НОВЫЙ СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ В ОБРАЗЦЕ ПАНКРЕАТИНА
NEW METHOD FOR RECOVERY AND VIRAL LOAD TEST IN PANCREATINE SAMPLE

Настоящее изобретение относится к способу практически количественного отделения вирусной нагрузки от образца панкреатина и высокочувствительному способу количественного определения вирусной нагрузки в указанном образце панкреатина.
Панкреатин представляет собой уже давно известную смесь различных обладающих физиологической активностью компонентов, которую получают из панкреатических желез млекопитающих. Основными компонентами панкреатина являются пищеварительные ферменты, прежде всего панкреатическая липаза, а также амилазы и протеазы. Благодаря его ценным терапевтическим свойствам и высокой степени безопасности при применении панкреатин в течение длительного времени используют с большим успехом в качестве фармацевтического препарата в ферментной заместительной терапии. В этом отношении наибольшее значение имеет панкреатическая липаза, однако амилазы и протеазы также вносят значительный вклад в терапевтическое благоприятное действие панкреатина. Для терапевтических целей панкреатин, как правило, получают из крупного рогатого скота («бычий панкреатин») или свиней («свиной панкреатин»), при этом свиной панкреатин с количественной точки зрения имеет наибольшее значение. Методы получения панкреатина для терапевтических целей хорошо известны, например, они описаны в публикации ЕР 0115023 А.
Вследствие того, что панкреатин получают из организма животных, исходные продукты могут содержать нежелательные биологические компоненты, такие как бактериальные или вирусные примеси. Однако в течение более чем 100 лет коммерческого применения фармацевтических продуктов, содержащих панкреатин, не было зафиксировано ни одного случая вредного воздействия содержащего вирусные примеси панкреатина на пациентов. Тем не менее, компании, производящие фармацевтические продукты, которые получают из биологических тканей и/или общей воды организма, испытывают все возрастающее давление со стороны регулирующих административных органов в отношении повышения уровня безопасности выпускаемых ими продуктов путем снижения содержания всех примесей до максимального низкого уровня независимо от того, считается ли рассматриваемая примесь патогенной для человека или нет. Таким образом, для применения панкреатина в фармакологических продуктах желательно располагать надежными аналитическими методами обнаружения и количественной оценки таких биологических примесей.
До настоящего времени не был разработан надежный метод количественного обнаружения или выделения вирусных примесей в образце панкреатина. Это, по-видимому, обусловлено тем, что обладающие ферментативной активностью компоненты панкреатина несовместимы с линиями клеток, которые, как правило, применяют для размножения вирусов с помощью методов, известных обычным специалистам в данной области, что затрудняет или даже делает невозможным определение титра вируса в образце панкреатина.
Только в последние годы был разработан метод, позволяющий выделять и определять вирусную нагрузку в образце панкреатина (см. неопубликованную заявку на патент РСТ/ЕР2007/054880). Однако, поскольку вирусная нагрузка в полученных из организма животных препаратах типа панкреатина очень мала, то продолжает сохраняться потребность в разработке обладающих высокой чувствительностью методов выделения и определения вирусной нагрузки в фармацевтических препаратах, прежде всего, в препаратах панкреатина, предназначенных для фармацевтического применения.
Таким образом, в основу изобретения была положена задача разработать высокочувствительный способ практически количественного выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и способ количественного определения вирусной нагрузки в этом образце панкреатина. В частности, задача изобретения заключалась в том, чтобы разработать способ практически количественного выделения инфекционной вирусной нагрузки из образца панкреатина и способ количественного определения инфекционной вирусной нагрузки в этом образце панкреатина.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что вирусную нагрузку, прежде всего инфекционную вирусную нагрузку, в образце панкреатина можно практически количественно определять с высокой чувствительностью в том случае, когда вирусную нагрузку сначала выделяют из образца панкреатина с помощью многостадийного процесса центрифугирования и затем выделенную вирусную нагрузку количественно оценивают с использованием хорошо известных вирусологических методов.
В опубликованном JP 12856990 уже был описан метод концентрирования или выделения вирусов гепатита с использованием нестандартной комбинации низкоскоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования.
Первый вариант осуществления изобретения относится к способу выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина, заключающемуся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых:
а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки;
б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, не образуют дебрис;
в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования, и сохраняют супернатант опытного образца панкреатина;
г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, первому ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность первого ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для первого центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в первую целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией; и количественно выделяют первую целевую фракцию, необязательно включающую любой дебрис, присутствующий после центрифугирования, которая содержит вирусную нагрузку, из супернатанта опытного образца панкреатина;
д) подвергают первую целевую фракцию, полученную на стадии г), второму ультрацентрифугированию, где второе ультрацентрифугирование осуществляют при относительной центробежной силе, превышающей относительную центробежную силу при первом ультрацентрифугировании, в градиентной среде того же типа, который используют для первого ультрацентрифугирования, где градиентная среда представляет собой градиентную среду с более высокой концентрацией по сравнению с концентрацией компонента градиента с наименьшей концентрацией в первой целевой фракции, и
е) получают вторую целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку путем отбрасывания верхних 75 об.% или более жидкости верхнего слоя, соответствующего первой целевой фракции, и получают нижнюю фракцию, соответствующую нижним 25 об.% или менее жидкости верхнего слоя, и полный слой градиентной среды с более высокой концентрацией за исключением любого дебриса, который необязательно присутствует после центрифугирования.
Второй вариант осуществления изобретения относится к способу количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, прежде всего инфекционной вирусной нагрузки в образце панкреатина. Например, во втором варианте осуществления изобретения в дополнение к способу, предложенному в первом варианте осуществления изобретения, осуществляют после стадии е) способа дополнительную стадию ж) способа, которая заключается в том, что количественно определяют вирусную нагрузку в образце панкреатина путем определения титра вирусной инфекции в содержащей вирусную нагрузку целевой фракции, что позволяет определять инфекционную вирусную нагрузку в опытном образце.
Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, употребляемые ниже, должны иметь в каждом случае такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в конкретной области техники. Диапазоны температур, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «0-15°С», обозначают диапазон температур от 0°С до 15°С, включая в каждом случае границы диапазона. Интервалы времени, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «30-120 мин», обозначают интервал времени от 30 мин до 120 мин, включая в каждом случае границы диапазона. Интервалы времени, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «2-8 ч», обозначают интервал времени от 2 ч до 8 ч, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны относительной центробежной силы, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «1500-5000×g», обозначают относительную центробежную силу, находящуюся в диапазоне от 1500×g до 5000×g, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны объема, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «10-15 мл», обозначают диапазон объема от 10 мл до 15 мл, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны мер длины, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «80-100 мм», обозначают диапазон мер длины от 80 мм до 100 мм, включая в каждом случае границы диапазона.
Способ, предлагаемый в изобретении, можно применять для всех типов панкреатина животного происхождения и в частности его можно применять для обычных поступающих в продажу типов свиного панкреатина и бычьего панкреатина. Предпочтительно способ осуществляют на образцах свиного панкреатина.
Способ, предлагаемый в изобретении, в целом можно применять для выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и последующего количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина. В частности, способ можно применять для выделения и количественного определения вирусной нагрузки в образцах панкреатина, где вирусная нагрузка представляет собой ротавирус А коров, вирус энцефаломиокардита (EMCV), цирковирус свиней (PCV), парвовирус свиней (PPV), ротавирус А свиней, тешовирус свиней и/или вирус заболевания свиней с везикулярным синдромом (SVDV). Благодаря очень близким свойствам человеческий Коксаки-вирус В 5/1 можно использовать в качестве модели для проверки пригодности способа, предлагаемого в изобретении, для выделения и/или количественного определения SVDV. Благодаря очень близким свойствам ротавирус А коров (например, штамм В 223) можно использовать в качестве модели для проверки пригодности способа, предлагаемого в изобретении, для выделения и/или количественного определения ротавируса А свиней. Способ, предлагаемый в изобретении, можно применять также для определения вирусной нагрузки, обусловленной вирусом гепатита Е (HEV), в образце панкреатина путем выделения вирусной нагрузки согласно описанному способу и последующего анализа с помощью известных методов, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или т.п.
Применяемый на стадии а) способа, предлагаемого в изобретении, жидкий опытный образец панкреатина, который можно использовать для центрифугирования, получают из образца панкреатина без изменения или модификации в нем вирусной нагрузки, прежде всего инфекционной вирусной нагрузки. Это можно осуществлять, например, путем приготовления суспензии опытного образца панкреатина из образца панкреатина. Суспензию опытного образца панкреатина приготавливают, например, путем объединения образца панкреатина со средой для культуры клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования предназначенных для изучения видов вируса, и с одним или несколькими антибиотиком(ами), пригодным(и) для этой цели. В другом варианте осуществления изобретения суспензию опытного образца панкреатина получают путем объединения образца панкреатина с физиологическим раствором, в частности, с забуференным фосфатом физиологическим раствором («ЗФР», pH 7,2). Как правило, для получения раствора антибиотиков, который необязательно применяют на стадии а) способа, можно использовать любые антибиотики. Как правило, применяют антибиотики широкого спектра действия или смеси таких антибиотиков широкого спектра действия. Пригодные антибиотики можно выбирать, например, из группы, включающей антибиотики β-лактамового типа, такие как пенициллины, цефалоспорины (включая оксацефемы и карбацефемы), карбапенемы и монобактамы; стрептомицин (включая стрептомицина сульфат); неомицины (включая неомицин А, неомицин В и паромомицин); канамицины (включая канамицин, гентамицин, амикацин и тобрамицин); спектиномицин; тетрациклины (включая тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин и миноциклин); макролидные антибиотики (включая эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин, йозамицин и спирамицин); ингибиторы гиразы (включая налидиксиновую кислоту, циноксацин, пипемидиновую кислоту, норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин и флероксацин); антагонисты фолиевой кислоты (включая сульфонамидные антибиотики, диаминобензилпиримидины и их комбинации); хлорамфеникол; линкозамиды; гликопептидные антибиотики (включая ванкомицин и теикопланин); фосфомицин; полипептидные антибиотики (включая полимиксин В, колистин, бацитрацин и тиротицин) и мупироцин. Предпочтительными антибиотиками являются стрептомицина сульфат и пенициллин, и смеси стрептомицина сульфата и пенициллина, например, «коктейль» из антибиотиков. Один или несколько антибиотиков можно применять, например, в виде раствора в растворителе, который пригоден для одного или нескольких антибиотиков в каждом случае, т.е. в виде раствора антибиотиков.
Суспензию опытного образца панкреатина, как правило, приготавливают при охлаждении до температуры 0-15°С, например, до температуры 4-10°С. Компоненты для получения суспензии опытного образца панкреатина, как правило, перемешивают при охлаждении на льду в течение по меньшей мере 30 мин, например, 30-120 мин, предпочтительно 45-90 мин, в частности, в течение 50 или 60 мин. Цель охлаждения суспензии опытного образца панкреатина в каждом случае заключается в том, чтобы избежать или по меньшей мере существенно снизить любую нежелательную дезактивацию вирусной нагрузки, обусловленную обладающими ферментативной активностью компонентами, присутствующими в образце панкреатина.
В том случае, когда для приготовления суспензии опытного образца панкреатина используют среду для культур клеток, то выбор среды для культур клеток, применяемой в каждом случае для приготовления суспензии опытного образца панкреатина на стадии а) способа, определяется тем, какие виды вирусов требуется выделять и/или количественно определять с помощью способа, предлагаемого в изобретении. Для культивирования и обнаружения конкретных видов вирусов используют разрешенные для применения культуры клеток, в которых подлежащие изучению виды вирусов инициируют, если это возможно, цитопатический эффект (CPE). СРЕ приводит к модификации зараженных вирусом клеток, которую можно выявлять с помощью световой микроскопии. Если виды вирусов размножаются в культуре клеток без СРЕ, то, как правило, такое размножение можно, тем не менее, выявить с помощью хорошо известных непрямых методов обнаружения.
Если, например, требуется выделить и/или количественно определить ротавирус А коров, то можно, например, применять для его культивирования клетки почки эмбриона обезьяны (клетки линии МА-104). В этом случае в качестве среды для культуры клеток можно применять хорошо известную модифицированную по методу Дульбекко среду Игла (среда Дульбекко). Если требуется выделить и/или количественно определить EMCV, то для его культивирования можно применять клетки почки свиньи (клетки линии РК-15) или клетки почки эмбриона свиньи (клетки линии SPEV). В случае клеток линии РК-15 можно применять в качестве пригодной среды для культуры клеток, например, хорошо известную минимальную незаменимую среду (MEM). В случае клеток линии SPEV в качестве среды для культуры клеток можно применять среду Дульбекко. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить PCV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии РК-15. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить PPV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки почки свиньи (клетки линии SK-6). В этом случае в качестве среды для культуры клеток можно применять, например, среду Дульбекко. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить ротавирус А свиней, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии МА-104. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить тешовирус свиней, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии РК-15. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить SVDV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии SPEV. Специалист в данной области располагает сведениями о том, какие линии клеток пригодны для культивирования конкретных видов вирусов и какие среды для культивирования клеток можно использовать для этой цели. Виды вирусов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, и пригодные для этой цели линии клеток можно получать из соответствующих источников, таких, например, как «Американская коллекция типовых культур (American Туре Culture Collection)», Манассас, США (АТСС), «Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур ГмбН (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Брауншвейг, Германия (DSMZ), «Институт Фридриха-Леффлера (Friedrich-Loffler-Institut)», Федеральный исследовательский институт ветеринарии (Federal Research Institute for Animal Health), Инзель Риме, Германия (FLI) или «Отделение ветеринарной службы (Veterinary Service Division))) «Департамента сельского хозяйства и сельского развития (Department of Agriculture and Rural Development)», Белфаст, Великобритания (DARD).
На стадии б) способа опытный образец панкреатина, полученный на стадии а) способа, можно либо использовать полностью, либо можно использовать определенную часть опытного образца панкреатина, в частности, определенный объем этого опытного образца панкреатина. Предпочтительно опытный образец панкреатина, полученный на стадии а) способа, используют полностью.
На стадии б) способа при осуществлении низкоскоростного центрифугирования можно создавать условия, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, прежде всего от ≥120 S до 5000 S, еще не образуют дебрис. Как правило, вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, прежде всего вирусы, характеризующиеся константами седиментации от ≥120 S до 5000 S, еще не образуют дебрис, когда низкоскоростное центрифугирование осуществляют при относительно небольших центробежных силах, составляющих в каждом случае менее 15000×g, предпочтительно составляющих в каждом случае 8000-15000×g, наиболее предпочтительно составляющих в каждом случае 102000-13500×g, например, составляющих в каждом случае 10800×g. Продолжительность стадии низкоскоростного центрифугирования обычно составляет по меньшей мере 5 мин, как правило, 5-60 мин, прежде всего 10-45 мин, предпочтительно 10-30 мин, например, 15 мин. В предпочтительном варианте осуществления стадии б) способа стадии низкоскоростного центрифугирования осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С, например, до температуры 4-10°С, предпочтительно в охлаждаемой центрифуге.
Цель осуществления процедур низкоскоростного центрифугирования на стадии б) способа заключается в основном в удалении из суспензии панкреатина таких компонентов панкреатина, как нерастворимые частицы и т.д., которые разрушаются в процессе выделения и/или количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, для получения супернатанта опытного образца панкреатина, пригодного для дальнейшего процессинга. Таким образом, твердые отложения, которые необязательно получают на стадиях низкоскоростного центрифугирования, как правило, отбрасывают при осуществлении стадии в), в то время как супернатант используют на следующей стадии г) способа. Стадии низкоскоростного центрифугирования с последующим отбрасыванием необязательно полученных при этом твердых отложений, как правило, повторяют до тех пор, пока твердые отложения не перестают образовываться. Как правило, после осуществления 1-3 повторов, в частности, уже после одного повтора, не требуется дополнительных повторов стадий низкоскоростного центрифугирования с последующим отбрасыванием необязательно полученных при этом твердых отложений. В одном из вариантов осуществления изобретения твердое отложение, полученное при осуществлении стадии б) способа, может представлять собой осадок или дебрис.
В одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют отмывку отложения, полученного на стадиях низкоскоростного центрифугирования, перед его отбрасыванием один раз или более, например, 1-3 раза, с помощью пригодной жидкости для отмывки. Пригодной жидкостью для отмывки может служить, например, сам супернатант опытного образца панкреатина, полученный после низкоскоростного центрифугирования, который затем можно применять на стадии г) способа. Если жидкость для отмывки отлична от супернатанта опытного образца панкреатина, то после завершения отмывки отложения ее объединяют с супернатантом опытного образца панкреатина и затем используют на стадии г) способа. Наиболее предпочтительно осуществлять отмывку отложения указанным выше образом перед осуществлением стадии г) способа в том случае, когда вирусная нагрузка образца панкреатина представляет собой EMCV.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является также супернатант опытного образца панкреатина, который можно получать согласно указанным выше стадиям а)-в) способа.
В качестве среды со ступенчатым градиентом для стадии г) способа, как правило, используют ступенчатый двухфазный градиент сахарозы. Среда со ступенчатым градиентом предпочтительно представляет собой градиент, полученный с помощью 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. В качестве буфера для растворов сахарозы можно применять, например, нейтральные буферы (т.е. буферы со значением pH примерно 7). Предпочтительно в качестве буфера применяют ЗФР («забуференный фосфатом физиологический раствор», pH 7,2). Как правило, используют стерильные среды с градиентом. Двухфазный ступенчатый градиент сахарозы указанного выше типа обеспечивает наиболее пригодные условия для осаждения и следовательно для выделения вирусов, которые могут быть обнаружены. Кроме того, ступенчатые градиенты сахарозы, прежде всего полученные как указано выше с помощью 50% (мас./об.) необязательно забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об) забуференного раствора сахарозы, создают пригодные осмотические условия, которые не приводят к дезактивации любой присутствующей вирусной нагрузки.
Ультрацентрифугирование, осуществляемое на стадии г) способа, гарантирует, например, что вирусная нагрузка, источником которой является образец панкреатина, практически количественно переносится из супернатанта опытного образца панкреатина в среду со ступенчатым градиентом. Понятие «практически количественно» в данном случае означает, что вирусная нагрузка, первоначально добавленная к в опытному образцу, выделяется настолько полностью, что разница между титром исходной вирусной нагрузки и титром вирусной нагрузки, выделенной в результате ультрацентрифугирования, равна или составляет менее половины единицы десятичного логарифма титра вируса (0,5 log-единицы). Кроме того, первое ультрацентрифугирование согласно стадии г) способа гарантирует, что вирусная нагрузка переносится в первую целевую фракцию, достаточно удаленную от опытного образца панкреатина, чтобы можно было механически отделить ее от опытного образца панкреатина без какого-либо повторного смешения фаз, нарушающего требуемое отделение.
Стадию г) способа обычно осуществляют путем внесения в ультрацентрифужную пробирку взятой в определенном объеме среды для градиентного центрифугирования (градиентной среды) с наибольшей концентрацией, на которую наслаивают взятые в определенном объеме градиентные среды со следующими более низкими концентрациями. Этот процесс повторяют столько раз, сколько необходимо для получения многофазной градиентной среды, где конечный (верхний) слой представляет собой объем жидкого опытного образца панкреатина, из которого требуется выделить вирусную нагрузку. В случае двухфазной градиентной среды на объем градиентной среды со следующей более низкой концентрацией сразу наслаивают объем жидкого опытного образца панкреатина или суспензии опытного образца панкреатина (объем опытного образца панкреатина), предназначенного для центрифугирования. В случае двухфазной градиентной среды это позволяет создавать в ультрацентрифужной пробирке следующую последовательность фаз (сверху вниз): первый слой, представляющий собой объем опытного образца панкреатина (верхний слой), затем объем градиентной среды с наименьшей концентрацией (средний слой, например, представляющий собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы) и, наконец, объем градиентной среды с наибольшей концентрацией (нижний слой, покрывающий дно ультрацентрифужной пробирки; например, 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы). При наслаивании каждого из объемов необходимо соблюдать осторожность для того, чтобы гарантировать, что на соответствующих границах не возникало турбулентности или перемешивания.
Первая целевая фракция, используемая на стадии г) способа, как правило, представляет собой (I) часть градиентной среды с наименьшей концентрацией, которая достаточно удалена и отделена от объема опытного образца панкреатина, и (II) весь объем градиентной среды со следующей более высокой концентрацией. В случае двухфазной градиентной среды целевая фракция представляет собой, например, часть градиентной среды с наименьшей концентрацией, которая достаточно удалена и отделена от объема опытного образца панкреатина, и весь объем градиентной среды с наибольшей концентрацией, простирающийся до дна ультрацентрифужной пробирки, необязательно включая дебрис, находящийся на дне этой пробирки.
При расчете положения первой или второй целевой фракции, которая достаточно удалена от объема опытного образца панкреатина для того, чтобы можно было осуществлять последующее отделение, следует иметь в виду, что получаемые расчетом значения для положения частиц (т.е. положение вирусных частиц, выделенных из образца панкреатина), как правило, соответствуют вершине гауссовского распределения. В таком случае частицы должны быть распределены как выше, так и ниже их полученного расчетом положения. Таким образом, при определении требуемого расстояния целевой фракции от объема опытного образца панкреатина необходимо брать дополнительный запас для учета гауссовского распределения положений частиц. Вирусную нагрузку обычно переносят в целевую фракцию, которая достаточно удалена от объема опытного образца панкреатина для того, чтобы можно было осуществлять последующее отделение, если частицы, характеризующиеся константой седиментации, составляющей ≥120 S, в частности от ≥120 S до 5000 S, мигрировали вследствие ультрацентрифугирования из объема опытного образца панкреатина по меньшей мере на 10 мм, например, по меньшей мере на 15 мм, по меньшей мере на 20 мм, по меньшей мере на 25 мм или по меньшей мере на 30 мм в градиентную среду с наименьшей концентрацией. В случае описанной выше двухфазной градиентной среды градиентная среда с наименьшей концентрацией представляет собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы. В одном из вариантов осуществления стадии ультрацентрифугирования практически все частицы, характеризующиеся константой седиментации, составляющей ≥120 S, в частности, составляющей от ≥120 S до 5000 S, полностью проходили через градиентную среду с наименьшей концентрацией и концентрировались в пограничном слое, примыкающем к градиентной среде со следующей более высокой концентрацией (т.е. на «сахарозной подушке»). Специалист в данной области должен обладать сведениями о пригодных методах расчета и уметь применять соответствующие условия для ультрацентрифугирования. Пригодные условия для ультрацентрифугирования можно определять на основе характеристик вируса(ов), подлежащего(их) выделению из образца панкреатина (например, плотности и константы седиментации), при этом подразумевается, что можно применять хорошо известные упрощения (см., например, Lebowitz и др., «Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review»; Protein Science 11, 2002, cc.2067-2079).
При условии, что первое ультрацентрифугирование осуществляют с использованием обычных объемных соотношений и в среде со ступенчатым градиентом, предпочтительно в двухфазном ступенчатом градиенте сахарозы, то вирусную нагрузку, как правило, транспортируют в первую целевую фракцию, пригодную для последующего выделения с помощью второго ультрацентрифугирования, если первое ультрацентрифугирование осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, как правило, по меньшей мере 4 ч, например, в течение по меньшей мере 9 ч, например, в течение 9-20 ч, в частности, в течение 12-18 ч. Пригодная относительная центробежная сила для первого ультрацентрифугирования, указанного в настоящем описании, составляет по меньшей мере 50000×g и/или менее 150000×g. В одном из вариантов осуществления первой стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 12-18 ч при относительной центробежной силе, составляющей 50000-150000×g, в объемных соотношениях, обычно применяемых для ультрацентрифугирования, и в градиенте, полученном с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. В другом варианте осуществления первой стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 15-17 ч при относительной центробежной силе, составляющей 70000-120000×g, в объемных соотношениях, обычно применяемых для ультрацентрифугирования, и в градиенте, полученном с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. Объемные соотношения, обычно применяемые для ультрацентрифугирования, получают, например, в том случае, когда применяют обычные ультрацентрифужные пробирки. Обычными ультрацентрифужными пробирками в данном случае являются, например, пробирки имеющие объем 10-50 мл, в частности, 25-50 мл. В том случае, когда на стадии г) способа используют обычную ультрацентрифужную пробирку, объем среды для градиентного ультрацентрифугирования с наибольшей концентрацией (например, 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, до 2 мл, объем градиентной среды со следующей более низкой концентрацией (например, 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, до 14 мл, и объем опытного образца панкреатина может составлять, например, до 17 мл.
Второе ультрацентрифугирование осуществляют на стадии д) с использованием первой целевой фракции, полученной на стадии г), помещая указанную первую целевую фракцию на подушку градиентной среды. Указанная подушка градиентной среды представляет собой, например, градиентную среду того же типа, которую применяли при осуществлении первого ультрацентрифугирования, при этом градиентная среда представляет собой градиентную среду с более высокой концентрацией по сравнению с концентрацией компонента градиента с наименьшей концентрацией первой фракции. Например, если в случае первого ультрацентрифугирования ступенчатый градиент для центрифугирования при использовании описанной выше системы представляет собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы и 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы, то полученная первая целевая фракция представляет собой забуференный раствор сахарозы с концентрацией более 20% (мас./об.) и менее 50% (мас./об.). В этом случае сахарозная подушка может представлять собой 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы. Первая целевая фракция, используемая на стадии г), как правило, содержит также весь, необязательно присутствующий после первого центрифугирования.
Второе ультрацентрифугирование осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, как правило, в течение по меньшей мере 2 ч, например, в течение 2-8 ч, в частности, в течение 3-6 ч. Пригодная относительная центробежная сила для указанного в настоящем описании второго ультрацентрифугирования составляет по меньшей мере 100000×g, например, превышает 150000×g, например, составляет 150000-350000×g. В одном из вариантов осуществления второй стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 3-6 ч при относительной центробежной силе 200000-350000×g при объемных соотношениях, общепринятых при осуществлении ультрацентрифугирования. В другом варианте осуществления второй стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 4,5-5,5 ч при относительной центробежной силе 250000-300000×g при объемных соотношениях, общепринятых при осуществлении ультрацентрифугирования. Объемные соотношения, обычно применяемые для ультрацентрифугирования, получают, например, в том случае, когда применяют обычные ультрацентрифужные пробирки. Обычными ультрацентрифужными пробирками в данном случае являются пробирки имеющие объем 10-15 мл, в частности, 12-13 мл; внутренний радиус 6-8 мм, в частности, 7 мм, и высоту 80-100 мм, в частности, 85-95 мм. В том случае, когда на стадии г) способа используют обычную ультрацентрифужную пробирку, объем градиентной подушки (например, 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, до 0,5 мл, а объем первой целевой фракции может составлять, например, до 10 мл.
Настоящее изобретение позволяет проводить обнаружение с пределом обнаружения, составляющим вплоть до одной инфекционной единицы на один грамм образца панкреатина, используемого в качестве исходного продукта.
В предпочтительном варианте осуществления стадий г) и д) способа вне зависимости от прочих выбранных условий ультрацентрифугирование осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С, предпочтительно до температуры 4-10°С.
На этой стадии способа можно применять обычные охлаждаемые центрифуги, известные специалисту в данной области. На стадиях г) и д) способа, как правило, применяют обычную поступающую в продажу ультрацентрифугу, такую как охлаждаемая ультрацентрифуга с ротором с качающимися стаканами, например, ультрацентрифуга Sorvall с ротором с качающимися стаканами модели «ТН-641».
Специалист в данной области, опираясь, прежде всего на дополнительную техническую информацию, приведенную в описании настоящего изобретения, может повышать или понижать масштаб описанных выше стадий низкоскоростного центрифугирования и стадий ультрацентрифугирования, предлагаемых в изобретении, в любой требуемой степени.
На стадиях г) и е) способа первую или вторую целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку, количественно выделяют из супернатанта опытного образца панкреатина и первой целевой фракции соответственно. Выделение, как правило, осуществляют, устанавливая метку на ультрацентрифужную пробирку на предварительно определенной высоте границы фракции-мишени. Затем весь объем, находящийся выше этой границы, удаляют от оставшегося объема, например, путем аспирации. Аспирацию можно осуществлять, например, с помощью обычного шлангового насоса, трубопровода и капилляров, которые перед этим следует подвергнуть стерилизации. Пригодная скорость откачки составляет, например, 2 мл/мин. В процессе аспирации следует принимать меры для того, чтобы капилляр шлангового насоса всегда находился на верхней границе жидкости. Целевую фракцию, оставшуюся в ультрацентрифужной пробирке, можно затем удалять из ультрацентрифужной пробирки хорошо известным методом с помощью обычной одноканальной пипетки, предпочтительно со стерильным концом. В это же время можно удалять любой осадок, все еще остающийся в ультрацентрифужной пробирке, например, путем повторного всасывания и ресуспендирования с использованием одноканальной пипетки.
Один из вариантов осуществления изобретения относится также к выделенной второй целевой фракции, которую можно получать с помощью стадий а)-е) способа.
Если требуется осуществлять способ количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, то после стадии е) способа следует осуществлять стадию ж) способа. На стадии ж) способа вирусную нагрузку в образце панкреатина количественно определяют путем определения титра вирусной инфекции в целевой фракции, содержащей вирусную нагрузку. В данном случае количественное определение титра вирусной инфекции в целевой фракции можно осуществлять согласно рабочим процедурам, хорошо известным в области вирусологии, например, с помощью хорошо известного метода определения титра вирусной инфекции (VITD).
Можно, например, разводить вторую целевую фракцию в соответствующем соотношении пригодной средой для культивирования клеток или соляным раствором, например, ЗФР, для получения опытного образца, предназначенного для определения вируса. В качестве пригодных сред для культивирования клеток можно использовать указанные выше среды, в каждом случае соответствующие исследуемым видам вирусов. В одном из вариантов осуществления изобретения для исключения ложных положительных ответов («хитов») на присутствие вирусной инфекции разведенную или неразведенную целевую фракцию можно фильтровать через микрофильтр перед количественным определением вирусной нагрузки на стадии ж).
50
50
Пригодное разведение можно получать, например, путем разведения целевой фракции средой для культивирования клеток или соляным раствором до достижения первоначального объема супернатанта опытного образца панкреатина, использованного на стадии г) способа. Затем в качестве первого шага можно сначала приготавливать хорошо известным методом серийные разведения опытных образцов, предназначенных для определения вируса, например, с использованием коэффициентов разведения 1:2, 1:5 или 1:10 или также комбинаций указанных стадий разведения, для осуществления количественного VITD. Затем в качестве второго шага можно осуществлять хорошо известным методом инокуляцию пригодной суспензии клеток опытными образцами, предназначенными для определения вируса, имеющими различные концентрации из серийных разведений, после чего дают сформироваться слою клеток на предназначенных для определения вируса опытных образцах с различными концентрациями. После этого для исключения ложных положительных ответов на наличие вирусной инфекции, которые могут быть обусловлены присутствием микроорганизмов, таких как инертные бактерии или микоплазмы, как правило, целесообразно осуществлять фильтрацию опытных образцов, предназначенных для определения вируса, перед осуществлением инокуляции ими клеток-детекторов. Для этой цели опытный образец, предназначенный для определения вируса, или разведенный опытный образец, предназначенный для определения вируса, можно фильтровать через фильтр с соответствующим размером пор, такой как микрофильтр, например, микрофильтр с размером пор (т.е. диаметром пор) от 0,1 до 10 мкм (включая границы указанного диапазона; т.е. осуществлять микрофильтрацию), предпочтительно от 0,1 до 0,45 мкм, как правило, микрофильтр с размером пор (т.е. диаметром пор) 0,1 мкм. Затем фильтрат можно использовать в качестве опытного образца для дальнейших исследований. После этого в качестве третьего шага в инокулированных опытных образцах определяют уровень инфекции с помощью метода, зависящего от типа инфекции. Когда, например, можно использовать СРЕ в качестве индикатора заражения слоя клеток, то СРЕ определяют хорошо известным методом по истечении примерно 4-7 дней. Титрование (по методу конечных разведений) опытных образцов, предназначенных для определения вируса, позволяет в данном случае количественно определять присутствующую в исходном образце инфицирующую дозу. Титрование обычно осуществляют путем разведения с коэффициентов 10, т.е. на основе десятичной логарифмической шкалы. На практике обычно рассчитывают среднюю (50%) инфицирующую дозу (ID). В случае нескольких параллельных партий выявленное значение ID соответствует наибольшему (обратная величина) разведению опытного образца, предназначенного для определения вируса, при котором СРЕ можно выявить ровно в половине партий. Результаты необязательно можно дополнительно корректировать или интерполировать хорошо известным методом с помощью компьютера. Наиболее широко распространенными методами расчета титров вирусов являются методы Спирмана и Кэрбера (см. С.Spearman, Br. J. Psychol. 2, 1908, cc. 227-242, и G. Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162, 1931, cc. 480-483; a также Bundesanzeiger [Federal gazette] №84, 4 мая 1994 г.) или Reed и Muench (см. Reed L.J., Muench H., Am. J. Hyg. 27, 1938, cc.493-497).
Можно использовать также другие индикаторы заражения клеточного слоя, такие, например, как индукция вирусного антигена или индукция бляшки. Специалисту в данной области известны такие методы и их применения для рассматриваемого случая, например, они описаны в таких учебниках по вирусологии, как H.W.Doerr и W.H.Gerlich, «Medizinische Virologie», изд-во Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1-е изд, 2002 г., или в более современных изданиях этой книги.
Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, можно применять прежде всего для анализа более крупных образцов панкреатина, используемых в качестве исходного продукта. Использование больших количеств исходного продукта, как правило, позволяет определять вирусную нагрузку с большей чувствительностью, а именно, выявлять более низкое количество инфекционных единиц на грамм продукта. Так, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, наиболее пригоден для анализа исходного продукта в количестве, составляющем по меньшей мере 5 г, например, 8, 10 или 12 г.
Примеры
Все процедуры, указанные в приведенных ниже примерах, осуществляли в стерильных условиях на стерильном лабораторном столе. Необходимо соблюдать все процедуры, которые обычно применяют в вирусологических лабораториях, например, процедуры, обеспечивающие безопасность. Применяли, среди прочего, следующие материалы:
1. раствор антибиотиков, 1,0 г стрептомицина сульфата и 1,2 г пенициллина растворяли в 20 мл дважды дистиллированной воды и фильтровали через фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Затем фильтрат разделяли на аликвоты объемом по 1 мл и необязательно хранили при -20°С до использования;
2. среду Дульбекко, среду для культур клеток, которую использовали для клеток линии SK 6, клеток линии SPEV и клеток линии МА 104;
3. одноканальные пипетки со стерильными концами;
4. FCS, фетальную телячью сыворотку, которую получали от фирмы Bio Whittaker (сыворотка);
2
5. колбы для культур тканей, стерильные, площадь дна колбы составляла в каждом случае 25, 75 или 175 см;
6. MEM, среду для культур тканей, дополненную 1,5 г/л бикарбоната натрия и 1 мМ пируватом, которую использовали для клеток линии РК-15;
7. титрационные микропланшеты, стерильные, 96-луночные с крышкой;
8. суспензию PAN, 10%-ную суспензию, панкреатина; отвешивали 8,0 г свиного панкреатина (если не указано иное) в стерильных условиях и вносили в лабораторный стакан, объединяли с 8 мл раствора антибиотиков и (если не указано иное) с 64,0 мл конкретной соответствующей среды для клеточных культур или ЗФР и (если не указано иное) суспендировали в течение 60 мин в ледяной бане при перемешивании;
9. буфер Pardee, буфер Pardee, содержащий диоксид углерода;
10. ЗФР, стерильный «забуференный фосфатом физиологический раствор» (pH 7,2);
11. пипетки, стерильные;
12. наконечники для пипеток, стерильные в стерильных поддонах;
2

13. пластиковые мешки, непроницаемые для СО, снабженные застежкой («Anaerocult» фирмы Merck);
14. поликлональное антитело к PPV, конъюгированное с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), приобретали у фирмы NatuTec GmbH;
15. пробирки, стерильные вместимостью 15 и 50 мл;
16. раствор сахарозы, 20%, забуференный ЗФР, стерильный; концентрацию регулировали хорошо известным методом с помощью обычного рефрактометра;
17. раствор сахарозы, 50%, забуференный ЗФР, стерильный; концентрацию регулировали хорошо известным методом с помощью обычного рефрактометра;
18. пробирки с завинчивающейся крышкой, стерильные;

19. раствор трипсина, «TrypL Express», приобретали у фирмы INVITROGEN;
20. шланговый насос, приобретали у фирмы «ismaTec», скорость накачки вплоть до 5,8 мл/мин;

21. охлаждаемую ультрацентрифугу, «Sorvall Pro 80» с ротором типа «ТН-641»;
22. ультрацентрифужные пробирки, стерильные вместимостью 11 мл, размеры 9×90 мм;
23. блоки для разведений, 96-луночные вместимостью по 1,0 мл/лунку;
24. клетки линии МА-104: приобретали у фирмы FLI;
25. клетки линии РК-15: приобретали у фирмы DARD;
26. клетки линии SK-6: приобретали у фирмы FLI;
27. клетки линии SPEV: приобретали у фирмы FLI;
28. суспензии клеток линий SK 6, SPEV и РК-15, предназначенные для тестирования, содержащие во 200000 клеток/мл в среде для культур клеток, дополненной 10% FCS;
29. стерильные микропробирки типа Falcon вместимостью 15 мл.
Пример 1: Исследование вредного воздействия панкреатина на различные линии клеток
При проведении обнаружения вирусов в материале опытных образцов с использованием клеточных культур необходимо оценивать вредное воздействие подлежащего изучению образца панкреатина на клетки для того, чтобы иметь возможность исключить ложные отрицательные результаты при оценке СРЕ. Поэтому были проведены описанные ниже исследования по оценке вредного воздействия суспензии опытного образца панкреатина на различные линии клеток.
Для тестирования вредного воздействия брали порции суспензии PAN объемом по 0,5 мл, которую обозначали как «опытный образец суспензии панкреатина».

Низкоскоростное центрифугирование: Оставшуюся часть суспензии PAN центрифугировали в течение 15 мин при 10000 об/мин (10800×g) и 4°С в обычной охлаждаемой центрифуге (Biofuge 22R Heraeus SEPATECH с фиксированным углом ротора №3745). После низкоскоростного центрифугирования супернатант центрифугировали еще в течение 15 мин при 10000 об/мин и 4°С и обозначали его как «супернатант, полученный после низкоскоростного центрифугирования», который применяли для титрования вирусов и ультрацентрифугирования. Два осадка, полученные в каждом случае после низкоскоростного центрифугирования, объединяли (общий объем 1 мл), ресуспендировали в 9 мл соответствующей пригодной среды для культур клеток и обозначали как «осадок» или дебрис.
Первое ультрацентрифугирование: опытный образец «супернатанта, полученного после низкоскоростного центрифугирования» подвергали первому ультрацентрифугированию на ультрацентрифуге. Для этой цели вносили с помощью пипетки по 2 мл 50% (мас./об.) раствора сахарозы в такое количество ультрацентрифужных пробирок, которое требовалось для осуществления анализа. Держа ультрацентрифужную пробирку под наклоном, осторожно наслаивали 14 мл 20%-ного раствора сахарозы поверх 50%-ного раствора сахарозы, при этом между двумя растворами образовывался различимый разделяющий слой. Затем также осторожно и избегая турбулентности и перемешивания на 20%-ный раствор сахарозы наслаивали слой взятого как описано выше опытного образца «супернатанта, полученного после низкоскоростного центрифугирования», объемом 17,0 мл. После этого ультрацентрифужные пробирки подвешивали в ультрацентрифужный ротор. Для этой цели в каждом случае две ультрацентрифужные пробирки на противоположных сторонах ротора уравновешивали с помощью ЗФР, вставляли в соответствующие держатели и плотно закрывали прилагаемой к пробирке крышкой. После установки держателей в ротор опытные образцы центрифугировали в течение 16 ч при 10°С и 22000 об/мин (87000×g). После ультрацентрифугирования ультрацентрифужные пробирки вынимали из держателей на стерильном лабораторном столе и наносили метку на высоте 5 см от дна ультрацентрифужной пробирки. С помощью шлангового насоса, трубопровода и капилляров, которые предварительно были простерилизованы, жидкость, находящуюся выше метки, удаляли путем аспирации из ультрацентрифужной пробирки при скорости откачивания 2 мл/мин, при этом капилляр всегда находился на верхней границе жидкости. Эту полученную таким образом первую фракцию обозначали как «верхняя фракция после первого ультрацентрифугирования». «Нижнюю фракцию после первого ультрацентрифугирования» (1,5 мл), оставшуюся в ультрацентрифужной пробирке, в каждом случае удаляли из ультрацентрифужной пробирки с помощью одноканальной пипетки. Любой осадок, который мог остаться на дне ультрацентрифужной пробирки, ресуспендировали путем повторного всасывания с помощью одноканальной пипетки и также удаляли. «Нижнюю фракцию после первого ультрацентрифугирования», содержащуюся во всех пробирках, объединяли и использовали непосредственно для второго ультрацентрифугирования. До осуществления последующей обработки две полученные таким образом фракции хранили при 4°С или, в случае длительного хранения, при -20°С.
Второе центрифугирование осуществляли в двух пробирках вместимостью по 11 мл в течение 5 ч при 4°С и 272000×g. Сначала в пробирки вносили подушку градиентной среды, представляющей собой 50% (мас./об.) раствор сахарозы (0,5 мл). Затем 5 мл первой целевой фракции наслаивали на градиентную подушку и осуществляли указанное ультрацентрифугирование. После отбрасывания верхней фракции со дна каждой пробирки удаляли по 1,5 мл для исключения дебриса.
Затем опытные образцы, представляющие собой «опытный образец суспензии панкреатина», «супернатант после низкоскоростного центрифугирования», «осадок» (после низкоскоростного центрифугирования), «верхнюю фракцию после первого ультрацентрифугирования» и «нижнюю фракцию после первого ультрацентрифугирования» (после доведения объема до 5,0 мл), а также «верхнюю фракцию после второго ультрацентрифугирования» и «нижнюю фракцию после второго ультрацентрифугирования», анализировали в отношении их вредного воздействия на различные линии клеток. Для этого приготавливали в каждом случае серийные разведения опытных образцов. Все предназначенные для тестирования опытные образцы подвергали дополнительному разведению с коэффициентом 2, начиная с разведения 1:5, с помощью соответствующей пригодной среды для культур клеток. В титрационные микропланшеты добавляли в 8 повторностях порции по 100 мкл на лунку суспензии клеток, содержащей клетки линии РК-15, SPEV или SK 6, в каждом случае 100 мкл полученных разведений опытных образцов к 100 мкл свежеполученной суспензии клеток. Когда тестировали клетки линии МА 104, то использовали титрационные микропланшеты со слоем клеток, нанесенным за 24 ч до этого. Для этой цели в каждом случае среду для культур клеток удаляли из лунок и заменяли 100 мкл свежей среды для культур клеток, не содержащей сыворотку, получая конечные разведения опытного образца 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. В качестве контроля в восемь лунок каждого титрационного микропланшета вносили по 100 мкл среды для культур клеток вместо 100 мкл серийных разведений. Пары планшетов вместе с пробиркой, содержащей 4 мл буфера Pardee, и фильтровальной бумагой помещали в воздухонепроницаемые пакеты и плотно закрывали с помощью закрывающего зажима. Затем планшеты инкубировали при 36±1°С в течение периода времени вплоть до 7 дней. В течение периода инкубации планшеты ежедневно обследовали с помощью микроскопа в отношении уровня СРЕ, т.е. в отношении лизиса клеток и/или дегенеративных изменений клеток и отсутствия образования слоя клеток в результате вредного воздействия панкреатина. Конечное обследование проводили через семь дней. Титрование повторяли в том случае, если дегенеративные изменения клеток обнаруживали уже в контролях при осуществлении конечного считывания.
Результаты тестирования различных опытных образцов в отношении их вредного воздействия на различные линии клеток свидетельствуют об отсутствии вредного воздействия «нижней фракции после второго ультрацентрифугирования», полученной из панкреатина, на различные линии клеток.
Результаты продемонстрировали, что «нижняя фракция после первого ультрацентрифугирования» и «нижняя фракция после второго ультрацентрифугирования», которые подвергали первой или первой и второй стадии ультрацентрифугированию согласно изобретению соответственно и в которых сконцентрирована вирусная нагрузка, оказывали существенно более низкое вредное воздействие на исследованные линии клеток по сравнению со всеми другими опытными образцами.
Пример 2: Анализ влияния различных концентраций панкреатина на вирусную нагрузку
Описанный выше способ двухстадийного ультрацентрифугирования, предлагаемый в настоящем изобретении, применяли для выделения вирусов из суспензий с различными концентрациями порошкообразного панкреатина. Выделение вирусов из панкреатина являлось предпосылкой для определения низких вирусных нагрузок путем титрования с использованием чувствительных линий клеток:
- 8 г лекарственной субстанции смешивали с 8 мл раствора антибиотиков (1,0 г стрептомицина сульфата и 1,2 г пенициллина G на 20 мл стерильного ЗФР) и 64 мл ЗФР и перемешивали в бане с ледяной водой в течение 60 мин;
- полученную суспензию центрифугировали при 4°С в течение 15 мин при 10800×g;
- супернатант после первого центрифугирования еще один раз подвергали центрифугированию при 4°С в течение 15 мин при 10800×g.
Супернатант, полученный после низкоскоростного центрифугирования, использовали для первого ультрацентрифугирования. Первое ультрацентрифугирование осуществляли с использованием ступенчатого градиента сахарозы (на 2 мл 50% (мас./об.) сахарозы и 14 мл 20% (мас./об.) сахарозы, содержащиеся в четырех центрифужных пробирках, наслаивали 17 мл супернатанта после низкоскоростного центрифугирования). Эта процедура позволяет отделять вирусные частицы от основной части суспензии панкреатина при соответствующих условиях. Вирусы из смеси вирусы/суспензия панкреатина концентрировались в пограничном слое между 50% (мас./об.) и 20% (мас./об.) сахарозой при соответствующих условиях центрифугирования. Растворимые панкреатиновые компоненты оставались после центрифугирования в супернатанте, находящемся над вирусным слоем. Вирусную фракцию отделяли от панкреатиновых слоев путем фракционированного отсасывания градиента сахарозы. Полученную вирусную фракцию снова подвергали ультрацентрифугированию для дальнейшего концентрирования вирусов на 50% (мас./об.) сахарозной подушке.
Первое центрифугирование осуществляли в четырех пробирках вместимостью по 36 мл в течение 16 ч при 4°С и 87000×g. После центрифугирования со дна каждой пробирки удаляли по 5 мл продукта.
Затем осуществляли второе центрифугирование в двух пробирках вместимостью по 11 мл в течение 5 ч при 4°С и 272000×g. Со дна каждой пробирки удаляли по 5 мл продукта. В результате получали 3 мл вирусного концентрата из 8 г порошкообразного панкреатина. Образцы хранили при -20°С.
Анализы инфективности
Анализ инфективности основан на предположении о том, что низкую вирусную нагрузку в образце можно выявлять с помощью трех последовательных пассажей образца с использованием чувствительных линий клеток. Содержащиеся в нем вирусы могут инфицировать новые клетки и амплифицироваться при этих пассажах, приводя к увеличению вирусного титра. Применяя многочисленные методы культивирования с использованием больших объемов можно после трех пассажей клеток обнаруживать даже один инфекционный вирус, характеризующийся такой низкой скоростью амплификации, как 10 (10 вирусов на 1 инфекционный вирус после инкубации в течение 6 дней), по образованию примерно 1000 бляшек на клеточном газоне после третьего пассажа.
Поэтому вирусные фракции, экстрагированные из образцов панкреатина, применяли для осуществления трех последовательных пассажей с использованием клеток линии SK 6 для выявления инфекционных парвовирусов свиней.
1-й пассаж (вирусная фракция объемом 1 мл = 2,66 г панкреатина)
Одной третью каждого индивидуального вирусного концентрата (1 мл из 3 мл) осуществляли инокуляцию содержащихся в колбе для культуры тканей площадью 75 см 30 мл среды для культуры клеток, дополненной 5% FCS, и выращенного в течение 24 ч субконфлюэнтного газона клеток линии SK 6. Содержащуюся в колбе культуру клеток инкубировали при 37±1°С в течение 6 дней.
Формирование цитопатических эффектов (бляшки) проверяли в процессе инкубации и по окончании периода инкубации с помощью инвертированного микроскопа. Пассаж прекращали путем создания вирусного/клеточного лизата с помощью двух циклов замораживания/оттаивания всего содержимого колбы для культуры ткани. Вирусный/клеточный лизат подвергали низкоскоростному центрифугированию (2800×g в течение 15 мн), получая свободный от клеток супернатант. Этот супернатант после низкоскоростного центрифугирования (30 мл на партию) фильтровали через фильтр с размером пор 0,1 мкм в качестве меры безопасности для снижения возможного загрязнения лизата микоплазмами.
2-й пассаж
2
Для второго пассажа каждой партии подготавливали колбу для культуры ткани площадью 75 см, содержащую 22,5 мл среды для культуры клеток, дополненной 5% FCS, и выращенный в течение 24 ч газон клеток линии SK 6. Добавляли 7,5 мл супернатанта культуры клеток, полученного после первого пассажа (=25%). Колбы инкубировали в течение 6 дней при 37±1°С и проверяли в отношении цитопатического эффекта с помощью инвертированного микроскопа.
Лизат вирусов/клеточной культуры (30 мл на партию) получали согласно процедуре, описанной для первого пассажа.
3-й пассаж
2
Для каждой партии приготавливали колбы для культуры ткани площадью 75 см согласно описанной выше процедуре. В каждую колбу вносили по 7,5 мл лизата вирусов/клеточной культуры, полученного после 2-го пассажа (=25%), и 22,5 мл среды для клеточной культуры, дополненной 5% FCS. Колбы инкубировали в течение 6 дней при 37±1°С и обследовали в отношении цитопатических эффектов с помощью инвертированного микроскопа.
Лизат вирусов/клеточной культуры (30 мл на партию) получали согласно процедуре, описанной для 1-го и 2-го пассажей.
4. Обнаружение парвовируса свиней (PPV) с помощью иммуноокрашивания с использованием конъюгированных с ФИТЦ антител к PPV
Подготавливали титрационные 96-луночные микропланшеты и выращенный в течение 24 ч газон клеток линии SK 6. 30 лунок инфицировали, внося в каждую по 100 мкл лизата вирусов/клеточной культуры, полученного после 3-го пассажа (=10%), и инкубировали при 37±1°С в течение 24 ч.
После инкубации отделяли супернатант клеточной культуры от клеток и газон клеток фиксировали с использованием охлажденной на льду смеси, содержащей 80% ацетона и 20% метанола. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора конъюгированного с ФИТЦ антитела к PPV и планшеты инкубировали в течение 45 мин при 37±1°С. После удаления раствора антитела газон клеток трижды отмывали ЗФР и покрывали 15%-ным раствором глицерина в ЗФР. Обнаружение клеток, инфицированных парвовирусом, осуществляли с помощью инвертированного микроскопа в УФ-свете.
Параллельно с образцами панкреатина на тех же титрационных микропланшетах осуществляли титрование парвовируса свиней NADL-2 с известным титром в качестве положительного контроля.
Пассажи всех тестируемых образцов на клетках линии SK 6 осуществляли параллельно с положительными контролями согласно описанной выше процедуре. С помощью этого метода оказалось возможным сравнивать формирование бляшек/цитопатических эффектов, типичных для парвовируса свиней, при использовании образцов панкреатина и положительных контролей.
Результаты, полученные при культивировании, представлены в таблице.
Результаты, полученные при пассажах тестируемых образцов с использованием клеток линии SK 6 в колбах для клеточных и тканевых культур
Номер партии порошкообраз-ного панкреатина
Результаты выявления цитопатических эффектов, полученные при пассажах вирусных фракций образцов панкреатина на клетках линии SK 6 в колбах для культуры ткани
1-й пассаж
2-й пассаж
3-й пассаж
0436
СРЕ не обнаружены
СРЕ не обнаружены
не выявлено типичных СРЕ, но обнаружена слабыедегенеративные изменения клеток через 6 дней после заражения
0437
СРЕ не обнаружены
одиночные бляшки на газоне клеток через 4 дня после заражения, но через 6 дней после заражения области СРЕ не являются конфлюэнтными
30% газона клеток заполнено бляшками через 6 дней после заражения
0438
СРЕ не обнаружены
через 4 дня после заражения 80% газона клеток заполнено бляшками, через 6 дней после инфекции области СРЕ являются конфлюэнтными
через 2 дня после заражения визуально выявлено формирование бляшек; через 4 дня после заражения выявлены конфлюэнтные области СРЕ
При первом пассаже с использованием трех тестируемых образцов через 6 дней после заражения не было выявлено СРЕ.
Не было выявлено СРЕ при трех пассажах образца 0436. Только при третьем пассаже образца 0436 была обнаружена слабые дегенеративные изменения клеток, которые, однако, не были идентичны выявленным цитопатическим эффектам, характерным для образцов 0437 и 0438.
Одиночные бляшки в газоне клеток были обнаружены при втором пассаже образца 0437 через четыре дня после заражения. Через 6 дней после заражения примерно на 20% газона клеток в колбе были выявлены СРЕ. После третьего пассажа примерно на 30% газона клеток были обнаружены цитопатические эффекты/бляшки.
Одиночные бляшки были выявлены через 3 дня после заражения при втором пассаже образца 0438. В процессе дальнейшего осуществления пассажа формирование бляшек продолжалось и приводило к почти конфлюэнтным областям СРЕ.
При третьем пассаже через 2 дня после заражения были выявлены четкие проявления СРЕ. Инкубация в течение 4 дней после заражения приводила к формированию конфлюэнтных областей СРЕ.
После третьего пассажа в колбах для культуры ткани лизат вирусов/клеточной культуры, полученные после третьего пассажа, переносили в титрационные микропланшеты, содержащие газоны клеток линии SK 6, для этой цели:
Вносили 30 раз по 100 мкл для каждой партии в 30 лунок параллельно в два планшета. На этих же планшетах титровали используемые в качестве положительного контроля клетки, зараженные парвовирусом свиней NADL-2.
Планшеты инкубировали при 37±1°С, первый планшет служил для выявления цитопатических эффектов, а второй планшет служил для обнаружения парвовируса свиней с помощью иммуноокрашивания.
Первый планшет инкубировали в течение 6 дней. По окончании периода инкубации для образцов 0437 и 0438 были выявлены такие же цитопатические эффекты, что и для используемого в качестве положительного контроля PPV NADL-2. Для образца 0436 не было обнаружено никаких проявлений СРЕ.
Супернатант культуры из второго титрационного микропланшета удаляли через 24 ч после начала инкубации. Короткий период инкубации должен уменьшать возможность обнаружения клеток, подвергшихся вторичной инфекции парвовирусами, которые высвободились из первично инфицированных клеток. Газон клеток фиксировали и окрашивали с помощью конъюгированного с ФИТЦ антитела к PPV и обследовали с целью выявления инфицированных клеток с помощью инвертитрованного микроскопа в УФ-свете. Это представляет собой аналог титрования бляшки и дает возможность определять титр вируса в лизате, полученном после третьего пассажа.
Были получены следующие результаты:
Ни одна из 30 лунок, которые были инфицированы свободным от клеток вирусным лизатом, полученным после третьего пассажа образца 0436, не содержала клеток с выраженной флуоресцентностью.
В дополнение к протестированным 3 мл (=10%) переносили еще 30×100 мкл свободного от клеток вирусного лизата в титрационный микопланшет, содержащий газон клеток линии SK 6, инкубировали в течение 24 ч при 37±1°С, фиксировали и окрашивали с помощью антитела к PPV. В этих 30 дополнительных лунках не было обнаружено инфицированных клеток.
Этот результат кореллирует с результатами, полученными при пассажах образца 0436 в колбах для культуры ткани, и результатами, полученными после третьего пассажа в титрационных микропланшетах, которые осуществляли для выявления цитопатических эффектов.
В случае образцов 0437 и 0438 все 30 лунок, которые были окрашены антителом к PCV, содержали клетки с выраженной флуоресценцией, такие же, как и используемые в качестве положительного контроля клетки, зараженные PPV NADL-2.
Как продемонстрировано выше, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, позволяет выявлять одну инфекционную единицу на 1 г панкреатин, и тем самым он представляет собой высокочувствительный способ выделения и определения вирусной нагрузки в образце панкреатина. Кроме того, в отличие от способов, основанных на методах молекулярной биологии, таких как обнаружение молекул нуклеиновой кислоты с помощью методов амплификации, таких как ПЦР, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, позволяет определять инфекционные единицы. Таким образом, оказывается возможным различать инфекционную и неинфекционную вирусную нагрузку или общую вирусную нагрузку, определяемую методами молекулярной биологии.
В другом варианте осуществления изобретения пассажи и обнаружение можно осуществлять поэтапно (как описано выше) или применяя параллельный подход. Параллельный подход означает, что во время осуществления одного пассажа уже может быть определена вирусная нагрузка после предыдущего пассажа. С использованием этого подхода можно получать результат после всех пассажей и, если результат получают после первого пассажа, то это означает, что результат получают в более ранний момент времени, чем при использовании поэтапного подхода. Это может быть важным, например, с точки зрения повышения эффективности временных затрат и/или, например, гарантии качества в производственных процессах, поскольку можно начинать выпуск соответствующего образца или продукта в более ранний момент времени.