Показатели активности щелочной фосфатазы и эстераз сестона в мониторинге поверхностных вод: теоретические предпосылки и перспективы использования

ваться к современным условиям и искать новые формы в своей деятельности. Целесообразно рассмотреть возможность вольерного содержания кабана, фазана и некоторых других охотничьих объектов в заказнике и при увеличении их поголовья — реализацию излишнего поголовья (в другие заказники, охотничьи хозяйства и т.д.).

- Заказник является государственным учреждением и различные, прежде всего государственные, организации должны оказывать ему помощь в сохранении окружающей среды и охране ресурсов животного мира (судебные органы, милиция, казачьи дружины и др.), обеспечении кормовой базы животным (приро-допользователи), научном обосновании и практическом сохранении полезных и редких видов биоты (Ростовский зоопарк, Ботанический сад, Ростовский госуниверситет и др.), вольерном содержании животных (Ростовский зоопарк) и других видах деятельности.

- С 90-х гг. XX в. заметно сократилась природоохранная пропаганда, снизился уровень экологического сознания и культуры населения, что негативно сказывается на природных, ресурсах, в том числе и находящихся в заказнике. Это заставляет все природоохранные и природопользующиеся структуры, в том числе и сотрудников Охотуправления, заказников

Ростовский государственный университет___________________________'___________________10 апреля 2003 г.

УДК 577.152.31:504.45.064.36:001

ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ И ЭСТЕР АЗ СЕСТОНА В МОНИТОРИНГЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

© 2003 г. Л.М. Предеина, Ю.А. Федоров, Е.В. Морозова, К.К. Уразаев, М.Н. Предеин

A generalized indicator for Z surface water quality that is calculation on the bases of values for the activity of hydrolytic enzymes of seston - alkaline phosphatase and esterases is suggested.

активизировать природоохранную пропагандистскую работу.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта по фундаментальным исследованиям в области естественных и точных наук Минобразования Российской Федерации № 02-6.0-331.

Литература

1. Демина О.Н. Растительный покров дельты реки Дон: Автореф. дис.... канд. биол. наук. Воронеж, 1996.

2. Карелов А.М. и др. Учебная книга промыслового охотника. Кн. 1: Биология промысловых животных и основы охотоведения. М., 1989.

3. Нечаев Б.А. // Природа донского края. Ростов н/Д, 1978. С. 171-182.

4. Оценочные показатели лесного фонда как среды обитания объектов животного мира. Одобрено и рекомендовано в печать НТС МПР Российской Федерации (протокол № 1 от 25.05.01 г.). М., 2001.

5. Экологический атлас Ростовской области / Под ред. В.Е. Закруткина. Ростов н/Д, 2000.

6. ’ Миноранский В.А. Состояние основных видов охот-

ничьих животных на территории Ростовской области (изменение численности, мониторинг). Ростов н/Д, 2001.

Теоретические предпосылки

Одним из основных способов, которыми биосфера поддерживает сбалансированность биогеохимического круговорота в условиях антропогенного воздействия на экосистемы, является увеличение интенсивности метаболизма биоценозов. В этой связи определенная степень загрязненности водных экосистем характеризуется соответствующим уровнем интенсивности метаболизма биоты, который обусловлен целым комплексом явлений, характеризующих состояние экосистемы: биомассой, видовым разнообразием и пространственно-временной структурой биоценозов, уровнем энтропии, характером межвидовых отношений [I].

Однако при высоком загрязнении, оказывающем токсическое воздействие на водные организмы, уровень метаболизма сообществ гидробионтов снижает-

ся, что приводит к нарушению сбалансированности круговорота веществ в экосистеме и в конечном итоге к ее гибели.

Интенсивность метаболизма в водных экосистемах оценивается главным образом скоростью продукции и деструкции органического вещества. Эти показатели в связи с трудностями методического характера не нашли широкого использования в мониторинге качества вод. Однако об интенсивности метаболизма гидробиоценозов можно судить и по активности ряда неспецифичных внеклеточных ферментов, которые участвуют в деградации определенных классов органических веществ как природного, так и антропогенного происхождения.

С точки зрения оценки скорости деструкции органического вещества в водных экосистемах наиболее

показательными, по-видимому, будут ферменты, участвующие в трансформации соединений биогенных элементов, в частности щелочная фосфатаза и эстера-зы, гидролизующие органические соединения фосфора и углерода. Субстратами щелочной фосфатазы являются фосфомоноэфиры, фосфаты фенолов, ацилфосфаты, диарилфосфаты, фосфоамид, неорганический пирофосфат и др. [2, 3]. Эстеразы гидролизуют эфиры карбоновых кислот, а также производные амидов.

Активность щелочной фосфатазы и эстераз в пресноводных экосистемах зависит главным образом от количества этих ферментов в среде и от скорости катализируемых ими реакций, на которую влияют pH, температуры среды, концентрации субстрата, а также присутствие активаторов и ингибиторов ферментов. Активаторами щелочной фосфатазы являются ионы магния, некоторые металлы, такие как марганец, кобальт, цинк, если они присутствуют в очень низких концентрациях, порядка КГ6 моль/л, некоторые аминокислоты [2, 3]. К ингибиторам фермента относятся тяжелые металлы в повышенных концентрациях, формальдегид, изоцианаты, некоторые комплексооб-разователи и окислители. Ингибиторами неспецифичных эстераз являются фосфорорганические соединения, эзерин, арсанилат, ионы фтора [2].

Количество фермента определяется прежде всего численностью и видовым составом продуцирующих их водорослей и бактерий, а также интенсивностью процесса синтеза и секреции ферментов организмами. Отсюда все факторы, влияющие на численность основных продуцентов щелочной фосфатазы и эстераз и на интенсивность синтеза и секреции ферментов в среду, будут оказывать влияние и на активность этих ферментов. Таким образом, к числу основных факторов, регулирующих активность щелочной фосфатазы и эстераз, следует отнести прежде всего соединения биогенных элементов и особенно их минеральные формы.

Данные натурных исследований свидетельствуют о том, что, как правило, существует прямая зависимость между активностью названных ферментов, с одной стороны, и численностью фитопланктона, бак-териопланктона, а также концентрациями азота и органического фосфора - с другой [4-8]. В этой связи были предприняты попытки использования активности щелочной фосфатазы в качестве показателя эв-трофирования пресноводных экосистем [9].

Что касается минерального фосфора, то его влияние на активность щелочной фосфатазы и эстераз характеризуется некоторыми особенностями. Если для эстераз с точки зрения ферментативной кинетики минеральный фосфор является индифферентным веществом и не должен влиять на каталитические свойства фермента, то для щелочной фосфатазы ортофосфат -конкурентный ингибитор, который угнетает не только скорость ферментативного гидролиза, но и интенсивность синтеза и секреции молекул фермента как со-

пряженных процессов [7, 10]. Однако исследования, проведенные на значительном количестве водных объектов, свидетельствуют о наличии прямой зависимости между концентрацией неорганического фосфора и активностью как щелочной фосфатазы, так и эстераз [11, 12]. Это казалось бы явное противоречие вполне объяснимо. Повышение концентраций неорганического фосфора неизбежно приведет к росту численности планктонных организмов, что должно увеличить количество обоих ферментов в водной среде, ' поскольку даже для щелочной фосфатазы существует механизм конститутивного синтеза, который не репрессируется повышенным содержанием фосфора в среде [13]. По данным [14], добавки неорганического фосфора в концентрациях 0,2-0,8 мг/л, которые являются высокими для природных вод, приводили лишь к частичному, не более 30 %, подавлению фосфатаз-ной активности. Таким образом, активность внеклеточной щелочной фосфатазы будет зависеть от соотношения названных механизмов ее регуляции неорганическим фосфором. Чаще, по-видимому, превалируют механизмы регуляции, в результате которых ингибирование фермента и репрессия его синтеза неорганическим фосфором экранируются быстрым ростом численности планктона, в результате чего повышение концентраций ортофосфата в среде приводит к увеличению общей активности щелочной фосфатазы.

Таким образом, представленные сведения позволяют предположить о том, что значения активности названных ферментов могут быть информативными показателями загрязнения вод соединениями азота, фосфора и органическими веществами.

Материалы и методы

Исследования проводились в комплексных экспедициях на более чем 30 водных объектах бывшего СССР, включая реки Волгу, Дон, Северский Донец, Уфу, Белую, Тобол, Иртыш, Малую и Большую Алма-Атинку, озера Ладожское, Чудско-Псковское, Валдай, водохранилища Цимлянское, Куйбышевское, Бухтар-минское, Капчагайское и др. Пробы воды отбирались летом в период интенсивного развития планктонных сообществ. Определяли активность прикрепленных к клеткам ферментов по [11], поскольку именно эта форма внеклеточных ферментов наиболее адекватно отражает функциональное состояние фитопланктона и бактериопланктона в момент отбора проб. Для этого водоросли осаждали на мембранном фильтре с диаметром пор 0,45 мкм, смывали 6-ю мл дистиллированной воды и сразу же помещали по 1 мл взвеси в инкубационную среду для определения активности ферментов, содержащую для щелочной фосфатазы 0,5 мл 0,3 моль/л гидрокарбонатного буфера, pH 10,0 и 0,7 мл 0,35 % водного раствора а-нафтилфосфата, для эстераз - 0,5 мл 0,1 моль/л трис-НС1 буфера, pH

7,4 и 0,1 мл 0,25 %-го раствора а-нафтилацетата в этаноле. После инкубирования ферментов при 30 °С в

термостате в течение 0,5 ч для эстераз и 1,0 ч для щелочной фосфатазы в пробирки приливали по 0,2 мл 0,1 % раствора РР-соли для связывания образовавшегося в результате ферментативной реакции а-нафтола в окрашенный комплекс. Через 3 мин для щелочной фосфатазы приливали по 0,4 мл 10 % раствора гидроксида натрия, для эстераз - по 0,4 мл 5 % раствора трихлоруксусной кислоты, а затем по 2 мл ацетона и дистиллированной воды. Растворы фильтровали через бумажный фильтр и фотометрировали при Х= 530 нм для щелочной фосфатазы и Х,=460 нм для эстераз.

Гидрохимические показатели качества вод определяли общепринятыми в системе Росгидромета методами.

Результаты и обсуждение

Обобщение результатов проведенных исследований показало, что активность обоих ферментов в целом возрастала с увеличением загрязненности вод. Особенно наглядно влияние загрязнения на ферментативную активность проявилось на водотоках. В табл. 1 приведены данные исследований, проведенных на участке реки Северский Донец в районе г. Лисичанска. Пробы воды отбирались в течение трех дней подряд на стационарных станциях государственной сети наблюдений Росгидромета.

Наиболее низкие значения активности обоих ферментов наблюдались на фоновой станции, расположенной в 19,8 км выше черты города. Ниже сбросов сточных вод промышленных предприятий показатели активности ферментов возрастали в 3-10 раз. На станции, расположенной ниже города, в результате процессов самоочищения активность обоих фермен-

тов вновь уменьшалась, не достигая, однако, фоновых значений. Сравнение активности эстераз и щелочной фосфатазы с некоторыми гидрохимическими показателями свидетельствовало о явно выраженной тенденции возрастания активности ферментов с увеличением содержания в воде фенолов, аммонийного и нитритного азота.

В комплексных исследованиях, проведенных в нижнем течении р. Дон и на малых реках Ростовской области, Тузлов и Большая Крепкая, наблюдалась та же тенденция, что и на р. Северский Донец. Воды р. Дон и малых рек отличались по характеру загрязнения. Тем не менее активность обоих ферментов возрастала с увеличением концентраций приоритетных загрязняющих веществ [15].

Таким образом, повышение активности щелочной фосфатазы и эстераз сестона является ответной реакцией планктонных сообществ на воздействие не какого-то определенного вещества, а на комплекс загрязняющих веществ.

Анализ всего массива полученных данных показал, что активность щелочной фосфатазы изменялась в широком интервале значений от 0,02 до 80,0 мкмоль/(л-ч) а-нафтола, эстераз - от 0,1 до 130,0 мкмоль/(л-ч) а-нафтола. Гидрохимические показатели качества вод варьировали от значений ниже ПДК до превышающих ПДК в 50 раз и более.

Парный корреляционный анализ выявил наличие достоверной положительной корреляции активности обоих ферментов с аммонийным азотом и неорганическим фосфором, отрицательной — с растворенным кислородом. Активность щелочной фосфатазы коррелировала также с показателем БПК5 (табл. 2).

Таблица 1

Активность щелочной фосфатазы и эстераз сестона и некоторые гидрохимические показатели качества воды р. Северский Донец в районе г. Лисичанска в июне 1989 г.

Створ реки Дата АЩФ АЭ pH 02, мг/л NHA мг/л N NCV, мг/л N N03\ мг/л N Фенолы, мг/л бпк5, мг/л 02 ХПК, мг/л О

19,8 км выше 12.06 0,02 0,14 - _ - - - - - —

г. Лисичанска 13.06 0,04 0,19 - - - - - — - -

14.06 0,01 0,21 8,0 6,76 0,58 0,071 3,08 0,002 2,92 91

Ниже сбросов 12.06 0,33 0,59 - - - - - - -

РПО «Краситель» 13.06 0,19 0,72 - - - - - - -

14.06 0,36 0,56 8,0 6,42 1,4 0,088 5,86 0,011 23,38 111

Ниже сбросов 12.06 0,14 0,68 - - - - - - - _

завода «Лиссода» 13.06 0,18 0,79 - - - - - - -

14.06 0,14 0,56 7,9 6,42 2,8 0,111 3,78 0,011 2,70 121

Устье р. Беленькой 12.06 0,22 0,43 - - - - - - - _

13.06 0,69 0,70 - - - - - - - -

14.06 0,80 0,95 8,1 5,98 3,16 0,390 4,06 0,009 3,52 130

4 км ниже 12.06 0,09 0,46 - - - - - — - —

г. Лисичанска 13.06 0,13 0,47 - - - - - - - _

14.06 0,15 0,48 7,9 6,08 1,92 0.12 2,06 0,003 3,04 101

Примечание.' АЩФ - активность щелочной фосфатазы, мкмоль/(л-ч) а-нафтола,«-» — данные отсутствуют.

мкмоль/(л ч) а-нафтола, АЭ - активность эстераз,

Таблица 2

Коэффициенты корреляции между активностью ферментов сестона и некоторыми гидрохимическими показателями качества воды

Активность ферментов Г идрохимические показатели

NH/ no2- NO,’ Р043' ХПК БПК, о2, НФПР

АЩФ АЩФ** АЭ АЭ** 0,50* 0,59* 0,43* 0,50* 0,06 0,08 0,06 0,07 -0,09 -0,09 -0,08 -0,08 0,37* 0,88* 0,35* 0,85* 0,08 0,10 0,03 0,03 0,24* 0,27* 0,17 0,19 -0,54* -0,59* -049* -0,54* 0,09 0,09 0,09 0,07

Примечание. АЩФ - активность щелочной фосфатазы, АЭ - активность эстераз, НФПР - нефтепродукты, * - значимые коэффициенты корреляции, ** - из массива данных исключены пробы с высокими (>30 ПДК) концентрациями тяжелых металлов.

При анализе массива полученных данных обнаружено, что в пробах с высокими концентрациями тяжелых металлов, превышающими ПДК в 30 раз и более, активность обоих ферментов была очень низкой, несмотря на высокий уровень загрязнения по другим гидрохимическим показателям. Исключение этих проб из общего массива данных существенно увеличило выявленные коэффициенты корреляции.

Уменьшение активности ферментов в присутствии высоких концентраций тяжелых металлов обусловлено, по-видимому, не только их ингибирующим эффектом, но и токсическим воздействием на планктонные организмы, в результате которого снижается численность фитопланктона и бакгериопланктона и соответственно количество секретируемых в окружающую среду ферментов. Пробы, в которых концентрации тяжелых металлов превышали ПДК в 30 раз и более, в дальнейших расчетах не учитывались.

Экспертная оценка полученного массива данных показала, что в некоторых ситуациях значения активности одного из ферментов не соответствуют загрязненности вод и находятся на фоновом уровне. Это может быть связано с присутствием в пробах воды специфических для данного фермента ингибиторов. Кроме того, возможно, что комбинированное воздействие различных факторов в определенных сочетаниях может привести к снижению активности лишь одного фермента, поскольку механизмы регуляции фос-фатазной и эстеразной активности различаются. Случаи одновременного угнетения активности обоих ферментов наблюдались лишь при высоких концентрациях тяжелых металлов.

В этой связи был проведен канонический анализ [16], в результате которого получено регрессионное уравнение зависимости двух канонических переменных с высоким коэффициентом канонической корреляции (11=0,89). В одну каноническую переменную вошли показатели активности ферментов, в другую -некоторые гидрохимические показатели:

0,847у! + 0,161у2= 0,007x1 + 0,029х2 + 0,933х3 +

+ 0,075х4-0,067х5,

где у^ активность щелочной фосфатазы, мкмоль/(л-ч) а-нафтола; у2 - активность эстераз, мкмоль/(л-ч) а-нафтола; XI - концентрация аммонийного азота, мг/л; х2 - концентрация нитритного азота, мг/л; х3 - концентрация неорганического фосфора, мг/л; х4 _ значение БПК5, мг/л 02; х5- концентрация кислорода, мг/л.

Столь высокий коэффициент канонической корреляции свидетельствует о том, что по активности двух ферментов, щелочной фосфатазы и эстераз, можно с

высокой надежностью судить об уровне загрязнения воды соединениями азота, фосфора и легко окисляемыми органическими веществами, имеющими зачастую антропогенное происхождение.

Используя подходы множественного шкалирования, получили регрессионное уравнение зависимости обобщенного показателя качества воды Z с активностью щелочной фосфатазы (X)) и эстераз (Х2) сестона:

Ъ - -0,247 + 0,077Х] + 0,008Х2.

Этот показатель, рассчитанный на основе значений активности щелочной фосфатазы и эстераз сестона, позволяет описывать определенное качество поверхностных вод суши. Для конструирования шкалы качества воды были рассчитаны значения показателя Z по уравнению (2) для всего массива данных и путем экспертного анализа установлены интервалы значений Ъ, соответствующие разному уровню загрязнения вод по аммонийному и нитритному азоту, неорганическому фосфору, БПК5 и кислороду, с использованием в качестве критерия рыбохозяйственных ПДК (табл. 3). Учитывая тот факт, что приведенные гидрохимические показатели являются основными при разработках различных обобщенных показателей качества вод, предложенный способ оценки уровня загрязненности воды может быть рекомендован для режимного и, в особенности, оперативного мониторинга качества поверхностных вод для выявления неблагоприятных экологических ситуаций, обусловленных повышенным содержанием соединений азота, фосфора и органических веществ.

При использовании фосфатазной и эстеразной активности в комплексном мониторинге по значениям

Таблица 3

Соответствие значений ПДК некоторых гидрохимических показателей качества вод

Значения показателя Z Превышение ПДК по одному или нескольким показателям из числа Ш4+, N02", РОД 02, бпк5

Z< -0,237 <пдк

-0,237<Z<-0,090 в 1-Ю раз

-0,090<Z<-0,015 в 10-50 раз

Z>-0,015 > 50 раз

активности ферментов можно судить о степени комбинированного влияния загрязняющих веществ на метаболизм планктонных сообществ, а также выявлять наличие токсического воздействия тяжелых металлов. В этом случае рассчитанный показатель Z при сопоставлении с содержанием - минеральных форм азота и фосфора будет существенно ниже указанных в табл. 3 значений.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минпромнауки РФ, грант № НШ - 1967.2003.5

Литература

1. Абакумов В.А. Комплексный глобальный мониторинг состояния биосферы. Т. 1 // Тр. 3-го Междунар. симп. Л., 1986. С. 191-202.

БерстонМ. Гистохимия ферментов. М., 1964.

Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т.1. М., 1982.

Брызгало В.А., Хоружая Т.А., Предеина Л.М. и др. II Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. Вып.2. Л., 1989. С. 85 - 108.

Heath R.T. II Can. J. Fish. Aquat. Sei. 1986. Vol. 43. № 2. P. 343-350.

Heath R.T., Cook G.D. // Verh. Internat. Verein Limnol. 1975. Vol. 19. P. 959-965.

Kobori H., Taga N. II Mar. Biol, and Ecol. 1979. Vol. 36.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11

№1. P. 23-39.

Taga N.. Kobory H. II Marine Biology. 1978. Vol. 49. P. 223-229.

Милиус А.Ю., Парк Т.И., Кываск В. О. Антропогенное евтрофирование природных вод // Тез. докл. II Всесо-юз. совещ. Ч. 2. Звенигород, 19-23 дек. 1977. Черноголовка, 1977. С. 233-237.

Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М., 1987.

Предеина Л.М. Методы определения активности внеклеточных эстераз и щелочной фосфатазы сестона и возможности их использования для оценки уровня ев-трофирования и загрязнения пресноводных экосистем: Автореф. дис___канд. хим. наук. Ростов н/Д, 1992. *

12. Предеина Л.М. И Закономерности океанографических и экологических процессов в Азовском море. Апатиты, 2000. С. 88-97.

13. Несмеянова М.А., Гонта С.А., Кулаев И.С. И Докл. АН СССР. 1976. Т. 224. Ха 3. С. 710-712.

Трифонова С.И. // Водн. ресурсы. 1990. № 3. С. 96—99. Федоров Ю.А., Предеина Л.М. // Безопасность жизнедеятельности, охрана труда и окружающей среды. Вып. 2. Ростов н/Д, 1998. С. 80-81.

Болч Б., Хуань К.Дж. Многомерные статистические методы для экономики. М., 1978.

14.

15.

16.

Ростовский гидрохимический институт Росгидромета

23 мая 2003 г.

УДК 551.510.7

КРИПТОН-85 В ОСАДКАХ НА ЮГЕ РОССИИ

© 2003 г. В.В. Пронько, И.О. Невинский

Procedure .of extraction of 85Kr from water samples is described. Work will be carried out with the purpose of development of methods of isotope’ dating natural waters, an estimation of ecological influence of the nuclear power stations and studying the processes of washing away of isotopes from an atmosphere. The data on activity 85Kr in the precipitations and monthly changes first time are received. In 2000 - 2001 years were observed activity 83Kr in the precipitations from 2,1 up to 9,5 105Bq/l.

В связи с пуском Ростовской АЭС большой интерес с точки зрения радиоэкологии вызывает измерение 85Кг в атмосфере и гидросфере прилегающих регионов. Криптон как инертный газ не принимает участия в химических реакциях и не вступает в соединения, однако может существенно влиять на окружающий мир, изменяя его электрическое состояние. Интерес представляет также измерение криптона-85 в подземных водах с целью их датирования, так как он охватывает диапазон возрастов, в которых тритиевый и углеродный метод дают неопределенность. Кроме того, нет экспериментального материала о величине радиоактивности атмосферных осадков, обусловленной 85Кг [1]. Вообще процесс удаления аэрозольных примесей и инертных радиоактивных газов из атмосферы представляет особый интерес, так как позволяет изучать взаимодействие между литосферой, гидросферой, атмосферой и космосом.

В нашей работе сделана попытка определения содержания 85Кт в осадках на территории Краснодарского края. Работы проводились в течение 2000-2001 гг. в станице Холмская (Абинский район), где расположена пробоотборная площадка. Отбор осадков осуществлялся с помощью воронки диаметром

3,5 м, с которой вода поступала в полиэтиленовый бак емкостью 100 л (всего использовалось три таких бака). Пробы накапливались в течение каждого месяца в количестве до 300 л.

Основное ограничение широкого применения криптонового метода на практике [2] связано с необходимостью отбора большого объема проб в полевых условиях (до 500 л из-за крайне низкой концентрации), многоступенчатой очисткой выделенного газа, измерением редких радиоактивных распадов с применением специфической низкофоновой техники.