АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К FLT3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES SPECIFIC TO FLT3 AND THEIR APPLICATIONS

Область техники
Настоящее изобретение относится к антителам, например, к полноразмерным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с Fms-подобной тирозинкиназой 3 (FLT3). Изобретение также относится к гетеромультимерным антителам (например, биспецифическим антителам), содержащим антитело FLT3 на одном плече. Также предложены композиции, содержащие антитела против FLT3, способы получения и очистки таких антител и их применение в диагностике и терапии.
Уровень техники
Duhier
Flt3 (также известный как CD135, FLK3, STK1), хорошо охарактеризованный антиген-мишень для острого миелоидного лейкоза (AML), сверхэкспрессируется на бластных клетках AML по сравнению со здоровыми клетками и экспрессируется на большинстве клеток пациента (см. например, Carow et al., Blood: 87 (3) (Feb 1996) и Birg et al., Blood: 80 (10) (Nov 1992)). Кроме того, Flt3 является наиболее часто мутированным геном у пациентов с AML, и мутации, приводящие к конститутивной активации рецептора, связаны с плохим прогнозом (см., например, Abu- et al. Br J Haematol., 111(1):190-5 (Oct 2000), Yamamoto et al.,Blood: 97 (8) (April 2001)).
Наличие онкогенного фактора на поверхности лейкозных бластов дает возможность для разработки направленной терапии. Низкомолекулярные ингибиторы Flt3 проявили активность в клинических испытаниях; однако ответы обычно являются транзиторными из-за приобретения устойчивости. Кроме того, с помощью ингибиторов киназы лечат только процент пациентов, экспрессирующих мутированную форму Flt3, что подчеркивает острую необходимость в разработке улучшенных методах лечения.
Недавно было также разработано биспецифическое антитело к Flt3 в форме биспецифического варианта с рекрутированием Т-клеток, поскольку Flt3 имеет относительно низкую экспрессию в опухолевых клетках по сравнению с другими опухолевыми антигенами. Однако ограничение многих биспецифических форматов состоит в том, что они имеют небольшую молекулярную массу и короткий период полужизни, требуя поэтому непрерывного вливания. Соответственно, остается потребность в антителах (например, моноспецифических или биспецифических) для лечения злокачественного новообразования, такого как AML, с улучшенными характеристиками эффективности и безопасности и подходящими для применения у пациентов-людей.
Сущность изобретения
Раскрытое в настоящем описании изобретение относится к антителам (например, моноспецифическим или биспецифическим антителам), которые специфически связываются с Fms-подобной тирозинкиназой 3 (FLT3). В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитела к FLT3, как описано в настоящем документе, в полноразмерном биспецифическом формате, имеют более продолжительный период полужизни, минимизируют Fc-взаимодействие и минимизируют неспецифическое высвобождение цитокинов in vivo посредством взаимодействия с иммунными клетками. Кроме того, обнаружено, что антитела против FLT3, нацеленные на домен 4 белка FLT3, как описано в настоящем документе, в полноразмерном биспецифическом формате более эффективны при истощении клеток AML сравнению с другими доменами, включая домены 1, 2, 3 и 5 в указанном биспецифическом формате.
Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с FLT3, где антитело содержит (а) вариабельную (VH) область тяжелой цепи, содержащую (i) область один, определяющую комплементарность VH (CDR1), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132 133, 134, 138, 139, 140, 246 или 247; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 или 255; и iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 или 254; и/или вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 или 275; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 или 271; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 или 274.
В другом аспекте предложено выделенное антитело, которое специфически связывается с FLT3, где антитело содержит: область VH, содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231 или 233; и/или область VL, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 или 232. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит область VH, содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO. 229; и/или область VL, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 228. В некоторых вариантах осуществления область VH, как описано в настоящем документе, содержит вариант с одной или более консервативными аминокислотными заменами в остатках, которые не находятся в пределах CDR, и/или область VL, как описано в настоящем документе, содержит вариант с одной или более аминокислотными заменами в аминокислотах, которые не входят в CDR. Например, в некоторых вариантах осуществления область VH или VL может содержать аминокислотную последовательность, описанную выше, или ее вариант с не более чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 консервативными заменами в остатках, которые не входят в CDR.
В некоторых вариантах осуществления предложено выделенное антитело, которое специфически связывается с FLT3, где антитело содержит: область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 215, 229 или 231; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 214, 228 или 230. В некоторых вариантах осуществления предложено выделенное антитело, которое специфически связывается с FLT3, где антитело содержит: область VH, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 229; и/или область VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 228.
В некоторых вариантах осуществления предложено антитело, которое специфически связывается с FLT3 и конкурирует с выделенным антителом, представленным в настоящем документе, которое специфически связывается с FLT3.
В другом аспекте предложено биспецифическое антитело, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее первый вариабельный домен биспецифического антитела, специфически связывающийся с антигеном-мишенью, и содержащее второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный к рекрутированию активности иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном, расположенным на иммунной эффекторной клетке человека, где первый вариабельный домен антитела связывается с доменом 4 FLT3, содержащим SEQ ID NO: 279, или доменом 5 FLT3, содержащим SEQ ID NO: 280.
В другом аспекте предложено биспецифическое антитело, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее первый вариабельный домен биспецифического антитела, специфически связывающийся с антигеном-мишенью (например, FLT3), и содержащее второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном (например, кластером дифференцировки 3 (CD3)), расположенным на иммунной эффекторной клетке человека. В некоторых вариантах осуществления первый вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 231 или 233; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 или 232. В некоторых вариантах осуществления первый вариабельный домен антитела содержит (а) вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую (i) область один, определяющую комплементарность VH, (CDR1), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 или 247; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 или 255; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 или 254; и/или (b) вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 или 275; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 или 271; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 или 274.
В некоторых вариантах осуществления второй вариабельный домен антитела содержит область VH и/или VL, специфичную к CD3. Например, второй вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 282; и/или вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 281.
В некоторых вариантах осуществления первый вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 229; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 228; и второй вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 282; и/или вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 281.
В некоторых вариантах осуществления второй вариабельный домен антитела содержит (а) область VH, содержащую (i) VH CDR1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 285, 286 или 287; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 288 или 289; и iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 290; и/или область VL, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 291; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 292; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 234.
В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем документе, содержат константную область. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем документе, относятся к подклассу IgG1, IgG2 или IgG2Δа, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем документе, содержат гликозилированную константную область. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем документе, содержат константную область, обладающую меньшей аффинностью связывания с одним или более человеческими Fc-гамма-рецепторами
В некоторых вариантах осуществления оба, первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела, содержат модификации аминокислот в положениях 223, 225 и 228 (например, (C223E или C223R), (E225R) и (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E (схема нумерации EU)) в области CH3 человеческого IgG2 (SEQ ID NO: 290).
В некоторых вариантах осуществления оба, первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела, содержат модификации аминокислот в положении 265 (например, D265A) человеческого IgG2.
В некоторых вариантах осуществления оба, первый и второй вариабельные домены антитела биспецифического антитела, содержат модификации аминокислот в одном или более положениях из 265 (например, D265A), 330 (например, A330S) и 331 (например, P331S) человеческого IgG2. В некоторых вариантах осуществления оба, первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела, содержат модификации аминокислот в каждом из положений 265 (например, D265A), 330 (например, A330S) и 331 (например, P331S) человеческого IgG2.
В других вариантах осуществления изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим любое из антител, описанных в настоящем документе.
Изобретение также относится к клеточным линиям, которые рекомбинантно продуцируют любое из антител, описанных в настоящем документе.
Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим любое из антител, описанных в настоящем документе. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи любого из антител, описанных в настоящем документе.
Изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор, предложенные в настоящем документе. Также предложен способ получения антитела (например, моноспецифического или биспецифического), представленный в настоящем документе, включающий культивирование клетки-хозяина, предложенной в настоящем документе, в условиях, которые приводят к продуцированию антитела, и выделение антитела из клетки-хозяина или культуры.
Изобретение также относится к наборам, содержащим эффективное количество любых антител или конъюгатов антител, описанных в настоящем документе.
Также предложено антитело или биспецифическое антитело, предложенное в настоящем документе для применения в качестве лекарственного средства.
Изобретение также относится к способам лечения пациентов, нуждающихся в этом, включающим предоставление выделенных антител или биспецифичных антител, описанных в настоящем документе, и введение указанных антител указанному пациенту.
Также предложены способы лечения состояния, связанного со злокачественными клетками, экспрессирующими FLT3, у пациента, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитела, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления состояние представляет собой злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой злокачественное новообразование, связанное с FLT3, выбранное из группы, состоящей из множественной миеломы, злокачественного новообразования в плазматических клетках, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, лейкоза плазматических клеток, плазмоцитомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, В-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL), острого миелоидного лейкоза (AML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), хронического миелоидного лейкоза (CML), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы мантийных клеток, крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы из предшественников В-клеток, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы лимфатической ткани, ассоциированной со слизистой, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы мантийных клеток, лимфомы Беркита, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфоплазмацитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодальной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, селезеночной лимфомы маргинальной зоны, интраваскулярной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной эффузионной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, Т-клеточной, богатой гистиоцитами крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной кожной диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (leg type), EBV-положительной диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы пожилых людей, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK-положительной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, плазмобластной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоцентровой болезни Кастлмана, B-клеточной лимфомы, не классифицированной с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, B-клеточной лимфомы, не классифицированной с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина и других злокачественных новообразований, связанных с гемопоэтическими клетками.
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста или прогрессирования опухоли у пациента, у которого есть злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей выделенные антитела или биспецифические антитела, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих FLT3 у пациента, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей выделенные антитела или биспецифические антитела, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение относится к способу индукции регрессии опухоли у пациента, у которого есть злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей выделенные антитела или биспецифические антитела, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают введение эффективного количества второго терапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент представляет собой биотерапевтический агент, например антитело.
В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент представляет собой цитокин, TNF-α (фактор некроза опухоли альфа), ингибитор PAP (фосфатаза фосфатидной кислоты), онколитический вирус, ингибитор киназы, ингибитор IDO (индолеамин-пиррол 2,3-диоксигеназа), ингибитор глутаминазы GLS1, CAR (химерный антигенный рецептор)-Т-клеточную терапию или Т-клеточную терапию, агонист TLR (Toll-подобный рецептор) (например, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9) или противоопухолевую вакцину. В некоторых вариантах осуществления этот цитокин представляет собой IL-15 (интерлейкин-15).
Краткое описание Фигур/Чертежей
На Фигуре 1 показано, что биспецифические FLT3/CD3 (плечо FLT3 представляет собой P5F7g, P5F7g1, P5F7g2, P5F7g3 или P5F7g4) индуцируют цитотоксичность в клеточной линии AML Eol1.
На Фигуре 2 показано, что биспецифические FLT3/CD3 (плечо FLT3 представляет собой P1F1, P4A4, P4E5 или P5F7) с эпитопами, связывающими домен 4 FLT3, очень эффективны в индукции цитотоксичности в ортотопической модели Eol1.
На Фигуре 3 показано, что биспецифические FLT3/CD3 (плечо FLT3 6B7 или P8B6), направленные на домен 4 белка FLT3, имеют повышенную противоопухолевую эффективность в ортотопическом ксенотрансплантате в присутствии Т-клеток человека.
50
На Фигурах 4A и 4B показаны сниженные значения EC для биспецифического антитела FLT3/CD3 (P5F7) в отсутствие или в присутствии IL15, соответственно.
На Фигурах 5А, 5В, 5С, 5D, 5E и 5F показано уничтожение двух первичных образцов AML в аспиратах костного мозга ex vivo, индуцированное повышением концентрации биспецифического FLT3/CD3 (P5F7) в присутствии аутологичных Т-клеток. Показано зависимое от концентрации увеличение общего количества Т-клеток и активированных Т-клеток, определяемое по проценту CD25+ клеток.
Подробное описание изобретения
Раскрытое в настоящем описании изобретение относится к антителам (например, моноспецифическим или биспецифичным), которые специфически связываются с FLT3 (например, человеческим FLT3). Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим эти антитела, композициям, содержащим эти антитела, и способам получения и применения этих антител. Изобретение также относится к способам лечения состояния, связанного с FLT3-опосредованной патологией у пациента, такого состояния как злокачественное новообразование. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитела к FLT3, описанные в настоящем документе, в полноразмерном биспецифическом формате, имеют более продолжительный период полужизни, минимизируют Fc-взаимодействие и минимизируют неспецифическое высвобождение цитокинов in vivo посредством взаимодействия с иммунными клетками. Кроме того, обнаружено, что антитела к FLT3, нацеленные на домен 4 белка FLT3, как описано в настоящем документе, в полноразмерном биспецифическом формате более эффективны при истощении клеток AML по сравнению с другими доменами, включая домены 1, 2, 3 и 5 в биспецифичном формате.
Общие методы
Практика настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, традиционные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, иммунологии, вирусологии, генерации и конструирования моноклональных антител, которые известны специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Определения
2
«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., по меньшей мере, через один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в настоящем описании термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их антигенсвязывающие фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab'), Fv), одноцепочечные (ScFv) и доменные антитела (включая, например, антитела акулы и верблюда), и слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт узнавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или его подкласс), и антитело не обязательно должно относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела иммуноглобулины можно отнести к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.
2
Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» антитела относится к одному или более фрагментам интактного антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с данным антигеном (например, FLT3). Антигенсвязывающие функции антитела могут выполняться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают Fab; Fab'; F(ab'); фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; фрагмент однодоменного антитела (dAb) (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) и выделенная область, определяющая комплементарность (CDR).
Антитело или полипептид, который «предпочтительно связывает» или «специфически связывает» (используются здесь взаимозаменяемо) с мишенью (например, белком FLT3), является хорошо понятным в данной области термином, и способы определения такого специфического или предпочтительного связывания также хорошо известны в области техники. Говорят, что молекула проявляет «специфическое связывание» или «предпочтительное связывание», если она реагирует или ассоциируется чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело «специфически связывается» или «предпочтительно связывается» с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или предпочтительно связывается с эпитопом FLT3, представляет собой антитело, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами FLT3 или не-FLT3 эпитопами. Также понятно, читая это определение, что, например, антитело (или фрагмент или эпитоп), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью, может специфически или предпочтительно не связываться со второй мишенью. Как таковое, «специфическое связывание» или «предпочтительное связывание» не обязательно требует (хотя может включать) исключительного связывания. Как правило, но не обязательно, ссылка на связывание означает предпочтительное связывание.
«Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации. Как известно в данной области техники, каждая вариабельная область тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости FR и вместе с CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител. Существует по меньшей мере два метода определения CDR: (1) подход, основанный на вариабельности последовательностей между видами (то есть Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273: 927-948). При использовании в настоящем документе, CDR может относиться к CDR, определенным либо одним подходом, либо комбинацией обоих подходов.
«CDR» вариабельного домена представляют собой аминокислотные остатки в вариабельной области, которые идентифицируются в соответствии с определениями Kabat, Chothia, накоплением как Kabat, так и Chothia, AbM, контактными и/или конформационными определениями или любым методом определения CDR, хорошо известным в данной области. CDR антител могут быть идентифицированы как гипервариабельные области, первоначально определенные Kabat et al. См., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Положения CDR также могут быть идентифицированы как структурные петлевые структуры, первоначально описанные Chothia и другими. См., например, Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989. Другие подходы к идентификации CDR включают «определение AbM», которое является компромиссом между Kabat и Chothia и получено с использованием программного обеспечения для моделирования антител AbM Oxford Molecular (теперь Accelrys), или «определение контакта» CDR на основе наблюдаемых контактов антигена, изложенное в MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. В другом подходе, упоминаемом в настоящем описании как «конформационное определение» CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, которые вносят энтальпийный вклад в связывание антигена. См., например, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166, 2008. Тем не менее, другие определения границ CDR могут не строго следовать одному из вышеприведенных подходов, но, тем не менее, будут перекрываться по меньшей мере с частью CDR Kabat, хотя они могут быть сокращены или удлинены в свете прогноза или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. Используемая в настоящем описании CDR может относиться к CDR, определенной любым подходом, известным в данной области техники, включая комбинации подходов. Используемые в настоящем описании способы могут использовать CDR, определенные в соответствии с любым из этих подходов. Для любого данного варианта осуществления, содержащего более чем одну CDR, CDR могут быть определены в соответствии с любым из подходов Kabat, Chothia, «расширенного», «AbM», «контактного» и/или «конформационного».
Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Модификатор «моноклональное» указывает на характер антитела, получаемого по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler and Milstein, Nature 256: 495, 1975, или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США, № 4816567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, полученных с использованием методик, описанных, например, в McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990.
Используемый в настоящем описании термин «гуманизированное» антитело относится к формам антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), которые представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Предпочтительно, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки области, определяющей комплементарность, (CDR), реципиента заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (донорское антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющей желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не обнаружены ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях, но включены для дальнейшего уточнения и оптимизации характеристик антитела. В некоторых примерах гуманизированное антитело будет включать, по существу, все, по меньшей мере, один, и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или, по существу, все области CDR соответствуют областям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все области FR представляют собой консенсусные последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Предпочтительными являются антитела, имеющие области Fc, модифицированные, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 или CDR H3), которые изменены по отношению к исходному антителу, которые также называются одной или более CDR, «производными из» одной или более CDR из исходного антитела.
in vitro).
Используемый в настоящем описании термин «человеческое антитело» означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или которое было получено с использованием любого из способов получения антител человека, известных специалистам в данной области техники, или раскрытых в настоящем описании. Это определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды мышиной легкой цепи и тяжелой цепи человека. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных методик, известных в данной области. В одном варианте осуществления человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, где эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Человеческие антитела также могут быть получены путем иммунизации животных, которым локусы человеческого иммуноглобулина были трансгенно введены вместо эндогенных локусов, например мышиных, у которых гены эндогенного иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в пат. США No. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016. Альтернативно, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации В-лимфоцитов человека, которые продуцируют антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть выделены из индивидуума или из клонирования одной клетки с кДНК, или могут быть иммунизированы  Смотри, например, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991; и Пат. США No. 5750373.
Термин «химерное антитело» предназначен для обозначения антител, в которых последовательности вариабельной области получены из одного вида, а последовательности константной области получены из другого вида, как например, антитело, в котором последовательности вариабельной области получены из мышиного антитела, а последовательности константной области получены из человеческого антитела.
Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения цепей аминокислот любой длины. Например, цепь может быть относительно короткой (например, 10-100 аминокислот) или более длинной. Цепь может быть линейной или разветвленной, она может содержать модифицированные аминокислоты и/или может прерываться не аминокислотами. Термины также охватывают аминокислотную цепь, которая была модифицирована естественным путем или путем вмешательства; например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любых других манипуляций или модификаций, такие как конъюгация с метящим компонентом. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Понятно, что полипептиды могут встречаться в виде отдельных цепей или связанных цепей.
«Одновалентное антитело» содержит один антигенсвязывающий сайт на молекулу (например, IgG или Fab). В некоторых случаях одновалентное антитело может иметь более чем один антигенсвязывающий сайт, но при этом сайты связывания относятся к разным антигенам.
«Моноспецифическое антитело» содержит два идентичных антигенсвязывающих сайта на молекулу (например, IgG), так что два сайта связывания связывают идентичный эпитоп на антигене. Таким образом, они конкурируют друг с другом за связывание с одной молекулой антигена. Большинство антител, встречающихся в природе, являются моноспецифическими. В некоторых случаях моноспецифическое антитело также может представлять собой одновалентное антитело (например, Fab).
«Двухвалентное антитело» содержит два антигенсвязывающих сайта на молекулу (например, IgG). В некоторых случаях два сайта связывания имеют одинаковую антигенную специфичность. Однако двухвалентные антитела могут быть биспецифическими.
«Биспецифическое» или «с двойной специфичностью» представляет собой гибридное антитело, имеющее два разных антигенсвязывающих сайта. Два антигенсвязывающих сайта биспецифического антитела связываются с двумя разными эпитопами, которые могут находиться на одной или разных белковых мишенях.
«Бифункциональным» является антитело, которое представляет собой антитело, имеющее идентичные антигенсвязывающие сайты (т.е. идентичные аминокислотные последовательности) в двух группах, но каждый сайт связывания может распознавать два разных антигена.
«Гетеромультимер», «гетеромультимерный комплекс» или «гетеромультимерный полипептид» представляет собой молекулу, содержащую, по меньшей мере, первый полипептид и второй полипептид, где второй полипептид отличается по аминокислотной последовательности от первого полипептида, по меньшей мере, одним аминокислотным остатком. Гетеромультимер может содержать «гетеродимер», образованный первым и вторым полипептидом, или может образовывать третичные структуры более высокого порядка, где присутствуют полипептиды в дополнение к первому и второму полипептиду.
«Гетеромультимер», «гетеромультимерный белок» или «гетеромультимерный комплекс» представляют собой молекулу, содержащую, по меньшей мере, первый полипептид и второй полипептид, где второй полипептид отличается по аминокислотной последовательности от первого полипептида, по меньшей мере, одним аминокислотным остатком.
Термин «шарнирная область», «шарнирная последовательность» и их вариации, используемые в настоящем описании, включают значение, известное в данной области техники, которое проиллюстрировано, например, в Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol.Methods (1997), 209:193-202.
Термин «иммуноглобулиноподобная шарнирная область», «иммуноглобулиноподобная шарнирная последовательность» и их вариации, используемые в настоящем описании, относятся к шарнирной области и шарнирной последовательности иммуноглобулиноподобной или антителоподобной молекулы (например, иммуноадгезины). В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулиноподобная шарнирная область может быть из любого подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или происходить из него или из IgA, IgE, IgD или IgM, включая их химерные формы, например химерная шарнирная область IgG1/2.
Используемый в настоящем описании термин «иммунная эффекторная клетка» или «эффекторная клетка» относится к клетке в естественном репертуаре клеток иммунной системы человека, которая может быть активирована для воздействия на жизнеспособность клетки-мишени. Жизнеспособность клетки-мишени может включать выживание, пролиферацию и/или способность клетки взаимодействовать с другими клетками.
Антитела по изобретению могут быть получены с использованием методов, хорошо известных в данной области, например, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или с использованием других технологий, которые легко обнаружить в данной области (см., например, Jayasena, SD, Clin., Chem., 45: 1628-50, 1999 и Fellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007).
2
2
Как известно в данной области, «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к цепям нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в цепь ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть произведена до или после сборки цепи. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, «cap», замену одного или более встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), содержащие боковые фрагменты, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), содержащие интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), содержащие алкилаторы, содержащие модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахаре, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми подложками. 5' и 3' концевой ОН может быть фосфорилирован или замещен аминами или органическими фрагментами кэппирующей группы с 1-20 атомами углерода. Другие гидроксилы также могут быть модифицированы до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые общеизвестны в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, аналоги карбоциклического сахара, альфа- или бета-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилоза или ликсоза, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и нуклеозидные аналоги без оснований, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связующие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты, в которых фосфат заменен P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR («амидат»), P(O)R, P(O)OR', CO или CH («формацеталь»), в которых каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предыдущее описание относится ко всем полинуклеотидам, указанным в настоящем описании, включая РНК и ДНК.
Как известно в данной области техники, «константная область» антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, по отдельности или в комбинации.
Используемый в настоящем описании термин «по существу чистый» относится к материалу, который по меньшей мере на 50% чист (т.е. не содержит загрязнений), более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% чист, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% чист, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% чист и наиболее предпочтительно по меньшей мере, на 99% чист.
«Клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или была реципиентом вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство необязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) исходной родительской клетке из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфецированные in vivo полинуклеотидом(ами) по настоящему изобретению.
Как известно в данной области, термин «область Fc» используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. «Область Fc» может представлять собой область Fc с нативной последовательностью или вариантную область Fc. Хотя границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, область Fc тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяется как протяженная от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца. Нумерация остатков в области Fc соответствует нумерации индекса EU, как у Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Область Fc иммуноглобулина обычно содержит две константные области, СН2 и СН3.
При использовании в настоящем описании «Fc-рецептор» и «FcR» описывают рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является тот, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются, главным образом, их цитоплазматическими доменами. FcR рассматриваются в Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34, 1994; и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41, 1995. «FcR» также включает неонатальный рецептор FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587, 1976; и Kim et al., J. Immunol. 24: 249, 1994).
Термин «конкурировать», используемый в настоящем описании в отношении антитела, означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (или часть) связывается с эпитопом способом, достаточно сходным со связыванием второго антитела, или его антигенсвязывающей части, так что результат связывания первого антитела с его родственным эпитопом заметно уменьшается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Альтернатива, где связывание второго антитела с его эпитопом также заметно снижается в присутствии первого антитела, может иметь место, но не обязательно. То есть, первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без того, чтобы это второе антитело ингибировало связывание первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако в тех случаях, когда каждое антитело детектируемо ингибирует связывание другого антитела с его родственным эпитопом или лигандом, в одинаковой, большей или меньшей степени антитела считаются «перекрестно конкурирующими» друг с другом за связывание их соответствующего эпитопа (эпитопов). Как конкурирующие, так и перекрестно конкурирующие антитела охватываются настоящим изобретением. Независимо от механизма, посредством которого происходит такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, стерическое затруднение, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его частью), специалист в данной области техники оценил бы, основываясь на представленных в настоящем описании идеях, что такие конкурирующие и/или перекрестно конкурирующие антитела охватываются и могут быть полезны для способов, раскрытых в настоящем описании.
«Функциональная область Fc» обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией области Fc с нативной последовательностью. Примерные «эффекторные функции» включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; Связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность; фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора) и т.д. Такие эффекторные функции обычно требуют объединения области Fc со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела) и могут быть оценены с использованием различных анализов, известных в данной области для оценка таких эффекторных функций антител.
«Область Fc с нативной последовательностью» включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. «Вариант Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности Fc-области с нативной последовательностью благодаря по меньшей мере одной модификации аминокислоты, но при этом сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc-области с нативной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-области имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью с нативной последовательностью или с Fc-областью исходного полипептида, например, от примерно одной до примерно десяти аминокислотных замен и предпочтительно от примерно одной до примерно пяти аминокислотных замен в области Fc с нативной последовательностью или в области Fc исходного полипептида. Вариант Fc-области в настоящем описании предпочтительно будет иметь по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности с Fc-областью с нативной последовательностью и/или с Fc-областью исходного полипептида и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% идентичности последовательности, более предпочтительно, при по меньшей мере, примерно 95%, по меньшей мере, примерно 96%, по меньшей мере, примерно 97%, по меньшей мере, примерно 98%, по меньшей мере, примерно 99% идентичности последовательности.
Термин «эффекторная функция» относится к биологической активности, относящейся к области Fc антитела. Примеры эффекторных функций антител включают, но не ограничиваются ими, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), связывание с Fc-рецептором, комплементзависимую цитотоксичность (CDC), фагоцитоз, связывание C1q и отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR). См., например, патент США № 6737056. Такие эффекторные функции обычно требуют, чтобы область Fc была объединена с доменом связывания (например, вариабельным доменом антитела), и могут оцениваться с использованием различных анализов, известных в данной области, для оценки таких эффекторных функций антитела. Примерное измерение эффекторной функции осуществляется посредством связывания Fcγ3 и/или C1q.
in vitro
PNAS (USA)
Используемый в настоящем описании термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, клетки-натуральные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. Активность ADCC интересующей молекулы можно оценить с помощью анализа ADCC , такого как описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в Clynes et al., 1998, , 95: 652-656.
J. Immunol.Methods
«Комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента, может быть осуществлен анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., , 202: 163 (1996).
Используемый в настоящем описании термин «лечение» представляет собой подход для получения полезных или желаемых клинических результатов. Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: уменьшение пролиферации (или уничтожения) неопластических или опухолевых клеток, ингибирование метастазирования опухолевых клеток, уменьшение или сокращение размера опухоли, экспрессирующей FLT3, ремиссия заболевания, связанного с FLT3 (например, злокачественного новообразования), ослабление симптомов, возникающих в результате заболевания, связанного с FLT3 (например, злокачественного новообразования), повышение качества жизни людей, страдающих от заболевания, связанного с FLT3 (например, злокачественного новообразования), уменьшение дозы других лекарств, необходимых для лечения заболевания, связанного с FLT3 (например, злокачественного новообразования), задержка прогрессирования заболевания, связанного с FLT3 (например, злокачественного новообразования), излечение заболевания, связанного с FLT3 (например, злокачественного новообразования) и/или продление выживаемости пациентов, имеющих заболевание, связанное с FLT3 (например, злокачественное новообразование).
«Ослабление» означает уменьшение или улучшение одного или более симптомов по сравнению с отсутствием введения антитела против FLT3 (моноспецифического или биспецифического). «Ослабление» также включает сокращение или уменьшение продолжительности симптома.
Используемый в настоящем описании термин «эффективная дозировка» или «эффективное количество» лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для достижения любого одного или более из полезных или желаемых результатов. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают устранение или уменьшение риска, уменьшение тяжести или отсрочку возникновения заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся в процессе развития заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как снижение частоты или ослабление одного или более симптомов различных заболеваний или состояний, связанных с FLT3 (таких как, например, множественная миелома), уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или задержка прогрессирования у пациентов заболевания, связанного с FLT3. Эффективная дозировка может быть введена за одно или более введений. Для целей настоящего изобретения эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения, прямо или косвенно. Как понятно из клинического контекста, эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может достигаться или не достигаться в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективная дозировка» может рассматриваться в контексте введения одного или более терапевтических агентов, и можно считать, что один агент вводится в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более другими агентами желаемый результат может иметь место или достигается.
«Индивидуум» или «пациент» представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, человека. Млекопитающие также включают, но не ограничиваются ими, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс.
Используемый в настоящем описании термин «вектор» означает конструкцию, которая способна доставлять и, предпочтительно, экспрессировать один или более генов или последовательностей, представляющих интерес, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы, векторы экспрессии «депротеинизированной» ДНК или РНК, плазмидные векторы, космидные или фаговые векторы экспрессии ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.
Используемый в настоящем описании термин «последовательность контроля экспрессии» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность контроля экспрессии может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор, или энхансер. Последовательность контроля экспрессии функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть транскрибирована.
Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» включает любой материал, который в сочетании с активным ингредиентом позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и не реагирует с иммунной системой пациента. Примеры включают, но не ограничиваются ими, любые стандартные фармацевтические носители, такие как фосфатно-буферный солевой раствор, воду, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы смачивающих агентов. Предпочтительными разбавителями для аэрозольного или парентерального введения являются фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) или обычный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, готовят общеизвестными стандартными способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005).
Используемый в настоящем описании термин «глутаминсодержащая метка ацильного донора» или «глутаминовая метка» относится к полипептиду или белку, содержащему один или более остатков Gln, которые действуют как акцептор трансглутаминазы амина. См. например, WO2012059882 and WO2015015448.
on
a
on
a
off
d
Используемый в настоящем описании термин «k» или «k» относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном. В частности, константы скорости (k/k и k/k) и константы равновесной диссоциации измеряют с использованием цельного антитела (т.е. двухвалентного) и мономерных белков FLT3 (например, меченного гистидином слитого белка FLT3).
off
d
Используемый в настоящем описании термин «k» или «k» относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.
D
Используемый в настоящем описании термин «K» относится к константе равновесной диссоциации взаимодействия антитело-антиген.
Ссылка на «примерно» в отношении значения или параметра в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к этому значению или параметру, как таковые. Например, описание, относящееся к «примерно X», включает в себя описание «X». Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Вообще говоря, термин «примерно» относится к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной ошибки указанного значения (например, в пределах 95% доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанного значения, в зависимости от того, что больше. Если термин «примерно» используется в контексте периода времени (годы, месяцы, недели, дни и т.д.), то термин «примерно» означает период времени плюс или минус одна величина следующего периода времени (например, примерно 1 год означает 11-13 месяцев, примерно 6 месяцев означает 6 месяцев плюс или минус 1 неделя, примерно 1 неделя означает 6-8 дней и т.д.) или в пределах 10% от указанного значения, в зависимости от того, что больше.
Понятно, что везде, где варианты осуществления описаны в настоящем документе выражением «содержащий», иные аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах «состоящий из» и/или «состоящий по существу из», также подразумеваются.
В тех случаях, когда аспекты или варианты осуществления изобретения описаны в виде группы Маркуша или другой группы альтернатив, настоящее изобретение охватывает не только всю группу, указанную в целом, но каждого члена группы в отдельности и все возможные подгруппы основной группы, но также если в основной группе отсутствует один или более членов группы. Настоящее изобретение также предусматривает явное исключение одного или более членов группы в заявленном изобретении.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. По всему тексту настоящего описания слово «содержать» или варианты, такие как «содержит» или «содержащий», следует понимать как подразумевающее включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел. Кроме того, если иное не требуется в контексте, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число.
Примерные способы и материалы описаны в настоящем документе, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, также могут использоваться при практическом применении или тестировании настоящего изобретения. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Антитела к FLT3 и способы их получения
Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с FLT3 [например, человеческим FLT3 (например, номер доступа: NP_004110 или SEQ ID NO: 235)] и характеризуется любой одной или более из следующих характеристик: (а) лечит, предотвращает, улучшает состояние одного или более симптомов состояния, связанного со злокачественными клетками, экспрессирующими FLT3 у пациента (например, злокачественное новообразование, такое как AML); (b) ингибирует рост или прогрессирование опухоли у пациента (у которого есть злокачественная опухоль, экспрессирующая FLT3); (c) ингибирует метастазирование опухолевых (злокачественных) клеток, экспрессирующих FLT3, у пациента (у которого есть одна или более злокачественных клеток, экспрессирующих FLT3); (d) индуцирует регрессию (например, длительную регрессию) опухоли, экспрессирующей FLT3; (е) проявляет цитотоксическую активность к злокачественным клеткам, экспрессирующим FLT3; (f) блокирует взаимодействие FLT3 с другими пока не идентифицированными факторами; и/или (g) индуцирует неспецифический эффект, который убивает или ингибирует рост злокачественных клеток поблизости, не экспрессирующих FLT3.
В одном аспекте предложено выделенное антитело, которое специфически связывается с FLT3, где антитело содержит (а) вариабельную область(VH) тяжелой цепи, содержащую (i) область один, определяющую комплементарность VH (CDR1), содержащую последовательность, представленную в 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 или 247; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 или 255; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 или 254; и/или вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 или 275; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 или 271; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 или 274.
В другом аспекте предложено выделенное антитело, которое специфически связывается с FLT3, где антитело содержит: область VH, содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231 или 233; и/или область VL, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 или 232. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит область VH, содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO. 229; и/или область VL, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 228.
за исключением
В некоторых вариантах осуществления предложено антитело, имеющее любую одну из частичных последовательностей легкой цепи, как указано в Таблице 1, и/или любую одну из частичных последовательностей тяжелой цепи, как указано в Таблице 1. В Таблице 1 подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности CDR в соответствии с Kabat и жирным шрифтом в соответствии с Chothia,  последовательностей CDR2 тяжелой цепи P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2 и P7F9, последовательность CDR Chothia подчеркнута, а последовательность CDR Kabat выделена жирным шрифтом.
Таблица 1
В настоящем описании также предложены CDR-участки антигенсвязывающих доменов антител к FLT3 (включая CDR Chothia, Kabat и области контакта CDR). Определение областей CDR хорошо известно специалистам в данной области. Понятно, что в некоторых вариантах осуществления CDR могут представлять собой комбинацию CDR Kabat и Chothia (также называемые «комбинированные CDR» или «расширенные CDR»). В некоторых вариантах осуществления CDR представляют собой CDR Kabat. В других вариантах осуществления CDR представляют собой CDR Chothia. Другими словами, в вариантах осуществления с более чем одной CDR они могут быть любыми из Kabat, Chothia, комбинированных CDR или их комбинаций. В Таблице 2 приведены примеры последовательностей CDR, представленных в настоящем описании.
Таблица 2
<b>Тяжелая цепь</b>
<b>mAb</b>
<b>CDRH1</b>
<b>CDRH2</b>
<b>CDRH3</b>
P4F6
SYGIS (SEQ ID NO: 37) (Kabat);GGTFGSY (SEQ ID NO: 38) (Chothia);GGTFGSYGIS (SEQ ID NO: 39) (Extended)
GIIPIFGTVTYAQKFQG (SEQ ID NO: 40) (Kabat);IPIFGT (SEQ ID NO: 41) (Chothia)
DSWSGATGASDT (SEQ ID NO: 42)
P4C7
SYTIS (SEQ ID NO: 43) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia)GGTFSSYTIS (Extended) (SEQ ID NO: 45)
GIIPAFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 46) (Kabat);IPAFGI (SEQ ID NO: 47) (Chothia)
GGSYSLDYFDI (SEQ ID NO: 48)
P3A1
SYDIS (SEQ ID NO: 49) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia);GGTFSSYDIS (SEQ ID NO: 50) (Extended)
GIIPVSGRANYAQKFQG (SEQ ID NO: 51) (Kabat);IPVSGR (SEQ ID NO: 52) (Chothia)
VRPTYWPLDY (SEQ ID NO: 53)
P5A3
SYYIG (SEQ ID NO: 54) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 55) (Chothia);GGTFSSYYIG (SEQ ID NO: 56) (Extended)
GIIPWFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 57) (Kabat);IPWFGT (SEQ ID NO: 58) (Chothia)
DHHDSPSGYTSGGFDV (SEQ ID NO: 59)
P9B5
SYAMS (SEQ ID NO: 60) (Kabat);GFIFASY (SEQ ID NO: 61) (Chothia);GFIFASYAMS (SEQ ID NO: 62) (Extended)
EISSSGGSTTYADSVKG (SEQ ID NO: 63) (Kabat);SSSGGS (SEQ ID NO: 64) (Chothia)
DRVMAGLGYDPFDY (SEQ ID NO: 65)
P9F1
SFAMS (SEQ ID NO: 66) (Kabat);GFIFSSF (SEQ ID NO: 67) (Chothia);GFIFSSFAMS (SEQ ID NO: 68) (Extended)
DISGSGASTYYADSVKG (SEQ ID NO: 69) (Kabat);SGSGAS (SEQ ID NO: 70) (Chothia)
ASGGSGSYWPYMDP (SEQ ID NO: 71)
P1B4
RYALS (SEQ ID NO: 72) (Kabat);GGVFSRY (SEQ ID NO: 73) (Chothia);GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 74) (Extended)
GIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 75) (Kabat);IPMLGF (SEQ ID NO: 76) (Chothia)
LDFGALDY (SEQ ID NO: 77)
P1B11
SFDIS (SEQ ID NO: 78) (Kabat);GGTFRSF (SEQ ID NO: 79) (Chothia);GGTFRSFDIS (SEQ ID NO: 80) (Extended)
RIIPILGYANYAQKFQG (SEQ ID NO: 81) (Kabat);IPILGY (SEQ ID NO: 82) (Chothia)
DLGAPWAGYPFDP (SEQ ID NO: 83)
P7H3
SYAMH (SEQ ID NO: 84) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 85) (Chothia);GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 86) (Extended)
AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 87) (Kabat);SGSGGS (SEQ ID NO: 88) (Chothia)
GTRWWWGDAFDH (SEQ ID NO: 89)
P3E10
SYAIQ (SEQ ID NO: 90) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 91) (Chothia);GGTFSSYAIQ (SEQ ID NO: 92) (Extended)
GIVGSWGLANYAQKFQG (SEQ ID NO: 93) (Kabat);VGSWGL (SEQ ID NO: 94) (Chothia)
SAFGELAS (SEQ ID NO: 95)
P1A5
RYALS (SEQ ID NO: 96) (Kabat);GGVFSRY (SEQ ID NO: 97) (Chothia);GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 98) (Extended)
GIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 99) (Kabat);IPMLGF (SEQ ID NO: 100) (Chothia)
LDFGALDY (SEQ ID NO: 101)
P5F7
SYAMN (SEQ ID NO: 102) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 103) (Chothia);GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 104) (Extended)
SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 105) (Kabat);SGGGRS (SEQ ID NO: 106) (Chothia)
DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 107)
P4H11
SYAMN (SEQ ID NO: 108) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 109) (Chothia);GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 110) (Extended)
SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 111) (Kabat);SGGGRS (SEQ ID NO: 112) (Chothia)
DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 113)
P15F7
NYAMN (SEQ ID NO: 114) (Kabat);GFTFNNY (SEQ ID NO: 115) (Chothia);GFTFNNYAMN (SEQ ID NO: 116) (Extended)
VISGSGGTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 117) (Kabat);SGSGGT (SEQ ID NO: 118) (Chothia)
GIWDLRY (SEQ ID NO: 119)
P12B6
SYAIS (SEQ ID NO: 120) (Kabat);GGTFMSY (SEQ ID NO: 121) (Chothia);GGTFMSYAIS (SEQ ID NO: 122) (Extended)
GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 123) (Kabat);IPIFGI (SEQ ID NO: 124) (Chothia)
ETLIYPIPFEL(SEQ ID NO: 125)
P8B6
SYAVS (SEQ ID NO: 126) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 127) (Chothia);GGTFSSYAVS (SEQ ID NO: 128) (Extended)
GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 129) (Kabat);IPIFGI (SEQ ID NO: 130) (Chothia)
EGIGGDLRYDGYDA (SEQ ID NO: 131)
P14G2
NYVMN (SEQ ID NO: 132) (Kabat);GFTFSNY (SEQ ID NO: 133) (Chothia);GFTFSNYVMN (SEQ ID NO: 134) (Extended)
AISGSGATTYYADSVKG (SEQ ID NO: 135) (Kabat);SGSGAT (SEQ ID NO: 136) (Chothia)
GLWAGGI (SEQ ID NO: 137)
P7F9
SYAMS (SEQ ID NO: 138) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 139) (Chothia);GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 140) (Extended)
AIGGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 141) (Kabat);GGSGGS (SEQ ID NO: 142) (Chothia)
DYYAFSDPAYGGMDV (SEQ ID NO: 143)
P08B06EE
SYAVS (SEQ ID NO: 126) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 127) (Chothia);GGTFSSYAVS (SEQ ID NO: 128) (Extended)
GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 129) (Kabat);IPIFGI (SEQ ID NO: 130) (Chothia)
EGIGGDLRYEGYDA (SEQ ID NO: 245)
P04A04
SYYIT (SEQ ID NO: 247)GGTFSSY (SEQ ID NO: 127) (Chothia)GGTFSSYYIT (SEQ ID NO: 246) (Extended)
RIMPAFGWTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 248) (Kabat)MPAFGW (SEQ ID NO: 249) (Chothia)
DEFGAFDV (SEQ ID NO: 250)
P01A05
RYALS (SEQ ID NO: 72) (Kabat);GGVFSRY (SEQ ID NO: 73) (Chothia);GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 74) (Extended)
IPMLGF (SEQ ID NO: 100) (Chothia)GGIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 251) (Kabat)
LDFGALDY (SEQ ID NO: 77)
P08B03
SYDIS (SEQ ID NO: 49) (Kabat);GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia);GGTFSSYDIS (SEQ ID NO: 50) (Extended)
RIIPSFGAANYAQKFQG (SEQ ID NO: 253) (Kabat)IPSFGA (SEQ ID NO: 252) (Chothia )
DDGEGWTPPFGY (SEQ ID NO: 254)
P5F7g;P10A02g;P10A04g;P10A05g;P10A07g;P10B03g;P10B06g
SYAMN (SEQ ID NO: 102) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 103) (Chothia);GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 104) (Extended)
SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 105) (Kabat);SGGGRS (SEQ ID NO: 106) (Chothia)
DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 107)
P5F7g2;P5F7g3
SYAMN (SEQ ID NO: 102) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 103) (Chothia);GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 104) (Extended)
AISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 255) (Kabat);SGGGRS (SEQ ID NO: 106) (Chothia)
DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 107)
P5F7g4
SYAMS (SEQ ID NO: 138) (Kabat);GFTFSSY (SEQ ID NO: 139) (Chothia);GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 140) (Extended)
AISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 255) (Kabat);SGGGRS (SEQ ID NO: 106) (Chothia)
DLSPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: 107)
<b>Легкая цепь</b>
<b>mAb</b>
<b>CDRL1</b>
<b>CDRL2</b>
<b>CDRL3</b>
P4F6
RASHSVSSSYLA (SEQ ID NO: 144)
GASSRAT (SEQ ID NO: 145)
QQYGSPPRT (SEQ ID NO: 146)
P4C7
RASQYVSASLLA (SEQ ID NO: 147)
GASTRAT (SEQ ID NO: 148)
QQYARSST (SEQ ID NO: 149)
P3A1
RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 150)
AASSLQS (SEQ ID NO: 151)
QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 152)
P5A3
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 153)
EVSKRPS (SEQ ID NO: 154)
SSYAGSNTVV (SEQ ID NO: 155)
P9B5
SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO: 156)
RNNQRPS (SEQ ID NO: 157)
AAWDDSLSGVV (SEQ ID NO: 158)
P9F1
SGSGSNIGSNYVY (SEQ ID NO: 159)
RNNQRPS (SEQ ID NO: 160)
AAWDGSLSRPV (SEQ ID NO: 161)
P1B4
RASQSVPNEQLA (SEQ ID NO: 162)
DASSRAT (SEQ ID NO: 163)
QQYGSPPLT (SEQ ID NO: 164)
P1B11
RASQSVSSSELA (SEQ ID NO: 165)
DASSRAT (SEQ ID NO: 166)
QQYDSSPLT (SEQ ID NO: 167)
P7H3
GGNNIGSKSVH (SEQ ID NO: 168)
YDSDRPS (SEQ ID NO: 169)
QVWDSSTAWV (SEQ ID NO: 170)
P3E10
RASQSVPSSQLA (SEQ ID NO: 171)
DASSRAT (SEQ ID NO: 172)
QQYGSSPLT (SEQ ID NO: 173)
P1A5
RASQAVDSSDLA (SEQ ID NO: 174)
DAYTRPS (SEQ ID NO: 175)
QQYGSSPLT (SEQ ID NO: 176)
P5F7
RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 177)
DTFTRAT (SEQ ID NO: 178)
QQYGSSPPT (SEQ ID NO: 179)
P4H11
RASQSVSNTYLA (SEQ ID NO: 180)
DTSSRAT (SEQ ID NO: 181)
QQYGSSLT (SEQ ID NO: 182)
P15F7
RASQSISTYLN (SEQ ID NO: 183)
AASNLQS (SEQ ID NO: 184)
QQSYSIPLT (SEQ ID NO: 185)
P12B6
RASQIVSSSYLA (SEQ ID NO: 186)
GASSRAS (SEQ ID NO: 187)
QQYGGSPYT (SEQ ID NO: 188)
P8B6
RASQSVSHSYLA (SEQ ID NO: 189)
GASFRAA (SEQ ID NO: 190)
QQYGSDPYT (SEQ ID NO: 191)
P14G2
RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 192)
DASDLQR (SEQ ID NO: 193)
QQSYNTPWT (SEQ ID NO: 194)
P7F9
TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 195)
DDSDRPS (SEQ ID NO: 196)
QVWDSSSDHWV (SEQ ID NO: 197)
P08B06EE
RASQSVSHSYLA (SEQ ID NO: 189)
GASFRAA (SEQ ID NO: 190)
QQYGSEPYT (SEQ ID NO: 256)
P04A04
RASQSVTSSQLA (SEQ ID NO: 257)
GASFRAA (SEQ ID NO: 190)
QQYGSSLLIT (SEQ ID NO: 258)
P01A05
RASQAVDSSDLA (SEQ ID NO: 174)
DAYTRPS (SEQ ID NO: 175)
QQYGSSPLT (SEQ ID NO: 176)
P08B03
RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 177)
DAYTRAT (SEQ ID NO: 259)
QQYGSPYT (SEQ ID NO: 260)
P5F7g
RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 177)
DTFTRAT (SEQ ID NO: 178)
QQYGSSPPT (SEQ ID NO: 179)
P10A02g
RASQDVSDLLA (SEQ ID NO: 261)
DAYTRAT (SEQ ID NO: 259)
QQYASSPIT (SEQ ID NO: 262)
P10A04g
RASQKVSDLLA (SEQ ID NO: 263)
DAYTRAT (SEQ ID NO: 259)
QQYTGSPIT (SEQ ID NO: 264)
P10A05g
RASLSVSDLLA (SEQ ID NO: 265)
DAYSRAT (SEQ ID NO: 266)
QQYSSNPIT (SEQ ID NO: 267)
P10A07g
RASGSVSDLLA (SEQ ID NO: 268)
DAYSRAT (SEQ ID NO: 266)
QQYASYPIT (SEQ ID NO: 269)
P10B03g
RASQSVSDLLA (SEQ ID NO: 270)
DAFSRAT (SEQ ID NO: 271)
QQYGTPPIT (SEQ ID NO: 272)
P10B06g
RASESVSDLLA (SEQ ID NO: 273)
DAYSRAT (SEQ ID NO: 266)
QQYSASPIT (SEQ ID NO: 274)
P5F7g2
RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 177)
DTFTRAT (SEQ ID NO: 178)
QQYGSSPPT (SEQ ID NO: 179)
P5F7g3;P5F7g4
RASQSVSSLLA (SEQ ID NO: 275)
DAYTRAT (SEQ ID NO: 259)
QQYTGSPIT (SEQ ID NO: 264)
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с FLT3 и конкурирует с антителом, как описано в настоящем документе, включая P4F6, P4C7, P3A, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, P08B06EE, P04A04, P01A05, P08B03, P5F7, P5F7g, P10A02g, P10A04g, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g3, P5F7 или P5F5.
В некоторых вариантах осуществления изобретение также относится к частям CDR антител к FLT3 на основе областей контакта CDR. Области контакта CDR представляют собой области антитела, которые придают специфичность антитела к антигену. Как правило, области контакта CDR включают положения остатков в CDR и зонах Vernier, которые ограничены для поддержания правильной структуры петли для антитела, чтобы связывать специфический антиген. Смотри, например, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007. Определение областей контакта CDR хорошо известно специалистам в данной области.
D
Аффинность связывания (K) антитела к FLT3, как описано в настоящем документе, с FLT3 (таким как человеческий FLT3 (например, (SEQ ID NO: 201)) может составлять от примерно 0,001 до примерно 5000 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет примерно любое значение из 5000 нМ, 4500 нМ, 4000 нМ, 3500 нМ, 3000 нМ, 2500 нМ, 2000 нМ, 1789 нМ, 1583 нМ, 1540 нМ, 1500 нМ, 1490 нМ, 1064 нМ, 1000 нМ, 933 нМ, 894 нМ, 750 нМ, 705 нМ, 678 нМ, 532 нМ, 500 нМ, 494 нМ, 400 нМ, 349 нМ, 340 нМ, 353 нМ, 300 нМ, 250 нМ, 244 нМ, 231 нМ, 225 нМ, 207 нМ, 200 нМ 186 нМ, 172 нМ, 136 нМ, 113 нМ, 104 нМ, 101 нМ, 100 нМ, 90 нМ, 83 нМ, 79 нМ, 74 нМ, 54 нМ, 50 нМ, 45 нМ, 42 нМ, 40 нМ, 35 нМ, 32 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 24 нМ, 22 нМ, 20 нМ, 19 нМ, 18 нМ, 17 нМ, 16 нМ, 15 нМ, 12 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5,5 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,3 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или 0,001 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания меньше чем примерно любое из 5000 нМ, 4000 нМ, 3000 нМ, 2000 нМ, 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4,5 нМ, 4 нМ, 3,5 нМ, 3 нМ, 2,5 нМ, 2 нМ, 1,5 нМ, 1 нМ или 0,5 нМ.
Биспецифические антитела, моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере для двух разных антигенов, могут быть получены с использованием антител, раскрытых в настоящем описании. Способы получения биспецифических антител известны в данной области (см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986). Традиционно рекомбинантное продуцирование биспецифических антител основывалось на совместной экспрессии двух пар тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина с двумя тяжелыми цепями, имеющими различную специфичность (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983). Соответственно, в одном аспекте предложено биспецифическое антитело, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее первый вариабельный домен биспецифического антитела, специфически связывающийся с антигеном-мишенью (например, FLT3), и содержащее второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном, расположенным на иммунной эффекторной клетке человека.
Иммунная эффекторная клетка человека может быть любой из множества иммунных эффекторных клеток, известных в данной области. Например, иммунная эффекторная клетка может быть членом линии лимфоидных клеток человека, включая, но не ограничиваясь этим, Т-клетку (например, цитотоксическую Т-клетку), В-клетку и клетку-натуральный киллер (NK). Иммунная эффекторная клетка также может быть, например, без ограничения, членом миелоидной линии человека, включая, но не ограничиваясь этим, моноцит, нейтрофильный гранулоцит и дендритную клетку. Такие иммунные эффекторные клетки могут оказывать цитотоксическое или апоптотическое действие на клетку-мишень или другой желаемый эффект при активации путем связывания эффекторного антигена.
Эффекторный антиген представляет собой антиген (например, белок или полипептид), который экспрессируется на эффекторной клетке человека. Примеры эффекторных антигенов, которые могут быть связаны гетеродимерным белком (например, гетеродимерное антитело или биспецифическое антитело), включают, но не ограничиваются этим, человеческий CD3 (или комплекс CD3 (кластер дифференцировки)), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 и CD89.
Клетка-мишень может быть клеткой, которая является нативной или чужеродной для человека. В нативной клетке-мишени клетка может быть трансформирована в злокачественную или патологически модифицированную (например, нативная клетка-мишень, инфицированная вирусом, плазмодием или бактерией). В чужеродной клетке-мишени клетка представляет собой патогенный микроорганизм, такой как бактерия, плазмодий или вирус.
Антиген-мишень экспрессируется на клетке-мишени при заболевании (например, при воспалительном заболевании, пролиферативном заболевании (например, при злокачественном новообразовании), иммунологическом расстройстве, неврологическом заболевании, нейродегенеративном заболевании, аутоиммунном заболевании, инфекционном заболевании (например, вирусная инфекция или паразитарная инфекция), аллергической реакции, болезни «трансплантат против хозяина» или болезни «хозяин против трансплантата»). Антиген-мишень не является эффекторным антигеном. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой FLT3.
В некоторых вариантах осуществления предложено биспецифическое антитело, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее первый вариабельный домен биспецифического антитела, специфически связывающийся с антигеном-мишенью, и содержащее второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном, расположенным на иммунной эффекторной клетке человека, где первый вариабельный домен антитела связывается с доменом 4 FLT3, содержащим SEQ ID NO: 279.
В некоторых вариантах осуществления предложено биспецифическое антитело, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее первый вариабельный домен биспецифического антитела, специфически связывающийся с антигеном-мишенью, и содержащее второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном, расположенным на иммунной эффекторной клетке человека, где первый вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231 или 233; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 или 232.
В некоторых вариантах осуществления предложено биспецифическое антитело, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее первый вариабельный домен биспецифического антитела, специфически связывающийся с антигеном-мишенью, и содержащее второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном, расположенным на иммунной эффекторной клетке человека, где первый вариабельный домен антитела содержит (а) вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую (i) область 1, определяющую комплементарность VH (CDR1), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 или 247; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 или 255; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 или 254; и/или вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность представленную в SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 или 275; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 или 271; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 или 274.
В некоторых вариантах осуществления первый вариабельный домен антитела содержит (а) вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую (i) область один, определяющую комплементарность VH (CDR1), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102, 103 или 104; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 255 или 106; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 107; и/или (b) вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 177; (ii) CDR2 VL, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 178; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 179.
В некоторых вариантах осуществления второй вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 282; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 281.
В некоторых вариантах осуществления первый вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 229; и/или вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 228; и второй вариабельный домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности VH, представленной в SEQ ID NO: 282; и/или вариабельную область (VL) легкой цепи, содержащую VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности VL, представленной в SEQ ID NO: 281.
В некоторых вариантах осуществления второй вариабельный домен антитела содержит (а) вариабельную (VH) область тяжелой цепи, содержащую (i) область один, определяющую комплементарность VH (CDR1), содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 285, 286 или 287; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 288 или 289; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 290; и/или (b) вариабельную (VL) область легкой цепи, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 291; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 292; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 234.
В Таблице 3 представлены конкретные последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот второго вариабельного домена антитела, который специфичен для CD3. В Таблице 3 подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности CDR в соответствии с Kabat и жирным шрифтом в соответствии с Chothia.
Таблица 3
В Таблице 4 представлены примеры последовательностей CDR второго вариабельного домена антитела, который специфичен для CD3.
Таблица 4
<b>Тяжелая цепь</b>
<b>mAb</b>
<b>CDRH1</b>
<b>CDRH2</b>
<b>CDRH3</b>
h2B4_HNPS_VL_TK
SDYYMT (SEQ ID NO: 285) (Kabat);gfTFSDY (SEQ ID NO: 286) (Chothia);GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 287) (Extended)
RNRARGYT (SEQ ID NO: 288) (Kabat)FIRNRARGYTSDHNPSVKG(SEQ ID NO: 289) (Extended)
DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 290)
<b>Легкая цепь</b>
<b>mAb</b>
<b>CDRH1</b>
<b>CDRH2</b>
<b>CDRH3</b>
h2B4_HNPS_VL_TK
KSSQSLFNVRSRKNYLA(SEQ ID NO: 291)
WASTRES(SEQ ID NO: 292)
KQSYDLFT(SEQ ID NO: 234)
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое содержит CD3-специфический вариабельный домен, имеющий последовательность анти-CD3, как предусмотрено в публикации США № 20160297885, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.
Согласно одному из подходов по получению биспецифических антител вариабельные домены антител с желаемыми специфичностями связывания (сайты объединения антитело-антиген) сливают с последовательностями константных областей иммуноглобулина. Слияние предпочтительно происходит с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей, по меньшей мере, часть областей петли, СН2 и СН3. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, если желательно, легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и ко-трансфецируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в регуляции взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальные выходы. Однако возможно встроить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения.
В другом подходе биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и пары тяжелой цепи-легкой цепи гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другом плече. Эта асимметричная структура с легкой цепью иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы способствует отделению желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина. Этот подход описан в публикации РСТ № WO 94/04690.
В другом подходе биспецифические антитела состоят из аминокислотной модификации в первой шарнирной области в одном плече, а замененная/замещенная аминокислота в первой шарнирной области имеет заряд, противоположный соответствующей аминокислоте во второй шарнирной области в другом плече. Этот подход описан в международной заявке на патент № PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).
В другом подходе образование желаемого гетеромультимерного или гетеродимерного белка (например, биспецифического антитела) улучшается путем изменения или конструирования интерфейса между первой и второй иммуноглобулиноподобной областью Fc (например, шарнирной областью и/или областью CH3). В этом подходе биспецифические антитела могут состоять из области СН3, где область СН3 содержит первый полипептид СН3 и второй полипептид СН3, которые взаимодействуют друг с другом, образуя интерфейс СН3, где одна или более аминокислот в интерфейсе СН3 дестабилизируют гомодимер и не являются электростатически неблагоприятными для образования гомодимеров. Этот подход описан в международной заявке на патент № PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).
В другом подходе биспецифичные антитела могут быть получены с использованием глутаминсодержащей пептидной метки, сконструированной для антитела, направленного на эпитоп (например, FLT3) в одном плече, и другой пептидной метки (например, Lys-содержащей пептидной метки или реакционноспособного эндогенного Lys), сконструированных для второго антитела, направленного на второй эпитоп в другом плече в присутствии трансглутаминазы. Этот подход описан в международной заявке на патент № PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882).
В некоторых вариантах осуществления гетеродимерный белок (например, биспецифическое антитело), как описано в настоящем документе, содержит полноразмерное человеческое антитело, где первый вариабельный домен биспецифического антитела специфически связывается с антигеном-мишенью (например, FLT3) и содержит второй вариабельный домен биспецифического антитела, способный рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном (например, CD3), расположенным на иммунной эффекторной клетке человека, где первый и второй вариабельные домены антитела гетеродимерного белка содержат аминокислотные модификации в положениях 223, 225 и 228 (например, (C223E или C223R), (E225E или E225R) и (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E) (Схема нумерации EU)) в области CH3 человеческого IgG2 (SEQ ID NO: 236).
В некоторых вариантах осуществления первый и второй вариабельные домены антитела гетеродимерного белка содержат аминокислотные модификации в положениях 221 и 228 (например, (D221R или D221E) и (P228R или P228E)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E (схема нумерации EU)) в области СН3 человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 237).
В некоторых вариантах осуществления первый и второй вариабельные домены антитела гетеродимерного белка содержат модификации аминокислот в положениях 228 (например, (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, R409 или L368E (схема нумерации EU)) в области CH3 человеческого IgG4 (SEQ ID NO: 238).
Антитела, используемые в настоящем изобретении, могут включать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгатные антитела, одноцепочечные (ScFv), их мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела (например, доменное антитело), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиного, крысиного, человеческого или любого другого происхождения (включая химерные или гуманизированные антитела).
В некоторых вариантах осуществления моноспецифическое антитело FLT3 или биспецифическое антитело FLT3 (например, FLT3-CD3), как описано в настоящем документе, представляет собой моноклональное антитело. Например, моноспецифическое антитело FLT3 представляет собой человеческое моноклональное антитело. В другом примере плечо FLT3 биспецифического антитела FLT3-CD3 представляет собой человеческое моноклональное антитело, а плечо CD3 биспецифического антитела FLT3-CD3 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит модифицированную константную область, такую как, например, без ограничения, константная область, которая обладает повышенным потенциалом для провоцирования иммунного ответа. Например, константная область может быть модифицирована, чтобы иметь повышенную аффинность к Fc-гамма-рецептору, такому как, например, FcγRI, FcγRIIA или FcγIII.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит модифицированную константную область, такую как константная область, которая иммунологически инертна, то есть обладает пониженным потенциалом для провоцирования иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol., 29: 2613-2624, 1999; в заявке PCT № PCT/GB99/01441; и/или патентной заявке Великобритании № 98099518. Fc может относиться к человеческому IgG1, человеческому IgG2, человеческому IgG3 или человеческому IgG4. Fc может относиться к человеческому IgG2, содержащему мутацию от A330P331 до S330S331 (IgG2Δa), где аминокислотные остатки пронумерованы со ссылкой на последовательность IgG2 дикого типа. Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область IgG4, содержащую следующие мутации (Armor et al., Molecular Immunology 40 585-593, 2003): E233F234L235-P233V234A235 (IgG4Δc), в которой нумерация указана со ссылкой на IgG4 дикого типа. В еще одном варианте осуществления Fc относится к человеческому IgG4 E233F234L235 - P233V234A235 с делецией G236 (IgG4Δb). В другом варианте осуществления Fc представляет собой человеческий Fc IgG4 (IgG4, IgG4Δb или IgG4Δc), содержащий шарнирную стабилизирующую мутацию S228-P228 (Aalberse et al., Immunology 105, 9-19, 2002). В другом варианте осуществления Fc может быть агликозилированным Fc.
В некоторых вариантах осуществления константная область агликозилируется путем мутации остатка присоединения олигосахарида (такого как Asn297) и/или фланкирующих остатков, которые являются частью последовательности распознавания гликозилирования в константной области. В некоторых вариантах осуществления константная область агликозилируется для N-связанного гликозилирования ферментативно. Константная область может быть агликозилирована для N-связанного гликозилирования ферментативно или путем экспрессии в клетке-хозяине с дефицитом гликозилирования.
В некоторых вариантах осуществления константная область имеет модифицированную константную область, которая удаляет или уменьшает связывание Fc-гамма-рецептора. Например, Fc может относиться к человеческому IgG2, содержащему мутацию D265, где аминокислотные остатки пронумерованы со ссылкой на последовательность IgG2 дикого типа (SEQ ID NO: 236). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления константная область имеет модифицированную константную область, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 239: astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcrvrcprcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysrltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk. И нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность, представленную в SEQ ID NO: 239, показана в SEQ ID NO: 240.
В некоторых вариантах осуществления константная область имеет модифицированную константную область, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 241:
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcevecpecpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltcevkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk. И нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность, представленную в SEQ ID NO: 241, показана в SEQ ID NO: 242.
Аминокислотная последовательность человеческой константной области Каппа представлена в SEQ ID NO: 243: gtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec. И нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность SEQ ID NO: 243, представлена в SEQ ID NO: 244.
D
on
a
off
d
D
off
on
Одним из способов определения аффинности связывания антител к FLT3 является измерение аффинности связывания двухвалентного антитела с мономерным белком FLT3. Аффинность антитела FLT3 можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса (система поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore™ 3000™, Biacore™, INC, Piscataway NJ), снабженного предварительно иммобилизованным антимышиным Fc или античеловеческим Fc, с использованием HBS-EP рабочего буфера (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. ПАВ Р20). Мономерный меченный 8-His внеклеточный домен человеческого FLT3 может быть разбавлен в буфере HBS-EP до концентрации менее чем 0,5 мкг/мл и инъецирован через отдельные каналы чипа с использованием переменного времени контакта, чтобы достичь двух диапазонов плотности антигена, либо 50-200 единиц ответа (RU) для детальных кинетических исследований или 800-1000 RU для скрининговых анализов. Исследования регенерации показали, что 25 мМ NaOH в 25% об./об. этаноле эффективно удаляет связанный белок FLT3, сохраняя активность антител FLT3 на чипе в течение более 200 инъекций. Как правило, последовательные разведения (охватывающие тестированные концентрации 0,1-10x K) очищенных меченых 8-гистидином образцов FLT3 вводят в течение 1 мин при 100 мкл/мин, и время диссоциации составляет до 2 часов. Концентрации белков FLT3 определяют по оптической плотности при 280 нм, основываясь на специфическом для последовательности коэффициенте экстинкции белка FLT3, меченного 8-гистидином. Скорость кинетической ассоциации (k или k) и скорости диссоциации (k или k) получают одновременно путем подгонки данных в целом к модели связывания Ленгмюра 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) с использованием программы оценки BIA. Значения равновесной константы диссоциации (K) рассчитываются как k/k. Этот протокол подходит для использования в определении аффинности связывания антитела с любым мономерным FLT3, включая человеческий FLT3, FLT3 другого млекопитающего (такого как мышиный FLT3, крысиный FLT3 или FLT3 примата), а также с различными формами FLT3 (например, гликозилированный FLT3). Аффинность связывания антитела обычно измеряют при 25°С, но также можно измерять при 37°С.
Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть получены любым способом, известным в данной области. Для получения линий гибридомных клеток путь и график иммунизации животного-хозяина в целом соответствуют установленным и общепринятым методам стимуляции и продуцирования антител, как дополнительно описано в настоящем документе. Общие методы получения антител человека и мыши известны в данной области и/или описаны в настоящем документе.
Предполагается, что любым субъектом-млекопитающим, включая человека, или клетками, продуцирующими антитела, можно манипулировать, чтобы они служил основой для продуцирования линий млекопитающего, включая клеточные линии и гибридомы. Как правило, животное-хозяин инокулируют внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриплацентарно и/или внутрикожно количеством иммуногена, в том числе описанным в настоящем документе.
Гибридомы могут быть получены из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общей методики гибридизации соматических клеток, описанной Kohler B. и Milstein, C., Nature 256: 495-497, 1975 или измененной Buck, DW, et al., In. Vitro, 18: 377-381, 1982. Доступные миеломные линии, включая, но не ограничиваясь этим, X63-Ag8.653 и линии от Института Солка, Центра распределения клеток, Сан-Диего, Калифорния, США, могут быть использованы при гибридизации. Как правило, метод включает слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием фузогена, такого как полиэтиленгликоль, или с помощью электрических средств, хорошо известных специалистам в данной области. После слияния клетки отделяют от среды слияния и растят в селективной среде для наращивания, такой как среда гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT), для удаления негибридизованных родительских клеток. Любая из сред, описанных в настоящем документе, с добавлением или без сыворотки, может быть использована для культивирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела. В качестве другой альтернативы методике слияния клеток EBV-иммортализованные В-клетки могут быть использованы для получения моноклональных антител по настоящему изобретению. Гибридомы наращивают и субклонируют, если желательно, и супернатанты анализируют на антииммуногенную активность с помощью обычных процедур иммуноанализа (например, радиоиммуноанализа, иммуноферментного анализа или флуоресцентного иммуноанализа).
Гибридомы, которые можно использовать в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки-потомки родительских гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные к FLT3, или их части.
in vitro
in vivo
2
1
1
Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, могут быть выращены  или  с использованием известных процедур. Моноклональные антитела могут быть выделены из культуральной среды или биологических жидкостей обычными процедурами очистки иммуноглобулина, такими как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация, если желательно. Нежелательная активность, если она присутствует, может быть удалена, например, путем прогона препарата над адсорбентами, приготовленными из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и путем элюирования или высвобождения желаемых антител из иммуногена. Иммунизация животного-хозяина клетками, экспрессирующими человеческий FLT3, человеческий белок FLT3 или фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность-мишень, конъюгированную с белком, который является иммуногенным для видов, подлежащих иммунизации, например, с гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, тироглобулином крупного рогатого скота или ингибитором трипсина сои с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl или RN=С=NR, где R и R представляют собой разные алкильные группы, может приводить к получению популяции антител (например, моноклональных антител).
При желании интересующее антитело (моноклональное или поликлональное) может быть секвенировано, и полинуклеотидная последовательность затем может быть клонирована в экспрессирующий вектор для экспрессии или наращивания. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может сохраняться в векторе в клетке-хозяине, а затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для будущего использования. Производство рекомбинантных моноклональных антител в клеточной культуре может быть осуществлено путем клонирования генов антител из В-клеток способами, известными в данной области. См., например, Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008; пат. США No. 7314622.
В альтернативном варианте полинуклеотидную последовательность можно использовать для генетической манипуляции с целью «гуманизации» антитела или для улучшения аффинности или других характеристик антитела. Например, константная область может быть сконструирована так, чтобы больше походить на константные области человека, чтобы избежать иммунного ответа, если антитело используется в клинических испытаниях и лечении людей. Может быть желательной генетическая манипуляция с последовательностью антител для получения большей аффинности к FLT3 и большей эффективности в ингибировании FLT3.
Существует четыре основных этапа гуманизации моноклонального антитела. К ним относятся: (1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела, т.е. определение того, какую каркасную область антитела использовать в процессе гуманизации (3) фактические методологии/методы гуманизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. Смотри, например, пат. США №№ 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761; 5693762; 5585089; и 6180370.
Описан ряд молекул «гуманизированных» антител, содержащих антигенсвязывающий сайт, полученный из иммуноглобулина, отличного от человеческого, в том числе химерных антител, имеющих V-области грызунов или модифицированные V-области грызунов, и связанные с ними CDR, слитые с константными областями человека. Смотри, например, Winter et al. Nature 349: 293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138: 4534-4538, 1987 и Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987. В других ссылках описаны CDR грызунов, трансплантированные в опорную каркасную область человека (FR) перед слиянием с подходящей константной областью человеческого антитела. Смотри, например, Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239: 1534-1536, 1988 и Jones et al. Nature 321:522-525, 1986. В другой ссылке описаны CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно сконструированными каркасными областями грызунов. См., например, Европейскую патентную публикацию № 0519596. Эти «гуманизированные» молекулы предназначены для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы антител грызунов против белков человека, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтического применения этих компонентов у людей-реципиентов. Например, константная область антитела может быть сконструирована таким образом, чтобы она была иммунологически инертной (например, не запускала лизис комплемента). См., например, публикацию PCT № PCT/GB99/01441; Патентная заявка Великобритании № 9809951.8. Другие способы гуманизации антител, которые также могут быть использованы, раскрыты Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, 1991, и в Пат. США No 6180377; 6054297; 5997867; 5866692; 6210671; и 6,350,861; и в публикации PCT No. WO 01/27160.
Обсуждаемые выше общие принципы, относящиеся к гуманизированным антителам, также применимы к адаптированию антител для использования, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и крупного рогатого скота. Кроме того, один или более аспектов гуманизации антитела, описанного в настоящем документе, могут быть объединены, например, трансплантация CDR, каркасная мутация и мутация CDR.
В одном варианте полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием коммерчески доступных мышей, которые были сконструированы для экспрессии специфических белков человеческого иммуноглобулина. Трансгенные животные, которые предназначены для выработки более желательного (например, полностью человеческих антител) или более надежного иммунного ответа, также могут быть использованы для генерации гуманизированных или человеческих антител. Примерами такой технологии являются Xenomouse™ от Abgenix, Inc. (Fremont, CA) и HuMAb-Mouse и TC Mouse™ от Medarex, Inc. (Принстон, Нью-Джерси).
in vitro
Альтернативно, антитела могут быть получены рекомбинантно и экспрессированы любым способом, известным в данной области. В другой альтернативе антитела могут быть получены рекомбинантно с помощью технологии фагового дисплея. Смотри, например, Пат. США № 565332; 5580717; 5733743; и 6265150; и Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, 1994. Альтернативно, технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348: 552-553, 1990) может быть использована для получения человеческих антител и фрагментов антител  из репертуара генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина от неиммунизированных доноров. Согласно этой методике гены V-домена антитела клонируются в рамке с геном основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и отображаются в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности частицы фага. Поскольку нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекция на основе функциональных свойств антитела также приводит к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства B-клетки. Фаговый дисплей может быть выполнен во множестве форматов; см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571, 1993. Несколько источников сегментов V-гена могут быть использованы для фагового дисплея. Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991, выделили разнообразный набор антител против оксазолона из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученных из селезенки иммунизированных мышей. Можно создать репертуар V-генов от неиммунизированных человеческих доноров, и антитела к разнообразному множеству антигенов (включая аутоантигены) могут быть выделены, по существу, следуя методикам, описанным Mark et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991, или Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734, 1993. При естественном иммунном ответе гены антител накапливают мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). Некоторые из внесенных изменений придают более высокую аффинность, и В-клетки, презентирующие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно реплицируются и дифференцируются во время последующей антигенной стимуляции. Этот естественный процесс можно имитировать, используя технику, известную как «перетасовка цепей». (Marks et al., Bio/Technol. 10: 779-783, 1992). В этом методе аффинность «первичных» человеческих антител, полученных с помощью фагового дисплея, может быть улучшена путем последовательной замены генов V-области тяжелой и легкой цепей репертуарами встречающихся в природе вариантов (репертуаров) генов V-домена, полученных от неиммунизированных доноров. Этот метод позволяет получать антитела и фрагменты антител с аффинностями в диапазоне пМ-нМ. Стратегия создания очень больших репертуаров фаговых антител (также называемых «мать-всех-библиотек») была описана Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993. Перетасовка генов также может быть использована для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет сходство и специфичность с исходным антителом грызуна. В соответствии с этим способом, который также называют «импринтингом эпитопа», ген V-домена тяжелой или легкой цепи антител грызунов, полученный методом фагового дисплея, заменяют репертуаром генов V-домена человека, создавая химеры грызунов-людей. Селекция по антигену приводит к выделению вариабельных областей человека, способных восстанавливать функциональный сайт связывания антигена, то есть эпитоп регулирует (впечатывает) выбор партнера. Когда процесс повторяют, чтобы заменить оставшийся V-домен грызуна, получают человеческое антитело (см. Публикацию PCT № WO 93/06213). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов с помощью трансплантации CDR, этот метод обеспечивает полностью человеческие антитела, которые не имеют каркасных или CDR-остатков грызунов.
Антитела могут быть получены рекомбинантно сначала путем выделения антител и клеток, продуцирующих антитела, из животных-хозяев, путем получения последовательности гена и использования последовательности гена для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другой способ, который можно использовать, заключается в экспрессии последовательности антител в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Способы экспрессии антител рекомбинантными в растениях или молоке были раскрыты. Смотри, например, Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; and Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999. Способы получения производных антител, например гуманизированных, одноцепочечных и т.д., известны в данной области.
Иммуноанализы и методы сортировки с помощью проточной цитометрии, такие как сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), также могут быть использованы для выделения антител, специфичных к FLT3, или к интересующим опухолевым антигенам.
Антитела, как описано в настоящем документе, могут быть связаны со многими различными носителями. Носители могут быть активными и/или инертными. Примеры хорошо известных носителей включают полипропилен, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Природа носителя может быть либо растворимой, либо нерастворимой для целей изобретения. Специалистам в данной области будут известны другие подходящие носители для связывания антител, или они смогут установить это, используя обычные эксперименты. В некоторых вариантах осуществления носитель содержит фрагмент, который нацелен на миокард.
ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко выделяется и секвенируется с использованием традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть встроена в экспрессирующие векторы (такие как экспрессирующие векторы, раскрытые в публикации РСТ № WO 87/04462), которые затем трансфецируются в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомяка (Клетки СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. См., например, публикацию PCT № WO 87/04462. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности для константных областей тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных мышиных последовательностей, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851, 1984, или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности для неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом, получают «химерные» или «гибридные» антитела, которые обладают специфичностью связывания моноклонального антитела.
Антитела к FLT3, как описано в настоящем документе, могут быть идентифицированы или охарактеризованы с использованием способов, известных в данной области техники, посредством которых обнаруживается и/или измеряется снижение уровней экспрессии FLT3. В некоторых вариантах осуществления антитело против FLT3 идентифицируют путем инкубации агента-кандидата с FLT3 и мониторинга связывания и/или сопутствующего снижения уровней экспрессии FLT3. Анализ связывания может быть выполнен с очищенным полипептидом(полипептидами) FLT3 или с клетками, естественно экспрессирующими или трансфецированными для экспрессии полипептида(полипептидов) FLT3. В одном варианте осуществления анализ связывания представляет собой анализ конкурентного связывания, где оценивают способность антитела-кандидата конкурировать с известным антителом FLT3 за связывание FLT3. Анализ может быть выполнен в различных форматах, включая формат ИФА.
После первоначальной идентификации активность антитела-кандидата FLT3 может быть дополнительно подтверждена и уточнена с помощью биоанализов, которые, как известно, тестируют целевые биологические активности. Кроме того, биологические тесты могут быть использованы для прямой селекции кандидатов. Некоторые из способов идентификации и характеристики антител подробно описаны в примерах.
Антитела к FLT3 могут быть охарактеризованы с использованием методов, хорошо известных в данной области. Например, один метод состоит в том, чтобы идентифицировать эпитоп, с которым он связывается, или «картирование эпитопа». В данной области известно много способов картирования и характеристики местоположения эпитопов на белках, включая определение кристаллической структуры комплекса антитело-антиген, анализы конкуренции, анализы экспрессии генных фрагментов и анализы на основе синтетических пептидов, как описано, например, в главе 11 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. В дополнительном примере эпитопное картирование может быть использовано для определения последовательности, с которой связывается антитело. Эпитопное картирование коммерчески доступно из различных источников, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH, Lelystad, The Netherlands). Эпитоп может быть линейным эпитопом, то есть содержащимся в одном отрезке аминокислот, или конформационным эпитопом, образованным трехмерным взаимодействием аминокислот, которое необязательно может содержаться в одном отрезке. Пептиды различной длины (например, длиной по меньшей мере 4-6 аминокислот) могут быть выделены или синтезированы (например, рекомбинантно) и использованы для анализов связывания с FLT3 или другим антителом против опухолевого антигена. В другом примере эпитоп, с которым связывается антитело FLT3, может быть определен путем систематического скрининга с использованием перекрывающихся пептидов, полученных из последовательности FLT3, и определения связывания антителом FLT3. В соответствии с анализами экспрессии фрагментов гена открытая рамка считывания, кодирующая FLT3, фрагментируется либо случайным образом, либо с помощью специфических генетических конструкций, и определяется реактивная способность экспрессированных фрагментов FLT3 с антителом, которое подлежит тестированию. Фрагменты гена могут, например, быть получены с помощью ПЦР, а затем транскрибированы и транслированы в белок in vitro в присутствии радиоактивных аминокислот. Связывание антитела с радиоактивно меченным FLT3 затем определяют с помощью иммунопреципитации и гель-электрофореза. Определенные эпитопы также могут быть идентифицированы с использованием больших библиотек случайных пептидных последовательностей, отображаемых на поверхности фаговых частиц (фаговые библиотеки). Альтернативно, определенная библиотека перекрывающихся пептидных фрагментов может быть протестирована на связывание с тестируемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере мутагенез антигенсвязывающего домена, эксперименты по замене доменов и сканирующий аланином мутагенез могут быть выполнены для идентификации остатков, необходимых, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа. Например, эксперименты по обмену доменами могут проводиться с использованием мутанта FLT3, в котором различные фрагменты белка FLT3 были замещены (заменены) последовательностями из FLT3 другого вида (например, мыши) или тесно связанного, но антигенно отличного белка. Оценивая связывание антитела с мутантным FLT3, можно оценить важность конкретного фрагмента FLT3 для связывания антитела. В случае FLT3-специфического антитела (то есть антитела, которое не связывается с FLT3wt (дикого типа) или любыми другими белками), эпитоп может быть выведен из выравнивания последовательности FLT3 по FLT3wt.
Еще один способ, который можно использовать для характеристики антитела FLT3, заключается в использовании конкурентных анализов с другими антителами, о которых известно, что они связываются с одним и тем же антигеном, то есть с различными фрагментами на FLT3, для определения того, связывается ли антитело FLT3 с тем же эпитопом, что и другие антитела. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области.
Экспрессирующий вектор может быть использован для прямой экспрессии антитела FLT3. Специалист в данной области знаком с введением экспрессирующих векторов для получения экспрессии экзогенного белка in vivo. См., например, Пат. США № 6436908; 6413942; и 6376471. Введение экспрессирующих векторов включает местное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, генной пушкой или катетеризированное введение и местное введение. В другом варианте осуществления экспрессирующий вектор вводят непосредственно в симпатический ствол или ганглион или в коронарную артерию, предсердие, желудочек сердца или перикард.
Также может быть использована адресная доставка терапевтических композиций, содержащих экспрессирующий вектор или субгеномные полинуклеотиды. Способы рецептор-опосредованной доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11: 202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, JA Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263: 621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 269: 542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990; and Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338, 1991. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводят в диапазоне от примерно 100 нг до примерно 200 мг ДНК для местного введения в протоколе генной терапии. Концентрационные диапазоны примерно от 500 нг до примерно 50 мг, примерно от 1 μг до примерно 2 мг, примерно от 5 μг до примерно 500 μг, и примерно от 20 μг до примерно 100 μг ДНК также могут быть использованы в ходе протокола генной терапии. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды могут быть доставлены с использованием носителей для доставки генов. Средство доставки гена может иметь вирусное или невирусное происхождение (см., в общем, Jolly, Cancer Gene Therapy, 1: 51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5: 845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1: 185 и Kaplitt, Nature Genetics, 6: 148, 1994). Экспрессия таких кодирующих последовательностей может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности может быть либо конститутивной, либо регулируемой.
Векторы на основе вирусов для доставки желаемого полинуклеотида и экспрессии в желаемой клетке хорошо известны в данной области. Типичные носители на основе вирусов включают, но не ограничиваются ими, рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации PCT № WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; патенты США № 5219740 и 4777127; патент Великобритании № 2200651 и EP патент № 0345242), векторы на основе альфа-вируса (например, векторы вируса Синдбис, вирус леса Семлики (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), вируса реки Росс (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) и вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR -532)) и векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) (см., например, публикации PCT №№ WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655). Введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3: 147, также может применяться.
Можно также использовать невирусные носители и способы доставки, включая, но не ограничиваясь этим, поликатионную конденсированную ДНК, связанную или несвязанную с одним убитым аденовирусом (см., например, Curiel, Hum. Gene Ther., 3: 147, 1992); ДНК, связанную с лигандом (см., например, Wu, J. Biol. Chem., 264: 16985, 1989); носители для доставки эукариотических клеток (см., например, патент США № 5814482; публикации РСТ № WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; и WO 97/42338) и нейтрализацию заряда ядра или слияние с клеткой мембраны. Депротеинизированная ДНК также может быть использована. Типичные способы введения депротеинизированной ДНК описаны в публикации РСТ № WO 90/11092 и пат. США № 5580859. Липосомы, которые могут действовать как носители для доставки генов, описаны в патенте США № 5422120; Публикации РСТ № WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; и ЕР 0524968. Дополнительные подходы описаны в Philip, Mol. Cell Biol., 14: 2411, 1994 и в Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581, 1994.
В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитела, описанные в настоящем документе или полученные способами и имеющие характеристики, описанные в настоящем документе. При использовании в настоящем описании, композиции содержат одно или более антител, которые связываются с FLT3, и/или один или более полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или более этих антител. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие вспомогательные вещества, такие как фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, включая буферы, которые хорошо известны в данной области.
Изобретение также относится к способам получения любого из этих антител. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены с помощью процедур, известных в данной области. Полипептиды могут быть получены протеолитической или другой деградацией антител, рекомбинантными методами (т.е. с использованием одиночных или слитых полипептидов), как описано выше, или химическим синтезом. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды, вплоть до примерно 50 аминокислот, удобно получать химическим синтезом. Способы химического синтеза известны в данной области и являются коммерчески доступными. Например, антитело может быть получено с помощью автоматического синтезатора полипептидов с использованием твердофазного метода. См. также пат. США № 5807715; 4816567; и 6331415.
В другом альтернативном варианте антитела могут быть получены рекомбинантно с использованием процедур, которые хорошо известны в данной области. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела P4F6, P4C7, P3A`, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, P08B06EE, P04A04, P01A05, P08B03, P5F7, P5F7g, P10A02g, P10A04g, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g3, P5F7 или P5F5. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может сохраняться в векторе в клетке-хозяине, а затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для будущего использования. Векторы (включая экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева дополнительно описаны в настоящем документе.
Гетероконъюгатные антитела, содержащие два ковалентно связанных антитела, также входят в объем изобретения. Такие антитела были использованы для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (публикации РСТ № WO 91/00360 и WO 92/200373; ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых удобных способов сшивки. Подходящие сшивающие агенты и методики хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980.
in vitro
Химерные или гибридные антитела также могут быть получены  с использованием известных методов химии синтетических белков, в том числе с использованием сшивающих агентов. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с использованием реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.
В рекомбинантных гуманизированных антител, область Fcγ может быть модифицирована, чтобы избежать взаимодействия с рецептором Fcγ и комплементом и иммунной системой. Методы получения таких антител описаны в WO 99/58572. Например, константная область может быть сконструирована так, чтобы больше походить на константные области человека, чтобы избежать иммунного ответа, если антитело используется в клинических испытаниях и лечении людей. Смотри, например, пат. США № 5997867 и 5866692.
Изобретение охватывает модификации антител и полипептидов по изобретению, включая варианты, представленные в Таблице 5, включая функционально эквивалентные антитела, которые не оказывают существенного влияния на их свойства, и варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью и/или аффинностью. Например, аминокислотная последовательность может быть мутирована для получения антитела с желаемой аффинностью связывания с FLT3. Модификация полипептидов является обычной практикой в данной области и не нуждается в подробном описании в настоящем документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или более делециями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного вредного изменения функциональной активности или которые способствуют созреванию (усиливают) аффинности полипептида к его лиганду, или использование химических аналогов.
Вставки аминокислотной последовательности включают слияния амино- и/или карбоксиконцевых областей длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности, состоящие из одного или более аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с эпитопной меткой. Другие варианты вставок молекулы антитела включают слияние с N- или C-концом антитела, фермента или полипептида, которое увеличивает период полужизни антитела в кровотоке.
Варианты замен имеют, по меньшей мере, один аминокислотный остаток в молекуле антитела, удаленный, и другой остаток, вставленный на его место. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также рассматриваются изменения FR. Консервативные замены приведены в Таблице 5 под заголовком «консервативные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные изменения, обозначенные «примерными заменами» в Таблице 5, или, как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты подвергнуты скринингу. В некоторых вариантах осуществления варианты замены антител, представленные в настоящем документе, имеют не более чем 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 консервативную замену в области VH или VL по сравнению с эталонным родительским антителом. В некоторых вариантах осуществления замены не находятся в пределах CDR области VH или VL.
Таблица 5: Аминокислотные замены
Исходный остаток(природная аминокислота)
Консервативные замены
Примеры замен
Ala (A)
Val
Val; Leu; Ile
Arg (R)
Lys
Lys; Gln; Asn
Asn (N)
Gln
Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D)
Glu
Glu; Asn
Cys (C)
Ser
Ser; Ala
Gln (Q)
Asn
Asn; Glu
Glu (E)
Asp
Asp; Gln
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Arg
Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I)
Leu
Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин
Leu (L)
Ile
Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)
Arg
Arg; Gln; Asn
Met (M)
Leu
Leu; Phe; Ile
Phe (F)
Tyr
Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Ser
Ser
Trp (W)
Tyr
Tyr; Phe
Tyr (Y)
Phe
Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)
Leu
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин
Существенные модификации в биологических свойствах антитела осуществляются путем выбора замен, которые существенно различаются по своему воздействию на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листовой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (с) объема боковой цепи. Встречающиеся в природе аминокислотные остатки делятся на группы на основе общих свойств боковых цепей:
(1) Неполярные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) полярные без заряда: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Кислотные (отрицательно заряженные): Asp, Glu;
(4) Основные (положительно заряженные): Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и
(6) Ароматические: Trp, Tyr, Phe, His.
Неконсервативные замены производятся путем замены члена одного из этих классов на другой класс.
Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также может быть заменен, как правило, серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аберрантного сшивания. И наоборот, цистеиновая связь(связи) может быть добавлена к антителу для улучшения его стабильности, особенно когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv.
Модификации аминокислот могут варьироваться от замены или модификации одной или более аминокислот до полной реорганизации области, такой как вариабельная область. Изменения в вариабельной области могут изменить аффинность связывания и/или специфичность. В некоторых вариантах осуществления не более чем от одной до пяти консервативных аминокислотных замен осуществляются в домене CDR. В других вариантах осуществления в домене CDR проводят не более чем от одной до трех консервативных аминокислотных замен. В еще других вариантах осуществления домен CDR представляет собой CDR H3 и/или CDR L3.
Модификации также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела гликозилированы в консервативных положениях в их константных областях (Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311-1318, 1996; Wittwe and Howard, Biochem. 29: 4175-4180, 1990) и внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, которое может влиять на конформацию и представленную трехмерную поверхность гликопротеина (Jefferis and Lund, выше; Wyss и Wagner, Current Opin. Biotech. 7: 409-416, 1996). Олигосахариды также могут служить для нацеливания данного гликопротеина на определенные молекулы на основе специфических структур распознавания. Также сообщалось, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В частности, сообщалось, что клетки CHO с регулируемой тетрациклином экспрессией β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей образование биссекторного GlcNAc, обладают улучшенной активностью ADCC (Umana et al., Mature Biotech). 17: 176-180, 1999).
Гликозилирование полипептидов обычно является «N-связанным» или «O-связанным». N-связанный относится к присоединению углеводной части к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где Х представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. «О-связанное» гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы оно содержало одну или более описанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть осуществлено путем добавления или замены одним или более остатками серина или треонина последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).
Характер гликозилирования антител также может быть изменен без изменения основной нуклеотидной последовательности. Гликозилирование в значительной степени зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Поскольку тип клеток, используемых для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например антител, в качестве потенциальных терапевтических средств, редко относится к нативным клеткам, можно ожидать изменений в характере гликозилирования антител (см., например, Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997).
В дополнение к выбору клеток-хозяев факторы, которые влияют на гликозилирование во время рекомбинантной продукции антител, включают режим роста, состав среды, плотность культуры, оксигенацию, pH, схемы очистки и тому подобное. Были предложены различные способы изменения характера гликозилирования, достигаемого в конкретном организме-хозяине, включая введение или избыточную экспрессию определенных ферментов, участвующих в продуцировании олигосахаридов (патенты США № 5047335; 5510261 и 5278299). Гликозилирование или определенные типы гликозилирования могут быть ферментативно удалены из гликопротеина, например, с использованием эндогликозидазы H (Endo H), N-гликозидазы F, эндогликозидазы F1, эндогликозидазы F2, эндогликозидазы F3. Кроме того, рекомбинантная клетка-хозяин может быть генетически модифицирована, чтобы быть дефектной при обработке определенных типов полисахаридов. Эти и подобные методы хорошо известны в данной области.
Другие способы модификации включают использование методов связывания, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации могут быть использованы, например, для прикрепления меток для иммуноанализа. Модифицированные полипептиды получают с использованием процедур, установленных в данной области, и могут быть подвергнуты скринингу с использованием стандартных анализов, известных в данной области, некоторые из которых описаны ниже и в примерах.
H
Другие модификации антител включают антитела, которые были модифицированы, как описано в публикации РСТ № WO 99/58572. Эти антитела содержат, помимо связывающего домена, направленного на молекулу-мишень, эффекторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу гомологичную всей или части константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Эти антитела способны связывать молекулу-мишень без значительного лизиса, зависимого от комплемента, или клеточного разрушения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен способен специфически связывать FcRn и/или FcγRIIb. Как правило, они основаны на химерных доменах, полученных из двух или более C2 доменов тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Антитела, модифицированные таким образом, являются особенно подходящими для использования в постоянной терапии с антителами, чтобы избежать воспалительных и других побочных реакций на традиционную терапию антителами.
Изобретение включает варианты созревания аффинности. Например, аффинно-зрелые антитела могут быть получены способами, известными в данной области (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896, 1992; и публикация РСТ № WO2004/058184).
D
Следующие методы могут быть использованы для корректировки аффинности антитела и для характеристики CDR. Один способ охарактеризовать CDR антитела и/или изменения (такого как улучшение) аффинности связывания полипептида, такого как антитело, называется «библиотека-сканирующий мутагенез». Как правило, библиотека-сканирующий мутагенез работает следующим образом. Одно или более аминокислотных положений в CDR заменены двумя или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислот с использованием известных в данной области методов. Это генерирует небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления по одному на каждое аминокислотное положение, которое анализируется), каждая со сложностью из двух или более членов (если две или более аминокислоты заменены в каждом положении). Как правило, библиотека также включает клон, содержащий нативную (незамещенную) аминокислоту. Небольшое количество клонов, например, примерно 20-80 клонов (в зависимости от сложности библиотеки), из каждой библиотеки подвергают скринингу на аффинность связывания с целевым полипептидом (или другой мишенью связывания) и идентифицировали кандидаты с повышенным, одинаковым, уменьшенным или с отсутствием связывания. Методы определения аффинности связывания хорошо известны в данной области. Аффинность связывания может быть определена с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса Biacore™, который детектирует различия в аффинности связывания примерно в 2 раза или более. Biacore™ особенно полезен, когда исходное антитело уже связывается с относительно высокой аффинностью, например, с K примерно 10 нМ или ниже. Скрининг с использованием поверхностного плазмонного резонанса Biacore™ описан в настоящем документе в Примерах.
Аффинность связывания может быть определена с использованием Kinexa Biocensor, анализов сцинтилляционной близости, ИФА, иммуноанализа ORIGEN (IGEN), гашения флуоресценции, переноса флуоресценции и/или дрожжевого дисплея. Аффинность связывания также может быть проверена с использованием подходящего биоанализа.
В некоторых вариантах осуществления каждое аминокислотное положение в CDR заменяется (в некоторых вариантах осуществления по одному за раз) всеми 20 природными аминокислотами с использованием известных в данной области методов мутагенеза (некоторые из которых описаны в настоящем документе). В результате создаются небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах по одному на каждое аминокислотное положение, которые анализируется), каждая из которых имеет сложность 20 членов (если все 20 аминокислот замещены в каждом положении).
В некоторых вариантах осуществления библиотека для скрининга содержит замены в двух или более положениях, которые могут находиться в одной и той же CDR или в двух или более CDR. Таким образом, библиотека может содержать замены в двух или более положениях в одной CDR. Библиотека может содержать замену в двух или более положениях в двух или более CDR. Библиотека может содержать замену в 3, 4, 5 или более положениях, причем указанные положения находятся в двух, трех, четырех, пяти или шести CDR. Замена может быть получена с использованием кодонов с низкой представленностью. См., например, Таблицу 2 Balint et al., Gene 137 (1): 109-18, 1993.
CDR может быть CDRH3 и/или CDRL3. CDR может быть одной или более из CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3. CDR может быть CDR Kabat, CDR Chothia или расширенной CDR.
Кандидаты с улучшенным связыванием могут быть секвенированы, тем самым идентифицируя мутант с заменой CDR, что приводит к улучшенной аффинности (также называемой «улучшенной» заменой). Кандидаты, которые связываются, также могут быть секвенированы, тем самым идентифицируя замену CDR, которая сохраняет связывание.
Может быть проведено несколько раундов скрининга. Например, кандидаты (каждый из которых содержит аминокислотную замену в одном или более положениях одной или более CDR) с улучшенным связыванием также полезны для разработки второй библиотеки, содержащей по меньшей мере исходную и замененную аминокислоту в каждом улучшенном положении CDR (т.е. положение аминокислоты в CDR, при котором мутант с заменой показал улучшенное связывание). Подготовка, скрининг или выбор этой библиотеки обсуждаются ниже.
Билиотека-сканирующий мутагенез также предоставляет средства для характеристики CDR, поскольку частота клонов с улучшенным связыванием, одинаковым связыванием, уменьшенным связыванием или отсутствием связывания также предоставляет информацию, касающуюся важности каждого положения аминокислоты для стабильности комплекс антитело-антиген. Например, если положение CDR сохраняет связывание при замене на все 20 аминокислот, это положение идентифицируется как положение, которое вряд ли потребуется для связывания антигена. И наоборот, если положение CDR сохраняет связывание только в небольшом проценте замен, это положение идентифицируется как положение, которое важно для функции CDR. Таким образом, методы библиотека-сканирующего мутагенеза генерируют информацию, касающуюся положений в CDR, которые можно изменить на множество различных аминокислот (включая все 20 аминокислот), и положений в CDR, которые нельзя изменить или которые можно изменить только на несколько аминокислот.
Кандидаты с улучшенной аффинностью могут быть объединены во второй библиотеке, которая включает улучшенную аминокислоту, исходную аминокислоту в этом положении, и может дополнительно включать дополнительные замены в этом положении, в зависимости от сложности библиотеки, которая желательна или разрешена с использованием желаемого метода скрининга или селекции. Кроме того, если желательно, соседнее аминокислотное положение может быть рандомизировано, по меньшей мере, до двух или более аминокислот. Рандомизация соседних аминокислот может обеспечить дополнительную конформационную гибкость в мутантной CDR, что, в свою очередь, может позволить или облегчить введение большего числа улучшающих мутаций. Библиотека также может содержать замену в положениях, которые не показали улучшенной аффинности в первом раунде скрининга.
Вторую библиотеку скринируют или селектируют на предмет членов библиотеки с улучшенной и/или измененной аффинностью связывания с использованием любого метода, известного в данной области, включая скрининг с использованием поверхностного плазмонного резонанса Biacore™ и селекцию с использованием любого метода, известного в данной области, для селекции, включая фаговый дисплей, дрожжевой дисплей и рибосомный дисплей.
Изобретение также охватывает слитые белки, содержащие один или более фрагментов или областей антител по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления предложен гибридный полипептид, который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230 или 232, и/или по меньшей мере, 10 аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231 или 233. В других вариантах осуществления предложен слитый полипептид, который содержит, по меньшей мере, примерно 10, по меньшей мере, примерно 15, по меньшей мере, примерно 20, по меньшей мере, примерно 25 или, по меньшей мере, примерно 30 смежных аминокислот вариабельной области легкой цепи и/или по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере, примерно 15, по меньшей мере, примерно 20, по меньшей мере, примерно 25 или, по меньшей мере, примерно 30 смежных аминокислот вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит одну или более CDR. Еще в других вариантах осуществления слитый полипептид включает CDR H3 (VH CDR3) и/или CDR L3 (VL CDR3). Для целей настоящего изобретения слитый белок содержит одно или более антител и другую аминокислотную последовательность, к которой он не присоединен в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другой области. Типичные гетерологичные последовательности включают, но не ограничиваются этим, «метку», такую как метка FLAG или метка 6His. Метки хорошо известны в данной области.
Слитый полипептид может быть создан способами, известными в данной области, например, синтетически или рекомбинантно. Как правило, слитые белки по настоящему изобретению получают путем получения экспрессирующего полинуклеотида, кодирующего их, с использованием рекомбинантных способов, описанных в настоящем документе, хотя они также могут быть получены другими способами, известными в данной области, включая, например, химический синтез.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитела, конъюгированные (например, связанные) с агентом, которые облегчают связывание с твердой подложкой (такой как биотин или авидин). Для простоты будет сделана ссылка, как правило, на антитела с пониманием, что эти способы применимы к любому из вариантов осуществления антитела к FLT3, описанным в настоящем документе. Конъюгация обычно относится к связыванию этих компонентов, как описано в настоящем документе. Связывание (которое обычно фиксирует эти компоненты в непосредственной близости, по меньшей мере, для введения) может быть достигнуто любым количеством способов. Например, прямая реакция между агентом и антителом возможна, когда каждый из них обладает заместителем, способным реагировать с другим. Например, нуклеофильная группа, такая как аминогруппа или сульфгидрильная группа, на одном из них может быть способна реагировать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной группой, содержащей хорошую уходящую группу (например, галогенид) на другом.
Изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела по изобретению, и векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид.
Соответственно, изобретение относится к полинуклеотидам (или композициям, включая фармацевтические композиции), содержащим полинуклеотиды, кодирующие любое из следующего: P4F6, P4C7, P3A, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, P08B06EE, P04A04, P01A05, P08B03, P5F7, P5F7g, P10A02g, P10A04g, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g, P5F7g2, P5F7g3, P5F7g4 или любой фрагмент или их часть, обладающие способностью связываться с FLT3.
В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любое из антител (включая фрагменты антител), и к полипептидам, описанным в настоящем документе, таким как антитела и полипептиды, имеющие нарушенную эффекторную функцию. Полинуклеотиды могут быть получены и экспрессированы способами, известными в данной области.
В другом аспекте изобретение относится к композициям (таким как фармацевтические композиции), содержащим любой из полинуклеотидов по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любое из антител, описанных в настоящем документе.
Экспрессирующие векторы и введение полинуклеотидных композиций дополнительно описаны в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения любого из полинуклеотидов, описанных в настоящем документе.
Полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям, также включены в настоящее изобретение. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномные, кДНК или синтетические) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК один к одному, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, присутствовать в полинуклеотиде по настоящему изобретению, и полинуклеотид может, но не обязательно, связываться с другими молекулами и/или материалами подложки.
Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (то есть, эндогенную последовательность, которая кодирует антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, так что иммунореактивность кодируемого полипептида не уменьшается по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Влияние на иммунореактивность кодируемого полипептида в целом можно оценить, как описано в настоящем документе. Варианты предпочтительно имеют по меньшей мере примерно 70% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативное антитело или его часть.
Считается, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются «идентичными», если последовательность нуклеотидов или аминокислот в этих двух последовательностях одинакова при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно выполняются путем сравнения последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. «Окно сравнения», как используется в настоящем описании, относится к сегменту, по меньшей мере, примерно из 20 смежных положений, обычно от 30 до примерно 75 или от 40 до примерно 50, в котором последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью того же числа смежных положений после того, как две последовательности оптимально выровнены.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено с использованием программы Megalign в наборе программного обеспечения для биоинформатики Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Эта программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, MO, 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11: 105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Предпочтительно, «процент идентичности последовательности» определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения по меньшей мере из 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (то есть пробелы) 20 процентов или менее, обычно от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов, по сравнению с эталонными последовательностями (которые не содержат добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывается путем определения количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотных остатков встречаются в обеих последовательностях, для получения числа совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в эталонной последовательности (т.е. размер окна) и умножение результатов на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности.
Варианты также могут или альтернативно могут быть по существу гомологичными нативному гену или его части или комплементу. Такие полинуклеотидные варианты способны гибридизоваться в умеренно жестких условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность).
Подходящие «умеренно жесткие условия» включают предварительную промывку в растворе 5×SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при 50-65°С, 5хSSC, в течение ночи; с последующим промыванием дважды при 65°C в течение 20 минут с каждым из 2X, 0,5X и 0,2X SSC, содержащим 0,1% SDS.
Используемый в настоящем описании термин «высоко жесткие условия» или «условия высокой жесткости» представляют собой такие, которые: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывки, например, 0,015 М хлорида натрия/0,0015 М цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°С; (2) используют во время гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (об./об.) Формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 6,5 с 750 мМ хлорид натрия, 75 мМ цитрат натрия при 42°С; или (3) используют 50% формамида, 5хSSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5 х раствора Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансульфат при 42°C, с промывкой при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамида при 55°C с последующей промывкой при высокой жесткости, состоящей из 0,1хSSC, ЭДТА при 55°C. Специалист в данной области техники поймет, как регулировать температуру, ионную силу и т.д. по мере необходимости, чтобы учитывать такие факторы, как длина зонда и тому подобное.
Специалистам в данной области будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, как описано в настоящем документе. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые варьируются из-за различий в использовании кодонов, специально предусмотрены настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе, входят в объем настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей в базе данных).
Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть получены с использованием химического синтеза, рекомбинантных методов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области и не требуют подробного описания в настоящем документе. Специалист в данной области может использовать представленные в настоящем описании последовательности и коммерческий синтезатор ДНК для получения желаемой последовательности ДНК.
Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных методов полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, может быть встроен в подходящий вектор, а вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как дополнительно обсуждается в настоящем документе. Полинуклеотиды могут быть встроены в клетки-хозяева любым способом, известным в данной области. Клетки трансформируют путем введения экзогенного полинуклеотида путем прямого захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-спаривания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться внутри клетки в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или может интегрироваться в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид может быть выделен из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., например, Sambrook et al., 1989.
Альтернативно, ПЦР позволяет воспроизводить последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области техники и описана в патентах США № 4683195, 4800159, 4754065 и 4683202, а также в PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
РНК можно получить, используя выделенную ДНК в подходящем векторе и вставляя ее в подходящую клетку-хозяин. Когда клетка реплицируется и ДНК транскрибируется в РНК, РНК может быть выделена с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как, например, изложенные в Sambrook et al., 1989, выше.
Подходящие векторы клонирования могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методиками или могут быть выбраны из большого числа векторов клонирования, доступных в данной области. Хотя выбранный вектор клонирования может варьироваться в зависимости от предполагаемой клетки-хозяина, пригодные векторы клонирования, как правило, будут обладать способностью к саморепликации, и могут обладать одной мишенью для конкретной рестрикционной эндонуклеазы и/или могут нести гены для маркера, которые могут быть использованы при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK +) и его производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие векторы клонирования доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.
Экспрессирующие векторы обычно представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат полинуклеотид по изобретению. Подразумевается, что экспрессирующий вектор должен быть реплицируемым в клетках-хозяевах либо в виде эписом, либо в качестве неотъемлемой части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессирующие векторы, раскрытые в публикации РСТ № WO 87/04462. Векторные компоненты могут, как правило, включать, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: сигнальная последовательность; точка начала репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы, контроля транскрипции (такие как промоторы, энхансеры и терминаторы). Для экспрессии (т.е. трансляции) обычно также требуется один или более элементов контроля трансляции, таких как сайты связывания рибосом, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.
Векторы, содержащие интересующие полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор представляет собой инфицирующий агент, такой как вирус коровьей оспы). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто будет зависеть от особенностей клетки-хозяина.
E.coli
B. subtillis
S. cerevisae
S. pombe
K. lactis
Изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем документе. Любые клетки-хозяева, способные сверхэкспрессировать гетерологичные ДНК, могут быть использованы с целью выделения генов, кодирующих антитело, полипептид или интересующий белок. Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки COS, HeLa и CHO. См. также публикацию PCT № WO 87/04462. Подходящие клетки-хозяева не млекопитающих включают прокариоты (такие как  или ) и дрожжи (такие как ,  или ). Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне примерно в 5 раз выше, более предпочтительно, в 10 раз выше, еще более предпочтительно, в 20 раз выше, чем соответствующее эндогенное антитело или представляющий интерес белок, если они присутствуют, в клетках-хозяевах. Скрининг клеток-хозяев на специфическое связывание с FLT3 осуществляется с помощью иммуноанализа или FACS. Может быть идентифицирована клетка, сверхэкспрессирующая интересующее антитело или белок.
Способы применения антител к FLT3
Антитела по настоящему изобретению полезны в различных применениях, включая, но не ограничиваясь ими, методы терапевтического лечения и методы диагностического лечения.
Антитела (например, моноспецифические и биспецифические), полученные способами, описанными выше, можно использовать в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления такое лекарственное средство можно использовать для лечения злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой гемобластоз, такой как лимфома или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование выбрано из следующего: множественной миеломы, злокачественного новообразования в плазматических клетках, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, лейкоза плазматических клеток, плазмоцитомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, В-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL), острого миелоидного лейкоза (AML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), хронического миелоидного лейкоза (CML), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы мантийных клеток, крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы из предшественников В-клеток, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, лимфомы лимфатической ткани, ассоциированной со слизистой, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы мантийных клеток, лимфомы Беркита, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфоплазмацитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодальной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, селезеночной лимфомы маргинальной зоны, интраваскулярной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной эффузионной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, Т-клеточной, богатой гистиоцитами крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной кожной диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (leg type), EBV-положительной диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы пожилых людей, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK-положительной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, плазмобластной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоцентровой болезни Кастлмана, B-клеточной лимфомы, не классифицированной с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, B-клеточной лимфомы, не классифицированной с признаками, промежуточными между диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина и других злокачественных новообразований, связанных с гемопоэтическими клетками. В предпочтительном воплощении злокачественное новообразование представляет собой AML. В предпочтительном воплощении злокачественное новообразование представляет собой ALL.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у пациента, у которого есть злокачественные клетки, экспрессирующие FLT3, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитела против FLT3 (например, биспецифические антитела против FLT3-CD3), как описано в настоящем документе. В других вариантах осуществления предложен способ ингибирования метастазирования клеток, экспрессирующих FLT3 у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитела против FLT3 (например, биспецифические антитела против FLT3-CD3), как описано в настоящем документе. В других вариантах осуществления предложен способ индукции регрессии опухоли в злокачественных клетках у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитела FLT3 (например, биспецифические антитела против FLT3-CD3), как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления антитело (например, биспецифическое антитело FLT3-CD3) по изобретению можно использовать при изготовлении лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования у пациента, нуждающегося в этом.
В некоторых вариантах осуществления лечение может быть в комбинации с одной или более противоопухолевыми терапиями, выбранными из группы, состоящей из терапии антителами, химиотерапии, терапии цитокинами, направленной терапии, вакцинотерапии, терапии дендритными клетками, генной терапии, гормонотерапии, хирургической резекции, лазеротерапии и лучевой терапии.
В некоторых вариантах осуществления цитокин, используемый в цитокиновой терапии, представляет собой интерлейкин (IL) - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17. В некоторых вариантах осуществления этот цитокин представляет собой IL-15, IL-12 или IL-2. Например, антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с IL-15 дикого типа (например, с номером доступа: >sp|P40933|49-162 или SEQ ID NO: 293).
В некоторых вариантах осуществления антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с лечением биотерапевтическим агентом, например антителом, включая но не ограничиваясь ими, антитело против CTLA-4, антитело против 4-1BB (например, PF-04518600), антитело против PD-1 (например, ниволумаб, пембролизумаб или PF-06801591), антитело против PD-L1 (например, авелумаб, атезолизумаб или дурвальмаб), антитело против TIM3, антитело против LAG3, антитело против TIGIT, антитело против OX40, антитело против IL-8, антитело против HVEM, антитело против BTLA, антитело против CD40, антитело против CD40L, антитело против CD47, антитело против CSF1R, антитело против CSF1, антитело против MARCO, антитело против CXCR4, антител против VEGFR1, антитело против VEGFR2, антитело против TNFR1, антитело против MCSF (например, PD-0360324), антитело против TNFR2, биспецифическое антитело против CD3, антитело против CD19, антитело против CD20, антитело против Her2, антитело против EGFR, антитело против COS, антитело против CD22, антитело против CD-52, антитело против CCR4, антитело против CCR8, антитело против CD200R, антитело против VISG4, антитело против CCR2, антитело против LILRb2, антитело против CXCR4, антитело против CD206, антитело против CD163, антитело против KLRG1, антитело против B7-H4, антитело против B7-H3 или антитело против GITR.
В некоторых вариантах осуществления антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с лечением антагонистом CCR2 (например, INC-8761), антивирусным агентом, цидофовиром и интерлейкином-2, цитарабином (также известным как ARA-C) или лечением натализимабом для пациентов с MS или лечением эфализтимабом для пациентов с псориазом или другими лечениями пациентов с PML. В некоторых вариантах осуществления антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с химиотерапией, облучением, иммунодепрессантами (такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506) или другими иммунодеструктивными агентами, такими как CAMPATH, цитотоксин, флударибин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, цитокины и/или облучение. Эти препараты ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальциневрин (циклоспорин и FK506) или ингибируют киназу p70S6, которая важна для передачи сигналов, индуцированных фактором роста (рапамицин). В других вариантах осуществления антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с ингибиторами киназы, включая, но не ограничиваясь ими, ингибиторы mTOR, мидостаурин, лестауртиниб, сорафениб, сунитиниб, квизартиниб, понатиниб, креноланиб, палбоциклиб и гилтеритиниб.
В некоторых вариантах осуществления антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению также можно использовать в комбинации с эпигенетическими модуляторами, ингибиторами протеасом, иммуномодулирующими агентами (например, леналидомидом), ингибиторами Hedgehog, TNFα (фактор некроза опухолей альфа), ингибиторами PAP (фосфатазы фосфатидной кислотоы), онколитическими вирусами, ингибиторами IDO (индолеамин-пиррол-2,3-диоксигеназы), ингибиторами глутаминазы GLS1, противоопухолевыми вакцинами, агонистами TLR (Toll-подобный рецептор) (например, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 или TLR9) или ингибиторами изоцитратдегидрогеназы (IDH).
В дополнительном варианте осуществления антитела к FLT3 (например, биспецифические антитела к FLT3-CD3) по настоящему изобретению вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с трансплантацией костного мозга, клетками CART (химерный антигенный рецептор T), Т-клеточной абляционной терапией с использованием химиотерапевтических агентов, таких как флударабин, наружная дистанционная лучевая терапия (XRT), циклофосфамид, или с антителами, такими как ОКТ3 или алемтузумаб.
Введение антител (например, моноспецифических или биспецифических) по изобретению может осуществляться любым удобным способом, включая аэрозольную ингаляцию, инъекцию, прием внутрь, переливание, имплантацию или трансплантацию. Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены пациенту подкожно, внутрикожно, внутриопухолево, внутричерепно, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, внутривенной или внутрилимфатической инъекцией или внутрибрюшинно. В одном варианте осуществления композиции антител по изобретению предпочтительно вводят внутривенной инъекцией.
В некоторых вариантах осуществления введение антител (например, моноспецифических или биспецифических) может включать введение, например, от примерно 0,01 до примерно 20 мг на кг массы тела, включая все целочисленные значения мг на кг в этих диапазонах. В некоторых вариантах осуществления введение антител может включать введение примерно от 0,1 до 10 мг на кг массы тела, включая все целочисленные значения мг на кг в этих диапазонах. Антитело можно вводить в одной или более дозах. В некоторых вариантах осуществления указанное эффективное количество антитела можно вводить в виде разовой дозы. В некоторых вариантах осуществления указанное эффективное количество антитела можно вводить в виде более чем одной дозы в течение периода времени. Время введения зависит от решения лечащего врача и зависит от клинического состояния пациента. В то время как индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств данного антитела (например, моноспецифического или биспецифического) для конкретного заболевания или состояний находятся в пределах уровня техники. Эффективное количество означает количество, которое обеспечивает терапевтическое или профилактическое преимущество. Вводимая доза будет зависеть от возраста, состояния здоровья и веса реципиента, вида параллельного лечения, если таковое имеется, частоты лечения и характера желаемого эффекта. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гетеромультимерного антитела или композиции, содержащей эти антитела, вводят парентерально. В некоторых вариантах осуществления введение может представлять собой внутривенное введение. В некоторых вариантах осуществления введение может осуществляться непосредственно путем инъекции в опухоль.
В некоторых вариантах осуществления антитела против FLT3, представленные в настоящем документе, можно использовать для диагностических целей, например, в анализах для идентификации белка FLT3 в образцах (например, в иммуногистохимических анализах) или у пациентов.
Композиции
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело (например, моноспецифическое или биспецифическое) по изобретению или его часть, как описано выше, в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах осуществления полипептиды по изобретению могут присутствовать в нейтральной форме (включая цвиттер-ионные формы) или в виде положительно или отрицательно заряженных частиц. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут образовывать комплекс с противоионом с образованием «фармацевтически приемлемой соли», которая относится к комплексу, содержащему один или более полипептидов и один или более противоионов, где противоионы получены из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований.
Антитело (например, моноспецифическое или биспецифическое) или его части можно вводить индивидуально или в комбинации с одним или более другими полипептидами по изобретению или в комбинации с одним или более другими лекарственными средствами (или в виде любой их комбинации). Фармацевтические композиции, способы и применения изобретения, таким образом, также охватывают варианты осуществления комбинаций (совместного введения) с другими активными агентами, как подробно описано ниже.
Подразумевается, что используемые в настоящем описании термины «совместное введение», «со-введение» и «в комбинации с», относящиеся к антителам по изобретению и одному или более другим терапевтическим агентам, обозначают, относятся и включают следующее: (i) одновременное введение такой комбинации антитела, раскрытого в настоящем описании, и терапевтического агента(агентов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты объединены в одну лекарственную форму, которая высвобождает указанные компоненты по существу в одно и то же время в организме указанного пациента; (ii) по существу одновременное введение такой комбинации антитела, раскрытого в настоящем описании, и терапевтического агента(агентов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены в состав отдельно друг от друга в отдельные лекарственные формы, которые принимаются по существу в одно и то же время указанным пациентом, после чего указанные компоненты высвобождаются по существу в одно и то же время в организме указанного пациента; (iii) последовательное введение такой комбинации антитела, раскрытого в настоящем описании, и терапевтического агента(агентов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены в состав отдельно друг от друга в отдельные лекарственные формы, которые указанный пациент принимает последовательно со значительным интервалом времени между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в по существу разное время в организме указанного пациента; и (iv) последовательное введение такой комбинации антитела, раскрытого в настоящем описании, и терапевтического агента(агентов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты объединены в единую лекарственную форму, которая высвобождает указанные компоненты контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно и/или частично высвобождается в одно и то же и/или разное время в организме указанного пациента, где каждая часть может вводиться одним и тем же или другим путем.
Как правило, антитело (например, моноспецифическое или биспецифическое), раскрытое в настоящем описании, или его части являются подходящими для введения в виде препарата в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Термин «вспомогательное вещество» используется в настоящем документе для описания любого ингредиента, отличного от соединения(соединений) по изобретению. Выбор вспомогательного вещества будет в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения, влияние вспомогательного вещества на растворимость и стабильность и характер лекарственной формы. Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ являются вода, физиологический раствор, фосфатно-буферный солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол и тому подобное, а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Дополнительными примерами фармацевтически приемлемых веществ являются смачивающие агенты или незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность антитела.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их приготовления будут очевидны для специалистов в данной области. Такие композиции и способы их получения можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995). Фармацевтические композиции предпочтительно изготавливаются в условиях GMP.
Фармацевтическая композиция по изобретению может быть приготовлена, упакована или продана оптом, в виде единичной дозы или множества единичных доз. При использовании в настоящем описании «стандартная доза» представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, которую вводят пациенту, или подходящей фракции такой дозировки, такой как, например, половина или треть такой дозировки. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может быть подходящим образом использован для гетеродимерных белков и их частей, раскрытых в настоящем описании.
Фармацевтические композиции по изобретению обычно подходят для парентерального введения. Используемый в настоящем описании термин «парентеральное введение» фармацевтической композиции включает любой путь введения, характеризующийся физическим повреждением ткани пациента и введением фармацевтической композиции через нарушение в ткани, что, как правило, приводит к прямому введению в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Парентеральное введение, таким образом, включает, но не ограничивается, введение фармацевтической композиции путем инъекции композиции, нанесения композиции через хирургический разрез, нанесения композиции через проникающую в ткань нехирургическую рану и тому подобное. В частности, предполагается, что парентеральное введение включает, но не ограничивается этим, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, надчревное, внутривенное, внутриартериальное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутриуретральное, внутричерепное, внутрисиновиальное введение или инфузии; и методика диалитической инфузии почек. Предпочтительные варианты осуществления включают внутривенный и подкожный пути.
Составы фармацевтической композиции, подходящей для парентерального введения, обычно содержат активный ингредиент в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический солевой раствор. Такие составы могут быть приготовлены, упакованы или проданы в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Инъецируемые препараты могут быть приготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, такой как ампулы или контейнеры с несколькими дозами, содержащие консервант. Композиции для парентерального введения включают, но не ограничиваются ими, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты и тому подобное. Такие составы могут дополнительно содержать один или более дополнительных ингредиентов, включая, но не ограничиваясь ими, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном варианте осуществления композиции для парентерального введения активный ингредиент предоставляется в сухой (то есть порошковой или гранулированной) форме для разведения подходящим носителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Парентеральные составы также включают водные растворы, которые могут содержать вспомогательные вещества, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно до рН от 3 до 9), но для некоторых применений они могут быть более подходящим образом приготовлены в виде стерильного неводного раствора или в виде высушенной формы для использования в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода. Типичные формы парентерального введения включают растворы или суспензии в стерильных водных растворах, например, водных растворах пропиленгликоля или декстрозы. Такие лекарственные формы могут быть подходящим образом забуферены, если желательно. Другие составы парентерального введения, которые являются полезными, включают те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомном препарате. Составы для парентерального введения могут быть приготовлены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Составы с модифицированным высвобождением включают составы с контролируемым, отсроченным, длительным, импульсным, направленным и запрограммированным высвобождением. Например, в одном аспекте стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены путем включения гетеродимерного белка, например биспецифического антитела, в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые на выходе дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный искомый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Длительная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Режимы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа. Например, может вводиться один болюс, несколько разделенных доз могут вводиться с течением времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указано в зависимости от терапевтической ситуации. Особенно выгодно готовить парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозировки. Используемая здесь стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для пациентов/индивидуумов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению обычно определяется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, присущих уровню техники приготовления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Таким образом, специалисту в данной области техники должно быть понятно, исходя из раскрытия, приведенного в настоящем описании, что доза и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в области терапии. То есть максимально допустимая доза может быть легко установлена, и также может быть определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемую терапевтическую пользу для пациента, а также временные требования для введения каждого агента, чтобы обеспечить обнаруживаемую терапевтическую пользу для пациента. Соответственно, хотя определенные схемы дозирования и введения приведены в настоящем описании в качестве примеров, эти примеры никоим образом не ограничивают дозу и схемы введения, которые могут быть предоставлены пациенту при осуществлении настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения доз могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести состояния, которое должно быть облегчено, и могут включать однократную или множественные дозы. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного пациента конкретные схемы дозировки должны корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным мнением лица, управляющего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны дозировок, изложенные в настоящем описании, приведены исключительно в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленной композиции. Кроме того, схема дозирования композиций по настоящему изобретению может основываться на множестве факторов, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояние здоровья пациента, тяжесть состояния, способ введения, и конкретное используемое антитело. Таким образом, схема дозирования может широко варьироваться, но может быть определена обычным образом с использованием стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических или фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты и/или лабораторные показатели. Таким образом, настоящее изобретение охватывает повышение дозы внутри пациента, определяемое специалистом в данной области. Определение подходящих дозировок и схем хорошо известно в соответствующей области и должно быть понятно специалисту в данной области техники, как только будут представлены идеи, раскрытые в настоящем описании.
Как правило, для введения антител, описанных в настоящем документе (моноспецифических или биспецифических), потенциальную дозу можно вводить ежедневно, каждую неделю, каждую вторую неделю, каждые три недели, каждые четыре недели, каждые пять недель, каждые шесть недель, каждые семь недель, каждые восемь недель, каждые десять недель, каждые двенадцать недель или чаще, чем каждые двенадцать недель. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов или пока не будут достигнуты достаточные терапевтические уровни, например, для уменьшения симптомов, связанных со злокачественным новообразованием. Прогресс этой терапии легко контролировать с помощью традиционных методов и анализов. Схема дозирования (включая используемые моноспецифические или биспецифические антитела против FLT) может меняться со временем.
В некоторых вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится ежедневно при дозе в диапазоне от примерно 1 мкг/кг до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, суточная доза составляет примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,03 мг/кг, примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2,5 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг и примерно 25 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждую неделю в диапазоне от примерно 1 мкг/кг до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в неделю можно использовать дозировку примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,03 мг/кг, примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2,5 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 25 мг/кг и примерно 30 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждые две недели в диапазоне от примерно 1 мкг/кг до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в две недели можно использовать дозировку примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2,5 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 25 мг/кг и примерно 30 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждые три недели в диапазоне от примерно от 1 мкг/кг до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в три недели можно использовать дозировку примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2,5 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг и примерно 50 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждый месяц или каждые четыре недели при дозировке в диапазоне от примерно 1 мкг/кг до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в месяц можно использовать дозировку примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2,5 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг и примерно 50 мг/кг.
В других вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится ежедневно с дозой в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 1200 мг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, суточная доза составляет примерно 0,01 мг, примерно 0,1 мг, примерно 1 мг, примерно 10 мг, примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 200 мг, примерно 300 мг, примерно 400 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг, примерно 700 мг, примерно 800 мг, примерно 900 мг, примерно 1000 мг, примерно 1100 мг или примерно 1200 мг.
В других вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждую неделю с дозировкой в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 2000 мг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в неделю может использоваться дозировка примерно 0,01 мг, примерно 0,1 мг, примерно 1 мг, примерно 10 мг, примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 200 мг, примерно 300 мг, примерно 400 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг, примерно 700 мг, примерно 800 мг, примерно 900 мг, примерно 1000 мг, примерно 1100 мг, примерно 1200 мг, примерно 1300 мг, примерно 1400 мг, примерно 1500 мг, примерно 1600 мг, примерно 1700 мг, примерно 1800 мг, примерно 1900 мг или примерно 2000 мг.
В других вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждые две недели с дозировкой в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 2000 мг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в две недели можно использовать дозировку примерно 0,01 мг, примерно 0,1 мг, примерно 1 мг, примерно 10 мг, примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 200 мг, примерно 300 мг, примерно 400 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг, примерно 700 мг, примерно 800 мг, примерно 900 мг, примерно 1000 мг, примерно 1100 мг, примерно 1200 мг, примерно 1300 мг, примерно 1400 мг, примерно 1500 мг, примерно 1600 мг, примерно 1700 мг, примерно 1800 мг, примерно 1900 мг или примерно 2000 мг.
В других вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждые три недели с дозировкой в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 2500 мг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в три недели можно использовать дозировку примерно 0,01 мг, примерно 0,1 мг, примерно 1 мг, примерно 10 мг, примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 200 мг, примерно 300 мг, примерно 400 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг, примерно 700 мг, примерно 800 мг, примерно 900 мг, примерно 1000 мг, примерно 1100 мг, примерно 1200 мг, примерно 1300 мг, примерно 1400 мг, примерно 1500 мг, примерно 1600 мг, примерно 1700 мг, примерно 1800 мг, примерно 1900 мг, примерно 2000 мг, примерно 2100 мг, примерно 2200 мг, примерно 2300 мг, примерно 2400 мг или примерно 2500 мг.
В других вариантах осуществления предполагаемая дозировка вводится каждые четыре недели или месяц с дозировкой в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 3000 мг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, раз в месяц можно использовать дозировку примерно 0,01 мг, примерно 0,1 мг, примерно 1 мг, примерно 10 мг, примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 200 мг, примерно 300 мг, примерно 400 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг, примерно 700 мг, примерно 800 мг, примерно 900 мг, примерно 1000 мг, примерно 1100 мг, примерно 1200 мг, примерно 1300 мг, примерно 1400 мг, примерно 1500 мг, примерно 1600 мг, примерно 1700 мг, примерно 1800 мг, примерно 1900, примерно 2000 мг, примерно 2100 мг, примерно 2200 мг, примерно 2300 мг, примерно 2400 мг, примерно 2500, примерно 2600 мг, примерно 2700 мг, примерно 2800 мг, примерно 2900 мг или примерно 3000 мг.
Наборы
Изобретение также относится к наборам для использования в способах по настоящему изобретению. Наборы по изобретению включают один или более контейнеров, содержащих антитело (например, моноспецифическое или биспецифическое), как описано в настоящем документе, и инструкции по применению в соответствии с любым из способов по изобретению, описанных в настоящем документе. Как правило, эти инструкции содержат описание введения белка антитела для вышеописанных терапевтических способов лечения.
Инструкции, относящиеся к применению антитела (например, моноспецифического или биспецифического), как описано в настоящем документе, обычно включают информацию о дозировке, схеме дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут быть в виде единичных доз, объемных упаковок (например, многодозовых упаковок) или в виде субъединичных доз. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, лист бумаги, включенный в комплект), но машиночитаемые инструкции (например, инструкции, хранящиеся на магнитном или оптическом диске для хранения) также приемлемы.
Наборы по настоящему изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается этим, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и тому подобное. Также рассматриваются упаковки для использования в сочетании с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как минипомпа. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Контейнер также может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере, один активный агент в композиции представляет собой биспецифичное антитело. Контейнер может дополнительно включать второй фармацевтически активный агент.
Наборы могут дополнительно предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы, и интерпретирующую информацию. Как правило, в комплект входит контейнер и этикетка или вкладыш(и) упаковки на контейнере или будучи связанными с ним.
Биологический депозит
Репрезентативные материалы по настоящему изобретению были депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801 Университетский бульвар, Манассас, Вирджиния. 20110-2209, США, на 1 июня 2017 года. Вектор P5F7g2-VL с номером доступа ATCC PTA-124230 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи P5F7g2, и вектор P5F7g2-VH с номером доступа ATCC PTA-124229 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи P5F7g2. Депозиты были сделаны в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и положений к нему (Будапештский договор). Это обеспечивает сохранение жизнеспособной культуры депозита в течение 30 лет с даты внесения депозита. Депозит будет предоставлен ATCC в соответствии с условиями Будапештского договора и при условии соглашения между Pfizer, Inc. и ATCC, которое гарантирует постоянный и неограниченный доступ к потомству культуры депозита для общественного использования при выдаче соответствующего патента США или, если он общедоступен, любой патентной заявки США или иностранного происхождения, в зависимости от того, что произойдет раньше, и гарантирует доступ к потомству по определению Комиссара по патентам и товарным знакам США в соответствии с 35 USC § 122. и в соответствии с правилами Комиссара (в том числе 37 CFR § 1.14 с особой ссылкой на 886 OG 638).
Правопреемник настоящей заявки согласился с тем, что если культура материалов, находящихся на хранении, погибнет или будет утрачена или уничтожена при культивировании в подходящих условиях, то при уведомлении материалы будут незамедлительно заменены другой из них. Доступность депонированных материалов не должна рассматриваться как лицензия на применение изобретения в нарушение прав, предоставленных властью любого правительства в соответствии с его патентным законодательством.
Ссылка также делается на материал, раскрытый в настоящем описании и хранящийся в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, США, 1 июня 2017 года. Вектор PE310-VL с номером доступа ATCC PTA-124228 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи PE310, а вектор P3E10-VH с номером доступа ATCC PTA-124227 представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи PE310. Депозиты также были сделаны в соответствии с положениями Будапештского договора, в соответствии с его условиями, кратко изложенными выше.
Следующие примеры предлагаются только для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в настоящем документе, станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и попадут в объем прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Определение кинетики и аффинности взаимодействий антител человека к FLT3/FLT3 при 37°С.
Этот пример определяет кинетику и аффинность различных антител против FLT3 при 37°C. Все эксперименты проводились на биосенсоре поверхностного плазмонного резонанса Biacore T200 (GE Lifesciences, Piscataway NJ).
Подготовку сенсорного чипа проводили при 25°C с использованием рабочего буфера 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,4. Сенсорный чип с антителом против человеческого Fc получали путем активации всех проточных ячеек сенсорного чипа Biacore CM4 смесью 1: 1 (об./об.) 400 мМ EDC и 100 мМ NHS в течение 7 минут при скорости потока 10 мкл/мин. Реагент против человеческого Fc (козье антитело против человеческого IgG Fc, Southern Biotech Catalog # 2081-01) разбавляли до 30 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия pH 4,5 и вводили во все проточные ячейки в течение 7 минут при 20 мкл/мин. Все проточные ячейки блокировали 100 мМ этилендиамином в 150 мМ боратном буфере, рН 8,5, в течение 7 минут при 10 мкл/мин.
J. Mol. Recognit.
Эксперименты проводили при 37°С, используя рабочий буфер из 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) Tween-20, рН 7,4, 1 мг/мл БСА. Антитела к FLT3 были захвачены из неразбавленных супернатантов на нижестоящих проточных ячейках (проточные ячейки 2, 3 и 4) со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 1 минуты. Различные антитела были захвачены в каждой проточной ячейке. Проточная ячейка 1 использовалась в качестве контрольной поверхности. После захвата антител FLT3 аналит (буфер, hFLT3) инъецировали со скоростью 30 мкл/мин во все проточные ячейки в течение двух минут. После инъекции аналита контролировали диссоциацию в течение 10 минут с последующей регенерацией всех проточных ячеек с помощью трех 1-минутных инъекций 75 мМ фосфорной кислоты. Для каждого захваченного антитела FLT3 были выполнены следующие инъекции аналита: буфер, 11 нМ hFLT3, 33 нМ hFLT3, 100 нМ hFLT3 и 300 нМ hFLT3. Буферные циклы собирали для каждого захваченного антитела FLT3 для целей двойного контроля (двойной контроль, как описано в Myszka, DG. Improving biosensor analysis.  12, 279-284 (1999)). Сенсограммы с двойным контролем глобально подходили к простой модели связывания 1:1 Ленгмюра с масс-переносом.
Параметры кинетики и аффинности для тестируемых антител против FLT3 показаны в Таблице 6.
Таблица 6
IgG формат
scFv формат
huFlt3
mFlt3
домен
ka (1/мс)
kd (1/с)
t1/2 (мин)
KD (нМ)
Kd (нМ)
ka (1/мс)
kd (1/с)
t1/2 (мин)
KD (нМ)
P4F6
1
1,40E+05
3,50E-03
3,3
25
36,1
1,32E+05
1,99E-03
5,8
15,1
P4C7
1
1,60E+05
1,20E-03
9,3
7,7
402,4
1,21E+05
1,64E-03
7
13,6
P3A1
2
9,50E+04
6,00E-03
1,9
64
-
1,07E+05
1,67E-03
6,9
15,67
P5A3
3
9,80E+04
1,00E-02
1,2
102
19,3
8,10E+04
1,75E-02
0,7
216
P9B5
3
4,20E+04
4,70E-04
24,4
11
1,5
3,80E+04
6,87E-04
16,8
18,1
P9F1
3
1,80E+05
2,30E-02
0,5
127
-
2,26E+05
2,86E-02
0,4
126,5
P1B4
4
1,80E+05
5,80E-03
2
32
-
1,20E+05
3,27E-03
3,5
27,3
P1B11
4
1,20E+05
5,50E-03
2,1
45
-
8,47E+04
2,57E-03
4,5
30,3
P7H3
4
9,90E+05
1,80E-03
6,6
2
0,9
2,05E+05
1,87E-03
6,2
9,1
P3E10
4
1,80E+05
1,90E-02
0,6
106
-
1,72E+05
1,12E-02
1
65,1
P1A5
4
1,78E+06
3,47E-04
33
0,19
-
2,59E+05
2,92E-04
40
1,1
P4A4
4
1,16E+06
4,69E-04
25
0,4
-
P1G12
4
6,17E+05
2,92E-04
40
0,47
6,5
P4E5
4
1,20E+06
1,51E-04
77
0,13
18,9
P5A4
4
5,53E+05
1,01E-04
114
0,18
-
P5F7
4
6,36E+05
1,52E-04
76
0,24
-
1,89E+05
1,97E-04
59
1
P4H11
4
6,18E+04
1,44E-02
1
233
-
1,60E+05
9,33E-03
1
58,3
P15F7
5
1,40E+05
5,50E-03
2,1
38
-
P12B6
5
1,10E+05
9,00E-03
1,3
84
-
P7D3
5
7,10E+04
5,20E-03
2,2
72
-
P7A6
5
3,40E+04
3,70E-04
31
11
P8B6
5
9,30E+04
2,30E-04
51
2,5
-
P14G2
5
1,40E+05
1,10E-03
10,7
8
-
9,35E+04
3,05E-04
37,9
3,3
P7F9
4
1,10E+05
1,30E-03
8,9
12
13,8
8,70E+04
2,41E-03
4,8
27,7
Пример 2: Опосредованное Т-клетками уничтожение клеточных линий AML с использованием Flt3-CD3 биспецифического IgG, нацеленного на домен 4, in vitro
Этот пример иллюстрирует in vitro цитотоксичность биспецифического антитела против Flt3/CD3 hIgG2ΔA_D265A в Flt3-положительных клетках.
Человеческие антитела против Flt3 (P5F7p, P5F7g2, P5F7g2, P5F7g3, P5F7g4) и человеческие антитела против CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK («H2B4»))) были экспрессированы в виде человеческого IgG2dA_D265A, сконструированного с EEERR на одном плече и REER на другом плече для биспецифического обмена в положениях 223, 225 и 228 (например, (C223E или C223R), (E225E или E225R) и (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E (схема нумерации EU)) в области СН3 человеческого IgG2 (SEQ ID NO: 236). Биспецифическое антитело FLT3/CD3 также имеет мутацию с D на A в положении 265 (схема нумерации EU).
CD3+ Т-клетки из РВМС человека были негативно отселектированы с использованием набора Pan T Cell Isolation для человека (Miltenyi, San Diego CA). Клетки, экспрессирующие мишень (Eol1) и CD3+ Т-клетки, высевали на прозрачные U-образные чашки при 20000 и 100000 клеток/лунку, соответственно. Клетки обрабатывали 8-кратно серийно разведенными биспецифическими антителами. Истощение клеток AML определяли методом проточной цитометрии через 24 часа после обработки. Истощение клеток измеряли по контрасту с клетками, обработанными контролем, в этом случае H2B4 только на Фигуре 1. EC50 рассчитывали с помощью программного обеспечения Prism. Цитотоксичность наблюдалась в этой клеточной линии Eol1, как показано на Фигуре 1.
Пример 3: биспецифическое IgG Flt3-CD3 индуцирует абляцию опухоли на модели ортотопической ксенотрансплантации AML
Этот пример иллюстрирует регрессию и ингибирование опухоли в модели ортотопической ксенотрансплантации Eol1.
In vivo
/
исследование эффективности биспецифических Flt3 проводили с Eol1, экспрессирующими люциферазу и GFP, на ортотопической модели. Триста тысяч клеток Eol1 LucGFP вводили внутривенно через хвостовую вену самкам животных Nod/Scid/IL2Rg-- (NSG) в возрасте 6-8 недель. Внутрибрюшинная инъекция D-люциферина (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 мкл на животное в концентрации 15 мг/мл) с последующей анестезией изофлуораном и последующей биолюминесцентной томографией (BLI) всего тела позволила контролировать опухолевую нагрузку. Биолюминесцентные сигналы, испускаемые при взаимодействии между люциферазой, экспрессируемой опухолевыми клетками, и люциферином регистрировали путем визуализации с использованием IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) и количественно определяли как общий поток (фотонов/сек) с использованием Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Когда общий поток достигал в среднем 15E6 для всех животных, животным вводили посредством болюсного введения в хвостовую вену 20 миллионов размноженных Т-клеток из РВМС. Вкратце, pan-T-клетки, приобретенные у AllCells (Alameda, CA), активировали с помощью набора для активации/наращивания T-клеток человека (Miltenyi, San Diego, CA). Через три дня каждые два дня добавляли 20 нг/мл IL2 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Германия) до дня 11. Клетки собирали, гранулы активации/наращивания удаляли магнитным способом, а клетки промывали и ресуспендировали в PBS. Через 2 дня после инъекции Т-клеток мышей визуализировали, как описано выше, и животных рандомизировали в группы из семи мышей: P1A5 10 мкг/кг, P4A4 10 мкг/кг, P4E5 10 мкг/кг, P5F7 10 мкг/кг, P5F7 30 мкг/кг и Stumpy (CD3 связывание только биспецифического контроля при 30 мкг/кг). Через три дня после Т-клеточного имплантата единичную дозу биспецифического антитела и отрицательного контроля биспецифического антитела (NNC) человеческого анти-Flt3/CD3 (антитела FLT3, как указано выше, в одной группе и антитела CD3 (h2B4-VH-hnps VL-TK) в другой группе) вводили инъекцией в хвостовую вену. Животных умерщвляли, когда у них был паралич задних конечностей, конечная точка для ортотопической модели AML. На Фигуре 2 показано, что однократная доза биспецифического антитела против Flt3/CD3 человека приводила к регрессии опухоли в зависимости от дозы.
Пример 4. Flt3-CD3-биспецифическое антитело IgG, нацеленное на домен 4, является более мощным по сравнению с биспецифическим антителом, нацеленным на домен 5, в модели ортотопической ксенотрансплантации AML
Этот пример иллюстрирует улучшенную опухолевую активность антител, нацеленных на домен 4 Flt3, по сравнению с антителами, нацеленными на домен 5.
Модель ортотопической ксенотрансплантации Eol1 была выполнена, как описано в Примере 3. В этом случае биспецифическое 6B7, нацеленное на домен 4, или биспецифическое P8B6, нацеленное на домен 5, дозировали в одной дозе 10 мкг/кг. Stumpy представляет собой CD3-связывающее только контрольное биспецифичное антитело. В тестируемой дозе P8B6 не обладало противоопухолевой активностью, тогда как 6B7 было деструктивным по отношению к опухоли.
in
Пример 5: Значения EC50 для биспецифического Flt3 значительно снижаются в присутствии IL15 при длительном анализе гибели  vitro.
in vitro
Этот пример иллюстрирует цитотоксичность  биспецифического антитела против Flt3/CD3, P5F7, в Flt3-положительных клетках в комбинации с IL-15.
6
-11
-14
Ранее замороженные Pan-T-лимфоциты человека оттаивали и извлекали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки (Hyclone), 1% Pen Strep (Corning) и 15 единиц на мл IL-2 человека (eBioscience) в течение одного дня. Т-лимфоциты человека, извлеченные в течение 1 дня, собирали и ресуспендировали в концентрации 1×10 клеток/мл в полной среде RPMI. Клетки EOL1, экспрессирующие Flt3, высевали при 50000 клеток в 100 мкл в 96-луночный планшет с U-образным дном. Пятьдесят тысяч (50000) жизнеспособных человеческих CD3+ лимфоцитов добавляли к покрытым опухолевыми клетками лункам в 25 мкл среды на лунку. Были приготовлены 5-точечные 5-кратные серийные разведения биспецифического антитела Flt3/CD3, P5F7 (диапазон доз от 1×10 нМ до 8×10 нМ конечной концентрации). Анализ цитотоксичности инициировали, добавляя разбавленные биспецифические антитела к планшетам и инкубируя при 37°С в течение 2, 5 или 7 дней. Чтобы проверить влияние IL15 на противоопухолевую эффективность Т-клеток, перенаправленных биспецифическим антителом Flt3/CD3, клеточные культуры получали либо 10 нг/мл IL15, либо контроль носителя. Истощение клеток AML определяли анализом люциферазы в соответствующие моменты времени. Значения EC50 затем определяли с помощью нелинейного регрессионного графика процентной специфической цитотоксичности в зависимости от концентрации Log10 биспецифичного Flt3/CD3 P5F7 с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software). Фигуры 4А и 4В иллюстрируют улучшенную противоопухолевую активность биспецифического Flt3/CD3 в отсутствие или в присутствии IL15 в анализе длительного уничтожения, соответственно.
Пример 6: Аутологичные Т-клетки, присутствующие в аспиратах костного мозга от пациентов с AML, эффективны в уничтожении бластов AML в присутствии биспецифического Flt3/CD3, P5F7
Этот пример иллюстрирует, что биспецифическое антитело Flt3/CD3 P5F7 эффективно перенаправляет аутологичные Т-клетки для устранения бластов AML ex vivo.
2
Для определения цитотоксической активности с использованием T-клеток пациента и клеток AML свежие аспираты костного мозга были приобретены в Онкологическом исследовательском центре Фреда Хатчинсона (Сиэтл, штат Вашингтон). Количество клеток-мишеней (AML-бластов) и клеток-эффекторов (T-клеток) определяли путем окрашивания каждого образца PerCP-cy5.5 антитела против человеческого CD3 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), BV 510 антитела против человеческого CD8 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), BUV650 антитела против человеческого CD4 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), PE-Texas Red антитела против человеческого CD33 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), APC антитела против человеческого Flt3 (BD Biosciences, Сан-Хосе, CA). Двести пятьдесят тысяч (250000) клеток костного мозга от каждого пациента высевали на 24-луночные планшеты в 1 мл среды и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO. Биспецифическое антитело P5F7 Flt3/CD3 разводили до 10 нМ в полной среде RPMI и готовили 5-точечные 10-кратные серийные разведения (диапазон доз от 10 нМ до 0,01 нМ). Анализ цитотоксичности инициировали, добавляя разбавленные биспецифичные антитела к планшетам и инкубируя клетки при 37°С в течение 4 дней.
После 4 дней инкубации жизнеспособность клеток пациента с AML, пролиферацию и активацию Т-клеток оценивали путем подсчета количества CD33+CD45dim AML-бластов, количества CD4+CD8+ клеток и процента клеток CD25+CD4+ или CD25+CD8+, соответственно, на приборе проточной цитометрии LSRII с использованием программного обеспечения FACS Diva (BD Biosciences). Результаты демонстрируют эффективное уничтожение первичных клеток AML, вызванное повышением концентрации биспецифического FLT3/CD3 (P5F7) в присутствии аутологичных Т-клеток (см. Фигуры 5А, 5В, 5С, 5D, 5E и 5F).
Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные применения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от идей, изложенных в настоящем описании, и заявленного изобретения ниже. Вышеприведенные примеры предоставлены для лучшей иллюстрации раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, представленных в настоящем описании. Хотя настоящие идеи были описаны в терминах этих примерных вариантов осуществления, специалист в данной области техники легко поймет, что многочисленные вариации и модификации этих примерных вариантов осуществления возможны без чрезмерного экспериментирования. Все такие вариации и модификации находятся в рамках настоящего раскрытия.
Все ссылки, цитируемые в настоящем описании, включая патенты, патентные заявки, документы, учебники и тому подобное, и ссылки, цитируемые в них, в той степени, в которой они еще не включены, настоящим включены в качестве ссылки во всей их полноте. В случае, если одна или более из включенных публикаций и аналогичных материалов отличаются или противоречат этой заявке, включая, но не ограничиваясь определенными терминами, применением терминов, описанными методами и т.п., настоящая заявка имеет преимущество.
Вышеприведенное описание и примеры детализируют определенные конкретные варианты осуществления изобретения и описывают наилучший способ, рассматриваемый авторами изобретения. Однако следует иметь в виду, что независимо от того, насколько подробно вышеизложенное приведено в тексте, изобретение может быть осуществлено многими способами, и изобретение следует истолковывать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  PFIZER INC.
<120>  АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К FLT3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  PC72360A
<150>  US 62/514,574
<151>  2017-06-02
<150>  US 62/660,908
<151>  2018-04-20
<160>  293
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro
85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  2
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Trp Ser Gly Ala Thr Gly Ala Ser Asp Thr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  3
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Ala Ser
20                  25                  30
Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Arg Ser Ser
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  4
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  5
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  6
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Arg Pro Thr Tyr Trp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  7
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  7
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85                  90                  95
Asn Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  8
<211>  125
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Asp His His Asp Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Gly Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  9
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  10
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ala Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Val Met Ala Gly Leu Gly Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  11
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  11
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85                  90                  95
Ser Arg Pro Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  12
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Trp Pro Tyr Met Asp Pro
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  13
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Asn Glu
20                  25                  30
Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  14
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  15
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  16
<211>  122
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Phe
20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Tyr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Asp Leu Gly Ala Pro Trp Ala Gly Tyr Pro Phe Asp Pro Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  17
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  17
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35                  40                  45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Trp
85                  90                  95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105
<210>  18
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Arg Trp Trp Trp Gly Asp Ala Phe Asp His Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  19
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Ser Ser
20                  25                  30
Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  20
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Val Gly Ser Trp Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Ser Ala Phe Gly Glu Leu Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  21
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser
20                  25                  30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  22
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  23
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  24
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  25
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Thr
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  26
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  27
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  28
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Gly Ile Trp Asp Leu Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>  29
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro
85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  30
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Met Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Thr Leu Ile Tyr Pro Ile Pro Phe Glu Leu Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  31
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro
85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  32
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ile Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Asp Gly Tyr Asp Ala
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  33
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  34
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Ser Gly Leu Trp Ala Gly Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>  35
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  35
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val
35                  40                  45
Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser
85                  90                  95
Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  36
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Asp Pro Ala Tyr Gly Gly Met Asp
100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  37
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  37
Ser Tyr Gly Ile Ser
1               5
<210>  38
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  38
Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr
1               5
<210>  39
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  39
Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr Gly Ile Ser
1               5                   10
<210>  40
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  40
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  41
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  41
Ile Pro Ile Phe Gly Thr
1               5
<210>  42
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  42
Asp Ser Trp Ser Gly Ala Thr Gly Ala Ser Asp Thr
1               5                   10
<210>  43
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  43
Ser Tyr Thr Ile Ser
1               5
<210>  44
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  44
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  45
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  45
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Ile Ser
1               5                   10
<210>  46
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  46
Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  47
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  47
Ile Pro Ala Phe Gly Ile
1               5
<210>  48
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  48
Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Asp Tyr Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>  49
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  49
Ser Tyr Asp Ile Ser
1               5
<210>  50
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  50
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Ile Ser
1               5                   10
<210>  51
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  51
Gly Ile Ile Pro Val Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  52
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  52
Ile Pro Val Ser Gly Arg
1               5
<210>  53
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  53
Val Arg Pro Thr Tyr Trp Pro Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>  54
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  54
Ser Tyr Tyr Ile Gly
1               5
<210>  55
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  55
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  56
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  56
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile Gly
1               5                   10
<210>  57
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  57
Gly Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  58
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  58
Ile Pro Trp Phe Gly Thr
1               5
<210>  59
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  59
Asp His His Asp Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Gly Phe Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  60
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  60
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  61
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  61
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe
1               5
<210>  62
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  62
Gly Phe Ile Phe Ala Ser Tyr Ala Met Ser
1               5                   10
<210>  63
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  63
Glu Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  64
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  64
Ser Ser Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>  65
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  65
Asp Arg Val Met Ala Gly Leu Gly Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  66
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  66
Ser Phe Ala Met Ser
1               5
<210>  67
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  67
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe
1               5
<210>  68
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  68
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe Ala Met Ser
1               5                   10
<210>  69
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  69
Asp Ile Ser Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  70
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  70
Ser Gly Ser Gly Ala Ser
1               5
<210>  71
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  71
Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Trp Pro Tyr Met Asp Pro
1               5                   10
<210>  72
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  72
Arg Tyr Ala Leu Ser
1               5
<210>  73
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  73
Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr
1               5
<210>  74
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  74
Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser
1               5                   10
<210>  75
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  75
Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  76
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  76
Ile Pro Met Leu Gly Phe
1               5
<210>  77
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  77
Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr
1               5
<210>  78
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  78
Ser Phe Asp Ile Ser
1               5
<210>  79
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  79
Gly Gly Thr Phe Arg Ser Phe
1               5
<210>  80
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  80
Gly Gly Thr Phe Arg Ser Phe Asp Ile Ser
1               5                   10
<210>  81
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  81
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Tyr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  82
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  82
Ile Pro Ile Leu Gly Tyr
1               5
<210>  83
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  83
Asp Leu Gly Ala Pro Trp Ala Gly Tyr Pro Phe Asp Pro
1               5                   10
<210>  84
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  84
Ser Tyr Ala Met His
1               5
<210>  85
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  85
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  86
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  86
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His
1               5                   10
<210>  87
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  87
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  88
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  88
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>  89
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  89
Gly Thr Arg Trp Trp Trp Gly Asp Ala Phe Asp His
1               5                   10
<210>  90
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  90
Ser Tyr Ala Ile Gln
1               5
<210>  91
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  91
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  92
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  92
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Gln
1               5                   10
<210>  93
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  93
Gly Ile Val Gly Ser Trp Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  94
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  94
Val Gly Ser Trp Gly Leu
1               5
<210>  95
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  95
Ser Ala Phe Gly Glu Leu Ala Ser
1               5
<210>  96
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  96
Arg Tyr Ala Leu Ser
1               5
<210>  97
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  97
Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr
1               5
<210>  98
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  98
Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr Ala Leu Ser
1               5                   10
<210>  99
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  99
Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  100
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  100
Ile Pro Met Leu Gly Phe
1               5
<210>  101
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  101
Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr
1               5
<210>  102
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  102
Ser Tyr Ala Met Asn
1               5
<210>  103
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  103
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  104
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  104
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn
1               5                   10
<210>  105
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  105
Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  106
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  106
Ser Gly Gly Gly Arg Ser
1               5
<210>  107
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  107
Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>  108
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  108
Ser Tyr Ala Met Asn
1               5
<210>  109
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  109
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  110
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  110
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn
1               5                   10
<210>  111
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  111
Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  112
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  112
Ser Gly Gly Gly Arg Ser
1               5
<210>  113
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  113
Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>  114
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  114
Asn Tyr Ala Met Asn
1               5
<210>  115
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  115
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
1               5
<210>  116
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  116
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Asn
1               5                   10
<210>  117
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  117
Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  118
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  118
Ser Gly Ser Gly Gly Thr
1               5
<210>  119
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  119
Gly Ile Trp Asp Leu Arg Tyr
1               5
<210>  120
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  120
Ser Tyr Ala Ile Ser
1               5
<210>  121
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  121
Gly Gly Thr Phe Met Ser Tyr
1               5
<210>  122
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  122
Gly Gly Thr Phe Met Ser Tyr Ala Ile Ser
1               5                   10
<210>  123
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  123
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  124
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  124
Ile Pro Ile Phe Gly Ile
1               5
<210>  125
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  125
Glu Thr Leu Ile Tyr Pro Ile Pro Phe Glu Leu
1               5                   10
<210>  126
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  126
Ser Tyr Ala Val Ser
1               5
<210>  127
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  127
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  128
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  128
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Val Ser
1               5                   10
<210>  129
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  129
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  130
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  130
Ile Pro Ile Phe Gly Ile
1               5
<210>  131
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  131
Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Asp Gly Tyr Asp Ala
1               5                   10
<210>  132
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  132
Asn Tyr Val Met Asn
1               5
<210>  133
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  133
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1               5
<210>  134
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  134
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Val Met Asn
1               5                   10
<210>  135
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  135
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  136
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  136
Ser Gly Ser Gly Ala Thr
1               5
<210>  137
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  137
Gly Leu Trp Ala Gly Gly Ile
1               5
<210>  138
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  138
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  139
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  139
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  140
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1               5                   10
<210>  141
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  141
Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  142
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  142
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>  143
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  143
Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Asp Pro Ala Tyr Gly Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  144
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  144
Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  145
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  145
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  146
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  146
Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro Arg Thr
1               5
<210>  147
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  147
Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Ala Ser Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  148
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  148
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1               5
<210>  149
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  149
Gln Gln Tyr Ala Arg Ser Ser Thr
1               5
<210>  150
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  150
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  151
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  151
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>  152
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  152
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  153
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  153
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  154
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  154
Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser
1               5
<210>  155
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  155
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Thr Val Val
1               5                   10
<210>  156
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  156
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr
1               5                   10
<210>  157
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  157
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>  158
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  158
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val
1               5                   10
<210>  159
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  159
Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr
1               5                   10
<210>  160
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  160
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>  161
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  161
Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu Ser Arg Pro Val
1               5                   10
<210>  162
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  162
Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Asn Glu Gln Leu Ala
1               5                   10
<210>  163
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  163
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  164
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  164
Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Pro Leu Thr
1               5
<210>  165
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  165
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Glu Leu Ala
1               5                   10
<210>  166
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  166
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  167
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  167
Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>  168
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  168
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1               5                   10
<210>  169
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  169
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1               5
<210>  170
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  170
Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Trp Val
1               5                   10
<210>  171
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  171
Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Ser Ser Gln Leu Ala
1               5                   10
<210>  172
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  172
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  173
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  173
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>  174
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  174
Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser Asp Leu Ala
1               5                   10
<210>  175
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  175
Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser
1               5
<210>  176
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  176
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>  177
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  177
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>  178
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  178
Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr
1               5
<210>  179
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  179
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr
1               5
<210>  180
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  180
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Thr Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  181
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  181
Asp Thr Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  182
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  182
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr
1               5
<210>  183
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  183
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  184
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  184
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1               5
<210>  185
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  185
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu Thr
1               5
<210>  186
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  186
Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  187
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  187
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser
1               5
<210>  188
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  188
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Thr
1               5
<210>  189
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  189
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  190
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  190
Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala
1               5
<210>  191
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  191
Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro Tyr Thr
1               5
<210>  192
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  192
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  193
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  193
Asp Ala Ser Asp Leu Gln Arg
1               5
<210>  194
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  194
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  195
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  195
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1               5                   10
<210>  196
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  196
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1               5
<210>  197
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  197
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val
1               5                   10
<210>  198
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  198
Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val
1               5                   10                  15
Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val
20                  25                  30
Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly
35                  40                  45
Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly
50                  55                  60
Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala
65                  70                  75                  80
Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp
85                  90                  95
Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu
100                 105                 110
Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met
115                 120                 125
Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe
130                 135                 140
Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile
145                 150                 155                 160
Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met
165                 170                 175
Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro
180                 185                 190
Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu
195                 200                 205
Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu
210                 215                 220
Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu
225                 230                 235                 240
Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr
245                 250                 255
<210>  199
<211>  135
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  199
Asn Gln Asp Leu Pro Val Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn
1               5                   10                  15
Asn Asp Ser Ser Val Gly Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu
20                  25                  30
Ser Pro Glu Asp Leu Gly Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr
35                  40                  45
Val Tyr Glu Ala Ala Ala Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr
50                  55                  60
Leu Gln Val Leu Val Asp Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val
65                  70                  75                  80
Phe Lys His Ser Ser Leu Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn
85                  90                  95
Arg Gly Val Val Ser Met Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala
100                 105                 110
Gly Glu Tyr Leu Leu Phe Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile
115                 120                 125
Leu Phe Thr Val Ser Ile Arg
130                 135
<210>  200
<211>  82
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  200
Asn Thr Leu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met Glu Asn
1               5                   10                  15
Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro Ile Val
20                  25                  30
Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu Glu Ser
35                  40                  45
Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu Phe Gly
50                  55                  60
Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu Cys Thr
65                  70                  75                  80
Arg Leu
<210>  201
<211>  102
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  201
Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr Leu Pro Gln Leu
1               5                   10                  15
Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys Lys Ala Val His
20                  25                  30
Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ala Leu
35                  40                  45
Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Arg Thr
50                  55                  60
Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val Ala Arg Asn Asp
65                  70                  75                  80
Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro Ser Gln Ser Ala
85                  90                  95
Leu Val Thr Ile Val Glu
100
<210>  202
<211>  88
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  202
Lys Gly Phe Ile Asn Ala Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp
1               5                   10                  15
Gln Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln
20                  25                  30
Ile Arg Cys Thr Trp Thr Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln
35                  40                  45
Lys Gly Leu Asp Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys
50                  55                  60
His Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln
65                  70                  75                  80
Phe Thr Lys Met Phe Thr Leu Asn
85
<210>  203
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  203
Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser Gln Ala
1               5                   10                  15
Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp Lys Lys
20                  25                  30
Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu Gly Val
35                  40                  45
Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val Ser Ser
50                  55                  60
Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val Lys Cys
65                  70                  75                  80
Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu Leu Asn
85                  90                  95
Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn
100                 105
<210>  204
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  204
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser His Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Phe Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Glu Pro
85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  205
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  205
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ile Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Glu Gly Tyr Asp Ala
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  206
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  206
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20                  25                  30
Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu
85                  90                  95
Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  207
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  207
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Met Pro Ala Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Asp Glu Phe Gly Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  208
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  208
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Asp Ser Ser
20                  25                  30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  209
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  209
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Val Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Leu Asp Phe Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  210
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  210
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  211
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  211
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ser Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Gly Glu Gly Trp Thr Pro Pro Phe Gly Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  212
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  212
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  213
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  213
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  214
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  214
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  215
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  215
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  216
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  216
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  217
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  217
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  218
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  218
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Lys Val Ser Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  219
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  219
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  220
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  220
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Asn Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  221
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  221
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  222
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  222
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Ser Val Ser Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  223
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  223
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  224
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  224
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Pro Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  225
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  225
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  226
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  226
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Ser Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  227
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  227
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  228
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  228
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  229
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  229
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  230
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  230
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  231
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  231
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  232
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  232
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  233
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  233
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100                 105                 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  234
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  234
Lys Gln Ser Tyr Asp Leu Phe Thr
1               5
<210>  235
<211>  165
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  235
Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val
1               5                   10                  15
Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val
20                  25                  30
Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly
35                  40                  45
Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly
50                  55                  60
Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala
65                  70                  75                  80
Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp
85                  90                  95
Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu
100                 105                 110
Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met
115                 120                 125
Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe
130                 135                 140
Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile
145                 150                 155                 160
Arg Asn Thr Leu Leu
165
<210>  236
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  236
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
<210>  237
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  237
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245                 250                 255
<210>  238
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  238
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
245                 250                 255
<210>  239
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  239
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Arg Val Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala
130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
<210>  240
<211>  255
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  240
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag       60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      180
ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc      240
tacacctgca acgta                                                       255
<210>  241
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  241
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala
130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
<210>  242
<211>  255
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  242
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag       60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      180
ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc      240
tacacctgca acgta                                                       255
<210>  243
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  243
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  244
<211>  255
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  244
ggaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct       60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag      120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac      180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag      240
aaacacaaag tctac                                                       255
<210>  245
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  245
Glu Gly Ile Gly Gly Asp Leu Arg Tyr Glu Gly Tyr Asp Ala
1               5                   10
<210>  246
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  246
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Ile Thr
1               5                   10
<210>  247
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  247
Ser Tyr Tyr Ile Thr
1               5
<210>  248
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  248
Arg Ile Met Pro Ala Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  249
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  249
Met Pro Ala Phe Gly Trp
1               5
<210>  250
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  250
Asp Glu Phe Gly Ala Phe Asp Val
1               5
<210>  251
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  251
Gly Gly Ile Ile Pro Met Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
1               5                   10                  15
Gln Gly
<210>  252
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  252
Ile Pro Ser Phe Gly Ala
1               5
<210>  253
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  253
Arg Ile Ile Pro Ser Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  254
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  254
Asp Asp Gly Glu Gly Trp Thr Pro Pro Phe Gly Tyr
1               5                   10
<210>  255
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  255
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  256
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  256
Gln Gln Tyr Gly Ser Glu Pro Tyr Thr
1               5
<210>  257
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  257
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Gln Leu Ala
1               5                   10
<210>  258
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  258
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Leu Ile Thr
1               5                   10
<210>  259
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  259
Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr
1               5
<210>  260
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  260
Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr
1               5
<210>  261
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  261
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Asp Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  262
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  262
Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Ile Thr
1               5
<210>  263
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  263
Arg Ala Ser Gln Lys Val Ser Asp Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  264
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  264
Gln Gln Tyr Thr Gly Ser Pro Ile Thr
1               5
<210>  265
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  265
Arg Ala Ser Leu Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  266
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  266
Asp Ala Tyr Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  267
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  267
Gln Gln Tyr Ser Ser Asn Pro Ile Thr
1               5
<210>  268
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  268
Arg Ala Ser Gly Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  269
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  269
Gln Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Ile Thr
1               5
<210>  270
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  270
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  271
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  271
Asp Ala Phe Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  272
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  272
Gln Gln Tyr Gly Thr Pro Pro Ile Thr
1               5
<210>  273
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  273
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  274
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  274
Gln Gln Tyr Ser Ala Ser Pro Ile Thr
1               5
<210>  275
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  275
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Leu Ala
1               5                   10
<210>  276
<211>  135
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  276
Asn Gln Asp Leu Pro Val Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn
1               5                   10                  15
Asn Asp Ser Ser Val Gly Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu
20                  25                  30
Ser Pro Glu Asp Leu Gly Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr
35                  40                  45
Val Tyr Glu Ala Ala Ala Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr
50                  55                  60
Leu Gln Val Leu Val Asp Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val
65                  70                  75                  80
Phe Lys His Ser Ser Leu Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn
85                  90                  95
Arg Gly Val Val Ser Met Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala
100                 105                 110
Gly Glu Tyr Leu Leu Phe Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile
115                 120                 125
Leu Phe Thr Val Ser Ile Arg
130                 135
<210>  277
<211>  82
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  277
Asn Thr Leu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met Glu Asn
1               5                   10                  15
Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro Ile Val
20                  25                  30
Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu Glu Ser
35                  40                  45
Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu Phe Gly
50                  55                  60
Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu Cys Thr
65                  70                  75                  80
Arg Leu
<210>  278
<211>  102
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  278
Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr Leu Pro Gln Leu
1               5                   10                  15
Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys Lys Ala Val His
20                  25                  30
Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ala Leu
35                  40                  45
Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Arg Thr
50                  55                  60
Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val Ala Arg Asn Asp
65                  70                  75                  80
Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro Ser Gln Ser Ala
85                  90                  95
Leu Val Thr Ile Val Glu
100
<210>  279
<211>  88
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  279
Lys Gly Phe Ile Asn Ala Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp
1               5                   10                  15
Gln Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln
20                  25                  30
Ile Arg Cys Thr Trp Thr Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln
35                  40                  45
Lys Gly Leu Asp Asn Gly Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys
50                  55                  60
His Gln Pro Gly Glu Tyr Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln
65                  70                  75                  80
Phe Thr Lys Met Phe Thr Leu Asn
85
<210>  280
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  280
Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser Gln Ala
1               5                   10                  15
Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp Lys Lys
20                  25                  30
Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu Gly Val
35                  40                  45
Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val Ser Ser
50                  55                  60
Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val Lys Cys
65                  70                  75                  80
Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu Leu Asn
85                  90                  95
Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn
100                 105
<210>  281
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  281
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val
20                  25                  30
Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  282
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  282
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  283
<211>  255
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  283
gacattgtga tgactcaatc ccccgactcc ctggctgtgt ccctcggcga acgcgcaact       60
atcaactgta aaagcagcca gtccctgttc aacgtccggt cgaggaagaa ctacctggcc      120
tggtatcagc agaaacctgg gcagccgccg aagcttctga tctcatgggc ctcaactcgg      180
gaaagcggag tgccagatag attctccgga tctggctccg gaaccgactt caccctgacg      240
atttcgagct tgcaa                                                       255
<210>  284
<211>  255
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  284
gaagtccaac ttgtcgaatc gggaggaggc cttgtgcaac ccggtggatc cctgaggctg       60
tcatgcgcgg cctcgggctt caccttttcc gattactaca tgacctgggt cagacaggcc      120
cctggaaagg ggttggaatg ggtggcattc atccggaata gagcccgcgg atacacttcc      180
gaccacaacc ccagcgtgaa ggggcggttc accattagcc gcgacaacgc caagaactcc      240
ctctacctcc aaatg                                                       255
<210>  285
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  285
Ser Asp Tyr Tyr Met Thr
1               5
<210>  286
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  286
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
1               5
<210>  287
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  287
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr
1               5                   10
<210>  288
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  288
Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr
1               5
<210>  289
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  289
Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210>  290
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  290
Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>  291
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  291
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>  292
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  292
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>  293
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  293
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1               5                   10                  15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20                  25                  30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35                  40                  45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50                  55                  60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65                  70                  75                  80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85                  90                  95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100                 105                 110
Thr Ser
<---