СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИГЕПАТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCING AN AGENT POSSESSING ANTIHEPATOTOXIC ACTIVITY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения средства, обладающего антигепатотоксическим действием, из лекарственного растительного сырья.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Токсические поражения печени занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения, прежде всего, вследствие увеличения числа алкогольных интоксикаций, неконтролируемого широкомасштабного применения лекарственных препаратов, загрязнения окружающей среды, в том числе воды и продуктов питания, чужеродными химическими соединениями (В.Т. Ивашкин. Гастроэнтерология: национальное руководство. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 704 с).
Рынок лекарственных препаратов растительного происхождения с доказанной антигепатотоксической активностью на сегодняшний день не велик, при этом проблема эффективной терапии далека от своего разрешения. Несмотря на использование достаточно активных профилактических мер и постоянно совершенствующихся методов лечения, даже при комплексном применении высокоэффективных антигепатоксических средств осложненные формы токсических гепатитов встречаются в 26-42% случаев, а у 15-25% больных существует проблема резистентности токсических гепатитов к самому современному терапевтическому воздействию (Джавахян М.А., Канунникова Ю.С. Анализ рынка современных средств гепатопротекторного действия //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - Т. 10. - №. 11. - С. 63-65.).
В связи с этим, актуальным является поиск средств, способных повышать резистентность печени к повреждающему действию токсинов и стимулировать процессы детоксикации (Николаев СМ. Фитофармакотерапия и фитофармакопрофилактика заболеваний. - Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2012. - 286 с).
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ получения препарата карсил, применяемого для лечения заболеваний гепатобилиарной системы (Авторское свидетельство N 63688/83 (Болгария). Метод за извличане на флавонолигнани от семена на Silybum marianum (L.) Gaertn. Даниела Методиева Бочева, Божидар Тодоров Тодоров и др.). Препарат карсил представляет собой сухой экстракт, получаемый из плодов расторопши пятнистой. Плоды расторопши пятнистой измельчают и обезжиривают циклогексаном в соотношении 1:3 (сырье: растворитель) в течение 3 ч при температуре 75-80°С. Операцию повторяют четыре раза. Затем циклогексан отделяют фильтрованием, сырье сушат на воздухе в течение 4-6 ч и передают на следующую стадию. Обезжиренные плоды экстрагируют 5-кратно ацетоном в соотношении 1:3 (сырье: растворитель) по 3 ч при слабом кипении экстрагента. Объединенные ацетоновые экстракты концентрируют до 1/3 объема при температуре 60-65°С. Концентрированный экстракт смешивают с водой, подогретой до 35-40°С. После охлаждения смесь обрабатывают дважды циклогексаном. Водный слой отделяют, готовый продукт осаждают 25%-ным раствором хлорида натрия. Осадок карсила промывают водой до отсутствия ионов хлора. Готовый продукт сушат в вакуум-сушильном шкафу и измельчают. Полученный по данной схеме сухой экстракт представляет собой аморфный порошок от бежевого до светло-коричневого цвета, без запаха, горьковатого вкуса. Основными действующими веществами являются флаволигнаны (Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2 т. -14-е изд. М.: 2000.).
Недостатком прототипа является сложная, многостадийная, трудоемкая технология получения экстракта и использование больших количеств легколетучих растворителей.
Настоящее изобретение решает техническую проблему необходимости расширении ассортимента отечественных высокоэффективных и безопасных лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний гепатобилиарной системы (Приказ Минздрава России от 13.02.2013 №66 (ред. от 07.04.2016) «Об утверждении Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 года и плана ее реализации»).
Техническим результатом заявленного изобретения является улучшение детоксицирующей функции печени и повышение активности ее цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы.
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что комплексный растительный экстракт корней и корневищ девясила высокого (Inula helenium L.), травы золотысячника обыкновенного  цветков пижмы обыкновенной  плодов шиповника (Rosa sp.) и плодов боярышника (Crataegus sp.) обладает выраженным антигепатотоксическим действием.
Компоненты растительного сбора были подобраны с учетом многофакторных механизмов развития заболеваний гепатобилиарной системы и соответствуют принципам фармакологической регуляции функций систем пищеварения.
Корни и корневища девясила высокого семейства Астровые (Asteraceae) содержат комплекс биологически активных веществ, оказывающих противовоспалительное действие и стимулирующих регенерацию тканей в органах желудочно-кишечного тракта (Энциклопедия фитотерапии. Травы жизни профессора Корсуна. М.: ЗАО Центрополиграф, 2007. - 443 с). Девясил высокий входит в состав отхаркивающих средств, применяемых при острых и хронических заболеваниях дыхательных путей, а также противоязвенных средств для лечения длительно незаживающих язв (Лекарственные растения, возделываемые в России/ И.Д. Семенихин, В.И. Семенихин. - М, 2013. - 240 с). На основе корней девясила высокого разработан препарат «Аллантон», обладающий противовоспалительным и гастропротективным действием.
Трава золототысячника обыкновенного семейства Горечавковые (Gentianaceae) оказывает желчегонное действие и стимулирует секрецию пищеварительных желез (Лекарственные растения в гепатологии. - М., Издательский дом «Русский врач», 2005. -274 с; Государственная Фармакопея Российской федерации XIV изд. - М., 2018). В медицине траву золототысячника обыкновенного используют как горечь для возбуждения аппетита, а также при заболеваниях печени и желчевыводящих путей (Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия). - М. Медицина, 1984.-464 с).
Цветки пижмы обыкновенной семейства Астровые (Asterales) содержат флавоноиды, обладающие спазмолитической активностью в отношении желчевыводящих путей и оказывающие стимулирующее действие на образование желчи (Лекарственные растения в гепатологии. - М., Издательский дом «Русский врач», 2005. -274 с; Государственная Фармакопея Российской федерации XIV изд. - М., 2018). Биологически активные вещества цветков пижмы проявляют также противовоспалительную и гепатопротекторную активность. В ФГБНУ ВИЛАР на основе экстракта цветков пижмы разработан препарат «Танацехол» для лечения хронического холецистита (Лекарственные растения, возделываемые в России/ И.Д. Семенихин, В.И. Семенихин. - М, 2013. - 240 с; Лекарственные средства из растений (опыт ВИЛАР): научное издание/ С.А. Вичканова, В.К. Колхир, Т.А. Сокольская, И.В. Воскобойникова, В.А. Быков. - М.6 АДРИС, 2009. -432 с).
Плоды шиповника семейства Розовые (Rosaceae) содержат комплекс поливитаминов, оказывающих противовоспалительное и желчегонное действие (Лекарственные растения в гепатологии. - М., Издательский дом «Русский врач», 2005. -274 с; Государственная Фармакопея Российской федерации XIV изд. - М, 2018). Биологически активные вещества плодов шиповника ускоряют окислительно-восстановительные процессы в организме, повышают сопротивляемость организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды и инфекционным факторам. Препараты на основе плодов шиповника применяют при острых и хронических заболеваниях печени, желчных путей, гиповитаминозах и заболеваниях, сопровождающихся повышенной потребностью организма в витаминах (Энциклопедия фитотерапии. Травы жизни профессора Корсуна. М.: ЗАО Центрополиграф, 2007. - 443 с).
Плоды боярышника семейства Розовые (Rosaceae) содержат сапонины, регулирующие тонус сосудов и оказывающие спазмолитическое действие (Лекарственные растения, возделываемые в России/ И.Д. Семенихин, В.И. Семенихин. - М, 2013. - 240 с; Энциклопедия фитотерапии. Травы жизни профессора Корсуна. М.: ЗАО Центрополиграф, 2007. - 443 с). Настои и экстракты плодов боярышника применяют как препараты, оказывающие седативное действие, нормализующие артериальное давление и тонизирующие сердечно-сосудистую систему (Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия). - М. Медицина, 1984. - 464 с).
Уровень техники содержит сведения о противовоспалительном, спазмалитическом, желчегонном и гепатопротекторном действии биологически активных веществ, входящих в состав корней и корневищ девясила высокого, травы золотысячника обыкновенного, цветков пижмы обыкновенной, плодов шиповника и плодов боярышника, однако применение комплекса указанных лекарственных трав для получения средства, обладающего антигепатотоксической активностью неизвестно.
Комплексный растительный экстракт, получаемый согласно настоящему изобретению, содержит различные группы биологически активных веществ (преимущественно полифенольные соединения), обладающие широким спектром биологической активности, благодаря чему обеспечивается целостное антигепатотоксическое действие препарата. Экспериментальным путем было установлено оптимальное соотношение компонентов в исходном растительном сборе, обеспечивающее воспроизводимость фармакологического эффекта.
Указанный технический результат достигается осуществлением заявленного способа получения средства, обладающего антигепатотоксическим действием. Способ включает следующие последовательные стадии. Растительный сбор, содержащий 15% мас.
травы золототысячника обыкновенного, 10% мас. цветков пижмы обыкновенной, 25% мае. корневищ с корнями девясила высокого, 27,5% мас. плодов шиповника, 22,5% мае. плодов боярышника, трижды экстрагируют 45-55% спиртом этиловым при постоянном перемешивании при 60-70°С в течение 2 часов. Объединенные извлечения упаривают в вакууме, очищают сепарированием и сушат.
Средство, полученное в результате реализации заявленного способа, может быть использовано для получения лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний гепатобилиарной системы. Многокомпонентные средства растительного происхождения являются перспективными для разработки методов фармакологической коррекции указанных состояний. Полученное многокомпонентное средство на основе растительного сбора отличается широтой терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения без риска развития побочных реакций. К преимуществам полученного средства можно также отнести взаимное усиление полезных фармакологических свойств каждого входящего ингредиента, соответствие поливалентности патогенеза заболевания и воздействие в целом на организм больного (Соколов СЛ. Фитотерапия и фитофармакология. Руководство для врачей. - Москва: МИА, 2000. - 976 с; Лубсандоржиева П.-Н.Б. Разработка и стандартизация фитосредств для лечения и профилактики заболеваний органов пищеварения. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2016.-280 с).
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сущность изобретения раскрывается в следующих примерах реализации заявленного способа, которые служат для иллюстрации, но не ограничивают объема притязаний.
Пример 1.
На мельнице для размола измельчали 150 г травы золотысячника обыкновенного до размера частиц диаметром 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-77), 100 г цветков пижмы обыкновенной - до 5 мм (сито №50 ГОСТ 214-77), 250 г корневищ с корнями девясила высокого - до 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-77), 275 г плодов шиповника и 225 г плодов боярышника - до 0,5 мм (сито 0,5 ГОСТ 214-77). Измельченное сырье смешивали и загружали в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливали 12 л 45% об. спирта этилового, с учетом коэффициента водопоглощения (К=2) соотношение сырье: экстрагент составило 1:10. Извлечение фильтровали через серо-шинельное сукно и бязь. В сборник заливали 45% об. спирт этиловый в количестве, равном слитому, и вновь экстрагировали. Операцию повторяли трижды. Объединенные извлечения сепарировали и упаривали в вакуум-выпарном аппарате до 1/5 первоначального объема. Очищенный концентрированный экстракт сушили в вакуум-сушильном шкафу.
Полученный экстракт (влажность 4,1%) представляет собой сыпучий порошок светло-коричневого цвета, хорошо растворимый в воде. Выход суммы экстрактивных веществ по предлагаемому способу составил 15,6%, содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-стандарт - 0,70%.
Фармакологическое исследование антигепатотоксического действия полученной суммы экстрактивных веществ проводили на здоровых белых крысах линии Wistar в сравнении с лекарственным препаратом карсил.
Для оценки антитоксической функции печени регистрировали продолжительность гексеналового сна по длительности нахождения крыс в боковом положении при внутрибрюшинном введении гексенала в дозе 60 мг/кг массы (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. -944 с). Комплексный растительный экстракт однократно вводили крысам в ранее установленной экспериментально-терапевтической дозе 300 мг/кг.
4
Оценка активности цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы печени была проведена на модели экспериментального токсического тетрахлорметанового гепатита у крыс. Токсическое повреждение печени, вызванное длительным введением CCl, является адекватной моделью цирротического поражения печени человека (Буеверов А.О. Лекарственные поражения печени //Российский медицинский журнал. -2012. -№3. - с. 107-110).
При введении экстракта продолжительность гексеналового сна у крыс составила 9 мин 45 с±1 мин 20 с, при введении препарата карсил - 11 мин 35 с±1 мин 27 с, в контрольной группе контроль (интактные животные) - 14 мин 13 с±2 мин 18 с. Было показано, что полученный экстракт достоверно уменьшает продолжительность гексеналового сна на 30% по сравнению с контролем, в то время как препарат сравнения карсил сокращает продолжительность гексеналового сна на 18,5%. Таким образом, полученный экстракт оказывает более выраженный антигепатотоксический эффект.
При фармакотерапии экспериментального токсического тетрахлорметанового гепатита полученным экстрактом было установлено повышение содержания цитохрома Р450 в микросомах печени белых крыс до 0,60±0,08 нмоль/г, при введении препарата карсил - до 0,53±0,07 нмоль/г белка. В контрольной группе (модель токсического гепатита) животных содержание цитохрома Р450 в микросомах печени составило 0,39±0,06 нмоль/г белка. Использование экстракта позволило повысить количество цитохрома Р450 в микросомах печени на 54% по сравнению с контролем, а препарат карсил - на 36% по сравнению с контролем. Таким образом, было показано, что полученный многокомпонентный растительный экстракт более выражено, чем препарат карсил повышает активность цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы печени в условиях экспериментального токсического тетрахлорметанового гепатита, т.е. стимулирует дезинтоксикационные процессы. Пример 2.
На мельнице для размола измельчали 150 г травы золотысячника обыкновенного до размера частиц диаметром 5 мм, 100 г цветков пижмы обыкновенной - до 5 мм, 250 г корневищ с корнями девясила высокого - до 3 мм, 275 г плодов шиповника и 225 г плодов боярышника - до 0,5 мм. Измельченное сырье смешивали и загружали в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливали 14 л 55% об. спирта этилового, с учетом коэффициента водопоглощения (К=2) соотношение сырье:экстрагент составило 1:12. Экстракцию проводили при 70°С и постоянном перемешивании в течении 2 часов. Извлечение фильтровали через серо-шинельное сукно и бязь в сборник. Заливали 55% этиловый спирт в количестве, равном слитому, и вновь экстрагировали. Операцию повторяли трижды. Объединенные извлечения сепарировали и упаривали в вакуум-выпарном аппарате до 1/5 первоначального объема. Очищенный экстракт сушили в вакуум-сушильном шкафу.
Полученный экстракт (влажность 4,1%) представляет собой сыпучий порошок светло-коричневого цвета, хорошо растворимый в воде. Выход суммы экстрактивных веществ по предлагаемому способу составил 14,6%, содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-стандарт - 0,67%.
Результаты фармакологических исследований показали, что продолжительность гексеналового сна на фоне введения многокомпонентного растительного экстракта уменьшается до 11 мин 30 с ± 1 мин 17 с, на фоне карсила - до 12 мин 35 с ± 1 мин 16 с. В контрольной группе продолжительность гексеналового сна составила (интактные животные) 14 мин 13 с ± 2 мин 18 с. Использование экстракта позволило снизить продолжительность гексеналового сна на 20% по сравнению с контролем, в то время как препарат сравнения карсил - на 11%.
Содержание цитохрома Р450 в микросомах печени на 7 сутки экспериментального токсического тетрахлорметанового гепатита при фармакотерапии полученным экстрактом составило 0,52±0,03 нмоль/мг, на фоне карсила - 0,50±0,04 нмоль/мг белка, в контрольной группе животных - 0,40±0,04 нмоль/мг (модель токсического тетрахлорметанового гепатита). Полученный многокомпонентный растительный экстракт повысил активность цитохрома Р450 на 25% по сравнению с контролем. Таким образом, было показано, что изучаемый многокомпонентный растительный экстракт оказывает более выраженное антигепатотоксическое действие, чем препарат сравнения карсил. Пример 3.
Для определения оптимального соотношения компонентов в сборе были составлены различные композиции из 5 видов лекарственного растительного сырья, приведенные в таблице 1.
Траву золотысячника обыкновенного измельчали на мельнице для размола до размера частиц диаметром 5 мм, цветки пижмы обыкновенной - до 5 мм, корневища с корнями девясила высокого - до 3 мм, плоды шиповника и плоды боярышника - до 0,5 мм Измельченное сырье смешивали в пропорциях, указанных в таблице 1. Полученные смеси растительного сырья использовали для приготовления экстрактов согласно методике, приведенной в примере 1.
Результаты фармакологических исследований показали, что уменьшение доли растительных ингредиентов (I вариант) ведет к ослаблению фармакологического эффекта по сравнению с оптимальным вариантом (II вариант). Увеличение доли компонентов (III вариант) не приводит к значительному увеличению эффективности экстракта, т.е. наступает своеобразное «плато» активности (таблицы 2 и 3).
Таким образом, на основании результатов фармакологических исследований было установлено оптимальное соотношение компонентов в исходном растительном сборе (II вариант), обеспечивающее получение экстракта с выраженным антигепатотоксическим действием.
Предложен следующий состав сырья для экстракции: травы золототысячника обыкновенного -15% мае, цветков пижмы обыкновенной -10% мае, корневищ с корнями девясила высокого - 25% мас, плодов шиповника - 27,5% мас, плодов боярышника - 22,5% мас Наибольший выход экстрактивных веществ и биологически активных флавоноидов из указанного растительного сырья обеспечивается использованием в качестве экстрагента 45-55% об. спирта этилового (таблица 4).
Из результатов, приведенных в примерах следует, что указанная техническая проблема решена - создано многокомпонентное растительное средство антигепатотоксического действия, улучшающее детоксицирующую функцию печени и повышающее активность ее цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы.