СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СКАФФОЛДА ИЗ СПЛАВА ТИТАНА С ЗАСЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК В НИЖНЮЮ ЧЕЛЮСТЬ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ МЫШЕЙ
METHOD FOR SCAFFOLD TRANSPLANTATION FROM TITANIUM ALLOY WITH A POPULATED CELL CULTURE INTO THE LOWER JAW OF IMMUNODEFICIENT MICE

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа трансплантации скаффолда из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток в нижнюю челюсть иммунодефицитных мышей для получения ортотопической модели опухолевого процесса в костях и мягких тканях нижнечелюстной и шейной области, позволяющей наиболее адекватно повторить клиническую картину туморогенеза.
Достижением последних десятилетий в клинической практике является трансплантация тканей и органов, выращенных из культур клеток на специальных подложках - скаффолдах. Данный способ считается более совершенным по сравнению с имплантацией эндопротезов, не способных к сращиванию с окружающими тканями. Соответствие характеристик трансплантируемых клеток микроокружению в организме реципиента и форма имплантата, организованная при помощи скаффолда, позволяют ему максимально точно повторить восполняемый орган или его часть. Скаффолды благодаря своей пористой структуре способны надежно закрепляться выращиваемым на них клеткам, а также окружающей ткани реципиента, в том числе и костной, которая врастает в поровое пространство (см. Vacanti J.P., Vacanti С.А. The history and scope of tissue engineering, in principles of tissue engineering // Academic Press. - 2000. - P. 3-8).
Подобные конструкции должны обладать определенной внешней формой и внутренней структурой (см. Yang S., Leong K.F., Du Z., Chua C.K. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. traditional factors // Tissue Eng. - 2001. - 7(6). - P. 679-689; см. Hollister S., Lin C., Saito E., Schek R., Taboas J., Williams J. Engineering craniofacial scaffolds // Orthod Craniofac Res. -2005. - 8(3). - P. 162-173).
Существует опыт применения имплантатов из керамики и полимеров (см. Chang B.S., Lee С.K., Hong K.S., Youn H.J., Ryu H.S., Chung S.S. Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations // Biomaterials. - 2000. - 21(12). - P. 1291-1298; см. Nagashima Т., Ohshima Y., Takeuchi H. Osteoconduction in porous hydroxyapatite ceramics grafted into the defect of the lamina in experimental expansive open-door laminoplasty in the spinal canal // Nippon Seikeigekagakkai Zasshi. - 1995. - 69(4). - P. 222-230). Однако они не обладают достаточной жесткостью и могут легко трансформироваться (см. Kalita S.J., Bose S., Hosick H.L., Bandyopadhyay A. Development of controlled porosity polymer-ceramics composite scaffolds via fused deposition modeling // Mater Sci Eng (C). - 2003. - 23. - P. 611-620; см. Zhang R., Ma P.X. Poly(a-hydroxyl acids)/hydroxyapatite porous composites for bone-tissue engineering. I. Preparation and morphology // J Biomed Mater Res. - 1999. - 44. - P. 446-155).
По этой причине наиболее распространенными материалами для скаффолдов и эндопротезов являются сплавы из титана (см. Lueck R.A., Galante J.O., Rostoker W., Ray R.D. Development of an open pore metallic implant to permit attachment to bone // Surg Forum. - 1969. - 20. - P. 456-457; см. Welsh R.P., Pilliar R.M., Macnab I. Surgical implants. The role of surface porosity in fixation to bone and acrylic // J Bone J Surg Am. - 1971. - 53(5). - P. 963-977.).
Титановые сплавы обладают значительными преимуществами благодаря их механическим свойствам в сравнении с другими металлами, высокому индексу прочности, их химической иннертности, коррозионной стойкости и совместимостью с живыми тканями (см. Liu X.Y., Chu Р.K., Ding С.Х. Surface modification of titanium, titanium alloys, and related materials for biomedical applications // Mater Sci Eng R Rep. - 2004. - 47: 49e121; см. Geetha M., Singh A.K., Asokamani R., Gogia A.K. Ti based biomaterials, the ultimate choice for orthopaedic implants e a review // Prog Mater Sci. - 2009. - 54: 397e425). Исследования in vitro биосовместимости титановых подложек показали не только их нетоксичность, но и положительное влияние на клетки: клеточную адгезию, пролиферацию, дифференциацию и миграцию (см. Lia J.P., Wijna J.R., Blitterswijka С.A., Groota K. Porous Ti6A14V scaffold directly fabricating by rapid prototyping: Preparation and in vitro experiment // Biomaterials. - 2006. - 27. - P. 1223-1235).
Известен способ трансплантации крысам скаффолдов из TA6V, содержащего костные морфогенетические белки ВМР-2 и культуру миобластов С2С12, между мышцами и апоневротическим слоем (см. Guillot R., Gilde F., Becquart P., Sailhan F., Lapeyrere A., Logeart-Avramoglou D., Picart C. The stability of BMP loaded polyelectrolyte multilayer coatings on titanium // Biomaterials. - 2013. - 34: 5737e5746). Преимуществом этого способа является покрытие скаффолда костными морфогенетическими белками, вызывающими остеиндукцию. Недостатком метода является имплантация скаффолда в мышечном слое без какого-либо закрепления, из-за чего трансплантант может во время мышечной работы перемещаться, вызывая болевые ощущения и мешая быстрому заживлению послеоперационной раны и сращению с окружающими тканями.
Известен способ трансплантации скаффолда цилиндрической формы с первичными мышиными остеобластами МС3Т3-Е1 в просверленное отверстие диафизарной части бедренной кости кролика (см. Fu Q., Hong Y., Liu X., Fan H., Zhang X. A hierarchically graded bioactive scaffold bonded to titanium substrates for attachment to bone // Biomaterials. - 2011. - 32. - 7333e7346). Преимущество данного способа заключается в надежной фиксации скаффолда. Данная модель наиболее проста и не способна продемонстрировать тканезамещение в наиболее сложных по форме костях.
Известен способ трансплантации скаффолда с заселенными мышиными остеобластами МС3Т3-Е1 в нижнюю челюсть кроликов, в которой предварительно был сделан прямоугольный дефект (см. Cao Н., Fenga L., WuaZh., Houb W., Li Sh., Hao Y., Wua L. Effect of low-intensity pulsed ultrasound on the biological behavior of osteoblasts on porous titanium alloy scaffolds: An in vitro and in vivo study // Materials Science and Engineering. - 2017. - С 80. - P. 7-17; Feng L., Liu X., Cao H., Qin L., Hou W., Wu L. A Comparison of 1- and 3.2-MHz Low-Intensity Pulsed Ultrasound on Osteogenesison Porous Titanium Alloy Scaffolds An In Vitro and In Vivo Study // J Ultrasound Med. - 2019. - 38. - P. 191-202). При этом скаффолд вкладывался в полученное углубление кости без закрепления, что является ненадежным способом фиксации имплантируемого материала.
Существенным недостатком перечисленных выше способов является создание либо аллогенной модели, либо ксеногенной, но с мышиными клетками, а не человеческими. Подобные модели не способны адекватно отражать процессы, протекающие в организме человека. Эту задачу способны решать ксеногенные модели с использованием скаффолдов и человеческих культур клеток, в том числе и опухолевых - с целью моделирования опухолевого процесса в различных тканях.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа трансплантации скаффолда из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток в нижнюю челюсть иммунодефицитных мышей для получения ортотопической модели опухолевого роста в костях и мягких тканях нижнечелюстной и шейной области мышей, наиболее адекватно отражающей клиническую картину развития злокачественных новообразований в данной анатомической области у человека.
Технический результат изобретения достигается тем, что разрез кожи производят параллельно телу нижней челюсти на протяжении 15 мм, начало разреза расположено на средней линии тела на расстоянии 5 мм от нижней губы, отодвигая анатомическим пинцетом подкожную мышцу шеи, осуществляют тупое выделение жевательной мышцы, которую рассекают параллельно телу нижней челюсти, при помощи хирургического бура производят повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани тела нижней челюсти диаметром 2 мм и глубиной 1 мм в области жевательного гребня, прошивают лигатурой скаффолд из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток и обвивают этой же лигатурой тело нижней челюсти, завязывают узел, сшивают разрезанную жевательную мышцу одним узловым швом, ушивают послеоперационную рану непрерывным швом.
Способ осуществляют следующим образом.
2
Предварительно скаффолд заселяют необходимой культурой опухолевых клеток человека, после чего инкубируют в стандартных условиях (в СО-инкубаторе при температуре плюс 37°С).
Реципиентами опухолевого материала являются иммунодефицитные мыши Balb/c Nude.
Для осуществления трансплантации животных вводят в наркоз. Для этого используют в качестве премедикации ксилазин концентрацией 20 мг/мл. Мышей наркотизируют при помощи золетила концентрацией 22,57 мг/мл.
Для обеспечения доступа к нижней челюсти делают разрез кожи параллельно телу нижней челюсти на протяжении 15 мм. Разрез начинается на средней линии тела на расстоянии 5 мм от нижней губы. Отодвигая анатомическим пинцетом подкожную мышцу шеи, осуществляют тупое выделение жевательной мышцы. Последнюю рассекают параллельно телу нижней челюсти. С помощью хирургического бура повреждают надкостницу и верхний слой костной ткани тела нижней челюсти диаметром 2 мм и глубиной 1 мм в области жевательного гребня. Скаффолд из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток прошивают лигатурой, которой также обвивают тело нижней челюсти, завязывают узел. Разрезанную жевательную мышцу сшивают одним узловым швом. Послеоперационную рану ушивают непрерывным швом.
Изобретение иллюстрируется фигурами (1-7).
На Фиг. 1 изображено повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани тела нижней челюсти иммунодефицитной мыши Balb/c Nude при помощи хирургического бура.
На Фиг. 2 показано обвитие лигатурой тела нижней челюсти иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг. 3 изображено расположение скаффолда из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток на нижней челюсти иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг. 4 изображена фиксация скаффолда из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток на теле нижней челюсти иммунодефицитной мыши Balb/c Nude при помощи лигатуры.
На Фиг. 5 показано ушитие жевательной мышцы иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг. 6 изображено ушитие послеоперационной раны у иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг. 7 изображен финальный вид иммунодефицитной мыши Balb/c Nude после трансплантации скаффолда из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток.
Данным способом произведена трансплантация скаффолдов из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток в нижнюю челюсть 30 иммунодефицитным мышам Balb/c Nude.
Приводим пример применения способа.
Данным способом была прооперирована самка мыши линии Balb/c Nude возрастом 7 недель массой 23 г.
2
Скаффолд заселили культурой клеток остеосаркомы человека HOS, после чего инкубировали их в стандартных условиях (в СО-инкубаторе при температуре плюс 37°С) в течение 3 суток.
Наркоз животного осуществляли с использованием ксилазина концентрацией 20 мг/мл и золетила концентрацией 22,57 мг/мл. Для обеспечения доступа к нижней челюсти разрезали кожу мыши параллельно телу нижней челюсти на протяжении 15 мм. Разрез начинался на средней линии тела на расстоянии 5 мм от нижней губы. Отодвигая анатомическим пинцетом подкожную мышцу шеи, осуществили тупое выделение жевательной мышцы, которую рассекали параллельно телу нижней челюсти. Используя хирургический бур, повредили надкостницу и верхний слой костной ткани тела нижней челюсти диаметром 2 мм и глубиной 1 мм в области жевательного гребня. Скаффолд из сплава титана с заселенной культурой опухолевых клеток прошивали лигатурой, которой также обвивали тело нижней челюсти, завязали узел. Разрезанную жевательную мышцу сшивали одним узловым швом. Послеоперационную рану ушивали непрерывным швом.
Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что он позволяет создать ортотопическую модель злокачественного роста в костях и мягких тканях нижнечелюстной и шейной области, трансплантируя опухолевые клетки в костную ткань, и исключает элиминацию опухолевого материала, создавая оптимальные условия для роста имплантируемых клеток.