Протеолитическая активность бактерий трибы proteeae

Н. М. Замалютдинова, И. Р. Галиева, А. О. Арапова,

Е. О. Михайлова, М. Р. Шарипова, А. М. Марданова

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ ТРИБЫ PROTEEAE

Ключевые слова: идентификация, энтеробактерии, протеиназы, зимография.

Микробиологическими и молекулярно-биологическими методами идентифицированы бактерии трех родов энтеробактерий - Proteus, Morganella, Providencia. С использованием различных белковых субстратов исследована вне- и внутриклеточная протеолитическая активность этих штаммов. Proteus mirabilis обладает высокой внеклеточной протеолитической активностью. В клеточных экстрактах Morgannella и Providencia обнаружены внутриклеточные протеиназы расщепляющие желатин.

Keywords: identification, enterobacteriaceae, proteinases, zymography.

The three genera of Enterobacteriaceae bacteria - Proteus, Morganella, Providencia were identified by microbiological and molecular-biological methods. Extracellular and intracellular proteolytic activities of these strains were investigated with the use of various protein substrates. Proteus mirabilis has high extracellular proteolytic activity. Intracellular proteases cleaving gelatine were found in Morganella and Providencia cell extracts.

Введение

Семейство Enterobacteriacee включает более 50 родов, которые объединяют много видов патогенных и условно-патогенных для человека бактерий. По современной классификации три рода энтеробактерий, Proteus, Morganella и Providencia, объединяют в трибу Proteeae [1]. Представители этих родов вызывают оппортунистические и госпитальные инфекции различной локализации. Чаще всего это инфекции мочевыделительных путей, хотя возможны инфекции дыхательных путей, кожи, слизистых оболочек. Описаны случаи сепсиса, бактериемии и менингита [2,3]. Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia stuartii обладают различными факторами вирулентности -адгезинами, уреазой, фимбриями и др. [4].

Внеклеточная протеиназа P mirabilis способна расщеплять иммуноглобулины и рассматривается как один из факторов вирулентности [5]. Данные о внутриклеточных протеиназах Proteus и о

протеолитических ферментах бактерий р.

Morganella и Providencia отсутствуют. Неизвестна роль протеолитических ферментов в вирулентности этих патогенов. Показано, что предобработка патогенных бактерий гомосеринлактоном приводит к повышению устойчивости протеаз [6].

Целью данной работы была идентификация клинических изолятов, представителей р. Proteus, Morganella и Providencia, а также сравнительная характеристика протеолитической активности этих штаммов с использованием различных белковых субстратов.

Материалы и методы исследования

Штаммы бактерий (Proteus sp. 17 и 57) были получены от профессора, д.б.н. С.Ю. Хайтлиной (институт цитологии, РАН, Санкт-Петербург) и Providencia sp. 6 - музея кафедры микробиологии ИФМиБ.

Бактерии культивировали при 37°С с интенсивностью качания 200 об/мин (вибростенд, B. Braun, Германия). В качестве инокулята использовали 12 часовую культуру, выращенную на

среде LB [7] (%): триптон - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.5, NaCl - 0.5, pH 8.5. Среда LBА содержала 2% агара. Для определения казеинолитической активности использовали среду (г/л): казеин - 5, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, агар - 2%.

Определение общего количества белка проводили по методу М. Брэдфорд [8].

Прирост биомассы измеряли

нефелометрически на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при длине волны 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах светопоглощения в кювете толщиной 1 см.

Идентификацию бактерий проводили по классическим микробиологическим методам [9] и молекулярно-биологическому методу, основанному на гомологии 16S рРНК [10].

Получение клеточного лизата проводили следующим образом: 200 мл культуральной

жидкости центрифугировали при 13000 об/мин, осадок отмывали дважды в растворе 0.8% NaCl. Клетки ресуспендировали в 0.1 мМ CaCl2, 5 мМ трис-HCl с рН 7.5 и подвергали ультразвуковому воздействию при 4оС в течение 8 - 9 секунд 8 раз с интервалом в 60 секунд. Для удаления разрушенных клеток и их обломков суспензию центрифугировали в течение 20 мин при 20000 об/мин и 4оС. Клеточный экстракт отбирали и замораживали до использования.

Расщеплению азоказеина проводили по методу [11]. За единицу активности принимали такое количество активности, которое приводит к повышению поглощения на 0.1 единицы.

Протеолитическое расщепление актина проводили по методу, описанному в работе [12].

Для электрофореза белков в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия использовали стандартную методику [13].

Зимографию в ПААГ с желатином (1 мг/мл) осуществляли согласно методу [14].

Математическую обработку данных проводили в программной среде «Microsoft Excel» путем расчета среднеквадратичного отклонения (сг). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении в ^ 15%. В

качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р «с 0.05 за достоверный уровень значимости.

Результаты исследований и их обсуждение

Бактериальные штаммы № 17 и 57 были выделены от урологических больных и предварительно идентифицированы как

представители рода Proteus, штамм 6 - Providencia. Была проведена дифференцировка штаммов до вида с использованием классических

микробиологических тестов и молекулярнобиологического метода, основанного на гомологии 16 S рРНК. Результаты изучения различных признаков штаммов представлены в таблице 1, из которой видно, что штаммы №17, 57 и 6 различаются по ряду признаков. На основании изученных свойств штамм 17 можно отнести к роду Proteus, штамм 57 к роду Morganella, а штамм 6 -Providencia. Однако для представителей рода Morganella, как правило, не характерно наличие гемолитических свойств. А штамм 57 проявил слабые гемолитические свойства. Использованный набор микробиологических тестов не позволяет сделать однозначный вывод о принадлежности исследуемых культур к тем или иным видам. Для более точной идентификации необходимо использование современных молекулярнобиологических методов.

Таблица 1 - Микробиологическая

характеристика штаммов бактерий

Изучаемые свойства №і7 №З7 №б Proteus ci n vi or P Morganella

Окраска по Граму - - - - - -

Подвижность + + + -

Роение (2% агар) + - - +/ - -

Протеолиз казеина + - - + - -

Гемолиз +++ + +/ + / +

Синтез сероводорода + - - + - -

Расщепление глюкозы + + + +

Расщепление мальтозы + - + - -

Расщепление маннита - - - - +

Расщепление сахарозы + + + +/ -

С целью идентификации микроорганизмов по последовательности гена 168 рРНК из клеток была выделена тотальная ДНК и проведена ПЦР-реакция с праймерами к гену 168 рРНК. ДНК-

продукты были секвенированы в компании «СИНТОЛ» и затем последовательности генов 16 8 рРНК были проанализированы на гомологию с известными генами в базе данных N031 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Идентификация бактериальных штаммов на основании гомологии генаІб S рРНК

Штамм Результат секвенирования

№ і7 Proteus mirabilis strain CIFRI Ch-TSB28, 99% Proteus mirabilis strain CIFRI Ch-TSB30, 99% Proteus mirabilis strain FUA!240, 99% Proteus mirabilis strain CIFRI P-TSB-іЗ, 99% Proteus mirabilis strain FFL2, 99% Proteus mirabilis strain HI4320, 99%

№ З7 Morganella morganii strain 3B4A, 98%

№ б Providencia stuartii strain S2SA-Sa 97%

Таким образом, полученные данные позволяют идентифицировать штамм 17 как Р. mirabilis с вероятностью 99%, штамм 57 как M. morganii с вероятностью 98%, а штамм 6 как Р. stuartii с вероятностью 97%.

Для определения наличия внеклеточных протеолитических ферментов, расщепляющих казеин, выращивали бактерии на молочном агаре. Показано, что протеолитическую активность в отношении казеина проявляет только штамм Р. mirabilis (рис. 1). Вокруг колоний штаммов M. morganii и P stuartii не обнаружено зоны просветления среды. Кроме того, видно, что колония P. mirabilis образует концентрические круги, что характерно для роящихся штаммов. Эти результаты согласуются с данными литературы, согласно которым многие штаммы р. Proteus, способные к роению, могут секретировать протеазы,

расщепляющие казеин [15]. Известно, что только представители р. Proteus способны к ползучему росту на среде, содержащей 2% агара. Бактерии р. Morganella и Providencia такой способностью не обладают.

Таким образом, только штамм P mirabilis 17 обладал выраженной внеклеточной

протеолитической активностью, и это коррелировало со способностью штамма к роению.

Исследовали внутриклеточную

протеолитическую активность в штаммах энтеробактерий с использованием трех белковых субстратов - азоказеина, желатина и актина. Протеолитическую активность по расщеплению

азоказеина определяли в клеточных экстрактах 24 и 48 часовых культур, полученных при разрушении клеток ультразвуком. На рисунке 2 представлены результаты исследования активности в клетках на 48 час роста. Видно, что в клетках штамма P mirabilis активность по отношению к азоказеину проявляется на низком уровне, в то время как в клетках штамма M. morganii эта активность выше в 4-4.5 раз, а в клетках P stuartii - в 2 раза.

Рис. 1 - Рост клинических изолятов на молочном агаре. 1 - M. morganii. 2 - P. stuartii. 3 - P. mirabilis. Стрелкой показана зона гидролиза казеина молока

н

а

<

0,5 0,4 0,3 0,2 ОД 0 -I—

I

Ж

і

Рис. 2 - Расщепление азоказеина клеточными лизатами энтеробактерий. 1 - M. morganii, 2 - P. stuartii, 3 - P. mirabilis

1 2 3

Рис. 3 - Зимография клеточных лизатов

энтеробактерий, субстрат - желатин. 1 - P mirabilis, 2 - P. stuartii, 3 - M. morganii

Расщепление желатина исследовали методом зимографии, который позволяет визуализировать в пробах белки, обладающие

способностью расщеплять белковые субстраты, что проявляется в виде прозрачной зоны или зон на голубом фоне геля. Исследование клеточных лизатов энтеробактерий на 24 час культивирования не выявило ферментов, способных расщеплять желатин. Однако в клетках на 48 час культивирования обнаружена внутриклеточная активность (рис. 3). Также как и в случае с азоказеином наибольшую активность проявил штамм М. то^апіі. В экстракте обнаружено несколько пептидных зон, обладающих высокой активностью в отношении желатина (м.м 25-35 кДа, а также в высокомолекулярной области). В лизате бактерий шт. Р. stuartii меньше протеолитической активности, расщепляющей желатин.

1

2

3

4

Рис. 4 - Расщепление актина клеточными лизатами энтеробактерий. 1 - актин, 2 -

клеточный лизат M. morganii + актин, 3 -клеточный лизат P. mirabilis + актин, 7 -клеточный лизат P. stuartii + актин

Все три штамма были исследованы на наличие внутриклеточных протеолитических ферментов, способных специфически расщеплять актин. Изучали активность в клетках на 48 час культивирования. Расщепление актина

контролировали электрофоретически по

исчезновению пептидной зоны, соответствующей актину (пептид с молекулярной массой 43 кДа) (рис. 4). Из трех штаммов только клеточный экстракт M. morganii проявлял активность по отношению скелетно-мышечного актина, расщепляя его неограниченно. Клеточные экстракты P mirabilis и P. stuartii не проявляли активности по отношению к актину.

Таким образом, виды бактерий,

относящиеся к трибе Рroteeae, различаются по протеолитической активности. Только вид Р. mirabilis проявляет высокую внеклеточную протеолитическую активность, что соотносится со способностью штамма к роению. В тоже время самая высокая внутриклеточная активность обнаружена в бактериях M. morganii при использовании в качестве субстратов азоказеина и желатина. Аналогичная активность в клетках Р. stuartii была гораздо ниже. Из трех штаммов только в клетках M. morganii обнаружена активность,

расщепляющая актин неограниченно.

Обнаруженные различия в спектре

протеолитических ферментов могут отражать

различия в вирулентности бактерий, относящихся к разным родам энтеробактерий. Изучение протеиназ патогенов важно с точки зрения поиска новых мишеней для понимания механизмов развития и терапии инфекционных заболеваний.

Работа поддержана Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2012-2013 гг. соглашение № 14.А18.21.1516.

Литература

1. C.M. O'Hara, F.W. Brenner, J.M. Miller, Clin Microbiol Rev., 13, 4, 534-546 (2000).

2. D. Juyal, V.K. Rathaur, N. Sharma, J. Clin Diagn Res., 7, 2, 369-370 (2013).

3. K. Tanaka, T. Haraguchi, F. Yamamichi, M. Muramaki, H. Miyake, M. Fujisawa, Korean J Urol., 54, 3, 189-193 (2013).

4. M.M. Pearson, M. Sebaihia, C. Churcher, M. A. Quail, A.S. Seshasayee, N.M. Luscombe, J Bacteriol., 190, 40274037 (2008).

5. P. Van, R. Belas, B.F. Gilmore, H. Ceril, Infection and Immunity, 76, 11, 4859-4864 (2008).

6. Н.В. Белоногова, А.Б. Маргулис, В.Я. Понамарев, А.И.

Колпаков, О.Н. Ильинская, Вестник Казанского

технологического университета, 15, 23, 109-112 (2012).

7. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989, 2344 p.

8. M.M. Bradford, Anal. Biochem, 72, 248-254 (1976).

9. О.К. Поздеев, Медицинская микробиология. ГЭОТАР-МЕД, Москва, 2001, 765 с.

10. J.M. Janda, S.L. Abbott, J. Clin. Microbiol, 45, 9, 27612764 (2007).

11. C. Wassif, D. Cheek, R. Belas, J. Bacteriol., 177, 20, 5790-5798 (1995).

12. О.А. Цаплина, Т.Н. Ефремова, Л.В. Кевер, Я.Ю. Комиссарчик, И.В. Демидюк, С.В. Костров, С.Ю. Хайтлина, Биохимия, 74, 797-804 (2009).

13. U.K. Laemmli, Nature (London), 227, 680-685 (1970).

14. G.W. Oliver, W.G. Stettler-Stevenson, D.E. Kleiner, In: Handbook of proteolyitic enzymes. Acad. Press, San Diego, 1999, P 61-76.

15. B. W. Senior, J. Med. Microbiol, 48, 623-628 (1999).

© Н. М. Замалютдинова - асп. каф. микробиологии К(П)ФУ; И. Р. Галиева - студ. К(П)ФУ; А. О. Арапова- магистр К(П)ФУ; Е. О. Михайлова - канд. биол. наук, доц. каф. химической кибернетики КНИТУ, katya_o_m@rambler.ru; М. Р Шарипова - д-р биол. наук, проф. каф. микробиологии К(П)ФУ, marsharipova@gmail.com; А. М. Марданова - канд. биол. наук, доц. той же кафедры, mardanovaayslu@mail.ru.