СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ
METHOD OF BIOLOGICAL ACTIVE ADDITIVE PRODUCTION

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано при производстве биологически активных добавок и в медицине.
Известен способ получения белоксодержащей биологически активной добавки, предусматривающий обработку биомассы клеток дрожжей экзогенными гидролитическими ферментами (Патент РФ №2230466, кл. A23L 1/30, опубл. 2004 г.) /1/.
Однако в данном известном способе не описаны условия обработки клеток дрожжей гидролитическими ферментами, не раскрыт состав используемого ферментного препарата, что не позволяет воспроизвести этот известный способ в части осуществления процесса ферментолиза.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является известный способ получения продукта обработки клеток дрожжей композицией гидролитических ферментов (Патент РФ №2104300, кл. A23L 1/28, опубл. 1998 г.) /2/.
Однако качество целевого продукта, получаемого этим известным способом, недостаточно высокое.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение качества и биологической ценности целевого продукта за счет его обогащения низкомолекулярными биологически активными продуктами глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров дрожжей.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активной добавки заключается в осуществлении трехстадийной обработки водной суспензии клеток дрожжей экзогенными ферментами, катализирующими гидролиз клеточных полимеров, с использованием на первой и второй стадиях соответственно первой и второй ферментных композиций и с получением целевого продукта в виде ферментолизата, при этом первая ферментная композиция содержит на 1 г сухих дрожжей 0,05-5,0 ед. ПС протеиназ и 10,0-50,0 ед. β-ГкС смеси эндо-β-глюканазы и экзо-β-глюканазы, а вторая - 50,0-300,0 ед. β-ГкС смеси эндо-β-глюканазы и экзо-β-глюканазы, 5,0-20,0 ед. МС маннаназы и 0,01-0,5 ед. ХС хитиназы, обработку суспензии клеток дрожжей первой ферментной композицией осуществляют при температуре 54-56°С в течение 1 часа 45 мин - 2 ч 15 мин, обработку второй ферментной композицией массы, полученной после завершения первой стадии, осуществляют при температуре 45-48°С в течение 3 ч 45 мин - 4 ч 15 мин, а на третьей стадии осуществляют дальнейшую обработку полученной массы ферментами второй ферментной композиции при температуре 35-38°С в течение 6-12 ч.
Перед обработкой клеток дрожжей экзогенными ферментами рекомендуется инактивировать эндогенные ферменты клеток дрожжей.
Инактивацию эндогенных ферментов клеток дрожжей рекомендуется осуществлять путем термической обработки водной суспензии их клеток при температуре 85-95°С в течение 15-20 мин.
Обработку суспензии клеток дрожжей ферментными композициями рекомендуется осуществлять при постоянном перемешивании.
В первой ферментной композиции в качестве источника протеиназ можно использовать протосубтилин.
В качестве источника эндо-β-глюканазы и экзо-β-глюканазы в ней можно использовать целловеридин.
Во второй ферментной композиции в качестве источника протеиназ, эндо-β-глюканазы, экзо-β-глюканазы, маннаназы и хитиназы можно использовать культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931.
В качестве источника эндо-β-глюканазы, экзо-β-глюканазы в ней дополнительно рекомендуется использовать целловеридин.
Способом согласно изобретению рекомендуется проведение при определенных режимных параметрах трехстадийной ферментативной обработки суспензии дрожжевых клеток, что обеспечивает глубокий ферментативный гидролиз клеточных полимеров и приводит к получению ферментолизата, обладающего высокой биологической активностью.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
2
4
Пример 1. Готовят водную суспензию из 100 г сухих пекарных дрожжей и 250 мл воды. Смесь тщательно перемешивают. Для инактивации эндогенных ферментов дрожжевых клеток приготовленную суспензию нагревают до температуры 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 20 мин, после чего смесь охлаждают до температуры 54°С. Смесь имеет естественный рН 5,8. В нее задают ферменты, катализирующие ферментативный гидролиз β-глюкана (целловеридин как источник смеси экзо-β-глюканазы и эндо-β-глюканазы в количестве 10,0 ед. β-ГкС на 1 г сухих дрожжей), и ферменты, катализирующие гидролиз по пептидным связям белково-β-глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров (протосубтилин как источник протеиназ из расчета 0,05 ед. ПС на 1 г сухих дрожжей). Активность в препарате целловеридина 1000 ед. β-ГкС на 1 г препарата. Активность в препарате протосубтилина 260 ед. ПС на 1 г препарата. Ферментативный гидролиз полимеров дрожжевых клеток на первой стадии проводят при естественном рН в течение 2 ч 15 мин при температуре 54°С при постоянном перемешивании. После завершения первой стадии ферментативного гидролиза полученная смесь состоит из продуктов гидролиза β-глюкана, освободившихся белков цитоплазмы, белков, образовавшихся в результате ферментативного гидролиза по пептидным связям белково-β-глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров, а также освободившихся из белковых комплексов β-глюкана, маннана и хитина. Затем суспензию, обработанную ферментами на первой стадии, охлаждают до температуры 45°С. При проведении второй стадии ферментативного гидролиза используют культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931, полученную при его культивировании на среде, содержащей, %: ячменную муку - 4,0, пшеничные отруби - 2,0, КНPO - 1,0, вода водопроводная - остальное. Штамм культивирован в аэробных условиях при температуре 32°С в течение 42 ч. Культуральная жидкость содержит высокоактивный комплекс протеиназ и пептидаз (карбоксильную, металлозависимую и сериновую протеиназу, аминопептидазу и карбоксипептидазу) с активностью 30 ед. ПС на 1 мл культуральной жидкости, смесь экзо-β-глюканазы и эндо-β-глюканазы с активностью 4,5 ед./мл, а также маннаназу и хитиназу. Культуральную жидкость микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931 дозирируют из расчета 20 ед. Пс на 1 г сухих дрожжей (67 мл культуральной жидкости), доводят активность β-глюканаз до 40,0 ед. ГкС на 1 г сухих дрожжей добавлением препарата целловеридина. Ферментолиз дрожжевой суспензии на второй стадии проводят при естественном рН в течение 4 ч 15 мин при температуре 45°С при постоянном перемешивании. Об окончании второй стадии ферментолиза судят по нарастанию концентрации аминного азота и растворимых сухих веществ в супернатанте обрабатываемой суспензии дрожжевых клеток. Затем температуру полученной массы снижают до 35°С и выдерживают ее при этой температуре в течение 6 ч. При этом ферментолиз клеточных полимеров катализирует те ферменты, которые были введены в процесс на первой и второй стадиях обработки дрожжевых клеток. Полученный ферментолизат нагревают до температуры 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин для инактивации экзогенных ферментов, затем его сушат на распылительной сушилке. В полученном ферментолизате концентрация аминного азота составляет 6,3%, концентрация редуцирующих веществ (углеводов) - 30,9%. Выход гидролизата составляет 92%. Препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров дрожжей: активные пептиды, незаменимые и заменимые аминокислоты, биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточной стенки (β-глюкана, маннанов, хитина) и рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Пример 2. Целевой продукт получают по методике примера 1 с соблюдением перечисленных далее режимных параметров. Инактивацию эндогенных ферментов дрожжевых клеток проводят при 95°С в течение 15 мин. На первой стадии обработки суспензии дрожжевых клеток используют первую ферментную композицию, содержащую на 1 г сухих дрожжей 5,0 ед. ПС протеиназ и 50.0 ед. β-ГкС смеси эндо-β-глюканазы и экзо-β-глюканазы, а на второй стадии - вторую ферментную композицию, содержащую на 1 г сухих дрожжей 100 ед. β-ГкС смеси эндо-β-глюканазы и экзо-β-глюканазы, 20 ед. Мс маннаназы и 0,5 ед. ХС хитиназы. Ферментолиз на первой стадии проводят при температуре 56°С в течение 1 часа 45 мин. Ферментолиз на второй стадии проводят при температуре 48°С в течение 3 ч 45 мин. Затем температуру полученной массы снижают до 37°С и выдерживают ее при этой температуре в течение 12 ч. При этом ферментолиз клеточных полимеров катализирует те ферменты, которые были введены в процесс на первой и второй стадиях обработки дрожжевых клеток. В полученном ферментолизате концентрация аминного азота составляет 6,1%, концентрация редуцирующих веществ (углеводов) - 21,5%. Выход гидролизата составляет 91%.
Полученный ферментолизат характеризуется высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и легкоусваиваемых продуктов гидролиза β-глюкана, маннанов и хитина, а также отсутствием горьких пептидов.
Пример 3. Проведены клинические испытания, которые показали эффективность использования препарата, полученного по способу согласно изобретению, в качестве лечебно-профилактической добавки в питании больных, страдающих нарушениями обменных процессов и нарушениями работы желудочно-кишечного тракта. Препарат показал высокую эффективность его применения в постоперационный период. Успешно применяется препарат для лечения псориаза и атопического дерматита. Он способствует нормализации белкового обмена, повышению усваиваемости пищи, оказывает общеукрепляющее действие, обладает иммуномодулирующим действием.
Результаты испытаний у детей с нарушениями противоинфекционной защиты показали высокую эффективность препарата как средства повышения иммунного статуса и функциональной выносливости организма и средства улучшения обменных процессов. Препарат рекомендован детям и взрослым, длительно болеющим, имеющим очаги хронической инфекции, детям и взрослым со сниженными показателями сопротивляемости организма, а также лицам, вследствие каких-либо причин не получающих с пищей необходимого количества полноценного белка, витаминов и микроэлементов.
Комплексом проведенных медико-биологических исследований показано наличие антиоксидантных и антионкологических свойств продукта, получаемого способом согласно изобретению. Препарат вызывает селективный апоптоз клеток перевиваемых линий клеток опухолей, не оказывая при этом влияния на нормальные клетки человека, что заключается в изменении клеточного цикла опухолевых клеток и активации каспазы-3.
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет получать высококачественную биологически активную добавку с антиоксидантными свойствами, рекомендуемую для лечебно-профилактических целей при питании людей с целью нормализации антиоксидантной защиты организма, а также в комплексной терапии и профилактике раковых заболеваний.