Способ выделения гордецина из зерна ячменя
METHOD OF SELECTING GORDECINE FROM BARLEY GRAIN

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выделения гордецина из зерна ячменя, который может быть использован в качестве противомикробного вещества в растениеводстве, ветеринарии, пищевой промышленности.
Гордецин - это природное антибактериальное вещество, которое обладает широким антибактериальным и микоцидным действием. Он представляет собой непредельное азотистое соединение кислотной природы. Его можно применять при лечении грибковых заболеваний, вызванных дерматофитами, при лечении кандидамикозов, эпидермофии стоп, рубофитии кожи, микробной экземы. Возможность использования гордецина в пищевой промышленности определена способностью останавливать рост спороносных бактерий. Его можно применять для увеличения срока хранения яиц, в борьбе с картофельной болезнью пшеничного хлеба.
Известен способ выделения гордецина из воды, оставшейся после замачивания зерна ячменя (Ежов И.С. Новый антибиотик гордецин и пути его использования в народном хозяйстве: автореф. дис. … д-ра наук / [Ленинградский технологический институт пищевой промышленности]. - Л., 1968. - 49 с.: ил. - Библиогр.: с. 49.; Новотельнов, Н.В., Ежов И.С. Новый антибиотик гордецин, выделенный из ячменного зерна / Н.В. Новотельнов, И.С. Ежов // Научные доклады высшей школы. Биологические науки. 1959. - №3. С. 178-182).
Данный способ предполагает размалывание 12 кг зерна до размера частиц (в основном оболочки, мучка эндосперма удалялась) 1,00-1,60 мм. Далее зерно подвергали грубому размолу на лабораторной мельнице с целью максимального освобождения оболочек и алейронового слоя. Для отсева мучки зерно просеивали через сито с отверстиями 0,25 мм. Оставшиеся оболочки экстрагировали трехкратным количеством дистиллированной воды в течение 72 часов при периодическом помешивании. В качестве антисептика применялся хлороформ. Затем масса отжималась и вытяжка центрифугировалась. Полученный центрифугат обрабатывался насыщенным раствором уксуснокислого свинца для удаления белковых и дубильных веществ. В случае наличия избытка свинца фильтрат обрабатывался насыщенным раствором сернокислого натрия. Для адсорбции действующего начала из фильтрата последний обрабатывался активированным углем (коллактивитом). Адсорбция проводилась в течение суток при периодическом взбалтывании. Затем угль отфильтровывался на Бухнеровской воронке, промывался дистиллированной водой и обрабатывался 96% этиловым спиртом. Спирт отгонялся под вакуумом.
Недостатком этого способа является невозможность воспроизведения схемы выделения гордецина из малых навесок зерна ячменя из-за отсутствия описания соотношения реагентов и операций по очистке гордецина. Известный способ выделения гордецина из воды после замачивания зерна ячменя трудоемок и не подходит для лабораторной оценки сортов ячменя на наличие этого компонента. При этом обработке подвергалась вода после 16 часов вымачивания ячменя.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ выделения гордецина из ячменной муки, в котором была исключена трехкратная водная обработка измельченных семян ячменя и заменена экстракцией диэтиловым эфиром в присутствии 5% соляной кислоты. Зерно ячменя размалывают до размера частиц 0,16-0,45 мм, затем мучка эндосперма удаляется, остаются только оболочки. Данный способ заключается в экстрагировании вещества системой растворителей. Сырье с подкисленным эфирным экстрагентом соединяют в соотношении 1:2,7. I ступень - предварительная, экстрагентом является смесь диэтилового эфира и 3%-ной соляной кислоты. Экстракцию гордецина из сырья осуществляют в течение 24 часов. II ступень - основная, экстрагент - 7% раствор карбоната натрия, гидроксида натрия. В результате получали вытяжку, разделенную на 2 фракции. Очистка гордецина от примесей проводилась в соответствии с выбранной фракцией (Выделение гордецина из зерна ячменя и исследование его биологического действия и взаимосвязи с морфофизиологическими признаками / Костромичева Е.В.: диссертация … кандидата биологических наук: 03.01.05 / Воронежский государственный университет. Орел, 2013).
Недостатком этого способа является недостаточно высокий выход гордецина из сырья, длительность процесса выделения гордецина, недостаточная степень очистки действующего вещества, высокий расход реагентов.
Задачей изобретения является повышение выхода гордецина из сырья и степени его очистки, снижение количества реагентов и времени экстракции.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе выделения гордецина из зерна ячменя, заключающемся в размалывании зерна ячменя, двухступенчатой экстракции и концентрировании под вакуумом, согласно изобретению зерна ячменя предварительно дезинфицируют тимолом, перемешивают и увлажняют водой с температурой 12-17°С до 43…48%-ного содержания влаги, затем проращивают в течение 2 суток при температуре +24°С при периодическом перемешивании и смене воды, после чего пророщенное зерно высушивают и измельчают вместе с ростками, а последующую экстракцию сырья проводят смесью диэтилового эфира и 3%-ной соляной кислоты в соотношении сырье-экстрагент 1:2.
Суть предлагаемого способа заключается в том, что сырье для извлечения гордецина - семена ячменя проращивали перед извлечением вещества, что позволяет увеличить выход и исключить операцию по отсеиванию мучки эндосперма. Для получения пророщенного зерна ячмень промывали для удаления загрязнений. Дезинфицировали тимолом, затем зерно перемешивали и увлажняли до 43…48%-ного содержания влаги и заливали водой с температурой 12-17°С. Проращивание зерна проводили в течение 2 суток при температуре +24°С, периодическом перемешивании и смене воды. Далее пророщенное зерно высушивали, измельчали вместе с ростками. Измельчение сырья проводили на лабораторной мельнице в течение 15 минут до размеров частиц 1,00-1,60 мм. Далее осуществляют двухступенчатую экстракцию. Сырье с подкисленным 3%-ной соляной кислотой эфирным экстрагентом соединяют в соотношении 1:2, что позволяет сократить объем кислоты и диэтилового эфира на 26%, без потери выхода.
I этап экстрагирования - предварительный. Экстрагентом является смесь диэтилового эфира и 3%-ной соляной кислоты в соотношении 93:7. Экстракцию гордецина из сырья осуществляют в течение 12 часов, количество выделенного гордецина, согласно экспериментальным данным, остается соразмерным количеству выделенного вещества при 24-часовой экстракции. Полученный экстракт фильтруют на Бухнеровской воронке. Дальнейшие операции проводят с эфирным слоем после разделения в делительной воронке.
II ступень - основная, экстрагирование эфирного слоя 7% раствором карбоната натрия до рН 7. В результате получают вытяжку, разделенную на 2 фракции: водную и эфирную. Проводят разделение в делительной воронке. Очистку гордецина от примесей проводят в соответствии с выбранной фракцией. Водный слой обрабатывают 3% раствором HCl в соотношении 4:1 в течение 20-30 минут. Затем экстракцию продолжают диэтиловым эфиром в течение 5-10 минут. Проводят разделение вытяжки в делительной воронке. Эфирный слой испаряется и концентрируется под вакуумом. На выходе получают карбонатную фракцию, содержащую гордецин. Водный слой не используется.
Эфирный слой, полученный в ходе основной ступени экстрагирования, обрабатывается 3% раствором гидроксида натрия в соотношении 7:1 в течение 15-20 минут, далее проводится разделение в делительной воронке. Эфирный слой испаряется и концентрируется под вакуумом. На выходе получается нейтральная фракция, содержащая гордецин.
Выделенное вещество гордецин - маслянистая жидкость желтого и светло-коричневого цвета, имеющая специфический запах меда и ржаного хлеба.
Очистка препарата гордецина проводится методом ВЭЖХ. Хроматография спиртового экстракта, содержащая гордецин, проводится при следующих условиях: колонка - Ultrasil-Si(250×7.8; 10 мкм); подвижная фаза - 97,5% гексан + 2,5% изопропанол; скорость протока - 2 мл/мин; проба, наносимая на колонку - 2 мл; детектирование - УФ при 260 нм.
Результат показал, что спиртовой экстракт карбонатной фракции содержит несколько пиков. Полученные на хроматограмме фракции собирают в круглодонные колбы, упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 25°С и растворяют в метаноле. УФ-спектр спектр метанольного раствора хроматографически очищенного препарата гордецина получен в 1 см кварцевой кювете на спектрофотометре SPECORDUV VIS. Для идентификации пика, соответствующего гордецину, использован тот факт, что очищенный препарат гордецина в УФ-области спектра содержит плато в области 260-275 нм. При снятии УФ-спектров полученных фракций установлено, что плато в указанной области характерно только для фракции-4. На этом основании этого можно предположить, что фракция-4 соответствует гордецину.
Аналитическая хроматография препаративно очищенного препарата гордецина получена при условиях: колонка - Ultrasil-Si(250×4,6; 5 мкм); подвижная фаза - 97,5% гексан + 2,5% изопропанол; скорость протока - 0,5 мл/мин; проба, наносимая на колонку - 10 мкл (с=1 мг/мл); детектирование - УФ при 260 нм. Она содержит только один пик, что свидетельствует о чистоте выделенного препарата гордецина. Для очищенного препарата гордецина регистрация в режиме сканирования масс отрицательных ионов проводится на масс-спектрометре Finnigan LCQ Advantage (США). На масс-спектре присутствует несколько пиков. Наиболее высокомолекулярный из них с M/z, равным 485,8, соответствует по молекулярной массе окисленной форме гордецина (469,6) (Новотельнов, 1967), а более низкомолекулярные соответствуют, по-видимому, продуктам распада гордецина. Данные масс-спектра препарата подтверждают, что он является гордецином, но в окисленной форме. Процесс окисления препарата гордецина, содержащего несколько сопряженных непредельных химических связей, по-видимому, происходит в процессе снятия масс-спектра.
Техническим результатом способа является сокращение объемов реагентов и времени экстракции, увеличение степени очистки и выхода гордецина.
Пример 1.
Зерно ячменя промывали для удаления загрязнений. Дезинфицировали тимолом, затем зерно перемешивали и увлажняли до 43…48%-го содержания влаги и заливали водой с температурой 12-17°С. Проращивание зерна проводили в течение 2 суток при температуре +24°С, периодическом перемешивании и смене воды. Далее пророщенное зерно высушивали, измельчали вместе с ростками. Измельчение сырья проводили на лабораторной мельнице в течение 15 минут до размеров частиц 1,00-1,60 мм. Для извлечения брали навеску измельченного сырья массой 10 г и заливали 20 мл раствора диэтилового эфира (18,6 мл.) и 3% соляной кислоты (1,4 мл). Через 12 часов экстракт отфильтровывали на Бухнеровской воронке. Объем экстракта составляет 20 мл. Разделение смеси проводят в делительной воронке.
18 мл эфирного слоя экстрагируют 7% раствором карбоната натрия до рН 7. В результате получают вытяжку, разделенную на 2 фракции - водную и эфирную. Проводят разделение в делительной воронке. Полученный водный слой обрабатывают 3% раствором HCl в соотношении 4:1 в течение 20-30 минут. Затем экстракцию продолжают диэтиловым эфиром в течение 5-10 минут. Проводят разделение вытяжки в делительной воронке. Эфирный слой испаряется и концентрируется под вакуумом. На выходе получают карбонатную фракцию, содержащую гордецин (табл. 1). Водный слой не используется.
Эфирный слой, полученный в ходе основной ступени экстрагирования, обрабатывается 3% раствором гидроксида натрия в соотношении 7:1 в течение 15-20 минут, далее проводится разделение в делительной воронке. Эфирный слой испаряется и концентрируется под вакуумом. На выходе получается нейтральная фракция, содержащая гордецин.
Дальнейшая очистка гордецина проведена методом ВЭЖХ с использованием подвижной фазы гексан (97,5%)/изопропанол (2,5%). Полученные на хроматограмме фракции собирают в круглодонные колбы, упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 25°С.
Пример 2.
Зерно ячменя промывали для удаления загрязнений. Дезинфицировали тимолом, затем часть зерно перемешивали и увлажняли до 43…48%-ного содержания влаги и заливали водой с температурой 12-17°С, вторую часть оставляли без проращивания. Проращивание зерна проводили в течение 2 суток при температуре +24°С, периодическом перемешивании и смене воды. Из части пророщенного зерна удаляли проростки. Пророщенное зерно с проростками высушивали, измельчали вместе с ростками. Измельчение сырья проводили на лабораторной мельнице в течение 15 минут до размеров частиц 1,00-1,60 мм. Пророщенное зерно с удаленными проростками также измельчали. Для извлечения гордецина брали навеску измельченного сырья массой 10 г и заливали 20 мл раствора диэтилового эфира (18,6 мл) и 3%-ной соляной кислоты (1,4 мл). Через 12 часов экстракт отфильтровывали на Бухнеровской воронке. Объем экстракта составляет 20 мл. Разделение смеси проводят в делительной воронке. Дальнейшее извлечения проводили также как и в первом примере.
Таким образом, проращивание зерна ячменя перед выделением гордецина позволяет увеличить выход вещества, изменение соотношения сырье-экстрагент до 1:2 сократит объем кислоты и диэтилового эфира на 26% без потери выхода, а снижение времени экстракции гордецина из сырья до 12 часов будет способствовать интенсификации процесса.