Способ оценки клеточного иммунитета при молозивном вскармливании животных
METHOD FOR EVALUATING CELL IMMUNITY IN MILK-FEEDING ANIMALS

Изобретение относится к иммунологии, экспериментальной медицине и касается диагностики, лечения и профилактики иммунодифицитных состояний новорожденных животных (мыши, крысы, кролики, телята…)
Известен способ оценки гуморального иммунитета. В начальный период лактации (молозивный период) учитывается только уровень иммуноглобулиов, который говорит о степени готовности гуморального иммунитета обеспечивающего защиту новорожденного от инфекции. Сведения об участии клеточного иммунитета в формировании резистентности к инфекционным заболеваниям отсутствуют. Известно также присутствие в молозиве значительного количества клеток лейкоцитарного ряда, причем от количества клеток в молозиве зависит степень предлактационной подготовки молочной железы к лактации. Что позволяет прогнозировать последующую молочную продуктивность (патенты на изобретение №1432377, №2444999).
Недостатком известных способов является высокая стоимость и продолжительность анализов молозива на присутствие иммуноглобулинов. Кроме того, совершенно не учитывается роль иммунокомпетентных клеток матери поступающих в молозиво и молоко в формировании иммунитета детеныша (мыши, крысы, кролики, телята…)
Техническим результатом является оценка наличия клеточного иммунитета у новорожденного мышенка-самца при молозивном вскармливании.
Технический результат предлагаемого изобретения достигается путем приготовления и окраски мазка крови и костного мозга по Паппенгейму с последующим подсчетом лейкоцитов в мазках крови и костного мозга, анализа лейкограмм мазков крови и костного мозга, и при обнаружении Т- и В-лимфоцитов с тельцами Barra в костном мозге у новорожденных мышат-самцов, на основании выполненных исследований путем анализа крови костногомозга, фиксируют наличие клеточного иммунитета. Способ оценки клеточного иммунитета осуществлялся на новорожденных линейных мышах-самцах молозивного периода. Для опыта отбирали клинически здоровых новорожденных мышат-самцов.
Была сформирована группа животных в количестве 5 новорожденных мышат-самцов.
1. Взятие крови:
Для исследования использовали кровь. Небольшое количество (2-3 капли) крови получают после ампутации кончика хвоста. Перед ампутацией хвост подогревают водой температурой 40-45°C и дезинфицируют. После взятия крови рану на хвосте прижигают раствором йода (1).
2. Приготовление мазка крови: Каплю крови наносят недалеко от края на тщательно вымытое и обезжиренное предметное стекло. Мазок делают шлифовальным стеклом, поставив его под углом 45° к предметному впереди капли. Подведя стекло к этой капле, ждут, пока кровь расплывается вдоль его ребра, затем быстрым легким движением проводят шлифованное стекло вперед, не отрывая от предметного раньше, чем иссякнет капля. Правильно сделанный мазок имеет желтоватый цвет (тонкий), не достигает краев стекла и заканчивается в виде следа (усов) (2).
3. Приготовленные мазки крови высушивают на воздухе.
4. Комбинированная окраска Мая-Грюнвальда-Романовского-Гимзы по Паппенгейму.
На нефиксированный мазок наливают пипеткой готовый краситель - фиксатор Мая - Грюнвальда, представляющий собой раствор эозинметиленового синего в метиловом алкоголе, на 3 минуты. Через 3 минуты к покрывающей мазок краске добавляют равное количество дистилированной воды и продолжают окрашивание еще 1 минуту. После этого краску смывают и мазок высушивают на воздухе. Затем высушенный мазок докрашивают свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 8-15 минут (2).
5. Получение костного мозга из бедренной кости
При проведении исследований у новорожденных мышат-самцов использовали материал, непосредственно отобранный из проксимального отдела бедренной кости.
2
У новорожденных мышат-самцов получить костный мозг проще всего из бедренной кости. Мышь, забитую с помощью С0 или путем цервикальной дислокации, кладут на спинку и растянутые передние и задние лапки прикалывают четырьмя булавками к пробковой пластинке.
С задней лапки и нижней части живота удаляют большой лоскут кожи для лучшего обозрения места операции. Затем перерезают коленное сухожилие. Удаляют с верхней части кости мышечную ткань. Бедренную кость слегка поднимают хирургическими пинцетами и перерезают коленный сустав. Затем кость снова поднимают и отрезают мышцы ее нижней части. Кость приподнимают так, чтобы суставная капсула, прикрепляющая бедро к подвздошной кости, натянулась и ее легко было перерезать.
Перед взятием костного мозга остатки мышечной ткани удаляют с помощью салфетки. Извлекают костный мозг, отрезав головку бедра, кусочек большого вертела и кусочек мыщелка на другом конце кости. Затем проделывают отверстия 6 обоих губчатых концах кости при помощи шприца па 2 или 5 мл с иглой 250X0,6. Костный мозг извлекают, промывая костномозговую полость шприцем с 1-2 мл сбалансированного солевого раствора (CP). О том, насколько полно удален костный мозг, можно судить по цвету диафиза кости. Промыванием с помощью CP можно удалять костный мозг и из других длинных костей (1).
6. Приготовление мазка красного костного мозга.
Каплю костного мозга наносят недалеко от края на тщательно вымытое и обезжиренное предметное стекло. Мазок делают шлифовальным стеклом, поставив его под углом 45° к предметному впереди капли. Ребром шлифовального стекла с поверхности забирают небольшое количество пунктата, затем этим же стеклом делают мазок на предметном стекле (2).
7. Приготовленные мазки высушивают на воздухе.
8. Комбинированная окраска Мая-Грюнвальда-Романовского-Гимзы по Паппенгейму.
На нефиксированный мазок наливают пипеткой готовый краситель - фиксатор Мая - Грюнвальда, представляющий собой раствор эозинметиленового синего в метиловом алкоголе, на 3 минуты. Через 3 минуты к покрывающей мазок краске добавляют равное количество дистилированной воды и продолжают окрашивание еще 1 минуту. После этого краску смывают и мазок высушивают на воздухе. Затем высушенный мазок докрашивают свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 8-15 минут (2).
9. Подсчет лейкоцитов в мазке крови.
Подсчет производят в окрашенных мазках периферической крови. Считают в самом тонком месте ближе к концу мазка (усам) не менее 200 клеток, а затем выводят процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов. Подсчет производят в следующем порядке: половину клеток считают в верхней, половину клеток - в нижней части мазка, не заходя на самый край и середину. Лейкоцитарную формулу выводят четырехпольным методом. На мазок наносят 4 капли иммерсионного масла и из каждой капли считают по 50 лейкоцитов. В глубину мазок просматривают не дальше, чем на 3-4 поля зрения (2).
10. Подсчет лейкоцитов в мазке костного мозга.
Подсчет производят в окрашенных мазках красного костного мозга. Считают в самом тонком месте ближе к концу мазка (усам) не менее 200 клеток, а затем выводят процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов. При этом учитывают количество лимфоцитов с тельцами Barra. Счет проводят по зигзагу (линия Меандра): 3-4 поля зрения вдоль мазка, 3-4 поля под прямым углом к середине мазка, затем 3-4 поля в сторону параллельно краю, вновь под прямым углом вверх (2).
11. Анализ лейкограммы мазка крови.
Анализируют процентное соотношение отдельных классов лейкоцитов в мазке крови новорожденного мышенка-самца после молозивного вскармливания. При этом учитывается профиль крови (нейтрофильный) и количество лимфоцитов с тельцами Barra.
12. Анализ лейкограммы мазка красного костного мозга. Анализируют процентное соотношение отдельных классов лейкоцитов в мазкекрасного костного мозга новорожденного мышенка-самца после молозивного вскармливания. При этом учитывается количество лимфоцитов с тельцами Barra.
На основании данных делают вывод о передаче клеточного иммунитета Т- и В-лимфоцитами с молозивом от матери новорожденным мышатам-самцам.
Изучение лейкограммы крови показало, что у 3-дневных мышат-самцов наблюдается становление лимфоцитарного профиля. Соотношение лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов составило 58% и 36% соответственно. Из 200 клеток лейкоцитов у новорожденных мышат-самцов в 5 клетках (лимфоцитах) установлен половой хроматин. В красном костном мозге у новорожденных мышат-самцов преобладают лимфоциты (до 48%) над сегментоядерными нейтрофилами (до 45%), и 11% из них были клетками материнского происхождения (лимфоциты с тельцами Barra). Т.е. лимфоциты с материнскими половыми хромосомами проникают в центральные органы иммунной системы новорожденного мышенка-самца (табл. 1).
При вскармливании, новорожденный мышенок-самец обеспечивается клеточным иммунитетом. С молозивом и молоком в организм детеныша мышенка-самца поступают Т- и В-лимфоциты. А именно Т- и В-клетки иммунной памяти (4).
Молозивные клетки по своим биохимическим и иммунным свойствам отличаются от лейкоцитов в кровеносном русле. Лимфоциты, взятые из кровеносного русла, не обладают способность проникать сквозь кишечную стенку. Наличие клеток в молозиве усиливает положительную динамику развития иммунной системы новорожденных мышат-самцов. Наличие и состав лейкоцитов в молочной железе находится в прямой зависимости от физиологического состояния самки. Это гуморальное взаимодействие является важным фактором поддержания молочной железы в определенном статусе, благодаря которому в альвеолах происходит синтез молозива и молока (3).
Таким образом, осуществляется передача иммунитета не только пассивно, но и закладывается фундамент для нормального функционирования иммунной системы новорожденного мышенка-самца в дальнейшем.
На основе предлагаемого изобретения может быть создан эффективный способ диагностики передачи клеточного иммунитета новорожденного при молозивном вскармливании новорожденных животных, путем обнаружения Т- и В-лимфоцитов с тельцами Barra в костном мозге у новорожденных мышат-самцов.
Источники информации
1. Абрамова Т.В., Гущин Я.А., Ковалёва М.А., Рыбакова А.В., Селезнева А.И., Соколова А.П., Ходько С.В. Справочник. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы эспериментальных животных. СПб.: Издательство «ЛЕМА», 2013. - С. 92-100.
2. Козловская Л.В., Николаев А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд. - М.: Медицина, 1984. - С. 52-53.
3. Скопичев В.Г., Боголюбова И.О. Физиология репродуктивной системы млекопитающих. Учебное пособие. - СПб.: Изд-во «Лань», 2007 - С. 391-428.
4. Скопичев В.Г., Н.Н. Максимюк. Молоко: учебное пособие. - СПб.: Проспект Науки, 2011. - С. 120-123.