СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ПАПАИНА
METHOD OF OBTAINING A HETEROGENEOUS DRUG BASED ON PAPAIN

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской и лабораторной практике при изготовлении лекарственных средств, обладающих регенерирующим и ранозаживляющим действием.
Ферментные препараты, применяемые при лечении гнойных осложнений повреждений кожи различного характера, на российском рынке представлены незначительной группой лекарственных средств. Несмотря на разработку и внедрение новых методов лечения гнойных ран, использование фармацевтических препаратов под повязкой является основным благодаря его доступности, простоте применения и экономической выгоде.
Для воздействия на микроорганизмы, вызывающие гнойно-воспалительный процесс, используют средства местного применения с антибиотиками и антисептиками. Однако следует отметить, что массовое, а порой бесконтрольное их применение приводит сначала к появлению, а затем к преобладанию в ране резистентной к ним микрофлоры [Патент RU 2542373, МПК А61K 31/14, А61K 31/4164, А61K 47/34, А61K 47/48, А61K 9/06, А61Р 31/04, А61Р 17/02, опубл. 20.02.2015].
Папаин (КФ 3.4.22.2) - растительная цистеиновая протеаза, катализирующая гидролиз белков, пептидов, амидов и сложных эфиров основных аминокислот. В значительных количествах этот фермент содержится в дынном дереве - папайе (Carica papaya). Папаин перспективен для применения в клинической практике, например, при обработке трансплантатов для повышения степени их очистки от фибриллярного коллагена и гликопротеинов, определяющих антигенность ткани [Патент RU 2136297, МПК А61K 35/32, A01N 1/02, опубл. 10.09.1999; Патент RU 2136298, МПК А61K 35/32, A01N 1/02, опубл. 10.09.1999]. Папаин также может использоваться при лечении келлоидных рубцов, осложненных форм неврита лицевого нерва, арахноидита головного мозга, при терапии различных патологий, связанных с развитием рубцово-спаечного процесса: при грыже позвоночного диска, травмах, в хирургической косметологии для лечения гипертрофических рубцов [Патент RU 2141359, МПК A61N 1/30, А61 K 35/78, опубл. 20.11.1999].
Использование многих энзимов в свободном состоянии (в растворе) не дает высокого эффекта, т.к. белок нестабилен в таких условиях и может подвергаться протеолизу. В частности, папаин утрачивает свою активность в течение нескольких часов [Патент RU 2174878, МПК В08В 3/08, A61L 12/00, опубл. 20.10.2001]. В этой связи достаточно распространенными стали ферментные таблетки, которые растворяют в дистиллированной воде, изотоническом растворе натрия хлорида или в специальном консервирующем растворе. Таблетированные формы протеаз имеют достаточно длительный срок хранения (1 год и более), однако, характеризуются значительной стоимостью, сложны в изготовлении, а их применение связано с затратами времени и дополнительными манипуляциями по растворению таблеток в используемых растворах [Пат. США 3910296, МПК C11D 3/00, C11D 3/386, G02C 13/00, C11D 17/00, A61L 12/08, опубл. 14.04.1987; Пат. США 4096870, МПК G02C 7/04, C11D 17/00, C11D 3/00, C11D 3/386, опубл. 27.06.1978].
Альтернативными и значительно более удобными для практического применения препаративными формами ферментных средств являются концентрированные растворы, несколько капель которых содержит эквивалентное таблеткам количество соответствующего энзима. Одним из способов длительного сохранения каталитической активности протеолитических ферментов, в том числе папаина, в таких растворах является перевод энзима в инактивированную форму путем обработки тетратионатом натрия или другими соединениями, создающими дополнительные дисульфидные S-S связи в его структуре. Непосредственно перед использованием этого раствора фермент снова переводят в активную форму путем восстановления цистеином или меркаптоэтанолом до соответствующей сульфгидрильной SH-формы. Существенным недостатком данного способа является необходимость использования цикла «дезактивация-активация», что делает этот метод сложным, дорогостоящим и практически непригодным для массового индивидуального применения [Пат. США 4715899, МПК C11D 7/04, C11D 3/00, C11D 3/386, A61L 12/08, опубл. 29.12.1987].
Другим способом сохранения протеолитической активности ферментов в их концентрированных растворах является использование стабилизаторов, например, сульфита натрия и/или пентабората натрия. Указанные стабилизаторы при их содержании в растворе от 1 до 15% (в среднем 4,5-9%) и концентрации фермента от 0,001 до 10% (предпочтительно 0,01-5%) обеспечивают сохранение протеазной активности в течение трех недель при температуре 37°С, что приблизительно соответствует 3-4 месяцам хранения препарата при комнатной температуре. Однако круг энзимов, пригодных для использования с данными стабилизаторами, ограничивается в основном бактериальными протеазами, для которых оптимальный диапазон рабочих значений pH находится в пределах 8-11. Кроме того, период времени, в течение которого ферментный препарат сохраняет свою активность, также недостаточно велик [Пат. США 4404115, МПК C11D 3/386, опубл. 13.09.1983].
Все большее применение в медицине и промышленности находят иммобилизованные ферментные системы. В широком смысле иммобилизация означает любое ограничение числа степеней свободы молекулы или ее фрагментов. Иммобилизованными называют энзимы, искусственно связанные с нерастворимым носителем посредством физических или химических взаимодействий и сохраняющие частично или полностью каталитические свойства.
Известно, что иммобилизация фермента на нерастворимом носителе позволяет решить несколько важных задач для медицины: 1) получение препаратов пролонгированного действия благодаря стабилизации и увеличению времени полужизни фермента, 2) решение проблемы диффузии вещества в организме, 3) направленное регулирование оптимумов функционирования препарата (температурный оптимум, оптимум pH).
Ионообменные волокна ВИОН - новые высокоэффективные материалы для очистки воздуха от ряда токсичных и агрессивных газов, а также аэрозолей. Основные преимущества волокон ВИОН заключаются в следующем: степень очистки ионита 98%, скорость сорбции и регенерации в 10-15 раз выше, чем для зернистых материалов, высокая объемная емкость, селективность, гидролитическая устойчивость к действию кислот, щелочей, регенерирующих агентов (сохранение обменной емкости после 100 и более циклов сорбция-регенерация).
Волокно ВИОН КН-1, использующееся в качестве дезодорирующего и ранозаживляющего материала, представляет собой слабокислотное катионнообменное хемосорбционное карбоксилсодержащее волокно с трехмерной сеткой. Этот материал характеризуется высокой скоростью сорбции, высокоразвитой поверхностью, высокой гигроскопической устойчивостью, гидрофильностью. Волокно ВИОН КН-1 очищает и дезинфицирует рану путем нейтрализации токсических веществ в полости раны, нормализации pH, выводит фиброгнойный экссудат, адсорбирует гнойноспецифический запах, не прилипает к раневой поверхности, не вызывает аллергии и раздражения, что благоприятно сказывается на росте грануляций и эпителизации, сокращает расход перевязочного материала и лекарственных препаратов. Применение материала эффективно при терапии пролежней и гнойных ран, позволяет сократить сроки лечения. ВИОН КН-1 обладает антибактерицидными и антигрибковыми свойствами [Патент RU 2229311, МПК A61L 15/00, A61L 15/16, A61L 15/22, опубл. 27.05.2004; Патент RU 2150877, МПК А43В 17/10, опубл. 20.06.2000].
Некоторые разновидности волокон ВИОН регенерируют ткань за счет окислительно-восстановительного процесса, очищают рану путем окисления токсических веществ в области раневой поверхности, выводят фибриногнойный экссудат за счет дренажных свойств, благоприятствуют эпителизации и грануляции тканей [Патент RU 2238760, МПК A61L 15/16, A61L 15/22, опубл. 27.10.2004].
Технология синтеза ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1, тканых и нетканых прошивных полотен из него известна и легко осуществима на заводах по производству полиакрилонитрильного волокна [Патент RU 2102544, МПК D01F 11/04, C08J 5/20, опубл. 20.01.1998; Патент RU 2054481, МПК C12N 11/08, опубл. 20.02.1996]. Сочетание недорогих компонентов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных лабораторий.
В качестве прототипа был выбран способ получения иммобилизованных ферментов по патенту RU 2054481 (МПК C12N 11/08, опубл. 20.02.1996), согласно которому водным раствором фермента обрабатывали хемесорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином. В частности, в рамках способа-прототипа для иммобилизации папаина на матрице ВИОН АН-1 авторами были апробированы следующие методики:
1) 72,2 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывали 1 мл раствора папаина с концентрацией 0,833 мг/мл, выдерживали 30 мин при 20°С. Количество адсорбированного папаина составило 11,54 мг/г волокна.
2) 72,2 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывали 1 мл раствора папаина с концентрацией 2,5 мг/мл, выдерживали 30 мин при 20°С. Количество адсорбированного папаина составило 17 мг/г волокна.
Недостатком способа является то, что количество иммобилизованного фермента было достаточно низким - не более 20 мг/г носителя. Кроме того, авторы не осуществили промывку иммобилизованных образцов, в которых могли находиться несорбированный или необменно сорбированный белок.
Целью настоящего изобретения является получение гетерогенного препарата иммобилизованного папаина на матрице ионообменных волокон ВИОН-синтетических полимеров, которые как носители для иммобилизации ферментов способны не только повысить их стабильность по отношению к действию различных денатурирующих факторов (что необходимо для достижения возможности пролонгированного действия лекарственных средств), но и сами обладают ранозаживляющими свойствами, что может повысить клиническую эффективность действия препаратов. Введение волокон ВИОН в основу лекарственного средства придает ему более высокую устойчивость к микробной деградации по сравнению с ферментными препаратами в растворе, что позволяет снизить в готовых формах лекарственного средства концентрацию химических консервантов, обеспечивая тем самым повышение его биосовместимости.
Действующим веществом предлагаемого нами средства является папаин, который ускоряет процессы репарации тканей. Папаин (КФ 3.4.22.2) - растительный протеолитический фермент. В значительных количествах содержится в дынном дереве - папайе (Carica papaya). Папаин принадлежит к группе цистеиновых протеиназ. Хорошо растворим в воде, водных солевых растворах и в 70% метиловом и этиловом спиртах. Активен не только в кислых, но и в нейтральных и щелочных средах (оптимум pH 6-7), сохраняет активность в широком температурном диапазоне (до 50-60°С), характеризуется относительно широкой субстратной специфичностью. Папаин обладает противовоспалительными свойствами. Не действуя напрямую на очаг воспаления, фермент стимулирует метаболизм, что ускоряет процессы регенерации воспаленных тканей. Папаин увеличивает приток крови и разрушает токсичные вещества в очаге воспаления. Кроме того, он нейтрализует токсины, выделяемые многими болезнетворными микроорганизмами. Папаин может использоваться при лечении келлоидных рубцов, осложненных форм неврита лицевого нерва, арахноидита головного мозга, при терапии различных патологий, связанных с развитием рубцово-спаечного процесса: при грыже позвоночного диска, травмах, в хирургической косметологии для лечения гипертрофических рубцов [Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. - М.: Наука, 1971. - 404 с.].
Технический результат заключается в разработке способа получения нового ранозаживляющего материала на основе папаина, позволяющего сократить расход ранозаживляющего средства благодаря высокой стабильности препарата при температурах выше физиологических и его пролонгированному действию.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами, включающем иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию папаина проводят на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (pH 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (pH 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (pH 9,0) или 0,05 М глициновый (pH 10,0) буфер; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре; образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
а
Фиг. 1. Структура элементарного звена катионита ВИОН КН-1 () и анионита ВИОН АН-1 (б). Фиг. 2. Приведены диаграммы содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах папаина, иммобилизованных на волокнах ВИОН. Фиг. 3. Приведены диаграммы общей каталитической активности (в ед на 1 мл раствора) препаратов папаина, иммобилизованных на волокнах ВИОН. Фиг. 4. Приведены диаграммы удельной каталитической активности (в ед на 1 мг белка в пробе) препаратов папаина, иммобилизованных на волокнах ВИОН.
В качестве объекта исследования был выбран папаин фирмы «AppliChem», носителями для иммобилизации - ионообменные волокна ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 (фиг. 1А и 1Б, соответственно).
Для подготовки ионообменных волокон к иммобилизации их помещали в дистиллированную воду. После набухания обрабатывали растворами HCl переменной концентрации (0,5; 1,0; 1,5; 1,0; 0,5 моль/л), процесс проводили в статических условиях. После отмывки дистиллированной водой осуществляли попеременную четырехкратную обработку 1 моль/л растворами NaOH и HCl с промежуточной промывкой дистиллированной водой. Каждый этап составлял не менее 20 мин.
Иммобилизацию папаина на волокнах осуществляли адсорбционным методом. К 1 г волокон ВИОН добавляли 20 мл буферного раствора фермента (применяли различные буферные системы, изменяя их pH и ионную силу), инкубировали в течение 24 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис- HCl буфером (pH 7,5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Определения протеолитической активности иммобилизованного папаина проводили спектрофотометрически с использованием азоказеина (Fluka) в качестве субстрата. К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис- HCl буфера, pH 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее приливали 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл трихлоруксусной кислоты, 50 мг образца и 200 мкл буфера (без предварительной инкубации с субстратом). За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность папаина рассчитывали по формуле:
ПA=D*1000/120/200/С,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка, D - оптическая плотность при 410 нм, С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури, 120 - время инкубации в минутах, 200 - объем пробы, 1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гетерогенных биокатализаторов на основе папаина, адсорбированного на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 в качестве иммобилизационной среды использовали следующие буферные растворы: 0,05 М глициновый (pH 8,6-10,0), 0,2 М ацетатный (pH 4,0-5,0), 0,1 М фосфатный (pH 6,0-8,0), 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (pH 8,0-10,0) и 0,05 М трис-глициновый буфер (pH 8,5-9,0).
Содержание белка, выраженное в мг на 1 г носителя, в препаратах папаина, иммобилизованных на матрице волокон ВИОН, отражено на фиг. 2. Наиболее высокую общую активность (в ед на мл раствора) показали образцы фермента, адсорбированного на катионите ВИОН КН-1 с использованием в качестве среды 0,2 М ацетатного буфера (диапазон pH 4,5-5,5) и 0,05 М боратного буфера с добавлением KCl (pH 9,0-10,0). Примерно равные значения каталитической активности были характерны для энзима, иммобилизованного на матрице анионита ВИОН АН-1 с применением 0,05 М трис-глицинового буфера (pH 9,0) и 0,05 М глицинового буфера (pH 10,0) (фиг. 3).
Максимальная удельная активность (в ед на мг белка) гетерогенного биокатализатора на основе папаина, адсорбированного на матрице волокна ВИОН КН-1, наблюдается при использовании в качестве иммобилизационной среды 0,2 М ацетатного буфера (pH 4,5-5,5) и 0,05 М боратного буфера с добавлением KCl (pH 9,0-9,5). Для ВИОН АН-1 оптимальными по данному параметру оказались 0,05 М трис-глициновый и 0,05 М глициновый буфер с pH 9,0 и 10,0 соответственно (фиг. 4).
Таким образом, была разработана методика получения гетерогенного препарата ветеринарного и медицинского назначения на основе папаина, иммобилизованного на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1. Предлагаемый нами продукт - современная безопасная альтернатива антибиотикам и химиопрепаратам при лечении ран и раневых инфекций, в том числе устойчивых к действию антибиотиков.