СПОСОБ ПРОДУКЦИИ 4-ГИДРОКСИ-L-ИЗОЛЕЙЦИНА

1. Способ получения 4-гидроксиизолейцина или его соли, включающий стадию получения 4-гидроксиизолейцина гидроксилированием изолейцина или его соли в присутствии гидроксилазы, полученной из микроорганизма и продуцирующей 4-гидроксиизолейцин из изолейцина.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизм принадлежит к роду Bacillus.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus, выбран из Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Bacillus sphaericus, Bacillus cereus и Bacillus weihenstephanensis.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция гидроксилирования осуществляется в присутствии лизата клеток, приготовленного из микробных клеток в логарифмической фазе роста.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакции гидроксилирования подвергается L-изолейцин.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидроксилазой является диоксигеназа.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидроксилаза обладает следующими свойствами:
(a) в качестве кофакторов требуются Fe2+, аскорбиновая кислота и α-кетоглутаровая кислота,
(b) имеет оптимальный рН реакции от 5 до 8,
(c) имеет оптимальную температуру реакции 45°С и ниже,
(d) инактивируется при 50°С и выше,
2+
2+
(e) ингибируется ЭДТА, Cu и Zn.
8. Диоксигеназа, обладающая следующими свойствами и выделяемая из бактерии Bacillus:
2+
(a) в качестве кофакторов требуются Fe аскорбиновая кислота и α-кетоглутаровая кислота,
(b) имеет оптимальный рН реакции от 5 до 8,
(c) имеет оптимальную температуру реакции 45°С и ниже,
(d) инактивируется при 50°С и выше,
2+
2+
(e) ингибируется ЭДТА, Cu и Zn,
(f) включает субъединицы, имеющие молекулярную массу 29,000±2,000, что определяется при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле,
(g) имеет на N-конце аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
9. Диоксигеназа по п.8, отличающаяся тем, что бактерией, принадлежащей к роду Bacillus, является бактерия Bacillus thuringiensis.
10. Фрагмент ДНК, выбранный из группы, состоящей из:
(a) фрагмент ДНК, включающий нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 1 (SEQ ID No: 1);
(b) фрагмент ДНК, который гибридизуется в жестких условиях с фрагментом ДНК, имеющим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1, и кодирующим белок, обладающий активностью L-изолейциндиоксигеназы;
(c) фрагмент ДНК, который кодирует белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No: 2);
(d) фрагмент ДНК, который кодирует белок с аминокислотной последовательностью, которая содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающий активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
(e) фрагмент ДНК, который кодирует белок с аминокислотной последовательностью, которая, по крайней мере, на 98% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающий активностью L-изолейциндиоксигеназы.
11. Рекомбинантный фрагмент ДНК, полученный путем лигирования фрагмента ДНК по п.10 в ДНК вектора.
12. Клетка, трансформированная рекомбинантным фрагментом ДНК по п.11.
13. Способ получения белка, обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы, включающий выращивание клеток по п.12 в питательной среде и накопление белка, обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы, в культуральной среде, в клетках, либо в них обоих.
14. Белок, выбранный из группы, состоящей из
(а) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2;
(б) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 и обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
(в) белка, который, по крайней мере, на 98% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы;
15. Белок, который
(A) обладает способностью катализировать реакцию по продукции (2S, 3R, 4S)-4-гидрокси-L-изолейцина путем гидроксилирования L-изолейцина;
2+
(B) активность указанного белка зависит от присутствия двухвалентного катиона Fe; и
(C) молекулярный вес указанного белка, измеренный методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS (SDS-PAGE) составляет приблизительно 29±2,0 кДа.
16. Способ получения (2S, 3R, 4S)-4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающий стадии
взаимодействия L-изолейцина в водном растворе в присутствии, по крайней мере,
одной L-изолейциндиоксигеназы, выбранной из группы, состоящей из
(f) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2 или 6;
(g) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, деление, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 или 6, и обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
(h) белка, который, по крайней мере, на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 или 6, и обладает активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
выделения полученного (2S, 3R, 4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.
17. Способ получения (2S, 3R, 4S)-4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающий стадии
взаимодействия L-изолейцина в водном растворе в присутствии бактерии,
содержащей L-изолейциндиоксигеназу, выбранную из группы, состоящей из
(f) белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2 или 6;
(g) белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая содержит замену, деление, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 или 6, и обладающего активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
(h) белка, который, по крайней мере, на 70% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2 или 6, и обладает активностью L-изолейциндиоксигеназы; и
выделения полученного (2S, 3R, 4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что бактерия модифицирована таким образом, что активность L-изолейциндиоксигеназы в такой бактерии увеличена.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что активность L-изолейциндиоксигеназы увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего указанную L-изолейциндиоксигеназу.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что экспрессия L-изолейциндиоксигеназы усилена путем изменения последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу, или путем увеличения количества копий гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу.
21. Способ по любому из пп.18-20, отличающийся тем, что бактерия принадлежит к роду Escherichia, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus или Bacillus.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что бактерия принадлежит к Escherichia coli, Arthrobacter simplex, Corynebacterium glutamicum, Arthrobactor globiformis, Arthrobactor sulfureus, Arthrobactor viscosus или Bacillus subtilis.
23. Способ по п.17, отличающийся тем, что бактерией является культура бактериальных клеток, бактериальные клетки, обработанные бактериальные клетки или клеточный лизат.