Основные субпопуляции регуляторных лимфоцитов у больных злокачественной меланомой и раком молочной железы

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014

ИММУНООНКОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 618.19-006.6+616.5-006.81.04]-092:612:017.1]-078.33

Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Заботина Т.Н., Короткова О.В., Борунова А.А., Славина Е.Г. ОСНОВНЫЕ СУБПОПУЛЯЦИИ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ

злокачественной меланомой и раком молочной железы

ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Представлены результаты изучения количественных изменений некоторых иммунологических показателей у первично-операбельных больных РМЖ и диссеминированной меланомой на разных этапах опухолевого роста и в процессе противоопухолевой терапии. У больных РМЖ обнаружена обратная зависимость процентного содержания CD8+CD28- Т- и CD45+CD3+CD16+CD56+ NKT-клеток, которые во многих исследованиях рассматриваются как супрессорные популяции, от стадии заболевания. У пациенток с I и II стадиями процент этих клеток был повышен по сравнению с донорами и больными с III стадией. У пациенток с III стадией их количество практически не отличалось от нормального уровня. Параллельное определение изменений количества основных популяций клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета у больных РМЖ показало, что повышенное по сравнению с контролем количество NK-клеток и CD8+ ЦТ Т-клеток и их цитотоксического потенциала отмечалось только на ранних стадиях заболевания, а у пациенток с III стадией было в пределах нормы. У больных диссеминированной меланомой, получавших лечение дендритно-клеточной вакциной, обнаружено неблагоприятное прогностическое значение CD3+CD8+CD16+ субпопуляции NKT-клеток. Обсуждается возможная связь между количественными изменениями супрессорных и эффекторных популяций лимфоцитов.

Ключевые слова: злокачественная меланома; рак молочной железы.

Kadagidze Z.G., ChertkovaA.I., Zabotina T.N., Korotkova O.V., BorunovaA.A., SlavinaE.G.

THE MAIN SUBPOPULATION REGULATORY LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH MALIGNANT MELANOMA AND BREAST CANCER

«Russian oncological scientific centre of AMI. Н.Н.Блохина Russian Academy of medical Sciences, 115478, Moscow The results of study of quantitative changes of some of the immunological parameters of primary operable breast cancer patients and disseminated melanoma at different stages of tumor growth and in the process of antineoplastic therapy. Patients of breast cancer detected inverse dependence between the percentage of CD8+CD28 - a - T-CD45+CD3+, CD16+CD56+ NKT cells that many studies are considered as супрессорные population, the stage of the disease. The patients from the I and II stages percentage of these cells was increased in comparison with donors and patients with III stage. In patients with III stage of their number did not differ from the normal level. Parallel to determine changes in the number of major populations of cells-effectors of anti-tumor immunity in patients breast cancer showed that increased compared with the control of the number of NK-cells and CD8+ DH T cells and their cytotoxic potential was only in the early stages of the disease, and in patients with III stage was normal. Patients disseminated melanoma treated дендритноклеточной vaccine adverse prognostic value of CD3+CD8+CD16+ subpopulations NKT-cells. Discusses a possible link between quantitative changes супрессорных and effector populations of lymphocytes.

Key words: malignant melanoma; breast cancer.

Результаты многочисленных экспериментальных и клинических исследований последнего десятилетия ясно продемонстрировали решающее значение иммунной системы в онкогенезе, опухолевой прогрессии и ответе на противоопухолевую терапию [1]. Взаимодействие между иммунной системой и злокачественной опухолью представляет тонкий баланс между процессами иммунной активации и иммунной супрессии. Опухоль имеет различные механизмы, способные разрушать иммунологическую защиту. В свою очередь иммунная система может не только подавлять, но и стимулировать опухолевый рост [2, 3]. Имеются данные о зависимости между количеством иммунокомпетентных клеток определенных популяций как в опухолевом узле, так и в периферической крови и продолжительностью безрецидивного периода и общей продолжительностью жизни пациентов со злокачественными новообразованиями [4-8]. Доказано, что незначительный успех различных видов иммунотерапии связан с опухольассоциированными механизмами, обеспечивающими нарушение иммуного ответа на опухоль и ускользание опухоли от иммунологического надзора. К настоящему

времени накоплен огромный материал, свидетельствующий о том, что различные субпопуляции регуляторных Т-клеток (CD4+, CD8+), а также NKT-клетки участвуют в подавлении как антигенспецифического, так и естественного противоопухолевого иммунитета [8-11]. Настоящее исследование посвящено изучению особенностей количественных изменений иммунологических показателей у первично-операбельных больных раком молочной железы (РМЖ) и диссеминированной меланомой на разных этапах опухолевого роста и в процессе противоопухолевой терапии.

Материалы и методы. В исследование были включены больные диссеминированной меланомой (n = 65) и первично-операбельным РМЖ (n = 73): I (NNJ (n = 24), II (T1N1, T2N0-N1) (n = 38), III (T2- N0-N2) (n = 11). Контролем служили здоровые лица (n = 35) соответствующего возраста и пола. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили методом многопараметрового цитометрического анализа с использованием коммерческих наборов моноклональных антител к поверхностным и внутриклеточным маркерам лимфоцитов (BD Biosciences Bekman Coulter,

- 64 -

иммуноонкология

Т аблица 1

Относительное содержание CD45+CD8+CD28- лимфоцитов периферической крови больных первично-операбельным рМЖ до и после операции в зависимости от стадии заболевания

Маркер I стадия II стадия III стадия Здоровые лица

% CD45+CD8+CD28-от CD45+CD8+: до операции после операции 83,2 ± 1,3* 81,8 ± 1,6* 75,3 ± 1,7* 72,7 ±1,6* 68,9 ± 4,5 63,1 ± 4,0 56,4 ± 2,3

Примечание. Здесь и в табл. 2-4: * р < 0,05 по сравнению с показателями у здоровых лиц.

США). Цитотоксический потенциал определяли как процент cD45+cD8+Perforin+- и СБ45+СШ6+РеПогт+-клеток в составе соответствующей популяции лимфоцитов (cD45+cD8+ и cD45+cD16+) [12]. Результаты статистически обрабатывали с использованием пакета статистических программ Statistica 7. Достоверность различий в исследовании оценивали по /-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям Вилкоксона-Манна-Уитни и Фишера в зависимости от характера распределения значений выборки. Различия считали достоверными при p < 0,05. Все результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки.

Результаты и обсуждение . При клинических исследованиях роли FOXP3+ Т-регуляторных клеток (Treg) при различных злокачественных новообразованиях установлено, что эта популяция клеток является гетерогенной и что неблагоприятное прогностическое значение Treg обнаруживают не при всех вариантах опухолей, в некоторых случаях эти клетки или не имеют прогностической ценности, или ассоциируются с положительным прогнозом заболевания [13, 14]. В результате определения процентного содержания Treg CD4+CD25+FOXP3+ или CD4+CD25“eh CD127low/neg у больных меланомой и первично-операбельным РМЖ выявили повышение этого показателя лишь у части из них. Повышение этого показателя по сравнению с таковым у здоровых лиц отметили лишь у 20,5% больных РМЖ. У остальных пациенток количество Treg в периферической крови как до, так и после операции не зависело от стадии заболевания и практически не отличалось от аналогичных показателей у здоровых лиц.

Результаты современных экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о том, что существенную роль в контроле иммунного ответа на аллотрансплантаты, аллергены, инфекционные агенты и опухолевые клетки играют CD8+T- и NKT-клетки. Описано несколько популяций CD8+T-лимфоцитов, проявляющих супрессорную активность. Особый интерес представляют CD8+CD28- Т-клетки, которые во многих экспериментальных и клинических исследованиях характеризуются как супрессорная популяция [8, 14-21]. CD8+CD28- Т-клетки включают как клетки-эффекторы, так и клетки-супрессоры.

G. Filaci и соавт. [15], исследуя опухолевые ткани, лимфоузлы и периферическую кровь у больных c различными формами злокачественных опухолей, обнаружили, что только у онкологических больных cD8+cD28- Т-клетки периферической крови проявляли супрессорную активность в отличие от CD8+CD28- Т-клеток здоровых лиц, которые супрессорной активностью не обладали.

Можно предположить, что CD8+CD28- Т-клетки играют отрицательную роль у онкологических больных и могут служить неблагоприятным прогностическим признаком, что должно учитываться в процессе лечения. В наших исследованиях проводили сравнение процентного содержания cD8+cD28- Т-клеток у пациенток с РМЖ до и после операции, а также у больных на

разных стадиях заболевания. Полученные результаты показали, что количество этих клеток было повышено у 78% больных по сравнению с таковым у здоровых лиц. Оперативное вмешательство не влияло на количество cD8+cD28- Т-лимфоцитов, в то время как обнаружилась зависимость процентного содержания этих клеток от стадии заболевания (табл. 1). До операции у пациенток с I и II стадией заболевания отметили статистически значимое повышение процента этих клеток в составе CD45+CD8+-лимфоцитов по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц (83,2 ± 1,3; 75,3 ± 1,7 и 56,4 ± 2,3%, соответственно). У пациенток с III стадией их количество в среднем было несколько выше, чем у здоровых женщин, однако различие оказалось статистически незначимым (68,9 ± 4,5 и 56,4 ± 2,3% соответственно). Подобное соотношение наблюдали и после оперативного лечения (см. табл. 1).

В последнее время значительное внимание уделяют NKT-клеткам. Эта популяция Т-клеток благодаря своей аутореактивности и способности быстро продуцировать достаточное количество различных цитокинов (Th1, Th2, Th3 и/или Th17) обеспечивает связь между врожденным и адаптивным звеньями иммунитета и играет уникальную роль в регуляции иммунного ответа при различных патологических состояниях [22]. NKT-клетки могут как стимулировать, так и подавлять противоопухолевый иммунный ответ [9, 21, 23]. В наших исследованиях показано, что процентное содержание NKT-клеток с фенотипом CD45+CD3+Cd16+CD56+ было статистически значимо повышено у 94,5% больных первичнооперабельным РМЖ - 14,8 ± 0,8% до операции и 14,4 ± 0,8% после операции. У здоровых лиц данный показатель составил 8,7 ± 1,1%. Интересно, что характер зависимости количества CD45+CD3+CD16+CD56+ NKT-клеток от стадии заболевания был таким же, как для cD8+cD28- Т-лимфоцитов. У пациенток с I и II стадией заболевания до операции отметили статистически значимое повышение процента этих клеток по сравнению с таковым у здоровых лиц и больных с III стадией (17,7 ± 1,3; 14,5 ± 1,2 и 8,7 ± 0,8% соответственно). У пациенток с III стадией их количество практически не отличалось от нормы (9,5 ± 1,6 и 8,7 ± 0,8% соответственно). Подобное соотношение наблюдали и после оперативного лечения (табл. 2).

В результате проведенного одновременно у тех же больных РМЖ определения изменения количества основных популяций клеток-эффекторов противоопухоле-

Таблица 2

Количество NKT-клеток периферической крови у больных первичнооперабельным рМЖ до и после операции в зависимости от стадии заболевания

Маркер I стадия II стадия III стадия Здоровые лица

% CD3+CD16+CD56+:

до операции 17,7 ± 1,3*,** 14,5 ± 1,2*,** 9,5 ± 1,6 8,7± 0,8

после операции 17,1 ± 1,4*** 13,7 ± 1,2* 11,0 ± 1,7

Примечание. ** - р < 0,05 по сравнению с показателями у больных с III стадией заболевания.

Таблица 3

Относительное содержание nK-клеток периферической крови у больных первично-операбельным рМЖ до и после операции в зависимости от стадии заболевания

Маркер

I стадия

II стадия III стадия Здоровые лица

% CD3-CD16+CD56+ NK-клетки:

до операции

после операции

22.7 ± 1,9 =

21.7 ± 2,5*

18,5 ± 1,5 17,8 ± 1,7

15,8 ± 2,2 15,2 ± 2,6

16,7± 1,3

- 65 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014

Таблица 4

Относительное содержание перфоринпозитивных лимфоцитов периферической крови и их цитотоксический потенциал у больных рМЖ до и после хирургического лечения в зависимости от стадии заболевания

Маркер Операция I стадия II стадия III стадия Доноры

СЭ45+С016+Регбэгт+ До 22,7 ± 1,3* 18,3 ± 1,2 16,2 ± 1,8 15,5 ± 1,4

После 22,7 ± 2,2* 16,8 ± 2,1 13,4 ± 1,7

СЭ45+С08+ Perforin+ До 18,5 ± 1,1* 17,8 ± 1,0* 15,0 ± 1,8 12,1 ± 1,2

После 19,1 ± 1,4* 16,0 ± 1,0* 12,1 ± 1,4

ЦТ-потенциал СЭ16+-лимфоцитов До 85,2 ± 1,3 78,8 ± 1,6 88,0 ± 2,7 75,9 ± 5,5

После 80,2 ± 3,3 79,9 ± 1,6 82,9 ± 4,2

ЦТ-потенциал СЭ8+-лимфоцитов До 54,4 ± 1,4* 51,8 ± 2,3* 47,1 ± 4,5* 36,5±2,5

После 55,4 ± 1,3* 50,7 ± 2,0* 42,3± 4,1

Примечание. ЦТ - цитотоксический.

вого иммунитета (NK-клетки и CD8+-цитотоксические Т-лимфоциты) и их цитотоксического потенциала установили, что оперативное лечение не влияло на эти показатели. В то же время, как и в случае с Treg cD8+28- и NKT-клетками, на ранних стадиях заболевания отметили повышение количества NK-клеток и их цитотоксического потенциала (I стадия) и CD8+-цитотоксических Т-клеток и их цитотоксического потенциала (I и II стадии) по сравнению с таковыми у здоровых лиц. У пациенток с III стадией

35- а

процентное содержание NK- и CD8+-цитотоксических Т-кле-ток и их цитотоксический потенциал практически не отличались от нормы (табл. 3 и 4). Полученные результаты позволяют предположить, что на более ранних стадиях заболевания повышение количества NKT-и cD45+cD8+cD28- Т-клеток отражает реакцию клеток-супрессоров на развивающийся противоопухолевый иммунный ответ, что уже не требуется на более поздних стадиях болезни, когда иммунный ответ уже подавлен. В определенной степени это предположение подтверждается обнаруженным в данном исследовании характером изменений количества и функциональной активности основных популяций цитотоксических клеток-эффекторов в зависимости от стадии заболевания. Цитотоксический потенциал как СD45+СD8+Perforin+Т-лимфоцитов, так и cD45+cD16+Perforin+ NK-клеток у больных с I и II стадией значительно превышал норму, но при дальнейшем распространении заболевания он снижался, и различие с показателями у здоровых лиц исчезало (см. табл. 3, 4). Таким образом, можно предположить, что нормальные показатели иммунитета, обнаруживаемые в определенных ситуациях у пациентов на поздних стадиях заболевания,

б

*

Безрецидивное течение заболевания Стаблизация Прогрессирование

Рис. 1. Динамика С045+С08+С011Ь+-цитотоксичесих Т-лимфоцитов больных меланомой в процессе вакцинотерапии. а - терапевтический режим, стабилизация; б - терапевтический режим, прогрессироание; в - профилактический режим, безрецидивное течение. По горизонтали - количество вакцинаций, по вертикали - % СВ45+СВ8+СБ11Ь+-клеток.

Рис. 2 Динамика популяции С016+С03+С08+-лимфоцитов периферической крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии.

а - профилактический режим вакцинотерапии; б - терапевтический режим вакцинотерапии,p < 0,05.

- 66 -

иммуноонкология

могут говорить не столько о сохранной иммунологической реактивности, сколько об исчерпанном потенциале иммунокомпетентных клеток, активность которых подавлена различными иммуносупрессивными факторами.

Одним из используемых в настоящее время иммунотерапевтических методов, направленных на повышение активности эффекторного звена противоопухолевого иммунитета, является вакцинотерапия с использованием дендритно-клеточной вакцины. Становится очевидным, что эффективность противоопухолевой терапии, особенно иммунотерапии, зависит не только от использованного метода лечения, но и в значительной степени от состояния иммунологической реактивности больного. На рис. 1 представлены результаты изучения изменения в динамике количества цитотоксических cD45+cD8+cD11b+ Т-лимфоцитов у больных диссеминированной меланомой, получавших дендритно-клеточную вакцину в терапевтическом и профилактическом режиме. У больных с прогрессированием заболевания на фоне терапии дендритно-клеточной вакциной исходно сниженное количество цитотоксиченских Т-клеток практически не изменялось (см. рис. 1, б), в то время как у больных, лечение которых привело к стабилизации процесса, процентное содержание этих клеток в процессе лечения заметно и постоянно возрастало и к концу наблюдения повысилось более чем в 3 раза (см. рис. 1, а). У больных, получавших дендритно-клеточную вакцину в профилактическом режиме, количество этих клеток увеличилось практически в 2 раза и оставалось на этом уровне до конца наблюдения (см. рис 1, в).

При изучении CD3+CD8+CD16+-субпопуляции NKT-клеток у больных диссеминированной меланомой, возможности стандартного лечения которых были исчерпаны, установили, что при исходно повышенном количестве этих клеток вакцинотерапия не имела должного эффекта в отличие от такового при исходно низком показателе (рис. 2, а). У больных, получавших дендритно-клеточную вакцинотерапию в профилактическом режиме, нарастание количества cD3+cD8+cD16+ NKT-клеток наблюдали только в случае рецидива заболевания (рис. 2, б). Важно отметить, что повышение количества этих клеток сочеталось со значительным снижением количества NK-клеток (CD3-

cD8-cD16+).

Полученные в работе результаты позволяют предположить, что отсутствие повышения количества цитотоксических cD45+cD8+cD11b+ Т-клеток у больных диссеминированной меланомой в процессе лечения дендритно-клеточной вакциной может служить показанием к прекращению вакцинотерапии в данном случае. Обнаруженная связь повышенного до лечения количества cD3+cD8+cD16+ NKT-клеток с отсутствием эффекта иммунотерапии и нарастанием количества cD3+cD8+cD16+ NKT-клеток в случае рецидива заболевания указывает на неблагоприятное прогностическое значение этой популяции клеток у больных диссеминированной меланомой при вакцинотерапии. Исходно повышенное количество cD3+cD8+cD16+ NKT-клеток у этой группы больных может служить основанием для отказа от данного вида лечения. Определение маркеров иммунологической реактивности, коррелирующих с течением заболевания и клинической эффективностью проводимой терапии, поможет усовершенствовать методы современной противоопухолевой терапии, разработать индивидуальные подходы к лечению пациентов с различными формами злокачественных новообразований и прогнозировать успех лечения.

ЛИТЕРАТУРА

12. Короткова О.В., Заботина Т.Н., Скотаренко Л.В. и соавт.

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных РМЖ // Российский биотерапевтический журнал. 2011;

10(3): 95-8.

REFERENCE

1. Swann J.B., Smyth M.J. Immune surveillance of tumors. J. Clin. Invest. 2007; 117: 1137-46.

2. Teng M.W.L., Swann J.B., Koebel C.M. et al. Immune-mediated dormancy: an equilibrium with cancer. J. Leukoc. Biol. 2008; 84: 988-93.

3. Yaguchi T., Sumimoto H., Kudo-Saito C., et al. The mechanisms of cancer immunoescape and development of overcoming strategies. Int. J. Hematol. 2011; 93: 294-300.

4. Dieu-Nosjean M-С., Antoine M., Danel C. Et al. Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structures. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 4410-17.

5. Eiro'N., Pidal I., Fernandez-Garcia B. et al. Impact of CD68/ (CD3+CD20) ratio at the invasive front of primary tumors on distant metastasis development in breast cancer. PLOS One. 2012; 7(12): e52796.

6. Hald S.M., Bremnes R.M., Al-Shibli K. et al. CD4/CD8 coexpression shows independent prognostic impact in resected nonsmall cell lung cancer patients treated with adjuvant radiotherapy. Lung Cancer. 2013; 80: 209-15.

7. Senovilla L., Vacchelli E., Galon J. et al. Prognostic and predictive value of the immune infiltrate in cancer. Oncoimmunology. 2012; 1: 1323-43.

8. Urbaniak-Kujda D., Kapelko-Slowik K., Wolowiec D. et al. Increased percentage of CD8+CD28- suppressor lymphocytes in peripheral blood and skin infiltrates correlates with advanced disease in patients with cutaneous T-cell lymphomas. Postepy Hig. Med. Dosw. 2009; 63: 355-9.

9. Berzofsky J. A., Terabe M. NKT cells in tumor immunity: opposing subsets define a new immunoregulatory axis. J. Immunol. 2008; 180: 3627-35.

10. Facciabene A., Motz G.T., Coukos G. T-regulatory cells: key players in tumor immune escape and angiogenesis. Cancer Res. 2012; 72: 2162-71.

11. Izhak L., Ambrosino E., Kato S. et al. Delicate balance among three types of T cells in concurrent regulation of tumor immunity. Cancer Res. 2013; 73: 1514-23.

12. Korotkova O.V, Zabotina T.N., Skotarenko L.V et al. Subpopulations lymphocytes peripheral blood of patients with breast cancer. Russian biotherapeutic journal. 2011; 10(3): 95-8.

13. deLeeuw R.J, Kost S.E, Kakal J.A. et al. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: a critical review of the literature. Clin. Cancer Res. 2012; 18: 3022-29.

14. Whiteside T.L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin. Cancer Biol. 2012; 22: 327-34.

15. Filaci G., Fenoglio D., Fravega M. CD8+CD28' T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and cytotoxic functions infiltrate human cancers. J. Immunol. 2007; 179: 4323-34.

16. Filaci G., Rizzi M., Setti M. et al. Non-antigen-specific CD8+ T suppressor lymphocytes in diseases characterized by chronic immune responses and inflammation. Ann. NY Acad. Sci. 2005; 1050: 115-23.

17. Karagoz B., Bilgi O., Gumus M. et al. CD8+CD28' cells and CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of advanced stage lung cancer patients. Med. Oncol. 2010; 27: 29-33.

18. Meloni F., Morosini M., Solari N. et al. Foxp3 expressing CD4+CD25+ and CD8+CD28' T regulatory cells in the peripheral blood of patients with lung cancer and pleural mesothelioma. Hum Immunol. 2006; 67: 1-12.

19. Najafian N., Chitnis T., Salama A.D. et al. Regulatory functions of CD8+CD28- T cells in an autoimmune disease model. J. Clin Invest. 2003; 112: 1037-48.

20. Wei S., Kryczek I., Zou L., Daniel B. Plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ regulatory T cells in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 2005; 65: 5020-6.

21. Xystrakis E., Dejean A.S., Bernard I. et al. Identification of a novel natural regulatory CD8 T-cell subset and analysis of its mechanism of regulation. Blood. 2004; 104: 3294-301.

22. Subleski J.J., Jiang Q., Weiss J.M., Wiltrout R.H. The split personality of NKT cells in malignancy, autoimmune and allergic disorders. Immunotherapy. 2011; 10: 1167-84.

23. Berzofsky J.A., Terabe M. The contrasting roles of NKT cells in tumor immunity. Curr. Mol. Med. 2009; 9: 667-72.

Поступила 03.07.13 Received 03.07.13

- 67 -