СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ
METHOD OF IMMUNOSUPPRESSION

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при обработке клеток костного мозга перед аутотрансплантацией при лечении лейкозов, при экстракорпоральной фармакотерапии и при локальной химиотерапии рака.
Циклофосфамид (ЦФ) является классическим цитостатическим препаратом, обладающим мощным противоопухолевым действием (М.Loeffler, J.A.Kruger, R.A.Raisfeld, Cancer Res., 2005, 65, 5027-5030) и выраженной иммуномодулирующей активностью in vivo (http://www.xpharm.com/citation?Article_ID=8220; F.С.Thistlethwaite, E.Elkord, R.W.Griffiths et al., Cancer Immunol. Immunother., 2008, 57, 623-634). Характерной особенностью ЦФ является отсутствие какой-либо активности in vitro. Его действие in vivo определяется активностью продуктов, образующихся в результате метаболической активации в печени с помощью цитохром Р450-зависимой полисубстратной монооксигеназной системы на изоформах CYP3A4, CYP2B6 и CYP2C9 (S.-F. Zhou, В.Chowbay, С.С.Хuе, Curr. Pharmacogenom, 2007, 5, 1-14). Точка зрения, что действие ЦФ in vivo обусловлено только его активными метаболитами, а, вернее, балансом между процессами активации ЦФ и инактивации его активных продуктов, является общепринятой. В 1984 г. было разработано соединение - производное первого продукта активации ЦФ (4-ОН-ЦФ) - мафосфамид (МАФ), который при растворении давал весь спектр активных метаболитов ЦФ (U.Niemeyer, J.Engel, P.Hilgard et al. В кн. "Progress in Clinical Biochemistry and Medicine, Vol. 9", Springer-Veriag, Berlin, Heidelberg, 1989, 38-60).
Предпосылкой для изобретения послужили наши ранние работы, где мы анализировали возможные причины контрастных межлинейных различий у мышей в чувствительности к иммунодепрессивному действию ЦФ in vivo (Л.Ю.Телегин, Бюл. эксперим. биол. и мед., 1979, 87, 250-252; L.A.Pevnitsky, L.Yu.Telegin, G.F.Zhimov et al., Int. J. Immunopharmacol., 1985, 7, 875-880; Л.А.Певницкий, В.М.Писарев, Л.Ю.Телегин и др. Вестник РАМН, 1992, 4, 52-55).
Прототипом для проведения нашего исследования послужила работа (Р.R.Kohn, N.Е.Sladek, Immunopharmacol. Immunotoxicol., 1988, 10, 387-398), где смесь мышиных клеток селезенки и костного мозга с целью профилактики возникновения такого осложнения, как реакция "трансплантат-против хозяина" (РТПХ), обрабатывали МАФ в концентрации 160 микромоль и затем вводили летально облученным аллогенным мышам-реципиентам. Продолжительность жизни без признаков РТПХ мышей-реципиентов незначительно возрастала, но при этом наблюдалась "приживляемость" (появление в кровотоке реципиентов) донорских клеток. Увеличение концентрации МАФ значительно увеличило выживаемость реципиентов, однако при этом у них существенно снизилось содержание донорских клеток в крови.
Целью изобретения является разработка нового способа подавления иммунных реакций иммунокомпетентных клеток путем экстракорпоральной обработки их иммунодепрессантами. Данная цель достигается комбинированной обработкой клеток ЦФ и МАФ. Принципиально новым является добавление циклофосфамида при обработке клеток мафосфамидом. Такая комбинация предложена впервые и в литературе не описана.
Техническая сущность изобретения заключается в следующем. В основе изобретения лежит установленное впервые свойство неметаболизированного циклофосфамида усиливать иммунодепрессивное действие своих активных метаболитов. Обоснование способа было получено в опытах с использованием системы адоптивного сингенного переноса иммунокомпетентных клеток и в экспериментах по изучению пролиферации Т-лимфоцитов селезенки мышей. Спленоциты мышей CBA/CaLacY инкубировали с циклофосфамидом и мафосфамидом (источник активных метаболитов циклофосфамида) как по отдельности, так и в комбинации. Было обнаружено, что циклофосфамид сам по себе не влиял на иммунный ответ тест-клеток. Обработка клеток мафосфамидом снизила их иммунный ответ до 46% от контрольного уровня. Добавление циклофосфамида к мафосфамиду привело к более чем двукратному увеличению иммуносупрессивного эффекта мафосфамида (21% от контроля). Аналогичные результаты были получены в опытах по исследованию антипролиферативного действия препаратов на Т-клетки мышей C57BL/6J и мутагенного действия ЦФ и МАФ на лимфоциты периферической крови человека.
8
8
Пример 1. Клетки селезенки мышей-самцов линии CBA/CaLacY обрабатывали при 37°С в течение 1 часа препаратами: 1,5 мкг/мл МАФ + 1000 мкг/мл ЦФ (группа 1), 1,5 мкг/мл МАФ (группа 2), 1000 мкг/мл ЦФ (группа 3). Контролем служили клетки, инкубируемые в среде 199 (группа 4). В предварительных экспериментах было установлено, что концентрация МАФ, равная 1,5 мкг/мл, обеспечивает 50% уровень подавления тест-клеток. Концентрация ЦФ, равная 1000 мкг/мл, приблизительно соответствует (с учетом общего объема жидкости тела мышей) дозе 70 мг/кг in vivo (http://www.labanimal.ru/?catid=10), при которой мы ранее наблюдали выраженные межлинейные различия у мышей в чувствительности к иммунодепрессивному действию ЦФ in vivo (Л. А. Певницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Большев, Бюл. эксперим. биол. мед., 1977, 83, 438-440). Концентрация клеток в инкубационной смеси (объем 1,5 мл) составляла 2,5×10 в 1 мл. Затем спленоциты трижды отмывали центрифугированием и вводили внутривенно по 50 млн вместе с 4×10 эритроцитов барана сингенным мышам-реципиентам, иммунореактивность которых была подавлена предварительным введением ЦФ в дозе 200 мг/кг за 3-4 ч до клеточного переноса. Такая обработка мышей-реципиентов эквивалентна сублетальному облучению и обеспечивает их иммунологическую ареактивность до 6 дней, что позволяет в течение этого срока оценивать иммунный ответ донорских клеток, обработанных различными агентами (Г.К.Баймуканова, Н.Н.Смирнова, Бюл. эксперим. биол. мед. 1977, 84, 336-339). Через 5 дней после клеточного переноса в селезенке реципиентов определяли содержание IgM-антителообразующих клеток (АОК) по методу Ерне. Результаты опытов представлены в табл. 1. Как видно из таблицы, обработка ЦФ практически не влияла на иммунный ответ спленоцитов, МАФ на 54% ингибировал иммунный ответ тест-клеток (Р<0,01). Добавление ЦФ достоверно, более чем в 2 раза усиливало иммунодепрессивное действие МАФ.
4
7
3
Пример 2. Поскольку одной из основных мишеней действия ЦФ являются Т-лимфоциты (Thistlethwaite F. С., Elkord E., Griffiths R. W. et al., Cancer Immunol. Immunother., 2008, 57, 623-634), в следующей серии опытов исследовали предположение, усилится ли подавление пролиферации Т-клеток селезенки мышей линии C57BL/6J при комбинированном воздействии ЦФ и его активных метаболитов. Для оценки пролиферации Т-клеток использовали планшеты с адсорбированными антителами против CDS-рецептора Т-клеток (Biocoat anti-mouse CD3 T-cell activation plate, Becton Dickmson, Labware, Bedford, MA, США). Поскольку полноценная активация Т-клеток посредством антител к CD3 нуждается в дополнительных стимулах, опосредуемых молекулами межклеточного взаимодействия, в качестве отвечающих клеток использовали неочищенные спленоциты, содержащие вспомогательные клетки, которые экспрессируют CD28 и другие костимулирующие молекулы. После лизиса эритроцитов раствором NHCL спленоциты отмывали дважды в изотоническом солевом растворе, забуференном фосфатами, и инкубировали при концентрации 10 клеток в 1 мл с ЦФ (1000 мкг/мл), МАФ (разные концентрации) или в комбинации в течение 1 часа при 37°С. Контрольные клетки инкубировали без препаратов. Инкубацию прекращали добавлением холодной среды, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы, трижды отмывали и переносили в планшеты с антителами к CD3. Клетки инкубировали 72 часа в объеме 200 мкл. За 8 часов до окончания культивирования в лунки добавляли 1 мкКu H-тимидина. Результаты опытов, представленные в табл.2, свидетельствуют о том, что при совместном действии ЦФ и МАФ наблюдается наиболее сильное подавление пролиферации Т-клеток. Как и при исследовании иммуносупрессивного действия препаратов в системе адоптивного переноса, ЦФ сам по себе не оказывал антипролиферативного действия на Т-клетки.
Пример 3. Поскольку биологическое действие ЦФ в организме и, в частности, его иммунодепрессивный эффект обусловлены алкилированием ДНК, мы изучали мутагенное действие (индукцию хромосомных аберраций) комбинации ЦФ и МАФ на лимфоциты периферической крови человека.
o
2
Условия культивирования клеток, полученных от здорового донора, приготовление и окраска препаратов (рутинное окрашивание) и их микроскопический анализ были общепринятыми (Hungerford D. A., Stain TechnoL, 1965, 40, 333-338). Культуру клеток, содержащихся в среде RPMI-1640 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Biotest, Германия), в течение 1 часа при 37°С обрабатывали ЦФ и разными концентрациями МАФ, которые вводили на стадии G клеточного цикла (до введения фитогемагглютинина, ФГА, ПанЭко, Москва, Россия). Далее клетки дважды отмывали и заменяли среду культивирования на новую, содержащую ФГА. Затем культуру фиксировали на 52 часу. За 2 часа до фиксации добавляли колхицин (Calbiochem, Великобритания) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты опытов представлены в табл. 3. Как видно из таблицы, добавление ЦФ достоверно (по критерию χ) усиливает мутагенное действие МАФ, особенно это выражено при использовании концентрации МАФ, равной 3 мкг/мл (более чем в 2 раза). ЦФ per se практически не оказывал мутагенного влияния.
Таблица 1
Влияние циклофосфамида, мафосфамида и их комбинации на иммунный ответ нормальных клеток селезенки мышей CBA/CaLacY
Группа
Препараты
Число АОК в селезенке
Р
1
МАФ+ЦФ
21 (13÷32)
P<sub>1,2</sub><0,01
n=12
2
МАФ
46 (33÷64)
Р<sub>2,3</sub><0,01
n=12
3
ЦФ
98 (81÷118)
Р<sub>3,4</sub>=0,643
n=12
4
Контроль
100 (85÷117)
-
n=11
Примечание. Представлены средние геометрические числа антителообразующих клеток в селезенке мышей, выраженные в процентах к контролю, и 95% доверительные интервалы (в скобках); n - число животных в группе.
Таблица 2
Чувствительность Т-клеток селезенки мышей C57BL/6J к циклофосфамиду и мафосфамиду
Номер, название группы
СD3-ответ, % к контролю
Р
Группа 1 "контроль"
100(91÷110)n=12
P<sub>1,2</sub>=0,661
Группа 2 "Цф"
103
(92÷114)
n=12
Группа 3
87
″МАФ (0,75мкг/мл)″
(78÷95)
P<sub>1,3</sub><0,05
n=12
Группа 4
64
"МАФ (1,5 мкг/мл)"
(56÷71)
P<sub>1,4</sub><0,0001
n=12
Группа 5
45
"МАФ (3,0 мкг/мл)"
(38÷53)
P<sub>1,5</sub><0,0001
n=12
Группа 6
62
"МАФ (0,75 мкг/мл) +ЦФ"
(52-72)
Р<sub>3,6</sub><0,001
n=12
Группа 7
44
"МАФ (1,5 мкг/мл) + ЦФ"
(39÷49)
P<sub>4,7</sub><0,0001
n=12
Группа 8
33
"MAФ (3,0 мкг/мл)+ ЦФ"
(23÷43)
Р<sub>5,8</sub><0,05
n=12
Примечание. Представлены средние значения числа имп/мин, выраженные в процентах к контролю, и (в скобках) 95% доверительные интервалы; n - число животных в группе.