СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ЦИСТЕИНОВЫХ КАТЕПСИНОВ
SPECIFIC PEPTIDE INHIBITORS OF CYSTEINE CATHEPSINS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биоинженерии, а именно к пептидам (пептидным соединениям), обладающим высокой аффинностью к каталитической триаде цистеиновых катепсинов, и может быть использовано для создания терапевтических средств, являющихся специфическими ингибиторами протеолитических процессов с участием цистеиновых катепсинов.
Уровень техники
Цистеиновые катепсины являются гомологичными протеиназами клана CA цистеиновых пептидаз, экспрессирующимися в различных клетках и тканях многих видов организмов [Rawlings, N.D., Barrett, A.J., Thomas, P.D., Huang, X., Bateman, A., and Finn, R.D. (2018) The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database, Nucleic Acids Res., 46, D624-D632.]. В геноме человека идентифицировано 11 цистеиновых катепсинов: B, C, F, H, K, L, O, S, V, W и X(Z), которые проявляют разнообразную каталитическую активность. Так, катепсины F, O, S, K, V, L и W представляют собой эндопептидазы с широкой субстратной специфичностью; катепсины H и B обладают как эндо-, так и экзопептидазной активностью, тогда как катепсины C и X являются исключительно амино- и карбоксипептидазой соответственно. Наибольшую активность цистеиновые катепсины проявляют в средах с пониженными значениями pH, вследствие чего изначально считалось, что функционирование этих ферментов ограничивается лизосомами и эндосомами. Однако появляется все больше данных о высокоспецифичной и направленной протеолитической активности катепсинов в других компартментах клеток, таких как секреторные везикулы, цитозоль и ядро, а также вне клеток [Spira, D., Stypmann, J., Tobin, D.J., Petermann, I., Mayer, C., Hagemann, S., Vasiljeva, O., Günther, T., Schüle, R., Peters, C., and Reinheckel, T. (2007) Cell type-specific functions of the lysosomal protease cathepsin L in the heart, J. Biol. Chem., 282, 37045-37052.]. Основной функцией катепсинов является низкоспецифичная деградация белков в лизосоме, однако некоторые представители этой группы ферментов выполняют и другие функции. Так, например, катепсины B, H, L, S, K задействованы в процессе апоптоза [Boya, P., and Kroemer, G. (2008) Lysosomal membrane permeabilization in cell death, Oncogene, 27, 6434-6451; Repnik, U., Cesen, M.H., and Turk, B. (2013) The Endolysosomal System in Cell Death and Survival, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 5, a008755-a008755.], а катепсины S, F, L и V участвуют в презентации антигенов MHC класса II [Sadegh-Nasseri, S., and Kim, A. (2015) MHC class II auto-antigen presentation is unconventional, Front. Immunol., 6, 372.].
Таким образом, цистеиновые катепсины выполняют различные функции в клетках и тканях, однако их активность должна строго регулироваться. Совокупность таких факторов как локализация (преимущественно в лизосомах), экспрессия эндогенных ингибиторов (цистатинов) низкие уровни pH (для оптимальной работы) катепсинов ограничивают область их действия и позволяют организму предотвращать деградацию белков цитоплазмы и межклеточного матрикса. Тем не менее любой сбой в регуляции, выраженной, например, в повышение уровня экспрессии и активности катепсинов часто связан с развитием различных патологических состояний, таких как неврологические расстройства, сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, ревматоидный артрит и опухолевые заболевания. В частности, при онкогенезе цистеиновые катепсины детектируются в микроокружении опухолей, где они участвуют в процессах пролиферации, инвазии и метастазирования, обеспечивая деградацию внеклеточного матрикса, разрушение межклеточных взаимодействий и стимулируя ангиогенез. В связи с этим, цистеиновые катепсины являются перспективными мишенями при разработке противоопухолевых препаратов, направленных на ингибирование этих ферментов.
Известны различные препараты, которые являются ингибиторами цистеиновых катепсинов. В основном это низкомолекулярные соединения, основанные на структурах эпоксисукцинила, винилсульфона или нитрила, действующие по принципу связывания с активным центром ферментов. Кроме того, для некоторых катепсинов были разработаны ингибиторы на основе антител. Однако все эти ингибиторы имеют различную специфичность, а также биологические свойства, связанные с проницаемостью в клетки и обладающие значительными побочными эффектами, ограничивающими возможности применения таких ингибиторов на практике. [Petushkova AI, Savvateeva LV, Korolev DO, Zamyatnin AA Jr. (2019) Cysteine Cathepsins: Potential Applications in Diagnostics and Therapy of Malignant Tumors. Biochemistry (Mosc).; 84(7):746-761.].
Кроме того, для ингибирования цистеиновых катепсинов (К, S, L) авторами патентов [RU 2692799, RU 2535479, RU 2399613] предложены конкретные соединения непептидного происхождения, которые предлагается использовать для лечения или профилактики катепсин-зависимых заболеваний или состояний у млекопитающих. Разнообразие представленных модификаций этих соединений также обусловлено их различной специфичностью и биологическими свойствами при тех или иных условиях использования.
Наиболее близкими к предлагаемому решению являются универсальный ингибитор каспаз, имеющий структуру Z-VAD-FMK (N-бензоилоксикарбонил-Va1-Ala-Asp-трифторметилкетон) [Van Noorden CJ. (2001) The history of Z-VAD-FMK, a tool for understanding the significance of caspase inhibition. Acta Histochem. 103(3):241-51], который предотвращает апоптоз, а также пептидные ингибиторы каспаз: z-DEVD.fmk, Ac-YVAD.cmk. Каспазы относятся к семейству цистеиновых протеиназ, расщепляющих белки после аспартата. С помощью пептидных производных фторметилкетонов и хлорметилкетонов (напоминающими место расщепления известных каспазных субстратов), необратимо алкилирующих остаток цистеина в активном участке каспазы, было показано эффективное ингибирование этих ферментов. Ингибирующий эффект z-VAD.fmk, z-DEVD.fmk и Ac-YVAD.cmk также был показан и для катепсинов B и Н [Schotte P. et al. Non-specific effects of methyl ketone peptide inhibitors of caspases // FEBS letters. - 1999. - Т. 442. - №.1. - С. 117-121. Для бензилоксикарбонил-фенил-аланил-фторметилкетона (z-FA-FMK) помимо подавления процессов апоптоза и воспаления посредством ингибирования некоторых каспаз, также показана способность ингибировать катепсин В [The Cathepsin B Inhibitor, z-FA-FMK, Inhibits Human T Cell Proliferation In Vitro and Modulates Host Response to Pneumococcal Infection In Vivo Clare P. Lawrence, Aras Kadioglu, Ai-Li Yang, William R. Coward, Sek C. Chow The Journal of Immunology September 15, 2006, 177 (6) 3827-3836].
Однако в связи с тем, что вышеуказанные пептидные ингибиторы были созданы для ингибирования членов семейства каспаз, их специфичности может быть не вполне достаточно для эффективного ингибирования ферментов семейства цистеиновых катепсинов.
Технической проблемой, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание новых пептидных последовательностей, являющихся специфическими ингибиторами цистеиновых катепсинов, т.е. способных ингибировать функциональную (протеолитическую) активность цистеиновых катепсинов, с перспективой использования в разработке противоопухолевых терапевтических средств.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом изобретения является создание специфических пептидов (пептидных соединений), обладающих ингибирующим действием на функциональную активность цистеиновых катепсинов.
Технический результат достигается за счет синтеза специфических пептидных соединений - производных фторметилкетонов или хлорметилкетонов тетрапептидов структуры R1-pept-R2, где PEPT - одна из аминокислотных последовательностей: PLVE, VLPE; R1 - одна из защитных групп: ацетильная (Ac), бензилоксикарбонильная (Z) или отсутствует; R2 - производные фторметилкетона (FMK) или хлорметилкетона (CMK), характеризующихся способностью ингибировать протеолитическую активность цистеиновых катепсинов.
Заявленное изобретение может применяться для приготовления фармацевтических композиций для подавления специфической активности цистеиновых катепсинов, содержащих пептидное соединение и фармацевтически приемлемый носитель. Пептидные соединения могут применяться для приготовления лекарственных средств, вызывающих подавление специфической активности цистеиновых катепсинов, в терапии опухолевых заболеваний.
Получение таких модифицированных пептидов легко осуществимо стандартными методами пептидного синтеза. Пептидная природа специфических ингибиторов позволяет использовать их в качестве действующего вещества для разработок фармкомпозиций. Преимуществами пептидов перед другими типами препаратов состоит в том, что они, в основном, безопасны, быстро выводятся из организма и имеют значительно меньше побочных эффектов, чем средства непептидной природы. Большинство пептидных лекарств вводят парентеральным путем, но с развитием соответствующих технологий разрабатываются и иные формы введения: пероральный, интраназальный, трансдермальный, т.е. возможен подбор вариантов места действия пептида конкретно под определенные условия применения.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется иллюстрациями, где на Фиг. 1 представлены структуры специфических пептидных ингибиторов цистеиновых катепсинов Ac-PLVE-FMK и Ac-VLPE-FMK.
На Фиг. 2 представлены графики зависимости интенсивности флуоресценции продукта гидролиза (свободной метки 7-Амино-4-метилкумарина (АМК), у.е.) цистеиновыми катепсинами (CtsB и CtsL) флуорогенного субстрата Ас-PLVQ-АМК от времени (мин), характеризующие ингибирующую активность ферментов, где a) график зависимости для катепсина В (CtsB), б) график зависимости для катепсина L (CtsL), с) график зависимости в отсутствии ферментов (в качестве контроля отсутствия флуоресценции метки); красными линиями показана активность ферментов без добавления ингибиторов, синими - в присутствии пептидного ингибитора структуры Ac-PLVE-FMK, зелеными - в присутствии  пептидного ингибитора структуры Ac-VLPE-FMK.
На Фиг. 3 представлены изображение и численные показатели результатов «скретч»-теста на монослое опухолевых клеток почки линии 769-P.
На Фиг. 4 представлены изображение и численные показатели результатов «скретч»-теста на монослое опухолевых клеток почки линии A498.
Осуществление изобретения
Изобретение иллюстрируется с использованием соединений R1-pept-R2, где PEPT - одна из аминокислотных последовательностей: PLVE, VLPE; R1 - ацетильная группа (Ac); R2 - производные фторметилкетона (FMK), т.е. Ac-PLVE-FMK (Acetyl-Pro-Leu-Val-Glu-FMK) и Ac-VLPE-FMK (Acetyl-Val-Leu-Pro-Glu-FMK).
На примере изучения функциональной активности цистеиновой протеиназы пшеницы Тритикаина-альфа были определены аминокислотные последовательности с предпочтительными сайтами расщепления субстратов [Savvateeva LV, Gorokhovets NV, Makarov VA, Serebryakova MV, Solovyev AG, Morozov SY, Reddy VP, Zernii EY, Zamyatnin AA Jr, Aliev G. (2015) Glutenase and collagenase activities of wheat cysteine protease Triticain-α: feasibility for enzymatic therapy assays. Int J Biochem Cell Biol., 62:115-24.]. На основе полученных данных посредством компьютерного моделирования (с помощью программы PLANTS [Korb, O.; Stutzle, T.; Exner, T.E. Empirical scoring functions for advanced protein- ligand docking with PLANTS. Journal of chemical information and modeling 2009, 49, 84-96.] для моделирования белково-лигандного взаимодействия) были подобраны пептидные последовательности, обладающие наибольшей аффинностью к каталитическому центру цистеиновых протеиназ, в частности тетрапептиды PLVQ(E) и VLPQ(E). Путем конъюгирования фторметилкетоновой группы (FMK) к данным пептидам PLVE и VLPE были получены новые высокоспецифические ингибиторы цистеиновых протеиназ (Фиг. 1). Механизм необратимого ингибирования осуществляется за счет ковалентного связывания каталитического цистеина с FMK [Rasnick, D. Synthesis of peptide fluoromethyl ketones and the inhibition of human cathepsin B. Analytical biochemistry 1985, 149, 461-465.].
Пептиды получали стандартными методами химического синтеза (твердофазным или в жидкой фазе), при котором пептиды получают путем соединения различных аминокислот друг с другом с последующей химической модификацией для введения функциональных групп. Способы химического синтеза пептидов широко известны и хорошо описаны с помощью известных в данной области техники методов [US 6015881; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, cc. 4005-4008; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, cc. 4009-4012; Peptides, Chemistry and Biology, под ред. Kamber и др., изд-во ESCOM, Leiden, 1992, cc. 525-526; Riniker и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc. 9307-9320; Lloyd-Williams и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc. 11065-11133, и Andersson и др., Biopolymers 55, 2000, cc. 227-250].
Ингибирующие свойства Ac-PLVE-FMK и Ac-VLPE-FMK оценивали in vitro биохимическими методами и на опухолевых линиях клеток. В качестве модельных ферментов были взяты рекомбинантные цистеиновые катепсины L и B человека (CtsL и CtsB), так как они проявляют как эндо-, так и эндо -/экзопептидазную активность соответственно.
Пример 1. Определение ингибирующей активности Ac-PLVE-FMK и Ac-VLPE-FMK с использованием специфического флуорогенного субстрата.
Активность рекомбинантных катепсинов Cts B и L определяли по способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа Ас-PLVQ-АМК, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК), c определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK как описано ранее [Патент RU 2603054.]. Так, к 20 нМ раствору рекомбинантного Cts B или Cts L в 0,1М натрий-ацетатного буфере с содержанием 100 мМ NaCl, 0,5% DMSO, 0,6 мМ ЭДТА, pH 4,6 в присутствии и отсутствии 2 мкМ тетрапептидных ингибиторов Ac-PLVE-FMK (Фиг. 2, синие линии) и Ac-VLPE-FMK (Фиг. 2, зеленые линии) добавляют 50 μM флуорогенного субстрата (Фиг. 2, красные линии) и детектируют интенсивность флуоресценции при комнатной температуре при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм (количество гидролизованного субстрата Ас-PLVQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции; скорость реакции при необходимости определяют по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессии).
Как видно из рисунка Фиг. 2 и таблицы 1, интенсивность флуоресценции заметно снижалась в присутствии заявляемых тетрапептидов (синие и зеленые линии), что говорит об активной конкуренции субстрата и ингибиторов за активный центр фермента, и, следовательно, свидетельствует о специфичном и эффективном подавлении протеиназной активности цистеиновых катепсинов.
Таблица 1
Время, мин
Интенсивность флуоресценции, у.е.
Blank (Субстрат Ac-PLVQ-АМК (Sub) без фермента)
CtsB
CtsL
+ Sub
+Sub+Ac-PLVE-FMK
+ Sub + Ac-VLPE-FMK
+ Sub
+Sub+Ac-PLVE-FMK
+ Sub + Ac-VLPE-FMK
0.3
0
3500
3000
3100
5000
4000
4300
3
0.1
4300
3700
3700
7300
6300
6400
6
0
5600
4700
4600
9500
7200
7800
9
0.1
6300
4900
4800
11300
8200
9100
12
0
7000
5050
4950
14000
9200
9500
Пример 2.  Оценка ингибирующей активности Ac-PLVE-FMK и Ac-VLPE-FMK с использованием опухолевых клеточных линий.
Известно, что эффективное ингибирование активности цистеиновых катепсинов ассоциировано с изменениями определенных свойств опухолевых клеток, в частности, инвазии и подвижности.
Для исследования влияния Ac-PLVE-FMK и Ac-VLPE-FMK на подвижность клеток использовали scratch-тест («скретч-тест»): на монослой клеток рака почки линий 769-P и A498, выращенных в ростовой среде RPMI 1640 с добавлением 10% бычьей сыворотки и 1% содержанием антибиотиков пенициллин-стрептомицин в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C, наносят царапину с помощью наконечника пипетки. Монослой промывают дважды фосфатно-солевым буфером для удаления открепившихся клеток и дебриса и добавляют ингибиторные тетрапептиды Ac-PLVE-FMK и Ac-VLPE-FMK в конечной концентрации 20 мкМ, после чего клетки продолжают наращивать в CO2-инкубаторе, детектируя «заживление» клеточного монослоя с использованием микроскопа в определенные временные интервалы (Фиг. 3, 4, таблица 2, 3).
Таблица 2
Клетки линии 769-P
Размер повреждения клеток (царапины), мкм
Время, ч
Ctrl (без добавления специфических пептидных ингибиторов)
Ac-PLVE-FMK
Ac-VLPE-FMK
0
390
389
387
8
236
300
277
24
15
56
80
Таблица 3
Клетки линии A489
Размер повреждения клеток (царапины), мкм
Время, ч
Ctrl (без добавления специфических пептидных ингибиторов)
Ac-PLVE-FMK
Ac-VLPE-FMK
0
508
514
520
8
437
467
476
24
282
407
376
Как видно из Фиг. 3, 4 и таблиц 2, 3, добавление тетрапептидов замедляло рост образования монослоя опухолевых клеток, т.е. пептидные ингибиторы эффективно препятствовали «заживлению» (закрытию зазора) как через 8, так и через 24 часа после образования царапины. Для наилучшей репрезентативности данных были построены гистограммы, отражающие процентное соотношение зарегистрированных изменений в размерах повреждения клеточного монослоя по сравнению с контролем (клетки без обработки тетрапептидами). Таким образом, можно утверждать, что ингибирование Cts с использованием тетрапептидов в опухолевых клетках может влиять на адгезию клеток, препятствуя образованию межклеточных контактов.
Таким образом, заявленные специфические пептидные ингибиторы, обладающие способностью ингибировать цистеиновые катепсины, могут служить основой фармацевтических композиций для разработки и получения лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с повышенной активностью цистеиновых катепсинов, в частности, противоопухолевых препаратов.