Разработка метода паспортизации сортов люпина

УДК - 575.857

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПАСПОРТИЗАЦИИ СОРТОВ ЛЮПИНА

A.B. Артюхова, С.Ю. Гришин, М.С. Князькина, М.И. Лукашевич, В.В. Заякин, И.Я. Нам

Изучали межсортовой полиморфизм фрагментов, амплифицируемых при PCR, у разных видов люпина с использованием 19 RAPD- и 21 ISSR-праймера. На 13 выбранных праймерах процент полиморфных полос составил 33,5% для узколистного люпина L.angustifolius, 23,2% - для желтого люпина L. luteus и 14,4% - для белого люпина L. albus. Предложен метод паспортизации сортов этих трех видов люпина на основе ISSR-PCR. Использование RAPD-праймеров оказалось неэффективным.

Ключевые слова: ISSR-PCR, молекулярно-генетическая паспортизация, L. angustifolius, L. albus, L. luteus.

На современном уровне развития селекции для ускорения создания устойчивых и высокопродуктивных форм растений большое значение имеет идентификация сортов, сортообразцов и гибридов. Морфологических признаков часто бывает недостаточно для оценки уровня изменчивости, генетического разнообразия и идентификации. Ранее для описания генотипов широко использовали биохимические маркеры: запасные белки и изоферменты [2].

В исследования по выявлению генетического полиморфизма растений все больше привлекаются данные ДНК-маркирования, полученные на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Хорошие результаты при анализе сортов различных культур получали с помощью техник RAPD-ПЦР (Random Amplification of Polymorphic DNA) и ISSR-ПЦР (inter simple sequence repeats).

В селекционном процессе большое значение имеют паспорта сортов. Они позволяют определять чистоту партий семян и решать вопросы защиты авторских прав на сорта. Основой для составления генетических паспортов сортов служат данные о внутривидовом полиморфизме выбранного объекта.

Среди полученных полиморфных фрагментов можно отыскать сцепленные с хозяйственно ценными признаками и разработать на их основе методы селекции, основанные на применении молекулярных маркеров.

Попытки использования белковых маркерных систем на основе альбуминовых и глобулиновых фракций семян люпина оказались нерезультативными [Заякин В.В., неопубликованные данные].

Целью данного исследование было изучение возможности использования методов RAPD-и ISSR-PCR для паспортизации сортов люпина.

Материалы и методы

В исследование были включены сорта трех видов люпина, селекция которых ведется в Брянской области: L. angustifolius (15 сортов), L. albus (5 сортов) и L. luteus (5 сортов).

Выделение ДНК проводили из 4-6-дневных проростков массой 200-450 мг на основе модифицированного гуанидин-изотиоционат фенол-хлороформенного метода выделения НК растений [3]. Качество и количество полученных препаратов НК определяли спектрофотометрически [1].

PCR проводили в четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Использовали праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва). Применяли ферменты и реактивы фирмы «СибЭнзим» (Москва).

Реакционная смесь для RAPD- и ISSR-PCR объемом 20 мкл содержала следующие компоненты: 12 ед. Taq-полимеразы E338, 2 мкл 10-кратного SE-буфера AS, 5 мМ MgCl2, 0,25 мМ каждого dNTP, 100-50 pmol каждого из праймеров, 100-300 нг тотальной геномной ДНК. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.

Условия амплификации были следующими: начальная денатурация 5 мин при 94°С, 35 циклов: денатурация при 94°С - 45 с, отжиг праймеров - 45 с (52°С для ISSR-PCR и 25°С для RAPD-PCR) и элогация при 72°С 90 с; заключительная элонгация 7 мин при 72°С.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с буфером TBE в присутствии бромистого этидия и визуализировали на UV-трансиллюминаторе или с использованием системы GelDocXR (BioRad, США) и программы для обработки электрофореграмм Quantity One. Для определения размера фрагментов ДНК использовали маркер M27 (СибЭнзим, Москва). Полиморфными считались фрагменты ДНК, присутствующие на электрофореграммах не всех сортов.

Результаты и обсуждение

Для проведения ПЦР-анализа было использовано 21 ISSR- и 19 RAPD-праймеров. Использование трех ISSR-праймеров не позволило получить отдельные фрагменты ДНК, видимые на электрофореграмме. ПЦР с применением еще четырех праймеров не привела к образованию полиморфных фрагментов. Для анализа полиморфизма сортов оказались пригодны остальные 13 праймеров. Для узколистного люпинаL.angustifolius получено 58 полиморфных фрагментов из 173 (33,5%), для желтого люпина L. luteus - 32 из 138 (23,2%), а для белого люпина L. albus - 18 из 125 (14,4%). Пример выявленного полиморфизма на одном из праймеров показан на рисунке 1.

Рис. 1. Электрофореграмма ISSR-PCR люпина для праймера UBC810. Люпин желтый: 1 - Престиж, 2 -Парис, 3 - Мистер, 4 - Лорд; Люпин узколистный: 5 - ИД 20-95, 6 - Жодинский, 7 - ИД 55-95, 8 - БГБ1; Люпин белый: 9 - Асс.24, 10 - Андромеда, 11 - Тур-Тор, 12 - Luxor 98B001-5-6; М - маркер молекулярного

веса.

Видно, что различные виды люпина: желтый (треки 1-4), узколистный (треки 5-8) и белый (9-12), значительно отличаются по спектрам ампликонов. При этом у узколистного люпина внутривидовой полиморфизм выражен значительно сильнее по сравнению с желтым и белым люпином. Но у последних двух видов тоже имеются полиморфные фрагменты.

Почти все амплифицируемые фрагменты находится в диапазоне от 100 до 1000 п.н.

Выбранные праймеры отличались по количеству амплифицируемых полиморфных полос как внутри видов, так и между ними. Например, при амплификации с праймером IS3 на узколистном люпине выявляется десять полиморфных фрагментов, на белом - один, а на желтом -три; с праймером UBC810 обнаруживается 5, 1 и 12 полиморфных фрагментов соответственно.

Для маркирования сортов целесообразно выбрать минимальный набор праймеров, позволяющий однозначно маркировать все сорта. Для проанализированных в настоящее время сортов трех видов люпина такой минимальный набор включает пять праймеров, представленных в таблице 1. Для L. angustifolius оказалось достаточно четыре праймера, для L. luteus - одного праймера, а для L. albus - двух.

Таблица 1

Характеристика ISSR-праймеров, использованных при составлении генетических паспортов сортов

люпинз.

Название Нуклеотидная последовательность Обозначение Виды люпина

UBC810 (GA)8T I L.angustifolius, L. luteus

IS2 (AC)8G B L.angustifolius, L. albus

IS3 (GA)8C C L.angustifolius

IS6 (AG)8(Y)T F L. angustifolius

K11 (GA)8(Y)C J L. albus

При расширении набора анализируемых сортов. Минимальный набор праймеров может быть увеличен. С праймерами, используемыми в настоящее время, амплифициурется только 43% полиморфных фрагментов для узколистного, 37,5% для желтого и 50% для белого люпина. Поэтому существует достаточно большой запас полиморфизма для описания новых сортов, которые будут включены в работу.

На основе индивидуальных спектров К8Я-фрагментов были составлены генетические паспорта, позволяющие однозначно определить каждый сорт. Каждый праймер обозначили буквой латинского алфавита, нижним индексом - длину полиморфного фрагмента, а верхним - его

присутствие или отсутствие. Паспорта для четырех сортов каждого вида в качестве иллюстрации приведены в таблице 2.

Таблица 2

Генетические формулы сортов разных видов люпина

Название сорта Общая формула полиморфных фрагментов

Lupinus angustifolius

Сидерат 38 lü l D і О Юс 10ü 01010^ 0110^ 1^ 1^ 1^ 0^ 1т7 B860 B450 B370 B210 B180 C670 C655 C640 C590 C550 C520 C490 C450 C320 C210 F860 F750 1f 10f 1т Ют 1t 1t 1t 1t F 640 F 550 t520 t470 t420 t360 t320 t290

CH 78-07 lß lß lß l^R 10r 0000l^ l^ 10^ l^ l^ l^ Ы ІТ7 B860 B450 B370 B2l0 Bl80 C670 C655 C640 C590 C550 C520 C490 C450 C320 C2l0 F860 F750 10f іт 10t 1t 1t 1t 1t F 640 F 550 t520 t470 t420 t360 t320 t290

Барон lü 1d 1d 0ü 10^ 00010^ 10^ l^ l^ l^ 10^ l^1 1t7 B860 B450 B370 B2l0 Bl80 C670 C655 C640 C590 C550 C520 C490 C450 C320 C2l0 F860 F750 l ü 10^ 1t 10t 1t 10t 10t 1t F 640 F 550 t520 t470 t420 t360 t320 t290

Борута lß lß lß 0R 0(-Л l (-Л 0(-Л 0(-Л 10^ l (-Л 10^ l (-Л l (-Л l (-Л Ы ІТ7 B860 B450 B370 B2l0 Bl80 C670 C655 C640 C590 C550 C520 C490 C450 C320 C2l0 F860 F750 l ü 10u 1t І0т 1t 10t 1t 1t F 640 F 550 t520 t470 t420 t360 t320 t290

Lupinus luteus

Престиж 0T l0T lT 0T 1t 10t lT 10t 0T 0T lT 1t t650 t600 t550 t430 t400 t370 t350 t250 t200 t170 t160 t150

Парис 0t at 0t at 10t 10t at at 0t at 0t at t650 t600 t550 t430 t400 t370 t350 t250 t200 t170 t160 t150

Мистер W 0t 1t 0t at at 10t 10t at 0t 0t at t650 t600 t550 t430 t400 t370 t350 t250 t200 t170 t160 t1 50

Дукат 0t at at 10t at at 10t at 0t 0t 0t at t650 t600 t550 t430 t400 t370 t350 t250 t200 t170 t160 t1 50

Lupinus albus

Гамма i ü i d i0o i0o i d 1t і t і t b1050 B7l0 B690 B650 B470 B420 J550 J3l0 Jl90

Дега lR lR l^R l^R lR Ют 1t і T b1050 B7l0 B690 B650 B470 B420 J550 J3l0 Jl90

Бутан l R l R l^R 0R 1^ü 1t 1t 1t b1050 B7l0 B690 B650 B470 B420 J550 J3l0 Jl90

Борос 0r l ü l ü l ü 0o l^ 1t 1t b1050 B7l0 B690 B650 B470 B420 J550 J3l0 Jl90

RAPD-праймеры были разделены на две группы по температуре отжига: выше 180C и ниже. Для второй группы с целью повышения специфичности анализа увеличили концентрацию буфера в 2 раза и праймеров в четыре раза, достигнув, таким образом увеличения температуры отжига.

Пять из RAPD-праймеров позволяли амплифицировать не более трех фрагментов, ни один из которых не являлся полиморфным, с помощью еще четырех праймеров обнаруживали более десяти мономорфных фрагментов, с использованием еще пяти удалось получить от одной до трех полиморфных полос.

Специфика RAPD-PCR, не позволяющая учитывать в исследовании минорные фрагменты и фрагменты различной концентрации, и слишком низкий уровень полиморфизма, обнаруженный в исследовании, заставили отказаться от использования данного метода при паспортизации сортов люпина.

Можно заключить, что метод ISSR-PCR пригоден для паспортизации сортов разных видов люпина. Его работоспособность доказана на 25 сортах люпина. Использование метода RAPD-PCR для этих целей оказалось неэффективным.

The PCR amplified fragment polymorphism of three lupin species was studied. Only 13 ISSR-primers display polymorphic bands from 19 RAPD- and 21 ISSR-primers. Percentage of polymorphic bands had to be 33.5% for L.angustifolius, 23,2% - for L. luteus and 14,4% - for L. albus. There was proposed an identification method for cultivars of these three species. Application of the RAPD-primers was ineffective.

The key words: ISSR-PCR, molecular-genetic identification, L. angustifolius, L. albus, L. luteus.

Список литературы

1. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: пер. с англ.; под. ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М.: Мир, 1991. 408 с.

2. Конарев В.Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967-2007 гг.). СПб.: ВИР, 2007. 134 с.

3. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. 1987. Vol. 162. P. 156-159.

Об авторах

Артюхова A.B. - младший научный сотрудник Брянского государственного университета

имени академмика И.Г. Петровского, nasteva@list.ru

Гришин С.Ю. - студент Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, greyxxx@mail.ru

Князькина М.С. - студент Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, respiracion@yandex.ru

Лукашевич М.И. - доктор сельскохозяйственных наук, заместитель директора по НИР, Всероссийский научно-исследовательский институт люпина Российской академии сельскохозяйственных наук, lupins2008@rambler.ru

Заякин В.В - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, гуапат 1@yandex.ru

Нам И.Я - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, ¡уапат 1@yandex.ru