АГЕНТ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ЦИТОКИНИНА
AGENT FOR INHIBITING CYTOKININ SIGNAL FUNCTION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к агенту, который проявляет ингибирующую активность в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора и регулирует рост или дифференцировку растения, и т.п.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Цитокинин представляет собой растительный гормон, который участвует в делении клеток и дифференцировке высших растений и является важным биологически активным веществом, которое, как известно, вызывает такие эффекты, как индукция деления клеток высших растений, дифференцировка из каллуса или сердцевины в листву, предотвращение этиоляции листьев, опавших листьев и опавших плодов, а также прекращение апикального доминирования (Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function, CRC Press (1994)). В качестве способа регулирования физиологических явлений, вызываемых цитокинином, был предложен способ, включающий введение цитокинина извне, способ, включающий регулирование биосинтеза цитокинина в растении, способ, включающий регулирование метаболизма цитокинина в растении и т.п.
Химическое вещество, служащее в качестве активного компонента регулятора роста растений, было найдено путем обычного случайного скрининга, в котором тестируемое химическое вещество приводят в непосредственный контакт с растением, а затем анализируют биологическую активность растения. В данном случае, после определения химического вещества, обладающего полезной биологической активностью, необходимо тщательно изучить, по какому механизму действия химическое вещество проявляет свой эффект и что служит целью химического вещества на молекулярном уровне, чтобы оценить безопасность и воздействие химического вещества на окружающую среду.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, а также способ поиска химического вещества, обладающего полезной биологической активностью, мишень которого была четко исследована, то есть способ скрининга химического вещества с использованием активности в отношении конкретной мишени в качестве индикатора, чтобы химически регулировать целевой сайт. В частности, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить агент, который обладает ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора и регулирует рост или дифференцировку растения, а также способ поиска химического вещества, которое служит активным компонентом агента.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает:
(1) агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, который обладает ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки;
(2) агент согласно вышеуказанному (1), где агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, является регулятором роста растения;
(3) агент согласно вышеуказанному (1), где агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, является агентом, способным регулировать рост растительного организма;
(4) агент согласно вышеуказанному (1), где агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, является агентом, способным регулировать дифференцировку растительной клетки;
(5) агент согласно вышеуказанному (3), где агент, способный регулировать рост растения, является агентом, способным регулировать рост почки растения;
(6) агент согласно вышеуказанному (5), где регуляция роста почки растения представляет собой ингибирование роста пазушной почки;
(7) агент согласно вышеуказанному (5), где контроль роста почки растения представляет собой ингибирование роста бутона;
(8) агент согласно вышеуказанному (3), где агент, способный регулировать рост растительного организма, является агентом, способным стимулировать развитие всходов растения;
(9) агент согласно вышеуказанному (3), где агент, способный регулировать рост растительного организма, является агентом, способным стимулировать рост побегов растения;
(10) агент согласно вышеуказанному (3), где агент, способный регулировать рост растительного организма, является агентом, способным стимулировать рост корней растения;
(11) агент согласно любому из вышеуказанных (1)-(10), где растительный цитокининовый рецептор клетки является цитокининовым рецептором, выбранным из следующей группы A:
<Группа A>
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора;
(12) агент согласно любому из вышеуказанных (1)-(10), где ингибирующая активность в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки является ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора, выбранного из следующей группы А в контактной системе клетки, включающей цитокининовый рецептор с веществом, обладающим агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора;
<Группа A>
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора;
(13) регулятор роста растения, включающий химическое вещество, способное ингибировать внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки или его сельскохозяйственно-приемлемую соль в качестве активного компонента;
(14) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (13), где химическое вещество обладает ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора, выбранного из следующей группы А, в контактной системе, включающей клетку, содержающую цитокининовый рецептор, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, а также химическое вещество;
<Группа A>
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора;
(15) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (14), где веществом, обладающим агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, является транс-зеатин;
(16) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (13), где химическое вещество обладает активностью, вызывающей снижение внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора, выбранного из следующей группы А, в контактной системе, включающей клетку, содержащую цитокининовый рецептор, 0,6 м.д. транс-зеатина и 2 м.д. химического вещества, в сравнении со случаем, когда химическое вещество не присутствует в контактной системе;
<Группа A>
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора;
(17) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (13), где химическое вещество обладает активностью, вызывающей снижение внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора, выбранного из следующей группы А, на 90% или более в контактной системе, включающей клетку, содержащую цитокининовый рецептор, 0,6 м.д. транс-зеатина и 2 м.д. химического вещества, по сравнению со случаем, когда химическое вещество не присутствует в контактной системе;
<Группа A>
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора;
(18) способ поиска химического вещества, способного стимулировать рост корней растения, который включает:
<1> первую стадию измерения количественного значения внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора, выбранного из следующей группы А, в контактной системе, включающей клетку, содержащую цитокининовый рецептор, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, а также тестируемое вещество; и
<2> вторую стадию отбора химического вещества, способного стимулировать рост корней растения, на основе различия, полученного при сравнении количественного значения внутриклеточной передачи сигналов, измеренного на первой стадии, с количественным значением внутриклеточной передачи сигналов в отсутствие химического вещества;
<Группа A>
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора;
(19) способ поиска согласно вышеуказанному (18), где клетка, содержащая цитокининовый рецептор, представляет собой трансформированную клетку, в которую введен полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1;
(20) способ поиска согласно вышеуказанному (18), где клетка, содержащая цитокининовый рецептор, представляет собой трансформированную дрожжевую клетку, в которую введен полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1;
(21) способ поиска согласно вышеуказанным (18), (19) или (20), где вещество, обладающее агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, представляет собой транс-зеатин;
(22) регулятор роста растения, включающий химическое вещество, выбранное способом поиска согласно вышеуказанным (18), (19), (20) или (21), или его сельскохозяйственно-приемлемую соль, в качестве активного компонента;
(23) способ регулирования роста растения, который включает нанесение эффективного количества регулятора роста растения, согласно вышеуказанным (13), (14), (15), (16), (17) или (22) на растение или место произрастания растения;
(24) способ регулирования роста растения, который включает определение химического вещества, способного стимулировать рост корней растения, способом поиска согласно вышеуказанным (18), (19), (20) или (21), и приведение в контакт с растением химического вещества, способного стимулировать рост корней растения, определенного таким способом;
(25) регулятор роста растения, включающий соединение, представленное общей формулой (I):
1
2
3
4
m
где R и X являются одинаковыми или различными и означают необязательно замещенную углеводородную группу, группу, представленную NRR, группу, представленную OR, группу, представленную S(O)R, нитрогруппой или атомом галогена,
1
где R означает атом водорода или необязательно замещенную углеводородную группу,
2
5
6
5
6
7
7
1
2
1-6
1-6
R означает атом водорода, необязательно замещенную углеводородную группу, группу, представленную NRR (где R и R являются одинаковыми или различными и означают атом водорода или необязательно замещенную C алкильную группу), или группу, представленную OR (где R означает атом водорода или необязательно замещенную C алкильную группу), или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют необязательно замещенную циклическую аминогруппу,
3
4
каждый R и R означает необязательно замещенную углеводородную группу,
l означает целое число от 0 до 1,
m означает целое число от 0 до 2,
n означает целое число от 0 до 4,
когда n равно 2 или больше, все X являются одинаковыми или отличными друг от друга, и
Ar означает необязательно замещенную арильную группу, или необязательно замещенную гетероарильную группу;
или его сельскохозяйственно-приемлемую соль, в качестве активного компонента;
(26) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (25), где l равно 1, а R является необязательно замещенной углеводородной группой;
1-3
(27) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (25), где l равно 1, а R является C алкильной группой, необязательно замещенной атомом (атомами) галогена или оксогруппой (оксогруппами);
1-3
(28) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (26), где необязательно замещенная углеводородная группа является C алкильной группой, необязательно замещенной атомом (атомами) галогена или оксогруппой (оксогруппами);
1
2
(29) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (25), где l равно 1, а R является пп. NRR;
1
2
1
2
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-6
3-6
3-6
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
(30) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (29), где R означает атом водорода или алкильную группу C, R означает атом водорода, аминогруппу, C алкиламиногруппу, ди-С алкиламиногруппу, амидиногруппу, C алкоксигруппу, фенильную группу, C ацильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, где фенильная группа необязательно замещена 1-3 одинаковыми или различными алкильными группами C, при этом фенильная группа, ацильная группа, алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены 1-3 одинаковыми или различными заместителями, выбранными из атома галогена, гидроксильной группы, C алкоксигруппы, гидрокси C алкоксигруппы, карбоксильной группы, C алкоксикарбонильной группы, карбамоильной группы, аминогруппы, C алкиламиногруппы, карбомоильной группы, аминогруппы, C алкиламиногруппы, ди-С алкиламиногруппы, меркаптогруппы, C ацилтиогруппы, цианогруппы, фурильной группы и тетрагидрофурильной группы, или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют пирролидиновую группу, пиперидиновую группу или морфолиновую группу;
1
2
1-6
3-6
3-6
(31) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (29), где R означает атом водорода, R означает атом водорода, формильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, где алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены (a) заместителем (заместителями), выбранным из гидроксильной группы, метоксигруппы, метоксикарбонильной группы, этоксикарбонильной группы, цианогруппы и фурильной группы;
3
(32) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (25), где l равно 1, а R является пп. OR;
3
1-3
(33) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (32), где R является C алкильной группой, которая необязательно замещена аминогруппой;
m
4
(34) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (25), где l равно 1, а R является пп. S(O)R;
4
1-3
(35) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (34), где R является C алкильной группой, которая необязательно замещена аминогруппой или гидроксильной группой, а m равно 0;
(36) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (25), где l равно 1, а R является атомом галогена;
(37) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (36), где атом галогена является атомом хлора;
1-3
1-3
1-3
(38) регулятор роста растения согласно любому из вышеуказанных (25)-(37), где n равно 1-2, а X является C алкильной группой, C алкоксигруппой, C галогеналкильной группой, цианогруппой, атомом галогена или нитрогруппой;
(39) регулятор роста растения согласно вышеуказанному (38), где X является атомом хлора, атомом брома или нитрогруппой, причем X находится в положении 6 и/или положении 8;
1-3
(40) регулятор роста растения согласно любому из вышеуказанных (25)-(37), где Ar является фенильной группой, которая необязательно замещена атомом (атомами) галогена или C алкильной группой (группами);
(41) способ регулирования роста растения, который включает нанесение эффективного количества регулятора роста растения согласно любому из вышеуказанных (25)-(40) на растение или место произрастания растения;
(42) соединение, представленное формулой (XI):
11
1-6
3-6
3-6
1-3
1-3
где Ph означает фенильную группу, R означает атом водорода, формильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, где алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из гидроксильной группы, C алкоксигруппы, C алкоксикарбонильной группы, цианогруппы, 2-фурильной группы и 2-тетрагидрофурильной группы,
m означает целое число от 0 до 3,
n означает целое число от 0 до 1,
по меньшей мере, одно из m и n не равно 0,
1
2
X и X являются одинаковыми или различными и означают атом хлора, атом брома, трифторметильную группу, цианогруппу или нитрогруппу,
1
когда m равно 2 или больше, все X являются одинаковыми или отличными друг от друга; при условии, что
1
11
a) когда m равно 1, X является атомом хлора в положении 5 или атомом хлора в положении 7, R означает метильную группу, а n означает целое число 1, или
b) когда n равно 1, и удовлетворено любое из условий (1)-(3), m означает целое число 1-3:
2
11
(1) X является атомом хлора, а R является группой, выбранной из атома водорода, метильной группы, 2-гидроксиэтильной группы, 3-гидроксипропильной группы, 2,2-диметоксиэтильной группы и цианометильной группы,
2
11
(2) X является атомом брома, а R является группой, выбранной из 2-гидроксиэтильной группы, 3-гидроксипропильной группы и 2-метоксиэтильной группы, и
2
11
(3) X является нитрогруппой, а R является 3-гидроксипропильной группой; или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
11
2
(43) соединение согласно вышеуказанному (42), где R означает атом водорода, формильную группу, метильную группу, этильную группу, 2-гидроксиэтильную группу, 2-метоксиэтильную группу, фурфурильную группу, метоксикарбонилметильную группу или этоксикарбонилметильную группу, m равно 0, n равно 1, а X является атомом хлора или нитрогруппой, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
11
1
2
(44) соединение согласно вышеуказанному (42), где R означает атом водорода, формильную группу, метильную группу, этильную группу, 2-гидроксиэтильную группу, 3-гидроксипропильную группу, 2-метоксиэтильную группу, фурфурильную группу, метоксикарбонилметильную группу или этоксикарбонилметильную группу, m равно 1, n равно 1, X является атомом хлора в положении 8, а X означает атом хлора или нитрогруппу, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
(45) соединение согласно вышеуказанному (42), где m равно целому числу 1-3, и n равно 0, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
11
11
4-6
3-6
3-6
1-3
1-3
1-3
1-3
(46) соединение согласно вышеуказанному (42), где R означает формильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, где алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены гидроксильной группой (группами) или C алкоксигруппой (алкоксигруппами), или R означает C алкоксикарбонилметильную группу, C алкокси C алкильную группу или фурфурильную группу,
m равно 0,
n равно 1,
2
X является атомом хлора, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
(47) соединение согласно вышеуказанному (42), где n равно 1, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
(48) соединение согласно вышеуказанному (42), где m равно 1-3, а n равно 1, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль;
11
1-3
(49) соединение согласно вышеуказанным (42), (45), (47) или (48), где R является C алкоксикарбонилметильной группой или фурфурильной группой, или его сельскохозяйственно-приемлемая соль; и
2
(50) соединение согласно вышеуказанному (42), где n равно 1, а X является трифторметильной группой или цианогруппой; и т.п.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 приведены результаты теста зависимости от дозы с использованием химического вещества, способного ингибировать внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки в примере 8. На фигурах линии данных представляют собой кривые ингибирования роста в зависимости от дозы, где ось X выражает концентрацию тестируемого химического вещества, а ось Y - относительный показатель роста. На фигурах слева (три субфигуры в левом вертикальном ряду) показаны результаты тест-систем с использованием трансформированной клетки TM182-CRE1. На фигурах справа (три субфигуры в правом вертикальном ряду) показаны результаты тест-систем с использованием трансформированной клетки TM182-p415CYC1. На верхних фигурах, средних фигурах и нижних фигурах представлены результаты тест-систем с использованием химического вещества Ic7-1, химического вещества Ic3-1 и химического вещества Ic3-3, соответственно.
На фиг.2 приведены результаты оценки активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием латука в примере 10. На фигуре линия данных представляет собой кривую стимулирования роста в зависимости от дозы, где ось X выражает концентрацию тестируемого химического вещества (химического вещества Ic3-1), а ось Y - показатель роста корней (%).
На фиг.3 приведены результаты оценки активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием латука в примере 10. На фигуре линия данных представляет собой кривую стимулирования роста в зависимости от дозы, где ось X выражает концентрацию тестируемого химического вещества (химического вещества Ic7-1), а ось Y - показатель роста корней (%).
На фиг.4 приведены результаты оценки активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса в примере 11. На фигуре линия данных представляет собой кривую стимулирования роста в зависимости от дозы, где ось X выражает концентрацию тестируемого химического вещества (химического вещества Ic3-1), а ось Y - показатель роста корней (%).
На фиг.5 приведены результаты оценки активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса в примере 11. На фигуре линия данных представляет собой кривую стимулирования роста в зависимости от дозы, где ось X выражает концентрацию тестируемого химического вещества (химического вещества Ic7-1), а ось Y - показатель роста корней (%).
На фиг.6 приведены результаты оценки активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса в примере 12. На фигуре "UTC" представляет собой результат контрольного теста, в котором при обработке семян использовали только ацетон. "IAA" представляет собой результат теста, в котором использовали ауксиновое соединение ИУК (IAA).
A. thaliana
На фиг.7 приведены результаты измерения активности формирования придаточных корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием гипокотиля  для оценки активности стимулирования дифференцировки растения в примере 13. На фигуре в "контрольной секции" показан результат контрольного теста с использованием агаровой среды, как описано в примере 13.
На фиг.8 приведены результаты измерения активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса в примере 14. На фигуре "UTC" представляет собой результат контрольного теста, в котором использовали только ацетон при обработке почвы поливом.
На фиг.9 приведены результаты анализа активности при стимулировании роста корней вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса, посредством анализатора изображений с целью измерения длины корней в примере 14. Относительно линий данных на фигуре, ось X выражает концентрацию тестируемого химического вещества (химическое вещество Ic3-3), а ось Y - полную сумму (полную длину корней) диаметров каждого корня. На фигуре "UTC" представляет собой результат контрольного теста, в котором использовали только ацетон при обработке почвы поливом. Условный знак (L) означает диаметр корня (мм).
На фиг.10 приведены результаты теста на ингибирование связывания цитокинина с цитокининовым рецептором тестируемым веществом в примере 19. На фигуре "только ДМСО" означает контроль, в котором тестируемое вещество не добавляли, а добавляли только ДМСО, который использовали в качестве растворителя для тестируемого вещества, вместо раствора тестируемого вещества в ДМСО. "Т-зеатин" означает добавление транс-зеатина в качестве тестируемого вещества, "Ic3-4" означает добавление Ic3-4 в качестве тестируемого вещества, и "ABA" означает добавление в качестве тестируемого вещества абсцизовой кислоты. Концентрация радиоактивной метки 2IP равна 10 нМ, а концентрация каждого тестируемого вещества равна 10 мкМ.
На фиг.11 приведены результаты оценки активности при стимулировании роста побегов риса вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина в тест-системе, в которой семена, обработанные тестируемым веществом, выращивали прямым сухим посевом в примере 21. На фигуре "Ic3-3" означает количество побегов на растение в случае использования пустой суспензии тестируемого вещества Ic3-3 для обработки семян, а "Обработка пустой суспензией" обозначает количество побегов на растение в случае использования для обработки семян пустой суспензии вместо раствора Ic3-3.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Zoysia matrella
В настоящем изобретении термин "растение" используется в широком смысле и означает организмы, живущие неподвижно и имеющие корни, такие как трава и деревья, а также имеет значение, включающее организм растения, ткань растения, клетку растения и т.п. В частности, термин "растение" означает организмы, такие как высшие растения, орган которых, называемый корнем, может играть важную роль, такую как фиксация растения в почве, а также поглощение воды и питательных веществ из внешней среды, при этом соответствующие примеры включают декоративные растения, такие как цветущие растения и декоративно-лиственные растения, сельскохозяйственные культуры, такие как зерновые культуры, овощи и плодовые деревья, волокнистые растения, деревья и травянистые растения. Конкретные примеры включают злаковые, такие как рис и кукуруза; травянистые растения, такие как полевица и ; тыквенные культуры, такие как томат, зеленый перец, красный перец и арбуз; тыквенные культуры, такие как огурец, тыква, дыня и арбуз; зеленые овощи, такие как капуста, брокколи и китайская капуста; зелень, например, сельдерей, петрушка и салат; овощные специи; луковые культуры, такие как лук-порей, лук и чеснок; бобовые, такие как соя, фасоль, горох и фасоль адзуки; ягодные культуры, такие как клубника; корнеплоды, такие как японская редька, японская репа, морковь, а также лопух; клубневые культуры, такие как таро, картофель, батат и ямс; зеленые травянистые культуры, такие как спаржа, шпинат и скрытница канадская; цветочные культуры, такие как эустома Русселя, левкой, гвоздика и хризантема; масличные культуры, такие как рапс и арахис; сахарные культуры, такие как сахарный тростник и сахарная свекла; волокнистые культуры, такие как хлопок и тростник; кормовые культуры, такие как клевер и сорго; листопадные плодовые деревья, такие как яблоня, груша, виноград, персик и каштан; цитрусовые деревья, такие как мандарин, лимон и грейпфрут; а также древесные растения, такие как азалия, рододендрон и кедр.
В настоящем изобретении термин "рост" растения означает общий процесс, в котором уже существующие вегетативные органы (корни, стебли, листья) формируются и увеличиваются в ходе процесса с раннего развития растения, начинающегося с прорастания семени, до роста и развития корней, стеблей и листьев, формирования цветов и последующего созревания семян. Примеры роста включают прорастание, рост корней, увеличение почек, расширение стеблей, формирование и увеличение верхушечных и пазушных почек, развитие ветвей и листьев, формирование бутонов, цветение, образование семян и созревание семян.
В настоящем изобретении термин "дифференцировка" растения означает, что растительная ткань, такая как корень, стебель или лист, формируется из каллуса, который является популяцией растительных клеток, обладающих тотипотентностью (повторная дифференцировка), или означает, что каллус формируется из клеток растительной ткани, такой как корень, стебель или лист (дедифференцировка).
В настоящем изобретении "регулирование роста почки" означает стимулирование или регулирование роста верхушечной почки или пазушной почки, при этом соотвествующие примеры включают инициирование роста пазушной почки, который подавлен апикальным доминированием, подавление роста пазушной почки, который начинается при удалении верхушечной почки, а также подавление нормального роста верхушечной почки.
В настоящем изобретении "агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения" является агентом, который может регулировать рост или дифференцировку растения посредством обработки агентом растения различными способами. Регулирование роста или дифференцировки растения применимо к регулированию роста или развития полезного растения, такого как сельскохозяйственная культура, которое способствует раннему созреванию, повышению качества, увеличению урожая, стабилизации урожая даже при неблагоприятных условиях, а также экономии рабочей силы в процессе производства. Таким образом, "агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения" может применяться в качестве "регулятора роста растения".
В настоящем изобретении "корень" растения включает главный корень, который развивается из первичного корешка, присутствующего в зародыше семени, а также боковой корень, который отходит от главного корня посредством ответвления, в случае двудольных и голосеменных растений. В случае однодольных растений "корень" включает корешок (первичный корешок), присутствующий в зародыше семени, корончатый корень (так называемый мочковатый корень), который формируется в верхней части после завершения роста первичного корня, и боковой корень, который тянется от придаточного корня посредством ответвления. Кроме того, "корень" иногда означает корневые волоски, которые отходят непрерывно в стороны и сформированы из эпидермальных клеток корня. Корень растения представляет собой орган, который играет важную роль в растении, такую как фиксация растения в почве, а также поглощение воды и питательных веществ из внешней среды. Корень растения также очень важен в качестве места, в котором вырабатывается растительный гормон. С точки зрения сельского хозяйства, многие культуры размножаются через их семена. Таким образом, очень важным элементом, ведущим к высокому качеству и высокому урожаю, является однородное развитие всходов, достигаемое на ранней стадии роста растения. Стимулирование роста корня растения, как ожидают, будет давать различные благоприятные эффекты, такие как повышение скорости укоренения в почве, повышение производительности или качества посредством улучшения развития всходов и т.п., борьба с сорняками на ранней стадии при улучшении развития всходов, и повышение эффективности источника семян. Стимулирование разрастания корней, как ожидают, приведет к повышению засухоустойчивости или устойчивости к вредителям, а также уменьшению количества удобрений при повышении способности к поглощению питательных веществ.
В настоящем изобретении "рост корня" растения означает, что длина корня и число корней увеличиваются или что количество, толщина и активность корней увеличиваются в результате деления, роста и увеличения веса корневых клеток.
В настоящем изобретении "стимулирование роста корня" растения означает, что рост корня растения активизирован в большей степени, нежели обычно, при этом растет длина корня и число корней, или количество, толщина и активность корня увеличиваются по сравнению со случаем, когда обработку не проводят.
В настоящем изобретении "агент, способный стимулировать рост корня растения" является агентом, который может стимулировать рост корня растения при обработке растения веществом различными способами. Стимулирование роста корня растения применимо к регулированию роста или развития полезного растения, такого как сельскохозяйственная культура, которое способствует раннему созреванию, повышению качества, увеличению урожая, стабилизации урожая даже при неблагоприятных условиях, а также экономии рабочей силы в процессе производства. Таким образом, "агент, способный стимулировать рост корня растения", может применяться в качестве "регулятора роста растения".
Используемый в настоящем описании термин "развитие всходов" означает, что посеянное семя прорастает, а затем укореняется в почве в состоянии, в котором обеспечивается нормальный рост организма растения, или что пересаженная рассада растения укореняется в почве, а затем нормально растет. Стимулирование развития всходов способствует раннему росту растения, благодаря чему можно вырастить здоровое растение. Кроме того, в результате увеличения количества выращенных здоровых растений можно ожидать увеличение конечного урожая. Например, в случае прямого посева риса обычно трудно гарантировать заданное количество прижившейся рассады по причине нестабильного прорастания и развития всходов. Агент, способный стимулировать развитие всходов согласно настоящему изобретению, может стимулировать развитие всходов, улучшая эффективность при прямом посеве риса. Термин "показатель развития всходов" означает долю развившихся растений от общего количества посеянных семян или общего количества пересаженной рассады растения. В случае риса, используемый в настоящем описании "показатель развития всходов" может быть определен из следующего уравнения.
[показатель развития всходов (%)]=[количество рассады, верхушка листа которой появляется над поверхностью воды]/[количество посеянных семян]×100.
Термин "образование побегов" растения означает ветвление в течение роста растения, или ветви, которые возникают в результате образование побегов. Например, в случае злаковых растений термин "образование побегов" означает боковые побеги. Стимулирование образования побегов включает ранее образование побегов и увеличение количества побегов. Например, когда регулятор роста растения настоящего изобретения применяется на растении в условиях стресса, например, при низкой температуре, высокой температуре и засухе, чтобы вызвать раннее образование побегов у растения, благодаря чему может быть получена здоровая ранняя рассада, что позволит избежать повреждения рассады при стрессе. Например, ранее образование побегов приводит к сокращению периода культивирования растения. Так как формирование побегов у растения непосредственно влияет на число всходов, то в зависимости от условий культивирования можно ожидать повышения урожая.
Ауксиновое активное вещество может проявлять неблагоприятные свойства, например, вызывать эпинастию листьев, скрученность стебля, растрескивание стебля и образование корневых узелков, в зависимости от вида растения, концентрации ауксина при обработке и т.п.
Считается, что вещества, обладающие цитокининовой активностью, вызывают и подавление, и стимулирование роста корня растения [например, PNAS 101 (23): 8821-8826 (2004)]. Однако чтобы использовать подобные свойства в сельскохозяйственной практике, нужно накопить данные многих исследований. Так как обычно трудно регулировать количество цитокинина в организме растения (в частности, чтобы уменьшить количество эндогенного цитокинина), то даже специалисту, квалифицированному в данной области, сложно точно определить функции цитокинина в растении.
Считается, что собственный уровень цитокинина растения можно негативно регулировать посредством ингибирования сигнальной трансдукции цитокинина для ослабления чувствительности к цитокинину. Например, сигнальную трансдукцию цитокинина можно ингибировать путем непосредственной мутации цитокининового рецептора, при этом были выделены мутанты цитокининовых рецепторов [The Plant Cell 16:1365-1377 (2004), PNAS 101 (23):8821-8826 (2004)]. Однако при использовании мутантов сложно регулировать степень ингибирования постепенно. Одиночный мутант цитокининового рецептора демонстрирует тот же фенотип, что и дикий тип. С другой стороны, тройной мутант цитокининового рецептора демонстрирует ингибирование удлинения корня и нарушение роста растительного организма.
"Растительный цитокининовый рецептор клетки" в настоящем изобретении означает цитокининовый рецептор, присутствующий в растении. Цитокининовый рецептор представляет собой белок, который специфично связывается с цитокинином, таким как цитокинин пуринового ряда, например, кинетин или зеатин, или цитокинин ряда мочевины, такой как N-фенил-N'-(4-пиридил)мочевина, регулируя пролиферацию и дифференцировку клеток высших растений посредством механизма внутриклеточной передачи сигналов, называемого двухкомпонентной регуляторной системой (или His-Asp системы фосфорилирования). Цитокининовый рецептор, используемый в настоящем изобретении, представляет собой белок, который относится к семейству гистидинкиназ и состоит из внеклеточного домена, трансмембранного домена, домена гистидинкиназы (области, которая обладает гистидинкиназной активностью в клетках и содержит остатки His в активном сайте) и реципиентного домена (области, которая включает реципиентную часть для переноса фосфатной группы и содержит остатки Asp в активном сайте).
Двухкомпонентная регуляторная система принимает информацию и является механизмом внутриклеточной передачи сигналов, который широко используется у эубактерий, древних бактерий, грибов и растений. В данном механизме гистидинкиназа действует в качестве рецептора, при этом гистидинкиназа содержит область приема для получения сигнала на N-конце и область, которая относится к переносу фосфатной группы, называемая доменом-переносчиком, на C-конце. Когда область приема получает сигнал, остаток His в домене-переносчике (вышеописанная область гистидинкиназы цитокининового рецептора) автофосфорилируется. Фосфатная группа переносится с поочередным фосфорилированием косервативных специфичных остатков His и Asp, и, наконец, фосфорилирует остаток Asp в реципиентном домене белка, называемого регулятором ответа. Фосфатная группа может переноситься непосредственно от гистидинкиназы к регулятору ответа или может переноситься к регулятору ответа посредством некоторых стадий переноса фосфатной группы. Простая двухкомпонентная регуляторная система, как и предыдущая, присутствует главным образом в прокариотах. С другой стороны, многостадийный перенос фосфата главным образом наблюдается в эукариотах, при этом к гистидинкиназе таких эукариотов часто присоединен реципиентный домен. Также в перенос фосфатной группы включен посредник переноса фосфатной группы. Фосфорилирование регулятора ответа контролирует активность области выхода, которая присоединена к регулятору ответа. Область выхода часто является регулятором транскрипции.
Arabidopsis thaliana
В случае цитокининового рецептора растения реципиентный домен присутствует в той же молекуле. Другими словами, в случае связывания цитокининового рецептора с цитокинином, известно, что автофосфорилирование остатка His в молекуле сопровождается переносом фосфатной группы от остатка His к остатку Asp в молекуле. Кроме того, установлено, что фосфатная группа переносится к остатку Asp регулятора ответа через остаток His в посреднике переноса фосфата. Например, в случае , установлено, что фосфатная группа переносится от цитокининового рецептора CRE1, AHK2 или AHK3 к регулятору ответа через посредник переноса фосфатной группы AHP.
Arabidopsis thaliana
Catharanthus roseus
Oryza sativa
Zea mays
Примеры гена, кодирующего цитокининовый рецептор, известные на настоящий момент, включают нуклеотидные последовательности генов, полученных из  (CRE1: регистрационный номер AB049934, AHK2: регистрационный номер AB046869, AHK3: регистрационный номер AB046870),  (регистрационный номер AY092025),  (регистрационный номер AY572461) и  (ZmHK1: регистрационный номер AB042270, ZmHK2: регистрационный номер AB102956, ZmHK3a: регистрационный номер AB102957, ZmHK3b: регистрационный номер AB121445). Такой ген, нуклеотидная последовательность которого известна, может быть амплифицирован с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК или кДНК организма, несущего желаемый ген, а также праймеров, которые получают на основе нуклеотидной последовательности, соответствующей N-концевой области белка, кодируемого указанным геном, и нуклеотидной последовательности, соответствующей его C-концевой области, а затем выделен. Ген, кодирующий цитокининовый рецептор, может быть также получен из растений, отличных от вышеописанных растений. Вначале из желаемого растения получают мРНК, и синтезируют кДНК с использованием мРНК в качестве матрицы и обратной транскриптазы. Полученную кДНК встраивают в вектор на основе фага, в такой как ZAPII, или в плазмидный вектор, например, pUC, с целью получения библиотеки кДНК. Затем выполняют ПЦР с использованием библиотеки кДНК в качестве матрицы и праймеров, которые создают и синтезируют на основе высококонсервативных нуклеотидных последовательностей генов, нуклеотидные последовательности которых известны, как описано выше, и таким образом может быть амплифицирован фрагмент ДНК, содержащий, по меньшей мере, часть гена, кодирующего цитокининовый рецептор. Затем библиотеку кДНК скринируют с использованием фрагмента ДНК в качестве зонда для отбора положительного клона. ДНК отобранного клона секвенируют, что позволяет подтвердить, что ген кодирует требуемый цитокининовый рецептор.
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Все три вида цитокининовых рецепторов (CRE1, AHK2, AHK3)  представляют собой гистидинкиназы, к которым в той же молекуле присоединен реципиентный домен. Гомология аминокислотной последовательности среди трех указанных цитокининовых рецепторов является высокой, и в частности, высокая гомология аминокислотной последовательности наблюдается среди их внеклеточных доменов, которые, как полагают, связываются с цитокинином. Кроме того, в случае рекомбинантных дрожжей, как описано далее, все три вида цитокининовых рецепторов начинали передачу внутриклеточного сигнала в ответ на цитокинин, что позволяет подтвердить, что они обладают активностью цитокининового рецептора. Цитокининовые рецепторы других растений также являются гистидинкиназами, а их аминокислотные последовательности обладают высокой гомологией с аминокислотными последовательностями цитокининовых рецепторов .
Arabidopsis thaliana
В таблице 1 показана идентичность аминокислотной последовательности цитокининового рецептора CRE1  и других цитокининовых рецепторов.
Arabidopsis thaliana
Предпочтительный пример "растительного цитокининового рецептора клетки" включает белок, который состоит из аминокислотной последовательности, обладающей идентичностью последовательности 45% или больше, предпочтительно 49% или больше, более предпочтительно 53% или больше, с аминокислотной последовательностью цитокининового рецептора CRE1 , и обладает функциональной активностью цитокининового рецептора.
<b>Таблица 1</b>
Идентичность аминокислотной последовательности (%) с CRE1
<i>A. thaliana</i> AHK2
53%
<i>A. thaliana</i> AHK3
54%
<i>Catharanthus roseus</i>
52%
<i>Oryza sativa</i>
49%
<i>Zea mays</i> ZmHK1
57%
<i>Zea mays</i> ZmHK2
51%
<i>Zea mays</i> ZmHK3a
52%
<i>Zea mays</i> ZmHK3b
49%
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
"Внутриклеточная передача сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки" является вышеописанной трансдукцией сигнала, которая достигается посредством переноса фосфатной группы, начинающейся с автофосфорилирования цитокининового рецептора, связывающегося с цитокинином. В растительной клетке сигнал ответа на цитокинин передается посредством автофосфорилирования цитокининового рецептора, которое инициируется связыванием с цитокинином, переноса фосфатной группы от автофосфорилированного цитокининового рецептора к посреднику переноса фосфатной группы, а затем переноса фосфатной группы от фосфатной группы посредника переноса фосфатной группы к регулятору ответа. Точно так же в рекомбинантной клетке, несущей растительный цитокининовый рецептор, внутриклеточная передача сигналов от цитокининового рецептора достигается переносом фосфатной группы. Однако в данном случае посредник переноса фосфатной группы и регулятор ответа могут происходить из клетки хозяина. Из клетки хозяина могут происходить все, или из клетки хозяина могут происходить некоторые из них. Более того, посредник переноса фосфатной группы может не присутствовать. Например, в рекомбинантных почкующихся дрожжах, несущих растительный цитокининовый рецептор, внутриклеточная передача сигналов от цитокининового рецептора обеспечивается посредством переноса фосфатной группы от цитокининового рецептора, автофосфорилированного при связывании цитокинина с регулятором ответа Ssk1, который является регулятором ответа, полученным из клетки-хозяина почкующихся дрожжей, с помощью посредника переноса фосфатной группы Ypd1, который является посредником переноса фосфатной группы, полученным из клетки-хозяина почкующихся дрожжей. В рекомбинантных делящихся дрожжах, несущих растительный цитокининовый рецептор, внутриклеточная передача сигналов от цитокининового рецептора обеспечивается посредством переноса фосфатной группы к регулятору ответа Mcs4, полученному из клетки-хозяина делящихся дрожжей, с помощью посредника переноса фосфатной группы Spy1, полученного из клетки-хозяина делящихся дрожжей. В рекомбинантной , несущей растительный цитокининовый рецептор, внутриклеточная передача сигналов от цитокининового рецептора обеспечивается посредством переноса фосфатной группы к регулятору ответа RcsB, полученному из хозяина , с помощью посредника переноса фосфатной группы YojN, полученного из хозяина .
Escherichia coli
Arabidopsis thaliana
Пример способа определения присутствия или отсутствия, или количественного значения такой внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора включает способ, который включает определение присутствия или отсутствия, или количественного значения экспрессии целевого гена, транскрипцию которого контролирует регулятор ответа, расположенный после внутриклеточной сигнальной системы растительного цитокининового рецептора. Данный способ включает способ, включающий непосредственное определение присутствия или отсутствия, или количественного значения экспрессии целевого гена, а также способ, включающий трансформацию клетки-хозяина репортерной плазмидой, в которой репортерный ген, такой как ген флуоресцентного белка или ген β-галактозидазы слит с областью промотора целевого гена, и, кроме того, определения присутствия или отсутствия, или количественного значения экспрессии репортерного гена при использовании флюоресценции или окрашивания в качестве индикатора, и способ, включающий измерение или наблюдение увеличения или уменьшения количества клеток, связанных с экспрессией целевого гена, изменения характеристик клетки и т.п. Например, в случае вышеописанных рекомбинантных почкующихся дрожжей, рост рекомбинантных почкующихся дрожжей в зависимости от цитокинина может использоваться в качестве индикатора при определении присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора. В случае рекомбинантных делящихся дрожжей, размер рекомбинантных делящихся дрожжей в зависимости от цитокинина может использоваться в качестве индикатора при определении присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора. В случае рекомбинантной , окрашивание, обусловленное экспрессией гена β-галактозидазы, который слит с областью промотора целевого гена cps, может использоваться в качестве индикатора при определении присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора. В случае , трансформированного репортерной плазмидой, в которой репортерный ген слит с промотерной областью регулятора ответа ARR5 или ARR6 типа A и обеспечивает флюоресценцию или развитие окрашивания в ответ на цитокинин, может использоваться в качестве индикатора при определении присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора. Вышеописанные способы описаны, например, в Higuchi et al., Nature 409, 1060-1063 (2001); Suzuki et al., Plant Cell Physiol. 42, 107-113 (2001); Hwang and Sheen, Nature 413, 383-389 (2001), и т.д.
Среди различных способов определения внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки, как описано выше, предпочтительным примером механического, количественного и эффективного способа является способ, который включает определение роста рекомбинантных почкующихся дрожжей в зависимости от цитокинина посредством измерения оптической плотности жидкой среды с помощью спектрофотометра. Конкретный пример включает способ, описанный в JP-A 2003-079393.
"Ингибирующая активность в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки" означает способность к уменьшению внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки. Другими словами, это означает способность к уменьшению количественного показателя переноса фосфатной группы, который инициируется автофосфорилированием цитокининового рецептора и в котором фосфатная группа переносится от цитокининового рецептора к регулятору ответа. Конкретные примеры ингибирующей активности в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки включают способность к ингибированию активности гистидинкиназы цитокининового рецептора, способность к ингибированию переноса фосфатной группы от цитокининового рецептора к посреднику переноса фосфатной группы, способность к ингибированию переноса фосфатной группы от посредника переноса фосфатной группы к регулятору ответа, и способность к ингибированию регуляции транскрипции регулятора ответа. Более конкретно, пример способности к ингибированию активности гистидинкиназы цитокининового рецептора включает способность к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора посредством механизма, в котором определяется присутствие или отсутствие ингибирования внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора в зависимости от присутствия или отсутствия ингибирования связывания между веществом, обладающим цитокининовой агонистической активностью, и цитокининовым рецептором, которое приводит к ингибированию активности гистидинкиназы цитокининового рецептора. В данном случае, поскольку пример способа определения, ингибирует ли тестируемое вещество связывание между веществом, обладающим цитокининовой агонистической активностью, и цитокининовым рецептором, включает способ, включающий использование меченного радиоактивным изотопом вещества, обладающего цитокининовой агонистической активностью, и цитокининового рецептора. Например, вещество, обладающее цитокининовой агонистической активностью, меченое радиоактивным изотопом водорода, тритием с целью обеспечения высокой радиоактивности, и белок цитокининового рецептора, полученный из рекомбинантных дрожжей, в которые введен ген цитокининового рецептора, выдерживают вместе в подходящем буфере, после чего белок цитокининового рецептора собирают на стеклянном фильтре, чтобы измерить радиоактивность. Таким образом, вещество, обладающее цитокининовой агонистической активностью, меченное тритием с целью обеспечения высокой радиоактивности, и которое связывается с цитокиновым рецептором, может быть обнаружено. Когда тестируемое вещество также выдерживают вместе с меченным радиоактивным изотопом веществом, обладающим цитокининовой агонистической активностью, и белком цитокининового рецептора в буфере, это позволяет определить, ингибирует ли тестируемое вещество связывание между веществом, обладающим цитокининовой агонистической активностью, и цитокининовым рецептором при использовании снижения значения при измерении радиоактивности в качестве индикатора. Таким образом, когда тестируемое вещество добавляют к вышеописанной реакционной системе с целью определения присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора, может быть исследовано влияние тестируемого вещества на внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора.
"Агент, который обладает ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки", означает агент, включающий в качестве активного компонента вещество, обладающее ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки.
В настоящем изобретении "агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, который обладает ингибирующей активностью в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки", означает агент, способность которого ингибировать внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки определяют посредством вышеописанного способа и который может регулировать рост или дифференцировку растения. Агент предпочтительно является агентом, в котором агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, является регулятором роста растения.
В настоящем изобретении "регулятор роста растения" является агентом, способным регулировать рост или дифференцировку растения.
Пример способа определения способности к регулированию роста или дифференцировки растения включает способ определения активности при стимулировании роста корня у растения, а также способы, раскрытые в настоящем изобретении. В частности, способность к регулированию роста или к дифференцировке растения может быть определена, например, согласно следующему способу.
Arabidopsis thaliana
Согласно композиции, описанной ниже, приготавливали стандартную среду Enshi (см. таблицу 2). Раствор химического вещества в ДМСО дозировали по 4 мкл в блок пробирок, чтобы конечная концентрация составляла 0,001-10 м.д. Затем 600 мкл стерилизованной стандартной среды Enshi добавляли в каждую пробирку с последующим перемешиванием. В каждую пробирку помещали 10-20 семян  и культивировали при 22°C в течение 10 дней при ярком свете. Затем измеряли среднюю длину главных корней. Определяли среднее значение в восьми повторах, а затем определяли показатель роста корня с помощью следующего уравнения.
<b>Таблица 2</b>
Состав
Концентрация (мг/л)
Нитрат кальция
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
950
Нитрат калия
KNO<sub>3</sub>
810
Сульфат магния
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
500
Фосфат аммония
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
155
Хелатированное железо
Fe-ЭДТА
22,62
Борная кислота
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
2,86
Сульфат марганца
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
1,81
Сульфат цинка
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0,22
Сульфат меди
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,08
Молибдат натрия
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,025
Доводили до pH 5,8
[показатель роста корня (%)]=(средняя длина главного корня в секции, обработанной химическим веществом)/(средняя длина главного корня в контрольной секции)×100
Можно сказать, что тестируемое вещество, вызывающее весьма высокий показатель роста корня, обладает активностью стимулирования роста корня. Более предпочтительно, тестируемое вещество, обладающее показателем роста корня 120% или больше, может быть оценено как обладающее активностью стимулирования роста корня.
Регулятор роста растения в настоящем изобретении включает химическое вещество, способное к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки, или его сельскохозяйственно-приемлемую соль в качестве активного компонента.
В настоящем изобретении "сельскохозяйственно-приемлемая соль" означает соль в форме, которая не лишает возможности производить регулятор роста растения и применять продукт, и может являться солью в любой форме. Конкретные примеры соли включают соли минеральных кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, нитрат и фосфат; соли органических кислот, такие как формиат, ацетат, пропионат, оксалат, малонат, сукцинат, фумарат, малеат, лактат, соль яблочной кислоты, тартрат, цитрат, метансульфонат и этансульфонат; соли присоединения кислот, например, кислые соли аминокислот, такие как аспартат и глутамат; соли металлов, такие как соли щелочных металлов (соль натрия, соль калия и т.д.), соли щелочноземельных металлов (соль магния и т.д.) и соли алюминия; соли присоединения органических оснований, такие как метиламин, этиламин и этаноламин, а также основных аминокислот, таких как лизин и орнитин; и соли аммония.
Регулятор роста растения обычно используется в форме композиции, такой как эмульгируемый концентрат, смачиваемый порошок, суспензия или водорастворимый порошок, которые получают путем смешивания с твердым носителем, жидким носителем и т.п., и, в случае необходимости, добавления поверхностно-активного вещества (поверхностно-активных веществ) и других вспомогательных добавок к композиции. Композиция содержит обычно 0,5-90 мас.%, предпочтительно 1-80 мас.% вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина.
Примеры твердого носителя, используемого в композиции, включают тонкие порошки и гранулированные глины (каолинит, кизельгур, синтетический гидратированный оксид кремния, глину Фубазами, бентонит, кислую глину и т.д.), тальк, другие неорганические минералы (серицит, порошок кварца, порошок серы, активированный уголь, карбонат кальция и т.д.), а также химические удобрения (сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, мочевину и т.д.). Примеры жидкого носителя включают воду, спирты (метанол, этанол и т.д.), кетоны (ацетон, метилэтилкетон, циклогексанон и т.д.), ароматические углеводороды (толуол, ксилол, этилбензол, метилнафталин и т.д.), неароматические углеводороды (гексан, циклогексан, керосин и т.д.), сложные эфиры (этилацетат, бутилацетат и т.д.), нитрилы (ацетонитрил, изобутиронитрил и т.д.), простые эфиры (диоксан, диизопропиловый эфир и т.д.), амиды кислот (диметилформамид, диметилацетамид и т.д.) и галогенированные углеводороды (дихлорэтан, трихлорэтилен и т.д.).
Примеры поверхностно-активного вещества включают алкилсульфаты, алкилсульфонаты, алкиларилсульфонаты, алкиларилэфиры, а также их полиоксиэтиленовые соединения, эфиры полиэтиленгликоля, сложные эфиры многоатомных спиртов и производные сахароспиртов.
Примеры других вспомогательных добавок композиции включают усилители адгезии и диспергирующие агенты, такие как казеин, желатин, полисахариды (крахмал, гуммиарабик, производные целлюлозы, альгиновую кислоту и т.д.), производные лигнина, бентонит, синтетические водорастворимые полимеры (поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиакриловую кислоту и т.д.) и стабилизаторы, такие как PAP (кислый изопропиловый фосфат), BHT (2,6-трет-бутил-4-метилфенол), BHA (2-/3-трет-бутил-4-метоксифенол), растительные масла, минеральные масла, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот.
В настоящем изобретении "регулятор роста растения, включающий химическое вещество, способное к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки, или его сельскохозяйственно-приемлемую соль, в качестве активного компонента" является агентом, который может регулировать рост или дифференцировку растения, и содержит в качестве компонента химическое вещество, способность которого к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки определена вышеописанным способом, или сельскохозяйственно-приемлемую соль химического вещества. Химическое вещество предпочтительно является химическим веществом, обладающим способностью ингибировать внутриклеточную передачу сигналов от цитокининового рецептора в контактной системе вышеописанных рекомбинантных почкующихся дрожжей, которые включают цитокининовый рецептор, и вещества, обладающего агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора. Более предпочтительно, пример химического вещества включает химическое вещество, обладающее способностью ингибировать активность цитокининового рецептора в контактной системе вышеописанных рекомбинантных почкующихся дрожжей, которые включают цитокининовый рецептор, и вещества, обладающего агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, при этом активность цитокининового рецептора может быть уменьшена в присутствии 0,6 м.д. транс-зеатина и 2 м.д. или большего количества химического вещества, по сравнению со случаем в отсутствие химического вещества. Еще более предпочтительно пример химического вещества включает химическое вещество, обладающее способностью ингибировать активность цитокининового рецептора в контактной системе вышеописанных рекомбинантных почкующихся дрожжей, которые включают цитокининовый рецептор, и вещества, обладающего агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, при этом активность цитокининового рецептора может быть уменьшена на 90% или больше в присутствии 0,6 м.д. транс-зеатина и 2 м.д. или большего количества химического вещества, по сравнению со случаем в отсутствие химического вещества.
В настоящем изобретении "способ проверки способности тестируемого вещества стимулировать рост корня растения, который включает:
(1) первую стадию измерения активности ингибирования внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора, выбранного из следующей группы A (присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов) в контактной системе, включающей клетку, несущую цитокининовый рецептор, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, и тестируемое вещество; и
(2) вторую стадию оценки способности тестируемого вещества стимулировать рост корня растения на основе различия, полученного при сравнении активности, измеренной в первой стадии, с активностью в контроле" является способом, включающим первую стадию и вторую стадию, среди различных способов проверки способности тестируемого вещества стимулировать рост корня растения.
"Группа A" представлена следующим образом:
(a) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, в которой одна или несколько аминокислот удалены, добавлены или заменены, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(c) белок, включающий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности 45% или выше относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора,
(d) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2,
(e) белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, комплементарным полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий функциональной активностью цитокининового рецептора.
Первая стадия является стадией измерения активности ингибирования внутриклеточной передачи сигналов от цитокининового рецептора (присутствия или отсутствия, или количественного значения внутриклеточной передачи сигналов) в контактной системе, включающей клетку, несущую различные вышеописанные цитокининовые рецепторы, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении цитокининового рецептора, и тестируемое вещество. Вторая стадия является стадией оценки способности тестируемого вещества стимулировать рост корня растения на основе различия, полученного при сравнении активности, измеренной на первой стадии, с активностью в контроле. Используемый в настоящем описании, например, в случае, когда раствор тестируемого вещества в растворителе добавляют в реакционную систему, "контроль" означает тест, в котором добавляют только растворитель.
Растительный цитокининовый рецептор клетки, который используется в способе проверки способности тестируемого вещества стимулировать рост корня растения, который включает первую стадию и вторую стадию, представляет собой белок, показанный в вышеописанной группе A. Среди белков вышеописанной группы A в аминокислотных последовательностях белков, показанных в (b), (c), (d) и (e), различия от аминокислотной последовательности (a), которые могут быть обнаружены в некоторых случаях, обусловлены делецией, заменой, дополнением и т.п. некоторых аминокислот. Различия включают делецию, вызванную процессингом, которому белок, имеющий аминокислотную последовательность (a), подвергается в клетках. Кроме того, различия включают делецию, замену, дополнение и т.п. аминокислот, вызванные естественными генетическими мутациями, обусловленными видовыми различиями, индивидуальным различием и т.п. организмов, из которых получен белок, или генетической мутацией, искусственно введенной посредством сайт-специфического мутагенеза, случайного мутагенеза, мутационной обработки и т.п.
Количество таких аминокислотных делеций, замен, дополнений и т.п. может находиться в пределах диапазона, в котором может быть обнаружена активность гистидинкиназы цитокининового рецептора. Примеры аминокислотной замены включают замены на аминокислоты, обладающие аналогичными свойствами, такими как гидрофобность, заряд, pK и пространственная структура. Конкретные примеры такой замены включают замены в пределах групп (1) глицин, аланин; (2) валин, изолейцин, лейцин; (3) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; (4) серин, треонин; (5) лизин, аргинин; (6) фенилаланин, тирозин и т.п.
2+
Пример способа искусственного выполнения такой делеции, дополнения или замены аминокислоты (в дальнейшем иногда называемый заменой аминокислоты, обычно) включает способ, который включает воздействие на ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность (a), посредством сайт-специфического мутагенеза и затем экспрессию ДНК обычной методикой. Примеры способа сайт-специфического мутагенеза включают способ, включающий использование амбер-мутации (способ с пробелами в двойной спирали, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), и способ, включающий ПЦР с использованием праймеров для введения мутации. Пример способа искусственного выполнения замены аминокислоты включает способ, который включает воздействие на ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность (a), посредством случайного мутагенеза и затем экспрессию ДНК обычным способом. Пример способа случайного мутагенеза включает способ, включающий ПЦР с использованием ДНК, кодирующей любую из вышеописанных аминокислотных последовательностей, в качестве матрицы и с использованием пары праймеров, с помощью которых может быть амплифицирована полноразмерная ДНК, в условиях реакции, при которых дополнительная концентрация каждого из dATP, dTTP, dGTP и dCTP, используемых в качестве субстратов, изменена по сравнению с обычными условиями, или в условиях реакции, при которых концентрация Mg, ускоряющих полимеразную реакцию, повышена по сравнению с обычными условиями. Пример такой методики ПЦР включает способ, описанный в Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112, а также способ, описанный в WO0009682.
Используемая в настоящем описании "идентичность последовательности" означает идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями или двумя аминокислотными последовательностями. "Идентичность последовательности" определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей по всем их областям. Оптимальное выравнивание нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей может содержать дополнение или делецию (например, пробел). Такая идентичность последовательности может быть рассчитана путем проведения анализа гомологии с помощью таких программ, как FASTA [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4, 2444-2448 (1988)], BLAST [Altschul et al., Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)] и CLUSTAL W [Thompson, Higgins&Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680 (1994a)] для построения выравнивания. Вышеописанные программы обычно доступны на главной странице (http://www.ddbj.nig.ac.jp) Базы данных ДНК Японии [международная база данных ДНК, работающая в Центре Информационной Биологии и База данных ДНК Японии; CIB/DDBJ Национального Института Генетики] и т.п. Идентичность последовательности может быть также получена при использовании коммерчески доступного программного обеспечения для анализа последовательности. В частности, например, анализ гомологии выполняли методом Lipman-Pearson [Lipman, D. J. и Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)] с использованием GENETYX-WIN Ver.5 (Software Development, Ltd.) для построения выравнивания, и, таким образом, может быть вычислена идентичность последовательности.
"Жесткие условия", описанные в (e), включают такие условия, когда гибридзацию выполняют при 45°C в растворе, содержащем 6×SSC (10×SSC содержит 1,5 M NaCl и 0,15 M цитрат тринатрия), с последующей промывкой 2×SSC при 50°C (Молекулярная Биология, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6), в отличии от гибридизации, выполняемой согласно обычной методике, например, как описано в Молекулярном клонировании, 2-е издание, Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Концентрация соли в стадии промывки может быть выбрана в диапазоне, например, от 2×SSC (менее жесткие условия) до 0,2×SSC (более жесткие условия). Температура в стадии промывки может быть выбрана в диапазоне, например, от комнатной температуры (менее жесткие условия) до 65°C (более жесткие условия). И концентрация соли, и температура могут быть изменены.
Каждый из указанных белков является белком, обладающим функциональной активностью цитокининового рецептора. Предпочтительно используют следующий белок: белок, включающий аминокислотную последовательность, в которой аминокислотные остатки, соответствующие положениям (I) 459 и (II) 973 SEQ ID NO: 1 являются соответственно (I) гистидином в положении 459 и (II) аспарагиновой кислотой в положении 973, когда аминокислотная последовательность белка выравнена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 таким образом, чтобы могла быть получена максимальная идентичность последовательности. Используемая в настоящем описании фраза "аминокислотная последовательность белка выравнена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 таким образом, чтобы могла быть получена максимальная идентичность последовательности" означает, что анализ идентичности последовательности ряда целевых аминокислотных последовательностей, включая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, выполняют с использованием вышеописанной программы, такой как FASTA, BLAST или CLUSTAL W для выравнивания аминокислотной последовательности. В результате выравнивания ряда последовательностей таким способом можно определить положения гомологичных аминокислотных остатков в каждой из аминокислотных последовательностей, несмотря на вставку или делецию, присутствующие в аминокислотных последовательностях. Гомологичные положения, как считают, являются идентичным положением в трехмерной структуре, и, как может быть оценено, обладают аналогичными эффектами в отношении специфической функции целевого белка. Например, в случае известных цитокининовых рецепторов, включая цитокининовый рецептор, последовательность которого раскрыта в настоящем изобретении, аминокислотные остатки, соответствующие положениям (I) 459 и (II) 973 из SEQ ID NO: 1 являются соответственно (I) гистидином в положении 459 и (II) аспарагиновой кислотой в положении 973, когда аминокислотная последовательность цитокининового рецептора выравнена с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 таким образом, чтобы могла быть получена максимальная идентичность последовательности.
Активный компонент агента, способного регулировать рост или дифференцировку растения, может быть найден, например, посредством определения способности стимулировать рост корня растения.
Способ проверки способности стимулировать рост корня растения, который включает использование растительного цитокининового рецептора клетки, как описано выше, может также использоваться при поиске вещества, обладающего способностью регулировать рост или дифференцировку растения. В частности, когда способность тестируемого вещества стимулировать рост корня растения, определенная при использовании способа проверки способности стимулировать рост корня растения, который включает использование растительного цитокининового рецептора клетки, является конкретным значением или больше, либо конкретным значением или меньше, вещество выбирают. Таким образом, может быть найдено вещество, обладающее способностью стимулировать рост корня растения.
Поскольку вещество, выбранное методом поиска, обладает способностью регулировать рост или дифференцировку растения, композиция, содержащая вещество или его сельскохозяйственно-приемлемую соль в качестве активного компонента, может являться регулятором роста растения.
Конкретные примеры вещества, способного к ингибированию сигнальной функции цитокинина, включают антагонисты цитокинина и агонисты цитокинина.
Вещество, ингибирующее сигнальную функцию цитокинина, выбранное вышеописанным способом поиска, может стимулировать рост корня растения. Рост корня включает удлинение главного корня, удлинение бокового корня и удлинение корневых волосков.
Активность при стимулировании роста корня вещества, ингибирующего сигнальную функцию цитокинина, выбранного вышеописанным способом поиска, может быть проверена при использовании, например, следующего способа. Например, водные растворы, среды для гидропонной культуры или среды для культуры тканей, содержащие вещество, ингибирующее сигнальную функцию цитокинина, при различных концентрациях в пределах диапазона 0,0001-100 м.д. приготавливают в зависимости от вида растения и способа тестирования. В случае теста на чашках Петри фильтровальную бумагу, помещенную на чашки Петри, пропитывают раствором, а затем помещают семена растения. В случае теста в мешочке плотную бумагу пропитывают раствором и помещают в мешочек, который позволяет наблюдать рост корня, например, в мешочек для проращивания семян, а затем в мешочек помещают семена растения. Твердую среду готовят, добавляя агарозу, агар и т.п. в раствор в пластиковой чашке Петри или пластмассовой центрифужной пробирке, а затем туда помещают семена растения. После инкубации в течение определенного периода при 10-30°C на свету измеряют длину главного корня и боковых корней, число боковых корней, вес корня во влажном состоянии, вес корня в сухом состоянии и т.д.
Вещество, ингибирующее сигнальную функцию цитокинина, выбранное вышеописанным способом поиска, может использоваться в качестве регулятора роста растения.
1
2
3
4
5
6
7
В группах, обозначенных как R, X, R, R, R, R, R, R и R, в соединении, представленном общей формулой (I), используемом в настоящем изобретении (в дальнейшем иногда называемом соединение (I)), примеры "углеводородной группы" включают алифатическую углеводородную группу, моноциклическую насыщенную углеводородную группу и ароматическую углеводородную группу, при этом углеводородная группа, включающая 1-16 атомов углерода, является предпочтительной. Конкретные примеры включают алкильную группу, алкенильную группу, алкинильную группу, циклоалкильную группу, аралкильную группу и арильную группу.
1-6
"Алкильная группа" предпочтительно является, например, низшей алкильной группой. Конкретные примеры алкильной группы включают C алкильные группы, такие как метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная, втор-бутильная и трет-бутильная, пентильная и гексильная.
2-6
"Алкенильная группа" предпочтительно является, например, низшей алкенильной группой. Конкретные примеры алкенильной группы включают C алкенильные группы, такие как винильная, 1-пропенильная, аллильная, изопропенильная, бутенильная и избутенильная.
2-6
"Алкинильная группа" предпочтительно является, например, низшей алкинильной группой. Конкретные примеры алкинильной группы включают C алкинильные группы, такие как этинильная, пропаргильная и 1-пропинильная.
3-6
"Циклоалкильная группа" предпочтительно является, например, низшей циклоалкильной группой. Конкретные примеры циклоалкильной группы включают C циклоалкильные группы, такие как циклопропильная, циклобутильная, циклопентильная и циклогексильная.
7-11
"Аралкильная группа" предпочтительно является, например, C аралкильной группой, такой как бензильная или фенэтильная. В частности, например, используется бензильная группа.
6-14
"Арильная группа" предпочтительно является, например, C арильной группой, такой как фенильная, 1-нафтильная, 2-нафтильная, бифенилильная или 2-антрильная. В частности, например, используется фенильная группа.
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
Примеры заместителя "углеводородной группы" и "C алкильной группы" в "необязательно замещенной углеводородной группе" и "необязательно замещенной C алкильной группе", включают атом галогена (например, фтор, хлор, бром, иод и т.д.), нитрогруппу, цианогруппу, гидроксильную группу, низшую алкильную группу (например, C алкильную группу, такую как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил или гексил, и т.д.), низшую алкоксигруппу (например, C алкоксигруппу, такую как метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, пентилокси или гексилокси, и т.д.), аминогруппу, низшую моноалкиламиногруппу (например, моно-C алкиламиногруппу, такую как метиламино или этиламино, и т.д.), низшую диалкиламиногруппу (например, ди-C алкиламиногруппу, такую как диметиламино или диэтиламино, и т.д.), иминогруппу, карбоксильную группу, низшую алкилкарбонильную группу (например, C алкилкарбонильную группу, такую как ацетильная или пропионильная, и т.д.), низшую алкоксикарбонильную группу (например, C алкоксикарбонильную группу, такую как метоксикарбонильная, этоксикарбонильная, пропоксикарбонильная или бутоксикарбонильная, и т.д.), карбамоильную группу, тиокарбамоильную группу, низшую моноалкилкарбамоильную группу (например, моно-C алкилкарбамоильную группу, такую как метилкарбамоильная или этилкарбамоильная, и т.д.), низшую диалкилкарбамоильную группу (например, ди-C алкилкарбамоильную группу, такую как диметилкарбамоильная или диэтилкарбамоильная, и т.д.), арилкарбамоильную группу (например, C6-10 арилкарбамоильную группу, такую как фенилкарбамоильная или нафтилкарбамоильная, и т.д.), арильную группу (например, C6-10 арильную группа, такую как фенильная или нафтильная, и т.д.), арилоксигруппу (например, C6-10 арилоксигруппу, такую как фенилокси или нафтилокси, и т.д.), гетероциклическую группу (например, 2- или 3-тиенил, 2- или 3-тетрагидротиенил, 2- или 3-фурил, 2- или 3-тетрагидрофурил, 1-, 2- или 3-пирролил,
1-, 2- или 3-пирролидинил, 2-, 4- или 5-оксазолил, 3-, 4- или 5-изоксазолил, 2-, 4- или
5-тиазолил, 3-, 4- или  5-изотиазолил, 3-, 4- или 5-пиразолил, 2-, 3- или 4-пиразолидинил,
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
2-, 4- или 5-имидазолил, 4- или 5-1H-1,2,3-триазолил, 3- или 5-1,2,4-триазолил, 5-1H- или 5-2H-тетразолил, 2-, 3- или 4-пиридил, 2-, 4- или 5-пиримидинил, 1-, 2- или 3-тиоморфолинил, 1-, 2- или 3-морфолинил, 1-, 2-, 3- или 4-пиперидино, 2-, 3- или 4-пиперидил, 2-, 3- или 4-тиопиранил, 2-, 3- или 4-4H-1,4-оксадинил, 2-, 3- или 4-4H-1,4-тиазинил, 1,3-тиазинил, 1- или 2-пиперазинил, 3-, 5- или 6-1,2,4-триазинил, 2-1,3,5-триазинил, 3- или 4-пиридазинил, 2-пиразинил, и т.д.), низшую алкилкарбониламиногруппу (например, C алкилкарбониламиногруппу, такую как ацетиламино, и т.д.), меркаптогруппу, C алкилтиогруппу (например, C алкилтиогруппу, такую как метилтио, и т.д.), алкилсульфинильную группу (например, C алкилсульфинильную группу, такую как метилсульфинильная, и т.д.), алкилсульфонильную группу (например, C алкилсульфонильную группу, такую как метилсульфонильная, и т.д.), арилтиогруппу (например, C6-10 арилтиогруппу, такую как фенилтио, и т.д.), арилсульфинильную группу (например, C6-10 арилсульфинильную группу, такую как фенилсульфинильная, и т.д.), арилсульфонильную группу (например, C6-10 арилсульфонильную группу, такую как фенилсульфонильная, и т.д.), оксогруппы и тиоксогруппы.
1-6
Ацильная группа (например, формил, ацетил, пропионил, пивалоил, акрилоил, бензоил и т.д.) является своего рода углеводородной группой, которая замещена оксогруппой и включена в "необязательно замещенную углеводородную группу" и "необязательно замещенную C алкильную группу".
1-6
1-6
1-6
"Углеводородная группа" и "C алкильная группа" в "необязательно замещенной углеводородной группе" и "необязательно замещенной C алкильной группы", может иметь 1 или больше, предпочтительно 1-3 вышеописанных заместителя в замещаемых положениях. В случае, когда заместителем является атом галогена, то углеводородная группа и C алкильная группа могут иметь замещаемое максимальное число заместителей. Когда они имеют 2 или больше заместителей, заместители являются одинаковыми или различными.
1-4
6-10
6-10
6-10
1-4
В случае, когда заместителем является низшая алкильная группа, низшая алкоксигруппа, низшая моноалкиламиногруппа, низшая диалкиламиногруппа, низшая алкилкарбонильная группа, низшая алкоксикарбонильная группа, низшая моноалкилкарбамоильная группа, низшая диалкилкарбамоильная группа, арилкарбамоильная группа, арильная группа, арилоксигруппа, гетероциклическая группа, низшая алкилкарбониламиногруппа, алкилтиогруппа, алкилсульфинильная группа, алкилсульфонильная группа, арилтиогруппа, арилсульфинильная группа, арилсульфонильная группа и т.п., указанный заместитель необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из атома галогена (например, фтора, хлора, брома, иода и т.д.), нитрогруппы, цианогруппы, гидроксильной группы, C алкоксигруппы (например, метокси, этокси, пропокси, изопропилокси, бутокси, изобутилокси), арильной группы, оксогруппы и т.п. Когда заместителем является арилкарбамоильная группа, арильная группа, арилоксигруппа, гетероциклическая группа, C арилтиогруппа, C арилсульфинильная группа, C арилсульфонильная группа и т.п., указанный заместитель необязательно замещен одной-тремя C алкильными группами (например, метильной, этильной, пропильной, изопропильной, бутильной, изобутильной, втор-бутильной, трет-бутильной и т.д.).
1-6
Примеры "C алкильной группы" включают метильную, этильную, пропильную, изопропильную, бутильную, изобутильную, втор-бутильную и трет-бутильную, пентильную и гексильную.
1-3
1-3
1-3
1-3
Примеры "C алкильной группы" (включающей C алкильную группу, содержащуюся в C алкиламиногруппе и ди-С алкиламиногруппе) включают метильную, этильную, пропильную и изопропильную.
3-6
Примеры "C алкенильной группы" включают 1-пропенильную, аллильную, изопропенильную, бутенильную и изобутенильную.
3-6
Примеры "C алкинильной группы" включают пропаргильную и 1-пропинильную.
1-3
1-3
1-3
1-3
Примеры "C алкоксигруппы" (включающей C алкильную группу, содержащуюся в гидрокси C алкоксигруппе и C алкоксикарбонильной группе) включают метокси, этокси, пропокси и изопропилокси.
1-3
1-3
1-3
Примеры "C ацильной группы" (включающей C ацильную группу, содержащуюся в C ацилтиогруппе) включают формильную, ацетильную и пропионильную.
1-3
Примеры "C галогеналкильной группы" включают хлорметильную, трифторметильную, 2-бромэтильную, 2,2,2-трифторэтильную и 2,2,3,3,3-пентафторпропильную.
1
2
1-3
1-3
Примеры "циклической аминогруппы" в "R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют необязательно замещенную циклическую аминогруппу" включают 1-азиридинильную, пирролидино, пиперидино, морфолино и тиоморфолино. Примеры заместителя "циклической аминогруппы" включают 1-3 заместителя, описанные выше, такие как C алкильная группа, C алкоксигруппа и гидроксильная группа.
1
2
3
4
5
6
7
Примеры "арильной группы" в группах, обозначенных Ar, включают арильные группы, описанные как примеры "углеводородной группы", обозначенные R, X, R, R, R, R, R, R и R.
Примеры "гетероарильной группы" в группах, обозначенных Ar, включают 2- или 3-тиенил, 2- или 3-фурил, 1-, 2- или 3-пирролил, 2-, 4- или 5-оксазолил, 3-, 4- или 5-изоксазолил, 2-, 4- или 5-тиазолил, 3-, 4- или 5-изотиазолил, 3-, 4- или 5-пиразолил, 2-, 4- или 5-имидазолил, 4- или 5-1H-1,2,3-триазолил, 3- или 5-1,2,4-триазолил, 5-1H- или 5-2H-тетразолил, 2-, 3- или 4-пиридил, 2-, 4- или 5-пиримидинил, 1- или 2-пиперазинил, 3-, 5- или 6-1,2,4-триазинил, 2-1,3,5-триазинил, 3- или 4-пиридазинил, и 2-пиразинил.
1-6
1
2
3
4
5
6
7
Примеры заместителя для "арильной группы" и "гетероарильной группа" включают группы, описанные как примеры заместителя для "необязательно замещенной углеводородной группы" и "необязательно замещенной C алкильной группы", обозначенной R, X, R, R, R, R, R, R и R.
Соединение общей формулы (I), в которой l равно 0, является соединением, в котором 2-е положение хиназолинового скелета незамещено, то есть соединением общей формулы (I-1):
1
2
3
4
m
где X означает необязательно замещенную углеводородную группу, группу, представленную NRR, группу, представленную OR, группу, представленную S(O)R, нитрогруппу или атом галогена,
1
где R означает атом водорода или необязательно замещенную углеводородную группу,
2
5
6
5
6
7
7
1
2
1-6
1-6
R означает атом водорода, необязательно замещенную углеводородную группу, группу, представленную NRR (в которой R и R являются одинаковыми или различными и представляют собой атом водорода или необязательно замещенную C алкильную группу), или группу, представленную OR (в которой R означает атом водорода или необязательно замещенную C алкильную группу), или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют необязательно замещенную циклическую аминогруппу,
3
4
каждый R и R означает необязательно замещенную углеводородную группу,
m означает целое число от 0 до 2,
n означает целое число от 0 до 4,
когда n равно 2 или больше, все X являются одинаковыми или отличными друг от друга, и
Ar означает необязательно замещенную арильную группу или необязательно замещенную гетероарильную группу.
Соединение общей формулы (I), в которой l равно 1, является соединением, в котором 2-е положение хиназолинового скелета замещено R, то есть соединением общей формулы (I-2):
1
2
3
4
m
где R и X являются одинаковыми или различными и означают необязательно замещенную углеводородную группу, группу, представленную NRR, группу, представленную OR, группу, представленную S(O)R, нитрогруппу или атом галогена,
1
где R означает атом водорода или необязательно замещенную углеводородную группу,
2
5
6
5
6
7
7
1
2
1-6
1-6
R означает атом водорода, необязательно замещенную углеводородную группу, группу, представленную NRR (в которой R и R являются одинаковыми или различными и означают атом водорода или необязательно замещенную C алкильную группу), или группу, представленную OR (в которой R означает атом водорода или необязательно замещенную C алкильную группу), или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют необязательно замещенную циклическую аминогруппу,
3
4
каждый R и R означает необязательно замещенную углеводородную группу,
m означает целое число от 0 до 2,
n означает целое число от 0 до 4,
когда n равно 2 или больше, все X являются одинаковыми или отличными друг от друга, и
Ar означает необязательно замещенную арильную группу или необязательно замещенную гетероарильную группу.
Соединение (I) может находиться в форме вышеописанной "сельскохозяйственно-приемлемой соли".
Когда соединение (I) имеет один или более асимметричных центров, соединение включает два или более стереоизомеров (например, энантиомер, диастереомер и т.д.). Соединение настоящего изобретения включает все стереоизомеры и смесь двух или более стереоизомеров.
Когда соединение (I) обладает геометрической изомерией, основанной на двойной связи и т.п., соединение (I) включает два или более геометрических изомеров (например, E/Z или транс/цис изомеры, S-транс/S-цис изомеры и т.д.). Соединение (I) включает все геометрические изомеры и смесь двух или более геометрических изомеров.
Предпочтительные примеры соединения (I) включают следующие соединения.
(1) Соединение общей формулы (I), где l равно 1, а R является необязательно замещенной углеводородной группой.
1-3
(2) Соединение общей формулы (I), где l равно 1, а R является C алкильной группой, необязательно замещенной атомом (атомами) галогена или оксогруппой (оксогруппами).
1-3
(3) Соединение общей формулы (I), где необязательно замещенная углеводородная группа является C алкильной группой, необязательно замещенной атомом (атомами) галогена или (оксо) группами.
1
2
(4) Соединение общей формулы (I), где l равно 1, а R является пп. NRR.
1
2
1
2
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-6
3-6
3-6
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
(5) Соединение вышеуказанного (4), где R означает атом водорода или C алкильную группу, R означает атом водорода, аминогруппу, C алкиламиногруппу, ди-С алкиламиногруппу, амидиногруппу, C алкоксигруппу, фенильную группу, C ацильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, где фенильная группа необязательно замещена одним-тремя одинаковыми или различными C алкильными группами, причем фенильная группа, ацильная группа, алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены 1-3 одинаковыми или различными заместителями, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, гидроксильной группы, C алкоксигруппы, гидрокси C алкоксигруппы, карбоксильной группы, C алкоксикарбонильной группы, карбамоильной группы, аминогруппы, C алкиламиногруппы, ди-С алкиламиногруппы, меркаптогруппы, C ацилтиогруппы, цианогруппы, фурильной группы и тетрагидрофурильной группы, или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют пирролидиновую группу, пиперидиновую группу или морфолиновую группу.
1
2
1-6
3-6
3-6
(6) Соединение вышеуказанного (4), где R означает атом водорода, R означает атом водорода, формильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, где алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены заместителем (заместителями), выбранным из группы, состоящей из гидроксильной группы, метоксигруппы, метоксикарбонильной группы, этоксикарбонильной группы, цианогруппы и фурильной группы.
3
(7) Соединение общей формулы (I), где l равно 1, а R является пп. OR.
3
1-3
(8) Соединение вышеуказанного (7), где R является C алкильной группой, которая необязательно замещена аминогруппой.
m
4
(9) Соединение общей формулы (I), где l равно 1, а R является пп. S(O)R.
4
1-3
(10) Соединение вышеуказанного (9), где R является C алкильной группой, которая необязательно замещена аминогруппой или гидроксильной группой, а m равно 0.
(11) Соединение общей формулы (I), где l равно 1, а R является атомом галогена.
(12) Соединение вышеуказанного (11), где атом галогена является атомом хлора.
1-3
1-3
1-3
(13) Соединение общей формулы (I), где n равно 1-2, а X является C алкильной группой, C алкоксигруппой, C галогеналкильной группой, цианогруппой, атомом галогена или нитрогруппой.
(14) Соединение вышеуказанного (13), где X является атомом хлора, атомом брома или нитрогруппой, причем X замещен в положении 6 и/или положении 8.
1-3
(15) Соединение общей формулы (I), где Ar является фенильной группой, которая необязательно замещена атомом (атомами) галогена или C алкильной группой (группами).
Соединение (I) включает известные соединения и может быть получено известным способом или способом, аналогичным ему.
Например, соединение (Ia), в котором l равно 1, а R является атомом хлора, может быть получено путем нагревания соединения (II) с оксихлоридом фосфора согласно следующему способу получения 1.
Пример документа: JP-A 62-145073
Способ получения 1
где условные обозначения определены выше.
Реакция может быть выполнена в растворителе, который не влияет на реакцию негативно, и обычно выполняется без растворителя и с использованием избыточного количества оксихлорида фосфора (5-30 эквивалентов относительно соединения (II)). Температура реакции обычно составляет от 80 до 200°C, предпочтительно от 90°C до температуры дефлегмации (105°C). Продолжительность реакции обычно составляет от 0,1 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 5 часов, более предпочтительно 0,5-2 часа. Когда реакция протекает медленно даже при дефлегмации, реакция может быть также нагрета приблизительно до 200°C и подвергнута повышению давления (например, до давления 1,1-100 атмосфер) в стойком к давлению закрытом сосуде.
a
Соединение (Ib), в котором l равно 1, а R является группой R, которая не является атомом галогена, может быть получено, например, путем взаимодействия соединения (III) с соединением (IV) согласно следующему способу получения 2.
Пример документа: Журнал Химического Общества Японии, 1973, стр. 1944; JP-A 58-88369
Способ получения 2
a
a
где Y означает уходящую группу (например, атом галогена, такого как фтор, хлор, бром или иод; алкан- или аренсульфонилоксигруппу, такую как метансульфонилоксигруппа, бензолсульфонилоксигруппа или п-толуолсульфонилоксигруппа; алкан-, арен- или ареналкансульфонильную группу, такую как метансульфонильная, бензолсульфонильная или фенилметансульфонильная и т.д.); R имеет то же значение, что и R, при условии, что R не является атомом галогена; другие обозначения определены выше.
Реакция может быть выполнена с или без использования растворителя. Примеры растворителя включают алифатический углеводород, такой как пентан, гексан, гептан, петролейный эфир или циклогексан; сложный эфир, такой как метилацетат, этилацетат, этилформиат или этилпропионат; кетон, такой как ацетон или метилэтилкетон; простой эфир, такой как диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан; спирт, такой как метанол, этанол или изопропанол; нитрил, такой как ацетонитрил или пропионитрил; амид кислоты, такой как диметилформамид или диметилацетамид; циклический амид, такой как 1-метил-2-пирролидон; амид фосфорной кислоты, такой как гексаметилфосфорамид; циклическую мочевину, такую как 1,3-диметил-2-имидазолидинон; сульфоксид, такой как диметилсульфоксид; сульфон, такой как сульфолан; галогенированный углеводород, такой как дихлорметан, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или тетрахлорид; ароматический амин, такой как пиридин, пиколин, лутидин или хинолин; их смеси, вода, а также смеси растворителей и воды.
Когда используется смесь растворителя и воды, а реакция не является гомогенной реакционной системой, может использоваться катализатор межфазного переноса (например, соль четвертичного аммония, такая как хлорид бензилтриэтиламмония или бромид бензилтриэтиламмония, краун-эфир, например, 18-краун-6 и т.д.).
Примеры основания включают алкоголят щелочного металла, такой как этилат натрия, метилат натрия или трет-бутилат калия; органическое основание, такое как пиридин, пиколин, лутидин, хинолин, триэтиламин, диизопропилэтиламин, 4-диметиламинопиридин или N,N-диметиланилин; неорганическое основание, такое как карбонат калия, карбонат натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидрокарбонат натрия или гидрокарбонат калия; гидрид металла, такой как гидрид лития, гидрид натрия или гидрид калия; а также литийорганическое соединение, такое как бутиллитий или диизопропиламид лития.
Используемое количество основания конкретно не ограничено при условии, что такое количество не оказывает неблагоприятного воздействия на реакцию. Большое избыточное количество основания может также использоваться в качестве растворителя.
Когда соединение (IV) является амином, избыточное количество соединения (IV) может также использоваться и в качестве основания, и в качестве растворителя.
Температура реакции обычно составляет от -50 до 200°C, предпочтительно от комнатной температуры до 150°C. Продолжительность реакции обычно составляет от 0,1 до 96 часов, предпочтительно от 0,1 до 72 часов, более предпочтительно от 0,1 до 24 часов.
Когда соединение (IV) является низкокипящим соединением, таким как аммиак, метиламин или этиламин, или когда реакция протекает медленно, реакция может быть также нагрета до температуры приблизительно 40-150°C и подвергнута повышению давления (например, до давления 1,1-100 атмосфер) в стойком к давлению закрытом сосуде.
Соединение (II) включает известное соединение и может быть получено известным способом или способом, аналогичным ему.
Например, соединение (II) может быть получено путем взаимодействия соединения (V) с соединением (VI) и метилхлоркарбонатом согласно следующему исходному способу получения 1.
Пример документа: Tetrahedron 42, 3697 (1986)
Ссылочный способ получения 1
где Z означает атом галогена, такого как хлор, бром или иод, а другие обозначения определены выше.
В данной реакции сначала соединение (V) взаимодействует с соединением (VI). Обычно используется растворитель. Примеры растворителя включают алифатический углеводород, такой как пентан, гексан, гептан или петролейный эфир; ароматический углеводород, такой как бензол, толуол или ксилол; эфир, такой как диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан, а также смесь двух или более видов указанных растворителей.
Соединение (VI) обычно используется в количестве 1-5 эквивалентов, предпочтительно 2-2,5 эквивалента по отношению к соединению (V).
На данной стадии температура реакции обычно составляет от 40 до 100°C, предпочтительно от 50 до 70°C.
Продолжительность реакции обычно составляет от 0,2 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 24 часов, более предпочтительно от 1 до 3 часов.
Затем метилхлоркарбонат добавляют к реакционной системе. Метилхлоркарбонат обычно используют в количестве 1-5 эквивалентов, предпочтительно 1-2 эквивалента по отношению к соединению (V). На данной стадии предпочтительно, чтобы метилхлоркарбонат добавляли после охлаждения до температуры 0-20°C с последующим нагреванием. Температура реакции после нагревания обычно составляет от 40 до 200°C, предпочтительно от 50 до 70°C. Полная продолжительность реакции обычно составляет от 0,2 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 10 часов, более предпочтительно приблизительно 1-3 часа.
Соединение (II) может быть также получено путем взаимодействия соединения (VII) с трихлорацетилхлоридом с получением соединения (VIII), которое затем взаимодействует с аммиаком или солью аммония со слабой кислотой согласно следующему исходному способу получения 2.
Пример документа: Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978)
Ссылочный способ получения 2
где условные обозначения определены выше.
В первой реакции трихлорацетилхлорид взаимодействует с соединением (VII) в присутствии основания. Реакция может быть выполнена в отсутствие растворителя, но обычно выполняется в присутствии растворителя. Примеры растворителя включают алифатический углеводород, ароматический углеводород, сложный эфир, кетон, эфир, нитрил, амид кислоты, циклический амид, амид фосфорной кислоты, циклическую мочевину, сульфоксид, сульфон, галогенированный углеводород, описанный в примере получения 2, и их смеси. Примеры основания включают основания, описанные в примере получения 2. Из указанных оснований предпочтительными являются органическое основание или неорганическое основание, при этом обычно используют триэтиламин.
Температура реакции обычно составляет от -50 до 100°C, предпочтительно 0-20°C. Продолжительность реакции обычно составляет приблизительно 0,1-96 часов, предпочтительно 0,2-5 часов, более предпочтительно 0,5-3 часа.
Во второй реакции соединение (VIII), полученное в первой реакции, взаимодействует с аммиаком или соединением, которое образует аммиак в системе. Примеры соединения включают соли аммиака со слабыми кислотами, такие как карбонат аммония, формиат аммония или ацетат аммония. В реакции обычно используют растворитель, описанный в примере получения 2. Предпочтительные примеры растворителя включают амид кислоты, циклический амид, амид фосфорной кислоты, циклическую мочевину, сульфоксид и сульфон.
Температура реакции обычно составляет от 20 до 200°C, предпочтительно от 50 до 120°C.
Продолжительность реакции обычно составляет от 0,2 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 10 часов, более предпочтительно 1-5 часов.
Соединение (III) включает известное соединение и может быть получено известным способом или способом, аналогичным ему.
Например, соединение (III), в котором Y является атомом хлора, представляет собой соединение (Ia), включенное в соединение (I), и может быть получено способом, описанным выше.
Соединение (IV), соединение (V), соединение (VI) и соединение (VII) являются широко известными соединениями и коммерчески доступны, или могут быть получены известным способом. В частности, соединение (VI) представляет собой соединение, называемое реактивом Гриньяра. Соединение (VI) может быть коммерчески доступным продуктом или может быть получено известным способом, а затем использоваться в исходном виде, без выделения и очистки.
Соединения, полученные способами получения 1, 2 и исходными способами получения 1, 2, описанными выше, могут быть выделены и очищены известными способами, например, концентрированием, концентрированием при пониженном давлении, экстракцией, растворением, кристаллизацией, перекристаллизацией или хроматографией.
Соединение, представленное общей формулой (XI) (в дальнейшем иногда называемое соединением (XI)), или его сельскохозяйственно-приемлемая соль, может также использоваться в качестве активного компонента регулятора роста растения. Известно конкретное соединение хиназолина с замещенной аминогруппой во 2-м положении (описание WO 2005/042501).
1-6
3-6
3-6
4-6
1-3
1-3
1-3
11
Примеры "C алкильной группы", обозначенной R в соединении, представленном общей формулой (XI) настоящего изобретения (в дальнейшем может быть упомянуто как соединение (XI)), включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, 3-метилбутил и гексил. Примеры "C алкенильной группы" включают аллил, 2-бутенил, 3-бутенил и 3-метил-2-бутенил. Примеры "C алкинильной группы" включают пропаргил, 2-бутинил и 3-пентинил. Примеры "C алкильной группы" включают бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, 3-метилбутил и гексил. Примеры "C алкоксикарбонилметильной группы" включают метоксикарбонилметил, этоксикарбонилметил, пропилоксикарбонилметил и изопропилоксикарбонилметил. Примеры "C алкокси C алкильной группы" включают 2-метоксиэтил, 2-метоксипропил, 3-метоксипропил, 2-этоксиэтил и 3-этоксипропил.
1-6
3-6
3-6
4-6
1-3
1-3
"C алкильная группа", "C алкенильная группа", "C алкинильная группа" и "C алкильная группа", описанные выше, могут иметь один или несколько заместителей, предпочтительно один-три заместителя, выбранные из гидроксильной группы, C алкоксигруппы, C алкоксикарбонильной группы, цианогруппы, 2-фурильной группы и 2-тетрагидрофурильной группы в замещаемых положениях. Когда число заместителей равно 2 или больше, заместители могут быть одинаковыми или различными.
1-3
1-3
Примеры "C алкоксигруппы", описанные как пример заместителя, включают метокси, этокси, пропилокси и изопропилокси. Примеры "C алкоксикарбонильной группы" включают метоксикарбонил, этоксикарбонил, пропилоксикарбонил и изопропилоксикарбонил.
Соединение (XI) может образовывать соль присоединения кислоты. Примеры соли присоединения кислоты включают соль неорганической кислоты, такую как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, фосфат, сульфат, нитрат или перхлорат; и соль органической кислоты, такую как формиат, ацетат, тартрат, соль яблочной кислоты, цитрат, оксалат, сукцинат, бензоат, пикрат, метансульфонат или п-толуолсульфонат.
Когда соединение (XI) имеет кислотную группу, такую как карбоксильная группа, фенольная гидроксильная группа или активная метиленовая группы, примеры соли, которая может быть образована, включают соли металлов, такие как соли щелочных металлов (соль лития, соль натрия, соль калия и т.д.) и соли щелочноземельных металлов (соль магния, соль кальция, соль бария и т.д.); соли аммония; и соли присоединения с органическими основаниями (например, диметиламином, триэтиламином, пиперазином, пирролидином, пиперидином, 2-фенилэтиламином, бензиламином, этаноламином, диэтаноламином, пиридином, коллидином и т.д.).
Таким образом, соединение (XI) могут находиться в форме сельскохозяйственно-приемлемой соли, как описано выше.
Когда соединение (XI) имеет один или несколько асимметричных центров, соединение включает два или больше стереоизомеров (например, энантиомер, диастереомер и т.д.). Соединение настоящего изобретения включает все стереоизомеры и смесь двух или более стереоизомеров.
Когда соединение (XI) обладает геометрической изомерией, основанной на двойной связи и т.п., соединение включает два или более геометрических изомеров (например, E/Z или транс/цис изомер, S-транс/S-цис изомер и т.д.). Соединение (XI) включает все геометрические изомеры и смесь двух или более геометрических изомеров.
Соединение общей формулы (XI), в которой m является целым числом 1-3, а n равно 0, представляет собой соединение, в котором 6-е положение хиназолинового скелета не замещено, то есть соединение общей формулы (XI-1):
11
1-6
3-6
3-6
1-3
1-3
где Ph означает фенильную группу, R означает атом водорода, формильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, причем алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из гидроксильной группы, C алкоксигруппы, C алкоксикарбонильной группы, цианогруппы, 2-фурильной группы и 2-тетрагидрофурильной группы,
m' означает целое число 1-3,
1
X означает атом хлора, атом брома, трифторметильную группу, цианогруппу или нитрогруппу,
1
когда m' равно 2 или больше, все X являются одинаковыми или отличными друг от друга,
1
1
11
при условии, что когда m' равно 1, X является атомом хлора, а R означает метильную группу, X является атомом хлора в 8 положении.
2
Соединение общей формулы (XI), в котором n равно 1, представляет собой соединение, в котором 6-е положение хиназолинового скелета замещено X, то есть соединение общей формулы (XI-2):
11
1-6
3-6
3-6
1-3
1-3
где Ph представляет фенильную группу, R означает атом водорода, формильную группу, C алкильную группу, C алкенильную группу или C алкинильную группу, причем алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из гидроксильной группы, C алкоксигруппы, C алкоксикарбонильной группы, цианогруппы, 2-фурильной группы и 2-тетрагидрофурильной группы,
m означает целое число 0-3,
1
2
X и X могут быть одинаковыми или различными и означать атом хлора, атом брома, трифторметильную группу, цианогруппу или нитрогруппу,
1
когда m равно 2 или больше, все X являются одинаковыми или отличными друг от друга,
при условии, что когда любое из следующих условий (1)-(3) удовлетворено, m означает целое число 1-3:
2
11
(1) X является атомом хлора, а R-группой, выбранной из атома водорода, метильной группы, 2-гидроксиэтильной группы, 3-гидроксипропильной группы, 2,2-диметоксиэтильной группы и цианометильной группы,
2
11
(2) X является атомом брома, а R выбран из 2-гидроксиэтильной группы, 3-гидроксипропильной группы и 2-метоксиэтильной группы, и
2
11
(3) X является нитрогруппой, а R является 3-гидроксипропильной группой.
Предпочтительные примеры соединения (XI) включают следующие соединения.
11
2
(1) Соединение общей формулы (XI), где R является атомом водорода, формильной группой, метильной группой, этильной группой, 2-гидроксиэтильной группой, 3-гидроксипропильной группой, 2-метоксиэтильной группой, фурфурильной группой, метоксикарбонилметильной группой или этоксикарбонилметильной группой, m равно 0, n равно 1, а X является атомом хлора или нитрогруппой.
11
1
2
(2) Соединение общей формулы (XI), где R является атомом водорода, формильной группой, метильной группой, этильной группой, 2-гидроксиэтильной группой, 2-метоксиэтильной группой, фурфурильной группой, метоксикарбонилметильной группой или этоксикарбонилметильной группой, m равно 1, n равно 1, X является атомом хлора в положении 8, а X является атомом хлора или нитрогруппой.
(3) Соединение общей формулы (XI), где m является целым числом 1-3, а n равно 0.
11
11
4-6
3-6
3-6
1-3
1-3
1-3
1-3
2
(4) Соединение общей формулы (XI), где R является формильной группой, C алкильной группой, C алкенильной группой или C алкинильной группой, где алкильная группа, алкенильная группа и алкинильная группа необязательно замещены гидроксильной группой (группами) или C алкоксигруппой (алкоксигруппами), или R является C алкоксикарбонилметильной группой, C алкокси C алкильной группой или фурфурильной группой, m равно 0, n равно 1, а X является атомом хлора.
(5) Соединение общей формулы (XI), где n равно 1.
(6) Соединение общей формулы (XI), где m равно 1-3, а n равно 1.
11
1-3
(7) Соединение общей формулы (XI), где R является C алкоксикарбонилметильной группой или фурфурильной группой.
2
(8) Соединение общей формулы (XI), где n равно 1, а X является трифторметильной группой или цианогруппой.
Соединение (XI) является новым веществом и может быть получено путем взаимодействия соединения (XII) с соединением (XIII) согласно следующему способу получения 11.
Способ получения 11
где Y означает уходящую группу (например, атом галогена, такого как фтор, хлор, бром или иод; алкан- или аренсульфонилоксигруппу, такую как метансульфонилоксигруппа, бензолсульфонилоксигруппа или п-толуолсульфонилоксигруппа; или алкан-, арен- или ареналкансульфонильную группу, такую как метансульфонил, бензолсульфонил или фенилметансульфонил), а другие обозначения определены выше.
Реакция может быть выполнена с или без использования растворителя. Примеры растворителя включают алифатический углеводород, такой как пентан, гексан, гептан, петролейный эфир или циклогексан; сложный эфир, такой как метилацетат, этилацетат, этилформиат или этилпропионат; кетон, такой как ацетон или метилэтилкетон; простой эфир, такой как диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан; спирт, такой как метанол, этанол или изопропиловый спирт; нитрил, такой как ацетонитрил или пропионитрил; амид кислоты, такой как диметилформамид или диметилацетамид; циклический амид, такой как 1-метил-2-пирролидон; амид фосфорной кислоты, такой как гексаметилфосфорамид; циклическую мочевину, такую как 1,3-диметил-2-имидазолидинон; сульфоксид, такой как диметилсульфоксид; сульфон, такой как сульфолан; галогенированный углеводород, такой как дихлорметан, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или четыреххлористый углерод; ароматический амин, такой как пиридин, пиколин, лутидин или хинолин; их смеси, воду, а также смеси растворителей и воды.
Когда используется смесь растворителя с водой, а реакция не является гомогенной системой, может использоваться катализатор межфазного переноса (например, соль четвертичного аммония, такая как хлорид бензилтриэтиламмония или бромид бензилтриэтиламмония, краун-эфир, такой как 18-краун-6 и т.д.).
Примеры основания включают алкоголят щелочного металла, такой как этилат натрия, метилат натрия или трет-бутилат калия; органическое основание, такое как пиридин, пиколин, лутидин, хинолин, триэтиламин, диизопропилэтиламин, 4-диметиламинопиридин или N,N-диметиланилин; неорганическое основание, такое как карбонат калия, карбонат натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидрокарбонат натрия или гидрокарбонат калия; гидрид металла, такой как гидрид лития, гидрид натрия или гидрид калия; а также литийорганическое соединение, такое как бутиллитий или диизопропиламид лития.
Используемое количество основания конкретно не ограничено, при условии, что не оказывает неблагоприятного воздействия на реакцию. Большое избыточное количество основания может также использоваться в качестве растворителя.
Когда соединение (XIII) является амином, избыточное количество соединения (XIII) может также использоваться и в качестве основания, и в качестве растворителя.
Температура реакции обычно составляет от -50 до 200°C, предпочтительно от комнатной температуры до 150°C. Продолжительность реакции обычно составлет от 0,1 до 96 часов, предпочтительно от 0,1 до 72 часов, более предпочтительно от 0,1 до 24 часов.
Когда соединение (XIII) является низкокипящим соединением, таким как аммиак, метиламин или этиламин, или когда реакция протекает медленно, реакция может быть также нагрета до температуры приблизительно 40-150°C и подвергнута повышению давления (например, до давления 1,1-100 атмосфер) в стойком к давлению закрытом сосуде.
Соединение (XII) включает известное соединение и может быть получено известным способом или способом, аналогичным ему. Например, соединение (XIIa), в котором Y является атомом хлора, может быть получено путем взаимодействия соединения (XIV) с оксихлоридом фосфора согласно следующему исходному способу получения 11.
Пример документа: JP-A 62-145073
Ссылочный способ получения 11
где условные обозначения определены выше.
Вышеуказанная реакция может быть выполнена в растворителе, который не оказывает неблагоприятного воздействия на реакцию, и обычно выполняется в отсутствие растворителя, с использованием избыточного количества оксихлорида фосфора (5-30 эквивалентов относительно соединения (XIV)).
Температура реакции обычно составляет от 80 до 200°C, предпочтительно от 90°C до температуры дефлегмации (105°C).
Продолжительность реакции обычно составляет от 0,1 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 5 часов, более предпочтительно 0,5-2 часа. Когда реакция протекает медленно даже при дефлегмации, реакция может также быть нагрета до температуры приблизительно 200°C и подвергнута повышению давления (например, до 1,1-100 атмосфер) в стойком к давлению закрытом сосуде.
Соединение (XIV) включает известное соединение и может быть получено известным способом или способом, аналогичным ему. Например, соединение (XIV) может быть получено путем взаимодействия соединения (XV) с соединением (XVI) и метилхлоркарбонатом согласно следующему исходному способу получения 12.
Пример документа: Tetrahedron 42, 3697 (1986)
Ссылочный способ получения 12
где Z означает атом галогена, такого как хлор, бром или иод, а другие обозначения определены выше.
В реакции сначала соединение (XV) взаимодействует с соединением (XVI). Растворитель обычно используют, и примеры растворителя включают алифатический углеводород, такой как пентан, гексан, гептан или петролейный эфир; ароматический углеводород, такой как бензол, толуол или ксилол; простой эфир, такой как диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан, а также смесь двух или более видов указанных растворителей.
Соединение (XVI) обычно используется в количестве 1-5 эквивалентов, предпочтительно 2-2,5 эквивалента относительно соединения (XV).
Температура реакции обычно составляет от 40 до 100°C, предпочтительно от 50 до 70°C.
Продолжительность реакции обычно составляет от 0,2 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 24 часов, более предпочтительно 1-3 часа.
Затем к реакционной системе добавляют метилхлоркарбонат. Метилхлоркарбонат обычно используют в количестве 1-5 эквивалентов, предпочтительно 1-2 эквивалента относительно соединения (XV). На данной стадии предпочтительно, чтобы метилхлоркарбонат добавляли после охлаждения до температуры 0-20°C с последующим нагреванием. Температура реакции после нагревания обычно составляет от 40 до 200°C, предпочтительно от 50 до 70°C. Полная продолжительность реакции обычно составляет от 0,2 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 10 часов, более предпочтительно приблизительно 1-3 часа.
Соединение (XIV) может быть также получено путем взаимодействия соединения (XVII) с трихлорацетилхлоридом с получением соединения (XVIII), которое затем взаимодействует с аммиаком или солью аммония со слабой кислотой согласно следующему исходному способу получения 13.
Пример документа: Chem. Pharm. Bull., 26, 1633 (1978)
Ссылочный способ получения 13
где условные обозначения определены выше.
В первой реакции трихлорацетилхлорид взаимодействует с соединением (XVII) в присутствии основания. Реакция может быть выполнена в отсутствие растворителя, но обычно выполняется в присутствии растворителя. Примеры растворителя включают алифатический углеводород, ароматический углеводород, сложный эфир, кетон, эфир, нитрил, амид кислоты, циклический амид, амид фосфорной кислоты, циклическую мочевину, сульфоксид, сульфон, галогенированный углеводород, описанный в примере получения 11, а также их смеси.
Примеры основания включают основания, описанные в примере получения 11. Среди указанных оснований предпочтительными являются органическое основание или неорганическое основание, при этом обычно используют триэтиламин.
Температура реакции обычно составляет от -50 до 100°C, предпочтительно 0-20°C.
Продолжительность реакции обычно составляет приблизительно от 0,1 до 96 часов, предпочтительно от 0,2 до 5 часов, более предпочтительно от 0,5 до 3 часов.
Во второй реакции соединение (XVIII), полученное в первой реакции, взаимодействует с аммиаком или соединением, которое образует аммиак в системе. Примеры соединения включают соли аммония со слабыми кислотами, такие как карбонат аммония, формиат аммония или ацетат аммония. В реакции обычно используется растворитель, как описано в примере получения 11. Предпочтительные примеры растворителя включают амид кислоты, циклический амид, амид фосфорной кислоты, циклическую мочевину, сульфоксид и сульфон.
Температура реакции обычно составляет от 20 до 200°C, предпочтительно от 50 до 120°C.
Продолжительность реакции обычно составляет от 0,2 до 96 часов, предпочтительно от 0,5 до 10 часов, более предпочтительно 1-5 часов.
Соединение (XIII), соединение (XV), соединение (XVI) и соединение (XVII) являются общеизвестными соединениями и коммерчески доступны, или могут быть получены известным способом.
В частности, соединение (XVI) является соединением, называемым реактивом Гриньяра. Соединение (XVI) может являться коммерчески доступным продуктом или может быть получено известным способом, а затем использоваться в исходном виде, без выделения и очистки.
Соединения, полученные способом получения 11, а также исходными способами получения 11, 12 и 13, могут быть выделены и очищены известными способами, например, концентрированием, концентрированием при пониженном давлении, экстракцией, растворением, кристаллизацией, перекристаллизацией или хроматографией.
Рост растения в настоящем изобретении обычно регулируется посредством нанесения эффективного количества регулятора роста растения на растение или место произрастания растения.
2
Когда регулятор роста растения настоящего изобретения применяется в сельском хозяйстве и лесоводстве, наносимое количество обычно составляет 0,01-1000 г/1000 м. Когда регулятор роста растения настоящего изобретения находится в форме эмульгируемого концентрата, смачиваемого порошка, жидкой композиции или микрокапсул, он обычно распыляется после растворения в воде до получения концентрации активного компонента 0,001-10000 м.д. Когда регулятор роста растения настоящего изобретения находится в форме порошка или гранул, он обычно применяется в исходном виде.
С целью стимулирования роста корней растений в почве возделываемого поля, причем почва может быть непосредственно обработана регулятором роста растения настоящего изобретения, который, таким образом, входит в состав композиции, или разведенным регулятором роста растения. Кроме того, регулятор роста растения может быть введен в состав композиции на основе смолы в форме листа или ленты. Композиция на основе смолы может применяться путем оборачивания растений, натягивания около растений, раскладывания на поверхности почвы у подножия растения и т.п. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также использоваться при обработке листвы или при обработке почек. Посевные грядки перед посадкой или посевные лунки, или корни растения при посадке могут быть также обработаны регулятором роста растения настоящего изобретения. Целевые растения обрабатывают регулятором роста растения однократно или несколько раз.
Когда регулятор роста растения настоящего изобретения используется для обработки листвы растительного организма или обработки почвы, наносимое количество может меняться в зависимости от типа композиции, выбора времени, способа и места нанесения, а также целевого растения, и обычно составляет от 0,1 до 10000 г на гектар. Когда регулятор роста растения используется в виде разведенного водного раствора, концентрация регулятора роста растения может меняться в зависимости от типа композиции, выбора времени, способа и места нанесения, а также целевого растения, и обычно составляет от 0,001 до 10000 м.д., предпочтительно от 0,01 до 1000 м.д.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может также использоваться для обработки растения перед пересадкой. Когда регулятором роста растения настоящего изобретения непосредственно пропитывают растение перед пересадкой, часть корня или все растение могут быть погружены в раствор или суспензию регулятора роста растения с концентрацией 0,001-10000 м.д.
Семена целевого растения можно непосредственно обработать композицией регулятора роста растения настоящего изобретения. Примеры такого способа обработки включают способ, который включает погружение семян растения в регулятор роста растения настоящего изобретения, приготовленный таким образом, чтобы концентрация активного компонента могла составлять 1-10000 м.д., способ, который включает распыление или нанесение на семена растений регулятора роста растения настоящего изобретения, приготовленного таким образом, чтобы концентрация активного компонента могла составлять 1-10000 м.д., и способ, который включает нанесение на семена растения порошка регулятора роста растения настоящего изобретения.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может быть смешан с водной культуральной средой для приготовления водной культуры, или может использоваться в качестве одного из компонентов среды для приготовления культуры ткани. Когда регулятор роста растения настоящего изобретения используется в водной культуре, регулятор роста растения может быть растворен или суспендирован в водной культуральной среде, такой как Enshi, в концентрации 0,001-10000 м.д. Когда регулятор роста растения настоящего изобретения используется в культуре ткани или культуре клеток, регулятор роста растения может быть растворен или суспендирован в стандартно используемой культуральной среде ткани растения, такой как среда MS, в концентрации 0,001-10000 м.д. В данном случае в среду обычно могут быть добавлены сахариды в качестве источника углерода и различные растительные гормоны.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может также использоваться в комбинации с фунгицидом, инсектицидом, акарицидом, нематоцидом, гербицидом, регулятором роста растения и/или удобрением.
Их наносимые количества и применяемые концентрации могут меняться в зависимости от типа композиции, выбора времени, места и способа нанесения, вида растения и ожидаемого эффекта, и поэтому они могут быть увеличены или уменьшены без ограничения до вышеуказанных диапазонов.
В способе регулирования роста растения, как описано выше, может использоваться регулятор роста растения.
Также можно установить вещество, обладающее способностью стимулировать рост корня растения, оцениваемое способом проверки способности тестируемого вещества стимулировать рост корня растения, который включает первую стадию и вторую стадию, с использованием цитокининового рецептора, выбранного из группы A, после чего указанное вещество, обладающее способностью стимулировать рост корня растения, приводят в контакт с растением, чтобы стимулировать рост корня растения. Способ приведения указанного вещества, обладающего способностью стимулировать рост корня растения, в контакт с растением, включает способ приготовления композиции и способ нанесения, как описано выше.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью улучшения развития рассады и улучшения скорости укоренения посредством стимулирования роста корней после прямого посева риса. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также применяться с целью стимулирования роста корней после появления всходов риса в рассадочной коробке. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также применяться с целью улучшения утолщения корней, а также повышения термо- и засухоустойчивости травяного покрытия на поле для гольфа. В случае таких культур, как соя, кукуруза и пшеница, регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью улучшения утолщения корней, повышения продуктивности посредством выращивания рассады на ранней стадии или снижения применяемого количества гербицидов. В случае таких культур, как томат, перец и т.п., регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью улучшения скорости укоренения при пересадке. В случае производства рассады овощей применение регулятора роста растения настоящего изобретения может обеспечивать однородное развитие рассады и, таким образом, повышение эффективности машинной высадки.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться для контроля апикального диминирования растения. Например, регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью ингибирования роста пазушных почек табака, розы и т.п. Регулятор роста растения настоящего изобретения может регулировать формирование бутонов плодовых культур, цветущих растений и т.п., и, таким образом, может применяться в качестве агента, снижающего количество цветов. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также увеличивать количество бутонов, повышая, таким образом, урожай плодовых культур, или улучшая качество цветущих растений. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также ингибировать рост ветвей плодовых культур, уменьшая количество ветвей, или может стимулировать рост ветвей плодовых культур, увеличивая количество ветвей, и, таким образом, может применяться для регулирования роста дерева.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может использоваться в методах тканевых культур, например, при дедифференцировке в каллус или повторной дифференцировке из каллуса. Например, регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью стимулирования формирования каллуса из тканей растения. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также применяться с целью повышения эффективности повторной дифференцировки из придаточного зародыша сои и т.п.
Регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью регулирования старения растения. Например, регулятор роста растения настоящего изобретения может применяться с целью ингибирования старения и улучшения хранения срезанных цветов цветущих растений, таких как гвоздика. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также применяться с целью ингибирования созревания плодов. Регулятор роста растения настоящего изобретения может также предотвращать старение листьев рассады риса-падди, благодаря чему может быть выращена хорошая рассада. Растения, такие как хлопок, можно обрабатывать регулятором роста растения настоящего изобретения перед сбором урожая с целью стимулирования старения листьев.
Растительный цитокининовый рецептор, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в вышеуказанной группе B, может использоваться в качестве инструмента исследования. Например, он может использоваться в качестве инструмента исследования с целью выполнения такого исследования, как испытание на способность стимулировать рост корня растения или поиск химического вещества, обладающего способностью регулировать рост или дифференцировку растения, как описано выше. Цитокининовый рецептор может также использоваться в качестве инструмента исследования в исследовании с целью изучения механизма действия вещества, которое действует на цитокининовый рецептор.
Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, показанную в группе B, и полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную ему, неполная нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, показанную в группе B, или полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную неполной нуклеотидной последовательности, а также полипептид, включающий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 или 4, могут также использоваться в качестве инструмента исследования. Например, их часть может функционировать как полинуклеотид, который используется в способе получения цитокининового рецептора, как описано выше. Также их часть может использоваться в качестве важного инструмента исследования для получения полинуклеотида, показанного в группе полинуклеотидов B, с помощью ПЦР, или получения полинуклеотида, показанного в группе полинуклеотидов B, с использованием гибридизации, как описано выше.
Когда проводят скрининг регулятора роста растения, они могут использоваться в качестве инструмента исследования при выполнении скрининга. В частности, они могут использоваться в качестве инструмента исследования в тестах на способность стимулировать рост корня растения и при поиске химического вещества, обладающего способностью регулировать рост или дифференцировку растения, как описано выше.
Настоящее изобретение дополнительно включает систему (в дальнейшем иногда называемую системой настоящего изобретения), которая включает устройство для ввода, хранения и распределения информационных данных относительно активности (либо присутствия или отсутствия внутриклеточной передачи сигналов, или соответствующего количественного значения) тестируемого вещества при ингибировании внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки (в дальнейшем иногда называемое устройством a), устройство для запрашивания и поиска информационных данных на основе заданных условий (в дальнейшем иногда называемое устройством b), а также устройство для отображения и вывода запрашиваемых и найденных данных (в дальнейшем иногда называемое устройством c).
Вначале описывается устройство а. Как описано выше, устройство а представляет собой устройство, которое вводит информационные данные по активности тестируемого вещества при ингибировании внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки, а затем сохраняет и распределяет введенную информацию. Подобная информация вводится посредством устройства ввода 1 и обычно сохраняется в устройстве памяти 2. Устройство ввода включает устройство а, способное к вводу информации, например, клавиатуру или мышь. Когда ввод, сохранение и распределение информации закончены, информация направляется к следующему устройству b. При хранении и распределении информации много данных может быть эффективно сохранено и распределено посредством ввода информации, имеющей структуру данных, с использованием такого оборудования, как компьютер, а также программного обеспечения, такого как ОС и база данных, и сохранения информации на подходящем запоминающем устройстве, например, на машиносчитываемом записываемом носителе, таком как гибкий диск, фотомагнитный диск, CD-ROM, DVD-ROM или жесткий диск.
Описывается устройство b. Как описано выше, устройство b представляет собой устройство, которое запрашивает и проводит поиск информационных данных, сохраненных и распределенных устройством a, на основе условий для получения необходимых результатов. Когда условия для запроса и поиска введены посредством устройства ввода 1, а информация, соответствующая условиям, обычно выбирается из информации, сохраненной в устройстве хранения 2, информация переходит к следующему устройству c. Выбранные результаты обычно сохраняются в устройстве хранения 2 и могут быть отображены устройством отображения и вывода 3.
Описывается устройство c. Как описано выше, устройство c представляет собой устройство, которое отображает и выводит запрошенные и найденные результаты. Устройство отображения и вывода 3 включает монитор и принтер, при этом результаты могут быть отображены на мониторе компьютера или выданы на бумажном носителе посредством печати.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение будет подробно описано посредством примеров, которыми настоящее изобретение не ограничено.
Соединение (I), используемое в настоящем изобретении будет описано более конкретно посредством примеров синтеза и ссылочных примеров синтеза, при этом соединение (I) не ограничено указанными примерами.
1
В примерах синтеза и ссылочных примерах синтеза "комнатная температура" обычно означает температуру 10-30°C. "H-ЯМР" означает спектр протонного магнитного резонанса. Измерение выполняли с помощью спектрометра (400 МГц) модели JNM-AL400, изготовленного фирмой JEOL Ltd., с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилана, при этом химические сдвиги (δ) выражали в м.д. "Т.пл." означает температуру плавления, которую измеряли с помощью измерителя температуры плавления модели Mettler FP61.
3
6
Сокращения, используемые в следующих примерах синтеза, ссылочных примерах синтеза и таблицах 3-7 имеют следующие значения. CDCl: дейтерированный хлороформ, ДМСО-d: дейтерированный диметилсульфоксид, с: синглет, д: дуплет, т: триплет, кв: квартет, дд: двойной дуплет, м: мультиплет, ушир.: уширенный, J: константа взаимодействия, Me: метил, Et: этил, Pr: пропил, i-Pr: изопропил, t-Bu: трет-бутил, Ph: фенил, Ac: ацетил, ТГФ: тетрагидрофуран, ДМФА: N,N-диметилформамид, ДМСО: диметилсульфоксид и МТБЭ: простой метил-трет-бутиловый эфир.
Пример синтеза 1
(Получение 2,8-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ia1-11)
1
3
К 1,24 г 8-хлор-4-фенил-2(1H)―хиназолинона (соединение № II-11) добавляли 6,65 г оксихлорида фосфора с последующим перемешиванием при 95°C в течение 1 часа. Полученный реакционный раствор вливали в 200 мл воды со льдом, после чего добавляли бикарбонат натрия, доводя, таким образом, уровень pH до 9. Затем выпавшие кристаллы собирали фильтрованием. Собранный продукт подвергали перекристаллизации из этанола, получая 1,07 г указанного в заголовке соединения. Т.пл. 154,4°C. H-ЯМР (CDCl): 7,52-7,65 (4H, м), 7,76-7,80 (2H, м), 8,02-8,08 (2H, м).
Пример синтеза 2
(Получение 2-амино-6,8-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ic12-4))
1
3
Смесь 300 мг 2,6,8-трихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ia1-12), 30 г водного 28%-ого раствора аммиака и 6 мл ацетонитрила подвергали взаимодействию при 105°C в течение 1,5 часа в стойком к давлению реакционному сосуду. Полученный реакционный раствор охлаждали, а затем вливали в 100 мл воды. Смесь экстрагировали 60 мл этилацетата, а полученный экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (хлороформ), получая 230 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 212,7°C. H-ЯМР (CDCl): 5,56 (2H, ушир.с), 7,54-7,60 (3H, м), 7,63-7,68 (2H, м), 7,74 (1H, д, J=2,3 Гц), 7,79 (1H, д, J=2,3 Гц).
Пример синтеза 3
(Получение 6-хлор-2-фурфуриламино-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-16))
1
3
Смесь 275 мг 2,6―дихлор-4―фенилхиназолина (соединение № Ia1-3) и 486 мг фурфуриламина перемешивали при 85°C в течение 40 минут, и затем вливали в 50 мл воды. Смесь экстрагировали этилацетатом, полученный экстракт промывали водой, а затем концентрировали. Полученный остаток подвергали перекристаллизации из этанола, получая 280 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 142,0°C. H-ЯМР (CDCl): 4,77 (2H, д, J=5,6 Гц), 5,70 (1H, ушир.т, J=5,6 Гц), 6,29-6,32 (2H, м), 7,36 (1H, дд, J=1,8, 0,9 Гц), 7,53-7,70 (7H, м), 7,78 (1H, д, J=2,2 Гц).
Пример синтеза 4
(Получение 6-хлор-2-этоксикарбонилметиламино-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-33))
1
3
К 550 мг 2,6―дихлор-4―фенилхиназолина (соединение № Ia1-3) и 419 мг гидрохлорида глицинэтилового эфира добавляли 3 мл ДМФА и 607 мг триэтиламина с последующим перемешиванием при 85°C в течение 5,5 часа. Полученный реакционный раствор вливали в 100 мл воды и экстрагировали этилацетатом. Экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат 6:1-3:1), получая 503 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 146,1°C. H-ЯМР (CDCl): 1,30 (3H, т, J=7,2 Гц), 4.25 (2H, кв, J=7,2 Гц), 4,31 (2H, д, J=5,2 Гц), 5,97 (1H, ушир.с), 7,54-7,63 (5H, м), 7,67-7,70 (2H, м), 7,79 (1H, с).
Пример синтеза 5
(Получение 6-хлор-2-метоксиамино-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-32))
1
3
К смеси 275 мг 2,6―дихлор-4―фенилхиназолина (соединение № Ia1-3), 10 мл ацетонитрила и 334 мг метоксиамингидрохлорида при комнатной температуре по каплям добавляли 506 мг триэтиламина, получая смесь. Смесь загружали в стойкий к давлению реакционный сосуд, изготовленный из нержавеющей стали, после чего реакцию проводили при 105°C в течение 3,5 часа. После охлаждения реакционный раствор вливали в 100 мл воды. Смесь экстрагировали этилацетатом, полученный экстракт промывали водой, а затем концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат 3:1), получая 156 мг неочищенных кристаллов. Неочищенные кристаллы подвергали перекристаллизации из этилацетата, получая 55 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 173,9°C. H-ЯМР (CDCl): 3,98 (3H, с), 7,47-7,72 (6H, м), 7,87 (1H, д, J=9,0 Гц), 7,89 (1H, д, J=2,2 Гц), 8,03 (1H, ушир.с).
Пример синтеза 6
(Получение 6-хлор-2-(2-гидроксиэтилтио)-4-фенилхиназолина (соединение № Ie3-1))
1
3
К раствору 86 мг 2-меркаптоэтанола в ДМФА (7,5 мл) добавляли 44 мг гидрида натрия (60%) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли 275 мг 2,6-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ia1-3) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор вливали в 100 мл воды и экстрагировали этилацетатом. Полученный экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат:гексан 1:5), получая 266 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 124,4°C. H-ЯМР (CDCl): 3,50 (2H, т, J=5,5 Гц), 3,64 (1H, ушир.т), 4,07 (2H, кв-подобный, J=5,5 Гц), 7,57-7,61 (3H, м), 7,71-7,74 (2H, м), 7,77 (1H, дд, J=8,9, 2,3 Гц), 7,85 (1H, д, J=8,9 Гц), 7,97 (1H, д, J=2,3 Гц).
Пример синтеза 7
(Получение 6-хлор-2-формамидо-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-35))
1
К раствору 54 мг сухого формамида в ДМФА (5 мл) добавляли 48 мг гидрида натрия (60%) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли 275 мг 2,6-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ia1-3) с последующим нагреванием до 85°C и дополнительным перемешиванием в течение 3 часов. Полученный реакционный раствор вливали в 100 мл воды и экстрагировали этилацетатом. Экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат:гексан 1:3), получая 64 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 252,1°C. H-ЯМР: 7,59-7,66 (3H, м), 7,72-7,81 (3H, м), 7,88 (1H, д, J=8,8 Гц), 8,02 (1H, д, J=2,0 Гц), 8,37 (1H, ушир.д, J=10,4 Гц), 9,71 (1H, д, J=10,4 Гц).
Пример синтеза 8
(Получение 6-хлор-2-(1-метилгидразино)-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-27))
1
3
Смесь 275 мг 2,6-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ia1-3) и 461 мг монометилгидразина перемешивали при 85°C в течение 30 минут. Полученный продукт реакции охлаждали и добавляли к нему 200 мл воды. Выпавшие кристаллы собирали фильтрованием, собранный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (этилацетат), получая 225 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 155,9°C. H-ЯМР (CDCl): 3,52 (3H, с), 4,65 (2H, с), 7,54-7,63 (5H, м), 7,70-7,74 (2H, м), 7,80 (1H, д, J=2,0 Гц).
Получение 2-(2-аминоэтокси)-6-хлор-4-фенилхиназолина (соединение № Id3-1))
1
3
Таким же способом, как и в примере синтеза 6, 500 мг 2,6-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ia1-3) и 382 мг N-(2-гидроксиэтил)фталимида подвергали взаимодействию, получая 380 мг 6-хлор-4-фенил-2-(2-фталимидоэтокси)хиназолина. Т.пл. 154,7°C. H-ЯМР (CDCl): 4,25 (2H, т, J=5,8 Гц), 4,84 (2H, т, J=5,8 Гц), 7,53-7,60 (3H, м), 7,67-7,71 (3H, м), 7,72-7,76 (3H, м), 7,78-7,82 (2H, м), 7,97 (1H, д, J=2,2 Гц).
1
3
Смесь 380 мг 6-хлор-4-фенил-2-(2-фталимидоэтокси)-хиназолина, 70 мг гидразингидрата и 6 мл этанола нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. К полученному реакционному раствору добавляли 1,2 мл воды, после чего отгоняли этанол. К полученному остатку добавляли 1,5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты с последующим нагреванием с обратным холодильником в течение 1 часа. Полученный продукт реакции охлаждали и вливали в насыщенный раствор бикарбоната натрия в воде, а затем экстрагировали этилацетатом. Экстракт концентрировали, получая 240 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 134,9°C. H-ЯМР (CDCl): 3,59-3,63 (2H, м), 3,84 (2H, т, J=4,6 Гц), 6,15 (2H, ушир.с), 7,53-7,59 (5H, м), 7,63-7,67 (2H, м), 7,75 (1H, д, J=1,2 Гц).
Пример синтеза 10
(Получение 2-(2-ацетилтиоэтиламино)-6-хлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-14))
1
3
К раствору 292 мг трифенилфосфина в безводном ТГФ (3 мл) по каплям добавляли 563 мг 40%-ного раствора диизопропилкарбодиимида в толуоле при охлаждении на льду, с последующим перемешиванием в течение 20 минут. К полученной суспензии по каплям добавляли раствор 167 мг 6-хлор-2-(2-гидроксиэтиламино)-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-1) в безводном ТГФ (2 мл) при охлаждении на льду, а затем немедленно по каплям добавляли 127 мг тиоуксусной кислоты. Полученный прозрачный желтоватый раствор перемешивали в течение 1 часа при охлаждении на льду, перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, вливали в насыщенный раствор бикарбоната натрия в воде, а затем экстрагировали хлороформом. Экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (хлороформ:этилацетат 10:1), получая 170 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 128,9°C. H-ЯМР (CDCl): 2,34 (3H, с), 3,22 (2H, т, J=6,5 Гц), 3,73 (2H, кв, J=6,5 Гц), 5,74 (1H, ушир.т, J=6,5 Гц), 7,53-7,62 (5H, м), 7,65-7,70 (2H, м), 7,77 (1H, с).
Пример синтеза 11
(6-хлор-2-(2-меркаптоэтиламино)-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-13) и бис[2-(6-хлор-4-фенил-2-хиназолинил)аминоэтил]дисульфида (соединение № Ic3-15))
1
3
Смесь 108 мг 2-(2-ацетилтиоэтиламино)-6-хлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ic3-14), 2 мл этанола и 362 мг 10%-ного водного раствора гидроксида натрия перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 30 минут. Затем нерастворимые вещества собирали с помощью фильтрации из реакционного раствора. Собранный продукт (твердое вещество) очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (хлороформ:этилацетат 10:1), получая вначале 50 мг 6-хлор-2-(2-меркаптоэтиламино)-4-фенилхиназолина. Т.пл. 165,9°C. H-ЯМР (CDCl): 1,46 (1H, т, J=8,5 Гц), 2,84 (2H, кв-подобный, J=7,2 Гц), 3,66 (2H, кв-подобный, J=6,4 Гц), 5,79 (1H, ушир.т, J=5,4 Гц), 7,55-7,57 (3H, м), 7,60 (2H, с), 7,66-7,69 (2H, м), 7,77-7,78 (1H, м). Затем было получено 28 мг бис[2-(6-хлор-4-фенил-2-хиназолинил)аминоэтил]дисульфида (соединения, представленного следующей формулой):
1
3
Т.пл. 159,2°C. H-ЯМР (CDCl): 3,02 (4H, т, J=6,4 Гц), 3,89 (4H, кв, J=6,4 Гц), 5,81 (2H, ушир.т, J=6,4 Гц), 7,51-7,61 (10H, м), 7,63-7,68 (4H, м), 7,75 (2H, д, J=2,2 Гц).
Примеры соединений, которые могут быть получены таким же способом, как в примерах синтеза, описанных выше, а также коммерчески доступные соединения, показаны в таблице 3, таблице 4, таблице 5 и таблице 6 (включая также соединения, полученные в примерах синтеза, описанных выше).
Обозначения "a)", "b)", "c)" и "d)" в таблице 4 и таблице 5 приведены ниже.
<b>Таблица 3</b>
<img file="00000016.tif" he="16" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
R
Ar
(X)<sub>n</sub>
Температура плавления (°C)
Ia1-1
Cl
Ph
5-Cl
125,7
Ia1-2
Cl
Ph
6-F
131,9
Ia1-3
Cl
Ph
6-Cl
166,2
Ia1-4
Cl
Ph
6-Br
185,1 (разложение)
Ia1-5
Cl
Ph
6-Me
137,8
Ia1-6
Cl
Ph
6-CF<sub>3</sub>
117,5 (разложение)
Ia1-7
Cl
Ph
6-NO<sub>2</sub>
242,5 (разложение)
Ia1-8
Cl
Ph
6-OMe
148,6
Ia1-9
Cl
Ph
6-CN
206,8 (разложение)
Ia1-10
Cl
Ph
7-Cl
115,4
Ia1-11
Cl
Ph
8-Cl
154,4
Ia1-12
Cl
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
160,3
Ia1-13
Cl
п-Cl-Ph
6-Cl
205,6
Ia1-14
Cl
м-Cl-Ph
6-Cl
161,3
Ib4-1
CHO
о-Cl-Ph
6-Br
Ic0-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
Ph
(n=0)
Ic1-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
5-Cl
175,7
Ic2-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-F
99,3
Ic3-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
137,9
Ic3-2
пирролидино
Ph
6-Cl
Ic3-3
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-Cl
135,9
Ic3-4
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>OH
Ph
6-Cl
115,6
Ic3-5
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>5</sub>OH
Ph
6-Cl
117,2
Ic3-6
NMe(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
128,5
Ic3-7
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OMe
Ph
6-Cl
89,7
Ic3-8
NHn-Pr
Ph
6-Cl
158,3
Ic3-9
NMe(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OMe
Ph
6-Cl
88,5
<b>Таблица 4</b>
<img file="00000017.tif" he="16" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
R
Ar
(X)<sub>n</sub>
Температура плавления (°C)
Ic3-10
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>CHMe<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
90,1
Ic3-11
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>OH
Ph
6-Cl
107,9
Ic3-12
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>CH(Me)CH<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
112,7
Ic3-13
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>SH
Ph
6-Cl
165,9
Ic3-14
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>SAc
Ph
6-Cl
128,9
Ic3-15
a)
159,2
Ic3-16
NHфурфурил
Ph
6-Cl
142,0
Ic3-17
NHCH<sub>2</sub>CH=CMe<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
95,9
Ic3-18
NHCH<sub>2</sub>CH=C(Me)CH<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
154,8
Ic3-19
NH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
157,8
Ic3-20
NHNH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
175,0
Ic3-21
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>NMe<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
102,1
Ic3-22
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>NH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
118,0
Ic3-23
NHMe
Ph
6-Cl
186,9
Ic3-24
NHEt
Ph
6-Cl
156,7
Ic3-25
NMe<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
141,8
Ic3-26
NHCH<sub>2</sub>CN
Ph
6-Cl
208,6 (разложение)
Ic3-27
NMeNH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
155,9
Ic3-28
NHi-Pr
Ph
6-Cl
112,5
Ic3-29
NHCH<sub>2</sub>CH=CH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
147,3
Ic3-30
NHCH<sub>2</sub>C≡CH
Ph
6-Cl
168,4
Ic3-31
NHCH<sub>2</sub>CONH2
Ph
6-Cl
140,3
Ic3-32
NHOMe
Ph
6-Cl
173,9
Ic3-33
NHCH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Et
Ph
6-Cl
146,1
Ic3-34
NHCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CN
Ph
6-Cl
198,7
Ic3-35
NHCHO
Ph
6-Cl
252,1
Ic3-36
гуанидин
Ph
6-Cl
253,4 (разложение)
<b>Таблица 5</b>
<img file="00000018.tif" he="16" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
R
Ar
(X)<sub>n</sub>
Температура плавления (°C)
Ic3-37
NHтетрагидрофурфурил
Ph
6-Cl
сироп, b)
Ic3-38
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OMe
Ph
6-Cl
89,1
Ic3-39
NHCH<sub>2</sub>CH(OH)CH<sub>3</sub>
Ph
6-Cl
154,2
Ic3-40
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>O(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
117,4
Ic3-41
NHCH<sub>2</sub>CH(OH)CH<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
147,0
Ic3-42
NHCH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
Ph
6-Cl
190,5
Ic3-43
NHCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
Ph
6-Cl
117,1
Ic3-44
NHCH(Me)CH<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
52,8
Ic3-45
NHCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>OEt
Ph
6-Cl
сироп, c)
Ic3-46
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OEt
Ph
6-Cl
сироп, d)
Ic4-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
Ph
6-Br
Ic4-2
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-Br
140,9
Ic4-3
NHCH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
Ph
6-Br
183,1 (разложение)
Ic5-1
NH-п-Cl-Ph
Ph
6-Me
Ic5-2
NHCH<sub>2</sub>CONH<sub>2</sub>
Ph
6-Me
Ic5-3
NHCH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Et
Ph
6-Me
Ic5-4
NH<sub>2</sub>
Ph
6-Me
151,8
Ic5-5
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-Me
121,1
Ic6-1
NH<sub>2</sub>
Ph
6-CF<sub>3</sub>
160,4
Ic6-2
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-CF<sub>3</sub>
135,1
Ic7-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-NO<sub>2</sub>
177,4
Ic8-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-OMe
115,9
Ic9-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6-CN
173,3 (разложение)
Ic10-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
7-Cl
129,7
<b>Таблица 6</b>
<img file="00000019.tif" he="17" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
R
Ar
(X)n
Температура плавления (°C)
Ic11-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
8-Cl
115,5
Ic12-1
NH(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
146,2
Ic12-2
NHCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>OH
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
168,8
Ic12-3
NHфурфурил
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
158,6
Ic12-4
NH<sub>2</sub>
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
212,7
Ic12-5
NHCH<sub>2</sub>CN
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
204,7
Ic12-6
NHCH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
201,4
Id3-1
O(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>NH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
134,9
Ie3-1
S(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
Ph
6-Cl
124,4
Ie3-2
S(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>NH<sub>2</sub>
Ph
6-Cl
88,3
a) Структура была описана в примере синтеза 11.
1
3
b) H-ЯМР (CDCl): 1,66-1,75 (1H, м), 1,86-2,08 (3H, м), 3,57-3,64 (1H, м), 3,75-3,83 (2H, м), 3,89-3,59 (1H, м), 4,13-4,20 (1H, м), 5,70 (1H, ушир.с), 7,52-7,60 (5H, м), 7,64-7,69 (2H, м), 7,75-7,76 (1H, м).
1
3
c) H-ЯМР (CDCl): 1,22 (3H, т, J=7,0 Гц), 3,55 (2H, кв, J=7,0 Гц), 3,68 (2H, т, J=5,2 Гц), 3,78 (2H, кв-подобный, J=5,2 Гц), 5,75 (1H, ушир.т), 7,53-7,60 (5H, м), 7,65-7,69 (2H, м), 7,75-7,77 (1H, м).
1
3
d) H-ЯМР (CDCl): 1,22 (3H, т, J=7,0 Гц), 1,96 (2H, квинтет, J=6,3 Гц), 3,50 (2H, кв, J=7,0 Гц), 3,58 (2H, т, J=6,3 Гц), 3,67 (2H, кв-подобный, J=6,3 Гц), 5,65 (1H, ушир.т), 7,53-7,60 (5H, м), 7,65-7,69 (2H, м), 7,74-7,76 (1H, м).
Ссылочный пример синтеза 1
(Получение 8-хлор-4-фенил-2(1H)-хиназолинона (соединение № II-11))
1
6
К 7,10 г фенилмагнийбромида (32%-ный раствор в ТГФ) при комнатной температуре по каплям добавляли раствор 953 мг 2-амино-3-хлорбензонитрила в ТГФ (7 мл) с последующим нагреванием с обратным холодильником в течение 30 минут. К полученному продукту реакции по каплям добавляли 885 мг метилхлоркарбоната при охлаждении на льду, с последующим нагреванием с обратным холодильником в течение 40 минут. Полученный реакционный раствор охлаждали и вливали в 40 мл 2 н. хлористоводородной кислоты, после чего добавляли 8 г бикарбоната натрия и 20 мл МТБЭ, с последующим перемешиванием. Выпавшие кристаллы собирали посредством фильтрации, получая 1,30 г указанного в заголовке соединения. H-ЯМР (ДМСО-d): 7,24 (1H, т, J=8,0 Гц), 7,57-7,70 (6H, м), 7,90-7,93 (1H, м), 11,45 (ушир.с).
Ссылочный пример синтеза 2
(4-фенил-6-трифторметил-2(1H)-хиназолинон (соединение № II-6))
1
3
К раствору 762 мг 2-амино-5-трифторметилбензофенона в 10 мл хлороформа по каплям добавляли 349 мг триэтиламина, а затем по каплям добавляли 627 мг трихлорацетилхлорида при охлаждении на льду. После перемешивания при той же температуре в течение 30 минут добавляли 50 мл воды, разделив, таким образом, раствор. Органический слой собирали и концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат 5:1), получая 1,08 г 2'-бензоил-2,2,2-трихлор-4'-трифторметилацетанилида. H-ЯМР (CDCl): 7,53-7,58 (2H, м), 7,66-7,75 (3H, м), 7,90-7,95 (2H, м), 8,81 (1H, д, J=8,6 Гц), 12,38 (1H, ушир.с).
1
3
Смесь 1,08 г 2'-бензоил-2,2,2-трихлор-4'-трифторметилацетанилида, 10 мл ДМСО и 1,18 г ацетата аммония перемешивали при 75°C в течение 1 часа. После охлаждения добавляли 100 мл воды, и выпавшие кристаллы собирали фильтрованием. Полученное собранное вещество расворяли в смеси гексан:этилацетат 1:1, обезвоживали с использованием безводного сульфата магния, а затем концентрировали, получая 765 мг указанного в заголовке соединения. H-ЯМР (CDCl): 7,58-7,68 (3H, м), 7,75 (1H, д, J=8,8 Гц), 7,79-7,83 (2H, м), 7,93 (1H, дд, J=8,8, 1,7 Гц), 8,17 (1H, ушир.с), 13,37 (1H, ушир.с).
Примеры соединений, которые могут быть получены таким же способом, как и в ссылочных примерах синтеза, описанных выше, показаны в таблице 7 (включая также соединения, полученные в ссылочных примерах синтеза, описанных выше).
Обощначения "a)"-"i)" в таблице 7 приведены ниже.
<b>Таблица 7</b>
<img file="00000020.tif" he="19" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
Ar
(X)<sub>n</sub>
Температура плавления (°C)
II-1
Ph
5-Cl
a)
II-2
Ph
6-F
b)
II-3
Ph
6-Cl
>300
II-4
Ph
6-Br
c)
II-5
Ph
6-Me
291,9
II-6
Ph
6-CF<sub>3</sub>
d)
II-7
Ph
6-NO<sub>2</sub>
280 (разложение)
II-8
Ph
6-OMe
e)
II-9
Ph
6-CN
f)
II-10
Ph
7-Cl
g)
II-11
Ph
8-Cl
h)
II-12
Ph
6,8-Cl<sub>2</sub>
i)
II-13
п-Cl-Ph
6-Cl
269,6 (разложение)
II-14
м-Cl-Ph
6-Cl
295 (разложение)
1
6
a) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,27 (1H, дд, J=7,7, 1,0 Гц), 7,38 (1H, дд, J=8,3, 1,1 Гц), 7,43-7,55 (5H, м), 7,69 (1H, т, J=8,1 Гц), 12,18 (1H, ушир.с).
1
6
b) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,35 (1H, дд, J=9,2, 2,7 Гц), 7,43 (1H, дд, J=9,2, 4,8 Гц), 7,58-7,74 (6H, м), 12,05 (1H, ушир.с).
1
6
c) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,35 (1H, д, J=9,2 Гц), 7,59-7,71 (6H, м), 7,91 (1H, дд, J=9,2, 2,2 Гц), 12,08 (1H, ушир.с).
1
d) H-ЯМР, описанный в ссылочном примере синтеза 2.
1
3
e) H-ЯМР (CDCl): 3,78 (3H, с), 7,25-7,27 (1H, м), 7,36-7,40 (1H, м), 7,54-7,62 (4H, м), 7,81-7,85 (2H, м), 13,37 (1H, ушир.с).
1
6
f) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,48 (1H, д, J=8,4 Гц), 7,60-7,68 (3H, м), 7,71-7,74 (2H, м), 8,05 (1H, с), 8,08-8,12 (1H, м), 12,36 (1H, ушир.с).
g) (не выделяли и не очищали).
1
h) H-ЯМР, описанный в ссылочном примере синтеза 1.
1
6
i) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,52-7,72 (6H, м), 8,10-8,12 (1H, м), 11,69 (1H, ушир.с).
Пример 1
Arabidopsis thaliana
(Создание фаговой библиотеки кДНК  для клонирования CER1)
Arabidopsis thaliana
TM
TM
Семена  линии Wassilewskija стерилизовали 70%-ным этиловым спиртом в течение одной минуты, а затем 1,5%-ным гипохлоритом натрия в течение 10 минут. Семена тщательно промывали стерильной водой, а затем культивировали в среде GM (4,3 минимальная смесь солей Мурасиге и Скуга, 1%-ная сахароза, 10 мл 5%-ного MES-KOH (pH 5,7), 0,3% Phytagel (SIGMA)) в течение 2 недель, получая 5 г растения. Растение замораживали в жидком азоте, а затем механически растирали в ступке. К полученному измельченному продукту добавляли смесь 10 мг экстракционного буфера (200 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0,5% ДСН, 14 мМ β-меркаптоэтанол) и 10 г фенола. Смесь перемешивали на смесителе Voltex. Затем к смеси добавляли 10 мл хлороформа с последующим тщательным перемешиванием. Затем полученную смесь центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 минут и собирали водный слой. К собранному водному слою добавляли LiCl до конечной концентрации 2 M с последующим выдерживанием при -80°C в течение 3 часов. Полученный замороженный продукт размораживали, а затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 минут. Собирали осадок. Собранный осадок растворяли в 2 мл TE (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА). Затем к раствору добавляли 0,2 мл 3 M ацетата натрия (pH 5,2) и 5 мл этанола, центрифугировали смесь с получением РНК в осадке. Затем РНК, содержащую polyA, экстрагировали из собранного осадка (РНК) с помощью Oligotex dT30super (изготовленного фирмой Roche Japan Co., Ltd.).
Фаговую библиотеку кДНК собирали из экстрагированной РНК, содержащей polyA, с использованием набора ZAP-cDNASynthesis (Stratagene, Ltd.) согласно инструкции в наборе. Титр собранной фаговой библиотеки кДНК составлял 500000 БОЕ.
Пример 2
(Получение ДНК-зонда для CRE1)
TM
Реакцию ПЦР проводили с использованием фаговой жидкости (приблизительно 1000000 БОЕ) фаговой библиотеки кДНК, полученной в примере 1, в качестве матрицы, а также ДНК SEQ ID NO:3 и ДНК SEQ ID NO:4 в качестве праймеров, с использованием набора TAKARA LA Taq (изготовленного фирмой Takara Shuzo Co., Ltd.) для амплификации ДНК. Детали описаны ниже.
32
32
Реакционную смесь ПЦР получали, добавляя компоненты реакции, такие как dNTP, к 1000000 БОЕ фага и по 0,2 мкМ ДНК каждого праймера согласно инструкции в наборе. ПЦР проводили при следующих условиях: нагревание при 94°C в течение 2 минут, 40 циклов при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 68°C в течение 5 минут, получая амплифицированный нужный фрагмент ДНК. Затем зонд, меченный P, получали с использованием амплифицированного фрагмента ДНК в качестве матрицы с помощью набора Megaprime DNA-labelling system (изготовленного фирмой Amersham Pharmacia). На данной стадии получали реакционную смесь (25 мкл), добавляя PdCTP 2,0 МБк к 25 нг амплифицированного фрагмента ДНК, и затем в полученную смесь добавляли компоненты реакции, указанные в наборе. Мечение проводили при 37°C в течение 10 минут.
Пример 3
(Получение клона фаговой кДНК, несущего ген CRE1)
Целевой ген DRE1 клонировали путем гибридизации бляшки с использованием ДНК-зонда, полученного в примере 2. Детали описаны ниже.
Бляшки получали с использованием фаговой библиотеки кДНК, полученной в примере 1, согласно инструкциям в наборе ZAP-cDNASynthesis. ДНК сформированных бляшек адсорбировали на нитроцеллюлозном фильтре, а затем фиксировали на фильтре посредством обработки ультрафиолетовым облучением. Фильтр, подготовленный таким образом, выдерживали при 65°C в присутствии 6×SSC (0,9 М NaCl, 0,09 M цитрат натрия), 5× раствор Денхардта (0,1% (вес/об) Фиколл 400, 0,1% (вес/об) поливинилпирролидон, 0,1% БСА), 0,5 % (вес/об) ДСН и 100 мкг/мл ДНК денатурированной спермы лосося, или в растворе DIG EASY Hyb (Boehringer Mannheim Co., Ltd.), содержащем 100 мкг/мл ДНК денатурированной спермы лосося, дважды выдерживали при комнатной температуре в течение 15 минут в присутствии 1×SSC (0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия) и 0,5% ДСН, а затем выдерживали при 68°C в течение 30 минут в присутствии 0,1×SSC (0,015 М NaCl, 0,0015 М цитрат натрия) и 0,5% ДСН, получая гибридизованный клон фаговой кДНК.
Пример 4
(Клонирование кДНК CRE1)
Реакцию ПЦР проводили с использованием кДНК клона фаговой кДНК, полученного в примере 3, в качестве матрицы, а также с использованием ДНК SEQ ID NO:5 и ДНК SEQ ID NO:6 в качестве праймеров для амплификации ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. Детали описаны ниже.
Реакцию ПЦР проводили с использованием Herculase Enhanced ДНК полимеразы (изготовленного фирмой TOYOBO, Ltd.) при следующих условиях: нагревание при 94°C в течение 1 минуты, 25 циклов при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 4 минут. На данной стадии смесь для ПЦР (50 мкл) готовили, добавляя такие компоненты реакции, как dNTP, к 500 нг кДНК клона фаговой кДНК и по 100 нг ДНК каждого праймера согласно инструкции в наборе.
Как описано выше, амплифицировали нужный фрагмент ДНК.
Пример 5
(Конструирование экспрессионной плазмиды CRE1)
Sma
Дрожжевой экспрессионный вектор p415CYC (Munberg et al., Gene: 156 119-122 (1995), доступный в библиотеке ATCC (№ 87382)), расщепляли рестриктазой I. Затем фрагмент ДНК, полученный в примере 4 (ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2), лигировали с последовательностью промотора CYC1 экспрессионного вектора p415CYC1 при помощи T4 ДНК лигазы, встроив его таким образом, чтобы целевой белок мог экспрессироваться в дрожжах. Посредством секвенирования подтверждали, что нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК была введена в правильном направлении и являлась нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2. Таким образом, получали экспрессионную плазмиду p415CYC-CRE1.
Пример 6
(Получение трансформированной клетки TM182-CRE1 и трансформированной клетки TM182-p415CYC1)
Экспрессионную плазмиду p451CYC-CRE1, полученную в примере 5, а также дрожжевой экспрессионный вектор p415CYC использовали для трансформации дефектного по Sln1-гену штамма, TM182 (sln1∆) (Maeda T et al., Nature: 369 242-245 (1994)). Трансформацию проводили с использованием способа полиэтиленгликоль/ацетат лития (ПЭГ/LiAc)-опосредованной трансформации согласно VII. Методики трансформации и скрининга библиотек описаны в CLONTECH Co., Ltd.: MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 User Manual, стр. 22. Так как потребность в присутствии лейцина у полученной трансформированной клетки исчезает, отбирали трансформированные дрожжи, способные расти на среде DOLU+Gal, с получением трансформированной клетки TM182-CRE1 и трансформированной клетки TM182-p415CYC1.
Пример 7
(Способ поиска химического вещества, способного ингибировать внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки)
600
Трансформированной клеткой TM182-CRE1 и трансформированной клеткой TM182-p415CYC1, полученным в примере 6, инокулировали 10 мл среды DOLU+Gal и инкубировали предварительно при 30°C в течение 18 часов, получая преинкубационную жидкость для каждой из трансформированных клеток. Преинкубационную жидкость разбавляли средой DOLU+Glu для трансформированной клетки TM182-CRE1 или средой DOLU+Gal для трансформированной клетки TM182-p415CYC1, до плотности OD 0,1, получая преинкубационный раствор для каждой из трансформированных клеток.
В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 1 мкл раствора (200 м.д.) тестируемого вещества в диметилсульфоксиде (ДМСО), подготовив аналитический планшет. В то же время в качестве контроля в часть лунок добавляли только ДМСО в количестве 1 мкл. Таким образом, получали аналитический планшет для трансформированной клетки TM182-CRE1 и аналитический планшет для трансформированной клетки TM182-p415CYC1.
600
Раствор, содержащий 10000 м.д. транс-зеатина (цитокинин) в ДМСО, разбавляли в 50 раз средой DOLU+Gul до 200 м.д. Раствор, содержащий 200 м.д. транс-зеатина добавляли в количестве 3/1000 по объему в каждый вышеописанный преинкубационный раствор, получая преинкубационный раствор, содержащий по 0,6 м.д. транс-зеатина. Преинкубационный раствор (0,6 м.д.) добавляли в количестве 100 мкл в каждую лунку аналитического планшета для каждой трансформированной клетки. Планшеты инкубировали при 30°C в течение 24 часов. Затем в каждой лунке измеряли оптическую плотность (OD) с использованием спектрофотометра для сканирования планшетов. Активность тестируемого вещества при ингибировании внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки определяли посредством сравнения измеренной оптической плотности с оптической плотностью в контрольной лунке. Результаты приведены в таблицах 8 и 9.
В случае трансформированной клетки TM182-CRE1, тестируемое вещество, которое показало более низкую оптическую плотность, чем оптическая плотность в контрольной лунке, отбирали как химическое вещество, способное к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки. В случае трансформированной клетки TM182-p415CYC1, однако, тестируемое вещество, которое показало более низкую оптическую плотность, чем оптическая плотность в контрольной лунке, при которой степень снижения эквивалентна или превышает соответствующий показатель в случае трансформированной клетки TM182-CRE1, являлось токсичным для дрожжей, и поэтому не было выбрано в качестве химического вещества, способного к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки.
(относительный показатель роста в тестовой секции по сравнению с контрольной секцией)[%]=[(оптическая плотность в тестовой секции)-(оптическая плотность в пустой пробе)]/[(оптическая плотность в контрольной секции)-(оптическая плотность в пустой пробе)]×100
(ингибирующая активность в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки)[%]=100-(относительный показатель роста в тестовой секции по сравнению с контрольной секцией)
<b>Таблица 8</b>
Химическое вещество (соединение №)
Относительный показатель роста (%) в тестовой секции по сравнению с контрольной секцией
Ингибирующая активность (%) тестируемого вещества в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки
Трансформированная клетка TM182-CRE1
Трансформированная клетка TM182-p415CYC1
Ia1-3
5,5
113,9
94,5
Ia1-7
1,2
78,8
98,8
Ib4-1
8,7
110,9
91,3
Ic11-1
2,2
114,5
97,8
Ic12-1
2,8
106,3
97,2
Ic2-1
2,8
124,6
97,2
IC3-1
5,4
114,1
94,6
Ic3-3
1,4
108,6
98,6
Ic3-4
1,4
106,4
98,6
Ic3-5
3,5
115,4
96,5
Ic3-6
2,8
114,6
97,2
Ic3-7
2,8
104,1
97,2
Ic3-9
1,5
122,0
98,5
Ic3-11
3,9
84,6
96,1
Ic3-12
5,6
90,9
94,4
Ic3-16
3,2
97,0
96,8
Ic3-18
4,0
105,3
96,0
Ic3-19
2,4
102,7
97,6
Ic3-20
5,0
86,5
95,0
Ic3-21
5,0
121,6
95,0
Ic3-22
4,9
110,6
95,1
Ic3-23
4,1
108,1
95,9
Ic3-24
2,1
112,5
97,9
Ic3-25
6,0
122,0
94,0
Ic3-26
5,3
110,7
94,7
Ic3-27
2,3
107,4
97,7
Ic3-29
1,6
92,7
98,4
Во всех случаях фактическую концентрацию транс-зеатина доводили до 0,6 м.д., а фактическую концентрацию химического вещества - до 2 м.д.
<b>Таблица 9</b>
Химическое вещество (соединение №)
Относительный показатель роста (%) в тестовой секции по сравнению с контрольной секцией
Ингибирующая активность (%) тестируемого вещества в отношении внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки
Трансформированная клетка TM182-CRE1
Трансформированная клетка TM182-CRE1
Ic3-30
2,2
108,9
97,8
Ic3-32
4,5
89,2
95,5
Ic3-33
1,0
114,6
99,0
Ic3-34
0,2
118,5
99,8
Ic3-37
3,5
114,2
96,5
Ic3-38
1,2
99,4
98,8
Ic3-39
-1,3
108,1
101,3
Ic3-40
0,7
123,4
99,3
Ic3-41
8,8
123,3
91,2
Ic3-42
-0,7
111,5
100,7
Ic3-43
0,8
122,0
99,2
Ic3-44
7,0
101,4
93,0
Ic3-45
0,8
98,7
99,2
Ic3-46
1,3
92,2
98,7
Ic4-1
4,6
95,0
95,4
Ic4-2
0,9
109,3
99,1
Ic5-4
8,9
116,8
91,1
Ic5-5
7,2
126,3
92,8
Ic7-1
6,7
115,8
93,3
Id3-1
2,1
112,5
97,9
Ie3-1
2,3
110,7
97,7
Во всех случаях фактическую концентрацию транс-зеатина доводили до 0,6 м.д., а фактическую концентрацию химического вещества - до 2 м.д.
Пример 8
(Способ оценки эффекта дозы химического вещества, способного к ингибированию внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки)
Химические вещества (которые ингибируют внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), отобранные в примере 7, тестировали при переменных концентрациях таким же способом, как и в примере 7. Трансформированную клетку TM182-CRE1 и трансформированную клетку TM182-p415CYC1, полученные в примере 6, инкубировали в тех же условиях, как и в примере 7, за исключением того, что тестируемые концентрации химических веществ (которые ингибируют внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), выбранные в примере 7, варьировали в пределах диапазона 0,06-6 м.д. Тестируемую концентрацию химического вещества регулировали с помощью ДМСО. После завершения инкубации эффект дозы в отношении активности ингибирования внутриклеточной передачи сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки исследовали на основе минимальной тестируемой концентрации, при которой не наблюдалось пролиферативное состояние трансформированной клетки TM182-CRE1, или на основе полученной нижеописанным способом кривой ингибирования роста в зависимости от дозы.
С целью построения кривой ингибирования роста в зависимости от дозы вначале вычисляли относительный показатель роста следующим образом.
(относительный показатель роста)[%]=(B)/(A)×100
(A)=[(оптическая плотность при 0,06 м.д. в тестовой секции)-(оптическая плотность в пустой пробе)]/[(оптическая плотность в контрольной секции)-(оптическая плотность в пустой пробе)]
(B)=[(оптическая плотность в каждой тестовой секции)-(оптическая плотность в пустой пробе)]/[(оптическая плотность в контрольной секции)-(оптическая плотность в пустой пробе)]
Затем строили график, в котором на оси X указана концентрация тестируемого химического вещества, а на оси Y указан относительный показатель роста (см. фиг.1, фигуры слева: трансформированная клетка TM182-CRE1, фигуры справа: трансформированная клетка TM182-p415CYC1), получая в результате кривую ингибирования роста в зависимости от дозы.
Пример 9
(Тест на активность стимулирования роста корней)
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Подготавливали стандартную среду Enshi, имеющую следующий состав (см. таблицу 10). В блок пробирок дозировали по 4 мкл раствора химического вещества в ДМСО до конечной концентрации 0,001-10 м.д., а затем добавляли по 600 мкл стерилизованной стандартной среды Enshi. Затем полученный раствор хорошо перемешивали. В каждую пробирку блока сеяли 10-20 семян  и выращивали при 22°C в течение 10 дней на свету. Затем измеряли длину главных корней (среднюю длину главных корней), образовавшихся из семян . Определяли среднее значение в восьми повторных измерениях, после чего показатель роста корня определяли согласно следующему уравнению. В результате химическое вещество, которое показало существенный показатель роста корня (например, показатель роста корня 120% или выше), можно быть оценить как вещество, обладающее активностью при стимулировании роста корня.
В качестве подробных результатов конечные концентрации, которые показали наиболее высокие показатели роста корня, приведены в таблице 11 и таблице 12.
Показатель роста корня (%)=(средняя длина главного корня в секции, обработанной химическим веществом)/(средняя длина главного корня в контрольной секции)×100
<b>Таблица 10</b>
Состав
Концентрация (мг/л)
Нитрат кальция
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
950
Нитрат калия
KNO<sub>3</sub>
810
Сульфат магния
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
500
Фосфат аммония
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
155
Хелатированное железо
Fe-ЭДТА
22,62
Борная кислота
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
2,86
Сульфат марганца
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
1,81
Сульфат цинка
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0,22
Сульфат меди
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,08
Молибдат натрия
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,025
Доводили до pH 5,8
<b>Таблица 11</b>
Соединение №
Конечная тестируемая концентрация (м.д.)
Активность стимулирования роста корня
Ic3-3
5
163,4
Ic3-4
0,625
129,5
Ic3-5
0,625
134,0
Ic3-6
0,625
122,4
Ic3-7
1,25
142,5
Ic3-8
1,25
136,4
Ia1-3
5
137,5
Ie3-1
5
120,9
Ie3-2
10
147,6
Ic3-10
10
120,6
Ic3-11
1,25
128,2
Ic3-12
1,25
128,9
Ic3-13
10
140,5
Ic3-14
2,5
126,2
Ic3-15
5
131,0
Ic3-16
5
155,3
Ic3-17
10
121,3
Ic3-18
2,5
139,5
Ic3-19
1,25
155,6
Ic3-20
10
137,8
Ic3-21
2,5
131,7
Ic3-22
0,156
129,3
Ic3-23
10
150,0
Ic3-24
1,25
122,8
Ic3-25
10
140,0
Ic3-26
5
136,4
Ic3-27
2,5
127,8
Ic5-4
2,5
136,6
Ic5-5
2,5
157,8
Ic3-28
10
120,4
Ic3-29
10
122,4
Ic3-31
10
142,2
Ic3-32
5
123,4
Ic3-33
5
123,9
<b>Таблица 12</b>
Соединение №
Конечная тестируемая концентрация (м.д.)
Активность стимулирования роста корня
Ic3-35
10
144,4
Ic3-36
2,5
123,1
Ia1-1
5
133,3
Ia1-2
10
139,7
Ic2-1
2,5
127,4
Ic9-1
10
141,5
Ic1-1
2,5
150,9
Ic10-1
10
163,6
Ic11-1
5
143,9
Ic12-1
2,5
184,6
Ic6-2
2,5
155,9
Ia1-6
0,625
126,9
Ic8-1
10
162,1
Ic3-37
5
138,5
Ic3-38
5
141,9
Ic3-39
10
169,0
Ic3-40
0,625
125,8
Ic3-41
5
134,5
Ic3-42
0,625
128,6
Ic3-43
2,5
137,9
Ic3-44
1,25
126,5
Ic3-46
2,5
121,6
Ic12-3
2,5
138,8
Ia1-14
0,156
129,3
II-5
10
124,4
II-7
5
124,4
II-14
2,5
126,1
Пример 10
(Оценка активности при стимулировании роста корней вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина, с использованием латука)
Lactuca sativa
В отношении химического вещества Ic3-1 и химического вещества Ic7-1 (которые ингибируют внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки) выбранных в примере 7, активность при стимулировании роста главного корня оценивали с использованием латука ( Красная волна). Приготавливали водные растворы химического вещества с различными концентрациями (0,6, 1,2, 2,5, 5, 10, 20 м.д., каждая содержала 0,1% ДМСО) и наносили в количестве 1 мл на фильтровальную бумагу диаметром 50 мм в 60 φ пластиковой чашке Петри. Затем 30 семян латука высевали на пластиковую чашку Петри. После выращивания на свету при 22°C в течение 4 дней измеряли длину главного корня. Определяли среднее значение в 3 повторных измерениях, а затем определяли показатель роста корней следующим уравнением.
Показатель роста корней (%)=(средняя длина главного корня в секции, обработанной химическим веществом)/(средняя длина главного корня в контрольной секции)×100-100
Результаты показаны на фиг.2 и фиг.3. В случае химического вещества Ic3-1 рост главного корня при 0,6-2,5 м.д. был увеличен на 15-17% по сравнению с контрольной секцией (см. фиг.2). В случае химического вещества Ic7-1 расширение главного корня при 10-20 м.д. было увеличено на 10-17% по сравнению с контрольной секцией (см. фиг.3). Результаты теста Даннетта показали, что во всех обработанных секциях присутствовало существенное различие на значимом уровне 5%, и, таким образом, наблюдался значительный эффект стимулирования роста корней.
Пример 11
(Оценка активности стимулирования роста корней вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса)
Oriza sativa
L
japonica
В отношении химического вещества Ic3-1 и химического вещества Ic7-1 (которые ингибируют внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), выбранных в примере 7, активность при стимулировании роста главного корня оценивали с использованием риса (. ). Приготавливали водные растворы химического вещества с различными концентрациями (10, 25 м.д., каждая содержала 0,1% ДМСО). Бумажное полотенце пропитывали 17 мл химического раствора, при этом плотную бумагу помещали в мешочек для проращивания семян с целью наблюдения за ростом корней (177×163 мм, Daiki Rika Kogyo Co., Ltd.), и 3 семени риса высевали на бумажное полотенце. Мешочек помещали в пластиковый контейнер, который затем закрывали. После выращивания на свету при 25°C в течение 7 дней, измеряли длину главного корня. Определяли среднее значение в 3 повторных измерениях, а затем определяли показатель роста корней следующим уравнением.
Показатель роста корней (%)=(средняя длина главного корня в секции, обработанной химическим веществом)/(средняя длина главного корня в контрольной секции)×100-100.
Результаты показаны на фиг.4 и фиг.5. В случае химического вещества Ic3-1 рост главного корня при 10 м.д. был увеличен на 17%, а рост главного корня при 25 м.д. был увеличен на 20%, по сравнению с контрольной секцией (см. фиг.4). В случае химического вещества Ic7-1 рост главного корня при 10 м.д. был увеличен на 17%, а рост главного корня при 25 м.д. был увеличен на 19%, по сравнению с контрольной секцией (см. фиг.5). Результаты теста Даннетта показали, во всех обработанных секциях присутствовало существенное различие на значимом уровне 5%, и, таким образом, наблюдался значительный эффект стимулирования роста корней.
Пример 12
(Оценка активности стимулирования роста корней вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина, при обработке семян риса)
Oriza sativa
L
japonica
В отношении химического вещества Ic3-1 и химического вещества Ic7-1 (которые ингибируют внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), выбранных в примере 7, активность при стимулировании роста главного корня, вызванного путем обработки семян, оцененивали с использованием риса (. ). Химическое вещество растворяли в ацетоне с получением раствора с концентрацией 10000 м.д. Раствор химического вещества в ацетоне (300 мкл), приготовленный таким образом, помещали в пробирку эппендорф. Затем 15 семян помещали в пробирку эппендорф. Полученную смесь перемешивали в течение приблизительно 30 секунд. Семена, химически обработанные таким образом, распределяли и высушивали на фильтровальной бумаге.
Приблизительно 820 мл почвы для выращивания помещали в пластиковый контейнер (длиной 120 мм и высотой 97 мм) с отверстием в основании. Химически обработанные семена высевали в пластиковый контейнер (15 семян на пластиковый контейнер). Семена выращивали в темноте при 30°C в течение 4 дней, а затем выращивали в теплице в течение 35 дней. Корни растения, выращенного таким образом, срезали, а почву, оставшуюся на растении, смывали с последующей лиофильной сушкой. Затем определяли вес корней после лиофильной сушки. Тест повторяли 3 раза для каждой обрабатываемой секции, при этом определяли среднее значение. Результаты показаны на фиг.6.
В случае соединения Ic3-1 сухой вес корней растения увеличился на 119% по сравнению с контрольной секцией. В случае соединения Ic7-1 сухой вес корней растения увеличился на 126% по сравнению с контрольной секцией. В обоих случаях был обнаружен значительный эффект стимулирования роста корней. В случае ауксинового соединения ИУК вес корней снизился на 87% по сравнению с контрольной секцией, и, таким образом, был обнаружен ингибирующий эффект в отношении роста корней.
Пример 13
Arabidopsis thaliana
(Оценка активности при стимулировании дифференцировки растения вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина, с использованием гипокотиля )
Arabidopsis thaliana
В отношении химического вещества Ic3-1 и химического вещества Ic7-1 (которые ингибируют внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), выбранных в примере 7, активность стимулирования дифференцировки растения оценивали посредством исследования активности формирования придаточных корней, используя гипокотиль  Колумбии.
Arabidopsis thaliana
Вначале приготавливали агаризованную среду для посева . Агаризованная среда содержала в качестве компонентов (в 1 литре водного раствора) 1 пакет смешанных солей для растительной среды Мурасиге-Скуга (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) на 1 литр, 10 г сахарозы, 10 мл 5%-ного водного раствора MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты), доведенного до pH 5,7 гидроксидом калия, 100 мг инозита, 1 мл стокового раствора витаминов (10 г гидрохлорида тиамина, 1 г гидрохлорида пиридоксина и 1 г никотиновой кислоты на 1 литр водного раствора) и 8 г агара. Затем агаризованную среду подвергали автоклавированию при 120°C в течение 20 минут, после чего заливали круглые чашки Петри и оставляли до затвердения.
Arabidopsis thaliana
Семена  (приблизительно 25 мкл) помещали в пробирку на 1,5 мл. К ним добавляли 1 мл разбавленного стерилизованной дистиллированной водой в 10 раз раствора гипохлорита натрия (Nacalai Tesque). Семя стерилизовали при перемешивании в течение приблизительно 1 минуты на встряхивателе для микропробирок (TOMY, MT-360, MIXING SPEED10). После осаждения семян на микроцентрифуге из пробирки удаляли разбавленный раствор гипохлорита натрия. После добавления в пробирку 1 мл стерилизованной дистиллированной воды семена промывали посредством перемешивания на встряхивателе для микропробирок в течение приблизительно 1 минуты. Семена осаждали портативной микроцентрифугой, а затем воду после промывки удаляли из пробирки. Операцию промывки повторяли 3 раза. После промывки семена высевали на агаризованную среду в круглой чашке Петри, проращивали и выращивали в темноте при 22°C.
Отдельно химическое вещество растворяли в ДМСО с получением раствора с концентрацией 10000 м.д. Кроме того, раствор разбавляли ДМСО с получением растворов с концентрацией 6000, 2000, 600 и 200 м.д. В каждую лунку 12-луночного планшета (SUMITOMO BAKELITE Co., Ltd.) вносили 2 мкл раствора в ДМСО, содержащего один вид химического вещества с одной концентрацией. В контрольную лунку вносили 2 мкл ДМСО вместо раствора химического вещества в ДМСО. Затем транс-зеатин растворяли в ДМСО с получением раствора с концентрацией 10000 м.д. Раствор разбавляли стерилизованной дистиллированной водой с получением раствора с концентрацией 10 м.д. Агаризованную среду вышеуказанного состава готовили путем автоклавирования с последующим охлаждением приблизительно до 50°C. К полученной агаризованной среде добавляли раствор транс-зеатина с концентрацией 10 м.д. до конечной концентрации 0,01 м.д., с последующим перемешиванием. Агаризованную среду, содержащую транс-зеатин (по 2 мл), вносили в каждую лунку 12-луночного планшета, в которую был внесен раствор химического вещества в ДМСО или чистый ДМСО, а затем оставляли до затвердения.
Arabidopsis thaliana
У рассады  после прорастания и выращивания в темноте при 22°C вырезали часть гипокотиля, а затем гипокотиль на стороне с семядолями использовали для измерения активности формирования придаточных корней, как описано ниже. Гипокотиль со стороны корней отбрасывали. В частности, гипокотиль с семядолями вставляли в агаризованную среду в каждой лунке 12-луночного планшета приблизительно на 5 мм от среза. Планшет держали на свету при 22°C в течение 16 часов (в темноте в течение 8 часов). В результате придаточные корни сформировались из части гипокотиля, вставленной в агаризованную среду, содержащую химическое вещество Ic3-1 (во всех тестовых секциях вещество содержалось в конечной концентрации 6, 2, 0,6 или 0,2 м.д.), и части гипокотиля, вставленной в агаризованную среду, содержащую химическое вещество Ic7-1 (в каждой тестовой секции вещество содержалось в конечной концентрации 6 или 2 м.д.). В контрольной секции, в которой вместо раствора химического вещества в ДМСО добавляли чистый ДМСО, образования придаточных корней из части гипокотиля не отмечали. Результаты тестов в случае оси зародыша, вставленной в агаризованную среду, содержащую химическое вещество Ic3-1 в конечной концентрации 0,6 м.д., гипокотиля, вставленного в агаризованную среду, содержащую химическое вещество Ic7-1 в конечной концентрации 2 м.д., и гипокотиля, вставленного в агаризованную среду контрольной секции, показаны на фиг.7.
Пример 14
(Измерение активности стимулирования роста корней вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина, с использованием риса)
Oriza sativa
japonica
В отношении химического вещества Ic3-3 активность при стимулировании роста корней определяли с использованием риса ( Nipponbare).
Вначале готовили раствор в ацетоне, содержащий определенную концентрацию химического вещества, который затем разбавляли в 100 раз дистиллированной водой до 10 м.д. с получением раствора химического вещества (содержащего 1%-ный ацетон). Семена погружали в воду на 2 дня для стимулирования прорастания. Семена высевали в кассету на 288 ячеек (по 3 семени в ячейку), а затем почву пропитывали вышеуказанным химическим раствором вещества в количестве 500 мкл на ячейку. После накрывания почвой, кассету помещали в полиэтиленовый пакет и ставили в кондиционируемое помещение (в темноте при 30°C) на 3 дня. После удаления полиэтиленового пакета кассету выдерживали на свету при световом режиме с соотношением свет/темнота 16 ч/8 ч в течение 4 дней при постоянном увлажнении кассеты снизу. Таким образом, семена риса выращивали, получая растения риса. Полученные корни риса промывали и измеряли полную длину корней, используя анализатор изображений WinRHIZO (изготовленный фирмой Regent Instruments) с целью измерения длины корней. В секции, обработанной химическим веществом Ic3-3, рост корней значительно ускорялся по сравнению с контрольной секцией (UTC), в которой в почву обрабатывали только посредством пропитки ацетоном. Фотография показана на фиг.8. Аналитические результаты, полученные при измерении длины корней с помощью анализатора изображений, показали увеличение полной длины корней в секции, обработанной химическим веществом Ic3-3. Результаты приведены на фиг.9.
Пример 15
(Клонирование кДНК CRE1, № 2)
Реакцию ПЦР проводили с использованием экспрессионной плазмиды p415CYC-CRE1, полученной в примере 5, в качестве матрицы, а также с использованием ДНК SEQ ID NO: 7 и ДНК SEQ ID NO: 8 в качестве праймером для амплификации ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Детали описаны ниже.
Реакцию ПЦР проводили с использованием ДНК полимеразы KOD Plus (изготовленной фирмой TOYOBO, Ltd.) при следующих условиях амплификации: нагревание при 94°C в течение 1 минуты, 30 циклов при 94°C в течение 15 секунд, при 58°C в течение 30 секунд и при 68°C в течение 3 минут и 30 секунд. На данной стадии реакционную смесь ПЦР (50 мкл) готовили, добавляя такие компоненты реакции, как dNTP, к 500 нг плазмиды p415CYC-CRE1 и к 100 нг ДНК каждого праймера, согласно инструкции в наборе.
Нужный фрагмент ДНК, амплифицированный таким образом, клонировали в вектор pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen Corporation) согласно инструкции, приложенной к набору. В данном случае нужный фрагмент ДНК встраивали в вектор pCR-Blunt II-TOPO в положении, которое позволяет нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7 располагаться близко к промотору T7, а нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8 располагаться близко к промотору Sp6. С помощью секвенирования подтверждали, что нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК была встроена в правильном положении и являлась нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.
Пример 16
(Конструирование экспрессионной плазмиды CRE1)
Bam
Дрожжевой экспрессионный вектор p425GPD (Munberg et al., Gene: 156 119-122 (1995), доступный в библиотеке ATCC (№ 87359)), расщепляли рестриктазой HI. Затем фрагмент ДНК, полученный в примере 15 (ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2), лигировали с последовательностью GPD промотора экспрессионного вектора p425GPD при помощи лигазы T4 ДНК, встроив его таким образом, чтобы целевой белок мог экспрессироваться в дрожжах. Посредством секвенирования подтверждали, что нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК была введена в правильном направлении и являлась нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2. Таким образом, получали экспрессионную плазмиду p425GPD-CRE1.
Пример 17
(Получение трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1)
Экспрессионную плазмиду, полученную в примере 16, использовали для трансформации дефектного по Sln1-гену штамма, TM182 (sln1∆) (Maeda T et al., Nature: 369 242-245 (1994)). Трансформацию проводили с использованием набора S. cerevisiae Direct Transformation Kit Wako (изготовленного фирмой Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) согласно прилагаемому руководству. Так как потребность в присутствии лейцина у полученной трансформированной клетки исчезает, отбирали трансформированные дрожжи, способные расти на среде DOLU+Gal, с получением трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1.
Аналогичным способом при использовании дрожжевого экспрессионного вектора p425GPD получали трансформированную клетку TM182-p425GPD.
Пример 18
(Получение фракции мембранных белков, содержащей CRE1)
Трансформированную клетку TM182-p425GPD-CRE1, полученную в примере 17, разрушали стеклянными гранулами, а затем подвергали ультрацентрифугированию с получением фракции мембранных белков, содержащую CRE1. Детали описаны ниже.
600
Трансформированной клеткой TM182-p425GPD-CRE1, полученную в примере 17, инокулировали 100 мл среды DOLU+Gal, а затем инкубировали при 30°C в течение 16 часов с получением инкубационной жидкости с плотностью ODприблизительно 1,4. Инкубационную жидкость помещали в центрифужную пробирку на 50 мл, а затем центрифугировали при 4°C и 7400 g в течение 5 минут, собрав клетки трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1. Полученные клетки ресуспендировали в фосфатном буфере (приготовленном путем смешивания 50 мМ водного раствора дигидрофосфата натрия с 50 мМ водным раствором гидрофосфата динатрия в соотношении 4:6 и доведения pH до 7,0), охлажденном до 4°C, переносили в пробирку на 2 мл и центрифугировали при 4°C и 1000 g в течение 5 минут, собрав клетки трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1. Полученные клетки ресуспендировали в фосфатном буфере, охлажденном до 4°C и центрифугировали при 4°C и 1000 g в течение 5 минут, собрав клетки трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1. Полученные клетки ресуспендировали в фосфатном буфере, содержащем DTT (дитиотреитол) и PMSF (фенилметилсульфонилфторид) (приготовленном путем добавления 5 мМ DTT и 0,5 мМ PMSF в вышеописанный фосфатный буфер) в тройном объеме (в расчете на клетки). Затем 200 мкл суспензии переносили в пробирку на 1,5 мл, содержащую 250 мкл стеклянных гранул (диаметром 0,25-0,5 мм), предварительно охлажденных до 4°C. Пробирку на 1,5 мл встряхивали на встряхивателе для микропробирок (МТ-360, изготовленного фирмой TOMY) на максимальном режиме в течение 30 секунд, а затем охлаждали во льду в течение 1 минуты, после чего указанную операцию повторяли еще раз. Кроме того, пробирку на 1,5 мл встряхивали на дезинтеграторе клеток (MB-200, изготовленного Yasui Kikai Corporation) в режиме (СКОРОСТЬ) 2000 в течение 30 секунд, а затем охлаждали во льду в течение 1 минуты, после чего указанную операцию повторяли еще два раза. Затем пробирку на 1,5 мл центрифугировали при 4°C и 1500 g в течение 10 минут с последующим отбором супернатанта. Супернатант переносили в новую пробирку на 1,5 мл и центрифугировали при 4°C и 10000 g в течение 3 минут с последующим отбором супернатанта. Супернатант центрифугировали при 4°C и 100000 g в течение 1 часа на ультрацентрифуге, с последующим отбором осадка. Полученный осадок растворяли в фосфатном буфере, содержащем 1%-ный монокапрат сахарозы (приготовленный путем добавления 1% монокапрата сахарозы в вышеописанный фосфатный буфер), с получением фракции мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1.
Аналогичным способом получали фракцию мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD.
Пример 19
(Способ анализа ингибирующего действия химического вещества в отношении связывания цитокинина с цитокининовым рецептором)
Фракция мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1, полученной в примере 18, и цитокинин, меченный радиоизотопом водорода, тритием, ставший в результате радиоактивным, использовали с целью исследования ингибирующего действия тестируемого вещества в отношении связывания цитокинина с цитокининовым рецептором. Детали описаны ниже.
В качестве цитокинина, меченного радиоизотопом водорода, тритием, ставшего в результате радиоактивным, использовали [3H]N-6-(изопент-2-енил)аденин, изготовленный Amersham Biosciences (в дальнейшем называемый радиоактивной меткой 2IP). Указанное вещество обладало определенной радиоактивностью 74,0 ГБк/ммоль и объемной радиоактивностью 37,0 МБк/мл.
Вначале 100 мкг фракции мембранных белков трансформированной клетки TM182-p415CYC1, раствор с определенной концентрацией радиоактивной метки 2IP в фосфатном буфере и 1 мкл тестируемого вещества, разведенного до определенной концентрации в ДМСО, смешивали в фосфатном буфере, получая 100 мкл реакционной жидкости. Затем реакционную жидкость оставляли во льду на 1 час, после чего фильтровали через стеклянный фильтр GF/B (изготовленный фирмой Whatman), собрав фракцию мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1. Стеклянный фильтр погружали в жидкую сцинтилляционную смесь Ultima Gold (изготовленную PerkinElmer Co., Ltd.) и измеряли радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика для жидкостей. В качестве контроля проводили тот же тест, в котором использовали фракцию мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD. Чтобы устранить влияние радиоактивности при неспецифичном связывании радиоактивной метки 2IP, значение радиоактивности, полученное в тесте с использованием фракции мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD, вычитали из значения радиоактивности, полученного в тесте с использованием фракции мембранных белков трансформированной клетки TM182-p425GPD-CRE1. Результаты теста приведены на фиг.10.
В случае, когда тестируемое вещество являлось транс-зеатином или Ic3-4, радиоактивность уменьшалась по сравнению со случаем, когда тестируемое вещество не добавляли (только ДМСО, который использовали в качестве растворителя для тестируемого вещества), или тестируемое вещество являлось абсцизовой кислотой.
Пример 20
(Оценка активности вещества, способного к ингибированию сигнальной функции цитокинина, в отношении стимулирования развития всходов риса посредством обработки семян в тесте с прямым посевом на подтопленном поле),
Oryza sativa japonica
Семена риса ( Nipponbare) обрабатывали химическим веществом Ic3-1 (которое ингибирует внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), отобранным в примере 7, и выращивали в условиях прямого посева. Затем анализировали показатель развития всходов, оценивая, таким образом, активность химического вещества в отношении стимулирования развития всходов риса.
Вначале приготавливали пустую суспензию, содержащую 5% (об./об.) Color Coat Red (изготовленного фирмой BECKER UNDERWOOD), 5% (об./об.) CF-Clear (изготовленного фирмой BECKER UNDERWOOD) и 0,42% (об./об.) Maxim-XL (изготовленного фирмой Syngenta). В 1,3 мл пустой суспензии растворяли 6,25, 12,5, 25 или 50 мг химического вещества Ic3-3. Семена обрабатывали раствором в количестве 1,3 мл на 50 г семян (что соответствовало 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг/г семян) с использованием прибора для обработки семян Hege11 (изготовленного фирмой Hans-Ulrich Hege).
Затем бетонный сосуд (50×50 см), находящийся вне помещения, затапливали на глубину 5 см под слоем воды и сеяли в сосуд 50 семян. На 23 день после посева исследовали количество всходов, верхушка которых появлялась на поверхности воды. В результате показатель развития всходов повышался при обработке семян в концентрации 0,125-1 мг/г семян, по сравнению с секцией, обработанной Пустой суспензией. Результаты тестов (среднее значение) каждой секции обработки (четыре повтора) приведены в таблице 13.
[Показатель развития всходов (%)]=[количество всходов, верхушка которых появилась на поверхности воды]/[количество посеяных семян]×100
<b>Таблица 13</b>
Химическое вещество
Количество вещества (мг/г семян)
Показатель развития всходов (%) на день 23 после посева
Пустая суспензия
76,7
Ic3-3
0,125
87,3
0,25
82,7
0,5
79,3
1
84,0
Пример 21
(Оценка активности при стимулировании образования побегов риса вещества, способного ингибировать сигнальную функцию цитокинина, при обработке семян в тесте с прямым посевом на сухом поле)
Oryza sativa japonica
Семена риса ( Nipponbare) обрабатывали химическим веществом Ic3-1 (которое ингибирует внутриклеточную передачу сигналов от растительного цитокининового рецептора клетки), выбранным в примере 7, и выращивали при прямом посеве в условиях сухого поля. Затем анализировали количество побегов и оценивали, таким образом, активность стимулирования образования побегов химического вещества.
Вначале приготавливали Чистую суспензию, содержащую 5% (об/об) Color Coat Red (изготовленного фирмой BECKER UNDERWOOD), 5% (об/об) CF-Clear (изготовленного фирмой BECKER UNDERWOOD) и 0,42% (об/об) Maxim-XL (изготовленного фирмой Syngenta). В 1,3 мл Чистой суспензии растворяли 12,5 мг химического вещества Ic3-3. Семена обрабатывали раствором в количестве 1,3 мл на 50 г семян (что соответствует 0,25 мг/г семян) с помощью прибора для обработки семян Hege11 (изготовленного фирмой Hans-Ulrich Hege).
Обработанные семена в количестве 20 семян на сосуд высевали в сосуд Вагнера 1/5000a на глубину 1 см, а затем выращивали в оранжерее. На 10 день после посева заливали воду до глубины заводнения 5 см, после чего продолжали выращивание. На 30 день после посева определяли количество побегов. В результате количество побегов в расчете на исходный материал было увеличено по сравнению с секцией, обработанной Пустой суспензией. Результаты тестов (среднее значение) каждой обработанной секции (три повтора) приведены в таблице 11.
Далее соединение (XI), используемое в настоящем изобретении, будет описано более конкретно посредством примеров синтеза и ссылочными примерами синтеза, при этом соединение (XI) не ограничено указанными примерами.
1
В примерах синтеза и ссылочных примерах синтеза "комнатная температура" обычно означает температуру 10-30°C. "H-ЯМР" означает спектр протонного магнитного резонанса. Измерение выполняли с помощью спектрометра (400 МГц) модели JNM-AL400, изготовленного фирмой JEOL Ltd., с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилана, при этом химические сдвиги (δ) выражали в м.д. "Т.пл." означает температуру плавления, которую измеряли с помощью измерителя температуры плавления модели Mettler FP61.
3
6
Сокращения, используемые в следующих примерах синтеза, ссылочных примерах синтеза и таблицах 2, 3, 4 и 5, имеют следующие значения. CDCl: дейтерированный хлороформ, ДМСО-d: дейтерированный диметилсульфоксид, с: синглет, д: дуплет, т: триплет, кв: квартет, дд: двойной дуплет, м: мултиплет, ушир.: уширенный, J: константа связывания, Me: метил, Et: этил, Pr: пропил, i-Pr: изопропил, t-Bu: трет-бутил, Ph: фенил, Ac: ацетил, ТГФ: тетрагидрофуран, ДМФА: N,N-диметилформамид, ДМСО: диметилсульфоксид и МТБЭ: простой метил-трет-бутиловый эфир.
Пример синтеза 12
(Получение 2-амино-6,8-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № Ie-4))
1
3
Смесь 300 мг 2,6,8-трихлор-4-фенилхиназолина (соединение № II-5), 30 г водного 28%-ного раствора аммиака и 6 мл ацетонитрила подвергали взаимодействию при 105°C в течение 1,5 часа в стойком к давлению реакционному сосуду. Полученный реакционный раствор охлаждали, а затем вливали в 100 мл воды. Смесь экстрагировали 60 мл этилацетата, а полученный экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (хлороформ), получая 230 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 212,7°C. H-ЯМР (CDCl): 5,56 (2H, ушир.с), 7,54-7,60 (3H, м), 7,63-7,68 (2H, м), 7,74 (1H, д, J=2,3 Гц), 7,79 (1H, д, J=2,3 Гц).
Пример синтеза 13
(Получение 6-хлор-2-фурфуриламино-4-фенилхиназолина (соединение № Ib-8))
1
3
Смесь 275 мг 2,6―дихлор-4―фенилхиназолин (соединение № II-2) и 486 мг фурфуриламина перемешивали при 85°C в течение 40 минут, и затем вливали в 50 мл воды. Смесь экстрагировали этилацетатом, полученный экстракт промывали водой, а затем концентрировали. Полученный остаток подвергали перекристаллизации из этанола, получая 280 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 142,0°C. H-ЯМР (CDCl): 4,77 (2H, д, J=5,6 Гц), 5,70 (1H, ушир.т, J=5,6 Гц), 6,29-6,32 (2H, м), 7,36 (1H, дд, J=1,8, 0,9 Гц), 7,53-7,70 (7H, м), 7,78 (1H, д, J=2,2 Гц).
Пример синтеза 14
(Получение 6-хлор-2-этоксикарбонилметиламино-4-фенилхиназолина (соединение № Ib-15))
1
3
К 550 мг 2,6―дихлор-4―фенилхиназолина (соединение № II-2) и 419 мг гидрохлорида глицинэтилового эфира добавляли 3 мл ДМФА и 607 мг триэтиламина с последующим перемешиванием при 85°C в течение 5,5 часа. Полученный реакционный раствор вливали в 100 мл воды и экстрагировали этилацетатом, после чего экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат 6:1-3:1), получая 503 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 146,1°C. H-ЯМР (CDCl): 1,30 (3H, т, J=7,2 Гц), 4,25 (2H, кв, J=7,2 Гц), 4,31 (2H, д, J=5,2 Гц), 5,97 (1H, ушир.с), 7,54-7,63 (5H, м), 7,67-7,70 (2H, м), 7,79 (1H, с).
Пример синтеза 15
(Получение 6-хлор-2-формамидо-4-фенилхиназолина (соединение № Ib-17))
1
К раствору 54 мг сухого формамида в ДМФА (5 мл) добавляли 48 мг гидрида натрия (60%) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли 275 мг 2,6-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № II-2) с последующим нагреванием до 85°C и дополнительным перемешиванием в течение 3 часов. Полученный реакционный раствор вливали в 100 мл воды и экстрагировали этилацетатом, а затем экстракт концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат:гексан 1:3), получая 64 мг указанного в заголовке соединения. Т.пл. 252,1°C. H-ЯМР: 7,59-7,66 (3H, м), 7,72-7,81 (3H, м), 7,88 (1H, д, J=8,8 Гц), 8,02 (1H, д, J=2,0 Гц), 8,37 (1H, ушир.д, J=10,4 Гц), 9,71 (1H, д, J=10,4 Гц).
Примеры соединений, которые могут быть получены таким же способом, как в примерах синтеза, описанных выше, показаны в таблице 14 и таблице 15 (включая также соединения, полученные в примерах синтеза, описанных выше). Обозначения "a)", "b)" и "c)" в таблице 14 и таблице 15 следующие.
1
3
a) H-ЯМР (CDCl): 1,66-1,75 (1H, м), 1,86-2,08 (3H, м), 3,57-3,64 (1H, м), 3,75-3,83 (2H, м), 3,89-3,59 (1H, м), 4,13-4,20 (1H, м), 5,70 (1H, ушир.с), 7,52-7,60 (5H, м), 7,64-7,69 (2H, м), 7,75-7,76 (1H, м).
1
3
b) H-ЯМР (CDCl): 1,22 (3H, т, J=7,0 Гц), 3,55 (2H, кв, J=7,0 Гц), 3,68 (2H, т, J=5,2 Гц), 3,78 (2H, кв-подобный, J=5,2 Гц), 5,75 (1H, ушир.т), 7,53-7,60 (5H, м), 7,65-7,69 (2H, м), 7,75-7,77 (1H, м).
1
3
c) H-ЯМР (CDCl): 1,22 (3H, т, J=7,0 Гц), 1,96 (2H, квинтет, J=6,3 Гц), 3,50 (2H, кв, J=7,0 Гц), 3,58 (2H, т, J=6,3 Гц), 3,67 (2H, кв-подобный, J=6,3 Гц), 5,65 (1H, ушир.т), 7,53-7,60 (5H, м), 7,65-7,69 (2H, м), 7,74-7,76 (1H, м).
<b>Таблица 14</b>
<img file="00000021.tif" he="23" wi="41" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
R<sup>11</sup>
m
X<sub>1</sub>
n
X<sub>2</sub>
Температура плавления (°C)
Ia-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
1
5-Cl
0
-
175,7
Ib-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>4</sub>OH
0
-
1
Cl
115,6
Ib-2
(CH<sub>2</sub>)<sub>5</sub>OH
0
-
1
Cl
117,2
Ib-3
(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OMe
0
-
1
Cl
89,7
Ib-4
н-Pr
0
-
1
Cl
158,3
Ib-5
(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>CHMe<sub>2</sub>
0
-
1
Cl
90,1
Ib-6
(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>OH
0
-
1
Cl
107,9
Ib-7
(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>CH(Me)CH<sub>2</sub>OH
0
-
1
Cl
112,7
Ib-8
фурфурил
0
-
1
Cl
142,0
Ib-9
CH<sub>2</sub>CH=CMe<sub>2</sub>
0
-
1
Cl
95,9
Ib-10
CH<sub>2</sub>CH=C(Me)CH<sub>2</sub>OH
0
-
1
Cl
154,8
Ib-11
Et
0
-
1
Cl
156,7
Ib-12
i-Pr
0
-
1
Cl
112,5
Ib-13
CH<sub>2</sub>CH=CH<sub>2</sub>
0
-
1
Cl
147,3
Ib-14
CH<sub>2</sub>C≡CH
0
-
1
Cl
168,4
Ib-15
CH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Et
0
-
1
Cl
146,1
Ib-16
CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CN
0
-
1
Cl
198,7
Ib-17
CHO
0
-
1
Cl
252,1
Ib-18
тетрагидрофурфурил
0
-
1
Cl
сироп, a)
Ib-19
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OMe
0
-
1
Cl
89,1
Ib-20
CH<sub>2</sub>CH(OH)CH<sub>3</sub>
0
-
1
Cl
154,2
Ib-21
(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>O(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>OH
0
-
1
Cl
117,4
Ib-22
CH<sub>2</sub>CH(OH)CH<sub>2</sub>OH
0
-
1
Cl
147,0
Ib-23
CH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
0
-
1
Cl
190,5
Ib-24
CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
0
-
1
Cl
117,1
Ib-25
CH(Me)CH<sub>2</sub>OH
0
-
1
Cl
52,8
Ib-26
CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>OEt
0
-
1
Cl
сироп, b)
Ib-27
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OEt
0
-
1
Cl
сироп, c)
<b>Таблица 15</b>
<img file="00000022.tif" he="23" wi="42" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
R<sup>11</sup>
m
X<sub>1</sub>
n
X<sub>2</sub>
Температура плавления (°C)
Ic-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
1
7-Cl
0
-
129,7
Id-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
1
8-Cl
0
-
115,5
Ie-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
1
8-Cl
1
Cl
146,2
Ie-2
CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>OH
1
8-Cl
1
Cl
168,8
Ie-3
фурфурил
1
8-Cl
1
Cl
158,6
Ie-4
H
1
8-Cl
1
Cl
212,7
Ie-5
CH<sub>2</sub>CN
1
8-Cl
1
Cl
204,7
Ie-6
CH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
1
8-Cl
1
Cl
201,4
If-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
0
-
1
Br
140,9
If-2
CH<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>Me
0
-
1
Br
183,1 (разложение)
Ig-1
H
0
-
1
CF<sub>3</sub>
160,4
Ig-2
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
0
-
1
CF<sub>3</sub>
135,1
Ih-1
(CH<sub>2</sub>)<sub>3</sub>OH
0
-
1
CN
173,3 (разложение)
Ссылочный пример синтеза 3
(Получение 2,8-дихлор-4-фенилхиназолина (соединение № II-4))
1
3
К 1,24 г 8-хлор-4-фенил-2(1H)―хиназолинону (соединение № IV-4) добавляли 6,65 г оксихлорида фосфора с последующим перемешиванием при 95°C в течение 1 часа. Полученный реакционный раствор вливали в 200 мл воды со льдом и добавляли бикарбонат натрия, доводив, таким образом, pH до 9. Затем выпавшие кристаллы собирали фильтрованием и перекристаллизовывали из этанола, получая 1,07 г указанного в заголовке соединения. Т.пл. 154,4°C. H-ЯМР (CDCl): 7,52-7,65 (4H, м), 7,76-7,80 (2H, м), 8,02-8,08 (2H, м).
Примеры соединений, которые могут быть получены таким же способом, как в Ссылочном примере синтеза 3, описанном выше, показаны в таблице 16 (включая также соединения, полученные в ссылочном примере синтеза 3).
<b>Таблица 16</b>
<img file="00000023.tif" he="25" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
m
X<sub>1</sub>
n
X<sub>2</sub>
Температура плавления (°C)
II-1
1
5-Cl
0
-
125,7
II-2
0
-
1
Cl
166,2
II-3
1
7-Cl
0
-
115,4
II-4
1
8-Cl
0
-
154,4
II-5
1
8-Cl
1
Cl
160,3
II-6
0
-
1
Br
185,1 (разложение)
II-7
0
-
1
CF<sub>3</sub>
117,5 (разложение)
II-8
0
-
1
CN
206,8 (разложение)
Ссылочный пример синтеза 4
(Получение 8-хлор-4-фенил-2(1H)-хиназолинона (соединение № IV-4))
1
6
К 7,10 г фенилмагнийбромида (32%-ный раствор в ТГФ) при комнатной температуре по каплям добавляли раствор 953 мг 2―амино-3-хлорбензонитрила в ТГФ (7 мл) с последующим нагреванием с обратным холодильником в течение 30 минут. К полученному продукту реакции при охлаждении на льду по каплям добавляли 885 мг метилхлоркарбоната с последующим нагреванием с обратным холодильником в течение 40 минут. Полученный реакционный раствор охлаждали и вливали в 40 мл 2 н. хлористоводородной кислоты, а затем добавляли 8 г бикарбоната натрия и 20 мл МТБЭ с последующим перемешиванием. Затем выпавшие кристаллы собирали фильтрованием, получая 1,30 г указанного в заголовке соединения. H-ЯМР (ДМСО-d): 7,24 (1H, т, J=8,0 Гц), 7,57-7,70 (6H, м), 7,90-7,93 (1H, м), 11,45 (1H, ушир.с).
Ссылочный пример синтеза 5
(Получение 4-фенил-6-трифторметил-2(1H)-хиназолинона (соединение № IV-7))
1
3
К раствору 762 мг 2-амино-5-трифторметилбензофенона в 10 мл хлороформа по каплям добавляли 349 мг триэтиламина, а затем при охлаждении на льду по каплям добавляли 627 мг трихлорацетилхлорида. После перемешивания при той же температуре в течение 30 минут, добавляли 50 мл воды, разделяя, таким образом, слои. Органический слой отбирали и концентрировали. Полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат 5:1), получая 1,08 г 2'-бензоил-2,2,2-трихлор-4'-трифторметилацетанилида. H-ЯМР (CDCl): 7,53-7,58 (2H, м), 7,66-7,75 (3H, м), 7,90-7,95 (2H, м), 8,81 (1H, д, J=8,6 Гц), 12,38 (1H, ушир.с).
1
3
Смесь 1,08 г 2'-бензоил-2,2,2-трихлор-4'-трифторметилацетанилида, 10 мл ДМСО и 1,18 г ацетата аммония перемешивали при 75°C в течение 1 часа. После охлаждения к смеси добавляли 100 мл. Выпавшие кристаллы собирали фильтрованием. Собранное вещество растворяли в смеси гексан:этилацетат 1:1, обезвоживали с использованием безводного сульфата магния, а затем концентрировали, получая 765 мг указанного в заголовке соединения. H-ЯМР (CDCl): 7,58-7,68 (3H, м), 7,75 (1H, д, J=8,8 Гц), 7,79-7,83 (2H, м), 7,93 (1H, дд, J=8,8, 1,7 Гц), 8,17 (1H, ушир.с), 13,37 (1H, ушир.с).
Примеры соединений, которые могут быть получены таким же способом, как в ссылочном примере синтеза 4, описанном выше, показаны в таблице 17 (включая также соединения, полученные в ссылочном примере синтеза 4, описанном выше). Обозначения "a)"-"g)" в таблице 17 следующие.
1
6
a) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,27 (1H, дд, J=7,7, 1,0 Гц), 7,38 (1H, дд, J=8,3, 1,1 Гц), 7,43-7,55 (5H, м), 7,69 (1H, т, J=8,1 Гц), 12,18 (1H, ушир.с).
b) (не выделяли и не очищали).
1
c) H-ЯМР, описанный в ссылочном примере синтеза 4
1
6
d) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,52-7,72 (6H, м), 8,10-8,12 (1H, м), 11,69 (1H, ушир.с).
1
6
e) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,35 (1H, д, J=9,2 Гц), 7,59-7,71 (6H, м), 7,91 (1H, дд, J=9,2, 2,2 Гц), 12,08 (1H, ушир.с).
1
f) H-ЯМР, описанный в ссылочном примере синтеза 5.
1
6
g) H-ЯМР (ДМСО-d): 7,48 (1H, д, J=8,4 Гц), 7,60-7,68 (3H, м), 7,71-7,74 (2H, м), 8,05 (1H, с), 8,08-8,12 (1H, м), 12,36 (1H, ушир.с).
<b>Таблица 17</b>
<img file="00000024.tif" he="22" wi="36" img-content="undefined" img-format="tif" />
Соединение №
m
X<sub>1</sub>
n
X<sub>2</sub>
Температура плавления (°C)
IV-1
1
5-Cl
0
-
a)
IV-2
0
-
1
Cl
>300
IV-3
1
7-Cl
0
-
b)
IV-4
1
8-Cl
0
-
c)
IV-5
1
8-Cl
1
Cl
d)
IV-6
0
-
1
Br
e)
IV-7
0
-
1
CF<sub>3</sub>
f)
IV-8
0
-
1
CN
g)
Пример 22
(Тест на активность стимулирования роста корней)
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Приготавливали стандартную среду Enshi, имеющую следующий состав (см. таблицу 18). В блок пробирок добавляли по 4 мкл раствора химического вещества в ДМСО до конечной концентрации 0,001-10 м.д., а затем добавляли по 600 мкл стерилизованной стандартной среды Enshi. Затем полученный раствор тщательно перемешивали. В каждую пробирку блока вносили по 10-20 семян  и выращивали при 22°C в течение 10 дней на свету. Затем измеряли длину главных корней (среднюю длину главных корней), образовавшихся из семян . Среднее значение определяли в восьми повторах, а показатель роста корней определяли согласно следующему уравнению. В результате химическое вещество, которое показало существенный показатель роста корней (например, показатель роста корней 120% или выше), можно было считать веществом, обладающим активностью стимулирования роста корней.
В качестве подробных результатов конечные концентрации, которые показали наиболее высокие показатели роста корней, показаны в таблице 19.
Показатель роста корней (%)=(средняя длина главного корня в секции, обработанной химическим веществом)/(средняя длина главного корня в контрольной секции)×100
Arabidopsis thaliana
A. thaliana
Приготавливали стандартную среду Enshi, имеющую следующий состав (таблица 18). В блок пробирок добавляли по 4 мкл раствора химического вещества в ДМСО до конечной концентрации 0,001-10 м.д., а затем добавляли по 600 мкл стерилизованной стандартной среды Enshi, после чего полученный раствор тщательно перемешивали. В каждую пробирку блока вносили по 10-20 семян . После выращивания при 22°C в течение 10 дней при ярком освещении измеряли длину главных корней (среднюю длину главных корней), взятых от семян . Определяли среднее значение в восьми повторах и скорость роста корней. В результате химическое вещество, которое показало существенный показатель роста корней (например, показатель роста корней 120% или выше), можно было считать веществом, обладающим активностью стимулирования роста корней.
Как детализированные результаты, ценность показала самый высокий темп роста корня в вышеуказанной заключительной концентрации, показывался в таблице 19.
Показатель роста корней (%)=(средняя длина главного корня в секции, обработанной химическим веществом)/(средняя длина главного корня в контрольной секции)×100
<b>Таблица 18</b>
Состав
Концентрация (мг/л)
Нитрат кальция
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
950
Нитрат калия
KNO<sub>3</sub>
810
Сульфат магния
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
500
Фосфат аммония
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
155
Хелатированное железо
Fe-ЭДТА
22,62
Борная кислота
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
2,86
Сульфат марганца
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
1,81
Сульфат цинка
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0,22
Сульфат меди
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,08
Молибдат натрия
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,025
Доводили до pH 5,8
<b>Таблица 19</b>
Соединение №
Тестируемая конечная концентрация (м.д.)
Активность стимулирования роста корней
Ia-1
2,5
150,9
Ib-1
0,625
129,5
Ib-2
0,625
134,0
Ib-3
1,25
142,5
Ib-4
1,25
136,4
Ib-5
10
120,6
Ib-6
1,25
128,2
Ib-7
1,25
128,9
Ib-8
5
155,3
Ib-9
10
121,3
Ib-10
2,5
139,5
Ib-11
1,25
122,8
Ib-12
10
120,4
Ib-13
10
122,4
Ib-15
10
140,4
Ib-17
2,5
134,0
Ib-18
5
138,5
Ib-19
5
141,9
Ib-20
10
169,0
Ib-21
0,625
125,8
Ib-22
5
134,5
Ib-23
0,625
128,6
Ib-24
2,5
137,9
Ib-25
1,25
126,5
Ib-27
2,5
121,6
Ic-1
10
163,6
Id-1
5
143,9
Ie-1
2,5
184,6
Ie-3
2,5
138,8
Ig-2
2,5
155,9
Ih-1
10
141,5
Составы сред, используемых в настоящем изобретении, описаны ниже.
(a) среда DOLU+Glu
Бакто-дрожжевая азотистая основа без аминокислот 6,7 г
Глюкоза 20 г
SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene) 1,66 г
Гистидин 0,076 г
Дистиллированная вода 1000 мл;
(b) среда DOLU+Gal
Бакто-дрожжевая азотистая основа без аминокислот 6,7 г
Глюкоза 20 г
SC-HIS-LEU-URA (Q-BIOgene) 1,66 г
Гистидин 0,076 г
Дистиллированная вода 1000 мл.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Согласно настоящему изобретению обеспечивается агент, способный регулировать рост или дифференцировку растения, а также способ поиска химического вещества, обладающего полезной биологической активностью, цель которого была четко разъяснена, то есть способ скрининга химического вещества с использованием активности в отношении специфичной мишени в качестве индикатора с целью химического регулирования целевого сайта.
Список последовательностей, свободный текст
SEQ ID NO: 3
Рассчитанный олигонуклеотидный праймер для ПЦР
SEQ ID NO: 4
Рассчитанный олигонуклеотидный праймер для ПЦР
SEQ ID NO: 5
Рассчитанный олигонуклеотидный праймер для ПЦР
SEQ ID NO: 6
Рассчитанный олигонуклеотидный праймер для ПЦР
SEQ ID NO: 7
Рассчитанный олигонуклеотидный праймер для ПЦР
SEQ ID NO: 8
Рассчитанный олигонуклеотидный праймер для ПЦР