Исследование комплексов включения некоторых антоцианов с гидроксипропил-b-циклодекстрином

Химия растительного сырья. 2014. №4. С. 139-146.

DOI: 10.14258/j cprm.201404187

УДК 544.342-14:547.814.5

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ВКЛЮЧЕНИЯ НЕКОТОРЫХ АНТОЦИАНОВ С ГИДРОКСИПРОПИЛ-р-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ

© М.С. Лапшова, В.И. Дейнека , Л.А. Дейнека

Белгородский государственный национальный исследовательский университет, ул. Победы, 15, Белгород, 308015 (Россия), e-mail: deineka@bsu.edu.ru

В работе спектрофотометрический метод, включая разностные спектры, был использован для исследования комплексообразования антоцианов с гидроксипропил-Р-циклодекстрином. Для анализа этого процесса использовано также компьютерное моделирование методом MM+. При этом теоретически предсказана и экспериментально подтверждена возможность образования комплексов включения антоцианов во флавилиевой форме, при которой в полость «хозяина» внедряется кольцо В. Показано, что устойчивость комплексов зависит от стерических факторов в комплексах, определяемых размером гликозидных заместителей в положении 3; при этом благодаря изменению геометрии ближайшего окружения атома углерода в положении 2 (при замене типа гибридизации sp2 ^sp3) такие напряжения ослабевают, что позволяет образовываться более устойчивым комплексам между циклодекстрином и полуаце-тальной формой антоцианов, сопровождающийся потерей окраски растворов. Показано, что медленный выход в стационарное состояние характерен не только для системы, содержащей циклодекстрин, но и при его отсутствии, и этот эффект связан с медленным установлением равновесия между полуацетальной и халконными формами, роль которых в образовании комплексов включения представляется небольшой.

Ключевые слова: антоцианы, гидроксипропил-Р-циклодекстрин, комплексы включения, электронные спектры, константы комплексообразования.

Введение

Антоцианы (I) - природные соединения, являющиеся гликозидами неустойчивых в обычных условиях антоцианидинов. Эти соединения в кислой среде (рН < 1) существуют в виде окрашенного флавилие-вого иона (Ia). Антоцианы обладают высокой биологической активностью, что объясняет большой интерес к этим соединениям - колорантам для пищевой и медицинской промышленности. Особенность антоцианов - изменение форм с ростом рН (рис. 1). Так, при рН = 4,5 окраска антоцианов практически исчезает из-за образования псевдооснования (Ib), которое находится в равновесии с двумя цис- (Ic) и транс- (Id) халконными формами [1]. При дальнейшем росте рН (Ib) превращаются в незаряженные, но окрашенные, хино-идные структуры.

Антоцианы относятся к химически лабильным соединениям, поэтому в ряде случаев их стабильность желательно увеличить. Одним из решений этой проблемы могло бы стать образование комплексов включения с подходящим «хозяином». В качестве безопасного, разрешенного к применению в пищевой и медицинской промышленности «хозяина» широко используются циклодекстрины - макроциклические соединения, в которых остатки D-(+)-rareK0nHpaH03bi объединены в макроциклы а^-1,4-гликозидными связями. В образующейся структуре (при шести, семи или восьми молекулах глюкозы в цикле, что соответствует а-, Р- и у-циклодекстринам) имеется полость тороидальной формы, которая может быть заполнена подходящими по размеру молекулами «гостей» [2]. Но если в целом опубликованных работ по исследованию комплексообразования флаво-ноидов с циклодекстринами много, то этого нельзя сказать об антоцианах.

Лапшова Мария Сергеевна - аспирант, e-mail: 139793@bsu.edu.ru

Дейнека Виктор Иванович - профессор кафедры общей химии биолого-химического факультета, e-mail: deineka@bsu.edu.ru

Дейнека Людмила Александровна - доцент кафедры общей химии биолого-химического факультета, e-mail: deyneka@bsu.edu.ru

* Автор, с которым следует вести переписку.

Рис. 1. Схема превращения антоцианов

В 1980 году была опубликована одна из немногих работ по комплексам включения антоцианов с циклодекстринами [3]. В этой работе было найдено, что окраска растворов цианидин-3-глюкозида (R3" = OH, R5" = H, рис.1, Cy3G) и пеларгонидин-3-глюкозида (R3» = R5» = H, рис.1, Pg3G) в водных растворах при pH = 2 ослабевала по мере добавления в раствор ß-циклодекстрина (bCD). При добавлении а-циклодекстрина (aCD) в раствор Cy3G не было обнаружено изменений, хотя в случае Pg3G ослабление окраски было заметно, хотя и в меньшей степени, чем в случае bCD. Эти эффекты и необходимость длительного времени для достижения равновесия (более 2 ч) авторы объяснили двухстадийностью процессов. Предполагалось, что на первом этапе образуется комплекс включения за счет внедрения Ia в полость bCD, а на второй стадии Ia в полости циклодекстрина превращается в Ib, образующее более прочный комплекс. Обесцвечивание тех же антоцианов при комплексообразовании с bCD в другой работе [4] также объясняли большей склонность к внедрению в полость «хозяина» неокрашенных форм антоцианов по сравнению с флавилиевой формой. Однако, для пеларгонидина, который, как и другие антоцианидины, довольно быстро обесцвечивается даже в кислой среде, добавки циклодекстринов, наоборот, уменьшают скорость этого процесса [5], причем в случае bCD антоцианы внедряются в полость «хозяина» кольцом В, тогда как у-циклодекстрин (gCD) имеет полость, достаточную для внедрения в нее бензопирилиевой части антоциа-нидина. Наконец, совсем необычны выводы о том, что добавление bCD к соку аронии черноплодной приводит к снижению потерь антоцианов при пастеризации и последующем хранении [6].

Цель настоящей работы - исследование закономерностей комплексообразования антоцианов с гид-роксипропил-Р-циклодекстрином спектрофотометрическим методом с применением техники получения разностных спектров.

Экспериментальная часть

Антоцианы экстрагировали из растительного материала (цианидин-3-глюкозид - из плодов восковни-цы красной Myrica rubra Siebold and Zucc., пеларгонидин-3-глюкозид - из плодов барбариса обыкновенного Berberís vulgaris L. и цианидин-3-рутинозид - из плодов черной смородины, Ribes nigrum L.), настаиванием в 0,1 М водном растворе HCl, отделяя экстракт от остатка фильтрованием через бумажный фильтр. Для получения агликона экстракт гидролизовали в 10% растворе серной кислоты кипячением на водяной бане в течение 30 мин. Затем экстракты очищали методом твердофазной экстракции на патронах ДИАПАК С18 (Био-ХимМак CT, Москва) и из полученных частично очищенных концентратов выделяли фракции индивидуальных антоцианов и определяли их состав методом ВЭЖХ, используя хроматографическую систему Agilent Infinity 1200 с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детекторами. В работе использовали колонку 250^4,0 мм Reprosil-Pur C18-AQ (5 мкм) при температуре термостата 40 °С с элюентом состава 10 об.% CH3CN и 10 об. % HCOOH. Контроль элюата осуществляли при 515 нм. При выделении индивидуальных

фракций антоцианов объем вводимой автосамплером пробы - 100 мкл (при контроле индивидуальности выделенных фракций - 20 мкл). Идентификацию антоцианов проводили по электронным спектрам с анализом масс-спектрометрических данных (записанных в режиме электрораспыления, MS ESI).

Концентрированные фракции антоцианов делили на несколько частей, в одной из которых доводили рН до 1,0 ± 0,1, ав других - до рН 3,0 ± 0,1 добавлением раствора NaOH; доводили до метки в мерной колбе на 10 мл и вновь контролировали рН перед спектрофотометрическим исследованием, навески цикло-декстрина добавляли непосредственно в кювету спектрофотометра. В работе использовали рН-метр рН-150МИ c комбинированным стеклянным электродом ЭСК-10603. Спектры растворов записывали в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре СФ-56 при комнатном термоста-тировании (27 °С). Сохраненные результаты поточечных измерений переносили в Excel 2010 для ручной обработки. Разностный спектр получали поточечным вычитанием из интенсивностей абсорбции конечного спектра (с добавкой циклодекстрина) интенсивности абсорбции начального спектра со вручную подбираемым понижающим коэффициентом.

В работе использовали гидроксипропил-Р-циклодекстрин KLEPTOSE, HPbCD (Roquette).

Обсуждениерезультатов

Выполненные нами исследования показали, что добавление HPbCD к растворам Cy3G приводит к заметному ослаблению интенсивности окраски, если рН > 1. В сильно кис лых растворах Cy3G в электронных спектрах при добавлении HPbCD наблюдаются минимальные изменения - максимум абсорбции батохромно смещается на 1 нм (от 511 до 512 нм), а интенсивность падает не более чем на 1,5% (при экспериментальной погрешности около 0,75%).

Полость HPbCD рассматривается как липофильная, а при добавлении органических растворителей к водным растворам антоцианов (увеличение липофильности среды) обычно наблюдается батохромный, зависящий от изменения полярности растворителя, сдвиг максимума абсорбции. Поскольку изменение полярности ближайшего окружения при переходе антоцианов из раствора в полость циклодекстрина неизвестно, то лишь по изменению электронных спектров судить о надежности комплексообразования Cy3G с HPbCD трудно. Отметим, однако, что в случае агликона (цианидина) при добавлении в раствор HPbCD спектральные параметры изменяются более чем очевидно - батохромное (подтверждающее липофильность полости циклодекстрина) смещение максимума абсорбции достигает 8-10 нм (рис. 2). Таким образом, комплексообразование между цианидином и HPbCD легко осуществляется даже в сильнокислой среде (pH < 1). К сожалению, авторы работы [5] не обратили внимания на изменение электронных спектров при комплексообразовании пеларгонидина с bCD.

Следовательно, наличие заряда на внедряемой частице не является препятствием к комплексообразо-ванию, тогда удивительно, что в случае Cy3G изменения в электронных спектрах минимальны, поскольку молекулы фенольных кислот с кольцом, аналогичным строению кольца В антоцианов (замещенные бензойные и коричные кислоты, включая хлороге-новые кислоты), легко образуют комплексы включения, если не заняты оба мета-положения по отношению к карбоксильной группе: только в этом случае внедрение фе-нольного радикала в полость bCD оказывается стерически затрудненным [7, 8]. Кстати, именно поэтому нельзя было рассчитывать на образование комплексов включения между bCD и мальвидин-3-глюкозидом (R3» = OCH3, R5" = OCH3, рис.1, Mv3G) при любых рН, установленное в работе [4].

Единственной причиной отсутствия или малой эффективности комплексообразования в случае флавилиевого иона 3-глюко-зидов могут быть стерические затруднения - из-за наличия глюкозидного радикала в положении 3.

—I—I—|—I—I—I—1—|—I—I—I—I—|—г—I—I—I—|—1—I—I

300 400 300 600

Длина волны, нм

Рис. 2. Изменение электронного спектра цианидина при добавлении в раствор гидроксипропил-Р-циклодекстрина рН = 0,95: 1 - без добавления ИРЬСБ; 2 - с ИРЬСБ

Однако расчет по методу молекулярной механики (ММ+), выполненный в среде ИурегСИеш 8.0, показал, что комплексообразование возможно, по крайней мере, для одной из конформаций СуЗв (рис. 3а). На представленных рисунках агликон (рис. 36) внедряется в полость ЪСБ заметно более полно. При этом вращение всего гликозидного радикала в случае цианидин-3-глюкозида (рис. За) должно приводить к выталкиванию антоциана из полости ЪСБ. Очевидно, что преобразование типа гибридизации атома углерода №2 антоцианового каркаса (Бр2 ^ Бр3) изменяет геометрию верхней части структуры, допуская более свободное вращение гликозидного радикала без извлечения кольца В из полости «хозяина». Тогда понятно, почему при повышении рН, сопровождающемся увеличением доли полуацеталя 1а, создаются более благоприятные условия для комплексообразования. Кстати, переход к обеим халконным формам не должен способствовать комплексообразованию, поскольку геометрия критических частей структуры не отличается от геометрии соответствующих частей флавилиевого иона.

Таким образом, можно предполагать, что в случае 3-гликозидов антоцианов комплексы включения образуют структуры 1Ь, внедряясь в пустоту ЪСБ кольцом В.

Как указывалось в работе [1], стабилизация электронного спектра после добавления циклодекстрина требует значительного времени - через 2 часа оптическая плотность достигает уровня, лишь немногим более высокого по сравнению со значением, найденным через 24 часа (рН = 2; 18 °С). В нашем исследовании мы также установили медленный выход на стационарный режим (около 3 ч, рис. 4), хотя температура была выше (25 °С) даже при отсутствии добавок циклодекстрина, причем достижение равновесных уровней оптической плотности во всех случаях происходит примерно за одно и то же время. Очевидно, что найденные изменения спектров указывают на медленное установление равновесия ме^ду флавилиевой и иными формами антоцианов, возникающими при повышении рН раствора. Для уточнения роли каждой из структур (рис. 1) можно воспользоваться методом контроля разностных спектров.

Если в системе несколько веществ, имеющих различные электронные спектры, то суммарный спектр является суперпозицией индивидуальных спектров (при отсутствии копигментации, - обычной для растворов с концентрацией антоцианов, приемлемой для записи спектров поглощения):

D (Я)=Х«(0-ef

где DS(A) - оптическая плотность раствора при заданной длине волны; a(i) - доля формы антоциана в растворе с начальной концентрацией с0; sf - коэффициент молярного погашения формы i на длине волны излучения к.

В таком случае из суммарного спектра можно поточечно вычесть спектр флавилиевой формы анто -цианов (единственной формы при рН < 1) с подбираемым вручную коэффициентом a(Ia) (что легко реализуется в программе MS Excel), равным доле флавилиевой формы в исследуемом растворе, так, чтобы в некоторой области спектра остаточное поглощение было равным нулю.

Рис. 3 Комплексы включения цианидин-3-глюкозида

При использовании такой техники было установлено, что при выходе раствора антоцианов при рН > 1 без добавок циклодекстрина разностный спектр имеет пологую полосу с относительно длинноволновым максимумом абсорбции около 350 нм, характерным для халконных форм. Следовательно, равновесие ме^ду 1а и 1Ь устанавливается достаточно быстро, а падение абсорбции антоцианов связано с постепенным медленным переходом полуацеталя в халконные формы, приводящим к уменьшению концентрации флавилиевой формы и интенсивности окраски раствора. Разностный спектр ме^ду конечной формой с добавкой циклодекстрина и того же начального спектра без добавки циклодекстрина имеет принципиально иной вид (на рис. 5 масштабирован в 3 раза): относительно коротковолновый максимум в районе 270 нм свидетельствует о том, что комплекс включения образован, как и предполагалось выше, именно полуацетальной формой. При этом в длинноволновой части спектра всегда обнаруживается слабый максимум, который можно интерпретировать как образование (но в небольшой степени) комплекса включения и флавилиевой формы с ожидаемым при этом батохромным сдвигом максимума абсорбции: с 513 до 550 нм.

Таким образом, из представленных данных следует, что антоцианы во флавилиевой форме образуют неустойчивые комплексы включения с ИР-Р-СБ, но комплексообразование антоцианов усиливается при переходе флавилиевого иона в полуацеталь, что объясняет обесцвечивание растворов антоцианов по мере добавления циклодекстринов.

Для количественного описания процесса комплексообразования пренебрежем комплексообразова-нием флавилиевой формы с циклодекстрином; в таком случае при постоянной суммарной концентрации всех форм антоцианов аналитический сигнал (оптическая плотность) определяется степенью перехода флавилиевого иона в полуацеталь:

0,4 -)-1-1-1-

О 100 200 ^мин

Рис. 4. Развитие систем при изменении рН и добавлении гидроксипропил-Р-циклодекстрина. Концентрации ИРЬСБ: 1 - 0; 2 - 0,0017; 3 - 0,0023; 4 - 0,0039 моль/л

1а + И20 ~ 1Ь + И+

с кажущейся константой равновесия:

[ 1Ь] • [Я + ]

Ккус1г ~ '

[ 1а ]

Рис. 5. Электронные спектры цианидин-3-глюкозида. Спектры записаны при рН = 3,00: 1 - в начальный момент; и 2 - через 3 ч без добавки ИР-Р-СБ; 3 - при добавке ИР-Р-СБ

Пусть комплексообразование полуацеталя с циклодекстрином осуществляется в мольном соотноше -нии 1 : 1:

Ib + CD ~ IbCD

c кажущейся константой равновесия:

K

compl

[IbCD] [Ib] -[CD]'

В растворе существуют флавилиевая форма Ia, полуацеталь Ib, и комплекс полуацеталя с циклодекстрином IbCD:

c0 = [Ia] + [Ib] + [IbCD]

Преобразуем уравнение (5), используя соотношения (2) и (4):

Со = [Ia] + [Ia]M + [Ia]И Kcompl • [CD].

Khydr Khydr

Тогда может быть определена концентрация флавилиевой формы:

[Ia] = c0 /(1 +

[ H+] , [Н+]

0 ' VA 1 у ' тт compl

K hydr K hydr

K compl -[CD ]).

С учетом того, что начальная концентрация флавилиевой формы (при рН = 1) равна с0, соотношение оптических плотностей составит:

[ Ia]o = 1 + ÎHH + ¡НИ. K

4 [Ia]

K

hydr

K

compl

[CD].

hydr

Строго говоря, в уравнении (9) фигурирует не исходная концентрация циклодекстрина, а равновесная, но при большом избытке циклодекстринов (концентрация циклодекстринов в наших экспериментах

была на 1-2 порядка выше концентрации антоцианов) вместо равновесной концентрации можно использовать начальную. И действительно, экспериментально всегда получаются прямолинейные зависимости между концентрацией циклодекстринов в растворе и обратным соотношением оптических плотностей раствора по уравнению (9).

Предложенный подход позволил рассчитать константы комплексообразо-вания HPbCD с цианидин-3-глюкозидом (Kcompl= 476), цианидин-3-рутинозидом (Kcompi= 342) и с пеларгонидин-3-Рис. 6. Зависимость отношения оптических плотностей глюкозидом (K^pP 823). Сравнивая

растворов цианидин-3-глюкозида отконцентрации данные, полученные для производных

гидроксипропил-р-циклодекстрина. Раствор Cy3G при цианидина, можно видеть, что увеличе-

рН = 3 02 ние РазмеРа гликозидного радикала при

0

переходе от 3-глюкозпда к 3-рутинозпду (6"-рамнозилглюкозпду) приводит к уменьшению константы, что подтверждает значимость объемного фактора заместителя в положении 3 на устойчивость комплексов. С другой стороны, снижение констант комплексообразования в ряду однотипных производных (3-глюкозидов) пеларгонидина - цианидина находится в полном соответствии с изменением аналогичных констант в рядах фенольных кислот с заполнением .медаа-положения в фенольных кольцах, что подтверждает определяющую роль кольца В с процессе комплексообразования с циклодекстринами.

Выводы

1. Методом молекулярной механики показано, что возможно комплексообразование антоцианов во флавилиевой форме с циклодекстринами. При этом гликозидный радикал при свободном вращении уменьшает стабильность комплекса. Более устойчивые комплексы также во флавилиевой форме могут образовывать агликоны.

2. Экспериментально показано, что более устойчивые комплексы с гидроксипропил-Р-циклодекстрином антоцианы образуют в форме полуацеталей, причем устойчивость комплексов снижается при удлинении гликозидного радикала.

3. Экспериментально показано, что антоцианы действительно образуют неустойчивые комплексы включения c гидроксипропил-Р-циклодекстрином.

4. Халконные формы антоцианов не образуют устойчивых комплексов с циклодекстринами, но медленность установления их равновесия с полуацетальной формой определяет необходимость длительной выдержки (более 2 ч) для выхода на стационарный уровень окраски антоцианов после добавления цикло-декстринов.

Авторы выражают благодарность компании РОКЕТТ РУС за предоставление образца гидрокси-

пропил-^-циклодекстрина.

Список литературы

1. Anthocyanins: Biosynthesis, Functions, and Applications / Ed. K.S. Gould, K.M. Davies, C. Winefield. Springer Sci-ence+Buisiness Media, LLC. 2009. 337 p.

2. Del Valle E.M. Martin Cyclodextrins and their uses: a review // Process Biochem. 2003. Vol. 39. Pp. 1033-1046.

3. Yamada T., Komiya T., Akaki M. Formation of an inclusion complex of anthocyanin with cyclodextrin // Agric. Biol. Chem. 1980. Vol. 44. Pp.1411-1413.

4. Dangles O., Brouillard R. A spectroscopic method based on the anthocyanin copigmentation interaction and applied to the quantitative study of molecular complexes // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 1992. Pp. 247-257.

5. Matsui Y., Sunouchi A., Yamamoto T. Inhibitory Effect of Cyclodextrins on the Discoloration Reaction of an Antho-cyanidin, Pelargonidin Chloride, in Acidic Media // J. Incl. Phenom. Mol. Recogn. Chem. 1998. Vol. 32. Pp. 57-67.

6. Howard L.R., Brownmiller C., Prior R.L., Mauromoustakos A. Improved Stability of Chokeberry Juice Anthocyanins by P-Cyclodextrin Addition and Refrigeration // J. Agric. Food Chem. 2013. Vol. 61. Pp. 693-699.

7. Анисимович И.П., Дейнека В.И., Дейнека Л.А., Селеменев В.Ф. Модулирование селективности разделения сорбатов за счет образования супрамолекулярных комплексов в подвижной фазе // Сорбционные и хромато-графические процессы. 2010. Т. 10, вып. 3. С. 401-408.

8. Анисимович И.П., Дейнека В.И., Дейнека Л.А. Исследование супрамолекулярных комплексов хлорогеновых кислот с Р-циклодекстрином // Научные ведомости БелЕУ. Серия Естественные науки. 2011. №9(104). Вып. 15/2. С. 225-232.

Поступило в редакцию 8 ноября 2013 г.

После переработки 22 марта 2014 г

146

M.C. ^AnmOBA, B.H. ^.EHHEKA, n.A. ^.EHHEKA

LapshovaM.S., Deineka V.I.*, Deineka L.A. INVESTIGATION OF INCLUSION COMPLEXES OF SOME ANTHO-CYANINS WITH HYDROXYPROPYL-B-CYCLODEXTRIN

Belgorod State University, ul. Pobedy, 15, Belgorod, 308015 (Russia), e-mail: deineka@bsu.edu.ru

In the present paper spectrophotometric (including electronic spectra differences) method has been used for investigation of complex formation between anthocyanins with hydroxypropyl-P-cyclodextrin (HPbCD). For the system analysis also molecular mechanics method (MM+) has been explored. It enables to theoretically predict as well as to prove experimentally the possibility of complex formation of flavylium form by inserting of B ring into cyclodextrin cavity. Stability of complexes was shown to depend upon steric factors - the volume of glycosyl moiety in 3 position of the anthocyanin backbone; the change of hybridization type of carbon atom 2 (sp2 ^sp3) decrease steric hindrance; the latter is the reason of the most stable complexes for hemiacetal form leading to solution bleaching. The slow anthocyanin forms equilibration is a property of hemiacetal -chalkone transitions depending not upon HPbCD addition, the participation of the latter in complexation is negligible.

Keywords: anthocyanins, hydroxypropyl-P-cyclodextrin, inclusion complexetion, electronic spectra, constants of complex stability

References

1. Anthocyanins: Biosynthesis, Functions, and Applications. Ed. K.S. Gould, K.M. Davies, C. Winefield. Springer Sci-ence+Buisiness Media, LLC, 2009, 337 p.

2. Del Valle E.M. Process Biochem. 2003, Vol. 39, pp. 1033-1046.

3. Yamada T., Komiya T., Akaki M. Agric. Biol. Chem. 1980, vol. 44, pp.1411-1413.

4. Dangles O., Brouillard R. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 1992, pp. 247-257.

5. Matsui Y., Sunouchi A., Yamamoto T. J. Incl. Phenom. Mol. Recogn. Chem. 1998, vol. 32, pp. 57-67.

6. Howard L.R., Brownmiller C., Prior R.L., Mauromoustakos A. J. Agric. Food Chem. 2013, vol. 61, pp. 693-699.

7. Anisimovich I.P., Dejneka V.I., Dejneka L.A., Selemenev V.F. Sorbcionnye i hromato-graficheskie processy, 2010, vol. 10, no. 3, pp. 401-408. (in Russ.).

8. Anisimovich I.P., Dejneka V.I., Dejneka L.A. Nauchnye vedomosti BelGU. Serija Estestvennye nauki. 2011, no. 9(104), is. 15/2. pp. 225-232. (in Russ.).

Received November 8, 2013 Revised March 22, 2014

* Corresponding author.