СПОСОБ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ ГРУНТА, ЗАГРЯЗНЕННОГО УГЛЕВОДОРОДАМИ (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF PHYTOREMEDIATION OF SOIL CONTAMINATED BY HYDROCARBONS (VERSIONS)

Изобретение относится к охране окружающей среды и может быть использовано для очистки почвы или грунта от загрязнения углеводородами во всех отраслях промышленности, связанных с добычей, транспортировкой, переработкой или хранением нефти и нефтепродуктов, а также при ликвидации последствий их аварийных разливов. Способ может быть применен для очистки почвы и грунта с концентрацией углеводородов до 30 г/кг.
В современных методах очистки окружающей среды от нефтяных углеводородов технология фиторемедиации, т.е. использования для восстановления загрязненных объектов растений и ассоциированных с ними микроорганизмов, является наиболее привлекательной. Эта технология обеспечивает устойчивый процесс очистки, благодаря высокому адаптационному потенциалу и мутуалистическим отношениям растений и микроорганизмов, не требует высоких энергозатрат, т.к. управляется солнечной энергией, используемой в процессе фотосинтеза, и, как следствие, является экономически выгодным и эстетически привлекательным способом очистки загрязненных объектов.
Известен способ очистки и рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, предусматривающий внесение в почву микроорганизмов, весеннюю или осеннюю вспашку загрязненной почвы на глубину 35-50 см с внесением перед вспашкой перегноя и минеральных удобрений, бороздование и высадку в дно борозды аборигенных пород саженцев древесных и сеянцев кустарниковых растений путем их порядкового смешения. Перед посадкой растения обрабатывают лазером, а внесение в почву микроорганизмов осуществляют путем погружения корневой системы растений перед посадкой в борозду в водный раствор, насыщенный микроорганизмами, выделенными из почв этого же региона, ранее подвергавшихся нефтяному загрязнению (патент РФ на изобретение №2294804).
Способ позволяет ускорить процесс рекультивации нефтезагрязненных почв, которые могут быть использованы под парковые зоны. Однако высадка на рекультивируемую почву древесных и кустарниковых растений часто недопустима на территории промзоны, где предполагается использование восстановленной территории для хозяйственных нужд или под застройку. Кроме того, к недостаткам известного способа относится его трудоемкость, так как для его реализации требуется значительное количество посевного материала, и затрудненное культивирование необходимого количества сложного микробного сообщества для обработки саженцев.
2
2
Известен способ биорекультивации нефтезагрязненных почв, который включает высадку на участок нефтезагрязненной почвы растений, формирующих в своей прикорневой зоне микробное сообщество с повышенным их содержанием и одновременно повышенными эмульгирующими свойствами, при этом биомасса подземной части растений составляет не менее 71,8 г/м в пересчете на сухой вес или 143,6 г/м сырого веса биомассы. Для реализации способа используют следующие растения: клевер луговой, клевер ползучий, кострец безостый, полевица тонкая, пырей ползучий, мятлик луговой, ежа сборная, тимофеевка луговая, овсяница луговая, тысячелистник обыкновенный (патент РФ на изобретение №2253209).
Способ упрощает процесс и повышает степень очистки почвы от нефтяных загрязнений, однако не обеспечивает эффективной приживаемости высаживаемых растений в загрязненной почве, что составляет сущность метода.
Известен способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, который предусматривает применение твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок, внесение органического разрыхлителя, использование биопрепарата нового состава и новой (олеофильной) формы на основе безопасных поверхностно-активных веществ бактериального происхождения и последующую фиторемедиацию (патент РФ на изобретение №2193464).
Способ обеспечивает сокращение периода биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов за счет ускорения естественных процессов биодеградации нефтепродуктов. Однако недостатками указанного способа являются ограниченная возможность его применения на месте, т.к. для реализации способа необходимо наличие биореактора и/или специальных площадок, а также значительные затраты, связанные с приобретением и применением указанного биопрепарата и обработкой загрязненного грунта.
Известен способ биологической рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, который включает двукратное внесение удобрений на загрязненный участок, рыхление почвы и внесение водного раствора нефтеразлагающих бактерий. В качестве удобрения используют навоз влажностью не менее 60%, который вносят из расчета 30-40 т/га с одновременным безотвальным рыхлением на глубину 27-30 см, повторно удобрение в виде композиции вносят на загрязненный участок через 5-7 дней. Композицию получают путем компостирования сапропеля, навоза и незагрязненного грунта, перед внесением ее смешивают с измельченным пером птицы, предварительно обработанным водным раствором электроактивированной воды в течение не менее 30 мин. В качестве нефтеразлагающих бактерий используют штамм бактерий Rhodococcus sp.MFN, культивируемый на питательной среде. Источником углерода являются нефтяные углеводороды, идентифицированные на загрязненном участке. Водный раствор бактерий Rhodococcus sp.MFN вносят не позднее 48 ч после внесения композиции, через 1,5-2 месяца проводят вспашку с оборотом пласта на глубину 25-27 см, выравнивают поверхности тяжелыми боронами и высевают семена однолетних и/или многолетних трав (патент РФ на изобретение №2329633).
Недостатком указанного способа является трудоемкость его осуществления, связанная с многостадийностью процесса обработки почвы, а также вероятность скорой элиминации внесенного в почву штамма-деструктора как чужеродного, неподдерживаемого каким-либо фактором (например, растением) микроорганизма. В представленном способе растения используются не как основной агент для ремедиации загрязненного грунта, а лишь на завершающем этапе очистки.
Известен способ ускоренной рекультивации почвы, загрязненной нефтепродуктами, включающий внесение незагрязненных грунтов, минеральных удобрений, обработку углеводородокисляющими микроорганизмами, рыхление и посев многолетних трав. При этом нефтезагрязненные почвы укладывают на глинисто-щебенчатый экран специально обустроенных делянок, вносят слой торфа, а в качестве минерального удобрения добавляют интрофоску, после чего композиционную почву перепахивают, выравнивают, наносят слой сухого активного ила, на поверхность ила укладывают семена многолетних трав, закрепляют их тонким слоем торфа и увлажняют суспензией ассоциированной культуры углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из почвы, длительно содержащей углеводороды нефти (патент РФ на изобретение №2066944).
Недостатком известного способа является трудоемкость и финансовая затратность его осуществления, связанная с обустройством специальных делянок для обработки нефтезагрязненной почвы.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ фиторемедиации материалов, загрязненных органическими поллютантами, включающий посев, по крайней мере, одного растения-хозяина в указанный материал и интродукцию, по крайней мере, одного микроорганизма в указанный материал. При этом микроорганизм способен к деградации, по крайней мере, одного загрязнителя и улучшению, по крайней мере, одного показателя растения-хозяина - всхожести, роста и приживаемости. Микроорганизм выбирается из группы, включающей штаммы Bukholderia, Sphingomonas и их смеси (заявка на изобретение US2004/101945).
Однако при реализации известного способа не применяются минеральные удобрения, что негативно сказывается на качестве фиторемециации.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является обеспечение устойчивой очистки грунта в течение всего периода восстановления почвы, загрязненного углеводородами, в том числе полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ).
Технический результат, который может быть достигнут при использовании заявляемого изобретения, заключается в обеспечении деградации загрязнителя грунта и увеличении эффективности фиторемедиации, за счет улучшения приживаемости и роста растений-фиторемедиантов.
2
8
Поставленная задача решается тем, что в способе фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами, включающем посев в грунт растений-фиторемедиантов, согласно 1 варианту технического решения перед посевом в грунт вносят минеральное азотное удобрение в количестве не менее 120 г/м, при этом в качестве растений-фиторемедиантов используют смесь семян бобовых и злаковых растений в соотношении 1:1-3, предварительно бактеризованных штаммом микроорганизма - деструктором углеводородов, стимулирующим рост растений. Для фиторемедиации грунта, загрязненного полициклическими ароматическими углеводородами, в качестве семян бобовых растений используют люцерну посевную, а в качестве семян злаковых используют сорго, при этом для бактеризации используют штамм Sinorhizobium meliloti Р221 деструктор полициклических ароматических углеводородов, стимулирующий рост растений в загрязненном грунте, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-9442. Для фиторемедиации грунта, загрязненного нефтяными углеводородами, в качестве семян бобовых растений используют люцерну посевную, а в качестве семян злаковых используют райграс пастбищный и/или рожь озимую, при этом для бактеризации используют штамм Azospirillum braselense SR80 деструктор нефтяных углеводородов, стимулирующий рост растений в загрязненном грунте. В качестве минерального азотного удобрения используют аммиачную селитру. При этом бактеризацию проводят погружением семян в течение 2-3 ч в суспензию, содержащую клетки штамма-деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений, в концентрации 1-3×10 клеток/мл.
2
7
Согласно 2 варианту технического решения в способе фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами, включающем посев в грунт растений-фиторемедиантов и бактеризацию грунта микроорганизмом, способным к деградации углеводородов, предварительно перед посевом в грунт вносят минеральное азотное удобрение в количестве не менее 120 г/м, при этом в качестве растений-фиторемедиантов используют смесь семян бобовых и злаковых растений в соотношении 1:1-3, а бактеризацию грунта осуществляют суспензией, содержащей клетки штамма микроорганизма деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений, при этом обработку грунта суспензией осуществляют до достижения концентрации 1-3×10 клеток/г грунта, содержащихся в поверхностном слое, глубиной до 30 см. Для фиторемедиации грунта, загрязненного полициклическими ароматическими углеводородами, в качестве семян бобовых растений используют люцерну посевную, а в качестве семян злаковых используют сорго, при этом для бактеризации используют штамм Sinorhizobium meliloti P221 деструктор полициклических ароматических углеводородов, стимулирующий рост растений в загрязненном грунте, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-9442. Для фиторемедиации грунта, загрязненного нефтяными углеводородами, в качестве семян бобовых растений используют люцерну посевную, а в качестве семян злаковых используют райграс пастбищный и/или рожь озимую, при этом для бактеризации используют штамм Azospirillum braselense SR80 деструктор нефтяных углеводородов, стимулирующий рост растений в загрязненном грунте. В качестве минерального азотного удобрения используют аммиачную селитру.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
2
2
2
1
8
2
Грунт, загрязненный углеводородами, обрабатывают минеральным азотным удобрением, например аммиачной селитрой в концентрации не менее 120 г/м почвы, в зависимости от типа почвы, концентрации и типа загрязнителя. При концентрации загрязнителя 5-10 г/кг норма внесения аммиачной селитры составит 120 г/м, при концентрации загрязнителя 20-30 г/кг удобрение вносится в концентрации 200-250 г/м. Обработка почвы перед посевом растений-фиторемедиантов включает в себя вспашку на глубину 30 см, внесение аммиачной селитры рассеиванием гранул удобрения на обрабатываемой поверхности грунта и рыхление. Внесение удобрений может быть осуществлено в несколько этапов - перед посевом растений (не менее / общего количества) и в течение вегетационного периода (оставшееся количество от расчетного в 1-2 приема). Внесение азотных удобрений оказывает стимулирующий эффект на общую численность почвенных гетеротрофов. После насыщения грунта азотными удобрениями осуществляют посев семян растений-фиторемедиантов. В качестве таких растений используют бобовые и злаковые растения. Группы семян формируют, исходя из наличия в обрабатываемом грунте того или иного загрязнителя. Так, для очистки грунта от нефтяных углеводородов используют травосмесь, включающую люцерну и рожь или люцерну и райграс, а для очистки грунта от полициклических ароматических углеводородов - люцерну и сорго веничное. Семена бобовых и злаковых растений смешивают в соотношении, например, 1:1, или 1:2, или 1:3. Однако оптимальный результат очистки достигается при смешивании семян в соотношении 1:2 бобовых и злаковых. При реализации 1 варианта изобретения семена перед посевом бактеризуют штаммом-деструктором углеводородов, стимулирующим рост растений. Бактеризацию проводят путем погружения смеси семян в суспензию, содержащую клетки штамма-деструктора в концентрации 1-3×10 клеток/мл. Семена выдерживают в суспензии в течение 2-3 ч при комнатной температуре и атмосферном давлении. При реализации заявляемого способа используют следующие штаммы микроорганизмов: штамм Sinorhizobium meliloti P221 деструктор полициклических ароматических углеводородов, стимулирующий рост растений в загрязненном грунте, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-9442, и штамм Azospirillum braselense SR80 деструктор нефтяных углеводородов, стимулирующий рост растений в загрязненном грунте, из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН.
Штамм Sinorhizobium meliloti P221 характеризуется следующими биотехнологическими признаками:
- способность стимулировать рост растений, за счет продукции фитогормона ИУК. Синтезирует ИУК в концентрации 30-40 мкг/мл за 3 сут культивирования в среде, содержащей предшественник фитогормона аминокислоту триптофан. Продукция ИУК штаммом определяется с использованием ВЭЖХ по появлению и накоплению фитогормона;
- способность к деградации полициклических ароматических углеводородов.
Разрушает ПАУ (фенантрен) в концентрации 0,1-1,0 г/л за 5 сут на 90-30% соответственно при культивировании в жидкой минеральной среде, содержащей янтарную кислоту (1 г/л) или без нее.
Штамм Azospirillum braselense SR80 характеризуется следующими биотехнологическими признаками:
- способность стимулировать рост растений, за счет продукции фитогормона ИУК. Синтезирует ИУК в концентрации 35-45 мкг/мл за 5 сут культивирования в среде, содержащей предшественник фитогормона аминокислоту триптофан. Продукция ИУК штаммом определяется с использованием ВЭЖХ по появлению и накоплению фитогормона;
- способность к деградации нефтяных углеводородов. Разрушает сырую нефть в концентрации 10 г/л за 14 сут на 57% при культивировании в жидкой минеральной среде, содержащей яблочную кислоту (5 г/л).
7
При реализации 2 варианта изобретения смесь семян растений, фиторемедиантов сеют в грунт, после чего грунт бактеризуют штаммом-деструктором углеводородов. Грунт с посеянными растениями единовременно обрабатывают суспензией, содержащей клетки штамма-деструктора в концентрации до 1-3×10клеток/г в поверхностном (глубиной до 30 см) слое грунта.
Для фиторемедиации загрязненного нефтешламами грунта был проведен скрининг растений, по результатам которого были отобраны перспективные виды: рожь озимая (Secale cereale L.) райграс пастбищный (Lolium perenne L.), и люцерна посевная (Medicago sativa L.) Согласно полученным данным, за 72 сут деградация углеводородов в почве под этими растениями составила 52, 46 и 41% соответственно, что на 18-20% было больше по сравнению с незасеянным контролем.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1
8
В вегетационных опытах с использованием комплексных систем, состоящих из растений, минерального удобрения и стимулирующего рост растения микроорганизма, исследовали фиторемедиацию почвы, загрязненной нефтешламом в концентрации 11,5 г/кг. Основным растением, применяемым для очистки нефтезагрязненного грунта, являлась озимая рожь (Secale cereale L.), в качестве дополнительных компонентов, по отдельности и в различных сочетаниях, использовали люцерну посевную (Medicago saliva L.), минеральное азотное удобрение и штамм стимулирующей рост растений ризобактерии (PGPR) Azospirillum braselense SR80, способный к деградации нефтяных углеводородов. Семена ржи озимой сеяли по 20 зерновок в 2-л вегетационные сосуды, содержащие 1,8 кг почвы. Люцерну высевали в количестве 10 семян на сосуд. Бактеризацию штаммом A. braselense SR80 проводили, поливая 4-дневные всходы ржи микробной суспензией до конечной концентрации микроорганизма в грунте 2×10 клеток на 1 г почвы. Минеральное удобрение вносили дробно каждые три недели, всего 5 раз. Растения выращивали в климатокамере при следующих условиях: продолжительность светового периода - 14 ч, темнового - 10 ч; освещенность 8000 люкс; температурный режим 24°/20°С; относительная влажность воздуха 70%. Растения поливали по мере необходимости до 45% от полной влагоемкости. Совместный посев ржи и люцерны привел к резкому (в 3 раза) увеличению суммарного содержания хлорофиллов а и b в листьях ржи, указывая на положительное влияние люцерны. Среди исследуемых вариантов обработки люцерна оказывала наиболее значительное влияние на накопление биомассы ржи, особенно в сочетании с азотным удобрением. Внесение азотного удобрения оказывало стимулирующий эффект на общую численность почвенных гетеротрофов, причем максимальная численность гетеротрофных микроорганизмов наблюдалась в присутствии люцерны и азотного удобрения. Использование люцерны значительно стимулировало и численность ризосферных микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов. Анализ остаточного содержания нефтешлама в грунте показал, что использование комплексной фиторемедиации позволило достичь 70% деградации загрязнителя через 120 сут. В среднем проведенная комплексная обработка загрязненной нефтешламом почвы привела к увеличению эффективности фиторемедиации на 4-12%.
Пример 2
8
4
3
Была проведена фиторемедиация почвы, загрязненной нефтешламом в концентрации 11,5 г/кг. Основным растением, применяемым для очистки грунта, являлся райграс пастбищный (Lolium perenne L.), в качестве дополнительных компонентов, по отдельности и в различных сочетаниях, использовали люцерну посевную, аммиачную селитру и штамм стимулирующей рост растений ризобактерии Azospirillum braselense SR80. Семена райграса сеяли по 20 зерновок в 2-л вегетационные сосуды, содержащие 1,8 кг почвы. Люцерну высевали в количестве 10 семян на сосуд. Перед посевом проводили бактеризацию растений, обрабатывая семена штаммом A. braselense SR80 в течение 2 ч на качалке в колбе с микробной суспензией, содержащей 3×10 клеток/мл. Для приготовления суспензии 3-суточную культуру штамма, выращенного на питательной среде (картофельном агаре), отмывали и ресуспендировали в фосфатном (рН 7.2) буфере. В качестве азотного удобрения использовали аммиачную селитру (NHNO) в концентрации 250 мг/кг почвы. Удобрение вносили дробно каждые три недели, всего 5 раз. Растения выращивали в климатокамере при следующих условиях: продолжительность светового периода - 14 ч, темнового - 10 ч; освещенность 8000 люкс; температурный режим 24°/20°С; относительная влажность воздуха 70%. Растения поливали по мере необходимости до 45% от полной влагоемкости.
Применение бактеризации стимулирующей рост растений ризобактерией-деструктором, азотного удобрения и совместного посева райграса с люцерной позволило достичь 69% деградации загрязнителя через 120 сут. Таким образом, использование комплексной фиторемедиации позволило повысить эффективность очистки почвы на 18%.
Пример 3
4
3
8
Очистку песчаного грунта от загрязнения полициклическим ароматическим углеводородом фенантреном (0,1 г/кг) исследовали в вегетационном опыте с использованием сорго веничного (Sorghum bicolor L. Moench) и люцерны посевной (Medicago sativa L.). Растения высаживали в количестве по 5 семян в 1-л вегетационный сосуд. Бактеризацию растений стимулирующей рост растений ризобактерией-деструктором ПАУ Sinorhizobium meliloti P221 проводили на 4 сут после посева, поливая проростки суспендированной в среде для полива растений (содержащей 400 мг/л NHNO) культурой штамма до конечной концентрации микроорганизма в грунте 10 клеток/г. Для приготовления суспензии 3-суточную LB-агаровую культуру S. meliloti P221 отмывали в фосфатном (рН 7.2) буфере и ресуспендировали в среде для полива растений. Через 1 мес культивирования определяли вес сухой подземной и надземной биомассы растений, убыль фенантрена в песке, а также численность штамма-инокулянта.
В загрязненном грунте бактеризация штаммом S. meliloti P221 повышала приживаемость сорго на 13% и увеличивала прирост биомассы его корней и побегов по сравнению с небактеризованным вариантом на 11 и 44% соответственно. В чистом грунте штамм не оказывал заметного влияния на изменение биомассы сорго. Бактеризация увеличивала прирост биомассы корней люцерны по сравнению с небактеризованным вариантом на 7% - в чистом грунте и на 15% - в загрязненном. В чистом грунте штамм практически не оказывал влияния на прирост надземной биомассы люцерны, тогда как в грунте, загрязненном фенантреном, надземная биомасса была на 27% больше у бактеризованных растений по сравнению с небактеризованными. Содержание фенантрена в песке с небактеризованными растениями через 1 мес культивирования снизилось на 54%, а с бактеризованными штаммом S. meliloti P221 - на 78%.
С использованием иммунодиффузионного анализа осуществляли мониторинг штамма S. meliloti P221 в корневой зоне растений. Установлено, что через 4 недели культивирования общая численность гетеротрофных микроорганизмов в ризосфере сокращалась под влиянием загрязнителя, но популяция штамма P221 в загрязненном грунте увеличивалась и была максимальной (более 50% от общей численности гетеротрофов) в варианте с уровнем загрязнения 10 мг/кг, что свидетельствовало о том, что растения поддерживали популяцию штамма в условиях загрязнения. Присутствие S. meliloti P221 в ризосфере растений без инокуляции не обнаружено. Таким образом, использование штамма для инокуляции растений-фиторемедиантов способствовало преодолению растениями поллютантного стресса, увеличивая их приживаемость и прирост биомассы в условиях загрязнения, и повышало эффективность очистки грунта на 24%. В свою очередь, растения поддерживали в грунте численность штамма-деструктора загрязнителя.