УСТАНОВКА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Полезная модель относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к установкам для культивирования микроорганизмов.
В последнее время большое внимание привлечено к углеводородокисляющим микроорганизмам. Это связано с тем, что с помощью подобных микроорганизмов открываются возможности получения технического белка и других ценных продуктов из непищевого сырья, а также борьбы с нефтяными загрязнениями биосферы.
Лучистые грибки составляют основную массу микроорганизмов, способных усваивать углеводороды. Впервые углеводородокисляющие лучистые грибки были описаны голландским микробиологом Зенгеном.
Парафинокисляющие микобактерии характеризуются способностью легко разлагать углеводороды. Это свойство, как оказалось, присуще обширной группе микобактерии. Поэтому большая часть парафинокисляющих микобактерии была отнесена выделившими их исследователями к известным видам. Описано и два новых вида парафинокисляющих микобактерии - Mycobact. ceroformans и Mycobact. paraffinicum. Исследование клеток этих организмов с помощью электронного микроскопа показало, что они обладают интересными морфологическими особенностями, не найденными до сих пор у микобактерии других видов. Оказалось, что клетки Mycobact. ceroformans окружены гроздевидными образованиями, которые прикреплены к оболочке клетки и состоят из отдельных округлых гранул. Сама оболочка имеет неровную, бугристую поверхность, усеянную тонкими нитями. Из крупных бугров на поверхности клетки, очевидно, и происходит выделение гранулярного вещества. Причем подобные гроздевидные структуры отсутствуют, если клетки Mycobact. ceroformans выращены на среде без углеводородов.
Клетки Mycobact. paraffinicum обладают длинными нитевидными выростами, при помощи которых они соединяются между собой и образуют гроздевидные или розетковидные скопления. Эти выросты отходят, как правило, от боковых сторон палочковидных клеток. При помощи этих выростов клетки соединяются друг с другом, образуя крупные скопления, состоящие из многих десятков, а иногда и сотен клеток). В электронном микроскопе видно, что выросты от разных клеток, встречаясь, спирально закручиваются один вокруг другого, образуя узловатые стволы - утолщения. К этим утолщениям присоединяются все новые выросты от других клеток. В конце концов, образуются очень крупные корневидные структуры, толщина которых может превышать диаметр вегетативных клеток
Роль этих структур в жизни клеток еще не до конца выяснена. Возможно, при их помощи происходит обмен продуктами метаболизма отдельных клеток или осуществляется максимальный контакт с субстратом. Последнее обстоятельство для парафинокисляющей культуры чрезвычайно важно, поскольку углеводороды нерастворимы в воде. Несмотря на это, углеводородокисляющие микобактерии прекрасно развиваются в водной среде с парафином.
Оказалось, что клетки микобактерии прочно прикрепляются к каплям парафина, окружая их плотным слоем, и в этом процессе, по-видимому, определенную роль играют поверхностные клеточные структуры. Постепенно парафин из капли «выбирается», а слой клеток нарастает.
Среда с углеводородом является для микобактерии оптимальной. Химическое строение углеводородов очень разнообразно, и отношение углеводородокисляющих микобактерии к этим соединениям неодинаково.
Механизм разложения углеводородов. Окисление углеводородов микобактериями представляет собой ряд ферментативных реакций, следующих одна за другой, конечным продуктом которых является жирная кислота - наиболее окисленное соединение:
CH3-(CH2)n-CH2-CH3->
->CH3-(CH2)n-CH2-CH2OH->
->CH3-(CH2)n-CH2-CHO->
->CH3-(CH2)n-CH2-COOH
углеводород->спирт->альдегид->кислота
Самым важным в этой цепи является первый этап - введение кислорода в молекулу углеводорода.
Первичное окисление парафинов микобактериями может идти двумя путями:
в окисляемую молекулу вводятся два атома кислорода, образуется гидроперекись, которая затем превращается в спирт:
CH3-(CH2)n-CH3+O2->
->CH3-(CH2)n-CH2-O-OH+H2->
->CH3-(CH2)n-CH2OH+H2O
в окисляемую молекулу вводится один атом кислорода, спирт образуется сразу:
CH3-(CH2)n-CH3+O2+H2->
->CH3-(CH2)n-CH2OH+H2O
Интенсивность окисления углеводорода зависит от того, насколько насыщена среда кислородом, т.е. от аэрации. Спирты и альдегиды являются промежуточными продуктами окисления углеводородов, в клетках они не накапливаются.
16
34
16
32
2
14
28
2
12
24
2
10
20
2
Конечный продукт окисления - кислоты. С помощью метода газожидкостной хроматографии было выявлено, что при окислении высокомолекулярных парафинов в клетках микобактерии обычно накапливаются жирные кислоты с таким же числом углеродных атомов, какое имел исходный углеводород. В меньшем количестве присутствуют кислоты, углеродные цепи которых укорочены на два углеродных фрагмента. Так, в клетках Mycobact. paraffinicum, окисляющей углеводород гексадекан CH, содержатся следующие жирные кислоты: пальмитиновая CHO (74%), маргариновая CHO (18%), лауриновая CHO (6%) и каприновая CHO (2%).
Жирные кислоты в свободном состоянии содержатся в клетках в небольшом количестве. Часть их используется микобактериями на синтез клеточных жиров и жироподобных веществ - липидов. Другая часть жирных кислот расщепляется на низкомолекулярные вещества, использующиеся клеткой для построения белков, углеводов и других необходимых соединений.
Липиды парафинокисляющих микобактерии, как, впрочем, и других микроорганизмов, представляют собой производные жирных кислот - триглицериды, воск и ряд специфических соединений. Все это - вещества сложно-эфирной природы. Так, триглицериды, выделенные из клеток Mycobact. paraffinicum, окисляющей гексадекан, представляют собой эфиры глицерина и трех жирных кислот - пальмитиновой, маргариновой и лауриновой. Причем преобладает в этой смеси соединение, называемое трипальмитином. Трипальмитин входит в состав многих природных жиров, в частности сливочного масла, воска - это тоже сложные эфиры, образованные высшими жирными кислотами и высшими спиртами(Н.А.Красильников, Т.В.Коронелли. Парафинокисляющие микобактерии ).
Микроорганизмы, поглощая углеводороды, содержащиеся в нефти, накапливают значительное количество клеточной массы. Более половины этой массы составляет белок. Таким образом, выращивая парафинокисляющие микроорганизмы на нефтяных фракциях, можно получать белок из непищевого сырья.
Наиболее перспективным является микробиологическое разрушение углеводородов нефти, приводящее к превращению их в нетоксичные кислородсодержащие вещества. Так, например, используя культуры активных парафинокисляющих микобактерии, можно во многих случаях предотвратить загрязнение биосферы нефтепродуктами. Такие культуры, как Mycobact. paraffinicum и Mycobact. lacticolum var. aliphaticum, прекрасно разлагают многие образцы нефти.
Учитывая имеющиеся данные о биосинтезе парафинокисляющими микроорганизмами витаминов, аминокислот, каротиноидов и других полезных метаболитов, можно предположить, что клеточная масса культур, разлагающих нефтяные отходы, может быть использована и в качестве удобрения
Таким образом, актуальной задачей является создание устройства для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов для исследований или промышленного применения для получения технического белка и других ценных продуктов из непищевого сырья, а также борьбы с нефтяными загрязнениями биосферы.
Известны аппараты и установки для получения биомассы микроорганизмов, содержащие корпус, аэратор, нагревательные элементы.
Известна установка для выращивания микроорганизмов (патент на полезную модель 5183) [1], включающая емкость с крышкой для их выращивания, снабженную мешалкой, средства для введения инокулята и отвода готового продукта и средство поддержания заданной температуры в емкости, она снабжена устройством для подачи газа в емкость и устройством стерильного розлива готового продукта, при этом средство поддержания заданной температуры в емкости содержит расположенную на последней пароводяную рубашку, размещенные в ней электронагреватели и гидросистему для подвода и отвода воды в рубашку, а средство ввода инокулята состоит из герметично установленного на крышке емкости патрубка, снабженного в верхней части, расположенной вне емкости, втулкой с резиновой пробкой и съемной крышкой с уплотнением, размещенной на втулке.
Известная установка не предназначен для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов.
Известен аппарат для выращивания микроорганизмов (патент №2352626) [2] для производства биомассы аэробных микроорганизмов (МО) для кормовых и других целей. Аппарат содержит емкость, заполняемую культуральной жидкостью до определенного уровня и снабженную патрубками для подвода жидкой минеральной питательной среды, воздуха и отвода накопленной биомассы, а также, как минимум, одну дополнительную емкость, являющуюся абсорбером газообразного субстрата. Эти емкости имеют обечайки с отбортовкой, установленные по оси емкости, служащие для разделения наполняемой жидкостью части емкости на подъемный и опускной каналы. Барботеры для подвода воздуха расположены в подъемных каналах емкостей. Емкости соединены в нижней части жидкостепроводом таким образом, что опускной канал основной емкости соединен с подъемным каналом дополнительной емкости, а опускной канал дополнительной емкости - с подъемным каналом основной емкости, а в жидкостепроводе между емкостями установлен побудитель циркуляции жидкости.
Однако, известный аппарат предназначен для использовании в качестве органического сырья газообразного субстрата, например природного или сжиженного газа, а не жидкого углеводорода. Он не имеет автоматического управления процессом работы аппарата.
Известны аппараты, содержащие электронные средства управления процессом получения биомассы микроорганизмов. Известна ферментационная установка для культивирования микроорганизмов (патент на полезную модель №86184)[3]. Установка содержит культуральный сосуд с термостатирующей рубашкой и крышкой, который оснащен технологическими патрубками. На крышке реактора расположен магнитный привод перемешивающего устройства с турбинной мешалкой. Привод оснащен разделительной мембраной. Барботер и сифонная трубка во внутренней полости реактора подключены к крану. Кран в открытом положении сообщает барботер и сифонную трубку с полостью реактора. Ферментационная установка оснащена совокупностью функциональных систем. Весь процесс работы установки контролируется и регулируется пультом контроля и управления. Однако известная установка относится к оборудованию для глубинного культивирования микроорганизмов при изготовлении вакцин и других биологических препаратов и не предназначена для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов, а потому имеет избыточность конструкции, а именно: перемешивающее устройство, цилиндрическая магнитная муфта, снабженную разделительной мембраной, крыльчатка пеногашения и турбинная мешалку.
По совокупности признаков установка для выращивания микроорганизмов [1] принята в качестве наиболее близкого аналога.
Техническим результатом заявляемой полезной модели является расширение арсенала технических средств для получения биомассы микроорганизмов, а именно, создание установки для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов.
Заявляемая установка для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов, включающая емкость с крышкой для их выращивания, средства для введения культуральной жидкости и отвода готового продукта и средство поддержания заданной температуры в емкости, содержащее расположенную на последней пароводяную рубашку, размещенные в ней электронагреватели и гидросистему для подвода и отвода воды в рубашку, согласно полезной модели дополнительно содержит фильтр, установленный в крышке, блок электронного управления работой устройства, аэратор, соединенный с воздушным компрессором, датчики измерения температуры, и таймер, причем воздушный компрессор, нагревательные элементы и датчики температуры соединены с блоком управления.
При этом в заявляемой установке корпус емкости выполнен в виде цилиндра с двойными стенками.
При этом в заявляемой установке аэратор размещен внутри емкости на всей площади нижней ее части.
Из уровня техники не выявлена установка для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов в совокупности существенных признаков заявляемой полезной модели, поэтому заявляемая полезная соответствует критерию «новизна».
Заявляемая полезная модель поясняется следующей схемой устройства, приведенной на фиг.1.
Установка для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов (фиг.1) содержит вентиляционный фильтр 1, крышку 2, емкость 3, трубку ввода культуральной жидкости 4, теплоноситель жидкостный 5 (пароводяная рубашка), аэратор 6 распылитель воздуха, трубу 7 подачи воздуха от компрессора 8 к аэратору 6, воздушный компрессор 8, датчики 11 измерения температуры, электронный блок 12 управления (временем, температурой, подачей воздуха), трубку 13 слива жидкости, нагревательные элементы 14.
Корпус емкости 3 заявляемой установки выполнен в виде цилиндра с двойными стенками. Пространство между стенками корпуса заполнено жидкостным теплоносителем (водой). Установка содержит средство поддержания заданной температуры в емкости. Оно состоит из пароводяной рубашки, электронагревателей и гидросистемы для подвода и отвода воды в рубашку (не показана). В межстенном пространстве корпуса установлены нагревательные элементы 14 и датчики температуры 11, электрически соединенные с блоком управления 12. Емкость 3 закрыта крышкой 2, снабженной фильтрующим элементом 1. На корпусе емкости 3 установлены патрубки подачи 4 и слива 13 жидкости. Внутри емкости 3, на всей площади нижней ее части, размещен аэратор 6. Аэратор соединен трубопроводом 7 с воздушным компрессором 8, управляемым электронным блоком 12 управления.
Работа установки.
Процесс получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов происходит в три этапа.
1. Начальный. Характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой.
2. Логарифмический. Характеризуется постоянным увеличением скорости деления клеток и значительным увеличением количества клеток в питательной среде. Движение и турбулентная диффузия кислорода, большое количество питательной среды и благоприятного температурного режима способствуют быстрому размножению.
3. Стационарный. Число клеток перестает делиться из-за наступления равновесия между числом вновь образованных и числом погибших клеток, создается динамическое равновесие.
Весь процесс работы установки происходит под контролем и управлением электронного блока 12 управления, который управляет параметрами процесса: временем, температурой, подачей воздуха.
12
Емкость корпуса установки через трубку 4 заполняют расчетным количеством органической жидкости - питательной среды, оптимальной для микобактерии (жидкий углеводород, например, нефть) и бактериальную популяцию микобактерии вида парафинокисляющих микобактерии - Mycobact. ceroformans или Mycobact. paraffinicum. Включают электронный блок 12 управления, который начинает отсчет времени процесса, который составляет 48-50 часов, измеряет температуру и электрическими нагревательными элементами 14 медленно нагревает всю субстанцию до заданной температуры. Оптимальным является температурный режим в диапазоне (+30)÷(+45)°C. При достижении заданной температуры, например, 38°C, по сигналу от блока 12 управления включается компрессор 8, который подает по трубопроводу 7 воздух в аэратор. Аэратор распыляет воздух на мелкие пузырьки. Этим достигаются две цели, во-первых- субстанция постоянно перемешивается и циркулирует, вторая - от степени насыщения среды кислородом зависит интенсивность окисления углеводорода, поступающий кислород ускоряет процесс роста и размножения микобактерии. Субстанция постоянно подогревается, чтобы поступающий воздух не охладил ее. Основной рост и размножение микобактерии происходит в течение 38÷40 часов, остальное время процесса требуется на подогрев субстанции и начальный этап. В результате испарения жидкости на фильтре 1 собирается конденсат. Остывая, углеводородный конденсат снова возвращается в субстрат. По истечении заданного времени (например, 50 часов), таймер блока 12 управления подает звуковой и/или световой сигнал, отключит воздушный компрессор 8 и нагревательные устройства 14. Полученный субстрат имеет показатель: рабочий титр препарата в 1 г (2-4)×10 КОЕ/грамм.
Полученный субстрат по трубке 13 сливают и смешивают с керосином (например, марки КО-25) в соотношении 1 л субстрата: 100 л керосина. Керосин является наиболее предпочтительным растворимым носителем субстрата, т.к. в нем содержится малое количество питательных углеводородов (парафинов, АПСО и др.). С керосином у полученного субстрата возникают прочные молекулярные связи, в результате чего полученный продукт обладает стабильностью, пригодностью к многократному использованию, транспортировке и хранению.
Таким образом, предлагаемая установка обеспечивает проведение работ с микроорганизмами вида парафинокисляющих микобактерии - Mycobact. ceroformans или Mycobact. paraffinicum. Наличие блока управления обеспечивает удобство обслуживания установки, соблюдение режима ее работы и максимальный выход готового продукта - биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов. Наличие фильтров, собирающих конденсат, также позволяет повысить вход готового продукта.
Заявляемая полезная установка для получения биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов может быть использована как для исследований, так и для промышленного применения для получения ценных продуктов из углеводородного сырья, а также борьбы с нефтяными загрязнениями биосферы.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ.
1. Патент на полезную модель №5183 Установка для выращивания микроорганизмов преимущественно бифидо- и лактобактерий. Опубликовано: 16.10.1997 наиболее близкий аналог.
2. Патент №2352626 Аппарат для выращивания микроорганизмов. Опубликовано: 20.04.2009.
3. Патент на полезную модель №86184 Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов. Опубликовано: 27.08.2009