СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИЭРГОТИПИЧЕСКОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD OF ESTIMATING ANTI-ERGOTYPIC RESPONSE IN EXPERIMENT

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к экспериментальным моделям иммунопатологических состояний.
В настоящее время для лечения иммунопатологических состояний широко используются методы, основанные на вакцинации больных Т-клетками, несущими рецепторы против аутологичных антигенов [1, 6, 7]. Показано, что в результате иммунизации аутоиммунными Т-лимфоцитами генерируется два типа клеток: одни распознают идиотип, ассоциированный с Т-клеточным рецептором, другие, названные антиэрготипическими, распознают «эрготоп» (активационные маркеры) и супрессируют Т-клетки путем, не связанным с распознаванием идиотипических детерминант [9, 13]. Антиэрготипический ответ был впервые описан в модели Т-клеточной вакцинации, защищающей животных от индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Показано, что вакцинация антиген-активированными Т-клетками, независимо от их антигенной специфичности, так же, как и "классическая" Т-клеточная вакцинация облученными антиген-реактивными клетками-эффекторами заболевания, могла защищать животных от последующей индукции заболевания живыми антиген-реактивными Т-клетками [10]. Ранее заявителем был предложен способ индукции антиэрготипического ответа в лечении ревматоидного артрита и атопического дерматита, отличающийся тем, что вместо антиген-активированных клеток использовались Т-клетки, активированные поликлонально - через Т-клеточный рецептор с помощью антител к молекуле CD3 [16, 17]. Наличие международных критериев позволяет оценить клинический ответ пациентов на вакцинацию поликлонально активированными Т-клетками, но остается проблема оценки развития самого антиэрготипического ответа и, как следствие, его связи с изменением течения заболевания. Исследование влияния антиэрготипического ответа на течение заболеваний в экспериментальных моделях на животных также требует надежного способа его оценки. Поскольку антиэрготипический ответ проявляется пролиферацией антиэрготипических клеток и созреванием цитотоксических Т-клеток против активационных маркеров, в эксперименте используются именно методы оценки пролиферации либо цитотоксичности [3, 11, 12], которые можно принять в качестве аналогов (прототипа).
Задачей настоящего изобретения является создание экспериментального способа надежной оценки антиэрготипического ответа in vivo, индуцированного поликлонально активированными клетками.
Поставленная задача решается с помощью оценки выраженности клеточных эффекторных функций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), вызванных в ответ на введение активированных спленоцитов под апоневроз подушечки лапки животного, предварительно иммунизированного активированными спленоцитами. О степени выраженности антиэрготипического ответа судят по величине отека лапки животного. Спленоциты активируют с помощью анти-CD3 антител и интерлейкина-2, а вакцинацию животных проводят подкожными инъекциями 1 раз в неделю в течение 4 недель.
Новизна изобретения, по мнению авторов, заключается в том, что известная методика оценки ГЗТ, описанная для оценки стандартного клеточного иммунного ответа in vivo против эритроцитов барана [14], где клеточный иммунный ответ оценивали по степени выраженности реакции ГЗТ: измеряли величину отека лапки после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным, применяется для оценки антиэрготипического ответа, индуцированного активированными анти-CD3 антителами и ИЛ-2 спленоцитами.
Заявленный способ позволяет определить, развивается ли иммунный ответ против активированных таким образом клеток в виде реакции ГЗТ, и оценить связь антиэрготипического ответа с изменением течения заболевания, что имеет важное значение в контроле аутоиммунных реакций.
Способ является менее затратным и методически более простым, чем ранее описанные аналоги.
Способ осуществляется следующим образом.
В работе использовали мышей-самцов линии DBA/2 в возрасте 2-8 месяцев и гибридов первого поколения (C57BL/6×DBA/2)F1 (H-2b/d), самок в возрасте 2-3 месяцев из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск). Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).
Выделение клеток. Мышей забивали дислокацией позвоночника, обрабатывали 70% этиловым спиртом и помещали на стерильный анатомический столик. Селезенку помещали во флакончики со средой, расстригали ножницами, многократно пропускали через шприц с иглой, фильтровали через металлическую сеточку и 2-3 раза отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды.
Активация и наращивание активированных спленоцитов. Клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды RPMI 1640 (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) (с добавлением 2 мг тиенама, 125 мкл гентамицина, 30 мг L-глутамина (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор), 40 мкл меркаптоэтанола (Ferak Berlin, Германия) и 1 мл хепеса (Gerbu, Германия) на 100 мл среды) и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Затем клетки помещали в культуральные матрасы (NUNC, Италия) из расчета 2 млн клеток на 1 мл полной среды с 10% FBS и активаторами (1 мкл/мл) анти-CD3 антител (BD Biosciences, США) и 50 ед./мл IL-2 (ООО Биотех). На 3-4 день (по состоянию культуры) заменяли 70% среды на новую с таким же составом. На 6-7 день клетки собирали, осаждали при 1,2 тыс. об/мин в течение 10 минут, ресуспендировали в 10 мл FBS и подсчитывали количество клеток. Затем добавляли FBS и DMSO (Riedel-deHaёn, Германия) с таким расчетом, чтобы в результате получить 30 млн клеток на 1 мл FBS с 10% DMSO, и фасовали в криопробирки по 1 мл. Далее клетки замораживали и хранили в морозильной камере при -80°С.
Интактные спленоциты выделяли подобным образом и криоконсервировали непосредственно после получения (без этапа культивирования).
Для введения с целью иммунизации клетки размораживали добавлением 10 мл физиологического раствора и осаждали в течение 5 минут при 1 тыс. об/мин в медицинской лабораторной центрифуге. Осадок ресуспендировали в 0,2 мл физиологического раствора и в таком виде вводили мышам подкожно в холку. Для индукции реакции ГЗТ клетки вводили под апоневроз задней лапы в 0,05 мл физиологического раствора.
7
Оценка иммунного ответа на активированные спленоциты. Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ): измеряли величину отека лапки после введения 2×10cингeнныx активированных спленоцитов под подошвенный апоневроз задней лапки, контроль - контрлатеральная лапка, в которую вводили среду в том же объеме; учет реакции проводили через 24, 48 и 72 часа по величине местного отека; результаты выражали в % относительно контрольной лапки [14].
8
8
Определение уровня гуморального ответа на эритроциты барана (ЭБ). Гуморальный иммунный ответ на ЭБ (число IgM - АОК в селезенке) оценивали на пике ответа, свойственного данному генотипу, по количеству локальных зон гемолиза после внутривенного введения 2×10 ЭБ [4]. Все процедуры с клетками проводили на льду. Для определения числа IgM-AOK инкубационную смесь, состоящую из клеток селезенки, ЭБ (4×10/мл) и комплемента, помещали в стеклянные камеры и инкубировали 1,5 часа при +37°С. Подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой.
7
8
Оценка клеточного ответа на эритроциты барана. Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции ГЗТ: измеряли величину отека лапки после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным по стандартной методике; сенсибилизирующая доза -2,5×10 ЭБ/ мышь внутрибрюшинно, разрешающая доза - 5×10 ЭБ/ мышь под подошвенный апоневроз задней лапки на 4 сутки, контроль - контрлатеральная лапка, в которую вводили среду в том же объеме; учет реакции проводили через 24 часа по величине местного отека; результаты выражали в % относительно контрольной лапки [14].
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы Statisica, version 5, с применением критерия Wilcoxon и методов описательной статистики.
Пример 1
Для оценки иммунного ответа на сингенные активированные спленоциты мышей разделили на 3 группы:
7
7
группа 1 (опытные) - были иммунизированы подкожно 2×10 сингенных активированных спленоцитов 1 раз в неделю в течение 4 недель, затем для индукции реакции ГЗТ под апоневроз задней лапы было введено 2×10 активированных спленоцитов;
7
7
группа 2 (контрольные) - были иммунизированы подкожно 2×10 интактных спленоцитов 1 раз в неделю в течение 4 недель, затем под апоневроз задней лапы вводили 2×10 интактных спленоцитов;
7
группа 3 (интактные) - не были иммунизированы, затем под апоневроз задней лапы вводили 2×10 активированных спленоцитов.
В контрлатеральную лапу вводили среду в том же объеме. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа оценивали по методике локальной ГЗТ через 24, 48 и 72 часа.
Было отмечено, что средний уровень реакции ГЗТ у мышей в опытной группе, иммунизированной активированными спленоцитами, достоверно выше (p<0,05) через 24 и 48 часов по сравнению с контрольной и интактной группами, что свидетельствует о существовании иммунного ответа, направленного против активированных сингенных клеток. Через 72 часа достоверных различий не было получено (см. чертеж).
Пример 2
Через 7 суток для того, чтобы исключить наличие иммунного ответа против активированных клеток при иммунизации интактными спленоцитами (которые могут содержать некоторое количество активированных клеток), мышам, иммунизированным активированными спленоцитами (группа 1) под апоневроз были введены интактные спленоциты, а группе мышей, иммунизированных интактными спленоцитами (группа 2), введены активированные клетки. Учет реакции ГЗТ производили через 24, 48 и 72 часа.
При введении активированных спленоцитов мышам группы 2 и интактных спленоцитов мышам группы 1 отмечался минимальный уровень реакции ГЗТ (менее 10% в обеих группах). Таким образом, эти эксперименты показали отсутствие иммунного ответа на введение активированных клеток при иммунизации интактными клетками, а также на введение интактных клеток при иммунизации активированными клетками (таблица 1).
Пример 3
Антиэрготипическому ответу придается большое значение в регуляции аутореактивных клеток и, таким образом, в контроле аутоиммунных заболеваний [2, 15], однако вопрос о роли антиэрготипических клеток в регуляции нормального иммунного ответа пока остается открытым. Представленный способ позволяет изучать влияние антиэрготипического ответа на стандартный клеточный и гуморальный иммунный ответ против эритроцитов барана.
Для изучения влияния активированных клеток на течение нормального иммунного ответа были взяты аналогичные группы: опытные мыши иммунизированы активированными спленоцитами еженедельно в течение 4 недель, контрольные - иммунизированы интактными спленоцитами, третья группа - интактная. После иммунизации у данных групп был исследован клеточный иммунный ответ на Т-зависимый антиген - эритроциты барана.
Были получены следующие результаты: уровень реакции ГЗТ в опытной группе достоверно не отличался от уровня реакции ГЗТ в контрольной и интактной группах. Таким образом, не было выявлено достоверного изменения иммунного ответа на стандартный антиген, при условии, что на введение самих активированных клеток, иммунный ответ развивался (таблица 2).
В литературе описано, что в результате вакцинации антиген-специфическими клетками при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите происходит увеличение продукции иммуноглобулина G к исследуемому антигену [5, 8]. Поскольку в литературе нет данных об изменении гуморального иммунного ответа при введении сингенных активированных клеток, далее был исследован гуморальный иммунный ответ на эритроциты барана у аналогичных групп мышей. Полученные результаты свидетельствовали об увеличении числа АОК у мышей в опытной группе по сравнению с интактной группой, т.е. о стимуляции гуморального иммунного ответа (таблица 2).
Предлагаемый способ был экспериментально опробован в многочисленных сериях опытов на мышах линии DBA/2 и гибридах первого поколения (C57BL/6×DBA/2)F1. Были получены аналогичные результаты: средний уровень реакции ГЗТ в опытной группе был достоверно выше (p<0,05) по сравнению с контрольной и интактной группами. Таким образом, существование иммунного ответа, направленного против сингенных клеток, активированных анти-CD3 антителами, может быть характерно и для других линий мышей.
Иммунизация мышей сингенными селезеночными клетками, стимулированными анти-CD3 антителами и ИЛ-2, приводит к развитию реакции ГЗТ на введение только активированных клеток, что является проявлением антиэрготипического ответа. Важно, с точки зрения создания клеточных технологий лечения болезней на основе иммунизации активированными Т-клетками, что такая иммунизация, видимо, не нарушает ответа на чужеродные антигены.
Представленный способ позволяет моделировать и оценивать антиэрготипический ответ у различных линий мышей, в разных моделях иммунопатологических состояний.
Таблица 1
Средний уровень реакции ГЗТ на интактные спленоциты в опытной группе и на активированные спленоциты в контрольной группе (перекрестное введение).
Группа 1 (опытные) n=10 M±m
Группа 2 (контрольные) n=10 M±m
ГЗТ % 24 часа
6,0±1,42
9,2±2,26
ГЗТ % 48 часов
2,6±1,44
2,4±0,74
ГЗТ % 72 часа
1,5±0,99
1,5±0,99
примечание: М±m - средняя и ошибка средней
Таблица 2
Уровень реакции ГЗТ на эритроциты барана и число АОК в селезенке
Группа 1 (опытные) (n=10) M±m
Группа 2 (контрольные) (n=10) M±m
Группа 3 (интактные) (n=10) M±m
ГЗТ %
42,4±2,7
43,6±3,5
46,3±3,3
АОК
83075±4761,35
81363±8366,77
45746±5122,1
примечание: М±m - средняя и ошибка средней
Литературные источники
1. Chen G., Li N., Zang Y.C.Q., et al. Vaccination with selected sinovial Т cells in rheumatoid arthritis. // Arthritis & rheumatism. - 2007. - Vol.56 (2). - P.453-463.
2. Cohen IR., Francisco J., Mimran A. Treg in Т cell vaccination: exploring the regulation of regulation. // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol.114. - P.1227-1232.
+
+
+
+
3. Correale J, Rojany M, Weiner LP. Human CD8TCR-αβ and TCR-γδ cells modulate autologous autoreactive neuroantigen-specific CD4 T-cells by different mechanisms. // Journal of Neuroimmunollogy. - 1997. - Vol.80. - P.47-64.
4. Cunningham, A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody forming cells. // Nature. - 1965. - Vol.207. - P.1106-1107.
5. Herkel J., Brunner S., Meyer zum Büschenfelde K.H., Lohse A.W. Humoral mechanisms in Т cell vaccination: Induction and functional characterization of anti-lymphocytic autoantibodies. // J Autoimmunity. - 1997. - Vol.10. - P.137-146.
6. Kingsley G., Panayi G. Intervention with immunomodulatory agents: Т cell vaccination? // Bailliere's Clinical Rheumatology. - 1992. - Vol.6 (2). - P. 435-454.
7. Laar J., Miltenburg A., et al. Effects of inoculation with attenuated autologous Т cells in patients with rheumatoid arthritis. // Journal of Autoimmunity. - 1993. - Vol.6 (2). - P.159-167.
8. Li X; Wang Y; Urso D; O'Rourke J; Cone RE. Thymocytes induced by antigen injection into the anterior chamber activate splenic CD8+ suppressor cells and enhance the antigen-induced production of immunoglobulin Gl antibodies. // Immunology.- 2004.-Vol.113(1). P.44-56.
9. Lider O., Rshef Т., et al. Antiidiotypic network induced by Т cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis. // Science. - 1988. - Vol.239. - P.181-183.
10. Lohse А., Моr F., et al. Control of experimental autoimmune encephalomyelitis by Т cells responding to activated Т cells. // Science. - 1989. - Vol.244. - P.820-822.
11. Mimran А., Моr F., Carmi P., Quintana F.J., Rotter V., Cohen I.R. DNA vaccination with CD25 protects rats from adjuvant arthritis and induces an antiergotypic response.// J.Clin.Invest.- 2004. - Vol.113. - P.924-932.
12. Mimran А., Моr F., Quintana F.J., Cohen I.R. Anti-ergotypic Т cells in naive rats.// Journal of Autoimmunity. - 2005. - Vol.24. - P.191-201.
13. Mor F., Cohen IR. Vaccines to prevent and treat autoimmune diseases. // Int. Arch. Allergy Immunol. - 1995.- Vol.108 (4). - P.345-349.
14. Yoshikai Y, Miake S, Matsumoto T, Nomoto K, Takeya K. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice.// Immunology.- 1979. - Vol.38(3). - P.577-583.
15. Zhang J. Medaer R., et al. MHC-restricted depletion of human myelin basic protein-reactive T cells be T cell vaccination. // Science. - 1993. - Vol.261. - P.1451-1454.
16. Кожевников B.C., Королькова О.Ю., Ильина Н.А., Сизиков А.Э., Коненков В.И., Коненкова Л.П. Способ лечения ревматоидного артрита. Патент РФ №2339385, 27.11.2008, Бюл. №33.
17. Кожевников B.C., Баровская Н.А., Королькова О.Ю., Непомнящих В.М., Леонова М.И, Демина Д.В. Способ лечения атопического дерматита. Патент РФ №2340348, 10.12.2008, Бюл. №34.