ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА БОЛЕЗНИ НАЙРОБИ ОВЕЦ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ - ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS, METHOD AND TEST SYSTEM FOR IDENTIFYING GENOME OF SHEEP NAIROBI DISEASE VIRUS BY REVERSE TRANSCRIPTION - POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.
Болезнь Найроби овец (далее - БНО) - зооантропонозная трансмиссивная болезнь овец и коз, проявляющаяся рецидивирующей лихорадкой, геморрагическим гастроэнтеритом, гломерулонефритом, слизисто-гнойными выделениями из носа и диареей; характеризуется уровнем смертности, который может варьировать между 40 и 90%.
Болезнь постоянно регистрируется в Кении, Танзании и Мозамбике и в Индии. Согласно данным МЭБ вспышки БНО были зарегистрированы также на Ближнем Востоке (Кувейт, 1995 г.) и в Европе (Греция, 2003 г.). Источником инфекции являются больные овцы и козы, а также скрытые вирусоносители.
Клинические симптомы сходны у овец и коз, хотя овцы более восприимчивы к инфекции.
Человек обычно заражается БНО при укусе инфицированными иксодовыми клещами, естественная восприимчивость людей высокая. После переболевания остается длительный иммунитет, повторные заболевания редки. В странах Африки мужчины заболевают чаще в связи с тем, что в этих местностях они, как правило, занимаются разведением животных. Инкубационный период длится 4-5 суток, основными клиническими симптомами являются: повышение температуры тела до 39-40°С с 2-3-суточными перерывами, озноб, боли в мышцах и суставах, кровавая диарея. В период разгара болезни на туловище и конечностях появляется сыпь. Описано бессимптомное течение болезни у человека.
Во время вспышки БНО при проведении противоэпизоотических мероприятий необходимо проведение быстрых и точных экспертизных исследований, позволяющих в кратчайшие сроки идентифицировать возбудитель.
Известны методы для диагностики инфекции, такие как реакция нейтрализации, иммуноферментный анализ, которые характеризуются высокой чувствительностью и широко применяются [1, 2]. Главным недостатком данных методов является длительность проведения анализа, а тот факт, что реакция нейтрализации дает перекрестные реакции с родственными буньявирусами, исключает возможность проверки подлинности результатов анализа.
Все исследования генома вируса БНО проведены сотрудниками Отдела вирусных и риккетсийных заболеваний Центра контроля и предотвращения болезней (Атланта, шт. Джорджия, США) [3, 4]. Ими были определены нуклеотидные последовательности S- и L-сегментов штаммов "NSD 708" и "Ganjam", проведен филогенетический анализ среди родственных найровирусов и разработаны методики амплификации различных участков генома вируса БНО. Однако одна половина сконструированных этими учеными олигонуклеотидных праймеров является штаммоспецифичными, а другая - родоспецифичными. Таким образом, данные праймеры не позволяют решить задачу выявления генома любого штамма вируса БНО из патологического материала и достоверной дифференциации его от других вирусов методом ПЦР.
Целью данного изобретения является разработка способа выявления геномной РНК вируса БНО с помощью гнездового варианта ОТ-ПЦР с использованием двух синтезированных пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области гена нуклеокапсидного белка N.
С помощью первой (внешней) пары праймеров можно амплифицировать фрагмент ДНК размером 690 пар нуклеотидов (далее - п.н.), являющийся мишенью для отжига второй (внутренней) пары праймеров, позволяющих синтезировать фрагмент размером 360 п.н. Использование двух пар праймеров позволяет добиться высокой специфичности и чувствительности реакции.
Поставленная цель достигается способом для обнаружения вируса БНО в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных или павших животных и/или в инфицированных культурах клеток, при котором вначале проводят синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК, а затем ее амплификацию. Данная процедура осуществляется с помощью 3-х наборов, составляющих тест-систему:
1. набор для выделения нуклеиновых кислот, включающий нуклеосорбент, лизирующий буфер с гуанидинтиоционатом и 2 раствора для последовательной отмывки сорбента;
2. набор для постановки ПЦР, включающий реакционную смесь для постановки ПЦР и 2 пары специфических олигонуклеотидных праймеров;
3. набор для проведения электрофореза, включающий агарозу и буфер для электрофореза с бромистым этидием.
1
Синтез кДНК проводят при температуре 50°С в течение 30 мин с праймером NSD R, а затем терминируют реакцию 5-минутным прогреванием реакционной смеси при температуре 94°С.
1
1
2
2
Полученную кДНК используют для проведения 1-го раунда ПЦР с участием внешней пары праймеров - NSD F и NSD R. Полученные в 1-ом раунде фрагменты ДНК размером 930 п.н. используют в качестве матрицы для проведения 2-го раунда ПЦР с использованием внутренней пары праймеров NSD F и NSD R. Нуклеотидный состав используемых праймеров следующий:
1
NSD F 5' -TAT GCT TCT GCC TTG GTT G - 3'
1
NSD R 5' - АТС CGA TTG GCA GTG AAG - 3'
2
NSD F 5' - AGA GCA CAT TGA CTG GGC - 3'
2
NSD R 5' - GCC TTC CAA AGC CAG TAG - 3'
Температурные режимы для проведения обоих раундов ПЦР одинаковы и включают следующие этапы: 2 мин предварительной денатурации при 94°С, 35 циклов амплификации (94°С - 30 сек, 61°С - 30 сек, 72°С - 30 сек), 1 цикл достройки цепей (94°С - 2 мин, 72°С - 5 мин).
После постановки ОТ-ПЦР проводят разделение продуктов путем горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Учет результатов реакции проводят только по 2-ому раунду ПЦР.
Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения диагностической работы по обнаружению вируса в пробах органов и крови от больных животных.
1
1
2
2
Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных праймеров (NSD F, NSD R, NSD F, NSD R) проводят гнездовую ОТ-ПЦР, позволяющую выявить геном вируса БНО. При наличии в исследуемых образцах РНК вируса БНО, во втором раунде ПНР синтезируется фрагмент ДНК размером 360 п.н. Использование двух пар праймеров позволяет увеличить специфичность и чувствительность метода.
Существенным отличием данных праймеров является то, что они:
1) комплементарны консервативной области гена нуклеокапсидного белка N вируса БНО и некомплементарны к - либо участкам геномов других вирусов;
1
1
2
2
2) фланкируют на кДНК, полученной на матрице вирусной РНК, фрагмент размером 970 п.н. (праймеры NSD F, NSD R) а внутри него - фрагмент размером 360 п.н. (праймеры NSD F, NSD R).
Изобретение иллюстрируется несколькими примерами.
Пример 1. Набор №1 используют для выделения РНК вируса БНО из крови, проб органов, культурального вируссодержащего материала.
3
Исследуемый материал (кровь, суспензия вируса, 10%-ная суспензия органов) в объеме 100-200 микролитров (далее - мкл) вносят в 1,5 см пробирки, в которые предварительно внесено 600 мкл лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата. Пробирки перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 8-10 мин. Затем добавляют 40 мкл нуклеосорбента, инкубируют при комнатной температуре 10 мин, периодически перемешивая смесь. После инкубации пробирки центрифугируют 30 сек при 8-13 тыс.об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают. Добавляют 300 мкл отмывочного буфера, тщательно ресуспендируют сорбент, центрифугируют 30 сек при 8-13 тыс об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Дважды промывают сорбент 75%-ным этиловым спиртом и далее подсушивают 10 мин при температуре 56°С. К осадку добавляют 50 мкл элюирующего буфера, перемешивают и инкубируют 10 мин при температуре 56°С. Центифугируют пробирки в течение 1 мин при 13 тыс.об/мин и переносят надосадочную жидкость в новые пробирки. Супернатант используют в дальнейшем для синтеза кДНК.
Пример 2. Синтез и амплификация участка кДНК вируса БНО с применением набора №2 для проведения гнездовой ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами.
Расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров.
1
1
2
2
С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности S-сегмента генома штаммов "NSD 708" и "Ganjam G619" вируса болезни Найроби овец. Проанализировав построенный элайнмент, внутри гена нуклеокапсидного белка N найден консервативный участок, расположенный между 238 и 1169 нуклеотидами (5'→3'). С помощью программы "Oligo 4.0" подобраны 2 пары праймеров - NSD F (238-256 нуклеотидные позиции) и NSD R (1152-1169), фланкирующих фрагмент размером 930 пар оснований, а также 2 пары праймеров - NSD F (642-659) и NSD R (984-1001), фланкирующих фрагмент размером 690 пар оснований.
С использованием программы "Oligo 4.0" описаны основные свойства рассчитанных праймеров, определившие возможность их использования в ПЦР. Данные свойства приведены в таблице.
Таблица
Свойства праймеров, рассчитанные с помощью программы "Oligo 4.0"
Название праймера
Температура плавления,<sup>1</sup> °С
ΔG гибридизации праймера на матрицу, kcal/mol
ΔG образования шпилечной структуры, kcal/mol
Эффективность отжига праймера на матрицу (Priming efficiency number)<sup>2</sup>
NSD F<sub>1</sub>
61,5
-35,9
1,4
392
NSD R<sub>1</sub>
60,4
-34,7
1,4
384
NSD F<sub>2</sub>
60,1
-34
1,4
429
NSD R<sub>2</sub>
60
-35,3
1
373
Примечания.
<sup>1</sup>Температура плавления рассчитана по алгоритму Nearest neighbor method.
<sup>2</sup>Priming efficiency number - это величина, определяющая эффективность отжига данного праймера на заданный участок матрицы, рассчитывается по уникальному алгоритму, разработанному создателями программы "Oligo". Минимальное значение Priming efficiency number, при котором праймер в ходе ПЦР эффективно отжигается на специфический участок матрицы, -210.
Тест-система апробирована на различных штаммах вируса БНО. В качестве отрицательных контролей использованы штаммы родственных буньявирусов: лихорадки долины Рифт (ЛДР), Конго-Крымской геморрагической лихорадки (ККГЛ) и Акабане.
3
1
Для получения кДНК готовят и маркируют 0,6 см пробирки на N-количество образцов, включая отрицательные контроли. В пробирки вносят по 15 мкл реакционной смеси, включающей буфер для ревертазы, 10 пкмоль праймера NSD R, 2,5 ммоль каждого dNTP, 20 ед. MMLV-ревертазы; поверх смеси наслаивают 1 каплю (40-45 мкл) минерального масла. Далее под масло вносят 5 мкл исследуемой РНК и помещают пробирки в амплификатор со следующим температурным режимом:
50°С
30 мин
1 цикл
94°С
5 мин
1
1
2
После инкубации реакционную смесь используют как препарат кДНК. Для проведения 1-го раунда ПЦР приготавливают реакционную смесь объемом 25 мкл, включающую по 10 пкмоль праймеров NSD F и NSD R, 2,5 ммоль каждого dNTP, буфер для Taq-полимеразы с 15 мM MgCl, 1 ед. Taq-полимеразы. Эту смесь вносят в заранее промаркированные пробирки, наслаивают сверху каплю минерального масла и под масло вносят 5 мкл кДНК. Пробирки помещают в амплификатор со следующим температурным режимом:
94°С
2 мин
1 цикл
94°С
30 сек
35 циклов
61°С
30 сек
72°С
30 сек
94°С
2 мин
1 цикл
72°С
5 мин
2
2
2
После завершения программы приступают к выполнению 2-го раунда ПЦР. Для этого переносят 5 мкл смеси из пробирок, в которых проводили 1-й раунд, в новые пробирки с 20 мкл реакционной смеси, включающей 10 пкмоль праймеров NSD F и NSD R, 2,5 ммоль каждого dNTP, буфер для Taq-полимеразы с 15 мM MgCl, 1 ед. Taq-полимеразы; сверху наслаивают 1 каплю минерального масла. Пробирки загружают в амплификатор с температурным режимом, аналогичным температурному режиму для проведения 1-го раунда ПЦР.
Пример 3. Определения размера продуктов ПЦР с применением набора №3 для проведения электрофореза.
Продукты 2-го раунда ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере.
15 мкл продукта ПЦР (уже содержащего буфер для внесения в гель) вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 15 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 260 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 360 пар оснований.
С применением тест-системы и рассчитанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса БНО. Отрицательные контроли не амплифицировались.
Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических олигонуклеотидных праймеров, на ген белка N.
Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену белка N вируса БНО.
Наименование препаратов
Титр вируса ТЦД50/мл
Шифр
Ожидаемый результат
Фактический результат
Вирус БНО штамм "ММ"
6,0
1
+
+
Вирус БНО штамм "ММ/К-05
5,8
2
+
+
Вирус БНО штамм "ММ/К-05
1,8
3
+
+
вирус ЛДР штамм "ВНИИВВиМ1974"
6,5
4
-
-
Вирус Акабане штамм "В8935"
4,75
5
-
-
вирус ККГЛ (положительный контроль из набора "АмплиСенс ККГЛ" производства ФГУН Ц ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора для выявления генома вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР)
5,0
6
Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует кДНК других вирусов.
Таким образом, предлагаемая тест-система позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью двух пар праймеров, позволяющих получить во 2-ом раунде ПЦР фрагмент размером 360 п.н.
Источники информации
1. Davies F.G. Nairobi sheep disease // Parassitologia. - 1997. - V.39 - №2 - C.95-98.
2. Davies F.G, Mungai J.N., Taylor M. The laboratory diagnosis of Nairobi sheep disease // Trop. Anim. Health. Prod. - 1977. - V.9 - №2 - С.75-80.
3. Marczinke В.I., Nichol. S.T. Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia // Virology. - 2002. - V.303. - №1 - С.146-151.
4. Terpstra C. Physical and biological properties of Nairobi sheep disease virus // Vet. Microbiol. - 1983. - V.8 - №6 - С.531-541.