СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИЙ FRANCISELLA TULARENSIS SUBSP. MEDIASIATICA
METHOD FOR DIFFERENTIATING FRANCISELLA TULARENSIS SUBSP MEDIASIATICA BACTERIA

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для экспресс-анализа при дифференциации одного из подвидов Francisella tularensis, а именно Francisella tularensis subsp.mediasiatica.
В настоящее время существует проблема ускоренной идентификации и быстрой внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя туляремии, отнесенного к категории A наиболее опасных агентов биотерроризма. Согласно современной классификации вид Francisella tularensis включает 4 подвида - Francisella tularensis subsp.nearctica, subsp.mediasiatica, subsp.holarctica и subsp.novicida, отличающиеся по ареалу распространения, биохимическим свойствам и патогенности для человека и животных. Эти обстоятельства определяют важность подвидовой дифференциации возбудителя туляремии при проведении микробиологических исследований для быстрого принятия решения о назначении адекватной антибактериальной терапии.
Известен способ дифференциации подвидов туляремийного микроба (см. авт. св. СССР №1655989, кл. C12Q 1/04, опубл. 15.06.91 г. БИ №22), заключающийся в том, что исследуемую культуру суспендируют в дистиллированной воде до концентрации 1-10 млрд. м.кл./мл, в качестве субстрата используют фенолфталеин фосфат в количестве 500-1500 мкг на 1 мл суспензии, инкубирование проводят в течение 10-15 минут, а в качестве реактива для визуализации ферментативной реакции используют щелочь.
Однако известный способ не может быть отнесен к экспрессным, так как требует определенных технологических операций и не позволяет провести дифференциацию между неарктическими и среднеазиатскими штаммами туляремийного микроба.
Наиболее близким по технической сущности является способ дифференциации среднеазиатского подвида туляремийного микроба (см. авт.св. СССР №1693063, кл. C12Q 1/04, опубл. 23.11.91 г. БИ №43), выполняемый путем нанесения исследуемых культур на подложку, в качестве которой используют фильтровальную бумагу, смоченную индикатором крезоловым красным в концентрации 1000-2000 мкг/мл и субстратом пенициллином в концентрации 2500-75000 мкг/мл, инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 минут и по появлению темно-красного окрашивания дифференцируют штаммы среднеазиатского подвида, а светло-желтого окрашивания - штаммы американского и голарктического подвидов.
Недостатком прототипа является наличие подготовительных работ, а именно приготовление растворов индикатора и субстрата, что не всегда возможно в стандартных условиях и к тому же увеличивает время получения результатов. Эти обстоятельства подтверждают, что известный способ не может рассматриваться как экспрессный.
Кроме того, нанесение культур на фильтровальную бумагу является отрицательным моментом в отношении соблюдения правил безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка экспресс-диагностики Francisella tularensis subsp.mediasiatica.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе дифференциации бактерий Francisella tularensis subsp.mediasiatica, включающем тестирование исследуемой культуры с помощью индикатора и субстрата, в качестве индикатора используют диски с нитроцефином, одновременно являющимся и субстратом, который в присутствии фермента β-лактамазы расщепляется с последующим окрашиванием, при этом диски предварительно смачивают стерильной дистиллированной водой и накладывают на исследуемые штаммы туляремийного микроба, затем при 37°C в течение 5-10 минут проводят инкубирование, учет результатов осуществляют по окраске дисков, штаммы Francisella tularensis среднеазиатского подвида не изменяют цвет дисков, а штаммы других подвидов окрашивают диски в красный цвет.
Кроме того, исследуемые штаммы туляремийного микроба предварительно выращивают в течение суток при 37°C на специальной питательной среде.
Способ осуществляется следующим образом.
Культуры исследуемых штаммов различных подвидов возбудителя туляремии выращивают в течение суток при температуре 37°C на специальной твердой питательной среде, предназначенной для культивирования F.tularensis (см. авт. св. СССР №1082816). После этого проводят внутривидовую дифференциацию F.tularensis по биохимическим свойствам (см. табл.1).
Из данных таблицы видно, что из четырех подвидов F.tularensis только у бактерий среднеазиатского подвида (Francisella tularensis subsp.mediasiatica) не обнаружена β-лактамазная активность. Используя эту особенность, заявитель предлагает применять коммерческие стандартные диски с нитроцефином, который в предложенном способе является индикатором и одновременно субстратом для β-лактамазы (хромогенный цефалоспорин, расщепляемый ферментом β-лактамазой с образованием окрашенного продукта) - фирмы BD, Becton, Dickinson and Company, USA. На практике упомянутые диски используют для детекции β-лактамаз (Эйдельштейн М.В. «β-лактамазы аэробных грамотрицательных бактерий: характеристика, основные принципы классификации, современные методы выявления и типирования», журнал «Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия» Москва, 2001 г., т.3, стр.223-242).
В предложенном способе диски, пропитанные нитроцефином, предварительно смачивают стерильной дистиллированной водой, после чего их накладывают на суточные агаровые культуры исследуемых штаммов. Затем в течение 5-10 минут образцы подвергают инкубированию при 37°C.
Учет результатов осуществляют по изменению окраски дисков, если цвет диска не изменился, это свидетельствует об отсутствии β-лактамазы у исследуемого штамма и подтверждает его принадлежность к среднеазиатскому подвиду, а штаммы других подвидов (F.tularensis subsp.nearctica, subsp.holarctica и subsp.novicida) окрашивают диски в красный цвет.
Данный способ апробирован на широкой коллекции культур РостНИПЧИ: Francisella tularensis subsp.nearctica - 6 штаммов, subsp.mediasiatica - 8 штаммов, subsp.holarctica - 33 штамма и другие франциселлы - 3 штамма (см. табл.2) и может быть использован для скрининга выделенных культур при микробиологических исследованиях и эпидемиологическом обследовании эндемичных по туляремии территорий.
Пример 1 - подтверждающий отсутствие β-лактамазной активности у исследуемых штаммов (см. фото, ряд III). На суточные агаровые культуры F.tularensis subsp.mediasiatica (148, 120, 240, 543), выращенные при 37°C на специальном питательном агаре, накладывают предварительно смоченные в стерильной дистиллированной воде диски с нитроцефином. В течение 15-30 минут инкубации при 37°C цвет диска не изменился, что свидетельствует об отсутствии β-лактамазы у исследуемого штамма, а следовательно, о его принадлежности к среднеазиатскому подвиду F.tularensis.
Пример 2 - подтверждающий наличие В-лактамазной активности у исследуемых штаммов (см. фото, ряд I, II, IV).
Так же, как в примере 1, предварительно выращивают культуры Francisella tularensis:
I ряд - F.philomiragia, F.tularensis subsp.novicida-like, F.tularensis subsp.novicida;
II ряд - F.tularensis subsp.nearctica (Schu, AE-261, Nevada, ACole);
IV ряд - F.tularensis subsp.holarctica (117, 250, 503).
Накладывают на суточные агаровые культуры различных штаммов диски с нитроцефином, предварительно смоченные в стерильной дистиллированной воде. В течение 5-10 минут проводят инкубацию при 37°C. Диски окрасились в красный цвет. Таким образом наглядно продемонстрировано, что все вышеуказанные штаммы характеризуются наличием β-лактамазы, расщепляющей нитроцефин (хромогенный цефалоспорин, являющийся субстратом для этого фермента) с образованием окрашенного продукта.
Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет коммерческих дисков с нитроцефином по β-лактамазной активности осуществлять экспресс-анализ при дифференциации штаммов F.tularensis subsp.mediasiatica (среднеазиатского подвида) от штаммов F.tularensis других подвидов.
Таблица 1
Подвид F.tularensis
Ферментация глицерина
Ферментация глюкозы
Активность ферментов
Цитруллин-уреидаза
Фосфатаза
Пенициллиназа (β-лактамаза)
F.tularensis subsp.nearctica
+
+
+
+
+
F.tularensis subsp.mediasiatica
+
-
+
+
-
F.tularensis subsp.holarctica
-
+
-
-
+
F.tularensis subsp.novicida (-like)
+
+
+
+
+
Таблица 2
Исследуемые культуры
Количество штаммов
Наличие β-лактамазы
Изменение цвета дисков с нитроцефином
F.tularensis subsp.nearctica
6
+
красный
F.tularensis subsp.mediasiatica
8
исходный
F.tularensis subsp.holarctica
33
+
красный
Другие франциселлы - F.tularensis subsp.novicida, F.tularensis subsp.novicida-like, F.philomiragia
3
+
красный