Биопленкообразование Listeria monocytogenes с микроорганизмами, выделенными из пищеварительного тракта мидии Грея (grenomytilusgrayanus)

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •

© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817787

Удк 579.262

А.И.Еськова1, Л.С. Бузолева12

биопленкообразование listeria monocytogenes с микроорганизмами, выделенными из пищеварительного

тракта мидии грея

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П.Сомова, г. Владивосток

2 Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток

В связи с тем, что Listeria monocytogenes обитают в морской среде, были проведены исследования на выявление их способности к образованию биоплёнок с морскими сапрофитными микроорганизмами, позволяющими сохранять жизнеспособность патогенов. В работе были использованы 11 штаммов L. monocytogenes и 15 сапротрофных штаммов, выделенных из желудочно-кишечного тракта мидии Грея. Идентификацию сапротрофных штаммов проводили с использованием традиционных микробиологических методов. В результате было показано, что образование биопленки с морскими микроорганизмами, в частности с бактериями рода Pseudomonas способствует сохранению и поддержанию численности L. monocytogenes в морской среде.

Ключевые слова: L. monocytogenes, биопленка, мидия Грея.

A.I. Eskova1, L.S.Buzoleva12

biofilformation of listeria monocytogenes with microorganisms in digestive tract of grenomytilus grayanus

1 Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia

2 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia

Seeing that Listeria monocytogenes is the bacteria which can habitat in the marine environment we conducted research to determine their ability to form biofilms with marine saprophyte microorganisms that allow the viability of pathogens to be maintained. In this study, we used 11 strains of L. monocytogenes and 20 saprotrophic strains isolated from the gastrointestinal tract of the Gray mussel. Identification of saprotrophic strains was carried out using traditional microbiological methods. In the result, was shown that the formation of biofilms with marine microorganisms, in particular with bacteria of the genus Pseudomonas contributes to the conservation and maintenance numbers of L. monocytogenes in the marine environment.

Keywords: L. monocytogenes, biofilm, Grenomytilus Grayanus.

Известно существование L. monocytogenes в морской среде [1, 2]. Привнесение их может быть связано с паводковыми и грунтовыми водами [3], с загрязнением вод канализационными стоками [3, 4]. Попадание патогенов в морскую среду представляет опасность для морской биоты, так, согласно литературным источникам, в природе мидии могут подвергаться воздействию различных патогенных бактерий, в частности, L. monocytogenes [5]. Зараженные L. monocytogenes двустворчатые моллюски регулярно являются причиной вспышек листериоза во всем мире [6, 7]. Но морская среда не является благоприятной для существования патогенных бактерий, поэтому возможность образовывать биопленки является одним из механизмов адаптации листе-рий, способствуя сохранению и поддержанию их численности в этих условиях.

Цель работы - изучить способность Listeria monocytogenes формировать биопленки с микроорганизмами, выделенными из пищеварительного тракта мидии Грея (Crenomytilus grayanus).

Материалы и методы. В работе использованы 11 штаммов L. monocytogenes: 37236/4№211(1), 8908(2), 9148/1(3), 6124 №355(4), 3835/6№316(5), 4835/6 №312(6), 2766 №314(7), 5672/6 №317(8), 11731/8-8297(9), 9656/2(10), 12734/В-8097(11), из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова. В качестве тест-культур выступали 15 штаммов, выделенных из желудочно-кишечного тракта мидии. Для определения таксономической принадлежности полученных микроорганизмов проводилось изучение их культуральных и физио-лого-биохимических свойств с помощью классических микробиологических методов.

При анализе биохимических свойств использовали стриповые диагностикумы «API» фирмы BioMerieux (Франция). Для определения сапротроф-ных штаммов до рода был использован определитель бактерий Берджи [цит по 5].

Для изучения биопленкообразования использовали модифицированный метод Christensen G.D. et al. (1985). Культивировали микроорганизмы на среде СММ при

HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 39

Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»

комнатной температуре (22°С) в течение 3 суток. Измерение оптической плотности проводили в течение трех суток инкубации в 96-луночных планшетах на планшетном ридере (Labsystems iEMS Reader MF, BioRad), при ^=540нм. Для определения динамики размножения бактерий в ассоциации учитывали количество микроорганизмов в планктонной и биопленочной фазах. Рост биопленок, сформированных каждым штаммом, исследовали в трех повторах (на чашках Петри).

На графиках представлены средние арифметические значения из n-числа повторностей (где n = 3) для каждого конкретного варианта эксперимента. На графиках также отображены стандартные отклонения от величин средних значений. Рассчитывали критерий значимости Стьюдента (t), статистически значимой считалась Р = 95%. Статистическую обработку результатов для каждого конкретного варианта эксперимента проводили в программе Microsoft Office Excel 2007.

Результаты и обсуждения. Была определена способность штаммов L. monocytogenes к биоплён-кообразованию в монокультуре и в ассоциации с бактериями из пищеварительного тракта мидии при температуре 22°С. Всего проведено 165 вариантов опыта. В результате к штаммам с высокими биопленкообразующими свойствами отнесен штамм МА-8 (выделен из желудочно-кишечного тракта мидии Грея), идентифицированной как представитель рода Pseudomonas. Как видно из табл., оптическая плотность составила 0,957. Данные определений динамики размножения представлены на рис. 1-4. В результате исследований было установлено, что оптимальная зрелая биоплёнка как у L. monocytogenes, так и у Pseudomonas sp. в монокультуре (рис. 1, 3) образуется на 3 сутки. Сравнение динамики образования биопленки листерий и Pseudomonas sp. в ассоциации, показало, что биопленки у листерий происходит на вторые сутки (рис.4), а у Pseudomonas sp. - на третьи (рис. 2).

Биопленкообразующая способность L. monocytogenes в ассоциации с Pseudomonas sp.

Штамм Показатели оптической плотности

Pseudomonas МА-8+ L. monocytogenes 3835/6№316 0,957±0,002

Контроль (среда без бактерий) 0,07±0,001

Таким образом, было показано, что образование биопленки с морскими сапротрофными микроорганизмами, в частности с бактериями родов Pseudomonas sp.способствует сохранению и поддержанию численности L. monocytogenes в морской среде.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа поддержана научным проектом (0545-2014-0011) ФАНО.

Рис.1. Динамика биопленкообразования

Рис. 2. Динамика биопленкообразования

Рис. 3. Динамика биопленкообразования

Рис. 4. Динамика биопленкообразования

40 ЗДОРОВЬЕ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ. НАУКА 3 (70) - 2017

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

ЛИТЕРАТУРА

1. Bou-m'handi N., Jacquet C., Marrakchi E.A., Martin P. Phenotypic and molecular characterization of Listeria monocytogenes strains isolated from a marine environment in Morocco. Foodborne Pathog Dis. 2007; 4(4): 409-417.

2. Терехова В.Е., Соснин В.А., Бузолёва Л.С., Ша-киров Р.Б. Распространение бактерий Listeria monocytogenes в западной части Охотского моря // Океанология. 2010; 50(2): 230-235.

3. Онищенко Г.Г. Влияние состояния окружающей среды на здоровье населения. Нерешенные проблемы и задачи // Гигиена и санитария, 2003; 31: 3-7.

4. Зуев В.С. Сапрофитизм патогенных бактерий // Ветеринарная патология. 2004; 4: 11-16.

5. Zhu Q., Gooneratne R., Hussain M.A. Listeria monocytogenes in Fresh Produce: Outbreaks, Prevalence and Contamination Levels. Foods. 2017; 6: 21.

6. Takahashi H., Miya S., Igarashi K., Suda T., Kura-moto S, Kimura B. Biofilm formation ability of Listeria monocytogenes isolates from raw ready-to-eat seafood.. J Food Prot. 2009; 72(7): 1476-1480.

7. Пономарева А.Л. Исследование интенсивности образования биопленок Listeria monocytogenes при различных температурах // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2016; 2 (65): 38-39.

Сведения об авторах

Еськова Алёна Игоревна - ФГБНУ «НИИ ЭМ имени Г.П. Сомова», младший научный сотрудник экологии патогенных бактерий; 690087, Владивосток, ул. Сельская, 1; e-mail: alenkaesya@gmail.com;

Бузолева Любовь Степановна - д.б.н., ФГБНУ «НИИ ЭМ имени Г.П. Сомова», профессор кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов ДВФУ; e-mail: buzoleva@mail.ru.

© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817801

Удк 579.68

А.В. Ким1, Л.С. Бузолева12, Е.А. Богатыренко1

сравнительная характеристика биологических свойств микроорганизмов, выделенных из морских акваторий с разной антропогенной нагрузкой

1 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

2 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, Владивосток

В данной работе представлены материалы исследования морских бактерий (кроме бактерий сем. Enterobacteriaceae), выделенных из вод районов с разной антропогенной нагрузкой. Была проведена работа по выявлению у изолятов гидролитической активности в отношении органических субстратов, антибиотикорезистентности, а также таких факторов патогенности, как адгезия, цитотоксичность, гемолитическая активность, активность ферментов плазмокоагулазы и гиалорунидазы. Сравнительные исследования проявления гидролитической активности у микроорганизмов, выделенных из морских акваторий с разной антропогенной нагрузкой, не выявили различий по этим показателям. Однако штаммы, выделенные из акваторий, испытывающих мощное влияние промышленных, бытовых и речных стоков, обладали высокой антибиотикоустойчивостью, высокоадгезивными свойствами и цитотоксичностью по сравнению со штаммами, выделенными из чистых морских вод. Можно предположить, что загрязнение морской среды приводит к проявлению агрессивных свойств у микроорганизмов как ответной реакции на воздействие стрессового фактора, что имеет как общебиологическое, так и важное эколого-эпидемиологическое значение.

Ключевые слова: морские микроорганизмы, факторы патогенности, антропогенное загрязнение, ферментативные свойства.

A.V. Kim1, L.S. Buzoleva1'2, E.A. Bogatyrenko1

comparative characteristic of the biological properties of microorganisms divided from marine aquatories with different anthropogenic load

1 Far Eastern Federal University, Vladivostok

2 Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok

In this work we investigated marine bacteria (except Enterobacteriaceae) bacteria isolated from water in areas with different anthropogenic load, both coastal zones with high levels of different pollutants and pure zones with no human impact and their biological activity, including pathogenicity factors. Then we worked with the rest of the isolates for

HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 41