ГИДРОЛИЗАТ РЫБЬЕГО БЕЛКА
FISH PROTEIN HYDROLYZATE

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применению обработанного ферментами гидролизата рыбьего белка (fish protein hydrolyzate, FPH). Вещество FPH снижает концентрацию холестерина в плазме и триглицеридов в печени. FPH также индуцирует благоприятное изменение картины жирных кислот и снижает концентрацию гомоцистеина в плазме. Предпочтительное воплощение изобретения относится к применению FPH в качестве антиатерогенного и кардиопротективного агента, даваемого либо в виде фармацевтического агента, либо в виде функционального питания.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
За последние годы рыбоводческое хозяйство, особенно разведение лососевых рыб, значительно возросло как в Норвегии, так и во всем мире. Большую часть рыбы продают потребителю в виде цельной непотрошеной рыбы, но значительные количества продаются в виде филе. Только 50-70% лососевых представляют собой филе, тогда как остальная часть продается в виде продуктов низкой ценности, таких как корм для рыб и силосованный корм для рыб.
Посредством ферментативной обработки из мяса рыбы, а также из рыбьих скелетов можно выделить водную фракцию, обогащенную белками, называемую гидролизатом рыбьего белка (FPH). Ферментативный процесс гидролиза является в высшей степени контролируемым, и продукты являются воспроизводимыми и хорошо определяемыми.
Неожиданно авторы настоящего изобретения показали, что гидролизат рыбьего белка (FPH) в соответствии с изобретением обладает несколькими благоприятными биологическими эффектами и что такое вещество можно применять в качестве фармацевтического или пищевого вещества.
Авторы изобретения показали, что FPH снижает концентрацию холестерина и гомоцистеина в плазме, а также снижает концентрацию триацилглицеринов в печени. На основании этих открытий ожидают, что FPH будет обладать превентивным и/или терапевтическим эффектом в отношении стеноза, атеросклероза, коронарной болезни сердца, тромбоза, инфаркта миокарда, удара и жировой дистрофии печени. Лечение веществом рыбьего белка представляет собой новый путь к лечению таких заболеваний.
FPH особенно полезен в качестве функционального белка в пищевых продуктах, в частности, при использовании в качестве заменителя природной плазмы в кормах для животных и в кормах для питомцев. При использовании в кормах для питомцев в продукт могут быть добавлены дополнительные ингредиенты, такие как жиры, сахара, соль, корригенты, минералы и так далее. Затем продукту можно придать форму ломтиков, напоминающих по внешнему виду и текстуре натуральные мясные ломтики. Продукт по изобретению обладает дополнительными преимуществами в том, что его легко изготовить с необходимым содержанием питательных веществ, он легко переваривается животными и является аппетитным для животных.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к FPH для изготовления фармацевтической или пищевой композиции для лечения и/или предупреждения атеросклероза, коронарной болезни сердца, стеноза, тромбоза, инфаркта миокарда, удара и жировой дистрофии печени.
Экспериментальные данные ясно показывают, что FPH по изобретению снижает концентрацию гомоцистеина в плазме. Гомоцистеин является фактором риска при заболеваниях, таких как атеросклероз, коронарная болезнь сердца, стеноз, тромбоз, инфаркт миокарда и удар, и, следовательно, ожидают, что вещество FPH будет эффективным при предупреждении и лечении этих заболеваний.
Эти данные также показывают, что уровень триацилглицеринов в печени снижается при введении FPH, и ожидают, что вещество FPH можно применять для лечения и предупреждения жировой дистрофии печени.
Дополнительное воплощение настоящего изобретения относится к FPH для изготовления фармацевтической или пищевой композиции для лечения и/или предупреждения гиперхолестеринемии, поскольку авторы изобретения показали, что указанное вещество способно к снижению концентрации холестерина в плазме.
Еще одно дополнительное воплощение относится к применению FPH для изготовления фармацевтической или пищевой композиции для снижения концентрации гомоцистеина в плазме. Повышенный уровень гомоцистеина может быть установлен прежде, чем проявятся вышеуказанные заболевания. Введение вещества FPH обладает общим эффектом снижения гомоцистеина, и вещество по настоящему изобретению, таким образом, является особенно подходящим для предупреждения возникновения и снижения риска вышеуказанных заболеваний.
Результаты также указывают на то, что вещество FPH обладает общими кардио- и артериопротективными свойствами, и авторы изобретения ожидают, что это вещество можно давать для снижения риска заболеваний, связанных с артериями и сердцем.
Задачей настоящего изобретения является введение вещества FPH либо в виде профилактического или фармацевтического лекарства, либо в виде функционального питательного или пищевого вещества. Это вещество можно давать человеку и животным, не представляющим собой человека.
Предпочтительное воплощение изобретения относится к питательному веществу, содержащему гидролизат рыбьего белка. Это вещество можно использовать для кормления сельскохозяйственного животного, такого как куры, коровы, овцы, козы или свиньи, домашние животные или питомцы, такие как кошка или собака, а также рыбы или ракообразные, такие как лосось, треска, тилапия, двустворчатые моллюски, устрицы, омары или крабы.
В предпочтительном воплощении изобретения применяют вещество FPH, получаемое путем ферментативной обработки мяса или скелетов рыбы. Предпочтительно применяют ферментативную композицию Protamex™, и рыба предпочтительно представляет собой лосося.
ПОДПИСИ К ГРАФИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛАМ
На Фиг.1 показано, что обработанный ферментами гидролизат рыбьего белка (FPH) снижает концентрацию холестерина в плазме.
На Фиг.2 показано, что обработанный ферментами гидролизат рыбьего белка (FPH) снижает концентрацию холестерина в печени.
На Фиг.3 показано, что обработанный ферментами гидролизат ингибирует фермент ацил-коэнзимА-холестеринацилтрансферазу (АСАТ).
На Фиг.4 показано, что обработанный ферментами гидролизат усиливает митохондриальное β-окисление.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЗАЯВКЕ
Животные
В данном контексте термин "животные" включает млекопитающих, таких как люди и фермерские (сельскохозяйственные) животные, особенно экономически значимые животные, такие как куры, коровы, овцы, козы и свиньи, особенно те, которые дают продукты, пригодные для потребления человеком, такие как мясо, яйца и молоко. Кроме того, в этот термин включены рыбы и ракообразные, такие как лосось, треска, тилапия, двустворчатые моллюски и устрицы. В этот термин также включены домашние животные, такие как собаки и кошки.
Лечение
В отношении фармацевтических применений по изобретению термин "лечение" относится к уменьшению тяжести заболевания.
Предупреждение
Термин "предупреждение" относится к предупреждению данного заболевания, то есть соединение по настоящему изобретению вводят до возникновения состояния. Это означает, что соединения по настоящему изобретению можно применять в качестве профилактических агентов или в качестве ингредиентов в функциональных продуктах питания или кормах с целью предупреждения риска или возникновения данного заболевания.
FPH - обработанный ферментами гидролизат рыбьего белка
Вещество FPH представляет собой белковый гидролизат, полученный в результате ферментативной обработки вещества рыбы. Вещество FPH содержит высокие доли белков и пептидов.
ВВЕДЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ
В качестве фармацевтического лекарства соединения по настоящему изобретению можно вводить непосредственно животному с помощью любой подходящей методики, включая парентеральную, интраназальную, пероральную или путем всасывания через кожу. Их можно вводить местным или системным путем. Конкретный путь введения каждого агента будет зависеть, например, от истории болезни животного. Предпочтительным путем введения является пероральный.
Примеры парентерального введения включают подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное и внутрибрюшинное введение.
Если соединения по изобретению дают постоянно, их обычно вводят путем 1-4 инъекций в сутки или путем непрерывных подкожных инфузий, например, используя мини-помпу. Можно также применять внутривенный раствор в баллоне. Ключевым фактором при выборе подходящей дозы является результат, полученный при измерениях снижений суммарной массы тела или отношения жировой массы к массе без жира или по другим критериям для оценки борьбы с ожирением или предупреждения ожирения либо предупреждения состояний, связанных с ожирением, как оценивается, соответственно, практикующим специалистом.
Для парентерального введения, в одном воплощении, соединения по настоящему изобретению изготавливают обычно путем смешивания каждого при желаемой степени чистоты в стандартной лекарственной инъекционной форме (растворе, суспензии или эмульсии) с фармацевтически приемлемым носителем, то есть носителем, не токсичным для реципиента при применяемых дозировках и концентрациях и совместимым с другими ингредиентами препарата.
Как правило, препараты готовят путем однородного и непосредственного приведения в контакт каждого из соединений по настоящему изобретению с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями либо с обоими. Затем, если необходимо, продукту придают форму желаемого препарата. Предпочтительно носитель представляет собой носитель для парентерального введения, более предпочтительно раствор, который является изотоническим с кровью реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Здесь также являются полезными неводные носители, такие как жирные масла и этилолеат, а также липосомы.
Носитель может подходящим образом содержать минорные количества добавок, таких как вещества, которые усиливают изотоничность и химическую стабильность. Такие вещества не токсичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат, сукцинат, уксусную кислоту и другие органические кислоты или их соли; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА: сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий, и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полоксамеры или полиэтиленгликоли (ПЭГ).
Для пероральных фармацевтических композиций можно использовать такое вещество-носитель, как, например, вода, желатин, смолы, лактоза, крахмалы, стеарат магния, тальк, масла, полиалкенгликоль, вазелин и тому подобное. Такой фармацевтический препарат может быть представлен в стандартной лекарственной форме и может дополнительно содержать другие терапевтически полезные вещества или общепринятые фармацевтические адъюванты, такие как консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и тому подобное. Фармацевтические препараты могут быть представлены в общепринятых жидких формах, таких как таблетки, капсулы, драже, ампулы и тому подобное, в общепринятых лекарственных формах, таких как ампулы с высушенным веществом, а также в виде суппозиториев и тому подобного.
Кроме того, соединения по настоящему изобретению целесообразно вводить в комбинации с другими терапиями для борьбы с конкретным заболеванием или его предупреждения.
Изобретение будет понятно в более полном объеме со ссылкой на приведенные ниже примеры. Их не следует, однако, рассматривать как ограничивающие объем изобретения.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к пищевой композиции, содержащей вещество FPH, которую можно изготовить любым общепринятым путем в виде кормового или пищевого продукта.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
Приведенные ниже неограничивающие примеры служат для дополнительной иллюстрации изобретения.
Химические реагенты
14
[1-С]-пальмитоил-L-карнитин (54 Ки/ммоль) приобретали у Amersham. Химические реагенты, используемые для полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) в реальном времени, были приобретены у Applied Biosystems. Все другие химические реагенты были получены из обычных коммерческих источников и имели степень чистоты для реактивов.
Гидролизат рыбьего белка (FPH)
FPH получали из остатков мяса рыбы на костных скелетах лосося после филетирования, как описано в примере 1, соевый белок Supro 530 EX получали от duPont Protein Technologies (St. Louis, МО, USA) и натриевую соль бычьего казеина С-8654 получали от Sigma-Aldrich.
Животные и обработка
Самцов крыс с ожирением Zucker в возрасте 4-5 недель, Crl:(ZUC)/faBR из Charles River, Germany, со средней массой 120±3 г в начале эксперимента держали в комнате, поддерживаемой при 12-часовых циклах свет-темнота при температуре 20±3°С и относительной влажности 65±15%. Через сутки после привоза крыс рандомизировали и помещали отдельно в металлические клетки и делили на три экспериментальные группы, по шесть животных в каждой. Крыс адаптировали к условиям эксперимента и экспериментальным диетам в течение 4 суток, после чего фекалии собирали в течение 7 суток. Полуочищенные диеты (таблица 1) содержали 20% сырого белка (N×6,25) в форме FPH или казеина (контроль).
ТАБЛИЦА 1Состав экспериментальных диет
г/кг диеты
FPH
Казеин
Белок
233,9
217,6
Соевое масло<sup>1</sup>
100
100
Сахароза
110
110
Витамины<sup>2</sup>
10
10
Минералы<sup>3</sup>
30
30
Целлюлоза
20
20
NaCl
-
21,8
Декстрин
496,1
490,6
<sup>1</sup>Состав жирных кислот соевого масла (г/100 г жира): 18:2n-6 (54,1±0,5), 18:1n-9 (21,8±0,2), 16:0 (11,2±0,1), 18:3n-3 (6,1±0,2), 18:0 (3,7±0,1), 18:1n-7 (1,5±0,1), 20:0 (0,5±0,1), 22:0 (0,5±0,1).
<sup>2</sup>Витамины (мг/кг диеты): 8 мг витамина А (4000 ME), 2 мг витамина D3 (1000 ME), 60 мг витамина Е (30 ME), 0,1 мг витамина К (0,05 ME), 1000 мг холина гидротартрата, 4 мг тиамина, 3 мг рибофлавина, 6 мг пиридоксина, 20 мг ниацина, 8 мг Са-пантотената, 1 мг фолина, 5 мг витамина В12 (0,05 ME).
<sup>3</sup>Минералы (г/кг диеты): 8,5 г СаСО<sub>2</sub>, 6,2 г CaHPO<sub>4</sub>×2Н<sub>2</sub>О, 12,3 г КН<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, 1,4 г MgCO<sub>3</sub>, 0,4 NaCO<sub>3</sub>, 0,8 г NaCl, 0,02 г CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O, 0,002 г NaF, 0,0002 г Kl, 0,2 г FeSO<sub>4</sub>×H<sub>2</sub>O, 0,05 г ZnSO<sub>4</sub>×H<sub>2</sub>O.
2
Животным ежесуточно были предложены равные пищевые рационы, которые приводили в соответствие с потребностями растущего животного. Животные имели свободный доступ к водопроводной воде. Крыс кормили в течение 22 или 23 суток после акклиматизации (трех крыс из каждой группы забивали на сутки 22, а остальных на сутки 23), и массу тела измеряли еженедельно. В конце периода кормления животных анестезировали подкожно 1:1 Hypnorm/Donnicum (Фентанил/флуанизон-Мидазолам), 0,2 мл/100 г массы тела. Проводили пункцию сердца для сбора образцов крови (в гепарине) и печень вырезали. Части печени немедленно замораживали в жидком N, тогда как оставшуюся печень охлаждали на льду для гомогенизации. Этот протокол одобрен Отделом биологических экспериментов с живыми животными Норвегии (Norwegian State Board of Biological Experiments with Living Animals).
Приготовление субклеточных фракций
Печени крыс гомогенизировали индивидуально в охлажденном во льду растворе сахарозы (0,25 моль/л сахарозы в буфере 10 ммоль/л HEPES рН 7,4 и 1 ммоль/л ЭДТА), используя гомогенизатор Potter-Elvehjem. Субклеточные фракции выделяли, как описано в Berge, R.К. et al (Berge, R.К., Flatmark, Т. & Osmundsen, H. (1984), Enhancement of long-chain acyl-CoA hydrolase activity in peroxisomes and mitochondria of rat liver by peroxisomal proliferators. Eur J Biochem 141: 637-644). Кратко, гомогенат центрифугировали при 1000×g в течение 10 мин, чтобы отделить постядерную фракцию от ядерной. Фракцию, обогащенную митохондриями, получали из постядерной фракции при 10000×g в течение 10 мин. Фракцию, обогащенную пероксисомами, получали путем центрифугирования постмитохондриальной фракции при 23500×g в течение 30 мин. Фракцию, обогащенную микросомами, выделяли из постпероксисомной фракции при 100000×g в течение 75 мин. Оставшуюся надосадочную жидкость собирали как цитозольную фракцию. Процедуру проводили при 0-4°С и фракции хранили при -80°С. Белок анализировали, используя набор для количественного определения белка BioRad (BioRad, Heraules, CA) и бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
Ферментативные анализы
14
14
14
14
3
Активность карнитинпальмитоилтрансферазы I (CPT-I) измеряли, по существу, как описано Bremer (Bremer, J. (1981) The effect of fasting on the activity of liver carnitine palmitoyltransferase and its inhibition by malonyl-CoA. Biochim Biophys Acta 665: 628-631). Анализ на CPT-I содержал 20 ммоль/л HEPES pH 7,5, 70 ммоль/л KCl, 5 ммоль/л KCN, 100 мкмоль/л пальмитоил-СоА, 10 мг БСА/л и 0,6 мг тканевого белка/мл. Реакцию запускали 200 мкмоль/л [метил-С]-L-карнитина (200 имп/мин/нмоль). Условия анализа на CPT-II были идентичными за исключением того, что БСА не использовали и включали 0,01% Тритон Х-100. Концентрация тканевого белка составляла 2,5 мкг/мл. Ацил-коэнзимА-холестеринацилтрансферазу (АСАТ) измеряли, используя 130 мг белка и С-олеил-СоА в качестве субстрата. Продукт разделяли на пластинках ТСХ, используя гексан: диэтиловый эфир: уксусную кислоту (80:20:1) в качестве подвижной фазы и считывали в сцинтилляционном счетчике (счетчик жидкостной сцинтилляции Win Spectral 1414, Wallac). 3-Гидрокси-3-метилглутарил(НМС)-СоА редуктазу измеряли, используя 80 мг белка и C-HMG-CoA в качестве субстрата. Продукт разделяли на пластинках ТСХ, используя ацетон: бензол (1:1) в качестве подвижной фазы, и считывали в сцинтилляционном счетчике. Синтазу жирных кислот измеряли, как описано Roncari (Roncari, D.A. (1981) Fatty acid synthase from human liver. Methods Enzymol 71 Pt С: 73-79), с модификациями согласно Skorve et al. (Skorve, J., al-Shurbaji, A., Asiedu, D., Bjorkhem, I., Berglund, L. & Berge, R.К (1993). On the mechanism of the hypolipidemic effect of sulfur-substituted hexadecanedioic acid (3-thiadicarboxylic acid) in normolipidemic rats. J Lipid Res 34: 1177-1185), и ацетил-СоА карбоксилазу определяли путем измерения количества NaHСО, включенного в малонил-СоА.
Анализ липидов
Липиды в цельной печени и гепаринизированной плазме измеряли в системе Tecnicon Axon (Miles, Tarrytown, NY) с ферментативными наборами для триглицеридов и холестерина Байера (Bayer, Terrytown, NY) и ферментативным набором для фосфолипидов РАР 150 (bioMérieux, Lyon, France). Липиды печени сначала экстрагировали по Bligh и Dyer (Bligh, E.G. & Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37: 911-91.
Стерины фекалий
18
Суммарные желчные кислоты фекалий получали согласно Suckling et al. (Suckling, К.E., Benson, G.M., Bond, В., Gee, A., Glen, A., Haynes, С. & Jackson, В. (1991) Cholesterol lowering and bile acid excretion in the hamster with cholestyramine treatment. Atherosclerosis 89: 183-190) с некоторыми модификациями. Два мл NaBH в этаноле (мг/мл) добавляли к 0,1 г порошкообразных сухих фекалий. Эту смесь оставляли взаимодействовать в течение 1 часа при температуре окружающей среды, после чего добавляли 50 мкл 2 моль/л HCl для удаления какого-либо избытка NaBH. Нейтральные стерины экстрагировали из образцов н-гексаном (две последовательные промывки), после чего образцы подвергали гидролизу в течение ночи 200 мкл 10 моль/л NaOH при 110°С. 240 мкл гидролизата вместе с 2,8 мл воды наносили на колонки Bond Elut С (Varian, 200 мг, 3 мл), которые были предварительно активированы 3 мл метанола и 3 мл воды. Желчные кислоты задерживались на колонках, которые дважды промывали 3 мл 20% метанола в воде, после чего желчные кислоты элюировали с 3 мл метанола. Желчные кислоты сушили на воздухе при 45°С и растворяли в 1 мл изопропанола. Суммарные желчные кислоты определяли ферментативным путем, используя диагностический набор суммарных желчных кислот (Sigma 450A) на системе Tecnicon Axon.
Аминокислоты
2
2
Аминокислоты в диетах определяли после гидролиза в 6 М HCl при 110±2°С в течение 22 часов и предварительного получения производных с фенилизотиоцианатом согласно способу Сопел и Strydom (34). Суммарный цистеин в кормах определяли после окисления цистеина и цистина 9:1 пермуравьиной кислотой (88%): НO (30%) (об/об) с образованием цистеиновой кислоты. Затем образцы подвергали гидролизу в 6 М HCl при 110±2°С в течение 22 часов, а затем обрабатывали, как для аминокислотного анализа, описанного выше. Аминокислоты в печени и в плазме определяли в анализаторе аминокислот Biochrom 20 plus (Amersham Phannacia Biotech, Sweden), оборудованном литиевой колонкой, с получением после колонки производных с нингидрином, как описано ранее (24). Перед анализом образцы печени экстрагировали и депротеинизировали добавлением 2 объемов 5% сульфосалициловой кислоты, держали на льду в течение 30 мин и центрифугировали при 5000×g в течение 15 мин. Надосадочные жидкости смешивали 4:1 (об/об) с внутренним стандартом (2,5 ммоль/л норлейцина в 0,1 моль/л HCl). Образцы плазмы смешивали 1:1 с внутренним стандартом (1 ммоль/л норлейцина в 0,1 моль/л HCl), центрифугировали при 10000×g в течение 5 мин, после чего надосадочную жидкость центрифугировали в фильтрующей пробирке (отсечение 10 кДа, полиэфирсульфоновая мембрана Biomax PB, Miilipore Corp., USA) при 10000×g в течение 30 мин.
Состав жирных кислот
3
-1
-1
-1
Жирные кислоты экстрагировали из образцов смесью 2:1 хлороформ:метанол (об/об) (35). Образцы фильтровали, омыляли и этерифицировали в 12% BF в метаноле (об/об). Состав жирных кислот в суммарных липидах из печени и плазмы анализировали, используя способы, описанные Lie и Lambertsen (Lie, О. & Lambertsen, G. (1991) Fatty acid composition of glycerophospholipids in seven tissues of cod (Gadus morhua), determined by combined high-performance liquid chromatography and gas chromatography. J Chromatogr 565: 119-129). Метиловые эфиры жирных кислот разделяли, используя газовый хроматограф Carlo Erba («холодное впрыскивание на колонку», 69°С в течение 20 с, повышали на 25°С мин до 160°С и держали при 160°С в течение 28 мин, повышали на 25°С мин до 190°С и держали при 190°С в течение 17 мин, повышали на 25°С мин до 220°С и держали при 220°С в течение 9 мин), оборудованный капиллярными колонками из кварцевого стекла 50 м CP-sil 88 (Chrompack, Middelburg, The Netherlands) (внутренний диаметр 0,32 мм). Жирные кислоты идентифицировали по времени удерживания, используя стандартные смеси метиловых эфиров (Nu-Chek-Prep, Elyian, MN, USA). Состав жирных кислот (массовый процент) вычисляли, используя интегратор (Turbochrom Navigator, Version 4.0), соединенный с газожидкостным хроматографом (GLC).
3
3
Липиды экстрагировали из обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов плазмы, используя смесь хлороформа и метанола, и разделяли тонкослойной хроматографией на пластинках силикагеля (0,25 мм Silica gel 60, Merck), проявляли в гексане-диэтиловом эфире-уксусной кислоте (80:20:1, об./об./об.) и визуализировали, используя Rhodamine 6G (0,05% в метаноле, Sigma) и УФ-свет. Пятна соскребали и переносили в пробирки, содержащие генейкозановую кислоту (21:0) в качестве внутреннего стандарта. К образцам добавляли BF-метанол для трансэтерификации. Для удаления нейтральных стеринов и неомыленного вещества экстракты ацилметиловых эфиров жирных кислот нагревали в 0,5 моль/л КОН в растворе этанол-вода (9:1). Затем восстановленные жирные кислоты повторно этерифицировали, используя BF-метанол. Метиловые эфиры анализировали на газовом хроматографе GC8000Top (Carlo-Erba Instrument), оборудованном пламенно-ионизационным детектором (FID), программируемой температурой пароструйного инжектора, автосэмплером AS 800 (Carlo Erba Instrument) и капиллярной колонкой (60 м × 0,25 мм), содержащей высокополярную фазу SP 2340 с толщиной пленки 0,20 мкм (Supeico). Исходная температура составляла 130°С с нагреванием на 1,4°С/мин до конечной температуры 214°С. Температура инжектора составляла 235°С. Температура детектора составляла 235°С, используя водород (25 мл/мин), воздух (350 мл/мин) и азот в качестве газового состава (30 мл/мин). Образцы пропускали при постоянном потоке, используя водород в качестве газа-носителя (1,6 мл/мин). Отношение разделения потока составляло 20:1. Метиловые эфиры положительно идентифицировали путем сравнения с известными стандартами (Larodan Fine Chemicals, Malmo, Sweden) и проверяли с помощью масс-спектрометрии. Количественное определение жирных кислот проводили с помощью хроматографической установки Chrom-Card A/D 1.0 (Carlo Erba Instruments) на основании генейкозановой кислоты в качестве внутреннего стандарта.
Ацил-СоА-эфиры
4
2
3
Ацил-СоА-эфиры в печени измеряли посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. 100 мг замороженной печени гомогенизировали в охлажденной во льду 1,4 моль/л HClO и 2 ммоль/л D-дитиотрейтола с получением 10% (масс./об.) гомогената и центрифугировали при 12000×g в течение 1 мин. 122 мкл охлажденного во льду 3 моль/л КСО с 0,5 моль/л триэтаноламина добавляли к 500 мкл надосадочной жидкости. После 10 мин на льду этот раствор центрифугировали при 12000×g в течение 1 мин при 4°С. 40 мкл надосадочной жидкости впрыскивали на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии и ацил-СоА-эфиры измеряли согласно Demoz et al (39) со следующими модификациями: буфер для элюции А доводили до рН 5,00, профиль градиента элюции был следующим: 0 мин, 83,5% А; 10 мин, 55% А; 17 мин, 10% А и скорость потока составляла 1,0 мл/мин.
Выделение обогащенной триглицеринами фракции липопротеинов плазмы
Обогащенную триглицеринами фракцию липопротеинов плазмы получали путем ультрацентрифугирования 3 мл плазмы с плотностью 1,063 г/мл в течение 19 ч при 105000×g при 15°С. Содержимое пробирок расслаивалось и плавающую фракцию на 1 мл вверху каждой пробирки собирали. Затем эту фракцию подвергали диализу против 150 ммоль/л хлорида натрия, 16 ммоль/л фосфата натрия и 4 ммоль/л фосфата калия, рН 7,4, насыщенного азотом.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК очищали, используя Trizol (Gibco BRL), и 1 мкг суммарной РНК подвергали обратной транскрипции в суммарном объеме 100 мкл путем использования набора обратной транскриптазы (Applied Biosystems). Реакции, в которых РНК отсутствовала, служили в качестве отрицательного контроля, а реакции, в которых РНК была разбавлена, служили в качестве стандартных кривых.
9
6
5
Праймеры и зонд Taqman для крысиных десатураз Δ, Δ и Δ, активируемого пролифератором пероксисом рецептора (PPAR)α и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) конструировали, используя Primer Express (Applied Biosystems). GAPDH и 18S pPHK использовали в качестве эндогенных контролей. Праймеры и зонд Taqman для 18S pPHK приобретали у Applied Biosystems.
9
6
5
ПЦР в реальном времени проводили в трех повторностях для каждого образца на системе определения последовательности ABI 7900 (Applied Biosystems). Для десатураз Δ, Δ и Δ, PPARα и GAPDH каждая 20-мкл реакция содержала 3 мкл первой нити кДНК, 1х Universal Master Mix (Applied Biosystems), 300 нмоль/л каждого прямого и обратного праймера и 250 нмоль/л зонда Taqman. Для 18S pPHK реакция содержала 3 мкл первой нити кДНК, 1х Universal Master Mix (Applied Biosystems) и 1х реакционную смесь 18S зонд/праймер. Все реакции проводили, используя следующие параметры цикла: 50°С в течение 2 мин и 95°С в течение 10 мин с последующими 40 циклами 95°С в течение 15 сек и 60°С в течение 1 мин, как обычно рекомендовано Applied Biosystems. Считывания Ct (порогового числа циклов) для каждого из неизвестных образцов использовали для вычисления количества десатураз, PPARa и GAPDH и 18S pPHK. Для каждого образца результаты нормализовали по GAPDH и 18S pPHK. Представлены только результаты, нормализованные по GAPDH, но эти результаты были подобны результатам, нормализованным по 18S pPHK.
Результаты приведены в виде среднего ±СКО (среднеквадратическое отклонение) для 6 животных в каждой экспериментальной группе. Статистический анализ проводили с помощью однофакторного критерия Данетта Anova (Prism, GraphPad).
Пример 1
Получение гидролизата рыбьего белка
FPH получали из остатков мяса рыбы на костных скелетах лосося после филетирования. Свежие скелеты атлантического лосося (Salmon salar, L.) без голов сразу после приготовления из него филе брали непосредственно с производственной линии и замораживали при -20±2°С. В пределах недели замороженные скелеты использовали в ферментативном процессе гидролиза.
Ферментативный гидролиз проводили с использованием Protamex™ при рН примерно 6,5 и при температуре 55±2°С. Protamex™ (E.C. 3.4.21.62/3.4.24.28) представляет собой комплекс протеаз Bacillus от Novozymes AS (Bagsvaerd, Denmark) и удовлетворяет требованиям чистоты для пищевых ферментов. Отношение скелетов лосося к воде составляло 1,14. При гидролизе использовали отношение фермента к субстрату 11,1 ЕД/кг сырого белка. После 60 мин ферментативной обработки температуру повышали до значения 98°С, которое было достигнуто за 105 мин.
2
Крупные кости оставались в гидролизном чане, тогда как мелкие кости удаляли фильтрованием гидролизата через сито. После этого нерастворимую фракцию удаляли в двухфазном сепараторе (Westfalia, Germany, SC.35-26-177, 15 кВт, 7200 об/мин), после чего оставшуюся смесь разделяли в трехфазном сепараторе (Westfalia, Germany, SB-7-36-+76,4 кВт, 8520 об/мин) на лососевое масло, эмульсионную фракцию и водную фракцию. Водную фракцию концентрировали (NitroAtomicer, Denmark, Falling Film Evaporator, Ft 100), фильтровали через ультрамембрану с номинальным пределом молекулярной массы 100000 (мембранные системы PCl; UK, PF100, 2,65 м) и, наконец, фракцию, профильтрованную через ультрамембрану (UF-фракцию), подвергали распылительной сушке (Niro Atomizer, Denmark, P-63 tower. Т на входе = 200°С, Т на выходе = 84°С).
Фракцию UF назвали гидролизатом рыбьего белка (FPH) и использовали в описанных ниже экспериментах. Вещество FPH содержит примерно 83% белка, 10% золы и примерно 2% липидов, на основании сухой массы. Аминокислотные составы приведены в таблице 2.
Таблица 2Суммарные аминокислоты во фракции UF, полученной путем гидролиза скелетов лосося с использованием Protamex™
Компонент
Фракция UF
Аминокислоты (г/кг<sup>-1</sup> сырого белка)
Arg
59,4±0,7
His
39±1
lie
27,5±0,4
Leu
56,4±0,1
Lys
63,7±0,3
Met
22±1
Phe
26,9±0,7
Thr
39±1
Trp
5,3±0,1
Val
35,5±0,4
Ala
74±1
Asn + Asp
73±3
Cysteine (суммарный)
6,1±0,7
Gln + Glu
116±5
Gly
89±3
OH-Pro
20,7±0,7
Pro
47±1
Ser
37±2
Tyr
21±2
Tau
6,2±1
Пример 2
FPH индуцирует эффект снижения холестерина в плазме
Крысам Zucker с ожирением была предложена диета, содержащая 20% FPH в качестве единственного источника белка. FPH представляет собой свободный от жирных кислот гидролизат рыбьего белка (FPH), полученный, как описано выше.
У крыс Zucker, которых кормили FPH, уровень холестерина в плазме был снижен на 49% по сравнению с крысами, которых кормили казеином в качестве пищевого белка. Этот результат показан на Фиг.1. Этот результат ясно демонстрирует, что FPH снижает уровни холестерина в плазме и может применяться в качестве агента, снижающего уровень холестерина.
Пример 3
FPH снижает концентрацию триацилглицеринов в печени
На Фиг.2 показано, что FPH индуцирует снижение концентрации триацилглицеринов (ТГ) в печени примерно на 50%. Это указывает на то, что соединение по настоящему изобретению может применяться в качестве агента, снижающего уровень липидов, и для лечения и предупреждения жировой дистрофии печени.
Пример 4
FPH ингибирует активность ацил-СоА:холестеринацилтрансферазы
АцилСоА:холестеринацилтрансфераза (АСАТ) катализирует реакцию, в которой ацил-СоА жирной кислоты этерифицируется до холестерина. Затем холестериловый эфир может запасаться в цитоплазме в виде липидных капелек или секретироваться в виде части ЛПОНП (липопротеинов очень низкой плотности) вместе со свободным холестерином. Таким образом, АСАТ играет главную роль в секреции ЛПОНП и последующей аккумуляции холестерилового эфира и риске сердечно-сосудистого заболевания. В настоящем эксперименте у крыс Zucker белок PFH изменил состав классов липидов в обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов, то есть содержания холестерилового эфира и фосфолипида были ниже, тогда как содержание триацилглицерина было выше, чем у крыс, которых кормили казеином.
Кроме того, на Фиг.3 показано, что активность АСАТ была снижена у крыс, которых кормили белком FPH, по сравнению с теми, которых кормили казеином. Поскольку существуют строгие данные, что повышенная активность АСАТ играет важную роль в прогрессировании атеросклероза (46-49), это открытие указывает на то, что FPH и соевый белок являются кардиопротективными.
На Фиг.3 показано, что активность АСАТ была снижена примерно на 30% у крыс, которых кормили FPH, по сравнению с крысами Zucker, которых кормили казеином.
Пример 5
FPH усиливает митохондриальное β-окисление
На Фиг.4 показано, что FPH усиливает митохондриальное β-окисление. Повышенное окисление жирных кислот является важным фактором помимо эффекта снижения холестерина при использовании FPH. Повышенный катаболизм жирных кислот будет снижать количество жирных кислот, доступных для этерификации, и тем самым снижать продуцирование и секрецию ЛПОНП печенью. Из Фиг.4 видно, что FPH значительно усиливает окисление пальмитоил-коэнзим А по сравнению с контролем.
Пример 6
FPH препятствует гомеостазу липидов
9
6
6
5
5
Настоящие данные указывают на то, что свободное от жиров вещество FPH препятствует гомеостазу липидов и может способствовать аккумуляции эндогенных лигандов для них. Несмотря на неизмененный уровень мРНК PPARα в печени (данные не приведены), состав жирных кислот в печени, плазме и обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов был изменен у крыс, которых кормили FPH, по сравнению с теми, которых кормили казеином, и эти изменения не являются параллельными в печени и в плазме (таблицы 3-5). Концентрации в печени (таблица 3) насыщенных 14:0 и 16:0 жирных кислот были снижены, тогда как концентрации 18:0 были повышены у крыс, которых кормили FPH, в частности тех животных, которых кормили соевым белком, по сравнению с теми, которых кормили казеином. Концентрации в печени мононенасыщенных жирных кислот, включая 18:1n-9, были снижены у крыс, которых кормили FPH. В результате отношение 18:1n-9/18:0 было снижено на 54 у крыс, которых кормили FPH. Однако диетический белок не оказал влияния на уровень мРНК десатуразы Δ в печени (данные не приведены). В отличие от печени противоположный эффект был обнаружен в плазме в отношении насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот (таблица 4). В плазме содержание насыщенных жирных кислот 14:0 и 16:0 повышалось в результате кормления FPH. Содержание мононенасыщенных жирных кислот 18:1n-9 и 16:1n-7 повышалось в 1,3-1,5 раза у крыс, которых кормили FPH, и отношение 18:1n-9 к 18:0 повышалось. В обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов (таблица 5) были только минорные изменения насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот, то есть 16:1n-7 в фосфолипидах было снижено у крыс, которых кормили FPH и соевым белком. Отношение 18:1n-9/18:0 было в целом неизмененным в обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов. Среди n-6 жирных кислот содержание 18:3n-6 было неизмененным в печени, 18:2n-6 повышалось менее чем в два раза, тогда как 20:3n-6 и 20:4n-6 повышалось в несколько раз при использовании FPH. Это привело в результате к снижению отношения 18:3n-6/18:2n-6, указывая на сниженную Δ десатурацию. Экспрессия мРНК десатуразы Δ в печени была действительно снижена (данные не приведены). Кроме того, отношение 20:4n-6/20:3n-6 было снижено, указывая на сниженную Δ десатурацию, что соответствовало сниженному уровню мРНК десатуразы Дв печени (данные не приведены). Двукратное повышение отношения 20:4n-6/18:2n-6 и 3-и 5-кратное повышение отношения 20:4n-6/18:3n-6 наблюдали у животных, которых кормили FPH. Следовательно, как ожидалось, активности их печеночной элонгазы были повышены. Животные, которых кормили FPH, показали повышенные концентрации в плазме 18:2n-6, в то время как они показали пониженные концентрации в плазме 20:4n-6. В результате их отношение 20:4n-6/18:2n-6 в плазме было снижено на 54. Кроме того, отношение 20:4n-6/20:3n-6 было снижено на 60% у крыс, которых кормили FPH, относительно тех, которых кормили казеином. Кроме того, существовала тенденция сниженных отношений 18:3n-6/18:2n-6 и 20:4n-6/18:3n-6 у животных, которых кормили FPH, хотя и незначительная. В обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов состав жирных кислот напоминал профиль плазмы, то есть повышенные 18:2n-6 и сниженные 20:4n-6, результатом чего были сниженные отношения 20:4n-6/18:2n-6 (на 49-68%), 20:4n-6/18:3n-6 (на 53-65%) и 20:4n-6/20:3n-6 (на 35-37%) у крыс, которых кормили FPH. Все эти n-3 жирные кислоты, измеренные в печени, были повышены у обоих крыс, которых кормили FPH. 18:3n-3 повышались в 1,8 раза в плазме в результате кормления FPH. 20:5n-3 были значительно повышены у крыс, которых кормили FPH (44% повышение), тогда как DHA было снижено в результате кормления FPH (27% снижение). В обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов картина состава n-3 жирных кислот была изменена только в фосфолипидах, где 20:5n-3 и 22:5n-3 были повышены у крыс, которых кормили FPH. Это напоминало результаты в плазме.
ТАБЛИЦА 3Состав жирных кислот в печени крыс Zucker, которых кормили FPH или казеином в течение 3 недель<sup>1</sup>
Жирные кислоты
FPH
Казеин
г/100 8 жира
14:0
1,5±0,0<sup>*</sup>
1,7±0,1
16:0
35,2±0,5<sup>*</sup>
39,3±0,6
18:0
8,8±0,3<sup>*</sup>
4,9±0,3
Количество насыщенных
45,5±0,7
45,9±0,6
16:1n-9
0,5±0,0<sup>*</sup>
0,8±0,0
18:1n-9
24,5±0,7<sup>*</sup>
29,6±0,4
16:1n-7
6,5±0,3<sup>*</sup>
8,1±0,5
18:1n-7
2,2±0,2<sup>*</sup>
3,0±0,1
Количество мононенасыщенных
33,6±0,9<sup>*</sup>
41,5±0,8
18:2n-6
11,6±0,1<sup>*</sup>
8,8±0,5
18:3n-6
0,3±0,0
0,4±0,0
20:3n-6
0,6±0,1<sup>*</sup>
0,1±0,1
20:4n-6
5,6±0,4<sup>*</sup>
2,1±0,3
Количество n-6
18,1±0,5<sup>*</sup>
11.4±0,8
18:3n-3
0,6±0,0<sup>*</sup>
0,3±0,0
20:5n-3
0,3±0,1
н/о
22:5n-3
0,4±0,0
н/о
22:6n-3
1,4±0,2<sup>*</sup>
0,5±0,1
Количество n-3
2,6±0,2<sup>*</sup>
0,8±0,1
Отношения
18:1n-9/18:0
2,8±0,2<sup>*</sup>
6,1±0,3
18:3n-6/18:2n-6
0,028±0,003<sup>*</sup>
0,045±0,003
20:4n-6/18:2n-6
0,5±0,0<sup>*</sup>
0,2±0,0
20:4n-6/18:3n-6
18,0±2,5<sup>*</sup>
5.9±1,1
<sup>1</sup>Значения представляют собой средние ± СКО, n=6.
<sup>*</sup>Отличие от казеина, Р<0,05, н/о - не определяли
ТАБЛИЦА 4Состав жирных кислот в плазме крыс Zucker, которых кормили FPH или казеином в течение 3 недель<sup>1</sup>
Жирные кислоты
FPH
Казеин
г/100 г жира
14:0
0,8±0,1<sup>*</sup>
0,6±0,0
16:0
21,8±1,0<sup>*</sup>
18,6±0,6
18:0
11,8±0,5
12,6±0,7
Количество насыщенных
33,3±0,7
32,9±0,8
16:1n-9
0,4±0,0
0,4±0,0
18:1n-9
13,6±0,7<sup>*</sup>
9,6±0,5
16:1n-7
4,0±0,3<sup>*</sup>
3,1±0,1
18:1n-7
1,6±0,2
1,5±0,1
Количество мононенасыщенных
18,5±1,4
16,1±1,1
18:2n-6
22,0±0,9<sup>*</sup>
17,4±1,0
18:3n-6
0,7±0,1
0,6±0,1
20:3n-6
1,3±0,2
0,9±0,2
20:4n-6
17,1±1,5<sup>*</sup>
29,2±1,1
Количество n-6
43,3±1,9
46,3±1,8
18:3n-3
0,8±0,1<sup>*</sup>
0,5±0,1
20:5n-3
1,0±0,1<sup>*</sup>
0,6±0,1
22:5n-3
0,6±0,0<sup>*</sup>
0,4±0,0
22:6n-3
1,6±0,1<sup>*</sup>
2,3±0,1
Количество n-3
4,0±0,1
3,7±0,1
Отношения
18:1n-9/18:0
1,2±0,1<sup>*</sup>
0,8±0,1
18:3n-6/18:2n-6
0,032±0,004
0,037±0,005
20:4n-6/18:2n-6
0,8±0,1<sup>*</sup>
1,7±0,1
20:4n-6/18:3n-6
35,2±7,4
41,6±6,3
20:4n-6/20:3n-6
14,4±2,2<sup>*</sup>
37,6±4,6
<sup>1</sup>Значения представляют собой средние ± СКО, n=6.
<sup>*</sup>Отличие от казеина, Р<0,05
ТАБЛИЦА 5Состав жирных кислот в различных классах липидов в обогащенной триацилглицеринами фракции липопротеинов крыс Zucker, которых кормили FPH или казеином в течение 3 недель<sup>1</sup>
Жирные кислоты
Триацилглицерин
Фосфолипид
Холестериловый эфир
FPH
Казеин
FPH
Казеин
FPH
Казеин
г/100 г жира
14:0
1,6±0,1
1,5±0,2
0,5±0,1
0,5±0,0
1,7±0,2
1,2±0,1
16:0
34,9±3,0
33,4±2,8
22,6±0,2
24,7±1,2
19,3±2,1
19,0±0,4
18:0
3,0±0,4
3,2±0,3
29,5±0,7
27,3±1,4
8,2±1,1
5,4±0,4
∑ насыщенные
39,9±3,4
38,6±3,2
54,8±0,8
54,8±0,3
32,0±3,5
27,7±0,8
16:1n-9
0,5±0,0
0,5±0,1
0,1±0,0
0,1±0,0
0,6±0,1
0,6±0,0
18:1n-9
26,0±0,8
25,5±1,0
5,7±0,5
5,3±0,3
11,8±2,8
12,2±1,8
16:1n-7
6,0±0,5
5,8±0,7
0,7±0,1
0,7±0,0
4,6±1,1
5,8±1,0
18:1n-7
2,6±0,3
3,1±0,2
1,0±0,1<sup>*</sup>
1,3±0,1
1,0±0,3
1,2±0,3
∑ мононенасыщенные
35,5±0,8
35,2±1,7
7,9±0,6
8,1±0,2
18,5±4,1
20,0±3,0
18:2n-6
19,4±1,8
19,5±4,3
20,4±0,7
17,5±1,1
17,7±0,6<sup>*</sup>
14,4±0,2
18:3n-6
0,3±0,0
0,3±0,0
0,1±0,0
0,1±0,0
1,3±0,2
1,0±0,2
20:3n-6
0,4±0,1
0,5±0,1
1,8±0,2
1,2±0,2
1,0±0,1*
0,5±0,1
20:4n-6
1,1±0,1
2,0±0,4
10,8±0,4<sup>*</sup>
13,8±0,7
27,0±7,3
34,5±3,5
Σ n-6
21,8±2,0
23,0±4,1
33,8±0,8
33,2±0,4
47,0±7,2
50,4±3,5
18:3n-3
1,8±0,0
1,5±0,4
0,1±0,0
0,1±0,0
0,5±0,1
0,5±0,1
20:5n-3
0,4±0,1
0,4±0,1
0,4±0,0<sup>*</sup>
0,1±0,0
1,2±0,3
0,6±0,2
22:5n-3
0,4±0,0
0,4±0,1
0,7±0,1<sup>*</sup>
0,5±0,0
н/о
н/о
22:6n-3
0,4±0,1
0,6±0,1
2,3±0,4
2,7±0,0
0,7±0,2
0,7±0,0
∑ n-3
2,5±0,8
3,0±0,5
3,4±0,4
3,5±0,0
2,5±0,3
1,8±0,2
Отношения
18:1n-9/18:0
8,9±1,1
8,0±0,5
0,2±0,0
0,2±0,0
1,4±0,2<sup>*</sup>
2,2±0,2
18:3n-6/18:2n-6
0,018±0,002
0,017±0,006
0,004±0,002
0,005±0,001
0,071±0,009
0,071±0,014
20:4n-6/18:2n-6
0,058±0,004
0,113±0,032
0,5±0,0<sup>*</sup>
0,8±0,1
1,5±0,4
2,4±0,2
20:4n-6/18:3n-6
3,3±0,1<sup>*</sup>
6,9±1,0
92,3±15,6
153,1±13,7
21,2±3,9
36,4±8,7
20:4n-6/20:3n-6
2,8±0,4<sup>*</sup>
4,3±0,2
6,0±0,8<sup>*</sup>
12,6±2,1
27,5±6,1<sup>*</sup>
73,6±11,2
<sup>1</sup>Значения представляют собой средние ±СКО, n=3 (суммарно шесть крыс, но плазму от двух крыс объединяли).
<sup>*</sup>Отличие от казеина, Р<0,05; н/о, не определяли; soy, соевый белок
Пример 7
FPH снижает концентрацию гомоцистеина в плазме
Повышенные уровни гомоцистеина, то есть гипергомоцистеинемия, предположительно ассоциирована с артериальными заболеваниями и поэтому авторы изобретения измерили уровни гомоцистеина в образцах плазмы от крыс.
4
Суммарный гомоцистеин плазмы измеряли с помощью полностью автоматизированного флуоресцентного анализа. 30 мкл плазмы восстанавливали 30 мкл раствора NaBH/ДМСО (6 моль/л). После 1,5 мин добавляли 20 мкл реагента флуоресценции монобромбимана (25 ммоль/л) в ацетонитриле и оставляли для взаимодействия в течение 3 мин. Затем 20 мкл образца непосредственно анализировали методом ВЭЖХ путем впрыска на сильную катионообменную колонку, а затем путем смены колонки на колонку циклогексил-силикагель (SCX). Колонку SCX элюировали изократически, и колонку СН элюировали линейным градиентом метанола (17-35% за 5 мин) в 20 ммоль/л формиатном буфере. Гомоцистеин элюировался при времени удерживания 4,5 мин. Результаты приведены в таблице 6.
Таблица 6Концентрация гомоцистеина в плазме
Концентрация в плазме (мкмоль/л)
Контроль (казеин)
1,37±0,27
FPH
1,17±0,18