СПОСОБ ИНДУКЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
METHOD OF INDUCING CYTOLOGICAL ACTION ON TUMOUR CELLS

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для получения цитотоксического действия на опухолевые клетки и для оценки цитотоксического эффекта наночастиц (НЧ) металлов.
Известна токсичность металлов по отношению к опухолевым клеткам, а их наноформы обладают рядом свойств, которые способны усиливать этот эффект. Среди этих свойств: 1. Высокая проникающая способность НЧ; 2. Высокая суммарная площадь поверхности НЧ по сравнению с более крупными частицами, чем определяется их более высокая метаболическая активность; 3. Меньшая токсичность в отношении неизмененных клеток по сравнению с солями тех же металлов; 4. Явление плазменного резонанса при действии СВЧ на клетки, включившие НЧ.
Известно цитотоксическое действие НЧ в культурах опухолевых клеток, где, однако, количество погибших клеток не достигает 100% (См. Способ индукции антипролиферативного цитотоксического эффекта в опухолевых клетках линейных и свежевыделенных культур. // Патент №2392668, опубл. 20.06.2010, Бюл. №17. Авторы: Е.Ю.Златник, Г.И.Закора, Л.В.Передреева, И.А.Горошинская). Сущность способа заключается в том, что НЧ Cu, Zn или Fe вносят в культуру опухолевых клеток и получают разрушение 35-85% из них при 30-45 мин инкубации. Однако в такой модельной системе эффективность цитотоксического действия не достигает 100%, следовательно, необходимы дополнительные методы воздействия на опухолевые клетки.
Известен метод СВЧ-гипертермии (СВЧ-ГТ), нашедший экспериментально и клинически доказанное, хотя и ограниченное, применение в онкологии, поскольку его действие угасает при увеличении расстояния (См. Экспериментальные основы применения гипертермии в онкологии. // Ростов-на-Дону, 2005. 163 с. Авторы: O.K.Курпешев, Т.В.Лебедева, П.В.Светицкий и соавт.).
Известно применение наночастиц серебра (НЧ Ag) в качестве термосенсибилизаторов для импульсной лазерной гипертермии (См. Импульсная лазерная гипертермия с наночастицами в качестве термосенсибилизаторов - новый потенциальный метод противоопухолевой терапии. // Российский онкологический журнал, №6, 2010, С.32-36. Авторы: Р.И.Якубовская, А.А.Панкратов, Т.Н.Андреев и соавт.). Метод выбран нами в качестве прототипа с целью получения торможения и регрессии перевиваемой опухоли в эксперименте. Авторы вводили диспергированные в воде НЧ Ag внутривенно, затем через 2-5 мин начинали импульсное лазерное облучение опухоли, которое выполняли в течение 24 часов для достижения оптимального эффекта, который представлял собой торможение роста опухоли на 94-81%.
Однако остается неисследованным влияние НЧ Ag в сочетании с гипертермией на клетки опухолей человека.
Целью изобретения является получение цитотоксического действия на клетки опухолей человека с помощью наночастиц серебра в присутствии и в отсутствие СВЧ-гипертермии.
Поставленная цель достигается тем, что культуру опухолевых клеток (линейную К562 или свежевыделенную - клетки первичного плоскоклеточного рака полости рта) подвергают действию коллоидного раствора наночастиц серебра в концентрации 34 мкг/мл и СВЧ-облучению с частотой 915 МГц, вызывающему гипертермию, в течение 30 мин, после чего определяют процент погибших клеток и устанавливают, что наступает гибель 95, 100% опухолевых клеток.
Изобретение «Способ индукции цитотоксического действия на опухолевые клетки» является новым, так как оно неизвестно в области медицины при экспериментальных исследованиях наночастиц серебра на культуры линейных и свежевыделенных опухолевых клеток человека.
Новизна изобретения заключается в том, что нами установлена цитотоксичность НЧ Ag на опухолевые клетки человека, более выраженная при сочетании с СВЧ-облучением.
Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при проведении экспериментальных исследований в НИИ онкологии.
5
Изобретение «Способ индукции цитотоксического действия на опухолевые клетки» выполняется следующим образом: культуру опухолевых клеток К562 выращивают в полной культуральной среде, клетки снимают, осаждают центрифугированием, доводят до концентрации 2,5×10/мл и вносят в 4 пластиковые чашки Петри по 1 мл в каждую. В пробу клеток №1 (контроль) вносят 100 мкл среды 199 и инкубируют в отсутствии других воздействий, в пробу №2 вносят такой же объем среды 199 и помещают в условия СВЧ-облучения, в пробу №3 вносят по 100 мкл коллоидного раствора НЧ Ag в концентрации 34 мкг/мл и инкубируют в отсутствии других воздействий, в пробу №4 вносят такой же объем НЧ Ag и помещают в условия СВЧ-облучения.
6
Свежевыделенные опухолевые клетки получают из удаленной опухоли, не подвергавшейся неоадъювантной химио- или лучевой терапии, следующим образом: образец ткани гомогенизируют с трипсином и раствором Версена в соотношении 1:3, помещают на магнитную мешалку на 20 мин, добавляют среду 199 с 8% эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, доводят концентрацию до 1,5×10/мл средой 199. Взвесь клеток помещают в 4 пластиковые чашки Петри по 1 мл в каждую. В пробу клеток №1 (контроль) вносят 100 мкл среды 199 и инкубируют в отсутствие других воздействий, в пробу №2 вносят такой же объем среды 199 и помещают в условия СВЧ-облучения, в пробу №3 вносят 100 мкл коллоидного раствора НЧ Ag в концентрации 34 мкг/мл и инкубируют в отсутствие других воздействий, в пробу №4 вносят такой же объем НЧ Ag и помещают в условия СВЧ-облучения.
СВЧ-облучение проводят на установке Яхта-3, частота 915 МГц, что обеспечивает нагрев до 42°С; время инкубации всех проб составляет 30 мин. По окончании инкубации определяют процент погибших клеток по окрашиванию трипановым синим.
Результаты представлены в таблице.
Процент погибших клеток свежевыделенных (плоскоклеточный рак) и линейных (К562) культур при воздействии НЧ Ag в присутствии и в отсутствии СВЧ-облучения
Пробы
% погибших клеток
Плоскоклеточный рак
К562
Контроль
40
15
СВЧ
70
60
HЧ Ag
80
31
СВЧ + НЧ Ag
100
95
НЧ Fe
65
-
СВЧ + НЧ Fe
70
-
НЧ Zn
70
-
СВЧ + НЧ Zn
85
-
Как видно из представленных данных, под действием НЧ Ag наблюдается двукратное повышение процента погибших клеток как К562, так и свежевыделенных клеток плоскоклеточного рака. СВЧ-облучение также вызывает усиление гибели опухолевых клеток, однако оно неодинаково в линейной и свежевыделенной культуре: в первом случае оно в 4 раза выше, во втором - в 1,75 раза выше, чем в контроле. Сочетанное использование НЧ Ag с СВЧ-облучением приводит к существенному увеличению цитотоксического эффекта каждого отдельного воздействия, при этом количество погибших клеток К562 достигает 95%, а клеток плоскоклеточного рака - 100%.
Для сравнения с эффектом НЧ Ag в таблице приведены результаты действия на клетки плоскоклеточного рака НЧ Zn и НЧ Fe как отдельно, так и при СВЧ-облучении. Как видно из таблицы, они ниже и не достигают 100%.
Итак, показан высокий цитотоксический эффект НЧ Ag на опухолевые клетки, особенно в сочетании с СВЧ-облучением на клетки, выделенные из первичной опухоли (плоскоклеточного рака).
Технико-экономическая эффективность «Способа индукции цитотоксического действия на опухолевые клетки» заключается в том, что при применении НЧ Ag в сочетании с СВЧ-облучением на клетки, выделенные из первичной опухоли человека (плоскоклеточного рака), достигнут высокий до 100% цитотоксический эффект. СВЧ-облучение вызывает усиление гибели опухолевых клеток линейной культуры в 4 раза, свежевыделенной - в 1,75 раза по сравнению с контролем, при этом количество погибших клеток К562 достигает 95%, а клеток плоскоклеточного рака - 100%.