Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на перфузию ишемизированного миокарда в эксперименте

 I I I I I I I 4- I   TT1

Оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на перфузию ишемизированного миокарда в эксперименте

А.А. Матюков

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

A.A. Matyukov

Effect of Bone Marrow Cell Intramyocardial Autotransplantation upon Perfusion of Ischemic Myocardium in Experiment

Saint-Petersburg State Pavlov Medical University

В работе представлены результаты изучения влияния аутологичной интрамиокардиальной трансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга и ядросодержащей фракции костного мозга на перфузию ишемизированного миокарда кролика. Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценку перфузии миокарда проводили методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии с использованием радиофармацевти-ческого препарата (РФП) 99тТс-тетрафосмина (Муо^еш) перед моделированием инфаркта миокарда и спустя 10 суток, 1,5 месяца, 3 месяца, 6 и 12 месяцев. Были сформированы три группы животных: 1 группа (п=12), которым в ишемизированную зону вводились ММСК костного мозга (2^1СР), 2 группа (п=14) - вводилась ядросодержащая фракция костного мозга (2*1СР) и 3 группа (п=15, контрольная), которым вводилась ростовая среда.

У всех животных 1-й и 2-й групп через 1,5 месяца после операции отмечалось значительное улучшение перфузии. Средние значения накопления РФП составили 0,92+0,03 и 0,89+0,03, соответственно. В контрольной группе - 0,62+0,02. К 3 месяцам после операции полная нормализация перфузии отмечалась в опытных группах, где уровень накопления РФП составил 1,00+0,02 и 0,98+0,01, тогда как в контрольной группе этот показатель не увеличился и равнялся 0,61+0,01. Показатели равномерности перфузии в патологической и референтной зонах на 10-е сутки после операции составили: в 1-й группе - 2,7+0,2 и 2,1+0,2; во 2-й -2,6±0,2 и 1,8+0,3; в контрольной - 2,8±0,3 и 2,1+0,1. Через 3 месяца после моделирования инфаркта в 1-ой и 2-ой группах эти значения достоверно не отличались (1,9+0,2; 2,0+0,1 и 2,1 +0,1; 2,0+0,2); в контрольной группе неравномерность перфузии значительно выросла и составила 3,5+0,2 в пораженном сегменте по отношению к 2,0+0,1 в интактном сегменте.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, перфузия миокарда, однофотонная эмиссионная компьютерная томография.

Введение

Ишемическая болезнь сердца [ИБС] представляет собой широко распространенное заболевание и является основной причиной смертности в большинстве промышленно развитых стран мира [1 ]. Необратимое повреждение кардиомио-цитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности. Используемые в настоящее время для лечения ишемии миокарда консервативные и оперативные методы не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин [2]. В связи с этим разрабатываются новые способы влияния на регенерацию пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии. Так, в последние 5-7 лет успешно реализуется

The article presents results of investigation into comparative evaluation of the effects of autologous intramyocardial transplantation of multipotent mesenchymal stromal cells taken from bone marrow and of mononuclear bone marrow fraction upon perfusion of a rabbit ischemic myocardium. Myocardial infarction was simulated by means of ligation of the left coronary artery descending branch. Myocardium perfusion was evaluated with single-photon emission computed tomography with the application of a radiopharmaceutic drug (RPD) 99mTc-tetraphosmine (Myoview) prior to the simulation of myocardial infarction and in 10 days, 1.5 months, 3,6 and 12 months. The animals were divided into three groups: the 1st group (n=12) included animals whom multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells were introduced into the ischemic zone (2H106); in the 2nd group (n=14) mononuclear bone marrow fraction was introduced (2H106); and the 3rd group (n=15, control) where growth medium was used.

In all the animals of the 1st and 2nd groups, considerable improvement of perfusion was observed in 1.5 months following the operation. Mean values of the RPD accumulation were 0.92±0.03 and 0.89±0.031 respectively. In the control group this value was 0.62±0.02. By the third month following the operation complete normalizing of perfusion occurred in the experimental groups with the RPD accumulation level of 1.00±0.02 and 0.98±0.01, whereas this parameter did not increase in the control group and was 0.61±0.01. On the 10th day afterthe operation the perfusion evenness parameters in pathologic and reference zones were as follows: in the 1st group - 2.7±0.2 and 2.1±0.2; in the 2nd group - 2.6±0.2 and 1.8±0.3; in the controls - 2.8±0.3 and 2.1 ±0.1. In 3 months after the infarction simulation these values did not significantly differ in the 1st and 2nd groups (1.9±0.2; 2.0±0.1 and 2.1±0.1; 2.0±0.2); in the controls the unevenness of perfusion increased considerably and amounted up to 3.5±0.2 in the damaged segment as compared with 2.0±0.1 in the intact one.

Key words: myocardial infarction, multipotent srtomal cells, mononuclear cells, bone marrow, autologous transplantation, perfusion of myocardium, single-photon emission computed tomography.

идея клеточной трансплантации для лечения ИБС. При этом многообещающим стал метод трансплантации клеток с целью замещения некротизированного миокарда вновь образованными кардиомиоцитами и стимуляции неоангиогенеза [3, 4]. Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования. Одним из них является вопрос о наиболее эффективном типе клеток для стимуляции ангиогенеза. В эксперименте на модели острого инфаркта миокарда было предложено использовать различные типы клеток для стимуляции неоангиогенеза в ишемизированой зоне: гемопоэтические стволовые клетки

[5], эндотелиальные прогениторные клетки пуповинной крови

[6], эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизованные

lililí

Оригинальные исследования

I I I

в периферический кровоток [7], эндотелиальные прогени-торные клетки костного мозга [8], ядросодержащие клетки (ЯСК) костного мозга [9] и периферической крови [10], муль-типотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) костного мозга [11 ]. Из всего многообразия используемых типов клеток наиболее перспективным является трансплантация аутогенных клеток в связи с отсутствием необходимости им-муносупрессивной терапии, которая обычно требуется после трансплантации эмбриональных и фетальных клеток, а также в связи с отсутствием этических и юридических проблем. Данные литературы свидетельствуют, что в настоящее время среди аутогенного клеточного материала чаще всего используются ядросодержащая фракция костного мозга и ММСК костного мозга [12]. Однако экспериментальных работ по сравнительной эффективности трансплантации этих клеток мало, а полученные результаты противоречивы.

Большинство экспериментальных работ по изучению влияния трансплантации клеток на репарацию миокарда выполнялись на модели инфаркта миокарда у мелких грызунов, которые, как известно, обладают выраженными адаптационными способностями, что, с нашей точки зрения, не позволяет достоверно оценить эффект от проводимой терапии [13].

Для моделирования инфаркта в эксперименте используются разнообразные способы воздействия на миокард: низкие и высокие температуры, лазер, токсины, фармакологические препараты и т. п. [14]. К сожалению, эти способы не позволяют в полной мере воспроизвести ситуацию, возникающую в клинике. Достаточно точно данный патологический процесс удается имитировать путем перевязки коронарной артерии.

Для оценки эффективности влияния трансплантации клеток на кровоснабжение ишемизированного миокарда применяются различные методы. В настоящее время золотым стандартом в оценке уровня перфузии и метаболизма миокарда являются однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионная томография. Использование этих методов в эксперименте представляется весьма привлекательным, однако зачастую из-за величины изучаемого объекта получаемое разрешение не позволяет проводить оценку данных [1 5].

Кроме того, для определения эффективности и безопасности трансплантации клеток важно проводить оценку результатов не только в ближайшие, но и в отдаленные сроки. Однако большинство исследований отражает оценку результатов в среднем до полугода, а результаты на более поздних

cporax пpeдcтaвлeны единичными cooбщeниями [12].

Цель paбoты - oцeнить влияние ayтoгeннoй тpaнcплaнтa-ции клеток mcmora мoзгa нa пepфyзию миoкapдa y ^лигав пocлe инфapктa, мoдeлиpoвaннoгo путєм кopoнapooкклюзии, c иcпoльзoвaниeм мeтoдa OФЭKT нa paзныx cporax.

Материалы и методы

Экcпepимeнты пpoвeдeны нa кpoликax-caмцax линии Шиншиллa мaccoй 2,7-3,0 кг. Boзpacт живoтныx к нaчaлy экcпepимeнтa cocтaвлял 3-4 мecяцa.

1. Выделение, культивирование и характеристика

полученных клеток

В paбoтe иcпoльзoвaли кyльтypy MMCK и ЯС^ пoлyчeн-ные из acпиpaтa ^^moro мoзгa.

Acпиpaт racn-iora мoзгa пoлyчaли путєм пункции ^b^a пoд-вздoшнoй rnc™ пocлe пpeмeдикaции [дpoпepидoл 0,5 мг/ кг, кcилaзин 14 мг/кг] пoд мecтным oбeзбoливaниeм 0,5% pa-cтвopoм нoвoкaинa. Acпиpaт в кoличecтвe 10 мл пoмeщaли в пpoбиpкy, coдepжaщyю aнтикoaгyлянт CPDS [citrate phosphate dextrose solution]. Пoлyчeнный кocтный мoзг фpaкциoниpoвaли c пoмoщью цeнтpифyгиpoвaния [1600g, 20 мин] в гpaдиeнтe плoтнocти Пepкoллa [63%]. Oбpaзoвaвшeecя интepфaзнoє шль^ c ЯCK кocтнoгo мoзгa пpoмывaли в pacтвope Xeнкca без Ca2+ и Mg2+ и ocaждaли цeнтpифyгиpoвaниeм. Ocaдoк cycпeндиpoвaли в cpeдe aMEM и иcпoльзoвали либo для дaльнeйшeгo кyльтивиpoвaния, либo для тpaнcплaнтaции без кyльтивиpoвaния.

Жизнecпocoбнocть ЯCK кocтнoгo мoзгa oпpeдeляли в кaмepe Гopяeвa c пoмoщью oкpacки тpипaнoвым cиним.

1<летки кyльтивиpoвaли в cpeдe aMEM [ISN, CI±IA] c 10% cывopoтки эмбpиoнoв кopoв [Hyclone, Hoвая Зeлaндия) и гeнтaмицинa cyльфaтa [50 мкг/ мл] в CO2-инкyбaтope пpи 5% кoнцeнтpaции yглeкиcлoгo гaзa. Смєну cpeды пpoизвo-дили чepeз кaждыe тpoe cynoк. Пocлe пepвoй cмeны cpeды в нее дoбaвляли acкopбинoвyю киcлoтy [50 мкг/ мл]. <лeтки, дocтигшиe cyбкoнфлюэнтнoгo cocтoяния, пepeceвaли пpи пoмoщи pacтвopa тpипcинa и ЭДTA [Gibco, CШA].

Xapaктepиcтикy клeтoчныx кyльтyp пpoвoдили путем o^ paшивaния cтaндapтнoй cмecью peaктивoв bCiP-NBT [Sigma, CШA] нa щeлoчнyю фocфaтaзy [ЩФ] для идентифи-кaции клeтoк ocтeoгeннoй диффepeнциpoвки и cyдaнoм-III [BDH Chemicals Ltd, Aнглия) для идeнтификaции клeтoк aди-пoцитapнoй диффepeнциpoвки.

И I II II

Оригинальные исследования

2. Моделирование инфаркта миокарда

Для моделирования инфаркта миокарда кроликам после премедикации [дроперидол 0,5 мг/ кг, метацин 0,8 мг/ кг) и эндотрахеальной интубации в условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом [кетамин 32 мг/ кг, ксилазин 14 мг/ кг, дитилин 3 мг/ кг) в четвертом межреберье слева выполнялась торакотомия. Затем осуществлялась пе-рикардиотомия и перевязка передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца [рис. 1 ). Сразу после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрамиокардиально с помощью инсулинового шприца вводили клетки или эквивалентное количество питательной среды [рис. 2). Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воздуха из плевральной полости. Интраоперационная летальность составила 10%, послеоперационная - менее 2%.

Все животные были разделены на 3 группы. Животным 1 -й группы (n=12) в пораженную зону инъекционным способом вводилась культура ММСК (2*106), животным 2-й группы (n=14) вводилась ядросодержащая фракция костного мозга (2*106), животным 3-й группы [контрольная, n=15) вводилась ростовая среда аМЕМ.

3. Окрашивание клеток

Окрашивание клеточных культур и ЯСК костного мозга проводили с помощью флуорохрома Hoechst [Sigma, США] в концентрации 1 мкг/мл. Идентификацию окрашенных клеток в сердце осуществляли после ферментативной обработки миокарда смесью трипсин-коллагеназы [Sigma, США). Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Ах^сор» [Zeiss, Германия).

4. Оценка перфузии миокарда

Оценку уровня перфузии миокарда проводили через 20-25 минут после внутривенного введения радиофар-мацевтического препарата (РФП) 99тТс-тетрофосмина (Myoview) в дозе 30-50 МБк методом ОФЭКТ [двухдетекторная гамма-камера E.Cam. var, Siemens). В каждой группе исследование осуществляли до выполнения операции и в определенные сроки после моделирования инфаркта: 10 суток, 1,5 месяца, 3 месяца, 6 месяцев и 12 месяцев. Для количественной оценки уровня перфузии использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в зоне моделированного инфаркта к таковому в ин-тактной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значения пикселя в патологической и референтной зонах [рис. 3).

Все эксперименты на животных выполнены в соответствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты и обсуждение

В результате культивирования клеток, выделенных из аспирата костного мозга, была получена культура клеток -ММСК, которые образовывали колонии фибробластоподоб-ных клеток, а плотный монослой формировали к 7-10 суткам [рис. 4). После окрашивания ММСК смесью реактивов BCIP-NBT участков, положительно окрашенных на ЩФ, выявлено не было. Окрашивание культуры клеток суданом-III также дало отрицательный результат.

Для изучения влияния трансплантированных клеток на перфузию поврежденного миокарда, прежде всего, необходимо было определить местонахождение введенных клеток. Детекция флуоресцентно окрашенных клеток в миокарде кроликов показала присутствие меченых клеток в зоне ишемического повреждения [рис. 5)

После трансплантации ММСК и ЯСК в ишемизированный миокард уровень перфузии определяли с помощью метода ОФЭКТ. Сводные данные уровня перфузии миокарда представлены в табл.

При количественной оценке перфузионных томосцинтиг-рамм миокарда кроликов через 10 суток после операции во всех группах отмечалось снижение перфузии в области передней стенки левого желудочка. В 1-й группе значения накопления РФП составили 0,81±0,01, во 2-й группе -0,75±0,03, в контрольной группе - 0,59±0,01.

Рис. 3. Перфузионная томосцинтиграмма миокарда кролика:

1 - референтная зона;

2 - патологическая зона

Рис. 4. Культура мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, полученных из костного мозга кролика, 21-е сутки культивирования, окраска азуром II. Увеличение *20

Рис. 5. Флуоресцентная микроскопия препарата миокарда кролика после ферментативной диссоциации. Стрелками обозначены ядра трансплантированных клеток, меченых флуорохромом Hoechst. Увеличение *400

I I I I I I

Оригинальные исследования

Таблица. Значения уровня накопления РФП после трансплантации клеток костного мозга на разных сроках эксперимента

Сроки исследования Трансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга

До операции 0,98±0,03 1,00±0,01 1,01 ±0,02

10 дней после операции 0,81 ±0,01 0,75±0,03 0,59±0,01

1,5 месяца после операции 0,92±0,03 0,89±0,03 0,62±0,02

3 месяца после операции 1,00±0,02 0,98±0,01 0,61±0,01

6 месяцев после операции 0,98±0,02 0,98±0,03 0,64±0,04

12 месяцев после операции 1,02±0,04 0,99±0,01 0,61±0,03

Примечание: р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

Через 1,5 месяца после операции в 1-й и во 2-й группах наблюдалось существенное улучшение перфузии. Средние значения накопления РФП составили 0,92±0,03 и 0,89±0,03 соответственно. В контрольной группе - 0,62±0,02.

К 3-му месяцу после операции полная нормализация перфузии отмечалась в опытных группах, где уровень накопления

Первая группа

Вторая группа

Контроль

Рис. 6. Перфузионные томосцинтиграммы миокарда кроликов:

первая группа - трансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга; вторая группа - трансплантация ядросодержащих клеток костного мозга; третья группа - контроль

РФП составил 1,00±0,02 и 0,98±0,01, тогда как в контрольной группе этот показатель не увеличился и равнялся 0,61 ±0,01.

На сроках 6 и 12 месяцев во всех группах уровень перфузии достоверно не отличался от показателей, выявленных при исследовании через 3 месяца после операции [рис. 6).

Показатели равномерности перфузии в патологической и референтной зонах на 10-е сутки после операции составили: в 1-ой группе - 2,7±0,2 и 2,1±0,2; во 2-ой - 2,6±0,2 и 1,8±0,3; в контрольной - 2,8±0,3 и 2,1 ±0,1.

Через 1,5 месяца после моделирования инфаркта в 1-й и во 2-й группах эти значения достоверно не отличались [2,1 ±0,1; 1,8±0,2 и 2,2±0,1; 1,9±0,2); в контрольной группе неравномерность перфузии нарастала и составила 2,9±0,2 в пораженном сегменте по отношению к 1,9±0,1 в интакт-ном сегменте.

На сроках 3 месяца, 6 и 12 месяцев в опытных группах динамики показателей равномерности перфузии не отмечалось. В контрольной группе по мере возрастания срока наблюдения происходило выраженное увеличение неравномерности перфузии в патологической зоне по отношению к референтной. К 3-му месяцу после операции этот показатель составил в патологической зоне 3,5±0,2, в референтной 2,0±0,1, через 6 месяцев 5,4±0,2 и 2,2±0,3, через 12 месяцев - 5,3±0,3 и 2,1±0,1 [рис. 7).

Представленные результаты показывают, что трансплантация ММСК и ЯСК костного мозга приводит к улучшению перфузии ишемизированного миокарда. Клетки, полученные из аспирата костного мозга, при культивировании образовывали колонии фибробластоподобных клеток, которые, по мнению А.Я. Фриденштейна [1991), являются потомками стволовой стромальной клетки [16]. Результаты окрашивания клеточной культуры реактивом BCIP-NBT и суданом-III показали отсутствие спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки клеток, что подтверждает их низкую диф-ференцировку. D. Orlic et al. [2001) показали, что недифференцированные ММСК обладают тропностью к поврежденным тканям и при трансплантации в зону альтерации активно участвуют в репаративных процессах [17]. ММСК вырабатывают некоторые гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы, интерлейкины и хемокины, а также экспрессируют рецепторы некоторых цитокинов и ростовых факторов. In vitro показано, что ММСК продуцируют цитокины: IL-1 a, IL-p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, рецепторы для IL-1 а, IL-1P, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, TNFa [tumor necrosis factor) [18,19]. Многие из этих цитокинов продуцируются конститутивно, а другие - только после стимуляции. P. Azarnous

И I II II

Оригинальные исследования

[ЖИШ

первая группа

I

Я

S

e s

s о я em °

5 H « «

сроки исследования

вторая группа

Й “ ,

1 I

(j !

2 * ! s S :

2 я ч

3 ï

о S Н аа

сроки исследования

контроль

я

л

2 * = =

к

с

& 2-& е

* 1

ИИ

^=а

10 суток 1.5 месяца 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев

сроки исследования

Рис. 7. Равномерность распределения РФП после трансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (первая группа) и ядросодержащей фракции (вторая группа) костного мозга в патологической (обозначена красным цветом) и референтной (обозначена синим цветом) зонах

et al. продемонстрировали способность ММСК после трансплантации в поврежденный миокард крыс вырабатывать ци-токин HIF-1a (hypoxia-inducible factor-1 а), который оказывает цитопротективное действие и ингибирует апоптоз, что позволяет трансплантированным клеткам выжить в условиях ишемии [20]. Кроме того, ММСК могут продуцировать факторы SDF-1 [stromal cell derived factor-1 ), SCF [stem cell factor), G-CSF [granulocyte colony-stimulating factor), способные дополнительно вызывать мобилизацию и хоуминг ММСК костного мозга в ишемизированный миокард и пролиферацию трансплантированных ММСК [21 ]. Этот механизм позволяет увеличить количество ММСК в миокарде. Участие ММСК в неоангиогенезе связано со способностью этих клеток секретировать ангиогенные факторы, такие как VEGF [vascular endothelial growth factor), bFGF [basic fibroblast growth factor), HGF [hepatocyte growth factor), TGF-ß [transforming growth factor ß), ангиопоэтин-1 и экспрессировать на своей поверхности рецепторы для VEGF (VEGFR2), фибронектина, ламинина, молекулы адгезии ICAM-1, ICAM-

2, VCAM-1 [22]. Среди многочисленных факторов ключевую роль в неоангиогенезе играет VEGF, являясь важным пара-кринным фактором нормального развития коронарной сосудистой сети. Так, А. Al-Khaldi (2003) на модели острого инфаркта миокарда после введения ММСК с помощью моноклональных антител блокировал рецепторы к VEGF и не получал эффекта стимуляции ангиогенеза [11]. Вырабатываемые

ММСК ангиогенные факторы способны мобилизовать про-гениторные эндотелиальные клетки из костного мозга, стимулировать пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и вызывать дифференцировку трансплантированных в миокард ММСК в эндотелиоциты, гладкие миоциты, перициты, фибробласты, которые затем становятся компонентами сосудистой стенки [23].

Таким образом, выявленное нами улучшение перфузии можно объяснить тем, что при попадании в поврежденный миокард ММСК способны активно участвовать в неоангиогенезе за счет продукции многочисленных ангиогенных факторов, мобилизации и хоуминга в инвалидизированный миокард ММСК и прогениторных эндотелиоцитов костного мозга, пролиферации и дифференцировки трансплантированных ММСК и регенерации эндотелия.

Трансплантация ЯСК костного мозга также приводила к полному восстановлению перфузии ишемизированного миокарда. Эти клетки представляют собой гетерогенную популяцию и содержат ММСК, гемопоэтические стволовые клетки, прогениторные эндотелиальные клетки, моноциты, лимфоциты и другие. ЯСК костного мозга после трансплантации в миокард секретируют ростовые факторы, создавая специфическое микроокружение, которое осуществляет контроль над процессами пролиферации и дифференцировки ММСК [9]. Однако роль этого механизма невелика, так как доля ММСК среди ЯСК минимальна. N. Такакига et а1. [2000] показали,

lililí

4- I   яггп

Оригинальные исследования

что гемопоэтические стволовые клетки способны продуцировать ангиогенные факторы роста, например, ангиопоэтин-1, который влияет на эндотелиальную дисфункцию путем повышения чувствительности эндотелия к ростовым факторам [24]. Присутствующие среди ЯСК костного мозга прогени-торные эндотелиальные клетки также вырабатывают факторы роста и участвуют в формировании новых сосудов. Основной механизм влияния ЯСК костного мозга на процессы неоангиогенеза реализуется через секрецию ангио-генных факторов в больших количествах: VEGF, bFGF, TGF-p, PDGF [platelet-derived growth factor) и другие. Эти факторы стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и трансплантированных прогенитор-ных эндотелиальных клеток. Синтезируемые ЯСК костного мозга цитокины также способны вызывать регенерацию эндотелия [12]. Таким образом, трансплантация ЯСК костного мозга в ишемизированный миокард приводит к усилению ангиогенеза, скорее всего, за счет выработки большого количества ангиогенных факторов, стимуляции регенерации эндотелия, участия прогениторных эндотелиальных клеток в образовании новых сосудов, регуляции процессов пролиферации и дифференцировки ММСК.

В контрольной группе не было отмечено увеличения перфузии ишемизированного миокарда, а дефект перфузии сохранялся на всех сроках исследования. После

коронароокклюзии в ишемизированный миокард из крови попадают нейтрофилы, лимфоциты и моноциты, которые вырабатывают разнообразные цитокины и ростовые факторы [VEGF, bFGF, TGF-p, IL-a, IL-1 p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15) [25]. Однако в силу того, что в миокарде отсутствуют ММСК, а количество секретируемых ангиогенных факторов невелико, вероятно, процессы неоангиогенеза в поврежденном миокарде не выражены. Вместо этого развивается фибропластическая реакция стромы, проявляющаяся в пролиферации фибробластов, расположенных между группами кардиомиоцитов и вокруг сосудов.

Заключение

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что интрамиокардиальная аутотрансплантация ММСК и ЯСК костного мозга приводит к полному восстановлению перфузии ишемизированного миокарда в эксперименте. Можно предположить, что трансплантированные ММСК, главным образом, влияют на процесс неоангиогенеза за счет их дифференцировки в сосудистые структуры и выработки ангиогенных факторов, а ЯСК - за счет секреции ростовых факторов. Однако механизм неоангиогенеза после трансплантации клеток до конца не изучен, что требует проведения дальнейших исследований.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Государственный доклад о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2001 году. Здравоохранение Российской Федерации 2000; 2: 7-22.

2. Беленков Ю.Н., Мареев В.Ю., Агеев Ф.Т. Медикаментозные пути улучшения прогноза больных хронической сердечной недостаточностью. 1997; М.: Инсайт: 77.

3. Репин В.С. Трансплантация клеток: новые реальности в медицине. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1998; 126 [приложение 1): 14-28.

4. Chachques J.S., Salanson-Lajos C., Lajos C. et al. Cellular cardiomyoplasty for myocardial regeneration. Asian Cardiovasc. Thorac. Ann. 2005; 13(3): 287-96.

5. Limbourg F.P., Ringes-Lichtenberg S., Schaefer A. et al. Haematopoietic stem cells improve cardiac function after infarction without permanent cardiac engraftment. Eur. J. Heart Fail. 2005; 7(5): 722-9.

6. Murohara T., Ikeda H., Duan J. et al. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J. Clin. Invest. 2000; 105: 1527-36.

7. Asahara T., Takahashi T., Masuda H. et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 1999; 18: 3964-72.

8. ^tritsis D.G., Sotiropoulou P.A., Karvouni E. et al. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infarcted human myocardium. Catheter Cardiovasc. Interv. 2005; 65(3): 321-9.

9. Shintani S., Murohara T., Ikeda H. et al. Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circ. 2001; 103: 897-5.

10. Zhang S. Long-term effects of bone marrow mononuclear cell transplantation on left ventricular function and remodeling in rats. Life Sci. 2004; 74(23): 2853-64.

11. Al-Khaldi A., Eliopoulos N., Martineau D. et al. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells. Ann. Thorac. Surg. 2003; 75(1): 204-9.

12. Tang Y.L. Autologous mesenchymal stem cells for post-ischemic myocardial repair. Methods Mol. Med. 2005; 112: 183-92.

13. Непомнящих Л.М. Морфология адаптивных реакций миокарда при экстремальных экологических воздействиях. Вестн. РАМН 1997; 3: 43-53.

14.Полежаев Л.В. Состояние проблемы регенерации мышцы сердца. Усп. совр. биол. 1995; 115: 198-212.

15. Matsunari I., Kanayama S., Yoneyama T. et. al. Myocardial distribution of 18F-FDG and 99mTc-sestamibi on dual-isotope simultaneous acquisition SPET compared with PET. E. J. of Nuclear Medicine 2002; 29(10): 1357-64.

16. Фриденштейн А.Я. Стволовые остеогенные клетки костного мозга. Онтогенез 1991 ; 2: 189-97.

17. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701-5.

18. Tang Y.L., Zhao Q., Qin X. et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann. Thorac. Surg. 2005; 80(1): 229-36; discussion 236-7.

19. Vandervelde S., Luyn M.J., Tio R.A. et al. Signaling factors in stem cell-mediated repair of infarcted myocardium. Mol. Cell Cardiol. 2005; 39(2): 363-76.

20. Azarnoush K., Maurel A., Sebbah L. et al. Enhancement of the functional benefits of skeletal myoblast transplantation by means of coadministration of hypoxia-inducible factor 1 alpha. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005; 130(1 ):173-9.

21. Archundia A., Aceves J.L., Lopez-Hernandez M. et al. Direct cardiac injection of G-CSF mobilized bone-marrow stem-cells improves ventricular function in old myocardial infarction. Life Sci. 2005; 78(3): 279-83.

22. Matsumoto R., Omura T., Yoshiyama M. et al. Vascular endothelial growth factor-expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005; 25(6): 1168-73.

23. Yoon J., Min B.G., Kim Y.H. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 2005; 60(3): 277-84.

24. Takakura N., Watanabe T., Suenobu S. et. al. A Role for Hematopoietic Stem Cells in Promoting Angiogenesis. Circ. 1999; 53(11 ): 452-68.

25. Kobayashi T., Hamano K., Li T.S. et al. Angiogenesis induced by the injection of peripheral leukocytes and platelets. Surg. Res. 2002; 103: 279-86.