СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ПРОРАСТАНИЯ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАЗВУКА БЕЗ НАРУШЕНИЯ СТЕРИЛЬНОСТИ
METHOD FOR STIMULATING THE GERMINATION OF POTATO MICROTUBERS IN VITRO USING ULTRASOUND WITHOUT VIOLATING STERILITY

Изобретение относится к биотехнологии в области сельского хозяйства, в частности, к подходу стимуляции прорастания микроклубней, полученных при культивировании микрорастений картофеля in vitro.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа снятия периода покоя и стимуляции прорастания микроклубней без нарушения стерильности для включения полученных микропобегов в систему клонального микроразмножения.
Микроклубни являются неотъемлемой частью системы клонального микроразмножения и в целом культуры тканей картофеля.
Микроклубни применяют для размножения безвирусных растений in vitro, т.к. на одном микроклубне, в зависимости от генотипа, находится несколько меристемных участков (почек), что позволяет потенциально получить несколько микропобегов с одного экспланта за короткий период времени. Данный метод значительно повышает эффективность размножения.
Помимо этого, микроклубни картофеля являются хорошим объектом для депонирования генотипов in vitro, поскольку способны сохранять жизнеспособность при низких положительных температурах долгое время без каких-либо дополнительных условий.
Использование микроклубней для получения новых форм также широко распространено, особенно часто применяют воздействие конкретного селективного фактора для получения сомаклонального варианта, устойчивого к данному негативному влиянию.
Воздействие химических и физических мутагенных факторов на микроклубни используют для получения новых генотипов с дальнейшим отбором полезных мутаций.
Однако прорастание микроклубней у картофеля (Solanum tuberosum L.) представляет собой сложный процесс [1], который зависит от фотопериода [2], температуры [3], углеводного питания [4], содержания азота [5]. Это связано с тем, что при интенсификации процесса размножения, свежеобразовавшиеся микроклубни не помещают в условия низких положительных температур, а сразу включают в систему размножения. Таким образом, микроклубни не успевают пройти период покоя, что существенно сказывается на их дальнейшей продуктивности.
Для решения данной проблемы ряд исследователей [6, 7], использовали цитокинины для индукции микроклубнеобразования и их прорастания. В то же время данные по влиянию биологически активных соединений неоднозначны, поскольку разные регуляторы роста, особенно вещества антигиббереллинового действия, например, абсцизовая кислота, в различной степени влияют на эффективность этого процесса.
Кроме этого, существует вероятность, что длительное использование веществ, регулирующих рост, особенно гормонов роста, вовремя культивирования может привести к соматическим изменениям и другим негативным эффектам [8].
Тем не менее, был разработан способ [9], который включает удаление частей растений, их отчуждение и обработку стимулятором. При размножении миниклубней в сосудах их извлекают спустя 50-55 дней, после чего субстрат дополняют кремнийсодержащим удобрением, предварительно смоченным в 0,2% водного раствора йода и 0,1% селена, в количестве 10-12% от общего объема. Растения с отчужденными клубнями помещают в те же сосуды, проращивая их еще 2-3 недели.
В других исследованиях [10] растения обрабатывали раствором биологически активных веществ. При этом в процессе культивирования в жидкой питательной среде увеличивают площадь ассимилирующей поверхности растений, содержание в них фотосинтетических пигментов и эффективность столонобразования путем однократной обработки корневой системы растений раствором 24-эпикастастерона в концентрации 0,01-1 нМ в течение 4-5 ч.
Для стимуляции кинетики прорастания (процент проросших микроклубней в течение времени) микроклубней, высаживали их в торф и выращивали в теплице, предварительно обработав различными концентрациями перекиси водорода (20, 40 и 60 мМ) и тиомочевины (250, 50 0 и 750 мМ) [11].
Кроме химических способов стимуляции используют и физические. Ультразвуковое воздействие на растительные ткани приводит к увеличению проницаемости клеточных мембран и тем самым регулирует физиологические процессы [12].
3
Для решения проблемы прорастания клубней картофеля разработан способ стимуляции миниклубней [13]. Разработанный способ сочетает в себе физические и химические факторы. Для стимуляции прорастания миниклубней картофеля применяли ультразвук с частотой 22-44 кГц, плотностью акустической мощности 0,3-1,0 Вт/см, в течение 15-360 секунд, в растворе, содержащем биостимуляторы - меланиноподобные вещества из дрожжей Nadsoniellanigra, роданистый калий и тиомочевину (по 1,0-3,0 г/л), а также индолуксусную, гиберрелиновую и янтарную кислоты (по 0,01-0,03 г/л).
Наиболее близким по своей сущности к заявленному изобретению является способ стимуляции миниклубней с помощью ультразвука и биостимуляторов [13].
Недостатком прототипа является то, что у данного метода крайне низкая производительность (16 миниклубней) при стимуляции их прорастания ультразвуком и продолжительное время воздействия до 360 с. Для стимуляции прорастания миниклубней в промышленных масштабах данный способ не пригоден. Кроме того, данный способ не применим для культуры in vitro микроклубней, поскольку процесс облучения и воздействия стимуляторами не обеспечивает стерильные условия для их дальнейшего культивирования in vitro.
Таким образом, в целом нет данных о применении ультразвука для стимуляции прорастания микроклубней картофеля в стерильных условиях.
Целью изобретения является стимуляция прорастания микроклубней картофеля in vitro с помощью ультразвука без нарушения стерильности.
2
Цель достигается за счет того, что стерильные микроклубни картофеля разрезают на две равные части, помещают в жидкую среду MS (Мурасиге-Скуга) в стерильную трубчатую насадку (фиг. 1, 2), обеспечивающую объемное облучение, и обрабатывают ультразвуком, мощностью 2,7-8,0 Вт/см, в течение 10-120 секунд, затем микроклубни высаживают на безгормональную питательную среду MS и помещают в темноту на 48 часов, после чего выставляют в стандартные условия культуральной комнаты. Заявляемое изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для стимуляции прорастания микроклубней картофеля in vitro.
Пример 1
С культивируемых in vitro микрорастений картофеля сорта Удача провели сбор микроклубней с целью дальнейшего их проращивания на искусственных питательных средах для получения микропобегов и включения их в стандартную систему клонального микроразмножения.
Стерильные микроклубни в стерильных условиях ламинарного бокса разрезали на две равные части и помещали в жидкую питательную среду MS [14] в заранее подготовленную стерильную трубчатую насадку (фиг. 1).
2
2
Данная насадка передает ультразвуковые колебания в жидкую среду на месте контакта с металлом. Таким образом, обеспечивается объемное воздействие ультразвукового облучения на биологические объекты, находящиеся внутри насадки (фиг. 2). Мощность ультразвукового облучения варьировала от 2,7 Вт/см до 8,0 Вт/см. Экспозиция воздействия 60 секунд. Затем микроклубни высаживали на безгормональную питательную среду MS и помещали в темноту на 48 часов. Субкультивирование микроклубней осуществляли в широкогорлых конических колбах емкостью 250 мл со 100 мл среды. Колбы закрывали тонкой алюминиевой фольгой и герметизировали пищевой пленкой.
Дальнейшее культивирование микроклубней осуществляли в специально оборудованной культуральной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 2400 люкс (люминесцентные лампы Osram L36W Cool Daylight), температуре воздуха 24±2°С и влажности воздуха 55-60%.
Контролем служили необлученные, аналогичным образом разрезанные, микроклубни картофеля сорта Удача.
Эффективность обработки оценивали через месяц культивирования по количеству микроклубней, образующих микропобеги, а также по количеству микропобегов на один микроклубень и их длине.
Опыт имел четырехкратную повторность. Статистическую обработку данных проводили в программной среде Microsoft Excel.
Воздействие ультразвука на половинки микроклубней позволило существенно повысить их всхожесть (фиг. 3, 6). Данный эффект объясняется воздействием ультразвука, создающим капиллярный эффект и стимуляцию меристематических участков микроклубней по всей поверхности благодаря объемному облучению. В результате деления микроклубней на две части поступление питательных веществ из искусственной среды значительно усиливается через разрезанный участок и таким образом индуцируется активное пробуждение и рост побегов из почек микроклубня.
2
2
Так, всхожесть микроклубней при воздействии УЗ мощностью 2,7 Вт/см повышает их прорастаемость до 76,9±2,7% по сравнению с 19,6±1,8% в контроле (фиг. 3, 6). Повышение мощности до 4,7 Вт/см увеличивает прорастаемость микроклубней до 83,3±4,7%. Данный показатель превышает контрольный более чем в четыре раза.
2
2
Дальнейшее увеличение мощности до 5,6 Вт/см и 8,0 Вт/см приводит к снижению значения, но достоверно превышает контрольные значения в 1,9 и 1,6 раза.
2
Воздействие УЗ на микроклубни, предложенным способом, позволяет значительно стимулировать меристематические участки во всех вариантах опыта (фиг. 6). На фигуре 2 представлены данные развития микропобегов из почек «глазков» микроклубней. Наименьшие значения отмечены в контрольном варианте (2,4±0,2 шт.). Воздействие УЗ на экспланты приводит к индукции развития меристем с пиковыми значениями данного признака (8,5±0,6 шт.) при мощности 4,7 Вт/см, что более чем в 3,5 раза выше контрольных значений.
2
2
Возникающий капиллярный эффект, под действием ультразвуковых колебаний позволяет насытить микроклубни питательными веществами, что обеспечивает качественное развитие микропобегов. Так воздействие УЗ мощностью 2,7 Вт/см и 4,7 Вт/см приводит к наилучшему развитию микропобегов до 8,1±0,4 см и 8,8±0,4 см соответственно (фиг. 5). Во всех остальных вариантах опыта данные значения также достоверно превышали контрольные (5,7±0,2 см).
Анализируя полученные данные, можно утверждать с высокой степенью вероятности, что дальнейшее усиление воздействия УЗ приведет к снижению всех показателей в связи с деструктивным его действием при высоких мощностях на биологические объекты.
Таким образом, изложенные выше сведения свидетельствуют о том, что представленное изобретение обладает заявленными свойствами, и совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение указанного результата.
Для заявленного способа, в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, нет препятствий его осуществления на практике с использованием современных технических средств. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».
Данное изобретение расширяет разнообразие возможностей, обеспечивающее оптимальный выбор способа стимуляции микроклубней без нарушения их стерильности.
Список использованной литературы
1. Sharma S., Chanemougasoundharam A., Sarkar D., Pandey S.K. Carboxylic acids affect induction, development and quality of potato (Solanum tuberosum L.) microtubers grown in vitro from single-node explants // Plant Growth Regulation -2004. - V. 44. - P. 219-229.
2. Seabrook J.E.A., Coleman S., Levy D. Effect of photoperiod on in vitrotuberization of potato (Solanum tuberosum L.) // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 1993. - V. 34. - P. 43-51.
3. Leclerc Y., Donnelly D., Seabrook J.E.A. Microtuberization of layered shoots and nodal cuttings of potato: the influence of growth regulators and incubation periods // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 1994. - V. 37. - P. 113-120.
4. Simko I. Sucrose application causes hormonal changes associated with potato tuber induction // J. Plant Growth Regul. - 1994. - V. 13. - P. 73-77.
5. Sarkar D., Naik P.S. Effect of inorganic nitrogen nutrition on cytokinin-induced potato microtuber production in vitro II Potato Res. - 1998. - V. 41. - P. 211-217.
6. Donnelly D.J., Coleman W.K., Coleman S.E. Potato microtuber production and performance: a review // Am. J. Potato Res. - 2003. - V. 80. - P. 103-115.
7. Wang P.-J., Hu C.-Y. Potato tissue culture and its application in agriculture // Li P.H. (ed.), Potato Physiology. - Academic Press, London. - 1985. - P. 503-577.
8. Bizarri M., Borghi L., Ranalli P. Effects of activated charcoal effects on induction and development of microtubers in potato (Solanum tuberosum L.) // Ann. Appl. Biol. - 1995. - V 127. - P. 175-181.
9. Патент РФ №2479983 «Способ повышения коэффициента размножения меристемных клубней картофеля» / авторы: Басиев С.С., Бекузарова С.А., Болиева З.А., Дзгоев O.K., Пухаев А.Р., Кцоева З.А. Зарегистрирован в госреестре полезных моделей РФ 27.10.2011. Заявка: №2011143521/13 от 27.10.2011. Опубликовано: 27.04.2013. Бюл. №12. 2013. Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Горский государственный аграрный университет».
10. Патент РФ №2711577 на изобретение «Способ повышения продуктивности растений картофеля в оптимальных и стрессовых условиях выращивания» / авторы: Ефимова М.В., Данилова Е.Д., Коломейчук Л.В. и др. Зарегистрирован в госреестре полезных моделей РФ 17.01.2020. Заявка №2019124997 от 07.08.2019. Опубликовано: 07.08.2019. Бюл. №2. 2020. Патентообладатель: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» (ТГУ, НИ ТГУ).
11. Mani F., Bettaieb Т., Doudech N., Hannachi С. Effect of hydrogen peroxide and thiourea on dormancy breaking of microtubers and field-grown tubers of potato // African Crop Science Journal. - Vol. 21, No. 3. - Pp. 221-234.
12. Акопян В.Б., Ершов А.Ю., Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами. - М., ЮРАЙТ, 2016. - 223 с.
13. Патент РФ №2708829 на изобретение «Способ стимуляции миниклубней картофеля» / авторы: Мартиросян Ю.Ц., Мартиросян В.В., Мартиросян Л.Ю., Акопян В.Б., Гарибян Ц.С. Зарегистрирован в госреестре полезных моделей РФ 11.12.2019. Заявка №2018144342 от 14.12.2018. Опубликовано: 11.12.2019. Бюл. №35. 2019. Патентообладатель: Мартиросян Юрий Цатурович.
14. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol.15, №13. - P. 473-497.