Способ получения морфолиновых олигомеров
METHOD FOR PRODUCING MORPHOLINE OLIGOMERS

Область техники
Изобретение относится к новым способам получения и очистки регулярных морфолиновых олигомеров, применяемых в генетических исследованиях и терапии.
Предшествующий уровень техники
Гетерофазный синтез регулярных олигомеров уже несколько десятилетий является основным подходом к синтезу коротких пептидов, нуклеиновых кислот и их миметиков. Одной из разновидностей миметиков нуклеиновых кислот, зарекомендовавшей себя как агент для нокдауна генов, являются морфолиновые олигонуклеотиды (олигомеры): миметики с морфолин-фосфородиамидатным скелетом. Синтез морфолиновых олигомеров проводится на модифицированном полистирольном носителе путем циклической манипуляции защитными группами и пошагового наращивания цепи олигомера с деактивацией непрореагировавших реакционных центров (кэпированием). В начале цикла концевые защитные группы удаляются, затем присоединяется новое звено, содержащее новую концевую защиту, после чего кэпирование предотвращает образование неполных цепей в следующих циклах. Используемые в синтезе мономеры представляют собой модифицированные звенья, содержащие помимо вводимого фрагмента цепи: лабильную концевую защитную группу, ортогональные ей защитные группы на активных элементах нескелетных участков и активную группу для присоединения к цепи. Реакции удаления лабильной защиты и присоединения должны быть высокоэффективными, поскольку при множественных циклах выход продукта реакции падает в геометрической прогрессии. После завершения синтеза олигомер отделяется от полимерного носителя, и производится пост-синтетическая обработка, например удаление нескелетных защитных групп, предотвращающих побочные реакции и ветвление цепей. Очистка от примесей, образующихся в процессе синтеза, обычно проводится методами ВЭЖХ, поскольку разница в физических свойствах молекул олигомера невелика, и разделение требует высокой разрешающей способности метода.
Существующие способы синтеза морфолиновых мономеров из рибонуклеозидов основаны на использовании реакции восстановительного аминирования с тетраборатом аммония. Существует два основных подхода. Их основным различием является селективное силилирование 5'-гидроксильной группы рибонуклеозидов, облегчающее течение дальнейших реакций. Стандартный метод предполагает использование несилилированных рибонуклеозидов и очистку тозилатов морфолин-нуклеозидов осаждением [патент US 5,185,444, опубл. 09.02.1993]. Силильный метод более трудоемок и предполагает использование хроматографической очистки до и после восстановительного аминирования, однако при этом выход продукта реакции выше [Pattanayak S. et al, 2012, DOI: 10.1080/15257770.2012.724491]. Это позволило предположить, что гидрофобные группы положительно влияют на эффективность реакции и использовать манипуляцию защитными группами иначе.
Восстановительное аминирование с образованием третичного морфолина проводилось с образованием бензильного производного, однако удаление бензильной защиты происходит в тех же условиях, что и разрыв связи между морфолиновым и нуклеиновым основанием [Bell N.B., 2010, DOI: 10.1002/chem.200902237]. Это позволило предположить, что возможно введение других защитных групп в процессе восстановительного аминирования.
Известны эфирный и фосфорамидитный подходы к синтезу морфолиновых олигомеров. Первый предполагает использование избытков хлорфосфорамидатов для обеспечения высокого выхода на каждом этапе синтеза [патент US 5185444 А, опубл. 09.02.1993]. Недостатком этого способа является высокий расход реагентов и долгое время синтеза фармакологически активных (20-25 звеньев) олигомеров. Фосфорамидитный синтез морфолиновых олигомеров основан на синтезе триэфиров фосфора (III) при активации фосфорамидитов тетразолами, с их стабилизацией борорганическими соединениями и последующим окислительным аминированием после завершения синтеза олигомера [заявка на патент WO 2018057430 A1, опубл. 29.03.2018]. Этот подход более оперативный и гибкий, но генерирует огромное количество примесей из-за высокой чувствительности к воде.
Недостатки первого метода могут быть компенсированы применением различных активаторов: веществ (обычно, третичных аминов), создающих с субстратами активные интермедиаты, вступающие в реакции быстрее [Pattanayak S. et al, 2012, DOI: 10.1016/j.tetlet.2012.09.126]. Такой подход представляет собой объединение принципов предыдущих способов с подбором новых условий для повышения эффективности реакций наращивания цепи олигомера.
Принципиальным недостатком очистки морфолиновых олигомеров с помощью ВЭЖХ является трудность масштабирования процесса для получения терапевтически значимого количества продукта. Квадратичный рост площади давления в делительной колонне приводит к тому, что разделение десятикратно большего количества вещества требует стократно более мощного насоса для нагнетания давления, что делает установку не только дорогостоящей, но и опасной. Другим недостатком является трудность отделения укороченных молекул от целевого продукта, что усугубляется отсутствием заряда на скелете морфолиновых олигомеров, делающим разницу в физических свойствах продукта и примеси еще меньше.
Однако существует принципиальная разница в химических свойствах продукта и примеси: наличие лабильной концевой защитной группы и активного центра с ней. Наиболее близким к заявленному техническому решению является протокол ретритилирования, который состоит из удаления концевой тритильной защитной группы из регулярного олигомера и ее замены на более лабильную группу для оптимизации процесса очистки вещества от примесей [патент US 8299206 В2, опубл. 30.10.2012]. Способ синтеза морфолинового олигомера по US 8299206 B2 включает в себя (а) взаимодействие морфолиновой субъединицы на твердофазной основе, имеющей незащищенный кольцевой азот, с морфолиновым мономером, имеющим триарилметил-защищенный кольцевой азот и активированную фосфорамидатную группу на 5'-экзоциклическом углероде, с образованием фосфородиамидатной связи между 5'-экзоциклическим углеродом и незащищенным кольцевым азотом;
(b) снятие защиты с защищенного кольцевого азота с образованием незащищенного кольцевого азота; и
(c) повторение стадий (а) и (b) один или несколько раз с дополнительными мономерами морфолиновой субъединицы с защищенным кольцевым азотом;
где упомянутое снятие защиты включает воздействие на триарилметил-защищенный кольцевой азот раствора реагента, содержащего соль гетероциклического амина в трифторэтанолсодержащем растворителе, при этом соль является солью гетероциклического амина, имеющего рКа в диапазоне 1-4 в его протонированной форме, и кислоты, выбранной из сульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и соляной кислоты. Обычно синтез дополнительно включает отщепление морфолинового олигомера от твердой фазы и снятие защиты с оснований в соответствии со стандартными процедурами.
Недостатком данного технического решения является то, что очистка конечного продукта, полученного таким способом, до фармакологически приемлемого уровня возможна лишь с помощью ВЭЖХ, что не решает проблему масштаба применения. Причина, препятствующая получению в известном способе требуемого технического результата, заключается в том, что данный способ позволяет проводить очистку только небольшого количества вещества. Из существующего уровня техники также известен подход модификации тритильных групп для получения особых спектральных свойств продуктов [Shchepinov M.S., Korshun V.A. Recent applications of bifunctional trityl groups // Chem. Soc. Rev., 2003. V.32. PP. 170-180. DOI: 10.1039/b0089001]. Недостатком данного технического решения является малое влияние введенных в данном исследовании модификаций на фазовую и хроматографическую подвижность.
Из патента РФ 2606627 известен способ синтеза морфолинового олигомера, причем способ включает: (а) взаимодействие морфолиновых звеньев с носителем в твердой фазе, имеющей незащищенный кольцевой атом азота, с мономером морфолинового звена с защищенным основанием, имеющим кольцевой атом азота, защищенный триарилметилом, и активированную фосфорамидатную группу на 5'-экзоциклическом углероде, при этом образуется фосфородиамидатный мостик между 5'-экзоциклическим углеродом и незащищенным кольцевым атомом азота; (b) снятие защиты с защищенного кольцевого атома азота для образования незащищенного кольцевого атома азота; и (с) повторение стадий (а) и (b) один или несколько раз со следующими мономерами морфолинового звена с защищенным основанием; где, по меньшей мере, один из мономеров морфолинового звена с защищенным основанием представляет собой дважды защищенное гуаниновое морфолиновое соединение, имеющее структуру I:
,
в которой R1 выбран из группы, состоящей из низшего алкила, ди(низший алкил)амино и фенила; R2 выбран из группы, состоящей из низшего алкила, моноциклического арилметила и моноциклического(арилокси)метила; R3 выбран из группы, состоящей из триарилметила (тритила) и водорода; и Y представляет собой хлорфосфорамидатную группу. Недостатком такого подхода является низкая скорость реакции и высокий расход субстратов, которые, ввиду использования в смеси с третичными аминами, не поддаются регенерации и повторному использованию из-за образования пирофосфатов. Также в патенте РФ 2606627 раскрыто снятие защиты, которое включает воздействие на кольцевой атом азота, защищенный триарилметилом, раствора реагента, содержащего гетероциклическую аминную соль, в растворителе, содержащем трифторэтанол, при этом соль является солью гетероциклического амина с рКа в интервале 1-4 в протонированной форме, с кислотой, выбранной из сульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и хлористоводородной кислоты.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является решение как минимум одной из вышеуказанных в уровне техники проблем.
Сущность изобретения
Технической решением является использование описанного признаками в пунктах формулы изобретения.
Одной из возможных технических задач, на решение которой может быть направлено настоящее изобретение, являлось создание способа получения морфолинового олигомера, который был бы пригоден для масштабирования до размеров промышленного производства. При этом чистота получаемых морфолиновых олигомеров должна быть не ниже 95%.
Задача может быть решена тем, что в способе получения морфолинового олигомера синтезируют морфолиновый олигомер из морфолиновых мономеров и затем проводят очистку упомянутого олигомера, при этом синтез морфолинового олигомера из морфолиновых мономеров проводят с деактивацией непрореагировавших реакционных центров (кэпированием), а для очистки полученный олигомер липофилизируют посредством присоединения моноалкилокситритильного производного к концевой тритильной группе, затем проводят фазовое разделение липофильного морфолинового олигомера и примесей, после чего упомянутое моноалкилокситритильное производное удаляют. Заявленный способ может масштабироваться и позволяет получить морфолиновые олигомеры с чистотой 95,3%, которая подходит для дальнейшего использования в медицинских целях.
Заявленный способ включает стадию синтеза морфолинового олигомера из морфолиновых мономеров и стадию очистки полученного олигомера от примесей. Морфолиновые мономеры, используемые при осуществлении заявленного способа, могут быть приобретены готовыми или получены с помощью известных из уровня техники способов. Способы синтеза морфолиновых мономеров широко описаны в уровне техники (патент US 5185444 А, опубл. 09.02.1993; заявка на патент WO 2018057430 А1, опубл. 29.03.2018) и могут быть использованы для получения морфолиновых мономеров для осуществления способа по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для синтеза морфолиновых мономеров рибонуклеозид конвертируют в N-аллилморфолин нуклеозид реакцией восстановительного аминирования и превращают в хлорфосфорамидат путем манипуляции защитными группами: силилирования, деаллилирования, тритилирования, десилилирования и хлорфосфораминирования.
Синтез морфолинового олигомера может быть осуществлен с помощью одного из описанных в уровне техники способов синтеза морфолинового олигомера из морфолиновых мономеров, использующего стадию деактивации непрореагировавших реакционных центров (кэпирования). Один из таких способов описан, например, в патенте US 8299206 В2, опубл. 30.10.2012. Способы синтеза олигомера с кэпированием позволяют сохранить реакционноспособный центр на олигомере для дальнейшей липофилизации, при этом такой центр отсутствует у молекул-примесей, образующихся в результате многостадийного синтеза регулярного олигомера. В одном из вариантов осуществления способа по настоящему изобретению, для синтеза морфолиновых олигомеров иммобилизованную на модифицированной полистирольной смоле тритильную группу удаляют в кислой среде с образованием протонированного амина. После чего упомянутый амин нейтрализуют и смешивают с раствором хлорфосфорамидатового мономера морфолина и активатора, содержащего третичный амин. Смесь равномерно нагревают, например, в термостате и перемешивают, например, с помощью вибрационного привода, по завершении реакции остатки смеси смывают и носитель обрабатывают кэпирующим раствором на основе уксусного ангидрида. Цикл повторяют до получения целевой последовательности морфолинового олигонуклеотида.
При осуществлении настоящего способа на стадии очистки полученного морфолинового олигомера липофильность синтезированного олигомера повышают путем присоединения липофилизирующего агента к концевой тритильной группе упомянутого олигомера. В качестве липофилизирующего агента может быть использовано любое моноалкилокситритильное производное, благодаря стабильности его связи с морфолиновой аминогруппой и высокой эффективности и относительно мягкими условиями удаления тритильной группы после процедуры очистки. При этом к остальным молекулам, являющимся примесями, загрязняющими препарат целевого олигомера, присоединения липофилизирующего агента не происходит. Поэтому при дальнейшем разделении молекул более липофильный целевой олигомер отделяют от менее липофильных примесей с большей эффективностью.
Разделение молекул может быть осуществлено любым известным из уровня техники способом фазового разделения веществ. Один из таких способов описан, например, в патенте US 8785695 B2 (опубл. 22.07.2014). В этом изобретении предлагается способ очистки соединений, содержащих аминогруппы, от полярной фазы, где соединение, содержащее аминогруппы, превращается в результате реакции с альдегидом или кетоном в соответствующий имин, который нерастворим или мало растворим в полярной фазе, затем имин переводится в неполярную фазу и отделяется от полярной фазы, затем соединение, содержащее аминогруппы, выделяют из имина.
В одном из вариантов осуществления настоящего способа для очистки морфолинового олигомера после завершения последнего цикла синтеза морфолинового олигомера концевую тритильную группу удаляют в кислой среде с образованием протонированного амина, упомянутый амин нейтрализуют и смешивают с моноалкилокситритильным производным с образованием липофилизированного морфолинового олигомера, после чего производят отделение олигомера от носителя, полученную смесь растворяют в органическом растворителе, несмешиваемом с водой, липофилизированный морфолиновый олигомер отмывают от примесей, после чего высушивают и упаривают до масла; упомянутое масло подвергают кислотной обработке для отделения липофильной группы и осаждают из эфира. Использование фазового разделения для очистки синтезированного морфолинового олигомера позволяет проводить синтез и последующую очистку большого количества вещества, что позволяет получать промышленное количество морфолинового олигомера с сохранением чистоты, необходимой для медицинского использования.
В одном из вариантов осуществления изобретения для получения моноалкилокситритильного производного диэфир серинола конъюгируют к п-гидрокситритильному фрагменту через триэтиленгликоль-карбаматный линкер.
Заявленный способ позволяет получать морфолиновые олигомеры с чистотой не менее 95%.
Детальное описание изобретения
В данном описании термин «морфолиновый олигомер» обозначает регулярный олигомер из метиленморфолиновых субъединиц, соединенных фосфородиамидатными связями. Рассматриваемые субъединицы представляют собой морфолиновые мономеры, являющиеся соединениями азотистого основания, способного участвовать в комплементарном связывании, и морфолина, иными словами - нуклеозидами, в которых сахарный остаток заменен на морфолин.
В данном описании термин «липофилизация» описывает процесс, обратимо повышающий липофильность целевой молекулы.
В данном описании термин «укороченные последовательности» описывает побочные продукты синтеза морфолиновых олигомеров, обладающие меньшей молекулярной массой, чем целевой продукт, из-за прерывания цепочки синтеза на ранней стадии. Они представляют собой основную часть примесей при синтезе морфолиновых олигомеров.
В данном описании термины «носитель», «твердая фаза», «смола» обозначают модифицированный полистирольный полимер, используемый в процессе синтеза олигомеров. Различные термины указывают на важность разных аспектов функциональности материала: «носитель» подчеркивает важность функционализирующих групп, «твердая фаза» - участие в гетерофазном процессе синтеза, а «смола» - изменение объема под действием растворителей.
В изобретении предложен масштабируемый способ получения морфолинового олигомера, подходящего для дальнейшего использования в медицинских целях, содержащий:
а) синтез морфолинового олигомера с использованием морфолиновых мономеров, и
б) очистку морфолиновых олигомеров путем обратимой липофилизации продукта моноалкилокситритильным производным и фазового разделения липофильного продукта и гидрофильных примесей с последующим удалением липофильной группировки.
,
Морфолиновые мономеры, используемые для синтеза морфолиновых олигомеров, могут быть получены с помощью известных из уровня техники способов. Также можно приобрести коммерчески доступные готовые морфолиновые мономеры, например, в компании Biosynth Carbosynth, Великобритания (https://www.carbosynth.com/carbosynth/website.nsf/(w-productdisplavV6FEDE36FE413CADF882580050072AA3E по ссылке, для иллюстрации, цитозиновый морфолиновый мономер, дата обращения 21.12.2021) и использовать их для синтеза морфолиновых олигомеров по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения проводят синтез морфолиновых мономеров способом, который представляет собой усовершенствование существующих способов синтеза морфолиновых мономеров. Известный из уровня техники процесс содержит несколько основных этапов: синтез морфолинового кольца, введение N-тритильной защитной группы, блокирование нескелетных реакционных центров и введение хлорфосфорамидатной группировки. В рамках упомянутого известного реакционного процесса используются субстраты с блокированными нескелетными реакционными центрами, что делает процесс более эффективным. Синтез морфолинового кольца производится путем периодатного расщепления рибозного кольца, за которым следует восстановление при добавлении раствора аллиламин гидрохлорида и тетрабората натрия, что приводит к образованию N-аллилморфолинового производного. Далее гидроксильную группу защищают с образованием силильного эфира, а аллильную защиту, связанную с атомом азота, удаляют для замены на стерически напряженную тритильную. Далее силильная защита удаляется, позволяя присоединить к деблокированной гидроксильной группе хлорфосфорамидатную группировку. Такой подход, несмотря на большее число стадий, позволяет получить удобно очищаемые продукты с высокой эффективностью. Значительная разница в гидрофобности продуктов промежуточных реакций делает флеш-хроматографию максимально простой и надежной. Источник морфолиновых мономеров и/или способ их получения не влияет на достижение технического результата настоящего изобретения.
Один из способов, которыми могут быть получены морфолиновые мономеры, описан в статье Nekrasov M.D., Lukyanenko E.R. Kurkin A.V. Synthesis of N-substituted morpholine nucleoside derivatives // Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids. 2020, V. 39:9, P. 1223-1244, DOI: 10.1080/15257770.2020.1788078. В частности, способ осуществляли следующим образом. К раствору рибонуклеозида (1 ммоль) в МеОН (20 мл) добавляли периодат натрия (1,02 ммоль), декагидрат тетрабората натрия (2 ммоль) и гидрохлорид амина (2,3 ммоль) и реакционную смесь перемешивали, перемешивали 2,5 ч, после чего реакционную смесь фильтровали. К раствору смеси в МеОН добавляли цианоборгидрид натрия (2,4 моль) и триэтиламин (0,33 мл) и смесь оставляли перемешиваться на 1 час. Затем 0,4 мл кислоты TFA смешивали с 5 мл метанола и добавляли, и смесь оставляли перемешивать 3 ч. Процесс был модифицирован для синтеза мономеров с 1,1-диаллилгидразиновым фрагментом, потому что гидразины являются восстановителями и реагируют с периодатом и иодатом натрия, препятствуя реакции нуклеозидов с этими реагентами. Для предотвращения непредвиденных побочных реакций оставшийся окислитель отфильтровывали, а затем последовательно добавляли тетраборат натрия и гидразина гидрохлорид. Другим ограничивающим фактором в этой реакции являются малорастворимые N-защищенные нуклеозиды, например N4-бензоилцитидин, в метаноле, что приводит к замедлению скорости окисления. Введение силильных заместителей, как правило, увеличивало растворимость нуклеозида и избегало ненужного перегрева реакции (нагревание увеличивало переокисление диальдегида) и позволяло увеличить выход целевых мономеров β. Такой подход позволил синтезировать N-замещенные морфолиновые мономеры с высоким выходом: до 95%, и с разнообразными заместителями. Такой способ синтеза морфолинового цикла сохраняет стереоспецифичность 1- и 5-положений, превращая производные фуранозы в морфолины и избегая рацемизации в а-положениях диальдегида. Все этапы этого синтеза просты и легко масштабируются до 0,5 1 моль с использованием стандартного лабораторного оборудования.
Первый этап способа по настоящему изобретению, касающийся синтеза морфолинового олигомера, представляет собой усовершенствование существующих способов. Известный из уровня техники процесс представляет собой четырехтактовый цикл реакций: детритилирование, нейтрализация, присоединение звена и кэпирование. В рамках первой стадии синтеза морфолинового олигомера по настоящему изобретению с твердой фазы при помощи кислотной обработки удаляется тритильная защитная группа, что создает новый и однородный реакционный центр на фазе в реакторе. Во время второй стадии образованный на твердой фазе аммонийный катион превращается во вторичный амин (морфолин), способный участвовать в реакции присоединения. Во время третьей стадии в реактор подаются смеси растворов мономера и активатора на основе диазабициклоундецена в 1,3-диметил-2-имидазолидиноне, реактор разогревается до 45°С, и реакция проводится до связывания всех доступных реакционных центров активированным мономером. Эта стадия значительно превосходит стандартные методы синтеза морфолинового олигомера в скорости и эффективности, позволяет значительно уменьшить расход мономеров на синтез. В четвертой стадии цикла твердая фаза обрабатывается смесью растворов 1-метилимидазола и уксусного ангидрида для связывания непрореагировавших реакционных центров и уменьшения количества примесей. Использование двухтактового кэпирования позволяет значительно уменьшить количество примесей за меньшее, чем по стандартным методикам, время. Реакционный цикл производится автоматизированно с помощью ДНК-синтезатора, управляемого компьютером, например ASM-10 производства Biosset, Россия. Это позволяет производить операции герметично, что важно из-за чувствительности хлорфосфоранов к влаге, и в многостадийном синтезе, превышающем по продолжительности сутки. Для достижения технического результата настоящего изобретения синтез морфолинового олигомера также может осуществляться другим известным из уровня техники способом синтеза морфолиновых олигомеров, имеющим стадию деактивации непрореагировавших реакционных центров (кэпирования). Один из таких способов описан, например, в патенте US 8299206 В2, опубл. 30.10.2012. Способы синтеза олигомера с кэпированием позволяют сохранить реакционноспособный центр на олигомере для дальнейшей липофилизации, при этом такой центр отсутствует у молекул-примесей, образующихся в результате многостадийного синтеза регулярного олигомера.
Второй этап способа по настоящему изобретению, касающийся очистки реакционной смеси, полученной в результате проведения первых двух этапов способа, производят за счет обратимой липофилизации. При этом сначала целевые молекулы модифицируют таким образом, что их аффинность гидрофобному слою значительно увеличивается, тогда как с примесями такого резкого изменения свойств не происходит. Это достигается благодаря дезактивации побочных продуктов при синтезе олигомера (первый этап заявленного способа) путем обработки ацилирующим реагентом, в результате чего только целевая молекула сохраняет реакционную способность терминальной аминогруппы. При постсинтетической обработке защитную группу удаляют в кислой среде с образованием протонированного амина, затем к упомянутому амину добавляют моноалкилокситритильное производное, что приводит к присоединению модифицированного липофилизированного тритила к терминальной аминогруппе целевого олигомера, в результате чего возникает значительная разница в гидрофобности целевого продукта и примесей. После липофилизации целевого олигомера носитель обрабатывают раствором, отделяющим олигомер от линкерной группировки (например, для линкеров сложноэфирной природы используют водные растворы аммиака или органических аминов). Получаемую смесь разводят дихлорметаном и промывают равными объемами воды, удаляя нелипофильные вещества, после чего олигомер в дихлорметане сушат и упаривают до масла при пониженном давлении. После этого для удаления липофилизированного тритила морфолиновый олигомер обрабатывают 5% раствором трихлоруксусной кислоты в дихлорметане с 10% изопропанола. Далее, реакционную смесь смешивают с избытком диэтилового эфира, центрифугируют для отделения осадка, декантируют эфирный слой, промывают осадок диэтиловым эфиром и сушат при пониженном давлении. Также, для достижения технического результата разделение различающихся по гидрофобности целевого продукта и примесей может быть проведено с использованием других известных из уровня техники способов фазового разделения веществ.
При осуществлении заявляемого способа масштабирование может быть ограничено только аппаратными характеристиками используемого оборудования (реактора, ДНК-синтезатора), в котором проводится синтез морфолинового олигомера. Описанный способ не ограничивается масштабом синтеза, приведенным в примерах, и может быть увеличен в соответствии с объемом используемого реактора. Стандартные приборы, используемые в настоящее время для синтеза олигомеров, позволяют получить до 10 г целевого олигомера, некоторые промышленные реакторы позволяют получить до 100 г целевого олигомера. Заявляемый способ может использоваться на этом оборудовании для увеличения количества целевого продукта. В настоящее время отсутствие ДНК-синтезаторов с большим объемом обусловлено отсутствием рутинных способов очистки большого количества олигонуклеотида. Заявляемое изобретение, включающее стадию, позволяющую очищать большое количество целевого продукта, позволит получать морфолиновые олигонуклеотиды в промышленных количествах.
Описание графических материалов
На Фиг. 1 схематически изображен тиминовый морфолиновый мономер.
На Фиг. 2 схематически изображен цитозиновый морфолиновый мономер.
На Фиг. 3 схематически изображен адениновый морфолиновый мономер.
На Фиг. 4 схематически изображен гуаниновый морфолиновый мономер.
На Фиг. 5 представлен масс-спектр морфолинового олигомера Т6.
На Фиг. 6 схематически изображена структура липофилизирующего агента на основе пальмитиновой кислоты.
На Фиг. 7 представлена хроматограмма реакционной смеси для синтеза морфолинового олигомера Т6 (профиль ВЭЖХ реакционной смеси после синтеза).
На Фиг. 8 представлена хроматограмма морфолинового олигомера Т6, очищенного путем обратимой липофилизации.
Данное изобретение поясняется следующими примерами осуществления:
Пример 1. Синтез N-аллилморфолин нуклеозидов
1 эквивалент рибонуклеозида (5-метилуридин, N6-бензоиладенозин, N2-изобутирилгуанозин, N4-бензоилцитидин) растворяли в 20 л/моль эквивалента метанола и смешивали с 1,02 эквивалента периодата натрия, 2,3 эквивалента тетрабората натрия и 2 л/моль эквивалента 1М раствора аллиламин гидрохлорида в метаноле. Смесь перемешивали 2,5 часа, после чего отфильтровывали, добавляли 0,33 л/моль эквивалента триэтиламина и 2,2 эквивалента цианоборогидрида натрия. 15 минут спустя 0,4 л/моль эквивалента трифторуксусной кислоты смешивали с 0,6 л/моль эквивалента метанола и добавляли к смеси по каплям. 3 часа спустя реакционную смесь упаривали, смешивали с 3 л/моль эквивалента воды и 5 эквивалентами карбоната калия и экстрагировали дважды 30 л/моль эквивалента дихлорметана. Органические слои объединяли, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла. Продукты очищали на хроматографической колонке, нейтрализованной аммиаком (градиент 0 2% метанола в дихлорметане).
Пример 2. Синтез хлорфосфорамидатных морфолиновых мономеров
1 эквивалент аллил-морфолинового нуклеозида растворяли в 2,5 л/моль эквивалента диметилформамида, смешивали с 3,5 эквивалента имидазола и 1,75 эквивалента трет-бутилдифенилсилилхлорида. Реакцию проводили 2 часа, после чего добавляли 1 л/моль эквивалента этилацетата, промывали дважды 10 л/моль эквивалента воды, однократно 3 л/моль эквивалента насыщенного раствора хлорида натрия, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла.
Продукт растворяли в 10 л/моль эквивалента метанола, смешивали с 3 эквивалентами 1,3-диметилбарбитуровой кислоты и 0,05 эквивалента тетракис(трифенилфосфин)палладия под аргоновой атмосферой. Реакцию проводили 3 часа, после чего упаривали досуха, смешивали с 3 л/моль эквивалента 15% водного раствора карбоната калия и экстрагировали трижды 3 л/моль эквивалента дихлорметана с 10% метанола. Органические слои объединяли, высушивали сульфатом натрия, отфильтровывали и упаривали досуха.
Продукт растворяли в 2,5 л/моль эквивалента диметилформамида, смешивали с 3 эквивалентами N-этилморфолина и охлаждали до 0°С. Затем 1,1 эквивалент тритил хлорида добавляли к смеси и продолжали реакцию 3 часа, после чего смешивали с 10 л/моль эквивалента этилацетата, промывали дважды 10 л/моль эквивалента, однократно 3 л/моль эквивалента насыщенного солевого раствора, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла. Продукт очищали на хроматографической колонке, нейтрализованной аммиаком (градиент 0-1% метанола в дихлорметане).
Продукт растворяли в 2 л/моль эквивалента тетрагидрофурана и смешивали с 1,1 эквивалента тетрабутиламмония фторида тригидрата. Реакцию продолжали 4 часа, после чего смешивали с 10 л/моль эквивалента этилацетата, промывали дважды 10 л/моль эквивалента, однократно 3 л/моль эквивалента насыщенного солевого раствора, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла.
Продукт растворяли в 8 л/моль эквивалента дихлорметана, смешивали с 8 л/моль эквивалента сухого ацетонитрила, 2 эквивалентами бромида лития и 2 эквивалентами диазабициклоундецена. Смесь охлаждали до 0°С, после чего добавляли 1,6 эквивалента диметиламинофосфорного дихлорида. 60 минут спустя реакционный раствор смешивали с 15 л/моль эквивалента дихлорметана, промывали дважды 30 л/моль эквивалента 0,1 М раствора винной кислоты, один раз 30 л/моль эквивалента воды и один раз 10 л/моль эквивалента насыщенного солевого раствора, высушивали сульфатом натрия и упаривали до масла. Продукт очищали на хроматографической колонке (градиент этилацетата 0-50% в дихлорметане).
Пример 3. Синтез морфолиновых олигомеров.
В качестве твердой фазы для синтеза продукта использовали полистирольную смолу (меш 150-200), содержащую аминометильные группы вне полимерной цепи в концентрациях 0,5 мкмоль /г, 1 мкмоль/г, 2 мкмоль/г или 4 мкмоль/г, модифицированные путем добавления линкера, обеспечивающего отсутствие стерических затруднений от полимера, отделение от полимера после синтеза, ортогональность синтезу олигомеров и наличие аминогруппы, защищенной тритильной группой.
Носитель может содержать триэтиленгликолевый, тетраэтиленгликолевый или 2,2'-дитиоэтанольный линкеры, соединенные карбаматной группой с N-тритилпиперидиновым фрагментом. Линкеры соединяли с твердой фазой при помощи эфирной связи. Разрыв связи олигомера с твердой фазой, соединенной с 2,2'-дитиоэтанольным линкером, производили 0,1М раствором дитиотреитола в N-метил-2-пирролидиноне с 10% триэтиламина. Разрыв связи олигомера с твердой фазой, соединенной с триэтиленглико левым или тетраэтиленгликолевым линкером, производили раствором аммиака или первичного амина при стандартном протоколе депротекции экзоциклических аминогрупп, при этом этил енгликоле вые группы остаются связанными с олигомером, что значительно увеличивает его растворимость в воде.
3
Реактор заполняли твердой фазой в зависимости от геометрии и расширения смолы под действием растворителей. Массу смолы расчитывали как 100-120 мг/(см объема)×(см радиуса сечения реактора). Перед синтезом реактор со смолой замачивали в N-метилпирролидоне на 30 минут, после чего промывали избытком дихлорметана и высушивали потоком аргона. Подготовленную таким образом систему использовали для проведения циклов синтеза олигомеров. Циклы синтеза морфолиновых олигомеров состояли из следующих этапов:
1. Удаление тритильной защиты. Раствором 10% цианоуксусной кислоты и 20% ацетонитрила в дихлорметане заполняли реактор и перемешивали 30 секунд с использованием вибропривода. Затем реактор заполняли снова и повторяли процедуру еще дважды. Затем раствор удаляли из реактора аргоном.
2. Нейтрализация системы. Реактор заполняли раствором из 5% диизопропилэтиламина и 25% изопропанола в дихлоретане и перемешивали 40 секунд с использованием вибропривода. Затем реактор заполняли снова и повторяли процедуру еще четырежды. Затем раствор удаляли из реактора аргоном. Затем реактор промывали чистым дихлорметаном и высушивали трижды.
3. Присоединение звена. Растворы хлорфосфорамидата (согласно заданной последовательности звеньев в олигомере) и активатора в диметилимидазолиноне закачивали в реактор. Реакцию проводили при 45°С на протяжении получаса при перемешивании виброприводом. Завершение реакции отслеживали с помощью хлоранильного теста. По завершении раствор удаляли давлением аргона, затем промывали реактор трижды дихлорметаном.
4. Копирование. Реактор заполняли смесью из 5% уксусного ангидрида, 5% 1-метилимидазола и 5% пиридина в тетрагидрофуране и перемешивали 300 секунд с использованием вибропривода. Затем реактор заполняли снова и повторяли процедуру еще один раз. Затем раствор удаляли из реактора аргоном, реактор промывали чистым дихлорметаном и высушивали трижды.
После завершения цикла процесс переходит к началу следующего согласно последовательности, либо к завершающему этапу для последнего звена. Завершающий этап содержит последовательность из 12 30-секундных промывок реактора N-метилпирролидоном, удаление концевой тритильной защиты, трехкратную промывку реактора дихлорметаном и высушивание от растворителя аргоном. После этого реактор извлекали и высушивали при пониженном давлении.
Пример 4. Синтез липофилизирующего агента
Монобензил сукцинат растворяли в 2 л/моль эквивалента дихлорметана, охлаждали до 0°С, смешивали с 2 эквивалентами оке ал ил хлорид а и каталитическим количеством диметилформамида. Смесь перемешивали 3 часа, после которых смесь испаряли при пониженном давлении, получая хлорангидрид монобензилянтарной кислоты.
3 эквивалента триэтиленгликоля (либо, тетра- или пента-этиленгликоля) смешивали с 2 л/моль эквивалента дихлорметана и 2 эквивалентами триэтиламина. Смесь охлаждали и добавляли по каплям раствор хлорангидрида монобензилянтарной кислоты в 2 л/моль эквивалента дихлорметана с активным перемешиванием. 3 часа спустя раствор промывали разбавленным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении. Продукт очищали флеш-хроматографией в дихлорметане в градиенте метанола (0-2%).
Продукт смешивали с 2 л/моль эквивалента дихлорметана, 1,5 эквивалента триэтиламина и 1,1 эквивалента метансульфонил хлорида. Через 30 минут раствор промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении. Продукт растворяли в 4 л/моль эквивалента сухого тетрагидрофурана, смешивали с 2 эквивалентами бромида лития, и нагревали до 75°С на рефлюксе. 6 часов спустя реакционную смесь испаряли при пониженном давлении, растворяли в этилацетате, промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении, получая бензил (2-(2-(2-бромоэтокси)этокси)этил сукцинат.
1 эквивалент п-гидрокси трифенилкарбинола смешивали с 1,2 эквивалента бензил (2-(2-(2-бромоэтокси)этокси)этил сукцината, 2 л/моль эквивалента диметилформамида, 2 эквивалентами карбоната калия и 0,1 эквивалента иодида калия. Смесь нагревали при активном перемешивании до 50°С 6 часов, после чего смешивали с этилацетатом, промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и испаряли при пониженном давлении. Продукт очищали флеш-хроматографией в гексане в градиенте этилацетата (25-50%).
Продукт растворяли в 2 л/моль эквивалента метанола и смешивали с 5% по массе 10% палладия на угле, устанавливали водородную атмосферу и проводили реакцию с интенсивным перемешиванием 6 часов. Потом смесь отфильтровывали на селите и очищали флеш-хроматографией в дихлорметане в градиенте метанола (0-2%), получая 4-(2-(2-(2-(4-гидроксидифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутановую кислоту.
2,5 эквивалента пальмитиновой (или маргариновой, стеариновой, нонадекановой, арахиновой) кислоты растворяли в 2 л/моль эквивалента дихлорметана, охлаждали до 0°С смешивали с 4 эквивалентами оксалилхлорида и каталитическим количеством диметилформамида. Смесь перемешивали 3 часа, после которых смесь выпаривали при пониженном давлении, получая хлор ангидрид пальмитиновой кислоты.
3 эквивалента триэтиламина смешивали с 2 л/моль эквивалента дихлорметана и 1 эквивалентом N-Boc-серинола. Смесь охлаждали и добавляли раствор хлорангидрида пальмитиновой кислоты в 2 л/моль эквивалента дихлорметана с активным перемешиванием. 3 часа спустя раствор промывали разбавленным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Продукт очищали флеш-хроматографией в гексане в градиенте этилацетата (3-5%).
Продукт смешивали с 2 л/моль эквивалента трифторуксусной кислоты и перемешивали 30 минут, после чего испаряли, растворяли в дихлорметане, промывали трижды одномолярным водным раствором гидроксида натрия, один раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали, получая 2-аминоопропан-1,3,-диил дипальмитинат.
4-(2-(2-(2-(4-гидроксидифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутановую кислоту (1,2 эквивалента) растворяли в 2 л/моль эквивалента дихлорметана, охлаждали до 0°С, смешивали с 2,4 эквивалентами оксалилхлорида и каталитическим количеством диметилформамида. Смесь перемешивали 3 часа, после которых смесь выпаривали при пониженном давлении. Продукт растворяли в 2,5 л/моль эквивалента сухого тетрагидрофурана, смешивали с 3 эквивалентами диизопропилэтиламина и охлаждали до 0°С. Затем раствор 2-аминоопропан-1,3,-диил дипальмитината в 2,5 л/моль эквивалента тетрагидрофуране добавляли по каплям и перемешивали смесь 6 часов. После этого раствор выпаривали и продукт очищали флеш-хроматографией в дихлорметане в градиенте этилацетата (0-50%).
Продукт растворяли в 2 л/моль эквивалента тионил хлорида и перемешивали 6 часов, затем выпаривали, получая 2-(4-(2-(2-(2-(4-(хлородифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутанамидо)-пропан-1,3-диил дипальмитат.
1
Пример 5. Анализ структур морфолиновых мономеров и липофилизирующего агента методами Н ЯМР
1
Анализ при помощи Н ЯМР проводился на приборе Bruker Avance 400 на частоте 400 МГц с калибровкой по недейтерированному хлороформу (δН = 7.28 ppm).
Моно(6-(5-метил-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или тиминовый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 1. Выход 75,4%. Белая пена. Rf (CH2Cl2:EtOAc 1:1, UV)=0.50. 1H NMR: 1.35-1.55 (2Н, m), 1.71 (1H, s), 1.84 (1H, s), 2.60-2.69 (6Н, m), 3.16 (1Н, d, J=11.86 Hz), 3.38 (1H, d, J=11.13 Hz), 4.04-4.10 (1H, m), 4.36-4.44 (1H, m), 6.14 (1H, dd, J1=9.6 Hz, J2=2.14 Hz), 7.00-7.57 (16Н, m), 8.57 (1H, s)
(6-(4-бензамидо-2-оксо-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или цитозиновый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 2. Выход 66,7%. Белая пена. Rf (CH2Cl2:EtOAc 1:1, UV)=0.39. 1Н NMR: 1.52 (1H, t, J=11.13 Hz), 1.75 (1H, s), 2.17 (1H, s), 2.64 (6H, d, J=13.82 Hz), 3.17 (1H, d, J=11.98 Hz), 3.60 (1H, d, J=11.37 Hz), 4.40-4.48 (1H, m), 6.29 (1H, d, J=7.58 Hz), 7.14-7.77 (20H, m), 7.87 (2H, d, J=7.46 Hz), 8.64 (1H, s)
(6-(6-бензамидо-9Н-пурин-9-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или адениновый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 3. Выход 48,5%. Белая пена. Rf (EtOAc, UV)=0.39. 1H NMR: 1.60-1.68 (1H, m), 1.82 (1H, td, J1=10.67 Hz, J2=4.59 Hz), 2.61 (3H, d, J=6.97H), 2.64 (3H, d, J=7.09 Hz), 2.71 (1H, d, J=1.34 Hz), 2.74 (1H, d, J=1.34 Hz), 3.26 (1H, dd, J=11.74 Hz, J2=1.83 Hz), 3.55 (1H, d, J=11.62 Hz), 4.49-4.57 (1H, m), 6.43 (1H, d, J=8.93 Hz), 7.18-7.64 (20H, m), 8.02 (2H, dd, J1=9.35 Hz, J2=2.02 Hz), 8.81 (1H, s)
(6-(2-изобутириламидо-6-метилен-1Н-пурин-9(6Н)-ил)-4-тритилморфолин-2-ил)метил диметилфосфорамидохлоридат, или гуаниновый морфолиновый мономер, представлен на Фиг. 4. Выход 47,0%. Белая пена. Rf (CH2Cl2:THF 9:1, UV)=0.47. 1H NMR: 1.23 (3Н, d, J=6.85 Hz), 1.30 (3H, d, J=6.97 Hz), 1.55 (1H, td, J1=3.30 Hz, J2=2.08 Hz), 1.65-1.74 (1H, m), 2.64 (6H, dt, J1=9.66 Hz, J2=4.16 Hz), 2.68-2.77 (1H, m), 3.22 (1H, d, J=11.86 Hz), 3.42 (1H, d, J=11.37 Hz), 4.01-4.22 (2H, m), 4.40-4.49 (1H, m), 6.00 (1H, ddd, J1=9.57 Hz, J2=7.31 Hz, J3=2.20 Hz), 7.15-7.51 (1H, m), 7.58 (1H, d, J=3.91 Hz), 9.05 (1H, d, J=84.12 Hz), 12.08 (1H, s)
2-(4-(2-(2-(2-(4-(хлородифенилметил)фенокси)этокси)этокси)этокси)-4-оксобутанамидо)пропан-1,3-диил дипальмитат, или липофилизирующий агент представлен на Фиг. 6. 0.77 (6Н, t, J=6.68 Hz), 1.15 (52Н, br.s.), 1.50 (4Н, t, J=6.86 Hz), 2.21 (4H, t, J=7.56 Hz), 2.36 (2H, t, J=6.65 Hz), 2.58 (2H, t, J=6.59 Hz), 3.52-3.65 (6H, m), 3.70-3.79 (2H, m), 4.05-4.19 (4H, m), 4.26-4.39 (1H, m), 5.91-5.98 (1H, m), 6.68-6.76 (2H, d, J=8.67 Hz), 6.85-7.04 (4H, m), 7.05-7.22 (8H, m)
Пример 6. Липофилизация олигомеров, полученных методом твердофазного синтеза
Очищаемый олигомер синтезировали методами твердофазного автоматизированного синтеза с кэпированием побочных продуктов, снятием терминальной защиты и без деблока боковых групп. Твердофазный носитель смешивали с 1-метил-2-пирролидоном, 10 эквивалентами липофилизирующего агента и 20 эквивалентами изопропилэтиламина, после чего перемешивали 4 часа при температуре 40°С. Затем раствор отфильтровывали.
Пример 7. Очистка липофилизированного олигомера
Носитель с липофилизированным продуктом смешивали с раствором для депротекции (например, трет-бутиламин : метанол : вода 1:1:2 для амидных защитных групп) и перемешивали согласно принятому для этого класса соединений протоколу [патент US 8299206 B2, опубл. 14.11.2014]. Затем раствор отфильтровывали, промывали, носитель обрабатывали 0,1 молярным раствором дитиотреитола в 1-метил-2-пирролидоне с 10% триэтиламина. Через 30 минут раствор собирали, смешивали с дихлорметаном и промывали водой 3 раза, затем 1 раз насыщенным раствором хлорида натрия, сушили сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали растворитель. Продукт обрабатывали 10% раствором цианоуксусной кислоты в смеси дихлорметан : ацетонитрил 4:1 на протяжении 1 часа, затем высаживали в диэтиловый эфир, нейтрализовали раствором из 5% диизопропилэтиламина, 25% изопропанола и 70% дихлорметана и повторно высаживали в диэтиловый эфир.
Пример 8. Оценка эффективности очистки олигонуклеотидов
Анализ методом ВЭЖХ проводили с помощью хроматографа Agilent 1220 Infinity LC на колонке ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18 (4,6×150 мм, размер гранул 5 мкм Agilent P/N 993967-902) со скоростью потока 1,5 мл/мин и регистрацией поглощения на волне 260 нм. 1,5 ОЕ олигомера в объеме 0,5 мл вносили на колонку при комнатной температуре и пропускали градиент буфера В 0-100% за 15 минут (со 2 до 17 минуты на хроматограмме).
Для сравнения использовали образцы реакционной смеси и очищенной порции морфолинового олигомера Т7 с модифицированным флуореноном концевым звеном.
Буфер А 0,01М триэтиламмония ацетат в бидистилированной воде
Буфер В вода : ацетонитрил 1:4 (v:v)
Раствор реакционной смеси (Фиг. 7) и очищенного вещества (Фиг. 8) был проанализирован приведенным выше методом анализа ВЭЖХ. Хроматограммы содержат отчетливый пик продукта (12,4 мин), а также низко интенсивные пики примесей. Отношение интегралов сигналов пиков примеси и основного вещества в реакционной смеси составило 10473 к 66974, то есть примесь составляет 13.52% смеси по оптическому поглощению на волне 260 нм. Отношение интегралов сигналов пиков примеси и основного вещества в очищенном веществе составило 2881.24 к 50167.41, то есть удаленная примесь составляла 5,43% смеси по оптическому поглощению на волне 260 нм. Оставшиеся примеси составляют менее 5%, что соответствует действующим фармакологическим стандартам.
Пример 9. Качественный анализ морфолиновых олигомеров, синтезированных заявляемым способом.
6
+
Качественный анализ полученных мономеров проводили методами MALDI масс-спектрометрии. Анализ проводили с помощью масс-спектрометра Autoflex III (Bruker Daltonics, Inc) с использованием 2,5-дигидроксибензойной кислоты в качестве матрицы (MALDI-TOF). В качестве стандарта использовали образец очищенного ВЭЖХ олигомера морфолино Т6. Пик m/z = 2211.71923828 совпадает с массой протонированного продукта (Т+Н), другие пики спектра соответствуют продуктам его распада при ионизации, что подтверждает пригодность метода для синтеза морфолиновых олигомеров. Масс-спектр приведен на Фиг. 5.
Таким образом, морфолиновые олигомеры могут быть синтезированы и очищены от укороченных последовательностей с помощью заявляемого способа. Получение хлорфосфорамидатных морфолиновых мономеров заявляемым способом подтверждается спектрами ЯМР. Получение морфолиновых олигомеров заявляемым способом подтверждается результатами MALDI масс-спектрометрии. Спектр поглощения УФ на волне 260 нм при ВЭЖХ - разделении очищенного и неочищенного продукта, подтверждает, что заявляемый способ позволяет очистить смесь от примесей до по меньшей мере 95.3% чистоты (по количеству вещества, на основании закона Бугера-Ламберта-Бера для усредненного поглощения нуклеотидов на волне 260 нм).
Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.
Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.
Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ получения морфолиновых олигомеров» на предмет выдачи патента на изобретение.