СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ
METHOD FOR PREDICTING RISK OF HABITUAL MISCARRIAGE

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано в диагностике.
Невынашивание беременности является мультифакториальной проблемой, решение которой до сих пор не найдено. Согласно статистическим данным около 15-20% всех клинически установленных беременностей заканчиваются самопроизвольным выкидышем. Среди основных причин невынашивания беременности выделяют анатомические, инфекционные, иммунологические, эндокринные и другие комплексные факторы (Макаров О.В. Гинекология. Клинические лекции. "ГЭОТАР-Медиа" 2010). Генетические аномалии, реализующиеся через несовместимую с жизнью патологию кариотипа эмбриона, занимают особое место среди причин потери беременности особенно в I триместре (Сидельникова В.М. / Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием. // Методические пособия и клинические протоколы.- М.: - МЕДпресс-информ, 2010. - 219 с.). Однако наряду с грубыми нарушениями немаловажную роль играют особенности генетической структуры материнского организма. Так, давно изученной причиной невынашивания является носительство аллельных вариантов системы гемостаза. В организме все процессы являются генетически детерминированными и специфика исходной структуры гена может обуславливать изменения в сигнальных и метаболических путях, негативно отражающихся не только на материнском организме, но и на течении беременности.
Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности, заключающийся в определении коэффициента соотношения содержания лактобацилл к условно-патогенной флоре в соскобах, взятых после удаления слизи с поверхности заднего свода влагалища и цервикального канала, и при их уменьшении не менее чем в 2 раза по отношению к норме делают вывод о риске прерывания беременности (RU 2255339, ММА им. И.М. Сеченова, 2007). Недостатком данного способа являются значительные временные и технические затраты, связанные с выполнением инкубации посевов, а также необходимость повторных исследований в связи с нестабильностью микрофлоры влагалища.
Известен также метод диагностики угрозы прерывания беременности в 1 триместре, основанный на определении уровня мелатонина в утренней и вечерней моче, при выявлении разницы между показателями мелатонина 30% и менее прогнозируют высокий риск угрозы прерывания беременности в 1 триместре (RU 2469331, РНИИАП 2011). Недостатком данного способа является трудоемкость выполнения, связанная с необходимостью предварительной оценки сенсомоторного статуса, неспецифичность, трудоемкость сбора материала для исследования.
α
α
Известен способ прогнозирования невынашивания беременности в ранние сроки, заключающийся в том, что при выявлении у женщины урогенитальной инфекции в 1 триместре проводят определение в слизи цервикального канала уровня MIP-1. При значении уровня MIP-1 в цервикальной слизи выше 36,9 пг/мл прогнозируют высокий риск невынашивания беременности в 1 триместре (RU 2501017, РНИИАП, 2012). Недостатком способа является большие материально-технические затраты, необходимые для постановки иммунологических реакций, невозможность широкого применения способа в качестве скринингового исследования в связи с трудоемкостью выполнения и отсутствия необходимого количества лабораторий, оснащенных необходимым оборудованием. Также к недостаткам способа можно отнести необходимость повторных исследований.
α
β
α
β
Известен способ прогнозирования неразвивающейся беременности (RU 2465589, Липатов и др., 2012), состоящий в определении в крови женщин концентрации фактора некроза опухоли альфа (ФНО), интерлейкина 1 бетта (ИЛ 1), интерлейкина 6 (ИЛ6), а также содержания лимфоцитов CD95+(Л CD95+), уровня альфа-2-микроглобулина фертильности (АМГФ), концентрации фактора роста плаценты (ФРП) и общего IgE. При значении этих показателей: концентрация ФНО (пкг/мл) - 294±39,5; концентрация ИЛ 1 (пкг/мл) - 588±46,3; концентрация ИЛ6 (пкг/мл) - 85,2±13,1; содержание Л CD95+(%) -14,1±5,2; уровень АМГФ (нг/мл) - 215±42; уровень ФРП (пкг/мл) - 21±6,2; содержание общего IgE (пкг/мл) - 68±24, прогнозируют неразвивающуюся беременность. К недостаткам данного способа можно отнести большое число определяемых показателей, с чем связана его высокая стоимость, сложность интерпретации и невозможность использования в качестве скрининга. Также данный способ позволяет оценить только частный случай невынашивания - неразвивающуюся беременность.
Известен способ прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности на основании определения полиморфизма гена ингибитора активатора плазминогена i типа (pai-1). Сущность данного способа заключается в выделении ДНК с последующей амплификацией фрагмента ДНК, включающего полиморфный сайт 675 5G>4G гена ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1) при помощи метода ПЦР. Вероятность развития отслойки хориона и плаценты у женщин с высоким риском самопроизвольных репродуктивных потерь при генотипе 4G/4G прогнозируют как 50,0%, при генотипе 4G/5G - как 35,3%. (RU 2494400, Научный центр акушерства …, 2013). Недостатком способа является неспецифичность, так как доля патологии гемостаза в генезе невынашивания составляет не более 5-10%.
Настоящее изобретение направлено на прогнозирование высокого риска потери беременности с помощью однократного обследования, не требующее больших технических затрат.
Патентуемый способ прогнозирования риска невынашивания беременности состоит в выделении ДНК из периферической крови пациентки с последующим генотипированием. Отличие данного метода состоит в том, что при выявлении генотипов C/G и G/G полиморфизма rs1052133 гена 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1) риск потери беременности оценивают как высокий.
Технический результат - выявление специфических генетических маркеров высокого риска невынашивания беременности и возможность использования в комплексе предгравидарной подготовки.
Патентуемый способ основан на следующих положениях.
В клетках человека все процессы реализуются на основе информации, заложенной в молекуле ДНК, поэтому поддержание стабильности генома крайне важно для гомеостаза организма. Система репарации, то есть восстановление повреждений в молекуле ДНК, функционирует благодаря множеству механизмов от простых (фотореактивация, деалкилирование) до многоэтапных, функция которых осуществляется под контролем множества генов (Спивак И.М. «Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие» Эко-Вектор, 2006, 220 с.). Одним из наиболее древних и важных систем репарации является эксцизионная репарация оснований (base excision repair, BER), которая заключается в удалении поврежденных азотистых оснований из ДНК с последующим восстановлением исходной структуры ДНК. Мишенью для системы BER являются преимущественно алкилированные, неправильно спаренные и окисленные основания. В процессе репарации первым звеном является распознавание дефектных оснований высокоспецифическими ферментами гликозилазами.
Одним из наиболее важных ферментов эксцизионной репарации ДНК является 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза (OGG1), осуществляющая элиминацию из молекулы ДНК окисленных оснований, которые, как известно, образуются под действием активных форм кислорода. 8-оксогуанин (8-oxoG) считается одним из основных биомаркеров окислительного повреждения ДНК с потенциально мутагенной и канцерогенной активностью. Фермент OGG1 обладает двумя функциями, с одной стороны, проявляя себя как гликозилаза, с другой - как апуриновая/апиримидиновая лиаза. (Фогель Ф. Генетика человека: в 3 т.: пер. с англ. / Ф. Фогель, А. Мотульски. М.: Мир, 1990). Процесс репарации ДНК под действием OGG1 происходит в два этапа: первый - гидролиз гликозидной связи 8-oxoG, на втором этапе происходит расщепление связи в регионе АР. Таким образом, при участии фермента OGG1 реализуются важнейшие процессы поддержания первозданной структуры молекулы ДНК, благодаря чему организм защищается от мутагенного воздействия со стороны генотоксических веществ. Однако в условиях недостаточности системы репарации в клетке накапливаются мутации, приводящие к развитию многих соматических заболеваний.
Ген OGG1, кодирующий фермент 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу, располагается на 3 хромосоме. Вариации генетической последовательности ДНК могут сопровождаться уменьшением колчества/активности/стабильность соответствующего фермента, что приводит к снижению эффективности защитной системы репарации ДНК и повышенной уязвимости организма перед возникающими мутагенами. Наиболее изученным, согласно данным отечественных и зарубежных авторов, является полиморфный вариант C977G (rs1052133) гена OGG1, приводящий к замене цитозина на гуанин в 246 положении, что сопровождается изменением в строении белка с заменой аминокислоты серина на цистеин (Ser326Cys). Минорный вариант 326Cys в гене OGG1 ассоциирован с риском развития онкологических заболеваний различной локализации (Chen X, Liu X, Wang J, Guo W, Sun C, Cai Z, Wu Q, Xu X, Wang Y. Functional polymorphisms of the hOGGI gene confer risk to type 2 epithelial ovarian cancer in Chinese. Int J Gynecol Cancer. 2011, Zhang J, Zhou J, Zhang P, Wang W, Tao S, Wang A meta-analysis of the association between the hOGGI Ser326Cys polymorphism and the risk of esophageal squamous cell carcinoma. M. PLoS One. 2013 Jun 6).
Показана меньшая активность фермента с 326Cys вариантом в условиях оксидативного стресса (Lee AJ, Hodges NJ, Chipman JK. Interindividual variability in response to sodium dichromate-induced oxidative DNA damage: role of the Ser326Cys polymorphism in the DNA-repair protein of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine DNA glycosylase 1. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005; 14:497-505).
Нами были обследованы 274 женщины, 151 из которых имели 2 и более эпизода потери беременности в анамнезе на сроке более 7 недель гестации, исключая случаи анэмбрионии и беременности, наступившие в результате ЭКО. Группу контроля составили 123 женщины с двумя и более нормальными беременностями в анамнезе, протекавшими без угрозы прерывания и закончившимися самопроизвольными родами. Также критерием включения пациенток в контрольную группу было отсутствие эпизодов невынашивания беременности в анамнезе.
По результатам генотипирования нами были получены данные о распределении частот аллелей полиморфизма rs1052133 гена OGG1, изображенные на фигуре.
Аллель С в гомозиготном состоянии у пациенток с невынашиванием беременности встречался в 63% случаев (n=94), в группе контроля данный генотип также являлся самым распространенным и составил 72% (n=87) наблюдений, достоверной разницы не установлено.
Гетерозиготы C/G выявлены у 30,80% (n=46) среди женщин с невынашиванием беременности, а в контрольной группе этот показатель составил 27,2% (n=33), что также достоверно не различалось.
2
Среди пациенток с потерей беременности аллель G в гомозиготном состоянии выявлен у 6,04% (п=9), при этом в группе контроля всего одна пациентка оказалась носителем генотипа G/G - 0,8%, что оказалось статистически достоверным χ=5,09, р=0,02.
2
С помощью аддитивного теста Кохрана-Армитажа нами был уточнен характер проявления наследуемого признака в гетерозиготном состоянии среди пациенток с невынашиванием беременности. В результате было установлено, что у пациенток с репродуктивными потерями наблюдалась доминантная модель наследования аллеля G, в связи с чем оба генотипа C/G и G/G являются рисковыми по невынашиванию беременности, χ=4,29, р=0,03.
Для оценки отношения шансов мы провели сравнение по двустороннему точному критерию Фишера, в результате чего было установлено, что у носителей аллеля G шанс репродуктивных потерь выше, по сравнению с носителями аллеля С (OR=1,62, p=0,04, 95%, df=0,38-0,99).
Таким образом, приведенные результаты подтверждают достижение технического результата: носительство генотипов C/G и G/G rs1052133 гена OGG1 повышает риск невынашивания беременности.
Способ осуществляют следующим образом.
Пациентке с невынашиванием беременности в комплекс обследования включают генотипирование на предмет выявления аллелей rs1052133 гена OGG1, проводя его на стандартном оборудовании для ПЦР-диагностики в один этап. Образцы периферической крови пациенток помещали в ЭДТА, содержащие вакутейнеры для последующей постановки реакций генотипирования. Хранили образцы до постановки реакции при температуре -20°С-80°С.
В ходе исследования с использованием наборов реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd, страна производитель Россия) осуществляли выделение ДНК согласно протоколу, заявленному производителем.
Постановку ПЦР реакции проводили с использованием готовых лиофилизированных наборов Master Mix (Фирма Изоген). В пробирки с лиофилизированным содержимым добавляют 10 мкл ПЦР-растворителя (входит в набор), 3 мкл праймеров (Евроген или Синтол и разводят деионизованной водой до концентрации 4 оптические единицы), 2 мкл деионизованной воды, 5 мкл исследуемой ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. После соединения компонентов реакции пробирки откручиваются на вортексе и ставятся в амплификатор.
Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Параметры источника тока (напряжение 150В, сила тока 50 мА, расстояние между электродами 15 см).
В случае носительства генотипов C/G и G/G rs1052133 гена OGG1 пациентку относят к группе высокого риска невынашивания беременности.
Нижеперечисленные клинические примеры подтверждают достижение технического результата.
Пример 1. Пациентка Е. 32 лет, в анамнезе неразвивающаяся беременность на сроке 10 недель. При планировании следующей беременности в комплекс предгравидарной подготовки пациентке включено генотипирование на наличие аллеля G rs1052133 гена OGG1. По результатам выявлено носительство генотипа G/G. На основании этого пациентка отнесена к группе высокого риска невынашивания беременности. В комплексе терапии пациентке проводилось лечение, направленное, в том числе, на компенсацию действия свободных радикалов, в результате чего самостоятельно наступила беременность, протекавшая без осложнений и закончившаяся самопроизвольными родами.
Пример 2. Пациентка К., 28 лет, поступила с диагнозом: неполный выкидыш при беременности 7-8 недель. Пациентке было произведено инструментальное удаление остатков плодного яйца. В комплекс обследования было включено генотипирование на наличие полиморфизма rs1052133 гена OGG1. По результатам было установлено наличие у пациентки аллеля С в гомозиготном состоянии. Пациентка не была отнесена к группе риска невынашивания беременности. Спустя год пациентке была проведена стандартная предгравидарная подготовка, в результате чего наступила беременность. На сроке 38 недель гестации произошли нормальные роды здоровым ребенком.
Пример 3. Пациентка О., 36 лет. В анамнезе три эпизода невынашивания беременности на сроке до 12 недель, причины не установлены. При обследовании на наличие полиморфизма rs1052133 гена OGG1 выявлено носительство аллеля G в гомозиготном состоянии, однако пациентка была отнесена к группе высокого риска невынашивания беременности, в связи терапию подобрали с учетом компенсации действия свободных радикалов. В результате пациентка родила здорового ребенка на сроке гестации 38 недель.
Пример 4. Пациентка А, 25 лет. В анамнезе самопроизвольный выкидыш. Поступила в стационар с диагнозом беременность 13-14 недель, начавшийся выкидыш. В комплекс обследования включено генотипирование на предмет носительства аллелей rs1052133 гена OGG1. По результатам выявлено наличие аллеля G в гетерозиготном состоянии. Комплекс стандартной терапии подобран с учетом результатов генотипирования. В последующем пациентка сохранила беременность, которая закончилась срочными самопроизвольными родами в доношенном сроке.
Вышеперечисленные результаты подтверждают возможность использования генетических исследований с целью выявления специфических маркеров повышенного риска невынашивания беременности. Применение данного метода в комплексе предгравидарной подготовки позволит сформировать группы риска с последующим подбором профилактических и лечебных мероприятий, направленных на снижение риска невынашивания беременности, с улучшением демографических показателей.