СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГРИППА В УСЛОВИЯХ ПРЕДЭПИДЕМИИ И ЭПИДЕМИИ И ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD FOR PREVENTING AND TREATING INFLUENZA IN PRE-EPIDEMIC AND EPIDEMIC ENVIRONMENT AND RELATED DRUG PREPARATION FOR IMPLEMENTATION THEREOF

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для профилактики и лечения гриппа в период предэпидемии и эпидемии.
Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), несмотря на определенные успехи в вакцино- и химиопрофилактике, остаются одной из самых актуальных медицинских и социально-экономических проблем. В России на грипп и ОРВИ приходится до 90% от всей ежегодно регистрируемой заболеваемости. ВОЗ прогнозирует появление нового антигенного варианта вируса гриппа и возможность развития пандемии с кратным ростом заболеваемости. Продолжают возникать случаи заражения людей вирусом гриппа животных, в частности вирусом гриппа птиц. Вирионы гриппа, адаптированные к лабораторным хозяевам, представляют собой частицы почти сферической формы диаметром порядка 100 нм. Свежевыделенные от человека штаммы имеют обычно вид длинных нитей.
Для профилактики и лечения гриппа в настоящее время используются следующие химиопрепараты: Оксолиновая мазь, Арбидол, Ремантадин, Тамифлю и другие ингибиторы нейраминидазы вируса гриппа, а также Когацел - препарат, содержащий альфа-интерферон, который активирует клеточный и гуморальный иммунитет. Однако использование этих препаратов ограничено эволюцией вируса гриппа, т.е. появлением «генетически новых» нейраминидаз.
В биотехнологии известно использование липосом - смектических фаз, в которых вода разделяет фосфолипидные бислои. В отличие от мицелл они не являются динамическими. Если липосомы образовались, они не диссоциируют на составляющие их липиды. Указанная особенность позволяет использовать их в качестве нанотранспортеров, в том числе для лечения вирусных инфекций (Контаров Н.А., и др. Изучение взаимодействия бораадамантана с липосомами. Биофизика, 2010, 55, 2, 269-270). Так, в заявке (BG 51003 (A1), KAVAKLOVA LILJANA et al., 15.01.1993) описывается процесс получения виросомальной вакцины для профилактики гриппа с использованием липосом в качестве носителей вирусных антигенов: гемагглютинина и нейраминидазы. Недостатком виросомальных вакцин является то, что действующим компонентом являются антигены вируса гриппа, а не фосфолипиды виросом. В патенте US 6391318 (B1) ILLUM LISBETH et al., 21.05.2002, описывается способ получения вакцинных композиций на основе липосом со встраиванием в них тяжелой цепи вирусного антигена - гемагглютинина, а также хитозана. В заявке (ЕР 0047480 (А2) THIBODEAU LISE, 17.03.1982) описывается получение так называемых иммунолипосом, т.е. липосом, нагруженных эпитопами Т-лимфоцитов, которые принимают участие в иммунном ответе на штамм вируса гриппа определенного антигенного состава.
Анализ указанных источников показывает, что липосомы выступают в роли лишь носителей иммунных компонентов, а вектором действия данных препаратов являются антигены вируса гриппа.
Настоящая группа изобретений направлена на создание способа и препарата для лечения и профилактики вируса гриппа, основанного на механизме инактивации липосомами гемагглютинирующей способности вирионов гриппа. Взаимодействие липосомы и вириона приводит к экстракции в липидный бислой липосом холестерина, входящего в состав мембран вирионов в значительном количестве. В пользу этого свидетельствует сокращение содержания липидов в мембранах вирионов, контактирующих с липосомами. Экстракция холестерина в липосомы приводит к уменьшению вязкости липидного бислоя вирионов, к появлению разницы в кривизнах наружного и внутреннего липидных слоев вирионов, что в свою очередь вызывает дезинтеграцию и дезориентацию гемагглютининов, а впоследствии и разрушение самих вирионов. Обращает внимание соотношение вирионов, находящихся одномоментно в состоянии контакта с адсорбированными липосомами (по данным электронной микроскопии их не более 20-30%) и нулевым значением гемагглютинирующего титра вируса. 70-80% вирионов, имея морфологически интактные гемагглютинины, тем не менее, утрачивают гемагглютинирующую активность. Это обстоятельство может указывать на наличие конформационных изменений в структуре молекул гемагглютининов, вызванных кратковременным контактом вирионов с липосомами. Однако эти изменения играют большую роль в процессе ингибирования вируса, чем морфологически выраженные деструктивные изменения 20-30% вирионов, содержащихся в препаратах.
Преимуществом разработанных липосомальных препаратов является независимость их вирусингибирующего действия от постоянно меняющейся антигенной структуры различных штаммов вирусов гриппа.
Патентуемый способ профилактики и лечения гриппа состоит во введении липосомсодержащего препарата, который включает дисперсию однослойных липосом, полученных из суспензии многослойных липосом группы фосполипидов, идентичных по составу фосфолипидам клеточных мембран организма человека, при этом линейные размеры однослойных липосом выбраны из условия соответствия линейным размерам вирионов гриппа.
Способ может характеризоваться тем, что группа фосфолипидов включает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, полученные из лецитинов природного и/или кефалинов искусственного происхождения, а также тем, что многослойные липосомы получены из сухих фосполипидов путем их растворения в растворе 0,01 М КCl и инкубирования при 60-70°С в течение не менее 10 мин при непрерывном встряхивании до появления опалесценции.
Способ может характеризоваться также тем, что суспензия многослойных липосом получена из смеси фосфолипидов - дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в мольном соотношении 1:2, а также тем, что дисперсия однослойных липосом получена из суспензии многослойных липосом путем ультразвукового диспергирования последней до достижения линейных размеров однослойных липосом в диапазоне 25-100 нм.
Способ может характеризоваться, кроме того, тем, что дисперсия однослойных липосом дополнительно включает стабилизатор-гелеобразователь, а именно раствор низкомолекулярного полиэтиленгликоля ПЭГ-400 с концентрацией 1,5-2,5 мМ на 1 мл дисперсии, и тем, что используют интраназальный и/или мукозальный, а также парентеральный методы введения препарата.
Способ может характеризоваться и тем, что с профилактической целью дисперсию однослойных липосом применяют в разовой дозе 1-10 мл с концентрацией 4-6 мг/мл, 2-3 раза в сутки, а при появлении первых признаков инфицирования орошают полость носа и/или носоглотки дисперсией однослойных липосом с разовой дозой 1-10 мл с концентрацией 10 мг/мл, 5 раз в сутки. При острой фазе заболевания чередуют орошение полости носа и/или носоглотки дисперсией однослойных липосом со стабилизатором-гелеобразователем каждые 3-4 часа.
Липосомсодержащий препарат для профилактики и лечения гриппа включает дисперсию однослойных липосом, полученных из многослойных липосом группы фосфолипидов, идентичных по составу фосфолипидам клеточных мембран организма человека, причем линейные размеры однослойных липосом выбраны из условия соответствия линейным размерам вирионов гриппа. Группа фосфолипидов может включать фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, полученные из лецитинов и кефалинов природного или искусственного происхождения.
Многослойные липосомы могут быть получены из сухих фосфолипидов путем их растворения в растворе 0,01 М КCl и инкубирования при 60-70°С в течение 10-15 минут при непрерывном встряхивании до появления опалесценции, а суспензия многослойных липосом получена из смеси фосфолипидов-дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в мольном соотношении 1:2.
Патентуемый препарат может характеризоваться тем, что дисперсия однослойных липосом получена из суспензии многослойных липосом путем ультразвукового диспергирования последней до достижения линейных размеров однослойных липосом в диапазоне 25-100 нм, а также тем, что дополнительно включает стабилизатор-гелеобразователь раствор низкомолекулярного полиэтиленгликоля ПЭГ-400 с концентрацией 1,5-2,5 мМ на 1 мл дисперсии.
Технический результат группы изобретений - воздействие непосредственно на липидную мембрану вируса гриппа для вирусингибирующего действия, что обеспечивает эффективность противовирусного препарата в условиях постоянно изменяющейся антигенной структуры различных штаммов вирусов гриппа и исключение гепатотоксического действия, свойственного химиопрепаратам. У многих же имеющихся на сегодняшний день лекарственных препаратов противовирусное действие состоит как раз в воздействии на антигенные белки вируса гриппа.
Существо изобретений поясняется на рисунках, где
на фиг.1 показаны электронно-микроскопические изображения вирионов гриппа; а) группа вирионов; б) отдельный вирион. Масштабная линейка - 100 нм;
на фиг.2 - электронно-микроскопические изображения взаимодействия нативных липосом с вирионами вируса гриппа и их деструктивные изменения;
а), б) - начальные стадии взаимодействия нативных липосом с вирионами; в), г) - заключительные стадии.
Приготовление однослойных липосом заданного размера включает следующие стадии.
1. Приготовление исходных многослойных липосом, идентичных по составу фосфолипидам клеточных мембран организма человека.
Для приготовления нативных жидких липосом используют как натуральные (яичный лецитин, яичный фосфатидилхолин), так и синтетические (фосфатидилхолин) лецитины и (фосфатидилэтаноламин) кефалины. Если липосомы готовят из сухих фосфолипидов (например, производства фирмы «Sigma» (США): дипальмитоилфосфатидилхолина или дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, взятых в мольном соотношении 1:2, их растворяют в растворе 0,01М KCl и инкубируют при температуре выше температур фазовых переходов используемых фосфолипидов (как правило, при температуре не ниже 70°С) при непрерывном встряхивании в течение не менее 10 минут до появления видимой опалесценции.
В результате получается суспензия многослойных липосом.
2. Обработка суспензии многослойных липосом по п.1 с получением дисперсии малых однослойных липосом (размером до 100 нм). Для обеспечения соответствия линейных размеров липосом и линейных размеров вирионов гриппа суспензию многослойных липосом обрабатывают на ультразвуковом диспергаторе типа УЗДН-А («НПП «Укрросприбор») в течение 2-3 мин. Размеры липосом и их концентрацию по мере обработки контролируют по спектру мутности суспензии (Контаров Н.А. и др. Новый метод измерения размеров и концентрации липосом. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009, 6, с.95-98) с использованием спектрофотометра «Zenyth 200st» и рефрактометра «РПЛ-3» для измерения показателя преломления суспензии.
Для сравнения оценку размеров полученных липосом проводят также с помощью электронной микроскопии. Для этого проводят адсорбцию дисперсии липосом на формваровой пленке, стабилизированной углеродом. После трехкратной промывки фосфатным буфером (рН 7,2) ФБР №2 (НПО Микроген, Москва) материал контрастируют фосфорновольфрамовой кислотой (рН 7,0-7,2). Дальнейшую обработку электронно-микроскопических сеточек проводят по обычной схеме.
В результате может быть получена дисперсия однослойных липосом с линейными размерами в диапазоне 25-100 нм. С целью выявления перекисного окисления фосфолипидов, возможного после ультразвуковой обработки в стерильных условиях липосомальной дисперсии, применяется хемилюминесцентный метод. Для дополнительного обеспечения стерильности препарата полученные липосомальные дисперсии пропускают через фильтры с соответствующим диаметром пор и высокой гидрофобностью (ядерные фильтры отечественного производства (Дубна) или фирмы Millipor (США)), через которые могут проходить только малые однослойные липосомы со средним диаметром 20-40 нм. После фильтрации стерильную липосомальную дисперсию разливают во флаконы. Полученные нативные липосомы следует использовать в течение 1 суток до сохранения ими опалесценции, либо лиофилизировать и сохранять при температуре минус 20°С.
3. Стабилизация структуры дисперсии однослойных липосом, полученных по п.2, при необходимости хранения запаса до момента применения. Для этого в дисперсию однослойных липосом вводят стабилизатор-гелеобразователь: раствор низкомолекулярного полиэтиленгликоля ПЭГ-400 с концентрацией 1,5-2,5 мМ на 1 мл дисперсии липосом.
Достижение технического результата патентуемой группы изобретений обосновывается приведенными ниже результатами ингибирования липосомами инфекционной и гемагглютинирующей активности вирионов гриппа:
- в модельных опытах на дисперсии липосом;
- на перевиваемой культуре клеток MDCK;
- на первичной культуре фибробластов куриного эмбриона (ФКЭ);
- на лабораторных животных - мышах линии Balb/c.
В опытах использованы следующие штаммы оболочечного вируса гриппа, в том числе обнаруживающие на сегодня пандемическую опасность для человека:
- Штамм вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (H7N7);
- Штамм вируса гриппа птиц А/Маллард Пенсильвания/102118/84 (H5N2);
- Штамм вируса гриппа птиц A/NIBRG-14 (H5N1).
Вирусы выращивали на 10-дневных куриных эмбрионах.
Получены следующие результаты.
1. Модельные опыты на дисперсии однослойных липосом. В модельных опытах для изучения взаимодействия липосом с вирионами гриппа используют в качестве сеточки пленку-подложку электронного микроскопа JEM 100-CY (JEOD, Japan) с инструментальным увеличением 58000-100000 и производят фотографирование на фотопленку AQFA Camera СЕ. Для этого проводят адсорбцию материала на формваровой пленке, стабилизированной углеродом. После 3-кратной промывки ФБР №2 (рН 7,2) материал контрастируют фосфорновольфрамовой кислотой (рН 7,0-7,2). При исследовании процесса взаимодействия липосом с вирионами вируса гриппа птиц сначала на пленке адсорбируют вирусные частицы, затем сеточку помещают на каплю липосомсодержащей смеси и в течение 5 мин инкубируют при комнатной температуре. Дальнейшую обработку электронномикроскопических сеточек проводят, как указано выше. Эффективно действующие в отношении вирусов гриппа концентрации липосом находятся в диапазоне 0,1 мг/мл - 10 мг/мл, линейные размеры липосом составляли 25-100 нм, вирионов - 100-160 нм (фиг.1, 2).
В опытных препаратах выявляют вирусные частицы 4-х типов - см. фиг.2: а), б) - вирионы с безхолестериновыми липосомами, адсорбированными на поверхности вирионов; в) вирионы с адсорбированными на их поверхности липосомами и частично разрушенным слоем гемагглютининов; г) полностью разрушенные вирионы с частично сохранившейся поверхностной мембраной, содержащей немногочисленные деструктурированные гемагглютинины.
Следовательно, взаимодействие однослойных липосом с вирионами приводит к ослаблению их функциональной активности вплоть до ее прекращения.
6
2. Опыты на перевиваемой культуре клеток MDCK. Изучение вирусингибирующего действия нативных липосом. Проведен ряд экспериментов по изучению вирусингибирующего действия липосом из дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в соотношении 1:2 на клетки MDCK, инфицированные вирусом чумы птиц (штамм А/ВЧП/Вейбридж). Титр гемагглютинирующей активности вирусов определяют микрометодом в реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией куриных эритроцитов и идентификации по бляшкам в 72-часовой культуре ФКЭ и в 10-дневных куриных эмбрионах при их заражении в аллантоисную полость. Инфекционный титр рассчитывают по методу Рида-Менча в модификации Томпсона (Thompson W.R., 1947). На начальной стадии данного изучения исследовано размножение вируса чумы птиц в присутствии липосом в поддерживающей среде RPMI-1640. С этой целью монослой клеток MDCK был инфицирован вирусом чумы птиц с множественностью заражения 0,01-0,1 ЭИД50/кл, концентрация клеток составляла 2,5-3,0·10кл/мл. Адсорбция длилась 30 мин при комнатной температуре. Затем вирус тщательно отмывали и в матрацы вносили среду RPMI-1640, содержащую дисперсию липосом (2 мг/мл).
В качестве контроля использовали вирусинфицированные клетки в присутствии среды RPMI-1640, содержащей нативные липосомы. Инфицированные клетки инкубировали четверо суток при температуре 37°С. Ежедневно проводили изучение состояния клеток под микроскопом и определяли инфекционный титр и титр гемагглютинирующих единиц в среде.
Показано, что инфекционный титр и титр гемагглютинирующих единиц необратимо снижается до нуля к четвертым суткам.
3. Результат, полученный на перевиваемой культуре клеток MDCK, вышеописанный в п.2, полностью подтвержден и на другой культуре клеток - на первичной культуре фибробластов куриного эмбриона (ФКЭ). Инфекционный титр и титр гемагглютинирующих единиц определялся по методикам, описанным в п.2.
4. Опыты на лабораторных животных - мышах линии Balb/c. В опытах использовано 500 особей.
Концентрации нативных липосом (НЛ), стабилизированных липосом (СЛ) и их вводимый объем для профилактики и терапии гриппа устанавливали на лабораторных животных - мышах линии Balb/c и затем проводили соответствующий перерасчет концентраций и объема разовой дозы для человека, исходя из отношения массы тела человека 60-80 кг к массе лабораторного животного 8-10 г, составляющего примерно 10000, из отношения поверхности или объема ноздревого пространства у человека и у лабораторного животного, равного примерно 150-200.
50
50
5
2
50
50
Лабораторных животных - мышей линии Balb/c с массой 8-10 г - предварительно инфицируют интраназально дозами 21 g ЭИД/мл и 41g ЭИД/мл штамма А/Маллард /Пенсильвания/10218/84 вируса гриппа птиц HN, адаптированными к мышам этой линии. Ранее установлено, что интраназальное введение мышам той линии дозы в 21 g ЭИД/мл вызывает гибель животных на 5-6 сутки, а интраназальное введение дозы в 41g ЭИД/мл - на 3-4 сутки. В качестве контроля наблюдают группу животных, инфицированных указанными дозами вируса, а также группу неинфицированных животных. Мышам под легким эфирным наркозом вводят вируссодержащую жидкость в объеме 20 мкл в каждую ноздрю. Спустя 6 часов инфицированным животным вводят исследуемые препараты. Дисперсию НЛ с концентрацией 1 мг/мл фосфолипидов вводят в объеме 20 мкл в каждую ноздрю животного. Животным препарат вводят ежедневно один раз в день в течение 7 дней.
50
50
5
2
Исследована возможность мукозального и парентерального способов введения НЛ. После интраназального инфицирования мышей линии Balb/c дозами 21 g ЭИД/мл и 41 g ЭИД/мл вируса гриппа птиц HN с лечебной целью используют интраназальный и мукозальный методы введения НЛ. Интраназальное введение НЛ осуществляют в концентрации 1 мг/мл.
Парентеральное введение препарата проводят в мышцу бедра. Препарат вводят животным в течение 7 дней. Возможно использование как интраназального и/или мукозального, так и парентерального методов введения. Достоверным снижением смертности инфицированных лабораторных животных, зараженным вирусом гриппа, после введения им различных доз НЛ различными способами показано вирусингибирующее действие нативных липосом. В таблице 1 представлены результаты по влиянию НЛ, полученных из дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина (в мольном соотношении 1:2 соответственно) на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (H7N7) в клетках MDCK. В таблице 2 представлены результаты по исследованию вирулентности штамма А/ Маллард/ Пенсильвания/10218/84 вируса гриппа птиц для мышей Balb/c при интраназальном введении липосом.
Пример изготовления. Сухие фосфолипиды производства фирмы «Sigma» (США): дипальмитоилфосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин (в мольном соотношении 1:2) в количестве 200 мг растворяют в 50 мл 0,01М стерильного раствора КCl, инкубируют при температуре 70±1°С при непрерывном встряхивании в течение 10 минут до появления видимой опалесценции.
Полученную суспензию многослойных липосом обрабатывают на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-А в течение 2-3 мин.
Размеры полученных однослойных липосом и их концентрацию в дисперсии по мере обработки контролируют по спектру мутности суспензии, а выявление возможного перекисного окисления фосфолипидов проводят хемилюминесцентным методом. Для дополнительного обеспечения стерильности препарата полученные дисперсии пропускают через молекулярные фильтры со средним диаметром пор 20-40 нм и высокой гидрофобностью. После фильтрации стерильную дисперсию разливают во флаконы с номинальным объемом 10-50 мл или лиофилизируют и расфасовывают в ампулы.
Лиофилизированный препарат в ампулах разводят соответствующим объемом физиологического раствора и используют для интраназального применения. Разовая доза препарата составляет 1-10 мл с концентрацией однослойных липосом 4-6 мг/мл, 2-3 раза в сутки интраназально с профилактической целью в течение месяца. При проявлении первых признаков инфицирования препарат используют интраназально и/или для полоскания носоглотки с назначением разовой дозы 1-10 мл липосомальной дисперсии с концентрацией однослойных липосом 4-6 мг/мл 5 раз в сутки до исчезновения симптомов заболевания. Полоскание носоглотки осуществляется 5-10 мл препарата в течение 1-1,5 мин, интраназальное введение осуществляется капельницей-дозатором.
Примеры применения
Пример 1. Профилактический прием в предэпидемический период Лиофилизированный препарат разводят соответствующим объемом физиологического раствора и используют для интраназального применения. Разовая доза препарата составляет 1-10 мл с концентрацией однослойных липосом 4-6 мг/мл, 2-3 раза в сутки интраназально, в течение месяца.
Пример 2. При наступлении эпидемии, при первых признаках инфицирования орошают полость носа и/или носоглотки дисперсией однослойных липосом с разовой дозой 5 мл, концентрацией 10 мг/мл, 5 раз в сутки. Для этого, так же как и в примере 1, лиофилизированный препарат разводят физиологическим раствором и применяют в течение не менее 3 суток.
Пример 3. В острой фазе заболевания гриппом проводят орошение полости носа и/или носоглотки дисперсией однослойных липосом со стабилизатором-гелеобразователем каждые 3-4 часа вплоть до выздоровления.
Таким образом, применение описанных однослойных липосом в качестве средства профилактики и лечения гриппа вызовет снижение заболеваемости в случае эпидемии и пандемии. Кроме того, практически сводится на нет необходимость прогнозирования появления новых штаммов вируса за счет мутаций, так как вектор вирусингибирующего действия липосом направлен на липидную мембрану вируса, а не на антигенные белки, как у многих имеющихся на сегодняшний день лекарственных препаратов. Использование однослойных липосом в качестве биосовместимого и биодеградируемого препарата позволяет применять их пролонгированно.
Таблица 1
Влияние липосом из дипальмитоилфосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина (в мольном соотношении 1:2) на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (H<sub>7</sub>N<sub>7</sub>) в клетках MDCK
Состав поддерживающей среды
Титр вируса ГАЕ/мл (lg ЭИД<sub>50</sub>/мл) после инфекции
2-й день
3-й день
4-й день
1
Среда RPMI-1640
64 (4,00±0,02)
128 (4,00±0,02)
128 (4,00±0,02)
2
Среда RPMI-1640 + липосомы (1 мг/мл)
64 (4,00±0,02)
0(0)
0(0)
Таблица 2
Вирулентность штамма А/Маллард/Пенсильвания/10218/84 вируса гриппа птиц для белых мышей Balb/c при интраназальном введении терапевтической дозы липосом
Доза введения
Выживаемость животных в различные сроки после введения вируса, %
1-й день
2-й день
3-й день
4-й день
7-й день
Критерий значимости по Гланцу, Z
21 g ЭИД<sub>50</sub>/мл
100
100
100
100
99
2,3
31 g ЭИД<sub>50</sub>/мл
100
100
100
100
98
2,2
41 g ЭИД<sub>50</sub>/мл
100
100
100
100
95
4,2
51 g ЭИД<sub>50</sub>/мл
100
100
100
97
95
3,5
61 g ЭИД<sub>50</sub>/мл
100
100
100
95
92
4,4
Контроль
100
100
100
100
100
-