Способ прогнозирования ранних рецидивов светлоклеточной карциномы тела матки
METHOD FOR PREDICTING EARLY RECURRENCE OF CLEAR CELL CARCINOMA OF THE UTERINE BODY

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для прогнозирования ранних рецидивов редких форм рака тела матки.
В мире рак тела матки (РТМ) занимает 4-е место в структуре заболеваемости женщин злокачественными новообразованиями и 7-е место в структуре смертности от них. РТМ чаще встречается у женщин в пре- и постменопаузе (75%), однако в последние годы отмечается тенденция омоложения больных РТМ. Значительные темпы прироста заболеваемости РТМ отмечаются в возрастных группах 40-49 (на 12,3%) и 50-56 лет (на 15,6%) (см. Трапезников Н. Н., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ (состояние онкологической помощи, заболеваемость и смертность). - М., 2001. - 296 с.).
Самой распространенной формой рака тела матки является эндометриоидная карцинома, удельный вес которой составляет около 80 %. На долю редких форм рака эндометрия (неэндометриоидных) приходится 15–20%, однако именно эти карциномы ответственны за более агрессивное течение с неблагоприятным прогнозом, когда 5-летняя выживаемость не превышает 40%. К ним можно отнести: муцинозную аденокарциному, серозную аденокарциному, светлоклеточную (мезонефроидную) аденокарциному, смешанно-клеточную аденокарциному, плоскоклеточный рак, переходно-клеточный рак, недифференцированный рак (см. Д.И. Халимбекова, Е.А. Ульрих Мезонефроидный (Светлоклеточный) рак женских половых органов (обзор литературы) Сибирский онкологический журнал. 2012. No 6 (54) С. 76-83).
В течение последних 10 лет активно изучаются различные молекулярные маркеры при раке тела матки. Многие из них являются достаточно значимыми независимыми прогностическими и предсказательными факторами, а некоторые имеют значение при выборе схем противоопухолевой терапии этого заболевания. В исследованиях российских ученых изучались циклооксигеназы (СОХ-2, СОХ-1), муцины (MUC-1, MUC-2), рецепторы эстрогенов (ER) и прогестерона (PR), антиген Ki-67, онкобелок HER2/neu при самой распространенной разновидности рака тела матки - эндометриоидной аденокарциноме. Для оценки эффективности лучевой терапии при раке шейки матки проводили иммуногистохимическое изучение пролиферативной активности и репаративной способности ДНК клеток опухоли по экспрессии маркеров Ki-67, Ku-70, Ku-86, онкобелков р53, HER2, c-myc (см. М.Р. Кайрбаев, Ж.К.Чингисова, Е.К. Кукубасов, Р.Ш. Шалбаева, Ж. Досаханов. Молекулярные маркеры рака шейки и тела матки как. clinical medicine of Kazakhstan. 43 No3 (29) 2013).
Современная онкология невозможна без разработки и применения новых способов прогнозирования бессобытийной выживаемости пациентов.
Из патентных источников известны следующие способы прогнозирования.
1. Для прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке желудка проводят гистологическое исследование резецированного желудка. Исследуют участки подслизистой основы слизистой оболочки желудка, расположенные на расстоянии 3-5 см от видимого края опухоли. При наличии в гистопрепаратах расширенных капилляров, образованных одним слоем эндотелиальных клеток, прогнозируют метастазы рака желудка в регионарных лимфатических узлах. Способ повышает точность прогнозирования риска лимфогенного метастазирования при раке желудка (см. патент RU 2425639 С1, опубл. 10.08.2011, Бюл. № 22).
2. Для прогнозирования рецидивов рака тела матки используют биохимические методики. Сущность способа заключается в том, что у менопаузальных и репродуктивных больных раком тела матки стадии III в ткани опухоли определяют активность ферментов моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы Б. При величине коэффициента 4,48-6,90 прогнозируют у пролеченных больных сохранение состояния ремиссии минимально в течение 12 месяцев после окончания лечения, а при величинах коэффициента 18,70-50,27 прогнозируют рецидив заболевания минимально через 7 месяцев. Использование способа позволяет определить эффективность комплексного лечения больных раком тела матки в менопаузальном и репродуктивном периодах (см. патент RU 2395097 C1, опубл. 20.07.2010, Бюл. № 20).
3. Для прогнозирования направленности патологического процесса при раке тела матки в опухолевой ткани эндометрия методом ИФА определяют содержание онкобелка Е6 и половых стероидов - эстрадиола, эстрона, тестостерона и прогестерона. Затем рассчитывают коэффициент соотношения половых стероидов по оригинальной расчетной формуле. При величинах онкобелка Е6, равных 420±32 нг/г тк, и К, равных 24,54±2,4, прогнозируют развитие рецидивов заболевания в срок до 6 месяцев после хирургического лечения. При величинах онкобелка Е6, равных 28±2,1 нг/г тк, и К, равных 8,15±1,2, рецидивы прогнозируют в срок свыше 6 месяцев до 1 года после хирургического лечения. При отрицательных значениях онкобелка Е6 и К, равных 3,69±0,25, прогнозируют безрецидивный период сроком более 1 года после хирургического лечения (см. патент RU 2712307 C1, опубл. 28.01.2020, Бюл. №4).
4. Известен способ, включающий определение через 1,5-2 недели после окончания лечения в суточной моче уровня кортизола и тетрагидро-11-дезоксикортизола. Определяют коэффициент соотношения тетрагидро-11-дезоксикортизола к кортизолу; при величине соотношения менее двух прогнозируют длительность безрецидивного периода пять и более лет, а при соотношении более двух - развитие рецидива в ближайшие два года (см. патент RU 2424806 C1, опубл. 27.07.2011, Бюл. № 21).
5. Также широко используются методики прогнозирования, основанные на определении иммуногистохимических параметров опухоли. Так, например, проводят определение в опухоли рецепторов эстрогенов (Х3) в баллах и дополнительно учитывают у больной длительность менопаузы (X1) в годах, стадию заболевания (Х2) по TNM и патогенетический вариант (Х6) заболевания, а в опухоли определяют индекс Ki-67 в % (Х4) и экспрессию HER2 (X5) в баллах, после чего рассчитывают дискриминантные функции Z=5.4157-0.1889X1-1.3646Х2+0.1828Х3-0.0354Х4 и Y=5.3183-0.1272X1-0.7169Х2-0.4347Х5-1.4333Х6, где Z - критерий прогнозирования 5-летней безрецидивной выживаемости больных, Y - критерий прогнозирования рецидива заболевания, и при значении Z> - 0.138 прогнозируют безрецидивную выживаемость больных 5 лет и более, при Z≤ - 0.138 - менее 5 лет, при значении Y>0.172 прогнозируют отсутствие рецидива заболевания, при Y<0.172 - появление рецидива (см. патент RU 2299690 C1 опубл. 27.05.2007, Бюл. № 15).
Вышеописанные способы имеют существенные недостатки, они не используют более точные и современные молекулярно-генетические методы для определения прогноза заболевания, особенно у пациентов с редкими формами рака тела матки.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности прогноза развития ранних рецидивов заболевания после противоопухолевого лечения больных неэндометриоидным (светлоклеточным и серозным) раком тела матки в первые два года после операции.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего прогнозировать ранние рецидивы светлоклеточной карциномы тела матки в первые два года после операции.
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
Технический результат достигается тем, что определяют относительную экспрессию генов ,,и в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия методом полимеразной цепной реакции  в реальном времени, при значении относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия для гена  равно или выше 7,6,  равно или выше 5,4, гена  равно или выше 3,9 и гена  равно или выше 3,7, прогнозируют появление рецидива заболевания в первые два года после операции независимо от стадии заболевания.
Применение способа позволяет повысить точность прогноза прогрессирования заболевания после противоопухолевого лечения больных неэндометриоидным раком тела матки.
CDKN2A, L1CAM, ERBB2
UBE2C
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
Для решения поставленной задачи, способ включает определение относительной экспрессии генов и  в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия методом полимеразной цепной реакции  (ПЦР) реального времени. При обнаружении превышения относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия для гена выше 7,6,  выше 5,4, гена  выше 3,9 и гена  выше 3,7, делают вывод об увеличении риска онкологической прогрессии в 74 раза независимо от стадии заболевания.
Разработанный способ позволяет повысить точность прогноза появления ранних рецидивов в первые два года после операции при наблюдении за больными с редкими формами рака тела матки.
Понятие рецидива при раке тела матки объединяет различные формы распространения болезни: продолженный либо возобновленный рост, инвазия в соседние органы, локорегиональные рецидивы (поражение подвздошных лимфатических узлов, влагалища, параметрия), а также отдаленные метастазы в лимфатические узлы и органы. Выделяют ранние (до двух лет после окончания первичного лечения) и поздние (два и более лет) сроки развития рецидивов рака тела матки. У 77% больных рецидивы рака тела матки развиваются в течение первых двух лет наблюдения, а у 88% в первые три года после окончания первичного лечения (см. Makker V., MacKay H., Ray-Coquard I., Levine D.A., Westin S.N., Aoki D. et al. Endometrial cancer. Nat Rev Dis Primers. 2021; 7: 88. doi:10.1038/s41572-021-00324-8).
Нами обследовано 33 пациентки с серозным и 24 со светлоклеточным раком тела матки II-IV cтадий по FIGO, всего 57 человек.  При серозном раке II стадия выявлена у 16 (48,5%), III – 12 (36,4%), IV – 5 (15,1%) человек. У пациенток со светлоклеточным раком II стадия имела место у 9 (37,5%), III – 10 (41,7%), IV – 5 (20,8%) больных.
У пациенток с серозным раком ранние рецидивы были выявлены у 13 больных (39,4%), а при светлоклеточном раке тела матки ранние рецидивы имели место у 9 больных (37,5%).
CDKN2A, L1CAM, ERBB2
UBE2C
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
Методом ROC анализа были найдены дифференциально-разделительные точки исходной относительной экспрессии генетических локусов для оценки риска ранних рецидивов. При проведении ROC анализа случаи рецидивов заболевания в первые два года наблюдения ранжировали как 1, отсутствие рецидивов как 0. У каждого пациента фиксировали исходные величины относительной экспрессии генов и в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия. При автоматизированном соотношении диагностической чувствительности и специфичности методом ROC анализа была определены дифференциально-разделительные точки:  для гена  точка cut-off составила 7,6,  - 5,4, гена  - 3,9 и гена  - 3,7. При достижении и превышении точек cut-off при исследовании относительной экспрессии генов величины диагностической информативности имели наибольшие значения.
Соотношение истинно положительных (n=19), ложноположительных (n=4), истинно отрицательных (n=31) и ложноотрицательных случаев  (n=3) позволило определить информативность заявленного способа. Диагностическая чувствительность составила 86,4%, специфичность 88,6%, диагностическая точность 87,7%. Площадь под ROC кривой составила 0,875, что свидетельствовало о хорошем качестве лабораторного теста.  ROC кривая статистически значимо отличалась от опорной диагональной линии (z-статистика=4,23, р<0,0001).
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
У больных с морфологически подтвержденным диагнозом  светлоклеточного или серозного рака тела матки в образцах опухоли и нормальной ткани эндометрия, полученных в ходе операции, определяют относительную экспрессию генов , ,  и  в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия методом ПЦР реального времени.
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводили на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе. Первичная денатурация: t=95°C в течение 3 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=60°C в течение 30 с, t=72°C в течение 15 с. В одной постановке в качестве матрицы использовали одновременно кДНК опытной (опухоль) и контрольной (условно нормальная ткань) пробы для определения сигналов, продуцируемых амплификатами локусов исследуемых генов и референсного АСТВ, каждого в трех повторах.
Относительная экспрессия генетических локусов вычислялась следующим образом:
- рассчитывали медиану Ct по трем повторам для каждого целевого генетического локуса и одного референсного АСТВ,
i
i
i
i
i
- далее последовательно рассчитывали величину различия между Ct(ГЕН)  для каждого из исследуемых генетических локусов CDKN2A, L1CAM, ERBB2 и UBE2C относительно референсного гена ACTB по формуле ΔCt=Ct(ГЕН) - Ct(ACTB)», где   ΔCt– различие между экспрессией изучаемого гена (Ct(ГЕН))  и референсного гена ACTB (Ct(ACTB));
-ΔCt
- относительную экспрессию изучаемых четырех генетических локусов (RE) рассчитывали по формуле 2.
Вывод об изменении экспрессии гена делали, сравнивая показатели относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой и условно нормальной ткани.
Для этого вычисляли медиану REcancer опухолевых образцов и медиану REnormal контрольных (условно нормальная ткань) для каждого генетического локуса и рассчитывали соотношение относительной экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия: К=REcancer/REnormal.
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
CDKN2A
L1CAM
ERBB2
UBE2C
Далее сравнивают полученные значения К для генов , ,  и  с дифференциально разделительными точками, найденными методом ROC анализа среди больных светлоклеточным раком тела матки в подгруппах с учетом наличия или отсутствия ранних рецидивов. Дифференциально разделительный уровень для гена  составил 7,6,  - 5,4, гена  - 3,9 и гена  - 3,7. Методом многомерного регрессионного анализа Кокса установлено, что  при обнаружении превышения относительной экспрессии гена в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани матки для гена  равно или выше 7,6,  равно или выше 5,4, гена  равно или выше 3,9 и гена  равно или выше 3,7, риск онкологической прогрессии заболевания в первые два года после операции возрастает в 74 раза (p<0,001) независимо от стадии заболевания. Диагностическая чувствительность метода составила 89,5%, диагностическая специфичность 91,4%.
Приводим клинический пример применения способа.
Пример 1
Больная К. 1953 года рождения, в январе 2019 г. обратилась к гинекологу. 28.01.19 г. по месту жительства выполнено ДВПМ, г/а фрагменты светлоклеточной карциномы с папиллярными структурами.
Пациентка обратилась в ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ для дообследования и лечения.
На этапе догоспитального обследования при комбинированном УЗИ органов малого таза и органов брюшной полости, было обнаружено минимальное распространение процесса в пределах полости матки, без перехода на цервикальный канал. В зоне срединного М-эха обнаружились участки повышенной эхогенности с толщиной эндометрия до 7-8 мм.
В тазовых и парааортальных лимфатических узлах при СРКТ органов малого таза признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию T1NxM0. Из сопутствующей патологии выявлено: Гипертоническая болезнь I ст., степень АГ 1 ст., риск 2, ХСН I ст., ФК 2, хронический гастрит в стадии ремиссии, варикозная болезнь нижних конечностей, ХВН 1 ст, 1 ф.кл.
21.02.2019 г.  выполнена лапаротомия, нервосберегающая экстирпация матки с придатками с верхней третью влагалища, тазовая лимфаденэктомия. При макроскопической оценке в удаленной матке была обнаружена полиповидная опухоль распространяющаяся на всю полость матки, исключая цервикальный канал. Послеоперационный период протекал - без осложнений.
По данным патоморфологического исследования после операции в полости матки светлоклеточная карцинома, G2 с инвазией менее 1/2 толщины стенки матки; в удаленных лимфоузлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала рT1aN0M0. Интраоперационно, после удаления макропрепарата в опухолевой ткани и нормальной ткани был осуществлен забор материала для определения относительной экспрессии CDKN2A, LICAM, ERBB2,UBE2C. Методом ПЦР реального времени обнаружено превышение относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия гена CDKN2A = 7,8, LICAM = 5,5, ERBB2 = 4,1, UBE2C = 3,8.
Учитывая гистологический тип опухоли и начальную стадию заболевания, в  отделении радиологии с 18.03.2019-17.04.2019 г. проведен курс  ДЛТ на область малого таза в проекции тазовых и забрюшинных л/узлов, СОД 47 Гр.
В сентябре 2019 г. появились кровянистые выделения из влагалища, в связи с чем пациентка вновь обратилась в КДО «НМИЦ онкологии» для дообследования.  Обследована: 20.09.2019 выполнено УЗИ органов брюшной полости и органов малого таза. Состояние после удаления матки с придатками. Влагалищный рубец изменен, уплотнен, неправильной формы, в нижней трети с переходом на влагалище, определяется неоднородный инфильтрат неправильной формы, с неровными контурами, размером 3,7х3,3 см. Диффузные изменения печени. Кисты левой почки. 20.09.2019 взята биопсия влагалищного рубца: светлоклеточная карцинома, G2.  Рентген ОГК выявил двустороннее мтс поражение легких, очаги до 4,0 см.
Консилиумом врачей «НМИЦ онкологии» принято решение о проведении 6 курсов ПХТ по схеме: паклитаксел 175 мг/м2 в/в в 1-ый день, карбоплатин АUC-5 в/в в 1-ый день 21-дневного курса, которую больная не закончила из-за продолжающейся неконтролируемой генерализации с метастазами в легкие. Смерть больной наступила в январе 2020 года.
Пример 2.
Больная И., 1950 г.р. госпитализирована в онкогинекологическое отделение ФГБУ «НМИЦ онкологии» 19 августа 2019 г. с верифицированным диагнозом: рак тела матки (г.а. - очаги светлоклеточной карциномы).
На догоспитальном этапе выполнено УЗИ органов малого таза обнаружено узловое образование тела матки, патология эндометрия в менопаузе.
При СРКТ признаков отдаленного метастазирования и поражения тазовых и парааортальных лимфоузлов не обнаружено.
Сопутствующая соматическая патология: лимфостаз нижних конечностей 1 ст., Миокардиодистрофия. ХСН 1 ст., ФК 2 сахарный диабет II типа.
26 августа 2019 г. больной выполнена операция: нервосберегающая экстирпация матки с придатками с верхней третью влагалища, тазовая лимфаденэктомия. Макроскопически преимущественно в области дна обнаружена экзофитная опухоль с инфильтрацией в миометрий и очагами деструкции и частичным переходом на цервикальный канал. Течение послеоперационного периода без особенностей.
Результат морфологического исследования – G2 светлоклеточная карцинома с инвазией в миометрий более 1/2 с распространением в строму цервикального канала. В эктоцервиксе хроническое слабо выраженное воспаление. В яичниках белые тела. Маточные трубы обычного гистологического строения.
В исследованных лимфатических узлах признаков опухолевого роста не обнаружено, что позволило определить степень распространения процесса, как рT2N0M0. Интраоперационно, после удаления макропрепарата в опухолевой ткани и нормальной ткани был осуществлен забор материала для определения относительной экспрессии CDKN2A, LICAM, ERBB2, UBE2C. Методом ПЦР реального времени обнаружено превышение относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани эндометрия гена CDKN2A = 7,4, LICAM = 5,1, ERBB2 = 3,8, UBE2C = 3,5.
Согласно стандарту лечения больная с 23.09.2019 получила курс ДЛТ на область малого таза в проекции тазовых и забрюшинных л/узлов, СОД 47 Гр. и II этап курса сочетанной лучевой терапии РОД 7 Гр на п/о рубец и стенки культи влагалища, СОД 40 Гр. Проведено 6 курсов ПХТ по схеме: паклитаксел 175 мг/м2 в/в в 1-ый день, карбоплатин АUC-6 в/в в 1-ый день 21-дневного курса. Окончила лечение в 09.03.2020 г.
Больная наблюдается по настоящее время без признаков рецидива и метастазов.
Технико-экономическая эффективность способа заключается в повышении точности прогноза появления ранних рецидивов при наблюдении за больными светлоклеточным раком тела матки.