СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИГНАНА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНАЛЬГЕТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD OF PRODUCING LIGNAN, HAVING ANALGESIC ACTION

Изобретение относится к области органической химии, конкретно, к способу получения биологически активного соединения органической природы, обладающего анальгетическим и противовоспалительным действием, а также к способу получения структурных аналогов этого соединения для применения в медицине, ветеринарии или научных исследованиях.
Севанол - это растительный лигнан из экстракта тимьяна Thymus armeniacus, структура которого описывается как: 1,2,3-пропантрикарбоксиловая кислота, 1,1'-[[(1R,2S)-1-(3,4-дигидроксифенил)-1,2-дигидро-6,7-дигидрокси-2,3-нафталенедиил]бис(карбонилокси)]бис-,(1S,1'S,2R,2'R)-(+)-; или ICPAC наименование: (1R,2S)-1-[(1R,2S)-1-(3,4-дигидроксифенил)-6,7-дигидрокси-3-[(1R,2S)-1,2,3-трикарбоксипропокси]карбонил-1,2-дигидронафтален-2-карбонил]оксипропан-1,2,3-трикарбоксиловая кислота (ФИГ. 1).
Это соединение имеет ярко выраженный анальгетический и противовоспалительный эффект и может быть выделено хроматографическими методами из уксуснокислого экстракта молодых побегов тимьяна (патент РФ 2491950). Недостаток хроматографического метода выделения из природного сырья заключается в ограниченности запасов молодых побегов лекарственного растения Thymus armeniacus (регион сбора высокогорное озеро Севан, Армения), и невозможности использования других видов тимьяна из других регионов, так как эти растения не синтезируют эту молекулу.
Севанол - природная молекула, построенная на основе эпифиловой кислоты, с расчетной средней молекулярной массой 706,52 Да содержит 6 хиральных центров, причем стереоизомеры молекулы такие как изосеванол (ФИГ. 2) также обладают анальгетической активностью и могут быть использованы как анальгетические препараты (Д.И. Осмаков, С.Г. Кошелев, О.А. Белозерова, В.С. Кублицкий, Я.А. Андреев, Е.В. Гришин, С.А. Козлов Биологическая активность севанола и его аналогов // Биоорганическая химия, 2015, т 41, с. 606-611).
Предложенный способ синтеза заключается в параллельном получении три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты и защищенной кофейной кислоты, с последующим синтезом соответствующего эфира дигидроксикоричной кислоты. Полученный эфир кофейной кислоты впоследствии димеризуется в окислительных условиях, образующийся продукт димеризации, содержащий защищенные карбоксильные группы, подвергается кислотно-катализируемому деблокированию с образованием целевого продукта - севанола.
Первая ключевая стадия данного подхода заключается в синтезе трет-бутилового эфира изолимонной кислоты за три стадии.
Известен способ получения трет-бутилового эфира изолимонной кислоты с общим выходом 33%, включающий в себя 7 синтетических стадий из исходной (L)-яблочной кислоты, основанный на методе, описанном в статье (F. Calo, J. Richardson, А. Barrett, Total Synthesis of Citrafungin A //, J. Org. Chem., 2008, v. 73, p. 9692-9697). Основным недостатком данного способа является многостадийность синтеза и использование большого количества дорогостоящих реагентов.
Вторая ключевая стадия синтеза целевой молекулы севанола заключается в окислительной димеризации сложного эфира дигидрокоричной кислоты (кофейной кислоты).
2
3
6
Известно несколько способов проведения данного процесса, которые разнятся выбором окислителя. Предложено использовать такие окислительные реагенты, как: MnO (С. Daquino, A. Rescifina, С. Spatafora, С. Tringali, Biomimetic Synthesis of Natural and "Unnatural" Lignans by Oxidative Coupling of Caffeic Esters // Eur. J. Org. Chem, 2009, p. 6289-6300), K[Fe(CN)] (S. Maeda, H. Masuda, T. Tokoroyama, Studies on the Preparation of Bioactive Lignans by Oxidative Coupling Reaction II. Oxidative Coupling Reaction of Methyl (E)-3-(4,5-Dihydroxy-2-methoxyphenyl)propionate and Lipid Peroxidation Inhibitory Effect of the Produced Lignans // Chem. Pharm. Bull., 1994, v. 42, p. 2506-2513), ферментные системы (H. Takahashi, K. Matsumoto, M. Ueda, Y. Miyake, Y. Fukuyama, Biomimetic Synthesis of Neurotrophic Americanol A and Isoamericanol A by Horseradish Peroxidase (HRP) Catalysed Oxidative Coupling // Heterocycles, 2002, v. 56, p. 245-256). Основным недостатком использования этих окислительных реагентов является образование большого количества побочных продуктов, и, как следствие, низкий выход целевого продукта димеризации.
3
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ с использованием FeCl (хлорида железа(III)) в водно-ацетоновом растворе, для окисления производных кофейной кислоты, описанный в работах (D.E. Bogucki, J.L. Charlton, A non-enzymatic synthesis of (S)-(-)-rosmarinic acid and a study of a biomimetic route to (+)-rabdosiin // Can. J. Chem. 1997, v. 75, p. 1783-1794; Zhi-Hong Jiang, TakashiTanaka, IsaoKouno Two diastereomeric triterpene-lignan esters having dimeric structure and their biosynthetically related triterpene caffeate from Rhoiptelea cheliantha // Tetrahedron Lett, 1994, v. 35, p. 2031-2034; Zhi-Hong Jiang, Takashi Tamaka and Isao Kouno, Chilianthins A-F, six triterpene esters having dimeric structures from Rhoiptelea cheliantha diels et Hand.-Mazz // Chem. Pharm. Bull., 1996, v. 44, p. 1669-1675). Основным недостатком данного способа является сравнительно низкие выходы целевых продуктов реакции 5-30%.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка технологичного и малостадийного способа синтеза природного лигнана - севанола, содержащего дигидронафталиновую систему, протекающего с высоким выходом по исходному производному кофейной кислоты.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является технологичный и малостадийный способ синтеза природного лигнана - севанола и способ его последующего выделения и очистки с суммарным выходом 2,2% целевого продукта.
Поставленный технический результат достигается в два этапа. Первый этап (ФИГ. 3) связан с разработкой нового способа получения три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты следующей формулы:
Сущностью данного способа является прямое введение трет-бутилацетатного фрагмента в молекулу (L)-яблочной кислоты с карбоксильными группами, защищенными трет-бутиловыми эфирами.
Преимуществом данного способа является высокий выход 61%, одностадийность процесса, простота выделения продукта реакции, малое количество реагентов для синтеза.
Способ заключается в металлировании ди-третбутилового эфира (L)-яблочной кислоты по ранее известной методике (М. F. A. Amer, K. Takahashi, J. Ishihara and S. Hatakeyama, Total synthesis of Citrafungin A// Heterocycles 2007, v. 72, p. 181-185) диизопропиламидом лития (ЛДА) с последующим алкилированием данного субстрата трет-бутиловым эфиром бромуксусной кислоты при температуре -78°С. При этом используется 2.5 кратный избыток литирующего реагента - ЛДА и 1.2 кратный избыток алкилирующего вещества. Обнаруживается, что уменьшение или увеличение количества диизопропиламида лития не улучшает выход продукта реакции, а увеличение или уменьшение температуры реакции приводит к значительному уменьшению выхода реакции.
Промежуточные стадии проводят с использованием стандартных процедур для получения двух основных промежуточных продуктов: эфира кофейной кислоты с три-трет-бутиловым эфиром изолимонной кислоты
и хлорангидрид бисацетикофейной кислоты
которую получают по способу (М. Sefkow, First efficient synthesis of chlorogenic acid // Eur. J. Org. Chem., 2001, i. 6, p. 1137-1141) (ФИГ. 4).
На стадии реакции ацилирования эфира кофейной кислоты с три-трет-бутиловым эфиром изолимонной кислоты хлорангидридом бисацетикофейной кислоты (ФИГ. 5) в качестве основания используют пиридин, что является ключевым моментом на этом этапе. Необходимым условием проведения синтеза во избежание образования побочных продуктов является проведение реакции при температурах близким к 0°С. При проведении данного процесса синтеза используют охлаждение реакционной смеси и порционное добавление хлорангдрида бисацетилкофейной кислоты, растворенного в хлористом метилене, при помощи капельной воронки. Такая процедура увеличивает эффективность реакции до 82% выхода.
Известен способ снятия ацетильных групп с эфиров кофейной кислоты с использованием метиламина в метаноле как растворителя (Патент WO 2015154721). Для соединения (10 на ФИГ. 5) этот способ дает очень низкий выход продукта, поэтому для удаления ацетильных групп используется N-метилпиперазин в абсолютном ТГФ. Это позволяет получать ключевой интермедиат (11 на ФИГ. 5) с выходом близким к количественному (96%). При масштабировании способа получения эфира три-третбутилового эфира изолимонной кислоты 3,4-дигидроксикоричной кислоты соблюдают температурный режим, а именно, реакцию деблокирования проводят при охлаждении до 0°С, а также исключают доступ кислорода (проведение реакции под аргоном).
3
Второй принципиальный этап заключается в окислительной димеризации соответствующего эфира кофейной кислоты, с использованием хлорида железа(III) в качестве реагента. Реакция димеризации требует соблюдения условий на предмет количества FeCl, используемых растворителей и температурного режима проведения реакции. Сущностью способа является реакция сочетания двух молекул производного кофейной кислоты (ФИГ. 5 стадия А8). Преимуществом данного способа является высокий выход 51%, небольшая продолжительность реакции 1 час, простота выделения продукта реакции, а также возможность получения различных производных эпифиловой кислоты, с разнообразной биологической активностью.
3
Способ заключается во взаимодействии эфира (три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты) кофейной кислоты с хлоридом железа(III), при мольном соотношении реагентов 1:2, в смеси растворителей ацетонитрил-вода в соотношении 4:1, при температуре 5°С, в течение 1 часа, в отсутствии света, с последующей экстракцией продукта реакции толуолом. При уменьшении продолжительности реакции не достигается хороший выход продукта. Увеличение продолжительности реакции является нецелесообразным с экономической точки зрения. Увеличение или уменьшение температуры реакции приводит к значительному уменьшению выхода реакции. Присутствие света приводит к образованию продуктов хлорирования целевого вещества. Оптимальным условием проведения реакции окислительной димеризации является ее осуществление при мольном соотношении производного коричной кислоты к хлориду железа(III), 1:2 соответственно. Меньший избыток FeCl приводит к снижению выхода целевого продукта, а увеличение избытка к значительному количеству побочных, трудноотделяемых примесей. Синтезированное соединение после обработки реакционной смеси подвергается очистки на силикагеле. После кислото-катализируемого (80% водная трифторуксусная кислота) деблокирования карбоксильных функций изолимонной кислоты, упаривания и очистки при помощи обращеннофазной хроматографии, получается продукт - севанол с суммарным выходом 2.2% и чистотой 98%.
Севанол проявляет анальгетическую активность на млекопитающих, что показывается в тестах на мышах ICR: как для модели тепловой гиперчувствительности после введения адъювант Фрейнда (ФИГ. 6), так и на модели стимуляции «уксусных корчей» (ФИГ. 7).
Изобретение иллюстрируют фигуры:
ФИГ. 1. Структура севанола.
ФИГ. 2. Структура изосеванола.
ФИГ. 3. Синтез три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты.
ФИГ. 4. Синтез хлорангидрида бис-ацетилкоричной кислоты.
ФИГ. 5. Заключительный этап синтеза севанола.
ФИГ. 6. Исследование влияния севанола на тепловую гиперчувствительность вызванную введением полного адьюванта Фрейнда (CFA) n=8. По оси ординат показано время отдергивания соответствующей лапы от горячей пластины (t=53°C). Внутримышечное введение севанола в различных дозах проводят за 120 минут до начала измерения. Статистически значимые различия от группы контроль отмечены * Р≤0,05 относительно контрольной группы (ANOVA-1, Duncan test).
ФИГ. 7. Исследование влияния севанола на внутрибрюшинное введение уксусной кислоты в животной модели «Уксусные корчи» n=8. По оси ординат показано количество корчей, измеренное сразу после введения кислоты за 15 минутный интервал наблюдения. Внутримышечное введение севанола в различных дозах проводят за 120 минут до начала измерения. Статистически значимые различия: * Р≤0,05 относительно контрольной группы (ANOVA-1, Duncan test); # Р≤0,05 относительно группы «0,1 мг/кг» (ANOVA-1, Duncan test).
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1.
Получение О-трет-бутилдиизопропилизомочевины (3). М=228, m=330 гр (бесцветная жидкость)
В круглодонную колбу объемом 1 л помещают соединение 1 (1,65 моль, 208 гр) и 0,01 эквивалента CuCl (20 ммоль, 1 гр), затем добавляют 1 эквивалент трет-бутилового спирта 2 (1,65 моль, 122 гр) и оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 72 часов. Полученную реакционную смесь фильтруют через пористый стеклянный фильтр и перегоняют при температуре 70-75°С/15 мм. рт.ст. В результате перегонки получают 330 гр целевого соединения О-трет-бутилдиизопропилизомочевины 3 с выходом 83%.
Пример 2.
Получение бис-трет-бутилового эфира (L)-яблочной кислоты (5): М=248, m=60 гр (бесцветное масло)
В круглодонную колбу объемом 2 л, снабженную капельной воронкой и внутренним термометром помещают соединение 4 (0,34 моль, 45 гр), прибавляют 500 мл хлористого метилена. Реакционную смесь охлаждают в ледяной бане до температуры 0-5°С и постепенно прикапывают 5 эквивалентов соединения 3 (1,7 моль, 330 гр) растворенного в хлористом метилене (500 мл). Реакционную смесь отогревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 16 часов. Прохождение реакции контролируют при помощи ТСХ в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:4. Далее выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, остаток очищают на силикагеле в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:4. Целевое соединение 5 получают с выходом 71% (60 гр).
Пример 3.
Получение три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты (6): М=360, m=53 гр (бесцветное масло)
2
4
В круглодонную колбу объемом 2 л, снабженную септой, переходом для ввода аргона и низкотемпературным термометром, помещают 2,5 эквивалента диизопропиламина (0,6 моль, 85 мл) растворенного в ТГФ (500 мл). Полученный раствор охлаждают при помощи жидкого азота до -70°С и, используя шприц, через септ постепенно прикапывают 2,5 эквивалента 2,5М бутиллития в гексане (0,6 моль, 240 мл). Реакционную смесь перемешивают при -50°С в течение 30 минут. Далее реакционную смесь охлаждают до -78°С и постепенно прикапывают соединение 5 (0,24 моль, 60 гр), растворенное в ТГФ (200 мл). Реакционную смесь отогревают до -60°С и перемешивают при данной температуре в течение 20 минут. Далее реакционную смесь охлаждают до -78°С и постепенно прикапывают 1,2 эквивалента трет-бутилбромацетата (0,29 моль, 42 мл), растворенного в ТГФ (100 мл). Реакционную смесь отогревают до -20°С и перемешивают при данной температуре в течение 3 часов. Прохождение реакции контролируют по ТСХ в системе этилацетат-гексан 1:9. Полученную реакционную смесь обрабатывают 1М соляной кислотой до рН=3. Полученный органический раствор сушат NaSO и упаривают на роторном испарителе. Целевое соединение выделяют при помощи прямофазной силикагельной хроматографии в системе этилацетат-гексан 1:9. Целевое соединение 6 получают с выходом 61% (53 гр).
Пример 4.
Получение 3,4-бисацилкоричной кислоты (8): М=264, m=37,4 гр (порошок белого цвета)
2
4
В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают 3,4-дигидроксикоричную кислоту 7 (0,15 моль, 28 гр) и 150 мл хлористого метилена, охлаждают до -20°С, затем добавляют 5 эквивалентов ацетилхлорида (0,77 моль, 55,5 мл) и при помощи капельной воронки постепенно прикапывают 10 эквивалентов пиридина (1,5 моль, 120,7 мл). Отогревают до комнатной температуры и далее перемешивают в течение 16 часов. Прохождение реакции контролируют при помощи ТСХ в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:2. Полученную реакционную смесь упаривают на роторном испарителе, растворяют полученный остаток в хлористом метилене (150 мл), обрабатывают охлажденной льдом разбавленной 1М соляной кислотой до рН=4. Органический слой сушат NaSO и упаривают на роторном испарителе. Затем добавляют гексан (100 мл), перемешивают 10 минут и полученный осадок фильтруют через пористый стеклянный фильтр. В результате перекристаллизации получают целевой бис-ацетил-защищенный продукт 8 с выходом 91% (37,4 гр).
Пример 5.
Получение хлорангидрида 3,4-бисацилкоричной кислоты (9): М=282,5, m=40 гр (светло-розовый порошок)
В круглодонную колбу объемом 500 мл помещают соединение 8 (0,14 моль, 37,4 гр) и толуол (300 мл). Далее при помощи капельной воронки, постепенно прикапывают 1,2 эквивалента тионилхлорида (0,17 моль, 12,2 мл). Добавляют каплю ДМФ (20 мкл) в качестве катализатора, снабжают колбу обратным холодильником с отводом газа и перемешивают при температуре 80°С в течение 2 часов. Затем реакционную смесь упаривают на роторном испарителе. Целевое соединение 9 получено количественно. (40 гр).
Пример 6.
Получение эфира три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты 3,4-бисацилкоричной кислоты (10): М=606, m=64,6 гр (порошок белого цвета)
2
4
В круглодонную колбу объемом 500 мл, снабженную капельной воронкой, помещают соединение 6 (0,13 моль, 46 гр), хлористый метилен (300 мл) и добавляют 1,2 эквивалента пиридина (0,16 моль, 12,5 мл). Полученную реакционную смесь охлаждают в ледяной бане до 0-5°С и постепенно прикапывают растворенное в хлористом метилене (200 мл) соединение 9 (0,14 моль, 40 гр). Перемешивают в течение 4 часов. Прохождение реакции контролируют при помощи ТСХ в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:4. Затем реакционную смесь обрабатывают 1М соляной кислотой до рН=3. Полученный органический раствор сушат NaSO и упаривают на роторном испарителе. Далее соединение выделяют при помощи прямофазной силикагельной хроматографии в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:4. Целевое соединение 10 получают с выходом 82% (64,6 гр).
Пример 7.
Получение эфира три-трет-бутилового эфира изолимонной кислоты 3,4-дигидроксикоричной кислоты (11): М=522, m=55 гр (масло светло-желтого цвета)
2
4
В круглодонную колбу объемом 1 л помещают соединение 10 (0,11 моль, 64,6 гр) и растворяют в ТГФ (500 мл). Реакционную смесь охлаждают в ледяной бане до 0-5°С и затем прикапывают при помощи капельной воронки 2,2 эквивалента N-метилпиперазина (0,23 моль, 26 мл), растворенного в ТГФ (100 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 4 часов при комнатной температуре. Прохождение реакции контролируют при помощи ТСХ в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:4. Далее упаривают ТГФ на роторном испарителе до объема ~100 мл, добавляют этилацетат (300 мл) и обрабатывают 1М соляной кислотой до рН=4. Органический раствор сушат NaSO и упаривают на роторном испарителе. Далее соединение выделяют при помощи прямофазной силикагельной хроматографии в системе этилацетат-гексан в соотношении 1:4. Целевое соединение 11 получают с выходом 96% (55 гр).
f
3
Н
3
27
39
10
1
13
+
+
R (35% ЭА/гексан) 0.3; Н ЯМР (300 MHz, CDCl): δ 7.54 (1Н, д, J=15.9 Hz), 6.99 (1Н, с), 6.86 (1Н, с), 6.85 (1H, с), 6.59 (1Н, с, ОН), 6.17 (1Н, д, J=15.9 Hz), 6.03 (1H, с, ОН), 5.31 (1Н, д, J 3.3 Hz), 3.45-3.51 (1Н, м), 2.77 (1H, дд, J=16.8, 9.7 Hz), 2.47 (1H, дд, J 16.8, 5.2 Hz), 1.52 (9H, c), 1.51 (9H, c), 1.48 (9H, с); C ЯМР (300 MHz, CDCl): 170.7, 169.5, 167.6, 166.3, 146.6, 146.3, 144.1, 127.1, 122.4, 115.5, 114.4, 113.9, 83.4, 82.3, 81.3, 71.9, 43.9, 34.0, 28.0; ИК (KBr): 1721, 2936, 2980, 3391; BPMC: MH теор. CHO 523.2537 (MH): фактическая 523.2536.
Пример 8.
Получение бис-эфира эпифиловой кислоты и три-третбутилового эфира изолимонной кислоты (12): М=1042 (масло желтого цвета), m=28 г
3
2
4
В круглодонную колбу объемом 1 л, снабженную капельной воронкой и помещенную в темное помещение при температуре 5°С, помещают соединение 11 (0,1 моль, 55 гр) и ацетонитрил (550 мл). При температуре не выше 5°С и отсутствии света по каплям прибавяют 10% водный раствор 2,5 эквивалентов FeCl (0,25 моль, 40,6 гр в 400 мл воды). Перемешивают при данной температуре 2 часа. Далее реакционную смесь обрабатывают 1М соляной кислотой до рН=4 и экстрагируют толуолом (300 мл). Полученный раствор в толуоле сушат NaSO и упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40°С в отсутствии света. Полученный остаток очищают на силикагеле в системе этилацетат-толуол = 4:1 с 3% уксусной кислоты. Целевое соединение 12 получают с выходом 51% (28 гр).
Пример 9.
Получение севанола: М=706, m=15 гр (стеклообразная массы коричневого цвета)
В круглодонную колбу объемом 1 л, снабженную обратным холодильником, помещают соединение 12 (21 ммоль, 22,5 гр) и добавляют смесь ТФУ-вода в соотношении 4:1 (400 мл ТФУ : 100 мл вода). Перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученную реакционную смесь упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Полученный остаток массой 15 г очищают на препаративной ВЭЖХ.
Хроматографирование севанола осуществляют на колонке LPS-500 (13 мкм, 50×250 мм) на приборе Waters Prep LC 2000. Водный раствор севанола (5 г в 20 мл воды) наносят на колонку с помощью одного из насосов. Хроматографию проводят в следующих условиях (буфер А - 0,1% трифторуксусная кислота в воде, буфер В - ацетонитрил):
1) 2% буфера В - 5 мин. со скоростью 80 мл/мин,
2) линейный градиент от 2% до 30% буфера В за 60 мин. со скоростью 80 мл/мин.
После очистки и лиофильной сушки фракций получают смесь севанола и изосеванола в соотношении 75% и 25% соответственно с выходом 30% (4,5 гр).
Пример 10.
Очистка севанола от изосеванола.
Разделение этой смеси осуществляют на колонке_Phenomenex (20×250 мм, 10 mkm, 300А, С18) на приборе Waters 515. Водный раствор смеси севанола и изосеванола в соотношении 75% и 25% соответственно (100 мг в 2 мл воды) наносят на колонку с помощью насоса. Хроматографию проводят в следующих условиях:
1) изократика: 7% буфер В за 90 мин. со скоростью 10 мл/мин.
После разделения и лиофильной сушки получают севанол с выходом 75% (75 мг).
Пример 11.
Подтверждение структуры севанола
1
13
1
13
1
13
-
-
2
Н
2
30
25
20
Достоверность структуры полученного соединения подтверждают данными спектроскопии ЯМР Н и С. Химические сдвиги и мультиплетность сигналов в спектрах ЯМР Н и С полученного образца севанола полностью совпадают с природным образцом севанола. Н ЯМР (700 MHz, DO): δ 7.75 (1H, с), 7.01 (1Н, с), 6.72 (1H, с), 6.68 (1Н, д, J=8.3 Hz), 6.62, (1Н, д, J=1.7 Hz), 6.43 (1H, дд, J=1.7 Hz, 8.3 Hz), 5.38 (1H, д, J=4.0 Hz), 5.33 (1H, д, J=3.4 Hz), 4.5 (1H, д, J=1.9 Hz), 4.08 (1H, д, J=1.9 Hz), 3.56-3.59 (1H, м), 3.45-3.47 (1H, м), 2.78 (1H, дд, J=9.3 Hz, 17.2 Hz), 2.6 (1H, дд, J=5.2 Hz, 17.2 Hz), 2.50 (1H, дд, J=9.6 Hz, 17.3 Hz), 2.24 (1H, дд, J=9.6 Hz, 17.3 Hz); C ЯМР (300 MHz, DO): 175.4, 175.2, 174.2, 173.7, 172.8, 172.7, 171.8, 166.9, 147.5, 143.9, 143.3, 142.8, 141.4, 134.5, 130.7, 123.7, 119.8, 119.6, 117.4, 116.6, 116.1, 115.3, 73.2, 73.2, 46.4, 44.0, 43.2, 42.2, 32.3, 31.8; ИК (KBr): 1709, 2648, 3253; MCBP: MH теор. CHO 705.0939 (MH): фактическая 705.0941.
Измеренная молекулярная масса методом хромато-масс-спектрометрии равняется 706.31 Да, что соответствует расчетной массе. Спектр УФ-поглощения имеет два максимума 253 и 344 нм и один минимум 279 нм, что соответствует ранее полученному спектру УФ-поглощения для природной молекулы.
Пример 12.
Тестирование анальгетической активности севанола в тесте тепловой гиперчувствительности.
Тесты проводят на мышах ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 4 группы по 8 в каждой. Воспаление у мышей, кроме контрольной группы, вызывают введением в подушечку задней лапы воспалительного агента, представляющего собой 20 мкл смеси полного адьюванта Фрейнда/физраствор 1:1 (v/v). Через 24 часа внутримышечно вводят 100 мкл физиологического раствора животным группы «физ. p-p», остальным группам внутримышечно вводят 100 мкл раствора севанола в дозе 10, 1 и 0,1 мг/кг. Измерение проводят через 120 мин после внутримышечного введения. Фиксируют латентное время отдергивания лапы, подвергшейся действию воспалительного агента, от горячей пластины (t=53°C). Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью ANOVA и теста Дункана. Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени, прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента отдергивания воспаленной лапы (ФИГ. 6).
Пример 13.
Тестирование анальгетической активности севанола в тесте кислотной стимуляции боли.
Тесты проводят на самцах мышей ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 4 группы по 8 в каждой. Севанол растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят по 100 мкл раствора внутримышечно за 120 мин до введения 0,75% раствора уксусной кислоты. Используют три дозы препарата 10, 1 и 0,1 мг/кг. Для контрольной группы животных вводят просто 100 мкл физиологического раствора (ФИГ. 7). Анальгетический эффект определяют на основании подсчета корчей, вызываемых внутрибрюшинной инъекцией 100 мкл раствора 0,75% уксусной кислоты за 15 минут наблюдения. Корчи - специфическая болевая реакция, сопровождающаяся характерными движениями животных, которые включают сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягивание задних конечностей и изгибание спины. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью ANOVA и теста Дункана. Анальгетический эффект измеряют по снижению болевой чувствительности к висцеральному и воспалительному типу боли, что выражается в снижении количества корчей за измеряемый промежуток времени.
Таким образом, предлагаемый способ получения севанола позволяет получать соединение заявленной структурной формулы с выполнением следующих совокупных условий:
а) целевое соединение получают в девять стадии с суммарным выходом 2,2%.
б) исходные соединения являются продажными реагентами и имеют низкую стоимость.
в) условия проведения реакций отличаются простотой и не требуют специального оборудования.