СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАДМИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ
METHOD FOR PREVENTION OF TOXIC ACTION OF CADMIUM IN EXPERIMENTAL ANIMALS SUFFERING CHRONIC POISONING

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности кадмия, на функциональное состояние почек.
Важность изучения особенностей влияния на человека соединений кадмия определяется значительным загрязнением ими окружающей среды, их стойкостью, способностью к высокой степени кумуляции в объектах биосферы и высоким риском накопления в организме в больших количествах. Кадмий является ядом политропного действия, что определяет многообразие патогенетических механизмов его воздействия. Однако, как показано исследованиями многих лет, ведущим является его способность замещать кальций в специфических физиологических процессах. Так, например, отмечено, что кадмий вызывает усиленную экскрецию кальция почками и изменяет процессы ремоделирования костной ткани [Takebayashi, S., S.Jimi, M.Segawa and Y.Kiyoshi. Cadmium induces osteomalacia mediated by proximal tubular atrophy and disturbances of phosphate reabsorption. A study of 11 autopsies. Pathol. Res. Pract., 2000; 196:853-663]. Кадмий относится к политропным токсикантам окружающей среды и способен взаимодействовать с различными компонентами клеточных структур, вызывая, тем самым, обширный спектр биохимических изменений [Довженкова Н.В., Куриленко А.В., Бельчева Н.Н., Челомин В.П. Окислительный стресс, индуцируемый кадмием, в тканях двустворчатого моллюска Modiolus Modiolus. / Биология моря, 2005. - №5. - Т.31. - С.358-362]. Кумулируясь в организме в условиях хронического отравления, кадмий преимущественно накапливается в митохондриях и ядре клеток, приводя к формированию ультраструктурных повреждений. Данный ксенобиотик блокирует SH-группы ферментов, снижая их активность, что впоследствии приводит к нарушению метаболических процессов в организме [Дзугкоева Ф.С., Дзоциева Л.Х. Изменения электролитовыделительной функции почек, про- и антиоксидантной систем на фоне интоксикации сульфатом кадмия у крыс. / Успехи современного естествознания, 2006. - №6. - С.72-74]. Выраженное нефротоксическое действие кадмия связано с его высоким сродством к клеткам почечной ткани и способностью накапливаться в почечных структурах [Мудрый И.В. Эколого-Гигиенические Аспекты загрязнения почвы кадмием. / Гигиена и санитария, 2003. - №1. - С.32-35].
Постоянное ухудшение экологической обстановки, связанное с чрезмерным накоплением кадмия в окружающей среде, приводит к увеличению выраженности его токсических эффектов на организм человека. Исходя из вышеизложенного следует, что проблема поиска и разработки новых эффективных средств профилактики токсического влияния кадмия на организм человека является чрезвычайно важной задачей современной медицины.
Известно множество медицинских препаратов, оказывающих профилактическое влияние в условиях хронического отравления тяжелыми металлами. К ним относятся тиоловые соединения - тиосульфат натрия, унитиол, тетацин кальций, различные комплексообразующие соединения - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин и др. (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - Харьков «Торсинг», 1998. С.212-220). Однако длительное применение этих препаратов в условиях хронического отравления тяжелыми металлами ограничено вследствие развития многочисленных побочных эффектов: расстройства деятельности ЖХТ, аллергические реакции, изменение количества форменных элементов крови, острый некроз проксимальных канальцев нефронов и др. Также наряду с увеличением элиминации из организма тяжелых металлов они повышают экскрецию из организма важных микроэлементов, таких как железо, кальций, цинк и др., вызывая нарушения обменных процессов, что препятствует их длительному профилактическому применению.
3)
3
2
3
В качестве профилактического средства в условиях хронической кадмиевой интоксикации нами был выбран водный раствор колекальциферола (витамина D - «Аквадетрим» фирмы МЕДАНА ФАРМА. Витамин D является естественной формой витамина D, которая образуется у человека в коже под действием солнечных лучей, и обладает значительным гиперкальциемическим эффектом. По сравнению с витамином D характеризуется на 25% более высокой активностью. Колекальциферол играет существенную роль в абсорбции кальция и фосфатов из кишечника, в транспорте минеральных солей и в процессе кальцификации костей, регулирует также выведение кальция и фосфатов почками. Водный раствор витамина D всасывается лучше, чем масляный раствор. Колекальциферол действует в кишечнике, увеличивая синтез кальцийсвязывающего белка, ответственного за транспорт кальция через мембрану клеток слизистой оболочки кишечника. В костной ткани 1,25-(OH)2D3 мобилизует кальций с использованием его вновь образовавшейся костной ткани для процессов минерализации [Glenville Jones. Current Understanding of the Molecular Actions of Vitamin D. - Physiol Rev 78: 1193-1231, 1998].
Известен способ профилактики кадмиевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении (Патент 2366459 С1, опубликованный 10.09.2009, Бюл. №25, заявка 2008114894/13, от 15.04.2008, МКИ A61K 51/00, A61K 31/4164, А61Р 39/02, авторы: Кокаев Р.И., Брин В.Б.), заключающийся в том, что животным вводят ацизол один раз в сутки в дозе 30 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,3 мг/кг.
Недостатком описываемого способа является то, что с целью профилактики используется синтетическое металлорганическое соединение, эффекты длительного применения которого находятся на стадии экспериментального изучения. Выбранный нами препарат «Аквадетрим» содержит активную форму витамина D, необходимого для ряда физиологических процессов, который является естественным для организма соединением и участвует в регуляции кальциевого гомеостазиса. Кальций и кадмий являются ионами-антагонистами ввиду одинаковых по знаку электрических зарядов и схожести ионных радиусов. Таким образом, они способны взаимно подавлять присущее каждому из них действие. Профилактическое действие витамина D основано на изменении кальциевого гомеостазиса, а именно - создании гиперкальциемии.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении.
Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение токсического действия кадмия при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем снижения повреждающего действия кадмия на клетки за счет создания экспериментальной гиперкальциемии.
Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных, отличающийся тем, что животным вводят «Аквадетрим» один раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 25000 МЕ/кг, предварительно за 1 час перед ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия.
Предлагаемый способ отличается тем, что впервые применяется водный раствор гиперкальциемического гормона колекальциферола - «Аквадетрим», с целью профилактики хронической токсической нефропатии.
Ежедневное профилактическое введение «Аквадетрима» через зонд в желудок в дозе 25000 МЕ/кг предварительно за 1 час до подкожного введения раствора сульфата кадмия, приводит к снижению проявлений токсической нефропатии, восстановлению функций почек. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных, отличающийся тем, что животным вводят «Аквадетрим» один раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 25000 МЕ/кг, предварительно, за 1 час перед ежедневым введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия. В научно-медицинской литературе нами не выявлено описание использования витамина D в качестве профилактического средства при хронической кадмиевой нефропатии, вызванной длительным введением сульфата кадмия, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия кадмия, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом.
С целью создания экспериментальной гиперкальциемии «Аквадетрим» вводят через атравматичный зонд в желудок в количестве 0,17 мл (2500 ME) на 100 г массы крысы в течение 30 дней, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемая дозировка кальцитриола вызывает повышение уровня кальция в крови интактных животных до 2,88±0,012 ммоль/л (фоновые значения - 2,14±0,047). Для получения токсического вещества сульфат кадмия растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия. На каждые 100 г веса крысы подкожно вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор сульфата кадмия вводят подкожно с помощью инсулинового шприца одноразового использования в дозировке 0,3 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней двум группам животных (№1 и №2). Группе №2 с первого дня эксперимента каждый день внутрижелудочно через атравматичный зонд вводят «Аквадетрим» в дозировке 25000 МЕ/кг, предварительно за 1 час до введения сульфата кадмия.
По истечении времени эксперимента (30 дней) исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина (мл/час/100 г) канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия и белка с мочой. Крысы забивались с использованием тиопентала натрия. Полученные результаты в группе №2 сравнивали с контролем (гр. №1) и фоновыми показателями интактной группы.
Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80*200*400.
Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг.-1 в опытной группе (группа №1) выявлены выраженные изменения в канальцевом и клубочковом аппарате почек. Гистологические изменения в клубочке характеризовались наличием набухших клеток эндотелия (а), пространство между капсулой и сосудистым клубочком было уменьшено (б), а в некоторых случаях практически отсутствовало. Изолированное подкожное введение сульфата кадмия приводило к увеличению просвета большинства канальцев (в), в просвете которых определялся тканевой детрит (г). Клетки канальцевого аппарата находились в состоянии зернистой (д) и гидропической (е) дистрофии, отмечались участки некробиоза (ж) и полного некроза эпителиоцитов, ядра которых находились в состоянии лизиса.
На Фиг.2 при гистологическом исследовании почек в группе №2 морфологическая картина характеризовалась снижением степени выраженности всех вышеописанных патологических изменений. Канальцевый и клубочковый аппарат почек полностью сохранял свою структуру, отмечались участки лимфоидно-гистиоцитарной пролифирации (а). Полностью отсутствовали очаги некроза канальцевого аппарата, отмечалось снижение количества эпителиоцитов с признаками гидропической дистрофии (б).
Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 250-300 г подкожно вводили раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг каждый день в течение 30 дней. Группе №2 с первого дня эксперимента каждый день внутрижелудочно через атравматичный зонд вводят «Аквадетрим» в дозировке 25000 МЕ/кг, предварительно за 1 час до введения сульфата кадмия. Через 30 дней исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярность мочи.
Содержание натрия, калия з плазме крови и моче определяли методом пламенной фотометрии, с помощью пламенного анализатора жидкостей ПАЖ-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (PV1251C) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (СФ-26) по методу Лоури. Для определения осмотической концентрации мочи использовали метод криоскопии, измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT-2». Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.
Результаты экспериментальных исследований позволили выявить увеличение объема спонтанного диуреза у животных, подкожно получавших сульфат кадмия, относительно фоновых животных, несмотря на снижение скорости клубочковой фильтрации. Полиурическая реакция была обусловлена выраженным снижением канальцевой реабсорбции воды (таб.1). Подкожное введение кадмия приводило к формированию выраженной протеинурии, одновременно с этим происходило значительное снижение осмолярности мочи (табл.1 и 5) относительно значений интактной группы животных.
Таблица 1
Влияние «Аквадетрима» на основные процессы мочеобразования и экскрецию белка с мочой у крыс на фоне введения сульфата кадмия (М±м)
Условия опыта
Стат. показат.
Процессы мочеобразования
Белок экскреции мг/час/100 г
Диурез, мл/час/100 г
F мл/час/100 г
R<sub>H2O</sub>%
Фон
M±m
0,06±0,002
19,44±0,75
99,70±0,011
1,21±0,019
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц)
M±m
0,19±0,009
16,03±0,45
98,89±0,089
2,12±0,045
p
*)
*)
*)
*)
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц) + «Аквадетрим» в/ж
M±m
0,12±0,007
16,71±0,95
99,06±0,039
1,83±0,023
p
#)
**)#)
**)#)
*)#)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(**) - достоверное (p≤0,05) изменение по сравнению с фоном;
(#) - достоверное (p≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO<sub>4</sub>;
F - скорость клубочковой фильтрации, R<sub>H2O</sub> - канальцевая реабсорбция воды.
Электролитовыделительная функция почек экспериментальных животных, получавших изолированное подкожное введение сульфата кадмия, характеризовалась повышением экскреции натрия, кальция и калия, относительно фоновых значений интактной группы животных, что объяснялось наличием выраженных изменений в фильтрационном заряде и канальцевой реабсорбции катионов (табл.2, 3 и 4).
Таблица 2
Влияние «Аквадетрима» на почечную обработку натрия у крыс на фоне подкожного введения сульфата кадмия (М±м)
Условия опыта
Стат. показат.
Процессы почечной обработки натрия
E<sub>Na</sub>
F<sub>Na</sub>
R<sub>Na</sub>
мкмоль/час/100 г
%
I
II
III
IV
V
Фон
M±m
9,08±0,163
2680±64,96
99,66±0,011
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц)
M±m
13,09±0,140
2099±60,82
99,37±0,026
p
*)
*)
*)
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц) + «Аквадетрим» в/ж
M±m
12,28±0,158
2353±74,61
99,46±0,019
p
*)#)
*)#)
*)##)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(#) - достоверное (p≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO<sub>4</sub>;
(##) - достоверное (p≤0,01) изменение относительно месяца введения CdSO<sub>4</sub>;
E<sub>Na</sub> - экскреция Na, F<sub>Na</sub> - фильтрационный заряд Na, R<sub>Na</sub> - относительная канальцевая реабсорбция Na.
Таблица 3
Влияние «Аквадетрима» на почечную обработку калия у крыс в условиях подкожного введения сульфата кадмия (М±м)
Условия опыта
Стат. показат.
Процессы почечной обработки натрия
E<sub>K</sub>
F<sub>K</sub>
мкмоль/час/100 г
I
II
III
IV
Фон
M±m
7,02±0,024
75,60±0,80
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц)
M±m
8,16±0,066
88,79±0,76
p
*)
*)
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц) + «Аквадетрим» в/ж
M±m
7,88±0,029
84,27±0,82
p
*)
*)#)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(**) - достоверное (p≤0,05) изменение относительно с фоном;
(#) - достоверное (p≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO<sub>4</sub>;
F<sub>K</sub> - фильтрационный заряд калия, E<sub>K</sub> - экскреция калия.
Таблица 4
Влияние «Аквадетрима» на почечную обработку кальция у крыс в условиях подкожного введения сульфата кадмия (М±м)
Условия опыта
Стат. показат.
Процессы почечной обработки кальция
E<sub>Ca</sub>
F<sub>Ca</sub>
R<sub>Ca</sub>
ммоль/час/100 г
%
I
II
III
IV
V
Фон
M±m
0,145±0,004
27,61±0,57
99,46±0,018
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц)
M±m
0,325±0,013
19,12±0,28
98,30±0,045
p
*)
*)
*)
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц) + «Аквадетрим» в/ж
M±m
0,289±0,010
21,65±0,60
98,86±0,015
p
*)#)
*)#)
*)#)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(**) - достоверное (p≤0,05) изменение относительно с фоном;
(#) - достоверное (p≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO<sub>4</sub>;
F<sub>Ca</sub> - фильтрационный заряд кальция, E<sub>Ca</sub> - экскреция кальция, R<sub>Ca</sub> - канальцевая реабсорбция кальция.
Внутрижелудочное ведение «Аквадетрима» способствовало профилактике нарушений водовыделительной функции почек в условиях хронической кадмиевой интоксикации, что характеризовалось снижением объема спонтанного диуреза относительно показателей группы животных, получавших изолированное подкожное введение кадмия, вследствие наличия менее выраженных изменений в скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды. Профилактическое введение «Аквадетрима» способствовало снижению степени протеинурии, повышая при этом показатели осмолярности мочи относительно значений группы животных, получавших подкожное введение сульфата кадмия (табл.1 и 5). Применение «Аквадетрима» повышало канальцевую реабсорцию катионов и нормализовывало их фильтрационные заряды в условиях хронической кадмиевой интоксикации, что способствовало снижению экскреции натрия, калия и кальция, относительно изолированной кадмиевой интоксикации (табл.2, 3 и 4).
Таблица 5
Влияние «Аквадетрима» на показатели осмолярности мочи в условиях подкожного введения сульфата кадмия (М±м)
Условия опыта
Стат. показатель
Osm
осм/л
I
II
III
Фон
M±m
2,120±0,065
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц)
M±m
1,801±0,015
p
*)
CdSO<sub>4</sub> п/к (месяц) + «Аквадетрим» в/ж
M±m
2,005±0,025
p
#)
Примечание: (*) - достоверное (p≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(**) - достоверное (p≤0,05) изменение относительно на фона;
(#) - достоверное (p≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO<sub>4</sub>.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что профилактическое применение «Аквадетрима» в условиях хронической кадмиевой интоксикации является эффективным способом профилактики токсического действия кадмия при хроническом отравлении.