НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ДНК КУРИЦЫ В МЯСНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
SET OF OLIGONUCLEOTIDES FOR SEMI-QUANTITATIVE ASSESSMENT OF CHICKEN DNA CONTENT IN MEAT PRODUCTS BY REAL-TIME PCR METHOD

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, и может применяться для расчета содержания ДНК курицы {Gallus gallus) (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц в образце.
В настоящее время разработано множество методик на основе ПЦР (полимеразная цепная реакция) для определения состава мясной продукции, как в качественном, так и в количественном формате. Качественный формат исследования позволяет детектировать только наличие мяса, не заявленного в составе, однако не позволяют дифференцировать возможную фальсификацию продукции от следовых количеств незаявленных мясных ингредиентов. Количественный же формат исследований позволяет не только выявить замену заявленного мяса в продукции другим видом мяса, но и отличить фальсификацию от контаминации продукта на технологической линии.
Как правило, в качественных ПЦР методиках целевыми являются высококопийные последовательности митохондриальной ДНК (мтДНК), что обеспечивает высокую чувствительность таких методик. Для ПЦР методик, направленных на выявление ДНК курицы (Gallus gallus), использование участков мтДНК в качестве таргетных может привести к ложным идентификациям, если производитель использует яйца или яичные продукты. В таком случае, невозможно будет достоверно отличить добросовестное следование рецептуре мясных продуктов, в составе которых заявлены яйца или меланж, от фальсификации более дешевым куриным мясом.
Большинство молекулярно-генетических количественных методик основано на ПЦР в реальном времени. Количественную оценку при использовании ПЦР в реальном времени получают, когда количество видоспецифичной ДНК соотносят с количеством ДНК внутреннего контроля, которым обычно служит последовательность ДНК, консервативная внутри крупного таксона.
В настоящее время большинство отечественных коммерческих наборов реагентов (Синтол, ФБУН ЦНИИЭ Россия) предназначено только для качественной оценки содержания мясных ингредиентов. Существует также ряд патентов на тест-системы или наборы олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК различных видов животных и птиц (курица, свинья, овца, бык, индейка, мышь, крыса, собака, кошка, осетровые рыбы и др.) в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах (RU 2700480 C1, RU 2702858 C1 RU 2560579 C2, RU 2734035 C1, RU 2332463 C1 и др.).
Например, компания «Синтол» (Россия) предлагает наборы для идентификации сырьевого состава мясной и рыбной продукции методом ПЦР в реальном времени. Производителем заявлено, что при использовании некоторых наборов возможно провести и полуколичественную оценку содержания каждого вида мяса относительно общего содержания мяса или при обнаружении в исследуемом образце 2-х и более видов мяса относительно друг друга в диапазоне более или менее 1%. [URL: http://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/dlya-identifikatsii-syrevogo-sostava-myasnoy-i-rybnoy-produktsii].
В указанных тест-системах и патентах чаще всего в качестве мишеней используются многокопийные митохондриальные последовательности ДНК, например, фрагменты гена cytB. Недостатком использования таких последовательностей ДНК в количественной ПЦР методике является различия по содержанию митохондрий в клетках тканей, отличающихся по энергетическому и метаболическому профилю. Так, в сердечных мышечных клетках и в нейронах количество митохондриальной ДНК (мтДНК) достигает тысяч копий, а в легких и печени клетки содержат на порядок меньшее число мтДНК. Помимо межтканевых различий существуют значительная индивидуальная вариабельность в количестве мтДНК в одних и тех же тканях.
Например, есть существенные возрастные различия по количеству митохондрий в клетках сердечной мышцы.
Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, используемой для полуколичественной оценки содержания ДНК курицы в мясной продукции, сырье и полуфабрикатах (кроме консервов).
Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность набора олигонуклеотидов, который позволяет дифференцировать возможную фальсификацию мясной продукции от следовых количеств незаявленных мясных ингредиентов курицы и от присутствия яичных продуктов.
Заявленный технический результат достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для сравнения содержания ДНК курицы (Galus galus) и ДНК внутреннего контроля, которым служит консервативный у птиц и млекопитающих участок генома. Преимуществом данного изобретения является использование однокопийных хромосомных мишеней (фрагменты Rarres1 и VE1800) вместо традиционных митохондриальных, что позволяет снизить избыточную чувствительность ПЦР и избавиться от проблемы ложных идентификаций из-за применения яиц или яичных продуктов.
Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Rarres-F GTGAATGAGATCCACGGAAAGA
Rarres-R CTGCCCTAACTCTGCTGAAA
Rarres-Z (R6G) - CAGCAAAGGGTGAAGGAGGGATCA - (BHQ1)
VE1800-F GCTGCTTGCCTCATTTCATATC
VE1800-R AACTTGCACACTAATTCCCTTTG
VE1800-Z (Cy5) - TTATGACAGGGCTGCAGCCAAGAT - (BHQ2)
Полуколичественная оценка содержания ДНК курицы основана на применении ПЦР в реальном времени для сравнения количества ДНК курицы (ген Rarres1) и ДНК внутреннего контроля (элемент VE1800). Оба участка геномной ДНК детектируют в одной пробирке в двух независимых ПЦР с использованием специфичных праймеров и зондов, меченых разными флуоресцентными красителями. Полученные значения порогового цикла ПЦР используют для расчета содержания ДНК курицы (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц.
3
3
Аналитическая чувствительность ПЦР с использованием данного набора олигонуклеотидов составляет 5*10 копий/см. Предел обнаружения составляет: 0,01% ДНК курицы для сырой мясной продукции; 0,05% ДНК курицы для продукции, подвергавшейся кулинарной обработке (кроме консервированной). Специфичность набора олигонуклеотидов составляет 100% при исследовании контрольной панели ДНК из образцов тканей позвоночных различных классов (птицы, млекопитающие, рыбы), беспозвоночных (головоногие, ракообразные), растений, а также яиц и меланжа.
Применение настоящего набора олигонуклеотидов в отличие от перечисленных выше аналогов распространяется на мясную продукцию, в том числе подвергавшуюся термической обработке; сырье для ее производства на всех этапах переработки; мясные полуфабрикаты; кулинарные мясные изделия (кроме консервов).
Следует отметить, что однокопийные хромосомные мишени для качественного выявления видоспецифичной ДНК курицы не применимы. Полуколичественную оценку содержания ДНК курицы с использованием настоящего набора олигонуклеотидов необходимо проводить только после качественного подтверждения наличия ДНК курицы в исследуемом образце.
На первом этапе для выбора и анализа целевых мишеней использовали референсные репрезентативные геномы сельскохозяйственных животных и птицы, опубликованные в базе данных NCBI. К анализу были добавлены референсный геном человека (Homo sapiens) и геномы животных, ДНК которых может попасть в анализируемые пробы из-за контаминации на производстве, при хранении продуктов, при отборе проб - мыши (Mus musculus), серой крысы (Rattus norvegicus) и кошки (Felis catus). Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов производили на онлайн-ресурсе «PCR Primer Design», оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Специфичность праймеров и зондов оценивали биоинформатически при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast».
В качестве видоспецифичного для курицы участка геномной ДНК был выбран однокопийный хромосомный ген Rarres1, последовательность которого высокополиморфна среди птиц. Для внутреннего контроля была выбрана последовательность однокопийного хромосомного элемента VE1800, которая высококонсервативна у млекопитающих, птиц и рептилий.
Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов Rarres-F, Rarres-R, Rarres-Z с фрагментом гена Rarres1 у курицы (Galus galus) и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других представителей класса птиц Aves; высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов VE1800-F, VE1800-R, VE1800-Z с фрагментом геномного элемента VE1800 млекопитающих и птиц, а также отсутствием формирования шпилек с температурой плавления выше комнатной температуры.
Далее были оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зондов, температура отжига и длительность основных стадий амплификации.
Материалом для исследования служат образцы мясной продукции, в том числе подвергавшейся термической обработке; сырья для ее производства на всех этапах переработки; мясных полуфабрикатов; кулинарных мясных изделий (кроме консервированной продукции).
3
Выделение ДНК осуществляют сорбционным методом. Проводят мультиплексную ПЦР в одной пробирке в конечном объеме 25 мм со следующим составом реакционной смеси:
3
• 10 мм ДНК-матрицы;
3
3
3
• 10 мм ПЦР-смеси-1 (по 6 пмоль каждого из праймеров Rarres-F, Rarres-R, VE1800-F, VE1800-R; по 3 пмоль каждого из зондов Rarres-Z и VE1800-Z; 0,2 мм раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 25 ммоль/дм(Синтол, Россия); деионизованная вода);
3
•0,5 мм Taq ДНК-полимеразы (Синтол, Россия);
3
•5 мм ПЦР-буфера с магнием (Синтол, Россия).
Амплификацию осуществляют в приборах Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) или Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия) в оптимизированном режиме: 95°С - 15 мин; 95°С - 15 с, 62°С - 45 с, 35 циклов. Детектирование результата амплификации (флуоресцентного сигнала) проводится на каналах Cy5/Red для ДНК млекопитающих и R6G/Yellow для ДНК курицы. Результаты амплификации в реальном времени интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией. Полученные значения порогового цикла ПЦР используют для расчета содержания ДНК курицы (% ДНК) относительно общего количества ДНК млекопитающих и птиц.
Пример 1. Проверка специфичности набора олигонуклеотидов и выявления ДНК курицы и геномного элемента VE1800.
С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, амплификацию ставили с ДНК, выделенной из образцов тканей позвоночных различных классов (птицы, млекопитающие, рыбы), а также беспозвоночных (головоногие, ракообразные) и растений: курицы (Gallus gallus), утки (Anas platyrhynchos), перепела (Coturnix coturnix), домашней индейки (Meleagris gallopavo), быка (Bos taurus), свиньи (Sus scrofa), лошади (Equus caballus), овцы (Ovis aries), кролика (Oryctolagus cuniculus), зайца-русака (Leprus europaeus), лося (Alces alces), косули (Capreolus capreolus), дельфина (Tursiops truncates), норки (Neovison vison), кошки (Felis catus), собаки (Canis lupus familiaris), мыши (Mus musculus), серой крысы (Rattus norvegicus), золотистого хомяка (Mesocricetus auratus), морской свинки (Cavia porcellus), страуса (Struthio camelus camelus), журавля-красавки (Anthropoides virgo), сизого голубя (Columba livia), крокодилового каймана (Caiman crocodilus), трески атлантической (Gadus morhua), северной креветки (Pandalus borealis), кальмара (Teuthida spp.), сои (Glycine max), риса (Oryza sativa), ДНК, выделенной из яиц и меланжа.
В рамках проанализированной панели образцов специфичность составляет 100%. По каналу Yellow (видоспецифичный ген Rarres1) наблюдается амплификация только в ПЦР, где использовали ДНК курицы (Gallus gallus), выделенную из мяса курицы, но не из яичных продуктов. По каналу Red (внутренний контроль VE1800) наблюдается амплификация во всех ПЦР, в которых использовали ДНК млекопитающих, птиц (кроме яиц и меланжа) и рептилий. Таким образом, ПЦР внутреннего контроля обладает необходимой универсальностью для полуколичественной оценки содержания ДНК в мясной продукции.
Отсутствие сигнала в ПЦР с ДНК из яиц и меланжа при использовании данного набора олигонуклеотидов является несомненным преимуществом данного набора и позволяет различать присутствие в образцах мясной продукции яичных продуктов или мяса курицы (продуктов убоя).
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов для полуколичественной оценки ДНК курицы в мясной продукции.
Для определения аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов использовали растворы плазмидной ДНК (на основе вектора pAL2-TA), содержащие соответствующие клонированные фрагменты гена Rarres1 и элемента VE-1800. Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой смесь в равной пропорции растворов плазмидной ДНК Rarres1 и ДНК VE-1800.
8
3
Для оценки аналитической чувствительности ПЦР использовали серийные разведения ПКО Rarres1/VE-1800 с начальной концентрацией плазмидной ДНК 5×10 копий/см, готовили серию из семи десятикратных разведений в ТЕ-буфере. Амплификацию проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах.
3
3
За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, которая воспроизводимо давала продукт в двух повторах ПЦР (значения Ct<31). Аналитическая чувствительность ПЦР с использованием данного набора олигонуклеотидов составляет 5*10 копий/см.