ШТАММ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ И АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
STRAIN OF MICROMYCETE ASPERGILLUS ORYZAE-PRODUCER OF PROTEOLYTIC AND AMYLOLYTIC FERMENTS TO BE USED IN FOOD INDUSTRY

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма - продуцента протеолитических и амилолитических ферментов, и может быть применено для гидролиза растительных и животных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве.
Известно, что мицелиальный гриб Aspergillus oryzae имеет широкое применение в пищевой промышленности, так как не обладает патогенными свойствами. Биосинтез протеаз и амилаз, характерный для представителей Aspergillus oryzae, используется, например, при изготовлении некоторых пищевых продуктов (ферментированных приправ, ферментированных напитков), когда требуется гидролиз белков и углеводов (RU 2361914, 2009, RU 2187947, 2002).
Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-369, обладающий способностью продуцировать комплекс протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне pH, α-амилазу. Однако основным недостатком этого штамма является отсутствие синтеза сопутствующих гидролаз, а также длительный период роста и развития микромицета; штамм интенсивно продуцирует α-амилазу и протеазу на жидких средах лишь на четвертые - пятые сутки (SU 1440922, 1988).
Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-683, продуцирующий комплекс кислых и слабокислых протеаз, α-амилазы и сопутствующих ксиланаз, глюканаз и цитаз. Известно, что при глубинном культивировании данный штамм продуцирует целый комплекс высокоактивных ферментов. Получаемые ферментные комплексы применяются в пищевой промышленности.
Однако применение штамма является ограниченным из-за недостаточно высокой скорости роста и особых требований к питательным средам, так как он растет на средах с содержанием сухих веществ не более 18% (RU 2070921, 1996).
Задача изобретения состоит в получении штамма Aspergillus oryzae, продуцирующего протеазы и α-амилазу, обладающего высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании.
В качестве изобретения предлагается новый штамм микромицета Aspergillus oryzae 37-53, полученный методом многоступенчатой селекции и мутагенеза, депонированный в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM01135. Штамм является продуцентом протеаз и α-амилазы, обладает высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании, и интенсивным спорообразованием.
Техническим результатом изобретения является более высокая скорость роста предлагаемого штамма Aspergillus oryzae RCAM01135.
В частности, на средах с соевым шротом максимумы протелитической и амилолитической активностей проявляются на третьи сутки культивирования, и интенсивность спорообразования была самой высокой также на третьи сутки. Это позволяет рассматривать заявленный штамм как перспективное средство для использования в пищевой промышленности для переработки сельскохозяйственного сырья, например сои, с целью получения различных пищевых вкусоароматических добавок, в бродильном производстве, хлебопекарной промышленности.
Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки:
а) характер роста (опушение, край колонии). Колонии пушистые, округлой формы, края ровные, мицелий белый, спорообразующий, цвет колонии от оливкового до темно-зеленого. Вегетативный мицелий септированный, хорошо разветвленный с крупными вздутиями, толщина гиф 6-12 мкм; конидии формируются экзогенно, поверхность конидии гладкая, форма округлая, диаметр спор 5-6 мкм; образует конидиальные головки с одноярусными стеригмами;
б) размер колонии (при определенном времени инкубации). На 3 сутки роста на сусло-агаре диаметр колонии 50×51 мм;
в) воздушный мицелий (наличие, цвет, особенности спороношения). С обильным спороношением темно-зеленого цвета. По краю колонии белый пушистый мицелий 3 мм;
г) цвет субстратного мицелия. Белый;
д) цвет обратной стороны колонии. Светло-коричневый;
е) другие признаки (пигмент, экссудат и т.д.). Пигменты не выделяются, экссудат отсутствует;
ж) изменения культуры по мере старения. Цвет колонии с возрастом темнеет, становится буро-зеленым;
з) поведение на других средах. На среде Чапека с глюкозой: на 3 сутки роста цвет колонии - зеленый, поверхность гладкая; диаметр колонии 32×34 мм.
По исследованиям морфологических признаков культуры проведена идентификация штамма в соответствии с определителем мицелиальных грибов (Билай В.И., Коваль Э.С. Аспергиллы. Определитель. - Киев: Наук. Думка, 1988, - 204 с.).
Физиолого-биохимические признаки
Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста - 28-30°C. Максимальная температура - 50°C. Минимальная температура - 18°C. Оптимальное значение pH для роста гриба - 5,5. Рост гриба отмечается в диапазоне pH от 2,5 до 10,0.
В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин и лактозу. Ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки. Штамм не патогенный. В режиме глубинного и твердофазного культивирования была установлена способность к синтезу ферментов амилолитического и протеолитического действия.
Штамм хранится на агаризованном солодовом сусле 8% CB; pH среды - естественный; температура хранения +20-25°C.
Пример 1
Глубинное и твердофазное культивировстие штамма Aspergillus oryzae RCAM01135
Глубинное культивирование штамма Aspergillus oryzae 37-53 осуществляли на различных комплексных естественных средах, составленных с учетом физиологических потребностей продуцента. При конструировании питательных сред принимали во внимание то обстоятельство, что для синтеза протеаз и α-амилазы благоприятны крахмал, белки, поэтому основными компонентами среды являлось зерновое сырье. В качестве источника фосфорного питания для микромицета применяли фосфорнокислый калий. Таким образом, для глубинного культивирования штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 были использованы питательные среды следующего состава, %:
2
4
1. Ячменная мука - 3,0, пшеничные отруби - 3,0, крахмал - 2,0, KHPO - 1,5;
2
4
2. Пшеничная мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KHPO - 1,5%;
2
4
3. Соевая мука - 6,0, ячменная мука - 5,0, KHPO - 1,5;
2
4
4. Соевая мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KHPO - 1,5;
3
3
Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 см, содержащих 50 см стерильной питательной среды, на круговой качалке с числом оборотов 220 об/мин при температуре 30°C. Полученные результаты представлены в табл.1.
Таблица 1
Глубинное культивирование гриба Asp.oryzae RCAM01135 на натуральных питательных средах
№ среды
Сутки
Рост (густота, цвет КЖ)
pH
РСВ, %
Ферм, акт-сть, ед./см<sup>3</sup>
ПС
АС
1
1
++бежевая каша
4,74
4,0
-
-
2
+хаки (желтоватая) каша
4,8
2,8
1,5
0,64
3
+хаки (желтоватая) жижа
5,36
2,2
1,8
0,82
2
1
++++бежевая каша
5,09
3,0
-
-
2
++хаки (желтоватая) каша
5,42
2,0
1,3
0,93
3
++хаки светлая жижа
5,6
2,2
1,5
1,10
3
1
+++++очень густая бежевая каша
5,69
5,0
-
-
2
темная бежевая каша
7,6
5,0
0,05
0,35
3
++++хаки темная каша
8,46
5,4
0,03
0,56
4
1
+++++густая бежевая каша
7,10
5,0
-
-
2
темная бежевая каша
8,33
4,9
0,06
0,35
3
+++хаки темная каша
8,73
5,4
0,02
0,12
3
3
Как видно из таблицы 1, селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 на питательных средах, содержащих ячменную или пшеничную муку, а также пшеничные отруби (среды №1 и 2), проявлял способность к синтезу протеаз и α-амилазы: общая протеолитическая активность на 3-и сутки культивирования составила 1,5-1,8 ед. ПС/см, амилолитическая 0,82-1,10 ед. АС/см. На средах, в состав которых входила соеваая мука (среды №3 и 4), уровень активности синтезируемых ферментов снижался в 2-3 раза.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на пшеничных отрубях с влажностью 52,4% и на соевом шроте с влажностью 51,8% при температуре 30°C в стационарных условиях. Полученные результаты представлены в табл.2.
Таблица 2
Поверхностное культивирование гриба A.oryzae RCAM01135 на различных средах
Среда для культивирования
Характеристика роста гриба, сутки
Ферментативная активность, ед./г
2
4
7
ПС
АС
Отруби
Белый мицелий, начало спорообразования, цвет спор зеленый
Обильное спорообразование, споры пылят, цвет зеленый с оливковым оттенком
Без изменений
43,5
9,0
Соевый шрот
1
2
3
41,0
12,0
Белый мицелий
Обильное спорообразование, цвет спор зеленый с оливковым оттенком
Обильное спорообразование, споры оливкового цвета
Результаты глубинного и твердофазного культивирования подтверждают биосинтетическую способность селекционированного штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 по отношению к протеолитическим и амилолитическим ферментам, что характерно грибам рода Aspergillus вида oryzae.
Таким образом, полученный штамм хорошо развивается на жидких и твердых питательных средах, синтезирует ферменты протеолитического и амилолитического действия и идентифицирован как мицелиальный гриб Aspergillus oryzae.
Пример 2
Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 на средах с соевым шротом
Наработку экспериментальных образцов селекционированной культуры Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на среде с соевым шротом и на соевом шроте с добавлением 10% перловки с разной влажностью в течение 3-х суток при 30°C (табл.3).
Таблица 3
Биохимическая характеристика экспериментальных образцов гриба A.oryzae RCAM01135
Среда для культивирования
Влажность поверхн. культуры, %
Биохимические показатели гриба
Белок по Кьельдалю, % а.с.в.
Белок по Лоури, мг/г а.с.в.
<maths num="1"><math display="block"><mrow><mi>n</mi><msubsup><mi>h</mi><mn>2</mn><mo>+</mo></msubsup></mrow></math><img file="00000001.tif" he="7" wi="8" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>мг%/г а.с.в.
Соевый шрот
58,7
43,0
35,0
317,0
Соевый шрот +10% перловки
51,3
41,0
52,8
309,7
62,4
44,3
58,3
322,5
Экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были получены в результате ускоренного роста микромицета при поверхностном культивировании на соевом шроте, обогащены белком, аминным азотом и могут быть использованы для дальнейшей переработки в производстве продуктов ферментации сои.
Селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 и наработанные экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были исследованы в Испытательной лаборатории технохимического контроля и арбитражных методов анализа ГНУ ВНИИПБТ Россельхоакадемии.
Результаты испытаний по идентификации ГМИ показали, что в чистой культуре микромицета Aspergillus oryzae RCAM01135 трансгенные последовательности отсутствуют (протокол испытаний от 23 марта 2012 г.).
При анализе тяжелых металлов в экспериментальных образцах гриба A. oryzae RCAM01135 было установлено, что их содержание не превышает предельно допустимых концентраций (протокол от 18 апреля 2012 г.). В таблице 4 приведены результаты анализа по содержанию тяжелых металлов в субстрате - соевом шроте и в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135. Аналогичные результаты получены во всех исследуемых экспериментальных образцах.
Таблица 4
Содержание тяжелых металлов в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135
Анализируемый объект
Содержание тяжелых металлов, мг/кг
Свинец Pb
Мышьяк As
Кадмий Cd
Ртуть Hg
Соевый шрот
0,0052
0,0034
0,0027
0,0009
(ПДК для сои)<sup>1</sup> (<sup>1</sup>СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»)
0,5
0,3
0,1
0,02
Поверхностная культура гриба A.oryzae 37-53
0,0065
0,0047
0,0029
0,0014