ШТАММ ВИРУСА ЭФЕМЕРНОЙ ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА EPHEMEROVIRUS BOVINUM ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭФЕМЕРНОЙ ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
EPHEMEROVIRUS BOVINUM STRAIN OF BOVINE EPHEMERAL FEVER VIRUS FOR PRODUCING BIOPREPARATIONS FOR DIAGNOSING OF BOVINE EPHEMERAL FEVER VIRUS

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса эфемерной лихорадки (ВЭЛ) крупного рогатого скота (КРС), который может быть использован при разработке и производстве средств диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Эфемерная лихорадка (трехдневная эпизоотическая лихорадка, болезнь тугоподвижности) - остро протекающая вирусная трансмиссивная болезнь КРС, клинически проявляющаяся внезапным повышением температуры тела до (+41°C)÷(+42°C), непродолжительной (1÷5 сут) лихорадкой, воспалением слизистых оболочек, ригидностью и хромотой (1, 2).
Возбудитель - РНК-содержащий вирус из группы рабдовирусов, в естественных условиях передается различного вида кровососущими насекомыми. Болезнь проявляется в теплое влажное время года, в период биологической активности кровососущих насекомых, быстро распространяется и протекает в виде энзоотии и эпизоотии.
В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV), ВЭЛ КРС относится к роду 01.062.0.03. Ephemerovirus, принадлежащему к семейству 01.062. Rhabdoviridae (3).
ВЭЛ КРС имеет пулевидную форму, размер 140×70 нм, полый осевой канал и сходен с вирусами везикулярного стоматита, фландерс, бешентсва и Керн Каньон, также относящихся к семейству рабдовирусов. В отличие от них ВЭЛ не имеет поперечной полосатости и внутренняя структура его вирусной частицы представлена 6-гранной белковой массой, а нуклеиновая кислота 2-нитевая. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа). Гликопротеин G может быть удален из вириона при обработке неионными детергентами, что применяется при изготовлении вакцинных препаратов (4÷6).
Эфемерная лихорадка КРС регистрируется ежегодно в основном в тропических и субтропических зонах (Израиле, Иране, Ираке, Сирии, Индии, Пакистане, Бангладеш, Китае, Японии, Австралии, Африке). Имеются сообщения о заболевании ею в Монголии и Средней Азии (4, 7, 8).
Эфемерная лихорадка КРС наносит значительный ущерб животноводству, обусловленный снижением привесов и молочной продуктивности.
Российская Федерация имеет общие границы с некоторыми из вышеуказанных стран, поэтому не исключена опасность возникновения этого заболевания в южных регионах страны. В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя эфемерной лихорадки КРС и впоследствии быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВЭЛ КРС, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.
Известен ряд штаммов ВЭЛ КРС, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.
50
3
Известен штамм YHL ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и HmLu-1 с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 Ig ТЦД/см и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки (9).
Известен штамм TLRI ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).
50
3
Известен штамм Liu Yin ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 5,6÷6,5 Ig ТЦД/см и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).
Известен штамм ВВ7721 ВЭЛ КРС, выделенный в 1968 г. из крови коровы с клиническими признаками эфемерной лихорадки, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и Vero и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (10-12).
50
3
Известен штамм 919 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС, полученный из полевого изолята в 1978 г. в Квинсленде (Австралия) и репродуцированный в культуре клеток Vero с титром инфекционности 5,3÷5,8 Ig ТЦД/см (13).
50
3
Известен штамм «Монгольский» ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 6,0÷6,5 Ig ТЦД/см и используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС (14).
Известен штамм РТ-1 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки, изолированный в 1990 г. из крови инфицированных коров и адаптированный к культурам клеток ВНК-21 и Vero (15).
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВЭЛ КРС, обладающих высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Указанная задача решена получением штамма «ВНИИЗЖ-М» (авторское наименование) ВЭЛ КРС, используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС.
Для получения ВЭЛ КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали монослойную перевиваемую линию клеток ВНК-21, как высокочувствительную к ВЭЛ КРС. В результате проведения 9 последовательных пассажей изолята на культуре клеток ВНК-21 был получен штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства и пригодный для изготовления сывороток и антигенов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
50
3
Накопление вируса штамма «ВНИИЗЖ-М» в культуре клеток ВНК-21 обеспечивалось на уровне от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД/см.
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС депонирован 21 июня 2007 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП ВЭЛ КРС.
Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:
фиг.1 представлена хроматограмма результатов электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента генома ВЭЛ КРС в 2% агарозном геле после окрашивания бромистым этидием, на которой:
1, 3 дорожка - маркер pUC 19 DNA/Mspl (Hpall) (стрелками указаны длины фрагментов п.н.);
2 дорожка - штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (специфический фрагмент ДНК длиной 460 п.н.);
фиг.2 - электронная микрофотография вирионов производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×50000.
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для семейства Rabdoviridae, рода Ephemerovirus.
Вирионы эфемерной лихорадки имеют пулевидную и конусовидную формы, диаметром 80÷110 нм, длиной 100÷170 нм и состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии, окруженного липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой имеются выступы длиной 5÷10 нм и диаметром 3 нм.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ-М» относится к ВЭЛ КРС.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Vero.
Введение вацинного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ коровам сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:4÷1:16.
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ-М» репродуцируется в монослойных культурах клеток: Vero и перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в которых в течение 2-3 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 Ig ТЦД/см. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 14 пассажей.
Генотаксономическая характеристика
Геном ВЭЛ КРС не обладает инфекционностью и представлен молекулой двухнитевой РНК. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа).
Физические свойства
3
Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. При ультрацентрифугировании в течение 2 ч при 4°С большая часть вируса осаждается при 73000 g.
Устойчивость к внешним факторам
ВЭЛ КРС штамм «ВНИИЗЖ-М» не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например хлороформу (5%), этиловому спирту (20%), трипсину (0,5÷1%). Вирус чувствителен к кислой и щелочной среде, действию ультрафиолетовых лучей. Многократное замораживание и оттаивание не влияют на инфекционный титр вируссодержащего материала.
Дополнительные признаки и свойства
3
Безвредность - при подкожном введении крупному рогатому скоту 5,0 и 20,0 см вируссодержащего материала заболевания не вызывает.
Вирулентность - авирулентен для крупного рогатого скота при подкожном введении.
Стабильность биологических свойств. Сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток ВНК-21 в течение 14 серийных пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 3 пассажей на быках.
Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ-М», был выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС. Подготовку материала проводили общепринятыми методами.
Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, к культуре клеток ВНК-21. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток ВНК-21 высокочувствительна к ВЭЛ и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления антигена.
3
-1
-7
3
-1
-7
В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37±0,5°С. После этого вносили поддерживающую среду Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) культуральные матрасы промораживали при минус 30°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток Vero, выращенной во флаконах в виде 2-суточного монослоя. Для этого содержимое 3 ампул растворяли стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см), тщательно перемешивали и объединяли. Готовили десятикратные разведения вируса на среде ПСП с содержанием 1% сыворотки КРС, начиная с 10 до 10. Затем в четыре флакона с монослоем клеток после удаления ростовой среды вносили по 1 см каждого разведения вируса, начиная с 10 по 10. Во флаконах с контрольной культурой клеток проводили только смену среды.
Флаконы инкубировали при 37±0,5°С, ежедневно просматривая их, начиная с 3 суток, под микроскопом на наличие специфической дегенерации клеток (ЦПД). Смену среды проводили через каждые 3 суток. Окончательный учет результатов проводили через 7 суток после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле. Расчет вели по методу Рида и Менча.
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Титр производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС 8 пассажа составил в среднем 4,6 Ig ТЦД/см в трех повторностях (4,5 Ig ТЦД/см; 4,66 Ig ТЦД/см; 4,66 Ig ТЦД/см), 9 пассажа составил в среднем 5,66 Ig ТЦД/см (5,5 Ig ТЦД/см; 5,5 Ig ТЦД/см; 6,0 Ig ТЦД/см), 14 пассажа - 5,88 Ig ТЦД/см (6,0 Ig ТЦД/см; 5,66 Ig ТЦД/см; 6,0 Ig ТЦД/см). Данные титрования представлены в таблицах 1, 2 и 3.
Пример 2.
Для проведения испытаний на стерильность использовали 20 ампул лиофилизированного производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.
Контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы контроля стерильности».
3
Содержимое ампул разводили водой для инъекций и объединяли по три ампулы. Из каждой пробы препарата по 1 см вносили в 3 пробирки, содержащие тиогликолевую среду, и пробирки инкубировали в течение 14 суток, при этом пробирки №№1 и 2 при 21±1°С, а пробирку №3 при 37±0,5°С. Затем из пробирки №3 делали пересевы:
3
1. По 0,5 см на следующие среды: скошенный казеиновый питательный агар, казеиновый питательный бульон, среда Сабуро (жидкая).
3
2. По 1,0 см на следующие среды: казеиновый питательный бульон под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени, казеиновый агар, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (МППБ), среда Сабуро при 21±1°С.
При испытании производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в течение 14 суток при 37±0,5°С, со средой Сабуро при 21±1°С.
3
3
Для исключения контаминации штамма микоплазмами были сделаны высевы по 0,5 см в 3 пробирки, содержащие по 4,5 смстандартного PPLO-бульона (20% лошадиной сыворотки; 1,47% PPLO-основы; 2,5% аутолизата дрожжей; 0,5% глюкозы; 0,25% аргинина; по 0,01% никотинамида динуклеотида и L-цистеина; 0,05% ацетата таллия; индикатор - феноловый красный). При отсутствии роста микоплазм на жидкой среде в течение 72 ч (сохранение цвета индикатора) проводили два «слепых» пассажа в течение 72 часов каждый, а затем делали высев на среду Каган. Пробирки просматривали визуально в течение 10 дней. При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте исследуемого материала.
В результате проведенных исследований установлено, что производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС свободен от грибов, анаэробных, аэробных, мезофильных бактерий и микоплазм.
Пример 3.
Определение авирулентности, безвредности, реверсибельности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.
3
Содержимое 15 ампул растворяли стерильным физиологическим раствором в объеме, равном объему препарата до лиофилизации, и объединяли. Для определения авирулентности, безвредности и реверсибельности вирус вводили подкожно по 5 см трем быкам.
3
Для определения реверсибельности проводили 3 пассажа на КРС. От первого животного через 5 дней после введения вируса отбирали кровь и в объеме 10 см ее вводили четвертому. От четвертого еще через 5 дней отбирали кровь и в таком же объеме вводили пятому. Ежедневно за животными вели наблюдение и проводили термометрию.
Через 21 день после введения вируса у животных брали пробы крови для определения наличия антител к ВЭЛ КРС.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таким образом, производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС не вызывает заболевание и гибель животных, является авирулентным, безвредным и нереверсибельным.
Пример 4.
Определение специфичности, антигенной и иммуногенной активности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.
3
3
50
Антигенную активность вакцинного штамма определяли на четырех быках. Вирус вводили подкожно в область шеи в объеме 5 смв дозе 5,5 Ig ТЦД/см.
До введения вируса (нулевые пробы) и через 21 день после введения вакцинного штамма у животных брали кровь для определения в сыворотке крови титра вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител. За животными вели ежедневное клиническое наблюдение в течение 21 суток с измерением температуры тела.
50
3
Вируснейтрализующую активность антител сывороток крови определяли в РН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с активностью 2,0 Ig ТЦД/см. Смеси вируса с сывороткой выдерживали в течение 1 часа при температуре 37,0°С, после чего ими инфицировали клеточную культуру Vero (по 4 флакона с культурой клеток на каждое разведение сыворотки). Флаконы с культурой клеток инкубировали при температуре 37±1°С в стационарном положении в течение 7 суток со сменой среды через 3-4 суток. За титр антител в сыворотке принимали наибольшее ее разведение, в котором подавлялось развитие ЦПД не менее чем в половине зараженных пробирок с культурой клеток.
При постановке РН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5. Титр вируснейтрализующих антител находился в пределах 1:8÷1:16.
Комплементсвязывающую активность сывороток крови животных определяли в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) общепринятым методом. С этой целью готовили двукратные разведения сыворотки крови КРС на физиологическом растворе рН 7,6.
Специфичность вируса подтвердили в РН и РДСК с типоспецифической сывороткой крови на ВЭЛ КРС, а также с использованием гетерогенных сывороток крови против вируса бешенства, чумы КРС и оспы овец.
3
Методом контрольного заражения КРС, иммунизированного вакциной из штамма ЭЛ «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС в дозах 1,0; 5,0 и 20,0 подкожно, через 21 день после вакцинации установлено, что вакцина защищала животных от заболевания при введении в дозах 5,0 и 20,0 см. Титры антител в крови животных были в РН 1:4÷1:16, а в РДСК 1:10, а после заражения 1:20 (таблицы 6 и 7).
Пример 5.
Контроль производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС на специфичность и отсутствие контаминации чужеродными вирусами
50
3
Для исследования была использована вируссодержащая суспензия с инфекционным титром 6,0 Ig ТЦД/см.
Специфичность исследуемого вируса подтверждали с помощью метода ПЦР. В работе использовали праймеры F1, 460R (Hsieh Y.-C. 2006), позволяющие амплифицировать фрагмент гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС. Анализ продуктов реакции осуществляли после 40 циклов (денатурация 94°С 30 с, отжиг праймеров 55°С 30 с и элонгация 72°С 1 мин). Результаты исследований представлены на фиг.1.
В результате проведения ПЦР с праймерами F1, 460R фрагмента гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС получен фрагмент размером около 460 п.н., что соответствует расчетному размеру.
С использованием метода ПЦР были проведены исследования по выявлению в исследуемом материале вируса инфекционного ринотрахеита, вируса парагриппа-3, вируса диареи и ротавируса КРС.
Последовательностей, специфичных для указанных вирусов, не обнаружено.
Сыворотки крови КРС, зараженного ВЭЛ КРС, были исследованы с помощью метода иммуноферментного анализа (набор для выявления антител к вирусу болезни Ауески фирмы IDEXX Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit) на наличие антител к вирусу болезни Ауески до и через 21 день после заражения. Сыворотки крови КРС не содержали антител к гетерологичному вирусу.
ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М», негативно контрастированный при помощи 4% фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) с рН=6,8, представлен вирионами сложного строения, состоящими из нуклеокапсида, окруженного гликопротеиновой оболочкой пулевидной и конусовидной формы диаметром 80÷110 нм и длиной 100÷170 нм. Кроме указанных форм частиц в препарате содержались частицы неправильной формы.
Электронно-микроскопическим методом подтверждена принадлежность штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС к семейству Rabdoviridae, роду Ephemerovirus. Наличие контаминации штамма вируса ЭЛ КРС чужеродными агентами (вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами) не установлено. Результаты исследований представлены на фиг.2.
Полученный штамм депонирован 21 июня 2007 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП ВЭЛ КРС.
Пример 6
Получение антигена ВЭЛ КРС.
3
3
50
Для приготовления антигена для диагностических целей содержимое 3-х ампул ВЭЛ штамма «ВНИИЗЖ-М» растворяют стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см), тщательно перемешивают и объединяют. Трехсуточную культуру клеток ВНК-21 монослойной (шведской) линии, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражают в дозе 0,1÷1,0 Ig ТЦД/см. Матрасы помещают на 1 час в термостат для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносят поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубируют при 37±0,5°С до появления ЦПД вируса, которое характеризуется округлением клеток, их скоплением и в дальнейшем разрушением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергают двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.
3
Полученную вирусную суспензию используют в качестве матровой расплодки, которой заражают клинские матрасы с культурой клеток ВНК-21, и, как описано выше, получают 11÷12 пассаж вируса. При появлении ЦПД на 70÷80% площади монослоя, сливают ростовую среду, оставляя около 20 см, и стерильным резиновым шпателем отделяют инфицированный слой клеток от стекла в культуральную жидкость.
3
Концентрирование антигена ВЭЛ осуществляют отделением клеточной фракции путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют физиологическим раствором из расчета 1 см на каждый матрас, что соответствует двухсоткратной концентрации вируса. Полученный концентрат подвергают двукратному промораживанию при минус 20°С и оттаиванию.
Полученный данным способом антиген используют в серологических реакциях для определения уровня антител к ВЭЛ, а также для изготовления диагностических сывороток.
Результаты исследований, приведенные в таблице 8, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 6, получен антиген, который является специфичным, что подтверждено их тестированием с гомологичными и гетерологичными сыворотками.
Пример 7
Получение гипериммунной сыворотки.
Для приготовления диагностических сывороток крови используют очищенный и концентрированный препарат антигена ВЭЛ КРС из штамма «ВНИИЗЖ-М».
Очистку антигена проводят в два этапа: на первом этапе используют 20%-ный раствор сахарозы, на втором - градиент плотности сахарозы (5%, 10%, 15%, 20% и 25% растворы). В обоих случаях соотношение вирусного материала и сахарозы должно составлять 3:1 соответственно. Первоначально вирусный материал очищают центрифугированием через 20% раствор сахарозы в течение 1,5 часов при 20000 об/мин. Полученный осадок растворяют в физиологическом растворе до первоначального объема исходного материала и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы при 20000 об/мин в течение 2 ч. Образовавшийся осадок ресуспендируют в минимальном объеме физиологического раствора и используют в дальнейшем в качестве антигена для иммунизации животных.
Получение гипериммунной сыворотки КРС.
3
3
Иммунизируют животных четырехкратно. После первого введения антигена иммунизацию проводят на 21, 28 и 35 дни с интервалом в 7 дней между инъекциями. Для иммунизации используют 2 см антигена с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 внутримышечно либо 1 см антигена с содержанием 0,25 мг сапонина подкожно. Через 7 дней после последней иммунизации отбирают кровь для получения сыворотки. Проверку проб сыворотки крови проводят на активность и специфичность в РДСК с набором специфических и гетерологичных антигенов. Результаты исследований приведены в таблице 9. Для составления серийного перпарата используют сыворотки крови, активность которых со специфическим антигеном в РДСК не ниже 1:20, а с гетерологичным антигеном они должны быть неактивны. Сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.
Получение гипериммунной сыворотки на кроликах.
Для получения специфической сыворотки ВЭЛ КРС на кроликах используют клинически здоровых животных средней упитанности массой 2,5-3,0 кг. Животных иммунизируют четырехкратно с интервалом в 7 дней.
3
3
3
3
3
3
При первой иммунизации очищенный и концентрированный антиген вводят в объеме 1,0 см в подушечки задних лап, при второй - 2,0 см в область подколенных лимфоузлов, при третьей - внутримышечно в бедро задней ноги 0,5 см антигена и 0,5 смполного адъюванта Фрейнда, при четвертой - 0,5 см антигена и 0,5 см неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины в несколько точек.
3
3
3
3
3
3
Возможна и следующая схема иммунизации: кроликам аналогичным способом вводят при первой иммунизации 0,5 см антигена и 0,5 см полного адъюванта Фрейнда, при второй - 1,0 смантигена и 1,0 см неполного адъюванта Фрейнда, при третьей и четвертой - 0,5 см антигена и 0,5 см неполного адъюванта Фрейнда.
3
Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливают и получают сыворотку крови. Сыворотки крови фасуют в ампулы по 1,0 см, лиофильно высушивают. Препараты сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.
Данные, представленные в таблицах 9, 10 и 11, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 7, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.
Полученные гипериммунные сыворотки крови КРС и кроликов были использованы для определения в РДСК специфической активности культурального производственного штамма ВЭЛ «ВНИИЗЖ-М» и для ретроспективной диагностики: определения уровня антител в крови животных, переболевших эфемерной лихорадкой, титр антител в крови которых был в пределах 1:5÷1:40.
При гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов концентрированным и очищенным антигеном вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота с адъювантом Фрейнда получена специфическая сыворотка крови с активностью 1:80 и 1:160 соответственно, которая может быть использована в РДСК для определения активности специфического антигена и ретроспективной диагностики заболевания КРС эфемерной лихорадкой.
Источники информации
1. Курченко Ф.П., Гононов Ю.М., Хлыбова Т.В., Зайцев В.Л., Кекух И.Г., Пасечников Л.Н., Алехин А.Ф. и Вяткина Н.В. Выделение и идентификация вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота. Ветеринария, 1991, 2,26÷28.
2. OIE. Bovine ephemeral fever. Ames. Jowa State Univ., 2005.
3. http://www.ictvdb.org/lctv/fs rhabd.htm.
4. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - с.319÷323.
5. Nandi S., Negi B.S. Bovine ephemeral fever: a review // Comparative Immunol., Microbiol. and Infectious Diseases. - 1999. - N 22. - P.81÷91.
6. Walker P.J. Bovine ephemeral fever virus // Encyclopedia of Virology, Third ed. - 2008. - P.354÷362.
7. Диев В.И., Назаров А.С. и Соколов Л.Н. Клинические признаки эфемерной лихорадки крупного рогатого скота при экспериментальном заражении // Тез. докл. 4-ой Межгосуд. конф. по научн. и приклад. проблемам 21÷23.10.1993 г., Киев, 1993.
8. George T.D. Studies on the pathogenesis of bovine ephemeral fever in sentinel cattle. Vet Microbiol., 1985, 10, 6, 493÷504.
9. Chiu S.Y., Lu Y.S. The serological study on bovine ephemeral fever in Taiwan in 1984 // Journal of the Chinese Society Veterinary Science. - 1986. - Vol.12. - P.289÷296.
10. Walker P.J. et al. Proteins of bovine ephemeral fever virus // J. Gen. Virol. - 1991. N 72. - P.67÷74.
11. Walker P.J. et al. The genome of ephemeral fever Rhabdovirus contains two related Glycoprotein genes // J. Virol. - 1992. - N 191. - P.49÷61.
12. Zakrzewsky H., Cybinski D.H., Walker P.J. A blocking ELISA for the detection of specific antibodies to bovine ephemeral fever virus // J. Immunol. Methodes. - 1992. - N 151. - P.289÷297.
13. Vanselow B.A., Walthall J.C., Abetz I. Field trials of ephemeral fever vaccines//Vet. Microbiol. - 1995. - N 46. - P.117÷130.
14. Диев В.И., Назаров А.С., Захаров В.М. и соавт. Экспериментальные исследования по изучению клиники эфемерной лихорадки крупного рогатого скота и получению диагностических препаратов // Вирусные и микробные болезни сельскохозяйственных животных: сб. научн. труд. - Владимир, 1995. - С.128÷131.
15. Chang C.J. et al. Apoptosis induced by bovine ephemeral fever virus // J. Virol. Methodes. - 2004. - Vol.122, №2. - P.165÷170.
Таблица 1
Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 8 пассаж от 03.1993 г.
Повторность титрования
Разведение вируса
Титр вируса, Ig ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
10<sup>-1</sup>
10<sup>-2</sup>
10<sup>-3</sup>
10<sup>-4</sup>
10<sup>-5</sup>
10<sup>-6</sup>
10<sup>-7</sup>
№1
++++
++++
++++
++++
----
----
----
4,5
№2
++++
++++
++++
++++
+---
+---
----
4,66
№3
++++
++++
++++
++++
+---
+---
----
4,66
Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе.
Таблица 2
Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 9 пассаж от 03.2007 г.
Повторность титрования
Разведение вируса
Титр вируса, Ig ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
10<sup>-1</sup>
10<sup>-2</sup>
10<sup>-3</sup>
10<sup>-4</sup>
10<sup>-5</sup>
10<sup>-6</sup>
10<sup>-7</sup>
№1
++++
++++
++++
++++
++++
----
----
5,5
№2
++++
++++
++++
++++
++++
----
----
5,5
№3
++++
++++
++++
++++
++++
++--
----
6,0
Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе.
Таблица 3
Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 14 пассаж от 04.2007
Повторность титрования
Разведение вируса
Титр вируса, Ig ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
10<sup>-1</sup>
10<sup>-2</sup>
10<sup>-3</sup>
10<sup>-4</sup>
10<sup>-5</sup>
10<sup>-6</sup>
10<sup>-7</sup>
№1
++++
++++
++++
++++
++++
++--
----
6,0
№2
++++
++++
++++
++++
++++
+---
----
5,66
№3
++++
++++
++++
++++
++++
++--
----
6,0
Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе.
Таблица 4
Результаты исследования авирулентности, безвредности и реверсибельности штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС
№ п/п
Возраст быков (мес.)
Хар-ка материала
Клинические признаки
1
18
Культуральный вирус в объеме 5 см<sup>3</sup>
Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали.
2
14
Культуральный вирус в объеме 5 см<sup>3</sup>
Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали.
3
14
Культуральный вирус в объеме 5 см<sup>3</sup>
Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали.
4
18
Гепаринизированная кровь в объеме 10 см<sup>3</sup>
Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали.
5
18
Гепаринизированная кровь в объеме 10 см<sup>3</sup>
Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали.
Примечание: титр культурального вируса - 5,5 Ig ТЦД<sub>50/см</sub> <sup>3</sup>
Таблица 5
Результаты исследования антигенной активности штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС
№ животного
Вид и возраст
Титр вируснейтрализующих антител (дни)
До имунизации
7
14
21
1
бык 18 мес.
н/а
н/а
1:4
1:8
2
бык 14 мес.
н/а
н/а
1:4
1:8
3
бык 14 мес.
н/а
1:2
1:4
1:16
Таблица 6
Результаты контроля напряженности иммунитета КРС после иммунизации вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС
№№ КРС
Иммунизация в дозе (см<sup>3</sup>)
Титр антител в крови в РН на 21 день после вакцинации
Температура тела (дни после заражения)
0 день
5
6
7
8
1
20 внутривенно
1:16
N
N
N
N
2
5,0 подкожно
1:8
N
N
N
N
3
5,0 подкожно
1:8
N
N
N
N
4
1,0 подкожно
1:4
41,2*
41,0*
40,5*
N
5
контроль
-
41,6*
41,2*
40,2*
N
N - показатели в пределах физиологической нормы;* - наличие клинических признаков;- - отсутствие антител.
Таблица 7
Динамика антител в крови КРС после иммунизации и контрольного заражения вирулентной кровью КРС
№№ КРС
Титры антител в РДСК
дни после вакцинации
14 дней после заражения
14
21
1
1:10
1:10
1:20
2
1:10
1:10
1:20
3
-
-
1:10
4
-
-
1:20
5
-
-
1:10
Таблица 8
Активность антигена ВЭЛ КРС
Материал
Титр
инфекционной активности, Ig ТДЦ<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
в РДСК
Исходный вирус
5,5±0,14
1:4
Нативный вирус
6,0±0,03
1:8
Антиген
8,5±0,15
1:320
Таблица 9
Специфическая активность сыворотки крови после иммунизации крупного рогатого скота ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М»
Метод иммунизации
Титры антител после иммунизации в РДСК
1-ой
2-ой
3-ей
4-ой
1,0 см<sup>3</sup> антигена + 0,25 мг сапонина подкожно
1:30
1:30
1:40
1:60
1,0 см<sup>3</sup> антигена + 1,0 см<sup>3 </sup>адъюванта Фрейнда* внутримышечно
1:30
1:40
1:80
1:80
* - при первой иммунизации использовали полный адъювант Фрейнда, а при следующих - неполный
Таблица 10
Специфическая активность сыворотки крови после гипериммунизации кроликов антигеном ВЭЛ КРС
№№ группы животных
Метод иммунизации
Титр антител в РДСК
в подушечки задних лап
в область подколенных лимфоузлов
в бедро задней лапы внутримышечно
в область спины подкожно
1
1,0 см<sup>3</sup> Аг*
2,0 см<sup>3</sup> Аг*
0,5 см<sup>3</sup> Аг* + 0,5 см<sup>3 </sup>полного адъюванта Фрейнда
0,5 см<sup>3</sup> Аг* + 0,5 см<sup>3 </sup>неполного адъюванта Фрейнда
1:160
2
0,5 см<sup>3</sup> Аг*+0,5 см<sup>3</sup> полного адъюванта Фрейнда
1,0 см<sup>3</sup> Аг*+1,0 см<sup>3</sup> неполного адъюванта Фрейнда
0,5 см<sup>3</sup> Аг* + 0,5 см<sup>3 </sup>неполного адъюванта Фрейнда
0,5 см<sup>3</sup> Аг* + 0,5 см<sup>3 </sup>неполного адъюванта Фрейнда
1:80
* Аг - специфический антиген ВЭЛ КРС
Таблица 11
Активность гипериммунной сыворотки крови против ЭЛ с гетерологичными антигенами
Антиген
Активность в РДСК
сывороток КРС
сывороток кроликов
Гомологичный ВЭЛ
1:60
1:80
1:80
1:160
Антигены ящурные штаммоспецифические сухие для серологических реакций ТУ 9388-006-00495527-99
н/а
н/а
н/а
н/а
Набор препаратов для диагностики чумы КРС методами РСК и РДП ТУ 9388-073-00495527-01
н/а
н/а
н/а
н/а
н/а - сыворотка крови неактивна