СРЕДСТВО ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ СИСТЕМНОЙ ИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ КОРМОВЫХ КУЛЬТУР, НАПРИМЕР ГОРОХА, К ГРИБКОВЫМ ПАТОГЕНАМ
MEANS FOR IMPROVING SYSTEMIC INDUCED PERSISTENCE OF FEED CROPS TO, FOR INSTANCE FUNGAL PATHOGENIC AGENTS

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к средствам для предпосевной обработки семян, повышающим системную индуцированную устойчивость (СИУ).
Известен широкий спектр ростовых веществ и средств защиты растений от сорняков, вредителей и болезней (1. Malamy J., Carr J.P., Klessig D.F., Raskin I. Salicilik acid: A Likely Endogenous Signal in the resistane response of tobacco to Viral Infection // Science. 1990. V.250. P.1002-1004; 2. Raskin I.Salicylate, a new plant hormone. // Plant Physiol. - 1992. - 99, №3, p.799-803).
К недостаткам указанных средств относится использование химических соединений, загрязняющих окружающую среду и создающих опасность для здоровья человека и животных, большая трудоемкость их изготовления.
Наиболее близким аналогом предлагаемому средству является средство, содержащее салициловую кислоту и обладающее ростостимулирующим действием (фирма ННПП «НЭСТ М» Препарат Циркон (0,1 г/л смеси гидроксикоричных кислот) // Патент RU 2257059 (прототип).
Предпосевная обработка семян салициловой кислотой в концентрации 0,2 мМ способствует ускорению их прорастания, ростовых процессов в молодых растениях, а также приводит к заметной прибавке урожая, что свидетельствует о перспективности применения его как регулятора роста (Сахабутдинова А.Р. [и др.] Влияние обработки семян салициловой кислотой и фунгицидом фенорам супер на гормональный статус и рост проростков пшеницы // Агрохимия, 2004, №4, с.17-21).
Салициловая кислота концентрацией менее 0,2 мМ играет ключевую роль в индукции системной приобретенной устойчивости к фитопатогенным грибам, бактериям, вирусам, вместе с тем повышает неспецифическую устойчивость растений (Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений // Аграрная Россия. - 1999. - №1. - с.4-9).
Задачей предлагаемого изобретения является однократная предпосевная обработка, полная совместимость с технологией предпосевной обработки семян традиционными протравителями, а также повышение системной индуцированной устойчивости кормовых культур к грибным патогенам.
-8
-8
4
4
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном препарате для повышения системной индуцированной устойчивости кормовых культур к грибным патогенам, содержащем 2·10 М салициловую кислоту, согласно изобретению дополнительно используют экстракты из лекарственных растений Эхинацея пурпурная и Синюха голубая, 2·10 М лектины из семян фасоли, 0,2 М сульфат магния и 0,2 М сульфат цинка при следующем соотношении компонентов: экстракт Эхинацеи пурпурной:экстракт Синюхи голубой:лектины из семян фасоли:салициловая кислота: MgSO:ZnSO=1:1:1:1:1:1.
В индукцию и координацию защитных антивирусных реакций растений при СИУ в качестве сигнальных молекул вовлечены как минимум четыре полипептидные гормона, лектины, PR-белки, салициловая и жасмоновая кислоты, а также некоторые другие соединения. Известно, что развитие патогенеза у растений сопровождается образованием перекисных радикалов, вызывающих деструктивные процессы в структуре клеточных мембран (Методы биохимического исследования растений. Под. ред. Ермакова А.И. - М.: Агропромиздат, - 1987. 431 с.).
В связи с этим особое значение приобретает идея терапевтического использования биоиммунных молекул для подавления реакций перекисного окисления. Таким образом, эти элиситорные молекулы потенциально способны выступать в роли индукторов системной устойчивости растений.
Вместе с тем требования экологии приводят к необходимости создания препаратов, относящихся к категории биопрепаратов, использование которых было бы эффективно в малых дозах.
Подготовка сырья включает в себя процессы взвешивания порошков, отмеривания жидкостей, измельчения растений.
Для приготовления экстрактов Эхинацеи и Синюхи использовалась родниковая слабоминерализованная вода, соответствующая требованиям СаН ПиН 2.3.2.1078-01 из природного источника национального заповедника «Орловское Полесье». Родниковую воду перед подачей на экстракцию подвергают стерилизации. Для этого воду разливают в стеклянную тару, укупоривают и стерилизуют в автоклаве паром в течение 30 минут при давлении 1,5 атм и температуре 119-120°С.
Лекарственные растения для производства экстрактов берут в следующем соотношении: 1 часть Эхинацеи и 1 часть Синюхи. Высушенные части растения (корни и наземные части в стадии цветения) измельчают на лабораторной мельнице. Размер измельченных частиц лекарственных трав составляет 3-5 мм. Далее осуществляют экстракцию 40%-ным водно-спиртовым раствором по стандартной методике в течение 10-12 часов при комнатной температуре. Выход фитокомпозиции составляет 87,69%.
Далее выделяют и проводят очистку пектинов из семян фасоли следующим образом:
Экстрагирование измельченных семян 0,9 М NACl 1 час (100 г муки: 900 мл NaCl).
↓
Центрифугирование (2000g 20 минут).
↓
Экстрагирование и центрифугирование (повторно) в том же режиме 0,9 М NaCl 500 мл. Объединенные супернатанты доводят до pH 4.0 4 н HCl.
↓
Центрифугирование (2000g, 20 минут). Супернатант нейтрализуется до pH 7.0
↓
Осадок удаляется центрифугированием (2000g, 20 минут).
↓
Белок высаливается 60% сульфатом аммония.
↓
Неочищенный (сырой) лектин собирается на фильтр и растворяется в пятикратном (по объему) количестве дистиллированной воды.
↓
Диализ: 24 ч при 110°С против буферной смеси (0,1 М ацетатный буфер, pH 6.8)
↓
Раствор лектина осветляют центрифугированием (6000g, 20 минут).
↓
Осветленный лектин наносят на колонку с Sephodex G-75, уравновешенную буферной смесью.
↓
Адсорбированный лектин элюируют 0,1М раствором глюкозы в 0,1М ацетатном буфере (pH 6.8). Белок определяют спектрофотометрически.
↓
Белок элюата осаждают 70% сульфатом аммония.
↓
Осадок отделяют центрифугированием (2000g, 30 минут) и растворяют в воде.
↓
Диализ: 18 ч при 14°C против 0,1 М ацетатного буфера (рН 6.8).
↓
Образованный осадок удаляется центрифугированием (6000g, 30 минут).
↓
Диализ: 24 ч при 14°C против дистиллированной воды.
↓
Сформированные кристаллы лектина растворяют в воде (подкисленной 0,1 н. HCl до рН-4,0), раствор нейтрализуется до рН 6.7-7.0 и лиофильно высушивается.
-1
В результате получен препарат лектинов с активностью гемагглютининов 27 (мг/мл).
Далее в необходимом количестве взвешивают салициловую кислоту, сульфаты магния и цинка на весовом дозаторе и подают на стадию приготовления растворов.
Затем смешивают предварительно приготовленные растворенные компоненты (экстракты Эхинацеи и Синюхи, пектины фасоли, салициловую кислоту, сульфаты магния и цинка) в соотношении 1:1:1:1:1:1.
Далее для приготовления 1 л рабочего раствора приготовленные растворенные компоненты разводят в пропорции 20 мл (столовая ложка препарата) на 1 л воды. Затем этот раствор смешивают с 2%-ным водным раствором КМЦ-натрий (обойный клей), который является традиционным инкрустатором семян в соотношении 1:1 по объему.
Эффективность данного средства была проверена на биологическую активность, осуществляемую с помощью измерения величины пероксидазной активности, являющейся экспресс-методом ускоренной оценки препаратов (Тарчевский И.А. Элиситориндуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. // Физиология растений, 2000, №2, с.321-331. Метод оценки устойчивости гороха к возбудителям фузариоза и аскохитоза по биохимическим показателям. / Павловская Н.Е., Шалимова О.А., Азарова Е.Ф, Орел. - ОрелГАУ, 2002, 20 с.).
В опытах использовались 1500 штук семян гороха сорта «Орлус». Было сформировано 3 группы по 500 штук семян.
Пример 1. Первая группа семян (контроль) была обработана традиционным инкрустатором КМЦ-натрий. Семена помещали в емкость и перемешивали с инкрустатором на качалке в течение 15 мин. Затем семена помещали в растильни на смоченную водой фильтровальную бумагу. Изучали энергию прорастания семян (таблица 1). С целью изучения системной индуцированной устойчивости трехсуточные проростки гороха обрабатывали культуральной жидкостью гриба патогена Fusarium oxyspomm и изучали пероксидазную активность в инфицированных проростках (таблица 2).
Пример 2. Брали по 500 штук семян гороха, помещали в емкость и перемешивали с порошкообразным препаратом «ЭКОСТ» на качалке в течение 15 мин. Семена помещали в растильни на смоченную водой фильтровальную бумагу. Результаты энергии прорастания представлены в таблице 1. С целью изучения системной индуцированной устойчивости трехсуточные проростки гороха обрабатывали культуральной жидкостью гриба патогена Fusarium oxysporum и изучали пероксидазную активность в инфицированных проростках (таблица 2).
Пример 3. Брали по 500 штук семян гороха, помещали в емкость и перемешивали с предлагаемым средством на качалке в течение 15 мин. Семена помещали в растильни на смоченную водой фильтровальную бумагу. Изучали энергию прорастания семян (таблица 1). С целью изучения системной индуцированной устойчивости трехсуточные проростки гороха обрабатывали культуральной жидкостью гриба патогена Fusarium oxysporum и изучали пероксидазную активность в инфицированных проростках (таблица 2).
Таблица 1
Влияние предпосевной обработки семян на энергию роста гороха сорта «Орлус»
Группа опыта
Количество семян, шт.
Энергия прорастания, %
Всхожесть, %
Кол-во бобов на 1 растение, шт.
1. Контроль
500
86,6
84,8
1,95
2. «ЭКОСТ»
500
87,5
91,3
2,12
3. Предлагаемое средство
500
88,0
84,0
2,32
Таким образом, видно, что применение предлагаемого средства позволит повысить энергию роста бобовых культур.
Таблица 2
Пероксидазная активность в проростках гороха при обработке инфицированных растений, в условных единицах активности.
Дни
Контроль
Препарат «ЭКОСТ» (прототип)
Предлагаемое средство
4
201
330
430
5
219,5
333,3
454,5
6
2250
652,2
535,7
7
1875
1666,7
1875
8
1153,8
1875
2142,9
В результате установлено, что предпосевная обработка предлагаемым биопрепаратом увеличивает энергию прорастания гороха, способствует повышению пероксидазной активности. Причем препарат вызывает более интенсивную активацию пероксидазы по сравнению с промышленным препаратом «ЭКОСТ».
Одним из природных механизмов устойчивости растений на грибную инфекцию является реакция сверхчувствительности, о которой можно судить по развитию некрозов. Так, на нижних инокулированных листьях гороха, предварительно обработанных предлагаемым средством, количество регистрируемых некрозов было значительно меньше в сравнении с контролем. В то же время в верхних неинфицированных листьях некрозы вообще не регистрировались (таблица 3).
Таблица 3
Динамика образования некротических пятен на инфицированных патогенном Fusarium oxysporum листьях гороха после обработки семян
Группа опыта
Сутки после инфицирования
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1. Контроль
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
2. «ЭКОСТ»
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
3. Предлагаемое средство
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
(+) - установлено наличие некротических пятен;
(-) - отсутствие некротических пятен.
Это свидетельствует о повышении системной индуцированной устойчивости кормовых культур к грибным патогенам под влиянием предлагаемого средства.
Таким образом, использование предлагаемого средства позволит исключить необходимость многократной предпосевной обработки семян, совместить применение средства с технологией предпосевной обработки семян традиционными протравителями, а также повысить системную индуцированную устойчивость к грибным патогенам.