УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ КАССЕТА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИИЯ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ IN VITRO И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
ADVANCED CASSETTE FOR IN VITRO DIAGNOSTICS AND ITS APPLICATION METHOD

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Нижеследующие патентные заявки, описания которых включены сюда посредством ссылки, полагаются относящимися к предмету изобретения согласно данной заявке:
заявка № 249856 на патент Израиля, поданная 29 декабря 2016 г. под названием “AN ELECTROPHERETIC CHIP FOR ELECTROPHORETIC APPLICATIONS” (“Электроферетический чип для электрофоретических приложений”); и
заявка № 249857 на патент Израиля, поданная 29 декабря 2016 г. под названием “AN ELECTROPHERETIC CHIP FOR ELECTROPHORETIC APPLICATIONS”.
Нижеследующая патентная заявка, описание которой включено сюда посредством ссылки и на приоритет которой настоящим выдвигаются притязания, также полагаются относящейся к предмету изобретения согласно данной заявке:
заявка по Договору о патентной кооперации PCT/IL2017/051398, поданная 28 декабря 2017 под названием “CARTRRIDGE USE IN IN VITRO DIAGNISTICS AND METHOD FOR USE THEREOF” («Применение кассеты в диагностике in vitro и способ ее применения»).
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к диагностике in vitro в целом.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В данной области техники известны различные устройства и способы диагностики in vitro.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении предпринимается попытка разработать кассету и усовершенствованный способ диагностики in vitro.
Так, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения предложена кассета для применения в диагностике in vitro, включающая в себя корпус кассеты, элемент кассеты, расположенный внутри корпуса кассеты и ограничивающий множество рабочих объемов, причем, по меньшей мере, некоторые из множества рабочих объемов взаимно выровнены линейно, переносчик растворов текучих сред, работающий, перенося растворы текучих сред, по меньшей мере, из одного из множества рабочих объемов, по меньшей мере, в один другой из множества рабочих объемов, причем переносчик растворов текучих сред включает в себя линейно перемещаемый переносящий элемент, работающий, последовательно сообщаясь с внутренними пространствами указанных, по меньшей мере, некоторых из множества рабочих объемов, и полость, включающую в себя линейно перемещаемый вентилирующий элемент, работающий во взаимодействии с переносчиком растворов текучих сред для вентиляции, по меньшей мере, одного из множества рабочих объемов.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения также предложена кассета для применения в диагностике in vitro, включающая в себя корпус кассеты, элемент кассеты, расположенный внутри корпуса кассеты и ограничивающий множество рабочих объемов, переносчик растворов текучих сред, работающий, перенося растворы текучих сред, по меньшей мере, из одного из множества рабочих объемов, по меньшей мере, в один другой из множества рабочих объемов и, по меньшей мере, одну перегородку, которая герметично сообщается, по меньшей мере, с некоторыми из множества рабочих объемов.
Указанная, по меньшей мере, одна перегородка предпочтительно включает в себя множество перегородок. В дополнительном или альтернативном варианте указанная, по меньшей мере, одна перегородка выполнена с возможностью пронизывания пронизывающим элементом.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения дополнительно предложена кассета для применения в диагностике in vitro, включающая в себя корпус кассеты, ограничивающий множество рабочих объемов, и переносчик растворов текучих сред, работающий, перенося растворы текучих сред, по меньшей мере, из одного из множества рабочих объемов, по меньшей мере, в один другой из множества рабочих объемов, при этом конфигурация, по меньшей мере, одного из множества рабочих объемов такова, что его внутреннее пространство может находиться в магнитной связи, по меньшей мере, с одним магнитом, находящимся снаружи него.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения переносчик растворов текучих сред включает в себя линейно перемещаемый переносящий элемент, работающий, последовательно сообщаясь с внутренними пространствами указанных, по меньшей мере, некоторых из множества рабочих объемов. В дополнительном или альтернативном варианте переносчик растворов текучих сред включает в себя узел привода потока текучей среды, сообщающийся с линейно перемещаемым переносящим элементом.
Линейно перемещаемый переносящий элемент предпочтительно включает в себя полую иглу. В дополнительном или альтернативном варианте кассета для применения в диагностике in vitro включает в себя также гибкую трубку, взаимно соединяющую узел привода потока текучей среды с линейно перемещаемым переносящим элементом.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения корпус кассеты включает в себя первый и второй внешние участки корпуса, которые шарнирно соединены друг с другом и, по меньшей мере, частично огораживают элемент кассеты.
Полость предпочтительно включает в себя узел иглы, который взаимодействует с множеством рабочих объемов.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения кассета для применения в диагностике in vitro включает в себя также подузел для введения пробы, сообщающийся, по меньшей мере, с одним из множества рабочих объемов. В дополнительном или альтернативном варианте множество рабочих объемов включает в себя большое количество рабочих объемов, конфигурация, по меньшей мере, некоторых из которых обеспечивает возможность впрыскивания в них растворов текучих сред.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения кассета для применения в диагностике in vitro включает в себя также микрофлюидную матрицу для полимеразной цепной реакции (ПЦР), установленную внутри корпуса кассеты. В дополнение к этому, по меньшей мере, один из множества рабочих объемов ограничивает внутренний проходной канал к порту микрофлюидной матрицы для ПЦР.
Кассета для применения в диагностике in vitro предпочтительно включает в себя также матрицу датчиков, установленную внутри корпуса кассеты. В дополнение к этому, по меньшей мере, один из множества рабочих объемов ограничивает внутренний проходной канал к порту матрицы датчиков. В дополнительном или альтернативном варианте, матрица датчиков сообщается, по меньшей мере, с одним из множества рабочих объемов, работающим в качестве объема для сбора отходов.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения кассета для применения в диагностике in vitro включает в себя также первое множество мест нахождения переносчика растворов текучих сред, соответственно сообщающихся, по меньшей мере, с некоторыми из множества рабочих объемов. В дополнение к этому, кассета для применения в диагностике in vitro включает в себя также второе множество мест нахождения вентилирующих элементов, соответственно сообщающихся с указанными, по меньшей мере, некоторыми из множества рабочих объемов.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения дополнительно предложен еще способ для применения в диагностике in vitro, включающий: обеспечение кассеты, имеющей множество рабочих объемов, причем, по меньшей мере, некоторые из множества рабочих объемов взаимно выровнены линейно; переносят растворы текучих сред, по меньшей мере, из одного из множества рабочих объемов, по меньшей мере, в один другой из множества рабочих объемов, при этом перенос растворов текучих сред заключается в том, что линейно перемещают переносящий элемент, последовательно обеспечивая сообщение с внутренними пространствами указанных, по меньшей мере, некоторых из множества рабочих объемов; и вентилируют указанный, по меньшей мере, один из множества рабочих объемов.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос предусматривает также приведение растворов текучих сред в движение посредством переносящего элемента между одними из множества рабочих объемов.
Перенос растворов текучих сред предпочтительно включает перенос растворов текучих сред, содержащих клеточный материал, в микрофлюидную матрицу для ПЦР, установленную внутри кассеты. В дополнение к этому, перенос растворов текучих сред также предусматривает перенос растворов текучих сред, содержащих клеточный материал, из микрофлюидной матрицы для ПЦР к матрице датчиков, связанной с кассетой.
Способ предпочтительно предусматривает также впрыскивание материала в некоторые из множества рабочих объемов перед подачей в них клеточного материала.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос растворов текучих сред предусматривает: расположение разрушающего клеточную мембрану материала в первом рабочем объеме; расположение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с первым рабочим объемом; всасывание, по меньшей мере, некоторой порции разрушающего клеточную мембрану материала в полую иглу; линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение со вторым рабочим объемом, имеющим заключенную в нем пробу, и осуществляемое неоднократно всасывание пробы и, по меньшей мере, части разрушающего клеточную мембрану материала в полую иглу и исторжение пробы и разрушающего клеточную мембрану материала из полой иглы во второй рабочий объем, тем самым смешивая пробу и разрушающий клеточную мембрану материал.
Перенос растворов текучих сред предпочтительно предусматривает дополнительно: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с третьим рабочим объемом, содержащим раствор для лизиса клеток и магнитные шарики; всасывание, по меньшей мере, порции раствора для лизиса клеток и магнитных шариков в полую иглу с введением во взаимодействие с пробой и разрушающим клеточную мембрану материалом и всасывание повторно пробы, по меньшей мере, части разрушающего клеточную мембрану материала, раствора для лизиса клеток и магнитных шариков в полую иглу; и исторжение пробы, указанной, по меньшей мере, части разрушающего клеточную мембрану материала, раствора для лизиса клеток и магнитных шариков из полой иглы в третий рабочий объем, тем самым высвобождая нуклеиновые кислоты из пробы и связывая нуклеиновые кислоты с магнитными шариками.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос растворов текучих сред дополнительно предусматривает: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с четвертым рабочим объемом, содержащим буфер для промывки; всасывание, по меньшей мере, порции буфера для промывки в полую иглу с введением во взаимодействие с магнитными шариками вместе со связанными с ними нуклеиновыми кислотами; и повторное всасывание буфера для промывки и магнитных шариков вместе со связанными с ними нуклеиновыми кислотами в полую иглу, тем самым смывая клеточный детрит и несвязанные нуклеиновые кислоты с магнитных шариков.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос растворов текучих сред дополнительно предусматривает: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с пятым рабочим объемом, содержащим элюирующий буфер; всасывание, по меньшей мере, порции элюирующего буфера в полую иглу с введением во взаимодействие с магнитными шариками вместе со связанными с ними нуклеиновыми кислотами; и повторное всасывание элюирующего буфера и магнитных шариков вместе со связанными с ними нуклеиновыми кислотами в полую иглу, тем самым выводя нуклеиновые кислоты из взаимодействия с магнитными шариками.
Перенос растворов текучих сред предпочтительно предусматривает дополнительно: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с шестым рабочим объемом, имеющим, по меньшей мере, один размещенный рядом с ним магнит; перенос элюирующего буфера и магнитных шариков вместе с выведенными из взаимодействия с ними нуклеиновыми кислотами в шестой рабочий объем, причем указанный, по меньшей мере, один магнит притягивает магнитные шарики; и всасывание элюирующего буфера вместе с нуклеиновыми кислотами в полую иглу.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос растворов текучих сред дополнительно предусматривает: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с седьмым рабочим объемом, который сообщается с микрофлюидной матрицей для ПЦР; перенос элюирующего буфера и нуклеиновых кислот в микрофлюидную матрицу для ПЦР, причем микрофлюидная матрица для ПЦР генерирует амплифицированные нуклеиновые кислоты путем амплификации нуклеиновых кислот; всасывание амплифицированных нуклеиновых кислот в полую иглу; линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с восьмым рабочим объемом, содержащим буфер для разбавления; всасывание буфера для разбавления в полую иглу с введением во взаимодействие с амплифицированными нуклеиновыми кислотами; и повторное всасывание буфера для разбавления и амплифицированных нуклеиновых кислот в полую иглу, тем самым генерируя разбавленные нуклеиновые кислоты.
Перенос растворов текучих сред предпочтительно предусматривает дополнительно: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с девятым рабочим объемом, который сообщается с матрицей датчиков; перенос, по меньшей мере, первой порции разбавленных нуклеиновых кислот в матрицу датчиков, тем самым промывая матрицу датчиков, а после этого - перенос второй порции разбавленных нуклеиновых кислот с введением в оперативное взаимодействие с матрицей датчиков.
Перенос растворов текучих сред предпочтительно предусматривает дополнительно: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с десятым рабочим объемом, который содержит концентрированный дискриминатор; всасывание концентрированного дискриминатора в полую иглу; линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с одиннадцатым рабочим объемом, который содержит буфер дискриминатора; всасывание буфера дискриминатора в полую иглу с введением во взаимодействие с концентрированным дискриминатором; повторное всасывание буфера дискриминатора и концентрированного дискриминатора в полую иглу и исторжение буфера дискриминатора и концентрированного дискриминатора из полой иглы в одиннадцатый рабочий объем, тем самым генерируя разбавленный дискриминатор; всасывание разбавленного дискриминатора в полую иглу; линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с девятым рабочим объемом, который сообщается с матрицей датчиков; и перенос разбавленного дискриминатора с введением в оперативное взаимодействие с матрицей датчиков.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос растворов текучих сред дополнительно предусматривает: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с двенадцатым рабочим объемом, который содержит буфер для восстановления репортера; всасывание буфера для восстановления репортера в полую иглу; повторное всасывание буфера для восстановления репортера в полую иглу и исторжение буфера для восстановления репортера из полой иглы в двенадцатый рабочий объем через тринадцатый рабочий объем, содержащий высушенный репортер, тем самым генерируя восстановленный репортер; всасывание восстановленного репортера в полую иглу; линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с девятым рабочим объемом, который сообщается с матрицей датчиков; и перенос восстановленного репортера с введением в оперативное взаимодействие с матрицей датчиков.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения перенос растворов текучих сред дополнительно предусматривает: линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с четырнадцатым рабочим объемом, который содержит буфер для промывки матрицы; всасывание буфера для промывки матрицы в полую иглу; линейное перемещение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с девятым рабочим объемом, который сообщается с матрицей датчиков; и перенос буфера для промывки матрицы с введением в оперативное взаимодействие с матрицей датчиков.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Понять и оценить данное изобретение в полной мере можно будет из нижеследующего подробного описания, при этом:
на фиг.1A—1H представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади кассеты, сконструированной и работающей в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения;
на фиг.2 представлено упрощенное наглядное изображение кассеты согласно фиг.1 в открытой ориентации перед герметизацией кассеты;
на фиг.3A, 3B и 3C представлены упрощенные соответственные изображения узла сердцевины, применяемого в варианте осуществления согласно фиг.2, при этом на фиг.3А представлено наглядное изображение узла сердцевины, а на фиг.3B и 3C представлены двумерные изображения соответственных противоположных сторон основания этого узла;
на фиг.4A—4H представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади узла сердцевины с расширенными функциональными возможностями, который можно использовать в кассете согласно фиг.1A—2 со внесением подходящих модификаций в корпус кассеты;
на фиг.5 представлено упрощенное изображение в разобранном виде узла сердцевины согласно фиг.4A—4H;
на фиг.6A—6H представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади микрофлюидного основания узла сердцевины согласно фиг.4A—5;
на фиг.7 представлено упрощенное изображение в разобранном виде узла верхней крышки, образующего часть узла сердцевины согласно фиг.4A—5;
на фиг.8A—8H представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади основного участка узла верхней крышки согласно фиг.7, образующего часть узла сердцевины согласно фиг.4A—5;
на фиг.9A—9E представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади и сверху/снизу и перспективные изображения спереди и сзади первой наформовываемой перегородки узла верхней крышки согласно фиг.7;
на фиг.10A—10H представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади второй наформовываемой перегородки узла верхней крышки согласно фиг.7;
на фиг.11A—11F представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху/снизу и сбоку и перспективные изображения спереди и сзади герметизирующей заглушки порта отбора проб узла верхней крышки согласно фиг.7;
на фиг.12A—12D представлены упрощенные изображения, иллюстрирующие четыре типичные стадии введения пробы в оперативное взаимодействие с узлом сердцевины согласно фиг.4A—11F;
на фиг.13A—13G представлены упрощенные изображения типичных дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A - 11F, при этом на фиг.13А показано рабочее состояние, соответствующее показанному согласно фиг.12D, на фиг.13A—13G показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A - 6H, а на фиг.13B - 13G показано оперативное взаимодействие с его камерой В1 и с его камерой для приема проб;
на фиг.14A—14E представлены упрощенные изображения типичных дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.14А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.13G, при этом на фиг.14A—14E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B2;
на фиг.15A—15E представлены упрощенные изображения других осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.15А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.14E, при этом на фиг.15A—15E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B3;
на фиг.16A—16E представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.16А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.15E, при этом на фиг.16A—16E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B4;
на фиг.17A—17E представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.17А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.16E, при этом на фиг.17A—17E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B5;
на фиг.18A—18D представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.18А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.17E, при этом на фиг.18A—18D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B6;
на фиг.19A—19D представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.19А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.18D, при этом на фиг.19A—19D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A3;
на фиг.20A—20D представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.20А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.19D, при этом на фиг.20A—20D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B7;
на фиг.21A—21E представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.21А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.20D, при этом на фиг.21A—21E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его подсистемой ПЦР-амплификации;
на фиг.22A—22G представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.22А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.21E, при этом на фиг.22A—22G показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B8;
на фиг.23A и 23B представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.23А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.22G, при этом на фиг.23A и 23B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A4;
на фиг.24A—24F представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.24А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.23B, при этом на фиг.24A—24F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A - 6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B10 и с его матрицей датчиков;
на фиг.25A и 25B представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.25А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.24F, при этом на фиг.25A и 25B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A5;
на фиг.26A—26F представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A— 2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.26А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.25B, при этом на фиг.26A—26F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B10 и с его матрицей датчиков;
на фиг.27A и 27B представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.27А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.26F, при этом на фиг.27A и 27B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A6;
на фиг.28A—28F представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.28А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.27B, при этом на фиг.28A—28F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B10 и с его матрицей датчиков;
на фиг.29A и 29B представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.29А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.28F, при этом на фиг.29A и 29B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A7;
на фиг.30A—30F представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.30А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.29B, при этом на фиг.30A—30F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B10 и с его матрицей датчиков;
на фиг.31A—31F представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.31А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.30F, при этом на фиг.31A—31F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B9 и с его матрицей датчиков; и
на фиг.32A—32D представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.32А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.31F, при этом на фиг.32A—2D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B13 и с его матрицей датчиков.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Обратимся теперь к фиг.1A—1H, где представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади кассеты, сконструированной и работающей в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения, и к фиг.2, где представлено упрощенное наглядное изображение кассеты согласно фиг.1 в открытой ориентации перед герметизацией кассеты.
Как видно на фиг.1A—1H и 2, предложена кассета 100, имеющая первый и второй двумерные участки 102 и 104, которые в предпочтительном варианте шарнирно соединены друг с другом посредством шарнира 106, выполненного как единое целое с ними.
Первый двумерный участок 102, внешняя поверхность 108 которого видна, в частности, на фиг.1A и 1G, предпочтительно является в целом двумерным, в целом прямоугольным элементом и включает в себя первый, второй и третий вырезы, соответственно обозначенные позициями 112, 114 и 116, на его верхнем краю 118, которые взаимодействуют с аналогично разнесенными вырезами на втором двумерном участке 104, описываемыми ниже, соответственно ограничивая переносящую пробу иглу, обеспечивая вентиляцию иглы и мест доступа к поршню шприца, как описывается ниже. Первый двумерный участок 102 также может включать в себя боковой вырез 120 для удержания фланца шприца.
Первый двумерный участок 102 также предпочтительно ограничивает отверстие 124 для взаимодействия с нагревателем, множество отверстий 126 с разрушаемым уплотнением для доступа к плунжеру и отверстие 128 для взаимодействия с магнитом. Отверстия 126 с разрушаемым уплотнением для доступа к плунжеру предпочтительно воплощены в соответствии с принципами документа WO2012019599 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve” («Устройство для переноса малых объемов текучей среды, в частности - микронасос или микроклапан»), описание которого включено сюда посредством ссылки.
Второй двумерный участок 104, внешняя поверхность 130 которого видна, в частности, на фиг.1B и 1H, предпочтительно является в целом двумерным, в целом прямоугольным элементом и включает в себя вырез 136, который ограничивает вместе с вырезом 116 место доступа к поршню шприца, как описывается ниже. Второй двумерный участок 104 также предпочтительно включает в себя вмещающий защелку крышки пробы вырез 138. Второй двумерный участок 104 также может включать в себя боковой вырез 140 для удержания фланца шприца.
Второй двумерный участок 104 также предпочтительно ограничивает отверстие 144 для взаимодействия с нагревателем, множество отверстий 146 с разрушаемым уплотнением для доступа к плунжеру, множество опорных выступов 148 и в целом прямоугольный отверстие 150 для доступа к углеродной матрице. Отверстия 146 с разрушаемым уплотнением для доступа к плунжеру предпочтительно воплощены в соответствии с принципами документа WO2012019599 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve”, описание которого включено сюда посредством ссылки.
Второй двумерный участок 104 предпочтительно включает в себя также первый и второй прорезы, 152 и 154, выполненные внутри его верхнего обода 156, яснее всего видные на фиг.1C. Первый и второй прорезы 152 и 154 соответственно ограничивают - вместе с первым и вторым вырезами 112 и 114 - переносящую пробу иглу и обеспечивают вентиляцию мест доступа к игле.
Обращаясь теперь к фиг.2, видим, что внутренняя поверхность 158 первого двумерного участка 102 предпочтительно ограничивает первую линейную матрицу 160 скользящих по вентилирующей игле установочных выступов 162 для взаимодействия с линейно перемещаемым вентилирующим элементом, предпочтительно воплощенным как вентилирующая игла 164, во время перевозки и перед применением. Также видно, что внутренняя поверхность 158 включает в себя вторую линейную матрицу 170 скользящих по переносящей пробу игле установочных выступов 172 для взаимодействия с линейно перемещаемым переносящим элементом, предпочтительно воплощенным как переносящая пробу игла 174, во время перевозки и перед применением. Следует принять во внимание, что соответственные вентилирующая игла 164 и переносящая пробу игла 174 выполнены с соответственные основаниями 176 и 178 для захвата игл и трубочными соединителями 180 и 182.
С трубочным соединителем 182 переносящей пробу иглы соединена переносящая пробу трубка 190, которая предпочтительно сообщается с люэровским соединителем (наконечником) 192 шприца 194, который удерживается в нужном положении посредством линейной матрицы 196 опор 198 шприца.
Также видно, что внутренняя поверхность 208 второго двумерного участка 104 предпочтительно ограничивает линейную матрицу 216 опор 218 шприца, которые взаимодействуют с опорами 198 шприца, удерживая шприц 194 в нужном положении. Узел 220 сердцевины предпочтительно удерживается внутри корпуса, по меньшей мере, первым и вторым линейными выступами 222 и 224.
Следует принять во внимание, что корпус смыкают после изготовления посредством относительного поворота первого и второго двумерных участков 102 и 104 вокруг шарнира 106.
Обратимся теперь к фиг.3A, 3B и 3C, где представлены упрощенные соответственные изображения узла 220 сердцевины, применяемого в варианте осуществления согласно фиг.2, причем на фиг.3А представлено наглядное изображение узла 220 сердцевины, а на фиг.3B и 3C представлены двумерные изображения основания этого узла.
Как видно на фиг.3A - 3C, узел 220 сердцевины предпочтительно включает в себя основание 230, которое изображено на фиг.3B и 3C, узел 240 верхней крышки, имеющий первую и вторую перегородки 242 и 244, наформовываемые на нее как единое целое с ней, а также первую матрицу портов 246 заполнения реагентами и вторую матрицу портов 248 заполнения реагентами, причем эти порты применяются уже во время изготовления. Узел 240 верхней крышки также снабжен множеством выравнивающих отверстий 250 для приема соответствующего множества выравнивающих выступов 252 на основании 230 и множество отверстий 260 для умещения закупоривающих реагенты пробок 270, которые установлены на основание 230 и предпочтительно воплощены в соответствии с принципами документа EP2821138 под названием “Flow Cell with Integrated Dry Substance” («Проточная ячейка с введенным в нее сухим веществом»), описание которого включено сюда посредством ссылки. Узел 240 верхней крышки предпочтительно также снабжен множеством отверстий 276 с разрушаемым уплотнением для доступа к плунжеру, предпочтительно воплощенных в соответствии с принципами документа WO2012019599 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve” и документа WO2016000998 под названием “Flow Cell comprising a Storage Zone and a Duct that can be Opened at a Predetermined Breaking Point” («Проточная ячейка с застойной зоной и каналом, который можно открывать в предварительно определенный момент проскока»), описания которых включены сюда посредством ссылки.
Узел 240 верхней крышки предпочтительно включает в себя также гибкую герметичную крышку 280 порта введения проб, которая с возможностью снятия и замены накрывает порт 292 введения проб камеры 293 введения проб, ограниченной основанием 230. Гибкая герметичная крышка 280 порта введения проб предпочтительно выполнена с защелкивающимся выступом 294, который вводится в зацепление с соответствующей выемкой 296, выполненной в основании 230. Следует отметить, что узел 220 сердцевины пригоден, в частности, для применения при проведении анализов клеток Раджи (АКР).
Обратимся теперь к фиг.4A—4H, где представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади узла 400 сердцевины с расширенными функциональными возможностями, который применим для обоих анализов - АКР и ПЦР - и который можно использовать в кассете согласно фиг.1A—2 со внесением подходящих модификаций в корпус кассеты, и к фиг.5, где представлено упрощенное изображение в разобранном виде узла сердцевины согласно фиг.4A—4H.
Как видно на фиг.4A—5, узел 400 сердцевины составляет элемент кассеты, предпочтительно включающий в себя микрофлюидное основание 410, узел 420 крышки, герметично взаимодействующий с микрофлюидным основанием 410 на первой его стороне, герметизирующую накрывающую пленку 430, герметично взаимодействующую с микрофлюидным основанием 410 на второй его стороне, углеродную матрицу 440, которая включает в себя слой двухстороннего скотча и которая установлена посредством слоя двухстороннего скотча на герметизирующую накрывающую пленку 430, и прозрачную крышку 450 углеродной матрицы.
Как видно на фиг.5, углеродная матрица 440 включает в себя впуск 460 углеродной матрицы и выпуск 462 углеродной матрицы. В дополнение к этому, герметизирующая накрывающая пленка 430 включает в себя впуск 470 для доступа к углеродной матрице и выпуск 472 для доступа к углеродной матрице, причем впуск 470 для доступа к углеродной матрице и выпуск 472 для доступа к углеродной матрице соответственно выровнены со впуском 460 углеродной матрицы и выпуском 462 углеродной матрицы при сборке узла 400 сердцевины.
В дополнение к этому, обратимся теперь к фиг.6A—6H, где представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади микрофлюидного основания 410 узла сердцевины согласно фиг.4A—5.
Как видно на фиг.6A—6H, микрофлюидное основание 410 является в целом двумерным элементом, предпочтительно - изготовленным из полипропилена методом литья под давлением. На фиг.6A и 6G видна первая поверхность 500, а на фиг.6B и 6H видна вторая - противоположная - поверхность 510. Микрофлюидное основание 410 предпочтительно выполнено с матрицей 520 отверстий 522 с разрушаемым уплотнением для доступа, предпочтительно воплощенных в соответствии с принципами документа WO2012019599A2 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve”, описание которого включено сюда посредством ссылки.
Обращаясь вначале принципиально к фиг.6A и 6G, где изображена первая поверхность 500, видим, что предусмотрена матрица 530 направляющих вентилирующую иглу выступов 532, расположенных вдоль продольной оси 534. Каждый из направляющих выступов 532 ограничивает туннель 536, а все туннели продольно выровнены вдоль оси 534.
Рядом с матрицей 530 находится в целом продольная матрица 538 портов 540 вентиляции реагентов. Рядом с матрицей 538 находится ограничивающий камеры хранения реагентов выступ 550, который предпочтительно ограничивает множество рабочих объемов или камер 552 для хранения регентов, которые для ясности обозначены на фиг.6A как камеры B1—B14. Каждая из камер хранения реагентов предпочтительно снабжена сквозным вентиляционным отверстием 554 и сквозным отверстием 556 для переноса реагентов.
Рядом с ограничивающим камеры хранения реагентов выступом 550 находится в целом продольная матрица 560 портов 562 подачи реагентов.
Рядом с ограничивающим камеру хранения реагентов выступом 550 находится в целом продольная матрица 570 портов 572 приема закупоривающих реагенты пробок, предпочтительно воплощенных в соответствии с принципами документа EP2821138 под названием “Flow Cell with Integrated Dry Substance”, описание которого включено сюда посредством ссылки.
Около матрицы 520 отверстий 522 с разрушаемым уплотнением для доступа находится матрица 580 направляющих переносящую иглу выступов 582, расположенных вдоль продольной оси 584, которая предпочтительно параллельна оси 534. Каждый из направляющих выступов 582 ограничивает туннель 586, а все тоннели продольно выровнены вдоль оси 584.
Около матрицы 580 находится подсистема 600 ПЦР-амплификации посредством микрофлюидной матрицы, включающая в себя вмещающий газовую пружину выступ 602, предпочтительно воплощенный в соответствии с принципами документа WO2010139295 под названием “Apparatus for Transporting a Fluid within a Channel Leg of a Microfluidic Element” («Устройство для переноса текучей среды внутри ответвления канала микрофлюидного элемента»), описание которого включено сюда посредством ссылки, множество портов 604 приема закупоривающих реагенты ПЦР пробок и выемку 606, которая ограничивает область взаимодействия с нагревателем. Ниже подсистемы 600 ПЦР-амплификации предусмотрена камера 610 для приема проб, имеющая отверстие 612 для введения проб.
Обращаясь теперь к фиг.6B и 6H, где изображена вторая поверхность 510, видим, что предусмотрена матрица 630 выемок 632, причем каждая из выемок 632 сообщается с соответствующим туннелем 536 соответствующего направляющего вентилирующую иглу выступа 532, расположенным вдоль продольной оси 534. Выемки 632 в сочетании с туннелями 536 предпочтительно ограничивают множество мест нахождения кончика вентилирующей иглы, которые для ясности обозначены на фиг.6H как места V11—V23 нахождения кончика вентилирующей иглы. Каждая из некоторых выемок 632 сообщается с соответственным микрофлюидным каналом 634, который, в свою очередь, сообщается с вентиляционным отверстием 554 соответствующей из камер B1—14. Каждая из других выемок 632 сообщается с соответственным микрофлюидным каналом 636, который, в свою очередь, сообщается с соответствующей из камер 640 хранения реагентов, которые соответственно обозначены на фиг.6B как камеры A1—A7. Дополнительная выемка 632 сообщается с внутренним пространством камеры 610 для приема проб с целью обеспечения ее вентиляции. Для обеспечения дополнительных функциональных возможностей, которые в настоящее время не предполагаются, можно предусмотреть одну или более дополнительных выемок 632, связанных с соответствующим туннелем.
Также видно, что предусмотрена матрица 730 выемок 732, каждая из которых сообщается с соответствующим туннелем 586 соответствующего направляющего переносящую иглу выступа 582, расположенным вдоль продольной оси 584. Выемки 732 в сочетании с туннелями 586 предпочтительно ограничивают множество мест нахождения кончика переносящей пробу иглы, которые для ясности обозначены на фиг.6H как места T1—T23 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Каждая из некоторых выемок 732 сообщается с соответственным микрофлюидным каналом 734, который, в свою очередь, сообщается с отверстием 556 переноса реагента соответствующей из камер B1—14. Каждая из других выемок 732 сообщается с соответственным микрофлюидным каналом 736, который, в свою очередь, сообщается с соответствующей из камер 640 хранения реагентов, которые соответственно обозначены на фиг.6B как камеры A1—A7.
Дополнительная выемка 738 сообщается с соответственным микрофлюидным каналом 740, который, в свою очередь, сообщается с внутренним пространством камеры 610 для приема проб с целью обеспечения переноса проб. Еще одна дополнительная выемка 742 сообщается с соответственным микрофлюидным каналом 744, который, в свою очередь, сообщается с камерой A1 через порт 572 закупоривающей реагент пробки и разрушаемое уплотнение, находящееся в отверстии 522 и предпочтительно воплощенное в соответствии с принципами документа WO2012019599 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve” и WO2016000998 под названием “Flow Cell comprising a Storage Zone and a Duct that can be Opened at a Predetermined Breaking Point”, описания которых включены сюда посредством ссылки. Дополнительные выемки 746 сообщаются с соответственными микрофлюидными каналами 748, которые, в свою очередь, сообщаются с соответствующим отверстием 556 для переноса реагента соответствующей из камер B1—B14 через соответственный порт 572 закупоривающей реагент пробки.
Еще одна дополнительная выемка 750 сообщается через микрофлюидный канал 752 с подсистемой 600 ПЦР-амплификации. Таким образом, микрофлюидный канал 752 ограничивает внутренний проходной канал к порту подсистемы 600 ПЦР-амплификации. Подсистема 600 ПЦР-амплификации предпочтительно включает в себя множество параллельных микрофлюидных каналов 760, каждый из которых сообщается с соответствующей камерой 770 ПЦР-амплификации. Каждая камера 770 сообщается через соответствующую закупоривающую реагент пробку 604 с соответствующей газовой пружиной 772, находящейся внутри выступа 602 и предпочтительно воплощенной в соответствии с принципами документа WO2010139295 под названием “Apparatus for Transporting a Fluid within a Channel Leg of a Microfluidic Element”, описание которого включено сюда посредством ссылки. Закупоривающие реагент пробки 604 внутри подсистемы 700 ПЦР-амплификации соответственно обозначены на фиг.6B как закупоривающие реагент пробки A8—A13.
Еще одна дополнительная выемка 780 сообщается через микрофлюидный канал 782 с углеродной матрицей 440, через отверстие 783, которое выровнено со впуском 470 для доступа к углеродной матрице герметизирующей накрывающей пленки 430 и впуском 460 углеродной матрицы, принадлежащим углеродной матрице 440. Углеродная матрица 440 сообщается с камерой B14 через вентиляционное отверстие 784, причем это отверстие 784 выровнено с выпуском 472 для доступа к углеродной матрице герметизирующей накрывающей пленки 430 и выпуском 462 углеродной матрицы, принадлежащим углеродной матрице 440. Камера B14 предпочтительно служит в качестве сборника отходов. Следует принять во внимание, что углеродная матрица 440 таким образом вентилируется в камеру B14 посредством вентиляционного отверстия 784, причем это вентиляционное отверстие 784 сопряжено и взаимно соединено с углеродной матрицей 440 и камерой B14.
Следует принять во внимание, что камеры B1—B14 и A1—A7 хранения реагентов, а также закупоривающие реагент пробки A8—A13 и камеру 610 для приема проб также можно охарактеризовать как рабочие объемы, ограниченные микрофлюидным основанием 410 элемента кассеты, образующим часть узла 400 сердцевины. Также следует принять во внимание, что множество рабочих объемов, включающее в себя камеры B1—B14, A1—A13 и камеру 610 для приема проб, дополнительно предусматривает большое количество рабочих объемов, образованных различными микрофлюидными каналами, включая каналы 634, 636, 734, 736, 740, 744, 748, 752, 760 и 782 (фиг.6B), взаимно соединяющие камеры B1—B14, A1—A13 и камеру 610 для приема проб, при этом конфигурация, по меньшей мере, некоторых из микрофлюидных каналов обеспечивают впрыскивание в них текучей среды, как подробно описывается в дальнейшем.
Как становится ясно в результате рассмотрения фиг.6A, отмечаем, что, по меньшей мере, некоторые из камер B1—B14 в предпочтительном варианте взаимно выровнены линейно. Помимо этого, как становится ясно в результате рассмотрения фиг.6B, отмечаем, что, по меньшей мере, некоторые из камер A1—A7 и A8—A13 в предпочтительном варианте взаимно выровнены линейно.
В дополнение к этому, обратимся теперь к фиг.7, где представлено упрощенное изображение в разобранном виде узла 420 верхней крышки, образующего часть узла сердцевины согласно фиг.4A—5. Узел 420 верхней крышки предпочтительно включает в себя основной участок 800, имеющий наформовываемые на нем первую и вторую перегородки 802 и 804 и участок 806 герметизации впуска проб.
В дополнение к этому, обратимся теперь к фиг.8A—8H, где представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади основного участка 800 узла верхней крышки согласно фиг.7, образующего часть узла сердцевины согласно фиг.4A—5.
Как видно на фиг.8A - 8H, основной участок 800 является в целом двумерным элементом, предпочтительно - изготовленным из полипропилена методом литья под давлением. Первая поверхность 810 видна на фиг.8A и 8G, а вторая - противоположная - поверхность 820 видна на фиг.8B и 8H. Основной участок 800 предпочтительно выполнен с первым и вторым отверстиями 830 и 832 для приема перегородок, предназначенными для приема соответственных перегородок 802 и 804, которые наформованы на нем. Основной участок 800 включает в себя также отверстие 834 для обеспечения доступа к матрице 538 портов 540 вентиляции реагентов микрофлюидного основания 410 и отверстие 836 для обеспечения доступа ко в целом продольной матрице 560 портов 562 подачи реагентов, матрице 570 портов 572 закупоривающих реагенты пробок и матрице 520 отверстий 522 с разрушаемым уплотнением для доступа, принадлежащих микрофлюидному основанию 410.
Обращаясь к фиг.8A и 8G, на которых изображена первая поверхность 810, и к фиг.8B и 8H, на которых изображена вторая поверхность 820, видим, что предусмотрена матрица 840 вентиляционных портов 842, каждый из которых сообщается с внутренним пространством отличающейся одной из камер B1—B13. Также видно, что предусмотрено множество портов 850 заполнения реагентами, каждый из которых сообщается с внутренним пространством отличающейся одной из камер B1—B13.
Основной участок 800 узла 420 верхней крышки предпочтительно включает в себя также гибкую герметичную крышку 860 порта введения проб, которая с возможностью снятия и замены накрывает порт 612 введения проб камеры 610 для приема проб, ограниченной основанием 410. Участок 806 герметизации впуска проб предпочтительно установлен, как при использовании скотча, на нижней поверхности гибкой герметичной крышки 860 порта введения проб для обеспечения герметизации порта 612 введения проб. Предпочтительный вариант осуществления участка 806 герметизации впуска проб изображен на фиг.11A—11F.
В дополнение к этому, обратимся теперь к фиг.9A—9E, где представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади и сверху/снизу и перспективные изображения спереди и сзади первой наформовываемой перегородки 802 узла 420 крышки согласно фиг.7, предпочтительно воплощенного в соответствии с принципами заявки № 17 172 994.0 на патент Германии под названием “Multifunctional co-molded housing for microfluidic card” («Многофункциональный корпус для микрофлюидной платы, сформованный совместно с ней»), описание которой включено сюда посредством ссылки.
Как видно на фиг.9A—9E, первая наформовываемой перегородка 802 является в целом прямоугольным наформовываемым элементом, имеющим продольную матрицу 870 выполненных в нем выемок 872. Продольная матрица 870 выемок 872 плотно перекрывает матрицу 530 направляющих вентилирующую иглу выступов 532, расположенных вдоль продольной оси 534.
В дополнение к этому, обратимся теперь к фиг.10A - 10H, где представлены упрощенные соответственные 10A—10H представлены упрощенные соответственные двумерные виды спереди, сзади, сверху, снизу, с первой и второй сторон и перспективные изображения спереди и сзади второй наформовываемой перегородки узла верхней крышки согласно фиг.7, предпочтительно воплощенной в соответствии с принципами заявки на патент Германии №. 17 172 994.0 под названием “Multifunctional co-molded housing for microfluidic card”, описание которого включено сюда посредством ссылки.
Как видно на фиг.10A—10H, вторая наформовываемая перегородка 804 является в целом прямоугольным наформовываемым элементом, имеющим боковой выступ 880. Основной участок 882 второй наформовываемой перегородки 804 выполнен с продольной матрицей 890 выемок 892. Продольная матрица 890 выемок 892 плотно перекрывает матрицу 580 направляющих переносящую иглу выступов 582, расположенных вдоль продольной оси 584.
Боковой выступ 880 плотно перекрывает разрушаемые уплотнения в отверстиях 522 и предпочтительно воплощен в соответствии с принципами документа WO2012019599 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve” и документа WO2016000998 под названием “Flow Cell comprising a Storage Zone and a Duct that can be Opened at a Predetermined Breaking Point”, описания которых включены сюда посредством ссылки.
Следует принять во внимание, что первая и вторая наформовываемые перегородки 802 и 804 предпочтительно сообщаются герметично посредством первого и второго наборов выемок 872 и 892, по меньшей мере, с некоторыми из множества рабочих объемов или камер A1—A13 и B1—B14 и камерой 610 для приема проб, когда кассета 100, включающая в себя узел 400 сердцевины, находится в собранном состоянии.
Специалисты в данной области техники поймут, что вышеописанную кассету 100 согласно фиг.1A—11F применяют предпочтительно для осуществления некоторого биологического процесса. Предпочтительный вариант осуществления этого процесса обобщен в таблицах I и II ниже.
В таблице I указано предпочтительное содержимое и/или предпочтительные функция и состав содержимого каждой из камер B1—B14 и A1—A13 микрофлюидного основания 410 узла 400 сердцевины с расширенными функциональными возможностями.
Понятно, что, благодаря узлу 400 сердцевины, подходящему для использования с обеими матрицами - для ПЦР и АКР, камеры, выбранные из числа камер B1—B14 и A1—A13, могут обладать двойными функциональными возможностями, а их содержимое может быть общим для обеих матриц - для ПЦР и АКР, как указано в таблице I по отношению к камерам B2—B5. В дополнение к этому, камеры, выбранные из числа из камер B1—B14 и A1—A13, могут иметь содержимые, отличающиеся в зависимости от того, используют узел 400 сердцевины с матрицей для ПЦР или матрицей для АКР, как указано в таблице I по отношению к камерам B6, B7, B9 и A3.
Также ясно, что выбранные из камер B1—B14 и A1—A13 применимы только совместно с одной, а не с обеими матрицами - для ПЦР и АКР, как дополнительно указано в таблице I по отношению к камерам B1, B8, B10—B13 и A1, A2 и A4—A13. В случае, если некоторую конкретную камеру применяют только совместно с одной а не с обеими матрицами - для ПЦР и АКР, эту камеру можно исключить или можно не наполнять, и поэтому она не будет принимать участие в биологическом процессе, осуществляемом внутри кассеты 100, когда кассету 100 используют совместно с матрицей того типа, для которой указанная камера не применятся.
Таблица I
Камера
Содержимое/Функция
Матрица амплификации,с которой используется
Состав
B1
Протеиназа K
ПЦР
Фермент - протеиназа K - в буфере, например, трис-HCl (pH 7,4).
B2
Раствор для лизиса
ПЦР/АКР
Гуанидинтиоцианат, ионогенный детергент, буфер (pH 7,4), Изопропиловый спирт, носитель РНК; модифицированные магнитные частицы Sera-Mag™ SpeedBalls.
B3
Буфер I для промывки
ПЦР/АКР
Гуанидинтиоцианат, ионогенный детергент, трис-HCl (pH 7,4), изопропиловый спирт, вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК-вода)
B4
Буфер II для промывки
ПЦР/АКР
KCl/трис (pH 7), Этиловый спирт, в воде, не содержащей рибонуклеаз
B5
Буфер III для промывки
ПЦР/АКР
KCl/трис (pH 7) в воде, не содержащей рибонуклеаз
B6
Элюирующий буфер
ПЦР
Трис-буфер/DDW (особо чистая рибонуклеаза и вода, не содержащая рибонуклеаз, от Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль).
АКР
В АКР, элюированный продукт - это удлиненная и запутанная геномная ДНК, которую надо сначала разрезать на меньшие сегменты с помощью рестрикционного фермента и инкубировать в течение 5 минут при 37 °C. За этим следует денатурация в течение 2 минут при 95°C. Элюирующий буфер предпочтительно содержит БАДП.
B7
Элюирующий буфер для разбавления
ПЦР/АКР
Буфер А для пробы (БАДП), содержащий L-гистидин, 1-тиоглицерин в DDW или саму DDW (особо чистую рибонуклеазу и воду, не содержащую рибонуклеаз, от Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль).В АКР, разбавление при элюировании проводят в БАДП.
B8
Буфер Amplicon для разбавления
ПЦР
Буфер А для пробы (L-гистидин, 1-тиоглицерин в DDW).
B9
Буфер для Восстановления репортера.
ПЦР
Либо высокосолевой буфер (ВСБ) (NaPO<sub>4</sub>, NaCl, тритон, pH 7,4) если репортер сушат в DDW, либо DDW, если репортер сушат в ВСБ.DDW для АКР, реакционная пробка содержит фермент - высушенную лигазу
Буфер для лигирования
АКР
B10
Буфер для разбавления дискриминатора, для всех дисриминаторов.
ПЦР
Буфер для разбавления смеси дискриминатора, предпочтительно - высокосолевой буфер (ВСБ) (NaPO<sub>4</sub>, NaCl, тритон, pH 7,4)
B11
Средство 1 для промывки датчиков
АКР
Низкосолевой буфер (НСБ) (NaPO<sub>4</sub>, тритон, pH 7,4)
B12
Средство 2 для промывки датчиков
АКР
Низкосолевой буфер (НСБ) (NaPO<sub>4</sub>, тритон, pH 7,4)
B13
Средство для промывки датчиков
ПЦР
Низкосолевой буфер (НСБ) (NaPO<sub>4</sub>, тритон, pH 7,4)
B14
Сборник отходов
ПЦР/АКР
A1
Протеиназа K
АКР
Фермент - протеиназа K - в буфере, например, трис-HCl (pH 7,4)
A2
Элюирующий буфер
АКР
Буфер А для пробы (БАДП) (L-гистидин, 1-тиоглицерин в DDW)
A3
Средство удаления шариков
ПЦР
Трис-буфер/DDW (особо чистая рибонуклеаза и вода, не содержащая рибонуклеаз, от Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль).В АКР используют БАДП
АКР
A4
Смесь 1 дискриминатора
ПЦР
Смесь 1 дискриминатора в TE
A5
Смесь 2 дискриминатора
ПЦР
Смесь 2 дискриминатора в TE
A6
Смесь 3 дискриминатора
ПЦР
Смесь 3 дискриминатора в TE.
A7
Смесь 4 дискриминатора
ПЦР
Смесь 4 дискриминатора в TE.
A8-A13
Амплификация
ПЦР
Смесь для ПЦР (т.е., буфер, полимераза ДНК и набор праймеров. В панелях, которые также включают в себя ДНК-мишени, в состав указанной смеси также входит обратная транскриптаза).Смесь для ПЦР разделяется на шесть каналов и сушится на закупоривающих реагент пробках A8—A13. На каждой закупоривающей реагент пробке возможны разные типы смеси для ПЦР.
В таблице II приведено упрощенное описание типичного биологического процесса, который имеет место в камерах B1—B14, A1—A13 и камере 610 для приема проб совместно с матрицей для ПЦР, такой, как подсистема 600 ПЦР-амплификации, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения.
Таблица II
Камера
Биологический процесс, происходящий внутри камеры
B1
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B1, содержащей протеиназу K. Поднимают поршень шприца 194, осуществляют всасывание протеиназы K в шприц 194 по пути текучей среды, содержащему микрофлюидный канал 734, соединенный с камерой B1 в отверстии 556, внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174 и внутреннее пространство гибкой трубки 190.Вентилируют камеру B1 посредством вентилирующей иглы 164 через микрофлюидный канал 634, который сообщается с камерой B1 через вентиляционное отверстие 554.Ниже, со ссылками на фиг.13A—13C, описывается соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F.
Камера 610 для приема проб
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой 610 для приема проб. Поршень шприца 194 опускают, тем самым проводя впрыскивание протеиназы K из шприца 194 в камеру 610 для приема проб.Перемещают поршень вверх и вниз, чтобы смешать протеиназу K и пробу, ранее введенную в камеру 610 для приема проб. Проба может быть любой пробой биологического и/или клеточного материала, содержащей нуклеиновые кислоты для анализа. В конце этапа смешивания поршень опускают, и смесь возвращается в камеру 610 для приема проб. За этим следует инкубация пробы смеси в камере 610 для приема проб, при этом пробу нагревают до 56 °C (±2 °C) в течение 8—10 мин в присутствии фермента - протеиназы K. Фермент растворяет клеточные мембраны и исключает нуклеазы, являющиеся ферментами, которые катализируют гидролитическое расщепление связей на основе сложного фосфодиэфира в остове нуклеиновой кислоты (НК), тем самым разрушая ДНК и/или РНК. В конце периода инкубации поршень поднимают, тем самым осуществляя всасывание протеиназы K и пробы по пути текучей среды, содержащем микрофлюидный канал 740, внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174 и внутреннее пространство трубки 190, в объем цилиндра под поршень в шприце 194.Камеру 610 для приема проб вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 через микрофлюидный канал 1349.Ниже, со ссылками на фиг.13D—13G, описывается соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F.
B2
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B2, которая содержит раствор для лизиса, а также содержит магнитные шарики. Поршень шприца 194 опускают, а пробу 1204 и протеиназу K смешивают с раствором для лизиса, содержащимся в камере B2, и магнитными шариками, после чего осуществляют непрерывное смешивание, поднимая и опуская поршень шприца 194 несколько раз.Состав раствора для лизиса, физический перенос по узкой переносящей пробу игле 174, а также силы нажима и среза при переносе, приводят к лизису клеток проб. Чтобы вызвать лизис клеток и в качестве денатуратора белков в целом, денатурирующего белки (включая нуклеазы), которые в противном случае могут препятствовать связыванию нуклеиновых кислот с магнитными шариками, используют гуанидинтиоцианат. Денатурацию проводят посредством разрыва водородных связей и ослабления гидрофобных взаимодействий. Ионогенный детергент и изопропиловый спирт действуют как детергенты и способствуют солюбилизации мембранных белков и липидов, вызывая лизис клетки и высвобождение ее содержимого. Нуклеиновые кислоты (НК) связывают с магнитными шариками посредством покрытия последних. В конце стадии лизиса нуклеиновые кислоты (НК) оказываются связанными с магнитными шариками. Затем эти шарики - вместе со связанными с ними НК - притягиваются магнитом к стенке шприца 194. Поршень шприца 194 опускают, а остающийся не связанным материал (содержащий клеточный детрит) принудительно возвращают в камеру B2.Камеру B2 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B2 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.14A—14E.
B3
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B3, содержащей буфер I для промывки. Магнит отводят, а связанные с ним шарики и нуклеиновые кислоты смывают. Содержимое камеры B3 всасывают в шприц 194, поднимая поршень шприца 194. Смывание осуществляют, неоднократно поднимая и опуская поршень шприца 194, тем самым перекачивая буфер I для промывки, шарики и связанные с ними нуклеиновые кислоты из камеры B3 во внутренний объем шприца 194 под поршень шприца 194 и обратно несколько раз по пути текучей среды, образованному между ними трубкой 190, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидным каналом 734, соединенным с камерой B3. В конце промывки магнит возвращается в окрестность шприца 194 и притягивает шарики - вместе со связанными с ними НК - к стенке шприца 194. Поршень шприца 194 опускают, а остающийся не связанным материал принудительно возвращают в камеру B3 по указанному пути текучей среды.Камеру B3 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B3 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.15A—15E.
B4
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B4, содержащей буфер II для промывки, и проводят биологическую обработку пробы так, как описано ранее для камеры B3. В конце промывки магнит возвращается в окрестность шприца 194 и притягивает шарики - вместе со связанными с ними НК - к стенке шприца 194. Поршень шприца 194 опускают, а остающийся материал принудительно возвращают в камеру B4 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B4 трубкой 190, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидным каналом 734, соединенным с камерой B4.Камеру B4 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B3 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.16A—16E.
B5
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B5, содержащей буфер III для промывки, и проводят биологическую обработку пробы так, как описано ранее для камер B3 и B4. В конце промывки магнит возвращается в окрестность цилиндра и притягивает шарики - вместе со связанными с ними НК - к стенке шприца 194. Поршень шприца 194 опускают, а остающийся материал принудительно возвращают в камеру B5 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B5 трубкой 190, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидным каналом 734, соединенным с камерой B5.Камеру B5 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B3 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.17A—17E.
B6
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B6, содержащей элюирующий буфер, а поршень шприца 194 поднимают, всасывая элюирующий буфер в шприц 194. Магнит отводят таким образом, что обеспечивают высвобождение шариков - вместе со связанными с ними НК - и их смывание. Смывание осуществляют, неоднократно поднимая и опуская поршень шприца 194, тем самым перекачивая элюирующий буфер, шарики и связанные с ними нуклеиновые кислоты из камеры B6 во внутренний объем шприца 194 под поршень шприца 194 и обратно несколько раз по пути текучей среды, образованному между ними трубкой 190, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидным каналом 734, соединенным с камерой B6. Элюирующий буфер высвобождает НК с шариков благодаря изменению концентрации соли. В конце элюирования поршень шприца 194 поднимают, и все текучие среды возвращаются в шприц 194.Камеру B6 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B3 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.18A—18D.
A3
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой A3 для удаления магнитных шариков. Поршень опускают, и происходит впрыскивание элюированных НК и магнитных шариков в камеру A3 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой A3 трубкой 190, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидным каналом, который оканчивается в проеме камеры A3. Предпочтительно, вдоль камеры A3 и - предпочтительно - параллельно ей расположен постоянный неподвижный магнит, не образующий часть кассеты 100, а скорее внешний по отношению к ней, так что он оказывается в окрестности стенки камеры A3. Магнит притягивает к стенке камеры A3 и шарики, и НК, остающиеся в растворе элюирующего буфера. Поршень впоследствии поднимают в некоторое находящееся выше положение, тем самым осуществляя всасывание некоторого желаемого объема элюированных и свободных НК во внутренний объем шприца 194 по указанному пути текучей среды.Камеру A3 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 636, который оканчивается в проеме камеры A3.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.19A—19E.
B7
Переносящую пробу иглу 174 теперь перемещают так, чтобы она находилась в косвенном контакте с камерой B7, содержащей элюирующий буфер для разбавления. Поршень шприца 194 оказывается в некотором находящемся выше промежуточном положении, при этом внутренний объем шприца 194 ниже поршня шприца 194 и объем, включающий в себя трубку 190 и внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174, содержат элюэнт из камеры A3. Разбавление осуществляют путем смешивания элюэнта и элюирующего буфера для разбавления из камеры B7, поднимая поршень в полностью выдвинутое положение, тем самым осуществляя всасывание элюирующего буфера для разбавления - либо буфера А для пробы, либо воды DDW, - из камеры B7 во внутренний объем шприца 194, и осуществляя повторяемые несколько раз подъем и опускание поршня шприца 194. В конце смешивания поршень шприца 194 поднимают и некоторый желаемый объем разбавленного элюэнта всасывают во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B7 трубкой 190, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидным каналом 734, соединенным с камерой B7.Камеру B7 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B7 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.20A—20D.
A8—A13
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в порт переноса, который сообщается с подсистемой 600 ПЦР-амплификации. Поршень опускают и осуществляют впрыскивание разбавленного элюэнта из камеры B7 по микрофлюидному каналу 752 в подсистему 600 ПЦР-амплификации. Подсистема 600 ПЦР-амплификации включает в себя множество параллельных микрофлюидных каналов 760, каждый из которых сообщается с соответствующей камерой 770 амплификации. Каждая камера 770 амплификации сообщается через соответствующую закупоривающую реагент пробку A8—13 с соответствующей газовой пружиной 772. Газовые пружины 772 гарантируют одинаковое распределение элюэнта среди различных камер 770 амплификации.Поршень поднимают вверх и опускают несколько раз, чтобы восстановить и перемешать высушенную смесь для ПЦР, находящуюся на каждой из закупоривающих реагент пробок A8-A13, располагающихся вдоль каждого ответвления микрофлюидного канала подсистемы над каждой камерой 770 амплификации.ПЦР-амплификацию проводят так, как описано здесь в других местах текста. В конце ПЦР-амплификации поршень шприца 194 поднимают в некоторое находящееся выше промежуточное положение, осуществляя всасывание некоторого желаемого объема амплифицированных НК - ампликонов - во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между подсистемой 600 ПЦР-амплификации и шприцем 194 микрофлюидным каналом 752, внутренним пространством переносящей пробу иглы 174 и трубкой 190.Чтобы интенсифицировать вентиляцию подсистемы 600 ПЦР-амплификации, можно - по выбору - предусмотреть клапан между подсистемой 600 ПЦР-амплификации и местом Т11 нахождения кончика иглы.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.21A—21E.
B8
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B8, содержащей буфер Amplicon для разбавления, такой, как проба буфера A (ПБА). Поршень шприца 194 оказывается в некотором находящемся выше промежуточном положении, при этом внутренний объем шприца 194 ниже поршня шприца 194 и объем, включающий в себя трубку 190 и внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174, содержащие продукты ПЦР (амплифицированные НК, т.е., ампликоны) из <b>под</b>системы 600 ПЦР-амплификации. Разбавление осуществляют путем смешивания ампликонов с буфером Amplicon для разбавления, поднимая поршень шприца 194 в полностью выдвинутое положение, тем самым осуществляя всасывание буфера Amplicon для разбавления из камеры B8 во внутренний объем шприца 194, и путем повторяемых несколько раз подъема и опускания поршня шприца 194. В конце смешивания поршень шприца 194 поднимают и разбавленные ампликоны всасывают во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B8 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B8.Затем переносящую пробу иглу 174 перемещают к месту T21 нахождения кончика переносящей иглы, которое сообщается по текучей среде с углеродной матрицей 440, а поршень шприца 194 опускают в некоторое нижерасположенное промежуточное положение. Разбавленные ампликоны проходят над углеродной матрицей 440 и связываются с трисахаридом (например, раффинозой), используемым, чтобы сберечь кассету во время хранения. Затем поршень шприца 194 опускают дальше, тем самым обеспечивая прохождение большего количества разбавленных ампликонов над углеродной матрицей 440 и электронную адресацию этих ампликонов к матрице 440 после ее активации.Камеру B8 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B8 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.22A—22G.
A4
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой A4, содержащей смесь 1 дискриминатора. Поршень шприца 194 поднимают в некоторое находящееся выше промежуточное положение, осуществляя всасывание некоторого желаемого объема смеси 1 дискриминатора во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой A4 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом, который оканчивается в проеме камеры A4.Камеру A4 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 636, который оканчивается в проеме камеры A4.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.23A и B.
B10
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B10, содержащей буфер для разбавления дискриминатора. Поршень шприца 194 оказывается в некотором находящемся выше промежуточном положении, при этом внутренний объем шприца 194 ниже поршня шприца 194 и объем, включающий в себя трубку 190 и внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174, содержат смесь 1 дискриминатора. Разбавление осуществляют путем смешивания смеси 1 дискриминатора и буфера дискриминатора для разбавления, который содержится в камере B10, и путем повторяемых несколько раз подъема и опускания поршня шприца 194. В конце смешивания поршень шприца 194 поднимают и разбавленный дискриминатор всасывают во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B10 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B10.Затем переносящую пробу иглу 174 перемещают к месту Т21 нахождения кончика переносящей пробу иглы, которое сообщается по текучей среде с углеродной матрицей 440, а поршень шприца 194 опускают так, что разбавленный дискриминатор проходит над углеродной матрицей 440 и связывается посредством гибридизации с конкретными мишенями и местами на матрице 440 после инкубации.Камеру B10 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B10 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.24A—F.
A5
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой A5, содержащей смесь 2 дискриминатора. Поршень шприца 194 поднимают в некоторое находящееся выше промежуточное положение, осуществляя всасывание некоторого желаемого объема смеси 2 дискриминатора во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой A5 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом, который оканчивается в проеме камеры A5.Биологический процесс протекает так, как описано выше для смеси 1 дискриминатора.Камеру A5 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 636, который оканчивается в проеме камеры A5.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.25A и B.
B10
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B10, содержащей буфер для разбавления дискриминатора. Поршень шприца 194 оказывается в некотором находящемся выше промежуточном положении, при этом внутренний объем шприца 194 ниже поршня шприца 194 и объем, включающий в себя трубку 190 и внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174, содержат смесь 2 дискриминатора. Разбавление осуществляют путем смешивания смеси 2 дискриминатора и буфера дискриминатора для разбавления, который содержится в камере B10, и путем повторяемых несколько раз подъема и опускания поршня шприца 194. В конце смешивания поршень шприца 194 поднимают и разбавленный дискриминатор всасывают во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B10 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B10.Затем переносящую пробу иглу 174 перемещают к месту Т21 нахождения кончика переносящей пробу иглы, которое сообщается по текучей среде с углеродной матрицей 440, а поршень шприца 194 опускают так, что разбавленный дискриминатор проходит над углеродной матрицей 440 и связывается посредством гибридизации с конкретными мишенями и местами на матрице 440 после инкубации. Смесь 2 разбавленного дискриминатора вытесняет ранее введенную смесь 1 разбавленного дискриминатора, и смесь 1 дискриминатора сливается из углеродной матрицы 440 через отверстие 462, ведущее в камеру B14, которая служит в качестве сборника отходов.Камеру B10 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B10 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.26A—F.
A6
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой A6, содержащей смесь 3 дискриминатора. Поршень шприца 194 поднимают в некоторое находящееся выше промежуточное положение, осуществляя всасывание некоторого желаемого объема смеси 3 дискриминатора во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой A6 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом, который оканчивается в проеме камеры A6.Биологический процесс протекает так, как описано выше для смеси 1 дискриминатора.Камеру A6 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 636, который оканчивается в проеме камеры A6.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.27A и B.
B10
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B10, содержащей буфер для разбавления дискриминатора. Поршень шприца 194 оказывается в некотором находящемся выше промежуточном положении, при этом внутренний объем шприца 194 ниже поршня шприца 194 и объем, включающий в себя трубку 190 и внутренним пространством переносящей пробу иглы 174, содержат смесь 3 дискриминатора. Разбавление осуществляют путем смешивания смеси 3 дискриминатора и буфера дискриминатора для разбавления, который содержится в камере B10, и путем повторяемых несколько раз подъема и опускания поршня шприца 194. В конце смешивания поршень шприца 194 поднимают и разбавленный дискриминатор всасывают во внутренний объем шприца по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B10 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B10.Затем переносящую пробу иглу 174 перемещают к месту Т21 нахождения кончика переносящей пробу иглы, которое сообщается по текучей среде с углеродной матрицей 440, а поршень шприца 194 опускают так, что разбавленный дискриминатор проходит над углеродной матрицей 440 и связывается посредством гибридизации с конкретными мишенями и местами на матрице 440 после инкубации. Смесь 3 разбавленного дискриминатора вытесняет ранее введенную смесь 2 разбавленного дискриминатора, и смесь 2 дискриминатора сливают из углеродной матрицы через отверстие 462, ведущее в камеру B14, которая служит в качестве сборника отходов.Камеру B10 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B10 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A— 2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.28A—F.
A7
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой A7, содержащей смесь 4 дискриминатора. Поршень шприца 194 поднимают в некоторое находящееся выше промежуточное положение, осуществляя всасывание некоторого желаемого объема смеси 4 дискриминатора во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой A7 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом, который оканчивается в проеме камеры A7.Биологический процесс протекает так, как описано выше для смеси 1 дискриминатора.Камеру A7 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 636, который оканчивается в проеме камеры A6.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.29A и B.
B10
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B10, содержащей буфер для разбавления дискриминатора. Поршень шприца 194 оказывается в некотором находящемся выше промежуточном положении, при этом внутренний объем шприца 194 ниже поршня шприца 194 и объем, включающий в себя трубку 190 и внутреннее пространство переносящей пробу иглы 174, содержат смесь 4 дискриминатора. Разбавление осуществляют путем смешивания смеси 4 дискриминатора и буфера дискриминатора для разбавления, который содержится в камере B10, и путем повторяемых несколько раз подъема и опускания поршня шприца 194. В конце смешивания поршень шприца 194 поднимают и разбавленный дискриминатор всасывают во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B10 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B10.Затем переносящую пробу иглу 174 перемещают к месту 21 нахождения кончика переносящей пробу иглы, которое сообщается по текучей среде с углеродной матрицей 440, а поршень шприца 194 опускают так, что разбавленный дискриминатор проходит над углеродной матрицей 440 и связывается посредством гибридизации с конкретными мишенями и местами на матрице 440 после инкубации. Смесь 4 разбавленного дискриминатора вытесняет ранее введенную смесь 3 разбавленного дискриминатора, и смесь 3 дискриминатора сливается из углеродной матрицы 440 через отверстие 462, ведущее в камеру B14, которая служит в качестве сборника отходов.Камеру B10 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B10 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.30A—F.
B9
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B9, содержащей буфер для восстановления репортера, и поднимают поршень шприца 194, тем самым осуществляя всасывание буфера для восстановления репортера, содержащегося в камере B9, во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B9 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B9. Восстановление осуществляют путем повторяемых несколько раз подъема и опускания поршня шприца 194, так что буфер для восстановления репортера течет по закупоривающей реагент пробке 572, содержащей высушенный красный репортер. В конце восстановления поршень шприца 194 поднимают и восстановленный репортер всасывают во внутренний объем шприца 194 по указанному пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B9 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 748, соединенным с камерой B9.Затем переносящую пробу иглу 174 перемещают к месту T21 нахождения кончика переносящей иглы, которое сообщается по текучей среде с углеродной матрицей 440, а поршень шприца 194 опускают так, что восстановленный репортер проходит над углеродной матрицей 440 и связывается посредством гибридизации дискриминаторами дискретизации в конкретных местах на матрице 440 после инкубации.Разбавленный репортер вытесняет ранее введенную смесь 4 разбавленного дискриминатора, а смесь 4 дискриминатора сливается из углеродной матрицы 440 через отверстие 462, ведущее в камеру B14, которая служит в качестве сборника отходов.Камеру B9 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B9 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.31A—F.
B13
Переносящую пробу иглу 174 перемещают, вводя в косвенный контакт с камерой B13, содержащей средство для промывки датчиков. Поршень шприца 194 поднимают, осуществляя всасывание средства для промывки датчиков в виде низкосолевого буфера (НСБ) из камеры B13 во внутренний объем шприца 194 по пути текучей среды, образованному между шприцем 194 и камерой B13 трубкой 190, внутренним пространством переносящей иглы 174 и микрофлюидным каналом 734, соединенным посредством камеры B13. Промывку осуществляют, опуская поршень шприца 194 вниз полностью, либо за один этап, либо за несколько стадий, что позволяет проводить несколько промывок, и пропуская средство для промывки в виде НСБ по углеродной матрице 440.Буфер для промывки вытесняет ранее введенный разбавленный репортер, и разбавленный репортер сливается из углеродной матрицы 440 через отверстие 462, ведущее в камеру B14, которая служит в качестве сборника отходов.Формирование изображений углеродной матрицы 440 происходит следующим образом.Камеру B13 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164 по микрофлюидному каналу 634, который сообщается с камерой B13 через вентиляционное отверстие 554.Соответствующее механическое действие релевантных элементов кассеты 100 согласно фиг.1A—2, включающей в себя узел сердцевины с расширенными функциональными возможностями согласно фиг.4A—11F, описывается ниже со ссылками на фиг.32A—D.
На основе биологического процесса, изложенного в таблице II, и соответствующего механического действия элементов кассеты 100, описанного здесь и в дальнейшем, понятно, что вентилирующая игла 164 представляет собой конкретно предпочтительный вариант осуществления линейно перемещаемого вентилирующего элемента, работающего как полость для вентиляции, по меньшей мере, одного из множества рабочих объемов A1—A13, B1—B14 и камеры 610 для приема проб. Помимо этого, понятно, что переносящая пробу игла 174 представляет собой конкретно предпочтительный вариант осуществления линейно перемещаемого переносящего элемента, работающего во взаимодействии с вентилирующей иглой 164, перенося растворы текучих сред, по меньшей мере, из одного из множества рабочих объемов A1—A13, B1—B14 и камеры 610 для приема проб, по меньшей мере, в один другой из множества рабочих объемов A1—A13, B1—B14 и камеру 610 для приема проб за счет последовательного введения в сообщение с внутренними пространствами, по меньшей мере, некоторых из множества рабочих объемов A1—A13, B1—B14 и камеры 610 для приема проб.
Также ясно, что переносящая пробу игла 174 во взаимодействии с узлом привода потока текучей среды, предпочтительно воплощенным как шприц 194, сообщающийся с переносящей пробу иглой 174 посредством гибкой трубки 190, образует часть узла переносчика растворов текучих сред, предназначенного для переноса текучей среды между одними из рабочих объемов A1—A13, B1—B14 и камерой 610 для приема проб. В частности, узел привода потока текучей среды, образованный шприцем 194, предпочтительно работает, приводя в движение растворы текучих сред через переносящий элемент, образованный переносящей пробу иглой 174, между одними из множества рабочих объемов A1—A13, B1—B14 и камерой 610 для приема проб.
Следует принять во внимание, что состав, концентрация и функционирование различных растворов, таких, как реагенты или буферы, описанные выше, как правило, известны в данной области техники и представлены в качестве примеров. Роль, которую каждое химическое вещество играет во всем процессе в целом, может изменяться от одной пробы к другой. Аналогичным образом, разные пробы могут потребовать разных химических веществ, что приводит к изменению точного содержимого каждой камеры.
Обратимся теперь к фиг.12A, 12B, 12C и 12D, где представлены упрощенные изображения типичных начальных этапов работы узла 400 сердцевины согласно фиг.4A—11F.
Как видно на фиг.12A, в предпочтительном варианте герметичная крышка 860 порта введения проб вначале выведена из контакта с камерой 610 для приема проб посредством подъема герметичной крышки 860 порта введения проб в направлении, указанном стрелкой 1200. Тем самым, порт 612 введения проб камеры 610 для приема проб разгерметизирован, что обеспечивает доступ в него.
Как видно на фиг.12B, в камеру 610 для приема проб через порт 612 введения проб предпочтительно вводят переносящую пробу пипетку 1202, как указано стрелкой 1203, и подают в указанную камеру пробу 1204.
Как видно на фиг.12C, после подачи пробы 1204 в камеру 610 для приема проб пипеткой 1202, переносящую пробу пипетку 1202 предпочтительно удаляют из камеры 610 для приема проб, как указано стрелкой 1205.
Как видно на фиг.12D, герметичную крышку 860 порта введения проб предпочтительно опускают в направлении, указанном дополнительной стрелкой 1206, таким образом герметизируя пробу 1204 внутри камеры 610 для приема проб посредством герметизации порта 612 введения проб участком 806 герметизации впуска проб.
После введения пробы 1204 внутрь кассеты 100 и до начала ее биологической обработки, все разрушаемые уплотнения внутри узла 400 сердцевины с расширенными функциональными возможностями предпочтительно открывают. Открытие разрушаемых уплотнений можно осуществлять с помощью набора подпружиненных плунжеров снаружи кассеты 100. Подпружиненные плунжеры могут получать доступ к разрушаемым уплотнениям через множество отверстий 126 и 146 с разрушаемыми уплотнениями для доступа к плунжеру, показанных на фиг.1A и 1B, предпочтительно - в соответствии с принципами документа WO2012019599 под названием “Device for Transporting Small Volumes of a Fluid, in particular a Micropump or Microvalve”, описание которого включено сюда посредством ссылки.
После введения пробы 1204 в камеру 610 для приема проб и разрушения разрушаемых уплотнений внутри кассеты 100, кассета 100 готова для биологической обработки пробы 1204, как описано выше со ссылками на таблицы I—II и ниже со ссылками на фиг.13A—32D. Следует принять во внимание, что хотя узел 400 сердцевины с расширенными функциональными возможностями изображен на фиг.13A - 32D как включающий в себя подсистему 600 ПЦР-амплификации, и при этом биологическая обработка пробы 1204 соответственно включает в себя в себя этапы ПЦР-амплификации, в альтернативном варианте возможно воплощение узла 400 сердцевины с расширенными функциональными возможностями с подсистемой АКР-амплификации, а биологическую обработку пробы 1204 в ней можно должным образом модифицировать.
Обратимся теперь к фиг.13A—13G, где представлены упрощенные изображения типичных дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.13А показано рабочее состояние, соответствующее показанному согласно фиг.12D, на фиг.13A—13G показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H, а на фиг.13B—13G показано оперативное взаимодействие с его камерой B1.
На фиг.13А показаны проба 1204, находящаяся в камере 610 для приема проб, и вентилирующая игла 164 и переносящая пробу игла 174, находящиеся в равновесии над матрицей 630 выемок 632 и матрицей 730 выемок 732, соответственно. Понятно, что вентилирующая игла 164 и переносящая пробу игла 174 предпочтительно сняты соответственно со скользящих по вентилирующей игле установочных выступов 162 (фиг.2) и скользящих по переносящей пробу игле установочных выступов 172 (фиг.2) и расположены так, как изображено на фиг.13A, посредством, по меньшей мере, одного электродвигателя движения иглы снаружи кассеты 100. Поршень 1300 шприца 194 предпочтительно находится в полностью опущенном положении в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, так что шприц 194 пуст.
На фиг.13B показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1304, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1306. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V1 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T2 нахождения кончика переносящей пробу иглы.
Следует принять во внимание, что для введения вентилирующей иглы 164 в любое из мест V1—V23 нахождения кончика вентилирующей иглы, предпочтительно обеспечивают проникновение вентилирующей иглы 164 в соответствующую из выемок 872 (фиг.9B), плотно перекрывающих матрицу 530 направляющих вентилирующую иглу выступов 532 (фиг.5). Аналогичным образом, следует принять во внимание, что для введения переносящей пробу иглы 174 в любое из мест T1—T23 нахождения кончика переносящей пробу иглы, предпочтительно обеспечивают проникновение переносящей пробу иглы 174 в соответствующую из выемок 892 (фиг.10B), плотно перекрывающих матрицу 580 направляющих переносящую иглу выступов 582 (фиг.5). Следует принять во внимание, что таким образом каждая из перегородок 802 и 804, включающая в себя выемки 872 (фиг.9B) и 892 (фиг.10B), оказывается - предпочтительно - пронизанной пронизывающим элементом, а этот пронизывающий элемент предпочтительно воплощен как вентилирующая игла 164 и переносящая пробу игла 174, соответственно.
На фиг.13C показан подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1320, вследствие чего осуществляется всасывание реакционной жидкости 1322, удерживаемой в камере B1, по меньшей мере, частично во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300. Поршень 1300 предпочтительно приводится в действие электродвигателем шприца снаружи кассеты 100. Реакционная жидкость 1322 предпочтительно является буфером, содержащим протеиназу K, как указано в таблице I. Как показано на фиг.13C, реакционная жидкость 1322 предпочтительно выходит из камеры B1 через отверстие 556 переноса реагента и всасывается вдоль микрофлюидного канала 734 по направлению к месту T2 нахождения кончика переносящей пробу иглы, как указано стрелкой 1324. Реакционная жидкость 1322 предпочтительно вводится в полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174, оказывающийся в месте T2 нахождения кончика переносящей пробу иглы, и предпочтительно всасывается вдоль внутреннего проходного канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1328. Внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно соединен по текучей среде с внутренним пространством переносящей пробу трубки 190, причем вдоль этой переносящей пробу трубки 190 реакционная жидкость 1322 предпочтительно всасывается в направлении, указанном стрелкой 1330. Внутреннее пространство переносящей пробу трубки 190, в свою очередь, сообщается с внутренним объемом 1302 шприца 194 посредством люэровского соединителя 192.
Камеру B1 предпочтительно вентилируют посредством вентилирующей иглы 164, оказывающейся в месте V1 нахождения кончика вентилирующей иглы и с введением в сообщение с камерой B1 через микрофлюидный канал 634, оканчивающийся в вентиляционном отверстии 554.
После переноса реакционной жидкости 1322 из камеры B1 в шприц 194, переносящую пробу и вентилирующую иглы 174, 164 предпочтительно опускают дальше, как изображено на фиг.13D. Вентилирующую иглу 164 предпочтительно опускают так, что ее полый заостренный конец 1310 вводится в месте V22 нахождения кончика вентилирующей иглы, как указано стрелкой 1340. Переносящую пробу иглу 174 предпочтительно опускают так, что ее полый заостренный конец 1312 вводится в месте T23 нахождения переносящей иглы, как указано стрелкой 1342.
На фиг.13E показано опускание поршня 1300, как указано стрелкой 1344, вынуждающее нагнетание реакционной жидкости 1322 из шприца 194 в камеру 610 для приема проб. Как будет ясно из рассмотрения фиг.13E, реакционную жидкость 1322 предпочтительно нагнетается из шприца 194, как указано стрелкой 1345, вдоль трубки 190 в направлении, указанном стрелкой 1346, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1347, и в камеру 610 для приема проб через микрофлюидный канал 740, взаимно соединяющий место T23 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камеру 610 для приема проб, как указано стрелкой 1348. Следует принять во внимание, что таким образом камера 610 для приема проб является конкретно предпочтительным вариантом осуществления подузла введения пробы, сообщающегося, по меньшей мере, с одним из множества рабочих объемов A1—A13 и B1—B14.
Камеру 610 для приема проб предпочтительно вентилируют посредством вентилирующей иглы 164, оказывающейся в месте V22 нахождения кончика вентилирующей иглы и с введением в сообщение с камерой 610 для приема проб через микрофлюидный канал 1349.
На фиг.13F показаны подъем и опускание поршня 1300, как указано стрелкой 1350, вследствие которых осуществляется неоднократное всасывание пробы 1204 и реакционной жидкости 1322, по меньшей мере, частично во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300. На фиг.13F также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение пробы 1204 и реакционной жидкости 1322 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1352; осуществляемое неоднократно перемещение пробы 1204 и реакционной жидкости 1322 внутри трубки 190, как указано стрелкой 1354; осуществляемое неоднократно перемещение пробы 1204 и реакционной жидкости 1322 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1355; и осуществляемое неоднократно перемещение пробы 1204 и реакционной жидкости 1322 в камеру 610 для приема проб и из нее через микрофлюидный канал 740, как указано стрелкой 1356. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смешать пробу 1204 и реакционную жидкость 1322.
После смешивания пробы 1204 с реакционной жидкостью 1322, проба 1204 и реакционная жидкость 1322 предпочтительно полностью или почти полностью всасываются во внутренний объем 1302 шприца 194 посредством подъема поршня 1300 в полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 1358 на фиг.13G. Смесь реакционной жидкости 1322 и пробы 1204 предпочтительно всасывает из камеры 610 для приема проб через микрофлюидный канал 740, как указано стрелкой 1360, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1361, а после этого - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1362, и во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300, как указано стрелкой 1364.
Как описано выше в таблице I и таблице II, пробу 1204 предпочтительно инкубируют при 56 °C в течение 8—10 минут в присутствии реакционной жидкости 1322 перед переносом посредством поршня 1300 и переносящей пробу иглы 174 в камеру B2, как описывается ниже со ссылками на фиг.14A. Следует принять во внимание, что нагрев пробы 1204 достигается с помощью нагревательного элемента, который не является частью кассеты 100 согласно фиг.1A—2.
Обратимся теперь к фиг.14A—14E, где представлены упрощенные изображения типичных дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.14А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.13G, на фиг.14A—14E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B2.
На фиг.14А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1400, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1402. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V2 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T3 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V2 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B2 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся вентиляционном отверстии 554 камеры B2. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T3 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B2 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B2.
Камера B2 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 1410, такую, как раствор для лизиса, содержащий гуанидинтиоцианат, ионогенный детергент в трис-HCL, а также магнитные шарики 1412, предпочтительно содержащие модифицированные магнитные частицы Sera-Mag™ SpeedBeads, промышленные поставки которых осуществляет компания GE Life Sciences.
На фиг.14B показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 1420, и тем самым - нагнетание пробы 1204 и реакционной жидкости 1322 из внутреннего объема 1302, как указано стрелкой 1421, через трубку 190, внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидный канал 734, как указано стрелками 1422, в камеру B2.
На фиг.14C показаны подъем и опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 1424, и тем самым - осуществляемое неоднократно всасывание пробы 1204, реакционных жидкостей 1322 и 1410 и шариков 1412, по меньшей мере, частично во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300, как указано стрелкой 1425. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы получить лизис клеток, образующих часть пробы 1204, который символически обозначен разрушением точек, которые представляют клетки пробы 1204. Нуклеиновые кислоты, высвобождающиеся из подвергшихся лизису клеток, предпочтительно связываются с магнитными шариками 1412 посредством покрытия последних.
На фиг.14D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 1428, и тем самым - всасывание магнитных шариков 1412 и связанных с ними нуклеиновых кислот из пробы 1204, а также реакционных жидкостей 1322 и 1410, во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300. После подъема поршня 1300, магнит 1430, не являющийся частью кассеты 100 согласно фиг.1A—2, вводят в окрестность внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1432, так что магнит 1430 притягивает магнитные шарики 1412, с которыми связаны нуклеиновые кислоты из пробы 1204.
На фиг.14E показано частичное опускание поршня 1300 в направлении, указанном стрелкой 1440, с тем, чтобы разделить большинство реакционных жидкостей 1322 и 1410 и остаток пробы 1204, включающей в себя клеточный детрит, с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами. Большинство реакционных жидкостей 1322 и 1410, а также остаток пробы 1204, включающей в себя клеточный детрит, предпочтительно возвращают в камеру B2 через трубку 190, как указано стрелкой 1442, переносящую пробу иглу 174, как указано стрелкой 1444, и микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 1446, где проба остается, при этом магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты остаются собранными в объеме 1302 посредством магнита 1430.
Следует принять во внимание, что практически все реакционные жидкости 1322 и 1410 возвращаются в камеру B2 и что лишь микроколичества их остаются в объеме 1302 шприца 194 вместе с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами пробы 1204.
Обратимся теперь к фиг.15A - 15E, где представлены упрощенные изображения других осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.15А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.14E, на фиг.15A—15E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B3.
На фиг.15А показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1500, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1502. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V4 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T4 нахождения кончика переносящей пробу иглы T4. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V4 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B3 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B3. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте Т4 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B3 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B3.
Камера B3 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 1504, предпочтительно содержащую буфер I для промывки, такой, как гуанидинтиоцианат, ионогенный детергент в трис-HCl (pH 7,4), изопропиловый спирт, ДЭПК-вода.
На фиг.15B показаны отвод магнита 1430 от шприца 194, как указано стрелкой 1505, и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1506, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 1504 из камеры B3 во внутренний объем 1302 под поршень 1300, причем во внутреннем объеме 1302 в дополнение к этому уже удерживаются магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты пробы 1204, а также любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322 и 1410 и остаточный материал пробы, как описано выше со ссылками на фиг.14D.
Как видно на фиг.15B, реакционную жидкость 1504 всасывается из камеры B3 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 1508, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1510, потом - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1512, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300.
На фиг.15C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1520, вынуждающие нагнетание реакционной жидкости 1504 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322 и 1410 и материала пробы - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.15C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1504 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322 и 1410 и материала пробы, в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1522; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1504 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322 и 1410 и материала пробы, внутри трубки 190, как указано стрелкой 1524; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1504 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322 и 1410 и материала пробы в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1526; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1504 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322 и 1410 и материала пробы внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 1527. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смыть шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты реакционной жидкостью 1504.
На фиг.15D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 1528, так что реакционная жидкость 1504 вместе со смытыми теперь шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также дополнительными компонентами, как описано выше, оказывается, по меньшей мере, почти полностью всосавшейся во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
На фиг.15D также показан магнит 1430, вводимый в окрестность внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1529, так что магнит 1430 притягивает магнитные шарики 1412, с которыми связаны нуклеиновые кислоты, из пробы 1204.
На фиг.15E показано частичное опускание поршня 1300, в направлении, указанном стрелкой 1530, с тем, чтобы разделить большинство реакционной жидкости 1504 и любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322 и 1410 и любую остаточную пробу 1204, включающую в себя клеточный детрит, с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами. Большинство материала, не представляющего собой шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты, возвращают в камеру B3, где он и остается, при этом магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты остаются собранными во внутреннем объеме 1302 посредством магнита 1430.
Следует принять во внимание, что практически всю реакционную жидкость 1504 возвращают в камеру B3 через трубку 190 и переносящую пробу иглу 174, как указано стрелкой 1532, и что лишь микроколичества их остаются в объеме 1302 вместе с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами.
Обратимся теперь к фиг.16A - 16E, где представлены упрощенные изображения других осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.16А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.15E, на фиг.16A—16E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B4.
На фиг.16А показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1600, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1602. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V5 нахождения кончика вентилирующая иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T6 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V5 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B4 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B4. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T6 нахождения переносящей пробу иглы и камерой B4 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B4.
Камера B4 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 1604, предпочтительно содержащую буфер I для промывки, такой, как KCl/трис (pH 7), этиловый спирт в воде, не содержащей рибонуклеаз.
На фиг.16B показаны отвод магнита 1430 от шприца 194, как указано стрелкой 1605, и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1606, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 1604 из камеры B4 во внутренний объем 1302 под поршень 1300, причем внутренний объем 1302 в дополнение к этому уже удерживает магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты пробы 1204, а также любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и любую остаточную пробу 1204, включающую в себя клеточный детрит.
Как видно на фиг.16B, реакционная жидкость 1604 всасывается из камеры B4 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 1608, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1610, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1612, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 1614.
На фиг.16C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1620, вынуждающие нагнетание реакционной жидкости 1604 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и материала пробы - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.16C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1604 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и материала пробы, в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1622; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1604 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и материала пробы, внутри трубки 190, как указано стрелкой 1624; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1604 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и материала пробы в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1626; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1604 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и материала пробы, внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 1627. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смыть шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты реакционной жидкостью 1604.
На фиг.16D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 1628, так что реакционная жидкость 1604 вместе со смытыми теперь шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также дополнительных компонентами, как описано выше, по меньшей мере, почти полностью всасываются во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
На фиг.16D также показан магнит 1430, вводимый в окрестность внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1629, так что магнит 1430 притягивает магнитные шарики 1412, с которыми связаны нуклеиновые кислоты, из пробы 1204.
На фиг.16E показано частичное опускание поршня 1300 в направлении, указанном стрелкой 1630, с тем, чтобы разделить большинство реакционной жидкости 1604 и любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322, 1410 и 1504 и любую остаточную пробу 1204, включающую в себя клеточный детрит, с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами. Большинство материала, не представляющего собой шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты, возвращают в камеру B4, где он и остается, при этом магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты остаются собранными во внутреннем объеме 1302 посредством магнита 1430.
Следует принять во внимание, что практически всю реакционную жидкость 1604 возвращают в камеру B4 через трубку 190 и переносящую пробу иглу 174, как указано стрелкой 1632, и что лишь микроколичества их остаются в объеме 1302 вместе с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами.
Обратимся теперь к фиг.17A—17E, где представлены упрощенные изображения других осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.17А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.16E, на фиг.17A—17E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B5.
На фиг.17А показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1700, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1702. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V7 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T4 нахождения кончика переносящей пробу иглы T8. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V7 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B5 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B5. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T8 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B5 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B5.
Камера B5 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 1704, предпочтительно содержащую буфер III для промывки, такой, как KCl/трис (pH 7) в воде, не содержащей рибонуклеаз, как подробно описано в таблицах I и II.
На фиг.17B показаны отвод магнита 1430 от шприца 194, как указано стрелкой 1705, и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1706, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 1704 из камеры B5 во внутренний объем 1302 под поршень 1300, причем внутренний объем 1302 в дополнение к этому уже удерживает магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты пробы 1204, а также любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и любую остаточную пробу 1204, включающую в себя клеточный детрит.
Как видно на фиг.17B, реакционная жидкость 1704 всасывается из камеры B5 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 1708, во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1710, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1712, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 1714.
На фиг.17C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1720, вынуждающие нагнетание реакционной жидкости 1704 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и материала пробы - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.17C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1704 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и материала пробы, в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1722; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1704 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и материала пробы, внутри трубки 190, как указано стрелкой 1724; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1704 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и материала пробы в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1726; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1704 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и материала пробы, внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 1727. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смыть шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты реакционной жидкостью 1704.
На фиг.17D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 1728, так что реакционная жидкость 1704 вместе со смытыми теперь шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также дополнительных компонентами, как описано выше, по меньшей мере, почти полностью всасываются во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
На фиг.17D также показан магнит 1430, вводимый в окрестность внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1729, так что магнит 1430 притягивает магнитные шарики 1412, с которыми связаны нуклеиновые кислоты, из пробы 1204.
На фиг.17E показано частичное опускание поршня 1300, в направлении, указанном стрелкой 1730, с тем, чтобы разделить большинство реакционной жидкости 1704 и любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504 и 1604 и любую остаточную пробу 1204, включающую в себя клеточный детрит, с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами. Большинство материала, не представляющего собой шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты, возвращают в камеру B5, где он и остается, при этом магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты остаются собранными во внутреннем объеме 1302 посредством магнита 1430.
Следует принять во внимание, что практически всю реакционную жидкость 1704 возвращают в камеру B5 через трубку 190 и переносящую пробу иглу 174, как указано стрелкой 1732, и что лишь микроколичества их остаются в объеме 1302 вместе с магнитными шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами.
Обратимся теперь к фиг.18A—18D, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.18А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.17E, на фиг.18A—18D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B6.
На фиг.18А показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1800, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1802. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V9 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T9 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V9 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B6 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B6. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T9 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B6 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B6.
Камера B6 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 1804, предпочтительно содержащую элюирующий буфер, такой, как трис-буфер или особо чистая рибонуклеаза и вода, не содержащая рибонуклеаз (DDW), промышленные поставки которого осуществляет компания Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль.
На фиг.18B показаны отвод магнита 1430 в направлении от внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1805, и последующий подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1806, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 1804 из камеры B6 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190. Следует принять во внимание, что внутренний объем 1302 уже удерживает магнитные шарики 1412 и нуклеиновые кислоты из пробы 1204, а также любые остаточные микроколичества реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504, 1604 и 1704, как описано выше со ссылками на фиг.17E.
Как видно на фиг.18B, реакционная жидкость 1804 всасывается из камеры B6 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 1808, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1810, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1812, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 1814, причем реакционная жидкость 1804 взаимодействует с содержимым, уже присутствующим в шприце 194.
На фиг.18C показаны последовательно осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 1820, вынуждающие нагнетание реакционной жидкости 1804 и любой остаточной пробы 1204, включающей в себя клеточный детрит, а также магнитные шарики 1412 и связанные с ними нуклеиновые кислоты, по меньшей мере, частично из внутреннего объема 1302 шприца 194 под поршнем 1300 и в этот объем. В результате, взаимодействие нуклеиновых кислот из пробы 1204 с магнитными шариками 1412 прекращается.
На фиг.18C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1804 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504, 1604 и 1704 и материала пробы в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 1822; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1804 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504, 1604 и 1704 и материала пробы, внутри трубки 190, как указано стрелкой 1824; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1804 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504, 1604 и 1704 и материала пробы в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1826; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 1804 вместе с шариками 1412 и связанными с ними нуклеиновыми кислотами, а также любых остаточных микроколичеств реакционных жидкостей 1322, 1410, 1504, 1604 и 1704 и материала пробы, внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 1827. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы прекратить взаимодействие нуклеиновых кислот из пробы 1204 с магнитными шариками 1412.
На фиг.18D показаны нуклеиновые кислоты из пробы 1204, разделенные с магнитными шариками 1412 в растворе, содержащем реакционную жидкость 1804, находящуюся во внутреннем объеме 1302 под поршнем 1300, а поршень 1300 на фиг.18D показан находящимся в полностью поднятом положении, как указано стрелкой 1830. Нуклеиновые кислоты после разделения показаны символически и обозначены позицией 1840.
Следует принять во внимание, что практически всю реакционную жидкость 1804 вместе с магнитными шариками 1412 и нуклеиновыми кислотами 1840 после разделения всасывают из камеры B6 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 1842, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1844, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1846, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300.
Обратимся теперь к фиг.19A—19D, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.19А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.18D, на фиг.19A—19D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A3.
На фиг.19А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 1900, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 1902. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V8 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T7 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V8 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой A3 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 636, оканчивающимся в проеме камеры A3. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T7 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой A3 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 736, оканчивающимся в еще одном проеме камеры A3.
Рядом с камерой A3 снаружи нее предпочтительно находится постоянный магнит 1904. Магнит 1904 предпочтительно простирается в целом параллельно длине камеры A3 и вдоль нее, так что внутреннее пространство камеры A3 предпочтительно находится в магнитной связи с магнитом 1904. Магнит 1904 предпочтительно не образует часть кассеты 100.
На фиг.19B показано опускание поршня 1300, как указано стрелкой 1906, вынуждающее нагнетание реакционной жидкости 1804, включающей в себя разделенные нуклеиновые кислоты 1840 и шарики 1412, в камеру A3.
Как видно на фиг.19B, реакционная жидкость 1804, включающая в себя разделенные нуклеиновые кислоты 1840 и шарики 1412, нагнетается из объема 1302 шприца 194 в трубку 190, как указано стрелкой 1908, после чего - через трубку 190, как указано стрелкой 1909, затем - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1910, а после этого - через микрофлюидный канал 736 в камеру A3, как указано стрелкой 1912, причем эту камеру A3 вентилируют посредством вентилирующей иглы 164.
На фиг.19C показано магнитное притяжение шариков 1412 посредством магнита 1904, так что лишь несвязанные нуклеиновые кислоты 1840 из пробы 1204 остаются свободными в реакционной жидкости 1804, находящейся в камере A3.
На фиг.19D показан частичный подъем поршня 1300 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 1920, вследствие чего осуществляется всасывание порции несвязанных нуклеиновых кислот 1840 из пробы 1204 и реакционной жидкости 1804 из камеры A3 через микрофлюидный канал 736, как указано стрелкой 1922, внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 1924, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 1926, а после этого - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300, как указано стрелкой 1928.
Обратимся теперь к фиг.20A—20D, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.20А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.19D, на фиг.20A—20D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B7.
На фиг.20А показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2000, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2002. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V10 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T10 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V10 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B7 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B7. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T10 нахождения переносящей пробу иглы и камерой B7 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B7.
Камера B7 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 2004, предпочтительно содержащую элюирующий буфер для разбавления, такой, как буфер А для пробы (L-гистидин, 1-тиоглицерин в DDW) или DDW (особо чистая рибонуклеаза и вода, не содержащая рибонуклеаз), промышленные поставки которого осуществляет компания Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль.
На фиг.20B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 2006, что обеспечивает всасывание, по меньшей мере, порции реакционной жидкости 2004 из камеры B7 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 по микрофлюидному каналу 734, внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174 и трубку 190. Следует принять во внимание, что внутренний объем 1302 уже удерживает несвязанные нуклеиновые кислоты 1840 из пробы 1204 и реакционную жидкость 1804, как описано выше со ссылками на фиг.19D.
Как видно на фиг.20B, реакционную жидкость 2004 всасывается из камеры B7 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 2008, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2010, затем - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2012, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2014, причем реакционная жидкость 2004 взаимодействует с содержимым, уже присутствующим в шприце 194.
На фиг.20C показаны последовательно осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 2020, вынуждающие нагнетание реакционной жидкости 2004 и несвязанных нуклеиновых кислот 1840 из пробы 1204, а также остальной реакционной жидкости 1804, по меньшей мере, частично во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема. В результате, несвязанные нуклеиновые кислоты 1840 из пробы 1204 смешивают с реакционной жидкостью 2004 и тем самым осуществляют разбавленные.
На фиг.20C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2004 вместе с несвязанными нуклеиновыми кислотами 1840 из пробы 1204, а также остальной реакционной жидкости 1804, в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2022; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2004 вместе с несвязанными нуклеиновыми кислотами 1840 из пробы 1204, а также остальной реакционной жидкости 1804, внутри трубки 190, как указано стрелкой 2024; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2004 вместе с несвязанными нуклеиновыми кислотами 1840 из пробы 1204, а также остальной реакционной жидкости 1804, в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2026; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2004 вместе с несвязанными нуклеиновыми кислотами 1840 из пробы 1204, а также остальной реакционной жидкости 1804, внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 2028. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смешать нуклеиновые кислоты 1840 и реакционную жидкость 2004.
На фиг.20D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2030, так что несвязанные нуклеиновые кислоты 1840 из пробы 1204, теперь разбавленные реакционной жидкостью 2004, а также остальной реакционной жидкостью 1804, по меньшей мере, почти полностью всасываются во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Следует принять во внимание, что, по меньшей мере, порция реакционной жидкости 2004 вместе с несвязанными нуклеиновыми кислотами 1840 из пробы 1204, а также остальной реакционной жидкости 1804, всасывается из камеры B7 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 2042, внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2044, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2046, а после этого - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300, как указано стрелкой 2048.
Обратимся теперь к фиг.21A—21E, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.21А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.20D, на фиг.21A—21E показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его подсистемой ПЦР-амплификации.
кончика
На фиг.21А показано опускание переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2100, так что полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T11 нахождения  переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T11 нахождения кончика переносящей пробу иглы и подсистемой 600 ПЦР-амплификации предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 752, сопряженным с местом T11 нахождения кончика переносящей пробу иглы и подсистемой 600 ПЦР-амплификации. Вентилирующую иглу 164 предпочтительно оставляют неподвижной в месте V10 нахождения кончика вентилирующей иглы.
Подсистема 600 ПЦР-амплификации предпочтительно производит амплификацию несвязанных нуклеиновых кислот 1840. В общем случае, подсистема 600 ПЦР-амплификации работает следующим образом: несвязанные нуклеиновые кислоты 1840 попадают в подсистему 600 ПЦР-амплификации через микрофлюидный канал 752. Нажатие на поршень 1300 предпочтительно приводит в движение раствор, содержащий несвязанные нуклеиновые кислоты 1840, по ответвлениям 760 канала подсистемы 600 ПЦР-амплификации, и это происходит до тех пор, пока раствор не достигает соответствующей камеры A8—A13, имеющей хранящуюся в ней высушенную реакционную смесь для ПЦР. Эта компоновка облегчает восстановление сухой реакционной смеси для ПЦР внутри камеры A8—A13 и последующую амплификацию нуклеиновых кислот внутри соответствующих камеры 770 амплификации. Газовые пружины 772 предпочтительно обеспечивают равномерное распределение нуклеиновых кислот 1840 среди различных камер ПЦР-амплификации 770. Сразу же после завершения ПЦР-амплификации конечные продукты ПЦР или ампликоны возвращаются в шприц 194 посредством подъема поршня 1300. Между местом T11 нахождения кончика переносящей пробу иглы и подсистемой 600 ПЦР-амплификации можно - по выбору - предусмотреть наличие клапана (не показан), чтобы обеспечить стравливание давления из подсистемы 600 ПЦР-амплификации во время процесса амплификации.
На фиг.21B показано опускание поршня 1300, как указано стрелкой 2110, и тем самым - нагнетание несвязанных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204 с введением в оперативное взаимодействие с подсистемой 600 ПЦР-амплификации через микрофлюидный канал 752. Как видно на фиг.21B, раствор, содержащий несвязанные нуклеиновые кислоты 1840, предпочтительно нагнетается из внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2112, после чего - через трубку 190 по направлению к переносящей пробу игле 174, как указано дополнительной стрелкой 2114, а после этого - вниз через внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174 и в микрофлюидный канал 752, как указано дополнительными стрелками 2116, 2118. Несвязанные нуклеиновые кислоты 1840 затем - предпочтительно - распределяются между камерами A8—A13 с закупоривающими реагент пробками и камерами 770 амплификации через ответвления 760 канала, как указано стрелкой 2119.
На фиг.21C показаны осуществляемые неоднократно подъем и опускание поршня 1300, как указано стрелкой 2120, и таким образом обеспечиваемое неоднократное пропускание раствора, содержащего несвязанные нуклеиновые кислоты 1840, по камерам A8—A13 с закупоривающими реагент пробками и тем самым - восстановление высушенной смеси для ПЦР, находящимся в камерах A8—A13, как указано стрелкой 2122 и как описано выше в таблице II. Раствор, содержащий несвязанные нуклеиновые кислоты 1840, предпочтительно перемещают, взад и вперед за счет повторяемого движения поршня 1300 вдоль пути текучей среды, образованного внутренним объемом 1302 шприца 194, трубкой 190, внутренним проходным каналом 1326 переносящей пробу иглы 174, микрофлюидным каналом 752 и ответвлениями 760 канала, как указано стрелками 2124, 2126, 2128, 2130 и 2132, соответственно.
На фиг.21D показано опускание поршня 1300, как указано стрелкой 2140, и тем самым - нагнетание нуклеиновых кислот 1840 в камеру 770 амплификации. Раствор, содержащий несвязанные нуклеиновые кислоты 1840, предпочтительно нагнетается вдоль пути текучей среды, образованного внутренним объемом 1302 шприца 194, трубкой 190, внутренним проходным каналом 1326 переносящей пробу иглы 174, микрофлюидным каналом 752 и ответвлениями 760 канала, как указано последовательностью стрелок 2142, 2144, 2146, 2148 и 2150, соответственно. Амплификация несвязанных нуклеиновых кислот 1840 символически представлена на фиг.24D несвязанными нуклеиновыми кислотами 1840 высокой плотности, присутствующими в камерах 770 амплификации.
На фиг.21E показан частичный подъем поршня 1300 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 2160, что обеспечивает всасывание амплифицированных несвязанных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204 из камеры 770 амплификации, как указано стрелкой 2162. Амплифицированные несвязанные нуклеиновые кислот 1840 предпочтительно всасываются вдоль ответвлений 760 канала, после чего - через микрофлюидный канал 752, а потом также - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, да еще и после этого - через трубку 190 во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300, как показано, соответственно, последовательностью стрелок 2164, 2166, 2168, 2170 и 2172.
Обратимся теперь к фиг.22A—22G, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.22А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.21E, на фиг.22A—22G показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B8.
На фиг.22А показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2200, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2202. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V11 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T12 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V11 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B8 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B8. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T12 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B8 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 748, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B8.
Как будет ясно из рассмотрения фиг.22A, вдоль микрофлюидного канала 748 предпочтительно присутствует негерметизированная закупоривающая реагент пробка 572. Закупоривающая реагент пробка 572 предпочтительно пуста в случае кассеты 100, используемой совместно с подсистемой 600 для ПЦР, и просто образует пассивную часть проходного канала между переносящей пробу иглой 174 и камерой B8. В других возможных вариантах осуществления данного изобретения, в которых систему АКР-амплификации можно применять совместно с кассетой 100, закупоривающую реагент пробку 572 можно использовать для сохранения сухого реагента АКР.
Камера B8 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 2204, предпочтительно содержащую буфер Amplicon для разбавления, такой, как буфер А для пробы (L-гистидин, 1-тиоглицерин в DDW) или DDW (особо чистая рибонуклеаза и вода, не содержащая рибонуклеаз), промышленные поставки которого осуществляет компания Biological Industries, Бейт-ха-Эмек, Израиль.
На фиг.22B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 2206, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 2204 из камеры B8 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 по микрофлюидному каналу 748, переносящей пробу игле 174 и трубке 190. Следует принять во внимание, что внутренний объем 1302 уже удерживает амплифицированные нуклеиновые кислоты 1840 пробы 1204, как описано выше со ссылками на фиг.21E.
Как видно на фиг.22B, реакционная жидкость 2204 всасывается из камеры B8 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 2208, во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2210, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2212, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2214.
На фиг.22C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 2220, вынуждающие нагнетание реакционной жидкости 2204 вместе с амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840 пробы 1204 - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.22C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2204 вместе с амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840 пробы 1204 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2222; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2204 вместе с амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840 внутри трубки 190, как указано стрелкой 2224; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2204 вместе с амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2226; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 2204 вместе с амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840 внутри микрофлюидного канала 748, как указано стрелкой 2227. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы разбавить амплифицированные нуклеиновые кислоты 1840 реакционной жидкостью 2204.
На фиг.22D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2228, так что реакционная жидкость 2204 вместе с теперь разбавленными нуклеиновыми кислотами 1840, по меньшей мере, почти полностью всасывается во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Следует принять во внимание, что практически вся реакционная жидкость 2204 вместе с разбавленными нуклеиновыми кислотами 1840 всасывается из камеры B8 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 2230, внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2232, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2234, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2236.
На фиг.22E показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2240, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2242. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784, которое выровнено с выпуском 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует Путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся в отверстии 783, которое выровнено со впуском 460 углеродной матрицы, принадлежащим углеродной матрице 440.
На фиг.22F показано частичное опускание поршня 1300 шприца 194 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 2250, так что порция разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 проходит над углеродной матрицей 440, чтобы смыть слой раффинозы, присутствующий на углеродной матрице 440, как описано выше в таблице II. Следует принять во внимание, что этап смывания раффинозы, изображенный на фиг.22F, можно повторять много раз с использованием аликвот разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840, в зависимости от требований к промывке углеродной матрицы 440.
Как видно на фиг.22F, порция разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 вытекает из внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2252, через трубку 190, как указано стрелкой 2254, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2256, через микрофлюидный канал 782, как указано стрелкой 2258, через углеродную матрицу 440 в камеру B14. Происходящее при сливе прохождение порции разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 из углеродной матрицы 440 через выпуск 462 углеродной матрицы, выровненный с отверстием 784 камеры B14, указано на фиг.22F стрелкой 2259.
На фиг.22G показано дальнейшее опускание поршня 1300, как указано стрелкой 2260, вынуждающее нагнетание остатка разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204, по меньшей мере, частично с введением в оперативное взаимодействие с углеродной матрицей 440. Разбавленные амплифицированные нуклеиновые кислоты 1840, также известные как ампликоны, оказываются прикрепленными к предварительно определенным местам на углеродной матрице 440, как подробно описано - среди прочих документов - в следующих патентах США: 5605662; 6238624; 6303082; 6403367; 6524517; 6960298; 7101661; 7601493 и 8288155, описания которых включены сюда посредством ссылки.
Как видно на фиг.22G, остаток разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 вытекает из внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2262, через трубку 190, как указано стрелкой 2264, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2266, через микрофлюидный канал 782, как указано стрелкой 2268, к углеродной матрице 440 через отверстие 783 и выровненное с ним впускное отверстие 462 углеродной матрицы.
Амплифицированные нуклеиновые кислоты 1840 который не становятся прикрепленными к углеродной матрице 440, предпочтительно сливаются из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы, выровненный с отверстием 784 камеры B14, и этот слив указан стрелкой 2270.
Обратимся теперь к фиг.23A и 23B, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A - 2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A - 11F, причем на фиг.23А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.22G, на фиг.23A и 23B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A - 6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A4.
На фиг.23А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2300, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2302. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V14 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T14 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V14 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой A4 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 636, оканчивающимся в проеме камеры A4. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте Т14 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой A4 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 736, оканчивающимся в еще одном проеме камеры A4.
Камера A4 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 2304, предпочтительно содержащую первую смесь дискриминатора, содержащую нуклеиновые кислоты, которые являются комплементарными к специфическим из разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204.
На фиг.23B показан частичный подъем поршня 1300 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 2306, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 2304 из камеры A4 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 по микрофлюидному каналу 736, внутреннему проходному каналу 1326 переносящей пробу иглы 174 и трубке 190.
Как видно на фиг.23B, реакционная жидкость 2304 всасывается из камеры A4 через микрофлюидный канал 736, как указано стрелкой 2308, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2310, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2312, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2314.
Обратимся теперь к фиг.24A—24F, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов эксплуатации кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.24А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.23B, на фиг.24A—24F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A - 6H и показано оперативное взаимодействие с камерой B10 и его матрицей датчиков.
На фиг.24А показаны подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2400, и опускание переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2402. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V13 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V13 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B10. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 748, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B10.
Как будет ясно из рассмотрения фиг.24A, вдоль микрофлюидного канала 748 предпочтительно присутствует негерметизированная закупоривающая реагент пробка 572. Закупоривающая реагент пробка 572 предпочтительно пуста в случае кассеты 100, используемой совместно с подсистемой 600 для ПЦР, и просто образует пассивную часть проходного канала между переносящей пробу иглой 174 и камерой B10. В других возможных вариантах осуществления данного изобретения, в которых систему АКР-амплификации можно применять совместно с кассетой 100, закупоривающую реагент пробку 572 можно использовать для сохранения сухого реагента АКР.
Камера B10 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 2404, предпочтительно содержащую буфер для разбавления смеси дискриминатора. Реакционная жидкость 2404 предпочтительно содержит высокосолевой буфер (ВСБ, как NaPO4, NaCl, тритон, pH 7,4.
На фиг.24B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 2406, что обеспечивает всасывание порции реакционной жидкости 2404 из камеры B10 во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 по микрофлюидному каналу 748, внутреннему проходному каналу 1326 переносящей пробу иглы 174 и трубке 190, причем в этом внутреннем объеме 1302 шприца 194 уже удерживается реакционная жидкость 2304.
Как видно на фиг.24B, реакционная жидкость 2404 всасывается из камеры B10 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 2408, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2410, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2412, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2414, причем реакционная жидкость 2404 взаимодействует с уже присутствующей реакционной жидкостью 2304.
На фиг.24C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 2420, вынуждающие нагнетание реакционных жидкостей 2304 и 2404, содержащих первую смесь дискриминатора, а значит и буфера - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема через трубку 190, внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174 и микрофлюидный канал 748.
На фиг.24C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2304 и 2404 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2422; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2304 и 2404 внутри трубки 190, как указано стрелкой 2424; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2304 и 2404 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2426; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2304 и 2404 внутри микрофлюидного канала 748, как указано стрелкой 2427. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смешать реакционные жидкости 2304 и 2404 и таким образом разбавить первую смесь дискриминатора, содержащую реакционную жидкость 2304, буфером дискриминатора, содержащим реакционную жидкость 2404.
На фиг.24D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2428, так что реакционная жидкость 2304, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, оказывается, по меньшей мере, почти полностью всосавшейся во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Как видно на фиг.24D, реакционная жидкость 2304, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, всасывается из камеры B10 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 2430, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2432, затем - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2434, а после этого - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300, как указано стрелкой 2436.
На фиг.24E показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2440, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2442. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B) и выпуск 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся в отверстии 783 (фиг.6B), которое выровнено со впуском 460 углеродной матрицы, принадлежащим углеродной матрице 440.
На фиг.24F показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2444, так что реакционная жидкость 2304, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, нагнетается с введением в оперативное взаимодействие с углеродной матрицей 440, а конкретнее - с разбавленными амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840, которые оказываются прикрепленными к предварительно определенным местам на углеродной матрице 440. В той степени, в которой нуклеиновые кислоты в разбавленной первой смеси дискриминатора являются комплементарными к разбавленным амплифицированным нуклеиновым кислотам 1840, происходит гибридизация.
Как видно на фиг.24F, реакционная жидкость 2304, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, вытекает из внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2450, через трубку 190, как указано стрелкой 2452, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2454, через микрофлюидный канал 782, как указано стрелкой 2456, к углеродной матрице 440 через отверстие 783 (фиг.6B) и выровненное с ним впускное отверстие 462 углеродной матрицы.
Нуклеиновые кислоты, содержащиеся в разбавленной первой смеси 2304 дискриминатора, которые не комплементарны к разбавленным амплифицированным нуклеиновым кислотам 1840 и которые поэтому не оказываются прикрепленными к углеродной матрице 440, предпочтительно сливаются из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы, выровненный с отверстием 784 (фиг.6B) камеры B14, как указано стрелкой 2460.
Обратимся теперь к фиг.25A и 25B, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.25А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.24F, на фиг.25A и 25B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A5.
На фиг.25А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2500, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2502. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V16 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T16 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V16 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой A5 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 636, оканчивающимся в проеме камеры A5. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T16 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой A5 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 736, оканчивающимся в еще одном проеме камеры A5.
Камера A5 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 2504, предпочтительно содержащую вторую смесь дискриминатора, содержащую нуклеиновые кислоты, которые являются комплементарными к другим из разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204.
На фиг.25B показан частичный подъем поршня 1300 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 2506, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 2504 из камеры A5 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 по микрофлюидному каналу 736, внутреннему проходному каналу 1326 переносящей пробу иглы 174 и трубке 190.
Как видно на фиг.25B, реакционная жидкость 2504 всасывается из камеры A5 через микрофлюидный канал 736, как указано стрелкой 2508, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2510, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2512, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2514.
Обратимся теперь к фиг.26A—26F, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A - 11F, причем на фиг.26А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.25B, на фиг.26A—26F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с камерой B10 и его матрицей датчиков.
На фиг.26А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2600, и подъем переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2602. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V13 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V13 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B10. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 748, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B10.
Как будет ясно из рассмотрения фиг.26A, вдоль микрофлюидного канала 748 предпочтительно присутствует негерметизированная закупоривающая реагент пробка 572. Закупоривающая реагент пробка 572 предпочтительно пуста в случае кассеты 100, используемой совместно с подсистемой 600 для ПЦР, и просто образует пассивную часть проходного канала между переносящей пробу иглой 174 и камерой B10. В других возможных вариантах осуществления данного изобретения, в которых систему АКР-амплификации можно применять совместно с кассетой 100, закупоривающую реагент пробку 572 можно использовать для сохранения сухого реагента АКР.
Как описано выше со ссылками на фиг.24A, камера B10 предпочтительно содержит реакционную жидкость 2404, предпочтительно содержащую буфер для разбавления смеси дискриминатора. Реакционная жидкость 2404 предпочтительно содержит высокосолевой буфер (ВСБ), такой, как NaPO4, NaCl, тритон, pH 7,4.
На фиг.26B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 2606, что обеспечивает всасывание дополнительной порции реакционной жидкости 2404 из камеры B10 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190, причем этом внутреннем объеме 1302 уже удерживается реакционная жидкость 2504.
Как видно на фиг.26B, реакционная жидкость 2404 всасывается из камеры B10 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 2608, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2610, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2612, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2614, причем реакционная жидкость 2404 взаимодействует с уже присутствующей реакционной жидкостью 2504.
На фиг.26C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 2620, вынуждающие нагнетание реакционных жидкостей 2504 и 2404, содержащих вторую смесь дискриминатора, а значит и буфера - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.26C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2504 и 2404 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2622; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2504 и 2404 внутри трубки 190, как указано стрелкой 2624; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2504 и 2404 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2626; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2504 и 2404 внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 2627. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смешать реакционные жидкости 2504 и 2404 и таким образом разбавить вторую смесь дискриминатора, содержащую реакционную жидкость 2504 буфером дискриминатора, содержащим реакционную жидкость 2404.
На фиг.26D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2628, так что реакционная жидкость 2504, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, оказывается, по меньшей мере, почти полностью всосавшейся во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Как видно на фиг.26D, реакционные жидкости 2404 и 2504 отсасываются из камеры B10 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 2630, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2632, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2634, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2636.
На фиг.26E показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2640, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2642. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B) и выпуск 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся на впуске 460 углеродной матрицы 440.
На фиг.26F показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2644, так что реакционные жидкости 2504 и 2404 нагнетаются с введением в оперативное взаимодействие с углеродной матрицей 440, а конкретнее - с разбавленными амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840, которые оказываются прикрепленными к предварительно определенным местам на углеродной матрице 440. Реакционные жидкости 2504 и 2404 вытесняют реакционные жидкости 2304 и 2404, присутствовавшие ранее, причем вытесняемые реакционные жидкости 2304 и 2404 предпочтительно сливаются из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы и вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B), как указано стрелкой 2660. В той степени, в которой нуклеиновые кислоты в разбавленной первой смеси дискриминатора являются комплементарными к разбавленным амплифицированным нуклеиновым кислотам 1840, происходит гибридизация.
Обратимся теперь к фиг.27A и 27B, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.27А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.26F, на фиг.27A и 27B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A6.
На фиг.27А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2700, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2702. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V18 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T18 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V18 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой A6 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 636, оканчивающимся в проеме камеры A6. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T18 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой A6 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 736, оканчивающимся в еще одном проеме камеры A6.
Камера A6 предпочтительно содержит еще одну дополнительную реакционную жидкость 2704, предпочтительно содержащую третью смесь дискриминатора, содержащую нуклеиновые кислоты, которые являются комплементарными к еще одним другим из разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204.
На фиг.27B показан частичный подъем поршня 1300 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 2706, что обеспечивает отсасывание реакционной жидкости 2704 из камеры A6 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190.
Как видно на фиг.27B, реакционная жидкость 2704 отсасывается из камеры A6 через микрофлюидный канал 736, как указано стрелкой 2708, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2710, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2712, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2714.
Обратимся теперь к фиг.28A—28F, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.28А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.27B, на фиг.28A—28F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с камерой B10 и его матрицей датчиков.
На фиг.28А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2800, и подъем переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2802. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V13 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V13 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B10. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B10.
Как будет ясно из рассмотрения фиг.28A, вдоль микрофлюидного канала 748 предпочтительно присутствует негерметизированная закупоривающая реагент пробка 572. Закупоривающая реагент пробка 572 предпочтительно пуста в случае кассеты 100, используемой совместно с подсистемой 600 для ПЦР, и просто образует пассивную часть проходного канала между переносящей пробу иглой 174 и камерой B10. В других возможных вариантах осуществления данного изобретения, в которых систему АКР-амплификации можно применять совместно с кассетой 100, закупоривающую реагент пробку 572 можно использовать для сохранения сухого реагента АКР.
Как описано выше со ссылками на фиг.24A, камера B10 предпочтительно содержит реакционную жидкость 2404, предпочтительно содержащую буфер для разбавления смеси дискриминатора. Реакционная жидкость 2404 предпочтительно содержит высокосолевой буфер (ВСБ), такой, как NaPO4, NaCl, тритон, pH 7,4.
На фиг.28B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 2806, что обеспечивает отсасывание дополнительной порции реакционной жидкости 2404 из камеры B10 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190, причем эта камера B10 уже удерживает реакционную жидкость 2704.
Как видно на фиг.28B, реакционная жидкость 2404 отсасывается из камеры B10 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 2808, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2810, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2812, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2814, причем реакционная жидкость 2404 взаимодействует с уже присутствующей реакционной жидкостью 2704.
На фиг.28C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 2820, вынуждающие нагнетание реакционных жидкостей 2704 и 2404, содержащих третью смесь дискриминатора, а значит и буфера - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.28C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2704 и 2404 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 2822; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2704 и 2404 внутри трубки 190, как указано стрелкой 2824; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2704 и 2404 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2826; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2704 и 2404 внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 2827. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смешать реакционные жидкости 2704 и 2404 и таким образом разбавить третью смесь дискриминатора, содержащую реакционную жидкость 2704, буфером дискриминатора, содержащим реакционную жидкость 2404.
На фиг.28D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2828, так что реакционная жидкость 2704, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, оказывается, по меньшей мере, почти полностью всосавшейся во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Как видно на фиг.28D, реакционные жидкости 2704 и 2404 всасываются из камеры B10 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 2830, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2832, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2834, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2836.
На фиг.28E показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2840, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2842. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B) и выпуск 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся на впуске 460 углеродной матрицы 440.
На фиг.28F показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 2844, так что реакционные жидкости 2704 и 2404 нагнетаются с введением в оперативное взаимодействие с углеродной матрицей 440, а конкретнее - с разбавленными амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840, которые оказываются прикрепленными к предварительно определенным местам на углеродной матрице 440. Реакционные жидкости 2704 и 2404 вытесняют реакционные жидкости 2504 и 2404, присутствовавшие ранее, причем вытесняемые реакционные жидкости 2504 и 2404 предпочтительно сливаются из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы и вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B), как указано стрелкой 2860. В той степени, в которой нуклеиновые кислоты в разбавленной третьей смеси 2704 дискриминатора являются комплементарными к разбавленным амплифицированным нуклеиновым кислотам 1840, происходит гибридизация.
Обратимся теперь к фиг.29A и 29B, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.29А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.28F, на фиг.29A и 29B показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой A7.
На фиг.29А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 2900, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 2902. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V20 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T20 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V20 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой A7 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 636, оканчивающимся в проеме камеры A7. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T20 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой A7 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 736, оканчивающимся в еще одном проеме камеры A7.
Камера A7 предпочтительно содержит еще одну дополнительную реакционную жидкость 2904, предпочтительно содержащую четвертую смесь дискриминатора, содержащую нуклеиновые кислоты, которые оказываются комплементарными к еще одним другим из разбавленных амплифицированных нуклеиновых кислот 1840 пробы 1204.
На фиг.29B показан частичный подъем поршня 1300 в некоторое его промежуточное положение, как указано стрелкой 2906, что обеспечивает отсасывание реакционной жидкости 2904 из камеры A7 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190.
Как видно на фиг.29B, реакционная жидкость 2904 отсасывается из камеры A7 через микрофлюидный канал 736, как указано стрелкой 2908, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 2910, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 2912, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 2914.
Обратимся теперь к фиг.30A—30F, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.30А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.29B, на фиг.30A—30F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с камерой B10 и его матрицей датчиков.
На фиг.30А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 3000, и подъем переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 3002. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V13 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V13 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B10. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T15 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B10 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 748, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B10.
Как будет ясно из рассмотрения фиг.30A, вдоль микрофлюидного канала 748 предпочтительно присутствует негерметизированная закупоривающая реагент пробка 572. Закупоривающая реагент пробка 572 предпочтительно пуста в случае кассеты 100, используемой совместно с подсистемой 600 для ПЦР, и просто образует пассивную часть проходного канала между переносящей пробу иглой 174 и камерой B10. В других возможных вариантах осуществления данного изобретения, в которых систему АКР-амплификации можно применять совместно с кассетой 100, закупоривающую реагент пробку 572 можно использовать для сохранения сухого реагента АКР.
Как описано выше со ссылками на фиг.24A, камера B10 предпочтительно содержит реакционную жидкость 2404, предпочтительно содержащую буфер для разбавления смеси дискриминатора. Реакционная жидкость 2404 предпочтительно содержит высокосолевой буфер (ВСБ), такой, как NaPO4, NaCl, тритон, pH 7,4.
На фиг.30B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 3006, что обеспечивает отсасывание еще одной дополнительной порции реакционной жидкости 2404 из камеры B10 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190, причем эта камера B10 уже удерживает реакционную жидкость 2904.
Как видно на фиг.30B, реакционная жидкость 2404 отсасывается из камеры B10 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 3008, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3010, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 3012, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 3014, причем реакционная жидкость 2404 взаимодействует с уже присутствующей реакционной жидкостью 2904.
На фиг.30C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 3020, вынуждающие нагнетание реакционных жидкостей 2904 и 2404, содержащих четвертую смесь дискриминатора, а значит и буфера - неоднократно - во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300 и из этого объема во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174.
На фиг.30C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2904 и 2404 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 3022; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2904 и 2404 внутри трубки 190, как указано стрелкой 3024; осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2904 и 2404 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3026; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционных жидкостей 2904 и 2404 внутри микрофлюидного канала 734, как указано стрелкой 3027. Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы смешать реакционные жидкости 2904 и 2404 и таким образом разбавлять четвертую смесь дискриминатора содержащую реакционную жидкость 2904, буфером дискриминатора, содержащим реакционную жидкость 2404.
На фиг.30D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 3028, так что реакционная жидкость 2904, теперь разбавленная реакционной жидкостью 2404, оказывается, по меньшей мере, почти полностью всосавшейся во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Как видно на фиг.30D, реакционные жидкости 2904 и 2404 всасываются из камеры B10 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 3030, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3032, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 3034, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 3036.
На фиг.30E показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 3040, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 3042. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B) и выпуск 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся на впуске 460 углеродной матрицы 440.
На фиг.30F показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 3044, так что реакционные жидкости 2904 и 2404 нагнетаются с введением в оперативное взаимодействие с углеродной матрицей 440, а конкретнее - с разбавленными амплифицированными нуклеиновыми кислотами 1840, которые оказываются прикрепленными к предварительно определенным местам на углеродной матрице 440. Реакционные жидкости 2904 и 2404 вытесняют раньше присутствующие реакционные жидкости 2704 и 2404, причем вытесняемые реакционные жидкости 2704 и 2404 предпочтительно сливаются из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы и вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B), как указано стрелкой 3060. В той степени, в которой нуклеиновые кислоты в разбавленной четвертой смеси 2904 дискриминатора оказываются комплементарными к разбавленным амплифицированным нуклеиновым кислотам 1840, происходит гибридизация.
Обратимся теперь к фиг.31A—31F, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.31А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.30F, на фиг.31A—31F показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B9 и с его матрицей датчиков.
T13
На фиг.31А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 3100, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 3102. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V12 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T13 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V12 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B9 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B9. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте  нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B9 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 748, сообщающимся с отверстием 556 для переноса реагента камеры B9 через закупоривающую реагент пробку 572.
Как будет ясно из рассмотрения фиг.31A, вдоль микрофлюидного канала 748 предпочтительно присутствует негерметизированная закупоривающая реагент пробка 572. Закупоривающая реагент пробка 572 предпочтительно имеет хранящийся на ней высушенный репортер 3103, который содержит нуклеиновые кислоты, связанные с флуоресцентными красками, которые гибридизируются с получением любой одной или более из комплементарных нуклеиновых кислот, содержащихся в смесях 2304, 2504, 2704 и 2904 дискриминаторов с первой по четвертую. Обнаружение флуоресцентных красок в предварительно определенных местах в углеродной матрице 440 указывает, который из дискриминаторов является комплементарным для участка-мишени некоторой предварительно определенной нуклеиновой кислоты, и тем самым обеспечивает индикацию присутствия некоторой конкретной нуклеиновой кислоты в пробе 1204.
Камера B9 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 3104, предпочтительно содержащую буфер для восстановления репортера. Реакционная жидкость 3104 предпочтительно содержит высокосолевой буфер (ВСБ) (NaPO4, NaCl, тритон, pH 7,4), если репортер 3103 сушат в DDW, или DDW если репортер 3103 сушат в ВСБ.
На фиг.31B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 3106, что обеспечивает отсасывание реакционной жидкости 3104 из камеры B9 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 посредством переносящей пробу иглы 174 и трубки 190. Как видно на фиг.31B, реакционная жидкость 3104 отсасывается из камеры B9 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 3108, и по закупоривающей реагент пробке 572, на которой имеется высушенный репортер 3103, как указано стрелкой 3109. Реакционная жидкость 3104 предпочтительно растворяет, по меньшей мере, порцию высушенного репортера 3103 при контакте с ним. Реакционная жидкость 3104 вместе с растворенной порцией репортера 3103 предпочтительно всасывается затем по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3110, а потом также - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 3112, да еще и после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 3114.
Следует принять во внимание, что протекание реакционной жидкости 3104 по закупоривающей реагент пробке 572, на которой имеется высушенный репортер 3103, изображено на фиг.31B очень упрощенно, чтобы схематически представить прохождение реакционной жидкости 3104 относительно закупоривающей реагент пробки 572.
На фиг.31C показаны осуществляемые неоднократно опускание и подъем поршня 1300, как указано стрелкой 3120, вынуждающие осуществляемое неоднократно нагнетание реакционной жидкости 3104, содержащей буфер для восстановления репортера, во внутренний объем 1302 шприца 194 - и из него - через внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174 и посредством of закупоривающую реагент пробку 572, имеющую остающийся на ней высушенный репортер 3103.
На фиг.31C также показаны: осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 3104 и растворенного репортера 3103 в пределах внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 3122; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 3104 и растворенного репортера 3103 внутри трубки 190, как указано стрелкой 3124; осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 3104 и растворенного репортера 3103 в пределах внутреннего канала 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3126; и осуществляемое неоднократно перемещение реакционной жидкости 3104 и растворенного репортера 3103 внутри микрофлюидного канала 748 и по закупоривающей реагент пробке 572, как указано стрелкой 3127.
Следует принять во внимание, что подъем и опускание поршня 1300 предпочтительно осуществляют много раз, чтобы и растворить весь репортер 3103, содержащийся на закупоривающей реагент пробке 572, реакционной жидкостью 3104, и смешать реакционную жидкость 3104 с растворенным в ней репортером 3103, тем самым восстанавливая репортер 3103.
На фиг.31D показан подъем поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 3128, так что реакционная жидкость 3104, имеющая смешанный с ней репортер 3113, оказывается, по меньшей мере, почти полностью всосавшейся во внутренний объем 1302 шприца 194 под поршень 1300.
Следует принять во внимание, что практически всю реакционную жидкость 3104 вместе с репортером 3103 отсасывают из камеры B9 через микрофлюидный канал 748, как указано стрелкой 3130, после чего - по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3132, затем - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 3134, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 3136.
На фиг.31E показано опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 3140, и переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 3142. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B), которое выровнено с выпуском 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся в отверстии 783, которое выровнено со впуском 460 углеродной матрицы, принадлежащим углеродной матрице 440.
На фиг.31F показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 3150, вынуждающее нагнетание восстановленного репортера, содержащего реакционную жидкость 3104, и репортера 3103, вводимых в оперативное взаимодействие с внутренним пространством углеродной матрицы 440, через впуск 460 углеродной матрицы, а конкретно - с нуклеиновыми кислотами, содержащимися в дискриминаторах с первого по четвертый, оказывающимися прикрепленными к предварительно определенным местам на углеродной матрице 440. В той степени, в которой нуклеиновые кислоты в восстановленном репортере являются комплементарными к нуклеиновым кислотам в одном или более из дискриминаторах с первого по четвертый, происходит гибридизация в месте нахождения релевантного дискриминатора. Восстановленный репортер, содержащий реакционную жидкость 3104, смешанную с репортером 3103, вытесняет реакционные жидкости 2904 и 2404, присутствовавшие ранее, причем вытесняемые реакционные жидкости 2904 и 2404 предпочтительно сливаются из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы и вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B), как указано стрелкой 3151.
Как видно на фиг.31F, восстановленный репортер, содержащий реакционную жидкость 3104 и репортер 3103, вытекает из внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 3152, через трубку 190, как указано стрелкой 3154, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3156, через микрофлюидный канал 782, как указано стрелкой 3158, и к углеродной матрице 440 через впуск 460 углеродной матрицы.
Обратимся теперь к фиг.32A—32D, где представлены упрощенные изображения еще одних осуществляемых в типичных случаях дополнительных этапов работы кассеты, такой, как показанная на фиг.1A—2, включая узел сердцевины согласно фиг.4A—11F, причем на фиг.32А показано рабочее состояние, наступающее после показанного на фиг.31F, на фиг.32A—32D показано микрофлюидное основание согласно фиг.6A—6H и показано оперативное взаимодействие с его камерой B13 основания и с его матрицей датчиков.
На фиг.32А показан подъем вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 3200, и опускание переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 3202. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V19 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T22 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V19 нахождения кончика вентилирующей иглы и камерой B13 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B13. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T22 нахождения кончика переносящей пробу иглы и камерой B13 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 734, оканчивающимся в отверстии 556 для переноса реагента камеры B13.
Камера B13 предпочтительно содержит дополнительную реакционную жидкость 3204, предпочтительно содержащую буфер для промывки датчиков, такой, как низкосолевой буфер (НСБ) (NaPO4, тритон, pH 7,4).
На фиг.32B показан подъем поршня 1300 в его полностью выдвинутое положение, как указано стрелкой 3206, что обеспечивает всасывание реакционной жидкости 3204 из камеры B13 во внутренний объем 1302 под поршень 1300 по микрофлюидному каналу 734, переносящей пробу игле 174 и трубке 190.
Как видно на фиг.32B, реакционная жидкость 3204 всасывается из камеры B13 через микрофлюидный канал 734, как указано стрелкой 3208, во внутренний проходной канал 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3210, после чего - вдоль трубки 190, как указано стрелкой 3212, а после этого - во внутренний объем 1302 под поршень 1300, как указано стрелкой 3214.
На фиг.32C показаны опускание вентилирующей иглы 164, как указано стрелкой 3240, и подъем переносящей пробу иглы 174, как указано дополнительной стрелкой 3242. Полый заостренный конец 1310 вентилирующей иглы 164 предпочтительно вводят на место V21 нахождения кончика вентилирующей иглы, а полый заостренный конец 1312 переносящей пробу иглы 174 предпочтительно вводят на место T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы. Между заостренным концом 1310 вентилирующей иглы 164 в месте V21 нахождения кончика вентилирующей иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь вентиляции для текучей среды, причем этот путь вентиляции для текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 634, оканчивающимся в вентиляционном отверстии 554 камеры B14, причем эта камера B14, в свою очередь, предпочтительно соединена с углеродной матрицей 440 через вентиляционное отверстие 784 (фиг.6B), которое выровнено с выпуском 462 углеродной матрицы. Между заостренным концом 1312 переносящей пробу иглы 174 в месте T21 нахождения кончика переносящей пробу иглы и углеродной матрицей 440 предпочтительно присутствует путь для переноса текучей среды, причем этот путь для переноса текучей среды предпочтительно образован микрофлюидным каналом 782, оканчивающимся в отверстии 783 (фиг.6B), которое выровнено со впуском 460 углеродной матрицы, принадлежащим углеродной матрице 440.
На фиг.32D показано опускание поршня 1300 шприца 194, как указано стрелкой 3250, вынуждающее нагнетание реакционной жидкости 3204, оказывающейся вводимой в оперативное взаимодействие с внутренним пространством углеродной матрицы 440, тем самым промывая углеродную матрицу 440. Реакционная жидкость 3204 вытесняет реакционную жидкость 3104, присутствовавшую ранее, причем эта вытесняемая реакционная жидкость 3104 предпочтительно сливается из углеродной матрицы 440 в камеру B14 через выпуск 462 углеродной матрицы и вентиляционным отверстием 784 (фиг.6B), как указано стрелкой 3251.
Как видно на фиг.32D, реакционная жидкость 3204 вытекает из внутреннего объема 1302 шприца 194, как указано стрелкой 3252, через трубку 190, как указано стрелкой 3254, по внутреннему каналу 1326 переносящей пробу иглы 174, как указано стрелкой 3256, через микрофлюидный канал 782, как указано стрелкой 3258, и к углеродной матрице 440 через впуск 460 углеродной матрицы.
Понятно, что углеродную матрицу 440 можно промывать всем объемом реакционной жидкости 3204 за один этап, как изображено на фиг.32D, или можно промывать аликвотами реакционной жидкости 3204 за несколько этапов, а между такими этапами осуществляют постепенное опускание поршня 1300 отдельными приращениями.
После промывки углеродной матрицы 440 предпочтительно формируют ее изображения.
Следует принять во внимание, что нагрев пробы 1204, описанной выше со ссылками на фиг.13F, а также движение магнита 1430, вентилирующей и переносящей пробу игл 164 и 174 и поршня 1300, описанных выше, предпочтительно обеспечивают посредством компьютеризованного контроллера и механизма, которые не являются частью кассеты 100.
Также следует по достоинству оценить тот факт, что те содержимые камер, которые описаны со ссылками на таблицы I—II и фиг.13A—32D и которые охарактеризованы как представленные в виде концентрированной текучей среды, требующей разбавления, в альтернативном варианте могут присутствовать в виде порошка или твердого вещества, требующего восстановления.
Кроме того, очевидно, что объем текучей среды, показанный в различных камерах, переносящей пробу игле 174 и шприце 194 на различных стадиях по всему процессу, описанных выше со ссылками на фиг.13A—32D, показаны не в масштабе и могут иллюстрировать объем текучей среды, больший или меньший, чем присутствующий на самом деле.
Специалисты в данной области техники поймут, что данное изобретение не ограничивается тем, что было конкретно описано выше, и включает в себя как комбинации, так и подкомбинации признаков, описанных выше, а также их эквиваленты и модификации, которые станут понятными специалистам в данной области техники по прочтении вышеизложенного и отсутствуют в известных технических решениях.