СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУСПЕНЗИИ ЕДИНИЧНЫХ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК ИЗ КЛЕТОЧНЫХ СФЕРОИДОВ
METHOD FOR OBTAINING A SUSPENSION OF SINGLE VIABLE CELLS FROM CELLULAR SPHEROIDS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу подготовки трехмерных клеточных культур - клеточных сфероидов - для получения суспензии единичных жизнеспособных клеток и может быть использовано, в частности, для характеризации субпопуляций и получения клеточных продуктов для регенеративной медицины. Кроме того, изобретение может найти применение при разработке препаратов на основе клеточных сфероидов и их компонентов для лечения пациентов с COVID-19 (терапии и профилактики острого респираторного дистресс-синдрома, вызванного коронавирусной инфекцией).
Уровень техники
in vitro
Frontiers in molecular biosciences
7
in vivo
in vivo
Cells
Anticancer Research, 39(3), 1105-1118
В системе  работы по онкологии, анализу эффективности и безопасности лекарственных средств, дифференцировки стволовых клеток и моделированию многих физиологических и патологических состояний стремительно переходят от двумерных 2D клеточных культур к трехмерным (Jensen, C., & Teng, Y. (2020). Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture? , , 33.). В трехмерных клеточных культурах, одной из форм которых являются клеточные сфероиды, поведение, пролиферативная активность и физиологические свойства клеток, в отличие от двумерных монослойных культур, приближены к условиям . Клеточные сфероиды представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. В сфероидах формируются межклеточные контакты, контакты с вновь синтезированным внеклеточным матриксом, образуется структура, организация которой приближена к организации тканей . Сфероиды широко применяют для анализа пролиферации, жизнеспособности, морфологии и дифференцировочного потенциала при формировании тканеинженерных конструктов, для изучения межклеточных взаимодействий, миграции и инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. За счет диффузионных ограничений в крупных сфероидах центральные области оказываются в условиях гипоксии и могут погибать. Различия концентрации газов и метаболитов в наружной и внутренней зонах сфероидов влияют на морфологию и физиологию клеток в этих зона (Ryu, Na-Eun, Soo-Hong Lee, and Hansoo Park. "Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells."  8.12 (2019): 1620; Vasyutin, I., Zerihun, L., Ivan, C., & Atala, A. (2019). Bladder Organoids and Spheroids: Potential Tools for Normal and Diseased Tissue Modelling. ).
Одной из актуальных до конца нерешенных задач является эффективная диссоциация сформированных сфероидов на единичные жизнеспособные клетки для их последующего анализа, банкирования и применения как самостоятельного клеточного продукта.
Для диссоциации сфероидов чаще всего используют ферментативную обработку. Ряд авторов предлагает обработку трипсином или трисином с ЭДТА (Патент РФ №2675930, Международная заявка WO2011060244A1).
Cell and Tissue Banking
22
Tumori Journal
98
Cell transplantation
26
Недостатком описанных подходов является снижение и изменение дифференцировочного потенциала клеток при длительной обработке трипсином (Chen, R. H., Xiao, L., Zhang, R. Z., Wang, S. Y., & Li, Y. (2021). Dedifferentiation of human epidermal melanocytes in vitro by long-term trypsinization. , (1), 67-75.). Кроме того, ферментативная обработка трипсином или трипсином с ЭДТА удаляет важные сигнальные белки и рецепторы с поверхности клеток (Zhang, B., Shan, H., Li, D., Li, Z. R., Zhu, K. S., Jiang, Z. B., & Huang, M. S. (2012). Different methods of detaching adherent cells significantly affect the detection of TRAIL receptors. , (6), 800-803; Tsuji, K., Ojima, M., Otabe, K., Horie, M., Koga, H., Sekiya, I., & Muneta, T. (2017). Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. , (6), 1089-1102.).
Advanced Science
6
Известен способ диссоциации сфероидов из мезенхимных стромальных клеток (МСК) перед анализом иммунофенотипа клеток посредством обработки клеток смесью 0.2% коллагеназы I типа (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany) и 2.5% ДНКазы I типа (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), приготовленной на среде DMEM с повышенным содержанием глюкозы и 2.2% GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) (Tietze, S. et al (2019). Spheroid culture of mesenchymal stromal cells results in morphorheological properties appropriate for improved microcirculation. , (8), 1802104.).
Известно также использование папаина, эластазы, проназы, гиалуронидазы и диспазы для подготовки суспензии единичных клеток (Патент РФ №2542964, Международная заявка WO2015033558A1, Международная заявка WO2017127921A1).
European journal of immunology
47
Известно применение ДНКазы I типа для удаления лишних клеток, например, при анализе плоидности в биоптатах опухолей (Cossarizza, A. et al.. (2017). Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. , (10), 1584-1797.).
Stem cell research & therapy
9
Однако известно, что обработка коллагеназой может снижать жизнеспособность и способность клеток к синтезу внеклеточного матрикса, прежде всего коллагена (Motoike, S. et al. (2018). Cryopreserved clumps of mesenchymal stem cell/extracellular matrix complexes retain osteogenic capacity and induce bone regeneration. , (1), 1-13.).
Stem cell research
32
Известен способ диссоциации сфероидов из кардиомиоцитов - кардиосфер человека, полученных после дифференцировки клеток с индуцированной плюрипотентностью, посредством их обработки свежеприготовленным раствором папаина на DPBS (37°С, 30 мин) с последующей гомогенизацией осторожным пипетированием 20 раз пипеткой с широким наконечником и нейтрализацией действия ферментов добавлением блокирующего раствора неназванного состава и среды KO-DMEM, или аккутазой, или TrypLE (37°С, 15 мин) с последующей гомогенизацией осторожным пипетированием 5-10 раз пипеткой с широким наконечником и нейтрализацией действия ферментов добавлением среды KO-DMEM (Fischer, B. et al. (2018). A complete workflow for the differentiation and the dissociation of hiPSC-derived cardiospheres. , , 65-72). После ферментативной обработки крупные агрегаты клеток удаляли ситом с диаметром пор 40 мкм и анализировали выход единичных клеток и их жизнеспособность. Применение папаина показало наилучший результат - 95.3±3.2% единичных клеток с жизнеспособностью 90.3±3.7%. После применения аккутазы выход единичных клеток составил 57±12.1% с жизнеспособностью 41.5±8.5%, после TrypLE - 76.1±11.6% единичных клеток с жизнеспособностью 70.1±10.8%.
Frontiers in physiology
9
Однако папаин широко применяют для моделирования пневмонии и эмфиземы легких на животных за счет литического действия на эпителий дыхательных путей (Machado, M. N. et al. (2018). Bone marrow-derived mononuclear cell therapy in papain-induced experimental pulmonary emphysema. , , 121.), соответственно, возможно отсроченное негативное действие данной протеазы на клетки, прежде всего стволовые. Кроме того, применение клеточного сита для отсеивания недиссоциировавших агрегатов снижает выход клеток, а использование специфических блокирующих растворов и пипетирование вручную не позволяют унифицировать и стандартизовать предложенные в вышеописанной работе подходы деагрегации кардиосфер.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ обработки клеточных агрегатов ферментом Tryple Select в фосфатно-солевом буфере без кальция и магния и с использованием шейкера для ускорения времени ферментирования (Международная заявка WO2017127921A1). Однако время обработки даже небольших агрегатов с диаметром до 100 мкм достигало 35 минут, а для агрегатов с диаметром 220 мкм - 55 минут.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка простого и эффективного способа получения суспензии единичных жизнеспособных клеток из клеточных сфероидов, обеспечивающего сокращение времени обработки.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом изобретения является обеспечение высокого выхода жизнеспособных клеток (более 75%) после диссоциации сфероидов при сокращении времени обработки материала до 10 мин (при диаметре сфероидов до 250 мкм).
Технический результат достигается за счет реализации способа получения суспензии единичных жизнеспособных клеток из клеточных сфероидов, включающего ферментативную обработку клеточных сфероидов диссоциирующим агентом до получения суспензии единичных клеток с последующей нейтрализацией ферментативной активности диссоциирующего агента, при этом в качестве диссоциирующего агента используют смесь ферментов TrypLE Express и Accutase, взятых в соотношении 1:1, в количестве не менее 0,5 мл на по меньшей мере 200 клеточных сфероидов.
При этом ферментативную обработку проводят при +37°С на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин в течение не менее 10 мин.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется иллюстрациями, где на Фиг. 1 представлены пробы клеточных сфероидов с использованием разных диссоциирующих агентов (примеры 1, 2 и 3) непосредственно перед началом диссоциации; на Фиг. 2 - пробы клеточных сфероидов после 8 минут диссоциации.
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Клеточные сфероиды формируют путем культивирования клеток в неадгезивных условиях в течение 3-7 суток в микролунках агарозных планшетов, полученных, например, с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США). Для снятия сфероидов с планшета при помощи механической пипетки несколько раз промывают планшет находящейся в лунках ростовой средой, и затем переносят всю среду со сфероидами в центрифужную пробирку. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляют при помощи микроскопа: при необходимости процедуру промывки планшета средой повторяют. После пассивного осаждения под действием силы тяжести сфероидов на дно пробирки осуществляют их диссоциацию. Для этого механической пипеткой отбирают среду над осадком сфероидов и добавляют раствор, содержащий ферменты для диссоциации клеток TrypLE Express и Accutase, взятые в соотношении 1:1 (не менее 0,5 мл раствора на по меньшей мере 200 сфероидов). Ферментацию осуществляют при +37°С на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин до образования вязкой суспензии (как правило, в течение 10 минут). В результате получают суспензию клеток с содержанием жизнеспособных клеток не менее 75%. Затем активность ферментов инактивируют добавлением ростовой среды в объеме, соответствующем или большем объема диссоциирующего агента. Для последующего ресупендирования клеток в буфере или ростовой среде после инактивации активности ферментов суспензию переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 6-7 мин при ускорении 100g с получением осадка жизнеспособных клеток.
Полученная суспензия единичных клеток может быть использована для анализа иммунофенотипа клеток на проточном цитометре.
Ниже представлены примеры получения суспензии единичных жизнеспособных клеток из клеточных сфероидов из различных типов клеток: мультипотентных мезенхимных стромальных клеток и клеток линий эмбриональных фибробластов мыши NIH 3Т3 и ретинального пигментного эпителия человека ARPE-19 при ферментативной обработке различными растворами (диссоциирующими агентами). Среднее время диссоциации сфероидов составляло до 10 мин - для сфероидов диаметром 150-250 мкм, состоящих из 1000-2000 клеток, для сфероидов диаметром более 250 мкм, время обработки увеличивалось до 15 мин.
Пример 1
Сфероиды из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) пупочного канатика человека (от 1000 до 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем двухкратного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 200 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осадком сфероидов и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С диссоциирующий раствор в объеме 0,5 мл: смесь 250 мкл TrypLE™ Express (Gibco, 12605028) и 250 мкл Accutase™ (BD, 561527). Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 15 раз/мин. На 8 минуте диссоциации проба помутнела, что свидетельствовало о формировании суспензии единичных клеток. На 10 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом. Сфероиды в пробе не наблюдались. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 0,5 мл полной ростовой среды.
Пример 2
Сфероиды из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) пупочного канатика человека (1000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 256 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осадком сфероидов и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С раствор Accutase™ (BD, 561527) в объеме 1 мл. Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 20 раз/мин. На 12 минуте диссоциации проба начала мутнеть, но сфероиды были видны в ней. На 20 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом: сфероиды в пробе отсутствовали. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 1 мл полной ростовой среды.
Пример 3
Сфероиды из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) пупочного канатика человека (2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 256 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осажденными сфероидами и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С раствор Трипсина (БиолоТ, 1.2.2.4) в объеме 1 мл. Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 20 раз/мин. На 12 минуте диссоциации проба начала мутнеть, но сфероиды были видны в ней. На 17 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом: сфероиды в пробе отсутствовали. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 1 мл полной ростовой среды.
Пример 4
Сфероиды из линии эмбриональных фибробластов мыши NIH 3Т3 (2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 256 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осажденными сфероидами и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С диссоциирующий раствор в объеме 1 мл: смесь 250 мкл TrypLE™ Express (Gibco, 12605028) и 250 мкл Accutase™ (BD, 561527). Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 20 раз/мин. На 10 минуте диссоциации проба мутнела, что свидетельствовало об образовании суспензии единичных клеток. На 15 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом: сфероиды в пробе отсутствовали. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 1 мл полной ростовой среды.
Пример 5
Сфероиды из линии эмбриональных фибробластов мыши NIH 3Т3 (1000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 200 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осажденными сфероидами и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С раствор Трипсина (БиолоТ, 1.2.2.4) в объеме 0,5 мл. Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 20 раз/мин. На 12 минуте диссоциации проба мутнела, что свидетельствовало об образовании суспензии единичных клеток. На 15 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом: сфероиды в пробе отсутствовали. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 0,5 мл полной ростовой среды.
Пример 6
Сфероиды из линии клеток ретинального пигментного эпителия человека ARPE-19 (1000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 200 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осажденными сфероидами и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С диссоциирующий раствор в объеме 0,5 мл: смесь 250 мкл TrypLE™ Express (Gibco, 12605028) и 250 мкл Accutase™ (BD, 561527). Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 20 раз/мин. На 10 минуте диссоциации проба помутнела, что свидетельствовало об образовании суспензии единичных клеток. На 15 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом: сфероиды в пробе отсутствовали. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 0,5 мл полной ростовой среды.
Пример 7
Сфероиды из линии клеток ретинального пигментного эпителия человека ARPE-19 (1000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся на агарозных планшетах в течение 7 суток, собирали в центрифужные пробирки объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки из расчета 1 планшет на 1 пробу (в одной пробе 200 сфероидов). В течение 1-1,5 минут происходило пассивное осаждение сфероидов. Затем механической пипеткой из пробирки отбирали среду над осажденными сфероидами и добавляли предварительно нагретый на водяной бане до +37°С раствор Трипсина (БиолоТ, 1.2.2.4) в объеме 0,5 мл. Пробирку помещали в термостат (+37°С) на мини-рокер-шейкер (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого 20 раз/мин. На 12 минуте диссоциации проба начала мутнеть, что свидетельствовало об образовании суспензии единичных клеток. На 15 минуте была проведена оценка степени диссоциации сфероидов под микроскопом: сфероиды в пробе отсутствовали. Ферментативную активность диссоциирующего агента остановили добавлением 0,5 мл полной ростовой среды.
Проводили оценку жизнеспособности полученных в соответствии с примерами 1-7 единичных клеток и иммунофенотипа мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, полученных в соответствии с примерами 1-3.
В полученных в результате диссоциации клеточных суспензиях с помощью автоматического счетчика клеток (Countess фирмы Thermo) подсчитывали количество выделенных жизнеспособных клеток,используя окрашивание 0.4% раствором трипанового синего для выявления погибших клеток, краситель проникает через поврежденные мембраны погибающих и погибших клеток. В таблице 1 приведены данные о количестве и жизнеспособности единичных клеток при использовании различных диссоциирующих агентов (примеры 1-7).
Таблица 1. Количество и жизнеспособность единичных клеток в полученных после диссоциации суспензиях
Пример
Всего клеток, шт.
Из них живых, шт.
Жизнеспособность (%)
1
1,45x10<sup>5</sup> ±0,65
1,05x10<sup>5</sup> ±0,35
79.5±13.5
2
1,15x10<sup>5</sup> ±0,25
0,85x10<sup>5</sup> ±0,25
65.0±13.0
3
1,25x10<sup>5</sup> ±0,75
0,85x10<sup>5</sup> ±0,55
68.5±16.5
4
1,62x10<sup>5</sup> ±0,35
1,11x10<sup>5</sup> ±0,25
75.5±14.1
5
1,27x10<sup>5</sup> ±0,25
0,92x10<sup>5</sup> ±0,15
69.0±11.4
6
1,41x10<sup>5</sup> ±0,45
1,05x10<sup>5</sup> ±0,4
78.0±10.0
7
1,22x10<sup>5</sup> ±0,35
0,84x10<sup>5</sup> ±0,25
71.0±13.0
Как видно из таблицы 1, применение в качестве диссоциирующего агента смеси TrypLE™ Express и Accutase в соотношении 1:1 (примеры 1, 4, 6) позволяет добиться достаточно высокого выхода единичных жизнеспособных клеток из сфероидов при сокращении времени диссоциации. Использование других ферментов (примеры 2, 3, 5, 7) приводило к понижению жизнеспособности и/или к уменьшению выхода клеток.
Иммунофенотип полученных после диссоциации сфероидов смесью TrypLE™ Express и Accutase в соотношении 1:1 (пример 1) мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика человека соответствовал критериям МСК - клетки стабильно экспрессировали CD105, CD90, CD73, CD44 и не экспрессировали маркеры лимфоцитарного и гемопоэтического ряда (CD19, CD11b, CD45, CD34), а также не экспрессировали антиген II класса главного комплекса гистосовместимости HLA-DR и иммуноглобулин подкласса IgG1 (таблица 2).
Таблица 2. Иммунофенотипирование полученных после диссоциации сфероидов мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика человека методом проточной цитометрии
Поверхностные маркеры
%
Позитивные
CD44
98.53
CD90
97.80
CD105
96.28
CD73
99.95
Негативные
Isotype IgG1
0.03
CD19
0.06
CD11b
0.06
CD45
0.07
CD34
0.06
HLA-DR
0.08