Идентификация биологически активных соединений фитосбора «Бронхолисан»

фоне экспериментальной болезни Альцгеймера. Данный фармакологический эффект экстракта «Ноофита» обусловлен широким спектром биологически активных веществ (флавоноидов, полисахаридов, эфирных масел, комплекса

ЛИТЕРАТУРА

1. Арушанян Э.Б. Препараты корня женьшеня и других растительных адаптогенов как ноотропные средства // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. -Т. 71. №6. - С.58-66.

2. Барнаулов О.Д., Поспелова М.Л. Сравнительная оценка влияния препаратов классических адаптогенов и цветков лабазника вязолистного на нарушенное исследовательское поведение мышей // Психофармакология и биологическая наркология. - 2006. - Т. 6. Вып.1. - С.1232-1238.

3. Воронина Т.А., ОстровскаяР.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - С.153-161.

витаминов, органических кислот, макро- и микроэлементов и других веществ), содержащихся в значительных количествах в компонентах исследуемого растительного средства.

4. Дамулин И.В. Некоторые аспекты дифференциальной диагностики и терапии деменций. — М., 2004. - 44 с.

5. Иллариошкин С.Н. Ранняя диагностика нейродегенера-тивных заболеваний // Нервы. - 2008. - №1. - С.6-8.

6. Капай Н.А., Солнцева Е.И., Скребицкий В.Г. Донепезил устраняет ингибирующее влияние р-амилоидного пептида (142) на длительную потенциацию в гиппокампе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. №1. - С.38-41.

7. Сергиенко В.И., Бондаренко И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М., 2006. - 256 с.

8. Pasquier F., Leys D. Why are stroke patients prone to develop dementia? // J. Neurol. - 1997. - Vol. 244. №3. - P.135-142.

9. Snowdon D.A., Greiner L.H., Mortimer J.A., et al. Brain infarction and the clinical expression of Alzheimer’s disease. The Nun Study // JAMA. - 1997. - Vol. 277. №10. - P.813-817.

Информация об авторах: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, ОБАВ, тел. (3012) 433463, e-mail: tatur75@mail.ru, Николаев Сергей Матвеевич - заведующий отделом, д.м.н., профессор; Разуваева Янина Геннадьевна - старший научный сотрудник, к.б.н.; Базарова Надежа Цыреновна - аспирант; Верлан Надежда Вадимовна -декан, д.м.н., профессор; Николаева Ирина Геннадьевна - старший научный сотрудник, к.фарм.н.

© МАРТЫНОВ А.М., ДАРГАЕВА Т.Д. - 2012 УДК 615.23.07

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ФИТОСБОРА «БРОНХОЛИСАН»

Альберт Михайлович Мартынов1, Тамара Дарижаповна Даргаева2

Резюме. Проведены исследования химического состава основных биологически активных веществ фитосбора бронхолитического и отхаркивающего действия. Идентифицировано 14 веществ фенольной структуры: танин, ка-техин, галловая, кофейная, цикориевая и феруловая кислоты; флавоноидные соединения: гесперидин, гиперозид, лютеолин-7-гликозид, рутин, витексин, кемпферол, кверцетин, а также кумарин.

Ключевые слова: фитосбор, фенольные соединения.

IDENTIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS OF PHITOMIXTURE «BRONCHOLISAN»

A.M. Martynov1, Т.П. Dargaeva2

Summary. The chemical composition of main biologically active substances of fitomixture of bronchodilatory and expectorant action have been investigated. 14 substances of phenolic structures have been identified, e.g. tannin, catechin, gallic, caffeic, chicory and ferulic acids; flavonoidcompounds: hesperidin, hyperoside, luteolin-7-glycoside, rutin, vitexin, kaempferol, quercetin and coumarin.

Key words: fitomixture, phenolic compounds.

Заболевания органов дыхания довольно часто встречающаяся патология, особенно в условиях резкого континентального климата. Характеризуются они большим разнообразием и представлены чаще всего простудными явлениями (ОРЗ). Нередко они являются предшественниками бронхита, пневмонии, плеврита, астмы, также приводят к нарушениям работы других органов и систем организма. Для лечения этой группы заболеваний используются антибиотики, сульфаниламиды, ферменты, иммуностимуляторы, витамины и др. Важное место в терапии органов дыхания занимают лекарственные растительные объекты, содержащие различные группы биологически активных веществ. Более широким спектром действия обладают фитосборы, состоящие из нескольких растительных объектов, подобранных с учетом характера и тяжести заболевания. Они могут использоваться как в комплексе с другими лекарственными препаратами, так и после их отмены, а также при хроническом течении болезни.

Цель работы: исследование состава биологически активных веществ фитосбора «Бронхолисан».

Материалы и методы

Объектом исследования служил разработанный нами фитосбор «Бронхолисан», составными частями которого являлись солодки корни, чабреца трава и фиалки одноцветковой трава (1:1:1). Состав фенольных соединений фитосбора изучали с использованием комплекса физико-химических методов (ТСХ, БХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия).

Фенольные соединения выделяли из измельченного сбора 70%-ным спиртом этиловым, в соотношении 1:5 при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником до полного истощения сырья. Полученные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом на роторном испарителе до удаления растворителя. Водное извлечение охлаждали и фильтровали для отделения лиофобных веществ (смол

и хлорофилла). Фильтрат последовательно экстрагировали органическими растворителями - эфиром, этилацетатом. Водный остаток спирто-водного извлечения многократно (5-6 раз) обрабатывали равными объемами эфира, отделяя эфирный слой в делительной воронке. Полученные эфирные извлечения объединяли, затем упаривали, получая, таким образом, эфирную фракцию. Водный остаток, оставшийся после экстрагирования эфиром, нагревали на водяной бане для удаления эфира. После охлаждения водный остаток экстрагировали этилацетатом. Этилацетатные извлечения объединяли, упаривали и получили этилацетатную фракцию.

В дальнейшем проводили исследования эфирной, этила-цетатной фракций и водного остатка на наличие фенольных соединений с использованием качественных реакций и хроматографических методов [2,5].

Присутствие кумаринов в эфирной фракции устанавливали с помощью качественных реакций и методом тонкослойной хроматографии на пластинках “Silufol” в системе растворителей гексан - бензол - метиловый спирт (5:4:1). Детектирование зон адсорбции проводили обработкой хроматограмм 10%-ным раствором гидроксида калия в метиловом спирте и высушиванием в сушильном шкафу при 110оС в течение 2 мин. и последующим просматриванием в УФ-свете, затем обработкой свежеприготовленным диазореактивом [4].

Флавоноиды определяли в этилацетатном извлечении и водном остатке с использованием качественных реакций: цианидиновой пробы, с 10%-ным раствором гидроксида натрия и с 2%-ным раствором хлорида алюминия. Кроме того, использован метод бумажной хроматографии с применением систем растворителей: бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5), 15 и 30%-ный раствор уксусной кислоты. Для проявления хроматограмм применяли специальные реактивы - 10%-ный раствор гидроксида натрия, пары аммиака [1,2]. Хроматограммы просматривали в видимом и УФ-свете до, и после обработки хромогенными реактивами.

Фенолкарбоновые кислоты определяли в этилацетатной фракции с помощью бумажной хроматографии после обработки парами аммиака, раствором железа (III) хлорида, реактивом Шмидта.

Детальное исследование состава фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе фирмы «GILSON» (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «MultiChrom for Windows». Использовали металлическую колонку размерами 4,6x250 мм Kromasil C18, размер частиц сорбента 5 мкм, подвижной фазой служила система: метанол-вода-фосфорная кислота, концентрированная в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре со скоростью подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа составляла 60 мин. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора «GILSON» UV/VIS модель 151 при длине волны 254 нм.

Для изучения состава все компоненты сбора предварительно измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (ГОСТ 214-83). 5,0 г сырья помещали в колбу объемом 250 мл, прибавляли 50 мл 70%-ного спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 часов с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. Смесь охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 100 мл и доводили спиртом этиловым 70%-ным до метки, перемешивали и фильтровали (исследуемый раствор). Одновременно готовили серию 0,05%-ных растворов сравнения в 70%-ном спирте этиловом флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и кумаринов. Объем вводимой исследуемой пробы и растворов сравнения составлял 20 мкл. Идентификацию разделяемых веществ проводили путем сопоставления времени удерживания компонентов смеси со временами удерживания стандартных образцов. Количественную оценку идентифицированных веществ в исследуемом образце осуществляли по площади пика, используя метод внутренней нормализации.

Количественное определение группы феноль-

ных соединений проводили методом прямой спектрофото-метрии [3] на спектрофотометре “Lambda 35 UV/Vis” Perkin Elmer instruments (США). При разработке методики были изучены условия извлечения фенольных соединений из сырья: измельченность сырья, экстрагент и время экстракции. Таким образом, определены оптимальные условия: нагревание на водяной бане в течение 1 ч, степень измельченности 2 мм, с использованием в качестве растворителя 70%-ного спирта этилового.

Проведенными исследованиями УФ-спектра поглощения спиртового извлечения фитосбора установлено, что максимум поглощения отмечается при длине волны 270±2 нм, такой же максимум имеет 0,05% раствор галловой кислоты. Поэтому за аналитическую длину волны принято 270 нм, в соответствии с которой проводилось количественное определение в пересчете на галловую кислоту.

Образцы растительного сырья, входящие в состав фитосбора, предварительно измельчали до размера части, проходящих сквозь сито 2 мм. Около 2 г (точная навеска) помещали в колбу 200 мл, прибавляли 100 мл спирта этилового 70%, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали в течение 1 ч на кипящей водяной бане. Водно-спиртовое извлечение охлаждали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили спиртом этиловым той же концентрации до метки (раствор А).

2 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем доводили спиртом этиловым 70% до метки и перемешивали (раствор Б). Измеряли оптическую плотность раствора Б при длине волны 270 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 70%.

Параллельно измеряли оптическую плотность СО галловой кислоты.

Приготовление раствора СО галловой кислоты. Около

0,05 г (точная навеска) галловой кислоты помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли в спирте этиловом 70%, затем объем раствора доводили до метки тем же растворителем. 2 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем раствора доводили тем же растворителем до метки.

Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье в % (Х) вычисляли по формуле:

х_ Dm,, -2-100-100• 100-100 _ Dm,,-100-100

где D - оптическая плотность испытуемого раствора, Do - оптическая плотность раствора СО галловой кислоты, m - масса навески сырья в граммах, mo - масса навески СО галловой кислоты в граммах, W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного общего фитохимического

Таблица 1

Результаты исследования фенольных соединений фитосбора методом ВЭЖХ

№ п/п Время удерживания, мин. Площадь пика тМ*сек Количественное содержание в смеси, % Соединение

1 3.093 1525.59 4.51 танин

2 3.444 3207.44 9.43 галловая кислота

3 3.944 б772.30 20.01 катехин

4 5.1б5 737.90 2.13 кофейная кислота

5 б.099 1392.31 4.11 цикориевая кислота

б б.914 402.05 1.19 феруловая кислота

7 8.51б 1045.33 3.09 гесперидин

З 10.39 2223.19 б.53 гиперозид

9 12.53 435.47 1.43 лютеолин-7-гликозид

10 14.15 1233.32 3.б4 рутин

11 1б.3б 3340.30 9.37 кумарин

12 13.б9 435.49 1.29 витексин

13 20.7б 247.5б 0.73 кемпферол

14 29.77 2319.37 б.35 кверцетин

анализа и хроматографических исследований в фитосборе обнаружено 4 вещества, относящиеся к фенолкарбоновым кислотам, 7 веществ флавоноидной структуры, 1 соединение кумариновой природы, а также танин и катехин.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту

f X S2 S р, % T(f, P) ДХ E, %

5 3,33 0,011 0,1049 95 2,73 0,15 ± 4,43

Методом ВЭЖХ обнаружено 32 вещества фенольной природы, в основном представленных фенолкарбоновыми кислотами и флаво-ноидами. Идентификацию фенольных соединений проводили по времени удерживания растворов стандартных образцов. В результате идентифицировали 14 соединений: галловую, кофейную, цико-риевую, феруловую кислоты, танин, ка-техин, гесперидин, гиперозид, лютеолин-7-гликозид, витексин, кемпферол, рутин, кверцетин и кумарин. Установлено, что преобладающими среди фенолокислот является галловая и цикориевая, из флавоноидных соединений - кверцетин, гиперозид.

Количественное определение суммы фенольных соединений в исследуемом фитосборе проводилось методом пря-

мой спектрофотометрии (в пересчете на галловую кислоту) и составляет 3,38 %.

Метрологические характеристики разработанной нами количественной оценки фенольных соединений, представленные в таблице 2, свидетельствуют об удовлетворительной ее воспроизводимости.

Результаты опытов с добавками в пересчете на галловую кислоту свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки.

Таким образом, проведенными исследованиями установлен состав фенольных соединений фитосбора «Бронхолисан», идентифицированы флавоноиды: гесперидин, гиперозид, лютеолин-7-гликозид, витексин, кемпферол, рутин, кверцетин; - фенольные кислоты: галловая, кофейная, цикориевая, феруловая; танин, катехин, а также кумарин.

Разработана методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы для стандартизации предлагаемого фитосбора.

Таблица 3

Результаты опытов с добавками галловой кислоты в навеску исследуемого фитосбора

Найдено суммы фенольных соединений в сборе, г Добавлено РСО галловой кислоты,г Должно быть фенольных соединений, г Найдено фенольных соединений, г Ошибка

0,034 0,002 0,03б 0,0349 - 0,0011 - 3,05

0,034 0,0043 0,0333 0.0391 + 0,0003 + 2,09

0,034 0,00б2 0,0402 0,0403 + 0,000б + 1,49

ЛИТЕРАТУРА

1. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.А., Казаков А.Л. Методы исследования природных флавоноидов. - Пятигорск, 1977. -72 с.

2. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е.Е. Сироткиной. - Томск, 1987. -185 с.

3. Государственная Фармакопея РФ. - XII изд. - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 704 с.

4. Кирхнер Ю.Г. Тонкослойная хроматография. - М.: Мир, 1981. - Т. 1. - С.478-527.

5. Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. - М., 1962. - 851 с.

Информация об авторах: бб4049, г. Иркутск, м-н Юбилейный, 100, ГБОУ ДПО ИГМАПО, кафедра фармации, тел. (39S2) 4б-53-2б; e-mail: martinov_irk@mail.ru, Мартынов Альберт Михайлович - доцент, к.ф.н.; Даргаева Тамара Дарижаповна - главный научный сотрудник, д.ф.н., профессор.

СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ

© БЕЛЯЛОВ Ф.И., ИВАНОВА О.А., ХРУЛЕВА И.Г., ЧАЙКИСОВ Ю.С., ХАМАЕВА А.А. - 2012 УДК 616.12-008.318

ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ УДЛИНЕННОГО ИНТЕРВАЛА QT У СПОРТСМЕНА

Фарид Исмагильевич Белялов1, Ольга Александровна Иванова2, Ирина Геннадьевна Хрулева3,

Юрий Сергеевич Чайкисов3, Александра Алексеевна Хамаева3 ('Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, ректор - д.м.н., проф.

В.В. Шпрах; 2Иркутский областной врачебно-физкультурный диспансер, гл. врач - д.м.н., проф. Г.И. Губин; 3Медико-санитарная часть Иркутского авиационного производственного объединения, гл. врач - Е.Л. Выговский)

Резюме. Представлен клинический случай, который демонстрирует существующие сложности диагностики синдрома удлиненного интервала QT и необходимость всесторонней оценки состояния пациентов, тщательной интерпретации результатов лабораторных исследований.

Ключевые слова: синдром удлиненного интервала QT, спортсмены.

THE PROBLEMS OF DIAGNOSIS OF PROLONGED QT INTERVAL IN ATHLETE

F.I. Belyalov1, O.A. Ivanova2, I.G. Hrulieva3, U.S. Chaikisov3, A.A. Hamaeva3