Способ морфометрической оценки прогноза течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по содержанию STAT3+ опухолевых клеток в лимфатических узлах
METHOD FOR MORPHOMETRIC ASSESSMENT OF A DIFFUSE B-LARGE-CELL LYMPHOMA PREDICTION BY STAT3+ TUMOR CELL COUNT IN LYMPH NODES

Изобретение относится к медицине, а в частности к гематологии и может быть использовано для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) для оценки и морфометрического подсчета относительного количества STAT3+ опухолевых клеток путем проведения иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания клеток в гистологических срезах лимфоузлов.
ДВККЛ является самым частым вариантом лимфом у взрослых. Она составляет 25-30% всех неходжкинских лимфом в европейских странах и встречается с еще большей частотой - в восточных (Sehn L.H. Diffuse large В-cell lymphoma: optimizing outcome in the context of clinical and biologic heterogeneity / Sehn L.H., Randy D. Gascone // Blood. - 2015.- Vol. 125(1). - p. 22-32; World Health Organization, Diffuse large B-cell lymphoma, not otherwise specified. - 2008). Современная классификация 2017 года отражает большое разнообразие нозологических форм, присущее этой патологии. Вследствие высокой гетерогенности заболевания, результаты лечения больных разные. По данным литературы 5-летняя общая выживаемость при ДВККЛ колеблется от 30 до 50% (Hui Liu. Clinical significance and prognostic value of STAT3 expression in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab-CHOP therapy / Hui Liu, Li Zhu [et al.] // Int J Clin Exp Med. - 2016. - Vol. 9(6). - p. 9356-9364). В связи с этим крайне важен прогноз на ранних стадиях заболевания для стратификации таких пациентов в группы риска. Существующие на сегодняшний день прогностические модели не потеряли своей значимости, но не всегда позволяют оценить выживаемость и индивидуальный риск неудач терапии.
В настоящее время проводятся исследования биомаркеров, играющих ключевую роль в патогенезе ДВККЛ. По мнению ряда авторов одним из потенциальных предикторов может стать протеин STAT3 (Chi Young Ok. Clinical implications of Phosphorylated STAT3 Expression in De Novo Diffuse Large B-cell Lymphoma / Chi Young Ok, Jiayu Chen [et al.] // Clinical Cancer Rec-2014. - Vol. 20(19). - p. 5113-5123; Song Lin. Expression and significance of leptin receptor, p-STAT3 and p-AKT in diffuse large B-cell lymphoma / Song Lin, Li Yujun, Xing Xiaoming [et al.] // Acta Histochemica. - 2014. - Vol.116. - p. 126-130; B. Belinda Ding. Constitutively activated STAT3 promotes cell proliferation and survival in the activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphomas / B. Belinda Ding, J. Jessica Yu [et al.] // Blood. - 2008. - Vol. 111. - №3. - p. 1515-1523). Данный белок активно участвует в регуляции клеточного цикла и является важным компонент JAK-STAT клеточного пути, имеет существенное значение в патогенезе лимфомы. Тем не менее, роль экспрессии STAT3+ клеток в патогенезе заболевания до сих пор изучена недостаточно. Практически отсутствуют сведения о связи уровня STAT3+ опухолевых клеток с характером течения патологического процесса.
Целью изобретения является разработка способа морфометрического прогнозирования течения ДВККЛ по относительному содержанию STAT3+ опухолевых клеток в лимфатических узлах.
Близким техническим решением к предполагаемому изобретению является оценка концентрации активной формы транскрипционного фактора STAT3, позволяющая изучить функциональное состояние мононуклеаров при бронхиальной астме (Минеев В.Н., / Характеристика экспрессии транскрипционного фактора pSTAT3 при бронхиальной астме / В.Н Минеев, Т.М. Лалаева // Терапевтический архив. - 2017; 89 (3). - С. 48-53). Данный метод дает возможность количественно точно оценить экспрессию STAT3 в клетках венозной крови при бронхиальной астме. Основными отличиями используемого метода являются, во-первых то, что количественный подсчет проводился не в опухолевых клетках, а в мононуклеарных клетках венозной крови; во-вторых, вычисления основывались не на морфометрическом анализе гистологического материала, а на иммунофенотипической оценке клеток суспензии крови. Следовательно, данный метод не позволяет количественно точно оценить состояние опухоли в лимфатическом узле.
Способа морфометрической оценки прогноза течения ДВККЛ по содержанию STAT3+ опухолевых клеток в гистологических срезах лимфоузлов не существует.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.
Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.
Способ осуществляется следующим образом
После лимфаденэктомии у больных ДВККЛ выполняли гистологическую проводку послеоперационного материала на гистологических срезах, приготовленных из парафиновых блоков лимфоузла, толщиной 3-5 мкм по общепринятому способу. Для идентификации и визуализации STAT3+ опухолевых клеток в исследуемом материале использовали ИГХ метод окрашивания. Иммунореактивность первичных антител («Dako») выявляли с помощью вторичных антител коньюгированных с пероксидазой, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako»). Постановку ИГХ реакции осуществляли по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку относительного содержания STAT3+ опухолевых клеток выполняли на световом микроскопе «AxioScope.Al» фирмы «Carl Zeiss М icroscopy GmbH» со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений, с окуляром х10, при объективе х100. Исследования проводили в 5 полях зрения для каждого образца. Исходя из полученных результатов, вычисляли среднее относительное содержание STAT3+ опухолевых клеток в лимфатическом узле по формуле:
S=D/n×100%,
где:
S - среднее относительное содержание STAT3+ опухолевых клеток в лимфатическом узле, %
D - количество STAT3+ опухолевых клеток в 5 полях зрения
n - общее количество опухолевых клеток в 5 полях зрения
Исследования выполнены на гистологических срезах лимфатических узлов от 50 пациентов с ДВККЛ в возрасте от 31 до 83 лет (28 - мужского пола и 22 женского). При оценке относительного содержания STAT3+ клеток благоприятное течение заболевания установлено у 16 пациентов (7 имели «нетерминальный» подтип и 9 «герминальный»). У остальных 34 больных определен неблагоприятный прогноз (25 пациентов с «нетерминальным» подтипом и 9 с «терминальным»).
Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение ДВККЛ после лимфаденэктомии по относительному содержанию STAT3+опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов.
Пример 1.
Больная П., 60 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 16.09.2014 г. Диагноз при поступлении: ДВККЛ, 3 стадия (подтип заболевания «нетерминальный»). Клиническая характеристика: увеличение внутригрудных и шейных лимфатических узлов, слабость, потливость. На 2 день (18.09.2014 г.) выполнена операция: шейная лимфаденэктомия, без осложнений. Проведено ИГХ окрашивание опухолевых клеток в гистологических срезах шейного лимфатического узла по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное содержание STAT3+ опухолевых клеток - 87% (S). Установленная величина S получена в ходе следующего расчета: S=368/422×100%. Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа определено, что у больного ДВККЛ неблагоприятный прогноз течения заболевания. В ходе динамического наблюдения за пациентом выявленные данные были подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Так, после лимфаденэктомии проведен курс химиотерапии по стандартному протоколу «RCHOP». Однако через 12 месяцев после окончания терапии 1 линии установлен ранний рецидив. Заболевание имело агрессивное течение, клинико-гематологического улучшения не наступило. Проведены повторные курсы химиотерапии. Спустя 18 месяцев после операции пациент умер.
Пример 2.
Больной К., 59 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 21.01.2016 г. Диагноз при поступлении: ДВККЛ, 3 стадия (подтип заболевания «нетерминальный»). Клиническая характеристика: увеличение внутригрудных и паховых лимфатических узлов, слабость, потливость. На 2 день (23.01.2016 г.) выполнена операция: паховая лимфаденэктомия, без осложнений. Проведено ИГХ окрашивание опухолевых клеток в гистологических срезах пахового лимфатического узла по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное содержание STAT3+ опухолевых клеток - 50% (S). Установленная величина S получена в ходе следующего расчета: S=375/755×100%. Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа отмечено, что у больного ДВККЛ благоприятный прогноз течения заболевания. При динамическом наблюдении за больным прогноз был подтвержден. Так, после лимфаденэктомии проведен курс химиотерапии по стандартному протоколу «RCHOP». Через 12 месяцев после терапии 1 линии установлен ранний рецидив. Однако заболевание протекало неагрессивно, после операции и повторных курсов химиотерапии пациент по настоящее время жив, находится в ремиссии, состояние удовлетворительное, в поддерживающей терапии не нуждается.
Пример 3.
Больной У., 52 года, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 24.11.2015 г. Диагноз при поступлении: ДВККЛ, 4 стадия (подтип заболевания «герминальный»). Клиническая характеристика: увеличение внутригрудных и шейных лимфатических узлов, слабость, потливость. На 3 день (27.11.2015 г.) выполнена операция: шейная лимфаденэктомия, без осложнений. Проведено ИГХ окрашивание опухолевых клеток в гистологических срезах шейного лимфатического узла по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное содержание STAT3+ опухолевых клеток - 22% (S). Установленная величина S получена в ходе следующего расчета: S=126/585×100%. Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больного ДВККЛ благоприятный прогноз течения заболевания. При динамическом наблюдении за больным прогноз был подтвержден. Так, после лимфаденэктомии проведен курс химиотерапии по стандартному протоколу «RCHOP». Заболевание протекало агрессивно, у больного наблюдался ранний рецидив после терапии 1 линии. Однако после операции и повторных курсов химиотерапии пациент по настоящее время жив, находится в ремиссии, состояние удовлетворительное, в поддерживающей терапии не нуждается.
Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по относительному содержанию STAT3+ опухолевых клеток в лимфатическом узле прогнозировать течение ДВККЛ после лимфаденэктомии. При величинах STAT3+ положительных клеток <66% констатируют благоприятное течение ДВККЛ, а при >66% устанавливают неблагоприятное течение заболевания.
Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, патоморфологических и гистологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ДВККЛ после лимфаденэктомии.