СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И/ИЛИ ПРОВЕРКИ ИНГИБИТОРОВ РЕЦЕПТОРНЫХ ТИРОЗИНКИНАЗ
METHOD FOR IDENTIFICATION AND/OR VERIFICATION OF INHIBITORS OF RECEPTOR TYROSINE KINASES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка касается клеточного способа идентификации и/или проверки ингибиторов активности рецепторных тирозинкиназ.
Уровень техники
Рецепторные тирозинкиназы (PTK) являются ключевыми регуляторами межклеточной коммуникации, которые контролируют рост, пролиферацию, дифференцировку, выживание и метаболизм клеток. Идентифицировано около 20 различных семейств PTK, имеющих одинаковую структуру, а именно: внеклеточный сайт связывания лигандов, трансмембранную область и внутриклеточный тирозинкиназный домен [1]. Внеклеточное связывание лигандов вызывает димеризацию рецептора или стабилизирует ее, что ведет к повышению киназной активности PTK. Внутриклеточный каталитический домен проявляет наибольшую степень консервативности среди PTK и включает АТФ-связывающий участок, который катализирует автофосфорилирование рецептора по цитоплазматическим остаткам тирозина, которые служат местом посадки для белков, содержащих домен гомологии с Src 2 (SH2) и домен связывания фосфотирозина (РТВ), таких как Grb2, She, Src, Cbl, или фосфолипазы Сγ. Эти белки впоследствии привлекают к активированному рецептору дополнительные эффекторы, содержащие домены SH2, SH3, РТВ, а также домен гомологии с плекстрином (РН), что приводит к сборке сигнальных комплексов на мембране и активации каскада внутриклеточных биохимических сигналов. К наиболее важным каскадам нисходящих сигналов, активируемых PTK, относятся путь Ras внеклеточной сигнал-регулирующей киназы (ERK) - митоген-активируемой (MAP) киназы, путь фосфоинозитид 3-киназы (PI 3-киназы) - Akt и путь JAK/STAT. Сложная сигнальная сеть, запускаемая PTK, в конечном счете, приводит либо к активации, либо к репрессии различных групп генов и, тем самым, определяет биологический ответ на данный сигнал.
Активность PTK и опосредованная ими клеточная передача сигналов хорошо скоординированы и строго контролируются в нормальных клетках. Разбалансировка сигнальной системы PTK, как при стимуляции фактором роста, так и при генетических изменениях, ведет к нарушению регуляции тирозинкиназной активности. Такие нарушения обычно приводят к тому, что киназная активность, а тем самым и сигнальная способность PTK, становится конститутивной (постоянной) или сильно повышается, что приводит к злокачественному перерождению клетки. Поэтому их часто связывают с раком человека, а также с другими гиперпролиферативными заболеваниями, такими как псориаз [2]. К наиболее важным механизмам, вызывающим конститутивную PTK передачу сигналов, относятся суперэкспрессия и/или амплификация генов PTK, такие генетические изменения, как делеции и мутации во внеклеточном домене, равно как изменения каталитического центра, либо аутокринно-паракринная стимуляция через аномальные системы факторов роста.
Например, при многих видах рака у человека происходит амплификация генов и/или суперэкспрессия PTK, что может повысить восприимчивость раковых клеток к нормальным уровням факторов роста. Кроме того, суперэкспрессия специфической PTK на клеточной поверхности повышает частоту димеризации рецепторов даже в отсутствие активирующего лиганда. Во многих случаях это приводит к конститутивной активации PTK, что ведет к аномальной и неконтролируемой пролиферации клеток и образованию опухолей. Важным примером такого сценария является HER2, также известная как ЕrbВ2, которая принадлежит к семейству PTK рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Суперэкспрессия HER2 обнаруживалась при различных типах рака человека, особенно в карциномах молочной железы и яичников [3]. Очень важно то, что аномально высокие уровни HER2 коррелируют с более агрессивным прогрессированием заболевания и уменьшением продолжительности жизни пациентов [4]. EGFR, первая рецепторная тирозинкиназа, которая была клонирована на молекулярном уровне [5], также играет существенную роль в онкогенезе. EGFR часто подвергается суперэкспрессии при немелкоклеточном раке легких, мочевого пузыря, шейки матки, яичников, почек и поджелудочной железы и при плоскоклеточной карциноме головы и шеи [6]. Преобладающим механизмом, ведущим к суперэкспрессии EGFR, является амплификация EGFR генов, причем в определенных опухолях оказалось до 60 копий на одну клетку [7]. Обычно повышение уровня экспрессии EGFR связано с высокой частотой метастазирования и усилением пролиферации опухолей [8].
Поскольку тирозинкиназы оказались вовлеченными в различные симптомы рака, PTK и активируемые ими сигнальные каскады являются перспективными областями для разработки селективных по отношению к этим мишеням противораковых препаратов. Одним из подходов к ингибированию аномальной передачи сигналов PTK является разработка низкомолекулярных препаратов, избирательно подавляющих присущую PTK тирозинкиназную активность и, тем самым, блокирующих автофосфорилирование рецептора и активацию преобразователей (transducers) нисходящих сигналов [9].
Для того чтобы идентифицировать PTK-специфичные ингибиторы, было разработано несколько методов скрининга библиотек соединений, в большинстве из которых применяются биохимические методы [10]. Одно из важных соображений при выборе эффективных ингибиторов тирозинкиназ состоит в том, что эти соединения должны проникать через клеточные мембраны и функционировать во внутриклеточной среде в течение необходимого времени. Кроме того, чтобы стать потенциальным прототипом лекарственного средства, ингибиторы киназ не должны проявлять цитотоксических эффектов. Поэтому желательно иметь клеточную систему для первичного скрининга соединений, способных ингибировать активность PTK. Требования к таким методам in vivo заключаются в возможности исследовать специфический клеточный процесс, запускаемый определенной мишенью, и в средстве для легкого измерения его результата в высокопроизводительной системе скрининга (HTS). Наличие все возрастающего числа средств биотехнологии для генетической модификации клеток и микроорганизмов позволило разработать простые цифровые методы анализа клеточных процессов, которые можно легко применить к автоматизированным системам при HTS [11-14]. Клеточный скрининг в идеальном случае должен проводиться на клетках из человека, которые, очевидно, представляют собой физиологически наиболее обоснованную модельную систему. Однако может оказаться, что будет трудно контролировать эффекты избыточных процессов на измеряемый результат и отличить их от тех эффектов, которые должны быть специфичными к заданной мишени; а генетическое манипулирование на клетках млекопитающих обычно является проблематичным и трудоемким. Более того, культивирование клеток человека стоит дорого, и их бывает затруднительно выращивать в автоматизированных системах для HTS. Микроорганизмы типа дрожжей представляют удобную альтернативу для измерения активности определенных белков человека хотя и в гетерологичной, но клеточной (эукариотической) среде. В клетках дрожжей функционирование белков человека зачастую может быть восстановлено и некоторые аспекты физиологических процессов человека могут быть воспроизведены вследствие высокой степени консервативности основных молекулярных и клеточных механизмов между клетками дрожжей и человека [14-17]. Тот факт, что многие белки человека функционируют в дрожжах, означает, что в этом эукариотическом организме имеет место требуемая для них конформация, стабильность, взаимодействие белок-белок и т.п.
Несмотря на то, что уже существуют способы выделения ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, однако имеется потребность в надежном клеточном способе идентификации и/или проверки таких ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, которые проникают через клеточные мембраны и не цитотоксичны.
Сущность изобретения
Таким образом, общим предметом изобретения является способ идентификации и/или проверки ингибиторов активности рецепторных тирозинкиназ. Данный способ включает следующие стадии:
a) получения клеток реципиента, содержащих конструкцию из нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, который включает тирозинкиназный домен рецепторной тирозинкиназы или его функциональный фрагмент, причем данный пептид не имеет трансмембранного домена или его функционального фрагмента, а активность данной тирозинкиназы вызывает прекращение пролиферации данных клеток реципиента;
b) взаимодействия данных клеток реципиента с соединением-кандидатом;
c) идентификации ингибиторов данной тирозинкиназной активности при культивировании данных клеток реципиента в соответствующих условиях, исходя из того, что модуляция тирозинкиназной активности соединением-кандидатом приводит к пролиферации клеток.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения данная конструкция из нуклеиновой кислоты кодирует пептид, содержащий всю цитоплазматическую часть данной рецепторной тирозинкиназы.
В другом предпочтительном воплощении данный пептид не имеет сигнальной последовательности и/или пептида, приводящего к ядерной локализации данного пептида.
В следующем предпочтительном воплощении данный пептид дополнительно содержит домен димеризации или его функциональный фрагмент. Домен димеризации предпочтительно выбирают из мотивов «лейциновой застежки» (leucine zipper motif) белков c-Fos, c-Jun и Gcn4.
В более предпочтительном воплощении клетки реципиента содержат два пептида, причем первый пептид включает лейциновую застежку c-Fos, а второй пептид включает лейциновую застежку c-Jun.
В следующем предпочтительном воплощении данный пептид включает последовательность, вызывающую заякоривание (anchoring) пептида в мембране, в частности, сигнал миристоилирования для заякоривания в мембране.
Тирозинкиназная активность в способе настоящего изобретения может исходить от любой рецепторной тирозинкиназы. К предпочтительным рецепторным тирозинкиназам относятся EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, INSR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSF-1R, KIT/SCFR, FLK2/FLT3, VEGRF 1-3, FGFR 1-4, CCK4, TRKA, TRKB, TRKC, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRО3, TIE, ТЕК, RYK, DDR1, DDR2, RET, ROS, LTK, ALK, ROR1, ROR2, MUSK, AATYK, AATYK2, AATYK3, RTK 106.
В более предпочтительном воплощении тирозинкиназную активность выбирают из группы, состоящей из INSR, IGF-1R, PDGFRα, PDGFRβ, KIT/SCFR, FGFR-1, TRKA, MET, RON, EPHB2, ЕРНВ4, AXL, ТЕК, RET, ROS.
В следующем предпочтительном воплощении данная рецепторная тирозинкиназа происходит из человека.
В следующем предпочтительном воплощении конструкция из нуклеиновой кислоты включает индуцибельный промотор, предпочтительно индуцируемый галактозой промотор, который контролирует экспрессию данного пептида.
В следующем предпочтительном воплощении клетки реципиента представляют собой клетки дрожжей или клетки бактерий, предпочтительно клетки S.cerevisiae, более предпочтительно клетки S.cerevisiae, несущие мутацию в гене АВС переносчика.
В следующем аспекте настоящее изобретение касается дрожжевого экспрессионного вектора, включающего конструкцию из нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, а также набора для идентификации и/или проверки ингибиторов рецепторных тирозинкиназ.
Краткое описание фигур
Изобретение станет более понятным, и станут явными и другие задачи, помимо изложенных выше, при рассмотрении нижеследующего подробного описания с привлечением приложенных фигур.
На фиг.1a представлены три конструкции для c-Met и влияние их экспрессии на рост дрожжей.
На фиг.1b представлены три конструкции для PDGFRβ и влияние их экспрессии на рост дрожжей. Глюкоза = репрессивные условия, т.е. пептиды не экспрессируются, а галактоза = пермиссивные условия, т.е. пептиды экспрессируются.
На фиг.2a представлен анализ экстрактов клеток методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к Мус.
На фиг.2b представлен анализ экстрактов клеток методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к фосфотирозину.
На фиг.3 представлено ингибирование активности рецепторной тирозинкиназы PDGFRβ под действием Gleevec в дрожжевых клетках.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение предусматривает клеточную систему для идентификации и/или проверки специфических ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (PTK), предпочтительно PTK человека. В этой системе клетки реципиента, предпочтительно дрожжевые клетки, экспрессирующие в определенных условиях заданные фрагменты PTK, способны расти только при ингибировании или инактивации протеинкиназной активности. Такой положительный признак позволяет проводить отбор специфических ингибиторов киназы, которые к тому же должны быть растворимы, стабильны и не цитотоксичны.
В клеточной системе настоящего изобретения тирозинкиназный домен PTK или его функциональные фрагменты, предпочтительно цитоплазматический домен PTK или его функциональные фрагменты, подвергаются экспрессии в цитоплазме клеток реципиента либо «как есть», либо в виде слитных пептидов, имеющих известные белковые последовательности, образующих прочные димеры. Экспрессия этих белков в клетках, предпочтительно дрожжевых клетках, предпочтительно контролируется индуцибельными промоторами типа промотора гена GAL1. Экспрессия димеризующихся производных PTK значительно снижает рост дрожжевых клеток в селективных условиях (фиг.1a и 1b). Такое ингибирование роста вызвано зависящей от димеризации активацией тирозинкиназной активности, так как введение точечной мутации в активный центр, которая устраняет тирозинкиназную функцию PTK, снимает эффект ингибирования роста (фиг.1a и 1b). Анализ экстрактов клеток методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к фосфотирозину показывает, что эффект ингибирования роста PTK, такими как, например, c-Met и PDGFRβ, коррелирует с их способностью катализировать фосфорилирование тирозина (фиг.2b).
Экспрессия пептидов PTK, включающих трансмембранный домен или его функциональный фрагмент, в особенности трансмембранный домен PTK, и сигнальный пептид для локализации N-концевого участка белка в просвете эндоплазматического ретикулума (ER) и внеклеточном пространстве, полностью устраняет эффект ингибирования роста (фиг.1а и 1b), тогда как она не уменьшает способности трансмембранной PTK катализировать фосфорилирование тирозина (фиг.2b). Встраивание активных цитоплазматических доменов PTK в цитозольную часть клеточных мембран, по-видимому, не существенно для фосфорилирования тирозина и эффектов ингибирования роста, так как не наблюдается различия между экспрессией простых цитоплазматических доменов PTK и тех же последовательностей, несущих сигнал миристоилирования для заякоривания в мембране (фиг.1a, 1b и 2a).
На предшествующем уровне техники показано, что экспрессия полноразмерной цитоплазматической тирозинкиназы c-src в S.pombe приводит к гибели клеток [18], а экспрессия pp60v-src в S.cerevisiae приводит к прекращению роста [19]. Мутанты pp60v-src, не имеющие функционального N-концевого сигнала миристоилирования, вызывают лишь частичное подавление остановки роста [19], т.е. полное прекращение роста, вызываемое экспрессией pp60v-src в S.cerevisiae, может наблюдаться только при попадании pp60v-src киназы в естественный для нее клеточный компартмент. Авторы настоящего изобретения, в отличие от предшествующего уровня техники, обнаружили, что экспрессия полноразмерной PTK в дрожжевых клетках не приводит к остановке роста, т.е. нахождение PTK в естественном клеточном компартменте (трансмембранная локализация) в дрожжевых клетках не приводит к остановке роста.

В типичном воплощении настоящего изобретения добавление специфического ингибитора тирозинкиназ иматиниб-мезилата (Gleevec, Novartis) к модифицированным дрожжевым клеткам, экспрессирующим димеризующийся фрагмент PTK PDGFRβ, ведет к блокированию зависящей от димеризации киназной активности этой PTK и к возобновлению роста в селективных условиях (фиг.3). Ингибирование роста под действием другой PTK (напр., RET), на которую не влияет специфический ингибитор киназ Gleevec, не устранялось в присутствии этого соединения (фиг.3).
Поскольку у бактериальных и дрожжевых клеток нет эндогенных тирозинкиназ того же типа, что у млекопитающих, эта клеточная система дает преимущество в нулевом фоне для экспрессии PTK и скрининга специфических ингибиторов этих мембранных киназ, что создает привилегированную ситуацию, которая не может быть достигнута на клетках млекопитающих.
Пептид настоящего изобретения можно экспрессировать из внехромосомной генной конструкции, например, из эписомного вектора, позволяющего экспрессировать слитный белок в клетках реципиента. Конструкция из нуклеиновой кислоты, кодирующей слитный пептид, может быть встроена в геном клеток реципиента. Нуклеиновую кислоту можно ввести в клетку любым методом трансфекции, приводящим к захвату последовательности нуклеиновой кислоты клеткой. Такие методы известны специалистам в этой области и описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory, 2001.
Конструирование соответствующих клеток реципиента и других молекулярно-биологических реагентов для настоящего изобретения, например, конструкций для слитного пептида, может осуществляться стандартными методами молекулярной биологии, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory, 2001.
Специалист в этой области также сможет установить подходящие условия культивирования, позволяющие детектирование и/или выживание используемых клеток. Эти условия зависят от используемых генетических конструкций и клеток реципиента.
Существует, по меньшей мере, три различные категории соединений, которые можно подвергать отбору способом скрининга по настоящему изобретению: химические библиотеки, библиотеки природных продуктов и комбинаторные библиотеки. Химические библиотеки состоят из структурных аналогов известных соединений. Библиотеки природных продуктов представляют собой коллекции микроорганизмов, животных, растений или морских организмов, которые применяются для образования смесей для скрининга, например, путем ферментации и экстрагирования культуральной жидкости из почвенных, растительных или морских микроорганизмов, либо экстрагирования растений или морских организмов. Комбинаторные библиотеки состоят из большого числа пептидов, олигонуклеотидов или органических соединений в виде смеси. Они могут быть сравнительно легко получены, например, традиционными методами синтеза, ПЦР или клонирования.
Далее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров.
Эксперимент 1
Результаты этого эксперимента представлены на фиг.1 и фиг.2a и 2b. Рост клеток и образование колоний на чашках с глюкозой, на которых происходит репрессия генов PTK, представлены в левом ряду. Рост клеток и образование колоний на чашках с галактозой, на которых происходит индукция генов PTK, представлены в правом ряду. Экспрессия активных цитоплазматических доменов PTK c-Met и PDGFRβ вызывает зависимое от киназы ингибирование роста дрожжевых клеток (фиг.1а и 1b, дорожки 1 и 4). Инактивация киназной активности посредством мутации консервативного остатка лизина (Lys=K) в АТФ-связывающем участке этих PTK ведет к супрессии эффекта ингибирования роста (фиг.1a и 1b, дорожки 3 и 6). В отличие от изолированных цитоплазматических доменов этих PTK, включение соответствующих трансмембранных доменов этих белков, вместе с сигнальным пептидом для локализации в ER и секреции, вызывало устранение эффекта ингибирования роста клеток (фиг.1a и 1b, дорожки 2 и 5).
Для конститутивной активации c-Met и PDGFRp проводили слияние гетерологического домена димеризации с цитоплазматическими доменами c-Met и PDGFRβ или с более длинными производными c-Met и PDGFRβ, включающими природный трансмембранный домен. В одной рамке считывания пришивали лейциновую застежку c-Jun или лейциновую застежку c-fos либо к N-концам цитоплазматических доменов c-Met (аминокислотные остатки, а.о. 932-1366) и PDGFRR (а.о. 524-1067), либо к N-концам конструкций для c-Met (а.о. 905-1366) и PDGFRβ (а.о. 496-1067), несущих трансмембранные домены. Для анализа экспрессии конструкций в дрожжевых клетках вставляли эпитоп НА или Мус между сайтом слияния домена димеризации и киназным доменом. Цитоплазматическим конструкциям придавали мембранную локализацию с помощью сигнала миристоилирования (черный столбик, заякоренный в мембране, фиг.1). Для того чтобы обеспечить надлежащую секрецию слитных белков, содержащих трансмембранные домены, по N-концам доменов димеризации пришивали дрожжевую сигнальную последовательность Suc2 (SS).
Экспрессию указанных гибридных белков исследовали методом SDS-PAGE с последующей Western-блот-гибридизацией с помощью антител к Мус (фиг.2a). Все указанные гибридные белки, несущие эпитоп Мус для детектирования, лейциновую застежку c-Fos для образования гетеродимеров и сигнал миристоилирования (Мyr) для заякоривания в мембране, подвергались экспрессии так же, как и аналогичные конструкции, несущие эпитоп НА и другую лейциновую застежку c-Jun вместо функционально эквивалентных последовательностей отмеченных белков. Фосфорилирование белков (автофосфорилирование PTK и трансфосфорилирование неизвестных субстратных белков) выявляли методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к pTyr (фиг.2b). Несмотря на то, что производные c-Met и PDGFRβ, несущие трансмембранные домены (ТМ), подвергались экспрессии и обладали активностью на уровне, сравнимом с изолированными цитоплазматическими доменами этих PTK (ср. дорожки 1 и 2 и дорожки 4 и 5 на фиг.2b), они не ингибировали пролиферацию дрожжей. Как и ожидалось, мутанты с инактивированной киназой не проявляли фосфорилирования тирозина (фиг.2b, дорожки 3 и 6).
Эксперимент 2
Результаты этого эксперимента представлены на фиг.3.

Селекция по специфическому ингибированию активности рецепторных тирозинкиназ проводилась на дрожжах. Экспрессия рецепторных тирозинкиназ человека PDGFRβ и RET у дрожжей вызывает сильное замедление роста клеток, судя по измерениям светорассеяния при 600 нм в обеих клеточных культурах. Добавление ингибитора киназ иматиниб-мезилата (Gleevec, Novartis), который ингибирует PDGFRp, но не RET, в концентрации 50 мкМ в дрожжевые культуры приводило к возобновлению роста именно PDGFRβ-экспрессирующих дрожжевых клеток, но не роста клеток, экспрессирующих RET.
Наряду с тем, что были представлены и описаны предпочтительные сейчас воплощения изобретения, следует четко понимать, что изобретение не ограничивается ими, а может быть реализовано и осуществлено различными другими способами в рамках нижеследующей формулы изобретения.
Библиография
1. Ullrich and J.Schlesinger, Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61, 203-212, 1990.
2. S.C.Robertson et al., RTK mutations and human syndromes when good receptors turn bad. Trends Genet. 16, 265-271, 2000.
3. D.J.Slamon et al., Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER2/neu oncogene. Science 235, 77-82, 1987.
4. S.Paik et al., Pathologic findings from the national surgical adjuvant project: Prognostic significance of erbB-2 protein overexpression in primary breast cancer. J.Clin. Oncol. 8, 103-112, 1990.
5. Ullrich et al., Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells. Nature 309, 418-425, 1984.
6. W.K.Hong and A.Ullrich, The role of EGFR in solid tumors and implications for therapy. Oncol. Biother. 1, 1-29, 2000.
7. T.A.Libermann et al., Amplification, enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumors of glial origin. Nature 313, 144-147, 1985.
8. К.Pavelic et al., Evidence for a role of EGF receptor in the progression of human lung carcinoma. Anticancer Res.13, pp.1133-1138, 1993.
9. Levitzki, Protein tyrosine kinase inhibitors as novel therapeutic agents. Pharmacol. Ther.82, 231-239, 1999.
10. S.B.Noonberg and С.С.Benz, Tyrosine kinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor receptor subfamily: Role as anticancer agents. Drugs 59, 753-767, 2000.
11. R.P.Herzberg and A.J.Pope, High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol.4, 445-451, 2000.
12. Johnston P.A. Cellular platforms for HTS: three case studies. Drug Discov. Today 7, 353-363, 2002.
13. Gonzales J.E. and Negulescu P.A. Intracellular detection assays for high-throughput screening. Curr. Opin. Biotechnol. 9, 624-631, 1998.
14. Hughes T.R. Yeast and drug discovery. Funct. Integr. Genomics 2, 199-211, 2002.
15. Botstein D., Chervitz S.A., and Cherry J.M. Yeast as a model organism. Science 277, 1259-1260, 1997.
16. Munder Т., and Hinnen A. Yeast cells as tools for target-oriented screening. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 311-320, 1999.
17. Brenner C. A cultivated taste for yeast. Genome Biol.1, reviews 103.1-103.4, 2000.
18. Superti-Furga G., Jonsson K., Courtneidge S.A. A functional screen for regulators and antagonizers of heterologous protein tyrosine kinases. Nat. Biotechnol. 14, 600-605, 1996.
19. Florio M., Wilson L.K., Trager J.B., Thomer J., Martin G.S. Aberrant protein phosphorylation at tyrosine in responsible for the growth-inhibitory action of pp60v-src expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 5, 283-296, 1994.