В качестве фармацевтически приемлемого носителя для композиции в виде жидкого раствора могут смешиваться один или более ингредиентов из солевого раствора, стерильной воды, раствора Рингера, буферного солевого раствора, раствора альбумина для инъекций, раствора декстрозы, раствора мальтодекстрина, глицерина и этанола, которые являются стерилизованными и пригодными для живого организма. При необходимости могут добавляться другие традиционные добавки, такие как антиоксидант, буфер, бактериостатический агент и др. Кроме того, дополнительно могут вводиться разбавитель, диспергатор, поверхностно-активное вещество, связующее вещество или смазывающее вещество в предназначенную для инъекций композицию, такую как водный раствор, суспензия, эмульсия и др., пилюля, капсула, гранула или таблетка.
Пищевая композиция настоящего изобретения может добавляться в различные пищевые продукты. Пищевые продукты, к которым может добавляться композиция настоящего изобретения, включают, например, напитки, витаминные комплексы, пищевые добавки и др.
Пищевая композиция настоящего изобретения может содержать ингредиенты, традиционно добавляемые при производстве пищевых продуктов, например, белок, жир, питательное вещество (нутриент), вкусо-ароматический агент и ароматизатор. Примеры углевода включают обычные сахара, такие как моносахариды, например, глюкоза, фруктоза и другие; дисахариды, например, мальтоза, сахароза, олигосахариды и другие; полисахариды, например, декстрин, циклодекстрин и другие; и сахароспирты, такие как ксилит, сорбит, эритрит и др. В качестве вкусо-ароматического агента может использоваться натуральный (тауматин, экстракт стевии [например, ребаудиозид A, глицирризин и другие]) или искусственный вкусо-ароматический агент (сахарин, аспартам и др.). Например, если пищевая композиция настоящего изобретения готовится как напиток, то она дополнительно может содержать лимонную кислоту, фруктозный сироп, сахар, глюкозу, уксусную кислоту, яблочную кислоту, фруктовый сок, растительные экстракты и др.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения нейродегенеративного заболевания, которая содержит бактерии Pediococcus inopinatus, культуру этих бактерий, лизат, пульверизованный продукт, продукт ферментации или экстракт бактерий в качестве активного компонента.
В одном конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей штамм WIKIM27 (номер доступа KCCM12653P) бактерий Pediococcus inopinatus.
В другом конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей живой или убитый штамм WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus.
В ещё одном конкретном примере осуществления композиция может быть композицией, содержащей культуру, лизат, продукт ферментации или экстракт штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus.
Помимо этого, настоящее изобретение предлагает способ лечения нейродегенеративного заболевания, который включает введение терапевтически эффективного количества бактерий Pediococcus inopinatus, культуры этих бактерий, лизата, пульверизованного продукта, продукта ферментации или экстракта бактерий нуждающемуся в этом субъекту.
Употребляемый в описании термин "субъект" относится к млекопитающему, которое является субъектом лечения, наблюдения или эксперимента, в частности, к человеку или животному, нуждающемуся в профилактике и/или лечении нейродегенеративного заболевания.
В дополнение к этому, “нейродегенеративное заболевание” может представлять собой одно или более заболеваний, выбранных из группы, включающей болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Лу Герига (амиотрофический боковой склероз), болезнь Крейтцфельдта–Якоба, инсульт, рассеянный склероз, нейровоспаление, нарушение способности к обучению, когнитивные нарушения и нарушение памяти, хотя весь перечень не ограничивается названными.
В конкретном примере осуществления нейродегенеративное заболевание может быть болезнью Паркинсона.
В примере, описанном ниже, было подтверждено, что нейровоспаление подавляется лечением штаммом бактерий Pediococcus inopinatus. Кроме того, было подтверждено путём прямого введения штамма бактерий Pediococcus inopinatus мышиной модели болезни Паркинсона и последующего проведения теста ротарод и теста силы хвата, что способность балансировать на вращающемся стержне (барабане) и сила схватки были наилучшими по сравнению с группой отрицательного контроля (группа, которой вводили PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). Другими словами, было подтверждено, что настоящее изобретение можно использовать для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Паркинсона, поскольку штамм бактерий Pediococcus inopinatus облегчает симптомы атаксии в мышиной модели болезни Паркинсона.
Нейровоспаление является причиной различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Лу Герига (амиотрофический боковой склероз), рассеянный склероз и других. Взаимосвязь между нейровоспалением и возникновением нейродегенеративного заболевания хорошо известна из целого ряда литературных источников (Mol. Med. Rep. 2016 Apr, 13(4): 3391-3396; J. Immunol. Res. 2018 Apr 16, 2018: 4784268; Transl. Neurodegener. 2015, 4: 19); применение регулирующих нейровоспаление веществ для лечения нейродегенеративных заболеваний также известно в данной области техники.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться обычными способами введения – внутривенно, внутриартериально, внутримышечно или в область грудины.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем изобретении термин “фармацевтически приемлемый носитель” относится к носителю или разбавителю, который не вызывает побочного эффекта непереносимости и позволяет активному ингредиенту сохранять свою биологическую активность и характеристики. В настоящем изобретении фармацевтически приемлемый носитель может быть получен из одного или более из солевого раствора, стерильной воды, раствора Рингера, забуференного солевого раствора, раствора декстрозы, раствора мальтодекстрина, глицерина и этанола. При необходимости могут быть внесены другие традиционные добавки, такие как антиоксидант, буфер, бактериостатический агент и др., с последующим приготовлением раствора для инъекций, пригодного для инъекции в ткань или орган. Кроме того, он может быть приготовлен из сухого препарата (в частности, препарата, полученного лиофильной сушкой), к которому для получения раствора для инъекций добавляется изотонический стерильный раствор или, при необходимости, стерильная вода либо физиологический раствор.
Специфическое антитело к органу-мишени или лиганд может связываться с носителем для специфического воздействия на орган-мишень. Подходящие препараты, известные в уровне техники, описаны в "Фармацевтической науке" Ремингтона (Mack Publishing Company, Easton PA).
Кроме того, композиция настоящего изобретения может, в частности, дополнительно содержать наполнитель, эксципиент, разрыхлитель, связующее вещество, скользящее вещество (глидант) и другое. Композиция настоящего изобретения может быть составлена с помощью известного в уровне технике метода таким образом, чтобы высвобождение активного ингредиента происходило сразу же, замедленно или с отсрочкой во времени после введения композиции млекопитающему.
В настоящем изобретении “введение” относится к введению композиции настоящего изобретения больному любым подходящим способом. Композиция настоящего изобретения может вводиться разным пероральным или парентеральным способом таким образом, чтобы она могла достигнуть ткани-мишени. Она может вводиться внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, перорально, местно, внутриназально, внутрилёгочно и внутриректально, хотя весь перечень не ограничивается перечисленным здесь.
Например, композиция настоящего изобретения может вводиться в виде внутримышечной, внутривенной или внутрибрюшинной инъекции для клинического введения.
Для инъекций композиция может быть специально приготовлена с применением фармацевтически приемлемого буфера, такого как раствор Хэнка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для трансмукозального (через слизистую оболочку) введения используется непроникающий агент, подходящий для проникания в барьер. Непроникающий агент в большинстве случаев известен в данной области техники.
Препараты для парентерального введения включают стерилизованный водный раствор, неводный раствор, суспензию, эмульсию и др. Для неводного раствора или суспензии могут использоваться пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, пригодный для инъекций сложный эфир, такой как этилолеат и др.
В настоящем изобретении "эффективное количество" относится к количеству, необходимому для отсрочки или полной остановки проявления или прогрессирования конкретной болезни, подлежащей лечению, и эффективное количество штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus, содержащегося в фармацевтической композиции настоящего изобретения, означает количество, требуемое для достижения эффекта предупреждения или лечения нейродегенеративного заболевания. Соответственно, эффективное количество может регулироваться в зависимости от различных факторов, включая тип заболевания, тяжесть заболевания, виды и количество других ингредиентов, содержащихся в композиции, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания больного, время введения, способ введения, период лечения и совместно вводимые лекарственные препараты. Специалистам в данной области техники очевидно, что подходящая суточная доза может быть определена лицом, выписывающим рецепт, в пределах установленного в медицине диапазона определения.
Для целей настоящего изобретения предпочтительно, чтобы конкретное терапевтически эффективное количество для конкретного больного варьировало в зависимости от различных факторов, включающих тип и степень достигаемой реакции; специфическую композицию, в которой в некоторых случаях могут использоваться другие ингредиенты; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания больного; время введения, способ введения, скорость экскреции композиции; период лечения, совместно вводимые лекарственные препараты и подобные факторы, хорошо известные в данной области техники.
В контексте настоящего изобретения “лечение” относится к подходу, который обеспечивает достижение благоприятных или желательных клинических результатов. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются только перечисленным, облегчение симптомов, снижение степени тяжести заболевания, стабилизация течения болезни (то есть профилактика ухудшения), задержка или замедление прогрессирования болезни, улучшение или временное облегчение течения болезни и ремиссия (частичная или полная), будь то выявляемая или невыявляемая ремиссия. Кроме того, “лечение” может означать повышение уровня выживаемости по сравнению с ожидаемым уровнем выживаемости без предоставления лечения. Термин “лечение” относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическому лечению. Лечение включает не только профилактику заболевания, но и требуемое лечение уже возникшей болезни. “Паллиативное лечение” заболевания означает уменьшение степени тяжести заболевания и/или нежелательных клинических симптомов, и/или замедление или продление периода прогрессирования болезни по сравнению с тем, когда лечение не проводится.
Настоящее изобретение предлагает также кормовую добавку или корм, содержащий бактерии Pediococcus inopinatus, культуру этих бактерий, их лизат, их пульверизованный продукт, их продукт ферментации или их экстракт в качестве активного ингредиента.
Если композиция используется как кормовая добавка, то она может быть приготовлена в виде 20% – 90%-го концентрата, порошка или гранулы. Кормовая добавка может дополнительно содержать одну или более из органических кислот, таких как лимонная кислота, фумаровая кислота, адипиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота и др.; фосфат, такой как фосфат натрия, фосфат калия, кислый пирофосфат, полифосфат и др.; либо природный антиоксидант, такой как полифенол, катехин, α-токоферол, экстракт розмарина, витамин C, экстракт зелёного чая, экстракт лакричника, хитозан, дубильная кислота, фитиновая кислота и др. Если композиция используется как корм, то она может быть приготовлена в виде обычного корма и может дополнительно содержать ингредиенты обычного корма.
Кормовая добавка и корм могут дополнительно содержать зёрна, например, измельчённое в порошок или дроблёное зерно пшеницы, овса, ячменя, кукурузы и риса; корма с растительным белком, например, корма с рапсом, бобами и подсолнечником в качестве основных ингредиентов; корма с животным белком, например, с кровяной кормовой мукой, мясной кормовой мукой, костной кормовой мукой и рыбной кормовой мукой; сахара и молочные продукты, например, различные виды сухого молока и сухих молочных продуктов, состоящих из сухой сыворотки и др. Кроме того, они могут дополнительно содержать питательную добавку, агент для улучшения пищеварения и всасывания питательных веществ, агент для стимулирования роста и др.
Кормовая добавка может вводиться животному либо как таковая, либо в комбинации с другой кормовой добавкой на съедобном носителе. Кроме того, кормовая добавка может перорально вводиться животному как заправка для корма, напрямую смешиваемая с кормом для животных, или отдельно от корма. Если кормовая добавка вводится отдельно от корма, то она может быть приготовлена в виде состава для мгновенного высвобождения или замедленного высвобождения в комбинации с фармацевтически приемлемым съедобным носителем, как хорошо известно в данной области техники. Съедобный носитель может быть твёрдым или жидким, например, кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, соевые хлопья, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или пропиленгликоль. Если используется твёрдый носитель, то кормовая добавка может быть в форме таблетки, капсулы, порошка, пастилки, леденца или тонкодисперсной заправки сверху. Если используется жидкий носитель, то кормовая добавка может быть в виде мягкой желатиновой капсулы, сиропа, суспензии, эмульсии или раствора.
Кроме того, кормовая добавка и корм могут содержать адъювант, например, консервант, стабилизатор, увлажнитель, эмульгатор, солюбилизатор и др. Кормовая добавка может добавляться в корм для животных путём погружения, распыления или смешивания.
Корм или кормовая добавка по настоящему изобретению может применяться для кормления различных животных, в том числе млекопитающих, домашней птицы и рыбы.
Млекопитающие могут быть домашними животными (например, собака или кошка), а также такими животными как свиньи, коровы, овцы, козы и лабораторные грызуны. Под (домашней) птицей имеются в виду цыплята, индейки, утки, гуси, фазаны, перепела и др. Рыба может быть форелью и др., хотя весь перечень не ограничивается только названными здесь.
Корм или кормовая добавка по настоящему изобретению может включаться в рацион кормления животного для ускорения роста, усиления иммунитета животного и др.
К тому же, корм или кормовая добавка по настоящему изобретению может использоваться для улучшения памяти, когнитивной способности, мышечной силы или двигательной способности животного либо для профилактики, облегчения симптомов или лечения нейродегенеративного заболевания.
6
12
7
11
8
10
6
12
7
11
8
10
Композиция настоящего изобретения может содержать штамм Pediococcus inopinatus в количестве примерно от 10до 10 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл, например, от 10до 10 КОЕ/мл или от 10до 10 КОЕ/мл, в пересчёте на разовую дозу. В частности, штамм может вводиться живым и может быть убитым или ослабленным (аттенуированным) перед приёмом. К тому же, он может быть дополнительно подвергнут процессу пастеризации нагревом. Количество штамма, необходимое для достижения минимального эффекта, и рекомендуемое суточное потребление обычно могут составлять примерно от 10до 10 КОЕ/мл, например, от 10до 10 КОЕ/мл или от 10 до 10 КОЕ/мл, хотя они могут варьировать в зависимости от физического состояния или состояния здоровья реципиента.
Преимущества и особенности настоящего изобретения и способы их достижения станут более очевидными из описанных ниже примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается примерами, описанными ниже, а может осуществляться в различных других формах. Примеры даются для того, чтобы полностью раскрыть настоящее изобретение и чтобы те, кто владеет обычными знаниями в данной области, к которой относится настоящее изобретение, могли полностью понять объём настоящего изобретения. Настоящее изобретение определяется только прилагаемой формулой изобретения.
Преимущества изобретения
Поскольку штамм бактерий Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению не только обладает подавляющим нейровоспаление действием, но и способен улучшить симптомы атаксии в животной модели болезни Паркинсона, его можно использовать для профилактики, облегчения симптомов и лечения различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 схематически показывает методику эксперимента по исследованию эффекта подавления нейровоспаления штаммом WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению.
Фиг. 2 показывает результат наблюдения результатов лечения нейроглиальных клеток, в которых воспаление было индуцировано липополисахаридом (LPS), штаммом WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению с проведением иммунофлуоресцентного окрашивания.
Фиг. 3 показывает результат наблюдения результатов лечения нейроглиальных клеток, в которых воспаление было индуцировано липополисахаридом (LPS), штаммом WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению.
Фиг. 4 показывает результат перорального введения мышиной модели болезни Паркинсона штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению с последующей оценкой двигательной способности мыши с помощью теста ротарод.
Фиг. 5 показывает результат перорального введения мышиной модели болезни Паркинсона штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus по настоящему изобретению с последующей оценкой силы хвата мыши.
Лучший вариант осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение описывается более подробно в следующих примерах. Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но масштаб настоящего изобретения не ограничивается только этими примерами.
Примеры
Пример 1. Получение штамма Pediococcus inopinatus
9
Для эксперимента использовали штамм WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus, который происходит из кимчи и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов под номером доступа KCCM12653P. После культивирования штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus в питательной среде MRS (агар MRS) при 30°C в течение 24 часов клетки центрифугировали при 8000 об./мин в течение 5 минут и оcтатки среды удаляли ополаскиванием фосфатно-солевым буфером (PBS). После высева клеток на питательную среду DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, HyClone, США) при плотности 1 x 10 КОЕ/мл и культивирования при 30°C в течение 24 часов клетки удаляли центрифугированием при 8000 об./мин в течение 5 минут. После установления pH супернатанта на уровне pH 7,2 супернатант фильтровали через шприцевой фильтр (размер пор: 0,22 мкм).
Пример 2. Первичная культура нейроглиальных клеток
2
После дезинфицирования спиртом скальпа крысы 2-дневного возраста линии Sprague-Dawley сразу же извлекали головной мозг, не повредив его. Извлечённый мозг погружали в холодный HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка) и под препаровальной лупой отделяли только кору головного мозга. После приготовления суспензии единичных клеток с помощью пастеровской пипетки клетки культивировали в течение 10 суток. Нейроглиальные клетки культивировали в 5% CO-инкубаторе при 37°C с использованием питательной среды DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США), 10% лошадиной сыворотки (HyClone, США) и 1% пенициллина/стрептомицина (GIBCO, США).
Пример 3. Исследование эффекта подавления нейровоспаления штаммом Pediococcus inopinatus
5
Чтобы исследовать эффект подавления нейровоспаления штаммом WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus, полученным в примере 1, индуцировали воспаление в нейроглиальных клетках с помощью LPS (липополисахарид) и клетки обрабатывали культурой WIKIM27. После посева нейроглиальных клеток на 24-луночный планшет в концентрации 1,0 x 10клеток/мл и замены спустя 24 часа на бессывороточную питательную среду клетки обрабатывали спустя 16 часов 100 нг/мл LPS. Через два часа после LPS-обработки клетки обрабатывали культурой WIKIM27 в объёме, составляющем 1/5 от объёма среды нейроглиальных клеток. Методика эксперимента схематически показана на фиг.1. Бактерии Weissella cibaria, штамм WIKIM28 (номер доступа KFCC11625P), и Lactobacillus sakei, штамм WIKIM30 (номер доступа KFCC11618P), использовали в контрольных группах.
Как видно из фиг. 2 и 3, иммуногистохимический анализ подтвердил, что обработанная штаммом WIKIM27 группа (W27_CM) показала значительно сниженную активность нейроглиальных клеток (микроглии и астроцитов), несмотря на индуцирование нейровоспаления с помощью LPS (липополисахарид). В качестве селективных маркёров для микроглии и астроцитов использовали соответственно Iba-1 (связывающая ионизированный кальций адаптерная молекула 1) и GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок). Было подтверждено, что культура штамма WIKIM27 облегчает симптомы нейровоспаления.
Пример 4. Получение и введение штамма Pediococcus inopinatus
10
9
После культивирования штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus в питательной среде MRS при 30°C в течение 24 часов клетки центрифугировали при 8000 об./мин в течение 5 минут и остатки среды удаляли ополаскиванием фосфатно-солевым буфером (PBS). С использованием PBS подсчитывали количество клеток в 1 x 10 КОЕ/мл. Экспериментальному животному 5 раз в неделю перорально вводили 0,2 мл (1 x 10 КОЕ). Стерилизованный PBS вводили животным в группах отрицательного и положительного контроля.
Пример 5. Исследование лечения животной модели штаммом Pediococcus inopinatus в целях профилактики и лечения болезни Паркинсона
Для исследования терапевтического действия, полученного в примере 1 штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus на болезнь Паркинсона, проводили тест ротарод и тест силы хвата на мышиной модели болезни Паркинсона. Мышиная модель болезни Паркинсона была создана путём приучения в течение недели мыши-самца 8-недельного возраста (C57BL/6) к обстановке лаборатории, перорального введения в течение 30 дней штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus и последующего индуцирования болезни Паркинсона внутрибрюшинным введением MPTP (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, 30 мг/кг, один раз в день в течение 5 дней). 'Нелеченный' (naïve) обозначает группу, ранее не получавшую лечения; MPTP – группу отрицательного контроля; селегилин (Selegiline) – группу положительного контроля. Селегилин является ингибитором моноаминоксидазы (MAO-B): это нейропротекторный материал, который вводился перорально (3 мг/кг) в течение 3 дней перед инъекцией MPTP.
1) Тест ротарод
Тест ротарод выполняли путём измерения времени удерживания мыши на приборе ротарод, состоящем из опорной платформы и вращающегося стержня (барабана) с нескользящей поверхностью. Оценку проводили спустя 30 минут после испытания мыши при скорости 4 об./мин в течение 2 минут для приучения. Скорость вращения увеличивали с 4 об./мин до 40 об./мин с ускорением 1 об./мин/8 секунд; максимальную скорость вращения поддерживали на уровне 40 об./мин в течение 300 секунд.
Результат показал (фиг. 4), что отрицательная контрольная группа, получавшая PBS, сохраняла равновесие при скорости вращения 7,7 об./мин в среднем, в то время как тестируемая группа, которой был введён перорально штамм WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus, могла удерживать равновесие при скорости вращения 10,6 об./мин в среднем.
2) Тест “сила хвата”
Тест “сила хвата” выполняли путём измерения усилия схватывания лапой мыши с помощью динамометра. Силу хвата лапой мыши измеряли 5 раз и по 3 максимальным значениям рассчитывали среднее.
В результате (фиг. 5) отрицательная контрольная группа показала силу хвата лапой мыши порядка 77,78 грамма, в то время как тестируемая группа, которой был введён перорально штамм WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus, показала очень высокую (по сравнению с группой отрицательного контроля) силу хвата – 85,79 грамма.
Другими словами, поскольку введение внутрь штамма WIKIM27 бактерий Pediococcus inopinatus привело к лучшим результатам тестов ротарод и “сила хвата” на мышиной модели болезни Паркинсона по сравнению с группой отрицательного контроля, то это подтверждает, что симптомы атаксии в мышиной модели болезни Паркинсона значительно улучшились (p < 0,05).