СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ОРГАНИЧЕСКОЙ ФАЗЫ В ОБРАЗЦАХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ТКАНЕЙ
METHOD FOR MEASURING ORGANIC PHASE AMOUNT IN BIOLOGICAL MINERALISED TISSUE SAMPLES

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к определению композиционного состава биологических минерализованных тканей, а также к оценке степени их деорганификации, и предназначено для использования при изготовлении деминерализованного костного матрикса при проведении реконструктивно-восстановительных операций с целью замещения дефектов костей, возникших в результате травмы или после резекции кости.
Костные трансплантаты широко используются при различных ортопедических манипуляциях: разрушении костей, медленном сращении или несращении переломов, а также в качестве имплантируемого материала при значительных дефектах костей. Трансплантационным материалом могут быть как деминерализованные, так и деорганифицированные фрагменты костной ткани.
Деминерализованный костный матрикс (ДКМ) представляет собой коллагеновую основу костной ткани, лишенную клеточного компонента (90%), и неколлагеновые протеины (10%). В деорганифицированном матриксе, наоборот, удалению подвергается минеральная фаза. Получение их возможно при использовании различных приемов физико-химической обработки.
Существуют различные способы изготовления аллотрансплантата. Например, известен способ, включающий подготовку образцов нативной кости (костный матрикс), механическую обработку до необходимого размера, промывку ее холодной водой, обезвоживание и обезжиривание по общепринятым методикам, вычисление количества минерального компонента и необходимое для деминерализации (поверхностной, частичной или полной) количество хлористоводородной кислоты, нейтрализацию остатков кислоты, лиофилизацию и стерилизацию заготовки / Савельев В.И. Деминерализованная кость как особая разновидность костно-пластического материала. Сборник научных трудов ЛНИИТО им P.P. Вредена. Заготовка и пересадка деминерализованной костной ткани в эксперименте и клинике. Л.: НИИТО, 1983, с.3-12 /. Качество, а именно степень деминерализации полученных образцов, контролируют гистоморфометрическим и рентгенологическим методами, а структуру - методом световой микроскопии и электронной микроскопии.
Существуют несколько методов определения состава биологических минерализованных тканей:
1. Метод определения состава костной ткани на основе измерения объемов пор одного и тоже же исследуемого образца в четырех меняющихся состояниях (нативном, с удаленными остатками жидких фракций, обезвоженном, с удаленной органикой). /.А.Е. Луньков, Г.Н. Амбросимов. Метод определения состава костной ткани // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1991. - №2. - С.88-91/. К недостаткам этого метода следует отнести проведение множества операций: сушка, взвешивание, центрифугирование, пикнометрирование, что свидетельствует о его сложности и трудоемкости и их влиянии на точность определения состава костной ткани.
2. Гистоморфометрический метод определения количества содержащейся органики в костном образце для оценки степени деминерализации или деорганификации костных образцов по ширине зоны деминерализации (деорганификации) на поперечных срезах /Матвейчук И.В. Структурно-функциональная адаптация костной ткани как композита с учетом видовых, возрастных и функциональных особенностях: дисс. доктора биол. наук - Москва, 1998. - 285 с./. Недостатки метода заключаются в косвенном определении степени деминерализации (деорганификации), проба для анализа должна быть строго определенной геометрической формы.
3. Метод, заключающийся в выжигании органики в муфельной печи в течение 3 ч при температуре 500°С / Н.Г. Смирнов и др. Физико-химические характеристики ископаемых костных остатков млекопитающих и проблема оценки их относительного возраста, ч.1. Термический и масс-спектрометрический элементный анализ. Екатеринбург: "Гощицкий", 2009. - 118 с./, или определение по зольному остатку / Звягин В.Н. Массивность, объем, плотность и процент зольного веса костей черепа. Вопросы судебно-медицинской и экспериментальной практики. Чита, 1973. - вып.6. - С.37-41./. Существенным недостатком является массовые потери, включающие не только органику, но и потерю костью адсорбированной воды.
4. Гравиметрический способ, заключающийся в количественной оценке содержания основных компонентов костной ткани (органический, минеральный, водный) с использованием специальных растворов, максимально щадящих структуру костной ткани, при деминерализации (деорганификации), в том числе и после дегидратирующих воздействий. / Матвейчук И.В., Денисов-Никольский Ю.И. Влияние процесса деминерализации на механические характеристики образцов компактной кости взрослого человека // Современные проблемы биомеханики." 1987. - вып.4. - С.175-183/. Однако существенными недостатками получения данных о композиционном составе по использованию этого способа является значительная трудоемкость и необходимость иметь образцы нужной геометрической формы. В процессе физико-химических воздействий разрушению подвергается не только минеральная часть, но и органическая фаза, что влияет на точность полученных данных содержания органики.
В настоящее время отсутствует способ, максимально отвечающий современным требованиям определения композиционного состава биологических минерализованных тканей. Между тем для биологии и медицины значительный интерес представляет эффективный способ контроля содержания органической фазы, оценки продолжительности деорганификации, а также регистрации в депротеинизированном образце остаточного содержания органического компонента, что не позволяют другие способы.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу относится способ определения органической фазы в биологической минерализованной ткани, включающий исследование образцов в нативном состоянии и на различных этапах деорганификации гистоморфометрическим методом. / Матвейчук И.В. Структурно-функциональная адаптация костной ткани как композита с учетом видовых, возрастных и функциональных особенностях: Автореф. дис. И.В. Матвейчук. - Москва, 1998. /. В известном способе при деорганификации костных образцов сохраняются основные закономерности, установленные при деминерализации - наличие видимой в световом микроскопе границы раздела области деорганифицированного костного матрикса и зоны с неизмененным композиционным составом кости, равномерное распределение ее от периферии к центру образца. Это позволяет осуществлять количественную оценку потери органической фазы. Недостатки данного гистоморфометрического метода указаны выше.
Технический результат предлагаемого изобретения направлен на устранение перечисленных существующих недостатков, что позволит оптимизировать технологический процесс получения образцов с заданной степенью деорганификации и обеспечить сокращение продолжительности анализа, высокий уровень воспроизводимости, использование при анализе небольшого количества костного вещества (несколько мг).
Технический результат достигается за счет использования способа определения органической фазы в биологической минерализованной ткани, включающего исследование образцов в нативном состоянии и на различных этапах деорганификации гистоморфометрическим методом. При этом предварительно определяют последовательно меняющееся количество органической фазы в калибровочных образцах в нативном состоянии и на различных этапах деорганификации гистоморфометрическим методом, затем определяют энергию горения органической фазы в данных образцах методом дифференциально сканирующей калориметрии, по которой вычисляют удельную энергию горения, после этого определяют относительное изменение содержания органической фазы в калибровочных образцах по формуле
н
обр
н
dM=(M-Q/(m×q))/M,
н
обр
где dM - изменение содержания органической фазы в образце относительно нативного образца, M - содержание органической фазы в нативном образце, отн. ед., Q - энергия горения органической фазы в образце, Дж, m - масса образца, г, q - удельная энергия горения органической фазы в образце, Дж/г, устанавливают корреляцию между количеством органической фазы в калибровочных образцах и его изменением относительно нативного образца в процессе деорганификации. После чего для определения органической фазы в исследуемом образце с неизвестным содержанием органического компонента измеряют энергию горения методом дифференциально сканирующей калориметрии и вычисляют изменение содержания органической фазы относительно нативного образца по предложенной формуле. Методом интерполяции по полученному значению dM определяют массу органической фазы в исследуемом образце.
Метод основан на регистрации тепловых свойств изучаемого костного образца (по сравнению с термоинертным веществом) при постепенном нагревании по заданной программе. Результатами измерения являются энергии горения органического вещества.
Используя предложенную формулу, полученную на основе экспериментальных данных и термодинамических показателей образца, можно определить относительное изменение количества органической фазы в образце биологической минерализованной ткани.
Предлагаемый способ может использоваться для оценки снижения количества органической фазы в образце в процессе хранения, деминерализации, деорганификации и др. технологических воздействий при которых происходит процесс деградации органического компонента биологической минерализованной ткани. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Построение калибровочной таблицы
Образцы биологических минерализованных тканях для анализа получали с помощью полых фрез из внутренней, передней и боковой зон проксимального, центрального и дистального поясов диафиза бедренных костей мужчин возрастной группы (19-44 года). Причина смерти не была связана с заболеваниями костно-суставной системы. Деорганификации подвергали цилиндрические образцы диаметром 5 и высотой 30 мм.
Деорганификацию образцов проводили в 6% растворе гипохлорита натрия при 20°С, в течении двух, трех, пяти, шести, восьми и десяти дней. Полное удаление органической фазы из образца наблюдалось на 10-й день. Для каждого калибровочного образца после деорганификации и нативного образца определяли содержание органики в % гистоморфометрическим методом. Затем от каждого калибровочного образца и нативного образца брали пробу (10 мг), измельчали ее и с использованием дифференциальной термической калориметрии по стандартной методике измеряли энергию горения Q органической фазы. Определили удельную энергию горения q органической фазы в исследуемой биологической минерализованной ткани, которая для всех образцов вне зависимости от продолжительности деорганификации равна 10762,5 Дж/г. По предложенной математической формуле определяли содержание органической фазы в % для всех образцов. Данные свели в калибровочную таблицу. Исходный нативный образец (не подвергавшийся деградации органической фазы) содержал максимально возможное количество органики в костной ткани, а именно 27%.
Таблица
Показатели
Калибровочные образцы
нативный
1
2
3
4
5
6
Продолжительность деорганификации, дни
0
2
3
5
6
8
10
Содержание органики в образце, %, М
27
24
23
16
11
6
полностью деорганифицированная
изменение органической фазы относительно нативного образца (dM)
0
0,09
0,10
0,39
0,58
0,69
0,713
Пример 2. Определение органической фазы в исследуемом образце
По калибровочной таблице методом интерполяции можно определить содержание органического компонента в испытуемом образце, используя только измеренное значение энергии горения органической фазы в данном образце.
обр
Исследуемый образец биологической минерализованной ткани с неизвестным содержанием органической фазы и неизвестным сроком деорганификации - измельчали пробу, m 0,00898 г.
H
обр
Для исследуемого образца с применением дифференциального сканирующего калориметра измерили Q - энергию горения органической фазы, которая составила 23,6 Дж. Зная из таблицы М=27%, m, q=10762,5 Дж/г определили по формуле относительное изменение содержания количества органики в образце dM, которое равно 0,095
Ближайшие по таблице максимальное и минимальное значения изменения органической фазы относительно нативного образца равные 0,09 и 0,1, соответствуют содержанию органического вещества 24 и 23%. Методом линейной интерполяции по таблице найдем содержание органической фазы М для исследуемого образца. М=23,5%. Срок деорганификации составил 2-3 дн.
Таким образом, используя полученную информацию: значение энергии горения органической фазы исследуемого образца, калибровочную таблицу, можно определить содержание органической фазы образцов биологической минерализованной ткани в различные периоды деорганификации.
Приведенный пример осуществления изобретения показывает его применимость и достижение технического результата, подтверждают возможность использования выведенной в результате эксперимента формулы.
Предлагаемый способ позволяет выявлять стадию деорганификации исследуемого образца для оптимизации технологического процесса получения образцов с заданной степенью деорганификации. Кроме того, способ после проведения деорганификации образца позволяет регистрировать в нем остаточное содержание органического компонента даже в минимальном количестве, которое не определяется при гравиметрическом методе.