Исследование конформационной подвижности в структуре лекарственного растения репейника (arctiumtomentosum Mill. ) методом спиновых меток

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2016, том 59, №9-10_

ФИЗИКА

УДК 541.64.543.422.23

И.Х.Юсупов, Н.Н.Умаров*, академик АН Республики Таджикистан Р.Марупов

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННОЙ ПОДВИЖНОСТИ В СТРУКТУРЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТЕНИЯ РЕПЕЙНИКА

МЕТОДОМ СПИНОВЫХ МЕТОК

Физико-технический институт им. С.У.Умарова АН Республики Таджикистан, Худжандский государственный университет им. Б.Гафурова

Методом спиновой метки изучена молекулярная динамика макромолекулы листьев дикорастущего лекарственного растения репейника. Показано, что параметры вращательной диффузии нитроксильного радикала, присоединенного к структурам репейника, зависят от радиационного фона места его произрастания. Установлено, что при увеличении дозы радиационного фона уменьшается скорость вращательной диффузии радикала и исчезает быстровращающйся компонент, относящийся к сверхтонкой структуре.

Ключевые слова: спиновая метка, молекулярная динамика, спектры ЭПР, репейник, вращательная диффузия.

В последнее время уделяется особое внимание изучению влияния экологических факторов на молекулярную структуру лекарственных растений методами ИК- и ЭПР-спектроскопии. Эти методы дают возможность изучать процессы формирования внутриклеточных структурообразований в растениях [1-5].

Согласно данным [6], в формировании структуры составных частей растения и его физико-химических свойств важную роль играют листья растений, так как в них под действием солнечной радиации формируются органические вещества, которые обеспечивают синтез жизненно важных органических веществ из неорганических соединений.

В данной работе методом спиновых меток исследовано влияние различных доз радиации на формирование молекулярно-динамической структуры в листьях лекарственного репейника, произрастающего в северном регионе Республики Таджикистан.

Листья растения отобраны в фазе цветения с хвостохранилища Дегмай (табл. 1).

По литературным данным [7], в народной медицине репейник широко используется для лечения различных заболеваний. Свежие листья, смазанные маслом, прикладывают при болях к колену или, намочив водой, к голове при головной боли. Кашицей из свежих листьев смазывают опухоли, раны, экзему, язвы, лишаи. В листьях содержится до 5-9 мг% каротина, 30-50 мг% витамина С, значительное количество сахара, дубильных веществ, 1.5-2.5% флавоноидов, 8.7-14.6% органических кислот.

Адрес для корреспонденции: Юсупов Изатулло Ходжаевич. 743063, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул. Айни, 299/1, Физико-технический институт АН РТ. E-mail: usupizat@yandex.ru ; Умаров Насимджон Нег-матович. 735700, г. Худжанд, ул. Мавлонбекова, 1, ХГУ. E-mail: nasimchon-74@mail.ru

Таблица 1

Радиационный фон места произрастания растения репейника

Место произрастания Радиационный фон, мкЗв/час

точкаА 0.18-0.21

точка В 0.6-0.8

точка С 2.6-2.8

точка Б 8.2-8.6

Примечание: Координаты: точка А (С40о 13' 26'', В 69о 38' 20''), точка В (С40о 13' 35'', В 69о38' 9'' ), точка С (С40о 13' 32'', В 69о 38' 2''), точка Б (С40о 13' 28'', В 69о 37' 50'').

Для оценки изменения молекулярной структуры лекарственных растений часто используют отдельные парамагнитные нитроксильные радикалы. Эти соединения вводят в исследуемую систему в качестве молекулярных зондов, ЭПР-спектры которых чувствительны к конформационной подвижности макромолекулы, связанной с анизотропией g-фактора и сверхтонкого взаимодействия электронного спина с ядрами атома азота. Спектр ЭПР радикала зависит от его ориентации во внешнем магнитном поле.

Стохастические изменения ориентации радикала модулируют магнитные взаимодействия, поэтому форма спектра ЭПР зависит от вращательной подвижности радикала. По форме спектра, регистрируемого в стандартных условиях (первая гармоника сигнала поглощения, ненасыщающие значения микроволновой мощности), можно оценить время корреляции вращательных движений тс радикала в диапазоне 510 -11 -10-7с. [8-11].

Наблюдая за сигналами парамагнитных зондов, можно проследить за структурными перестройками биополимеров, макромолекулярных комплексов, молекулярной подвижности различных биологических систем, а также других надмолекулярных структур клеток растений. Авторы [3-5] методом спиновых меток установили, что экологические условия, место произрастания, высота над уровнем моря, естественный радиационный фон, а также содержание влажности и температура влияют на формирование молекулярной структуры в процессе синтеза биохимических компонентов в растениях, в том числе лекарственных.

Для снятия спектра ЭПР образца листья репейника тщательно очищали от экстрактивных веществ, промывали обычной и дистиллированной водой, спиртом и высушивали при комнатной температуре, измельчали и из полученного порошка брали навеску 30 мг.

Образцы химически модифицировались по гидроксильным группам растения спиновой меткой по методике [4,5,11]. Первую производную сигнала ЭПР поглощения У1 регистрировали на спектрометре ЭПР-1306.

В работах [10,11] показано, что модификация хлопковой целлюлозы спиновой меткой протекает по её гидроксильным группам. Так как по происхождению основы химической структуры хлопкового волокна и лекарственных растений очень близки и в основном состоят из целлюлозы, то можно утверждать, что нитроксильный радикал (I) ковалентно взаимодействует с гидроксильной группой лекарственного растения преимущественно с ОН-группой целлюлозной основы лекарственных растений. Об этом свидетельствует вид спектра ЭПР (рис.1в и рис.2), соответствующего заторможенно-

му вращению радикала с частотой вращения у«108 с-1, а также практическая независимость спектра ЭПР от многократных промывок.

На рис.1 приведены спектры ЭПР нитроксильного радикала (I) - а, эталон 50%-го водно-глицеринового раствора при 77 К - б и спин-меченого листа репейника при комнатной температуре - в. Время корреляции спин-меченых образцов определяли по формуле [9]:

гс= 8 -10-10

/ \-1Дб

!_2

2 А У

22 У

где 2 Агг - расстояние между внешними экстремумами спектра ЭПР образца при заданной температуре опыта; 2А™ - расстояние между внешними экстремумами спектра ЭПР 50%-го водно-глицеринового эталона при температуре 77 К (см. рис.1б,в ).

Формула (1) справедлива для процесса изотропного вращения нитроксильного фрагмента спиновой метки по механизму броуновской диффузии. Однако реальное вращение фрагмента спиновой метки в матрице репейника может быть анизотропным. Выбор модели вращения в рамках данных по спектроскопии ЭПР в 3-х сантиметровом диапазоне представляет сложную, во многих случаях не решенную задачу.

Как показано в работе [9], имеет место прямая пропорциональная зависимость между значением тc , рассчитанным из теоретических спектров [12] по формуле типа (1) для изотропного движения, и значениями т°, заложенными в расчеты для анизотропного вращения.

Рис.1. ЭПР-спектры свободного нитроксильного радикала (I): в спиртовом растворе с концентрацией 410 -3 М/л и с временем корреляции (хе <10-7с) - (а); эталон 50%-го водно-глицеринового раствора при 77 К - (б); спин-меченых листьев репейника при комнатной температуре - (в).

Для определения количества спиновых меток присоединившихся к образцу, использовали формулу (2):

в = в Квр

эт \ эт /

где Яэт, Яобр - количество спин-меток в эталоне и образце, соответственно; Нэт , кобр - соответственно высота центральной компоненты спектра ЭПР эталона и образца; АНэт, АНобр - ширина центральной компоненты спектра ЭПР эталона и образца. Расчет количества спиновых меток (Я), присоединившихся к изученным образцам, приведен в табл.2. Откуда видно, что при больших дозах радиации (8.4 мкЗв/час) количество присоединившихся спин-меток уменьшается. Это свидетельствует о том, что при больших дозах радиации (8.4 мкЗв/час), возможно, происходят структурные изменения, которые сопровождают в дальнейшем увеличение доли рыхлых участков в структурной матрице.

Как видно из рис. 1(а), в спектрах ЭПР наблюдается свободная вращательная подвижность спиновой метки, которая характерна для нитроксильного радикала (I) в растворе с временем корреляции тс < 10-7с, а также спектры спин-меченого репейника, имеющего сильно заторможенный вид, свидетельствующий о суперпозиции двух радикалов. Радикал (I), относящийся к быстровращающим-ся (показано стрелками I) компонентам сигнала, и радикал (II), относящийся к медленновращающим-ся компонентам, показаны стрелками II сигнала спектра ЭПР (см. рис. 1 в).

2Л-

----ЧУ \ /

12Гс ^

Рис. 2. ЭПР-спектры спин-меченых образцов листьев репейника в зависимости от радиационного фона места произрастания при комнатной температуре: а) 0.2 мкЗв/час; б) 0.7 мкЗв/час; в) 2.7 мкЗв/час; г) 8.4 мкЗв/час.

При исследовании образцов листьев репейника, собранных из различных мест и с различной дозой радиации, было установлено, что при изменении дозы радиации спектры ЭПР отличаются друг от друга (рис.2). Определены следующие параметры спектров ЭПР спин-меченых образцов при комнатной температуре: 2Л'2- расстояние между внешними экстремумами; А/ и АН - полуширины линии

в низком и высоком поле, соответственно; Н'/ Н - отношение амплитуд низкопольных линий слабо иммобилизованных меток и АНо - ширина линии центрального компонента спектра ЭПР и время корреляции.

Спектры ЭПР спин-меченых образцов (рис.2) при комнатной температуре представляют собой суперпозиции двух сигналов и сильную заторможенность вращательной подвижности спиновой метки с временем корреляции тс < 10-8с, что характеризует неоднородность аморфных областей в ис-

следуемых образцах в местах присоединения метки и свидетельствует об изменении системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области частот гидроксильных групп.

Таблица 2

Параметры спектров ЭПР спин-меченых листьев репейника в зависимости от радиационного фона места произрастания

Место произрастания А1, Гс Ак, Гс АHобр, Гс 2Л. ^ Гс тс-10-8с Количество присоединившихся спин - метки Яобр-1016 спин/г

точкаА 12 10.8 24 218 0.4 0.47 22

точка В 9.6 10 21.6 210 0.25 0.41 13

точка С 8.4 7.2 18 204 0.17 0.36 5.3

точка Б 7.2 5.6 16.8 177 - 0.25 3.7

Из табл. 2 и рис.1 и 2 следует, что для листьев репейника параметры полуширины линии в низком и высоком поле, соответственно А/ и АН в спектрах ЭПР, относящихся к медленновращаю-щемуся радикалу, изменяются в зависимости от радиационного фона места произрастания, а параметр Н' / Н является очень чувствительным и изменяется интенсивно, что характеризует появление нового компонента сигнала ЭПР, относящегося к быстровращающемуся радикалу, что свидетельствует о появлении сверхтонкой структуры (СТС) в спектрах исследуемых образцов.

Эти изменения свидетельствует об уменьшении низкопольного и высокопольного компонентов сигнала ЭПР, которые характеризуют изменение системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области присоединения метки.

На рис. 3 приведен график изменения относительных параметров Н' / Н от радиационного фота места произрастания. Как видно из рис.3, параметр Н'/ Н при увеличении дозы радиационного фона монотонно уменьшается, а при больших дозах - стремится к нулю.

Рис.3. Зависимость параметров к/к спектров ЭПР листья репейника от радиационного фона (Я, мкЗв/ч) места произрастания.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что: - в спектрах ЭПР спин-меченого репейника при больших дозах радиационного фона уменьшаются низкопольный и высокопольный компоненты Ак и А/, это, возможно, связано с изменением конформационной подвижности молекулярной структуры репейника;

- изменения параметров спектра ЭПР, а также поглощение компонентов сигнала, относящегося к быстровращающемся радикалу, наблюдаются при больших дозах (8.4 мкЗв/час);

- при воздействии радиации повреждение макромолекулы листьев репейника вызывает такие реакции, как дегидрирование или дегидроксилирование молекул в составе листьев репейника.

Поступило 28.11.2016 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Умаров Н.Н., Усмонов А., Шукуров Т. Проблемы разработки месторождении полезных ископаемых. - Мат-лы междунар. конф. - Бустон, Таджикистан, 2016, с.163-166.

2. Умаров Н., Давлатмамадова С.Ш., Шукуров Т., Усмонов А., Марупов Р. - ДАН РТ, 2014, т.57, № 1, с.32-36.

3. Юсупов И.Х. Умаров Н.Н., Марупов Р. - ДАН РТ, 2015, т.58, № 9, с. 813-818.

4. Юсупов И.Х., Бахдавлатов А.Д., Марупов Р. - Теоретическая и прикладная экология, 2014, №2, с. 41-45.

5. Юсупов ИХ., Бахдавлатов А.Д., Алидодов Т.М., Умаров Н., Марупов Р. - ДАН РТ, 2015, т.58, №4, с.309-315.

6. Ничипорович А.А. О фотосинтезе растений. - М.: Правда,1948, с.3-16.

7. Ходжиматов Х. Дикорастущие лекарственные растения Таджикистана. - Душанбе: Гл. науч.ред. ТСЭ, 1989, 368 с.

8. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. - М.: Наука, 1977, 256 с.

9. Фрид Д.Ж. Метод спиновых меток. Теория и применение. - М., 1979, с.97.

10. Марупов Р., Юсупов И.Х., Бободжанов П.Х., Кольтовер В.К., Лихтенштейн Г.И. - ДАН АН СССР, 1981, т.256, №2, с.414-417.

11. Юсупов И.Х., Бободжанов П.Х., Марупов Р., Анциферова Л.И., Кольтовер В.К., Лихтенштейн Г.И. - ВМС, сер.А, 1984, т.26, №2, с.369-374.

И.Х.Юсупов, Н.Н.Умаров*, Р.Марупов

ТАТЦИЦИ ХРЛАТХРИ КОНФОРМАТСИОНИИ СОХТИ ГИЁ^И ДОРУВОРИИ МУШХОР БО УСУЛИ НИШОНА^ОИ СПИНЙ

Институти физикаю техникаи ба номи С.У. Умарови Академия илм^ои Цум^урии Тоцикистон,

*Донишго%и давлатии Хуцанд ба номи Б.Рафуров

Бо усули нишонахои спинй динамикаи молекулавии макромолекулахо дар барги гиёхи дорувории мушхор омухта шудааст. Нишон дода шудааст, ки параметрхои чархзанандагии диффузионии радикали нитроксилии бо сохти структуравии мушхор пайвастшуда бо радиатсияи мухити сабзиш вобастагй дорад. Муайян карда шудааст, ки бо зиёдшавии дозаи радиатсияи мухити чой суръати диффузионии чархзанандагии радикал хурд шуда ва ба аз байн рафтани компонентаи зудчархзанандаи, баланд хасоси структуравй молик буда, оварда мерасонад.

Калима^ои калиди: нишонахои спини, динамикаи молекулави, спектри-ЭПР, гиё^и дорувории мушхор, диффузияи чархзанандаги.

I.Kh.Yusupov, N.N.Umarov*, R.Marupov STUDY OF THE CONFORMATIONAL MOBILITY WITHIN THE STRUCTURE OF THE MEDICINAL PLANTS THISTLES (Arctium tomentosum Mill.) BY SPIN

LABELS METHOD

S.U.Umarov Physico-Тechnical Institute, Аcademy of Scienccs of the Republic of Тajikistan,

B.Gafurov KhujandState University

The molecular dynamics of leaves of the wild medical plants thistles macromolecules have been studied be spin label method. It is shown that the parameters of the rotational diffusion of nitroxyl radical attached to the thistles structure depends on radioactivity level of the ground where it is growing. It was found that by increasing of the dose of grounds radioactivity the level of rotational diffusion of radicals decreases and the fast rotational component belonging to the ultra-thin structure (STS) disapears. Key words: spin label, molecular dynamics, ESR spectra, arctium tomentosum МШ., rotational diffusion.