Полиморфизм промоторной области (-174g'!c) гена IL6 и выживаемость при множественной миеломе

УДК 575.113:616-006.448-036.8

D.Kh. Kalimullina, А.В. Bakirov, T.V. Victorova

POLYMORPHISM OF INTERLEUKINE-6 PROMOTER REGION GENE (-174G—>C) IN MULTIPLE MYELOMA PATIENTS

Bashkir State Medical University, Ufa Institute of Biochemistry and Genetics Ufa Scientific Centre Russian Academy of Science, Ufa

ABSTRACT

Pathogenesis of multiple myeloma (MM) depends on the presence of Growth Factor (Cytokines). Interleukine-6 (IL-6) supports survival and distribution of myelogenetic cells. The cytokine concentration in plasma may be caused by the expression of the associated genes. There is a polymorphic site in Interleukine-6 promoter region gene (-174G->C), where two alleles of this locus - G and С - define different levels of IL-6 gene functional activity.

The analysis of (-174G->C) IL-6 gene polymorphism was carried out by polymerase chain reaction method. The results showed that the frequency of CC-genotype in MM-patients was 16,2 % and allele С was registered with the frequency 40,4 %. The respective data in the control group were 11,7 % (CC-genotype) and 37,7 % (allele C).

The median of the survival time of MM-patients with CC-genotype was 58 months; 25% of patients died during 34 months and 75 % - during 96 months. The median of the survival time of MM-patients with GG-genotype was 23,7 months; 255 of the patients died during 12 months and 75% - during 34,2 months. The comparative analysis of the survival time revealed that MM-patients were characterized by the best survival time while the MM-patients with GG-genotype were characterized by the worst survival time (p<0,05).

Thus, the molecular-genetic analysis revealed the association of GG-genotype of (-174G—>C) IL-6 gene polymorphism with higher parameters of survival time of MM-patients.

Key words: multiple myeloma, (-174G—>C) IL-6 gene polymorphism, survival time

Д.Х. Каттултна, А.Б. Бакиров, Т.В. Викторова

ПОЛИМОРФИЗМ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ (-174С-»С) ГЕНА \и И ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ

Башкирский государственный медицинский университет, Уфа Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа

РЕЗЮМЕ

Патогенез множественной миеломы (ММ) зависит от присутствия ростовых факторов (цитокинов). Йнтер-лейкин-6 (1Ь-6) поддерживает выживание и распространение миеломных клеток. Уровень цитокинов в сыворотке крови может быть обусловлен степенью экспрессии соответствующих генов. В полиморфном сайте (-1740—>С) гена П,-6 аллели в и С определяют различный уровень экспрессии гена.

Методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК проведен анализ полиморфных локусов-1740->С промоторного участка гена интерлейкина 6 (-1740—>С) 1Ь-6.

Частота генотипа СС в группе больных множественной миеломой составила 16,2 %, на долю аллеля С приходилось 40,4 %; в контроле частота генотипа СС -11,7 % и аллеля С - 37,7 % (%2=1,66; р=0,43).

Медиана времени выживания у пациентов с генотипом СС составила 58 мес, 25 % больных погибли в течение 34 мес, а 75 % - 96 мес. Медиана времени выживания при генотипе вв составила 23,7 мес, 25 % больных погибли в течение года, 75 % - 34,2 мес. При генотипе ОС 25 % больных погибли за 22,2 мес, 50 % -за 36,7; 75 % - за 54,3 мес. При сравнительном анализе выживаемости оказалось, что наилучшей выживаемостью характеризовались пациенты с генотипом СС, затем ОС и наихудшей- Ой, но статистически значимой разница была лишь в группах СС и вв (р< 0,05).

Таким образом, в результате молекулярно-генетического исследования больных множественной миеломой выявлена ассоциация генотипа СС полиморфизма -1740—>С промоторного участка гена 11^-6 гена с более высокими показателями выживаемости.

Ключевые слова: множественная миелома, полиморфизм (-1740—>С) 11^-6, выживаемость

ВВЕДЕНИЕ

Множественная миелома (ММ) - лимфопролиферативное заболевание из группы В - клеточных опухолей, морфологическим субстратом которого являются плазматические клетки, продуцирующие моноклональные иммуноглобулины [1]. По классификации REAL миелома относится к лимфоидным опухолям низкой степени злокачественности [15]. Миеломные клетки при ММ локализованы в костном мозге чаще всего в тесной ассоциации со стромальными. В костном мозге миеломные и стромальные клетки секрети-руют цитокины и взаимодействуют друг с другом. При этом активируются стромальные клетки (включая остеокласты), которые в дальнейшем поддерживают рост и выживание миеломных клеток и ведут к осложнениям, связанным с ММ [20; 18].

Патогенез ММ зависит от присутствия ростовых факторов (цитокинов), которые поддерживают выживание, пролиферацию и дифференцировку клеток ММ в костном мозге на протяжении различных стадий заболевания [4]. В культурах миеломных клеток in vitro продуцируются многие цитокины, в частности, грану-лоцито-макрофагальный колонийстимулирующий фактор, интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1 Ь, интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11(IL-11), фактор некроза опухояей-а (ФНО-а) и онкостатин М [11; 12].

Несмотря на то, что все эти цитокины могут стимулировать спонтанную пролиферацию миеломных клеток [21], только моноклональные антитела на IL-6 способны почти полностью ингибировать пролиферацию миеломных клеток in vitro [5; 27; 7]. Этот факт является очевидным указанием на то, что IL-6 является главным ростовым фактором миеломных клеток in vitro [21].

IL-6 поддерживает выживание и распространение миеломных клеток не только стимуляцией клеточного деления, но и путем предотвращения программированной клеточной гибели (апоптоза) [16; 27; 7]. Показано, что IL-6 может продуцироваться либо аутокрин-ным путем [17], либо паракринной секрецией клетками микросреды опухоли в костном мозге [19; 18]. Секреция IL-6 стромальными клетками костного мозга, остеобластами [5; 27] может быть обусловлена степенью экспрессии соответствующих генов.

Определение IL-6 имеет прогностическое значение, так как его концентрация в сыворотке крови зависит только от уровня продукции, а не от нарушения фильтрации вследствие почечной недостаточности, как это свойственно другому прогностическому маркеру- (І2-микроглобулину [29]. Уровень сывороточного IL-6 был повышен только в фазе прогрессии заболевания и достигал максимальных величин у больных агрессивной формой ММ [3; 30; 25].

В 1998 г. появилась публикация, сообщающая о полиморфном сайте (-174G-»C) в регуляторном участке гена IL-6 (промоторная область), в котором два аллеля G и С определяют различный конституитив-ный и индуцируемый уровень экспрессии гена [31]. Был установлен возрастающий эффект “дозы гена” в ряду генотипов С/С, G/C, G/G, выражающийся соответственно в повышении активности его транскрипции. На молекулярном уровне это явление объясняет факт расположения данного полиморфного сайта в участке

между -225 и -164, который демонстрирует негативный регуляторный эффект на транскрипцию гена IL-6 [26]. По-видимому, полиморфизм в сайте -174 может влиять на связывание глюкокортикоидного рецептора. Интересно также то, что замена гуанина цитозином в позиции -174 создает потенциальный сайт связывания для фактора транскрипции NF-1. В опытах на культурах клеток показано репрессорное влияние NF-1 на экспрессию гена [22].

Ассоциации функционального полиморфизма в промоторной области (-174G-»C) гена IL6 выявлены при некоторых мультифакториальных заболеваниях, в частности, системном хроническом артрите с ранней манифестацией [13], остеопорозе [24].

Данные литературы, касающиеся изучения клини-ко-генетических ассоциаций при гемобластозах, на сегодняшний день крайне малочисленны [31], а сведения об ассоциации полиморфизма (-174G->C) гена IL6 с выживаемостью при множественной миеломе отсутствуют. В этой связи представляется актуальным выявление клинико-генетических ассоциаций при ММ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Под наблюдением находились 68 больных, страдающих ММ, в возрасте от 31 года до 76 лет (средний возраст 58,0±0,9 лет). Контрольную группу составили 102 донора, сопоставимых по возрасту, полу и национальности с основной группой. Диагноз ставился на основании критериев CLMTF (Chronic Leukemia - Myeloma Task Force, 1973), включающих классическую триаду: плазмоцитоз костного мозга (не менее 10 %), костные повреждения различной степени-от остеопорозадо остеолизиса, моноклональный белок в крови и/или в моче. Согласно классификации B.G.Durie, S.E. Salmon(1975) [9] у 3 пациентов (2,3 %) была установлена I стадия, у 38 (29,5 %) - И, у 88 (68,2 %) - III.

По секреции типа патологических иммуноглобулинов пациенты распределились следующим образом: у 101 (78,3 %) - IgG-тип, у 23 (17,8 %) - IgA-тип, у 4 (3,1 %) - субвариант Бенс-Джонса, а у 1 (0,8 %) - не-секретирующий вариант.

Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [23]. Анализ полиморфного локуса-174 G->C промоторного участка гена интерлейкина 6 (-174G-»C IL-6) проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотид-ных праймеров [10].

Нуклеотидную замену гуанина цитозином в положении -174 выявляли рестрикцией полученного ПЦР-продукта (198 н.п.) ферментом Hsp92II [31]. Генотипы идентифицировались по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции, так что Hsp92II -генотип GG - это гомозиготы по отсутствию вариабельного сайта (31+167 н.п.), генотип GC - гетерозиготы по отсутствию и наличию сайта (31+167+122+45 н.п.), генотип СС -гомозиготы по наличию сайта (31+122+45 н.п.).

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 7 %-ном полиакриламидном

неденатурированном геле и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансшшюминаторе.

Разницу в распределении частот генотипов между группами рассчитывали с использованием критериях2 с поправкой Йетса на непрерывность с помощью программы RxC-статистика (Rows and Columns) [28]. Попарное сравнение изучаемых признаков (больные-контроль) проводилось с помощью критерия Фишера [2]. Уровень значимости (а) определяли по %2-распределению с одной степенью свободы. Различия между признаками считались достоверными при а <0,05; %2> 3,84.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты изучения полиморфизма -174G-»C промоторной области гена интерлейкина-6 (IL-6) у больных ММ представлены в таблице.

Как видно из таблицы, частота генотипа СС в группе больных множественной миеломой составила

16,2 % и на долю аллеля С приходилось 40,4 %. Более низкие значения аналогичных показателей оказались характерными для контрольной группы, где частота генотипа СС составила 11,7 % и аллеля С - 37,7 %. Однако сравнительный анализ распределения частот генотипов между больными множественной миеломой и контрольной группой существенных отличий не выявил (%2=1,66; р=0,43). Наши данные согласуются с результатами других авторов, которые также не обнаружили существенных различий характера распределения частот генотипов локуса -174G—>С промоторной области гена IL-6 между больными ММ и контрольной группой [31; 8].

В зависимости от генотипа по гену IL-6 нами был проведен анализ выживаемости пациентов с ММ по Caplan, Meier (1958) [6].

Установлено, что медиана времени выживания у пациентов с генотипом С С составила 58 мес, 25 % больных погибли в течение 34 мес, а 75 % - за 96 мес. Значительно более низкими показателями общей выживаемости характеризовались пациенты с генотипом GG: медиана времени выживания составила 23,7 мес, 25 % больных погибли в течение года, 75 % -

34,2 мес (рис. 1).

Промежуточное положение по выживаемости занимали пациенты с генотипом GC: 25 % больных погибли за 22,2 мес, медиана времени выживания оставила 36,7 мес и 75 % пациентов погибли в течение 54,3 мес (рис. 2).

При проведении сравнительного анализа выживаемости оказалось, что наилучшей выживаемостью характеризовались пациенты стенотипом СС, затем GC и наихудшей- GG, но статистически значимой разница была лишь в группах СС и GG (р< 0,05).

ВЫВОДЫ

Таким образом, в результате молекулярно-генетического исследования больных ММ выявлена ассоциация генотипа СС полиморфизма -174G-»C промотор-ного участка гена IL-6 гена с более высокими показателями выживаемости по сравнению с генотипами GC и GG. По-видимому, низкий уровень транскрипции гена IL-6 у индивидов с генотипом СС может иметь важное значение для клинического течения и выжива-

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) о Complete + Censored

Месяцы

Рис. 1. Сравнительная выживаемость больных с генотипом СС и СС гена 11,-6 при множественной миеломе:

! — пациенты с генотипом СС 1Ь-6;

— пациенты с генотипом СіО 1Ь-6

Cumulative Proportion Surviving

о Complete + Censored

Месяцы

Рис. 2. Сравнительная выживаемость больных с генотипом вС и ЄЄ гена 1Ь - 6:

( — пациенты с генотипом СС 11,-6;

— пациенты с генотипом йв 11,-6

емости при этом заболевании, а выявление генотипа

СС полиморфизма-1740—>С гена 1Ь-6 позволяет прогнозировать доброкачественное течение заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии: В 3 т. Под ред. А.И Воробьева - 3-е изд., перераб. и допол. - М: Ньюдиамед, 2003.

2. Животовекий Л.А. Популяционная биометрия. - М: Наука, 1991.-269 с.

3. Зарайский М. И. Роль маркеров главного комплекса ги-стосовмеетимости в прогнозировании активности течения множественноймиеломы: Автореф. дис.... канд. мед. наук. СПб., 1998.-23 с.

4. Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэм. Биохимия человека. - М.: Мир, 1993.-Т.2.-415 с.

5. Вг1еуа 1.А., МагИп Я.А., МагНпег-Мага О. е/ а1.

Interleukin 6 is essential for antibody secretion by human in vivo antigen-induced lymphoblastoid B cells // Cell Immunol. -1990. - Vol. 130, №2. -P. 303-310.

6. Caplan E.L., Meier P. Non parametric estimation from incomplete observations // J. Am. Stat. Assoc. - 1958. -Vol. 53.-P. 457-481.

7. Chauhan B.D., Kharbanda S., Ogata A. et al. Interleukin-6 inhibits fas-induced apoptosis and stress-activated protein kinase activation in multiple myeloma cells // Blood. -1997. - Vol. 89, № 1. - P. 227-234.

8. DringA.M., Davies F.E., Rollinsston S.J. et al. Interleukin-6, tumor necrosis factor a and lymphotoxin polymorphisms in monoclonal gammopathy of uncertain significance and multiple myeloma // Br. J. Haematol. - 2001. - Vol.l 12. - P. 248-253.

9. B. G.Durie, S.E. Salmon A clinical staging system for multiple myeloma. Correlation measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment, and survivae // Cancer. -1975. - Vol. 36, № 3. - P. 842-854.

Частота генотипов и аллелей полиморфного локуса -174С—»С промоторной области гена 1Ь*6 у больных множественной миеломой и в контрольной группе

Генотипы Больные ММ, N=68 Контроль N=102

Абс. % Абс. %

GG 24 35,29 37 36,3

GC 33 48,51 53 52,0

СС 11 16,20 12 11,7

у} 1,66

Аллель G 81 59,60 127 62,3

Аллет С 55 40,40 77 37,7

У2 0Д4

10. Fernandez-Real J.M., Broch M., Vendrell J. et al. Interleukin-6 gene polymorphism and lipid anomalities in healthy subjects //J. Clin. Endocrinol. Metabol. -2000. -Vol. 85.-P. 1334-1339.

11. Filella X„ Blade J., Guillermo A.L. et al. Cytokines (IL-6, TNF-alpha, IL-lalpha) and soluble interleukin-2 receptor as serum tumor markers in multiple myeloma // Cancer Detect Prev. -1996. - Vol. 20, № 1. - P. 52-56.

12. Filella X., Blade J., Montoto S. et al Impaired production of interleukin 6 and tumor necrosis factor a in whole blood cell cultures of patients with multiple myeloma // Cytokine. -1998. - Vol. 10, № 12.-P. 993-996.

13. Fishman D., Faulds G„ Jeffery R. et al. The effect of novel' polymorphisms in the interleukin-6 on IL-6 transcription and plasma levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis // J. Clin. Invest. - 1998. -Vol.l02.-P.1369-1376.

14. M. Hallek, P.L. Bergsagel, K.C. Anderson Multiple Myeloma: Increasing Evidence for a Multistep Transformation Process //Blood. -1998. - Vol. 91, № 1. - P. 3-21.

15. Harris N.L., JaffeE.S., Stein H. et al A Revised Europian-American Classification of Lymphoid Neoplasms: A Proposal From the International Lymphoma Study Group // Blood. - 1994. - Vol. 84. - P. 1361-1392.

16.Ishioka S., Haaften-Day C., Sagae S. et al. Effects of interleukin-6 (IL-6) on chemotherapy-induced apoptosis in human ovarian cancer cell lines // Int. J. Clin. Oncol. -1999,-Vol. 4.-P. 84-89.

17. Kawano M., Hirano T., Matsuda T. et al. Autocrine generation and requirement of BSF-2/IL-6 for human multiple myeloma // Nature. - 1988. - Vol.332. - P.83.

18. B. Klein, X.G. Zhang, Z.Y. Lu, R. Bataille Interleukin-6 in human multiple myeloma II Blood. -1995. - Vol. 85. - P. 863.

19. Klein B., Zhang, Content J. etal. Paracrine rather than autocrine regulation of myeloma-cell growth and differentiation by interleukin-6 II Blood. -1989. - Vol.73. -P. 517.

20. Kuninaka S., Yano T„ YokoyamaH. etal. Direct influences of pro-inflammatory cytokines (IL-ip, TNF-a, IL-6) on the proliferation and cell-surface antigen expression of cancer cells II Cytokine. - 2000. - Vol. 12, № 1. - P. 8-11.

21. Lauta V.M. Interleukin-6 and the network of several cytokines in multiple myeloma: an overview of clinical and experimental

data// Cytokine. -2001. -Vol.l 6, № 3. - P. 79-86.

22. Y. Liu, H. U. Bernard, D. Apt NFI-B3, a novel transcriptional repressor of the nuclear factor I family, is generated by alternative RNA processing // J. Biol.Chem. -1997. - Vol. 272. - P. 10739-10745.

23. Mathew C. C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. J.M. Walker - N.Y., London: Human Press, 1984. - Vol. 2. -P. 31-34.

24. OtaN., Nakajima T., Nakazaval. etal. A nucleotide variant in the promoter region of the interleukin-6 gene associated with decreased bone mineral density // Hum. Genet. - 2001. - Vol. 46. - P. 267-272.

25. Plante M., Rubin S. C., Wong G. Y. et al. Interleukin-6 level in serum and ascites as a prognostic factor in patients with epithelial ovarian cancer // Cancer. - 1994. - Vol. 73. -P. 1882-1888.

26. A. Ray, K.S. La Forge, P.B. Sehgal On the mechanism for efficient repression of the interleukin-6 promoter by glucocorticoids: enhancer, TATA box, and RNA start site (Inr motif) occlusion 1! Mol.Cell.Biol. - 1990. - Vol. 10. -P. 5736-5746.

27. J.E. Reittie, K.L. Yong, P. Panayiotidis, A. V. Hoffbrand Interleukin-6 inhibins apoptosis and tumor necrosis factor induced proliferation of B-chronic lymphocitic leukemia // Leuk.Lymphoma. -1996. - Vol. 22, № 1-2. - P. 83-90.

28.D.F. Roff, P. Bentzen The statistical analysis of mitochondrial DNA: %z and problem of small samples // Mol. Biol. Evol. -1989. - Vol. 6. - P. 539-545.

29. Thavasu P. W, Ganjoo R.K., Maidment S.A. et al. Myltiple myeloma: an immunoclinical study of disease and response to treatment//Haematol. Oncol. -1995.- Vol.91. -P. 69-82.

30. J.M. Watson, J.L. Sensintaffar, J.S. Berek, O. Martinez-Maza Constitutive production of interleukin-6 by ovarian cancer cell lines and by primary ovarian tumor cultures // Cancer Res. -1990. - Vol. 50. - P. 6959-6965.

31. Zheng Ch. Y, Huang D.R., Bergenbrant S. etal. Interleukin-

6, tumor necrosis factor a, interleukin IB and interleukin-

1 receptor antagonist promoter or coding gene polymorphisms in multiple myeloma II Br. J. Haematol. -2000.-Vol. 109.-P. 39-48.