ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК МИКРООРГАНИЗМОВ АКТИВНОГО ИЛА НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДА КАК ОСНОВА ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО БПК-БИОСЕНСОРА

УДК 579.695 DOI: 10.24412/2071-6176-2023-1-69-81

ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК МИКРООРГАНИЗМОВ АКТИВНОГО ИЛА НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДА КАК ОСНОВА ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО БПК-БИОСЕНСОРА

Р.Н. Перчиков, В.А. Арляпов

Разработана лабораторная модель биосенсора для определения биохимического потребления кислорода (БПК5) на основе кворума микроорганизмов активного ила и медиатора электронного транспорта - ферроцена. С помощью оптической микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) было доказано, что на поверхности электрода сформирована биопленка активного ила, константа скорости взаимодействия медиатора ферроцена с микроорганизмами биопленки активного ила составила 0,21±0,02 дм3/(г-с), нижняя граница определяемых концентраций для разработанного сенсора ровна 0,29 мгО2/дм3, а долговременная стабильность рецепторной системы составила 52 дня.

Ключевые слова: биопленка, биосенсор, ферроцен, активный ил, биохимическое потребление кислорода, БПК5.

Введение

Мониторинг качества очистки сточных вод, а также состояния природных вод, испытывающих высокую антропогенную нагрузку со стороны промышленных предприятий, является приоритетной задачей для предотвращения экологически опасных ситуаций. Отследить распространение загрязнения, а также быстро и точно ответить на вопрос о качестве воды в том или ином регионе позволяют интегральные аналитические системы. Последнее десятилетие отмечено интенсивным использованием микроорганизмов для количественного определения интегральных показателей [1,2]. Биохимическое потребление кислорода (БПК) является одним из наиболее широко используемых показателей для контроля чистоты водных сред и представляет, по определению, количество кислорода, необходимое для биохимического окисления органических веществ, содержащихся в образце воды. Принятый метод определения БПК регламентирован в международном стандарте ISO 58151:2003 [3]. Основной недостаток методики - длительность анализа (минимум 5 суток), что привело к разработке экспресс-методов, в частности, созданию биосенсорных анализаторов, основанных на применении микроорганизмов, метаболизирующих широкий спектр органических соединений, которые позволяют определять этот же показатель за несколько минут [4].

Использование иммобилизованной клеточной биомассы является классическим подходом к созданию микробных биосенсоров, в то время как подход, основанный на выращивании электроактивных биопленок с

заданными свойствами на поверхности сенсорных датчиков из проводящих графитовых материалов, является инновационным [5]. В настоящее время предпринимаются попытки интегрирования электроактивных биопленок в микробные топливные элементы [6], однако возможности использования биопленок гораздо шире. В работе для создания биорецепторного элемента БПК-биосенсора использовали бактерии активного ила, так как он применяется для стандартного метода анализа БПК [3], что обуславливает высокую корреляцию данных биосенсора с результатами классического метода [4]. Кроме того, активный ил и выделенные из него микроорганизмы успешно применяются для создания БПК-биосенсоров [7, 8].

Материалы и методы

Реактивы и материалы. В качестве медиатора электронного транспорта использовали ферроцен («Диаэм», Россия). Для приготовления питательной среды применяли D-глюкозу («Panreac», Испания), пептон («Condra», Испания), триптон («Condra», Испания), дрожжевой экстракт («Helicon», Россия). Для создания рабочего графито-пастового электрода были взяты графитовая пудра с размером частиц 75 мкм с высокой частотой 99,997% («Fluka», Германия), парафиновое масло («Fluka», Германия) и диализная мембрана с пределом пропускания 14 кДа («Roth», Германия). Для проведения биосенсорных измерений использовали натрий-калий фосфатный буферный раствор рН=6,8 (33 мМ KH2PO4 + 33 мМ N2HPO4, «Диаэм», Россия).

Культивирование клеток микроорганизмов. Активный ил был отобран в очистных сооружениях завода по производству химических удобрений. Клетки микроорганизмов активного ила выращивали на жидкой среде LB состава: триптон - 10 г/дм3, дрожжевой экстракт - 5 г/дм3, хлорид натрия - 10 г/дм3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 1,15 атм. в течение 45 мин. Клетки выращивали аэробно 20-24 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 оС. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре на центрифуге «Eppendorf» (Германия) при 10000 об/мин 10 минут и отмывали от культуральной среды 20 мМ фосфатным буфером рН=6,8 (2 раза). Осевшие клетки промывали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге 10 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -10 оС.

Формирование рабочего медиаторного электрода. Рабочий графито-пастовый электрод (ГПЭ) формировали, наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра - минеральное масло» пластиковую трубку с площадью рабочей поверхности 6,3 мм2.

Поверхность электрода механически очищали и полировали. Для модификации рабочего электрода экзогенным медиатором электронного транспорта навеску ферроцена (10 мг) растворяли в 500 мкл ацетона и добавляли к 90 мг графитовой пудре (массовая доля ферроцена от общей массы пудры составляла 10 % масс.).

Для формирования электродов с суспензией клеток на поверхность модифицированного рабочего электрода наносили микроорганизмы в виде суспензии с титром 330 мг/мл в количестве 10 мкл. Таким образом, удельная масса микроорганизмов на поверхности графито-пастового электрода составила 0,52 мг/мм2. Для фиксации суспензии микроорганизмов на поверхности электрода использовали диализную мембрану. Для формирования электродов с биопленками клеток модифицированный рабочий электрод помещали в стерильные пробирки с питательной средой LB (15 см3) и микроорганизмами. Эксперимент проводился при температуре 29 оС в течении 53 часов. Для фиксации биопленки на поверхности электрода использовали диализную мембрану, которую закрепляли при помощи пластикового кольца.

Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «ГРС-тюго» (ООО НТФ Вольта, Санкт-Петербург), интегрированного с персональным компьютером. Диапазон возможных регистрируемых токов составлял от 5 до 20 мкА. Ошибка измерения потенциала была не более 0,1 мВ для интервала ±5 мВ. Рабочий потенциал составлял +280 мВ для электродов на основе ферроцена. Измерения проводили при температуре 20 0С; объем измерительной ячейки составлял 5 см3. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (300 об/мин). После установления стабильного уровня тока в ячейку вводили необходимое для получения заданной концентрации количество исследуемого соединения. После каждого измерения производили промывку ячейки калий-натрий-фосфатным буферным раствором рН=6,8. Измеряемым параметром сигнала сенсора являлась амплитуда изменения силы тока, определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения исследуемого соединения в измерительную кювету.

Вольтамперометрические измерения. Вольтамперограммы (ЦВА) регистрировали с использованием трехэлектродной схемы с помощью вольтамперометрического анализатора Экотест-ВА (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия). В качестве рабочего электрода использовали модифицированный графито-пастовый электрод, в качестве вспомогательного электрода - платиновый. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребряный электрод (Ag/AgQ). Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости развертки 20-100 мВ/с в калий-натрий-фосфатном буфере (рН=6,8).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Электронно-микроскопический анализ образцов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-6510 LV (JEOL, Япония) в режиме низкого вакуума (30 Па) при регистрации вторичных электронов.

Оптическая микроскопия. Для изучения формирования биопленок был использован оптический световой микроскоп NikonEclipseCi (Nikon, Япония), оборудованный камерой ProgResSpeed XTcore5 (Jenoptik, Германия). Наблюдение проводили в режиме фазового контраста.

Контроль формирования биопленок. Физиологическую активность микроорганизмов в биопленках регистрировали с помощью дыхательного теста, основанного на способности клеточных оксидоре-дуктазных ферментов восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (МТТ) в нерастворимый формазан (МТТ-тест) [9]. Микроорганизмы выращивали в стерильных микропробирках типа эппендорф при температуре 29 °C. Образование биопленок определяли после удаления ростовой среды. Для контроля образования биопленок в микропробирки добавляли 0,5 мл 0,1% раствора МТТ, затем инкубировали 1 ч при 29 °С. После окрашивания тетразолиевым красителем жидкость сливали и промывали водой, добавляли 96% этанол и оставляли на 45 минут для экстракции красителя из биопленок. Оптическую плотность экстракта определяли на фотометре «Эксперт-003» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия) на длине волны 590 нм. По интенсивностям окраски полученных растворов судили об уровне образования биопленок.

Определение БПК5 стандартным методом разбавления. В качестве референтного метода для определения БПК5 был использован метод разбавления. Анализ проводили в соответствии с методикой, указанной в [3]. Определение содержания растворенного кислорода проводили с использованием БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия).

Обсуждение результатов

Контроль физиологической активности микроорганизмов в составе биопленок на поверхности чувствительных элементов в in vitro-эксперименте определяли при помощи дыхательного МТТ-теста. Формирование биопленок фиксировали по нарастанию интенсивности окрашивания микроорганизмов в пурпурный цвет, в результате чего была построена зависимость оптической плотности от времени роста биопленок. Рост оптической плотности указывает на процесс увеличения физиологической активности биомассы, обусловленный размножением микроорганизмов, образованием и ростом биопленки. Время максималь-

ной физиологической активности для микроорганизмов активного ила составило 53 ч, после чего наступало ее постепенное снижение. Образование биопленки в период максимальной физиологической активности клеток было подтверждено методом оптической микроскопии с фазовым контрастом (рис. 1).

В Г

Рис. 1. Микроскопические исследования образования биопленок активного ила: А - суспензия микроорганизмов активного ила; Б - биопленка активного ила через 53 часа роста; В - поверхность чистого ГПЭ, полученная методом СЭМ; Г - биопленка активного ила на поверхности ГПЭ, полученная методом СЭМ

Как видно из рис. 1Б после 53 часов роста биопленка активного представляет собой популяцию различных микроорганизмов, различающихся по морфологии. В отличие от суспензии при формировании биопленки четко видны образования полисахаридного матрикса, кроме того видна четкая граница образования биопленки и свободноживущих микроорганизмов.

Образование биопленок микроорганизмов активного ила на поверхности рабочего графито-пастового электрода было показано с использованием метода сканирующей электронной микроскопии (рис. 1В, 1Г). Используемый графито-пастовый электрод обладает развитой поверхностью, что позволяет надежно удерживать биоматериал на поверхности (рис. 1В). На полученных изображениях отчетливо видна пористая структура биопленки (рис. 1Г). Сформированные биопленки достаточно плотно покрывают поверхность электрода и образуют сплошной матрикс. Таким образом, по результатам комплексных микроскопических исследований можно предположить, что на поверхности графито-пастовых электродов получены равномерные и метаболически-активные биопленки, которые можно использовать в качестве основы сенсорных датчиков.

С точки зрения использования в биосенсорных устройствах интересным представляется изучение биокаталитических свойств микроорганизмов в биопленках. В данной работе в качестве медиатора был выбран ферроцен из-за того, что электрохимическая реакция с его участием не зависит от рН среды, что позволяет использовать оптимальный рН рабочего электролита для соответствующего микроорганизма, а также малая растворимость ферроцена в воде позволяет модифицировать графитовую пасту, иммобилизуя медиатор на поверхности рабочего электрода [10].

Для определения константы скорости взаимодействия микроорганизмов с медиатором электронного транспорта применяли метод циклической вольтамперометрии и моделирование Николсона-Шайна для данных систем (уравнение 1).

h

h "V

k e3auAE]RT

nFv

где Ik - предельный ток в присутствии субстрата, мкА; Id- предельный ток в отсутствии субстрата, мкА; квзаим - константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала; [E] - титр клеток, мг/л; R - универсальная газовая постоянная, Дж/(моль К); T - температура, К; n - количество перенесенных электронов; F - постоянная Фарадея, Кл/моль; v - скорость развертки, В/с.

Для определения констант скорости были получены зависимости отношения предельных анодных токов в присутствии и в отсутствии глюкозы (Ik/Id) от величины (1/v)1/2; по тангенсу угла наклона линейной регрессии находили квзаим. Типичный вид вольтамперограмм и расчетного графика представлен на рис. 2.

0,915

350 .750 -650 -550 -450 -350 250 150 50

А

0,07 0,09 0Д1 0,13 0,15 0,

Б

Рис. 2. Определение константы скорости взаимодействия медиатора с бактериями активного ила в биопленке методом циклической вольтамперометрии: А - типичный вид получаемых вольтамперограмм; Б - зависимость отношения предельных токов в присутствии и в отсутствии субстрата от 1М/2 в системе «биопленка активного ила - медиатор ферроцен»

Константа скорости взаимодействия медиатора ферроцена с микроорганизмами активного ила составила 0,21±0,02 дм3/(г с) при использовании его суспензии и 0,38±0,02 дм3/(г с) при использовании биопленки. Таким образом, наилучшими кинетическими параметрами обладает биосенсор на основе биопленки активного ила, что делает его наиболее перспективным в дальнейшем использовании. Необходимо отметить, что константа скорости взаимодействия медиатора с микроорганизмами в бактериальных биопленках выше, чем в суспензии. Этот факт может быть связан с гораздо лучшим контактом их ферментных систем с поверхностью электрода.

Электрод

Рис. 3. Механизм электронного переноса в системе «графито-пастовый электрод - ферроцен - биопленка микроорганизмов»

Поскольку известно, что матрикс биопленок может содержать электроактивные вещества [6, 11], такой контакт может быть обеспечен за счет возникновения двухмедиаторной системы «графито-пастовый электрод - ферроцен - эндогенный медиатор матрикса - микроорганизмы» (рис. 3). Таким образом, экзогенный медиатор ферроцен может передавать электроны на эндогенный медиатор в полисахаридном матриксе, а эндогенный медиатор в свою очередь более эффективно взаимодействует с ферментными системами бактерий, чем ферроцен. Подобные системы с двумя экзогенными медиаторами ранее показывали большую эффективность в биоэлектрокатализе [12, 13].

Для проведения анализа БПК5 необходимо, чтобы разработанный биосенсор мог регистрировать биохимическое окисление широкого спектра органических субстратов, поэтому была исследована субстратная специфичность биосенсоров на основе созданных систем. Анализ субстратной специфичности позволил сделать вывод о том, что биосенсор на основе биопленки активного ила позволяет регистрировать окисление наиболее широкого спектра органических соединений, что обеспечит правильность результатов анализа БПК5. Для количественного определения содержания анализируемых веществ в образце были получены гиперболические зависимости ответа сенсора от БПК5 (рис. 4), которые были аппроксимированы уравнением Михаэлиса-Ментен: ^ _ Утах М

_ Кщ+т,

где V - скорость ферментативной реакции; Утах - максимальная скорость ферментативной реакции; Км - кажущаяся константа Михаэлиса;

БПК5, мгО2/дм3

Рис. 4. Градуировочные зависимости ответа сенсора от БПК5 для созданных биосенсорных систем

Для анализа стабильности и устойчивости ответа сенсора при длительном использовании были исследованы такие характеристики, как долговременная и операционная стабильность. В качестве субстрата была выбрана глюкозо-глютаматная смесь (ГГС), которую применяют в качестве стандарта в международной практике при определении БПК5 [3]. В таблице представлены все характеристики разработанных медиаторных биосенсоров на основе активного ила и литературных аналогов.

Сравнение аналитических и метрологических характеристик разработанныхмедиаторных биосенсоров с аналогами.

Биоматериал/ Долговре- Относительное Линейный tан., «Ссылка»

проводящая система менная стабильность, Сутки стандартное отклонение, % (п=15, Р=0,95) диапазон БПК5, мг/дм3 мин

Суспензия активного 29 5,12 1,31-1,6 5 Данная работа

ила/ферроцен

Биопленка активного 52 6,79 0,87-31 5 Данная работа

ила/ферроцен

Биопленка на

основе сообщества - - 20-500 - [14]

микроорганизмов

Активный ил/

метиленовый 65 2,9 1-100 9 [15]

синий/графен

Биопленка/

гидрогель на

основе 60 - 2-64 10 [11]

восстановленного

оксида графена

Бактерии из

активного ила/

ковалентно 50 5,0 0,1-4,5 5 [6]

связанный

ферроцен/ УНТ

По полученным данным можно отметить, что нижняя граница определяемых концентраций БПК5 разработанных биосенсоров с использованием электродов на основе ферроцена и биопленки активного ила превосходит многие известные аналоги. Биопленка позволяет увеличить эффективность переноса электронов за счет повышения константы гетерогенного переноса электронов на электрод при биоэлектрокатализе. Исходя из полученных результатов, биосенсор на

основе биопленки активного ила по селективности, долговременной стабильности и диапазону определяемых концентраций является перспективным для создания БПК-биосенсора. Разработанный БПК-биосенсор на основе биопленки позволяет получать стабильный сигнал -относительное стандартное отклонение не превышает 6%, а время стабильной работы более 50 суток. Таким образом, по результатам комплексных микроскопических исследований можно предположить, что на поверхности графито-пастовых электродов получены равномерные и метаболически-активные биопленки, которые можно использовать в качестве основы сенсорных датчиков.

БПК5 может быть довольно низким и составлять ~1 мг/дм3 (чистые природные воды). Разработанный биосенсор на основе биопленки активного ила не уступает уже известным аналогам биосенсоров на основе активного ила, а по многим характеристикам даже превосходит [6, 11, 14, 15]. Он является наиболее чувствительным и имеет меньшее время единичного анализа, что делает его перспективным для проведения анализа БПК5 в поверхностных и сточных водах.

Апробация биосенсора на основе биопленки активного ила была проведена на двенадцати образцах природной и сточной воды. Отбор проб и определение БПК5 стандартным методом проводилось согласно действующим нормативным документам. Статистическая обработка (модифицированный тест Стьюдента) полученных результатов показала, что данные обоих методов незначимо отличаются. Разработанный биосенсор можно эффективно использовать в качестве альтернативы стандартному анализу БПК5.

Заключение

Таким образом, в работе созданы электроактивные биопленки активного ила, сформированные на поверхности графито-пастового электрода. Формирование биопленок подтверждено комплексом микроскопических методов: оптической микроскопией с фазовым контрастом и сканирующей электронной микроскопией. С помощью метода циклической вольтамперометрии были определены константы скорости взаимодействия микроорганизмов с медиатором, и гетерогенная константа скорости переноса электронов. Анализ метрологических и аналитических характеристик созданных биосенсоров показал, что высокая чувствительность БПК-биосенсора на основе биопленки активного ила позволяет проводить анализ практически любых образцов поверхностных вод. Результаты анализа образцов природных вод, полученные биосенсорным и стандартным методом, отличаются незначительно, что указывает на перспективу использования

разработанного биосенсора в качестве прототипа для разработки серийных анализаторов БПК.

Работа выполнена в рамках гранта Правительства Тульской области в сфере науки и техники от 22 июля 2022 года № ДС/121 «Разработка биокомпозитных материалов на основе новых кремнийорганических полимеров для создания сенсорных систем раннего оповещения о экологически опасных ситуациях».

Список литературы

1. A Mediated BOD Biosensor Based on Immobilized B. Subtilis on Three-Dimensional Porous Graphene-Polypyrrole Composite/ Hu J., Li Y., Gao G. [et al]. // Sensors. 2017. V. 17. № 11. P. 2594.

2. New applications of genetically modified Pseudomonas aeruginosa for toxicity detection in water/ Yu D., Yong Y.-C., Liu C. [et al]. // Chemosphere, 2017. V. 184. P. 106-111.

3. ISO. Water quality: Determination of biochemical oxygen demand after n days (BODn), Part 1: Dilution and seeding method with allylthiourea addition. ISO 5815-1: 2003. International Organization for Standardization Geneva, 2003.

4. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review/ Jouanneau S., Recoules L., Durand M.J. [et al]. // Water Res, 2014. V. 49. P. 62-82.

5. Cell-based biosensors: Recent trends, challenges and future perspectives / Gupta N., Renugopalakrishnan V., Liepmann D. [et al]. // Biosens. Bioelectron., 2019. V. 141. P. 111435.

6. An electroactive biofilm-based biosensor for water safety: Pollutants detection and early-warning / Qi X., Wang S., Li T. [et al]. // Biosens. Bioelectron. Elsevier, 2021. V. 173. P. 112822.

7. Мeдиаторный БПК-биосенсор на основе клеток микроорганизмов, выделенных из активного ила / Харькова А.С., Арляпов В.А., Туровская А.Д. [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология 2019. Т. 55. С.199-208.

8. A sensitive ferricyanide-mediated biochemical oxygen demand assay for analysis of wastewater treatment plant influents and treated effluents / Jordan M.A., Welsh D.T., John R. [et al.] // Water Res. Elsevier, 2013. V. 47. № 2. P. 841-849.

9. The Effect of Modified Nanodiamonds on the Wettability of the Surface of an Optical Oxygen Sensor and Biological Fouling During Long-Term in Situ Measurements / Aleksandrovskaya A.Y., Melnikov P. V, Safonov A. V. [et al.] // Nanotechnologies Russ. Springer, 2019. V. 14. № 7-8. P. 389-396.

10. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity / Kharkova A.S., Arlyapov V.A., Turovskaya A.D. [et al.] // Enzyme Microb. Technol. Elsevier, 2020. V. 132. P. 109435.

11. One-pot synthesis of 3-dimensional reduced graphene oxide-based hydrogel as support for microbe immobilization and BOD biosensor preparation / Liu L., Zhai J., Zhu C. [et al.] // Biosens. Bioelectron., 2015. V. 63. P. 483489.

12. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay / Kharkova A.S., Arlyapov V.A., Ilyukhina A.S. [et al.] // 3 Biotech. Springer, 2021. V. 11. № 5. P. 222.

13. Use of one- and two-mediator systems for developing a BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii / Zaitseva A.S., Arlyapov V.A., Yudina N.Y. [et al.] // Enzyme Microb. Technol. Elsevier, 2017. V. 98. P. 43-51.

14. Guo F., Liu Y., Liu H. Hibernations of electroactive bacteria provide insights into the flexible and robust BOD detection using microbial fuel cell-based biosensors // Sci. Total Environ. Elsevier, 2021. V. 753. P. 142244.

15. A novel BOD biosensor based on entrapped activated sludge in a porous chitosan-albumin cryogel incorporated with graphene and methylene blue/ Niyomdecha S., Limbut W., Numnuam A. [et al.] // Sensors Actuators B Chem., 2017. V. 241. P. 473-481.

Перчиков Роман Николаевич, мл. науч. сотр. лаборатории биологических соединений и биокомпозитов, perchikov_roma@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Арляпов Вячеслав Алексеевич, д-р техн. наук, доц., ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных соединений и биокомпозитов, v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет

FORMATION OF BIOFILMS OF ACTIVE SLUDGE MICROORGANISMS ON THE ELECTRODE SURFACE AS THE BASIS OF A HIGHLY SENSITIVE BOD

BIOSENSOR

R.N. Perchikov, V.A. Arlyapov

A laboratory model of a biosensor for determining biochemical oxygen demand (BOD5) based on a quorum of activated sludge microorganisms and ferrocene, an electron transport mediator, has been developed. Using optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM),it was proved that a biofilm of activated sludge was formed on the electrode surface. The rate constant of the interaction of the mediator ferrocene with the microorganisms of the activated sludge biofilm was 0.21±0.02 dm3/(g*s), the lower limit of the developed sensor was 0.29 mgO2/dm3, and the long-term stability of the receptor system was 52 days.

Key words: biofilm, biosensor, ferrocene, activated sludge, biochemical oxygen de-

mand, BOD5.

Perchikov Roman Nikolaevich, junior researcher of the laboratory of environmental and medical biotechnology, perchikov_roma@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,

Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, doctor of technical sciences, docent, leading researcher of Bioactive Compounds and Biocomposites Laboratory, v.a.arlya-pov@,gmail.com, Tula, Russia, Tula State University