ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОТЕРМОСТОЙКОГО CAS-БЕЛКА И СПОСОБ И НАБОР РЕАКТИВОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ЦЕЛЕВОЙ МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Система обнаружения для обнаружения целевых молекул нуклеиновой кислоты, при этом система включает:
(a) белок Cas12b, причем белок Cas12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b;
(b) направляющую РНК, причем направляющая РНК направляет белок Cas12b для специфического связывания с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты; и
(c) зонд на основе нуклеиновой кислоты, который представляет собой одноцепочечную ДНК;
причем целевой молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК-мишень.
2. Система обнаружения по п. 1, в которой, когда целевой молекулой нуклеиновой кислоты является одноцепочечная ДНК, сайт обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты находится в положении 9 или в положениях 10-16, предпочтительно в положениях 10 14 и более предпочтительно в положениях 10-12 за последовательностью РАМ направляющей РНК.
3. Система обнаружения по п. 2, в которой, когда сайт обнаружения находится в положении 9 за последовательностью РАМ направляющей РНК, сайтом обнаружения является G.
4. Система обнаружения по п. 2, в которой сайт обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты находится в положениях 1-12, предпочтительно в положении 1, 3 или 10 за последовательностью РАМ направляющей РНК.
5. Система обнаружения SNP, при этом данная система содержит первую систему обнаружения и вторую систему обнаружения;
в которой первая система обнаружения включает:
(a1) белок Cas12b, причем белок Cas12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b;
(b1) первую направляющую РНК, причем первая направляющая РНК направляет белок Cas12b для специфического связывания с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты; и
(c1) зонд на основе нуклеиновой кислоты, который представляет собой одноцепочечную ДНК;
а вторая система обнаружения включает:
(а2) белок Cas12b, причем белок Cas12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b;
(b2) вторую направляющую РНК, причем вторая направляющая РНК направляет белок Cas12b для специфического связывания с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты; и
(с2) зонд на основе нуклеиновой кислоты, который представляет собой одноцепочечную ДНК;
причем целевой молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК-мишень;
кроме того, первая направляющая РНК и вторая направляющая РНК нацелены на одну и ту же область последовательности нуклеиновой кислоты, содержащую SNP-сайт, а первая направляющая РНК нацелена на последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа (или немутированной) SNP-сайта, а вторая направляющая РНК нацелена на последовательность мутированной нуклеиновой кислоты SNP-сайта.
6. Система обнаружения по п. 5, которая дополнительно содержит систему контроля холостой пробы, а система контроля холостой пробы включает:
(а3) белок Cas12b, причем белок Cas12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b;
(с3) зонд на основе нуклеиновой кислоты, который представляет собой одноцепочечную ДНК.
7. Набор для обнаружения целевых молекул нуклеиновой кислоты, который влючает:
i) первый контейнер и белок Cas12b, находящийся в первом контейнере, причем белок Cas12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b;
ii) необязательный второй контейнер и направляющую РНК, находящуюся во втором контейнере, причем вторая направляющая РНК направляет белок Cas12b для специфического связывания с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты;
iii) третий контейнер и зонд на основе нуклеиновой кислоты, находящийся в третьем контейнере;
iv) необязательно четвертый контейнер и буфер, находящийся в четвертом контейнере;
причем целевой молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК-мишень.
8. Набор по п. 7, который дополнительно содержит:
v) пятый контейнер и полимеразу для амплификации ДНК-мишени, находящейся в пятом контейнере;
vi) необязательный шестой контейнер и обратную транскриптазу для обратной транскрипции, находящуюся в шестом контейнере;
vii) седьмой контейнер и dNTP для реакции амплификации и/или реакции обратной транскрипции, находящийся в седьмом контейнере.
9. Способ обнаружения присутствия в образце целевых молекул нуклеиновой кислоты, который включаетследующие этапы:
(i) получение системы обнаружения целевых молекул нуклеиновой кислоты по п. 1, и система обнаружения дополнительно содержит образец, подлежащий обнаружению; и
(ii) выяснение, расщеплен ли зонд на основе нуклеиновой кислоты в системе обнаружения белком Cas12b, причем расщепление представляет собой транс-расщепление обходной одноцепочечной ДНК;
при этом, если зонд на основе нуклеиновой кислоты расщепляется белком Cas12b, это указывает на то, что целевая молекула нуклеиновой кислоты присутствует в образце; а если зонд на основе нуклеиновой кислоты не расщепляется белком Cas12b, это указывает на отсутствие целевой молекулы нуклеиновой кислоты в образце.
10. Способ обнаружения присутствия в образце целевых молекул нуклеиновой кислоты, который включает следующие этапы:
(i) получение системы обнаружения, которая включает:
(a) белок Cas12b, причем белок Cas 12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b;
(b) направляющую РНК, причем направляющая РНК направляет белок Cas12b для специфического связывания с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты;
(c) зонд на основе нуклеиновой кислоты, который представляет собой одноцепочечную ДНК;
причем целевой молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК-мишень;
(d) буфер;
(e1) полимеразу, которая используется для амплификации ДНК-мишени;
(е2) необязательную обратную транскриптазу, которая используется для обратной транскрипции;
(е3) dNTP, который используется для реакции амплификации и/или реакции обратной транскрипции; и
(f) образец для тестирования;
(ii) выполнение реакции обратной транскрипции и/или амплификации в системе обнаружения, получая таким образом обратно транскрибированную и/или амплифицированную систему обнаружения;
(iii) выяснение, расщеплен ли зонд на основе нуклеиновой кислоты в системе обнаружения, полученной на предыдущем этапе, белком Cas12b, причем расщепление представляет собой транс-расщепление обходной одноцепочечной ДНК;
при этом, если зонд на основе нуклеиновой кислоты расщепляется белком Cas12b, это указывает на то, что целевая молекула нуклеиновой кислоты присутствует в образце; а если зонд на основе нуклеиновой кислоты не расщепляется белком Cas12b, это указывает на указывает на отсутствие целевой молекулы нуклеиновой кислоты в образце.
11. Способ по п. 10, в котором обнаружение содержит: качественное выявление или количественное выявление;
в предпочтительном варианте количественное выявление представляет собой абсолютное количественное выявление; в более предпочтительном варианте количественное выявление представляет собой количественное выявление в сочетании с технологией цифровой ПИР.
12. Способ по п. 10, в котором способ амплификации нуклеиновой кислоты выбирается из группы, состоящей из: ПЦР-амплификация, петлевая изотермическая амплификация (LAMP), рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA), лигазная цепная реакция, амплификация методом разветвленной ДНК, амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), амплификация с замещением цепей (SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация, амплификация по типу катящегося кольца, геликаза-зависимая амплификация (HDA), изотермическая амплификация с одним праймером (SPIA), амплификация с использованием никирующих ферментов (NEAR), транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА) и амплификация SMAP2.
13. Способ по п. 10, в котором целевая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность метилированной нуклеиновой кислоты, или последовательность метилированной нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, полученной после преобразования неметилированного С в урацил.
14. Применение белка Cas12b для подготовки реагента или набора для обнаружения целевых молекул нуклеиновой кислоты на основании обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК, причем белок Cas12b представляет собой белок Cas12b или Cas, обладающий активностью, аналогичной обходной расщепляющей активности одноцепочечной ДНК белка Cas12b.
15. Устройство обнаружения присутствия в образце целевых молекул нуклеиновой кислоты, которое включает:
(a) модуль реакции амплификации - обходной реакции расщепления, который используется для выполнения реакций амплификации нуклеиновой кислоты и обходных реакций расщепления в цифровой реакционной системе, в которой обходная реакция расщепления опосредована белком Cas12b; и
(b) модуль обнаружения сигнала, который используется для выявления того, происходит ли обходная реакция расщепления, опосредованная белком Cas12b, в каждой цифровой реакционной системе.