Молекулярно-генетические аспекты патогенеза рака эндометрия

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА РАКА ЭНДОМЕТРИЯ

Л.Ф. Гуляева1, С.Э. Красильников2

НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск1 Новосибирский областной онкологический диспансер2

Рак эндометрия является наиболее распространенным злокачественным новообразованием женской половой сферы. Многочисленные исследования показали, что злокачественные опухоли женской репродуктивной сферы, в том числе рак эндометрия, в большинстве случаев являются гормонозависимыми [1, 5]. Особое место в этом процессе занимают эстрогены, играющие важную роль в стимуляции клеточной пролиферации в органах-мишенях [4]. И хотя

о молекулярных механизмах действия стероидов накоплен большой экспериментальный материал, вопрос о том, как эти гормоны стимулируют пролиферацию в раковых клетках, пока остается открытым. Показана роль эстрогенов в активации рецепторов, принимающих участие в регуляции транскрипции многих генов, участвующих в клеточной пролиферации [7]. Все эти исследования объединяет тот факт, что необходимым условием запуска процессов трансформации в клетках-мишенях является увеличение содержания стероидов, в частности эстрогенов. В последнее время появилась концепция локального синтеза эстрогенов в отдельных клетках, влекущего изменение содержания эстрогенов и, как следствие этого, усиление процессов пролиферации, особенно у женщин в постменопаузе [14].

Синтез эстрогенов in situ может происходить путем конверсии андрогенов в результате сложной цепи биохимических преобразований. Ключевую роль в конечной цепи превращений играет фермент ароматаза (CYP19) [10]. Кроме того, активные формы эстрогенов могут образовываться путем гидролиза стероидной сульфатазой (STS) биологически не активных эстроген-сульфатов (E1S) [13]. Ранее считалось, что присоединение сульфатной группы к стероидным гормонам приводит к их гидрофильности, что увеличивает их скорость выведения из организма и, как следствие, уменьшение концентрации биологически активных гормонов в крови и органах-мишенях [12]. Однако исследования, проведенные в последнее десятилетие, убедительно демонстрируют, что

сульфаты стероидов, такие как эстрон-сульфат, могут являться предшественниками для синтеза биологически активных гормонов.

Биологический эффект эстрогенов реализуется через их взаимодействие с эстрогеновыми рецепторами, которые, в свою очередь, активируют гены-мишени во многих тканях. В настоящее время идентифицировано два вида ER: б- и в-биологическое значение которых интенсивно изучается. Так, показано, что повышенная экспрессия ERб сопровождает процессы трансформации во многих тканях и его содержание может измениться в ответ на повышение концентрации эстрогенов, что, в свою очередь, приводит к усилению пролиферации в тканях-мишенях [6]. Одним из механизмов этого процесса может быть увеличение активности ароматазы. Однако вопрос о том, как связаны эти два процесса, остается открытым. Определение содержания эстрогеновых рецепторов и активности ароматазы поможет выявить гормональную природу опухоли, что является, прежде всего, важным показателем для проведения эффективного лечения.

Вопрос о том, какое звено метаболизма эстрогенов вовлечено в патогенез рака эндометрия, все еще остается открытым. Изучение и выявление нарушений в метаболизме эстрогенов позволит не только установить их роль в процессе опухолеобразования, но и в дальнейшем найти подходы к лечению. В настоящем исследовании проведен молекулярно-генетический анализ больных раком эндометрия, где основной акцент сделан на исследовании ключевых ферментов метаболизма эстрогенов.

Для исследования генетического полиморфизма ферментов метаболизма эстрогенов использовалась суспензия клеток буккального эпителия здоровых (п=170) и больных раком тела матки (п=166) женщин, пациенток Новосибирского областного онкологического диспансера. Генотипирование женщин проводили методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длины рестрикционых фрагментов) продуктов ПЦР специ-

Таблица 1

Частоты аллелей и генотипов диких и полиморфных вариантов генов CYP1A2 и

Гены Рак тела матки Контрольная группа, n

n (%) ОШ (95 % ДИ) P

CYP1A2

Частота

аллелей с 94

A 238 0,49

Частота

генотипов

с/с 0

C/A 6

A/A 82

78 (47,0) 170

всего 166

SULT1A1

Частота

аллелей 206 180

G

A 126 0,93)

Частота

60

генотипов G/G 0,999 60

A/G 68

A/A 70 (42,2) 1,67) 170

Всего 28 (16,9) 0,49 (0,27-

166 0,88)

фических участков генома с использованием подобранных праймеров и соответствующих ферментов рестрикции. Для определения уровня экспрессии генов ER6, CYP19, SULT1E1, hSTSв опухолевых тканях использовался метод полуколичественной мультиплексной ОТ-ПЦР. Активность стероидной сульфата-зы определяли методом ВЭЖХ с использованием в качестве субстрата сульфата эстрона.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы «Origin 6.1». В качестве отклонения от среднего значения использовалась средняя статистическая ошибка, в качестве критерия достоверности был использован t-критерий Стьюден-та.

Для выяснения роли ферментов метаболизма в патогенезе рака эндометрия одним из подходов является исследование генетического полиморфизма. Нами были определены генотипы ферментов метаболизма ксенобиотиков: цитохромов P450 CYP1A1, CYPA2, CYP1B1 и CYP19 (Ароматаза) и SULT1A1

(сульфотрансфераза) у здоровых и больных раком эндометрия. Частота встречаемости мутантных аллелей и генотипов цитохромов Р450: СУР1А1 и СУР1В1 у здоровых и больных женщин была практически одинаковой (данные не приведены). Достоверные различия были выявлены для генов СУР1А2 и SULT1A1 (табл. 1).

Так, у больных раком тела матки чаще встречается С аллель дикого типа гена СУР1А2, чем у здоровых (ОШ=0,49). Известно, что исследуемая мутация (замена А>С в первом интроне, в 734 положении от старта транскрипции) приводит к значительному снижению активности фермента. Тогда увеличение частоты встречаемости мутантного аллеля у здоровых женщин может говорить о том, что окисление эстрогенов в печени у них не нарушено. Эти результаты были подтверждены нашим исследованием больных миомой матки. Теофеллиновый тест, позволяющий определить активность СУР1А2 в печени, показал, что у больных миомой фармакокинетика этого препара-

Рис. 1. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации генов hSTS и 18S rRNA: 1, 2 - больные с диагнозом аденокарцинома тела матки; Н - нетрансформированная ткань, О - опухолевая ткань

та снижена (данные не приведены). Достоверные различия были выявлены и для другого печеночного фермента - сульфотрансферазы. Видно, что мутантные аллели и генотипы SULT1A1 чаще встречались у здоровых, чем у больных (ОШ=0,68 для аллеля и 0,49 для генотипа). Из этих результатов следует, что повышенная активность сульфотрансферазы 1А1 способствует развитию заболевания. Известно, что этот фермент участвует в активации многих канцерогенных ариламинов и гетероциклических аминов, что сопровождается увеличением содержания активных метаболитов ксенобиотиков, полученных из окружающей среды и пищи [12]. Этот факт может говорить о вовлечении химически индуцированного канцерогене-

I 2

за в процессы развития исследуемой патологии. Суммируя результаты молекулярно-генетического анализа, можно заключить, что катаболизм эстрогенов, катализируемый данными ферментными системами, может вносить существенный вклад в патогенез рака эндометрия.

Роль ферментов сульфонации/десульфонации эстрогенов в патогенезе рака эндометрия была подтверждена исследованием экспрессии генов, отвечающих за эти биохимические превращения. Так, в большинстве исследуемых опухолей

со 450 -

а

ц

ф 400 -

\о

і_ 350 -

2

У 300 -

~2

§ 250 -

С 200 -

> 150 -

100 -

50 -

Нетрансформированная ТК.ІНЬ І I Опухолевая ткань

Рис. 2. Ферментативная активность hSTS в ^трансформированной и опухолевой тканях эндометрия больных с диагнозом аденокарцинома тела матки. Представлено среднее значение ± SD. Каждый эксперимент проводился трижды. Отличия значений с достоверностью: * - р<0,01, ** - р<0,05

Рис. 3. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации генов SULT1E1 и 18S rRNA:

1, 2 - больные с диагнозом аденокарцинома тела матки; Н - нетрансформированная ткань, О -опухолевая ткань

Результаты по экспрессии гена стероидной суль-фатазы были подтверждены измерением активности фермента. Ферментативная активность STS была измерена в S9 фракциях образцов опухолевых и нетран-сформированных тканей у 10 больных с диагнозом аденокарцинома тела матки. В большинстве случаев регистрировалось повышение активности этого фермента в опухолевой ткани по сравнению с прилежащей, нетрансформированной тканью

Исследования экспрессии генов стероидной суль-фотрансферазы SULT1E1 показали, что в опухолевых тканях она заметно снижена (рис. 3).

Анализируя полученные данные, можно сделать заключение, что в опухолевых тканях эндометрия регистрируется повышение экспрессии гена STS, а экспрессия гена SULT1E1 имеет тенденцию к снижению. Эти результаты свидетельствуют о вовлечении ферментов сульфонирования/десульфонирования эстро-

генов в механизм возникновения и поддержания гормонозависимых опухолей эндометрия человека. Стероидная сульфатаза осуществляет реакцию гидролиза сульфатов эстрона и БНЕЛ, из которых могут быть синтезированы стероиды с эстрогенными свойствами (например, эстрадиол и андростендиол), стимулирующие рост опухоли. В этом случае индукция hSULT1E1 и/или ингибирование hSTS могут иметь потенциальный лечебный эффект в терапии рака эндометрия.

В настоящее время установлено, что важным критерием успешного лечения опухолей органов женской репродуктивной сферы является установление гормональной природы опухоли. Для рака эндометрия подходы к определению гормонального статуса опухоли пока находятся в стадии развития. Тем не менее эта проблема также важна как для лечения, так и для прогноза этого заболевания. Имеющиеся лите-

Таблица 2

Характеристика клинических образцов и результаты изменения уровня экспрессии генов CYP19 и ERa в злокачественных опухолях эндометрия

Номер пациентки Описание опухолевых Иммуногисто - Относительный уровень мРНК

образцов химия

TNM Стадия ERa ERa CYP19

1 T1N0M0 1 н.о. II t

2 T2N0M0 2 н.о. t t

3 T1N0M0 1 н.о. II t

4 T2NM0 2 н.о. t t

5 T2N0M0 2 н.о. і t

6 T1NXM0 1 н.о. і t

7 T1N0M0 1 н.о. t t

8 T1N0M0 1 н.о. t t

9 T2N0M0 2 н.о. t t

10 T2N0M0 2 н.о. t t

ратурные данные по экспрессии ERб достаточно противоречивы. Так, в одних источниках указывается на повышение экспрессии ERб в опухолевой ткани эндометрия по сравнению с нормой [9], тогда как в других наблюдается обратная картина: снижение экспрессии в опухолях [11]. Все это свидетельствует о недостаточно полной картине гормональной природы опухолей эндометрия.

Для установления гормональной природы опухоли в клинике стандартным подходом является им-муногистохимический анализ (ИГХА) эстрогеновых рецепторов в опухолях молочной железы. С помощью ОТ-ПЦР нами была измерена экспрессия ERб в образцах опухолевой и прилежащей, нетрансформи-рованной ткани у 25 больных с диагнозом рак молочной железы. Эти результаты были сравнены с данными иммуногистохимического анализа, выполняемого в клинике. В большинстве случаев эти данные совпадали с результатами эксперимента (данные не приведены). Аналогичный подход был использован нами для установления гормональной природы опухолей эндометрия. Была измерена экспрессия генов ERa и СУР19 (табл. 2).

Как видно из табл. 2, у шести из 10 исследуемых больных в опухолевой ткани наблюдалось усиление экспрессии гена ERб по сравнению с нормой, у двух пациентов наблюдалась обратная картина, у двух уровень экспрессии гена ERб не изменялся. Этот факт также может говорить в пользу гормональной природы опухолей для таких больных. Следует заметить, что отсутствие изменений в экспрессии ERб в анализируемых образцах не исключает гормональной природы опухоли, так как ее рост может поддерживаться за счет постоянного синтеза эстрогенов, где существенную роль играет повышение активности арома-тазы или стероидной сульфатазы.

На сегодняшний день считается доказанным тот факт, что локальное усиление экспрессии гена аро-матазы в тканях-мишенях является одним из этиологических факторов возникновения и поддержания роста гормонозависимых опухолей у женщин [3]. Так, показано, что у женщин, страдающих эндометрио-зом или другими предраковыми заболеваниями эндометрия, определялся высокий уровень экспрессии гена ароматазы в репродуктивных органах, что позволяло судить о гормонозависимой природе данных

заболеваний и проводить лечение ингибиторами аро-матазы [4]. Во всех 10 исследуемых образцах было выявлено повышение уровня экспрессии гена CYP19 в опухолевой ткани относительно прилежащей не-трансформированной ткани (табл. 2). Эти данные могут свидетельствовать о существенном вкладе этого фермента в патогенез рака эндометрия, что подтверждают результаты, полученные N. Pathirage et al. в 2006 г. [9]. Тогда этот важный факт можно использовать для лечения опухолей эндометрия ингибиторами ароматазы, что в настоящее время применяется в НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН [2].

Анализ полученных результатов указывает на гетерогенность экспрессии генов CYP19 и ER6 в исследуемых образцах. В половине случаев выявляется повышение экспрессии ER, сопровождающееся повышением экспрессии ароматазы. Аналогично можно выявить ситуацию, когда экспрессия данных генов существенно не меняется, хотя такие случаи довольно редки. Интересным является также выявление опухолей с повышением экспрессии лишь одного из генов. Так, выявлена комбинация, когда увеличение экспрессии ароматазы не сопровождалось увеличением эстрогенового рецептора. В этом случае можно предположить, что такие опухоли будут чувствительны к ингибиторам ароматазы.

Таким образом, характеристика опухолей по экспрессии ER6 и CYP19 может быть и одним из этапов разработки стратегии для дифференциального лечения опухолей эндометрия.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берштейн ЛМ. Эпидемиология, патогенез и пути профилактики рака эндометрия: стабильность или эволюция // Практическая онкология. 2004. № 5. С. 1-8.

2. Бочкарева Н.В., Коломиец Л.А., Кондакова И.В. Патогенетическое обоснование использования ингибиторов аро-матазы в лечении рака эндометрия // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2003. № 2. С. 57-60.

3. Bulun S.E., Lin Z., Amin S. et al. Regulation of aromatase expression in estrogen-responsive breast and uterine disease: from bench to treatment // Pharmacol. Rev. 2005. Vol. 57. P 359-383.

4. Bulun S.E., Yang S., Fang Z. et al. Role of aromatase in endometrial disease // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2001. Vol. 79. P. 19-25.

5. Emons G., Fleckenstein G., Hinney D. et al. Hormonal interactions in endometrial cancer // Endocrine-Related Cancer. 2000. Vol. 7. P. 227-242.

6. Enmark E., Gustafsson JA. Oestrogen receptors - an overview // Journal of Internal Medicine. 1999. Vol. 2. P. 133-

138.

7. Enmark E., Pelto-Huikko M., Lagercrantz S., et al. Human estrogen receptor B-gene structure, chromosomal localization and expression pattern // Clin. Endocrinol. Met. 1997. Vol. 82. P.4258-4265.

8. Katzenellenbogen B.S. Estrogen Receptors: Bioactivities and Interactions with Cell Signaling Pathways // Biol. Reproduction. 2001. Vol. 54. P. 287-293.

9. Pathirage N., Di Nezza L.A., Salmonsen L.A. et al. Expression of aromatase, estrogen receptors, and their coactivators in patients with endometrial cancer // Fertil Steril. 2006. Vol. 86. P. 469-472.

10. Simpson E.R., Davis S.R. Minireview: Aromatase and the Regulation of Estrogen Biosynthesis - Some New Perspectives

// Endocrinology. 2001. Vol. 142. P. 4589-4594.

11. Smuca T., Rupreht R., Sinkovec J. et al. Expression analysis of estrogen-metabolizing enzymesin human endometrial cancer // Mol. Cell. Endocrinol. 2006. Vol. 248. P. 114-117.

12. Strott C. A. Steroid sulfotransferases // Endocrinol. Rev. 1996. Vol. 17. P. 670-697.

13. Suzuki T, Miki Y, Nakata T. et al. Steroid sulfatase and estrogen sulfotransferase in normal human tissue and breast carcinoma // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 86. P. 449-454.

14. Thijssen J.H. Local biosynthesis and metabolism of oestrogens in the human breast // Maturitas. 2004. Vol. 49. P. 25-33.