СПОСОБ СОЗДАНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ЛИНИЙ РЖИ
METHOD OF CREATION OF RYE HOMOZYGOTIC LINES

Предлагаемое изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к созданию гомозиготных линий озимой ржи, необходимых при получении высокопродуктивных гибридов.
Эффективным способом повышения продуктивности растений, в том числе и ржи, является получение гетерозисных гибридов на основе гомозиготных линий. Для получения гомозиготных линий используют: длительное (пяти- и более кратное) самоопыление, а также искусственно созданные методами биотехнологии (андро- и гиногенеза, партеногенеза), отдаленной гибридизации и мутагенеза гаплоиды с последующим удвоением количества хромосом с помощью разных полиплоидогенных веществ.
Сравнительное изучение двух основных методов получения гомозиготных линий у ржи показало (Wilde P.: Multi-stage selection for combining ability among pollen parent lines in hybrid rye breeding / International symposium on rye breeding and genetics // Vortrage fur Pflanzenzuchtung. - 1996. - H.35. - P.15-25), что, несмотря на довольно большую продолжительность процесса, более эффективным и экономически выгодным считается получение гомозиготных линий с помощью самоопыления.
Большая продолжительность процесса получения гомозиготных линий при использовании для этих целей самоопыления растений, с одной стороны, а также сложность и дороговизна получения их с помощью применения биотехнологий - с другой, заставляет искать для этих целей другие способы.
Источником для получения гомозиготных линий могут служить спонтанные гаплоиды. Но для использования их в практической селекции гомозиготных линий ржи в качестве основного способа необходимы два условия. Первое - большая частота спонтанных гаплоидов в исходном материале и второе - самосовместимость исходных растений, т.е. их способность завязывать семена при самоопылении. То и другое условие соблюсти у ржи проблематично, т.к. частота спонтанных гаплоидов у ржи очень низкая (Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений. Пер. с англ. В.В. Попова. Под ред. Ю.П. Лаптева. - М.: Колос, 1980. - С.50. Селиванов А.С. Многозародышевость семян и селекция. Часть 1. Перспективы использования и пути создания многозародышевых форм культурных растений. - Изд-во Саратовского ун-та, 1983. - С.10) и абсолютное большинство растений (по данным разных авторов 94-100%) самонесовместимы (В. и В. Антроповы. Рожь СССР и сопредельных стран. - Л., 1929. - С.116; А.Н. Сидоров. Изучение фертильности ржи при самоопылении // Известия Сибирского отделения АН СССР. - 1971. - №15, вып.3. - С.66-75. В.Г. Смирнов, А.В. Войлоков. Автофертильные формы перекрестноопыляющихся культур и перспективы их использования в селекции. В сб.: Селекция ржи. Материалы симпозиума ЕУКАРПИА. - Л.: ВИР, 1990. С.20-21; В.В. Пыльнев, Ю.Б. Коновалов, Т.И. Хупацария и др. Частная селекция полевых культур. - М.: КолосС, 2005. - С.44).
Известен способ, где в качестве источника спонтанных гаплоидов для получения гомозиготных форм рекомендуется использовать близнецовые проростки (Патент РФ №2028044, кл. A01H 1/04, 1995), - прототип.
Этот способ заключается в получении гомозиготных линий ржи путем выращивания гаплоидных растений, удвоения их набора хромосом, выращивания их до фазы цветения, принудительного самоопыления, получения семян гомозиготных линий и контроля гомозиготности. При этом выращиваемые гаплоидные растения получают из полиэмбриональных семян путем их проращивания, разделения полиэмбрионов и отбора гаплоидов.
Преимуществом данного способа, в сравнении с используемыми, является сокращение сроков получения гомозиготных линий при экономии сил и средств на их получение.
К числу его недостатков относится низкая производительность, то есть сравнительно небольшое количество получаемых этим способом линий, обусловленная низкой концентрацией полиэмбрионов в исходной популяции (одна гомозиготная линия из 100000 исходных зерен) и самонесовместимостью абсолютного большинства растений, а также низкая продуктивность (семенная продуктивность) и большая трудоемкость, вызванные этой самонесовместимостью. Из-за всего этого в известном техническом решении проводят такие трудоемкие и малоэффективные операции, как клонирование гаплоидных растений, использование для повышения завязываемости семян при самоопылении термического шока, получение и использование разновозрастной пыльцы. К этому необходимо добавить еще и то, что полученные на основе самонесовместимых растений линии можно поддерживать и размножать только в районах, благоприятных для возникновения модификационной изменчивости самонесовместимости [Попова И.С. Популяционно-генетическое изучение самонесовместимости у яровой ржи (Secale cereale L.) Автореф. дисс. … канд. биол. наук. - Новосибирск, 2002, с.3]. Все эти операции отсутствуют у предложенного изобретения, что значительно снижает его трудоемкость и положительно влияет на достижение технического результата. Производительность способа (количество полученных гомозиготных линий на основе гаплоидов) и продуктивность полученных (созданных) линий (семенная продуктивность) из-за их самонесовместимости очень низкая, поэтому как компоненты промышленных гибридов они не представляют никакого интереса.
Таким образом, технический результат предложенного решения заключается в увеличении производительности и продуктивности при снижении трудоемкости создания гомозиготных линий на основе гаплоидов, возникающих у растений при полиэмбрионии.
Технический результат достигают тем, что в качестве исходного материала, содержащего полиэмбриональные семена, используют самофертильные популяции, увеличивают концентрацию полиэмбриональных семян в популяции двух и более кратным отбором, а после их проращивания и разделения близнецовых проростков растения доращивают до фазы кущения, отбирают с развитой корневой системой и удваивают набор хромосом колхицинированием.
Признак «в качестве исходного материала, содержащего полиэмбриональные семена, используют самофертильные популяции» является существенным, так как способствует достижению технического результата. По способу-прототипу самонесовместимые (несамофертильные) формы озимой ржи необходимо размножать клонированием. При этом полученные гомозиготные линии нужно выращивать в специальных условиях для нарушения механизма самонесовместимости, который является причиной низкой завязываемости семян, а значит, и низкой производительности и продуктивности известных способов. С помощью известных способов можно получить сравнительно меньше гаплоидов, а значит, и меньшее количество гомозиготных линий. Создание таких специальных условий является также и трудоемким процессом.
Самосовместимость линий - компонентов будущих гибридов является обязательным условием гибридной селекции озимой ржи (Roggen - Getreide mit Zukunft! Herausgeber: Roggenforum е. V. - Verlag, 2007. - C.36). Этот признак генетически контролируется (Смирнов В.Г., Соснихина С.П. Генетика ржи. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1984. - С.163), и его передача в исходную популяцию путем гибридизации реальна. В заявляемом решении используются самофертильные популяции, что позволяет увеличить производительность, продуктивность и снизить трудоемкость предложенного способа, то есть способствует достижению им технического результата.
Признак «увеличивают концентрацию полиэмбриональных семян в популяции двух и более кратным отбором» также является существенным. Полиэмбриония (многозародышевость) прежде всего наследственный признак (Селиванов А.С., Тырнов B.C. Полиэмбриония и гаплоидия. В сб.: Гаплоидия и селекция. - М.: Наука, 1976. - С.80), поэтому с помощью отборов встречаемость полиэмбрионов можно резко увеличить (Селиванов А.С. Многозародышевость семян и селекция. Часть 1. Перспективы использования и пути создания многозародышевых форм культурных растений. - Изд-во Саратовского ун-та, 1983. - С.16), поэтому отбор увеличивает концентрацию полиэмбриональных семян в популяции, а двух- и более кратным отбором можно увеличить концентрацию полиэмбриональных семян в сотни раз, что необходимо для достижения представленным решением технического результата.
Признаки «а после их проращивания и разделения близнецовых проростков растения доращивают до фазы кущения, отбирают с развитой корневой системой и удваивают набор хромосом колхицинированием» также является существенным. Гаплоидные растения отличаются низкой жизнеспособностью, поэтому доращивание проростков таких растений до фазы кущения и отбор растений с развитой корневой системой увеличивает их выживаемость. Это особенно важно при их колхицинировании, так как оно снижает жизнеспособность растений и может привести к их гибели, что снизит производительность способа, отрицательно повлияв на достижение технического результата. Особенно при колхицинировании ослаблению и гибели подвержены проростки, а не дорощенные до фазы кущения растения с развитой корневой системой, которые являются значительно более жизнеспособными.
Таким образом, каждый существенный признак необходим, а их совокупность достаточна для достижения заявленным решением задачи технического результата.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
В качестве исходного материала используют зерновки популяции самосовместимых (автофертильных) растений. При отсутствии таковой интересующую популяцию скрещивают с источником самофертильности и для работы используют зерновки полученного в результате этого скрещивания гибрида. Озимые формы в середине лета проращивают и отбирают среди них для дальнейшей работы многозародышевые (близнецовые) формы (полиэмбриоиды). Их высаживают на гидропонную установку и выращивают до фазы 2-3 листьев. Затем близнецовые растения разделяют, у каждого подсчетом количества хромосом в корешках определяют плоидность.
Для дальнейшей работы отбирают только гаплоиды, которые вновь высаживают на гидропонную установку для дальнейшего доращивания. Раскустившиеся с хорошо развитой корневой системой гаплоидные растения вынимают из гидропонной установки, промывают в воде, листья наполовину укорачивают, а затем помещают в 0,05%-ный раствор колхицина на 36 часов. По истечении указанного срока растения вынимают из указанного раствора и в течение 6 часов промывают в проточной воде.
После этого растения высаживают в сосуды с землей и помещают в вегетационный домик, защищая в течение одного месяца от прямых солнечных лучей. По истечении указанного срока растения выращивают в естественных условиях и за месяц до наступления средней многолетней даты прекращения осенней вегетации высаживают в поле, где выращивают в естественных условиях.
Перед цветением каждое растение отдельно изолируют для самоопыления. После окончания цветения на поле всех растений изоляторы снимают и выращивают до полного созревания. Затем растения убирают вручную, в лабораторных условиях обмолачивают, а полученные от самоопыления семена высевают для размножения созданных таким образом гомозиготных линий.
Пример. Для работы в качестве исходной была взята популяция, состоящая из свободно переопыленных линий-закрепителей ЦМС P-типа, обладающих самосовместимостью. При анализе 60 тыс. проростков было обнаружено 9 близнецовых, что составило 0,015%. После яровизации в естественных условиях они в течение зимне-весеннего периода были размножены в условиях искусственного климата и осенью были высеяны для дальнейшего размножения на изолированном участке в естественных условиях.
Таблица 1
Пооперационное сравнение предлагаемого решения с прототипом.
№ п/п
Операции
Прототип
Предлагаемый способ
1
В качестве исходного материала используют самофертильные популяции
-
+
2
Отбор близнецовых проростков
+
+
3
Повторный отбор в популяции близнецовых проростков
-
+
4
Разделение близнецов и отбор среди них гаплоидов
+
+
5
Колхицинирование гаплоидов с целью удвоения числа хромосом сразу после разделения
+
-
6
Доращивание растений с целью получения интенсивно кустящихся с развитой корневой системой
-
+
7
Колхицинирование окрепших растений
-
+
8
Многократное клонирование обработанных колхицином растений с целью их размножения и преодоления самонесовместимости
+
-
9
Высадка растений на постоянное место для выращивания до созревания
+
+
10
Самоопыление растений
-
+
11
Переопыление растений в пределах клона
+
-
12
Выращивание растений до созревания
+
+
13
Отбор и обмолот растений (клонов), завязавших семена
+
+
14
Размножение полученных линий
+
+
Из полученной после повторного отбора новой популяции было взято для проращивания 1600 зерновок. Среди полученных проростков многозародышевых (близнецов) оказалось 23, что составляет 1,44% от взятых для анализа зерновок. Таким образом, содержание близнецовых форм было увеличено в 96 раз.
Среди 23 полиэмбрионов было обнаружено 13 гаплоидов, что составляет 56,5%. В фазе кущения гаплоидные растения были обработаны 0,05% раствором колхицина и через месяц (в конце сентября) были высажены в поле. Цитологический анализ показал, что все они являются дигаплоидами.
Анализ предлагаемого способа и известного (прототипа: патент РФ на изобретение №2028044) позволил выявить ряд существенных признаков, характеризующих новизну предлагаемого способа (см. таблицу).
Предлагаемый способ в сравнении с известными аналогами обладает рядом важных преимуществ.
1. Работа с популяцией самосовместимых растений позволяет получить гомозиготные линии, которые можно использовать и в практической селекционной работе, например в гибридной селекции. При этом исключается необходимость использования многократного клонирования, применения термического шока, использования пыльцы разного возраста и т.п. для преодоления самонесовместимости абсолютного большинства растений. Отпадает также необходимость использования для сохранения и размножения линий, полученных на основе самонесовместимых растений, особых условий выращивания, благоприятных для возникновения модификационной изменчивости самонесовместимости. В иных условиях сохранность самонесовместимых линий чрезвычайно низкая. Из-за несовместимости завязываемость семян у полученных после удвоения числа хромосом дигаплоидов низкая. Такая же низкая и продуктивность создаваемых на их основе линий, поэтому как компоненты гибридов они не представляют интереса.
2. Включение в качестве обязательной операции повторных отборов с целью увеличения концентрации близнецовых проростов позволяет на порядки увеличить эффективность работы. Так, из 1600 зерновок предлагаемым способом было выделено 13 гаплоидов, что составляет 0,81%, в то время как известным способом, взятым за прототип, из 100000 зерновок получается в среднем только один гаплоид, что составляет всего лишь 0,001%, т.е. в 810 раз меньше. Поэтому в предлагаемом способе увеличивается производительность, продуктивность и при этом снижается трудоемкость их получения (то есть при получении большего количества гаплоидов получают и большее число гомозиготных линий).