КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В УМЕНЬШЕНИИ НОЦИЦЕПЦИИ У МЛАДЕНЦЕВ И ДЕТЕЙ МЛАДШЕГО ВОЗРАСТА
COMPOSITION FOR USE IN REDUCTION IN NOCICEPTION IN INFANTS AND YOUNG CHIDREN

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N-тетраозу (LNT), для применения в уменьшении ноцицепции у младенца или у ребенка младшего возраста. Композиции, в частности, полезны для уменьшения боли в животе, например боли, связанной с дискомфортом в кишечнике и/или кишечными расстройствами, и, следовательно, также способствуют сокращению периодов плача и улучшению качества сна и общего качества жизни младенцев и детей младшего возраста.
Предпосылки создания изобретения
Младенцы, в том числе новорожденные, испытывают боль так же, как и взрослые, как указано, например, в работе Goksan et al.; fMRI reveals neural activity overlap between adult and infant pain; eLife 2015;4:e06356. В других исследованиях даже предполагают, что младенцы могут воспринимать боль острее, чем взрослые и дети старшего возраста.
Младенцы и дети младшего возраста могут испытывать различные типы боли, от острой боли до привычной боли, которая может, например, быть вызвана воспалением, которое может стать хроническим. У младенцев и детей младшего возраста, как и у взрослых, боль связана с реакциями, такими как повышенная частота сердечных сокращений, более быстрые и поверхностные дыхательные движения, приводящие к пониженному насыщению кислородом, и повышенное артериальное давление. Было обнаружено, что такие реакции, вызванные длительным или многократным воздействием боли, оказывают отрицательное влияние на развитие младенцев и детей младшего возраста и могут приводить, например, к отклонениям в развитии болевой системы, таким как гипералгезия, или к нарушению регуляции связанных со стрессом гормонов, такому как повышенная выработка кортизола. См., например, работу Ziraldo, Breanne, Infant Pain Management (2010); Senior Honors Theses; 198, которая может быть получена из Университета Либерти, Вирджиния, США, и доступна на дату подачи заявки по адресу http://digitalcommons.liberty.edu/honors/198.
Младенцы и дети младшего возраста особенно подвержены воздействию определенных источников боли, такой как боль в животе. Причины боли в животе включают абдоминальный дискомфорт и абдоминальные расстройства. Одним из примеров распространенной причины дискомфорта является, например, колика. Причина колики не вполне понятна, но, по-видимому, связана с гиперчувствительностью кишечника к боли, поэтому растяжение кишечника, вызванное нормальным прохождением газов или фекалий, приводит к боли у страдающих коликами младенцев, провоцируя длительные периоды плача, плохой сон и снижение качества жизни как для младенца, так и для родителей. Боль в животе также может быть результатом других причин дискомфорта, таких как нарушение характера стула, воздействие новых продуктов питания, вздутие живота и спазмы. Случаются также расстройства, такие как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), диарея, например инфекционная диарея, некротизирующий энтероколит (НЭК) и функциональные абдоминальные болевые расстройства. Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) представляет собой серьезное хроническое и деструктивное расстройство желудочно-кишечного тракта. Оно включает в себя болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Функциональные абдоминальные болевые расстройства и недеструктивные расстройства желудочно-кишечного тракта и включают в себя синдром раздраженного кишечника (СРК), абдоминальную мигрень и функциональную абдоминальную боль без дополнительных уточнений (ФАБ-БДУ). Дополнительное подробное определение функциональных абдоминальных болевых расстройств представлено в работе Hyams et al.; Childhood Functional Gastrointestinal Disorders: Child/Adolescent; Gastroenterology 150 (2016):1456–1468.
Таким образом, для младенцев и детей младшего возраста желательно уменьшение ноцицепции. Однако побочные эффекты, связанные с лекарственными препаратами для купирования боли, у младенцев и детей младшего возраста могут вызывать еще больше проблем, чем у взрослых. Таким образом, особый интерес представляет идентификация таких средств для уменьшения ноцицепции у младенцев и детей младшего возраста, которые не являются фармакологическими и связаны с низким риском для младенца или ребенка младшего возраста. Особое преимущество обеспечила бы идентификация ингредиентов, специально подобранных для человеческих младенцев и/или детей младшего возраста и способных уменьшать ноцицепцию.
Материнское молоко рекомендовано всем младенцам. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или неэффективным по медицинским причинам либо мать решает не кормить грудью. Для этих ситуаций были разработаны детские смеси. Были разработаны также обогатители для витаминизации материнского молока или детской смеси определенными ингредиентами. В таких случаях было бы еще более предпочтительно обеспечить средства для уменьшения ноцицепции и тем самым снизить частоту возникновения боли у младенцев и детей младшего возраста посредством вмешательства в питание.
На предшествующем уровне техники уже исследовано влияние пищевых ингредиентов, таких как олигосахариды человеческого грудного молока, на боль. В US2016/0243139 раскрыто применение синтетических композиций, содержащих один или более моно- или олигосахаридов грудного молока, для лечения висцеральной боли. В соответствии с положениями данного документа можно применять широкое разнообразие моно- и олигосахаридов грудного молока, причем предпочтительными являются 2’-FL, 3’FL, DFL, LNnT, 3’-SL, 6’-SL или LNFP-1 и наиболее предпочтительной является смесь 2’-FL и LNnT или LNT.
WO2016/139329 относится к композициям для применения в улучшении консистенции или частоты стула у младенцев или детей младшего возраста, причем такие эффекты связаны с предотвращением и/или лечением колики и/или кишечного дискомфорта. Для достижения этого полезного эффекта применяют питательную композицию, содержащую по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид и по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид. Фукозилированный олигосахарид и N-ацетилированный олигосахарид могут быть выбраны из широкого перечня. Наиболее предпочтительным фукозилированным олигосахаридом является 2-FL, а наиболее предпочтительным N-ацетилированным олигосахаридом является LNnT.
Было бы полезно дополнительно оптимизировать влияние питательных композиций на уменьшение ноцицепции у всех младенцев и детей.
Некоторые конкретные группы младенцев и детей младшего возраста особенно нуждаются в композициях, способных уменьшать восприятие боли. Такими младенцами и детьми младшего возраста являются, например, недоношенные младенцы, младенец с низким весом при рождении и/или младенцы или дети младшего возраста с задержкой роста. Действительно, такие младенцы часто испытывают неблагоприятные медицинские состояния и требуют существенно более частого медицинского вмешательства, чем доношенные младенцы и нормально развивающиеся младенцы. Многие из таких медицинских вмешательств, к сожалению, болезненны для младенца или ребенка младшего возраста, который таким образом сталкивается с повторяющейся и иногда острой болью. Для таких младенцев особенно предпочтительно дополнять фармакологическое купирование боли питательными композициями, способными уменьшать ноцицепцию.
Существует очевидная потребность в разработке подходящих способов уменьшения ноцицепции у младенцев и детей младшего возраста.
Также существует потребность в обеспечении таких полезных для здоровья эффектов способом, который особенно приемлем для субъектов младшего возраста (младенцев и детей младшего возраста), при этом способ не должен включать в себя классическое фармацевтическое вмешательство, поскольку эти младенцы или дети младшего возраста особенно уязвимы.
Существует потребность в обеспечении у этих младенцев или детей младшего возраста таких полезных для здоровья эффектов способом, который не вызывает побочных эффектов и/или который можно легко предоставлять и который приемлем для родителей или медицинских работников.
Также существует потребность в обеспечении таких полезных эффектов способом, который позволит сохранять разумную и доступную для большинства стоимость такого обеспечения.
Таким образом, существует очевидная потребность в разработке альтернативных способов, отличных от классического фармацевтического вмешательства, такого как применение фармацевтических анальгетиков, по меньшей мере из-за связанного риска возникновения побочных эффектов.
Изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что композицию, содержащую 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N-тетраозу (LNT), можно преимущественно применять для уменьшения ноцицепции у младенца или ребенка младшего возраста. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, считают, что эти олигосахариды действуют синергетически для достижения этого полезного эффекта посредством активации сопряженного с G-белком рецептора 35 (GPR35). Было обнаружено, что 6’SL и LNT способны запускать активацию рецептора GPR35 по отдельности и синергетически запускать активацию такого рецептора при использовании в комбинации. Напротив, в отличие от того, что можно было бы предположить исходя из предшествующего уровня техники, другой олигосахарид грудного молока (такой как 3’-сиалиллактоза (3-SL), лакто-N-неотетраоза (LNnT), 2’-фукозиллактоза (2-FL) и дифукозиллактоза) не активирует рецептор GPR35.
Рецептор GPR35, который имеет высокую экспрессию, например в желудочно-кишечном тракте, в многочисленных исследованиях был идентифицирован как участвующий в уменьшении ноцицепции, и его активация была описана как вызывающая анальгезию (см., например, Resta et al.; Kynurenic acid and zaprinast induce analgesia by modulating HCN channels through GPR35 activation; Neuropharmacology 108 (2016), 136–143; Cosi et al.; G-protein coupled receptor 35 (GPR35) activation and inflammatory pain: Studies on the antinociceptive effect of kynurenic acid and zaprinast, Neuropharmacology 60 (2011), 1227–1231; и Zhao et al.; Targetting of the Orphan Receptor GPR35 by Pamoic Acid: A Potent Activator of Extracellular Signal-Regulated Kinase and β-Arrestin2 with Antinociceptive Activity; Mol Pharmacol 78(2010):560–568). На основании таких исследований соединения, способные активировать рецепторы GPR35, были рассмотрены для применения в качестве анальгетических лекарственных средств, и скрининг активаторов GPR35 был предложен в качестве способа идентификации новых анальгетических лекарственных средств. Таким образом, активация рецептора GPR35 посредством 6’SL и LNT обеспечивает прочную основу для применения композиций, содержащих такие олигосахариды грудного молока, для достижения полезного эффекта уменьшения ноцицепции. Синергетическое активирующее влияние 6’SL и LNT на GPR35 также обеспечивает прочную основу для превосходного ноцицептивного эффекта такого олигосахарида грудного молока при использовании в комбинации.
Соответственно, в настоящем изобретении, таким образом, предложена питательная композиция, содержащая 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N-тетраозу (LNT), для применения в способе уменьшения ноцицепции у младенца или ребенка младшего возраста.
В настоящем изобретении также предложена молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, содержащая 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N тетраозу (LNT), для применения в способе уменьшения ноцицепции у ребенка.
Питательная композиция, соответственно молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, в частности, эффективна для применения в способе
- уменьшения боли в животе;
- уменьшения боли, связанной с дискомфортом в желудочно-кишечном тракте и/или расстройствами желудочно-кишечного тракта;
- сокращения периодов плача;
- улучшения качества сна; и
- улучшения качества жизни
у младенца или ребенка младшего возраста, соответственно у ребенка.
Изобретение также относится к применению питательной композиции, содержащей 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N тетраозу (LNT), в способе
- сокращения периодов плача;
- улучшения качества сна; и
- улучшения качества жизни
у младенца или ребенка младшего возраста; и
питательной композиции в форме молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, содержащей 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N-тетраозу (LNT), в способе
- сокращения периодов плача;
- улучшения качества сна; и
- улучшения качества жизни
у ребенка.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - отклик GPR35 in vitro на LNT в клеточном анализе из примера 2. Значение EC50 составляет 4,5 мМ.
Фиг. 2 - отклик GPR35 in vitro на 6’SL в клеточном анализе из примера 2. Значение EC50 составляет 6,5 мМ.
Фиг. 3 - отклик GPR35 in vitro на смесь олигосахаридов грудного молока (ОГМ), состоящую из смеси 6’SL и LNT, в клеточном анализе из примера 2. Значение EC50 составляет 2,2 мМ.
Фиг. 4 - анализ 6’SL (A) и LNT (B) методом высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (ВЭАОХ-ИАД) до и после обработки нейраминидазой (6’SL) или β-галактозидазой (LNT), показывающий полное расщепление обоих ОГМ
Фиг. 5 - отклик GPR35 in vitro на смесь ОГМ, состоящую из смеси 6’SL и LNT, в клеточном анализе из примера 2 (столбцы, заштрихованные горизонтальными линиями) в сравнении со смесью расщепленных 6’SL и LNT (столбцы, заштрихованные вертикальными линиями). График показывает, что при расщеплении 6’SL и LNT активность, состоящая в активации рецептора, теряется.
Фиг. 6 - амплитуда сокращения, измеренная в зависимости от колоректальной дилатации у несенсибилизированных мышей (AIN93; точки), у сенсибилизированных мышей (was:AIN93; квадраты) и у сенсибилизированных мышей, которым вводили 6’SL и LNT (was:LNT+6’SL; ромбы).
Подробное описание изобретения
В настоящем документе следующие термины имеют приведенные ниже определения.
Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев. Выражение «ребенок младшего возраста» означает ребенка в возрасте от одного до менее трех лет (его также называют ребенком, начинающим ходить). Выражение «ребенок» означает возраст от трех до семи лет.
«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством кесарева сечения» означает младенца или ребенка младшего возраста, рожденного посредством кесарева сечения. Это означает, что младенец или ребенок младшего возраста не был рожден посредством вагинальных родов.
«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством вагинальных родов» означает младенца или ребенка младшего возраста, который был рожден посредством вагинальных родов, а не посредством кесарева сечения.
«Недоношенный» или «преждевременно родившийся» означает младенца или ребенка младшего возраста, который родился раньше срока. По существу, этот термин относится к младенцу или ребенку младшего возраста, рожденному до 37-й недели беременности.
«Младенец с низким весом при рождении» означает новорожденного, имеющего массу тела менее 2500 г (5,5 фунта) по причине либо преждевременных родов, либо ограниченного роста плода. Таким образом, этот термин включает:
- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении от 1500 до 2500 г (обычно называемый «низким весом при рождении», или НВР);
- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении от 1000 до 1500 г (обычно называемый «очень низким весом при рождении», или ОНВР);
- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении менее 1000 г (называемый «крайне низким весом при рождении», или КНВР).
«Младенец, родившийся маленьким для своего гестационного возраста (SGA)» означает ребенка с весом при рождении менее 10-го процентиля для детей того же гестационного возраста.
Выражение «питательная композиция» означает композицию, которой питается субъект. Данная питательная композиция обычно предназначена для перорального или внутривенного применения и обычно включает в себя источник липидов или жира и источник белка.
В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой гипоаллергенную питательную композицию. Выражение «гипоаллергенная питательная композиция» означает питательную композицию, которая с низкой вероятностью вызовет аллергические реакции.
В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой «искусственную питательную композицию». Выражение «искусственная питательная композиция» означает смесь, полученную с помощью химических и/или биологических средств, которые могут быть химически идентичны смеси природного происхождения, присутствующей в молоке млекопитающих (т.е. искусственная композиция не является грудным молоком).
Выражение «детская смесь» при использовании в настоящем документе относится к продукту питания, который специально предназначен для употребления в пищу младенцами в течение первых месяцев жизни и сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой категории лиц (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC 2006/141/EC от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и смесях для прикармливаемых детей). Оно также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и Infant Specialities (включая статью Food for Special Medical Purpose). Выражение «детская смесь» охватывает как «начальную детскую смесь», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей».
«Смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» дают начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона питания для данной категории лиц.
Выражение «детское питание» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Выражение «детская композиция на зерновой основе» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Выражение «молочная смесь для детей от 1 до 3 лет» (или GUM) относится к напитку на основе молока, как правило, с добавлением витаминов и минеральных веществ, который предназначен для детей младшего возраста или детей.
Термин «обогатитель» относится к жидким или твердым питательным композициям, подходящим для смешивания с грудным молоком или детской смесью.
Выражение «период отлучения от груди» означает период, в течение которого в рационе младенца или ребенка младшего возраста материнское молоко заменяют другой пищей.
Выражения «в возрасте дней/недель/месяцев/лет» и «дней/недель/месяцев/лет после рождения» могут использоваться как взаимозаменяемые.
Выражение «уменьшение ноцицепции» включает одно или несколько из следующего:
- уменьшение боли в животе;
- уменьшение боли, связанной с дискомфортом в желудочно-кишечном тракте и/или расстройствами желудочно-кишечного тракта;
- сокращение периодов плача;
- улучшение качества сна; и
- улучшение качества жизни.
Под «материнским молоком» следует понимать грудное молоко или молозиво матери.
«Олигосахарид» представляет собой сахаридный полимер, содержащий небольшое число (как правило, от трех до десяти) простых сахаров (моносахаридов).
Термин «ОГМ» относится к олигосахариду (-ам) грудного молока. Эти углеводы обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу, что указывает на то, что они могут проявлять существенные функции, непосредственно не относящиеся к их калорийности. В первую очередь было показано, что они играют жизненно важную роль в раннем развитии младенцев и детей младшего возраста, например в развитии иммунной системы. В грудном молоке обнаружено много различных видов ОГМ. Каждый отдельный олигосахарид основан на комбинации глюкозы, галактозы, сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты), фукозы и/или N-ацетилглюкозамина с образованием многочисленных и разнообразных связей между ними, что обусловливает присутствие огромного числа различных олигосахаридов в грудном молоке — на данный момент было выявлено более 130 таких структур. Почти все они на своем восстанавливающем конце имеют лактозный фрагмент, в то время как сиаловая кислота и/или фукоза (при наличии) занимают концевые положения на невосстанавливающих концах. ОГМ могут быть кислыми (например, содержащий заряженную сиаловую кислоту олигосахарид) или нейтральными (например, фукозилированный олигосахарид).
«Фукозилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, имеющий остаток фукозы. Он имеет нейтральный характер. Некоторыми примерами являются 2-FL (2’-фукозиллактоза), 3-FL (3-фукозиллактоза), дифукозиллактоза, лакто-N-фукопентаоза (например, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V), лакто-N-фукогексаоза, лакто-N-дифукогексаоза I, фукозиллакто-N-гексаоза, фукозиллакто-N-неогексаоза, дифукозиллакто-N-гексаоза I, дифукозиллакто-N-неогексаоза II и любая их комбинация. Хотя авторы не желают ограничиваться какой-либо теорией, считается, что фукозил-эпитоп фукозилированных олигосахаридов может выступать в качестве «ловушки» на поверхности слизистой оболочки. Посредством конкурентного эффекта он может предотвращать и/или ограничивать действие патогенов, вызывающих инфекции (вирусного или бактериального происхождения), или секретируемых ими компонентов (например, токсинов), в первую очередь исключая их связывание с природными лигандами, и, безотносительно к какой-либо теории, считается, что за счет этого будет снижаться риск возникновения инфекций/воспалений, и в частности риск возникновения инфекций и/или воспалений нижних дыхательных путей (НДП)/уха. Дополнительно принято считать, что фукозилированные олигосахариды стимулируют рост и метаболическую активность специфических симбиотических микробов, снижающих воспалительную реакцию и создающих неблагоприятную среду для патогенов, тем самым обеспечивая колонизационную резистентность.
Выражения «фукозилированные олигосахариды, содержащие 2’-фукозил-эпитоп» и «2-фукозилированные олигосахариды» охватывают фукозилированные олигосахариды с определенной гомологией формы, поскольку они содержат 2’-фукозил-эпитоп, следовательно, можно ожидать определенную гомологию функции. Хотя авторы не желают ограничиваться какой-либо теорией, считается, что 2’-фукозил-эпитоп этих фукозилированных олигосахаридов особо характерен для патогенов (или секретируемых ими компонентов), вызывающих инфекции НДП и/или уха.
Выражение «N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы)» охватывает как «N-ацетиллактозамин», так и «олигосахарид (-ы), содержащий (-ие) N-ацетиллактозамин». Они являются нейтральными олигосахаридами, имеющими остаток N-ацетиллактозамина. Подходящими примерами являются LNT (лакто-N-тетраоза), пара-лакто-N-неогексаоза (пара-LNnH), LNnT (лакто-N-неотетраоза) и любые их комбинации. Другими примерами являются лакто-N-гексаоза, лакто-N-неогексаоза, пара-лакто-N-гексаоза, пара-лакто-N-неогексаоза, лакто-N-октаоза, лакто-N-неооктаоза, изо-лакто-N-октаоза, пара-лакто-N-октаоза и лакто-N-декаоза.
Выражения «по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид» и «по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид» означают «по меньшей мере один тип фукозилированного олигосахарида» и «по меньшей мере один тип N-ацетилированного олигосахарида».
«Предшественник ОГМ» представляет собой ключевое соединение, которое включается в выработку ОГМ, такое как сиаловая кислота и/или фукоза.
«Сиалилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, содержащий заряженную сиаловую кислоту, т.е. олигосахарид, имеющий остаток сиаловой кислоты. Он имеет кислотный характер. Некоторыми примерами являются 3-SL (3'-сиалиллактоза) и 6’SL (6'-сиалиллактоза).
Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой форме (например, порошок) или в жидком виде. Количество различных ингредиентов (например, олигосахаридов) может выражаться в г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, если она представлена в твердой форме, например в порошке, или как концентрация в г/л композиции, если она относится к жидкой форме (последний случай также включает жидкую композицию, которую можно получать из порошка после растворения в жидкости, например в молоке, воде и т.п., например растворенную детскую смесь, или смесь для прикармливаемых детей/смесь последующего уровня, или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, или зерновой продукт для детского питания, или любую другую смесь, предназначенную для детского питания).
Термин «пребиотик» означает неперевариваемые углеводы, которые благоприятно влияют на организм-хозяина, избирательно стимулируя рост и/или активность полезных для здоровья бактерий, например бифидобактерий, в толстом кишечнике человека (Gibson GR, Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. 1995;125:1401–12).
Термин «пробиотик» означает препараты клеток микроорганизмов или компонентов клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или самочувствие организма-хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. «Probiotics: how should they be defined» Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107–10.) Клетки микроорганизмов, по существу, представляют собой бактерии или дрожжи.
Под термином «КОЕ» следует понимать колониеобразующую единицу.
Если не указано иное, все процентные содержания даны по массе.
Дополнительно в контексте изобретения термины «содержащий» или «содержит» не исключают других возможных элементов. Композиция настоящего изобретения, включая многие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, может содержать существенные элементы и ограничения изобретения, описанные в настоящем документе, а также любые дополнительные или необязательные ингредиенты, компоненты или ограничения, описанные в настоящем документе или иным образом, в зависимости от потребностей, состоять или по существу состоять из них.
Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники является широко известным или составляет часть общеизвестных знаний в данной области.
Более подробное описание изобретения будет представлено ниже. Следует отметить, что различные аспекты, признаки, примеры и варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут быть совместимыми и/или скомбинированными друг с другом.
Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является питательная композиция, содержащая 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N-тетраозу (LNT), для применения в уменьшении ноцицепции у младенца или ребенка младшего возраста.
Вторым объектом настоящего изобретения является молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, содержащая 6’-сиалиллактозу (6’SL) и лакто-N-тетраозу (LNT), для применения в уменьшении ноцицепции у ребенка.
Для достижения таких преимуществ питательная композиция, соответственно молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, изобретения предназначена предпочтительно для применения в способе
- уменьшения боли в животе у субъекта;
- уменьшения боли, связанной с желудочно-кишечным дискомфортом и желудочно-кишечными расстройствами, причем желудочно-кишечный дискомфорт предпочтительно вызван коликой, вздутием живота и/или спазмами, и при этом желудочно-кишечное расстройство предпочтительно выбрано из воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), диареи, например инфекционной диареи, некротизирующего энтероколита (НЭК) и функциональных абдоминальных болевых расстройств, предпочтительно выбранных из синдрома раздраженного кишечника (СРК), абдоминальной мигрени и функциональной абдоминальной боли без дополнительных уточнений (ФАБ-БДУ);
- сокращения периодов плача у субъекта, предпочтительно сокращения периодов плача у субъекта, испытывающего боль, предпочтительно у субъекта, испытывающего боль в животе, наиболее предпочтительно у субъекта, испытывающего боль, связанную с желудочно-кишечным дискомфортом и/или желудочно-кишечными расстройствами, как определено выше;
- улучшения качества сна у субъекта, предпочтительно у субъекта, испытывающего боль, более предпочтительно у субъекта, испытывающего боль в животе, наиболее предпочтительно у субъекта, испытывающего боль, связанную с желудочно-кишечным дискомфортом и/или желудочно-кишечными расстройствами, как определено выше; и
- улучшения качества жизни субъекта, предпочтительно субъекта, испытывающего боль, более предпочтительно субъекта, испытывающего боль в животе, наиболее предпочтительно субъекта, испытывающего боль, связанную с желудочно-кишечным дискомфортом и/или желудочно-кишечными расстройствами, как определено выше,
причем субъект представляет собой младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка.
Для цели настоящего изобретения уменьшение боли достигают путем снижения восприятия боли. Композиции настоящего изобретения оказывают влияние на механизм ноцицепции и, следовательно, способны снижать восприятие боли независимо от происхождения такой боли. Таким образом, они эффективны для снижения, например, восприятия боли, возникающей в связи с выполнением медицинского или хирургического мероприятия или в связи с каким-либо повреждением, заболеванием, расстройством и/или дискомфортом. Механизм снижения восприятия боли отличается от уменьшения боли, которое может быть достигнуто путем лечения повреждения, заболевания, расстройства или дискомфорта, которые вызывают боль. Таким образом, предполагается, что композиция настоящего изобретения предназначена не для лечения повреждения, заболевания, расстройства или дискомфорта, которые вызывают боль, а только для облегчения восприятия боли субъектом.
В особенно преимущественном варианте осуществления настоящего изобретения 6’SL и LNT присутствуют в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в некоторых конкретных количествах.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения LNT присутствует в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в количестве 0,005–3 г/л композиции. В некоторых вариантах осуществления LNT может присутствовать в количестве 0,01–1,5 г/л композиции, например 0,04–1,2 г/л, или 0,05–1 г/л, или 0,09–0,8 г/л композиции. В конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,5 г/л композиции. В другом конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,1 г/л композиции.
LNT может присутствовать в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в количестве 0,004–2,3 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, LNT может присутствовать в количестве 0,008–1,2 г/100 г композиции, например 0,03–0,9 г/100 г, или 0,04–0,8 г/100 г, или 0,07–0,6 г/100 г композиции. В конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,38 г/100 г композиции. В другом конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,08 г/100 г композиции.
LNT можно синтезировать химическим путем с помощью ферментативного переноса сахаридных звеньев с донорных фрагментов на акцепторные фрагменты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5,288,637 и WO 96/10086.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет может включать 0,005–5 г/л 6’SL, или 0,008–2,5 г/л, или 0,01–1 г/л, или 0,03–0,7 г/л, например 0,04 или 0,5 г/л.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением может содержать 0,004–3,8 г 6’SL на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,006–1,9 г, или 0,008–0,8 г, или 0,023–0,5 г, или 0,031–0,4 г 6’SL на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,18 г или 0,04 г на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
6’SL может быть выделена из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления ее можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических сиалилтрансфераз или сиалидаз, нейраминидаз либо методом ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), путем химического синтеза, либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида или смешанные культуры. Образование 6’SL можно инициировать акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления 6’SL можно получать путем химического синтеза из лактозы и свободной N’-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты).
В конкретном аспекте 6’SL и LNT, включенные в питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением, как правило, присутствуют в соотношении 6’SL : LNT от 3 : 1 до 1 : 3, например от 2 : 1 до 1 : 2 или от 2 : 1 до 1 : 1. В особенно преимущественном варианте осуществления такое соотношение составляет 2 : 1 или около 2 : 1, предпочтительно такое соотношение составляет 1 : 1 или около 1 : 1.
В конкретном аспекте изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит 6’SL и LNT, причем:
- 6’SL присутствует в количестве 0,005–5 г/л композиции и/или в количестве 0,004–3,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- LNT присутствует в количестве 0,005–3 г/л композиции и/или в количестве 0,004–2,3 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В конкретном аспекте изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит 6’SL и LNT, причем:
- 6’SL присутствует в количестве 0,008–2,5 г/л композиции и/или в количестве 0,006–1,9 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- LNT присутствует в количестве 0,01–1,5 г/л композиции и/или в количестве 0,008–1,2 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения содержит 6’SL и LNT, причем:
- 6’SL присутствует в количестве 0,01–1 г/л композиции и/или в количестве 0,008–0,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- LNT присутствует в количестве 0,04–1,2 г/л композиции и/или в количестве 0,03–0,9 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения содержит 6’SL и LNT, причем:
- 6’SL присутствует в количестве 0,03–0,7 г/л композиции и/или в общем количестве 0,023–0,5 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- LNT присутствует в количестве 0,05–1 г/л композиции и/или в количестве 0,04–0,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения содержит 6’SL и LNT, причем:
- 6’SL присутствует в количестве 0,04–0,5 г/л композиции и/или в количестве 0,031–0,4 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- LNT присутствует в количестве 0,09–0,8 г/л композиции и/или в количестве 0,07–0,6 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением содержит 6’SL и LNT, причем:
- 6’SL присутствует в количестве 0,24 или 0,05 г/л композиции и/или в количестве 0,18 или 0,04 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или
- LNT присутствует в количестве 0,5 г/л или 0,1 г/л композиции и/или в количестве 0,38 г/100 г композиции или 0,08 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
В конкретном варианте осуществления 6’SL содержится в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,005–3,3 г, или 0,006–1,3 г, или 0,02–0,9 г, например 0,024–0,7 г, в сутки.
В конкретном варианте осуществления LNT содержится в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–3,9 г, предпочтительно 0,006–2 г, или 0,02–1,6 г, или 0,03–1,3 г, например 0,05–1 г, в сутки.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения питательная композиция, соответственно молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, настоящего изобретения может содержать дополнительные олигосахариды грудного молока. Даже если такой олигосахарид грудного молока неэффективны для активации рецепторов GPR35, их можно добавлять для получения других полезных для здоровья эффектов.
Таким образом, в конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид. В ней может присутствовать один или несколько типов фукозилированного (-ых) олигосахарида (-ов). Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно фактически выбирать из перечня, включающего в себя 2’-фукозиллактозу, 3’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу (например, лакто-N-фукопентаозу I, лакто-N-фукопентаозу II, лакто-N-фукопентаозу III, лакто-N-фукопентаозу V), лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу I, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу (например, фукозиллакто-N-неогексаозу I, фукозиллакто-N-неогексаозу II), дифукозиллакто-N-гексаозу I, дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу I, дифукозиллакто-N-неогексаозу II, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу, три-фуко-пара-лакто-N-гексаозу I и любую их комбинацию.
В некоторых конкретных вариантах осуществления фукозилированный олигосахарид включает 2’-фукозил-эпитоп. Он может быть, например, выбран из перечня, включающего 2’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу, лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-гексаозу дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу и любую их комбинацию.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция, соответственно молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, в соответствии с изобретением содержит 2’-фукозиллактозу (или 2FL, или 2’FL, или 2-FL, или 2’-FL). В конкретном варианте осуществления не используется никакой другой тип фукозилированного олигосахарида, кроме 2’-фукозиллактозы, т.е. питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения в качестве фукозилированного олигосахарида содержит только 2’-фукозиллактозу.
Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления его (их) можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических фукозилтрансфераз и/или фукозидаз, либо посредством применения метода ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае или микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида и/или смешанные культуры. Образование фукозилированного олигосахарида может быть инициировано акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления фукозилированные олигосахариды можно получать из лактозы и свободной фукозы с помощью химического синтеза. Фукозилированные олигосахариды также доступны, например, от компании Kyowa, Hakko, Kogyo, Япония.
В другом конкретном аспекте изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет может содержать по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид в дополнение к LNT. В ней может присутствовать один или несколько типов N-ацетилированных олигосахаридов. В некоторых конкретных вариантах осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой лакто-N-неотетраозу (LNnT), пара-лакто-N-неогексаозу (пара-LNnH) или любую их комбинацию. В некоторых конкретных вариантах осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой LNnT. В некоторых конкретных вариантах осуществления, где присутствует LNnT, питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит как LNT, так и LNnT в соотношении LNT : LNnT от 5 : 1 до 1 : 2, или от 2 : 1 до 1 : 1, или от 2 : 1,2 до 2 : 1,6.
N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно синтезировать химическим путем с помощью ферментативного переноса сахаридных звеньев с донорных фрагментов на акцепторные фрагменты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5,288,637 и WO 96/10086. В альтернативном варианте осуществления LNnT можно получать путем химического превращения кетогексоз (например, фруктозы), либо свободных, либо связанных с олигосахаридом (например, лактулозой), в N-ацетилгексозамин или N-ацетилгексозамин-содержащий олигосахарид, как описано в Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827–828. Полученный таким образом N-ацетиллактозамин можно затем переносить на лактозу в качестве акцепторного фрагмента.
В особенно преимущественном варианте осуществления настоящего изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит 2’-фукозиллактозу (2FL) и/или лакто-N-неотетраозу (LNnT).
В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением может содержать другой (-ие) сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) в дополнение к 6’SL, такой как 3'-сиалиллактоза (3-SL).
Сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (могут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления их можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических сиалилтрансфераз или сиалидаз, нейраминидаз либо методом ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), путем химического синтеза, либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида или смешанные культуры. Образование сиалилолигосахаридов можно инициировать акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления сиалиллактозы можно получать путем химического синтеза из лактозы и свободной N’-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты). Сиалиллактозы также доступны в продаже, например от компании Kyowa Hakko Kogyo, Япония.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением может также содержать другие типы олигосахарида (-ов) (т.е. отличающийся (-иеся) от указанных выше олигосахаридов грудного молока) и/или по меньшей мере волокно (-а), и/или по меньшей мере его (их) предшественник (-и). Другой олигосахарид, и/или волокно, и/или их предшественник могут быть выбраны из перечня, включающего галактоолигосахариды (GOS), фруктоолигосахариды (FOS), инулин, ксилоолигосахариды (XOS), полидекстрозу и любую их комбинацию. Они могут присутствовать в количестве от 0 до 10 мас.% композиции. В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет может также включать по меньшей мере один олигосахарид коровьего молока (BMO).
Подходящие доступные в продаже продукты, которые можно применять для получения питательных композиций или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением, включают в себя комбинации FOS с инулином, такие как продукт, продаваемый компанией BENEO под товарным знаком Orafti, или полидекстрозу, продаваемую компанией Tate & Lyle под товарным знаком STA-LITE.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением может также необязательно включать по меньшей мере один предшественник олигосахарида. В ней может присутствовать один или несколько предшественников олигосахарида. Например, предшественником олигосахарида грудного молока является сиаловая кислота, фукоза или их смесь. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция содержит сиаловую кислоту.
В конкретных примерах питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит от 0 до 3 г/л предшественника (-ов) олигосахарида, или от 0 до 2 г/л, или от 0 до 1 г/л, или от 0 до 0,7 г/л, или от 0 до 0,5 г/л, или от 0 до 0,3 г/л, или от 0 до 0,2 г/л предшественника (-ов) олигосахарида. Композиция в соответствии с изобретением может включать от 0 до 2,1 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например от 0 до 1,5 г, или от 0 до 0,8 г, или от 0 до 0,15 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения может дополнительно включать по меньшей мере один пробиотик (или пробиотический штамм), такой как пробиотический бактериальный штамм.
Чаще всего применяют пробиотические микроорганизмы, которые главным образом представляют собой бактерии и дрожжи следующих родов: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. и Saccharomyces spp.
В некоторых конкретных вариантах осуществления пробиотик представляет собой пробиотический бактериальный штамм. В некоторых конкретных вариантах осуществления он представляет собой, в частности, штаммы Bifidobacteria и/или Lactobacilli.
Подходящие пробиотические бактериальные штаммы включают в себя Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, от компании Valio Oy, Финляндия, под товарным знаком LGG; Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Streptococcus salivarius DSM 13084, продаваемые компанией BLIS Technologies Limited, Новая Зеландия, под названием KI2; Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, продаваемый в числе прочих компанией Christian Hansen, Дания, под товарным знаком Bb 12; Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, продаваемый компанией Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Япония, под товарным знаком BB536; Bifidobacterium breve, продаваемый компанией Danisco под товарным знаком Bb-03; Bifidobacterium breve, продаваемый компанией Morinaga под товарным знаком M-16V; Bifidobacterium infantis, продаваемый компанией Procter & GambIe Co. под товарным знаком Bifantis; и Bifidobacterium breve, продаваемый компанией Institut Rosell (Lallemand) под товарным знаком R0070.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением может включать от 10e3 до 10e12 КОЕ пробиотического штамма, более предпочтительно от 10e7 до 10e12 КОЕ, например от 10e8 до 10e10 КОЕ, пробиотического штамма на грамм композиции в расчете на массу сухого вещества.
В одном варианте осуществления пробиотики являются жизнеспособными. В другом варианте осуществления пробиотики являются неразмножающимися или инактивированными. В некоторых других вариантах осуществления можно использовать как жизнеспособные пробиотики, так и инактивированные пробиотики. Также можно добавлять пробиотические компоненты и метаболиты.
Питательная композиция в соответствии с изобретением может, например, представлять собой детскую смесь, начальную детскую смесь, смесь для прикармливаемых детей или смесь последующего уровня, молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель, такой как обогатитель человеческого грудного молока, или добавку. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4 или 6 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь.
В некоторых других вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой обогатитель. Обогатитель может представлять собой обогатитель грудного молока (например, обогатитель человеческого грудного молока) или обогатитель смеси, такой как обогатитель детской смеси или обогатитель смеси для прикармливаемых детей / смеси последующего уровня.
Если питательная композиция представляет собой добавку, она может быть обеспечена в форме стандартных доз. В таких случаях особенно полезно определить количество N-ацетилированных олигосахаридов и необязательно других олигосахаридов в отношении суточной дозы для введения младенцу или ребенку младшего возраста, как описано выше.
Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой (например, порошок), жидкой или клейстеризованной форме. В конкретном варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку, содержащую 6’SL и LNT в соотношении от 1 : 3 до 3 : 1, причем добавка находится в порошковой форме и предложена в пакете-саше, предпочтительно в пакете-саше с 1–10 г смеси 6’SL и LNT на пакет-саше, или в форме сиропа, предпочтительно сиропа с общей концентрацией твердых веществ от 5 до 75 г/100 мл (от 5 до 75% (масс./об.)). Если добавка находится в форме порошка, она может включать в себя носитель. Однако предпочтительно, чтобы носитель в добавке отсутствовал. Если добавка находится в форме сиропа, ОГМ предпочтительно растворяют или суспендируют в воде, подкисленной цитратом.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением обычно содержит источник белка. Белок может содержаться в количестве от 1,6 до 3 г на 100 ккал. В некоторых вариантах осуществления, в частности когда композиция предназначена для преждевременно родившихся младенцев, количество белка может составлять от 2,4 до 4 г/100 ккал или более 3,6 г/100 ккал. В некоторых других вариантах осуществления количество белка может быть ниже 2,0 г на 100 ккал, например от 1,8 до 2 г/100 ккал, или белок может содержаться в количестве ниже 1,8 г на 100 ккал.
Тип белка не считается критическим для настоящего изобретения при условии, что соблюдены минимальные требования по содержанию незаменимых аминокислот и обеспечен удовлетворительный рост. Таким образом, можно применять источники белка на основе молочной сыворотки, казеина и их смесей, а также источники белка на основе сои. Что касается сывороточных белков, источник белка может быть основан на кислой сыворотке или сладкой молочной сыворотке или их смесях и может включать в себя альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желаемых пропорциях.
В некоторых преимущественных вариантах осуществления в источнике белка преобладает молочная сыворотка (т.е. более 50% белков происходят из сывороточных белков, например 60% или 70%).
Белки могут быть нативными или гидролизованными, либо они могут представлять собой смесь нативных и гидролизованных белков. Под термином «нативный» подразумевают, что основная часть белков является нативной, т.е. их молекулярная структура не изменена, например не изменено по меньшей мере 80% белков, например не изменено по меньшей мере 85% белков, предпочтительно не изменено по меньшей мере 90% белков, еще более предпочтительно не изменено по меньшей мере 95% белков, например не изменено по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления не изменено 100% белков.
Термин «гидролизованный» в контексте настоящего изобретения означает белок, который был гидролизован или расщеплен на составляющие его аминокислоты. Белки могут быть полностью или частично гидролизованными. Может быть желательным вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза от 2 до 20%), например младенцам или детям младшего возраста, предположительно подверженным риску развития аллергии на коровье молоко. При необходимости использования гидролизованных белков процесс гидролиза можно проводить по желанию и способом, известным в данной области. Например, гидролизаты сывороточного белка можно получать ферментативным гидролизом фракции молочной сыворотки в одну или более стадий. Если фракция молочной сыворотки, применяемая в качестве исходного материала, по существу, не содержит лактозы, то установлено, что в процессе гидролиза блокировка лизина белка проявляется в гораздо меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокировки лизина с около 15 мас.% общего лизина до менее около 10 мас.% лизина; например, до около 7 мас.% лизина, что значительно улучшает питательное качество источника белка.
В одном варианте осуществления изобретения гидролизовано по меньшей мере 70% белков, предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 80% белков, например гидролизовано по меньшей мере 85% белков, еще более предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 90% белков, например гидролизовано по меньшей мере 95% белков, в частности гидролизовано по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления гидролизовано 100% белков.
В одном конкретном варианте осуществления белки питательной композиции гидролизованы, полностью гидролизованы или частично гидролизованы. Степень гидролиза (DH) белка может составлять от 8 до 40, или от 20 до 60, или от 20 до 80, или более 10, 20, 40, 60, 80 или 90.
В альтернативном варианте осуществления белковый компонент может быть заменен смесью или искусственной аминокислотой, например для недоношенных младенцев или младенцев с низким весом при рождении.
В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную композицию. В другом конкретном варианте осуществления композиция в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит источник углеводов. Это особенно предпочтительно в том случае, когда питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае можно применять любой источник углеводов, обычно находящийся в детских смесях, такой как лактоза, сукроза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, хотя одним из предпочтительных источников углеводов является лактоза.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит источник липидов. Это особенно важно, если питательная композиция настоящего изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае источником липидов может быть любой липид или жир, который подходит для применения в детских смесях. Некоторые подходящие источники жира включают в себя пальмовое масло, структурированное триглицеридное масло, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, масло триглицерида средней цепи. Можно также добавлять незаменимые жирные кислоты — линолевую кислоту и α-линоленовую кислоту, а также небольшие количества масел, содержащих большие количества арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в готовом виде, например рыбьи жиры или микробные масла. Соотношение n-6 и n-3 жирных кислот в источнике жира может составлять от около 5 : 1 до около 15 : 1; например, от около 8 : 1 до около 10 : 1.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать все витамины и минеральные вещества, считающиеся обязательными в повседневном рационе питания, в значимых с точки зрения питания количествах. Для некоторых витаминов и минеральных веществ установлены минимальные требования. Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, которые необязательно присутствуют в композиции изобретения, включают в себя витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлор, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавляют в форме солей. Присутствие и количества конкретных минеральных веществ и других витаминов могут варьироваться в зависимости от предполагаемой популяции.
Если это необходимо, питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соя, лецитин, моно- и диглицериловые сложные эфиры лимонной кислоты и т.п.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятное воздействие, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.
Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать каротиноид (-ы). В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения питательная композиция изобретения не содержит каротиноидов.
Питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением можно получать любым подходящим способом. Далее композиция будет описана на конкретном примере.
Например, смесь, такую как детская смесь, можно получать путем смешивания источника белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. На данном этапе можно включать эмульгаторы в случае их применения. На данном этапе можно добавлять витамины и минеральные вещества, но обычно их добавляют позднее для предотвращения термического разложения. Перед смешиванием в источнике жира можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. Затем можно примешивать воду, предпочтительно очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Температура воды для удобства находится в диапазоне от около 50°С до около 80°С для облегчения диспергирования ингредиентов. Для образования жидкой смеси можно использовать доступные в продаже разжижители.
На данном этапе можно добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы), особенно если конечный продукт должен иметь жидкую форму. Если конечный продукт должен представлять собой порошок, эти компоненты при желании также можно добавлять на данной стадии.
Затем жидкую смесь гомогенизируют, например в две стадии.
Затем жидкую смесь можно термически обрабатывать для снижения бактериальной нагрузки путем быстрого нагрева жидкой смеси, например до температуры в диапазоне от около 80°C до около 150°C, в течение периода времени от около 5 секунд до около 5 минут. Нагревание можно осуществлять путем нагнетания пара с помощью автоклава или теплообменника, например пластинчатого теплообменника.
Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от около 60°C до около 85°C, например путем мгновенного охлаждения. Затем жидкую смесь можно снова гомогенизировать, например в две стадии: под давлением в диапазоне от около 10 МПа до около 30 МПа на первой стадии и от около 2 МПа до около 10 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охлаждать для добавления любых термочувствительных компонентов, таких как витамины и минеральные вещества. На данном этапе для удобства регулируют рН и содержание твердых веществ в гомогенизированной смеси.
Если конечный продукт должен представлять собой порошок, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, например в распылительную сушилку или сублимационную сушилку, и превращают в порошок. Влагосодержание порошка должно составлять менее около 5 мас.%. На данном этапе можно также или в качестве альтернативы добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) путем сухого смешивания или путем перемешивания их в форме сиропа из кристаллов вместе с пробиотическим (-ими) штаммом (-ами) (при использовании), и смесь подвергают распылительной сушке или сублимационной сушке.
Если предпочтительна жидкая композиция, гомогенизированную смесь можно стерилизовать, а затем асептически разливать в подходящие контейнеры, либо можно сначала разливать в контейнеры, а затем стерилизовать в автоклаве.
В другом варианте осуществления композиция изобретения может представлять собой добавку. Добавка может быть представлена, например, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости. Добавка может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т.п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты и гелеобразующие агенты. Добавка также может содержать традиционные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, эксципиенты и разбавители, включая, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, увлажняющие агенты, наполнители и т.п.
Дополнительно добавка может содержать органический или неорганический материал-носитель, подходящий для перорального или парентерального введения, а также витамины, минеральные микроэлементы и другие микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.
Питательная композиция в соответствии с изобретением предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста. Младенцы или дети младшего возраста могут быть рожденными в срок или недоношенными. В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста, родившихся недоношенными, имеющих низкий вес при рождении и/или родившихся маленькими для своего гестационного возраста (SGA). В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у недоношенных младенцев, младенцев, имеющих низкий вес при рождении и/или младенцев, родившихся маленькими для своего гестационного возраста (SGA).
Питательную композицию настоящего изобретения можно также применять у младенцев или детей младшего возраста, рожденных посредством кесарева сечения или посредством вагинальных родов.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с изобретением может быть предназначена для применения до и/или во время периода отлучения от груди.
Возраст для введения (или применения) питательной композиции или вскармливания ей, а также продолжительность такого введения зависят от потребностей.
Питательную композицию можно, например, давать младенцам сразу же после рождения. Композицию изобретения также можно давать в течение первой недели жизни младенца, или в течение первых 2 недель жизни, или в течение первых 3 недель жизни, или в течение первого месяца жизни, или в течение первых 2 месяцев жизни, или в течение первых 3 месяцев жизни, или в течение первых 4 месяцев жизни, или в течение первых 6 месяцев жизни, или в течение первых 8 месяцев жизни, или в течение первых 10 месяцев жизни, или в течение первого года жизни, или в течение первых двух лет жизни, или даже дольше. В некоторых особенно преимущественных вариантах осуществления изобретения питательную композицию дают (или вводят) младенцу в течение первых 4, 6 или 12 месяцев после рождения указанного младенца. В некоторых других вариантах осуществления питательную композицию изобретения дают в течение нескольких дней (например, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20 и т.д.), или нескольких недель (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.), или нескольких месяцев (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) после рождения. В первую очередь это может быть актуально, но не обязательно, в том случае, когда младенец родился преждевременно.
В одном варианте осуществления композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве композиции, добавочной по отношению к материнскому молоку. В некоторых вариантах осуществления изобретения младенец или ребенок младшего возраста получает материнское молоко в течение по меньшей мере первых 2 недель, первых 1, 2, 4 или 6 месяцев. В одном варианте осуществления питательную композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста после такого периода питания материнским молоком или дают во время такого периода питания материнским молоком. В другом варианте осуществления изобретения композицию дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве единственной или основной питательной композиции в течение по меньшей мере одного периода времени, например после 1, 2 или 4-го месяца жизни, в течение по меньшей мере 1, 2, 4 или 6 месяцев.
В одном варианте осуществления питательная композиция изобретения является полной питательной композицией (удовлетворяющей все или большинство потребностей субъекта в питании). В другом варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку или обогатитель, предназначенные, например, для дополнения человеческого грудного молока или для дополнения детской смеси или смеси для прикармливаемых детей / смеси последующего уровня.
Примеры
Следующие примеры демонстрируют некоторые конкретные варианты осуществления композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением. Примеры приводятся исключительно в целях иллюстрации и не должны рассматриваться в качестве ограничений настоящего изобретения.
Пример 1
Ниже в таблице 1 приведен пример состава питательной композиции (например, детской смеси) в соответствии с настоящим изобретением. Эта композиция приведена исключительно в качестве иллюстрации.
Таблица 1. Состав детской смеси согласно примеру 1
Питательные вещества
На 100 ккал
На литр
Энергетическая ценность (ккал)
100
670
Белок (г)
1,83
12,3
Жиры (г)
5,3
35,7
Линолевая кислота (г)
0,79
5,3
α-Линоленовая кислота (мг)
101
675
Лактоза (г)
11,2
74,7
Минеральные вещества (г)
0,37
2,5
Na (мг)
23
150
K (мг)
89
590
Cl (мг)
64
430
Ca (мг)
62
410
P (мг)
31
210
Mg (мг)
7
50
Mn (мкг)
8
50
Se (мкг)
2
13
Витамин A (мкг РЭ)
105
700
Витамин D (мкг)
1,5
10
Витамин E (мг ТЭ)
0,8
5,4
Витамин K1 (мкг)
8
54
Витамин С (мг)
10
67
Витамин В1 (мг)
0,07
0,47
Витамин В2 (мг)
0,15
1,0
Ниацин (мг)
1
6,7
Витамин В6 (мг)
0,075
0,50
Фолиевая кислота (мкг)
9
60
Пантотеновая кислота (мг)
0,45
3
Витамин B12 (мкг)
0,3
2
Биотин (мкг)
2,2
15
Холин (мг)
10
67
Fe (мг)
1,2
8
I (мкг)
15
100
Cu (мг)
0,06
0,4
Zn (мг)
0,75
5
Олигосахариды(ОГМ)
6’SL (г)
0,035
0,24
LNT (г)
0,07
0,45
Пример 2
Принцип проведения анализа
Был проведен скрининг шести олигосахаридов грудного молока (LNnT, LNT,2-FL, ди-FL, 6’SL и 3-SL) на их способность активировать рецептор GPR35 в анализе in vitro. Скрининг проводился на приборе DiscoverX (г. Фримонт, Калифорния, США) с использованием аналитической системы PathHunter с β-аррестином. В рамках этого анализа прослеживают активацию GPR35, экспрессируемого в культивируемых клетках, с использованием комплементации фрагментов фермента с β-галактозидазой (β-Gal) в качестве функционального репортера. Фермент разделяют на две неактивные комплементарные части, EA и PK, экспрессируемые в клетке в виде гибридных белков. EA слит с β-аррестином, а PK слит с GPR35. Если GPR35 активируется и β- аррестин рекрутируется на рецепторе, осуществляется комплементация PK и EA с восстановлением активности β- Gal, которую измеряют с помощью хемилюминесцентных детектирующих реагентов.
Способы
Клеточную линию GPR35 размножали из исходных замороженных культур и культивировали в соответствии со стандартными процедурами. Клетки высевали в общем объеме 20 мкл в 384-луночные микропланшеты с белыми стенками и инкубировали при 37°C в течение необходимого времени до тестирования. Все тесты проводили в двух повторностях.
Пробы ОГМ доставляли в DiscoverX в виде концентрированных маточных растворов в фосфатно-солевом буфере (PBS). В день проведения теста готовили 5-кратный рабочий раствор промежуточного соединения в PBS. К клеткам добавляли по пять мкл 5-кратной пробы и инкубировали при комнатной температуре в течение 3–5 часов.
Аналитический сигнал получали посредством однократного добавления 12,5 мкл (50% об./об.) смеси детектирующих реагентов PathHunter с последующей инкубацией в течение одного часа при комнатной температуре. Показания с микропланшетов регистрировали после получения сигнала на приборе PerkinElmer EnvisionTM для обнаружения хемилюминесцентных сигналов.
В качестве положительного контроля использовали запринаст (который известен как активатор GPR35).
Активность в процентах рассчитывали по следующей формуле:
Активность в % = 100% x (среднее RLU исследуемой пробы - среднее RLU контроля несущей средой) / (среднее максимальное значение для контрольного лиганда - среднее RLU контроля несущей средой).
Графики «доза — отклик» строили с помощью итеративных 3-кратных разведений самой высокой исследуемой концентрации (10 мМ).
Выводы
LNT активировала GPR35 со значением EC50, равным 4,5 мМ (фиг. 1). 6’SL активировала GPR35 со значением EC50, равным 6,5 мМ (фиг. 2). Для 3SL, 2FL, ди-FL и LNnT активации GPR35 не получали.
Поскольку было обнаружено, что LNT и 6’SL являются активаторами, эти два ОГМ тестировали в комбинации. Эквимолярная смесь 6’SL и LNT активировала GPR35 со значением EC50, равным 2,2 мМ (фиг. 3). Эти результаты демонстрируют синергию между 6’SL и LNT.
Было также проведено тестирование смеси всех шести ОГМ в эквимолярном соотношении с получением таких же результатов, как для комбинации LNT и 6’SL. Эти результаты демонстрируют, что синергетический эффект LNT и 6’SL сохраняется даже при смешивании с другими олигосахаридами грудного молока.
Пример 3
Следующие испытания были проведены путем расщепления LNT и 6’SL и использования расщепленного материала для проведения анализа активации GPR35, чтобы валидировать результаты испытания из примера 2.
Расщепление LNT β-галактозидазой
LNT расщепляли β-галактозидазой, очищенной из аспергилла черного (Megazyme, ref: E-AGLAN), используя следующий протокол: в пробирке емкостью 1,5 мл с внешней резьбой и навинчиваемой крышкой смешивали 84 мг LNT в 900 мкл 100 мМ ацетатного буфера (pH 4,5) и 100 мкл фермента (400 Ед.). Эту пробирку инкубировали в течение 72 ч при 55°C в шейкере ThermoMix со скоростью перемешивания 450 об/мин. Инактивацию фермента проводили путем термообработки в течение 5 минут при 100°C. Инактивированную пробирку хранили при -20°C до дальнейшего анализа.
Расщепление 6’SL нейраминидазой
6’SL расщепляли нейраминидазой, очищенной из энтеритной клостридии (Megazyme, ref: E-SIALCP), используя следующий протокол: в пробирке емкостью 1,5 мл с внешней резьбой и навинчиваемой крышкой смешивали 78 мг 6’SL в 900 мкл 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,0) и 50 мкл фермента (50 Ед.). Эту пробирку инкубировали в течение 72 ч при 37°C в шейкере ThermoMix со скоростью перемешивания 450 об/мин. Инактивацию фермента проводили путем термообработки в течение 5 минут при 100°C. Инактивированную пробирку хранили при -20°C до дальнейшего анализа.
Контроль расщеплений
Авторы подтверждали полное расщепление LNT и 6’SL путем их количественной оценки методом высокоэффективной анионообменной хроматографии c импульсным амперометрическим детектированием (ВЭАОХ-ИАД). Результаты этого анализа представлены на фиг. 4. Пики четко подтверждают полное расщепление как LNT, так и 6’SL.
Подготовка проб, исследуемые пробы и результаты
Пробы разводили в 1-кратном PBS (pH ~ 7) в 5-кратной концентрации и отправляли в DiscoverX. Анализ активации GPR35 проводили, как описано в примере 2. Результаты представлены на фиг. 5. Реакция GPR35 на расщепленную и нерасщепленную смесь LNT и 6’SL показала отклик с нерасщепленной смесью и фоновый отклик на расщепленную смесь, продемонстрировав таким образом специфичность реакции GPR35 на LNT и 6’SL.
Пример 4
Эффективность комбинации 6’SL и LNT в уменьшении ноцицепции была подтверждена in vivo.
Стресс избегания воды (WAS) и вмешательства в питание
Мышей C57Bl.6/J приобретали у компании Janvier SA (Ле-Женест-Сент-Иль, Франция). По прибытии их содержали в полипропиленовых клетках в помещении с контролем температуры при 12-часовом цикле освещения в течение 1 недели перед имплантацией электродов (см. ниже). Через пять дней после операции мышей ежедневно в течение 9 дней подвергали WAS, помещая их по отдельности на 1 ч на платформу 3 x 3 см в бассейне размером 40 x 40 см, наполненном холодной водопроводной водой на расстоянии до 1 см от верхней поверхности платформы. При ложном WAS животных на 1 ч/день помещали на платформу в бассейне без воды. Животные имели свободный доступ к воде и корму. Специальные рационы питания начинали вводить за 3 дня до процедуры WAS и продолжали до конца эксперимента. Три группы по 12 мышей случайным образом подвергали следующим вмешательствам в питание:
Группа 1: контрольный рацион питания (AIN93), ложный WAS (несенсибилизированные)
Группа 2: контрольный рацион питания (was:AIN93), WAS (сенсибилизированные)
Группа 3: экспериментальный рацион питания (WAS:LNT+6’SL), AIN93 с добавлением 6’SL 0,09% масс./об. и LNT 0,18% масс./об.), WAS (сенсибилизированные)
Колоректальное растяжение (КРР)
Для измерения сокращений живота в качестве показателя боли мышам устанавливали 2 проволочных электрода из сплава никеля и хрома, имплантированных в наружную косую мышцу живота, и один — под кожу живота. Операцию проводили в условиях анестезии ксилазином/кетамином (оба по 1,2 мг, подкожно). В прямую кишку вводили небольшой баллон (Fogarty, Edwards Laboratories Inc., г. Санта-Анна, США) и фиксировали у основания хвоста. Баллон постепенно надували от 0 до 0,10 мл с шагом 0,02 мл. Каждый шаг растяжения длился 10 с и чередовался с периодом восстановления в 5 мин без растяжения.
Оценку висцеральной чувствительности к КРР проводили методом электромиографии мышц живота.
Результаты
Результаты представлены на фиг. 6. Амплитуда сокращения, которое связано с болью, воспринимаемой мышами, была значительно увеличена в связи с фактом сенсибилизации мышей WAS (was:AIN93, группа 2) по сравнению с несенсибилизированными мышами (AIN93, группа 1). Введение смеси 6’SL и LNT способствовало уменьшению амплитуды сокращения и, таким образом, воспринимаемой боли у сенсибилизированных мышей (was:LNT+6’SL, группа 3). Для КРР 0,06 мл и более амплитуду сокращения было даже невозможно статистически отличить от наблюдаемой у несенсибилизированных мышей. Это очень значимое достижение, поскольку КРР 0,06 мл соответствует типичному порогу боли, тогда как меньшие объемы дилатации, скорее, связаны с дискомфортом.