Разработка технологии получения диагностической тест-системы к вирусу «Астрахань-12»

Список литературы

1. Баранов, А. А. Показатели ретикулоцитарных индексов у здоровых детей / А. А. Баранов, Е. Л. Семикина, О. С. Мельничук и др. // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2010. - Т. 2, № 4. -С.17-21.

2. Бокова, Е. В. Растворимый трансферриновый рецептор в диагностике, дифференциальной диагностике и прогнозе некоторых заболеваний у детей / Е. В. Бокова, Е. С. Ковригина, А. Г. Румянцев и др. // Российский педиатрический журнал. - 2006. - № 6. - С. 47-52.

3. Румянцев, А. Г. Эритропоэтин в диагностике, профилактике и лечении анемий / А. Г. Румянцев, Е. Ф. Морщакова, А. Д. Павлов. - М. : Медпрактика, 2003. - 448 с.

4. Шило, В. Ю. Анемия при хронической болезни почек : патогенез, диагностика и лечение / В. Ю. Шило, Н. Н. Хасабов, В. М. Ермоленко // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2008. - Т. 7, № 2. - С. 28-35.

5. Corwin, H. L. Efficacy and safety of epoetin alfa in critically ill patients / H. L. Corwin,

A. Gettinger, T. C. Fabian et al. // The New England Journal of Medicine. - 2007. - Vol. 357, № 10 -P.965-976.

6. Fleming, R. E. Iron and inflammation : cross-talk between pathways regulating hepcidin / R. E. Fleming // J. Mol. Med. - 2008. - Vol. 86, № 5. - P. 491-494.

7. Thomas, C. Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of functional iron deficiency / C. Thomas, L. Thomas // Clin Chem. - 2002. - Vol. 48, № 7. - P. 1066-1076.

8. Vaziri, N. D. Erytropoetin and transferrin metabolism in nephrotic syndrome / N. D. Vaziri // Am. J. Kidney Dis. - 2001. - Vol. 38. - P. 1-8.

Гордеева Ольга Борисовна, кандидат медицинских наук, врач педиатр, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии, ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, НИИ педиатрии, Россия, 119991, г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 2/62, тел.: (499) 134-03-59, е-таіі: obr@yandex.ru.

УДК 616-022.6-053.3-07

© В.И. Журавлев, Г.А. Харченко, О.Г. Кимирилова, 2013

В.И. Журавлев1, Г.А. Харченко2, О.Г. Кимирилова2

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ К ВИРУСУ «АСТРАХАНЬ-12»

:ФГУЗ «Астраханская противочумная станция» Минздрава России 2ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России

Представлены результаты изоляции из крови лихорадящего больного арбовируса, получившего название «Астрахань-12» и создания на основе его антигенов диагностической тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антител класса М и G в сыворотках крови больных и реконвалесцентов.

Ключевые слова: арбовирусы, иммуноферментный анализ, разработка метода.

V.I. Zhuravlev, G.A. Hurchenko, O.G. Kimirilova THE WORKING-OUT OF TECHNOLOGY IN RECEIVING THE DIAGNOSTIC TEST-SYSTEM TO VIRUS «ASTRAKHAN-12»

The results of isolation from the blood of fiverish patient, type arbovirus, having got the name «Astrakhan-12» and creation on its’ base the antygene of diagnostic test system of immunoenzyme analysis (IEA) for discovery of anty-bodies of class M and G in the blood resum of patients and recovering persons are represented.

Key words: arbovirus, immune-enzyme analysis, working-out of method.

Введение. В связи с активацией природных очагов проблема арбовирусных инфекций продолжает оставаться актуальной для врачей всех специальностей. В настоящее время на территории Астраханской области установлена циркуляция 10 арбовирусов: Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН), Тягиня, Инко, Батаи, Синдбис, Укуниеми, Дхори, Бханджа, штамм № 913/64.

Полиморфизм клинических проявлений арбовирусных инфекций и трудность дифференциальной диагностики требуют разработки новых систем специфической диагностики [1, 2, 3].

Примером частичного решения этих задач может служить изоляция из крови лихорадящего больного арбовируса, условно названного «Астрахань-12», а также создание на основе его антигенов диагностической тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антител класса М и G в сыворотках крови больных реконвалесцентов.

Цель: разработать и усовершенствовать методы серологической диагностики арбовирусных инфекций.

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служили пробы крови и парные сыворотки от 56 больных детей в возрасте от 5 до 14 лет, лечившихся в детских отделениях ГБУЗ АО «Областная инфекционная клиническая больница им. А.М. Ничоги» с диагнозом серозный менингит или лихорадочное заболевание неясного генеза. Кровь от больных в остром периоде (вторые-третьи сутки от начала заболевания) использовали для интрацеребрального заражения биопроб-ных животных - новорожденных белых мышей (НБМ). Парные сыворотки крови больных исследовали на наличие антител класса М и G к десяти арбовирусам и штамму «Астрахань-12» в различных вариантах ИФА.

В работе использовали диагностические тест-системы ИФА, сахарозоацетоновые антигены (САА) и иммунные асцитные жидкости к вирусам КГЛ, ЛЗН, Тягиня, Инко, Синдбис, Батаи, Бханд-жа, Дхори, Укуниеми и штамму № 913/64 производства ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России). При определении иммуноглобулинов класса М и G человека использовали антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) производства НПО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Результаты исследования и их обсуждение. Из тринадцати проб крови от больных острыми лихорадящими заболеваниями в начальном периоде болезни изолированы два штамма вируса Лихорадки Западного Нила и выделен вирусный изолят № 12 (от больной Ш.), получивший впоследствии наименование «Астрахань-12».

Больная Ш., 9 лет, проживающая в г. Астрахани, заболела остро. Госпитализирована на второй день заболевания с диагнозом острая респираторная вирусная инфекция, нейротоксикоз. Клиническими признаками инфекции были: лихорадка 38,5° С в течение 4 суток, головная боль, рвота, катаральные явления в ротоглотке, увеличение печени на 1,5 см. В крови лейкопения, увеличение СОЭ, биохимические признаки поражения печени (биллирубин 35 мкмоль с преобладанием прямой фракции, АЛТ-2,1 мкмоль). Маркеры вирусных гепатитов не обнаружены, моча и копрограмма без изменений. Клинический диагноз - вирусный гепатит недифференцированный. Из эпиданамнеза: проживает в частном секторе пригорода Астрахани, отмечает постоянные контакты с домашними животными, птицами, кровососущими насекомыми.

На 2 и 12 день заболевания у больной проводили забор крови для клинических лабораторных исследований. Часть материала была передана в лабораторию экологии и индикации возбудителей природно-очаговых инфекций ФГУЗ «Астраханская противочумная станция» Роспотребнадзора. Из кровяного сгустка в лаборатории приготовили 10 % суспензию на растворе Хенкса с антибиотиками, центрифугировали материал 15 мин при 8 000 об/мин на холоде. Надосадочную жидкость использовали для интрацеребрального заражения 2-3-дневных НБМ и исследования в ИФА. Антигены вирусов КГЛ, ЛЗН, Тягиня, Инко, Синдбис, Батаи, Бхаджа, Дхори, Укуниеми и штамма № 913/64 не выявлены. На 7 сутки у части биопробных животных появились признаки инфицирования - анорексия, адинамия, судороги, параличи задних конечностей. Мозг больных животных использовали для последующих пассажей. К восьмому пассажу был закреплен инкубационный период (6 суток), определена патогенность для 2-3-дневных НБМ (^ LD50/мл - 5,62) и проведено накопление вируссодержащего материала. Из вируссодержащей суспензии мозга НБМ готовили антиген методом сахарозоацетоновой экстракции по общепринятой методике. Затем леофильно высушенный антиген тщательно гомогенизировали и добавляли 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфер (КББ) рН = 9,6 из расчета

0,5 мл на один мозг. Смесь инкубировали 18 часов на холоде при постоянном перемешивании и цен-

трифугировали 1 час при 10 000 об/мин. Концентрацию антигена проводили добавлением к супернатанту до 4 % полиэтиленглюколя (ПЭГ 6000 «Serva»). Инкубировали смесь 2 часа при 4° С, периодически перемешивая. После центрифугирования (на холоде в течение 1 часа при 10 000 об/мин) осадок тщательно ресуспендировали в 0,05 М КББ рН = 9,6 в объеме из расчета 0,2 мл на один изначально взятый мозг. Очищенный антиген разливали по 100 мкл в микропробирки и хранили при -70° С. Первичную идентификацию вирусного изолята «Астрахань-12» проводили в прямом варианте ИФА. Планшеты Flow Laboratories (Англия) в течение 18 часов при 4° С сенсибилизировали очищенным антигеном вируса «Астрахань-12» в разведении 1 : 100 на 0,05 М КББ рН = 9,6. После трехкратной промывки 0,15 М фосфатно-солевым буферным раствором (рН = 7,4), содержащим 0,1 % твина-20 (ФБР-Т), в лунки вносили 1 % альбумин по 200 мкл и инкубировали 1 час при 37° С. Планшеты трижды отмывали раствором ФБР-Т. В вертикальные ряды планшет вносили по 100 мкл иммунных асцитных жидкостей (ИАЖ) к вирусам штаммов, № 913/64, ЛЗН, КГЛ, Тягиня, Инко, Синдбис, Батаи, Бхаджа, Дхори, Укуниеми и нормальные иммуноглобулины мышей, в разведениях от 1 : 500 до 1 : 64 000 на растворе ФБР-Т-альбумин. После инкубации в течение 1 часа при 37° С и трехкратной промывки в каждую лунку планшета добавляли по100 мкл антимышинного иммунопероксидазного конъюгата к Ig G (H- и L- цепям) мышей производства ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» РАМН в рабочем разведении. Планшеты инкубировали 1,5 часа при 37° С, затем пятикратно по 3 мин промывали раствором ФБР-Т и подсушивали на воздухе. В лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси: фосфат-цитратного буфера рН = 5,0, содержащего 0,4 мг/мл ортофенилендиамина «Sigma>rn 0,006 % перекиси водорода. Реакцию останавливали по мере проявления окраски через 20-30 мин добавлением 50 мкл 4 н раствора серной кислоты. Учет результатов проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе - АИФЦ-01С (Россия). За титр реакции принимали максимальное разведение ИАЖ, при котором оптическая плотность в 2,1 раза превышала таковую в отрицательном контроле.

При серологической идентификации штамма «Астрахань-12» в прямом ИФА было установлено, что антигены вируса тесно взаимодействуют с ИАЖ к штамму № 913/64 при разведении до 1 : 64 000, с ИАЖ к штамму № 913/64 при разведении до 1 : 32 000. Антигены вируса «Астрахань-12» слабо взаимодействовали с поликлональными ИАЖ к вирусу ЛЗН в разведении 1 : 500 и не реагировали с коммерческими препаратами ИАЖ к представителям других родов арбовирусов и нормальными иммуноглобулинами мышей. Для определения общности антигенной структуры вируса «Астрахань-12», вирусов ЛЗН и штамма № 913/64 использовали непрямой вариант ИФА с коммерческими тест-системами производства ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России). Для этого лунки планшетов сенсибилизировали иммуноглобулинами из ИАЖ к вирусам ЛЗН и штамма № 913/64. После промывки и блокировки свободных участков альбумином в параллельные ряды вносили разведения от 1 : 200 до 1 : 12 800 САА вирусов «Астрахань-12», ЛЗН и штамма № 913/64, приготовленных по единой методике и стандартизованных по белку (100 мкг/мл). Связавшиеся антигены выявляли ИПК к вирусам ЛЗН и штамма № 913/64. В тест-системе ИФА к вирусу ЛЗН гомологичные антигены выявляли в разведении 1 : 12 800, антигены вируса «Астрахань-12» только 1 : 200, антигены штамма № 913/64 и нормальные мозговые антигены (отрицательный контроль) не выявляли. В тест-системе к вирусу штамм № 913/64 выявляли только гомологичные антигены в титре 1 : 6 400 и антигены вируса «Астрахань-12» в разведении 1 : 3 200.

Заключение. На основании полученных данных можно сделать предположение о наличии глубоких антигенных связей вируса «Астрахань-12» с группой неклассифицированных арбовирусов, выделенных ранее из объектов окружающей среды, представленных штаммами № 913/64. В то же время изолированный из крови лихорадящего больного вирус «Астрахань-12» отличается от них по своим биологическим свойствам. При исследовании клинического материала от 56 больных детей у 14 (25 %) выявлены антитела к вирусу «Астрахань-12» и диагностическая динамика их титров. Изоляция этиологического фактора заболевания и выявление антител в сыворотках крови больных с характерными клиническими проявлениями делают возможным выделение новой нозологической формы инфекционной патологии - Астраханской арбовирусной инфекции.

Список литературы

1. Гришанова, А. П. Серологическая диагностика арбовирусных инфекций в Астраханской области в 1999-2000 гг. / А. П. Гришанова, А. Р. Азарян, Т. Е. Инкина // Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России их профилактика и лабораторная диагностика. - Астрахань : ГП АО «ИПК Волга», 2001. -- С. 313-315.

2. Львов, Д. К. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больных людей в период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях / Д. К. Львов, А. М. Бутенко, О. П. Вышемирский // Вопросы вирусологии - 2002. - № 3. - С. 9-12.

3. Львов, Д. К. Лихорадка Западного Нила / Д. К. Львов, В. Б. Писарев, В. А. Петров, Н. В. Григорьева. - Волгоград : ГУ Издатель, 2004. - 101 с.

Журавлев Виталий Иванович, кандидат медицинских наук, научный сотрудник, ФГУЗ «Астраханская противочумная станция» Минздрава России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Кубанская, д. 3, тел.: (8512) 33-37-00, е-mail: antichum@astranet.ru.

Харченко Геннадий Андреевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой детских инфекций, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 31-05-46, e-mail: agma@astranet.ru.

Кимирилова Ольга Геннадьевна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры детских инфекций, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 31-05-46, e-mail: agma@astranet.ru.

УДК616.24-002.191-053.3

© С.А. Красовский, Д.Ф. Сергиенко, А.А. Степанова, Н.В. Петрова, 2013

С.А. Красовский1, Д.Ф. Сергиенко2, А.А. Степанова3, Н.В. Петрова3

ГЕНО-ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ У ВЗРОСЛЫХ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ

ХФГУ «Научно-исследовательский институт пульмонологии» ФМБА России 2ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России 3ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, г. Москва

Определено, что для «тяжелых» генотипов муковисцидоза характерно раннее установление диагноза, наоборот, при «мягком» генотипе - более позднее, преимущественно в подростковом и зачастую во взрослом возрасте. В структуре грамотрицательной флоры определена большая частота высева Burkholderia cepacia (B. cepacia) среди пациентов с «тяжелым» генотипом. Не выявлено различий между «мягкими» и «тяжелыми» генотипами по респираторному и нутритивному статусу, частоте бронхолегочных осложнений, желчекаменной болезни и остеопороза. Сахарный диабет, цирроз печени, кишечная непроходимость встречались только у «тяжелых» генотипов.

Ключевые слова: муковисцидоз, «мягкие» генотипы, «тяжелые» генотипы, гено-фенотипические связи.

S.A. Krasovskiy, D.F. Sergienko, A.A. Stepanova, N.V. Petrova

GENO-PHENOTYPE RELATIONSHIP IN ADULT PATIENTS WITH CYSTIC FIBROSIS

It was determined that the «heavy» cystic fibrosis genotypes characterized by early-tion establishedthe diagnosis, on the contrary, with a «soft» genotype - later, mostly in sub-sprout and often in adulthood. The structure of the gramnegative flora of ethylene higher rate of seeding Burkholderia cepacia among patients with «severe» genotype was defined. The differences between «soft» and «severe» genotypes on respiratory and Nutritive-Nome status, incidence of bronchopulmonary complications of cholelithiasis and osteoporosis was not revealed. Diabetes, cirrhosis of the liver, intestinaobstruction were exclusive to the «heavy» genotypes.

Key words: cystic fibrosis, «mild» genotypes «severe» genotypes, genotype-phenotype relation.

Введение. Муковисцидоз (МВ) - наследственная патология с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленная мутацией гена МВ, которая приводит к нарушению функции расположенного в апикальной части мембран экзокринных желез хлорного канала. Секрет экзокринных желез приобретает чрезмерную вязкость и обезвоженность, что обусловливает ряд патологических про-