СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF PARKINSON'S DISEASE

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики болезни Паркинсона (БП).
БП - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера. На сегодняшний день ключевым звеном в патогенезе БП считается накопление и агрегация пресинаптического белка альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах черной субстанции головного мозга, приводя к их гибели и развитию характерной симптоматики.
Было показано статистически значимое повышение олигомерного альфа-синуклеина плазмы крови пациентов с болезнью Паркинсона по сравнению с индивидуумами контрольной группы (p<0,002) (El-Agnaf ОМ, Salem SA, Paleologou KE, Curran MD, Gibson MJ, Court JA, Schlossmacher MG, Allsop D. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. // FASEB J. – 2006. - №20(3). - P. 419-25.). Однако позднее показано отсутствие различий в уровне олигомерного альфа-синуклеина плазмы крови при сравнении группы пациентов с БП и контроля (Foulds PG, Mitchell JD, Parker A, Turner R, Green G, Diggle P, Hasegawa M, Taylor M, Mann D, Allsop D. Phosphorylated α-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. // FASEB J. – 2011. - №25 (12). - P. 4127-37).
Противоречивость полученных результатов может быть обусловлена контаминацией олигомерным альфа-синуклеином целевых образцов плазмы крови в результате как внутреннего физиологического гемолиза эритроцитов, так и внешнего, связанного с процедурой забора материала. Это является существенным ограничением в применимости используемых в указанных исследованиях подходов, поскольку искажение конечных результатов может быть существенным в связи с тем, что содержание альфа-синуклеина в эритроцитах во много раз превышает его содержание в других фракциях клеток крови. Кроме того, используемые в указанных выше исследованиях методики по оценке олигомерного альфа-синуклеина не показали диагностической значимости по причине низкой чувствительности и специфичности.
Известно исследование (П.А. Андоскин, Емельянов, М.А. Николаев, К.А. Сенкевич, В.П. Шилин, А.А. Тимофеева, А.Ф. Якимовский, С.Н. Пчелина. Влияние дофамина плазмы на уровень альфа-синуклеина CD45+ клеток крови при болезни Паркинсона. // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Том XXII. №2. – 2015. - С. 14-17), в котором в качестве биомаркера БП рассматривался общий альфа-синуклеин гомогенной фракции клеток крови, полученной методом магнитного сортинга, а именно - CD45+ клеток, экспрессирующих основные белки дофаминергической нейротрансмиссии и, таким образом, отражающих процессы метаболизма альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах. При оценке уровня общего альфа-синуклеина в CD45+ в клетках крови был обнаружен более высокий уровень у пациентов с БП (n=14) по сравнению с пациентами контрольной группы (n=17) (p=0,04). Однако при расширении исследуемых групп различий в уровне общего альфа-синуклеина между группой пациентов с БП (n=43) и контрольной группой (n=39) не получено (p=0,28) (Емельянов А.К., Андоскин П.А., Милюхина И.В., Тимофеева А.А., Якимовский А.Ф., Сенкевич К.А., Николаев М.А., Пчелина С.Н. Ассоциация rs356219 и rs356165 с Болезнью Паркинсона и повышенной экспрессией гена альфа-синуклеина в CD45+ клетках. // Цитология, 2016. - N 2. - С. 99-104.).
Технический результат заявленного изобретения заключается в создании способа диагностики БП, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью.
Заявленный технический результат достигается тем, что в способе диагностики болезни Паркинсона, включающем забор периферической крови, выделение однородной фракции CD45+ клеток и лизирование выделенной клеточной фракции, в лизате CD45+ клеток измеряют концентрацию олигомерного альфа-синуклеина и при концентрации более 2,7 пг/мл диагностируют болезнь Паркинсона.
Способ разработан на основе проведенного исследования уровня олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках в группе пациентов с вновь диагностированной БП, не получавших лечения Л-ДОФА-содержащими препаратами (N=29, 12 муж., 17 жен., сред. возр. 61,11±7,20), по сравнению с соответствующей по возрасту и полу контрольной группой лиц, не имеющих неврологических расстройств (N=25, 11 муж., 14 жен., сред. возр. 59,56±8,01).
При анализе концентрации олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках периферической крови (медиана (мин-макс), пг/мл), в группе пациентов с БП (3,29 (1,38-8,27), пг/мл) по сравнению с контрольной группой (2,014 (1,48-3,39), пг/мл) было установлено статистически значимое повышение уровня олигомерного альфа-синуклеина (p<0,0001).
Для оценки возможности использования уровня олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках в клинической практике, а именно для подтверждения диагноза БП, а также формирования групп риска среди лиц с отсутствием неврологических расстройств с повышенным уровнем олигомерного альфа-синуклеина в клетках, был проведен ROC-анализ с целью установления порога концентрации вышеуказанной формы белка. Точка отсечения концентрации олигомерного альфа-синуклеина составила 2,7 пг/мл. Чувствительность метода составила 69,0% (95% доверительный интервал 50,77-82,72%), специфичность метода - 91,7% (95% доверительный интервал 74,15-97,68%), индекс точности метода составил: 79,63%, площадь под ROC-кривой составила 0,84. Полученные данные позволили установить критерий диагностики БП.
На фигуре графически представлен уровень олигомерного альфа-синуклеина в CD45+ клетках периферической крови в группе пациентов с БП и контрольной группе.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Забор крови у пациентов проводят из вены в пробирку объемом 9 мл с ЭДТА. Выделение лимфоцитарной фракции периферической крови производят путем центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare). С целью получения фракции CD45+ клеток осуществляют магнитную сепарацию лимфоцитарной фракции путем смешивания с магнитными микрочастицами (CD45+ MicroBeads, human, Miltenyi Biotec, США), с дальнейшим использованием магнитного ручного сепаратора MACS (Miltenyi Biotec, США) и колонок для сортинга miniMACS типа MS (Miltenyi Biotec, США). В результате получают однородную фракцию CD45+ клеток крови, которую далее замораживают и хранят при температуре -80°C до выполнения иммуноферментного анализа (ИФА).
Перед выполнением ИФА осуществляют лизис CD45+ клеток крови с использованием набора Total Protein Extraction Kit (Chemicon (Millipore), США) согласно прилагаемой инструкции. Измерение уровня общего белка в клеточных лизатах проводят с использованием набора Pierce ВСА Protein Assay kit (Thermo Scientific, США) согласно прилагаемой инструкции. Для проведения ИФА могут быть использованы образцы клеточных лизатов с концентрацией общего белка 30-60 мкг. Определение концентрации олигомерного альфа-синуклеина в исследуемых образцах проводят на основе метода ИФА с использованием набора Human alpha-synuclein РАТНО ELISA (ajRoboscreen, Германия). В данном наборе используются моноклональные антитела 5G4, которые специфично связываются с олигомерным альфа-синуклеином, имеющим конформацию бета-складчатого листа. С целью построения стандартной кривой используют соответствующие разведения входящих в набор стандартов олигомеров альфа-синуклеина согласно инструкции. Аналитическая чувствительность вышеуказанного набора составляет 250-0,05 пг/мл. Концентрацию олигомерного альфа-синуклеина определяют путем детекции хемилюминесценции на планшетном спектрофлюориметре. При концентрации более 2,7 пг/мл диагностируют болезнь Паркинсона.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
1. Пациент 65 лет, со слов - отмечал смешанный тремор (покоя и постурально-кинетический) в левой руке более 10 лет, без нарастания характера, принимал пропанолол без выраженного эффекта, в течение последнего года появился тремор покоя с элементами постурально-кинетического в правой руке. Пациент также указал на изменение почерка, появление некоторой скованности, неловкости, замедленности движений в правой руке.
У пациента был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация олигомерного альфа-синуклеина.
Концентрация белка составила 4,2 пг/мл, что свидетельствует о диагнозе БП. На основании полученных данных врачом-неврологом назначена дофаминергическая терапия, при повторном осмотре через 1 месяц отмечается положительная динамика, уменьшение интенсивности тремора, снижение скованности.
2. Пациент 43 лет, со слов пациента - отмечает скованность и легкий тремор покоя в правой руке в течение последних двух лет, также появились болевые ощущения в шейной области справа, элементы выраженного поворота головы вправо. С учетом выявленных клинических признаков необходимо было провести дифференциальный диагноз между дистонией и БП.
У пациента был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация олигомерного альфа-синуклеина.
Концентрация белка составила 1,2 пг/мл, что является нормой. На основании полученных данных врачом-неврологом проведена инъекция ботулотоксина в шейную область, симптоматика полностью купировалась.
3. Пациентка 54 лет, с отягощенным анамнезом, мать больна БП, у тети тремор, к врачу не обращалась. В течение последних 5 лет отмечает появление запоров, незначительное снижение обоняния за последние несколько месяцев. Пациентке проведена генетическая диагностика, выявлена мутация G2019S в гене LRRK2. С учетом выявленного отягощенного анамнеза и известных данных о неполной пенетрантности в гене LRRK2 нельзя исключить премоторную стадию БП.
У пациентки был осуществлен забор периферической крови, методом магнитного сортинга выделена однородная фракция CD45+ клеток, в лизате CD45+ клеток измерена концентрация олигомерного альфа-синуклеина.
Концентрация белка составила 5,5 пг/мл, что свидетельствует о диагнозе БП. На основании полученных данных врачом-неврологом поставлена премоторная стадия БП, пациентке даны рекомендации по модификации образа жизни, рекомендован амбулаторный осмотр врачом неврологом 1 раз в 12 месяцев.
Заявленный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью, что позволяет устанавливать диагноз БП, а также формировать группы риска среди лиц с отсутствием неврологических расстройств.