Изучение антагонистической активности лакто- и бифидумбактерий, входящих в состав пробиотиков, к штаммам гемолитических эшерихий, выделенных от больных с соматическими заболеваниями желудочно-кишечного тракта

Однозначного мнения о том, какой должна быть вязкость глазных капель, не существует, однако считается, что данный показатель должен составлять 15-30 сПз [4]. С другой стороны, нецелесообразно введение слишком большого количества пролонгатора, так как это может привести к раздражению, нечеткому зрению, а также к кристаллизации полимера на ресницах [6].

В рамках разработки новых композитных глазных капель одной из задач явились подбор пролонгатора и определение его оптимальной концентрации. Для исследования были отобраны следующие полимерные соединения:

эфиры целлюлозы: натрийкарбоксиметилцеллюло-за ^а-КМЦ), гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), гидрокси-пропилметилцеллюлоза (ГПМЦ); поливинилпирролидон; поливиниловый спирт;

сополимер винилацетата и винилпирролидона -Р!авСопе Б-630;

декстран низкомолекулярный 40 000; полиэтиленгликоль (ПЭГ) 6000.

Для определения оптимального пролонгатора и его концентрации были исследованы такие показатели растворов высокомолекулярных веществ, как рН, плотность, вязкость (табл. 2).

Измерения рН проводили с помощью потенциометра, кинематическую вязкость определяли с помощью стеклянного капиллярного вискозиметра ВПЖ-2, плотность — ареометров (АОН-1) и пикнометра согласно фармакопейным методикам [1].

По результатам измерений были рассчитаны динамическая вязкость и коэффициент К, численно равный отношению динамической вязкости раствора пролонгатора к динамической вязкости воды (0,8937 сПз) [1].

Полученные результаты позволили подобрать пролонгаторы, наиболее подходящие для составов глазных капель. Таковыми явились 0,4%-ный раствор ГПМЦ (рН 6,28; динамическая вязкость 10,53 сПз),

0,2%-ный раствор ГЭЦ (рН 6,25; динамическая вязкость 9,65 сПз), 3,0%-ный раствор ПВС (рН 6,22; динамическая вязкость 7,94 сПз). Конечный выбор пролонгатора, естественно, обуславливается его химической совместимостью с действующим ингредиентом создаваемого лекарственного средства.

Полученные результаты можно применять для математического моделирования составов лекарственных препаратов с заданными показателями.

Представленные данные получены при разработке композитных глазных капель целевого фармакологического действия в рамках университетских грантов БелГУ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Государственная фармакопея СССР. - XI выпуск. Том 2. -М.: Медицина, 1990. - 397 с.

2. Жилякова Е. Т., Степанова Э. Ф., Новикова М. Ю. Гармонизация требований к глазным каплям в свете современного развития фармацевтического производства: Материалы Международной научно-практической конференции «Биологически активные соединения природного происхождения: фитотерапия, фармацевтический маркетинг, фармацевтическая технология, фармакология, ботаника». - Белгород, 2008. - С. 62-66.

3. Кудряшова Ю. И. Роль слезной жидкости, ее количественного и качественного состава в развитии синдрома «сухого глаза» // Вестник офтальмологии. - 2002. - Т. 118, № 6. - С. 51-54.

4. Технология и стандартизация лекарств: Сборник научных трудов. - Т. 2. - Харьков: ИГ «РИРЕГ», 2000. - 784 с.

5. European Pharmacopoeia 5th edition. - Strasbourg, 2005. - 3333 p.

6. Ridder III W. H., Lamotte J. O., Ngo L., Fermin J. Shortterm Effects of Artificial Tears on Visual Performance in Normal Subjects // Optometry and vision science. - 2005. - Vol. 82. № 5. - P. 370-377.

Поступила 28.04.2009

Н. С. ХИШТОВА12, С. А. ЗАВГОРОДНИЙ1, О. Н. СТЕНИНА1

ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛАКТО- И БИФИДУМБАКТЕРИЙ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ ПРОБИОТИКОВ, К ШТАММАМ ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ЭШЕРИХИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ

С СОМАТИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

1Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Адыгея;

2кафедра общей гигиены и микробиологии АФ ГОУ ВПО Кубанского государственного медицинского университета, г. Майкоп, тел. 8-928-422-16-30. E-mail: polioadg@radnet.ru

Изучена антагонистическая активность препаратов пробиотиков (лакто- и бифидумбактерий) в отношении гемолитических эшерихий, выделенных от больных с заболеваниями проксимальных отделов ЖКТ. Выявлено, что все штаммы культур гемолитических эшерихий проявляли высокую чувствительность к антагонистическому действию лактобактерий и в меньшей степени к бифидумбактериям из коммерческих препаратов «лактобактерин» и «бифидумбактерин». Полученные данные говорят о более эффективной терапии при совместном использовании этих препаратов и их использовании в комплексной терапии соматических заболеваний ЖКТ.

Ключевые слова: антагонизм, пробиотики, гемолитические эшерихии.

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009 УДК 616.3

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

N. S. KHISHTOVA, S. A. ZAVGORODNYI, O. N. STENINA

THE STUDYING OF ANTAGONISTIC ACTIVITY OF LACTOBACTERIA AND BIFIDOBACTERIA, FORMING PROBIOTICS, TO HEMOLITIC ESCHERICHIA STOCKS, TAKEN FROM PATIENTS WITH SOMATIC DISEASES OF GASTRO- INTESTINAL TRACT

The Center of Hygiene and Epidemiology in Adygeya Republic The Department of General Hygiene and Microbiology AF SEIHPE KSMY,

Maikop, tel. 918-422-16-30. E-mail: polioadg@radnet.ru

We have studied antagonistic activity of probiotic preparations (lacto- and bifidobacteria) in relation to hemolytic Escherichia, taken of patients with Diseases of proximal parts of GIT. We have determined that all stocks of hemolytic escherichia cultures showed high sensitivity to antagonistic action of lactobacteria, and less to bifidobacteria from commercial preparations «Lactobacterin» and «Bifidobacterin». Received data show the therapy of combined use of these preparations and their usage in complex therapy of somatic diseases of GIT to be more effective.

Key words: antagonism, probiotics, hemolytic escherichia.

Введение

В настоящее время у различных грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий описаны бакте-риоцины с высокой и микроцины - с низкой молекулярной массой. Действие бактериоцинов: нарушение проницаемости бактериальной мембраны атакуемой клетки, блокирование белкового синтеза, подавление репликации ДНК, изменение мембранного потенциала клетки, нарушение процессов деления, ведущее к дезорганизации структуры клеток [1, 2, 7, 15, 6]. В условиях in vitro антагонистическая активность лактобацилл обусловлена образованием антибиотиков, бактериоцинов, перекисей, органических кислот, алкоголей, лизоцима и других соединений с антимикробной активностью, с конкуренцией за пищевые субстраты [8, 9]. Антибактериальная активность лактобактерий связана с образованием ими антибиотикоподобных субстанций (бактериоцинов), выработкой в процессе гидролиза углеводов молочной кислоты, спирта, диацетила, лизоцима [5, 10]. Применение высокоантагонистически активных штаммов лактобацилл, продуцирующих антибиотикоподобные вещества с широким спектром действия, перспективно для лечения соматических заболеваний ЖКТ. Ранее проведенное нами изучение микрофлоры толстого кишечника больных с соматическими заболеваниями ЖКТ выявило дисбактериоз, и одним из критериев было появление гемолитических эшерихий как показателя воспалительных процессов в ЖКТ. Цель нашей работы - изучить антагонистическую активность препаратов пробиотиков (лакто- и бифидумбактерий) в отношении гемолитических эшерихий, выделенных от больных с заболеваниями проксимальных отделов ЖКТ.

Методика исследования

Нами исследовано 25 культур гемолитических эше-рихий, выделенных из кишечника больных с заболеваниями проксимального отдела ЖКТ (желчекаменная болезнь, дискенезия желчевыводящих путей, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки). В качестве индикаторных штаммов использовались препараты пробиотиков «лактобактерин сухой» производства ФГУП «НПО Микроген», С 354-1007, и «бифидумбакте-рин сухой» производства ЗАО «Экополис», г. Ковров, С 958. В состав лактобактерина входят Lactobacillus plan-

tarum 8Р-А3, 38, 1_. Тегтеп^т 90Т-С4 39 в количестве не менее 2*109 - 4*109 м. к. Состав бифидумбактерина представлен В1АСитЬайепит ЫАСит № 1, 791, ЛВА-3 в количестве не менее 107 м. к. в одной дозе.

Для культивирования лактобацилл применяли плотную питательную среду [3], которую готовили путем смешивания гидролизата молока (20%), концентрированного аутолизата дрожжей (10%), агара-агара (2%), и дистиллированной воды (до 100%). рН готовой среды после автоклавирования 5,4. Для бифидобактерий использовали полужидкую среду «Бифидумагар» производства ГНЦ МПО «Питательные среды», г. Оболенск. Культивирование лактобацилл осуществляли как в анаэробных условиях с использованием микроанаэро-стата и системы GasPak+, так и в аэробном режиме.

В своей работе мы использовали несколько методов изучения антагонистической активности.

1. Метод смешанной культуры (прямого антагонизма). Штамм-продуцент в 107 степени в количестве 1,0 мл вносили в 10,0 мл полужидкой среды «Бифидумагар». Тест-культуры (индикаторные) вносили в количестве 0,1 мл в 107 степени, т. е. в десятикратной уменьшенной концентрации. Для обнаружения и количественного учета гемолитических эшерихий проводили высев в 0 часов и через 24 часа на среду «Эндо» 0,1 мл суспензии. Подсчет вели в КОЕ/мл. Этим методом исследовали антагонистическую активность лактобактерий и бифидумбактерий [11].

2. Этот метод также использовали при отсроченном антогонизме с опережающим посевом штамма продуцента в течение 48 часов.

3. Метод перпендикулярных штрихов (отсроченного антагонизма). На дно чашки с плотной питательной средой «Лактобакагар» петлей диаметром 2 мм наносили полоской культуру бифидобактерий или лактобактерий. Посевы инкубировали при 37° С в течение 72 часов. Для выявления антагонистической активности микроорганизма к выросшей культуре подсевали тест-культуры, предварительно выращенные в НВ1-бульоне в течение 18 ч. Посев тест-штаммов производили петлей диаметром 1 мм в направлении от зоны роста штамма молочно-кислых бактерий, не касаясь ее, и перпендикулярно ей. Учет результатов производили через 24 ч инкубирования при 37° С по величине зоны отсутствия роста тест-культуры. Контролем роста тест-культуры служил их параллельный посев на чашки

Таблица 1

Антагонистическое действие бифидо- и лактобактерий из БТП на гемолитические эшерихии

Зоны задержки роста в мм ^±m), n= 25

Бифидобактерии Лактобактерии

t= 4,4

9,0±0,7 13,4±0,7 n>30

p< 0,0001

Таблица 2

Антагонистическое действие бифидум- и лактобактерий из БТП на гемолитические эшерихии

Рост гемолитических эшерихий (КОЕ/г) через 48 ч культивирования с: Р Процент подавления штаммов гемолитических эшерихий при культивировании с: Р

бифидобактериями лактобактериями бифидобактериями лактобактериями

53,2±25,3 0 ,1 0 ,02 =2,1 >30 >0,0 t= n > p 60,0±9,8 100,0 t=4,1 n>30 p<0,001

с той же средой без испытуемой культуры. Результаты оценивались по торможению роста тест-штаммов, чувствительных к антагонистическому действию: до 2 мм - +, от 2 до 5 мм - ++, 5-10 мм - +++, более 10 мм - ++++. Таким образом, изучали антагонистическую активность лакто- и бифидумбактерий [1, 14].

Результаты исследования

При использовании метода отсроченного антагонизма были получены результаты:

а) метод перпендикулярных штрихов (табл. 1).

Изучение микробного антагонизма пробиотиков

методом перпендикулярных штрихов достоверно показало выраженную чувствительность к антагонистическому действию лактобацилл и бифидобактерий у всех изучаемых культур, но также были отмечены различия в способности подавлять рост и размножение у лак-то- и бифидобактерий. Наибольшая эффективность действия наблюдалась у лактобактерий - 13,4±0,7 мм задержки роста E. coli Hly +, и 9,0±0,7 мм при действии бифидобактерий, т. е. больше в 1,5 раза. В 19 случаях из 25 (76%) антагонистическое действие на ++++ оказывали лактобактерии, и только в 8 случаях (32%) би-фидумбактерии - больше в 3,1 раза. Таким образом, лактобактерии проявляли большую антагонистическую активность к гемолитическим эшерихиям, чем бифидобактерии;

б) отсроченный антагонизм в полужидкой среде (табл. 2).

Изучение микробного антагонизма пробиотиков в отношении гемолитических эшерихий методом отсроченного антагонизма в полужидкой среде также выявило высокую антагонистическую активность лак-то- и бифидумбактерий. Но в отличие от метода перпендикулярных штрихов было обнаружено, что не

все индикаторные штаммы гемолитических эшерихий проявляли чувствительность к бифидумбактериям: из 25 исследуемых культур 10 штаммов E. coli Hly + дали рост - 40,0%. Но, как и в первом опыте, все 100% E. coli Hly + штаммов были чувствительны к антагонистическому действию лактобактерий. Достоверно выявлена высокая активность лактобактерий: процент подавления E. coli Hly + составил 100% (отсутствие роста через 48 часов). Для бифидобактерий процент подавления составил 60,0±9,8% с соответствующим ростом гемолитических эшерихий 53,2±25,3 КОЕ/г. Т. е. процент подавления роста E. coli Hly + выше при воздействии лактобактерий в 1,7 раз, чем у бифидобактерий;

в) высокая активность штаммов лактобацилл и бифидобактерий не была подтверждена методом смешанной культуры (прямой антагонизм). Так, при высеве образцов из смешанной культуры в 0 ч наблюдали хороший рост в 108-109 КОЕ/мл как гемолитических эшерихий, так и лактобактерий и бифидобактерий. После 24 часов инкубации смесей наблюдали наличие штаммов гемолитических эшерихий в концентрации не менее 106 КОЕ/мл. Во всех пробах штаммы лактобактерий продолжали расти в опытных пробирках, чего не наблюдалось в случае бифидобактерий.

Обсуждение

Установлено, что смешанное микробное сообщество формирует многослойные бактериальные пленки, экранирующие поверхность слизистой оболочки [4, 12]. В биопленках микробные клетки располагаются на достаточно близком расстоянии друг от друга, достигая больших концентраций на поверхности. Экранированные биопленкой бактерии характеризуются большей устойчивостью к воздействию защитных факторов макроорганизма и антимикробным препаратам.

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

УДК 616.3 Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

Высокая способность пробиотиков ингибировать различные патогенные и условно-патогенные микроорганизмы обычно рассматривается как результат неспецифического действия антагонистически активных продуктов бактериального метаболизма. Вырабатываемые лакто- и бифидобактериями бактериоцино-подобные вещества обладают достаточно широким спектром ингибиции, включающим E. coli, Salmonella spp., Clostridium spp. Подавить образование условнопатогенными микроорганизмами биопленки могут, по-видимому, бактериоцинпродуцирующие бактерии пробиотических штаммов [10], что позволяет их отнести к перспективным лекарственным антимикробным препаратам по аналогии с антибиотиками [13].

Бактерии, на основе которых создаются пробиотики, должны отвечать определенным условиям: должны быть выделены от здоровых людей, идентифицированы до вида, обладать оптимальной адгезивной активностью и широким спектром антимикробного действия в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, быть безопасными для людей и удовлетворять технологическим требованиям.

В результате настоящего исследования выявлено, что все культуры гемолитических эшерихий проявляли высокую чувствительность к антагонистическому действию лактобактерий и в меньшей степени к бифидумбактериям из коммерческих препаратов «лактобактерин» и «бифидумбактерин». Вероятно, целесообразно применять пробиотические препараты, содержащие лактобактерии, в комплексной терапии больных с соматическими заболеваниями ЖКТ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Блинкова Л. П. Бактериоцины: критерии, классификация. Свойства, методы выявления // Журн. микробиол. - 2003. - № 3. -С. 109-113.

2. Бондаренко В. М., Воробьев А. А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиол. - 2004. - № 1. -С. 84-92.

3. Глушанова Н. А, Блинов А. И., Дворецкий Б. М. Способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала.

РФ. Патент № 2154822 С1 7 G 01 N 33/48, С 12 N 1/20. БИ № 23, от 20.08.2000.

4. Ильина Т. С., Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - № 40 (11). С. 1-12.

5. Ленцнер А. А., Ленцнер Х. П. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. -№ 3. - С. 173-177.

6. Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., Вербицкая Н. Б. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на клетки Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis // Журн. микробиол. - 2006. - № 7. - С. 8-11.

7. Хмель И. А. Микроцины - пептидные антибиотики энтеробактерий: генетический контроль синтеза, структура, механизмы действия // Генетика. - 1999. - № 35 (1). - С. 5-16.

8. Червинец Ю. В., Бондаренко В. М., Шабанова Н. А, Самоуки-на А. М., Червинец В. М. Бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл // Журн. микробиол. - 2006. - № 7. - С. 78-82.

9. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Грантъ, 1998.

10. Annuk H., Shchepetova J., Kullisaar T. et al. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates // J. Appl. Microbial. - 2003. - № 94 (I. 3). - P. 403.

11. Bhatia S. J., Kochaz N., Abraham P. et al. J. Clin. Microbiol. -1989. - V. 27. - P. 2328-2330.

12. Donlan R. M., Costerton J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. -№ 15. - P. 167-193.

13. Jack R. W., Tagg J. R., Ray B. Bacteriocins of gram-positive bacteria // Microbiol. Rev. - 1995. - № 59 (2). - P. 171-200.

14. Muriana P. M., Klaenhammer T. R. Conjugal transfer of plasmid- encoded determinants for bacteriocin production and immunity of Lactobacillus acidophilus 88 // Appl. Microbiol. - 1987. -№ 53. - P. 553-560.

15. Nes I. F., Bao Diep B. D., Havarstein L. S. et al. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. -1996. - № 70. - P. 113-128.

Поступила 17.02.2009

Н. С. ХИШТОВА12, Н. А. ЗАВГОРОДНИЙ1, Н. А. ТРУФАНОВА1, М. Н. АЙТЕКОВА1

МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ДИСФУНКЦИЯХ ЖКТ У АМБУЛАТОРНЫХ БОЛЬНЫХ г. МАЙКОПА

1Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Адыгея;

2кафедра общей гигиены и микробиологии АФ ГОУ ВПО Кубанского государственного медицинского университета, г. Майкоп, тел. 8-928-422-16-30. E-mail: polioadg@radnet.ru

Изучены клиническая картина у 210 и характеристика микробного пейзажа содержимого толстой кишки у 548 амбулаторных больных с воспалительными процессами ЖКТ и роли бифидо- и лактобактерий в формировании флоры кишечника. Показано, что отсутствие бифидо- и (или) лактобактерий влияет на частоту встречаемости большинства условно патогенных бактерий. Это определяет клиническую картину и является причиной неэффективности комплекса терапевтических мероприятий для лечения больных с дисфункциями ЖКТ.

Ключевые слова: лактобактерии, бифидобактерии, микробный пейзаж, дисфункция ЖКТ.