Изменение онколитической активности вируса cендай при адаптации к культурам клеток

Voeikova TA.1, Zhuravliova O.A.1'2, Bulushova N.V.1, Veiko V.P.3, Ismagulova T.T.4, Lupanova T.N.5, Shaitan K.V.4-6, Debabov V.G.1

«PROTEIN CORONA» OF NANOPARTICLES OF SULFIDE SILVER OBTAINED IN THE PRESENCE OF GRAM-NEGATIVE AND GRAM-POSITIVE BACTERIA

1 State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, 117545, Moscow, Russian Federation 2 Agricultural Technology Institute, People's Friendship University, 117198, Moscow, Russian Federation 3 Research Center of Biotechnology RAS, Bach Institute of Biochemistry RAS, 119071, Moscow, Russian Federation

4 Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russian

Federation

5 Institute of Gene Biology of the RAS, 119334, Moscow, Russian

Federation

6 Semenov Institute of Chemical Physics, RAS, 119991, Moscow,

Russian Federation

The comparative analysis of the amount and composition of proteins adsorbed on the surface of silver sulfide nanoparticles (NpAg2S) obtained by biosynthesis with bacteria: gram-negative — Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli K12 and gram-positive bacteria — Bacillus subtilis 168 was carried out for the first time. The biosynthesis of NpAgjS was carried out in a 1 mM aqueous solution of AgNO3 and Na2S2O, x 5HO salts in the presence of bacterial cells under aerobic conditions. Analysis of Ag2S nanoparticles by transmission electron microscopy showed that the particles are spherical with an average diameter of 8 ± 2 nm for S. oneidensis MR-1, E. coli K12 and 10 ± 3 nm for B. subtilis 168. It was found that the greatest amount of protein is sorbed on NpAg2S when B. subtilis was used, the smallest when E. coli was used. The main proteins, adsorbed on NpAg2S, were determined by the MALDI/TOF/TOF method, and the heterogeneity of the protein coating was revealed. The least heterogeneity of proteins on the surface of nanoparticles is observed in the case of using B. subtilis

(only one protein predominates—flagellin); the greatest heterogeneity of proteins on nanoparticles obtained with S. oneidensis MR-1. It is shown that all the proteins covering the surface of NpAg2S are proteins of the outer membrane or cytoplasmic membrane of2 the bacteria studied. The composition of the protein coating of nanoparticles is individual and constant for each strain of bacteria. The Z-potential and hydrodynamic diameter differ in magnitude, depending on the «protein corona» of the strain used to obtain NpAg2S. The characteristic of the «protein corona» of biologically produced nanoparticles is an important and necessary condition for their practical application. Keywords: silver sulfide nanoparticles, biosynthesis, «protein corona», Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli K12, Bacillus subtilis 168.

For citation: Voeikova T.A., Zhuravliova O.A., Bulushova N.V., Veiko V.P., Ismagulova T.T., Lupanova T.N., Shaitan K.V., Debabov V.G. «Protein Corona» Of Nanoparticles Of Sulfide Silver Obtained In The Presence Of Gram-Negative And Gram-Positive Bacteria. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 151-156 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-151-156.

For correspondence: Voeikova Tatiana Aleksandrovna, PhD, Chief Researcher scientist of the Laboratory of Protein Engineering, Email: voeikova.tatyana@yandex.ru

Acknowledgments. The work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grant No.16-04-00471).

Studies on electron microscopy of objects were carried out with the financial support of the Program of the Presidium of the RAS (No. 24). Studies using analytical TEM methods were performed on the equipment of the centre of collective usage MSU M.V. Lomonosov with financial support of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation. In this work we used the equipment of the centre of collective usage of the IBG RAS. Conflict of interest. The authors state that there is no conflict of interest.

Received 24.07.17 Accepted 05.10.17

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 578.832.1.083.2

Зайнутдинов С.С.1'2, Гражданцева А.А.2, Кочетков Д.В.3, Чумаков П.М.3'4, Нетесов С.В.1,

Матвеева О.В.5, Кочнева Г.В.1'2

изменение онколитической активности вируса стндай при адаптации к культурам клеток

1 Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, Россия; 2 ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Россия; 3 Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, 119991, Москва, Россия; 4 Федеральный научный центр по исследованиям и разработке иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН,

108819, Москва, Россия; 5 Biopolymer Design LLC, Acton, Massachusetts, USA

Данная работа посвящена изучению корреляции между мутационной изменчивостью и цитотоксическими свойствами онко-литического вируса Сендай при использовании разных систем культивирования. Мы показали, что в результате 12-ти последовательных пассажей в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов вирус Сендай накапливается в ней в высоких титрах без изменения геномной последовательности РНК и цитотокси-ческих свойств в отношении клеток меланомы (Ме18) и глиомы человека (U87MG). Однако для препаратов, полученных в этой системе, существует проблема аллергенности и стандартизации. Её решением могла бы явиться адаптация вируса к культуре клеток. Мы использовали культуры клеток 4647 (клетки почки африканской зелёной мартышки) и 293 (клетки почки эмбриона человека), которые аттестованы для производства вакцин в России.

Оказалось, что при репродукции вируса в данных культурах клеток в течение 21—25 пассажей происходит накопление мутаций с наибольшей плотностью несинонимичных замен в генах F и HN, которые кодируют поверхностные белки вириона и обеспечивают его инфекционность. Накопление мутаций приводит к существенному снижению цитотоксической активности штамма Moscow вируса Сендай в отношении клеток меланомы и глиомы человека. Возвратное пассирование на куриных эмбрионах адаптированного к клеткам 4647 вируса Сендай обеспечивает частичную элиминацию адаптивных мутаций и восстановление онколитической активности вируса. Мутации, приобретённые при адаптации к клеткам 293, не элиминируются в процессе 10-кратного обратного пассирования на куриных эмбрионах и не происходит восстановления онколитической активности вируса. Таким образом, стабильность генома вируса Сендай имеет важное значение для реализации его онколитического потенциала, и это необходимо учитывать при выборе технологии производства противоопухолевых препаратов на основе данного вируса.

Ключевые слова: вирус Сендай, онколитический вирус, культура клеток, структура генома, цитотоксическая активность, адаптивные мутации.

Для корреспонденции: Кочнева Галина Вадимовна — д-р биол. наук, зав. лабораторией вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора; е-таН: kochneva@vector.nsc.ru, g.v.kochneva@yandex.ru

Для цитирования: Зайнутдинов С.С., Гражданцева А.А., Кочетков Д.В., Чумаков П.М., Нетесов С.В., Матвеева О.В., Кочнева Г.В. Изменение онколитической активности вируса Сендай при адаптации к культурам клеток. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35(4): 156-160. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-156-160.

Введение

Вирус Сендай относится к роду Respirovirus семейства Pneu-moviridae отряда Mononegavirales. Его вирион диаметром около 200 нм имеет липидную мембрану. Геном вируса Сендай представляет собой негативную одноцепочечную РНК длиной 15384 н., которая кодирует 6 белков: нуклеокапсидный, матриксный, фосфопротеин, белок слияния, гемагглютинин-нейраминидазу и РНК-полимеразу [6]. За взаимодействие с клеткой у респиро-вирусов отвечают белки гемагглютинин (связывание сиаловой кислоты на поверхности клетки) и нейраминидаза (расщепление сиаловой кислоты). Обе функции у вируса Сендай объединены в едином белке гемагглютинин-нейраминидаза (HN). Вирусы с этим с белком используют расположенную на клеточной поверхности сиаловую кислоту в качестве рецептора. HN взаимодействует с сиаловой кислотой с высокой степенью аффинности, в результате чего происходит слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной и вхождение вируса в клетку. В этом процессе также участвует белок слияния (F) [2, 6]. Таким образом, два поверхностных белка вируса Сендай, гемагглютинин-нейраминидаза и белок слияния, обеспечивают способность вируса распознавать чувствительные к нему клетки и инфицировать их. Вирус Сендай вызывает инфекцию респираторного тракта у мышей, хомяков, морских свинок и крыс, но совершенно безопасен для человека [10].

Вирус Сендай обладает выраженными онколитическими и иммуностимулирующими свойствами [7]. Показано, что даже инактивированный ультрафиолетом вирус Сендай сохраняет свои противоопухолевые свойства [3, 4, 5]. Первые фазы клинических испытаний ряда препаратов на основе данного вируса продемонстрировали обнадёживающие результаты [8, 9].

Вирус Сендай первоначально был выделен и охарактеризован в Японии, после завоза одного из японских изолятов этого вируса в Россию прошёл около 30 пассажей в Москве на куриных эмбрионах и получил название штамм Moscow [11]. В России в 1990-х гг. противоопухолевые свойства штамма Moscow тестировались на добровольцах со злокачественными заболеваниями III и IV стадии, у некоторых из них наблюдалась длительная ремиссия [8].

Вирус Сендай хорошо размножается в аллантоисной полости куриных эмбрионов, однако вирусные препараты, полученные таким путём, могут быть аллергенными из-за присутствия в них куриного белка. Существует также проблема стандартизации таких препаратов. Решением данных проблем может являться адаптация вируса к репродукции in vitro на специализированных культурах клеток. Однако не известно, происходит ли при смене системы культивирования возникновение адаптивных мутаций, и влияют ли эти мутации на цитотоксические свойства вируса в отношении опухолевых клеток. Настоящая работа посвящена этому вопросу, а именно изучению корреляции между мутационной изменчивостью и онколитическими свойствами штамма вируса Сендай. Данную корреляцию мы изучали при пассировании вируса на культурах клеток 4647 (клетки почки африканской зелёной мартышки) и 293 (клетки почки эмбриона человека). Обе клеточные культуры аттестованы для производства вакцин в России.

Материалы и методы

Штамм Moscow вируса Сендай (SeV) был получен из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, в коллекции АТСС зарегистрирован под № РТА-121432. Полная нуклеотид-ная последовательность seV штамма Moscow была определена нами и депонирована в базу данных GenBank под номером KP717417.1.

Культуры клеток почки африканской зелёной мартышки 4647 (ЕСАСС 90091902) и почки эмбриона человека 293 (дериват HEK 293, ЕСАСС 85120602) получены из Коллекции культур клеток Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор». Культуры клеток опухолей человека Mel8 и U87MG получены из коллекции АТСС. Клетки выращивали

в ростовой среде ДМЕМ (Invitrogen, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США) при температуре 37°C.

Куриные эмбрионы 10-дневного возраста получали в ЗАО «Птицефабрика «Ново-Барышевская»» (с. Барышево, Новосибирская обл.).

Пассирование SeV штамма Moscow на культурах клеток проводили в среде ДМЕМ с добавлением трипсина (Sigma, США) до конечной концентрации 0,01 мг/мл при температуре 37°C. Титр вируса в культуральной среде определяли каждые сутки с использованием реакции гемагглютинации (РГА) (см. ниже). Культивирование проводили до остановки роста титра вируса (72—96 ч).

Пассирование SeV штамма Moscow на куриных эмбрионах проводили путем введения 100 мкл вирусной суспензии, содержащей 32 гемагглютинирующие единицы (ГАЕ, см. ниже), в ал-лантоисную полость. Далее заражённый куриный эмбрион инкубировали при 37°C в течение 72 ч, после чего вируссодержащую аллантоисную жидкость извлекали и анализировали в РГА.

РГА проводили путём смешивания 1%-го раствора эритроцитов петуха в физиологическом растворе с 2-кратными разведениями вируссодержащей жидкости в объёмном соотношении 1:1 и последующей инкубацией при 4°C в течение 1 ч. Количество гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) принимали равным наибольшему разведению вируса, где произошла гемагглютинация.

Концентрацию вируса в образцах (физический титр) оценивали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония) методом негативного контрастирования. Вирус сорбировали на медные сетки (50 мкл), покрытые формваровой плёнкой и напылённые углеродом, в течение 30 с, далее контрастировали уранилацетатом в течение 30 с. При расчёте концентрации использовали только морфологически цельные вирионы.

Цитотоксическую активность различных вариантов SeV в культурахклетокопределялимикрометодомна96-луночныхплан-шетах (Greiner, Австрия) с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент XTT, Sigma, США) [1]. Метод основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый ХТТ в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помощью феназин-метасульфата (PMS) и последующая фотометрия позволяют точно соотнести изменение оптической плотности раствора с изменением количества жизнеспособных клеток. Мы оценивали специфическую гибель инфицированных вирусами клеток по отношению к не-инфицированным (контроль, 100% жизнеспособности). Онколи-тическую активность выражали как 50%-ную цитотоксическую дозу (ЦТД50) — это концентрация вируса, вызывающая гибель 50% клеток. Для определения ЦТД50 в лунки планшета с 50%-ым монослоем клеток вносили десятикратные разведения вирусной суспензии 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 в 100 мкл среды 199 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Эту же среду без вируса использовали в качестве контроля (100% выживаемость клеток). Планшеты помещали в термостат при температуре 37°C, 5% C02, влажности 85% и инкубировали 72 ч. После инкубации в каждую тестируемую лунку добавляли по 50 мкл смеси ХТТ (Sigma, США) и PMS (Fluka, США), приготовленной из расчёта 20 мкл 1,25 мМ PMS на каждый мл рабочего раствора XTT 1мг/мл. Планшет инкубировали ещё 4 ч и определяли оптическую плотность ОП490/620 на планшетном спектрофотометре SpectraCount (Packard, США). Каждую точку делали в пяти повторах, определяли среднее значение и дисперсию для различных концентраций вируса, строили график зависимости ОП от множественности инфекции. По графику определяли ЦТД50 — концентрацию вируса, при которой величина ОП490/620, измеренная в заражённых лунках, составляет 50% от величины ОП490/620, измеренной в лунках с незаражённой культурой. Все расчёты проводили с использованием программного обеспечения LabView.

Обратную транскрипцию вирусной РНК и получение кДНК проводили с использованием набора «Реверта L» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва) в соответствии с рекомендациями производителя.

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием буфера для ПЦР, смеси дНТФ и фермента Pfu-ДНК-

100000 1

й-Б

юооо -

о

X

о s а.

5

m

о" ю FC

1000 -

100 -

10

Mel8

Ы Moscow ¡1 Sen4647mos25K310

U87MG

Культура клеток I SenK312 Ш Sen4647mos25 I Sen293nsk21 ЕЭ Sen293nsk21K310

Рис. 1. Сравнительная цитотоксическая активность штаммов вируса Сендай на культурах опухолевых клеток человека Mel8 и U87MG. На оси ординат представлены значения ЦТД50, выраженные в числе вирионов Сендай на опухолевую клетку. Число вирионов (физический титр) определяли электронно-микроскопическим анализом (негативное контрастирование). * — максимально использованная доза вируса (105 вирионов на клетку) не вызывала 50%-го цитотоксического эффекта.

полимеразы фирмы «СибЭнзим» (Новосибирск). Длина ампли-фицируемых фрагментов генома составила 800—900 п.н.

кДНК секвенировали по методу Сенгера. Реакцию Сенгера проводили набором BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждой молекулы ДНК секвенировали обе её цепи. После этого ДНК осаждали 96% этанолом, растворяли в формамиде и анализировали с помощью прибора 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Сборку полногеномных последовательностей из секвениро-ванных фрагментов, их выравнивание и анализ делали с помощью программы MEGA 5.

замен, спектр которых отличался у разных культур клеток (табл. 1).

Из таблицы 1 следует, что как исходный штамм Moscow, так и полученные штаммы Sen4647mos25 и Sen293nsk21 гетероген-ны. Возможно, различия в геномах, видимые как мутации, в действительности возникли из-за отбора вирусных клонов, которые оказались наиболее адаптированы к соответствующим культурам клеток. С уверенностью можно сказать, что фиксации одного из двух нуклеотидов произошли в позициях №№ 4, 8, 14, причём фиксации случились как у Sen4647mos25, так и у Sen293nsk21.

Совпадающих позиций мутаций между штаммами, кроме упомянутых позиций фиксации нуклеотидов, нет. Однако имеются мутации, произошедшие достаточно близко друг к другу: №№ 4, 5 (мутации в соседних кодонах гена F) и №№ 9, 10 (мутации в одном и том же кодоне гена HN). Важность данных участков соответствующих белков для более эффективной репликации вируса на культуре клеток может быть проверена путём возвратного пассирования культуральных штаммов на куриных эмбрионах (см. далее).

Следующий этап работы состоял в изучении цитотоксиче-ского действия полученных штаммов SeV на культуры раковых клеток человека. Мы в своей работе использовали клетки мела-номы (Mel8) и клетки глиобластомы U87MG — двух видов опухолей человека, которые наиболее трудно поддаются терапии. Цитотоксическую активность измеряли в колориметрическом тесте с использованием реагента ХТТ путём расчёта 50%-ой ци-тотоксической дозы (ЦТД50, см. Материалы и методы), выраженной в числе вирионов на клетку. Чем больше ЦТД50, тем меньшей цитотоксической активностью обладает вирус для данной культуры клеток. Результаты XTT-тестов представлены на рис. 1. Видно, что ЦТД50 адаптированных к культурам клеток штаммов seV в отношении опухолевых клеток человека достоверно превышает ЦТД50 исходного штамма Moscow (Р < 0,01). Это свидетельствует о потере выраженных онколитических свойств штамма Moscow seV при адаптации к культуре клеток.

С целью проверки стабильности изменения онколитических свойств и их связи с мутационной изменчивостью seV оба культу-ральных штамма sen4647mos25 и sen293nsk21 были подвергнуты возвратному пассированию на куриных эмбрионах в течение 10 пассажей. Полученные после такого пассирования штаммы были названы соответственно Sen4647mos25K310 и Sen293nsk21K310.

Результаты и обсуждение

Исходный препарат штамма Moscow seV прошёл около 30 пассажей на куриных эмбрионах (аллантоисная жидкость) и не культивировался ранее на культурах клеток. Титр данного препарата составлял 1:1024. Инфицирование исходным препаратом вируса клеток 4647 и 293 вызывало активное формирование цитопатического эффекта в виде синцития (клетки 4647) и/или в виде округления и слущивания клеток (клетки 293). Однако уже после первого пассажа титр вируса в культу-ральной среде существенно снижался и составлял 1:4—1:8, несмотря на наличие трипсина. Последующее пассирование приводило к увеличению титра вируса до 1:256—1: 512 и было прекращено после его стабилизации на этом уровне в течение не менее чем 3-х пассажей. В результате на культуре клеток 4647 вирус прошёл 25 пассажей, а на культуре клеток 293—21 пассаж. Полученные культуральные варианты штамма Moscow seV названы соответственно, Sen4647mos25 и Sen293nsk21.

Для вариантов sen4647mos25 и Sen293nsk21 было проведено полногеномное секвенирование. Для удобства анализа для каждого генома была построена комплементарная последовательность, представляющая собой (+)ДНК. Сравнение геномов культуральных и исходного штаммов выявило достаточно большое количество

Таблица 1

Спектр мутаций вариантов штамма Moscow SeY, адаптированных к культурам кле-

Номер Позиция

мута- в (+) Ген* Moscow Sen4647mos25** Sen293nsk21

ции ДНК

1 109 НТО C — — M — - C — —

2 3064 P C TAC тир C TAC тир Y TAY тир

3 5320 F C GCA ала M GMA глу/ала C GCA ала

4 5445 F R RTA иле/вал A ATA иле A ATA иле

5 5450 F C AGC сер C AGC сер A AGA арг

6 6640 НТО G — — R — — G — —

7 6760 HN T TTA лей T TTA лей Y TYA сер/лей

8 7242 HN Y YCT про/сер T TCT сер C CCT про

9 7341 HN G GCT ала G GYT ала/вал A ACT тре

10 7342 HN C GCT ала Y GYT ала/вал C ACT тре

11 7834 HN A AAT асн A AAT асн G AGT сер

12 8072 HN T AAT асн T AAT асн A AAA лиз

13 9389 L A TCA сер A TCA сер R TCR сер

14 10394 L Y AAY асн T AAT асн C AAC асн

15 10814 L T AGT сер Y AGY сер T AGT сер

16 11295 L C CCG про Y YCG про/сер C CCG про

17 14582 L A GAA глу R GAR глу A GAA глу

Примечание. * НТО — - нетранслируемая область генома; Р — фосфопротеин; F — бе

лок слияния; НК — гемагглютинин-нейраминидаза; 1 — РНК-полимераза. ** Светло-серым цветом показаны несинонимичные замены, темно-серым — фиксации из двух аминокислот. М = А или С; У = Т или С; И = А или G.

Таблица 2

Спектр мутаций штаммов Sen4647mos25 и Sen293nsk21 после возвратного пассирования на куриных эмбрионах

Номер мутации Позиция в (+) ДНК Ген* Moscow Sen4647mos25 Sen4647mos25КЭ10

3 5320 F C GCA ала M GMA глу/ала M GMA глу/ала

4 5445 F R RTA иле/вал A ATA иле R RTA иле/вал

6 6640 НТО G — — R — — G — —

8 7242 HN y yCT про/сер T TCT сер T TCT сер

10 7342 HN C GCT ала y GyT ала/вал T GTT вал

Номер мутации Позиция в (+) ДНК Ген Moscow Sen293nsk21 Sen293nsk21КЭ10

4 5445 F R RTA иле/вал A ATA иле A ATA иле

5 5450 F C AGC сер A AGA арг A AGA арг

7 6760 HN T TTA лей y TYA сер/лей C TCA сер

8 7242 HN y yCT про/сер C CCT про C CCT про

9 7341 HN G GCT ала A ACT тре A ACT тре

11 7834 HN A AAT асн G AGT сер G AGT сер

12 8072 HN T AAT асн A AAA лиз A AAA лиз

* Все обозначения — как в таблице 1.

В качестве контроля стабильности генома исходный препарат штамма Moscow был также пассирован на куриных эмбрионах в течение 12 пассажей, и был получен штамм SenTO12.

Поскольку в генах F и HN мы наблюдали больше всего несинонимичных замен (табл. 1), секвенирование именно этих генов проводили для возвратно пассированных вариантов. Секвенирование генов F и HN штамма Sen4647mos25^10 показало, что после прохождения 10 пассажей на куриных эмбрионах часть «культуральных» замен Sen4647mos25 (№№ 4, 6) вернулась к исходному варианту вируса (штамм Moscow) (табл. 2). Другие позиции сохранились (№№ 3, 8) либо закрепились (№ 10). Следовательно, только часть мутаций, приобретённых в результате пассажей на культуре клеток 4647, благоприятна для размножения SeV на куриных эмбрионах. Важно, что даже при частичном возврате к исходному генотипу происходит восстановление онко-литических свойств вируса (рис. 1). Отметим, что ЦТД50 штамма Sen4647mos25^10 для опухолевых клеток человека Mel8 и U87MG не отличаются от аналогичных показателей исходного штамма Moscow.

Мутации, приобретаемые SeV при адаптации к клеткам 293, не исчезают в процессе возвратного пассирования на куриных эмбрионах (табл. 2). Секвенирование генов F и HN штамма Sen293nsk21^10 обратных мутаций не выявило: все мутации сохранились, одна (№ 7) закрепилась. Это свидетельствует о том, что мутации, приобретённые на культуре клеток 293, не влияют на размножение SeV на куриных эмбрионах. Однако эти мутации влияют на онколитическую активность вируса, восстановления которой в данном случае не происходит. ЦТД50 штаммов Sen293nsk21 и Sen293nsk21^10 для опухолевых клеток человека Mel8 и U87MG достоверно не отличаются (см. рис. 1).

Секвенирование генов F и HN штамма SenTO12 не выявило отличий от исходного штамма Moscow. Это свидетельствует о том, что геном SeV при пассировании на куриных эмбрионах стабилен, по крайней мере, в течение 12 пассажей. При этом также сохраняется цитотоксическая активность вируса в отношении опухолевых клеток человека Mel8 и U87MG (см. рис. 1).

Ранее мы предположили, что мутации №№ 4, 5, 9, 10 могут играть важную роль для развития вируса на культуре клеток, так как при адаптации к культурам клеток они независимо затронули одни и те же участки белков F и HN. После возвратного пассирования на куриных эмбрионах три из этих мутаций не вернулись к исходному варианту (штамму Moscow), кроме мутации № 4, которая вновь приобрела гетерогенность (иле/вал), как в штамме Moscow. По-видимому, присутствие валина в данной позиции (5445 н.) существенно для репликации вируса в куриных эмбрионах, а также способствует сохранению/восстановлению его онколитической активности.

Сравнительный анализ (см. табл. 1, 2 и рис. 1) также показал, что для проявления онколитической активности штамма Moscow SeV имеет значение наличие следующих аминокислотных остатков в структуре белков F и HN: серина в позиции 5450 н. (мутация № 5); аланина в позициях 7341 и 7342 н. (мутации № 9 и 10); аспарагина в позициях 7834 и 8072 н. (мутации № 11 и 12); а также нуклеотида G в позиции 6640 н. нетранслируемой области генома (мутация № 6). Сохранение мутаций в этих позициях в случае штаммов Sen293nsk21 и Sen293nsk21^10 является, по-видимому, основной причиной снижения цитотоксической активности данных штаммов в отношении опухолевых клеток человека Mel8 и U87MG. Важно отметить также, что ни одна из выявленных нами «культуральных» мутаций не препятствовала размножению вируса на куриных эмбрионах, в аллан-тоисной жидкости которых уже в первом возвратном пассаже регистрировался высокий титр вируса 1:1024—1:2048 ГАЕ.

Таким образом, куриные эмбрионы являются высоко пермиссивной системой для культивирования и сохранения онколитических свойств SeV. При адаптации вируса к культурам клеток 4647 и 293 происходит накопление мутаций с наибольшей плотностью несинонимичных замен в генах F и HN, которые кодируют поверхностные белки вириона и обеспечивают эффективность его взаимодействия с раковой клеткой. Накопление этих мутаций приводит к существенному снижению цитотоксической активности SeV по крайней мере в отношении использованных нами клеток меланомы и глиомы человека. Возвратное пассирование на куриных эмбрионах адаптированного к клеткам 4647 SeV обеспечивает частичную элиминацию адаптивных мутаций и восстановление онколитической активности вируса. Выявленные закономерности необходимо учитывать при разработке противоопухолевых препаратов на основе онколити-ческих штаммов SeV, а также, по-видимому, и многих других вирусов.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования Российской Федерации (уникальный код проекта: RFMEFI60721X0014). и инициативного научного проекта в рамках Госзадания Новосибирского государственного университета 6.5546.2017/БЧ (Номер для публикаций: 6.5546.2017/8.9).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кочнева Г.В., Бабкина И.Н., Лупан Т.А., Гражданцева А.А., Юдин П.В., Сиволобова Г.Ф., Швалов А.Н., Попов Е.Г., Бабкин И.В., Не-тесов С.В., Чумаков П.М. Апоптин усиливает онколитическую активность вируса осповакцины in vitro. Молекулярная биология. 2013; 47(5): 842—52.

6. Матвеева О.В., Кочнева Г.В., Нетесов С.В., Оникиенко С.Б., Чумаков П.М. Механизмы онколитического действия парамиксовируса Сендай. Acta Naturae. 2015; 7(2): 6—17.

REFERENCES

1. Kochneva G.V., Babkina I.N., Lupan T.A., Grazhdantseva A.A., Yudin P.V., Sivolobova G.F., Shvalov A.N., Popov E.G., Babkin I.V., Netesov S.V., Chumakov P.M. Apoptin enhances oncolytic activity of vaccinia virus in vitro. Molekulyarnaya biologiya. 2013; 47

2. Chang A., Dutch R.E. Paramyxovirus fusion and entry: multiple paths to a common end. Viruses. 2012; 4(4): 613—36.

3. Fujihara A., Kurooka M., Miki T., Kaneda Y. Intratumoral injection of inactivated Sendai virus particles elicits strong antitumor activity by enhancing local CXCL10 expression and systemic NK cell activation. Cancer Immunol. Immunother. 2008; 57(1): 73—84.

4. Kawaguchi Y., Miyamoto Y., Inoue T., Kaneda Y. Efficient eradication

of hormone-resistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle. Int. J. Cancer. 2009; 124(10): 2478—87.

5. Kurooka M., Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells. Cancer Res. 2007; 67(1): 227—36.

6. Matveeva O.V., Kochneva G.V., Netesov S.V., Onikienko S.B., Chuma-kov P.M. Mechanisms of oncolysis by paramyxovirus Sendai. Acta Naturae. 2015; 7

7. Matveeva O.V., Guo Z.S., Shabalina S.A., Chumakov P.M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. Mol. Ther. Oncolytics. 2015; 2: pii: 15011. doi: 10.1038/ mto.2015.11.

8. Matveeva O.V., Guo Z.S., Senin V.M., Senina A.V., Shabalina S.A., Chumakov P.M. Oncolysis by paramyxoviruses: preclinical and clinical studies. Mol. Ther. Oncolytics. 2015; 2: pii: 150017. doi: 10.1038/ mto.2015.17.

9. Saga K., Tamai K., Yamazaki T., Kaneda Y. Systemic administration of a novel immune-stimulatory pseudovirion suppresses lung metastatic melanoma by regionally enhancing IFN-y production. Clin. Cancer Res. 2013; 19(3): 668—79.

10. Slobod K.S., Shenep J.L., Lujan-Zilbermann J., Allison K., Brown B., Scroggs R.A. et al. Safety and immunogenicity of intranasal murine parainfluenza virus type 1 (Sendai virus) in healthy human adults. Vaccine. 2004; 22(23-24): 3182—6.

11. Zainutdinov S.S., Tikunov A.Y., Matveeva O.V., Netesov S.V., Kochneva G.V. Complete Genome Sequence of the Oncolytic Sendai virus Strain Moscow. GenomeAnnounc. 2016; 4(4): pii: e00818—16.

Zainutdinov S.S.12, Grazhdantseva AA.2, Kochetkov D.V.3, Chumakov P.M.3-4, Netesov S.V.1, Matveeva O.V.5, Kochneva G.V.'-2

CHANGES IN ONCOLYTIC ACTIVITY OF SENDAI VIRUS DURING ITS ADAPTION TO CELL CULTURES

1 Novosibirsk state university, 630090, Novosibirsk, Russia;

2 State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», 630559, Koltsovo, Russia; 3 Engelhardt Institute of Molecular Biology of RAS, 119991, Moscow, Russia;

4 Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune Biology Products RAS, 108819, Moscow,

Russia;

5 Biopolymer Design LLC, Acton, Massachusetts, USA

The study compares cytotoxic activity of oncolytic Sendai virus strains that went through a series of passages in different cell cultures and in chicken embryo. We show that 12 consecutive passages in chicken embryo results in an accumulation in allantois fluid of high titers of Sendai virus (Moscow strain) that demonstrates no sequence changes in the genomic RNA and a high cytotoxic activity for human melanoma (Mel8) and glioblastoma (U87MG) cells. However, the virus stocks obtained from allantois fluid may be difficult to standardize and to void of potential allergenic components. An adaptation of the virus to cell culture could have solved the problem. We preformed the adaptation passaging in two different cell lines — African green monkey kidney derived 4647 cells and Ad2 DNA transformed human embryonic kidney cells 293. The cell lines have been approved for vaccine production in Russia. The reproduction of the virus in these cells during 21—25 passages resulted in an accumulation of non-synonymous substitutions

that preferentially cluster within the F and HN genes encoding surface proteins of virions and are required for the infectivity. The accumulation of mutations in Sendai virus Moscow strain resulted in to a substantial mitigation of the cytolytic activity toward human melanoma and glioglastoma cells. A reverse passaging of the virus adapted to 4647 cells in chicken embryo resulted in an elimination of some acquired adaptive mutations and a restoration of oncolytic activity of the virus. However 10 passages in chicken embryos neither eliminated the mutations acquired by passaging in 293 cells, nor restored the oncolytic activity of the virus. We conclude that a genome stability of Sendai virus is important in the preservation of the oncolytic properties, which should be taken into account when considering a technology for a production of anticancer agents based on the virus.

Keywords: virus Sendai, oncolytic virus, cell culture, genome structure, cytotoxic activity, adaptive mutations.

For citation: Zainutdinov S.S., Grazhdantseva A.A., Kochetkov D.V., Chumakov P.M.,, Netesov S.V., Matveeva O.V., Kochneva G.V. Changes in oncolytic activity of Sendai virus during its adaption to cell cultures. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologi-ya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 156-160 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-156-160.

For correspondence: Galina V. Kochneva — Ph.D./Dr.Sci., Head of viral hepatitis lab, State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»; e-mail: kochneva@vector.nsc.ru; g.v.kochneva@ yandex.ru

Acknowledgments. This work was supported by the Russian Ministry of Education and Science (unique project identifier RFMEFI60721X0014). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 29.05.17 Accepted 05.11.17

Сведения об авторах:

Новосибирский государственный университет Нетесов Сергей Викторович — член-корр. РАН, профессор, д-р биол. наук, зав. лаб., e-mail: svn15@hotmail.com

Зайнутдинов Сергей Сергеевич — аспирант, e-mail: zaynutdinov_ss@vector.nsc.ru

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Кочнева Галина Вадимовна (автор для переписки) — д-р биол. наук, зав. лаб., е-mail: g.v.kochneva@yandex.ru

Гражданцева Антонина Анатольевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр., e-mail: gaa@vector.nsc.ru

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

РАН

Кочетков Дмитрий Владимирович — канд. биол. наук, науч. сотр., e-mail: dvkochetkov@gmail.com

Федеральный научный центр по исследованиямиразработке иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Чумаков Петр Михайлович — д-р биол. наук., зав. отделом, e-mail: chumakovpm@yahoo.com Biopolymer Design LLC

Матвеева Ольга Вячеславовна — учредитель, e-mail: olga. matveeva@gmail.com