СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
METHOD OF IDENTIFYING MYCOBACTERIA BY POLYMERASE CHAIN REACTION

Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции относится к эпизоотологии, микробиологии, биотехнологии и медицине. Предлагаемый способ идентификации предназначен для идентификации микобактерий в клиническом и патологическом материале полимеразной цепной реакцией с использованием специфических олигонуклеотидов, соответствующих участкам генов pРНК. Предлагаются способы автоматизированного и простого ДНК секвенирования.
Стандартные способы точной идентификации видов микобактерий, в соответствии с фенотипическими характеристиками включают сложные и длительные процедуры. Способы, основанные на анализе липидов, такие как жидкостная, тонкослойная, газово-жидкостная хроматография, являются громоздкими, дорогими и используются только в нескольких клинических лабораториях Европы. Не только Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis, но и другие микобактерии становятся все более важными как оппортунистические патогены, которые могут вызывать ряд серьезных заболеваний. Наиболее яркий пример - распространение Mycobacterium avium и недавно описанной Mycobacterium genavense у пациентов, больных СПИДом.
Существует большая необходимость быстрой идентификации всех видов микобактерий.
Известен способ обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса [RU 2163638 С1, 7 C12Q 1/68, 06.12.1999] и аналогичные способы [RU 94017389 А1, 6 C12Q 1/68, 10.05.1994], [RU 97100857 A1, 6 C12Q 1/68, 24.01.1997], которые не позволяют провести видовую идентификацию всех видов микобактерий.
Идентификации последовательностей нуклеотидов - быстрый и широко используемый способ, но он охватывает только узкий диапазон видов микобактерий; кроме того, существуют проблемы, связанные со специфичностью и чувствительностью. Известны молекулярно-генетические способы типирования микроорганизмов, такие как анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции и дот-блот-гибридизация, однако универсальным является способ определения последовательности 16S pРНК [Rogall, Т., Flohr, Т., and Böttger, Е.С. (1990) Differentiation of mycobacterium species by direct sequensing of amplified DNA. J. Gen. Microbiol. 136, 1915-1920].
Гены для 16S и 23S pРНК особенно подходят для идентификации микроорганизмов, потому что (за исключением вирусов) pРНК гены найдены у всех организмов. Рибосомальные нуклеиновые кислоты рассматриваются как филогенетически значимые молекулы.
Разделение бактерий на секции, классы, семейства, роды и виды отражено в последовательности pРНК. Последовательности pРНК или «молекулярные отпечатки» являются основой идентификации микроорганизмов. «Молекулярные отпечатки» учитывают не только первичную, но и вторичную структуру рибосомальных генов.
В отличие от фенотипических и биохимических особенностей последовательность 16S pРНК особи - устойчивая характеристика, которая является специфической для микроорганизмов на уровне вида. При этом для идентификации вида особенно важны гипервариабельные участки, так как только низкая изменчивость по ним наблюдается в пределах вида. Аналитическое секвенирование нуклеиновых кислот включает выделение нуклеиновых кислот, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) - установленное умножение фрагмента гена 16S pРНК, определение последовательности и анализ данных. Определение последовательности 16S pРНК позволяет правильно идентифицировать изоляты, то есть определять микобактерии в уже установленный таксон, а так же быстро определять до сих пор непризнанные виды [Seung-Jung Kee, Shin-Mook Kim, Soo-Hyun Kim, Myung-Geun Shin, Jong-Hee Shin, Soon-Pal Suh and Dong-Wook Ryang. (2009) Multiplex PCR Assay for Identification of MycobacterialSpecies Isolated from Liquid Cultures. Chonnam Medical Journal. Vol.45, No.1, p.19-26].
После выделения нуклеиновой кислоты путем простого механического разрушения бактерий проводят амплификацию фрагмента 16S pРНК длиной 1 кД с использованием праймеров SEQ ID No:2 и SEQ ID No:1 (таблица 1 и фиг.1). Высокий уровень специфичности праймера SEQ ID No:2 позволяет осуществлять точную идентификацию микобактерий в загрязненных культурах. Биотинилирование ПЦР праймера SEQ ID No:1 позволяет использовать технику простого одноцепочечного твердофазного секвенирования. Для лаборатории, имеющей автоматизированный ДНК-секвенатор, прилагается протокол для Applied Biosystems 373A секвенатора (см. подзаголовок 3.3). Точная идентификация возможна путем сравнивания либо определенных последовательностей с известными последовательностями, либо определенных последовательностей с базовыми данными. Способы секвенирования являются высоко надежными методами, которые можно легко внедрить в любой крупной клинической лаборатории.
Полное секвенирование не требует больших временных затрат (не более чем 36 часов, начиная с момента получения микобактериальной культуры до заключительной идентификации). При наличии современной аппаратуры амплификацию и секвенирование можно провести в течение одного дня.
Приложение 1
1. Материалы для проведения подготовки образцов, ПЦР амплификации и секвенирования
1.1. Подготовка образцов и ПЦР амплификация:
1.1.1. Большой тканевой дезинтегратор;
1.1.2. Амплификатор;
1.1.3. Оборудование для электрофореза в агарозном геле:
- Обработанные кислотой стеклянные бусинки диаметром 100 мм;
- ТЕ-буфер: 10 мМ TriS-HCl, pH 8,3 1 мМ EDTA;
2
10Х ПЦР буфер (GeneAmp): 100 мМ Трис-HCl, pH 8,3; 500 мM KCl, 15 мM MgCl, 0,01% желатин;
- АмплиTaq ДНК-полимераза;
- смесь dNTP: 1,25 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
- Олигонуклеотиды (см. табл. 1);
- Дважды автоклавированная вода;
- Минеральное масло;
- Оранжевый G буфер: 0,25% оранжевый G, 30% глицерол в ТЕ;
- Маркер молекулярного веса;
- ТВЕ буфер: 89 мМ Трисборат, 89 мМ борная кислота, 8 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота).
1.2. Автоматизированное ДНК секвенирование:
1.2.1. Applied Biosystems 373A ДНК секвенатор;
1.2.2. Амплификатор Perkin Elmer GeneAmp 9600 или другой амплификатор;
1.2.3. Вакуумная центрифуга;
1.2.4. Призма окрашивания терминального цикла секвенирования готовым комплексом реакции (Applied Biosystems);
1.2.5. 0,2 мл GeneAmp ПЦР пробирки;
1.2.6. QIA quick ПЦР комплект очистки;
1.2.7. 3А ацетат натрия, pH 5,2;
1.2.8. Этанол;
1.2.9. Формамид, 50 мМ EDTA, pH 8,0 (5:1).
1.3. Простое ДНК секвенирование:
1.3.1. Аппаратура для секвенирования;
1.3.2. Dynal MPC-E магнитный сепаратор;
1.3.3. Dynabeads M-280 Steptovidin;
1.3.4. Комплект секвенирования, например, Seguenase версия 2,0 ДНК комплект секвенирования;
2
1.3.5. Буфер для секвенирования: 200 мМ Трис, рН 7,5; 100 мМ MgCl;
1.3.6. Меченая смесь: 0,2 мМ dATФ; 0,2 мМ dTTФ; 0,2 мМ dГTФ;
1.3.7. dЦTФ, 3000 Ci/ммоль, 10 mCi/мл;
1.3.8. Буфер остановки: 95% формамид (деионизированный), 20 мM EDTA, бромфенол синий до формирования насыщенного цвета;
1.3.9. Акриламид;
1.3.10. Мочевина;
1.3.11. Фотолаборатория;
1.3.12. Рентген-установка.
2. Способы подготовки образцов, ПЦР амплификации и секвенирования
2.1. Подготовка образцов:
2.1.1. Для амплификации с помощью ПЦР для образца берут 0,5 мл жидкой культуры (12В ВАСТЕС, Becton-Dickinson) из 10 разных культур микобактерий с индексом роста 50.0, или колонию со среды (например, Löwenstein-Jensen), растворенную в 0,5 мл ТЕ, или микроскопически положительную конденсированную жидкость с твердой яичной средой Löwenstein-Jensen;
2.1.2. Помещают образец в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой. Инкубируют в течение 10 мин при 80°C с целью инактивации микобактерий;
2.1.3. Центрифугируют пробирки на максимальной скорости (приблизительно 17000 g) в микроцентрифуге 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость;
2.1.4. Добавляют 100 мкл ТЕ и петлевые стеклянные бусинки. Размещают пробирки в большом тканевом дезинтеграторе и подвергают обработке на максимальной скорости в течение 2 мин;
2.1.5. Центрифугируют образец на максимальной скорости в микроцентрифуге 5 мин;
2.1.6. Переливают верхний слой в новую микроцентрифужную пробирку и используют 5 мкл для постановки ПЦР.
2.2. ПЦР-амплификация:
2.2.1. Готовят реакционную смесь для проведения ПЦР. Проводят 10 реакций и используют при этом:
- 50,0 мкл 10Х GeneAmp. ПЦР буфер;
- 80,0 мкл смеси dNTP;
- 10,0 мкл биотинилированного праймера SEQ ID No: 1 (8 пмоль/мл);
- 10 мкл праймера SEQ ID No: 2 (20 пмоль/мл);
- 297,5 мкл стерильной воды;
- 2,5 мкл Taq-полимеразы;
2.2.2. По 45,0 мкл реакционной смеси помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл и в каждую добавляют каплю минерального масла;
2.2.3. Пробирки помещают в амплификатор при температуре 72°С;
2.2.4. Добавляют 5,0 мкл образца к приготовленной смеси;
2.2.5. Амплификацию проводят согласно следующему протоколу:
- 94°С, 1 мин (денатурация);
- 64°С, 2 мин (отжиг) 40 циклов;
- 72°С, 2 мин (синтез);
- 72°С, 5 мин (заключительный этап);
2.2.6. Берут 5,0 мкл (аликвота) смеси и добавляют 5,0 мкл оранжевого G буфера;
2.2.7. Подготовленные образцы наносят на 0,8% агарозный гель в ТВЕ буфере и проводят электрофорез. Оранжевый маркер перемещался приблизительно на 6-10 см. Визуализацию продукта амплификации проводят в УФ-свете. Полученные ПЦР продукты были проанализированы автоматизированным прямым или простым ДНК секвенированием.
2.3. Автоматизированное ДНК секвенирование.
Для Taq циклического секвенирования на Applied Biosystems 373А ДНК секвенаторе используют следующую методику:
2.3.1. Очищают двухцепочечный продукт ПЦР от праймеров и нуклеотидов, используя QIAquick ПЦР комплект очистки, как указано изготовителем. Затем промывают от QIAquick столбик очищенного продукта ПЦР в 50,0 мкл стерильной воды;
2.3.2. Смешивают компоненты для Taq циклической секвенирующей реакции в 0,2 мл пробирке GeneAmp:
- 5,0 мкл очищенного ПЦР продукта (соответствующего 100-150 нг ДНК);
- 8,0 мкл конечного готового соединения реакции (ABI PRISM краситель конечного цикла секвенирования);
- 2,0 мкл секвенирующих олигонуклеотидных праймеров SEQ ID No: 3 (5 пмоль/мкл);
- 5,0 мкл воды (деминерализованной);
2.3.3. Помещают пробирку в Perkin Elmer GeneAmp 9600 амплификатор и проводят амплификацию по схеме:
- 25 циклов: 96°С, 10 мин;
- 60°С, 4 мин;
- после последнего цикла выдерживают образец при 4°С;
2.3.4. В подготовленную микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл для каждой реакции добавляют следующие компоненты:
- 2,0 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2;
- 50,0 мкл 95% этанола;
2.3.5. Переносят все 20,0 мл содержимого пробирки реакции в пробирки, содержащие раствор этанола. Перемешивают и помещают на лед на 10 мин;
2.3.6. Центрифугируют пробирку при максимальной скорости в микроцентрифуге 15 мин;
2.3.7. Тщательно отбирают раствор этанола пипеткой;
2.3.8. Ополаскивают бусинку, добавляют 250,0 мкл 70% этанола. Центрифугируют пробирку в микроцентрифуге при максимальном ускорении 3 мин. Тщательно отбирают весь раствор спирта;
2.3.9. В вакуумной центрифуге высушивают бусинку 3-5 мин;
2.3.10. Повторно помещают бусинку в 4,0 мкл формамида/50 мМ EDTA (5:1);
2.3.11. Инкубируют в течение 2 мин при 90°С, с последующим помещением на магний и производят секвенирование;
2.3.12. Гель-секвенирование проводят согласно инструкции с помощью Applied Biosystems;
2.3.13. Выполняют исследование флуоресценции на основе программного обеспечения Applied Biosystems.
2.4. ДНК секвенирование:
2.4.1. Для приготовления одноцепочечной ДНК-пробы (используют биотинилированый праймер SEQ ID No: 1) смешивают 20,0 мкл продукта ПЦР реакции (см. Подзаголовок 3.2) и 10,0 мкл Dynabeads M280 streptavidin, используя Dynal MPC-E магнитный сепаратор (по инструкции производителя). Повторно помещают бусинки с одноцепочечной связанной ДНК в 10,0 мл воды;
2.4.2. Смешивают компоненты секвенирования в 1,5 мл реакционной пробирке:
- 2-5 мкл Dynabead-одноцепочечный раствор ДНК (суспензия бусин из шага 1);
- 1,0 мкл праймеров секвенирования SEQ ID No: 4 или SEQ ID No: 5 (3 пмоль/мл) 2,0 мкл буфера секвенирования;
- 1,0 мкл NP 40 (5%);
- доводят водой до объема 10,0 мкл;
2.4.3. Отжиг в течение 20 мин при 37°С на водяной бане;
2.4.4. К отожженному соединению праймера-образца добавляют:
- 1,0 мл 0,1 M DTT;
- 2,0 мл маркерной смеси;
- 2,0 мл секвенсора (растворенного в ТЕ 1:8);
- 0,5 мл α-dCTP (3000 Ci/мМ), растворенной в ТЕ 1:6 (можно готовить смесь на несколько реакций и добавлять ее по 5,5 мл);
2.4.5. Инкубируют 5 мин при комнатной температуре;
2.4.6. 3,0 мкл (аликвота) реакции секвенирования переносят в четыре 1,5 мл пробирки, к которым добавляют 2,5 мл деокси/дидеокси конечного соединения. Каждое соединение содержит 80 мМ dATP, 80 мМ dCTP, 80 мМ dGTP, 80 мМ dTTP и 8 мМ соответствующего дидеоксинуклеотидтрифосфата;
2.4.7. Инкубируют пробирки с конечным соединением в течение 5 мин при 37°C, затем добавляют 4,0 мкл буфера. Необходимо убедиться, что буфер достигает дна пробирок с приостановкой магнитной бусины;
2.4.8. Инкубируют пробирки в течение 5 мин при 75°C и отмывают свежесинтезированные волокна ДНК от бусин;
2.4.9. Используют Dynal MPC-E магнитный сепаратор, чтобы связать бусинки, и загружают 3,0 мкл реакционной смеси (без бусинок) в 6%-ный полиакриламидный гель мочевины - секвенирование;
2.4.10. Проводят секвенирование;
2.4.11. Результаты анализа фиксируют с помощью рентгеновской пленки.
Анализируют данные проведенных исследований путем сравнения определенной последовательности с выравниванием микобактериальных последовательностей, включая гипервариабельный регион А (передающий Е. coli 16S pРНК положение от 129 до 266, см. Фиг.1 и 2) и гипервариабельный регион В (Е. coli 16S pРНК положение от 430 до 497, см. Фиг.3). При этом результаты исследований совпадают с данными таблицы. Из 10 культур патогенных и атипичных микобактерий все были классифицированы со 100% совпадаемостью.
Приложение 2
Для положительной среды ВАСТЕС 13А культуру крови разливают в матрасы, готовят субкультуры, чтобы растворить кровь, или же используют гуанидин изотиоцианат/фенольный способ для подготовки образцов, т.к. оставшиеся компоненты крови затруднят ПЦР.
Необходимо контролировать перекрестные загрязнения с помощью отрицательного контроля. Предотвратить загрязнение предварительно усиленными ПЦР продуктами, используя предосторожности типа физического разделения различных шагов, различные наборы пипеток, свободные от аэрозоля наконечники и ношение отдельных халатов и перчаток в каждой лаборатории.
Биотинилирование праймера SEQ ID No:1 и его ограничение до размера 8 пмоль необходимо только при простом секвенировании.
Все амплификаторы по техническим данным различны и в зависимости от этого изменяются условия амплификации. Контроль правильного выполнения амплификации - последовательные разведения положительного контроля, например, водной микобактериальной суспензии (Mc.Farland, стандарт 0,5). Аликвоты разведений 1:100 могут храниться при -20°С. Каждый раз используется новый растворенный положительный контроль.
Для идентификации культуральных изолятов с использованием простого секвенирования достаточно применения праймера SEQ ID No: 4 для секвенирования региона А. Иногда дополнительно для региона В используют праймер SEQ ID No:5.
Если рибосомальная последовательность изолята не включена в выравнивание (Фиг.1-3), то ищут текущую базу данных последовательностей, например, GenBank. В базе данных GenBank поток 16S pРНК последовательности доступен через электронную почту. Всемирную сеть и на CD-ROM (PC/Gene, IntelliGenetics Inc., Mountain View, CA). "Рибосомальный проект базы данных" обеспечивает различное программное обеспечение и анализ представленных пользователем последовательностей через электронную почту, FTP и Всемирную сеть.
Смешанные микобактериальные инфекции могут определяться присутствием нескольких последовательностей, т.е. одновременным присутствием полос в различных линиях геля секвенирования в ходе простого секвенирования.
Близкие виды М. kansasii и М. gastri показывают идентичную 16S pРНК последовательность; эти два таксона можно различить определением последовательности 16S-23S pРНК региона. М. ulcerans и М. marinum показывают почти идентичную 16S pРНК последовательность гена, но гипервариабельные регионы А и В позволяют дифференцировать эти таксоны между собой. Напротив, М. gordonae показывает видовую рибосомальную изменчивость последовательности внутри региона А. Это открытие геномных разновидностей внутри вида сопоставимо с результатом анализа фермента рестрикции, усиленного hsp-65 фрагментом гена. М. avium имеет одну нуклеотидную последовательность, вариабельную в пределах 16S pРНК гена в положении 135 (позиция, соответствующая Е. coli).