УЛУЧШЕННЫЙ БИОФИЗИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ КЛЕТОЧНЫЙ МОНИТОРИНГ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦИТОЛОГИИ НА ОСНОВЕ СИЛЫ ЛАЗЕРА

1. Способ измерения клеточных реакций на различные возбудители с помощью оптических и/или жидкостных сил, при этом способ содержит этапы, на которых
принимают выбор первоначальных образцов, содержащих биологические клетки, обработанные различными известными уровнями возбудителей или анализируемого вещества,
выполняют измерения на основе оптической силы на образцах,
выясняют показатель реакции (RM), чтобы описывать клеточную реакцию на возбудители на основе одного или более параметров на основе оптической или жидкостной силы.
2. Способ по п. 1, при этом показатель реакции используется для измерения реакции дополнительных неизвестных образцов.
3. Способ по п. 1, дополнительно содержащий этап, на котором анализируют разбавленные растворы образца до тех пор, пока точный показатель измерения инфекционности не будет определен, на основе наличия RM, которая попадает в приемлемый целевой диапазон значений.
4. Способ по п. 1, при этом измеряемые образцы являются ядрами клеток, митохондриями или другим субклеточным компонентом или долей.
5. Способ по п. 1, где оптические и жидкостные силы основываются на цитологии на основе силы лазера.
6. Способ по п. 1, дополнительно содержащий этап, на котором
сравнивают показатель реакции первоначального образца с целевым значением
выбирают второй образец на основе результатов первого и алгоритма, определяющего ожидаемую или известную реакцию
сравнивают показатель реакции второго образца с целевым значением
выбирают последующие образцы аналогичным образом до тех пор, пока образец, совпадающий с целевым показателем реакции или другой определенной конечной точкой, не будет идентифицирован.
7. Способ по п. 5, при этом измерения на основе оптической силы используют цитологию на основе силы лазера, чтобы оценивать параметры, содержащие линейную скорость, размер, периметр, размер (площадь, диаметр, объем и т.д.), число захваченных клеток в каждом образце, число выпустивших излучение клеток в каждом образце, число смесей (на основе размера и/или формы или других параметров), число частиц, имеющих размер остаточных веществ (на основе размера и/или формы или других параметров), нормализованную скорость, минимальную x-позицию, время оптической выдержки, время оптического захвата, оптическую силу, оптический крутящий момент, ориентацию, оптические и жидкостные динамические характеристики, эффективный показатель преломления, эксцентричность, малую ось, большую ось, деформируемость, деформируемость эксцентричности, деформируемость по малой и большой оси, коэффициент вытянутости, коэффициент сжатости, коэффициент круглости, изображения, включающие в себя отличительные признаки по шкале серого цвета, целые изображения, компоненты изображения или полученные с помощью изображения параметры, морфологические характеристики или другие полученные с помощью цитологии на основе силы лазера параметры.
8. Способ по п. 1, при этом биологическая клетка содержит клетки растений (клетки водорослей или другие), прокариотические клетки (бактерии), эукариотические клетки, дрожжи, грибки, клетки плесени, эритроциты, нейроны, яйцеклетку (овы), сперматозоиды, лейкоциты, базофилы, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, макрофаги, тромбоциты, везикулы, экзосомы, стромальные клетки, многоклеточные конструкции, такие как сфероиды, мезенхимальные клетки и индуцированные плюрипотентные стволоые клетки (iPSC).
9. Способ по п. 1, при этом анализируемое вещество содержит вирус.
10. Способ по п. 1, при этом анализируемое вещество содержит бактерию.
11. Способ по п. 1, при этом анализируемое вещество является вирусом, а нейтрализующая сыворотка содержит антитела (тест нейтрализации).
12. Способ по п. 1, при этом анализируемое вещество является бактерией, а нейтрализующая сыворотка содержит антитела.
13. Способ по п. 1, при этом анализируемое вещество является токсином, а антитела в сыворотке являются приспособленными (или нет) для нейтрализации токсина.
14. Способ по п. 1, при этом анализируемое вещество является вирусом и противовирусным составом или веществом.
15. Способ по п. 1, при этом клетки присутствуют в монослойной культуре, суспензии или внедрены в матрицу.
16. Способ по п. 1, при этом клетки являются суспендированными посредством альгината, желатина или другой аналогичной полутвердой суспензии.
17. Способ по п. 1, при этом клетки отбираются из текущего процесса и анализируются непосредственно без дополнительной инкубации.
18. Способ по п. 1, дополнительно содержащий объекты калибровки.
19. Способ по п. 18, при этом объекты калибровки содержат гранулы, частицы, биологические вещества, липиды, везикулы живые клетки или химически связанные клетки.
20. Способ по п. 19, при этом гранулы или частицы содержат органические вещества, полимеры, металлы, сплавы, стекло, сапфир или алмаз.
21. Способ по п. 18, при этом объекты калибровки существуют в сферических или несферических формах, имеющих размер от нанометров до миллиметров.
22. Способ по п. 18, при этом объекты калибровки смешиваются с одним или более образцами и анализируются в то же самое время.
23. Способ по п. 18, при этом объекты калибровки могут отличаться от образцов клеток на основе анализа изображения яркого поля клеток, измерений флюоресценции или одного или более измерений на основе оптической силы.
24. Способ формирования калибровочной кривой на основе клеточной реакции на изменяющиеся концентрации средств лечения и затем использования ее для прогнозирования образца неизвестного уровня, способ содержит этапы, на которых
добавляют средства лечения и инкубируют клетки образца,
анализируют посредством измерений на основе жидкостной и/или оптической силы множество образцов, имеющих клетки, и известный диапазон средств лечения, чтобы определять показатель реакции,
определяют оптимальный показатель реакции и время на основе тренда с разбавленным раствором,
используют сформированные данные для прогнозирования будущих образцов.
25. Способ по п. 24, при этом измерения на основе оптической силы используют цитологию на основе силы лазера.
26. Способ по п. 24, при этом измеряемые образцы являются ядрами клеток, митохондриями или другим субклеточным компонентом или долей.
27. Способ по п. 24, при этом возбудитель является вирусной инфекцией, а концентрация является вирусным титром.
28. Способ по п. 24, содержащий, возможно, дополнительный анализ, включающий в себя одномерные показатели, суммарные данные гистограммы популяции, подмножество данных гистограммы популяции, кластеризацию методом K-средних, или PLS, PCA, нейронную сеть или другие многомерные алгоритмы или алгоритмы машинного обучения, чтобы создавать многомерный показатель.
29. Способ для формирования калибровочной кривой на основе клеточных изменений во время получения биологической молекулы или другого текущего биопроцесса, которая сопоставляет клеточную реакцию с продуктом или интересующим клеточным свойством, и затем используют калибровку для прогнозирования результатов будущего процесса:
добавляют средства лечения и инкубируют клетки образца,
анализируют посредством измерений на основе оптической силы множество образцов, имеющих клетки, и известный диапазон концентраций продукта для определения показателя реакции;
определяют оптимальный показатель реакции на основе тренда с разбавленным раствором,
используют сформированные данные для прогнозирования будущих образцов.
30. Способ по п. 29, при этом измерения на основе оптической силы используют цитологию на основе силы лазера.
31. Способ по п. 29, при этом измеряемые образцы являются ядрами клеток, митохондриями или другим субклеточным компонентом или долей.
32. Способ по п. 29, при этом продукт является продуктом на основе вируса, таким как вакцина, онколитический вирус, белок, нуклеиновая кислота или вирусный вектор.
33. Способ по п. 29, при этом продукт является созданным невирусным способом белком, нуклеиновой кислотой, полимером или липидом.
34. Способ по п. 29, при этом клеточным свойством является продуктивность, живучесть или способность создавать целевую молекулу.
35. Способ по п. 29, при этом клеточным свойством является состояние дифференциации, способность убивать конкретный тип клеток, такой как опухоль, способность активировать другой тип клеток или способность изменять биохимическое состояние другого типа клеток.
36. Способ по п. 29, необязательно содержащий дополнительный анализ, включающий в себя одномерные показатели, суммарные данные гистограммы популяции, подмножество данных гистограммы популяции, кластеризацию методом K-средних, или PLS, PCA, нейронную сеть или другие многомерные алгоритмы или алгоритмы машинного обучения, чтобы создавать многомерный показатель.
37. Способ для вычисления абсолютного титра/инфекционности, содержащий этапы, на которых
анализируют посредством измерений на основе оптической силы множество образцов, имеющих клетки, и известный диапазон разбавленных растворов вирусного штамма для определения показателя инфекции;
идентифицируют образец, демонстрирующий максимальный показатель инфекции;
задают максимальный показатель инфекции в качестве 100% инфицирования;
вычисляют количество вируса, добавленного в каждый разбавленный раствор (инфекционных единиц/мл) на основе числа клеток во время инфицирования, процентной доли неинфицированных клеток, математического распределения во время инфицирования и объема вирусного штамма, добавленного в разбавленный раствор; и
используют только разбавленные растворы, которые попадают в указанный диапазон, прогнозируют общий титр неизвестного образца.
38. Способ по п. 37, при этом измерения на основе оптической силы используют цитологию на основе силы лазера.
39. Способ по п. 37, при этом измеряемые образцы являются ядрами клеток, митохондриями или другим субклеточным компонентом или долей.
40. Способ по п. 37, при этом распределение, описывающее инфицирование, является пуассоновским, байесовским или другим математическим распределением.
41. Способ по п. 37, дополнительно содержащий этап, на котором определяют как время инкубации после инфицирования, так и параметры цитологии на основе силы лазера, используемые для формирования показателя инфекции при вычислении титра и создании калибровочной кривой из неизвестной вирусной системы с образцом неизвестного титра.
42. Способ по п. 37, дополнительно содержащий этап, на котором объекты калибровки, такие как гранулы или частицы, используются для повышения уверенности в том, что инструментальное оснащение ведет себя согласованным образом.
43. Способ по п. 37, при этом гистограммы, графики рассеяния и/или многомерные данные используются в своей полноте или частично в качестве показателя инфекции или составляющей более сложной показателя инфекции.
44. Способ по п. 37, в котором кластеризация методом K-средних используется для формирования показателя инфекции.
45. Способ для обнаружения наличия занесенных агентов, содержащий использование измерений на основе оптической силы, способ содержит этапы, на которых
отбирают клетки непосредственно из биореактора или другого резервуара без какой-либо дополнительной инкубации
выполняют измерения на основе оптической силы по популяции клеток
обнаруживают занесенные агенты на основе сочетания измеренной клеточной реакции и предыдущих наборов данных, описывающих процесс в обычных рабочих условиях.
46. Способ для обнаружения наличия занесенных агентов, содержащий использование измерений на основе оптической силы, способ содержит этапы, на которых:
смешивают тестовый образец с клетками, растущими в суспензии или адгезивной культуре, и инкубируют; и
обнаруживают занесенные агенты в среде тестового образца посредством цитологии на основе силы лазера.
47. Способ по п. 46, при этом пустые пробы клеток используются в качестве контрольных для сравнения с тестовыми образцами.
48. Способ по п. 46, при этом кондиционированная среда получается из биореактора или другого производственного процесса.
49. Способ по п. 46, при этом интервал времени, в течение которого клетки подвергаются воздействию кондиционированной среды, может быть отрегулирован как часть оптимизации анализа.
50. Способ по п. 48, при этом клетки являются яичником китайского хомячка (CHO), почкой новорожденного хомячка (BHK) или другими родственными клетками или их вариантами.
51. Способ по п. 48, при этом клетки включают в себя, но не только, Vero, HEK-293, MDCK, EB66, AGE1, WI-38, MRC-5, MARC 145, CRFK, A549, HL60, U937, SK-MEL-28, HCC2429, HEp-2 или другие родственные клетки или их варианты
52. Способ по п. 48, при этом клетки являются клетками HeLa.
53. Способ по п. 48, при этом клетки являются химически или генетически модифицированными, чтобы быть чувствительными к вирусной инфекции либо широко, либо особым образом посредством добавления, изменения или удаления генетического материала или изменения биологического или физического состояния клетки.
54. Способ по п. 48, при этом клетки являются химически или генетически модифицированными, чтобы быть чувствительными к вирусной инфекции либо широко, либо особым образом посредством добавления, изменения или удаления генетического материала или изменения биологического или физического состояния клетки.
55. Способ по п. 48, при этом клетки являются химически или генетически модифицированными, чтобы быть чувствительными к вирусной инфекции либо широко, либо особым образом посредством добавления, изменения или удаления генетического материала или изменения биологического или физического состояния клетки, и имеют хорошие характеристики для измерения с помощью LFC.
56. Способ по п. 48, при этом клетки являются химически или генетически модифицированными, чтобы быть чувствительными к токсину или особой молекуле или молекулярному классу посредством добавления, изменения или удаления генетического материала или изменения биологического или физического состояния клетки.
57. Способ по п. 48, при этом клетки являются макрофагальными клетками.
58. Способ по п. 57, при этом макрофагальные клетки обрабатываются с помощью химического или биохимического вещества, чтобы оказывать воздействие на их фагоцитотическую активность или клеточную реакцию.
59. Способ по п. 48, дополнительно содержащий этап, на котором отсортировывают и собирают интересующие клетки для дальнейшего анализа.
60. Способ по п. 59, при этом дополнительный анализ включает в себя рамановскую спектроскопию, флюоресцентную спектроскопию, масс-спектрометрию, полимеразную цепную реакцию, секвенирование одиночной клетки, секвенирование следующего поколения и поточную, флюоресцентную, масс-цитометрию или отображающую цитометрию.
61. Способ по п. 46, дополнительно содержащий этап, на котором классифицируют занесенный агент на основе измерений на основе оптической силы, чтобы определять идентичность занесенного агента.
62. Способ по п. 46, при этом занесенный агент содержит вирусы, бактерии, внутриклеточные бактерии, микоплазму, грибки, простейшие, паразиты или малые молекулы.
63. Способ по п. 46, дополнительно содержащий этап, на котором классифицируют агент, содержащий использование искусственных нейронных сетей, распознавание шаблона и прогностических аналитических инструментов.
64. Способ по п. 63, при этом искусственные нейронные сети используют множество параметров цитологии на основе силы лазера для классификации занесенного агента.
65. Способ по п. 64, при этом множество параметров цитологии на основе силы лазера содержат линейную скорость, размер, периметр, размер (площадь, диаметр, объем и т.д.), число захваченных клеток в каждом образце, число выпустивших излучение клеток в каждом образце, число смесей (на основе размера и/или формы или других параметров), число частиц, имеющих размер остаточных веществ (на основе размера и/или формы или других параметров), нормализованную скорость, минимальную x-позицию, время оптической выдержки, время оптического захвата, оптическую силу, оптический крутящий момент, ориентацию, оптические и жидкостные динамические характеристики, эффективный показатель преломления, эксцентричность, малую ось, большую ось, деформируемость, деформируемость эксцентричности, деформируемость по малой и большой оси, коэффициент вытянутости, коэффициент сжатости, коэффициент круглости, изображения, включающие в себя отличительные признаки по шкале серого цвета, полные изображения, компоненты изображения или полученные с помощью изображения параметры, морфологические характеристики или другие полученные с помощью цитологии на основе силы лазера параметры.
66. Способ по п. 46, при этом множество клеточных линий могут быть проанализированы одновременно, чтобы ускорять анализ.
67. Способ для тестирования занесенного агента с помощью измерений на основе оптической силы, содержащий этапы, на которых
выращивают клеточные линии в мини-биореакторах;
закачивают образцы кондиционированной среды в мини-биореакторы из биореактора большого процесса; и
обнаруживают занесенные агенты в кондиционированной среде с помощью измерений на основе оптической силы.
68. Способ по п. 67, при этом клеточные линии могут быть клеточными линиями суспензии, чтобы форсировать рост и инфицирование каким-либо занесенным агентом, присутствующим в биореакторе большого процесса.
69. Способ сопоставления реакции клетки с биологическим состоянием, содержащий этапы, на которых
принимают клетки от пациента или из другого биологического источника;
выполняют измерения на основе оптической силы по клеткам от пациента;
выводят данные измерения на основе оптической силы, при этом данные из проанализированных клеток используют вместе со сравнительными данными, чтобы указывать биологическое состояние.
70. Способ по п. 69, при этом сравнительные данные поступают от того же пациента в другом состоянии, таком как заболевание или лечение и/или в момент времени.
71. Способ по п. 69, при этом сравнительные данные поступают от другого пациента или пациентов.
72. Способ по п. 69, при этом биологическое состояние включает в себя диагноз инфекции и/или идентификацию патогенного агента.
73. Способ по п. 69, при этом биологическое состояние включает в себя оценку терапевтической эффективности, включающей в себя эффективность вакцины или антител.
74. Способ по п. 69, при этом биологическое состояние включает в себя оценку иммунитета или устойчивости к лекарственному средству.
75. Способ по п. 69, при этом биологическое состояние включает в себя оценку рака, метастатического потенциала клеток.
76. Способ по п. 69, при этом образцы собираются со временем от одного и того же пациента, чтобы создавать основу нормальных характеристик клеток.
77. Способ по п. 69, при этом биологическое состояние включает в себя лечение с помощью клеточной или генной терапии.
78. Способ по п. 69, при этом цитология на основе силы лазера содержат оценку параметров, включающих в себя линейную скорость, размер, периметр, размер (площадь, диаметр, объем и т.д.), число захваченных клеток в каждом образце, число выпустивших излучение клеток в каждом образце, число смесей (на основе размера и/или формы или других параметров), число частиц, имеющих размер остаточных веществ (на основе размера и/или формы или других параметров), нормализованную скорость, минимальную x-позицию, время оптической выдержки, время оптического захвата, оптическую силу, оптический крутящий момент, ориентацию, оптические и жидкостные динамические характеристики, эффективный показатель преломления, эксцентричность, малую ось, большую ось, деформируемость, деформируемость эксцентричности, деформируемость по малой и большой оси, коэффициент вытянутости, коэффициент сжатости, коэффициент круглости, изображения, включающие в себя отличительные признаки по шкале серого цвета, полные изображения, компоненты изображения или полученные с помощью изображения параметры, морфологические характеристики или другие полученные с помощью цитологии на основе силы лазера параметры.