ПЕРОРАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБЫ ИММУНОТЕРАПИИ
ORAL COMPOSITION AND METHODS OF IMMUNOTHERAPY

Перекрестная ссылка на родственную заявку
По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/997902, поданной 13 июня 2014 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области онкологии и иммунологии и в широком смысле относится к пероральной композиции и способам иммунотерапии злокачественных и аутоиммунных заболеваний.
Уровень техники
В 2012 г. во всем мире произошло около 14,1 миллионов новых случаев заболевания раком, около 8,2 миллионов случаев смерти от рака, число больных раком составило 32,6 миллиона человек. Рак поражает практически все органы человеческого организма. Вопреки общепринятому мнению, генетически наследуется менее пяти процентов рака. Напротив, обнаружена связь между воспалением и раком (см., например, обзорную статью Lu Н, Ouyang W, Huang С. Inflammation, a key event in cancer development. Mol Cancer Res 2006, 4: 221-33). Например, известно, что рак печени, в большинстве случаев представляющий собой определенный вид, называемый гепатоклеточной карциномой (ГКК), также является воспалительным заболеванием (Bishayee A. The inflammation and liver cancer. Adv Exp Med Biol 2014, 816: 401-35, реферат которого включен в настоящее описание посредством ссылки). ГКК находится на пятом месте среди самых распространенных видов рака во всем мире, и на третьем месте по уровню смертности. Каждый год диагностируется около одного миллиона новых случаев и почти такое же количество смертей, что указывает на неудовлетворенную потребность в лучшем лечении. Традиционные способы воздействия, такие как хирургическое вмешательство, радиотерапия и химиотерапия, обладают сильным токсическим воздействием и в целом являются не очень эффективными. В последнее время внимание переключилось на биологические способы лечения, т.е., иммунотерапию.
Иммунотерапия рака основывается на использовании иммунной системы хозяина для предупреждения или устранения рака. Существует три основные группы иммунотерапии: терапии с использованием клеток, терапии антителами и терапии цитокинами. Все они основаны на том, что раковые клетки часто имеют слегка отличающиеся молекулы на своей поверхности, которые могут быть обнаружены иммунной системой. Эти молекулы, известные как раковые или опухолевые антигены, как правило являются белками, но также включают и другие молекулы, такие как углеводы. Согласно общепринятому мнению, иммунотерапия провоцирует иммунную систему атаковать опухолевые клетки путем использования этих опухолевых антигенов в качестве мишеней.
Терапии с использованием клеток, более широко известные как раковые вакцины, обычно включают отбор иммунных клеток у больного раком, например, из крови. Иммунные клетки, специфические к опухоли, активируют, выращивают in vitro и вводят обратно больному раком, при этом иммунные клетки обеспечивают иммунный ответ против рака. Видами клеток, которые могут применяться, являются естественные киллеры, клетки-киллеры, активируемые лимфокинами, цитотоксические Т-клетки и дендритные клетки. Первой клинически одобренной терапией с использованием клеток является вакцина компании Dendreon, Provenge (Sipuleucel), которую применяют для лечения рака предстательной железы.
В настоящее время терапия антителами является самым широко распространенным видом иммунотерапии, для которого одобрено большое количество способов лечения для широкого диапазона видов рака. Антитела представляют собой белки, продуцируемые иммунной системой, которые связываются с антигеном-мишенью на поверхности опухолевой клетки. В условиях нормальной физиологии они используются иммунной системой для борьбы с патогенами. Каждое антитело является специфическим к одному или нескольким белкам, и те из них, которые связываются с раковыми антигенами, используются при лечении рака. Наиболее интенсивно исследуются вмешательства с использованием антител к CD47, GD2 ганглиозидного углеводного антигена, иммунной контрольной точки, белка программируемой смерти клеток-1 (PD-1; также известного как CD279) и его лиганда, PD-1 лиганда 1 (PD-L1), и рецептора EGF. В настоящее время существует ряд антител, одобренных для лечения рака, например, алемтузумаб, бевацизумаб, брентуксимаб, цетуксимаб, гемтузумаб, ибритумомаб, ипилимумаб, офатумумаб, панитумумаб, ритуксимаб, тозитумомаб и трастузумаб.
Интерферон-α и интерлейкин-2 (IL-2) представляют собой примеры цитокинов - белков, регулирующих и координирующих поведение иммунной системы. Они обладают способностью усиливать противоопухолевую активность иммунной системы, и поэтому могут использоваться при лечении рака. Интерферон-α используют при лечении волосатоклеточного лейкоза, саркомы Капоши, связанной со СПИДом, фолликулярной лимфомы, хронического миелоидного лейкоза и злокачественной меланомы. IL-2 используют при лечении злокачественной меланомы и почечно-клеточной карциномы.
Кроме того, некоторые соединения, главным образом полисахаридные соединения, могут активировать иммунную систему и обладать противораковыми свойствами. Например, бета-глюканы, такие как лентинан, и другие полисахариды, получаемые из съедобных грибов, были исследованы для определения их противоракового потенциала (например, патент США №7011845). Эти соединения обычно вводятся перорально, тогда как другие виды иммунотерапии осуществляются при помощи инъекций.
Все большее количество исследований в настоящее время посвящается разработке различных видов иммунотерапии рака. Было предложено несколько подходов к лечению, включая пицибанил (OK-432) - смесь антигенов стрептококков (патент США №5559211); белки теплового шока, например, HSP70 (патенты США №8729111 и 6139841); онколитические вирусы (патент США №8450106); ДНК-вакцины и генная терапия (патенты США №8216595 и 5631236); различные варианты так называемого адоптивного переноса клеток, включая дендритные клетки (публикации заявок на патенты США № US 2011/0076290 и US 2005/0260227), клетки-киллеры, активируемые лимфокинами (патент США №8691568), цитокин- или хемокин-индуцированные клетки-киллеры (патенты США №6716425 и 6562347), естественные киллеры или NK-клетки (патент США №8450112); собственные опухолевые клетки, отдельно или в комбинации с дополнительными стимуляторами (патент США №6207147); опухолевые антигены, отдельно или в комбинации с аллогенным антигеном (патент США №7438922); опухолевые лизаты в различных формах (патент США №4108983); цитокины, один или несколько; например, IL-2 и GM-CSF (патент США №5478556); иммуноадъюванты различного происхождения (патент США №8216595); моноклональные антитела (патент США №8680247) и различные их смеси (патенты США №5126132 и 7919079). Содержание вышеприведенных патентов включено в настоящее описание посредством ссылки. Экспертами в этой области предложено большое число видов иммунотерапии рака. При исследовании этих видов иммунотерапии в ходе клинических испытаний случаи полной ремиссии рака (т.е., выздоровления) происходили редко; большинство из них оказывали умеренный эффект на выживание, как правило, величиной лишь в несколько месяцев. Таким образом, несмотря на немалые усилия в этой области и огромные достижения в понимании иммунологии рака, очевидно, что необходимо разрабатывать более эффективные виды иммунотерапии.
Краткое описание изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предложена пероральная композиция, содержащая металл, связанный с по меньшей мере одним опухолевым антигеном и по меньшей мере одним аллоантигеном, или их фрагментами.
В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один опухолевый антиген и по меньшей мере один аллоантиген гидролизован.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один опухолевый антиген и по меньшей мере один аллоантиген денатурирован нагреванием.
В одном из вариантов осуществления металл представляет собой магний. В другом варианте осуществления металл представляет собой кальций.
Опухолевый антиген может представлять собой белок, пептид, гаптен, полисахарид, гликопротеин, липополисахарид или молекулу ДНК.
В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген выбран из группы, состоящей из AFP, СЕА, CD31, CD34, CD99, CD117, GCDFP-15, EMA, ETA, MPG, р97, Neu, c-myc, raf, ras, MAGE, BAGE, DAGE/Prame, GAGE, RAGE, SMAGE, NAG, CQA 72/4, ламинина P1, Yale Col. Sr. Factor, UGP, hCG, PD1 (CD279), PTPRC (CD45), HMB-45, MART-1/мелана-A, Myo D1, MSA, M2-PK, PLAP, PSA, gp100, MUC-1, MUC-2, MUC16, TRP-1, MUM-1, CDK-4, TAG-72, CA-15-3, CA-19-9, CA-27-29, CA-72-4, CA-125, Cyfra 21-1, CYP24, NSE, AMFr, M-344, 19a211, erb-2, p15, p21, p53, пептида с точечным разрывом Bcr/Abl, WT1, HER-2/neu, PD-41, TCSF, GA733-2, HPV16 E7, E6, MZ2-E, B7.1, B7.2, HOM-MEL-40, HOM-MEL-55, NY-COL-2, HOM-HD-397, HOM-RCC-1.14, HOM-HD-21, HOM-NSCLC-11, HOM-MEL-2.4, HOM-TES-11, GRP78, EGFR, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, NY-ESO-1, 4-5, PSMA, PSCA, EpCam, POA, GnT-V, TERT, кальцитонина, калретинина, хромогранина, цитокератина, десмина, ингибина, кератина, рековерина, калликреина, бета-катенина, аннексина, маммаглобина, тирозиназы и их смесей.
В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой антиген, полученный из раковой клетки, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака надпочечника, рака анального канала, рака желчевыводящих протоков, рака мочевого пузыря, рака кости, опухолей мозга/ЦНС, рака молочной железы, болезни Кастлемена, рака шейки матки, рака толстой/прямой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, опухоли Юинга, рака глаза, рака желчного пузыря, рака желудка, желудочно-кишечной карциномы, желудочно-кишечной стромальной опухоли, гестационной трофобластической болезни, болезни Ходжкина, саркомы Капоши, рака гортани и гипофарингеального рака, лейкозов, например, ОЛЛ, ОМЛ, ХЛЛ, ХМЛ и ХММЛ, лимфомы, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака легкого, злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, рака носовой полости и околоносовых пазух, рака носоглотки, нейробластомы, рака полости рта и ротоглотки, остеосаркомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака полового члена, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, рака почки, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака слюнных желез, саркомы, базально-клеточной и сквамозно-клеточной карциномы, меланомы, рака из клеток Меркеля, рака тонкой кишки, рака желудка, тестикулярного рака, рака тимуса, рака щитовидной железы, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрема и опухоли Вильмса.
В одном из вариантов осуществления опухолевый антиген представляет собой AFP.
В одном из вариантов осуществления аллоантиген представляет собой альбумин.
В некоторых вариантах осуществления массовое соотношение между опухолевым антигеном и аллоантигеном составляет от 1:1 до 1:1000000 или от 1:50 до 1:200.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая металл, связанный с по меньшей мере одним денатурированным нагреванием гидролизованным аллоантигеном и с по меньшей мере одним денатурированным нагреванием гидролизованным опухолевым антигеном, где указанная композиция находится в составе пилюли. Металл может представлять собой магний или кальций, или любой другой подходящий металл, способный образовывать металлоорганическую связь. Гидролизованный и денатурированный опухолевый антиген и гидролизованный и денатурированный аллоантиген может представлять собой пептид, такой как олигопептид, или полипептид.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий пероральное введение субъекту терапевтически эффективной дозы композиции, раскрытой в настоящем описании.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ индуцирования противовоспалительной иммунной реакции у субъекта. Способ включает пероральное введение терапевтически эффективной дозы композиции субъекту, где композиция содержит опухолевый антиген и аллоантиген, связанные с металлом. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген и аллоантиген гидролизованы. В других вариантах осуществления опухолевый антиген и аллоантиген денатурированы нагреванием.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения композиции, включающий: получение смеси опухолевого антигена и аллоантигена; денатурацию опухолевого антигена и аллоантигена; и образование по меньшей мере одного из связанного с металлом денатурированного опухолевого антигена и связанного с металлом денатурированного аллоантигена. Способ может дополнительно включать гидролиз по меньшей мере одного из опухолевого антигена и аллоантигена.
В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген получают из смешанной крови доноров, у которых были диагностированы требуемые виды рака. В других вариантах осуществления опухолевый антиген получают из линий раковых клеток или раковых тканей.
В некоторых вариантах осуществления аллоантиген получают из незлокачественных клеток, полученных из периферической крови или линий клеток.
В некоторых вариантах осуществления стадия денатурации включает нагревание.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показаны сканы компьютерной томографии (КТ) пациента с гепатоклеточной карциномой до и после иммунотерапевтического лечения с применением композиции по настоящему изобретению. На изображении (а) показана одна большая опухоль в правой доли печени перед тем, как опухоль была хирургически удалена; на изображении (б) по истечении четырех месяцев множественные злокачественные образования рецидивировали в левой доле; уровни AFP в этот период составляли 92,407 МЕ/мл; на изображении (в) все образования были устранены по истечении 8 месяцев принятия ежедневной разовой дозы композиции; уровни AFP в этот момент времени снизились до уровня ниже нормального порогового значения, 2,3 МЕ/мл. Сейчас пациент здоров и через 2 года после лечения чувствует себя очень хорошо.
-6
На Фиг. 2 показано воздействие инкубации Т-лимфоцитов in vitro в течение 48 часов с вакцинной композицией по настоящему изобретению (разбавленной в 10 раз) на экспрессию IFN-γ, TNF-α; IL-2 и маркеры клеточной пролиферации/активации, т.е., Ki-67 и CD69, как показано в нижнем ряду. Верхний ряд представляет собой контрольные нестимулированные Т-клетки, анализированные в это же время с помощью проточной цитометрии. Данные показывают, что экспрессия IFN-γ повысилась с 1,65% до 9,11%; уровень TNF-α понизился с 5,05% до 0,38%; IL-2 - с 1,65% до 1,45%; Ki-67 - с 10,7% до 44,3%; CD69 - с 10,5% до 16,1%.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложена вакцинная композиция (также называемая в настоящем описании вакциной, терапевтической вакциной или иммунотерапевтической композицией) и способы ее получения и применения для лечения и/или предупреждения рака и некоторых воспалительных заболеваний.
Для осуществления настоящего изобретения не требуется понимания механизма, и настоящее изобретение не ограничено каким-либо определенным механизмом действия. Тем не менее, опыт клинического применения настоящей композиции на нескольких видах рака и воспалительных заболеваний указывает на то, что настоящее изобретение противоречит некоторым убеждениям, в настоящее время преобладающим в данной области.
Во-первых, настоящее изобретение противоречит общепринятому убеждению в том, что важно сохранять антигенные эпитопы в их нативной форме с тем, чтобы они могли должным образом распознаваться иммунной системой субъекта. Термин "эпитоп" обозначает антиген или его фрагмент в качестве иммунногенной детерминанты, способной специфически связываться с антителом или Т-клеточным рецептором. Эпитоп обычно состоит из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладает определенными характеристиками трехмерной структуры, а также определенными характеристиками заряда. Настоящая композиция включает денатурированные и гидролизованные антигены, которые необратимо утратили свою нативную конфигурацию, но, тем не менее, неожиданно являются высокоэффективными при иммунотерапии рака и аутоиммунных заболеваний.
Термин "иммунная толерантность" означает не иммунную супрессию или анергию, а относится к активному иммунному процессу противовоспалительной природы, который является таким же действенным, как и классическая иммунная активация. Согласно общепринятому в настоящий момент убеждению, причиной возникновения рака является "иммунная толерантность" хозяина и обусловленной этим неспособности иммунной системы бороться с раком (патент США №5723718).
В-третьих, в настоящем изобретении не требуется иммуноадъювант или иммуностимулянт для усиления иммунной реакции хозяина.
В-четвертых, в настоящем изобретении для улучшения эффективности композиции совместно с опухолевыми антигенами используются аллогенные антигены (аллоантигены).
В-пятых, клетки кишечника, выстилающие эпителиальную поверхность кишечного тракта, где абсорбируется антиген, значительно более эффективно служат в роли антигенпрезентирующих клеток, нежели дендритные клетки, которые считаются определяющими для многих раковых вакцин, предложенных другими исследователями. Однако до настоящего момента вакцины с дендритными клетками не были успешны при лечении, и клинические ответы обычно наблюдались не более чем в 15% случаев.
В-шестых, было обнаружено, что настоящая композиция, полученная из крови пациентов с раком, настолько же эффективна, как и композиция, полученная из опухолевых тканей или клеток. Вероятно, причиной этого явления является тот факт, что буквально миллионы раковых клеток ежедневно спонтанно развиваются в человеческом организме, но в большинстве случаев это не приводит к заболеванию, так как они сдерживаются иммунной системой.
Наконец, настоящая композиция находится в форме для перорального введения, что кардинально отличается от раковых вакцин, известных из уровня техники, которые изготовлены в форме для инъекций. Когда вакцина вводится путем инъекции, необходимо иметь высокоочищенный опухолевый антиген, так как примеси могут привести к нежелательным побочным эффектам - явление, хорошо известное из уровня техники и указывающее на то, что комбинированные вакцины обладают большим количеством побочных эффектов, чем моновакцины, содержащие один эпитоп/антиген. Но в то же время вакцина с меньшим количеством антигенов менее эффективна. Таким образом, дилемма, с которой столкнулись авторы изобретения, была разрешена путем изготовления вакцины в форме для перорального введения. Введение смеси антигенов без их разделения, в виде единой смеси, не приводит к каким-либо побочным эффектам, так как введение осуществляется перорально, и мукозальная иммунная система хозяина обращается с ними так же, как и при переваривании пищи, имеющей множество чужеродных антигенов. В отличие от системного иммунитета, мукозальная иммунная система была приспособлена и в высшей степени адаптирована к обращению с большим разнообразим антигенов.
В настоящем описании термины "рак", "неоплазма", "злокачественное новообразование" и "опухоль" использованы взаимозаменяемо в единственном или во множественном числе. Эти термины относятся к клеткам, которые претерпели злокачественную трансформацию, сделавшую их патогенными для организма хозяина, что приводит к летальному исходу. Некоторые виды рака в объеме настоящего изобретения среди многих прочих включают, но не ограничены перечисленным: рак надпочечника, рак анального канала, рак желчевыводящих протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, опухоли мозга/ЦНС, рак молочной железы, болезнь Кастлемена, рак шейки матки, рак толстой/прямой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, опухоль Юинга, рак глаза, рак желчного пузыря, рак желудка, желудочно-кишечную карциному, желудочно-кишечную стромальную опухоль (ГИСО), гестационную трофобластическую болезнь, болезнь Ходжкина, саркому Калоши, рак почки, рак гортани и гипофарингеальный рак, много различных видов лейкоза, например, ОЛЛ, ОМЛ, ХЛЛ, ХМЛ и ХММЛ, лимфому, неходжкинскую лимфому, рак печени, рак легкого, злокачественную мезотелиому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, рак носовой полости и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластому, рак полости рта и ротоглотки, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак полового члена, опухоль гипофиза, рак предстательной железы, рак почки, рабдомиосаркому, ретинобластому, рак слюнных желез, саркому, базально-клеточную и сквамозно-клеточную карциномы, меланому, рак из клеток Меркеля, рак тонкой кишки, рак желудка, тестикулярный рак, рак тимуса, рак щитовидной железы, саркому матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема и опухоль Вильмса. Для рака солидного строения "клинически обнаруживаемая" опухоль - это такая опухоль, которая обнаруживается на основании массы опухоли; например, посредством КТ-скана, магнитно-резонансной томографии (МРТ), рентгенографии, ультразвука или пальпации. В случае рака крови, т.е., лейкоза, при исследовании образца крови на наличие патологий применяются другие диагностические критерии.
Термин "белок" при использовании в настоящем описании относится к функционально активным биологическим молекулам, состоящим из одного или более аминокислотных остатков. Пептиды, олигопептиды, полипептиды и белки представляют собой термины, используемые для описания цепочек аминокислот различной длинны, от низкомолекулярных до высокомолекулярных. Термин "олигопептид" при использовании в настоящем описании относится к пептидам, содержащим приблизительно от 10 до 30 аминокислот. Хотя не существует четкого деления, для удобства термин "полипептид" при использовании в настоящем описании относится к пептидному сегменту длиной более 30 аминокислот.
При использовании в настоящем описании термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к дозе настоящей вакцины, необходимой (например, при введении субъекту) для выработки требуемого иммунного ответа у субъекта.
При использовании в настоящем описании термин "эксципиент" относится к веществу, объединенному с активным ингредиентом (API) в лекарственном препарате, таком как пилюля, капсула или таблетка. Эксципиенты обычно необходимы для получения стабильной и пригодной для использования пероральной дозированной формы, такой как пилюля или таблетка. Подбор подходящих фармацевтически приемлемых эксципиентов хорошо известен специалистам в данной области. Обычно эксципиенты включают антиадгезионные, такие как стеарат магния; связывающие: сахариды и их производные, дисахариды: сахарозу, лактозу; полисахариды и их производные: крахмалы, целлюлозу или модифицированная целлюлозу, такую как микрокристаллическая целлюлоза и сложные эфиры целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза; сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит или мальтит; белковые: желатин; синтетические полимеры: поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль; компоненты оболочки: гидроксипропил- или метилцеллюлозную пленочную оболочку, шеллак, кукурузный белок зеин или другие полисахариды, жирные кислоты, воски, полимерные материалы и растительные волокна; разрыхлители, такие как сшитые полимеры: поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза (кроскармеллоза натрия), гликолят крахмала; наполнители, такие как целлюлозы кальция фосфат, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит, сорбит, карбонат кальция и стеарат магния; вкусовые добавки, например, фруктовые экстракты или искусственные ароматизаторы, такие как мятный, вишневый или анисовый; различные красители, например, оксид титана, пунцовый розовый, и т.д.; смазывающие вещества, такие как тальк или диоксид кремния, и жиры, например, растительный стеарин, стеарат магния или стеариновую кислоту; скользящие вещества, включающие пирогенный диоксид кремния, тальк и карбонат магния; сорбенты; консерванты, такие как антиоксиданты: витамин А, витамин Е, витамин С, ретинилпальмитат, селен, цистеин, метионин, лимонную кислоту, цитрат натрия, метилпарабен, пропилпарабен; подсластители и тому подобные.
Неограничивающие примеры металлов, используемых в настоящем описании, включают алюминий, сурьму, бор, хром, медь, золото, железо, свинец, литий, натрий, кальций, калий, магний, марганец, платину, селен, кремний, натрий, серебро, титан, стронций, олово, вольфрам, ванадий и цинк. Более предпочтительными являются металлы и их соли, входящие в повседневный рацион питания, такие как натрия, калий, кальций, марганец и магний, тем не менее, другие не менее подходящие металлы, входящие в повседневный рацион, включают железо, кобальт, медь, цинк, молибден, йод и селен. Даже более предпочтительными являются магний и кальций, представляющие собой два наиболее распространенных бивалентных катиона в сыворотке крови. Непредпочтительные металлы представляют собой токсичные или тяжелые металлы, такие как мышьяк, бериллий, кадмий, хром, свинец, ртуть и платина. В предпочтительных вариантах осуществления металлы могут представлять собой магний или кальций. В одном из вариантов осуществления металл представляет собой магний. Металл может быть связан с активными ингредиентами (API), опухолевыми антигенами и аллоантигенами с образованием нерастворимого осадка или агрегата.
Неограничивающие примеры солей в контексте настоящего описания включают, но не ограничены перечисленным: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, бромид, бутират, камфорат, камфорсульфонат, хлорид, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, флюкогептаноат, фумарат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, иодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат, органометаллическую соль и тому подобные. Для терапевтического применения соли соединений по настоящему изобретению рассматриваются как фармацевтически приемлемые. Тем не менее, соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми или служат в качестве вспомогательных веществ, могут также найти применение, например, на начальных стадиях получения фармацевтически приемлемого соединения или в качестве эксципиента.
В настоящем описании "соль металла" представляет собой соединение, полученное в результате химического взаимодействия металла и неорганических или органических кислот или оснований, и физиологически переносимое целевым субъектом. Примеры кислот включают, но не ограничены перечисленным, уксусную, бензолсульфоновую кислоту, бензойную, лимонную, этансульфоновую, муравьиную, фумаровую, гликолевую, бромоводородную, соляную, молочную, малеиновую, малоновую, метансульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, азотную, хлорную, фосфорную, салициловую, сукциновую, сульфоновую, серную, винную, толуол-р-сульфоновую, и тому подобные. Примеры оснований включают, но не ограничены перечисленным, гидроксид щелочного металла (например, натрия), гидроксид щелочноземельного металла (например, магния), аммиак и тому подобные. Не ограничиваясь солями металлов, образованных с кислотами и основаниями, подходят также и другие соли металлов, такие как металлорганические соединения, содержащие связь между органическим лигандом, т.е., углеродом, кислородом или азотом, и металлом.
В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция (также называемая вакциной, вакцинной композицией или иммунотерапевтической композицией), содержащая денатурированный опухолевый антиген или его фрагменты, денатурированный аллоантиген или его фрагменты, и металл, связанный с вышеуказанными компонентами. Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты для пероральной дозированной формы.
В настоящем описании "опухолевый антиген" относится к антигенному или иммуногенному веществу, продуцируемому опухолевыми клетками, т.е., он может вызывать иммунный ответ у хозяина. Тем не менее, опухолевый антиген может представлять собой один антиген или иметь несколько компонентов. Чаще всего антиген представляет собой белок, но другие формы опухолевых антигенов также включены в контексте настоящего изобретения. Опухолевый антиген может представлять собой белок (включая рекомбинатный белок), пептид, гаптен, полисахарид, гликопротеин, липополисахарид, молекулу ДНК или их смеси. При использовании в настоящем описании термин "рекомбинантный белок" относится к белку, полученному экспрессией рекомбинантной ДНК; термин "пептид" относится к белковому фрагменту, состоящему из аминокислот; термин "фрагмент" по отношению к белку означает длину от двух аминокислотных остатков до полной аминокислотной последовательности белка за вычетом одной аминокислоты; термин "гаптен" относится к небольшой молекуле, которая, будучи присоединенной к большому носителю, такому как белок, способна вызывать иммунный ответ; термин "полисахарид" относится к углеводному полимеру, состоящему из длинных цепей моносахаридных единиц, связанных вместе гликозидными связями, хорошо известным примером полисахарида является бета-глюкан; термин "гликопротеин" относится к белку, содержащему олигосахаридные цепи, ковалентно связанные с полипептидом (примером гликопротеина является опухолево-ассоциированный гликопротеин 72 (TAG-72), который находится на поверхности многих раковых клеток, включая клетки яичника, молочной железы, толстой кишки и поджелудочной железы); термин "липополисахарид" (также известный как липогликан или эндотоксин) относится к большой молекуле, состоящей из липида и полисахарида; термин "молекула ДНК" относится к полинуклеотиду, кодирующему белок; термин "раковая клетка" обозначает атипичную неконтролируемо делящуюся клетку, совокупность которых может образовывать массы опухолей или циркулировать в крови.
Примеры опухолевых антигенов в контексте настоящего описания включают онкофетальные антигены, такие как альфа-фетопротеин (AFP) и карциноэмбриональный антиген (СЕА), MPG и р97 меланомы, онкогенный продукт Neu карциномы, члены семейства MAGE, семейства BAGE, семейства DAGE/Prame, семейства GAGE, семейства RAGE, семейства SMAGE, NAG, тирозиназу, GnT-V, CQA 72/4, ламинин P1, Yale Col. Sr. Factor, пептид гонадотропин мочи (UGP), hCG и его цепи, BHCG, IL-13Rα2, PD1 (CD279), CTLA-4, PSA, мелан-A/MART-1, gp100, TRP1, MUC-1, MUC-2, бета-катенин, MUM-1, CDK-4, TAG-72, CA-15-3, CA-19-9, CA 72-4, CA-125, Cyfra 21-1, NSE, AMFr, M-344, 19a211, erb-2, p15, p21ras, мутированный p53, пептид с точечным разрывом Bcr/Abl, WT1, HER-2/neu, PD-41, TCSF, GA733-2, HPV16 E7 или E6, MZ2-E, B7.1, B7.2, HOM-MEL-40, HOM-MEL-55, SSX2, NY-ESO-1, SCP1, CT7, NY-COL-2, HOM-HD-397, HOM-RCC-1.14, HOM-HD-21, HOM-NSCLC-11, HOM-MEL-2.4 и HOM-TES-11.
В некоторых вариантах осуществления опухолевые антигены согласно настоящему описанию могут быть выбраны из AFP, СЕА, CD31, CD34, CD99, CD117, GCDFP-15, EMA, ETA, MPG, р97, Neu, c-myc, raf, ras, MAGE, BAGE, DAGE/Prame, GAGE, RAGE SMAGE, NAG, CQA 72/4, ламинина P1, Yale Col. Sr. Factor, UGP, hCG, PD1 (CD279), PTPRC (CD45), HMB-45, мелана-A/MART-1, Myo D1, MSA, M2-PK, PLAP, PSA, gp100, MUC-1, MUC-2, MUC16, TRP-1, MUM-1, CDK-4, TAG-72, CA-15-3, CA-19-9, CA-27-29, CA-72-4, CA-125, Cyfra 21-1, CYP24, NSE, AMFr, M-344, 19a211, erb-2, p15, p21, p53, пептида с точечным разрывом Bcr/Abl, HER-2/neu, PD-41, TCSF, GA733-2, HPV16 E7, E6, MZ2-E, B7.1, B7.2, HOM-MEL-40, HOM-MEL-55, NY-COL-2, HOM-HD-397, HOM-RCC-1.14, HOM-HD-21, HOM-NSCLC-11, HOM-MEL-2.4, HOM-TES-11, GRP78, EGFR, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, NY-ESO-1, 4-5, PSMA, PSCA, EpCam, POA, GnT-V, TERT, кальцитонина, калретинина, хромогранина, цитокератина, десмина, ингибина, кератина, рековерина, калликреина, бета-катенина, аннексина, маммаглобина, тирозиназы и т.д.
Опухолевый антиген может также включать один или более генов или последовательностей ДНК, кодирующих вышеуказанные белки или пептиды. К настоящему времени обнаружено около 400 опухолевых антигенов. Периодически обновляемый список антигенов можно найти в различных базах данных, например, в такой как http://cancerimmunity.org/v13p15/, включенной в настоящее описание посредством ссылки. В контексте настоящего описания любой антиген, не являющийся опухолевым антигеном, считается аллоантигеном.
Специалист в данной области может обнаружить присутствие определенного опухолевого антигена путем проведения исследования на присутствие соответствующих опухолевых маркеров: например, при колоректальном раке: М2-РK, СЕА, СА 19-9, СА 125; при раке молочной железы: СЕА, СА 15-3, Cyfra 21-1; при раке яичников: СЕА, СА 19-9, СА 125, AFP, BHCG; при раке матки: СЕА, СА 19-9, СА 125, Cyfra 21-1, SCC; при раке предстательной железы: PSA, FPSA, PSCA, PSMA; при тестикулярном раке: AFP, BHCG, IL-13Rα2; при раке поджелудочной железы/желудка: СЕА, СА 19-9, СА 72-4; при раке печени: СЕА, AFP; при раке пищевода: СЕА, Cyfra 21-1; при раке щитовидной железы: СЕА, NSE; при раке легкого: СЕА, СА 19-9, СА 125, NSE, Cyfra 21-1; и при раке мочевого пузыря: СЕА, Cyfra 21-1 и ТРА. Эти опухолевые маркеры также могут быть включены в состав настоящей композиции в качестве опухолевых антигенов.
В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой антиген, полученный из раковой клетки, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака надпочечника, рака анального канала, рака желчевыводящих протоков, рака мочевого пузыря, рака кости, опухолей мозга/ЦНС, рака молочной железы, болезни Кастлемена, рака шейки матки, рака толстой/прямой кишки, рака эндометрия, рака пищевода, опухоли Юинга, рака глаза, рака желчного пузыря, рака желудка, желудочно-кишечной карциномы, желудочно-кишечной стромальной опухоли, гестационной трофобластической болезни, болезни Ходжкина, саркомы Капоши, рака гортани и гипофарингеального рака, лейкозов, включая ОЛЛ, ОМЛ, ХЛЛ, ХМЛ и ХММЛ, лимфомы, неходжкинской лимфомы, рака печени, рака легкого, злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, рака носовой полости и околоносовых пазух, рака носоглотки, нейробластомы, рака полости рта и ротоглотки, остеосаркомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака полового члена, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, рака почки, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака слюнных желез, саркомы, базально-клеточной и сквамозно-клеточной карциномы, меланомы, рака из клеток Меркеля, рака тонкой кишки, рака желудка, тестикулярного рака, рака тимуса, рака щитовидной железы, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрема и опухоли Вильмса.
Опухолевые антигены по настоящему изобретению могут быть получены в виде отдельного антигена, например, в виде выделенного и/или очищенного белка (включая рекомбинантный белок). В качестве альтернативы, опухолевые антигены могут быть получены из хирургически удаленных опухолей, биологических жидкостей раковых пациентов, таких как кровь или асцит, первичных линий опухолевых клеток или иммортализованных линий раковых клеток. Предпочтительно опухолевые клетки имеют тот же вид рака, как и у субъекта, подлежащего лечению, хотя это и не является принципиально необходимым. Специалист в данной области может легко получить линии раковых клеток из множества депозитариев клеточных линий, или создать дополнительные линии клеток путем культивирования опухолевых клеток, используемых в качестве первичного источника. Например, АТСС предлагает группу из семи линий клеток рака печени, включающих SNU-387, SNU-423, SNU-449, SNU-475, PLC/PRF/5, SK-HEP-1 и HepG2/C3A. Эти клетки могут быть использованы отдельно или в комбинации в качестве источника опухолевых антигенов для настоящей композиции. В некоторых вариантах осуществления первичные опухолевые или раковые клетки используют непосредственно в качестве исходного материала для получения настоящей композиции, без выделения из них опухолевых антигенов.
При использовании в настоящем описании термин "аллогенный антиген" или "аллоантиген" относится к антигену, имеющему индивидуальные характеристики, характерные для одной особи, и отличающиеся у другого индивидуума того же вида, такого как, например, человек. Даже несмотря на то, что все антигены кодируются одним и тем же геном, индивидуального различия достаточно для того, чтобы вызвать иммунный ответ, когда аллогенный антиген одного индивидуума контактирует с иммунной системой другого. Аллоантигены более широко известны в контексте трансплантации органов и ориентировочно разделяются на минорные и главные антигены гистосовместимости, и могут вызывать отторжение трансплантированной ткани. В контексте настоящего описания аллогенный антиген может быть заменен на, или объединен с ксеногенным антигеном (т.е., антигеном особи другого вида) и считается нормальным, незлокачественным антигеном при условии, что он отличается от специфических опухолевых антигенов. Ксеногенные антигены могут быть введены в явной форме, или могут присутствовать в составе композиции в результате переноса из культуральной среды, к которой для усиления роста клеток была добавлена, например, бычья или лошадиная сыворотка. В контексте настоящего описания аллогенные антигены могут быть получены из нормальных гепатоцитов; можно использовать клетки, предлагаемые, например, ScienCell Research Laboratories, которые располагают такими линиями клеток печени, как HHSEC, НН, HHSteC и HGBF, полученными от здоровых индивидуумов. Другим легкодоступным источником аллоантигенов является периферическая кровь.
В некоторых вариантах осуществления аллоантигены могут быть получены из крови пациента, или, предпочтительно, множества пациентов, у которых был диагностирован рак. В определенных вариантах осуществления опухолевые клетки во время получения композиции отделяют от аллогенных компонентов в клеточной суспензии. В других вариантах осуществления опухолевые клетки не отделяют от аллогенных клеток, присутствующих в исходном необработанном препарате. В контексте настоящего изобретения подходящий и удовлетворительный массовый процент опухолевых клеток в исходном необработанном препарате (перед денатурацией или гидролизом) составляет менее чем 80%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или даже меньше, при этом оставшиеся клетки представляют собой аллогенные клетки (т.е., клетки, которые не являются опухолевыми).
При использовании в качестве основания для расчетов опухолевого антигена, количество аллоантигена в настоящей композиции может быть по меньшей мере равным по массе количеству опухолевого антигена, и также может быть в 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 20000, 30000, 50000, 100000, 200000, 300000, 500000 или 1000000 раз больше, чем количество опухолевого антигена, или даже больше. В предпочтительных вариантах осуществления массовое соотношение между опухолевым антигеном и аллоантигеном может составлять от 1:1 до 1:100000 или от 1:50 до 1:200. Подходящее соотношение может быть определено путем клинических исследований с использованием общепринятых в данной области методов. В качестве ориентира, соотношение циркулирующих опухолевых и неопухолевых клеток представляет собой соотношение в периферической крови пациента, больного раком или в предраковом состоянии, и считается оптимальным. Когда смешивают большое количество исходных необработанных образцов (например, когда исходные образцы получены от более чем одного индивидуума), соотношение становится сбалансированным и более точно представляет ситуацию в естественной популяции. В случае смешанных источников спектр антигенов будет шире по сравнению с единственным источником.
В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген и аллоантиген настоящей композиции денатурированы. При использовании в настоящем описании термин "денатурация" относится к процессу, в котором биоактивные макромолекулы, такие как белки или нуклеиновые кислоты, утрачивают, по крайней мере частично, свою четвертичную структуру, третичную структуру и/или вторичную структуру, в которой они находятся в естественном состоянии, путем применения какого-либо внешнего воздействия или реагентов. В одном из вариантов осуществления денатурация выполняется путем нагревания, например, нагреванием опухолевых антигенов и аллоантигенов в автоклаве при температуре по меньшей мере 115°С в течение по меньшей мере 15 минут и при атмосферном давлении по меньшей мере 100 кПа (15 psi). Эти рабочие параметры автоклава (температура, давление, продолжительность и т.д.) могут быть определены специалистом в данной области, например, при известном соотношении между этими параметрами.
В некоторых вариантах осуществления антигены настоящей композиции гидролизованы, т.е., их молекулярная структура расщеплена до компонентов или фрагментов меньшего размера, например, пептидов меньшего размера (олигопептидов и полипептидов), а также свободных аминокислот. Гидролиз может проводиться до, после или совместно с денатурацией.
В предпочтительных вариантах осуществления гидролиз является частичным, т.е., меньшим, чем понадобилось бы для полного превращения данного(ых) белка(ов) в свободные аминокислоты. Предпочтительно менее 10% гидролизованных антигенов состоит из свободных аминокислот, более предпочтительно содержание свободных аминокислот составляет менее 8%, и даже более предпочтительно, когда это содержание составляет менее 5%, или менее 3%. В предпочтительных вариантах осуществления композиция после гидролиза содержит олигопептиды, составляющие по меньшей мере 30 масс. % от общего количества исходного белка. В дополнительных вариантах осуществления олигопептиды составляют по меньшей мере 35 масс. %, по меньшей мере 40 масс. %, по меньшей мере 45 масс. %, по меньшей мере 50 масс. %, по меньшей мере 55 масс. %, или по меньшей мере 60 масс. % от исходного белка.
Примеры реакции гидролиза, подходящей для настоящего изобретения, включают кислотный или щелочной гидролиз, где белок подвергают воздействию кислоты, такой как соляная кислота, или гидроксида натрия.
Степень гидролиза и состав его продуктов зависят от реагентов для гидролиза, а также условий его проведения. Например, такой белок, как альбумин, может быть полностью гидролизован в свободные аминокислоты путем нагревания с 6М соляной кислотой в течение приблизительно 24 часов при 110°С. При уменьшении этой температуры наполовину, например, до 50°С, более 80% исходного белка расщепляется до олигопептидов и свободных аминокислот, а остаток гидролизуется до полипептидов. Специалист в данной области может легко модифицировать условия реакции для получения требуемого содержания олигопептидов или требуемой длины аминокислот. Например, если уменьшить концентрацию соляной кислоты и/или понизить температуру реакции, будет получено больше полипептидов и меньше свободных аминокислот, и средняя длина цепи полученных олигопептидов будет больше.
2
В щелочном гидролизе используются гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид натрия (NaOH) или гидроксид магния (Mg(OH)). Например, при гидролизе альбумина с 6М NaOH при 50°С в течение 24 ч можно получить приблизительно 80% пептидов, остаток составляют свободные аминокислоты. Пептиды, полученные в результате гидролиза, могут иметь средний размер приблизительно 13 кДа или менее, и включают олигопептиды, имеющие среднюю длину цепи приблизительно 12 аминокислот. В одном из примеров продукты гидролиза включают пептиды, более 60% которых имеют размер больше 10 кДа, и приблизительно 15% которых имеют размер от 6 до 10 кДа, и приблизительно 1% которых имеет размер от 1 до 6 кДа. Продукт гидролиза также включает приблизительно 4% свободных аминокислот и приблизительно 8% нерастворимых белковых агрегатов. Эти числа приведены в качестве примера и не ограничивают специалиста в плане модификации условий проведения гидролиза, чтобы получить другие соотношения пептидов и аминокислот.
Гидролиз также может катализироваться ферментами - реакции, хорошо известные специалистам в данной области. Такие реакции в естественных условиях происходят в человеческом организме при переваривании полученных с пищей белков, или в клетках при процессинге антигенов. Для ферментативного гидролиза выбирают известные из уровня техники протеазы, такие как актинидии, аминопептидаза, астацин, карбоксипептидаза, каспаза, катепсин, химозин, химотрипсин, клострипаин, коллагеназа, эластаза, эндопротеиназа, экзопептидаза, калликреин, металлопротеиназа, папаин, пепсин, плазмин, проназа, протеиназа, ренин, серрализин, субтилизин, термитаза, термолизин, тонин или трипсин, и расщепляют белок до меньших фрагментов посредством общепринятых методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, типичный протеазный гидролиз при нейтральном рН 6,8, температуре 40°С и инкубационном периоде 8-12 часов, может привести к выходу приблизительно 30% свободных аминокислот. Соответственно, условия проведения гидролиза могут быть модифицированы для получения требуемого соотношения пептидов и аминокислот. Содержание свободных аминокислот может быть определено, например, с использованием высокоскоростного анализатора аминокислот L-8900 (Hitachi, Япония).
Металлический компонент по настоящему изобретению может быть внесен различными способами. В зависимости от выбранного типа гидролиза, например, щелочного или кислотного гидролиза, могут быть выбраны различные реакции. Например, реакция для белка, претерпевающего щелочной или кислотный гидролиз, может быть изображена следующим образом:
2
2
Белок(aq)+MgCl(aq)+2NaOH(aq)→2NaCl(aq)+Mg(OH)(s)+Mg-R(s), или
2
2
2
Белок(aq)+Mg(OH)(s)+2HCl(aq)→HO(aq)+MgCl(aq)+Mg-R(s),
где R может обозначать белковый (или пептидный) радикал, например, амид, или белковый (пептидный) ион, и (s) обозначает твердую фазу, a (aq) обозначает водную или растворимую фазу. В первой реакции добавляют NaOH, а во второй добавляют HCl - в классической химии такой тип реакций именуется реакцией двойного обмена или замещения: АВ+CD→AD+ВС. В присутствии белка металл взаимодействует с белком и происходит осаждение или агрегация. Подразумевается, что связь между металлом и белком (или пептидом) по своей природе может быть ковалентной, ионной или иметь частичные характеристики обеих. Реагенты в реакции обычно находятся в эквимолярных соотношениях или равных массовых/объемных соотношениях, где идеальное соотношение легко устанавливается без излишнего экспериментирования с учетом того, что главной целью является наибольший выход осажденного антигена.
Несмотря на то, что описанные выше стадии происходят последовательно, эти процессы также могут чередоваться. Другими словами, любая последовательность или порядок стадий, раскрытые в настоящем описании, необязательно указывают на необходимость проведения стадий именно в таком порядке. Стадии описанных выше процессов могут быть проведены в любом целесообразном порядке. Более того, некоторые стадии могут быть проведены одновременно, например, стадия гидролиза может быть проведена при высокой температуре, что делает отдельную стадию денатурации излишней. Другим примером одновременных стадий являются стадии гидролиза и осаждения, где связывание металла с фрагментами гидролизованного белка может происходить одновременно с фрагментацией белка в кислотной или щелочной среде. Еще одним примером комбинирования стадий является осаждение и сушка осадка - это может происходить в вакуумной камере при высокой температуре - таким образом процессы осаждения, сушки и денатурации могут происходить одновременно. В этом случае стадия гидролиза может быть первоначальной стадией. Вне зависимости от стадий, на которых получают осадок, его затем высушивают, превращают в порошок и смешивают с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Затем эту смесь превращают в пилюли, таблетки или капсулы (например, желатиновые капсулы, содержащие сухие порошки активных ингредиентов и эксципиенты). Таблетки, пилюли или капсулы могут быть дополнительно покрыты или иным образом обработаны с помощью общеизвестных в уровне техники способов.
Иллюстративная композиция пилюли или таблетки, полученной в результате стадий, приведена в Таблице 1 ниже.
Иллюстративная композиция пилюли или таблетки, полученной в результате этих стадий, приведена в Таблицах 1, 2, 3.
3
3
3
2
2
В Таблице 1 анализ был проведен с использованием атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-АЭС) путем разложения композиции по изобретению 3 различными растворителями (растворами HNO; HCl+HNO; и HNO+HO). В зависимости от использованного растворителя состав может слегка различаться, но в целом результаты всех трех тестов согласуются.
Результаты, представленные в Таблице 2, были получены с использованием высокоскоростного анализатора аминокислот L-8900 (Hitachi, Япония) путем растворения образца в 0,02N НСl.
Иллюстративный вариант осуществления способа получения настоящей композиции состоит в следующем. Получают смешанную сыворотку из периферической крови множества пациентов с ГКК. Сыворотку гидролизуют соляной кислотой и затем осаждают 1М гидроксидом магния, постепенно добавляемым до тех пор, пока в реакционном сосуде не образуется осадок. Осадок, содержащий магний, связанный с альфа-фетопротеином, в качестве основного опухолевого антигена и смесь аллоантигенов крови, среди которых преобладающим видом является альбумин, собирают, денатурируют нагреванием, измельчают в порошок и добавляют стандартные эксципиенты, известные из уровня техники (см. Таблицу 3) с образованием пилюли.
Композиции, содержащие опухолевые антигены других видов рака, могут быть получены схожим образом с использованием сыворотки смешанной периферической крови пациентов с соответствующим видом рака, или из опухолевых тканей, полученных хирургическим вмешательством. Вакцина не обязательно должна быть специфической для конкретного вида рака. Можно получить вакцину широкого спектра путем смешивания образцов опухолей или крови индивидуумов с различными видами рака. Для упрощения процесса и повышения воспроизводимости в качестве источника опухолевых антигенов можно использовать линии опухолевых клеток, например, раковая вакцина широкого спектра может содержать линии клеток рака молочной железы (MCF7), мозга (U87), поджелудочной железы (PANC-1), печени (Нер3В), толстой кишки (НСТ-15), шейки матки (HeLa), предстательной железы (DU145) и меланомы (MeWo), смешанные в требуемом массовом соотношении. Эти линии клеток могут затем быть комбинированы с сывороткой смешанной периферической крови и затем подвергнуты гидролизу, денатурации и/или вызванному металлом осаждению, как описано выше.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения рака у субъекта или пациента, и/или предупреждения или уменьшения вероятности возникновения рака у субъекта или пациента, подверженного риску возникновения рака, включающие пероральное введение субъекту эффективного количества вакцины по настоящему изобретению. В контексте настоящего описания рак включает, но не ограничен перечисленным: рак печени (например, гепатому, холангиокарциному, гепатобластому, ангиосаркому, гепатоклеточную карциному, гепатоклеточную аденому, гемангиому); рак легкого (например, бронхогенную карциному, альвеолярную карциному, бронхиальную аденому, саркому, лимфому, хондроматозную гамартому, мезотелиому); рак сердца (например, саркому, миксому, рабдомиому, фиброму, липому и тератому); рак желудочно-кишечного тракта (например, рак пищевода, желудка, поджелудочной железы, тонкого кишечника и толстого кишечника); урогенитальный рак (например, почки, мочевого пузыря и мочеиспускательного канала, предстательной железы, тестикулярный рак); рак кости (например, остеобластическую саркому, фибросаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, хондросаркому, саркому Юинга, злокачественную лимфому, множественную миелому, злокачественную гигантоклеточную хордому, остеохондрому, доброкачественную хондрому, хондробластому, хондромиксофиброму, остеоид-остеому и гигантоклеточные опухоли); рак нервной системы и мозга (например, черепа, мягких мозговых оболочек, мозга и спинного мозга); гинекологический рак (например, матки, шейки матки, яичников, вульвы, влагалища); гематологический рак (например, рак, относящийся к крови, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому); рак кожи (например, злокачественную меланому, базально-клеточную карциному, сквамозно-клеточную карциному, саркому Карпоши, дисплазию родинок, липому, ангиому, дерматофиброму, келоиды, псориаз); и рак надпочечников (например, нейробластому).
В некоторых вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят субъекту совместно с химиотерапевтическим(ими) агентом(ами), другой раковой вакциной или вакцинами и/или иммуноадъювантом(ами). В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят субъекту в качестве самостоятельной терапии.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения или уменьшения интенсивности воспалительных заболеваний аутоиммунной природы (также называемых "аутовоспалительные заболевания"), при которых иммунная система хозяина направлена против своих собственных клеток и тканей, с использованием композиций, описанных в настоящем описании. Неограничивающий список таких состояний включает острый рассеянный энцефаломиелит, болезнь Аддисона, агаммаглобулинемию, гнездную алопецию, амиотрофический латеральный склероз, анклиозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, антисинтетазный синдром, атопическую аллергиию, атопический дерматит, аутоиммунную апластическую анемию, аутоиммунную кардиомиопатию, аутоиммунную энтеропатию, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную периферическую нейропатию, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунную уртикарию, аутоиммунный увеит, болезнь Бало, болезнь Бехчета, болезнь Бергера, энцефалит Бикерстаффа, синдром Блау, буллезный пемфигоид, рак, болезнь Кастлемена, целиакию, болезнь Чагаса, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, хронический рецидивирующий мультифокальный остеомиелит, хроническое обструктивное заболевание легких, синдром Черджа-Строс, рубцующийся пемфигоид, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, дефицит С2-компонента комплемента, контакнтный дерматит, краниальный артериит, КРЕСТ-синдром, болезнь Крона, синдром Кушинга, кожный лейкоцитокластический васкулит, болезнь Дего, болезнь Деркума, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, сахарный диабет 1 типа, диффузный кожный системный склероз, синдром Дресслера, лекарственную волчанку, дискоидную красную волчанку, экзему, эндометриоз, энтезит-ассоциированный артрит, эозинофильный фасциит, эозинофильный гастроэнтерит, эозинофильную пневмонию, приобретенный буллезный эпидермолиз, нодозную эритему, эритробластоз плода, наследственную криоглобулинемию смешанного типа, синдром Эвенса, прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию, фиброзирующий альвеолит, инфаркт Фрайберга, гастрит, гастроинтестинальный пемфигоид, гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, энцефалопатию Хашимото, тиреоидит Хашимото, пурпуру Шенлейна-Геноха, гестационный герпес, гнойный гидраденит, синдром Хьюза-Стовина, гипогаммаглобулинемию, идиопатические воспалительные демиелинизирующие заболевания, идиопатический легочный фиброз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, IgA-нефропатия, миозит с включенными тельцами, интерстициальный цистит, ювенильный идиопатический артрит, болезнь Кавасаки, болезнь Кинбека, болезнь Келера, синдром Ламберта-Итона, болезнь Легга-Кальве-Пертеса, лейкоцитокластический васкулит, красный плоский лишай, лишайный склероз, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, волчаночный гепатит, эритематозную волчанку, синдром Маджида, болезнь Меньера, микроскопический полиангиит, синдром Миллера-Фишера (разновидность синдрома Гийена-Барре), смешанное заболевание соединительной ткани, кольцевидную склеродермию, болезнь Мухи-Габерманна, рассеянный склероз, миастению гравис, микроскопический колит, миозит, нарколепсию, оптиконевромиелит, нейромиотонию, глазной рубцующийся пемфигоид, опсо-миоклональный синдром, атрофический аутоиммунный тиреоидит, болезнь Осгуда-Шлаттера, рассекающий остеохондрит, палиндромный ревматизм, PANDAS, болезнь Паннера, паранеопластическую церебеллярную дегенерацию, пароксизмальную ночную гемоглобинурию, синдром Парри-Ромберга, синдром Парсонаж-Тернера, парспланит, вульгарный пемфигус, злокачественную анемию, перивенозный энцефаломиелит, POEMS-синдром, нодозный полиартериит, ревматическую полимиалгию, полиомиозит, первичный биллиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, прогрессирующую воспалительную нейропатию, псориаз, псориатический артрит, гангренозную приодермию, истинную эритроцитарную аплазию, энцефалит Расмуссена, феномен Рейно, рецидивирующий полихондрит, синдром Рейтера, синдром беспокойных ног, ретроперитонеальный фиброз, ревматоидный артрит, ревматическую лихорадку, саркоидоз, шизофрению, синдром Шмидта (вариант АПС), болезнь Шейерманна, синдром Шницлера, склерит, склеродермию, сывороточную болезнь, болезнь Севера, синдром Шегрена, спондилоартропатию, болезнь Стилла, синдром мышечной скованности, подострый инфекционный эндокардит, синдром Сусака, синдром Свита, хорея Сиденгама, симпатическую офтальмию, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит, тромбоцитопения, синдром Толоса-Ханта, поперечный миелит, язвенный колит, недифференцированное заболевание соединительной ткани, недифференцированную спондилоартропатию, уртикарный васкулит, васкулит, витилиго или гранулематоз Вегенера.
В общем, содержание как опухолевых антигенов, так и аллоантигенов по изобретению может составлять порядка 0,01 мкг - 100 мг на индивидуальную дозу, предпочтительно 0,1 мкг - 10 мг на дозу, и более предпочтительно 1 мкг - 5 мг на дозу. Для практических целей и лучшего результата разовые дозы могут составлять от 10 мкг до 1 мг. Предпочтительный размер таблеток для перорального введения составляет от приблизительно 0,3 до приблизительно 2 грамм, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,2 грамм, или от приблизительно 0,8 до приблизительно 1 грамма. Таблетки могут приниматься раз в сутки, в других вариантах осуществления это частота возрастает до 4 раз в сутки, оптимальная частота определяется лечащим врачом на основании клинического ответа.
В некоторых вариантах осуществления введение настоящих вакцин осуществляется энтеральным путем, включая трансмукозальную доставку композиции. Способ включает приведение мукозальной поверхности субъекта, нуждающегося в такой композиции, в контакт с эффективным количеством композиции. Подходящие мукозальные поверхности включают, но не ограничены перечисленным, оральную, буккальную, назальную, влагалищную, поверхность шейки матки, глазную, ушную, легочный тракт, уретральную, желудочно-кишечный тракт, кожную, кожно-слизистую, анальную, клоакальную и ректальную поверхность, и тому подобные. В одном из вариантов осуществления введение представляет собой пероральное введение, при котором композиция проходит желудок и абсорбируется в кишечнике, очень схоже с абсорбцией любой пищи. В других вариантах осуществления композицию вводят сублингвально, ректально или вагинально.
При пероральном введении настоящая вакцинная композиция может быть введена субъекту один раз в сутки в виде разовой дозы, представляющей собой пилюлю. В некоторых случаях доза может быть увеличена до двух, трех, четырех пилюль в сутки на протяжении по меньшей мере 14 дней, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, или до тех пор, пока это необходимо. Терапия настоящей композицией может продолжаться 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, а в некоторых случаях может потребоваться один год непрерывного введения доз.
Композиция может вводиться раковому пациенту вне зависимости от того, находится ли заболевание на начальной или последней стадии. Композиция также может вводиться субъекту, не имеющему заболевания, но с повышенным риском его развития, или субъекту, желающему предотвратить рак путем профилактического приема вакцины.
В некоторых вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят субъекту в качестве самостоятельной терапии. В других вариантах осуществления введение настоящей композиции может быть совмещено с хирургическим вмешательством, радиотерапией, химиотерапией, другим видом иммунотерапии, гормональной терапией или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят субъекту совместно с химиотерапевтическим(ими) агентом(амии), другой раковой вакциной или вакцинами и/или иммуноадъювантом(ами). Дополнительная терапия может осуществляться до, во время или после введения настоящей композиции.
В случае, когда настоящая композиция предназначена для применения у животных или ветеринарного применения, композиция может быть с легкостью введена с кормом для животных, таким как зерно или кормовые гранулы, приманкой или с питьевой водой для животных. Композиция также может быть включена в прием пищи, например, путем распыления на пищу.
ПРИМЕРЫ
Изобретение дополнительно описано следующими примерами, не ограничивающими его каким-либо образом.
Пример 1: Композиция и получение
Композицию для лечения рака печени получали из смешанной сыворотки, полученной из периферической крови 20 пациентов с ГКК, которую подвергали гидролизу в течение приблизительно 12 часов при комнатной температуре с 1М соляной кислотой, и затем осаждали 1М гидроксидом магния, постепенно добавляемым до тех пор, пока в реакционном сосуде не образовался осадок. Осадок, содержащий магний, связанный с альфа-фетопротеином в качестве основного опухолевого антигена и смесь аллоантигенов крови, среди которых преобладающим видом являлся альбумин, собирали, денатурировали нагреванием в промышленном автоклаве в течение 20 минут при температуре 110°С и атмосферном давлении 100 кПа (15 psi), измельчали в порошок и добавляли эксципиенты (как показано в Таблице 3) с образованием пилюли. Следует отметить, что гидролиз в вышеописанном способе был частичным, при этом приблизительно 80% исходных антигенов расщепилось до пептидов размером от 1 кДа до 30 кДа.
Пилюля, полученная в соответствии с вышеуказанным способом, содержит денатурированный и гидролизованный альфа-фетопротеин в количестве по меньшей мере 10 микрограмм на дозу, денатурированный и гидролизованный альбумин в количестве по меньшей мере 100 микрограмм на дозу, и металлический магний в количестве по меньшей мере 200 микрограмм на дозу.
Аминокислотный состав полученной таким способом репрезентативной композиции приведен ниже. Изменения характеристик от серии к серии лежали в диапазоне среднеквадратического отклонения, составлявшего менее 15%, и не оказывали какого-либо воздействия на клиническую эффективность.
Вышеуказанную композицию предоставляли пациентам с ГКК, как описано в Примере 2 ниже.
Композиция, которую предоставляли пациентам, обсуждаемым в Примерах 3-13, содержала раковую вакцину широкого спектра, включавшую гидролизованные ткани первичных опухолей, включая, при наличии, их метастазы, полученные хирургическим путем. В равной степени эффективная альтернатива, применявшаяся для лечения пациентов с различными видами опухолей, была изготовлена из иммортализованных линий раковых клеток, выращенных in vitro. Такая композиция содержала линии клеток рака молочной железы (MCF7), мозга (U87), поджелудочной железы (PANC-1), печени (Нер3В), толстой кишки (НСТ-15), шейки матки (HeLa), предстательной железы (DU145) и меланомы (MeWo), смешанные в равном массовом соотношении. Эти линии клеток объединяли с сывороткой из смешанной периферической крови здоровых индивидуумов и затем подвергали гидролизу, денатурации и/или вызванному металлом осаждению, как описано выше.
Пример 2: Рак печени
70 пациентов с прогрессирующей ГКК, включавших 26 (37,1%) женщин и 44 (62,9%) мужчины со средним возрастом 60 лет (среднее 61,7±8,3) были включены в исследование вакцинной композиции по настоящему изобретению. Из них 30 (42,9%) были инфицированы гепатитом В, и 39 (56,5%) - гепатитом С, 8 (11,4%) имели обе инфекции, у 4 (5,7%) не было выявлено ни одного из этих вирусов, включая 2 с наследственным гемохроматозом (2,9%), и 5 (7,1%) с невыявленным диагнозом. По прошествии медианы длительностью 2 месяца перорального приема суточной дозы содержащей вакцину пилюли, у 47 из 70 пациентов произошло снижение уровней опухолевого маркера, альфа-фетопротеина, в сыворотке крови (67,1%; Р=0,007, определено с использованием критерия знаковых рангов Вилкоксона). Исходная медиана AFP составляла 223 МЕ/мл (среднее 4328; диапазон 7,2-92407; 95% CI 1077-7045), и значения после лечения составили 101,2 МЕ/мл (среднее 2701; диапазон 0,9-54478; 95% CI 521-4881). Снижение уровней AFP было связано или с устранением опухоли, или с регрессией на КТ-сканах. Медиана общего выживания не могла быть установлена, так как 65 из 70 пациентов (92,9%) были еще живы после медианы последующего наблюдения, составившей 8 месяцев (среднее 11,2; диапазон 3-55; 95% CI 8,8-13,5). Первый пациент в данном исследовании получал иммунотерапию в течение 55 месяцев до, чувствовал себя хорошо, и у него не было обнаружено никаких следов метастазов. Ни один из пациентов не ощущал побочных эффектов, напротив, функция их печени улучшилась. В Таблице 4 приведены результаты иммунотерапевтического вмешательства.
Как показано на Фиг. 1, КТ-сканы репрезентативного пациента №12 из вышеперечисленных 70 пациентов до и после ежедневного введения композиции указывают на то, что множественные опухоли в печени пациента бесследно исчезли после лечения.
Пример 3: Рак молочной железы
Четыре женщины с диагностированным раком молочной железы перорально принимали настоящую вакцину раз в сутки. Первые два пациента проходили хирургическое лечение, радиотерапию и химиотерапию, однако позднее у них были обнаружены метастазы, бесследно исчезнувшие после перорального приема вакцины раз в сутки в течение 3 и 6 месяцев, соответственно. Третья пациентка имела схожую историю болезни, за исключением того, что продолжительность лечения составила только один месяц. У четвертой дамы в возрасте между пятидесятью и шестидесятью годами был диагностирован рак молочной железы во время стандартного медицинского обследования, диагноз был подтвержден биопсией. Вместо хирургического вмешательства она решила принимать раковую вакцину по принципу "лечение-перерыв" в течение приблизительно одного года. Через год, когда она вернулась в больницу для медицинского обследования, ее маркеры рака молочной железы оставались на границе нормы, и у нее не было обнаруживаемой массы опухоли. Ни у одной из женщин не наблюдалось побочных эффектов.
Пример 4: Рак легкого
Один индивидуум в возрасте, близком к 60 годам, с немелкоклеточным раком легкого на последней стадии решил перорально принимать вакцину по настоящему изобретению дважды в сутки, так как хирургическое вмешательство на этой стадии было невозможно. По истечении 3 месяцев пациент был все еще жив, хотя вероятность выживания составляла только один месяц. Он по-прежнему явно имел массу опухоли, но она уменьшилась в размере, и он смог нормально дышать, так как жидкости, первоначально присутствовавшие в его левом легком, исчезли.
Пример 5: Рак пищевода
50-летний мужчина заметил, что его голос стал хриплым, и испытывал затруднения при глотании. Пища застревала в пищеводе, он испытывал боль при глотании, боль в груди, изжогу, и имел некоторую потерю массы тела. После медицинского обследования в больнице у него был диагностирован рак пищевода. Вместо хирургического вмешательства и радиотерапии он принимал вакцину в течение 4 месяцев совместно с некоторыми растительными лекарственными средствами. Пациент излечился от рака и вернулся к работе. Другой пациент, узнавший о первом пациенте, начал лечение, но на данной стадии, через месяц после лечения, результат был неизвестен, за исключением того, что пациент был все еще жив и испытывал меньшие затруднения при глотании.
Пример 6: Рак шейки матки/матки
У двух дам в возрасте, близком к 50 годам, был диагностирован рак шейки матки/матки. Одна из пациенток подверглась хирургическому вмешательству и химиотерапии, после чего она принимала вакцину в течение 6 месяцев дважды в день. Один год спустя она все еще жива и хорошо себя чувствует. Вторая дама начала терапию настоящей вакциной после того, как у нее началось кровотечение и произошла потеря веса. Больница отказалась ее принять, так как она была неоперабельным пациентом. После принятия вакцины в течении одной недели она обнаружила, что кровотечение прекратилось, боль в нижней части живота исчезла, и через один месяц пациентка вернулась к нормальной жизни. В настоящее время она все еще жива.
Пример 7: Опухоль мозга
ВИЧ-положительный пациент испытывал прогрессирующую головную боль и начал испытывать затруднения с поддержанием равновесия при ходьбе, что сделало его по большому счету лежачим больным. На рентгеновском снимке была обнаружена большая опухоль мозга, диагностированная как глиобластома. После 2 месяцев принятия вакцины раз в сутки, к пациенту вернулась способность ходить самостоятельно, и его головная боль, так же как и масса опухоли, исчезла. У второго пациента, женщины в возрасте, близком к 50 годам, была диагностирована опухоль мозга, не подлежащая хирургическому вмешательству. После 8 месяцев принятия вакцины она по-прежнему принимала вакцину и не испытывала выраженных симптомов, за исключением редких головных болей. Опухоль явно осталась на месте, но не увеличилась в размере.
Пример 8: Лейкоз
13-летний ребенок с острым лимфоидным лейкозом принимал вакцину дважды в сутки и по истечении 6 месяцев был все еще жив. Другой пациент в возрасте, близком к 40 годам, у которого был диагностирован хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) принимал вакцину раз в сутки и был все еще жив по истечении одного года, хотя он не подвергался химиотерапии.
Пример 9: Опухоль мочевого пузыря
Взрослый пациент мужского пола, у которого была диагностирована опухоль мочевого пузыря, принимал вакцину в течение 2 месяцев в количестве 4 пилюль в сутки. По-видимому, его опухоль исчезла, и пациент был все еще жив по истечении одного года. Еще два пациента, у которых был диагностирован этот же вид рака, принимали вакцину раз в сутки; по истечении их прогнозируемого времени смерти они были все еще живы, и симптомы ослабли.
Пример 10: Миосаркома
У женщины в возрасте, близком к 70 годам, была диагностирована опухоль мышечной ткани ног. Она имела генетическую предрасположенность к заболеванию, так как ее мать и тетя умерли от того же самого заболевания. Она испытывала сильную боль в ногах и ломоту, которые исчезли по истечении 2-3 дней после того, как она начала раз в сутки принимать вакцину. После приблизительно 3 месяцев она вновь обратилась в больницу, где врачи с удивлением обнаружили, что она все еще жива, и в результате обширного медицинского обследования она была объявлена вылечившейся. Пациентка вернулась к своей обычной деятельности, включая ежедневные поездки на велосипеде и упражнения по бальным танцам.
Пример 11: Рак кости
У 75-летнего пациента мужского пола в течение приблизительно 3 лет была остеосаркома без видимых метастазов, и большую часть дня он проводил в постели. Он начал принимать вакцину один раз в сутки в течение 3 месяцев, и его состояние улучшилось до такой степени, что он смог ходить, и его необходимость в обезболивающих существенно снизилась. Он набрал вес, и у него прекратилось недержание мочи.
Пример 12: Рак предстательной железы
У двух мужчин в возрасте 56 лет и 62 года с доброкачественной гиперплазией предстательной железы в анамнезе были обнаружены подозрения на злокачественную трансформацию ввиду наличия боли в области таза и позвоночнике и более высоких уровней PSA, чем обычно. Вместо хирургического вмешательства они принимали ежедневную дозу вакцины в течение приблизительно двух месяцев, и их симптомы исчезли. Исходно наблюдавшиеся симптомы частого мочеиспускания, неполного опорожнения мочевого пузыря и затрудненного начала мочеиспускания спали и вернулись к нормальным уровням, наблюдавшимся до диагностирования ДГПЖ.
Пример 13: Измерение иммунного ответа, индуцированного настоящей вакциной.
-1
-6
Свежевыделенные клетки периферической крови инкубировали с вакциной по настоящему изобретению, разбавленной в миллион раз (1 млн или 1:10) в течение 48 часов. Это разбавление отражает приблизительную физиологическую дозу композиции после ее перорального приема. Затем проводили проточную цитометрию на выращенной in vitro популяции CD4-положительных Т-лимфоцитов для оценки воздействия настоящей композиции на селективные маркеры иммунной активации у клеток, подвергшихся воздействию вакцины, по сравнению с контрольными клетками, не подвергшимися воздействию вакцины. Результаты показали, что в клетках повысилась экспрессия IFN-гамма почти в 6 раз или на 600%; 13-кратное уменьшение (на 1300%) клеток, пролиферирующих воспалительный маркер TNF-альфа, практически отсутствовало воздействие на экспрессию IL-2; повысилась экспрессия CD69, представляющего собой маркер Т-клеточной активации, также повысилась частота клеток, пролиферирующих Ki-67, представляющий собой маркер индуцированной вакциной пролиферации клеток памяти, в 4 раза (на 400%)). Схожие результаты наблюдались с CD8-положительными Т-клетками. Следовательно, физиологическая концентрация вакцины оказывала очень сильное и быстрое воздействие на иммуноциты. Данный противовоспалительный эффект уникален, и о нем никогда не сообщалось в случае других раковых вакцин (см., например, PCT/US2012/024009, где наибольшее повышение уровня Ki-67 составило 95% после 29 дней). Схема изменения уровней биомаркеров указывает на то, что настоящая вакцина обладает сильным противовоспалительным действием, как показано на Фиг. 2. Эти in vitro исследования не ограничены проточной цитометрией, специалист в данной области может воспользоваться другими in vitro исследованиями, такими как метод ELISA, исследование экспрессии mRNA цитокинами или комплексным исследованием, описанным, например, в патенте США №5223395, ЕР1664796 В1 и ЕР1222468 В1, включенных в настоящее описание посредством ссылки.
Следует понимать, что хотя изобретение было подробно описано посредством примеров и иллюстративно с целью разъяснения его сущности, вышеизложенное описание не предназначено для ограничения объема изобретения. Другие аспекты, преимущественные варианты осуществления и модификации, очевидные для специалиста в данной области, находятся в объеме следующей формулы.