НОВЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ЭКСТРАКТЫ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ДЕРМАТОЛОГИИ
NEW BACTERIA AND THEIR EXTRACTS, AND USE THEREOF IN DERMATOLOGY

Настоящее изобретение касается нового штамма бактерий, выделенных из почвенно-грунтовых вод. Изобретение также касается бактериальных экстрактов и их применению в контексте лечения воспаления.
Более конкретно, настоящее изобретение касается новых композиций, представляющих интерес в лечении и предупреждении воспалительных заболеваний, в особенности дерматологической патологии.
Дерматологические заболевания, такие как атопический дерматит, прурит, экзема и псориаз все чаще встречаются у детей младшего возраста. В развитых странах распространенность атопического дерматита за последние 30 лет удвоилась или утроилась: им страдают от 15% до 30% детей и от 2% до 10% взрослых (Williams Н. et al., JACI 2006; 118: 209-13). Атопический дерматит представляет собой кожную манифестацию атопии; он представляет собой хронический воспалительный дерматоз или экзему, которые возникают вследствие ряда генетически детерминированных факторов. В настоящее время его считают важной проблемой общественного здравоохранения. Атопический дерматит часто связан с другими атопическими болезнями, такими как аллергический ринит и астма. Это заболевание чаще всего возникает в раннем детском возрасте и характеризуется повторяющимися вспышками на протяжении нескольких лет. При прогрессировании заболевания наблюдаются обострения, перемежающиеся спонтанными ремиссиями.
Качество жизни пациентов, страдающих атопическим дерматитом, существенно снижается. Существующее лечение включает местные кортикостероиды и иммуномодуляторы, препараты системного действия, длительное применение которых ограничено из-за часто возникающих побочных эффектов, а также смягчающие средства. Общепринятая терапия является «реагирующей» - применяется для лечения обострений - однако, в настоящее время считается, что раннее вмешательство, направленное на сдерживание обострениями и кожным воспалением, может оказывать благоприятный эффект как в плане сдерживания заболевания, так и возможного возникновения астмы и/или ринита (Bieber, Т. 2008, Atopic dermatitis, The New England Journal of Medicine, vol.358 (14) 1483-1494), т.к. атопический дерматит считается начальной фазой атопического марша. В большинстве случаев лечение включает местно действующие средства для облегчения состояния пациентов.
В стандартном лечении атопического дерматита, в частности, используют местные кортикостероиды или иммуносуппрессоры, хотя такие методы лечения не лишены побочных эффектов, особенно у детей.
Атопический дерматит представляет собой комплексное и мультифакторное заболевание. По данным литературы, в некоторых эпидемиологических исследованиях было продемонстрировано, что фактор «гигиены» в городском окружении способствует возникновению аллергических и аутоиммунных заболеваний. С другой стороны, в сельских условиях, где человек постоянно находится в контакте с микроорганизмами и/или аллергенами, такое воздействие стимулирует защитную иммунную систему человека с рождения.
При атопическом дерматите барьерная функция кожи ослабляется и нарушается, что способствует инвазии и колонизации патогенов (бактерий, вирусов), в частности золотистого стафилококка, преобладающего в симбиотической микрофлоре кожи.
С иммунологической точки зрения, проблема заключается в несбалансированности иммунного ответа. Атопию часто описывают как манифестацию аллергии (опосредованной IgE, с преобладанием цитокинов IL-4, IL-5, IL-13) или Th2-иммунный ответ. Последний более всего усиливается в присутствии «антигенной стимуляции» золотистым стафилококком. Иммуномодуляция заключается в том, что баланс Th1/Th2 возвращают в состояние иммунного равновесия.
Врожденный иммунитет представляет собой первичный, быстрый и неспецифический иммунный ответ млекопитающих. У клеток первый защитный барьер представлен Toll-подобными рецепторами (TLR). Каждый TLR специфически распознает патоген-ассоциированные молекулярные структуры (РАМР), такие как нуклеиновые кислоты (TLR3), пептиды, поверхностные белки, липотейхоевую кислоту (TLR2), жгутики (TLR5) и липополисахариды (TLR4), происходящие из чужеродных микроорганизмов. Специфическое взаимодействие между таким структурным фрагментом (агонистом) и TLR запускает каскад сложных реакций, приводящий к транскрипции NFκB, с последующей продукцией провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и хемокинов (Kang et al., 2006). Другими фармакологическими последствиями является индукция противомикробных пептидов (AMP), которые обладают способностью ингибировать рост патогенов (бактерий, вирусов, паразитов) (Glaser, R. et al. 2005, Nat Immunol. 6: 57-64).
Атопический дерматит зачастую сопровождается зудом и пруритом, вызывая дискомфорт и беспокойство в повседневной жизни (расчесывание, потерю сна и т.д.). Одной из причин этой воспалительной патологии является активация связанного с G-белком рецептора, носящего название PAR2 (от англ. protease-activated receptor 2, активируемый протеазами рецептор) (Steinhoff, М. et al. 2003 J Neurosci. 23: 6176-6180). PAR2 экспрессируется на поверхности многих клеток, в частности кератиноцитов, эндотелиальных клеток, миоцитов толстой кишки, энтероцитов, нейронов кишечника и иммунных клеток. Протеазы (трипсин, триптаза), присутствующие в большом количестве в эпидермисе, расщепляют PAR2 со стороны N-конца, что приводит к экспонированию особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации) (Vergnolle, N. 2009, Pharmacol. Ther. 123: 292-309). В ходе этого процесса происходит активация гена NFκB с последующей индукцией провоспалительных цитокинов и запуском воспалительных реакций. В связи с этим, разработка антагонистов PAR2 и/или ингибиторов протеаз обладает большим потенциалом для лечения такой патологии, как прурит.
Псориаз также представляет собой кожное воспалительное заболевание с хроническим прогрессирующим течением; им страдает 2% населения. Наряду с атопическим дерматитом псориаз является одним из наиболее распространенных хронических кожных воспалительных заболеваний. Он характеризуется аномальным ростом эпидермальных клеток, связанным с воспалительными реакциями. Основной механизм, лежащий в основе феномена воспаления, связан с функционированием Т клеток иммунной системы, преимущественно Th1 клеток (Wilsman-Theis, D. et al., Eur J Dermatol., vol.18(2) 172-180), запускающих и поддерживающих воспалительный процесс и стимулирующих избыточную пролиферацию кератиноцитов, которые затем проходят ускоренную и неполную фазу дифференцировки. Кератиноциты экспрессируют рецепторы, делающие их чувствительными к воспалительным сигналам, и высвобождают провоспалительные медиаторы. Таким образом, воспаление при псориазе поддерживается за счет взаимной стимуляции Т-клеток и кератиноцитов.
Таким образом, заболевание требует длительного лечения. Существует потребность и большой спрос на альтернативные методы лечения этих воспалительных дерматозов.
Следует упомянуть патентный документ EP 2018891 (Guéniche А., 2009) и публикацию Guéniche А. et al., 2006 (European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384), в которых описано применение бактериального экстракта Vitreoscilla filiformis (V. filiformis) для лечения атопического дерматита). Недостатком данного экстракта является необходимость культивирования указанной нитчатой бактерии V. filiformis в среде, имеющую в своем составе минеральную воду, не содержащую серы.
В этой связи настоящее изобретение предлагает решение для лечения этих воспалительных заболеваний путем выделения, характеризации и получения фракций новых бактерий, не описанных ранее.
Заявителю неожиданно удалось впервые выделить из почвенно-грунтовых вод штамм, принадлежащий новому виду бактерий, этот новый бактериальный штамм (или бактерия) получил название LMB64.
Бактерия LMB64 была не только выделена, но и охарактеризована, и была установлена ее принадлежность классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, и возможно, новому роду, который еще не был описан. Анализ последовательности гена, кодирующего рибосомальную РНК (рРНК) 16S, позволил поместить эту бактерию близко к родам Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia и Glubenkiana, с соответствующими последовательностями которых наблюдается 95% сходство.
Эта непатогенная бактерия является грамотрицательной и будет более подробно описана в Примерах. Эта бактерия также характеризуется тем, что не является нитчатой. Кроме того, эту бактерию выгодно отличает способность расти в среде, имеющей в своем составе воду любого типа, и более конкретно, обычную воду. Например, в отличие от V. filiformis, культивирование бактерии LMB64 по настоящему изобретению не требует конкретных условий культивирования и, более конкретно, не требует среды, имеющей в своем составе по меньшей мере один вид минеральной и/или термальной воды, не содержащей серы. Это является явным преимуществом как в отношении условий культивирования и оборудования, так и с экономической точки зрения.
Ген, кодирующий 16S рРНК был практически полностью секвенирован (1487 пн, соответствует последовательности SEQ ID No. 1). Бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду размером 10948 пн. Эта плазмида была полностью секвенирована и ее последовательность представлена в последовательности SEQ ID No. 2.
Согласно первому воплощению, настоящее изобретение касается непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, у которой нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 16S рРНК, включает или содержит последовательность SEQ ID No. 1 или любую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична указанной последовательности SEQ ID No. 1.
Предпочтительно, настоящее изобретение касается непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, характеризующейся тем, что нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК указанной бактерии включает или содержит последовательность SEQ ID No. 1.
В контексте настоящего изобретения "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот обозначает процентное содержание идентичных нуклеотидов между двумя сравниваемыми последовательностями, полученный после наилучшего выравнивания (оптимального выравнивания), причем это процентное содержание является сугубо статистическим, а различия между двумя последовательностями случайным образом распределены по всей их длине. Сравнение последовательностей двух нуклеиновых кислот как правило выполняют путем сравнения этих последовательностей после их выравнивания оптимальным образом, причем указанное сравнение можно выполнять по сегментам или по "окнам сравнения". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять не только вручную, но и при помощи алгоритма поиска локальной гомологии, предложенного Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2: 482], при помощи алгоритма поиска локальной гомологии, предложенного Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], при помощи методики поиска сходства, разработанной Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85: 2444] или при помощи компьютерных программ, использующих эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Group Computer, 575 Science Dr., Madison, WI, или программ BLAST N или BLAST P, выполняющих сравнение).
Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот определяют путем сравнения этих двух выровненных оптимальным образом последовательностей, причем сравниваемая последовательность нуклеиновой кислоты может иметь вставки или делеции по отношению к референсной последовательности для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывают путем определения числа позиций, в которых нуклеотиды идентичны между двумя последовательностями, путем деления этого числа идентичных позиций на общее число позиций в окне сравнения и умножения полученного результата на 100 для получения процента идентичности между этими двумя последовательностями.
Например, можно использовать программу "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences," FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250), доступную по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с используемыми по умолчанию значениями параметров (в частности, с параметрами "штраф за открытие гэпа": 5, и "штраф за удлинение гэпа": 2; с выбором в качестве матрицы, например, матрицы "BLOSUM 62", предлагаемой программой), с расчетом процента идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями непосредственно самой программой. Также возможно использовать другие программы, такие как программы "ALIGN" или "Megalign" (DNASTAR).
Согласно другому воплощению, бактерия по изобретению имеет по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID No. 2 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% указанной последовательности SEQ ID No. 2.
Предпочтительно, бактерия LMB64 имеет по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID No. 2.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения, бактерия LMB64 характеризуется тем, что она не является нитчатой.
Другие характеристики указанной бактерии LMB64 будут подробно описаны ниже в Примерах.
Кроме того, согласно Будапештскому Соглашению, бактерия LMB64 по настоящему изобретению была депонирована от имени Заявителя в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) в институте Пастера в Париже 8 апреля 2010 г. под номером I-4290.
Таким образом, один объект изобретения представляет собой бактерию, депонированную в CNCM 8 апреля 2010 г.под номером I-4290, или ее гомолога, потомка или любого мутанта.
Термин "мутант" обозначает любую бактерию, которая непосредственно происходит из штамма I-4290 и может содержать естественные мутации или рекомбинации, такие как, например, любые рекомбинации, связанные с клеточной пролиферацией, клеточным делением (мутации вследствие ошибок, возникающих в ходе деления бактерий или репликации ДНК) или любым иным механизмом естественной селекции, такой как селекция мутантов, резистентных или становящихся резистентными к заданному соединению. Эти мутанты включают любых бактерий, происходящих из штамма I-4290, имеющих одну или более мутаций в их геномной последовательности (или последовательности их плазмиды), у которых мутации вызваны радиацией, вирусом, транспозонами или мутагенными химическими веществами.
Согласно первому воплощению изобретения, из бактериальной культуры можно выделить общую биомассу при помощи различных известных способов, например, таких как фильтрация, осаждение спиртом (этанолом, изопропанолом, изобутанолом), высушивание на цилиндре с предслоем с очищаемой поверхностью, и т.д., а затем использовать в высушенной вымораживанием или инактивированной нагреванием форме.
Согласно другому предпочтительному воплощению, изобретение в общем касается бактериального экстракта, также называемого бактериальной фракцией, полученного (ой) из суспензии бактерий, описанных выше, а именно бактерии LMB64.
Термин "бактериальный экстракт" обозначает любой экстракт или фракцию бактериальной биомассы или любую активную фракцию указанного экстракта. Например, такой экстракт можно получить из культуры бактерии LMB64, при этом способ получения включает по меньшей мере один этап лизиса бактерий и один этап разделения различных составляющих его фракций путем центрифугирования или путем фильтрации.
Экстракт согласно изобретению может состоять из бактериальных клеток, выделенных из культуральной среды, которую сконцентрировали, например, путем центрифугирования; или из концентрата бактериальных клеток, прошедших обработку, при которой клеточная оболочка была разрушена любым способом, известным специалистам в данной области, например, под воздействием ультразвука или автоклавирования; или из супернатанта, полученного путем фильтрования, но не исчерпывается этим.
Важный этап способа приготовления экстракта по изобретению состоит в удалении различных внутриклеточных компонентов, например, таких как нуклеиновые кислоты (хромосомная ДНК, внехромосомная кольцевая ДНК, плазмиды), рибосомы и внутриклеточные запасные вещества, такие как гликоген, крахмал и поли-β-гидроксибутират и т.д.
Предпочтительно, бактериальный экстракт согласно изобретению получают после обработки указанной бактериальной суспензии таким образом, чтобы удалить внутриклеточные компоненты.
В результате экстракт по изобретению преимущественно содержит компоненты, происходящие из мембраны, периплазматического пространства и/или из внеклеточного пространства.
Более конкретно, указанные внутриклеточные компоненты содержат по меньшей мере нуклеиновые кислоты.
Помимо удаления внутриклеточных компонентов, в качестве примера, не являющегося исчерпывающим, после проведения лизиса бактерий и центрифугирования также возможно разделение компонентов культурального супернатанта (далее обозначается фракция S0) и компонентов, составляющих осадок (далее обозначаются Е0), которое может быть легко выполнено специалистами в данной области. Например, можно предложить, чтобы пороговое значение для разделения компонентов S0 и Е0 приблизительно соответствовало молекулярному весу 100 кДа. Таким образом, компоненты фракции S0 будут преимущественно иметь молекулярный вес менее 100 кДа, тогда как компоненты фракции Е0 будут преимущественно иметь молекулярный вес более 100 кДа.
Более конкретно, при помощи методик, известных специалистам в данной области, возможно экстрагировать и отделять биомолекулы, присутствующие в культуральном супернатанте (S0), от тех, которые главным образом представлены поверхностными белками и белками, находящимися в периплазматическом пространстве бактерий (Е0).
Согласно одному воплощению изобретения, бактериальный экстракт включает фракцию Е0, содержащую по меньшей мере мембранные белки, периплазматические белки и белки, происходящие из жгутика.
rd
Периплазматические белки включают белки, находящиеся в периплазматическом пространстве грамотрицательных бактерий, которые могут высвобождаться при осмотическом шоке или при инкубации со средой, содержащей хаотропные агенты или детергенты (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 edition: Sambrook and Russell. CSHL Press).
Белки, происходящие из жгутика, включают мультимерные белки жгутика или фрагменты жгутика. Способы выделения и очистки целых бактериальных жгутиков при помощи детергентов с последующим разделением при помощи ультрацентрифугирования (в градиенте CsCl) описаны в литературе. В изобретении приведенные примеры способов экстракции позволили выделить фрагменты жгутиков.
Мембранные белки включают белки, закрепленные в мембране и частично экспонированные на поверхность (белки наружной мембраны, или Omp, от англ. outer membrane proteins), белки, адгезированные к поверхности мембраны, липопротеины и порины (Ward JB., Microbial adhesion to surfaces, 1980).
Предпочтительно, указанные мембранные белки состоят из поринов, OmpA, липополисахаридов и/или липопротеинов.
Согласно другому воплощению изобретения может быть предпочтительно применять фракцию S0.
Более конкретно, бактериальный экстракт согласно изобретению включает фракцию S0, содержащую по меньшей мере секретируемые пептиды и белки, а также вторичные метаболиты.
Секретируемые пептиды и белки включают пептиды и белки, которые естественным образом вырабатывают и секретируют бактерии LMB64 и которые можно получить путем центрифугирования или фильтрации.
Вторичные метаболиты включают низкомолекулярные молекулы, вырабатываемые и секретируемые в культуральную среду бактериями LMB64.
Следует здесь отметить присутствие липополисахаридов в составе фракции S0. В действительности, липополисахариды, хотя они преимущественно обнаруживаются во фракции Е0, также обнаруживаются в меньших количествах во фракции S0.
Предпочтительно, фракции Е0 и S0 можно комбинировать таким образом, чтобы получить фракцию ES0, например, оставляя культуральную среду для инкубации и реагирования в щелочной среде (pH от 9 до 11) приблизительно в течение 5 часов при температуре 4°C, центрифугируя и фильтруя через фильтр 0,2 мкм для получения прозрачного раствора ES0.
Бактериальный экстракт ES0, таким образом, состоит, помимо прочего, из мембранных белков, липополисахаридов, периплазматических белков, фрагментов белков жгутика и первичных и вторичных метаболитов, вырабатываемых бактериями.
Предпочтительно, экстракт ES0 имеет белковый профиль, в котором при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле можно выделить по меньшей мере двенадцать полос, включая три основные полосы, соответствующие молекулярным весам (приблизительный молекулярный вес указан относительно стандартов с известным молекулярным весом, в частности поставляемых Bio-Rad Laboratories), находящимися в пределах:
- полоса 1: между 30 кДа и 36 кДа, предпочтительно 34 кДа;
- полоса 2: между 41 кДа и 45 кДа, предпочтительно 43 кДа;
- полоса 3: между 47 кДа и 51 кДа, предпочтительно 49 кДа.
Согласно другому воплощению изобретения, бактериальный экстракт включает фракцию ES0, содержащую по меньшей мере фракцию Е0 и фракцию S0.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения бактериальный экстракт включает фракцию ES0, у которой белковый профиль, полученный при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле, включает три основные полосы, соответствующие молекулярным весам, находящимся в пределах 30 кДа и 36 кДа, 41 кДа и 45 кДа, и 47 кДа и 51 кДа, соответственно.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения бактериальный экстракт включает фракцию ES0, у которой белковый профиль, полученный при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле, включает три основные полосы, соответствующие молекулярным весам 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа, соответственно.
В другом аспекте изобретения описан способ приготовления бактериального экстракта, включающий этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде; и
b) удаления внутриклеточных компонентов.
Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта S0, причем указанный способ включает этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;
b) центрифугирования указанной культуры; и
c) сбора супернатанта S0.
Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта Е0, причем указанный способ включает этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;
b) центрифугирования указанной культуры и удаления супернатанта;
c) обработки биомассы, полученной на этапе b) таким образом, чтобы удалить внутриклеточные компоненты; и
d) сбора осадка Е0.
Предпочтительно, этап с) состоит из ультразвуковой обработки биомассы, полученной на этапе b), с последующим предварительным центрифугированием, предназначенным для удаления осадка, содержащего указанные внутриклеточные компоненты, а затем вторым центрифугированием супернатанта.
Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта Е0, причем указанный способ включает этапы:
а) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;
b) центрифугирования указанной культуры и удаления супернатанта;
c) обработки ультразвуком биомассы, полученной на этапе b);
d) центрифугирования указанной биомассы, обработанной ультразвуком, и удаления полученной биомассы;
e) центрифугирования супернатанта, полученного на этапе d); и
f) сбора осадка Е0.
Следует отметить, что различные способы, описанные выше, приведены только в качестве иллюстрации и что можно применять любые способы, известные с специалистам в данной области.
Как станет очевидным из приведенных ниже Примеров, помимо активности, предполагаемой для экстрактов такого типа, Заявитель продемонстрировал некоторые новые виды активности, не описанные ранее.
Первый преимущественный аспект изобретения, касающийся иммуномодуляции, основан на модуляции свойств провоспалительных цитокинов. Более конкретно, применение бактерии и/или экстракта согласно изобретению вызывает значимую индукцию цитокинов IL-10, IL-12 и TNFα, которые преимущественно задействованы в Th1-иммунном ответе, и значимое ингибирование цитокинов IL-4 и IL-6. В результате происходит активация клеток Лангерганса и нормализация баланса Th1/Th2.
Кроме того, согласно другим наблюдениям было показано, что применение бактерии и/или бактериального экстракта согласно изобретению позволяет значительно понизить экспрессию рецепторов IgE, что представляет интерес, поскольку IgE потенциирует аллергические процессы.
Другое преимущество изобретения основано на том факте, что, как станет очевидно из Примеров, применение бактерии и/или экстракта согласно изобретению индуцирует образование противомикробных пептидов, например, таких как пептиды hBD-2, hBD-3, S1007A и LL-31.
Более конкретно, как упоминалось выше, бактериальный экстракт Vitreoscilla filiformis (Guéniche A. et al., Eur J Dermatol 2006; 16: 380) известен своей активностью в отношении TLR2, благодаря наличию OmpA, и в отношении TLR4, благодаря наличию липополисахаридов. Из-за отсутствия жгутиков у бактерии V. filiformis экстракт, получаемый из V. filiformis, не обладает активностью в отношении TLR5.
Впервые Заявителем был описан бактериальный экстракт по изобретению, который помимо активности в отношении TLR2 и TLR4, обладает активностью в отношении TLR5.
Таким образом, изобретение относится к применению бактерии и/или бактериального экстракта, описанных выше, в качестве активатора TLR2, TLR4 и TLR5.
Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт, активирующий TLR2, TLR4 и TLR5, состоит из экстракта, содержащего все или некоторые из белков, происходящих из жгутика. В этом случае, например, указанный экстракт предпочтительно представляет собой экстракт Е0 или экстракт ES0.
Указанная активность, приводящая к стимуляции TLR5, представляет значительный интерес, поскольку известно, что TLR5 повышает уровень некоторых противомикробных пептидов, таких как псориазин (S100A7) и hBD-2 (Glaser et al., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649). Кроме того, агонисты TLR5 действуют синергично с агонистами TLR2 и TLR4, что потенциирует выработку противомикробных пептидов. Было показано, что при блокировании TLR5 при помощи антител, последние вырабатываются в малых количествах или не вырабатываются совсем.
Таким образом, данный аспект является особенно инновационным в части, касающейся использования бактерии и/или экстрактов согласно изобретению для иммуномодуляции.
Кроме того, Заявителем была неожиданно продемонстрирована антагонистическая активность в отношении PAR2, в отличие от бактериальных экстрактов, описанных до настоящего времени. Эта активность представляет значительный интерес в контексте противовоспалительного лечения.
Таким образом, изобретение в частности касается применения бактерии и/или бактериального экстракта, описанных выше, в качестве антагониста PAR2.
Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт, являющийся антагонистом PAR2, состоит из экстракта S0 или экстракта ES0.
Повышенная экспрессия PAR2 наблюдается в эндотелиальных клетках, миоцитах толстой кишки, энтероцитах, нейронах кишечника, иммунных клетках и кератиноцитах. Протеазы (трипсин, триптаза), присутствующие в большом количестве в окружающей среде, расщепляют PAR2 со стороны N-конца, что приводит к экспонированию особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации). В результате это активирует выработку провоспалительных цитокинов и запускает воспалительные реакции (Vergnolle, N. 2009, Pharmacol. Then 123: 292-309). Этот феномен наблюдается у мышей дикого типа, но отсутствует у мышей с генным нокаутом (с отсутствием PAR2). Лечение антипротеазами и/или антагонистами PAR2 позволяет избежать этих воспалительных явлений.
Сочетание всех этих видов активности и синергия между ними обеспечивают бактерии LMB64 или любому экстракту, получаемому из этих бактерий, большие потенциальные возможности в лечении воспалительных заболеваний и, в частности, воспалительных заболеваний, в которые вовлечен PAR2 и/или при которых происходит ослабление, нарушение или дисбаланс иммунной системы.
Таким образом, изобретение касается применения бактерии, описанной выше, и/или бактериального экстракта, полученного из указанных бактерий, для изготовления композиции, предназначенной для лечения и/или предупреждения кожных воспалительных заболеваний.
Предпочтительно, указанные кожные воспалительные заболевания состоят из атопического дерматита, прурита, экземы и псориаза.
Согласно другому воплощению изобретение, представленное в данной патентной заявке, относится к композиции, содержащей, в качестве активного ингредиента, по меньшей мере одну бактерию и/или один бактериальный экстракт согласно изобретению.
Таким образом, изобретение предпочтительно касается косметической или дерматологической композиции.
Композиция согласно изобретению имеет отношение к лечению кожных воспалительных заболеваний.
Предпочтительно, указанные кожные воспалительные заболевания состоят из атопического дерматита, прурита, экземы и псориаза.
Композиция согласно изобретению может, в частности, содержать добавки и вспомогательные компоненты, такие как эмульгаторы, загустители, желирующие агенты, связывающие воду добавки и компоненты, лиофилизирующие агенты, стабилизаторы, красители, ароматизаторы и консерванты.
Косметическая или дерматологическая композиция согласно изобретению также содержит один или более стандартных дерматологически совместимых наполнителей.
Композиция согласно изобретению может быть изготовлена в форме эмульсии «вода в масле» (W/О) или «масло в воде» (O/W), сложной эмульсии, такой как, например, «вода в масле в воде» (W/O/W) или «масло в воде в масле» (O/W/O), микроэмульсии или в форме водно-дисперсной системы или липодисперсной системы, геля или аэрозоля.
Дерматологически или косметически совместимые наполнители могут представлять собой любой наполнитель, известный специалистам в данной области, позволяющие получить композицию для местного применения в форме молочка, крема, бальзама, масла, лосьона, геля, пены, помады, спрея и т.д.
Помимо дерматологических и косметических композиций изобретение также касается фармацевтических композиций для применения в качестве лекарства.
Таким образом, изобретение касается фармацевтической композиции, также содержащей фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем описании "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает соединение или комбинацию соединений, являющиеся частью фармацевтической композиции, которые не вызывают побочных реакций и которые, например, облегчают введение активных соединений, повышают длительность их существования и/или эффективность в организме, повышают их растворимость в растворе или улучшают их сохранность. Указанные фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть адаптированы специалистами в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранных активных соединений.
Предпочтительно, указанные соединения можно вводить системно внутримышечным, интрадермальным, интраперитонеальным или подкожным путем, или оральным путем. Композиции, содержащие антитела по изобретению, можно вводить в виде нескольких доз, разделенных во времени.
Их оптимальные способы введения, режимы дозирования и галеновые формы могут быть установлены в соответствии с критериями, обычно принимаемыми во внимание при разработке лечения, адаптированного для пациента, например, с учетом возраста или веса пациента, общего состояния здоровья пациента, переносимости лечения и отмеченных побочных эффектов.
Приведенные ниже Примеры, иллюстрирующие изобретение, позволяют лучше понять изобретение, но не ограничивают его объема.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фигуре 1 изображено филогенетическое положение последовательности, кодирующей 16S рРНК штамма LMB64. Последовательности, представленные на этом дереве, являются последовательностями из базы данных GenBank, наиболее близкими последовательности LMB64.
На Фигурах 2А и 2Б представлен вид бактерии LMB64 в трансмиссионном электронном микроскопе (А) и сканирующем электронном микроскопе (Б).
На Фигуре 3 представлены оптимальные условия культивирования, установленные в зависимости от температуры, pH и минерализации культуральной среды R3.
На Фигуре 4 показана индукция цитокинов IL-10 и IL-12 под воздействием экстракта Е0 (дозозависимое действие).
На Фигуре 5 показана индукция экспрессии поверхностных молекул CD80, CD86, CD83 и CD54 под воздействием экстракта Е0 (дозозависимое действие).
На Фигуре 6 показано ингибирование рецепторов IgE под воздействием экстракта Е0.
На Фигуре 7 показана активация TLR2 под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 8 показана активация TLR4 под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 9 показана активация TLR5 под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 10 показана антагонистическая активность экстракта ES0, специфическая в отношении PAR2.
На Фигуре 11 показана индукция противомикробных пептидов и белков под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 12 показаны результаты денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле экстракта ES0.
Пример 1: Выделение и характеристика бактерии LMB64
Бактерия AV13 была выделена из почвенно-грунтовых вод.
Таксономическое положение новой бактерии LMB64 предложено на Фигуре 1.
Более конкретно, бактерия LMB64 имеет палочковидную форму, длиной приблизительно 2,3 мкм (±0,3) и толщиной приблизительно 1,0 мкм (±0,1). Отличительной чертой этой бактерии является наличие полярно расположенного жгутика (Фигуры 2А и 2Б). Как видно на изображениях, бактерия LMB64 представляет собой бактерию, которая не относится к нитчатым бактериям.
Как было упомянуто выше, бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду размером приблизительно 11 тпн. Эта плазмида была полностью секвенирована (SEQ ID No. 2).
Ген, кодирующий 16S рРНК, также был секвенирован (SEQ ID No. 1). Бактерию культивировали в ферментере в искусственной среде. Скорость роста была выше, когда среда содержала углеродные субстраты в низких концентрациях.
Были апробированы культуральные среды R3, MS-глюкоза и LB, состав которых представлен ниже в Таблицах 1а, 1б и 1в, соответственно.
Таблица 1а
Состав среды R3
Дрожжевой экстракт
1 г/л
Протеозопептон Difco
1 г/л
Казаминовые кислоты
1 г/л
Глюкоза
1 г/л
Растворимый крахмал
1 г/л
Пируват натрия
0,5 г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,6 г/л
MgSO<sub>4</sub>, 7H<sub>2</sub>O
0,1 г/л
Таблица 1б
Состав среды MS-Глюкоза
Глюкоза
6,0 г/л
Лимонная кислота
0,84 г/л
MgSO<sub>4</sub>, 7H<sub>2</sub>O
0,25 г/л
NH<sub>4</sub>Cl
1,06 г/л
Безводный K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
8,75 г/л
Пируват натрия
0,5 г/л
Сульфат цинка, 7H<sub>2</sub>O
4 мг/л
Хлорид кобальта, 6H<sub>2</sub>O
3,5 мг/л
Молибдат натрия, 2H<sub>2</sub>O
3,5 мг/л
Сульфат марганца, 1H<sub>2</sub>O
5 мг/л
Борная кислота
2 мг/л
Концентрированная соляная кислота
50 мг/л
Сульфат меди, 5H<sub>2</sub>O
4 мг/л
Хлорид железа, 6H<sub>2</sub>O
27 мг/л
Таблица 1в
Состав среды LB
Триптон
10 г/л
Дрожжевой экстракт
5 г/л
NaCl
5 г/л
Скорость роста бактерии LMB64 в зависимости от культуральной среды представлена ниже в Таблице 2.
Таблица 2
Скорость роста (1 ч)
LB
0,25 (±0,05)
LB (разведение 1/2)
0,46 (±0,11)
LB (разведение 1/5)
0,60 (±0,14)
LB (разведение 1/10)
0,69 (±0,15)
MS-глюкоза
0,13 (±0,04)
R3
0,62 (±0,14)
Были установлены оптимальные условия культивирования в зависимости от температуры, pH и минерализации культуральной среды R3 (Фигура 3).
Источники углерода, усваиваемого бактериями, были охарактеризованы при помощи тест-системы API 50СН (температура инкубации: 25°С). Результаты кратко представлены ниже в Таблице 3.
Таблица 3
Время инкубации
4 сут
5 сут
1. Глицерол
2. Эритритол
3. D-арабиноза
4. L-арабиноза
5. D-рибоза
6. D-ксилоза
7. L-ксилоза
8. D-адонитол
9. Метил-β-D-ксилопиранозид
10. D-галактоза
11. D-глюкоза
+
+
12. D-фруктоза
+
+
13. D-манноза
14. L-сорбоза
15. L-рамноза
16. Дульцит
17. Инозитол
I
+
18. D-маннитол
19. D-сорбитол
20. Метил-α-D-маннопиранозид
21. Метил-α-D-глюкопиранозид
22. N-ацетилглюкозамин
23. Амигдалин
24. Арбутин
25. Эскулин/цитрат железа
26. Салицин
27. D-целлобиоза
28. D-мальтоза
I
+
29. D-лактоза (бычья)
30. D-мелибиоза
31. D-сахароза
+
+
32. D-трегалоза
I
+
33. Инулин
34. D-мелецитоза
35. D-Раффиноза
36. Крахмал
37. Гликоген
38. Ксилитол
39. Гентиобиоза
40. D-тураноза
I
+
41. D-ликсоза
42. D-тагатоза
43. D-фукоза
44. L-фукоза
45. D-арабит
46. L-арабит
47. Клюконат калия
48. 2-кетоглюконат калия
49. 5-кетоглюконат калия
+: используемый субстрат, I: ограниченное использование
При помощи тест-системы API ZYM была выявлена активность следующих ферментов: щелочной фосфатазы, эстеразы (С4), эстеразы/липазы (С8), лейцин ариламидазы, валин ариламидазы, кислой фосфатазы, нафтол-AS-BI-фосфогидролазы и α-глюкозидазы.
Бактерия LMB64 чувствительна ко всем протестированным антибиотикам, представленным ниже в Таблице 4.
Таблица 4
Протестированные антибиотики
Диаметр зоны подавления роста (мм)
Ингибиторная активность
R3
LB 1/2
LB 1/5
Ампициллин (10 мкг)
29
28
29
+
Хлорамфеникол (30 мкг)
29
26
24
+
Ципрофлоксацин (5 мкг)
38
34
34
+
Канамицин (30 мкг)
27
30
27
+
Пенициллин (6 мкг)
21
26
20
+
Полимиксин В (50 мкг)
11
15
13
+
Рифампицин (30 мкг)
20
19
15
+
Тетрациклин (30 мкг)
30
25
20
+
Стрептомицин (10 мкг)
25
25
24
+
Ванкомицин (30 мкг)
20
21
21
+
Пример 2: Способ выделения фракций Е0, S0 и ES0
600
Прекультура: Штамм AV13 инокулировали в колбы Эрленмейера, содержащие 250 мл среды MS с глюкозой и пируватом (см. Таблицу 5 ниже), с последующей инкубацией при перемешивании приблизительно в течение 40 часов при 30°C (pH 7) и 200 об/мин до достижения OD≈1,5.
Таблица 5
MS Глюкоза Пируват
Лимонная кислота
0,84 г
MgSO<sub>4</sub>, 7H<sub>2</sub>O
0,25 г
NH<sub>4</sub>Cl
1,06 г
Безводный K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
8,75 г
Пируват натрия
0,5 г
Смесь Oligo
1 мл
ddH<sub>2</sub>O qsp
1000 мл
Проверка pH
7
Автоклавирование
121°C 30 мин
Добавление после автоклавирования:20% глюкоза
30 мл
Смесь OLIGO
Растворить в 100 мл дистиллированной воды:
Сульфат цинка, 7H<sub>2</sub>O
4 г
Хлорид кобальта, 6H<sub>2</sub>O
3,5 г
Молибдат натрия, 2H<sub>2</sub>O
3,5 г
Сульфат марганца, 1H<sub>2</sub>O
5 г
Борная кислота
2 г
Концентрированная соляная кислота
50 г
Сульфат меди, 5H<sub>2</sub>O
4 г
Растворить в 50 мл дистиллированной воды:
Хлорид железа, 6H<sub>2</sub>O
27 г
ddH<sub>2</sub>O qsp
1000 мл
4
600
Культура: Прекультуру затем инокулировали в ферментер (Applikon), в котором содержалось 3,7 л среды MS с пируватом + 114 мл 20% раствора глюкозы. При помощи температурных сенсоров поддерживали температуру предпочтительно около 30°С. Кислородный сенсор (AppliSens) использовали для поддержания концентрации растворенного кислорода в среде на уровне 18-25%. Сенсор pH (AppliSens) использовали для поддержания pH 7 путем добавления 10% NHOH при помощи помпы с фиксированной скоростью потока. Для мониторинга изменений оптической плотности в реальном времени использовали сенсор Wedgewood Analytical. Культивирование осуществляли методом периодических культур с подпиткой; при помощи помпы с переменной скоростью тока в культуру добавляли 20% раствор глюкозы. Ферментацию останавливали при PD≈22-26, как правило, по прошествии приблизительно 30 часов.
Выделение S0: Супернатант отделяли от биомассы путем центрифугирования в течение 1 часа при 4°C и 4000 g.
Выделение Е0: Влажную биомассу ресуспендировали в растворе NaCl (1 М). После центрифугирования в течение 15 мин при 4°C  и 9000 g, супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в растворе 1 М NaCl. Затем пробирку с образцом на несколько минут погружали в охлаждаемую ванну соникатора с мощностью, настроенной на 50-60 W. После центрифугирования в течение 30 мин при 4°C и 6000 g осадок отбрасывали и собирали супернатант. Добавляли два объема холодного этанола и оставляли суспензию на ночь при 4°C. После центрифугирования в течение 30 мин при 4°C  и 6000 g супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 25 мМ Tris буфере, pH 8,8.
Выделение ES0: Приводили pH культуры к щелочным значениям (pH 9-11) при помощи основного буфера. На следующем этапе проводили инкубацию при перемешивании в течение 5 часов при температуре 4°C. После центрифугирования супернатант пропускали через фильтр предварительной очистки для удаления остатков дебриса биомассы, а затем фильтровали с помощью 0,2 мкм фильтра. Получали прозрачный желтый раствор (ES0).
Белки анализировали согласно протоколу набора DC Protein Assay Kit II (Bio-Rad). Углеводы определяли по реакции с фенолом и серной кислотой (Dubois, М. et al., 1956), выражая результаты в глюкозном эквиваленте.
В качестве примера в Таблице 6 ниже представлены некоторые специфические характеристики экстракта ES0, полученного в условиях, описанных выше.
Таблица 6
Тестовая проба
Доклиническая проба 1
Органолептические характеристики
Гомогенная и прозрачная желто-оранжевая жидкость
Плотность близка плотности воды
pH (в присутствии основного буфера)
10,0
10,2
Сухой остаток (температурное равновесие)
5,9%
5,1%
Белковый профиль (SDS-PAGE)
12 детектируемых полос (включая 3 основные полосы размером приблизительно 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа, соответственно)
Определение общего белка (μBCA)
2,9 мг/мл
3,0 мг/мл
Очевидно, что данные, приведенные выше, представлены здесь исключительно в иллюстративных целях.
Более подробно приводятся данные, относящиеся к белковому профилю, полученному при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле, который позволил выявить три основные полосы.
Протокол денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле:
Экстракт ES0 ресуспендировали в буфере (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 1 мМ EDTA; 2,5% SDS и 0,01% бромофеноловый синий) и 1 М DTT (1,4-дитиотрейтол). Образец и смесь маркеров молекулярного веса (WesternC, Bio-Rad) наносили соответственно в лунки 8-16% полиакриламидного геля (GeBaGel, Gene Bio-Application). Буфер для миграции содержал 2,5 мМ Tris, 19,2 мМ глицина и 0,01% SDS (вес/объем). Миграцию осуществляли при постоянном напряжении 160 В приблизительно в течение 1 часа (GeBaGel system). После этого полосы белков окрашивали кумасси синим (Instant Blue, Expedeon). Размеры рассчитывали по отношению к известным стандартам (STD).
Полученный гель показан на Фигуре 12.
Согласно одному воплощению изобретения, эти три полосы имеют молекулярный вес приблизительно 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа, соответственно.
Пример 3: Демонстрация фармакологической активности фракций Е0 и ESQ Клетки Лангерганса (LC) получали in vitro из моноцитов человека, выделенных из лейкоконцентрата, полученного из Французской Национальной Службы Крови (Etablissement Français du Sang (EFS) Pyrénées Méditerranée): выделение осуществляли в градиенте фиколла (Lymphocyte Separation Medium, плотность 1,077 г/мл) и очищали при помощи магнитной иммуноселекции (Miltenyi Biotec); дифференцировку LC осуществляли в течение 6 дней в присутствии коктейля цитокинов (GM-CSF/IL-4/TGFβ). LC помещали в 24-луночные планшеты в культуральной среде RPMI-5% FCS и инкубировали в течение 24 часов с экстрактом ES0.
Поверхностные молекулы анализировали при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur, BD Biosciences) с окрашиванием по трем или четырем маркерам: CD1a/CD54/CD80/CD83/CD86/FcεRI; при помощи Cytometry Bead Array (кат номер 550749, BD) с использованием проточной цитометрии анализировали цитокины, секретируемые в культуральный супернатант: IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10, IL-12.
3.1 Индукция ключевых цитокинов, вызывающих поляризацию клеток в направлении Th1
Экстракт Е0 индуцировал с дозозависимым эффектом экспрессию цитокинов IL-10 и IL-12 клетками Лангерганса (Фигура 4). Эти цитокины способствуют направлению поляризации наивных Т лимфоцитов к ТН1 типу.
3.2 Созревание клеток Лангерганса и ингибирование рецептора IgE (FcεRI)
Экстракт Е0 индуцировал созревание клеток Лангерганса, которое регистрировали по дозозависимой индукции экспрессии поверхностных молекул CD80, CD86, CD83 и CD54 (Фигура 5). Таким же образом, экстракт Е0 ингибировал экспрессию рецепторов IgE (FcεRI), проявляя дозозависимый эффект (Фигура 6).
3.3 Активация Toll-подобных рецепторов (TLR)
Активность ES0 в отношении TLR оценивали на TLR2, TLR4 и TLR5 с использованием в качестве модели клеток НЕК293, совместно трансфецированных геном TLR2, TLR4 или TLR5 и геном-репортером NFκB-sAP (секретируемой щелочной фосфатазы). Связывание лиганда со своим TLR приводило к активации транскрипционного фактора NFκB; ген sAP помещали под контроль промотора, индуцируемого NFκB. Этот ген-репортер позволяет отслеживать клеточную сигнализацию, опосредуемую TLR: высвобождение sAP, индуцированное ES0 и измеренное при помощи колориметрического теста, позволяло определить активность этого активного ингредиента в качестве агониста TLR2, TLR4 или TLR5.
Исследование проводили на следующих линиях эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney, HEK293):
- клетки HEK-Blue™-2 для TLR2,
- клетки HEK-Blue™-4 для TLR4,
- клетки HEK-Blue™-5 для TLR5.
Эти клеточные линии содержали в культуральной среде HEK-Blue™ Selection с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а затем переносили в 96-луночные планшеты в среду HEK-Blue™ Detection в присутствии ES0 на 18 часов. Считывали показания с планшетов при помощи калориметрии при 620 нм.
3.3.1 Активация TLR2
Экстракт ES0 вызывал активацию TLR2, обладая дозозависимым эффектом с максимальной активностью при 100 нг/мл (Фигура 7).
3.3.2 Активация TLR4
Экстракт ES0 вызывал активацию TLR4 с максимальной активностью при 10 нг/мл (Фигура 8).
3.3.3 Активация TLR5
Экстракт ES0 вызывал активацию TLR5, обладая дозозависимым эффектом. Данная активность подавлялась в присутствии антитела к TLR5, что указывало на специфичность активирующего действия ES0 в отношении TLR5 (Фигура 9).
3.4 Ингибирование активируемого протеазами рецептора 2 (PAR2)
Ингибирование активируемых протеазами рецепторов под воздействием экстракта ES0 оценивали на кератиноцитах человека клеточной линии (HaCaT) путем измерения притока внутриклеточного кальция, вызванного при специфической стимуляции PAR2 трипсином рогового слоя (stratum corneum tryptic enzyme, SCTE). Использовали флуоресцентный зонд Fluo-4/АМ: его эстерифицированная форма облегчает его проникновение внутрь клеток путем пассивной диффузии; только деэстерифицированная форма, связанная с ионами кальция, способна возбуждаться при 485 нм с испусканием флуоресценции при 535 нм.

Флуоресцентный зонд в течение 30 минут внедряли в клетки, раскапанные по 96-луночным планшетам, после чего в течение 30 минут проводили инкубацию с экстрактом ES0. Приток кальция регистрировали в каждой лунке по отдельности в реальном времени кинетическим методом до и после инъекции SCTE. Считывали показания планшетов при помощи считывающего устройства Mithras LB940™ (Berthold Technologies).
Экстракт ES0 ингибировал дозозависимым образом активацию PAR2, индуцированную SCTE человека (Фигура 10).
3.5 Модуляция в кератиноцитах генов-мишеней, связанных с атопическим дерматитом
Исследование проводили на нормальных эпидермальных кератиноцитах человека (NHEK, культуральная среда K-SFM) при индукции фенотипа, характерного для атопического дерматита. Активность ES0 изучали на кератиноцитах, приобретающих фенотип, характерный для атопического дерматита, после стимуляции в течение 24 часов Poly I:C + IL-4 + IL-13 + TNFα и анализировали при помощи ПЦР-эррея экспрессию 32 выбранных генов, входящих в состав панели.
Как видно из Таблицы 7 ниже, экстракт ES0 вызывал в кератиноцитах дозозависимое ингибирование 15 мишеней, относящихся к медиаторам, задействованным в патологии атопического дерматита (результаты приведены для каждого гена-мишени в виде степени ингибирования, выраженной в процентах).
Таблица 7
ES0
Дексаметазон
10 м кг/мл
30 м кг/мл
60 м кг/мл
2 мкМ
Цитокины
TSLP
56%
75%
92%
91%
IL-1α
35%
46%
59%
54%
IL-18
27%
44%
65%
44%
IFN-β1
66%
82%
90%
49%
Хемокины
IL-8
37%
55%
88%
75%
MIP-1α
10%
43%
75%
76%
RANTES
15%
44%
65%
12%
МСР-3
43%
63%
88%
Pro 20%
TARC
58%
64%
39%
Pro 20%
MIP-3α
41%
61%
80%
40%
MDC
16%
44%
58%
45%
Skinkine
28%
32%
39%
59%
Рецепторы
IL-4-R
30%
45%
69%
75%
RARRES3
30%
47%
63%
28%
TLR3
22%
50%
60%
Pro 29%
3.6 Индукция противомикробных пептидов
Активность экстракта ES0 в отношении экспрессии противомикробных пептидов и белков изучали на клеточной линии кератиноцитов HaCaT: через 3 часа обработки в присутствии ES0 клетки собирали для анализа экспрессии генов-мишеней, кодирующих противомикробные пептиды, при помощи количественной ОТ-ПЦР; выделяли и брали в анализ общую РНК; после обратной транскрипции мРНК в кДНК проводили амплификацию при помощи количественной ПЦР в 96-луночных планшетах с использованием системы для количественной ПЦР iCycler (Bio-Rad). Полученные результаты выражали как относительное количество (RQ) мРНК после обработки ES0 по отношению к контролю без использования активного ингредиента. Параллельно в качестве положительного контроля, вызывающего индукцию экспрессии противомикробных пептидов, использовали IL-1B. Экспрессию гена, представляющего интерес, считали измененной при RQ≥2 (индукция) или RQ≤0,5 (ингибирование).
Экстракт ES0 индуцирует экспрессию противомикробных пептидов и белков hBD2, hBD3, S1007A, LL37, PI3, РНКазы7 и NOD2 (Фигура 11).
Пример 4: Состав крема для лица и тела, содержащего бактериальный экстракт ES0
Экстракт ES0
0,1-5%
Масло энотеры
1-3%
Глицин
0,1-0,4%
Церамиды
0,1-0,3%
Увлажнители
5-20%
Эмульгаторы
2-7%
Триглицериды каприловой и каприновой кислот
1-10%
Консерванты
Вода до 100%
Пример 5: Состав очищающего геля для лица и тела, содержащего бактериальный экстракт ES0
Экстракт ES0
0,1-5%
Масло энотеры
0,5-2%
Глицин
0,1-0,4%
Церамиды
0,1-0,4%
Поверхностно-активные вещества
10-20% в активном веществе
Увлажнители
5-15%
Консерванты
Вода до 100%