СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ ФЕНОЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ЧАГИ
METHOD OF PRODUCING FRACTION OF PHENOL SUBSTANCES FROM SHELF FUNGUS

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к получению фракции биологически активных фенольных веществ из чаги.
Известны способы выделения фенольных веществ из гриба чаги, включающие экстракцию измельченного гриба органическими растворителями: этиловым спиртом (Zheng Wei-Fa // Mycosystema. - 2008. - V.27. - P.575-581), метанолом (Yu Jin Kim // J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. - 2011. - V.54. - P.287-294), гексаном (Kahlos K. // Planta Medica. - 1984. - №50. - P.197-198). В экстрактах идентифицированы соединения фенольной природы: аналоги гиспидина, флавоноиды (апегинин, нарингенин, морин, мирицетин, робинетин, кемпферол), фенолкарбоновые кислоты (ксантуреновая, п-кумаровая, β-, γ-резорциловая, галловая, сиреневая, коричная). Эти вещества обладают высокими биологическими и терапевтическими свойствами.
Недостаток данных способов заключается в извлечении малого количества фенольных веществ и сложности (многостадийности) процесса извлечения.
Известен способ выделения фракции фенольных веществ из гриба чаги (W. Mazurkiewicz [and others] // Acta Poloniae Pharmaceutica. - 2010. - V.67, I.4. - P.397-406). Получают водный экстракт гриба, который затем концентрируют и высушивают. Далее проводят гидролиз сухого остатка хлористоводородной кислотой, отделяют осадок 1, оставшийся фильтрат упаривают досуха и получают осадок 2. Осадки 1 и 2 обрабатывают этилацетатом и метанолом, полученные экстракты объединяют и удаляют растворители под вакуумом с получением сухого остатка черного цвета. Разделение веществ сухого остатка проводят с помощью колоночной хроматографии.
Известен способ получения фенольных веществ из гриба чаги, включающий получение этанольных экстрактов чаги, дальнейшее их концентрирование под вакуумом, проведение гель-фильтрации и элюирование метанолом. Получают две фракции темного и желтого цвета, которые объединяют и далее упаривают досуха в потоке азота (Zheng Wei-Fa // Mycosystema. - 2008. - V.27. - P.575-581).
Известен способ выделения фракции фенольных веществ из гриба чаги (Сысоева М.А. Разделение водных извлечений чаги с использованием этилацетата. IV. Состав веществ фенольной и терпеновой природы, отделяемых из водного извлечения чаги этилацетатом / Сысоева М.А. [и др.] // Химия растительного сырья. - 2008. - №4. - С.111-114). Получают водное извлечение из гриба, проводят исчерпывающую экстракцию водных извлечений этилацетатом. Далее этилацетатный экстракт концентрируют, отделяют меланин и проводят разделение экстрактивных веществ по стандартной схеме.
Известен способ выделения фракции фенольных веществ из гриба чаги (Zhao YX et al. // Chinese Herbal Medicines. - 2013. V.5 (1). - P.67-72). Гриб чаги культивируют на агаризованной среде с картофельной декстрозой в течение 7 дней, а затем на качалках в колбах на 500 мл в течение 14 дней. Грибной мицелий фильтруют через бумажный фильтр, промывают дистиллированной водой. 50 мг грибного мицелия заливают 20 мл дистиллированной воды, 7 мл ацетона, 5,5 мг сульфата аммония и проводят экстракцию с применением ультразвука в течение 5 мин. Верхний слой органического экстракта отбирают и доводят до объема 30%-ным этиловым спиртом. Количество экстрактивных фенольных веществ определяли методом Фолина-Чокальтеу, их содержание составило 37,8 мг/г.
Недостатком данных способов является сложность при выделении и анализе фенольных веществ из водных извлечений чаги, заключающаяся в том, что эти биологически активные вещества находятся в коллоидной системе водного извлечения чаги как в свободном, так в связанном с меланином состоянии (Калашникова Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата «Бефунгин»: автореф. дис. … д-ра. фарм. наук / Е.А. Калашникова. - Пятигорск, 2003. - 22 с.). Кроме того, данные способы характеризуются нерациональным использование сырья, поскольку в водный и спиртовой экстракты чаги переходит около 20±5% веществ гриба. При этом значительная часть биологически активных соединений чаги, обладающих гидрофобными свойствами, остаются в шроте (жоме, остатке сырья). В промышленности шрот в дальнейшем не используется. При этом известно, что 70% фенольных веществ остается в шроте чаги (Юмаева Л.Р. Состав и свойства экстрактов из шрота чаги: автореф. дис. … канд. хим. наук / Л.Р. Юмаева. - Казань, 2009. - 16 с.). Состав фенольных веществ, экстрагируемых из природного сырья и культивированного сырья, существенно отличается.
Наиболее близким техническим решением, взятым за прототип, является способ получения спиртового экстракта из чаги (патент РФ №2341277, A61K 36/06, B01D 11/02, 2007). Измельченную чагу экстрагируют водой, от шрота отделяют водный экстракт. Шрот заливают 70%-ным этиловым спиртом и кипятят в течение 1-3 часов. Полученный спиртовый экстракт отделяют.
Недостатком данного способа является извлечение из чаги сложного комплекса соединений, включающего фенольные вещества, углеводы и меланин. Это усложняет методику стандартизации полученных экстрактов, выделения из них индивидуальных биологически активных веществ.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа получения фракции фенольных веществ, включающих флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и фенолы простого строения, из чаги.
Поставленная задача достигается способом, в котором измельченную чагу экстрагируют водой, полученный водный экстракт отделяют от шрота чаги, шрот высушивают, добавляют к нему этилацетат при массовом соотношении 1:40, кипятят в течение 1 ч, органический экстракт отделяют, растворитель удаляют с получением сухого остатка фракции фенольных веществ.
Технический результат заключается в получении фракции фенольных веществ, включающих флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и фенолы простого строения.
Сущность способа заключается в следующем.
Измельченную чагу экстрагируют водой. Водный экстракт отделяют и используют, например для получения меланина. Так же на основе водного экстракта чаги в фармацевтической промышленности получают препарат «Бефунгин». При водной экстракции из сырья в экстракт переходят гидрофильные компоненты, что позволяет органическому растворителю легче проникать внутрь сырья (шрота) и увеличить доступность оставшихся в шроте чаги фенольных (гидрофобных) веществ к их дальнейшему извлечению. Оставшийся после отделения водного экстракта шрот предварительно высушивают при комнатной температуре для удаления остаточной влаги. К навеске высушенного шрота чаги добавляют этилацетат при массовом соотношении 1:40. Данное соотношение является оптимальным для извлечения максимального количества экстрактивных веществ из сырья. Выбор растворителя обоснован его селективностью по отношению к фенольным веществам шрота чаги, в том числе к флавоноидам. Проводят кипячение шрота с органическим растворителем в течение 1 ч. Этого времени достаточно для максимального извлечения экстрактивных веществ из сырья. Дальнейшее кипячения сырья нецелесообразно. Полученный органический экстракт отделяют, растворитель удаляют и получают сухой остаток фракции фенольных веществ.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Использовали сырье ООО «КФХ «Кентавр», партия 011209.
Измельченную чагу экстрагировали водой, от шрота отделяли водный экстракт, шрот высушивали при комнатной температуре. 2 г высушенного шрота чаги заливали 80 мл этилацетата, кипятили 1 ч. Экстракт отделяли, растворитель удаляли и получали 0,0131±0,0008 г фенольных веществ. В полученной фракции фенольных веществ показано наличие флавоноидов и фенолов простого строения, количественное содержание которых составило 4,81±0,11 мас.% и 5,92±0,03 мас.% от экстрактивных веществ соответственно.
Пример 2
Аналогичен примеру 1, но для экстракции использовали сырье ИП Гордеев М.В., серия 041010.
Получили 0,0213±0,0014 г фенольных веществ. В полученной фракции фенольных веществ показано наличие флавоноидов и простых фенолов, количественное содержание которых составляет соответственно 6,26±0,13 мас.% и 5,73±0, 07 мас.% от экстрактивных веществ.
f
Качественный состав фенольных веществ в полученных экстрактах определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil» с использованием систем растворителей: для разделения фенолов простого строения - №1 (бензол, Хроматография в тонких слоях / под ред. Э. Шталя. - М.: Мир, 1965. - 508 с.), для разделения фенолкарбоновых кислот - №2 (бензол - метанол - уксусная кислота в соотношении 90:16:8, Хроматография в тонких слоях / под ред. Э. Шталя. - М.: Мир, 1965. - 508 с.) и для разделения флавоноидов - №3 (хлороформ - метанол - вода в соотношении 26:14:3, Анисимов М.М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посевной / Анисимов М.М. [и др.] // Известия Самарского научного центра РАН. - 2010. - №1(8). - С.2011-2014). Идентификацию веществ проводили сравнением коэффициентов распределения (R) с метчиками и данными литературы. Результаты хроматографии представлены в таблице.
Таблица
Качественный состав фракции фенольных веществ, выделенных из чаги
Система растворителей
Коэффициент распределения (R<sub>f</sub>)
Отнесение
№1*
0,80
не идентифицировано
0,70
не идентифицировано
0,08
фенол
0,03
резорцин
0,00
пирокатехин, гидрохинон
№2*
0,84
не идентифицировано
0,79
не идентифицировано
0,75
не идентифицировано
0,70
вератровая кислота
0,60
сиреневая, n-оксибензойная кислота
0,58
феруловая кислота
0,23
галловая кислота
№3**
0,8
кверцетин
* - Хроматография в тонких слоях / под ред. Э. Шталя. - М.: Мир, 1965. - 508 с.
** - Анисимов М.М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посевной / Анисимов М.М. [и др.] // Известия Самарского научного центра РАН. - 2010. - №1(8). - С.2011-2014.
Согласно данным, приведенным в таблице, фракция фенольных соединений, выделенная из шрота чаги, содержит ряд биологически активных веществ фенольной природы: фенолкарбоновые кислоты, фенолы простого строения, флавоноиды. Неидентифицированные соединения также можно отнести к фенольным веществам по специфической окраске пятен на хроматограмме.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет извлечь из чаги фракцию фенольных веществ, включающих флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, фенолы простого строения, обладающие выраженной биологической активностью. Фракция фенольных веществ может быть использована для разработки биологически активных добавок и лекарственных препаратов различной направленности действия. Предлагаемое изобретение может быть использовано в промышленных условиях для комплексной переработки сырья чаги.