ПОВЫШЕННАЯ ЭКСКРЕЦИЯ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА-β С МОЧОЙ РАННИЙ МАРКЕР НЕФРОПАТИИ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА

Осложнение

Повышенная экскреция трансформирующего фактора роста-р с мочой - ранний маркер нефропатии у больных сахарным диабетом 1 типа

И.А. Бондарь1, В.В. Климонтов1, А.П. Надеев2

Кафедра эндокринологии (зав. - проф. И.А. Бондарь), I

2Кафедра патологической анатомии (зав. - акад. РАМН В.А. Шкурупий) Новосибирского государственного медицинского университета

Нефросклероз - основная причина функциональной недостаточности почек у пациентов с сахарным диабетом (СД). Главным патогенетическим фактором, запускающим процесс склерозирования почечных клубочков и интерстиция при СД, является гипергликемия. Ее эффект реализуется через изменение экспрессии ряда цитокинов и факторов роста. Под контролем последних находится синтетическая функция клубочковых и канальцевых клеток, аккумуляция и распад компонентов межклеточного матрикса (коллагена, глико-заминогликанов, фибронектина и др.) [1, 2].

Центральную роль в развитии нефросклероза играет трансформирующий фактор роста-р (ТФР-р) [3, 4]. ТФР-р - мультифункциональный цитокин, впервые выделенный из тромбоцитов в 1990-х гг. Он является важным регулятором клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, иммунного ответа, ремоделирования внеклеточного матрикса [5]. ТФР-р синтезируется многими резидентными клетками органов, а также инфильтрирующими лейкоцитами. Почти все типы почечных клеток могут продуцировать данный фактор [6].

В единичных клинических исследованиях обнаружено возрастание мочевой экскреции ТФР-р у больных с диабетической нефропатией (ДН) [7, 8]. Взаимосвязь продукции ТФР-р с аккумуляцией межклеточного матрикса в почках и формированием нефросклероза у пациентов с СД не изучена.

Целью нашей работы являлось изучение экскреции ТФР-р с мочой у больных СД 1 типа в сопоставлении с качеством гликемического контроля, структурными и функциональными изменениями в почках.

Материалы и методы исследования

Почечная экскреция ТФР-р исследована у 54 больных СД 1 типа, в том числе у 24 мужчин и у 30 женщин. Возраст обследованных от 16 до 54 лет

(средний возраст 29,6+9,7 года). Длительность СД варьировала от 1 мес до 31 года, составляя в среднем 7,3+7,1 года. В исследование не включались больные с заболеваниями почек недиабетического генеза, кетоацидозом, обострением сопутствующих заболеваний. Комплекс нефрологического обследования включал исследование суточной протеинурии, альбуминурии, мочевого осадка, креатинина крови с расчетом скорости клубочковой фильтрации (СКФ) по Cockcroft-Gault, УЗИ почек.

У 24 пациентов выявлена нормоальбуминурия (1-я группа), у 20 - микроальбуминурия (2-я группа) и у 10 - клинически выраженная ДН (3-я группа). Нарушение клиренса креатинина имело место у 6 больных 3-й группы (СКФ 10,6-59,5 мл/мин). Клинико-лабораторная характеристика больных разных групп представлена в табл. 1. Пациенты с выраженной нефропатией в целом были несколько старше, имели большую длительность СД и, по определению, более высокие показатели протеину-рии и креатинина и меньшую СКФ по сравнению с больными других групп. Прослеживалась тенденция к увеличению уровней гликированного гемоглобина от 1-й к 3-й группе, однако эти различия не были статистически значимыми.

Исследование содержания ТФР-р проводили в утренней порции мочи методом иммуноферментно-го анализа с помощью коммерческих наборов «Bender MedSystems» (Австрия) с использованием планшеточного ридера «BioRad 680» («BioRad», США) и программного обеспечения «Zemfira». Результаты определения приводили к величине экс-кретируемого креатинина и сравнивали с таковыми в контрольной группе. Последнюю составили 11 здоровых лиц от 21 до 54 лет (5 мужчин и 6 женщин, средний возраст 26,7±13,2 года). Исследования содержания ТФР-р проведены в гормональной лаборатории МЦ «Лабораторная диагностика» (зав. лабораторией - к.м.н. В.В. Романов).

Осложнение

Сахарный диабет

Таблица 1

Характеристика групп больных СД с различными стадиями нефропатии

Показатель Группы больных

1-я

Пол, м/ж 9/13 10/10 3/7

Возраст, годы 27,2±8,8 28,4±8,3 38,3±10,4**

Длительность СД, годы 3,6±3,9 7,5±6,2* 16,2±8,9**

НЬА1с, % 9,5±3,2 10,0±1,6 10,8±2,5

Гликемия натощак, ммоль/л 8,1±2,7 9,7±3,5 9,4±2,4

Гликемия через 2 часа после еды, ммоль/л 9,1±2,7 10,0±2,6 10,3±2,5

Протеинурия, г/сут - 0,2±0,1 2,2±2,3**

Креатинин крови, мкмоль/л 80,9±12,5 82,2±10,0 239,6±222,8**

СКФ, мл/мин 103,0±30,5 103,2±18,8 55,2±35,9**

*р<0,05 - при сравнении с 1-й группой больных;

**р<0,05 - при сравнении с 1-й и 2-й группой.

Прижизненное морфологическое исследование почек проведено у 22 пациентов с нормальной фильтрационной функцией почек, в том числе у 11 с нор-моальбуминурией, 10 - с микроальбуминурией и у одной пациентки с протеинурией (0,8 г/сут). Процедура выполнялась под контролем УЗИ в отделении ультразвуковой диагностики (зав. -А.В. Сасин) Новосибирской Государственной областной клинической больницы. Пациенты давали письменное информированное согласие на проведение биопсии. Морфологическое исследование почек включало светооптическую микроскопию срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, ШИК-реакцией, по ван Гизон, а также электронную микроскопию ультратонких срезов толщиной 35-45 нм. Для количественной оценки выраженности изменений в почках применяли морфометрию. Соотношение объем мезангия/объем клубочка определяли с помощью окулярной сетки на 289

О

2

о

<и

а

НЬА1с

Рис. 1. Экскреция с мочой ТФР-р у больных СД 1 типа в зависимости от уровня НЬА1с: р<0,002 - при сравнении с контролем

точек (ГГ Автандилов, 1990). Морфометрию структурных компонентов нефрона проводили при увеличении электронного микроскопа в 38000, определяли толщину базальных мембран клубочков и проксимальных канальцев, количество и среднюю толщину малых отростков подоцитов.

В качестве контроля при проведении световой микроскопии использовали почки 15 здоровых лиц, погибших от черепно-мозговых травм (автокатастрофы). При судебно-медицинском исследовании этих лиц не выявлено признаков хронических заболеваний, отравлений, травматических и иных повреждений почек. Образцы почек забирали не позднее 24 ч от момента биологической смерти. При проведении электронно-микроскопических исследований в качестве контроля использовали неизмененные фрагменты почек 5 больных с нефрокарцино-мами. При клиническом обследовании этих лиц были исключены нарушения углеводного обмена, артериальная гипертензия, инфекции мочевыводящих путей и другие заболевания, которые могут оказывать влияние на структуру и функцию почек. Образцы почек для исследования забирали во время извлечения почки.

Протокол исследования одобрен этическим комитетом Новосибирского государственного медицинского университета (протокол № 1/11 от 16. 11. 2005 г.).

Статистическая обработка проведена с использованием пакета 8ТАТ18Т1СА 6.0 ^а^оИ, 2001). Применяли дисперсионный анализ (ANOVA), корреляционный анализ, многофакторный регрессионный пошаговый анализ. Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро-Уилкса, различия оценивали по критерию Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные представлены как средние и стандартные отклонения (M±SD).

15

Сахарный диабет I

Осложнение

6,32±2,99*

3,56±1,89*

2,06±1,21 1,64±0,80

Н

І I

Контроль 1-я 2-я

Группы

Рис. 2. Экскреция с мочой ТФР-|3 у больных СД 1 типа в зависимости от выраженности ДН:

*р<0,02 - при сравнении с контролем и 1-й группой больных

Результаты и их обсуждение

Экскреция ТФР-р с мочой у больных СД варьировала от 0,47 до 12,06 пг/мкмоль креатинина, составляя в среднем 3,41±2,42 пг/мкмоль. В контрольной группе экскреция ТФР-р составила 1,64±0,80 пг/мкмоль (колебания от 0,61 до 3,18 пг/мкмоль). Таким образом, средняя экскреция ТФР-р у больных оказалась в 2,1 раза выше, чем в контроле (р=0,02).

Экскреция ТФР-р коррелировала с длительностью СД (г=0,30, р=0,03) и с возрастом больных (г=0,33, р=0,01). Положительная взаимосвязь обнаружена между концентрацией ТФР-р и уровнем гликированного гемоглобина (г=0,34, р=0,03). Экскреция ТФР-р увеличивалась по мере нарастания концентрации НЬА1с (рис. 1). Наибольшие значения зафиксированы при уровне НЬА1с>12%.

Зависимость экскреции ТФР-р от стадии ДН представлена на рис. 2. У пациентов с нормоальбуми-нурией средняя экскреция ТФР-р достоверно не отличалась от нормы (р=0,30). У больных с микроальбуминурией выделение ТФР-р было увеличено в среднем в 2,2 раза (р=0,003). У больных с протеину-рией экскреция ТФР-р превышала норму в 3,9 раза (р=0,00008). Группы больных с микро- и макроальбуминурией имели достоверно более высокую экскрецию ТФР-р в сравнении с пациентами с нормальной ЭАМ (р=0,003, р=0,000001 соответственно).

Взаимосвязь экскреции ТФР-р с выраженностью ДН подтверждена при корреляционном анализе. Положительные корреляции обнаружены между экскрецией ТФР-р и суточной протеинурией (г=0,29; р=0,03), уровнем креатинина (г=0,32; р=0,02), мочевины (г=0,37; р=0,006). Содержание ТФР-р обратно коррелировало с СКФ (г=-0,36; р=0,007).

При исследовании биоптатов почек у обследованных больных выявлены изменения, свойственные начальным стадиям ДН: гипертрофия и гипер-клеточность клубочков, очаговое расширение мез-ангия, расширение просвета и утолщение стенок капиллярных петель, перигломерулярный склероз, утолщение и частичное слияние малых отростков подоцитов, неравномерное утолщение базальных мембран, дистрофические и атрофические изменения эпителия канальцев, начальные этапы склероза интерстиция и артериол. При морфометрическом анализе обнаружено достоверное увеличение соотношения мезангий/клубочек, значительное увеличение толщины клубочковых и канальцевых базальных мембран, а также толщины малых отростков подоцитов в сравнении с контролем (табл. 2).

При сопоставлении экскреции ТФР-р с морфологическими изменениями в почках установлена положительная корреляция между концентрацией ТФР-р и относительным объемом мезангия (г=0,34; р=0,12). Наиболее тесные взаимосвязи выявлены между ТФР-р и толщиной базальной мембраны клубочков (г=0,64; р=0,004) и канальцев (г=0,86; р<0,00001). Кроме того, экскреция ТФР-р была взаимосвязана с шириной малых отростков подоцитов (г=0,44; р=0,04).

С помощью многофакторного пошагового регрессионного анализа изучена зависимость экскреции ТФР-р от возраста пациентов, длительности СД, стадии нефропатии, показателей гликемии натощак и после еды, гликированного гемоглобина, протеинурии, креатинина и СКФ. Наиболее значимое влияние на экскрецию ТФР-р оказывала выраженность ДН (параметры модели: р=0,77; р0=3,47; Я2=0,39; F=8,2; р=0,0004). Самостоятельного влияния остальных факторов не установлено.

Полученные результаты свидетельствуют о тесной взаимосвязи между продукцией ТФР-р и развитием нефропатии у пациентов с СД 1 типа. Наблюдаемое нами значительное возрастание мочевой экскреции ТФР-р соответствует результатам работ, авторы которых зафиксировали повышение экспрессии гена ТФР-р в почках при СД [3, 9-12]. Помимо возрастания продукции самого ТФР-р, в «диабетических» почках возрастает экспрессия рецепторов ТФР-р типа I [13] и типа II [13, 14], что создает условия для реализации патогенного действия данного фактора.

В настоящее время ТФР-р рассматривается как один из ключевых медиаторов в развитии нефро-склероза. Его эффект связан с изменением обмена межклеточного матрикса. Активируя синтез коллагена и других компонентов матрикса (фибронекти-на, ламинина), ТФР-р способствует развитию гипертрофии клубочков, утолщению базальных мембран и увеличению мезангия при СД [3, 4]. Кроме того, ТФР-р ускоряет развитие фиброза интерстиция за

7

6

5

4

3

2

0

Осложнение

Сахарный диабет

Таблица 2

Результаты морфометрического анализа структур почек больных СД

Параметр Больные СД Контроль р

Отношение мезангий/клубочек, % 23,5±5,1 17,2±2,9 0,03

Толщина клубочковой базальной мембраны, нм 569±139 338±50 0,002

Средняя толщина малых отростков подоцитов, нм 849±543 438±54 0,11

Толщина базальной мембраны проксимальных канальцев, нм 829±162 580±63 0,003

счет стимуляции синтеза матрикса эпителиоцитами канальцев и интерстициальными фибробластами [10, 15]. Профиброгенные свойства ТФР-р усиливаются его стимулирующим действием на синтез фактора роста соединительной ткани, который оказывает сходные с ТФР-р эффекты [15, 16]. Еще один механизм реализации профиброгенного действия ТФР-р состоит в подавлении синтеза матриксных металлопротеиназ - ферментов, расщепляющих межклеточный матрикс [17].

Полученные нами данные свидетельствуют о тесной взаимосвязи между качеством гликемического контроля и концентрацией ТФР-р в моче. Это согласуется с результатами исследований in vitro, показавшими, что гипергликемия запускает синтез ТФР-р в клетках почечных клубочков и канальцев [4, 12]. Введение инсулина животным с экспериментальным СД уменьшало выраженность изменений экспрессии гена ТФР-р в почках [12]. Это подтверждает значимость гипергликемии при возникновении изменений синтеза ТФР-р. Дисбаланс в продукции ТФР-р можно рассматривать как связующее патогенетическое звено между гипергликемией и нефросклерозом.

Как показало проведенное исследование, мочевая экскреция ТФР-р у больных СД 1 типа взаимосвязана со структурными и функциональными изменениями в почках. Повышение экскреции ТФР-р начинается уже на доклинических стадиях ДН. На этих стадиях содержание ТФР-р отражает выраженность ранних морфологических изменений в почках. В частности, нами отмечена взаимосвязь между повышенным содержанием ТФР-р и такими характерными признаками ДН, как утолщение гломерулярных и тубулярных базальных мембран, расширение малых отростков подоцитов, увеличение объема мезангия. Наибольшая экскреция ТФР-р зафиксирована у пациентов с выраженной ДН. У этих больных содержание фактора роста в моче возрастает обратно пропорционально снижению фильтрационной и азотвыделительной функции почек. Таким образом, определение экскреции ТФР-р с мочой можно использовать в качестве неинвазив-

ного теста для ранней диагностики и мониторирова-ния течения ДН. Возможно, исследование ТФР-р окажется полезным и в прогнозировании развития диабетического нефросклероза, однако это предположение нуждается в проверке в проспективных исследованиях.

Полученные данные ставят вопрос о подходах к коррекции синтеза ТФР-р у пациентов с СД. Безусловно, поддержание нормогликемии является важным условием для предотвращения активации синтеза данного фактора при СД. В экспериментальных работах показано, что ингибиторы ангио-тензин-превращающего фермента (АПФ) и антагонисты рецепторов ангиотензина II тормозят почечный синтез ТФР-р и предупреждают утолщение базальных мембран и расширение мезангия при диабете [10, 11, 18]. Это соответствует представлениям об ангиотензине II как о стимуляторе синтеза ТФР-р в почках [19]. Имеются данные, что двойная блокада ренин-ангиотензиновой системы с помощью ингибитора АПФ и антагониста рецепторов ангиотензина II (рамиприл + кандесартан) оказывает более выраженный антипротеинурический эффект и приводит к более выраженному снижению экскреции с мочой ТФР-р у больных СД 2 типа с протеину-рией [20].

С воздействием на синтез и рецепцию ТФР-р связаны некоторые перспективные подходы к лечению ДН. Показано, что введение антител к ТФР-р животным с СД уменьшает синтез компонентов межклеточного матрикса [21], выраженность морфологических изменений в клубочках и предупреждает снижение функции почек [3]. Обнадеживающие результаты дало использование траниласта - ингибитора синтеза коллагена, взаимодействующего с ТФР-р. По предварительным данным, препарат подавляет образование коллагена и замедляет снижение функции почек у пациентов с СД и выраженной нефропатией [22]. Синтез ТФР-р и коллагена в почках снижают антагонисты эндотелиновых рецепторов [23] и блокаторы гликации альбумина [24]. Установление клинической эффективности данных препаратов в лечении ДН -задача будущих исследований.

Сахарный диабет I

Осложнение

Выводы

1. Развитие диабетической нефропатии у больных СД 1 типа сопровождается значительным увеличением экскреции ТФР-р с мочой. Наиболее высокие значения экскреции наблюдаются у больных с протеинурией.

2. Мочевая экскреция ТФР-р у больных СД 1 типа связана со степенью компенсации углеводного обмена, альбуминурией, фильтрационной и азотвы-делительной функцией почек.

3. Содержание ТФР-р в моче у больных с ранними стадиями диабетической нефропатии отражает выраженность морфологических изменений в почках: утолщение гломерулярных и тубулярных базальных мембран, расширение малых отростков подо-цитов, увеличение объема мезангия.

Литература

1. Бондарь ИА, Климонтов ВВ Роль дисфункций клубочковых клеток в развитии диабетической нефропатии. // Пробл эндокринол 2006;

4: 45-49

2. Дедов ИИ, Шестакова МВ Диабетическая нефропатия. М:

Универсум паблишинг, 2000

3. Chen S, Jim B, Ziyadeh FN Diabetic nephropathy and transforming growth factor-beta: transforming our view of glomerulosclerosis and fibrosis build-up. // Semin Nephrol 2003; 23 (6): 532-543

4. van Det NF, Verhagen NA, Tamsma JT, et al. Regulation of glomerular epithelial cell production of fibronectin and transforming growth factorbeta by high glucose, not by angiotensin II. // Diabetes 1997; 46 (5): 834-840

5. Bottinger EP, Bitzer M TGF- signaling in renal disease. // J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2600-2610

6. Ando T, Okuda S, Yanagida T, et al. Localization of TGF and its receptors in the kidney. // Miner Electrolyte Metab 1998; 24 (1-2): 149-153

7. Korpinen E, Teppo AM, Hukkanen L, et al. Urinary transforming growth factor-beta1 and alpha1-microglobulin in children and adolescents with type 1 diabetes. // Diabetes Care 2000; 23 (5): 664-668

8. Sato H, Iwano M, Akai Y, et al. Increased excretion of urinary transforming growth factor beta 1 in patients with diabetic nephropathy. // Am J Nephrol 1998; 18 (6): 490-494

9. Craven PA, DeRubertis FR, Kagan VE, et al. Effects of supplementation with vitamin C or E on albuminuria, glomerular TGF-beta, and glomerular size in diabetes. // J Am Soc Nephrol 1997; 8 (9): 1405-1414

10. Gilbert RE, Cox A, Wu LL, et al. Expression of transforming growth fac-tor-beta1 and type IV collagen in the renal tubulointerstitium in experimental diabetes: effects of ACE inhibition. // Diabetes 1998; 47 (3): 414-422

11. Kalender B, Ozturk M, Tuncdemir M et al. Renoprotective effects of val-sartan and enalapril in STZ-induced diabetes in rats. // Acta Histochem 2002; 104 (2): 123-130

12. Park IS, Kiyomoto H, Abboud SL, Abboud HE Expression of transforming growth factor-beta and type IV collagen in early streptozotocin-induced diabetes. // Diabetes 1997; 46 (3): 473-780

13. Kang MJ, Ingram A, Ly H, et al. Effects of diabetes and hypertension on glomerular transforming growth factor-beta receptor expression. // Kidney Int 2000; 58 (4): 1677-1685

14. Hill C, Logan A, Smith C, et al. Angiotensin converting enzyme inhibitor suppresses glomerular transforming growth factor beta receptor expression in experimental diabetes in rats. // Diabetologia 2001; 44 (4): 495-500

15. Kobayashi T, Inoue T, Okada H, et al. Connective tissue growth factor mediates the profibrotic effects of transforming growth factor-beta produced by tubular epithelial cells in response to high glucose. // Clin Exp Nephrol 2005; 9 (2): 114-121

16. Wang S, Denichilo M, Brubaker C, Hirschberg R Connective tissue growth factor in tubulointerstitial injury of diabetic nephropathy. // Kidney Int 2001; 60 (1): 96-105

17. McLennan SV, Fisher E, Martell SY, et al. Effects of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activities in mesangial cells: possible role in diabetic nephropathy. // Kidney Int Suppl 2000; 77: S81-S87

18. Davis BJ, Forbes JM, Thomas MC, et al. Superior renoprotective effects of combination therapy with ACE and AGE inhibition in the diabetic spontaneously hypertensive rat. // Diabetologia 2004; 47 (1): 89-97

19. Singh R, Alavi N, Singh AK, et al. Role of angiotensin II in glucose-induced inhibition of mesangial matrix degradation. // Diabetes 1999; 48 (10): 2066-2073

20. Song JH, Cha SH, Lee HJ, et al. Effect of low-dose dual blockade of renin-angiotensin system on urinary TGF-beta in type 2 diabetic patients with advanced kidney disease. // Nephrol Dial Transplant 2006; 21 (3): 683-689

21. Sharma K, Ziyadeh FN, Alzahabi B, et al. Increased renal production of transforming growth factor-beta1 in patients with type II diabetes. // Diabetes 1997; 46 (5): 854-859

22. Soma J, Sugawara T, Huang YD, et at. Tranilast slows the progression of advanced diabetic nephropathy. // Nephron 2002; 92 (3): 693-698

23. Cosenzi A, Bernobich E, Trevisan R, et al. Nephroprotective effect of bosentan in diabetic rats.// J Cardiovasc Pharmacol 2003; 42 (6): 752756

24. Cohen MP, Ziyadeh FN, Hong SW, et al. Inhibiting albumin glycation in vivo ameliorates glomerular overexpression of TGF-beta1. // Kidney Int 2002; 61 (6): 2025-2032