УНИВЕРСАЛЬНАЯ СИСТЕМА ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИНТЕГРИРОВАННОЙ СИСТЕМЕ АНАЛИЗА
UNIVERSAL SYSTEM FOR SAMPLE PREPARING AND APPLICATION IN INTEGRATED SYSTEM OF ANALYSIS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
Данная заявка является родственной по отношению к USSN 61/184759, поданной 5 июня 2009 г, и USSN 61/235664, поданной 20 августа 2009 г., полностью и во всех отношениях включенным сюда посредством ссылки.
ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ИССЛЕДОВАНИЯ, ФИНАНСИРУЕМОГО ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА
Это изобретение было осуществлено при поддержке правительства по контракту №2004*Н838109*000, заключенному Центральным разведывательным управлением. Правительство может иметь определенные права на это изобретение.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Подготовка образцов является распространенной проблемой в биологических аналитических системах. Проблема получения по существу очищенных мишеней из различных типов необработанных образцов для надежного проведения последующих аналитических исследований очень распространена и затрагивает клеточную биологию, геномику, протеомику, метаболомику, биологию питания, молекулярную диагностику и многие другие биологические и медицинские исследования. В то время как в подготовке образцов были достигнуты существенные успехи, наиболее успешным решением является разработка реагентов, используемых вручную или в робототехнических системах, в которых используют прямолинейные платформы или многоосевые манипуляторы для манипуляций с образцами.
Микрогидродинамика и наногидродинамика позволяют подготавливать для анализа миниатюрные объемы образцов. Преимущества включают незначительный расход реагентов с уменьшением эксплуатационных расходов и полную автоматизацию, исключающую человеческий фактор. Подготовка микрожидкостного образца может либо включать применение существующих способов детектирования или способов детектирования, которые будут разработаны в будущем, либо являться частью полностью интегрированной системы. В настоящей заявке раскрыты способы и аппараты, в которые интегрирована подготовка полнообъемных образцов, объем которых превышает 10 мл, с объемами для подготовки и анализа образцов, составляющими несколько микролитров или менее.
Начиная с образца, настоящее изобретение может быть использовано для концентрирования и предварительного разделения компонентов для дальнейшей обработки с детектированием и классификацией организмов в матрицах, включая аэрозольные образцы, воду, жидкости, кровь, кал, назальные, буккальные и другие мазки, биологические жидкости, образцы окружающей среды, с анализом посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других методик амплификации нуклеиновых кислот, детектирования единичных молекул, белковых биочипов, масс-спектроскопии и других аналитических способов, хорошо известных специалисту в данной области техники.
Микрожидкостная очистка нуклеиновых кислот может быть проведена для подготовки образца для исследований нуклеиновых кислот.Для анализа ДНК одним современным способом является ПЦР-амплификация. Для анализа с использованием ДНК-, РНК- и белковых микрочипов также необходима тщательная подготовка образца перед тем, как образец можно будет нанести на микрочип для проведения реакции и получения результатов.
Образцы могут быть получены с использованием широкого спектра субстратов и матриц. Матрица может содержать сложные смеси, содержащие соединения-ингибиторы, такие как гемы, индиго, гуминовые кислоты, двухвалентные катионы, и белки, и так далее, препятствующие амплификации на основе ДНК. Аэрозоли могут содержать большие количества плесени, металлов, и гумусовых почв, и других кислот, препятствующих ПЦР-амплификации, являющейся золотым стандартом.
В проведенных ранее работах была показана возможность детектирования всего трех высеянных организмов в разведенных образцах почвенных экстрактов с последующей ПЦР-амплификацией двух 16S рибосомных генных фрагментов. Агарозу с низкой температурой плавления использовали для выделения ДНК из образцов почвы для ПЦР-амплификации 16S и 18S рибосомной ДНК (рДНК) с использованием универсальных праймеров. Могут быть использованы гели для разделения центрифугированием в формате колонок, такие как колонки Sephadex. Были разработаны многостадийные методики очистки, такие как экстракции органическими растворителями в комбинации с колонками Sephadex. Было обнаружено, что измельчение гранулами является эффективным способом подготовки образцов при больших количествах организмов, и что измельчение в жидком азоте является эффективным для детектирования малых количеств организмов. Несмотря на эффективность этих способов, они лучше всего подходят для условий исследовательских лабораторий.
Твердофазные экстракции на колонках, гранулы и поверхности могут быть использованы для очистки ДНК перед анализом ДНК. Было проведено сравнение протеиназы К с последующим использованием колонок с силикагелевой мембраной Qiagen QIA Amp и IsoCode Stix, импрегнационной технологии на основе мембран, с последующим нагреванием, отмывкой и непродолжительным центрифугированием при использовании вегетативных клеток В. anthracis Sterne в буфере, сыворотке и цельной крови, и спор в буфере, и было обнаружено, что оба способа были эффективны.
С применением устройств и способов по изобретению может быть проведено множество разделений. Например, устройства и способы по изобретению могут быть использованы для проведения хроматографии, фазового или магнитного разделения, электрофореза, дистилляции, экстракции и фильтрации. Например, микрожидкостный канал или капилляр может быть использован для хроматографии или электрофореза. Также, гранулы, такие как магнитные гранулы, могут быть использованы для фазовых разделений и магнитных разделений. Гранулы или любые другие поверхности, описанные здесь, могут быть функционализированы связывающими группировками, демонстрирующими специфичное или неспецифичное связывание с мишенью. Связывание может быть основано на электростатике, взаимодействиях Ван-дер-Ваальса, гидрофобности, гидрофильности, водородных связях, ионных взаимодействиях, а также частично ковалентных взаимодействиях, как взаимодействия между золотом и серой. В предпочтительных воплощениях в устройствах и способах по изобретению используют иммуномагнитные сепарации.
Иммуномагнитная сепарация (IMS) представляет собой эффективную технологию, позволяющую захватывать и концентрировать мишени за одну стадию с использованием механически упрощенного формата с использованием парамагнитных гранул и магнитного поля (см. Grodzinski P, Liu R, Yang J, Ward MD. Microfluidic system integration in sample preparation microchip-sets - a summary. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2004; 4:2615-8., Peoples MC, Karnes HT. Microfluidic immunoaffinity separations for bioanalysis. J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Aug 30., и Stevens KA, Jaykus LA. Bacterial separation and concentration from complex sample matrices: a review. Crit Rev Microbiol. 2004; 30(1):7-24.). IMS может быть использована для захвата, концентрирования и затем очистки определенных целевых антигенов, белков, токсинов, нуклеиновых кислот, клеток и спор. Несмотря на то, что изначальное применение IMS включало использование антитела, авторы изобретения расширяют ее применение с включением других специфичных аффинных взаимодействий, включая лектиновые, ДНК-ДНК-, ДНК-РНК-, биотин-стрептавидиновые и другие аффинные взаимодействия на твердой фазе. Механизм IMS включает связывание специфичного аффинного реагента, обычно антитела или ДНК, с парамагнитными гранулами, проявляющими магнитные свойства только в присутствии внешнего магнитного поля. Гранулы могут быть добавлены в сложные образцы, такие как аэрозоли, жидкости, биологические жидкости или пищевые продукты. После связывания мишени с аффинным реагентом (который в свою очередь связан с парамагнитной гранулой) проводят захват гранулы магнитным полем. Несвязанные или непрочно связанные вещества удаляют отмывкой совместимыми буферами, что обеспечивает очистку мишени от других нежелательных веществ исходного образца. Поскольку гранулы имеют небольшие размеры (от приблизительно 1 нм до приблизительно 1 мкм) и активно связываются с мишенью, при концентрировании гранул магнитным полем они обычно образуют слои гранул объемом от 1 нл до 1 мкл, концентрируя, таким образом, мишень во время ее очистки. Очищенные и концентрированные мишени могут быть легко транспортированы, денатурированы, лизированы или проанализированы без их отсоединения от гранул или с их элюированием из гранул для дальнейшей подготовки образца или анализа.
Иммуномагнитные сепарации широко используют для множества применений, включая детектирование микроорганизмов в пищевых продуктах, биологических жидкостях и других матрицах. Парамагнитные гранулы можно легко смешивать, ими легко манипулировать, и их можно адаптировать к микромасштабным и микрожидкостным применениям. Эта технология обеспечивает отличное решение для интерфейса макроскопического масштаба и микроскопического масштаба: гранулы являются почти идеальным носителем для очистки образцов в макроскопическом масштабе и дальнейшего концентрирования в наноскопическом масштабе (порядка 100 нл) для введения в микрожидкостные или наножидкостные платформы. Иммуномагнитные сепарации обычно используют в качестве стадии очистки, предшествующей ПЦР в реальном времени, электрохемилюминесценции и магнитной селекции (magnetic force discrimination).
Возможность перемещения текучих сред на микрочипах очень важна. В данном изобретении описаны технологии захвата и очистки образцов, микросепарарации, микроклапаны, микронасосы и микромаршрутизаторы, технологии наножидкостного контроля и наноскопической биохимии. Ключевым компонентом технологии является технология микроробототехнических чиповых клапанов (MOVe, Micro-robotic On-chip Valves) (пример которых показан на Фиг.1) и ее применение для миниатюризации и автоматизации сложных технологических процессов. Вместе взятые, MOVe-клапаны, насосы, и маршрутизаторы, и оборудование для управления ими можно назвать микрочиповой платформой жидкостной обработки (microchip fluid processing platform).
Центральным элементом технологии микрочиповой платформы жидкостной обработки являются MOVe-насосы, клапаны и маршрутизаторы, обеспечивающие перемещение и обработку образцов и позволяющие проводить их анализ. Эти новые внешне активируемые пневматически управляемые чиповые клапаны, насосы и маршрутизаторы, изначально разработанные в лаборатории Mathies Калифорнийского университета Беркли (University of California at Berkeley, U.C.Berkeley) (Grover, W.H. A.M.Skelley, C.N.Liu, E.T.Lagally, and R.M.Mathies. 2003. Sensors and Actuators B89:315-323; Richard A. Mathies et al., заявка на патент США, 20040209354 А1, 21 октября 2004 г.; каждая из которых полностью включена сюда посредством ссылки), позволяют контролировать поток текучей среды в манипулируемых объемах от 20 нл до 10 мкл.
MOVe-клапаны и насосы (Фиг.1) позволяют комбинировать два стеклянных и/или пластиковых микрожидкостных слоя и слой деформируемой мембраны из полидиметилсилоксана (PDMS), открывающий и закрывающий клапан, и пневматический слой, деформирующий мембрану и активирующий клапан. Микрожидкостный канал, проделанный в верхней стеклянной жидкостной пластине, прерывист и ведет к седлу клапана, которое обычно закрыто (Фиг.1А). При подаче вакуума в пневматическую камеру переменного объема с использованием обычных источников вакуума и давления, обычно закрытая PDMS-мембрана поднимается от седла клапана, открывая клапан (Фиг.1Б). На Фиг.1В показан вид клапана сверху в масштабе, сходном с Фиг.1А-Б.
Три микроклапана могут быть использованы для создания микронасоса на микрочипе для перемещения текучих сред из области внесения к области выведения на микрочипе А. Перемещение текучих сред осуществляют с использованием трех или более клапанов. Клапаны могут быть созданы передвижением деформируемой структуры. В некоторых воплощениях создают седло клапана, и в других воплощениях в седле клапана может не быть необходимости. На Фиг.2 показаны MOVe-устройства, сверху вниз: клапан, маршрутизатор, мешалка, устройство для захвата гранул. Самовсасывающие MOVe-насосы (Фиг.2, сверху) изготавливают, координируя действие трех клапанов, и эти насосы могут создавать поток в любом направлении. Маршрутизаторы изготавливают из трех или более MOVe-клапанов (Фиг.2, второе изображение сверху). Перемешивание является «Священным Граалем» микрогидродинамики: MOVe-мешалки (Фиг.2, второе изображение снизу) быстро перемешивают образцы и реагенты. MOVe-устройства очень точно работают с магнитными гранулами для подачи совокупностей гранул насосом или их захвата (Фиг.2, нижнее изображение).
Обычно закрытые MOVe-клапаны, насосы и маршрутизаторы долговечны, просты и недороги в изготовлении, применимы с высокоплотными биочипами (dense arrays) и имеют небольшое мертвое пространство. Чипы с MOVe-клапанами, насосами и маршрутизаторами легко изготовить на микрочипах. Существенно, что все MOVe-клапаны, насосы и маршрутизаторы на микрочипе создают одновременно простым способом изготовления с использованием одного листа PDMS-мембраны, стоимость изготовления 5 и 500 MOVe-микронасосов на микрочипе одинакова. Эта инновационная технология впервые позволяет создавать сложные микро- и наножидкостные контуры на микрочипах.
Патенты и заявки, в которых обсуждены применение и разработка микрочипов, включают US 7312611, выданный 25 декабря 2007 г.; патент США 6190616, выданный 20 февраля 2001 г.; патент США 6423536, выданный 23 июля 2002 г.; патент США 10633171, 22 марта 2005 г.; патент США 6870185, выданный 22 марта 2005 г.; заявку на патент США №US 2001-0007641, поданную 25 января 2001 г.; заявку на патент США US 20020110900, поданную 18 апреля 2002 г.; заявку на патент США 20070248958, поданную 15 сентября 2005 г.; заявку на патент США US 20040209354, поданную 29 декабря 2003 г.; заявку на патент США US 2006/0073484, поданную 29 декабря 2003 г.; US 20050287572, поданную 25 мая 2005 г.; заявку на патент США US 20070237686, поданную 21 марта 2007 г.; US 20050224352, поданную 24 ноября 2004 г.; US 20070248958, поданную 15 сентября 2005 г.; US 20080014576, поданную 2 февраля 2007 г.; и заявку на патент США US 20070175756, поданную 26 июля 2006 г.; каждая/каждый из которых полностью включена/включен сюда посредством ссылки.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
3
Согласно изобретению предложена система, позволяющая обрабатывать несколько необработанных биологических образцов, проводить биохимические реакции и обеспечивать вывод результатов анализа. Например, система позволяет выделять ДНК из мазка, амплифицировать локусы коротких тандемных повторов (STR-локусы) с использованием ДНК и анализировать амплифицированные локусы и STR-маркеры в образце. Система интегрирует эти функции посредством применения микрожидкостных компонентов для соединения макрожидкостных функциональных компонентов. В одном воплощении система включает модуль очистки образца, реакционный модуль, модуль послереакционной очистки, модуль капиллярного электрофореза и компьютер. В определенных воплощениях система включает одноразовый картридж для проведения захвата аналита. Картридж может включать жидкостный распределитель, имеющий макрожидкостные камеры, соединенные с микрожидкостными чипами, направляющими жидкости между камерами. Система может быть помещена в корпус объемом не более 10 кубических футов (куб. футов) (0,28 м) и может представлять собой закрытую, переносную и/или работающую от аккумулятора систему. Система может быть использована для проведения анализа образца менее чем за 4 часа.
3
3
3
3
В одном аспекте согласно данному изобретению предложена система, которая может быть помещена в корпус объемом не более 10 куб. футов (0,28 м), включающая: (а) модуль подготовки образца, выполненный с возможностью захвата аналита из немикрожидкостного объема на захватывающей частице и направления захваченного аналита через микрожидкостный канал; (б) реакционный модуль, включающий реакционную камеру, имеющую жидкостное сообщение с микрожидкостным каналом, выполненный с возможностью иммобилизации захваченного аналита и проведения биохимической реакции с аналитом в немикрожидкостном объеме с получением продукта реакции; (в) модуль анализа, имеющий жидкостное сообщение с реакционной камерой, выполненный с возможностью проведения анализа продукта реакции. В одном воплощении система сконфигурирована для захвата аналита, проведения биохимической реакции с аналитом и проведения анализа продукта менее чем за 4 часа, менее чем за 3 часа или даже менее чем за 2 часа. В одном воплощении система дополнительно включает модуль анализа данных, сконфигурированный для получения данных об анализе от модуля анализа и включающий исполняемую программу, преобразующую данные и выводящую результат анализа. В другом воплощении система дополнительно включает модуль обработки, имеющий жидкостное сообщение с реакционной камерой и модулем анализа и выполненный с возможностью (1) направления продукта реакции через второй микрожидкостный канал в нем и крожид костную камеру для обработки, (2) обработки продукта реакции и (3) направления обработанного продукта реакции в модуль анализа, В одном определенном воплощении система может быть помещена в корпус объемом не более 8 куб. футов (0,23 м), не более 5 куб. футов (0,14 м) или не более 2,5 куб. фута (0,07 м). В другом воплощении системы модуль подготовки образца выполнен с возможностью высвобождения аналита из клетки. В другом воплощении системы захватывающая частица представляет собой захватывающую частицу, реагирующую на магнитное поле, и реакционный модуль включает источник магнитного поля, сконфигурированный для иммобилизации захваченного аналита. В другом воплощении системы реакционный модуль выполнен с возможностью проведения термоциклирования. В другом воплощении системы система представляет собой закрытую систему и/или работающую от аккумулятора систему.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложена система, включающая крышку картриджа, картридж и пневматический распределитель, где картридж может быть присоединен к крышке картриджа и пневматическому распределителю с возможностью отсоединения, где картридж включает один или более чем один пневматически активируемый клапан и один или более чем один микрожидкостный канал, где как пневматический распределитель, так и крышка картриджа имеют жидкостное соединение с по меньшей мере одним источником давления, и где как пневматический распределитель, так и крышка картриджа выполнены с возможностью управления потоком текучей среды в картридже. В одном воплощении пневматический распределитель выполнен с возможностью открытия пневматически активируемых клапанов, и крышка картриджа выполнен с возможностью подачи давления в одну или более чем одну камеру картриджа.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложена система, включающая: (а) одноразовый картридж, включающий по меньшей мере одну совокупность жидкостных камер, включающую камеру для образца, камеру для смешивания и камеру для термоциклирования, имеющие жидкостное сообщение друг с другом, и плату с реагентами, содержащую реагенты для проведения химической реакции, включающей термоциклирование, сконфигурированную для транспортировки на картридже в закрытой конфигурации и для установления жидкостного сообщения с по меньшей мере одной совокупностью жидкостных камер; (б) узел привода, сконфигурированный для перемещения текучих сред между камерами, когда картридж соединен с узлом привода; (в) термоциклер, сконфигурированный для циклического изменения температуры в камере для термоциклирования, когда картридж соединен с узлом привода; (г) блок капиллярного электрофореза, сконфигурированный для получения образца из картриджа, когда картридж соединен с узлом привода, и для проведения капиллярного электрофореза образца; и (д) компьютеризированную систему управления, сконфигурированную для управления узлом привода, термоциклером и блоком капиллярного электрофореза.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен картридж, включающий: (а) жидкостный распределитель, включающий сторону жидкостных элементов и сторону платы с реагентами, где жидкостный распределитель включает: (1) по меньшей мере одну совокупность жидкостных камер, где каждая камера включает вход/выход на стороне жидкостных элементов; (2) по меньшей мере одну камеру для термоциклирования, включающую по меньшей мере один вход/выход; (3) по меньшей мере один выход; (4) гнездо на стороне платы с реагентами, выполненное с возможностью присоединения платы с реагентами, включающее множество каналов гнезда, включающих канюли на стороне платы с реагентами и обеспечивающих сообщение между двумя сторонами; (б) по меньшей мере один микрожидкостный чип, включающий: (1) по меньшей мере один жидкостный контур; (2) множество входов/выходов, имеющих жидкостное сообщение с жидкостным контуром; (3) по меньшей мере один пневматически активируемый мембранный клапан, сконфигурированный для регулирования потока текучей среды в жидкостном контуре; где по меньшей мере один чип соединен с жидкостным распределителем таким образом, что входы/выходы по меньшей мере одного чипа имеют жидкостное сообщение с входами/выходами камер и каналами гнезда, где каждая жидкостная камера имеет жидкостное сообщение с по меньшей мере одной другой жидкостной камерой, и каждая канюля имеет сообщение с жидкостной камерой; и (в) плату с реагентами, вставленную в гнездо, включающую множество камер для реагентов, содержащих реагенты, каждая из которых выровнена с по меньшей мере одной канюлей и адаптирована для первого вставочного положения, где камеры для реагентов не проколоты канюлями, и второго вставочного положения, где камеры для реагентов проколоты канюлями, устанавливая, посредством этого, жидкостное сообщение камер для реагентов с жидкостным контуром. В одном воплощении реагенты включают реагенты для проведения ПЦР. В другом воплощении реагенты включают праймеры для амплификации множества коротких тандемных повторов. В другом воплощении по меньшей мере одна совокупность жидкостных камер представляет собой множество совокупностей жидкостных камер. В еще одном воплощении картридж характеризуется тем, что жидкостный распределитель дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный жидкостный канал на стороне жидкостных элементов распределителя, по меньшей мере один чип представляет собой множество чипов, и жидкостные контуры каждого из множества чипов имеют жидкостное сообщение с жидкостными контурами по меньшей мере одного другого чипа через дополнительный жидкостный канал. В данном воплощении картридж может дополнительно включать прокладку между чипами и распределителем, закрывающую каналы распределителя. В другом воплощении картриджа жидкостные камеры включают распределительную камеру, камеру для захвата, камеру для образца и очистительную камеру. В другом воплощении картриджа по меньшей мере одна жидкостная камера содержит частицы, реагирующие на магнитное поле. В другом воплощении картриджа по меньшей мере одна совокупность жидкостных камер представляет собой по меньшей мере 4 совокупности или по меньшей мере 8 совокупностей. В другом воплощении картриджа чипы включают по меньшей мере один мембранный клапан.
3
3
В другом аспекте согласно изобретению предложена система, включающая: (а) пневматический блок, включающий: (1) пневматический распределитель, выполненный с возможностью присоединения картриджа со стороны жидкостных элементов с возможностью отсоединения, включающий множество пневматических входов/выходов, сконфигурированных для соединения с пневматическими каналами по меньшей мере одного микрожидкостного чипа и активации мембранных клапанов; и (2) источник давления, сконфигурированный для подачи положительного или отрицательного давления в пневматические каналы; (б) блок активации картриджа, выполненный с возможностью присоединения картриджа со стороны платы с реагентами, включающий: (1) пневматический распределитель реагентов, включающий сторону пневматических элементов и сторону платы с реагентами, где пневматический распределитель реагентов включает каналы пневматического распределителя реагентов, обеспечивающие сообщение между двумя сторонами и включающие канюлю на стороне платы с реагентами; (2) источник давления, сконфигурированный для подачи положительного или отрицательного давления в каналы пневматического распределителя реагентов; и (3) зажим, сконфигурированный для перемещения платы с реагентами из первого вставочного положения во второе вставочное положение, где фиксация зажимом приводит к прокалыванию камер для реагентов канюлями пневматического распределителя реагентов и установлению сообщения камер для реагентов с источником давления; (в) термоциклер, сконфигурированный для циклического изменения температуры в по меньшей мере одной камере для термоциклирования, когда картридж зафиксирован зажимом; (г) блок капиллярного электрофореза, включающий: (1) по меньшей мере один сепарационный канал, имеющий жидкостное сообщение с выходом, когда картридж зафиксирован зажимом; и (2) оптический подблок, сконфигурированный для детектирования сигнала от по меньшей мере одного сепарационного канала; и (д) компьютеризированную систему управления, сконфигурированную для управления пневматическим блоком, блоком активации картриджа, термоциклером и блоком капиллярного электрофореза. В одном воплощении данной системы фиксация зажимом приводит к соединению входов/выходов камер и каналов гнезда с по меньшей мере одним микрожидкостным чипом. В другом воплощении данной системы блок активации картриджа дополнительно включает по меньшей мере один нагреватель, сконфигурированный для нагревания по меньшей мере одной из жидкостных камер, когда пневматический распределитель реагентов соединен с картриджем. В другом воплощении данной системы блок активации картриджа дополнительно включает подвижные магниты, сконфигурированные для перемещения в и из положения, где магниты воздействуют магнитным полем на по меньшей мере одну жидкостную камеру. В другом воплощении данной системы блок активации картриджа дополнительно включает сенсоры, сконфигурированные для детектирования присутствия образца в камере для образца жидкостного распределителя. В другом воплощении данной системы термоциклер включает устройство Пельтье. В другом воплощении система содержится в переносном контейнере. В одном определенном воплощении контейнер имеет внутренний объем не более 10 куб. футов (0,28 м) или не более 2,5 куб. фута (0,07 м), В родственном воплощении системы согласно изобретению предложен продукт в машиночитаемой форме, содержащий программу для управления системой.
В другом аспекте согласно изобретению предложен способ, включающий получение из образца, содержащэго по меньшей мере одну клетку, содержащую ДНК, машинного файла, идентифицирующего множество STR-маркеров в ДНК, осуществляемый менее чем за 4 часа. В одном воплощении способ осуществляют менее чем за 3 часа. В другом воплощении способ осуществляют менее чем за 2 часа. В родственном воплощении получение включает выделение ДНК из по меньшей мере одной клетки, амплификацию STR-маркеров с использованием ДНК, проведение капиллярного электрофореза амплифицированных маркеров, детектирование амплифицированных маркеров и проведение компьютерного анализа детектированных амплифицированных маркеров для идентификации маркеров. В одном воплощении множество STR-маркеров представляет собой по меньшей мере 5 STR-маркеров. В другом воплощении множество маркеров представляет собой STR-маркеры, входящие в систему CODIS (Combined DNA Index System, Объединенная система данных ДНК). В родственном воплощении множество STR-маркеров представляет собой по меньшей мере 5, 10 или 13 STR-маркеров, входящих в систему CODIS. В этих воплощениях по меньшей мере одна клетка может представлять собой множество клеток. В некоторых воплощениях образец представляет собой образец для судебной экспертизы. В определенных воплощениях способ осуществляют на месте сбора образца. Образец может включать кровь или может включать буккальный мазок. Способ может быть осуществлен любой системой, описанной здесь.
В родственном аспекте согласно изобретению предложена система, сконфигурированная для осуществления способа, включающего получение из образца, содержащего по меньшей мере одну клетку, содержащую ДНК, машинного файла, идентифицирующего множество STR-маркеров в ДНК, где способ осуществляют менее чем за 4 часа.
В другом аспекте согласно данному изобретению предложен способ, включающий (а) предоставление системы, включающей: (1) одноразовый картридж, включающий по меньшей мере одну совокупность жидкостных камер, включающую камеру для образца, камеру для смешивания и камеру для термоциклирования, имеющие жидкостное сообщение друг с другом, и плату с реагентами, содержащую реагенты для проведения химической реакции, включающей термоциклирование, сконфигурированную для переноски на картридже в закрытой конфигурации и для установления жидкостного сообщения с по меньшей мере одной совокупностью жидкостных камер; (2) узел привода, сконфигурированный для перемещения текучих сред между камерами, когда картридж соединен с узлом привода; (3) термоциклер, сконфигурированный для циклического изменения температуры в камере для термоциклирования, когда картридж соединен с узлом привода; (4) блок капиллярного электрофореза, сконфигурированный для получения образца из картриджа, когда картридж соединен с узлом привода, и проведения капиллярного электрофореза образца; и (5) компьютеризированную систему управления, сконфигурированную для управления узлом привода, термоциклером и блоком капиллярного электрофореза; (б) установление жидкостного сообщения платы с реагентами с по меньшей мере одной совокупностью жидкостных камер; (в) внесение образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, в камеру для образца; и (г) управление системой для амплификации и детектирования по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты в образце. В одном воплощении проведение стадий (б)-(г) занимает менее 4 часов. В одном воплощении способ включает внесение каждого из множества образцов в отдельную камеру для образца. В другом воплощении способ включает амплификацию и детектирование множества последовательностей нуклеиновых кислот в образце. В родственном воплощении множество последовательностей нуклеиновых кислот включает короткие тандемные повторы (STR). В определенном воплощении короткие тандемные повторы включают множество маркеров, входящих в систему CODIS (Combined DNA Index System, Объединенная система данных ДНК). В другом воплощении маркеры, входящие в систему CODIS, включают множество маркеров, выбранных из AMEL, D3S1358, THO1, D21s11, D18s51, D5s818, D13s317, D7s820, D16s539, CSF1PO, vWA, D8S1179, ТРОХ и FGA. В одном воплощении система включает: (а) пневматический блок, включающий: (1) пневматический распределитель, выполненный с возможностью присоединения картриджа со стороны жидкостных элементов с возможностью отсоединения, включающий множество пневматических входов/выходов, сконфигурированных для соединения с пневматическими каналами по меньшей мере одного микрожидкостного чипа и активации мембранных клапанов; и (2) источник давления, сконфигурированный для подачи положительного или отрицательного давления в пневматические каналы; (б) блок активации картриджа, выполненный с возможностью присоединения картриджа со стороны платы с реагентами, включающий: (1) пневматический распределитель реагентов, включающий сторону пневматических элементов и сторону платы с реагентами, где пневматический распределитель реагентов включает каналы пневматического распределителя реагентов, обеспечивающие сообщение между двумя сторонами и включающие канюлю на стороне платы с реагентами; (2) источник давления, сконфигурированный для подачи положительного или отрицательного давления в каналы пневматического распределителя реагентов; и (3) зажим, сконфигурированный для перемещения платы с реагентами из первого вставочного положения во второе вставочное положение, где фиксация зажимом приводит к прокалыванию камер для реагентов канюлями пневматического распределителя реагентов и установлению сообщения камер для реагентов с источником давления; (в) термоциклер, сконфигурированный для циклического изменения температуры в по меньшей мере одной камере для термоциклирования, когда картридж зафиксирован зажимом; (г) блок капиллярного электрофореза, включающий: (1) по меньшей мере один сепарационный канал, имеющий жидкостное сообщение с выходом, когда картридж зафиксирован зажимом; и (2) оптический подблок, сконфигурированный для детекции сигнала от по меньшей мере одного сепарационного канала; и (д) компьютеризированную систему управления, сконфигурированную для управления пневматическим блоком, блоком активации картриджа, термоциклером и блоком капиллярного электрофореза. В другом воплощении система представляет собой любую систему, названную здесь. В одном воплощении образец представляет собой образец для судебной экспертизы. В родственном воплощении образец выбран из буккального мазка, крови, волоса или семенной жидкости. В другом воплощении образец представляет собой необработанный образец. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает транспортировку системы на место проведения судебной экспертизы.
В другом аспекте согласно изобретению предложена оптическая система, включающая: (а) множество оптически прозрачных каналов; (б) источник света, сконфигурированный для направления в множество оптически прозрачных каналов; (в) дисперсионный элемент, рассеивающий свет, проходящий через оптически прозрачные каналы зависимым от длины волны образом; и (г) детектор, сконфигурированный для реагирования на рассеянный свет. В одном воплощении множество оптически прозрачных каналов включает по меньшей мере восемь капилляров. В другом воплощении оптически прозрачные каналы выровнены в первой плоскости, и дисперсионный элемент рассеивает свет по второй плоскости, где первая плоскость и вторая плоскость различны. В другом воплощении первая плоскость перпендикулярна второй плоскости.
В другом аспекте согласно изобретению предложена оптическая система, включающая: (а) источник возбуждения, сконфигурированный для направления света возбуждения на объект; (б) носитель для объекта, излучающего свет, отличный от света возбуждения, при возбуждении энергией возбуждения; (в) заграждающий фильтр, сконфигурированный для отфильтровывания энергии возбуждения и пропускания излученного света; (г) визуализирующую линзу, сконфигурированную для фокусировки излученного света; (д) дихроичное зеркало, по существу пропускающее энергию возбуждения и сконфигурированное для отражения излученного света на детектор; (е) систему фокусировки, включающую по меньшей мере одну линзу, сконфигурированную для фокусировки света, отраженного от дихроичного зеркала; и (ж) фотодетектор (камеру на приборе с зарядовой связью, CCD-камеру), сконфигурированный для реагирования на отраженный свет. В одном воплощении оптической системы свет возбуждения включает свет с длиной волны от 0,3 мкм до 1 мкм. В другом воплощении носитель включает ряд капилляров, и объект включает флуоресцентные частицы. В другом воплощении зеркало отражает излученный свет, и угол падения составляет от приблизительно 5 градусов до приблизительно 10 градусов. В другом воплощении дихроичное зеркало дополнительно включает блок, пропускающий по существу весь свет. В другом воплощении система фокусировки включает по меньшей мере одно складывающееся зеркало. В другом воплощении фотодетектор включает CCD-камеру. В родственном воплощении оптическая система может дополнительно включать призму, расположенную между объектом и визуализирующей линзой.
В другом аспекте согласно изобретению предложена оптическая система, включающая: (а) ряд капилляров, где капилляры выровнены по существу параллельно и по существу в одной плоскости; (б) блок возбуждения, включающий источник возбуждения и сконфигурированный для доставки света возбуждения от источника возбуждения к ряду капилляров, где блок доставки света сконфигурирован (1) для доставки тонкого пучка света, накрывающего ряд капилляров, и (2) для доставки света к ряду капилляров под углом к плоскости, отличным от 90 градусов; (в) собирающую линзу, сконфигурированную для собирания света от ряда капилляров, излученного объектами в ряде капилляров, возбужденными светом возбуждения; где блок возбуждения и собирающая линза сконфигурированы относительно ряда капилляров таким образом, что свет возбуждения, проходящий через ряд капилляров, по существу не попадает в собирающую линзу. В одном воплощении угол составляет от приблизительно 10 градусов до приблизительно 85 градусов.
В другом аспекте согласно изобретению предложен прибор, включающий: (а) микрожидкостный компонент, включающий множество пересекающихся микрожидкостных каналов и по меньшей мере один регулируемый клапан, сконфигурированный для регулирования потока текучей среды между пересекающимися каналами; и (б) немикрожидкостный компонент, включающий множество немикрожидкостных камер, каждая из которых имеет жидкостное соединение с по меньшей мере одним из микрожидкостных каналов; где прибор сконфигурирован для перемещения текучей среды из по меньшей мере одной немикрожидкостной камеры в другую немикрожидкостную камеру через микрожидкостный канал, и поток регулируют с помощью по меньшей мере одного клапана. В одном воплощении прибора множество немикрожидкостных камер включает по меньшей мере три камеры, и по меньшей мере один клапан селективно направляет текучую среду из одной камеры в любую из по меньшей мере двух других камер. В другом воплощении прибор дополнительно включает насос для подачи текучей среды из немикрожидкостной камеры в микрожидкостный канал. В другом воплощении прибора по меньшей мере один клапан представляет собой мембранный клапан. В родственном воплощении насос представляет собой диафрагменный насос, включающий группу из трех мембранных клапанов. В другом воплощении микрожидкостный компонент включает монолитный блок. В другом воплощении комбинация микрожидкостного компонента и немикрожидкостного компонента определяет жидкостный контур, и прибор включает множество жидкостных контуров. В другом воплощении немикрожидкостный компонент дополнительно включает захватывающий агент в форме частиц. В другом воплощении частицы реагируют на магнитное поле, и прибор дополнительно включает магнит, сконфигурированный для иммобилизации частиц. В другом воплощении согласно изобретению предложено устройство, включающее множество немикрожидкостных камер, имеющих жидкостное соединение с общим микрожидкостным каналом.
В другом аспекте согласно изобретению предложен способ, включающий: (а) предоставление устройства, включающего: (1) микрожидкостный компонент, включающий множество пересекающихся микрожидкостных каналов и по меньшей мере один регулируемый клапан, сконфигурированный для регулирования потока текучей среды между пересекающимися каналами; и (2) немикрожидкостный компонент, включающий множество немикрожидкостных камер, каждая из которых имеет жидкостное соединение с по меньшей мере одним из микрожидкостных каналов; где прибор сконфигурирован для перемещения текучей среды из по меньшей мере одной немикрожидкостной камеры в другую немикрожидкостную камеру через микрожидкостный канал, и поток регулируют с помощью по меньшей мере одного клапана; и где первая немикрожидкостная камера содержит первый объем образца, содержащего аналит; (б) внесение некоторого количества захватывающего агента в форме частиц в первую немикрожидкостную камеру для связывания выбранного количества аналита из образца; (в) перемещение захватывающего агента в форме частиц, связанного с аналитом, через микрожидкостный канал микрожидкостного устройства во вторую немикрожидкостную камеру; (г) приведение захватывающего агента в форме частиц, связанного с аналитом, в контакт с реагентом во второй немикрожидкостной камере; и (д) проведение химической реакции с аналитом с использованием реагента. В одном воплощении способа приведение в контакт включает перемещение реагента из третьей немикрожидкостной камеры через микрожидкостный канал микрожидкостного устройства во вторую немикрожидкостную камеру. В другом воплощении способа частицы реагируют на магнитное поле, и способ дополнительно включает иммобилизацию захватывающего агента в форме частиц, связанного с аналитом, в приборе магнитным полем. В другом воплощении способ включает суспендирование захватывающего агента в форме частиц, связанного с аналитом, в приборе в объеме, который по меньшей мере на порядок величины меньше, чем объем образца.
В другом аспекте согласно изобретению предложен способ, включающий: (а) проведение первой химической реакции с аналитом в первой камере, представляющей собой немикрожидкостную камеру, с получением продукта первой реакции; и (б) перемещение продукта первой реакции через микрожидкостный канал во вторую камеру, представляющую собой немикрожидкостную камеру, и проведение второй химической реакции с первым продуктом с получением продукта второй реакции.
В другом аспекте согласно изобретению предложен способ, включающий: (а) проведение первой химической реакции с аналитом в первой камере, представляющей собой немикрожидкостную камеру, с получением продукта первой реакции; и (б) перемещение продукта первой реакции через микрожидкостный канал во вторую камеру, представляющую собой микрожидкостную камеру, и проведение второй химической реакции с первым продуктом с получением продукта второй реакции. В родственном аспекте изобретения здесь предложен способ, включающий: (а) проведение первой химической реакции с аналитом в первой камере, представляющей собой микрожидкостную камеру, с получением продукта первой реакции; и (б) перемещение продукта первой реакции через микрожидкостный канал во вторую камеру, представляющую собой немикрожидкостную камеру, и проведение второй химической реакции с первым продуктом с получением продукта второй реакции. В одном воплощении способы по этим родственным аспектам включают очистку продукта первой реакции перед его перемещением во вторую камеру. В другом воплощении способы по этим родственным аспектам включают по меньшей мере однократное перемещение продукта реакции через микрожидкостный канал в следующую немикрожидкостную камеру и проведение следующей химической реакции с продуктом реакции с получением продукта следующей реакции. В другом воплощении способы по этим родственным аспектам включают, перед перемещением продукта реакции в немикрожидкостную камеру, по меньшей мере однократное перемещение продукта реакции через микрожидкостный канал в микрожидкостную камеру и проведение следующей химической реакции с продуктом реакции с получением продукта следующей реакции.
В другом аспекте изобретения здесь предложено устройство, включающее: (а) канал для образца, имеющий вход в канал и выход из канала; (б) электрофорезный капилляр, имеющий вход в капилляр и выход из капилляра, где капилляр содержит электропроводящую среду и имеет сообщение с каналом для образца в точке соединения; (в) анод и катод, сконфигурированные для приложения напряжения ко входу в капилляр и выходу из капилляра, где один из анода или катода включает разветвленный электрод, ветви которого имеют электрическое сообщение с каналом для образца по разные стороны от точки соединения; и (г) второй электрод, имеющий электрическое сообщение с каналом для образца по существу напротив точки соединения. В одном воплощении устройства второй электрод представляет собой третью ветвь разветвленного электрода.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены сюда посредством ссылки в такой же степени, как если бы было специально и по отдельности указано, что каждая отдельная публикация или патентная заявка включена посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Новые признаки изобретения подробно изложены в приложенной формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения обеспечит ссылка на следующее подробное описание, где изложены иллюстративные воплощения, в которых использованы принципы изобретения, и приложенные графические материалы, описанные ниже.
На Фиг.1 показан пример микромасштабного чипового клапана (MOVe-клапана).
На Фиг.2 показаны MOVe-микроклапан, микромаршрутизатор, MOVe-мешалка и устройство для захвата гранул на микрочипах.
На Фиг.3 показан жидкостный картридж с MOVe-микроклапанами.
На Фиг.4 показан жидкостный картридж с входами/выходами на микрожидкостный микрочип с микроклапанами.
На Фиг.5 показан микрожидкостный микрочип с MOVe-клапанами, управляющий потоками в картридже.
На Фиг.6 показан картридж, соединенный с реакционной камерой и детектором, с последующими MOVe-насосами и реагентами.
На Фиг.7 показан терморегулятор, позволяющий проводить термоциклирование, включающий устройство для захвата магнитным полем, распорно-клиновые зажимы и позволяющий проводить термоциклирование для семи реакций одновременно.
На Фиг.8 показан терморегулятор, позволяющий проводить термоциклирование, включающий устройство для захвата магнитным полем, распорно-клиновые зажимы и позволяющий проводить термоциклирование для семи реакций одновременно.
На Фиг.9 показана реакция амплификации STR (коротких тандемных повторов) PowerPlex 16, проводимая в пассивной тефлоновой (политетрафторэтиленовой, PTFE) цилиндрической реакционной камере в устройстве подсистемы термоциклирования MBI с сепарацией и детекцией в МеgаВАСЕЮОО.
На Фиг.10 показана очистка ДНК из 25 мкл крови за 69 минут, 23,5 минуты, 10,5 минуты и 4,5 минуты; выход в нг показан на столбцах.
На Фиг.11 показана схема использования микроклапанов для захвата гранул на микрочипе.
На Фиг.12 показано устройство для захвата гранул из картриджа на микрочипе с использованием MOVe-микроклапана.
На Фиг.13 показано устройство для захвата гранул из картриджа на микрочипе с использованием MOVe-микроклапана.
На Фиг.14 показан микрочип для захвата и проведения реакции, в котором использованы MOVe-микроклапаны.
На Фиг.15 показан микрочип для захвата и проведения реакции, в котором использованы MOVe-микроклапаны.
На Фиг.16 показан блок из четырех модулей.
На Фиг.17 показан пример STR-реакций на микрочипах.
На Фиг.18 показан универсальный технологический процесс подготовки образцов с выделением нуклеиновых кислот и токсинов.
На Фиг.19 показана очистка образцов в картридже с использованием парамагнитных гранул.
На Фиг.20 показан интегрированный пневматический распределитель для управления MOVe-микроклапанами картриджа.
На Фиг.21 показан картридж, установленный на устройстве с компьютерным управлением.
Distribution valve - распределительный клапан; Regulator - регулятор; Bead Mixer - мешалка для гранул; Magnet - магнит; Waste - отходы; Reagent storage - хранилище реагентов; Cube - картридж; Manifold - распределитель; IO - controller - контроллер ввода/вывода (IO-контроллер); Heater control - контроллер нагревателя.
На Фиг.22 показан картридж, установленный на устройстве с компьютерным управлением.
На Фиг.23 показана распределительная система для реагентов, основанная на технологии MOVe, позволяющая распределять пять реагентов по пяти устройствам для экстракции/выделения или другим устройствам.
На Фиг.24 показана распределительная система для реагентов, основанная на технологии MOVe, позволяющая распределять пять реагентов по пяти устройствам для экстракции/выделения или другим устройствам.
На Фиг.25 показана распределительная система с петлями для образцов и MOVe-микроклапанами.
На Фиг.26 показан пневматический распределитель, на верхнем изображении показана верхняя сторона, и на нижнем изображении показана нижняя сторона.
На Фиг.27 показано детектирование Е.соli иммуномагнитной сепарацией (IMS) с последующим щелочным лизисом (NaOH), очисткой ДНК посредством захвата на магнитных гранулах с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) и анализом ПЦР в реальном времени.
На Фиг.28 показано применение картриджа с тремя камерами, который могут быть использован для конструирования геномных библиотек и других применений.
На Фиг.29 показан технологический процесс получения геномных библиотек с использованием картриджа.
1 т.п.о. - 1 тысяча пар оснований; T4PNK - Т4-полинуклеотидкиназа; emPCR - эмульсионная ПЦР.
На Фиг.30 показан разветвленный инжектор для микрочипового электрофореза.
500 µm - 500 мкм.
На Фиг.31 показано расположение образцов при использовании разветвленного инжектора.
500 µm - 500 мкм; 100 µm - 100 мкм.
На Фиг.32 показан разветвленный инжектор в сочетании с MOVe-микроклапанами.
На Фиг.33 показан разветвленный катодный инжектор в сочетании с MOVe-микрочипом.
На Фиг.34 показана фотография микрочипа с разветвленным инжектором.
На Фиг, 35 показана фотография микрочипа с разветвленным инжектором.
На Фиг.36 показана одноцветная электрофореграмма продуктов секвенирования ДНК из разветвленного катодного инжектора.
Размер образца 500 мкм, разделение с использованием 125 В/см в LPA-полимере. Фрагменты ДНК выявляли через 6,5 см разделения.
Время: первый пик появляется приблизительно через 2 минуты и последний показанный пик появляется приблизительно через 6,5 минут.
Интенсивность сигнала: пики 100-500 импульсов.
На Фиг.37 показаны сепарации STR с использованием разветвленной катодной инжекционной системы.
RFU - относительные единицы флуоресценции.
На Фиг.38 показан разветвленный катод с MOVe-микрожидкостными компонентами для внесения с возвратно-поступательным движением вносящего устройства.
На Фиг.39 показана интегрированная система для выделения, амплификации (амплификации), сепарации и детекции нуклеиновых кислот.
Reagents - реагенты.
На Фиг.40 показано устройство с картриджем, микрожидкостным микрочипом и магнитом.
На Фиг.41 показан микрожидкостный микрочип с жидкостным слоем, эластомерным слоем и пневматическим слоем.
На Фиг.42 показан жидкостный слой, полученный из двух слоев материала.
На Фиг.43 показан жидкостный слой, полученный из одного слоя материала.
На Фиг.44 показана реакционная схема амплификации матричной РНК (мРНК).
кДНК - комплементарная ДНК; аРНК - антисмысловая РНК.
На Фиг.45 показан микрожидкостный микрочип с MOVe-клапанами, управляющий потоками в картридже.
На Фиг.46 показан разветвленный электрод.
На Фиг.47 показан разветвленный электрод, разветвленный электрод с проволочным электродом и разветвленный электрод с трубчатым электродом.
ID 1/16"- внутренний диаметр 1/16 дюйма (0,16 см),
На Фиг.48 показано введение образца в сепарационный канал.
На Фиг.49 показано устройство для соединения сепарационного капилляра с инжекционной трубкой.
На Фиг.50 показано устройство для соединения сепарационных капилляров с четырьмя инжекционными трубками.
На Фиг.51 показан термоциклер с распорно-клиновым зажимом Ultem.
На Фиг.52 приведена схема, на которой показано перемещение реагентов между компонентами четырехканального устройства для параллельной обработки.
На Фиг.53 показано четырехканальное устройство для параллельной доставки реагентов: микрочиповая конструкция чипа С показана слева сверху, жидкостный распределитель показан слева снизу, и изготовленное и собранное устройство показано справа.
На Фиг.54 показано четырехканальное устройство для подготовки образцов (слева) и четырехканальное устройство для подготовки образцов, установленное на монолитном пневматическом распределителе (справа).
На Фиг.55 показаны схемы MOVe-микрочипа четырехканального устройства для подготовки образцов.
На Фиг.56 показаны STR-профили IdentiFiler образцов ДНК, подготовку которых проводили в четырехканальном устройстве для подготовки образцов, где амплификации STR проводили с применением быстрых протоколов (1,5 часа) в термоциклере STR-реакционной подсистемы.
R6-C2_18M_all alleles present and called correctly - R6-C2_18M_вce присутствующие и корректно названные аллели; R6-C1_4F_partial profile* - R6-С1_4F_частичный профиль*.
На Фиг.57 показано четырехканальное послеамплификационное устройство в комбинации с чипом А, представляющим собой микрочип, с жидкостным распределителем: микрочиповая конструкция чипа А показана слева, изготовленный микрочип показан в середине, и собранные жидкостный распределитель и микрочип показаны справа.
На Фиг.58 показана подсистема послеамплификационной очистки STR с послеамплификационным устройством.
На Фиг.59 показана микрочиповая конструкция чипа Е, который может быть использован в послеамплификационном устройстве.
На Фиг.60 представлено изображение мешалки.
На Фиг.61 представлено изображение мешалки.
На Фиг.62 показаны результаты использования мешалки для лизиса клеток.
На Фиг.63 показаны компоненты интегрированной системы анализа.
На Фиг.64 показаны аппаратные компоненты интегрированной системы анализа.
На Фиг.65 показаны программные компоненты интегрированной системы анализа.
На Фиг.66 показаны расходные компоненты интегрированной системы анализа.
На Фиг.67 показаны компоненты документации интегрированной системы анализа.
На Фиг.68 представлено изображение интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер.
На Фиг.69 показано схематическое изображение интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер.
На Фиг.70 показано схематическое изображение переносной интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер.
На Фиг.71 показано схематическое изображение переносных интегрированной системы анализа и системы для введения полимера, помещенных в контейнер.
На Фиг.72 показано схематическое изображение системы оптической детекции и пневматической системы.
На Фиг.73 показана схема интегрированной системы анализа.
Air supply - источник воздуха; Reagent control and active elements - контроль реагентов и активные элементы; Swab load detection and heaters - детекция внесения мазка и нагреватели; Movable Magnets - подвижные магниты; Lysis - лизис; 70% EtOH - 70% этанол; Beads - гранулы; Waste - отходы; Swab Syringe - шприц с мазком; Water - вода; Ladder (opt.) - лэддер (оптимальный); Premix - предварительная смесь; Diluent - разбавитель; Buffer - буфер; Fluidic connectors - жидкостные соединители; Thermocycler Cover/Clamp - крышка/зажим термоциклера; Magnet - магнит; Reagent Distribution Manifold Section - секция распределительной системы для реагентов; Swab Extractor Manifold Section - секция распределителя устройства для выделения веществ из мазков; Post Amp - послеамплификационная секция; Waste Collection - сбор отходов; Reagent Dist. Chip - чип распределителя реагентов; Swab Extractor Chip - чип устройства для выделения веществ из мазков; Post Amp Chip - послеамплификационный чип; Pneumatic Manifold - пневматический распределитель; Air - воздух; ControlValves - контрольные клапаны; Vac - вакуум; Two of eight channels shown - показаны два из восьми каналов; Optical Detector Assembly - блок оптического детектора; Polymer - полимер; Pressure Cart. - картридж под давлением; Electrophoresis Channels - электрофорезные каналы; Cathode - катод; Heater - нагреватель; Anode - анод; Separation Polymer Fill Module - модуль заполнения сепарационным полимером; Electrophoresis Hardware - аппаратные компоненты для электрофореза; High Voltage Supply - источник высокого напряжения; High Voltage Controller - контроллер высокого напряжения.
На Фиг.74 показано схематическое изображение крышки картриджа и пневматических компонентов.
На Фиг.75 показано схематическое изображение крышки картриджа, картриджа, пневматического распределителя и термоциклера.
На Фиг.76 показан картридж с кассетой с реагентами.
На Фиг.77 показан картридж с кассетой с реагентами.
На Фиг.78 показан вид картриджа с кассетой с реагентами сверху.
На Фиг.79 показан вид картриджа без кассеты с реагентами сверху.
На Фиг.80 показан вид картриджа снизу.
На Фиг.81 показан вид картриджа с трубками снизу.
На Фиг.82 показан вид картриджа с трубками снизу.
На Фиг.83 показана вставка картриджа в интегрированную систему анализа, помещенную в контейнер.
На Фиг.84 показана вставка картриджа в интегрированную систему анализа, помещенную в контейнер.
На Фиг.85 показана вставка картриджа в интегрированную систему анализа, помещенную в контейнер.
На Фиг.86 показана схема способа анализа образца.
На Фиг.87 показана схема способа анализа образца.
На Фиг.88А показана временная шкала способа анализа образца.
На Фиг.88Б показана временная шкала способа анализа образца.
На Фиг.88В показана временная шкала способа анализа образца.
На Фиг.89 показана платформа, на которой расположен ряд микрокапилляров, включающая отверстие, ограничивающее количество рассеянного света, собираемого оптическими приборами.
На Фиг.90 показан оптический блок.
На Фиг.91 показано прохождение света через ряд капилляров, каждый из которых формирует отдельное изображение.
На Фиг.92 показан оптический блок, включающий дихроичное зеркало (складывающееся зеркало 1), пропускающее свет от источника возбуждения, и второе складывающееся зеркало, уменьшающее площадь, занимаемую блоком.
На Фиг.93 показано направление света возбуждения под косым углом к плоскости, в которой расположен ряд капилляров, таким образом, что свет, проходящий через капилляры, не направлен под прямым углом к плоскости, в которой может быть собрано излученное флуоресцентное излучение.
На Фиг.94 показан вид конфигурации, представленной на Фиг.93, сверху вниз.
На Фиг.95 показано изображение, полученное с использованием восьми капилляров, по которым проходят возбужденные светом флуоресцентные частицы.
На Фиг.96 показана инжекционная система для введения образца в электрофорезный капилляр.
На Фиг.96А показаны три электрода напротив капилляра внутри просвета трубки. Третий электрод не имеет электрического соединения с двумя другими электродами, и он электрически заряжается независимо от двух других электродов.
На Фиг.96Б показаны три электрода напротив капилляра внутри просвета трубки. Все электроды электрически соединены друг с другом.
На Фиг.97 показаны интегрированные подсистемы.
На Фиг.98А и 98Б показаны воплощения устройства для регулирования температуры электрофорезных капилляров, например, ряда капилляров. Электрически изолированная схемная плата имеет обычно S-образную линию для расположения капилляров.
На Фиг.99 показано одно воплощение оптической системы для детекции аналитов в ряде капилляров.
На Фиг.100 показана доставка «ценного реагента», одно воплощение расположения «картриджей с ценными реагентами» в устройстве.
На Фиг.101 показано жидкостное и пневматическое строение микрожидкостного чипа, который затем соединяют с жидкостным картриджем с образованием послеамплификационного модуля.
На Фиг.102 показано одно воплощение системы в корпусе с размерами 2×2×2 фута (0,61×0,61×0,61 м).
На Фиг.103 показано жидкостное и пневматическое строение микрожидкостного чипа, который затем соединяют с жидкостным картриджем с образованием модуля доставки реагентов.
На Фиг.104 показано покомпонентное изображение блока устройства, где жидкостный слой включает множество подслоев. Верхний или наружный подслой 121 называют слоем «с вытравленными каналами» и нижний слой 122 называют слоем «со сквозными отверстиями». Текучая среда, проходящая по каналу в слое с вытравленными каналами, может затекать в канал в слое со сквозными отверстиями, соприкасающемся с эластичным слоем.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение включает устройства, конструкция которых включает клапаны, такие как микроклапаны (включая, без ограничения, пневматически активируемые клапаны и микромасштабные чиповые клапаны), для управления перемещением текучей среды. Эти устройства могут быть использованы для выделения компонента, для подготовки образцов и/или для анализа одного или более чем одного компонента в образце или из образца.
Согласно изобретению также предложены устройства для обработки текучих сред и аналитов и способы их применения. Устройства по изобретению могут быть использованы для проведения множества действий с текучей средой и аналитом. Эти действия могут включать перемещение, перемешивание, разделение, нагревание, охлаждение и анализ. Устройства могут включать несколько компонентов, таких как картридж, микрожидкостный микрочип и пневматический распределитель.
Микрожидкостная-немикрожидкостная интеграция
В одном аспекте согласно данному изобретению предложен прибор, в котором использованы микрожидкостные компоненты для интеграции функций, осуществляемых в немикрожидкостном масштабе. Прибор включает немикрожидкостные камеры, имеющие жидкостное соединение друг с другом и с микрожидкостными камерами через микрожидкостные каналы микрожидкостного устройства, например, микрожидкостного чипа. Микрожидкостное устройство включает механизмы управления потоками, такие как клапаны и насосы, посредством которых можно селективно направлять текучую среду по разным камерам и через разные каналы, и посредством которых одна камера может иметь сообщение с несколькими другими камерами. Эти сообщения и направляющие механизмы позволяют автоматизировать функции. В определенных воплощениях в приборе использованы захватывающие агенты в форме частиц, которые могут связываться с аналитом, которые можно иммобилизовать, суспендировать или ресуспендировать в желаемом объеме жидкости и направлять в камеры и из камер через микрожидкостные каналы. Это упрощает переход аналита из немикрожидкостной среды в микрожидкостную среду и обратно в немикрожидкостную среду. Количество захватывающего агента может быть выбрано для захвата желаемого количества аналита из образца, например, для концентрирования аналита из разбавленного образца, для количественного захвата всего или по существу всего аналита из образца или для отбора части аналита из более концентрированного образца. Это позволяет «регулировать» количество аналита, используемое в реакции, и также уменьшает количество стадий манипулирования текучими средами. Прибор может включать множество параллельных жидкостных контуров, посредством которых операции с текучими средами можно проводить одновременно. Интеграция микрожидкостных и немикрожидкостных компонентов в устройстве упрощает работу с образцами при проведении химических реакций (например, химической реакции, биохимической реакции и ферментативной реакции). Это также позволяет уменьшить объем, используемый при операциях, уменьшить площадь и общее пространство, занимаемое системой. Соответственно, в приборы по данному изобретению интегрированы немикрожидкостные и микрожидкостные среды.
2
Конкретнее, согласно данному изобретению предложены приборы, включающие микрожидкостный компонент и немикрожидкостный компонент, имеющие жидкостное сообщение друг с другом. Микрожидкостный компонент включает по меньшей мере один микрожидкостный канал. Микрожидкостный канал обычно имеет площадь поперечного сечения менее 1 мм или по меньшей мере один размер в поперечном сечении в диапазоне от приблизительно 0,1 мкм до приблизительно 500 мкм, например, менее приблизительно 350 мкм. Немикрожидкостный компонент включает по меньшей мере одну немикрожидкостную камеру (открытую или закрытую), то есть, камеру, имеющую немикрожидкостный объем, например, по меньшей мере 10 микролитров, по меньшей мере 20 микролитров, по меньшей мере 50 микролитров, по меньшей мере 100 микролитров, по меньшей мере 500 микролитров, по меньшей мере 1 мл, по меньшей мере 10 мл или по меньшей мере 100 мл. Соответственно, в приборах по данному изобретению немикрожидкостная камера имеет жидкостное сообщение с микрожидкостным каналом. Приборы выполнены с возможностью транспортировки образцов текучей среды (например, жидкости) из немикрожидкостной камеры в микрожидкостный канал, и/или из микрожидкостного канала в немикрожидкостную камеру, или, в противном случае, из микрожидкостного устройства. В других воплощениях микрожидкостные устройства включают микрожидкостные камеры, имеющие жидкостное сообщение с микрожидкостными каналами. В этом случае приборы выполнены с возможностью транспортировки образцов текучей среды между микрожидкостными камерами и немикрожидкостными камерами через микрожидкостные каналы. Текучая среда, перемещенная из микрожидкостного канала в немикрожидкостную камеру, может быть выведена из устройства.
Манипуляции с аналитом могут включать множество стадий. Они могут включать, например, подготовку аналита для химической реакции, смешивание с одним или более чем одним реагентом в различных последовательностях, проведение химической реакции с аналитом, удаление отходов и отмывку. Прибор по данному изобретению может быть использован для осуществления этих функций, направляя аналиты, реагенты, отходы и отмывочные растворы по камерам. Соответственно, в определенных воплощениях приборы данного устройства включают множество немикрожидкостных камер, соединенных друг с другом через микрожидкостные каналы. Текучую среду можно перемещать из одной камеры в другую любой подходящей движущей силой, например, непрерывным давлением или прерывистым давлением (например, поршневыми насосами), электроосмотическим потоком или центрифугированием. По происхождению давление может быть внутренним (например, полученным чиповыми мембранными клапанами) или внешним. Каналы могут включать механизмы управления потоками для селективного направления текучих сред по желаемым камерам. Эти механизмы могут представлять собой клапаны, такие как мембранные клапаны, описанные в других частях данного описания, одноразовые клапаны, такие как восковые клапаны, или другие клапаны. Открывая и закрывая клапаны в соответствующей последовательности, аналит, реагенты и отходы можно направлять в подходящие места. Таким образом, микрожидкостный блок прибора используют для направления текучих сред по нем и крожид костным средам, где с аналитом могут быть проведены различные действия.
Немикрожидкостные камеры могут включать захватывающие агенты для связывания с аналитами. Захватывающие агенты обычно содержат твердый субстрат и способны специфично или неспецифично связываться с аналитами. Субстрат может иметь связывающую силу, или к субстрату может быть присоединена молекула, имеющая связывающие свойства, например, антитело. Захватывающий агент может представлять собой захватывающий агент в форме частиц. Альтернативно, вещество может представлять собой хроматографическое вещество. В этом случае, образец может быть пропущен через хроматографическое вещество и разделенные фракции могут быть введены в микрожидкостное устройство. Альтернативно, захватывающий агент может представлять собой монолит. Альтернативно, захватывающий агент может быть присоединен к поверхности камеры, такой как опора, или поверхность камеры может быть дериватизирована захватывающей молекулой.
Устройство дополнительно выполнено с возможностью перемещения частиц, таких как гранулы, между микрожидкостным каналом и немикрожидкостной камерой. Частицы могут реагировать на магнитное поле, электрическое поле или другие силы. Например, они могут представлять собой парамагнитные или магнитные частицы. Это делает возможными дальнейшие манипуляции с частицами в устройстве воздействием магнитными полями с использованием фиксированных или подвижных магнитов, включая электромагниты. Частицы могут выполнять функции захватывающего агента, захватывая один или более чем один аналит из образца. Например, частицы могут иметь специфичную или неспецифичную аффинность в отношении аналита. Поскольку частицы являются твердыми, они позволяют переходить от немикрожидкостных объемов жидкости к микрожидкостным объемам жидкости посредством иммобилизации частиц и изменения объема содержащей их жидкости. Частицы могут быть иммобилизованы в немикрожидкостной камере или в микрожидкостном устройстве.
Прибор по данному изобретению может быть использован для захвата выбранного количества аналита из образца в немикрожидкостной камере и перемещения этого количества аналита из камеры в микрожидкостный канал. После перемещения в микрожидкостный канал частицы могут быть направлены в немикрожидкостную камеру для хранения или обработки. Например, в камеру вносят немикрожидкостный объем образца. Образец может быть, например, разбавленным или концентрированным в отношении аналита. Правильным определением количества захватывающего агента и условий может быть осуществлен захват выбранного количества аналита захватывающим агентом. Например, в случае концентрированного образца, может быть выбрано небольшое количество захватывающего агента, таким образом, что происходит захват лишь части аналита для использования в реакции. Это позволяет получать образцы, содержащие часть аналита из объема образца, например, количество, достаточное или подходящее для проведения химической реакции. Альтернативно, в случае разбавленного образца, может быть использовано большее количество захватывающего агента, таким образом, что происходит захват большей части или по существу всего присутствующего аналита захватывающим агентом. Это эффективно концентрирует аналит. Отмывка аналита может удалять загрязнения, эффективно очищая аналит от нежелательных компонентов образца, таких как ингибиторы, другие аналиты и так далее. Специфичность захвата можно также контролировать, корректируя химический состав для выбора более широкого или более узкого спектра аналитов, например, более длинных или коротких участков ДНК, проводя различия между ДНК и РНК или используя аффинные реагенты с более широкой или более узкой специфичностью. В некоторых воплощениях можно проводить захват нескольких аналитов, комбинируя аффинные реагенты или применяя несколько способов захвата, либо на одном типе гранул, либо смешивая несколько типов гранул или частиц. В определенных воплощениях прибор дополнительно включает детектор, например, оптический детектор, для детекции молекул на какой-нибудь стадии способа.
Предполагают множество последовательностей реакций. С аналитом можно проводить химическую реакцию. В таком случае, продукт реакции можно очистить и провести с ним другую химическую реакцию. Эту последовательность очистки продукта реакции и проведения последующей другой реакции можно повторять. В частности, в данном изобретении предполагают проведение серии биохимических или ферментативных реакций, разделенных стадиями очистки. Одним примером этого является химия Eberwine, где за первой химической реакцией, обратной транскрипцией, следует вторая реакция, синтез второй цепи, за которой следует третья реакция, транскрипция. Перед каждой последующей реакцией и обычно после последней реакции проводят очистку продукта от примесей при подготовке к следующей стадии. В одном воплощении продукт реакции из немикрожидкостной камеры перемещают через микрожидкостный канал в другую немикрожидкостную камеру. В другом воплощении продукт реакции из немикрожидкостной камеры перемещают через микрожидкостный канал в микрожидкостную камеру, например, на чипе. В другом воплощении продукт реакции из микрожидкостной камеры перемещают через микрожидкостный канал в немикрожидкостную камеру. Соответственно, согласно данному изобретению предложено применение небольших объемов аналита и небольших объемов реагента, что уменьшает, посредством этого, расход реагента.
Например, прибор может быть использован для проведения химических реакций с нуклеиновыми кислотами, таких как амплификация ДНК. Немикрожидкостный объем образца (например, несколько сотен микролитров), содержащего ДНК, может быть собран в немикрожидкостной камере данного устройства. Парамагнитные захватывающие частицы могут быть поданы через микрожидкостные контуры в камеру для захвата точно определенного количества нуклеиновой кислоты. Парамагнитные частицы могут быть задержаны в камере магнитным полем, и незахваченный образец может быть удален в виде отходов, например, через микрожидкостный канал. Клапаны микрожидкостного устройства могут затем быть сконфигурированы для направления объема, например, немикрожидкостного объема, отмывочного раствора в камеру. Аналит и частицы можно отмыть и иммобилизовать, и отходы можно удалить. Затем частицы с захваченным и очищенным аналитом могут быть ресуспендированы в некотором объеме и перемещены из камеры через микрожидкостный канал в камеру для термоциклирования, которая может представлять собой немикрожидкостную реакционную камеру или микрожидкостную реакционную камеру. Там частицы могут быть иммобилизованы, и жидкость может быть удалена. Это позволяет концентрировать частицы приблизительно до объема частиц (например, в нанолитровом диапазоне). Реагенты для проведения амплификации нуклеиновых кислот в подходящем объеме могут быть направлены через микрожидкостный канал в камеру для термоциклирования. В определенных условиях реакционную смесь будут использовать для элюирования нуклеиновых кислот из частиц. Соответственно, согласно данному изобретению предполагают приведение реагентов для проведения химической реакции, такой как ПЦР, циклическое секвенирование, ПЦР в реальном времени, амплификация по типу катящегося кольца, расщепление рестриктазами, фрагментация РНК, расщепление белков и так далее, в контакт с аналитом, присоединенным к частице, без предшествующего элюирования аналита из частицы, и, например, определения концентрации и выбора количества аналита для смешивания с реагентом. Это осуществимо, частично, посредством правильного определения количества захватывающего агента, используемого для захвата аналита, таким образом, что соответствующее количество аналита уже присутствует. После ферментативной реакции или термоциклирования продукт может быть перемещен в микрожидкостный канал для очистки, например, в микрожидкостную камеру или в немикрожидкостную камеру. Это может включать разведение продукта для уменьшения концентрации солей. Это также может включать связывание аналитов с гранулами, их иммобилизацию и их отмывку. Это также может включать хроматографию, твердофазную экстракцию или другие способы очистки в микрожидкостном масштабе или немикрожидкостном масштабе. В это время микрожидкостные компоненты могут направлять продукт в нужное место для анализа, например, капилляр для капиллярного электрофореза, или продукт может быть выведен в немикрожидкостный объем для анализа неинтегрированной системой, такой как коммерческий прибор для капиллярного электрофореза, масс-спектрометр или другой анализатор. Микрожидкостное устройство может также включать область сбора отходов.
В определенных воплощениях микрожидкостные устройства по данному изобретению представляют собой монолитные блоки. В монолитных блоках на одном субстрате представлено множество контуров. В случае устройств, включающих мембранные клапаны, монолитный блок включает один эластичный слой, функционирующий как мембрана для множества клапанов. В определенных воплощениях активационный канал может управлять множеством клапанов монолитного блока. Это позволяет одновременно активировать множество жидкостных контуров. Монолитные блоки могут иметь множество расположенных рядом микрожидкостных контуров. Эти контуры функционируют очень надежно, отчасти ввиду того, что каналы каждого контура формируют одновременно на одном субстрате вместо изготовления по отдельности и сборки.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Жидкостные контуры этих устройств могут быть расположены близко друг к другу. Контур включает открытый или закрытый жидкостный канал. В определенных воплощениях устройство может включать по меньшей мере 1 жидкостный контур на 1000 мм, по меньшей мере 2 жидкостных контура на 1000 мм, по меньшей мере 5 жидкостных контуров на 1000 мм, по меньшей мере 10 жидкостных контуров на 1000 мм, по меньшей мере 20 жидкостных контуров на 1000 мм, по меньшей мере 50 жидкостных контуров на 1000 мм. Альтернативно, устройство может включать каналы, протяженность которых на площади 10 мм составляет по меньшей мере 1 мм, каналы, протяженность которых на 10 мм составляет по меньшей мере 5 мм, каналы, протяженность которых на 10 мм составляет по меньшей мере 10 мм, или каналы, протяженность которых на 10 мм составляет по меньшей мере 20 мм. Альтернативно, устройство может включать клапаны (с седлами клапанов или без седел клапанов), плотность которых может составлять по меньшей мере 1 клапан на см, по меньшей мере 4 клапана на см или по меньшей мере 10 клапанов на см. Альтернативно, устройство может включать элементы, такие как каналы, отстоящие друг от друга от края до края не более чем на 5 мм, отстоящие друг от друга не более чем на 2 мм, отстоящие друг от друга не более чем на 1 мм, отстоящие друг от друга не более чем на 500 мкм или отстоящие друг от друга не более чем на 250 мкм.
Универсальная система подготовки образцов
Согласно данному изобретению предложена универсальная система подготовки образцов. Система сконфигурирована для внесения биологического образца, содержащего аналит в неочищенной форме, очистки аналита, проведения по меньшей мере одной биохимической реакции с аналитом и анализа продукта биохимической реакции.
3
3
3
3
3
3
3
Универсальная система подготовки образцов может быть сконфигурирована таким образом, что ее можно поместить в объеме не более 6 куб. футов (0,17 м), не более 7 куб. футов (0,2 м), не более 8 куб. футов (0,23 м), не более 9 куб. футов (0,25 м) или не более 10 куб. футов (0,28 м). В одном определенном воплощении универсальная система подготовки образцов сконфигурирована таким образом, что ее можно поместить в объеме приблизительно 8 куб. футов (0,23 м). В другом определенном воплощении универсальная система подготовки образцов может быть сконфигурирована для того, чтобы ее можно было поместить в объеме не более 10 куб. футов (0,28 м).
Универсальная система подготовки образцов может включать следующие модули: модуль подготовки образца, реакционный модуль, послереакционный модуль, модуль анализа и/или компьютерный модуль. Модуль подготовки образца может быть сконфигурирован для захвата аналита, например, ДНК, из образца, имеющего немикрожидкостный объем, и перемещения захваченного аналита в первый микрожидкостный канал. Это может быть осуществлено с использованием, например, захватывающих частиц, реагирующих на магнитное поле, для концентрации аналита. Реакционный модуль имеет жидкостное соединение с первым микрожидкостным каналом и сконфигурирован для проведения по меньшей мере одной биохимической реакции с аналитом в реакционной камере с получением продукта реакции. Обычно аналит в реакционной камере имеет большую концентрацию, чем в модуле подготовки образца. Послереакционный модуль имеет жидкостное сообщение с реакционным модулем и сконфигурирован для обработки продукта реакции для анализа. Послереакционный модуль может быть сконфигурирован для перемещения продукта реакции через второй микрожидкостный канал в немикрожидкостную камеру послереакционного модуля. Модуль анализа имеет жидкостное соединение с реакционным модулем или послереакционным модулем и сконфигурирован для проведения анализа, такого как капиллярный электрофорез, продукта реакции. Модуль анализа генерирует данные о продукте реакции. Компьютерный модуль включает исполняемую компьютерную программу для обработки и/или анализа данных, включая форматирование данных с приданием им универсального формата. Система может быть дополнительно сконфигурирована для доступа в Интернет, передачи данных на не входящий в систему сервер и получения информации от сервера.
Типичное устройство показано на Фиг.6. На Фиг.6 показан картридж с интегрированным микрочипом (1), терморегулятором (400) и устройством для последующего анализа (500). В определенных воплощениях устройство включает модуль подготовки текучих сред, включающий картридж, соединенный или, в противном случае, имеющий жидкостное соединение с микрочипом; внечиповый терморегуляторный модуль, соединенный с модулем подготовки текучих сред через устройство для переноса текучих сред с жидкостным каналом, таким как трубка, через картридж и сконфигурированный для регулировки температуры в устройстве для переноса текучих сред, где устройство для переноса текучих сред имеет дополнительное жидкостное соединение со вторым микрочипом с клапанами и жидкостными каналами, которые могут селективно направлять текучую среду в одно или более чем одно последующее устройство. Это устройство может быть использовано для термоциклирования или изотермических реакций.
В одном применении система сконфигурирована для получения на основании анализа биологического образца файла, совместимого с системой CODIS для поиска в базе данных CODIS. CODIS представляет собой систему для судебных экспертиз, в которой в настоящее время используют тринадцать локусов коротких тандемных повторов (STR) в качестве маркеров генетической идентичности, см., например, www.fbi.gov/hq/lab/html/codisl.htm. Информация от менее или более чем 13 маркеров может быть использована для обеспечения идентификации личности. Модуль подготовки образца обеспечивает выделение ДНК из материала для судебной экспертизы, захват предопределенного количества ДНК на захватывающих частицах, например, на частицах, реагирующих на магнитное поле, и доставку ДНК в немикрожидкостную реакционную камеру реакционного модуля, где частицы иммобилизуют, например, магнитным полем. После этого реагенты для ПЦР доставляют в реакционную камеру и STR-маркеры, использованные в системе CODIS, амплифицируют с применением ПЦР. Амплификация может быть проведена с использованием имеющихся в продаже реагентов, таких как реагенты, доступные от Promega (например, серия продуктов PowerPlex). В этом продукте использовано четыре разноцветных флуоресцентных маркера. Продукты ПЦР направляют в послереакционный модуль и разводят до концентрации, подходящей для капиллярного электрофореза. Новый продукт направляют в модуль анализа, где проводят капиллярный электрофорез. Аналиты в продукте выявляют флуоресцентной детекцией. Полученные данные затем обрабатывают с использованием алгоритма, приводящего к получению записей для каждой разновидности флуоресцентных частиц. Эти записи могут затем быть проанализированы компьютером для идентификации маркеров в STR-локусах, использованных в системе CODIS. Такое программное обеспечение имеется в продаже, например, от Life Technologies, как например программное обеспечение GeneMapper™ ID-X или инструментальное программное обеспечение NIST (www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/software htm). Программное обеспечение может преобразовывать эти данные в формат файла, совместимый с системой CODIS. См., например, www.ncjrs.gov/pdffilesl/nij/sl413apf.pdf. Файл, совместимый с системой CODIS, может быть использован для поиска в базе данных для судебных экспертиз, такой как база данных CODIS. Система может быть сконфигурирована для доступа в Интернет, и доставки файла в соответствующую базу данных для анализа, и получения ответа от базы данных с указанием вероятных совпадений исходного образца и индивида.
I. Модуль подготовки образца
Модуль подготовки образца сконфигурирован для захвата аналита из немикрожидкостного объема на твердом субстрате и направления захваченного аналита через микрожидкостный канал в реакционную камеру реакционного модуля. Аналит может быть захвачен из образца, в котором аналит присутствует в невыделенной форме. Аналит не является выделенным, если он присутствует с другими клеточными или биомолекулярными компонентами, с которыми он связан естественным образом. Они могут включать, например, цитоплазматические компоненты или вирусные компоненты. Модуль подготовки образца может быть сконфигурирован для захвата аналита из необработанного образца. Необработанный образец представляет собой образец, в котором аналит содержится в клетке или вирусе. Например, кровь, буккальный мазок и семенная жидкость представляют собой необработанные образцы, содержащие в качестве аналита ДНК. В этом случае, модуль подготовки образца может содержать вещества для лизиса клеток и выделения ДНК из лизата.
В одном аспекте устройство для подготовки образца, как показано на Фиг.16, Фиг.21, Фиг.22 (устройство 1000) и Фиг.54, включает картридж, интегрированный с микрожидкостным микрочипом, контролирующим перемещение текучей среды в картридже посредством микроклапанов и компонентов управления картриджем. Картридж и/или его камеры могут иметь достаточный размер для обработки одного или более чем одного миллилитра образца, внесенного в автоматическое устройство. Картридж может обрабатывать образец с выведением компонента, который может быть перемещен с использованием потока под давлением или вакуума, регулируемого микроклапанами. Картридж может обеспечить соединение с устройством для доставки, содержащим макромасштабные образцы, такие как кровь, аэрозольные жидкости, мазки, биологические жидкости, соскобы и другие жидкие, твердые и газообразные образцы. Картридж может обрабатывать макромасштабные объемы образца с применением микромасштабных подготовки и анализа образца. Картридж может позволить обрабатывать образцы макромасштабного или большого объема с использованием микрожидкостных устройств и компонентов, имеющих небольшое мертвое пространство и позволяющих снизить потери веществ.
А. Картриджи
Картридж, также называемый здесь жидкостным распределителем, может быть использован с несколькими целями. Обычно картридж имеет входы/выходы, имеющие размеры, подходящие для соединения с устройствами больших размеров, а также с микрожидкостными устройствами. Картриджи или жидкостные распределители были описаны в публикации заявки на патент США US 20090253181. Картридж может быть использован для внесения веществ, таких как образцы, реагенты или твердые частицы, от источника и доставки их в микрожидкостный микрочип.Перенос веществ между картриджем и микрожидкостным микрочипом возможен через соединенные отверстия картриджа и микрожидкостного микрочипа. Например, для переноса веществ в картридж может быть использована пипетка, где картридж, в свою очередь, может затем обеспечить доставку веществ в микрожидкостное устройство. В другом воплощении перенос веществ в картридж может происходить по трубке. В другом воплощении перенос веществ в картридж может быть осуществлен шприцем. В дополнение, картридж может иметь резервуары, объемы которых позволяют удерживать нанолитры, микролитры, миллилитры или литры текучей среды. Резервуары могут быть использованы в качестве удерживающих камер, реакционных камер (например, содержащих реагенты для проведения реакции), камер для обеспечения нагревания или охлаждения (например, включающих терморегуляторные элементы, или камер, термически соединенных с терморегуляторами) или сепарационных камер (например, камер для сепарации с использованием парамагнитных гранул, аффинных захватывающих матриц или хроматографии). В устройствах, описанных здесь, могут быть использованы камеры любого типа, например, описанные в публикации заявки на патент США №2007/0248958, включенной сюда посредством ссылки. Резервуар может быть использован для обеспечения нагревания или охлаждения через входы и выходы для перемещения текучих сред с регулируемой температурой в картридж и из картриджа, который затем может обеспечить терморегуляцию микрожидкостного микрочипа. Альтернативно, резервуар может включать элементы Пельтье или любые другие нагревательные или охлаждающие элементы, известные специалистам в данной области техники, которые могут обеспечить теплоотвод или источник тепла. Резервуар или камера картриджа может иметь объем по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или более мкп. Относительный объем камеры или резервуара может приблизительно в 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 или более раз превосходить относительный объем канала или клапана микрожидкостного микрочипа. Размер камер и резервуаров картриджа, которые могут быть соединены с микрожидкостным микрочипом, может быть выбран таким образом, чтобы обеспечить возможность обработки большого объема образца, такого как образец объемом более чем приблизительно 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000 или более мкл, где потоком текучих сред для обработки образца управляют клапаны микрожидкостного микрочипа. Это может позволить уменьшить количество потерянных образца и реагентов, благодаря уменьшенному мертвому пространству микрожидкостного микрочипа по сравнению с другими устройствами для управления потоками, такими как пипетки и клапаны большого размера. Мертвое пространство микрожидкостного микрочипа может составлять менее 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0,5, 0,1 или 0,05 мкл. Это может позволить уменьшить количество потерянных образца и реагентов при обработке образца до менее 20, 15, 10, 7, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,05 процентов.
Картридж может быть изготовлен из любого материала, известного специалистам в данной области техники. Например, картридж может быть изготовлен из пластика, стекла или металла. Пластиковый материал может включать любой пластик, известный специалистам в данной области техники, такой как полипропилен, полистирол, полиэтилен, полиэтилентерефталат, полиэстер, полиамид, поливинилхлорид, поликарбонат, полиуретан, поливинилдиенхлорид, сополимер циклоалкенов или любая их комбинация. Картридж может быть изготовлен с применением любой методики, известной специалистам в данной области техники, такой как мягкая литография, твердая литография, фрезеровка, чеканка, абляция, высверливание, травление, литье под давлением или любая их комбинация.
Как показано на Фиг.3 и Фиг.4, картридж (1) может иметь прямоугольную форму с плоскими сторонами. В другом воплощении картридж имеет изогнутую, округлую, зазубренную или выступающую поверхность. В одном воплощении картридж имеет по меньшей мере одну по существу плоскую поверхность, расположенную рядом с микрожидкостным микрочипом. Картридж выполнен с возможностью жидкостного соединения со входами/выходами микрочипа. Например, отверстия на поверхности картриджа могут быть выровнены со входами/выходами микрочипа. При соединении картриджа и микрочипа друг с другом происходит выравнивание отверстий для установления жидкостных соединений, позволяющих пропускать жидкости из картриджа во входы/выходы микрочипа, соединенные с каналами, обычно имеющими клапаны и образующими жидкостные контуры.
В одном воплощении картридж включает один или более чем один элемент, включая, без ограничения, камеру, вход/выход, канал или магнит. В одном воплощении с микрожидкостным картриджем комбинируют микроклапаны, такие как пневматически активируемые клапаны. В некоторых воплощениях микроклапаны представляют собой активные механические микроклапаны (такие как магнитные, электрические или пьезоэлектрические температурные микроклапаны), немеханические микроклапаны (такие как бистабильные микроклапаны, реагирующие на изменение электромеханической фазы, или реологические микроклапаны), внешние микроклапаны (такие как модульные или пневматические микроклапаны), пассивные механические микроклапаны (такие как обратные микроклапаны) или пассивные немеханические микроклапаны (такие как капиллярные микроклапаны) (Oh et al., A review of microvalves, J.Micromech Microeng. 16 (2006) R13-R39)).
В другом воплощении пневматически активируемые клапаны, такие как MOVe-клапаны, регулируют поток давления воздуха, вакуума или текучих сред в микрожидкостном микрочипе 2 или нескольких микрожидкостных микрочипах. MOVe-клапаны могут представлять собой микромасштабные чиповые клапаны, микрожидкостные чиповые клапаны или микроробототехнические чиповые клапаны. В одном воплощении регулирование потока давления воздуха, вакуума или текучих сред осуществляет один или более чем один гидравлический насос переменного давления, такой как соленоидные клапаны или соленоидные насосы. В одном воплощении микрожидкостный микрочип представляет собой структуру, включающую микроканалы и/или микроуглубления, где микроканал представляет собой закрытую структуру, и микроуглубление представляет собой открытую структуру. В одном воплощении микрожидкостный микрочип представляет собой плоскую структуру. В родственном воплощении микрожидкостное устройство включает микрожидкостный микрочип с микроклапанами, сгруппированными на одной стороне картриджа. В одном воплощении (Фиг.3 и Фиг.4) картридж (1) может включать один или более чем один вход/выход (4, 5, 6, 7, 8, 9) для внешних текучих сред, воздуха или вакуума. Функциями входов/выходов могут быть выведение отходов (4), поступление реагентов (5), вентиляция (6), внесение образца (7), выведение продукта (8). Картридж (1) может включать один или более чем один вход для внесения образцов или одну или более чем одну реакционную камеру, (7) и (3).
Одна камера картриджа, такая как реакционная камера, может иметь одно, или более чем одно, или по меньшей мере одно, два или три жидкостных соединения с микрочипом. Например, на Фиг.3 и Фиг.4 реакционная камера (3) имеет жидкостное соединение с микрочипом через соединение 120, расположенное в основании камеры, и другое жидкостное соединение с микрочипом через вход/выход (9), соединенный с камерой (3) через проход, расположенный в верхней стенке камеры. Верхняя стенка камеры (3), вход/выход (9) и проход между камерой (3) и входом/выходом (9) могут быть закрыты от внешней среды, таким образом, что текучие среды в камере (3) неизбежно поступают во вход/выход (9), когда камера (3) наполнена, и наоборот. Такая камера, или комбинация, или камера и вход/выход могут также быть названы закрытой камерой. Расположение жидкостных соединений в основании и в верхней стенке камеры необязательно, однако жидкостные соединения в основании и в верхней стенке камеры позволяют уменьшить захват газа в камере. Альтернативно, реакционную камеру (3) можно рассматривать как комбинацию двух камер, имеющих жидкостное соединение друг с другом в верхних стенках камер, которые могут быть расположены в картридже, и каждая из которых также имеет отверстие в основании. Отверстия в основании, также называемые апертурами камер, могут иметь жидкостное соединение с апертурами входов/выходов микрочипа. Два жидкостных соединения могут позволить направлять текучие среды в камеру и из камеры через микрожидкостный микрочип.
В другом воплощении устройство включает картридж, включающий по меньшей мере один пневматически активируемый клапан, такой как MOVe-клапан, расположенный на одной или более чем одной поверхности или структуре нелинейным образом. Картридж может включать один или более чем один пневматически активируемый клапан, расположенный в картридже, в месте, отличном от основания картриджа.
Функциональные элементы картриджа могут включать входы/выходы, каналы, камеры, фильтры, магниты или вентиляционные каналы, камеры, которые могут иметь общее название «функциональные элементы». В одном воплощении, на Фиг.4, функциональные элементы соединены с микрожидкостным микрочипом, включающим микроклапаны, в соединениях 100, 120, 140, 160 и 230. Функциональные элементы могут быть соединены с трубками или капиллярами, введенными во входы/выходы, равнопроходным соединением или переходниками. В одном воплощении равнопроходное соединение может включать вход/выход картриджа, выровненный непосредственно с апертурой микрожидкостного микрочипа. В одном воплощении картридж и микрожидкостный микрочип образуют интегрированный модуль. В другом воплощении картридж и микрожидкостный микрочип представляют собой два отдельных элемента, которые присоединяют друг к другу перед применением.
Картридж может включать по меньшей мере одну камеру, вход для внесения образца, вход для внесения реагентов, выход, выход для выведения отходов и магнит. Магнит может быть расположен рядом с камерой таким образом, что магнитное поле, создаваемое магнитом, может притягивать парамагнитные частицы в указанной камере к стенке камеры. В одном воплощении парамагнитные частицы представляют собой гранулы или клетки, реагирующие на магнитное поле (например, клетки, содержащие гемоглобин, обработанные нитратом натрия). Магнит может представлять собой электромагнит или постоянный магнит, такой как магнит из редкоземельного металла.
В одном воплощении, как показано на Фиг.4, соединения или входы/выходы (4, 5, 6, 7, 8 и 9) ведут в каналы картриджа (14, 15, 16, 17, 18 и 19), соответственно. На входах/выходах (4, 5, 6, 7 и 8) присутствуют зубцы для надежного присоединения соединителя или трубки к зубцу, такому как зубец, показанный для соединения (7) (см. различие диаметра соединения (7) и канала (17)). В одном воплощении входы или выходы могут быть соединены с множеством соединителей или трубок, таких как капилляры, как описано в патенте США №6190616, патенте США №6423536, заявке на патент США №09/770412, 1-25-01, заявке на патент США №60/402959, или одним или более чем одним микрочипом с модульными микрожидкостными входами/выходами, как описано в патенте США №6870185 и заявке на патент США №11/229065; каждая/каждый из которых полностью включена/включен сюда посредством ссылки. В одном воплощении модульные микрожидкостные входы/выходы позволяют соединять микрочипы или капилляры с возможностью отсоединения без мертвого пространства или утечки.
В другом воплощении камера (3) соединена с проходом (9) и с конусом (13), ведущим к соединению (120). Камера (3) может быть использована для реакций и таким же образом может быть использован любой из каналов. На Фиг.4 каналы картриджа ведут непосредственно к апертурам входов/выходов микрочипа (2). По необходимости каналы картриджа могут быть соединены друг с другом. В некоторых воплощениях по меньшей мере один канал картриджа не имеет физического соединения с микрожидкостным микрочипом. В другом воплощении по меньшей мере один канал картриджа имеет жидкостное соединение с по меньшей мере одним микроканалом микрожидкостного микрочипа. В соединении может быть использована или не использована апертура микрожидкостного микрочипа. Апертура может представлять собой отверстие или переходник, выполненные с возможностью соединения микрочипа и картриджа. В некоторых воплощениях изобретения переходник включает уплотнитель, такой как прокладка или уплотнительное кольцо.
Б. Микрожидкостные устройства
В одном воплощении картридж и микрожидкостный микрочип интегрированы друг с другом с образованием одного модульного устройства. Картридж и микрожидкостный микрочип могут иметь жидкостное соединение или быть соединены твердым клеем или механически. В одном воплощении клей представляет собой полиакрилат, липкую ленту, двустороннюю липкую ленту или любой другой клей, известный специалисту в данной области техники. Картридж может включать элемент (12), как показано на Фиг.4, который может обеспечивать затекание клея на жидкой основе в соединение между микрожидкостным микрочипом и картриджем. В другом воплощении картридж присоединен к микрожидкостному микрочипу нежидкостным слоем клея. Альтернативно, удержание картриджа и микрочипа рядом друг с другом могут обеспечивать скрепки, зажимы или другое удерживающее устройство. Картридж и микрочип могут быть выровнены перед интегрированием по видимым подсказкам, с использованием микроскопа или без него, или с использованием физических направляющих элементов. Видимые подсказки могут включать линии или элементы, нарисованные, вытравленные или иным образом представленные на картридже, микрочипе или как на картридже, так и на микрочипе. Физические направляющие элементы включают зубцы, выступы и контуры, которые могут быть снабжены указателями для облегчения или обеспечения правильной сборки.
В некоторых случаях микрожидкостный микрочип имеет мембранные клапаны для управления потоком текучей среды. Микрожидкостные устройства с мембранными клапанами для управления потоком текучей среды описаны в патенте США №7445926, публикациях заявок на патент США №2006/0073484, 2006/0073484, 2007/0248958 и 2008/0014576 и РСТ-публикации WO 2008/115626. Клапанами можно управлять, воздействуя положительным или отрицательным давлением на пневматический слой микрочипа через пневматический распределитель.
В одном воплощении микрочип представляет собой «МOVе»-микрочип. Такие микрочипы включают три функциональных слоя: жидкостный слой, включающий микрожидкостные каналы; пневматический слой, включающий пневматические каналы; и активирующий слой, расположенный между двумя другими слоями. В определенных воплощениях жидкостный слой состоит из двух слоев. Один слой может включать бороздки, обеспечивающие микрожидкостные каналы, и сквозные отверстия или поры, проходящие от наружной поверхности до жидкостного канала. Второй слой может включать сквозные отверстия, проходящие от поверхности, контактирующей с активирующим слоем, до поверхности, контактирующей с пневматическими каналами другого слоя. При соединении эти два слоя формируют один жидкостный слой, включающий внутренние каналы и сквозные отверстия, открывающиеся наружу, соединяя канал с жидкостным распределителем, или внутрь, соединяя канал с активирующим слоем с образованием клапана, камеры или другого функционального элемента. Активирующий слой обычно образован деформируемым веществом, например, эластомерным веществом, способным к деформации при воздействии на него вакуумом или давлением. В местах, где жидкостные каналы или пневматические каналы имеют отверстия или иным образом контактируют с активирующим слоем, могут быть образованы функциональные устройства, такие как клапаны, например, мембранные клапаны. Поперечное сечение такого клапана показано на Фиг.1. Как жидкостный слой, так и пневматический слой могут включать входы/выходы, соединяющие каналы с наружной поверхностью, в качестве входов/выходов. Такие входы/выходы могут быть адаптированы для соединения с жидкостными распределителями, например, картриджами, или пневматическими распределителями.
Как показано на Фиг.40, микрожидкостный микрочип (103) может быть соединен с картриджем (101). Микрожидкостный микрочип может иметь камеру (105) с отверстием, связанным с отверстием (117) картриджа (101). Камера может быть использована для множества целей. Например, камера может быть использована в качестве реакционной камеры, камеры для смешивания или камеры для захвата. Камера может быть использована для захвата магнитных частиц, таких как магнитные гранулы, парамагнитные гранулы, вещества для твердофазных экстракций, монолиты или хроматографические матрицы.
Магнитный компонент (109) может быть расположен таким образом, что он обеспечивает захват магнитных частиц в резервуаре (107) и/или микрожидкостной камере (105) картриджа на поверхности микрожидкостной камеры (105). Магнитный компонент может создавать магнитное и/или электромагнитное поле с использованием постоянного магнита и/или электромагнита. При использовании постоянного магнита его можно перемещать в одном или более чем одном направлении, приближая магнит к микрожидкостному микрочипу для воздействия магнитным полем на микрожидкостную камеру. В некоторых воплощениях изобретения магнит перемещают в направлении (111), показанном на Фиг.40.
Альтернативно, любое из множества устройств может быть соединено с микрожидкостным микрочипом. Например, детекторы, сепарационные устройства (например, газовые хроматографы, жидкостные хроматографы, устройства для капиллярного электрофореза, масс-спектрометры и так далее), источники света или терморегуляторы могут быть расположены рядом с микрожидкостным микрочипом или использованы в сочетании с микрожидкостным микрочипом. Эти устройства могут позволить выявлять аналиты детекцией сопротивления, емкостного сопротивления, поглощения или излучения света, флуоресценции, температуры или другими химическими или физическими измерениями. Альтернативно, эти устройства могут позволить направлять свет на часть или область микрожидкостного микрочипа.
Может быть разработано микрожидкостное устройство с несколькими камерами, сконфигурированными для захвата магнитных частиц. Несколько камер и магнитный компонент могут быть расположены таким образом, что магнитное поле может воздействовать на все камеры одновременно или воздействовать на каждую или некоторые камеры независимо от других камер. Расположение камер и магнитных компонентов может способствовать более быстрой или более эффективной регенерации магнитных частиц. В частности, расположение может способствовать регенерации магнитных частиц в нескольких камерах.
Как показано на Фиг.41, микрожидкостный микрочип (103) может быть образован жидкостным слоем (203), эластомерным слоем (205) и пневматическим слоем (207). Жидкостный слой может включать такие элементы, как камера (105), а также каналы, клапаны и входы/выходы. Каналы могут представлять собой микрожидкостные каналы, используемые для переноса текучих сред между камерами и/или входами/выходами. Клапаны могут представлять собой клапаны любого типа, используемые в микрожидкостных устройствах. В предпочтительных воплощениях изобретения клапан включает микромасштабный чиповый клапан (MOVe), также называемый здесь микрожидкостным мембранным клапаном. Группа из трех MOVe-клапанов может образовывать MOVe-насос. MOVe-клапаны и MOVe-насосы можно активировать с использованием пневматических компонентов. Источники пневматического воздействия могут быть расположены внутри или вне микрожидкостного микрочипа.
Пример MOVe-клапана показан на Фиг.1. Вид MOVe-клапана с разделенными слоями показан на Фиг.1А. Поперечное сечение закрытого MOVe-клапана показано на Фиг.1Б. На Фиг.1В показан вид MOVe-клапана сверху вниз. Канал (251), идущий от жидкостного слоя, может быть соединен с эластомерным слоем (259) через одно или более чем одно сквозное отверстие (257). Канал может иметь одно или более чем одно седло (255) для прекращения потока через канал при контакте эластомерного слоя (259) с седлом (255). Эластомерный слой может обычно контактировать с седлом или обычно не контактировать с седлом. Воздействие положительным или отрицательным давлением через пневматическую линию (261) с повышением или понижением давления в пневматической камере (253) относительно жидкостного канала (251) может приводить к деформации эластомерного слоя с приближением эластомерного слоя к седлу или отдалением эластомерного слоя от седла.
В некоторых воплощениях изобретения MOVe-клапан не имеет седла клапана, и при воздействии положительным или отрицательным давлением не происходит полного прекращения потока текучей среды через жидкостный канал. Клапаны этого типа применимы в качестве резервуаров для жидкости и в качестве насосных камер и могут быть названы насосными клапанами. Возможно воздействие вакуумом, включая очень глубокий вакуум, средний вакуум, неглубокий вакуум, вакуум по определению пользователя и такое давление, как 5 фунтов на квадратный дюйм (34,47 кПа), 10 фунтов на квадратный дюйм (68,95 кПа), 15 фунтов на квадратный дюйм (103,43 кПа), 25 фунтов на квадратный дюйм (172,38 кПа), 30 фунтов на квадратный дюйм (206,85 кПа), 40 фунтов на квадратный дюйм (275,8 кПа), 45 фунтов на квадратный дюйм (310,28 кПа) и 50 фунтов на квадратный дюйм (344,75 кПа).
Группа из трех MOVe-клапанов может образовывать насос, где первый MOVe-клапан используют в качестве впускного клапана, второй MOVe-клапан -в качестве насосного клапана, и третий MOVe-клапан - в качестве выпускного клапана. Перемещение текучей среды через группу MOVe-клапанов может быть осуществлено последовательным открыванием и закрыванием MOVe-клапанов. При подаче текучей среды ко впускному клапану типичная последовательность может включать, начиная с состояния, когда все три MOVe-клапана закрыты, (а) открытие впускного клапана, (б) открытие насосного клапана, (в) закрытие впускного клапана и открытие выпускного клапана, (г) закрытие насосного клапана и (д) открытие выпускного клапана. Поскольку впускной и выпускной клапаны могут иметь одинаковое строение, MOVe-насосом можно перемещать текучие среды в любом направлении перепрограммированием последовательности открытия впускного или выпускного клапанов.
Жидкостный слой (203) может быть сконструирован из одного или более чем одного слоя материала. Как показано на Фиг.42, жидкостный слой (203) может быть сконструирован из двух слоев материала. Каналы (301, 303, 305) могут быть образованы на границе раздела двух слоев материала, и камера (105) может быть образована полным удалением части одного слоя материала. Каналы могут иметь любую форму, например, закругленную с одной стороны (301), прямоугольную (303) или кольцеобразную (305). Канал может быть образован углублениями только в одном слое (301, 303) или углублениями в обоих слоях (305). Каналы и камеры могут быть соединены жидкостными каналами, пересекающими показанные каналы и камеры. В объем настоящего изобретения также входят многомерные микрочипы, где жидкостные каналы и соединения присутствуют между несколькими жидкостными слоями.
Толщина (307) второго слоя материала может представлять собой любую толщину. В некоторых воплощениях изобретения второй слой имеет толщину, минимизирующую ослабление магнитного поля в камере (105), распространяющегося через второй слой от внешнего магнитного компонента, или минимизирующую снижение теплопередачи.
Как показано на Фиг.43, жидкостный слой (203) может быть изготовлен из одного слоя материала. Один слой затем соединяют с эластомерным слоем (205) с образованием каналов (305, 303) и камер (305) между жидкостным слоем и эластомерным слоем.
Микрожидкостный микрочип может быть изготовлен из любого материала, известного специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях изобретения жидкостный и пневматический слой изготовлены из стекла, и эластомерный слой изготовлен из PDMS. В альтернативных воплощениях эластомер может быть заменен тонкой мембраной из деформируемого материала, такого как тефлон (PTFE), кремний, или другой мембраной. Элементы жидкостного и пневматического слоев могут быть изготовлены с применением любой методики микрообработки, известной специалистам в данной области техники, такой как литография, травление, фрезеровка, прессование, чеканка, трафаретная печать, лазерная абляция, напыление на подложку, напыление парообразными химическими соединениями или любая их комбинация.
Микрожидкостные устройства могут быть сконфигурированы таким образом, чтобы снизить вязкость в области клапанов. Это может быть осуществлено покрытием седел клапанов и других поверхностей, над которыми протекает текучая среда, и которые, вероятно, будут контактировать с эластичным слоем, материалом с низким энергетическим произведением, таким как благородный металл (например, золото) или перфторированный полимер (например, тефлон). Такие устройства описаны более подробно в заявке на патент США №12/789186.
В одном воплощении на микрожидкостном микрочипе 2 образованы контуры из микроканалов, как показано на Фиг.5, связывающие группы микроклапанов с микроканалами. В одном воплощении микроклапаны представляют собой пневматически активируемые клапаны. В одном воплощении пневматически активируемые клапаны представляют собой MOVe-микроклапаны. В одном воплощении жидкостным сообщением между картриджем и микрожидкостным микрочипом, как например между камерами, входами/выходами, каналами, микроканалами и другими функциональными элементами, можно управлять, открывая или закрывая по меньшей мере один микроклапан. В одном воплощении микроклапаном управляет микропроцессорное устройство управления, такое как компьютер. Компьютер может включать контроллер ввода/вывода или любые другие компоненты, известные специалисту в данной области техники, такие как запоминающее устройство и процессор. В одном воплощении микроклапан представляет собой MOVe-клапан, активируемый источником пневматического воздействия, как например через пневматические входы/выходы 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 70. В одном воплощении управление источником пневматического воздействия осуществляет по меньшей мере один соленоид. В одном воплощении соленоид имеет малые размеры и может быть соединен с источниками вакуума или давления. В одном воплощении источник пневматического воздействия соединен с пневматическим входом/выходом с использованием нажима, такого как использование зажима, пружин, пневматических устройств или винтового нажима, возможно с герметизацией, обеспеченной уплотнительным кольцом.
В одном воплощении на Фиг.5 показано изображение верхней части микрожидкостного микрочипа (2), эта сторона контактирует с основанием картриджа (1). Микроклапан 110 управляет жидкостным сообщением между микроканалами 101 и 121. Микроклапан 130 управляет жидкостным сообщением между микроканалами 131 и 141. Микроклапан (150) управляет жидкостным сообщением между микроканалами 151 и 152. Микроклапан 180 управляет жидкостным сообщением между микроканалами 181 и 191. Микроклапан 200 управляет жидкостным сообщением между микроканалами 201 и 212. Микроклапан 220 управляет жидкостным сообщением между микроканалами 221 и 231.
В одном воплощении соединения могут соединять один или более чем один микроканал. На Фиг.5 показана схема микрочипа, который может быть соединен с картриджем, показанным на Фиг.4. На Фиг.5 соединение 100 соединено с одним микроканалом 101, соединение 140 соединено с одним микроканалом 141, соединение 160 соединено с одним микроканалом 161, и соединение 230 соединено с одним микроканалом 231. Соединение 190 соединено с двумя микроканалами 191 и 201. Соединение 120 соединено с тремя микроканалами 121, 131 и 151. В одном воплощении с одним соединением могут быть соединены более трех микроканалов.
Микроканалы могут быть получены одной или более чем одной методикой, такой как фотолитография, прессование, чеканка, литье или фрезерование. Микроканалы могут быть получены в таком материале, как стекло, пластик, полимер, керамика, гель, металл или другой подходящий твердый материал.
В одном воплощении картридж используют в способе выделения веществ из образца, включающем доставку образца в камеру через вход для внесения образца и доставку парамагнитных частиц в камеру через вход для внесения реагентов. Парамагнитные частицы (например, парамагнитные гранулы) связываются с по меньшей мере одним компонентом образца (таким как ДНК, РНК, микро-РНК, белок, липид, полисахарид или другой лиганд). Парамагнитные частицы притягивают к стенке камеры посредством магнитного поля, созданного магнитом, расположенным вне камеры. Парамагнитные частицы отмывают отмывочным раствором, доставленным в камеру, содержащую парамагнитные частицы, через вход для внесения реагентов, и отмывочный раствор удаляют через выход для выведения отходов. Может быть добавлен реагент для элюирования компонента образца из парамагнитных частиц и выведения компонента образца в другое устройство для дальнейшей обработки или анализа. Предпочтительным воплощением является выведение компонента образца на парамагнитных частицах.
В одном воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют в способе диагностики, В одном воплощении диагностика включает выявление инфекционного агента в образце. В одном воплощении инфекционный агент представляет собой бактерии, вирус, грибы, микоплазму или прион. В другом воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют в способе диагностики наследственного заболевания. В одном воплощении наследственное заболевание вызвано одной или более чем одной мутацией ДНК, такие мутации включают, без ограничения, присоединения оснований к триплетам (triplet base expansions), мутации с заменой оснований, делеционные мутации, присоединения, нонсенс-мутации, преждевременные стоп-кодоны, хромосомные делеции, хромосомные дупликации, анеуплоидию, частичную анеуплоидию или моносомию. В другом воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют в способе диагностики рака или предрасположенности к раку. В другом воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют в способе диагностики наследственного заболевания, такого как аутизм, синдром Дауна, трисомия, болезнь Тея-Сакса или другие наследственные заболевания. В некоторых воплощениях образец, используемый для диагностики с использованием устройства, включающего микрожидкостный микрочип, представляет собой образец крови, образец слизи, образец жидкости бронхоальвеолярного лаважа, образец мочи, образец кала, образец кожи, образец волос, образец семенной жидкости, образец вагинального секрета или образец амниотической жидкости.
В другом воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют для установления наличия загрязнения окружающей среды агентом. В одном воплощении агент представляет собой биологический агент, такой как бактерии, вирус, грибы или микоплазма, в образце окружающей среды. В другом воплощении агент представляет собой загрязняющий агент, такой как пестицид, гербицид или удобрение. В одном воплощении образец окружающей среды представляет собой образец почвы, образец воды, образец воздуха, образец мяса, образец овоща или образец фрукта. В другом воплощении агент представляет собой генетически модифицированный организм.
В другом воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют для генотипирования, идентификации отдельного млекопитающего (такого как человек), судебных экспертиз, анализа экспрессии генов, модификаций генов, анализа микро-РНК или риботипирования.
В другом воплощении устройство, включающее микрожидкостный микрочип, используют в способе, включающем молекулярно-биологический анализ, включая, без ограничения, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию нуклеиновых кислот образца (такую как аллель-специфичная ПЦР, ПЦР-сборка (assembly PCR), асимметричная ПЦР, метод молекулярных колоний (colony PCR), хеликаза-зависимая амплификация, ПЦР с «горячим стартом», специфичная ПЦР промежуточных последовательностей (intersequence-specific (ISSR) PCR), инвертированная ПЦР, опосредованная лигированием ПЦР, специфичная ПЦР метилированных участков (methylation-speciffc PCR), мультиплексная лигазная цепная реакция (multiplex ligation-dependent probe amplification), мультиплексная ПЦР, вложенная ПЦР, ПЦР с перекрывающимися праймерами (overlap-extension PCR), количественная ПЦР, ПЦР с обратной транскрипцией, TAIL-ПЦР (thermal asymmetric interlaced PCR), touchdown-ПЦР или РАМ-АС-ПЦР), изотермические амплификации нуклеиновых кислот (такие как изотермическая петлевая амплификация (loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)), амплификация с одноцепочечными разрывами и вытеснением цепи (nick displacement amplification), платформа для хеликаза-зависимой амплификации (HDA) и платформа для амплификации всего генома на основе праймазы (pWGA), однопраймерная изотермическая амплификация (SPIA) и Ribo-SPSA для РНК, амплификация с вытеснением цепи (SDA); EXPAR (Van Ness J, Van Ness LK, Galas DJ. (2003) Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proc NatI Acad Sci USA. 100:4504-9.), амплификация по типу катящегося кольца (RCA), система амплификации на основе транскрипции (TAS) и ее производные, включая самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR), изотермическую амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (isothermal nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)), и амплификацию, опосредованную транскрипцией (ТМА), лигазная цепная реакция (LCR)), реакции секвенирования ДНК или РНК (такие как секвенирование по Максаму-Гилберту, метод обрыва цепи по Сенгеру, секвенирование с красителями-терминаторами, секвенирование эмульсионной ПЦР, массивно-параллельное секвенирование, секвенирование методом молекулярных колоний (polony sequencing), лигазное секвенирование, синтетическое секвенирование (sequencing by synthesis) или секвенирование гибридизацией), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP-анализ), анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), анализ коротких тандемных повторов (STR), микросателлитный анализ, анализ генетических «отпечатков пальцев» (DNA fingerprint analysis, DNA footprint analysis) или анализ метилирования ДНК.
В одном воплощении в картридже используют гранулы, к которым присоединена связывающая группировка, включая, без ограничения, связывающий рецептор, трансферрин, антитело или его фрагмент (такой как Fc-фрагмент или Fab-фрагмент), пектин или последовательность ДНК или РНК. В другом воплощении картридж содержит реагент, такой как антикоагулянт, фиксатор, стабилизирующий реагент, консервант или осаждающий реагент.
В. Пневматический распределитель
Пневматический распределитель может быть интегрирован с любым микрочипом и/или картриджем, описанным здесь, для облегчения распределения давления воздуха или вакуума. Давление воздуха или вакуум могут быть использованы для активации клапанов микрочипа. Альтернативно, давление воздуха или вакуум могут быть поданы в картридж таким образом, что давление воздуха или вакуум проникают в микроканалы жидкостного слоя микрочипа, которые могут быть использованы для перемещения жидкостей или газов в жидкостном слое. Пневматический распределитель обеспечивает давление воздуха или вакуум для управления микроклапанами микрочипа (2) на картридже (1) Фиг.3 или управления микроклапанами других устройств.
Пневматический распределитель может быть использован для соединения пневматических линий микрожидкостного микрочипа с внешними источниками давления. Пневматический распределитель может иметь входы/выходы, выровненные со входами/выходами пневматического слоя микрожидкостного микрочипа, и входы/выходы могут быть соединены с трубками, обеспечивающими соединение с внешними источниками давления. Входы/выходы могут быть соединены с одним или более чем одним каналом, обеспечивающим жидкостное сообщение для жидкости, или газа, или другого вещества между входами/выходами.
Пневматический распределитель может быть соединен с микрожидкостным микрочипом по любой поверхности микрочипа. Пневматический распределитель может быть расположен на той же стороне микрожидкостного микрочипа, что и картридж, или пневматический распределитель и картридж могут быть расположены на разных сторонах микрожидкостного микрочипа. Как показано на Фиг.40, пневматический распределитель (113) может быть расположен на поверхности микрожидкостного микрочипа напротив картриджа. Также, пневматический распределитель может быть сконструирован таким образом, чтобы занимать лишь часть поверхности микрожидкостного микрочипа. Расположение, конструкция и/или форма пневматического распределителя может допускать доступ других компонентов к микрожидкостному микрочипу. Пневматический распределитель может занимать очерченное или кольцеобразное пространство, что позволяет располагать другие компоненты рядом с микрожидкостным микрочипом или близко к нему. Это может позволить, например, расположить магнитный компонент (109) рядом с камерой микрожидкостного микрочипа.
Пневматический распределитель может быть изготовлен из любого материала, известного специалистам в данной области техники. Например, картридж может быть изготовлен из пластика, стекла или металла. Пластиковый материал включает любой пластик, известный специалистам в данной области техники, такой как полипропилен, полистирол, полиэтилен, полиэтилентерефталат, полиэстер, полиамид, поливинилхлорид, поликарбонат, полиуретан, поливинилиденхлорид, сополимер циклоалкенов или любая их комбинация. Пневматический распределитель может быть изготовлен с применением любой методики, известной специалистам в данной области техники, такой как мягкая литография, обычная литография, фрезеровка, прессование, чеканка, высверливание, травление или любая их комбинация.
Устройство, показанное на Фиг.21 и Фиг.22, может включать пневматический распределитель. Устройство может быть использовано для подготовки образцов, как описано здесь, и может включать картридж. Картридж (1), обозначенный надписью «картридж», соединен с распределителем (370) соленоидами (1819). Блок, состоящий из картриджа и распределителя, устанавливают на опорной плите устройства. Пневматическим распределителем может управлять контроллер ввода/вывода (IO-контроллер) (1803).
Источник газа, такой как резервуар, в котором можно поддерживать желаемое давление или вакуум, может обеспечивать подачу газа к распределителю. Источник газа может быть соединен с внешним источником давления или вакуума. Источник газа, обеспечивающий подачу газа к распределителю, связанному с источником газа, может иметь манометр для мониторинга давления на входе. Источник газа может обеспечивать подачу газа к нескольким компонентам системы через распределитель источника газа (1821). Распределитель источника газа может обеспечивать подачу газа к пневматическому распределителю (370) и к отдельным контейнерам с реагентами, (1809) и (1807). Линией, обеспечивающей подачу газа к распределительному клапану (390), может управлять управляющее устройство (1815).
Внесение реагентов и/или образца в картридж может также быть осуществлено через клапан для распределения реагентов (390), соединенный с контейнерами (1809) в области хранения реагентов (380) и контейнером с раствором гранул (1807), установленным на мешалке для гранул (1805). Адаптер (1817) может быть установлен на картридже и/или выровнен с картриджем, таким образом, что устройство для доставки, такое как шприц, может обеспечить доставку вещества в картридж. Терморегуляцию адаптера (1817) может обеспечивать контроллер нагревателя (1801). Адаптер может иметь проводник тепла, такой как латунь, для распределения тепла, генерированного нагревательной катушкой или элементом Пельтье. Адаптер может поддерживать температуру приблизительно от 20 до 100, от 20 до 75 или от 50 до 60 градусов по Цельсию.
Магнитный блок (1811) может быть расположен рядом с картриджем. Магнит (300) магнитного блока может быть расположен рядом с картриджем (1), и его может перемещать привод таким образом, что магнит может воздействовать магнитным полем на картридж или микрочип, интегрированный, соединенный или связанный с картриджем. Магнитное поле может быть использовано для захвата парамагнитных или магнитных частиц, таких как гранулы, в картридже или микрочипе и отделения вещества, связанного с частицами, от отходов. Отходы из картриджа и/или микрочипа могут быть перемещены в контейнер для отходов (1813).
В устройстве, показанном на Фиг.21 и Фиг.22, могут быть использованы семь соленоидных клапанов для управления картриджем (1). Размер и сложность устройства могут быть дополнительно уменьшены использованием MOVe-микроклапанов. На Фиг.23 и Фиг.24 показано устройство для распределения реагентов, включающее микрожидкостный микрочип 600 шириной приблизительно два дюйма (5,08 см). Группы соленоидов 680 и 684 обеспечивают соединение с любым внешним источником вакуума и давления через соединители 681, 682, 685 и 686. Управление соленоидами осуществляют через электрические соединения 689 и 687. Контакт микрожидкостного микрочипа 600, имеющего MOVe-клапаны, с распределителем 700 поддерживает соединение 711, в котором использован зажим 710. Для соединения микрочипа с пневматическим распределителем 700 могут быть применены другие способы, известные специалисту в данной области техники.
Г. Одновременная обработка образцов
В некоторых воплощениях изобретения один или более чем один картридж можно использовать одновременно, обеспечивая возможность одновременной обработки образцов. На Фиг.16 показано одновременное или групповое использование нескольких картриджей с микроклапанами на одном пневматическом распределителе в блоке выделения веществ из мазков (800). Распределитель (370) распределяет регулируемые вакуум и давление для управления четырьмя картриджами (1), показанными на изображении, с использованием соленоидов (680). Соленоиды (680) контролируют давление на пневматический слой микрочипа, интегрированного с каждым картриджем через пневматический распределитель (370, 380, 390). Пневматический распределитель образован верхней пластиной (370), прокладкой (380) и нижней пластиной (390). Верхняя пластина может иметь вытравленные на ней каналы. Каналы могут быть закрыты прокладкой, расположенной между верхней пластиной и нижней пластиной (390). Привод 310 перемещает стержень 810 для перемещения магнитов (320) ближе к картриджам (1) или дальше от картриджей (1). Зажимы 805 удерживают картриджи (1) на месте.
В других воплощениях изобретения один картридж, интегрированный с микрочипом, может обрабатывать несколько образцов одновременно с использованием параллельных каналов. Например, устройство может быть сконфигурировано таким образом, что оно имеет 4, 8 или даже 12 каналов. На Фиг.14 и Фиг.15 показан собранный микрочип для захвата и проведения реакции с капиллярным подающим устройством и магнитами. Микрочип может захватывать растворы гранул и проводить, например, четыре STR-ПЦР-реакции одновременно. На Фиг.14 показан микрочип (1201) с картриджем (1203), присоединенным к микрочипу, и трубками (1205, 1207, 1209, 1211, 1213, 1215, 1217 и 1219), ведущими в микрочип и из микрочипа. Показаны в общей сложности восемь трубок, и для каждой параллельной реакции используют по две трубки. Например, с одной единицей устройства для одновременной обработки соединены трубки 1205 и 1213.
В типичном воплощении четырехканальное устройство для подготовки образцов соединено с четырехканальным устройством для одновременной доставки реагентов (Фиг.53), определяющим дозу и обеспечивающим доставку реагентов одновременно во все четыре канала одного интегрированного картриджа (Фиг.54), что позволяет одновременно и быстро обрабатывать четыре образца.
Четырехканальное устройство для одновременной доставки реагентов соединяет микрочип (см. Фиг.53) с жидкостным распределителем, установленным на пневматическом контрольном распределителе. На Фиг.53 показан модуль выделения веществ из образца, включающий картридж, связанный с микрожидкостным микрочипом. Картридж включает отверстия для шприцев (6701) и камеры для захвата аналита гранулами (6702). Эти камеры имеют жидкостное соединение друг с другом через каналы (6703) микрожидкостного чипа, соединенного с нижней поверхностью картриджа. Картридж для распределения реагентов может включать камеры, сконфигурированные сходным образом с камерами, показанными на Фиг.3. Две могут иметь жидкостное соединение, например, через трубки, и реагенты можно подавать насосом из резервуаров с реагентами в камеры картриджа для реагентов и затем в модуль выделения веществ из образца. Предполагают устройства с 4, 8, 12 и более каналами. Дозу реагентов определяют с использованием одной из двух петель для реагентов разного размера, которые могут быть сходными с петлями для образцов, описанными здесь, для каждого канала, и доставку реагентов осуществляют одновременно во все четыре канала устройства для подготовки образцов. Одновременная доставка реагентов во все четыре канала устройства для подготовки образцов с использованием устройства для одновременной доставки реагентов может занимать менее 4 минут, что соответствует экономии времени при обработке более 11 минут по сравнению с серийным устройством для доставки реагентов первого поколения, с использованием которого обработка четырех образцов занимала приблизительно 15 минут.
Связанные пневматические распределители могут быть использованы для управления как устройством для доставки реагентов, так и устройством для подготовки образцов при изготовлении распределителей с применением способа соединения склеиванием; тем не менее, распределители могут быть подвержены расслоению со временем из-за давления воздуха, используемого в подсистеме, и размера и сложности распределителя. Термически связанные распределители могут уменьшать проблемы, связанные с расслоением, но этот подход может быть эффективным только для относительно небольших и несложных распределительных конструкций, таких как устройство для доставки реагентов. Монолитный распределитель, изготовленный из одного фрагмента поликарбоната, с трубками, соединяющими пневматические входы/выходы с соленоидными контрольными клапанами, может обеспечить управление четырехканальным картриджем для подготовки образцов, и было показано, что он является эффективной альтернативой связанным пневматическим распределителям. Эту концепцию пневматических распределительных конструкций также используют для управления микрочипом А подсистемы послеамплификационной очистки STR (коротких тандемных повторов).
Также усовершенствованы способы соединения микрочипа и жидкостного распределителя четырехканального картриджа для подготовки образцов. Исторически, для скрепления картриджа со связанным с ним MOVe-микрочипом можно использовать эпоксидный клей, обеспечивая затекание клея между микрочипом и картриджем. Свойственный этому способу недостаток контроля движения эпоксидного клея может иногда позволять ему затекать во входы/выходы микрочипа или картриджа, приводя к блокаде жидкостного сообщения и невозможности использования устройства. Этот способ усовершенствован использованием двусторонней липкой ленты (Adhesives Research ARcare90106) для соединения жидкостных картриджей и микрочипов; сейчас это предпочтительный способ соединения, применяемый для четырехканального картриджа для доставки реагентов, устройства для подготовки образцов и послеамплификационного устройства подсистемы послеамплификационной очистки STR, описанной ниже.
Проводили тестирование интегрированного четырехканального картриджа для подготовки образцов с микрочипом 069 (см. Фиг.55). Конструкцию микрочипа 069 используют с картриджем для выделения веществ из образца. Другие чипы, например чип 070, используют с послеамплификационным картриджем.
Блокада микрочипов ввиду непреднамеренного попадания волокон в системы и устройства, описанные здесь, может быть микрогидродинамической проблемой. Для уменьшения риска возникновения блокад все реагенты, за исключением растворов парамагнитных гранул, могут быть профильтрованы перед введением, и для уменьшения риска возникновения блокад микрочипов могут быть использованы проходные фильтры.
Д. Сепарация и очистка
С использованием устройств, описанных здесь, может быть проведено множество сепарации. Эти сепарации включают хроматографическую, аффинную, электростатическую, гидрофобную, ионообменную, магнитную сепарацию, сепарацию по сопротивлению (drag-based separation) и сепарацию по плотности (density-based separation). В некоторых воплощениях изобретения аффинные или ионообменные взаимодействия используют для связывания веществ с твердыми веществами, такими как гранулы. Гранулы могут быть отделены от жидких растворов с применением любого способа, известного специалистам в данной области техники.
Магнитные сепарации могут быть применены для захвата и концентрации веществ за одну стадию с применением механически упрощенного формата с использованием парамагнитных гранул и магнитного поля. Гранулы могут быть использованы для захвата, концентрации и затем очистки определенных целевых антигенов, белков, углеводов, токсинов, нуклеиновых кислот, клеток, вирусов и спор. Гранулы могут включать специфичный аффинный реагент, обычно антитело, аптамер или ДНК, связывающийся с мишенью. Альтернативно, для связывания с мишенью могут быть использованы электростатические взаимодействия, или взаимодействия ионных пар, или взаимодействия соляных мостиков. Гранулы могут представлять собой парамагнитные гранулы, проявляющие магнитные свойства только в присутствии внешнего магнитного поля. Альтернативно, гранулы могут включать постоянные магниты. Гранулы могут быть добавлены в сложные образцы, такие как аэрозоли, жидкости, биологические жидкости, экстракты или пищевые продукты. После (или до) связывания вещества-мишени, такого как ДНК, может быть проведен захват гранулы магнитным полем. Несвязанные или непрочно связанные вещества удаляют отмывкой совместимыми буферами, что обеспечивает очистку мишени от других нежелательных веществ исходного образца. Гранулы могут иметь малые размеры (от 1 нм до 1 мкм) и могут связываться с большими количествами мишени. При концентрации гранул магнитным полем они могут образовывать слои гранул объемом от 1 нл до 1 мкл, концентрируя, таким образом, мишень во время ее очистки. Очищенные и концентрированные мишени могут быть легко транспортированы, денатурированы, лизированы или проанализированы без их отсоединения от гранул или с их элюированием из гранул для дальнейшей подготовки образца или анализа.
Сепарации широко используют для множества применений, включая выявление микроорганизмов в пищевых продуктах, биологических жидкостях и других матрицах. Парамагнитные гранулы можно легко смешивать, ими легко манипулировать, и их можно адаптировать к микромасштабным и микрожидкостным применениям. Эта технология обеспечивает отличное решение для интерфейса макромасштаба и микромасштаба: гранулы позволяют проводить очистку образцов в макромасштабе и дальнейшую концентрацию в наномасштабе (порядка 100 нл) для введения в микрожидкостные или наножидкостные платформы. Магнитные сепарации можно применять в качестве стадии очистки, предшествующей ПЦР в реальном времени, электрохемилюминесценции и магнитной селекции (magnetic force discrimination), сепарации магнитофорезом, капиллярному электрофорезу, и сепарации под действием поля и потока (field-flow separation), или другим способам сепарации, хорошо известным специалисту в данной области техники.
Устройства по изобретению могут быть адаптированы для использования магнитных гранул. Например, гранулы или суспензия гранул могут быть поданы к входу картриджа. Гранулы могут быть смешаны с раствором или суспендированы в растворе в картридже с использованием насосов, магнитных полей или внешних мешалок. Гранулы могут затем быть поданы насосом в желаемые камеры или резервуары микрожидкостного устройства или картриджа. Может быть проведен захват гранул в камере с использованием магнитного поля. Захват гранул в растворе может быть проведен при его прохождении через магнитное поле, или может быть проведен захват гранул в неподвижном растворе.
Для иллюстрации способов применения картриджа предполагают несколько примеров. Первый пример состоит в обработке нуклеиновой кислоты из буккального мазка парамагнитными гранулами для очистки образца с последующей ПЦР-амплификацией и очисткой продуктов ПЦР с использованием гранул. Во втором примере описано проведение иммуномагнитных сепарации для очистки клеток, белков или другого антигенного материала с использованием связывающей группировки, прикрепленной к гранулам. В третьем примере описано проведение молекулярно-биологических процедур для подготовки образцов для таких методик секвенирования, как синтетическое секвенирование, секвенирование гибридизацией или лигазное секвенирование. Специалисту в данной области техники будет ясно, что в настоящем изобретении может быть применено множество различных химических и биохимических методик. Они включают, без ограничения, ферментативные реакции, очистки на гелях, монолитах, гранулах, фильтрующих слоях, поверхностные реакции, молекулярно-биологические методики и другие химические и биохимические реакции.
Картридж с интегрированным микрочипом могут представлять собой любые картридж и микрочип, описанные здесь, например, картридж и микрочип, показанные на Фиг.3, Фиг.4 и Фиг.5. Подвижный магнит (300) может быть расположен рядом с картриджем. Перемещение подвижного магнита может осуществлять привод (310). Подвижный магнит может быть использован для воздействия магнитным полем на картридж или микрочип. В некоторых воплощениях подвижный магнит может быть использован для содействия накоплению или сбору гранул у стенки камеры картриджа или микрочипа.
II. Реакционный модуль
Реакционный модуль будет обычно включать реакционную камеру, имеющую жидкостное сообщение с микрожидкостным каналом, и камеру для подготовки образца, через которую проходит аналит. Реакционный модуль может быть выполнен с возможностью размещения аналита в объеме, например, нем икрожид костном объеме, меньше исходного объема образца. Например, реакционный модуль может включать камеру, на которую можно воздействовать магнитным полем, адаптированную для иммобилизации частиц, реагирующих на магнитное поле, на которых проводят захват аналита. Объем слоя гранул обычно меньше исходного объема образца. В реакционной камере может происходить высвобождение аналита из частиц, и с аналитом может быть проведена биохимическая реакция, такая как ПЦР. Объем жидкости в реакционной камере может представлять собой немикрожидкостный объем, например, от 10 до 50 микролитров. Соответственно, использование веществ для захвата аналита, которые можно перемещать потоком и иммобилизовать, позволяет захватывать, перемещать и концентрировать аналит.
Как показано на Фиг.6, терморегулятор может иметь жидкостное соединение с картриджем и микрочипом через реакционный канал (250). Реакционная камера (250) может быть соединена на конце (251) с картриджем. Терморегулятор может быть использован для циклического изменения температуры реакционного канала (250), содержащего реакционную смесь и нуклеиновую кислоту, выделенную из образца (которые вместе называют образцом ПЦР-реакции). Для управления работой терморегулятора может быть использован механизм управления. Для мониторинга или контроля реакции может быть использован оптический блок. Оптический блок может излучать или детектировать свет. Например, оптический блок 410 может быть использован для проведения ПЦР в реальном времени или других измерений в реальном времени или конечных измерений. В определенных воплощениях в терморегуляторе использован термически связанный термоэлектрический модуль Пельтье, обычный термоэлектрический модуль, горячий воздух, инфракрасное излучение или микроволны. В одном воплощении для желаемого нагревания или охлаждения образца ПЦР-реакции в терморегуляторе использован термоэлектрический модуль Пельтье, расположенный вне реакционного канала. Нагревающее и охлаждающее действие термоэлектрического модуля может распространяться на область 350. Дополнительные изображения терморегулятора 400 показаны на Фиг.7 и Фиг.8. На Фиг.7 показан реакционный канал 250, контактирующий с терморегулируемой областью 350. Терморегулятор может также включать подвижный магнит 320, перемещаемый приводом 330. Подвижный магнит может быть использован для захвата магнитных частиц в положении 340, как показано на Фиг.6. В некоторых воплощениях изобретения терморегулируемая область включает две части. Две части могут представлять собой части двухстворчатого элемента, удерживаемые вместе зажимом, замком или другим удерживающим устройством, для поддержания температурного контакта с реакционным каналом 250. Одна часть терморегулируемой области, часть 711 на Фиг.8, может быть прижата ко второй части терморегулируемой области. Терморегулируемые области могут иметь каналы-бороздки для расположения одного или более чем одного реакционного канала, как показано на правой стороне Фиг.7 и на Фиг.8. На левой стороне Фиг.7 показана терморегулируемая область в закрытой конфигурации. В дополнение, терморегулируемая область может включать один или более чем один сжимающий компонент, показанные как 709 и 701 на Фиг.8. В точках сжатия может происходить сжатие реакционного канала, приводящее к изоляции одной части реакционного канала от другой части реакционного канала. В некоторых воплощениях изобретения сжатие реакционного канала происходит в двух местах, приводя к изоляции части жидкости, такой как реакционная смесь. Возможно соединение сжимающих компонентов 709 и 701 с дополнительными сжимающими компонентами 707 и 705, что обеспечивает сжатие реакционного канала.
Альтернативно, терморегулятор может обеспечивать сжатие реакционной трубки с использованием распорно-клинового зажима, как показано на Фиг.51. Использование распорно-клинового зажима, который может быть изготовлен из пластика, такого как Ultem, может снизить теплопередачу реакционному каналу. Снижение теплопередачи может уменьшить вероятность слипания стенок реакционного канала при термоциклировании или терморегуляции. Альтернативно, в качестве реакционного канала может быть использована трубка из другого материала для обеспечения сохранения формы реакционного канала до и после проведения термоциклирования или терморегуляции. Трубка из другого материала может также быть использована для уменьшения интенсивности испарения при терморегуляции. Типичные материалы включают этилвинилацетат, кремний и трубки из силанизированного C-Flex.
3
3
3
3
3
3
3
Терморегулятор может изменять температуру со скоростью от 0,5 до 3 и более градусов по Цельсию в секунду. Нагреватель может потреблять от 25 до 100 Вт, и вентилятор, который может быть использован для охлаждения терморегулятора, может обеспечивать скорость потока воздуха по меньшей мере приблизительно 75 куб. футов/мин (2,1 м/мин), 100 куб. футов/мин (2,8 м/мин), 130 куб. футов/мин (3,64 м/мин), 150 куб. футов/мин (4,2 м/мин), 200 куб. футов/мин (5,6 м/мин), 250 куб. футов/мин (7 м/мин) или 300 куб. футов/мин (8,4 м/мин).
В одном воплощении устройство для подготовки образцов, включающее картридж, интегрированный с микрожидкостным микрочипом, который может быть использован для управления перемещением текучей среды в картридже, может быть использовано в сочетании с терморегулятором 400 в качестве термоциклера для потоковой ПЦР. Движущую силу для перемещения текучей среды может обеспечивать внешний источник давления или внутренний источник давления, такой как MOVe-клапаны микрочипа. Термоциклер для потоковой ПЦР может быть использован, когда желательна высокочувствительная ПЦР или ПЦР с высокой пропускной способностью. Существует много ситуаций, в которых может быть нужен чувствительный ПЦР-анализ образцов воздуха, крови, воды, слюны, клеток или другой среды. Он может быть применен для выявления множества биологических загрязнителей, включая вирусы гриппа, бактериальные патогены и любое число вирусных или бактериальных патогенов. Потоковая ПЦР может позволить проводить ПЦР автоматизированным образом без необходимости вмешательства человека. Система потоковой ПЦР может также выполнять функции системы раннего оповещения в системах отопления, вентиляции и кондиционирования воздуха в зданиях, самолетах, автобусах и других транспортных средствах, и может быть использована для мониторинга крови, воды или других источников, из которых могут быть получены образцы, на предмет присутствия инфекционного агента или загрязнителя.
Как показано на Фиг.6, устройство для потоковой ПЦР получает образец от устройства для сбора образцов, таких как буккальный мазок, например, шприца, устройства для получения образцов воздуха, устройства для получения образцов жидкостей или другого устройства для получения образцов, и доставляет его в устройство для подготовки образцов 1 (на Фиг.6 может быть не соблюден масштаб). Подготовка образа происходит в устройстве для подготовки 1 и в некоторых воплощениях может включать лизис клеток, выделение или очистку ДНК, РНК или микро-РНК, фильтрацию или обратную транскрипцию. В одном воплощении выделяют по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, В другом воплощении по меньшей мере одну выделенную нуклеиновую кислоту подготавливают к ПЦР, добавляя нуклеиновую кислоту к реагентам для ПЦР (таким как по меньшей мере одна ДНК-полимераза, РНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), буфер или соль) и праймерам (таким как специфичные для анализа праймеры или наборы праймеров широкого применения для патогенов с несколькими мишенями). Эти праймеры могут быть выбраны для селективной амплификации по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, выделенной из определенного патогена (такого как плесень, вирус, бактерии, паразит или амеба), гена, или другой желаемой нуклеиновой кислоты, или любой их комбинации. Композицию, содержащую по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, выделенную из образца, реагенты для ПЦР и праймеры, называют образцом ПЦР-реакции. В одном воплощении потоковая ПЦР может быть применена в форме устройства с непрерывным потоком, в то время как в других воплощениях образцы перемещают в область термоциклирования и останавливают.
Образец ПЦР-реакции затем переходит через реакционный канал (250) в устройство или область с контролируемой температурой (350). В некоторых воплощениях реакционный канал является прозрачным или светопроницаемым. В другом воплощении реакционный канал является непрозрачным. В одном воплощении реакционный канал представляет собой цилиндр. В другом воплощении поперечное сечение реакционного канала включает одну или более чем одну плоскость, образующую такую форму, как треугольник, квадрат, прямоугольник, пятиугольник, шестиугольник, семиугольник, восьмиугольник, девятиугольник, десятиугольник или другой многоугольник. В одном воплощении объем образца ПЦР-реакции таков, что она занимает небольшую дискретную длину пространства реакционного канала, остальную часть которого занимают воздух, газ или нереакционноспособная жидкость, такая как минеральное масло. Воздух, газ или нереакционноспособная жидкость могут быть использованы для разделения отдельных образцов ПЦР-реакции. В одном воплощении температуру терморегулируемой области (350) регулирует один или более чем один модуль, включая, без ограничения, термически связанный термоэлектрический модуль Пельтье, обычный термоэлектрический модуль, горячий воздух, микроволны или инфракрасное излучение. В одном воплощении для желаемого нагревания и охлаждения образца в термоциклере использованы термоэлектрические модули Пельтье, расположенные вне трубки. В одном воплощении детекторный модуль (410) измеряет флуоресценцию, люминесценцию, оптическую плотность или другие оптические свойства для детекции сигнала от образца ПЦР-реакции, когда он расположен в терморегулируемой области или после того, как он покинул терморегулируемую область. Детекторный модуль может включать источник света (такой как источник когерентного излучения или источник некогерентного излучения), используемый для возбуждения флуоресцентного красителя (такого как интеркалирующий краситель, включая, без ограничения, бромид этидия или Syber green) в образце ПЦР-реакции, и свет возбуждения обнаруживают фотодетектором (таким как оптический CCD-детектор, оптический детектор на основе комплементарного металлооксидного полупроводника (CMOS-детектор), оптический детектор на основе фотоэлектронного умножителя (РМТ-детектор) или другой оптический детектор). Детекторные электронные компоненты позволяют оценивать сигнал, поступающий от детекторного модуля (410).
В одном воплощении после завершения желаемого числа температурных циклов образец ПЦР-реакции подают насосом или перемещают далее по реакционному каналу с использованием давления или вакуума, при этом образец ПЦР-реакции покидает терморегул ируемую область и переходит во второй микрожидкостный микрочип (500). Второй микрочип (500) может быть присоединен на конце (252) к реакционному каналу (250). Микрожидкостный микрочип (500) может включать микроклапаны (510, 520, 530 и 545). Любые три микроклапана, как например 510, 520 и 530 или 510, 520 и 545, могут образовывать насос.Микроканалы 505, 515, 525 и 540 могут соединять насосы микрочипа. Расположенные далее устройства 535 и 550 могут быть соединены с микрочипом. Поток веществ к устройствам (535 и 550) можно контролировать микроклапанами, например, сохраняя один из клапанов 530 и 545 закрытым при подаче или перемещении жидкости. В одном предпочтительном воплощении расположенные далее устройства могут представлять собой аналитические устройства, которые могут быть использованы для осуществления электрофореза, масс-спектроскопии или других аналитических методик, известных специалисту в данной области техники.
III. Послереакционный модуль
В определенных воплощениях после завершения биохимической реакции проводят обработку продукта реакции перед анализом. Система может включать послереакционный модуль, выполненный с возможностью обработки продукта реакции. Послереакционный модуль может включать микрожидкостное устройство, включающее клапаны и насосы устройства, выполненные с возможностью направления текучей среды, содержащей продукт реакции через микрожидкостный канал в камеру для обработки, например, немикрожидкостную камеру. Например, если биохимическая реакция представляет собой амплификацию ДНК, например, ПЦР, и анализ включает, например, капиллярный электрофорез, обработка может включать коррекцию концентрации солей в объеме, содержащем продукт. Это может включать, например, разведение объема, содержащего продукт реакции.
В другом воплощении несколько реакционных каналов могут быть использованы одновременно для увеличения пропускной способности в отношении образцов. В еще одном воплощении система может оповещать пользователя при успешном завершении амплификации (при положительном результате), указывая на присутствие целевой последовательности. В одном воплощении реакционный канал используют только для одноразового использования и затем утилизируют. В альтернативном воплощении реакционные каналы могут быть использованы для амплификации и выявления присутствия или отсутствия продуктов ПЦР-амплификации в нескольких образцах. Возможно внесение более чем одного образца ПЦР-реакции через определенные промежутки времени с разделением образцов барьерным болюсом газа или жидкости для предотвращения их смешивания. В одном воплощении образцы отделены друг от друга таким образом, что при проведении термоциклирования одного образца другой образец расположен в детекторной области, где проводят его исследование. Специалисту в данной области техники будет ясно, что ПЦР-амплификация может быть заменена другими методиками амплификации нуклеиновых кислот, в которых может быть применено термоциклирование или которые могут представлять собой изотермические реакции.
В других воплощениях устройство позволяет проводить изотермические реакции, такие как сэндвич-анализы с использованием аффинных реагентов, таких как антитела или аптамеры, для определения присутствия или отсутствия клеток, белков, токсинов или других мишеней в детекторном модуле (Фиг.6, 410), обеспечивая определения количества присутствующей мишени. В таких применениях картридж 1 позволяет проводить аффинную очистку, такую как IMS-очистка, и затем добавлять вторичное антитело, к которому может быть присоединена флуоресцентная метка. Образец можно затем перемещать в область 350, где терморегулятор настроен для оптимизации реакции. Затем можно проводить мониторинг реакции детекторным модулем (410). В одном воплощении к реакционному каналу (250) присоединено несколько картриджей, и детектор 410 позволяет получать результаты от нескольких образцов.
IV. Устройство для анализа продукта (например, капиллярного электрофореза)
В одном воплощении предложена система, полностью обеспечивающая проведение анализа образца с получением результата, которая может включать микрожидкостные компоненты, где необходимо объединение всех стадий друг с другом для соответствия объемов и концентраций. Анализ образцов с применением капиллярного электрофореза является обычным аналитическим способом, который быть применен со способами подготовки образцов, включающими применение микрожидкостных компонентов, как описано выше. Капиллярный электрофорез легко адаптировать к микрожидкостным микрочипам. В настоящем изобретении капиллярный электрофорез на микрочипах комбинируют с MOVe-клапанами для обеспечения контроля образцов, обработки гранул с концентрацией образцов и улучшения внесения и сепарации.
На Фиг.48 показан источник образца 6009, соединенный с каналом для образца 6005, также называемым каналом для внесения, который соединен с сепарационным каналом 6011. Два электрода, 6003 и 6001, могут быть использованы для приложения электрического поля к сепарационному каналу. В некоторых воплощениях изобретения источник образца может проходить через MOVe-насос микрочипа, используемый для управления потоком текучей среды в канале для образца. Канал для образца может представлять собой микрожидкостный канал или инжекционную трубку. Инжекционная трубка может представлять собой гибкую трубку или другой гибкий соединитель. Примеры гибкой трубки включают политетрафторэтиленовую трубку или кремниевую трубку. Гибкий соединитель может также быть соединен с другим картриджем, связанным с микрочипом. Альтернативно, гибкий соединитель может возвращаться к картриджу, от которого он отходит. Сепарационный канал может представлять собой микрожидкостный канал, капилляр или трубку для капиллярного электрофореза. Капилляр может иметь внешний диаметр приблизительно от 150 до 500 мкм и внутренний диаметр приблизительно от 10 до 100 мкм. Капилляр может иметь полиимидное или политетрафторэтиленовое покрытие. Капилляр может иметь длину от приблизительно 2 до 100 см. Капилляр может быть соединен с инжекционной трубкой или гибкой трубкой сначала формированием отверстия в инжекционной трубке и затем введением капилляра в гибкую трубку. Альтернативно, капилляр может быть введен в гибкую трубку без необходимости предварительного формирования отверстия в гибкой трубке.
Один из двух электродов, например, электрод 6003, может представлять собой катод, и другой электрод, например, электрод 6001, может представлять собой анод. Катод может представлять собой любой катод, как например разветвленный катод, описанный здесь. Анод может быть соединен с сепарационным каналом с использованием любых устройств, известных специалистам в данной области техники. Например, сепарационный канал может быть соединен с резервуаром переходником Upchurch, имеющим электрический контакт с анодом, который может представлять собой металлический электрод.
В некоторых воплощениях изобретения стабилизирующий компонент, показанный в месте пересечения сепарационного капилляра и инжекционной трубки на Фиг.49, может быть использован для выравнивания, герметизации и/или защиты соединения сепарационного капилляра и инжекционной трубки. В некоторых воплощениях изобретения несколько инжекционных трубок выравнивают с несколькими сепарационными капиллярами с использованием стабилизирующего компонента. Как показано на Фиг.50, стабилизирующий компонент может удерживать четыре инжекционные трубки, показанные на изображении в виде вертикальных трубок, и стабилизировать соединение с четырьмя сепарационными капиллярами (не показано).
На изображениях 1-6 Фиг.48 показан способ введения образца в сепарационный канал. На изображении 1 в сепарационном канале 6005 образца нет. На изображении 2 показан образец, поступающий в канал для образца от источника образца (6009). При продвижении образца по каналу для образца образец пересекает сепарационный капилляр, как показано на изображении 3. Образец может быть изолирован болюсами газа спереди и сзади от образца. При приближении образца к сепарационному каналу прикладывают электрическое поле, напряженность которого может составлять от 25 до 500 В/см, между первым электродом 6003, который может представлять собой катод или разветвленный катод, и вторым электродом 6001, который может представлять собой анод. Буфер для электрофореза, поступление которого в канал для образца от источника образца показано на изображении, может также быть введен в канал для образца, как показано на изображении 3. Напряжение и/или сила тока между анодом и катодом могут падать при прохождении воздушным болюсом соединения канала для образца и сепарационного канала, уменьшая или предотвращая попадание воздуха в сепарационный канал. Падение напряжения и/или силы тока можно детектировать для выяснения того, когда образец и/или буфер для электрофореза расположены рядом с сепарационным каналом. При приближении буфера для электрофореза к сепарационному каналу, как показано на изображении 5, падение силы тока и/или напряжения между анодом и катодом можно увеличивать. Это может позволить провести сепарацию аналита в сепарационном канале, как показано на изображении 6, поскольку буфер для электрофореза обеспечивает ионы для высокоэффективной сепарации.
В одном воплощении STR-анализа способ введения представляет собой следующее.
А. Микрожидкостные каналы могут быть заполнены буфером.
Б. Сепарационный канал может быть заполнен гелем, в то время как буфер пропускают через канал для образца, прочищая поперечное сечение, образованное сепарационным каналом и каналом для образца, от сепарационного полимера.
В. Могут быть проведены захват образца с амплифицированными STR (очищенного от солей и захваченного на гранулах) на микрочипе 500, его элюирование в жидкость с низкой электропроводностью (воду), содержащую размерный стандарт и подача насосом в канал для образца с применением технологии MOVe.
Г. Между катодом и анодом может быть приложено поле с «обратным» напряжением в частях, расположенных ближе к источнику образца и выходу для выведения отходов, для направления образца в сепарационный канал, где он скапливается у края сепарационного полимера. При введении образца электропроводность канала для образца может быстро уравновесить буфер в частях, расположенных ближе к катоду, обеспечивая введение за одну стадию.
Разветвленный электрод или катод может представлять собой два металлических проводника, как показано на Фиг.46. Жидкостное сообщение для образца, подлежащего анализу, как показано на Фиг.46, может проходить по каналу для внесения. При приближении образца к сепарационному каналу разветвленный электрод может быть использован для введения образца в сепарационный канал, как описано здесь. Электропроводность вещества в канале для образца может быть меньше электропроводности вещества в сепарационном канале, которое может представлять собой сепарационный полимер. Различие в электропроводности может приводить к накоплению образца при приложении электрического поля посредством разветвленного электрода, который может представлять собой катод, и расположенного далее электрода, который может представлять собой анод. Полярность разветвленного электрода и расположенного далее электрода может быть изменена на противоположную таким образом, что разветвленный катод будет анодом, и расположенный далее электрод будет катодом.
В некоторых воплощениях изобретения дополнительный электрод может быть использован для уменьшения попадания газа в сепарационный канал или образования пузырьков в канале для внесения образца, что может привести к уменьшению напряженности поля, приложенного к сепарационному каналу. Попадание газа в сепарационный канал или образование пузырьков в канале для внесения образца могут привести к неудовлетворительному разделению аналитов и могут быть выявлены по неудовлетворительному току между анодом и катодом, используемыми для приложения электрического поля к сепарационному каналу. Использование дополнительного электрода для предотвращения или уменьшения попадания газа или пузырьков в сепарационный канал показано на Фиг.47. Дополнительный электрод может представлять собой отдельный проволочный электрод или трубчатый электрод. Увеличенная площадь поверхности и/или больший внутренний диаметр трубчатого электрода могут позволить существенно уменьшить образование пузырьков, или блокаду пузырьками, и/или попадание пузырьков в сепарационный канал. В некоторых воплощениях изобретения трубка, используемая в трубчатом электроде, имеет внутренний диаметр по меньшей мере приблизительно 1/64 дюйма (0,04 см), 1/32 дюйма (0,08 см), 1/16 дюйма (0,16 см), 1/8 дюйма (0,32 см) или 1/4 дюйма (0,64 см).
В другом воплощении, показанном на Фиг.96Д и 96Б, для предварительной концентрации аналитов перед введением может быть использована конфигурация из трех электродов. В этом способе внешним электродам сообщают заряд, совпадающий с зарядом аналита, и электроду, расположенному между ними и напротив электрофорезного капилляра, сообщают заряд, противоположный заряду аналита. Например, в случае нуклеиновых кислот, имеющих отрицательный заряд, внешним электродам сообщают отрицательный заряд и среднему электроду сообщают положительный заряд. Это приводит к концентрации аналита между боковыми электродами и рядом со средним электродом. Затем заряд на среднем электроде меняют на противоположный и подают напряжение на другой конец электрофорезного капилляра. Это приводит к движению аналитов через капилляр. Показанная конфигурация электродов для инжектора для капиллярного электрофореза может включать разветвленный электрод и другой электрод. Обе показанные конфигурации включают разветвленный электрод, имеющий две точки контакта, расположенные в стороне от соединения с электрофорезным капилляром, и один электрод непосредственно напротив просвета капилляра. В одном воплощении второй электрод представляет собой третью ветвь разветвленного электрода. Во втором воплощении второй электрод не является частью цепи, включающей другие электроды. Это позволяет использовать в инжекторе две цепи. В одном способе применения конфигурации из трех электродов образец перемещают в место, противоположное капилляру, с использованием жидкостной системы. Затем, образец вводят в капилляр с использованием только среднего электрода, расположенного напротив капилляра. Затем средний электрод отключают, включают боковые электроды и используют их для электрофореза аналитов через капилляр.
Согласно данному изобретению предложено устройство для терморегуляции электрофорезных капилляров, например, ряда капилляров. Воплощение показано на Фиг.98Б. Электрически изолированная схемная плата имеет обычно S-образную линию для расположения капилляров. Обычно S-образная линия разделена на 6 разных секций 12, 14, 16, 18, 20 и 22. Эти 6 разных секций 12, 14, 16, 18, 20 и 22 по отдельности регулируют температуру в части капилляра, имеющей термический контакт с определенной секцией. Каждая из разных секций 12, 14, 16, 18, 20 и 22 заполнена электрической цепью, идущей взад-вперед, например, в форме змеевика, по площади этой секции, заполняя эту секцию. Эта электрическая цепь, идущая взад-вперед, подробно показана в секции 22. Несмотря на то, что это не показано в целях ясности иллюстрации, другие секции 12, 14, 16, 18 и 20 также заполнены электрическими цепями, идущими взад-вперед по площади этих секций, заполняя эти секции.
Схемная плата также имеет ряд отверстий 10, расположенных по обеим сторонам обычно S-образной линии для расположения капилляров. Отверстия уменьшают теплопередачу между обычно S-образной линией схемной платы и остальной частью схемной платы. Поскольку воздух является хорошей теплоизоляцией, происходит уменьшение теплопередачи между этими двумя частями схемной платы. Схемная плата сама по себе также плохо проводит тепло. В другом воплощении вместо рядов отверстий между этими двумя частями схемной платы расположен материал, плохо проводящий тепло. Такое уменьшение теплопередачи облегчает терморегуляцию обычно S-образной линии и капилляров, расположенных на обычно S-образной линии. Отверстия используют для уменьшения теплоемкости терморегулируемой области до по существу обычно S-образной линии и капилляров, расположенных на обычно S-образной линии. При меньшей теплоемкости достижение желаемой температуры обычно S-образной линии и капилляров, расположенных на обычно S-образной линии, происходит быстрее.
Схемная плата также включает отверстие 8 рядом с обычно S-образной линией ближе к выходному концу обычно S-образной линии. Ввиду отсутствия материала, составляющего схемную плату, отверстие 8 облегчает оптическое взаимодействие с капилляром, расположенным над отверстием 8. Отверстие 8 позволяет возбуждать и детектировать флуоресценцию с использованием таких оптических конфигураций, как эпифлуоресцентные схемы и различные схемы исследования в отраженном свете (skew illumination schemes).
Электрическая цепь в различных воплощениях представляет собой полученный литографией или травлением проводящий путь, связанный с электрически изолированной схемной платой. Подученная литографией электрическая цепь может быть изготовлена «субтрактивной» литографией, при которой удаляют нежелательный проводящий материал, оставляя желаемый проводящие цепи, или «аддитивной» литографией, при которой добавляют дополнительный проводящий материал для формирования желаемых проводящих цепей. Схемная плата может иметь проводящие цепи на однослойной схемной плате или как часть многослойной схемной платы.
Различные примеры проводников, используемых в электрической цепи, представляют собой металлы, такие как медь, алюминий, серебро, или неметаллические проводники, такие как графит или проводящие чернила, но могут представлять собой любой другой проводник.
В отличие от проводника, используемого в электрической цепи, материал, используемый в схемной плате, представляет собой непроводник, обычно диэлектрик.
Каждая электрической цепь создает и определяет температурную область. В одном типичном воплощении шесть нагревательных областей, каждая из которых включает медные ленты длиной приблизительно 1 м и шириной 150 мкм, уложены в форме, необходимой для образования нагревательных форм, показанных ниже. В различных воплощениях длина ленты варьирует, составляя менее или более 1 м, в зависимости от длины, подходящей для разделения аналитов электрофорезом. В различных воплощениях ширина электрических цепей может быть больше или меньше в зависимости от сопротивления электрических цепей, подходящего для адекватного нагревания для терморегуляции капилляров, имеющих термический контакт с нагревательной областью. В различных воплощениях число нагревательных областей может быть больше или меньше.
В некоторых воплощениях электрическая цепь, такая как лента, имеет ширину в диапазоне от 0,0001 дюйма (2,54 мкм) до 0,5 дюйма (1,27 см) и длину в диапазоне от 0,25 дюйма (0,64 см) до 750 дюймов (19,1 м).
Проведение электрофореза в капилляре позволяет эффективно рассеивать тепло через стенки капилляра. Это позволяет использовать высокое напряжение для достижения быстрой сепарации.
На Фиг.2 показан вид температурного блока сверху со схемной платой, электрическими цепями на схемной плате, группой капилляров и температурными сенсорами.
На схемной плате, такой как схемная плата, показанная на Фиг.98А, электрофорезные капилляры присоединены к обычно S-образной линии, например, клейким веществом. В показанном воплощении присоединена группа из 8 капилляров. В других воплощениях число капилляров может быть любым, варьируя от 1 до большего числа в зависимости от требований конкретного применения электрофореза для одновременной обработки аналитов. Входы в капилляры 54 имеют развернутые концы для облегчения введения аналитов в различные капилляры. На изображении выходы из капилляров 56 оставлены сгруппированными.
Каждая из отдельных терморегулируемых областей или секций обычно 8-образной линии имеет термический контакт с температурным сенсором. Показанные температурные сенсоры обозначены 32, 34, 36, 38, 40 и 42. Температурный сенсор 42 имеет термический контакт не с капиллярами, а с самой схемной платой или, альтернативно, с окружающим воздухом. Примерами температурных сенсоров являются терморезисторы, или другое изменяемое температурой сопротивление, или термопары, или другой изменяемый температурой источник напряжения. В другом воплощении данные о температуре отдельных терморегулируемых секций получают не дискретным температурным сенсором, а с использованием самих электрических цепей, как например исходя из сопротивления электрических цепей.
В показанном воплощении температурные сенсоры представляют собой терморезисторы, прикрепленные к полоскам, заканчивающимся в части схемной платы, расположенной снаружи от ряда термоизолирующих отверстий. Терморезисторы проходят через ряд капилляров и заключены в клейкое вещество, связывающее ряд капилляров с платой, обеспечивая хороший термический контакт терморезисторов с капиллярами и минимизируя потери тепла, генерируемого нагревателями.
Данные о температуре, полученные такими температурными сенсорами, способствуют терморегуляции капилляров, имеющих термическмй контакт с электрическими цепями. Электрический ток через электрическую цепь приводит к выделению тепловой энергии в электрической цепи посредством нагрева джоулевым теплом. Количество выделяемой тепловой энергии варьирует в зависимости от величины электрического тока и сопротивления электрических цепей.
В одном воплощении согласно изобретению предложен переносной восьмиканальный интегрированный автоматизированный ДНК-анализатор для судебных экспертиз, обеспечивающий проведение анализа образца с получением результата. Такой анализатор позволяет вносить образцы буккальных мазков или образцы крови, проводит STR-анализ и выводит CODIS-файл, готовый для проведения поиска в базе данных.
В другом воплощении согласно изобретению предложен автоматизированный анализ коротких тандемных повторов в образце, включающий выделение и очистку веществ из образца, содержащего аналит, включающий нуклеотидную последовательность коротких тандемных повторов; амплификацию нуклеотидной последовательности коротких тандемных повторов; очистку нуклеотидной последовательности коротких тандемных повторов; и проведение капиллярного электрофореза очищенной нуклеотидной последовательности коротких тандемных повторов с определением размера нуклеотидной последовательности коротких тандемных повторов.
При применении стандартных методик для проведения анализа от биологического образца (например, буккального мазка) до вывода данных в форме CODIS-файла необходимо более шести часов. Это включает выделение ДНК, количественную ПЦР, нормализацию ДНК, амплификацию STR меченными праймерами, послереакционную подготовку образца, анализ капиллярным электрофорезом и анализ данных. Система по настоящему изобретению позволяет проводить весь этот анализ менее чем за 5 часов, менее чем за 4 часа, менее чем за 3 часа или даже менее чем за 2 часа.
В другом воплощении согласно изобретению предложен автоматизированный анализ коротких тандемных повторов с показателем эффективности получения правильной формы STR из необработанного или другого неочищенного образца по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98%. А. Детектор
В одном аспекте согласно данному изобретению предложена оптическая система для выявления аналитов в ряде капилляров, например, ряде из 4 капилляров, ряде из 8 капилляров или ряде, включающем до 12 капилляров. В этой системе линза объектива перемещается относительно капилляров, источника возбуждения и собирательных оптических компонентов. При движении объектива свет возбуждения проходит через разные части линзы и фокусируется на разных точках области капилляров. Передвижение объектива приводит к перемещению фокальной точки, обеспечивая поочередное сканирование каждого капилляра.
На Фиг.99 источник возбуждения, испускающий возбуждающий пучок 170, представляет собой твердотельный лазер, луч от которого проецируют на капилляр 174 с использованием объединителя пучков 162, расположенного под углом 45 градусов на оптическом пути непосредственно над объективом 160. В различных воплощениях объединитель пучков включает чувствительный к длине волны отражатель или пространственный светоделитель, такой как малая отражающая точка, расположенная на прозрачном листе стекла. Функционирование объединителя пучков зависит от длины волны, и его выравнивание проще выравнивания пространственного объединителя пучков.
Объектив с большой числовой апертурой используют как для возбуждающего пучка 170 на его пути к капилляру 174, так и для оптического сигнала излученной флуоресценции от капилляра 174.
Оптический сигнал флуоресценции, излученной аналитами капилляра 174, коллимируют объективом 160. Оптический сигнал проходит через чувствительный к длине волны отражатель 162 и сталкивается с длинноволновым пропускающим фильтром 164, задерживающим часть оптического сигнала, включая возбуждающий пучок 170.
Основой схемы детекции флуоресценции является призменный спектрометр. Оптический сигнал затем проецируют на рассеивающую призму 166, которую используют для изменения угла лучей согласно длине волны. Этот рассеянный оптический сигнал затем фокусируют на плоскости детектора 170 с использованием изображающей линзы 168, приводя к фокусировке частей рассеянного оптического сигнала, имеющих разную длину волны, в разных местах на плоскости детектора 170. Примером детектора 170 является CCD-камера. Альтернативой является CMOS-камера или другие оптические сенсоры.
Если ряд капилляров включает капилляры диаметром 30 мкм, диапазон сканирования детекторного устройства составляет +/- 0,8 мм для ряда из восьми каналов. Этот ограниченный диапазон сканирования минимизирует число передвижных частей. В других воплощениях диапазон сканирования может быть больше или меньше для работы с другим числом капилляров и/или различными числами капилляров. При движении объектива 160 возбуждающий лазерный пучок 170 остается в непосредственной близости к центру объектива 160, даже когда пучок 170 расположен на верхней части капилляра, расположенного в конце ряда. Возбуждающий пучок 170 сталкивается с капилля ряду.
V. Интегрированная система анализа с одноразовым картриджем
Согласно изобретению предложена интегрированная система анализа, которая может быть соединена с одноразовым картриджем, интегрирующим несколько функций системы, включая выделение веществ из образца, термоциклирование и послеамплификационную обработку. Интегрированная система анализа и одноразовый картридж могут быть использованы для анализа образца, полученного от источника, и получения информации относительно источника. Например, система и картридж могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот из множества образцов и анализа выделенных нуклеиновых кислот на предмет коротких тандемных повторов с получением генетической информации относительно источника.
Общий вид интегрированной системы анализа и одноразового картриджа показан на Фиг.63. Интегрированная система анализа может включать аппаратные компоненты, расходные компоненты, программные компоненты и документацию. Как показано на Фиг.64, аппаратные компоненты интегрированной системы анализа могут включать один или более чем один корпус, один или более чем один электронный компонент, один или более чем один пневматический компонент, один или более чем один оптический компонент, один или более чем один термоциклер, одну или более чем одну систему электрофореза и одну или более чем одну крышку картриджа. Дополнительные аппаратные компоненты показаны на Фиг.64. Интегрированная система анализа может также включать одну или более чем одну систему управления, одну или более чем одну энергосистему, один или более чем один компьютер и один или более чем один дисплей. Как показано на Фиг.65, программные компоненты интегрированной системы анализа могут включать программы для обеспечения графического пользовательского интерфейса, анализа данных, ядро и сценарии. Ядро может быть использовано для управления аппаратными компонентами. Сценарии могут представлять собой запускаемые программы. Программы могут соответствовать определенным аналитическим способам.
Как показано на Фиг.66, расходные компоненты могут включать один или более чем один ряд капилляров, одну или более чем одну плату с реагентами, один или более чем один картридж и один или более чем один картридж с сепарационным полимером. Платы с реагентами могут содержать реагенты для проведения аналитических реакций. Картридж может включать камеры для внесения образцов и чипы, имеющие один или более чем один пневматически активируемый клапан для управления перемещением текучих сред. Другие расходные компоненты показаны на Фиг.66.
На Фиг.67 показана документация, которая может быть включена в интегрированную систему анализа. Документация может включать тестовую документацию, руководства, проектную документацию, требования и технические условия, документацию продукта и управление рисками.
3
3
3
3
3
3
Интегрированная система анализа и одноразовый картридж могут быть помещены в контейнер, имеющий общий объем менее приблизительно 10 куб. футов (0,28 м), менее приблизительно 5 куб. футов (0,14 м), менее приблизительно 3 куб. футов (0,09 м), менее приблизительно 2 куб. футов (0,06 м) или менее приблизительно 1 куб. фута (0,03 м), такого как контейнер Pelican, модель 1610. Контейнер Pelican №1610 объемом 2,2 куб. фута (0,06 м) может быть использован для расположения всех частей системы, включая элементы пользовательского управления и запасные картриджи. Размеры контейнера могут составлять приблизительно 22 дюйма (55,88 см)×17 дюймов (43,18 см)×11 дюймов (27,94 см) или менее. Контейнер может иметь колеса и ручки для облегчения транспортировки системы. Контейнер может иметь с мягкую набивку или повышенную прочность для защиты системы от повреждения при транспортировке или применении. Контейнер может быть надежно закрыт или иметь одну или более чем одну сигнализацию для предотвращения и/или остановки непреднамеренного проникновения и/или кражи. Пример интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер, показан на Фиг.68. Соответственно, эта система включает приборы, которые могут быть помещены в контейнер размером с чемодан, для внесения биологического образца и проведения анализа генетического содержимого этого образца. Система позволяет обрабатывать несколько образцов и проводить множество операций одновременно, например, проводить одновременную обработку по меньшей мере 2, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, или даже по меньшей мере 12 образцов, или более. В определенном воплощении система позволяет проводить одновременную обработку 2, 4, 6 или 8 образцов.
Грузоподъемность контейнера может составлять менее 50 кг, и контейнер можно переносить без защиты. В дополнительной упаковке может не быть необходимости, что позволяет быстро вводить устройство в действие. Можно открывать крышку и подключать устройство по прибытии. Малый размер и масса, позволяющая осуществлять переноску двумя людьми, может позволить проводить установку и транспортировку без необходимости использования грузоподъемного оборудования. В некоторых воплощениях изобретения система включает внутренний источник питания или генератор. Внутренний источник питания может представлять собой батарею для электропитания системы в отсутствие источника электропитания. Батарея может представлять собой перезаряжаемую батарею или может представлять собой неперезаряжаемую батарею. Генератор может представлять собой топливный элемент, солнечный элемент или генератор любого другого типа, известный специалисту в данной области техники.
Контейнер или корпус может также иметь один или более чем один внутренний корпус. Внутренние корпусы могут защищать аппаратные компоненты от повреждения или разливов. Пример внутреннего корпуса показан на Фиг.68. Внутренний корпус имеет два вентиляционных отверстия с радиальными контурами для обеспечения потока воздуха. На Фиг.69 показана система, где внутренний корпус (1.0, справа снизу) извлечен из контейнера, и видны аппаратные компоненты интегрированной системы анализа. На Фиг.69 также показано расположение оптических компонентов (4.0), пневматических компонентов (3.0), картриджа (10.0), термоциклеров (5.0), крышки картриджа (7.0), платы с реагентами (9.0) и электронных компонентов (2.0).
При работе система может потреблять сотни ватт, чем обусловлена необходимость отведения воздуха от шасси. Два вентилятора могут осуществлять забор воздуха через несколько фильтров и обеспечивать достаточное охлаждение для поддержания температуры воздуха во внутренней части шасси в пределах 5°С от температуры внешней среды при функционировании двух вентиляторов и менее 10°С - при функционировании одного вентилятора. Вентиляторы могут представлять собой вентиляторы бесщеточного типа для увеличения срока службы до 25 тысяч часов и более.
Подсистема воздушного и температурного контроля управляет тепловым потоком в корпусе контейнера, термоциклере и блоке капиллярного электрофореза (САЕ). В конструкции использован внутренний пленум, заполненный нагнетаемым воздухом, с входами по бокам системы Apollo 200, и конструкция обеспечивает выведение профильтрованного воздуха спереди и сзади от картриджа, способствуя адекватной терморегуляции и минимизируя проникновение частиц в систему.
Другое изображение интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер, показано на Фиг.70. На Фиг.70 показан контур для капиллярного электрофореза для проведения сепарации, CCD-детектор для выявления аналитов, интегрированная кассета (одноразовый картридж, соединенный с платой с реагентами), пневматические соленоиды, зажим и интерфейс кассеты (пневматический распределитель, соединенный с крышкой картриджа), встроенный планшетный персональный компьютер (планшетный ПК) с интерфейсом с сенсорным экраном, вытяжной вентилятор, пневматический источник давления, и балласт, и электронные компоненты.
Компьютер и программное обеспечение системы управления могут интегрировать систему и обеспечивать интерфейсы, синхронизацию и управление электронными компонентами. Компьютер может представлять собой промышленный ПК с Microsoft XP. Программное обеспечение может представлять собой программное обеспечение системы управления. Основной пользовательский интерфейс может представлять собой панель сенсорного экрана с дополнительным интерфейсом посредством монитора (VGA или большего разрешения), внешней клавиатурой (USB) и мышью (USB), которые могут не быть включены в корпус. Через USB с компьютером могут быть соединены устройство считывания штрихового кода (такое как Keyence BL-180) и модуль глобальной системы навигации и определения положения (GPS-модуль) (такой как модуль от производителя оригинального оборудования на основе набора микросхем Sirf-Star III).
На Фиг.71 показан вид интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер. На Фиг.71 показан сенсорный экран (1.5.1), устройство считывания штрихового кода (1.5.2), GPS-модуль (1.5.3), контейнер (1.1), источники питания (1.7), шасси и структура (1.2), внутренние перегородки (1.3), электронные компоненты (2.1-2.5), устройство для сепарации и заполнения полимером (6.2) и картридж с сепарационным полимером (11.0). Электронные компоненты включают связной контроллер (2.1), контроллер соленоидных клапанов (2.2), терморегулятор (2.3), устройство управления электроприводом (2.4) и сенсорную плату (2.5).
На Фиг.72 показан вид оптической и пневматической систем интегрированной системы анализа, помещенной в контейнер, крупным планом. Оптические компоненты включают компоненты и основание для выравнивания (4.1), источник возбуждения (4.2), детектор (4.3). Пневматические компоненты включают источник вакуума (3.1) и источник давления (3.2).
Для увеличения срока службы системы могут быть использованы промышленные источники питания. Номинальная мощность источников питания не должна превышать 500 Вт.Могут быть использованы соединения, соответствующие стандартам вибрации и имеющие доказанные длительные сроки службы.
Конструкция шасси для установки подсистем может включать несколько структур, в которых может быть использовано алюминиевое литье для уменьшения массы и стоимости крупных частей. Алюминиевые структуры могут служить опорой подсистем 2, 3, 4, 5, 6 и 11 (Фиг.64). Структуры, в которых использованы части из листового металла, могут служить опорой подсистем 1.5 и 2. Конструкция может позволить снизить массу и стоимость при сохранении жесткости и долговечности для соответствия техническим требованиям вибрации при транспортировке. Структуры могут включать внутреннюю изоляцию между корпусом и системой/подсистемами.
Перегородки для отделения секций для пользовательских манипуляций, таких как вставка картриджа, от электронных и оптических компонентов во избежание разливов и перегородки для предотвращения проникновения рассеянного света в оптические компоненты могут быть изготовлены из пластиковых или алюминиевых частей.
Конструкция шасси может включать подсистему для манипуляций с картриджами. Подсистема для манипуляций с картриджами соединяет шасси со специализированным картриджем и расположена в центре шасси спереди (Фиг.39). Подсистема для манипуляций с картриджами может быть активирована при нажатии пользователем перепрограммируемой кнопки «Вставить». Подсистема для манипуляций с картриджами может принимать картридж, помещенный пользователем в приемник картриджа, сходный с механизмом, используемым в видеомагнитофонах, который может затем быть активирован для перемещения картриджа в шасси.
Картридж будет сначала перемещен от пользователя и затем вниз. Верхняя пластина может закрывать верхнюю часть приемника картриджа. Жидкостные и пневматические соединения могут быть установлены через верхнюю и нижнюю поверхность картриджа через верхнюю и нижнюю пластину, в обоих случаях с использованием пружин. При обработке и хранении все соединения могут быть защищены от внешней среды верхней пластиной. Подсистема для манипуляций с картриджами и первый картридж являются элементами наибольшего риска в данном проекте.
Когда подсистема для манипуляций с картриджами завершает вставку картриджа, происходит герметизация как пневматических компонентов, так и жидкостных компонентов, при фиксации картриджа пружинами на миниатюрных уплотнителях уплотнительного кольца на нижней пластине.
Модуль может быть сконструирован в соответствии со стандартами вибрации при транспортировке и экстремальных условий окружающей среды. Модуль может быть использован при разных ориентациях контейнера. Модуль может быть разработан для работы в условиях экстремальной температуры и влажности. Модуль может быть разработан для предотвращения утечек света.
Компоненты интегрированной системы анализа и одноразового картриджа показаны на Фиг.73.
Пневматический блок для реагентов обеспечивает присоединение картриджа и может выполнять несколько функций. Крышка картриджа, соединенная с источником воздуха, показана в левой верхней части схемы, показанной на Фиг.73. Изображение крышки картриджа показано на Фиг.74. На Фиг.74 показаны входы для подачи воздуха для источника вакуума (3.4, «Вакуум») и источника давления (3.4, «Давление»). Крышка картриджа также включает магнитный блок (7.1), интерфейс для манипуляций с реагентами (7.4) и нагревательный блок (7.2).
Крышка картриджа соединена с верхней стороной картриджа и платой с реагентами. Она может включать несколько функций: расположение магнита для захвата магнитных частиц при выделении веществ из образца, расположение нагревателя для лизиса при выделении веществ из образца, соединение катодной трубки для введения разведенных продуктов в систему электрофореза, подачу давления и вакуума к плате с реагентами, освещение для контроля внесения образца и ресуспендирования магнитных частиц перед активацией платы с реагентами.
Основная функция крышки картриджа состоит в выравнивании с картриджем, активации платы с реагентами и соединении с картриджем для обеспечения полной функциональности. Функции могут включать следующее, со ссылкой на Фиг.74.
А. Магнитный блок (7.1). После лизиса может быть проведен захват ДНК из образца на магнитных частицах и ее подготовка к дальнейшей обработке отмывкой с удалением загрязнителей и ингибиторов ПЦР. Для обеспечения захвата и высвобождения частиц в картридже крышка картриджа включает блок для облегчения перемещения и расположения совокупности магнитов из редкоземельных металлов относительно камеры для захвата, входящей в картридж. Этот блок состоит из совокупности магнитов и механизма. Магниты можно перемещать в и из положения для воздействия магнитным полем на камеры картриджа, которые могут содержать парамагнитные гранулы.
Б. Нагревательный блок (7.2). Лизис клеток проводят при повышенной температуре, обычно при 60-80°С. Лизис происходит в камере для образца, нагретой нагревательным блоком. Крышка картриджа располагает резистивный нагреватель у камеры для образца и обеспечивает соединения с терморегуляторным компонентом, входящим в электронные компоненты. Температурную обратную связь обеспечивают термопарами нагревателя.
В. Соединение катодной трубки (7.3). После ПЦР и разведения образца разведенный продукт перемещают в катодную трубку для введения в капилляр. Катодная трубка подсоединена через крышку картриджа и соединена с картриджем через уплотнение низкого давления, как например соединение с торцевым уплотнением или обжимным уплотнением. Такое соединение не допускает утечек, является чистым и имеет небольшое мертвое пространство.
Г. Манипуляции с реагентами (7.4). Для обеспечения максимальной производительности MOVe-клапанов иногда полезно подавать реагенты к клапанам под давлением. В крышке картриджа есть несколько входов/выходов, которые при активации платы с реагентами при настройке системы подают давление к определенным ячейкам с реагентами. Таким же образом, наилучшее удаление отходов часто проводят с использованием вакуума. Снова, при активации платы с реагентами для этого могут быть опорожнены определенные ячейки с отходами. Соединение с платой с реагентами устанавливают через канюли, встроенные в крышку картриджа, прокалывающие верхнюю стенку платы с реагентами.
Д. Внесение образцов (7.5). Для облегчения правильного и контролируемого внесения образцов, положительных контролей, отрицательных контролей и аллельного лэддера крышка картриджа может быть снабжена сенсорами и осветителями, функционирующими по принципу замкнутого контура с программным обеспечением для мониторинга и контроля действий. В зависимости от типа картриджа и запущенных установочных параметров система может «активировать» одну или более чем одну камеру для образца, например, от пяти до всех восьми камер для образца. Камера может быть активирована освещением камеры светодиодом (LED) или другим источником света, встроенным в крышку картриджа. При внесении мазка, FTA-пластинки или контроля в камеру, это детектирует оптический сенсор, встроенный в крышку картриджа. Затем система отключает освещение, фактически дезактивируя камеру. При внесении образца в дезактивированную камеру система переходит в режим оповещения об ошибке. Осветители и сенсоры соединены с сенсорной платой, входящей в электронные компоненты.
Е. Соединение термоциклера (7.6). Реакционная трубка картриджа механически выровнена с компонентами термоциклера крышкой картриджа.
Ж. Ресуспендирование магнитных частиц (7.7). Перед активацией платы с реагентами магнитные частицы могут быть ресуспендированы, поскольку возможно их осаждение при транспортировке и хранении. Крышка картриджа может обеспечивать соединение устройства для ресуспендирования, такого как ультразвуковой зонд, пьезоэлектрический виброзонд (peizo vibration probe) или мешалка, с ячейкой для магнитных частиц платы с реагентами.
Крышка картриджа может быть соединена с картриджем, показанным внутри пунктирных контуров под крышкой картриджа на Фиг.73. Крышка картриджа может обеспечивать подачу давления воздуха к картриджу и/или быть сконфигурирована для воздействия магнитным полем и/или нагреванием на один или более чем один компонент картриджа. Изображение картриджа, соединенного с крышкой картриджа и пневматическим распределителем, показано на Фиг.75. На Фиг.75 также показаны вентилятор и система труб (5.3) и компоненты термоциклера: теплопроводящая пластина (5.1), термоэлектрические (5.2) и контрольные компоненты (5.4).
Картридж, показанный внутри пунктирных контуров на Фиг.73, может включать одну или более чем одну камеру, одно или более чем одно жидкостное соединение, один или более чем один микрочип и/или один или более чем один пневматически активируемый клапан. Вид картриджа сверху показан на Фиг.76, Фиг.77, Фиг.78 и Фиг.79. На Фиг.79 показаны камеры для распределения реагентов, камеры для захвата, камеры для образца и послеамплификационные камеры. Картридж может также иметь приемник для соединения с камерами для реагентов, расположенными на плате с реагентами. Плата с реагентами может иметь множество камер, включая камеры для реагентов (Фиг.76, 9.0), реакционные камеры и камеры для отходов. Плата с реагентами (также называемая сменной кассетой с реагентами) может быть изготовлена отдельно от картриджа. Плата с реагентами может быть вставлена в гнездо для платы с реагентами или соединена с гнездом для платы с реагентами (показанным на Фиг.79). Картридж может быть изготовлен из фрагмента отлитого под давлением пластика. Объем камер, например камер для образца, камер для захвата и послеамплификационных камер может составлять приблизительно 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5 или 7 мл или менее. Картридж может иметь размеры приблизительно 1, 2, 5, 7, 10, 15 или 20 см или менее в ширину или высоту и приблизительно 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 или 5 см или менее в толщину.
Картриджный элемент состоит из нескольких интегрированных частей. Они включают фрагмент, включающий реакционные камеры и выполняющий функции жидкостного распределителя. Камеры на одной стороне фрагмента имеют сообщение с противоположной стороной фрагмента через входы/выходы. Противоположная сторона, или сторона жидкостных элементов соединена с жидкостными чипами, включающими каналы, и мембранные клапаны, и насосы, перемещающие жидкости между реакционными камерами и реакционными трубками. Чипы могут быть присоединены к стороне жидкостных элементов через прокладку. В некоторых воплощениях картридж включает множество чипов. В этом случае фрагмент жидкостного распределителя может включать каналы, обеспечивающие жидкостное соединение одного чипа с другим. Такие каналы показаны, например, на Фиг.94. Они могут представлять собой бороздки, проходы или другие углубления в поверхности фрагмента, закрытые прокладкой между нижней стороной фрагмента и микрожидкостными чипами. Жидкостные элементы для доставки реагентов, жидкостные элементы для выделения веществ из образца, послеамплификационные жидкостные элементы, верхний фрагмент, нижний фрагмент и реакционные трубки. Верхний фрагмент, также называемый жидкостным распределителем, представляет собой пластиковый блок, и жидкостные элементы представляют собой трехслойные стеклянные MOVe-чипы, направляющие и контролирующие поток реагентов через систему. Блок подсоединен к пневматическому распределителю и соединен с крышкой картриджа. Картридж способствует обработке всего образца до внесения амплифицированных, меченых продуктов в разделительную колонку. Все отходы, образующиеся при работе картриджа, остаются в нем, и его заменяют после каждого анализа во избежание загрязнения.
Верхний фрагмент может представлять собой отлитую пластиковую часть с камерами для заполнения реагентами, выделения веществ из образца, захвата частиц, внесения/лизиса образца и разведения продукта. Он также может иметь секцию кремниевых трубок, используемых для реакций, а также соединительную секцию для соединения с катодной трубкой и область для соединения с платой с реагентами. Например, кремниевая трубка может быть использована в качестве реакционной камеры для реакций, включающих термоциклирование, которую при проведении термоциклирования пережимают зажимом на обоих концах. Фрагмент состоит из нескольких частей. Жидкостные компоненты присоединены к основанию верхнего фрагмента двусторонней липкой лентой.
Нижний фрагмент может выполнять функции прокладки и закрывать каналы, выпрессованные в верхнем фрагменте, и обеспечивает посадочную поверхность и проходы, называемые сквозными отверстиями, к MOVe-жидкостным компонентам.
Жидкостные элементы для доставки реагентов могут обеспечивать доставку предопределенного объема реагента в секцию устройства для выделения веществ из образца, способствуя обработке образца. Эта доставка основана на подаче давления к ячейкам платы с реагентами, которая снабжает жидкостное MOVe-устройство для распределения реагентов. MOVe-устройство управляет заполнением и состоянием камеры с реагентами в верхнем фрагменте. Сжатый воздух также пригоден для доставки в секцию картриджа для устройства для выделения веществ из образца. Секция включает один или более чем один MOVe-чип, присоединенный к нижней стороне нижнего фрагмента интегрированного картриджа. Связанные с секцией распределитель и камерные элементы соединены с последующими секциями через верхний фрагмент.
Устройство для выделения веществ из образца может включать одну или более чем одну камеру для шприца, которая может быть сконфигурирована для внесения одного или более чем одного образца, такого как буккальные образцы или мазки. На Фиг.78 камеры для шприцев представляют собой ряд вертикальных цилиндров, расположенный вторым слева. Камеры для шприцев также называют камерами для захвата (показаны на Фиг.79). Возможно нагревание шприца компонентом картриджа или компонентом крышки картриджа.
В устройстве для выделения веществ из образца проводят промывку тампона/щетки/диска, лизис клеток, захват ДНК на частицах, очистку частиц и их доставку в реакционную трубку для захвата. Жидкостный компонент представляет собой трехслойный стеклянный MOVe-чип, соединенный с нижним фрагментом интегрированного картриджа. MOVe-устройство распределяет поток реагентов из секции распределения реагентов в камеру для лизиса/внесения образца, камеру для захвата или послеамплификационные жидкостные компоненты.
Послеамплификационные жидкостные компоненты соединены с секцией выделения веществ из образца, камерой для разведения, реакционной трубкой и катодной трубкой. Эти жидкостные компоненты состоят из одного или более чем одного трехслойного стеклянного MOVe-устройства, соединенного с нижним фрагментом. Послеамплификационные жидкостные компоненты обеспечивают управление захватом частиц из секции выделения веществ из образца, дозирование и перемещение предварительной смеси из платы с реагентами в реакционную трубку, перемещение продукта из реакционной трубки в камеру для разведения и дозирование разбавителя из платы с реагентами в камеру для разведения. Они также обеспечивают дозирование и перемещение буфера, воды и образца к катодной трубке.
Картридж может включать реакционную трубку (показанную на Фиг.77). Трубки могут быть соединены с температурным контроллером, таким как термоциклер (показанный на Фиг.73). Трубки могут также быть соединены с магнитом (показанным на Фиг.73).
Модуль термоциклера обеспечивает циклическое изменение температуры при проведении ПЦР-ЗТК-реакций в реакционной трубке. Он имеет несколько различных компонентов. Реакционную трубку помещают в двустворчатый элемент, включающий два фрагмента, обеспечивающий термический контакт и, при полном закрытии, сжатие приводит к герметизации кремниевой трубки. Нижний фрагмент двустворчатого элемента является частью картриджа. Выравнивание верхнего фрагмента двустворчатого элемента и терморегуляторных элементов с нижним фрагментом и трубкой обеспечивает крышка картриджа. При захвате частиц и внесении предварительной смеси двустворчатый элемент «открыт», перед термоциклированием двустворчатый элемент «закрывают». В закрытом состоянии верхний и нижний фрагменты контактируют друг с другом, что может способствовать температурному соединению и сжатию трубки, ограничивая испарение и перемещение реакционной смеси. Нагревание и охлаждение блока обеспечивает термоэлектрическое устройство. Терморегуляцию при термоциклировании осуществляет контроллер, управляемый электронными компонентами. Обратную связь обеспечивает термопара, постоянно связанная с верхним фрагментом двустворчатого элемента.
Для терморегуляции термоциклера могут быть использованы программные объекты и терморегуляторная плата, адаптированная для 12 каналов. Для нагревания секции картриджа для выделения веществ из образца с использованием BeadStorm для анализа ДНК-профиля и капилляров картриджа для САЕ может быть применено резистивное нагревание, контролируемое термопарами. В базовой комплектации для STR-реакций может быть применено резистивное нагревание и вентиляторное охлаждение. По необходимости, нагревание и охлаждение элементами Пельтье/термоэлектрическими элементами может также быть применено для очень высоких или очень низких температур; в MBI использованы термоэлектрические элементы с MOVe-микрочипами в рамках проекта со стратегическим партнером. Возможно отведение воздуха от термоциклера в пленум. Терморегуляция может происходить с использованием терморегуляторной платы MBI, управляемой существующим программным обеспечением.
Камеры могут иметь жидкостное соединение с распределителем картриджа. Распределитель картриджа показан на Фиг.80. Распределители могут включать один или более чем один канал. Эти каналы могут быть предназначены для выведения веществ из устройства для выделения веществ из мазков, распределения реагентов, могут представлять собой каналы, соединяющие послеамплификационный модуль и термоциклер, каналы для лизиса, каналы для этанола, каналы для отходов и каналы для гранул.
Распределитель картриджа может иметь один или более чем один канал, обеспечивающий жидкостное соединение камер верхнего слоя чипа с одним или более чем одним микрочипом. Распределитель картриджа может также обеспечивать жидкостное соединение одного или более чем одного микрочипа друг с другом, позволяя перемещать текучую среду из одного микрочипа во второй микрочип. Например, вещества из камер для реагентов (показанных на Фиг.73) могут быть перемещены в шприц с мазком (показанный на Фиг.73) перемещением через следующие компоненты: секцию распределителя реагентов, чип для распределения реагентов, секцию распределителя реагентов, секцию распределителя устройства для выделения веществ из мазков, чип устройства для выделения веществ из мазков и секцию распределителя устройства для выделения веществ из мазков.
Микрочипы показаны в виде прямоугольных контуров на Фиг.81 и Фиг.82, на которых показан вид основания картриджа. Чипы могут представлять собой послеамплификационные чипы, чипы устройства для выделения веществ из образцов и чипы для распределения реагентов. Чипы, также называемые здесь микрочипами, могут иметь один или более чем один пневматически активируемый клапан. Клапаны могут быть использованы для управления потоком текучей среды путем блокировки или открыия жидкостных сообщений или обеспечения движущей силой для перемещения текучей среды. Клапанами может управлять пневматический распределитель (показанный на Фиг.73). Пневматический распределитель (показанный на Фиг.73) может быть сходен с любым другим пневматическим распределителем, описанным здесь. Пневматический распределитель может быть соединен с источником воздуха и вакуума.
Чипы могут иметь жидкостное соединение друг с другом через каналы картриджа. Каналы картриджа могут быть альтернативой трубкам, обеспечивающим жидкостное соединение микрочипов, как описано в других частях настоящего описания. Это может уменьшить пространство, необходимое для интегрированной системы анализа, и время, необходимое для проведения аналитической реакции,
Как показано на Фиг.73, плата с реагентами может включать камеры для реагентов, например, для лизирующего буфера, этанола, гранул, отходов, шприца, воды, лэддера, предварительной смеси, разбавителя, буфера, и камеры для отходов. Предварительная смесь может представлять собой любую предварительную смесь, описанную здесь. В некоторых воплощениях предварительная смесь представляет собой предварительную смесь для проведения реакции амплификации нуклеиновых кислот.Камеры для реагентов могут иметь объем приблизительно 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 5, 7 или 10 мл или менее. Камеры могут включать элементы или механизмы для поддержания охлаждения, нагревания или перемешивания реагентов. Например, камеры могут включать миксеры или мешалки. Камеры для реагентов могут быть закрытыми до соединения с картриджем. Соединение платы с реагентами с картриджем может приводить к обратимому или необратимому установлению жидкостного соединения камер для реагентов с картриджем. В некоторых воплощениях картридж имеет одну или более чем одну канюлю, прокалывающую перегородку, закрывающую камеру с реагентом. Перегородка может представлять собой пластиковую перегородку или резиновую перегородку. В некоторых воплощениях изобретения резиновая перегородка может обеспечивать эффективное повторное закрытие камеры после отсоединения. Соответственно, плата может быть соединена с картриджем в неактивной конфигурации. При соединении картриджа с пневматическим распределителем крышка может опускать плату в активное положение, в котором канюли прокалывают камеры для реагентов с одной стороны, и крышка прокалывает камеры для реагентов с другой стороны. Это приводит к установлению жидкостного сообщения камер для реагентов с реакционной камерой через каналы, соединенные микрожидкостными чипами. Это также позволяет воздействовать положительным давлением для перемещения реагента в чипы, подающие его в соответствующие места, а также позволяет воздействовать вакуумом для удаления образованных в чипах отходов в камеры для отходов, расположенные на плате.
Плата разработана с камерами, вмещающими определенные объемы наполнения без захвата воздуха. Обе стороны камер закрыты эластомерной мембраной. Это устраняет необходимость центрифугирования перед применением. Плата прикреплена к картриджу и зафиксирована в поднятом «безопасном» положении. В таком положении осуществляют транспортировку платы с картриджем. В этом положении нижняя перегородка выровнена с канюлей на верхней части картриджа. Предохранительный механизм предотвращает перемещение платы в нижнее «активное» положение, в котором канюли картриджа прокалывают перегородки платы с реагентами.
Далее описаны компоненты платы с реагентами со ссылкой на Фиг.66.
А. Набор реагентов (9.2). Набор реагентов, и способ, и оборудование для вставки платы с реагентами включают реагенты, адаптированные для проведения определенной желаемой химической реакции. Например, они могут включать реагенты для проведения STR-анализа одного или более чем одного маркера, входящего в систему CODIS. Плата может содержать следующие реагенты.
Б. Разбавитель (9.2.1). Разбавитель используют для уменьшения концентрации солей в продукте ПЦР-реакции и введения размерного стандарта. Размерный стандарт в разбавителе может иметь фрагменты от приблизительно 60 до 600 пар оснований (п.о.).
В. Отмывочный раствор (9.2.2). Отмывочный раствор используют для очистки магнитных частиц и облегчения их перемещения в реакционную трубку.
Г. Лизирующий буфер (9.2.3). Лизирующий буфер используют для лизиса клеток образца.
Д. Аллельный лэддер (9.2.4). Картриджи одного типа включают аллельный лэддер. Аллельный лэддер используют для установления стандартного расположения всех возможных размеров локусов. При использовании аллельный лэддер занимает один канал, при внесении образцов в этот канал нельзя вносить стандарт или образец.
Е. Захватывающие частицы (9.2.5). Захватывающие частицы используют для облегчения выделения, очистки и уменьшения объема ДНК образца.
Ж. Буфер для анализа (9.2.6). Буфер для анализа используют в качестве электролита при электрофорезе.
З. Предварительная смесь (9.2.7). Предварительная смесь обеспечивает праймеры, буфер и фермент для проведения ПЦР-реакции.
И. Вода (9.2.8). Воду используют для подготовки катодной трубки к продуктам реакции.
Один небольшой бесшумный насос или несколько таких насосов могут быть использованы вместе с балластами и точными регуляторами для подачи необходимого давления и вакуума. Регуляторы могут иметь заводские настройки, и система может проводить их мониторинг посредством электронных датчиков давления для обеспечения постоянного, точного и предсказуемого функционирования пневматических компонентов. MOVe-клапаны имеют очень слабый поток, но им необходимо точно регулируемое давление. Жидкостный распределитель картриджа работает в основном с MOVe-клапанами. Крышка картриджа/распределитель реагентов подает давление для перемещения реагентов и необходимый воздух под внутренним давлением картриджа, а также вакуум для ячеек с отходами. Это несколько более сильный поток по сравнению с MOVe-клапанами. Распределитель механизмов имеет более сильный поток, но обычно может не требовать такой же точности регулировки.
Пневматический распределитель обеспечивает установку картриджа и интерфейс управления MOVe-жидкостными элементами. Распределитель имеет трехходовые соленоиды с отверстием для доставки с переключением между вакуумом и давлением. С соленоидами связан компонент контроллера соленоидных клапанов, входящий в электронную подсистему. Соленоиды встроены в распределитель, распределяющий пневматическое воздействие на выходы, выровненные с входами на нижней стороне MOVe-микрожидкостных чипов, являющихся частью картриджа. Распределитель также функционирует как компонент для выравнивания и соединения с картриджем.
Пневматический распределитель может быть соединен с шасси корпуса таким образом, что пневматический распределитель может быть выведен из-под крышки картриджа. Это может способствовать вставке картриджа в интегрированную систему анализа. На Фиг.83, Фиг.84 и Фиг.85 показана вставка картриджа в интегрированную систему анализа, помещенную в корпус. На Фиг.83 показан пневматический распределитель, расположенный не под крышкой картриджа. На Фиг.83 картридж расположен над пневматическим распределителем. На Фиг.84 показан картридж, соединенный с пневматическим распределителем. Пневматический распределитель может затем быть перемещен или переведен в такое положение, что картридж может быть соединен с крышкой картриджа, как показано на Фиг.85. На Фиг.69 показан картридж в таком положении, что картридж соединен и имеет жидкостное соединение с крышкой картриджа и пневматическим распределителем.
Для обеспечения максимальной производительности MOVe-клапанов иногда может быть полезной подача реагентов к клапанам под давлением. В крышке картриджа есть несколько входов/выходов, которые при активации платы с реагентами при настройке системы подают давление к определенным ячейкам с реагентами. Таким же образом, наилучшее удаление отходов часто проводят с использованием вакуума. Снова, при активации платы с реагентами для этого могут быть опорожнены определенные ячейки с отходами. Данный распределитель представляет собой смешанный распределитель с трехходовыми соленоидами, обеспечивающими подачу давления или вакуума к выходному отверстию. Третье отверстие обычно открывается в атмосферу. Соленоиды соединены с компонентом контроллера соленоидных клапанов, входящим в электронные компоненты.
Для перемещения и установки ряда механизмов в системе используют пневматические цилиндры. Эти механизмы включают термоциклер, крышку картриджа и компоненты крышки. Распределитель механизмов распределяет только давление с использованием трехходовых соленоидов для подачи давления к выходному отверстию и выходу в атмосферу через третье отверстие. Соленоиды соединены с компонентом контроллера соленоидных клапанов, входящим в электронные компоненты.
Крышка картриджа, картридж и пневматический распределитель могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот и проведения реакций амплификации, как описано в других частях настоящего описания. Амплифицированные нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в один или более чем один электрофорезный канал (показанный на Фиг.73) через жидкостные соединители (показанные на Фиг.73). Электрофорезные каналы могут иметь электрическое соединение с катодом и анодом. Катод или анод могут иметь электрическое соединение с контроллером высокого напряжения (показанным на Фиг.73). Электрофорезные каналы могут быть заполнены сепарационным полимером с использованием модуля заполнения сепарационным полимером (показанного на Фиг.73).
Аппаратные компоненты для электрофореза состоят из источника и контроллера высокого напряжения, устройства для заполнения сепарационным полимером и терморегулятора ряда капилляров. Они также облегчают установку ряда капилляров. Терморегулятор обеспечивает точное нагревание капилляров при электрофорезе.
Катод является частью ряда капилляров и фиксирован аппаратными компонентами системы электрофореза. Анод является частью модуля заполнения сепарационным полимером и соединен с аппаратными компонентами системы электрофореза. Контроллер высокого напряжения представляет собой высоковольтную плату (HV-плату) МВ1, обеспечивающую переключение источника высокого напряжения от производителя оригинального оборудования. Управление и мониторинг этих действий обеспечивают электронные компоненты. Высокое напряжение прикладывают к анодному электроду, в то время как шестнадцать катодных электродов (по два на канал) заземляют. Проводят мониторинг тока между катодами и землей и мониторинг тока для отдельных каналов на HV-плате МВ1. Катодные электроды являются частью ряда капилляров, и их соединяют с HV-системой при установке ряда капилляров. Анодный электрод является частью модуля заполнения сепарационным полимером, и его электрическое соединение с катодом устанавливают, погружая электрод в сепарационный полимер.
Заполнение сепарационным полимером обеспечивает введение сепарационного полимера в капилляры через отверстие у анода. Он соединен с аппаратными компонентами системы электрофореза для прикладывания и контроля высокого напряжения на аноде. Картридж для заполнения сепарационным полимером присоединен к модулю и обеспечивает подачу давления и реагента для каждого анализа. Работу системы обеспечивает давление, и управление системой осуществляют соленоиды, которыми управляют электронные компоненты. Мониторинг давления можно проводить электронными датчиками, мониторинг которых осуществляют электронные компоненты. Безопасность могут обеспечивать каналы для пассивного и активного снижения давления.
Картридж для заполнения сепарационным полимером включает сепарационный полимер, контейнер под давлением и резервуар для отходов. Блок устанавливают в системе перед анализом. Во время анализа система использует давление для промывки анода и его повторного заполнения свежим полимером, и затем вводит полимер в ряд капилляров.
Высокое напряжение, используемое при электрофорезе в ряде капилляров (САЕ), приводит к значительным тепловым нагрузкам, которым можно противодействовать для устранения вероятности теплового убегания, обусловленного джоулевым теплом, препятствующим электрофорезу. САЕ обычно проводят при повышенной температуре 40-80°С, что приводит к требованию свойств термической однородности капилляров при электрофорезе, приводящем к выделению тепла. Наряду с термической однородностью для получения предсказуемых электрофореграмм высокого разрешения необходимо эффективное отведение джоулевого тепла. Капиллярный блок обеспечивает нагревание и физическую терморегуляцию капилляров. Соединение и терморегуляцию осуществляют посредством капиллярного терморегуляторного компонента системы электрофореза и терморегуляторного компонента, входящего в электронные компоненты.
Капиллярный блок включает анодный разъем, катодную трубку и электрические соединения, держатель окна, нагреватель, удерживающее устройство и восемь капилляров; он обеспечивает разделение меченых продуктов и соединен с системой электрофореза (6.0) и оптическими компонентами (4.0). Блок можно использовать повторно, и необходима его замена квалифицированным техническим специалистом по прошествии определенного периода времени, вероятно, при регулярном техническом обслуживании. Замена включает удаление старого блока, подсоединение нового блока и выравнивание капилляров с оптическим блоком. Анодная часть соединяет капилляры с устройством для заполнения сепарационным полимером (6.2) и анодным электродом (в 6.1). Он также обеспечивает соединение с резервуаром для отходов. Катодная трубка обеспечивает соединение капилляров с картриджем (10.0). Она также обеспечивает соединение с резервуаром для отходов. В потоковой инжекционной системе TREKI используют два катодных инжекционных электрода с постоянным креплением, которые удаляют вместе с блоком. Держатель окна располагает и удерживает детекционное окно в оптическом пути и соединен с системой выравнивания оптического блока. Восемь скрепленных кварцевых капилляров с полиамидным покрытием, когда они заполнены сепарационным полимером, способствуют разделению меченых продуктов по размеру. Окна в полиамиде обеспечивают возможность возбуждения и детекции продуктов при их прохождении через систему. Терморегуляцию капилляров обеспечивает плотный контакт с высокотеплопроводным материалом. Терморегуляцию блока обеспечивает резистивный элемент, и ею управляют терморегуляторные электронные компоненты (2.3). Обратную связь обеспечивает термопара.
Высокое напряжение, используемое при капиллярном электрофорезе (САЕ), приводит к значительным тепловым нагрузкам, которым можно противодействовать для устранения вероятности теплового убегания, обусловленного джоулевым теплом, препятствующим электрофорезу. САЕ обычно проводят при повышенной температуре, 40-80°С, что приводит к требованию свойств термической однородности капилляров при электрофорезе, приводящем к выделению тепла. Наряду с термической однородностью для получения предсказуемых электрофореграмм высокого разрешения необходимо эффективное отведение джоулевого тепла. В системе могут быть использованы материалы со свойствами высокой теплопроводности и хорошей термической однородностью, такие как алюминий или графит, в сочетании с мощными настраиваемыми резистивными нагревателями, и высокоточными терморегулятором и устройством мониторинга температуры для поддержания температурных отклонений незначительными.
Детектор (показанный на Фиг.73) может быть использован для наблюдения или мониторинга веществ в электрофорезных каналах. Детектор может представлять собой систему на основе CCD-камеры или любую другую систему детекции, описанную здесь.
Блок оптической детекции обеспечивает детекцию сепарированных меченых продуктов и направляет данные программному обеспечению. Блок состоит из оптических компонентов для проведения возбуждающих лучей и собирающих оптических компонентов, источника возбуждения, призмы и камеры. Источник возбуждения представляет собой лазер станции обработки данных (DPSS), проходящий через специализированные оптические компоненты, формирующие из пучка линию. Линию фокусируют на окна капилляров. Излучение, генерированное возбуждением флуоресцентных частиц при их прохождении через область окна, собирают объективом и пропускают через призму, разделяющую свет на его компоненты по длине волны. Свет, выходящий из призмы, фокусируют на камере, обеспечивающей сбор данных, где ряд капилляров расположен по одной оси, и спектры излучения - по другой. С использованием обычных наборов реагентов спектры излучения можно сначала разделить на пять полос. Число отдельных полос может быть увеличено до семи и более без изменения механической конструкции.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Электрофорезные каналы и блок оптической детекции, включая детектор и источник света, могут занимать объем приблизительно 0,1 куб. фута (0,003 м), 0,2 куб. фута (0,006 м), 0,3 куб. фута (0,008 м), 0,4 куб. фута (0,011 м), 0,5 куб. фута (0,014 м), 0,75 куб. фута (0,021 м), 1 куб. фут (0,028 м), 1,25 куб. фута (0,035 м), 2 куб. фута (0,056 м) или 5 куб. футов (0,14 м) или менее.
В некоторых воплощениях изобретения интегрированная система анализа может включать аналитические устройства других типов. Эти аналитические устройства могут включать устройства для проведения масс-спектрометрии, газовой хроматографии, жидкостной хроматографии или анализа любого другого типа, описанного здесь.
Системы управления, включая компьютер и программное обеспечение, могут позволить пользователю выбирать параметры анализа, управлять аппаратными компонентами и получать данные. Электронные компоненты прибора изготовлены по высокомодульному принципу с использованием распределенных микроконтроллеров для управления периферийным оборудованием и выполнения задач управления, таких как терморегуляция, переключение соленоидов и управления другими исполнительными механизмами, используемыми в системе. Основной «процессор приложений» обеспечивает взаимодействие с компьютером с запущенным пользовательским интерфейсом и управление и координацию работы системы.
Основной пользовательский интерфейс может представлять собой встроенный планшетный сенсорный экран с диагональю 13 дюймов (33 см), установленный в крышке корпуса. В дисплее может быть предусмотрена возможность ночного режима со значительно ослабленным свечением. Возможно наложение специализированного графического пользовательского интерфейса (GUI) на программное обеспечение системы управления прибора и программное обеспечение для анализа.
Пользователь может включать переключатель включения-выключения, сканировать свой отпечаток пальца или вводить его через сенсорный экран. Для обычного пользователя возможно отображение четырех кнопок: вставка картриджа, внесение образцов, пуск и остановка. Схема GUI может также обеспечивать вход в режим квалифицированного пользователя и режим администратора для замены САЕ-картриджа и калибровки и обслуживания прибора. В режиме квалифицированного пользователя GUI может также предоставлять пользователю различные возможности анализа, отображения и вывода данных, для определенных сценариев и конфигураций устройства могут также быть предусмотрены USB-порты и подключаемые клавиатуры.
Каждая периферическая подсистема разработана с аппаратной обратной связью и предохранителями для обеспечения возможности определения встроенным программным обеспечением, обеспечивающим работу модуля, того, работает ли подсистема правильно с точки зрения электроники. Например, проводят мониторинг тока через соленоиды и моторы для обеспечения возможности определения того, подсоединен ли исполнительный механизм, и потребляет ли он соответствующее количество тока. (Например, можно определить состояние электромотора постоянного тока (остановлен, работает правильно или отсоединен от его нагрузки) простым сопоставлением тока, проходящего через мотор, и напряжения, используемого для его питания.)
Сходным образом проводят мониторинг важных жидкостных сообщений с использованием оптических сенсоров для определения того, содержат ли они жидкость, пузырьки или воздух.
В определенные важные системы, такие как система терморегуляции, могут быть интегрированы избыточные сенсоры и аппаратные компоненты с термической защитой для исключения возможности повреждения системы при ошибках встроенного программного обеспечения. Кроме того, температурные сенсоры, используемые для обратной связи с встроенным программным обеспечением системы управления, имеют строго контролируемое напряжение, что позволяет определить, присоединен сенсор или нет.
Избыточные схемы блокировки используют для обеспечения безопасности оператора в отношении высокого напряжения, воздействия света возбуждения флуоресценции и других потенциальных вредностей.
В системе использована шина сети контроллеров (CAN) для сообщения микроконтроллеров с распределенной сетью. (CAN является надежной последовательной сетью). Это обеспечивает быструю и надежную передачу сообщений между модулями и может обеспечивать схемы управления типа «главный-подчиненный», хорошо реагирующие на события в приборе в реальном времени.
Управление прибором может быть иерархическим. Компьютер с пользовательским интерфейсом отправляет высокоуровневые команды основному «процессору приложений», который переводит их в последовательности команд для отдельных микроконтроллеров. Выполнение каждой стадии такой последовательности включает отправку сообщения соответствующему контроллеру. Команды всегда получают подтверждение, либо отправкой требуемых данных, либо определенным ответом, указывающим на получение команды. По выполнении модулем такой команды второго типа модуль может посылать сообщение «процессору приложений» с указанием того, было ли выполнение успешным или нет.(Существуют определенные команды, позволяющие «процессору приложений» посылать запрос на предмет подробного описания состояния, которое может объяснить любую ошибку.)
Любой узел CAN-сети может отправлять сообщение любому другому узлу в любое время. Система использует это для разрешения исключительных ситуаций при проведении обычных операций. Если, например, терморегуляторный модуль не может поддерживать температуру в пределах заданных значений, он может послать спонтанное сообщение об ошибке «процессору приложений», чтобы «проинформировать» его о проблеме. Сходным образом, контроллер, осуществляющий мониторинг жидкостных линий на предмет воздуха или пузырьков, будет послать спонтанное сообщение, чтобы позволить системе (или пользователю) предпринять подходящее действие в ответ на проблему. В зависимости от подробностей проблемы управляющая программа может выбрать прекращение анализа, запрос действия пользователя или просто регистрацию без реакции на проблему.
При запуске системы все подсистемы проходят тест на общую работоспособность для подтверждения правильной работы всех частей прибора. Программа может также выбрать запуск всего этого теста или его части в начале каждого эксперимента. Во время работы каждый модуль проводит мониторинг его аппаратной обратной связи на предмет признаков ошибок. При выявлении ошибки происходит отправка сообщения об этом «процессору приложений», который может предпринять подходящее действие для устранения проблемы (что может привести к выводу сообщения об ошибке пользователю через GUI). Система регистрирует все ошибки и другие значимые события в энергонезависимой памяти для дальнейшего извлечения для содействия поиску и устранению неисправностей и техническому обслуживанию прибора.
Со ссылкой на Фиг.64, электронные компоненты могут включать следующее: связной контроллер (2.1), обеспечивающий сообщение с компьютером и последовательно с другими электронными модулями для передачи и мониторинга исполнения команд; контроллер соленоидных клапанов (2.3), управляющий работой MOVe-клапанов для обеспечения различной подачи насосами и режимов управления клапанами, контроллер может также управлять соленоидами для манипуляций с реагентами и отходами, а также управления механизмами; температурный контроллер (2.3), управляющий термоэлектрическими устройствами для проведения термоциклирования и терморегуляции реагентов, а также резистивными нагревательными элементами для поддержания температуры нагреваемых областей (например, подсистемы сепарации); устройство управления приводом (2.4), управляющее приводом магнита и другими подвижными элементами; сенсорную плату (2.5), являющуюся аналоговым и цифровым входным устройством, осуществляющим мониторинг состояния различных сенсоров в системе.
Программное обеспечение управляет всеми приложениями, контролирует аппаратные компоненты и обеспечивает функциональность GUI. Программное обеспечение разработано для соединения и управления инструментальными и автоматическими компонентами. Эта архитектура является простой, гибкой и разработана для обеспечения быстрого выполнения лабораторных протоколов. В программном обеспечении применена стандартизированная модель конечного автомата с использованием XML-файлов, заданного сценариями кода и стандартных библиотек для описания устройств, необходимых для выполнения данного процесса. Конечный автомат определяет логику действий для аппаратного компонента или программной службы, определяет внешне доступные способы и предоставляет подробности о текущем состоянии и данные. Начальный анализ данных осуществляет программное обеспечение МВ1, в то время как основной конечный вызов генерирует экспертная система третьей стороны. Из данных вычитают фон и проводят их фильтрацию, затем проводят их спектральное разделение на их четыре или пять цветных каналов. Дополнительную фильтрацию проводят перед созданием из данных АВ-совместимого файла и началом анализа с использованием программного обеспечения экспертной системы и вызова.
Со ссылкой на Фиг.65, программное обеспечение состоит из следующих четырех основных программных совокупностей.
А. Ядро (12.1). Служба окон и набор библиотек, обеспечивающие совокупность конечных автоматов (один для каждого аппаратного модуля). Конечный автомат определяет логику действий для аппаратного компонента или программной службы, определяет внешне доступные способы и предоставляет подробности о текущем состоянии и данные.
Б. GUI (12.2). Простой графический пользовательский интерфейс соединен с ядром, позволяя оператору управлять сценариями процессов и проводить их мониторинг.
В. Сценарии (12.3). Сценарии процессов составляют логику действий, управляющую аппаратными компонентами для исполнения логики определенных протоколов. Сценарии компилируют и запускают динамически, что обеспечивает большую гибкость при модификации логики системы.
Г. Анализ данных (12.4). Начальный анализ данных осуществляет программное обеспечение MBI, в то время как основной конечный вызов генерирует экспертная система третьей стороны. Из данных вычитают фон и проводят их фильтрацию, затем проводят их спектральное разделение на их четыре или пять цветных каналов. Дополнительную фильтрацию проводят перед созданием из данных АВ-совместимого файла и началом анализа с использованием программного обеспечения экспертной системы и вызова.
IV. Пример работы
Пример работы интегрированной системы, помещенной в контейнер, показан на Фиг.86 и Фиг.87.
После включения системы и входа в систему распознаванием отпечатка пальца или пароля пользователь может нажать кнопку «Вставить» на сенсорном экране устройства. Механизм для манипуляций с картриджами может открыться, и пользователь может вставить картридж в механизм, который может затем опуститься и автоматически установить все жидкостные и пневматические соединения.
Затем пользователь может получить приглашение для внесения каждого образца. Оптические штриховые коды могут обеспечить цепь обеспечения сохранности идентификации образцов и связи с ассоциированной биометрической информацией, такой как фотография, отпечаток пальца или изображение радужной оболочки глаза. Для переноса любой ассоциированной информации могут быть использованы радиометки (RFID-метки). После внесения образцов и нажатия пользователем кнопки «Пуск» взаимодействие с пользователем может быть прекращено до сообщения системой результатов.
Затем происходит обработка картриджа в шасси с использованием реагентов картриджа. Картридж может содержать все реагенты и положительный и отрицательный контроль. Обработка образцов при определении ДНК-профиля может занимать приблизительно 1,25 часа. В интегрированной системе анализа, помещенной в корпус, может быть проведена любая биологическая реакция. Например, может быть проведен SNP-анализ или любые другие аналитические реакции, описанные здесь.
Картридж для определения ДНК-профиля может иметь четыре основных функциональных области, удерживаемых в рамке.
А. Область для предварительной обработки и выделения нуклеиновых кислот с использованием устройства на основе BeadStorm.
Б. STR-реакционные камеры в трубке.
В. Область для микрожидкостных манипуляций с использованием MOVe-микронасосов для манипуляций с ценными реагентами и обработанными микромасштабными образцами.
Г. Хранилище реагентов и отходов.
Пневматическая подсистема шасси, управляемая подсистемой управления, управляет всеми жидкостными операциями на картридже, включая дозирование и распределение реагентов, перемешивание и очистки с использованием гранул. Образцы перемещают в область «на основе BeadStorm» и выделяют нуклеиновые кислоты из сырых и/или иным образом необработанных образцов большого объема, включая мазки и миллилитры жидкости, с использованием MOVe-микроклапанов для управления потоком, движимым давлением.
Температурная подсистема осуществляет термоциклирование для амплификации STR в картридже. Предварительно обработанные образцы на гранулах перемещают в температурную подсистему и проводят элюирование образцов из гранул в STR-смесь и термоциклирование. Термоциклер может быть основан на настоящем термоциклере МВ1. STR-продукты после термоциклирования затем разводят в размерных стандартах и подают MOVe-микронасосами в подсистему САЕ.
Подсистема САЕ проводит автоматическую сепарацию STR-продуктов с применением электрофореза в ряде капилляров (САЕ) в многоразовом картридже для САЕ приблизительно за 45 минут. Подсистема САЕ на шасси может иметь источник и контроллер высокого напряжения, контроллер нагревателей и лазерный флуоресцентный детектор с системой визуализации, позволяющей проводить высокочувствительную детекцию и получать данные о разделенных STR-продуктах или других флуоресцентно меченных биомолекулах.
Картридж для САЕ проводит эффективную электрофоретическую сепарацию меченых продуктов в ряде из 12 сепарационных капилляров. Картридж для САЕ имеет ряд капилляров, анод и катодные блоки, держатель окна и детекционное окно, присоединенное к рамке, содержащей встроенные нагревательные сегменты. Устройство для заполнения сепарационным полимером подает полимер и буфер к одноразовому картриджу для определения ДНК-профиля и проводит замену сепарационного полимера через отверстие у анода.
По завершении сепарации с разрешением, составляющим одно основание, цифровые данные обрабатывают с удалением фона и шума и проводят спектральное разделение посредством анализатора следов МВ1 (MBI's Trace Analyzer). Экспертная система, основанная на FSS's IQ3, затем обрабатывает данные с получением CODIS-метафайла. Метафайл используют для поиска в местных и удаленных базах данных, и при идентификации образца система выводит ответ на экран через 2 часа после внесения.
Анализ с использованием интегрированного одноканального ANDE-устройства МВ1 может занимать от трех до трех с половиной часов в зависимости от условий анализа. Это включает внесение образца, лизис, выделение, очистку, перемещение, элюирование, термоциклирование 16-плексной реакции, перемещение, разведение, введение, сепарацию и детекцию продуктов (см. Фиг.88А). Наиболее продолжительный период времени, для термоциклирования в течение 100 минут, может быть существенно сокращен. Например, время термоциклирования может быть уменьшено до 45 минут или менее. Внесистемное тестирование показало хорошие результаты при времени термоциклирования менее часа. Сочетание интеллектуальной конструкции праймеров PowerPlex с усовершенствованными буфером, ферментом и химическими свойствами красителей, и с эффективностью жидкостных компонентов и способа сепарации может позволить уменьшить время обработки до менее двух с половиной часов (см. Фиг.88Б). Можно достичь времени обработки менее 1 часа (см. Фиг.88В).
VII. Система оптической детекции
Согласно изобретению предложен системный способ осуществления восьмиканальной капиллярной флуоресцентной детекции и подсистема возбуждения.
Флуоресцентно меченные молекулы пропускают через отсеивающую матрицу в капилляры (ID 200 мкм и OD 50-75 мкм). В капиллярах присутствуют четыре или более разных красителя, и необходимо, чтобы детекторная часть системы позволяла различать их индивидуальные спектральные свойства. Возбуждение всех красителей проводят с использованием твердотельного лазера с длиной волны 488 нм.
Как показано на Фиг.89, восемь из этих капилляров зафиксированы параллельно на стекле (или другом субстрате со сходными свойствами теплового расширения) эпоксидным клеем. Субстрат имеет отверстие, обеспечивающее оптической системе неограниченный доступ к верхним и нижним частям капилляров.
Основной задачей отверстия является ограничение количества вещества, с которым сталкивается возбуждающий пучок, что минимизирует фоновую флуоресценцию системы.
Система детекции может включать пять элементов:
а) объектив с большой числовой апертурой (NA (числовая апертура)=0,65) с достаточно большим полем обзора для визуализации восьми капилляров (1,6 мм);
б) лазерный заграждающий фильтр, способный ослаблять возбуждающий лазер по меньшей мере на пять порядков;
в) дисперсионный элемент (призму), разделяющий изображения капилляров по длине волны;
г) оптический компонент для построения изображения, проецирующий изображение спектрально разложенного света от дисперсионного элемента на детектор;
д) детекторную область, способную фиксировать изображения восьми параллельных спектрально разделенных изображений капилляров со скоростью от пяти до десяти изображений в секунду.
Программное обеспечение, способное разделять изображения восьми капилляров и получать спектральный профиль содержимого капилляра, также является неотъемлемой частью системы.
Воплощение основной части оптической системы показано на Фиг.90. Конфигурация сходна с конфигурацией современного микроскопа с конструкцией, «скорректированной на бесконечность». Объектив собирает излученный свет от капилляров и коллимирует его у своей задней апертуры. На пути коллимированного света установлена призма для разделения изображения капилляров на его спектральные компоненты. Оптический компонент для построения изображения (известный как «линза окуляра» в микроскопе) затем проецирует это спектрально разложенное изображение на основную фокальную плоскость детектора.
Как показано на Фиг.91, каждый капилляр формирует свое собственное спектрально разложенное изображение, как показано на следующем изображении. На нем показан "вид сбоку" оптического пути, проецирующего каждое изображение капилляра на плоскость основного изображения.
Несмотря на то, что для использования в оптическом пути детекционной системы выбраны компоненты, обеспечивающие низкий уровень шума, в системе все же существует возможность появления, собирания и доставки рассеянного света на основную первичную фокальную плоскость. Большая часть такого света может достигать этой фокальной плоскости под углами, существенно отличающимися от углов, под которыми желаемый сигнал достигает этой фокальной плоскости.
В альтернативной оптической конфигурации использовано преимущество введения апертуры в основную фокальную плоскость. Затем она передает изображение этой плоскости детектору с использованием передающего оптического компонента, эффективно подавляющего свет вне желаемого изображения капилляров. Дополнительным усовершенствованием идеи апертуры является расположение дихроичного зеркала, размер которого соответствует размеру изображения, в основной фокальной плоскости. При правильном выборе длины волны, отсекаемой покрытием, оно может задерживать более 90% лазерного излучения, которое могло пройти через лазерный заграждающий фильтр. Зеркало расположено под углом для направления света к детектору. На Фиг.92 дихроичное зеркало показано как складывающееся зеркало №1.
Задача складывающегося зеркала №2 состоит, главным образом, в уменьшении объема, занимаемого оптическим путем, и обеспечении простого способа выравнивания изображения на детекторе. Покрытие этого зеркала может, однако, также представлять собой покрытие того же типа, что и покрытие складывающегося зеркала №1, в таком случае будет возможна дополнительная задержка лазерных лучей.
Детектор для системы может включать любой фотодетектор. В одном воплощении фотодетектор представляет собой исследовательскую двухмерную CCD-камеру с умеренным охлаждением.
Возбуждение флуоресцентных красителей в капиллярах может быть осуществлено с использованием твердотельного лазера с длиной волны 488 нм. Лазер проецируют на капилляры с направления, противоположного системе детекции, как показано на Фиг.93. Капилляры расположены по существу в одной плоскости. Если свет направлен перпендикулярно к плоскости, свет возбуждения проходит через капилляры, и происходит его детекция оптической системой, что снижает чувствительность детекции. Во избежание захвата большей части лазерного излучения в собирающей системе возбуждение проецируют на капилляры под непрямым углом относительно нормальной ориентации. В таком случае свет, проходящий через капилляры, минует собирательные оптические компоненты и не попадает в них.
Оптическая модель демонстрирует рассеяние лазерного луча в капиллярах с образованием «шлейфа» рассеянного света вне отверстия для захвата собирательными оптическими компонентами. (Он будет направлен строго вверх к пересечению лазерного луча и капилляров на описанном выше изображении.)
На Фиг.94 показан вид пути возбуждения сверху. На изображении показан лазерный луч, несколько расходящийся от его источника. Это обусловлено тем, что в системе использованы либо «сконструированный рассеиватель», либо линза Powell, для преобразования гауссова профиля интенсивности лазера в линию света с равномерной освещенностью. Эту линию затем проецируют (цилиндрическими линзами) непосредственно на капилляры, действующие как цилиндрические линзы с очень коротким фокусным расстоянием, эффективно фокусируя световую энергию внутри себя.
Фиг.95 показано симулированное изображение капилляров, показывающее освещенность в псевдоцвете.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Работа картриджа для очистки нуклеиновых кислот
Этот пример относится к применению устройства, включающего картридж, соединенный с микрочипом. Числа относятся к картриджу, показанному на Фиг.3 и Фиг.4, соединенному с микрочипом с конфигурацией контуров, показанной на Фиг.5. Этот подблок может также иметь жидкостное соединение с другими подблоками прибора, показанного на Фиг.6. Для информации, картридж, соединенный с микрочипом, также показан на Фиг.40 и Фиг.45.
Возможна очистка нуклеиновых кислот из широкого спектра матриц для многих целей, включая генотипирование, установление личности, судебные экспертизы, анализ экспрессии генов, модификаций генов, анализ микро-РНК, риботипирование, диагностику или лечение. Вносимый образец может представлять собой твердое тело, мазок, жидкость, суспензию, аэрозоль или газ.
Для молекулярной диагностики и судебных экспертиз обычно используют мазки. Буккальный мазок может быть взят с использованием тампона со сбрасываемым наконечником, и тампон может быть сброшен в шприц, присоединенный к соединению 7, показанному на Фиг.4. Соединение 5, показанное на Фиг.4, ведет через трубку или капилляр к распределителю реагентов, который может выбирать один реагент из множества реагентов открытием полноразмерного клапана или открытием MOVe-клапана с реагентами либо под давлением, либо под воздействием вакуума. MOVe- или другие микронасосы микрочипа 2, показанного на Фиг.4, могут также перемещать жидкости или газы.
В одном воплощении человеческие или другие клетки в мазке сначала лизируют с использованием буфера с нагретым разобщающим агентом и/или другими обычными коммерческими химическими веществами в шприце 1, введенном во вход 7. Лизат переносят в камеру для выделения ДНК (3 на Фиг.4), в которую были внесены парамагнитные гранулы из резервуара для адсорбции нуклеиновых кислот на гранулах. Подвижный магнит затем перемещают для захвата гранул на стенке камеры для выделения, где их автоматически отмывают с использованием буфера. Очищенную ДНК, все еще связанную с гранулами, затем подают через трубку малого диаметра 250, где проводят множественную ПЦР. Предварительно подготовленное программное обеспечение автоматизирует и завершает процесс. Программное обеспечение определяет ряд протоколов связи и управления в стандартизированной архитектуре автоматизации, осуществление чего проще, более гибкое и быстрое, чем осуществление других способов разработки программного обеспечения. Концепция внедрения программного обеспечения основана на технологиях ядра, охватывающих множество операционных систем, языков разработки и протоколов связи. Программные драйверы обеспечивают оболочки отдельных интеллектуальных компонентов системы, значительно сокращая время, обычно необходимое для разработки системного программного обеспечения de novo. Это делает относительно простой интеграцию работы множества модулей системы (насосов, клапанов, температурных контроллеров, I/O-контроллеров и так далее), основанных на СОМ или.NET. Программное обеспечение обеспечивает профессиональную систему разработки программного обеспечения для создания прототипов вплоть до выпуска и технического обслуживания продукта.
Поскольку амплификация ДНК полезна для положительной идентификации микроорганизмов, образцы могут быть получены из широкого спектра субстратов и матриц, содержащих соединения, ингибирующие реакции амплификации ДНК. Необработанные образцы чаще всего представляют собой сложные смеси, которые могут содержать ингибиторы, такие как гемы, ионы металлов, гуминовые и фульвовые кислоты, хелаторы, ДНКазы, протеазы и плесени. Несмотря на то, что начальное выделение целевых организмов и токсинов из матрицы образца посредством IMS может устранять большую часть таких ингибиторов, может также быть необходимым удаление или разведение компонентов лизированных клеток или лизирующих агентов из образцов нуклеиновых кислот, чтобы они не препятствовали успешной амплификации. Необработанные образцы иначе называют сырыми образцами, и они могут представлять собой образцы окружающей среды, биологические образцы и тому подобное.
В одном воплощении применяют очистку нуклеиновых кислот в малом объеме. Эти способы очистки могут быть использованы с широким спектром образцов, таких как кровь, аэрозоли, буккальные мазки. В раскрытом устройстве могут быть использованы парамагнитные гранулы для выделения ДНК из различных источников образцов. В одном воплощении микрожидкостный микрочип может быть использован для определения последовательности нуклеиновой кислоты с использованием магнитных гранул и реагентов для очистки продуктов, являющихся нуклеиновыми кислотами, для секвенирования в микромасштабных реакциях. В одном воплощении микрожидкостный микрочип представляет собой 24-канальный микрожидкостный микрочип.
В одном воплощении применяют очистку нуклеиновых кислот с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) на карбоксилированных магнитных гранулах. Этот способ с применением ПЭГ может обеспечить выходы более 80% при использовании образцов, предварительно захваченных иммуномагнитной сепарацией (IMS). Разработка универсального модуля подготовки образцов (USPM) может частично включать подключение очистки нуклеиновых кислот с использованием ПЭГ к устройству, включающему картридж, такому как устройства, показанные на Фиг.21 или Фиг.16. В другом воплощении в сочетании с устройством по настоящему изобретению могут быть применены химические способы Agencourt Orapure или Promega DNA IQ.
Распределение и доставка гранул
Для очистки нуклеиновых кислот парамагнитные гранулы с различными химическими свойствами поверхности могут быть смешаны в контейнере для реагентов. Затем используют давление для подачи реагентов к соединению 5. MOVe-микроклапаны или другие клапаны могут быть закрыты, если не указано, что они открыты. Для перемещения парамагнитных гранул в реакционную камеру (3) открывают микроклапаны 180 и 150. Гранулы перемещают через соединение 5 в канал 115, ведущий к соединению 190 и микроканалу 191. Поскольку микроклапаны 180 и 150 открыты, а микроклапаны 200 и 170 и другие микроклапаны закрыты, открытое микрожидкостное соединение проходит от микроканала 191 через микроклапан 180 к микроканалу 181, через микрочип 152 к открытому микроклапану 150 и через микрочип 151 к соединению 120. Соединение 120 ведет к конусу 13 и камере 3, которая может быть заполнена гранулами. Объем гранул, поданных в камеру 3, можно контролировать, регулируя время открытия клапанов для реагентов и микрокпапанов или заполнение и опорожнение петли для образца, соединенной с микрочипом или картриджем.
В раскрытой системе могут быть применены коммерческие химические способы с использованием гранул, включая, без ограничения, Orapure от Agencourt (Waltham МА) и DNA IQ от Promega (Madison, WI). В Orapure использованы гранулы с карбоксилированной поверхностью и химия SPRI, в то время как DNA IQ является примером гранул из диоксида кремния и разобщающей химии. В сочетании с раскрытой системой могут быть применены другие воплощения парамагнитных гранул или химических способов обработки нуклеиновых кислот, включая, без ограничения, гранулы с олигонуклеотидами, закрытые нуклеиновые кислоты, вырожденные основания, синтетические основания, конформации, структуры нуклеиновых кислот или другие способы гибридизационного или специфичного захвата.
Заполнение камеры (3) гранулами
Для гранул Orapure или DNA IQ 450 мкл могут быть перемещены в камеру (3) с использованием трех заполнений петли для образца 630 или 631 объемом 150 микролитров. Подвижный магнит 300, присоединенный к приводу 310, может затем быть перемещен к картриджу (1) ближе к стороне 3 для притягивания гранул к стенке камеры (3). Размер и ориентацию магнита можно корректировать для создания магнитных полей, подходящих для конкретных применений. Сжатый воздух может затем быть подан через распределитель реагентов с открытыми микроклапанами 180, 150 и 110. Открытие микроклапана 110 обеспечивает соединение от соединения 190, соединенного с распределителем реагентов, через соединение 120 и микроканалы 121 и 101 с соединением 100, ведущим через канал 14 к соединению (4) и к соединению для отходов. Любую оставшуюся в контуре жидкость можно удалить воздухом. Воздух или другие газы можно также использовать для просушки гранул, испарения растворителей или для перемешивания барботированием (описанного здесь).
Барботирование газа через камеру (3)
Если микроклапаны 180, 150 и 220 открыты, и все другие микроклапаны закрыты, давление может привести к движению воздуха через камеру (3) в канал 9 и нижний канал 19 к соединению 210 через микроканалы 211 и 221, через открытый микроклапан 220 и микроканал 231 к соединению 230, через канал 16 к соединению 6, которое может представлять собой отверстие. Эта последовательность может приводить к барботированию воздуха или других газов через камеру (3) и может быть использована для перемешивания реакционных смесей в камере (3) или для изменения газовой фазы.
Перемещение жидкостей и гранул из камеры (3) к соединению для отходов
Жидкости и гранулы могут быть перемещены из реакционной камеры (3) или любого другого места к соединению для отходов. Это может быть использовано для отмывки гранул, промывки каналов, перемещения жидкостей или гранул к соединению для отходов. При подаче давления к соединению 6 с открытыми микроклапанами 220 и 110 и при закрытии всех других микроклапанов давление может привести к движению воздуха через канал 16 к соединению 230 и микроканалу 231, через открытый микроклапан 220 и микроканалы 222 и 221, через соединение 210 и каналы 19 и 9 в реакционную камеру (3) и через соединение 120, через микроканал 121, открытый микроклапан 110, микроканал 101 и канал 14 к соединению 4.
Эквивалентный эффект можно получить подачей вакуума к соединению (4), если соединение 6 представляет собой отверстие без какого-либо дополнительного контроля давления воздуха. Давление воздуха или вакуум могут приводить к перемещению любых жидкостей из камеры (3) к соединению для отходов 4. Когда магнит 300 расположен близко к камере (3), парамагнитные гранулы могут остаться на стенке камеры (3), и результатом является удаление жидкости. Когда магнит 300 расположен достаточно далеко от камеры (3), парамагнитные гранулы не могут остаться на стенке камеры (3), и результатом является удаление жидкости и гранул.
Для очистки парамагнитных гранул гранулы притягивают к стенке камеры (3) магнитом 300 (см. Фиг.6) и жидкость удаляют к соединению для отходов. 450 микролитров буфера могут быть поданы из распределителя реагентов и добавлены в камеру (3) открытием микроклапанов 180 и 150. Если желательно, захват гранул можно прекратить и затем повторить перемещением магнита 300, и жидкость можно затем удалить. Это повторяют в общей сложности три раза с получением гранул, готовых для обработки образцов.
Лизис и выделение нуклеиновых кислот из клеток мазка
Мазок может быть помещен в цилиндр шприца, введенного в соединение 7, и затем лизирован добавлением лизирующего буфера через соединение для реагентов 5 при открытых микроклапанах 180 и 170. В некоторых воплощениях применяют химические способы Orapure или DNA IQ.
Перемещение лизированного клеточного материала в камеру (3) и смешивание с частицами
Материал из шприца, введенного в соединение 7, может быть перемещен в камеру (3) подачей давления к шприцу или подачей вакуума к отверстию 6. При использовании вакуума открывают микроклапаны 170, 150 и 220. Подачу вакуума осуществляют через микроканалы 231, 221, 211 и каналы 9 и 19, через камеру (3), микроканалы 151, 152, 171 и 161 с перемещением материала от соединения 7 в камеру (3). После внесения и очистки парамагнитных гранул в камере (3) материал лизированного образца смешивают с гранулами в камере (3) при расположении магнита далеко от камеры.
Очистка нуклеиновых кислот на гранулах
Парамагнитные гранулы затем инкубируют с лизированным образцом. Непрерывный поток воздуха или газа может способствовать перемешиванию. Магнит 300 затем перемещают в положение, близкое к камере, и гранулы захватывают на стенке камеры (3). Лизат образца может затем быть удален из камеры (3) к соединению для отходов, и могут быть внесены несколько объемов отмывочных растворов согласно описаниям изготовителей для химического способа Orapure или химического способа DNA IQ. Компоненты образца на гранулах теперь очищены и готовы для реакций в картридже или выведения к соединению для продуктов из образцов. В одном воплощении гранулы используют для выделения компонента, представляющего собой нуклеиновую кислоту, из образца.
Выведение образцов через соединение для продуктов из образцов 8
Очищенные компоненты образцов на гранулах могут быть перемешены к соединению 8 подачей давления к соединению для реагентов 5 при открытых микроклапанах 180, 150 и 130. В одном воплощении соединение 8 соединено с реакционным каналом 250, таким как трубка C-flex (Cole Farmer), и в реакционном канале проводят дополнительные реакции.
Мультиплексная ПЦР-амплиФикация STR-маркеров
Амплификация ДНК может быть проведена ПЦР-амплификацией. Настоящее изобретение позволяет проводить ПЦР-реакции, а также многие другие реакции амплификации и модификации ДНК. Реакции могут быть проведены в камере (3), реакционном канале 250, соединенном с соединением 8, который может представлять собой трубку 250 (Фиг.3, Фиг.4, Фиг.6), или в другом устройстве или микроустройстве, соединенном с трубкой 250. Это демонстрирует полезность подготовки образцов для реакций с ДНК, включающих термоциклирование.
Захват гранул, содержащих нуклеиновые кислоты, в реакционном канале
Очищенную ДНК, выведенную через соединение для продуктов из образцов 8, перемещают в реакционный канал 250 на конце 251 подачей давления или, альтернативно, подачей вакуума к концу 252. Привод 330 перемещает магнит 320 под управлением программного обеспечения в положение, близкое к области захвата гранул 340. Могут быть использованы постоянные магниты различных размеров и форм (такие как магниты из редкоземельных металлов), а также электромагниты или сверхпроводящие магниты. При движении раствора, содержащего гранулы, через область 340 магнитное поле притягивает гранулы к стенке реакционного канала и удерживает их на месте. Жидкость затем проходит под давлением воздуха через соединение для реагентов 5, оставляя гранулы в области 340 в воздухе.
Внесение реагентов и перемещение образцов в реакционную область
Реагенты могут быть внесены из распределителя реагентов согласно описанию. В одном воплощении реагенты вносят с конца 252 реакционного канала 250. Конец 252 присоединен к микрожидкостному микрочипу 500, включающему микроклапаны 510, 520, 530 и 540. Любые три микроклапана, такие как 510, 520 и 530 или 510, 520 и 540 могут образовывать насос. Микроклапан 530 соединен через микроканал с расположенным далее устройством 535, которое может быть соединено с трубкой, ведущей к резервуару с реагентами. Микроклапан 540 соединен через микроканал с расположенным далее устройством 545, которое может быть соединено с трубкой, ведущей к резервуару с реагентами.
Реакционные смеси (такие как по меньшей мере одна ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), буфер и соль), включая, без ограничения, готовые смеси без праймеров (master mix), и праймеры (такие как специфичные для анализа праймеры или наборы праймеров широкого применения для патогенов с несколькими мишенями), или полные готовые мастер-смеси для ПЦР, такие как PowerPlex 16 от Promega (Madison, WI) или IdentiFiler или MiniFiler от Applied Biosystems (Foster City, CA), из резервуара с реагентами 600 могут быть доставлены микронасосом, образованным микроклапанами 530, 520 и 510, через трубку 610 и микроканалы 531, 521, 511 и 512 в конец 252 реакционного канала 250, как показано на Фиг.6. MOVe-микроклапаны могут обеспечить точное расположение текучих сред и перемещение текучей среды в область 340, где происходит контакт реакционной смеси с гранулами, содержащими нуклеиновые кислоты. Магнит 320 перемещают от реакционного канала 250 приводом 330, что приводит к высвобождению гранул от внутренней поверхности реакционного канала 250. MOVe-микроклапаны микрочипа 500 обеспечивают подачу гранул в устройство 400 и область реакционного канала 250, образующие терморегулируемую область 350. В области 350 можно поддерживать постоянные температуры, проводить термоциклирование или изменять температуру иным образом, как хорошо известно специалисту в данной области техники. Область 350 может представлять собой терморегулятор или иметь температурный контакт с терморегулятором.
На Фиг.7 показано терморегулирующее устройство 400, способное изменять температуру с использованием терморегулятора для нагревания и охлаждения с термоциклированием реакционного канала. В одном воплощении терморегулятор включает элемент Пельтье, инфракрасный модуль, микроволновый модуль, модуль горячего воздуха или световой модуль. В другом воплощении образец ПЦР-реакции перемещают в реакционный канал через одну или более чем одну зону с постоянной температурой.
На Фиг.9 показаны реакции амплификации STR PowerPlex 16, которые были подготовлены в картридже (1) из образцов буккальных мазков и проведены в реакционном канале 250 с использованием терморегулирующего устройства 400, показанного на Фиг.7. STR-маркеры амплифицировали в стандартных условиях при концентрации магния, оптимизированной для устройства 1000.
Терморегулирующее устройство 400 может также иметь детектор 410. Детектор может осуществлять оптическую детекцию, например, оптической плотности, флуоресценции, хемилюминесценции, визуализацию и другие способы, хорошо известные специалисту в данной области техники, или такие измерения как инфракрасные измерения (IR), измерения ядерного магнитного резонанса (NMR) или спектроскопия комбинационного рассеяния. Детектор может включать источник света, используемый для возбуждения флуоресцентного или люминесцентного красителя в образце ПЦР-реакции, и свет возбуждения обнаруживают фотодетектором (таким как CCD-детектор, CMOS-детектор, РМТ-детектор или другой оптический детектор). В одном воплощении источник света представляет собой источник когерентного света, такой как лазер или лазерный диод. В другом воплощении источник света представляет собой источник некогерентного света, такой как светодиод (LED), или галоидный источник света, или ртутная лампа.
Для амплификации нуклеиновых кислот ПЦР в реальном времени является одним примером способа анализа нуклеиновых кислот, который может быть проведен в трубке 250 в терморегулируемой области 350 с выявлением детектором 410.
Пример 2: Универсальная подготовка образцов
В предыдущем примере показано одно воплощение, в котором раскрытое устройство может быть использовано для подготовки образцов для анализа, и показан один пример амплификации STR. Другое воплощение включает применение универсального модуля подготовки образцов (USPM). USPM-устройство может состоять из картриджа для обработки образцов (1), сопровождающего устройства для управления картриджем, микропроцессора и программного обеспечения, которое может легко быть соединено с последующими аналитическими устройствами. В одном воплощении USPM может быть тесно интегрирован с аналитическими устройствами с образованием модульной системы, полностью обеспечивающей проведение анализа образца с получением результата. Картридж может иметь конфигурацию устройства для одноразового использования, позволяющего обрабатывать мазки или жидкости (включая аэрозольные образцы) для способов контроля в процессе эксплуатации, или формат многоразового поточного устройства для удаленных операций при небольшой частоте положительных результатов. Специфичность USPM в отношении мишеней обеспечивают использованием специфичных антител (связывающихся с выбранными мишенями), присоединенных к парамагнитным гранулам; возможна поставка различных картриджей с различными сочетаниями мишеней.
В USPM может быть применен многостадийный полностью автоматизированный способ подготовки биологических образцов для последующего анализа. В одном примере, показанном на Фиг.18, могут быть использованы мазки или жидкости; оператор может выбрать тип образца и затем внести образцы во вход (входы). На первой стадии могут быть применены иммуномагнитные сепарации (IMS) для захвата, концентрации и очистки молекул-мишеней из раствора на парамагнитных гранулах. Уже исследованные мишени включают клетки, споры, вирусы, белки или токсины. Для выявления токсинов и белков или для использования в качестве триггерного механизма захваченные мишени, полученные IMS, могут быть выведены непосредственно к последующему аналитическому устройству. Для выявления нуклеиновых кислот вторая стадия может включать лизис клеток или спор с высвобождением ДНК и/или РНК с использованием механических или других методик лизиса. Третья стадия, очистка нуклеиновых кислот, может включать адсорбцию, концентрацию и очистку нуклеиновых кислот на второй совокупности парамагнитных гранул и выведение гранул с нуклеиновой кислотой или очищенной десорбированной нуклеиновой кислоты для дальнейшего анализа.
Относительно картриджа (1) иммуномагнитная сепарация может быть проведена с использованием в качестве реагентов гранул, имеющих антитела, или с применением других иммуномагнитных, аффинных магнитных сепарации или магнитных сепарации с использованием химических свойств поверхностей. Например, в картридж (1) могут быть внесены иммуномагнитные гранулы с антителами для захвата, очистки и концентрации клеток, вирусов, спор, токсинов и других биомолекул на гранулах.
Начальная обработка образцов для USPM может быть проведена в устройствах для подготовки образцов, позволяющих обрабатывать образцы объемом более 0,6 мл в микрожидкостном картридже (1) (Фиг.21). Картридж для обработки образцов кубической формы размерами приблизительно 1 (Фиг.3, Фиг.21) был разработан для автоматического выделения собранных клеток слизистой оболочки щеки из мазка, обеспечивает лизис клеток и очистку высвобожденной клеточной ДНК на магнитных гранулах. Слои гранул обычно имеют объем 100 нл и могут быть использованы для дальнейшего STR-анализа с применением микрожидкостных устройств или полнообъемных количественных ПЦР-реакций.
В устройстве для подготовки образцов использован микрочип с MOVe-микроклапанами, соединенный с нижней поверхностью картриджа (Фиг.3, стрелка 2), для направления потоков, управляемых давлением, состоящих из жидкостей, гранул и образцов, по резервуарам для реагентов и реакционным резервуарам. MOVe-микроклапаны заменяют обычные клапаны и трубки между резервуарами, обеспечивая, посредством этого, направляемый перенос текучих сред, устойчивый к утечкам, и позволяя уменьшить размер всего картриджа и устройства для подготовки образцов.
Эта технология устройства для подготовки образцов применена для автоматизации выделения ДНК из буккальных мазков, как описано выше. На Фиг.10 показано автоматическое получение ДНК из 25 мкл крови в устройстве для автоматической подготовки образцов с использованием потоков, управляемых давлением, вибрационного перемешивания, MOVe-клапанов, передвижных магнитов и магнитных гранул. Полностью автоматизированный процесс приводит к получению ДНК, готовой для STR-анализа, менее чем за пять минут.
Разработана автоматизированная система для захвата, концентрации и очистки клеток, вирусов и токсинов из жидких образцов (1-10 мл) с использованием магнитных гранул, покрытых антителами, специфичными в отношении интересующих мишеней. Таким образом, множество мишеней было концентрировано и очищено с использованием этой автоматизированной системы. С использованием этой системы проводили захват и выявление клеток Е.соli при концентрациях клеток всего 15 клеток/мл/образец (Фиг.27). Сходные результаты с эффективностью захвата более 90% были получены с использованием в качестве мишеней спор Bacillus, вегетативных грамположительных и грамотрицательных клеток, модельного вируса (бактериофага fd), стафилококкового энтеротоксина В (SEB) и овальбумина. Может быть проведена дальнейшая обработка очищенных образцов в устройстве для подготовки образцов (например, лизис и очистка нуклеиновых кислот), их перемещение на микрочип для анализа или использование с внечиповым устройством для ПЦР/количественной ПЦР.
5
Была показана эффективность IMS-захвата при использовании сложных образцов, таких как аэрозоли, и в присутствии биологических примесей (см. публикацию заявки на патент США №20080014576, полностью включенную сюда посредством ссылки). Относительно примесей авторы изобретения продемонстрировали, что увеличение количества внесенных бактерий в 10 раз или менее приводило к снижению эффективности захвата лишь в два раза. Для сложных образцов в дополнительных экспериментах с использованием множества различных аэрозольных образцов было установлено, что аэрозольные образцы уменьшают связывание спор В. cereus с IMS-гранулами менее чем на 50%. Следовательно, использование сложных образцов, используемых в практике, приводит к снижению чувствительности менее чем в два раза.
IMS была применена для захвата, концентрации и выявления токсинов. Авторы изобретения разработали IMS-анализы для овальбумина, SEB, мультиплексные анализы и два поколения полностью интегрированных микрожидкостных систем, автоматизирующих IMS-анализы. Возможно надежное выявление менее 10 нг SEB в образцах объемом один миллилитр без трудностей, связанных с близкородственными стафилококковыми энтеротоксинами.
IMS позволяет:
а) отбирать организмы-мишени из образцов с большим количеством фоновых мешающих примесей (селективность);
б) различать два разных штамма или вида бактерий (специфичность);
в) эффективно захватывать клетки и токсины при широком спектре концентраций из широкого спектра образцов (чувствительность, надежность);
г) значительно уменьшать объем целевого образца, от миллилитров до нанолитров.
Настоящее изобретение и устройство и способы по настоящему изобретению позволяют проводить IMS и сочетать ее с выделением нуклеиновых кислот.
Следующей стадией в USPM является лизис захваченной мишени, если она представляет собой клетку, вирус, прион или спору. Лизис спор особенно затруднителен. MagMill или устройство для магнитного лизиса или гомогенизации было разработано для эффективного лизиса Bacillus и других спор, а также вегетативных клеток. MagMill состоит из быстро вращающегося магнита 2000, приводимого в движение мотором 2001 (Фиг.60), обеспечивающего вращение другого магнита 2002, расположенного в емкости 2003 или камере, содержащей образец (Фиг.61). Магнит 2002, расположенный в емкости, содержащей образец, может иметь любую форму. Например, магнит может иметь форму бруска, сферическую, цилиндрическую, прямоугольную, овальную, шестиугольную форму или форму винта. Альтернативно, магнит может иметь сквозные отверстия, пропускающие жидкость и увеличивающие усилие сдвига, воздействующее на образец при вращении магнита магнитным полем. Те же основные компоненты могут быть уменьшены в размерах, включены в микрожидкостный формат или соединены с микрожидкостным форматом. Общий эффект аналогичен эффекту пластины с магнитной мешалкой с быстрым вращением образца в трубке для образца. С применением магнитного перемешивания образца посредством MagMill проводят лизис спор без гранул из диоксида кремния, диоксида циркония или других гранул. Лизис может быть осуществлен усилием сдвига, возникающим при прохождении спор между магнитом и стенками сосуда. Скорость вращения магнита может превышать приблизительно 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000 или 10000 об/мин.
7
Эффективность разрушения спор данным устройством сходна с эффективностью обычного измельчения гранулами с использованием гранул из диоксида кремния/диоксида циркония (Фиг.62). Споры (3,2×10) лизировали в объеме 1 мл и жизнеспособность определяли посевом на триптический соевый агар; результаты представляют собой среднее двух отдельных экспериментов, для каждого из которых использовали по два образца (всего n=4). Нежизнеспособность лизатов спор, полученных магнитным лизисом, составила 93% в сравнении с лизатами, полученными обычным измельчением гранулами (измельчитель BioSpec) с использованием диоксида циркония/диоксида кремния, где нежизнеспособность составила 96%, или гранул из диоксида кремния, где нежизнеспособность составила 80%. Сходные результаты были подтверждены количественной ПЦР.
Преимуществом использования MagMill (по сравнению с обычным измельчением гранулами) является большая механическая надежность конструкции и, следовательно, способность выдерживать множество циклов использования без поломок, при этом образцы можно лизировать с использованием только перемешивания образцов магнитом без необходимости включения гранул из диоксида кремния/диоксида циркония, которые, как было показано, связывают высвобождаемую ДНК, приводя к потере чувствительности при последующей детекции. Основные элементы MagMill могут быть реконфигурированы в миниатюризированном формате, который можно интегрировать в устройство для подготовки образцов. Потенциально система может быть уменьшена в размерах для ее размещения в микрожидкостном микрочипе. Однако, несмотря на изменения конфигурации, принцип лизиса быстро вращающимся магнитом, расположенным в емкости с образцом, остается неизменным.
Пример 3: Сочетание устройства для подготовки образцов с микрочиповой очисткой и сепарацией образцов
На Фиг.34 и Фиг.35 показано устройство с картриджем (2907) и микрочипом (2901), разработанное для включения конструкции инжектора с разветвленным катодом, показанной на Фиг.32, распределителя для заполнения гелем (2903) и связанных с ними компонентов. Картридж имеет жидкостное соединение с пневматическим распределителем и трубкой (2905). Было проведено тестирование различных конфигураций конструкции инжектора, длины сепарационного канала и сепарационного полимера. На Фиг.36 показана электрофореграмма М13 T-track, введение и сепарацию которого проводили в канале микрочипа с использованием инжектора с разветвленным катодом с детекцией образца в лабораторной системе с конфокальным микроскопом. Образец вводили равномерно с равным содержанием коротких и длинных фрагментов ДНК. Результаты демонстрируют возможность равномерного введения ДНК-лэддера М13 T-track и получения разрешения в одну пару оснований для приблизительно 330 пар оснований менее чем за 20 минут. Интенсивность полученных сигналов от образцов была выше, чем при введениях с использованием обычной двойной Т-схемы (twin T design). При интеграции с системой детекции поддерживают постоянную температуру микрочипа 50°С для получения хорошего разрешения при сепарациях.
С применением этих способов были получены отличные результаты для MOVe-интегрированных повторных инъекций жидких образцов при амплификации на месте их получения (Фиг.37). Эти данные были получены при осуществлении всех способов внесения образцов, манипуляции и введения под управлением программного обеспечения с использованием MOVe-микроклапанов. Проводили минимальную обработку и цветокоррекцию данных, полученных от детектора, в котором использованы восемь диодных каналов для записей, полученных для четырех красителей.
Одно воплощение микрочипа с сочетанием разветвленного катода и MOVe-устройства для подготовки образцов показано на Фиг.38. Это устройство включало дополнительные способы, позволяющие интегрировать его с остальной системой, то есть, устройством для подготовки образцов (1000, показанным на Фиг.22), реакционным каналом (250, показанным на Фиг.6) и выведением очищенных STR, как описано в примере STR-анализа. На Фиг.38 показан разветвленный катод с MOVe-жидкостными элементами и внесение образцов с перемещением образца взад-вперед для интеграции с системой послеамплификационной очистки STR. Части представляет собой следующее: 1 - вход для внесения реагентов, 2 - напор насоса для реагентов, 3 - вход для внесения образца, 4 - вход для внесения размерного стандарта/элюента, 5 - клапан для захвата, 6 - выход для выведения отходов, 7 - клапан для элюирования, 8 - выход для выведения отходов образца, 9 - катод, 10 - катодный вход, 11 - клапан для выведения образца, 12 - выход для выведения образца, и 13 - сепарационный канал. Анодный вход/выход, расположенный далее по ходу канала, не показан.
Образец, подлежащий сепарации, вводят в форме раствора гранул в этаноле. Он может представлять собой очищенные продукты реакции на гранулах, как описано выше. В одном воплощении образец представляет собой STR-реакцию. В другом воплощении образец может представлять собой фрагменты нуклеиновых кислот различной длины, полученные другими химическими способами проведения реакций, включая химический способ проведения секвенирования ДНК по Сенгеру. Раствор, содержащий образец, перемещают от входа для внесения образца к выходу для выведения отходов образца при открытии клапана для захвата и других промежуточных клапанов. Открытый клапан для захвата способствует снижению скорости потока и захвату гранул неподвижным магнитом, расположенным над или под клапаном. Весь раствор в этаноле пропускают через систему с последующим пропусканием воздуха, что приводит к получению относительно сухого и чистого слоя гранул с очищенными продуктами в клапане. В это время клапан закрывают и открывают повторно (в координации с другими клапанами) для его заполнения раствором элюента от связанного с клапаном входа. Для STR-анализа или других анализов, где необходим внутренний размерный стандарт, элюент может содержать размерный стандарт. Раствор перемещают между клапаном для элюирования и клапаном для захвата, способствуя перемешиванию и, в конечном счете, оставляя раствор у клапана для элюирования. Клапан для образца затем открывают в координации с клапаном для элюирования, прекращая перемещение образца взад-вперед через канал для образца, оставляя его заполненным. FASS-введение образца проводят, как описано выше. Дополнительная заслуживающая внимания функция устройства состоит в том, что в одном воплощении вход для внесения реагентов и насос для реагентов используют для подачи дозированной предварительной STR-реакционной смеси в реакционный канал (250, показанный на Фиг.6) после выделения ДНК из мазка в устройстве для подготовки образцов; в других воплощениях устройство позволяет подавать реагенты для других реакций с нуклеиновыми кислотами, такие как смесь для циклического секвенирования, или подачу реагентов для ПЦР для ПЦР-амплификации с последующей подачей реагентов для циклического секвенирования для проведения циклического секвенирования, по необходимости, с интегрированными реакциями очистки с использованием гранул. Другие химические способы будут очевидны специалисту в данной области техники.
Несмотря на то, что здесь были показаны и описаны предпочтительные воплощения настоящего изобретения, специалисту в данной области техники будет ясно, что такие воплощения приведены лишь в качестве примера. Специалистам в данной области техники будут теперь очевидны многочисленные вариации, изменения и замены без выхода за рамки объема изобретения. Например, любые МOVе-клапан, насос, маршрутизатор или другое MOVe-устройство, описанные здесь, могут быть заменены любым пневматически активируемым клапаном, насосом, маршрутизатором или другим устройством. Следует понимать, что при практическом использовании изобретения могут быть применены различные альтернативы воплощениям изобретения, описанным здесь. Подразумевают, что следующая формула изобретения определяет объем изобретения и охватывает способы и структуры, входящие в объем данной формулы изобретения, и их эквиваленты.