СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АРАБИНОГАЛАКТАНОВ
METHOD FOR PRODUCTION OF MODIFIED ARABINOGALACTAN

Изобретение относится к области химии, в частности к способу получения новых веществ - производных арабиногалактана, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии.
Арабиногалактаны - класс полисахаридов, строительный материал клеточной стенки многих деревьев и растений [Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Остроухова Л.А. // Химия растительного сырья. 2003. № 1. С.27-37]. Лиственница западная (Larix occidentalis) и сибирская {Larix sibirica) являются коммерчески значимыми источниками арабиногалактана, который применяется в качестве эмульсификатора или стабилизатора при изготовлении некоторых пищевых продуктов. Высокомолекулярный арабиногалактан рекомендуется для применения в качестве иммуностимулирующего средства, активизирующего макрофаги [Заявка WO 2006082707], а в комплексе с солями железа - при железодефицитных анемиях [Пат. RU 2208440].
4
6
Молекулы арабиногалактана состоят из основной цепи (1→3) - связанных остатков D-галактозы с состоящими из L-арабинозы и D-галактозы (1→6) - ответвлениями практически при каждом остатке D-галактозы в основной цепи [Методы химии углеводов. Под редакцией Кочеткова Н.К. Москва: 1967. 317 С.]. В лиственничных арабиногалактанах соотношение галактоза:арабиноза составляет от 5:1 до 10:1. Подобно многим полисахаридам молекулярная масса арабиногалактанов варьирует от 10 до 2·10 Да.
3
Не так давно установлено, что входящие в состав арабиногалактана L-арабиноза и D-галактоза, в отличие, например, от таких моносахаридов, как глюкоза или манноза, проявляют аффинность к асиалогликопротеиновым рецепторам клеток печени, особенно важную роль при этом выполняет 4-ОН-группа галактозы [Groman E.V., Enriquez P.M., Jung С, Josephson L. // Bioconjug. Chem. 1994. V.5 (6). P.547-556]. Это свойство стимулировало работы по синтезу и изучению свойств модифицированных арабиногалактанов в качестве систем доставки лекарственных средств к клеткам печени. Например, в присутствии NaBHCN с поли-L-лизином был получен графт-сополимер арабиногалактана реакцией восстановительного аминирования между остатком восстанавливающего сахара в конце цепи арабиногалактана и ε-аминогруппой поли-L-лизина. Дендритоподобный сополимер в качестве системы доставки ДНК к клеткам печени показал высокую специфичность к асиалогликопротеиновым рецепторам, что перспективно для применения сополимера в генной терапии [Park J.U., Ishihara Т., Kano A., Akaike Т., Maruyama А. // Prep. Biochem. Biotechnol. 1999. V.29 (4). P.353-370].
Другие графт-сополимеры арабиногалактана получают привитой сополимеризацией с акриламидом и с последующей обработкой диметиламином и формальдегидом по реакции Манниха. Такие сополимеры применяют для улучшения обезвоживания и повышения прочности бумаги [Авт. св. № 633965].
2
Известны эфиры арабиногалактанов с коричной кислотой или ее производными, содержащими алкильные, аллильные, CN, Hal или NH-группы; во многих случаях были модифицированы не менее 50% гидроксигрупп арабиногалактана [Заявка JP 60219202]. По гидроксильным группам арабиногалактанов получены конъюгаты с тиофенкарбоновыми кислотами (они могут быть полезны в качестве носителей, адсорбентов или смол [Заявка JP 60219201]) и некоторыми жирными кислотами (пальмитиновой, стеариновой и деканоевой) [Заявка US 2001036933]. Водорастворимые биосовместимые арабиногалактаны с липофильными заместителями могут применяться в качестве адьювантов, ингибиторов клеточной адгезии, инфекции или воспаления.
Ряд производных арабиногалактана, проявляющих аффинность к асиалогликопротеиновым рецепторам, синтезирован с целью получения соединений с противовирусными, противовоспалительными, радиопротекторными свойствами [Пат. WO 9325239]. Арабиногалактан сначала был модифицирован гидразином или этилендиамином или конъюгирован с поли-L-лизином. По полученным свободным аминогруппам при помощи 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) были присоединены антивирусные агенты аденозин-5'-монофосфат и аденин арабинозид-5'-монофосфат, а также противовоспалительный агент пепстатин. Фосфатные группы в фосфорилированном арабиногалактане были этерифицированы в присутствии КДИ S-2-(3-аминопропиламино)этилтиофосфорной кислотой, обладающей радиопротекторными свойствами [Пат. WO 9325239].
В природе встречаются кислые формы арабиногалактанов, содержащие в своем составе небольшой процент уроновых кислот. Арабиногалактаны с карбоксифункцией получают и синтетическим путем - этерификацией гидроксигрупп янтарным или глутаровым ангидридом или обработкой арабиногалактана диангидридом диэтилентриаминопентауксусной (DTPA) кислоты. Содержание карбоксигрупп в гемисукцинате арабиногалактана составило 1.96 милли-экв/г продукта, в эфире арабиногалактана с DTPA - 0.117 милли-экв/г. Карбоксиметил- и карбоксиэтиларабиногалактаны, полученные по реакции с бромуксусной и 2-бромпропионовой кислотами, содержали 5.2 и 1.3 милли-экв карбоксигрупп на грамм конечного продукта [Пат. WO 9325239].
Другим способом введения карбоксигрупп в молекулу арабиногалактана является окисление его первичной спиртовой группы. При окислении пероксидом водорода в водной среде при повышенной температуре (90°С) с барботированием через реакционную смесь воздуха продукты окисления содержали до 10-12% уроновых кислот [Борисов И.М., Широкова Е.Н., Мударисова Р.Х. и др. // Известия АН. Серия хим. 2004. № 2. С.305-311]. Происходит также деструкция макромолекул, сопровождающаяся окислением аномерного центра до карбоксильной группы.
2
Селективным способом окисления первичной гидроксигруппы в полисахаридах (гиалуроновой кислоте, целлюлозе, хитине) является окисление системой 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-оксил радикал (ТЕМПО)-NaBr-NaClO-HO (рН 10.2) [Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo М. // Carbohydr. Res. 2000. V.327. P.455-461; Isogai A., Kato Y. // Cellulose. 1998. V.5. P.153-164]. Однако для окисления арабиногалактана этот метод не применялся.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения конъюгатов альгиновой кислоты с содержащими аминогруппу соединениями, в присутствии КДИ при комнатной температуре в водной среде (рН 4.7-4.8) [Пат. РФ № 2283848]. По этому способу получают конъюгаты с конверсией карбоксигрупп в амидные до 100%.
Задачей предлагаемого изобретения является получение модифицированных арабиногалактанов.
2
2
2
2
2
Это достигается следующим образом. Первичные гидроксигруппы арабиногалактана из лиственницы селективно окисляют до карбоксильных в системе 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-оксил радикал (ТЕМПО)-NaBr-NaClO-HO (рН 10.2). Таким образом получают арабиногалактан, содержащий карбоксильные группы (АГ-СООН), которые затем в присутствии конденсирующего реагента КДИ вовлекают в реакцию с соединениями, содержащими первичную аминогруппу (RNH). Реакцию проводят в водной среде (рН 4.7-4.8) при комнатной температуре в течение 20-30 мин при соотношении реагентов АГ-COOH:RNH:КДИ = 1:2:1.5 или АГ-COOH:RNH:КДИ = 1:5:1.5, если в качестве RNH используются α-аминокислоты и их производные. В качестве аминосодержащих соединений используют фармакозначимые n- (1) и о-аминофенолы (2), n-аминобензойную (3) антраниловую (4), 4- (5) и 5-аминосалициловые (6) кислоты, этиловый эфир n-аминобензойной кислоты (анестезин) (7), β-диэтиламиноэтиловый эфир n-аминобензойной кислоты (новокаин) (8), гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид) (9), 2-аминоэтансульфоновую кислоту (таурин) (10), 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон-5 (4-аминоантипирин) (11), а также сульфаниламидные препараты, содержащие свободную аминогруппу, такие как n-аминобензолсульфамид (стрептоцид) (12), n-аминобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий) (13). Могут быть использованы и другие амины: α-аминокислоты (глицин (14), лизин (15) и др.) или их эфиры, различные диамины (гидразин, этилендиамин, гексаметилендиамин) и дигидразиды, например дигидразид адипиновой кислоты.
Следует отметить, что по способу, предлагаемому в работе Jiang В. et al., гиалуроновая кислота была окислена по первичным гидроксигруппам не больше чем на ~80%. Арабиногалактан был окислен по первичным гидроксигруппам на 100%, что составляет 5.1 милли-экв карбоксигрупп на 1 г продукта АГ-СООН (в виде натриевой соли). Другими способами, приведенными в описании уровня техники, такой результат не получен. Высокое содержание уроновых кислот в структуре модифицированного арабиногалактана позволяет увеличить фармакологическую нагрузку на макромолекулу, что достигается эффективной карбодиимидной конъюгацией карбоксигрупп с аминами.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
2
2
-1
13
13
а) Арабиногалактан (АГ) окисляют по методике, приведенной в работе [Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo M. Study on TEMPO-mediated selective oxidation of hyaluronan and the effects of salt on the reaction kinetics // Carbohydr. Res. 2000. V.327. P.455-461]. Условия реакции окисления АГ: рН 10.2, 0°С, ТЕМПО=0.027 ммоль, NaBr=0.5 ммоль, АГ=2.5 ммоль в 200 мл воды, и 4 мл 13%-ного водного раствора гипохлорита натрия (NaClO), время реакции - 1 час. Окисленный продукт из водного раствора выделяют осаждением в метанол. Осадок отделяют центрифугированием, промывают метанолом, диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении и температуре не выше 60°С. Получают водорастворимый порошок желтоватого цвета. Селективность окисления СНОН-групп до карбоксильных подтверждается данными ИК-(по появлению интенсивного пика при 1600 см для карбоксилат-аниона) и С ЯМР-спектроскопии. В С ЯМР-спектре окисленного арабиногалактана (АГ-СООН) в области 176-178 м.д. наблюдается появление группы сигналов, отвечающих атомам углерода карбоксильных групп окисленных остатков арабинозы и галактозы (арабинуроновой и галактуроновой кислот соответственно). При этом сигналы атомов углерода СНОН-групп в области 62-63 м.д. отсутствуют, что также свидетельствует о полной трансформации первичных гидроксигрупп арабиногалактана в карбоксильные (рис.1).
2
2
б) К смеси 60 мг (~0.3 ммоль) АГ-СООН и 66.5 мг (0.6 ммоль) n-аминофенола (1) в 10 мл НО добавляют 0.1 н. NaOH (или, если требуется, 0.1 н. HCl) до рН 4.7-4.8, затем при интенсивном перемешивании и температуре 20-22°С вносят 86.3 мг (0.45 ммоль) карбодиимида (соотношение реагентов Ar-COOH:RNH:КДИ=1:2:1.5), поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 н. НС1. Через 0.5 ч к охлажденной до 0°С реакционной смеси последовательно добавляют 0.1 н. NaOH (до рН 7-8), 2-3 мл насыщенного раствора NaCl и 30 мл охлажденного метанола. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 6% NaCl, добавляют 30 мл метанола. Вновь выпавший осадок центрифугируют, промывают метанолом (10×3 мл), затем эфиром (10×3 мл) и сушат при температуре ≤60°С и пониженном давлении. Получают ~60 мг конъюгата в виде белого порошка. Конверсия карбоксигрупп в амидные в конъюгате с n-аминофенолом ~100%.
1
Конверсию карбоксильных групп АГ-СООН в амидные определяют по данным Н-ЯМР-спектроскопии, используя интегральные интенсивности характеристических сигналов протонов остатков соответствующих аминов по отношению к внутреннему стандарту - интенсивности сигналов всех протонов исследуемого образца в области 3.25-4.50 м.д.
1
1
2
Спектры Н-ЯМР регистрировали для растворов в DO на спектрометре Bruker АМХ-300 (рабочая частота для Н-ЯМР-300.13 МГц), в качестве внутреннего стандарта использовали натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. УФ-спектры получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».
Примеры 2-13. Окисление арабиногалактана и реакцию полученного АГ-СООН с соответствующим амином (2-13) и очистку продуктов проводят аналогично примеру 1. Конверсия карбоксигрупп в амидные окисленного арабиногалактана достигает 90-95%.
2
Примеры 14, 15. Окисление арабиногалактана и реакцию АГ-СООН с глицином (14), D,L-лизином (15) проводят аналогично примеру 1, но при соотношении реагентов АГ-СООН:RNH:КДИ=1:5:1.5; при данном соотношении конверсия карбоксигрупп в амидные окисленного арабиногалактана достигает 90-95%. Очистку целевых конъюгатов проводят аналогично примеру 1.
Некоторые спектральные характеристики конъюгатов (в сравнении с аминами) приведены в таблице.