Перспективы использования плюрипотентных стволовых клеток человека для получения компонентов крови

6

Обзоры

ОБЗОРЫ

Перспективы использования плюрипотентных стволовых клеток человека для получения компонентов крови:эритропоэз

Е.С. Филоненко, М.А. Лагарькова, СЛ. Киселев Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва.

Prospects for the use of pluripotent stem cells - derived blood components: erythropoiesis

E.S. Philonenko, M.A. Lagarkova, S.L. Kiselev Vavilov Institute of General Genetics of RAS, Moscow

Обзор посвящён проблеме получения клеток эритроид-ного ряда из плюрипотентных стволовых клеток человека. Плюрипотентные стволовые клетки человека (эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) обладают способностью к самоподдержанию и дифференцировке во все типы клеток организма, в том числе клетки крови. Поскольку проблема нехватки донорской крови стоит во всем мире очень остро, разработка технологий получения крови или отдельных форменных элементов из плюрипотентных клеток — крайне современная и нужная задача, которой посвящены работы многих лабораторий мира.

Ключевые слова: плюрипотентные стволовые клетки, гемопоэз, эритропоэз.

Актуальность

С тех пор, как J.A. Thomson и соавт. (1998) впервые получили эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека из внутренней клеточной массы бластоцисты [1], благодаря потенциальной способности дифференцироваться во все типы клеток организма (свойства плюрипотентности) ЭСК рассматриваются как модель для изучения процессов ранней клеточной дифференцировки и специализации. ЭСК человека могут служить также источником клеток для «регенеративной медицины», но их использование связано с рядом проблем, основная из них — проблема иммунологической совместимости. В 2006 г. K. Takahashi и S. Yamanaka получили ещё один тип плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) [2]. иПСК могут быть получены для каждого пациента индивидуально, а неограниченная пролиферация позволяет производить генетические манипуляции (трансгенез и гомологичную рекомбинацию), что делает иПСК перспективным источником клеток для лечения многих заболеваний, в том числе гематологических. Проблема нехватки иммуносовместимого аллогенного материала (костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)) остро стоит во всём мире [3—4], в то время как трансплантация

We review the problem of producing erythroid cells from human pluripotent stem cells. Pluripotent stem cells (embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells) are capable of self-renewal and differentiation into all cell types of an organism, including blood cells. Since a worldwide problem of blood donation shortage is very serious, the development of technologies to produce blood from pluripotent cells is a very modern and necessary task, which is the subject of investigations of many laboratories around the world.

Key words: pluripotent stem cells, hematopoiesis, erythropoiesis.

элементов крови является основой современной медицины. Кроме нехватки доноров, существуют такие проблемы, как передача инфекционных заболеваний и иммунологическая несовместимость. Использование ЭСК и иПСК в качестве источников клеток крови позволило бы решить эти проблемы. Этот обзор посвящён вопросам получения пригодных для использования в клинической практике клеток эритроидно-го ряда из ПСК человека.

Эритропоэз человека

В процессе эмбриогенеза млекопитающих эритропоэз происходит в 2 этапа: этап примитивного эритропоэза, начинающийся и ограничивающийся внезародышевым желточным мешком [5—8], и этап дефинитивного гемопоэза, который начинается в желточном мешке и (или) собственно в зародышевых тканях [9—10] и продолжается в зародышевой печени, а затем — в костном мозге [7].

Эмбриональный эритропоэз человека почти недоступен для исследований in vivo. Для изучения этого процесса на клеточном и молекулярном уровне служат модели in vitro. Для анализа кроветворения in vitro используются следующие методы оценки качества кроветворных предшественников: морфологическая характеристика по окрашиванию специфическими красителями (такие, как метод

e-mail: lagar@vigg.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Обзоры

7

Романовского — Гимзы); исследование набора экспрессируемых глобинов; исследование суррогатных стадиеспецифичных маркеров ГСК и клеток-пред-шественниц, выявленных при исследованиях, проведённых на мышиных моделях; функциональный непрямой тест на образование колоний в полужидких средах в культуре [11—14]. Тест на образование колоний в полужидких средах позволяет выявлять в составе кроветворных предшественников колониеобразующие единицы (КОЕ). Помещение КОЕ в полужидкую среду (обычно метиллцеллюлозу или агар), дополненную гемопоэтическими цитокинами, вызывает локальную экспансию и дифференциров-ку гемопоэтических клеток в дискретных колониях. По морфологии колоний можно определить тип КОЕ.

В процессе ранних стадий клеточной диффе-ренцировки образуются эритроидные предшественники, которые обнаруживаются в тесте на образование колоний в полужидких средах: эритроидная бурстобразующая единица (БОЕэ) — ранний эри-троидный предшественник, мало чувствительный к эритропоэтину (EPO), гормону терминальной дифференцировки, и затем эритроидная колониеобразующая единица (КОЕэ), которые постепенно дифференцируются в эритробласты, нормобласты, ретикулоциты и, наконец, в зрелые энуклеированные эритроциты [15]. Этот комплекс процессов контролируется ростовыми факторами, включающими EPO [16].

Дефинитивные и примитивные эритроидные клетки отличаются морфологически [17, 18] и на молекулярном уровне по разнице в составе гемоглобина. Гемоглобин является гетеротетрамером, состоящим из двух гомодимеров: принадлежащихк альфа- и бета-глобиновому кластерам.

Примитивные эритроидные клетки экспрессируют эмбриональный Hb Gower 1 (Z2b2), Hb Gower 2 (a2B2) и фетальный Hb F (a2y2) гемоглобины, а взрослые — 95% (a2P2), 1,5—3,5% (a2S2) и небольшое количество (a2y2), начинающего экспрессироваться в третьем триместре [19—22]. Эмбриональные и фетальные гемоглобины, а также небольшое количество взрослого гемоглобина детектируются на 5-6 нед. развития эмбриона человека [21, 22], т.е. уже на этом этапе развития существуют и примитивные, и дефинитивные эритроидные клетки. Таким образом, примитивные и дефинитивные эритроидные клетки экспрессируют в, у, и весь набор a-глобинового кластера, в то время как Z экспрессируется на 5 нед. только в примитивных клетках, заменяясь р глобином на 6 нед. [22]. р-глобин является отличительной чертой исключительно дефинитивных эритроидных клеток. Существует две теории происхождения примитивных и дефинитивных эритроидных клеток: из разных предшественников и из одного [17, 18].

Гемопоэтическая дифференцировка ПСК

человека

Впервые способность ЭСК дифференцироваться в гемопоэтические клетки была показана в лаборатории J.A. Thomson [23]. К этому времени уже были разработаны основные способы индукции дифференцировки ЭСК мыши in vitro: метод диф-ференцировки через стадию эмбриоидных телец (ЭТ) [24, 25], метод совместного культивирования со стромальными линиями [26, 27] и метод культивирования на поверхностях, покрытых коллагеном

[28]. Для гемопоэтических клеток, полученных из ЭСК мыши, был исследован паттерн экспрессии генов, характерных для различных типов клеток крови, проведён фенотипический анализ и функциональные тесты, позволившие охарактеризовать гемопоэз мыши in vitro. Все методы индукции дифференци-ровки и характеристики дифференцированных производных ЭСК мыши были использованы для разработки методов регуляции дифференцировки ЭСК человека. Однако в связи с тем, что in vivo гемопоэз человека в значительно степени отличается от гемопоэза мыши, методы индукции дифференцировки были адаптированы лишь частично, а критерии оценки дифференцированных производных пришлось впоследствии во многом пересмотреть. Например, поверхностные маркеры, которые были успешно использованы для описания ранних кроветворных предшественников, появляющихся при дифферен-цировке ЭСК мыши, оказались не подходящими для описания кроветворной дифференцировки ЭСК человека (многие из этих маркеров экспрессировались недифференцированными ЭСК человека) [29, 30]. Например, Flk-1 +-клетки, появляющиеся при диф-ференцировке ЭСК мыши и способные к дальнейшей дифференцировке как в эндотелиальные, так и в гемопоэтические клетки [31—34], присутствуют и в недифференцированных популяциях ЭСК человека, и в ЭТ в сходных количествах, поэтому Flk-1 не может рассматриваться как маркер гемопоэтической дифференцировки ЭСК человека [29]. К моменту выхода первой работы по дифференцировке ЭСК человека также были накоплены знания по гемопоэзу человека in vitro, полученные при исследованиях гемопоэтических предшественников, выделяемых из костного мозга, периферической и пуповинной крови человека. Были описаны основные методы, позволяющие характеризовать и выделять ГСК человека, обладающие высоким пролиферативным потенциалом и способные восстанавливать кроветворение у облученных или генетически дефектных мышей [35], так называемые длительно репопулирующие ГСК (ДР-ГСК). ДР-ГСК человека характеризуются экспрессией молекулы адгезии CD34 и имеют фенотип: Un-/c-Kit+/CD34+/CD38- (Lin- — отсутствие

маркеров линейных дифференцировок) [36, 37]. Также существуют ГСК, способные кратковременно репопулировать облученное животное (КР-ГСК). Их отличие от ДР-ГСК состоит в том, что они способны репопулировать облученный организм, однако через

4—6 нед. их кроветворные способности истощаются. Хотя методы характеристики и селекции ГСК и позволили получить достаточную информацию, чтобы использовать эти клетки для трансплантации, биология ГСК человека остается еще малоизученной. Так, была выявлена популяция CD34--клеток также обладающих свойствами ГСК: способностью к диф-ференцировке, самовозобновлению и длительной репопуляции костного мозга [38—41].

Методы индукции дифференцировки ПСК человека включают несколько основных подходов: совместное культивирование со стромальными клеточными линиями [23; 42—48], дифференцировка через стадию эмбриоидных телец [29, 30, 49—55], а также комбинация указанных подходов [56].

При выращивании кластеров ЭСК в суспензии происходит их агрегация, сопровождающаяся спонтанной дифференцировкой в различные клеточные

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

8

Обзоры

типы, относящиеся к производным эндодермы, эктодермы и мезодермы. Эти агрегаты, имеющие форму сфер, называются ЭТ [57—60]. Впервые метод индукции дифференцировки ЭСК по гемопоэтическому пути через стадию ЭТ был применён в лаборатории М. Bhatia [49]. В этой же работе был определен один из ключевых факторов, запускающих гемопоэтическую дифференцировку ЭСК человека, — BMP-4 (bone morphogenetic protein-4), для которого ранее была показана способность изменять пролиферативный потенциал и способность к дифференцировке дефинитивных гемопоэтических предшественников плода, новорожденных и взрослого человека [61—64]. Впоследствии было показано, что добавление BMP-4, VEGF (vascular endothelial growth factor) [50], SCF (stem cell factor), TPO (thrombopoietin) и Flt3L (Flt-3 ligand) в бессывороточную среду для дифференци-ровки ЭСК через стадию ЭТ в значительной степени улучшает кроветворную дифференцировку [44]. Установленный набор из этих пяти цитокинов является основным для практически всех протоколов индукции дифференцировки [65—67].

В качестве стромальных клеточных линий для совместного культивирования, как правило, используются линии клеток, для которых было показано, что они поддерживают рост гемопоэтических предшественников, выделенных из костного мозга. Так, D.S. Kaufman и соавт. (2001), первыми показавшие возможность дифференцировки ЭСК человека по гемопоэтическому пути [23], использовали линии клеток костного мозга S17 и эндотелия желточного мешка мыши C166 [68, 69]. Наиболее широко для регуляции дифференцировки ПСК человека используются стромальные клетки мыши линии OP9 [47; 70—72]. Также возможна эффективная индукция дифференцировки ПСК человека с использованием стромальных клеток, полученных их аорта-гона-до-мезонефроса и зародышевой печени мыши [67, 73-76].

Независимо друг от друга, разные группы исследователей получили ряд похожих результатов. Во-первых, при дифференцировке методом совмест-

А Б

• BMP4

.. • SCF

Индукторы ^ FGF

дифференцировки ^ VEGF

• FLT-3-ligand

• TPO

ного культивирования и через стадию эмбриоидных телец наблюдается сходная временная шкала диф-ференцировки, в то время как сам процесс является следствием случайных событий, происходящих в ходе дифференцировки, а повышение вероятности дифференцировки по выбранному направлению достигается варьированием условий культивирования [23, 29, 30, 42, 49, 51]. Во-вторых, в процессе дифференцировки гемопоэтические клетки развиваются из CD45 + -предшественников, которые экспрессируют поверхностные маркеры CD31 и CD34 [23, 42, 49, 29, 30].

Эритроидные клетки, получаемые из ПСК

В первой же работе по получению клеток крови из ЭСК было показано, что дифференцированные кроветворные предшественники содержат БОЕэ (по результатам теста на образование колоний в полужидких средах) и клетки в эритроидных колониях экспрессируют гликофорин А (CD 235a), основной маркер эритроидных клеток [23]. Последующие работы также продемонстрировали возможность получения эритроидных клеток из ЭСК [30, 42, 43, 49, 65, 77, 78]. Ряд исследований сосредоточены непосредственно на получении эритроидных клеток, причём используются как способ дифференцировки через стадию эмбриоидных телец или совместное культивирование со стромальными клеточными линиями, так и комбинация этих подходов [56, 65, 75, 79-83]. Основные этапы дифференцировки ПСК по пути эритропоэза представлены на рисунке.

Несмотря на достаточное количество опубликованных методик получения эритроидных клеток, ни одна из них не может быть использована для получения эритроцитов, пригодных для клинического использования. Основная причина заключается в том, что эритроидные клетки, получаемые из ПСК человека, как правило, экспрессируют набор глобинов, характерный для эмбриональных эритроцитов

В Г

• Метилцеллюлоза

• Epo

• SCF

• G-CSF

• GM-CSF

• IL-3

• IL-6

Основные этапы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток по пути эритропоэза:

А - плюрипотентные стволовые клетки; Б - эмбриоидные тельца; В - колониеобразующие единицы; Г - эритроидные клетки

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Обзоры

9

была достигнута всего в нескольких исследованиях, причём доля клеток, экспрессирующих р-глобин, была незначительна и скорее демонстрировала возможность эритроидных клеток «созревать». Также одной из проблем является получение энуклеированных эритроцитов. Энуклеация взрослых эритроидных клеток in vitro была достигнута при дифференциров-ке ГСК, полученных из взрослых гемопоэтических тканей. Перенести разработанные методы на эри-троидные клетки, получаемые из ПСК, не удалось. Одним из объяснений данного явления может быть то, что эритроидные клетки, получаемые из ПСК, представляют собой аналог примитивных эритро-идных клеток человека, появляющихся в процессе онтогенеза в желточном мешке. Такие клетки выходят в кровоток содержащими ядра, и уже в процессе циркуляции происходит их энуклеация. Действительно, если рассматривать ЭТ как модель желточного мешка, то получение при дифференцировке через стадию ЭТ преимущественно ранних кроветворных клеток, таких как примитивные эритроциты, является вполне логичным [85]. Совместное культивирование ПСК со стромальными клеточными линиями из взрослых кроветворных тканей могло бы обеспечить более подходящие условия для эффективного получения взрослых кроветворных клеток.

Наиболее интересные результаты при дифферен-цировке через стадию ЭТ были получены H. Lapillonne и соавт. (2010) [83]. 93% полученных эритроидных клеток экспрессировали фетальный гемоглобин HbF и всего 2,3% и 4,3% из общего гемоглобина было эмбриональным (HbGower1/HbGower2). Кинетика связывания CO2 гемоглобином, выделенным из полученных клеток, была практически полностью идентична образцам, полученным из образцов зародышевой крови человека. Кроме того, 4—10% эритроцитов, полученных из иПСК, и 52—66%, полученных из ЭСК, было энуклеировано. Эта же группа исследователей показала, что при введении эритроидных предшественников, полученных из ПСК человека, иммунодефицитным мышам происходит переключение экспрессии глобиновых генов на взрослый тип [12]. Данное наблюдение свидетельствует о том, что полное созревание эритроидных клеток, полученных из ПСК человека, возможно, и для этого, по всей видимости, необходимо создание микроокружения, поддерживающего взрослый гемопоэз [86—87]. При использовании для индукции дифференцировки ПСК клеточной линии, полученной из печени зародыша мыши, было показано, что стромальное микроокружение, поддерживающее дефинитивный гемопоэз in vivo, in vitro активирует переключение синтеза глобинов с набора HbGowerl/ HbGower2, характерного для примитивных эритроидных линий, на HbF — гемоглобина дефинитивных эритроцитов зародышевого типа, но не на гемоглобин взрослого типа [65]. Уровень энуклеации был также предельно низким и не превышал 16%, в то время как для Сй34+-клеток, выделенных из пуповинной и периферической крови, составлял 25—35% и 60—70%, соответственно, при дифференцировке в этих же условиях. Таким образом, наличие соответствующего стромального микроокружения не является достаточным условием для дифференцировки в энуклеированые эритроидные клетки зрелого типа.

При эритроидной дифференцировке иПСК, в отличие от ЭСК, не достигается терминальная стадия

процесса [78, 88, 89], хотя иПСК дифференцируются в эндотелиальные клетки и эритробласты [89]. Было показано, что иПСК демонстрируют значительно более высокий уровень апоптоза, ограниченную пролифератичную активность и способность к дифференцировке, в том числе в гемопоэтическом направлении [89]. Другие авторы, напротив, продемонстрировали, что иПСК не отличаются от ЭСК по возможности достигать терминальной стадии эри-троидной дифференцировки и экспрессируют набор эритроидных маркеров, идентичный дифференцированным производным ЭСК [65]. Однако всеми отмечено, что иПСК и ЭСК различаются по количеству дифференцированных эритроидных производных по сравнению с изначальным количеством ПСК, использованных для дифференцировки [65, 89]. В то же время, C. Chang с соавт. (2011) при индукции эритроидной дифференцировки иПСК, полученных из различных соматических линий (фибробластов кожи, эмбриональных и фетальных мезенхимных стволовых клеток), показали, что полностью репро-граммированные иПСК вне зависимости от возраста доноров и типа соматических клеток подвергаются эритроидной дифференцировке с той же эффективностью, что и ЭСК, а конечным продуктом являются зрелые эритроидные клетки, экспрессирующие (по данным HPLC) соответствующий ЭСК уровень эмбриональных и фетальных глобинов [81]. По нашим собственным наблюдениям иПСК и ЭСК в значительной степени отличаются друг от друга по потенциалу эри-троидной дифференцировки (в большей степени, чем различаются между собой различные линии ЭСК). иПСК, полученные из эндотелия пупочной вены, являются полностью репрограммироваными по данным in vitro и in vivo анализов [90, 91]. Однако они демонстрируют высокий пролиферативный потенциал при дифференцировке по эритроидному пути, большую долю эритроидных клеток, по сравнению с клеточными типами других ветвей гемопоэза, высокий выход эритроидных клеток, полученный на единицу иПСК, подвергнутых дифференцировке, по сравнению с различными линиями ЭСК, культивируемыми в лаборатории. Несмотря на полноту репрограммирования по функциональным и молекулярным критериям, по всей видимости, эффекты соматической памяти сохраняются. Для подтверждения данного предположения нами была использована линия ЭСК, содержащая в своём геноме факторы репрограммирования под инду-цибельными промоторами [Шутова и соавт., публикация готовится]. иПСК, полученные при репрограммировании нейрональных клеток, дифференцированных из данной линии ЭСК, демонстрируют низкий потенциал дифференцировки по гемопоэтическому пути, по сравнению с исходной линией ЭСК, при том что и ЭСК, и иПСК имеют идентичный генетический фон, а иПСК полностью репрограммированы [Филоненко и соавт., публикация готовится]. Нейрональная ткань и кровь — производные разных зародышевых листков, и остаточная соматическая память отражается на способности иПСК, полученных из нейрональных клеток, дифференцироваться по гемопоэтическому пути.

Таким образом, нет однозначного мнения о пригодности иПСК для получения эритроидных клеток. Хотя весьма привлекательно выглядит перспектива использования иПСК в качестве персонифицированного источника эритроидных клеток для трансплантации, учитывая возможность генетической

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

10

Обзоры

коррекции дефектов при тяжёлых наследственных заболеваниях, типа анемий.

В животных модельных системах с использованием ПСК мыши были успешно получены как различные типы зрелых клеток крови, так и ГСК, способные к длительной репопуляции костного мозга облучённых мышей. Из иПСК мыши, больной гемоглобинопатией, с использованием методов генетической коррекции были получены нормальные аутологичные ГСК, пригодные для трансплантации и лечения серповидноклеточной анемии [92]. Впоследствии данный подход был применён и для коррекции иПСК человека, полученных из фибробластов пациента, страдающего тем же заболеванием [93]. Однако до сих пор не получено ни ГСК человека, способных к длительной репопуляции костного мозга, ни форменных элементов крови, по качеству и количеству пригодных для трансплантации.

Использованию эритроидных клеток, полученных из ПСК, в клинических целях препятствует также такой немаловажный факт, как довольно длительное время дифференцировки ПСК до состояния эритроид-ной клетки, занимающее, как правило, более месяца. Альтернативой получению эритроидных клеток из ПСК может служить получение эритроидных клеток из CD34+-клеток, предварительно дифференцированных из ПСК и сохраненных. E. Olivier с соавт. (2012) опубликовали бессывороточный протокол индукции дифференцировки CD34+-клеток, полученных из ЭСК и выделенных из 6—8-недельного желточного мешка, 16—18-недельной печени зародыша, пуповинной и периферической крови [94]. Полученные эритроидные клетки экспрессировали набор глобинов, соответствующий стадии развития Сй34+-клеток: HbF из желточного мешка и зародышевой печени, зародышевый и взрослый гемоглобины — из Сй34+-пупочной вены, взрослый гемоглобин — из Сй34+-клеток периферической крови. Сй34+-клетки, полученные из ЭСК, дифференцировались в эритроидные клетки, практически идентичные полученным из желточного мешка и зародышевой печени. Авторы отметили, что пролиферативный потенциал Сй34+-клеток из ЭСК был низким, однако, учитывая тот факт, что большинство Сй34+-клеток, получаемых при дифференцировке ПСК, не являются кроветворными и погибают в селективных для гемопоэза условиях культивирования, 1%-5% выживших клеток имеют пролиферативный потенциал схожий или даже превышающий потенциал Сй34+-клеток желточного мешка и зародышевой печени. Таким образом, была показана возможность эффективной дифференцировки Сй34+-клеток, полученных из ЭСК, в эритроидные клетки: 3х105 Сй34+-клеток можно получить с 1 лунки 6-луночно-го планшета ЭСК (3х10в клеток), из которых может быть получено 1010 эритроидных клеток. Таким образом, получение эритроидных клеток ограничено размерами биореактора и, конечно, высокой стоимостью факторов дифференцировки. В связи с этой работой стоит отметить тот факт, что Сй34 является марке-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7.

2. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663-76.

ром ГСК, однако Сй34+-клетки, получаемые из ЭСК, имеют сходство с Сй34--клетками эмбрионального происхождения и не являются ГСК в прямом смысле этого слова, не репопулируют облучённых животных, а скорее представляют собой более ранние предшественники кроветворных клеток, чем собственно ГСК. Но Сй34+-клетки, получаемые из ЭСК, могут быть хорошим источником эритроцитарной массы.

Сейчас перспективным направлением исследований является непосредственная конверсия одних клеточных типов в другие. Так соматические клетки напрямую были репрограммированы в такие дифференцированные клеточные типы, как миобласты [95], макрофаги [96], бета-клетки [97] и нейроны [98]. V.M. Sandler с соавт. (2011) показали, что репрограммирование эмбриональных фибробластов человека в гемопоэтические клетки возможно при слиянии с Сй34+-клетками, выделенными из зародышевой печени [99]. Также было показано репрограммирование фибробластов человека в кроветворные предшественники путём эктопической экспрессии OCT4 [100]. Прямое репрограммирование дифференцированных клеточных типов в тканеспецифические предшественники открывает перспективы как для развития новых методов клеточной терапии, так и для лучшего понимания механизмов репрограммирования [101, 102], клеточной пластичности in vitro [103] и in vivo [104], а также онтогенеза человека [65].

Заключение

Исследования, проведённые в области гемопоэтической дифференцировки ПСК, позволили получить различные клеточные типы клеток крови, включая клетки эритроидного ряда. Однако до конкретного использования эритроидных клеток, дифференцированных из ПСК, в клинической практике, предстоит ещё решить ряд вопросов, таких как получение чистых популяций взрослых типов энуклеированных эритроцитов; возможность использования фетальных эритроцитов для трансплантации; получение эритроидных клеток без использования неохарактеризованных компонетов и компонентов животного происхождения; возможность применения в клинических целях эритроидных предшественников; использование прямого репрограммирования соматических клеток для получения зрелых эритроцитов и ряд других. В то же время, разработанные модельные системы эритропоэза человека in vitro уже сейчас дают возможность решать фундаментальные проблемы, касающиеся генетики человека, регуляции транскрипции, изучения биохимии и структуры мембран, и других вопросов.

Благодарности

Работа поддержана Государственным контрактом 14.512.11.0025, грантом компании ОПТЭК для поддержки молодых ученых (Е.С.Ф.) и грантом РФФИ 11-04-01504-а.

3. Ballen K.K., Koreth J., Chen Y.B. et al. Selection of optimal alternative graft source: mismatched unrelated donor, umbilical cord blood, or haploidentical transplant. Blood 2012; 119(9): 1972-80.

4. Korbling M., Freireich E.J. Twenty-five years of peripheral blood stem cell transplantation. Blood. 2011; 17(24): 6411-6.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Обзоры

11

5. Moore M.A., Metcalf D. Ontogeny of the haemopoietic system: yolk sac origin of in vivo and in vitro colony forming cells in the developing mouse embryo. Br. J. Haematol. 1970; 18: 279—96.

6. Palis J., Yoder M.C. Yolk-sac hematopoiesis: the first blood cells of mouse and man. Exp. Hematol. 2001; 29: 927—36.

7. Galloway J.L., Zon L.I. Ontogeny of hematopoiesis: examining the emergence of hematopoietic cells. 2003; 53: 139—58.

8. Palis J., Malik J., McGrath K.E. et al. Primitive erythropoiesis in the mammalian embryo. Int. J. Dev. Biol. 2010; 54: 1011—8.

9. Medvinsky A.L., Samoylina N.L., Muller A.M. et al. An early preliver intraembryonic source of CFU-S in the developing mouse. Nature 1993; 364: 64-7.

10. Tavian M., Hallais M.F., Peault B. Emergence of intraembryonic hematopoietic precursors in the pre-liver human embryo. Development 1999; 126: 793-803.

11. Bradley T.R., Metcalf D. The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1966; 44: 287-99.

12. Dexter T.M., Allen T.D., Lajtha L.G. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J. Cell Physiol. 1977; 91(3): 335-44.

13. Sutherland H.J., Lansdorp P.M., Henkelman D.H. et al. Functional characterization of individual human hematopoietic stem cells cultured at limiting dilution on supportive marrow stromal layers. PNAS USA 1990; 87(9): 3584-8.

14. Kobari L., Pflumio F., Giarratana M. et al. In vitro and in vivo evidence for the long-term multilineage (myeloid, B, NK, and T) reconstitution capacity of ex vivo expanded human CD34( + ) cord blood cells. Exp. Hematol. 2000; 28(12): 1470-80.

15. Buhring H.J., Muller T., Herbst R. et al. The adhesion molecule E-cadherin and a surface antigen recognized by the antibody 9C4 are selectively expressed on erythroid cells of defined maturational stages. Leukemia 1996; 10: 106-16.

16. Cantor A.B., Orkin S.H. Transcriptional regulation of erythropoiesis: an affair involving multiple partners. Oncogene 2002; 21: 3368-76.

17. Kennedy M., D'souza S.L., Lynch-Kattman M. et al. Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures. Blood 2007; 7: 2679-87.

18. Nakano T., Kodama H., Honjo T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science 1996; 272: 722-4.

19. Brotherton T.W., Chui D.H., Gauldie J. et al. Hemoglobin ontogeny during normal mouse fetal development. PNAS USA 1979; 76: 2853-7.

20. Barker J.E. Development of the mouse hematopoietic system, I: types of hemoglobin produced in embryonic yolk sac and liver. Dev. Biol. 1968; 18: 14-29.

21. Peschle C., Migliaccio A.R., Migliaccio G. et al. Embryonic-fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. PNAS USA 1984; 81: 2416-20.

22. Peschle C., Mavilio F., Care A. et al. Haemoglobin switching in human embryos: asynchrony of zeta-alpha and epsilon-gamma-globin switches in primitive and definite erythropoietic lineage. Nature 1985; 313: 235-8.

23. Kaufman D.S., Hanson E.T., Lewis R.L. et al. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. PNAS USA 2001; 98: 10716-21.

24. Keller G., Kennedy M., Papayannopoulou T. et al. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol. Cell Biol. 1993; 13(1): 473-86.

25. Keller G.M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr. Opin. Cell Biol. 1995; 7(6): 862-9.

26. Nakano T., Kodama H., Honjo T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science 1994; 265(5175): 1098-101.

27. Palacios R., Golunski E., Samaridis J. In vitro generation of hematopoietic stem cells from an embryonic stem cell line. PNAS USA 1995; 92(16): 7530-4.

28. Ogawa M., Kizumoto M., Nishikawa S. et al. Expression of alpha4-integrin defines the earliest precursor of hematopoietic cell lineage diverged from endothelial cells. Blood 1999; 93(4): 1168-77.

29. Wang L., Li L., Shojaei F. et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity 2004; 20: 31-41.

30. Zambidis E.T., Peault B., Park T.S. et al. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hemato-endothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood 2005; 107: 860-70.

31. Nishikawa S.I., Nishikawa S., Hirashima M. et al. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin + cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development 1998; 125: 1747-57.

32. Choi K., Kennedy M., Kazarov A. et al. A common precursor for hematopoietic and endothelial cells. Development 1998; 125: 725-32.

33. Cho S.K., Bourdeau A., Letarte M. et al. Expression and function of CD105 during the onset of hematopoiesis from Flk1( + ) precursors. Blood 2001; 98: 3635-42.

34. Chung Y.S., Zhang W.J., Arentson E. et al. Lineage analysis of the hemangioblast as defined by FLK1 and SCL expression. Development 2002; 129: 5511-20.

35. Boggs D.R., Saxe D.F., Boggs S.S. Aging and hematopoiesis. II. The ability of bone marrow cells from young and aged mice to cure and maintain cure in W/Wv. Transplantation 1984; 37: 300-6.

36. Baum C.M., Weissman I.L., Tsukamoto A.S. et al. Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population. PNAS USA 1992; 89(7): 2804-8.

37. Morrison S.J., Uchida N., Weissman I.L. The biology of hematopoietic stem cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1995; 11: 35-71.

38. Goodell M.A., Rosenzweig M., Kim H. et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat. Med. 1997; 3(12): 1337-45.

39. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch B. et al A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity. Nat. Med. 1998; 4(9): 1038-45.

40. Nakamura Y., Ando K., Chargui J. et al. Ex vivo generation of CD34( + ) cells from CD34(-) hematopoietic cells. Blood 1999; 94(12): 4053-9.

41. Sato T., Laver J.H., Ogawa M. Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells. Blood 1999; 94(8): 2548-54.

42. Vodyanik M.A., Bork J.A., Thomson J.A. et al. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood 2005; 105: 617-26.

43. Qiu C., Hanson E., Olivier E. et al. Differentiation of human embryonic stem cells into hematopoietic cells by coculture with human fetal liver cells recapitulates the globin switch that occurs early in development. Exp. Hematol. 2005; 33: 1450-8.

44. Tian X., Morris J.K., Linehan J.L. et al. Cytokine requirements differ for stroma and embryoid body-mediated hematopoiesis from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 2004; 32: 1000-9.

45. Tian X., Woll P.S., Morris J.K. et al. Hematopoietic engraftment of human embryonic stem cellderived cells is regulated by recipient innate immunity. Stem Cells. 2006; 24: 1370-80.

46. Woll P.S., Martin C.H., Miller J.S. et al. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. J. Immunol. 2005; 175: 5095-103.

47. Slukvin I.I., Vodyanik M.A., Thomson J.A. et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional dendritic cells through the myeloid pathway. J. Immunol. 2006; 176: 2924-32.

48. Narayan A.D., Chase J.L., Lewis R.L. et al. Human embryonic stem cell-derived hematopoietic cells are capable of engrafting primary as well as secondary fetal sheep recipients. Blood 2005; 107: 2180-3.

49. Chadwick K., Wang L., Li L. et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood 2003; 102: 906-15.

50. Cerdan C., Rouleau A., Bhatia M. VEGF-A165 augments erythropoietic development from human embryonic stem cells. Blood 2004; 103: 2504-12.

51. Zhan X., Dravid G., Ye Z. et al. Functional antigen-presenting leucocytes derived from human embryonic stem cells in vitro. Lancet 2004; 364: 163-71.

52. Ng E.S., Davis R.P., Azzola L. et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood 2005; 106: 1601-3.

53. Cameron C.M., Hu W.S., Kaufman D.S. Improved development of human embryonic stem cell-derived embryoid bodies by stirred vessel cultivation. Biotechnol Bioeng. 2006; 94: 938-48.

54. Bowles K.M., Vallier L., Smith J.R. et al. HOXB4 overexpression promotes hematopoietic development by human embryonic stem cells. Stem Cells 2006; 24: 1359-69.

55. Wang L., Menendez P., Shojaei F. et al. Generation of hematopoietic repopulating cells from human embryonic stem cells independent of ectopic HOXB4 expression. J. Exp. Med. 2005; 201: 1603-14.

56. Lu S.J., Feng Q., Park J.S. et al. Biologic properties and enucleation of red blood cells from human embryonic stem cells. Blood 2008; 112(12): 4475-84.

57. Itskovitz-Eldor J., Schuldiner M., Karsenti D. et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Mol. Med. 2000; 6: 88-95.

58. Kehat I., Kenyagin-Karsenti D., Snir M. et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J. Clin. Invest. 2001; 108: 407-14.

59. Assady S., Maor G., Amit M., et al. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 2001; 50: 1691-7.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

12

Обзоры

60. Levenberg S., Golub J.S., Amit M. et al. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. PNAS USA 2002; 99: 4391-6.

61. Murdoch B., Gallacher L., Chadwick K. et al. Human embryonic-derived hematopoietic repopulating cells require distinct factors to sustain in vivo repopulating function. Exp. Hematol. 2002; 30: 598605.

62. Bhatia M., Bonnet D., Kapp U. et al. Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic repopulating cells after short-term ex vivo culture. J. Exp. Med. 1997; 186: 619-24.

63. Bhardwaj G., Murdoch B., Wu D. et al. Sonic hedgehog induces the proliferation of primitive human hematopoietic cells via BMP regulation. Nat. Immunol. 2001; 2: 172-80.

64. Bhatia M., Bonnet D., Wu D. et al. Bone morphogenetic proteins regulate the developmental program of human hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 1999; 189: 1139-48.

65. Qiu C., Olivier E.N., Velho M. et al. Globin switches in yolk sac-like primitive and fetal-like definitive red blood cells produced from human embryonic stem cells. Blood 2008; 111: 2400-8.

66. Kobari L., Yates F., Oudrhiri N. et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica 2012; 97(12): 1795-803.

67. Olivier E., Qiu C., Bouhassira E.E. Novel, high-yield red blood cell production methods from CD34-positive cells derived from human embryonic stem, yolk sac, fetal liver, cord blood, and peripheral blood. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1(8): 604-14.

68. Wineman, J., Moore K., Lemischka I. et al. Functional heterogeneity of the hematopoietic microenvironment: rare stromal elements maintain long-term repopulating stem cells. Blood 1996; 87(10): 4082-90

69. Lu L.S., Wang S.J., Auerbach R. In vitro and in vivo differentiation into B cells, T cells, and myeloid cells of primitive yolk sac hematopoietic precursor cells expanded > 100-fold by coculture with a clonal yolk sac endothelial cell line. PNAS USA 1996; 93(25): 14782-7.

70. Gaur M., Kamata T., Wang S. et al. Megakaryocytes derived from human embryonic stem cells: a genetically tractable system to study megakaryocytopoiesis and integrin function. J. Thromb. Haemost. 2006; 4: 436-42.

71. Takayama N., Nishikii H., Usui J. et al. Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs, VEGF-promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors. Blood 2008; 111: 5298-306.

72. Timmermans F., Velghe I., Vanwalleghem L. et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. J. Immunol. 2009; 182: 6879-88.

73. Xu M.J., Tsuji K., Ueda T. et al. Stimulation of mouse and human primitive hematopoiesis by murine embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cell lines. Blood 1998; 92: 2032-40.

74. Ma F., Wang D., Hanada S. et al. Novel method for efficient production of multipotential hematopoietic progenitors from human embryonic stem cells. Int. J. Hematol. 2007; 85: 371-9.

75. Ma F., Ebihara Y., Umeda K. et al. Generation of functional erythrocytes from human embryonic stem cell-derived definitive hematopoiesis. PNAS USA 2008; 105: 13087-92.

76. Ma F., Gu Y., Nishihama N. et al. Differentiation of human embryonic and induced pluripotent stem cells in coculture with murine stromal cells. In: Marton P, Ye K, Jin S, editors. Human embryonic and induced pluripotent stem cells lineage-specific differentiation protocols. New York: Humana Press; 2011. p. 321-35.

77. Vodyanik M.A., Thomson J.A., Slukvin I.I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood 2006; 108(6): 2095-105.

78. Choi K.D., Vodyanik M.A., Slukvin I.I. Generation of mature human myelomonocytic cells through expansion and differentiation of pluripotent stem cell-derived lin-CD34+CD43+CD45+ progenitors. J. Clin. Invest. 2009; 119: 2818-29

79. Olivier E.N., Qiu C., Velho M. et al. Largescale production of embryonic red blood cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 2006; 34: 1635-42.

80. Chang K.H., Nelson A.M., Cao H. et al. Definitive-like erythroid cells derived from human embryonic stem cells coexpress high levels of embryonic and fetal globins with little or no adult globin. Blood 2006; 108(5): 1515-23.

81. Chang C.J., Mitra K., Koya M. et al. Production of embryonic and fetal-like red blood cells from human induced pluripotent stem cells. PLoS One 2011; 6: e25761.

82. Dias J., Gumenyuk M., Kang H. et al. Generation of red blood cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 2011; 20: 1639-47.

83. Lapillonne H., Kobari L., Mazurier C. et al. Red blood cell generation from human induced pluripotent stem cells: perspectives for transfusion medicine. Haematologica 2010; 95(10): 1651-9.

84. Chang K.H., Huang A., Hirata R.K. et al. Globin phenotype of erythroid cells derived from human induced pluripotent stem cells. Blood 2010; 115(12): 2553-4.

85. Sakamoto H., Tsuji-Tamura K., Ogawa M. Hematopoiesis from pluripotent stem cell lines. Int. J. Hematol. 2010; 91: 384-91.

86. Neildez-Nguyen T.M., Wajcman H., Marden M.C. et al. Human erythroid cells produced ex vivo at large scale differentiate into red blood cells in vivo. Nat. Biotechnol. 2002; 20(5): 467-72.

87. Hayakawa J., Hsieh M.M., Anderson D.E. et al. The assessment of human erythroid output in NOD/SCID mice reconstituted with human hematopoietic stem cells. Cell Transplant. 2010; 19(11): 1465-73.

88. Choi K.D., Yu J., Smuga-Otto K. et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells 2009; 27(3): 559-67.

89. Feng Q., Lu S.J., Klimanskaya I. et al. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells 2010; 28(4): 704-12.

90. Shutova M.V., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., et al. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Acta Naturae 2009; 1(2): 91-2.

91. Lagarkova M.A., Shutova M.V., Bogomazova A.N. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. Cell Cycle 2010; 9(5): 937-46.

92. Hanna J., Wernig M., Markoulaki S. et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 2007; 5858: 1920-23.

93. Sebastiano V., Maeder M.L., Angstman J.F. et al. In situ genetic correction of the sickle cell anemia mutation in human induced pluripotent stem cells using engineered zinc finger nucleases. Stem Cells 2011; 29(11): 1717-26.

94. Olivier E., Qiu C., Bouhassira E.E. Novel, high-yield red blood cell production methods from CD34-positive cells derived from human embryonic stem, yolk sac, fetal liver, cord blood, and peripheral blood. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1(8): 604-14.

95. Davis R.L., Weintraub H., Lassar A.B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell 1987; 51: 987-1000.

96. Xie H., Ye M., Feng R. et al. Stepwise reprogramming of B cells into macrophages. Cell 2004; 117: 663-76.

97. Zhou Q., Brown J., Kanarek A. et al. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature 2008; 455: 627-32.

98. Vierbuchen T., Ostermeier A., Pang Z.P. et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 2010; 463: 1035-41.

99. Sandler V.M., Lailler N., Bouhassira E.E. Reprogramming of embryonic human fibroblasts into fetal hematopoietic progenitors by fusion with human fetal liver CD34+ cells. PLoS One 2011; 6(4): e18265.

100. Szabo E., Rampalli S., Risueno R.M. et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature 2010; 468(7323): 521-6.

101. Philonenko E.S., Shutova M.V., Chestkov I.V. et al. Current progress and potential practical application for human pluripotent stem cells. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2011; 292: 153-96.

102. Bhutani N., Brady J.J., Damian M. et al. Reprogramming towards pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation. Nature 2010; 463: 1042-7.

103. Yamanaka S., Blau H.M. Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature 2010; 465: 704-12.

104. Johansson C.B., Youssef S., Koleckar K. et al. Extensive fusion of haematopoietic cells with Purkinje neurons in response to chronic inflammation. Nat. Cell Biol. 2008; 10: 575-83.

Поступила 0306.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013