Способ получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови
METHOD FOR PRODUCING AUTOLOGOUS THROMBOCYTE-RICH BLOOD PLASMA

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано при хирургическом лечении идиопатических макулярных разрывов сетчатки.
До настоящего времени ведутся дискуссии о протоколах получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови. Дизайн и используемое лабораторное оборудование во многом разнятся, что объясняется отсутствием стандартизированной технологии.
В получении аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови можно выделить общие ключевые моменты: забор крови, использование антикоагулянта, двухэтапное центрифугирование с использованием различных систем.
Известны различные способы получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови.
Известен способ получения аутоплазмы с богатым содержанием тромбоцитов, получивший название Плазмолифтинг™. На внутренней стенке пробирки в верхней и средней ее части нанесен мелкодисперсионный гепарин натрия, в нижней части разделительный гель, после забора крови пробирку устанавливают в центрифугу, осуществляют центрифугирование. Относительная сила центрифугирования составляет 1000 об/мин в течение 10 минут (Патент РФ на изобретение №2606338). Следует отметить, что разделительный гель, присутствующий в пробирках, адсорбирует клетки, приводя к получению плазмы с низким содержанием тромбоцитов.
Известен способ получения аутологичного тромбоцитного лизата (pHPL), осуществляемый следующим образом: в 6-8 специализированных пробирок с коммерческим названием Plasmolifting, содержащих гепарин и уникальный гель, производят забор крови объемом 9 мл (всего 54-72 мл), пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 6-7 минут при 3700-3800 об/мин. В ходе вращения в центрифуге, кровь разделяется на две основные фракции - эритроцитарно-лейкоцитарный сгусток и плазму крови, содержащую тромбоциты (тромбоцитарная аутоплазма). Затем шприцем (10,0-20,0 мл) из пробирок забирают супернатант, содержащий аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, находящуюся в верхней части пробирки над разделительным гелем помещают в одну пробирку объемом (15,0-50,0 мл) и производят повторное центрифугирование в течение 12-15 минут при 3500-3600 об/мин. Концентрация тромбоцитов в аутоплазме составляет не менее 1000×10 кл/мл. Из обогащенной тромбоцитами аутоплазмы готовят лизат, путем лизиса мембраны тромбоцитов. Тромбоциты аутологичной плазмы лизируют путем двукратного замораживания в жидком азоте (минус 196°С) и быстрого оттаивания на водяной бане (+37°С). Полученный аутологичный тромбоцитный лизат (pHPL) фильтруют через фильтр (0,22 нм) и хранят до использования при температуре минус 20°С. (Патент РФ на изобретение №2652076): Следует отметить необходимость забора большого объема крови, многоэтапность и длительность получения тромбомассы.
Ближайшим аналогом является способ получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови, в которой говорится об эффективном применении аутологичных тромбоцитов в хирургии макулярных разрывов (Konstantinidis, Aristeidis, et al. Efficacy of autologous platelets in macular hole surgery // j. Clinical Ophthalmology / - 2013. - vol. 7, no. 7, p. 745-750). В конце операции на разрыв наносили аутологичный тромбоконцентрат. Получали концентрат следующим путем. Забор 50 мл венозной крови выполняется за 1 час до операции. Данный образец крови смешивают с 6 мл цитрата декстрозы и центрифугируют в режиме 280g (1500 об/мин) в течение 15 минут. Затем выделяется обогащенная тромбоцитами плазма и смешивается с 1/8 объема цитрата декстрозы, после чего снова выполняют центрифугирование в режиме 1000 g в течение 10 минут. Тромбоцитарную массу смешивают с 0,6 мл 0,9% NaCl. Две капли (каждая по 0,1 мл) вводят на поверхность разрыва. По мнению авторов, независимо от скорости вращения центрифуги и времени центрифугирования разделение эритроцитов и тромбоцитов за один этап невозможно.
Недостатком данного способа является то, что забор большого объема крови и двухэтапное центрифугирование усложняет методику, а «ручные» процессы получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы четко не регламентированы (перенос слоев из пробирки в пробирку осуществляется «на глаз» с помощью шприца, пипетки), в результате чего не исключено случайное получение плазмы с заниженным количеством тромбоцитов.
Задачей изобретения является разработка способа получения аутологичной плазмы с высоким содержанием тромбоцитов путем одноэтапного закрытого центрифугирования из небольшого количества крови.
Технический результат, получаемый в результате решения данной задачи, состоит в получении аутологичной богатой тромбоцитами плазмы с высоким содержанием тромбоцитов из небольшого количества крови, путем одноэтапного закрытого центрифугирования, что является доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что расширяет возможности ее применения.
Технический результат достигается тем, что, в способе получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови, включающем забор венозной крови, смешивание с антикоагулянтом и центрифугирование, согласно изобретению, забор крови проводят в подсоединенный к катетеру шприц с предварительно набранным антикоагулянтом в количестве 1,5 мл, при этом для мужчин объем крови составляет 12,5 мл, а для женщин -13,5 мл; затем шприц закрывают, содержимое перемешивают и вводят в пробирку YCELLBIO-KIT иглой 18 G через парацентральное отверстие в крышке пробирки; центрифугирование проводят при комнатной температуре со скоростью вращения 4000 об/мин в течение 5 минут, извлечение слоя богатой тромбоцитами плазмы проводят тупоконечной тонкостенной канюлей 27 G через центральное отверстие в крышке пробирки.
Способ осуществлялся следующим образом.
Образец крови берут из кубитальной вены за 30 минут до операции, перед премедикацией. Подготавливают катетер-бабочку, место прокола обрабатывают 70% спиртом и дают высохнуть. После введения иглы в вену жгут тотчас же расслабляют. Забор крови проводят в подсоединенный к катетеру шприц объемом 20 мл с предварительно набранным антикоагулянтом (Цитрат натрия + Декстроза) - 1,5 мл, учитывая пол пациента и физиологическую норму количества тромбоцитов (12,5 мл для мужчин или 13,5 мл для женщин).
Затем шприц закрывают, перемешивают содержимое путем 6-8-кратного переворачивания или вращения (без встряхивания) и переносят кровь в пробирку YCELLBIO-KIT (РУ № РЗН 2014/2149 от 08.12.2014).
Кровь вводят в парацентральное отверстие крышки пробирки под углом 45° иглой 18 G, что облегчает введение.
Универсальный размер пробирки подходит для всех типов центрифуг: с угловым ротором (угол наклона ротора 45°) и ротор-крестовиной с подвесными стаканами.
Время между взятием образца крови из вены и центрифугированием составляет не более 10 минут. Центрифугирование проводят на лабораторной центрифуге «Armed»:80-2S с угловым ротором при комнатной температуре (от +18 до +24°С). Диапазон скорости вращения прибора - от 1000 до 4000 об/мин с шагом 500 об/мин. Для контроля работы пользуются таймером с установкой времени центрифугирования.
Пробирку с кровью помещают в центрифугу. В противоположную ячейку ставят такую же пробирку, заполненную водой, в качестве противовеса для уравновешивания образцов.
Частоту вращения и времени устанавливают на панели управления прибором: время центрифугирования 5 минут скорость вращения центрифуги 4000 об/мин.
Сужение в центральной части пробирки обеспечивает точное извлечение слоя богатой тромбоцитами плазмы, которое проводят тупоконечной тонкостенной канюлей 27 G через центральное отверстие в крышке пробирки, что облегчает извлечение.
Таким образом, разработан способ получения плазмы, который может найти широкое применение в травматологии, спортивной медицине, стоматологии, косметологии. Для получения плазмы сделаны необходимые практические шаги: налажено производство и осуществляется реализация специализированных пробирок (Номер регистрационного удостоверения: YCELLBIO-KIT (Южная Корея) - РУ № РЗН 2014/2149 от 08.12.2014). Особенности конструкции пробирки позволяют проводить закрытое центрифугирование, что исключает непосредственный контакт крови пациента с внешней средой, предотвращая вторичную контаминацию в ходе манипуляций с кровью и плазмой. Герметичная крышка обеспечивает стерильность и неизменность состава плазмы. Разработанный способ получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови с использованием специализированных пробирок позволит получить плазму с высоким количеством тромбоцитов. Лабораторные исследования подтвердили увеличение тромбоцитов после центрифугирования в указанном режиме, в среднем, в 7-9 раза. Выбранный опытным путем режим: 4000 об/мин в течение 5 минут - это оптимальный режим для того малого объема крови, с которым необходимо работать, чтобы получить плазму для закрытия макулярного разрыва в центральной зоне сетчатки.
При этом способ является малоинвазивным (требуется незначительное количество крови больного), не затратен (не требуется дорогостоящего оборудования и инструментария).
Пример 1.
Пациентка Д., 67 лет. Обратилась с жалобами на искривление и снижение зрения на левом глазу в течение 3 месяцев. При обследовании острота зрения на левом глазу 0,06, коррекция улучшения не давала. ВГД=20 мм рт.ст. На правом глазу патологии не выявлено. При офтальмоскопии левого глаза обнаружены помутнения в кортикальных слоях хрусталика и сквозной дефект в макуле. При дополнительном обследовании на оптическом когерентном томографе подтвержден макулярный разрыв D=576 мкм, без задней отслойки стекловидного тела. Диагноз: OS: Осложненная катаракта. Идиопатический макулярный разрыв. Проведена операция микроинвазивная субтотальная витрэктомия с применением богатой тромбоцитами плазмы, полученной из 13,5 мл крови указанным способом. При контрольной явке через 1 месяц коррегированная острота зрения левого глаза 0,4. ВГД 21 мм рт.ст. При офтальмоскопии: передний отрезок без особенностей, интраокулярная линза (ИОЛ) в капсульном мешке, авитрия, макулярный разрыв блокирован, сетчатка прилежит. При осмотре через 3 месяца после операции коррегированная острота зрения левого глаза 0,8. ВГД 19 мм рт.ст. При офтальмоскопии: передний отрезок без особенностей, ИОЛ в капсульном мешке, авитрия, макулярный разрыв блокирован, сетчатка прилежит.
Пример 2.
Пациент П., 47 лет. Обратился с жалобами на появление пятна в поле зрения правого глаза в течение 7 месяцев. 3 года назад была проведена факоэмульсификация катаракты обоих глаз. При обследовании острота зрения на правом глазу 0,02, коррекция улучшения не давала. ВГД=20 мм рт.ст. На левом глазу патологии не выявлено. ИОЛ в капсульном мешке. При офтальмоскопии правого глаза - ИОЛ в капсульном мешке, в и сквозной дефект в макуле. При дополнительном обследовании на оптическом когерентном томографе подтвержден макулярный разрыв D=720 мкм, без задней отслойки стекловидного тела. Диагноз: OD: Артифакия. Идиопатический макулярный разрыв. Проведена операция микроинвазивная субтотальная витрэктомия с применением богатой тромбоцитами плазмы, полученной из 12,5 мл крови указанным способом. При контрольной явке через 1 месяц коррегированная острота зрения правого глаза 0,3, ВГД 21 мм рт.ст. При офтальмоскопии: передний отрезок без особенностей, ИОЛ в капсульном мешке, авитрия, макулярный разрыв блокирован, сетчатка прилежит. При осмотре через 3 месяца после операции коррегированная острота зрения правого глаза 0,8. ВГД 19 мм рт.ст. При офтальмоскопии: передний отрезок без особенностей, ИОЛ в капсульном мешке, авитрия, макулярный разрыв блокирован, сетчатка прилежит.
С применением богатой тромбоцитами плазмы, полученной указанным способом в ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» прооперировано 512 пациентов. Во всех случаях были получены хорошие результаты, с высоким количеством тромбоцитов, полученных из небольшого объема крови путем одноэтапного закрытого центрифугирования, что сделало технологию получения плазмы проще.