Способ выявления в биологическом материале ДНК вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной ПЦР
METHOD FOR HEPATITIS B VIRUS DNA IDENTIFICATION IN BIOLOGICAL MATERIAL WITH LOW VIRAL LOAD BASED ON TWO-STAGE PCR

Изобретение относится к медицине, в частности к проблеме изучения инфекционных вирусных заболеваний, и касается поиска новых направлений в специфической диагностике хронического вирусного гепатита В.
Клинические проявления хронического вирусного гепатита В многообразны и зависят, в основном, от биологических свойств вируса и его взаимодействия с иммунной системой хозяина. Вирус гепатита В характеризуется высокой степенью генетической гетерогенности в связи с использованием обратной транскриптазы в процессе репликации вируса. Определение генотипов и субтипов вируса гепатита В важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, а также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии. Одной из форм естественного течения хронического вирусного гепатита В является оккультный гепатит В, характеризующийся сохранением ДНК вируса гепатита B в печени и, в значительно более низкой, часто не идентифицируемой, концентрации в периферической крови пациентов с негативным HBsAg. Более 20% больных серонегативны по всем маркерам вируса гепатита В [Torbenson М., Thomas D.L. Occult hepatitis В // Lancet Infect. Dis. 2002. vol. 2. P. 479-486]. При этом оккультный ВГВ может играть существенную роль в развитии фиброза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170].
Глубокое типирование, позволяющее выявлять субтипы вируса, важно для лучшего понимания эпидемиологических и вирусологических особенностей заболевания, что обретает большую значимость в связи с общемировой тенденцией к смещению за счет миграционной активности распространенности тех или иных генотипов и субтипов ВГВ в различных регионах и выявлению редких субтипов в нехарактерных для них географических ареалах [Raimondo G., Pollicino Т., Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection // J. Hepatol. 2007. vol. 46. P. 160-170]. Глубокое типирование также предоставляет дополнительную информацию для принятия решения о выборе тактики противовирусной терапии, так как, например, для ВГВ субтипа D1 показана высокая частота мутаций в промоторе гена Core, ассоциированных с развитием гепатоцеллюлярной карциномы, а также значительно более высокая, чем при ВГВ субтипа D2, частота двойной мутации, приводящей к уменьшению или предотвращению синтеза HBeAg, в то время как субтип А2 редко ассоциируется с HBeAg(-) заболеванием или раком печени [Bissinger A.L., Fehrle С, Werner C.R., Lauer U.M., Malek N.P., Berg CP. Epidemiology and Genotyping of Patients with Chronic Hepatitis B: Genotype Shifting Observed in Patients from Central Europe // Pol J Microbiol. - 2015 - 64(1): 15-21; Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871).
Субтипы Al, С, B2-B5 и H связаны с более серьезными осложнениями, чем субтипы А2, В1 и В6 [Khan, A. Novel point mutations and mutational complexes in the enhancer II, core promoter and precore regions of hepatitis В virus genotype D1 associated with hepatocellular carcinoma in Saudi Arabia / Khan A., Al Balwi M.A., Tanaka Y., Hajeer A., Sanai P.M., Al Abdulkarim I., Al Ayyar L., Badri M., Saudi D., Tamimi W., Mizokami M., Al Knawy B. // Int. J. Cancer. - 2013. - vol. 133 (12). P. 2864-2871].
В то время как прямое секвенирование нуклеотидной последовательности является золотым стандартом для классификации генотипов и субгенотипов вируса гепатита В [Banerjee, P.A Rare HBV Subgenotype D4 with Unique Genomic Signatures Identified in North-Eastem India - An Emerging Clinical Challenge? / Banerjee P., Mondal R.K., Nandi M., Ghosh S., Khatun M., Chakraborty N., Bhattacharya S., RoyChoudhury A., Banerjee S., Santra A., Sil S., Chowdhury A., Bhaumik P., Datta S. // PLoS One. -2014. - vol. 9 (10). e109425], используемые для выявления вируса гепатита В методики на основе технологии ПЦР недостаточно чувствительны для выявления вируса гепатита В низких концентраций при малых объемах клинического материала и/или основаны на выявлении коротких консервативных фрагментов нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять глубокое типирование вируса.
Известен метод выявления ВГВ, основанный на полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, представленный в коммерческом наборе "АмплиСенс HBV-FL" (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови совместно с ВКО и проведении амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «по конечной точке» (формат FEP) или в режиме «реального времени» (формат FRT). Данный метод позволяет выявить вирус при низких концентрациях, до 5 МЕ/мл. Однако для обнаружения вируса столь низких концентраций необходимо соблюдение двух условий экстракции ДНК: обязателен большой объем образца (1000 мл плазмы крови) и специализированный набор для выделения ДНК, использующийся вкупе с автоматической станцией для экстракции нуклеиновых кислот.
При использовании более доступных и широко распространенных методов экстракции ДНК, включая коммерческие наборы для выделения НК «АмплиПрайм Рибо-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва), с объемом экстракции 100 мкл, предел аналитической чувствительности составляет 200 МЕ/мл и 100 МЕ/мл для форматов FEP и FRT соответственно. Полученные в ходе амплификации фрагменты невозможно использовать для секвенирования и дальнейшего глубокого типирования вируса в связи с их небольшой протяженностью.
Известен также набор реагентов для выявления и дифференциации генотипов А, В, С и D вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс HBV-генотип-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Принцип тестирования основывается на экстракции ДНК из плазмы крови и амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием олигонуклеотидов, высокоспецифичных к коротким консервативным участкам ВГВ генотипов А, В, С и D. К недостаткам метода относится низкая аналитическая чувствительность - 500 МЕ/мл и, как и при первом решении, невозможность дальнейшего секвенирования фрагментов для глубокого типирования вируса. Таким образом, данный метод не позволяет обнаружить иные генотипы, выявить субтипы вируса и не может быть использован при низкой вирусной нагрузке.
Известен также набор реагентов для выявления мутаций устойчивости ВГВ к противовирусным препаратам в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием продуктов амплификации «АмплиСенс HBV-Resist-Seq» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Использование двухэтапной ПЦР позволяет увеличить чувствительность метода для получения достаточных для анализа протяженных фрагментов генома вируса. Тем не менее, порог чувствительности относится к недостаткам метода, так как составляет 150 МЕ/мл. Кроме того, метод предназначен для секвенирования фрагмента ревертазного (RT) домена P-гена ВГВ размером 970 п.н., не позволяющего определить субтип вируса.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе зарубежных коллег, посвященной передаче ВГВ от матери ребенку [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В vims genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. Метод заключается в гнездовой ПЦР с последовательным использованием двух пар праймеров: на первом этапе прямой праймер 5'-ACATACTCTTTGGAAGGCKG-3' и обратный праймер 5'-CGTCAGCAAACACTTGGC-3', на втором этапе прямой праймер 5'-GCCTCATTTTGYGGGTCA-3' и обратный праймер 5'-AGCAAARCCCAAAAGACC-3'. При этом ПЦР для каждого раунда проводили в конечном объеме 50 мкл с 2,25 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 1 мкМ каждого праймера, 1X ПЦР-буфера II, 1 ед. полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom), ДНК-матрицы 10 мкл. при следующих условиях: тридцать пять циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 48°С в течение 30 секунд и элонгацию при 72°С в течение 30 секунд. Чувствительность предложенного метода достигала 10 МЕ/мл. Недостаток метода заключается в необходимости большого объема плазмы крови для экстракции ДНК (500 мкл), а также в невозможности убедиться в полноценности генома вируса за счет секвенирования как минимум двух из четырех участков генома ВГВ, как это было рекомендовано на совещании по оккультному ВГВ [Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis В virus infection. // Journal of Hepatology. - 2008. - vol. 49. №4. - Р. 652-657].
1. Авторами предложен метод выявления вируса гепатита В методом «гнездовой» ПЦР с использованием на втором этапе нескольких пар праймеров, фланкирующих четыре региона генома вируса. В том числе фрагменты, включающие рекомендованный для гено- и субтипирования ВГВ регион Pre-S1/Pre-S2/S область 2848-3182…1-835 нт., core регион область 1901-2452 нт., регион X область 1374-1838 нт., регион pol область 247-1280 нт., согласно представленному в международной базе данных GenBank изоляту Mart-B47 (НЕ974377.1) [Brichler S., Lagathu G., Chekaraou M.A. et al. African, Amerindian and European hepatitis В virus strains circulate on the Caribbean Island of Martinique // J. Gen. Virol. 2013. vol. 94 (Pt 10). P. 2318-2329].
Технический результат - повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать изоляты вируса гепатита В с высокой идентичностью нуклеотидных последовательностей.
Сущность метода заключается в том, что на первом этапе проводится амплификация ДНК методом асимметричной полимеразной цепной реакции с использованием протяженных олигонуклеотидных праймеров с разной температурой плавления, комплементарных области наибольшего сходства геномов различных изолятов вируса гепатита В. Для повышения чувствительности проводится вторая полимеразная цепная реакция с использованием продукта амплификации первой реакции и внутренних (вложенных, гнездовых) праймеров, некоторые из которых были предложены на совещании по оккультному вирусному гепатиту В [Candotti D., Danso K., Allain J-P. Matemofetal transmission of hepatitis В virus genotype E in Ghana, west Africa // J. Gen. Virol. - 2007. - vol. 88. - P. 2686-2695, doi: 10.1099/vir.0.83102-0]. При этом состав реакционного буфера изменяется на разных этапах.
На первом этапе используются протяженные олигонуклеотидные праймеры:
Прямой праймер 5'-CTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3'
Обратный праймер 5'-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCTA-3'
Состав амплификационной смеси на первом этапе:
2
3 пмоль/л прямого праймера, 30 пмоль/л обратного праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 7,5 ммоль/л MgCl, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), формамид 4% от конечного объема, глицерин 6% от конечного объема, 10 мкл раствора ДНК, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.
ПЦР проводят при следующих условиях:
после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 68°C - 5 мин; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.
На втором этапе используют одну из пар праймеров:
Пара 1:
Прямой праймер 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3'
Обратный праймер 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3'
Пара 2:
Прямой праймер 5'-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3'
Обратный праймер 5'-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3'
Пара 3:
Прямой праймер 5'-CCATACTGCGGAACTCCTAGC-3'
Обратный праймер 5'-CCCAAGGCACAGCTTGGAGG-3'
Пара 4:
Прямой праймер 5'-TCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'
Обратный праймер 5'-AGTTCCGCAGTATGGATCGG-3'
Состав амплификационной смеси на втором этапе:
2
15 пмоль/л каждого праймера, по 0,7 ммоль/л аденин- и тиминнуклеозидтрифосфата, по 1 ммоль/л гуанин- и цитозиннуклеозидтрифосфата, 6,7 ммоль/л MgCl, 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq ДНК-полимеразы (750 ммоль/л Трис-HCl, (рН 8,8), 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) твин 20), DMSO 10% от конечного объема, формамид 4% от конечного объема, 10 мкл продукта амплификации первого этапа, вода без нуклеаз до конечного объема 30 мкл.
ПЦР проводят при следующих условиях:
после денатурации при 95°C в течение 5 минут устанавливали 35 циклов амплификации в режиме: 95°C - 30 сек, 52°C - 30 сек, 72°C - 1 мин 30 сек; затем финальная элонгация при 72°C - 5 мин.
2
Таким образом, предложенный метод отличается от прототипа тем, что на первом этапе используется асимметричная ПЦР с протяженными праймерами (прямой праймер 5'-ctgcgcaccagcaccatgcaactttttcacctctgc-3', обратный праймер 5'-cagaccaatttatgcctacagcctccta-3'), на втором этапе используются праймеры к одному из четырех регионов геном ВГВ, при этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе неравномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов и высокая концентрация MgCl, на первом этапе в смеси присутствуют формамид и глицерин в количестве 4% и 6% от конечного объема соответственно, а на втором этапе формамид и DMSO в количестве 4% и 10% от конечного объема соответственно.
Аналитическую чувствительность метода проверяли методом поэтапного разведения.
Были выбраны 10 образцов плазмы крови, содержащие различные концентрации ВГВ. Вирусную нагрузку предварительно измеряли с помощью стандартизированного набора для количественного определения ДНК ВГВ в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». «АмплиСенс НВУ-Монитор-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва).
Каждый образец поэтапно разводили предварительно проанализированной плазмой крови без ВГВ (чистой плазмой) следующим образом. Аликвоту образца объемом 100 мкл вносили в микропробирку Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 100 мкл чистой плазмы, тщательно пипетировали и переносили 100 мкл полученного пула в новую микропробирку, куда снова добавляли 100 мкл чистой плазмы, пипетировали и 100 мкл нового пула переносили в третью пробирку и т.д. до десятикратного последовательного разведения (таб. 1).
После разведения осуществляли экстракцию ДНК из каждого пула разведения каждого образца с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва). Полученные образцы ДНК амплифицировали, согласно предложенному методу. Результаты выявления вируса в пулах разведения представлены в таблице 2.
3
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен электрофорез продуктов амплификации второго этапа (праймеры 5'-GGTCACCATATTCTTGGGAA-3', 5'-AATGGCACTAGTAAACTGAG-3') последовательных разведений образца №9, вирусная нагрузка 5*10 МЕ/мл. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) виден очень слабо. На фиг. 2 представлен Черно-белый негатив фотографии 1. Продукт амплификации последнего разведения (предположительно около 9,7 МЕ/мл) обозначен овалом.
Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода.
Пример 1
Больные с различной степенью выраженности фиброза печени и циррозом: 11 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, 5 пациентов с гепатитом неясной этиологии. Все пациенты серонегативны к вирусу гепатита В. При использовании стандартных наборов ДНК вируса гепатита В не была выявлена в плазме крови. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови была выявлена у 6 пациентов с ХВГС и у всех пациентов с криптогенным гепатитом. Полученные результаты были подтверждены при получении биопсийного материала печени.
Пример 2
Больная с клинической картиной острого гепатита, начавшейся после пребывания в стационаре по причине, не связанной с заболеваниями печени. Высказаны подозрения об инфицировании пациентки в клинике. ДНК вируса гепатита В стандартными методами не выявлен. При использовании нашего метода ДНК вируса гепатита В в плазме крови выявлен, осуществлено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S, проведен филогенетический анализ для сравнения с вирусом гепатита В, выявленным у пациентов стационара (предположительный источник инфекции). Показаны значимые отличия изолятов. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В на фоне иммуносупресси.
Пример 3
Больной из Центральной Африки спустя несколько месяцев после пребывания в РФ поступил в госпиталь с симптомами острого гепатита в тяжелой форме. При использовании стандартных методов был выявлен вирус гепатита В, генотипировать вирус не удалось. При использовании нашего метода в плазме крови больного были выявлены и типированы два изолята вируса гепатита В: субтипа D2 и субтипа А1, не характерного для РФ. Предположительно невозможность типирования стандартным методом с использованием коммерческого набора объясняется множественными мутациями вируса. Высказано предположение об активации репликации оккультного вируса гепатита В субтипа А1 на фоне подавления иммунитета при инфицировании вирусом гепатита В субтипа D2.
Пример 4
Представлены 155 клинических образцов из Республики Гвинея, в том числе 130 образцов сыворотки крови в объеме, не превышающем 80 мкл, а также 25 клинических образцов посмертных ротоглоточных соскобов. ДНК Вируса гепатита В не удалось выявить при использовании стандартных методов. При использовании предлагаемого нами способа выявлена ДНК вируса гепатита В в 19 образцах, полученных из сыворотки крови, а также в 13 образцах, полученных из ротоглоточных соскобов, при этом ДНК вируса гепатита В выявлена как в HBsAg (+) образцах, так и в HBsAg (-) образцах. Проведено секвенирование региона Pre-S1/Pre-S2/S. Представлены субтипы ВГВ: А2, A3, D1, D2, D3, Е. Таким образом, подтверждается возможность использования предлагаемого способа для выявления в малых объемах клинических образцов вируса гепатита В разных генотипов и субтипов, включая генотипы и субтипы не характерные для РФ.
Также в течение 2015-2016 года было проведено более 800 исследований предложенным методом на основе технологии ПЦР. Выявлен высокий процент встречаемости оккультного гепатита В среди доноров в географических регионах с высокой распространенностью вирусных гепатитов. Показана широкая распространенность оккультного вируса гепатита В у ВИЧ-инфицированных пациентов.