ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ
INFLUENZA VIRUS STRAIN A/17/Anui/2013/61 (H7N9) FOR PRODUCTION OF LIVE INTRANASAL INFLUENZA VACCINE

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении. Создан вакцинный штамм вируса гриппа (Ortomyxoviridae, род Influenza) подтипа A(H7N9) - А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) для профилактики потенциально-пандемического гриппа подтипа A(H7N9) среди взрослых и детей в случае его распространения в человеческой популяции.
В начале 2013 г. впервые были зарегистрированы случаи заражения людей новым вирусом гриппа птиц подтипа A(H7N9), и по данным на ноябрь 2013 г. подтверждено инфицирование 139 людей, включая 45 смертельных случаев. Опасность данных вирусов заключается в том, что они вызывают тяжелые респираторные заболевания у млекопитающих, и при этом являются низкопатогенными для птиц, что способствует их персистенции в популяции птиц. Кроме того, вирусы A(H7N9) характеризуются наличием в геноме множественных маркеров адаптации к клеткам млекопитающих, что создает предпосылки для возникновения новой пандемии A(H7N9). Для того чтобы избежать разрушительных последствий новой пандемии, необходимо иметь в наличии вакцинные штаммы A(H7N9) для своевременной вакцинации наиболее уязвимых групп населения.
Применяемые в настоящее время для профилактики сезонного гриппа А вакцины подтипов A(H1N1) и A(H3N2) не могут вызывать выраженную защитную реакцию в случае возникновения пандемической ситуации, вызванной широким распространением вирусов подтипа A(H7N9), к которым у населения нет иммунитета.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), используя в качестве источника поверхностных антигенов вирус гриппа птиц А/Ануи/1/2013 (H7N9). Штамм А/Ануи/1/2013 (H7N9), выделенный от человека во время вспышки гриппа H7N9 в Китае в 2013 году, был получен из коллекции Центра по контролю и профилактике заболеваний США (CDC ID №2013759189).
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - температурочувствительный, холодоадаптированный штамм вируса гриппа, используемый для получения живых гриппозных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации, в результате чего образуются реассортанты с вакцинной формулой генома 6:2 - 6 генов, кодирующих внутренние белки вириона (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), наследуются от безвредного донора аттенуации, а два поверхностных антигена (гемагглютинин и нейраминидаза) наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма. Известен вакцинный штамм А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) [Патент №2183672, опубл. 20.06.02], а также вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) [Патент №2319744, опубл. 19.04.06] на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Прототипом полученного вакцинного штамма подтипа A(H7N9) является вакцинный штамм подтипа A(H7N3) - А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) для профилактики гриппа в случае наступления пандемии, вызванной вирусами гриппа подтипа A(H7N3) [Desheva J, Rudenko L, Rekstin A, Swayne D, Cox N, Klimov A. Development of candidate H7N3 live attenuated cold-adapted influenza vaccine. In: Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza VI, Toronto, Ontario, Canada, June 17-23, 2007 (Ed. Jacqueline M Katz). (2007)]. Однако вирус гриппа подтипа A(H7N9) значительно отличается от вакцинного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) по антигенным свойствам, в результате чего иммунный ответ на вакцинацию вирусом А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) будет неэффективным в отношении нового вируса A(H7N9). Кроме того, один из важных антигенов вируса - гликозилированный белок нейраминидаза (NA) - существенно различается у вирусов H7N3 и H7N9: гомология по их аминокислотному составу не превышает 50% [Gamblin SJ, Skehel JJ. Influenza hemagglutinin and neuraminidase membrane glycoproteins. The Journal of biological chemistry 285(37), 28403-28409 (2010)]. Такие различия в последовательностях N3 и N9 нейраминидаз говорят о низкой вероятности выработки кросс-реактивных антинейраминидазных антител против NA подтипа N9 после вакцинации штаммом А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3).
Реассортантный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) был получен методом генетической реассортации потенциально-пандемического вируса гриппа А/Ануи/1/2013 (H7N9) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации, по методу, описанному ранее [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4, - С.387-395.]. Методом частичного секвенирования участков генов установлено, что вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу от эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9).
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ
Поверхностные антигены вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) гемагглютинин и нейраминидаза - являются идентичными родительскому вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) по результатам их прямого нуклеотидного секвенирования.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВНУТРЕННИХ ГЕНОВ И НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ
Показано, что все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации [Klimov A.I., Сох N.J., Yotov W.V. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus. Virology. 1992:86:795-797], присутствуют в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) (табл.1). Дальнейшее полногеномное секвенирование вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) не выявило дополнительных мутаций во внутренних генах вируса.
Таблица 1.
Наличие аттенуирующих мутаций во внутренних генах реассортантного вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9)
Ген
Нукл.
Л-дт<sup>1</sup>
Л/17<sup>2</sup>
17/Ан<sup>3</sup>
Белок
ак
Л-дт
Л/17
17/Ан
РВ2
1459
G
Т
Т
РВ2
478
Val
Leu
Leu
РВ1
819
G
Т
Т
РВ1
265
Lys
Asn
Asn
1795
G
А
А
591
Val
Ile
Ile
РА
107
Т
С
С
РА
28
Leu
Pro
Pro
1045
G
Т
Т
341
Val
Leu
Leu
М
68
А
G
G
М1
15
Ile
Val
Val
457
Т
G
G
144
Phe
Leu
Leu
NS
798
G
А
А
NS2
100
Met
Ile
Ile
<sup>1</sup> вирус дикого типа, предшественник донора аттенуации: А/Ленинград/134/57 (H2N2);
<sup>2</sup> донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);
<sup>3</sup> реассортантный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9).
АНТИГЕННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА

Изучение антигенных свойств показало, что эпидемический вирус А/Ануи/1/2013 (H7N9) и его холодоадаптированный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) являются антигенно идентичными (взаимодействие с гомологичной типоспецифической сывороткой согласно ФСП ЛСР-002340/09-250309 [Фармакопейная статья предприятия (ФГУП «НПО «Микроген») на Ультрагривак - вакцину гриппозную живую для профилактики гриппа птиц. ФСП ЛСР-002340/09-250309]. Показатели взаимодействия вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительского штамма А/Ануи/1/2013 (H7N9) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9), были идентичными (табл.2).
Таблица 2.
Антигенная специфичность эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9) и вакцинного реассортанта А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) по данным РТГА с крысиной сывороткой
Антиген
Титр крысиной сыворотки в РТГА
К вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9)
Нормальная
А/Ануи/1/2013 (H7N9)
1:320
<1:10
А/17/Ануи/2013/61 (H7N9)
1:320
<1:10
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА
Для оценки генетической стабильности реассортантного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проводили 5 серийных пассажей в 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионах. После пассирования проводили полногеномный сиквенс вируса. Показано, что нуклеотидная последовательность вируса остается неизменной в результате серийных пассажей, что указывает на высокую степень генетической стабильности вакцинного штамма.
РЕПРОДУКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ
В таблице 3 представлены показатели репродукции в развивающихся куриных эмбрионах вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) при разных температурах инкубации. Показано, что реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проявлял высокую репродуктивную активность при оптимальной температуре инкубации 33°С. Подобно донорскому родительскому штамму А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), реассортантный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) приобрел ts- и са-фенотип. Он хорошо репродуцировался при пониженной до 26°С температуре и практически утратил способность к размножению при повышенной до 38-39°С температуры. Родительский вирус А/Ануи/1/2013 (H7N9), напротив, отличался температуроустойчивостью при 39°С и низкой репродукцией при 26°С.
Таблица 3.
Репродуктивная активность вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительских вирусов в развивающихся куриных эмбрионах при различных температурах инкубации
Вирус
Инфекционная активность вирусов при указанной температуре, Ig ЭИД<sub>50</sub>/мл
Фенотип
33°С
38°С
39°С
26°С
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
8.9±0.5
1.8±0.5
≤1.2
7.0±0.2
ts<sup>1</sup>, ca<sup>2</sup>
А/Ануи/1/2013 (H7N9)
9.0±0.6
9.0±0.5
8.2±0.4
3.5±0.8
non-ts, non-са
А/17/Ануи/2013/61 (H7N9)
10.2±0.3
2.2±0.5
1.7±0.4
7.6±0.7
ts, ca
<sup>1</sup> ts, temperature sensitive (температурочувствительный);
<sup>2</sup> ca, cold-adapted (холодоадаптированный).
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
50
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-34°С в течение 48 часов - 10,2 lg ЭИД/мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
50
50
Вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 40°С составляет 8,5 lg ЭИД/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 26°С равна 2,6 lg ЭИД/мл).
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Пример получения вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) представлен в прилагаемом паспорте.
Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского 04.07.2013 года под №2738.
ПАСПОРТ ШТАММА
1
Название штамма:
А/17/Ануи/2013/61
2
ИЭМ идентификационный №:
613/1
3
Серия:
№1
4
Тип/подтип:
H7N9
5
Метод подготовки:
Классическая реассортация в куриных эмбрионах
6
Родительские вирусы
6.1 Эпидемический вирус:
А/Ануи/1/2013 (H7N9); CDC ID# 2013759189
6.2 Донор аттенуации:
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
7
Число пассажей в процессе реассортации:
Е6/Е1 (скрещивание, два селективных пассажа и три клонирования предельными разведениями + накопление)
8
Состав генома:
Гены РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS - от донора аттенуации; гены НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2)
9
Характеристика штамма до лиофилизации
9.1 Оптимальные условия репродукции: 32°С, 48 часов
9.2 Гемагглютинирующая активность: 1:512 с 1.0% куриными эритроцитами
9.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 10.2 lg ЭИД<sub>50</sub>/мл
9.4 ts маркер (температурочувствительность репродукции): 1.7 log<sub>10</sub> ЭИД<sub>50</sub>/мл при 40°С (титр при 40°С, ts фенотип)
9.5 са маркер (холодоустойчивость репродукции): 7.8 log<sub>10</sub> ЭИД<sub>50</sub>/мл при 26°С (титр при 26°С, са фенотип)
10
Характеристика штамма после лиофилизации
10.1 Дата лиофилизации: 20.06.2013
10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл
10.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 9.1 lg ЭИД<sub>50</sub>/МЛ
10.4 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% куриными эритроцитами
11
Антигенная специфичность
11.1 Гемагглютинин: идентичен вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) поданным секвенирования и РТГА
11.2 Нейраминидаза: идентична вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) по данным секвенирования
12
Токсикологические исследования in vivo (острая токсичность):
Не токсичен после внутрибрюшинного заражения мышей
13
Контроль стерильности:
Стерилен (04.07.2013)
Пример. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИННОГО ШТАММА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ХОРЬКАХ
Известно, что наиболее пригодной моделью животных для изучения гриппозных вакцин являются хорьки (Mustela putoris furo). Гриппозная инфекция у этих животных и у человека сходна по симптоматике, течению инфекции, распространению вируса в организме и индукции гуморального иммунного ответа [Langlois I. Viral diseases of ferrets. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2005; 8 (1):139-160.]. Поэтому исследование безвредности и степени аттенуации вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проводили на этих животных.
7
50
50
Хорьков заражали вакцинным штаммом А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) или родительскими вирусами интраназально 0,5 мл аллантоисной жидкости, содержащей 10 50%-ных эмбриональных инфицирующих доз вируса (ЭИД). Репликацию вируса определяли путем титрования носовых смывов и мазков из зева хорьков каждые 2 сутки после заражения. Для титрования вируса использовали культуру клеток MDCK, а титры вируса выражали в 50%-ных тканевых цитопатических дозах (ТЦИД). Также концентрацию вируса определяли в гомогенатах тканей зараженных животных (носовые ходы, трахея, легкие, мозг) на 4 сутки после введения вируса. Вакцинный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), как и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), являлся аттенуированным для хорьков, поскольку размножался только в тканях верхних дыхательных путей, но не в легких или мозге. Вирус дикого типа А/Ануи/1/2013 (H7N9) реплицировался до высоких титров в легких и тканях мозга, что говорит о его вирулентности (табл.4).
Иммуногенность вакцинного штамма оценивали путем определения титров сывороточных антигемагглютинирующих антител через 2 недели после иммунизации. Вакцинный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) был иммуногенным для хорьков: среднегеометрический титр антител в реакции торможения гемагглютинации с гомологичным антигеном достигал значения 127 (табл.5).
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, безвредностью для хорьков, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации, а также иммуногенностью.
Таблица 4.
Репродукция вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительских вирусов в различных органах хорьков
Биоматериал
День после заражения
Титр вируса, lg ТЦИД<sub>50</sub>/мл
А/Ануи/1/2013 (H7N9)
А/Ленинград/ 134/17/57 (H2N2)
А/17/Ануи/2013/61 (H7N9)
Носовые смывы
2
3,9±0,3
1,8±0,8
1,7±0,2
4
2,6±0,9
1,6±0,2
-
6
1,6±0,3
1,6±0,4
-
8
-*
2,1±0,0
-
10
-
-
-
Мазок из зева
2
4,0±0,3
2,9±0,4
4,3±0,8
4
5,0±0,1
2,2±0,1
-
6
4,2±0,5
3,7±0,9
-
8
2,1±0,1
2,9±0,1
-
10
2,1±0,0
3,0±0,4
-
Носовые ходы
4
7,3±0,1
3,9±0,3
3,2±1,2
Трахея
4
5,6±0,3
-
*
Легкие
4
5,2±0,8
-
-
Мозг
4
4,4±0,8
-
-
* вирус не обнаружен
Таблица 5.
Иммуногенность вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительских вирусов в эксперименте на хорьках
Штамм
Среднегеометрические титры антител с антигеном
А/Ануи/1/2013 (H7N9)
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
А/Ануи/1/2013 (H7N9)
403
5
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
5
32
А/17/Ануи/2013/61 (H7N9)
127
5
Характеристики полученного вакцинного штамма соответствуют требованиям Фармакопейной статьи ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения у взрослых и детей, поэтому заявляемый штамм обладает, помимо новизны и изобретательского уровня, техническим результатом, т.е. пригоден для производства живой гриппозной вакцины.