СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК
METHOD AND DEVICE FOR BLOOD PURIFICATION FROM FREE-CIRCULATING DNA

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ.
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/559222, поданной 18 сентября 2017 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[002] Изобретение раскрывает устройства для афереза и их применение для удаления практически всех типов внеклеточной ДНК (вкДНК) из крови пациентов, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая двухцепочечную ДНК (дцДНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК) и олигонуклеотиды), для ограничения негативного влияния циркулирующей вкДНК и лечения различных заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[003] Циркулирующая внеклеточная ДНК (вкДНК), также называемая экстрацеллюлярная ДНК (эДНК), присутствует в небольших количествах в крови здоровых людей.
[004] Повышенные уровни циркулирующей вкДНК в настоящее время широко признаны в качестве маркера для ряда заболеваний и патологических состояний, включая, но не ограничиваясь указанными, рак, метастатический рак, острую органную недостаточность, инфаркт органа (включая инфаркт миокарда и ишемический инсульт), геморрагический инсульт, аутоиммунные расстройства, болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD), отторжение трансплантата, сепсис, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром полиорганной дисфункции (MODS), болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD), травматическое повреждение, провоспалительный статус у лиц пожилого возраста, диабет, атеросклероз, нейродегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания, эклампсия, бесплодие, нарушение свертываемости крови, осложнения, связанные с беременностью, и инфекции. Различные подтипы циркулирующей внеклеточной ДНК могут играть существенную роль в прогрессировании определенных заболеваний и патологических состояний.
[005] Было предложено использовать системное введение фермента дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), который специфически гидролизует циркулирующую вкДНК для лечения бесплодия (патент США №8916151); сердечно-сосудистых заболеваний (патент США №9642822); рака; сепсиса, болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD); органной недостаточности; сахарного диабета; атеросклероза; реакции гиперчувствительности замедленного типа (патенты США №9248166; 8535663; 7612032; 8388951; 8431123).
[006] Однако, вопреки результатам, полученным на животных моделях, результаты в реальных клинических условиях показали, что системное применение фермента дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) оказывает весьма ограниченное влияние на уменьшение количества циркулирующей вкДНК.
[007] Hazout A. (PCT/IB 2013/056321) описал 10 женщин с высоким уровнем циркулирующей вкДНК (>80 нг/мкл), получавших 0,1 мг/кг DNasel ежедневно внутримышечно два раза в день в течение семи дней, при этом наблюдалось только в среднем 26% снижение уровня циркулирующей вкДНК. Их наблюдения согласуются с данными Davis et al., который не смог продемонстрировать снижение уровня циркулирующей двухцепочечной ДНК у пациентов с волчаночным нефритом, получающих человеческую рекомбинантную дезоксирибонуклеазу в дозе 25 мкг/кг в виде одной внутривенной и десяти подкожных инъекций в течение периода 19 дней, несмотря на достижение в плазме каталитически эффективных концентраций дезоксирибонуклеазы между 40-100 нг/мл. (Davis J.С. et al., Recombinant human Dnase I (rhDNase) in patients with lupus nephritis Lupus (1999) Vol 8 (1), pp. 68-76.)
3
3
[008] Наиболее распространенный тип циркулирующей вкДНК представлен связанной с нуклеосомами ДНК. Нуклеосома является субъединицей ядерного хроматина и состоит из центрального ядра, образованного октамером гистоновых белков, связанных с фрагментом двухцепочечной ДНК размером приблизительно 147 пар оснований. (Oudet Р, Gross-Bellard М, Chambon P. Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. Cell. 1975; 4: 281-300). Связанная с нуклеосомами вкДНК может циркулировать в крови в виде мононуклеосом или структур более высокого порядка, таких как олигонуклеосомы или даже фрагменты хроматина, содержащие более 50-100×10 пар оснований ДНК. Этот конкретный тип циркулирующей вкДНК происходит из клеток, подвергающихся некрозу или апоптозу. Другим источником циркулирующей вкДНК является образование внеклеточных ловушек нейтрофилами. Внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET) представляют собой внеклеточные нити деконденсированной ДНК, выделенной из активированных нейтрофилов размером более 15×10 пар оснований ДНК и организованных в трехмерные сетчатые структуры размером 10-30 нм. Происходящая в процессе образования внеклеточных ловушек нейтрофилами вкДНК может быть либо свободной от частиц, либо связанной с частицами. Внеклеточные ловушки нейтрофилов также содержат высоко цитотоксические ферменты и цитотоксические белки, происходящие из внутреннего пространства нейтрофилов. (Sørensen, О.Е. and Borregaard, N., Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J. Clin. Invest. 2016 May 2; 126(5): 1612-20). Недавно было показано, что не только нейтрофилы, но и макрофаги могут выделять NET-подобные структуры. (Nat Med., 2018, 24(2): 232-238).
3
[009] Другим важным типом вкДНК, связанной с циркулирующими частицами, является ДНК, связанная с экзосомой. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы (30-100 нм) экзоцитотического происхождения, секретируемые большинством типов клеток, которые могут содержать одноцепочечную ДНК (оцДНК), митохондриальную ДНК (мтДНК) и двухцепочечную (дцДНК) размером до 2,5-10×10 пар оснований, расположенную во внутреннем пространстве экзосомы или на поверхности ее мембраны. (Thakur, В.K. et al., Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection, Cell Research (2014) 24: 766-769).
[010] Значительная часть циркулирующей вкДНК, не связанной с частицами, представлена линейной и кольцевой двухцепочечной ДНК и одноцепочечной ДНК, секретируемой раковыми клетками, активированными иммунными клетками и некоторыми другими типами клеток. Этот тип вкДНК обычно имеет длину 250-1000 пар оснований или более и может быть обогащен уникальными последовательностями генома (Kumar, P. et al., Normal and cancerous tissues release extrachromosomal circular DNA (eccDNA) into the circulation, (Mol. Cancer. Res., June 20, 2017 DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-17-0095.) Другой важной составляющей циркулирующей вкДНК, не связанной с частицами, является митохондриальная ДНК (мтДНК) различной длины.
[011] Другой недавно открытый тип циркулирующей вкДНК, не связанной с частицами, представлен ультракороткими олигонуклеотидами двухцепочечной ДНК (дцДНК) и олигонуклеотидами одноцепочечной ДНК (оцДНК) с субнуклеосомальной длиной (то есть обычно менее чем ~147 пар оснований). Было показано, что эта конкретная вкДНК обогащена митохондриальной ДНК (мтДНК), ДНК микробного происхождения и мутированными последовательностями генома человека. (Burnham Р., Single-stranded DNA library preparation uncovers the origin and diversity of ultrashort cell-free DNA in plasma, Scientific Reports 6, Article number: 27859 (2016), doi:10.1038/srep27859). Важно, что этот тип циркулирующей вкДНК также содержит фрагменты ДНК с низкой молекулярной массой, которые аналогичны тем, которые появляются после разрушения связанной с частицами ДНК ферментом ДНКазы I в крови пациентов.
[012] Было предпринято несколько попыток использовать технологии экстракорпорального удаления для очистки крови пациента от определенных компонентов пула циркулирующей вкДНК. См. например патент США №9364601; публикация заявки на патент США №2007/0092509; Kusaoi et al., Ther. Apher. Dial, 2016, 20: 348-353.
[013] Существует потребность в новых экстракорпоральных способах лечения заболеваний, связанных с высоким уровнем циркулирующей вкДНК в крови, и в новых более эффективных устройствах для реализации таких способов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[014] Как указано в разделе «Уровень Техники» выше, существует потребность в новых экстракорпоральных способах лечения заболеваний, связанных с высоким уровнем циркулирующей вкДНК в крови, и в новых более эффективных устройствах для реализации таких способов. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие потребности путем обеспечения устройств для афереза и связанных с ними процессов.
[015] В одном аспекте настоящего изобретения предложено устройство, выполненное для проведения афереза, содержащее одну или более аффинных матриц, где указанные одна или более аффинных матриц способны захватывать внеклеточную ДНК (вкДНК), связанную с нуклеосомамии, экзосомо-связанную вкДНК и несвязанную вкДНК из крови или плазмы субъекта.
[016] В некоторых вариантах осуществления несвязанная вкДНК включает в себя двухцепочечную дцДНК, одноцепочечную оцДНК и олигонуклеотиды.
[017] В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство содержит две или более аффинных матриц. В некоторых вариантах осуществления (i) одна или более аффинных матриц способны захватывать нуклеосом-связанную внеклеточную ДНК (вкДНК) и/или экзосом-связанную вкДНК и (ii) следующая одна или более аффинных матриц способна захватывать несвязанную вкДНК, и где первая и вторая аффинные матрицы расположены внутри устройства в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления (i) одна или более аффинных матриц содержит ДНК-связывающий белок (например, гистон [например, гистон H1]), антитело против гистона (например, антитело против гистона Н2А), антитело против нуклеосом (например, AN-1, AN-44), интеркалирующий ДНК агент (например, краситель Hoechst, такой как, например, Hoechst 33342), ДНК-связывающий полимер (например, катионный/основной полимер [например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, поли-L-аргинин, гексадиметрин бромид, амино-концевой (-NH2) полиамидоаминный (РАМАМ) дендример, полипропиленимин (PPI) дендример], неионный/нейтральный полимер [например, поливинилпирролидон (PVP), поливинилполипирролидон (PVPP), поли (4-винилпиридин-N-оксид)], анионный/кислотный полимер, линейный полимер [например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, поли-L-аргинин], разветвленный полимер [например, гиперразветвленный поли-L-лизин, гиперразветвленный полиэтиленимин], дендримерный полимер [например, полиамидоаминный (РАМАМ) дендример, полипропиленимин (PPI) дендример]), анти-ДНК-антитело (например, мышиное моноклональное IgM-антитело против дц+оц ДНК ([49/4А1], ab35576, Abeam), лектин (например, лектин Galanthus nivalis (GNA), лектин Narcissus Pseudonarcissus (NPA), Conconavalin A, фитогемаглутанин или циановирин) и любую их комбинацию, и (ii) следующая одна или более аффинных матриц содержит ДНК-связывающий белок (например, гистон [например, гистон HI]), интеркалирующий ДНК агент (например, краситель Hoechst, такой как, например, Hoechst 33342), ДНК-связывающий полимер (например, катионный/основной полимер [например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, поли-L-аргинин, гексадиметрин бромид, амино-концевой (-NH2) полиамидоаминный (РАМАМ) дендример, полипропилениминный (PPI) дендример], неионный/нейтральный полимер [например, полив инилпирролид он (PVP), поливинилполипирролидон (PVPP), поли (4-винилпиридин-N-оксид)], анионный/кислотный полимер, линейный полимер [например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, поли-L-аргинин], разветвленный полимер [например, гиперразветвленный поли-L-лизин, гиперразветвленный полиэтиленимин], дендримерный полимер [например, полиамидоаминный (РАМАМ) дендример, полипропилениминный (PPI) дендример]), анти-ДНК-антитело (например, мышиное моноклональное IgM-антитело против дц+оц ДНК ([49/4А1], ab35576, Abeam) и любая их комбинация.. В некоторых вариантах осуществления указанные две или более аффинных матриц последовательно размещаются в виде двух или более аффинных колонок. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная матрица в последовательности содержит ДНК-связывающий полимер (например, дендример с аминоконцевым (-NH2) полиамидоамином (РАМАМ), дендример полипропиленимина (PPI), гиперразветвленный поли-L-лизин или гиперразветвленный полиэтиленимин) или интеркалирующий ДНК агент (например, Hoechst 33342). В некоторых вариантах осуществления аффинная матрица не является полиамидоаминный (РАМАМ) дендримером.
[018] Нелимитирующими примерами полезных комбинаций колонок (расположенных в любом порядке) являются: (a) (i) аффинная колонка с интеркалирующий агентом ДНК Hoechst 33342 и (ii) аффинная колонка с анти-ДНК-антителом; или (b) (i) колонка с аффинной матрицей, содержащей анти-нуклеосомное антитело (ANAM), и (ii) колонка с аффинной матрицей, содержащей анти-ДНК-антитела; или (с) (i) колонка с аффинной матрицей, содержащей анти-нуклеосомное антитело (ANAM), и (ii) колонка с аффинной матрицей, содержащей полиамидоаминный дендример (PDAM); или (d) (i) колонка с аффинной матрицей, содержащей анти-нуклеосомное антитело (ANAM), и (ii) колонка с аффинной матрицей, содержащей гиперразветвленный поли-L-лизин (PLLAM); или (e) (i) аффинная колонка с анти-гистоновым антителом Н2А, (ii) аффинная колонка с лектином и (iii) аффинная колонка с гистоном H1 или колонка с аффинной матрицей, содержащей полиамидоаминный дендример (PDAM), или колонка с аффинной матрицей, содержащей гиперразветвленный поли-L-лизин (PLLAM), или колонка с аффинной матрицей, содержащей ДНК-интеркалирующий агент Hoechst 33342.
[019] В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство по изобретению содержит одну аффинную матрицу. Нелимитирующие примеры подходящих матриц, которые можно использовать в качестве одной аффинной матрицы, включают: аффинные матрицы, содержащие гистон (например, гистон H1, такой как, например, гистон Н1.3), аффинные матрицы, содержащие ДНК-связывающий полимер (например, катионный полимер, такой как, например, амино-концевой (-NH2) полиамидоамин (РАМАМ) дендример или гиперразветвленный поли-L-лизин), аффинные матрицы, содержащие интеркалирующий ДНК агент (например, Hoechst 33342), аффинные матрицы, содержащие анти-ДНК антитело (например, мышиное моноклональное IgM-антитело против дц+оц ДНК ([49/4А1], ab35576, Abcam). В некоторых вариантах осуществления аффинная матрица не является полиамидоаминным (РАМАМ) дендримером.
[020] В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство по изобретению захватывает по меньшей мере 30 мг вкДНК за одну процедуру афереза.
[021] В некоторых вариантах осуществления устройство по изобретению снижает уровень вкДНК в крови по меньшей мере на 25% за одну процедуру афереза. В некоторых вариантах осуществления устройство по изобретению снижает уровень вкДНК в крови по меньшей мере на 50% за одну процедуру афереза. В некоторых вариантах осуществления устройство по изобретению снижает уровень вкДНК в крови по меньшей мере на 75% за одну процедуру афереза.
[022] В другом аспекте изобретение относится к способу снижения уровня внеклеточной ДНК (вкДНК) в крови субъекта, включающему: (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от субъекта в устройство для афереза по настоящему изобретению для получения крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК субъекту, причем процедура афереза снижает уровень связанной с нуклеосомами вкДНК, связанной с экзосомами вкДНК и несвязанной вкДНК в крови субъекта. В некоторых вариантах субъект имеет заболевание, характеризующееся повышенным уровнем вкДНК в крови. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание, выбранное из группы, состоящей из нейродегенеративного заболевания, рака, токсичности, связанной с химиотерапией, токсичности, индуцированной облучением (например, острый радационный синдром), органной недостаточности, повреждения органов, инфаркта органа, ишемии, острого сосудистого события, инсульта, болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD), отторжения трансплантата, сепсиса, синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), синдрома полиорганной дисфункции (MODS), травматического повреждения, старения, диабета, атеросклероза, аутоиммунного заболевания, эклампсии, бесплодия, осложнений, связанных с беременностью, нарушения свертываемости крови и инфекции.
[023] В дополнительном аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает: (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от субъекта в устройство для афереза по настоящему изобретению для получения крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК субъекту, причем процедура афереза снижает уровень связанной с нуклеосомами вкДНК, связанной с экзосомами вкДНК и несвязанной вкДНК в крови субъекта. В некоторых вариантах субъект имеет заболевание, характеризующееся повышенным уровнем вкДНК в крови. Неограничивающие примеры заболеваний, которые можно лечить способами по изобретению, включают, например, нейродегенеративное заболевание, рак, токсичность, связанную с химиотерапией, токсичность, вызванную облучением (например, острый лучевой синдром), органную недостаточность, повреждение органов, инфаркт органа, ишемия, острое сосудистое заболевание, инсульт, болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD), отторжение трансплантата, сепсис, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром полиорганной дисфункции (MODS), травматическое повреждение, старение, диабет, атеросклероз, аутоиммунное заболевание, эклампсия, бесплодие, осложнения, связанные с беременностью, нарушение свертываемости крови и инфекцию.
[024] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов по изобретению способ дополнительно включает мониторинг уровня вкДНК в крови субъекта.
[025] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов по изобретению способ включает продолжение или повторение процедуры афереза до тех пор, пока уровень вкДНК не уменьшится по меньшей мере на 25%. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов по изобретению способ включает продолжение или повторение процедуры афереза до тех пор, пока уровень вкДНК не уменьшится по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов по изобретению способ включает продолжение или повторение процедуры афереза до тех пор, пока уровень вкДНК не уменьшится по меньшей мере на 75%.
[026] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов по изобретению способ включает продолжение или повторение процедуры афереза до тех пор, пока по меньшей мере 30 мг вкДНК не будет удалено из крови субъекта.
[027] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов по изобретению процедуру афереза повторяют два или более раз.
[028] В некоторых вариантах осуществления любого из указанных выше способов по изобретению кровь для процедуры афереза получают из воротной вены.
[029] В некоторых вариантах осуществления любого из указанных выше способов по изобретению несвязанная вкДНК включает в себя дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды.
[030] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов изобретения субъект является человеком.
[031] Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники исходя из следующего описания, формулы изобретения и чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[032] Фигура 1 показывает электрофоретический профиль вкДНК, выделенной из плазмы крови пациента с метастатическим раком.
[033] Фигуры 2А и 2В показывают опухоли, вырезанные у мышей, которым вводилась ДНК в соответствии с примером 3, где кровь очищали с помощью аффинной матрицы с анти-гистоновыми антителами и аффинной матрицы с лектином из Galanthus nivalis (подснежник). На фигуре 2А показаны опухоли, вырезанные у мышей контрольной группы. На фигуре 2В показаны опухоли, вырезанные у мышей, которым вводили ДНК от пациента с NSCLC T3N2M+, очищенную от циркулирующей вкДНК, связанной с нуклеосомами и экзосомами.
[034] Фигура 3 показывает электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК из плазмы пациента с метастатическим раком и пациента с инсультом.
[035] Фигура 4 показывает электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК из плазмы пациента с синдромом системного воспалительного ответа (SIRS) и синдромом множественной дисфункции органов (MODS).
[036] Фигура 5 показывает электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК, используемой в экспериментах по культивированию клеток.
[037] Фигура 6 показывает электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК, вестерн-блоттинга ДНКазы I и количественного определения активности ДНКазы I и циркулирующей вкДНК.
[038] Фигура 7 показывает электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК из плазмы пациента с сепсисом.
[039] Фигура 8 показывает результаты электрофореза в 1% агарозном геле модельной плазмы, обогащенной вкДНК, до и после теста объемной адсорбции. Дорожка-1 - модельная плазма, обогащенная вкДНК до инкубации; дорожка-2 - модельная плазма, обогащенная вкДНК, после инкубации с контролем этаноламин-сефарозой FF; дорожка 3 - модельная плазма, обогащенная вкДНК, после инкубации с PDAM; дорожка-4 - модельная плазма, обогащенная вкДНК, после инкубации с PLLAM; дорожка-5 - модельная плазма, обогащенная вкДНК, после инкубации с аффинной матрицей содержащей гистон Н1.3.
[040] Фигура 9 показывает результаты электрофореза в 1% агарозном геле в плазме пациента, у которого диагностирован одонтогенный сепсис до и после теста объемной адсорбции. Дорожка-1 - плазма пациента с одонтогенным сепсисом после инкубации с этаноламин-сефарозой FF-контроль; дорожка-2 контроль-дистиллированная вода; дорожка 3 - плазма пациента с одонтогенным сепсисом после инкубации с аффинной матрицей содержащей гистон Н1.3; дорожка-4 - контроль-дистиллированная вода; дорожка-5 - плазма пациента с одонтогенным сепсисом после инкубации с PDAM; дорожка-6 - плазма пациента с одонтогенным сепсисом после инкубации с PLLAM.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Термины и определения
[041] Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
[042] Формы единственного числа «а», «ап» и «the» включают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «способ» включает в себя один или более способов и/или этапов описанного здесь типа и/или которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного раскрытия.
[043] Термин «примерно» или «приблизительно» включает в себя нахождение в пределах статистически значимого диапазона значения. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 50%, более предпочтительно в пределах 20%, еще более предпочтительно в пределах 10% и еще более предпочтительно в пределах 5% от данного значения или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое терминами «примерно» или «приблизительно», зависит от конкретной исследуемой системы и может быть легко оценено специалистом в данной области техники.
[044] Используемый в данном описании термин «устройство» относится к любому узлу, известному в данной области техники, для обеспечения возможности очистки жидких растворов, такому как, без ограничения, например, любая полая посуда, колонка, матрица колонки, фильтр, мембрана, полупроницаемый материал, шарик (например, микрошарик или наношарик) или трубка. Термины «колонка» и «картридж» используются в данном описании взаимозаменяемо в контексте устройства для афереза.
[045] Термин «аффинная матрица», используемый в данном документе, относится к (i) твердому носителю, в который иммобилизован лиганд (например, вкДНК-связывающая молекула), или (ii) твердому носителю, образованному самим лигандом (например, нерастворимый в воде ДНК-связывающий полимер).
[046] Термин «ДНК-связывающий белок» относится к белкам, которые связываются с одноцепочечной ДНК (оцДНК) или двухцепочечной ДНК (дцДНК). ДНК-связывающие белки могут связывать ДНК специфичным для последовательности образом (например, факторы транскрипции и нуклеазы) или не специфически по отношению к последовательностям ДНК (например, полимеразы и гистоны). Члены семейства линкерных гистонов H1 являются ключевым компонентом хроматина и связываются с ядром нуклеосомы в области участков входа и выхода ДНК.
[047] Используемые в данном описании термины «циркулирующая ДНК», «внеклеточная ДНК (вкДНК)», «экстрацеллюлярная ДНК (эДНК)» и «циркулирующая экстрацеллюлярная ДНК (эДНК)» используются взаимозаменяемо для обозначения ДНК, присутствующей в крови или плазме, находящихся вне циркулирующих клеток гематопоэтического и негематопоэтического происхождения.
3
[048] Связанная с нуклеосомами вкДНК представляет собой ДНК, которая связана с нуклеосомой. Нуклеосома является субъединицей ядерного хроматина. Связанная с нуклеосомами вкДНК может циркулировать в крови в виде мононуклеосом или структур более высокого порядка, таких как олигонуклеосомы или даже фрагменты хроматина, содержащие более 50-100×10 пар оснований ДНК. Циркулирующая связанная с нуклеосомами вкДНК может происходить из клеток, подвергающихся некрозу или апоптозу, а также из-за образования внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET).
[049] вкДНК, связанная с экзосомой, представляет собой вкДНК, которая связана с экзосомами или присутствует в экзосомах. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы (около 30-100 нм) экзоцитотического происхождения, секретируемые большинством типов клеток, которые могут содержать одноцепочечную ДНК (оцДНК), митохондриальную ДНК (мтДНК) и двухцепочечную ДНК (дцДНК) во внутреннем или внешнем пространстве экзосомы.
[050] Термины «несвязанная вкДНК» или «вкДНК, не связанная с частицами» или «вкДНК свободная от частиц» относятся к вкДНК, которая не связана с экзосомами или нуклеосомами и включает двухцепочечную ДНК (дцДНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК), линейную или кольцевую, и олигонуклеотиды, в том числе ультракороткие молекулы ДНК субнуклеосомного размера (обычно менее 147 пар оснований).
[051] Используемые в данном описании термины «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо и относятся к животным, включая млекопитающих, таких как люди, ветеринарные животные (например, кошки, собаки, коровы, лошади, овцы, свиньи и т.д.) и экспериментальные модели животных. В определенных вариантах осуществления субъект относится к пациенту-человеку, включая оба пола во взрослой и детской популяциях.
[052] В контексте настоящего изобретения, поскольку оно относится к любому из болезненных состояний, указанных в данном описании, термины «лечить», «лечение» и тому подобное означают облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, связанного с таким состоянием, или замедление или обращение вспять прогрессирования такого состояния. В значении настоящего изобретения термин «лечить» также обозначает остановку, задержку начала (то есть периода до клинического проявления заболевания) и/или уменьшение риска развития или ухудшения заболевания. Термины «лечить», «лечение» и тому подобное в отношении состояния, расстройства или состояния могут также включать (1) предотвращение или задержку появления по меньшей мере одного клинического или субклинического симптома состояния, расстройства или состояния, развивающегося в субъекте, который может быть поражен или предрасположен к состоянию, расстройству или состоянию, но еще не испытывает или не проявляет клинических или субклинических симптомов состояния, расстройства или состояния; или (2) подавление состояния, расстройства или состояния, то есть прекращение, уменьшение или задержка развития заболевания или его рецидива (в случае поддерживающего лечения) или по меньшей мере одного его клинического или субклинического симптома; или (3) облегчение заболевания, то есть вызывание регрессии состояния, расстройства или состояния или по меньшей мере одного из его клинических или субклинических симптомов.
[053] В практике настоящего изобретения используют, если не указано иное, обычные методы статистического анализа, молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, химии конъюгации и биохимии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие инструменты и методики подробно описаны, например, в Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; and Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ. Hermanson (2013) Bioconjugate Techniques' 3rd ed., Academic Press; Niemeyer (2004) Bio conjugation Protocols: Strategies and Methods, Springer Science & Business Media and Hermanson et al. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press. Дополнительные методики описаны, например, в патенте США No. 7912698 и в заявках на патент США No. 2011/0202322 и 2011/0307437.
Устройства и Способы согласно изобретению
[054] Как указано в разделе «Уровень техники», в данной области техники существует большая потребность в разработке новых способов и устройств для снижения уровня практически всех типов циркулирующей вкДНК в крови. Настоящее раскрытие направлено на удовлетворение этой и других потребностей путем предоставления устройств и способов для афереза, в которых устройство для афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды).
[055] Применение технологий экстракорпорального удаления может обеспечить эффективное решение для удаления вкДНК из кровообращения и, соответственно, снизить уровень и негативные эффекты циркулирующей вкДНК. Терапевтический аферез является экстракорпоральным лечением, которое удаляет компоненты крови у пациентов; он используется для лечения состояний, при которых патогенное вещество или компонент в крови вызывает развитие заболеваний: см., например Ward M.D., Conventional Apheresis Therapies: A Review Journal of Clinical Apheresis 26: 230 238 (2011).
[056] Неожиданно, как показано в настоящем документе, экстракорпоральное удаление практически всех типов циркулирующей вкДНК оказывает положительное влияние на лечение заболеваний, характеризующихся повышенными уровнями циркулирующей вкДНК в крови.
[057] Настоящее раскрытие изобретения обеспечивает способ лечения заболеваний, характеризующихся повышенными циркулирующими уровнями вкДНК путем удаления практически всех типов вкДНК, включая нуклеосом-связанную вкДНК, экзосом-связанную вкДНК и несвязанную вкДНК (включая днДНК, оцДНК и олигонуклеотиды) из крови субъекта, чтобы уменьшить негативные эффекты циркулирующей вкДНК.
[058] Не желая быть связанными теорией, при определенных заболеваниях, в которых уровень циркулирующей вкДНК повышен, различные типы циркулирующей вкДНК могут действовать совместно, запуская разные молекулярные механизмы, каждый из которых ведет к прогрессированию заболевания и смертности пациентов; различные типы циркулирующей вкДНК, действующие вместе, могут генерировать синергетическую токсичность, то есть токсический (отрицательный) эффект двух или более типов циркулирующей вкДНК больше, чем сумма отрицательных эффектов каждого типа вкДНК, взятых отдельно.
[059] Авторы изобретения обнаружили, что удаление практически всех типов вкДНК, включая нуклеосом-связанную вкДНК, экзосом-связанную вкДНК и несвязанную вкДНК (включая двухцепочечную ДНК [дцДНК], одноцепочечную ДНК [оцДНК] и олигонуклеотиды) из крови пациентов с повышенными уровнями циркулирующей вкДНК могут эффективно уменьшить или даже полностью отменить патогенные эффекты, опосредованные указанной циркулирующей вкДНК. Удаление практически всех типов вкДНК, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды), представляется критическим для снижения патогенных эффектов, опосредованных вкДНК.
[060] Авторы изобретения также неожиданно обнаружили, что удаление практически всех типов циркулирующей вкДНК может привести к реактивации эндогенных дезоксирибонуклеаз.
[061] Далее описано, что несколько аффинных матриц или их комбинации способны эффективно захватывать практически все типы вкДНК, включая связанные с нуклеосомами вкДНК, связанные с экзосомами вкДНК и несвязанные вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды) из крови пациентов, нуждающихся в этом. Примеры аффинных матриц, используемых в устройствах и способах для афереза по изобретению, включают (i) матрицы, содержащие ДНК-связывающий белок (например, гистон [например, гистон H1]), (ii) матрицы, содержащие антитело против гистона (например, антитело против гистона Н2 А), антитело против нуклеосомы (например, AN-1, AN-44), (iii) матрицы, содержащие интеркалирующий ДНК агент (например, краситель Hoechst, такой как, например, Hoechst 33342), (iv) матрицы, содержащие ДНК-связывающий полимер (например, катионный/основной полимер [например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, поли-L-аргинин, гексадиметрин бромид, концевой амино-концевой (-NH2) полиамидоамин (дендример, полипропиленимин) (PPI) дендример], неионный/нейтральный полимер [например, поливинилпирролидон (PVP), поливинилполипирролидон (PVPP), поли (4-винилпиридин-N-оксид)], анионный/кислотный полимер, линейный полимер [например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, поли-L-аргинин], разветвленный полимер [например, гиперразветвленный поли-L-лизин, гиперразветвленный полиэтиленимин], дендримерный полимер [например, дендример полиамидоамина (РАМАМ), дендример полипропиленимина (PPI); см. Kaur et al., J NanopartRes., 2016, 18:146]; see, e.g., U.S. Patent No. 7,713,701 and Morozov et al., General Reanimatology, 2016, 12:6 для дополнительных прмеров), (v) матрицы, содержащие анти-ДНК-антитело, (vi) матрицы, содержащие лектин (например, лектин Galanthus nivalis (GNA), лектин Narcissus Pseudonarcissus (NPA), конконавалин A, фитогемаглуттанин или циановирин) и любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления две или более аффинных матриц последовательно расположены в виде двух или более аффинных колонок. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная матрица в последовательности включает ДНК-связывающий полимер (например, дендример с аминоконцевым (-NH2) полиамидоамином (РАМАМ), дендример полипропиленимина (PPI), гиперразветвленный поли-L-лизин или гиперразветвленный) полиэтиленимин или интеркалирующий ДНК-агент (например, Hoechst 33342).
[062] В настоящем документе описаны аффинные матрицы и устройства для афереза, содержащие такие матрицы. Устройство для афереза в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнено в соответствии с опытом специалиста в данной области техники, например, как описано в заявке на патент США. No. 2017/0035955 (Eliaz Issac, Опублкован 9 февраля 2017 г.). В одном возможном варианте осуществления устройства для афереза аффинные матрицы помещают в различные колонки для аффинного афереза или картриджи. Устройство для афереза может содержать фильтрующий картридж и одну или более аффинных колонок, имеющих вход и выход, в которых устройство способно захватывать связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды), из крови или плазмы пациента. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит две или более колонки для аффинного афереза в последовательности. Вход и выход могут быть расположены относительно аффинных матриц так, что кровь, поступающая на вход, должна контактировать с аффинными матрицами перед выходом через выход. Предпочтительно, чтобы геометрия устройства была разработана таким образом, чтобы максимизировать контакт крови (или плазмы) с аффинными матрицами во время прохождения через устройство. Разнообразие таких конструкций известно в данной области техники. Например, устройство может представлять собой полый цилиндр, заполненный аффинным лигандом, иммобилизованным на гранулах, имеющий вход на одном конце и выход на противоположном конце. Другие устройства, такие как массивы микротрубочек, также могут быть сконструированы. Все такие вариации геометрии и объема контейнера и содержащихся в нем аффинных матриц могут быть разработаны в соответствии с известными принципами. При подготовке колонки аффинной матрицы аффинная матрица может быть загружена до объема колонки по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. Подходящий буфер (например, PBS, в частности холодный PBS) может быть использован для уравновешивания колонки.
[063] В одном аспекте предложена аффинная матрица на основе гистона, содержащая целлюлозные шарики и рекомбинантный человеческий гистон Н1.3, где рекомбинантный человеческий гистон Н1.3 иммобилизован на целлюлозных шариках и где размер шариков составляет от 50 до 350 микрометров. В некоторых вариантах осуществления размер шариков составляет от 100 до 250 микрометров.
[064] В некоторых вариантах осуществления аффинную матрицу на основе гистона получают способом, включающим а) окисление целлюлозных шариков размером от 100 до 250 микрометров с получением активированных целлюлозных шариков; b) промывание гранул активированной целлюлозы; с) приготовление концентрированного раствора рекомбинантного человеческого гистона Н1.3; d) инкубирование гранул активированной целлюлозы с концентрированным раствором рекомбинантного гистона человека Н1.3; и е) блокирование любых свободных групп СНО на гранулах активированной целлюлозы.
[065] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает f) промывание гранул активированной целлюлозы буфером.
[066] В некоторых вариантах осуществления на стадии а) целлюлозные шарики находятся в водной суспензии и окисляются NaIO. В некоторых вариантах осуществления на стадии b) гранулы активированной целлюлозы промывают бикарбонатом натрия, соляной кислотой и водой. В некоторых вариантах осуществления стадия с) включает диализ раствора рекомбинантного человеческого гистона Н1.3 и концентрирование диализированного раствора в 0,1 М NaHCO3 при рН 7-9. В некоторых вариантах осуществления диализированный раствор концентрируют в 0,1 М NaHCO3 при рН 8. В некоторых вариантах осуществления на стадии d) инкубацию проводят в течение 3-5 часов при 15-30°С. В некоторых вариантах осуществления на этапе d) инкубацию проводят в течение 4 часов при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления на стадии е) стадия блокирования включает добавление 1 М этаноламина к шарикам активированной целлюлозы и взаимодействие в течение от 30 минут до 2 часов при 15-30°С. В некоторых вариантах осуществления на стадии f) гранулы активированной целлюлозы промывают буфером TBS.
[067] Также предложена колонка, содержащая аффинную матрицу на основе гистона по любому из вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления.
[068] В другом аспекте предложена аффинная матрица на основе лектина, полученная в соответствии со способом, включающим а) взаимодействие лектина с активированными агарозными гранулами с получением связанной с лектином агарозы; и b) промывание связанной с лектином агарозы буфером.
[069] В некоторых вариантах осуществления лектин происходит от Galanthus nivalis (подснежник). В некоторых вариантах осуществления активированные агарозные гранулы представляют собой активированные агарозными гранулами CNBr. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой PBS, такой как стерильный холодный PBS при рН 7,2-7,4.
[070] Также предложена колонка, содержащая аффинную матрицу на основе лектина по любому из вышеуказанных аспектов и вариантов осуществления.
[071] В еще одном аспекте предложена аффинная матрица полиамидоамин дендримера (PDAM), полученная способом, включающим а) промывание целлюлозных гранул этанолом и водой; b) инкубирование промытых целлюлозных гранул с (±)-эпихлоргидрином и NaOH с получением активированных целлюлозных гранул; с) взаимодействие гранул активированной целлюлозы с дендримером полиамидоамина (РАМАМ) с получением гранул PDAM и удаление дендримера РАМАМ, который не реагировал с гранулами активированной целлюлозы; и d) блокирование непревращенных эпоксидных групп на шариках PDAM.
[072] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя е) промывание гранул PDAM 0,1 М фосфатным буфером и водой.
[073] В некоторых вариантах осуществления на стадии а) целлюлозные шарики промывают 98% этанолом и дистиллированной водой. В некоторых вариантах осуществления на стадии b) промытые целлюлозные шарики инкубируют со смесью (±) -эпихлоргидрина и 2,5 М NaOH. В некоторых вариантах осуществления на стадии с) гранулы активированной целлюлозы суспендируют с 20%-ным раствором РАМАМ-дендримера с этилендиаминовым ядром. В некоторых вариантах осуществления на стадии с) суспендирование проводят при 20-30°С в течение 3-6 часов. В некоторых вариантах осуществления на стадии с) суспендирование проводят при 24°С в течение 5 часов.
[074] Также предложена колонка, содержащая аффинную матрицу РАМАМ-дендримера (PDAM), описанную выше. В некоторых вариантах осуществления колонка представляет собой колонку из PTFE (политетрафторэтилен), и аффинная матрица с полиамидоаминный дендримером стерилизуется.
3
[075] В другом аспекте предложена аффинная матрица содержащая анти-ДНК-антитела, полученная способом, включающим а) получение активированных агарозных гранул путем сшивания N-гидроксисукцинимида с агарозными гранулами; b) промывание активированных агарозных гранул буфером для связывания, содержащим NaHCO и NaCl; с) добавление антитела против двухцепочечной и одноцепочечной ДНК в буфер для связывания; d) инкубирование буфера для связывания, содержащего антитело, с активированными агарозными гранулами с получением аффинной матрицы на основе анти-ДНК-антитела; и е) промывание аффинной матрицы анти-ДНК-антител буфером для связывания и ацетатным буфером.
3
[076] В некоторых вариантах осуществления агарозные гранулы имеют средний размер 90 микрометров. В некоторых вариантах осуществления буфер для связывания содержит 0,2 М NaHCO и 0,5 М NaCl и имеет рН 8,3. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело мыши. В некоторых вариантах осуществления этап промывания выполняется по меньшей мере три раза. В некоторых вариантах осуществления ацетатный буфер представляет собой 0,1 М ацетатный буфер при рН 4,0.
[077] Также предложена колонка, содержащая аффинную матрицу на основе анти-ДНК-антитела, описанную выше.
[078] В некоторых вариантах осуществления колонку получают путем инкубации аффинной матрицы анти-ДНК-антитела со стерильным буфером трис-HCl. В некоторых вариантах осуществления стерильный буфер трис-HCl имеет рН 7,4.
3
[079] В другом аспекте предложена аффинная матрица, содержащая антитела против нуклеосом (ANAM), полученная способом, включающим а) получение активированных агарозных гранул путем сшивания N-гидроксисукцинимида с агарозными гранулами; b) промывание активированных агарозных гранул буфером для связывания, содержащим NaHCO и NaCl; с) добавление в буфер для связывания антитела, которое связывается с нуклеосомами, где антитело получают у мыши MRL/Mp (-)+/+; d) инкубирование буфера для связывания, содержащего антитело, с активированными агарозными гранулами для получения аффинной матрицы антинуклеосомных антител; и е) промывание аффинной матрицы антинуклеосомного антитела буфером для связывания и ацетатным буфером.
[080] В некоторых вариантах осуществления матрица связывается со связанной с нуклеосомой циркулирующей вкДНК, и матрица не связывается с несвязанной вкДНК, которая включает дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды.
[081] Также предложена колонка, содержащая аффинную матрицу антител против нуклеосом (ANAM), описанную выше.
[082] В еще одном аспекте предложена аффинная матрица на основе интеркалирующего ДНК агента Hoechst 3342, полученная способом, включающим а) окисление целлюлозных шариков; b) промывание окисленных гранул целлюлозы; с) взаимодействие промытых шариков окисленной целлюлозы с раствором, содержащим Hoechst 33342 и N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC), с получением шариков с иммобилизованной целлюлозой Hoechst 33342; и d) промывание шариков с иммобилизованной целлюлозой Hoechst 33342.
[083] В некоторых вариантах осуществления на стадии а) целлюлозные шарики окисляют NaIO в течение 3-5 часов. В некоторых вариантах осуществления на стадии b) гранулы окисленной целлюлозы промывают 1 М бикарбонатом натрия, 0,1 М соляной кислотой и водой. В некоторых вариантах осуществления на стадии с) раствор представляет собой рН-буферный раствор. В некоторых вариантах осуществления на этапе d) промывка проводится по меньшей мере три раза.
3
3
[084] В другом аспекте предложена гиперразветвленная аффинная матрица поли-L-лизина (PLLAM), полученная способом, включающим а) растворение моногидрохлорида L-лизина в воде и нейтрализация с помощью КОН с получением раствора L-лизина; b) нагревание раствора L-лизина с получением раствора, содержащего гиперразветвленный поли-L-лизин; с) удаление L-лизина и соли из раствора, содержащего гиперразветвленный поли-L-лизин; d) фракционирование раствора, содержащего гиперразветвленный поли-L-лизин, с получением фракции, содержащей гиперразветвленный поли-L-лизин, со средней молекулярной массой от 21000 до 32000; е) диализ и лиофилизация фракции, содержащей гиперразветвленный поли-L-лизин со средней молекулярной массой от 21000 до 32000, с получением лиофилизата; f) растворение лиофилизата в дистиллированной воде и диализ против NaHCO с получением раствора, содержащего HBPL; и g) инкубирование раствора, содержащего гиперразветвленный поли-L-лизин, с сефарозой 4 В, активированной циан ore нбро мидом, суспендированной в NaHCO, для получения гиперразветвленной матрицы сродства поли-L-лизина.
[085] В некоторых вариантах осуществления на стадии b) раствор L-лизина нагревают до 150°С в течение 48 часов в потоке азота. В некоторых вариантах осуществления на стадии с) раствор, содержащий гиперразветвленный поли-L-лизин, подвергают диализу против воды. В некоторых вариантах осуществления на этапе d) фракционирование проводят с помощью колонки исключения по размеру (size exclusion). В некоторых вариантах осуществления на этапе d) фракционирование проводят на колонке для гель-фильтрации.
[086] Также предложена колонка, содержащая гиперразветвленную аффинную матрицу поли-L-лизина (PLLAM), описанную выше.
[087] В еще одном аспекте предложено устройство, выполненное для проведения афереза, содержащее одну или более аффинных колонок, содержащих аффинную матрицу, и выполненное для удаления по существу всех типов вкДНК из крови или плазмы пациента. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит две или более аффинных колонок в последовательности. В некоторых вариантах осуществления устройство дополнительно содержит фильтрующий картридж. В некоторых вариантах фильтрующий картридж имеет вход и выход. В некоторых вариантах одна или более аффинных колонок имеют вход и выход.
[088] В некоторых вариантах осуществления устройство содержит два или более из следующих аффинных колонок, расположенных в любой последовательности: а) колонка, содержащая аффинную матрицу ДНК-связывающего белка (например, гистона); б) колонка, содержащая аффинную матрицу лектин (например, лектин Galanthus nivalis (GNA), лектин Narcissus Pseudonarcissus (NPA), конконавалина A, фитогемагглуттанина или циановирина); с) колонка, содержащая аффинную матрицу ДНК-связывающего полимера (например, катионный полимер, такой как, например, амино-концевой (-NH2) РАМАМ -дендример, гиперразветвленный поли-L-лизин или гиперразветвленный полиэтиленимин); d) колонка, содержащая аффинную матрицу анти-ДНК-антитела; е) колонка, содержащая аффинную матрицу ДНК-интеркалирующего агента (например, Hoechst 3342); f) колонка, содержащая аффинную матрицу антител против нуклеосом (ANAM); и g) колонка, содержащая аффинную матрицу анти-гистонового антитела.
[089] В некоторых вариантах осуществления устройство содержит одну из следующих комбинаций колонок, расположенных в любом порядке: (a) (i) аффинная колонка, содержащая ДНК-интеркалирующий агент Hoechst 33342 и (ii) аффинная колонка, содержащая анти-ДНК-антитело; или (b) (i) колонка с аффинной матрицей анти-нуклеосомных антител (ANAM) и (ii) колонка с аффинной матрицей, содержащей анти-ДНК-антитела; или (с) (i) колонка с аффинной матрицей анти-нуклеосомных антител (ANAM) и (ii) колонка с аффинной матрицей, содержащей полиамидоамин дендример (PDAM); или (d) (i) колонка с аффинной матрицей анти-нуклеосомных антител (ANAM) и (ii) колонка с аффинной матрицей содержащей гиперразветвленный поли-L-лизин (PLLAM); или (е) (i) аффинная колонка с анти-гистоновыми антителами Н2А, (ii) аффинная колонка с лектином, и (iii) аффинная колонка с гистоном H1, или колонка с аффинной матрицей, содержащей полиамидоаминный дендример (PDAM), или колонка с аффинной матрицей, содержащей гиперразветвленный поли-L-лизин (PLLAM) или колонка с аффинной матрицей, содержащей ДНК-интеркалирующий агент Hoechst 33342.
[090] В другом аспекте предложено устройство для афереза, содержащее фильтрующий картридж и одну или более аффинных колонок, имеющих вход и выход, в которых устройство способно захватывать практически все типы вкДНК, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды) из крови или плазмы пациента.
[091] В некоторых вариантах осуществления устройство содержит две или более аффинных колонки в последовательности. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная колонка в последовательности содержит ДНК-связывающий полимер или ДНК-интеркалирующий агент.
[092] В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе гистона на входе или перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе лектина. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе гистона перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе лектина или перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе РАМАМ. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе анти-ДНК-антитела перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе Hoechst 3342. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе антинуклеосомного антитела перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе РАМАМ.
[093] В некоторых вариантах осуществления устройство для афереза захватывает по меньшей мере 30 мг вкДНК за одну процедуру афереза. В некоторых вариантах осуществления аффинная колонка содержит молекулу, эффективно захватывающую одну или более фракций вкДНК: нуклеосом-связанных вкДНК, экзосом-связанных вкДНК, и несвязанных вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления иммобилизованная молекула выбрана из группы, состоящей из: ДНК-связывающего антитела, ДНК-интеркалирующего агента, ДНК-связывающего белка, ДНК-связывающего полимера, лектина, антитела против нуклеосом и антитела против гистонов.
[094] В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающий белок представляет собой гистон H1 (например, гистон Н1.3).
[095] В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающий полимер представляет собой катионный полимер. В некоторых вариантах катионный полимер представляет собой поли-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления поли-L-лизин представляет собой гиперразветвленный поли-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления катионный полимер представляет собой полиэтиленимин. В некоторых вариантах осуществления полиэтиленимин представляет собой гиперразветвленный полиэтиленимин. В некоторых вариантах осуществления катионный полимер представляет собой дендример с аминоконцевым (-NH2) полиамид о амином (РАМАМ).
[096] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанного устройство для афереза содержит две последовательных аффинных колонки, в которых одна колонка захватывает вкДНК, связанную с нуклеосомой, и вкДНК, связанную с экзосомой, а другая колонка захватывает несвязанную вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления аффинная матрица содержит одновременно иммобилизованные молекулы из комбинации двух или более групп молекул: ДНК-связывающее антитело, ДНК-интеркалирующий агент, ДНК-связывающий белок, ДНК-связывающий полимер, лектин, антитело против нуклеосом или антитело против гистонов.
[097] В другом аспекте предложен способ снижения уровня вкДНК в крови пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды).
[098] В некоторых вариантах осуществления способ эффективен для лечения одного или более заболеваний, выбранных из: полиорганной недостаточности, нейродегенеративного заболевания (например, болезни Альцгеймера), рака, сепсиса, септического повреждения почек, токсичности, вызванной облучением (например, острого радиационного синдрома), и токсичности, вызванной химиотерапией.
[099] В некоторых вариантах осуществления пациент имеет заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака, метастатического рака, острой органной недостаточности, инфаркта органа, геморрагического инсульта, болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD), отторжения трансплантата, сепсиса, системного синдрома воспалительного ответа (SIRS), синдрома полиорганной дисфункции (MODS), токсичности, вызванной облучением (например, острый лучевой синдром), токсичности, связанной с химиотерапией, травматического повреждения, провоспалительного статуса у лиц пожилого возраста, диабета, атеросклероза, нейродегенеративных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, эклампсии, бесплодия, нарушения свертываемости крови и инфекции.
[0100] В некоторых вариантах осуществления способ эффективен для лечения расстройства у пациента, где расстройство выбрано из рака, метастатического рака, острой органной недостаточности, инфаркта органа (включая инфаркт миокарда и ишемический инсульт, геморрагический инсульт), аутоиммунных расстройств, болезни трансплантат против хозяина (GVHD), отторжения трансплантата, сепсиса, синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), синдрома полиорганной дисфункции (MODS), болезни трансплантат против хозяина (GVHD), травматического повреждения, провоспалительного статуса у пожилых индивидуумов, диабета, атеросклероза, нейродегенеративного заболевания, аутоиммунного заболевания, эклампсии, бесплодия, нарушения свертывания крови, осложнений, связанных с беременностью, и инфекции. В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении расстройства.
[0101] В еще одном аспекте предложен способ лечения синдрома полиорганной недостаточности (MODS) у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы; и (b) возврат очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении MODS.
[0102] В другом аспекте предложен способ лечения нейродегенеративного заболевания у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении нейродегенеративного заболевания.
[0103] В другом аспекте предложен способ лечения болезни Альцгеймера у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении болезни Альцгеймера.
[0104] В другом аспекте предложен способ лечения рака у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении рака.
[0105] В другом аспекте предложен способ лечения сепсиса у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении сепсиса.
[0106] В другом аспекте предложен способ лечения повреждения почек у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении повреждения почек.
[0107] В другом аспекте предложен способ лечения токсичности, связанной с химиотерапией, у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении токсичности, связанной с химиотерапией.
[0108] В другом аспекте предложен способ лечения токсичности, индуцированной облучением (например, острый лучевой синдром) у пациента. Способ включает (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК; и (b) возврат очищенной крови или плазмы пациенту. Процедура афереза снижает уровень практически всех типов вкДНК в крови пациента, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления пациент нуждается в лечении токсичности, вызванной облучением.
[0109] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов кровь отводится от воротной вены пациента.
[ОНО] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанного очищенная кровь имеет пониженные уровни вкДНК по сравнению с уровнями вкДНК в крови у пациента до процедуры афереза.
[0111] В некоторых вариантах осуществления очищенная кровь имеет пониженные уровни всех связанных с нуклеосомами вкДНК, связанных с экзосомами вкДНК и несвязанных вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает периодический мониторинг уровня циркулирующей вкДНК в крови пациента и продолжение процедуры афереза для снижения уровня циркулирующей вкДНК по меньшей мере на 25% перед завершением процедуры афереза. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает периодический мониторинг уровня циркулирующей вкДНК в крови пациента и продолжение процедуры афереза у пациента для снижения циркулирующих уровней вкДНК по меньшей мере на 50% перед завершением процедуры афереза. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает периодический мониторинг уровня циркулирующей вкДНК в крови пациента и продолжение процедуры афереза у пациента для снижения уровней циркулирующей вкДНК по меньшей мере на 75% перед завершением процедуры афереза.
[0112] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеперечисленного по меньшей мере 30 мг вкДНК удаляют из крови пациента во время одной или нескольких последовательных процедур афереза.
[0113] В некоторых вариантах осуществления вышеописанного этапы способа повторяются или выполняются по расписанию. Этапы способа могут выполняться два раза в день, каждый день, каждые два дня, каждые три дня, каждые четыре дня, каждые пять дней, каждые шесть дней, каждую неделю, каждые восемь дней, каждые девять дней, каждые 10 дней, каждые 11 дни, каждые 12 дней и т.д. Образцы крови могут быть взяты у пациента и проверены на уровни вкДНК для оценки частоты проведения способов лечения.
[0114] Расположение аффинных колонок в последовательности может позволить захватывать практически все типы вкДНК, включая нуклеосом-связанную вкДНК, экзосом-связанную вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды), из крови или плазмы пациента.
[0115] Различные последовательности, описанные в настоящем документе, и другие варианты сочетания могут быть использованы. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе гистона перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе лектина. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе гистона перед колонкой, содержащей аффинную матрицу лектина или перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе полиамидоамин дендримера (PDAM). В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу, содержащую анти-ДНК-антитела перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе Hoechst 3342. В некоторых вариантах осуществления устройство содержит колонку, содержащую аффинную матрицу на основе анти-нуклеосомных антител (ANAM) перед колонкой, содержащей аффинную матрицу на основе полиамидоаминного дендримера (PDAM).
[0116] Частью различных аспектов, описанных в заявке, является (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы; и (b) возврат очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК пациенту.
[0117] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу, содержащую гистон. Аффинная матрица на основе гистона может содержать рекомбинантный человеческий гистон Н1.3. Аффинная матрица на основе гистона может быть частью аффинной колонки для проведения афереза. Шарики, используемые в качестве носителя в колонке, содержащей аффинную матрицу на основе гистона, могут быть целлюлозными шариками, которые окисляются окислителем перед связыванием с гистоном. Шарики могут быть, например, сефарозными шариками. В качестве альтернативы можно использовать иные носители помимо шариков (полое волокно, мембрана, трубки и т.д.). Носитель аффинной матрицы может быть изготовлен из других органических и неорганических соединений, известных специалисту в данной области техники, например, поливинилпирролидон (PVP), полисульфон (PS), полиэфирсульфон (PES), полиарилэфирсульфон (PAES), полиакрилат, поли (метил) метакрилат (РММА), поли(глицидилметакрилат) (PGMA), поли(гидроксиметакрилат), полистирол (PS), политетрафторэтилен (PTFE), полиакриламид, полиакролеин, акрилонитрил-бутадиен-стирол (ABS), полиакрилонитри (PAN), eupergit, полиэтиленгликоль (PEG), гиперфторуглерод, агароза (например перекрестно связанная агароза), альгинат, каррагинан, хитин, крахмал, целлюлоза, нитроцеллюлоза, сефароза, стекло, диоксид кремния, кизельгур, диоксид циркония, оксид алюминия, оксид железа, пористый углерод и смеси и/или производные указанных твердых носителей; и протонированные и депротонированные формы этого разделительного материала.
[0118] Шарики или иные носители могут быть покрыты ДНК-связывающими белками. ДНК-связывающие белки, такие как гистоны или анти-ДНК-антитела, могут быть иммобилизованы путем химического связывания их с твердым нерастворимым носителем, таким как полис ахаридные шарики. Например, агарозные шарики активируются с использованием цианогенбромида, и белок, захватывающий вкДНК, инкубируется с активированной агарозой, чтобы произошло связывание. Неконъюгированный материал удаляют промывкой буфером, и агарозу, связанную с белком, упаковывают в целевое устройство для афереза/ аффинный картридж. Существует много различных способов химического связывания белков с различными матрицами нерастворимых носителей. Указанные и другие матричные материалы, и способы их связывания с белками, известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы в любом из способов и устройств, описанных в настоящем документе.
[0119] Например, присоединение молекулы, захватывающей вкДНК, к твердому носителю может осуществляться с помощью амина, тиола, имида (например, водорастворимого карбодиимида) или другого метода химического присоединения, известного специалисту в данной области техники для присоединения полипептида или олигонуклеотида к твердому носителю.
[0120] Размер шариков может составлять, например, от 30 до 200 микрон, от 40 до 180 микрон, от 45 до 165 микрон, от 60 до 150 микрон. Можно использовать различные окислители, такие как метапериодат натрия (NaIO). Альтернативно, первичная гидроксильная группа целлюлозы может быть селективно преобразована с получением 6-дезокси-6-карбоксицеллюлозы путем окисления, опосредованного солями пиперидиноксоаммония (TEMPO), или окислена хлоритом. См., например, Eyle, S. and Thielemans, W., Surface modifucation of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756k). Также целлюлозный (или агарозный) носитель может быть окислен другими соединениями, известными специалисту в данной области техники, например хромовой кислотой, триоксидом пиридина хрома, диметилсульфоксидом. (см. например Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J.Biotechnology, 5 (1987) 255-265). Окисленные шарики затем инкубируют с достаточно очищенным и концентрированным раствором гистонового белка, такого как рекомбинантный человеческий гистон Н1.3. Реакция может быть остановлена и затем промыта буфером для удаления растворимых белковых загрязнений. Альтернативно, первичная гидроксильная группа целлюлозы может быть селективно преобразована с получением 6-дезокси-6-карбоксицеллюлозы путем окисления, опосредованного солями пиперидиноксоаммония (TEMPO), или окислена хлоритом. См. например Eyle, S. and Thielemans, W., Surface modifucation of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756k. Также целлюлозный (или агарозный) носитель может быть окислен другими соединениями, известными специалисту в данной области техники, например хромовой кислотой, триоксидом пиридина хрома, диметилсульфоксидом. См. например Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J.Biotechnology, 5 (1987) 255-265).
[0121] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу, содержащую гистон. Аффинная матрица на основе гистона может содержать рекомбинантный человеческий гистон Н1.3. Аффинная матрица на основе гистона может быть частью аффинной колонки для проведения афереза. Шарики, используемые в качестве носителя в аффинной колонке, содержащей аффинную матрицу на основе гистона, могут быть целлюлозными шариками, которые окисляются окислителем перед связыванием с гистоном. Шарики могут быть, например, сефарозными шариками. Шарики могут быть покрыты стрептавидином. Размер шариков может составлять, например, от 30 до 200 микрон, от 40 до 180 микрон, от 45 до 165 микрон, от 60 до 150 микрон. Можно использовать различные окислители, такие как метапериодат натрия (NaIO). Альтернативно, первичная гидроксильная группа целлюлозы может быть селективно преобразована с получением 6-дезокси-6-карбоксицеллюлозы путем окисления, опосредованного солями пиперидиноксоаммония (TEMPO). См., например, Eyle, S. and Thielemans, W., Surface modifucation of cellulose nanocrystals, Nanoscale, 2014, 6, 7764, DOI: 10.1039/c4nr01756k). Также целлюлозный (или агарозный) носитель может быть окислен другими соединениями, известными специалисту в данной области техники, например хромовой кислотой, триоксидом пиридина хрома, диметилсульфоксидом. См. например Peng, L. et al. Evaluation of activation methods with cellulose beads for immunosorbent purification of immunoglobulins, J.Biotechnology, 5 (1987) 255-265). Окисленные шарики затем инкубируют с достаточно очищенным и концентрированным раствором гистонового белка, такого как рекомбинантный человеческий гистон Н1.3. Реакция может быть остановлена и затем промыта буфером для удаления растворимых белковых загрязнений.
[0122] Аффинную матрицу на основе гистона можно получить способом, включающим a) окисление целлюлозных шариков размером от 100 до 250 микрометров с получением активированных целлюлозных шариков; b) промывание гранул активированной целлюлозы; с) приготовление концентрированного раствора рекомбинантного человеческого гистона Н1.3; d) инкубирование гранул активированной целлюлозы с концентрированным раствором рекомбинантного гистона человека Н1.3; и е) блокирование любых свободных групп СНО на гранулах активированной целлюлозы.
[0123] Вышеуказанный процесс может дополнительно включать: f) промывание гранул активированной целлюлозы буфером.
3
[0124] Любой окислитель может быть использован на стадии а). Одним примером окислителя является NaIO. Любой способ промывки может быть предпринят на этапе b). Например, гранулы активированной целлюлозы промывают бикарбонатом натрия, соляной кислотой и водой. На этапе с) можно использовать диализ или другие методы. Например, раствор рекомбинантного человеческого гистона Н1.3 диализируют, а диализированный раствор концентрируют в 0,1 М NaHCO при рН 7-9 или при рН 8. На этапе d) инкубацию можно проводить в течение 3-5 часов при 15-30°С или в течение 4 часов при комнатной температуре. На стадии е) этап блокирования включает добавление 1 М этаноламина к активированным целлюлозным шарикам и взаимодействие в течение от 30 минут до 2 часов при 15-30°С. На стадии f) шарики активированной целлюлозы могут быть промыты буфером TBS.
[0125] Шарики могут быть загружены в колонку, такую как, например, колонка из политетрафторэтилена (PTFE). Другие примеры колонок могут иметь стенку из поликарбоната, полиэтилена, поливинилхлорида, полипропилена, полиэфирсульфона, полиэфира или другого полимерного материала, одобренного FDA или ЕМЕА для изготовления устройств для экстракорпоральной обработки крови или компонента крови.
[0126] Колонка или картриджное устройство также могут быть изготовлены из нетоксичного материала, который обеспечивает жесткую опору для аффинной матрицы внутри. Обычно материал представляет собой пластиковую композицию, такую как поликарбонат, полиэтилен, поли винил хлорид, полипропилен, полиэфирсульфон, полиэфир, полистирол или другой подобный материал, одобренный регуляторами, такими как FDA или ЕМЕА, для изготовления устройств для экстракорпоральной обработки крови или компонента крови. В некоторых вариантах осуществления в нижней части колонны (картриджа) имеется внутренний фильтр для предотвращения выхода аффинной матрицы из устройства. В некоторых вариантах осуществления в верхней части устройства также имеется внутренний фильтр для содержания аффинной матрицы внутри устройства. В некоторых вариантах осуществления эти фильтры состоят из пластика и/или целлюлозного материала и имеют поры, которые обеспечивают возможность прохождения жидкости, такой как плазма, но не материала в виде частиц, такого как аффинная матрица.
[0127] При подготовке колонки, содержащей аффинную матрицу на основе гистона, аффинную матрицу на основе гистона можно загружать по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% объема колонки. Фосфатный буфер, в частности холодный фосфатный буфер, можно использовать для уравновешивания колонки. Другие подходящие буферы также могут быть использованы для уравновешивания колонки.
[0128] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу на основе лектина. Не лимитирующие примеры полезных лектинов включают, например, лектин Galanthus nivalis (подснежник) лектин (GNA), лектин Narcissus Pseudonarcissus (нарцисс) (NPA), Conconavalin А, фитогемаглуттанин и циановирин. В одном варианте осуществления лектин может быть связан с матрицей агарозы путем инкубации в течение ночи при нейтральном или слабощелочном рН. После такой инкубации может быть предпринята интенсивная промывка буфером при рН около 7,0-7,5 для удаления несвязанного лектина.
[0129] Аффинная матрица на основе лектина может быть получена в соответствии со способом, включающим а) взаимодействие лектина с активированными агарозными шариками для получения связанной с лектином агарозы; и b) промывание связанной с лектином агарозы буфером.
[0130] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу на основе полиамидоамин (РАМАМ) дендримера (PDAM) или полипропиленимин (PPI) дендримера. См., например, Kaur et al., J Nanopart Res., 2016, 18: 146. Дендримеры - это уникальные синтетические полимеры нанометрового размера с сильно разветвленной структурой и шаровидной формой. Среди дендримеров полиамидоамин (РАМАМ) получил наибольшее внимание в качестве потенциального агента для трансфекции и доставки генов, потому что эти макромолекулы связывают ДНК при физиологическом рН. РАМАМ - дендримеры состоят из алкилдиаминового ядра и третичных аминных ответвлений. Они доступны в десяти поколениях (G0-10) с 5 различными типами сердцевин и 10 функциональными группами поверхностей. ДНК и полиамидамин (РАМАМ) дендримеры образуют комплексы на основе электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновой кислоты и протонированными (положительно заряженными) аминогруппами полимеров. Образование комплексов с высокой молекулярной массой и высокой плотностью зависит главным образом от концентрации ДНК с увеличением за счет увеличения соотношения зарядов дендример-ДНК. (Shcharbin, D. et al., Practical Guide to Studying Dendrimers. Book, iSmithers Rapra Publishing: Shawbury, Shrewsbury, Shropshire, UK, 2010. 120 p. ISBN: 978-1-84735-444-0).
[0131] Аффинная матрица на основе РАМАМ -дендримера, полученная способом, включающим а) промывание целлюлозных гранул этанолом и водой; b) инкубирование промытых целлюлозных гранул с (±)-эпихлоргидрином и NaOH с получением активированных целлюлозных гранул; с) взаимодействие гранул активированной целлюлозы с РАМАМ - дендримером с получением гранул РАМАМ и удаление РАМАМ -дендримера, который не вступал в реакцию с гранулами активированной целлюлозы; и d) блокирование непревращенных эпоксидных групп на гранулах РАМАМ.
[0132] Шарики могут быть загружены в колонку, такую как колонка из политетрафторэтилена (PTFE). Другие примеры колонок могут иметь стенку из поликарбоната, полиэтилена, поливинилхлорида, полипропилена, полиэфирсульфона, полиэфира или другого полимерного материала, одобренного FDA или ЕМЕА для изготовления устройств для экстракорпоральной обработки крови или компонента крови.
[0133] Устройство для афереза, содержащее аффинную матрицу на основе РАМАМ-дендримера, может быть более эффективным при удалении вкДНК или, альтернативно, может более полно удалять вкДНК или, альтернативно, может удалять большее общее количество вкДНК в конкретном образце крови, чем при использовании устройства для афереза, содержащего аффинную матрицу на основе гистона и аффинную матрицу на основе лектина.
[0134] В определенных вариантах осуществления устройство для афереза может содержать одновременно аффинную матрицу на основе РАМАМ-дендримера, аффинную матрицу на основе гистона и аффинную матрицу на основе лектина.
[0135] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу на основе анти-ДНК-антитела. Антитела к ДНК составляют подгруппу антиядерных антител, которые связывают одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК или и то, и другое (антитело против дц+оц ДНК). Они могут быть, например, антителами IgM или любым из подклассов антител IgG. Антитела, которые связываются исключительно с одноцепочечной ДНК, могут связывать ее составляющие основания, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды и рибозо-фосфатный остов, все из которых присутствуют в отдельных нитях ДНК. Антитела, которые связывают двухцепочечную ДНК, могут связываться с рибозо-фосфатным остовом, парами оснований (дезоксигуанозин-дезоксицитидин и дезоксиаденозин-дезокситимидин) или конкретными конформациями двойной спирали (Bevra Hannahs Hahn, Antibodies to DNA. N Engl J Med 1998; 338: 1359-1368). Антитела к ДНК могут также связывать надмолекулярные структуры, содержащие ДНК, такие как нуклеосомы и хроматин.
[0136] Аффинная матрица на основе анти-ДНК-антитела может быть получена путем активации агарозных гранул, например N-гидроксисукцинимидом (NHS). Затем активированные шарики можно инкубировать с антителом или другим реагентом, который имеет сродство к ДНК. Избыток антител/реагентов затем удаляют промывкой.
3
[0137] Аффинная матрица на основе антител против нуклеосом (ANAM), полученная способом, включающим а) получение активированных агарозных гранул путем сшивания N-гидроксисукцинимида с агарозными гранулами; b) промывание активированных агарозных гранул буфером для связывания, содержащим NaHCO и NaCl; с) добавление в буфер для связывания антитела, которое связывается с нуклеосомами, где антитело получают из мыши MRL/Мр (-)+/+; d) инкубирование буфера для связывания, содержащего антитело, с активированными агарозными гранулами для получения аффинной матрицы на основе антинуклеосомных антител; и е) промывание аффинной матрицы антинуклеосомного антитела буфером для связывания и ацетатным буфером.
[0138] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу на основе интеркалятора ДНК. Есть несколько способов, которыми молекулы могут взаимодействовать с ДНК. Лиганды могут взаимодействовать с ДНК путем ковалентного связывания, электростатического связывания или интеркалирования. Интеркаляция происходит, когда лиганды соответствующего размера и химической природы помещаются между парами оснований ДНК. Связывающие ДНК агенты имеют тенденцию нековалентно взаимодействовать с молекулой ДНК хозяина двумя основными способами: (i) пронизывающая интеркаляция в бороздки, стабилизированная смесью гидрофобных, электростатических и водородных взаимодействий и (ii) классическая интеркаляция посредством интеркалирующей ассоциации, в которой плоский, гетероароматический фрагмент включается между парами оснований ДНК. Наиболее часто изучаемое интеркалирующее связывание представляет собой нековалентное стековое взаимодействие, возникающее в результате вставки плоского гетероциклического ароматического кольца между парами оснований двойной спирали ДНК. См. http://nptel.ac.in/courses/104103018/35. Hoechst 33342 представляет собой производное бисбензимида, которое связывается с АТ-богатыми последовательностями в малой бороздке двухцепочечной ДНК. Гетероциклический фрагмент в этом красителе важен для эффективного взаимодействия с двойной спиралью ДНК, что делает комплекс Hoechst-ДНК более стабильным.
[0139] Аффинная матрица на основе интеркалятора ДНК может быть получена путем окисления (активации) шариков, таких как шарики целлюлозы (носитель), реагирующих с соединением (линкером), таким как N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC), который связывает ДНК-интеркалятор (ДНК-связывающий фрагмент, т.е. Hoechst 33342), с поверхностью носителя. Шарики затем промывают.[0140] Аффинная матрица на основе Hoechst 3342, полученная способом, включающим а) окисление целлюлозных шариков; b) промывание окисленных целлюлозных шариков; с) взаимодействие промытых шариков окисленной целлюлозы с раствором, содержащим Hoechst 33342 и N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC), с получением шариков с иммобилизованным на них Hoechst 33342; и d) промывание шариков с иммобилизованным на них Hoechst 33342.
[0141] Устройство для афереза может содержать аффинную матрицу на основе гиперразветвленного поли-L-лизина. Аффинная матрица на основе
3
3
гиперразветвленного поли-L-лизина может быть получена способом, включающим а) растворение моногидрохлорида L-лизина в воде и нейтрализация с помощью КОН с получением раствора L-лизина; b) нагревание раствора L-лизина с получением раствора, содержащего поли-L-лизин; с) удаление L-лизина и соли из раствора, содержащего поли-L-лизин; d) фракционирование раствора, содержащего поли-L-лизин, с получением фракции, содержащей поли-L-лизин, со средней молекулярной массой от 21000 до 32000; е) диализацию и лиофилизацию фракции, содержащей поли-L-лизин со средней молекулярной массой от 21000 до 32000, с получением лиофилизата; f) растворение лиофилизата в дистиллированной воде и диализ против NaHCO с получением раствора, содержащего HBPL; и g) инкубирование раствора, содержащего HBPL, с сефарозой 4В, активированной цианогенбромидом, суспендированной в NaHCO.
[0142] В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство для афереза может содержать все или любое из следующего: аффинную матрицу на основе интеркалятора ДНК, аффинную матрицу Hoechst 33342, аффинную матрицу анти-ДНК антител, аффинную матрицу на основе РАМАМ, аффинную матрицу на основе гистона, аффинную матрицу на основе лектина и аффинную матрицу на основе поли-L-лизина.
[0143] Различные процедуры афереза и способы лечения описаны в заявке. Различные способы и процедуры включают (а) выполнение процедуры афереза, включающей отвод крови или плазмы от пациента в устройство для афереза для получения очищенной крови или плазмы; и (b) возврат очищенной крови или плазмы с пониженными уровнями вкДНК пациенту. Любая вена может быть выбрана для оптимального отвода крови. Например, кровь может отводиться от воротной вены пациента. Альтернативно, кровь может быть отведена из бедренной вены или яремной вены пациента.
[0144] В различных вариантах лечения процедура афереза может проводиться более одного раза или даже дважды, например, в 1-й и 3-й день. При лечении повреждения почек уровень повреждения почек можно оценивать путем измерения сыворотки. Уровни креатинина и азота мочевины в крови с помощью Roche Reflotron Plus (Roche Diagnostics) перед каждой процедурой афереза.
[0145] Циркулирующая вкДНК может быть извлечена из образцов плазмы с помощью обычного метода ТНР (Triton-Heat-Phenol) (Breitbach et al., PLoS ONE, 2014, 9 (3): e87838). Извлеченную вкДНК можно количественно определить с помощью различных тестов, таких как, например, тест PicoGreen (Molecular Probes, Нидерланды), следуя инструкциям производителя. Для визуализации вкДНК в агарозном геле, как описано в примерах ниже, можно использовать хорошо известные ДНК-красители, в том числе, например, этидийбромид (Sigma-Aldrich), алмазный краситель Diamond™ (Promega), SYBR Gold Nucleic Acid Gel (Molecular Probes). Красители могут быть использованы в качестве гелевого красителя, средства для предварительной обработки или могут быть предварительно загружены непосредственно в буфер загрузки образца.
[0146] В различных вариантах осуществления изобретения процедура афереза дополнительно включает разделение крови на плазму. Затем плазменная часть может быть направлена на одну или более аффинных матриц для удаления вкДНК.
ПРИМЕРЫ
[0147] Настоящее изобретение также описано и продемонстрировано с помощью следующих примеров. Однако использование этих и других примеров в любом месте описания является только иллюстративным и никоим образом не ограничивает объем и значение изобретения или любого приведенного в качестве примера термина. Аналогично, изобретение не ограничено какими-либо конкретными предпочтительными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, многие модификации и вариации изобретения могут быть очевидны для специалистов в данной области техники после прочтения этого описания, и такие вариации могут быть сделаны без отклонения от сущности или объема изобретения. Следовательно, изобретение должно быть ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения вместе с полным объемом эквивалентов, на которые имеют право указанные пункты формулы изобретения.
Пример 1. Получение аффинной матрицы на основе гистона H1 и аффинной колонки.
3
[0148] Аффинную матрицу на основе гистона H1 и аффинную колонку готовили следующим образом: целлюлозные шарики (размер шариков 100-250 микрометров, Sigma-Aldrich) окисляли метапериодатом натрия. Для этого водную суспензию шариков (3 г, 5 мл) и NaIO (0,1 г, 0,5 ммоль) в 10 мл воды встряхивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Активированные шарики собирали и промывали 1 М бикарбонатом натрия, 0,1 М соляной кислотой и 200 мл воды. Раствор рекомбинантного человеческого гистона Н1.3 (≥98% чистоты, Институт биоорганической химии, Москва) подвергали диализу и концентрировали (10 мл; 5 мг/мл) в 0,1 М NaHCO (рН 8). Затем раствор инкубировали с окисленными шариками (5 мл) при комнатной температуре в течение 4 ч при перемешивании. После инкубации 1 М этаноламин (1,5 мл) добавляли к суспензии активированных гранул (15 мл) для блокирования свободных групп СНО; Реакция продолжалась в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученные целлюлозные шарики с иммобилизованным гистоном H1 трижды промывали буфером TBS для удаления растворимых белковых загрязнений и для получения аффинной матрицы на основе гистона H1. Поликарбонатные колонки объемом 4-30 мл загружали (до 70-90% объема) целлюлозной матрицей с иммобилизованным гистоном H1.
Пример 2: Очистка крови больного раком от различных типов циркулирующей вкДНК
[0149] Отделение типа вкДНК, связанного с частицами (то есть вкДНК, связанного с нуклеосомой, и вкДНК, связанного с экзосомой) от несвязанной циркулирующей вкДНК проводили следующим образом: плазма от больного раком с прогрессирующей аденокарциномой желудка и множественными метастазами в легких и печени (T4N2M1) готовили путем сбора крови в пробирки, обработанные цитратом, и центрифугирования в течение 10 минут при 2000 g с использованием центрифуги с охлаждением и сбора супернатанта.
[0150] Связанную с нуклеосомами вкДНК и связанную с экзосомами вкДНК удаляли, используя две последовательно связанные аффинные колонки, содержащие аффинную матрицу на основе антигистоновых антител и аффинную матрицу на основе лектина, как описано соответственно в WO 2007 /049286 А1 и патенте США №9364601.
[0151] Вкратце, аффинную матрицу на основе антигистоновых антител и колонку готовили следующим образом: 0,5 мл (1 объем) покрытых стрептавидином шариков сефарозы (средний размер шариков: от 45 до 165 мкм, Pierce Biotechnology, США) помещали в полистирольную колонку объемом 1,3 мл. Колонку уравновешивали 2 мл (4 объема) забуференного фосфатом солевого раствора (PBS). 1 мл (объем) раствора биотинилированных антигистоновых антител с концентрацией 100 мкг/мл (Н2А.Х; Santa Cruz Biotechnologies) добавляли в колонку и позволяли войти в слой геля. Нижнюю и верхнюю крышки последовательно заменяли и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После инкубации колонку промывали 2 мл (4 объема) холодного забуференного фосфатом солевого раствора (PBS).
3
[0152] Аффинную матрицу на основе лектина готовили следующим образом: 2 мл (1 объем) лектина Galanthus nivalis (подснежник), то есть раствора GNA (Sigma-Aldrich), в концентрации 10 мг/мл в 0,1 М NaHCO, рН 9,5 добавляли к 2 мл (1 объем) гранул активированной CNBr агарозы (цианоген-бромид-активированная сефароза 6МВ, 6% агароза, макрогранулы диаметром 200-300 мкм, Sigma-Aldrich) и оставляли для реакции в течение ночи на холоде при рН 7,4-8,0. Когда реакция была завершена, агарозу, связанную с лектином, тщательно промывали стерильным холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) при рН 7,2-7,4. Полученную аффинную матрицу на основе лектина переносили в полистирольную колонку размером 0,6×6 см.
[0153] Для очистки от вкДНК, связанной с нуклеосомами, 1,0 мл плазмы наносили на первую аффинную колонку (содержащую аффинную матрицу на основе анти-гистонового антитела Н2А) и пропускали через колонку. Затем плазму помещали во вторую аффинную (связывающую экзосомы) колонку, содержащую аффинную матрицу на основе лектина [GNA] и пропускали через колонку.
[0154] В качестве альтернативы, такое же количество плазмы пациента пропускали через одну единственную аффинную колонку с гистоном H1, приготовленную, как описано в примере 1 (целлюлозные шарики, связанные с иммобилизованным гистоном Н1.3).
[0155] Все образцы плазмы анализировали гель-электрофорезом с окрашиванием флуоресцентным ДНК-красителем до афереза и после завершения афереза.
[0156] Электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК из плазмы больного раком перед удалением нуклеосом-связанной ДНК и экзосом (дорожка А), после последовательной аффинной очистки на колонках, содержащих аффинную матрицу на основе анти-гистоновых антител Н2А и аффинную матрицу на основе лектина (дорожка В) и очисткой на колонке содержащей аффинную матрицу на основе гистона Н1.3 (дорожка С) представлен на фигуре 1.
[0157] Несмотря на то, что связанная с нуклеосомами циркулирующая вкДНК и экзосомы были удалены из плазмы, образец, показанный на средней полосе (дорожка В), все еще содержал значительные количества циркулирующей вкДНК, визуализированной в пределах молекулярного диапазона 100-1000 пар оснований. Как показано на правой полосе, ДНК не визуализировалось в образце плазмы после прохождения через колонку, содержащую аффинную матрицу на основе гистона Н1.3. Таким образом, аферез/очистка плазмы пациента через колонку с аффинной матрицей на основе ДНК-связывающего белка (гистон Н1.3), может удалить большую часть, почти всю или всю нуклеосом-связанную вкДНК экзосом-связанную вкДНК и несвязанную вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды, из крови пациента.
Пример 3: Циркулирующая вкДНК, очищенная от связанной с нуклеосомами и экзосомами вкДНК, ускоряет рост опухоли
[0158] 60 мл плазмы от пациента с метастатической немелкоклеточной карциномой легкого (NSCLC T3N2M+) собирали в течение нескольких последовательных дней и очищали от вкДНК, связанной с нуклеосомами и от вкДНК, связанной с экзосомами, используя последовательно аффинные колонки на основе анти-гистонов ого антитела Н2.А и лектина, как описано в примере 2 (аффинная матрица на основе антигистоновых антител и аффинная матрица на основе лектина из Galanthus nivalis (подснежник)). Для приготовления аффинных колонок использовали колонки из поликарбоната размером 2,0×7,0 см. Каждая колонка была загружена на 70-80% объема колонки соответствующей аффинной матрицей. Оставшуюся после прохождения через колонки циркулирующую вкДНК экстрагировали из очищенной плазмы с использованием классической экстракции фенол/хлороформом и осаждения этанолом (Stirling, D. et al, DNA extraction from plasma and serum, In: Methods in Molecular Biology, vol. 226: PCR Protocols, Second Edition, Ed. by J.M.C. Bartlett and D. Stirling, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003, 556 pages). Высушенную экстрагированную вкДНК хранили при -70°С.Общее количество остаточной вкДНК, выделенной из плазмы пациента после ее очистки от вкДНК, связанной с нуклеосомам, и вкДНК, связанной с экзосомами, составило 9,7 мкг.ВкДНК повторно растворяли в PBS и использовали для экспериментов на животных, как описано ниже.
6
[0159] Влияние на рост опухоли вкДНК, которая не была связана с нуклеосомами и экзосомами, было изучено с использованием ортотопической модели Panc02/С57/BL6 (Jiang Y-J, Lee C-L, Wang Q, et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model. World Journal of Gastroenterology: WJG. 2014; 20(28): 9476-9485). 1×10 клеток Panc02, суспендированных в ледяном мартигеле, вводили в хвост поджелудочной железы каждого животного (день 0). 24 мыши с опухолями были разделены на 3 группы по 8 мышей в каждой. Мышам контрольной группы делали однократные ежедневные инъекции PBS (100 мкл; ретро орбитальный венозный синус) в течение 10 дней с 10 по 20 день. Мышам группы 1 ежедневно вводили 100 нг вкДНК от больного раком, очищенного как описано выше. Мышам из группы 2 в качестве неспецифического контроля вводили по 100 нг ДНК спермы лосося UltraPure ™ (Life Technologies) со средним размером ≤2000 пар оснований с использованием того же графика и метода введения.
[0160] Таблица 1 ниже суммирует результаты влияния инъекций ДНК на массу опухоли у животных по сравнению с контрольной группой. Вес опухоли измеряли в конце исследования на 23-й день.
[0161] На фигуре 2А показаны опухоли, вырезанные у мышей контрольной группы. На фигуре 2В показаны опухоли, вырезанные у мышей, получавших вкДНК из плазмы больного NSCLC T3N2M+, очищенной от вкДНК связанной с нуклеосомами и экзосомами. Опухоли контрольной группы были значительно меньше, плотные, хорошо отделены от соседних органов и не имели некроза и кровоизлияний.
[0162] Циркулирующая вкДНК из плазмы больного раком, очищенная от связанной с нуклеосомой и экзосомой циркулирующей вкДНК, сохраняет значительные онкогенные свойства. Таким образом, может быть полезно снизить уровни всей циркулирующей вкДНК: вкДНК связанной с нуклеосомами, вкДНК связанной с экзосомами и несвязанной вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды.
Пример 4: Получение аффинной матрицы с полиамидоаминным дендример ом и аффинной колонки на его основе
[0163] Аффинную матрицу на основе РАМАМ-дендримера (PDAM) и колонки, содержащей аффинную матрицу на основе PDAM, получали в соответствии с Wang (Wang, Y., et al., New method for the preparation of adsorbent with high adsorption capacity, Chinese Science Bulletin 2005, Vol.50, No. 21, pp 2432-2435) следующим образом. Целлюлозные шарики (Macroporous Bead Cellulose MT 500, размер частиц 100-250 мкм, Iontosorb, Чехия) дважды промывали 98% этанолом и дистиллированной водой. 1 грамм гранул инкубировали со смесью 1,0 мл (±)-эпихлоргидрина (Sigma-Aldrich) и 3,0 мл 2,5 М NaOH. Реакцию активации проводили при 40°С в течение 2,5 ч в шейкере. Активированные шарики тщательно промывали дистиллированной водой. Содержание эпоксидных групп определяли как около 0,31 ммоль/г сухих гранул путем титрования тиосульфатом натрия с хлористым водородом. 4,0 мл приготовленных влажных гранул активированной целлюлозы суспендировали с 9,0 мл 20% -ного раствора РАМАМ-дендримера с концевыми аминогруппами (-NH2) (ядро этилендиамина, поколение 3,0, Sigma-Alrich) и встряхивали при 24°С в течение 5 часов. После модификации непрореагировавший РАМАМ удаляли путем промывания дистиллированной водой, а оставшиеся непрореагировавшие эпоксидные группы на шариках блокировали путем взаимодействия с этиламином. Затем функционализированную аффинную матрицу промывали 0,1 М фосфатным буфером и водой MilliQ. 2,0-20,0 мл приготовленной аффинной матрицы помещали в апирогенную колонку из политетрафторэтилена (PTFE) (0,5-3,0) см×(1,0-10,0) см до загрузки 70-90% объема колонки. Подготовленную аффинную колонку стерилизовали авто клав ированием при 121°С в течение 30 мин.
Пример 5: Очистка плазмы крови больного раком и больного инсультом от различных типов циркулирующей вкДНК.
[0164] Аликвоты по 1,0 мл образцов плазмы пациента с ишемическим инсультом (через 24 часа после начала инсульта), и больного раком с запущенной аденокарциномой желудка с множественными метастазами в легких и печени (T4N2M1) очищали последовательно с помощью аффинных колонок на основе анти-гистонового антитела Н2.А и лектина как описано в примере 2 (аффинная матрица с анти-гистоновыми антителами Н2А и аффинная матрица с лектином из Galanthus nivalis (подснежник)) либо только через аффинную колонку с полиамидоаминным дендримером размером 0,6×10,0 см приготовленную, как описано в примере 4 (аффинная матрица на основе целлюлозных шариков, связанных с РАМАМ-дендримером).
[0165] Все образцы плазмы анализировали гель-электрофорезом с окрашиванием флуоресцентным красителем ДНК перед очисткой и после завершения очистки.
[0166] Электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК из плазмы этих пациентов до удаления связанной с нуклеосомами вкДНК и экзосом, после очистки на аффинных колонках с анти-гистоновым антителом и лектином, и после очистки с помощью аффинной колонки с полиамидоаминным дендримером представлен на фигуре 3.
[0167] Последовательная очистка плазмы больного раком с помощью аффинных колонок с антигистоновыми антителами и лектином удалила большую часть вкДНК, связанных с частицами; однако видимое количество вкДНК связанной с нуклеосомами, и циркулирующей вкДНК мононуклеосомного и субнуклеосомного размера (длиной менее 147 пар оснований), оставалось в плазме. Очистка плазмы с помощью аффинной колонки с дендримером полиамидоамин а (РАМАМ) приводит к полному удалению циркулирующей вкДНК из плазмы больного раком. У пациентов, перенесших инсульт, аффинная очистка с помощью аффинной колонки с полиамидоаминным дендримером (используется в качестве одностадийного процесса) приводит к достаточному удалению практически всех типов циркулирующей вкДНК из плазмы таким образом, что они не о бнаружив аются.
[0168] Таким образом, плазма крови пациента может быть очищена, по существу, от всех типов вкДНК, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды) с помощью аффинной матрицы, содержащей ДНК-связывающий полимер.
Пример 6: вкДНК плазмы крови, очищенная от вкДНК, связанной с нуклеосомами, и экзосом, обладает прокоагулянтной активностью
[0169] В патенте США №9642822 раскрыто, что циркулирующая вкДНК, связанная с нуклеосомами и обладающая с высокой молекулярной массой, представляющая собой внеклеточные ловушки нейтрофлов (NET) обладает прокоагулянтной активностью у пациентов с запущенным раком и острыми сосудистыми состояниями. Плазму крови пациента с инсультом (24 часа от момента начала) и больного раком с прогрессирующей аденокарциномой желудка с множественными метастазами в легких и печени (T4N2M1) отбирали и очищали последовательно через аффинные колонки как с лектином, так и с анти-гистоновым антителом (приготовленные, как описано в Примере 2 (аффинная матрица с анти-гистоновыми антителами Н2А и аффинная матрица с лектином из Galanthus nivalis
[подснежник]) или через аффинную колонку с полиамидоаминным дендримером 1,0×5,0 см (полученную, как описано в Примере 4). Далее очищенные и необработанные контрольные образцы плазмы дефибринировали вращением при 3000 g в течение 20 минут и фильтрованием через фильтр 0,22 мкм. Образцы разделяли на аликвоты в пластиковых пробирках по 1,0 мл, встряхивали на водяной бане при 50°С в течение 25 минут и центрифугировали при 10000 g (10 минут). Полученные супернатанты хранили при -80°С и затем тестировали в анализе образования тромбина следующим образом: смесь из 25 мкл разбавленного (1:9) тромбопластина (Sigma), 25 мкл 0,9% NaCl и 50 мкл 1:1 разбавленной дефибринированной плазмы (все реагенты были разведены в 0,9% NaCl).
[0170] Все реагенты в анализе образования тромбина были разведены в 0,9% NaCl. Смесь 25 мкл тромбопластина, 25 мкл 0,9% NaCl и 50 мкл разведенной дефибринированной плазмы в разведении 1:1 добавляли в лунки планшета для микротитрования и предварительно нагревали до 37°С в течение 10 минут.Затем последовательно добавляли 50 мкл 1 мМ спектрозима, хромогенного субстрата для тромбина и 50 мкл 30 мМ хлорида кальция. Планшеты считывали в автоматическом ридерном планшете для иммуноферментного анализа (Victor, Perkin Elmer) при 1000 сек. и 405 нм при комнатной температуре. Все измерения были выполнены в трех повторах. В этом тесте значение OD пропорционально прокоагулянтной активности плазмы (генерация тромбина).
[0171] Результаты показаны в Таблице 2. Таким образом, не только вкДНК, связанная с нуклеосомами и экзосомами, но также несвязанная вкДНК обладает прокоагулянтной активностью при раке и острых сосудистых событиях. Таким образом, снижение уровней всех типов вкДНК, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды) является выгодным.
Пример 7. Получение аффинной матрицы и колонки на основе анти-ДНК антитела
3
[0172] Аффинную матрицу на основе анти-ДНК-антитела и аффинную колонку получали следующим образом: использовали 5 мл сферических шариков из активированной N-гидроксисукцинимидом (NHS) 4% агарозы с высокой степенью перекрестной сшивки, средний размер шариков 90 микрометров (NHS-активированная сефароза 4 Fast Flow, GE Healthcare Life Sciences). Активированную матрицу дважды промывали холодным (2-4°С) буфером для связывания (0,2 М NaHCO, 0,5 М NaCl, рН 8,3). 1000 мкг высокоаффинного мышиного моноклонального антитела IgM против дц и оц ДНК ([49/4А1], ab35576, Abeam) подвергали диализу против буфера для связывания и затем связывали в соответствии с инструкцией производителя с NHS-активированной сефарозой. Три цикла промывки буфером для связывания с последующей промывкой 0,1 М ацетатным буфером (рН 4,0) использовали для удаления избытка несвязанных антител 4 мл промытой аффинной матрицы вносили в 5 мл колонку после чего аффинную колонку уравновешивали стерильным трис-HCl буфером (рН 7,4).
Пример 8: Получение ДНК-интеркаляторной аффинной матрицы и колонки на основе ДНК-интеркалятора
[0173] Аффинную матрицу на основе Hoechst 33342 и соответствующую аффинную колонку готовили следующим образом: целлюлозные шарики (размер шариков 100-250 микрометров, Sigma-Aldrich) окисляли метапериодатом натрия. Для этого водную суспензию шариков (3 г, 5 мл) и NaIO (0,1 г, 0,5 ммоль) в 10 мл воды встряхивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Активированные шарики собирали и промывали 1 М бикарбонатом натрия, 0,1 М соляной кислотой и 200 мл воды. 450 мг шариков активированной целлюлозы смешивали с 1000 мл рН забуференого раствора, содержащего 0,047 мг/мл Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) и 0,4 мг/мл N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC) и проводили реакцию с постоянной скоростью встряхивания в течение 1 ч при 32°С. Шарики с иммобилизованным Hoechst 33342 трижды промывали деионизированной водой для удаления непрореагировавшего красителя. Подготовленную аффинную матрицу на основе ДНК-интеркалятора помещали в пластиковую (поликарбонатную) колонку объемом 4 мл. Колонку хранили при 4°С.
Пример 9. Разделение различных типов циркулирующей вкДНК крови пациента с синдромом системного воспалительного ответа (SIRS) и синдромом полиорганной дисфункции (MODS).
[0174] Образцы плазмы получали от пациента, поступившего в отделение интенсивной терапии (ICU) с диагнозом синдром системного воспалительного ответа (SIRS) с полиорганной недостаточностью (синдром полиорганной дисфункции, MODS), вторичными по отношению к острому панкреатиту. Терапевтический плазменный обмен (ТРЕ) проводился в качестве спасательной терапии. Аликвоты по 1 мл плазмы пациента полученной при плазмообмене очищали через аффинные колонки как с лектином, так и с анти-гистоновым антителом, как описано в примере 2 (аффинная матрица с анти-гисто новы ми антителами и аффинная матрица с лектином из Galanthus nivalis (подснежник)) или через аффинную колонку с интеркалятором, как описано в примере 8 (целлюлозные шарики, соединенные с Hoechst 33342, аффинная матрица на основе ДНК интеркалятора). Все образцы плазмы анализировали гель-электрофорезом с окрашиванием флуоресцентным красителем ДНК перед очисткой и после очистки.
[0175] Как показано на фигуре 4, плазма пациента SIRS содержала значительные количества циркулирующей вкДНК, которая давала сильный флуоресцентный сигнал после окрашивания флуоресцентным красителем ДНК. Очистка плазмы афинными колонками на основе анти-гистонового антитела и лектина удалила вкДНК связанную с нуклеосомами, однако определенное количество связанной с нуклеосомами циркулирующей вкДНК и циркулирующей субнуклеосомной вкДНК (длиной менее 147 пар оснований) оставалось в плазме. Аффинная очистка с помощью аффинной колонки Hoechst 33342 приводила к удалению циркулирующей субнуклеосомной вкДНК, но определенное количество связанной с нуклеосомой циркулирующей вкДНК все еще присутствовало. Поэтому авторы изобретения протестировали последовательную очистку с различными колонками: аликвоту 1 мл плазмы пациента очищали последовательно через аффинную колонку с интеркалятором Hoechst 33342 с последующей очисткой на аффинной колонке содержащей матрицу на основе антитела против ДНК способом, описанным в примере 2 для последовательного использования аффинных колонок на основе антитела против гистона и на основе лектина. После этого плазму проверяли с помощью гель-электрофореза с окрашиванием флуоресцентным ДНК-красителем, и циркулирующая вкДНК не была обнаружена.
[0176] Таким образом, очистка с использованием комбинаций аффинных матриц по настоящему изобретению, может удалить практически все типы вкДНК в крови пациента, включая вкДНК связанную с нуклеосомами, вкДНК связанную с экзосомами и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды) из крови или плазмы пациента.
Пример 10. Циркулирующая вкДНК плазмы, очищенной от вкДНК связанной с нуклеосомами и вкДНК связанной с экзосомами, обладает провоспалительной активностью и способствует дисфункции органов при сепсисе.
[0177] Плазму получали от пациента, поступившего в отделение интенсивной терапии (ICU) с диагнозом синдром системного воспалительного ответа с синдромом полиорганной дисфункции (MODS), вторичным по отношению к острому панкреатиту. Терапевтический обмен плазмы проводился в качестве спасательной терапии. 100 мл отобранной плазмы пациента дважды очищали через аффинные колонки как с лектином, так и с анти-гистоновыми антителами (как описано в примере 2, т.е. через аффинную матрицу с антигистоновыми антителами и аффинную матрицу с лектином из Galanthus nivalis
[подснежник]) дважды для обеспечения полной очистки от вкДНК связанной с нуклеосомами и экзосомами. Оставшуюся циркулирующую вкДНК экстрагировали из плазмы, очищенной из нуклеосом и экзосом, как описано в примере 3. Общее количество остаточной ДНК (выделенной из плазмы пациента, очищенной до этого из циркулирующей вкДНК, связанной с нуклеосомами и экзосомами), составляло около 50 мкг.Выделенную ДНК ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) при рН 7,2 и использовали для эксперимента на животных, как описано ниже.
[0178] Восемь 10-недельных самцов мышей С57/BL6 внутривенно инъецировали 1 мкг экстрагированной вкДНК три раза с интервалом 1 час.Животных подвергали эвтаназии через 4 часа после последней инъекции ДНК для сбора крови.
[0179] Уровни креатинина в плазме измеряли ферментативным анализом. Иммунноанализ на основе флуоресцентных магнитных шариков (Bio-Rad Laboratories, США) использовали для определения в плазме TNF-a, IFN-g и IL-12. Результаты приведены в таблице 3 ниже.
[0180] Таким образом, вкДНК плазмы, очищенная от вкДНК, связанной с нуклеосомами и экзосомами обладает сильной провоспалительной активностью и способствует нарушению функции органов.
Пример 11. Циркулирующая вкДНК плазмы пациента, очищенная от нуклеосом-и экзосом-связанной вкДНК, но не очищенная от несвязанной вкДНК, ответственна за активацию TLR9.
[0181] Активация рецепторов TLR9 была недавно признана важным компонентом в развитии системного воспалительного ответа, недостаточности органов, инвазии рака и метастазирования, повреждения нейронов при инсульте, аутоиммунного состояния, эклампсии и возрастной дерегуляции иммунитета, приводящей к связанному с возрастом провоспалительному статусу.
[0182] Пациентом был 33-летний мужчина с острым миелоидным лейкозом и получивший HLA-подобранный трансплантат костного мозга (ВМТ) с последующей стандартной иммуносупрессией и антибиотикопрофилактикой. Приблизительно через 1 месяц после ВМТ у пациента появилась эритематозная сыпь, соответствующая РТПХ III степени и тяжелая диарея. Образцы плазмы были получены о при поступлении пациента и очищались последовательно через аффинные колонки как с лектином, так и с анти-гистоновыми антителами (как описано в примере 2, т.е. через аффинную матрицу с антигистоновыми антителами и аффинную матрицу с лектином из Galanthus nivalis
[подснежник]) или очищалась с помощью аффинной колонки с гистоном Н1.3, полученную, как описано в примере 1 (аффинная матрица на основе целлюлозных шариков, связанных с гистоном Н1.3).
[0183] Репортерные клетки hEK-Blue ™ hTLR9 (Invivogen) промывали средой для отделения их от колбы для культивирования, и клетки ресуспендировали до плотности клеток, указанной в протоколе производителя. 180 мкл клеточной суспензии в лунке стимулировали в течение 24 ч (37°С, 5% СО) с помощью 60 мкл необработанной плазмы пациента, плазмы очищенной через аффинные колонки с антителами к гистону и лектином плазмы, очищенной через аффинную колонку с гистоном Н1.3 (за одну стадию). После инкубации анализ секретированной эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) проводили с использованием среды для детекции Quanti-Blue, как описано в инструкциях производителя. Детекцию поглощения при 650 нм измеряли с использованием считывающего устройства для микропланшетов.
[0184] Количественную оценку активации TLR9 проводили путем считывания оптической плотности (OD) при 620 нм. (N=3.) Результаты показаны в таблице 4. Удивительно, что удаление циркулирующей вкДНК, связанной с экзосомами и нуклеосомами, предотвращало активацию TLR9 плазмой пациента в довольно ограниченной степени, в то же время удаление практически всех типов вкДНК включая связанную с частицами и несвязанную с частицами дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды, почти полностью предотвращала активацию TLR9 плазмой пациента.
Пример 12. Получение гиперразветвленной аффинной матрицы поли-L-лизина (PLLAM) и аффинной колонки.
[0185] Известно, что катионные полиаминокислоты, такие как поли-Е-лизин (PLL), эффективны для конденсации плазмидной ДНК в компактные наноструктуры и используются для связывания ДНК in vitro и in vivo.
3
3
3
[0186] Катионный ДНК-связывающий полимер, а именно гиперразветвленный поли-Е-лизин (HBPL), получали, как описано у Kadlecova, Z. et al, A comparative study on the in vitro cytotoxicity of linear, dendritic and hyperbranched polylysine analogs, Biomacromolecules, v. 13 (2012) pp 3127-3137): 27,45 г моногидрохлорида L-лизина (уровень реагента>98%, Sigma-Aldrich, США) растворяли в 55 мл воды Milli-Q и нейтрализовали 8,4 г КОН. Затем раствор нагревали до 150°С в течение 48 ч в токе азота. Затем для удаления избытка соли и оставшегося L-лизина продукт полимеризации диализовали с помощью диализной мембранной трубки против воды Milli-Q (Snakeskin Dialysis Tubing, Thermo Fisher Scientific, Швейцария, отсекаемая молекулярная масса: 3000 г/моль). Продукт диализа сушили и позднее фракционировали на гель-фильтрационной колонке Sephadex G75 (GE Healthcare Life Science, Швейцария): в колонку загружали 50 мл 2 мг/мл раствора HBPL в 0,01 М HCl и последующем элюировали 0,01 М HCl. Фракции по 20 мл собирали и лиофилизировали. Фракцию со средней молекулярной массой 21000-32000 (как определено с помощью эксклюзионной хроматографии) собирали и лиофилизировали. Лиофилизированную фракцию растворяли в бидистиллированной воде, диализовали против 0,1 М NaHCO и использовали для дальнейшего приготовления аффинной матрицы. Агарозную матрицу, которая содержит иммобилизованный HBPL, получали обычным способом следующим образом: сефарозу 4 В, активированную цианогенбромидом (влажная масса 10 г, Sigma), суспендировали в 10 мл 0,1 М NaHCO, смешанного с 10 мл фракции 21000-32000 HBPL (5 мг/мл в 0,1 М NaHCO) и перемешивали в течение 24 ч при 4°С.Полученную сефарозу HBPL (4 мг HBPL на мл суспензии шариков) затем вносили в поликарбонатную колонку (1,0×12 см) и промывали 750 мл 0,1 М NaHCO3, 750 мл 0,5 М NaCl, рН 9,2. Колонку уравновешивали 0,05 М трис-HCl-буфером, рН 7,5. Подготовленную аффинную колонку с гиперразветвленной аффинной матрицей поли-L-лизина (PLLAM) хранили при 4°С.
Пример 13. Разделение различных типов циркулирующей вкДНК крови пациента с нейродегенеративным заболеванием.
[0187] Циркулирующая вкДНК у пациентов с нейродегенеративными нарушениями может проходить через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) и вызывать гибель нейрональных клеток. Использование фермента дезоксирибонуклеазы может предотвращать этот эффект.См. WO2016190780. Чтобы исследовать влияние различных подтипов циркулирующей вкДНК на гибель нейрональных клеток и выяснить, может ли очистка крови одновременно от вкДНК связанной с нуклеосомами, вкДНК связанной с экзосомами и несвязанной вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды, предотвращать гибель нейронных клеток, были проведены следующие эксперименты.
2
2
[0188] Для получения нейронных культур церебральные кортикальные слои удаляли из эмбрионов (Е) 15-17 дней крыс Sprague Dawley. Кортикальные эксплантаты рассекали на кусочки размером около 200-400 мкм, используя тонкие иглы, и диссоциировали с помощью системы диссоциации папаина (Worthington Biochemicals) в соответствии с инструкциями производителя и далее хранили на ледяной минимальной необходимой среде (Gibco). Нейроны наносили на стеклянные покровные стекла диаметром 13 мм, покрытые сначала поли-D-лизином (10 мкг/мл в PBS), а затем ламинином (10 мкг/мл в PBS) (Gibco) и культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере 8% СО (об./об.) в течение 24 часов в нейробазальной среде с 1% (об./об.) антибиотика-антимикотика (Gibco).
[0189] После начального периода культивирования среду для культивирования клеток разводили в два раза (об./об.) одним из следующих образцов плазмы с последующим культивированием в течение еще 24 часов: (а) плазма здорового 20-летнего донора, (b) плазма пациента с быстро прогрессирующей болезнью Альцгеймера (AD), (с) плазма того же пациента с AD, обработанная в течение 6 часов ДНКазой I (Pulmozyme, Genentech) в концентрации 5 мкг/мл, (d) плазма того же пациента с AD, пропущенная через аффинные колонки как с лектином, так и с анти-гистоновыми антителами (как описано в примере 2, т.е. через аффинную матрицу с антигистоновыми антителами и аффинную матрицу с лектином из Galanthus nivalis [подснежник]) и (е) плазма того же пациента после прохождения через аффинную колонку с гистоном Н1.3 (матрица была приготовлена, как описано в примере 1, то есть аффинная матрица на основе целлюлозных шариков, связанных с гистоном Н1.3 помещенная в поликарбонатную колонку 0,8×9 см (до 80% от объема колонки). Через соответствующие колонки было пропущено около 2,0 мл. плазмы.
[0190] Электрофоретический профиль циркулирующей вкДНК из образцов плазмы, используемых в экспериментах по культивированию клеток, представлен на фигуре 5.
[0191] В плазме здорового донора было обнаружено только незначительное ограниченное количество связанной с нуклеосомами циркулирующей вкДНК в форме мононуклеосом. Высокие уровни связанной с нуклеосомами циркулирующей вкДНК в форме моно- и олигонуклеососм были обнаружены в плазме пациента с AD. Обработка плазмы пациента с AD ферментом ДНКазой I приводила к снижению содержания вкДНК в олигонуклеосомной и мононуклеосомной фракциях, но со значительным увеличением вкДНК в субнуклеосомной фракции (~ менее 147 пар оснований в длину). Плазма пациента с AD, очищенная с помощью аффинных колонок с антителами к гистону Н2А и лектином не содержала связанной с нуклеосомой циркулирующей вкДНК, а имела только субнуклеосомную (то есть несвязанную) вкДНК. Плазма пациента с AD, очищенная с помощью аффинной колонки с гистоном Н1.3 (в один этап), не содержала циркулирующей вкДНК.
[0192] Индукцию маркера апоптической гибели клеток каспазы 3 определяли в диссоциированных кортикальных нейронах, культивируемых в течении 24 часов после внесения образцов плазмы. Клетки фиксировали в 4% (мас./об.) параформальдегиде (PFA) и инкубировали в течение 1 часа с расщепленным антителом против каспазы 3 (Abeam), разведенным 1: 500 в PBS. Клетки промывали и инкубировали в течение 1 часа с козьими анти-кроличьими поликлональными антителами Alexa Fluor 488 (hwitrogen в PBS с последующей отмывкой и подсчетом.
[0193] Результаты показаны в таблице 5. Таким образом, очистка крови по существу от всех типов вкДНК, включая связанную с нуклеосомами вкДНК, связанную с экзосомами вкДНК и несвязанную вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды), предотвращает гибель нейронных клеток существенно в большей степени, чем простая очистка от нуклеосом-связанной вкДНК и экзосом-связанной вкДНК и даже лучше, чем расщепление циркулирующей вкДНК в плазме ферментом ДНКазой I, вероятно, из-за высвобождения побочных продуктов ферментативного расщепления ДНК или низкой чувствительности циркулирующей вкДНК к ДНКазе I.
Пример 14: Реактивация эндогенной дезоксирибонуклеазы
[0194] Фермент дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) является основным ферментом, ответственным за деградацию высокомолекулярной ДНК в кровообращении. Многочисленные исследования показывают, что активность дезоксирибонуклеазы подавляется в определенных условиях, включая повышение циркулирующей вкДНК в крови, таких как рак, метастатический рак, аутоиммунное заболевание, сепсис, бесплодие (Tamkovich SN, Circulating DNA and DNase activity in human blood. Ann N Y Acad Sci. 2006 Sep; 1075:191-6; Martinez-Valle, DNase 1 activity in patients with systemic lupus erythematosus: relationship with epidemiological, clinical, immunological and therapeutical features. Lupus. 2009 Apr; 18(5): 418-23; EP20070827224; Travis J Gould, Cellular and Biochemical Properties of Cell-Free DNA: A Prognostic Marker in Severe Sepsis Patients, Blood 2011, 118: 2169).
[0195] Чтобы оценить, как снижение уровня нуклеосом-связанной вкДНК, экзосом-связанной вкДНК и несвязанной вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотидов влияет на активность ДНКазы I в плазме, был проведен следующий эксперимент.ВкДНК измеряли в плазме с использованием метода, описанного Goldstein (Goldshtein, Н. et al., A rapid direct fluorescent assay for cell-free DNA quantification in biological fluids, Annals of Clinical Biochemistry, Vol 46, Issue 6, pp.488^194). SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen) сначала разбавляли в соотношении 1: 1000 в диметилсульфоксиде, а затем в соотношении 1: 8 в фосфатно-солевом буфере. 10 мкл образцы плазмы наносили в 96-луночные планшеты. 40 мкл разведенного SYBR Gold добавляли в каждую лунку (конечное разведение 1: 10000) и флуоресценцию измеряли с помощью 96-луночного флуорометра при длине волны излучения 535 нм и длине волны возбуждения 485 нм.
[0196] Вестерн-блоттинг ДНКазы I проводили в образцах плазмы, разделенных с использованием 10% гелей SDS-PAGE перенесенных на блоттинговые мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) и инкубированных с козьими антителами против ДНКазы I человека (Santa Cruz Biotechnology). Связывание визуализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal (Pierce) после инкубации с конъюгированным с HRP IgG козы.
[0197] Активность дезоксирибонуклеазы в сыворотке крови измеряли с использованием ORG590 (Orgentec) в соответствии с протоколом производителя. Детектирование проводили с использованием фотометра для микропланшетов (Multiscan FC) при 450 нм с коррекцией длины волны 620 нм.
[0198] Образцы крови были взяты у 56-летней пациентки с раком молочной железы, множественными метастазами в легких, печени и средостении (T4N3M1). Аликвоту плазмы объемом 5 мл подвергали многократным пассажам через поликарбонатную колонку объемом 1 мл (0,5×5 см), содержащую 0,5 мл аффинной матрицы на основе гистона Н1.3: оценку электрофоретического профиля циркулирующей вкДНК, вестерн-блоттинг ДНКазы и количественную оценку дезоксирибонуклеазной активности проверяли после каждого пассажа плазмы через колонку. Результаты суммированы на фигуре 6.
[0199] Электрофоретическая оценка профиля циркулирующей вкДНК показала непрерывное снижение содержания всех фракций вкДНК по мере увеличения числа пассажей через колонки. Это наблюдение было подтверждено прямой количественной оценкой циркулирующей вкДНК в плазме. Сравнимое количество фермента ДНКазы I, обнаруженное вестерн-блоттингом, изначально присутствовало в плазме пациента. Однако ферментативная активность ДНКазы I была сильно подавлена и стала значимой только после 4 кратного пассажа через колонки, когда количество циркулирующей вкДНК уменьшилось примерно вдвое.
[0200] Таким образом, аферез в соответствии с настоящим изобретением, в котором общие циркулирующие уровни вкДНК снижены по меньшей мере на 50%, может реактивировать активность эндогенного фермента ДНКазы I, что полезно для пациентов, которым требуется снижение уровней циркулирующей вкДНК.
[0201] Принимая во внимание самые высокие зарегистрированные уровни циркулирующей вкДНК, составляющей приблизительно 5000 нг/мл (которые сообщаются для некоторых пациентов с поздними стадиями рака, септических расстройств и пациентов с травмой), аффинная колонка или комбинация аффинных колонок со связывающей способностью 30 мг могла бы обеспечить почти полную очистку плазмы пациента от всей с вкДНК, связанной с нуклеосомами, вкДНК, связанной с экзосомами, и несвязанной вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды.
Пример 15: Получение аффинной колонки, содержащей аффинную матрицу на основе антител против нуклеосом (ANAM)
[0202] Мышиное моноклональное нуклеосом-специфическое антитело получали с использованием мыши MRL/Мр (-)+/+в соответствии со способом, описанным в М. J. Losman (Monoclonal autoantibodies to subnucleosomes from a MRL/Mp (-)+/+mouse. Oligoclonality of the antibody response and recognition of a determinant composed of histones H2A, H2B, and DNA. J Immunol March 1, 1992, 148 (5) 1561-1569). Подготовленные моноклональные (IgG) антитела (mAb), названные в данном описании как AN-1 и AN-44, соответственно, были отобраны на основе их способности селективного связывания нуклеосом, но не компонентов нуклеосом, таких как коровые гистоны или ДНК. (Kees Kramers, Specificity of monoclonal anti-nucleosome auto-antibodies derived from lupus mice, Journal of Autoimmunity, V. 9, Issue 6, 1996, P. 723-729). Относительная аффинность AN-1 и AN-44 к нуклеосомам и гистоновым и не гистоновым компонентам нуклеосомы суммирована в таблице 6 ниже.
[0203] 1 мл колонка HiTrap, содержащая NHS активированную сефарозу Sepharose High Performance (GE Healthcare) была использована для приготовления аффинной матрицы и картриджа. 200 мкг AN-1 связывали в соответствии с процедурой производителя с NHS-активированной сефарозой.
[0204] На основании данных об аффинности, представленных в таблице выше, очевидно, что аффинная матрица ANAM связывает только вкДНК связанную с нуклеосомами, но не несвязанную циркулирующую вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды.
[0205] Таким образом, для обеспечения связывания несвязанной вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды, в эксперименте на животных использовали две последовательно связанные колонки. Одна колонка с аффинной матрицей на основе антител против нуклеосом (ANAM) была приготовлена, как описано выше в этом примере. Вторую колонку с аффинной матрицей на основе полиамидоаминного дендримера готовили, как описано в примере 4.
Прмер 16: Процедура афереза
[0206] Постоянные венозные катетеры вводили в бедренную вену и яремную вену экспериментальных крыс под общей анестезией (т.е. инъекция 0,8 мг ксилазина и 4 мг кетамина). Катетеры промывали три раза в неделю гепаринизированным физиологическим раствором во время исследования. Перед каждой процедурой афереза вводили гепариновый болюс (90 МЕ/100 г массы тела (масса тела). Экстракорпоральная система была полностью заполнена гепаринизированным физиологическим раствором, после чего концы катетеров соединялись с экстракорпоральной системой.
[0207] Для экспериментов с аферезом на животных аффинные колонки, описанные в данном описании, были снабжены входами и выходами для дальнейшего встраивания этих подготовленных аффинных колонок во второй (плазменный) контур системы экстракорпорального/афереза.
[0208] В первом контуре системы кровь откачивали (вращающийся перистальтический мини-насос, Fisher Scientific) от животного (бедренная вена) через плазменный сепаратор (Saxonia medical, Radeberg, Germany) и возвращали животному посредством венозного катетера. Отделенная плазма поступала во второй контур (через второй вращающийся перистальтический мини-насос) и проходила через один или более аффинных картриджей в соответствии с конкретными примерами процедур афереза, описанных в этом описании. В первом контуре системы кровь откачивали (вращающийся перистальтический мини-насос, Fisher Scientific) от животного (бедренная вена) через плазменный сепаратор (Saxonia medical, Radeberg, Germany) и возвращали животному с помощью вставленного венозного катетера в яремную вену. Отделенная плазма поступала во второй контур (поддерживаемый вторым перистальтическим мини-насосом Rotary) и проходила через аффинные картриджи (в соответствии с конкретными примерами процедур афереза, описанных в этом описании) и возвращалась в организм животного через полимерную линию, также соединенную с катетером, вставленным в яремную вену.
Прмер 17: Применение афереза для лечения сепсиса и септического поражения почек
[0209] Были использованы классические модели индукции сепсиса методом лигирования и пункции слепой кишки (CLP). Использовали самок крыс Sprague-Dawley (SD) массой тела 350-400 г. Животных анестезировали пентобарбиталом натрия (50 мг/кг внутрибрюшинно).
[0210] Осуществляли срединный абдоминальный разрез около 1,5 см. Брыжейка слепой кишки была вскрыта, чтобы обнажить слепую кишку. Затем слепую кишку лигировали между терминалом и илеоцекальным клапаном, чтобы сохранить непрерывность кишечника. Затем слепую кишку перфорировали однократной сквозной пункцией иглой 21-го калибра в центральном сегменте перевязки. Связанный сегмент осторожно прижимали, чтобы небольшое количество фекалий было выдавлено на поверхность кишечника. Слепая кишка была возвращена в брюшную полость. Хирургическая рана была зашита послойно с рассасывающимся швом для мышечного слоя и хирургическими скобками для кожи. После операции крысам вводили 10 мл/кг теплого 0,9% хлорида натрия для инъекций и после восстановления животных случайным образом разделяли на группы (группы 1-3; по 6 животных в каждой группе) согласно лечению.
[0211] Лечение аферезом проводили, как описано в Примере 16. Процедуру афереза проводили дважды: в день 1 (через 24 часа после CLP) и на день 3 (через 72 часа после CLP). 6 крыс получали процедуру афереза с использованием колонки/картриджа с аффинной матрицей на основе антинуклеосомных антител (ANAM), предварительно приготовленной, как указано в примере 15, и 6 крыс получали процедуру афереза с использованием колонки/картриджа, содержащей аффинную матрицу на основе ПАМАМ-дендримера (PDAM), приготовленной, как указано в примере 4. Шесть крыс (группа отрицательного контроля) получали процедуру афереза с картриджем, в который загружен соответствующий объем немодифицированного матриксного материала. Уровень острого повреждения почек (почечная функция) оценивали путем измерения уровней креатинина и азота мочевины в крови (BUN) с помощью Roche Reflotron Plus (Roche Diagnostics) перед каждой процедурой афереза. Циркулирующая вкДНК экстрагировалась из 100 мкл образцов плазмы с помощью обычного ТНР (Triton-Heat-Phenol) метода (Breitbach et al., PLoS ONE, 2014, 9 (3): e87838). ДНК определяли количественно с помощью теста PicoGreen (Molecular Probes, Нидерланды), следуя инструкциям производителя. Изменения уровня вкДНК выражали в процентах от базового уровня, т.е. до уровня перед процедурой первого афереза. Для группы отрицательного контроля колонки/картриджи содержали соответствующее количество немодифицированного матриксного материала (Macroporous Bead Cellulose МТ 500, размер частиц 100-250 мкм, Iontosorb, Чешская Республика, дважды промытые 98% этанолом и бидистиллированной водой). Коэффициент выживаемости (120 часов после CLP) был принят в качестве основного параметра эффективности лечения сепсиса. Распределение животных и результаты приведены в таблице 7 ниже.
[0212] Результаты показывают, что устройство для афереза PDAM способно захватывать практически все типы вкДНК, включая связанные с нуклеосомами вкДНК, связанные с экзосомами вкДНК и несвязанные вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды), и обеспечивало лучшую терапевтическую эффективность и более эффективно снижало уровень циркулирующей вкДНК при сепсисе и септическом повреждении почек.
Пример 18: Использование афереза для лечения токсичности, вызванной хиимиотер алией
[0213] 18 самок крыс Sprague-Dawley (SD) массой тела 300-350 г готовили для процедуры афереза, как описано в примере 16. Животным вводили однократную внутривенную болюсную инъекцию паклитаксела (таксол, Bristol-Myers Squibb SrL) в дозе 10 мг/кг.Процедура афереза начали через 4 часа после инъекции паклитаксела и продолжалась в течение 12 часов; 6 крыс получали процедуру афереза с использованием колонки/картриджа с аффинной матрицей на основе антител к нуклеосомам (ANAM), и 6 крыс получали процедуру афереза с использованием колонки/картриджа, содержащей аффинную матрицу на основе гиперразветвленного поли-L-лизина (PLLAM). 6 крыс (отрицательный контроль) получали процедуру афереза с картриджем, который был загружен соответствующим объемом немодифицированной матрицы (сефароза 4 В).
[0214] Уровни циркулирующей вкДНК были определены количественно и представлены, как описано в Примере 17 (уровень вкДНК, выраженный в процентах по отношению к исходному уровню). Показатель выживаемости (через 24 часа после болюса) был принят в качестве основного показателя эффективности лечения. Распределение животных и результаты показаны в Таблице 8 ниже.
[0215] Результаты показывают, что устройство для афереза PLLAM, способное захватывать практически все типы вкДНК, включая связанные с нуклеосомами вкДНК, связанные с экзосомами вкДНК и несвязанные вкДНК (включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды), обеспечивает лучшую защиту/терапевтическую эффективность и более эффективно снижает уровень циркулирующей вкДНК у животных, отравленных химиотерапевтическим препаратом.
Пример 19. Очистка/аферез плазмы вкДНК с одним картриджем, который захватывает нуклеосомную и экзосомную вкДНК, и другим картриджем, который захватывает несвязанную вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотидьь
[0216] Для измерения уровня вкДНК в плазме вкДНК выделяли из 500 мкл образцов плазмы с использованием модифицированного метода НТР (Xue, X., et al. Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum, Clinica Chimica Acta, V.404 (2009), pp.100-104) и количественно определяли с использованием анализа PicoGreen (Molecular Probes, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя.
[0217] Когда вкДНК не обнаруживали в образце с помощью анализа PicoGreen, отсутствие вкДНК в образцах было дополнительно подтверждено с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле способом, описанным в описании выше.
[0218] Для проведения процедур афереза/очистки образцы плазмы наносили на соответствующие аффинные колонки и пропускали через них.
[0219] Образец плазмы объемом 2,0 мл, полученный от 67-летнего пациента с септическим шоком, очищали последовательно через аффинную колонку ANAM (аффинная колонка ANAM, захватывающая вкДНК, связанную с нуклеосомами, была изготовлена на основе 1 мл HiTrap NHS активированной колонки HP (как описано в примере 15), и аффинную колонку с лектином (которая захватывает вкДНК, связанную с экзосомами), изготовленную, как описано в Примере 2 (аффинная матрица на основе лектина из Galanthus nivalis [подснежник]).
[0220] Начальный уровень вкДНК в плазме пациента составлял 1150 нг/мл со значительным присутствием практически всех типов вкДНК, визуализированных с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле (см. фигуру 7, дорожка А). Уровень вкДНК в плазме после первого прохождения через комбинацию аффинных колонок на основе ANAM и лектина снизился до 350 нг/мл. Частично очищенную плазму пациента дополнительно подвергали второму прогону через ту же комбинацию свежих колонок на основе ANAM и лектина. Уровень вкДНК в плазме после второго прохождения оставался неизменным с видимыми количествами вкДНК ненуклеосомного происхождения с молекулярной массой до 750 кДа, визуализированной с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле с окрашиванием флуоресцентным красителем ДНК (см. Фиг. 7, дорожка С).
[0221] Эксперимент прояснил, что неспособность аффинных колонок на основе ANAM и лектина полностью очистить плазму пациента от вкДНК не связана с общей связывающей емкостью комбинации аффинных колонок на основе АМАМ и лектина, а скорее с их неспособностью захватывать вкДНК ненуклеосомного и неэкзосомного происхождения. Чтобы подтвердить это, авторы изобретения дополнительно пропустили образец через аффинную колонку на основе анти-ДНК-антитела, полученную как описано в Примере 7 (матрица на основе агарозы связанная с высоко аффинным мышиным моноклональным IgM антителом связывающим дц+оцДНК). После одного цикла очистки уровень вкДНК в плазме пациента стал необнаружимым при измерении с помощью анализа PicoGreen. Это наблюдение было также подтверждено отсутствием видимого материала ДНК после электрофореза ДНК в агарозном геле.
[0222] Таким образом, использование двух последовательных аффинных колонок/картриджей, в которых одна колонка/картридж захватывает ДНК, связанную с нуклеосомой и экзосомной ДНК, а другая колонка/картридж захватывает несвязанную вкДНК, включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды, очень эффективно для очистки/афереза крови пациента от всех типов циркулирующих вкДНК.
[0223] Другие 2 мл образца плазмы от того же пациента очищали последовательно через аффинную колонку на основе интеркалятора ДНК (полученную, как описано в примере 8, т.е. целлюлозные шарики конъюгрованные с Hoechst 33342) и аффинную колонку на основе антител против ДНК (полученную, как описано в Примере 7, т.е. матрица агарозы, связанная с высокоаффинным мышиным моноклональным анти-ДНК IgM). Уровень вкДНК в плазме после первого пробега через комбинацию аффинных колонок ДНК-интеркалятор и анти-ДНК-антитело снизился до 475 нг/мл и при этом вкДНК различного происхождения, визуализировали с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле (Фигура 7, дорожка В). Эту частично очищенную плазму пациента дополнительно подвергали второму прогону через ту же комбинацию свежих аффинных колонок ДНК-интеркалятор и анти-ДНК-антитело. Уровень вкДНК в плазме после второго запуска в плазме пациента стал необнаружимым при измерении тестом PicoGreen. Это наблюдение было также подтверждено отсутствием видимого материала ДНК после электрофореза ДНК в агарозном геле с окрашиванием флуоресцентным красителем ДНК.
[0224] Таким образом, использование комбинации колонок/картриджей, содержащих матрицы, которые связывают практически все типы вкДНК (включая нуклеосом-связанную вкДНК, экзосом-связанную вкДНК и несвязанную вкДНК [включая дцДНК, оцДНК и олигонуклеотиды]) согласно изобретению позволяет захватить необычно большое количество вкДНК.
Пример 20. Очистка/аферез плазмы из воротной вены для очистки крови от вкДНК у крыс с острым панкреатитом
[0225] В эксперименте использовали шесть самцов крыс Sprague-Dawley весом 250-350 грамм. Все хирургические процедуры выполняли на нагретом операционном столе под общим наркозом с внутрибрюшинным введением 0,8 мг ксилазина и 4 мг кетамина.
[0226] Острый панкреатит вызывали следующим образом. Во время лапаротомии папиллу Ватера канюлировали трансдуодально, используя 24G Abbocath-T i.v. инфузионную канюлю. Перед инфузией при контролируемом давлении 0,5 мл стерилизованной гликодезоксихолевой кислоты в забуференном растворе глицилглицин-NaOH (10 ммоль/л, рН 8,0, 37°С) общий желчный проток зажимали, и желчи и панкреатической жидкости позволяли стечь через канюлю. Непосредственно после инфузии гепато-дуоденальное течение желчи восстанавливали удалением зажима. Пункционное отверстие в двенадцатиперстной кишке было тщательно закрыто с использованием 8,0 полипропиленового серозного шва.
[0227] После закрытия брюшной полости у крыс 1, 2 и 3 в бедренную вену и яремную вену вставляли хронические венозные катетеры, как описано в Примере 16.
[0228] Крысы 4, 5 и 6 имели катетер портальной вены, имплантированный в печеночную портальную вену в области хвостовой части печени, как описано Strubbe (Strubbe J.H. et al, Hepatic-portal and cardiac infusion of CCK-8 and glucagon induce different effects on feeding. Physiol Behav 46: 643-646, 1989).
[0229] Процедуру афереза выполняли, как описано в Примере 16, с использованием аффинного картриджа PDAM, приготовленного, как описано в Примере 4, и снабженного входным и выходным патрубками из полипропилена. Процедуру афереза проводили ежедневно в течение 1-3 дней с продолжительностью 12 часов для каждой процедуры афереза.
[0230] Выживаемость (96 часов после индукции панкреатита) была принята в качестве основного параметра эффективности лечения. Для количественного определения вкДНК крысы и вкДНК бактериального происхождения (то есть бактериальной нагрузки) общую вкДНК выделяли из 200 мкл образцов плазмы крысы с использованием мини-набора QIAamp DNA в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию вкДНК в образцах плазмы измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием детектора последовательностей ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) и TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя. Для количественного определения вкДНК бактериального происхождения были разработаны специфические праймеры для консервативных областей бактериальной 16S рДНК: прямой праймер, 5'-TCCTACGGGAGGC AGCAGT-3', обратный праймер 5'-GGACT АСС AGGGTATCTAATCCTGTT-3' и зонд (6-FAM)-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3' - (TAMRA) (см: Mangala, A.; Nadkarni, А. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology, 2002, vol. 148, pp.257-266). Тест TaqMan Gene Expression Assay rat p-actin Rn00667869_m1 (Applied Biosystems) использовали для амплификации геномной вкДНК крысы.
[0231] Выживаемость и результаты каждой ПЦР (Ct, т.е. значение порогового цикла) для гена (3-актина крысы и бактериальной 16S рДНК в плазме крови, отобранной из яремной вены, представлены в таблице 9.
[0232] Результаты показывают, что отвод/забор крови для афереза в устройство для афереза в соответствии с изобретением из воротной вены приводило к лучшей (по сравнению с отводом крови от бедренной, то есть не регионарной вены) выживаемости и более эффективной очистка крови от вкДНК (в том числе вкДНК бактериального происхождения) у крыс с острым панкреатитом.
[0233] Таким образом, в клинических условиях, когда патологический процесс, приводящий к высвобождению вкДНК (опухолевый рост, септическое или асептическое воспаление, высвобождение бактериальной ДНК), происходит из областей/регионов, дренируемых преимущественно портальной веной (пищевод, желудок, кишечник, селезенка, поджелудочная железа, желчный пузырь, брюшная полость) может быть полезным отвод крови для процедуры афереза из воротной вены.
Пример 21. Сравнение удаления вкДНК из плазмы пациента с помощью аффинной матрицы на основе H1 гистона, аффинной матрицы на основе РАМАМ-дендримера и аффинной матрицы на основе поли-L-лизина (PLLAM).
[0234] Аффинную матрицу на основе поли-L-лизина (PLLAM) получали, как указано в Примере 12. Аффинную матрицу на основе дендримера РАМАМ (PDAM) получали, как указано в Примере 4. Аффинную матрицу на основе гистона H1 получали, как указано в Примере 1.
[0235] Модельную плазму, обогащенную вкДНК, получали путем смешивания плазмы здорового добровольца с маркерной ДНК (1 kbp плюс DNA Ladder, Invitrogen) до конечной концентрации вкДНК 10 мкг/мл. Адсорбционная способность аффинной матрицы на основе поли-L-лизина (PLLAM), аффинной матрицы на основе РАМАМ-дендримера (PDAM) и аффинной матрицы на основе гистона H1 по отношению к модельной плазме, обогащенной искусственной lkbp плюс ДНК Ladder, была протестирована методом адсорбции с объемным соотношением аффинная матрица: плазма 1: 5 (100 мкл аффинной матрицы смешивали с 500 мкл модельной плазмы) в течение 1 часа при 37°С при медленном вращении. Этаноламин-сефарозу FF использовали в качестве контроля. Образцы плазмы анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с использованием системы E-Gel Invitrogen до инкубации и после осаждения аффинной матрицы. вкДНК выделяли из плазмы пациента с использованием QIAamp DNA Blood Mini Kit, Quagen и количественно определяли с помощью флуориметра Qubit 3.0. Те же аффинные матрицы инкубировали с плазмой пациента, у которого был диагностирован одонтогенный сепсис с соотношением аффинная матрица: плазма 1:10 (100 мкл аффинной матрицы смешивали с 1 мл плазмы пациента), используя те же условия инкубации. Через один час аффинную матрицу удаляли центрифугированием. Образцы плазмы анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с использованием системы E-Gel Invitrogen до инкубации и после осаждения аффинной матрицы. Этаноламин-сефарозу FF использовали в качестве контроля. вкДНК выделяли из плазмы пациента с использованием QIAamp DNA Blood Mini Kit, Quagen и количественно определяли с помощью флуориметра Qubit 3.0. Данные количественного определения вкДНК представлены в таблице 10 ниже.
[0236] Видно, что аффинная матрица на основе поли-L-лизина (PLLAM), аффинная матрица на основе РАМАМ-дендримера (PDAM) и аффинная матрица на основе гистона H1 обладают равной способностью удалять модельную вкДНК из модельной плазмы, обогащенной вкДНК, но аффинная матрица гистона H1 значительно превосходит остальные в удалении вкДНК из плазмы пациента. Данные результаты были подтверждены электрофоретическим анализом образцов (см. Фигуры 8 и 9).
[0237] Тест адсорбции в объеме с модельной плазмой с аффинной матрицей на основе поли-L-лизина (PLLAM), аффинной матрицей на основе РАМАМ-дендримера (PDAM) и аффинной матрицей на основе гистона H1 дал почти одинаковую электрофоретическую картину с небольшим содержанием вкДНК.
[0238] Тест адсорбции в объеме с плазмой пациента с аффинной матрицей на основе поли-Е-лизина (PLLAM), аффинной матрицей на основе РАМАМ-дендримера (PDAM) и аффинной матрицей на основе гистона H1 показал различную электрофоретическую картину с содержанием маргинальной вкДНК после инкубации с аффинной матрицей на основе H1 гистона, но значимым содержанием вкДНК после инкубации с аффинной матрицей на основе поли-Е-лизина и аффинной матрицей на основе РАМАМ -дендримера.
[0239] Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным в данном документе станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и сопровождающих чертежей. Такие модификации предназначены для попадания в объем прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, следует понимать, что все значения являются приблизительными и представлены для описания.
[0240] Патенты, заявки на патенты, публикации, описания продуктов и протоколы цитируются по всему описанию данной заявки, раскрытия которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей.