ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, С НАРУШЕНИЕМ В ЛОКУСЕ C9ORF72
NON-HUMAN ANIMALS WITH DISTURBANCE IN LOCUS C9ORF72

Ссылка на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №62/168171, поданной 29 мая 2015 года, предварительной заявке на патент США №62/232658, поданной 25 сентября 2015 года, и предварительной заявке на патент США №62/245382, поданной 23 октября 2015 года, причем полное содержимое каждой из них включено в данный документ посредством ссылки.
Включение перечня последовательностей посредством ссылки
Перечень последовательностей находится в текстовом файле в формате ASCII, который назван 32698_10152US01_SequenceListing, имеет размер 56 кБайт, создан 19 мая 2016 года и предоставлен в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, и он включен в данный документ посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Нейродегенеративные заболевания являются основными факторами, вносящими вклад в инвалидизацию и развитие заболеваний. В частности, боковой амиотрофический склероз (ALS, также называемый болезнью Лу Герига) и лобно-височная деменция (FTD) представляют собой редкие нарушения нервной системы, характеризующиеся прогрессирующей потерей и/или гибелью нейронов. Несмотря на то что старение рассматривается как наибольший фактор риска в случае нейродегенеративного заболевания, были открыты несколько генетических составляющих. Например, мутации в гене медь-цинк супероксид-дисмутазы (SOD1) долго связывали с ALS. Кроме того, была выявлена связь увеличенного количества гексануклеотидных повторов GGGGCC в некодирующем участке гена C9ORF72 как с ALS, так и с FTD. В настоящее время не существует средства для излечения от любого из этих заболеваний, хотя существуют методы лечения, которые помогают сдерживать развитие заболевания и/или облегчать его симптомы.
Воспалительные заболевания включают в себя большое разнообразие заболеваний, которые часто характеризуется генетической мутацией(мутациями), приводящими в результате к нарушениям или дисфункции иммунной системы. Несмотря на то что механизмы, например, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника и гломерулонефрита, не полностью понятны, была обнаружена связь несколько генетических составляющих с различными признаками и симптомами, присутствующими у пациентов. Такие заболевания характеризуется системным воспалением и проявлением различных аномалий в организме пациента. Как и в случае ALS и FTD, методы лечения воспалительных заболеваний нацелены только на ослабление симптомов и замедление прогрессирования заболевания.
Несмотря на то что различные модели на лабораторных животных широко применяются в разработке большинства терапевтических средств, существует лишь несколько из них, в которых нейродегенеративные и воспалительные заболевания рассматриваются таким образом, чтобы обеспечить освещение точного молекулярного механизма, посредством которого идентифицированные генетические составляющие вызывают заболевание. Следовательно, способ, посредством которого генетические мутации вызывают нейродегенеративное и/или воспалительное заболевание, остается по большей части неизвестным. Идеальные животные модели будут содержать такие же генетические составляющие и проявлять характеристики, подобные человеческому заболеванию. С учетом генетических различий между видами, существует значительная неудовлетворенная потребность в разработке улучшенных животных моделей, которые подробно повторяют человеческое нейродегенеративное и/или воспалительное заболевание. Конечно, такие улучшенные животные модели представляют значительную ценность в разработке эффективных терапевтических и/или профилактических средств.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящим изобретением охватывается признание того, что желательным является конструирование животных, отличных от человека, которые обеспечивают улучшенные in vivo системы для идентификации и разработки новых терапевтических средств и, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, терапевтических схем, которые можно применять для лечения нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления in vivo системы, которые описаны в данном документе, можно применять для идентификации и разработки новых терапевтических средств для лечения воспалительных заболеваний, нарушений и состояний. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления in vivo системы, которые описаны в данном документе, также можно применять для идентификации и разработки новых терапевтических средств для лечения аутоиммунных заболеваний, нарушений и состояний. Кроме того, описанные в данном документе животные, отличные от человека, которые содержат нарушение в локусе C9ORF72 и/или у которых иным образом обеспечен функциональный сайленсинг локуса C9ORF72, в результате чего полипептид C9ORF72 не экспрессируется или не продуцируется, являются желательными, например, для применения в идентификации и разработке терапевтических средств, мишенью которых является гексануклеотидный повтор GGGGCC, транскрипция и регуляция C9ORF72 и/или повышение или снижение уровней C9ORF72, которое было ассоциировано с заболеванием у людей. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные in vivo системы (или модели) для нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний (например, ALS и/или FTD). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления описанные в данном документе животные, отличные от человека, обеспечивают улучшенные in vivo системы (или модели) для воспалительного заболевания, нарушений и состояний.
Настоящим изобретением предполагаются модели на животных, отличных от человека, для бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD) и/или гломерулонефрита. В соответствии с различными вариантами осуществления предполагаются модели на животных, отличных от человека, для ALS и/или FTD, которые характеризуется нарушением (например, делецией всего кодирующего участка) в локусе C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение в локусе C9ORF72 поражает один или несколько нейронов животного, отличного от человека, которое содержит указанное нарушение. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение в локусе C9ORF72 поражает одно или несколько из селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга, почки и крови животного, отличного от человека, которое содержит указанное нарушение.
+
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение в локусе C9ORF72 у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, приводит в результате к одному или нескольким из следующих фенотипов: ALS-подобный фенотип; спленомегалия; лимфаденопатия; гломерулонефрит; инфильтрация одного или нескольких из макрофагов, моноцитов и гранулоцитов в селезенку, шейные лимфатические узлы, костный мозг и/или кровь; инфильтрация F4/80 макрофагов в почку и/или печень; сокращение количества В- и/или Т-клеток в костном мозге; снижение содержания лимфоцитов в крови; и повышение экспрессии одного или нескольких цитокинов (например, IL-17, IL-10, TNF-α и IL-12) в сыворотке крови.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение (например, делеция) в локусе C9ORF72 у животного, отличного от человека, является результатом вставки последовательности нуклеиновой кислоты, которая, в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления, содержит репортерный ген.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается животное, отличное от человека, содержащее в своем геноме делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, т.е. делецию геномной последовательности, кодирующей все изоформы C9ORF72 (т.е. изоформы VI, V2 и V3).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления деления относится к сегменту генома размером приблизительно 26 т.п.н. в локусе C9ORF72 у животного, отличного от человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления деления относится к сегменту генома, охватывающему по меньшей мере экзоны 2-11 (например, экзоны 2-11 в VI) целиком или частично. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления делеция включает в себя экзоны 1-11. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления локус C9ORF72, имеющий делецию, содержит репортерный ген. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления репортерный ген является функционально связанным с промотором C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления промотор C9ORF72 представляет собой эндогенный промотор.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления локус C9ORF72 у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, лишен участка с кодирующего участка экзона 2 по кодирующий участок экзона 11 и содержит репортерный ген. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления репортерный ген является функционально связанным с промотором C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления репортерный ген является функционально связанным с некодирующим участком экзона 2 (т.е. частью 5' UTR) гена C9ORF72, тем самым помещая репортерный ген в функциональную связь с экзоном 1 (т.е. экзоном 1а или экзоном 1b) и расположенными выше регуляторными последовательностями (в том числе с промотором) в локусе C9ORF72 у животного, отличного от человека. В соответствии с конкретными вариантами осуществления функциональная связь между репортерным геном и некодирующей частью экзона 2 достигается посредством целенаправленной делеции геномной последовательности C9ORF72 с кодона сразу после старт-кодона ATG в экзоне 2 по кодирующий участок экзона 11 и вставки кодирующей последовательности репортера без старт-кодона ATG в сайт локуса C9ORF72 сразу после оставшегося старт-кодона ATG в экзоне 2 гена C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления экспрессия репортерного гена имеет сходство с характером (или профилем) экспрессии локуса C9ORF72.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления репортерный ген является выбранным из группы, состоящей из генов β-галактозидазы (lacZ), люциферазы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), улучшенного GFP (eGFP), голубого флуоресцентного белка (CFP), желтого флуоресцентного белка (YFP), улучшенного желтого флуоресцентного белка (eYFP), синего флуоресцентного белка (BFP), улучшенного синего флуоресцентного белка (eBFP), DsRed и MmGFP. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления репортерный ген представляет собой lacZ.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, является гомозиготным или гетерозиготным в отношении делеции всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, проявляет один или несколько фенотипов, которые описаны в данном документе; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления фенотипы являются выявляемыми в возрасте после приблизительно 8 недель.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляются один или несколько симптомов ALS и/или FTD в ходе развития; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления, в возрасте после приблизительно 36 недель; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления, в возрасте после приблизительно 40 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляются прогрессирующие нарушения двигательной функции в возрасте после приблизительно 36 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется патология нижних мотонейронов в возрасте после приблизительно 40 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется снижение массы тела в возрасте после приблизительно 36 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется в ходе развития митохондриальная дисфункция в мотонейронах; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления митохондриальная дисфункция характеризуется снижением одного или нескольких из митохондриального дыхания, базального дыхания, максимального дыхания, резервной респираторной емкости, выработки АТФ и протонной утечки; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления митохондриальная дисфункция характеризуется повышением соотношения митохондриальной ДНК к ядерной по сравнению с соотношением митохондриальной ДНК к ядерной в мотонейронах от контрольного или эталонного животного, отличного от человека.
+
+
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляются в ходе развития один или несколько симптомов гломерулонефрита в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления в возрасте после приблизительно 35 недель, в возрасте после приблизительно 35-41 недели включительно или в возрасте после приблизительно 35-60 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется спленомегалия в возрасте после приблизительно 8 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется лимфаденопатия в возрасте после приблизительно 8 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления лимфаденопатия является доступной пальпации в возрасте после приблизительно 12-18 недель включительно или в возрасте после приблизительно 18-60 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, характеризуется инфильтрацией одной или нескольких из плазматических клеток, моноцитов, гранулоцитов и F4/80 макрофагов; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления инфильтрация является выявляемой в возрасте после приблизительно 8 недель; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления инфильтрация является выявляемой в возрасте до 60 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется инфильтрация F4/80 макрофагов в почку и/или печень в возрасте после приблизительно 8 недель.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется повышенный уровень одного или нескольких из цитокинов IL-10, IL-12, IL-17, IFN-γ, TNF-α и МСР-1 в сыворотке крови в возрасте после приблизительно 8 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется повышенный уровень IL-12 в сыворотке крови в возрасте после приблизительно 8 недель, который является повышенным приблизительно 6-кратно или более по сравнению с эталонным или контрольным животным, отличным от человека.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется заболевание почек, характеризующееся утолщенной базальной мембраной, образованием цилиндров (или образованием гиалиновых цилиндров), отложением иммунных комплексов, мембранопролиферативным гломерулонефритом, интерстициальным мононуклеарным воспалением, гломерулосклерозом, базофильными канальцами или их комбинацией, в возрасте после приблизительно 28-35 недель включительно, в возрасте после приблизительно 35-41 недели включительно или в возрасте после приблизительно 35-60 недель включительно.
+
+
+
+
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется увеличенная популяция миелоидных дендритных клеток в одном или нескольких из селезенки, лимфатических узлов, костного мозга, почки и крови в возрасте после приблизительно 28-35 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления популяция миелоидных дендритных клеток характеризуется как CD45CD11bCD11cMHCII.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется повышенный уровень одного или нескольких аутоантител в сыворотке крови в возрасте после приблизительно 8 недель; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления в возрасте после приблизительно 28-35 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется повышенный уровень одного или нескольких аутоантител в сыворотке крови в возрасте от приблизительно 8 недель до приблизительно 60 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одно или несколько аутоантител являются выбранными из антител к ревматоидному фактору (anti-RF), антител к дцДНК, антинуклеарных антител (ANA), антител к антигену Смита (anti-Sm), антител к кардиолипину и их комбинаций.
+
+
+
+
+
-
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется повышенный уровень F4/80 макрофагов в одном или нескольких из селезенки, лимфатических узлов, костного мозга, почки и крови в возрасте после приблизительно 28-35 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления F4/80 макрофаги характеризуется как CD45CD11bF4/80Ly6G.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется увеличенная популяция Т-клеток в одном или нескольких из селезенки, лимфатических узлов, костного мозга, почки и крови в возрасте после приблизительно 28-35 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления Т-клетки характеризуется как CD8CD44, CD8CD69, CD8PD1, CD4CD44, CD4CD69 или CD4PD1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется увеличенная популяция регуляторных Т-клеток в селезенке и/или лимфатических узлах в возрасте после приблизительно 28-35 недель включительно, и при этом популяция регуляторных Т-клеток характеризуется как CD4FoxP3. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется увеличенное количество клеток фолликулярных Т-хелперов (Tfh) в селезенке, лимфатических узлах (например, шейных лимфатических узлах или «CLN» и брыжеечных лимфатических узлах или «MLN») и/или в крови в возрасте после приблизительно 26 недель, и при этом популяция Tfh клеток характеризуется как CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+.
+
-
-
+
+
int
int
+
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется повышенная популяция плазматических клеток в одном или нескольких из селезенки, лимфатических узлов и костного мозга в возрасте после приблизительно 8-60 недель включительно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления популяция плазматических клеток характеризуется как CD45CD19B220CD138 или CD45CD19B220CD138.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется в ходе развития аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется в ходе развития волчаночный нефрит. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляется пролиферативная гломерулонефропатия. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляются в ходе развития один или несколько фенотипов, ассоциированных с системной красной волчанкой (SLE). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, проявляются один или несколько фенотипов или симптомов, выбранных из группы, состоящей из повышенных титров аутоантител и цитокинов в сыворотке крови, лимфаденопатии, спленомегалии и избирательного размножения клеток миелоидных и лимфоидных классов или их комбинаций. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько фенотипов или симптомов наблюдаются уже в 8 недель. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько фенотипов или симптомов наблюдаются в возрасте от приблизительно 18 недель до приблизительно 24 недель включительно.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается выделенная клетка или ткань, не относящаяся к человеку, от животного, отличного от человека, которое описано в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенная клетка или ткань содержит локус C9ORF72, который описан в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка представляет собой нервную клетку или клетку из линии нервных клеток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка происходит из лимфоидной или миелоидной линии. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка является выбранной из В-клетки, дендритной клетки, макрофага, моноцита и Т-клетки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ткань является выбранной из жировой ткани, ткани мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, костного мозга, глаза, сердца, кишечника, почки, печени, легкого, лимфатического узла, мышцы, поджелудочной железы, плазмы крови, сыворотки крови, кожи, селезенки, желудка, тимуса, семенника, яйцеклетки и их комбинации.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается иммортализированная клеточная линия, которая получена из выделенной клетки из животного, отличного от человека, которое описано в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, геном которой содержит локус C9ORF72, который описан в данном документе, или делецию в локусе C9ORF72, которая описана в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой мышиную эмбриональную стволовую клетку и происходит из линии 129, линии C57BL или их смеси. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбриональная стволовая клетка грызуна представляет собой мышиную эмбриональную стволовую клетку и представляет собой смесь линий 129 и C57BL.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, которая описана в данном документе, для получения генетически модифицированного животного, отличного от человека. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой мышиную эмбриональную стволовую клетку, и ее применяют для получения мыши, содержащей локус C9ORF72, который описан в данном документе. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой крысиную эмбриональную стволовую клетку, и ее применяют для получения крысы, содержащей локус C9ORF72, который описан в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается эмбрион, не относящийся к человеку, который содержит, создан из, получен из или образован из эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, которая содержит локус C9ORF72, описанный в данном документе. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбрион, не относящийся к человеку, представляет собой эмбрион грызуна; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, мышиный эмбрион; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крысиный эмбрион.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение эмбриона, не относящегося к человеку, который описан в данном документе, для получения генетически модифицированного животного, отличного от человека. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбрион, не относящийся к человеку, представляет собой мышиный эмбрион, и его применяют для получения мыши, содержащей локус C9ORF72, который описан в данном документе. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления эмбрион, не относящийся к человеку, представляет собой крысиный эмбрион, и его применяют для получения крысы, содержащей локус C9ORF72, который описан в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается конструкция нуклеиновой кислоты (или нацеливающая конструкция или нацеливающий вектор), которая описана в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, которая описана в данном документе содержит в направлении от 5' к 3' не относящееся к человеку нацеливающее плечо, содержащее полинуклеотид, который является гомологичным 5' части локуса C9ORF72, не относящегося к человеческому (например, грызуна, такого как мышь или крыса), первый сайт распознавания для рекомбиназы; первый промотор, функционально связанный с геном рекомбиназы, второй промотор, функционально связанный с селектируемым маркером, второй сайт распознавания для рекомбиназы, репортерный ген, который описан в данном документе, и не относящееся к человеку нацеливающее плечо, содержащее полинуклеотид, который является гомологичным 3' части локуса C9ORF72, не относящегося к человеческому (например, грызуна, такого как мышь или крыса). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления 3' часть локуса C9ORF72, не относящегося к человеческому, включает в себя геномную последовательность ниже стоп-кодона в экзоне 11 гена C9ORF72, отличного от человеческого (например, грызуна, такого как мышь или крыса). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления 5' часть локуса C9ORF72 включает в себя геномную последовательность выше старт-кодона в экзоне 2 гена C9ORF72, не относящегося к человеческому (например, грызуна, такого как мышь или крыса). В соответствии со многими вариантами осуществления первый и второй сайты распознавания для рекомбиназы ориентированы таким образом, чтобы управлять вырезанием. В соответствии со многими вариантами осуществления ген рекомбиназы кодирует рекомбиназу, которая распознает первый и второй сайты распознавания для рекомбиназы. В соответствии со многими вариантами осуществления первый промотор управляет экспрессией гена рекомбиназы в дифференцированных клетках и не управляет экспрессией гена рекомбиназы в недифференцированных клетках. В соответствии со многими вариантами осуществления первый промотор является транскрипционно компетентным и регулируемым стадией развития.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сайты распознавания для рекомбиназы включают в себя 1охР, lох511, lох2272, lох2372, lох66, lox71, 1охМ2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, Dre, rox или их комбинацию. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ген рекомбиназы является выбранным из группы, состоящей из Cre, Flp (например, Flpe, Flpo) и Dre. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления первый и второй сайты распознавания для рекомбиназы представляют собой сайты lox (например, loxP), и ген рекомбиназы кодирует рекомбиназу Cre.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления первый промотор является выбранным из группы, состоящей из промотора гена протамина (Prot; например, Prot1 или Prot5), Blimp1, Blimp1 (фрагмент из 1 т.п.н.), Blimp1 (фрагмент 2 т.п.н.), Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 и Рах3. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления первый промотор является выбранным из промотора, который приведен в таблице 2. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления первый промотор представляет собой или содержит SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
r
r
r
r
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления селектируемый маркер является выбранным из группы, состоящей из неомицин-фосфотрансферазы (neo), гигромицин В-фосфотрансферазы (hyg), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro), бластицидин S-дезаминазы (bsr), ксантин/гуанин-фосфорибозил-трансферазы (gpt) и тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk).
r
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления второй промотор является выбранным из группы, состоящей из промотора UbC, промотора Ubi, промотора hCMV, промотора mCMV, промотора CAGGS, промотора EF1, промотора pgk1, промотора гена бета-актина и промотора ROSA26. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления селектируемый маркер представляет собой neo, и второй промотор представляет собой Ubi.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается способ получения животного, отличного от человека, геном которого содержит делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, причем способ предусматривает (а) введение последовательности нуклеиновой кислоты в эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, таким образом, чтобы вся кодирующая последовательность в локусе C9ORF72 была удалена, причем нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, который является гомологичным локусу C9ORF72; (b) получение генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, из (а); и (с) получение животного, отличного от человека, с применением генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, из (b). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ получения животного, отличного от человека, описанного в данном документе, дополнительно предусматривает стадию скрещивания животного, отличного от человека, которое получено в (с), таким образом, чтобы получить животное, отличное от человека, которое является гомозиготным в отношении делеции.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой конструкцию нуклеиновой кислоты, которая описана в данном документе, содержит ее или присутствует в ней. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит один или несколько маркеров для отбора. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит один или несколько сайтов для сайт-специфической рекомбинации. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит ген рекомбиназы и маркер для отбора, фланкированные сайтами распознавания для рекомбиназы, причем сайты распознавания для рекомбиназы ориентированы таким образом, чтобы управлять вырезанием. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит репортерный ген, который находится ниже относительно маркера для отбора. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит ген рекомбиназы, который является функционально связанным с промотором, управляющим экспрессией гена рекомбиназы в дифференцированных клетках и не управляющим экспрессией гена рекомбиназы в недифференцированных клетках. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит ген рекомбиназы, который является функционально связанным с промотором, являющимся транскрипционно компетентным и регулируемым стадией развития. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит ген рекомбиназы, являющийся функционально связанным с промотором, который представляет собой или содержит SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается способ получения животного, отличного от человека, геном которого содержит делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, причем способ предусматривает модификацию генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, получая таким образом указанное животное, отличное от человека.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается животное, отличное от человека, которое может быть получено с помощью, создано из или получено посредством способа, который описан в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается модель на животном, отличном от человека, для бокового амиотрофического склероза (ALS) или лобно-височной деменции (FTD), причем животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается модель на животном, отличном от человека, для бокового амиотрофического склероза (ALS) или лобно-височной деменции (FTD), которая получена посредством делеции всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, причем у животного, отличного от человека, проявляются в ходе развития один или несколько симптомов ALS и/или FTD.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается модель для гломерулонефрита на животном, отличном от человека, причем животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается модель для гломерулонефрита на животном, отличном от человека, которую получают посредством делеции всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, причем у животного, отличного от человека, проявляются в ходе развития один или несколько симптомов гломерулонефрита.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается модель для лимфопролиферативного заболевания на животном, отличном от человека, причем животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается модель для лимфопролиферативного заболевания на животном, отличном от человека, которую получают посредством делеции всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, причем у животного, отличного от человека, проявляются в ходе развития один или несколько симптомов дисрегуляции или дисфункции иммунной системы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается способ идентификации терапевтического кандидата для лечения заболевания, нарушения или состояния у животного, отличного от человека, причем способ предусматривает (а) введение средства-кандидата животному, отличному от человека, геном которого содержит делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72; (b) осуществление одного или нескольких анализов для определения того, оказывает ли средство-кандидат воздействие на один или несколько признаков, симптомов и/или состояний, ассоциированных с заболеванием, нарушением или состоянием; и (с) идентификацию средства-кандидата, которое оказывает воздействие на один или несколько признаков, симптомов и/или состояний, ассоциированных с заболеванием, нарушением или состоянием, в качестве терапевтического кандидата.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевание, нарушение или состояние у животного, отличного от человека, представляет собой нейродегенеративное заболевание, нарушение или состояние. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевание, нарушение или состояние у животного, отличного от человека, представляет собой воспалительное заболевание, нарушение или состояние. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевание, нарушение или состояние у животного, отличного от человека, представляет собой аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевание, нарушение или состояние у животного, отличного от человека, представляет собой аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS; также известный как синдром Канале-Смит). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ALPS характеризуется повышенным уровнем IL-10, антител к ревматоидному фактору (антител к RF), антинуклеарных антител (ANA) или их комбинаций в сыворотке крови.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевание, нарушение или состояние у животного, отличного от человека, представляет собой волчаночный нефрит. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления волчаночный нефрит характеризуется пролиферацией и/или разрастанием мезангиальной ткани. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления волчаночный нефрит характеризуется одной или несколькими аномалиями канальцев. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления одна или несколько аномалий канальцев являются выбранными из расширения, образования цилиндров, базофилии и их комбинации.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления заболевание, нарушение или состояние у животного, отличного от человека, представляет собой системную красную волчанку (SLE). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SLE характеризуется одним или несколькими из лимфоидной гиперплазии, активации Т-клеток, повышенным содержанием антинуклеарных антител (ANA) в сыворотке крови и системным воспалением, поражающим сердце, легкие, печень, кожу, суставы, нервную систему и почки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения нейродегенеративного заболевания, нарушения или состояния.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения воспалительного заболевания, нарушения или состояния.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения лимфопролиферативного заболевания, нарушения или состояния.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома (ALPS).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается применение животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения волчаночного нефрита.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нейродегенеративное заболевание, нарушение или состояние представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нейродегенеративное заболевание, нарушение или состояние представляет собой лобно-височную деменцию (FTD). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления воспалительное заболевание, нарушение или состояние представляет собой гломерулонефрит.В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние представляет собой гломерулонефрит, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS), волчаночный нефрит или системную красную волчанку (SLE).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние, которое описано в данном документе, характеризуется значительным повышением концентрации аутоантител в сыворотке крови. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние, которое описано в данном документе, характеризуется значительным повышением уровня одного или нескольких цитокинов (например, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-α и т.д.) в сыворотке крови.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления лимфопролиферативное заболевание, нарушение или состояние, которое описано в данном документе характеризуется значительным повышением содержания одной или нескольких иммунных клеток в одном или нескольких из селезенки, костного мозга, лимфатического узла(лимфатических узлов), почки или крови. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления лимфопролиферативное заболевание, нарушение или состояние, которое описано в данном документе, характеризуется дерегуляцией или дисрегуляцией одного или нескольких лимфоцитов.
В соответствии с различными вариантами осуществления делеция всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72 включает в себя делеции, которые описаны в данном документе. В соответствии с различными вариантами осуществления отличный от человеческого локус C9ORF72 включает в себя отличный от человеческого локус C9ORF72, который описан в данном документе. В соответствии с различными вариантами осуществления отличный от человеческого локус C9ORF72 представляет собой мышиный C9orf72 (например, мышиный или крысиный локус C9orf72).
В соответствии с различными вариантами осуществления один или несколько фенотипов, которые описаны в данном документе, сравнивают с эталоном или контролем. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталон или контроль включает в себя животное, отличное от человека, имеющее модификацию, которая описана в данном документе, модификацию, которая отличается от модификации, описанной в данном документе, или не имеющее модификации (например, отличное от человека животное дикого типа).
В соответствии с различными вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой грызуна; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, мышь; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, крысу.
Используемые в контексте данной заявки термины «приблизительно» и «примерно» используются как эквиваленты. Предполагается, что любые числительные, используемые в данной заявке с терминами «приблизительно»/ «примерно» или без них, охватывают любые нормальные колебания, понятные квалифицированному специалисту в соответствующей области техники.
Другие признаки, объекты и преимущества животных, отличных от человека, клеток и способов, представленных в данном документе, приведены в подробном описании определенных вариантов осуществления, которое представлено ниже. Тем не менее, следует понимать, что подробное описание, хотя в нем указаны определенные варианты осуществления, представлено только с целью иллюстрации, но не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения будут понятны специалистам в данной области техники из подробного описания.
Краткое описание чертежей
В данный документ включены чертежи, которые состоят из следующих фигур, и они предназначены только для иллюстрации, но не для ограничения. Файл с патентом или заявкой содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации патентной заявки с цветным чертежом(чертежами) будут предоставлены Ведомством по запросу и при оплате необходимого сбора.
На фиг. 1А, верхняя секция, показана схематическая иллюстрация без соблюдения масштаба трех описанных мышиных изоформ (V1, V2 и V3) транскрипта C9orf72 и стратегии целенаправленной делеции для разрушения мышиного локуса C9orf72. Создавали нацеливающий вектор, который включает в себя верхнее мышиное гомологичное плечо (или «mHU», содержащее геномную последовательность выше старт-кодона и включающее старт-кодон в экзоне 2 мышиного гена C9ORF72), репортерный ген lacZ (без старт-кодона ATG), самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству (которая включает в себя ген, обеспечивающий устойчивость к неомицину, и ген рекомбиназы Cre, связанный с мышиным промотором гена протамина 1 (Prm1), фланкированные сайтами loxP) и нижнее мышиное гомологичное плечо (или «mHD», содержащее геномную последовательность из 49 п.о. ниже стоп-кодона в экзоне 11 мышиного гена C9ORF72). При гомологичной рекомбинации удалялся участок мышиного генома приблизительно из 26 т.п.н., в том числе кодирующую последовательность C9orf72 для всех прогнозируемых мышиных изоформ C9orf72 (т.е. кодирующую последовательность, начинающуюся с кодона сразу после старт-кодона ATG в экзоне 2 мышиного C9orf72, продолжающуюся в экзонах 3-10, промежуточных интронах и 49 п.о. 3'UTR в экзоне 11 мышиного C9orf72); и репортерный ген lacZ (без старт-кодона ATG) вводили сразу после оставшегося эндогенного старт-кодона ATG в мышиный C9orf72. Полученный в результате модифицированный мышиный локус C9orf72 изображен на фиг. 1А, нижняя секция. Технологию самоудаления использовали для удаления неомициновой кассеты перед фенотипическим анализом, оставляя репортер lacZ и один сайт loxP под контролем мышиного промотора C9orf72. Модифицированный мышиный локус C9orf72 после того, как из него была удалена неомициновая кассета, изображен на фиг. 1А, нижняя секция. Нуклеотидная последовательность модифицированного локуса C9orf72, начинающаяся со вставленной последовательности lacZ и продолжающаяся до 3' сайта loxP, изложена в SEQ ID NO: 8; и нуклеотидная последовательность модифицированного локуса C9orf72, начинающаяся с экзона 1а и продолжающаяся до 3' UTR изложена в SEQ ID NO: 9.
+/-
-/-
На фиг. 1В показан выполненный с помощью метода TAQMAN анализ экспрессии C9orf72 (вверху; также известный как 3110043021RIK) и активатора 3В MOB киназы (Mob3b; внизу) у мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей.
-/-
-/-
2
-/-
+/+
-/-
+/+
-/-
+/+
+/-
-/-
На фиг. 2A-2L показаны ALS-подобные фенотипы, измеренные у мышей дикого типа (n=9) и C9orf72 мышей (n=11). Фиг. 2А: иллюстративный процент выживших (ось у) со временем (ось х, недели); фиг. 2В: иллюстративное изменение массы тела (ось у, в граммах) со временем (ось х, недели); фиг. 2С: иллюстративная средняя оценка двигательного нарушения со временем (ось х, недели); фиг. 2D: иллюстративная средняя оценка тремора со временем (ось х, недель); фиг. 2Е: иллюстративная средняя оценка ригидности со временем (ось х, недели); фиг. 2F: иллюстративное максимальное время на вращающемся барабане (ось у, в секундах) со временем (ось х, недели); фиг. 2G: иллюстративное локомоторное поведение в тесте «открытое поле», например, отсутствие подвижности (слева; ось у, в секундах) и время на задних лапах (справа; ось у, в секундах) со временем (ось х, недели); фиг. 2Н: иллюстративное поведение в тесте catwalk, например, средняя длина шага (вверху слева, ось у, сантиметры [см]), координация между конечностями (вверху справа) представлена в виде показателя правильности в процентах (ось у) со временем (ось х, недели), и фаза опоры (внизу по центре) представлена в виде среднего времени стояния (ось у, в секундах) со временем (ось х, недели); фиг. 2I: иллюстративные изображения мотонейронов 60-недельных мышей дикого типа (WT, n=5) и C9orf72 мышей (n=5), и иллюстративное подсчитанное количество мотонейронов (внизу слева), средняя площадь (в мкм, внизу по центру, р<0,0001) и площадь текла клетки (у ряда клеток, внизу справа) для мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; 10 мотонейронов подвергали измерению в отношении площади поверхности тела клеток на срезе (три среза на группу), набухание указывало на гипоксию и повреждение клеток; фиг. 2J: иллюстративный процент выживших со временем (вверху слева), изменение массы тела в граммах (вверху справа), средняя оценка двигательного нарушения со временем (внизу слева), средняя оценка тремора со временем (внизу по центру), и средняя оценка ригидности со временем (внизу справа) у 32-60-недельных мышей дикого типа (C9orf72; n=14) и C9orf72 (n=17) мышей; фиг. 2K: иллюстративный максимальное время на вращающемся барабане со временем (вверху слева), локомоторное поведение в тесте «открытое поле», например, отсутствие подвижности со временем (вверху по центру) и время на задних лапах со временем (вверху справа), поведение в тесте catwalk, например, среднюю длину шага со временем (внизу слева) и координацию между конечностями, представленную в виде показателя правильности в процентах со временем (внизу по центру), и общее пройденное расстояние со временем (внизу справа) у 32-60-недельных мышей дикого типа (С9orf72; n=14) и C9orf72 (n=17) мышей; фиг. 2L: иллюстративная средняя оценка двигательного нарушения со временем (вверху слева), средняя оценка тремора со временем (вверху по центру), средняя оценка ригидности со временем (вверху справа) и сила сжатия (в граммах силы) у мышей дикого типа (С9оrf72), гетерозиготных (C9orf72) и гомозиготных (C9orf72) мышей. Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA).
-/-
-/-
+/-
-/-
-/-
-/-
+/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+/-
-/-
-/-
-/-
-
-
-
+
+
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+
+
+
-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+
+
+
mid
+
-/-
+
-/-
+
-/-
+
-/-
+
+
-/-
+
+
-/-
+
+
-/-
+
+
-/-
+
+
-/-
+
+
-/-
+
+
-/-
+
+
+
+
+
+
+
+
-/-
+/-
-/-
+/-
-/-
+/-
-/-
+/-
-/-
-/-
+/-
-/-
+/-
-/-
+/-
-/-
-/-
-/-
я
я
На фиг. 3A-3AL показаны результаты иммунофенотипирования, измеренные на мышах дикого типа (n=≥4) и мышах, имеющих нарушение в локусе C9orf72 (n=≥4). Фиг. 3А: иллюстративные изображения вскрытых самок мышей дикого типа (WT) и C9orf72, показывающие увеличенные шейные лимфатические узлы (стрелки) у C9orf72 мыши, и значения массы селезенки (справа, в граммах) у самок мышей дикого типа (WT), C9orf72 (НЕТ) и С9оrf72 (KO) мышей в 8 (верхний ряд) и 18 (нижний ряд) недель; фиг. 3В: иллюстративные изображения вскрытых самцов мышей дикого типа (WT) и C9orf72, показывающие увеличенные шейные лимфатические узлы (стрелки) у C9orf72 мыши, и значения массы селезенки (справа, в граммах) у самцов мышей дикого типа (WT), C9orf72 (НЕТ) и C9orf72 (KO) мышей в 9-10 (верхний ряд) и 18 (нижний ряд) недель; фиг. 3С: иллюстративные изображения 37-недельной самки и 56-недельного самца C9orf72 мышей, показывающие увеличенные шейные лимфатические узлы (стрелки); фиг. 3D: иллюстративные изображения вскрытых 30-35-недельных самок мышей дикого типа (верхний ряд) и C9orf72(средний ряд), показывающие увеличенные шейные лимфатические узлы (стрелки), и массы тела (в граммах), массы селезенок (в граммах) и массы селезенки, нормализованная к массе тела (в виде % от массы тела) (нижний ряд); иллюстративное изображение вырезанной селезенки (внизу слева) от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 (-/-); фиг. 3Е: иллюстративные данные СВС с определением лейкоцитарной формулы, показывающие общее подсчитанное количество лейкоцитов и популяции различных типов иммунных клеток в кровотоке у 34-38-недельных самцов мышей дикого типа (WT), C9orf72 (НЕТ), и C9orf72 (KO) мышей (тип клеток указаны в верхней части каждого графика); фиг. 3F: иллюстративные изображения срезов ткани селезенки и шейного лимфатического узла от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей при 4-кратном увеличении и окрашивании гематоксилином и эозином; фиг. 3G: иллюстративные изображения срезов ткани шейного лимфатического узла от C9orf72 мышей при 60-кратном увеличении и окрашивании гематоксилином и эозином (голубые стрелки: клетки с плазмоцитоидной морфологией; желтые стрелки: нейтрофилы; зеленые стрелки: клетки по типу макрофагов; красная стрелка: клетка Мотта); фиг. 3Н: иллюстративный процент положительных В-клеток (CD11b, CD11с, CD3, В220, CD19) из селезенка, шейных лимфатических узлов, костного мозга и крови у самцов мышей дикого типа (WT) и C9orf72 (KO); фиг. 3I: иллюстративные плазматические клетки на различных стадиях, экспрессирующие специфические антигены клеточной поверхности и выделенные из селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга и крови самцов мышей дикого типа (WT) и C9orf72 (KO) мышей в 9-10 недель (черные столбики), 18 недель (светло-серые столбики) и 57-60 недель (темно-серые столбики); фиг. 3J: иллюстративные плазматические клетки на различных стадиях, экспрессирующие специфические антигены клеточной поверхности и выделенные из селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга и крови самок мышей дикого типа (WT) и C9orf72 (KO) мышей в 8 недель (черные столбики), 18 недель (светло-серые столбики) и 30-35 недель (темно серые столбики); фиг. 3K: иллюстративный процент положительных миелоидных клеток на различных стадиях, экспрессирующих специфические антигены клеточной поверхности и выделенных из селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга и крови самцов мышей дикого типа (WT) и C9orf72 (KO) мышей в 9-10 недель (черные столбики), 18 недель (светло-серые столбики) и 57-60 недель (темно-серые столбики); фиг. 3L: иллюстративный процент положительных миелоидных клеток на различных стадиях, экспрессирующих специфические антигены клеточной поверхности и выделенных из селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга и крови самок мышей дикого типа (WT) и C9orf72 (KO) мышей в 8 недель (черные столбики), 18 недель (светло-серые столбики) и 30-35 недель (темно-серые столбики); фиг. 3М: иллюстративный процент положительных клеток-макрофагов (CD45, CD11b, F4/80, Ly6G) в селезенке, шейных лимфатических узлах, костном мозге, почке и крови 30-35-недельных самок мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3N: иллюстративные изображения срезов селезенки от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей при 4-кратном увеличении, окрашенных с использованием различных маркеров (указанных под каждым изображением); фиг. 3О: иллюстративные изображения срезов шейных лимфатических узлов от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей при 4-кратном увеличении, окрашенных с использованием различных маркеров (указанных под каждым изображением; стрелка: клетки, периодически окрашивающиеся CD138); фиг. 3Р: иллюстративные изображения срезы селезенки и шейного лимфатического узла от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей при 4-кратном и 60-кратном увеличении, окрашенные в отношении F4/80; фиг. 3Q: иллюстративные общие подсчитанные количества клеток в селезенке, шейных лимфатических узлах, костном мозге и почке у мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей. Подсчет клеток выполняли с использованием прибора для подсчета и определения жизнеспособности клеток Cellometer Auto Т4 Cell Viability Counter перед анализом с помощью метода FACS. Его выполняли для расчета общего количества клеток, положительных в отношении поверхностных маркеров, представляющих интерес, дополнительно к представлению данных в виде процента клеток, положительных в отношении указанных маркеров. Поскольку эти подсчеты количества выполнялись после лизиса эритроцитов, они также являются характерными для сильной инфильтрации иммунных клеток (лейкоцитов), поскольку общие подсчитанные количества клеток были повышенными у нуль-мышей по сравнению с диким типом; фиг. 3R: иллюстративные процент положительных клеток и подсчитанные количества миелоидных дендритных клеток (слева; CD11b, CD11c, МНСII) и NK-клеток (справа; NKp46, CD49b) в селезенке и костном мозге для мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3S: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD45 клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3Т: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD8 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3U: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD4 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3V: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD8CD44 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3W: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD4CD44 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3Х: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD8CD69 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3Y: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD4CD69 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3Z: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD8PD1 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3АА: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD4PD1 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3АВ: иллюстративные процент положительных клеток (верхний ряд) и общее подсчитанное количество клеток (нижний ряд) для CD4FoxP3 Т-клеток в различных тканях мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3АС: иллюстративные процент положительных клеток (слева в каждой паре) и общее подсчитанное количество клеток (справа в каждой паре) для популяций CD8CD62L (вверху слева), CD4CD62L (внизу слева), CD8CD127 (вверху справа) и CD4CD127 (внизу справа) Т-клеток в селезенке мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей; фиг. 3AD: иллюстративная панель цитокинов, показывающая экспрессию различных цитокинов у 18-недельных самцов мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей (цитокины указаны в над каждым графиком); фиг. 3АЕ: иллюстративная панель цитокинов, показывающая экспрессию различных цитокинов у 8-58-недельных самцов мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей (цитокины указаны над каждым графиком); фиг. 3AF: иллюстративная панель цитокинов, показывающая экспрессию различных цитокинов у 8-38-недельных самок мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей (цитокины указаны над каждым графиком); фиг. 3AG: иллюстративные уровни азота мочевины крови (ось у, мг/дл), глобулина (ось у, г/дл) и сывороточного иммуноглобулина (ось у, IgG, Ед./мл (слева); ось у, IgM, Ед./мл (справа)) у мышей дикого типа (WT), C9orf72 и C9orf72 мышей (результаты измерений азота мочевины крови и глобулина получены от 45-56-недельных самцов мышей; результаты измерения содержания IgM и IgG антител к ревматоидному фактору в сыворотке крови получены от 8-58-недельных самцов мышей; значительное повышение содержания RF IgG и IgM наблюдали у C9orf72 мышей во все моменты времени, начиная с возраста 8 недель); фиг. 3АН: иллюстративные уровни IgG и IgM антител к ревматоидному фактору у самок (верхний ряд) и самцов (нижний ряд) мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей; измерения в сыворотке крови у мышей в возрасте 8-10 недель (самцы: 7 WT, 5 Het, 9KO; самки: 7 WT, 5 Het, 8 KO), 18 недель (самцы: 9 WT, 6 Het, 13 KO; самки: 5 WT, 12 Het, 15 KO), 30-41 неделя (самцы: 3WT, 4 Het, 4 KO; самки: 10 WT, 9 Het, 9 KO) и 54-65 недель (самцы: 6WT, 9 Het, 5 KO); фиг. 3AI: иллюстративные уровни IgG и IgM в кровотоке (в мкг/мл, ось у) у самок (верхний ряд) и самцов (нижний ряд) мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей; фиг. 3AJ: иллюстративные уровни аутоантител в кровотоке (в Ед./мл, ось у) у самок, возраст 26-34 недель, (верхний ряд) и самцов, возраст 26-34 недель, (нижний ряд) мышей дикого типа (WT), C9orf72 (Het) и C9orf72 (KO) мышей; фиг. 3AK: иллюстративные изображения срезов почки (вверху) и печени (внизу) от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей при 100-кратном и 20-кратном увеличении, соответственно, окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е) или в отношении F4/80 с помощью методики иммуногистохимического окрашивания (F4/80 IHC); фиг. 3AL: иллюстративные изображения срезов ткани почки от мышей дикого типа (WT) и C9orf72 мышей возрастом 8-63 недель, окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е, верхняя секция), в отношении IgG (2 секция сверху), IgM (3 секция сверху) и комплемента С3 (нижняя секция). Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA).
На фиг. 4 показано иллюстративное процентное содержание живых нейронов относительно контроля (ось у) для культивируемых нейронов дикого типа, обработанных различными концентрациями токсинов. Вверху иллюстрируется план эксперимента, который описан в примере 4. DA (домоевая кислота; агониста АМРА/каинатного рецептора), ВМАА (β-метиламино-L-аланин, 100 мкМ), MK801 (дизоцилпин, 10 мкМ; антагониста NMDA-рецептора), NBQX (2,3-дигидрокси-6-нитро-7-сульфамоил-бензохиноксалин-2,3-дион, 10 мкМ; антагонист АМРА/каинтаного рецептора); глутатион (10 мкМ, антиоксидант). Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA). Сох, Р.А. et al., 2003, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 100(23):13380-13383; Murch, S.J. et al., 2004, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 101(33):12228-12231; Соx, P.A. et al., 2005, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 102(14):5074-5078; Erdner, D.L. et al., 2008, Environmental Health, 7 (Suppl. 2):S2.
На фиг. 5A-5D показано измерение ALS-подобных фенотипов у мышей дикого типа, которым вводили i.p.инъекции ВММА (n=5) или PBS (контроль, n=5). На фиг. 5А: Вверху иллюстрируется план эксперимента и моменты времени для обработки, измерения массы тела и поведенческих исследований, внизу показано иллюстративное изменение массы тела (ось у, в граммах) со временем (ось х, недели) у контрольных (черным) и обработанных ВМАА мышей (серым); фиг. 5В: иллюстративное максимальное время на вращающемся барабане (ось у, секунды) со временем (ось х, недели) у контрольных (черным) и обработанных ВМАА мышей (серым); фиг. 5С: иллюстративное локомоторное поведение в тесте «открытое поле», например, отсутствие подвижности (слева; ось у, в секундах) и время на задних лапах (справа; ось у; в секундах) со временем (ось х, недели) у контрольных (черным) и обработанных ВМАА мышей (серым); фиг. 5D: иллюстративное поведение в тесте catwalk, например, средняя длина шага (вверху слева, ось у, сантиметры [см]), координация между конечностями (вверху справа), представленная в виде выраженного в процентах показателя правильности (ось у) со временем (ось х, недели), и фаза опоры (внизу по центру) представленная в виде среднего значения времени стояния (ось у, в секундах) со временем (ось х, недели) у контрольных (черным) и обработанных ВМАА мышей (серым). Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA).
-/-
На фиг. 6А-6Е показано измерение ALS-подобных фенотипов у мышей дикого типа и C9orf72 мышей, которым вводили i.p. инъекции ВММА (дикий тип с ВМАА: 3 самцов, 2 самки; нокаутные с ВМАА: 3 самцов, 3 самки) или PBS (контроль дикого типа: 4 самца, 1 самка; нокаутный контроль: 5 самцов, 1 самка). На фиг. 6А: вверху иллюстрируется план эксперимента и моменты времени для обработки, измерения массы тела и поведенческих исследований, внизу слева показан иллюстративный процент выживших (ось у) со временем (ось х, недели), внизу справа показано иллюстративное изменение массы тела (ось у, в граммах) со временем (ось х, недели); на фиг. 6В: вверху слева показано иллюстративная средняя оценка двигательного нарушения со временем (ось х, недели), вверху справа показано иллюстративная средняя оценка тремора со временем (ось х, недели), внизу показано иллюстративная средняя оценка ригидности со временем (ось х, недели); фиг. 6С: иллюстративное максимальное время на вращающемся барабане (ось у, секунды) со временем (ось х, недели); фиг. 6D: иллюстративный локомоторное поведение в тесте «открытое поле», например, отсутствие подвижности (слева; ось у, в секундах) и время на задних лапах (справа; ось у, в секундах) со временем (ось х, недели); фиг. 6Е: иллюстративное поведение в тесте catwalk, например, средняя длина шага (вверху слева, ось у, сантиметры [см]), координация между конечностями (вверху справа), представленная в виде выраженного в процентах показателя правильности (ось у) со временем (ось х, недели), и фаза опоры (внизу по центру), представленная в виде среднего значения времени стояния (ось у, в секундах) со временем (ось х, недели). Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA).
-/-
-/-
На фиг. 7 показаны полученные in vitro данные выживания (внизу слева) и окислительного стресса (внизу справа) мотонейронов дикого типа и C9orf72 (нокаутных), обработанных ВМАА. Вверху приведена схематическая иллюстрация плана эксперимента; выживание (внизу слева) представлено в виде процента живых нейронов относительно контроля дикого типа (ось у) на нейронах дикого типа (контроль) и C9orf72 (нокаутных) нейронах, обработанных 100 мМ ВМАА. Окислительный стресс в День 1 (в левой части изображения внизу справа) и День 7 (в правой части изображения внизу справа) представлен в виде средней оптической плотности флуоресценции при длине волны ~485/520 нм, которую дает чувствительный к ROS зонд, CellROX Green (Life Technologies). Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA).
-/-
+/+
+/+
го
+/+
+/+
На фиг. 8 показаны иллюстративные данные выживания (вверху слева), окислительного стресса (вверху посередине), соотношения митохондриальной ДНК к ядерной (вверху справа) и различных измерений митохондриальной функции (внизу слева направо) в мотонейронах дикого типа (WT) и C9orf72. Выживание (вверху слева) представлено в виде количества клеток, виде процента от C9orf72; окислительный стресс в День 1 и День 7 представлен в виде количества активных форм кислорода (ROS; оптическая плотность в процентах от C9orf72); соотношение митохондриальной ДНК к ядерной представлено в виде среднего значения количества копий митохондриальной ДНК; митохондриальное дыхание представлено в виде скорости потребления кислорода, рассчитанной в виде процента от данных 1 измерения у C9orf72; базальное дыхание, выработка АТФ, протонная утечка, максимальное дыхание, резервная респираторная емкость и немитохондриальное дыхание представлены в виде скорости потребления кислорода, рассчитанной в виде процента от C9orf72 контроля.
-/-
-/-
На фиг. 9А-9С показана прогрессирующая гломерулонефропатия у C9orf72 мышей. На фиг. 9А показаны взвешенные графы для гистопатологической оценки, которые демонстрируют, что наиболее значительные изменения в почках, наблюдаемые у нуль-мышей, являются ассоциированными с мембранопролиферативным гломерулонефритом. На фиг. 9В показаны отдельные результаты гистопатологической оценки, соответствующие взвешенным графам, изображенным на фиг. 9А. Вкратце, окрашенные Н&Е срезы почки оценивали в слепом формате в отношении категорий признаков заболевания почек, ассоциированного с иммуноопосредованной гломерулонефропатией: мембранопролиферативным гломерулонефритом, интерстициального мононуклеарного воспаления, образования гиалиновых цилиндров, гломерулосклероза и базофильных канальцев. Оценка 0 = нет, 1 = минимальное, 2 = легкое, 3 = умеренное и 4 = тяжелое. У всех нуль-мышей проявлялся мембранопролиферативный гломерулонефрит со степенью тяжести от минимальной до тяжелой, с периодическими проявлениями заболеваний из дополнительных категорий у животных с более тяжелым поражением. На фиг. 9С показаны результаты измерений ACR в моче, полученные в моменты времени 14 недель (фиг. 9С, вверху) и 24 недели (фиг. 9С, внизу) от одной и той же когорты мышей, которые указывают на появление альбуминурии у C9orf72 мышей с возрастом. Гетерозиготные мыши показывали значения, сравнимые с WT, что согласуется с отсутствием наблюдаемого фенотипа.
-/-
-/-
На фиг. 10 демонстрируется, что содержание фолликулярных Т-хелперных (Tfh) клеток (CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+) было значительно повышено, что выражалось в процентном отношении и в общем количестве клеток в C9orf72 селезенке, CLN, MLN и крови. На графиках представлено среднее значение±s.e.m. (*Р≤0,05, **Р≤0,01, ***Р≤0,001 при использовании непарного t-критерия Стьюдента), самки возрастом 26 недель, n=5 на генотип. Повышенное содержание Tfh-клеток также наблюдали в C9orf72 ВМ, которое не достигало значимого уровня.
Определения
Настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и условиями экспериментов, описанными в данном документе, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предполагается ограничение ею, поскольку объем настоящего изобретения определяется пунктами формулы изобретения.
Если не определено иное, все термины и фразы, используемые в данном документе, включают в себя значения, которые получили данные термины и фразы в уровне техники, если противоположное явно не указано или явно не очевидно из контекста, в котором используется термин или фраза. Несмотря на то что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, можно применять при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения, далее будут описаны конкретные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки.
«Введение» включает в себя введение композиции субъекту или в систему (например, в клетку, орган, ткань, организм или в их соответствующую составляющую или набор составляющих). Квалифицированные специалисты в данной области техники поймут, что путь введения может варьировать в зависимости, например, от субъекта или системы, в которую вводят композицию, природы композиции, цели введения и т.д. Например, в соответствии с определенными вариантами осуществления введение субъекту-животному (например, человеку или грызуну) может быть бронхиальным (в том числе посредством бронхиальной инсталляции), буккальным, энтеральным, интердермальным, внутриартериальным, интрадермальным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, интраперитонеальным, интратекальным, внутривенным, интравентрикулярным, мукозальным, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, сублингвальным, местным, трахеальным (в том числе посредством интратрахеальной инсталляции), трансдермальным, вагинальным и/или витреальным. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления введение может включать введение дозы с перерывами. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления введение может включать непрерывное введение дозы (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.
«Ослабление» включает в себя предупреждение, снижение или временное облегчение состояния или улучшение состояния субъекта. Ослабление включает в себя, но не подразумевает полное восстановление или полное предупреждение заболевания, нарушения или состояния (например, радиационного поражения).
Термин «примерно», используемый с одним или несколькими значениями, представляющими интерес, включает в себя значение, которое является подобным изложенному заданному значению. В соответствии с определенными вариантами осуществления термин «примерно» или «приблизительно» относится к диапазону значений, который находится в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любом направлении (больше или меньше) относительно изложенного заданного значения, если не указано иное, или если иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое число будет превышать 100% от возможного значения).
«Биологически активный» включает в себя характеристику любого средства, которое обладает активностью в биологической системе, in vitro или in vivo (например, в организме). Например, средство, которое в случае, когда оно присутствует в организме, оказывает биологический эффект внутри этого организма, считается биологически активным. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, в которых белок или полипептид является биологически активным, часть такого белка или полипептида, которая также характеризуется по меньшей мере одной биологической активностью белка или полипептида, как правило, называется «биологически активной» частью.
«Сравнимый» включает в себя два или более средств, молекул, ситуаций, наборов условий и т.д., которые могут не быть идентичными друг другу, но которые являются достаточно подобными, чтобы позволить их сравнение, в результате которого могут быть сделаны обоснованные выводы на основании наблюдаемых различий или сходств. Квалифицированному специалисту в данной области техники будет понятно, исходя из контекста, какая степень идентичности требуется в любых заданных условиях для двух или более таких средств, молекул, ситуаций, наборов условий и т.д., чтобы считать их сравнимыми.
«Консервативная» в случае описания консервативной аминокислотной замены включает в себя замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь в виде R-группы с подобными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять представляющие интерес функциональные свойства белка, например, способность рецептора к связыванию с лигандом. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи с подобными химическими свойствами, включают в себя: алифатические боковые цепи, такие как глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; алифатические боковые цепи с гидроксильной группой, такие как серин и треонин; амид-содержащие боковые цепи, такие как аспарагин и глутамин; ароматические боковые цепи, такие как фенилаланин, тирозин и триптофан; основные боковые цепи, такие как лизин, аргинин и гистидин; кислотные боковые цепи, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и серосодержащие боковые цепи, такие как цистеин и метионин. Группы консервативных аминокислотных замен включают в себя, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке на аланин, что применяется, например, в сканирующем аланином мутагенезе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления производится консервативная замена, которая характеризуется положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet, G.H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, причем замена характеризуется неотрицательным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
«Контроль» включает в себя принятое в данной области техники значение термина «контроль», представляющего собой стандарт, с которым сравнивают результаты. Как правило, контроли применяют для повышения достоверности в экспериментах посредством выделения переменных для того, чтобы сделать вывод в отношении таких переменных. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления контроль представляет собой реакцию или анализ, которые осуществляются одновременно с исследуемой реакцией или анализом для обеспечения элемента для сравнения. «Контроль» также включает в себя «контрольное животное». «Контрольное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, которая отличается от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. животное дикого типа). В одном эксперименте применяется «тест» (т.е. тестируемая переменная). Во втором эксперименте, «контроль», тестируемая переменная не применяется. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления контроль представляет собой исторический контроль (т.е. относительно теста или анализа, проведенного ранее, или количества или результата, которые являются ранее известными). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления контроль представляет собой или содержит распечатанную или иным образом сохраненную запись. Контроль может представлять собой положительный контроль или отрицательный контроль.
«Нарушение» включает в себя результат события гомологичной рекомбинации с молекулой ДНК (например, с эндогенной гомологичной последовательностью, такой как ген или локус гена). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может достигать вставки, делеции, замены, замещения, миссенс-мутации или сдвига рамки считывания в последовательности(последовательностях) ДНК или любой их комбинации или представлять собой вставку, делецию, замену, замещение, миссенс-мутацию или сдвиг рамки считывания в
последовательности(последовательностях) ДНК или любую их комбинацию. Вставки могут включать в себя вставку целых генов или фрагментов генов, например, экзонов, происхождение которых может быть отличным от эндогенной последовательности (например, гетерологичная последовательность). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может повышать экспрессию и/или активность гена или генного продукта (например, бежа, кодируемого геном). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может снижать экспрессию и/или активность гена или генного продукта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может изменять последовательность гена или кодируемый генный продукт (например, кодируемый белок). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может приводить к усечению или образованию фрагментов гена или кодируемого генного продукта (например, кодируемого белка). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может приводить к удлинению гена или кодируемого генного продукта. В соответствии с некоторыми такими вариантами осуществления нарушение может достигать сборки слитого белка. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может воздействовать на уровень, но не на активность гена или генного продукта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может воздействовать на активность, но не на уровень гена или генного продукта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может не оказывать значительного воздействия на уровень гена или генного продукта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может не оказывать значительного воздействия на активность гена или генного продукта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение может не оказывать значительного воздействия либо на уровень, либо на активность гена или генного продукта.
«Определение», «измерение», «оценка», «оценивание», «анализ» и «проведение анализа» включает в себя любой вид измерения и включает определение того, присутствует ли элемент или нет. Эти термины включают в себя количественные и/или качественные определения. Анализироваться могут относительные или абсолютные величины. «Анализ наличия» может представлять собой определение количества чего-либо присутствующего и/или определение того, присутствует ли оно или отсутствует.
«Эндогенный локус» или «эндогенный ген» включает в себя генетический локус, обнаруживающийся в родительском или эталонном организме перед введением нарушения, делеции, замены, изменения или модификации, которые описаны в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эндогенный локус имеет последовательность, обнаруживающуюся в естественных условиях. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонный организм представляет собой организм дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонный организм представляет собой сконструированный организм. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонный организм представляет собой выведенный в лабораторных условиях организм (либо дикого типа, либо сконструированный).
«Эндогенный промотор» включает в себя промотор, который в естественных условиях ассоциирован, например, в организме дикого типа, с эндогенным геном.
«Ген» включает в себя последовательность ДНК в хромосоме, которая кодирует продукт (например, РНК-продукт и/или полипептидный продукт). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ген включает в себя кодирующую последовательность (т.е. последовательность, которая кодирует конкретный продукт). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ген включает в себя некодирующую последовательность. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления ген может включать в себя как кодирующую (например, экзонную), так и некодирующую (например, интронную) последовательность. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ген может включать в себя одну или несколько регуляторных последовательностей (например, промоторов, энхансеров и т.д.) и/или последовательностей интронов, которые, например, могут контролировать или оказывать воздействие на один или несколько аспектов генной экспрессии (например, экспрессия, специфическая в отношении типа клеток, индуцируемая экспрессия и т.д.). Для ясности авторы настоящего изобретения обращают внимание на то, что используемый в контексте данной заявки термин «ген», в целом, относится к части нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид; термином необязательно могут охватываться регуляторные последовательности, что будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники из контекста. Не предполагается, что данное определение исключает применение термина «ген» к единицам экспрессии, не кодирующим белок, но все же стоит пояснить, что в большинстве случаев термин, который используется в данном документе, относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид.
«Гетерологичный» включает в себя средство или молекулу из отличающегося источника. Например, при использовании в отношении полипептида, гена или генного продукта, присутствующих в конкретной клетке или организме, термин поясняет, что соответствующий полипептид, ген или генный продукт: 1) был сконструирован руками человека; 2) был введен в клетку или организм (или его предшественник) руками человека (например, посредством методов генной инженерии) и/или 3) не продуцируется или не присутствует в естественных условиях в соответствующей клетке или организме (например, в соответствующем типе клеток или типе организма). «Гетерологичный» также включает в себя полипептид, ген или генный продукт, который в норме присутствует в конкретной нативной клетке или организме, но был модифицирован, например, посредством мутации или помещения под контроль регуляторных элементов (например, промотора), с которыми он в естественных условиях не ассоциирован, и которые в соответствии с некоторыми вариантами осуществления представляют собой регуляторные элементы, отличные от эндогенных.
«Клетка-хозяин» включает в себя клетку, в которую была введена нуклеиновая кислота или белок. Специалисту в данной области техники при изучении данного раскрытия будет понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но они также используются применительно к потомству такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях либо вследствие мутации, либо из-за воздействий окружающей среды, такое потомство, в действительности, может не быть идентичным родительской клетке, но при этом все еще включено в объем используемой в данном документе фразы «клетка-хозяин». В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка-хозяин представляет собой или содержит прокариотическую или эукариотическую клетку. В целом, клетка-хозяин представляет собой любую клетку, которая является подходящей для получения и/или продуцирования гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка вне зависимости от царства жизни, к которому относится клетка. Иллюстративные клетки включают в себя клетки прокариот и эукариот (одноклеточных или многоклеточных), бактериальные клетки (например, штаммы Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica и т.д.), растительные клетки, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, Trichoplusia ni и т.д.), клетки животного, отличного от человека, человеческие клетки или слитые клетки, такие как, например, гибридомы или квадромы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка представляет собой человеческую клетку, клетку обезьяны, примата, хомяка, крысы или мыши. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетка сетчатки, Vero, CV1, клетка почки (например, НЕK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, НаK, ВНK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60, (например, ВНK21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальная), CV-1, U937, 3Т3, L-клетка, клетка С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетка Сертоли, BRL клетка 3А, клетка НТ1080, клетка миеломы, опухолевая клетка, а также из клеточной линии, полученной из вышеупомянутых клеток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка содержит один или несколько вирусных генов, например, клетка сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка-хозяин представляет собой или содержит выделенную клетку. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка-хозяин представляет собой часть ткани. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка-хозяин представляет собой часть организма.
«Идентичность» применительно к сравнению последовательностей включает в себя идентичность, которую определяют с помощью разных алгоритмов, известных в уровне техники, которые можно применять для измерения идентичности нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления значения идентичности, которые описаны в данном документе, определены с применением выравнивания в ClustalW версия 1.83 (медленное), в котором используется штраф за открытие гэпа, составляющий 10,0, штраф за продолжение гэпа, составляющий 0,1, и с применением матрицы сравнения подобия по Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008).
«Улучшение», «повышение», «устранение» или «снижение» включает в себя указанные значения, которые являются относительными в сравнении с результатом измерения исходного уровня, как например, с измерением у того же индивида (или животного) перед началом обработки, описанной в данном документе, или с результатом измерения у контрольного индивида (или животного) или нескольких контрольных индивидов (или животных) в отсутствие обработки, описанной в данном документе.
«Выделенный» включает в себя вещество и/или молекулу, которые были (1) отделены по меньшей мере от некоторых из компонентов, с которыми они были ассоциированы при первоначальном получении (или в естественных условиях и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) сконструированы, получены, приготовлены и/или произведены руками человека. Выделенные вещества и/или молекулы могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были первоначально ассоциированы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенные средства являются чистыми приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или более чем приблизительно на 99%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вещество является «чистым», если оно практически не содержит других компонентов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, как будет понятно специалисту в данной области техники, вещество может все еще считаться «выделенным» или даже «чистым» после того, как оно было объединено с определенными другими компонентами, такими как, например, один или несколько носителей или вспомогательных веществ (например, буфер, растворитель, вода и т.д.); в соответствии с такими вариантами осуществления выраженную в процентах степень выделения или чистоты вещества рассчитывают без включения таких носителей или вспомогательных веществ. В качестве одного примера, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, который встречается в естественных условиях, считается «выделенным», если: а) в силу его происхождения или источника получения не связан с некоторыми или всеми из компонентов, которые сопутствуют ему в его нативном состоянии в естественных условиях; b) он практически не содержит других полипептидов или нуклеиновых кислот, относящихся к тому же виду, что и вид, который продуцирует его в естественных условиях; или с) он экспрессируется или находится в иной ассоциации с компонентами из клетки или другой экспрессионной системы, которая не относится к виду, продуцирующему его в естественных условиях. Таким образом, например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид, который получают с помощью химического синтеза, или который синтезируется в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в естественных условиях, считается «выделенным» полипептидом. В качестве альтернативы или дополнения, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид, который подвергся очистке с помощью одной или нескольких методик, может считаться «выделенным» полипептидом в той мере, в которой он был отделен от других компонентов: а) с которыми он связан в естественных условиях; и/или b) с которыми он был связан при первоначальном получении.
Термины «локус» или «локусы» включают в себя специфическое местоположение (специфические местоположения) гена (или значительной последовательности), последовательности ДНК, последовательности, кодирующей полипептид, или положение на хромосоме в геноме организма. Например, «локус C9ORF72» может относиться к специфическому местоположению гена C9ORF72, последовательности ДНК C9ORF72, последовательности, кодирующей C9ORF72, или к положению C9ORF72 на хромосоме в геноме организма, который был идентифицирован как тот, в котором находится данная последовательность. Локус C9ORF72 может содержать регуляторный элемент гена C9ORF72, в том числе, без ограничения, энхансер, промотор 5' и/или 3' UTR или их комбинацию. Квалифицированные специалисты в данной области техники поймут, что в соответствии с некоторыми вариантами осуществления хромосомы могут содержать сотни или даже тысячи генов и демонстрируют физическую совместную локализацию подобных генетических локусов при сравнении между различными видами. Такие генетические локусы могут быть описаны как имеющие общую синтению.
«Животное, отличное от человека», включает в себя любой позвоночный организм, который не представляет собой человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, представляет собой круглоротое, костную рыбу, хрящевую рыбу (например, акулу или ската), амфибию, рептилию, млекопитающее и птицу. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления отличное от человека млекопитающее представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.
«Нуклеиновая кислота» включает в себя любое соединение и/или вещество, которое является включенным или может быть включено в олигонуклеотидную цепь. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой соединение и/или вещество, которое является включенным или может быть включено в олигонуклеотидную цепь посредством фосфодиэфирной связи. Как будет ясно из контекста, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» относится к отдельным остаткам нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидам и/или нуклеозидам); в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» относится к олигонуклеотидной цепи, содержащей отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит РНК; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит ДНК. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит или состоит из одного или нескольких остатков природной нуклеиновой кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит, или состоит из одного или нескольких аналогов нуклеиновой кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналог нуклеиновой кислоты отличается от «нуклеиновой кислоты» тем что, в нем не используется фосфодиэфирный остов. Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит, или состоит из одной или нескольких «пептидо-нуклеиновых кислот», которые являются известными в уровне техники и имеют пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей в остове, и они рассматриваются в пределах объема настоящего изобретения. В качестве альтернативы или дополнения, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» имеет одну или несколько фосфоротиоатных и/или 5'-N-фосфорамидитных связей вместо фосфодиэфирных связей. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит, или состоит из одного или нескольких природных нуклеозидов (например, аденозина, тимидина, гуанозина, цитидина, уридина, дезоксиаденозина, дезокситимидина, дезоксигуанозина и дезоксицитидина). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой, содержит, или состоит из одного или нескольких нуклеозидных аналогов (например, 2-аминоаденозина, 2-тиотимидина, инозина, пирроло-пиримидина, 3-метиладенозина, 5-метилцитидина, С-5-пропилцитидина, С-5-пропинилуридина, 2-аминоаденозина, С5-бромуридина, С5-фторуридина, С5-йодуридина, С5-пропинилуридина, С5-пропинилцитидина, С5-метилцитидина, 2-аминоаденозина, 7-деазааденозина, 7-деазагуанозина, 8-оксоаденозина, 8-оксогуанозина, O(6)-метилуганина, 2-тиоцитидина, метилированных оснований, интеркалированных оснований и их комбинаций). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» содержит один или несколько модифицированных Сахаров (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) по сравнению с сахарами в природных нуклеиновых кислотах. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональный генный продукт, такой как РНК или белок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя один или несколько интронов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя один или несколько экзонов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» является полученной с помощью одного или нескольких из выделения природного источника, ферментативного синтеза посредством полимеризации на основе комплементарной матрицы (in vivo или in vitro), воспроизводства в рекомбинантной клетке или системе и химического синтеза. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» имеет длину по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более остатков. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» является одноцепочечной; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» является двухцепочечной. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один элемент, который кодирует полипептид, или представляет собой последовательность, комплементарную последовательности кодирующей полипептид. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «нуклеиновая кислота» обладает ферментативной активностью.
«Функционально связанный» включает в себя смежное расположение, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, что позволяет им функционировать надлежащим образом. Управляющая последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, является лигированной таким образом, что достигается экспрессия кодирующей последовательности в условиях, совместимых с управляющими последовательностями. «Функционально связанные» последовательности включают в себя как последовательности, управляющие экспрессией, которые являются смежными с геном, представляющим интерес, так и последовательности, управляющие экспрессией, которые действуют удаленно или на расстоянии, управляя геном, представляющим интерес. Термин «последовательность, управляющая экспрессией», включает в себя последовательности полинуклеотидов, которые являются необходимыми для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. «Последовательности, управляющие экспрессией», включают в себя: соответствующие последовательности инициации, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козак); последовательности, которые повышают стабильность белка; и если это желательно, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Природа таких управляющих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот, такие управляющие последовательности обычно включают в себя промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции, тогда как у эукариот такие управляющие последовательности, как правило, включают в себя промоторы и последовательность терминации транскрипции. Предполагается, что термин «управляющие последовательности» включает в себя компоненты, присутствие которых является обязательным для экспрессии и процессинга, и он также может включать в себя дополнительные компоненты, присутствие которых является полезным, например, лидерные последовательности и последовательности-партнеры по слиянию.
«Фенотип» включает в себя признак или класс или набор признаков, проявляющихся клеткой или организмом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления конкретный фенотип может коррелировать с конкретным аллелем или генотипом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фенотип может быть дискретным; в соответствии с некоторыми вариантами осуществления фенотип может быть непрерывным.
Термин «физиологические условия» включает в себя его понятное в данной области техники значение, относящееся к условиям, при которых клетки или организмы живут и/или размножаются. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления термин включает в себя условия внешней или внутренней среды, которые могут встречаться в природе для организма или клеточной системы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления физиологические условия представляют собой такие условия, которые присутствуют внутри организма человека или животного, отличного от человека, в особенности, такие условия, которые присутствуют вблизи и/или в пределах области проведения хирургической операции. Физиологические условия, как правило, включают в себя, например, диапазон температур 20-40°С, атмосферное давление, составляющее 1, рН, составляющий 6-8, концентрацию глюкозы, составляющую 1-20 мМ, концентрацию кислорода на уровне, соответствующем атмосферному, и силу тяготения, которая встречается на Земле. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления условия в лаборатории подвергаются манипуляции и/или поддерживаются на уровне физиологических условий. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления физиологические условия встречаются в организме.
«Полипептид» включает в себя любую полимерную цепь из аминокислот. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая встречается в естественных условиях. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая не встречается в естественных условиях. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая содержит части, встречающиеся в естественных условиях отдельно друг от друга (т.е. из двух или более отличающихся организмов, например, часть от человека и часть, не относящуюся к человеку). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая сконструирована в том смысле, что она создана руками человека и/или продуцируется посредством действий человека.
«Предупреждать» или «предупреждение» применительно к случаям возникновения заболевания, нарушения и/или состояния включает в себя снижение риска развития заболевания, нарушения и/или состояния и/или задержку появления одной или нескольких характеристик или симптомов заболевания, нарушения или состояния. Предупреждение может считаться полным, когда появление заболевания, нарушения или состояния было задержано на предварительно определенный период времени.
«Эталон» включает в себя стандартное или контрольное средство, животное, когорту, индивида, популяцию, образец, последовательность или значение, с которым сравнивают средство, животное, когорту, индивида, популяцию, образец, последовательность или значение, представляющее интерес. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонное средство, животное, когорта, индивид, популяция, образец, последовательность или значение подвергаются исследованию и/или определяются практически одновременно с исследованием или определением средства, животного, когорты, индивида, популяции, образца, последовательности или значения, представляющего интерес. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонное средство, животное, когорта, индивид, популяция, образец, последовательность или значение представляет собой ретроспективный эталон, необязательно содержащийся на материальном носителе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталон может относиться к контролю. «Эталон» также включает в себя «эталонное животное». «Эталонное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, которая отличается от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. животное дикого типа). Специалисту в данной области техники будет понятно, что, как правило, эталонное средство, животное, когорту, индивид, популяцию, образец, последовательность или значение подвергают определению или характеризуют при условиях, сравнимых условиями, которые используют для определения или характеристики средства, животного (например, млекопитающего), когорты, индивида, популяции, образца, последовательности или значения, представляющего интерес.
«Ответ» включает в себя любое полезное изменение состояния субъекта, которое возникает в результате обработки или коррелирует с ней. Такое изменение может включать в себя стабилизацию состояния (например, предупреждение ухудшения, которое имело бы место в отсутствие обработки), ослабление симптомов состояния и/или улучшение перспектив излечения от состояния и т.д. Оно может относится к ответу субъекта или к ответу нейрона. Ответ нейрона или субъекта может быть измерен в соответствии с широким набором критериев, в том числе клинических критериев и объективных критериев. Оценка двигательной системы субъекта может включать в себя оценку одного или нескольких из силы, сухожильных рефлексов, поверхностных рефлексов, мышечной массы, координации, мышечного тонуса, ненормальных движений, положения тела и походки. Методики для оценки ответа включают в себя, без ограничения, клиническое обследование, исследование сокращения при растяжении (миотатического рефлекса), рефлекса Гоффмана и/или прессорную пробу. Способы и руководства по оценке ответа на обработку обсуждаются в Brodal, A.: Neurological Anatomy in Relation to Clinical Medicine, ed. 2, New York, Oxford University Press, 1969; Medical Council of the U.K.: Aids to the Examination of the Peripheral Nervous System, Palo Alto, Calif., Pendragon House, 1978; Monrad-Krohn, G.H., Refsum, S.: The Clinical Examination of the Nervous System, ed. 12, London, H.K. Lewis & Co., 1964; и Wolf, J.K.: Segmental Neurology, A Guide to the Examination and Interpretation of Sensory and Motor Function, Baltimore, University Park Press, 1981. Точные критерии ответа могут быть выбраны любым соответствующим образом при условии, что при сравнении групп нейронов и/или пациентов группы, подлежащие сравнению, оценивают на основании одинаковых или сравнимых критериев для определения показателя ответа. Квалифицированный специалист в данной области техники будет способен выбрать соответствующие критерии.
Как будет понятно из контекста, «риск» заболевания, нарушения и/или состояния предусматривает вероятность того, что у конкретного индивида будет развиваться заболевание, нарушение и/или состояние (например, радиационное поражение). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления риск выражен в процентах. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления риск составляет от 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и до 100%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления риск выражен в виде показателя риска относительно риска, ассоциированного с эталонным образом или группой эталонных образцов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонный образец или группа эталонных образцов имеет известный риск заболевания, нарушения, состояния и/или события (например, радиационного поражения). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонный образец или группа эталонных образцов получены от индивидов, сравнимых с конкретным индивидом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления относительный риск составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более.
«Практически» включает в себя качественное условие проявления полной или почти полной степени или величины характеристики или свойства, представляющего интерес. Квалифицированному специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, проходят до завершения и/или продолжаются до достижения завершенности или достигают или исключают абсолютный результат. Таким образом, термин «практически» используется в данном документе для отражения потенциального недостатка завершенности, присущего многим биологическим и химическим явлениям.
«Значительная гомология» включает в себя сравнение между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты. Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, две последовательности обычно считают «практически гомологичными», если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут представлять собой идентичные остатки. В качестве альтернативы, гомологичные остатки могут представлять собой неидентичные остатки с соответственно подобными структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как хорошо известно квалифицированному специалисту в данной области техники, определенные аминокислоты, как правило, классифицируются как «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты и/или как имеющие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замена одной аминокислоты на другую такого же типа часто может считаться «гомологичной» заменой. Типичное деление аминокислот по категориям кратко изложено ниже.
Как хорошо известно в уровне техники, аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты можно сравнивать с применением любого из ряда алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gapped BLAST и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Иллюстративно такие программы описаны в Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., и В.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Дополнительно к идентификации гомологичных последовательностей вышеупомянутые программы, как правило, обеспечивают указание степени гомологии. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления две последовательности считаются практически гомологичными, если в соответствующем отрезке остатков по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более из соответствующих остатков в них являются гомологичными. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок представляет собой полную последовательность. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок составляет по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или более остатков. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок включает в себя смежные остатки в полной последовательности. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок включает в себя прерывающиеся остатки в полной последовательности, например, несмежные остатки, сближающиеся в свернутой конформации полипептида или его части. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок имеет длину по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.
«Значительная идентичность» включает в себя сравнение между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты. Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, две последовательности обычно считают «практически идентичными», если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Как хорошо известно в уровне техники, аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты можно сравнивать с применением любого из ряда алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, gapped BLAST и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Иллюстративно такие программы описаны в Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F. et al., 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; и Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Дополнительно к идентификации идентичных последовательностей вышеупомянутые программы, как правило, обеспечивают указание степени идентичности. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления две последовательности считаются практически идентичными, если в соответствующем отрезке остатков по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более из соответствующих остатков в них являются идентичными. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок представляет собой полную последовательность. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления соответствующий отрезок имеет длину по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.
«Нацеливающий вектор» или «нацеливающая конструкция» включает в себя молекулу полинуклеотида, которая содержит нацеливающий участок. Нацеливающий участок содержит последовательность, которая является идентичной или практически идентичной последовательности в целевой клетке, ткани или животном и обеспечивает интеграцию нацеливающей конструкции в положение в геноме клетки, ткани или животного посредством гомологичной рекомбинации. Также включены нацеливающие участки, которые осуществляют целенаправленное воздействие с использованием сайтов распознавания для сайт-специфической рекомбиназы (например, сайты loxP или Frt). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нацеливающая конструкция, которая описана в данном документе, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты или ген (например, репортерный ген или гомологичный или гетерологичный ген), представляющий особый интерес, селектируемый маркер, управляющие и/или регуляторные последовательности, а также другие последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют рекомбиназу или рекомбиногенный белок. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нацеливающая конструкция может содержать ген, представляющий интерес, целиком или частично, причем ген, представляющий интерес, кодирует полипептид, весь или часть, который обладает подобной функцией, что и белок, кодируемый эндогенной последовательностью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нацеливающая конструкция может содержать гуманизированный ген, представляющий интерес, целиком или частично, причем гуманизированный ген, представляющий интерес, кодирует полипептид, весь или часть, который обладает подобной функцией, что и полпептид, кодируемый эндогенной последовательностью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нацеливающая конструкция может содержать репортерный ген, целиком или частично, причем репортерный ген кодирует полипептид, который может быть легко идентифицирован и/или измерен с применением методик, известных в уровне техники.
+
+
«Трансгенное животное», «трансгенное животное, отличное от человека», или «Tg» включает в себя любое не встречающееся в естественных условиях животное, отличное от человека, у которого одна или несколько из клеток животного, отличного от человека, содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или ген, который кодирует полипептид, представляющий интерес, весь или часть. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или ген вводят в клетку непосредственно или опосредованно с помощью введения в клетку-предшественник посредством преднамеренной генетической манипуляции, как например, посредством микроинъекции или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Термин «генетическая манипуляция» не включает в себя классические методики селекции, а, скорее, направлен на введение молекулы(молекул) рекомбинантной ДНК. Эта молекула может интегрироваться в хромосому, или она может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК. Термин «Tg» включает в себя животных, которые являются гетерозиготными или гомозиготными в отношении гетерологичной нуклеиновой кислоты и/или гена, и/или животных, которые имеют одну или несколько копий гетерологичной нуклеиновой кислоты и/или гена.
«Лечение», «лечить» или «осуществление лечения» включает в себя любое введение вещества (например, терапевтического кандидата), которое частично или полностью облегчает, ослабляет, смягчает, ингибирует, задерживает появление, снижает тяжесть и/или снижает частоту возникновения одного или нескольких симптомов, признаков и/или причин конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такое лечение может быть назначено субъекту, у которого не проявляются признаки соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или субъекту, у которого проявляются только ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния. В качестве альтернативы или дополнения, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления лечение может быть назначено субъекту, у которого проявляются один или несколько определенных признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления лечению может быть подвергнут субъект, который был диагностирован как страдающий от соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления лечению может быть подвергнуть субъект, о котором известно, что он имеет один или несколько факторов чувствительности, которые статистически коррелируют с повышенным риском развития соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния.
«Вариант» включает в себя молекулу, которая проявляет значительную структурную идентичность с эталонной молекулой, но отличается в плане структуры от эталонной молекулы наличием или уровнем одного или нескольких химических фрагментов по сравнению с эталонной молекулой. В соответствии со многими вариантами осуществления «вариант» также функционально отличается от эталонной молекулы. В целом, правильно ли считать конкретную молекулу «вариантом» эталонной молекулы, определяют, исходя из степени идентичности ее структуры с эталонной молекулой. Как будет понятно специалисту в данной области техники, любая биологическая или химическая эталонная молекула имеет определенные характерные структурные элементы. Исходя из определения, «вариант» представляет собой химическую молекулу, которая также имеет один или несколько таких характерных структурных элементов. В качестве нескольких примеров, малая молекула может иметь характерный основной структурный элемент (например, макроциклическую основу) и/или один или несколько характерных боковых фрагментов, таким образом вариант малой молекулы представляет собой таковой, который имеет такой основной структурный элемент и характерные боковые фрагменты, но отличается другими присутствующими боковыми фрагментами и/или типом связей (одинарная в сравнении с двойной, Е в сравнении с Z и т.д.) внутри основы, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, которые имеют обозначенные положения по сравнению друг с другом в линейном или трехмерном пространстве и/или вносят вклад в конкретную биологическую функцию, нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, которые имеют обозначенные положения друг относительно друга в линейном или трехмерном пространстве. Например, «вариант полипептида» может отличаться от эталонного полипептида в результате одного или нескольких различий в аминокислотной последовательности и/или одного или нескольких различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и т.д.), ковалентно прикрепленных к остову полипептида. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «вариант полипептида» также проявляет общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, которая составляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В качестве альтернативы или дополнения, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления «вариант полипептида» не имеет по меньшей мере одного одинакового характерного элемента последовательности с эталонным полипептидом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эталонный полипептид характеризуется одной или несколькими биологическими активностями. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «вариант полипептида» характеризуется одной или несколькими из биологических активностей эталонного полипептида. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у «варианта полипептида» отсутствует одна или несколько из биологических активностей эталонного полипептида. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «вариант полипептида» проявляет пониженный уровень одной или нескольких биологических активностей по сравнению с эталонным полипептидом. В соответствии со многими вариантами осуществления полипептид, представляющий интерес, считается «вариантом» исходного или эталонного полипептида, если полипептид, представляющий интерес, имеет аминокислотную последовательность, которая является идентичной последовательности исходной формы за исключением небольшого количества изменений последовательности в конкретных положениях. Как правило, менее чем 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% или 2% остатков в варианте заменены по сравнению с исходной формой. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления «вариант» имеет 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещенный остаток по сравнению с исходной формой. Часто «вариант» имеет очень малое количество (например, менее чем 5, 4, 3, 2 или 1) замененных функциональных остатков (т.е. остатков, которые принимают участие в конкретной биологической активности). Более того, «вариант», как правило, имеет не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 добавление или делецию и часто не имеет добавлений или делеций по сравнению с исходной формой. Кроме того, любые добавления или делеций, как правило, присутствуют менее чем приблизительно в 25, приблизительно в 20, приблизительно в 19, приблизительно в 18, приблизительно в 17, приблизительно в 16, приблизительно в 15, приблизительно в 14, приблизительно в 13, приблизительно в 10, приблизительно в 9, приблизительно в 8, приблизительно в 7, приблизительно в 6 остатках, и обычно они присутствуют менее чем приблизительно в 5, приблизительно в 4, приблизительно в 3 или приблизительно в 2 остатках. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления исходный или эталонный полипептид представляет собой полипептид, обнаруживающийся в природе. Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, обычно в природе может обнаруживаться множество вариантов конкретного полипептида, представляющего интерес, в особенности, в случае, когда полипептид, представляющий интерес, представляет собой полипептид возбудителя инфекции.
«Вектор» включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В соответствии с одним вариантом осуществления векторы являются способными к внехромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны, в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные управлять экспрессией функционально связанных генов, называются в данном документе «векторами экспрессии».
«Дикий тип» включает в себя молекулу, имеющую структуру и/или активность, которая обнаруживается в естественных условиях в «нормальном» (в противоположность мутантному, пораженному заболеванием, измененному и т.д.) состоянии или контексте. Квалифицированному специалисту в данной области техники будет понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют в виде многочисленных отличающихся форм (например, аллелях).
Подробное раскрытие определенных вариантов осуществления настоящего изобретения
Предполагаются животные, отличные от человека, с нарушением в локусе C9ORF72. В частности, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, имеют делецию всей кодирующей последовательности в локусе C9ORF72, т.е. делецию сегмента генома, кодирующего все изоформы C9ORF72 (например, делецию участка с кодирующей части экзона 2 по кодирующую часть экзона 11 у изоформы V1). Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, демонстрируют потерю массы и ALS-подобные двигательные аномалии, такие как, например, отсутствие двигательной активности и нарушение походки. Также, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, демонстрируют спленомегалию и/или лимфаденопатию в возрасте приблизительно восьми (8) недель. Кроме того, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, демонстрируют гломерулонефрит в возрасте приблизительно 35 недель. Таким образом, представленные животные, отличные от человека, являются особенно полезными для разработки и идентификации терапевтических кандидатов для лечения и/или ослабления нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний и, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, нарушений и состояний. В частности, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, включают введение репортерного гена в эндогенный локус C9ORF72, приводящее в результате к экспрессии репортерного гена (т.е. репортерного полипептида) в нервной и иммунной системах животного, отличного от человека. Такие трансгенные животные, отличные от человека, обеспечивают источник клеток для определения эффективности терапевтических кандидатов в ослаблении ALS и/или FTD. Помимо этого, такие трансгенные животные, отличные от человека, обеспечивают полезную модельную систему на животном для разработки терапевтических средств для лечения нейродегенеративных, аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, нарушений и состояний.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, проявляется ALS- и/или FTD-подобное заболевание вследствие отсутствия, недостатка или пониженного уровня C9ORF72 (например, РНК, полипептида и т.д.) в клетках животных, отличных от человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления у животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, развивается гломерулонефрит вследствие отсутствия, недостатка или пониженного уровня C9ORF72 (например, РНК, полипептида и т.д.). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, являются гетерозиготными в отношении нарушения в локусе C9ORF72, которое описано в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, являются гомозиготными в отношении нарушения в локусе C9ORF72, которое описано в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, содержат репортерный ген целиком или частично, причем указанный репортерный ген является функционально связанным с промотором C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления промоторы C9ORF72 включают в себя эндогенные промоторы C9ORF72.
-/-
-/-
-/-
+/-
В настоящем раскрытии представлен всесторонний фенотипический анализ линии животных, отличных от человека, с полным удалением C9orf72 и открытие уникальной роли C9orf72 в гомеостазе иммунной системы. В настоящем раскрытии специально демонстрируется, что полное удаление C9orf72, приводило к аномалиям в походке и признаку, указывающему на слабость задних конечностей, что говорит о возможном появлении патологии нижних мотонейронов, начиная с возраста приблизительно 40 недель. Как описано в данном документе, иммунный фенотип, проявляемый C9orf72 животными, отличными от человека, заключался в избирательном размножении клеток как миелоидного, так и лимфоидного классов с повышенной активацией Т-клеток и увеличенным количеством плазматических клеток. Нейтрофилия и моноцитоз приводили в результате к смешанным инфильтратам в органах иммунной системы, которые разрастались, но не теряли основную структуру. C9orf72 животные, отличные от человека, демонстрировали повышенное содержание цитокинов в сыворотке крови (например, IL-12) и сигнатуры экспрессии РНК в тканях, соответствующие повышающей регуляции клеток миелоидного типа. Заболевание почек с сопутствующими патологическими изменениями, такими как, например, утолщенная базальная мембрана и образование цилиндров, присутствовало у большинства животных, отличных от человека, к возрасту приблизительно 35 недель. На микроскопическом уровне клубочки окрашивались с высокой интенсивностью в отношении антител IgG и IgM и компонента системы комплемента С3, причем характер окрашивания указывал на отложение иммунных комплексов. В данном документе также описано, что C9orf72 животные, отличные от человека, демонстрировали высокий титр аутоантител, в том числе антител к RF, ANA, антител к Sm и антител к кардиолипину, это указывает на то, что потеря экспрессии C9orf72 серьезно нарушает иммунный гомеостаз. Ни одна из связанных с иммунной системой фенотипических характеристик не наблюдалась у отличных от человека животных дикого типа или C9orf72 (гетерозиготных) животных, отличных от человека. Таким образом, настоящим изобретением предполагается, среди прочего, создание улучшенной in vivo системы для разработки новых методов терапии и/или идентификации новых терапевтических мишеней для лечения различных заболеваний, нарушений или состояний, что не может быть достигнуто посредством применения известных in vivo систем отчасти вследствие отсутствия конкретных фенотипов в таких известных системах.
Различные аспекты настоящего изобретения подробно описаны в следующих разделах. Использование разделов не подразумевает ограничение настоящего изобретения. Каждый раздел может применяться к любому аспекту настоящего изобретения. В настоящей заявке применение слова «или» означает «и/или», если не указано иное.
C9ORF72
Боковой амиотрофический склероз (ALS), часто называемый болезнью Лу Герига, является наиболее частым паралитическим нарушением, возникающим во взрослом возрасте, и он характеризуется потерей верхних и/или нижних мотонейронов. ALS встречается у вплоть до 20000 индивидов в Соединенных Штатах Америки, причем приблизительно 5000 новых случаев возникает каждый год. Лобно-височная деменция (FTD), первоначально называемая болезнью Пика в честь врача Арнольда Пика, представляет собой группу нарушений, вызванных прогрессирующей дегенерацией клеток в лобной или височной долях головного мозга. Сообщается, что FTD составляет 10-15% всех случаев деменции. Увеличение количества гексануклеотидных повторов GGGGCC между двумя некодирующими экзонами в C9ORF72 связывали как с ALS, так и FTD (DeJesus-Hernandez, М. et al., 2011, Neuron 72:245-256; Renton, A.E. et al., 2011, Neuron 72:257-268; Majounie, E. et al., 2012, Lancet Neurol. 11:323-330; Waite, A.J. et al., 2014, Neurobiol. Aging 35:1779.e5-1779.e13). Тем не менее, остается неясным механизм, посредством которого такие мутации повторов вызывают заболевание: либо вследствие потери функции, либо вследствие приобретения функции токсичности. Например, данио рерио с пониженной экспрессией C9ORF72 в результате целенаправленного снижения экспрессии или нокдауна демонстрирует аксонопатию и нарушения локомоторной функции (Ciura, S. et al., 2013, Ann. Neurol. 74(42):180-187), в то время как мыши с пониженной экспрессией C9ORF72 не проявляют каких-либо поведенческих или патологических признаков, ассоциированных с заболеванием ALS (Lagier-Tourenne, С. et al., 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. E4530-E4539). Кроме того, у полученных мышей с нокин-мутацией, которые содержали 66 повторов C9ORF72, проявлялись очаги РНК и дипептидные белковые агрегаты в их нейронах. У этих мышей наблюдалась потеря нейронов коры головного мозга, а также проявлялись поведенческие нарушения и нарушения двигательной функции в возрасте 6 месяцев (Chew, J. et al., 2015, Science May 14. Pii:aaa9344).
Сообщалось о многих патологических аспектах, связанных с увеличенным количеством гексануклеотидных повторов GGGGCC в C9ORF72, таких как, например, зависимое от длины повторов образование очагов РНК, секвестрация специфических РНК-связывающих белков и накопление и агрегация дипептидных белков с повторами (например, обсуждаемые в Stepto, A. et al., 2014, Acta Neuropathol. 127:377-389; см. также Almeida, S. et al., 2013, Acta Neuropathol. 126:385-399; Bieniek, K.F. et al., 2014, JAMA Neurol. 71(6): 775-781; van Blitterswijk, M. et al., 2014, Mol. Neurodegen. 9:38, 10 pages). Несмотря на то что C9ORF72, как сообщалось, регулирует перемещение веществ в эндосомах (Farg, М.А. et al., 2014, Human Mol. Gen. 23(13):3579-3595), большинство функций C9ORF72 в клетке остаются неизвестными. Фактически, C9ORF72 представляет собой ген, который кодирует неохарактеризованный белок с неизвестной функцией. Несмотря на недостаток понимания окружения C9ORF72, было разработано несколько моделей на животных, в том числе сконструированные клеточные линии, для ALS и/или FTD (Roberson, E.D., 2012, Ann. Neurol. 72(6):837-849; Panda, S.K. et al., 2013, Genetics 195:703-715; Suzuki, N. et al., 2013, Nature Neurosci. 16(12):1725-1728; Xu, Z. et al., 2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 110(19):7778-7783; Hukema, R.K. et al., 2014, Acta Neuropathol. Comm. 2:166, 4 pages). Например, трансгенные мыши, имеющие вставку гена lacZ, которая заменяет экзоны 2-6 в C9orf72 (311004O21Rik), были получены при попытках целенаправленного воздействия на ген в рамках проекта по получению нокаутных мышей Knockout Mouse Project (см. фиг. 1d в Suzuki, N. et al., 2013, выше; что касается KOMP, см. Skarnes, W.C. et al., 2011, Nature 474(7351):337-342). Окрашивание в отношении X-gal наблюдали в головном мозге, спинном мозге, семеннике и зародышевых центрах в селезенке у этих мышей, тем не менее, оно не наблюдалось в мышце (передней большеберцовой мышце), сердце, легком, печени и почке. Тем не менее, непонятно, обеспечивали ли оставшиеся не удаленные экзоны (т.е. 7-11) какую-либо экспрессию и, следовательно, функцию. В другом сообщении о применении линии трансгенных мышей, содержащей 80 повторов GGGGCC, функционально связанных с флуоресцентным репортером и управляемых восприимчивым к тетрациклину элементом без каких-либо окружающих последовательностей C9orf72, демонстрировались включения в цитоплазме нейронов, подобные включениям наблюдаемым у пациентов с ALS-FTD, это говорит о том, что увеличение количества повторов само по себе может быть ответственно за заболевание (Hukema, R.K. et al., 2014, Acta Neuropathol. Comm. 2:166, 4 pages). Эти мыши были полезными для определения первоначального профиля экспрессии C9orf72 в клетках в ЦНС и обеспечили некоторое понимание механизма действия, связанного увеличением количества повторов; тем не менее, остается непонятным, указывает ли конкретная структура этих конструкций в этих мышах на специфические функции, которые могут быть уверенно приписаны C9orf72, или они являются результатом какой-либо другой несвязанной с C9orf72 функции.
Тем не менее, в некоторых случаях структура конструкции может оказывать влияние на фенотип полученного в результате трансгенного животного (см., например, Muller, U., 1999, Mech. Develop. 81:3-21). Поскольку в мышах с разрушенным C9orf72, которые описаны выше, использовался нацеливающий вектор с управляемой промотором кассетой для отбора (см. фиг. 1d в Suzuki, N. et al., 2013, выше; фиг. 1 в Skarnes, W.C. et al., 2011, выше), непонятно, корректно ли коррелирует проявляющийся характер экспрессии с нормальной экспрессией C9ORF72. Действительно, не было определено, управляется ли экспрессия остальных экзонов 7-11 связанным с кассетой для отбора промотором или самим промотором C9ORF72. В результате этого, фенотипы и, возможно, экспрессия C9ORF72 с lacZ, наблюдаемая у таких мышей, может быть модифицирована или иным образом иным образом искажена вследствие особенностей нацеливающего вектора. Кроме того, линия трансгенных мышей, содержащая индуцируемый повтор GGGGCC (Hukema, 2014, выше), была сконструирована без человеческой фланкирующей последовательности, предположительно, вследствие того факта, что такая окружающая последовательность, как полагают, оказывает воздействие на трансляцию последовательностей повторов. Таким образом, такие in vivo системы, использующие опосредуемую C9ORF72 биологическую функцию для терапевтических применений, являются неполными.
Как описано в данном документе, настоящим раскрытием специально описывается модель для ALS и/или FTD на животном, отличном от человека, причем животное, отличное от человека, содержит нарушение в локусе C9ORF72. В частности, настоящим раскрытием специально описывается модель для ALS и/или FTD на грызуне, причем грызун содержит делецию всей кодирующей последовательности для всех изоформ C9orf72 (например, участка с кодирующей части экзона 2 по кодирующую часть экзона 11 в V1) гена C9orf72 посредством вставки репортерного гена lacZ. Нацеливающий вектор, используемый авторами настоящего изобретения, был сконструирован таким образом, чтобы он содержал самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству (см., например, патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, все из которых включены в данный документ посредством ссылки), что обеспечивает возможность удаления кассеты для отбора по чувствительности к лекарственному средству зависящим от стадии развития образом, тем самым устраняя любую возможность воздействий промотора, или аберрантной экспрессии оставшихся экзонов, или эффектов самой кассеты для отбора. Как описано в данном документе, авторами настоящего изобретения достигалось полное удаление C9orf72. Кроме того, авторами настоящего изобретения проводились измерения двигательных поведенческих реакций этих грызунов с применением анализа удержания равновесия на вращающемся барабане, теста «открытое поле» и теста CatWalk в возрасте до 60 недель, и неврологические нарушения определялись в этот же период. Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, настоящим раскрытием демонстрируется, что только 40% из нокаутных по C9orf72 грызунов выживали в возрасте после 60 недель, и грызуны прекращали набирать массу тела, начиная с возраста около 40 недель. Несмотря на то что тесты на удержание равновесия на вращающемся барабане не показывали значительных изменений, обусловленных делецией C9orf72 делеция, грызуны, описанные в данном документе, демонстрировали значительный парез задних конечностей, двигательное нарушение, уменьшенную подвижность и аномалии походки в возрасте около 50 недель. Кроме того, настоящее раскрытие специально демонстрирует, что генетический сайленсинг мышиного C9orf2 приводит в результате к многочисленным двигательным и неврологическим аномалиям, подобным обнаруживающимся при заболеваниях двигательных нейронов у человека. Таким образом, грызуны, описанные в данном документе, обеспечивают, по меньшей мере в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, улучшенные in vivo системы для разработки терапевтических кандидатов для лечения нейродегенеративного заболевания, такого как, например, ALS и/или FTD. Кроме того, грызуны, описанные в данном документе, преодолевают недостатки в существующих моделях на животных, характеризующихся неоптимальной делецией C9orf72, для разработки методов терапии, направленных на C9orf72.
Последовательности C9ORF72
Варианты транскриптов мышиного C9ORF72 были представлены в уровне техники (например, Koppers et al., Ann Neurol (2015); 78: 426-438; Atkinson et al., Acta Neuropathologica Communications (2015) 3: 59), а также представлены на фиг. 1А. Геномная информация для трех описанных вариантов транскриптов мышиного C9ORF72 также является доступной на веб-сайте Ensembl под обозначениями ENSMUST00000108127 (V1), ENSMUST00000108126 (V2) и ENSMUST00000084724 (V3). Иллюстративные последовательности мРНК и аминокислотные последовательности C9ORF72, не относящегося к человеческому (например, грызуна), изложены в таблице 1. В случае последовательностей мРНК символами жирным шрифтом, содержащимися в круглых скобках, показана кодирующая последовательность и последовательные экзоны там, где они показаны, разделены чередующимися строчными и заглавными буквами. В случае аминокислотных последовательностей последовательности зрелых полипептидов там, где они показаны, выделены жирным шрифтом.
Варианты транскриптов человеческого C9ORF72 являются известными в уровне техники. У одного варианта транскрипта человеческого C9ORF72 отсутствуют несколько экзонов в центральных и 3' кодирующих участках, и его 3' концевой экзон продолжается за пределы сайта сплайсинга, который используется в варианте 3 (см. ниже), что дает в результате новый 3' нетранслируемый участок (UTR) по сравнению с вариантом 3. Этот вариант кодирует значительно более короткий полипептид, и его С-концевая аминокислота отличается в сравнении с аминокислотой, которая кодируется двумя другими вариантами. Последовательность мРНК и аминокислотная последовательность этого варианта могут быть найдены в GenBank под номерами доступа NM_145005.6 и NP_659442.2, соответственно, и тем самым включены в данный документ посредством ссылки. Второй вариант транскрипта человеческого C9ORF72 (2) отличается 5' нетранслируемым участком (UTR) в сравнении с вариантом 3. Последовательность мРНК и аминокислотная последовательность этого варианта могут быть найдены в GenBank под номерами доступа NM_018325.4 и NP_060795.1, соответственно, и тем самым включены в данный документ посредством ссылки. Третий вариант транскрипта человеческого C9ORF72 (3) содержит самую длинную последовательность среди трех известных вариантов и кодирует более длинную изоформу. Последовательность мРНК и аминокислотная последовательность этого варианта могут быть найдены в GenBank под номерами доступа NM_001256054.2 и NP_001242983.1, соответственно, и тем самым включены в данный документ посредством ссылки. Варианты 2 и 3 кодируют одинаковый белок.
Нацеливающие векторы для C9ORF72 и получение животных, отличных от человека, с нарушением в локусе C9ORF72
В данном документе представлены нацеливающие векторы или нацеливающие конструкции для получения животных, отличных от человека, с нарушением в локусе C9ORF72, которые описаны в данном документе.
Последовательности ДНК можно применять для получения нацеливающих векторов для нокаутных животных (например, C9ORF72 KO). Как правило, молекулу полинуклеотида (например, вставку нуклеиновой кислоты), кодирующую репортерный ген и/или селектируемый маркер, встраивают в вектор, предпочтительно ДНК-вектор, с целью репликации молекулы полинуклеотида в подходящей клетке-хозяине.
Молекула полинуклеотида (или вставки нуклеиновой кислоты) содержит сегмент ДНК, который необходимо интегрировать в целевой локус. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вставка нуклеиновой кислоты содержит один или несколько полинуклеотидов, представляющих интерес. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вставка нуклеиновой кислоты содержит одну или несколько кассет экспрессии. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления кассета экспрессии содержит полинуклеотид, представляющий интерес, полинуклеотид, кодирующий маркер для отбора и/или репортерный ген, в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления, вместе с различными регуляторными компонентами, которые оказывают влияние на экспрессию. Практически любой полинуклеотид, представляющий интерес, может содержаться во вставке нуклеиновой кислоты и, благодаря этому, интегрироваться в целевой геномный локус. Способы, раскрытые в данном документе, обеспечивают интеграцию по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более полинуклеотидов, представляющих интерес, в целевой геномный локус C9ORF72.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, содержащийся во вставке нуклеиновой кислоты, кодирует репортер. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, кодирует селектируемый маркер.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотид, представляющий интерес, является фланкированным сайтами для сайт-специфической рекомбинации (например, loxP, Frt и т.д.) или содержит их. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления сайты для сайт-специфической рекомбинации фланкируют сегмент ДНК, который кодирует репортер, и/или сегмент ДНК, который кодирует селектируемый маркер. Иллюстративные полинуклеотиды, представляющие интерес, в том числе маркеры для отбора и репортерные гены, которые могут быть включены во вставки нуклеиновой кислоты, описаны в данном документе.
Различные способы, используемые в получении плазмид, конструкций ДНК и/или нацеливающих векторов и трансформации организмов-хозяев являются известными в уровне техники. Для получения информации о других подходящих экспрессионных системах как для прокариотических, так и эукариотических клеток, а также об общих процедурах с использованием рекомбинации, см. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.
Как описано выше, иллюстративные последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности для C9ORF72, не относящегося к человеческому (например, грызуна), для применения в конструировании нацеливающих векторов для нокаута животных представлены в таблице 1. Другие последовательности C9ORF72, отличного от человеческого, также могут быть найдены в базе данных GenBank. Нацеливающие векторы для C9ORF72 в соответствии с некоторыми вариантами осуществления содержат последовательности ДНК, кодирующие репортерный ген и/или селектируемый маркер, фланкированные последовательностями, которые являются идентичными или практически гомологичными фланкирующим последовательностям целевого участка (также называемые «гомологичными плечами») для вставки в геном трансгенного животного, отличного от человека. В качестве одного примера, точка начала делеции может быть задана выше (5') относительно первого экзона, первого кодирующего экзона или первого или второго кодона, чтобы обеспечить возможность функциональной связи вставки нуклеиновой кислоты с эндогенной регуляторной последовательностью (например, промотором). На фиг. 1А иллюстрируется стратегия целенаправленного воздействия для получения целенаправленной делеции всей кодирующей последовательности мышиного гена C9orf72 и замены ее на кассету, содержащую последовательность из гена lacZ, который кодирует β-галактозидазу, и кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству (Neo), которая кодирует неомицин-фосфотрансферазу для отбора устойчивых к G418 колоний эмбриональных стволовых клеток (ES). Нацеливающий вектор также включает в себя последовательность, кодирующую рекомбиназу (например, Cre), которая регулируется miRNA, специфическими в отношении ES клеток, или промотором, специфическим в отношении эмбриональных клеток (например, промотором гена протамина 1; Prot-Cre-SV40). Последовательности, кодирующие кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству и рекомбиназу Cre, являются фланкированными сайтами распознавания для рекомбиназы loxP (LP), которые обеспечивают возможность опосредованного Cre вырезания кассеты для отбора по чувствительности к лекарственному средству зависящим от стадии развития образом, например, потомки, полученные от грызунов, зародышевые клетки которых содержат разрушенный ген C9orf72, описанный выше, будут проявлять селектируемый маркер (Neo) в ходе развития (см. патенты США №№8697851, 8518392, 8354389, 8946505 и 8946504, все из которых включены в данный документ посредством ссылки). Это обеспечивает возможность, среди прочего, автоматического вырезания кассеты для отбора или из дифференцированных клеток, или из зародышевых клеток. Следовательно, перед фенотипическим анализом кассета для отбора по чувствительности к лекарственному средству удаляется, оставляя только репортерный ген lacZ, функционально связанный с мышиным промотором C9orf72.
Как описано в данном документе, нарушение в локусе C9orf72 может предусматривать замену локуса C9orf72 или его части вставкой нуклеиновой кислоты или вставку/добавление к локусу C9orf72 или его части вставки нуклеиновой кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вставка нуклеиновой кислоты содержит репортерный ген. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления репортерный ген располагают в функциональной связи с эндогенным промотором C9orf72. Такая модификация обеспечивает возможность экспрессии репортерного гена, управляемой эндогенным промотором C9orf72. В качестве альтернативы, репортерный ген не располагают в функциональной связи с эндогенным промотором C9orf72.
Ряд репортерных генов (или выявляемых фрагментов) можно применять в нацеливающих векторах, описанных в данном документе. Иллюстративные репортерные гены включают в себя, например, гены β-галактозидазы (кодируемой геном lacZ), зеленого флуоресцентного белка (GFP), улучшенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), MmGFP, синего флуоресцентного белка (BFP), улучшенного синего флуоресцентного белка (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, желтого флуоресцентного белка (YFP), улучшенного желтого флуоресцентного белка (eYFP), Emerald, CyPet, голубого флуоресцентного блека (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы или их комбинации. Способы, описанные в данном документе, демонстрируют конструирование нацеливающих векторов, в которых используется репортерный ген lacZ, который кодирует β-галактозидазу, тем не менее, квалифицированный специалист в данной области техники при изучении настоящего раскрытия поймет, что животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, могут быть получены в отсутствие репортерного гена или с любым репортерным геном, известным в уровне техники.
В случае когда это целесообразно, кодирующий участок в генетическом материале или последовательность полинуклеотида (последовательности полинуклеотидов), кодирующие репортерный полипептид, весь или часть, могут быть модифицированы с включением кодонов, которые являются оптимизированными для экспрессии в животном, отличном от человека (например, см. патенты США №5670356 и №5874304). Оптимизированные по кодону последовательности представляют собой синтетические последовательности и предпочтительно кодируют идентичный полипептид (или биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида, который характеризуется практически той же активностью, что и полноразмерный полипептид), который кодируется не оптимизированным по кодону исходным полинуклеотидом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления кодирующий участок в генетическом материале, который кодирует репортерный полипептид (например, lacZ), весь или часть, может включать в себя измененную последовательность для оптимизации частоты использования кодонов для конкретного типа клеток (например, клеток грызуна). Например, кодоны в репортерном гене, подлежащие вставке в геном животного, отличного от человека (например, грызуна), могут быть оптимизированы для экспрессии в клетке животного, отличного от человека. Такая последовательность может быть описана как оптимизированная по кодону последовательность.
Предполагаются композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые содержат нарушение в локусе C9ORF72, описанное в данном документе, в том числе композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют репортерный ген с промотора C9ORF72 и с использованием регуляторной последовательности C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления также предполагаются композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют репортерный ген с эндогенного промотора и с использованием эндогенной регуляторной последовательности. Способы включают в себя введение нацеливающего вектора, который описан в данном документе, кодирующего репортерный ген (например, lacZ), в геном животного, отличного от человека таким образом, чтобы вся кодирующая последовательность локуса C9ORF72 была удалена целиком или частично. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы включают в себя введение нацеливающего вектора в геном животного, отличного от человека, таким образом, чтобы вся кодирующая последовательность для всех изоформ C9ORF72 в локусе C9ORF72 была удалена.
Вставка репортерного гена, функционально связанного с промотором C9ORF72 (например, эндогенным промотором C9ORF72), использует сравнительно минимальную модификацию генома и приводит в результате к экспрессии репортерного полипептида специфическим для C9ORF72 образом у животного, отличного от человека. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, содержит локус C9ORF72, содержащий нацеливающий вектор, который описан в данном документе.
Нацеливающие векторы, описанные в данном документе, могут быть введены в ES клетки, и они могут быть подвергнуты скринингу в отношении клонов ES, несущих нарушение в локусе C9orf72, как описано в Frendewey, D., et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307. Ряд эмбрионов-хозяев можно использовать в способах и композициях, раскрытых в данном документе. Например, плюрипотентные и/или тотипотентные клетки, имеющие целенаправленную генетическую модификацию, могут быть введены в эмбрион, находящийся на стадии предморулы (например, эмбрион на 8-клеточной стадии развития), из соответствующего организма. См., например, патентные документы US 7576259, US 7659442, US 7294754 и US 2008/0078000 A1, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В других случаях донорские ES клетки могут быть имплантированы в эмбрион-хозяин на 2-клеточной стадии, 4-клеточной стадии, 8-клеточной стадии, 16-клеточной стадии, 32-клеточной стадии или 64-клеточной стадии. Эмбрион-хозяин также может представлять собой бластоцисту или может представлять собой эмбрион, находящийся на стадии предбластоцисты, эмбрион, находящийся на стадии предморулы, эмбрион на стадии морулы, эмбрион на стадии некомпактизированной морулы или эмбрион на стадии компактизированной морулы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ VELOCIMOUSE (Poueymirou, W.T. et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99) можно применять для инъекции положительных ES клеток в 8-клеточный эмбрион для получения происходящих полностью из ES клеток гетерозиготных мышей поколения F0, готовых для определения профиля экспрессии lacZ или скрещивания с целью получения гомозиготности. Иллюстративные способы получения животных, отличных от человека, которые имеют нарушение в локусе C9orf72, представлены в примере 1.
Способы получения трансгенных животных, отличных от человека, в том числе нокаутов и нокинов, являются хорошо известными в уровне техники (см., например, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Например, получение трансгенных грызунов необязательно может включать разрушение генетических локусов эндогенного гена грызуна и введение репортерного гена в геном грызуна, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, в то же местоположение, что и у эндогенного гена грызуна.
Схематическая иллюстрация (без соблюдения масштаба) геномной организации мышиного C9orf72 представлена на фиг. 1А. Иллюстративная стратегия целенаправленного воздействия для делеции всей кодирующей последовательность мышиного локуса C9orf72 с применением репортерного гена также представлена на фиг. 1А. Как иллюстрируется, геномная ДНК, содержащая участок с кодирующей части с экзона 2 по кодирующую часть экзона 11 мышиного локуса C9orf72, подвергается удалению и замене на репортерный ген и кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству, фланкированные сайтами распознавания для сайт-специфической рекомбиназы. Нацеливающий вектор, применяемый в этой стратегии, включает в себя последовательность, кодирующую рекомбиназу, которая является функционально связанной с промотором, регулируемым стадией развития, в результате чего рекомбиназа экспрессируется в недифференцированных клетках. Иллюстративные промоторы, которые могут быть включены в нацеливающие векторы, описанные в данном документе, представлены в таблице 2. Дополнительные подходящие промоторы, которые можно применять в нацеливающих векторах, описанных в данном документе, включают в себя промоторы, описанные в патентах США №№8697851, 8518392 и 8354389; все из которых включены в данный документ посредством ссылки). При гомологичной рекомбинации вся кодирующая последовательность (например, участок с кодирующей части экзона 2 по кодирующую часть экзона 11) эндогенного мышиного локуса C9orf72 заменяется последовательностью, содержащейся в нацеливающем векторе. Кассета для отбора по чувствительности к лекарственному средству удаляется зависимым от стадии развития образом, т.е. у потомства, полученного от мышей, линия зародышевых клеток которых содержит нарушение в локусе C9orf72, описанное выше, будет проявляться селектируемый маркер в дифференцированных клетках в ходе развития (см. патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, все из которых включены в данный документ посредством ссылки).
Трансгенное животное-основателя, отличное от человека, можно идентифицировать на основании присутствия репортерного гена (или отсутствия C9ORF72) в его геноме и/или экспрессии репортера в тканях или клетках животного, отличного от человека (или отсутствия экспрессии C9ORF72). Трансгенное животное-основатель, отличное от человека, можно затем применять для выведения дополнительных животных, отличных от человека, несущих репортерный ген, таким образом получая ряд животных, отличных от человека, каждое из которых несет одну или несколько копий локуса C9ORF72, как описано в данном документе.
Также можно получать трансгенных животных, отличных от человека, содержащих выбранные системы, которые обеспечивают возможность регулируемой или направленной экспрессии трансгена. Иллюстративные системы включают в себя систему из рекомбиназы Cre/loxP из бактериофага Р1 (см., например, Lakso, М. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) и систему из рекомбиназы FLP/Frt из S. cerevisiae ( S. et al, 1991, Science 251:1351-1355). Такие животные могут быть получены посредством конструирования «двойных» трансгенных животных, например, посредством спаривания двух трансгенных животных, одно из которых содержит трансген, кодирующий выбранный полипептид (например, репортерный ген), а другое содержит трансген, кодирующий рекомбиназу (например, рекомбиназу Cre).
Несмотря на то что варианты осуществления, использующие нарушение в локусе C9ORF72 у мыши (т.е. мышь с делецией всей кодирующей последовательности C9orf72), всесторонне обсуждаются в данном документе, также предполагаются другие животные, отличные от человека, которые содержат нарушение в локусе C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такие животные, отличные от человека, содержат нарушение в локусе C9ORF72, характеризующееся вставкой репортера, функционально связанного с эндогенным промотором C9ORF72. Такие животные, отличные от человека, включают в себя любых из животных, которые могут быть генетически модифицированы с целью делеций всей кодирующей последовательности локуса C9ORF72, как раскрыто в данном документе, в том числе, например, млекопитающих, например, мышь, крысу, кролика, свинью, жвачное животное (например, корову, быка, буйвола), оленя, овцу, козу, курицу, кошку, собаку, хорька, примата (например, игрунку, макака-резуса) и т.д. Например, для тех животных, отличных от человека, для которых подходящие доступные для генетической модификации ES клетки не являются легко доступными, используются другие способы для получения животного, отличного от человека, которое содержит генетическую модификацию. Такие способы включают в себя, например, модификацию генома клетки, не относящейся к ES клеткам (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки) и использование метода переноса ядра соматической клетки (SCNT) для переноса генетически модифицированного генома в подходящую клетку, например, в ооцит с удаленным ядром, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в животном, отличном от человека, в подходящих условиях для образования эмбриона.
Вкратце, способы способы переноса ядра включают в себя стадии: (1) удаления ядра из ооцита; (2) выделения клетки-донора или ядра, подлежащих объединению с ооцитом с удаленным ядром; (3) введения клетки или ядра в ооцит с удаленным ядром с образованием реконструированной клетки; (4) имплантации реконструированной клетки в утробу животного для образования эмбриона; и (5) обеспечения возможности развития эмбриона. В таких способах ооциты обычно извлекают из умерших животных, хотя они также могут быть выделены или из маточных труб и/или из яичников живых животных. Ооциты могут дозревать в ряде сред, известных специалистам в данной области техники, перед удалением ядра. Удаление ядра из ооцита может осуществляться с помощью ряда способов, известных специалистам в данной области техники. Введение клетки-донора или ядра в ооцит с удаленным ядром с образованием реконструированной клетки, как правило, достигается посредством микроинъекции клетки-донора под прозрачную оболочку перед слиянием. Слияние может индуцироваться применением электрического импульса постоянного тока (DC) в плоскости контакта/слияния (электрослияние), посредством воздействия на клетки стимулирующих слияние химических продуктов, таких как полиэтиленгликоль, или под действием инактивированного вируса, такого как вирус Сендай. Реконструированную клетку, как правило, активируют с помощью электрических и/или не-электрических средств до, во время и/или после слияния донора ядра и ооцита-реципиента. Способы активации включают в себя электрические импульсы, химически стимулируемый шок, проникновение сперматозоида, повышенные уровни двухвалентных катионов в ооците и снижение фосфорилирования клеточных белков (посредством использования ингибиторов киназ) в ооците. Активированные реконструированные клетки или эмбрионы, как правило, культивируют в среде, известной специалистам в данной области техники, а затем переносят в утробу животного. См., например, публикацию заявки на патент США №2008-0092249 А1, международную заявку № WO 1999/005266 А2, публикацию заявки на патент США №2004-0177390 А1, международную заявку № WO 2008/017234 A1 и патент США №7612250, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
Способы модификации генома животного, отличного от человека (например, свиньи, коровы, грызуна, курицы и т.д.), включают в себя, например, использование нуклеазы с белковым доменом «цинковые пальцы» (ZFN) или эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции, (TALEN) для модификации генома с целью включения в нарушения в локус C9ORF72, как описано в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой млекопитающее. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой мелкое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления генетически модифицированное животное, описанное в данном документе, представляет собой грызуна. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления грызун, описанный в данном документе, является выбранным из мыши, крысы и хомяка. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления грызун, описанный в данном документе, является выбранным из надсемейства Muroidea. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления генетически модифицированное животное, описанное в данном документе, происходит из семейства, выбранного из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяк, крысы и мыши Нового света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, карликовые песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (рипидомисы, скальные крысы, белохвостые крысы, Малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления генетически модифицированный грызун, описанный в данном документе, является выбранным из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), карликовой песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления генетически модифицированная мышь, описанная в данном документе, происходит от члена семейства Muridae. В соответствии с одним вариантом осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой грызуна. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления грызун, описанный в данном документе, является выбранным из мыши и крысы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой мышь.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой грызуна, который представляет собой мышь из линии C57BL, выбранную из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой линию 129, выбранную из группы, состоящей из линии, которая представляет собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления генетически модифицированная мышь, описанная в данном документе, представляет собой смесь вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой смесь вышеупомянутых линий 129 или смесь вышеупомянутых линий BL/6. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления линия 129 в смеси, описанной в данном документе, представляет собой линию 29S6 (129/SvEvTac). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой линию BALB, например, линию BALB/c. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления мышь, описанная в данном документе, представляет собой смесь линии BALB и другой вышеупомянутой линии.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, представляет собой крысу. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления крыса, описанная в данном документе, является выбранной из крысы Вистар, линии LEA, линии Спраг-Доули, линии Фишер, F344, F6 и Dark Agouti (темный агути). В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления линия крыс, которая описана в данном документе, представляет собой смесь двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из Вистар, LEA, Спраг-Доули, Фишер, F344, F6 и Dark Agouti.
aν1
aν1
Крысиная плюрипотентная и/или тотипотентная клетка может происходить из любой линии крыс, в том числе, например, линии крыс ACI, линии крыс Dark Agouti (DA), линии крыс Вистар, линии крыс LEA, линии крыс Спраг-Доули (SD) или линии крыс Фишер, как например, Фишер F344 или Фишер F6. Крысиные плюрипотентные и/или тотипотентные клетки также могут быть получены из линии, происходящей из смеси двух или более линий, упомянутых выше. Например, крысиная плюрипотентная и/или тотипотентная клетка может происходить из линии DA или линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется как имеющая окрас черный агути с белым животом и лапами и гаплотип RT1. Такие линии являются доступными из ряда источников, в том числе от Harlan Laboratories. Примером крысиной линии ES клеток из крысы ACI является крысиная ES клетка ACI.G1. Линия крыс Dark Agouti (DA) характеризуется как имеющая шерсть «агути» и гаплотип RT1. Такие крысы являются доступными из ряда источников, в том числе от Charles Rivera и Harlan Laboratories. Примерами крысиной линии ES клеток из крысы DA являются линия крысиных ES клеток DA.2B и линия крысиных ES клеток DA.2C. В некоторых случаях крысиные плюрипотентные и/или тотипотентные клетки происходят из инбредной линии крыс. См., например, заявку на патент США №2014/0235933 А1, поданную 20 февраля 2014 года, и она включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Предполагаются животные, отличные от человека, которые содержат нарушение в локусе C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нарушение в локусе C9ORF72 приводит в результате к потере функции. В частности, мутации потери функции включают в себя мутации, результатом которых является снижение или отсутствие экспрессии C9ORF72 и/или снижение или отсутствие активности/функции C9ORF72. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления мутации потери функции приводят в результате к одному или нескольким фенотипам, описанным в данном документе. Экспрессия C9ORF72 может быть измерена непосредственно, например, с помощью анализа уровня C9ORF72 в клетке или ткани животного, отличного от человека, которое описано в данном документе.
Как правило, уровень экспрессии и/или активности C9ORF72 является пониженным, если уровень экспрессии и/или активности C9ORF72 статистически значимо ниже (р≤0,05), чем уровень C9ORF72 в соответствующей контрольной клетке или животном, отличном от человека, которые не содержат такого же нарушения (например, делеций). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления концентрация и/или активность C9ORF72 является пониженной по меньшей мере на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более относительно контрольной клетки или животного, отличного от человека, у которого отсутствует такое же нарушение (например, деления).
В соответствии с другими вариантами осуществления клетки или организмы, имеющие нарушение в локусе C9ORF72, которое снижает уровень экспрессии и/или активность гена C9ORF72, отбирают с применением способов, которые включают в себя, без ограничения, анализ методом Саузерн-блоттиинга, секвенирование ДНК, ПЦР-анализ или фенотипический анализ. Такие клетки или животные, отличные от человека, затем используются в различных способах и композициях, описанных в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эндогенный локус C9ORF72 не подвергается делеций (т.е. является интактным). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эндогенный локус C9ORF72 подвергается изменению, нарушению, делеций или замене на гетерологичную последовательность (например, последовательность, кодирующую репортерный ген). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления весь или практически весь эндогенный локус C9ORF72 заменяют на вставку нуклеиновой кислоты; в соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления замена включает в себя замену всей кодирующей последовательности эндогенного локуса C9ORF72 на репортерный ген lacZ таким образом, чтобы репортерный ген lacZ находился в функциональной связи с промотором C9ORF72 (например, эндогенным промотором C9ORF72). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления часть репортерного гена (например, его функциональный фрагмент) вводят в эндогенный локус C9ORF72, отличный от человеческого. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления репортерный ген представляет собой ген lacZ. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления репортерный ген вводят в одну из двух копий эндогенного локуса C9ORF72, что приводит к получению животного, отличного от человека, которое является гетерозиготным в отношении репортерного гена. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предполагается животное, отличное от человека, которое является гомозиготным в отношении репортерного гена.
Способы применения животных, отличных от человека, с нарушением в локусе C9ORF72
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные модели на животных для нейродегенеративных заболеваний, нарушений и состояний. В частности, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные модели на животных, которые переносятся на человеческие заболевания, такие как, например, ALS и/или FTD, характеризующиеся симптомами, связанными с поражением верхних мотонейронов, и/или потерей нейронов, не относящихся к двигательным.
Например, нарушение в локусе C9ORF72, которое описано в данном документе, может приводить в результате к различным симптомам (или фенотипам) у животных, отличных от человека, представленных в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления делеция локуса C9ORF72 дает в результате животных, отличных от человека, которые являются относительно нормальными при рождении, но у которых проявляются ALS-подобные симптомы при взрослении, например, после приблизительно 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель, 13 недель, 14 недель, 15 недель, 16 недель, 17 недель, 18 недель, 19 недель, 20 недель, 21 недели, 22 недель, 23 недель, 24 недель, 25 недель, 26 недель, 27 недель, 28 недель, 29 недель, 30 недель, 31 недели, 32 недель, 33 недель, 34 недель, 35 недель, 36 недель, 37 недель, 38 недель, 39 недель, 40 недели, 41 недель, 42 недель, 43 недель, 44 недель, 45 недель, 46 недель, 47 недель, 48 недель, 49 недель, 50 недель, 51 недели, 52 недель, 53 недель, 54 недель, 55 недель, 56 недель, 57 недель, 58 недель, 59 недель, 60 недель и т.д. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления деления локуса C9ORF72 приводит в результате к ненормальным функциям одного или нескольких типов клеток, например, нейрона и/или его части. Нейрон включает в себя сенсорный нейрон или мотонейрон. Другие фенотипы, ассоциированные с ALS и/или FTD, могут присутствовать у животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе. Например, ALS-подобный фенотип может включать нарушение в одном или нескольких нейронах, например, мотонейронах и/или сенсорных нейронах. Кроме того, ALS-подобный фенотип, затрагивающий верхние мотонейроны, может приводить в результате к спастичности (например, спастическому параличу, ригидности), усиленным и/или аномальным рефлексам (например, симптом Бабинского), треморам и их комбинациям. ALS-подобный фенотип, включающий нарушение в нижних мотонейронах, может приводить в результате к мышечной слабости и атрофии, фасцикуляциям и их комбинации, и/или к нарушению в продолговатом мозге, приводящему в результате к неспособности к глотанию и фасцикуляциям в языке. ALS-подобный симптом также может предусматривать один или несколько из следующих фенотипов: а) кифоз; b) аномальное сжатие, волочение задней конечности или сгибание пальцев нижней конечности; с) недостаточность в способности к координации движений и усвоению двигательных навыков, недостаточные результаты в тесте способности к удержанию равновесия на вращающемся барабане, тесте catwalk и/или тесте «открытое поле»; d) потеря мотонейронов в спинном мозге; е) астроцитоз в спинном мозге; f) потеря массы по сравнению с контрольным грызуном; g) накопление полиубиквитинированных белков и/или (h) повышенная оценка неврологического нарушения при использовании системы оценки неврологического нарушения ALS-TDI (таблица 3).
Таким образом, в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами осуществления животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные животные модели для нейродегенеративных заболеваний, нарушений или состояний (например, ALS и/или FTD) и могут применяться для разработки и/или идентификации терапевтических средств для лечения, предупреждения и/или ингибирования одного или нескольких фенотипов (или симптомов) нейродегенеративных заболеваний, нарушений или состояний. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления один или несколько симптомов (или фенотипов) у животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, приведены в таблице 3.
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, также обеспечивают in vivo систему для идентификации терапевтического средства для лечения, предупреждения и/или ингибирования одного или нескольких симптомов нейродегенеративных заболеваний, нарушений или состояний (например, ALS и/или FTD). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибирующий эффект терапевтического средства определяют in vivo посредством введения указанного терапевтического средства животному, отличному от человека, которое имеет нарушение C9ORF72, описанное в данном документе, и у которого проявляются нейродегенеративные симптомы в возрасте после 38 недель.
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, также обеспечивают улучшенные модели на животных для воспалительных или аутоиммунных заболеваний, нарушений и состояний. В частности, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные животные модели, которые переносятся на человеческое воспалительное заболевание, характеризующееся инфильтрацией иммунных клеток в различные органы (например, в почку, печень, селезенку и т.д.). Кроме того, животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные животные модели, которые переносятся на человеческое аутоиммунное заболевание, характеризующееся повышенным присутствием аутоантител (например, IgG и IgM) в сыворотке крови.
Например, нарушение в локусе C9ORF72, которое описано в данном документе, может приводить в результате к различным состояниям (или фенотипам) у животных, отличных от человека, представленных в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления делеция локуса C9ORF72 дает в результате животных, отличных от человека, которые являются относительно нормальными при рождении, но у которых развиваются воспалительные и/или аутоиммунные состояния при взрослении, например, после приблизительно 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель, 13 недель, 14 недель, 15 недель, 16 недель, 17 недель, 18 недель, 19 недель, 20 недель, 21 недели, 22 недель, 23 недель, 24 недель, 25 недель, 26 недель, 27 недель, 28 недель, 29 недель, 30 недель, 31 недели, 32 недель, 33 недель, 34 недель, 35 недель, 36 недель, 37 недель, 38 недель, 39 недель, 40 недель, 41 недели, 42 недель, 43 недель, 44 недель, 45 недель, 46 недель, 47 недель, 48 недель, 49 недель, 50 недель, 51 недели, 52 недель, 53 недель, 54 недель, 55 недель, 56 недель, 57 недель, 58 недель, 59 недель, 60 недель и т.д. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления делеция локуса C9ORF72 приводит в результате к инфильтрации одного или нескольких типов иммунных клеток, например, плазматических клеток, моноцитов, гранулоцитов и/или макрофагов. Другие фенотипы, ассоциированные с воспалительным и/или аутоиммунным состоянием, могут присутствовать у животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе. Например, воспалительное или аутоиммунное состояние может включать увеличение одного или нескольких из селезенки, лимфатических узлов, почки и/или печени. Кроме того, воспалительное или аутоиммунное состояние, затрагивающее кровь, может приводить в результате к повышенному присутствию аутоантител. Воспалительное или аутоиммунное состояние, затрагивающее печень, может приводить в результате к гепатиту.
Таким образом, в соответствии с по меньшей мере некоторыми вариантами осуществления животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенные животные модели для воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, нарушений или состояний и могут применяться для разработки и/или идентификации терапевтических средств для лечения, предупреждения и/или ингибирования одного или нескольких фенотипов (или симптомов) воспалительного и/или аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления воспалительное и/или аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние присутствует в одном или нескольких органах или тканях животного, отличного от человека, которое описано в данном документе. В соответствии с некоторыми определенными вариантами осуществления один или несколько органов или тканей включает в себя селезенку, печень, лимфатические узлы, почку, костный мозг и кровь.
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, также обеспечивают in vivo систему для идентификации терапевтического средства для лечения, предупреждения и/или ингибирования одного или нескольких симптомов воспалительного и/или аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибирующий эффект терапевтического средства определяют in vivo посредством введения указанного терапевтического средства животному, отличному от человека, которое имеет нарушение C9ORF72, описанное в данном документе, и у которого развивается воспалительное и/или аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние в возрасте после 8 недель. В соответствии с различными вариантами осуществления воспалительное и/или аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние представляет собой или включает гломерулонефрит или гепатит.
Животным, отличным от человека, может быть введено терапевтическое средство, подлежащее исследованию, посредством любого подходящего пути, например, посредством системной инъекции, с помощью насосов для длительного воздействия или прямой интрацеребральной инъекции. Такие животные могут быть включены в поведенческое исследование для того, чтобы определить воздействие терапевтического средства в отношении поведения, например, двигательных поведенческих реакций, у животных, отличных от человека, по сравнению с соответствующими контрольными животными, отличными от человека, которые не получали терапевтическое средство. Также можно выполнять биопсию или анатомическую оценку спинного мозга, мышечной ткани и/или ткани головного мозга животного и/или можно собирать образцы крови или CSP.
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают улучшенную in vivo систему и источник биологических материалов (например, клеток), у которых отсутствует экспрессия и которые являются пригодными для ряда анализов. В соответствии с различными вариантами осуществления, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для разработки терапевтических средств, которые лечат, предупреждают и/или ингибируют один или несколько симптомов, ассоциированных с отсутствием экспрессии и/или активности C9ORF72. В соответствии с различными вариантами осуществления, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для идентификации, скрининга и/или разработки терапевтических средств-кандидатов (например, антител, siRNA и т.д.), которые связываются с C9ORF72. В соответствии с различными вариантами осуществления, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для скрининга и разработки терапевтических средств-кандидатов (например, антител, siRNA и т.д.), которые блокируют активность C9ORF72. В соответствии с различными вариантами осуществления, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для определения профиля связывания антагонистов и/или агонистов полипептида (или транскрипта) C9ORF72 у животного, отличного от человека, которое описано в данном документе. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для определения эпитопа или эпитопов для одного или нескольких терапевтических антител-кандидатов, которые связываются с C9ORF72.
В соответствии с различными вариантами осуществления животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для определения фармакокинетических профилей лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на C9ORF72. В соответствии с различными вариантами осуществления каждое из одного или нескольких животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, и одного или нескольких контрольных или эталонных животных, отличных от человека, подвергают воздействию одного или нескольких лекарственных средств-кандидатов, целенаправленно воздействующих на C9ORF72, в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или более). Дозы терапевтических антител-кандидатов можно вводить посредством любого желаемого пути введения, в том числе парентеральных и отличных от парентеральных путей введения. Парентеральные пути включают в себя, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, интраперитонеальный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, интракраниальный, интраплевральный или другие пути введения инъекцией. Пути, отличные от парентеральных, включают в себя, например, пероральный, назальный, трансдермальный, легочный, ректальный, буккальный, вагинальный, глазной. Введение также может осуществляться посредством непрерывной инфузии, локального введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран или подобного) и/или внутривенной инъекции. Кровь выделяют из животных, отличных от человека, (гуманизированных и контрольных) в различные моменты времени (например, 0 часов, 6 часов, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток или до 30 или более суток). Различные анализы можно осуществлять для определения фармакокинетических профилей введенных лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на C9ORF72, с применением образцов, полученных от животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, в том числе, без ограничения, анализ общего IgG, ответа в виде выработки антител к терапевтическому антителу, агглютинации и т.д.
В соответствии с различными вариантами осуществления животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для измерения терапевтического эффекта блокирования, модулирования и/или ингибирования активности C9ORF72 (или передачи сигнала с участием C9ORF72, или опосредуемых C9ORF72 взаимодействий) и воздействия на экспрессию гена в результате изменений в клетках. В соответствии с различными вариантами осуществления животное, отличное от человека, которое описано в данном документе, или клетки, выделенные из него, подвергают воздействию лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на C9ORF72 у животного, отличного от человека, и затем спустя определенный период времени анализируют в отношении воздействий на С9ORF72-зависимые процессы (или взаимодействия), например, перемещение веществ в эндосомах, иммунный гомеостаз или функционирование мотонейронов и/или нейронов, не относящихся к мотонейронам.
Клетки из животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, можно выделять и применять специально для конкретной цели, или их можно поддерживать в культуре в течение многих поколений. В соответствии с различными вариантами осуществления клетки от животного, отличного от человека, которое описано в данном документе, подвергают иммортализации (например, посредством применения вируса) и поддерживают в культуре неопределенно долго (например, в перевиваемых культурах).
В соответствии с различными вариантами осуществления клетки и/или животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, применяют в различных схемах иммунизации для определения опосредуемых C9ORF72 функций в иммунном ответе на антиген (например, гуморальном иммунном ответе). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления терапевтические средства-кандидаты, которые связываются с C9ORF72 или блокируют одну или несколько его функций, характеризуют в животном, отличном от человека, которое описано в данном документе. Подходящие измерения включают в себя различные клеточные анализы, анализы пролиферации, анализ уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови (например, титр антител), анализы цитотоксичности, характеристику взаимодействий лиганд-рецептор (например, анализы иммунопреципитации) и характеристику взаимодействий лиганд-лиганд. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для характеристики опосредуемых C9ORF72 функций, регулирующих иммунный ответ на антиген. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антиген является ассоциированным с аутоиммунным заболеванием, нарушением или состоянием. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антиген является ассоциированным с воспалительным заболеванием, нарушением или состоянием. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такой антиген является ассоциированным с неврологическим заболеванием, нарушением или состоянием. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антиген является ассоциированным с инфекционным агентом (например, бактерией). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антиген представляет собой тестовый антиген (например, овальбумин или OVA). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антиген представляет собой мишень, ассоциированную с заболеванием или состоянием, от которого страдает один или несколько пациентов-людей, нуждающихся в лечении.
В соответствии с различными вариантами осуществления животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для стимулирования одним или несколькими антигенами для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств для модуляции C9ORF72-зависимой регуляции иммунного ответа, в том числе без ограничения, зависимых от В-клеток специфических реакций на заданный антиген.
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают in vivo систему для анализа и исследования лекарственного средства или вакцины. В соответствии с различными вариантами осуществления лекарственное средство-кандидат или вакцину-кандидат можно доставлять в одно или несколько животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, с последующим мониторингом животных, отличных от человека, с целью определения одного или нескольких из иммунного ответа на лекарственное средство или вакцину, показателей безопасности лекарственного средства или вакцины или эффекта в отношении заболевания или состояния и/или одного или нескольких симптомов заболевания или состояния. Иллюстративные способы, применяемые для определения показателей безопасности, включают в себя измерения токсичности, концентрации при оптимальной дозе, эффективности лекарственного средства или вакцины и возможных факторов риска. Такие лекарственные средства или вакцины можно вводить таким животным, отличным от человека, и/или разрабатывать с их применением.
Эффективность вакцины можно определить различными способами. Вкратце, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, подвергают вакцинации с применением способов, известных в уровне техники, а затем подвергают стимуляции вакциной или вакцину вводят животным, отличным от человека, у которых уже присутствует инфекция. Ответ животного, отличного от человека(животных, отличных от человека), в отношении вакцины может быть измерен посредством мониторинга животного, отличного от человека(животных, отличных от человека), и/или выполнения одного или нескольких анализов на животном, отличном от человека(животных, отличных от человека), (или на клетках, выделенных из них) с целью определения эффективности вакцины. Ответ у животного, отличного от человека(животных, отличных от человека), в отношении вакцины затем сравнивают с контрольными животными с применением одного или нескольких измерений, известных в уровне техники и/или описанных в данном документе.
Эффективность вакцины можно также определить с помощью анализов реакций нейтрализации вируса. Вкратце, животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, подвергают иммунизации и сыворотку крови собирают в разные дни после иммунизации. Серийные разведения сыворотки крови подвергают предварительному инкубированию с вирусом, во время которого антитела в сыворотке крови, которые являются специфичными в отношении вируса, будут связываться с ним. Смесь вирус/сыворотка затем добавляют к пермиссивным клеткам для определения неэффективности с помощью анализа бляшкообразования или анализа микронейтрализации. Если антитела в сыворотке крови нейтрализуют вирус, то образуется меньшее количество бляшек или проявляется меньший сигнал от люциферазы в виде относительных единиц флуоресценции по сравнению с контрольной группой.
Животные, отличные от человека, которые описаны в данном документе, обеспечивают in vivo систему для оценки фармакокинетических свойств и/или эффективности лекарственного средства (например, лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на C9ORF72). В соответствии с различными вариантами осуществления лекарственное средство можно доставлять или вводить одному или нескольким животным, отличным от человека, которые описаны в данном документе, с последующим мониторингом животных, отличных от человека, или осуществления одного или нескольких анализов на животных, отличных от человека, (или клетках, выделенных из них) для определения воздействия лекарственного средства на животное, отличное от человека. Фармакокинетические свойства включают в себя, без ограничения, то, как животное перерабатывает лекарственное средство в различные метаболиты (или выявление наличия или отсутствия одного или нескольких метаболитов лекарственного средства, в том числе, без ограничения, токсичных метаболитов), период полувыведения лекарственного средства, уровни лекарственного средства в кровотоке после введения лекарственного средства (например, концентрация лекарственного средства в сыворотке крови), ответ на лекарственное средство в виде образования антител (например, антител к лекарственному средству), абсорбция и распределение лекарственного средства, путь введения, пути экскреции и/или выведения лекарственного средства. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармакокинетические и фармакодинамические свойства лекарственных средств (например, модуляторов C9ORF72) подвергают мониторингу с применением или посредством применения животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления осуществление анализа включает в себя определение воздействия на фенотип и/или генотип животного, отличного от человека, которому вводят лекарственное средство. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления осуществление анализа включает в себя определение варьирования между партиями для лекарственного средства (например, модулятора C9ORF72, такого как, например, антагонист или агонист). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления осуществление анализа включает в себя определение различий между эффектами лекарственного средства, вводимого животному, отличному от человека, которое описано в данном документе, и эталонным животным, отличным от человека. В соответствии с различными вариантами осуществления эталонные животные, отличные от человека, могут иметь модификацию, которая описана в данном документе, модификацию, которая отличается от описанной в данном документе (например, животное, которое имеет измененный, разрушенный, удаленный, вставленный, модифицированный и т.д. или нефункциональный вследствие иных воздействий локус C9ORF72), или могут не иметь модификации (т.е. отличное от человека животное дикого типа).
Иллюстративные параметры, которые могут быть измерены у животных, отличных от человека, (или в клетках, выделенных из них, и/или с применением таких клеток) для оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, включают в себя, без ограничения, агглютинацию, аутофагию, деление клеток, гибель клеток, комплемент-опосредованный гемолиз, целостность ДНК, титр антител, специфических в отношении лекарственного средства, метаболизм лекарственного средства, характер экспрессии генов, метаболическую активность, митохондриальную активность, окислительный стресс, фагоциоз, биосинтез белка, деградацию белков, секрецию белков, реакцию на стресс, концентрацию лекарственного средства в ткани-мишени, концентрацию лекарственного средства в тканях, отличных от ткани-мишени, активность транскрипции и т.п. В соответствии с различными вариантами осуществления животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, применяют для определения фармацевтически эффективной дозы лекарственного средства (например, леккарственного средства, целенаправленно воздействующего на C9ORF72).
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры представлены для того, чтобы описать квалифицированному специалисту в данной области техники осуществление и применение способов и композиций согласно настоящему изобретению, и не предполагается, что они ограничивают объем, который рассматривается авторами настоящего изобретения как их изобретение. Если не указано иное, температура указана в градусах Цельсия, и давление равно или примерно соответствует атмосферному.
Пример 1. Создание нарушения в локусе C9ORF72, не относящемся к человеческому
Настоящим изобретением иллюстрируется целенаправленное нарушение в локусе C9orf72 у грызуна. В частности, настоящим изобретением специально описывается делеция всей кодирующей последовательности мышиного локуса C9orf72 с применением конструкции с репортером lacZ, размещенной в функциональной связи с мышиным промотором C9orf72. Нацеливающий вектор C9orf72-lacZ для создания нарушения в эндогенном мышином локусе C9orf72 получали, как описано ранее (см., например, патент США №6586251; Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; и Adams, N.C. and N.W. Gale, в Mammalian and Avian Transgenesis-New Approaches, ed. Lois, S.P.a.C., Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2006). Полученный в результате модифицированный локус C9orf72 изображен на фиг. 1А, нижняя секция.
-/-
+/-
-/-
+/-
Вкратце, нацеливающий вектор создавали с использованием клонов искусственной бактериальной хромосомы (ВАС) из мышиной библиотеки ВАС RP23 (Adams, D.J. et al., 2005, Genomics 86:753-758) и вводили в эмбриональные стволовые клетки (ES) гибрида Fl (129S6SvEvTac/C57BL6NTac) с последующим культивированием в селективной среде, содержащей G418. Устойчивые к лекарственному средству колонии собирали через 10 суток после электропорации и подвергали скринингу в отношении корректного целенаправленного воздействия, как описано ранее (Valenzuela et al., выше; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307). Применяли способ VELOCIMOUSE (DeChiara, T.M. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; Dechiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99), в котором целевые ES клетки вводили инъекцией в эмбрионы линии Swiss Webster, находящиеся на стадии некомпактизированных 8-клеточных эмбрионов, с получением здоровых, полностью полученных из ES клеток мышей поколения F0, гетерозиготных в отношении делеции C9orf72. Гетерозиготных самцов поколения F0 скрещивали с самками C57Bl6/NTac с получением гетерозигот F1, которых скрещивали между собой с получением поколения F2 C9orf72, C9orf72 мышей и мышей дикого типа для фенотипических анализов. Вторую когорту мышей поколения N2F2 получали посредством оплодотворения w vitro (IVF) с использованием замороженной спермы гетерозиготных F1 и ооцитов от самок-доноров C57Bl6/NTac. Гетерозиготных потомков N2F1 затем скрещивали между собой с получением N2F2 C9orf72, C9orf72 мышей и мышей дикого типа для фенотипического анализа.
Фенотипические исследования F2 и N2F2 мышей начинали в возрасте шести (6) недель. Мыши подвергались наблюдению с рождения в отношении различных основных показателей развития (карликовость, дыхание, аномалии морды и конечностей, цвет кожи, осанка, выравнивание и открытие глаз) до возраста 6 недель, когда их содержали по 2-5 на клетку с периодом освещения 12 часов в сутки при 20-23°С и влажности 40-60% для исследования. Мышей содержали в клетках размером 95,6×309,1×133,4 мм (Thoren) с подстилкой на основе измельченных стержней кукурузных початков (The Andersons Lab Bedding) и клочками хлопчатобумажной ткани для организмции гнезда (Ancare). При содержании мышей мышей подвергали мониторингу дважды в сутки в отношении состояния здоровья, и они имели неограниченный доступ к нормальному корму (LabDiet) и воде. Все процедуры с животными выполняли в четком соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Care and Use of Laboratory Animals) от Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health). Протокол был утвержден ведомственным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) Regeneron Pharmaceuticals, и были предприняты все усилия для того, чтобы минимизировать их страдания.
2
Анализ экспрессии методом TAQMAN: Ткани подмышечных, плечевых и шейных лимфатических узлов, гонадальной жировой прослойки, лобного отдела коры головного мозга, диафрагмы, спинного мозга, селезенки и тимуса вырезали сразу после умерщвления животного, помещали в стабилизирующий реактив RNALater (QIAgen) и хранили при -20°С. Ткани гомогенизировали в реактиве TRIZOL и подвергали разделению фаз с использованием хлороформа. Водную фазу, содержащую общую РНК, очищали с использованием мини-набора miRNeasy Mini Kit (QIAgen) в соответствии с инструкциями производителя. Геномную ДНК удаляли с использованием буфера для ДНКазы MAGMAX™ TURBO™ и ДНКазы TURBO™ (Ambion). мРНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием мастер-микса SUPERSCRIPT VILO™ (SuperScript III RT, RNaseOUT™, рекомбинантный ингибитор рибонуклеазы, патентованный белок-помощник, случайные праймеры, MgCl, dNTP; Invitrogen в составе Life Technologies). кДНК подвергали амплификации с использованием мастер-микса TAQMAN Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) при использовании системы для выявления последовательностей ABI 7900НТ (Applied Biosystems). Ген бета-актина использовали в качестве внутреннего контроля для нормализации различий при внесении кДНК. Тимус от мышей дикого типа использовали в качестве эталонного образца для расчета кратности различия уровней мРНК в образцах (n=5 самок на ткань на генотип). Иллюстративные результаты приведены на фиг. 1В.
Определение профилей экспрессии LacZ: Мышей подвергали глубокой анестезии посредством IP (интраперитонеальной) инъекции кетамина/ксилазина (120/5 мг/кг) и осуществляли фиксацию посредством перфузии через сердце с использованием 0,2% раствора глутарового альдегида, 4% раствора параформальдегида. Ткани головного мозга, грудной клетки, лимфатических узлов, слюнных желез, тимуса, сердца, легкого, печени, селезенки, желудка, почки, кишечника, мочеполовой системы, мышц и задней конечности вырезали, промывали в PBS и подвергали последующей фиксации в течение 30 минут в 0,2% растворе глутарового альдегида, 4% растворе параформальдегида. Ткани промывали и инкубировали в окрашивающем растворе X-gal (1 мг/мл) в течение 1-24 часов при 37°С. После окрашивания ткани промывали, подвергали последующей фиксации в 4% параформальдегиде и просветляли в серии растворов глицерина с концентрациями 50%, 70% и 100%. Фотографии получали с использованием стереомикроскопа Nikon SMZ1500 и цифровой камеры Nikon DS-Ri1 при использовании программного обеспечения NIS-Elements D Imaging Software (Nikon).
-/-
Профили экспрессии определяли в моменты времени, соответствующие 12,5 суток эмбрионального развития (Е12.5), возрасту 6 недель и 28 недель. Иллюстративные данные в виде профиля относительной экспрессии β-галактозидазы (lacZ) в Е12.5 эмбрионах (таблица 4) и у C9orf72 мышей возрастом 6 и 28 недель (таблица 5) представлены ниже (- = нет экспрессии; + = низкая экспрессия; ++ = умеренная экспрессия; +++ = высокая экспрессия; wt = C57BL/6N дикого типа; nd = не определено).
+/-
-/-
Как показано на фиг. 1В, высокие уровни экспрессии C9orf72 выявляли в полученных от животных дикого типа (WT) образцах гонадальной жировой прослойки, лобного отдела коры головного мозга и спинного мозга, причем более низкие уровни присутствовали в тимусе, селезенке и лимфатическом узле. Уровень экспрессии у C9orf72 (Het) мышей составлял приблизительно половину от уровня экспрессии у дикого типа (WT), как и ожидалось, а у С9оrf72 (KO) мышей не было выявляемой экспрессии C9orf72. Среди исследуемых генотипов наблюдалось различий в уровне транскрипции в близлежащих локусах Mob3b, Ak045932 и Ifnk, что указывает на то, что только вставка lacZ (т.е. удаление кодирующей последовательности) воздействовало на экспрессию C9orf72.
-/-
+/-
В соответствии с данными, приведенными на фиг. 1В, окрашивание на lacZ у 6- и 28-недельных C9orf72 (KO) животных выявило активность фермента в нескольких областях головного мозга и спинного мозга, а также в селезенке селезенке, семенниках и почке (таблицы 4 и 5), что согласуется с другими сообщениями (Suzuki, N. et al., 2013, Nat. Neurosci. 16(12):1725-8; Koppers, M. et al., 2015, Am. Neurol. 78(3):425-38). Кроме того, наблюдалось менее выраженное окрашивание в других тканях. Активность репортера была более ограниченной по интенсивности и масштабу в C9orf72 тканях, как и ожидалось для одного заменяющего аллеля lacZ.
В совокупности, настоящее изобретение демонстрирует, что мышиный C9orf72 экспрессируется в различных тканях нервной и иммунной систем. Кроме того, настоящее изобретение демонстрирует, что по меньшей мере в некоторых тканях экспрессия повышается с возрастом животного и непосредственно коррелирует с неврологическими и иммунологическими фенотипами, описанными в следующих примерах (см. ниже).
Пример 2. Поведенческий анализ животных, отличных от человека, с нарушением в локусе C9orf72
Настоящее изобретение демонстрирует, среди прочего, что у животных, отличных от человека, (например, грызунов), которые описаны в данном документе, проявляются ALS-подобные симптомы, такие как, например, уменьшенная масса тела и значительные двигательные аномалии, являющиеся результатом нарушения в локусе C9orf72 у грызуна (например, мыши), которые описаны в примере 1.
Фенотипические исследования мышей, имеющих нарушение в C9orf72, которое описано выше, осуществляли в 8, 18, 37 (самки) и 57-60 недель (самцы). Массу тела измеряли раз в две недели, и композиционный состав тела животного анализировали с помощью μКТ-сканирования (Dynamic 60). Стандартные 24 сканограммы использовали для визуализации массы шейного отдела позвоночника. Все процедуры с животными проводили в соответствии с протоколами, утвержденными ведомственным комитетом по содержанию и использованию животных (Institutional Animal Care and Use Committee) Regeneron Pharmaceuticals.
Оценку общей двигательной функции осуществляли с использованием анализов субъективной балльной оценки в слепом формате. Анализ двигательного нарушения проводили с использованием теста оценки способности удерживаться на вращающемся барабане, теста локомоторной активности «открытое поле» и теста на системе catwalk. Оценку двигательного нарушения получали при помощи измерения с использованием системы, разработанной Институтом по разработке терапии для ALS (ALS Therapy Development Institute) (ALSTDI, Gill A. et al., 2009, PLoS One 4:e6489). Во время теста catwalk субъекты идут по подсвеченной стеклянной платформе, в то время как видеокамера ведет запись снизу. Связанные с походкой параметры, такие как рисунок шагов, скорость переноса отдельных лап, продолжительность фазы опоры и давление, записывают для каждого животного. Этот тест используют для фенотипирования мышей и оценки новых химических молекул в отношении их воздействия на двигательные характеристики. CatWalk XT представляет собой систему для количественной оценки шагов и походки у крыс и мышей. Ее используют для оценки локомоторных способностей у грызунов практически в любом виде экспериментальной модели аномалий центральной нервной системы, периферической нервной системы, мышечных или скелетных аномалий.
Анализ походки в системе CatWalk: Животных помещают в начало дорожки в системе Noldus CatWalk XT 10, причем открытый проход находится перед ними. Мыши самостоятельно бегут к концу дорожки, пытаясь сбежать. Камера осуществляет запись, и программное обеспечение в системе осуществляет измерение отпечатков лап. Отпечатки лап анализируют в отношении нарушений в размещении лап.
Тест «открытое поле»: Мышей помещают в систему «открытое поле» Kinder Scientific и оценивают в течение 60 минут. Аппарат использует инфракрасные лучи и компьютерное программное обеспечение для расчета тонких движений, передвижения в направлениях X+Y, пройденного расстояния, количества случаев подъема на задние лапы, время, проведенное на задних лапах, и время при отсутствии движения.
Оценка способности к удержанию равновесия на вращающемся барабане: Тест способности удерживаться на вращающемся барабане (IITC Life Science, Вудленд-Хиллс, Калифорния) измеряет время ожидания до того момента, пока мышь упадет с вращающегося барабана. Установку с вращающимся барабаном устанавливают в экспериментальный режим, который начинается с 1 об./мин. и ускоряется до 15 об./мин. за 180 секунд. Затем записывают время ожидания падения животного после режима постепенного ускорения. Среднее и максимальное значения для трех наиболее длинных периодов времени, в течение которых животные остаются на барабане без падения, используют для оценки времени ожидания падения. Животные, которые способны удерживаться на барабане более 180 секунд, считаются не проявляющими симптомы.
Нарушение верхних мотонейронов присутствует в виде спастичности (т.е. ригидности), усиленных рефлексов, тремора, брадикинезии и симптомов Бабинского. Нарушение нижних мотонейронов присутствует в виде мышечной слабости, атрофии, сжатия, сгибания и волочения лапы и фасцикуляций. Бульбарное нарушение присутствует в виде трудности при глотании, нечеткость в артикуляции и фасцикуляций в языке. В таблице 6 изложена методика оценки, связанная с двигательными нарушениями, тремором и ригидностью у животных во время тестирования. Иллюстративные результаты приведены на фиг. 2А-2Н.
-/-
-/-
-/-
+/-
Как показано на фиг. 2А-2Н, C9orf72 мыши демонстрировали ALS-подобные фенотипы, такие как, например, уменьшенная масса тела, отсутствие двигательной активности и нарушение походки. В частности, уменьшенная масса у C9orf72 мышей по сравнению с контрольными мышами дикого типа начинала проявляться в возрасте приблизительно 30 недель (фиг. 2В). Кроме того, за исключением теста способности удерживаться на вращающемся барабане, наблюдали значительное двигательное нарушение (например, значительную слабость и неспособность к выпрямлению задних конечностей в направлении продольной средней линии, а также легкий тремор и ригидные мышцы задней конечности р<0,0001) у C9orf72 мышей во всех типах тестов (фиг. 2С-2Н), начиная с возраста приблизительно 40 недель, что указывало на появление патологии верхних и нижних мотонейронов. Подобные дефекты не наблюдались у животных дикого типа или гетерозиготных (C9orf72) животных.
-/-
-/-
-/-
Тест способности удерживаться на вращающемся барабане и анализ походки CatWalk на C9orf72 мышах демонстрировали значительно ослабленные локомоторные поведенческие реакции и меньшее количество случаев вставания на задние лапы, что указывает на нарушение в задних конечностях. В анализах походки CatWalk выявили признаки нарушенной координации между нижними конечностями и уменьшенную длину шага, а также брадикинезию и волочение задних конечностей. Эти данные указывают на значительные нарушения походки по сравнению с диким типом. Отсутствие различий между мышами дикого типа и C9orf72 мышами наблюдали в отношении максимального времени удержания равновесия на вращающемся барабане. Уже 36-недельного возраста C9orf72 мыши демонстрировали значительные и прогрессирующие нарушения двигательной функции.
-/-
-/-
-/-
В еще одном эксперименте поясничные отделы спинного мозга от мышей дикого типа и C9orf72 мышей (n=5, возраст 60 недель) собирали для гистопатологического анализа. Наблюдали отсутствие различий в общем количестве мотонейронов в спинном мозге (фиг. 2I). Тем не менее, средняя площадь поверхности тела клетки у C9orf72 мотонейронов была значительно больше по сравнению с диким типом (р<0,0001). В частности, мотонейроны у C9orf72 мышей демонстрировали характеристики гипертрофии, подтверждающиеся значительно большими значениями средней площади поверхности тела клетки по сравнению с диким типом (фиг. 2I). Таким образом, эти данные указывают на возможное возникновение патологии нижних мотонейронов, начиная с возраста 40 недель.
+/+
-/-
В подобном эксперименте двигательные аномалии оценивали у дикого типа (C9orf72, n=14; 11 самок, 3 самца) и C9orf72' (n=17; 12 самок, 5 самцов), начиная с возраста 32 недель, и до 60 недель в виде процента живых животных к данной неделе. Мышей взвешивали каждую неделю и оценку общей двигательной функции осуществляли с использованием анализов субъективной балльной оценки в слепом формате (как описано выше). Каждую неделю или два раза в месяц проводили клинические неврологические осмотры в двух группах мышей, изучая у них двигательное нарушение, тремор и ригидность мышц их задних конечностей. В случае двигательного нарушения авторы настоящего изобретения руководствовались шкалой для оценки неврологического нарушения (описана выше) в слепом формате от нуля (нет симптомов) до четырех (мышь не может самостоятельно встать в течение 30 секунд после того, как ее поместили на один из боков). В случае тремора и ригидности авторы настоящего изобретения создали систему оценки со шкалой от нуля (нет симптомов) до трех (тяжелые). Все данные приведены в виде среднего значения ± SEM. Типичные результаты изложены на фиг. 2J.
Локомоторные поведенческие реакции оценивали в течение 60 минут через неделю с использованием автоматизированной системы «открытое поле» (Kinder Scientific), теста способности удерживаться на вращающемся барабане (Rota Rod, IITC Life Science, Вудленд-Хиллс, Калифорния) и анализа походки (CatWalk XT 10, Noldus), как описано выше. Все данные приведены в виде среднего значения ± SEM. Типичные результаты изложены на фиг. 2K.
-/-
-/-
-/-
Используя шкалы для оценки, описанные выше, авторы настоящего изобретения наблюдали, что в возрасте около 40 недель C9orf72 мыши начинали проявлять значительную слабость и неспособность к выпрямлению задних конечностей в направлении продольной средней линии, а также легкий тремор и ригидность мышц задних конечностей (Р<0,0001), что говорит о появлении патологии верхних и нижних мотонейронов. Кроме того, все из мышей дикого типа были живы в возрасте после 60, и только ~53% C9orf72 мышей (9 из 17; 5 самок, 4 самца) оставались живы в возрасте 60 недель (фиг. 2J, вверху слева). Начиная с возраста около 36 недель C9orf72 мыши прекращали набирать массу тела, в отличие от когорты мышей дикого типа.
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Из анализа «открытое поле» авторы настоящего изобретения наблюдали, что C9orf72 мыши проявляют значительно пониженные локомоторные поведенческие реакции по сравнению с мышами дикого типа (Р=0,0008). Эти мыши также проявляли значительно меньшее число поведенческих реакций, связанных со вставанием на задние лапы (Р=0,0009), что указывает на нарушение в их задних конечностях. Наблюдали отсутствие значительного изменения в максимальном времени, в течение которого мыши оставались на вращающемся барабане в любой момент в ходе исследования у мышей дикого типа и C9orf72 мышей. Из анализа походки CatWalk авторы настоящего изобретения наблюдали, что C9orf72 мыши имели значительно нарушенную координацию между конечностями (Р=0,0005) и длину шага (Р=0,0013), а также брадикинезию и волочение задних конечностей. Эти данные указывают на значительные нарушения походки у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом. Таким образом, пример демонстрирует, что, начиная с возраста около 36 недель, C9orf72 мыши показывают значительные и прогрессирующие нарушения двигательной функции по сравнению с диким типом.
+/-
-/-
+/-
-/-
+/-
-/-
В другом эксперименте гетерозиготных (C9orf72) и гомозиготных (C9orf72) мышей оценивали с использованием теста силы сжатия. Вкратце, сила сжатия измеряет нервно-мышечную функцию как максимальную силу мышц передних конечностей, и ее оценивают с помощью силы сжатия, прикладываемой мышью к решетке, которая подсоединена к сенсору. Проводили три последовательных испытания с измерением только силы верхних конечностей. Все полученные значения силы сжатия нормализовали к массе тела мышей. Тест силы сжатия осуществляли на тринадцати мышах дикого типа, семи C9orf72 и восьми C9orf72 мышах в возрасте 20 недель (до появления двигательных симптомов) и на двенадцати мышах дикого типа, четырех C9orf72 и тринадцати C9orf72 мышах в возрасте 60 недель. Типичные данные изложены на фиг. 2L.
+/-
+/-
Как показано на фиг. 2L, гетерозиготные (C9orf72) мыши не показывали какого-либо значительного двигательного нарушения, тремора или ригидности в 60 недель. Кроме того, гетерозиготные (C9orf72) мыши не показывали какого-либо изменения в силе сжатия в 60 недель по сравнению с диким типом.
В совокупности, настоящее изобретение демонстрирует, что описанные выше животные, отличные от человека, демонстрируют поддающийся измерению нейродегенеративный фенотип и, следовательно, обеспечивают подходящие модели бокового амиотрофического склероза (ALS) и/или лобно-височной деменции (FTD), причем животные, отличные от человека, имеют геном, содержащий делецию всей кодирующей последовательности (т.е. экзонов 2-10) эндогенного локуса C9orf72, которая является результатом вставки репортерного гена (например, lacZ). Такие животные модели обеспечивают полезную in vivo систему для разработки и скрининга терапевтических кандидатов для лечения ALS и/или FTD.
Пример 3. Иммунофенотидический анализ животных, отличных от человека. с нарушением в локусе C9orf72
-/-
Настоящее изобретение демонстрирует, что животные, отличные от человека, которые получены согласно примеру 1, демонстрируют иммунологический фенотип, характеризующийся в соответствии с некоторыми вариантами осуществления спленомегалией и лимфаденопатией, которые являются результатом инфильтрации различных популяций иммунных клеток. Кроме того, настоящее изобретение специально демонстрирует, что у таких животных, отличных от человека, развивается гломерулонефрит, характеризующийся инфильтрацией популяций иммунных клеток в почку. Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, авторы настоящего изобретения предполагают, что продукт локуса C9ORF72 играет критически важную роль в функционировании иммунной системы и потеря полипептида C9ORF72 у животных, отличных от человека, которые описаны в данном документе, не является основным механизмом заболевания ALS и/или FTD. Различные ткани собирали от C9orf72 мышей и мышей дикого типа для анализа (n=4-6 животных на генотип в 8, 18 и 37 недель для самок и 9-10,18 и 57-60 недель для самцов).
2
Получение клеток и анализ с помощью проточной цитометрии. Максимальный объем крови собирали в пробирки, покрытые EDTA, посредством прокола сердца непосредственно после умерщвления с использованием СО и примерно 200 мкл переносили в пробирки, покрытые гепарином, для подготовки к анализу методом FACS. Селезенку, костный мозг и шейные лимфатические узлы собирали, диссоциировали на суспензии отдельных клеток в 1X PBS со средой Дульбекко с 2% фетальной бычьей сывороткой (Stem Cell Technologies), а также 2 мМ EDTA (Ambion) и фильтровали с использованием способов, известных в уровне техники. Лизис эритроцитов (RBC) выполняли в крови, селезенке и костном мозге с использованием буфера для лизиса RBC (eBioscience) или лизирующего буфера ACK Lysing Buffer (Life Technologies). Клетки лимфатических узлов, селезенки и костного мозга подсчитывали с использованием прибора для подсчета и определения жизнеспособности клеток Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter (Nexcelom Bioscience) и высевали в количестве примерно 10 миллионов клеток на лунку для селезенки и 1 миллион клеток на лунку или в максимальном объеме для лимфатических узлов и костного мозга. Кровь высевали в максимальном объеме (примерно 250 мкл) на лунку. Клетки обрабатывали фиксируемым красителем на водной основе LIVE/DEAD Fixable Aqua stain (Life Technologies) при комнатной температуре, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в блокирующем растворе (очищенное mAb к мышиному CD16/CD32, BD Pharmingen, 1:100 в FACS буфере) в течение 15 минут на льду. Клетки окрашивали конъюгированными антителами в течение 30 минут на льду, промывали, фиксировали (набор BD Cytofix/cytoperm) и снова промывали. Наконец, клетки ресуспендировали в FACS буфере (1X PBS со средой Дульбекко с 2% фетальной бычьей сывороткой. Stem Cell Technologies, а также с 2 мМ EDTA, Ambion) и анализировали на проточном цитометре BD FACSCanto Flow Cytometer II или проточном цитометре LSRFortessa (BD Biosciences). Окрашивание Foxp3 (eBioscience) осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.
-/-
Панель для окрашивания плазматических клеток: CD11b (M1/70; Biolegend), CD11c (N418; Biolegend), CD3 (145-2C11; Biolegend), B220 (RA3-6B2; Biolegend), CD19 (1D3; BD Pharmingen), CD138 (281-2; BD Pharmingen) и CD45 (30-F11; BD Pharmingen). Панель для окрашивания миелоидных клеток: F4/80 (ВМ8; Biolegend), CD115 (AFS98; eBioscience), Ly6G (RB6-8C5; eBioscience), CD11b (M1/70; eBioscience), CD45 (30-F11; BD Biosciences) и Ly6C (AL-21; BD Biosciences). Антитела к CD8, CD25, CD62L, CD69, CD127, PD1 (RPMI-30), NKp46 получали от BioLegend (Сан-Диего, Калифорния). Антитело Foxp3 получали от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния). Антитело CD49b получали BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo Software (Tree Star). Подсчет процента положительных клеток и общего количества клеток проводили для селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга и почки самок возрастом 30-35 недель (дикой тип: n=4; C9orf72 n=4) на приборе для подсчета и определения жизнеспособности клеток Nexelcom Bioscience Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter с использованием для определения жизнеспособности красителей AO/PI (акридиновый оранжевый и пропидиум йодид). Подсчитанные количества клеток использовали для определения абсолютного количества клеточных популяций, наблюдаемых при поверхностном окрашивании и отображенных на графиках, соответственно.
Гистология: Ткани собирали в 4% параформальдегид (PFA, Electron Microscopy Sciences) или собирали после транскардиальной перфузии 50 мл солевого раствора, 50 мл 4% PFA в ацетатном буфере с рН 6,5 и, в конце, 50 мл 4% раствора PFA в боратном буфере с рН9,5. Спинные мозги собирали в 15% раствор сахарозы с последующим повышением концентрации сахарозы до 30% в боратном буфере до тех пор, пока они не опускались на дно. Все ткани подвергали последующей фиксации в 4% PFA и переносили в 70% этанол спустя 24 или 48 часов. Заливка в парафин, получение срезов и окрашивание гематоксилином и эозином (Н&Е) осуществлялись коммерческой гистологической лабораторией (Histoserv, Inc.; Германтаун, Мериленд). Иммуногистохимический анализ в отношении IgM, IgG, фактор комплемента С3, CD45R, CD3, CD138 и F4/80 выполнялся коммерческой лабораторией (Histotox Labs; Боулдер, Колорадо). Подсчет количества клеток мотонейронов и количественное определение площади поверхности тела клетки осуществляли с использованием Image J. Подсчитанное количество мотонейронов представляет собой среднее от трех срезов на животное, n=5 мышей, и площадь поверхности тела клетки представляет собой среднее от трех срезов на животное, 10 мотонейронов на срез, n=5 мышей. Количественное определение фактора комплемента С3 с помощью IHC (иммуногистохимия) осуществляли с использованием Halo.
2
Гематологические анализы: Образцы крови собирали из ретроорбитального синуса под анестезией изофлураном или посредством прокола сердца после умерщвления под действием вдыхания СО в соответствии с протоколом IACUC Regeneron. Клинический анализ крови (СВС) с определением лейкоцитарной формулы осуществляли на 20 мкл цельной крови с использованием Hemavet 950 (Drew Scientific Group) и клинический биохимический анализ крови выполняли на образцах сыворотки крови с использованием системы для химического анализа ADVIA 1800 Chemistry System (Siemans Medical Solutions USA). Анализы методом ELISA осуществляли на образцах плазмы крови использованием следующих наборов: набор ELISA анализа мышиных IgG антител к ревматоидному фактору и набор ELISA анализа мышиных IgM антител к ревматоидному фактору (Shibayagi Co., Ltd.), набор для ELISA анализа всех мышиных Ig антител к дцДНК, набор для ELISA анализа всех мышиных Ig антинуклеарных антител (ANA), набор для ELISA анализа всех мышиных Ig антител Anti-Sm (к антигену Смита), набор для ELISA анализа всех мышиных Ig антител к кардиолипину (Alpha Diagnostic Intl.) и набор для ELISA анализа мышиных IgG и IgM (Abcam), в соответствии с инструкциями производителя. Считывание результатов от образцов производили на микропланшет-ридере Spectramax M5 при длине волны 450 нм (Molecular Devices). Образцы анализировали в двух повторностях и усредняли с получением среднего значения. IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 (общий), IL-17, MCP-1 и TNF-α измеряли в образцах плазмы крови с использованием Multi-Spot 10-плексного анализа с электрохемолюминесцентным выявлением (Meso Scale Discovery) в соответствии с инструкциями производителя и считывали на планшет-ридере Meso Sector S 600 при длине волны 620 нм (Meso Scale Discovery). Образцы анализировали в двух повторностях и усредняли с получением среднего значения.
Выделение, секвенирование и анализ РНК: Селезенку и шейные лимфатические узлы вырезали сразу после умерщвления животного, помещали в стабилизирующий реактив RNALater (Qiagen) и хранили при -20°С. Общую РНК выделяли с использованием набора для выделения нуклеиновой кислоты MagMAX™ Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion) согласно инструкциям производителя. РНК количественно определяли с использованием УФ-спектрофотометра и целостность РНК оценивали с помощью Qiaxcel (Qiagen). ПолиА-мРНК очищали от общей РНК с использованием набора для очистки мРНК Dynabeads mRNA kit (Invitrogen) и цепь-специфические библиотеки для секвенирования РНК получали с использованием набора для создания библиотек РНК ScriptSeq RNA-seq Library Preparation kit (Illumina). Библиотеки для секвенирования РНК подвергали секвенированию до длины 33 п.о. с использованием секвенатора Hiseq 2000 NGS (Illumina). Уровни экспрессии генов получали из необработанных ридов после секвенирования с использованием Nimbus2, программного обеспечения для секвенирования РНК, разработанного Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Способ анализа мочи: образцы мочи получали посредством сбора пятен и концентрацию альбумина в моче определяли с использованием наборе для непрямого конкурентного ELISA анализа Albuwell M (Exocell, Филадельфия, Пенсильвания). Концентрацию креатинина в моче анализировали с использованием набора Creatinine Companion kit (Exocell). Анализы осуществляли в соответствии с инструкциями производителя и полученные данные использовали для расчета соотношения альбумина к креатинину в моче (ACR).
Статистический анализ: Статистические и графические анализы осуществляли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 3.0). Данные анализировали с использованием непарного t-критерия Стьюдента и однофакторного диперсионного анализа (ANOVA). Результаты считали статистическим значимыми при значениях р<0,05 («усы» изображают s.e.m.). Иллюстративные результаты приведены на фиг. 3A-3AL.
-/-
+/-
-/-
-/-
+/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+/-
Как показано на фиг. 3A-3D, у C9orf72 мышей развивалось значительное увеличение селезенки по сравнению с мышами дикого типа и C9orf72 мышами. Кроме того, шейные лимфатические узлы прогрессивно увеличивались с возрастом (фиг. 3A-3D), Таким образом, уже с 8-недельного возраста C9orf72 мыши демонстрируют увеличенные селезенки и шейные лимфатические узлы. Такие увеличения были доступны пальпации в шейных областях всех C9orf72 мышей, но не мышей дикого типа или C9orf72 мышей. При дополнительном изучении такие массы доступны пальпации к возрасту 12 недель у самок C9orf72 мышей, и как у самцов, так и у самок C9orf72 мышей к 18 неделям. При анатомировании подтверждалось происхождение масс из шейных лимфатических узлов, причем увеличение наблюдалось уже в возрасте 8 недель (фиг. 3А). Полное анатомирование также выявляло дополнительные увеличенные лимфатические узлы по всему телу, в особенности брыжеечные лимфатические узлы у более старших C9orf72 мышей (>35 недель). Пейеровы бляшки также были заметно увеличены, и спленомегалия явно проявлялась у C9orf72 мышей к возрасту 8 недель (фиг. 3D, внизу слева). Только девять из 17 C9orf72 мышей оставались живы в возрасте после 60 недель, тогда как все мыши дикого типа, подвергавшиеся периодическим исследованиям неврологических функций, выжили к концу периода проведения эксперимента. В возрасте приблизительно 18-24 недель спленомегалия и гиперплазия шейных лимфатических узлов явно проявлялись у всех C9orf72 мышей, и кривые набора массы тела у C9orf72 мышей начали уплощаться по сравнению с мышами дикого типа и C9orf72 мышами (например, фиг. 2В).
-/-
-/-
-/-
Данные СВС цельной крови с определением лейкоцитарной формулы показывают, что у C9orf72' мышей проявляется значительное повышение содержания циркулирующих нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов по сравнению с диким типом, в то же время они демонстрируют значительное снижение циркулирующих лимфоцитов (фиг. 3Е). Данные СВС от C9orf72 мышей (например, возрастом 34-38 недель) также демонстрировали, что лейкоцитарная формула для циркулирующих лейкоцитов была изменена по сравнению с мышами дикого типа. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что значительное повышение доли моноцитов и нейтрофилов и снижение доли лимфоцитов у C9orf72 мышей по сравнению с мышами дикого типа, было выявляемым уже в возрасте 8 недель.
-/-
-/-
Окрашивание Н&Е выявило смешанную популяцию клеток с несколькими типами морфологии в селезенке и шейных лимфатических узлах у C9orf72 мышей (фиг. 3F, 3G). В частности, в шейных лимфатических узлах, рассматриваемых при 4-кратном увеличении, проявлялось большое количество больших круглых клеток, характеризующихся переменно четкими границами клеток и с умеренными-сильными эозинофильными характеристиками (фиг. 3F). Иногда пенистую цитоплазму наблюдали в разрастающейся клеточной популяции. При рассмотрении под 60-кратным увеличением клетки в шейных лимфатических узлах демонстрировали плазмацитоидную морфологию (голубые стрелки) и были перемешаны с нейтрофилами (желтые стрелки) и другими зрелыми лимфоцитами (фиг. 3G). Клетки, которые оказались соответствующими макрофагам (зеленые стрелки), также присутствовали, как и MotT-клетки (нерегулярно, красная стрелка; аномальные плазматические клетки с конденсированными иммуноглобулинами), все из этих признаков указывали на хроническое воспаление в шейных лимфатических узлах у C9orf72 мышей (фиг. 3G).
-/-
-/-
+
3+
-/-
+/-
Наблюдаемое увеличение селезенок и лимфатических узлов у C9orf72 мышей указывало на патологический процесс, связанный с неопластической или иммунной дисрегуляцией, который ранее не описывался у пациентов с ALS-FTD. Гистопатологический анализ на C9orf72 лимфоидных тканях (т.е. окрашивание срезов лимфатических узлов и селезенки от мышей возрастом 8-60 недель гематоксилином и эозином (Н&Е)) подтверждал, что базовая клеточная организация увеличенных лимфатических узлов сохранялась. Кроме того, IHC окрашивание подтверждало присутствие В-клеток (CD45R) в кортексе и Т-клеток (CD) между фолликулами и в паракортикальной зоне. Тем не менее, присутствовало разрастание кортикальной и медуллярной структур узла за счет популяции клеток, состоящей преимущественно из больших круглых клеток с переменно четкими границами и с одним круглым ядром, окруженным эозинофильной и пенистой цитоплазмой. Подобный клеточный инфильтрат также присутствовал в селезенке, располагаясь преимущественно в красной пульпе, что приводило к разрастанию структуры селезенки и к увеличению в результате веса селезенок у C9orf72 мышей. Также было отмечено, что присутствовало большое количество плазмацитоидных клеток, содержащих перинуклеарные ореолы, которые соответствовали морфологии плазматических клеток, вместе с редкими MotT-клетками. Подобные смешанные инфильтраты не наблюдались у мышей дикого типа и C9orf72 (гетерозиготных) мышей.
-/-
Популяция больших круглых клеток не окрашивалась соответственно CD45R, CD3 или CD138, но была строго положительно в отношении F4/80, маркера макрофагальной линии дифференцировки. Сигнал при IHC преобладал на клеточной мембране, но ограничивался в цитоплазме вследствие сильно вакуолизированной цитоплазмы. В отличие от этого, для окрашивании WT и гетерозиготного контроля в отношении F4/80 характерным был цитоплазматический и мембранный характер окрашивания, ожидаемый для макрофагов, причем общий сигнал от F4/80 был более сильным, чем наблюдаемый у C9orf72 мышей (см. ниже, например, фиг. 3Р).
-/-
+
-/-
+
-/-
-/-
Анализы дополнительных органов с использованием Н&Е и IHC у мышей возрастом 8-60 недель выявили спорадическую медуллярную гиперплазию тимуса и очаговый фиброз костного мозга и/или миелоидную гиперплазию у определенных C9orf72 мышей. Более распространенным результатом наблюдения было присутствие заметной популяции дендритных клеток, обнаруживающейся в печени и почках нуль-мышей. Эти клетки удлиненной-угловатой формы были F4/80 и морфологически подобными типичным дендритным клеткам (DC), хотя и имели больший размер и были более многочисленными. Они были более явно выраженными в печени C9orf72 животных уже в 8 недель по сравнению с диким типом, хотя не было свидетельств ассоциированного заболевания печени. Авторы настоящего изобретения также наблюдали повышение содержания F4/80 клеток в почке C9orf72 животных в 8 недель, которое становилось более явно выраженным с возрастом. DC располагались преимущественно в наружной части мозгового вещества, где они образовывали агрегаты вблизи плотного пятна и смежных канальцев вместе с явно выраженными скоплениями вокруг клубочков совместно с лимфоцитами. Авторы настоящего изобретения отмечали повышенное содержание инфильтратов смешанных лейкоцитов в почке по мере старения мышей, сопровождающееся варьирующимися степенями иммунообусловленного гломерулярного заболевания, которое явно проявлялось к возрасту 35-60 недель. Не наблюдали свидетельств воспаления в ткани головного мозга или спинного мозга у любого из оцениваемых животных. Следовательно, селезенка и лимфатические узлы были основными центрами иммунной патологии у C9orf72 мышей с признаками вторичного прогрессирующего гломерулярного заболевания в почке.
-/-
-
-
-
+
+
mid/low
mid/low
low/-
low/-
+
mid/+
-/-
Как показано на фиг. 3Н, самцы C9orf72 мышей демонстрируют повышенные количества CD11bCD11cCD3B220CD19 В-клеток в шейных лимфатических узлах, в то же время показывая сравнимое или пониженное процентное содержание этих же В-клеток в селезенке, костном мозге и крови по сравнению с диким типом. Оказывается, что содержание В-клеток, которые пребывают в процессе превращения в плазматические клетки (B220CD19), и зрелых плазматических клеток (B220CD19CD45CD138) повышается с возрастом в селезенке, шейных лимфатических узлах и костном мозге у самцов C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3I).
+
+
-/-
-/-
+
int
int
+
+
-
-
+
-/-
-/-
Процентное содержание В-клеток (CD45CD19) было либо неизменным, либо пониженным у самок C9orf72 мышей по сравнению с диким типом в зависимости от изучаемого органа (например, шейных лимфатических узлов). Самки C9orf72 мышей демонстрируют повышенное процентное содержание В-клеток, которые пребывают в процессе превращения в плазматические клетки/плазмобластов (CD45CD19B220CD138) и зрелых плазматических клеток (CD45CD19B220CD138) в селезенке, лимфатическом узле и костном мозге по сравнению с диким типом (фиг. 3J). Авторы настоящего изобретения не наблюдали каких-либо системных различий между C9orf72 и контрольными мышами по этим типам клеток в крови. В совокупности, эти данные демонстрируют развивающуюся адаптивную иммунную реакцию у C9orf72 мышей.
+
+
+
-/-
-/-
-/-
+
+
low/-
high
-/-
+
+
low/-
mid/-
-/-
+
-/-
Как показано на фиг. 3K и 3L, повышенное процентное содержание нейтрофилов (CD11bLy6GLy6C) наблюдали в селезенке самцов и самок C9orf72 мышей по мере их старения. Повышения также наблюдали в шейных лимфатических узлах самцов C9orf72 мышей в период 9-18 недель и самок C9orf72 мышей во все изучаемые моменты времени. Популяции гранулоцитов также увеличивались в костном мозге и в крови с переменной значимостью изменений в большинство моментов времени. Содержание участвующих в воспалении моноцитов (CD11b, CD115, Ly6G, Ly6C) было значительно повышено у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом в случае селезенки, шейных лимфатических узлов, костного мозга и крови по меньшей мере в один момент времени в ходе исследования (фиг. 3K и 3L, средний ряд). Подобные повышения содержания резидентных моноцитов (CD11bCD115Ly6GLy6C) со временем также наблюдали у C9orf72 мышей в селезенке, костном мозге и крови, тогда как снижения были заметны в шейных лимфатических узлах (фиг. 3K и 3L, нижний ряд, соответственно). Как показано на фиг. 3М, увеличенные популяции F4/80 макрофагов в селезенке, шейных лимфатических узлах, почке и костном мозге наблюдали у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом.
-/-
-/-
Гистопатологический анализ в отношении экспрессии CD45R, CD3 и CD 138 также выполняли на селезенке и шейных лимфатических узлах мышей дикого типа и C9orf72 мышей (фиг. 3N, 3O). Срезы рассматривали при 4-кратном и 60-кратном увеличении. В селезенке C9orf72 мыши демонстрировали потерю нормальной морфологии фолликулов (фиг. 3N). Области белой пульпы были увеличенными и диспластическими со слабовыраженными границами. Наблюдалось накопление клеток с большим количеством светло-розовой цитоплазмы (клеток, подобных плазматическим клеткам). Окрашивание в отношении CD138 не выявило заметных отличий от мышей дикого типа, и некоторые из пролиферирующих клеток в центре белой пульпы не окрашивались CD45R, CD3 или CD138. Селезенки мышей дикого типа демонстрировали, в целом, нормальную морфологию с областями белой пульпы, состоящими из центральных Т-клеток (окрашивались антителом к CD3 при IHC), которые были окружены кольцом В-клеток (окрашивались антителом к CD45R при IHC), и окрашивание в отношении CD138 для плазматических клеток было минимальным (фиг. 3N, слева).
-/-
В шейных лимфатических узлах C9orf72 мыши демонстрировали островки лимфоидных тканей, рассеянные среди крупных агрегатов круглых клеток с одним ядром и большим количеством эозинофильной цитоплазмы (фиг. 3O). Эти клетки заменяли нормальную структуру, но оставались относительно нормальные области В-клеток и Т-клеток (явно видные в центре окрашенных в отношении CD3 и CD45R срезов). Аномальные клетки периодически окрашивались в отношении CD3, CD138 (стрелка на изображении внизу справа на фиг. 3O) и CD45R, но обычно были отрицательными по всем трем маркерам. Мыши дикого типа показывали нормальную морфологию лимфатических узлов (фиг. 3O, справа). Иммуноокрашивание в отношении CD45R (В-клетки) было выявлено в периферических зонах, окружающих Т-клетки (CD3), и клетки в мозговом веществе редко окрашивались в отношении CD138.
-/-
-/-
-/-
+
-/-
-/-
Гистопатологический анализ в отношении экспрессии F4/80 также выполняли на селезенке и шейных лимфатических узлах мышей дикого типа и C9orf72 мышей (фиг. 3Р). Срезы рассматривали при 4-кратном и 60-кратном увеличении. Данные демонстрировали положительное окрашивание в отношении F4/80 (макрофаги) у C9orf72 мышей, которое коррелирует с инфильтратом из крупных пенистых клеток, наблюдаемым при окрашивании Н&Е (описано выше). Окрашивание внеклеточного пространства в отношении F4/80 также наблюдалось в красной пульпе селезенки у C9orf72 мышей. Количество F4/80 клеток увеличивалось с возрастом с 8-58 недель у C9orf72 мышей, и оно было увеличено в лимфатических узлах у C9orf72 животных по сравнению с лимфатическими узлами у дикого типа.
+
-/-
+
+
+
+
int
-
+
+
+
-/-
+
+
+
+
-
-/-
+
+
+
-
hi
-/-
Общие посчитанные количества CD45 (общий лейкоцитарный антиген) клеток были повышены во всех оцениваемых тканях от C9orf72 мышей, что согласовалось с наблюдаемой инфильтрацией иммунных клеток. Тем не менее, процентное содержание CD45 в сравнении с общим количеством клеток в анализируемых популяциях либо было неизменным, либо снижалось по сравнению с диким типом (фиг. 3S). Панели специфических антител использовали для определения того, был ли изменен гомеостаз в субпопуляциях лейкоцитов. Процентное содержание нейтрофилов (CD45CD11bLy6GLy6CCD115) и общих моноцитов (CD45CD11bCD115) были переменно повышены в лимфатических узлах, селезенке и костном мозге C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3K и 3L). Повышение содержания F4/80 макрофагов (CD45CD11bF4/80Ly6G) также наблюдалось в селезенке, лимфатических узлах, почке и крови (фиг. 3М). Интересно то, что хотя больше клеток окрашивалось положительно в отношении F4/80 в тканях от C9orf72 мышей, общий сигнал был менее сильным, чем наблюдаемый у мышей дикого типа, что указывает на более распространенные, но менее концентрированный профиль IHC окрашивания для F4/80 (фиг. 3Р). Окрашивание в отношении Ly6G и Ly6C выявило повышенный процент воспалительных моноцитов (CD45CD11bCD115Ly6GLy6C) в селезенке, лимфатическом узле, почке и крови C9orf72 мышей,
-/-
+
+
+
+
-/-
+
+
+
-/-
+
+
Дополнительный анализ методом FACS выполняли на самках возрастом 30-35 недель, момент времени, представляющий особый интерес, поскольку у большинства нуль-мышей уже развилась патология почек, но они все еще остаются жизнеспособными. Как показано на фиг. 3Q, подсчеты общего количества клеток, выполненные на цельной ткани, демонстрируют значительное повышение подсчитанных абсолютных количеств клеток при анализе с помощью проточной цитометрии для различных классов клеток у C9orf72 мышей. Идентичность таких повышений определяли с помощью проточной цитометрии с использованием различных маркеров для миелоидных дендритных клеток, NK-клеток и Т-клеток (фиг. 3R-3AC). Содержание миелоидных дендритных клеток (CD45CD11bCD11cMHCII) было повышенным и в виде процентной доли, и в виде общего подсчитанного количества клеток у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом, тогда как доля NK-клеток (NKp46CD49b) была уменьшенной (фиг. 3R). Процент CD45 (общий лейкоцитарный антиген; окрашиваются все лейкоциты) клеток является сравнимым в тканях мышей дикого типа и C9orf72 мышей, тем не менее общие подсчитанные количества клеток являются значительно повышенными, что указывает на значительную инфильтрацию иммунных клеток (фиг. 3S). Окрашивание с использованием специфических в отношении Т-клеток маркеров CD4 (популяция Т-хелперных клеток) и CD8 (популяция цитотоксических Т-клеток) демонстрировало повышенное процентное содержание популяций Т-клеток (фиг. 3Т-3АС). Как показано с помощью IHC, определения молекулярного профиля и результаты СВС, снижения, наблюдаемые в популяциях лимфоцитов, могут отражать повышение доли миелоидных клеток.
+
+
+
+
-/-
-/-
+
+
+
-/-
-/-
+
-/-
+
+
-/-
-/-
Как показано выше, процентное содержание CD45CD8 и CD45CD4 клеток было, в целом, пониженным у C9orf72 мышей по сравнению с мышами дикого типа, что, вероятно, являлось следствием повышения доли миелоидных клеток, согласующегося с данными определения сигнатуры экспрессии генов. В отличие от этого, общие подсчитанные количества клеток для этих популяций Т-клеток были повышенными у C9orf72 мышей. Это отражало наблюдаемое явное разрастание лимфоидной ткани и выраженную инфильтрацию иммунных клеток. Популяции CDS8 и CD4 Т-клеток подвергали дальнейшему разделению на основании экспрессии дополнительных поверхностных маркеров активации (фиг. 3V-3AC). В случае CD8 Т-клеток значительно повышенный процент маркеров ранней активации и эффекторных Т-клеток памяти CD69 и CD44, соответственно, наблюдали у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3V и 3Х). Кроме того, повышенный процент Т-клеток, экспрессирующих PD-1, коингибирующий рецептор, экспрессия которого повышается на активированных клетках, и который играет важную роль в понижающей регуляции иммунной системы, наблюдали у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3Z). Шейные лимфатические узлы демонстрировали повышенную экспрессию CD44 и PD1, тогда как экспрессия CD69 была понижена (фиг. 3V-3AA). В случае CD4 Т-клеток значительные повышения процентов CD44 и PD1 в селезенке, лимфатических узлах, почке и крови наблюдали у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом, причем значения были сравнимы с диким типом в костном мозге (фиг. 3U, 3W, 3АА). Процент клеток, экспрессирующих CD69, был повышен в селезенке, шейных лимфатических узлах и почке с переменным уровнем значимости (фиг. 3Y). Одновременно с повышением процента активированных Т-клеток наблюдали повышенное процентное содержание CD4FoxP3регуляторных Т-клеток в селезенках и лимфатических узлах у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3АВ). Кроме того, селезеночный компартмент демонстрировал пониженную экспрессию CD62L и CD127 (фиг. 3АС), которые экспрессируются на наивных Т-клетках или центральных Т-клетках памяти, и и экспрессия которых снижается после того, как Т-клетки становятся активированными. Измерения с подсчетом клеток также демонстрировали значительные повышения у C9orf72 мышей с переменным уровнем значимости.
-/-
-/-
-/-
+/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Данные, полученные с использованием панелей цитокинов (фиг. 3AD, 3АЕ и 3AF) демонстрировали повышенные уровни цитокинов в сыворотке крови C9orf72 мышей возрастом 8-58 недель. В частности, в возрасте 18 недель уровни IL-17, IL-10, TNF-α и IL-12 (общий) были значительно повышенными в сыворотке крови самцов C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3AD). В случае тех же самых цитокинов значительно повышенные уровни наблюдали у C9orf72 мышей по сравнению с C9orf72 мышами. Эти данные указывают на системную активацию макрофагов у этих мышей. У всех анализируемых самцов мышей (возрастом 8-58 недель) C9orf72 мыши демонстрируют значительное снижение уровней IFN-γ, IL-10, IL-12 (общий), IL-17 и TNF-α в кровотоке по сравнению с мышами дикого типа. У самок C9orf72 мышей возрастом 8-38 недель наблюдали значительное повышение уровней IL-10, IL-12 (общий), IL-17, TNF-α и МСР-1 в кровотоке, а также тенденцию к повышению для IFN-γ по сравнению с мышами дикого типа. Содержание IL-12 (общего) было повышено примерно 6-кратно у C9orf72 мышей по сравнению с мышами дикого типа. Уровни IL-10, IL-17a и TNF-α также были повышенными, хотя и в меньшей степени. Наблюдали отсутствие изменений в уровнях IL-1β, IL-2 или IL-4, и хотя содержание IL-6 было повышено у некоторых C9orf72 мышей по сравнению с дикого типа, это различие не достигало статистической значимости. Уровни хемокина МСР-1 были значительно повышены у самок, но не у самцов C9orf72 мышей (фиг. 3АЕ и 3AF), и содержание IFN-γ было значительно повышено у самцов, при этом некоторые самки демонстрировали незначительное повышение (фиг. 3АЕ и 3AF). Таким образом, повышенные, в целом, уровни провоспалительных цитокинов наблюдают уже с 8 недель у C9orf72 мышей с переменным уровнем значимости по сравнению с мышами дикого типа.
-/-
-/-
+
-/-
Как показано на фиг. 3AG-3AK, у стареющих C9orf72 мышей проявлялась повышенная тяжесть гломерулонефрита. Этот результат подтверждали при окрашивании Н&Е и IHC в отношении F4/80 в печени и почке (фиг. 3AK). Например, повышенное окрашивание в отношении F4/80 при IHC, выполненное на печени C9orf72 животных в возрасте 8 недель, демонстрировало повышенную инфильтрацию макрофагов, в то время как сильную инфильтрацию клеток F4/80 макрофагов наблюдали в почках самок мышей возрастом 38 недель (фиг. 3AK). Повышенный уровень азота мочевины крови при химическом анализе сыворотки крови коррелировал с заболеванием почек у C9orf72 мышей, в то время как повышенное содержание глобулинов в сыворотке крови указывало на воспалительное состояние. Нормальный уровень азота мочевины крови у мышей находится в диапазоне 8-33 мг/дл, в то время как уровни глобулинов в норме находятся в диапазоне 1-4 г/дл (см., например, Zaias, J. et al., 2009, J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 48(4):387-390).
+
-/-
-/-
-/-
Дополнительный анализ почек выявил крупные F4/80 мононуклеарные клетки, которые имели характеристики дендритных клеток, присутствующие в больших количествах и ориентированные вокруг клубочков, у C9orf72 мышей возрастом 35-41 неделя (фиг. 3AK). Гломерулонефрит в степени от легкой до умеренной наблюдали в почках C9orf72 мышей возрастом 35-60 недель при окрашивании Н&Е (фиг. 3AK). У животных с более тяжелым поражением клубочки были увеличены, содержали увеличенное количество клеток и показывали пролиферацию мезангиальной ткани и инфильтрацию лейкоцитов. Проявление иммуно-обусловленного заболевания было разнообразным с наблюдаемым утолщением стенок капилляров и пролиферацией париетального эпителия в некоторых клубочках, тогда как в других проявлялось зарастание мезангия с бесклеточным эозинофильным гиалиновым материалом, что соответствовало гломерулосклерозу и разной степени перигломерулярного фиброза. Интересно, что эти области не были подтверждены как положительные в отношении отложения амилоида при окрашивании Конго красным. Изменения в канальцах включали в себя расширение канальцев в корковом и мозговом веществе почек и наличие белковых гиалиновых цилиндров и базофилию канальцев с дегенерацией/регенерацией. Такие изменения не наблюдались у мышей дикого типа. Набор результатов химических анализов сыворотки крови, выявляющих азот мочевины крови (например, фиг. 3AG) и пониженный сывороточный альбумин, соответствовал нарушенной клубочковой фильтрации, что коррелировало с данными гистологического анализа почек у C9orf72 мышей по сравнению с мышами дикого типа.
-/-
Для дополнительного измерения тяжести заболевания почек, наблюдаемого у нуль-мышей окрашенные Н&Е срезы почки оценивали в слепом формате в отношении мембранопролиферативного гломерулонефрита, интерстициального мононуклеарного воспаления, образования гиалиновых цилиндров, гломерулосклероза и базофильных канальцев; категорий заболевания почек, ассоциированного с иммунообусловленной гломерулонефропатией. Как показано на фиг. 9А, взвешенные графы для результатов гистопатологической оценки демонстрируют, что наиболее значительные изменения в почках, наблюдаемые у нуль-мышей, являются ассоциированными с мембранопролиферативным гломерулонефритом. Представлены отдельные гистопатологические оценки (фиг. 9В) для того, чтобы показать, что у всех нуль-мышей проявлялся мембранопролиферативный гломерулонефрит со степенью тяжести от минимальной до тяжелой, с периодическими проявлениями заболеваний из дополнительных категорий у животных с более тяжелым поражением. Оценка 0 = нет, 1 = минимальное, 2 = легкое, 3 = умеренное и 4 = тяжелое. Результаты измерений ACR в моче, выполняемых в моменты времени 14 недель (фиг. 9С, вверху) и 24 недели (фиг. 9С, внизу) из одной и той же когорты мышей, указывают на появление альбуминурии у C9orf72 мышей с возрастом. Гетерозиготные мыши показывали значения, сравнимые с WT, что согласуется с отсутствием наблюдаемого фенотипа.
-/-
-/-
Также C9orf72 мыши демонстрировали повышенные уровни общих IgG и IgM аутоантител при ELISA анализе по сравнению с мышами дикого типа, что указывает на аутоиммунное заболевание (фиг. 3AI) и соответствует повышенным уровням глобулинов в сыворотке крови, наблюдаемым при химическом анализе сыворотки крови (фиг. 3AG, верхняя секция). Кроме того, ELISA анализ сыворотки крови C9orf72 мышей указывали на значительно повышенные уровни антител к двухцепочечной ДНК (дцДНК), антинуклеарных антител (ANA), антител к антигену Смита (anti-Sm) и антител к кардиолипину в кровотоке по сравнению с мышами дикого типа. ANA представляют собой аутоантитела, которые связываются с содержимым ядра клетки. Антитела к дцДНК представляют собой тип ANA антител, которые специфично связываются с двухцепочечной ДНК, и антитела к кардиолипину направлены против фосфолипидных компонентов митохондриальной мембраны.
-/-
Кроме того, C9orf72 мыши демонстрировали значительное повышение содержания антител к ревматоидному фактору (RF) в кровотоке уже в возрасте 8 недель (фиг. 3АН). Повышенное содержание глобулинов и аутоантител в сыворотке крови может указывать на любое из различных болезненных состояний, например, нарушение в костном мозге, аутоиммунное заболевание, хроническое воспалительное состояние(состояния), заболевание печени, заболевание почек, инфекции и т.д. В качестве одного примера, системная красная волчанка (SLE) характеризуется высокими титрами аутоантител ко многим антигенам клеточной мембраны и внутриклеточным антигенам. Например, anti-Sm антитела, которые являются направленными против коровых областей малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP), являются специфическим маркером для SLE.
-/-
-/-
Повышенные титры аутоантител у пациентов с волчанкой положительно коррелируют с повышенной частотой циркулирующих фолликулярных Т-хелперных клеток (Tfh) (Xu, H. et al. Cell Immunol 295, 46-51 (2015)). Изучение этой конкретной клеточной популяции (CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+) в селезенке, шейных LN, брыжеечных LN и крови с помощью анализа методом FACS выявило значительно увеличенные популяции Tfh-клеток в C9orf72 тканях по сравнению с контролями (фиг. 10). Повышенное содержание Tfh-клеток также наблюдали в C9orf72 ВМ, которое не достигало значимого уровня (фиг. 10). В совокупности, эти наблюдения подтверждают мнение, что иммунная реакция, подобная таковой при SLE у человека, возникает при отсутствии экспрессии C9orf72.
-/-
+
-/-
-/-
+/-
-/-
-/-
Увеличения количества плазматических клеток и В-клеток, превращающихся в плазматические клетки/плазмобластов может быть ассоциировано с конкретными злокачественными новообразованиями, такими как множественная миелома и плазмацитома, а также с аутоиммунными состояниями. Селезенка и лимфатический узел у C9orf72 мышей были увеличенными, и инфильтрат иммунных клеток был явно заметен, тем не менее, инфильтрирующие клетки были отрицательными в отношении В-клеточных маркеров (CD45R) и представляли собой F4/80 с характеристиками пенистых макрофагов. Хотя популяция этих клеток была большой, они занимали региональные области этих тканей, считающиеся подходящими для данной линии, и не нарушали базовую структуру этих тканей. Кроме того, митотический индекс был низким, и наблюдались только редкие митозы. Следовательно, наличие злокачественного новообразования кажется маловероятным. Тем не менее, в этих тканях присутствовала популяция плазматических клеток и редкие клетки Мотта, как и свидетельства гломерулонефрита, которые указывали на аутоиммунную реакцию у C9orf72 мышей. Как показано выше, титры антител к RF, относящихся как к типу IgG, так и к IgM, были значительно повышены у C9orf72 мышей по сравнению с мышами дикого типа и C9orf72 (гетерозиготными) мышами (фиг. 3АН). Кроме того, общие уровни IgG и IgM в сыворотке крови были значительно повышенными у C9orf72 мышей, начиная с возраста 8 недель (фиг. 3AG и 3AI), что согласовалось с набором результатов химических анализов сыворотки крови, показывающих повышенное содержание глобулинов у C9orf72 мышей.
-/-
-/-
-/-
-/-
Было описано, что аутоантитела к базальной мембране клубочков или отложение растворимых иммунных комплексов в капиллярах клубочков, с последующей фиксацией комплемента и воспалением вызывают заболевание почек (иммунообусловленный гломерулонефрит). Для определения того, вносит ли наблюдаемое повышение уровней общего иммуноглобулина и аутоантител вклад в гломерулонефрит, IHC выполняли на срезах почки от C9orf72 мышей и мышей дикого типа возрастом 8-63 недель в отношении общего IgG и IgM (фиг. 3AL). Как описано в данном документе, C9orf72 мыши демонстрируют наглядное свидетельство гломерулонефрита как на уровне анализа сыворотки, так и на уровне гистологического анализа. В частности, почки от C9orf72 мышей демонстрировали повышенное иммуноокрашивание в отношении IgG по сравнению с мышами дикого типа во все оцениваемые моменты времени. Кроме того, в 8 недель почки C9orf72 животных показывали в IHC анализе сильный диффузный сигнал в сосудистой сети и эпителии канальцев в мозговом и корковом веществе. Коррелирующее с возникновением патологии гломерулонефрита заметное повышение окрашивания IgG и IgM в клубочках наблюдали к 38 неделям. Окрашивание в отношении как IgG, так и IgM часто было ассоциировано с париетальным слоем капсулы Боумена. Окрашивание в отношении IgG иногда наблюдалось в мочевом пространстве и/или в проксимальных почечных канальцах, что указывает на нарушенную функцию клубочковой фильтрации (т.е. утечка, которая превышает ресорбтивную способность). Сильное окрашивание в отношении IgG присутствовало в клетках эпителия канальцев у животных с тяжелым заболевания, что соответствовало реабсорбции большого количества IgG. Подобное, хотя и менее сильное окрашивание наблюдали менее часто в случае IgM. Окрашивание в склеротических клубочках было ослабленным по сравнению с диким типом, что соответствовало нарушенному кровотоку к этим частям (т.е. сосудистые петли были заменены матриксом или клетками мезангия). Тем не менее, клубочки, которые сохраняли открытые сосудистые петли проявляли тенденцию к повышенному содержанию IgG по сравнению с диким типом. Мелкодисперсные гранулярные отложения и/или линейное окрашивание IgG и IgM, ассоциированное с мембранами сосудов, часто наблюдали при большом увеличении, и это говорит об отложении иммунных комплексов.
-/-
Отложение фактора комплемента С3 часто является ассоциированным с отложениями иммуноглобулинов на базальных мембранах в почке. IHC анализ в отношении фактора комплемента С3 выявил повышенное окрашивание в пучках капилляров в клубочках у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом (фиг. 3AL). Гранулярное и линейное окрашивание было наиболее выраженным на мембранах висцерального слоя капсулы клубочка, заметно очерчивая петли капилляров и подоциты.
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+
Данные определения сигнатуры экспрессии генов при определении молекулярного профиля в селезенке и шейных лимфатических узлах (мыши дикого типа и C9orf72 мыши возрастом 8-10 и 35 недель) указывали на инфильтрацию клеточных популяций макрофагов, моноцитов и гранулоцитов. Также наблюдали сокращение количества Т- и В-клеток, которое может отражать повышение доли присутствующих миелоидных клеток. В глобальных иерархических анализах образцы головного мозга разделялись преимущественно по полу и возрасту, а не по генотипу, указывая на то, что различия в профиле экспрессии генов в этой ткани были обусловлены базовыми биологическими свойствами образцов и генотипа. Только C9orf72 экспрессия последовательно отличалась в ткани головного мозга у обоих возрастных групп и у обоих полов. В отличие от этого, образцы из селезенки и лимфатических узлов группировались на основании генотипа, причем возраст и пол были лишь вторичны, что указывает на различия в транскриптоме в этих органах были результатом изменений экспрессии C9orf72. Кроме того, более 100 локусов, ассоциированных с функцией иммунной системы, демонстрировали значительные отличия в экспрессии у C9orf72 мышей по сравнению с диким типом как для самцов, так и для самок в ранние и поздние моменты времени. Характерные сигнатуры экспрессии генов в селезенке и лимфатических узлах у C9orf72 мышей указывали на инфильтрацию миелоидных клеток с одновременным снижением доли лимфоцитов, что согласуется с данными СВС (см. выше), демонстрирующими сравнимые общие подсчитанные общие количества лейкоцитов у линий, которые обусловлены балансом между повышенным количеством миелоидных клеток и пониженным количеством лимфоцитов. При сравнении наборов характерных сигнатур экспрессии генов для разных условий получали наибольшее совпадение профилей с профилями, характерными для иммунной реакции, мышиных моделей различных воспалительных состояний и человеческих инфекционных заболеваний. Как показано в настоящем изобретении, данные иммунофенотипирования демонстрировали, что у мышей, имеющих нарушение в локусе C9orf72 (C9orf72), развивается спленомегалия и лимфаденопатия уже в возрасте 8 недель. В частности, данные СВС показывали повышение содержания моноцитов, нейтрофилов и эозинофилов в кровотоке у C9orf72 мышей, а также пониженное содержание лимфоцитов в крови, начиная с 8 недель. Кроме того, шейные лимфатические узлы прогрессивно увеличивались с возрастом у самцов (58 недель) и самок (37 недель) C9orf72 мышей. Настоящим изобретением также специально демонстрируется, что у C9orf72 мышей развивается гломерулонефрит (т.е. инфильтрация F4/80 макрофагов в почку) и аутоиммунное заболевание (т.е. значительно повышенные уровни аутоантител IgM и IgG) по мере взросления. Таким образом, настоящим изобретением специально описывается, что грызуны, имеющие нарушение в локусе C9orf72, которое описано в примере 1, демонстрируют выявляемые аномалии в периферических тканях и кровотоке уже в возрасте приблизительно 8 недель. В частности, удаление C9orf72 приводит к хронической системной иммунной реакции, приводящей в результате к повышенным уровням воспалительных цитокинов и разрастанию миелоидных клеток в нескольких компартментах.
Пример 4. Введение нейротоксинов животным, отличным от человека, с нарушением в локусе C9orf72
-/-
-/-
Этот эксперимент демонстрирует, что введение различных токсинов животным, отличным от человека, которые описаны в данном документе, может усугублять проявления наблюдаемого ALS-подобного фенотипа. В частности, настоящее изобретение специально демонстрирует, что введение различных токсинов C9orf72 мышам слегка усугубляет ALS-подобный двигательный фенотип и повышает окислительный стресс в мотонейронах, но не оказывает воздействие на повышенную неактивность и аномалии походки у этих мышей. Настоящее изобретение также демонстрирует, что мотонейроны C9orf72 мышей проявляют значительную митохондриальная дисфункция.
Вкратце, мышиные эмбриональные стволовые клетки культивируют и подвергают дифференцировке в мотонейроны в течение периода восьми суток. В первый день предварительно замороженные мышиные эмбриональные стволовые клетки размораживают и добавляют в 15 мл пробирку falcon с пятью мл среды для эмбриональных стволовых клеток (среда ES: DMEM с 15% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% глутамин, 1% заменимые аминокислоты, 1% нуклеозиды, 0,1% β-меркаптоэтанол, 1% пируват натрия и LIF в количестве 10000 единиц/мл). Пробирку затем центрифугируют в течение минут при 800 об./мин. Супернатант отсасывают и клетки суспендируют в 10 мл среды ES. Клетки затем высевают на матрас Т75, который покрыт 10 мл 0,1% желатина, и инкубируют в течение 30 минут при 37°С для облегчения прикрепления ко дну матраса. Клетки затем инкубируют в течение ночи. На следующий день среду заменяют свежей средой для поддержания жизнедеятельности.
На следующий день среду отсасывают из матраса. Матрас затем промывают 10 мл PBS, а затем добавляют 5 мл трипсина для отделения клеток от дна матраса. Клетки инкубируют в течение пяти минут при 37°С. Отделение подтверждают посредством проверки матраса под микроскопом. Среду для дифференцировки (10 мл среды DFNK: 44% улучшенной DMEM/F12, 44% нейробазальной среды, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% глутамина, 0,1% β-меркаптоэтанола, 10% заменителя сыворотки knock-out) добавляют в матрас для того, чтобы остановить реакцию с трипсином. Раствор из матраса собирают в пробирку falcon и центрифугируют в течение пяти минут при 800 об./мин. Супернатант отсасывают и клетки суспендируют в 12 мл среды DFNK. Клетки затем высевают в чашки для культивирования клеток и помещают в инкубатор на ночь при 37°С. На следующий день раствор с клетками переносят в пробирку falcon и центрифугируют в течение двух минут при 500 об./мин. Супернатант отсасывают и клетки суспендируют в 12 мл среды DFNK. Клетки затем высевают на новые чашки для культивирования клеток и помещают в инкубатор на ночь. На следующий день среду из чашки собирают и переносят в пробирку falcon. Пробирку затем центрифугируют в течение двух минут при 500 об./мин., а затем Супернатант отсасывают. Клетки суспендируют в 36 мл среды DFNK с ретиноевой кислотой в концентрации 1 мкМ и антагонистом белка smoothened в конечной концентрации 0,25 мкМ для дифференцировки в мотонейроны. Среду разделяют по 12 мл на чашку на три чашки.
Через трое суток эмбриоидные тельца (ЕВ), которые образуются, разделяют. Вначале ЕВ собирают и переносят в пробирку falcon. Клетки затем центрифугируют в течение двух минут при при 500 об./мин. и супернатант отсасывают. Клетки затем промывают 4 мл смеси PBS-глюкоза. После этого 4 мл трипсина добавляют к клеткам для химического разделения и инкубируют в течение пяти минут. Затем 1 мл лошадиной сыворотки добавляют для остановки реакции с трипсином. ЕВ дают осесть в течение пяти минут и супернатант отсасывают. Добавляют 2 мл смеси PBS-глюкоза-ДНКаза и клетки подвергают механическому разделению десять раз. Клеткам дают осесть в течение 5 минут и разделенные клетки переносят в отдельную пробирку. Добавляют 2 мл смеси PBS-глюкоза-ДНКаза к неразделившимся клеткам и механическое разделение повторяют. Клеткам дают осесть в течение пяти минут, а затем разделенные клетки переносят в отдельную пробирку. Разделенные клетки затем центрифугируют в течение пяти минут при 800 об./мин., а затем супернатант отсасывают. Разделенные клетки суспендируют в 5 мл среды для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в мотонейроны (среда ESMN: нейробазальная среда, 2% В27, 2% лошадиной сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,25% глутамина, 0,01% β-меркаптоэтанола, 10 нг/мл BDNF, 10нг/мл CNTF, 10 нг/мл GDNF). Клетки центрифугируют в течение минут при 800 об./мин. Супернатант отсасывают и клетки суспендируют в среде ESMN. Клетки затем подсчитывают с использованием автоматического счетчика клеток Countess (Life Technologies) и 0,5-1 миллион клеток высевают с 2 мл среды ESMN на лунку в каждую лунку шестилуночного планшета. Клетки остаются либо в ESMN (контроль), либо в ESMN с ВМАА в концентрациях 0,1-100 мкМ. Подсчитанные количества клеток получали с использованием 0,4% трипанового синего и при заданном значении среднего диаметра клеток >20 μм (мотонейроны). Иллюстративные результаты представлены на фиг. 4.
В другом эксперименте мышам дикого типа вводили еженедельно i.p. инъекции ВМАА (500 мг/кг) или PBS (контроль) в течение шести недель, начиная с недели 1 (фиг. 5А, сверху). Результаты измерений массы тела записывали каждую неделю до 6 недель, в неделю 14 и неделю 18. Результаты анализов двигательного нарушения с использованием теста способности удерживаться на вращающем барабане, теста локомоторных функций «открытое поле» и теста catwalk (которые описаны выше) записывали в момент начала эксперимента (недели 0, возраст 10 недель), каждую неделю до 6 недель, в неделю 14 и неделю 18. Иллюстративные результаты приведены на фиг. 5A-5D.
В случае мышей дикого типа данные демонстрировали, что ВМАА уничтожает культивируемые мотонейроны дикого типа дозозависимым с помощью пути, опосредуемого АМРА/каинатным рецептором. Кроме того, еженедельные инъекции (i.p.) BMAA не индуцировали ALS-подобный фенотип у мышей дикого типа (фиг. 5А-5D). Подобные результаты наблюдали при использовании 100 мг/кг BMAA.
-/-
-/-
В другом эксперименте старым (т.е. в возрасте 32 недели) мышам дикого типа и C9orf72 мышам вводили еженедельно i.p. инъекции BMAA (500 мг/кг) или PBS (контроль) в течение шести недель. Результаты измерений массы тела записывали каждую неделю до 38 недель, начиная с нулевого дня (т.е. 32 недели). Результаты анализов двигательного нарушения с использованием теста способности удерживаться на вращающем барабане, теста локомоторных функций «открытое поле» и теста catwalk (которые описаны выше) также записывали в момент начала эксперимента (недели 0, возраст 10 недель) и каждую неделю до 38 недель. В таблице 6 изложена методика оценки, связанная с двигательными нарушениями, тремором и ригидностью у животных во время тестирования. Иллюстративные результаты приведены на фиг. 6А-6Е. Данные демонстрировали, что введение BMAA C9orfF72 мышам слегка усугубляет ALS-подобный двигательный фенотип, но не оказывает воздействие на повышенную неактивность и аномалии походки у этих мышей.
-/-
-/-
В другом эксперименте мотонейроны от C9orfF72 мышей культивировали, как описано выше (см. также фиг. 7) и обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами, которые селективно целенаправленно воздействуют на смысловую цепь содержащих повтор РНК и сокращают очаги с РНК в смысловой ориентации, не воздействуя на общую экспрессию C9orf72. За обработкой следовало добавление 100 мМ BMAA. Выживание и окислительный стресс у культивируемых мотонейронах измеряли в дни 1 и 7. Вкратце, окислительный стресс у мотонейронов, полученных из выращиваемых эмбриональных стволовых клеток, (описаны выше) оценивали посредством измерения уровней активных форм кислорода (ROS) в клетках с использованием реактива для измерения окислительного стресса CellROX Oxidative Stress Green от Life Technologies в конечной концентрации 5 мкМ и при инкубировании в течение 30 минут при 37°С. После инкубирования клетки три раза промывали PBS и флуоресценцию измеряли с использованием стандартной флуориметрии на микропланшетах. Иллюстративные результаты представлены на фиг. 7. Данные демонстрировали, что воздействие на C9orfF72 мотонейроны BMAA вызывает повышенный окислительный стресс.
-/-
-/-
В другом эксперименте митохондриальную функцию определяли у мышей дикого типа и C9orf72 мышей. Вкратце, соотношение митохондриальной ДНК к ядерной у мотонейронов, полученных из выращиваемых эмбриональных стволовых клеток, (описаны выше) измеряли при выделении ДНК с использованием реактива DNAzol (Invitrogen). Чистоту и количество ДНК оценивали с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) и набора для определения соотношения митохондриальной ДНК к ядерной у мышей NovaQUANT mouse mitochondrial to nuclear ratio kit (Novagen) в соответствии с инструкциями производителя. Анализатор Seahorse Bioscience XFe96 использовали для оценки митохондриального дыхания у мотонейронов, полученных из выращиваемых эмбриональных стволовых клеток. Выраженная в процентах скорость потребления кислорода относительно первого измерения у мышей дикого типа записывали для 12 измерений с использованием анализатора XFe96 Extracellular Flux Analyzer. Среднее значение от трех измерений представляло базальное дыхание, следующие три после добавления олигомицина (1 мкМ) представляли протонную утечку, разница между базальным дыханием и протонной утечкой представляла выработку АТФ, следующие три измерения после добавления FCCP (1 мкМ) представляли максимальное дыхание, разница между максимальным и базальным дыханием представляла резервную респираторную емкость, и последние три измерения после добавления ротенона/антимицина А (0,5 мкМ) представляли немитохондриальное дыхание. Все данные собирали по меньшей мере в трех независимых экспериментах, и они приведены в виде среднего значения ± SEM. Т-тест Стьюдента осуществляли для статистического анализа, в котором сравнивали значения для мышей дикого типа и C9orf72 мышей, причем символ * указывает Р≤0,05, ** указывает Р≤0,01, и *** указывает Р≤0,001. Иллюстративные результаты представлены на фиг. 8.
+
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Предшествующие сообщение демонстрировали, что сокращение количества АТФ приводит в результате к внутриклеточному накоплению Na, приводящему к патологической гипертрофии клеток (Liang D. et al., 2007, Neurosurg. Focus 22(5):E2). Как показано на фиг. 8, использование мотонейронов, дифференцировавшихся из стволовых клеток мышей дикого типа и C9orf72 мышей (описано выше; см. также Wichterle H. et al., 2002, Cell 110(3):385-97), C9orf72 мышей, демонстрировало недостаточность в работе Na-K АТФазного насоса, обусловленную отсутствием АТФ и/или нарушением целостности клеточной мембраны. В отличие от этого, наблюдали отсутствие различий в выживании и окислительном стрессе у нейронов дикого типа или C9orf72 нейронов (фиг. 8, вверху). Интересно, что большая величина соотношения митохондриальной ДНК к ядерной наблюдалась в мотонейронах от C9orf72 мышей (фиг. 8, вверху справа), также как значительно более низкая скорость митохондриального дыхания (Р<0,0001) по сравнению с мотонейронами дикого типа (фиг. 8, внизу слева). Кроме того, все показатели из базального дыхания, выработки АТФ, максимального дыхания, протонной утечки и резервной респираторной емкости были существенно ниже у C9orf72 мотонейронов по сравнению с диким типом (фиг. 8, внизу справа). Таким образом, мотонейроны от C9orf72 мышей демонстрируют значительную митохондриальную дисфункцию, которая, вероятно, приводит к повреждению и гипертрофии клеток.
-/-
-/-
-/-
Данный пример специально демонстрирует, что у C9orf72 мышей проявляются ALS-подобные нарушения двигательной функции. Кроме того, настоящее изобретение акцентирует внимание на том, что несмотря на то что ВМАА вызывает гибель мотонейронов посредством пути АМРА/каинат-опосредованной эксайтотоксичности глутамата, воздействие ВМАА является недостаточным для индукции заболевания in vivo. Более того, воздействие ВМАА только незначительно ухудшает фенотип, соответствующий заболеванию ALS, у C9orf72 мышей. Таким образом, данные, представленные в данном документе, говорят о том, что по меньшей мере в некоторых вариантах осуществления, потеря белка C9orf72 у C9orf72 мышей не является основным механизмом заболевания ALS-FTD.
-/-
-/-
-/-
-/-
+
-/-
В совокупности, настоящим раскрытием специально демонстрируется, что у C9orf72 мышей, полученных в соответствии с примером 1, демонстрируется полное удаление локуса C9orf72. Кроме того, как описано в данном документе, у C9orf72 мышей в ходе развития проявляются несколько отличающихся фенотипов, характеризующихся, например, значительными нарушениями двигательной функции и нарушением иммунной системы и митохондриальной функции. Например, у C9orf72 мышей проявляется аутоиммунный фенотип, характеризующийся значительным повышением концентрации аутоантител в сыворотке крови и инфильтрацией различных иммунных клеток в селезенку, лимфатические узлы, костный мозг, почку и кровь. Интересно, что данные иммунофенотипирования, представленные в данном документе, иллюстрируют, что продукт гена C9orf72 играет критическую роль в гомеостазе иммунной системы и здоровье нейронов. В частности, спленомегалия и лимфаденопатия у C9orf72 мышей являются результатом инфильтрации ряда клеточных популяций, в том числе плазматических клеток, моноцитов, гранулоцитов и прежде всего F4/80 макрофагов в возрасте уже 8 недель и прогрессирующей к возрасту 60 недель. Использование панели цитокинов и данные определения молекулярного профиля явно говорят о повышенном пути активации Th1/макрофагов у C9orf72 мышей. Таким образом, настоящее раскрытие специально демонстрирует, что маловероятно то, что гаплонедостаточность является главной причиной патологии ALS-FTD в контексте C9orf72, и предполагает новую роль для C9orf72 в функционировании и гомеостазе иммунной системы в развернутом фенотипическом анализе животного, отличного от человека, с полным удалением C9orf72.
Эквиваленты
Таким образом, после изучения описания нескольких аспектов по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения специалисту в данной области техники будет понятно, что различные изменения, модификации и усовершенствования легко придут в голову специалисту в данной области техники. Предполагается, что такие изменения, модификации и усовершенствования составляют часть настоящего раскрытия, и предполагается, что они находятся в пределах идеи и объема настоящего изобретения. Соответственно, вышеизложенное описание и описание чертежей представлены исключительно в качестве примера, и настоящее изобретение подробно описывается пунктами формулы изобретения, которая представлена ниже.
Применение порядковых терминов, таких как «первый», «второй», «третий» и т.д., в пунктах формулы изобретения для модификации элемента пункта формулы изобретения само по себе не означает какого-либо приоритета, превосходства или порядка расположения одного элемента пункта формулы изобретения относительно другого или временного порядка, в котором осуществляются действия в способе, а применяются только как метки для того, чтобы отличать один элемент пункта формулы изобретения, имеющий определенное название, от другого элемента, имеющего такое же название (но с использованием порядкового термина), отличая таким образом элементы пункта формулы изобретения.
Формы единственного числа в описании и в пунктах формулы изобретения, если явно не указано противоположное, следует понимать как включающие в себя соответствующие формы множественного числа. Пункты формулы изобретения или части описания, которые включают в себя «или» между одним или несколькими членами группы, считаются удовлетворяющими требования, если один, более чем один или все члены группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу, если не указано противоположное, или если иное не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает в себя варианты осуществления, в которых именно один член группы присутствует, используется или иным образом относится к данному продукту или процессу. Настоящее изобретение также включает в себя варианты осуществления, в которых более чем один или все члены группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу. Более того, следует понимать, что настоящим изобретением охватываются все варианты, комбинации и перестановки, при которых одно или несколько ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.д. из одного или нескольких из представленных пунктов формулы изобретения введены в другой пункт формулы изобретения, зависимый от того же основного пункта (или, если уместно, в любого другого пункта формулы изобретения), если не указано иное, или если квалифицированному специалисту в данной области техники будет очевидно, что будет возникать противоречие или несоответствие. В случае, когда элементы представлены в виде перечней (например, в виде групп Маркуша или в подобном формате), следует понимать, что каждая подгруппа элементов также является раскрытой, и любой элемент(элементы) можно удалить из группы. Следует понимать, что обычно в случаях, когда настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения описываются как содержащие конкретные элементы, признаки и т.д., определенные варианты осуществления настоящего изобретения или аспекты настоящего изобретения состоят из или состоят, по существу, из таких элементов, признаков и т.д. С целью обеспечения простоты такие варианты осуществления не были специально изложены полностью в каждом случае в данном документе. Также следует понимать, что любой вариант осуществления или аспект настоящего изобретения может быть в явной форме исключен из пунктов формулы изобретения вне зависимости от того, является ли конкретное исключение описанным в описании.
Специалистам в данной области техники будут понятны типичные стандартные отклонения или погрешности, связанные со значениями, полученными в анализах или других процессах, описанных в данном документе.
Публикации, адреса веб-сайтов и другие справочные материалы, упоминаемые в данном документе для описания предшествующего уровня техники настоящего изобретения и для обеспечения дополнительных деталей, касающихся его практического осуществления, включены таким образом в данный документ посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК.
<120>  ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, С НАРУШЕНИЕМ В ЛОКУСЕ C9ORF72
<130>  32698 (10152-US01)
<150>  62/168,171
<151>  2015-05-29
<150>  62/232,658
<151>  2015-09-25
<150>  62/245,382
<151>  2015-10-23
<160>  9
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  3198
<212>  DNA
<213>  Mus musculus
<400>  1
gtgtccgggg cggggcggtc ccggggcggg gcccggagcg ggctgcggtt gcggtccctg       60
cgccggcggt gaaggcgcag cagcggcgag tggctattgc aagcgttcgg ataatgtgag      120
acctggaatg cagtgagacc tgggatgcag ggatgtcgac tatctgcccc ccaccatctc      180
ctgctgttgc caagacagag attgctttaa gtggtgaatc acccttgttg gcggctacct      240
ttgcttactg ggataatatt cttggtccta gagtaaggca tatttgggct ccaaagacag      300
accaagtgct tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag      360
aaattcttcg aaatgcagag agtggggcta tagatgtaaa attttttgtc ttatctgaaa      420
aaggggtaat tattgtttca ttaatcttcg acggaaactg gaatggagat cggagcactt      480
atggactatc aattatactg ccgcagacag agctgagctt ctacctccca cttcacagag      540
tgtgtgttga caggctaaca cacattattc gaaaaggaag aatatggatg cataaggaaa      600
gacaagaaaa tgtccagaaa attgtcttgg aaggcacaga gaggatggaa gatcagggtc      660
agagtatcat tcccatgctt actggggaag tcattcctgt aatggagctg cttgcatcta      720
tgaaatccca cagtgttcct gaagacattg atatagctga tacagtgctc aatgatgatg      780
acattggtga cagctgtcac gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacctgcaga      840
cctgtggctg ttccgttgta gttggcagca gtgcagagaa agtaaataag atagtaagaa      900
cgctgtgcct ttttctgaca ccagcagaga ggaaatgctc caggctgtgt gaagcagaat      960
cgtcctttaa gtacgaatcg ggactctttg tgcaaggctt gctaaaggat gcaacaggca     1020
gttttgtcct acccttccgg caagttatgt atgccccgta ccccaccacg cacattgatg     1080
tggatgtcaa cactgtcaag cagatgccac cgtgtcatga acatatttat aatcaacgca     1140
gatacatgag gtcagagctg acagccttct ggagggcaac ttcagaagag gacatggcgc     1200
aggacaccat catctacaca gatgagagct tcactcctga tttgaatatt ttccaagatg     1260
tcttacacag agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtcttccat ttgaagcctg     1320
gcctgtctct caggagtact ttccttgcac agttcctcct cattcttcac agaaaagcct     1380
tgacactaat caagtacatc gaggatgata cgcagaaggg gaaaaagccc tttaagtctc     1440
ttcggaacct gaagatagat cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg     1500
ctctagctga gaaaattaag ccaggcctac actctttcat ctttgggaga cctttctaca     1560
ctagtgtaca agaacgtgat gttctaatga ccttttgacc gtgtggtttg ctgtgtctgt     1620
ctcttcacag tcacacctgc tgttacagtg tctcagcagt gtgtgggcac atccttcctc     1680
ccgagtcctg ctgcaggaca gggtacacta cacttgtcag tagaagtctg tacctgatgt     1740
caggtgcatc gttacagtga atgactcttc ctagaataga tgtactcttt tagggcctta     1800
tgtttacaat tatcctaagt actattgctg tcttttaaag atatgaatga tggaatatac     1860
acttgaccat aactgctgat tggttttttg ttttgttttg tttgttttct tggaaactta     1920
tgattcctgg tttacatgta ccacactgaa accctcgtta gctttacaga taaagtgtga     1980
gttgacttcc tgcccctctg tgttctgtgg tatgtccgat tacttctgcc acagctaaac     2040
attagagcat ttaaagtttg cagttcctca gaaaggaact tagtctgact acagattagt     2100
tcttgagaga agacactgat agggcagagc tgtaggtgaa atcagttgtt agcccttcct     2160
ttatagacgt agtccttcag attcggtctg tacagaaatg ccgaggggtc atgcatgggc     2220
cctgagtatc gtgacctgtg acaagttttt tgttggttta ttgtagttct gtcaaagaaa     2280
gtggcatttg tttttataat tgttgccaac ttttaaggtt aattttcatt atttttgagc     2340
cgaattaaaa tgcgcacctc ctgtgccttt cccaatcttg gaaaatataa tttcttggca     2400
gagggtcaga tttcagggcc cagtcacttt catctgacca ccctttgcac ggctgccgtg     2460
tgcctggctt agattagaag tccttgttaa gtatgtcaga gtacattcgc tgataagatc     2520
tttgaagagc agggaagcgt cttgcctctt tcctttggtt tctgcctgta ctctggtgtt     2580
tcccgtgtca cctgcatcat aggaacagca gagaaatctg acccagtgct atttttctag     2640
gtgctactat ggcaaactca agtggtctgt ttctgttcct gtaacgttcg actatctcgc     2700
tagctgtgaa gtactgatta gtggagttct gtgcaacagc agtgtaggag tatacacaaa     2760
cacaaatatg tgtttctatt taaaactgtg gacttagcat aaaaagggag aatatattta     2820
ttttttacaa aagggataaa aatgggcccc gttcctcacc caccagattt agcgagaaaa     2880
agctttctat tctgaaaggt cacggtggct ttggcattac aaatcagaac aacacacact     2940
gaccatgatg gcttgtgaac taactgcaag gcactccgtc atggtaagcg agtaggtccc     3000
acctcctagt gtgccgctca ttgctttaca cagtagaatc ttatttgagt gctaattgtt     3060
gtctttgctg ctttactgtg ttgttataga aaatgtaagc tgtacagtga ataagttatt     3120
gaagcatgtg taaacactgt tatatatctt ttctcctaga tggggaattt tgaataaaat     3180
acctttgaaa ttctgtgt                                                   3198
<210>  2
<211>  481
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  2
Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu
1               5                   10                  15
Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr
20                  25                  30
Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys
35                  40                  45
Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn
50                  55                  60
His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile
65                  70                  75                  80
Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser
85                  90                  95
Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu
100                 105                 110
Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His
115                 120                 125
Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile
130                 135                 140
Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val Leu Glu
145                 150                 155                 160
Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu
165                 170                 175
Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met Lys Ser
180                 185                 190
His Ser Val Pro Glu Asp Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp
195                 200                 205
Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile
210                 215                 220
Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr
245                 250                 255
Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe
260                 265                 270
Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ala Thr
275                 280                 285
Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro
290                 295                 300
Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro
305                 310                 315                 320
Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu
325                 330                 335
Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr
340                 345                 350
Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln
355                 360                 365
Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val
370                 375                 380
Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln
385                 390                 395                 400
Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile
405                 410                 415
Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn
420                 425                 430
Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile
435                 440                 445
Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe
450                 455                 460
Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr
465                 470                 475                 480
Phe
<210>  3
<211>  3435
<212>  DNA
<213>  Rattus norvegicus
<400>  3
cgtttgtagt gtcagccatc ccaattgcct gttccttctc tgtgggagtg gtgtctagac       60
agtccaggca gggtatgcta ggcaggtgcg ttttggttgc ctcagatcgc aacttgactc      120
cataacggtg accaaagaca aaagaaggaa accagattaa aaagaaccgg acacagaccc      180
ctgcagaatc tggagcggcc gtggttgggg gcggggctac gacggggcgg actcgggggc      240
gtgggagggc ggggccgggg cggggcccgg agccggctgc ggttgcggtc cctgcgccgg      300
cggtgaaggc gcagcggcgg cgagtggcta ttgcaagcgt ttggataatg tgagacctgg      360
gatgcaggga tgtcgactat ctgcccccca ccatctcctg ctgttgccaa gacagagatt      420
gctttaagtg gtgaatcacc cttgttggcg gctacctttg cttactggga taatattctt      480
ggtcctagag taaggcacat ttgggctcca aagacagacc aagtactcct cagtgatgga      540
gaaatcactt ttcttgccaa ccacactctg aatggagaaa ttcttcggaa tgcggagagt      600
ggggcaatag atgtaaagtt ttttgtctta tctgaaaagg gcgtcattat tgtttcatta      660
atcttcgacg ggaactggaa cggagatcgg agcacttacg gactatcaat tatactgccg      720
cagacggagc tgagtttcta cctcccactg cacagagtgt gtgttgacag gctaacgcac      780
atcattcgaa aaggaaggat atggatgcac aaggaaagac aagaaaatgt ccagaaaatt      840
gtcttggaag gcaccgagag gatggaagat cagggtcaga gtatcatccc tatgcttact      900
ggggaggtca tccctgtgat ggagctgctt gcgtctatga gatcacacag tgttcctgaa      960
gacctcgata tagctgatac agtactcaat gatgatgaca ttggtgacag ctgtcatgaa     1020
ggctttcttc tcaatgccat cagctcacat ctgcagacct gcggctgttc tgtggtggta     1080
ggcagcagtg cagagaaagt aaataagata gtaagaacac tgtgcctttt tctgacacca     1140
gcagagagga agtgctccag gctgtgtgaa gccgaatcgt cctttaaata cgaatctgga     1200
ctctttgtac aaggcttgct aaaggatgcg actggcagtt ttgtactacc tttccggcaa     1260
gttatgtatg ccccttatcc caccacacac atcgatgtgg atgtcaacac tgtcaagcag     1320
atgccaccgt gtcatgaaca tatttataat caacgcagat acatgaggtc agagctgaca     1380
gccttctgga gggcaacttc agaagaggac atggctcagg acaccatcat ctacacagat     1440
gagagcttca ctcctgattt gaatattttc caagatgtct tacacagaga cactctagtg     1500
aaagcctttc tggatcaggt cttccatttg aagcctggcc tgtctctcag gagtactttc     1560
cttgcacagt tcctcctcat tcttcacaga aaagccttga cactaatcaa gtacatagag     1620
gatgacacgc agaaggggaa aaagcccttt aagtctcttc ggaacctgaa gatagatctt     1680
gatttaacag cagagggcga ccttaacata ataatggctc tagctgagaa aattaagcca     1740
ggcctacact ctttcatctt cgggagacct ttctacacta gtgtccaaga acgtgatgtt     1800
ctaatgactt tttaaacatg tggtttgctc cgtgtgtctc atgacagtca cacttgctgt     1860
tacagtgtct cagcgctttg gacacatcct tcctccaggg tcctgccgca ggacacgtta     1920
cactacactt gtcagtagag gtctgtacca gatgtcaggt acatcgttgt agtgaatgtc     1980
tcttttccta gactagatgt accctcgtag ggacttatgt ttacaaccct cctaagtact     2040
agtgctgtct tgtaaggata cgaatgaagg gatgtaaact tcaccacaac tgctggttgg     2100
ttttgttgtt tttgtttttt gaaacttata attcatggtt tacatgcatc acactgaaac     2160
cctagttagc tttttacagg taagctgtga gttgactgcc tgtccctgtg ttctctggcc     2220
tgtacgatct gtggcgtgta ggatcacttt tgcaacaact aaaaactaaa gcactttgtt     2280
tgcagttcta cagaaagcaa cttagtctgt ctgcagattc gtttttgaaa gaagacatga     2340
gaaagcggag ttttaggtga agtcagttgt tggatcttcc tttatagact tagtccttta     2400
gatgtggtct gtatagacat gcccaaccat catgcatggg cactgaatat cgtgaactgt     2460
ggtatgcttt ttgttggttt attgtacttc tgtcaaagaa agtggcattg gtttttataa     2520
ttgttgccaa gttttaaggt taattttcat tatttttgag ccaaattaaa atgtgcacct     2580
cctgtgcctt tcccaatctt ggaaaatata atttcttggc agaaggtcag atttcagggc     2640
ccagtcactt tcgtctgact tccctttgca cagtccgcca tgggcctggc ttagaagttc     2700
ttgtaaacta tgccagagag tacattcgct gataaaatct tctttgcaga gcaggagagc     2760
ttcttgcctc tttcctttca tttctgcctg gactttggtg ttctccacgt tccctgcatc     2820
ctaaggacag caggagaact ctgaccccag tgctatttct ctaggtgcta ttgtggcaaa     2880
ctcaagcggt ccgtctctgt ccctgtaacg ttcgtacctt gctggctgtg aagtactgac     2940
tggtaaagct ccgtgctaca gcagtgtagg gtatacacaa acacaagtaa gtgttttatt     3000
taaaactgtg gacttagcat aaaaagggag actatattta ttttttacaa aagggataaa     3060
aatggaaccc tttcctcacc caccagattt agtcagaaaa aaacattcta ttctgaaagg     3120
tcacagtggt tttgacatga cacatcagaa caacgcacac tgtccatgat ggcttatgaa     3180
ctccaagtca ctccatcatg gtaaatgggt agatccctcc ttctagtgtg ccacaccatt     3240
gcttcccaca gtagaatctt atttaagtgc taagtgttgt ctctgctggt ttactctgtt     3300
gttttagaga atgtaagttg tatagtgaat aagttattga agcatgtgta aacactgtta     3360
tacatctttt ctcctagatg gggaatttgg aataaaatac ctttaaaatt caaaaaaaaa     3420
aaaaaaaaaa aaaaa                                                      3435
<210>  4
<211>  481
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  4
Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu
1               5                   10                  15
Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr
20                  25                  30
Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys
35                  40                  45
Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn
50                  55                  60
His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile
65                  70                  75                  80
Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser
85                  90                  95
Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu
100                 105                 110
Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His
115                 120                 125
Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile
130                 135                 140
Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val Leu Glu
145                 150                 155                 160
Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu
165                 170                 175
Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met Arg Ser
180                 185                 190
His Ser Val Pro Glu Asp Leu Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp
195                 200                 205
Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile
210                 215                 220
Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser
225                 230                 235                 240
Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr
245                 250                 255
Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe
260                 265                 270
Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ala Thr
275                 280                 285
Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro
290                 295                 300
Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro
305                 310                 315                 320
Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu
325                 330                 335
Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr
340                 345                 350
Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln
355                 360                 365
Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val
370                 375                 380
Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln
385                 390                 395                 400
Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile
405                 410                 415
Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn
420                 425                 430
Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile
435                 440                 445
Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe
450                 455                 460
Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr
465                 470                 475                 480
Phe
<210>  5
<211>  680
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic polynucleotide-prot promoter
<400>  5
ccagtagcag cacccacgtc caccttctgt ctagtaatgt ccaacacctc cctcagtcca       60
aacactgctc tgcatccatg tggctcccat ttatacctga agcacttgat ggggcctcaa      120
tgttttacta gagcccaccc ccctgcaact ctgagaccct ctggatttgt ctgtcagtgc      180
ctcactgggg cgttggataa tttcttaaaa ggtcaagttc cctcagcagc attctctgag      240
cagtctgaag atgtgtgctt ttcacagttc aaatccatgt ggctgtttca cccacctgcc      300
tggccttggg ttatctatca ggacctagcc tagaagcagg tgtgtggcac ttaacaccta      360
agctgagtga ctaactgaac actcaagtgg atgccatctt tgtcacttct tgactgtgac      420
acaagcaact cctgatgcca aagccctgcc cacccctctc atgcccatat ttggacatgg      480
tacaggtcct cactggccat ggtctgtgag gtcctggtcc tctttgactt cataattcct      540
aggggccact agtatctata agaggaagag ggtgctggct cccaggccac agcccacaaa      600
attccacctg ctcacaggtt ggctggctcg acccaggtgg tgtcccctgc tctgagccag      660
ctcccggcca agccagcacc                                                  680
<210>  6
<211>  1052
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic polynucleotide-Blimp1 promoter 1kb
<400>  6
tgccatcatc acaggatgtc cttccttctc cagaagacag actggggctg aaggaaaagc       60
cggccaggct cagaacgagc cccactaatt actgcctcca acagctttcc actcactgcc      120
cccagcccaa catccccttt ttaactggga agcattccta ctctccattg tacgcacacg      180
ctcggaagcc tggctgtggg tttgggcatg agaggcaggg acaacaaaac cagtatatat      240
gattataact ttttcctgtt tccctatttc caaatggtcg aaaggaggaa gttaggtcta      300
cctaagctga atgtattcag ttagcaggag aaatgaaatc ctatacgttt aatactagag      360
gagaaccgcc ttagaatatt tatttcattg gcaatgactc caggactaca cagcgaaatt      420
gtattgcatg tgctgccaaa atactttagc tctttccttc gaagtacgtc ggatcctgta      480
attgagacac cgagtttagg tgactagggt tttcttttga ggaggagtcc cccaccccgc      540
cccgctctgc cgcgacagga agctagcgat ccggaggact tagaatacaa tcgtagtgtg      600
ggtaaacatg gagggcaagc gcctgcaaag ggaagtaaga agattcccag tccttgttga      660
aatccatttg caaacagagg aagctgccgc gggtcgcagt cggtgggggg aagccctgaa      720
ccccacgctg cacggctggg ctggccaggt gcggccacgc ccccatcgcg gcggctggta      780
ggagtgaatc agaccgtcag tattggtaaa gaagtctgcg gcagggcagg gagggggaag      840
agtagtcagt cgctcgctca ctcgctcgct cgcacagaca ctgctgcagt gacactcggc      900
cctccagtgt cgcggagacg caagagcagc gcgcagcacc tgtccgcccg gagcgagccc      960
ggcccgcggc cgtagaaaag gagggaccgc cgaggtgcgc gtcagtactg ctcagcccgg     1020
cagggacgcg ggaggatgtg gactgggtgg ac                                   1052
<210>  7
<211>  2008
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic polynucleotide-Blimp1 promoter 2kb
<400>  7
gtggtgctga ctcagcatcg gttaataaac cctctgcagg aggctggatt tcttttgttt       60
aattatcact tggacctttc tgagaactct taagaattgt tcattcgggt ttttttgttt      120
tgttttggtt tggttttttt gggttttttt tttttttttt tttttggttt ttggagacag      180
ggtttctctg tatatagccc tggcacaaga gcaagctaac agcctgtttc ttcttggtgc      240
tagcgccccc tctggcagaa aatgaaataa caggtggacc tacaaccccc cccccccccc      300
ccagtgtatt ctactcttgt ccccggtata aatttgattg ttccgaacta cataaattgt      360
agaaggattt tttagatgca catatcattt tctgtgatac cttccacaca cccctccccc      420
ccaaaaaaat ttttctggga aagtttcttg aaaggaaaac agaagaacaa gcctgtcttt      480
atgattgagt tgggcttttg ttttgctgtg tttcatttct tcctgtaaac aaatactcaa      540
atgtccactt cattgtatga ctaagttggt atcattaggt tgggtctggg tgtgtgaatg      600
tgggtgtgga tctggatgtg ggtgggtgtg tatgccccgt gtgtttagaa tactagaaaa      660
gataccacat cgtaaacttt tgggagagat gatttttaaa aatgggggtg ggggtgaggg      720
gaacctgcga tgaggcaagc aagataaggg gaagacttga gtttctgtga tctaaaaagt      780
cgctgtgatg ggatgctggc tataaatggg cccttagcag cattgtttct gtgaattgga      840
ggatccctgc tgaaggcaaa agaccattga aggaagtacc gcatctggtt tgttttgtaa      900
tgagaagcag gaatgcaagg tccacgctct taataataaa caaacaggac attgtatgcc      960
atcatcacag gatgtccttc cttctccaga agacagactg gggctgaagg aaaagccggc     1020
caggctcaga acgagcccca ctaattactg cctccaacag ctttccactc actgccccca     1080
gcccaacatc ccctttttaa ctgggaagca ttcctactct ccattgtacg cacacgctcg     1140
gaagcctggc tgtgggtttg ggcatgagag gcagggacaa caaaaccagt atatatgatt     1200
ataacttttt cctgtttccc tatttccaaa tggtcgaaag gaggaagtta ggtctaccta     1260
agctgaatgt attcagttag caggagaaat gaaatcctat acgtttaata ctagaggaga     1320
accgccttag aatatttatt tcattggcaa tgactccagg actacacagc gaaattgtat     1380
tgcatgtgct gccaaaatac tttagctctt tccttcgaag tacgtcggat cctgtaattg     1440
agacaccgag tttaggtgac tagggttttc ttttgaggag gagtccccca ccccgccccg     1500
ctctgccgcg acaggaagct agcgatccgg aggacttaga atacaatcgt agtgtgggta     1560
aacatggagg gcaagcgcct gcaaagggaa gtaagaagat tcccagtcct tgttgaaatc     1620
catttgcaaa cagaggaagc tgccgcgggt cgcagtcggt ggggggaagc cctgaacccc     1680
acgctgcacg gctgggctgg ccaggtgcgg ccacgccccc atcgcggcgg ctggtaggag     1740
tgaatcagac cgtcagtatt ggtaaagaag tctgcggcag ggcagggagg gggaagagta     1800
gtcagtcgct cgctcactcg ctcgctcgca cagacactgc tgcagtgaca ctcggccctc     1860
cagtgtcgcg gagacgcaag agcagcgcgc agcacctgtc cgcccggagc gagcccggcc     1920
cgcggccgta gaaaaggagg gaccgccgag gtgcgcgtca gtactgctca gcccggcagg     1980
gacgcgggag gatgtggact gggtggac                                        2008
<210>  8
<211>  8388
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Polynucleotide sequence of a modified C9ORF72 locus from lacZ
through the 3' loxP site
<400>  8
ggtaccgatt taaatgatcc agtggtcctg cagaggagag attgggagaa tcccggtgtg       60
acacagctga acagactagc cgcccaccct ccctttgctt cttggagaaa cagtgaggaa      120
gctaggacag acagaccaag ccagcaactc agatctttga acggggagtg gagatttgcc      180
tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc      240
gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc      300
aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt      360
tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt      420
atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac      480
ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa      540
aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat      600
atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa      660
atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag      720
gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg      780
cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag      840
cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg      900
agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg      960
ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg     1020
ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct     1080
ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag     1140
aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg     1200
tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg     1260
ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg     1320
cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa     1380
tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc     1440
cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg     1500
atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa     1560
aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg     1620
atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt     1680
ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac     1740
ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc     1800
tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa     1860
caccagcagc agtttttcca gttccgttta tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa     1920
tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag     1980
ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa     2040
ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg     2100
caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt     2160
ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc     2220
accagcgaaa tggatttttg catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag     2280
tcaggctttc tttcacagat gtggattggc gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc     2340
gatcagttca cccgtgcacc gctggataac gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt     2400
gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg     2460
ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg     2520
tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt     2580
ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg     2640
attggcctga actgccagct ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg     2700
ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca     2760
ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg     2820
cgcgaattga attatggccc acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc     2880
tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc     2940
acatggctga atatcgacgg tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg     3000
tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt     3060
caaaaataat aataaccggg caggggggat ctaagctcta gataagtaat gatcataatc     3120
agccatatca catctgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg     3180
aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat     3240
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat     3300
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat cccccggcta     3360
gagtttaaac actagaacta gtggatcccc gggctcgata actataacgg tcctaaggta     3420
gcgactcgag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgcat ggcctccgcg     3480
ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga     3540
cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg     3600
ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt     3660
gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc     3720
ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa     3780
ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt     3840
gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct ggccggggct     3900
ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt     3960
agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cagcaaaatg     4020
gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga ggtcgttgaa     4080
acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt cgctaatgcg     4140
ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct gacgtgaagt     4200
ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt tatggcggtg     4260
ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc gtgacgtcac     4320
ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg cggtaggctt     4380
ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat cgacaggcgc     4440
cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg gttttatgta     4500
cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg ttggcgagtg     4560
tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca atatgtaatt     4620
ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct tttttgttag     4680
acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag     4740
gaactaaacc atgggatcgg ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc     4800
ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc     4860
cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc     4920
cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg     4980
cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt     5040
gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc     5100
catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga     5160
ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga     5220
tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct     5280
caaggcgcgc atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc     5340
gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt     5400
ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg     5460
cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat     5520
cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat ccgctgtaag tctgcagaaa     5580
ttgatgatct attaaacaat aaagatgtcc actaaaatgg aagtttttcc tgtcatactt     5640
tgttaagaag ggtgagaaca gagtacctac attttgaatg gaaggattgg agctacgggg     5700
gtgggggtgg ggtgggatta gataaatgcc tgctctttac tgaaggctct ttactattgc     5760
tttatgataa tgtttcatag ttggatatca taatttaaac aagcaaaacc aaattaaggg     5820
ccagctcatt cctcccactc atgatctata gatctataga tctctcgtgg gatcattgtt     5880
tttctcttga ttcccacttt gtggttctaa gtactgtggt ttccaaatgt gtcagtttca     5940
tagcctgaag aacgagatca gcagcctctg ttccacatac acttcattct cagtattgtt     6000
ttgccaagtt ctaattccat cagacctcga cctgcagccc ctagtcgagc gccagtagca     6060
gcacccacgt ccaccttctg tctagtaatg tccaacacct ccctcagtcc aaacactgct     6120
ctgcatccat gtggctccca tttatacctg aagcacttga tggggcctca atgttttact     6180
agagcccacc cccctgcaac tctgagaccc tctggatttg tctgtcagtg cctcactggg     6240
gcgttggata atttcttaaa aggtcaagtt ccctcagcag cattctctga gcagtctgaa     6300
gatgtgtgct tttcacagtt caaatccatg tggctgtttc acccacctgc ctggccttgg     6360
gttatctatc aggacctagc ctagaagcag gtgtgtggca cttaacacct aagctgagtg     6420
actaactgaa cactcaagtg gatgccatct ttgtcacttc ttgactgtga cacaagcaac     6480
tcctgatgcc aaagccctgc ccacccctct catgcccata tttggacatg gtacaggtcc     6540
tcactggcca tggtctgtga ggtcctggtc ctctttgact tcataattcc taggggccac     6600
tagtatctat aagaggaaga gggtgctggc tcccaggcca cagcccacaa aattccacct     6660
gctcacaggt tggctggctc gacccaggtg gtgtcccctg ctctgagcca gctcccggcc     6720
aagccagcac catgggaacc cccaagaaga agaggaaggt gcgtaccgat ttaaattcca     6780
atttactgac cgtacaccaa aatttgcctg cattaccggt cgatgcaacg agtgatgagg     6840
ttcgcaagaa cctgatggac atgttcaggg atcgccaggc gttttctgag catacctgga     6900
aaatgcttct gtccgtttgc cggtcgtggg cggcatggtg caagttgaat aaccggaaat     6960
ggtttcccgc agaacctgaa gatgttcgcg attatcttct atatcttcag gcgcgcggtc     7020
tggcagtaaa aactatccag caacatttgg gccagctaaa catgcttcat cgtcggtccg     7080
ggctgccacg accaagtgac agcaatgctg tttcactggt tatgcggcgg atccgaaaag     7140
aaaacgttga tgccggtgaa cgtgcaaaac aggctctagc gttcgaacgc actgatttcg     7200
accaggttcg ttcactcatg gaaaatagcg atcgctgcca ggatatacgt aatctggcat     7260
ttctggggat tgcttataac accctgttac gtatagccga aattgccagg atcagggtta     7320
aagatatctc acgtactgac ggtgggagaa tgttaatcca tattggcaga acgaaaacgc     7380
tggttagcac cgcaggtgta gagaaggcac ttagcctggg ggtaactaaa ctggtcgagc     7440
gatggatttc cgtctctggt gtagctgatg atccgaataa ctacctgttt tgccgggtca     7500
gaaaaaatgg tgttgccgcg ccatctgcca ccagccagct atcaactcgc gccctggaag     7560
ggatttttga agcaactcat cgattgattt acggcgctaa ggtaaatata aaatttttaa     7620
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttaggat gactctggtc     7680
agagatacct ggcctggtct ggacacagtg cccgtgtcgg agccgcgcga gatatggccc     7740
gcgctggagt ttcaataccg gagatcatgc aagctggtgg ctggaccaat gtaaatattg     7800
tcatgaacta tatccgtaac ctggatagtg aaacaggggc aatggtgcgc ctgctggaag     7860
atggcgattg atctagataa gtaatgatca taatcagcca tatcacatct gtagaggttt     7920
tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa     7980
ttgttgttgt taaacctgcc ctagttgcgg ccaattccag ctgagcgtga gctcaccatt     8040
accagttggt ctggtgtcaa aaataataat aaccgggcag gggggatcta agctctagat     8100
aagtaatgat cataatcagc catatcacat ctgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc     8160
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt     8220
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag     8280
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg     8340
tctggatcct cgacataact tcgtataatg tatgctatac gaagttat                  8388
<210>  9
<211>  17210
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Polynucleotide sequence of a modified C9ORF72 locus from Exon 1a
through 3' UTR
<400>  9
cgtttgtagt gacagccatc ccaattgccc tttccttcta ggtggaaagt ggtgtctaga       60
cagtccaggg agggtgtgcg agggaggtgc gttttggttg cctcagctcg caacttaact      120
ccacaacggt gaccaaggac aaaagaagga aacaagactg cagagatccg caccggggag      180
ccctgcagat tctgggtctg ctgtggactg ggggcgggac tgcgactggg cgggcctggg      240
ggcgtgtccg gggcggggcg gtcccggggc ggggcccgga gcgggctgcg gttgcggtcc      300
ctgcgccggc ggtgaaggcg cagcagcggc gagtgggtga gtgagacgcg cgggcggagg      360
ggggctgctg ccacggtcgg ctcgcgggcc ggccggctcc gggtaccagc ggggtttttt      420
tctccttcga ggtgaactcc tccctgtccc ccgggcgaaa gagcccttgg ccttgcagga      480
gttgcggggg ccgcggcggt gcggagggga tggggatggg cctcatcttt gctgtccgcc      540
cgcgctcccc gatcccgacc cggagcgtct cccgggccct tgagggaacc ctccgggagt      600
acggcgagcg cggcccccac cgccacaagc ctgggcccca ggggcctggc ccggcgacag      660
ctggtgggtc ctgcgaccca gtcaggtctc ccgagggtcc ccgcccggga ggagaaagcg      720
ccggtgggat ggagtaagga cggacagaac aacacgcagg caggatttcg cagaagtttg      780
caaggagtgc ggatgcccac ttacatgggc tgctactctt accaggttgt tccccagttc      840
tgtgggacgt gacctggttg cctcacagct ccgcggttgt acagacttat taaaggaagt      900
gaccattgtg acttgggcat cacttgactg atggtaatca gttgcagaga gagaagtgca      960
ctgattaagt ctgtccacac agggtctgtc tggccaggag tgcatttgcc tgggagggat     1020
tggttgcgct ttctggtgtg gggactatta ggctcttgta gagttttgtc ccggcagatg     1080
gataaatttc ttgttacact gttcccgttc gtcaccagtt gagaaaaacg ggtacacagt     1140
ctgtctcagt agtactttta ctttatatta agggcccaaa agggactgga aaatacttta     1200
agatagaatc gttagtccac ttggaaaact taaaatatga gagagagagg ggggggggag     1260
agagagagag agagagagag agaaaggaag gaagaaggag gaagaggagg aggaaagaga     1320
ttgagattat gttaataata tggaatcaga atatttgaaa tatagtaagc gtcccctcag     1380
ttaaagagga cattccagga ggcccccagt atagcctgaa atctcaggaa acgcctacat     1440
acacccatcg tgtggatata ggtgttttcc cttcattaca tttcatacac agatgttaaa     1500
gtttagaaag taggcacaat aagagattac aaataactga taataaagtc gagccattgc     1560
agctgctctg taaaagtcct gtgaatgtga tcgctttgtg tttcaaagta acttactgta     1620
cttcacccct gttaagcaaa acaagattca cctgaacgca ggcaccttgg taccttggca     1680
gacaccagat ctgataacca agaggatgga gaagtagtgg cagacagtgt ggagagcatg     1740
aatatgctag acaaaagggt gaatcataac ctaggagcag aaagcaggta tttcatcatc     1800
ctccacagta aaaacctatg tcacgtaaaa aacctacaag tagtttttct tttactcttt     1860
ttgaatgaaa gcttgctaca ggcactgaaa gttaaaataa tctgtggatc aggaggaaca     1920
ggggttttct gtctgagtca ctgctgacta gcacctcagt gaccattggc actgtgggaa     1980
accccagagt cagttggaaa cttcgaaact aaaggtgacg gtgttcttat ttcatagaac     2040
acaaaaaata agaggggtta cagcctgcgc tgcagactgg acattcaaca agcatttaaa     2100
tttctgggag acaaatgtaa atataacttt aaaagttggt aaaatactct gtttggctat     2160
gttggccatc caatgtttgc ttttagaaaa tgactgaatg gataaaacgt ctatcttttg     2220
agcctgccct agacccccat gttgagtgaa tactgtccaa gtgttaggtt agccggcctg     2280
agaaacttgg atctaggcaa gatggcacag tcctggtgtc atgagtatgc atgtgagttt     2340
tggctgaaat tgaacatttg tagagaatga caaaggctgg tctggcaagt agtccactgt     2400
ctttacagtg gtcttggtta gttcctgttt ggctgagagg gctggttgat ggctgtcctg     2460
cccctcttcc cacaagtgga agccttatgg tataattctt gatcacagta gcagtaggca     2520
aatgaacttc ctcaaagcag cctggaaagc tgattttttt ttctttcttt ctcttttttt     2580
tttttttttc acaaggttaa agaaaaaaca aagggcttca aatgtgccag tctgctaaca     2640
gtgttaacat gtttattaac ataaataaac tttattagtt tttggaagta ttggttaagc     2700
cctcgtgacc cctgaactcg gtttatagag tgatgagtcg tagcctcact ctggtttgga     2760
ctctggcttc tctcagaaga ctctgtggct aatgttaacc ttctgaagta gccagaaaac     2820
atataagcaa aagtctgtga ggttgaaatg aattttttgg ccacatttgt atatgggttc     2880
ccaccaatgc taacttcagg tgttagtaat atcagactca cagcttccct gattacactt     2940
cgctataaga ctttattttt taggtcatag gaatttcccc tttttcatga ttcctaaatc     3000
atgaaataac atagtctaaa aatacggtat tcctgaaata aacaatttct aagttttaag     3060
ctgcgtgcta ttctgaacag tctgatgccc tcttgtagct tttactgtgt cctaccccgg     3120
gcatggttga ttcctttgtc caaacatctg tctgttgtat ccacactgga ttgcaccacc     3180
tgcgtgctag tcagtcactc agacatttta gttataaggt agcttatatt tactccttat     3240
tttatttaat aatggcctca tagcaaggcg gtaatgatac tggtaatttg ggtttgctta     3300
agaggagcca tgaagtagtt ttaaatgaaa aggtgaaaat tcccactata gtttggaggg     3360
ggaggctata ctggtactac tacgattcac ggtaagacta aatcttctgt gaaattatga     3420
aggagaaaaa gttacactgg tctggtcttg ctgttggatt aattttatag ttataaccac     3480
tgtacatgat aaataaccct aaaacaatga atttgtaggt ggatggcata atctgaaaac     3540
catgttctga gcagttgatg gcagcaggct gtgctggaag tgttaggcat atttatagat     3600
ttcagcccaa gttctgaaga ggctggagag atggctcagt ggttaagagt gcttgctatt     3660
gcagaggacc taggttcctc tacaggcacc aggcaagcgt gggacacact gagatacata     3720
cagacaaaac ataaaattaa ataaattgtg cataataata ctagtaatat atgagtaaaa     3780
taaggataaa tacacatcat aattaaataa ataaattgta aagttcccta gaagtgaggg     3840
tcaccaagcc attcacaaga tggctgcgct gatgcaggga tatatgtgaa ctagaaaaag     3900
gtcaaactta acagagaagt tccaaggcat gctactgcag gcttggctag catgcttgac     3960
ctgcagaaat gctgacggcc actgggaggt tttcacaaat gaggaattag aagaactttt     4020
tttactaatc tccagaaaaa aaaaagggaa gaagaaactg aagcagcctg tgatgtggac     4080
cagaaacgca gtgacagtaa catgtgtgac attgcaaagg catgaaagga cagagctgtg     4140
gaatacagac ctcaggtgga gctcagcata gagtcattcg gggattatgc ctgctgcagc     4200
aacaaaagga tgagctcaaa agagacaccg acttctgaat gcagtgggtg tttgttttgt     4260
tttgtttcaa atgaattggg cagaaaactt tccagctgtg gaagcttctg aaccgtccct     4320
tgctgctgac atctaagcgt ccgctgtgtc ccagctcagt gatctagggt cttccaaaca     4380
gatggtccgg tgctgagcac tttgaatctc aatcctgagt ttctaccacg cctttggcca     4440
tttaattccc agataaaaga cacatacaac ctttatattt ataataaacc ttagtcagca     4500
caagagctga gcaaatatct gtcctctatg ctattatatc tattacccag ccaataaccc     4560
cattctataa tttgctgtgc ttcatctggg ctgctcttaa cttcagtcag ccagcccacg     4620
tggccattat tttaagattt ttttacccca tagtgtcttc tcactttact ttacattttt     4680
ctctctctcc tcatggttct cctctgaccc caagcctagg aaccctaaac cccacccatg     4740
tctcttctgc ccatctattg gctgtaggca tctttattca ccaatcagga taacttggag     4800
gcaaggttaa gtagtctcct gggtctaggt gctgtctctg ggagcaacca gtatttagca     4860
tagcaaaaga ccagacctcc acaatgatca ctctgaccat cggggcagaa ggcacctact     4920
agcctgtgcc actcacctca ctttgttgaa tcacatctta tcctgtagtg tgtatcactg     4980
cctgttatca caggaaaaag tgagtcccat caaataagat gtttcagaaa gagaccatgt     5040
tcatataatt atcattctgg taagctttta atggttatat tttgttatta atctctttgt     5100
tcctattttg caaattatac cttacagtaa atatatatgc atccaatggg gtctttgaat     5160
tcctccccgg ggagtaggag gactctttga ggatgggctg catttaaagc taaacaacgc     5220
aacatgacct ttagtcctta tagatagcct agagatgaga ctaaataaaa gaaatggtat     5280
ataatgcttt aagtttccca atcagcttaa aagcttttcc tataaatctt taagattatg     5340
ctctggggct caatactgct tcaagaaggg cttttctttt gtatttagaa ttattcacct     5400
ttttaaacaa aaggagaaaa tggaatagaa atatgtttgc aacataattt tatgactatg     5460
tgtttatttc gcgtgttctg tgggcctgca gtttgctgct gttaatgagg acaacagtgg     5520
caccaataca gtttccactc agattacatt ctctgttccc tttctgaaag ctgccctctc     5580
cactgggccc aaaagagtca gtatcttaaa caagctgtac aacttagata accatggtct     5640
cttcagacta gttaattgac atatattaaa aagtaaatag taccaaagtg aatttctgaa     5700
attaaaaatg aacatttaaa aactctaggt aaactattcc ttagagttaa gtgttttgcc     5760
aagttctgta atcataatat gatagaaacg ctcactcagc attctaaata tagaagttac     5820
tccttcgcat gacactctaa ttcttgataa ggtggagaaa gagagagaga gagggggaga     5880
gacagaaaat atggtggttc aaggaccatt tgagggaatt agttatgttc ttccgtcctc     5940
tgtggatctt aggggttgaa tacagtcatt gagctcggtg gatggctgtc ctgttgaaag     6000
gtctgcccag cagagcaaat agactttttt atttacatgg acatccgttt gtgactaatc     6060
taatgttcac tcccaaagta atcacacaga cagagaggta gcttccttca gtactcttac     6120
cttacatgaa tcctaccatt ttgttatttt ttttccactt taaatctttg attatgtgtt     6180
tttaattaga aaatttgcat acaaatttcc atacagtatg tagaattgac tgtgtttgaa     6240
tgggtgaaga tccacatgtg taaccctagc tctggactgg ctctgagctt gtttgctctt     6300
ctcttttgtg ttctgagtaa ctgaaactct ttcattttag cagcttagta tgcgcccttc     6360
acattgctgt gctgcctgct gcactaacat tactcctttg cttatgttcc ccttcctgat     6420
tcagtgtcat tttaagcagt agtactggac ctcagtacct tagccggagc tcactgaggt     6480
gacagggctg aggctctgct gctgtctttt gagcttacct ctttttaatg ttttatggta     6540
tttctgctgc caggtttggg ggttttgttt tgttttgttt tttgtttttt gtttttttta     6600
attttctagg aacacctaga aaacacaaac taggaaactt aaaagagcag cgtcttgttc     6660
cctgcgttct agaaagtcca agcctaatgc cagtgtcatg gttgtcagga acatgagcct     6720
ctgaaggctt cttgggaaac ctttcttgtc tcaacacctc tggtggcaag cagtagtcca     6780
tggtactctc tctgtccacg gtcagcatcc cagtccctgc cctttatctt tgtgcagccg     6840
accagctttg ctttagtctg tctccttctc aggtctcctt ccccgctcct cttaagcaca     6900
gcagtcattg gattagagcc catccttccc tcggatggcc catttgacct aattttacgt     6960
atttgtaact aaggtcccat ttacttacac agggccctcc ccttcctgtt ttgttcttta     7020
gctgaaatgg tttggagacc aaatatccaa tcattacaat tgtgcacaag ctatgttcat     7080
ttggaggtaa taaaggctca ttctttgctt ctattggtat gtgacatttt tctaagtcac     7140
ttggggtttg atagatatct ttaaatggct gaacctgatc actgttcttt tgtatgtccc     7200
tgtttagcta ttgcaagcgt tcggataatg tgagacctgg aatgcagtga gacctgggat     7260
gcagggatgg gtaccgattt aaatgatcca gtggtcctgc agaggagaga ttgggagaat     7320
cccggtgtga cacagctgaa cagactagcc gcccaccctc cctttgcttc ttggagaaac     7380
agtgaggaag ctaggacaga cagaccaagc cagcaactca gatctttgaa cggggagtgg     7440
agatttgcct ggtttccggc accagaagcg gtgccggaaa gctggctgga gtgcgatctt     7500
cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca aactggcaga tgcacggtta cgatgcgccc     7560
atctacacca acgtgaccta tcccattacg gtcaatccgc cgtttgttcc cacggagaat     7620
ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa gctggctaca ggaaggccag     7680
acgcgaatta tttttgatgg cgttaactcg gcgtttcatc tgtggtgcaa cgggcgctgg     7740
gtcggttacg gccaggacag tcgtttgccg tctgaatttg acctgagcgc atttttacgc     7800
gccggagaaa accgcctcgc ggtgatggtg ctgcgctgga gtgacggcag ttatctggaa     7860
gatcaggata tgtggcggat gagcggcatt ttccgtgacg tctcgttgct gcataaaccg     7920
actacacaaa tcagcgattt ccatgttgcc actcgcttta atgatgattt cagccgcgct     7980
gtactggagg ctgaagttca gatgtgcggc gagttgcgtg actacctacg ggtaacagtt     8040
tctttatggc agggtgaaac gcaggtcgcc agcggcaccg cgcctttcgg cggtgaaatt     8100
atcgatgagc gtggtggtta tgccgatcgc gtcacactac gtctgaacgt cgaaaacccg     8160
aaactgtgga gcgccgaaat cccgaatctc tatcgtgcgg tggttgaact gcacaccgcc     8220
gacggcacgc tgattgaagc agaagcctgc gatgtcggtt tccgcgaggt gcggattgaa     8280
aatggtctgc tgctgctgaa cggcaagccg ttgctgattc gaggcgttaa ccgtcacgag     8340
catcatcctc tgcatggtca ggtcatggat gagcagacga tggtgcagga tatcctgctg     8400
atgaagcaga acaactttaa cgccgtgcgc tgttcgcatt atccgaacca tccgctgtgg     8460
tacacgctgt gcgaccgcta cggcctgtat gtggtggatg aagccaatat tgaaacccac     8520
ggcatggtgc caatgaatcg tctgaccgat gatccgcgct ggctaccggc gatgagcgaa     8580
cgcgtaacgc gaatggtgca gcgcgatcgt aatcacccga gtgtgatcat ctggtcgctg     8640
gggaatgaat caggccacgg cgctaatcac gacgcgctgt atcgctggat caaatctgtc     8700
gatccttccc gcccggtgca gtatgaaggc ggcggagccg acaccacggc caccgatatt     8760
atttgcccga tgtacgcgcg cgtggatgaa gaccagccct tcccggctgt gccgaaatgg     8820
tccatcaaaa aatggctttc gctacctgga gagacgcgcc cgctgatcct ttgcgaatac     8880
gcccacgcga tgggtaacag tcttggcggt ttcgctaaat actggcaggc gtttcgtcag     8940
tatccccgtt tacagggcgg cttcgtctgg gactgggtgg atcagtcgct gattaaatat     9000
gatgaaaacg gcaacccgtg gtcggcttac ggcggtgatt ttggcgatac gccgaacgat     9060
cgccagttct gtatgaacgg tctggtcttt gccgaccgca cgccgcatcc agcgctgacg     9120
gaagcaaaac accagcagca gtttttccag ttccgtttat ccgggcaaac catcgaagtg     9180
accagcgaat acctgttccg tcatagcgat aacgagctcc tgcactggat ggtggcgctg     9240
gatggtaagc cgctggcaag cggtgaagtg cctctggatg tcgctccaca aggtaaacag     9300
ttgattgaac tgcctgaact accgcagccg gagagcgccg ggcaactctg gctcacagta     9360
cgcgtagtgc aaccgaacgc gaccgcatgg tcagaagccg ggcacatcag cgcctggcag     9420
cagtggcgtc tggcggaaaa cctcagtgtg acgctccccg ccgcgtccca cgccatcccg     9480
catctgacca ccagcgaaat ggatttttgc atcgagctgg gtaataagcg ttggcaattt     9540
aaccgccagt caggctttct ttcacagatg tggattggcg ataaaaaaca actgctgacg     9600
ccgctgcgcg atcagttcac ccgtgcaccg ctggataacg acattggcgt aagtgaagcg     9660
acccgcattg accctaacgc ctgggtcgaa cgctggaagg cggcgggcca ttaccaggcc     9720
gaagcagcgt tgttgcagtg cacggcagat acacttgctg atgcggtgct gattacgacc     9780
gctcacgcgt ggcagcatca ggggaaaacc ttatttatca gccggaaaac ctaccggatt     9840
gatggtagtg gtcaaatggc gattaccgtt gatgttgaag tggcgagcga tacaccgcat     9900
ccggcgcgga ttggcctgaa ctgccagctg gcgcaggtag cagagcgggt aaactggctc     9960
ggattagggc cgcaagaaaa ctatcccgac cgccttactg ccgcctgttt tgaccgctgg    10020
gatctgccat tgtcagacat gtataccccg tacgtcttcc cgagcgaaaa cggtctgcgc    10080
tgcgggacgc gcgaattgaa ttatggccca caccagtggc gcggcgactt ccagttcaac    10140
atcagccgct acagtcaaca gcaactgatg gaaaccagcc atcgccatct gctgcacgcg    10200
gaagaaggca catggctgaa tatcgacggt ttccatatgg ggattggtgg cgacgactcc    10260
tggagcccgt cagtatcggc ggaattccag ctgagcgccg gtcgctacca ttaccagttg    10320
gtctggtgtc aaaaataata ataaccgggc aggggggatc taagctctag ataagtaatg    10380
atcataatca gccatatcac atctgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac    10440
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca    10500
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt    10560
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc    10620
ccccggctag agtttaaaca ctagaactag tggatccccg ggctcgataa ctataacggt    10680
cctaaggtag cgactcgaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatatgcatg    10740
gcctccgcgc cgggttttgg cgcctcccgc gggcgccccc ctcctcacgg cgagcgctgc    10800
cacgtcagac gaagggcgca gcgagcgtcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc    10860
ggcccgctgc tcataagact cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg    10920
acgggacttg ggtgactcta gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga    10980
aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg    11040
attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc    11100
gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg    11160
gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc    11220
aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc    11280
agcaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga atggaagacg cttgtgaggc gggctgtgag    11340
gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc    11400
gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga gatgggctgg ggcaccatct ggggaccctg    11460
acgtgaagtt tgtcactgac tggagaactc ggtttgtcgt ctgttgcggg ggcggcagtt    11520
atggcggtgc cgttgggcag tgcacccgta cctttgggag cgcgcgccct cgtcgtgtcg    11580
tgacgtcacc cgttctgttg gcttataatg cagggtgggg ccacctgccg gtaggtgtgc    11640
ggtaggcttt tctccgtcgc aggacgcagg gttcgggcct agggtaggct ctcctgaatc    11700
gacaggcgcc ggacctctgg tgaggggagg gataagtgag gcgtcagttt ctttggtcgg    11760
ttttatgtac ctatcttctt aagtagctga agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt    11820
tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa    11880
tatgtaattt tcagtgttag actagtaaat tgtccgctaa attctggccg tttttggctt    11940
ttttgttaga cgtgttgaca attaatcatc ggcatagtat atcggcatag tataatacga    12000
caaggtgagg aactaaacca tgggatcggc cattgaacaa gatggattgc acgcaggttc    12060
tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg    12120
ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac    12180
cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc    12240
cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg    12300
gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga    12360
gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg    12420
cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg    12480
tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt    12540
cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgatgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc    12600
ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg    12660
gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga    12720
gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc    12780
gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaggggatc cgctgtaagt    12840
ctgcagaaat tgatgatcta ttaaacaata aagatgtcca ctaaaatgga agtttttcct    12900
gtcatacttt gttaagaagg gtgagaacag agtacctaca ttttgaatgg aaggattgga    12960
gctacggggg tgggggtggg gtgggattag ataaatgcct gctctttact gaaggctctt    13020
tactattgct ttatgataat gtttcatagt tggatatcat aatttaaaca agcaaaacca    13080
aattaagggc cagctcattc ctcccactca tgatctatag atctatagat ctctcgtggg    13140
atcattgttt ttctcttgat tcccactttg tggttctaag tactgtggtt tccaaatgtg    13200
tcagtttcat agcctgaaga acgagatcag cagcctctgt tccacataca cttcattctc    13260
agtattgttt tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagcccc tagtcgagcg    13320
ccagtagcag cacccacgtc caccttctgt ctagtaatgt ccaacacctc cctcagtcca    13380
aacactgctc tgcatccatg tggctcccat ttatacctga agcacttgat ggggcctcaa    13440
tgttttacta gagcccaccc ccctgcaact ctgagaccct ctggatttgt ctgtcagtgc    13500
ctcactgggg cgttggataa tttcttaaaa ggtcaagttc cctcagcagc attctctgag    13560
cagtctgaag atgtgtgctt ttcacagttc aaatccatgt ggctgtttca cccacctgcc    13620
tggccttggg ttatctatca ggacctagcc tagaagcagg tgtgtggcac ttaacaccta    13680
agctgagtga ctaactgaac actcaagtgg atgccatctt tgtcacttct tgactgtgac    13740
acaagcaact cctgatgcca aagccctgcc cacccctctc atgcccatat ttggacatgg    13800
tacaggtcct cactggccat ggtctgtgag gtcctggtcc tctttgactt cataattcct    13860
aggggccact agtatctata agaggaagag ggtgctggct cccaggccac agcccacaaa    13920
attccacctg ctcacaggtt ggctggctcg acccaggtgg tgtcccctgc tctgagccag    13980
ctcccggcca agccagcacc atgggaaccc ccaagaagaa gaggaaggtg cgtaccgatt    14040
taaattccaa tttactgacc gtacaccaaa atttgcctgc attaccggtc gatgcaacga    14100
gtgatgaggt tcgcaagaac ctgatggaca tgttcaggga tcgccaggcg ttttctgagc    14160
atacctggaa aatgcttctg tccgtttgcc ggtcgtgggc ggcatggtgc aagttgaata    14220
accggaaatg gtttcccgca gaacctgaag atgttcgcga ttatcttcta tatcttcagg    14280
cgcgcggtct ggcagtaaaa actatccagc aacatttggg ccagctaaac atgcttcatc    14340
gtcggtccgg gctgccacga ccaagtgaca gcaatgctgt ttcactggtt atgcggcgga    14400
tccgaaaaga aaacgttgat gccggtgaac gtgcaaaaca ggctctagcg ttcgaacgca    14460
ctgatttcga ccaggttcgt tcactcatgg aaaatagcga tcgctgccag gatatacgta    14520
atctggcatt tctggggatt gcttataaca ccctgttacg tatagccgaa attgccagga    14580
tcagggttaa agatatctca cgtactgacg gtgggagaat gttaatccat attggcagaa    14640
cgaaaacgct ggttagcacc gcaggtgtag agaaggcact tagcctgggg gtaactaaac    14700
tggtcgagcg atggatttcc gtctctggtg tagctgatga tccgaataac tacctgtttt    14760
gccgggtcag aaaaaatggt gttgccgcgc catctgccac cagccagcta tcaactcgcg    14820
ccctggaagg gatttttgaa gcaactcatc gattgattta cggcgctaag gtaaatataa    14880
aatttttaag tgtataatgt gttaaactac tgattctaat tgtttgtgta ttttaggatg    14940
actctggtca gagatacctg gcctggtctg gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag    15000
atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg agatcatgca agctggtggc tggaccaatg    15060
taaatattgt catgaactat atccgtaacc tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc    15120
tgctggaaga tggcgattga tctagataag taatgatcat aatcagccat atcacatctg    15180
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa    15240
tgaatgcaat tgttgttgtt aaacctgccc tagttgcggc caattccagc tgagcgtgag    15300
ctcaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa aataataata accgggcagg ggggatctaa    15360
gctctagata agtaatgatc ataatcagcc atatcacatc tgtagaggtt ttacttgctt    15420
taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg    15480
ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca    15540
caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat    15600
cttatcatgt ctggatcctc gacataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattgc    15660
tagcgtgtct cagcagtgtg tgggcacatc cttcctcccg agtcctgctg caggacaggg    15720
tacactacac ttgtcagtag aagtctgtac ctgatgtcag gtgcatcgtt acagtgaatg    15780
actcttccta gaatagatgt actcttttag ggccttatgt ttacaattat cctaagtact    15840
attgctgtct tttaaagata tgaatgatgg aatatacact tgaccataac tgctgattgg    15900
ttttttgttt tgttttgttt gttttcttgg aaacttatga ttcctggttt acatgtacca    15960
cactgaaacc ctcgttagct ttacagataa agtgtgagtt gacttcctgc ccctctgtgt    16020
tctgtggtat gtccgattac ttctgccaca gctaaacatt agagcattta aagtttgcag    16080
ttcctcagaa aggaacttag tctgactaca gattagttct tgagagaaga cactgatagg    16140
gcagagctgt aggtgaaatc agttgttagc ccttccttta tagacgtagt ccttcagatt    16200
cggtctgtac agaaatgccg aggggtcatg catgggccct gagtatcgtg acctgtgaca    16260
agttttttgt tggtttattg tagttctgtc aaagaaagtg gcatttgttt ttataattgt    16320
tgccaacttt taaggttaat tttcattatt tttgagccga attaaaatgc gcacctcctg    16380
tgcctttccc aatcttggaa aatataattt cttggcagag ggtcagattt cagggcccag    16440
tcactttcat ctgaccaccc tttgcacggc tgccgtgtgc ctggcttaga ttagaagtcc    16500
ttgttaagta tgtcagagta cattcgctga taagatcttt gaagagcagg gaagcgtctt    16560
gcctctttcc tttggtttct gcctgtactc tggtgtttcc cgtgtcacct gcatcatagg    16620
aacagcagag aaatctgacc cagtgctatt tttctaggtg ctactatggc aaactcaagt    16680
ggtctgtttc tgttcctgta acgttcgact atctcgctag ctgtgaagta ctgattagtg    16740
gagttctgtg caacagcagt gtaggagtat acacaaacac aaatatgtgt ttctatttaa    16800
aactgtggac ttagcataaa aagggagaat atatttattt tttacaaaag ggataaaaat    16860
gggccccgtt cctcacccac cagatttagc gagaaaaagc tttctattct gaaaggtcac    16920
ggtggctttg gcattacaaa tcagaacaac acacactgac catgatggct tgtgaactaa    16980
ctgcaaggca ctccgtcatg gtaagcgagt aggtcccacc tcctagtgtg ccgctcattg    17040
ctttacacag tagaatctta tttgagtgct aattgttgtc tttgctgctt tactgtgttg    17100
ttatagaaaa tgtaagctgt acagtgaata agttattgaa gcatgtgtaa acactgttat    17160
atatcttttc tcctagatgg ggaattttga ataaaatacc tttgaaattc               17210
<---