Анализ мутаций генов CEBPA, NPM1, FLT3 и p53 в группах пациентов с миелодиспластическим синдромом и острым нелимфобластным лейкозом

Проблемы здоровья и экологии

108

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Дорошенко, Е. М. Методологические аспекты и трудности анализа свободных (физиологических) аминокислот и родственных соединений в биологических жидкостях и тканях / Е. М. Дорошенко // Сборник тезисов Республиканской научной конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика РБ-2010». — Минск, 2010. — С. 126.

2. Лях, И. В. Влияние совместного и раздельного хронического введения свинца и динила на уровень катехоламинов в мозге крыс: возможность коррекции нарушений препаратом «тауцинк» / И. В. Лях // Тезисы докладов конференции студентов и молодых ученых, посвященной памяти профессора И. П. Протасевича 15-16 апреля 2010 г. / ГрГМУ; редкол.: П. В. Гарелик [и др.]. — Гродно, 2010. — С. 264.

3. Лях, И. В. Влияние хронического и острого воздействия динилом на уровень биогенных аминов в мозге крыс / И. В. Лях // Наука - 2010: сб. науч. ст. В 2 ч. Ч. 2 / ГрГУ им. Я. Купалы; редкол.: А. Ф. Проневич [и др.]. — Гродно, 2010. — Ч. 2. — С. 17-19.

4. Лях, И. В. Влияние внутрижелудочного поступления ди-нила и свинца на концентрации свободных аминокислот в гипоталамусе крысят / И. В. Лях, Е. М. Дорошенко, В. Ю. Смирнов // Проблемы здоровья и экологии. — 2011. — № 3(29). — С. 127-132.

5. Лях, И. В. Изменение уровней биогенных аминов в среднем мозге и стриатуме крыс при острой интоксикации динилом / И. В. Лях // НИРС - 2010: сб. науч. раб. студ. Респ. Беларусь / БГУ; редкол.: С. В. Абламейко [и др.]. — Минск, 2011. — С. 69.

6. Лях, И. В. Изменение уровней индоламинов в мозге крыс при совместном и раздельном введении свинца и динила: возможность коррекции нарушений препаратом «тауцинк» / И. В. Лях // Тезисы докладов конференции студентов и молодых ученых, посвященной памяти профессора И. П. Протасевича 15-16 апреля 2010 г. / ГрГМУ; редкол.: П. В. Гарелик [и др.]. — Гродно, 2010. — С. 265.

7. Acute reduction of brain serotonin and 5-HIAA following food consumption: correlation with the ratio of serum tryptophan to

the sum of competing neutral amino acids / D. Fernstromj [et al.] // J. Neural. Transm. — 1975. — Vol. 36, № 113. — P. 121.

8. Flora, S. J. Combined administration of taurine and meso 2,3-dimercaptosuccinic acid in the treatment of chronic lead intoxication in rats / S. J. Flora, M. Pande, S. Bhadauria // Hum. Exp. Toxicol. — 2004. — Vol. 23, № 4. — P. 157-166.

9. Fortune, T. Chronic low-level lead exposure affects the mono-aminergic system in the mouse superior olivary complex / T. Fortune, D. I. Lurie // J. Comp. Neurol. — 2009. — Vol. 513, № 5. — P. 542-258.

10. Gedeon, Y. Changes in mesocorticolimbic DOPAmine and D1/D2 receptor levels after low level lead exposure: a time course study / Y. Gedeon, G. T. Ramesh, P. J. Wellman // Toxicol. Lett. — 2001. — Vol. 15, № 123(2-3). — P. 217-226.

11. Montgomery, A. J. Reduction of brain dopamine concentration with dietary tyrosine plus phenylalanine depletion: an [11C] raclopride PET study / A. J. Montgomery, S. F. Mc Tavish, P. J. Cowen // Am. J. Psychiatry. — 2003. — Vol. 160, № 10. — P. 1887-1889.

12. Sansar, W. Effects of chronic lead intoxication on rat sero-toninergic system and anxiety behavior / W. Sansar, M. M. Bouyatas, S. Ahboucha // Acta Histochem. — 2012. —Vol. 114, № 1. — P. 41^5.

13. Saxena, G. Changes in brain biogenic amines and haem biosynthesis and their response to combined administration of succimers and Centella asiatica in lead poisoned rats / G. Saxena, S. J. Flora // J. Pharm. Pharmacol. — 2006. — Vol. 58, № 4. — P. 547-559.

14. Shan-Shan, Yu. Influences of different developmental periods of taurine supplements on synaptic plasticity in hippocampal CA1 area of rats following prenatal and perinatal lead exposure / Yu Shan-Shan // BMC Developmental Biology. — 2007. — Vol. 7. — P. 51.

15. Zhu, D. M. Protection by a taurinesupplemented diet from lead-induced deficits of long-termpotentiation/depotentiation in dentate gyrus of rats in vivo / D. M. Zhu, M. Wang, J. Q. She // Neuroscience. — 2005. — Vol. 134, № 1. — P. 215-224.

Поступила 15.07.2013

УДК 616-006.446-053.8:[575.224.22+575.224.23]-036

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ ГЕНОВ CEBPA, NPM1, FLT3 И P53 В ГРУППАХ ПАЦИЕНТОВ С МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ И ОСТРЫМ НЕЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ

А. Е. Силин, В. Н. Мартинков, Д. К. Новик, Ж. М. Козич, И. Б. Тропашко,

В. К. Шпудейко, А. А. Силина, А. В. Воропаева, С. М. Мартыненко

Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека, г. Гомель

В группе, состоящей из 23 пациентов с миелодиспластическим синдромом МДС (вариант — рефрактерная анемия с избытком бластов, РАИБ) и 97 пациентов с острым нелимфобластным лейкозом (ОНЛЛ) проведен молекулярно-генетический анализ распространенности соматических мутаций генов FLT3, NPM1, CEBPA и p53.

Установлено, что мутации FLT3-ITD в группе пациентов с МДС РАИБ встречаются с частотой 8,7 ± 5,9 %, а в группе с ОНЛЛ — 22,7 ± 4,3 %. Мутация FLT3 D835 выявлена только в группе ОНЛЛ с частотой 7,2 ± 2,6 %.

Мутации гена NPM1 выявлены в 8,7 ± 5,9 % случаев МДС РАИБ и 21,6 ± 4,2 % случаев ОНЛЛ.

Соматические мутации CEBPA обнаружены в 11,3 ± 3,2 % случаев ОНЛЛ, а в группе МДС РАИБ отсутствовали. Мутации гена р53 выявлены в 17,4 ± 7,9 % случаев МДС РАИБ и 10,3 ± 0,3 % случаев ОНЛЛ.

Посредством прямого секвенирования дана характеристика всем выявленным мутациям генов CEBPA и p53.

В результате проведенного анализа установлено, что использование молекулярно-генетических маркеров совместно с цитогенетическими позволяет расширить группу с прогностическими маркерами на 41,3 % по сравнению с использованием только цитогенетических данных.

Ключевые слова: миелодиспластический синдром, острый нелимфобластный лейкоз, мутации генов, FLT3, NPM1, CEBPA, p53.

THE ANALYSIS OF CEBPA, NPM1, FLT3 AND P53 GENE MUTATIONS IN GROUPS OF PATIENTS WITH MYELODYSPLASTIC SYNDROME AND ACUTE NONLYMPHOCYTIC LEUKAEMIA

A. E. Silin, V. N. Martinkov, D. K. Novik, Zh. M. Kozich, I. B. Tropashko,

V. K. Shpudeyko, A. A. Silina, A. V. Voropayeva, S. M. Martynenko

Republican Research Centre for Radiation Medicine and Human Ecology, Gomel

The article presents the molecular genetic analysis of the prevalence of somatic mutations in FLT3, NPM1, CEBPA, and p53 genes in a group consisting of 23 patients with myelodysplastic syndrome MDS (option — refractory anemia with excess blasts, RAEB) and 97 patients with acute nonlymphoblastic leukemia (ANLL).

Проблемы здоровья и экологии

109

It was ascertained that FLT3-ITD mutations in the group of patients with MDS RAEB occur with the prevalence of 8,7 ± 5,9 %, while in the group with ANLL they are observed in 22,7 ± 4,3 % cases. FLT3 D835 mutations were detected only in the ANLL group with the prevalence of 7.2±2.6 %. NPM1 gene mutations were detected in

8,7 ± 5,9 % of MDS RAEB cases and in 21,6 ± 4,2 % of ANLL cases.

CEBPA somatic mutations were found in 11,3 ± 3,2 % of ANLL cases, while the group of MDS RAEB was free of them. Mutations in the p53 gene were detected in 17,4 ± 7,9 % of MDS RAEB cases and in 10,3 ± 0,3 % of ANLL cases.

All the detected CEBPA and p53 gene mutations were described by means of direct sequencing.

The analysis results show that the use of molecular genetic markers in combination with cytogenetic ones makes it possible to expand the group with prognostic markers by 41,3 % in comparison with the use of only cytogenetic data.

Key words: myelodysplastic syndrome, acute nonlymphoblastic leukemia, gene mutation, FLT3, NPM1, CEBPA, p53.

Введение

Важной составляющей лечения острых нелимфобластных лейкозов (ОНЛЛ) является своевременный прогноз заболевания и оценка на каждом из этапов лечения эффективности проводимой терапии. Для этих целей в качестве маркеров используются различные хромосомные аберрации. В то же время более половины случаев ОНЛЛ составляют больные с нормальным кариотипом, которые относятся к подгруппе с промежуточным прогнозом. Проведенные исследования показывают, что фенотипически данная группа является гетерогенной и может быть разделена на прогностически различные подгруппы. Таким образом, расширение спектра прогностических маркеров и маркеров, которые позволили бы оценивать эффективность лечения, является актуальным, особенно в группе пациентов без видимых хромосомных аберраций.

В настоящее время особое внимание уделяется поиску молекулярно-генетических маркеров при ОНЛЛ. По данным различных исследований, ОНЛЛ часто сопровождается соматическими мутациями ряда генов. К их числу относятся ген FLT3, мутации которого (FLT3-ITD и FLT3 D835), по литературным данным, определяют неблагоприятный прогноз [1-5], ген NPM1 (мутации определяют благоприятный прогноз, кроме случаев сочетания с мутациями FLT3) [5-7], ген CEBPA (благоприятный прогноз) [8-10] и ген p53 (неблагоприятный прогноз) [11-12].

Цель

Анализ вклада мутаций генов FLT3, NPM1, CEBPA и p53 в формирование оценки прогноза заболевания у пациентов с миелодиспластиче-ским синдромом МДС (вариант — рефрактерная анемия с избытком бластов, РАИБ) и ОНЛЛ.

Материалы и методы

Материал для проведения молекулярногенетического анализа был собран в виде образцов цельной венозной крови и костного мозга у 120 пациентов, проходивших лечение в период 2009-2013 гг. в гематологическом отделении для взрослых ГУ «РНПЦ РМ и ЭЧ». В зависимости от диагноза данные пациенты разделены на 2 группы — группа с МДС РАИБ и группа с ОНЛЛ. Диагноз выставлялся по

клинической информации при первичном поступлении пациента вне зависимости от возможного последующего трансформирования МДС в ОНЛЛ. Группа пациентов с МДС насчитывала 23 человека: 14 мужчин и 9 женщин. Средний возраст в данной группе составил 58,0 года. Группа с ОНЛЛ сформирована из 97 пациентов, из них 38 мужчин и 59 женщин. Средний возраст — 54,0 года.

По классификации FAB, группа исследования из числа пациентов с ОНЛЛ подразделялась на 5 подгрупп (М0-М4). В подгруппу с М0 (острый ранний миелобластный лейкоз) входили 7 пациентов: 3 мужчин и 4 женщины, средний возраст — 50,7 года. Подгруппа с М1 (острый миелобластный лейкоз) состояла из 29 пациентов: 17 мужчин и 12 женщин, средний возраст — 58,6 года. Подгруппа с М2 (острый миелобластный лейкоз с частичным созреванием) насчитывает 25 пациентов: 4 мужчин и 21 женщину, средний возраст — 55,6 года. Подгруппа М3 (острый промиелоцитарный лейкоз) состояла из 23 пациентов, из них 9 мужчин и 14 женщин, средний возраст — 46,0 года. Подгруппа с М4 (острый миеломонобластный лейкоз) насчитывала 13 пациентов: 5 мужчин и 8 женщин, средний возраст — 56,5 года.

Образцы ДНК из крови и костного мозга выделялись стандартным SDS-методом.

Мутации FLT-ITD и NPM1, представляющие собой крупные дупликации, анализировали методом ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими 14-15 экзоны гена FLT3 и 11 интрон-12 экзон гена NPM1 с последующей электрофоретической детекцией в 2,7 % агарозном геле с окраской бромистым этиди-ем. Мутацию FLT3 D835 анализировали посредством метода RFLP-PCR с рестриктазой EcoRV. Мутации гена CEBPA выявляли методом SSCP-PCR в пределах всей кодирующей последовательности гена посредством 12 % неденатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза с окраской серебром. Таким же методом анализировали мутации гена p53 в пределах 5-9 экзонов. Для идентификации мутаций генов CEBPA и р53 проводили секвени-рование с прямым и обратным праймерами посредством генетического анализатора AB3500.

Проблемы здоровья и экологии

110

Результаты и обсуждение

Молекулярно-генетический анализ мутаций генов FLT3 и NPM1 проводили с использованием ДНК, выделенной как из цельной венозной крови, так и из костного мозга. В результате проведенного молекулярно-генетического анализа 14-15-го и 20-го экзонов гена FLT3 и 12-го экзона гена NPM1 в группе пациентов с МДС РАИБ было выявлено 2 случая присутствия как в костном мозге, так и в образцах крови соматической мутации FLT3-ITD. Частота данной мутации в группе составила 8,7 ± 5,9 %.

Как было сказано выше, постановка диагноза пациентам и, как следствие, распределение их по группам исследования осуществлялись на основании клинической информации, полученной при первичном поступлении. В этой связи следует отметить, что у пациентов с выявленными случаями мутации FLT3-ITD, которых при первичном диагнозе включены в группу МДС РАИБ, че-

рез короткий промежуток времени произошла трансформация в ОНЛЛ М4.

Также в группе МДС РАИБ были выявлены 2 случая мутации NPM1 (8,7 ± 5,9 %). Примечательно, что в 1 случае мутация выявлена только в образце крови.

В группе пациентов с ОНЛЛ было выявлено 50 случаев наличия в крови и (или) в костном мозге различных мутаций из числа анализируемых: в 22 случаях (22,7 ± 4,3 %) — мутация FLT-ITD, у 21 пациента (21,6 ±

4,2 %) — мутация гена NPM1, в клиническом материале 7 пациентов (7,2 ± 2,6 %) — мутация D835 гена FLT3.

Наблюдались различия в составе и частоте встречаемости анализируемых мутаций в различных подгруппах пациентов с ОНЛЛ. Наглядное изображение распространенности анализируемых мутаций в группах и подгруппах исследований представлено на рисунке 1.

Рисунок 1 — Распространенность мутаций генов FLT3-ITD и NPM1 в исследуемых группах и подгруппах пациентов с МДС РАИБ и ОНЛЛ

В подгруппе пациентов с М0 по FAB классификации выявлены по 1 случаю присутствия мутаций FLT-ITD (14,3 ± 13,2 %) и D835 гена FLT3 (14,3 ± 13,2 %). При этом данные мутации выявлены совместно у 1 пациента. Однако следует учитывать немногочисленность данной подгруппы, что может повлиять на точность оценки распространенности как выявленных мутаций, так и отсутствующих на данном этапе исследования.

Среди 29 пациентов, входящих в подгруппу М1, было выявлено 13 различных мутаций. У 5 пациентов (17,2 ± 7,0 %) определена мутация FLT3-ITD, а в 8 случаях (27,6 ± 8,3 %) — NPM1. Следует отметить, что данная подгруппа оказалась наиболее насыщенной мутациями гена NPM1. При этом в большинстве случаев мутация FLT3-ITD сочеталась с мутациями NPM1. Мутация FLT3 D835 у пациентов из данной подгруппы отсутствовала.

В пределах подгруппы М2, насчитывающей 25 пациентов, выявлены 13 случаев мутаций. В 6 случаях (24,0 ± 8,5 %) присутствовала мутация FLT3-ITD, еще в 6 случаях (24,0 ± 8,5 %) —

мутация гена NPM1. При этом в 3 случаях эта мутация сочеталась с FLT3-ITD. Мутация FLT3 D835 в данной подгруппе выявлена у 1 пациента (4,0 ±

3,9 %) и присутствовала только в образце крови.

Среди 23 случаев острого промиелоцитар-ного лейкоза (М3) выявлены все типы анализируемых мутаций. Эта подгруппа оказалась одной из наиболее насыщенной мутациями FLT3-ITD, которые присутствовали в 30,4 ± 9,6 % случаев данного типа лейкоза. У 4 пациентов (17,4 ± 7,9 %) выявлена мутация гена NPM1, которая в 1 случае сочеталась с FLT3-ITD. В 4 случаях (17,4 ± 7,9 %) присутствовала мутация FLT3 D835, которая в 2 случаях сочеталась с мутацией FLT3-iTd, а в 1 — с NPM1.

В подгруппе пациентов с М4, состоящей из 13 пациентов, как и в предыдущей подгруппе, выявлены все три типа анализируемых мутаций. У 3 пациентов (23,1 ± 11,7 %) была выявлена мутация FLT3-ITD. В 3 случаях выявлена мутация NPM1 (23,1 ± 11,7 %), которая в 1 случае сочеталась с мутацией FLT3-ITD. В 1 случае (7,7 ± 7,4 %) была выявлена мутация FLT3 D835.

Проблемы здоровья и экологии

111

Таким образом, в результате проведенного молекулярно-генетического анализа была описана частота встречаемости трех типов мутаций генов FLT3 и NPM1 в исследуемых группах сравнения. В качестве особенностей распространенности анализируемых мутаций в группе пациентов с ОНЛЛ следует отметить совместное проявление мутаций FLT3-ITD и NPM1, которое наблюдалось у более половины мутантных случаев. Часть мутаций выявлялась только в каком-либо одном образце клинического материала, что требует при проведении анализа использовать в качестве источника ДНК как костный мозг, так и кровь.

Молекулярно-генетический анализ мутаций гена CEBPA проводили с использованием образцов ДНК, выделенных из костного мозга. В ходе проведенного SSCP-анализа в целом были выявлены 18 случаев отличающихся электрофоретических паттернов. Однако прямое секве-нирование фрагментов ДНК подтвердило только 14 случаев присутствия в образцах соматических мутаций гена CEBPA. Характеристика выявленных мутаций представлена в таблице 1.

Как видно из даннах таблицы, у 3 пациентов были выявлены по 2 мутации, локализованные в различных анализируемых фрагментах. Во всех этих случаях одна из мутаций была локализована в 4-м фрагменте, а вторая мутация выявлена либо в 1-м (AML21 и AML75), либо во 2-м фрагменте (AML51). Двойные му-

тации являются известной особенностью гена CEBPA при ОНЛЛ и ранее описаны в литературных источниках [9, 10].

В подавляющем большинстве случаев у пациентов выявлены мутации в виде инсерций или делеций, при этом изменения отмечались относительно крупные — от 3-х до 18-ти пар нуклеотидов (таблтца 1). Также выявлены четыре случая однонуклеотидных замен. При этом в 3 случаях мутация представляла собой синонимическую замену g.5512G>A, что предположительно не может привести к клинически значимому эффекту. В 1 случае присутствовала несинонимическая замена g.6027G > C, приводящая к изменению кодирующей последовательности p.Arg306Pro.

Распределение выявленных мутаций по группам и подгруппам исследования было неравномерным. На рисунке 2 в процентном соотношении представлена встречаемость мутаций CEBPA в различных подгруппах исследования. Рассчеты произведены по количеству пациентов с мутациями (11 случаев) без учета случаев двойных мутаций.

Интересно отметить, что в относительно большой группе пациентов с МДС РАИБ не было выявлено ни одного случая мутаций CEBPA. Также мутации отсутствовали в подгруппе ОНЛЛ М0. Однако это может быть связано с небольшим количеством пациентов, входящих в данную подгруппу.

Таблица 1 — Характеристика мутаций, выявленных в результате молекулярно-генетического анализа гена CEBPA

№ Образец FAB Фраг- мент Тип изменения Genomic description NG 012022.1: Coding description NM 004364.3: AA change

1 AML009 М4 3 In-frame coding g.5696-5697insCGCACC c.586-587insCGCACC p.Pro196 Pro197insProHis

2 AML021 М2 1 Frameshift coding g.5287-5288insG c.177-178insG p.Thr60Aspfs47

3 AML021 М2 4 In-frame coding g.6038-6039ins18 c.928-929ins18 p. Thr310LisGlnArgAsnValGluThr

4 AML051 М1 2 Frameshift coding g.5374-5381del8 c.264-271del8 p.Gln88HisfsX16

5 AML051 М1 4 Non-synonymous coding g.6027G>C c.917G>C p.Arg306Pro

6 AML052 М1 2 Synonymous coding g.5512G>A c.402G>A p.Ala134=

7 AML058 М4 2 Synonymous coding g.5512G>A c.402G>A p.Ala134=

8 AML062 М1 2 Synonymous coding g.5512G>A c.402G>A p.Ala134=

9 AML068 М2 2 Frameshift coding g.5479-5479insG c.368-369insG p.Gly123GlyfsX46

10 AML073 М3 3 In-frame coding g.5696-5697insCGCACC c.586-587insCGCACC p.Pro196 Pro197insProHis

11 AML075 М2 1 Frameshift coding g.5213delC c.103delC p.Arg35GlyfsX123

12 AML075 М2 4 In-frame coding g.6049-6050insAAG c.939-940insAAG p.Lys313 Val314insLys

13 AML091 М2 3 In-frame coding g.5696-5697insCGCACC c.586-587insCGCACC p.Pro196 Pro197insProHis

14 AML095 М2 4 In-frame coding g.6049-6050insAAG c.939-940insAAG p.Lys313 Val314insLys

Рисунок 2 — Распределение мутаций гена CEBPA по группам и подгруппам исследования

Проблемы здоровья и экологии

112

В целом в группе пациентов с ОНЛЛ мутации CEBPA присутствовали в 11,3 ± 3,2 % случаев (11 пациентов из 97 обследованных). В относительно многочисленной подгруппе М1 (29 пациентов) было выявлено 3 пациента с мутациями CEBPA (10,3 ± 5,6 %). В подгруппе ОНЛЛ вариант М2 (25 пациентов) было выявлено 5 случаев различных мутаций (20,0 ± 8,0 %). При этом у 2 пациентов из этой подгруппы были выявлены по 2 мутации. В подгруппе М3, насчитывающей 23 пациента, выявлена только 1 мутация (4,3 ± 4,2 %), в то время как в относительно небольшой подгруппе М4, насчитывающей 13 пациентов, было выявлено 2 случая мутаций CEBPA (15,4 ± 1,1 %).

В ходе проведенного анализа ДНК, выделенной из костного мозга 120 пациентов из

различных подгрупп исследования, по результатам предварительного SSCP-PCR анализа с последующим секвенированием выявлены 17 случаев наличия соматических мутаций гена р53, локализованных в пределах 5-9 экзонов. При этом у 3 пациентов были выявлены одновременно по две различные мутации. Таким образом, среди 120 исследованных пациентов у 14 присутствовали в костном мозге различные соматические мутации р53. Характеристика выявленных мутаций представлена в таблице 2.

Из 14 пациентов с мутациями 4 человека были с диагнозом МДС РАИБ (17,4 ± 7,9 % в группе с МДС). Однако следует отметить, что одна из выявленных мутаций была локализована в 8-м интроне (таблица 2) и, по всей видимости, не имеет клинического эффекта.

Таблица 2 — Характеристика выявленных соматических мутаций гена р53 в костном мозге пациентов из исследуемых групп

№ Образец FAB Экзон Тип изменения Genomic description NG_017013.2 Coding description CCDS11118.1 NM 000546.5 AA change

1 AML06 М1 intron 9 Intronic g.14028T>C c.993+12T>C —

2 AML17 МДС exon 7 Frameshift coding g. 13274-13275delGT c.686-687delGT c.686-687del2b p.Cys229TyrfsX9

3 AML19 МДС intron 8 Essential splice site g.13851G>A c.919+1G>A —

4 AML27 М4 exon 7 Non-synonymous coding g.13303A>G c.715A>G p.Asn239Asp

5 exon 8 Frameshift coding g.13718- 13723AATCTA>G c.787-792AATCTA>G c.787-792delAATCTAinsG p.Asn263-Leu264AlafsX6

6 AML28 МДС exon 7 In-frame coding g.13304-13324del21 c.716-736del21 p.Asn239-Gly245del

7 AML32 М0 exon 6 Non-synonymous coding g.12597C>T c.577C>T p.His193Tyr

8 AML35 М2 exon 8 Non-synonymous coding g.13749G>A c.818G>A p.Arg273His

9 AML48 МДС exon 5 Non-synonymous coding g.12394C>T c.455C>T p.Pro152Leu

10 AML55 М1 exon 6 Non-synonymous coding g.12679A>G c.659A>G p.Tyr220Cys

11 exon 6 Synonymous coding g.12692G>A c.672G>A p.Glu224Glu

12 AML57 М1 exon 6 Frameshift coding g.12634insA c.614insT p.Tyr205LeufsX3

13 AML63 М4 exon 7 Non-synonymous coding g.13331G>A c.743G>A p.Arg248Gln

14 AML71 М1 exon 7 Non-synonymous coding g.13289A>G c.701A>G p.Tyr234Cys

15 exon 7 Non-synonymous coding g.13319G>A c.731G>A p.Gly244Asp

16 AML86 М1 exon 5 Non-synonymous coding g.12334A>G c.395A>G p.Lys132Arg

17 AML101 М0 exon 5 Stop gained g.12369C>T c.430C>T p.Gln 144 Stop

Несмотря на немногочисленность подгруппы пациентов с ОНЛЛ, вариант М0, в пределах данной подгруппы выявлены 2 случая мутации в экзоне 5 и экзоне 6 (таблица 2), что составляет 28,6 ± 17,1 %.

В группе ОНЛЛ вариант М1 среди 29 пациентов были выявлены 5 случаев с мутациями (17,2 ± 7,0 %). У пациентов AML55 и AML71 были одновременно выявлены 2 различные мутации в пределах 6-го и 7го экзонов соответственно. При этом следует отметить, что у пациента AML55 одна из мутаций является синонимической и не приводит к изменению первичной структуры белка p.Glu224Glu. Кроме этого, в 1 случае в данной подгруппе мутация была локализована в пределах 9-го интрона (AML06).

1 случай мутации был выявлен в подгруппе ОНЛЛ М2, насчитывающей 25 пациентов, что составляет 4,0 ± 3,9 %. В подгруппе острого про-

миелоцитарного лейкоза мутации р53 отсутствовали. В относительно немногочисленной подгруппе ОНЛЛ вариант М4 выявлены 2 мутантных случая (15,4 ± 10,0 %). У 1 пациента (AML27) выявлены одновременно две различные мутации, локализованные в 7 и 8 экзонах.

Распространенность мутаций гена р53 по подгруппам исследования наглядно представлена на рисунке 3.

Подавляющее большинство выявленных мутаций р53 представляли собой однонуклеотидные замены, что является одним из известных свойств данного гена. Реже выявлены делеции (3 случая). При этом следует обратить внимание, что в 1 случае была идентифицирована крупная делеция, приводящая к потере 21 нуклеотида. Инсерции были выявлены в 2 случаях. При этом у пациента AML27 данный тип мутации сочетался с делецией (таблица 2).

Проблемы здоровья и экологии

113

МДС ОНЛЛ МО Ml М2 М3 М4 РАИ Б

Рисунок 3 — Распространенность мутаций генов р53 в исследуемых группах и подгруппах пациентов с МДС РАИБ и ОНЛЛ

Одной из основных задач данного исследования является расширение спектра прогностических маркеров и маркеров оценки эффективности лечения ОНЛЛ. Для того, чтобы оценить, какой вклад могут внести исследуемые нами мутации в оценку прогноза и эффективности лечения и насколько они расширят традиционный спектр цитогенетических маркеров, был проведен анализ сопряженности выявленных мутаций и хромосомных аберраций в исследуемых группах и подгруппах пациентов с МДС РАИБ и ОНЛЛ.

В соответствии с имеющимися протоколами диагностики ОНЛЛ в пределах исследуемой группы был проведен цитогенетический анализ хромосомных аберраций. В результате этого анализа только у 25 пациентов выявлена какая-либо хромосомная аберрация, что составляет 20,8 ± 3,7 %.

Если анализировать группу, включающую всех исследованных пациентов (120 человек), то при использовании в качестве маркеров только мутации FLT3 и NPM1 охватывается группа из 39 пациентов (32,5 ± 4,3 %). Добавление в тестирование мутаций CEBPA и р53 без хромосомных аберраций увеличивает группу с прогностическими маркерами до 60 пациентов (50,0 ± 0,6 %).

Совместное использование при тестировании всех анализируемых мутаций и хромосомных аберраций позволяет охватить прогностическими маркерами группу из 72 пациентов, что составляет 60,0 ± 0,7 %. Таким образом, в общей группе пациентов использование молекулярно-генетических маркеров позволяет расширить группу с какими-либо прогностическими характеристиками почти на 40 %.

В группе ОНЛЛ выявлен 21 случай хромосомных аберраций среди 97 обследованных пациентов (21,6 ± 0,5 %).

При совместном использовании всех анализируемых соматических мутаций (без хромосомных аберраций) группу с маркерами прогноза составляет 51 пациент из 97 обследованных (52,6 ± 0,7 %).

Совместное использование всех анализируемых маркеров, включая хромосомные аберрации, позволяет охватить прогностическими маркерами

группу из 61 пациента (62,9 ± 0,8 %). Иными словами, использование молекулярно-генетических маркеров совместно с цитогенетическими позволяет расширить группу с прогностическими маркерами на 41,3 % по сравнению с использованием только цитогенетических данных.

Заключение

В группе, состоящей из 23 пациентов с МДС РАИБ и 97 пациентов с ОНЛЛ, проведен молекулярно-генетический анализ распространенности соматических мутаций генов FLT3, NPM1, CEBPA и p53.

Установлено, что мутации FLT3-ITD в группе пациентов с МДС РАИБ встречаются с частотой 8,7 ± 5,9 %, а в группе с ОнЛл — 22,7 ±

4.3 %. Мутация FLT3 D835 выявлена только в группе ОНЛЛ с частотой 7,2 ± 2,6 %.

Мутации гена NPM1 выявлены в 8,7 ± 5,9 % случаев МДС РАИБ и 21,6 ± 4,2 % случаев ОНЛЛ.

Соматические мутации CEBPA обнаружены в 11,3 ± 3,2 % случаев ОНЛЛ, а в группе МДС РАИБ отсутствовали. Мутации гена р53 выявлены в 17,4 ± 7,9 % случаев МДС РАИБ и

10.3 ± 0,3 % случаев ОНЛЛ.

Посредством прямого секвенирования дана характеристика всем выявленным мутациям генов CEBPA и p53.

В результате проведенного анализа установлено, что использование молекулярно-генетических маркеров совместно с цитогенетическими позволяет расширить группу с прогностическими маркерами на 41,3 % по сравнению с использованием только цитогенетических данных.

Данная работа выполнена в рамках Государственной программы научных исследований «Фундаментальная и прикладная медицина и фармация» подпрограмма «Фундаментальная и прикладная медицина», раздел 2 «Изучение патогенетических основ социально-значимых заболеваний человека для разработки методов их диагностики, лечения и профилактики» (договор № 1.2.26 от 28.02.2011 г.).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients / M. H. Sheikhha [et al.] // The Hematology Journal. — 2003. — № 4. — P. 41-46.

Проблемы здоровья и экологии

114

2. FLT3 and NPM1 Mutations in Myelodysplastic Syndromes: Frequency and Potential Value for Predicting Progression to Acute Myeloid Leukemia / A. Bains [et al.] // American Journal of Clinical Pathology. — 2011. — Vol. 135, № 1. — P. 62-69.

3. Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia: correlation to cytogenetics, FAB subtype, and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease : Presented in part at the 42nd annual meeting of the American Society of Hematology, December 1-5, 2000, San Francisco, CA (abstract 3569) / S. Schnittger [et al.] // Blood. — 2002. — Vol. 100, № 1. — P. 59-66.

4. Бавыкин, А. С. FLT3-тирозинкиназа при острых нелимфобластных лейкозах / А. С. Бавыкин, М. А. Волкова // Онкогематология. — 2006. — № 1-2. — C. 15-24.

5. Fms Like Tyrosine Kinase (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) Mutations in De Novo Normal Karyotype Acute Myeloid Leukemia (AML) / N. R. Dunna [et al.] // Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. — 2010. — Vol. 11. — P. 1811-1816.

6. Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia (AML) / C. Thiede [et al.] // Blood. — 2001. — Vol. 107, № 10. — P. 4011^020.

7. Mutations in nucleophosmin (NPM1) in acute myeloid leukemia (AML): association with other gene abnormalities and previ-

ously established gene expression signatures and their favorable prognostic significance / R. G. W. Verhaak [et al.] // Blood. — 2005. — Vol. 106, № 12. — P. 3747-3754.

8. Mutations in the gene encoding the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein a in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias / Gombart [et al.] // Blood. — 2002. — Vol. 99, № 4. — P. 1332-1340.

9. Characterization of CEBPA Mutations in Acute Myeloid Leukemia: Most Patients with CEBPA Mutations Have Biallelic Mutations and Show a Distinct Immunophenotype of the Leukemic Cells / Lin [et al.] // Clinical Cancer Research. — 2005. — Vol. 11. — P. 1372-1379.

10. Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic markers in intermediate-risk AML / Doorn-Khosrovani [et al.] // The Hematology Journal. — 2004. — № 4. — P. 31^1.

11. The prognostic impact of 17p (p53) deletion in 2272 adults with acute myeloid leukaemia / Seifert [et al.] // Leukemia advance online publication, 8 January 2009. — doi:10.1038/leu.2008.375. PMID: 19151774.

12. Prognostic value of p53 gene mutations and the product expression in de novo acute myeloid leukemia / Nakano [et al.] // Eur J. Haematol. — 2000. — Vol. 65. — P. 23-31.

Поступила 19.08.2013

УДК 616.36: 611.08

ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ А. Г. Скуратов, Д. Р. Петренев Гомельский государственный медицинский университет

Цель: изучить теоретические основы и провести экспериментальное обоснование эффективности выделения изолированных гепатоцитов методом ферментативной перфузии печени.

Материалы и методы. Крысы линии Вистар массой 200 г, выделение гепатоцитов методом ферментативной перфузии печени, световая микроскопия; оценка функциональной способности клеток синтезировать и накапливать гликоген.

Результаты. Показана высокая эффективность метода адаптированной 2-стадийной ферментативной перфузии печени для выделения изолированных гепатоцитов. Получена культура жизнеспособных гепато-цитов с сохраненными морфологическими и функциональными свойствами.

Ключевые слова: ферментативная перфузия печени, изолированные гепатоциты.

ISOLATION OF HEPATOCYTES A. G. Skuratov, D. R. Petreniov Gomel State Medical University

Objective: to study the theoretical basis and give the experimental validation of the efficiency of hepatocyte isolation by the method of enzymatic perfusion of the liver.

Material and methods. Wistar rats at a mass of 200 g, isolation of hepatocytes by enzymatic perfusion of the liver, light microscopy, assessment of functional cell capacity to synthesize and accumulate glycogen.

Results. The article shows the high efficiency of the method of the 2-step adapted enzymatic perfusion of the liver to isolate hepatocytes. The culture of viable hepatocytes with preserved morphological and functional properties was obtained.

Key words: enzymatic perfusion of the liver, isolated hepatocytes.

Введение

Использование изолированных гепатоцитов является прогрессивной технологией, используемой в современной биохимии, клеточной биологии, фармакологии и токсикологии для изучения особенностей протекания метаболических процессов, жизнедеятельности и функциональной активности клеток, а также оценки фармакологического

действия различных факторов химической и физической природы и экспериментального (доклинического) изучения эффективности ге-патопротективных препаратов [1].

Первичные гепатоциты стали одними из первых типов клеток, использованных для клинических целей — клеточной терапии больных с врожденными и приобретенными поврежденими печени [2, 3, 4]. Однако по