СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ
METHOD FOR PRODUCTION OF STAPHYLOCOCCIC ANATOXIN-VACCINE

Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и лечения болезней животных стафилококковой этиологии.
Известные способы получения инактивированных вирусных и бактерийных вакцин, анатоксинов основаны на использовании 0,8±0,2% раствора формалина, УФ-лучей, ионизирующих лучей и пр. (Шапиро Я.С. «Микроорганизмы - вирусы бактерии грибы». Издательство «ЭЛБИ». - СПб, 2003 г., с.156-160).
Недостатком указанных способов является проведение детоксикации стафилококковых экзо- и эндотоксинов с помощью 0,8±0,2% раствора формалина, который является канцерогенным и практически не обеспечивает детоксикацию суперэнтеротоксинов и соответственно не превращает их в анатоксины (Коротяев А.И., Бабичев С.А. «Медицинская микробиология, иммунология и вирусология». Санкт-Петербург, издательство «Специальная литература», 1998 г., с.333).
Поиск более эффективных и безвредных детоксикаторов с использованием жирных кислот, перекиси водорода, антибиотиков, фотоокисления, нингидрида, тирозина, Р-пропилактона носил случайный характер и не получил признание.
В то же время в Японии в основу изготовления столбнячного, стафилококкового и стрептококкового анатоксинов положено использование в качестве детоксикатора глюкуроновой кислоты, глюконата и глюкороната натрия (патент №23345 с приоритетом от 06.12.1961 г.).
При этом в отношении стафилококковых суперэнтеротоксинов детоксицирующее действие указанных инактиваторов (детоксикаторов) не указывается, хотя они являются сильнейшими пищевыми ядами и проявляют устойчивость к формалину и температуре.
Следует указать, что термин суперантигены (САГ) используется для определения глобулярных белков-молекул, продуцируемых патогенными микроорганизмами, обладающих пирогенным (эритрогенным) и митогенным действием, способных вызывать артриты, кожные поражения, СПИД, усиливать патогенез и пр.
За прототип взят «Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины» (RU 2139091, 10.10.1999), включающий выращивание стафилококков, их стерилизацию, поэтапную детоксикацию формалином: добавление формалина вначале до концентрации смеси 0,3-0,4% с инкубацией при температуре 37-40°С в течение 7-10 суток, а затем - до конечной концентрации 0,5-0,8% с последующей инкубацией при температуре 44-46°С в течение 5-8 суток, сорбцию на гидроксиде алюминия до концентрации 1 мг/мл и стерилизацию автоклавированием.
Недостатком указанного способа является проведение детоксикации стафилококковых токсинов одним детоксикатором - формалином, который не обеспечивает полноту инактивации всех видов токсинов, и соответственно не может превратить суперэнтеротоксины в анатоксины.
Сравнительная оценка вышеуказанных детоксикаторов и испытание новых выявили эффективность ряда бисчетвертичных аммониевых соединений, в частности этония, который был взят за основу получения стафилококковой анатоксин-вакцины.
Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и безопасности анатоксин-вакцины посредством детоксикации стафилококковых токсинов двумя детоксикаторами в два этапа - первоначально 0,2% раствором формалина, вместо 0,8% в течение 9-10 суток, а затем 0,6±0,1% раствором этония в течение 7-9 суток при 40-45°С.
Поставленная цель достигается снижением концентрации канцерогенного и неэффективного в отношении стафилококковых суперэнтеротоксинов формалина с 0,8±0,2% до 0,2% и последующим прибавлением 0,6±0,1% этония для полной и необратимой детоксикации всех видов токсинов, сорбцией на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл и декантацией 50% надосадочной жидкости.
При этом исходная концентрация формалина снижается с 0,2% до 0,1% из-за связывания с белковыми молекулами токсинов, а безвредность этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид-бисчетвертичное аммониевое соединение) доказана многолетним использованием его в виде 0,5-1% раствора, мазей и пр. в гуманной медицине в стоматологии, офтальмологии, дерматологии и т.д.
В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с использованием этония.
Применение 0,6±0,1% раствора этония при снижении концентрации формалина с 0,8±0,2% до 0,2% в предложенном способе позволяет достичь полной и необратимой детоксикации стафилококковых экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов и получения безвредной и эффективной стафилококковой анатоксин-вакцины.
Установленная возможность полной и необратимой детоксикации комплекса стафилококковых экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов путем использования на первом этапе 0,2% раствора формалина вместо 0,8%, а во втором этапе 0,6±0,1% этония, сорбции на гидроксиде алюминия, декантации 50% надосадочной жидкости позволила разработать оптимальную схему технологического процесса для получения стафилококковой анатоксин-вакцины в промышленных условиях.
Предполагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины
3
Выращенные стафилококки с экзо- и эндотоксинами на жидкой синтетической среде в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, в течение 12±2 суток до 10,0±2,0 млрд/см суспензии микроорганизмов подвергли автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут, далее проводили детоксикацию комплекса токсинов первоначально 0,2% раствором формалина в течение 9-10 суток при 40-45°С, а затем 0,6±0,1% раствором этония при 40-45°С в течение 7-9 суток. После детоксикации проводили сорбцию на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и увеличивали концентрацию инактивированных токсинов с микроорганизмами декантацией 50±5% надосадочной жидкости.
Полученную анатоксин-вакцину расфасовывали в 20, 100 и 200 мл флаконы и подвергали стерилизациии при 1,0 атм в течение 20 минут.
Пример 2.
Определение безвредности стафилококковой анатоксин-вакцины (CAB)
Изучение токсичности CAB проводили на 12 белых мышах массой 20±2,0 г путем внутрибрюшинного (6го.л) и подкожного (6гол.) введения по 1,0 мл биопрепарата.
Все животные без видимых некротических, воспалительных процессов и общего токсикоза оставались живыми при наблюдении в течение 15 суток.
Пример 3
Испытание безвредности на собаках
Для исследований использовано 6 беспородных щенков в возрасте 2-3 месяцев массой 3-4 кг. Подопытным животным одновременно подкожно и внутримышечно ввели по 5 мл CAB. В течение 15 суток все животные оставались живыми, а на месте введения биопрепарата не отмечено воспалительных и гнойно-некротических поражений.
Пример 4
Сравнительная оценка эффективности лечения ожоговых ран у свиней
Ожог кожи у поросят в размере 7-10 см получали путем приложения на 5-7 минут нескольких слоев марли, смоченной 5% раствором карболовой кислоты, - 18 голов.
Лечение проводили в виде примочек два раза в день с помощью 2-х вариантов стафилококковой анатоксин-вакцины, полученных с помощью детоксикации токсинов 0,8% раствором формалина (1-й контрольный вариант) и 0,2% раствором формалина с 0,6% раствором этония (испытуемый вариант). При этом установлено, что грануляционная ткань у поросят при лечении испытуемым вариантом анатоксин-вакцины проявлялась на 2-3 дня раньше, чем у контрольной, грануляция всей раневой поверхности происходила к 20-22 дню лечения, а при лечении ожоговых ран контрольной вакциной к 25-27 дню. Следовательно, при лечении ожоговых ран у свиней стафилококковой анатоксин-вакциной, полученной с помощью этония, процесс заживления ран завершался на 3-5 суток раньше, чем при использовании формолвакцины.
Пример 5
Сравнительная эффективность стафилококковой анатоксин-вакцины с этонием
В исследованиях использовано 45 коров, больных катаральным и гнойно-катаральным маститом (от гр. mastos - грудь, сосок и фр. caftare - воспаление слизистой оболочки). При бактериологическом исследовании молока больных коров были выделены культуры золотистого стафилококка - S. aureus.
Больные животные были разделены на три группы по 15 коров.
В качестве контроля использовали в первом контрольном опыте формоланатоксин-вакцину, во втором мастисан-А, содержащий в суспензии подсолнечное масло, пенициллин, стрептомицин, норсульфазол и воск. Перед введением препаратов из вымени сдаивали молоко, сосок протирали 70% спиртом. Мастисан-А вводили интрацистернально ежедневно по 15 мл, а формолвакцину и стафилококковую анатоксин-вакцину с этонием по 4-5 мл. При этом установлено, что при лечении коров, больных маститом, CAB с этонием выздоровело за 6-7 суток, 13 коров и 2 коровы выздоровели через 9 суток, при лечении CAB с формалином успех лечения был достигнут только через 9-10 суток, а при использовании мастисана через 11-12 суток. Существенным недостатком при лечении коров мастисаном-А является наличие в препарате антибиотиков, которые выделяются с молоком во время лечения и после прекращения введения препарата.