Разработка живой коревой вакцины с повышенной иммуногенностью

КОРЬ | ИММУНИТЕТ | ИССЛЕДОВАНИЕ

Разработка живой коревой вакцины с повышенной иммуногенностью

Нечаева Е.А., СенькинаТ.Ю., Жилина Н.В., Нечаев Ю.С., Думченко Н.Б., Свириденко Т.М.

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация

Нечаева Елена Августовна - e-mail: nechaeva@vector.nsc.ru

Представлены результаты исследования по изучению иммуностимулирующей активности различных препаратов при совместном применении с живой коревой вакциной. Обосновано введение в состав вакцины иммуномодулятора, позволяющего усилить иммунный ответ к вирусу кори без увеличения дозы вируса, значительно снизить иммуно-супрессивные реакции, вызываемые вирусом кори, и использовать его для вакцинации детей со сниженным иммунным статусом.

Ключевые слова: вакцина, иммунитет, вирус кори, профилактика, исследование.

The results of studies on the immunostimulatory activity of various drugs when combined with live measles vaccine. Justified the introduction of the vaccine immunomodulator of strengthening the immune response to measles virus without increasing the dose of the virus, significantly reduce the immunosuppressive reactions caused by the measles virus, and use it for the vaccination of children with reduced immune status.

Keywords: vaccine, immunity, measles virus, prevention, research.

В течение последнего десятилетия в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» проводятся исследования по созданию усовершенствованной формы живой коревой вакцины для муко-зального применения. Известно, что вирус кори обладает иммуносупрессирующим действием и введение его в высокой дозе может привести к патологическим реакциям и повышенной летальности [1]. Поэтому во всем мире существуют ограничения на дозу вводимого в состав живой коревой вакцины вируса кори. Однако снижение дозы вируса в вакцине снижает ее иммуногенность. В то же время показано, что цитокины улучшают представление антигена, позволяют обходить дефекты иммунологической памяти [2, 3] и позволяют повысить иммуногенность вакцин; полисахариды различного происхождения, а также полимеры и полимерные комплексы [4, 5] усиливают иммунный ответ.

В связи с вышеизложенным представляется перспективным создание новых форм живой коревой вакцины с включением препаратов, обладающих иммуномодули-рующими свойствами (таких, как ИСКОМ, микросферы, цитокины и др.).

ЦЕЛЬРАБОТЫ

Создание композиций новой формы живой коревой вакцины, обладающей повышенной иммуногенностью в сравнении с коммерческим препаратом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штамм Ленинград-16 вируса кори из посевного банка вируса, аттестованного в ГИСК им. Л .А. Тарасевича. Субстратом для культивирования вируса служила культура фибробластов эмбрионов японских перепелов, полученных из безлейкозного хозяйства. Живую коревую вакцину получали по коммерческой технологии [6]. Специфическую активность вирус-содержащего материала определяли по цитопатическому действию на культуру клеток Vero [7]. В экспериментах использовали живую коревую вакцину для парентерального применения в дозе 2000 ТЦЦбо вируса кори.

В качестве препаратов, модулирующих иммунный ответ, использовали рекомбинантный альфа-2-интерфе-рон («Реаферон» производства ЗАО «Вектор-Медика», Россия) в концентрации 104-106 МЕ, фактор некроза опухоли альфа (ФНОф) в концентрации 102-104 МЕ, фактор

vwvw.mia-med.ru

№2 (2) декабрь 2014 53

КОРЬ | ИММУНИТЕТ | ИССЛЕДОВАНИЕ

cfmrn)

С/ XjMm^f

некроза опухоли альфа (ФНО) в концентрации 102-104 ME (производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), отечественный иммуномодулятор полиоксидоний в концентрации 0,25-10 мг/дозу (производства НИИ иммунологии РАМН, Россия), интерлейкин-2 в концентрации 1,0-5,0 мкг, интерлейкин-5 в концентрации 25,0-50,0 мкг, интерлейкин-6 в концентрации 150,0-300,0 мкг, мурамилдипептид в концентрации 100,0-200,0 мкг и холерный токсин В в концентрации 25,0-100,0 мкг (фирмы «Sigma», США) на дозу вакцины. Для проверки иммуногенности экспериментальных образцов вакцины указанные препараты добавляли к живой коревой вакцине. Для получения микрокапсул использовали сополимеры полиакриловой кислоты (ПАК) с этиловым спиртом (ЗАО «ДЕЛСИ», г. Санкт-Петербург), хитозан, альгинат натрия (фирмы «Pronova», Норвегия), спермин (фирмы «ICN», США). Вируссодержащую жидкость объединяли со стабилизатором и полимерами по разработанному нами способу, смесь разливали в ампулы и подвергали лиофильному высушиванию. Образцы вакцины вводили подкожно морским свинкам, на 28-й день осуществляли забор крови от лабораторных животных, сыворотку крови исследовали в реакции торможения гемагглютинации с 4 АЕтвин-эфирного антигена вируса кори в соответствии [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время в разных странах мира для профилактики кори выпускаются и применяются живые коревые вакцины на основе различных штаммов вируса кори для парентерального применения. Эти вакцины способны индуцировать достаточно устойчивый протективный иммунитет против кори у детей старше 9 месяцев с нормальным иммунным статусом. Однако много детей в развивающихся странах заболевают и умирают от кори в возрасте 5-9 месяцев, т.е. до начала вакцинации традиционными вакцинами. Поэтому для ликвидации кори необходимы новые коревые вакцины, которые позволили бы создать протективный иммунный ответу детей 5-6 месяцев и у детей с пониженным иммунным статусом. Кроме того, необходимы вакцины, которые обладали бы повышенной иммуногеннос-тью при снижении дозы вируса кори в вакцине.

В ГНЦ ВБ «Вектор» проводятся исследования по созданию микрокапсулированной формы живой коревой вакцины для парентерального и интраназального применения. Такой препарат должен представлять собой частицы размером от 1 до 800 мкм, ядро которых содержит вируссодержащую субстанцию и различные наполнители, а оболочка представлена рН-зависимыми полимерами. К настоящему времени подобраны полимеры и полимерные комплексы, перспективные для включения в состав оболочки микрокапсулы, которые не токсичны для вируса кори и организма лабораторных животных. Однако для получения выраженного

иммунного ответа необходимо ввести в состав ядра микрокапсулы иммуномодуляторы, которые позволят достичь высокого иммунного ответа без повышения дозы вводимого вируса.

С целью повышения иммуногенности живой коревой вакцины нами были проведены эксперименты по подбору эффективных отечественных и зарубежных иммуномодуля-торов, которые могут быть включены в состав новой формы вакцины. Из литературы известны иммуномодулирующие свойства таких полимеров, как поливинилпирролидон (ПВП), полиакриловая кислота (ПАК) и ее сополимеры, причем иммуномодулирующий эффект прямо зависит от степени полимеризации и дозы полимеров [4]. Широкое применение при конструировании новых вакцинных препаратов находят цитокины. Интерлейкины 2, 5, 6 усиливают пролиферацию и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, включают биосинтез 1дМ и [2]. Интерфероны оказывают иммуномодулиру-ющее действие на все функции клеток иммунной системы: антителообразование, фагоцитоз, киллерную активность лимфоцитов, антителозависимую цитотоксичность и др.

Положительные результаты получены при одновременном введении интерферона с вакциной против вируса герпеса I типа [3]. Адъюванты также могут узнаваться М-клетками пейеровых бляшек и непосредственно активировать секреторный иммунитет. Действие адъювантов также может вызвать продукцию цитокинов, которые активируют лимфоциты, усиливая продукцию 1д С1, 1д С2, 1д А, 1д Е. Способностью усиливать иммунный ответ обладают полисахариды различного происхождения (сальмозан, хитин и его производные, др.). Широко известный иммуномодулятор мурамилдипептид является копией выделенного в стенке микобактерий соединения, обладающего выраженной способностью модулировать иммунную реактивность. Необходимо отметить, что данные препараты в сочетании с вакцинным штаммом /1-16 вируса кори при парентеральном применении нами были испытаны впервые.

В литературе имеются только данные по использованию мукозального адъюванта холерного токсина В совместно с инактивированным вирусом кори [8] для интраназального применения, что приводило к увеличению титров антител на вводимый вирус кори в 8-10 раз. Результаты изучения имму-ногенных свойств образцов живой коревой вакцины в сочетании с различными иммуномодуляторами и полимерами представлены в таблице. Как видно из таблицы 1, коммерческая форма живой коревой вакцины при парентеральном применении вызывает сероконверсию у 75 % морских свинок при средней геометрической титра антител, равной 13. Введение в состав вакцины Реаферона в испытанных концентрациях не приводило к росту титра антител, а наоборот, оказывало иммуносупрессирующий эффект.

КОРЬ | ИММУНИТЕТ | ИССЛЕДОВАНИЕ

опыт

С/ XjMm^f

Таблица 1

Иммуногенность образцов живой коревой вакцины, содержащих различные иммуномодуляторы

Иммуномодулятор, вводимый в состав вакцины РТГА сывороток крови морских свинок

Среднегеометрическое значение титра антител Доверительный интервал % сероконверсии

Контроль (вакцина без иммуномодулятора) 13 2,8 75

Полиоксидоний 0,25 мг 223 3,8 100

Полиоксидоний 0,75 мг 215 1,9 100

Полиоксидоний 1,0 мг 5 3,8 80

Холерный токсин 25,0 мкг 13 1,6 100

Холерный токсин 100,0 мкг 10 1,6 100

Мурамилдипептид 100,0 мкг 256 1,6 100

Мурамилдипептид 200,0 мкг 20 1,6 100

Интерлейкин-21,0 мкг 11 1,8 100

Интерлейкин-2 5,0 мкг 5 2,3 80

Интерлейкин-2 -10,0 мкг 102 4,5 100

Интерлейкин-5 25,0 мкг 362 2,4 100

Интерлейкин-5 50,0 мкг 38 5,1 100

Интерлейкин-6150,0 мкг 128 3,5 100

Интерлейкин-6 300,0 мкг 114 3,2 100

ФНОф -102 ME 5 1,6 100

ФНОф -103 ME 5 1,6 100

ФНОф-104 ME 3 2,5 67

Реаферон 104 ME 3 3,4 66

Реаферон 10е ME 4 2,7 75

МИК-форма вакцины с этилкрилатом 128 3,6 100

МИК-форма вакцины с альгинатом натрия/спермином 203,2 4,5 100

МИК-форма вакцины с альгинатом натрия/хитозаном 38,1 3,5 100

Аналогичные результаты получены при испытании ФНО. Введение в состав инъекционной формы вакцины холерного токсина В в концентрациях 25-100 мкг также не выявило стимуляции иммунного ответа. Применение в составе живой коревой вакцины интерлейкина-2 показало усиление иммунного ответа при использовании концентрации 10 мкг и интерлейкина-6 - в дозах 150 и 300 мкг.

Более выраженные иммуномодулирующие свойства выявлены при сочетанном использовании живой коревой вакцины и Полиоксидония в концентрациях 0,25 и 0,75 мг и мурамилдипептида в концентрации 100 мкг. Максимальный уровень гемагглютинирующих антител получен при испытании живой коревой вакцины совместно с интерлей-кином-5 в концентрации 25 мкг (средняя геометрическая

www.mia-med.ru

№2 (2) декабрь 2014 55

КОРЬ I ИММУНИТЕТ I ИССЛЕДОВАНИЕ

С/ XjMm^f

титра антител равна 362). Однократная подкожная иммунизация микрокапсулированной формы живой коревой вакцины была эффективна при введении всех исследованных образцов и вызывала индукцию антител у 100 % животных. Наибольшей иммуногенностью обладали образцы вакцины на основе этилкрилата и альгината натрия/спермина.

Таким образом, проведенные исследования по изучению иммуностимулирующей активности различных препаратов при совместном применении с живой коревой вакциной позволили подобрать ряд препаратов, перспективных для создания новой формы вакцины. В результате экспериментов было установлено, что выраженными им-муномодулирующими свойствами обладают отечественный иммуностимулятор Полиоксидоний в концентрациях 0,25-0,75 мг, мурамилдипептид в концентрации 100 мкг, интерлейкин-2 в концентрации 10 мкг, интерлейкин-5 в концентрации 25 мкг, интерлейкин-6 в концентрации 150-300 мкг/дозу, а также микрокапсулированные формы вакцины на основе этилкрилата и альгината натрия / спермина при парентеральном применении. Добавление к живой коревой вакцине низких концентраций Реаферо-на, ФНО и холерного токсина не выявило иммуномодули-рующего действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показали, что исследуемые препараты оказывают иммуномодулирующее действие и могут быть эффективны при конструировании новых форм вакцин, в частности, микрокапсулированной формы живой коревой вакцины. Можно предположить, что введение в состав вакцины иммуномодулятора позволит не

только усилить иммунный ответ к вирусу без увеличения дозы вируса, но и значительно снизить иммуносупрессив-ные реакции, вызываемые вирусом кори, и использовать его для вакцинации детей со сниженным иммунным статусом, которых прививать традиционной вакциной нежелательно.

ЛИТЕРАТУРА

1. Попов В.Ф. Корь и коревая вакцина /1-16. - М. -Триада-Х. - 2002. -192 с.

2. Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность. Клиническая лабораторная диагностика. -1998. - № 11. -С. 21-32.

3. Медуницын Н.В. Вакцинология. М., Триада-Х. -2010.-508 с.

4. Петров RB., Хаитов P.M. Искусственные антигены нового типа, ЖМЭИ. -1982. - № 13. - С. 22-28.

5. Couch R.B., Keitel W.A., Cate Th. Improvement of inactivated Influenza Virus Vaccines. J. Infect. Dis. -1997. -176(1).-P. 338-344.

6. Промышленный регламент № 05664012-1484-13 на производство вакцины коревой культуральной живой, лиофилизатадля приготовления раствора для подкожного введения.

7. ФСП 2975-07. Вакцина коревая культуральная живая, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения.

8. Muller С.Р., Beauverger P. Cholera toxin В stimulates systemic neutralizing antibodies after intranasal co-immu-nization with measles virus. J.Gen. Virol. -1995. - 76 (6). -R1371-1380.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ

Нечаева Елена Августовна - кандидат медицинских наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 336-64-81, e-mail: nechaeva@vector.nsc.ru

СенькинаТатьяна Юрьевна- сотрудник Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 336-64-81, e-mail: sen'kina@vector.nsc.ru

Жилина Наталья Валентиновна - сотрудник Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 336-64-81, e-mail: gilina@vector.nsc.ru

Нечаев Юрий Сергеевич - кандидат биологических наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 336-64-81, e-mail: nechaev@vector.nsc.ru

Думченко Наталья Борисовна - сотрудник Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 336-64-81, e-mail: dumchenko@vector.nsc.ru

Свириденко Татьяна Михайловна - сотрудник Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», отдел клеточных технологий, г. Новосибирск, Российская Федерация, рабочий телефон: +7 (383) 336-64-81, e-mail: sviridenko@vector.nsc.ru