Сульфатированные полисахариды бурых водорослей: структурные изменения дендритных клеток

что свидетельствует о стимулирующем влиянии на функциональную активность клеток врожденного и адаптивного иммунитета и являются перспективными веществами для создания лекарственных препаратов нового поколения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кузнецова Т.А. и др. Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей и перспективы их применения в медицине // Антибиотики и химиотерапия. 2004; 49(5): 24-30.

2. Незговоров Д.В. и др. Иммунокорригирующая терапия фукоиданом при вторичных иммунодефи-цитах //Мед. иммунология. 2005. 7(2-3): 150.

3. Кузнецова Т.А. и др. Иммуностимулирующая и антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens // Антибиотики и химиотерапия. 2003; 48(4): 11-13.

4. Palkama T. Induction of interleukin-1 production by ligands binding to the scavenger receptor in human monocytes and Th1 cell line. Immunology. 1991. 74(3): 432-438.

5. Shibata Н., et. al. Properties of fucoidan from Cla-dosifon okamuranus Tokida in gastric mucosal protection. Bio. Factors. 2000; 11: 235-245.

6. Mytar B., et al. Induction of intracellular cyto-kine production in human monocytes/macrophages stimulated with ligands of pattern recognition receptors. Inflamm. Res. 2004; 53(3): 100-106. doi: 10.1007/ s00011-003-1233-1.

7. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural similarities of fucoidans from brown algae Silvetia babingtonii and Fucus evanescens, determined by tandem MALDI-TOF mass spectrometry. Carbohydrate Research. 2012; 358: 78-81. doi: 10.1016/j.carres.2012.06.015.

8. Imbs T.I., Skriptsova A.V., Zvyagintseva T.N. Antioxidant activity of fucoidan-containing sulfated polysac-charides obtained from Fucus evanescens by different extraction methods. Journal of AppliedPhycology. 2015; 27(1): 545-553. doi: 10.1007/s10811-014-0293-7.

9. Сильченко А.С. Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.: Автореф. дис. ... канд. хим. наук: - Владивосток. 2014; 24 с.

Сведения об авторах

Иванушко Людмила Александровна - к.м.н., с.н.с. лаборатории иммунологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова; e-mail: l.iva_57@mail.ru;

Имбс Татьяна Игоревна - к.х.н, с.н.с. лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, e-mail: tatyanaimbs@mail.ru.

© Коллектив авторов, 2017 г. doi: 10.5281/zenodo.817823

Удк 577.114:582.272

И.Д. Макаренкова1, Н.К. Ахматова2, Т.П. Ермакова3, М.Ю. Хотимченко4,

H.Н. Беседнова1, И.Б. Семенова2, М.А. Макаренков5, Т.Н. Звягинцева3

сульфатированные полисахариды бурых водорослей: структурные изменения дендритных клеток

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток

2 НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва

3 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

4 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

5 Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток

Изучено влияние различных по химической структуре сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей Laminaria cichorioides и Laminaria japonica на морфофункциональную характеристику дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей линии CBA. Установлено, что сульфатированные полисахариды способствуют структурным и функциональным изменениям дендритных клеток.

Ключевые слова: дендритные клетки, сульфатированные полисахариды, морфология.

I.D. Makarenkova1, N.K. Akhmatova2, S.P. Ermakova3, M.Y. Khotimchenko4, N.N. Besednova1, I.B. Semenova2, M.A. Makarenkov5, T.N. Zvyagintseva3 SULFATED PoLYSACCHARIDES oF BRoWN ALGAE: structural and functional changes of DENDRITIC CELLS

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •

1 Somov Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia

2 Mechnikov Scientific Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow; Russia

3 Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RUS Vladivostok; Russia

4 Far Eastern Federal University, Vladivostok; Russia

5 Pacific State Medical University, Vladivostok; Russia

The effect of different chemical structure of sulfated polysaccharides from the brown alga Laminaria cichorioides and Laminaria japónica on the morphofunctional characteristics of dendritic cells generated from the bone marrow of CBA mice was studied. It has been determined that sulfated polysaccharides promote to structural and functional changes in dendritic cells.

Keywords: dendritic cells, sulfated polysaccharides, brown algae, morphology.

Введение. Изучение механизмов действия природных иммунобиологических препаратов - потенциальных адъювантов и модификаторов эффектор-ных функций врожденного иммунитета являются крайне актуальными, поскольку создают научную основу для разработки лекарств нового поколения, направленных на защиту организма [1, 2, 3].

Одной из основных мишеней для разработки новых адъювантов являются Toll-like рецепторы (TLRs), активация которых в результате распознавания и связывания с лигандами играет ключевую роль в созревании и активации дендритных клеток (ДК), развитии эффекторных механизмов врожденного и адаптивного иммунного ответа. Распознавание и связывание TLRs с лигандами индуцирует секрецию цитокинов, хемокинов, экспрессию костимулирую-щих и MHC молекул I и II классов, необходимых для защиты клеток организма от проникновения чужеродных микроорганизмов и формирования адаптивного иммунного ответа [5, 6].

Обладающие уникальной химической структурой, низкой токсичностью и широким спектром фармакологического действия на различные системы организма сульфатированные полисахариды из морских бурых водорослей являются потенциальными адьювантами для усиления иммунных реакций [2, 3, 7, 8, 9]. В связи с чем, изучение механизма действия полисахаридов на ключевые эффекторы врожденного иммунитета, а в частности на ДК, позволит расширить рациональный спектр их дальнейшего применения.

Цель работы - изучить влияние сульфатирован-ных полисахаридов из бурых водорослей Laminaria cichorioides и Laminaria japónica на структурные и функциональные изменения дендритных клеток.

Методы исследования. Выделение и изучение химической структуры сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей проведены в ТИБОХ ДВО РАН с применением современных методов исследования [7].

1. (1^-3)-а^-фукан из L. cichorioides, сульфати-рован по положениям С2 и С4 остатков фукозы (интервал М.м. 40-80 кДа), соотношение Fuc:SO42- составляет 1:1,7 моль/моль.

2. a-L-фукан из L. japónica отличается высоким содержанием галактозы, сульфатирован в основном по положению С4 и в меньшей степени по С2 остатков фукозы (интервал М.м. 10-30 кДа), содержит Fuc:Gal:Man:Xyl:Glc (65:20:8:4:3) и Fuc:SO42-(1:0,9 моль/моль).

Дендритные клетки генерировали из костного мозга мышей линии СВА [10]. В качестве индукторов созревания ДК, в культуральные флаконы вносили полисахариды из L. cichórióides и L. japónica (100 мкг/мл). Контролем служили незрелые ДК, культивируемые в присутствии только GM-CSF (20 нг/мл) и IL-4 (80 нг/ мл). Положительным контролем являлись ДК, культивируемые только с классическим индуктором созревания - TNFa (20 нг/мл, «BioSource International, Inc.», Бельгия). Фенотип ДК определяли на проточном цито-метре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США) с использованием моноклональных антител CD34, CD11c, CD38, CD83, CD86, MHC I, MHC II, TLR2, TLR4 и TLR9 («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов, согласно инструкции производителя.

Фазово-контрастная микроскопия культуральной взвеси проведена с использованием компьютерной системы и фотосистемы Axiocam HS AxioVision 4 («Carl Zeiss», Германия). Окраску актинового цито-скелета производили с использованием фаллоиди-на с флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 594 phalloidin, Invitrogen) в разведении 1:150. Молекулу ДНК клеток окрашивали водным раствором красителя Hoechst 33342 (Sigma), разведенном до концентрации 1цг/мл. Фотографии клеток на стеклах делали при помощи микроскопа Nikon Eclipse Ti-U, оснащенного камерой Infinity 3, и флуоресцентными фильтрами UV-1A (для препаратов, окрашенных красителем Hoechst 33342 «Sigma»), B-2A (для наблюдения флуоресценции в зеленом диапазоне) и G-2A (для наблюдения флуоресценции в красном диапазоне). Статистическая обработка данных проведена с использованием программного пакета «Statistika 7».

Результаты и обсуждение. Анализ фенотипа ДК показал, что как полностью сульфатированный полисахарид из L. cichórióides, так и частично аце-тилированный полисахарид из L. japónica способствуют снижению экспрессии маркера незрелых ДК

HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 63

(CD34) и увеличению маркера терминальной диф-ференцировки клеток (CD83), активационного маркера (CD38), экспрессии костимулирующих (CD86), адгезивных (CD11^ и антигенпредставляющих молекул (MHC II), что согласуется с данными литературы [4, 11]. Созревшие ДК характеризовались следующим фенотипом: CD34-/+, CD38+, CD11c+. CD86+, CD83+, MHC I-/+, MHC II+.

Известно, что направление дифференцировки Т-клеток зависит от типа паттерн-распознающих рецепторов, и прежде всего TLRs, активация которых индуцирует экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферониндуцибельных генов, вызывает созревание ДК, способствует активации клеток-эффекторов врожденного иммунитета и последующей индукции адаптивного иммунного ответа [5, 6].

Ранее нами было установлено, что сульфати-рованные полисахариды из Fucus evanescens, L. cichorioides и L. japonica при специфическом взаимодействии с TLR-2, TLR-4 и гетеродимером TLR-2/TLR-6 на эукариотических клеточных лини-

Результаты цитологического исследования показали, что структурные изменения клеток начинают появляться после повторного внесения ростовых факторов GM-CSF и ^-4. Так, на 6 сутки округлой формы с вакуализироанной цитоплазмой незрелые ДК характеризовались способностью к выраженной пролиферации. Для созревания клеток, в опытные флаконы были внесены полисахариды из L. сichorioides и L. japonica, а в качестве положительного контроля был добавлен классический индуктор - ТОТа. Установлено, что на 9 сутки культивирования, популяция приобрела выраженные морфологические изменения, которые характеризовались появлением крупных клеток неправильной округлой формы с обширной вакуализироанной цитоплазмой и эксцентрично расположенным базофильным ядром (рис. А), а также характерным наличием многочисленных тонких цитоплазматических псевдоподий разнообразной формы (рис. В), что свидетельствует о созревании ДК.

Заключение и выводы. Высокоспециализированные антигенпрезентирующие дендритные клетки

ях эмбрионального почечного эпителия человека НЕК293^ содержащих репортерный ген фермента Р-галактозидазы под контролем транскрипционного ядерного фактора NF-kB и соответствующий TLR, вызывают активацию NF-kB, что способствует экспрессии провоспалительных цитокинов через MyD88 сигнальный путь и 1КК-индуцибельных генов через адаптерную пару TRIF/TRAM, активации иммунокомпетентных клеток и формированию развития адаптивного иммунного ответа [9].

Результаты исследования экспрессии TLR на дендритных клетках показали, что сульфатирован-ные полисахариды из L. сichorioides и L. japonica способствуют увеличению экспрессии TLR-2 и TLR-4 на ДК, но не оказывают влияния на экспрессию TLR-9 (табл.). Увеличение экспрессии TLR под действием полисахаридов свидетельствует, что созревшие ДК способны оказывать влияние на стимуляцию эффекторных механизмов врожденного иммунитета, направленных на формирование про-тивоинфекционной защиты организма.

а

AkML Л 1

Рис. Микрофотографии дендритных клеток, генерированных из

костного мозга мышей. Окраска по Романовскому-Гимза. А - незрелые ДК на 6 сутки культивирования без индукторов созревания

играют центральную роль в инициации иммунного ответа и регуляции иммунных процессов в организме. Результаты исследований демонстрируют, что полностью сульфатированный полисахарид из L. dchorioides и частично ацетилированный полисахарид из L. japonica за счет универсальных угле-водспецифических взаимодействий с мембранными рецепторами, вызывают морфологические и фено-

Таблица

Влияние сульфатированных полисахаридов на экспрессию TLR на дендритных клетках

Уровень экспрессии молекул, %, (n=30) Незрелые ДК TNFа L. cichorioides L. japonica

Me

TLR2 15,0 (14,2-15,2) 30,5 (27,8-31,2) p=0,000 26,0 (25,0-28,5) p=0,000 24,50 (20,7-33,2) p=0,044

TLR4 1,5 (1,3-1,6) 5,4 (5,1-6,0) p=0,000 8,1 (8,0-8,3) p=0,000 7,30 (5,6-8,7) p=0,003

TLR9 3,6 (3,2-3,8) 3,5 (3,1-3,8) p=0,816 2,0 (2,0-2,3) p=0,002 2,50 (2,3-3,2) p=0,056

Примечание: Ме - медиана значений, LQ-UQ - нижний и верхний квартили; р - достоверность полученных значений по сравнению с контролем - незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента).

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

типические изменения, связанные с процессом созревания и активации дендритных клеток.

Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей, являются активаторами врожденного иммунитета, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных адъювантов и лекарственных средств нового поколения для создания противоинфекционной защиты организма.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа поддержана научным проектом (0545-2014-0011) ФАНО.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет противоопухолевый и противоинфекци-онный. 2008. - М.: Практическая медицина. - 255 с.

2. Беседнова Н.Н. Морские гидробионты - потенциальные источники лекарств // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 4-10.

3. Fitton J.H., Stringer D.N., Karpiniec S.S. Therapies from fucoidan: an update.Mar. Drugs. 2015; 13(9): 5920-5946. doi: 10.3390/md13095920.

4. Kim S-Y., Joo H-G. Evaluation of adjuvant effects of fucoidan for improving vaccine efficacy. J. Vet. Sci. 2015; 16(2): 145-150. doi: 10.4142/jvs.2015.16.2.145.

5. Jun-O Jin, Wei Zhang, Jiang-Yuan Du et al. Fu-coidan can function as an adjuvant in vivo to enhance dendritic cell maturation and function and promote antigen-specific T-cell immune responses. PLoS One. 2014; 9(6): e99396. doi: 10.1371/journal.pone.0099396.

6. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н. и соавт. Toll-подобные рецепторы и их адаптор-ные молекулы // Биохимия. 2010; 75(9): 1224-1243.

7. Hochrein H., O'Keeffe M. Dendritic cell subsets and toll-like receptors. Handb. Exp. Pharmacol. 2008; 183: 153-179. doi: 10.1007/978-3-540-72167-3_8.

8. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions. J. Exp. marine Biol. Ecol. 2003; 294(1): 1-13.

9. Lebedynskaya E.A., Makarenkova I.D., Lebedyn-skaya O.V., et al. The effect of sulfated polysaccharides from brown seaweed Laminaria japonica on the morphology of lymfoid organs and functional characteristics of immunocompetent cells. Biochem. Moscow Sup-pl. Ser. B: Biomed Chemistry. 2015; 9(1): 86-94. doi: 10.1134/S1990750815010060.

10. Makarenkova I.D., Logunov D.Yu., Tukhvatulin A.I., et al. Sulfated polysaccharides of brown seaweeds are ligands of toll-like receptors. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B: Biomedical Chemistry. 2012; 6(1): 75-80. doi: 10.1134/S1990750812010118.

11. Lutz M.B., Kukutsch N., Ogilvie A.L., et al. .An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 1999; 223(1): 77-92.

12. Meng J., Cao Y., Meng Y., Luo H., Gao X., Shan F. Maturation of mouse bone marrow dendritic cells (BMDCs) induced by Laminaria japonica polysaccharides (LJP). Int. J. Biol. Macromol. 2014; 69: 388-392. doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.05.018.

Сведения об авторах

Макаренкова Илона Дамировна - д.м.н., ведущий научный сотрудник НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова. 690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (423)2442-446; e-mail: ilona_m@mail.ru; Ахматова Н.К. - научный сотрудник НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва; Ермакова Т.П. - научный сотрудник Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток;

Беседнова Н.Н. - академик РАН, д.м.н., профессор НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; Хотимченко М.Ю. - д.м.н., заведующий лабораторией фармакологии и биоиспытаний Школы биомедицины ДВФУ;

Семенова И.Б. - научный сотрудник НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва; Макаренков М.А. - преподаватель Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток; Звягинцева Т.Н. - научный сотрудник Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток.

© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817827

Удк 611.42:612.42

А.В. Полевщиков1'2, Е.Л. Прозоровская1, И.В. Кудрявцев12, М.К. Серебрякова1

формирование иммунного ответа на тимус-зависимые и тимус-независимые антигены: роль тИМУСА

1 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

2 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 65