Способ восстановления утраченного объема дермы в эксперименте на крысах
METHOD FOR RECOVERY OF LOST VOLUME OF DERMA EXPERIMENT IN RATS

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии, и может быть использовано для стимуляции заживления обширных ран кожи (после ожогов, травм и др.)
Эффект регенерации кожи как физиологической - в ответ на возрастные ее изменения, так и репаративной регенерации в рамках травмы или какого-либо патологического процесса, остается одной из актуальных проблем современной медицины. [1, 2]. При создании или реконструкции органов одним из важнейших этапов является формирование соединительнотканного каркаса, стромы. Главную роль в создании биологического каркаса играют фибробласты. Эти клетки способны дифференцироваться в несколько клеточных типов. [5]. Трафик фибробластов в место повреждения и их участие в регенеративном процессе может проходить по типу естественного ответа, присущего фибробласту - это активация процесса синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса, состав и организация которого являются специфичным для каждого органа или ткани. Для организации искусственных тканевых заместителей используют чаще всего фибробласты дермы человека и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), обладающие способностью обеспечивать генеративное микроокружение. Исходом этого является активация синтеза фибробластами и клетками МСК компонентов внеклеточного матрикса, который может быть использован уже в качестве биологического каркаса. В последующем он может быть заселен собственными клетками, выращенными in vitro. [3, 4]. Однако уже в сформированном каркасе можно использовать вещества, стимулирующие объема внеклеточного матрикса, и, следовательно, к управлению этим процессом, что является важным не только для косметологии, регенеративной медицины, но и для актуальной проблемы медицины «заживление ран», использующей современные методы лечения, включая клеточную терапию [6].
Известно использование экзогенных эмбриональных фибробластов в косметологии, хирургии, регенеративной медицине. Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную популяцию клеток мезенхимного ряда и играют ключевую роль в процессах регуляции клеточных взаимодействий и поддержания гомеостаза кожи. Способность фибробластов формировать межклеточный матрикс, синтезировать цитокины, вызывать миграцию и пролиферацию разных типов клеток при повреждениях кожи делает их перспективными для широкого клинического применения. [7]. Введение эмбриональных фибробластов позволяет ускорить процесс формирования зрелой соединительной ткани на более ранних сроках, положительно влияя при этом на структуру и прочность рубца, однако не исключен риск заражения пациента инфекционными агентами (HIV, RW, HCV и др.), а также риск развития аллергических реакций, возникают трудности с поиском подходящих доноров.
За ближайший аналог принят способ лечения острых ран и ожогов с использованием аллогенных фибробластов в составе кожных эквивалентов. [8]. Пересаженные на кожу клетки закрывают раневой дефект и стимулируют дерму, выделяемыми аутокинами (факторами роста, цитокинами и др.) Они действуют на собственные фибробласты, повышая их синтетическую и пролиферативную активность. Применение аллофибробластов способствует восстановлению дермы, ускорению заживления ран, снижению риска образования рубцов.
Недостатки: жизненный срок аллогенных фибробластов в трансплантате весьма ограничен. Так, при использовании кожного трансплантата аллогенные фибробласты не обнаруживаются уже через 6 недель после нанесения препарата на свежие раны. Использование клеточных технологий в медицинской практике не обеспечивает биологической безопасности применяемых препаратов. Для биологической безопасности культивируемых клеток использование культуральных сред и сывороток, культивирование, тестирование клеток на наличие вирусных инфекций и микоплазм, онкогенных свойств, патологических трансформаций клеток, стабильности хромосомного аппарата требуются специальные условия. Доказано, что при длительном культивировании фибробласты теряют способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, возникает риск накопления в клетках хромосомных аномалий.
Задачами изобретения являются: использование импланта с длительным сроком жизни, который, по сравнению с аллогенными клетками сохраняется дольше и имеет более длительный клинический эффект, при этом исключить риск заражения пациента инфекционными агентами, а также риск развития аллергических реакций и других побочных эффектов. Провести управляемый процесс активации собственных клеток (фибробластов) дермы с исходом в неоколлагеногенез, достигнув при этом сокращения сроков лечения и полного восстановления обьемов утраченной дермы.
2
Сущность изобретения: Способ предусматривает стимуляцию синтетической активности фибробластов с исходом в неоколлагеногенез, отличающийся тем, что в зону утраченного объема дермы на 12-15 день после нанесения раны однократно вводят по 0.05-0.10 мл на каждый 1 см препарата Радиесс и через 30 дней инъекции профилактически повторяют в том же режиме.
Технический результат: основным действующим веществом препарата «Радиесс» является гидроксиапатит кальция - естественная составляющая костной ткани, поэтому он имеет полную биосовместимость с организмом человека. «Радиесс» зарекомендовал себя как непирогенный, когезивный, субдермальный препарат, не обладающий токсичностью и мутагенностью, имеет большое преимущество перед широким спектром других препаратов: работает как классический филлер, вовлекает фибробласты в активный синтез волокнистого компонента дермы (коллаген), ускоряя восстановление утраченных объемов в 3-4 раза, обеспечивая сохранение эффекта на протяжении 6-10 мес. Предлагаемый способ гарантирует отсутствие осложнений, заживление идет без образования рубцов. Положительный эффект появляется через 7-10 дней после воздействия, полное восстановление на 40-45 день, результат устойчивый Способ апробирован на 25 крысах в течение двух лет. Подтвержден ожидаемый технический результат.
2
2
Способ осуществляют следующим образом: обезболивание лабораторных крыс проводят с использованием ингаляционного наркоза, например препаратом «Севаран». Для моделирования ожоговой раны используют латунный цилиндр площадью рабочей поверхности 706 мм, массой 100 г, нагретый до 100°С в кипящей воде. После нагрева цилиндра его прикладывают рабочей поверхностью к депилированной коже лабораторного животного на 15 секунд, что обеспечивает формирование ожога III степени. Препарат вводят инъекционно на 15 день после нанесения раны, этот период обеспечивает отторжение струпа и начало эпителизации поверхности раны. Для инъекции используют иглы 25-32 G и шприц. Инъекции проводят интрадермально по принципу микропапул, каждая, в объме 0,05-0,1 мл на 1 см раневой поверхности. Объем препарата варьирует в указанных пределах в зависимости от состояния животного - от нескольких инъекций до 50 за сеанс. Для активации фибробластов по пути синтеза экстрацеллюлярного матрикса и ускорения процесса неоколлагеногенеза через 30 дней после первой инъекции введение препарата повторяют. Для сведения болевых ощущений к минимуму, поверхность кожи предварительно обрабатывают спреем с анестетиком (ледокаин - спрей 10%). «Радиесс» нетоксичен, имеет предельно низкие антигенные свойства, постепенная резорбция проходит без признаков рубцевания, а также обратного развития поствоспалительных изменений в тканях. Изобретение иллюстрируется следующими экспериментальными и клиническими примерами:
2
Пример 1. Беспородная крыса-самец в возрасте 45 дней и весом 200 г. Крысе на 14 день после нанесения раны обработали поверхность кожи спреем с анестетиком и ввели интрадермально по принципу микропапул 0,1 мл препарата Радиесс на 1 см раневой поверхности (6 уколов). К 15-м суткам на фоне введения филлера эффект заживления учтен, когда у животного контрольной группы закрытие раневой поверхности произошло не полностью. Для активации синтетической активности фибробластов и получения устойчивого результата через 30 дней после первых инъекции введение препарата повторили. В результате лечения утраченный обьем ткани восстановился полностью без образования рубцов, развития аллергических реакций и других побочных эффектов.
2
Пример 2. Беспородная крыса-самец в возрасте 45 дней и весом 200 г. В связи с тем, что ожоговая рана была менее глубокой, чем в примере 1, крысе на 13 день после нанесения раны обработали поверхность кожи спреем с анестетиком и ввели интрадермально по принципу микропапул 0,05 мл препарата Радиесс на 1 см раневой поверхности (6 уколов). К 10-м суткам на фоне введения филлера эффект заживления учтен, когда у животного контрольной группы закрытие раневой поверхности еще не произошло. Для получения устойчивого результата через 30 дней после первых инъекций введение препарата повторили. Утраченный обьем ткани восстановился полностью без образования рубцов, аллергические реакции и другие побочные эффекты отсутствовали.
В перечисленных примерах положительный эффект был устойчивым и сохранялся весь период наблюдения (2 года).
Литература.
1. Lemperle G., Knapp Т., Sadick N., Lemperle S.M. Arte Fill permanent injectable for soft tissue augmentation. I. Mechanism of action and injection techniques.// Aesth Plast Surg. 2010. Vol. 34. P. 264-272. DOI: org/10.1007/s00266-009-9413-1.
2. Quan Т., Fisher G.J. Role of age-associated alterations of the dermal extracellular matrix microenvironment in human skin aging: a mini-review experimental section.// Gerontology. 2015. Vol. 61.P. 427-434. DOI: 10.1159/000371708 a16
3. Chang F. Shen Y., Ponnus wamy Mohanasundarametall. Vimentin coordinates fibroblast proliferation and keratinocyte differentiation in wound healing via TGF-P-Slug signaling.// Proc. Natl AcadSci USA. 2016.Vol. 113(30). P. 4320-4327. DOI: org/10.1073/pnas. 1519197113.
4. Quan Т., Fisher G.J. Role of age-associated alterations of the dermal extracellular matrix microenvironment in human skin aging: a mini-review experimental section.// Gerontology. 2015. Vol. 61.P. 427-434. DOI: 10.1159/000371708 a16.
5. Бозо И.Я., Деев P.B., Пинаев Г.П. «Фибробласт» - специализированная клетка или функциональное состояние клеток мезенхимального происхождения?// Вестник эстетической медицины. 2011. том 10, №2. Р. 99-108
6. Клеточные и молекулярные основы заживления ран.//Морфология. 2016. Т. 10(3). С. 19-23.
7. М. Petreaca, М. Martins-Green. Pluripotent stem cells.// Handbook of Stem Cells (Second Edition), 2013
8. Donati G. Watt F. Stemcell heterogeneity and plasticity in epithelia. //Cell Stem Cell. 2015;Vol. 16. P. 465-76.