СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ ИЗ МОЛОЧНЫХ ЗУБОВ
METHOD OF PRODUCING BIOLOGICAL PRODUCTS FROM PRIMARY TEETH

Изобретение относится к области биотехнологий, получению биоматериалов для регенеративной медицины, а именно -одновременному получению культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов.
Известен способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток [1], включающий забор и подготовку материала, его отмывку, ферментативную обработку, выделение суспензии клеток, их идентификацию
Недостатком метода является снижение качества получаемого клеточного материала из-за агрессивности ряда технологий обработки, утилизация ценного ювенильного биоматериала - дентина, который может быть использован для нужд регенеративной медицины.
2
Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов [2], включающий получение, транспортировку, отмывку материала, инкубирование с сывороткой плодов коровы, контроль стерильности забора, ферментативную обработку и забор содержимого канала молочного зуба с центрифугированием и инкубированием при комнатной температуре; инактивацию фермента, удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка клеток в полной питательной среде; культивирование в CO-инкубаторе со сменой питательных сред, центрифугирование кондиционированной культуральной среды.
Недостатком способа является высокая частота контаминации материала из-за его недостаточной первичной обработки. Инкубирование при комнатной температуре не обеспечивает полноценной ферментативной обработки биоматериала, снижает выход клеток и качество биологических продуктов в целом. При этом способе также происходит утилизация ценного ювенильного биоматериала- дентина, который может быть использован для нужд регенеративной медицины. Данный способ взят нами за прототип.
Целью изобретения является разработка технологии
одновременного получения культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и деминерализованного дентина из молочных зубов.
2
Эта цель достигается тем, что из молочных зубов получают МСК и деминерализованный дентин, при этом используют также молочные зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей; после первичной трехкратной отмывки зуба стерильным раствором Хенкса с антибиотиками его дополнительно обрабатывают при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл; после аспирации содержимого канала зуба в шприц с ферментом его переносят в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37°; полная питательная среда, в которой ресуспендируют осадок клеток, включает 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК; после помещения клеток в культуральный флакон его помещают на 1 час в термошейкер при температуре +37°С, скорости 50 об/ мин; осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа; при культивировании в CO-инкубаторе смену среды проводят каждые 5 суток; на 4 пассаже определяют количество и жизнеспособность клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК; после аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55; деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.
Предлагаемый способ одновременного безотходного получения МСК и деминерализованного дентина значительно оптимизирует производственный цикл, снижает время, расход сырья и трудозатраты, позволяя получить продукты для регенеративной медицины, в частности обладающие оптимальными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами для успешной регенерации костной ткани.
Использование помимо естественно выпавших молочных зубов, зубы у детей, удаленные по ортодонтическим показаниям расширяет возможности получения биоматериала.
Дополнительная обработка зуба при помощи ультразвуковой ванны значительно снижает количество случаев контаминации материала.
Инкубирование содержимого канала зуба в шприце с ферментом в центрифужной пробирке в течение 2 минут в термошейкере при температуре 37° повышает качество ферментной обработки, выход клеток и качество получаемых биопродуктов в целом.
Низкочастотная ультразвуковая обработка с частотой 24-40 кГц позволяет выполнить первичную стерилизацию будущих биоматериалов. Этапный контроль эффективности деминерализации материала с помощью оптического метода, спектральная оценка поверхностей дентина до и после деминерализации стандартизирует характеристики получаемого продукта.
Способ реализуется следующим образом. Забор удаленных по ортодонтическим показаниям или естественно выпавших молочных зубов проводят как в домашних условиях, так и в условиях стоматологических учреждений при добровольном согласии родителей детей. Молочный зуб помещают в транспортировочный флакон со стерильным раствором Хенкса с антибиотиком.
После доставки в лабораторию зуб изымают из флакона, переносят в культуральную чашку Петри, проводят первичную отмывку биоматериала сначала трижды стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, затем при помощи ультразвуковой ванны с частотой ультразвуковых волн 40 кГц в течение 2 минут, используя стерильный раствор Хенкса с Гентамицином 8 мкг/ мл.
После отмывки зуб переносят при помощи стерильных инструментов в стерильную пробирку с раствором Хенкса и помещают в медицинский холодильник на 24 часа. Параллельно исследуют качество забора биоматериала на стерильность, для чего в транспортировочный флакон с раствором вносят 10 мкл эмбриональной телячьей сыворотки, герметично закрывают флакон крышкой и переносят ее в термостат на 24 часа при температуре 37°.
При отсутствии признаков контаминации в инсулиновый шприц набирают 0,2 мл 0,1% коллагеназы из панкреаса краба ООО «БиолоТ». Иглу шприца вводят в канал молочного зуба и аспирируют его содержимое в шприц; переносят полученный материал в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение 2 мин в термошейкере при температуре 37°.
Инактивируют действие фермента, добавляя в пробирку 2 мл стерильного 0,02% раствора Версена и 1 мл 10% полной ростовой среды α-МЕМ с глютамином; центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре+4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, тестированную на поддержание роста МСК, 8 мкг/мл гентамицина. Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего.
2
Высевают клетки в дозе 1×10 жизнеспособных кл./см в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой. Для равномерного распределения клеток по дну культурального пластика флакон помещают на 1 час в термошейкер, например, ES-20 Biosan Латвия, при температуре +37°С, скорости вращения 50 об/ мин. Осматривают состояние клеток при помощи инвертированного микроскопа.
2
2
Культивирование проводят в СО-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО и постоянной влажности. Смену среды проводят каждые 5 суток, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2. На 4 пассаже при получении в достаточном количестве клеток определяют их количество и жизнеспособность в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; проводят криоконсервацию МСК.
После аспирации содержимого канала для получения МСК зуб обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% раствором перекиси водорода. Убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением. Подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц.
Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 11 до 17, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое имеет значение от 2,6 до 3,3. Деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты. После деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1, которое принимает значение от 0,25 до 0,65, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1, которое принимает значение от 0,4 до 0,55. Деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.
Способ иллюстрируется клиническими примерами.
Пример 1. У ребенка П, 9 лет выпал молочный зуб. Мама ребенка переложила его в транспортный флакон и доставила его в биотехнологический центр. По предложенному способу была получена культура МСК и деминерализованный дентин. Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Клетки соответствовали иммунофенотипу МСК.
Характеристика полученных линий МСК: Клеток имели высокий индекс адгезии (90±0,2% - 96±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 90 до 97,8%. Клетки использовали для создания клеточно- тканевых трансплантатов.
Для получения дентина материал подвергали низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24 кГц. Перед деминерализацией отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 11, отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 2,6. После деминерализации в 2,4Н растворе соляной кислоты отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 0,25; отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1 0,4. Деминерализованный дентин использовали для выполнения костной пластики в стоматологии.
Пример 2. У ребенка Л, 10 лет в стоматологической клинике по ортодонтическим показаниям был удален молочный зуб. Врач переложил его в транспортный флакон и служба доставила его в биотехнологический центр. По предложенному способу была получена культура МСК и деминерализованный дентин.
Клетки прижизненно окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD90, CD105, CD73, CD10, CD44, CD45, CD34, CD117, CD14. Для каждой из исследуемых популяций клеток определяли количество окрашенных клеток и среднюю интенсивность флюоресценции. Клетки соответствовали иммунофенотипу МСК. Характеристика полученных линий МСК: Клеток имели высокий индекс адгезии (90 ±0,2% - 96 ±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8 ±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 90 до 97,8%>. Клетки использовали для создания клеточно-тканевых трансплантатов.
Для получения дентина материал подвергали низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 40 кГц. Перед деминерализацией отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 17, отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 3,3.
После деминерализации в 4,8Н растворе соляной кислоты отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см-1 к интенсивности линии Амида I 1660 см-1 имело значение 0,65; отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см-1 к интенсивности линии Амида 1 1660 см-1 0,55. Деминерализованный дентин использовали для выполнения костной пластики в стоматологии.
Способ может использоваться в специализированных биотехнологических центрах для получения культур клеток, биоматериалов для доклинической и клинической практики в области регенеративной медицины.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Патент RU 2679082 С1 от 05.02.2019 «Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток »
2. Патент RU 2726554 С1 от 27.02.2020 « Способ получения и культивирования фибробластоаподобных клеток из пульпы молочных зубов».