Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов
MICROORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF O-SUCCINYLHOMOSERINE AND A METHOD FOR THE PRODUCTION OF O-SUCCINYLHOMOSERINE USING THE SPECIFIED MICROORGANISMS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
O
O
Настоящее изобретение относится выделенному полипептиду, обладающему резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью, микроорганизму, экспрессирующему указанный полипептид, и способу получения -сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
O
O
O
O
O
O
O
metA
O
Известно, что большинство микроорганизмов, представленных в природе, используют -сукцинилгомосерин или -ацетилгомосерин в качестве промежуточного продукта биосинтеза метионина. Обычно -сукцинилгомосерин образует гомосерин--сукцинилтрансфераза (MetA), конъюгирующая сукцинильную группу сукцинил-КоA с гомосерином, и -ацетилгомосерин образует гомосерин--ацетилтрансфераза (MetX), конъюгирующая ацетильную группу ацетил-КоA с гомосерином. То есть, применительно к получению -сукцинилгомосерина наряду с другими промежуточными продуктами,  является одним из наиболее важных генов при разработке микроорганизмов, продуцирующих -сукцинилгомосерин. В то же время известно, что, в отличие от MetA, MetX не подвержен ингибированию по принципу обратной связи и обладает высокой ферментной стабильностью.
O
O
L
O
O
Накопление -сукцинилгомосерина происходит при блокаде цистатионин-гамма-синтазы в метаболическом пути биосинтеза метионина, и, таким образом, штамму, продуцирующему -сукцинилгомосерин, необходим -метионин. Соответственно, в среду добавляют метионин, который ингибирует активность гомосерин--сукцинилтрансферазы, и, в конечном счете, -сукцинилгомосерин не может быть получен в высокой концентрации.
metA
O
metA
O
metA
Соответственно, во многих предшествующих патентах первостепенное внимание было уделено исследованиям по устранению ингибирования  по принципу обратной связи контрольной системой обратной связи. Тем не менее, для гомосерин--сукцинилтрансферазы, кодируемой , свойственны проблемы низкой стабильности самого белка дикого типа, и введение мутаций для устранения ингибирования по принципу обратной связи усугубляет нестабильность. Соответственно, для разработки штамма, продуцирующего -сукцинилгомосерин с высокой продуктивностью, необходимо устранение ингибирования гена  по принципу обратной связи и сохранение стабильности фермента.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
O
Escherichia sp.
O
O
Для решения феномена ингибирования metA по принципу обратной связи и проблемы нестабильности фермента, описанной выше, авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать гомосерин--сукцинилтрансферазу с сохраненной стабильностью фермента, не подверженную, в то же время, ингибированию метионином по принципу обратной связи, и провели на предмет этого скрининг новых ферментов, обладающих указанной активностью. В результате отбора генов-кандидатов, прошедших такой скрининг, и культивирования в колбах после их введения в  авторы настоящего изобретения обнаружили, что происходило образование -сукцинилгомосерина и что отобранные таким образом гены обладали гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, завершив посредством этого настоящее изобретение.
Техническое решение
O
Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового выделенного полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего новый выделенный полипептид.
O
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма для получения -сукцинилгомосерина, экспрессирующего новый выделенный полипептид.
O
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения -сукцинилгомосерина с использованием указанного выше микроорганизма.
Полезные эффекты изобретения
O
O
O
L
Микроорганизм для получения -сукцинилгомосерина, содержащий новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью, который может обладать резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и продуцировать -сукцинилгомосерин с высоким выходом и, таким образом, может быть эффективно использован для получения -метионина, используемого им в качестве предшественника, с высоким выходом.
Наилучший вариант осуществления изобретения
O
Для решения указанных выше задач в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью.
O
O
Использованный здесь термин «гомосерин--сукцинилтрансферазная активность» относится к активности по превращению гомосерина в -сукцинилгомосерин.
O
Использованный здесь термин «ингибирование по принципу обратной связи» относится к ингибированию активности гомосерин--сукцинилтрансферазы метионином.
O
O
Полипептид по настоящему изобретению характеризуется тем, что он имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, обладающую гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи. Любой полипептид, последовательность которого на 80% или более гомологична указанному выше полипептиду, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более, также включен в объем настоящего изобретения, с учетом того, что полипептид обладает гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, предложенными в настоящем изобретении. Процент гомологии может быть определен с использованием BLAST 2.0, являющегося эталонным алгоритмом, или FASTA по Pearson [Methods Enzymol., 183, 63(1990), ниже]. На основе алгоритма BLAST разработаны программы, называемые BLASTN и BLASTX [www.ncbi.nlm.nih.gov, ниже].
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид. Конкретно, полипептид может быть кодирован полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Ввиду вырожденности кодонов объем настоящего изобретения также включает, без ограничения, полинуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 80%, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более гомологична указанной выше последовательности.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий функциональный полинуклеотид.
Использованный здесь термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего интересующий белок, где интересующий белок функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, таким образом, что интересующий белок может быть экспрессирован в подходящем хозяине. Регуляторная последовательность может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания рибосом на мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации подходящего хозяина вектор может быть реплицирован, или может функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина.
Относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что вектор может быть реплицирован в хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в данной области.
O
O
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий -сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью.
O
O
Использованный здесь термин «микроорганизм, продуцирующий -сукцинилгомосерин», может относиться к микроорганизму, способному продуцировать -сукцинилгомосерин и хранить его внутриклеточно и внеклеточно.
O
Escherichia
Erwinia
Serratia
Providencia
Corynebacterium
Brevibacterium
Escherichia
Escherichia coli
Микроорганизм для получения -сукцинилгомосерина включает штаммы прокариотических и эукариотических микроорганизмов, например, без ограничения, штаммы микроорганизмов, принадлежащие к роду , роду , роду , роду , роду  и роду . Конкретно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду , например, .
O
L
L
L
L
L
L
O
O
Микроорганизм, продуцирующий -сукцинилгомосерин, может быть получен с использованием штаммов микроорганизмов, продуцирующих -лизин, -треонин или -изолейцин, и, конкретно, с использованием штамма, продуцирующего -треонин. Поскольку штамм, продуцирующий -треонин, представляет собой штамм, способный синтезировать -треонин и гомосерин в качестве предшественника -сукцинилгомосерина, с использованием этого штамма может быть синтезировано большое количество предшественников метионина, то есть -сукцинилгомосерина.
В настоящем изобретении экспрессия полипептида может быть достигнута трансформацией рекомбинантным вектором, содержащим функциональный ген, кодирующий полипептид, или введением полинуклеотида, кодирующего полипептид, в хромосому, однако методы не ограничены указанными выше.
Использованный здесь термин «трансформация» относится к процессу введения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, что позволяет экспрессировать полинуклеотид, кодируемый белком, в клетке-хозяине. Неважно, введен ли полинуклеотид, используемый для трансформации, в хромосому клетки-хозяина, будучи расположен в ней, или расположен вне хромосомы, при условии что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, с учетом того, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой полинуклеотидную конструкцию, содержащую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может содержать промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания (далее - «ORF») гена, сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции.
T7
trc
tac
cysK
Относительно промотора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что он способен инициировать транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в клетке-хозяине с высокой частотой, и может быть использован любой промотор, известный в данной области. Конкретно, но без ограничения, могут быть использованы промотор , промотор , промотор  и промотор  (патент Кореи № 10-0966324).
metB
В типичном воплощении настоящего изобретения ген , кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, у микроорганизма может быть дополнительно удален или ослаблен.
thrB
metA
O
В типичном воплощении настоящего изобретения ген , кодирующий гомосеринкиназу, и ген , кодирующий гомосерин--сукцинилтрансферазу, у микроорганизма могут быть дополнительно удалены или ослаблены.
В настоящем изобретении последовательности генов могут быть получены из баз данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI).
Использованный здесь термин «делеция» относится к типу удаления из хромосомы части или всей области нуклеотидной последовательности целевого гена, начиная с нуклеотидной последовательности, соответствующей инициирующему кодону, до нуклеотидной последовательности, соответствующей терминирующему кодону, или части или всей области нуклеотидной последовательности его регуляторной области.
Использованный здесь термин «ослабление» относится к устранению или снижению внутриклеточной активности по меньшей мере одного фермента, кодируемого соответствующей ДНК, у штамма микроорганизма. Например, экспрессия белка может быть ослаблена модификацией промоторной области нуклеотидной последовательности 5'-UTR (5'-нетранслируемой области) гена, или активность белка может быть ослаблена введением мутации в область ORF соответствующего гена.
O
O
O
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения -сукцинилгомосерина, включающий культивирование микроорганизма в среде для получения -сукцинилгомосерина и получение -сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды.
O
Biochemical Engineering
Культивирование штамма микроорганизма для получения -сукцинилгомосерина, полученного выше, может быть проведено в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Способ культивирования может быть легко адаптирован специалистом в данной области для применения в соответствии с выбранным штаммом. Конкретно, культура может представлять собой, без ограничения, периодическую культуру, непрерывную культуру и адаптированную культуру (fetch culture). Эти различные способы культивирования раскрыты, например, в приведенной ссылке (“” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138 - 176).
Manual of Methods for General Bacteriology
Среды, используемые для культивирования, должны подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Примеры сред для различных микроорганизмов раскрыты, например, в приведенной ссылке (“” by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Среды могут содержать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Примеры источников углерода для включения в среды могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для включения в среды могут включать органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL) и бобовую муку; и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации. В качестве источника фосфора среды могут содержать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и соответствующие натрий-содержащие соли. В дополнение, культуральные среды могут содержать металлы, такие как сульфат магния и сульфат железа. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины, подходящие предшественники и так далее. Эти культуральные среды или предшественники могут быть добавлены в культуру в форме периодической культуры или непрерывной культуры.
O
В дополнение, во время культивирования pH культуры можно подходящим образом корректировать добавлением такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, образование пузырьков во время культивирования можно предотвращать с использованием пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. В дополнение, в культуру может быть добавлен газообразный кислород или газ, содержащий газообразный кислород (например, воздух), для поддержания в культуре аэробных условий. Температура культуры может входить в диапазон от 20°C до 45°C и, конкретно, от 25°C до 40°C. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества продукта -сукцинилгомосерина и, конкретно, от 10 часов до 160 часов.
O
O
L
O
L
3
-сукцинилгомосерин, полученный способом по настоящему изобретению, может быть превращен в метионин цистатионин-гамма-синтазой или -сукцинилгомосеринсульфгидрилазой. Кроме того, возможно получение янтарной кислоты в качестве побочного продукта, в дополнение к -метионину, посредством взаимодействия -сукцинил--гомосерина, полученного способом по настоящему изобретению, с CHSH.
O
O
O
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин--сукцинилтрансферазной активностью, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Было подтверждено, что новый выделенный полипептид по настоящему изобретению обладает резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и способен продуцировать -сукцинилгомосерин с высоким выходом, и, таким образом, указанный полипептид может быть использован для получения -сукцинилгомосерина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.
Пример 1: Отбор полипептидов, обладающих новой
O
-сукцинилтрансферазной активностью
metA
Chromobacterium violaceum
metX
O
L
metX
metA
В качестве способа устранения контроля гена  по принципу обратной связи и сохранения его стабильности был разработан metX, имеющий происхождение от , на основании того факта, что ген  (гомосерин--ацетилтрансфераза) не подвержен ингибированию -метионином по принципу обратной связи, несмотря на то, что ген  имеет структуру, близкую к структуре гена .
O
Chromobacterium violaceum
Sideroxydans lithotrophicus
В этом отношении, для разработки новой гомосерин--ацетилтрансферазы авторы настоящего изобретения провели анализ гомологии аминокислотных последовательностей уже разработанных metX, имеющих происхождение от , и в итоге отобрали полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, не подверженный ингибированию метионином по принципу обратной связи. Авторы настоящего изобретения недавно подтвердили, что отобранный полипептид, несмотря на то, что он представляет собой metX, имеющий происхождение от  ES-1, обладает новой активностью, о которой никогда не сообщалось ранее.
Пример 2: Конструирование плазмид
2-1. Синтез гена
metX
, имеющего происхождение из
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
metX
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
sli
metX
E. coli
Ген , имеющий происхождение из  () (SEQ ID NO: 3), синтезировали на основе последовательности гена  (SEQ ID NO: 2) из базы данных NCBI (эталонная последовательность: YP_003522665.1) с оптимизацией кодонов, чтобы ген можно было экспрессировать в .
2-2. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген
metX
, имеющий происхождение из
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
metX
Hind
Ген  амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием праймеров SEQ ID NO: 4 и 5 на основе синтезированной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3. Праймер SEQ ID NO: 5 имеет сайт рестрикции III.
SEQ ID NO: 4) 5'-ATCTTGAGTATTTCGGTTGGTATTG-3'
SEQ ID NO: 5) 5'-CCCAAGCTTTTAAGCAGCTGATTCCCAAGC-3'
Hind
pCL1920
cysK
Eco
Hind
metX
ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоявших из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,14 т.п.о. элюировали, очищали и обрабатывали III. Вектор , содержащий промотор , обрабатывали RV и III и полученные рестрикционные фрагменты клонировали. Плазмида, экспрессирующая ген , полученная в результате клонирования, была названа «pCL-PcysK-metX (sli)».
Пример 3: Конструирование экспериментальных штаммов
3-1. Делеция гена metB
metB
E. coli
W3110
metB
PNAS
metB
pKD3
PNAS
Проводили делецию гена , кодирующего цистатионин-гамма-синтазу, у штамма  (K12)  дикого типа. Для делеции гена  применяли метод делеции «FRT-one-step-PCR» ( (2000) vol 97: P 6640 - 6645). Для делеции гена  конструировали делеционную кассету посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 6 и 7 и вектора  ( (2000) vol 97: P 6640 - 6645) в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 6)
5'-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 7)
5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
E. coli
K12
W3110
pKD46
PNAS
W3110
pKD46
L
metB
600
ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм  () , уже трансформированный вектором  ( (2000) vol 97 P 6640 - 6645). Для электропорации штамм , трансформированный , культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ -арабинозы, при 30°C до достижения OD 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°C в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу. Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 8 и 9 и делецию гена  подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.
SEQ ID NO: 8) 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3'
SEQ ID NO: 9) 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'
pCP20
PNAS
metB
CC03-0131
Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором  ( (2000) vol 97 P 6640 - 6645) и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена , имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Сконструированный таким образом штамм, которому необходим метионин, был назван «».
3-2. Делеция гена
thrB
O
thrB
thrB
thrB
CC03-0131
thrB
pKD3
Была предпринята попытка увеличить количество -сукцинилгомосерина, синтезируемого из гомосерина, делецией гена , кодирующего гомосеринкиназу. В частности, для использования штамма, продуцирующего треонин, необходима делеция гена , поскольку активность утилизации гомосерина очень высока. Делецию гена  в штамме , конструированном выше, проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR». Делеционную кассету  конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 10 и 11 и вектора  в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 10)
5'-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 11)
5'-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
CC03-0131
pKD46
CC03-0131
pKD46
600
ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм , уже трансформированный вектором . Для электропорации штамм , трансформированный , культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, при 30°C до достижения OD 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°C в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.
thrB
Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 12 и 13 и делецию гена  подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.
SEQ ID NO: 12) 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3'
SEQ ID NO: 13) 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'
pCP20
thrB
CC03-0131-2
Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором  и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена , имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «».
3-3. Делеция гена
metA
metX
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
E. coli
metA
CC03-0131-2
E. coli
K12
W3110
metB
thrB
metA
metA
pKD3
Для описания субстратной специфичности и активности гена , имеющего происхождение из , у штамма  проводили делецию исходного гена  на хромосоме на основе штамма , представляющего собой штамм ()  с делециями генов  и . Делецию гена  проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR». Делеционную кассету  конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 и 15 и вектора  в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 14)
5'-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
SEQ ID NO: 15)
5'-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
CC03-0131-2
pKD46
CC03-0131-2
pKD46
600
ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C в течение 30 с, отжига при 55°C в течение 30 с и удлинения при 72°C в течение 1 мин. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и полосу 1,1 т.п.о. элюировали и очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм , уже трансформированный вектором . Для электропорации штамм , трансформированный , культивировали в среде LB, содержащей 200 мкг/л ампициллина и 5 мМ арабинозы, при 30°C до достижения OD 0,5 и для использования промывали 3 раза 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 30 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°C в течение 1-2 суток и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.
metA
Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях, что описаны выше, с использованием праймеров SEQ ID NO: 16 и 17 и делецию гена  подтверждали, наблюдая присутствие 1,5 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле.
SEQ ID NO: 16) 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3'
SEQ ID NO: 17) 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'
pCP20
metA
CC03-0132
Подтвержденный таким образом штамм трансформировали вектором  и культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина. Конечный штамм с делецией гена , имеющего уменьшенный размер, подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «».
3-4. Конструирование штамма с введенной плазмидой, экспрессирующей ген
metX
, имеющий происхождение из
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
metX
Sideroxydans lithotrophicus ES-1
CC03-0132
E. coli
K12
W3110
metB
thrB
metA
pCL-PcysK-metX
sli
Для описания субстратной специфичности и активности гена , имеющего происхождение из , в штамм , представляющий собой штамм  ()  с делециями генов ,  и , вводили плазмиду  (), конструированную в Примере 2.
CC03-0132
pCL-PcysK-metX
sli
CC03-0136
Штамм  с введенной  () был назван «» и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM), расположенном по адресу 361 - 221, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, являющемся дочерней структурой Корейской федерации коллекций культур (Korean Federation of Culture Collections, KFCC) и признанном международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению 10 июня 2013 г., под регистрационным номером KCCM11424P.
pCL-PcysK-metA
metA
CC03-0132
CC03-0132/pCL-PcysK-metA
Штамм был конструирован введением плазмиды , конструированной таким же образом, как в Примере 2, за исключением того, что в качестве контрольной группы был использован  дикого типа в штамме . Конструированный таким образом штамм был назван «».
CJM002
L
CJM-BTA
Кроме того, конструировали штамм с использованием штамма , продуцирующего треонин, не нуждающегося в метионине (регистрационный номер: KCCM-10568), посредством искусственной мутации с использованием NTG на основе штамма TF4076 (регистрационный номер: KFCC-10718), продуцирующего -треонин, представляющего собой штамм, которому необходим метионин, раскрытый в патенте Кореи № 10-0905381, таким же образом, как в Примерах 3-1 - 3-3, и конструированный таким образом штамм был назван «».
pCL-PcysK-metX (sli)
pCL-PcysK-metA
CJM-BTA
CJM-BTA/pCL-PcysK-metX
sli
CJM-BTA
pCL-PcysK-metA
Плазмиды  и , как описано выше, вводили в штамм , и конструированные таким образом штаммы были названы « ()» и «/», соответственно.
Пример 4: Получение
O
сукцинилгомосерина с использованием штамма
-
4-1. Эксперимент с культивированием в колбах
metX
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
Для описания субстратной специфичности и активности гена , имеющего происхождение из , введенного в штамм, конструированный в Примере 3, проводили культивирование в колбах Эрленмейера. Состав культур в колбах показан в Таблице 1 ниже.
Таблица 1
Состав
Исходно
Концентрация(на литр)
Объем(мл)
Глюкоза
40 г
200
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2 г
100
Сульфат аммония
17 г
500
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1 г
Дрожжевой экстракт
4 г
Метионин
0,4 г
MnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
10 мг/мл
0,01 г (1 мл маточного раствора)
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1 мг/мл
0,01 г (10 мл маточного раствора)
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
10 мг/мл
10 мг (1 мл маточного раствора)
Карбонат кальция
30 г
200
CC03-0132
CJM-BTA
CC03-0136
CC03-0132
pCL-PcysK-metA
CJM-BTA
pCL-PcysK-metX
sli
CJM-BTA
pCL-PcysK-metA
CJM-BTA
O
600
Штамм  и штамм  высевали на чашки со средой LB в качестве контрольных групп. Штамм  (трансформированный вектором экспрессии metX), штамм / (трансформированный вектором экспрессии metX, полученный с использованием того же вектора) и два других штамма, / () и / (трансформированные вектором экспрессии metX или вектором экспрессии metA на основе штамма , соответственно), высевали на чашки со средой LB, содержащей спектиномицин, и культивировали при 33°C в течение ночи. Затем отдельные колонии засевали в 2 мл среды LB, содержащей спектиномицин, культивировали при 33°C в течение 2 часов, засевали снова в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащие 25 мл среды, до оптической плотности OD 0,07, культивировали при 33°C и 200 об/мин в течение 48 часов и количество полученного -сукцинилгомосерина сравнивали посредством HPLC-анализа (высокоэффективная жидкостная хроматография). Результаты показаны в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
Штамм
OD
Потребление глюкозы(г/л)
Количество полученного O-сукцинилгомосерина(г/л)
CC03-0132
16
40
0,0
CC03-0132/pCL-PcysK-metA
20
40
0,5
CC03-0132/pCL-PcysK-metX (sli) : CC03-0136
20
40
1,3
CJM-BTA
5
40
0,0
CJM-BTA/pCL-PcysK-metA
6
40
1,0
CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (sli)
6
40
3,5
metX
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
metA
E. coli
O
O
metX
Sideroxydans lithotrophicus
ES-1
В результате было подтверждено, что ген , имеющий происхождение из , как и ген , продуцирует -сукцинилгомосерин, используя сукцинил-КоА в качестве субстрата, но не продуцирует -ацетилгомосерин. При введении гена , имеющего происхождение из , не было ингибирования метионином, добавленным в среду, по принципу обратной связи, даже при использовании дикого типа самого по себе, без каких-либо модификаций.
Специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без выхода за рамки его сущности или основных признаков. Описанные воплощения следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные и не ограничивающие. Таким образом, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием. Все изменения в рамках значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения следует рассматривать как включенные в объем настоящего изобретения.
--->
<110>    СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн
<120>    МИКРООРГАНИЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ O-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА И СПОСОБ
ПОЛУЧЕНИЯ O-СУКЦИНИЛГОМОСЕРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
<130>    OPA14138
<150>    KR 10-2013-0126612
<151>    2013-10-23
<160>    17
<170>    KopatentIn 2.0
<210>    1
<211>    377
<212>    ПРТ
<213>    Sideroxydans lithotrophicus
<400>    1
Met Ser Ile Ser Val Gly Ile Val Thr Ala Gln Arg Ala Val Phe Asp
1               5                  10                  15
Lys Pro Leu Ser Phe Arg Ser Gly Ala Val Leu Pro Arg Tyr Glu Leu
20                  25                  30
Val Tyr Glu Thr Tyr Gly Thr Leu Asn Ala Glu Arg Ser Asn Ala Ile
35                  40                  45
Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly Asn His His Val Ala Gly Tyr Tyr
50                  55                  60
Ala Gly Asp Glu Lys Ser Leu Gly Trp Trp Asp Asn Met Val Gly Pro
65                  70                  75                  80
Gly Lys Pro Ile Asp Thr Asn Lys Phe Phe Val Val Gly Leu Asn Asn
85                  90                  95
Leu Gly Gly Cys His Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ser Ile Asp Pro Gln
100                 105                 110
Thr Gly Lys Pro Tyr Gly Ala Ser Phe Pro Val Val Thr Val Glu Asp
115                 120                 125
Trp Val Glu Ser Gln Ala Arg Leu Ala Asp His Leu Gly Val Tyr Arg
130                 135                 140
Phe Ala Ala Val Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Met Gln Ala Met Gln
145                 150                 155                 160
Trp Ala Leu Ala Tyr Pro Asp Arg Val Arg His Val Leu Ala Ile Ala
165                 170                 175
Thr Ala Pro His Leu Thr Ala Gln Asn Ile Ala Phe Asn Asp Val Ala
180                 185                 190
Arg Asn Ala Ile Leu Thr Asp Pro Asp Phe His Asn Gly Asp Phe Tyr
195                 200                 205
Gln His Gly Val Val Pro Thr Arg Gly Leu Arg Leu Ala Arg Met Leu
210                 215                 220
Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met Ala Asp Lys Phe Gly
225                 230                 235                 240
Arg Glu Leu Arg Thr Gly Lys Leu Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Glu Phe
245                 250                 255
Gln Ile Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Asp Lys Phe Ala Ala Tyr
260                 265                 270
Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Phe
275                 280                 285
Asp Pro Ala Arg Glu Leu Asp Gly Asp Leu Asn His Ala Phe Ala Ala
290                 295                 300
Ala Lys Ala Lys Phe Leu Val Val Ser Phe Thr Thr Asp Trp Arg Phe
305                 310                 315                 320
Ser Pro Glu Arg Ser Arg Glu Ile Val His Ala Leu Leu His Asn Lys
325                 330                 335
Arg Asp Val Ser Tyr Ala Glu Ile Thr Ser Gln His Gly His Asp Ser
340                 345                 350
Phe Leu Met Gln Asp Glu Gln Tyr Phe Ala Val Met Arg Asn Tyr Leu
355                 360                 365
Asp Asn Val Ala Trp Glu Ser Ala Ala
370                 375
<210>    2
<211>    1134
<212>    ДНК
<213>    Sideroxydans lithotrophicus
<400>    2
ttgagcatct cggttggcat cgttacagcg caacgcgcgg tttttgacaa acctctctcc         60
ttcaggagcg gagcagtatt gccgcgttat gaactggtat atgagaccta tggcacgctg        120
aacgcagagc gcagcaacgc catcctgatc tgtcacgcct tgtccggcaa tcaccatgtc        180
gctggctact acgccggcga tgaaaagagc ctcggctggt gggacaacat ggtgggaccc        240
ggcaaaccga tagacaccaa caaattcttt gtcgtcgggt tgaacaacct tggcggctgc        300
catggctcga ccggtccttc cagtatcgat ccgcagaccg gcaagccata tggtgcgagt        360
ttcccggtgg tcacggtgga agactgggtg gagtcgcagg cccgtctcgc cgaccatctc        420
ggcgtctacc ggttcgccgc agtggtcggc ggcagcctgg gtggcatgca ggccatgcaa        480
tgggcactgg cctatccgga tcgcgtgcga catgtgctgg ccatcgccac cgcaccgcat        540
cttacggcgc agaacatcgc attcaacgac gtggcgcgca atgcgatcct caccgacccg        600
gatttccata acggcgattt ctaccagcat ggcgtggtgc ctacacgcgg cctgcgcctg        660
gcgcgcatgc ttgggcacat cacctatctt tccgacgatg ccatggcgga caagttcggg        720
cgcgaattgc gcacgggtaa attaaatttc agctacgaca tcgaattcca gatcgaatcc        780
tacctgcgct accagggcga caagttcgcc gcgtatttcg acgcgaacac ttacctgctg        840
atgaccaagg cgctggatta tttcgacccg gcgcgcgaac tcgacggtga cctgaatcat        900
gccttcgcag ctgccaaggc caaattcctt gtcgtgtctt tcacgaccga ctggcgcttc        960
tcgccggagc gttcgcgcga gatcgtgcat gcgctgctgc acaacaagcg cgatgtgagt       1020
tacgcggaga tcacttcgca gcacggccac gattccttcc tgatgcagga cgagcagtat       1080
ttcgcggtca tgcgcaatta tctcgataac gtcgcctggg aaagtgcggc atga             1134
<210>    3
<211>    1134
<212>    ДНК
<213>    Sideroxydans lithotrophicus
<400>    3
ttgagtattt cggttggtat tgttacagcc caacgcgcgg tttttgacaa acccctctcc         60
tttaggtcag gagcagtatt gccacgttat gaattagtat atgaaaccta tggtacactg        120
aatgcagagc ggagcaatgc cattctgatt tgtcacgcat tgtccggtaa tcatcatgtc        180
gctggctact acgccgggga tgaaaaaagc ctaggctggt gggataacat ggtgggacct        240
ggcaaaccaa ttgatacgaa caaatttttt gtcgtcgggt taaataatct tggaggctgc        300
catggctcaa ccggtcctag cagtatcgat ccgcagactg gtaaaccata tggtgcgagt        360
tttcccgttg tcacggtgga agattgggta gaatctcagg cccgtctagc ggatcatctc        420
ggcgtttatc ggttcgctgc agtcgttggc ggatctttag gtggtatgca agccatgcag        480
tgggcactgg cttatccgga tcgcgtgcga catgttctgg ccatagctac cgcaccgcat        540
cttacggctc agaatattgc atttaacgac gttgcgcgca atgcaatcct taccgacccg        600
gattttcata acggagattt ttaccagcat ggagtggtgc ctacacgcgg cctgcgtctg        660
gcgcgaatgt tagggcacat aacctattta agcgatgatg ccatggcgga taaatttggt        720
cgtgaattgc gcacggggaa attaaatttc tcttatgata tcgaattcca gatcgaaagt        780
tacctgagat accaaggcga caaattcgct gcgtatttcg atgcgaacac ttacctgctg        840
atgaccaagg ccttggatta ttttgatccg gcgagagaac ttgacggtga tctgaatcat        900
gccttcgcag ctgccaaggc caaatttctt gtggtatctt tcactacaga ttggcggttt        960
tcgccggagc gttcacgcga aatagttcat gcgttactgc acaacaagcg cgatgtgagt       1020
tacgcagaga ttacttcaca gcacggccac gattcctttc tgatgcaaga cgaacagtat       1080
tttgcagtga tgagaaatta tttagataac gtagcttggg aatcagctgc ttaa             1134
<210>    4
<211>    25
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    4
atcttgagta tttcggttgg tattg                                               25
<210>    5
<211>    30
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    5
cccaagcttt taagcagctg attcccaagc                                          30
<210>    6
<211>    70
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    6
ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg         60
gagctgcttc                                                                70
<210>    7
<211>    70
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    7
cgctgcgcca gctccatacg cggcaccagc gttcgcaacc cacgtagcag catatgaata         60
tcctccttag                                                                70
<210>    8
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    8
tattcgccgc tccattcagc                                                     20
<210>    9
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    9
taccccttgt ttgcagcccg                                                     20
<210>    10
<211>    70
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    10
catggttaaa gtttatgccc cggcttccag tgccaatatg agcgtcgggt gtgtaggctg         60
gagctgcttc                                                                70
<210>    11
<211>    70
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    11
ggagataccg ctcgctaccg cgccgatttc cgcgaccgcc tgccgcgcct catatgaata         60
tcctccttag                                                                70
<210>    12
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    12
actcgacgat ctctttgcc                                                      19
<210>    13
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    13
acgccgagag gatcttcgca g                                                   21
<210>    14
<211>    70
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    14
tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg cccgcagagc gtgtaggctg         60
gagctgcttc                                                                70
<210>    15
<211>    70
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    15
ccgtcacaaa ggcaatgcgc ttatctttac tggcaaacag atatgcatcc catatgaata         60
tcctccttag                                                                70
<210>    16
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    16
ctcattaacg ttggttgtca                                                     20
<210>    17
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    17
tatcttgctg ctgctgaatg                                                     20
<---