Способ ультразвуковой спектрометрии при исследовании биологических жидкостей
METHOD OF ULTRASONIC SPECTROMETRY WHEN EXAMINING BIOLOGICAL FLUIDS

Изобретение относится к медицине, а именно к ультразвуковой интерферометрии, и предназначено для ультразвуковой спектрометрии при исследовании биологических жидкостей.
Исследование физических характеристик биологических жидкостей является актуальной задачей, имеющей как самостоятельное научное (т.к. организм создает уникальные по своим свойствам жидкости и структуры), так и прикладное значение в области медицины и биологии. В настоящее время известен целый ряд физических методов, с помощью которых можно получать разнообразную информацию о биологических средах, т.е. средах, содержащих малые молекулы (органические и неорганические), макромолекулы (биополимеры: белки, полипептиды, нуклеиновые кислоты), клеточные и субклеточные элементы, которые имеют биологическое происхождение. Примерами жизненно важных биосред являются кровь, лимфа, желудочный сок, слюна, различные внутренние органы и ткани человека.
Экспериментальные исследования физических характеристик биосред имеют, некоторые особенности, которые связаны с их спецификой, поэтому это накладывает определенные ограничения на выбор физического метода их исследования. Определенные успехи при изучении биосред были сделаны при использовании ультразвуковых методов для измерения их акустических характеристик. Именно акустические исследования этих биологических сред позволяют изучить тонкие структурные характеристики, их межмолекулярные взаимодействия и конформационные перестройки.
Исследование физических характеристик биологических жидкостей является актуальной задачей, имеющей как самостоятельное научное (т.к. организм создает уникальные по своим свойствам жидкости и структуры), так и прикладное значение в области медицины и биологии. В настоящее время известен целый ряд физических методов, с помощью которых можно получать разнообразную информацию о биожидкостях (Буров В.А. и др., Активная и пассивная медицинская акустическая томография сильно неоднородных сред, Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2002. №3. с. 5-13), т.е. водных растворах и суспензиях, содержащих малые молекулы (органические и неорганические), макромолекулы (биополимеры: белки, полипептиды, нуклеиновые кислоты), клеточные и субклеточные элементы, которые имеют биологическое происхождение. Примерами жизненно важных биожидкостей являются кровь, лимфа, желудочный сок, слюна.
Экспериментальные исследования физических характеристик биожидкостей имеют, по сравнению с обычными жидкостями, некоторые особенности, которые связаны с их спецификой.
Компоненты биожидкостей сохраняют нативное (естественное) состояние в ограниченном интервале внешних условий. Поэтому физические методы, не позволяющие работать с биожидкостями в нативном состоянии, заведомо дадут искаженную информацию. Измерения их физических характеристик необходимо производить в условиях, близких к условиям организма. Биожидкость, постоянно взаимодействуя с организмом, отражает изменения, которые происходят в нем под действием внешних факторов. Следовательно, в каждый момент времени их физические характеристики различны и, несмотря на то, что в нормальном состоянии адаптационные системы организма поддерживают постоянство внутренней среды, всегда приходится иметь дело с усредненными физическими характеристиками биологических жидкостей. Физический метод исследования биожидкостей, основанный на взаимодействии какого - либо вида энергии с биологической средой, должен незначительно возмущать равновесные состояния, существующие в жидкости, чтобы не вызвать необратимых изменений. Отсюда вытекает требование высокой чувствительности приемного устройства в установке, реализующей метод исследования биожидкостей.
Небольшие изменения внешних условий приводят к незначительным изменениям биосред. Тем не менее, эти небольшие изменения могут повлечь за собой серьезные последствия для организма. Это означает, что для исследования необходим метод, позволяющий регистрировать крайне малые изменения их свойств, т.е. обладающий повышенной точностью изменения регистрируемых параметров.
Биожидкости могут иметь как высокую (кровь, лимфа), так и низкую (желудочный сок) концентрацию компонентов. Поэтому, при выборе физического метода их исследования желательно, чтобы была возможность извлекать информацию о физических свойствах как в высоко-, так и в низко-концентрированных биожидкостях.
Все выше сказанное накладывает определенные ограничения на выбор физического метода исследования свойств биожидкостей.
Определенные успехи при изучении биосред были сделаны при использовании ультразвуковой интерферометрии для измерения акустических характеристик растворов белков и аминокислот. Именно акустические исследования этих биологических жидкостей позволяют изучить тонкие структурные характеристики и гидратацию биологических макромолекул в растворе, их межмолекулярные взаимодействия и конформационные перестройки биополимеров.
Ультразвуковые методы с целью их применения для исследования биологических сред использовались еще с девятнадцатого века, однако для медико-биологических приложений, в частности, в области медицинской диагностики известные технические решения применять не представляется возможным из-за того, что биосреды организма человека, используемые для медицинской диагностики (кровь, образцы внутренних органов), как правило, могут быть использованы в очень ограниченном объеме, а также точность измерений скорости и поглощения ультразвука должна быть предельно высокой для высококонцентрированных биосред (Клемин В.А Безреагентная диагностика: акустические технологии, Н. Новгород, 2014 г., 12 с.).
Известны различные способы измерения резонансной частоты в таких ячейках. Широкое применение получил способ, реализованный в устройстве (SU 1758510 А1, 30.08.1992), которое выполнено на базе экстремального регулятора. В этом устройстве высокочастотный генератор, управляемый напряжением (ГУН), автоматически настраивается на резонансную частоту радиочастотного датчика и отслеживает все ее изменения. При этом частота высокочастотного генератора осциллирует около максимума амплитудно-частотной характеристики (АЧХ) этого датчика и усредненное значение этой частоты считается резонансной частотой этого датчика. Однако данный способ имеет следующие недостатки. Получаемые данные могут быть значительно искажены за счет множества резонансных пиков при произвольном захвате соседних резонансных пиков, погрешность измерения частоты зависит от времени измерения.
Кроме того, в уровне техники известен способ ультразвуковой спектрометрии при исследовании биологических жидкостей (Клемин В.А Безреагентная диагностика: акустические технологии, Н. Новгород, 2014 г., 12 с.), принятый нами за прототип. Способ заключается в проведении исследования образца биологической жидкости в акустической ячейке ультразвукового спектрометра фиксированной длины, а именно подаче на пластины пьезопреобразователей ячейки высокочастотного сигнала, частотное и температурное сканирование исследуемого образца, при этом проведение измерения резонансной частоты ячейки с исследуемым образцом проводят последовательно относительно ячейки с дистиллированной водой, непосредственно оцифровывают опорный сигнал и сигнал на выходе из акустических ячеек, полученную информацию в виде массива акустических параметров и коэффициентов поглощения передают в персональный компьютер и обрабатывают с помощью программного обеспечения. Способ обладает следующими недостатками: во-первых, сигнал при подаче гармонических колебаний заданной частоты на вход резонатора подвержен искажениям за счет нарушения нормальных амплитудных и фазовых соотношений между отдельными парами боковых частот, что негативно влияет на погрешность измерения при изменении резонансной частоты в ячейке во время измерения, во-вторых, погрешность измерения частоты зависит от времени измерения.
Таким образом, существует потребность в способе ультразвуковой спектрометрии при исследовании биологических жидкостей, позволяющем избежать вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом настоящего изобретения является создание способа ультразвуковой спектрометрии при исследовании биологических жидкостей, позволяющего увеличить точность и скорость измерения резонансной частоты и ширины резонансного пика в ультразвуковых спектрометрах фиксированной длины.
Этот технический результат достигается тем, что в способе ультразвуковой спектрометрии при исследовании биологических жидкостей, заключающемся в проведении измерения образца биологической жидкости в акустической ячейке ультразвукового спектрометра фиксированной длины, а именно подаче на пластины пьезопреобразователей ячейки высокочастотного сигнала, частотное сканирование исследуемого образца, при этом проведение измерения резонансной частоты ячейки с исследуемым образцом проводят последовательно относительно ячейки с дистиллированной водой, непосредственно оцифровывают опорный сигнал и сигнал на выходе из акустических ячеек, полученную информацию в виде массива акустических параметров и коэффициентов поглощения передают в персональный компьютер и обрабатывают с помощью программного обеспечения, предлагается процесс измерения одной точки частотной характеристики осуществлять в следующей последовательности: с помощью управляющей программы записывать в цифровой синтезатор значение частоты, которую необходимо подать на резонатор, с выхода синтезатора сигнал гармонических колебаний заданной частоты подавать на вход резонатора и одновременно на первый вход аналого-цифрового преобразователя, после окончания переходного процесса в резонаторе и установления в нем стационарных колебаний, полученный на выходе резонатора стабильный по амплитуде и фазе гармонический сигнал направлять на второй вход аналого-цифрового преобразователя, одномоментно с помощью управляющей программы запускать процесс синхронной дискретизации сигналов с обоих каналов аналого-цифрового преобразователя, при этом результат дискретизации сохраняют в буферной памяти аналого-цифрового преобразователя и затем передают в управляющую программу, при этом из ячейки с образцом получают два массива цифровых данных регистрации гармонических сигналов, для построения амплитудо-частотной характеристики (АЧХ) вычисляют значение коэффициента передачи амплитуды в резонаторе по формуле:
1
2
1
1
2
1
где i - номер измерения, х(i) - значения, измеренные в первом канале, x(i) - значения, измеренные во втором канале, Х - среднее значений x(i), Х - среднее значений x(i).
Для построения фазо-частотной характеристики (ФЧХ) R(j), значение фазового сдвига для заданной частоты вычисляют по формулам:
ϕ(j) = arccos(R(j)).
0
получают график зависимости ϕ(j), для определения фазового сдвига ϕ(0) между каналами АЦП выбирают ближайший к оси ординат участок линии с положительным наклоном, аппроксимируют его прямой линией и определяют точку пересечения с осью абсцисс j, фазовый сдвиг определяют по формуле:
Ацп
где ƒр - предполагаемая резонансная частота, а ƒ - частота дискретизации АЦП; для определения положения резонансного пика; определяют ФЧХ окрестности данного пика, при этом в окрестности предполагаемой резонансной частоты формируется сетка частот по формуле:
m,n
p
1
2
ƒ =ƒ + mΔƒ + nΔƒ,
p
где ƒ - предполагаемая резонансная частота, m=-1,0,1, n=-2,-1,0,1,2,
1
a
Δƒ = Δƒm,
2
Δƒ = bΔƒm.
m
а
где Δƒ - полуширина резонансного пика на полувысоте максимальной амплитуды пика,  - коэффициент размаха сканирования, равный 0,5, b - коэффициент размаха сканирования, равный 0,1,
в соответствии с этой сеткой частот проводят измерения ФЧХ по указанному алгоритму, положение резонансного пика определяют по нулю второй производной ФЧХ в окрестности резонансной частоты, для чего определяют вторую производную фазы ϕ'' (n) по формуле (фиг. 1):
-1,n
1,n
1
0,n
ϕ''(n) = ϕ(ƒ) + ϕ(ƒ) - 2ϕ(ƒ).
Таким образом, получают зависимость ϕ''(n), которую аппроксимируют прямой (Фиг. 2):
ϕ''(n)  = wn+u,
0
где - w - величина угла наклона аппроксимации, u - точка пересечения с нулем; и определяют точку пересечения n с осью абсцисс:
рнов
текущую резонансную частоту ƒ определяют по формуле:
рнов
рсс
0
2
ƒ = ƒ + nΔƒ.
pcc
2
где ƒ - резонансная частота на предыдущем шаге измерений, Δƒ  - полуширина резонансного пика на полувысоте максимальной амплитуды пика с учетом коэффициента размаха сканирования, равного 0,1; текущую ширину резонансного пика определяют по наклону характеристики ϕ''(n):
2
где Δƒ  - полуширина резонансного пика на полувысоте максимальной амплитуды пика с учетом коэффициента размаха сканирования, равного 0,1, w - коэффициент наклона аппроксимации.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят измерение резонансной частоты и ширины резонансного пика образца биологической жидкости в акустической ячейке ультразвукового спектрометра фиксированной длины. Применяемые в ультразвуковых спектрометрах фиксированной длины резонансные ячейки для исследования жидких образцов отличаются следующими характеристиками: они имеют малый объем камеры для исследуемого жидкого образца (0,1÷1 мл), они имеют малую длину камеры (4÷10 мм) и высокую рабочую частоту (1÷10МГц), в пределах которой возможна регистрация резонансных пиков АЧХ камеры. Выражение для резонансной частоты в камере имеет вид:
n
где V - скорость звука в исследуемом образце, ƒ - частота резонансного пика с номером n,  - длина камеры. Указанные характеристики резонансных ячеек приводят к тому, что в исследуемый частотный диапазон попадают резонансные пики с номерами n=70÷100. Резонансный пик ячейки при исследовании малопоглощающей жидкости (дистиллированной воды) имеет ширину около 700 Гц. Аппаратная часть измерителя резонансной частоты состоит из цифрового высокочастотного DDS-синтезатора гармонических колебаний с рабочим диапазоном, соответствующем рабочему диапазону измерительной ячейки, и шагом перестройки частоты менее 1 Гц, двухканального синхронного аналого-цифрового преобразователя с частотой дискретизации более чем в 10 раз большей, чем предельная рабочая частота измерительной ячейки.
Управляющая программа записывает в цифровой синтезатор значение частоты, которую необходимо подать на пластины пьезопреобразователей ячейки. Проведение измерения резонансной частоты ячейки с исследуемым образцом проводят последовательно относительно ячейки с дистиллированной водой.
С выхода синтезатора сигнал гармонических колебаний заданной частоты поступает на вход резонатора и одновременно на первый вход аналого-цифрового преобразователя. После окончания переходного процесса в резонаторе и установления в нем стационарных колебаний, на выходе резонатора появляется стабильный по амплитуде и фазе гармонический сигнал, который поступает на второй вход аналого-цифрового преобразователя. В этот момент управляющая программа запускает процесс синхронной дискретизации сигналов с обоих каналов аналого-цифрового преобразователя. Результат дискретизации сохраняется в буферной памяти аналого-цифрового преобразователя и затем передается в управляющую программу. В результате измерения получается два массива цифровых данных регистрации гармонических сигналов.
Вычислительная часть измерителя резонансной частоты реализована в виде компьютерной или микропроцессорной программы, осуществляющей следующие действия. Для построения амплитудо-частотной характеристики вычисляют значение коэффициента передачи амплитуды в резонаторе по формуле:
1
2
1
1
2
1
где i - номер измерения, x(i) - значения, измеренные в первом канале, х(i) - значения, измеренные во втором канале, Х - среднее значений x{i), Х - среднее значений х(i).
Для построения фазо-частотной характеристики, значение фазового сдвига для заданной частоты вычисляют по формулам:
ϕ(j) = arccos(R(j)).
0
Формула для вычисления R(j) является формулой для вычисления корреляции Пирсона с введенным виртуальным сдвигом фазы j. График зависимости ϕ(j) имеет вид пилообразной линии. Для определения фазового сдвига между каналами аналого-цифрового преобразователя выбирают ближайший к оси ординат участок линии с положительным наклоном, аппроксимируют его прямой линией и определяют точку пересечения с осью абсцисс j. Фазовый сдвиг определяют по формуле:
Таким образом, для любой заданной частоты, подаваемой в резонатор определяют точку амплитудной и фазовой характеристики.
Для определения положения резонансного пика, определяется фазочастотная характеристика его окрестности. На рисунке 2 поясняется принцип построения сетки частот и способ приближенного вычисления второй производной фазы по частоте. Для этого в окрестности предполагаемой резонансной частоты формируется сетка частот по формуле:
р
где ƒ - предполагаемая резонансная частота, m=-1,0,1, n=-2,-1,0,1,2,
а
где Δƒ - полуширина резонансного пика на полувысоте максимальной амплитуды пика,  - коэффициент размаха сканирования, обычно равный ~0,5, b - коэффициент размаха сканирования, обычно равный ~0,1.
В соответствии с этой сеткой (матрицей) частот проводят измерения фазочастотной характеристики способом, указанным выше. Перебор частот производят следующим образом: фиксируют n=-2 и изменяют m от -1 до 1, затем увеличивают n на единицу и т.д. Такой способ исследования резонансного пика дает минимальную погрешность измерения при изменении резонансной частоты в ячейке во время измерения.
Положение резонансного пика определяют по нулю второй производной фазочастотной характеристики в окрестности резонансной частоты. Для этого приближенно определяют (см. Фиг. 1) вторую производную фазы по формуле:
Таким образом, получают зависимость ϕ''(n), которую аппроксимируют прямой (Фиг. 2):
и определяют точку пересечения с осью абсцисс:
Текущую резонансную частоту определяют по формуле:
Текущую ширину резонансного пика определяют по наклону характеристики ϕ''(n):
Описанный выше режим измерений позволяет отслеживать изменения резонансной частоты со временем при выполнении условия
0
2
1
nΔƒ < Δƒ,
что накладывает ограничения на скорость измерения и стабильность условий измерения резонансной частоты в резонансной ячейке с исследуемой жидкостью.
При определении общего белка сыворотки крови была выполнена проверка воспроизводимости, правильности (сравнением с контрольными сыворотками «Randox») и чувствительности предлагаемого способа. В качестве метода сравнения использовался биуретовый метод определения концентрации общего белка в сыворотке крови. Был проведен регрессионный анализ и рассчитан коэффициент корреляции для оценки связи показателей, полученных двумя методами. Получена высокая степень корреляции (r=0,98) для выборки n=100 (количество проб). Все полученные значения соответствуют нормам аналитической точности клинических лабораторных исследований. Чувствительность предлагаемого способа составила менее 10 г/л в интервале концентраций общего белка 10 - 150 г/л. Анализ полученных данный свидетельствует, что результаты вполне удовлетворяют нормам аналитической точности клинических лабораторных исследований.
Воспроизводимость определения параметров липидограммы (определение холестерина общего, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и триглицеридов) производили в сыворотке больных с различным содержанием липидов и контрольных сыворотках. Для оценки правильности определения липидных компонентов были использованы контрольные сыворотки «Serodos» и проведены сопоставительные исследования акустического метода определения липидных компонентов сыворотки крови с традиционными биохимическими методами. Результаты сопоставительных исследований имеют по всем измеренным липидным компонентам коэффициенты корреляции от 0,77 до 0,85, что соответствует высокой корреляционной связи, достаточной для правильной диагностики нарушений липидного обмена. Статистическая обработка данных показала, что средние величины смещения находятся в пределах допустимых значений для показателей липидного обмена.
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет увеличить точность и скорость измерения в ультразвуковых спектрометрах фиксированной длины.