СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИЛФЕОФОРБИДА (А)
METHOD OF PRODUCING METHYL PHEOPHORBIDE (A)

Изобретение относится к области органической химии, в частности к химии природных соединений, а именно к получению метил-феофорбида (а), который предназначен для синтеза на его основе порфиринов и хлоринов для целей фотодинамической терапии.
Уровень техники
nd
rd
6
6
Инновационные медицинские технологии, базирующиеся на нанотехнологиях и клеточных технологиях, позволяют создавать устройства для регистрации межмолекулярных взаимодействий на основе оптических и нанопроводных биосенсоров для диагностики и лечения вирусных и раковых заболеваний. Для этих же целей широко применяется метод фотодинамической терапии [Photodynamic tumor therapy, 2 and 3 generation photosensitizers. Ed. J.G. Moser, Harwood Academic Publishers, 1998, Amsterdam]. Этот подход основан на введении в организм некоторых специальных веществ, а именно красителей (сенсибилизаторов), которые вызывают формирование активных форм кислорода в ответ на облучение светом. Наиболее эффективными сенсибилизаторами в силу своих спектральных свойств являются порфирины и хлорины, которые получают из метилфеофорбидов. Так, аргинил-хлорин е и лизил-хлорин р запатентованы как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака [Pat. 5,378,835 (01/1995) USA / Nakazato М. Method of Prodacing Water-soluble Sodium Pheo-phorbide a // C.A. - 1993. - V.117. - 178303у]. Метилфеофорбид синтезируют метанолизом феофитина, который является свободным от металла аналогом хлорофилла. Хлорофилл выделяют из растительного сырья.
Таким образом, разработка новых эффективных способов получения из растительного сырья индивидуальных производных хлорофилла, в частности метилфеофорбида (a) высокой чистоты, с хорошим выходом и в больших количествах является актуальной задачей.
Известен способ получения метилфеофорбида (a), включающий извлечение производных хлорофилла из растительного сырья, а именно из липофильной фракции растений рода Serrotula coronate L, метилирование производных хлорофилла и хроматографическое разделение соединений [Кучин А.В., Карманова Л.П., Белых Д.В. Способ получения метиловых эфиров феофорбидов. Патент РФ №99106221, опубл. 20.03.2001].
Известен способ получения метилфеофорбида (a) [Fischer Н., Stern A. Die chemie des Pyrrols. - Bd.II, 1940. - S.74-75], включающий перемешивание микроводоросли Spirulina Platensis в метаноле в присутствии концентрированной серной кислоты при комнатной температуре в темном месте в течение 2-х суток. Реакционную массу фильтруют на стеклянном пористом фильтре, промывают смесью метанолразбавленная серная кислота. Фильтрат частично выпаривают, разбавляют холодной дистиллированной водой и нейтрализуют водным раствором гидроксида калия. Осадок фильтруют на стеклянном фильтре через слой Celite, многократно промывают кипятком, подсушивают и промывают гексаном. Метилфеофорбид-сырец извлекают с сорбента сначала ацетоном, затем смесью ацетон-хлороформ (1:1), после чего раствор выпаривают. Продукт затирают в метаноле, отфильтровывают на стеклянном фильтре, промывают метанолом и гексаном.
Метилфеофорбид-сырец высушивают и очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент - хлористый метилен-серный эфир 95:5). Затем очищенный метилфеофорбид (a) перекристаллизовывают из смеси хлористый метилен-метанол, кристаллический осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре, промывают метанолом. Из 20 г водоросли получают 0,06 г метилфеофорбида (a).
Известен способ получения метилфеофорбида (а) [Порфирины: структура, свойства, синтез / К.А. Аскаров, Б.Д. Березин и др. - М.: Наука, 1985. - 333 с.], включающий извлечение смеси феофитинов (а+б) из сухих листьев крапивы, выделение феофитина (a) и его мета-нолиз. Для извлечения феофитинов (а+б) тонкоизмельченные высушенные в темноте листья крапивы заливают этанолом. Через сутки раствор хлорофилла (а+б) отфильтровывают, к фильтрату добавляют разбавленную соляную кислоту. Через 12 часов выпавший осадок феофитинов (а+б) отфильтровывают. Из 300 г порошка крапивы получают 2,0-2,2 г феофитина (а+б). Для разделения феофитина (а+б) смесь феофитинов растворяют при кипении в хлороформе с раствором реактива Жирара Т в метаноле и уксусной кислоте, раствор упаривают под вакуумом, твердый остаток растворяют в метиленхлориде и фильтруют через стекловату, фильтрат хроматографируют на окиси алюминия. Полученное после частичного упаривания метиленхлорида вещество переосаждают из метиленхлорида в метанол и получают чистый феофитин (а). Феофитин (а) метилируют метанолом в присутствии разбавленной серной кислоты в темноте при комнатной температуре в течение 15 часов. Затем смесь разбавляют хлороформом, дважды промывают водой, высушивают, переосаждают из метиленхлорида в метанол. Из 20 г крапивы получают 0,1 г метилфеофорбида (а).
Наиболее близким по существу к изобретению, т.е. прототипом, является способ получения метилфеофорбида (a) [Water-soluble porph-rin derivatives for photodynamic therapy, their use and manufacture. US Patent 6777402, August 17, 2004]. Способ осуществляют следующим образом. Перемешивают растительное сырье, а именно Spirulina pla-tensis, или Spirulina maxima, или Chlorella, или Powdered Dry Nettle Leaves, или Frozen Spinach Leaves, в метаноле в присутствии концентрированной серной кислоты 3 час при комнатной температуре. При этом происходит извлечение хлорофилла (а) из растительного сырья, деметаллизация образовавшегося хлорофилла (а) серной кислотой, приводящая к образованию феофитина (а), и метилирование феофитина (а) метанолом, приводящее к получению метилфеофорбида (а).
При этом реакционная масса содержит метанол с растворенным в нем целевым продуктом метилфеофорбидом (а), избыток метанола, избыток серной кислоты, остатки растительного сырья без хлорофилла, растительное сырье, из которого не до конца извлечен хлорофилл, хлорофилл, который не до конца подвергся деметаллизации, феофитин (а), который не до конца подвергся метилированию.
Затем из реакционной массы выделяют целевой продукт. Для этого реакционную массу разбавляют метанолом и фильтруют через Celit, многократно промывая осадок метанолом. Фильтрат дважды экстрагируют гексаном, разбавляют хлороформом, промывают водным раствором хлорида калия, затем водой и растворители отгоняют.
Для очистки метилфеофорбида (а) осадок после отгонки растворителей хроматографируют на окиси алюминия (элюент гексан-хлороформ), растворители отгоняют, продукт дважды перекристаллизовывают из смеси метиленхлорид-метанол.
Недостатками этого способа являются:
3
1. Крайне высокая физиологическая и экологическая опасность процесса из-за использования в синтезе больших количеств метанола. Так, для получения 0,1 г чистого метилфеофорбида (а) на разрушение клеточных стенок растительного сырья, экстракцию содержимого клеток, промывку, хроматографирование, переосаждение, перекристаллизацию требуется 1500-1700 мл метанола. Метанол - сильный нервный и сосудистый яд. Особую токсичность метилового спирта обычно связывают с образованием из него в организме формальдегида и муравьиной кислоты. Отравления метанолом возможны даже при вдыхании его паров, при попадании на кожу. Предельно допустимая концентрация метанола в воздухе 5 мг/м. Особенно опасен метиловый спирт при попадании в органы пищеварения, т.к. 30 мл могут быть смертельны. Все работы с применением метанола должны проводиться с использованием средств индивидуальной защиты, в вытяжном шкафу при наличии хорошо работающей вентиляции. Поскольку при синтезе метилфеофорбида (а) кроме непосредственно метилирования метанол используется для промывки, переосаждения, перекристаллизации и т.д., поэтому в процессе синтеза накапливается большое количество отходов метанола и возникает проблема их утилизации.
2. Значительная длительность и трудоемкость процесса. Процессы выделения хлорофилла (а) из растительного сырья, его деметаллизация в феофитин (а) и метилирование феофитина (а) протекают в одной реакционной массе в течение 3-х час. При этом реакционная масса содержит метанол с растворенным в нем целевым продуктом метилфеофорбидом (а), избыток метанола, избыток серной кислоты, остатки растительного сырья без хлорофилла, растительное сырье, из которого не до конца извлечен хлорофилл, хлорофилл, который не до конца подвергся деметаллизации, феофитин (а), который не до конца подвергся метилированию. Это приводит к тому, что стадии выделения (промывка метанолом, экстракция гексаном, промывка водным раствором хлорида калия, а затем водой, отгонка растворителей) и очистки (хроматографирование на колонке с окисью алюминия, отгонка растворителей, двукратная перекристаллизация) занимают много времени (7-8 суток) и достаточно трудоемки и требуют сборки установки для отгона растворителей, приготовления хроматографических колонок, замены окиси алюминия в колонках после хроматографирования каждой порции продукта.
3. Низкий выход целевого продукта. Из 1 кг растительного сырья получается 1,75 г метилфеофорбида (а).
Сущность изобретения
Изобретательская задача состояла в поиске способа получения метилфеофорбида (а) из микроводоросли Spirulina Platensis путем извлечения из нее хлорофилла (а), его деметаллизации для получения феофитина (а), метилирования последнего метанолом в присутствии серной кислоты и последующих выделения и очистки целевого продукта, который позволил бы значительно сократить физиологическую и экологическую опасность процесса, уменьшить его продолжительность и трудоемкость и увеличить выход целевого продукта.
Поставленная цель достигается способом получения метилфеофорбида (а) из микроводоросли Spirulina Platensis путем извлечения из нее хлорофилла (а), его деметаллизации для получения феофитина (а), метилирования последнего метанолом в присутствии серной кислоты и последующих выделения и очистки целевого продукта, отличающийся тем, что выделение хлорофилла (а) и его деметаллизацию проводят в концентрированной уксусной кислоте при воздействии на реакционную массу ультразвука с частотой 25-30 кГц в течение 2,0-2,5 час при температуре 45-50°С, затем феофитин (а) выделяют осаждением водой, после чего его подвергают метилированию в среде тетрагидрофурана в присутствии серной кислоты при 50-55°С в течение 1,0-1,5 час, выделение целевого продукта осуществляют осаждением водой, а его очистку проводят двукратным переосаждением из метиленхлорида в этанол.
Изобретение позволяет получить следующие преимущества:
- значительно снизить физиологическую и экологическую опасность процесса, т.к. в 55-60 раз сокращается количество применяемого ядовитого метанола, поскольку он используется только для метилирования феофитина (а);
- значительно (в 4-5 раз) сократить длительность процесса;
- в 2 раза увеличить выход продукта.
Сведения, подтверждающие возможность воспроизведения изобретения
Для реализации способа используют следующие вещества:
1. Микроводоросль Spirulina Platensis
2. Уксусная кислота ГОСТ 19814-74
3. Метанол ГОСТ 2222-95
4. Тетрагидрофуран ГОСТ 8313-88
5. Метиленхлорид ГОСТ 8728-88
6. Серная кислота ГОСТ 2184-77
7. Этанол ГОСТ 5964-93
Реализация способа иллюстрируется следующим примером.
Пример 1.
Экстракция хлорофилла из растительного сырья и деметаллизация его в феофитин (а). 1000 г микроводоросли Spirulina Platensis заливают 900 мл 80-85%-уксусной кислоты и нагревают 2,0-2,5 час при 45-50°С при воздействии на реакционную смесь ультразвука с частотой 25-30 кГц. В этих условиях уксусная кислота, полностью экстрагируя хлорофилл, одновременно превращает его в феофитин (а). Реакционную смесь фильтруют, фильтрат выливают в воду, осадок феофитина (а) отфильтровывают. Из 1000 г порошка микроводоросли получают 5 г феофитина (а).
Получение метилфеофорбида (а). 5 г феофитина (а) и 45-50 мл метанола, содержащего 4-5% серной кислоты для подкисления среды, нагревают при перемешивании в 90-100 мл тетрагидрофурана при 50-55°С 1,0-1,5 час.
Выделение метилфеофорбида (а). Смесь голубовато-зеленого цвета выливают в 1,0-1,2 л ледяной воды, осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре, высушивают.
1
2
2
2
3
3
2
2
3
3
2
3
Очистка метилфеофорбида (а). Продукт очищают двукратным переосаждением из метиленхлорида в этанол. Получают 3 г чистого метилфеофорбида (а). ЯМРН-спектр: 9.41, 9.23, 8.56 (3Н, все s, мезо-Н); 7.88 (1H,q, -CH.dbd.CH), 6.25-6.10 (2Н, -CH.dbd.CH), 6.28 (1Н, s, циклопентанон-H), 4.50, 4.25 (2H, m, 7-H, 8-H); 3.55 (2H,q, 4-CHCH); 3.93, 3.70, 3.63, 3.39, 3.15 (15H, все s, 5.upsilon. -CH); 2.75-2.20 (4H, m, -CHCHCOOCH); 1.85 (3H,d, 8-CH); 1.71 (3H, m, 4-CHCH); 0.55 и -1.68 ppm (2H, 2 broad s, 2.upsilon. -NH-).
Выходы целевого продукта, полученного заявленным способом при различных параметрах его осуществления, приведены в таблице.
Таблица
Выход целевого продукта
№ п/п
Параметры
Выход, г
Частота ультразвука, кГц
Время обработки ультразвуком, час
Темпер. обработки ультразвуком, °С
Время метилирования, час
Темпер. метилирования, °С
1
25
2.1
48
1.0
50
3.1
2
27
2.0
45
1.3
52
3.3
3
30
2.5
50
1.5
55
3.5