Адсорбция ионов н+ и он− на коллагене

А. С. Чухно, И. Б. Дмитриева, С. С. Колодеева, Д. В. Мартынов АДСОРБЦИЯ ИОНОВ Н+ И ОН~ НА КОЛЛАГЕНЕ*

Введение. Коллаген — самый распространённый естественный полимер и главный белковый компонент межклеточного вещества соединительных тканей всех типов. В настоящее время активно изучаются свойства коллагена применительно к медицине (заживление ран) и пластической хирургии, так как именно коллагены выполняют важные опорно-механические функции, являясь главными белками соединительных тканей и костей млекопитающих.

Изучению коллоидно-химических свойств коллагена сегодня уделяется мало внимания. Между тем, исследование адсорбционных свойств дисперсных систем, содержащих биологически активные вещества (БАВ), способствует дальнейшему развитию теории адсорбции сложных органических соединений, позволит оптимизировать условия транспорта лекарственных препаратов в живых организмах, уменьшить влияние вредных экологических явлений.

Свойства белков (адсорбция ионов Н+ и ОН~, значения точки нулевого заряда рНтнз, способность адсорбировать различные важные для живых организмов вещества) зависят от баланса между амино- и карбоксильными группами белка. Изменение заряда белка в зависимости от состава водной фазы (рН, ионной силы раствора, содержания веществ, способных повлиять на заряд) определяет пространственную структуру белков — их конформационные превращения, способность к специфическим взаимодействиям и, в конечном счёте, их биологическую активность.

Коллаген относят к классу склеропротеинов. В настоящее время под названием склеропротеинов объединяют те белки, которые:

— обладают одновременно нерастворимостью или весьма ограниченной растворимостью в воде, водных растворах нейтральных солей, этаноле и смесях этанола с водой;

— обладают относительно высокой устойчивостью к химическим реагентам и действию ферментов;

— характеризуются фибриллярной структурой частиц;

— выполняют, главным образом, опорно-механические или механозащитные функции.

Видимые в оптическом микроскопе коллагеновые волокна состоят из различимых в электронном микроскопе фибрилл — вытянутых в длину белковых молекул, названных тропоколлагеном. Тропоколлаген — основная структурная единица коллагена. Одной из отличительных черт данного белка является то, что треть всех его аминокислотных остатков составляет глицин, треть — пролин и 4-гидроксипролин, около 1 % — гид-роксилизин; некоторые молекулярные формы коллагена содержат также 3-гидрокси-пролин, хотя и в весьма ограниченном количестве [1].

Молекулы коллагена собираются в коллагеновые фибриллы. В результате перекрёстного связывания цепей и спиральных молекул фибрилл через основания Шиф-фа и альдольную конденсацию (т. е. перекрёстное связывание их рядом ковалентных

* Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации «Ведущие научные школы» № НШ-6291.2010.3 «Термодинамические, механические, реологические и электрические свойства поверхностных слоёв, дисперсных систем и материалов».

© А.С.Чухно, И.Б.Дмитриева, С.С.Колодеева, Д.В.Мартынов, 2011

связей) образовавшиеся фибриллы приобретают силу напряжения зрелых коллагеновых волокон [2]. Согласно последним исследованиям структуры коллагенов [3], молекулы тропоколлагена, расположенные ближе к периферии фибриллы, связаны большим количеством ковалентных связей, нежели центральные тропоколлагеновые молекулы, отчего фибрилла в целом обладает жестким поверхностным слоем и более мягкой сердцевиной. Химические и физические свойства, структура белков в большой степени определяются процессами диссоциации карбоксильных групп и протонизации аминогрупп. Иными словами, процессами сорбции и десорбции ионов Н+, ОН~.

Целью настоящей работы являлось исследование влияния солей одно-, двух- и трёхзарядных катионов металлов на сорбцию Н+, ОН~ на коллагене в зависимости от концентрации и рН раствора.

Объекты и методики исследования. В качестве объекта исследования использовался коллаген, выделенный из бычьих хвостов на заводе «Белкозин» и очищенный в лаборатории С. С. Скороходова НИИ ВМС (ИВС). Коллаген подвергался лиофильной осушке (при высоком вакууме и при замораживании).

Исследования сорбционных свойств данного белка проводились в растворах: КС1,

СаС12, MgCl2, А1С1з, Fe(NOз)з.

Концентрации рабочих растворов КС1 и СаС12 равнялись 1 • 10~3, 1 • 10~2, 1 • 10-1, 1 • 100; А1С13 — 1 • 10~3, 1 • 10~2; MgC12 и Fe(NO3)3 — 1 • 10~3 моль/л.

Все применяемые реактивы были марки ч.д.а., кроме хлорида алюминия — х.ч. Растворы готовились на дистиллированной воде с удельной электропроводностью (1 + 2) • 10~6 См/см. Для титрования готовились растворы щёлочи и кислоты на воде, освобождённой от углекислого газа кипячением в течение 30 мин, которые хранились без доступа СО2 под натронной известью. Концентрации растворов проверялись по электропроводности и аналитически.

В работе использовались следующие методы: потенциометрического титрования (исследование сорбционных свойств коллагена в водных растворах электролитов, метод вискозиметрии) — для определения значения молекулярной массы; кондуктометриче-ское титрование — для количественного определения несвязанных функциональных групп.

Сорбцию ионов Н+ и ОН~ исследовали методом непрерывного потенциометрического титрования. Титрование проводили в атмосфере азота для исключения влияния СО2 воздуха. В ячейку помещали 25 мл исследуемого раствора, выдерживали 30 мин в атмосфере азота и затем титровали раствором КОН (0,020 моль/л). Титрант добавляли порциями по 0,1 мл с интервалом 1 мин. Вначале титровали раствор без сорбента, а потом с сорбентом. В растворах КС1 (с =1 • 10~3 моль/л), СаС12 (с =1 • 10~3 моль/л), А1С13 (с =1 • 10~3 моль/л) титрование проводили не только через 30 мин после добавления сорбента, но и через сутки после добавления сорбента к исследуемому раствору. Регистрацию рН осуществляли на рН-метре-150 М с точностью измерения рН ±0,05 мВ.

В работе проведено исследование кинетики сорбции ионов Н+ и ОН~ на коллагене. Для этого приготовлялась серия растворов КС1 (с =1 • 10~3 + 1 • 10-1 моль/л ) и СаС12 (с =1 • 10~3 + 1 • 10° моль/л). Значение рН растворов доводили до 3.0, добавляя НС1. Далее в раствор помещали навеску коллагена. Через определённые интервалы времени измеряли значение рН. Аналогичные измерения проводили и для растворов КС1, СаС12 всех указанных концентраций без сорбента. Отсчёт времени начинали после помещения объекта в раствор. Было замечено, что через 30 мин практически во всех случаях значение рН устанавливается постоянным и неизменным в последующие семь суток, то

есть наступает сорбционное равновесие. И все последующие опыты проводились через 30 мин после того, как коллаген помещали в раствор.

Для коллагена характерна одновременная сорбция Н+ и ОН~ ионов. В кислой области при рН < рНтнз преобладает сорбция Н+ ионов, в щелочной при рН > рНтнз десорбция Н+ ионов (сорбция ОН~ ионов), поэтому рассчитывали избыток сорбированных ионов ж(Н+ — ОН~) как функцию рН по формуле

£

т т

где VI — объём КОН, пошедший на титрование раствора в присутствии сорбента, мл; У° — объём КОН, пошедший на титрование раствора без сорбента, мл; т — масса навески сорбента, г; с — концентрация щёлочи, моль/мл.

Молекулярную массу (М) определяли вискозиметрическим методом по стандартной методике [4]. Следует отметить, что гидродинамические характеристики макромолекул, выражающие действие сил трения на частицы при движении в среде, очень сильно зависят не только от размеров и формы, принимаемых белком в растворе [5-7], но и от электрического заряда молекулы [8], что необходимо учитывать при определении молекулярной массы природных полимеров вискозиметрическим методом. Также отметим, что из-за присутствия молекул с различными массами, определение М по характеристической вязкости приводит к средневязкостному значению молекулярного веса, несколько отличному от среднечисленного и средневесового значений М. Молекулярная масса коллагена составила 160 000 моль/г, полученное значение согласуется с приводимыми в литературе. Ошибка метода вискозиметрии не превышала ±10 %.

Количественное определение несвязанных пептидной связью функциональных групп проводили методом кондуктометрического титрования. В ячейку помещали 100 мл исследуемой дисперсии коллагена и титровали раствором КОН (с = 0,015 моль/л) для определения карбоксильных групп, для определения аминогрупп — раствором НС1 (с = 0,010 моль/л). Титрант добавляли порциями по 0,1 мл. После каждой добавленной порции титранта измеряли значение электропроводности (к) раствора. Интервал между дозами титранта составлял 1 мин. Исследуемую дисперсию готовили следующим образом: навеску коллагена т = 0,05 г помещали в 100 мл дистиллированной воды. По истечении суток раствор оттитровывали.

Удельную электропроводность регистрировали на кондуктометре типа АНИ0Н-410 с точностью измерения 0,1 мкСм/см.

Количество групп рассчитывали по формуле

УТ Ст

[(*)„] = (2) т

где [(X)„] — количество карбоксильных или аминогрупп, моль/г; Ут — объём титранта КОН (НС1), мл; Ст — концентрация титранта, моль/мл; т — масса навески коллагена, г.

Точность измерения удельной электропроводности составила ±1 %.

Результаты и обсуждения. На рис. 1, а, приведена кривая кондуктометрического титрования дисперсии коллагена раствором КОН. Две точки перегиба соответствуют двум конечным точкам титрования. Это свидетельствует о существовании двух видов карбоксильных групп, отличающихся константами диссоциации. Разные константы диссоциации имеют карбоксильные группы в а, в и т. п. положениях. Общее количество свободных карбоксильных групп, рассчитанное по суммарному объёму щёлочи, пошедшей на титрование, составляет [(-СООН)] = 1,2 • 10~3 моль/г.

рН

мл

уНС1, мл

Рис. 1. Кондуктометрическое титрование водной дисперсии коллагена раствором КOH

Ут, мл

Рис. 2. Кривые потенциометрического титрования: 1 — раствор КС1, с = 1 х х 10~3 моль/л, 2 — дисперсий коллагена в растворе КС1, с =1 х х 10~3 моль/л

Подобным образом вычисляли количество несвязанных аминогрупп, приходящихся на единицу массы коллагена (рис. 1, б) — [(-МН^)] = 0,774 • 10~3 моль/г. Важно отметить, что методом кондуктометрического титрования определяется количество карбоксильных и аминогрупп, не связанных пептидной связью — «свободных».

Рассмотрим результаты потенциометрического титрования дисперсий коллагена в растворах КС1 (с =1 • 10~3 + 1 • 10° моль/л). В качестве примера на рис. 2 приведены кривые титрования дисперсии коллагена в растворе КС1 1 • 10~3 моль/л. Точка пересечения кривых соответствует точке нулевого заряда (рНтнз). Анализ кривых потенциометрического титрования показывает, что в области рН < рНтнз кривая титрования с сорбентом идёт выше, чем без сорбента (во всех случаях), вследствие сорбции Н+-ионов на коллагене. Коллаген в этой области рН заряжен положительно. В области рН > рНтнз кривая с сорбентом идёт ниже, чем без сорбента, из-за сорбции ОН--ионов, при этом поверхность белка заряжается отрицательно. При увеличении ионной силы

Рис. 3. Зависимость количества сорбированных ионов Н+, ОН- на коллагене от значений рН дисперсий для различных концентраций КС1:

1 — 1 • 10 3; 2 — 1-10 2; 3 — ЬЮ-1;

4 — 1•100

раствора происходит увеличение обмена катионов и анионов на Н+, ОН~, что отражается на увеличении сорбции Н+, ОН~.

По кривым потенциометрического титрования рассчитывали количество сорбированных Н+-, ОН~-ионов как функции рН. Для этого строили зависимости, приведенные на рис. 3. Было установлено, что значение рНтнз коллагена в растворах КС1 (с =1 • 10~3 + 1 • 100 моль/л) слабо смещается в кислую область, что свидетельствует

0 незначительной специфической сорбции катиона (К+).

Аналогично проводили потенциометрическое титрование дисперсий коллагена в растворах СаСЬ (с =1 • 10~3 +1 • 100 моль/л). Кривые потенциометрического титрования дисперсий коллагена в растворах СаС12 (рис. 4, 5) имели такой же вид, как и для КС1. Отметим, что значение рНтнз коллагена в растворах СаС12 в диапазоне концентраций от 1 • 10~3 до 1 • 10-1 моль/л слабо смещается в кислую область, что свидетельствует о незначительной специфической сорбции катиона (Са2+). Значительное смещение рНтнз коллагена наблюдается только в растворах СаС12 с концентрацией 1 • 10° моль/л. Это может быть связано с тем, что при высоких концентрациях электролита происходит частичная дегидратация ионов кальция, и они в состоянии образовывать более прочные связи с карбоксильными группами коллагена.

Для случая титрования дисперсий коллагена в растворе MgCl2 с концентрацией

1 • 10~3 моль/л по кривым потенциометрического титрования рассчитывали количество сорбированных ионов Н+ и ОН~ (рис. 6). В точке нулевого заряда рН составляет 4,9, что выше, чем для растворов хлорида кальция той же концентрации. Так как заряды катионов одинаковые, то это может быть связано с ионными радиусами, у кальция он больше, а значит меньше размер гидратированного иона и сильнее его взаимодействие с коллагеном.

На рис. 7 представлены рассчитанные значения х/т для дисперсий коллагена в растворах А1С1з, Fe(NOз)з (с =1 • 10~3 моль/л). Можно было бы ожидать увеличения смещения рНтнз коллагена в кислую область с ростом заряда катиона. Однако в области рН > 5 в растворе не существует А13+, Fe3+, а присутствуют различные гидролизные

Ут, мл

Рис. 4- Кривые потенциометрического титрования:

1 — раствор СаС12, с = 1 • 10~3 моль/л,

2 — дисперсия коллагена в растворе СаС12, с =1 • 10~3 моль/л

рн

Ут, мл

Рис. 5. Кривые потенциометрического титрования:

1 — раствор СаС12, с =1 • 100 моль/л,

2 — дисперсия коллагена в растворе СаС12, с =1 • 100 моль/л

формы — [А10Н]2+, [А1(0Н)2]+, А1(ОН)з, более сложные полимерные формы и анионы типа [Н4АЮ4Г [8-16]. Специфическая сорбция анионных форм алюминия и железа отражается в смещении рНтнз в щелочную область.

На рисунке, на кривой для А1С1з, виден ярко выраженный минимум, который можно объяснить адсорбцией иона [А1(0Н)]2+, содержание которого в растворе в диапазоне рН от 3 до 6 вначале резко возрастает, а потом уменьшается с максимумом при рН = 4,4 + 4,6 согласно литературным данным [8-16]. Сорбция иона [А1(0Н)]2+ значительна, с одной стороны, вследствие большой способности к поляризации этого несимметричного иона при взаимодействии с сорбционными центрами коллагена, с другой стороны, она облегчена, так как идёт с отщеплением молекулы воды. В присутствии Fe(N03)3 такое явление не наблюдали, что согласуется с отсутствием формы ^е(0Н)]2+

Рис. 6. Зависимость количества сорбированных ионов Н+, ОН~ на коллагене от значений рН дисперсий:

1 — раствор MgСl2, 2 — раствор СаС12, с =1 • 10~3 моль/л

10

рН

Рис. 7. Зависимость количества сорбированных ионов Н+, ОН~ на коллагене от значений рН дисперсий:

1 — раствор AlСlз, 2 — раствор Fe(NO3)3, с =1 • 10~3 моль/л

для железа при данных рН. В растворе Fe(N03)3 эта форма существует в значительных количествах при рН < 3 [17].

Из величин х/т, определённых методом потенциометрического титрования, и определённых методом кондуктометрического титрования полных количеств карбоксильных и аминогрупп (х/т)то для каждого значения рН и концентрации фонового электролита рассчитывали степень протонизации аминогрупп а+ и диссоциации карбоксильных групп а_ как отношение

— (Н+ - ОН-) т

х

- Н+ - ОН-

т

Используя метод расчёта, предложенный в работах [18-20], вычисляли концентрационные константы протонизации аминогрупп р^а1 и диссоциации карбоксильных р^а2 по

а

уравнениям

pQal = pH + lg pQ a2 = pH — lg

a

+

1 — a+' a-1 — a_ ’

Значения констант диссоциации кислотно-основных групп коллагена

Параметры Коллаген Глицин

pA'ai протонизации аминогрупп 3,2 2,34

РКа2 диссоциации

карбоксильных 5,9 9,6

групп

а затем методом двойной экстраполяции (с ^ 0, а ^ 0) находили истинные константы протонизации аминогрупп р^а1 и диссоциации карбоксильных рКа2.

В таблице приведены рассчитанные константы для коллагена и для сравнения представлены литературные данные для глицина [14, 21]. Значения констант протонизации аминогрупп и диссоциации карбоксильных групп для коллагена отличаются от глицина, по-видимому, вследствие влияния других аминокислот, входящих в состав молекулы коллагена.

Заключение. В ходе настоящей работы установлено, что:

1) молекулярная масса исследуемого образца равна 160 000 моль/г;

2) кислотно-основное равновесие для водных дисперсий коллагена в негидролизую-щихся электролитах устанавливается менее чем за 30 мин;

3) значение рНтнз коллагена в растворах КС1 с ростом концентрации электролита

0,001 ^ 0,01 ^ 0,1 моль/л незначительно смещается в кислую область 4,68 ^ 4,62 ^ ^ 4,48 вследствие слабой специфической адсорбции катиона;

4) значение рНТНЗ коллагена в растворах СаС12 смещается в кислую область сильнее до рН = 4,04, чем в растворах КС1, свидетельствуя о более значительной специфической адсорбции катиона Са+2, чем К+;

5) сильная специфическая сорбция на коллагене в растворе А1С13 объясняется сорбцией различных гидролизных форм алюминия и, в первую очередь, А1(0Н)+2; на кривой х/т(Н+ — ОН-)—рН виден ярко выраженный минимум, который обусловлен существованием в растворе иона А1(0Н)+2;

6) рассчитаны константы диссоциации карбоксильных групп (рК = 5,9) и протонизации аминогрупп (рК = 3,2) для коллагена.

Литература

1. Уайт А., Хендлер Ф., СмитЭ. и др. Основы биохимии. М., 1981. 1878 с.

2. Березов Т. Т., КоровкинБ. Ф. Биологическая химия. М., 1998. 750 с.

3. Gutsmann T., Fantner G. E., Venturoni M. et al. Evidence that Collagen Fibrils in tendons are in homogeneously structured in a tubelike manner // Biophysical J. 2003. Vol. 84. P. 2593-2598.

4. Бугреева Е. В., Евстратова К. И., Купина Н. А. и др. Практикум по физической и коллоидной химии / под ред. проф. К. И. Евстратовой. М., 1990. 255 с.

5. Цветков В. Н., Эскин В. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворе. М., 1964. 718 с.

6. Бреслер С. Е., ЕрусалимскийБ. Л. Физика и химия макромолекул. М.—Л., 1965. 510 c.

7. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот / под ред. Ю. С. Лазур-кина. М., 1967. 668 c.

8. Гауровиц Ф. Химия и функции белков. М., 1965. 530 c.

9. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. М., 1982. 354 c.

10. Ramachandran G. N., Sasirekharan V. Conformation of Polypeptides and Proteins // Adv. Prot. Chem. 1968. Vol. 23. Р. 283-438.

11. Nemethy G. Interaction Between Poly (Gly-Pro-Pro) Triple Helices: A Model for Molecular Packing in Collagen // Biopolymers. 1983. Vol. 22. Р. 33-36.

12. JaningJ. Structure and stability of proteins: The role of solvent // Colloids and Surface. 1984. Vol. 10. Р. 1-7.

13. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. М., 1980. 662 c.

14. Lilley T. H. Chemistry and Biochemistry of amino acids. N.-Y., 1985. 684 p.

15. Клебанов А. В., Богданова Н. Ф., Ермакова Л. Э. и др. Электроповерхностные характеристики (гидр)оксидов и оксидных наноструктур в растворах 1 : 1-зарядных электролитов.

1. Адсорбционные характеристики бемита, гетита и оксида кремния // Коллоид. журн. 2001. Т. 63. № 5. С. 617-623.

16. Клебанов А. В., Богданова Н. Ф., Ермакова Л. Э., Сидорова М. П. Электроповерхностные характеристики (гидр)оксидов и оксидных наноструктур в растворах 1 : 1-зарядных электролитов. 2. Адсорбционные характеристики бемита, гетита и оксида кремния // Коллоид. журн. 2001. Т. 63. № 5. С. 624-628.

17. Cornell R. M., PosnerA. M., Quckl. P. I. Sitrimetric and electrophoretic investigation of the p.z.c. and the i.e.p. of pigment rutile // J. Coll. Unt. Sci. 1975. Vol. 53. № 1. P. 6.

18. Matijevic’E, Couch J. P., Kerker M. Detection of Metal Ion Hydrolysis by Coagulation. IV Zinc // J. Phys. Chem. 1962. Vol. 66. P. 111-114.

19. Matijevic’ E, Stryker Z. J. Coagulation and Reversal of Charge of Lyophobic Colloids by Hydrolysed Metal Ions. III. Aluminum Sulfate // J. Coll. Int. Sci. 1966. Vol. 22. № 1. P. 68-77.

20. Matijevic’E, Abramson M. B., SchulzK. F., Kerker M. Detection of Metal Ion Hydrolysis by Coagulation: thorium // J. Phys. Chem. 1960. Vol. 64. № 9. P. 1157-1161.

21. ЯкубкеХ-Д., ЕшкайтХ. Аминокислоты. Пептиды. Белки. М., 1985. 33 с.

Статья поступила в редакцию 4 марта 2011 г.