Экспрессия сплайс-вариантов мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 в эритроидных клетках человека

УДК 577.175.14

A.Н. Силков, Т.В. Инжелевская, C.B. Крысов, C.B. Сенников,

B.А. Козлов

ЭКСПРЕССИЯ СПЛАЙС-ВАРИАНТОВ МРНК ГЕНОВ ИЛ-4 И ИЛ-6 В ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск

Ранее нами была продемонстрирована способность эритроидных клеток к продукции широкого ряда медиаторов, посредством, которых они могут участвовать в регуляции гемо и имму-нопоэза. Известно, что посредством альтернативного сплайсинга мРНК цитокинов, регуля-торные возможности клеток значительно возрастают за счет экспрессии сплайс-вариантов. Целью настоящего исследования было изучение экспрессии альтернативных сплайс-вариан-тов ИЛ-4 и ИЛ-6 в эритроидных клетках человека. В работе установлено, что для обоих цитокинов помимо полноразмерных форм мРНК детектируются более короткие продукты амплификации с делецией вторых экзонов. Полученные данные указывают, что экспрессия генов цитокинов в эритродных клетках происходит с участием механизмов альтернативного сплайсинга, что значительно расширяет регуляторный потенциал этих клеток.

Ключевые слова: альтернативный клетки

ИЛ-4 является одним из ключевых медиаторов в регуляции иммунного ответа. Показано, что в результате альтернативного сплайсинга мРНК ИЛ-4 образуется сплайс вариант — ИЛ-452 [8, 9]. Рекомбинантный белок ИЛ-452 показал свойства антагониста ИЛ-4, блокируя его эффекты на Т-, В-лимфоциты и моноциты [1,2]. Предполагается, что ИЛ-452 связывается с рецептором ИЛ-4, не вызывая передачи сигнала в клетку. Экспрессия мРНК ИЛ-452 обнаружена в различных типах клеток человека: мононуклеарных клетках периферической крови, в клетках миндалевидной железы, бронхоальвеолярного лаважа, легких, кишечника и тимуса [4, 8]. Кроме того, в ряде работ установлено изменение уровня экспрессии мРНК ИЛ-452 при некоторых патологиях [3, 13].

Сплайс-вариант ИЛ-6 с делецией второго эк-зона выявлен при исследовании экспрессии этого гена в стимулированных митогенами мононуклеарных клетках периферической крови человека [7]. В тканях легких человека и в первичных культурах легочных фибробластов экспрессируются, помимо указанных выше ИЛ-6 и ИЛ-652, также изоформы мРНК ИЛ-654 и ИЛ-652,4. Анализ последовательностей сплайс-вариантов показал, что мРНК, образующиеся с делецией второго экзона, ИЛ-652 и ИЛ-652,4 содержат стоп-кодон, который преждевременно терминирует трансляцию, а при структурном анализе белка установлено, что ИЛ-654 не имеет сайтов связывания с рецептором ИЛ-6 ^р130) и, следовательно, не способен активировать трансдукцию сигнала и выполняет фун-

сплайсинг, интерлейкин-4, интерлейкин-6, эритроидные

кцию регулятора эффектов ИЛ-6. Таким образом, функциональная активность белков сплайс-изо-форм ИЛ-6 остается под вопросом.

В предыдущих исследованиях мы показали экспрессию мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 эритроидны-ми клетками мыши и продукцию этих цитокинов эритроидными ядросодержащими клетками человека, полученными из фетальной печени и нормального костного мозга [6, И]. В настоящей работе нами проведены исследования экспрессии сплайс вариантов мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 в эритроидных клетках человека. Мы установили, что в этих клетках присутствуют как полноразмерные, так и альтернативно сплайсированные формы мРНК.

Методика

Источниками для получения эритроидных ядросодержащих клеток человека в ходе нашего исследования служили фетальная печень 17-20 недели развития плода и костный мозг здоровых доноров. Прерывание беременности проводилось по социальным показателям. Фетальные ткани печени выделяли из абортивного материала и исследовали на отсутствие основных инфекций (герпес 2-го типа, гепатиты В и С, цитомегаловирус, ВИЧ, реакция на Hbs-Ag и ИЛУ). У всех доноров костного мозга было получено информированное согласие на процедуру забора биологического материала и разъяснены цели исследования.

Выделение эритроидных клеток, их культивирование, а также получение эритроидных колоний проводили, как описано ранее [И, 12].

Силков АЛ. Экспрессия сплайс-вариантовмРНКгенов ИЛ-4 И ИЛ-6 в эритроидных клетках человека/с. 129-131

Выделение РНК проводили стандартным методом фенольной экстракции, как описано [5]. Синтез кДНК и ПЦР проводили, как описано ранее [6|. Праймеры для амплификации последовательностей ИЛ-4 и ИЛ-6 были синтезированы согласно последовательностей опубликованных |1). Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозных гелях, визуализацию и анализ результатов осуществляли с помощью видео-денситометра и пакета прикладных программ «ImageMasterVDS» (Pharmacia Biotech).

Результаты

При исследовании мРНК гена ИЛ-4 вэритро-карибцитах человека, выделенных из фетальной печени и нормального костного мозга, были выявлены две формы мРНК, соответствующие ИЛ-4 и ИЛ-462 (Рис. 1) При исследовании экспрессии гена ИЛ-6 в эритроидных клетках также была обнаружена ранее описанная изиформа ИЛ-682 (Рис. 1). Факт наличия сплайс-варнантов мРНК в эритроидных клетках был подтвержден нами и при исследовании клеток эритроидных колоний, выращенных в полужидких средах из клеток фетальной печени и костного мозга (Рис. 2).

Таким образом, впервые установлено, что в эритроидных клетках, выделенных из фсгалыюй

печени и нормального костного мозга человек имеются альтернативно сплайсированные Bapi анты мРНК ИЛ-462 и ИЛ-652. Эти изоформ представлены в эритроидных клетках фетально печени и нормального костного мозга человек культивированных 24 часа в безсывороточно среде, в субпопуляциях эритроидных клето позитивных по антигену эритробластов и гликс форину А и культивированных 24 часа как в о-сутствие, так и в присутствие эритропоэтина, клетках эритроидных колоний (КОЕ-Э), культ! вированных 14 дней в полужидкой среде, а так» в клетках эритроидных колоний, дополнительн культивированных 24 часа в безсывороточно среде. Следует отметить, что в различных обра: цах соотношение оптической плотности фрагмег тов ИЛ-682/ИЛ-6 варьировало от 0,08 до 0,45, соотношение ИЛ-452/ИЛ-4 отОдо 0.19.

Заключение

Таким образом, полученные факты свидетелг ствуют об использовании эритроидными клеткг ми механизмов альтернативного сплайсинга дл регуляции экспрессии генов ИЛ-4 и ИЛ-6, яе ляющпхея важными факторами индукции гем и иммунопоэза и пролиферации эрптрондиы и других кроветворных клеток [10]. Эти данны

А

Б

Рис. 1. Детекция мРНК цитокинов в эритроидных клетках человека, выделенных из фетальной печени (А) и костного мозга (Б). После выделения клетки культивировались 24 часа в безсывороточной среде. М — маркер молекулярного веса ДНК - риС19/Кго91 (955, 585, 341,258 п.о.). ИЛ-4 - 288 п.о., ИЛ-462 - 240 п.о., ИЛ-6 - 640 п.о., ИЛ-682 - 450 п.о.

А

м IL-4 IL-б 2 2

Б

Рис. 2. Определение мРНК цитокинов в клетках эритроидных колоний, выделенных из фетальной печени (А) и костного мозга (Б). М — маркер

молекулярного веса ДНК - р1/С19/Кго91 (955, 585, 341,258 п.о.). ИЛ-4 - 288 п.о., ИЛ-462 - 240 п.о., ИЛ-6 - 640 п.о., ИЛ-682 - 450 п.о. 1 — эритроидные клетки после 24 часов культивирования в безсывороточной среде, 2 -клетки эритроидных колоний без дополнительного культивирования

Силков А.Н. Экспрессия сплайс-вариантов мРНК генов ИЛ-4 И ИЛ-6 в эритроидных клетках человека /с. 129-131

значительно расширяет регуляторный потенциал эритроидных клеток как в период эмбрионального развития, так и во взрослом организме. В частности, ИЛ-452 в роли антагониста вполне может служить фактором, сдерживающим активность пролиферации эритроидных предшественников и предшественников В лимфопоэза через блок рецептора ИЛ-4 на поверхности клеток.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант 03-04-49397.

EXPRESSION OF SPLICE-VARIANTS OF IL-4 AND IL-6 NRNA IN HUMAN ERYTHROID CELLS.

A.N. Silkov, T.V. Injelevskaya, S.V. Krysov, S.V. Sennikov, V.A. Kozlov

Earlier we showed ability of erythroid cells to production of wide range of mediators, by means of which they can participate in a regulation haemo-and immunopoiesys. It is known, that regulatory opportunity of cells considerably grow for the account of splice-variants expression. The purpose of the present research was study of alternative splice-variants of IL-4 and IL-6 expression in human erythroid cells. In work is fixed, that both cytokines besides of the fully spliced mRNA forms the shorter products of amplification with deleted second exon are expressed. The received data specify, that expression of cytokines in erythroid cells occurs to participation of mechanisms alternative splicing, that considerably dilates regulatory potential of these cells.

Литература

1. An alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation / S.P. Atamas, J. Choi, V.V. Yurovsky, B. White //J. Immunol. - 1996. - Vol. 156. - P. 435-441.

2. Antagonistic effects of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4delta2, on IL-4 activities in human monocytes and В cells / Y. Arinobu, S.P. Atamas,

T. Otsuka. ,et all..// Cell Immunol. - 1999. - Vol. 191.

- P. 161-167.

3. Asthmatic airway biopsy specimens are more likely to express the IL-4 alternative splice variant IL-4delta2 / E.M. Glare, M. Divjak, J.M. Rolland, E.H. Walters // J. Allergy Clin. Immunol. - 1999. - Vol. 104. - P. 978-982.

4. Atamas S.P. Interleukin 4 in systemic sclerosis: not just an increase / S.P. Atamas, B. White // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol. 6. - P. 658-659.

5. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem.

- 1987. - Vol. 162. - P. 156-159.

6. Cytokine gene expression in erythroid cells / S.V. Sennikov, L.V. Eremina, D.M. Samarin, et al. // Eur. Cytokine Netw. - 1996. - Vol. 7. - P. 771-774.

7. Detection and analysis of an alternatively spliced isoform of interleukin-6 mRNA in peripheral blood mononuclear cells / D.P. Kestler, S. Agarwal, J. Cobb, et al. // Blood. - 1995. - Vol. 86. - P. 4559-4567.

8. Generation of a variant of human interleukin-4 by alternative splicing / W.J. Alms, S.P. Atamas, V.V. Yurovsky, B. White // Mol. Immunol. - 1996. - Vol. 33.

- P. 361-370.

9. Identification of an alternatively spliced transcript of human interleukin-4 lacking the sequence encoded by exon 2 / R.V. Sorg, J. Enczmann, U.R. Sorg, et al. // Exp. Hematol. - 1993. - Vol. 21. - P. 560-563.

10. Interleukin 4 (B-cell stimulatory factor 1) can enhance or antagonize the factor-dependent growth of hemopoietic progenitor cells / D. Rennick, G. Yang, C. Muller-Sieburg, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1987. - Vol. 84. - P. 6889-6893.

11. Production of cytokines by immature erythroid cells derived from human embryonic liver / S.V. Sennikov, S.V. Krysov, T.V. Injelevskaya, et al. // Eur. Cytokine Netw. - 2001. - Vol. 12. - P. 274-279.

12. Production of hemo- and immunoregulatory cytokines by erythroblast antigen+ and glycophorin A+ cells from human bone marrow / S.V. Sennikov, T.V. Injelevskaya, S.V. Krysov, et al. // BMC Cell Biol. - 2004.

- Vol. 5. - P. 39.

13. Production of type 2 cytokines by CD8+ lung cells is associated with greater decline in pulmonary function in patients with systemic sclerosis / S.P. Atamas, V.V. Yurovsky, R. Wise, et al. // Arthritis Rheum. — 1999. — Vol. 42. -P. 1168-1178.