НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ СИЛИБИНИНА И ДРУГИХ АКТИВНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
NANOSTRUCTURED COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF SILIBININ AND OTHER ACTIVE INGREDIENTS FOR TREATING EYE DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области продуктов для лечения глазных заболеваний и к композициям, содержащим их.
Предшествующий уровень техники
Неконтролируемый неоангиогенез вовлечен в этиологию различных заболеваний, таких как солидные опухоли, ревматоидный артрит, псориаз, а на уровне глаза - неоваскуляризация роговицы, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), макулярный отек, ретинопатия недоношенных (РПН), хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ), диабетическая ретинопатия (ДР) и неоваскулярная глаукома.
ВМД, как и многие другие хронические заболевания, связанные со старением, имеет многофакторную природу, и её начало вызвано неблагоприятным сочетанием генетических факторов и факторов образа жизни.

Исследования применения анти-ФРЭС (исходно разработанного для терапии рака) в лечении ХНВ привели к использованию пегаптаниба (Macugen, Pfizer) и ранибизумаба (Lucentis, Genentech) в лечении ХНВ. Бевацизумаб (Avastin, Genentech) в настоящее время применяют вне зарегистрированных показаний при лечении ВМД.
Необходимо также учитывать, что лечение ВМД не ограничивается только лечением хориоидальной неоваскуляризации (внутривенными инъекциями анти-ФРЭС и фотодинамической терапией), но также включает применение ряда веществ с антиоксидантным, противовоспалительным и нейропротективным эффектом, которые позволяют действовать на разных уровнях процесса, приводящего к резко выраженному заболеванию, и предотвращают проявление заболевания, замедляют его прогрессирование до запущенных форм, и усиливают действие анти-ФРЭС лекарств.
Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из наиболее тяжелых и частых микрососудистых осложнений сахарного диабета I и II типа, которое существенно влияет на качество жизни пациента, поскольку оно часто приводит к слепоте из-за начала макулярного отека и вторичной неоваскуляризации сетчатки и стекловидного тела.
Современные виды лечения ДР направлены на противодействие ангиогенным и воспалительным процессам заболеваний сетчатки, и в результате в некоторых случаях они замедляют прогрессирование заболевания.
Глаукома является оптической нейропатией, приводящей к прогрессирующей потере ткани зрительного нерва, оставляющей его диск незащищенным, что приводит к потере зрения. Увеит является воспалением части или всей средней (сосудистой) оболочки глаза, состоящей из радужной оболочки, ресничного тела и хориоида.
Терапевтическими инструментами, доступными в настоящее время для лечения заднего увеита, являются интравитреальные инъекции или имплантаты (Taylor S.R. еt al, «New developments in corticosteroid therapy for uveitis», Ophthalmologica. 2010; 224 Suppl 1:46-53 («Новые разработки в кортикостероидной терапии увеита»)), которые могут быть связаны с очень серьезными побочными эффектами (эндофтальмитом, отеком сетчатки, и т.д.) в отношении органа зрения.
В течение двух последних десятилетий интравитреальные инъекции считаются очень ценными, поскольку, по сравнению с другими путями применения, как правило, позволяют достигать более высоких концентраций в сетчатке и стекловидном теле. Тем не менее, интравитреальное введение связано с риском тяжелых осложнений для пациента, таких как отслойка сетчатки, эндофтальмит и интравитреальные геморрагии. Кроме того, этот способ применения требует повторных инъекций лекарства для обеспечения терапевтического эффекта, которые часто плохо переносятся пациентом.
Таким образом, современные виды лечения являются неудовлетворительными из-за существующего несоразмерного отношения пользы/побочных эффектов.
По этой причине были разработаны небиодеградируемые системы контролируемого высвобождения, имплантируемые в стекловидное тело (Vitrasert, Retisert), но даже для них имеется определенный риск, связанный с интравитреальным введением, а также необходимостью операции для введения имплантата, и возможностью отторжения.
Компромисс между риском и пользой был достигнут с использованием пути периокулярного применения (околобульбарного, заднего околосклерального, ретробульбарного субтенонового и субконъюнктивального), который является более безопасным, хотя менее эффективным, чем интравитреальный путь.
Эти пути применения используют традиционные композиции для инъекций, и позволяют активному ингредиенту достигать целевого участка (стекловидного тела и сетчатки) посредством диффузии через фиброзную ткань склеры, которая образует барьер, менее устойчивый к лекарствам. Введенное лекарство в любом случае выходит через передний (вытекает из водянистой влаги) или задний (сетчатка и системная циркуляция) путь, что требует множества применений, связанных с несоблюдением режима пациентом (боль, катаракта, отслойка сетчатки, эндофтальмит и кровоизлияния в стекловидное тело).
Таким образом, в настоящее время лечение заболеваний заднего сегмента глаза использует только системы доставки лекарств с нежелательными эффектами.
Также известно, что прогрессивные системы доставки лекарств наночастичного типа на сегодняшний день являются передовыми системами доставки лекарств.
Системы наночастиц липидной природы, такие как твердые липидные наночастицы (ТЛН) и наноструктурированные липидные носители (НЛН), являются коллоидными системами, состоящими из биосовместимых липидов (чистых триглицеридов, комплексных смесей глицеридов, восков) и стабилизированными нетоксичными сурфактантами, таким как лецитины и полоксамеры. Их размер составляет от 100 до 500 нм. При комнатной температуре частицы находятся в твердом состоянии.
Уже было показано, что липидные наночастицы повышают биодоступность некоторых лекарств в глазу благодаря увеличению времени преокулярного удержания по сравнению с обычной фармацевтической формой, таким образом, позволяя избежать повторных и частых инстилляций (Int. J. Pharm., 238 241-245 (2002)).
Инулин является натуральным полисахаридом, экстрагируемым из различных растений и фруктов. Он является углеводом, состоящим из линейных цепей D-фруктозных единиц, связанных посредством β-(2-1) глюко-фуранозидных связей, которые изредка связываются с молекулой глюкозы на её восстанавливающем конце. Благодаря своим многочисленным выгодным свойствам (отсутствию токсичности, биосовместимости, растворимости в воде и пробиотическому эффекту в отношении интестинальной бактериальной флоры), инулин получил широкое применение (Kolida S, Gibson GR. J Nutr2007;137:2503S-2506S; Gocheva et al., Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng.Aspects, 2011; 391:101-104), и среди прочего, в биомедицинской области.
Недавно для получения новых систем доставки лекарств (СДЛ), таких как гидрогели, наночастицы, макромолекулярные биоконъюгаты и полимерные мицеллы, многочисленные исследователи сфокусировали свое внимание на химической модификации инулина.
Его подвергали химической модификации в боковой цепи с первичными аминами, которые использовали для достижения конъюгации с гидрофильными цепями, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), и с гидрофобными молекулами, такими как церамид.
Каликсарены являются циклическими полифенолами, которые легко синтезировать, даже с низкими затратами, которые характеризуются значительной универсальностью синтеза, склонностью к функционализации на различных уровнях, и наконец, низкой степенью цитотоксичности и иммуногенности.
В последние годы каликс[4]арены интенсивно исследовались в качестве новых молекулярных платформ для биомедицинского применения, поддержанного низкой цитотоксичностью (Int. J. Pharm. 2004, 273, 57) и иммуногенностью (Bioconjugate Chem. 1999, 10, 613), продемонстрированными их производными in vitro и in vivo.
Подходящая функционализация каликсаренового каркаса обеспечивает производные с противовоспалительной, противоопухолевой, антимикробной и вакцина-имитирующей активностью (Curr. Drug Discov. Technol. 2009, 6, 306; Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 366, US 2010/0056482; WO2005123660 A2). Водорастворимые каликсарены, подобные циклодекстринам по способности комплексообразования с лекарствами внутри их гидрофобной полости, предложены в качестве вспомогательных средств для фармацевтической промышленности, в то время как амфифильные каликсарены, способные к сборке в наноструктурированные системы в водной среде, являются многообещающими системами доставки лекарств (J. Sci. Ind. Res. 2012, 71, 21; Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 366, EP 1 293 248 A1; US 2010/0185022 A19). Некоторые из них были сконструированы подходящим образом для высвобождения лекарства в соответствии с внешними стимулами, такими как изменения окислительно-восстановительного потенциала, температуры (ACSNANO, 2011, 5, 2880), pH (Phys. Rev. E, 2007, 73, 051904), ферментативной активности (RSC Advances, 2013, 3, 8058), и т.д. Способность каликсареновых производных к проникновению через клеточную мембрану (Chem. Commun. 2012, 48,1129; J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 2892) и способность к функционализации каликсаренового каркаса направленными группами, которые распознают и связывают комплементарные рецепторы, присутствующие на поверхности клетки-мишени, делает каликсарены также многообещающими системами направленной доставки лекарств (Org. Biomol. Chem. 2015, 13, 3298).
Силибинин является смесью двух диастереоизомеров А и В в отношении примерно 1:1, содержащейся в Silybum marianum (Расторопше пятнистой).
Его основными видами применения в клинической области являются: лечение заболеваний печени, вызванных злоупотреблением алкоголем, цирроза печени, отравлений ядовитыми шляпочными грибами, вирусного гепатита, и болезней печени, индуцированных лекарствами.
С другой стороны, известно, что биодоступность и эффективность силибинина ограничена из-за его низкой растворимости в воде (430 мг/л).
Силибинин, как кажется, является эффективным агентом для профилактики и лечения злокачественных глиом у людей (Rana P. Singh, Oncogene, 2005).
Далее, антиангиогенная активность силибинина, в частности, при ВМД, была показана in vitro и после перорального применения препарата на основе силимарина.
В свете вышеизложенного, перспектива наличия новых фармакологических композиций, способных облегчить для врача терапевтическое лечение заболеваний глаза, в частности, нейродегенеративных заболеваний, таких как макулярная дегенерация и диабетическая ретинопатия, повышает интерес к соединениям, таким как силибинин, функционализированным для улучшения их биодоступности in situ.
В дополнение к силибинину, широко изучаемому со всеми описанными системами доставки, исследовали другие активные ингредиенты натурального происхождения, не характеризующиеся низкой растворимостью в воде, легкой химической и ферментативной деградацией, низкой биодоступностью, с некоторыми из этих наноструктурированных композиций, такие как сорафениб, куркумин и латанопрост.
Сорафениб

Сорафениб (BAY43-9006, Bayer) является диарилмочевиной, действующей на множество мишеней (ФРЭС, ТФР, ЭФР; фактически, он определен как мультикиназный ингибитор), с преобладающей анти-ФРЭС активностью, с доказанным антиангиогенным эффектом в опухолях (EP 1140840B1, Bayer), и является первым противоопухолевым агентом, разрешенным в Европе для лечения гепатоцеллюлярной карциномы (таблетки Nexavar).
Терапевтический индекс Сорафениба в лечении заболеваний сетчатки может быть повышен путем местного применения, на уровне глаза; таким образом, может быть достигнут фармакологический эффект при ограничении частоты системных побочных эффектов. Далее, местное применение позволяет использовать ограниченные дозы, по сравнению с теми, которые необходимы для достижения того же самого эффекта при системном применении, и таким образом, снижает затраты для готового продукта.
Куркумин
Куркумин является желтым полифенолом (диферулоилметаном), экстрагируемым из корневища Curcuma Longa (Куркумы длинной), азиатского растения, используемого в кулинарии и в медицине благодаря его лечебным свойствам при билиарных заболеваниях и некоторых воспалительных состояниях.
Латанопрост
Латанопрост является активным ингредиентом, который, как биматопрост и травопрост, является представителем аналогов простагландинов. Аналоги простагландинов являются классом лекарственных средств для местного применения, которые недавно стали применять в лечении открытоугольной глаукомы; исходно их не рекомендовали в качестве лечения первой линии из-за отсутствия информации об их долговременных эффектах. Среди побочных эффектов, связанных с долговременным лечением простагландинами, главными эффектами являются изменение пигментации радужной оболочки, утолщение и удлинение ресниц, развитие макулярного отека (Alexander CL et al., «Prostaglandin analog treatment of glaucoma and ocular hypertension»; Ann Pharmacother., 2002 («Лечение глаукомы и глазной гипертензии аналогами простагландинов»)).
Краткое описание фигур
Фиг. 1 демонстрирует процент силибинина, высвобождаемого ТЛН-А в ФБР при рН 7,4 в зависимости от времени инкубации, по сравнению с кривой растворения свободного силибинина.
Фиг. 2 демонстрирует процент силибинина, высвобождаемого НЛН-В системами, покрытыми INU-DETA и хитозаном в ФБР при рН 7,4, в зависимости от времени инкубации, и кривую растворения свободного силибинина.
Фиг. 3 демонстрирует процент силибинина, высвобождаемого полимерными мицеллами INU-C8 и INU-C8-PEG в ФБР при рН 7,4, в зависимости от времени инкубации, по сравнению с кривой диффузии свободного силибинина.
Фиг. 4 (А и В) демонстрирует профиль цитосовместимости пустых мицелл INU-C8 и INU-C8-PEG для клеточной линии 16НВЕ спустя 4 часа (4А) и 24 часа (4В) инкубации в различных концентрациях.
2
2
Фиг. 5А демонстрирует влияние на ARPE-19 клетки, предварительно обработанные в течение 20 часов системой INUC8PEG-Сорафениб, с пустым носителем INUC8PEG и с Сорафениб-тозилатом; затем их подвергали воздействию HO; проводили количественное определение высвобождения ЛДГ в среду.
2
2
Фиг. 5В демонстрирует влияние на ARPE-19 клетки, обработанные HOв течение трех часов, а затем обработанные в течение 20 часов системой INUC8PEG-Сорафениб (C8PEGSor), с пустым носителем INUC8PEG (C8PEG) и с Сорафениб-тозилатом (Sor); проводили количественное определение высвобождения ЛДГ в среду.
2
2
Фиг. 6А демонстрирует влияние на ARPE-19 клетки сетчатки, предварительно обработанные в течение 20 часов системой INUC8PEG-Сорафениб, с пустым носителем INUC8PEG и с силибинином, с последующей обработкой HO; проводили количественное определение высвобождения ЛДГ в среду.
2
2
Фиг. 6В демонстрирует влияние на ARPE-19 клетки сетчатки, обработанные HOв течение трех часов, а затем обработанные в течение 20 часов системой INUC8PEG-силибинин (C8PEGSib), с пустым носителем INUC8PEG (C8PEG) и с силибинином (Sib); проводили количественное определение высвобождения ЛДГ в среду.
2
2
Фиг. 7 демонстрирует пример вестерн-блоттинга, проводимого с образцами без (контроль, С) или с HO(H), и обработанными или не обработанными INUC8PEG (1 мкМ и 10 мкМ), INUC8PEGSlb (1 мкМ и 10 мкМ) или Slb (1 мкМ и 10 мкМ). Использовали анти-PARP1 1:800 первичные антитела (Cell Signaling). Результаты денситометрического анализа полос (гистограммы) нормализовали по β-актину.
Фиг. 8 демонстрирует процент силибинина, высвобождаемого наночастицами каликсарена в ФБР при рН 7,4 в зависимости от времени инкубации.
4
Фиг. 9А демонстрирует влияние на ARPE-19 клетки сетчатки, предварительно обработанные в течение 20 часов системой Каликсарена-Силибинина (CalixSlb), с пустым носителем (calix) и с одним силибинином, а затем обработанные 50 мкМ FeSO; проводили количественное определение высвобождения ЛДГ в среду.
4
Фиг. 9В демонстрирует влияние на ARPE-19 клетки сетчатки, обработанные 50 мкМ FeSО в течение 5 часов, а затем обработанные в течение 20 часов системой Каликсарена-Силибинина (CalixSlb), с пустым носителем (calix) и с одним силибинином (Sib); проводили количественное определение высвобождения ЛДГ в среду.
Фиг. 10А/В демонстрирует пример вестерн-блоттинга, проводимого с образцами без (CTR) или с FeSO4 (Fe), обработанными или не обработанными Calix (1 мкM), CalixSIb (1 мкM) или Sib (1 мкМ). Использовали анти-ФРЭС 1:100 первичные антитела (Santa Cruz) (10A). Показан пример вестерн-блоттинга, проводимого с образцами без (CTR) или с FeSO4 (Fe), обработанными или не обработанными Calix (0,1 мкМ и 1 мкM), CalixSIb (0,1 мкМ и 1 мкM) или Sib (0,1 мкМ и 1 мкM). Использовали анти-катепсин D 1:200 первичные антитела (Santa Cruz). Результаты денситометрического анализа полос (гистограммы) нормализовали по β-актину (10В).
Фиг. 11 демонстрирует защитный эффект каликсареновой системы в отношении активного ингредиента куркумина, для которого представлена для сравнения деградация 90% в течение 30 минут в 0,1 М ФБР и в бессывороточной среде.
Фиг. 12 демонстрирует результаты анализов цитотоксичности на клетках роговицы SIRC после обработки куркумином, системой каликсарена и системой каликсарена-куркумина.
Фиг. 13 демонстрирует результаты анализов цитотоксичности с MIT на J744 макрофагах для куркумина, каликсарена и каликсарена-куркумина.
Фиг. 14 демонстрирует жизнеспособность J744 макрофагов, стимулированных ЛПС и предварительно обработанных куркумином, системой каликсарена и системой каликсарена-куркумина.
Фиг. 15 демонстрирует снижение деградации конститутивного белка IkBα в макрофагах J744, подвергнутых воздействию ЛПС в присутствии куркумина, с куркумином, системой каликсарена и системой каликсарена-куркумина.
Фиг. 16 демонстрирует снижение NFkB в макрофагах J744, подвергнутых воздействию ЛПС, в присутствии куркумина, одного каликсарена и каликсарена-куркумина.
Фиг. 17 демонстрирует экспрессию iNOs и COX2 в макрофагах J744, подвергнутых воздействию ЛПС, и её снижение при обработке куркумином, одним каликсареном и каликсареном-куркумином.
Фиг. 18А/В демонстрирует результаты гистологического анализа и анализа белка в водянистой влаге животных, леченных силибинином, встроенным или не встроенным в систему каликсарена, с куркумином, встроенным или не встроенным в систему каликсарена, на модели увеита.
Фиг. 19А/В демонстрирует тенденцию к снижению внутриглазного давления на модели гипертонии после единственного применения (А) и после хронического лечения системой каликсарен-латанопрост и коммерческим продуктом IOPIZE, содержащим латанопрост.
Изложение сущности изобретения
Описаны композиции для местного применения, содержащие силибинин, встроенный в ТЛН и НЛН системы липидных наночастиц, и основанные на каликсаренах, при необходимости мукоадгезивных, или в мицеллярные системы или наночастичные системы на основе амфифильных инулиновых сополимеров для применения в лечении нейродегенеративных глазных заболеваний.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение преодолевает недостатки, описанные выше, с композициями для местного применения, содержащими силибинин, встроенный в:
(1) липидные наночастичные системы типа ТЛН (твердых липидных наночастиц) и НЛН (наноструктурированных липидных носителей);
(2) наноструктурированные системы на основе каликсарена;
(3) мицеллярные и наночастичные системы на основе амфифильных инулиновых сополимеров; для последних приведены примеры встраивания и высвобождения других активных ингредиентов, которые могут применяться для интересующих глазных заболеваний.
Указанные композиции способны к доставке активного ингредиента к стекловидному телу или сетчатке в терапевтически эффективных дозах для лечения нейродегенеративных глазных заболеваний, таких как макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия, глаукома. Настоящее изобретение также относится к способам приготовления наночастичных систем, включающих силибинин, как описано выше.
В частности, использовали общую процедуру, описанную далее, для приготовления систем ТЛН и НЛН типа.
Липидную фазу (состоящую из твердого липида или смеси жидкого липида с твердым) плавят при температуре примерно на 5-10°С выше температуры плавления.
Силибинин солюбилизируют в аликвотах этанола, а затем добавляют в расплавленную липидную смесь при перемешивании магнитной мешалкой.
Горячую липидную смесь, содержащую силибинин, затем осаждают в водном растворе, содержащем воду, сурфактант или смесь сурфактантов (способ осаждения), или эмульгируют с водным раствором, содержащим воду, сурфактант или смесь сурфактантов, предварительно нагретым до той же самой температуры. В последнем случае полученную предварительную эмульсию либо диспергируют в воде или водной среде, охлажденной до температуры от 2 до 5°С (способ микроэмульсии), либо подвергают гомогенизации под высоким давлением (способ горячей гомогенизации под высоким давлением). Во всех случаях полученной наноэмульсии дают остыть до комнатной температуры, а затем очищают посредством исчерпывающего диализа (COMW 12000-14000) против дистиллированной воды. Затем добавляют криопротектор к наночастичной дисперсии, которую можно подвергнуть центрифугированию (4000 об./мин в течение 10 минут при 10°С). Наконец, после лиофилизации извлекают твердые липидные наночастицы и хранят в морозильнике для последующей характеристики и/или покрывают мукоадгезивными полимерами. В последнем случае INU-EDA и INU-DETA полимеры и хитозан в 0,1% водном растворе добавляют к наночастичным суспензиям и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре и при перемешивании посредством магнитной мешалки.
Вышеуказанная липидная фаза состоит из липидов, например, выбранных из: триглицеридов, таких как тристеарин, трипальмитин, триглицеридов каприловой/каприновой кислоты (Mygliol); диглицеридов, таких как Precirol ATO5 (глицерил-дистеарат); моноглицеридов, таких как глицерил-моностеарат; алифатических спиртов, таких как цетиловый спирт; жирных кислот (С10-С22); жирнокислотных сложных эфиров с жирными спиртами, таких как цетил-пальмитат; смесей моно-, ди- и триглицеридов пэгилированной и не пэгилированной бегеновой кислоты, таких как Compritol HD-5-ATO (ПЭГ-8 бегенат и трибегенин) и Compritol 888 ATO (смесь моно-, ди- и трибегената); моно-, ди-, и триглицеридов пэгилированной каприловой и капроновой кислоты, таких как Accocon CC-6.
Вещества, используемые в качестве сурфактантов/вторичных сурфактантов в способе, могут быть, например, выбраны из: неионных сурфактантов, включающих лецитины, такие как Epikuron 200; полиэтиленгликолевых и пропиленгликолевых блок-сополимеров, таких как Pluronic; пэгилированных сорбитановых производных, таких как Tween; жирноспиртовых простых эфиров с полиэтиленгликолем, таких как Brij; ионных сурфактантов, включая соли желчной кислоты, такие как натрия таурохолат; четвертичных аминов, включая цетилпиридиния хлорид и бромид диоктадецил-диметиламмоний.
Вещества, используемые в качестве криопротекторов в способе, могут, например, быть выбраны из: сахаров, таких как лактоза и трегалоза; полимеров, таких как поливинилпирролидон (ПВП).
Вещества, используемые для обеспечения мукоадгезии в способе, выбирают, например, из: инулиновых полимеров, несущих аминогруппы (INU-EDA и INU-DETA), низкомолекулярных полимеров (Хитозан) и катионных сурфактантов (CCP и DDAB).
2
p
3
В соответствии с другим вариантом осуществления, изобретение относится к композициям для офтальмологического применения, содержащим сополимеры на основе инулина следующих формул (I) или (II), где R является –(CH)-CH; где p находится в диапазоне от 0 до 19;
(I) (II)
2
p
3
где R является –(CH)-CH; где p находится в диапазоне от 0 до 19, а n находится в диапазоне от 9 до 450;
и к таким сополимерам.
Сополимеры на основе инулина по формуле (I) и (II), как указано выше, получают путем функционализации инулина с алифатическими цепями С8 или с цепями С8 и ПЭГ.
Доказано, что эти сополимеры, которые имеют амфифильные свойства, способны к агрегации с образованием мицелл или наночастиц, для включения гибких и различных количеств лекарств, и высвобождения их в активной форме в течение длительного и контролируемого времени; кроме того, они являются высоко биосовместимыми, и позволяют легко изготовить офтальмологическую композицию.
Композицию получают путем добавления определенного количества активного ингредиента, такого как сорафениб или силибинин, к раствору полимера в ДМФ. Полученный раствор затем сушат под вакуумом, и диспергируют в ФБР при рН 7,4 посредством обработки ультразвуком и циклов перемешивания (3 циклов по 10 минут). Затем дисперсию помещают в орбитальный шейкер на 18 часов при 25°С, а затем диализуют против воды с мембраной, имеющей номинальный предел отсечения (MWCO) 1000 Да.
Наконец, полученную дисперсию лиофилизируют.
В соответствии с другом вариантом осуществления настоящего изобретения, оно относится к композициям для офтальмологического применения, содержащим наноструктурированные системы на основе амфифильных каликсаренов.
В таких системах присутствие множества положительно заряженных лигандных единиц, в дополнение к обеспечению мукоадгезивных свойств, может облегчать пересечение эпителия роговицы и сетчатки путем молекулярного распознавания комплементарных рецепторов, присутствующих на поверхности клеток.
В частности, настоящее изобретение относится к композициям для местного офтальмологического применения, содержащим катионные макромолекулы, состоящие из производных каликс[4]арена, функционализированных алкоксаминами, включая холин, для получения новых носителей общей формулы (А)
(A)
где:
2
X
3
2
X
R = CH3, (CH)CH, (CH)OH
1
2
X
3
2
X
R = CH3, (CH)CH, (CH)OH
где x= 1-3; n= 4, 6, 8; m= 2-15
1
3
и где когда R = R = CH, то m отличается от 2 - 9;
которые, в дополнение к доставке известных активных ингредиентов, также обеспечивают собственную биологическую активность, которая может усиливать эффективность активного ингредиента.
Как можно видеть, формула А представляет каликсареновые производные, которые отличаются по числу фенольных единиц, образующих макроцикл (n = 4, 6, 8), по длине гидрофобных хвостов (m = 2-15, указывает число СН2 групп), по структуре полярных групп, присутствующих на верхнем крае каликсарена (R и R1 = CH3, (CH2)xCH3, (CH2)xOH, где х=1-3, и их комбинации).
Каликсареновые соединения, как описано выше, являются новыми, и они также являются объектом настоящего изобретения; эти соединения продемонстрировали высокую универсальность в загрузке и высвобождении активных ингредиентов, характеризующихся низкой растворимостью в воде, легкой химической и ферментативной деградацией, имеющих натуральное или иное происхождение, для применения в лечении заболеваний глаза.
Холин является направляющей молекулой, проводящей и стимулирующей пересечение эпителия роговицы, гематоретинального барьера и эпителия сетчатки (Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58, 1136), где присутствуют носители холина.
Кроме того, в этом случае, как для сополимеров на основе инулина, описанных выше, было установлено, что каликсареновые системы демонстрируют способность к формированию наноагрегатов, способных к включению и высвобождению силибинина или других активных ингредиентов, таких как куркумин/латанопрост.
Биосовместимость и простота приготовления характеризует композицию, полученную путем простого растворения каликсаренового производного в ФБР (рН 7,4), добавления избытка активного ингредиента (способ фазовой растворимости), обработки ультразвуком в течение 15 минут, перемешивания при 25°С в течение 2-3 суток, центрифугирования и фильтрации на фильтре GHP 0,2 мкм.
Наночастичные системы, полученные в настоящем изобретении, имеют средний диаметр в диапазоне от 50 до 200 нм с индексом полидисперсности ниже 0,5. Фармакологически эффективное количество активного ингредиента встроено в описанные наночастицы. В частности, наночастичные системы, полученные в настоящем изобретении, имеют содержание лекарственного вещества в диапазоне от 1 до 15 масс.%.
Дополнительные характеристики и преимущества настоящего изобретения станут более понятными из следующего описания некоторых его вариантов осуществления, приведенных в качестве не ограничивающего примера.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением, содержащие активный ингредиент, выбранный из: силибинина или сорафениба, или куркумина, или латанопроста, в липидных наночастичных системах ТЛН (твердых липидных наночастиц) и НЛН (наноструктурированных липидных носителей) типа, или в наноструктурированных системах на основе каликсарена, мукоадгезивных или не мукоадгезивных, или в мицеллярных и наночастичных системах на основе амфифильных инулиновых сополимеров, обеспечивают местное применение активных ингредиентов для лечения нейродегенеративных глазных заболеваний, таких как ХНВ, ВМД, макулярный отек, неоваскулярная глаукома, ретинопатия недоношенных (РПН), диабетическая ретинопатия (ДР), увеит, эндофтальмит, ретинит, хориоидит, хориоретинит, ретинальные осложнения системных заболеваний.
Композиции обычно находятся в форме лиофилизированного твердого продукта, и могут содержать, в дополнение к активному ингредиенту, встроенному в липидную, полимерную или каликсареновую наноструктуру, как описано выше, также такие компоненты, как сурфактанты и/или криопротекторы и другие вспомогательные вещества, обычно применяемые в офтальмологических препаратах.
Пример 1
Приготовление ТЛН, содержащих силибинин (ТЛН-А)
Процедура и экспериментальные данные, полученные с объектом изобретения ТЛН, приготовленным с Compritol HD-5-ATO, загруженным силибинином, описаны далее.
Приготовление ТЛН-А
ТЛН-А готовили способом горячей гомогенизации под высоким давлением. 200 мг Compritol HD5ATO плавили при температуре примерно на 5-10°С выше его точки плавления (65-70°С). Лекарство (68 мг) солюбилизировали в аликвоте этанола (0,5 мл), а затем добавляли к плавленой липидной смеси при перемешивании магнитной мешалкой. Горячую липидную смесь, содержащую лекарство, затем эмульгировали в водном растворе сурфактанта Pluronic F68 (60 мг в 100 мл), предварительно нагретого до той же самой температуры. Полученную предварительную эмульсию подвергали гомогенизации под высоким давлением (4 цикла при 7500 ± 2500 ф./кв.дюйм) с применением оборудования Emulsiflex-C5 (Avestin), помещали в горячую водяную баню с температурой 65-70°C. Полученной наноэмульсии давали остыть до комнатной температуры, а затем очищали посредством диализа (COMW 12000-14000) против дистиллированной воды. Затем криопротектор трегалозу (массовое отношение липидов: криопротектора = 1:1) добавляли к наночастичной дисперсии, которую подвергали центрифугированию (4000 об./мин в течение 10 минут при 10°С). Наконец, после лиофилизации с применением лиофилизатора Modulyo, ТЛН извлекали и хранили в морозильнике для последующей характеристики.
Определение размера и анализ дзета-потенциала ТЛН-А систем
Средний диаметр и индекс полидисперсности (ИПД) приготовленных ТЛН-А систем определяли с применением фото-корреляционной спектроскопии (ФКС) с использованием Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instrument). Каждый образец разбавляли подходящим образом для анализа водным раствором NaCl 0,9 масс.%, фильтровали через 0,2 мкм фильтры и проводили сканирование под углом 173° относительно падающего луча, и проводили анализ в трех повторностях.
Дзета-потенциал определяли в соответствии с принципами допплеровской лазерной велосиметрии и анализа светорассеяния (методики (M3-PALS) с применением Zetasizer Nano ZSP (Malvern) с He-Ne лазером, мощность 4,0 мВ, длина волны 633 нм.
Результаты, полученные для среднего диаметра, индекса полидисперсности (ИПД) и дзета-потенциала, приведены в таблице 1.
Таблица 1. Средний гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (ИПД), дзета-потенциал ТЛН-А систем
ДРС (в NaCl 0,9 масс.%)
Z-среднееe (нм)
ИПД
Дзета-потенциал (мВ±ОСКО)
До лиофилизации
189,0
0,22
-9,4±1,2
После лиофилизации
171,5
0,31
-6,5±3,5
Определение содержания лекарственного средства (% СЛС) ТЛН-А
Для определения количества силибинина, загруженного в ТЛН-А образец, 10 мг композиции, предварительно подвергнутой лиофилизации, солюбилизировали в тетрагидрофуране (ТГФ). Затем органический раствор обрабатывали метанолом для осаждения липидов и экстракции активного ингредиента. Полученную суспензию затем фильтровали через 0,45 мкм фильтры и анализировали посредством ВЭЖХ. Полученные результаты %СЛ (выраженные в процентах активного ингредиента, загруженного в ТЛН, с учетом 100 мг материала, подвергнутого лиофилизации, состоящего из липидов + активного ингредиента) составили 8,5 масс.%.
Высвобождение силибинина из ТЛН-А при рН 7,4
Систему, описанную в настоящем изобретении, подвергали исследованиям высвобождения in vitro при 37°C с применением фосфатного буфера со временем инкубации в диапазоне от 0 до 12 часов. Полученные результаты показали, что система из настоящего изобретения медленно высвобождает лекарство до максимум 7,8 масс.% в течение 12 часов. Профили высвобождения и растворения лекарства после инкубации при 7,4 и при 37°С показаны на фиг. 1.
Описанная система является стабильной, т.е. высвобождает лекарство очень медленно во внешнюю среду при рН 7,4, и это может быть предпочтительным для оптимизации доставки активного ингредиента в патологический участок посредством наночастиц, которые его содержат.
Пример 2
Получение НЛН, содержащих силибинин (НЛН-В)
В качестве не ограничивающего примера, процедура и экспериментальные данные, полученные с объектом изобретения НЛН, приготовленным с Compritol HD-5-ATO, Gelucire 44/14 и Acconon CC-6, загруженными силибинином, описаны выше.
Получение НЛН-В
НЛН-В готовили способом осаждения растворителем и выпаривания. Compritol HD5ATO (250 мг) плавили при температуре примерно на 5-10°C выше его точки плавления (65-70°C), и добавляли лекарство (30 мг) к расплавленному липиду. Gelucire 44/14 (100 мг) и Acconon CC-6 (100 мг) солюбилизировали в этаноле (2,0 мл), а затем добавляли в расплавленную липидную смесь при перемешивании на магнитной мешалке. Горячую липидную смесь, содержащую лекарство и сурфактанты, осаждали в горячем водном растворе, содержащем сурфактант натрия таурохолат (100 мг в 100 мл), предварительно нагретом до той же самой температуры, и подвергали гомогенизации с применением Ultra-Turrax (13,500 об./мин). Горячую наночастичную суспензию при перемешивании помещали на ледяную баню до достижения значения температуры 10°С. Полученные наночастицы затем очищали путем диализа (COMW 12000-14000) против дистиллированной водой в течение 3 суток, а затем добавляли криопротектор трегалозу (массовое отношение липид: криопротектор = 1:2). Наконец, после лиофилизации с применением лиофилизатора Modulyo, НЛН извлекали и хранили в морозильнике для последующего покрытия инулиновым производным (INU-DETA) и хитозаном. В случае покрытия INU-DETA, 9 мл диализованной наночастичной суспензии (концентрация 4,3 мг/мл) инкубировали с 1 мл 0,1% INU-DETA в течение 1 часа при перемешивании магнитной мешалкой. В случае покрытия низкомолекулярным (М.м. 5000) хитозаном, 9 мл диализованных и лиофилизированных наночастиц (концентрация 0,165 мг/мл) с добавлением трегалозы инкубировали с 1 мл 0,1% хитозана в течение 30 минут при перемешивании магнитной мешалкой. Наночастицы с оболочкой лиофилизировали и хранили в виде порошка для последующего анализа.
Определение размера и анализ дзета-потенциала НЛН-В систем
Средний диаметр и индекс полидисперсности (ИПД) приготовленных НЛН-В систем, покрытых INU-EDA и хитозаном, определяли с применением фотокорреляционной спектроскопии (ФКС) с использованием Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instrument). Каждый образец разбавляли подходящим образом для анализа водным раствором NaCl 0,9 масс.%, фильтровали через 0,2 мкм фильтры и проводили сканирование под углом 173° относительно падающего луча, и проводили анализ в трех повторностях.
Дзета-потенциал определяли в соответствии с принципами допплеровской лазерной велосиметрии и анализа светорассеяния (методики (M3-PALS) с применением Zetasizer Nano ZSP (Malvern) с He-Ne лазером, мощность 4,0 мВ, длина волны 633 нм.
Результаты, полученные для среднего диаметра, ИПД и дзета-потенциала, приведены в таблице 2.
Таблица 2. Средний гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (ИПД), дзета-потенциал НЛН-В, покрытых INU-DETA и хитозаном
ДРС (в NaCl, 0,9%)
Z-среднее (нм)
ИПД
Дзета-потенциал (мВ±ОСКО)
НЛН-B INU-DETA
236,8
0,45
-1,1
НЛН-B хитозан
69,1
0,45
+18,2
Определение %СЛ в НЛН-В, покрытых INU-DETA и хитозаном.
Для определения количества силибинина, загруженного в НЛН-В образцы, покрытые INU-DETA и хитозаном, 2 мг композиций, предварительно подвергнутых лиофилизации, солюбилизировали в горячем состоянии в 8 мл этанола (ЭтОН) и обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут. Полученные растворы затем фильтровали через 5,00 мкм фильтры из регенерированной целлюлозы, и анализировали с ВЭЖХ.
Полученные результаты %СЛ (выраженные в процентах активного ингредиента, загруженного в НЛН, с учетом 100 мг материала, подвергнутого лиофилизации, состоящего из липидов + активного ингредиента) составили 6,05 масс.% для НЛН-В, покрытых INU-DETA и 3,07 масс.% для НЛН-В, покрытых хитозаном.
Высвобождение при рН 7,4 активных ингредиентов из НЛН-В, покрытых INU-DETA и хитозаном.
НЛН-В системы, покрытые INU-DETA и хитозаном, описанные в настоящем изобретении, подвергали исследованиям высвобождения in vitro при 37°C с применением фосфатного буфера при рН 7,4 со временем инкубации в диапазоне от 0 до 12 часов. Полученные результаты показали, что обе системы из настоящего изобретения медленно высвобождают лекарство до максимум 50 масс.% в пределах 12 часов для НЛН-В, покрытых INU-DETA, и максимум до 30 масс.% в пределах 12 часов для НЛН-В, покрытых хитозаном. Профили высвобождения и растворения лекарства силибинина из двух систем с оболочкой после инкубации при рН 7,4 при 37°С показаны на фиг. 2.
8
8
2000
Приготовление полимерных мицелл на основе INU-Cи INU-C-PEG
8
8
2000
В качестве не ограничивающего примера, процедура и экспериментальные данные, полученные с объектом изобретения полимерными мицеллами на основе INU-Cи INU-C-PEG, загруженными силибинином или сорафенибом, описаны далее.
8
8
2000
Определение критической концентрации агрегации (ККА) сополимеров INU-Cи INU-C-PEG
8
8
2000
Получение сополимеров INU-Cи INU-C-PEGпроводили, с хорошим выходом, в соответствии с процедурами, описанными в литературе.
8
8
2000
-5
-5
-7
ККА сополимеров INU-Cи INU-C-PEGопределяли посредством спектрофлуориметрического анализа, с применением пирена в качестве флуоресцентного зонда. 20 мкл раствора пирена в ацетоне (6,0×10M) помещали в пробирки и выпаривали при 37°С в орбитальном шейкере до сухого состояния. Затем 2 мл водного раствора сополимера с повышающей концентрацией и в диапазоне от 1×10 до 5 мг/мл добавляли в пробирки, содержащие пиреновый осадок до получения конечной концентрации пирена, равной 6,0×10M. Дисперсию, полученную таким способом, выдерживали при 37°С в течение 24 часов при постоянном перемешивании для достижения баланса зонда с мицеллами. Регистрировали спектры испускания и возбуждения пирена с применением следующих длин волн: 373 нм и 333 нм, соответственно. Результаты показаны в таблице 3.
Таблица 3. ККА некоторых приготовленных сополимеров
Сополимер
ККА (мг/мл)
INU-C<sub>8</sub>
0,3
INU-C<sub>8</sub>-PEG
1,2
Приготовление полимерных мицелл INU-C8 и INU-C8-PEG, нагруженных силибинином или сорафенибом.
Полимерные мицеллы, загруженные силибинином и сорафенибом, готовили с помощью способа сухого комплексообразования (замешивания). В частности, 200 мг INU-C8 или INU-C8-PEG смешивали в сухом состоянии с лекарством (50 мг) с применением ступки и пестика, и перемалывали в присутствии этанола (5 мл). Затем сухой матрикс, образованный полимером, где было однородно диспергировано лекарство, полученный после испарения этанола, медленно гидратировали при механическом перемешивании для стимуляции самоагрегации мономеров и включения лекарства в гидрофобную сердцевину полученных мицелл.
Полученную дисперсию подвергали обработке ультразвуком и циклами перемешивания (3 цикла по 10 минут). Затем дисперсию центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 минут и фильтровали шприц-фильтрами с отсечением 5 мкм для удаления несвязанного лекарства. Наконец, полученную дисперсию замораживали в жидком азоте и лиофилизировали.
2000
Определение %СЛ полимерных мицелл INU-C8 и INU-C8-PEG
3 мг мицелл, загруженных силибинином или сорафенибом, диспергировали в метаноле (5 мл); дисперсию обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, и оставляли при энергичном перемешивании на 4 часа. Спустя это время дисперсию фильтровали с применением шприц-фильтра с отсечением 0,2 мкм, и наконец, фильтры промывали метанолом (5 мл) для получения конечного объема 10 мл. Для определения силибинина в 600 мкл раствора в метаноле, полученном во время процедуры экстракции, добавляли 400 мкл 1 об.% уксусной кислоты для соответствия составу смеси элюента, используемой для ВЭЖХ анализа. Таким образом, количество лекарства, экстрагированного из мицелл, определяли посредством ВЭЖХ анализа, с применением колонки с С6-фенилметанолом: 1 об.% уксусной кислоты (60:40) в качестве элюирующей фазы. Скорость потока устанавливали на 0,65 мл, и элюат контролировали при 288 нм.
Для определения сорафениба 1 мл раствора в метаноле, полученного при процедуре экстракции непосредственно анализировали посредством ВЭЖХ для определения количества лекарства, встроенного в мицеллы. ВЭЖХ анализ проводили с применением С6-фенилметанола: воды (о/о) (90:10) в качестве элюирующей фазы. Скорость потока устанавливали на 1 мл/мин, и элюат контролировали при 266 нм.
Результаты показаны в таблице 4.
Определение среднего размера и дзета-потенциала полимерных мицелл INU-C8 и INU-C8-PEG
Распределение мицелл по размеру определяли посредством анализа динамического светорассеяния с применением Malvern Zetasizer Nano ZS. Эти измерения проводили под фиксированным углом 173° и при температуре 25°C. Водные растворы мицелл (2 мг/мл) анализировали после фильтрации через целлюлозные мембранные фильтры с отсечением 5 мкм. Определяли средний гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (ИПД) с применением кумулятивных анализов функции корреляции. Дзета-потенциал (мВ) рассчитывали по электрофоретической подвижности и с применением уравнения Смолуховского, принимая K⋅a >> 1 (где «K» и «а» являются параметром Дебая-Хюккеля и радиусом частицы, соответственно). Результаты показаны в таблице 4. Как можно видеть, все сополимеры способны встраивать гидрофобные лекарства сорафениб и силибинин.
Таблица 4. Средний гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (ИПД), дзета-потенциал и содержание лекарственного средства для мицелл
Мицеллы
Средний диаметр (нм)
ИПД
Дзета-потенциал(мВ)
Содержание лекарства<sup>a</sup> (%)
INU-C<sub>8</sub>-Силибинин
164,9
0,27
+21,9±3,82
1,7±0,5
INU-C<sub>8</sub>-PEG-Силибинин
166,7
0,46
+18,5±3,5
1,8±0,1
INU-C<sub>8</sub>-Сорафениб
150,4
0,16
+19,9±4
18,45
INU-C<sub>8</sub>-PEG-Сорафениб
179,7
0,18
+26,5±3,7
11,41
a
Загруженное лекарство означает сорафениб и силибинин.
Исследования высвобождения
Для оценки способности полученных систем к высвобождению встроенных лекарств, подходящие полимерные мицеллы INU-C8 и INU-C8-PEG (15 мг) диспергировали в ФБР, рН 7,4 (5 мл), и переносили на плавающую диализную мембрану Spectra/Por с номинальным отсечением (MWCO) 1 кДа. Диализные мембраны, содержащие дисперсии мицелл, загруженные лекарством, и лекарство по отдельности, погружали в ФБР при рН 7,4 (50 мл), и инкубировали при 37°С в течение 24 часов при перемешивании (100 об./мин) в инкубаторе - орбитальном шейкере Benchtop 808C модели 420. С запланированными интервалами времени отбирали аликвоты внешней среды (1 мл) с внешней части диализной мембраны, и заменяли равным количеством свежей среды. Взятые образцы лиофилизировали, суспендировали в метаноле: уксусной кислоте 1% (о/о), и анализировали посредством ВЭЖХ для определения количества высвобождаемого лекарства. В качестве примера показан график высвобождения активного ингредиента силибинина, встроенного в системах. Все полученные данные по высвобождению сравнивали с профилем диффузии силибинина по отдельности (0,25 мг), полученным с применением той же самой процедуры (фиг. 3). Собранные данные корректировали с учетом процесса разбавления. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях, и было установлено, что результаты соответствовали среднеквадратическому отклонению ± 5%. Как можно видеть из графика, полимерные мицеллы INU-C8 и INU-C8-PEG, загруженные силибинином, демонстрируют очень медленные кинетики высвобождения, по сравнению с диффузией свободного силибинина (менее 5 масс.% силибинина высвобождается после 12 часов инкубации). Подобные профили высвобождения также были получены для активного ингредиента сорафениба.
Исследования стабильности
Стабильность мицелл INU-C8 и INU-C8-PEG, нагруженных силибинином или сорафенибом, оценивали путем инкубации лиофилизированных систем в течение 1, 2 и 3 месяцев при 4°С и 25°С. В частности, свежеприготовленные и лиофилизированные образцы хранили при контролируемой температуре в течение 1, 2 и 3 месяцев. После периода инкубации образцы диспергировали в бидистиллированной воде (2 мг/мл) и анализировали посредством определения динамического светорассеяния для оценки среднего диаметра, индекса полидисперсности и дзета-потенциала. В частности, 3 мг образца диспергировали в метаноле (5 мл); дисперсию вначале обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут и перемешивали в течение 2 часов, и наконец, фильтровали через шприц-фильтр с отсечением 5 мкм и разбавляли дополнительно с 5 мл метанола. Количество экстрагированного активного ингредиента определяли посредством ВЭЖХ анализа, с применением той же самой процедуры, которая описана для определения содержания лекарственного средства.
Полученные результаты показали, что и приготовленные мицеллы, и загруженное лекарство имели хорошую физическую стабильность в течение длительных периодов хранения. В качестве примера, таблица 5 показывает данные стабильности, относящиеся к INU-C8 мицеллам, нагруженным силибинином или сорафенибом, полученным посредством определения динамического светорассеяния для оценки изменений среднего диаметра, ИПД и дзета-потенциала, и ВЭЖХ анализа для оценки содержания лекарственного средства и стабильности нагруженного лекарства.
Таблица 5. Стабильность INU-C8 мицелл, нагруженных силибинином/сорафенибом, спустя 1, 2 и 3 месяца хранения при 4 и 25°С
INU-C<sub>8 </sub>мицеллы
Время инкубации
Средний диаметр (нм)
ИПД
Дзета-потенциал (мВ)
Содержание лекарства (%)
Время 0
164,9
0,27
+21,9±3,82
1,7±0,5
1 месяц при 4°C
153,3
0,37
+10,9±4,3
1,9±0,9
1 месяц при 25°C
188,2
0,26
+10,9±4,2
1,7±0,9
2 месяца при 4°C
195,8
0,39
+7,38±3,4
1,7±0,3
2 месяца при 25°C
185,6
0,44
+6,37±3,9
1,7±0,7
3 месяца при 4°C
137,8
0,32
+8,76±4,5
1,7±0,3
3 месяца при 25°C
151,6
0,38
+7,88±3,3
1,7±0,7
INU-C<sub>8</sub> сорафениба мицеллы
Время инкубации
Средний диаметр (нм)
ИПД
Дзета-потенциал (мВ)
Содержание лекарства (%)
Время 0
150,4
0,16
+19,9±4
18,4±0,5
1 месяц при 4°C
153,8
0,15
+23,82±4,72
19±0,9
1 месяц при 25°C
198,5
0,098
+29,9±5,39
17±0,9
2 месяца при 4°C
160,8
0,15
+31,6±5,46
17,5±0,3
2 месяца при 25°C
431,8
0,29
-0,644±3,33
18,3±0,7
3 месяца при 4°C
250,3
0,22
+15,7±5,5
18,1±0,3
3 месяца при 25°C
318
0,273
+17,1±3,4
17,3±0,7
Исследования цитосовместимости in vitro
4
2
Биологическую совместимость пустых мицелл INU-C8 и INU-C8-PEG оценивали на клеточной линии человеческого бронхиального эпителия (16НВЕ) посредством MTS анализа, с применением коммерческого набора («Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation assay», Promega). Клетки помещали на 96-луночные планшеты с плотностью клеток 2⋅10 клеток на лунку, и суспендировали в среде Игла с модификацией Дульбекко (DMEM), с добавлением 10 об.% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1 об.% антибиотиков (10 мг/мл стрептомицина, 10000 Ед./мл пенициллина), и инкубировали при стандартных условиях (95% ОВ и 5% СО при 37°С). Спустя 24 инкубации, среду удаляли и заменяли 200 мкл свежей среды, содержащей пустые мицеллы INU-C8 и INU-C8-PEG в концентрации 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и 1 мг/мл. Спустя 4 часа и 24 часа инкубации, дисперсию мицелл в DMEM удаляли, клетки промывали 1 раз фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко (DPBS) и инкубировали в течение 2 часов при 37°С со 100 мкл свежей среды и 20 мкл MTS раствора. Клетки, инкубированные с DMEM по отдельности, использовали в качестве отрицательного контроля. Результаты выражены в процентах снижения жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками (фиг. 4А и 4В). Все эксперименты проводили в трех повторностях.
Проведенные исследования показали, что тестированные полимерные мицеллы имеют хорошую цитосовместимость и не проявляют цитотоксических эффектов in vitro в отношении клеточной линии бронхиального эпителия человека. Этот результат свидетельствует о возможности применения этих систем в качестве эффективных систем доставки лекарства in vivo. Биосовместимость пустых систем и систем, загруженных активными ингредиентами, также была подтверждена на ARPE-19 клетках сетчатки и SIRC клетках эпителия роговицы.
2
2
Для мицеллярных носителей INU-C8 и INU-C8-PEG, конъюгированных с силибинином или с сорафениба тозилатом, оценивали защитное влияние на клетки сетчатки, повергнутые предварительной обработке в течение 20 часов, с последующим воздействием HOдля индукции окислительного стресса. Пустой и конъюгированный INUC8PEG носитель показал больший защитный эффект, чем у носителя без ПЭГ, однако, только носитель INUC8PEG, конъюгированный с силибинином или с сорафенибом, способен снижать высвобождение ЛДГ при более высоких концентрациях благодаря присутствию ПЭГ. В качестве примера, фиг. 5А и фиг. 6 показывают результаты эксперимента для системы, конъюгированной с активным ингредиентом сорафенибом или силибинином, соответственно.
2
2
2
2
В протоколе после обработки клетки сетчатки, подвергнутые 3-часовому воздействию HO, а затем обработанные INU-C8 и INU-C8-PEG системами, конъюгированными с силибинином или сорафенибом, демонстрируют хорошую способность обоих носителей к нейтрализации повреждения, индуцированного стрессом. Однако INUC8PEG система, конъюгированная с любым активным ингредиентом, является более эффективной в ингибировании HO-индуцированного стресса. В качестве примера, фиг. 5В и фиг. 6В показывают результаты экспериментов для системы, конъюгированной с активным ингредиентом сорафенибом или силибинином, соответственно.
2
2
2
2
2
2
2
2
Лизаты клеток сетчатки, подвергнутые последующей обработке с INUC8PEG системой, пустой или конъюгированной с силибинином, анализировали посредством вестерн-блоттинга для определения экспрессии PARP-1 белка, поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы 116 кДа, вовлеченной в восстановление ДНК в ответ на воздействие окружающей среды («Calcium Overload Is A Critical Step In Programmed Necrosis Of Arpe-19 Cells Induced By High-Concentration HO» Guang-Yu Li et al., (2010) Biomedical And Environmental Sciences («Перегрузка кальцием является критическим этапом программированного некроза клеток АRРЕ-19, индуцированного высокими концентрациями НО»)). In vivo и in vitro, PARP-1 процессируется каспазой 3 и каспазой 7 с образованием 24 кДа ДНК-связывающего домена и 89 кДа каталитического домена, который участвует в апоптозе («Importance of Poly (ADP-ribose) Polymerase and Its Cleavage in Apoptosis» F.J Oliver et al., (1998) J. Biol. Chem. («Важность поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы и её расщепления в апоптозе»)). Фиг. 7 демонстрирует снижение PARP-1 белка после обработки HO, что подтверждает статус апоптоза клеток. Наоборот, в образцах, обработанных конъюгированным носителем, наблюдалась более высокая экспрессия PARP-1, по сравнению со свободным носителем и самим силибинином. Способность INUC8PEG, конъюгированного с силибинином, к ингибированию апоптоза, индуцированного окислительным повреждением, подтверждена в дозо-зависимом виде в образцах, обработанных HO. Последующая обработка силибинином снижает процесс апоптоза, однако с меньшей эффективностью, чем у конъюгированного носителя.
Пример 4
Приготовление каликсареновых наночастиц
В качестве примера, далее описана процедура и экспериментальные данные, полученные с каликс[4]ареновым производным (соединением 1), загруженным силибинином, куркумином или латанопростом.
Приготовление
Синтезировали амфифильные каликс[4]ареновые производные, несущие четыре додецильных алифатических цепи на нижнем крае макроцикла и четыре полярных головки холина на верхнем крае (соединение 1), с хорошим выходом, адаптировав процедуру, описанную в литературе для подобных производных. Соединение характеризовали посредством ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии.
Сборка каликсаренового производного в наноагрегаты осуществляется самопроизвольно. Простое растворение в ФБР (рН 7,4) обеспечивает коллоидный раствор, содержащий наноагрегаты с размером, индексом полидисперсности и дзета-потенциалом, показанными в таблице 6. Загрузку лекарства осуществляли путем добавления избытка лекарства (молярное отношение 1:5) к коллоидному раствору в качестве нижней части. Смесь подвергали воздействию ультразвука в течение 15 минут, и перемешивали в шейкере при 25°С, 200 об./мин в течение 2-3 суток. Последующее центрифугирование при 4000 об./мин в течение 30 минут и фильтрация на GHP Acrodisc 0,2 мкм фильтре обеспечивало коллоидный раствор наночастиц, нагруженных силибинином. Лиофилизация этого раствора без добавления криопротекторов и с применением стандартного лиофилизатора обеспечивала белый порошок, который ресуспендировали в воде, восстанавливая коллоидный раствор наночастиц, нагруженных лекарством. Повторная фильтрация коллоидного раствора на GHP Acrodisc 0,2 мкм фильтре и последующий ВЭЖХ анализ для определения %СЛ показали, что после лиофилизации система сохраняет встроенное лекарство (таблица 6).
Определение размера и анализ дзета-потенциала
Средний диаметр, индекс полидисперсности (ИПД) и дзета-потенциал каликсареновых наночастиц, загруженных или не загруженных силибинином, измеряли с применением Zetasizer Nano ZS-90 (Malvern Instrument), сканирование проводили под углом 90º по отношению к падающему лучу, и анализировали в трех повторностях. Результаты, полученные для среднего диаметра, ИПД и дзета-потенциала, приведены в таблице 6.
Таблица 6. Средний гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (ИПД), дзета-потенциал каликсареновых наноагрегатов
ДРС (в ФБР, pH 7,4)
Z-среднее (нм)
ИПД
Потенциал ϛ (мВ±ОСКО)
Каликсареновая наночастица (НЧ)
44,3
0,29
24
Наночастица каликсарена-силибинина
77,8
0,3
23,4
НЧ-силибинин после лиофилизации
81,5
0,35
23
Определение содержания лекарства (%СЛ) каликсареновой наночастицы
Для определения количества силибинина, загруженного в коллоидный раствор, содержащий 1 мг/мл каликсареновой наночастицы, аликвоту раствора разбавляли метанолом и анализировали посредством ВЭЖХ. Количество лекарства определяли с учетом поглощения полосы силибинина при 288 нм. Количество лекарства также определяли на спектрофотометре при 327 нм для полосы силибинина в ФБР.
Результаты, полученные для %СЛ (выраженные в процентном отношении массы загруженного активного ингредиента, и массы загруженного активного ингредиента + масса наночастицы), составили 10-11%.
Высвобождение силибинина из каликсареновых НЧ в ФБР при рН 7,4.
Высвобождение силибинина в фосфатном буфере при рН 7,4 исследовали in vitro при 37°C со временем инкубации в диапазоне от 0 до 12 часов посредством диализа. Полученные результаты показали, что система медленно высвобождает лекарство до максимум 6,5 масс.% в пределах 12 часов (фиг. 7). Медленное высвобождение может быть предпочтительным для доставки лекарства в патологический участок.
Исследования стабильности каликсареновой наночастицы, нагруженной силибинином, в ФБР при рН 7,4
Стабильность каликсареновых наночастиц, нагруженных силибинином, оценивали при хранении коллоидных растворов в ФБР при 25°С. Анализ спустя 7 и 14 суток после приготовления показал, что размер, ИПД и %СЛ являются фактически неизменными (таблица 10). Стабильность композиции является важным фармакологическим условием (например, достижение патологических участков в задней части глаза) и требованием для индустриализации.
Таблица 10. Стабильность коллоидного раствора каликсареновых наночастиц-силибинина спустя 7 и 14 суток при 25°С
Время инкубации
Средний диаметр (нм)
ИПД
Время 0
77,8
0,3
7 суток
78,8
0,3
14 суток
80,6
0,3
4
4
4
4
После предварительных исследований каликсарен-холинового носителя, конъюгированного с силибинином, на ARPE-19 клетках, было установлено, что концентрация носителя, свободного или конъюгированного с силибинином, включенным в диапазоне 0,01-1 мкМ, и инкубированного в течение 20 часов, не вызывала токсичности. Затем тестировали эффекты конъюгированных и пустых систем с применением соединения FeSO для окислительного стресса, с изменениями клеточного окислительно-восстановительного статуса. Спустя 24 часа инкубации клетки предварительно обрабатывали в течение 20 часов, а затем подвергали воздействию 50 мкМ FeSOв течение 3 часов ["Предварительная обработка" 20 часов лекарством + 3 часа стрессового воздействия]. Проводили анализ жизнеспособности для оценки токсичности и способности к защите от повреждения исследуемого носителя, заключающийся в оценке высвобождения ЛДГ в культуральную среду. Фиг. 8А демонстрирует кривую дозы носителя, конъюгированного с силибинином (CalixSlb), пустого носителя (Calix) и силибинина по отдельности (Slb) в ARPE клетках, подвергнутых или не подвергнутых воздействию 50 мкМ FeSO. Отмечалось, что силибинин снижает высвобождение ЛДГ, в то время как CalixSlb и пустой Calix не вызывают существенного изменения высвобождения ЛДГ ARPE-19 клетками. Напротив, когда клетки подвергали воздействию FeSO(50 мкM), CalixSlb показал хороший потенциал снижения высвобождения ЛДГ; эффект не наблюдался в образцах, обработанных Calix и Slb по отдельности. Эти результаты позволяют предположить, что Calix и Slb могут вместе подготавливать клетки к защите против изменений окислительно-восстановительного статуса.
4
В последующих экспериментах анализировали эффекты последующей обработки соединениями на основе каликсарена. Таким образом, клетки обрабатывали 50 мкМ FeSO в течение 5 часов, и инкубировали в течение 20 часов с различными соединениями. Как показано на фиг. 8В, CalixSlb защищает от стресса даже в условиях последующей обработки; и эффект подтвержден как синергетическое действие двух соединений, которые по отдельности способны защищать от изменения окислительно-восстановительного статуса.
4
Фиг. 9А демонстрируют результаты вестерн-блоттинга ФРЭС, которые показывают снижение уровней экспрессии растворимого ФРЭС после воздействия FeSO, этого снижения не наблюдается при применении пустого Calix, Slb и CalixSlb при концентрации 1 мкM CalixSlb. Фактически, CalixSlb сам по себе способен к повышению уровней ФРЭС. Эти результаты согласуются с наблюдениями Lin et al. («Silibinin inhibits VEGF secretion and age-related macular degeneration in a hypoxia-dependent manner through the PI-3 kinase/Akt/mTOR pathway», C.H. Lin et al., (2013) British Journal of Pharmacology («Силибинин ингибирует секрецию ФРЭС и возрастной макулярной дегенерации в зависимости от гипоксии посредством PI-3 киназа/Akt/mTOR пути»)) по ингибированию секреции ФРЭС в условиях гипоксии ARPRE клеток и предварительной обработки лекарствами. Отсутствие секреции приводит к отсутствию свободного ФРЭС, который не может действовать в качестве саморегулятора (аутокринной передачи сигналов) с сопутствующим снижением процесса ангиогенеза.
4
Катепсин D является внутриклеточной аспартил-протеазой, синтезируемой в эдоплазматической сети в качестве препрофермента, который процессируется до генерации активных фрагментов. В зависимости от клеточной среды, где он находится, он может индуцировать или ингибировать апоптоз посредством различных механизмов. Фрагмент 48 кДа является активной промежуточной формой, которая образует два дополнительных активных фрагмента; таким образом, его снижение связано с активацией процесса протеолиза, и наоборот, его повышение является показателем ингибирования апоптоза. В присутствии окислительного стресса активация катепсина D может приводить к активации каспазы 8, которая, в свою очередь активирует каспазу 3, что приводит к гибели клетки («Regulatory role of cathepsin D in apoptosis», A. Minarowska et al., (2007) Folia Histochemica et Cytobiologica («Регуляторная роль катепсина D в апоптозе»)) («Caspase-8-mediated apoptosis induced by oxidative stress is independent of the intrinsic pathway and dependent on cathepsins», H.K. Baumgartner et al., (2007) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. («Каспаза-8-опосредованный апоптоз, индуцированный окислительным стрессом, не зависит от собственного пути, и зависит от катепсинов»)). Как показано на фиг. 9В, воздействие на клетки FeSOприводит к снижению 48 кДа полосы катепсина D. Последующая обработка с Calix или Slb повышает уровни экспрессии катепсина D, но большее повышение белка наблюдается в образцах, обработанных CalixSlb, что подтверждает усиление эффекта конъюгата с точки зрения защитной активности, проявляющегося в виде ингибирования процесса апоптоза, в который вовлечен катепсин D.
Каликсареновый носитель соединение (1) сам по себе может быть загружен различными гидрофобными молекулами; в этом изобретении в качестве примера его загружали куркумином и латанопростом, в дополнение к силибинину. Вышеуказанные активные ингредиенты характеризуются низкой растворимостью в воде, легкой химической и ферментативной деградацией, низкой биодоступностью. Куркумин и силибинин являются натуральными веществами, которые применяются при ряде заболеваний, от воспаления до рака; латанопрост является аналогом простагландина F2α, применяемым в лечении глаукомы, состояния, которое является основной причиной необратимой слепоты в мире.
Кроме того, для этих активных ингредиентов загрузку активного ингредиента в наноагрегатное соединение (1) осуществляют посредством способа фазовой растворимости с загрузкой лекарства ≥ 10%. Дозировку активного ингредиента определяли посредством ВЭЖХ анализа и УФ-спектроскопии.
Наноагрегат (соединение 1), загруженный активным ингредиентом, характеризовали посредством ДРС и анализа дзета-потенциала, которые показали, что наноразмеры, индекс полидисперсности и поверхностная нагрузка остаются пригодными для систем доставки лекарств (таблица 11).
Таблица 11. Химические и физико-химические характеристики агрегата 1, загруженного активным ингредиентом куркумином или латанопростом
Физико-химические характеристики
Носитель-куркумин
Носитель-латанопрост
Размеры ≤ 100 нм
Z-среднее 82 нм, D<sub>H</sub> 113 нм
Z= 65,7 нм
Полидисперсность ≤ 0,5
0,2
ИПД= 0,26
Дзета-потенциал ≠0
23 мВ
Стабильность в ФБР при комнатной температуре
ДРС стабильное, [лекарство], ЖХ в течение 15 суток
ДРС стабильное, [лекарство], ЖХ спустя 4 месяца
Стерилизация
Фильтрация 0,2 мкм
Фильтрация 0,2 мкм
Содержание лекарственного средства %
10%
45%
Высвобождение лекарства при диализе, %
20-30% ЭтOH/ФБР, 1-27% за 24 часа; 20% ЭтOH/ФБР 1% за 24 часа
Каликсарен 1 повышает растворимость куркумина, а также силибинина в водной среде по меньшей мере в десять раз.
Каликсарен 1 защищает куркумин в ФБР в виде растворителя, который демонстрирует деградацию 80-90% за 30 минут в 0,1 М ФБР и бессывороточной среде (фиг. 10).
Каликсарен 1 защищает латанопрост от деградации (таблица 12) в ФБР в качестве растворителя при комнатной температуре в течение 6 месяцев. Это интересный результат, поскольку он свидетельствует о получении новой композиции, которая в настоящее время не является коммерческой, не требует холодовой цепи и не содержит консервантов.
Таблица 12. Стабильность коллоидного раствора каликсарена-латанопроста до 4 месяцев от приготовления в ФБР при комнатной температуре: размер, ИПД, концентрация латанопроста
Z среднее
ИПД
Конц. лекарства
дни
t.a.
t.a.
t.a.
0
69,2
69,2
0,26
0,26
52
54
6
72,0
72,3
0,30
0,29
54
56
14
69,0
68,2
0,30
0,32
54
57
34
72,6
69,6
0,34
0,33
55
56
48
66,9
66,3
0,35
0,31
52
54
92
76,8
78,0
0,39
0,37
53
58
130
65,3
68,9
0,31
0,29
50
53
Коллоидные растворы каликсарена 1, каликсарена, нагруженного активным ингредиентом, и активного ингредиента по отдельности тестировали на цитотоксичность на: SIRC клетках роговицы (фиг. 11), J774 макрофагах (фиг. 12) и ARPE клетках сетчатки. Результаты показали хорошую биосовместимость каликсарена и комбинации каликсарена-активного ингредиента на всех анализируемых типах клеток.
Противовоспалительную активность коллоидных растворов каликсарена 1, каликсарена-куркумина и куркумина по отдельности тестировали in vitro на J774 клетках, подвергнутых воспалительному стрессу, путем обработки ЛПС. В частности, J774 клетки стимулировали липополисахаридом (ЛПС) в концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов; стимуляция ЛПС индуцирует активацию воспалительных процессов, таких как транслокация NFκB в ядро и продукция цитокинов, если только не высвобождение нитритов и стресс нитрозилирования. Жизнеспособность клеток затем оценивали после стимуляции ЛПС (10 мкг/мл в течение 24 часов), и двухчасовой предварительной обработки изучаемыми системами доставки при различных концентрациях. Жизнеспособность клеток после стимуляции ЛПС снижалась на 50%; обработка исследуемыми веществами, такими как куркумин, носитель, и связанный с куркумином носитель, позволяла восстановить жизнеспособность клеток, почти возвращая её к контрольным уровням, за исключением более высоких концентраций, которые были токсичными для поврежденных клеток (фиг. 13). Противовоспалительную активность систем доставки затем оценивали посредством вестерн-блоттинга. Вначале наблюдали деградацию IκBα (фиг. 14) и последующую транслокацию NFκB в ядро (фиг. 15), что приводило к продукции и активации провоспалительных генов, таких как те, которые кодируют цитокины. Результаты демонстрируют, что стимуляция ЛПС (10 мкг/мл в течение 30 минут) существенно повышает деградацию IκBα и последующую транслокацию NFκB в ядро (чьи уровни существенно повышаются, как можно видеть на фиг. 15). Напротив, предварительная обработка системами доставки позволяет существенно снизить деградацию IκBα и транслокацию NFκB (фиг. 15). Активация NFκB включает продукцию белков и медиаторов воспаления, таких как циклооксигеназа 2 (СОХ-2) и индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS), и последующее повышение продукции нитритов. Посредством вестерн-блоттинга было установлено, что стимуляция ЛПС (10 мкг/мл в течение 24 часов) существенно повышает уровни iNOS и COX-2. Предварительная обработка куркумином, носителем, и носителем, связанным с куркумином, существенно снижает дозозависимым образом уровни iNOS и COX-2 (фиг. 16).
Каликсареновое производное действует не только в качестве носителя, но также обладает противовоспалительной активностью в отношении макрофагов, подвергнутых воспалительному стрессу с ЛПС. Проведенные анализы показали, что противовоспалительная активность каликсарена, нагруженного куркумином >> каликсарена >> куркумина по отдельности.
С целью подтверждения эффективности каликсареновой системы, нагруженной активным ингредиентом, в интересующем участке глаза, проводили эксперимент in vivo на модели увеита. Увеит индуцировали у крыс Lewis массой тела 160-180 г путем единственного подкожного введения в заднюю лапу 200 мкг ЛПС эндотоксина из Salmonella Minnesota, разбавленного в 0,2 мл ФБР, рН 7,4. В контрольной группе вводили только 0,2 мл ФБР в заднюю лапу. Крыс разделяли на экспериментальные группы (каликсареновая система, каликсарен-силибинин, силибинин по отдельности, каликсарен-куркумин, и куркумин по отдельности); с предварительной обработкой путем местного применения в течение трех суток перед индукцией увеита, и до момента умерщвления спустя 16 часов для одних животных и 72 часа для других животных после введения эндотоксина. Глаза энуклеировали для гистологического и иммуногистологического анализа. Также отбирали водянистую влагу для анализа белка.
Гистологический анализ тканей глаза животных после инъекции ЛПС показал признаки тяжелого увеита с сильной инфильтрацией нейтрофилов. У животных, леченных одним носителем, степень воспаления не снижалась. Лечение силибинином показало незначительное снижение воспаления глаза, в то время как система каликсарена+силибинина снижала повреждение.
Однако лечение куркумином, и в частности, комбинацией каликсарена+куркумина существенно снижало повреждение тканей. Не отмечалось воспаления глаза в группе с имитацией введения ЛПС.
Далее, не отмечено достоверного различия в группах спустя 16 и 72 часа. В качестве примера, показан график, обобщающий гистологические результаты для разных групп спустя 72 часа (фиг. 17А). Спустя 16 и 72 часа после инъекции ЛПС наблюдалось повышение уровней белка в водянистой влаге животных после инъекции ЛПС. Лечение одним носителем не приводило к снижению уровней белка в тканях глаза. Животные, леченные силибинином, показали незначительную тенденцию, в то время как комбинация системы каликсарена+силибинина существенно снижала уровни белков в водянистой влаге. Однако куркумин и комбинация системы каликсарена+силибинина наиболее эффективно определяли снижение белков в ткани глаза. Образцы, взятые спустя 16 часов и 72 часа, продемонстрировали схожие тенденции во всех экспериментальных группах; в качестве примера, показан график количества белка спустя 72 часа в различных группах лечения (фиг. 17В).
Для проверки эффективности каликсареновой системы, загруженной латанопростом, проводили эксперимент in vivo на модели глазной гипертензии, индуцированной у коричневых норвежских крыс путем катетеризации эписклеральной вены (КЭВ).
Лечение проводили один раз в сутки путем инстилляции 12 мкл в глаз (левый глаз); протокол эксперимента включал однократное применение в ходе лечения системы носителя с активным ингредиентом, при котором проводили измерение внутриглазного давления (ВГД) спустя 1 час, 3 часа, 5 часов, 7 часов, 24 часа, 30 часов и 48 часов; и хроническое применение в течение семи последовательных дней, при котором проводили измерение ВГД каждые 24 часа перед следующей инстилляцией.
Каждая группа лечения состояла из десяти животных; регистрировали среднее значение ВГД в разное время и сравнивали со средним фоновым значением, определенным раньше. Графики (фиг. 18А/В) демонстрируют тенденцию к снижению внутриглазного давления (ВГД) при лечении каликсареном+латанопростом по сравнению с коммерческим продуктом (IOPIZE) после однократного применения в ходе эксперимента в разные моменты времени (фиг. 18А), и после хронического применения в течение семи суток (фиг. 18В).
Тенденция к изменению давления для двух разных лечений является достаточно схожей, как в случае системы каликсарена-латанопроста, так и в случае продукта IOPIZE; наблюдался парадоксальный эффект латанопроста во время первых часов сразу после применения, и заключался в заметном повышении ВГД; этот эффект, описанный в литературе, является типичным для крыс («Latanoprost-induced changes in rat intraocular pressure: direct or indirect?» Husain S. et al. J. Ocul. Pharmacol. Ther. (2008) («Индуцированные латанопростом изменения внутриглазного давления у крыс: прямые или опосредованные?»); «Effects of latanoprost on rodent intraocular pressure». Husain S et al. Exp Eye Res. (2006) («Влияние латанопроста на внутриглазное давление у грызунов»)); затем отмечалось постепенное снижение глазного давления, которое достигало пика только спустя 24 часа, а затем отмечалась тенденция к повышению. Хроническое лечение с применением каждые 24 часа позволяет снизить ВГД, где снижение достигает наивысшей точки примерно на четвертые сутки с системой каликсарена-латанопроста. Каликсареновая система, по сравнению с коммерческими продуктами, обеспечивает преимущество отсутствия необходимости в холодовой цепи для продукта, в приготовлении продукта без консервантов при сохранении эффективности активного ингредиента.