УЛУЧШЕННАЯ НАПРАВЛЕННАЯ ЗАМЕНА НУКЛЕОТИДОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ LNA

1. Олигонуклеотид для направленного изменения последовательности дуплексной ДНК, содержащей первую последовательность ДНК и вторую последовательность ДНК, которая комплементарна первой последовательности ДНК, где олигонуклеотид содержит домен, способный гибридизироваться с первой последовательностью ДНК, где домен содержит по меньшей мере одно ошибочное спаривание по отношению к первой последовательности ДНК, и где олигонуклеотид содержит по меньшей мере один участок, который содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, обладающий большей аффинностью связывания по сравнению с природными нуклеотидами A, C, T или G, причем по меньшей мере один модифицированный нуклеотид представляет собой LNA и расположен на расстоянии по меньшей мере одного нуклеотида от по меньшей мере одной точки ошибочного спаривания, и где необязательно олигонуклеотид содержит не более приблизительно 75% модифицированных нуклеотидов LNA.
2. Олигонуклеотид по п.1, в котором по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, предпочтительнее по меньшей мере 4, еще предпочтительнее по меньшей мере 5 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов представляют собой LNA.
3. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором LNA распределены независимо на расстоянии не более 10 нуклеотидов, предпочтительно не более 8 нуклеотидов, предпочтительнее не более 6 нуклеотидов, еще предпочтительнее не более 4, 3 или 2 нуклеотидов с обеих сторон от точки ошибочного спаривания.
4. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором 2, предпочтительнее 3, еще предпочтительнее 4, еще предпочтительнее 5 и наиболее предпочтительно 6 нуклеотидов представляют собой LNA.
5. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором не более 50% модифицированных нуклеотидов олигонуклеотида представляют собой производные LNA, предпочтительнее не более 40%, еще предпочтительнее не более 30%, еще предпочтительнее не более 20% и наиболее предпочтительно не более 10%.
6. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором по меньшей мере один модифицированный нуклеотид независимо расположен с 5'- стороны и/или с 3'-стороны от точки ошибочного спаривания.
7. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором два модифицированных нуклеотида LNA расположены с одной 5'- или 3'-стороны от точки ошибочного спаривания и отделены друг от друга по меньшей мере одной, предпочтительнее по меньшей мере двумя парами оснований.
8. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором нуклеотид в положении ошибочного спаривания не модифицирован.
9. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором по меньшей мере один модифицированный нуклеотид расположен не рядом с точкой ошибочного спаривания, а предпочтительно находится от точки ошибочного спаривания на расстоянии 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов.
10. Олигонуклеотид по п.1 или 2, имеющий длину от 10 до 500 нуклеотидов.
11. Олигонуклеотид по п.1 или 2, в котором модифицированный участок представляет собой домен.
12. Способ направленного изменения последовательности дуплексной акцепторной ДНК, включающий комбинирование последовательности дуплексной акцепторной ДНК с донорным олигонуклеотидом, в котором последовательность дуплексной акцепторной ДНК содержит первую последовательность ДНК и вторую последовательность ДНК, которая комплементарна первой последовательности ДНК, а донорный олигонуклеотид включает домен, который содержит по меньшей мере одно ошибочное спаривание по отношению к последовательности дуплексной акцепторной ДНК, подлежащей изменению, предпочтительно по отношению к первой последовательности ДНК, и в котором олигонуклеотид содержит участок, который содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, обладающий более высокой аффинностью связывания по сравнению с природными A, C, T или G, причем модифицированный нуклеотид прочнее связывается с нуклеотидом в противоположном положении в первой последовательности ДНК по сравнению с природным нуклеотидом, комплементарным нуклеотиду в противоположном положении в первой последовательности ДНК, в присутствии белков, способных осуществлять направленную замену нуклеотидов, где модифицированный олигонуклеотид определен в пп.1-11.
13. Способ по п.12, в котором изменение происходит внутри клетки, предпочтительно выбранной из группы, которая состоит из растительной клетки, клетки гриба, клетки грызуна, клетки примата, клетки человека и дрожжевой клетки.
14. Способ по п.12, в котором белки получены из клеточного экстракта.
15. Способ по п.14, в котором клеточный экстракт выбран из группы, состоящей из экстракта растительных клеток, экстракта клеток грибов, экстракта клеток грызунов, экстракта клеток приматов, экстракта клеток человека и экстракта дрожжевых клеток.
16. Способ по п.12, в котором изменение представляет собой делецию, замещение или инсерцию по меньшей мере одного нуклеотида.
17. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором клетка является эукариотической клеткой, растительной клеткой, нечеловеческой клеткой, клеткой млекопитающего или клеткой человека.
18. Способ по любому из пп.12-16, в котором ДНК-мишень происходит от грибов, бактерий, растений, млекопитающих или человека.
19. Способ по любому из пп.12-16, в котором дуплексная ДНК происходит из геномной ДНК, линейной ДНК, искусственных хромосом млекопитающих, бактериальных искусственных хромосом, дрожжевых искусственных хромосом, растительных искусственных хромосом, ядерной хромосомной ДНК, хромосомной ДНК органелл, эписомной ДНК.
20. Способ по любому из пп.12-16 для изменения клетки, исправления мутации с возвратом к дикому типу, индуцирования мутации, инактивирующей фермент за счет разрушения кодирующей области, модифицирования биологической активности фермента за счет изменения кодирующей области, модифицирования белка за счет разрушения кодирующей области.
21. Применение олигонуклеотида, определенного в пп.1-12, для изменения клетки, для исправления мутации с возвратом к дикому типу, для индуцирования мутации, инактивирующей фермент за счет разрушения кодирующей области, для модифицирования биологической активности фермента за счет изменения кодирующей области, для модифицирования белка за счет разрушения кодирующей области, для репарации ошибок спаривания, для направленного изменения генетического материала (растений), для включения генной мутации, направленной репарации генов и генного нокаута.
22. Применение олигонуклеотида, определенного в пп.1-12, для улучшенного направленного изменения последовательности дуплексной ДНК, где последовательность дуплексной ДНК содержит первую последовательность ДНК и вторую последовательность ДНК, которая комплементарна первой последовательности ДНК, где олигонуклеотид содержит домен, способный гибридизироваться с первой последовательностью ДНК, причем домен содержит по меньшей мере одно ошибочное спаривание по отношению к первой последовательности ДНК, и где олигонуклеотид содержит участок, который содержит модифицированные нуклеотиды, причем модифицированные нуклеотиды обладают более высокой аффинностью связывания по сравнению с природными A, C, T или G, где модифицированные нуклеотиды прочнее связываются с нуклеотидом в противоположном положении в первой последовательности ДНК по сравнению с природным нуклеотидом, комплементарным нуклеотиду в противоположном положении в первой последовательности ДНК, где модифицированный нуклеотид представляет собой LNA.
23. Применение олигонуклеотида, определенного в пп.1-11, в способе создания у растений устойчивости к гербицидам.
24. Набор, содержащий олигонуклеотид, определенный в пп.1-11.
25. Модифицированный генетический материал, полученный способом по пп.12-20.
26. Клетка, содержащая модифицированный генетический материал по п.25.
27. Растение или часть растения, полученные способом по пп.11-20 или содержащие генетический материал по п.25.