Тест-система для выявления генома вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
TEST SYSTEM FOR DETECTION OF SHEEPPOX VIRUS GENOME BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к выявлению генома вируса оспы овец.
Оспа овец - трансграничная высоко-контагиозная особо опасная вирусная болезнь овец, которая представляет серьезную угрозу животноводству не только в Российской Федерации, но и в других странах, где выращивание и разведение овец является культурной традицией [1, 3]. У естественно восприимчивых животных заболевание проявляется лихорадкой, затрудненным дыханием, отеком век, выделением серозно-слизистого экссудата из глаз и носа, развитием на коже и слизистых оболочках папулезно-пустулезной сыпи, поражением внутренних органов и высокой летальностью, иногда достигающей 100%. Болезнь регистрируется в любое время года, при этом степень тяжести зависит от ряда факторов: возраст, порода и индивидуальные особенности организма, а также воздействие условий окружающей среды [2].
Возбудителем является ДНК-содержащий вирус (Sheeppox virus), относящийся к роду Capripoxvirus семейства Poxviridae. Возбудитель обладает видовой специфичностью и вызывает заболевание только у одного вида животных [4].
Для выявления вируса оспы овец вирусологическим способом требуются значительны затраты времени и расходных материалов. В связи с этим разработка специфичной и чувствительной тест-системы для обнаружения генома вируса оспы овец является актуальной задачей. Диагностика заболевания методом ПЦР в режиме реального времени на ранней стадии является одним из методов, который может быть применен для выявления вируса при вспышках заболевания. Это может быть ценным дополнением к применению основных методов, которые должны включать быструю диагностику, отслеживание и контроль за распространенностью заболевания.
Патентные документы зарубежных авторов в основном относятся к мультиплексным системам, предназначенным для обнаружения генома возбудителей нескольких заболеваний МРС и КРС методом ПЦР. В основном патенты разработаны для диагностики каприпоксвирусных инфекций: оспа овец, оспа коз, заразный узелковый дерматит КРС.
Так же с помощью мультиплексных тест-систем ПЦР проводят исследования для выявления геномов возбудителей таких инфекций МРС, как: блютанг, ящур, контагиозный пустулезный дерматит, чумы мелких жвачных. При этом в тест-системе используется 6 пар праймеров: пара для выявления вируса блютанга - bTV-F и BTV-R; праймеры для обнаружения вируса ящура FMDV-F и FMDV-R с; праймеры для обнаружения вируса чумы мелких жвачных - PPRV-F и PPRV-R; праймеры для обнаружения вируса оспы овец - SPPV-F и SPPV-R; праймеры для обнаружения вируса оспы коз -GTPV-F и GTPV-R.; праймеры для обнаружения вируса контагиозного пустулезного дерматита ORFV-F и ORFV-R [5].
Недостатком таких тест-систем является многокомпонентность, что значительно усложняет сбор реакционной смеси и контроль качества компонентов тест-системы. Более того, амплификация нескольких фрагментов в одной пробирке неизбежно ингибирует процесс образования копий матрицы ДНК, концентрация которой является наименьшей в испытуемой пробе.
Известен способ выявления генома поксвирусов с помощью ПЦР без дифференциации на оспу овец [6]. Недостатком такого метода является отсутствие возможности подтверждения или исключения наличия ДНК возбудителя именно оспы овец, что снижает точность диагностики.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является тест-система ПЦР-ОСПА-ФАКТОР (Фактор, Троицк, Россия), которая основана на способе диагностики оспы овец и коз. Недостатком данного способа является то, что оспа овец и коз являются разными нозологическими единицами и вызываются разными вирусами [7].
Целью настоящего изобретения является создание тест-системы для специфичного выявления генома вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Таким образом, разработка чувствительной и специфичной тест-системы для обнаружения генома всех возможных генетических вариантов вируса оспы овец, с возможностью исследования широкого спектра биологического материала (внутренние органы, папулезно-пустулезные поражения, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), является технической проблемой. Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система ПЦР-РВ, содержит специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд, а для постановки ПЦР в режиме реального времени проведен подбор условий, обеспечивающий минимальный риск контаминации в тестируемых образцов и исключающих субъективность при оценке результатов и при проведении исследований с помощью разработанного диагностикума.
Изобретение относиться к тест-системе для специфичной экспресс-идентификации генома всех генетических вариантов оспы овец, циркулирующих на территории РФ, так и других эндемичных очагов, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, состоящей из смеси олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, фермента Taq-полимеразы, положительного контроля и отрицательного контроля.
Флуоресценцию измеряют по каналу FAM. Пересечение кривой флуоресценции линии порогового цикла (Ct) свидетельствует о наличии в образце генома вируса оспы овец, причем, чем меньше показатель «Ct», тем выше концентрация генома вируса оспы овец в исследуемом образце. Отсутствие пересечения кривой флуоресценции линии Ct свидетельствует об отсутствии генома вируса оспы овец в тестируемом материале.
Изобретение может быть использовано для выявления ДНК вируса оспы овец в пробах биологического материала (суспензия парнехиматозных органов, лимфоузлов, кожных поражений, сыворотки крови, цельной крови, культуры клеток), с целью проведения клинической и лабораторной диагностики, а также научно-исследовательских работ в ветеринарии.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической тест-системы, состоящей из олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, в отношении всех возможных генетических вариантов вируса оспы овец циркулирующих в мире; из расширенного спектра биологического материала (суспензия паренхиматозных органов, лимфоузлов, кожных поражений, сыворотки крови, цельной крови, культуры клеток), пригодного для проведения исследований без получения ложноположительных результатов; с возможностью использования широкого спектра амплификаторов, отвечающих минимальным требованиям для постановки ПЦР-РВ; с сокращением времени тестирования проб на наличие генома вируса оспы овец за счет укороченного термического профиля циклирования и использования готовой ПЦР смеси, в том числе и при проведении массовых исследований; и расширение арсенала средств диагностики оспы овец.
Представленный метод включает последовательности олигонуклеотидов, специфичные только для вируса оспы овец и имеющие следующую нуклеотидную последовательность:
Forward TCGCATATGGAATTATCGGAAT
Reverse GATTTGACAAACACGTGTACAAA
probe FAM ACGAACATTTTTCCCTCTAAGCTACTTTAC BHQ1
Сущность изобретения заключается в том, что выявление ДНК вируса оспы овец проводится в присутствии родственных каприпоксвирусов (вирусы оспы коз и заразного узелкового дерматита) без какого-либо влияния последних на качественный результат реакции. Высокая степень специфичности тест-системы подтверждена с помощью лабораторных исследований на панели проб гомологичных и гетерологичных вирусов.
Сущность изобретения пояснена на графическом изображении (Фиг. 1), на котором представлен линейный график результатов ПЦР-РВ при тестировании 10-кратных разведений выделенной ДНК вируса оспы овец (штамм «ВНИИЗЖ»),
Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, генерируемой в результате разрушения гибридизационного зонда, находящегося на 5'-конце флуорофор FAM, а на 3'-конце - гасителя BHQ1. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены, и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. При накоплении в ходе ПЦР специфических продуктов зонд гибридизируется на ампликон, что ведет к его разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.
Праймеры и зонд разработаны для амплификации и детекции фрагмента генома оспы овец, расположенный между ORF131 и ORF132, консервативный и уникальный только для всех вариантов вируса оспы овец.
Тест-система/набор для выявления генома вируса оспы овец в ПЦР-РВ состоит из следующих компонентов:
№1 готовая ПЦР смесь, объем 550 мкл - 2 пробирки;
№2 фермент Taq-ДНК-полимераза, объем 14 мкл - 1 пробирка;
№3 положительный контрольный образец, объем 100 мкл - 1 пробирка;
№4 отрицательный контрольный образец, объем 100 мкл - 1 пробирка.
ПЦР-РВ проводится в программируемом амплификаторе в одну стадию с использованием готовой ПЦР смеси (№1), включающей на одну реакцию: буфер 5х для ПЦР-РВ (5 мкл), 25 мМ хлорид магния (3,5 мкл), дезоксирибонуклеотид трифосфаты (0,5 мкл 10 пмолль), олигонуклеотидные праймеры (1 мкл каждого праймера 15 пмоль), зонд (1 мкл 2,5 пмоль); и фермента Taq-ДНК-полимеразы (№2). Перед началом постановки реакции необходимо разморозить все компоненты реакции, встряхнуть их на шейкере, затем центрифугировать несколько секунд на низкоскоростной центрифуге.
Реакционную смесь для проведения ПЦР-РВ готовят в пробирке в расчете на одну реакцию (V=25 мкл) следующим образом:
- готовая ПЦР смесь №1
20 мкл,
- фермент Taq-ДНК-полимераза №2
0,25 мкл,
- выделенная ДНК (в т.ч. отрицательный контроль №3 и положительный контроль №4)
5 мкл.
В качестве отрицательного контроля используется деионизованная вода, а в качестве положительного контроля - ДНК вируса оспы овец.
Приготовленную в отдельных пробирках реакционную ПЦР-смесь переносят по 20 мкл в пробирки соответствующего объема и вносят 5 мкл суммарной ДНК. В соответствующие пробы вносят также выделенные образцы ДНК отрицательного и положительного контролей. Общий объем смеси - 25 мкл.
Пробирки устанавливают в амплификатор для постановки ПЦР-РВ, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий краситель (FAM), устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.
Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя. Режим термического профиля должен соответствовать показателям, описанным в таблице 1.
t
Пробы считаются положительными, если в пробе значение Ct<35, что говорит о наличии генома вируса оспы овец. Пробы считаются отрицательными, если значения C не определяются/не регистрируется.
Если значение порогового цикла Ct находится в пределах от 35 до 37, результат обнаружения генома вируса оспы овец считается сомнительным, и подлежит повторному исследованию. Если при проведении повторного исследования значение Ct<37, результат обнаружения генома вируса оспы овец считается положительным; если значение Ct не регистрируется (нет значения) или Ct>37 результат обнаружения генома вируса оспы овец считается отрицательным.
Результат считается достоверным только в случае, если:
- для положительного контроля амплификатором на канале FAM регистрируется значение порогового цикла амплификации - Ct<35;
- для отрицательного контроля амплификатором не регистрируется какое-либо значение порогового цикла на канале FAM.
Результат считается недостоверным (не подлежат учету) в случае, если:
- для образца положительного контроля регистрируется значение Ct>35;
- для образца отрицательного контроля регистрируется какое-либо значение Ct.
Предлагаемая разработанная ФГБУ «ВНИИЗЖ» тест-система для идентификации генома вируса оспы овец является новой и промышленно применимой. Тест-система создана путем дизайна и подбора праймеров, компоновки компонентов тест-системы, лабораторной оценки основных характеристик и совместного использования сведений, содержащихся в уровне техники, а также общих знаний специалиста в области биотехнологии.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Оценка специфичности тест-системы.
Для оценки специфичности тест-системы использовались следующие образцы ДНК генома референтных гомологичных и гетерологичных вирусов, а также ДНК полевых изолятов вируса оспы овец, эктимы и заразного узелкового дерматита выявленные на территории РФ в период 2015-2019 гг. Результаты оценки специфичности представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что тест-система для выявления генома вируса оспы овец показывает высокую специфичность при тестировании с генетическим материалом от вирусов оспы овец различного географического происхождения, так и гетерологичных вирусов КРС и МРС.
Работу с ДНК проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Процедуру выделения ДНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов на основе мембранных колонок.
ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
- готовая ПЦР смесь №1
20 мкл,
- фермент Taq-ДНК-полимераза №2
0,25 мкл,
- выделенная ДНК (в т.ч. отриц. контроль №3 и полож. контроль №4)
5 мкл.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в ПЦР-РВ приборе по описанной выше программе.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случаи, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию (Таблица 3).
При тестировании специфичности тест-системы с использованием ДНК гомологичных и гетерологичных вирусов ложноположительных и ложноотрицательных результатов не выявлено.
Пример 2. Оценка чувствительности тест-системы.
50
50
3
3
Для оценки чувствительности тест-системы для выявления генома вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени использовали ДНК вируса оспы овец (штамм «ВНИИЗЖ») с титром инфекционной активности в культуре клеток ЯДК-04 5,5 lg ТЦД/см. Полученные результаты показали, что тест-система выявляла вирусную ДНК с чувствительностью 0,05 lg ТЦД/см. Для оценки эффективности амплификации было проведено 3 повторных эксперимента. Полученные значения Ct использовались для вычисления эффективности. В результате была выстроена линейная регрессия со значением эффективности амплификации (Е) 94,84%. Полученные данные приведены на графическом изображении (Фиг. 1).
Пример 3. Оценка воспроизводимости тест-системы.
2
Воспроизводимость тест-системы для выявления генома вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени определяли с помощью величины стандартного отклонения (SD) значения Ct, полученных для каждой серии разведений. SD варьировало от 0,01 до 0,24 на протяжении шести 10-кратных разведений. Коэффициент детерминированности r составил 0,9987.
Таким образом, изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления генетического материала вируса оспы овец в биологических образцах; с целью постановки и уточнения диагноза; для решения научно-исследовательских задач; изучения мониторинга распространения вируса оспы овец среди восприимчивых животных. Использование специфических праймеров и зонда позволяет выявить генетический материал всех циркулирующих генетических вариантов вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (РВ).
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для выявления генома вируса оспы овец методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».
1. Константинов А.В., Старов С.К., Диев В.И. и другие. Антигенная и протективная активность ассоциированной вирусвакцины против оспы овец, оспы коз и чумы мелких жвачных // Ветеринария сегодня, 2017. №3 (22). С. 28-32.
2. Нургазиев Р.З., Оторова А.А., Акматова Э.К., Нургазиева А.Р.. Вопросы биобезопасности при работе с вирусом оспы овец в лабораторных и полевых условиях / Вестник Кыргызского национального аграрного университета им. К.И. Скрябина. 2017. №3 (44). С. 96-102.
3. Приказ №24 об утверждении ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов оспы овец и коз от 23 января 2018 г.
4. Руководство по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2017.
5. Патент: CN105331742 (A) - Multiplex-PCR (polymerase chain reaction) kit for detecting six viruses of sheep and goats simultaneously
6. Патент: RU 2658493 - Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, способ и тест-система ПЦР в режиме реального времени для выявления генома каприпоксвирусов
7. Патент: CN 103276111 - Kit used for detecting sheep pox virus and detection method thereof