Роль структуры в элиситорной активности хитозана

Том 150, кн. 2

Естественные науки

2008

УДК 578.245

РОЛЬ СТРУКТУРЫ В ЭЛИСИТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ХИТОЗАНА

С.Н. Куликов, В. П. Варламов Аннотация

Метод индуцирования неспецифической устойчивости у растений с помощью хи-тозановых элиситоров является одним из перспективных способов защиты сельскохозяйственных культр от грибных, бактериальных и вирусных болезней. Для хитозана, который является гетерополимером, в силу специфики его получения характерна структурная неоднородность, что сказывается на его иммуномодулирующих свойствах, зависящих от особенностей структуры полимера. В обзоре представлено современное состояние данных о связи между химическим строением хитозана и его элиситорными свойствами и определены перспективы исследований в этой области.

Ключевые слова: хитозан, элиситор, химическая структура, степень ацетилиро-вания, степень полимеризации.

Введение

Хитозан является биогенным гетерополимером К-ацетилглюкозамина и глю-козамина, который обладает разнообразными биологические свойствами (рис. 1). Он проявляет антибактериальную [1] и антигрибную [2] активности, способен стимулировать иммунную систему посредством активации макрофагов, фибро-бластов, системы комплемента, активации миграции полиморфноядерных лейкоцитов. Хитоолигомеры вовлечены в биосинтез гиалуроновой кислоты и обладают морфогенетической активностью у позвоночных. Хитозан может быть использован как адьювант [3] или радиопротектор [4]. В качестве элиситора повышает устойчивость растений к грибным [5] и вирусным [6] заболеваниям. Элиситорами называют вещества, которые индуцируют в растениях неспецифическую иммунную реакцию, вызывая накопление антипатогенных веществ посредством повышения экспрессии защитных генов.

сн3

I

со

I

сн

Рис. 1. Структурная формула хитозана

1. Взаимодействие хитина и хитозана с растительными клетками

Элиситорной активности хитозана посвящено большое количество экспериментальных работ. Изучалась способность хитозана индуцировать в растениях образование сигнальных [7] и защитных веществ [8]. Были разработаны и внедрены в практику биопрепараты на его основе для защиты растений от патогенов [9]. Тем не менее особенности взаимодействия хитозана с растительным организмом на клеточном и молекулярном уровнях раскрыты неполностью. До сих пор нет чёткого ответа на вопрос о роли которую играют остатки К-ацетилглю-козамина и глюкозамина хитозана в проявлении им элиситорной активности.

хитрш хитозан

Рис. 2. Типы взаимодействия хитина и хитозана с растительной клеткой. а - остаток К-ацетилглюкозамина; Ь - остаток глюкозамина; с - ЦПМ; ё - хитиновый рецептор; е -ДНК

Основные патогены растений - грибы - часто содержат в своих клеточных стенках хитин. Молекулы хитина взаимодействуют со специфическими рецепторами в цитоплазматической мембране (ЦПМ) растительных клеток (рис. 2). Таким способом растения получают химический сигнал о близости патогена. Наличие таких рецепторов у растительных клеток впервые было обнаружено у риса [10, 11]. Существование подобных рецепторов было показано и у других растений: томата [12], сои [13], ячменя, моркови, пшеницы, табака [14], что свидетельствует об их широком распространении и важности биологического значения в растительном мире [15]. Рецепторы обладают сродством к хитиновым фрагментам и не связываются с близкими по химическому строению олигоме-рами N-ацетилгалактозамина и полностью деацетилированного хитозана [11]. Локализуются рецепторы в ЦПМ, что подтверждает их присутствие в микро-сомальной фракции мембран [16], а также то, что молекулы хитина, искусственно введённые в цитоплазму, минуя контакта с внешней поверхностью клетки, не проявляют элиситорную активность [17]. Количество хитин-связываю-щих доменов, приходящихся на единицу растительной массы, может быть различным у разных видов растений. Так, в ряду растений морковь, ячмень, рис количество центров связывания хитиновых олигомеров на единицу растительной массы растёт и прямо связано с величиной вызываемого физиологического

ответа при действии элиситора [14]. У растений, лишённых рецепторов, отсутствует реакция на хитин [14], даже несмотря на то что в неспецифическое связывание с поверхностью растительной клетки может быть вовлечена существенная часть хитиновых олигомеров [13].

Рецепторов, которые бы были специфичны к деацетилированной форме хи-тозана, у растений не обнаружено. Деацетилированный хитозан сродства к хитиновым рецепторам не имеет [11, 13]. В отличие от ацетилированных аналогов, деацетилированный хитозан не индуцирует образование активных форм кислорода (АФК) в клетках ячменя и моркови [14], пероксидазную активность в листьях пщеницы [18] и синтез фитоалексина в клетках риса [10, 19].

Таким образом, напрашивается вывод, что элиситорная активность обусловлена наличием остатков К-ацетилглюкозамина, в то время как деацетилирован-ные остатки благодаря своим аминогруппам лишь придают способность высокополимерным молекулам хитозана растворяться. Это подтверждается и тем, что минимальная концентрация для проявления хитином элиситорной активности составляет 10-9 М [10, 19], и даже менее 10-10 М [12], в то время как для хитозана, у которого только 1/10 часть остатков ацетилирована, требуется концентрация на порядок большая - 10- М [20].

Тем не менее данных об элиситорной активности деацетилированного хи-тозана становится всё больше. Были получены сведения о том, что полностью деацетилированные олигомеры индуцировали хитиназную активность в клетках ямса [21] и риса [22], экспрессию гена БЬ2, кодирующего основной белок, в клетках риса [23], отложение лигнина в листьях пшеницы [18], фенилаланин-аммоний- и тирозин-аммоний-лиазные активности в листьях сои [24].

Как оказалось, растения в природе сталкиваются с хитозаном чаще, чем можно было ожидать. Так, при контакте патогенного гриба с клетками эндокарпа гороха обнаруживаются хитозановые олигомеры, которые аккумулируются вокруг грибных гиф и индуцируют в растении образование защитных белков [25]. При этом формы взаимодействия хитозана с растительной клеткой могут быть сколь разнообразными, столь и необычными (рис. 2). В отличие от нейтрального хитина, поликатионная природа хитозана позволяет ему с помощью электростатических взаимодействий связываться с отрицательно заряженной ЦПМ растительных клеток [26]. Это подтверждается тем, что полианионы и двухвалентные катионы некоторых металлов ингибируют подобное взаимодействие, блокируя аминогруппы хитозанового полимера. Хитозан, в том числе выделяемый гифами гриба, не только взаимодействует с поверхностными структурами растительных клеток, но и способен проникать через ЦПМ в цитоплазму и даже ядро [27]. Там он взаимодействовует с нуклеиновыми кислотами, что приводит к нарушению нормального связывания ДНК с гистонами, локальным изменениям в структуре хроматина, одиночным и двойным разрывам нуклеиновой цепи [28]. Такие изменения в ДНК могут послужить сигналом для активации репарационных процессов и транскрипции защитных генов. Похожий элиситорный эффект вызывают и другие ДНК-разрушающие агенты - митомицин С, акти-номицин Б, псорален.

Таким образом, элиситорные способности хитозана обусловлены как специфическим связыванием остатков К-ацетилглюкозамина с рецепторами на

поверхности растительных клеток, так и неспецифическим взаимодействием остатков глюкозамина за счёт свободных аминогрупп с внешними и внутренними клеточными компонентами. Такое многогранное действие хитозана - специфическое и неспецифическое - на внешние и внутренние структуры клетки, может позволить растению более надёжно фиксировать хитозановый сигнал и включать защитные реакции с разными механизмами запуска и действия.

2. Связь химической структуры хитозана и элиситорной активности

Сочетание в полимере остатков N-ацетилглюкозамина и глюкозамина определяет его степень ацетилирования (СА). Таким образом, от СА будет зависеть характер взаимодействия хитозана с растительной клеткой, а следовательно, и его элиситорная активность. Так, было показано, что олигомеры хитина индуцировали в листьях пшеницы пероксидазу, хитозан индуцировал пероксида-зу и фенилаланин-аммоний-лиазную активность, деацетилированный хитозан эти активности не индуцировал, зато вызывал накопление лигнина [18]. В растениях фасоли накопление фитоалексина киевитона в наибольшей степени происходило при использовании олигомеров хитозана с невысокой СА - до 13%, дальнейшее увеличение доли N-ацетилглюкозамина в составе хитозана снижала элиситорную активность [29]. В растениях гороха синтез фитоалекси-на пизатина происходил под действием хитозана, несущего небольшое количество остатков N-ацетилглюкозамина. Отсутствие ацетилированных остатков делало хитозан инертным, но и увеличение доли остатков N-ацетилглюкозамина свыше одной трети уменьшало индукцию пизатина [29-31]. Отложение каллозы клетками Catharanthus roseus становилось более интенсивным при уменьшении доли остатков N-ацетилглюкозамина в хитозановом полимере [32]. Но мало влияла СА в пределах 2-40% на противовирусную активность хитозана в опытах на растениях фасоли [33]. Можно сделать вывод, что наличие свободных аминогрупп в хитозане, способных приобретать положительный заряд благодаря протонированию в растворах с кислым значением рН, играет важную роль в проявлении хитозаном элиситорных свойств. Так, противовирусная активность хитозана при перемене знака заряда поликатиона на противоположный в результате О-сульфатирования и N-сукцинилирования снижалась в соответствии с величиной внесённого отрицательного заряда. В результате сульфатирован-ные и сукцинилированные производные оказались на 2-3 порядка менее активны, чем немодифицированный хитозан [34].

На биологическую активность хитозана влияет также его степень полимеризации (СП) или молекулярная масса. Мономерные и димерные молекулы хитина имеют малое сродство к хитиновым рецепторам и как элиситоры практически неактивны [13, 35-37]. Олигомеры со СП 3-4 в некоторых случаях могут выступать как активные элиситоры. Олигомеры такой величины вызывали деполяризацию ЦПМ в клетках томата [38] и клетках Picea abies [39], образование АФК в клетках Picea abies [39] и клетках картофеля [40], индуцировали хитиназную активность в клетках риса [22] и ямса [21], в листьях сои фенила-ланин-аммоний- и тирозин-аммоний-лиазные активности [24], вызывали накопление в клетках риса фитоалексина [19]. В то же время олигомеры со СП 3-4, в отличие от молекул с большей СП, не вызывали деполимеризацию мембраны

клеток риса [37]. В клетках моркови, ячменя и табака олигомеры со СП 5-7 индуцировали образование АФК, но только у моркови АФК в заметном количестве индуцировались олигомером со СП 3 [14]. Олигомеры со СП 5-10 обладают максимальным сродством к специфическим рецепторам и элиситорной активностью [13]. Это позволяет им проявлять свою активность на растениях в очень низких концентрациях, до 10- М [10, 12]. Такие олигомеры индуцируют в клетках риса деполяризацию ЦПМ [37], образование перекиси водорода [36] и синтез фитоалексина [10]. Вызывают образование митоген-активируемых про-теинкиназ в клетках Arabidopsis thaliana [41]. Индуцируют в растениях дыни хитиназную активность [42]. При этом более короткие олигомеры в большей степени индуцировали экзохитиназную активность, а более длинные олигомеры - эндохитиназную активность.

С увеличением СП олигомеров глюкозамина усиливалась индукция фени-лаланин-аммоний- и тирозин-аммоний-лиазных активностей в листьях сои [24]. Однако при изучении индукции хитиназной активности в клетках ямса была отмечена обратная зависимость: при увеличении СП олигомеров от 2 до 6 их элиситорная активность понижалась [21].

Различия в биологической активности отмечены и у высокомолекулярных хитозанов. Так, молекулярная масса хитозана играла роль в индукции отложения каллозы клетками Catharanthus roseus, где заметные её количества образовывались при использовании хитозана не менее 100 кДа, а максимальное отложение каллозы наблюдалось при использовании хитозана массой 1000 кДа и больше [32]. Препараты хитозана с молекулярной массой 3, 8 и 50 кДа эффективно подавляли образование видимых местных некрозов при заражении растений фасоли вирусом мозаики люцерны. При этом противовирусная активность хитозана возрастала с увеличением его молекулярной массы [34]. В целом аналогичная зависимость была обнаружена при изучении влияния хитозана на системную инфекцию вируса Х картофеля в растениях картофеля. При заражении растений через сутки после обработки хитозан с молекулярной массой 120 кДа обладал более высокой противовирусной активностью, чем хитозаны с молекулярной массой 3 и 36 кДа. Таким образом, доля растений с индуцированной устойчивостью прямо зависела от молекулярной массы хитозана, использованного для их обработки [43].

Вместе с тем показано, что деполимеризация высокомолекулярного хито-зана хитиназами гриба Aspergillus fumigatus значительно повышала его противовирусную активность при заражении растений табака ВТМ [44, 45]. В ряду хитозанов с молекулярными массами 50, 3.5, 2.7 и 1.3 кДа наибольшей элиси-торной активностью на растениях риса обладали самые низкомолекулярные. Это проявлялось как в величине индуцированного хитозаном окислительного взрыва, активности фенилаланин-аммоний-лиазы и хитиназы, уровня экспрессии генов хитиназы и глюканазы, так и в степени защиты проростков риса от патогенного гриба Magnaporthe grisea [46]. В клубнях картофеля хитозаны с молекулярной массой 5, 24 и 200 кДа индуцировали глюканазную и хитиназ-ную активности, образование ингибиторов протеаз и фитоалексина, при этом максимальный эффект достигался при использовании самого низкомолекулярного образца, в то время как хитозан с массой 200 кДа был наименее активен [5].

При этом следует учесть, что элиситорная активность хитозана по всей видимости опосредована его влиянием на растительный организм и зависит от вида растения. Особенно ярко это продемонстрировано в опытах по противовирусной активности хитозана, в которых было отмечено, что обработка растений хитозаном препятствовала заражению их вирусами, существенно различающимися по структуре вирусной частицы и механизмам экспрессии генома, а также вироидом веретеновидности клубней картофеля [6]. Возможно, именно неспецифическим характером действия глюкозаминных остатков, в результате которого у растений развивается неспецифическая устойчивость, и объясняется то, что хитозан подавляет инфекцию независимо от вида вируса.

Приведённые выше данные показывают, что соотношение К-ацетилглюко-замина и глюкозамина в хитозановом полимере, а также его молекулярная масса играют большую роль в проявлении хитозаном биологической активности. Однако эти же данные не лишены и противоречий, указывающих порою на прямо противоположные результаты о связи между химическими характеристиками хитозана и элиситорной активностью. Такая ситуация может возникнуть в результате недостаточной полноты физико-химических характеристик хитозанов, использующихся в биологических опытах.

Несложно получить и проконтролировать качество олигомеров К-ацетил-глюкозамина и глюкозамина. Следовательно, исследования биологической активности с применением олигомеров хитина или деацетилированного хитозана обладают высоким уровнем достоверности результатов. Это подтверждается многочисленными данными об элиситорной активности, которая имеет чёткую зависимость для каждого олигомера определённой степени полимеризации [13, 18, 24]. Иначе обстоит дело с более высокомолекулярным хитозаном. Для определения СА хитозанов, используемых в биологических экспериментах, применяются различные методы: кондуктометрическое титрование [47, 48], ядер-номагнитный резонанс [18], инфракрасное излучение [32]. При этом следует учесть, что различные методы определения СА могут дать различные результаты для одного и того же образца хитозана [49].

Так или иначе, указываемая СА образцов хитозана является усреднённой величиной, которая показывает только молярное соотношение К-ацетилглюко-замина и глюкозамина в полимере. В этом случае не учитывается то, что ацети-лированные остатки способны располагаться вдоль полимерной цепи определённым образом, что может сказаться на особенностях взаимодействия хитоза-на с растительной клеткой и проявлении им биологической активности (рис. 3).

Характер расположения ацетилированных остатков в хитозане будет зависеть прежде всего от степени кристалличности или соотношения кристаллических и аморфных областей хитина, используемого в получении хитозана методом щелочного деацетилирования, так как реакция деацетилирования хитина легче протекает именно в аморфных областях. Так, в-хитин обладает большей аморфностью по сравнению с а-хитином. Поэтому в-хитин проявляет большую реакционноспособность, способность к гидролизу и растворимость. Щелочное деацетилирование в-хитина происходит практически как в гомогенных

Рис. 3. Влияние кристалличности хитина на структуру хитозана и возможное взаимодействие с растительной клеткой олигомеров после ферментативного гидролиза. а -кристаллическая область хитина; Ь - аморфная область хитина; с - гетерогенное деаце-тилирование; ё - гомогенное деацетилирование; е - ферментативный гидролиз; /- участок молекулы хитозана, взаимодействующий с хитиновым рецептором; g - участок молекулы хитозана возможного взаимодействия с хитиновым рецептором; к - участок молекулы хитозана, взаимодействующий с ЦПМ или ДНК

условиях, поскольку его аморфная структура позволяет взаимодействовать щёлочи со всеми областями полимера. Гомогенному деацетилированию подвергаются и аморфные области а-хитина [50, 51]. Однако большая величина кристалличности приводит к тому, что хитозан, полученный из а-хитина, насыщен молекулами, которые несут блоки, состоящие из К-ацетилглюкозамина. А длина блоков, очевидно, будет зависеть от размера и расположения аморфных областей хитина. Всё это влечёт за собой различия в растворимости и других

свойствах двух образцов хитозана, имеющих одинаковые средневесовую массу, степень полидисперсности и СА, но полученых путём гомогенного и гетерогенного деацетилирований или из в- и а-хитина. Таким образом, особенности кристалличности и способы деацетилирования хитина будут определять характер распределения ацетилированных остатков в полимерной цепи хитозана [52].

Можно предположить, что остатки К-ацетилглюкозамина, находящиеся в блоках, будут обладать сродством к хитиновым рецепторам растений, а имеющиеся в молекуле остатки глюкозамина будут обеспечивать дополнительную связь молекулы хитозана с близлежащей поверхностью растительной клетки за счёт электростатического взаимодействия (рис. 2). Такое двойное взаимодействие, возможно, позволит повысить сродство блоков к рецепторам в сравнении с небольшими олигомерами хитина размерам которых эти блоки соответствуют. Возможно, что определённой функциональной специфичностью обладают и некоторые короткие последовательные звенья, состоящие из К-ацетилглюкоза-мина и глюкозамина, микроструктурная композиция которых имеет определенный состав. Использование в биологических экспериментах образцов хито-зана с определённым расположением ацетилированных остатков может помочь в установлении особенностей взаимодействия элиситора с растительным организмом и проявлении им биологической активности.

Успешные опыты синтеза олигомеров определённой структуры были продемонстрированы в [53]. Предварительно полученные химическим синтезом димеры, состоящие из К-ацетилглюкозамина и глюкозамина, благодаря ферментативной полимеризации образовывали олигомеры со СП до 10-12. Полученные таким путём олигомеры хитозана имеют, во-первых, строго определённую, а во-вторых, очень интересную структуру, где ацетильные группы располагаются по одну сторону молекулы, а аминогруппы, способные нести положительный заряд, на противоположной, так как каждое звено полимера повёрнуто друг к другу на 180°. Возможно, такие молекулы могут эффективно взаимодействовать как с хитиновыми рецепторами той стороной, где расположены ацетилированные звенья, так и с отрицательно заряженными ЦПМ и ДНК противоположной стороной, где имеются свободные аминогруппы (рис. 4). Была высказана версия и относительно подобного расположения заряженных и незаряженных аминогрупп, когда на определённых участках заряженные аминогруппы могут оказаться преимущественно по одну сторону полимерной цепи хитозана [54]. Таким образом, образуется своеобразная структура полузаряженного полимера, одна сторона плоскости пиранозных колец которого заряжена положительно, другая же сторона - практически неионогенна.

Получение хитозана с определённым и более сложным по последовательности чередованием остатков К-ацетилглюкозамина и глюкозамина представляется задачей более сложной, но отчасти выполнимой.

Давно показано, что ферменты, расщепляющие хитозан, производят разрыв в его полимерной цепи преимущественно в области, обладающей определённой последовательностью ацетилированных и деацетилированных остатков полимера. Таким образом, получаемые в результате ферментативной деполимеризации олигомеры хитозана несут на редуцирующем и нередуцирующем концах молекул в основном одну и ту же последовательность остатков К-ацетилглюко

И

,-А-^

а адззд^Ъ

^-v—'

il

'-.-г

я

С:

%ft£b ЭДзЙэ

о - ï © - d

Рис. 4. Олигомеры хитозана с фиксированной структурой, полученные путём ферментативного синтеза (А) и ферментативной деполимеризации (В, С). a - участок молекулы, возможного взаимодействия с ЦПМ и ДНК; b - участок молекулы, возможного взаимодействия с хитиновым рецептором; c - остаток N-ацетилглюкозамина; d - остаток глюкозамина

замина и глюкозамина [55-57]. Последовательность расположения остатков будет зависеть от вида фермента и механизма расщепления им цепи хитозана. Было показано, что в результате деполимеризации хитозана ферментами гриба Pénicillium олигомеры со степенью полимеризации до 12 преимущественно имели распределение ацетилированных остатков в молекуле, соответствующее формуле (D-X-Y)3-D-A-A, где D соответствует глюкозамину, A - N-ацетил-глюкозамину, X и Y - глюкозамину либо N-ацетилглюкозамину при условии, что X Ф Y [58] (рис. 4). Как видно из рисунка, тот и другой типы молекул имеют достаточное количество глюкозаминных звеньев для взаимодействия с отрицательно заряженными компонентами растительных клеток, тогда как только один тип структуры, образующийся после ферментативного гидролиза, обладает тремя ацетилированными звеньями из четырёх на редуцирующем конце олигомера хитозана. Возможно, такое расположение ацетилированных остатков делает взаимодействие этого участка молекулы с хитиновым рецептором более вероятным, что может обусловить различие в биологической активности этих структур хитозана несмотря на их полное сходство по степени полимеризации и степени ацетилирования. Можно предположить, что использование ферментов других видов микроорганизмов, которые обладают своими особенностями расщепления хитозанового полимера, позволит получить низкомолекулярный хитозан и олигомеры иной композиции ацетилированных и деацети-лированных звеньев в полимерной цепи. Таким образом, это даст новые воз-

можности в установлении взаимосвязи между фиксированной микроструктурой хитозана и его элиситорной активностю.

Определённая последовательность остатков N-ацетилглюкозамина и глю-козамина в случае ферментативной деполимеризации будет, очевидно, характерна только для концевых областей молекул хитозана. Однако структура концевых частей молекул может отвечать за особенности проявления хитозаном своей биологической активности. Так, сильным антивирусным действием обладали дезаминированные производные хитозана [33, 34]. Дезаминирование происходит при разрыве полимерной цепи хитозана под действием азотистой кислоты, когда в месте разрыва образовывается новая структура 2,5-ангидро-маннозы. Предполагается, что наличием именно этого терминального остатка и определяется повышенная активность таких производных [59]. Было отмечено, что структура терминального сахарного остатка влияет на деполимеризацию ЦПМ клеток томата. Восстановление с помощью NaBH4 редуцирующего сахарного остатка у олигомера хитозана со СП 4 (но не со СП 5) полностью лишало его элиситорной активности [12]. Восстановленный таким же образом низкомолекулярный хитозан 5-20 кДа обладал меньшим защитным действием на клубнях картофеля против фитофторы (данные не представлены). Подобным образом полностью теряли элиситорную активность при модификации редуцирующего остатка и NOD-факторы - производные хитинового олигомера со СП 4, но не NOD-факторы - производные хитинового олигомера со СП 5 [60].

Важным параметром для проявления хитозаном биологической активности является его молекулярная масса. Как и у всякого другого полимера, данная характеристика у хитозана может сильно варьировать: от 1-2 кДа у олигомеров и достигая сотен кДа у высокомолекулярных форм.

В биологических экспериментах часто применяют хитозан, молекулярная масса которого определена вискозиметрическим методом. Поскольку хитозан существует в виде смеси разных по длине молекул, то молекулярная масса, определённая таким образом, является усреднённой величиной и не даёт представления о молекулярно-массовом распределении хитозановых молекул в образце. Поэтому, чем выше величина полидисперсности образца, тем труднее становится интерпретировать экспериментальные данные, потому что биологический эффект хитозана может определяться минорной долей молекул с массой, значительно отличающейся от средней для данного образца величины.

Важность получения низкодисперсных образцов хитозана продемонстрирована при изучении его химических свойств [61-63]. В одних случаях свойства хитозанов с различной молекулярной массой могут различаться незначительно, а в других разница может быть существенной. Так, при изучении комплексооб-разования плазмидной ДНК с низкодисперсными хитозанами со СП 10-14, 1521, 22-35, 36-50 и полидисперсными со средней СП 18 и 25 было показано, что все образы образовывали комплекс с нуклеиновой кислотой. Однако низкодисперсные образцы со СП 10-21 плохо защищали нуклеиновую кислоту от расщепления её ДНКазами. В опытах in vitro по доставке ДНК в животные клетки наиболее эффективными были высокополидисперсные образцы и образец со СП 36-50. Тем не менее в опытах по доставке плазмиды in vivo эффективность высокополидисперсных образцов и образца со СП 10-14 была невысокой, а

самым лучшим оказался низкодисперсный хитозан со СП 15-21 [64, 65]. Такая картина объясняется оптимальным характером комплексообразования хитозана с нуклеиновой кислотой, который обеспечивает её сохранность от повреждающих действий и в то же время обеспечивает необходимый уровень декомплек-сирования компонентов при использовании образца со СП 15-21.

В нашей работе было осуществлено фракционирование высокополидис-персного образца хитозана с помощью последовательной ультрафильтрации через мембраны [66]. Полученные четыре фракции хитозана обладали меньшей полидисперсностью по сравнению с исходным и различались по своей элиси-торной активности. Так, две более низкомолекулярные фракции более эффективно, чем исходный, подавляли инфекцию вируса мягкой мозаики фасоли в растениях Phaseolus vulgaris L. Две более высокомолекулярные фракции менее эффективно по сравнению с исходным защищали растения от вируса. Таким образом, был сделан вывод, что степень противовирусной устойчивости, индуцированной хитозаном, возрастала с уменьшением его молекулярной массы. А противовирусная активность исходного хитозана определяется прежде всего входящими в его состав олигомерами со СП 6-11, так как мономеры - глюкозамин и N-ацетилглюкозамин - противовирусной активностью не обладали [66].

Полученные результаты подтверждают необходимость более грамотного подхода к оценке влияния физико-химических свойств хитозана на его элиси-торную и иную биологическую активности. Требуется тщательный анализ хи-тозана, используемого в биохимических экспериментах, применение хромато-графических и иных методов исследований для определения его средневесовой и среднечисловой молекулярной массы, степени полидисперсности, учёта особенностей его молекулярно-массового распределения при интерпритации полученных данных [67]. Самым перспективным подходом для изучения роли молекулярной массы в биологической активности является, несомненно, фракционирование. Использование препаративной хроматографии, дробного осаждения или растворения, фракционирования посредством ультрафильтрации на мембранах должно помочь выяснению роли молекулярных характеристик хи-тозана в проявлении им элиситрных свойств.

3. Выводы

Таким образом, хитозан - это группа веществ, которые различаются по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетилированных остатков вдоль полимерной цепи. Подобная структурная неоднородность затрудняет идентификацию и определение количественных соотношений различных молекул в смеси, а также установление более точных связей между их физико-химическими характеристиками и биологической активностью. Однако это позволяет расширить рамки соотношения структура/свойства хитозанового полимера, направить исследования на поиск и получение более эффективных форм хитозана, точнее определить особенности взаимодействия хитозана с живыми организмами на клеточном и молекулярном уровнях в проявлении им той или иной биологической активности.

Summary

S.N. Kulikov, V.P. Varlamov. The Role of Chitosan Chemical Structure in Its Elicitor Activity.

The induction of nonspecific resistance in plants by chitosan elicitor is a promising method for plant protection against fungal, bacterial and viral diseases. Biological properties of chitosan depend on its structural parameters, such as molecular weight, acetylation degree, and the distribution of the two kinds of residues constituting the chain. This review focuses on relationship of chitosan chemical structure with its elicitor activity and novel trends in this field of research.

Key words: chitosan, elicitor, chemical structure, degree of acetylation, degree of polymerization.

Литература

1. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева О.Ю., Варламов В.П. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. - 2004. -Т. 40, № 3. - С. 301-306.

2. Guo Z., Xing R., Liu S., Zhong Z., Ji X., Wang., Li P. The influence of molecular weight of quaternized chitosan on antifungal activity // Carbohydr. Polym. - 1997. - V. 71, No 4. - P. 694-697.

3. Алексеева Л.Г., Свирщевская Е.В., Ильина А.В., Лопатин С.А., Шевченко М.А., Варламов В.П. Изучение адъювантных свойств низкомолекулярных хитозанов // Совр. пробл. дерматовенерол. иммунол. врачебн. косметол. - 2006. - Т. 1. - С. 45-51.

4. Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А., Банникова Г.Е., Варламов В.П. Лечебно-профилактические свойства низкомолекулярного хитозана при экспериментальном лучевом поражении // Радиац. биол. радиоэкол. - 2004. - Т. 44, № 5. -С. 547-549.

5. Васюкова Н.И., Зиновьева С.В., Ильинская Л.И., Переход Е.А., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Ильина А.В., Варламов В.П. Модулирование болезнеустойчивости растений с помощью водорастворимого хитозана // Прикл. биохим. и микробиол. -

2001. - Т. 37, № 1. - С. 115-122.

6. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана // Прикл. биохим. и микробиол. -

2002. - Т. 38, № 1. - С. 5-13.

7. Obara N., Hasegawa M., Kodama O. Induced volatiles in elicitor-treated and rice blast fungus-inoculated rice leaves // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2002. - V. 66, No 12. -P. 2549-2559.

8. O-зерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Зиновьева С.В. Хитозан как элиситор индуцированной устойчивости растений // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука, 2002. - С. 339-345.

9. Куликов С.Н., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев С.В., Варламов В.П. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибными болезнями картофеля // Прикл. биохим. и микробиол. - 2006. - Т. 42, № 1. - C. 86-92.

10. Shibuya N., Kaku H., Kuchitsu K., Maliarik M.J. Identification of a novel high-affinity binding site for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the membrane fraction from suspension-cultured rice cells // FEBS Lett. - 1993. - V. 329, No 1-2. - P. 75-78.

11. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. - 1997. - V. 12, No 2. - P. 347-356.

12. Baureithel K., Felix G., Boller T. Specific, high affinity binding of chitin fragments to tomato cells and membranes // J. Biol. Chem. - 1994. - V. 269, No 27. - P. 17931-17938.

13. Day R.B., Okada M., Ito Y., Tsukada K., Zaghouani H., Shibuya N., Stacey G. Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane // Plant Physiol. - 2001. -V. 126, No 3. - P. 1162-1173.

14. Okada M., Matsumura M., Ito Y., Shibuya N. High-affinity binding proteins for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membranes from wheat, barley and carrot cells: conserved presence and correlation with the responsiveness to the elicitor // Plant Cell Physiol. - 2002. - V. 43, No 5. - P. 505-512.

15. Stacey G., Shibuya N. Chitin recognition in rice and legumes // Plant and Soil. - 1997. -V. 194. - P. 161-169.

16. Shibuya N., Ebisu N., Kamada Y., Kaku H., Cohn J., Ito Y. Localization and binding characteristics of a high-affinity binding site for N-acetylchito-oligosaccharide elicitor in the plasma membrane from suspension-cultured rice cells suggest a role as a receptor for the elicitor signal at the cell surface // Plant Cell Physiol. - 1996. - V. 37. - P. 894-898.

17. Saito M., Chikazawa T., Matsuoka H., Nishizawa Y., Shibuya N. Elicitor action via cell membrane of a cultured rice cell demonstrated by the single-cell transient assay // J. Biotechnol. - 2000. - V. 76, No 2-3. - P. 227-232.

18. Vander P., Varum K.M., Domard A., Eddine El Gueddari N., Moerschbacher B.M. Comparison of the ability of partially N-acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance reactions in wheat leaves // Plant Physiol. - 1998. - V. 118, No 4. -P. 1353-1359.

19. Yamada A., Shibuya N., Kodama O., Akatsuka T. Induction of phytoalexin formation in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides // Biosci. Biotech. Bio-chem. - 1993. - V. 57, No 3. - P. 405-409.

20. Bohland C., Balkenhohl T., Loers G., Feussner I., Grambow H.J. Differential induction of lipoxygenase isoforms in wheat upon treatment with rust fungus elicitor, chitin oligosaccharides, chitosan, and methyl jasmonate // Plant Physiol. - 1997. - V. 114. - P. 679685.

21. Koga D., Hirata T., Sueshige N., Tanaka S., Ide A. Induction patterns of chitinases in yam callus by inoculation with autoclaved Fusarium oxysporum, ethylene, and chitin and chito-san oligosaccharides // Biosci. Biotech. Biochem. - 1992. - V. 56, No 2. - P. 280-285.

22. Inui H., Yamaguchi Y., Hirano S. Elicitor actions of N-acetylchitooligosaccharides and laminarioligosaccharides for chitinase and L-phenylalanine ammonia-lyase induction in rice suspension culture // Biosci. Biotech. Biochem. - 1997. - V. 61, No 6. - P. 975-978.

23. Minami E., Kuchitsu K., He D.Y., Kouchi H., Midoh N., Ohtsuki Y., Shibuya N. Two novel genes rapidly and transiently activated in suspension-cultured rice cells by treatment with N-acetylchitoheptaose, a biotic elicitor for phytoalexin production // Plant Cell Physiol. - 1996. - V. 37, No 4. - P. 563-567.

24. Khan W., Prithiviraj B., Smith D.L. Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves // J. Plant Physiol. - 2003. - V. 160, No 8. - P. 859-863.

25. Hadwiger L.A., Beckman J.M. Chitosan as a component of Pea-Fusarium interactions // Plant Physiol. - 1980. - V. 66. - P. 205-211.

26. Young D.H., Kauss H. Release of calcium from suspension-cultured Glycine max cells by chitosan, other polycations, and polyamines in relation to effects on membrane permeability // Plant Physiol. - 1983. - V. 73. - P. 698-702.

27. Hadwiger L.A., Beckman J.M., Adams M.J. Localization of fungal components in the Pea-Fusarium interaction detected immunochemically with anti-chitosan and anti-fungal cell wall antisera // Plant Physiol. - 1981. - V. 67. - P. 170-175.

28. Choi J.J., Klosterman S.J., Hadwiger L.A. A comparison of the effects of DNA-damaging agents and biotic elicitors on the induction of plant defense genes, nuclear distortion, and cell death // Plant Physiol. - 2001. - V. 125. - P. 752-762.

29. Akiyama K., Kawazu K., Kobayashi A. A novel method for chemo-enzymatic synthesis of elicitor-active chitosan oligomers and partially N-deacetylated chitin oligomers using N-acylated chitotrioses as substrates in a lysozyme-catalyzed transglycosylation reaction system // Carbohydr. Research. - 1995. - V. 279. - P. 151-160.

30. Kendra D.F., Hadwiger L.A. Characterisation of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum // Exp. Mycol. - 1984. - V. 8. - P. 276-281.

31. Hadwiger L.A., Ogawa T., Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthesized oligomers // Mol. Plant Microbe Interact. - 1994. - V. 7, No 4. - P. 531-533.

32. Kauss H., Jeblick W., Domard A. The degrees of polymerization and N-acetylation of chitosan determine its ability to elicit callose formation in suspension cells and protoplast of Catharanthus roseus // Planta. - 1989. - V. 178. - P. 385-392.

33. Pospieszny H. Inhibition of tobacco mosaic virus (TMV) infection by chitosan // Phyto-path. Polonica. - 1995. - V. 22, No 10. - Р. 69-74.

34. Чирков С.Н., Сургучёва Н.А., Гамзазаде А.И., Поспешны Г. Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений // Докл. РАН. - 1998. - Т. 360, № 2. - C. 271-273.

35. Kuchitsu K., Kikuyama M., Shibuya N. N-acetylchitooligosaccharides, biotic elicitor for phytoalexin production, induce transien membrane depolarization in suspension-cultured rice cells // Protoplasma. - 1993. - V. 174. - P. 79-81.

36. Kuchitsu K., Kosaka H., Shiga T., Shibuya N. EPR evidence for generation of hydroxyl radical triggered by N-acetylchitooligosaccharide elicitor and a protein phosphatase inhibitor in suspension-cultured rice cells // Protoplasma. - 1995. - V. 188. - P. 138-142.

37. Kukiyama M., Kuchitsu K., Shibuya N. Membrane depolarization induced by N-acetyl-chitooligosaccharide elicitor in suspension-cultured rice cells // Plant Cell Physiol. -1997. - V. 38, No 8. - P. 902-909.

38. Felix G., Baureithel K., Boller T. Desensitization of the perception system for chitin fragments in tomato cells // Plant Physiol. - 1998. - V. 117, No 2. - P. 643-650.

39. Salzer P., Hebe G., Hager A. Cleavage of chitinous elicitors from the ectomycorrhizal fungus hebeloma crustuliniforme by host chitinases prevents induction of K+ and Cl- release, extracellular alkalinization and H2O2 synthesis of Picea abies cells // Planta. -1997. - V. 203. - P. 470-479.

40. Кашулин П.А., Мерзляк М.Н., Гужова Н.В., Максимова Н.И., Решетникова И.В., Гусев М.В., Шевырева В.В. Исследование влияния олигомера N-ацетилглюкозами-на, арахидоновой и леноленовой кислот на активацию свободнорадикального метаболизма в клетках суспензионной культуры картофеля // Вестн. Моск. ун-та. -1996. - Т. 16, № 4. - С. 37-42.

41. Wan J., Zhang S., Stacey G. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin // Mol. Plant Pathol. - 2004. - V. 5, No 2. - P. 125-135.

42. Roby D., Gadelle A., Toppan A. Chitin oligosaccharides as elicitors of chitinase activity in melon plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1987. - V. 143, No 3. - P. 885-892.

43. Чирков С.Н., Ильина А.В., Сургучёва Н.А., Летунова Е.В., Варицев Ю.А., Татари-нова Н.Ю., Варламов В.П. Влияние хитозана на системную вирусную инфекцию и некоторые защитные реакции в растениях картофеля // Физиол. аст. - 2001. - Т. 48, Вып. 6. - С. 890-896.

44. Pospieszny H., Struszczyk H., Cajza M. Biological activity of Aspergillus-degraded chi-tosan // Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. - Ancona, Italy: Atec Edizioni, 1996. - V. 2. - P. 385-389.

45. StruszczykM.H., Pospieszny H., Schanzenbach D., Peter M.G. Biodegradation of Chitosa // Struszchyk H. (ed.) Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives: Proc. 4th Workshop of the Polish Chitin Society, Poznan, Oct. 16-17, 1997. - Lodz: Polish Chitin Society, 1998. - V. 5. - P. 65-77.

46. Lin W., Hu X., Zhang W., Rogers W.J., Cai W. Hydrogen peroxide mediates defence responses induced by chitosans of different molecular weights in rice // J. Plant Physiol. -

2005. - V. 162, No 8. - Р. 937-944.

47. Nemtsev S.V., Il'ina A.V., Varlamov V.P., Ozeretskovskaya O.L., Vasyukova N.I., Chirkov S.N., Skryabin K.G. Stimulation of plant growth and induction of potato resistance to diseases by low molecular weight chitosan // Bull. Polish. Acad. Sci. - 2003. -V. 51, No 3. - P. 243-249.

48. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Чаленко., Озерецковская О.Л. Изменение активности каталазы клубней картофеля под действием иммунорегуляторов // Докл. РАН. -2004. - Т. 395, № 5. - С. 712-714.

49. Khan T.A., Peh K.K., Ch'ng H.S. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods // J. Pharm. Pharm. Sci. - 2002. - V. 5, No 3. -P. 205-212.

50. Lamarque G., Viton C., Domard A. Comparative study of the first heterogeneous deacetylation of a- and ß-chitins in a multistep process // Biomacromol. - 2004. - V. 5, No 3. -P. 992-1001.

51. Lamarque G., Viton C., Domard A. Comparative study of the second and third heterogeneous deacetylations of a- and ß-chitins in a multistep process // Biomacromol. - 2004. -V. 5, No 5. - P. 1899-1907.

52. Ng C.-H., Hein S., Ogawa K., Chandrkrachang S., Stevens W.F. Distribution of D-gluco-samine moieties in heterogeneously deacetylated cuttlefish chitin // Carbohydr. Polym. -2007. - V. 69, No 2. - P. 382-390.

53. Makino A., Kurosaki K., Ohmae M., Kobayashi S. Chitinase-catalyzed synthesis of alter-natingly N-deacetylated chitin: a chitin-chitosan hybrid polysaccharide // Biomacromol. -

2006. - V. 7, No 3. - P. 950-957.

54. Гамзазаде А.И. Структурная неоднородность как фактор изменчивости свойств хитина и хитозана // // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука, 2002. - С. 112118.

55. Varum K.M., Holme H.K., Izume M., Stokke B.T., Smidsrod O. Determination of enzymatic hydrolysis specificity of partially N-acetylated chitosans // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - V. 1291, No 1. - P. 5-15.

56. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydr. Res. - 1999. - V. 320, No 5. - P. 257-260.

57. Lin H., Wang H., Xue C., Ye M. Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain // Enzyme Microb. Technol. - 2002. - V. 31, No 5. - P. 588-592.

58. Bahrke S., Einarsson J.M., Gislason J., Haebel S., Letzel M.C., Peter-Katalinic J., Peter M.G. Sequence analysis of chitooligosaccharides by matrix-assisted laser desorption ionization postsource decay mass spectrometry // Biomacromol. - 2002. - V. 3, No 4. -P. 696-704.

59. Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана// Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука, 2002. - С. 327-338.

60. Stokkermans T.J., Ikeshita S., Cohn J., Carlson R.W., Stacey G., Ogawa T., Peters N.K. Structural requirements of synthetic and natural product lipo-chitin oligosaccharides for induction of nodule primordia on Glycine soja // Plant Physiol. - 1995. - V. 108, No 4. -P. 1587-1595.

61. Schatz C., Viton C., Delair T., Pichot C., Domard A. Typical physicochemical behaviors of chitosan in aqueous solution // Biomacromol. - 2003. - V. 4, No 3. - P. 641-648.

62. Sorlier P, Rochas C, Morfin I, Viton C, Domard A. Light scattering studies of the solution properties of chitosans of varying degrees of acetylation // Biomacromol. - 2003 -V. 4, No 4. - P. 1034-1040.

63. Lamarque G., Lucas J.-M., Viton C., Domard A. Physicochemical behavior of homogeneous series of acetylated chitosans in aqueous solution: role of various structural parameters // Biomacromol. - 2005. - V. 6, No 1. - P. 131-142.

64. Koping-Hoggard M., Mel'nikova Y.S., Varum K.M., Lindman B., Artursson P. Relationship between the physical shape and the efficiency of oligomeric chitosan as a gene delivery system in vitro and in vivo // J. Gene Med. - 2003. - V. 5, No 2. - P. 130-141.

65. Koping-HoggardM., Varum K.M., Issa M., Danielsen S., Christensen B.E., Stokke B.T., Artursson P. Improved chitosan-mediated gene delivery based on easily dissociated chitosan polyplexes of highly defined chitosan oligomers // Gene Ther. - 2004. - V. 11, No 19. - P. 1441-1452.

66. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина А.В., Лопатин С.А, Варламов В.П. Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях // Прикл. биохим. и микробиол. - 2006. - Т. 42, № 2. - C. 224-228.

67. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Хайруллин Р.З. Роль структуры в биологической активности хитозана // Вест. Казан. технол. ун-та. - 2007. - № 6. - С.10-15.

Поступила в редакцию 22.05.06

Куликов Сергей Николаевич - кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры биохимии Казанского государственного университета. E-mail: kuliks@yandex.ru

Варламов Валерий Петрович - доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва. E-mail: varlamov@biengi.ac.ru