Участие системы глутатиона в редокс-регуляции нейтрофилов при внебольничной пневмонии и окислительном стрессе in vitro

Жаворонок Т.В., Петина Г.В., Стариков Ю.В., Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Агеева Т. С.

УЧАСТИЕ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В РЕДОКС-РЕГУЛЯЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ IN VITRO ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Томск

Чрезмерное образование активных форм кислорода (АФК) при остром воспалении способствует формированию окислительного стресса (ОС), изменяет функциональное состояние фагоцитирующих клеток и индуцирует их апоптоз. Несмотря на множество исследований по изучению молекулярных событий, вовлечённых во взаимодействие АФК с флогогеном и тканями, удивительно небольшое внимание уделено эффекту этих метаболитов непосредственно на эффекторные клетки острого воспаления - нейтрофилы. Защиту от повреждающего действия АФК и поддержание редокс-потенциала клетки реализует система антиоксидантов, существенный вклад в которую вносит многокомпонентная система глутатиона (GSH).

Цель: оценить вклад компонентов системы глутатиона в поддержание редокс-состояния нейтрофилов у больных внебольничной пневмонией (ВП) и при ОС in vitro.

Материалы и методы. Обследовано 33 больных ВП в возрасте от 18 до 50 лет (в среднем 34,6±4,1 г.). Из них 21 пациент был с альвеолярным типом лёгочного инфильтата ткани (ВПа), 12 - с интерстициальным (ВПи). Тип инфильтата верифицирован по данным компьютерной томографии высокого разрешения, проводимой на гамма-камере «Омега 500» («Technicare», США-Германия). Группу контроля составили 20 практически здоровых доноров (ЗД) того же возраста. Нейтрофилы выделяли из венозной крови на двойном градиенте Ficoll-Paque плотностью 1,077 и 1,093 г/см3 («GE Healthcare», Швеция) и культивировали 18 ч при 37е С и 5 % СО2, ОС в клетках ЗД индуцировали добавлением 5 мМ H2O2. Для исследования особенностей формирования тиол-дисульфидного (ТД) равновесия при реализации антиоксидантной защиты (АОЗ) нейтрофилов (в условиях ОС in vitro и у больных ВП) клетки инкубировали с блокатором SH-групп N-

этилмалеимидом (NEM) или с их протектором 1,4-дитио-эритритолом (DTE) в концентрации 5 мМ. На лазерном проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) находили внутриклеточное содержание АФК, реагирующих с диацетатом дихлорфлюоресцеина, («Sigma», США). Определяли продукцию нейтрофилами гидроксил-радикалов (OH^) по разрушению модельного субстрата 2-дезокси-Д-рибозы («МР», США) и активность в клетках миелопероксидазы (МП) с учётом преобразования ферментом о-фенилендиамина («МР», США). Оценивали состояние системы GSH в нейтрофилах: содержание GSH и глутатион-дисульфида (GSSG) - циклическим кинетическим методом, белковосвязанного глутатиона (белок-SSG) - после высвобождения с помощью боргидрида Na («Sigma», США), активность глутатион-зависимых ферментов - пероксидазы (ГП) с учётом способности энзима катализировать реакцию GSH («МР», США) с гидроперекисью т-бутила («МР», США) и редуктазы (ГР), используя НАДФ-Н-зависимое («GERBU», Германия) преобразование GSSG («МР», США). Концентрацию белка в пробах определяли методом Бредфорда. Для статистического анализа данных использовали критерий Вилкоксона и ранговый критерий Манна-Уитни, критический уровень значимости при проверке статистических гипотез задавался величиной 0,05.

Результаты и обсуждение. В острый период ВП возрастала продукция Off (р<0,01) нейтрофилами в среду инкубации с одновременным увеличением внутри-клеточного количества АФК (р<0,05) и повышением в клетках активности МП, нарабатывающей ионы С10- (р<0,05). Увеличение продукции АФК нейтрофилами коррелировало с усилением выраженности инфильтрации паренхимы лёгких и клини-ческой картиной заболевания, однако активность МП в этих клетках была одинаковой у больных ВПа и ВПи. Аналогичная картина активации окислительных процессов в нейтрофилах регистрировалась in vitro при моделировании ОС в культурах клеток ЗД. Усиленная продукция АФК активированными нейтрофилами в окружающую среду при остром воспалении способствует элиминации флогогена. Однако и в случае ВП, и при ОС in vitro параллельно регистрировался факт накопления АФК в самих эффекторных клетках острого воспаления. NEM и DTE в острый период ВП не влияли на проявления активности МП и в целом на продукцию АФК нейтрофилами.

Продуцируя большое количество АФК, нейтрофильные лейкоциты сами становятся их мишенью, и в первую очередь объектом окислительной модификации (ОМ) являются SH-содержащие белки. При моделировании ОС и у больных ВП фиксировался дисбаланс в работе глутатион-зависимой системы нейтрофилов. Это выражалось угнетением активности ГП (р<0,05), вне зависимости от характера лёгочного инфильтрата, а снижение уровня GSH (р<0,05) и

интегрального показателя GSH/GSSG, характеризующего ёмкость ТД-потенциала, больше выражено у больных ВПа. GSH, выступая акцептором OH и синглетного кислорода, значительно снижает цитотоксическое и деструктивное действие АФК. Одновременно GSH является кофактором ГП и глутатион^-трансферазы, которым принадлежит ведущая роль в защите мембран путём детоксикации гидропероксидов.

Возрастание количества GSSG (р<0,05) в нейтрофилах пациентов с ВП (и при ОС in vitro) сочеталось с недостаточной активностью ГР (р<0,05), которая регенерирует SH-потенциал клетки. Соответственно, в клетках оказались угнетены возможности к восстановлению дисульфидных сшивок, способствующих ингибированию ключевых SH-содержащих ферментов. Переход HS/SS -репарируемый момент в процессах ОМ белков, а другие варианты не подлежат репарации. Поэтому соотношение HS/SS тиоловых групп и их буферная ёмкость (способность к обратимой ОМ) являются важными критериями неспецифической резистентности клеток. Одним из механизмов АОЗ белков от необратимых последствий ОС могло стать активное связывание GSH с SH-группами белковых молекул с образованием белок-SSG, концентрация которого в нейтрофилах возрастала (р<0,05), как в случае ВП, так и при культивировании клеток ЗД с добавлением 5 мМ H202. Блокада NEM свободных SH-групп способствовала повышению уровня GSSG, снижению индекса GSH/GSSG, дополнительному ингибированию ГП, что более выражено в случае ВПа. Усиление восстановительного потенциала SH-групп DTE в большей мере сказывалось у пациентов с ВПи, как в отношении активности ГП, так и в плане поддержания тиолдисульфидного равновесия в эффекторных клетках острого воспаления. Динамика изменения продуктов обратимой ОМ белков определяет редокс-состояние и резервноадаптационные возможности нейтрофилов в условиях ОС.

Заключение. Несмотря на клинически более выраженные проявления ВПа, одинаковые нарушения пероксидазной активности могут формироваться в нейтрофилах и при ВПи, что указывает на значимость вовлечения интерстиция лёгких в процесс воспаления при ВП. ОМ белковых компонентов в системе GSH и снижение буферной ёмкости ТД-потенциала нейтрофилов может выступать ранним маркёром ОС и механизмом усугубления патологических процессов при ВП. Истощение резервов АОЗ и повышение уровня АФК, повреждающих функциональные белки, приводят к созданию ситуации дисбаланса редокс-регуляции клеток-эффекторов острого воспаления, что может снижать эффективность их функционирования и способствовать элиминации из организма.