СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ЛЕЧЕНИИ
METHODS AND COMPOSITIONS WITH APPLICATION OF IMMUNOMODELLING COMPOUNDS IN COMBINED TREATMENT

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 60/808602, зарегистрированной 26 мая 2006 года, содержание которой полностью включено ссылкой в настоящее изобретение.
1. Область изобретения
in vitro
in vivo
Настоящее изобретение относится к композициям, которые содержат одно или более иммуномодулирующих соединений и вальпроевую кислоту, гидроксимочевину или трихостатин A, к способам их применения для роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+  и  для восстановления костного мозга и при пересадке костного мозга путем повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина, и к способам лечения, предупреждения и/или контролирования рака, опухолей и гематологических заболеваний и нарушений.
2. Уровень техники
2.1 IMiDs™
.
,
.
Id.
Проводились многочисленные исследования, направленные на получение соединений, которые можно безопасно и эффективно применять для лечения заболеваний, связанных с патологической продукцией фактора некроза опухолей TNF-α. Например, см. публикации: Marriott J.B. et al. Expert Opin. Biol. Ther 1(4): 1-8 (2001); G.W. Muller et al. Journal of Medicinal Chemistry, 39(17): 3238-3240 (1996) и G.W. Muller et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8: 2669-2674 (1998). В ряде исследований рассматривалась группа соединений, выбранных по их способности мощно ингибировать продукцию TNF-α (ФНО-α) посредством стимулированных липополисахаридом (LPS, ЛПС) мононуклеаров периферической крови PBMC (L.G. Corral et al. AnnRheum. Dis. 58:(Suppl I) 1107-1113 (1999)). Эти соединения под наименованием IMiDs™ (Celgene Corporation), или иммуномодулирующие лекарственные средства, проявляют не только мощное ингибирование TNF-α, но также заметное ингибирование продукции LPS-индуцированных моноцитов IL1β и IL12. Также иммуномодулирующие соединения обладают ингибирующим, хотя частично, действием на LPS-индуцированный IL6. Эти соединения являются мощными стимуляторами LPS-индуцированного IL10.
2.2 4-(АМИНО)-2-(2,6-ДИОКСО(3-ПИПЕРИДИЛ))ИЗОИНДОЛИН-1,3-ДИОН
4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион является иммуномодулирующим соединением, которое имеет следующее химическое строение:
и описано в патенте США № 5635517 авторами G.W. Muller et al., которое полностью включено ссылкой в настоящее изобретение.
2.3 3-(4-АМИНО-1-ОКСО-1,3-ДИГИДРОИЗОИНДОЛ-2-ИЛ)ПИПЕРИДИН-2,6-ДИОН
3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион является иммуномодулирующим соединением, которое имеет следующее химическое строение:
и описано в патенте США № 5635517 авторами G.W. Muller et al., которое полностью включено ссылкой в настоящее изобретение.
2.4 ТРИХОСТАТИН A (TSA)
Трихостатин А (TSA, ТСА) является ингибитором деацетилазы гистонов и имеет следующую формулу:
2.5 ГИДРОКСИМОЧЕВИНА (ГМ)
Гидроксимочевина (HU, ГМ) является рибонуклеотидной редуктазой, имеющей следующую формулу:
2.6 ВАЛЬПРОЕВАЯ КИСЛОТА
Вальпроевая кислота представляет собой ингибитор деацетилазы гистонов и имеет следующую формулу:
in vitro
in vivo
.
Показано, что вальпроевая кислота и  усиливает и пролиферацию и самообновление гематопоэтических стволовых клеток и проявляет мощное противоопухолевое действие (см. Kaiser et al., 2006 Haematologica 91 (2):248-251; Li et al., 2005, Mol. Cancer Ther4(12): 1912-1922), но вместе с тем необходимы усовершенствования для обеспечения безопасного и эффективного средства для лечения заболеваний и нарушений, связанных с гематопоэтическими стволовыми клетками (Bug et al., 2005, Cancer Res. 65(7): 2537-2541).
in vitro
in vivo
Поэтому в данной области техники остается потребность в безопасных и эффективных способах роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+  и .
3. Сущность изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения основаны на том открытии, что иммуномодулирующие соединения в комбинации с вальпроевой кислотой, гидроксимочевиной или трихостатином A проявляют аддитивные и синергические эффекты на рост гематопоэтических стволовых клеток CD34+, экспрессию эмбрионального гемоглобина (Hb) и апоптоз и антипролиферацию злокачественных клеток.
В одном варианте осуществления 4-(амино)-2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион (также называемый в настоящем изобретении "соединением 1") или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион (также называемый в настоящем изобретении "соединением 2") в комбинации с вальпроевой кислотой, гидроксимочевиной или трихостатином A проявляют аддитивные и синергические эффекты на рост CD34+ гематопоэтических стволовых клеток, экспрессию эмбрионального гемоглобина и апоптоз и антипролиферацию злокачественных клеток.
Соответственно, настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям), содержащим эффективное количество иммуномодулирующего соединения или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, пролекарство, стереоизомер или полиморф, и вальпроевую кислоту, гидроксимочевину или трихостатин A, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, пролекарство, стереоизомер или полиморф, и включает способы их применения для роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+, экспрессии эмбрионального гемоглобина и апоптоза и антипролиферации раковых клеток и для лечения, предупреждения или контролирования связанных с этим заболеваний и нарушений.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям), которые содержат эффективное количество 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, пролекарство, стереоизомер или полиморф и вальпроевую кислоту, гидроксимочевину или трихостатин A или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, пролекарство, стереоизомер или полиморф, и включает способы их применения для роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+, экспрессии эмбрионального гемоглобина и апоптоза и антипролиферации раковых клеток, и для лечения, предупреждения или контролирования связанных с этим заболеваний и нарушений.
4. Краткое описание фигур
Фиг.1 показывает синергический и аддитивный эффект TSA (трихостатина A) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на пролиферацию клеток Namalwa.
Фиг.2 показывает синергический и аддитивный эффект TSA (трихостатина A) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на апоптоз клеток Namalwa.
Фиг.3 показывает синергический и аддитивный эффект VPA (ВПК) (вальпроевой кислоты) и cоединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на пролиферацию клеток Namalwa.
Фиг.4 показывает синергический и аддитивный эффект VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на апоптоз клеток Namalwa.
Фиг.5 показывает синергический и аддитивный эффект VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на пролиферацию клеток Namalwa. В таблице указаны концентрации соединения 2 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.6 показывает синергический и аддитивный эффект VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на апоптоз клеток Namalwa. В таблице указаны концентрации соединения 2 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.7 показывает аддитивные и синергические эффекты TSA (трихостатина A) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.7 показывает количество клеток CD34+, полученное после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 1 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.8 показывает аддитивные и синергические эффекты TSA (трихостатина A) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.8 показывает процент клеток CD34+, полученных после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 1 и TSA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.9 показывает аддитивные и синергические эффекты TSA (трихостатина A) и соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.9 показывает количество клеток CD34+, полученное после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 2 и TSA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.10 показывает аддитивные и синергические эффекты TSA (трихостатина A) и соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.10 представляет процент клеток CD34+, полученных после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 2 и TSA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.11 показывает аддитивные и синергические эффекты VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.11 показывает количество клеток CD34+, полученное после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 1 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.12 показывает аддитивные и синергические эффекты VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.12 представляет процент клеток CD34+, полученных после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 1 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.13 показывает аддитивные и синергические эффекты VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.13 показывает количество клеток CD34+, полученное после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 2 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.14 показывает аддитивные и синергические эффекты VPA (вальпроевой кислоты) и соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на рост полученных из пуповинной крови CD34+. Фиг.14 показывает процент клеток CD34+, полученных после 6 дней культивирования. В таблице указаны концентрации соединения 2 и VPA, необходимые для достижения аддитивного или синергического эффекта.
Фиг.15 показывает синергический эффект ГМ (гидроксимочевины) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) или соединения 2 (3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) на экспрессию эмбрионального гемоглобина в клетках CD34+ нормального донора, дифференцированного по эритоцитам в течение 6 дней.
Фиг.16 показывает синергический эффект ГМ (гидроксимочевины) и соединения 1 (4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона) на экспрессию эмбрионального гемоглобина в клетках CD34+ больного серповидноклеточной анемией (СКА), дифференцированных по эритоцитам в течение 6 дней.
5. Подробное описание
Варианты осуществления настоящего изобретения основаны на открытии того, что иммуномодулирующие соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4 амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) и вальпроевая кислота, гидроксимочевина или трихостатин A обладают аддитивными и синергическими эффектами на рост гематопоэтических стволовых клеток CD34+, экспрессию эмбрионального гемоглобина и апоптоз и антипролиферативным действием на злокачественные клетки.
Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям), которые содержат эффективное количество иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям), которые содержат эффективное количество 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
in vitro
in vivo,
in vitro
in vivo
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам усиления роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+  или к способам, которые включают контактирование гематопоэтической стволовой клетки CD34+  или  с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатином A.
in vitro
in vivo
in vitro
in vivо
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам усиления роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+ или , к способам, которые включают контактирование гематопоэтической стволовой клетки CD34+  или с эффективным количеством 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
in vitro
in vivo
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования заболевания или нарушения, которое поддается лечению, предупреждению или контролированию посредством роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+  или , к способам, которые включают введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
in vitro
in vivo
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования заболевания или нарушения, которое поддается лечению, предупреждению или контролированию посредством роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+  или , к способам, которые включают введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
in vitro
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам пересадки костного мозга, включающим контактирование  костного мозга с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина А, с последующей трансплантацией нуждающемуся в этом пациенту.
in vitro
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам пересадки костного мозга, включающим контактирование  костного мозга с эффективным количеством 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина А, с последующей трансплантацией нуждающемуся в этом пациенту.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга больного, которому проводили или проводят химиотерапевтическое лечение и/или лучевую терапию, к способам, включающим введение больному эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга больного, которому проводили или проводят химиотерапевтическое лечение и/или лучевую терапию, к способам, включающим введение больному эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, включающим контактирование костного мозга с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A. В конкретном варианте осуществления костный мозг подвергали или подвергают лучевой терапии или химиотерапии.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, включающим контактирование костного мозга с эффективным количеством 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A. В конкретном варианте осуществления костный мозг подвергали или подвергают лучевой терапии или химиотерапии.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования солидной опухоли, включающей, без ограничения, злокачественную меланому, карциному поджелудочной железы, карциноид неизвестной первичной локализации, карциному почки, карциному молочной железы, адренокортикальную карциному, колоректальную карциному, эндокринную опухоль, меланому, нейробластому, остеосаркому, ретинобластому, опухоль Вильмса или немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), к способам, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования солидной опухоли, включающей без ограничения злокачественную меланому, карциному поджелудочной железы, карциноид неизвестной первичной локализации, карциному почки, карциному молочной железы, адренокортикальную карциному, колоректальную карциному, эндокринную опухоль, меланому, нейробластому, остеосаркому, ретинобластому, опухоль Вильмса или немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), к способам, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования гематологического заболевания или нарушения (например, гематологического рака или опухоли), включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования гематологического заболевания или нарушения (например, гематологического рака или опухоли), включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, бета-гемоглобинопатии, лейкозов, миелом, лимфом, миелопролиферативных нарушений, неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза и острого миелобластного лейкоза, к способам, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина в клетках, включающим контактирование клетки, экспрессирующей эмбриональный гемоглобин, с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина в клетках, включающим контактирование клетки, экспрессирующей эмбриональный гемоглобин, с эффективным количеством 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина у нуждающегося в этом пациента, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина у больного серповидноклеточной анемией (СКА), включающим введение больному СКА эффективного количества иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина у нуждающегося в этом пациента, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина у больного СКА, которые включают введение больному, имеющему СКА, эффективного количества 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования апоптоза злокачественной клетки, включающим контактирование злокачественной клетки с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования апоптоза злокачественной клетки, включающим контактирование злокачественной клетки с эффективным количеством 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации злокачественных клеток, включающим контактирование злокачественной клетки с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации злокачественных клеток, включающим контактирование злокачественной клетки с эффективным количеством 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A.
5.1 Определения
Термин "больной/пациент", используемый в настоящем изобретении, означает любое животное (например, корова, лошадь, овца, свинья, курица, индейка, перепел, кошка, собака, мышь, крыса, кролик или морская свинка), в одном варианте осуществления означает млекопитающее, такое как примат или не примат (например, обезьяна или человек), и в другом варианте осуществления подразумевает человека. В некоторых вариантах осуществлениях человеком является младенец, ребенок, подросток или взрослый. В конкретном варианте осуществления пациент имеет в анамнезе гематологическое заболевание или нарушение или имеет риск его возникновения. В число пациентов группы риска включены без ограничения пациенты с наследственным анамнезом гематологических заболеваний или нарушений или пациенты, чье состояние физического здоровья ведет к риску возникновения гематологических заболеваний или нарушений. В одном варианте осуществления больной человек проходил лечение ранее или в настоящее время проходит лечение гематологического заболевания или нарушения.
Выражение "иммуномодулирующее соединение и вальпроевая кислота, гидроксимочевина или трихостатин А" включает следующие комбинации: (a) иммуномодулирующее соединение и вальпроевая кислота; (b) иммуномодулирующее соединение и гидроксимочевина и (c) иммуномодулирующее соединение и трихостатин A, и включают фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты, пролекарства, стереоизомеры или полиморфы каждого из указанных веществ.
Выражение "4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион и вальпроевая кислота, гидроксимочевина или трихостатин А" включает следующие комбинации: (a) 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион и вальпроевая кислота; (b) 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион и трихостатин A; (c) 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион и гидроксимочевина; (d) 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион и вальпроевая кислота; (e) 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион и трихостатин A и (f) 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион и гидроксимочевина и включает фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты, пролекарства, стереоизомеры или полиморфы каждого из указанных веществ.
Используемый в настоящем изобретении термин "фармацевтически приемлемая соль", если не указано иначе, относится к солям, изготовленным из фармацевтически приемлемых кислот, включающих неорганические кислоты и органические кислоты. Подходящие кислоты включают неорганические и органические кислоты, такие как уксусная, альгиновая, аминобензойная, бензолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, лимонная, этенсульфоновая, муравьиная, фумаровая, фуранкарбоновая, глюконовая, глутаминовая кислота, глюкуроновая, галактуроновая, глицидная, гидробромистая, хлористоводородная, изэтионовая, молочная, малеиновая, яблочная, миндальная, метансульфоновая, муциновая, азотная, памовая, пантотеновая, фенилуксусная, пропионовая, фосфорная, салициловая, стеариновая, янтарная, сульфаниловая, серная, виннокаменная кислота, п-толуосульфоновая и тому подобные кислоты без ограничения. Конкретными подходящими кислотами являются хлористоводородные, бромистоводородные, фосфорные и серные кислоты.
Используемый в настоящем изобретении термин "сольват", если иначе не указано, означает соединение, рассматриваемое в настоящем изобретении или его соль, дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, связанного нековалентными межмолекулярными силами. Если растворителем является вода, сольват представляет собой "гидрат".
Используемый в настоящем изобретении термин "полиморф" означает конкретную кристаллическую формулу соединения, описанного в настоящем изобретении. Полиморфы можно получать с помощью разных условий обработки и/или разных растворителей. В частности, полиморфы можно изготавливать путем рекристаллизации в конкретном растворителе соединения, описанного в настоящем изобретении.
in vitro
in vivo
2
2
Используемый в настоящем изобретении термин "пролекарство", если не указано иначе, означает производное соединения, которое можно подвергать гидролизу, окислению или иной реакции в биологических условиях (или) для получения указанного соединения. Примеры пролекарств включают, без ограничения, соединения, которые содержат биогидролизуемые функциональные группы, такие как биогидролизуемые амиды, биогидролизуемые сложные эфиры, биогидролизуемые карбаматы, биогидролизуемые карбонаты, биогидролизуемые уреиды и биогидролизуемые фосфатные аналоги. Другие примеры пролекарств включают соединения, которые содержат функциональные группы -NO, -NO, -ONO или -ONO. Обычно пролекарства можно изготавливать, используя общеизвестные способы, такие как описанные в изданиях Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5th ed., 1995) и Design of Prodrugs (H. Bundgaard ed., Elselvier, New York, 1985).
in vivo
in vivo
Используемые в настоящем изобретении термины "биогидролизуемый карбамат", "биогидролизуемый карбонат", "биогидролизуемый уреид" и "биогидролизуемый фосфат", если не указано иначе, означают, соответственно, карбамат, карбонат, уреид и фосфат соединения, которое обладает всеми следующими свойствами: 1) не нарушает биологическую активность соединения, но  может придавать указанному соединению выгодные свойства, такие как поглощение, продолжительность действия или начало действия; или 2) является биологически не активным, но превращается в биологически активное соединение. Примеры биогидролизуемых карбаматов включают, без ограничения, низшие алкиламины, замещенные этилендиамины, аминокислоты, гидроксиалкиламины, гетероциклические и гетероароматические амины и полиэфирные амины.
Используемый в настоящем изобретении термин "стереоизомер", если не указано иначе, охватывает все энантиомерно/стереоизомерно чистые и энантиомерно/стереоизомерно богатые соединения, рассматриваемые настоящим изобретением.
Соединения, относящиеся к настоящему изобретению, могут существовать в виде рацемической смеси энантиомеров или смеси диастереомеров. Рассматриваемые здесь варианты осуществления охватывают использование стереоизомерно чистых форм таких соединений, а также использование смесей указанных форм. Например, в способах и композициях настоящего изобретения можно использовать смеси, содержащие равное или неравное количество энантиомеров соединения. Эти изомеры можно получать путем асимметричного синтеза или разделять путем использования общепринятых способов, таких как хиральные колонки или агенты хирального разделения. См., например, следующие публикации: Jacques J. et al. Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen S.H., et al. Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962) и Wilen S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions, р.268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972). Используемые в настоящем изобретении понятия "стереоизомерно чистый", "энантиомерно чистый" или "оптически чистый", если не указано иначе, означают, что соединение содержит один стереоизомер и по существу не содержит его противоположного стереоизомера или энантиомера. Например, соединение является стереоизомерно или энантиомерно чистым, если в нем содержится 80, 90 или 95% или больше одного стереоизомера и 20, 10, или 5% или меньше противоположного стереоизомера. В некоторых случаях соединение считают оптически активным или стереоизомерно/энантиомерно чистым (т.е. по существу R-формой или по существу S-формой) по отношению к хиральному центру, если энантиомерный избыток (э.и.) соединения составляет около 80% или больше, в одном варианте осуществления э.и. соединения равно или больше 90% относительно конкретного хирального центра и в другом варианте осуществления э.и. соединение составляет 95% относительно конкретного хирального центра.
Используемые в настоящем изобретении понятия "стереоизомерно богатый" или "энантиомерно богатый", если не указано иначе, также охватывает смеси, отличные от рацемических, такие как смеси стереоизомеров соединений (например, R/S=30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 и 70/30).
Используемые в настоящем изобретении понятия "лечить", "лечение" и "процесс лечения", если не указано иначе, означают действия, которые имеют место, когда больной страдает от указанного заболевания или нарушения, которые уменьшают тяжесть заболеваний или нарушения или их симптомов или задерживают или замедляют развитие заболевания или нарушения или их симптома.
Используемые в настоящем изобретении понятия "предупреждать", "предупреждение" и "способ предупреждения", если не указано иначе, означают действия, которые имеют место перед появлением у пациента указанного заболевания или нарушения или их симптома, которые задерживают или замедляют развитие заболевания или нарушения или их симптома. Кандидатами для указанного профилактического лечения являются пациенты группы риска по возникновению гематологического заболевания или нарушения.
Используемые в настоящем изобретении, если не указано иначе, понятия "контролирование", "контроль" и "способ контролирования" означают предупреждение рецидива указанного заболевания или нарушения или их симптома у пациента, который уже перенес заболевание или нарушение или их симптом, и/или увеличение периода времени, в течение которого у пациента, который перенес заболевание или нарушение или их симптом, наблюдается ремиссия. Термины охватывают снижение порога возникновения, развития и/или продолжительности заболеваний или нарушения или их симптома или изменения механизма реакции ответа пациента на заболевание или нарушения или их симптом.
Используемое в настоящем изобретении понятие "эффективное количество" соединения или композиции, если не указано иначе, означает количество, достаточное для обеспечения терапевтической полезности при лечении, предупреждении и/или контролировании заболевания или для задержки развития или минимизации одного или более симптомов, связанных с этим заболеванием или нарушением. В одном варианте осуществления термин "эффективное количество", используемый в отношении соединений, способах применения и способах лечения, предупреждения и контролирования, рассматриваемых в настоящем изобретении, означают количество иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и количество вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, которые при использовании в комбинации друг с другом являются полезными для способа, описанного в настоящем изобретении, или обеспечивают терапевтическую полезность у пациента при лечении, предупреждении и/или контролировании заболевания или для задержки развития или минимизации одного или более симптомов, связанных с этим заболеванием или нарушением. Например, выражение "эффективное количество 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина А" включает эффективное количество каждого из соединения, которые при использовании их в комбинации, описанной в настоящем изобретении, обеспечивают терапевтическую полезность у пациента при лечении, предупреждении и/или контролировании заболевания или для задержки развития или минимизации одного или более симптомов, связанных с этим заболеванием или нарушением.
Термин "эффективное количество" может охватывать количество, которое улучшает лечение в целом, уменьшает или устраняет симптомы или причины заболевания или нарушения или их симптомы или повышает терапевтическую эффективность другого терапевтического агента.
Понятия "cовместное введение" и "в комбинации с" включают введение двух терапевтических агентов (т.е. иммуномодулирующего соединения, такого как 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа) или одновременно, или параллельно, или последовательно без конкретных ограничений по времени. В одном варианте осуществления оба агента присутствуют в клетках или в организме больного одновременно или проявляют свой биологический или терапевтический эффект в одно и то же время. В другом варианте осуществления два терапевтических агента находятся в одной композиции или в единичной стандартной лекарственной форме. Еще в одном варианте осуществления два терапевтических агента находятся в отдельных композициях или единичных стандартных лекарственных формах.
К термину "лейкоз" относятся злокачественные новообразования кровеобразующих тканей. В некоторых вариантах осуществлениях лейкоз включает, без ограничений, миелоидные лейкозы, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и острый миелобластный лейкоз. Лейкоз может быть рецидивирующим, рефракторным или резистентным к общепринятому лечению. Термин "рецидивирующий" относится к ситуации, когда у больных в состоянии ремиссии лейкоза после лечения наблюдалось возвращение лейкозных клеток в костном мозге и уменьшение количества нормальных клеток крови. Термины "рефракторный или резистентный" означают ситуацию, когда у больных даже после интенсивного лечения в костном мозге выявляют остаточные лейкозные клетки.
Термин "восстановление" по отношению к костному мозгу включает рост нормальных гематопоэтических клеток-предшественников для восстановления популяции нормальных клеток крови.
Термины "стандартная лекарственная форма" и "единичная стандартная лекарственная форма" включают таблетки; жевательные таблетки; каплеты; капсулы, такие как мягкие эластичные желатиновые капсулы; саше; крахмальные капсулы; пастилки; таблетки для рассасывания; порошки; растворы; гели; жидкие лекарственные формы, подходящие для орального введения или нанесения на слизистые оболочки больного, включающие суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии), эмульсии (например, эмульсии масло-в-воде или жидкая эмульсия вода-в-масле), растворы и эликсиры и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые можно восстанавливать для получения жидких лекарственных форм, подходящих для орального или парентерального введения пациенту. Единичную стандартную лекарственную форму необязательно нужно вводить в виде однократной дозы.
5.2 Иммуномодулирующие соединения
Конкретные примеры иммуномодулирующих соединений включают, без ограничения, циано- и карбоксипроизводные замещенных стиролов, такие как соединения, раскрытые в патенте США № 5929117; 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины, такие как описанные в патентах США № 5874448 и 5955476; тетразамещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, описанные в патенте США № 5798368; 1-оксо- и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины (например, 4-метилпроизводные талидомида), включающие, без ограничения, соединения, раскрытые в патентах США № 5635517, 6476052, 6555554 и 6403613; 1-оксо- и 1,3-диоксоизоиндолины, замещенные в 4 или в 5 положениях кольцом индолина (например, 4-(4-амино-1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-4-карбамоилбутановая кислота), описанная в патенте США № 6380239; изоиндолин-1-он и изоиндолин-1,3-дион, замещенные в положении 2 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом (например, 2-(2,6-диоксо-3-гидрокси-5-фторпиперидин-5-ил)-4-аминоизоиндолин-1-он), описанный в патенте США № 6458810; класс неполипептидных циклических амидов, раскрытых в патентах США № 5698579 и 5877200; аминоталидомид, а также аналоги, продукты гидролиза, метаболиты, производные и предшественники аминоталидомида, и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)талидомиды и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолы, такие как описанные в патентах США № 6281230 и 6316471; и изоиндолимидные соединения, такие как описанные в патентной заявке США № 09/972487, зарегистрированной 5 октября 2001 года, в патентной заявке США № 10/032286, зарегистрированной 21 декабря 2001 года и в международной патентной заявке № PCT/US01/50401 (международная публикация № WO 02/059106). Каждый из патентов и патентных заявок, указанных в настоящем изобретении, включен в настоящее изобретение во всей своей полноте ссылкой. В одном варианте осуществления иммуномодулирующие соединения не включают талидомид.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения, 1-оксо- и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, замещенные амино в бензольном кольце, как описано в патенте США № 5635517, который включен в настоящее изобретение со ссылкой. Указанные соединения имеют формулу I:
2
2
в которой один из X и Y представляет собой C=O, другие X и Y представляют собой C=O или CH, и R является водородом или низшим алкилом, в частности метилом. Конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения,
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин;
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-5-аминоизоиндолин;
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-6-аминоизоиндолин;
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-7-аминоизоиндолин;
1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин и
1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-5-аминоизоиндолин.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат к классу замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)фталимидов и замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолов, например, как описанные в патентах США № 6281230; 6316471; 6335349 и 6476052 и международной патентной заявке № PCT/US97/13375 (международная публикация № WO 98/03502), каждая из которых включена в настоящее изобретение со ссылкой.
Примеры соединений имеют формулу:
в которой
2
один из X и Y представляет собой C=O, а другие X и Y представляют собой C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R и R, независимо от других, является галогеном, алкилом с количеством атомов углерода от 1 до 4 или алкокси, содержащим 1-4 атома углерода, или (ii) один из R, R, R и R представляет собой -NHR и остальные R, R, R и R являются водородом;
5
R представляет собой водород или алкил, содержащий 1-8 атомов углерода;
6
6
1
2
3
4
1
2
3
4
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, бензил или галоген; при условии, что R не является водородом, если X и Y представляют собой C=O и (i) каждый из R, R, R и R является фтором или (ii) один из R, R, R или R представляет собой амино.
Примеры соединений этого класса имеют следующие формулы:
1
в которых R является водородом или метилом. В отдельном варианте осуществления способы и композиции, рассматриваемые в настоящем изобретении, содержат использование энантиомерно чистых форм (например, оптически чистых (R)- или (S)-энантиомеров) иммуномодулирующих соединений.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат классу изоиндол-имидов, раскрытых в патентных опубликованных заявках US 2003/0096841 и US 2003/0045552 и в международной заявке PCT/US01/50401 (международная публикация № WO 02/059106), каждая из которых включена в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединений имеют формулу II:
и фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, клатраты, энантиомеры, диастереомеры, рацематы и смеси их стереоизомеров, в которых
2
один из X и Y является C=O, и другой представляет собой CH или C=O;
1
3
3
4
6
5
5
3
3
3
3'
3
3'
5
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
1
8
2
1
8
1
8
1
8
R представляет собой H, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, C(O)R, C(S)R, C(O)OR, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, C(O)NHR, C(S)NHR, C(O)NRR, C(S)NRR или (C-C)алкил-O(СО)R;
2
1
8
2
8
2
8
R представляет собой H, F, бензил, (C-C)алкил, (C-C)алкенил или (C-C)алкинил;
3
3'
6
5
5
5
5
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
0
8
2
1
8
1
8
1
8
R и R независимо представляют собой (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, (C-C)алкил-O(CО)R или O(CО)R;
4
5
1
8
2
8
2
8
1
4
0
4
1
6
0
4
2
5
R представляет собой (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, (C-C)алкил-OR, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил или (C-C)алкил-(C-C)гетероарил;
5
1
8
2
8
2
8
2
5
R представляет собой (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, или (C-C)гетероарил;
6
5
6
1
8
2
8
2
8
2
5
0
8
каждый из присутствующих R независимо представляет собой H, (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)гетероарил или (C-C)алкил-C(O)O-R, или группы R могут соединяться для образования гетероциклоалкильной группы;
n является 0 или 1 и
* обозначает хиральный углеродный атом.
1
3
4
6
5
5
3
5
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
1
8
2
1
8
1
8
1
8
В конкретных соединениях формулы II, если n равен 0, тогда Rпредставляет собой (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, C(O)R, C(O)OR, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, C(S)NHR или (C-C)алкил-O(СО)R;
2
1
8
R представляет собой H или (C-C)алкил и
3
6
5
5
5
5
5
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
5
8
2
0
8
1
8
1
8
1
8
Rпредставляет собой (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил-N(R); (C-C)алкил-NH-C(O)O-R; (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, (C-C)алкил-O(СО)R или C(O)OR; и другие переменные имеют аналогичные определения.
2
1
4
В других конкретных соединениях формулы II R представляет собой H или (C-C)алкил.
1
1
8
В других конкретных соединениях формулы II Rпредставляет собой (C-C)алкил или бензил.
1
1
8
2
3
2
2
3
В других конкретных соединениях формулы II Rпредставляет собой H, (C-C)алкил, бензил, CHOCH, CHCHOCH или
1
В другом варианте осуществления соединений формулы II Rпредставляет собой
7
6
5
5
5
5
7
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
0
8
2
1
8
1
8
1
8
в которых Q является O или S, и каждый из присутствующих R независимо представляет собой H, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, галоген, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, (C-C)алкил-O(СО)R или C(O)OR или соседние присутствующие R можно соединять для образования бициклического алкильного или арильного кольца.
1
3
В других конкретных соединениях с формулой II R представляет собой C(O)R.
3
5
0
4
2
5
1
8
0
4
В других конкретных соединениях с формулой II Rпредставляет собой (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (С-C)алкил, арил или (C-C)алкил-OR.
В других конкретных соединениях с формулой II гетероарил является пиридилом, фурилом или тиенилом.
1
4
В других конкретных соединениях с формулой II R представляет собой C(O)OR.
1
4
В других конкретных соединениях с формулой II H в формуле C(O)NHC(O)может быть замещен (C-C)алкилом, арилом или бензилом.
Дополнительные примеры соединений в этом классе включают, без ограничения, [2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил]амид; трет-бутиловый сложный эфир (2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)карбаминовой кислоты; 4-(аминометил)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион; N-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)ацетамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил)-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}циклопропилкарбоксамид; 2-хлор-N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил)ацетамид; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-3-пиридилкарбоксамид; 3-({1-оксо-4-(бензиламино)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион; 2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-4-(бензиламино)изоиндолин-1,3-дион; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}пропанамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-3-пиридилкарбоксамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}гептанамид; N-{(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-2-фурилкарбоксамид; {Ν-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)карбамоил}метилацетат; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)пентанамид; N-(2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-2-тиенилкарбоксамид; Ν-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(бутиламино)карбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(октиламино)карбоксамид и N-{[2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил]метил}(бензиламино)карбоксамид.
Вместе с тем, другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат к классу изоиндол-имидов, раскрытых в опубликованных патентных заявках США № 2002/0045643, в международной публикации № WO 98/54170 и патенте США № 6395754, все из которых включены в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединений имеют формулу III:
и фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, клатраты, энантиомеры, диастереомеры, рацематы и смеси их стереоизомеров, в которых
2
один из X и Y представляет собой C=O, а другой является CH или C=O;
2
R является H или CHOCOR';
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R или R независимо от других представляет собой галоген, алкил, содержащий 1-4 атома углерода, или алкокси, содержащий 1-4 атома углерода, или (ii) один из R, R, R или R представляет собой нитро или -NHR и остальные R, R, R или R являются водородом;
5
R представляет собой водород или алкил, содержащий 1-8 атомов углерода;
6
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, бензо, хлор или фтор;
7
10
8
9
R' представляет собой R-CHR-N(RR);
7
n
2n
R представляет собой м-фенилен или п-фенилен или -(CH)-, в котором n имеет значение от 0 до 4;
8
9
8
9
2
2
1
2
2
1
каждый из R и R, взятые независимо от другого, является водородом или алкилом, содержащим 1-8 атомов углерода, или R и R, взятые вместе, представляют собой тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CHCHXCHCH-, в котором X является -О-, -S- или -NH-;
10
R представляет собой водород, алкил, имеющий до 8 атомов углерода или фенил; и
* обозначает хиральный углеродный атом.
Другие примеры соединений имеют формулу:
в которой
2
один из X и Y является C=O, а другой из X и Y представляет собой C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R или R, независимо от других, является галогеном, алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, или алкокси, содержащий 1-4 атома углерода, или (ii) один из R, R, R и R представляет собой -NHR и остальные из R, R, R и R являются водородом;
5
R представляет собой водород или алкил, содержащий 1-8 атомов углерода;
6
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, бензо, хлор или фтор;
7
n
2n
R представляет собой м-фенилен или п-фенилен или -(CH)-, в котором n имеет значение от 0 до 4;
8
9
8
9
1
1
2
2
2
2
каждый из R и R, взятый независимо от другого, является водородом или алкилом, содержащим 1-8 атомов углерода, или R и R, взятые вместе, являются тетраметиленом, пентаметиленом, гексаметиленом или -CHCHXCHCH-, в котором X представляет собой -О-, -S- или -NH-;
10
R представляет собой водород, алкил, имеющий до 8 атомов углерода, или фенил.
Другие примеры соединений имеют формулу:
в которой
2
один из X и Y является C=O, а другой из X и Y представляет собой C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R и R, независимо от других, является галогеном, алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, или алкокси, содержащим 1-4 атома углерода, или (ii) один из R, R, R и R представляет собой нитро или защищенный амино, и остальные из R, R, R и R являются водородом; и
6
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, бензо, хлор или фтор.
Другие примеры соединений имеют формулу:
в которой
2
один из X и Y является C=O, а другой из X и Y представляет собой C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R и R независимо от других представляет собой галоген, алкил, содержащий 1-4 атома углерода, или алкокси, содержащий 1-4 атома углерода, или (ii) один из R, R, R и R представляет собой NHR и остальные R, R, R и R являются водородом;
5
7
10
8
9
7
8
9
10
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, или CO-R-CH(R)NRR, где каждый из R, R, R и R определен согласно настоящему изобретению, и
6
R является алкилом, содержащим 1-8 атомов углерода, бензо, хлором или фтором.
Конкретные примеры соединений имеют формулу:
в которой
2
один из X и Y является C=O, а другой из X и Y представляет собой C=O или CH;
6
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, бензил, хлор или фтор;
7
n
2n
R представляет собой м-фенилен, п-фенилен или -(CH)-, где n имеет значение от 0 до 4;
8
9
8
9
1
1
2
2
2
2
каждый из R и R, взятый независимо от другого, является водородом или алкилом, содержащим 1-8 атомов углерода, или R и R, взятые вместе, представляют собой тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, или -CHCHXCHCH-, где X представляет собой -O-, -S- или -NH-; и
10
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, или фенил.
Конкретными иммуномодулирующими соединениями являются 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион и 3-(4 амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион.
4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион имеет следующую химическую формулу:
и описан в патенте США № 5635517 авторами G.W. Muller et al., включенном во всей полноте ссылкой в настоящее изобретение. Можно изготавливать 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион, используя общепринятые способы органического синтеза и используя коммерчески доступные исходные материалы. В качестве неограничивающего примера можно изготавливать 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион, как описано в патенте США № 5635517.
3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион представляет собой иммуномодулирующее соединение, которое имеет следующую химическую формулу:
и описан в патенте США № 5635517 авторами G.W. Muller et al., включенном во всей полноте ссылкой в настоящее изобретение. Можно изготавливать 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион, используя общепринятые способы органического синтеза и используя коммерчески доступные исходные материалы. В качестве неограничивающего примера можно изготавливать 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион, как описано в патенте США № 5635517.
В другом варианте осуществления конкретные иммуномодулирующие соединения настоящего изобретения охватывают полиморфные формы 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, такие как формы A, B, C, D, E, F, G и H, раскрытые в предварительной патентной заявке США № 60/499723, поданной 4 сентября 2003 года и соответствующей непредварительной заявке США, поданной 3 сентября 2004 года, обе из которых включены в настоящее изобретение ссылкой. Например, форма А 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона является несольватированным кристаллическим веществом, которое можно получать из систем неводных растворителей. Форма A характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 8, 14,5, 16, 17,5, 20,5, 24 и 26 градусов и максимумом на кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно 270°C. Форма A является слабогигроскопичной или негигроскопичной и представляет собой наиболее термодинамически устойчивый безводный полиморф 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, открытый к настоящему времени.
Форма B 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона является полугидратированным кристаллическим веществом, которое можно получать из разных систем растворителей, включающих, без ограничения, гексан, толуол и воду. Форма B характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 16, 18, 22 и 27 градусов, и эндотермой на кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC, ДСК) в области приблизительно 146 и 268°C, которые идентифицированы как дегидратация и плавление в экспериментах высокотемпературной микроскопии. Исследования взаимопревращения показывают, что форма B превращается в форму E в системах водных растворителей и превращается в другие формы в ацетоне и других безводных системах.
Форма C 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой гемисольватированное кристаллическое вещество, которое можно получать из растворителей, таких как ацетон, но не ограниченных им. Форма C характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 15,5 и 25 градусов, и максимумом кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии приблизительно 269°C. Форма C не является гигроскопической при относительной влажности (RH, ОВ) ниже около 85%, но может превращаться в форму B при более высоких значениях относительной влажности.
Форма D 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона является прозрачным, сольватированным полиморфом, изготовленным из смеси ацетонитрила и воды. Форма D характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 27 и 28 градусов, и максимумом кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии приблизительно 270°C. Форма D является слабогигроскопичной или негигроскопичной, но обычно будет превращаться в форму B, когда подвергается воздействию более высокой относительной влажности.
Форма E 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой дигидратированное кристаллическое вещество, которое можно получать суспендированием 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в воде и медленным испарением 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в системе растворителей с соотношением ацетон:вода около 9:1. Форма E характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 20, 24,5 и 29 градусов, и максимумом кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии около 269°C. Форма E может превращаться в форму C в системе растворителя ацетона и в форму G в системе растворителя тетрагидрофурана (ТГФ). В системах водных растворителей форма E представляет собой наиболее устойчивую форму. Эксперименты по десольватированию, проводимые с формой E, показывают, что после нагревания при температуре около 125°C в течение около пяти минут форма E может превращаться в форму B. После нагревания при 175°C в течение около пяти минут форма B может превращаться в форму F.
Форма F 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона является несольватированным кристаллическим веществом, которое можно получать дегидратацией формы E. Форма F характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 19, 19,5 и 25 градусов, и максимумом кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии приблизительно 269°C.
Форма G 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона является несольватированным кристаллическим веществом, которое можно получать суспендированием форм B и E в растворителе, таком как тетрагидрофуран (ТГФ), но не ограниченным им. Форма G характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 21, 23 и 24,5 градусов, и максимумом кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии приблизительно 267°C.
Форма H 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона является частично гидратированным (около 0,25 моль) кристаллическим веществом, которое можно получить воздействием на форму E относительной влажностью 0%. Форма H характеризуется порошковой рентгенограммой, содержащей выраженные пики в области значений 2θ приблизительно 15, 26 и 31 градусов, и максимумом кривой температуры плавления, определенной методом дифференциальной сканирующей калориметрии приблизительно 269°C.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения, 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины, такие как описанные в патентах США № 5874448 и 5955476, каждый из которых включен в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединений имеют формулу:
2
в которой Y представляет собой кислород или H и
1
2
3
4
каждый из R, R, R и R независимо от других является водородом, галогеном, алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, содержащим 1-4 атома углерода, или амино.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения, тетразамещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, описанные в патенте США № 5798368, который включен в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединений имеют формулу:
1
2
3
4
в которой каждый из R, R, R и R независимо от других является галогеном, алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, или алкокси, содержащим 1-4 атома углерода.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения, 1-оксо- и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, раскрытые в патенте США № 6403613, который включен в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединений имеют формулу:
в которой
2
Y является кислородом или H,
1
2
1
2
первые из R и R представляют собой галоген, алкил, алкокси, алкиламино, диалкиламино, циано или карбамоил, вторые из R и R независимо от первых являются водородом, галогеном, алкилом, алкокси, алкиламино, диалкиламино, циано или карбамоилом, и
3
R представляет собой водород, алкил или бензил.
Конкретные примеры соединений имеют формулу:
1
2
в которой первые из R и R представляют собой галоген, алкил, содержащий 1-4 атома углерода, алкокси, содержащий 1-4 атома углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит 1-4 атома углерода, циано или карбамоил,
1
2
вторые из R и R независимо от первых являются водородом, галогеном, алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, содержащим 1-4 атома углерода, алкиламино, в котором алкил содержит 1-4 атома углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит 1-4 атома углерода, циано или карбамоил, и
3
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-4 атома углерода, или бензил. Конкретные примеры включают, без ограничения, 1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-метилизоиндолин.
Другие примеры соединений имеют формулу:
1
2
в которой первые из R и R представляют собой галоген, алкил, содержащий 1-4 атома углерода, алкокси, содержащий 1-4 атома углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит 1-4 атома углерода, циано или карбамоил,
1
2
вторые из R и R независимо от первых являются водородом, галогеном, алкилом, содержащим 1-4 атома углерода, алкокси, содержащим 1-4 атома углерода, алкиламино, в котором алкил содержит 1-4 атома углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит 1-4 атома углерода, циано или карбамоил, и
3
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-4 атома углерода или бензил.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения, 1-оксо- и 1,3-диоксоизоиндолины, замещенные в 4 или в 5 положениях индольным кольцом, описанные в патенте США № 6380239 и в совместно рассматриваемой заявкой США № 10/900270, поданной 28 июля 2004 года, которые включены в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединения имеют формулу:
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
1
2
в которой атом углерода, обозначенный C*, представляет собой хиральный центр (когда n не равен нулю и R не является идентичным R); один из X и X представляет собой амино, нитро, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, или NH-Z, и другие из X или X представляют собой водород; каждый из R и R независимо друг от друга является гидрокси или NH-Z; R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, галоген или галоалкил; Z представляет собой водород, арил, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, формил или aцил, содержащий 1-6 атомов углерода; и n имеет значение 0, 1 или 2; при условии, что если X является амино и n равен 1 или 2, то оба R и R не являются гидрокси; и их соли.
Дополнительные примеры соединений имеют формулу:
1
2
1
2
1
2
1
2
3
в которой атом углерода, обозначенный C*, представляет собой хиральный центр, если n не равен нулю и R и Rне являются идентичными; один из X и X представляет собой амино, нитро, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, или NH-Z, а другие из X или X представляют собой водород; каждый из R и R независимо друг от друга являются гидрокси или NH-Z; R представляет собой алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, галоген или водород; Z представляет собой водород, арил, или алкил, или ацил, содержащий 1-6 атомов углерода; и n имеет значение 0, 1 или 2.
Конкретные примеры включают, без ограничения, 2-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляную кислоту и 4-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляную кислоту, которые, соответственно, имеют следующие структуры, и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и стереоизомеры:
Другие примеры соединения имеют формулу:
∗
1
2
1
2
1
2
1
2
3
в которой атом углерода, обозначенный C, представляет собой хиральный центр, если n не равен нулю и R не идентичен R; один из X и X представляет собой амино, нитро, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, или NH-Z, а другие из X или X представляют собой водород; каждый из R и R независимо друг от друга являются гидрокси или NH-Z; R представляет собой алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, галоген или водород; Z представляет собой водород, арил, или алкил, или aцил, содержащий 1-6 атомов углерода; и n имеет значение 0, 1 или 2; и их соли.
Конкретные примеры включают, без ограничения, 4-карбамоил-4-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}масляную кислоту, 4-карбамоил-2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}масляную кислоту, 2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-4-фенилкарбамоилмасляную кислоту и 2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}пентандиовую кислоту, которые имеют, соответственно, следующие структуры, и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и стереоизомеры:
Другие конкретные примеры соединений имеют формулу:
1
2
1
2
в которой один из X и X представляет собой нитро или NH-Z, а другой из X или X является водородом;
1
2
каждый из R и R независимо друг от друга является гидрокси или NH-Z;
3
R представляет собой алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, галоген или водород;
Z представляет собой водород, фенил, ацил, содержащий 1-6 атомов углерода, или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; и
n имеет значение 0, 1 или 2;
1
2
1
2
при условии, что если один из X и X является нитро и n равен 1 или 2, то R и R не являются гидрокси; и
2
1
∗
2
n
если -COR и -(CH)COR различны, обозначенный C атом углерода представляет собой хиральный центр. Другие примеры соединения имеют формулу:
1
2
в которой один из X и X представляет собой алкил, содержащий 1-6 атомов углерода;
1
2
каждый из R и R независимо от другого является гидрокси или NH-Z;
3
R представляет собой алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, галоген или водород;
Z представляет собой водород, фенил, ацил, содержащий 1-6 атомов углерода, или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; и
n имеет значение 0, 1 или 2; и
2
1
*
2
n
если -COR и -(CH)COR различны, обозначенный C атом углерода представляет собой хиральный центр.
Вместе с тем, другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, без ограничения, изоиндолин-1-он и изоиндолин-1,3-дион, замещенный во 2 положении 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом, описанным в патенте США № 6458810, который включен в настоящее изобретение ссылкой. Примеры соединений имеют формулу:
в которой
атомы углерода, обозначенные ∗, представляют собой хиральные центры;
2
X представляет собой -C(O)- или -CH-;
1
3
R представляет собой алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, или -NHR;
2
R представляет собой водород, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, или галоген;
и
3
R представляет собой водород,
алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, незамещенный или замещенный алкокси, содержащий 1-8 атомов углерода, галоген, амино или алкиламино, содержащие 1-4 атома углерода,
циклоалкил, имеющий от 3 до 18 атомов углерода,
фенил, незамещенный или замещенный алкилом, содержащий 1-8 атомов углерода, алкокси, содержащий 1-8 атомов углерода, галоген, амино или алкиламино, содержащий 1-4 атомов углерода,
4
бензил, незамещенный или замещенный алкилом, содержащий 1-8 атомов углерода, алкокси, содержащий 1-8 атомов углерода, галоген, амино или алкиламино, содержащие 1-4 атома углерода, или -COR, в котором
4
R представляет собой водород,
алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, незамещенный или замещенный алкокси, содержащий 1-8 атомов углерода, галоген, амино или алкиламино, содержащий 1-4 атома углерода,
циклоалкил, имеющий от 3 до 18 атомов углерода,
фенил, незамещенный или замещенный алкилом, содержащий 1-8 атомов углерода, алкокси, содержащий 1-8 атомов углерода, галоген, амино или алкиламино, содержащий 1-4 атома углерода,
бензил, незамещенный или замещенный алкилом, содержащий 1-8 атомов углерода, алкокси, содержащий 1-8 атомов углерода, галоген, амино или алкиламино, содержащий 1-4 атома углерода.
Иммуномодулирующие соединения можно приобретать у коммерческих поставщиков или изготавливать согласно способам, описанным в патентах или патентных публикациях, раскрытых в настоящем изобретении, или способами, известными специалисту в данной области техники. Дополнительно оптически чистые соединения можно получать путем асимметричного синтеза или разделять, используя известные агенты для разделения или хиральные колонки, а также другие стандартные технологии синтеза в органической химии.
Разные иммуномодулирующие соединения содержат один или более хиральных центров и могут существовать в виде рацемической смеси энантиомеров или смеси диастереомеров. Способы и композиции, относящиеся к настоящему изобретению, охватывают использование стереомерно чистых форм таких соединений, а также использование смесей этих форм. Например, в способах и композициях настоящего изобретения можно использовать смеси, содержащие равное или неравное количество энантиомеров конкретных иммуномодулирующих соединений. Указанные изомеры можно получать путем асимметричного синтеза или разделять, используя стандартные технологии, такие как хиральные колонки или агенты для хирального разделения. См., например, публикации Jacques J. et al. Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen S.H. et al. Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962) и Wilen S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions, р.268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972).
Необходимо отметить, что если существует несоответствие между изображенной формулой и названием, то в первую очередь во внимание принимается структура, соответствующая изображенной формуле. Кроме того, если стереохимия формулы или части формулы не обозначена, например, жирными или пунктирными линиями, нужно интерпретировать формулу или часть указанной формулы как охватывающую все ее стереоизомеры.
5.3. Трихостатин А, гидроксимочевина и вальпроевая кислота
Трихостатин А (TSA) является ингибитором деацетилазы гистонов и имеет следующую формулу:
Трихостатин A можно изготавливать, используя общепринятые способы органического синтеза и используя коммерчески доступные исходные материалы. Трихостатин A также коммерчески доступен (например, от компании Sigma-Aldrich, CAS RN: 58880-19-6).
Гидроксимочевина (ГМ) является рибонуклеотидной редуктазой, имеющей следующую формулу:
Гидроксимочевину можно получать, используя общепринятые способы органического синтеза и используя коммерчески доступные исходные материалы. Гидроксимочевина также коммерчески доступна (например, от компании Sigma-Aldrich, CAS RN: 127-07-1).
Вальпроевая кислота представляет собой ингибитор деацетилазы гистонов и имеет следующую формулу:
Вальпроевую кислоту можно получать, используя общепринятые способы органического синтеза и используя коммерчески доступные исходные материалы. Вальпроевая кислота также коммерчески доступна (например, от компании Sigma-Aldrich, CAS RN: 99-66-1, или в виде соли натрия, CAS RN: 1069-66-5).
5.4 Способы применения и лечения
in vitro
in vivo
in vitro
in vivо
in vitro
in vivo
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам усиления роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+ или , к способам, которые содержат контактирование гематопоэтической стволовой клетки CD34+  или с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислотой, гидроксимочевиной или трихостатином A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа. В конкретных вариантах осуществлениях рост гематопоэтических стволовых клеток CD34+ увеличивается  или  примерно на 25%, около 50%, около 100%, около 200%, около 300%, около 400%, около 500% или около 1000% относительно клеток, которые не контактировали с комбинациями, описанными в настоящем изобретении.
in vitro
in vivo
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования заболевания или нарушения или их симптома, которые поддаются лечению, предупреждению или контролированию путем роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+  или , к способам, которые содержат введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В конкретном варианте осуществления заболевание или нарушение, поддающееся лечению, предупреждению или контролированию путем роста гематопоэтических стволовых клеток CD34+, является гематологическим заболеванием или нарушением, таким как миелодиспластический синдром, множественная миелома, бета-гемоглобинопатия, лейкозы, миеломы, лимфомы, миелопролиферативное нарушение, неходжкинская лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и острый миелобластный лейкоз.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования гематологического заболевания или нарушения (например, гематологического рака или опухоли), включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования лейкоза, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования мантийноклеточной лимфомы, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
in vitro
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам пересадки костного мозга, включающим контактирование костного мозга с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, , с последующей трансплантацией его пациенту, которому это необходимо.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга пациента, которому проводили или проводят химиотерапию и/или лучевую терапию, включающим введение указанному пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, включающим контактирование костного мозга с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам восстановления костного мозга, который подвергался или подвергается химиотерапии или лучевой терапии, включающим контактирование костного мозга с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
Конкретные заболевания, связанные с ростом гематопоэтических стволовых клеток CD34+, включают, без ограничения, гематологические раковые заболевания. В одном варианте осуществления гематологическим раком является множественная миелома, бета-гемоглобинопатии, лейкоз, миелома, лимфома, неходжкинская лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и острый миелобластный лейкоз.
Конкретное использование гематопоэтических стволовых клеток CD34+ включает, без ограничения, восстановление костного мозга и пересадку костного мозга. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение рассматривает способы лечения, предупреждения или контролирования гематологического заболевания или нарушения (например, гематологического рака), содержащие введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества гематопоэтических стволовых клеток CD34+, которые контактировали или находятся в контактировании с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
Конкретные заболевания и нарушения, поддающееся лечению, предупреждению и/или контролированию с применением комбинации иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина А, раскрытых в настоящем изобретении, включают, без ограничения, миелодиспластический синдром, множественную миелому, бета-гемоглобинопатии, лейкозы, миеломы, лимфомы, миелопролиферативное нарушение, неходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и острый миелобластный лейкоз.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или контролирования миелодиспластического синдрома, множественной миеломы, бета-гемоглобинопатий, лейкозов, миелом, лимфом, миелопролиферативного нарушения, неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза и острого миелобластного лейкоза, которые содержат введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина в клетках, включающим контактирование клетки, экспрессирующей эмбриональный гемоглобин, с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения экспрессии эмбрионального гемоглобина у нуждающегося в этом пациента, включающим введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования апоптоза злокачественной клетки, включающим контактирование злокачественной клетки с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации злокачественных клеток, включающим контактирование злокачественной клетки с эффективным количеством иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа, и вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, пролекарства, стереоизомера или полиморфа.
В одном варианте осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, содержат применение по существу чистого (S)-энантиомера или по существу чистого (R)-энантиомера иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона).
Иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) или их фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, пролекарство, стереоизомер или полиморф, и вальпроевая кислота, гидроксимочевина или трихостатин A, или их фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат, пролекарство, стереоизомер или полиморф в любом из применений и способов, описанных в настоящем изобретении, можно вводить одновременно, параллельно или последовательно.
5.4.1 Циклическая терапия
В конкретных вариантах осуществлениях иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) и вальпроевую кислоту, гидроксимочевину или трихостатин A вводят пациенту циклически. Циклическая терапия предполагает введение активного вещества в течение периода времени, с последующим перерывом (т.е. отсутствие лечения) в течение некоторого времени, и повторение такой последовательности введения. Циклическая терапия способна уменьшить развитие резистентности к одному или более способам лечения, избежать или снизить побочные эффекты одного из способов лечения и/или повысить эффективность лечения.
Следовательно, в одном конкретном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) вводят в комбинации с вальпроевой кислотой, гидроксимочевиной или трихостатином А ежедневно и непрерывно в начальной дозе от 0,1 до 5 мг/в день с повышением дозы (каждую неделю) от 1 до 10 мг/на дозу до максимальной дозы 50 мг/на дозу, по мере переносимости лечения. В другом варианте осуществления иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) вводят в комбинации с вальпроевой кислотой, гидроксимочевиной или трихостатином А в количестве около 1, 5, 10, или 25 мг/в день или в количестве около 10 мг/в день в течение трех-четырех недель, с последующим перерывом на одну неделю или две недели в четырех- или шестинедельном цикле.
2
2
2
2
В одном варианте осуществления иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) и вальпроевую кислоту, гидроксимочевину или трихостатин A вводят орально, с осуществлением введения иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) за 30-60 минут до вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, на протяжении цикла от четырех до шести недель. В другом варианте осуществления комбинацию вводят путем внутривенного вливания в течение около 90 минут в каждом цикле. В конкретном варианте осуществления один цикл содержит введение от около 1 около до 25 мг/в день иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона) и от около 1 до около в 2000 мг/м/в день, от около 10 до около 1000 мг/м/в день, от около 10 до около 500 мг/м/в день или от около 50 до около 200 мг/м/в день вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина А в течение трех-четырех недель и затем перерыв в одну или две недели. Обычно количество циклов, во время которых пациенту проводят комбинационную терапию, будет составлять от около одного до около 24 циклов, более обычно от около двух до около 16 циклов и еще более обычно от около трех до около четырех циклов.
5.5 Фармацевтические композиции и лекарственные формы
Фармацевтические композиции можно использовать при изготовлении индивидуальных, единичных стандартных лекарственных форм. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, рассматриваемые в настоящем изобретении, содержат эффективное количество иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион), или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, пролекарства или полиморфа, и эффективное количество вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, стереоизомера, пролекарства или полиморфа. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут дополнительно содержать один или более наполнителей, носителей или разбавителей. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут дополнительно содержать гематопоэтические стволовые клетки CD34+ или костный мозг.
Единичные стандартные лекарственные формы, рассматриваемые в настоящем изобретении, подходят для орального введения, нанесения на слизистые (например, назальное, сублингвальное, вагинальное, буккальное или ректальное), парентерального (например, подкожное, внутривенное, болюсная инъекция, внутримышечное или внутриартериальное), местное (например, глазные капли или другие офтальмологические препараты), трансдермального или чрескожного введения пациенту. Примеры лекарственных форм включают, без ограничения, таблетки (например, жевательные таблетки); каплеты; капсулы, такие как мягкие эластичные желатиновые капсулы; саше; крахмальные капсулы; пастилки; таблетки для рассасывания; дисперсии; суппозитории; порошки; аэрозоли (например, назальные спреи и ингаляторы); гели; жидкие лекарственные формы, подходящие для орального введения или нанесения на слизистые оболочки пациента, включающие суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии), эмульсии (например, эмульсии масло-в-воде или жидкая эмульсия вода-в-масле), растворы и эликсиры; жидкие лекарственные формы, подходящие для парентерального введения больному; глазные капли и другие офтальмологические препараты, подходящие для местного введения; и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые можно восстанавливать для получения жидких лекарственных форм, подходящих для орального или парентерального введения пациенту.
Композиция, ее вид и тип лекарственной формы обычно будут варьировать в зависимости от их применения. Например, лекарственная форма, применяемая для неотложного лечения заболевания, может нести в себе большее количество одного или больше активных компонентов, чем лекарственная форма, применяемая для лечения хронической фазы того же заболевания. Аналогично, парентеральная лекарственная форма может содержать в себе меньшее количество одного или более активных компонентов, чем оральная лекарственная форма, применяемая для лечения того же заболевания. Эти и другие подходы к варьированию конкретных лекарственных форм, рассматриваемых настоящим изобретением, будут с легкостью понятны специалистам в данной области техники. Например, см. издание Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).
Обычные фармацевтические композиции и лекарственные формы содержат один или более наполнителей. Подходящие наполнители известны специалистам в области фармации, и в настоящем изобретении представлены неограничивающие примеры подходящих наполнителей. Является ли конкретный наполнитель подходящим для включения его в фармацевтическую композицию или лекарственную форму, зависит от множества факторов, известных в данной области техники, включающих, без ограничения, путь введения лекарственной формы пациенту. Например, оральные лекарственные формы, такие как таблетки, могут содержать наполнители, которые не подходят для использования в парентеральных лекарственных формах. Пригодность конкретного наполнителя также может зависеть от конкретных активных компонентов в лекарственной форме. Например, некоторые наполнители, такие как лактоза, или воздействие воды могут ускорять расщепление некоторых активных компонентов. Активные компоненты, которые содержат первичные или вторичные амины, в особенности восприимчивы к такому ускоренному расщеплению. Следовательно, конкретные варианты осуществления охватывают фармацевтические композиции или лекарственные формы, которые содержат мало других моно- или дисахаридов, отличных от лактозы, если вообще их содержат. Используемое в настоящем изобретении понятие "безлактозный" означает, что количество присутствующей лактозы, если таковая вообще имеется, недостаточно для значительного увеличения скорости расщепления активного компонента.
Безлактозные композиции, относящиеся к настоящему изобретению, могут содержать наполнители, известные в данной области техники, и перечислены, например, в Фармакопее США (USP), 25-NF20 (2002). Обычно безлактозные композиции содержат активные компоненты, связующее вещество/наполнитель и смазывающее вещество в фармацевтически совместимых и фармацевтически приемлемых количествах. Конкретные безлактозные лекарственные формы содержат активные компоненты, микрокристаллическую целлюлозу, прежелатинизированный крахмал и стеарат магния.
Дополнительно настоящее изобретение рассматривает безводные фармацевтические композиции или лекарственные формы, содержащие активные компоненты, поскольку вода может способствовать расщеплению некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко принято в области фармации в качестве способов моделирования длительного хранения, для определения таких свойств, как срок годности или устойчивость рецептуры в течение времени. См., например, Jens T. Carstensen. Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, р.379-80. В действительности вода и высокая температура ускоряют расщепление некоторых соединений. Таким образом, действие воды на рецептуру может иметь большое значение, поскольку влага и/или влажность обычно присутствует во время изготовления, обработки, упаковки, хранения, отгрузки и применения рецептур.
Безводные фармацевтические композиции или лекарственные формы, рассматриваемые в настоящем изобретении, можно изготавливать, используя безводные компоненты или имеющие низкую влажность, и условия с низким содержанием влаги или низкой влажностью. Фармацевтические композиции или лекарственные формы, которые содержат лактозу и по меньшей мере один активный компонент, который содержит первичный или вторичный амин, могут быть безводными, если во время производства, упаковки и/или хранения ожидается значительное контактирование с влагой и/или влажностью.
Безводную фармацевтическую композицию необходимо изготавливать и хранить таким образом, чтобы поддерживать ее безводные характеристики. Соответственно, безводные композиции могут быть упакованы с использованием материалов, предотвращающих воздействие воды, таким образом, что их можно включать в состав подходящих рецептурных наборов. Примеры подходящей упаковки включают, без ограничения, герметично запечатанную фольгу, пластики, контейнеры для единичной стандартной лекарственной формы (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные упаковки.
Дополнительно настоящее изобретение рассматривает фармацевтические композиции или лекарственные формы, которые содержат одно или больше соединений, которые уменьшают скорость расщепления активного компонента. Такие соединения, называемые в настоящем изобретении "стабилизаторами", включают, без ограничения, антиокислители, такие как аскорбиновая кислота, pH буферы или солевые буферы. Аналогично количеству и типам наполнителей количество и конкретные типы активных компонентов в лекарственной форме могут отличаться в зависимости от таких ограничивающих факторов, как путь введения их больному. Вместе с тем, обычные лекарственные формы, относящиеся к настоящему изобретению, содержат иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф в количестве от около 0,10 до около 150 мг. Обычные лекарственные формы содержат иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф в количестве около 0,1, 1, 2, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 50, 100, 150 или 200 мг. В конкретном варианте осуществления лекарственная форма содержит иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф в количестве около 1, 2, 5, 10, 25 или 50 мг. Обычные лекарственные формы содержат вальпроевую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф в количестве от 1 до около 1000 мг, от около 5 до около 500 мг, от около 10 до около 350 мг или от около 50 до около 200 мг. Обычные лекарственные формы содержат трихостатин A или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф в количестве от 1 до около 5000 мг, от около 5 до около 1000 мг, от около 10 до около 500 мг или от около 50 до около 200 мг. Обычные лекарственные формы содержат гидроксимочевину или ее фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф в количестве от 1 до около 5000 мг, от около 5 до около 2500 мг, от около 10 до около 2000 мг, от около 50 до около 1000 мг, от около 50 до около 500 мг или от около 50 до около 250 мг. Конкретное количество агента будет безусловно зависеть от конкретного используемого вещества и типа заболевания или нарушения, лечение, предупреждение или контролирование которого проводят.
5.5.1 Оральные лекарственные формы
Фармацевтические композиции, относящиеся к настоящему изобретению, которые подходят для орального введения, могут представлять собой дискретные лекарственные формы, такие как таблетки (например, жевательные таблетки), каплеты, капсулы и жидкости (например, ароматизированные сиропы), но не ограничены вышеперечисленным. Такие лекарственные формы содержат заданное количество активных компонентов и могут быть изготовлены фармацевтическими способами, общеизвестными специалистам в данной области техники. См. общую информацию в издании Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing, Easton PA (2000).
Обычные оральные лекарственные формы, относящиеся к настоящему изобретению, изготавливают комбинированием активных компонентов при тщательном смешивании по меньшей мере с одним наполнителем согласно общепринятой фармацевтической технологии составления рецептуры. Наполнителями может быть широкое разнообразие форм в зависимости от желательной для введения формы препарата. Например, наполнители, подходящие для использования в оральных жидких или аэрозольных лекарственных формах, включают, без ограничения, воду, гликоли, масла, спирты, ароматические вещества, консерванты и красители. Примеры наполнителей, подходящих для использования в твердых оральных лекарственных формах (например, порошки, таблетки, капсулы и каплеты), включают, без ограничения, крахмалы, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие вещества, смазывающие вещества, связующие вещества и дезинтегранты.
Если желательно, таблетки можно покрывать с помощью стандартных водных или неводных технологий. Такие лекарственные формы можно изготавливать согласно любому из способов в фармации. Обычно фармацевтические композиции и лекарственные формы изготавливают путем однородного и тщательного смешивания активных компонентов с жидкими носителями, тонкодисперсными твердыми носителями или и с тем, и с другим, и затем придают продукту форму желательного внешнего вида при необходимости.
Например, таблетку можно изготавливать прессованием или формованием. Прессованные таблетки можно изготавливать прессованием в подходящей машине активных компонентов в свободно-текучем виде, таком как порошок или гранулы, необязательно смешанные с наполнителем. Формованные таблетки можно изготавливать формованием в подходящей машине смеси порошкованного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем.
Примеры наполнителей, которые можно использовать в оральных лекарственных формах, относящихся к настоящему изобретению, включают, без ограничения, связующие вещества, наполнители, дезинтегранты и смазывающие вещества. Связующие вещества, подходящие для использования в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, без ограничения, кукурузный крахмал, картофельный крахмал или другие крахмалы, желатин, натуральную и синтетическую смолу, такую как аравийская камедь, альгинат натрия, альгиновая кислота, другие альгинаты, порошкованный трагакант, гуаровую смолу, целлюлозу и ее производные (например, этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, кальций- карбоксиметилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу, (например, № 2208, 2906, 2910), микрокристаллическую целлюлозу и их смеси.
Подходящие формы микрокристаллической целлюлозы включают, без ограничения, материалы, продаваемые по маркой AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103, AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (доступные от компании FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA) и их смеси. Конкретное связующее вещество представляет собой смесь микрокристаллической целлюлозы и натрий-карбоксиметилцеллюлозы, продаваемой под маркой AVICEL RC-581. Подходящие безводные наполнители или наполнители с низкой влажностью или добавки включают AVICEL-PH-103™ и Starch 1500 LМ.
Примеры наполнителей, подходящих для использования в фармацевтических композициях и лекарственных формах, рассматриваемых в настоящем изобретении, включают, без ограничения, тальк, карбонат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу, порошкованную целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбит, крахмал, прежелатинизированный крахмал и их смеси. Связующее вещество или наполнитель в фармацевтических композициях, относящихся к настоящему изобретению, обычно присутствует в количестве от около 50 до около 99 вес.% фармацевтической композиции и лекарственной формы.
В композициях, рассматриваемых настоящим изобретением, могут применяться дезинтегранты для получения таблеток, которые распадаются при воздействии водной среды. Таблетки, которые содержат излишек дезинтегрирующего вещества, могут разлагаться при хранении, тогда как таблетки, содержащие слишком малое количество дезинтегранта, могут не расщепляться с желательной скоростью или при желательных условиях. Таким образом, для создания твердых оральных лекарственных форм, относящихся к настоящему изобретению, необходимо использовать достаточное количество дезинтегранта, которое является ни чрезмерным, ни слишком малым, чтобы отрицательно влиять на высвобождение активных компонентов. Количество используемых дезинтегрантов варьирует в зависимости от типа рецептуры и является очевидным для рядового специалиста в данной области техники. Обычные фармацевтические композиции содержат от около 0,5 до около 15 вес.% дезинтегранта, в одном варианте осуществления содержат от около 1 до около 5 вес.% дезинтегранта.
Дезинтегранты, которые можно использовать в фармацевтических композициях и лекарственных формах, относящихся к настоящему изобретению, включают, без ограничения, агар-агар, альгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, натрий-кроскармеллозу, кросповидон, калия полакрилин, натрия крахмалгликолят, картофельный или тапиоковый крахмал, другие крахмалы, прежелатинизированный крахмал, другие крахмалы, глины, другие альгины, другие целлюлозы, смолы и их смеси.
Смазывающие вещества, которые можно использовать в фармацевтических композициях и лекарственных формах, рассматриваемых настоящим изобретением, включают, без ограничения, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, светлое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, лаурилсульфат натрия, тальк, гидрированное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллаурат, агар и их смеси. Дополнительные смазывающие вещества включают, например, силоидный силикагель (AEROSIL200, производимый W.R. Grace Co., Baltimore, MD), коагулированный аэрозоль синтетического диоксида кремния (выпускаемый компанией Degussa Co. Piano, TX), CAB-O-SIL (пирогенный диоксид кремния, продаваемый компанией Cabot Co., Boston, MA) и их смеси. При использовании смазывающих веществ обычно их применяют в количестве менее примерно 1 вес.% фармацевтических композиций или лекарственных форм, в которые они вводятся.
5.5.2 Лекарственные формы с отсроченным высвобождением
Активные компоненты, относящиеся к настоящему изобретению, можно вводить способом контролируемого высвобождения или с помощью устройств доставки, известных рядовым специалистам в данной области техники. В число примеров входят, без ограничения, описанные в патентах США № 3845770; 3916899; 3536809; 3598123; 4008719; 5674533; 5059595; 5591767; 5120548; 5073543; 5639476; 5354556 и 5733566, каждый из которых полностью включен в настоящее изобретение со ссылкой. Такие лекарственные формы можно использовать для обеспечения замедленного или контролируемого высвобождения одного или более активных компонентов, например, путем использования гидроксипропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинации, чтобы обеспечить желательный профиль высвобождения в варьируемых соотношениях. Для использования с активными компонентами, относящимися к настоящему изобретению, можно легко выбрать подходящие рецептуры контролируемого высвобождения, включающие рецептуры, описанные в настоящем изобретении, известные рядовому специалисту в данной области техники. Таким образом, к настоящему изобретению относятся единичные стандартные лекарственные формы, подходящие для орального введения, такие как таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и каплеты, адаптированные для управляемого высвобождения, но не ограниченные вышеперечисленным.
5.5.3 Парентеральные лекарственные формы
Парентеральные лекарственные формы можно вводить пациентам разными путями, включающими, без ограничения, подкожный, внутривенный (включающий болюсную инъекцию), внутримышечный и внутриартериальный. Поскольку их введение обычно обходит природную защиту пациента против заражения, парентеральные лекарственные формы могут быть стерильными или их можно стерилизовать перед введением пациенту. Примеры парентеральных лекарственных форм включают, без ограничения, готовые растворы для инъекций, сухие продукты, готовые для растворения или суспендирования в фармацевтически приемлемом носителе для инъекции, готовые суспензии для инъекций и эмульсии.
Подходящие носители, которые можно использовать для получения парентеральных лекарственных форм, относящихся к настоящему изобретению, известны специалистам в данной области техники. Примеры включают, без ограничения, воду для инъекции USP; водные носители, такие как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, декстроза для инъекций, декстроза и хлорид натрия для инъекций и раствор Рингера с лактатом для инъекций; но не ограниченные вышеперечисленным, смешивающиеся с водой носители без ограничения, такие как этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; и неводные носители без ограничения, такие как кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.
Соединения, которые повышают растворимость одного или более активных компонентов, раскрытых в настоящем изобретении, также могут быть включены в парентеральные лекарственные формы, относящиеся к настоящему изобретению. Например, можно использовать циклодекстрин и его производные для повышения растворимости активных агентов, относящихся к настоящему изобретению. См., например, патент США № 5134127, который ссылкой включен в настоящее изобретение.
5.6 Наборы
В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее соединение (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) и вальпроевую кислоту, гидроксимочевину или трихостатин A не вводят пациенту одновременно или одним и тем же путем введения. Соответственно, настоящее изобретение относится к наборам, применение которых может позволить врачу упростить введение соответствующего количества активных компонентов пациенту.
Обычный набор, относящийся к настоящему изобретению, содержит контейнер, содержащий лекарственную форму иммуномодулирующего соединения (например, 4-(амино)-2-(2,6-диоксо(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-диона или 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион), или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф и контейнер, содержащий лекарственную форму вальпроевой кислоты, гидроксимочевины или трихостатина A, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, стереоизомер, пролекарство или полиморф.
Наборы, относящиеся к настоящему изобретению, дополнительно содержат устройства, которые используют для введения активных компонентов. Примеры таких устройств включают, без ограничения, шприцы, безыгольные инъекторы, капельницы, пластыри и ингаляторы.
Наборы, относящиеся к настоящему изобретению, могут дополнительно содержать CD34+ гематопоэтические стволовые клетки или костный мозг для трансплантации, а также фармацевтически приемлемые носители, которые могут применяться для введения одного или более активных компонентов. Например, если активный компонент представлен в твердой форме, которую необходимо восстанавливать для парентерального введения, набор может содержать герметичный контейнер подходящего носителя, в котором можно растворять активный компонент для образования стерильного раствора, не содержащего твердых частиц, подходящего для парентерального введения. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, воду для инъекции USP; водные носители, такие как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, декстроза для инъекций, декстроза и хлорид натрия для инъекций, и раствор Рингера с лактатом для инъекций; но не ограниченные вышеперечисленным, смешивающиеся с водой носители без ограничения, такие как этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; и неводные носители без ограничения, такие как кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.
6. ПРИМЕРЫ
Некоторые из вариантов осуществления, рассматриваемых в настоящем изобретении, иллюстрированы приведенными ниже примерами, не ограничивающими его объем.
6.1 Методики экспериментов
6.1.1 Материалы
+
Клетки Namalwa CSN.70 были приобретены в фирме DSМZ (Brauschweig, Германия). Костный мозг и CD34 клетки пуповинной крови были куплены в фирмах Cambrex (Walkersville, MD) и AllCells (Emeryville, CA), соответственно. Клетки CD34+ костного мозга больного серповидноклеточной анемией (СКА) были предоставлены Christopher Morris (Loma Linda University Medical Center, CA).
Анти-CD34-PE был куплен в фирме BD pharmingen. Вальпроевая кислота, трихостатин A и гидроксимочевина поставлялись фирмой Sigma.
6.1.2 Культивирование и обработка клеток
+
Клетки Namalwa культивировали в среде RPМI-1640 (Invitrogen, Carlsbad) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Рост клеток CD34 проводили в условиях без сыворотки в среде DМEМ Iscove's (Invitrogen, Carlsbad, CA) с добавлением 20% заменителя сыворотки BIT (StemCell Techologies, Vancouver, BC) в присутствии фактора стволовых клеток SCF (100 нг/мл), гена Flt3-L (100 нг/мл) и IL-3 (20 нг/мл) ((Biosource International, Camarillo, CA). Клетки Namalwa и клетки CD34+ культивировали в течение 3 и 6 дней, соответственно. В течение 3 или 6 дня культивирования в указанной концентрации добавляли диметилсульфоксид ДМСО 0,1%, соединение 1 или соединение 2, вальпроевую кислоту (VPA) или трихостатин А (TSA).
+
+
Клетки BМ-CD34 культивировали в среде МDМ Iscove's с BIT 95000 ((StemCell technologies) в присутствии факторов роста. В течение первых 6 дней рост CD34+ клеток проводили с SCF (100 нг/мл), Flt3-L (100 нг/мл) и IL-3 (20 нг/м1) и затем дифференцировали по эритроидному ростку путем культивирования с SCF (50 нг/мл) и эритропоэтином EPO (2 Ед или 4 Ед/мл) в течение 6 дней. Для изучения эффекта иммуномодулирующих соединений клетки предшественники CD34 дифференцировали в течение 6 дней в присутствии или отсутствие соединения 1, соединения 2 или гидроксимочевины (ГМ).
6.1.3 Анализ пролиферации и апоптоза клеток
+
+
Клетки Namalwa и CD34 высевали в количестве 4000 и 2000 клеток на лунку, соответственно, в 96-луночный планшет и обрабатывали соединением. Через указанное время клетки подсчитывали и фенотипически анализировали проточной цитометрией, используя систему клеточного сортера с возбуждением флуоресценции FACS. Процент клеток в апоптозе и CD34 клеток контролировали, используя окрашивание с пропидий йодидом (BD pharmingen, Chicago, IL) и антитело анти-CD34 (PE-конъюгирование) (BD pharmingen), соответственно, согласно методике эксперимента изготовителя.
6.1.4 Анализ пролиферации клеток Namalwa с включением BrDu
Клетки Namalwa высевали в количестве 10000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и обрабатывали в течение 3 дней TSA и соединения 1 в указанной концентрации. Действие TSA и соединения 1 на клеточную пролиферацию измеряли с использованием набора включения BrDu (Roche, Германия).
6.1.5 Иммунофлуоресцентное окрашивание на эмбриональный гемоглобин
Через 6 дней культивирования клетки промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР, PBS), фиксировали 2% параформальдегидом, получали пермеат с цитопермеафиксом (BD Pharmingen), окрашивали HbF-PE (BD-pharmingen, San Diego, CA) и анализировали проточной цитометрией (FACSAria, BD Pharmingen).
6.2 Результаты
Используя клетки Namalwa (человеческая лимфома Беркитта), было выявлено, что TSA в дозе 10 нМ обладает синергизмом к соединению 1 в плане прекращения индукции клеточной пролиферации (фиг.1).
Используя клетки Namalwa (человеческая лимфома Беркитта), было выявлено, что TSA в дозе 10 нМ обладает синергизмом к соединению 1 в отношении индукции апоптоза (фиг.2).
Используя клетки Namalwa (человеческая лимфома Беркитта), было выявлено, что VPA имеет аддитивный и синергический эффект к соединению 1 в плане прекращения индукции клеточной пролиферации (фиг.3).
Используя клетки Namalwa (человеческая лимфома Беркитта), было выявлено, что VPA имеет аддитивный и синергический эффект к соединению 1 в отношении индукции апоптоза (фиг.4).
Используя клетки Namalwa (человеческая лимфома Беркитта), было выявлено, что VPA имеет аддитивный и синергический эффект к соединению 2 в плане прекращения индукции клеточной пролиферации (фиг.5).
Используя клетки Namalwa (человеческая лимфома Беркитта), было выявлено, что VPA имеет аддитивный и синергический эффект к соединению 2 в отношении индукции апоптоза (фиг.6)
Изучали эффект комбинации соединения 1 и TSA на рост CD34+ клеток. Как показано на фиг.7 и 8, соединение 1 единственное увеличивало дозозависимым образом количество и процент CD34+ клеток после 6 дней культивирования. Добавление TSA в дозе 10 нМ к ростовой смеси значительно улучшало эффект соединения 1 на рост CD34+. Как показано в таблицах на фиг.7 и 8, VPA является аддитивным к соединению 1, и при некоторых условиях наблюдался синергический эффект.
Изучали эффект комбинации соединения 2 и TSA на рост CD34+ клеток. Как показано на фиг.9 и 10, соединение 2 единственное увеличивало дозозависимым образом количество и процент CD34+ клеток после 6 дней культивирования. Добавление TSA к ростовой смеси в дозе 1 и 10 нМ значительно улучшало эффект соединения 2 на рост CD34+. Как показано в таблицах фиг.9 и 10, VPA является аддитивным к соединению 1, и при некоторых условиях наблюдался синергический эффект.
Изучали действие комбинации соединения 1 и VPA на рост CD34+ клеток. Как показано на фиг.11 и 12, соединение 1 единственное увеличивало дозозависимым образом количество и процент CD34+ клеток после 6 дней культивирования. Добавление VPA в дозах 0,1, 0,3 и 1 мМ к ростовой смеси значительно улучшало эффект соединения 1 на рост CD34+. Как показано в таблицах фиг.11 и 12, VPA является аддитивным к соединению 1, и при некоторых условиях наблюдался синергический эффект.
Изучали эффект комбинации соединения 2 и VPA на рост CD34+ клеток. Как показано на фиг.13 и 14, соединение 2 единственное увеличивало дозозависимым образом количество и процент CD34+ клеток после 6 дней культивирования. Добавление VPA в дозах 0,1 и 0,3 мМ к ростовой смеси значительно улучшало эффект соединения 2 на рост CD34+. Как показано в таблицах фиг.13 и 14, VPA является аддитивным к соединению 2, и при некоторых условиях наблюдался синергический эффект.
Изучали эффект комбинации соединения 1 и соединения 2 и гидроксимочевины на экспрессию эмбрионального гемоглобина в гематопоэтических стволовых клетках CD34+ здорового донора, дифференцированных к эритоцитам. Как показано на фиг.15, соединение 1 и соединение 2 единственные дозозависимо увеличивали процент клеток, экспрессирующих HbF, после 6 дней культивирования. Добавление к ростовой смеси ГМ в дозе 10 мкМ значительно синергичным образом улучшало эффект соединения 1 и соединения 2 на экспрессию HbF.
Изучали эффект комбинации соединения 1 и гидроксимочевины (ГМ) на экспрессию эмбрионального гемоглобина в CD34+ клетках больного серповидноклеточной анемией (СКА), дифференцированных к эритоцитам. Как показано в фиг.16, соединение 1 единственное увеличивало дозозависимым образом процент клеток, экспрессирующих HbF, после 6 дней культивирования. Добавление ГМ в дозе 10 мкМ к ростовой смеси значительно улучшало эффект соединения 1 на экспрессию HbF синергическим образом.
Все ссылки, цитируемые в настоящем изобретении, включены со ссылкой во всей их полноте. Поскольку раскрытие описано в отношении конкретных вариантов осуществления, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что можно осуществлять разные изменения и модификации, не отступая от сущности и объема раскрытия, как изложено в прилагаемой формуле изобретения.
Предполагается, что варианты осуществления настоящего изобретения являются просто примерами, и специалисты в данной области техники будут понимать или, применяя не более чем рутинные эксперименты, смогут выявить многочисленные эквиваленты определенных конкретных соединений, веществ и методик. Предполагается, что все такие эквиваленты входят в объем настоящего раскрытия и охвачены прилагаемой формулой изобретения.