СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ПЛОСКИХ МОРСКИХ ЕЖЕЙ
METHOD OF INTEGRATED SAND DOLLAR PROCESSING

Изобретение относится к технологии переработки плоских морских ежей с одновременным получением разных по природе биологически активных веществ: свободных жирных кислот, преимущественно полиненасыщенных, и каротиноидов, используемых в качестве добавок в пищевые продукты, медицинские препараты и косметические средства, а также в препараты для сельского хозяйства и ветеринарии. Способ позволяет дополнительно получать стерины морского происхождения высокой степени чистоты для использования в модельных опытах исследования метаболических путей образования стероидов в морских беспозвоночных из предшественников - холестерина и его производных, и в лабораторных исследованиях проблем атеросклероза и сахарного диабета.
Актуальность задачи получения жирных кислот обусловлена следующими причинами. Клинические испытания показали, что применение даже относительно низких количеств омега-3 жирных кислот приводит к существенному понижению инфарктов и коронарных болезней сердца. Показано, что омега-3 ПНЖК обладают антиканцерогенной, противоопухолевой, антиметастатической, антитромботической и антиаритмической активностями [Noda H. at al. (1990) Hydrobiologia, 204/205, 577-584; Roberts D.D., Ginsburg V. (1998) Arch. Biochem. Biophys., 267, 405-415; Carroll D.N., Roth M.T. (2002) Ann. Pharmacotherapy, 36, 1950-1956].
Коммерческим источником омега-3 ПНЖК до сих пор были жиры (триацилглицерины) морских рыб. Однако запасы рыбных жиров продолжают понижаться, а потребность в полиненасыщенных жирных кислотах увеличивается. В связи с этим не менее важным источником ПНЖК могут стать морские беспозвоночные и отходы их переработки, содержащие значительные количества этих кислот. Содержание липидов (сумма фосфолипидов, гликолипидов, нейтральных липидов) достигает во многих видах морских беспозвоночных значительных величин (1,0-11,7% на сырой вес ткани), в связи с чем некоторые виды морских беспозвоночных используются для выделения ПНЖК. Так гонады морских ежей давно используются в Японии для получения эйкозапентаеновой кислоты. Из печени командорского кальмара получено средство, представляющее собой липидную фракцию, содержащую 10% полиненасыщенных жирных кислот и 50% алкил-диацилглицеридов, обладающее выраженными липидкорригирующими и иммуномодулирующими свойствами [RU 2259824 С2, 10.09.2005].
Каротиноиды морских беспозвоночных обладают антиоксидантными свойствами [Bandaranayake W.M. Nat. Prod. Rep., 2006, 23, 223-255]. Известно противовоспалительное, антисклеротическое, антистрессовое действие морских каротиноидов, широкое применение их для производства различных продуктов питания [Ямасита Э. Функциональные характеристики астаксантина и его применение. Japanese J. of Phycol. 2002, 50, 49-51].
Из плоских морских ежей получают разные по химической природе биологически активные вещества.
Известен способ получения эхинохрома А (2,3,5,7,8-пентагидроокси-6-этил-1,4-нафтохинона), включающий экстракцию морских ежей разбавленными растворами серной кислоты в этиловом спирте с последующей жидкостной экстракцией хлороформом в смеси с водой при комнатной температуре и объемном соотношении хлороформ: вода 1:1 и последующей перекристаллизацией целевого продукта из смеси диоксан-гексан [SU 1508535 A1, 27.08.1996].
Недостатком этого способа является использование ценного биологического сырья для получения одного продукта - эхинохрома А, липидная же фракция составляет примесь, для удаления которой вводится процедура перекристаллизации целевого продукта из смеси диоксан-гексан.
Известен способ комплексной переработки плоских морских ежей с одновременным получением ганглиозидов и эхинохрома А, а также белкового концентрата и минеральной муки [RU 2305548 C1, 10.09.2007].
Способ заключается в том, что сырье последовательно обрабатывают: 1) водным раствором лимонной кислоты для частичного удаления нелипидных примесей и растворимых в воде пигментов, 2) водным раствором щелочи для омыления липидов в сырье, 3) спиртовым раствором лимонной кислоты для экстракции продуктов гидролиза, 4) спиртовыми растворами серной кислоты (трижды) для получения фракций, содержащих эхинохром А. После концентрирования растворов ганглиозиды извлекают гексаном из щелочного концентрата и концентрата спиртового раствора лимонной кислоты. Гексановые экстракты концентрируют до минимального объема и добавляют к ним холодный ацетон для осаждения ганглиозидов. Осадок ганглиозидов дополнительно промывают холодным ацетоном. После концентрирования спиртовых растворов серной кислоты проводится извлечение из них сначала гексаном холестерина и свободных жирных кислот, а затем - хлороформом фракции, содержащей эхинохром А, с последующей очисткой его от свободных жирных кислот и сопутствующих пигментов водным раствором хлористого магния.
Способов комплексной переработки плоских морских ежей с получением свободных жирных кислот, преимущественно полиненасыщенных, каротиноидов, а также свободных стеринов в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено.
Задача изобретения - разработка способа комплексной переработки плоских морских ежей с получением смеси свободных жирных кислот с высоким содержанием полиненасыщенных кислот, а также веществ каротиноидной природы, свободных стеринов.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра биологически активных веществ, получаемых из плоских морских ежей. Заявляемый способ обеспечивает получение из этого сырьевого источника помимо хиноидных пигментов и, в частности, эхинохрома А, других отличающихся от него по природе ценных биологически активных веществ, а именно свободных жирных кислот с высоким содержанием полиненасыщенных кислот, а также веществ каротиноидной природы и свободных стеринов высокой степени чистоты и с высокими выходами.
Поставленная задача решена способом комплексной переработки плоских морских ежей, в котором согласно изобретению сырье заливают 2,0-2,5%-ным водным раствором щелочи, выдерживают при температуре 70-75°С в течение 5-6 часов, далее раствор нейтрализуют серной кислотой до рН 3-5 и оставляют сырье в подкисленном растворе на 16-18 час, затем сливают его из реактора и извлекают хлороформом смесь, включающую свободные жирные кислоты (экстракт I), далее остаток сырья в реакторе дважды экстрагируют 96%-ным этиловым спиртом настаиванием в течение 16-24 час, затем спиртовые экстракты отделяют от сырья, объединяют и концентрируют до минимального объема с последующим извлечением из концентрата хлороформом смеси веществ, содержащих свободные жирные кислоты (экстракт II), далее экстракты I и II объединяют и концентрируют, затем концентрат веществ растворяют в гексане и наносят на хроматографическую колонку с силикагелем для выделения свободных жирных кислот, свободных стеринов и производных каротиноидов последовательным элюированием веществ гексаном и градиентом серного эфира в гексане с последующим концентрированием целевых продуктов; затем из концентрата свободных жирных кислот получают полиненасыщенные жирные кислоты кристаллизацией их при температуре (-25-10°С) в течение 2-3 часов.
Плоские морские ежи, остающиеся в реакторе после извлечения целевых продуктов, используют для получения смеси хиноидных пигментов.
Таким образом, в заявляемом способе образование смеси жирных кислот происходит в сырье за счет гидролиза его липидов (триацилглицеринов и фосфолипидов) горячим (70-75°С) раствором щелочи, при этом сдвиг реакции в сторону образования свободных жирных кислот происходит в результате подкисления реакционной смеси. Экстракцию сырья после удаления из реактора подкисленного раствора продолжают спиртом для полного извлечения целевых продуктов. Предварительную очистку от примесей целевых продуктов проводят хлороформом, окончательную - с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.
Способ позволяет получить помимо свободных жирных кислот смесь пигментов. Для этого остаток морских ежей в реакторе после процедур, описанных выше, экстрагируют при комнатной температуре в течение 2-3 часов 3,5-4,0%-ным спиртовым раствором серной кислоты (экстракт III). Повторную экстракцию проводят таким же раствором в течение 16-18 часов при комнатной температуре (экстракт IV). После концентрирования экстрактов III и IV до небольшого объема проводят извлечение хлороформом смеси пигментов, содержащих эхинохром А
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения:
Пример 1.
I. Извлечение свободных жирных кислот, свободных стеринов, каротиноидов.
5 кг плоских морских ежей помещают в десятилитровый реактор с рубашкой и заливают (с образованием «зеркала» над поверхностью сырья) 6 л 2,0%-ного водного раствора щелочи (КОН или NaOH). Температуру в реакторе 70°С обеспечивают за счет подачи в рубашку реактора горячей воды. Сырье выдерживают в щелочном растворе в течение 5 час для гидролиза триацилглицеринов и фосфолипидов. После этого щелочной раствор из реактора сливают в приемник, осторожно приливают 1,2 л 30%-ного раствора серной кислоты. Раствор перемешивают, доводят рН реакционной смеси до 3-5 и вновь подают в реактор с ежами. Смесь оставляют в реакторе с ежами на 16-18 час. После окончания процесса нейтрализации реакционную смесь сливают из реактора в реакционный сосуд с нижним сливом, далее в сосуд подают 2 л хлороформа. Смесь в сосуде перемешивают и оставляют для расслаивания на две фракции. Отбирают через нижний слив хлороформную фракцию, содержащую свободные жирные кислоты (экстракт I). Процедуру извлечения свободных жирных кислот повторяют трижды. Хлороформные экстракты объединяют, промывают 2-3 раза дистиллированной водой до нейтральной рН. Очищенный и нейтрализованный хлороформный экстракт I концентрируют до небольшого объема. Выход продукта на стадии составляет 15,0 г.
Далее остаток сырья в реакторе дважды экстрагируют 6 л 96%-ного этилового спирта настаиванием в течение 16-24 час. Процедуру повторяют дважды. Соотношение сырья и экстрагента выдерживают в пределах 1:1 по объему. Спиртовые экстракты объединяют и концентрируют до 1,0-1,5 л, далее к спиртовому раствору добавляют равный объем хлороформа и воду (0,5 л). Смесь перемешивают и оставляют до расслоения на две фазы. Отбирают хлороформную фазу (экстракт II), промывают ее дважды водой и концентрируют до небольшого объема. Выход продукта на этой стадии составляет 7,5 г.
Экстракты I и II объединяют, концентрируют досуха и растворяют в 0,5 литрах гексана. Очистку свободных жирных кислот из объединенных экстрактов I и II проводят на хроматографической колонке с 500 г силикагеля (размер частиц 40/100 или 100/160 микрон). Для этого 0,5 л гексанового раствора загружают на колонку. Элюирование веществ с колонки проводят гексаном и ступенчатым градиентом серного эфира в гексане. Ход элюирования каротиноидных пигментов, свободных жирных кислот, стеринов контролируют тонкослойной хроматографией (ТСХ), используя систему для разделения липидов, состоящую из гексана, серного эфира и уксусной кислоты, взятых в объемных соотношениях 80:20:1.
Концентрирование продуктов ведут на вакуумном роторном испарителе при температуре водяной бани 45-50°С досуха. Выход свободных жирных кислот составляет 11,0 г, каротиноидных пигментов - 1,1 г, свободных стеринов - 7,0 г. По данным ТСХ чистота целевых продуктов в пределах 98-99%.
Концентрат свободных жирных кислот (11,0 г) отправляют на процедуру кристаллизации насыщенных жирных кислот вымораживанием их при температуре -10-25°С. Через 2-3 часа вымораживания отделяют жидкую фазу ненасыщенных жирных кислот от твердой фазы насыщенных жирных кислот. В жидкой фракции определяют массовое содержание жирных кислот взвешиванием аликвоты раствора, высушенного до постоянного веса. Выход жирных кислот составляет 7,5 г с содержанием ПНЖК омега-3 серии в пределах 45-65%.
Остаток морских ежей в реакторе направляют на процедуру получения смеси хиноидных пигментов, одним из компонентов которой является эхинохром А.
II. Извлечение смеси хиноидных пигментов.
Остаток морских ежей в реакторе заливают 6 л 3,5%-ного спиртового раствора серной кислоты и экстрагируют настаиванием при комнатной температуре в течение 3 час (экстракт I). Повторную экстракцию пигментов из ежей проводят таким же раствором в течение 16-18 часов при комнатной температуре (экстракт II). После концентрирования экстрактов 1 и II до 2 л, проводят извлечение смеси пигментов хлороформом: к 2 л спиртового концентрата добавляют 2 л хлороформа и 1 л воды. Смесь перемешивают и оставляют для разделения на две фракции. Отбирают хлороформную фракцию. Из верхней водно-спиртовой фракции повторно хлороформом извлекают пигменты. Хлороформные фракции объединяют и отмывают остаток серной кислоты дистиллированной водой до нейтральной рН. Хлороформный экстракт выпаривают досуха (выход 5,5 г, содержание эхинохрома А в смеси 30%, что составляет порядка 80% от его содержания в морских ежах).
Пример 2.
5 кг замороженных плоских ежей подвергают процедурам, описанным в примере 1. Однако обработку ежей проводят 2,5%-ным водным раствором щелочи при температуре в пределах 75°С в течение 3 часов. Щелочной раствор сливают, нейтрализуют. Далее рН доводят до 4-5 и извлекают свободные жирные кислоты, как описано в примере 1. В этом случае гидролиз липидов проходит неполно (примерно на 60%), что приводит лишь к увеличению в липидной смеси свободных жирных кислот.
Пример 3. Выполняется аналогично примеру 1, но гидролиз липидов осуществляют при 45°С в течение суток 2,5%-ным раствором щелочи. В этом случае триацилглицерины, фосфолипиды из-за их неполного гидролиза составляют примеси, а выход свободных жирных кислот составляет порядка 40%.
Пример 4. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что процедура проводится при комнатной температуре в течение 18-24 часов. В этих условиях процедура омыления липидов проходит частично (примерно на 20%), что приводит лишь к увеличению в липидной смеси свободных жирных кислот на фоне триацилглицеринов, непредельных углеводородов, стеринов, фосфолипидов и гликолипидов.