ПОЛИПЕПТИД, ИМЕЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА
POLYPEPTIDE DEMONSTRATING ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND SUITABLE FOR OBTAINING THERAPEUTIC MEDICATIONS FOR TREATMENT OF HUMAN BACTERIAL INFECTIONS

Область техники, к которой относится изобретение.
Настоящее изобретение относится к биохимии, а именно к новым пептидным соединениям, обладающим бактерицидным эффектом. Более конкретно данное изобретение относится к применению таких соединений для производства лекарственных препаратов для профилактики или терапевтического лечения бактериальной или грибковой инфекции человека.
Уровень техники.
С середины прошлого столетия для борьбы с бактериальными инфекциями широко применяют антибиотики, однако использование антибиотиков сталкивается с проблемой появления устойчивых штаммов микроорганизмов. Увеличение устойчивости к классическим антибиотикам отмечено у целого ряда патогенов человека: Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeroginosa, Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae. Salmonella typhi. В связи с этим явлением поиск новых веществ, обладающих антимикробной активностью, является актуальной задачей. Открытие в 1980-х годах антимикробных пептидов, как ключевых инструментов системы врожденного иммунитета, позволяет разрабатывать на их основе антибиотики с принципиально новым механизмом действия, который не вызывает появления устойчивости у бактерий. Поэтому антимикробные пептиды могут стать альтернативой классическим антибиотикам (Giuliani et al., 2008, Cell. Mol. Life Sci., 65, 2450-2460).
Антимикробные пептиды были выделены из растений, насекомых, рыб, земноводных и млекопитающих (Ganz Т., 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen, 8, 209-217). Эти пептиды различаются по длине, аминокислотному составу и структуре, но большинство из них небольшие катионные амфипатические пептиды с широким спектром действия против грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий, дрожжей, грибов и оболочечных вирусов. Несколько белков и пептидов человека также обладают антимикробной активностью и играют важную роль в системе врожденного иммунитета.
К настоящему моменту известны три основные группы антимикробных пептидов человека (Табл.1. Аминокислотные последовательности дефенсинов, гистатинов и кателицидина (LL-37)): дефенсины, гистатины, кателицидины (Contreras R., 2005, Biotechnology Letters, 27, 1337-1347).
Дефенсины - катионные пептиды, содержащие три дисульфидные связи между шестью остатками цистеина, и имеющие трехпетельную бета-складчатую пространственную структуру. У человека было обнаружено два класса дефенсинов: альфа-дефенсины и бета-дефенсины. Альфа-дефенсины являются хемоаттрактантами по отношению к моноцитам, дендритным клеткам и Т-лимфоцитам. Они являются важным компонентом иммунной системы человека, осуществляя защиту организма от инфекции и участвуя в развитии адаптивного (приобретенного) иммунного ответа. Бета-дефенсины - хемоаттрактанты для дендритных и Т-клеток памяти через хемокиновый рецептор CCR6 (Tang Y.-Q. et al., 1999, Science 286, 498-502). На мышиной модели показано, что человеческие дефенсины, введенные интраназально, усиливают приобретенный иммунный ответ, увеличивая уровень антиген-специфичных IgG и IgM в сыворотке крови (Lillard J.W. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96, 651-656). Дефенсины проявляют высокую антибактериальную, антигрибковую и антивирусную активность против широкого спектра микроорганизмов (Selsted M.E. et al., 1984, Infect. Immun. 46, 150-154). В опытах in vitro минимальная концентрация ингибирующая рост микроорганизмов для большинства дефенсинов находится в интервале 0.5-10 мкМ (Risso А., 2000, J. Leukoc. Biol. 68, 785-792). Эти данные доказывают, что дефенсины участвуют в процессах врожденного и приобретенного иммунитета.
Гистатины - небольшие, катионные, гистидин-обогащенные пептиды, обнаруженные в слюне человека (MacKay B.J. et al., 1984, Infect. Immun. 44, 688-694). Эти пептиды продуцируются и секретируются подчелюстными, подъязычными и околоушными гландами (van derSpek J.C. et al., 1989, Am. J. Hum. Genet. 45: 381-387). Исследования показали, что гистатины обладают некоторым бактерицидным и, что особенно важно, фунгицидным действием (Pollock J.J. et al., 1984, Infect. Immun. 44: 702_707). Эти пептиды являются частью системы врожденного иммунитета и играют ключевую роль в ограничении инфекций полости рта. Гистатины имеют неупорядоченную структуру в водных растворах и образуют альфа-спираль в неводных растворителях.
Третья группа антимикробных пептидов человека содержит только один пептид - кателицидин LL-37. LL-37 образуется при протеолитическом отщеплении С-концевой части белка hCAP18, который экспрессируется в лейкоцитах, таких как нейтрофилы, моноциты, NK-клетки, Т-клетки, В-клетки, и в эпителиальных клетках кожи, желудочно-кишечного и дыхательного трактов (Gudmundsson G.H. et al.,1996, Eur. J. Biochem. 238, 325-332). Повышение экспрессии LL-37 происходит в ответ на воспалительный или инфекционный процесс (Frohm М., 1997, J. Biol. Chem. 272, 15258-15263). LL-37 обладает антимикробной активностью против грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий (Turner J. et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemother., 42, 2206-2214), а также способностью связывать и нейтрализовывать липополисахарид (LPS) бактерий и защищать против эндотоксического шока при гнойной инфекции (Bals R. et al., 1999, Infect. Immun. 67, 6084-6089). Кроме того, LL-37 является хемоаттрактантом для нейтрофилов, моноцитов, тучных клеток и Т-лимфоцитов, стимулирует ранозаживление и реэпитализацию кожи (Zanetti М., 2004, J. Leukoc. Biol. 75, 39-48). LL-37 состоит из 37 аминокислот, не содержит цистеина и имеет линейную структуру. Так же, как и гистатин, кателицидин обладает неупорядоченной структурой в гидрофильном окружении и образуют амфипатическую альфа-спираль в гидрофобной среде.
Основной механизм действия антимикробных пептидов человека основан на электростатическом связывании положительно заряженного пептида с отрицательно заряженными компонентами внешней мембраны патогена, которые представлены липополисахаридом (LPS) у грамм-отрицательных бактерий, полисахаридом (тейхоевой кислотой) у грамм-положительных бактерий и фосфолипидами. Следующее за связыванием с мембраной встраивание пептида в липидный бислой бактериальной клетки приводит к образованию пор, к хаотизации липидного бислоя и, в конечном счете, к разрушению микроорганизма (White et al. 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 521-527).
В базах данных по антимикробным пептидам содержится более полутора тысяч веществ (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). к настоящему времени некоторые из них находятся на разных стадиях клинических испытаний в качестве лекарственных средств для лечения и профилактики местных и системных инфекций (Gordon Y.J. et al., 2005, Curr Eye Res. July, 30(7), 505-515), но необходимость в создании новых структур, пригодных для получения на их основе лекарственных средств, только возрастает. Поскольку пептиды-кандидаты для использования в качестве лекарственных средств должны не только обладать нужной биологической активностью, но и быть пригодными для промышленного получения. С этой стороны вышеприведенные пептиды обладают некоторыми недостатками: гистатины проявляют большую фунгицидную активность, нежели бактерицидную, и это ограничивает их применение, а дефенсины, ввиду их структуры, сложны для получения, поскольку в процессе образования трех дисульфидных связей между остатками цистеина могут образовываться изомерные продукты, которые не обладают биологической активностью. В то же время, кателицидин (LL-37) не содержит цистеинов, поэтому может быть получен при помощи химического синтеза с высоким выходом и обладает мощным бактерицидным эффектом. LL-37 является наиболее близким к заявляемому пептиду по структуре и антимикробным свойствам. Подробные сведения о свойствах LL-37 и его фрагментов, а также о применении этих пептидов для лечения различных бактериальных инфекций человека можно найти в патентах WO 2009/001087, WO 2004/067025, WO 96/08508, RU 2346950.
Настоящее изобретение решает задачу расширения арсенала антимикробных пептидов пригодных для получения на их основе лекарственных средств для лечения и профилактики бактериальных инфекций человека.
Раскрытие изобретения.
Поставленная задача решается за счет структуры пептида SE-41, являющегося ретропоследовательностью С-концевой части белка CAP 18, обладающего антимикробной активностью и имеющего следующий аминокислотный состав SEQ ID NO:1: SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSKRFFDGLLAFRK, а также фрагментов пептида SE-41, имеющих в своем составе от 16 до 40 аминокислот и выбранных из группы, состоящей из
соответственно. Аминокислотные последовательности заявляемых пептидов приведены в табл.2.
Ретро-пептиды это молекулы, имеющие топохимическое сродство с исходными пептидами, изомерные природным пептидам и отличающиеся от них противоположным направлением пептидных связей. Такие молекулы могут обладать биологической активностью исходных соединений. Для С-концевого фрагмента белка CAP 18 человека компьютерная модель альфа-спирали как прямой, так и ретро-последовательности, указывает на высокую вероятность образования в физиологических условиях амфипатичекой структуры, что является ключевым фактором для проявления пептидами бактерицидной активности.
Помимо самих ретро-пептидов изобретение охватывает также аналоги ретро-пептидов и модифицированные ретро-пептиды. К аналогам относят пептиды, полученные путем замены одной или нескольких аминокислот на гомологичные, а также пептиды, являющиеся ретро-последовательностями С-концевой части белка CAP 18 различных млекопитающих, например, макаки, гиббона, орангутанга, шимпанзе, крысы, гориллы, мыши и т.д., последовательности которых можно найти в общедоступных базах данных (http://au.expasy.org/cgi-bin/blast.pl). Дополнительным аспектом изобретения являются пептиды, полученные из SE-41 SEQ ID NO:1 и его фрагментов путем замены одной или нескольких аминокислот на гомологичную. Следующие пары аминокислот относят к близким, гомологичным, выбор любой аминокислоты из пары не приводит к заметному изменению свойств пептида: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly (WO 2004/108752). Еще одним аспектом изобретения являются модифицированные пептиды, которые содержат аминокислоты в D форме и/или альфа-аминогруппа N-концевой аминокислоты ацетилирована, а альфа-карбоксильная группа С-концевой аминокислоты амидирована. Такие модификации позволяют повысить устойчивость пептидов к действию протеолитических ферментов.
Таким образом, с учетом всех условий формулу заявляемых пептидов можно представить в общем виде:
и где аминокислоты, составляющие полипептид, выбраны независимо из D или L форм. Технический результат заявляемого изобретения достигается за счет таких свойств нового пептида, как: возможность получения пептида при помощи химического синтеза, бактерицидная активность, ранозаживляющее действие.
Поскольку заявляемые пептиды относительно небольшие по размеру и содержат в своем составе от 16 до 41 аминокислоты, то они могут быть получены при помощи химического синтеза. Кроме того, пептиды являются линейными и не содержат цистеинов, что также упрощает их получение химическим синтезом, поскольку исключена возможность образования неактивных изомеров при замыкании дисульфидных связей.
Дополнительными признаками заявляемых пептидов, которые обеспечивают бактерицидное действие, являются положительный суммарный заряд и способность образовывать амфипатическую альфа-спираль в неводном окружении. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей пептидов SE-41 и его ближайшего известного аналога LL-37, проведенный при помощи программы на Интернет-сайте базы данных антимикробных пептидов (http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php), приведен в табл.3.
Таблица 3.Свойства пептидов SE-41 и LL-37.
Пептид
LL-37
SE-41
Количество гидрофобных остатков
13
15
Количество остатков глицина и пролина
3
3
Отрицательно заряженные аминокислоты
5
5
Положительно заряженные аминокислоты
11
13
Другие аминокислоты
5
5
Процент гидрофобности
35%
36%
Суммарный заряд
+6
+8
Белок-связывающий потенциал (индекс Бомана)
2.99 ккал/моль
3.08 ккал/моль
Число гидрофобных остатков, находящихся на одной поверхности
10
13
Способность взаимодействовать с липидными мембранами
+
+
Из данных, представленных в таблице 3, следует, что ключевые для образования амфипатической альфа-спирали и проявления пептидом бактерицидных свойств параметры, а именно положительный суммарный заряд, процент гидрофобности, индекс Бомана (Boman, H.G. (2003) J.Inter.Med. 254: 197-215) и число гидрофобных остатков на одной стороне поверхности молекулы, лучше для заявляемого пептида SE-41 SEQ ID NO:1 по сравнению с известным аналогом LL-37.
Дополнительным аспектом изобретения является бактерицидная активность заявляемых пептидов, показанная в опытах с применением проточной лазерной цитофлуориметрии на бактериях Staphylococcus aureus (Wood46). Для полного ингибирования роста перечисленных микроорганизмов в опытах in vitro необходимы микромолярные концентрации заявляемых пептидов. При этом LD50 для SE-41 составляет 4.0 мкг/мл, а для LL-37 - 4.3 мкг/мл. Кроме того, бактерицидная активность была показана для следующих фрагментов пептида SE-41: SE37, IR20, IR24, LN31, LN35, характеризующихся тем, что имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:151.
Дополнительно бактерицидные свойства заявляемых пептидов, на примере пептидов SE41, LN31, IR20, IR24, характеризующихся тем, что имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:90, были подтверждены в классическом бактериологическом опыте ингибиции образования колониеобразующих единиц на твердых питательных средах на чашках Петри. Также заявляемые пептиды оказывают ранозаживляющее действие в опытах на модели плоскостного раневого дефекта у лабораторных мышей в концентрации 25 мкг/мл. Таким образом, совокупность существенных признаков заявляемых пептидов позволяет достичь технического результата - использовать новые бактерицидные пептиды для получения лекарственных средств для лечения и профилактики бактериальных инфекций человека.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Синтез пептида SE41 SEQ ID NO:1:
Получение Fmoc-Lys(Boc)-P (I).
2
2
2
П-алкоксибензильный полимер с содержанием гидроксильных групп 0,37 ммоль/г промывают диметилформамидом, диэтиловым эфиром и сушат на стеклянном фильтре. В минимальном объеме диметилформамида суспендируют 300 мг n-алкоксибензильного полимера и 13,2 мг диметиламинопиридина (0,11 ммоль). В 5 мл диметилформамида растворяют 515 мг (1,1 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 149 мг (1,1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, и 172 мкл (1,1 ммоль) NN'-диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0°С и затем приливают к суспендированному полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом и обрабатывают 5 мл смеси AcO-пиридин-CHCl (20:20:60) в течение 1 ч, после чего полимер промывают изопропанолом и диметилформамидом.
Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-P (II).
а) Полученный на предыдущем этапе пептидил-полимер (I) в течение 20 мин. обрабатывают 20%-ным раствором пиперидина в диметилформамиде. Полимер промывают последовательно 5 мл следующих растворителей: диметилформамидом - 3 раза по 2 мин, смесью диоксан-вода (2:1) - 2 раза по 5 мин, диметилформамидом - 5 раз по 2 мин.
2
б) В 5 мл диметилформамида растворяют 713 мг (1,1 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH, 149 мг (1,1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 172 мкл (1,1 ммоль) NN'-диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0°С и затем приливают к суспендированному полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом и обрабатывают 5 мл смеси АсO-пиридин-диметилформамид (20:20:60) в течение 1 ч, после чего полимер последовательно промывают диметилформамидом, изопропанолом, диметилформамидом.
Синтез пептида SE41: SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSKRFFDGLLAFRK.
Синтез полипептидной цепи проводят вручную в стеклянном проточном реакторе (2×20 см) по следующему протоколу для каждого синтетического цикла (из расчета 8-10 мл растворителя на 300 мг исходного полимера), при проведении реакции конденсации (операция 6) используют объем реакционной смеси 3-4 мл:
1. DMF (5×2 мин);
2. 20% пиперидин в DMF (20 мин);
3. DMF (3×2 мин);
4. диоксан-вода, 2:1, (2×5 мин);
5. DMF (5×2 мин);
6. Реакция конденсации: 10 экв. активированной Fmoc-аминокислоты (4 ч);
7. DMF (3×2 мин);
2
8. ацетилирование: АсО-пиридин-диметилформамид, 20:20:60, (1 ч);
9. DMF (3×2 мин);
10. изопропанол (3×2 мин);
Для активации Fmoc-производных аминокислот DIPCDI/HOBT-методом к раствору 10 экв.(1.1 ммоль) Fmoc-защищенной аминокислоты и 149 мг (10 экв., 1.1 ммоль) HOBt в 3-4 мл DMF добавляют 172 мкл (10 экв., 1.1 ммоль) DIPCDI, раствор перемешивают 10 мин.
Полноту протекания реакции конденсации контролируют с помощью нингидринового или, в случае N-концевого пролина, пикринового тестов после операции 6 синтетического протокола.
Для реакции отщепления пептида от полимера и одновременного деблокирования защитных групп боковых цепей аминокислот отбирают 300 мг пептидил-полимера (из 1.2 г пептидил-полимера). К пептидил-полимеру приливают 5 мл смеси TFA-EDT-DMS-м-крезол в объемном соотношении 91:3:3:3, суспензию перемешивают в течение 2 ч, затем полученный раствор пептида отфильтровывают от полимера, промывают 5 мл TFA и избыток TFA упаривают при пониженном давлении. Пептид осаждают 100 мл этилового эфира, отфильтровывают и промывают эфиром (5×20 мл). Осадок растворяют в 5 мл 10% АсОН 20 мин, отфильтровывают и промывают 5 мл 10% АсОН. Полученный раствор пептида лиофилизовывают и обессоливают на колонке (2,5×60 см) с Сефадексом G-10 в 0.1М АсОН. Очистку пептида проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила (от 10% до 70% за 60 мин) в 0,1% TFA при расходе элюента 4 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Фракции, соответствующие основному пику на хроматограмме, собирают и лиофилизируют. Выход пептида в расчете на С-концевую аминокислоту составил 30%. Пептид анализируют с помощью аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят в градиенте ацетонитрила в 0,1% TFA (от 10% до 70% за 60 мин) при расходе элюента 1 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Время удерживания пептида в условиях аналитической ВЭЖХ составило 40,3 мин. Экспериментальная молекулярная масса 4993.5, теоретическая молекулярная масса 4992.9.
Сокращения:
DIPCDI-N,N'-диизопропилкарбодиимид; Fmoc-9 - флуоренилметилоксикарбонил; НОВТ - 1-гидроксибензотриазол; TFA - трифторуксусная кислота; DMAP - диметиламинопиридин; EDT - этандитиол; DMS - диметилсульфид; АсОН - уксусная кислота; DMF - диметилформамид
Пример 2. Оценка бактерицидной активности пептидов LL-37 и SE-41 методом проточной лазерной цитофлуориметрии.
Антимикробные свойства синтетических катионных пептидов (LL37 и SE41) исследуют на модели St. aureus (Wood46).
8
+
+
+
8
Суточную агаровую культуру St.aureus (штамм Wood46) смывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ), дезинтегрируют с помощью ультразвука на УЗ-бане (51 кГц, 90 W) 2 часа, осаждают при 1000 g 25 мин и отмывают 10 мл ФСБ. Второй раз отмывку проводят 0,01М карбонатно-бикарбонатным буфером (рН=9,5). Ресуспендируют в этом же буфере и по стандарту мутности концентрацию бактерий доводят до 1×10/мл. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор изотиоцианат флуоресцеина - ФИТЦ (Сигма) из расчета 1 мг/мл и выдерживают карбонатно-бикарбонатном буфере рН=9,5 в течение 16 часов при +4°С в темноте (St.aureus-ФИТЦ). После инкубации St.aureus-ФИТЦ трижды отмывают ФСБ (1000g 25 мин), ресуспендируют в ФСБ с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% ДМСО. Концентрацию St.aureus-ФИТЦ доводят до 5×10/мл с помощью Tru Count пробирок (Becton Dickinson) с известным количеством микробусинок. Аликвоты хранят при -70°С.
После разморозки аликвоты бактерий, осаждают и отмывают в 10 мМ растворе ФСБ рН=7,4 2 раза при 1000g 25 мин.
+
7
+
Реакцию бактерицидной активности биологических жидкостей проводят в 96-луночном круглодонном планшете. Для этого инкубируют 90 мкл катионных пептидов и 90 мкл St.aureus-ФИТЦ (1×10 КОЕ/мл) в течение 3 часов при +37°С. Контролем реакции является спонтанная гибель St.aureus-ФИТЦ (бактерии с ФСБ, находящиеся в тех же условиях).
После инкубации к бактериям вносят пропидиум иодид (2,5 мкг/мл) на ФСБ. Как известно, пропидиум иодид проникает и окрашивает только убитые клетки. Через 10 мин образцы анализируют на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson) в программе CellQuest в координатах FL1 и FL3. Среди общей популяции клеток стафилококка, окрашенных ФИТЦ (зеленый флуорохром), определяют процент клеток стафилококка, окрашенных в пропидиум иодидом (красный флуорохром) (Табл.4. Антибактериальная активность синтетических кателицидинов). Далее при помощи программы Exel рассчитывают LD50 методом Ашмарина-Кербера (Табл.5. Определение LD50 препаратов в отношении St.aureus Wood46).
Таблица 4.Антибактериальная активность пептидов LL-37 и SE-41.
№ опыта
Процент гибели St.aureus
LL37 мкг/мл
SE41 мкг/мл
0
1
10
100
0
1
10
100
1
1
5
70
83
2
6,4
67,4
78
2
1
5
70
84
2
6
82
74
3
1
4,9
73
86
2
7
88,9
82
4
1,98
11,98
76,7
88,5
3
7
81,7
71,2
5
1,98
11
88,68
91,5
3
7,2
81,5
75,9
6
1,98
12
79,7
94,5
3
8
87,8
73,8
Таблица 5.Определение LD50 пептидов LL-37 и SE-41 в отношении St.aureus Wood46.
№ опыта
LD50, мкг/мл
LL37
SE41
1
5,0
5,4
2
5,0
3,9
3
4,7
3,4
4
4,0
3,9
5
3,3
3,9
6
3,8
3,5
Ср.знач
4,3
4,0
Станд.отклон
0,7
0,7
Пример 3. Оценка антимикробного действия синтетических катионных пептидов LL37 и SE41 при помощи классического бактериологического метода.
Оценку антимикробного действия полученных синтетических катионных пептидов (кателицидинов) осуществляли классическим бактериологическим методом. Антимикробные свойства синтетических катионных пептидов (LL37 и SE41) исследовали на модели St.aureus (Wood46) и Escherichia coli (ATCC 25922).
620
7
7
Культуру бактерий, выращивают на скошенном триптиказосоевом агаре (Beckton Dickinson), смывают 10 мМ физиологическим раствором PBS (Sigma) рН=7,4 и осаждают при 1000g 25 мин. Далее отмывают в PBS и осадок ресуспендируют в PBS. Методом высева на плотные питательные среды определяют в трех независимых опытах количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Оптическую плотность (OD) бактериальной суспензии измеряют на спектрофотометре Beckman Coulter DU 730 при λ=620 нм. OD, равная 0,2, соответствует 5×10 КОЕ/мл. Концентрацию бактерий во всех опытах доводят PBS до 1×10 КОЕ/мл.
50
Эксперимент проводят в стерильных пластиковых пробирках объемом 1,5 мл (Sarstedt). В пробирки вносят 10 мкл бактерий, 10 мкл раствора синтетического пептида в соответствующей концентрации и 30 мкл PBS. В контрольную пробирку пептид не вносят. При оценке антибактериального действия пептидов на модели St. aureus и E.coli используют концентрации 0.2, 2 и 20 мкг/мл и 2.5, 5, 10 и 20 мкг/мл соответственно. Пластиковые пробирки со смесью бактерий и пептидов инкубируют в водяной бане TW-2.02 (ELMI) в течение 3 ч при 37°С. После инкубации смеси разводят раствором PBS и делают высевы в объеме 50 мкл на триптиказосоевый агар (Beckton Dickinson) в чашках Петри. Чашки помещают в термостат при 37°С на 18-24 час, после чего производят подсчет выросших колониям. Определяют процент убитых бактерий по отношению к контролю и рассчитывают LD по методу Рида и Менча.
Результаты экспериментов представлены в табл.6. Оценка противомикробного действия препаратов на модели St.aureus(Wood46) и табл.7. Оценка противомикробного действия препаратов на модели Е.coli (АТСС 25922), а также на фиг.1. Эффект подавления роста бактериальной культуры (St. aureus Wood 46) и фиг.2. Эффект подавления роста бактериальной культуры на модели Е.coli (ATCC 25922). Результаты экспериментов показывают, что оба пептида LL-37 и SE-41 обладают высокой бактерицидностью по отношению к St.aureus и E.coli, причем в низких концентрациях эффект на Е.coli пептида SE-41 выше, чем LL-37.
Таблица 6.Оценка противомикробного действия препаратов на модели St.aureus (Wood46).
Пептид
Доза (мкг/мл)
0
0,2
2
20
колонии
колонии
колонии
колонии
№
число
% убитых
число
% убитых
число
% убитых
число
% убитых
LL37
1
67
0
56
16,4
30
46,4
3
99
2
67
0
55
17,9
31
43,6
5
98,4
3
67
0
50
25,4
30
40,0
2
99,3
М±δ
67±0
0±0
53.7±3.2
19.9±4.8
30.3±0.6
43.4±3.2
3.3±1.5
98.9±0.5
SE41
1
70
0
66
5,8
34
47,6
3
91,1
2
70
0
60
14,4
33
45,2
0
100
3
70
0
61
13,2
33
45,6
4
98,8
М±δ
70±0
0±0
62.3±3.2
11.1±4.7
33.3±0.6
46.1±1.3
2.3±2.1
99.3±0.6
Таблица 7.Оценка противомикробного действия препаратов на модели Е.coli (ATCC 25922).
Пептид
0
2,5
10
20
колонии
колонии
колонии
колонии
LL37
№
число
% убитых
число
% убитых
число
% убитых
число
% убитых
1
42
0
36
14
17
59,5
2
95
2
30
0
24
20
4
86,7
2
93
3
30
0
24
20
1
96,7
2
93
М±δ
34±7
0±0
28±7
18±3
7.3±8.5
81±19
2±0
94±1
SE41
1
30
0
24
20
3
90
2
93.3
2
31
0
25
19
2
83,3
2
93.3
3
30
0
20
33
5
93,5
2
93.5
М±δ
30±0.5
0±0
23±2
24±6
3±1.2
89±4
2±0
93±1
Таблица 8.Определение LD50 пептидов LL-37 и SE-41 на модели St. aureus (Wood 46).
№ опыта
LD50, мкг/мл
LL37
SE41
1
1,5
1,9
2
1,6
1,7
3
1,3
1,7
ср.знач
1,5
1,8
ст.откл
0,2
0,1
Таблица 9.Определение LD50 пептидов LL-37 и SE-41 на модели Е.coli (ATCC 25922).
№ опыта
LD50, мкг/мл
LL37
SE41
1
4,5
3,5
2
5,3
3,5
3
4,2
3,1
ср.знач
4,7
3,4
ст.откл
0,6
0,2
Пример 4. Изучение ранозаживляющего действия пептида SE41 на модели плоскостного раневого дефекта у лабораторных мышей.
1
Ранозаживляющее действие SE41 оценивали на полнослойной ране у 20 мышей F (CBA×C57 BL/6). Под легким эфирным наркозом у животных выбривают шерсть на спине, по трафарету наносят «метку» 0,5 см ×0,5 см и вырезают полнослойный лоскут кожи, моделируя стандартный по площади раневой дефект. Через сутки после нанесения раны животных распределяют на 4 группы по 5 мышей:
1 гр. - контрольные мыши, которым на рану капают физраствор.
2 гр. - мыши, которым на рану капают раствор SE41 в концентрации 100 мкг/мл.
3 гр. - мыши, которым на рану капают раствор SE41 в концентрации 50 мкг/мл.
4 гр. - мыши, которым на рану капают раствор SE41 в концентрации 25 мкг/мл.
Животных каждой группы содержат в отдельных клетках в одинаковых условиях по 5 шт. при свободном доступе к воде и пище.
Для приготовления рабочих растворов SE41 используют стерильную апирогенную воду с добавлением 0,9% стерильного хлористого натрия. Приготовленный таким образом физраствор служит основой для дальнейшего разведения SE41 до рабочих концентраций. Растворы SE41 готовят перед нанесением на раны.
На рану растворы SE41 капают через сутки после травмы с помощью инсулинового шприца без иглы по 0,1 мл, далее ежедневно в течение 7 дней.
На 2, 4, 8 и 11 день от начала эксперимента проводят измерение величины ран по массе слюдяных выкроек. Результаты измерений представлены в табл.10-14.
Таблица 10.Изменение величины раневой поверхности у мышей контрольной группы.
№ животного
Масса выкройки (мг)/День наблюдений
2
4
8
11
14
15
1
6,5
5,0
2,5
1,5
0
2
6,0
5,0
2,0
1,0
0
3
6,5
5,0
2,5
1,5
0
4
6,0
5,0
1,5
1,0
0
5
6,0
5,0
1,5
0
Среднее
6,2
5,0
2,0
1,0
0
Результаты наблюдения показывают, что в контрольной группе мышей, без использования на ране препарата SE41, раны зажили к 14 дню, у одной мышки из 5 раневой дефект отсутствовал на 11 день после травмы.
Таблица 11.Изменение величины раневой поверхности у мышей группы №2
№ животного
Масса выкройки (мг)/День наблюдений
2
4
8
11
14
15
1
6,0
6,0
3,5
1,5
0,5
0
2
6,0
5,5
4,0
1,0
0
0
3
6,5
6,0
4,5
2,0
0,5
0
4
6,0
6,0
3,5
1,0
0
0
5
6,0
6,0
3,5
1,5
0,5
0
Среднее
6,1
5,9
3,8
1,4
0,3
0
Необходимо отметить, что при нанесении раствора SE41 в концентрации 100 мкг/мл животные проявляли двигательное беспокойство, после чего начинали вылизывать друг другу раневую поверхность. В дальнейшем раны у животных этой группы внешне отличались от ран у животных других групп. Через 48 часов после травмы у животных контрольной группы, №3 и №4 раневой дефект представлял собой сухой струп (корочку), у животных гр. №2 в течение 4 суток после травмы рана была сухой, но корочки не образовывалось, края раны при этом казались приподнятыми над дном раны. Далее сформировался сухой струп и внешний вид уже не отличался, но размеры в среднем были больше, полная краевая эпителизация закончилась к 15 суткам.
Таблица 12.Изменение величины раневой поверхности у мышей группы №3
№ животного
Масса выкройки (мг)/День наблюдений
2
4
8
11
14
15
1
6,0
5,0
2,0
1,5
0,5
2
6,0
5,0
2,0
1,0
0,5
3
6,5
5,0
1,5
1,5
0
4
6,0
4,5
1,5
1,0
0
5
6,5
5,0
2,0
1.5
0,5
Среднее
6,2
4,9
1,8
1,3
0,3
В группе №3 результаты измерения раневого дефекта практически не отличались от контрольной группы, в то же время некоторую тенденцию к ускорению процесса регенерации на 4-8 сутки после раны следует отметить.
В группе №4 при лечении ран раствором SE41 в концентрации 25 мкг/мл у всех мышей выявлено ускорение заживления раневого процесса.
Таблица 13.Изменение величины раневой поверхности у мышей группы №4.
№ животного
Масса выкройки (мг)/День наблюдений
2
4
8
11
14
15
1
6,5
5,0
2,0
0,5
2
6,0
4,5
1,5
0
3
6,5
5,0
2,0
0,5
4
6,0
5,0
1,5
0
5
6,5
4,5
1,5
0
Среднее
6,3
4,8
1,3
0,5
Таблица 14.Суммарные данные по ранозаживляющему эффекту SE41 (массы
Доза (мкг/мл)
Дни наблюдений
2
4
8
11
14
15
0
6,2
5,0
2,0
1,0
0
0
25
6,3
4,8
1,3
0,5
0
0
50
6,2
4,9
1,8
1,3
0,3
0
100
6,1
5,9
3,8
1,4
0,3
0
выкройки в мг).
Таким образом, по результатам данного эксперимента можно сделать вывод о наличии у пептида SE41 ранозаживляющей активности при местном его использовании в концентрации 25-50 мкг/мл. Наилучший эффект наблюдается при применении раствора SE41 с концентрацией 25 мкг/мл.
Пример 5. Оценка бактерицидной активности фрагментов пептида SE-41 методом проточной лазерной цитофлуориметрии.
Оценку бактерицидной активности пептидов проводят, как описано в примере 2. Результаты определения LD50 приведены в табл.15. LD50 пептида SE-41 и его фрагментов в отношении St.aureus (Wood 46) в проточной цитофлуориметрии.
Таблица 15.
LD50 пептида SE-41 и его фрагментов в отношении St.aureus (Wood 46) в проточной цитофлуориметрии.
SEQ ID NO:
Название
LD50, мкг/мл
SEQ ID NO:1
SE41
5,0+0,5
SEQ ID NO:5
SE37
3,9+0,4
SEQ ID NO:20
IR20
3,8+0,6
SEQ ID NO:26
IR16
4,1±0,1
SEQ ID NO:90
IR24
44,8+13,1
SEQ ID NO:83
LN31
9,9+3,8
SEQ ID NO:151
LN35
8,5+1,2
Пример 6. Оценка антимикробного действия пептида SE41 и его фрагментов при помощи классического бактериологического метода.
Эксперимент по оценке антимикробного действия пептида SE41 и его фрагментов проводят, как описано в примере 3. Результаты приведены в табл.16. Оценка противомикробного действия пептида SE-41 и его фрагментов на модели St.aureus (Wood46).
Таблица 16.
Оценка противомикробного действия пептида SE-41 и его фрагментов на модели St.aureus (Wood46).
Пептид
Доза (мкг/мл)
0
2.5
5
10
колонии
колонии
колонии
колонии
№ опыта
число
% убитых
число
% убитых
число
% убитых
число
% убитых
SE41
1
64
0
36
43.7
4
91.3
0
100
2
64
0
31
51.6
2
94.3
0
100
3
64
0
31
51.6
2
95.0
0
100
М±δ
64±0
0±0
32.7±2.9
49.0±4.5
2.7±1.2
93.5±2.0
0±0
100±0
LN31
1
63
0
32
49.2
12
81.0
0
100
2
63
0
31
50.8
11
82.5
0
100
3
63
0
28
55.6
6
90.5
0
100
М±δ
63±0
0±0
30.3±2,1
51.9±3.3
9.7±3.2
84.7±5.1
0±0
100±0
IR20
1
57
0
14
75.4
2
96.5
2
96.5
2
46
0
14
69.6
1
97.8
0
100
3
46
0
14
69.6
1
97.8
0
100
М±δ
49.7±6.4
0±0
14.0±0
71.5±3.4
1.3±0,6
97.4±0.8
0.7±1.2
98.8±0.8
IR24
1
65
0
65
0
27
58.5
3
95.4
2
65
0
60
7.7
12
71.5
2
96.9
3
65
0
50
23.1
7
89.2
1
98,5
М±δ
65±0
0±0
58.3±7.6
10.3±11.8
15.3±10.4
76.4±16.0
2.0±1.0
96.9±1.5
IR16
1
67
0
55
18
24
60
19
71,6
2
63
0
54
14
22
63
16
74,6
3
58
0
53
9
21
65
14
76
М±δ
63±5
54±1
14±5
22±2
63±3
16±3
74±2
Таблица 17.
LD50 пептида SB-41 и его фрагментов в отношении St.aureus (Wood 46)
LD50, мкг/мл
SE41/SEQ NO NO:1
LN31/SEQ ID NO:83
IR20/SEQ ID NO:20
IR24/SEQ ID NO:90
IR16/SEQ ID NO:26
1
2,7
2,5
1,7
4,5
4,0
2
2,1
2,5
1,8
3,7
4,1
3
2,3
2,3
1,2
3,3
4,2
ср. знач
2,4
2,4
1,6
3,9
4,1
ст. откл
0,3
0,1
0,2
0,6
0,1
Аминокислотная последовательность пептида SE41 SEQ ID NO:1:
SETRPVLNRLFDKIRQVIRKFEKGIKEKSKRFFDGLLAFRK