БИОЧИП ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА

Предлагаемая полезная модель относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний.
Понимание физиологических и патофизиологических процессов в клетках, тканях и организме человека, в том числе, в целях диагностики, требует идентификации и анализа множества биологических объектов, механизмов их действия и регуляции. Технология биологических чипов (биочипов) является одним из наиболее эффективных инструментов, способных решить эти задачи. Биочипы обладают оптимальным балансом между производительностью, чувствительностью и специфичностью, способны одновременно детектировать в мультиплексных тестах наличие многих биомолекул, содержащихся в микрообъемах. Биочипы позволяют проводить параллельный анализ здоровых или патологически измененных тканей и клеток, выполнять сравнительный анализ, выявляя изменения, ассоциированные с широким спектром социально-значимых заболеваний человека, что является чрезвычайно актуальным направлением современных биомедицинских исследований.
Известна многопараметрическая диагностическая  тест-система,предназначенная для обнаружения и мониторинга  терапии ракамолочной железы и рака яичников,  и способ проведения  анализа сее использованием, защищенная патентом РФ № 2599890, МПК G01N 33/53, опубл.20.10.2016.
Тест-система (набор реагентов) характеризуется тем, что обнаружение и мониторинг осуществляются путем одновременного количественного определения нескольких опухоль-ассоциированных антигенов (онкомаркеров) в сыворотке крови человека, и включает в себя биологический микрочип (биочип) для одновременного определения концентраций нескольких опухоль-ассоциированных антигенов в образце сыворотки крови человека, проявляющую систему, набор калибровочных проб, набор буферных растворов и инструкцию по проведению анализа. Способ проведения многопараметрического анализа образца с использованием данной тест-системы представляет собой проведение на биологическом микрочипе сэндвич варианта иммуноанализа образца сыворотки крови человека с  флуоресцентной регистрацией сигналов.
Недостатком известного решения является использование флуоресцентных красителей, отличающихся относительно низкой фотостабильностью и яркостью, а также наличием флуоресцентного фона, затрудняющего интерпретацию результатов, полученных с использованием такого биочипа. Кроме того, упомянутый биочип предназначен для количественной оценки онкомаркеров, ассоциированных с развитием только рака молочной железы и рака яичников.
Известен способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, А и М в крови человека на биологическом микрочипе, защищенный патентом РФ №2625018, МПК G01N 33/543,  G01N 33/574, опубл.11.07.2017.
Биочип содержит гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами к белковым онкомаркерам, гидрогелевые элементы с иммобилизованными гликанами, гидрогелевые элементы с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека классов G, А, М. Изменение уровня анализируемых маркеров по сравнению с уровнем маркеров в сыворотке крови здоровых доноров свидетельствует о колоректальном раке.
Недостатком известного решения также является факт использования флуоресцентных красителей наряду с количественной оценкой онкомаркеров только в сыворотке крови. Данный биочип не предназначен для работы с любым другим биоматериалом, который потенциально может обладать более высокой клинической информативностью.
Известен биочип для диагностики в области медицины, защищенный патентом РФ №137188, МПК А61B10/00, опубл.10.02.2014. Биочип состоит из пластиковой подложки, разделенной на две части: рабочую и для фиксации биочипа в руках. Рабочая часть биочипа разделена на 15 равных ячеек (3 ряда по 5 ячеек в каждом) посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержатся флуоресцентно меченые антитела (0,01 мкл). В первом ряду (5 ячеек) содержатся флуоресцентно меченые антитела к рецепторам эстрогена, во втором ряду (5 ячеек) содержатся флуоресцентно меченые антитела к рецепторам прогестерона, в последнем (третьем) ряду (5 ячеек) содержатся флуоресцентно меченые антитела к рецепторам HER-2neu. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавляют реагент PBS в количестве 0,1 мкл, а сверху рабочей поверхности нанесена гидрофобная пленка, предотвращающая высыхание раствора флуоресцентно меченых антител и перемещение антител из одной ячейки в другую.
Недостатком такого биочипа является использование флуоресцентно меченых антител, способных к фотообесцвечиванию, а также формированию флуоресцентного фона, затрудняющего интерпретацию полученных результатов и требующего проведения дополнительных процедур, направленных на снижение его интенсивности, что в конечном итоге усложняет процедуру анализа. Кроме того, в состав тест-системы не входят контрольные материалы, позволяющие оценивать адекватность получаемых в ходе исследования результатов.
Наиболее близкой к заявляемой полезной модели, выбранной в качестве прототипа, является биочип для мультиплексного анализа, защищенный патентом РФ № 142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014. Биочип для мультиплексного анализа содержит прозрачную подложку из стекла с полилизиновым покрытием и разделен на 9 ячеек посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержатся флуоресцентно меченые антитела (0,01 мкл). Для исследований в рабочей области использовались тестовые участки с антителами к рецепторам эстрогена, рецепторам прогестерона, рецепторам СА-125, рецепторам РЭА, рецепторам СК7, рецепторам СК20, рецепторам Ber-EP4, рецепторам TTF1 и рецепторам WT1. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS в количестве 0,1 мкл, а сверху на рабочую поверхность нанесена гидрофобная пленка, препятствующая транзиту антител из одной ячейки в другую и их высыханию. С помощью предложенной полезной модели для исследования серозных жидкостей, жидкостей с менее богатым, чем кровь клеточным составом, содержащего иммобилизованные флуоресцентно меченые антитела, специфичные к антигенам клеток, имеется возможность определить характер асцита (реактивный или онкологический), а также первичный очаг, который имеет опухоль, продуцирующая асцит.
Недостатком такого биочипа, помимо использования флуоресцентно меченых антител, является сложность и длительность анализа, так как сначала проводится флуоресцентный этап оценки экспрессии антигена, а потом определяется морфология клетки. Кроме того, препарат пригоден для исследования в течение 10 минут, вследствие чего повторный просмотр препарата невозможен.
Техническая проблема, решаемая предлагаемой полезной моделью, - создание биочипа для мультиплексного анализа, позволяющего качественно детектировать экспрессию онкомаркеров и параллельно оценивать морфологию клеток.
Технический результат от использования полезной модели заключается в упрощении процедуры анализа с использованием биочипа, а также сокращении длительности анализа за счет одновременной оценки экспрессии антигена и морфологии клетки. Кроме того, заявляемый биочип лишен недостатков, связанных с использованием в качестве его функциональной основы флуоресцентно меченых антител, и предназначен для оценки онкомаркеров, ассоциированных с различными онкологическими заболеваниями.
Указанный технический результат достигается тем, что в биочипе, состоящем из прозрачной подложки, покрытой адгезирующим составом, имеющим положительный заряд и разделенной на ячейки посредством решетки, закрытой защитной пленкой, ячейки для внесения и фиксации биоматериала расположены на части подложки, покрытой адгезирующим составом, имеющим положительный заряд, и отделены площадкой от ячеек для хранения и разведения антител тест-системы, расположенных на части подложки без адгезирующего состава и снабженных содержащимися в буферном растворе антителами, специфичными к определенным антигенам клеток.
Заявляемый биочип для мультиплексного анализа поясняется чертежами:
На фиг.1 изображен предлагаемый биочип, вид сверху;
на фиг.2 изображен предлагаемый биочип, вид сбоку
на фиг.3 к примеру 1 - пунктат предстательной железы. Цитологическая картина дисплазии 2-3 степени. Окраска по Романовскому, увеличение х100;
на фиг.4 к примеру 1 - положительное окрашивание с антителом к ПСА. Пероксидазный метод, увеличение х200, тест-система биочип;
на фиг.5 к примеру 2- смыв с мочевого пузыря. В поле зрения группа уротелиальных клеток с нерезким полиморфизом, архитектоника сохранена. Окраска по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.6 к примеру 2 приведена отрицательная реакция (отсутствие коричневого ядерного окрашивания) в реакции с антителом к белку Р53. Пероксидазный метод, увеличение  х400, тест-система биочип;
на фиг.7 к примеру 3 представлен мазок с шейки матки. В поле зрения клетки плоского эпителия всех слоев, в части клеток отмечаются укрупнение ядра и неровность ядерной мембраны, наличие дисплазии 1-2 степени не  исключается:
на фиг.8 к примеру 3 приведена отрицательная реакция с антителом к белку Ki67 (отсутствует ядерное окрашивание) и положительная (цитоплазматическое окрашивание) реакция клеток с антителом к белку Р16. Пероксидазный метод, увеличение х1000, тест-система биочип;
на фиг.9 к примеру 4 представлен пунктат щитовидной железы. В поле зрения псевдопапиллярное скопление фолликулярного эпителия, в части клеток отмечается складчатость, видны нуклеолы. Окраска по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.10 к примеру 4 показана положительная (ядерная) реакция с антителом к белку TTF1. Пероксидазный метод, увеличение х200, тест-система биочип;
на фиг.11 к примеру 5 представлен соскоб с коньюнктивы нижнего века левого глаза. В поле зрения преобладают преимущественно зрелые лимфоциты, отмечаются фрагменты разрушенных клеток. Окраска по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.12 к примеру 5 демонстрируется положительное окрашивание с антителом к белку CD20. Пероксидазный метод, увеличение х1000, тест-система биочип;
на фиг.13 к примеру 6 приведен пунктат лимфатического узла. Окраска по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.14 к примеру 6 показана отрицательная реакция с антителом к ЕрСАМ. Пероксидазный метод, увеличение х1000, тест-система биочип;
на фиг.15 к примеру 7 использовалась плевральная жидкость. В поле зрения скопления эпителиальных клеток с признаками полиморфизма. Цитологическая картина метастатического выпота. Окраска по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.16 к примеру 7 показана положительная реакция с антителом к белку СА125. Пероксидазный метод, увеличение х1000, тест-система биочип;
на фиг.17 к примеру 8 фигурирует асцитическая жидкость. В поле зрения находятся клетки, предположительно мезотелия, с нерезким полиморфизмом. Окраска по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.18 к примеру 8 демонстрируется отрицательная иммуноцитохимическая реакция с антителом к белку ЕрСАМ в клетках асцитической жидкости. Пероксидазный метод, увеличение х1000, тест-система биочип;
на фиг.19 к примеру 9 использовалась асцитическая жидкость. В поле зрения локализованы клеточные скопления с признаками полиморфизма, морфологически сходные с эпителиальными. Окраска  по Романовскому, увеличение х1000;
на фиг.20 к примеру 9 показана иммуноцитохимическая положительная реакция с антителом к ЕрСАМ. Пероксидазный метод, увеличение х1000, тест-система биочип.
Биочип для мультиплексного анализа (фиг. 1) содержит прозрачную подложку 1 из стекла с полилизиновым покрытием 2, разделенную на две равные части, отделенные друг от друга площадкой 3. Одна часть подложки покрыта адгезирующим составом, имеющим положительный заряд, необходимым для связывания клеток, другая часть не имеет адгезирующего покрытия на дне. Каждая часть разделена на ячейки посредством решетки 4 из пластика. Ячейки 5 для хранения и разведения антител содержат антитела 6, являющиеся функциональной основой биочип тест-системы. Ячейки 7 для внесения и фиксации биоматериала расположены на части подложки, покрытой адгезирующим составом, имеющим положительный заряд. Биочип содержит защитную пленку 8 из полисилоксана, закрепленную поверх решетки 4. Площадка 3 не позволяет перетекать раствору антител, а после внесения биоматериала, суспензии клеток с растворенными в ней антителами, из ячейки в ячейку.
Тест-система в формате биочипа предназначена для определения степени поражения предстательной железы, мочевого пузыря, мониторинга в процессе лечения злокачественных опухолей мочевого пузыря, уточнения степени интраэпителиального поражения плоского эпителия, типирования опухолевых поражений щитовидной железы, первичного типирования лимфом, определения характера поражения лимфатического узла, органопринадлежности опухолевых клеток в жидкостях из серозных полостей, характера самих жидкостей из серозных полостей.
Настоящая полезная модель представляет собой пластиковую подложку размерами 25,4 мм × 76,2 мм, толщиной 1 мм. Тест-система в формате биочипа может храниться на свету в течение 11 месяцев при температуре от +2 до +8°С.
Предлагаемый биочип работает следующим образом. На начальном этапе осуществляется пробоподготовка биоматериала для исследования, в качестве которого используются биологические жидкости человека различных локализаций, а также материал, полученный в результате тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ).
Подготовка материала:
Материал, доставленный в лабораторию, центрифугируют для получения клеточного осадка  при 2000g в течение 5 минут, после чего удаляют надосадочную жидкость.
Ход исследования на тест-системе в формате биочипа
Удалить с поверхности тест-системы защитную пленку 8. Полученный клеточный осадок внести в ячейки тест-системы, свободные от антител 7, в объеме 20,0 мкл на одну ячейку и тщательно распределить по всей поверхности. Высушить  биоматериал  в ячейках  7  при комнатной температуре (18-22°С) до полного высыхания, внести в ячейки 7 с биоматериалом по 30,0 мкл раствора 3% перекиси водорода и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Промыть ячейки 7 тест-системы в двух емкостях с раствором фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) в течение 2 минут в каждой емкости. Удалить защитную пленку 8 с ячеек тест-системы, содержащей антитела. В каждую ячейку 5 тест-системы, содержащую антитела 6, внести по 30,0 мкл растворителя (индивидуальным наконечником) и тщательно ресуспензировать. Растворенные антитела 6 в объеме 30,0 мкл перенести в соответствующие ячейки 7 тест-системы с биоматериалом и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть ячейки 7 тест-системы в двух емкостях с раствором фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) в течение 2 минут в каждой емкости. Индивидуальным наконечником внести в ячейки 7 тест-системы с биоматериалом по 30,0 мкл раствора вторичных антител и инкубировать в течение 15 минут. Промыть ячейки 7 тест-системы в двух емкостях с раствором фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) в течение 2 минут в каждой емкости. Приготовить рабочий раствор хромогена (ДАБ) путем разведения в соотношении 1:1 концентрированного раствора ДАБ и растворителя (внимание! Рабочий раствор ДАБ стабилен в течение 4 часов). В ячейки 7 с биоматериалом внести по 30,0 мкл рабочего раствора хромогена и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут. Промыть ячейки 7 тест-системы в трех емкостях с водой в течение 2 минут в первой и второй емкости и в течение 10 минут в третьей емкости. В ячейки 7 с биоматериалом внести по 30,0 мкл раствора гематоксилина Майера и инкубировать в течение 1 минуты, затем промыть в емкости с  водой в течение 2 минут. Тест-систему высушить на воздухе, и микроскопировать в световом поле при увеличении х100-200.
Примеры конкретного использования предлагаемого биочипа для мультиплексного анализа.
1.Тест-система «UROp» (определение степени поражения предстательной железы. Фиг.3, 4.
В цитологическую лабораторию доставлен материал, полученный при ТИАБ предстательной железы (биопсию выполнить не удалось). Пациент А в возрасте 57 лет с диагнозом гиперплазия предстательной железы, подозрение на рак. При дополнительном обследовании уровень ПСА составил 12,7 нг/л. При цитологическом исследовании в доставленном материале преобладали клетки кубического эпителия преимущественно в виде голых ядер, в части которых отмечались признаки атипии. Цитологическая картина гиперплазии эпителия с участками интраэпителиальной неоплазии 2-3 степени (фиг.3). Для уточнения степени поражения выполнено исследование с использованием тест-системы в формате биочипа (фиг.4). В результате исследования уровень экспрессии Ki67 – 48% , PSA+, P53+. Данный иммунофенотип клеток указывает на высокую степень интраэпителиального поражения. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
2. Тест-система «UROb» (определение степени поражения мочевого пузыря, мониторинг в процессе лечения злокачественных опухолей мочевого пузыря). Фиг.5, 6.
В клинико-диагностическую лабораторию доставлен смыв с мочевого пузыря, полученный при цистоскопии у пациента с диагнозом: «Макрогематурия. Тампонада мочевого пузыря. Susp. Cr мочевого пузыря.?» При цитологическом исследовании материала наблюдались мелкие скопления уротелиальных клеток на фоне элементов крови, в части клеток уротелия отмечались признаки нерезкого полиморфизма (фиг. 5).Для уточнения степени клеточных изменений выполнено исследование материала с помощью тест-системы в формате биочипа (фиг.6). В результате исследования выявлялась положительная экспрессия белка Ki67 в 12% клеток, реакция  с антителами  к белкам Р16 и Р53 отрицательный. Данный результат свидетельствовал в пользу реактивных изменений. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
3. Тест-система «GYN» (уточнение степени интраэпителиального поражения плоского эпителия). Фиг.7, 8.
В ходе проведения профилактического медицинского осмотра пациентке А поставлен цитологический диагноз дисплазия шейки матки 1-2 степени, выявлены признаки вирусного поражения. (Фиг.7).  При исследовании вирусной нагрузке и генотипа определен вирус папилломы человека 31 типа в количестве 3,8lg.  Для уточнения степени интраэпителиального поражения оставшееся количество материала исследовалось с использованием тест-системы в формате биочипа. Не выявлено клеток с коэкспрессией белков Ki67 (в ядре) и Р16 (в цитоплазме) в  препаратах, поэтому диагноз при цитологическом исследовании не подтвержден, в препарате отмечались реактивные изменения (Фиг.8) на фоне вирусной нагрузки. При морфологическом исследовании биопсийного материала диагноз подтвердился.
4. Тест-система «TYR» (типирование опухолевых поражений щитовидной железы). Фиг.9, 10.
В клинико-диагностическую лабораторию доставлен материал от ТИАБ щитовидной железы пациентки А с диагнозом узловое образование левой доли щитовидной железы. Эутериоз. По данным УЗИ щитовидной железы в левой доли отмечалось узловое образование размером 12х7 мм солидной структуры с локусами периферического кровотока (Фиг.9). При цитологическом исследовании материала в препаратах отмечался обильный клеточный состав, представленный псевдопапиллярными скоплениями фолликулярного эпителия, в части клеток отмечались внутриядерные цитоплазматические включения, хроматин ядер имел борозды и складчатость, отмечались единичные многоядерные клетки. Цитологическая картина фолликулярной опухоли, вероятно, папиллярный рак. Для уточнения диагноза остаток материала проанализирован с использованием тест-системы в формате биочипа (Фиг.10). В результате исследования получены следующие результаты: положительное окрашивание клеток отмечалось в ячейке тест-системы, содержащей антитела к СК19, тиреоглобулину, НМВЕ1, TTF1, Галектину 3. Полученный иммунофенотип указывал на папиллярный рак щитовидной железы. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
5. Тест-система «NOD2» (первичное типирование лимфом). Фиг.11, 12.
В клинико-диагностическую лабораторию доставлен материал, полученный при соскобе с конъюнктивы нижнего века левого глаза. Клинический диагноз: Susp. Лимфома (Фиг.11). При цитологическом исследовании в препаратах отмечалось большое количество преимущественно зрелых лимфоцитов. С целью первичного типирования лимфоцитов часть материала исследовалась с использованием тест-системы в формате биочипа. В результате исследования отмечалось диффузное окрашивание клеток в ячейки с антителом к белку СD20, в других ячейках окрашивание клеток отсутствовало (Фиг.12). Таким образом, выявление маркера СD20 указывает на принадлежность клеток к В-лимфоцитам. Для  подробного типирования клеток необходимо дальнейшее исследование иммунофенотипа. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
6. Тест-система «NOD1» (определение характера поражения лимфатического узла). Фиг.13, 14.
В клинико-диагностическую лабораторию доставлен пунктат лимфатического узла шеи слева. По данным УЗИ в левой шейной области отмечался единичный лимфатический узел размером 7х9 мм с локусами нодулярного кровотока (Фиг.13). При  цитологическом исследовании в препарате отмечалось небольшое количество клеток округло-овальной формы с периферически распложенным ядром без признаков резкого полиморфизма, элементы лимфатического узла отсутствовали. Клеточные изменения необходимо дифференцировать  между кистозными изменениями и неэпителиальным процессом. Для уточнения процесса выполнено исследование с использованием тест-системы в формате биочипа. В результате исследования все реакции с используемыми антителами были отрицательные (Фиг.14). Таким образом, клеточные изменения более всего соответствовали кисте. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
7. Тест-система «SER2» (определение органопринадлежности опухолевых клеток в жидкостях из серозных полостей). Фиг.15, 16.
В клинико-диагностическую лабораторию доставлена плевральная жидкость от пациентки Н с клиническим диагнозом правосторонний плеврит. Состояние после ПХТ по поводу рака яичников Т3NхМх и рака молочной железы в 2012 г ст.Т3N0М0 (Фиг.15). При цитологическом исследовании доставленного материала отмечался метастатический характер поражения. Для установления органопренадлежнности опухолевых клеток выполнено исследование с использованием тест-системы в формате биочипа. В результате исследования отмечалась положительная реакция клеток с антителами к СА125, ЕрСАМ, что указывает на принадлежность клеток к ткани яичника (Фиг.16). При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
8. Тест-система «SER1» (определение характера жидкостей из серозных полостей). Фиг.17, 18.
Пациент М, возраст 38 лет. Поступил для проведения планового лапароцентеза. Клинический диагноз: инфицирование вирусом гепатита С, цирроз печени. Асцит (Фиг.17). По результатам пункции удалено 1,7 литра асцитической жидкости, материал отправлен в клинико-диагностическую лабораторию для цитологического исследования. В результате цитологического исследования в препаратах отмечался обильный клеточный состав, представленный раздельно лежащими клетками, в которых отмечались признаки полиморфизма и дегенеративных изменений. Учитывая клинический диагноз, должна проводиться дифференциальная диагностика между реактивными изменениями и злокачественной природой клеточных изменений, что требовало дополнительных методов исследования. При изучении клеточного состава с использованием тест-системы в формате биочипа отмечалась положительная иммуноцитохимическая реакция с антителами к белкам НМВЕ1 и Десмин, что указывало на реактивную природу клеточных изменений в асцитической жидкости(Фиг.18). Применение тест-системы биочип позволило уточнить характер асцитической жидкости. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
9. Тест-система «SER1» (определение характера жидкостей  из серозных полостей). Фиг.19, 20.
Пациентка Р. в возрасте 43 лет с жалобами на увеличение живота в объеме, общую слабость поступила в хирургическое отделение. По данным УЗИ свободная жидкость в брюшной полости, образование левого яичника (Фиг.19). После лапароцентеза удалено 3,0 л асцитической жидкости. Материал доставлен в клинико-диагностическую лабораторию. В ходе проведения цитологического исследования в препаратах обнаруживались клеточные скопления предположительно эпителиального происхождения. Для уточнения проводилось исследование с помощью тест-системы в формате биочипа. В результате исследования демонстрировалась положительная иммуноцитохимическая реакция с антителами к СК7, EpCAM (Фиг.20). Полученный иммунофенотип клеток указывал на их эпителиальное происхождение. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.
Таким образом, предлагаемый по сравнению с прототипом вариант биочипа позволяет упростить и сократить длительность анализа за счет одновременной оценки экспрессии антигена и морфологии клетки. Появляется возможность готовить цитологические препараты длительного хранения (по данным литературы цитопрепараты подобного плана могут храниться более 20 лет).