СПОСОБЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ БЕЛКОВ В ИХ ДВУХЦЕПОЧЕЧНУЮ ФОРМУ

1. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина, содержащего двуцепочечный петлевой участок, в его двуцепочечную форму, включающий следующие этапы:
а) выращивание клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение около 3,5 ч, двойной экспрессионный конструкт содержит;
i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, одноцепочечный клостридиальный токсин содержит энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и
ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;
б) выращивание клетки при 22°С в течение от около 16 до около 18 ч,
при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и
производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.
2. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что одноцепочечный клостридиальный токсин содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность одного полипептида порядка: 1) энзимного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, транслокационного домена, клостридиального токсина и связывающего домена клостридиального токсина; 2) энзимного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, связывающего домена клостридиального токсина и транслокационного домена клостридиального токсина; 3) связывающего домена клостридиального токсина, транслокационного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, и энзимного домена клостридиального токсина; 4) связывающего домена клостридиального токсина, энзимного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой и транслокационного домена клостридиального токсина; 5) транслокационного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержащит сайт расщепления TEV протеазой, энзимного домена клостридиального токсина и связывающего домена клостридиального токсина; или 6) транслокационного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, клостридиального связывающего домена и энзимного домена клостридиального токсина.
3. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.
4. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.
5. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что связывающий домен клостридиального токсина представляет собой связывающий домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/C1, связывающий домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/G, связывающий домен TeNT, связывающий домен BaNT, или связывающий домен BuNT.
6. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, включающий следующие этапы
а) выращивание клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение около 8 ч, двойной экспрессионный конструкт содержит;
i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок содержит энзимный домен, транслокационный домен интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов; и
ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;
б) выращивание клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 ч,
при этом вращивание на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и
производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящийся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.
7. Внутриклеточный способ по п.6, отличающийся тем, что белок содержит следующую линейную амино-карбоксильную очередность одного полипептида порядка: 1) энзимного домена клостридиального токсина, транслокационного домена клостридиального токсина, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, 2) энзимного домена клостридиального токсина, интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, и транслокационного домена клостридиального токсина, 3) интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, транслокационного домена клостридиального токсина, и энзимного домена клостридиального токсина, 4) интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов, энзимного домена клостридиального токсина, и транслокационного домена клостридиального токсина, 5) транслокационного домена клостридиального токсина, интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, и энзимного домена клостридиального токсина; или 6) транслокационного домена клостридиального токсина, энзимного домена клостридиального токсина, и интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов
8. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.
9. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.
10. Внутриклеточный способ по п.1, отличающийся тем, что интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов представляет собой интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ноцицептина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания динорфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания энкефалина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания ВАМ22, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндоморфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания эндорфина, интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания геморфина, или интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания риморфина.
11. Внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, включающий следующие этапы
а) выращивание клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение около 8 ч, при этом двойной экспрессионный конструкт содержит:
i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок содержит энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и
ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу;
б) выращивание клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 ч,
при этом выращивание на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и
производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.
12. Внутриклеточный способ по п.11, отличающийся тем, что следующую линейную амино-карбоксильную очередность одного полипептида порядка: 1) энзимного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, транслокационного домена клостридиального токсина и связывающего домена не клостридиального токсина; 2) энзимного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, связывающего домена не клостридиального токсина и транслокационного домена клостридиального токсина; 3) связывающего домена не клостридиального токсина, транслокационного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого, содержит сайт расщепления TEV протеазой и энзимного домена клостридиального токсина; 4) связывающего домена не клостридиального токсина, энзимного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой и транслокационного домена клостридиального токсина; 5) транслокационного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, энзимного домена клостридиального токсина и связывающего домена не клостридиального токсина; или 6) транслокационного домена клостридиального токсина, двуцепочечный петлевой участок которого содержит сайт расщепления TEV протеазой, не клостридиального связывающиего домена и энзимного домена клостридиального токсина.
13. Внутриклеточный способ по п.11, отличающийся тем, что энзимный домен клостридиального токсина представляет собой энзимный домен BoNT/A, энзимный домен BoNT/B, энзимный домен BoNT/C1, энзимный домен BoNT/D, энзимный домен BoNT/E, энзимный домен BoNT/F, энзимный домен BoNT/G, энзимный домен TeNT, энзимный домен BaNT, или энзимный домен BuNT.
14. Внутриклеточный способ по п.11, отличающийся тем, что транслокационный домен клостридиального токсина представляет собой транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/C1, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT, или транслокационный домен BuNT.
15. Внутриклеточный способ по п.11, отличающийся тем, что связывающий домен не клостридиального токсина является доменом связывания пептида опиоида, доменом связывания пептида меланокортина, доменом связывания пептида галанина, доменом связывания пептида гранина, доменом связывания пептида тахикинина, доменом связывания пептида, родственного нейропептиду Y, доменом связывания пептида нейрогормона, доменом связывания пептида цитокина, доменом связывания пептида кинина, доменом связывания пептида фактора роста фибробластов, доменом связывания пептида нейротрофина, доменом связывания пептида фактора некроза опухоли, доменом связывания пептида нейротрофического фактора глии, доменом связывания пептида трансформационного фактора роста β, доменом связывания пептида костного морфогенетического белка, доменом связывания пептида фактора роста и дифференциации, доменом связывания пептида активина, доменом связывания пептида фактора роста эндотелия сосудов, доменом связывания пептида инсулин фактора роста, доменом связывания пептида эпидермального фактора роста, доменом связывания пептида глюкагон-подобного гормона, доменом связывания пептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза, доменом связывания пептида гормона высвобождения гормона роста, доменом связывания вазоактивного кишечного пептида, доменом связывания пептида желудочного ингибиторного полипептида, доменом связывания пептида кальцитонин-связанных пептидов висцеральных органов, или связывающего домена пептида активируемого протеазой рецептора.