СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ДОПИНГОВОМ КОНТРОЛЕ СПОРТСМЕНОВ
METHOD OF DETECTING CONJUGATED XENOBIOTICS DURING DOPING TESTS IN ATHLETES

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии, в частности к способам определения уровня содержания ксенобиотиков в организме, и может быть использовано, например, при допинговом контроле спортсменов.
Известен способ определения ксенобиотиков, например стероидов, методами колориметрического анализа [1].
Способ этот относится к методам качественного анализа и соответственно позволяет определить только наличие стероидов, без определения их структурных характеристик и, собственно, природы. К тому же по указанному способу возможно анализировать объекты только с очень высоким содержанием стероидов.
Известны также способы определения ксенобиотиков методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией [2-4].
Общим недостатком таких методов является трудоемкая и продолжительная во времени стадия получения летучих производных, что существенно усложняет ход анализа, увеличивает его продолжительность и удорожает проведение процесса.
Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является ГХ-МС способ определения конъюгированных ксенобиотиков, в т.ч. стероидов, в моче человека методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) [5].
E.coli).
По указанному способу в образец мочи добавляют фосфатный буферный раствор, внутренний стандарт, а также фермент (β-глюкуронидаза Смесь перемешивают и инкубируют и после гидролиза добавляют карбонатный буферный раствор и диэтиловый эфир, далее органический слой отделяют после центрифугирования, упаривают досуха, дериватизируют и анализируют методом ГХ/МС. Основным недостатком указанного способа является низкая степень достоверности определения ксенобиотиков и высокий порог чувствительности (например, для эпитестостерона до 25-50 нг/мл), поскольку указанный стероид выводится в мочу в виде как глюкуронидов, так и сульфатов, а анализу подвергаются только глюкурониды.
Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение  степени достоверности определения ксенобиотиков за счет снижения порога чувствительности определения и расширения номенклатуры определяемых ксенобиотиков (КБ).
E.coli
H.pomatia
Поставленный технический результат достигается тем, что в процессе пробоподготовки гидролиз анализируемого образца мочи ведут смесью двух ферментов: β-глюкуронидазы  и арилсульфатазы  в объемном соотношении от 1:1 до 1:3, и в качестве буферного раствора используют цитратный буферный раствор.
Известно, что при ГХ/МС анализе КБ необходимо провести несколько стадий пробоподготовки, поскольку выведение КБ в мочу происходит после фазы II метаболизма, а именно конъюгирования, во время которого образуются сложные эфиры соединений, причем КБ выводятся в мочу в виде глюкуронидов и сульфатов. Некоторые КБ образуют наиболее долгоживущие метаболиты именно в сульфатной фракции, поэтому их можно обнаружить в биологической жидкости в течение, например, не 8 часов, а в течение 18 или 24 часов, что должно повысить достоверность подтверждения приема допинга спортсменом. Тем не менее в настоящее время концентрации КБ, в том числе и стероидов, по нормативам WADA рассчитывают исходя из глюкуронидов соответствующих соединений [6].
При реализации заявляемого изобретения в качестве аппаратурного оформления процесса может быть использован, например, хроматограф Agilent 6890, соединенный с масс-селективным детектором Agilent 5973N с электронной ионизацией (70 eV), колонка Restek Rxi - 1ms (длина 12 м, внутренний диаметр 0.20 мм, толщина неподвижной фазы 0.33 мкм).
Температурная программа может быть установлена со следующими параметрами: подъем от 188 до 232°C со скоростью 2°C/мин, далее от 232 до 300°C по 12°C/мин, изотерма 5.33 мин при объеме вводимой пробы 2 мкл в режиме деления потока (1:20), температура инжектора - 280°С. Газ-носитель - гелий (0.6 мл/мин). Температура источника ионов - 230°С, температура переходной линии - 290°С, квадруполя - 150°С, скорость сканирования - 1.69 циклов/сек, диапазон масс в режиме полного сканирования - 50-600 а.е.м.
N
N
H.pomatia,
H.pomatia
В качестве реагентов и материалов могут быть использованы, например -метил--(триметилсилил)-трифторацетамид (МСТФА), β-глюкуронидаза из  арилсульфатаза из  и ацетат натрия (Sigma-Aldrich, США); стандартные образцы тербуталина, форместана, карведиолола, морфина, тимолола, андростендиона, эпиандростерона и станозолола (Steraloids, Newport, США); метанол, соляная кислота и уксусная кислота (Merck, ФРГ); дигидрофосфат калия, гидрофосфат натрия и йодид аммония (Riedel-de-Haën, ФРГ); карбонат калия, гидрокарбонат калия и сульфат натрия (ХимМед, РФ); диэтиловый эфир  (МедХимПром,  РФ); 1,4-дитио-DL-триэтол (ДТТ), имидазол (Fluka, Швейцария); цитрат калия (Alfa Aesar, США); внутренний стандарт - метилтестостерон (МТ), D4-андростерон-глюкуронид и D5-этиохоланолон (LGC Standards, Великобритания); деионизированная вода (MilliQ, ФРГ).
Разумеется, могут быть использованы оборудование, материалы и реактивы других производителей, однако с тем условием, что по качественным характеристикам они будут обеспечивать воспроизводимость результатов исследования в объеме заявляемых патентных притязаний.

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы: автоматический шейкер фирмы Glas-Col, США для ЖЖЭ; центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами; упариватель фирмы Barnstead Inc. (США), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта. В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован  метилтретбутиловый эфир (МТБЭ). В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.
Изобретение может быть осуществлено следующим образом.
4
Готовят образцы мочи, добавляют в них буферный раствор, внутренний стандарт (метилтестостерон, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества фермента или смеси ферментов. Смесь далее перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0 -1,5 ч. По окончании гидролиза в смесь добавляют карбонатный буферный раствор (рН 10,4) и диэтиловый эфир, встряхивают в течение 3-10 мин, центрифугируют, отделяют органический слой и упаривают его досуха и дериватизируют раствором МСТФА/NHI/ДТТ при нагревании в течение 20-40 минут, дериватизат переносят в виалу и анализируют методом ГХ/МС. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов, а также всех растворов и проб (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например ChemStation фирмы Agillent, США.
Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.
Пример 1
4
Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл), в частности тербуталина, форместана, карведиолола, морфина, тимолола, андростендиона, эпиандростерона и станозолола. Рабочие растворы готовят растворением точной навески ксенобиотиков - эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы разбавлением стандартных растворов до содержания 10 мкг/мл. Стандартные растворы каждого из КБ (1 мг/мл) готовят растворением точной навески в точном объеме метанола. К 3 мл мочи (из приготовленных ранее образцов) добавляют 1 мл буферного раствора, 30 мкл внутреннего стандарта (МТ, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества смеси ферментов. Смесь перемешивают и инкубируют при 55°С 1 час 10 минут. После гидролиза добавляют 1 мл карбонатного буферного раствора (рН 10.4) и 5 мл диэтилового эфира. Встряхивают в течение пяти минут, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин; органический слой отделяют, упаривают досуха при 70°C в течение 40 минут и проводят дериватизацию - 50 мкл раствора МСТФА/NHI/ДТТ (1000:3:2) при нагревании до 70°С в течение 30 минут, раствор переносят в виалу и анализируют далее методом ГХ/МС (параметры аналитической процедуры приведены выше).
С разрешения этической комиссии и согласия добровольцев (5 человек) ими были приняты допинг (андростендион и тербуталин - 1-й;  форместан и карведиолол - 2-й; морфин - 3-й; тестостерон - 4-й и станозолол - 5-й). Пробоподготовку образцов мочи допированных добровольцев проводят в описанном выше порядке (добавляют буферный раствор, внутренний стандарт, точные количества фермента или смеси ферментов, далее смеси перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0 -1,5 ч) и далее проводят ГХ/МС анализ. КБ в пробах мочи определяют в том же порядке и при тех же параметрах, что и в стандартных растворах. Результаты анализов представлены  в  Таблице 1.
Таблица 1
Образец мочи
фермент
Буфер
Найденные КБ, концентрация, нг/мл
1
E.coli + helix pomatia
цитратный
Андростендион, 120Тербуталин, 430
2
E.coli + helix pomatia
цитратный
Форместан, 260Карведиолол, 120
3
E.coli + helix pomatia
цитратный
Морфин, 1450
4
E.coli + helix pomatia
цитратный
Тестостерон, 279
5
E.coli + helix pomatia
цитратный
Станозолол, 153
Одновременно эти же образцы мочи исследуют по методике, предписанной в прототипе (фермент E. Coli, фосфатный буфер). Результаты анализов представлены в Таблице 2.
Таблица 2
Образец мочи
фермент
Буфер
Найденные КБ, концентрация, нг/мл
1
E.coli
фосфатный
Андростендион не обнаруженТербуталин, 180
2
E.coli
фосфатный
Форместан, 100Карведиолол, 120
3
E.coli
фосфатный
Морфин, 500
4
E.coli
фосфатный
Тестостерон, 240
5
E.coli
фосфатный
Станозолол, 140
Из представленных в Таблице 1 результатов становится очевидным, что использование для гидролиза смеси ферментов E.coli + helix pomatia в цитратном буфере позволяет расширить номенклатуру определяемых КБ, а также существенно понизить порог определения указанных соединений.
В частности, это видно из сопоставления полученных результатов в Таблице 2 (количество определенных в пробе КБ - нг/мл).
Для сравнения проводят анализы образцов мочи, подвергнутых гидролизу при различных сочетаниях ферментов и буферов (см. Таблицу 3).
Таблица 3
1
Фермент E.coli
Буфер фосфатный
По WADA
2
Смесь ферментов Е.coli + helix pomatia
Буфер цитратный
По изобретению
3
Фермент E.coli
Буфер цитратный
Для сравнения
4
Фермент helix pomatia
Буфер фосфатный
Для сравнения
5
Фермент helix pomatia
Буфер цитратный
Для сравнения
На рис.1-5 представлены результаты анализов для исследованной серии КБ в зависимости от природы фермента(ов) и буфера.
Из представленных иллюстративных материалов вытекает, что при использовании в качестве гидролизующей среды смеси ферментов (Е.coli + helix pomatia) в цитратном буфере нижний предел обнаружения исследованных КБ по сравнению с известным (единица, или 100%) понижается по меньшей мере до 0,8-0,35 (т.е. в 1,2-1,65 раза)
Пример 2
Готовят образец мочи, добавляют в него буферный раствор, внутренний стандарт (МТ, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества фермента или смеси ферментов. Смесь далее перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0-1,5 ч и далее процедуру проводят, как в Примере 1, включая технику и условия проведения ГХ/МС анализа, за исключением того, что образец мочи разделяют на пять аликвот и каждую аликвоту подвергают гидролизу при следующих условиях (Таблица 4):
Таблица 4
Аликвота
Фермент Е.coli (мл)
Helix pomatia (мл)
Примечание
1
1,0
0,7
2
1,0
1,0
3
1,0
2,0
4
1,0
3,0
5
1,0
3,5
На рис.6 приведены результаты определения карведиолола в зависимости от соотношения объемов смеси используемых ферментов.
Из рис.6 следует, что оптимальное соотношение объемов используемых ферментов составляет 1:2 - 1:3. Выход соотношения за заявленные пределы снижает ожидаемый результат определения ЭС.
Как видно из описания и приведенных примеров осуществления способа и сравнительных примеров, изобретение обеспечивает снижение порога чувствительности определения ЭС, а также расширение номенклатуры определяемых соединений.
Источники информации
1. RU 2190853 С2, G01N 33/74, 2002 г.
2. Хим. фарм. Журнал, 1988, т.22, с.622.
3. RU 2313086 C2, G01N 30/72, 2007.
4. J.Anal. Toxicol., 2005, v.29, №4, p.217.
5. WADA Technical Document - TD2004EAAS - прототип.
6. Wada Prohibited List, Version 5.0, 2010.