УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ, ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ СУХИХ ОБРАЗЦОВ ЖИДКОСТНЫХ ОБЪЕКТОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА
DEVICE FOR PREPARATION, STORAGE AND TRANSPORTATION OF DRY SAMPLES OF LIQUID OBJECTS TO BE SUBJECT TO LABORATORY ANALYSIS

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности, к средствам для взятия, хранения и транспортировки проб биологических жидкостей (кровь, сыворотка, моча, лимфа, пот, молоко, вытяжки тканей и т.д.) с целью последующего проведения анализа материала на содержание биологически активных веществ методами ИФА-диагностики, ПЦР и др.
Известен (SU, авторское свидетельство 1017343) контейнер для хранения пробы крови. Известный контейнер содержит емкость с крышкой, на которую установлен стержень для крепления гигроскопической бумаги. В нижней части емкости с зазором по отношению к стержню размещен влагопоглотитель и установлено средство его фиксации, содержащее капроновую сетку и пружину. Известный контейнер используют следующим образом. Открывают крышку емкости и каплей крови смачивают поверхность гигроскопической бумаги, закладывают на дно емкости влагопоглотитель и фиксируют его действием капроновой сетки и пружины. После нанесения капли крови на гигроскопическую бумагу крышку емкости закрывают, размещая тем самым гигроскопическую бумагу с каплей крови внутри контейнера над влагопоглотителем. Под действием влагопоглотителя проба крови на гигроскопической бумаге высыхает.
Недостатком известного контейнера следует признать сложность его конструкции. Кроме того, не оговорены характеристики поглотителя пробы - гигроскопической бумаги, что не позволяет учесть объем пробы крови при проведении анализа, при этом уменьшается точность анализа.
Широко известен подход (Edelbroek РМ, van der Heijden J and Stolk LM. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Therapeutic Drug Monitoring 2009; 31(3): 327-336), основанный на использовании пористой целлюлозной бумаги для нанесения на нее пятен крови в виде капель в несколько заранее обозначенных кружочками мест, высушивании полученной бумажной карточки и хранении или пересылки полученных образцов в специализированную лабораторию, где в последующем проводят вырезание кружочков бумаги с сорбированными образцами крови с использованием дырокола и последующую десорбцию образца в раствор с целью дальнейшего проведения анализа на содержание в исходном образце различных биологически активных веществ.
В заявке Cohen с сотр. (US Patent Application Nr. 2012/0045792 Al) приведено использование в таком варианте в качестве мембранного материала вместо пористой целлюлозы (бумаги) мембраны из стекловолокна с расположенными на ней окружностями для обозначения мест нанесения капель крови.
Недостатками указанных подходов следует признать необходимость нанесения капель крови строго по центру обозначенных на бумаге кружочков, невозможность точного дозирования количества наносимого образца и необходимость использования специальных дыроколов с фиксированным диаметром вырезаемого отверстия бумаги для последующего вырезания кружочков мембраны с образцом для их последующей десорбции. Кроме того, данный способ получения сухих пятен крови не позволяет проводить отделение клеточных элементов крови для последующего использования в анализе только плазмы или сыворотки крови.
Для улучшения потребительских свойств устройства предложено использовать (US, патент 5,516,487) мембраны в виде небольшого листа, на котором в определенных местах заранее перфорированы кружочки, на которые наносят анализируемый образец крови. Данное решение не требует использования дырокола, однако его недостатком является детерминированная площадь поверхности мембраны с определяемым образцом, что не позволяет изменять объем анализируемого образца крови, необходимость нанесения капель крови строго по центру перфорированных кружочков, что часто приводит к затруднениям при получении образцов во внелабораторных условиях, а следовательно, значительным ошибкам при проведении анализа. Перфорированные кружочки могут самопроизвольно отделяться от мембраны до начала аналитической процедуры.
Указанное техническое решение использовано в качестве ближайшего аналога разработанного устройства.
Технический результат, получаемый в результате реализации разработанного технического решения, состоит в упрощении конструкции сорбирующего элемента при одновременном расширении области применения за счет расширения возможных объектов анализа.
2
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанное устройство для получения, хранения и транспортировки сухих образцов жидкостных объектов, предназначенных для последующего проведения лабораторного анализа. Разработанное устройство содержит защитный контейнер, в котором размещен, по меньшей мере, один адсорбционный элемент, выполненный с возможностью нанесения на него аликвоты жидкостного объекта, содержащего анализируемые компоненты, и последующего его высушивания, причем адсорбционный элемент для получения сухой пробы выполнен из впитывающего влагу пористого материала с адсорбционной емкостью не менее 40 мг воды на см, способного к обратимой десорбции сухих компонентов жидкостного объекта в растворитель для пробы при погружении, по меньшей мере, рабочей зоны адсорбционного элемента с высушенным образцом в растворитель для пробы с эффективностью не менее 30% по истечении не более 300 с после контакта высушенного образца с растворителем для пробы.
Конкретизация сорбирующих/десорбирующих характеристик адсорбционного элемента позволяет получать воспроизводимые результаты при анализе биологических жидкостей, поскольку для анализа будут использованы сравнимые количества адсорбированной, высушенной и десорбированной пробы биологической жидкости.
В качестве впитывающего влагу пористого материала адсорбционного элемента могут быть использованы целлюлоза и ее производные, а также стеклянное или полиэфирное микроволокно. Кроме того, адсорбционный элемент может быть выполнен из полисульфона. Выбор конкретного материала, из которого изготовлен адсорбционный элемент, зависит от условий взятия пробы, условий и длительности хранения пробы, а также от вида биологической жидкости, подлежащей анализу.
В некоторых вариантах реализации адсорбционный элемент выполнен в виде полоски шириной от 0,2 до 2 см и длиной от 1 до 10 см, причем на конце полоски с рабочей зоной на одинаковом расстоянии с шагом 0,2-1,0 см друг от друга в поперечном направлении нанесены идентификационные линии, ограничивающие одинаковые по площади участки. Использование адсорбционного элемента в таком варианте позволяет осуществлять равномерное нанесение анализируемого образца на мембрану путем контакта конца мембраны с образцом в течение определенного времени, достаточного для сорбции жидкости на мембране с определенной площадью поверхности. Нанесение идентификационных линий на полоску с мембраной позволяет путем отрезания мембраны обычными ножницами различным по площади ее участков с хорошей точностью получать высушенные образцы анализируемой жидкости с различным фиксированным содержанием анализируемого материала.
Адсорбционный элемент может дополнительно содержать пористую мембрану, способную задерживать клеточные элементы крови при прохождении через ее структуру крови и расположенную в контакте с рабочей зоной полоски.
В некоторых вариантах реализации защитный контейнер может быть выполнен из плотного материала в виде свернутого конверта, обеспечивающего внешнюю защиту адсорбционного материала с двух сторон.
Также защитный контейнер может представлять собой стандартный полимерный наконечник для автоматического или полуавтоматического дозатора. В таком варианте мембранный материал, способный эффективно впитывать в себя кровь или другую биологическую жидкость, строго определенного размера (площади или объема) вкладывают в наконечник, фиксированный объем биологической жидкости (меньший, чем объем жидкости впитываемый мембраной) с использованием автоматического дозатора вносят в наконечник, после чего мембрану с жидкостью высушивают (например, с использованием фена или в присутствии эффективного влагопоглощающего осушителя). Хранение или пересылку полученных образцов осуществляют в полимерных пакетах, предотвращающих поглощение мембраной влаги из окружающей среды. Для проведения анализа наконечник с мембраной и высушенным образцом прикрепляют к дозатору и отбирают дозатором объем буферного раствора, эквивалентный первоначальной пробе, проводят инкубацию в течение нескольких минут для десорбции определяемых компонентов в раствор, раствор переносят в кювету анализатора для проведения анализа с использованием соответствующих наборов реагентов.
Возможен вариант реализации, когда защитный контейнер выполнен из плотного материала в виде содержащего осушитель закрывающегося пенала, обеспечивающего внешнюю защиту адсорбционного материала.
В любом варианте реализации защитного конверта он должен изолировать адсорбционный элемент с нанесенной на него пробой биологической жидкости от внешней среды.
Устройство выполнено с возможностью анализа биологических жидкостей (кровь, сыворотка, моча, лимфа, пот, молоко, вытяжки тканей и т.д.) живых существ, а также воды и содержащих воду проб.
Ниже приведены примеры использования разработанного устройства.
Пример 1. Устройство для получения сухих образцов крови для проведения лабораторного иммуноферментного анализа антител к возбудителям инфекционной бурсальной болезни (ИББ) в крови иммунизированных цыплят и кур.
2
2
С использованием коммерческого иммуноферментного набора реагентов BioChek (Англия) определяли титры антител в крови иммунизированных цыплят кур к возбудителям инфекционной бурсальной болезни (ИББ) и инфекционного энцефаломиелита (АЕ) в нативных и в высушенных на мембране образцах. Для получения сухих пятен крови использовали устройство в виде трех отдельных бумажных полосок шириной 0,5 см и длиной 7 см, находящихся в картонном конверте, при этом один из концов каждой из полосок был закреплен в конверте, обеспечивавшем внешнюю защиту с двух сторон полосок, а второй конец находился в свободном состоянии. Полоски были изготовлены из пористой фильтровальной бумаги фирмы Whatman 903, на которых в поперечном направлении были нанесены тонкие линии на равном расстоянии 0,5 см друг от друга. Сорбционная емкость образца используемой бумаги составляла 90 мкл воды на 1 см площади поверхности мембраны. Свободный конец полоски погружали в образец исследуемой крови на 2-3 с(время, в течение которого кровь под действием капиллярных сил проходила на расстояние больше двух обозначенных делений). Полоску вынимали из жидкости и высушивали на воздухе в течение 2 часов. Высушенные образцы хранили при комнатной температуре в течение 2 суток перед проведением анализа. При проведении анализа с использованием ножниц аккуратно отрезали от свободного конца полоски кусочек мембраны, соответствующий двум нанесенным делениям (площадь мембраны с высушенным образцом сыворотки составляла 1 см). Отрезанный кусочек бумаги с сухим образцом помещали в пробирку, в которую добавляли 270 мкл 0,01 М фосфатного буферного раствора, содержащего 0,14 М NaCl, что в три раза превышало первоначальный сорбированный объем образца крови. Пробирку встряхивали в течение 3 минут. Для проведения анализа из пробирки отбирали аликвоту раствора в объеме 20 мкл, которую затем разводили в 167 раз, чтобы конечное разведение, требуемое согласно инструкции к набору, составило соотношение 1:500. Результаты по определению титра антител к ИББ и АЕ с использованием предлагаемого устройства и нативных образцов крови приведены в таблицах 1 и 2, соответственно.
Табл.1
Антитела к вирусам
Титр антител в нативных образцах крови(n-14)
Интерпретация результата
Мембрана
Средний титр антител
Интерпретация результата
% к титру антител в крови
1:15408
+
1:13940
+
81.9
1:15429
+
1:10455
+
67.8
1:9158
+
1:7472
+
81.6
1:10725
+
1:8169
+
76,2
1:14226
+
1:12071
+
84,9
1:9603
+
1:972 1
+
101.2
1:6491
+
1:9574
+
147.4
ИББ
1:9433
+
1:6911
+
73.3
1:8285
+
1:11365
+
137.2
1:10745
+
1:11287
+
105,0
1:11074
+
1:1931
+
107.7
1:14184
+
1:16372
+
115.4
1:10405
+
1:13124
+
126.1
1:10576
+
1:11406
+
107.8
Среднее значение
101,0
Табл. 2
Антитела к вирусам
Титр антител в нативных образцах крови (n=14)
Интерпретация результата
Мембрана
Средний титр антител
Интерпретация результата
% к титру антител в крови
1:9606
1:8197
+
85,3
1:5622
+
1:3999
+
71,1
1:4800
+
1:3364
+
70,1
1:6984
1:4935
+
70,7
1:6372
1:5822
+
91,4
1:8712
-
1:9591
+
100,1
1:7328
1:8835
+
120,5
1:7112
1:7043
+
99,0
АЕ
1:2504
-
1:3566
+
142,4
1:6402
1:7463
+
116,6
1:4
Отр.
1:79
Отр.
Отр.
1:45
Отр.
1:76
Отр.
Отр.
1:28
Отр.
1:94
Отр.
Отр.
1:13
Отр.
1:68
Отр.
Отр.
Среднее значение
96,7
Для всех исследованных сывороток полученные с использованием сухих пятен данные хорошо коррелируют с результатами определения титра антител в нативных сыворотках, что свидетельствует о возможности использования устройства для получения сухих пятен сыворотки для последующего серологического исследования.
Пример 2. Устройство для получения сухого образца сыворотки для проведения лабораторного анализа сыворотки кур на наличие антител к возбудителям ньюкаслской болезни (НБ).
2
2
Сравнительное определение антител к возбудителям ньюкаслской болезни кур определяли в нативных сыворотках, содержащих антитела в различном титре с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в образцах нативных сывороток и образцах, полученных после их высушивания на мембранах и последующей элюции. Для получения сухих пятен сыворотки использовали устройство в виде трех отдельных бумажных полосок шириной 0,5 см и длиной 7 см, находящихся в картонном конверте, при этом один из концов каждой из полосок был закреплен в конверте, обеспечивавшем внешнюю защиту с двух сторон полосок, а второй конец находился в свободном состоянии. Полоски были изготовлены из пористой фильтровальной бумаги фирмы Munktell, на которых в поперечном направлении были нанесены тонкие линии на равном расстоянии 0,5 см друг от друга. Сорбционная емкость образца используемой бумаги составляла 70 мкл воды на 1 см площади поверхности мембраны. Свободный конец полоски погружали в образец исследуемой крови на 2-3 сек (время, в течение которого кровь под действием капиллярных сил проходила на расстояние больше двух обозначенных делений). Полоску вынимали из жидкости и высушивали на воздухе в течение 2 часов. Высушенные образцы хранили при комнатной температуре в течение 2 суток перед проведением анализа. При проведении анализа с использованием ножниц аккуратно отрезали от свободного конца полоски кусочек мембраны, соответствующий двум нанесенным делениям (площадь мембраны с высушенным образцом крови составляла 1 см). Отрезанный кусочек бумаги с сухим образцом помещали в пробирку, в которую добавляли 210 мкл 0,01 М фосфатного буферного раствора, содержащего 0,14 М NaCl, что в три раза превышало первоначальный сорбированный объем образца сыворотки. Пробирку встряхивали в течение 3 минут. Для проведения анализа из пробирки отбирали аликвоту раствора в объеме 20 мкл. Результаты по определению титра антител с использованием предлагаемого устройства и нативных сывороток приведены в таблице 3.
Табл.3
№ сывороток
Титр антител в РТГА (log2)
% к титру антител в нативной сыворотке
Нативная сыворотка
После элюции с мембраны
1
4
5
125
2
5
5
100
3
5
4
80
4
5
4
80
5
2
2
100
6
3
3
100
7
3
3
100
8
3
3
100
9
3
4
133
10
3
3
100
11
4
4
100
12
4
4
100
13
1
1
100
14
4
5
125
15
4
5
125
16
5
5
100
17
7
7
100
18
6
6
100
19
8
8
100
20
9
9
100
21
8
7
88
22
8
8
100
23
6
6
100
24
11
10
91
Среднеезначение
102
Как видно из таблицы, титр антител, определяемый в элюентах с использованием сухих образцов сывороток, получаемых с использованием предлагаемого устройства, соответствовал исходному на 88-125%, что свидетельствовало о пригодности данных мембран для получения и хранения образцов сывороток крови птиц для дальнейших серологических исследований.
Пример 3. Устройство для получения сухих образцов коровьего молока для проведения лабораторного анализа молока для определения содержания прогестерона с целью определения стельности коров.
Для экспресс-выявления стельности коров использовали подход, основанный на определении концентрации прогестерона (ПГ) в молоке осемененных коров на 21 день после осеменения методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа. Концентрация ПГ в молоке коров претерпевает циклические изменения. Концентрация ПГ менее 2 нг/мл соответствует моменту овуляции, и затем возрастает до максимума (>10 нг/мл) на 13-15 сутки. Если стельность не наступает, то уровень ПГ падает уже на 18-20 сутки. Если корова стельная, высокая концентрация ПГ сохраняется. Поэтому, определяя концентрацию прогестерона на 21 сутки, можно определить статус исследуемых животных как стельных (с высоким уровнем прогестерона) или нестельных (с низким уровнем прогестерона). Стельной считается корова с содержанием ПГ в молоке >7 нг/мл.
2
В качестве анализируемого материала использовали как свежеполученные образцы молока коров, так и образцы молока, нанесенного на пористые мембраны предлагаемого устройства. Так как отбор молока у коров осуществляется непосредственно на ферме, а анализ проводится в специализированных лабораториях, процессы транспортировки и сохранения образцов до проведения анализа являются ключевыми. Как правило, для сохранения жидких полученных образцов используют их замораживание, что представляет дополнительные трудности. В данном случае для тестирования предлагаемого устройства для получения сухих образцов аналитического материала использовали вариант устройства, основанный на использовании стандартных наконечников автоматических дозаторов на 200 мкл, в которые были помещены стандартные мембраны Whatman 903 в виде узких свернутых полосок площадью 1 см. С помощью полуавтоматического одноканального дозатора отбирали объемы молока 50 мкл для каждого животного, наконечники с образцами помещали в штатив и высушивали содержимое с использованием фена в течение 1 часа. Полученные образцы, а также соответствующие образцы свежего молока, перевозили в лабораторию, где проводили определение содержания ПГ в образцах молока с использованием стандартных коммерческих наборов реагентов для твердофазного иммуноферментного анализа ПГ производства компании «Хема-Медика» (РФ) с целью определения стельности животных. Всего был протестирован 101 образец молока от 92 животных. Полученные результаты приведены в таблице 4.
Табл. 4
Иммуноферментный анализ
Ректальное исследование
Всего образцов
Жидкие образцы молока
Сухие образцы молока
100%
Время проведения анализа(дней после осеменения)
21
21
65-75
Результат исследования
Стельные
Стельные
Стельные
58 (57%)
Стельные
Стельные
Нестельные
14 (14%)
Нестельные
Нестельные
Нестельные
29 (29%)
29% от общего числа проб (всего 29 проб от 27 животных) с использованием метода иммуноферментного анализа были диагностированы как принадлежащие нестельным животным, что в последующем было подтверждено в результате ректального исследования. Количество животных, определенное как стельные, полностью соответствовало для образцов жидкого молока и сухих образцов, полученных в предлагаемом устройстве. Таким образом, имеется полное соответствие между результатами определения ПГ в образцах жидкого и сухого молока, что свидетельствует о применимости предлагаемого устройства для получения сухих образцов биологической жидкости для последующего проведения анализа.
Сравнительный анализ разработанного устройства и устройства, использованного в качестве ближайшего аналога, показал несомненное упрощении конструкции сорбирующего элемента при одновременном расширении области применения за счет расширения возможных объектов анализа.