МИКРОЭЛЕКТРОННОЕ СЕНСОРНОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ЧАСТИЦ-МЕТОК
MICROELECTRONIC SENSOR DEVICE FOR DETECTING LABEL PARTICLES

Изобретение относится к микроэлектронному сенсорному устройству и способу для обнаружения целевых компонентов, например, биологических молекул, содержащих частицы-метки. Кроме того, изобретение относится к носителю и планшету с лунками, которые пригодны, в частности, для упомянутого сенсорного устройства.
В заявке на патент США №2005/0048599 A1 предлагается способ для исследования микроорганизмов, которые помечены частицами так, что на них может действовать (например, магнитная) сила. В одном варианте осуществления данного способа, световой пучок направляют сквозь прозрачный материал к поверхности, на которой происходит его полное внутреннее отражение. Свет данного пучка, который выходит из прозрачного материала в виде исчезающей волны, рассеивается микроорганизмами и/или другими компонентами на поверхности и затем обнаруживается фотоприемником или применяется для подсветки микроорганизмов для визуального наблюдения.
С учетом упомянутого положения дел, целью настоящего изобретения было создание средства для усовершенствованного обнаружения целевых компонентов, содержащих частицы-метки. В частности, желательно, чтобы способ был простым, и чтобы его чувствительность и/или точность были выше по сравнению с соответствующим уровнем техники.
Упомянутая цель достигается с помощью микроэлектронного сенсорного устройства по пункту 1, носителя по пункту 19, планшета с лунками по пункту 20 и способа по пункту 28 формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
Микроэлектронное сенсорное устройство в соответствии с настоящим изобретением служит для качественного или количественного обнаружения целевых компонентов, содержащих частицы-метки, при этом целевые компоненты могут быть, например, биологическими веществами типа биологических молекул, комплексов, клеточных фракций или клеток. Термин «частица-метка» должен означать частицу (атом, молекулу, комплекс, наночастицу, микрочастицу и т.п.), которая обладает некоторым свойством (например, оптической плотностью, магнитной восприимчивостью, электрическим зарядом, флуоресценцией, радиоактивностью и т.п.), которое можно обнаружить, с косвенным выявлением, тем самым, присутствия соответствующих целевых компонентов. Микроэлектронное сенсорное устройство содержит следующие компоненты:
a) Носитель с поверхностью связывания, на которой могут собираться целевые компоненты. Термин «поверхность связывания» выбран в настоящем случае в качестве однозначной ссылки на конкретную часть поверхности носителя, и, хотя, целевые компоненты во многих случаях применения будут действительно связываться с упомянутой поверхностью, данное условие не обязательно. Необходимо только, чтобы целевые компоненты могли достигать поверхности связывания для сбора на ней (обычно, в концентрациях, определяемых параметрами, соответствующими целевым компонентам, их взаимодействию с поверхностью связывания, их подвижности и т.п.). Носитель должен обладать высокой прозрачностью для света в данном спектральном диапазоне, в частности, для света, излучаемого источником света, который описан ниже. Носитель можно изготавливать, например, из стекла или какого-нибудь прозрачного пластика.
b) Источник света для излучения светового пучка, называемого, в дальнейшем, «входным световым пучком», в вышеупомянутый носитель таким образом, чтобы световой пучок претерпевал полное внутреннее отражение в исследуемой области на поверхности связывания носителя. Источник света может быть, например, лазером или светоизлучающим диодом (LED), по желанию, снабженным какой-нибудь оптической системой для формирования и направления входного светового пучка. «Исследуемая область» может представлять собой подобласть поверхности связывания или содержать целиком поверхность связывания; как правило, исследуемая область будет иметь форму, по существу, круглого пятна, которое освещается входным световым пучком. Кроме того, следует отметить, что для полного внутреннего отражения требуется, чтобы показатель преломления носителя был больше, чем показатель преломления материала, смежного с поверхностью связывания. Данное условие обеспечивается, например, в случае, если носитель выполнен из стекла (n=1,6), и смежный материал является водой (n=1,3). Дополнительно следует отметить, что термин «полное внутреннее отражение» должен включать в себя случай, называемый «нарушенным полным внутренним отражением», при котором некоторая часть падающего света теряется (поглощается, рассеивается и т.п.) в процессе отражения.
c) Светоприемник для определения количества света в «выходном световом пучке», который содержит свет, который возникает в результате вышеупомянутого полного внутреннего отражения входного светового пучка. Выходной световой пучок не обязательно должен содержать весь свет, претерпевший полное внутреннее отражение, (хотя именно данный вариант предпочтителен), так как некоторая часть упомянутого света может, например, применяться для других целей или просто теряться, или выходной световой пучок не обязательно должен целиком состоять из света, претерпевшего полное внутреннее отражение, так как упомянутый пучок может также содержать, например, рассеянный свет или флуоресцентный свет.
Приемник может содержать любой подходящий датчик или множество датчиков, например, фотодиод, фоторезистор, фотоэлемент, интегральная схема на приборах с зарядовой связью (ПЗС-ИС) или фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), посредством которых можно обнаруживать данный спектр.
Описанное микроэлектронное сенсорное устройство допускает высокочувствительное и высокоточное количественное и качественное обнаружение целевых компонентов в исследуемой области на поверхности связывания. Упомянутый результат обусловлен тем, что входной световой пучок, претерпевший полное внутреннее отражение, создает исчезающую волну, которая распространяется от поверхности носителя на короткое расстояние в смежный материал. Если свет данной исчезающей волны рассеивается или поглощается частицами-метками, связанными с целевыми компонентами, находящимися на поверхности связывания, то он будет отсутствовать в выходном световом пучке. Следовательно, количество света в выходном световом пучке (точнее, количество света, отсутствующего в выходном световом пучке, по сравнению с входным световым пучком) указывает на присутствие и количество частиц-меток на поверхности связывания. Одно преимущество описанной процедуры оптического обнаружения содержит ее точность, так как исчезающая волна зондирует лишь небольшой объем толщиной обычно 10-300 нм непосредственно над поверхностью связывания, что исключает помехи от материала основы позади упомянутого объема. Высокая чувствительность достигается, когда измеряют отраженный свет, так как обнаруживаются все эффекты, которые уменьшают количество света, претерпевшего полное внутреннее отражение. Кроме того, оптическое обнаружение можно, по желанию, выполнять на некотором расстоянии, т.е. в отсутствие механического контакта между носителем и источником света или светоприемником.
Микроэлектронное сенсорное устройство можно, в частности, выполнить так, чтобы световой пучок, претерпевший полное внутреннее отражение, становился нарушенным, что приводит к снижению интенсивности света, претерпевшего полное внутреннее отражение, когда частицы-метки, которые связаны с целевыми компонентами, являются макроскопическими рассеивающими и/или поглощающими частицами.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, микроэлектронное сенсорное устройство содержит генератор поля для генерации магнитного и/или электрического поля, которое может воздействовать на частицы-метки. Генератор поля можно выполнить, например, посредством постоянного магнита, провода, пары электродов или катушки. Генератор поля может воздействовать на частицы-метки, например, индуцированием намагничивания или поляризации и/или приложением к ним сил. Упомянутое микроэлектронное сенсорное устройство допускает разнообразное манипулирование целевыми компонентами с помощью полей, которые можно использовать, например, для ускорения совокупности целевых компонентов на поверхности связывания и/или для удаления нежелательных (несвязанных или, при строгом критерии, слабо связанных) компонентов с поверхности связывания.
В общем случае, пространство около носителя на стороне поверхности связывания можно выполнить в произвольной конфигурации. Например, возможен вариант, в котором данное пространство является внешним относительно микроэлектронного сенсорного устройства, и в котором целевые компоненты наносят на поверхность связывания распылением или окрашиванием; пространство может быть также открыто в окружающую среду для обнаружения целевых компонентов, например, в окружающей атмосфере. Кроме того, возможен вариант, в котором целевые компоненты проникают к поверхности связывания сквозь носитель, например, посредством диффузии. Однако, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения, микроэлектронное сенсорное устройство содержит камеру для проб, которая расположена около поверхности связывания, и в которой можно обеспечивать пробу с целевыми компонентами. Камера для проб обычно представляет собой пустую полость или полость, заполненную некоторым веществом типа геля, который может впитывать вещество пробы; камера может быть открытой полостью, закрытой полостью или полостью, соединенной с другими полостями соединительными каналами для текучей среды.
Как уже упоминалось, микроэлектронное сенсорное устройство можно применять для качественного обнаружения целевых компонентов, с выработкой, например, простого бинарного отклика в отношении конкретной целевой молекулы («присутствует» или «отсутствует»). Однако сенсорное устройство предпочтительно содержит модуль оценки для количественного определения количества целевых компонентов в исследуемой области по обнаруживаемому выходному световому пучку. Упомянутая оценка может базироваться, например, на том, что количество света в исчезающей световой волне, которая поглощается или рассеивается частицами-метками, пропорциональна концентрации целевых частиц, связанных с частицами-метками в исследуемой области. Количество целевых компонентов в исследуемой области может быть, в свою очередь, характеристикой концентрации данных компонентов в соседней пробе текучей среды в зависимости от кинетики соответствующих процессов связывания.
При дополнительном усовершенствовании вышеупомянутого варианта осуществления, микроэлектронное сенсорное устройство содержит модуль записи для контроля определенного количества света в выходном световом пучке в течение периода наблюдения. Следовательно, создается возможность контроля кинетики сбора или отделения целевых компонентов на или от поверхности связывания. Благодаря этому можно получать важную информацию о целевых компонентах и/или преобладающих окружающих условиях. Модуль оценки и/или модуль записи обычно сопряжены со светоприемником и могут быть реализованы посредством некоторого оборудования для обработки данных, например, микрокомпьютера в сочетании с соответствующим программным обеспечением.
До сих пор описание микроэлектронного сенсорного устройства включало в себя случай, в котором на поверхности связывания существует единственная исследуемая область. Ниже будет приведено описание нескольких вариантов осуществления микроэлектронного сенсорного устройства, в котором носитель содержит множество исследуемых областей, на которых возможно полное внутреннее отражение разных входных световых пучков. В таком случае, один носитель допускает обработку нескольких исследуемых областей и, следовательно, например, поиск разных целевых компонентов, наблюдение одинаковых целевых компонентов в разных условиях и/или проведение нескольких выборочных измерений в статистических целях. «Разные входные световые пучки» могут быть, по желанию, компонентами одного широкого светового пучка, который однородно формируется источником света.
Разные входные световые пучки, которые применяются в вышеупомянутом варианте осуществления, могут быть разными во времени. Данный случай имеет место, например, если микроэлектронное сенсорное устройство содержит сканирующий модуль для последовательного сопряжения источника света с разными исследуемыми областями. В альтернативном варианте или дополнительно, источник света может содержать сканирующий модуль для оптического сопряжения светоприемника с разными исследуемыми областями на поверхности связывания. Сканирующие модули могут содержать, например, оптические компоненты типа линз или зеркал для направления падающего или выходного светового пучка по подходящему пути. Сканирующие модули могут также содержать средство для перемещения носителя относительно источника света и/или светоприемника.
В другом варианте осуществления микроэлектронного сенсорного устройства с множеством исследуемых областей содержится множество источников света и/или множество светоприемников, которые направляют на разные исследуемые области на поверхности связывания. В данном случае возможна одновременная обработка данных от множества исследуемых областей, что соответственно ускоряет сопутствующий измерительный процесс. Разумеется, данный вариант осуществления можно объединять с вышеописанным вариантом, т.е., например, возможно применение сканирующего модуля для сканирования входных световых пучков от множества источников света по разным матрицам исследуемых областей и/или сканирующего модуля для направления выходных световых пучков из разных матриц исследуемых областей к множеству светоприемников. Благодаря применению сканирующих модулей, число источников света/светоприемников может быть меньше, чем число исследуемых областей.
В другом варианте осуществления с множеством исследуемых областей, микроэлектронное сенсорное устройство содержит множество раздельно управляемых генераторов (магнитного или электрического) полей, которые соответствуют разным исследуемым областям. При этом можно раздельно управлять частицами-метками в каждой исследуемой области в соответствии с требованиями конкретных анализов, которые требуется выполнить.
Микроэлектронное сенсорное устройство можно применять, в принципе, с частицами-метками любого типа. Однако, в предпочтительном варианте, микроэлектронное сенсорное устройство снабжают частицами-метками, которые особенно подходят к другим компонентам устройства. Сенсорное устройство может содержать, главным образом, частицы-метки с оболочкой из прозрачного материала, причем, данная оболочка обычно покрывает (полностью или частично) одно или более ядер из другого материала, например, железо-оксидных гранул. При этом свет исчезающей световой волны на поверхности связывания может легко проникать в частицы-метки, где он поглощается и/или рассеивается и, следовательно, теряется в выходном световом пучке. Прозрачный материал оболочки может быть, в частности, материалом с таким же показателем направления, как материал носителя, так как, при этом оптимизируется переход света из носителя в частицы-метки. Оболочка может состоять, например, из такого же материала, как носитель.
Микроэлектронное сенсорное устройство может содержать, по желанию, «второй светоприемник» для определения (качественного или количественного) флуоресцентного света, излучаемого целевыми компонентами на поверхности связывания. Флуоресценция может возбуждаться исчезающей волной входного светового пучка в небольшом объеме, смежном с поверхностью связывания, и затем обнаруживаться, с выявлением, тем самым, присутствия (и количества) флуоресцентных целевых компонентов.
В другом варианте осуществления изобретения микроэлектронное сенсорное устройство содержит датчик, контролирующий входной свет, для определения количества света во входном световом пучке. Благодаря этому, упомянутое количество можно учитывать в процессе (количественной) оценки результатов измерений выходного светового пучка и/или управления входным световым пучком в контуре обратной связи.
Датчик для контроля входного света можно встраивать в источник света, что обеспечивает надежную и компактную конструкцию и удобно для интегрирования в контур управления с обратной связью. В альтернативном варианте датчик для контроля входного света (или, по меньшей мере, часть упомянутого датчика) может быть размещен снаружи источника света в виде независимого компонента. Последняя конфигурация обладает преимуществом в том, что измерение упомянутым датчиком можно точнее сконцентрировать на фактическом входном световом пучке в месте его входа в носитель, так как контрольное измерение имеет место за оптическими элементами типа линз или точечными отверстиями, которые обычно присутствуют на пути светового луча от источника света.
Выше уже упоминалось, что результаты измерений датчиком для контроля входного света можно соотносить с количеством света в выходном световом пучке, которое определяется светоприемником. Поэтому микроэлектронное сенсорное устройство может содержать модуль оценки, который выполнен с возможностью реализации упомянутого соотношения. С данной целью, из датчика для контроля входного света и светоприемника в модуль оценки обычно подаются сигналы, которые представляют измеренные количества света. Модуль оценки может, по желанию, предварительно обрабатывать упомянутые сигналы, например, фильтром (нижних частот). В предпочтительном варианте осуществления количество света в выходном световом пучке нормируется к количеству света во входном световом пучке, вследствие чего результат не зависит от изменений мощности источника света.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, источник света выполнен с возможностью создания поляризованного входного светового пучка, в частности, линейно поляризованного входного светового пучка. В поляризованном световом пучке векторы электрического поля (и, следовательно, также связанного с ним магнитного поля) имеют не случайную, а упорядоченную ориентацию в плоскости, перпендикулярной направлению распространения светового пучка. Упомянутая ориентация является постоянной в пространстве для линейно поляризованного светового пучка и периодическим образом вращается для светового пучка с круговой или эллиптической поляризацией. Создание входного светового пучка с некоторой поляризацией придает ему характерную внутреннюю особенность, которая влияет на взаимодействие такого пучка с другими объектами, например, с оптическими компонентами на пути светового луча или с целевыми частицами, подлежащими обнаружению. Упомянутое влияние открывает многочисленные возможности, которые можно эффективно использовать, например, возможность отличать в выходном световом пучке свет, который происходит из входного светового пучка от света из других источников, например, из окружающей среды.
В предпочтительном исполнении вышеупомянутого варианта осуществления входной световой пучок имеет линейную поляризацию в плоскости падения относительно входного окна носителя, через которое входной световой пучок входит в носитель. В дополнение или в качестве альтернативы, выходной световой пучок может иметь линейную поляризацию в плоскости падения относительно выходного окна носителя, через которое выходной световой пучок выходит из носителя. Как обычно, «плоскостью падения» светового пучка называют плоскость, которая содержит упомянутый световой пучок и перпендикулярна поверхности, на которую падает упомянутый световой пучок. Когда световой пучок падает на поверхность носителя, (небольшая) доля упомянутого света обычно отражается. Помимо того, что такой свет теряется для других целей, конкретный недостаток описанного отражения состоит в том, что он может нарушать работу других компонентов, например, светоприемника или лазера в источнике света. Поэтому желательно уменьшать количество света, который отражается на входном или выходном окне носителя. Упомянутое уменьшение возможно с помощью предложенной схемы устройства, в которой входной световой пучок и/или выходной световой пучок имеют описанную поляризацию.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения входное окно, через которое входной световой пучок входит в носитель, установлено под углом Брюстера к входному световому пучку, и/или выходное окно, через которое выходной световой пучок выходит из носителя, установлено под углом Брюстера к выходному световому пучку. Как известно в оптике, отраженный пучок исчезает, если падающий световой пучок с линейной поляризацией в плоскости падения падает на поверхность под соответствующим углом Брюстера. Если данный вариант осуществления сочетать с вышеупомянутым вариантом осуществления (имеющим линейно поляризованный входной световой пучок), то возможно полное подавление отражений на входном или выходном окне носителя. Угол Брюстера для конкретной схемы устройства можно вычислить с учетом того, что, при падении под углом Брюстера, угол между преломленным световым пучком и направлением (подавляемого) отраженного светового пучка составляет 90°.
Изобретение дополнительно относится к носителю для обеспечения исследования пробы, при этом упомянутый носитель может быть пригодным, в частности, в качестве носителя для микроэлектронного сенсорного устройства вышеописанного типа. Носитель содержит камеру для пробы, в которой можно обеспечить пробу, и которая имеет прозрачную стенку для наблюдения. На внутренней стороне стенка для наблюдения содержит поверхность связывания, на которой могут собираться компоненты пробы. На внешней стороне стенка для наблюдения содержит, по меньшей мере, одну оптическую структуру, которая выполнена так, что
(i) входной световой пучок, который направлен снаружи носителя на оптическую структуру, входит в стенку для наблюдения,
(ii) упомянутый входной световой пучок претерпевает (по меньшей мере, однократно) полное внутреннее отражение в исследуемой области на поверхности связывания, и
(iii) выходной световой пучок, содержащий, по меньшей мере, некоторое количество света, претерпевшего полное внутреннее отражение, и/или флуоресцентного света, испускаемого целевыми компонентами на поверхности связывания, выходит из стенки для наблюдения сквозь оптическую структуру, предпочтительно, в направлении от носителя.
Стенка для наблюдения обычно будет иметь основную форму пластины с, по существу, параллельными внутренней и внешней поверхностями, при этом внутренняя поверхность содержит поверхность связывания, и, причем, оптическая структура выступает наружу из внешней поверхности. Кроме того, стенка для наблюдения может быть, в принципе, любой частью стенки камеры для пробы, например, боковой стенки или верхней стороны. Однако в предпочтительном варианте стенка для наблюдения является частью дна (или всего дна) носителя, что дает два преимущества: Во-первых, компоненты пробы, расположенные под осадком, будут концентрироваться на поверхности связывания дна. Во-вторых, компоненты соответствующего прибора можно располагать ниже упомянутого дна, и поэтому по сторонам носителя остается пространство, допускающее размещение дополнительных носителей.
Преимущество описанного носителя состоит в том, что пробу внутри соответствующей камеры для пробы можно исследовать оптически с помощью входного светового пучка, который претерпевает полное внутреннее отражение, с обеспечением, тем самым, поля исчезающей волны в небольшом объеме на поверхности связывания. Такие эффекты, как поглощение или рассеяние, имеющие место в упомянутом небольшом объеме, будут оказывать влияние на выходной световой пучок, который выходит из носителя. Кроме того, во флуоресцентных целевых компонентах исчезающей волной может возбуждаться флуоресценция, которая обеспечивает дополнительный показатель присутствия цели. Поскольку как входной световой пучок, так и выходной световой пучок направлены снаружи на носитель или наоборот, то соответствующие источник света и светоприемник можно располагать на удалении и отдельно от носителя.
Изобретение дополнительно относится к планшету с лунками, который содержит множество носителей вышеописанного типа, т.е. множество камер для проб с прозрачными стенками для наблюдения, имеющими, на их внутренней стороне, поверхность связывания и, на их внешней стороне, по меньшей мере, одну оптическую структуру, при этом упомянутая оптическая структура дает возможность входному световому пучку, приходящему снаружи носителя, входить в стенку для наблюдения, претерпевать полное внутреннее отражение на поверхности связывания и затем выходить из стенки для наблюдения в форме выходного светового пучка, который направлен от носителя.
Планшет с лунками объединяет множество вышеописанных носителей в виде матрицы и, следовательно, допускает параллельное исследование множества проб и/или одной пробы в ходе множества исследовательских анализов. Поскольку планшет с лунками выполнен на основе вышеописанного носителя, то более подробные сведения о преимуществах, особенностях и усовершенствованиях упомянутого планшета с лунками содержатся в вышеприведенном описании.
Ниже приведено описание различных вариантов осуществления изобретения, которые применимы к микроэлектронному сенсорному устройству, носителю и планшету с лунками вышеописанного типа.
В принципе, возможен вариант, в котором носитель имеет несколько специализированную конструкцию с несколькими компонентами из разных материалов, однако, в предпочтительном варианте, носитель изготовлен в виде однородного изделия из прозрачного материала, например, прозрачного пластика. Следовательно, носитель можно легко изготавливать, например, литьевым формованием.
Исследуемая область носителя предпочтительно имеет слабую шероховатость для минимизации нежелательного влияния на (нарушенное) полное внутреннее отражение. Если λ является характеристической (например, пиковой или средней) длиной волны света, составляющего входной световой пучок, то шероховатость исследуемой области должна быть предпочтительно слабее, чем 0,5 λ, предпочтительнее всего, слабее, чем 0,1 λ (в том смысле, что разность высот микроскопических «впадин» и «гребней» поверхности носителя в исследуемой области меньше, чем приведенные значения).
Исследуемая область носителя может быть, по желанию, покрыта захватывающим элементом, по меньшей мере, одного типа, который может связывать один или более целевых компонентов. Типичным примером данного захватывающего элемента является антитело, с которым могут специфически связываться соответствующие антигены. При снабжении исследуемой области захватывающими элементами, которые являются специфическими по отношению к некоторым целевым компонентам, создается возможность селективно повышать концентрацию упомянутых целевых компонентов в исследуемой области. Кроме того, нежелательные целевые компоненты можно удалять с поверхности связывания подходящими (например, магнитными) отталкивающими силами (которые не разрывают связи между искомыми целевыми компонентами и захватывающими элементами). Поверхность связывания можно предпочтительно снабдить захватывающими элементами нескольких типов, которые являются специфическими по отношению к разным целевым компонентам. В микроэлектронном сенсорном устройстве с множеством исследуемых областей существует предпочтительно, по меньшей мере, две исследуемые области, содержащие разные захватывающие элементы, чтобы упомянутые области были специфическими по отношению к разным целевым компонентам.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, поверхность носителя, по существу, перпендикулярна входному световому пучку и/или выходному световому пучку на входном окне или выходном окне, где упомянутый пучок, соответственно, входит в носитель или выходит из него, т.е. угол падения находится в пределах приблизительно ±5° около 90°. При этом направление входного светового пучка и/или выходного светового пучка не будет или будет лишь минимально изменяться во время перехода из окружающей среды в носитель или наоборот. Кроме того, отражение будет минимальным. В дополнение или в качестве альтернативы, соответствующие области могут также иметь противоотражающее покрытие. Для предотвращения подачи оптического излучения обратно в источник света (например, лазер), возможно, было бы предпочтительно, чтобы падающий пучок отклонялся от перпендикуляра на (самое большее) несколько градусов.
Носитель может, в частности, содержать, по меньшей мере, одну поверхность c формой, подобной или идентичной полусфере или усеченной пирамиде. Как более подробно поясняется ниже со ссылкой на фигуры, данные формы выполняют функцию типа линз и/или призм и, следовательно, обеспечивают подходящее направление падающего и выходящего световых пучков.
Носитель может, по желанию, дополнительно содержать полость, в которой можно, по меньшей мере, частично расположить генератор (магнитного или электрического) поля. Таким образом, источник поля можно установить как можно ближе к поверхности связывания, что допускает генерацию поля высокой напряженности в исследуемой области, при минимальном усилии (например, электрических токах) и минимальных возмущениях, воздействующих на другие области (например, соседние исследуемые области). Кроме того, данную полость можно использовать для центрирования носителя относительно генератора поля, источника света и светоприемника.
Микроэлектронное сенсорное устройство может быть, в принципе, выполнено как «неразъемный» узел из монолитно смонтированных компонентов, но в предпочтительном варианте носитель имеет конструкцию сменного компонента устройства, например, планшета с лунками. Следовательно, носитель можно использовать как дешевую часть одноразового использования, что особенно полезно, если носитель приходит в контакт с биологическими пробами, и/или если его покрытие (например, антителами) истощается во время одного процесса измерений.
Изобретение дополнительно относится к способу обнаружения целевых компонентов, содержащих частицы-метки, при этом упомянутый способ содержит этапы, на которых:
a) Собирают целевые компоненты на поверхности связывания носителя.
b) Направляют входной световой пучок в носитель так, чтобы упомянутый пучок испытывал полное внутреннее отражение в исследуемой области на поверхности связывания.
c) Определяют количество света в выходном световом пучке, который содержит, по меньшей мере, некоторую часть света, претерпевшего полное внутреннее отражение, из входного светового пучка; выходной световой пучок предпочтительно содержит только такой свет, который претерпел полное внутреннее отражение.
Способ в общем виде содержит этапы, которые могут быть выполнены микроэлектронным сенсорным устройством вышеописанного типа. Поэтому более подробные сведения о деталях, преимуществах и усовершенствованиях упомянутого способа содержатся в вышеприведенном описании.
В варианте осуществления способа манипулирование частицами-метками осуществляется магнитным и/или электрическим полем, при этом упомянутое манипулирование может, в частности, включать в себя притяжение частиц к исследуемой области или их отталкивание от нее.
В другом варианте осуществления способа количество света во входном световом пучке измеряют и соотносят с измеренным количеством света в выходном световом пучке. Следовательно, изменения интенсивности входного светового пучка можно обнаруживать и использовать для, например, коррекции измеренного количества света в выходном световом пучке, вследствие чего результат не зависит от флуктуаций входного света.
Упомянутые и другие аспекты изобретения очевидны из нижеописанных вариантов осуществления и поясняются со ссылкой на них. Данные варианты осуществления описаны ниже для примера с помощью прилагаемых чертежей, на которых:
Фиг.1 - схематичное изображение общей схемы устройства микроэлектронного сенсорного устройства в соответствии с настоящим изобретением;
Фиг.2 - изображение углов падения, когда входной световой пучок и выходной световой пучок ориентированы под углом Брюстера;
Фиг.3 - изображение микроэлектронного сенсорного устройства с лункой, имеющей сферическое дно;
Фиг.4 - изображение конструкции, показанной на фиг.3, но с дополнительным средством для фокусировки светового пучка;
Фиг.5 - изображение лунки, содержащей множество полусфер на дне;
Фиг.6 - изображение лунки, имеющей дно в форме усеченной пирамиды;
Фиг.7 - изображение конструкции, показанной на фиг.6, с полостью для электромагнита;
Фиг.8 - график, представляющий нормированный измеренный сигнал s в зависимости от времени t для растворов с разными концентрациями морфина, меченного магнитными частицами;
Фиг.9 - график, представляющий нормированный измеренный сигнал s в зависимости от времени t для растворов, содержащих морфин, меченный магнитными частицами, и разные концентрации свободного морфина;
Фиг.10 - изображение образования столбиков из магнитных гранул в магнитном поле;
Фиг.11 - график, представляющий нормированный измеренный сигнал s в зависимости от времени t для растворов с разными концентрациями морфина, меченного магнитными частицами, когда применяется только один этап магнитного притяжения;
Фиг.12 - график, представляющий нормированный измеренный сигнал s в зависимости от времени t для растворов, содержащих слюну и морфин, меченные магнитными частицами;
Фиг.13 - график, представляющий нормированный измеренный сигнал s в зависимости от времени t для двухступенчатого анализа PTH (паратиреоидного гормона) по сравнению с раствором, не содержащим PTH;
Фиг.14 - кривая зависимости доза-реакция для PTH в буферном растворе для оптического обнаружения;
Фиг.15 - график, подобный графику на фиг.13, для разных концентраций PTH;
Фиг.16 - кривая зависимости доза-реакция для PTH в буферном растворе и в крови для оптического обнаружения;
Фиг.17 - кривая зависимости гранула-реакция при обнаружении датчиком супермагниторезистивного типа (GMR-датчиком);
Фиг.18 - кривая зависимости гранула-реакция при оптическом обнаружении.
Одинаковые позиции или позиции, отличающиеся на целое число, кратное 100, обозначают на фигурах идентичные или сходные компоненты.
На фиг.1 показана общая схема устройства микроэлектронного сенсорного устройства в соответствии с настоящим изобретением. Центральным компонентом данного устройства является носитель 11, который может быть выполнен, например, из стекла или прозрачного пластика типа полистирола. Носитель 11 расположен около камеры 2 для пробы, в которой может быть обеспечена проба текучей среды с подлежащими обнаружению целевыми компонентами (например, лекарствами, антителами, ДНК и т.п.). Проба дополнительно содержит магнитные частицы 1, например, суперпарамагнитные гранулы, при этом упомянутые частицы 1 обычно связываются как метки с вышеупомянутыми целевыми компонентами (для простоты, на фигуре показаны только магнитные частицы 1).
Граница раздела между носителем 11 и камерой 2 для пробы образована поверхностью, называемой «поверхность 12 связывания». Упомянутую поверхность 12 связывания можно, по желанию, покрыть захватывающими элементами, например, антителами, которые могут специфически связывать целевые компоненты.
Сенсорное устройство содержит генератор 41 магнитного поля, например, электромагнит с катушкой и сердечником, для генерации, с возможностью регулирования, магнитного поля B на поверхности 12 связывания и в смежном пространстве камеры 2 для пробы. С помощью упомянутого магнитного поля B можно манипулировать магнитными частицами 1, т.е. производить их намагничивание и, особенно, перемещение (если применяют градиентные магнитные поля). Следовательно, например, существует возможность притягивания магнитных частиц 1 к поверхности 12 связывания для ускорения связывания соответствующего целевого компонента с упомянутой поверхностью.
c
Сенсорное устройство дополнительно содержит источник 21 света, например, лазер или LED (светоизлучающий диод), который формирует входной световой пучок L1, который распространяется в носитель 11. Входной световой пучок L1 подходит к поверхности 12 связывания под углом, большим, чем критический угол θ полного внутреннего отражения (TIR) и поэтому претерпевает полное внутреннее отражение с превращением в «выходной световой пучок» L2. Выходной световой пучок L2 выходит из носителя 11 через другую поверхность и обнаруживается светоприемником 31, например, фотодиодом. Светоприемник 31 определяет количество света в выходном световом пучке L2 (например, в виде интенсивности света в упомянутом световом пучке в пределах всего спектра или некоторой части спектра). Результаты измерений оцениваются и, по желанию, контролируются в течение всего периода наблюдения модулем 32 оценки и записи, который сопряжен с приемником 31.
В источнике 21 света можно применить коммерческий лазерный диод, применяемый с DVD, (λ=658 нм). Для формирования параллельного входного светового пучка L1 можно воспользоваться коллиматорной линзой, и, для уменьшения диаметра пучка можно применить точечное отверстие 23 диаметром, например, 0,5 мм. Для точных измерений требуется высокостабильный источник света. Однако, даже при идеально стабильном источнике света, температурные изменения лазера могут вызвать дрейф и случайные изменения на выходе.
Для решения данной проблемы источник света, по желанию, может содержать встроенный диод 22, контролирующий входной свет, для измерения уровня на выходе лазера. Затем выходной сигнал (обработанный фильтром нижних частот) контрольного датчика 22 может быть подан в блок 32 оценки, который может делить оптический сигнал (обработанный фильтром нижних частот) из детектора 31 на выходной сигнал контрольного датчика 22. Для повышения отношения сигнал-шум результирующий сигнал можно усреднять по времени. Деление устраняет эффект флуктуаций выходного сигнала лазера, обусловленных колебаниями мощности питания (исключается необходимость стабилизации источника питания), а также температурным дрейфом (исключается необходимость в мерах предосторожности типа элементов Пельтье).
Дополнительного улучшения можно добиться, если измерять не сам по себе (или не только) выходной сигнал лазера, а окончательную выходную мощность источника 21 света. Как показано, в общем, на фиг.1, только фракция выходного сигнала лазера выходит из точечного отверстия 23. Только упомянутая фракция будет применяться для фактического измерения в носителе 11 и поэтому является самым точным сигналом источника. Конечно, данная фракция зависит от выходного сигнала лазера, определяемого, например, встроенным контрольным диодом 22, но будет зависеть от любого механического изменения или нестабильности на пути светового луча (профиль лазерного пучка является приблизительно эллиптическим, с гауссовым профилем, т.е. более или менее неоднородным). Следовательно, целесообразно измерение количества света входного светового пучка L1 за точечным отверстием 23 и/или за возможными другими оптическими компонентами источника 21 света. Такое измерение можно выполнять несколькими способами, например:
- плоскопараллельную стеклянную пластину 24 можно установить под углом 45°, или светоделительный куб (например, с 90% коэффициентом пропускания, 10% коэффициентом отражения) можно вставить в путь светового луча, позади точечного отверстия 23, чтобы отклонять небольшую фракцию светового пучка в направлении отдельного датчика 22' контроля входного света;
- небольшое зеркало на краю точечного отверстия 23 или входного светового пучка L1 можно применить для отклонения небольшой части пучка к приемнику.
На фигуре изображен «второй светоприемник 31'», который, в качестве альтернативы или дополнительно, можно применить для обнаружения флуоресцентного света, излучаемого флуоресцентными частицами 1, которые возбуждены исчезающей волной входного светового пучка L1. Так как упомянутый флуоресцентный свет обычно излучается изотропно во все стороны, то второй приемник 31' можно располагать, в принципе, в любом месте, например, также над поверхностью 12 связывания. Кроме того, конечно, можно также применить приемник 31 для взятия отсчетов флуоресцентного света, при этом последний можно, например, спектрально выделять из отраженного света L2.
Описанное микроэлектронное сенсорное устройство применяет оптические средства для обнаружения магнитных частиц 1 и целевых компонентов, обнаружение которых действительно представляет интерес. Для устранения или, по меньшей мере, минимизации влияния фона (например, от пробы текучей среды, например, слюны, крови и т.п.), метод обнаружения должен быть специфическим по отношению к поверхности. Данное условие обеспечивается путем использования принципа нарушенного полного внутреннего отражения, который поясняется в дальнейшем.
A
B
В соответствии с законом преломления Снеллиуса, углы θ и θ относительно нормали к границе раздела между двумя средами A и B удовлетворяют уравнению
n
sinθ
=n
sinθ
A
A
B
B
A
B
A
B
B
B
A
A
B
c
c
B
A
где n, n означают показатели преломления сред A и B, соответственно. Луч света в среде A с высоким показателем преломления (например, стекле с n=2) будет, например, преломляться дальше от нормали, под углом θ, на границе раздела со средой B с меньшим показателем преломления, например, воздухом (n=1) или водой (n ≈ 1,3). Часть падающего света будет отражаться на границе раздела под таким же углом, как угол θ падения. Когда угол θ падения постепенно увеличивают, то угол θ преломления будет увеличиваться, пока не достигнет 90°. Соответствующий угол падения называется критическим углом θ и определяется уравнением sinθ=n/n. При больших углах падения, весь свет будет отражаться внутри среды A (стекло), откуда следует название «полное внутреннее отражение» для данного явления. Однако, в непосредственной близости к границе между средой A (стеклом) и средой B (воздухом или водой), в среде B формируется исчезающая волна, которая экспоненциально затухает с удалением от поверхности. Амплитуду поля в зависимости от расстояния z от поверхности можно выразить в виде:
<mrow><mi>exp</mi><mo stretchy="false">(</mo><mo>−</mo><mi>k</mi><msqrt><mrow><msubsup><mi>n</mi><mi>A</mi><mn>2</mn></msubsup><mi>sin</mi><mo stretchy="false">(</mo><msub><mi>θ</mi><mi>A</mi></msub><mo stretchy="false">)</mo><mo>−</mo><msubsup><mi>n</mi><mi>B</mi><mn>2</mn></msubsup></mrow></msqrt><mo>⋅</mo><mi>z</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow>
,
A
A
B
где k=2π/λ, θ означает угол падения пучка, претерпевающего полное отражение, и n и n означают показатели преломления соответствующих связанных сред.
A
B
При типичном значении длины волны λ, например, λ=650 нм, и n=1,53 и n=1,33, амплитуда поля снижается до exp(-1)=0,37 от ее исходного значения на расстоянии z, приблизительно равное 228 нм. Когда упомянутая исчезающая волна взаимодействует с другой средой типа магнитных частиц 1 в схеме устройства, показанной на фиг.1, то часть падающего света будет входить в пробу текучей среды (тогда явление называется «нарушенным полным внутренним отражением»), и интенсивность отраженного света будет ослаблена (тогда как, для чистой границы раздела и в отсутствие взаимодействия, интенсивность отраженного света будет 100%). В зависимости от степени возмущения, т.е. числа магнитных гранул на поверхности 12 связывания или в непосредственной близости (не далее, чем, приблизительно 200 нм) от упомянутой поверхности (но не в остальной части камеры 2 для пробы), интенсивность отраженного света будет соответственно ослабляться. Ослабление интенсивности является непосредственным критерием числа связанных магнитных гранул 1 и, следовательно, концентрации целевых молекул. Если упомянутое 200-нм расстояние взаимодействия исчезающей волны сравнить с типичными размерами антител, целевых молекул и магнитных гранул, то становится очевидным, что влияние фона будет минимальным. При больших длинах волн λ, расстояние взаимодействия будет больше, но влияние создающей фон жидкости будет оставаться очень слабым.
Описанная процедура не зависит от прилагаемых магнитных полей. Данная процедура позволяет оптически контролировать в реальном времени этапы приготовления, измерения и промывки. Контролируемые сигналы можно применять также для управления измерением или отдельными этапами процесса.
c
A
B
B
A
Что касается конкретных применяемых материалов, среда A носителя 11 может быть стеклом и/или некоторым прозрачным пластиком с типичным показателем преломления 1,52. Среда B в камере 2 для пробы будет на водной основе, с показателем преломления около 1,3. Данные параметры соответствуют критическому углу θ, равному 60°. Поэтому на практике выбирают угол падения 70°, чтобы показатель преломления текучей среды мог быть несколько больше (в предположении n=1,52, n может достигать, максимум, 1,43). При больших значениях n, потребуются большие n и/или большие углы падения.
Преимущества описанного оптического считывания в сочетании с магнитными метками для активации заключаются в следующем:
- Дешевый контейнер: Контейнер носителя 11 может состоять из относительно простого изделия, которое выполнено литьевым формованием из полимерного материала и может также содержать каналы для текучей среды.
- Расширенные возможности мультиплексирования для анализа нескольких аналитов: Поверхность 12 связывания в одноразовом контейнере можно оптически сканировать по большой площади. В альтернативном варианте, возможна визуализация большой площади, что обеспечивает большую матрицу обнаружения. Упомянутую матрицу (расположенную на оптически прозрачной поверхности) можно создать, например, нанесением методом струйной печати разных связывающих молекул на оптическую поверхность. Кроме того, способ делает возможным высокопроизводительный анализ в планшетах с лунками путем применения нескольких пучков и нескольких приемников и нескольких активирующих магнитов (либо механически перемещаемых, либо приводимых в действие электромагнитным способом).
- Активация и считывание взаимно ортогональны: магнитная активация магнитных частиц (сильными магнитными полями и градиентами магнитных полей) не влияет на процесс считывания. Поэтому оптический способ допускает непрерывный контроль сигнал во время активации. Тем самым обеспечивается наблюдение множества аспектов процесса анализа и возможность применения простых кинетических способов обнаружения на основе крутизны сигналов.
- Система, фактически, обладает чувствительностью по поверхности благодаря экспоненциально ослабевающему полю исчезающей волны.
- Удобное сопряжение: Отсутствие необходимости в электрическом соединении контейнера и устройством считывания. Единственным требованием для зондирования контейнера является наличие оптического окна. Поэтому возможно исполнение бесконтактного считывания.
- Возможность считывания с низким уровнем шумов.
На фиг.2 подробнее показаны углы падения входного светового пучка L1 и выходного светового пучка L2 на входном окне 14, поверхности 12 связывания и выходном окне 15 носителя 11. Если входное и выходное окна 14, 15 ортогональны входящему пучку, то часть света (обычно, около 4%) обычно отражается обратно и вызывает, например, в источнике 12 света нежелательные флуктуации выходного сигнала лазера (называемые «обратной связью в лазере»). Данное явление искажает измерение. Кроме того, в светоприемнике на приемной стороне возможно также образование эффектов интерференции из-за того, что на данной стороне обычно также применяется перпендикулярная ориентация, и применяемый источник света (лазер) является когерентным.
Из-за нежелательного нагревания измерительного контейнера, которое происходит, например, из-за нагревания активирующих магнитов 41 во время работы или под воздействием других внешних факторов, небольшое смещение положений граней носителя может приводить к замедленным изменениям интенсивности, которые имеют место как в источнике света, так и в приемной ветви схемы устройства, и которые трудно исключить из результата измерения. Путем установки светоприемника под углом (вместо перпендикулярной установки) относительно приходящего выходного светового пучка L2 можно эффективно устранить некоторые из проблем, возникающих на приемной стороне схемы устройства. Однако, подобное решение невозможно на стороне источника света.
Поэтому входное и выходное окна 14, 15 носителя 11 целесообразно выполнить так, чтобы устранить отражения без применения дорогих оптических просветляющих покрытий.
Для решения данной проблемы, входное и выходное окна 14, 15 предлагается размещать под углом Брюстера относительно входящего светового пучка и обеспечивать в данном пучке (линейную) поляризацию в плоскости падения (называемую «p-поляризацией»). Как известно из оптики (смотри, например, Pedrotti & Pedrotti, Introduction to Optics, Prentice Hall), отраженный пучок исчезает, если p-поляризованный падающий пучок падает на поверхность (прозрачной среды) под углом Брюстера.
P-поляризованный входной световой пучок L1 можно получить выбором правильной ориентации полупроводникового лазера в источнике света или применением полуволновой пластины для поворота поляризации до правильной ориентации.
3
c
2
6
Распространение входного светового пучка L1 внутри носителя 11 является фиксированным, поскольку упомянутый пучок должен падать на поверхность 12 связывания под углом θ, который больше критического угла θ TIR (полного внутреннего отражения). При этом ориентация входного и выходного окон или граней носителя 11 также фиксируется, если их углы, соответственно, θ или θ по отношению к преломленному пучку должны соответствовать углу Брюстера. Данные параметры, в свою очередь, фиксируют направление входного светового пучка L1 и выходного светового пучка L2.
1
2
Угол θ падения входного светового пучка L1 равен углу Брюстера, когда сумма угла падения и угла θ преломления составляет 90°. Данное условие в сочетании с законом Снеллиуса приводит к нижеследующей формуле для угла падения под углом Брюстера:
tg(θ
)=n
/n
,
1
2
1
1
2
где n означает показатель преломления среды, в которой входной световой пучок L1 распространяется перед преломлением, обычно, воздуха, и n означает показатель преломления среды, в которой распространяется преломленный луч, обычно, пластика носителя (например, поликарбоната, Zeonex (циклоолефинового термопластичного полимера) или полистирола).
2
Для угла θ преломленного пучка действует отношение.
tg(θ
)=n
/n
.
2
1
2
3
c
Другое условие, которое необходимо обеспечить, состоит в том, что входной световой пучок L1 должен падать на поверхность 12 связывания под углом θ, близким к критическому углу θ полного внутреннего отражения, но превосходящим данный угол, т.е.
θ
>θ
, при sin(θ
)=n
/n
,
3
c
c
3
2
3
где n означает показатель преломления среды над поверхностью 12 связывания. Кроме того, углы на стороне выходного светового пучка L2 являются зеркальными относительно входной стороны, т.е.
θ
=θ
, θ
=θ
и θ
=θ
.
4
3
5
2
6
1
1
2
3
3
4
1
6
2
5
При типичных значениях n=1 (воздух), n=1,5 (прозрачный пластик) и n=1,3 (на водной основе), можно получить следующие численные значения: θ=θ>60°, θ=θ=56°, θ=θ=34°.
При установке входного и выходного окон носителя под углом Брюстера, нежелательные отражения назад в лазер предотвращаются без обязательного применения дорогого противоотражающего покрытия. Кроме того, при установке приемника под углом, а не перпендикулярно, можно также предотвратить эффекты интерференции на стороне приемника. При этом расширение или сжатие носителя/контейнера во время измерения, например, вследствие тепловых воздействий, не повлияет на результат измерений.
В лабораторных условиях обычно применяют планшеты с лунками, которые содержат матрицу из множества камер («лунок») для проб, в которых можно параллельно выполнять разные анализы. На фиг.3-7 показаны разные возможные варианты осуществления одной лунки упомянутого планшета с лунками, при этом упомянутые варианты особенно подходят для применения описанного принципа измерения. Данные (одноразовые) лунки очень просты и дешевы в изготовлении, поскольку достаточно одного этапа литьевого формования.
c
Источник 121 света, показанный на фиг.3, выполнен с возможностью формирования параллельного светового пучка L1, падающего на поверхность дна лунки под углом, большим, чем критический угол θ. Для предотвращения излишнего отражения упомянутого входного светового пучка L1 на первой границе раздела между воздухом и носителем 111 (например, стеклом или пластиковым материалом), дно лунки имеет полусферическую форму 114 с радиусом R и центром, совпадающим с поверхностью 112 обнаружения. Входной световой пучок L1 направлен к тому же центру. На стороне отражения установлен фотоприемник, например, фотодиод 131, для обнаружения интенсивности выходного светового пучка L2. Типичный диаметр D лунки 102 находится в пределах от 1 до 8 мм. На фигуре дополнительно изображен магнит 141 для создания магнитных активирующих полей внутри лунки 102 (упомянутый магнит для упрощения не показан на последующих фигурах).
На фиг.4 изображен альтернативный вариант осуществления, в котором источник света содержит некоторый оптический элемент типа линзы 222 для формирования входного светового пучка L1, который, по существу, фокусируется в центре полусферы 214. На стороне приема можно применить аналогичный оптический элемент 232 для сбора и обнаружения интенсивности света в выходном световом пучке L2.
В дополнительно разработанной измерительной процедуре можно использовать несколько входных световых пучков и выходных световых пучков для одновременного обнаружения присутствия разных целевых молекул в разных местах в одной и той же лунке. На фиг.5 показана подходящая для этого лунка с несколькими полусферами 314a, 314b на дне лунки, которые можно использовать для введения света от нескольких входных световых пучков L1a, L1b в соответствующие исследуемые области 313a, 313b на дне лунки. В данном случае можно применить несколько фотоприемников (не показанных) для измерения нескольких выходных световых пучков L2a, L2b.
На фиг.6 представлен альтернативный вариант осуществления, в котором применена призма или усеченная пирамидальная структура 414 для введения/выведения света входного светового пучка L1 и выходного светового пучка L2. Наклонные края пирамиды должны быть, по существу, перпендикулярны упомянутым световым пучкам. Преимущества такой конструкции состоят в том, что она проста в изготовлении и не блокирует пучки от соседних областей. Соседние лунки показаны на данной фигуре пунктирными линиями.
Как показано на фиг.6, можно применить один параллельный входной световой пучок L1 с диаметром, охватывающим все площадки обнаружения на дне лунки. В качестве приемника можно применить несколько фотодиодов, ориентированных на каждую отдельную площадку обнаружения. В альтернативном варианте можно применить ПЗС-ИС или КМОП-ИС (не показанную), например, такую, которая применяется в цифровой камере, чтобы визуализировать характеристику интенсивности в отраженном свете по всему дну лунки, включая все площадки обнаружения. При использовании соответствующей обработки сигналов, можно получить все сигналы, как с помощью отдельных приемников, но без необходимости предварительной юстировки.
На фиг.7 показан дополнительный вариант осуществления, в котором дно 511 лунки содержит открытую полость 515, центр которой находится за пределами оптического пути входного(ых) светового(ых) пучка(ов) L1 и выходного(ых) светового(ых) пучка(ов) L2. Данное решение обеспечивает следующие преимущества:
- (T-образный) ферритовый сердечник 542 магнитной катушки 541 для повышения напряженности и концентрации поля можно установить вплотную к поверхности 512 связывания, что обеспечивает компактную конструкцию со сниженным потреблением мощности.
- Создается самосовмещающаяся конструкция: если оптические элементы и генератор 541 магнитного поля жестко связаны, то происходит автоматическое совмещение лунки на ферритовом сердечнике 542.
Магнитные гранулы 1, которые применяются в описанных вариантах осуществления изобретения, обычно представляют собой полистирольные сферы, наполненные мелкими магнитными крупинками (например, оксида железа). Подобная структура придает гранулам суперпарамагнитные свойства. Показатель преломления полистирола точно согласуется с показателем преломления типичного материала подложки планшетов с лунками. При этом улучшаются оптические характеристики вывода света.
Экспериментальные результаты A
Ниже приведено описание некоторых экспериментальных результатов, которые получены в схеме устройства с планшетом с лунками такого типа, который показан на фиг.3. Применялись стандартные 96-луночные полистирольные титровальные планшеты с плоским дном (6 мм в диаметре, с толщиной дна около 1 мм). Для создания полусферического дна, к дну присоединяли стеклянные линзы с использованием иммерсионного масла, согласованного по показателю преломления (n=1,55). Стеклянные линзы полировали от полусферической формы (с диаметром 6 мм) до толщины 2 мм. Модельным образцом для анализа, выбранным для серии экспериментов, является допускающее злоупотребление лекарство в слюне. Допускающие злоупотребления лекарства обычно представлены некрупными молекулами, которые имеют только один эпитоп и, по данной причине, не могут быть обнаружены сэндвич-анализом. Способом обнаружения упомянутых молекул является сравнительный или ингибиторный анализ. Общеизвестная схема устройства для сравнительного анализа предусматривает сопряжение представляющих интерес целевых молекул на поверхности и связывание антител с метками для обнаружения (например, ферментом, флуорофором или магнитной частицей). Данная система применялась для выполнения сравнительного анализа между целевыми молекулами из пробы и целевыми молекулами на поверхности, с использованием меченых антител. Метка в данных экспериментах представляла собой магнитную частицу. При активации, под лунку устанавливали постоянный магнит путем его механического перемещения. Расстояние между дном лунки и магнитом составляло около 2 мм. Постоянный магнит в лунке применяли для промывки магнитным полем.
На фиг.8 показан нормированный измеренный сигнал s в зависимости от времени t для первого испытания на чувствительность. Для данного испытания дно лунки подготовили для обнаружения целевых молекул. Целевым объектом исследования был морфин. Молекула морфина является небольшой, всего с одним эпитопом, поэтому для выявления концентрации морфина в пробе требуется выполнять сравнительный анализ. Прозрачную поверхность полистирола (96-луночного титровального планшета) покрывали на 2 часа системой BSA-морфин (бычий сывороточный альбумин - морфин) с концентрациями в диапазоне от 1 пг/мл до 1 мкг/мл. Затем функционализированные суперпарамагнитные наночастицы «MP» (300-нм карбоксилсодержащие гранулы фирмы Adem (Carboxyl-Adembeads), функционализированные моноклональными антиморфиновыми антителами), растворенные в системе PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) + 10 мг/мл BSA + 0,65 % раствор Tween-20, вводили в лунки (при разведении MP в отношении 1:20, общее количество раствора составляло 50 мкл). MP притягивали к поверхности попеременным приложением магнитных сил (порядка 10 фН), как показано символом A на фиг.8. В конце, несвязанные частицы удаляли с поверхности выполнением этапа промывки, обозначенного символом W на фиг.8. На фигуре показано, что самая низкая концентрация BSA-морфина (10 пг/мл) дает наибольший динамический диапазон измерений. Кроме того, максимальной является также крутизна кривой после активации, что позволяет повысить быстродействие/сократить время измерения и получить максимальную чувствительность.
Для проверки чувствительности анализа, проводили испытание способности свободного морфина конкурировать за связывание функционализированными MP с поверхностью. На фиг.9 показан результирующий нормированный сигнал s, принятый приемником в зависимости от времени t. Прозрачную поверхность полистирола (96-луночного титровального планшета) покрывали на 2 часа системой BSA-морфин с концентрацией 10 пг/мл. MP, функционализированные антиморфиновыми антителами, предварительно смешанными с заданным количеством свободного морфина, растворенного в системе PBS+10 мг/мл BSA+0,65% раствор Tween-20, вводили в лунки (при разведении MP в отношении 1:20, общее количество раствора составляло 40 мкл). Как изложено выше и показано на фигуре, MP активировали четыре раза в моменты времени t=30 с, t=140 с, t=210 с, t=290 с в течение 15 с (смотри символ A). С момента времени t=390 с, несвязанные MP удаляли из лунки методом промывки W магнитным полем, т.е. несвязанные MP удаляют приложением магнитной силы с помощью постоянного магнита в текучей среде над поверхностью связывания.
Как можно видеть на фигуре, при представляющих интерес концентрациях свободного морфина, ослабление сигнала (после промывки W магнитным полем) невелико, а при низкой концентрации свободного морфина, ослабление сигнала значительно (высокая концентрация MP на поверхности приводит к очевидному ослаблению сигнала после промывки W магнитным полем).
Ослабление сигнала во время активации и магнитной релаксации, обнаруженное во время описанных экспериментов, в сочетании с информацией, ранее полученной из микроскопических исследований, предлагает следующую интерпретацию результатов: При магнитной активации, MP концентрируются у поверхности, но не проявляют усиленного связывания с поверхностью (отсутствие ослабления сигнала). После снятия магнитного поля, сигнал снижается, что указывает на связывание MP с поверхностью. Затем приложение магнитного поля вызывает образование столбиков: MP намагничиваются, и те из них, которые могут свободно перемещаться (специфически связанные MP и свободные MP в растворе) будут прикрепляться к специфически связанным MP в направлении линий магнитного поля, которые перпендикулярны к поверхности связывания. Данное состояние показано на фиг.10, на которой также показано поле EF исчезающей магнитной волны. Поскольку система обнаружения в исчезающей волне будет обнаруживать MP только на поверхности, то образование столбиков во время магнитной активации будет иметь следствием ослабление изменения сигнала. После снятия магнитного поля, MP будут терять свои магнитные свойства и снова опускаться на поверхность, на которой сможет происходить связывание.
Для ускорения анализа схему активации можно оптимизировать с использованием вышеописанных результатов. На фиг.11 показана кривая зависимости доза-реакция, при полистирольных лунках с покрытием системой BSA-морфин с концентрацией 10 пг/мл. MP, функционализированные антиморфиновыми антителами, предварительно смешанными с заданным количеством свободного морфина, растворенного в системе PBS+10 мг/мл BSA+0,65% раствор Tween-20, вводили в лунки (при разведении MP в отношении 1:20, общее количество раствора составляло 40 мкл, окончательные концентрации морфина были от 1 до 1000 нг/мл). MP активировали в течение 15-секундного периода, обозначенного A, с помощью постоянного магнита под лункой для повышения концентрации MP вблизи поверхности. Затем, предоставляли 60 секунд времени для связывания MP с поверхностью. Данные демонстрируют, что уже через 20 секунд скорость связывания магнитных частиц с поверхностью является непосредственным показателем концентрации свободного морфина в растворе. Это означает, что процедуру измерения можно упростить и ускорить, поскольку этап промывки не требуется. Для ускорения процедуры требуется этап A повышения концентрации магнитным полем.
Затем проверяли сигнал фона от слюны. Фильтрованную слюну вводили в лунку, и сигнал отслеживали в течение 120 секунд. Как можно видеть на фиг.12, фон является незначительным. Для сравнения показан также сигнал от MP в системе PBS+10 мг/мл BSA+0,65% раствор Tween-20, смешанной с 0,1-нг/мл раствором морфина. В момент t=13 с вводили как слюну (SL), так и раствор морфина+MP. Как можно видеть, сигнал фона от слюны <1%, и им можно пренебречь.
Экспериментальные результаты B
Для проверки чувствительности способа обнаружения выполнили двухступенчатый анализ PTH (PTH=паратиреоидный гормон) на описанных планшетах с лунками на оптической подложке. На фиг.13 представлены графики зависимости переходных сигналов s (в произвольных единицах) от времени t как для контрольной (0 нМ, верхняя кривая), так и для относительно высокой (4 нМ) концентраций. Наблюдается отчетливое различие кинетических режимов связывания, и также остается отчетливое различие сигналов после промывки W.
Для сравнения магнитного считывания (с помощью датчиков супермагниторезистивного типа (GMR-датчиков), которые описаны, например, в заявках WO 2005/010543 A1 или WO 2005/010542 A2) с оптическим считыванием (с использованием вышеописанного принципа нарушенного полного внутреннего отражения), на фиг.14 представлена кривая зависимости доза-реакция для PTH.
Соответствующие переходные кривые для анализа PTH с оптическим обнаружением представлены на фиг.15. Кривая доза-реакция, показанная на фиг.14, измеряется в буферной матрице. Кривая отражает оптический сигнал s в процентах от сигнала, вызываемого отражением от пустой подложки. Интересно отметить, что кривая линейна в двойном логарифмическом масштабе (аналогично кривой для магнитного обнаружения). Кроме того, пределы обнаружения можно вычислить из выражения «контрольное значение+2×стандартное отклонение контрольного значения» (при этом «контрольное значение» означает уровень сигнала, при тестировании пробы с нулевой концентрацией целевого объекта).
При магнитном считывании данное значение равно 3 пМ. В оптическом эксперименте, который выполнялся экспериментальным устройством с, по существу, базовой схемой, данное значение равнялось 13 пМ. Можно сделать вывод, что оба метода обнаружения, по-видимому, имеют одинаковую чувствительность.
Затем важно проверить сигнал фона для оптического способа обнаружения, при измерении в комплексных матрицах. По этой причине такой же анализ PTH выполнили в матрице крови. Из результатов, показанных на фиг.16 (Bld.=кровь, Buf.=буфер), с очевидностью следует, что результирующая кривая доза-реакция очень точно соответствует кривой, которая измерена в буфере. Кроме того, сигнал от контрольной пробы является очень слабым. Данное полезное свойство можно объяснить тем, что полное внутреннее отражение обусловлено разностью между показателями преломления материала оптической подложки и матрицы. Матрица может состоять из разных компонентов, например, плазмы, (красных кровяных клеток) эритроцитов и т.п. Однако все данные компоненты имеют значительно меньший показатель преломления, чем материал подложки. Поэтому полное внутреннее отражение не испытывает влияние матрицы. Только когда гранулы (например, из полистирола с магнитными крупинками) связаны, полное внутреннее отражение нарушается, и можно измерить ослабление интенсивности в отраженном свете.
Экспериментальные результаты C
2
Важным свидетельством в пользу предложенной технологии является, так называемая, кривая зависимости гранула-реакция. Упомянутая кривая дает представление об изменении сигнала из расчета на одну гранулу, присоединенную к поверхности датчика. В идеальном случае возможно обнаружение единственной гранулы (в присутствии шума, искажений). В данных обстоятельствах, дополнительного совершенствования технологии не требуется. В таком случае возможно лишь снижение предела биологического обнаружения с помощью таких способов, как повышение концентрации гранул (при анализе с улавливанием) и т.п. На фиг.17 показана кривая зависимости гранула-реакция в случае обнаружения датчиком GMR-типа и с использованием 300-нм гранул (Δs=изменение сигнала; BD=плотность гранул; NB=число гранул). С данными гранулами, предел обнаружения составлял 3 гранулы на 40 мкм, при частоте взятия замеров 1 Гц.
Для оценки зависимости гранула-реакция при оптическом обнаружении приготовили ряд проб (предметных стекол) с различными концентрациями гранул. Получаемую степень покрытия поверхности определяли с использованием оптического микроскопа, с последующим измерением (изменения) оптического сигнала s по сравнению с чистой контрольной пробой без гранул. Экспериментальные данные, полученные с использованием простой схемы устройства графически представлены на фиг.18. В данной схеме устройства уровень шума соответствует изменению сигнала при степени покрытия поверхности SC, равной 0,01%. Представленные данные показывают, что чувствительность данного метода, по меньшей мере, аналогична результатам для известного уровня техники, при использовании GMR-датчиков и при одинаковых концентрациях гранул.
В общих словах, изобретение относится к микроэлектронному сенсорному устройству для обнаружения целевых компонентов, которые содержат частицы-метки, например, магнитные частицы 1. Сенсорное устройство содержит носитель 11 с поверхностью 12 связывания, на которой целевые компоненты могут собираться и, по желанию, связываться со специфическими захватывающими элементами. Входной световой пучок L1 пропускается в носитель и претерпевает полное внутреннее отражение на поверхности 12 связывания. Затем количество света в выходном световом пучке L2 обнаруживается светоприемником 31. Свет исчезающей волны, созданной в процессе полного внутреннего отражения, взаимодействует с частицами-метками 1, связанными с целевыми частицами на поверхности 12 связывания, что ведет к его поглощению и/или рассеянию и, поэтому появлению потерь в выходном световом пучке L2. Данное явление можно использовать для определения количества целевых компонентов на поверхности 12 связывания по количеству света в выходном световом пучке L2, L2a, L2b. По желанию, применяют генератор 41 магнитного поля, чтобы создавать на поверхности 12 связывания магнитное поле B, с помощью которого можно манипулировать магнитными частицами 1, например, притягивать или отталкивать их.
Частицы-метки 1 являются, например, магнитными гранулами, под которыми понимают магнитные частицы MP, например, парамагнитные, ферромагнитные или суперпарамагнитные частицы или гранулы. Данные частицы-метки 1 находятся в области отражения светового пучка L1, падающего на поверхность 12 связывания носителя. Чем больше частиц-меток 1 связано с поверхностью 12 связывания, тем большая часть светового пучка L1 не будет претерпевать полного внутреннего отражения на поверхности 12 связывания, но исчезающая волна будет создаваться. Световой пучок L2, отраженный поверхностью 12 связывания называется нарушенным вследствие рассеяния приходящего светового пучка L1 частицами-метками 1. Чем больше частиц-меток 1 связано с поверхностью 12 связывания, тем большая часть отраженного светового пучка L2 будет нарушена. Светоприемник 31, 131 измеряет световой пучок L2, приходящий от поверхности 12 связывания и использует отраженный световой пучок L2 для измерения количества частиц-меток 1, связанных с поверхностью 12 связывания. Чем больше частиц-меток 1 связано с поверхностью 12 связывания, тем большее рассеяние светового пучка L1 имеет место под действием частиц-меток 1, при создании исчезающей волны. Частицы-метки 1, вызывающие описанные эффект, обладают, например, следующими особенностями. Магнитные гранулы с шириной приблизительно 300 нм однородных суперпарамагнитных частиц, содержащих полимерную оболочечную структуру на сердцевине. Данные частицы-метки 1 или магнитные гранулы вызывают такое рассеяние светового пучка L1, которое достаточно для обнаружения в отраженном световом пучке L2 при определении частиц-меток 1. Пригодны также частицы-метки 1 из сходных материалов и с похожими значениями ширины, например, частицы-метки 1 шириной 200 нм. Тем не менее, установлено, что рассеяние света только на целевых компонентах, с которыми связываются частицы-метки 1, не подходит для обнаружения. Это означает отсутствие возможности непосредственного измерения целевых компонентов по нарушенному внутреннему отражению для измерения количества данных целевых компонентов. Возможность обнаружения и последующего вычисления количества целевых частицей 1 обеспечивается рассеянием света на частицах-метках 1. Благодаря этому не требуется обнаруживать флуоресценцию флуоресцентного материала, как обычно принято в соответствии с известным уровнем техники с помощью других оптических систем для обнаружения. Кроме того, в этом контексте следует дополнительно подчеркнуть, что обнаружение флуоресцентного света, излучаемого целевыми компонентами, является дополнительной возможностью, которую можно сочетать с описанными способом и сенсорным устройством.
Выше изобретение описано на примере конкретных вариантов осуществления, однако, возможны различные модификации и расширения, например:
- В дополнение к молекулярным анализам, с помощью сенсорных устройств в соответствии с изобретением можно также обнаруживать более крупные составляющие, например, клетки, вирусы или фракции клеток или вирусов, тканевые экстракты и т.п.
- Обнаружение может иметь место со сканированием или без сканирования чувствительного элемента относительно чувствительной поверхности.
- Данные измерений можно получать в виде результата измерения в конце процесса, а также записью сигналов в динамике или попеременно.
- Частицы, выполняющие функцию меток, можно обнаруживать непосредственно с использованием способа измерения. Частицы можно также дополнительно обрабатывать до обнаружения. Например, дополнительная обработка состоит в том, что добавляют материалы или модифицируют (био)химические или физические свойства метки, чтобы облегчить обнаружение.
- Устройство и способ можно применять вместе с биохимическими анализами нескольких типов, например, анализом связывания/освобождения, сэндвич-анализом, сравнительным анализом, анализом смещения, ферментным анализом и т.п. Данный подход особенно подходит для обнаружения ДНК, так как создает удобную возможность массового мультиплексирования, и на оптическую подложку можно точечно наносить разные олиговещества методом струйной печати.
- Устройство и способ пригодны для мультиплексирования датчиков (т.е. параллельного применения разных датчиков и чувствительных поверхностей), мультиплексирования меток (т.е. параллельного применения меток разных типов) и мультиплексирования камер (т.е. параллельного применения разных реакционных камер).
- Устройство и способ можно использовать в качестве быстродействующих, надежных и удобных для применения точечно зондирующих биодатчиков для небольших объемов пробы. Реакционная камера может быть одноразовым изделием, подлежащим использованию с компактным устройством считывания, содержащим одно или более средств создания поля и одно или более средств обнаружения. Кроме того, устройство, способы и системы в соответствии с настоящим изобретением можно применять для автоматизированных высокопроизводительных анализов. При этом реакционная камера представляет собой, например, планшет с лунками или кювету, вставляемые в автоматизированный прибор.
И, наконец, следует указать, что в настоящей заявке термин «содержащий» не исключает другие элементы или этапы, что применение единственного числа не исключает множественного числа, и что единственный процессор или другой блок может выполнять функции нескольких средств. Изобретение состоит в каждом новом отличительном признаке и каждой комбинации отличительных признаков. Кроме того, позиции в формуле изобретения нельзя интерпретировать в смысле ограничения объема ее притязаний.