ВЕКТОР
VECTOR

Область техники
Настоящее изобретение относится к вектору, содержащему определенные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие NPY и его рецептор Y2 (NPY2R), в сочетании с конкретными элементами вектора. Более того, настоящее изобретение относится к указанному вектору, инкапсулированному в капсидные белки из аденоассоциированного вируса серотипа 1, 2 и 8, образующие частицы AAV. Наконец, настоящее изобретение относится к указанному вектору или к указанным частицам AAV, которые применяют для получения лекарственного средства для лечения у млекопитающего неврологического нарушения, такого как эпилепсия.
Уровень техники
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), нарушения, относящиеся к центральной нервной системе, создают значительную социально-экономическую медицинскую проблему, и доступные на сегодняшний день варианты лечения являются недостаточными. Данные нарушения включают, без ограничения, эпилепсию и болезнь Паркинсона.
Эпилепсия представляет собой одно из старейших распознанных неврологических состояний в мире, первые письменные упоминания о котором датируются 4000 годом до н.э. Страх, непонимание, дискриминация и социальная стигматизация сопровождали эпилепсию в течение столетий. Данная стигматизация, которая во многих странах продолжается и сегодня, может повлиять на качество жизни людей, страдающих от данного нарушения, а также их семей. Приблизительно 1% людей по всему миру страдают от эпилепсии, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологических заболеваний на мировом уровне.
Эпилептические припадки представляют собой эпизоды, которые могут варьировать от кратких и практически не обнаруживаемых до длительных периодов интенсивного тремора. При эпилепсии припадки, как правило, повторяются, и часто не имеют идентифицируемой первопричины.
Эпизоды припадков являются следствием чрезмерных электрических разрядов в группе синхронизированных клеток головного мозга. Различные части головного мозга могут представлять собой участок таких разрядов. Наиболее распространенный тип эпилепсии, который поражает 6 из 10 субъектов, страдающих от данного нарушения, называют идиопатической эпилепсией, и он не имеет идентифицируемой причины. Эпилепсию с известной причиной называют вторичной эпилепсией, или симптоматической эпилепсией. Причины вторичной (или симптоматической) эпилепсии включают: повреждение головного мозга вследствие пренатальных или перинатальных травм, врожденные аномалии или генетические заболевания со связанными врожденными пороками развития головного мозга, тяжелую травму головы, инсульт, который ограничивает количество кислорода, поступающее в головной мозг, инфекцию головного мозга, такую как менингит, энцефалит, нейроцистицеркоз, определенные генетические синдромы или опухоль головного мозга.
Согласно оценкам, свыше 70% случаев эпилепсии можно лечить ежедневным введением лекарственных средств. Однако в случае людей, плохо отвечающих на лечение, они могут оставаться не получавшими лечение или прибегнуть к хирургическому или нефармакологическому лечению эпилепсии, такому как глубокая стимуляция головного мозга (ГСГМ), стимуляция блуждающего нерва (СБН) или диета.
Согласно данным ВОЗ, на эпилепсию приходится 0,75% от общего бремени заболевания - зависящего от времени показателя, который объединяет годы жизни, потерянные в связи с преждевременной смертностью, и время, прожитое в состоянии, не соответствующем полному здоровью. В 2012 году эпилепсия была причиной утраты приблизительно 20,6 миллионов лет жизни с поправкой на инвалидность (disability-adjusted life years, DALY). Эпилепсия характеризуется значительными экономическими последствиями с точки зрения потребностей здравоохранения, преждевременной смерти и потери производительности труда.
Таким образом, существует потребность в разработке новых подходов и, следовательно, новых способов лечения эпилепсии. В патенте ЕР 2046394 А1 описан многообещающий подход для лечения нарушений нервной системы, в котором один или несколько нейропептидов сверхэкспрессируют в клетках нервной системы вместе с одним или несколькими их соответствующими рецепторами. Повышенное высвобождение нейромедиатора часто приводит к компенсаторной понижающей регуляции рецепторов, опосредующих эффекты нейромедиатора, таким образом, экспрессия соответствующих рецепторов помогает избежать ограничения терапевтического эффекта с течением времени. Улучшенный подход с применением концепции сверхэкспрессии нейропептида и рецептора будет характеризоваться преимуществом для нового варианта лечения эпилепсии, в особенности, для лечения фармакорезистентной эпилепсии - типов эпилепсии, в которых применяемые на сегодняшний день подходы фармацевтического лечения не приводят к желаемому терапевтическому эффекту.
Краткое описание изобретения
Соответственно, аспекты настоящего изобретения, предпочтительно, направлены на смягчение, облегчение или устранение одной или нескольких из указанных выше недоработок в данной области техники, а также недостатков, по отдельности или в любой комбинации, и на решение по меньшей мере вышеупомянутых проблем посредством обеспечения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного (recombinant adeno-associated viral, rAAV) вектора, содержащего последовательность, кодирующую нейропептид Y (neuropeptide Y, NPY), и последовательность, кодирующую рецептор нейропептида Y2 (NPY2R).
Согласно одному аспекту настоящего изобретения вектор также содержит по меньшей мере один, предпочтительно, все, из следующих функциональных элементов: последовательностей инвертированных концевых повторов (Inverted Terminal Repeat, ITR) AAV2, гибридного промотора CAG из энхансера цитомегаловируса/бета-актина кур (CAG), внутреннего участка посадки рибосомы (internal ribosome entry site, IRES), посттрансляционного регуляторного элемента вируса гепатита сурков (woodchuck hepatitis post-translational regulatory element, WPRE) и/или сигнальной последовательности полиаденилирования бычьего гормона роста (bovine growth hormone polyadenylation, bGH-polyA).
Согласно одному аспекту настоящего изобретения частица AAV содержит указанный вектор, причем вектор является инкапсулированным капсидными белками аденоассоциированного вируса (adeno-associated virus, AAV).
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит указанную частицу AAV для применения при предотвращении, ингибировании или лечении неврологического нарушения, такого как эпилепсия или болезнь Паркинсона, у млекопитающего.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения способ лечения, ингибирования или облегчения неврологического нарушения у субъекта включает введение в клетки центральной нервной системы субъекта, такого как млекопитающий субъект или субъект-человек, страдающий от неврологического нарушения, такого как эпилепсия или болезнь Паркинсона, фармацевтически эффективного количества указанной композиции.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения способ доставки генома NPY и Y2 в клетку млекопитающего включает введение в клетку указанной частицы AAV. Согласно еще одному варианту реализации способ введения генома NPY и Y2 субъекту, такому как млекопитающий субъект или субъект-человек, включает введение субъекту указанной клетки.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения способ доставки генома NPY и Y2 субъекту включает введение в клетку млекопитающего у субъекта указанной частицы AAV, причем вирусную частицу вводят в гиппокамп субъекта.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения способ снижения тяжести заболевания, при котором NPY обладает терапевтическим эффектом или которое вызвано недостаточностью NPY, причем указанное заболевание выбрано из эпилепсии или болезни Паркинсона, включает введение в клетки центральной нервной системы субъекта, страдающего от неврологического нарушения, фармацевтически эффективного количества указанной композиции.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения способ обеспечения NPY субъекту, который нуждается в NPY, такому как субъект, выбранный как таковой, страдающий от недостаточности NPY, по результатам клинической оценки или диагностического теста, такого как, например, ЭЭГ (электроэнцефалография) и/или клинический диагноз эпилепсии или болезни Паркинсона, включает выбор субъекта, который нуждается в NPY, такого как субъект, страдающий от недостаточности NPY, и обеспечение указанного субъекта фармацевтически эффективным количеством указанной композиции.
Другие аспекты настоящего изобретения также касаются альтернативных вариантов, представленных в формуле изобретения.
Краткое описание чертежей
Данные и другие аспекты, свойства и преимущества, которые способно обеспечить настоящее изобретение, будут очевидны и объяснены в последующем описании вариантов реализации настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
Фиг. 1А и В представляют собой схематические представления векторов, применяемых в нескольких из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, причем трансгенный порядок расположения нейропептида Y (NPY) и рецептора 2 нейропептида (NPY2R) является следующим: NPY расположен в направлении 3'-5' от NPY2R (фигура 1А) или NPY2R расположен в направлении 3'-5' от NPY (фигура 1В).
3
На фигуре 2 представлен график, обобщающий трансгенную экспрессию в трансфицированных клетках НЕК293 методом цкПЦР (цифровой капельной полимеразной цепной реакции). Количество целевых последовательностей NPY и NPY2R измеряли методом цкПЦР. В качестве контролей использовали необработанные клетки или плазмиду экспрессии AAV без последовательностей, кодирующих NPY и NPY2R (IRES). Парный t-критерий Стьюдента, t=3,927, *Р=0,0294. Точки/столбцы данных представляют собой среднее значение + СОС (стандартная ошибка среднего, n=4 на лечение).
На фигуре 3 представлен график, иллюстрирующий экспрессию NPY в гиппокампальных срезах крыс. Уровни NPY в области СА1 дорсального гиппокампа через три недели после одностороннего лечения вектором AAV. Уровни NPY оценивали в соответствии с наблюдаемым NPY-положительным иммунофлуоресцентным сигналом: 1 (уровни NPY, соответствующие эндогенным уровням), 2 (низкая экспрессия NPY выше эндогенного уровня), 3 (умеренная экспрессия NPY выше эндогенного уровня) и 4 (высокая экспрессия NPY выше эндогенного уровня). Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни. *Р<0,05 по сравнению с контрольными животными, ранее не получавшими лечение.
На фигуре 4 представлены изображения, иллюстрирующие экспрессию NPY в дорсальном гиппокампе через три недели после одностороннего лечения вектором AAV-NPY/Y2. Чем темнее окрашивание DAB (3,3-диаминобензидином), тем выше уровни NPY-подобной иммунореактивности. Крысы, получавшие лечение векторами AAV-Y2/NPY (не показано), характеризовались экспрессией NPY, соответствующей 9-17% экспрессии, наблюдаемой на фигуре.
Фигура 5А и 5В иллюстрирует функциональность NPY2R в гиппокампальных срезах крыс, причем на фигуре 5А представлен график, иллюстрирующий уровни связывания функционального NPY2R в области СА1 дорсального гиппокампа через три недели после одностороннего лечения вектором AAV. Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью непарного двустороннего t-критерия Стьюдента. *Р<0,05, ***Р<0,001 по сравнению с контрольными животными, ранее не получавшими лечение. На фигуре 5В представлены типичные изображения связывания функционального NPY2R, проиллюстрированного на фигуре А.
Фигура 6 иллюстрирует экспрессию NPY2R в гиппокампальных срезах крыс, причем на фигуре 6А представлен график, иллюстрирующий уровни связывания NPY2R в дорсальном гиппокампе через три недели после одностороннего лечения вектором AAV. Связывание рецептора Y2 оценивали в гиппокампальной области СА1, и присваивали значения, соответствующие сигналу рецептора Y2: 1 (экспрессия рецептора Y2, соответствующая эндогенным уровням), 2 (низкая экспрессия рецептора Y2 выше эндогенного уровня), 3 (умеренная экспрессия рецептора Y2 выше эндогенного уровня) и 4 (высокая экспрессия рецептора Y2 выше эндогенного уровня). Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни. *Р<0,05 по сравнению с контрольными животными, ранее не получавшими лечение. На фигуре 6 В представлены типичные изображения связывания функционального NPY2R, проиллюстрированного на фигуре 6А.
На фигуре 7 представлен график, иллюстрирующий развитие припадка в течение периода наблюдения длительностью 2 часа после однократной инъекции каината (п.к., подкожно), в зависимости от уровней индуцированной AAV сверхэкспрессии трансгена. На фигуре 7А представлена взаимосвязь между развитием припадка и индуцированной AAV сверхэкспрессией трансгена NPY. Контроль: уровни NPY, соответствующие эндогенным уровням (соответствующие значению 1 на фигуре 3); Низкие: Низкие уровни экспрессии трансгена NPY (соответствующие значению 2 на фигуре 3); Высокие: Высокие уровни экспрессии трансгена NPY (соответствующие значениям 3-4 на фигуре 3). а) Время ожидания первого двигательного припадка (ДП), b) Время ожидания эпилептического состояния (ЭС), и с) Время припадка в значительной степени отличались у получавших лечение крыс с высоким уровнем экспрессии трансгена NPY, что демонстрирует противоэпилептические эффекты, по сравнению с крысами, которые характеризовались экспрессией NPY, равной эндогенным уровням, d) Количество припадков оставалось неизменным во всех категориях. На фигуре 7В представлена взаимосвязь между развитием припадка и индуцированной AAV сверхэкспрессией трансгена NPY2R (Y2). Контроль: уровни NPY2R, соответствующие эндогенным уровням (соответствующие значению 1 на фигуре 3); Низкие: Низкие уровни экспрессии трансгена NPY2R (соответствующие значению 2 на фигуре 3); Высокие: Высокие уровни экспрессии трансгена NPY2R (соответствующие значениям 3-4 на фигуре 3). а) Время ожидания первого двигательного припадка (ДП), b) Время ожидания эпилептического состояния (ЭС), с) Время припадка и d) Количество припадков в значительной степени не изменялись в какой-либо из категорий экспрессии NPY2R. Однако в категории высоких уровней экспрессии NPY2R наблюдалась четкая тенденция, в особенности, в отношении снижения с) Времени припадка. Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью апостериорных критериев множественного сравнения Бонферрони с последующим статистически значимым однофакторным анализом ANOVA. *Р<0,05, **Р<0,01.
Фигура 8 иллюстрирует эффекты двусторонних интрагиппокампальных инъекций вектора AAV в отношении вызванных КА (каинатом) припадков: На фигуре 8А представлены эффекты двусторонних интрагиппокампальных инъекций вектора AAV1 в отношении вызванных КА припадков, а) Время ожидания первого двигательного припадка и d) общее количество припадков оставались неизменными после опосредованной вектором AAV1 сверхэкспрессии NPY и Y2 по сравнению с контролем (пустой AAV1). b) Время ожидания эпилептического состояния (ЭС) и с) Общее время припадка в значительной степени снижались после лечения AAV1-NPY/Y2 по сравнению с контролем (пустой AAV1), тогда как AAV1-Y2/NPY не оказывал значительных эффектов. Данные представляют собой среднее значение ±СОС (n=7-8 в каждой группе). *Р<0,05 по сравнению с контролем (пустой AAV1), апостериорные критерии множественного сравнения Бонферрони с последующим статистически значимым однофакторным анализом ANOVA. На фигуре 8 В представлены эффекты двусторонних интрагиппокампальных инъекций AAV2 в отношении вызванных КА припадков. После опосредованной вектором AAV2 сверхэкспрессии NPY и Y2 не наблюдались эффекты в отношении вызванных КА припадков. Исследование включало следующие наблюдения: а) Время ожидания первого двигательного припадка, b) Время ожидания эпилептического состояния (ЭС), с) Общее время припадка, и d) общее количество припадков. Данные представляют собой среднее значение ±СОС (n=8 в каждой группе). Апостериорные критерии множественного сравнения Бонферрони с последующим статистически значимым однофакторным анализом ANOVA. На фигуре 8С представлены эффекты двусторонних интрагиппокампальных инъекций вектора AAV8 в отношении вызванных КА припадков. После опосредованной вектором AAV8 сверхэкспрессии NPY и Y2 эффекты в отношении вызванных КА припадков не наблюдались. Исследование включало следующие наблюдения: а) Время ожидания первого двигательного припадка, b) Время ожидания эпилептического состояния (ЭС), с) Общее время припадка и d) общее количество припадков. Данные представляют собой среднее значение ±СОС (n=8-12 в каждой группе). Апостериорные критерии множественного сравнения Бонферрони с последующим статистически значимым однофакторным анализом ANOVA.
Фигура 9 иллюстрирует эффекты двусторонних интрастриарных инъекций вектора AAV1-NPY/Y2 или пустого AAV (контроль) мышам при вызванной галоперидолом каталепсии паркинсонических симптомов. А) Лечение вектором AAV1-NPY/Y2 вызывало значительное снижение времени, проведенного в каталепсическом состоянии, по сравнению с пустым AAV1. Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью двустороннего ANOVA для повторных измерений. *Р<0,05 указывает на общий значимый эффект лечения между лечением пустым вектором AAV1 и вектором AAV1-NPY/Y2. В) Лечение вектором AAV1-NPY/Y2 вызывало значительное снижение среднего времени, проведенного в каталепсическом состоянии, наблюдаемого с интервалами длительностью 15 минут, по сравнению с пустым AAV1. Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью двумерного t-критерия Стьюдента. *Р<0,05.
Описание вариантов реализации
Следующее описание сфокусировано на варианте реализации настоящего изобретения, применимом к векторам AAV для генотерапии, и, в особенности, к частицам AAV указанных векторов для лечения неврологического нарушения, такого как эпилепсия, у млекопитающего.
Неврологические нарушения включают большую группу нарушений нервной системы, включая, без ограничения, головной мозг, спинной мозг и другие нервы, со структурными, биохимическими аномалиями и/или аномалиями передачи сигналов, среди прочего. Неврологические нарушения не ограничены людьми, но также обнаружены у других млекопитающих, таких как лошади, собаки и кошки, которых в настоящем документе называют «субъектами». Например, частота возникновения эпилепсии собак в общей популяции собак, согласно оценкам, составляет от 0,5% до 5,7%.
Нейропептид Y (NPY) представляет собой пептидный нейромедиатор длиной 36 аминокислот, один из наиболее обильно экспрессируемых в центральной нервной системе млекопитающих. На моделях нейродегенеративных заболеваний на животных, таких как болезнь Альцгеймера (Rose et al., 2009), Хантингтона и болезнь Паркинсона, было показано, что NPY осуществляет нейропротекторную функцию. Изначально было показано, что NPY снижает возбуждение в коллатеральных синапсах СА1 Шеффера на гиппокампальных срезах крыс и, как впоследствии было показано, осуществляет рецептор Y2-зависимое ингибирование предсинаптического высвобождения глутамата. Глутамат представляет собой главный возбуждающий нейромедиатор в головном мозге и, как следствие, отвечает за запуск, распространение и увеличение масштаба синаптической передачи, которая наблюдается при судорожной активности. Соответственно, мутантные мыши с дефицитом NPY являются более подверженными припадкам, и интрацеребровентрикулярное введение NPY оказывает антиэпилептиформные эффекты in vivo на экспериментальных моделях припадков на крысах. Важно отметить, что NPY также ингибирует возбуждающую синаптическую передачу в эпилептическом гиппокампе человека (Patrylo et al., 1999; Ledri et al., 2015). Антиэпилептические эффекты NPY в гиппокампе опосредованы, преимущественно, связыванием с рецепторами Y2 или Y5 (Woldbye et al., 1997, 2005; El Bahh et al., 2005; Benmaamar et al., 2005), тогда как активация рецепторов Y1 стимулирует возникновение припадков (Benmaamar et al., 2003).
Благодаря антиэпилептическим эффектам NPY применяли в таргетной генотерапии. Таким образом, опосредованная rAAV гиппокампальная сверхэкспрессия NPY оказывает супрессивные эффекты в отношении вызванных стимуляцией острых припадков на крысах и в отношении спонтанных припадков через три месяца после поражения эпилептическим состоянием. Для извлечения преимуществ из неодинаковой вовлеченности, специфичной к подтипу рецептора NPY, также проводили генотерапию со сверхэкспрессией рецепторов Y1, Y2 или Y5 самих по себе или в комбинации с NPY. Таким образом, объединенная гиппокампальная сверхэкспрессия NPY и Y2 или Y5 обладала превосходящим подавляющим припадки эффектом в отношении вызванных стимуляцией острых припадков на крысах по сравнению со сверхэкспрессией NPY или рецептора самих по себе (Woldbye et al., 2010;  et al., 2012).
Напротив, гиппокампальная сверхэкспрессия рецепторов Yl приводила к стимулирующим припадки эффектам, как было предсказано в последующих исследованиях (Benmaamar et al., 2003; Olesen et al., 2012). В аналогичном подходе опосредованная вектором rAAV сверхэкспрессия предпочтительного агониста Y2 - NPY13-36 - также демонстрировала антиэпилептические эффекты (Foti et al., 2007). Как следствие, трансляционное значение антиэпилептических эффектов опосредованной вектором rAAV сверхэкспрессии рецептора NPY и Y2 получило дальнейшую поддержку при исследовании на клинически значимой долговременной хронической модели эпилепсии на крысах (Ledri et al., 2016).
В настоящем документе описаны несколько подходов генотерапии с применением векторов AAV для лечения или ингибирования эпилепсии и/или болезни Паркинсона у субъекта, который нуждается в таком ингибировании. Более того, на сегодняшний день векторы AAV считают безопасными для применения с целью доставки терапевтических трансгенов при лечении неврологических заболеваний (McCown, 2011; Bartus et al., 2014). Однако разработка рекомбинантных вирусных векторов, эффективно экспрессирующих свои терапевтические трансгены безопасным способом, столкнулась с несколькими трудностями, которые являются естественным препятствием для широкого применения таких векторов в генотерапии человека. Таким образом, разработка новой генотерапии с использованием векторов rAAV включает тщательный отбор многих различных элементов, позволяющих создать изготовленные по специальным требованиям заказчика и уникальные конструкции для специфичного нацеливания тканевой и генотерапии.
Предполагается, что новая генотерапия, включающая сверхэкспрессию рецепторов NPY и Y2, кодируемых одним rAAV, обеспечит эффективную экспрессию in vivo с учетом конкретного выбора компоновки вектора и функциональных элементов, изложенных в настоящем документе (например, порядка генетических элементов в конструкции и/или расстояния между определенными генетическими элементами), при применении в сочетании с капсидными белками конкретного серотипа AAV. Описание изобретения, представленное ниже, обеспечивает более подробные сведения о данных композициях, а также способах получения и применения данных композиций для лечения и/или ингибирования эпилепсии и/или болезни Паркинсона у субъектов, нуждающихся в средстве, которое лечит или облегчает эпилепсию или болезнь Паркинсона либо связанные с ними расстройства, такие как судорожная активность.
Вектор rAAV NPY и NPY2R
При наличии последовательности, кодирующей NPY и NPY2R, в одном векторе, NPY2R и NPY будут распространяться гомологичным образом, обеспечивая непосредственную близость экспрессии эффекторной молекулы NPY и ее мишени, ингибирующего припадки рецептора NPY2R. Также при наличии последовательности, кодирующей NPY и NPY2R, в одном векторе, количество вставок в геном NPY и NPY2R в одной клетке может являться гомологичным, что обеспечивает контролируемое соотношение встроенных генов NPY и NPY2R.
Таким образом, согласно первому варианту реализации рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор содержит последовательность, кодирующую нейропептид Y (NPY; см. также SEQ ID NO: 15), и последовательность, кодирующую рецептор нейропептида Y2 (NPY2R; см. также SEQ ID NO: 16).
Последовательность, кодирующая нейропептид Y (NPY), в векторе может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, или характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 1. Последовательность, кодирующая нейропептид Y (NPY), может быть усечена при условии, что она кодирует функциональный нейропептид Y, например, молекула может связываться со своим рецептором. Усеченная последовательность может содержать по меньшей мере 255, например, 265, 275, 285, 290 (из 294) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 1 и кодировать функциональный нейропептид Y, например, молекула может связываться со своим рецептором.
Последовательность, кодирующая рецептор нейропептида Y2 (NPY2R), в векторе может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, или характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 2. Последовательность, кодирующая рецептор нейропептида Y2 (NPY2R), может быть усечена при условии, что она представляет собой функциональный рецептор нейропептида Y2, например, молекула может связываться со своим лигандом. Усеченная последовательность может содержать по меньшей мере 975, например, 1000, 1115, 1130, 1140 (до 1146) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 2 и кодировать функциональный рецептор нейропептида Y2, например, молекула может связываться со своим лигандом.
Несмотря на то, что изобилие рецептора является фактором тканеспецифичной экспрессии, на тканеспецифичную экспрессию могут оказывать влияние другие элементы вектора AAV. Дополнительный контроль экспрессии обеспечен в дизайне вектора путем контроля ориентации трансгена, что означает порядок генов NPY и NPY2R и/или расстояния до промоторных элементов и/или энхансерных элементов от генов, кодирующих NPY и/или NPY2R, в векторе, как описано ниже. Транскрипционная интерференция, вызванная эндогенными промоторами генов или промоторными элементами или энхансерными элементами, оказывает влияние на экспрессию трансгена в локусе. Таким образом, вектор был модифицирован для улучшения экспрессии трансгена в отношении отобранных промоторных элементов и/или энхансерных элементов вектора, по сравнению с общепринятыми дизайнами вектора, в которых данные модификации отсутствуют. Согласно первому варианту реализации трансгенная ориентация генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе является такой, что ген, кодирующий NPY, предшествует гену, кодирующему NPY2R, с точки зрения близости к промотору (например, ген, кодирующий NPY, присутствует на векторе в направлении 3'-5' от гена, кодирующего NPY2R, так что он является более проксимальным к промотору, чем ген, кодирующий NPY2R). Указанная последовательность, кодирующая нейропептид Y (NPY), может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью. Указанная последовательность, кодирующая рецептор нейропептида Y2 (NPY2R), может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью. Посредством экспрессии генов последовательность, кодирующая нейропептид Y (NPY), используется в синтезе препробелка про-нейропептида Y (SEQ ID NO: 15), и последовательность, кодирующая рецептор нейропептида Y2 (NPY2R), используется в синтезе рецептора нейропептида Y типа 2 (SEQ ID NO: 16). Как известно специалисту в данной области техники, возможно, что альтернативные последовательности могут также кодировать одну пептидную последовательность. Таким образом, рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор может также содержать последовательность, кодирующую белок согласно SEQ ID NO: 15, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью, и последовательность, кодирующую белок согласно SEQ ID NO: 16, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью. Ген, кодирующий NPY, может являться смежным с указанным промотором. Ген, кодирующий NPY, может начинаться в пределах 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца области промотора (например, ген, кодирующий NPY, начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27,28, 29,30,31,32,33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 нуклеотидов от конца области промотора, или ген, кодирующий NPY, начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от промотора). Промотор может представлять собой промотор из энхансера цитомегаловируса/β-актина кур (CAG). Последовательность промотора CAG в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4. Последовательность промотора CAG может быть усечена при условии, что она является функциональной (например, индуцирует экспрессию гена), и усеченная последовательность промотора CAG может содержать по меньшей мере 850, например, 875, 900, 925, 935 (из 936) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4 и индуцировать экспрессию гена; то есть, быть функционально связанной с указанным промотором. Промотор CAG может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) (%ИП), с SEQ ID NO: 4. Последовательность IRES может быть расположена между генами, кодирующими NPY и NPY2R, в векторе. Последовательность IRES может начинаться в пределах 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY (например, последовательность IRES начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY, или последовательность IRES начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от последовательности, кодирующей NPY). Последовательность IRES может заканчиваться в пределах 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от начала гена, кодирующего NPY2R (например, последовательность IRES заканчивается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов от начала гена, кодирующего NPY2R, или последовательность IRES заканчивается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от начала последовательности, кодирующей NPY2R). Последовательность IRES может представлять собой последовательность IRES А7 EMCV. Последовательность IRES А7 EMCV в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 3. Последовательность IRES А7 EMCV может быть усечена при условии, что она является функциональной (например, индуцирует экспрессию генов), и усеченная последовательность IRES А7 EMCV может содержать по меньшей мере 525, 545, 560, 570 или 575 (из 582) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 3. IRES может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 3. Посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE) может быть расположен в направлении 5'-3' от генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе, и WPRE необязательно является проксимальным к гену и/или является смежным с геном, кодирующим NPY2R. Последовательность WPRE может быть расположена в направлении 5'-3' от гена, кодирующего NPY2R, в векторе. Последовательность WPRE может начинаться в пределах 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY2R (например, последовательность WPRE начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY2R, или последовательность WPRE начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от последовательности, кодирующей NPY2R). Последовательность WPRE в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. Данная последовательность характеризуется 100%-ной гомологией с парами оснований с 1093 по 1684 генома вируса гепатита В сурков (WHV8). Последовательность WPRE может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность WPRE может содержать по меньшей мере 525, 545, 555, 565, 575 или 585 (из 593) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. WRPE может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. Вектор может содержать сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA), который расположен в направлении 5'-3'от генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе, и необязательно является проксимальным к гену и/или является смежным с WPRE. Последовательность BGHpA может быть расположена в направлении 5'-3' от последовательности WPRE. Последовательность BGHpA может начинаться в пределах 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца последовательности WPRE (например, последовательность BGHpA начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов от конца последовательности WPRE, или последовательность BGHpA начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от последовательности WPRE). Последовательность BGHpA, также называемая «сигнальной последовательностью BGHpA», в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6. Сигнальная последовательность BGHpA может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная сигнальная последовательность BGHpA может содержать по меньшей мере 225, 235, 245, 255 или 265 (из 269) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%о, 98%) или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6. Сигнал BGHpA может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6. Вектор может также содержать первый домен инвертированного концевого повтора (ITR) AAV2, расположенный в направлении 3'-5' от промотора, и/или второй домен ITR, расположенный в направлении 5'-3' от генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе, предпочтительно, второй домен ITR расположен проксимально относительно домена BGHpA. 5'-концевая последовательность ITR в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7. 5'-концевая последовательность ITR может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность ITR может содержать по меньшей мере 145, например, 155, 165, 175, 180 (из 183) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7. 3'-концевая последовательность ITR в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. 3'-концевая последовательность ITR может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность ITR может содержать по меньшей мере 145, например, 155, 165, 175, 180 (из 183) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. 5'-концевой ITR может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 7, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7, и 3'-концевой ITR содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. Любой один или несколько из вышеупомянутых генов могут являться кодон-оптимизированными для экспрессии у человека. Как описано ниже, было обнаружено, что три серотипа AAV являются эффективными для доставки генов векторами, описанными в настоящем документе: AAV2, AAV1 и AAV8. Соответственно, векторы, описанные выше, могут быть упакованы с капсидными белками AAV, которые выбраны из группы, состоящей из AAV1, AAV2 и AAV8. Также, как описано ниже, было обнаружено, что векторы, упакованные с капсидными белками AAV, продемонстрировали лучшие результаты в исследованиях на модели эпилептических припадков; таким образом, предпочтительной упаковкой векторов является упаковка с капсидными белками AAV1.
Согласно второму варианту реализации трансгенная ориентация генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе является такой, что ген, кодирующий NPY2R, предшествует гену, кодирующему NPY, так что он является более проксимальным к промотору (например, ген, кодирующий NPY2R, присутствует на векторе в направлении 3'-5' от гена, кодирующего NPY, так что он является более проксимальным к промотору, чем ген, кодирующий NPY). Указанная последовательность, кодирующая нейропептид Y (NPY), может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью. Указанная последовательность, кодирующая рецептор нейропептида Y2 (NPY2R), может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью. Посредством экспрессии генов последовательность, кодирующая нейропептид Y (NPY), используется в синтезе препробелка про-нейропептида Y (SEQ ID NO: 15), и последовательность, кодирующая рецептор нейропептида Y2 (NPY2R), используется в синтезе рецептора нейропептида Y типа 2 (SEQ ID NO: 16). Как известно специалисту в данной области техники, возможно, что альтернативные последовательности могут также кодировать одну пептидную последовательность. Таким образом, рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор может содержать последовательность, кодирующую белок согласно SEQ ID NO: 15, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью, и последовательность, кодирующую белок согласно SEQ ID NO: 16, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с указанной последовательностью. Ген, кодирующий NPY, может являться смежным с указанным промотором. Ген, кодирующий NPY2R, может начинаться в пределах 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца области промотора (например, ген, кодирующий NPY2R, начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 нуклеотидов от конца области промотора, или ген, кодирующий NPY2R, начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от промотора). Промотор может представлять собой промотор из энхансера цитомегаловируса/β-актина кур (CAG). Последовательность промотора CAG в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4. Последовательность промотора С AG может быть усечена при условии, что она является функциональной (например, индуцирует экспрессию гена), и усеченная последовательность промотора CAG может содержать по меньшей мере 850, например, 875, 900, 925, 935 (из 936) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4 и индуцировать экспрессию гена, то есть, быть функционально связанной с указанным промотором. Промотор CAG может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%), 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4. Последовательность IRES может быть расположена между генами, кодирующими NPY и NPY2R, в векторе. Последовательность IRES может начинаться в пределах 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY2R (например, последовательность IRES начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY2R, или последовательность IRES начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от последовательности, кодирующей NPY2R). Последовательность IRES может заканчиваться в пределах 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от начала гена, кодирующего NPY (например, последовательность IRES заканчивается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов от начала гена, кодирующего NPY, или последовательность IRES заканчивается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от начала последовательности, кодирующей NPY). Последовательность IRES может представлять собой последовательность IRES А7 EMCV. Последовательность IRES А7 EMCV в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 3. Последовательность IRES А7 EMCV может быть усечена при условии, что она является функциональной (например, индуцирует экспрессию генов), и усеченная последовательность IRES А7 EMCV может содержать по меньшей мере 525, 545, 560, 570 или 575 (из 582) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 3. IRES может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 3. Посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE) может быть расположен в направлении 5'-3' от генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе, и WPRE необязательно является проксимальным к гену и/или является смежным с геном, кодирующим NPY. Последовательность WPRE может быть расположена в направлении 5'-3' от гена, кодирующего NPY, в векторе. Последовательность WPRE может начинаться в пределах 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY (например, последовательность WPRE начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов от конца гена, кодирующего NPY, или последовательность WPRE начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от последовательности, кодирующей NPY). Последовательность WPRE в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. Данная последовательность характеризуется 100%-ной гомологией с парами оснований с 1093 по 1684 генома вируса гепатита В сурков (WHV8). Последовательность WPRE может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность WPRE может содержать по меньшей мере 525, 545, 555, 565, 575 или 585 (из 593) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. WRPE может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. Вектор может содержать сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA), который расположен в направлении 5'-3' от генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе и необязательно является проксимальным к и/или является смежным с WPRE. Последовательность BGHpA может быть расположена в направлении 5'-3' от последовательности WPRE. Последовательность BGHpA может начинаться в пределах 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15 или 5-10 нуклеотидов от конца последовательности WPRE (например, последовательность BGHpA начинается за 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов от конца последовательности WPRE, или последовательность BGHpA начинается в пределах диапазона, заданного любыми двумя из вышеупомянутых количеств положений нуклеотидов, от последовательности WPRE). Последовательность BGHpA, также называемая «сигнальной последовательностью BGHpA», в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) (%ИП), с SEQ ID NO: 6. Сигнальная последовательность BGHpA может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная сигнальная последовательность BGHpA может содержать по меньшей мере 225, 235, 245, 255 или 265 (из 269) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%) или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6. Сигнал BGHpA может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6. Вектор может также содержать первый домен инвертированного концевого повтора (ITR) AAV2, расположенный в направлении 3'-5' от промотора, и/или второй домен ITR, расположенный в направлении 5'-3'от генов, кодирующих NPY и NPY2R, в векторе, предпочтительно, второй домен ITR расположен проксимально относительно домена BGHpA. 5'-концевая последовательность ITR в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7. 5'-концевая последовательность ITR может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность ITR может содержать по меньшей мере 145, например, 155, 165, 175, 180 (из 183) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7. 3'-концевая последовательность ITR в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. 3'-концевая последовательность ITR может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность ITR может содержать по меньшей мере 145, например, 155, 165, 175, 180 (из 183) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. 5'-концевой ITR может содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 7, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%), 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7, и 3'-концевой ITR содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO:8, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. Любой один или несколько из вышеупомянутых генов могут являться кодон-оптимизированными для экспрессии у человека. Как описано ниже, было обнаружено, что три серотипа AAV являются эффективными для доставки генов векторами, описанными в настоящем документе: AAV2, AAV1 и AAV8. Соответственно, векторы, описанные выше, могут быть упакованы с капсидными белками AAV, которые выбраны из группы, состоящей из AAV1, AAV2 и AAV8. Также, как описано ниже, было обнаружено, что векторы, упакованные с капсидными белками AAV1, продемонстрировали лучшие результаты в исследованиях на модели эпилептических припадков; таким образом, предпочтительной упаковкой векторов является упаковка с капсидными белками AAV1. Более подробное описание конкретных элементов данных векторов и систем упаковки представлено в следующих абзацах.
Аденоассоциированный вирус
Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой группу небольших ДНК-вирусов, не имеющих оболочки, из семейства Parvoviridae, которые, как известно, инфицируют людей, приматов и виды животных, отличные от приматов (такие как кошки и собаки, а также многие другие). На сегодняшний день не известно, чтобы AAV вызывали заболевание, и вирус вызывает весьма незначительный иммунный ответ. Векторы для генотерапии на основе AAV могут трансдуцировать, т.е. вводить и запускать экспрессию трансгена, как делящиеся, так и покоящиеся клетки (состояние клетки, когда она не делится), и могут поддерживаться без встраивания в геном клетки-хозяина во внехромосомном состоянии (в случае нативного вируса возникает некоторая степень встраивания генов, которые несет вирус, в геном хозяина в специфичном участке хромосомы 19 человека). Данные свойства делают AAV весьма привлекательным для создания вирусных векторов для генотерапии.
По состоянию на 2005 год в образцах ткани от человекообразных и нечеловекообразных приматов было обнаружено и описано по меньшей мере 110 неизбыточных серотипов AAV. Серотипы представляют собой различимые вариации в пределах видов бактерии или вируса или среди иммунных клеток различных индивидуумов, которые были классифицированы в одну группу на основании их антигенов поверхности клетки, что позволяет проводить серологическую и эпидемиологическую классификацию организмов на подвидовом уровне. Все из известных серотипов AAV могут инфицировать клетки из множества различных типов тканей. Тканеспецифичность определяется серотипом капсида векторов AAV, и ее можно изменить путем псевдотипирования, т.е. замены серотип-специфичных капсидных белков, для изменения диапазона тропизма, который является важным для применения векторов в терапии. Исходя из этого, на сегодняшний день наиболее интенсивно изучали серотип 2 (AAV2). AAV2 демонстрирует природный тропизм в отношении скелетной мускулатуры, нейронов, гладкомышечных клеток сосудов и гепатоцитов. Для AAV2 были описаны три клеточных рецептора: гепарансульфат-протеогликан (ГСПГ), интегрин aVβ5 и рецептор фактора роста фибробластов 1 (fibroblast growth factor receptor 1, FGFR-1); считают, что первый функционирует в качестве первичного рецептора.
Было обнаружено, что три серотипа AAV являются эффективными для доставки генов векторами, описанными в настоящем документе: AAV2, AAV1 и AAV8. В головном мозге данные серотипы AAV демонстрируют нейрональный тропизм.
Сравнительные исследования с вектором, состоящим из геномной структуры на основе AAV2, псевдотипированного капсидными белками из серотипа AAV 1, 2 или 8, и взаимозаменяемого промотора (CMV, СаМКП или Syn I) в коре головного мозга мартышки, мыши и макака, выявили серотип-специфичные отличающиеся свойства тропизма, распространения и эффективности трансдукции и экспрессии трансгена (Watakabe et al., 2015).
В целом, AAV2 отличался от других серотипов более низким распространением вектора и встречающимся в природе нейрональным тропизмом. Однако все серотипы были способны индуцировать экспрессию трансгена в нейронах под контролем нейрон-специфичных промоторов (CaMKII или Syn1), и, за исключением серотипа 2, распространение вируса не отличалось среди других серотипов. Все из предложенных серотипов, как оказалось, являлись подходящими для опосредованной вектором AAV доставки трансгена в головной мозг.
Серотипы 1 и 8 оказались сравнимыми и более эффективными, чем серотип 2, в отношении распространения и экспрессии трансгена. Серотипы 1, 2 и 8, как доказано, были способны трансдуцировать глию и нейроны, и рестрикция в зависимости от типа клеток, как представляется, лучше достигается путем выбора различных промоторов.
Согласно одному варианту реализации капсидные белки AAV выбраны из группы, состоящей из AAV1, AAV2 и AAV8.
Геномные элементы вектора AAV
С целью получения векторов AAV, подходящих для индукции экспрессии трансгенов, элементы в кассетах экспрессии AAV тщательно оценивали и отбирали. Данные элементы включают последовательности ITR, промотор, мультицистронные элементы экспрессии для экспрессии нескольких трансгенов с одного вектора, и энхансерные элементы.
Последовательности ITR
Последовательности инвертированного концевого повтора (ITR) являются единственными сохраненными генетическими элементами из применяемого генома дикого типа, и данные последовательности необходимы для нескольких цис-действующих процессов, включая самоинициирование для синтеза второй цепи ДНК и капсидирования ДНК в частицы AAV. Последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) получили такое название в связи со своей симметричностью, которая, как представляется, требуется для эффективного размножения генома AAV. ITR приобретают данное свойство благодаря своей способности формировать шпильку, способствующую так называемому самоинициированию, которое обеспечивает независимый от праймазы синтез второй цепи ДНК. Было показано, что ITR необходимы для интеграции ДНК AAV в геном клетки-хозяина (19-ая хромосома у человека), а также для эффективного капсидирования ДНК AAV в сочетании с получением полностью собранных, устойчивых к воздействию дезоксирибонуклеазы частиц AAV. Относительно отбора доступных последовательностей ITR для множества векторов, описанных в настоящем документе, был отобран серотип 2 AAV, который обеспечивает эффективную упаковку векторов в капсиды AAV1, AAV2 или AAV8 для образования вирионов, как описано ниже. Являясь концевыми повторами, две последовательности ITR расположены на 5'-конце и 3'-конце вектора, соответственно.
Согласно одному варианту реализации две последовательности ITR расположены на 5'-конце и 3'-конце вектора, соответственно, в направлении 3'-5' ив направлении 5'-3' от последовательностей, кодирующих NPY и NPY2R.
5'-концевая последовательность ITR в векторе согласно настоящему изобретению может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7. 5'-концевая последовательность ITR может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность ITR может содержать по меньшей мере 145, например, 155, 165, 175, 180 (из 183) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7.
3'-концевая последовательность ITR в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8. 3'-концевая последовательность ITR может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность ITR может содержать по меньшей мере 145, например, 155, 165, 175, 180 (из 183) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8.
Согласно одному варианту реализации 5'-концевой ITR содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 7, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 7, и 3'-концевой ITR содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 8.
Промотор CAG
В генетике промотор представляет собой область ДНК, которая инициирует транскрипцию конкретного гена. Промоторы расположены вблизи от сайтов начала транскрипции генов, на той же цепи и в направлении 3'-5' на ДНК (по направлению к 5'-области смысловой цепи). Обычно промотор составляет 100-1000 пар оснований в длину. Как правило, промоторы классифицируют на два основных класса, а именно - TATA и CpG. Однако гены, использующие одну и ту же комбинаторную конфигурацию факторов транскрипции, характеризуются различными паттернами экспрессии генов. Более того, было установлено, что у людей в различных тканях используются различные классы промоторов.
Эффекты различных последовательностей промотора в отношении скоростей трансдукции и уровней экспрессии гена будут варьировать между типами клеток. Исследовали и оценивали широкий диапазон доступных промоторов, чтобы сделать возможным отбор оптимального из них. В настоящем изобретении промотор CAG, как было установлено, обеспечивает подходящий запуск экспрессии генов в целевой ткани. В нескольких ранее проведенных клинических исследованиях с применением векторов AAV для генотерапии возникли проблемами с получением достаточно высокой эффективности терапевтических благоприятных эффектов. Вследствие этого был выбран промотор CAG, который известен как сильный синтетический промотор, используемый для запуска высоких уровней экспрессии генов в векторах экспрессии млекопитающих. Было установлено, что для многих типов тканей промотор CAG обеспечивает более высокие уровни экспрессии, чем другие обычно используемые клеточные промоторы, такие как промоторы UBC и PGK. Промотор CAG содержит следующие последовательности: (С) ранний энхансерный элемент цитомегаловируса (CMV), (А) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина кур, (G) сплайс-акцептор гена бета-глобина кролика. Как следствие, строго говоря, CAG не является промотором, поскольку содержит часть транскрибируемой последовательности (два экзона и интрон) и энхансерные элементы.
Согласно одному варианту реализации последовательность промотора CAG расположена в направлении 3'-5' от последовательностей, кодирующих NPY и NPY2R.
Последовательность промотора CAG в векторе согласно настоящему изобретению может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4.
Последовательность промотора CAG может быть усечена при условии, что она является функциональной (например, индуцирует экспрессию гена), и усеченная последовательность промотора CAG может содержать по меньшей мере 850, например, 875, 900, 925, 935 (из 936) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4, и индуцировать экспрессию гена, то есть, быть функционально связанной с указанным промотором.
Согласно одному варианту реализации промотор CAG содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 4.
IRES
Внутренний участок посадки рибосомы, сокращенно обозначаемый IRES, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая обеспечивает инициацию трансляции в середине последовательности матричной РНК (мРНК) как часть большего процесса синтеза белка. Обычно трансляцию у эукариот можно инициировать исключительно на 5'-конце молекулы мРНК, поскольку для сборки комплекса инициации необходимо распознавание 5'-«кэпа». Путем встраивания последовательностей IRES в вектор обеспечивается бицистронная экспрессия двух генов с одного вектора, при этом первый ген инициируется в нормальном 5-«кэпе», а второй - в IRES.
Более того, несмотря на то, что вектор rAAV NPY и NPY2R обеспечивает гомогенную вставку NPY и NPY2R в одной клетке, встраивание элемента IRES обеспечивает гетерогенную экспрессию генов NPY и NPY2R. Более того, путем выбора трансгенной ориентации генов NPY и NPY2R возможно изменить соотношение экспрессии двух трансгенов, как описано выше. Таким путем можно достичь подходящего равновесия соотношения экспрессии NPY и NPY2R in vivo для нацеливания на ткань и лечения.
Согласно одному варианту реализации последовательность IRES расположена между последовательностями, кодирующими NPY и NPY2R.
Существует несколько различных вирусных последовательностей IRES, известных на сегодняшний день, такие как IRES пикорнавируса, различные IRES вируса гепатита и IRES крипавируса.
Автор настоящего изобретения установил, что среди возможных известных последовательностей IRES для вектора наилучшим образом подходил внутренний сайт связывания рибосомы (IRES) из вируса энцефаломиокардита (encephalomyocarditis virus, EMCV), несущий модифицированную последовательность А7.
IRES из вируса энцефаломиокардита общепринято используют в экспериментальных и фармацевтических вариантах применения для экспрессии белков в эукариотических клетках или бесклеточных экстрактах, и данный IRES обеспечивает высокий уровень «кэп»-независимой трансляционной активности соответствующим образом конфигурированных цистронов. Было показано, что модифицированная последовательность А7 (Rees et al., 1996; Bochkov and Palmenberg, 2006) обеспечивала лучшую цистронную трансляцию для IRES А7 EMCV, чем немодифицированная IRES EMCV.
Последовательность IRES А7 EMCV в векторе согласно настоящему изобретению может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с олигонуклеотидной последовательностью соответствующей длины, представленной в SEQ ID NO: 3.
Последовательность IRES А7 EMCV может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность IRES А7 EMCV может содержать по меньшей мере 525, 545, 560, 570 или 575 (из 582) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с олигонуклеотидной последовательностью соответствующей длины, представленной в SEQ ID NO: 3.
Согласно одному варианту реализации IRES содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с олигонуклеотидным фрагментом соответствующей длины, представленным в SEQ ID NO: 3.
WPRE
Для обеспечения экспрессии генов в целевых клетках можно оптимизировать доставку и уровень транскрипции. Однако для улучшения экспрессии генов можно также применять посттранскрипционные способы. Вектор согласно настоящему изобретению может содержать посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE). WPRE представляет собой последовательность ДНК, которая способствует увеличению экспрессии трансгена путем образования специфичной третичной структуры, в результате чего экспрессия гетерологичных генов усиливается посттранскрипционным способом. WPRE представляет собой регуляторный элемент, состоящий из трех частей, с компонентами гамма, альфа и бета. В вектор согласно настоящему изобретению был включен полный WPRE, состоящий из трех частей, для обеспечения полной активности WPRE.
Согласно одному варианту реализации последовательность WPRE расположена в направлении 5'-3' от последовательностей, кодирующих NPY и NPY2R.
Последовательность WPRE в векторе согласно настоящему изобретению может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5. Данная последовательность характеризуется 100%-ной гомологией с парами оснований с 1093 по 1684 генома вируса гепатита В сурков (WHV8).
Последовательность WPRE может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная последовательность WPRE может содержать по меньшей мере 525, 545, 555, 565, 575 или 585 (из 593) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5.
Согласно одному варианту реализации WRPE содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%о, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 5.
Сигнальная последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA)
Вектор может также содержать сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA или bGH-polyA). Сигнальная последовательность BGHpA представляет собой 3'-фланкирующую последовательность, которая обеспечивает эффективное и точное полиаденилирование транскриптов трансгена (Goodwin and Rottman, 1992). Двумя основными функциями является завершение транскрипции ДНК и защита 3'-конца транскрибированной РНК от деградации в дополнение к транспортированию РНК из ядра в рибосомы. Таким образом, сигнальная последовательность BGHpA представляет собой предпоследний элемент в векторе, расположенный сразу в направлении 3'-5' течению от последовательности ITR на 3'-конце.
Таким образом, согласно одному варианту реализации сигнальная последовательность (bGH-polyA) расположена в направлении 5'-3' от указанных последовательностей, кодирующих NPY и NPY2R.
Сигнальная последовательность BGHpA в векторе может характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6.
Сигнальная последовательность BGHpA может быть усечена при условии, что она является функциональной, и усеченная сигнальная последовательность BGHpA может содержать по меньшей мере 225, 235, 245, 255 или 265 (из 269) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6.
Согласно одному варианту реализации сигнальная последовательность BGHpA содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 6.
Краткая характеристика вектора
В целом, на основании конкретного выбора в отношении промоторных и энхансерных элементов, цис-действующих элементов, а также ориентации трансгена и бицистронных элементов, согласно иллюстративному варианту реализации были отобраны два полученных в результате дизайна:
Таким образом, согласно одному варианту реализации вектор содержит функциональные элементы последовательностей инвертированных концевых повторов (ITR) AAV2, гибридный промотор CAG из энхансера цитомегаловируса/бета-актина кур (CAG), внутренний участок посадки рибосомы (IRES), посттрансляционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE) и сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGHpA).
Согласно еще одному варианту реализации последовательности из следующих функциональных элементов вектора являются функционально связанными и находятся в следующем порядке (в направлении от выше по течению к ниже по течению):
Полная последовательность вектора будет также содержать некоторое количество оснований между функциональными элементами, и две такие полные последовательности были объединены согласно иллюстративному варианту реализации. Согласно одному варианту реализации вектор содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 9, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%о, 97%, 98%о или 99%о (%ИП), с SEQ ID NO: 9, или вектор содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 10, или последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 10.
Последовательность или последовательности вектора могут быть усечены при условии, что они являются функциональными, и усеченная последовательность или последовательности вектора могут содержать по меньшей мере 4200, например, 4230, 4260, 4270, 4280 (из 4288) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%о или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 9, или усеченная последовательность или последовательности вектора могут содержать по меньшей мере 4200, например, 4230, 4260, 4270, 4280 (из 4288) оснований и характеризоваться идентичностью последовательности по меньшей мере 90%, такой как идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% (%ИП), с SEQ ID NO: 10.
Вектор можно также описать во внутривекторных диапазонах, таких как расстояния между последовательностями промотора или внутреннего участка посадки рибосомы и последовательностями, кодирующими NPY и/или NPY2R. Также следует учитывать общий размер вектора, поскольку AAV характеризуется упаковочной емкостью ~4,7К.
Согласно одному варианту реализации расстояние между последовательностью промотора CAG и последовательностью, кодирующей NPY или NPY2R расположенной в направлении 5'-3' от последовательности промотора С AG и в направлении 3'-5' от последовательности IRES, находится в диапазоне от 60 до 0 оснований, предпочтительно, от 40 до 5 оснований, наиболее предпочтительно, от 20 до 10 оснований.
Согласно одному варианту реализации расстояние между последовательностью IRES и последовательностью, кодирующей NPY или NPY2R, в направлении 5'-3' находится в диапазоне от 60 до 0 оснований, предпочтительно, от 40 до 2 оснований, наиболее предпочтительно, от 10 до 4 оснований.
Как известно в данной области техники, существует несколько инструментов для оптимизации гена с использованием преимуществ вырожденности генетического кода. Благодаря вырожденности один белок может кодироваться многими альтернативными последовательностями нуклеиновой кислоты. Предпочтительность кодонов отличается в каждом организме, и это может вызвать сложности при экспрессии рекомбинантных белков в гетерологичных системах экспрессии, которые приводят к низкой и ненадежной экспрессии. Данный факт может также быть справедливым для аутологичной экспрессии, когда последовательности дикого типа могут быть не оптимизированы для выхода экспрессии, а также для деградации, регуляции и других свойств. Таким образом, вектор можно оптимизировать для экспрессии у человека с применением большого количества связанных с последовательностью параметров, вовлеченных в различные аспекты экспрессии генов, такие как транскрипция, сплайсинг, трансляция и деградация мРНК.
Таким образом, согласно одному варианту реализации последовательность вектора была кодон-оптимизирована для применения у людей.
Получение частицы AAV
Как далее описано в разделе экспериментов, векторы упакованы в капсидные белки серотипа 1, 2 или 8. Таким образом, из двух векторов (выше) можно получить шесть различных частиц AAV, как обобщено ниже:
Таким образом, согласно одному варианту реализации частица AAV содержит вектор согласно настоящему изобретению, инкапсулированный капсидными белками аденоассоциированного вируса (AAV), упакованными в так называемые псевдотипированные частицы AAV, что означает, что частицы покрыты капсидными белками из различных серотипов AAV.
Доставка частицы AAV
Доставку генотерапии NPY и NPY2R, предпочтительно, следует осуществлять путем сайтспецифичных внутричерепных инъекций частиц AAV, содержащих вектор. Фармацевтическую композицию, содержащую частицу AAV, применяют при предотвращении, ингибировании, облегчении или лечении неврологического нарушения, такого как эпилепсия или болезнь Паркинсона, у млекопитающего. Первичной мишенью является фармакорезистентная (инкурабельная, рефрактерная, медицинская инкурабельная, резистентная к лекарственным средствам) эпилепсия, поскольку для данных форм эпилепсии существует лишь несколько эффективных способов лечения. Фармакорезистентная эпилепсия включает широкий спектр типов эпилепсии, при которых фармацевтическое лечение не оказывает эффекта, или при которых наблюдается вариабельность результатов фармацевтического лечения в течение времени. В очень широком и общем смысле фармакорезистентность можно обозначить как неспособность обеспечения полного контроля или приемлемого контроля над припадками в ответ на терапию противоэпилептическим лекарственным средством (ПЭЛС).
Согласно одному варианту реализации фармацевтическая композиция содержит частицу AAV для применения при предотвращении, ингибировании, облегчении или лечении неврологического нарушения, такого как эпилепсия или болезнь Паркинсона, у млекопитающего. Согласно еще одному варианту реализации указанное неврологическе нарушение представляет собой эпилепсию. Согласно еще одному варианту реализации указанная эпилепсия представляет собой фармакорезистентную эпилепсию. Согласно еще одному варианту реализации субъект представляет собой млекопитающего субъекта, такого как субъект-человек, лошадь, собака или кошка. Согласно еще одному варианту реализации субъект представляет собой субъекта-человека. Согласно еще одному варианту реализации неврологическое нарушение представляет собой эпилепсию, и композиция содержит частицы AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, AAV2-Y2/NPY, AAV8-NPY/Y2 или частицы AAV8-Y2/NPY, такие как частицы AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY или AAV8-NPY/Y2, такие как AAV1-NPY/Y2. Согласно еще одному варианту реализации неврологическое нарушение представляет собой болезнь Паркинсона, и композиция содержит частицы AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, AAV2-Y2/NPY, AAV8-NPY/Y2 или AAV8-Y2/NPY, предпочтительно, частицы AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY или AAV8-NPY/Y2, предпочтительно, частицы AAV1-NPY/Y2.
Отличительной чертой болезни Паркинсона является утрата дофаминовых нейронов в черном веществе, выступающих в полосатое тело, что вызывает прекращение высвобождения дофамина в полосатом теле. Это приводит к снижению дофаминэргической передачи сигналов и абнормальному возбуждению в нижестоящих цепях базальных ганглиев, что вызывает ригидность и каталептические симптомы. NPY противодействует данному угнетению дофаминэргической передачи сигналов посредством стимуляции синтеза и высвобождения дофамина в результате активации рецептора Y2, тогда как активация рецептора Y1 оказывает противоположный эффект (Adewale et al., 2005, 2007). Более того, NPY оказывает опосредованные Y2 нейропротекторные эффекты в отношении дофаминэргических нейронов против вызванной 6-гидроксидофамином (6-OHDA) токсичности in vitro и in vivo (Decressac et al., 2011, 2012). Помимо этого, в образцах головного мозга, отобранных при вскрытии пациентов, страдавших от болезни Паркинсона, наблюдается увеличение количества NPY-положительных клеток в хвостатом ядре и скорлупе по сравнению со здоровыми контролями (Cannizzaro et al., 2003), что может отражать эндогенный, но последовательно недостаточный нейропротекторный ответ. Эти данные согласуются с тем, что дофаминэргические нейроны в полосатом теле и черном веществе экспрессируют функциональные рецепторы Y2 (Shaw et al., 2003), и что количество NPY-положительных нейронов в полосатом теле и прилежащем ядре увеличено после вызванной 6-OHDA утраты дофаминэргических нейронов в полосатом теле (Kerkerian-Le Goff et al., 1986; Salin et al., 1990).
Согласно еще одному варианту реализации указанное неврологическое нарушение представляет собой болезнь Паркинсона.
Генотерапию можно также доставлять системно на основании тканевого тропизма серотипа AAV; однако с помощью внутричерепной инъекции обеспечивается точное нацеливание в желаемую область головного мозга с высокой эффективностью и минимальными побочными эффектами. Благодаря этому вирусный вектор будет содержаться в пределах заданной области с ожидаемым минимальным распространением на соседние области вдоль тяжей белого вещества. В зависимости от типа неврологического нарушения подход доставки AAV может быть направлен в очень ограниченные области головного мозга или, при необходимости, доставка может охватывать большие области коры головного мозга. В зависимости от типа эпилепсии и расположения эпилептического очага или очагов подход доставки AAV может быть направлен в очень ограниченные области головного мозга или, при необходимости, доставка может охватывать большие области коры головного мозга. Таким образом, существует несколько возможных способов введения, такого как интрацеребровентрикулярное, интравитреальное, внутривенное, подкожное, внутримышечное, интраназальное, чресслизистое, интрацеребральное, интраперитонеальное, интратекальное, интраартериальное введение.
Согласно одному варианту реализации фармацевтическую композицию, содержащую частицы AAV, доставляют путем сайтспецифичных внутричерепных инъекций.
Все серотипы AAV согласно настоящему изобретению доказали свою способность трансдуцировать клетки глии и нейроны. Серотипы AAV2 продемонстрировали меньшее распространение вектора и встречающийся в природе нейрональный тропизм, вследствие чего вектор с капсидными белками серотипа AAV2 может быть подходящим для доставки в более маленькие и более ограниченные области головного мозга. Аналогично, векторы с капсидными белками серотипа AAV1 или AAV8 могут быть подходящими для доставки, охватывающей большие области коры головного мозга.
Доза частиц AAV может состоять из одной дозы или нескольких доз, которые вводят одновременно или в различные периоды времени. Однократная доза характеризуется тем преимуществом, что она позволяет избежать многократных внутричерепных инъекций, тогда как многократные дозы могут позволить применять более низкую дозу для каждой инъекции, при этом проводя мониторинг ответа пациента на дозу между инъекциями. Как правило, доза может варьировать в пределах от 0,01 до 100 мкг, например, 0,1-50 мкг или 0,5-20 мкг функциональной частицы AAV. На эффективность трансдукции также могут оказывать влияние другие факторы, такие как положение субъектов в течение и после инъекции, для облегчения распространения вектора.
Согласно одному варианту реализации эффективная доза функциональной AAV варьирует от 0,01 до 100 мкг, например, 0,1-50 мкг или 0,5-20 мкг функциональной частицы AAV. Согласно еще одному варианту реализации частица AAV приготовлена в состав для введения в виде однократной дозы или многократных доз, например, двух, трех, четырех, пяти доз.
Согласно одному варианту реализации способ для лечения, ингибирования или облегчения неврологического нарушения у субъекта включает введение в клетки центральной нервной системы субъекта, страдающего от неврологического нарушения, фармацевтически эффективного количества такой композиции. Согласно еще одному варианту реализации субъект представляет собой млекопитающего субъекта, такого как субъект-человек. Более того, неврологическое нарушение представляет собой эпилепсию или болезнь Паркинсона. В данном способе композицию доставляют путем сайтспецифичных внутричерепных инъекций, и согласно еще одному варианту реализации неврологическое нарушение представляет собой эпилепсию, и композицию доставляют в расположение эпилептического очага или очагов.
Доставку NPY и NPY2R можно также осуществить в клетки, такие как эндогенные клетки от субъекта, путем доставки в указанные клетки частиц AAV, содержащих вектор. В свою очередь, такие клетки можно ввести, например, клетки могут быть инъецированы или могут мигрировать в участок у субъекта, для предотвращения, ингибирования, облегчения или лечения неврологического нарушения, такого как эпилепсия или болезнь Паркинсона, у млекопитающего, например, как наблюдается в генотерапевтических подходах ex vivo, с последующей трансплантацией клеток, инфицированных или трансдуцированных векторами AAV. Такой субъект может представлять собой млекопитающее, такое как субъект-человек.
Согласно одному варианту реализации способ доставки генома NPY и Y2 в клетку млекопитающего включает введение в клетку указанной частицы AAV. Согласно еще одному варианту реализации клетка выбрана из группы, состоящей из нервной клетки, клетки легких, клетки сетчатки, эпителиальной клетки, мышечной клетки, клетки поджелудочной железы, клетки печени, миокардиальной клетки, костной клетки, клетки селезенки, кератиноцита, фибробласта, эндотелиальной клетки, клетки предстательной железы, зародышевой клетки, клетки-предшественника и стволовой клетки. Согласно одному варианту реализации способ введения генома NPY и Y2 субъекту включает введение субъекту указанной клетки (содержащей геном NPY и Y2). Согласно одному варианту реализации субъект представляет собой млекопитающего субъекта, такого как субъект-человек.
Согласно одному варианту реализации способ доставки генома NPY и Y2 субъекту включает введение в клетку млекопитающего у субъекта указанной частицы AAV, причем вирусную частицу вводят в гиппокамп субъекта.
Согласно одному варианту реализации способ доставки генома NPY и Y2 субъекту включает введение в клетку млекопитающего у субъекта указанной частицы AAV, причем вирусную частицу вводят в полосатое тело, прилежащее ядро, черное вещество, вентральную область покрышки или медиальный пучок переднего мозга субъекта.
Доставку NPY и NPY2R можно также осуществлять для снижения тяжести заболевания, при котором активация NPY и/или NPY2R обладает терапевтическим эффектом или которое вызвано недостаточностью NPY, причем заболевание выбрано из эпилепсии и болезни Паркинсона. Таким образом, согласно одному варианту реализации способ снижения тяжести заболевания, при котором NPY обладает терапевтическим эффектом или которое вызвано недостаточностью NPY, причем заболевание выбрано из эпилепсии и болезни Паркинсона, включает введение в клетки центральной нервной системы субъекта, страдающего от неврологического нарушения, фармацевтически эффективного количества указанной композиции.
Согласно одному варианту реализации способ обеспечения NPY субъекту, который нуждается в NPY, включает выбор субъекта, который нуждается в NPY, такого как субъект, страдающий от недостаточности NPY, и обеспечение указанного субъекта фармацевтически эффективным количеством указанной композиции. Согласно еще одному варианту реализации указанного субъекта выбирают как такового, страдающего от недостаточности NPY, по результатам клинической оценки или диагностического теста, такого как, например, ЭЭГ и/или клинический диагноз эпилепсии или болезни Паркинсона.
Оценка экспрессии трансгена
Векторы согласно настоящему изобретению исследовали в отношении их способности инициировать экспрессию NPY и NPY2R. Временная трансфекция клеток НЕК293 плазмидами экспрессии AAV, содержащими последовательности для NPY и NPY2R, привела к повышению уровней транскрипта мРНК, кодирующей оба трансгена, что было измерено на основании повышения количеств целевых последовательностей NPY и Y2 в дуплексных реакциях цкПЦР, как видно на фигуре 2. В случае обеих плазмид уровни экспрессии целевой последовательности для транс гена в направлении 3'-5' от IRES являлись большими, чем целевой последовательности для трансгена в направлении 5'-3'.
Экспрессия NPY и NPY2R в гиппокампе
После экспериментального подтверждения последовательностей плазмид экспрессии AAV, включая последовательности NPY и NPY2R, плазмиды упаковывали в капсидные частицы AAV, происходящие из серотипа AAV 1, 2 или 8, получая в сумме 6 уникальных частиц вектора AAV, как описано выше. Данные частицы очищали и направляли в исследование in vivo на крысах. Через три недели после внутричерепных инъекций в дорсальный гиппокамп взрослых самцов крыс Вистар животным проводили эвтаназию, и головной мозг отбирали и быстро замораживали. Затем проводили оценку экспрессии трансгена NPY и NPY2R в срезах головного мозга из данных образцов головного мозга с применением иммуногистохимических анализов, нацеленных на NPY, а также авторадиографических анализов, визуализирующих связывание NPY2R и функциональное связывание GPCR (G-protein coupled receptor, рецептора, сопряженного с G-белком). Лечение AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2 или AAV8-NPY/Y2 приводило к значительному увеличению уровней NPY (фигуры 3 и 4). Иерархический порядок векторов AAV в отношении индукции экспрессии NPY являлся следующим: AAV1-NPY/Y2=AAV1-Y2/NPY=AAV8-NPY/Y2>AAV-NPY/Y2>AAV8-Y2/NPY=AAV2-Y2/NPY. Все шесть векторов приводили к увеличению уровней функционального NPY2R (фигуры 5А и 5 В), и после лечения AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-Y2/NPY или AAV8-Y27NPY также наблюдалось значительное увеличение уровней связывания NPY2R (фигуры 6А и 6 В). Иерархический порядок векторов AAV в отношении индукции экспрессии NPY2R являлся следующим: AAV1-Y2/NPY>AAV8-Y2/NPY=AAV1-NPY/Y2>AAV2-Y2/NPY>AAV8-NPY/Y2=AAV2-NPY/Y2.
Таким образом, обе плазмиды экспрессии AAV (AAV-NPY/Y2 и AAV-Y2/NPY) успешно транскрибировались и приводили к экспрессии белка NPY и NPY2R. Более того, во всех случаях уровень экспрессии трансгена зависел от расположения последовательности трансгена в направлении 3'-5' или в направлении 5'-3' от последовательности IRES, причем трансген, расположенный в направлении 3'-5' от последовательности IRES, экспрессировался на относительно более высоких уровнях, чем трансген, расположенный в направлении 5'-3' от последовательности IRES.
Векторы AAV, псевдотипированные капсидными белками из серотипа AAV 1, характеризовались наиболее высокой эффективностью экспрессии трансгена (AAV1>AAV8>AAV2) при инъецировании внутричерепным способом в гиппокамп крыс.Таким образом, согласно одному варианту реализации капсидные белки AAV частицы AAV выбраны из группы, состоящей из AAV1, AAV2 и AAV8, предпочтительно, AAV1 и AAV8.
Неожиданно было обнаружено, что векторы AAV, псевдотипированные капсидными белками из серотипа AAV 1, продемонстрировали очень высокую экспрессию транс гена, расположенного в направлении 5'-3' от элемента IRES (как видно на фигурах 4А и 4В), по сравнению с другими векторами AAV, псевдотипированными капсидными белками из серотипа AAV 2 и 8, которые продемонстрировали относительно более низкую экспрессию для транс гена в направлении 5'-3'. Таким образом, векторы AAV, псевдотипированные капсидными белками из серотипа AAV 1, демонстрируют высокую экспрессию первого и второго трансгена (т.е. NPY и NPYR2).
Одним из наибольших препятствий для клинической генотерапии AAV является обеспечение безопасной экспрессии с высокой эффективностью. Таким образом, равномерно высокая экспрессия считается весьма положительной. Таким образом, согласно одному варианту реализации капсидные белки AAV частицы AAV выбраны из группы, состоящей из AAV1, AAV2 и AAV8, наиболее предпочтительно, AAV1. Согласно еще одному варианту реализации частица AAV содержит капсидные белки AAV1 для более гомологичной сверхэкспрессии обоих трансгенов (NPY и NPY2R).
Напротив, в случаях, когда желательной является разнородная эффективность экспрессии для трансгенов NPY и NPY2R, векторы AAV, псевдотипированные с капсидными белками из серотипов AAV 2 и 8, могут являться предпочтительными.
Согласно варианту реализации идентичность последовательности (%ИП) в настоящем документе можно оценить любым общепринятым способом. Общепринятой практикой является применение для таких расчетов компьютерных программ, и пакеты стандартных программ для сравнения и выравнивания пар последовательностей включают ALIGN (Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988), FASTA (Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990) и gapped BLAST (Altschul era/., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), или BLASTP (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12:387, 1984). Если ни один из таких ресурсов не доступен, согласно одному варианту реализации идентичность последовательности (%ИП) можно рассчитать как (%ИП) = 100% * (количество идентичных остатков в попарном выравнивании) / (длина самой короткой последовательности).
Затем результаты экспрессии можно проанализировать с применением балльной оценки, как показано в таблицах 1-3. В таблице 1 экспрессию трансгена оценивали в зависимости от серотипа.
В таблице 1 представлены уровни белка NPY и NPY2R у животных, которые получали лечение векторами AAV1, -2 и -8, сверхэкспрессирующими NPY и Y2. Уровни белка оценивали в соответствии с наблюдаемым сигналом белка NPY или NPY2R: 1 (уровни белка, соответствующие эндогенным уровням), 2 (низкая экспрессия белка выше эндогенного уровня), 3 (умеренная экспрессия белка выше эндогенного уровня) и 4 (высокая экспрессия белка выше эндогенного уровня). Данные представлены в виде средних значений ±СОС. Затем различным векторам AAV присваивали ранг от 1 до 3, причем 1 соответствует наивысшим уровням экспрессии, и 3 соответствует самым низким.
Таким образом, очевидно, что векторы AAV, псевдотипированные капсидными белками из серотипа AAV 1, характеризовались наиболее высокой эффективностью экспрессии транс гена (AAV1>AAV8>AAV2) при инъецировании внутричерепным способом в гиппокамп крыс.
Более того, экспрессию трансгена можно также оценить в отношении двух вариантов ориентации вектора (NPY/Y2 или Y2/NPY), как показано в таблице 2.
В таблице 2 представлены уровни белка NPY и NPY2R у животных, которые получали лечение векторами AAV NPY/Y2 или Y2/NPY. Уровни белка оценивали в соответствии с наблюдаемым сигналом белка NPY или NPY2R: 1 (уровни белка, соответствующие эндогенным уровням), 2 (низкая экспрессия белка выше эндогенного уровня), 3 (умеренная экспрессия белка выше эндогенного уровня) и 4 (высокая экспрессия белка выше эндогенного уровня). Данные представлены в виде средних значений ±СОС. Затем различным векторам AAV присваивали ранг от 1 до 2, причем 1 соответствует наивысшим уровням экспрессии, и 2 соответствует самым низким.
Таким образом, очевидно, что уровень экспрессии трансгена зависел от расположения последовательности трансгена в направлении 3'-5' или в направлении 5'-3' от последовательности IRES, причем трансген, расположенный в направлении 3'-5' от последовательности IRES, экспрессировался на относительно более высоких уровнях, чем трансген, расположенный в направлении 5'-3' от последовательности IRES.
Опосредованные вектором AAV эффекты в отношении вызванных КА припадков
ого
Для оценки ингибирующих припадки эффектов опосредованной вектором AAV экспрессии NPY и его рецепторов использовали модель вызванных каинатом припадков на крысах. Данная модель, как считают, отражает события острых припадков при височной эпилепсии, включая измерение времени ожидания первого двигательного припадка и эпилептического состояния, а также частоту и длительность припадков, и показатель общей модифицированной шкалы оценки тяжести припадков. Данная модель проиллюстрирована на фигуре 7, на которой представлена графическая иллюстрация развития припадка в течение периода наблюдения длительностью 2 часа после однократной инъекции каината (п.к.) в зависимости от уровней индуцированной AAV сверхэкспрессии трансгена. Высокие уровни индуцированной вектором AAV экспрессии NPY привели к увеличению времен ожидания как 1 двигательного припадка, так и эпилептического состояния, а также к снижению времени, проведенного в припадках, по сравнению с эндогенными и более низкими уровнями экспрессии NPY (фигура 7А). Высокие уровни индуцированной вектором AAV экспрессии NPY2R привели к тенденции к снижению времени, проведенного в припадках, по сравнению с эндогенными и более низкими уровнями экспрессии NPY2R (фигура 7 В), однако, без достижения значимых уровней.
На фигуре 8А также можно наблюдать, что лечение AAV1-NPY/Y2 увеличивало время ожидания развития эпилептического состояния (ЭС) и снижало общее время припадка, тогда как эффекты, наблюдаемые после лечения AAV1-Y2/NPY, не продемонстрировали статистической значимости, по сравнению с лечением пустым AAV1 (фигура 8А). Как AAV1-NPY/Y2, так и AAV1-Y2/NPY не оказывали влияния на время ожидания первого двигательного припадка или общее количество припадков (фигура 8А).
Как видно на фигуре 8В, лечение AAV2-NPY/Y2 или AAV2-Y2/NPY не приводило к каким-либо значимым изменениям в развитии или тяжести припадка по сравнению с пустым AAV2 (фигура 8В).
Как видно на фигуре 8С, лечение AAV8-NPY/Y2 не демонстрировало увеличения времени ожидания до развития эпилептического состояния (ЭС) и не снижало общее время припадка, тогда как для AAV8-Y2/NPY значимых эффектов по сравнению с пустым AAV8 не наблюдали (фигура 8С). Однако наблюдалась устойчивая, хотя и не значимая тенденция к вызванному AAV8-NPY/Y2 снижению общего времени припадка (фигура 8С).
Было обнаружено, что среди всех частиц вектора лечение AAV1-NPY/Y2 приводило к противоэпилептическим эффектам, что подтверждается наблюдаемым снижением длительности припадков и увеличением времени ожидания развития ЭС. Лечение AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2, AAV2-Y2/NPY, AAV8-NPY/Y2 или AAV8-Y2/NPY не приводило к статистически значимому ингибированию развития или тяжести припадка. Распространение и эффективность экспрессии трансгена NPY в случае векторных частиц AAV, как было обнаружено, являлись зависимыми от серотипа (AAV1>AAV8>AAV2). Экспрессию трансгена NPY и Y2 подтверждали посредством иммунного окрашивания NPY и функциональных анализов связывания рецептора Y2, соответственно. После внутричерепных инъекций и лечения вектором AAV у животных не наблюдали какого-либо абнормального поведения или очевидных проблем со здоровьем.
Таким образом, фигура 8 иллюстрирует, что AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV8-NPY/Y2 демонстрируют четкую тенденцию противоэпилептических эффектов, что подтверждается наблюдаемым снижением длительности припадков и увеличением времени ожидания развития ЭС, в случае AAV1-NPY/Y2 - с однозначной статистической значимостью. Результаты являются менее очевидными для конструкций AAV2, и ни один из AAV8-Y2/NPY не продемонстрировал четкую тенденцию противоэпилептических эффектов. В случае систем in vivo очевидно, что, несмотря на то, что экспрессия не эквивалентна эффективности, однако экспрессия является существенной для функции вектора.
Посредством получения трансгенов для NPY и NPY2R, экспрессируемых с единой конструкции, векторы согласно настоящему изобретению обеспечивают никогда ранее не достигнутую возможность наблюдать на модели на животных оба уровня экспрессии для белков NPY/NPY2R в корреляции с медицинскими эффектами. Все трансдуцированные клетки инфицировали конструкциями, содержащими равное количество генов NPY и NPY2R, в которых все переносимые гены располагались в одинаковом положении, и в которых доза NPY/NPY2R является постоянной и зависимой от вектора (причем соотношение будет также постоянным для всех трансформированных клеток). Распространенность и распределение генов NPY и NPY2R также не будет отличаться, но они будут располагаться в абсолютно одних и тех же клетках. Данные эффекты невозможно достичь с применением двух векторов, содержащих гены NPY и NPY2R, соответственно. Положительные эффекты данного подхода включают очень последовательный результат лечения. С точки зрения статистики, это также упрощает балльную оценку каждого отдельного вектора в отношении его эффектов. С помощью балльной оценки различных качеств векторов (экспрессия и эффективность при подавлении вызванных каинатом припадков), как показано в таблице 3, становится проще определить, какие векторы являются наиболее компетентными для лечения.
В таблице 3 представлено общее ранжирование шести векторов AAV на основании как экспрессии трансгена, так и эффективности в качестве противоэпилептического лечения, на модели острых вызванных каинатом припадков. Приведены ранги от 1 до 6, причем 1 соответствует наивысшему рангу, и 6 соответствует самому низкому. Общий ранг представляет собой средний ранг ранжирования экспрессии и эффективности. Общее ранжирование представлено следующим образом: AAV1-NPY/Y2=AAV1-Y2/NPY=AAV8-NPY/Y2>AAV8-Y2/NPY=AAV2-NPY/Y2>AAV2-Y2/NPY.
Таким образом, согласно одному варианту реализации частица AAV представляет собой AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY или AAV8-NPY/Y2. Согласно одному варианту реализации частица AAV представляет собой AAV1-NPY/Y2.
Лечение AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-NPY/Y2 или AAV8-NPY/Y2 приводило к значительному увеличению уровней NPY (фигуры 3 и 4). Лечение всеми 6 векторами приводило к увеличению уровней функционального NPY2R (фигуры 5А и 5В), хотя наивысшая экспрессия наблюдалась в случае AAV1-Y2/NPY. Уровни связывания NPY2R были увеличены в случае всех 6 векторов, и в значительной степени увеличились после лечения AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY, AAV2-Y2/NPY или AAV8-Y2/NPY (фигуры 6А и 6В).
Иерархический порядок векторов AAV в отношении индукции экспрессии NPY являлся следующим: AAV1-NPY/Y2=AAV1-Y2/NPY=AAV8-NPY/Y2>AAV-NPY/Y2>AAV8-Y2/NPY=AAV2-Y2/NPY. Иерархический порядок векторов AAV в отношении индукции экспрессии NPY2R являлся следующим: AAV1-Y2/NPY>AAV8-Y2/NPY=AAV1-NPY/Y2>AAV2-Y2/NPY>AAV8-NPY/Y2=AAV2-NPY/Y2. Это свидетельствует, что высокая экспрессия NPY с колокализированной экспрессией NPY2R представляется благоприятной для эффективности in vivo.
Тест на сетке при вызванной галоперидолом каталепсии
Для оценки эффектов опосредованной вектором AAV экспрессии NPY и его рецепторов в отношении каталептического состояния использовали модель вызванной галоперидолом каталепсии у мышей. В данной модели применяют введение галоперидола, который, как известно, выступает антагонистом дофаминовых D2-рецепторов и снижает содержание дофамина в полосатом теле. Это приводит к получению в результате блокады дофаминэргической передачи сигналов и абнормальному возбуждению в нижестоящих цепях базальных ганглиев, которое проявляется в виде симптомов ригидности и каталепсии, имитирующих двигательные симптомы, наблюдаемые при болезни Паркинсона.
Как видно на фигуре 9А, инъекции вектора AAV1-NPY/Y2 у мышей вызывали значительное снижение времени, проведенного в каталепсическом состоянии, по сравнению с пустым AAV1. Более того, фигура 9 В иллюстрирует, что лечение вектором AAV1-NPY/Y2 также вызывало значительное снижение среднего времени, проведенного в каталепсическом состоянии, наблюдаемого с интервалами длительностью 15 минут, по сравнению с пустым AAV1.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано выше со ссылкой на конкретный вариант или варианты реализации, его ограничение конкретной формой, изложенной в настоящем документе, не предполагается. Напротив, настоящее изобретение ограничено исключительно прилагаемой формулой изобретения, и другие варианты реализации, отличные от таковых, указанных выше, являются в равной степени возможными в пределах объема данной прилагаемой формулы изобретения, например, отличные от таковых, описанных выше.
В формуле изобретения термины «содержит/содержащий» и «включает/включающий» не исключают присутствия других элементов или этапов. Более того, несмотря на индивидуальное перечисление, множество средств, элементов или этапов способа может быть включено, например, в один блок или процессор. Дополнительно, несмотря на то, что индивидуальные свойства могут быть включены в различные пункты формулы изобретения, они могут быть, возможно, преимущественно объединены, и включение в различные пункты формулы изобретения не подразумевает, что комбинация свойств не является реализуемой и/или преимущественной. Кроме того, упоминания объектов в единственном числе не исключают множественное число. Термин, обозначающий объект в единственном числе, термины «первый», «второй» и т.д. не исключают множественное число. Ссылочные позиции в формуле изобретения представлены исключительно в качестве уточняющего примера, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем формулы изобретения каким-либо способом.
Экспериментальная часть
Следующие примеры являются исключительно примерами, и их ни в коем случае не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, настоящее изобретение ограничено исключительно прилагаемой формулой изобретения.
Векторы
Открытые рамки считывания (ОРС) NPY (NM_000905.3) и NPY2R (NM_000910.2) человека, а также внутренний участок посадки рибосомы (последовательность IRES, версия А7) клонировали в плазмиде экспрессии AAV под контролем гибридного промотора размером 0,9 т.о. из энхансера цитомегаловируса/β-актина кур (CAG), которая содержала посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE) и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH) и была фланкирована инвертированными концевыми повторами AAV2. Полученные в результате векторы схематично обобщены на фигуре 1А и 1В.
Упаковка геномов вектора AAVв частицы АЛ V
Чувствительные эукариотические клетки (такие как клетки 293 человека) трансфицировали с помощью ДНК вектора в присутствии дополняющего генома AAV (такого как pAV2 (АТСС)) или рекомбинантной AAV-плазмиды. Клетки культивировали в течение от 2 до 4 дней (в среде LB с добавлением ампициллина при температуре 37°С), после чего вирусные частицы высвобождались в результате множественных циклов замораживания/оттаивания, а затем аденовирусный вирус-помощник инактивировали путем нагревания до температуры 60°С. Полученный в результате лизат клеток содержал частицы AAV, содержащие вектор AAV, упакованный в частицы AAV. С применением двух векторов, описанных выше, и вируса-помощника AAV1, 2, 8, можно получить 6 различных частиц AAV. Все полученные векторы состояли из вышеупомянутых плазмидных конструкций AAV с ITR из серотипа AAV 2, упакованных в так называемые псевдотипированные частицы AAV, что означает, что частицы покрыты капсидными белками из различных серотипов AAV 1, 2 и 8.
Инъекции вектора AAV в гиппокамп крыс
12
Векторы AAV под наркозом инъецировали с одной стороны в дорсальный гиппокамп.(Точная установка координат 1: переднезадняя ось -3,3 мм, срединно-латеральная 1,8 мм, дорсально-вентральная -2,6 мм от твердой мозговой оболочки, или точная установка координат 2: переднезадняя -4,0 мм, срединно-латеральная -2,1 мм, дорсально-вентральная -4,3 мм от поверхности черепа) или инъецировали с двух сторон в дорсовентральный гиппокамп (переднезадняя ось -3,3 мм, срединно-латеральная +/-1,8 мм, дорсально-вентральная -2,6 мм, переднезадняя - 4,8 мм, срединно-латеральная ± 5,2 мм, дорсально-вентральная - 6,4 и -3,8 мм) взрослым самцам крыс Вистар. Началом координат являлись брегма для переднезадней оси и срединная линия для срединно-латеральной оси. Проводили инфузию суспензии вирусного вектора (1,1×10 геномных частиц/мл) объемом 1 или 3 мкл на полушарие.
Вызванные каинатом припадки у крыс
Через три недели после инъекций вектора AAV крысам подкожно инъецировали каинат (КА; 10 мг/кг; разведенный в 0,9% изотоническом солевом растворе; рН 7,4), животных помещали в отдельные коробки из органического стекла (30×19×29 см) и проводили видеорегистрацию в течение 2 ч. Затем наблюдатель, которому не было известно условие лечения, оценивал время ожидания первого двигательного припадка и эпилептического состояния, время, проведенное в двигательных припадках, а также количество припадков. Двигательные припадки определяли как клоническое движение передних и/или задних конечностей длительностью в течение по меньшей мере 15 с.
Умерщвление и отбор ткани от крыс
Через три часа после инъекции КА животным вводили глубокий наркоз и обезглавливали. Головной мозг быстро отбирали и быстро замораживали на сухом льду, а затем хранили при -80°С до последующей обработки.
Оценка опосредованной вектором АА V экспрессии трансгена у крыс
Уровни экспрессии после вариантов лечения вектором AAV сравнивали с уровнями экспрессии у соответствующих не получавших лечение контрольных крыс. Уровни экспрессии и паттерны распределения двух трансгенов NPY и NPY2R оценивали с применением цкПЦР, иммуногистохимического и авторадиографического анализов на клетках или гиппокампальных срезах головного мозга от получавших лечение животных.
Анализ методом цифровой капельной ПЦР (цкПЦР): из клеток почки эмбриона человека 293, трансфицированных векторами AAV-NPY/Y2 или AAV-Y2/NPY, выделяли РНК. кДНК синтезировали с применением набора iScript Advanced cDNASynthesis для ОТ-кПЦР (количественной ПЦР с обратной транскрипцией, Bio-Rad). Праймеры и зонды для анализа (Integrated DNA Technologies) для цкПЦР разрабатывали с применением инструмента для дизайна анализа Integrated DNA Technologies RealTime qPCR: NPY (прямой:  (SEQ ID NO: 11); обратный:  (SEQ ID NO: 12)), NPY2R (прямой:  (SEQ ID NO: 13); обратный:  (SEQ ID NO: 14)). Дуплексный анализ цкПЦР, в ходе которого измеряли меченную FAM целевую последовательность NPY и меченную HEX целевую последовательность NPY2R, проводили с применением платформы Bio-Rad QX200. Для получения капли и проведения ПЦР использовали реакционные смеси объемом 20 мкл, содержащие 1х Супермикс для зондов цкПЦР (без дУТФ) (Bio-Rad), праймеры NPY/зонд FAM (900 нМ/250 нМ), праймеры NPY2R/зонд HEX (900 нМ/250 нМ) и 2 мкл кДНК, разведенной в соотношении 1:5000. Применяли стандартные условия цикла для цифровой капельной ПЦР (термоциклер BioRad С1000 Touch) при температуре отжига/удлинения 60°С. Образцы анализировали на считывающем устройстве для капельной ПЦР QX200 (BioRad) с применением программного обеспечения QuantaSoft™ (BioRad).
Иммуногистохимический анализ NPY: Инкубацию с антителом кролика против NPY (1:500 / 1:10000; Sigma-Aldrich) с последующей инкубацией с конъюгированным с Су3 антителом осла против антитела кролика (1:200, Jackson Immunoresearch, США) или с биотинилированным вторичным антителом осла против антитела кролика и 3,3-диаминобензидином (DAB) использовали для визуализации экспрессии NPY в гиппокампальных срезах. Оцифрованные изображения получали с применением микроскопа Olympus ВХ61 и программного обеспечения CellSens. Уровни NPY оценивали в дорсальном гиппокампальном слое СА1 (пирамидная пластинка и краевой и радиальный слои) после качественной оценки и присваивали значения, соответствующие NPY-положительному сигналу: 1 (уровни NPY, соответствующие эндогенным уровням), 2 (низкая экспрессия NPY выше эндогенного уровня), 3 (умеренная экспрессия NPY выше эндогенного уровня) и 4 (высокая экспрессия NPY выше эндогенного уровня). Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни. *Р<0,05 по сравнению с контрольными животными, ранее не получавшими лечение.
125
Авторадиографический анализ связывания рецептора NPY Y2: гиппокампальные срезы инкубировали с 0,1 нМ [I][Tyr36]моноиод-PYY (4000 Ки/ммоль; №IM259; Amersham Biosciences) вместе с 10 нМ Leu31, Pro34-нейропептида Y (предпочтительный агонист Y1/Y4/Y5; №Н-3306, Bachem AG, Швейцария) для визуализации связывания Y2. Для визуализации неспецифичного связывания добавляли 1 мкМ немеченного NPY (синтетический человека/крысы, Schafer-N, Дания). Затем срезы экспонировали с 1251-чувствительными пленками Kodak Biomax MS (Amersham Biosciences) и визуализировали. Связывание рецептора Y2 оценивали в дорсальном гиппокампальном слое СА1 (пирамидная пластинка и краевой и радиальный слои) после качественной оценки и присваивали значения, соответствующие сигналам рецептора Y2: 1 (экспрессия рецептора Y2, соответствующая эндогенным уровням), 2 (низкая экспрессия рецептора Y2 выше эндогенного уровня), 3 (умеренная экспрессия рецептора Y2 выше эндогенного уровня) и 4 (высокая экспрессия рецептора Y2 выше эндогенного уровня). Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни. *Р<0,05 по сравнению с контрольными животными, ранее не получавшими лечение.
35
35
Авторадиографический анализ связывания функционального рецептора NPY Y2: гиппокампальные срезы инкубировали с 40 пМ [S]-GTPγS (1250 Ки/ммоль; NEG030H250UC; PerkinElmer, Дания), 1 мкМ NPY (Schafer-N, Копенгаген, Дания), 1 мкМ антагониста рецептора Y1 BIBP3226 (№Е3620, Bachem AG, Швейцария) и 10 мкМ антагониста рецептора Y5 L-152,804 (№1382, Tocris Cookson, Великобритания) для визуализации функционального связывания рецептора Y2. Для подтверждения связывания рецептора Y2 1 мкМ антагониста рецептора Y2BIIE0246 (№1700, Tocris Cookson, Великобритания) добавляли к NPY вместе с BIBP3226 и L-152,804. Неспецифичное связывание определяли путем инкубации в буфере В с 40 пМ [S]-GTPγS и 10 мкМ немеченного GTPγS (№89378; Sigma-Aldrich). Затем срезы экспонировали с пленками Kodak BioMax MR и визуализировали. Функциональное связывание рецептора Y2 оценивали в дорсальном гиппокампальном слое СА1 (пирамидная пластинка и краевой и радиальный слои) с применением программного обеспечения ImageJ (Национальный институт здравоохранения, США). Данные представлены в виде средних значений ±СОС и проанализированы с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента. *Р<0,05, ***Р<0,001 по сравнению с контрольными животными, ранее не получавшими лечение.
Инъекции вектора АА V в полосатое тело мыши
12
Мышам под наркозом инъецировали вирусный вектор (1,1×10 геномных частиц/мл) в три участка со следующими координатами относительно брегмы: переднезадняя ось: +0,85 мм; срединно-латеральная: ±1,85 мм; дорсально-вентральная: -3,00 мм (1 мкл), -3,4 мм (0,5 мкл), -3,85 мм (1 мкл) с использованием в качестве начала координат наружной части черепа).
Тест на сетке при вызванной галоперидолом каталепсии
В данной общепринято используемой фармакологической модели симптомов при болезни Паркинсона применяют введение галоперидола, который, как известно, выступает антагонистом дофаминовых D2-рецепторов и снижает содержание дофамина в полосатом теле (Duty and Jenner, 2011). Это приводит к получению в результате блокады дофаминэргической передачи сигналов и абнормальному возбуждению в нижестоящих цепях базальных ганглиев, которое проявляется в виде симптомов ригидности и каталепсии, имитирующих двигательные симптомы, наблюдаемые при болезни Паркинсона.
Мышам инъецировали галоперидол (1,0 мг/кг, и.п.), исследовали путем помещения мышей на металлическую сетку в течение периода времени 60 секунд и отмечали время обездвиживания. Исследование проводил наблюдатель, которому не было известно условие лечения, в течение периодов наблюдения по 60 секунд каждые 30 мин. в течение периода наблюдения 2 часа после инъекции галоперидола.
Список литературы
Adewale AS, et al., 2005. Neuropeptide Y induced modulation of dopamine synthesis in the striatum. Regul Pept 129:73-78.
Adewale AS, et al., 2007. Neuropeptide Y-induced enhancement of the evoked release of newly synthesized dopamine in rat striatum: mediation by Y2 receptors. Neuropharmacology 52:1396-1402
Altschul, S.F., Madden, T.L.,  A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402.
Bartus RT, Weinberg MS, Samulski RJ, 2014. Parkinson's disease gene therapy: success by design meets failure by efficacy. Mol Ther 22:487-497.
Benmaamar, R., Pham-Le, B.T., Marescaux, C, Pedrazzini, Т., Depaulis, A., 2003. Induced down-regulation of neuropeptide Y-Y1 receptors delays initiation of kindling. Eur. J. Neurosci. 18, 768-774.
Benmaamar, R., Richichi, C, Gobbi, M., Daniels, A.J., Beck-Sickinger, A.G., Vezzani, A., 2005. Neuropeptide Y Y5 receptors inhibit kindling acquisition in rats. Regul. Pept. 125, 79-83.
Bochkov, Y.A., Palmenberg, A.C., 2006. Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location. Biotechniques 41:283-290.
Cannizzaro C, et al., 2003. Increased neuropeptide YmRNA expression in striatum in Parkinson's disease. Brain Res Mol Bain Res 110:169-176.Decressac M, et al., 2011. Exogenous neuropeptide Y promotes in vivo hippocampal neurogenesis. Hippocampus 21:233-238.
Decressac M, et al., 2012. Neuroprotection by neuropeptide Y in cell and animal models of Parkinson's disease. Neurobiol Aging 33:2125-37.
Devereux, J., Haeberli, P., Smithies, O., 1984. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res., 12, 387-395.
Duty, S., Jenner, P., 2011. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology, 165, 1357-1391.
Foti, S., Haberman, R.P., Samulski, R.J., McCown, T.J., 2007. Adeno-associated virusmediated expression and constitutive secretion of NPY or NPY13-36 suppresses seizure activity in vivo. Gene Ther. 14, 1534-1536.
Goodwin, E.C., Rottman, F.M., 1992. The 3'-flanking sequence of the bovine growth hormone gene contains novel elements required for efficient and accurate polyadenylation. J. Biochem. 23:16330-16334.
CR, Nikitidou L,  AT, Olesen MV, Serensen G, Christiansen SH,  M, Woldbye DP, Kokaia M. Combined gene overexpression of neuropeptide Y and its receptor Y5 in the hippocampus suppresses seizures. Neurobiol Dis. 2012, 45:288-96.
Kerkerian-Le Goff, et al., 1986. Striatal neuropeptide Y neurones are under the influence of the nigrostriatal dopaminergic pathway: immunohistochemical evidence. Neurosci Lett 66:106-112.Ledri M,  AT, Madsen MG, Christiansen SH, Ledri LN, Cifra A, Bengzon J, Lindberg E, Pinborg LH, Jespersen B, Getzsche CR, Woldbye DP, Andersson M, Kokaia M. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. J Neurosci. 2015, 35:9622-31.
Ledri, L.N., Melin, E., Christiansen, S.H., , C.R., Cifra, A., Woldbye, D.P., Kokaia, M, 2016. Translational approach for gene therapy in epilepsy: Model system and unilateral overexpression of neuropeptide Y and Y2 receptors. Neurobiol.Dis. 86, 52-61.
McCown TJ, 2011. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther 2011, 11:181-188.
Myers E.W., Miller, W., 1988. Optimal alignments in linear space. Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17.
Olesen, M.V., Christianse, S.H., , C.R., Nikitidou, L., Kokaia, M., Woldbye, D.P.D., 2012. Neuropeptide Y Yl receptor hippocampal overexpression via viral vectors is associated with modest anxiolytic-like and proconvulsant effects in mice. J Neurosci Res, 90, 498-507.
Patrylo PR, van den Pol AN, Spencer DD, Williamson A. NPY inhibits glutamatergic excitation in the epileptic human dentate gyrus. J Neurophysiol. 1999, 82:478-83.
Pearson, W.R., 1990. Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol., 183, 63-98.
Rees, S., J. Coote, J. Stables, S. Goodson, S. Harris, and M.G. Lee, 1996. Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibiotic-resistant cells to express recombinant protein. BioTechniques 20:102-110.
Rose JB, et al., 2009. Neuropeptide Y fragments derived from neprilysin processing are neuroprotective in a transgenic model of Alzheimer's disease. J Neurosci, 29:1115-1125.
Salin P, et al., 1990. Expression of neuropeptide Y immunoreactivity in the rat nucleus accumbens is under the influence of the dopaminergic mesencephalic pathway. Exp Brain Res, 81:363-371.
Shaw JL, et al., 2003. Functional autoradiography of neuropeptide Y Yl and Y2 receptor subtypes in rat brain using agonist stimulated [35S]GTPgammaS binding. J Chem Neuroanat 26:179-193.Watakabe, A, Ohtsuka, M, Kinoshita, M, Takaji, M, Isa, K, Mizukami, H, Ozawa, K, et al. (2015). Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res 93:144-157.
Woldbye DP, Larsen PJ, Mikkelsen JD, Klemp K, Madsen TM, Bolwig TG. Powerful inhibition of kainic acid seizures by neuropeptide Y via Y5-like receptors. Nat Med. 1997, 3:761-4.
Woldbye, D.P., Nanobashvili, A., Serensen, A.T., Husum, H., Bolwig, T.G., , G., et al., 2005. Differential suppression of seizures via Y2 and Y5 neuropeptide Y receptors. Neurobiol. Dis. 20, 760-772.Woldbye, D.P.,  M., , C.R.,  H., , A.T., Christiansen, S.H., et al., 2010. Adeno-associated viral vector-induced overexpression of neuropeptide Y Y2 receptors in the hippocampus suppresses seizures. Brain 133,2778-2788.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  COMBIGENE AB
<120>  ВЕКТОР
<130>  P129070003
<160>  16
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  294
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
atgctaggta acaagcgact ggggctgtcc ggactgaccc tcgccctgtc cctgctcgtg       60
tgcctgggtg cgctggccga ggcgtacccc tccaagccgg acaacccggg cgaggacgca      120
ccagcggagg acatggccag atactactcg gcgctgcgac actacatcaa cctcatcacc      180
aggcagagat atggaaaacg atccagccca gagacactga tttcagacct cttgatgaga      240
gaaagcacag aaaatgttcc cagaactcgg cttgaagacc ctgcaatgtg gtga            294
<210>  2
<211>  1146
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
atgggtccaa taggtgcaga ggctgatgag aaccagacag tggaagaaat gaaggtggaa       60
caatacgggc cacaaacaac tcctagaggt gaactggtcc ctgaccctga gccagagctt      120
atagatagta ccaagctgat tgaggtacaa gttgttctca tattggccta ctgctccatc      180
atcttgcttg gggtaattgg caactccttg gtgatccatg tggtgatcaa attcaagagc      240
atgcgcacag taaccaactt tttcattgcc aatctggctg tggcagatct tttggtgaac      300
actctgtgtc taccgttcac tcttacctat accttaatgg gggagtggaa aatgggtcct      360
gtcctgtgcc acctggtgcc ctatgcccag ggcctggcag tacaagtatc cacaatcacc      420
ttgacagtaa ttgccctgga ccggcacagg tgcatcgtct accacctaga gagcaagatc      480
tccaagcgaa tcagcttcct gattattggc ttggcctggg gcatcagtgc cctgctggca      540
agtcccctgg ccatcttccg ggagtattcg ctgattgaga tcattccgga ctttgagatt      600
gtggcctgta ctgaaaagtg gcctggcgag gagaagagca tctatggcac tgtctatagt      660
ctttcttcct tgttgatctt gtatgttttg cctctgggca ttatatcatt ttcctacact      720
cgcatttgga gtaaattgaa gaaccatgtc agtcctggag ctgcaaatga ccactaccat      780
cagcgaaggc aaaaaaccac caaaatgctg gtgtgtgtgg tggtggtgtt tgcggtcagc      840
tggctgcctc tccatgcctt ccagcttgcc gttgacattg acagccaggt cctggacctg      900
aaggagtaca aactcatctt cacagtgttc cacattatcg ccatgtgctc cacttttgcc      960
aatccccttc tctatggctg gatgaacagc aactacagaa aggctttcct ctcggccttc     1020
cgctgtgagc agcggttgga tgccattcac tctgaggtgt ccgtgacatt caaggctaaa     1080
aagaacctgg aggtcagaaa gaacagtggc cccaatgact ctttcacaga ggctaccaat     1140
gtctaa                                                                1146
<210>  3
<211>  582
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  A7 EMCV IRES
<400>  3
cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg       60
tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc      120
cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa      180
ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga      240
caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc      300
ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc      360
cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac      420
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg      480
tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac      540
ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagtcg ac                         582
<210>  4
<211>  936
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CAG Промотор
<400>  4
cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac       60
gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata      120
tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc      180
agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta      240
ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc      300
cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg      360
gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc      420
ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga      480
ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc      540
gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac      600
tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt      660
agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc      720
tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc      780
cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga      840
gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg      900
gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattg                                936
<210>  5
<211>  593
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  WPRE
<400>  5
atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat       60
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct      120
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag      180
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc      240
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc      300
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct      360
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg      420
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg      480
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg      540
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc ccc             593
<210>  6
<211>  269
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  bGH-polyA
<400>  6
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc       60
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa      120
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac      180
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg      240
gcttctgagg cggaaagaac cagctgggg                                        269
<210>  7
<211>  183
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  5' конец ITR
<400>  7
tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc       60
tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc      120
actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc      180
tct                                                                    183
<210>  8
<211>  183
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  3' конец ITR
<400>  8
agcatggcta cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag       60
tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa      120
aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag      180
ctt                                                                    183
<210>  9
<211>  4288
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR
<400>  9
tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc       60
tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc      120
actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc      180
tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt      240
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag      300
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc      360
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag      420
tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc      480
ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg      540
gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg      600
gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt      660
ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag      720
tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc      780
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg      840
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc      900
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg      960
gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc     1020
ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc     1080
aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgagatg     1140
ctaggtaaca agcgactggg gctgtccgga ctgaccctcg ccctgtccct gctcgtgtgc     1200
ctgggtgcgc tggccgaggc gtacccctcc aagccggaca acccgggcga ggacgcacca     1260
gcggaggaca tggccagata ctactcggcg ctgcgacact acatcaacct catcaccagg     1320
cagagatatg gaaaacgatc cagcccagag acactgattt cagacctctt gatgagagaa     1380
agcacagaaa atgttcccag aactcggctt gaagaccctg caatgtggtg acaattgcgc     1440
ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt     1500
gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg     1560
aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga     1620
atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa     1680
acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc     1740
tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac     1800
gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag     1860
gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc     1920
acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg     1980
gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taagtcgaca ctagcatggg tccaataggt     2040
gcagaggctg atgagaacca gacagtggaa gaaatgaagg tggaacaata cgggccacaa     2100
acaactccta gaggtgaact ggtccctgac cctgagccag agcttataga tagtaccaag     2160
ctgattgagg tacaagttgt tctcatattg gcctactgct ccatcatctt gcttggggta     2220
attggcaact ccttggtgat ccatgtggtg atcaaattca agagcatgcg cacagtaacc     2280
aactttttca ttgccaatct ggctgtggca gatcttttgg tgaacactct gtgtctaccg     2340
ttcactctta cctatacctt aatgggggag tggaaaatgg gtcctgtcct gtgccacctg     2400
gtgccctatg cccagggcct ggcagtacaa gtatccacaa tcaccttgac agtaattgcc     2460
ctggaccggc acaggtgcat cgtctaccac ctagagagca agatctccaa gcgaatcagc     2520
ttcctgatta ttggcttggc ctggggcatc agtgccctgc tggcaagtcc cctggccatc     2580
ttccgggagt attcgctgat tgagatcatt ccggactttg agattgtggc ctgtactgaa     2640
aagtggcctg gcgaggagaa gagcatctat ggcactgtct atagtctttc ttccttgttg     2700
atcttgtatg ttttgcctct gggcattata tcattttcct acactcgcat ttggagtaaa     2760
ttgaagaacc atgtcagtcc tggagctgca aatgaccact accatcagcg aaggcaaaaa     2820
accaccaaaa tgctggtgtg tgtggtggtg gtgtttgcgg tcagctggct gcctctccat     2880
gccttccagc ttgccgttga cattgacagc caggtcctgg acctgaagga gtacaaactc     2940
atcttcacag tgttccacat tatcgccatg tgctccactt ttgccaatcc ccttctctat     3000
ggctggatga acagcaacta cagaaaggct ttcctctcgg ccttccgctg tgagcagcgg     3060
ttggatgcca ttcactctga ggtgtccgtg acattcaagg ctaaaaagaa cctggaggtc     3120
agaaagaaca gtggccccaa tgactctttc acagaggcta ccaatgtcta aggatccact     3180
agtccagtgt ggtggaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa     3240
tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg     3300
ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct     3360
tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg     3420
gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct     3480
gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg     3540
ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg     3600
tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc     3660
tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc     3720
gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc     3780
ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg atcgactcgc tgatcagcct     3840
cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga     3900
ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt     3960
gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg     4020
attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg     4080
aaagaaccag ctggggctcg actagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta     4140
atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc     4200
tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc     4260
tcagtgagcg agcgagcgcg cagagctt                                        4288
<210>  10
<211>  4288
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR
<400>  10
tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc       60
tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc      120
actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc      180
tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt      240
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag      300
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc      360
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag      420
tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc      480
ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg      540
gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg      600
gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt      660
ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag      720
tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc      780
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg      840
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc      900
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg      960
gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc     1020
ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc     1080
aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgacact     1140
agcatgggtc caataggtgc agaggctgat gagaaccaga cagtggaaga aatgaaggtg     1200
gaacaatacg ggccacaaac aactcctaga ggtgaactgg tccctgaccc tgagccagag     1260
cttatagata gtaccaagct gattgaggta caagttgttc tcatattggc ctactgctcc     1320
atcatcttgc ttggggtaat tggcaactcc ttggtgatcc atgtggtgat caaattcaag     1380
agcatgcgca cagtaaccaa ctttttcatt gccaatctgg ctgtggcaga tcttttggtg     1440
aacactctgt gtctaccgtt cactcttacc tataccttaa tgggggagtg gaaaatgggt     1500
cctgtcctgt gccacctggt gccctatgcc cagggcctgg cagtacaagt atccacaatc     1560
accttgacag taattgccct ggaccggcac aggtgcatcg tctaccacct agagagcaag     1620
atctccaagc gaatcagctt cctgattatt ggcttggcct ggggcatcag tgccctgctg     1680
gcaagtcccc tggccatctt ccgggagtat tcgctgattg agatcattcc ggactttgag     1740
attgtggcct gtactgaaaa gtggcctggc gaggagaaga gcatctatgg cactgtctat     1800
agtctttctt ccttgttgat cttgtatgtt ttgcctctgg gcattatatc attttcctac     1860
actcgcattt ggagtaaatt gaagaaccat gtcagtcctg gagctgcaaa tgaccactac     1920
catcagcgaa ggcaaaaaac caccaaaatg ctggtgtgtg tggtggtggt gtttgcggtc     1980
agctggctgc ctctccatgc cttccagctt gccgttgaca ttgacagcca ggtcctggac     2040
ctgaaggagt acaaactcat cttcacagtg ttccacatta tcgccatgtg ctccactttt     2100
gccaatcccc ttctctatgg ctggatgaac agcaactaca gaaaggcttt cctctcggcc     2160
ttccgctgtg agcagcggtt ggatgccatt cactctgagg tgtccgtgac attcaaggct     2220
aaaaagaacc tggaggtcag aaagaacagt ggccccaatg actctttcac agaggctacc     2280
aatgtctaag gatccactag tccagtgtgg tggaattgcg cccctctccc tccccccccc     2340
ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat     2400
tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct     2460
tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg     2520
tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc     2580
tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg     2640
tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg     2700
tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga     2760
aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt     2820
agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa     2880
aaacacgatg ataagtcgag atgctaggta acaagcgact ggggctgtcc ggactgaccc     2940
tcgccctgtc cctgctcgtg tgcctgggtg cgctggccga ggcgtacccc tccaagccgg     3000
acaacccggg cgaggacgca ccagcggagg acatggccag atactactcg gcgctgcgac     3060
actacatcaa cctcatcacc aggcagagat atggaaaacg atccagccca gagacactga     3120
tttcagacct cttgatgaga gaaagcacag aaaatgttcc cagaactcgg cttgaagacc     3180
ctgcaatgtg gtgacaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa     3240
tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg     3300
ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct     3360
tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg     3420
gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct     3480
gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg     3540
ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg     3600
tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc     3660
tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc     3720
gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc     3780
ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg atcgactcgc tgatcagcct     3840
cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga     3900
ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt     3960
gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg     4020
attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg     4080
aaagaaccag ctggggctcg actagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta     4140
atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc     4200
tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc     4260
tcagtgagcg agcgagcgcg cagagctt                                        4288
<210>  11
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  прямой праймер NPY
<400>  11
ctcatcacca ggcagagata tg                                                22
<210>  12
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  обратный праймер NPY
<400>  12
accacattgc agggtcttc                                                    19
<210>  13
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  прямой праймер NPY2R
<400>  13
ctggacctga aggagtacaa ac                                                22
<210>  14
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  обратный праймер NPY2R
<400>  14
gttcatccag ccatagagaa gg                                                22
<210>  15
<211>  97
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys
20                  25                  30
Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr
50                  55                  60
Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met
85                  90                  95
Trp
<210>  16
<211>  381
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Met Gly Pro Ile Gly Ala Glu Ala Asp Glu Asn Gln Thr Val Glu Glu
1               5                   10                  15
Met Lys Val Glu Gln Tyr Gly Pro Gln Thr Thr Pro Arg Gly Glu Leu
20                  25                  30
Val Pro Asp Pro Glu Pro Glu Leu Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ile Glu
35                  40                  45
Val Gln Val Val Leu Ile Leu Ala Tyr Cys Ser Ile Ile Leu Leu Gly
50                  55                  60
Val Ile Gly Asn Ser Leu Val Ile His Val Val Ile Lys Phe Lys Ser
65                  70                  75                  80
Met Arg Thr Val Thr Asn Phe Phe Ile Ala Asn Leu Ala Val Ala Asp
85                  90                  95
Leu Leu Val Asn Thr Leu Cys Leu Pro Phe Thr Leu Thr Tyr Thr Leu
100                 105                 110
Met Gly Glu Trp Lys Met Gly Pro Val Leu Cys His Leu Val Pro Tyr
115                 120                 125
Ala Gln Gly Leu Ala Val Gln Val Ser Thr Ile Thr Leu Thr Val Ile
130                 135                 140
Ala Leu Asp Arg His Arg Cys Ile Val Tyr His Leu Glu Ser Lys Ile
145                 150                 155                 160
Ser Lys Arg Ile Ser Phe Leu Ile Ile Gly Leu Ala Trp Gly Ile Ser
165                 170                 175
Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Ala Ile Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Ile
180                 185                 190
Glu Ile Ile Pro Asp Phe Glu Ile Val Ala Cys Thr Glu Lys Trp Pro
195                 200                 205
Gly Glu Glu Lys Ser Ile Tyr Gly Thr Val Tyr Ser Leu Ser Ser Leu
210                 215                 220
Leu Ile Leu Tyr Val Leu Pro Leu Gly Ile Ile Ser Phe Ser Tyr Thr
225                 230                 235                 240
Arg Ile Trp Ser Lys Leu Lys Asn His Val Ser Pro Gly Ala Ala Asn
245                 250                 255
Asp His Tyr His Gln Arg Arg Gln Lys Thr Thr Lys Met Leu Val Cys
260                 265                 270
Val Val Val Val Phe Ala Val Ser Trp Leu Pro Leu His Ala Phe Gln
275                 280                 285
Leu Ala Val Asp Ile Asp Ser Gln Val Leu Asp Leu Lys Glu Tyr Lys
290                 295                 300
Leu Ile Phe Thr Val Phe His Ile Ile Ala Met Cys Ser Thr Phe Ala
305                 310                 315                 320
Asn Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Met Asn Ser Asn Tyr Arg Lys Ala Phe
325                 330                 335
Leu Ser Ala Phe Arg Cys Glu Gln Arg Leu Asp Ala Ile His Ser Glu
340                 345                 350
Val Ser Val Thr Phe Lys Ala Lys Lys Asn Leu Glu Val Arg Lys Asn
355                 360                 365
Ser Gly Pro Asn Asp Ser Phe Thr Glu Ala Thr Asn Val
370                 375                 380
<---