СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ РАССТРОЙСТВ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА
AGENT FOR CORRECTING AUTISM SPECTRUM DISORDERS

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается применения 5-этокси 2-[2-(морфолино)этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида (Афобазола) и фармацевтической композиции на его основе в качестве средства коррекции расстройств аутистического спектра.
Термин расстройства аутистического спектра (РАС, англ.: ASD - autism spectrum disorders) относится к группе состояний, связанных с развитием нервной системы и характеризующихся нарушениями в трех сферах: социальном взаимодействии, коммуникации (использовании вербального и невербального языка), а также ограниченными и повторяющимися моделями в поведении, интересах и деятельности. Растущая с каждым годом распознаваемость этой группы расстройств, эмоциональное влияние, оказываемое ими на семьи, и связанное с их лечением и социальной помощью бремя финансовых затрат делают РАС важным заболеванием с точки зрения науки, общественного здравоохранения и защиты прав человека [IACAPAP Textbook of Child and Adolescent Mental Health. Autism spectrum disorder, 2015. Гл. C. 2: 1-38; Wallace S, Fein D, Rosanoff M, Dawson G, Hossain S, Brennan L. et al. A global public health strategy for autism spectrum disorders // Autism Res., 2012. Vol. 5(3): 211-217]. Сегодня распространение аутизма сравнивают по масштабу с эпидемией, охватившей весь мир, а количество больных детей уже достигает одного на 200 и более [Wallace S, Fein D, Rosanoff M, Dawson G, Hossain S, Brennan L. et al. A global public health strategy for autism spectrum disorders // Autism Res., 2012. Vol. 5(3): 211-217]. По данным Всемирной организации аутизма, в 2008 году 1 случай аутизма приходился на 150 детей; за 10 лет количество детей с аутизмом выросло в 10 раз. Риск развития аутизма опосредован генетическими и средовыми факторами и их сочетанием [IACAPAP Textbook of Child and Adolescent Mental Health. Autism spectrum disorder, 2015. Гл. C. 2: 1-38].
Расстройство аутистического спектра - это расстройство развития, характеризующееся стойким дефицитом способности поддерживать и инициировать социальное взаимодействие и социальные связи, а также стереотипными формами поведения, ограниченностью интересов, повышенной тревожностью. Эти качественные нарушения являются общими чертами индивидуального развития и проявляются во всех ситуациях, хотя могут варьировать по степени выраженности. Независимо от наличия или отсутствия умственной отсталости, эпилептических приступов, врожденной краснухи, туберозного склероза, церебрального липидоза, фрагильной X-хромосомы, которые нередко сопровождают аутизм, расстройство определяется только по наличию особенностей поведения, не соответствующих умственному развитию.
На сегодняшний день отсутствуют средства патогенетической терапии РАС [Психиатрия детского и подросткового возраста / под ред. Гиллберга К., Хеллгрена Л., рус. изд. под общ. ред. акад. РАМН Сидорова П.И. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 544 с.]. Выбор препарата проводится с учетом особенностей психопатологической структуры расстройства, наличия или отсутствия со11утствующих психических, неврологических и соматических нарушений [Симашкова Н.В. Эффективная фармакотерапия и реабилитация больных с расстройствами аутистического спектра. «Неврология и психиатрия», 2011. №3: 14-22]. Антипсихотики назначаются для коррекции таких симптомов, как раздражительность и стереотипное поведение, на фоне терапии некоторыми из них (галоперидол, трифлуоперазин) наблюдается увеличение социальных контактов [Doyle СА, McDougle CJ. Pharmacologic treatments for the behavioral symptoms associated with autism spectrum disorders across the lifespan. Dialogues Clin Neurosci. 2012. 14: 263-279]. При этом типичные нейролептики эффективнее атипичных, однако на их фоне наблюдаются многочисленные побочные эффекты: острые дистонические реакции, акатизия, седация и др. [Faretra G, Dooher L, Dowling J. Comparison of haloperidol and fluphenazine in disturbed children. Am J Psychiatry. 1970. 126:1670-1673]. Антидепрессанты группы ингибиторов обратного захвата серотонина у пациентов с РАС применяются для терапии навязчивого стереотипного поведения, их назначение может сопровождаться такими побочными эффектами, как нарушения цикла «сон-бодрствование», сухость во рту, констипация, дистония, депрессия, слабость и нарушения поведения [Doyle СА, McDougle CJ. Pharmacologic treatments for the behavioral symptoms associated with autism spectrum disorders across the lifespan. Dialogues Clin Neurosci. 2012. 14:263-279]. В 40-59% случаев у детей с РАС диагностируются критерии синдрома дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) [Gadow KD, Sverd J. Attention deficit hyperactivity disorder, chronic ticdisorder, and methylphenidate. Adv Neurol 2006. 99:197-207; Goldstein S, Schwebach AJ. The comorbidity of pervasive developmental disorder and attention deficit hyperactivity disorder: results of a retrospective chart review. J Autism Dev Disord. 2004. 34:329-339]. При назначении таким пациентам лекарственных средств, используемых для терапии СДВГ, эффективность лечения ниже, чем у детей с СДВГ, при увеличении частоты развития побочных эффектов [Doyle СА, McDougle CJ. Pharmacologic treatments for the behavioral symptoms associated with autism spectrum disorders across the lifespan. Dialogues Clin Neurosci. 2012. 14:263-279]. В РФ в комплексной терапии РАС разрешены к использованию и некоторые противосудорожные препараты, а также лекарственные средства с ноотропным действием. В частности, антиковульсант вальпроат натрия применяют для купирования двигательных и поведенческих стереотипий [Симашкова Н.В. Эффективная фармакотерапия и реабилитация больных с расстройствами аутистического спектра. «Неврология и психиатрия», 2011. №3:14-22]. Данные об использование противосудорожных препаратов для терапии РАС за рубежом отсутствуют, а из средств с ноотропной активностью назначается мемантин с целью улучшения социальной адаптации и коррекции нарушений внимания у детей [Erickson СА, Posey DJ, Stigler KA, Mullett J, Katschke AR, McDougle CJ. A retrospective study of memantine in children and adolescents with pervasive developmental disorders. Psychopharmacology (Berl). 2007. 191:141-147].
Транквилизаторы (анксиолитики) не нашли широкого применения у больных РАС.Классические анксиолитики могут давать парадоксальные реакции у детей с аутизмом. Так, диазепам в дозе 10 мг/сут вызвал драматическое усиление тревоги, агрессивности и взрывчатости, которые прошли сразу после отмены препарата [Бородина Л.Г. Лекарственная терапия расстройств аутистического спектра у детей: опыт зарубежных психофармакологов // Аутизм и нарушения развития. 2012. №4. С. 1-18].
В целом арсенал лекарственных средств для терапии РАС ограничен вследствие развития нежелательных побочных эффектов, отсутствия доказательной эффективности и разрешения к применению препаратов в детском возрасте [Симашкова Н.В. Эффективная фармакотерапия и реабилитация больных с расстройствами аутистического спектра. «Неврология и психиатрия», 2011. №3:14-22; Kohane IS. An autism case history to review the systematic analysis of large-scale data to refine the diagnosis and treatment of neuropsychiatric disorders, Biol Psychiatry. 2015. 77(1):59-65].
Таким образом, разработка новых способов коррекции расстройств аутистического спектра является актуальной задачей.
Афобазол (5-этокси 2-[2-(морфолино) этилтио]-бензимидазола дигидрохлорид) - оригинальный анксиолитик, обладающий антиоксидантными, нейропротекторными, цитопротекторными, антитератогенными и антимутагенными свойствами [Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В., Середенин С.Б. Антимутагенные и антитератогенные свойства афобазола. Экспер. и клин, фарм., 2009. Т. 72. №1:46-51]. Известно, что введение Афобазола беременным самкам крыс снижает выраженность неблагоприятных эффектов вследствие патогенных воздействий на их организм и на развитие плодов. Так, Афобазол корригирует воздействия торфяного дыма у беременных крыс и их плодов, а именно: повышает сниженный прирост массы тела, снижает постимплантационную гибель, а также число гематом и кровоизлияния у плодов [Горбатова Д.М., Немова Е.П., Соломина А.С., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Пренатальные эффекты продуктов сгорания торфа и их коррекция афобазолом у потомства крыс. Бюл. экспер. биол. и мед. 2014, Т. 158. №11:604-608]. Пероральное введение афобазола беременным крысам со стрептозотоциновым диабетом приводит к снижению нарушений развития и пре- и постимплантационной гибели эмбрионов, а также нормализует гликемический статус и уменьшает выраженность нарушений когнитивных функций у потомства [Забродина В.В., Шредер Е.Д., Шредер О.В., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Нарушения пренатального развития и гликемического статуса у потомства крыс с экспериментальным стрептозоциновым диабетом и их коррекция афобазолом. Бюл. Экспер. Биол. и Мед. 2014. Т. 158. №7:20-24; Забродина ВВ, Шредер ОВ, Шредер ЕД, Дурнев АД. Влияние «Афобазола» и Бетаина на нарушения когнитивных способностей с повреждениями ДНК. Бюл. Экспер. Биол. и Мед. 2016. Т. 161. №3: 335-342].
Известно, что Афобазол в однократной дозе 10 мг оптимизирует ряд психофизиологических характеристик у стресс-неустойчивых индивидуумов, не вызывая негативных изменений показателей внимания, психомоторного реагирования и скорости принятия решений при моделировании операторской деятельности [Богдан Н.Г., Колотилинская Н.В., Надоров С.А., Яркова М.А., Бадыштов Б.А. Влияние афобазола на психофизиологические показатели здоровых добровольцев. Экспер. и клин, фармак., 2011. Т. 74, №8: 8-12]. Особенностью Афобазола является то, что он не вызывает заторможенности и сонливости, напротив, обладает легким активизирующим действием, снимая при этом тревожность, напряжение, раздражительную слабость, ощущение постоянно грозящей опасности, позволяет человеку собраться с силами и адаптироваться в коллективе. Афобазол не токсичен, не вызывает расслабления скелетных мышц, не оказывает отрицательного воздействия на память и концентрацию внимания, не вызывает привыкания и лекарственной зависимости.
Задачей настоящего изобретения был поиск препарата, обладающего способностью снижать проявления нарушений аутистического спектра.
Техническим результатом по изобретению является уменьшение степени выраженности основных симптомов, характерных для расстройств аутистического спектра, расширение арсенала препаратов, используемых при РАС и не имеющих нежелательных побочных эффектов.
Поставленная задача решалась посредством применения в качестве препарата, снижающего выраженность расстройств аутистического спектра, в особенности в социальной сфере, Афобазола (5-этокси 2-[2-(морфолино)этилтио]-бензимидазола), что поясняется нижеследующими примерами, но не ограничена ими.
Пример 1.
Одним из первых отличительных признаков РАС является нарушение социального взаимодействия. Исследование проводят на грызунах в тесте «Социальное взаимодействие» [Shah CR, Forsberg CG, Kang J, Veenstra-Vanderweele J. Letting a typical mouse judge whether mouse social interactions are atypical // Autism Res., 2013. V. 6(3): P. 212-220]. Установка представляет собой камеру разделенной прозрачными стенками на три равных отсека. Тестируемое животное помещают в центральный отсек, а в крайние отсеки помещают цилиндры в которых располагаются новые объекты: социальный объект - незнакомое животное того же вида, пола и возраста, и новый несоциальный объект. Тестирование поведения животного проводят в течение 10 минут. Регистрируется время, которое тестируемое животное проводит в отсеке с социальным объектом и с новым несоциальным объектом. Если время, проведенное в отсеках с разными по социальной значимости объектами, статистически не отличается, или время, проведенное в отсеке с несоциальным объектом, больше, чем в отсеке с социальным объектом, - регистрируется утрата общительности, характерная для РАС [Kaidanovich-Beilin О, Lipina Т, Vukobradovic I, Roder J., Woodgett JR. Assessment of Social Interaction Behaviors // J. Vis. Exp. 2011. (48), e2473, doi: 10.3791/2473]. Подобное поведение характерно для мышей линии Balb/C, наряду с другими фенотипическими проявлениями, близкими к аутистическому состоянию, и именно эта линия животных использовалась в эксперименте для оценки влияния афобазола на нарушения ЦНС при аутизме [Brodkin ES. BALB/c mice: low sociability and other phenotypes that may be relevant to autism. Behav Brain Res. 2007; 176: 53-65; Moy SS., Nadler JJ., Рое MD., Nonneman RJ., Young NB., Koller ВН., Crawley JN., Duncan GE., Bodfish JW. Development of a mouse test for repetitive, restricted behaviors: relevance to autism. Behav Brain Res. 2008; 188(1):178-194].
По полученным показателям вычисляли коэффициент предпочтения социального объекта тестируемым животным по формуле: К=Б/(А+Б), где А - время нахождения в отсеке с несоциальным объектом и Б - время нахождения в отсеке с социальным объектом.
Также регистрировали время обнюхивания объектов, и число заходов в отсеки с объектами и число подходов к объектам.
Эксперимент проводили на мышах-самцах линии Balb/C массой 22-25 г., полученных из питомника РАН «Столбовая» и содержащихся на стандартном корме и воде (ad libitum) в условиях регламентированных нормативными документами (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. №199н "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики" и СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным Главным Государственным санитарным врачом 29.08.2014 г. №51).
Афобазол вводили внутрь в дозе 10 мг/кг за 40 минут до каждого тестирования. Контрольным животным линии Balb/C вводили внутрь физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,1 мл на 10 г массы мыши) за 40 минут до тестирования.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы «Statistica V. 6.0.», используя однофакторный дисперсионный анализ; непараметрический анализ для независимых переменных (U-тест Манна-Уитни) и парный критерий Стьюдента для внутригрупповых сравнений. Данные в таблицах представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
Контрольные животные проводили больше 53% времени в отсеке с несоциальным объектом, затрачивали равное время на обнюхивание разных по социальной значимости объектов (Табл. 1), что позволяло судить о мышах линии Balb/C как о малообщительных, демонстрирующих низкий уровень социального взаимодействия, что характерно для аномалий поведения при аутизме.
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой.
# - р<0,05 по сравнению с продолжительностью нахождения в отсеке с незнакомым предметом (внутригрупповое сравнение);
опыт
опыт
опыт
контроль
t(%)=100%*t/(t+t).
Афобазол способствовал увеличению на 36,8% времени нахождения животных в отсеке с социальным объектом по сравнению с противоположным отсеком (внутригрупповое сравнение) и достоверному росту предпочтения социального объекта по сравнению с контролем (Табл. 1). На фоне введения афобазола увеличилось на 27,4% число заходов животных в отсек с социальным объектом по сравнению с числом заходов в отсек с несоциальным объектом, и отмечался достоверный рост на 45,4% числа подходов к цилиндру с социальным объектом по сравнению с данными контрольной группы (Табл. 2).
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о значимом благоприятном влиянии афобазола на способность мышей линии Balb/C к социальному взаимодействию.
Пример 2.
Зацикленное, повторяющееся, стереотипное поведение, ограниченный круг интересов и активности и невозможность или трудность изменения рутинных повседневных схем поведения являются характерными проявлениями аутизма [South М, Ozonoff S, McMahon WM. Repetitive behavior profiles in Asperger syndrome and highfunctioning autism. J Autism Dev Disord. 2005; 35:145-158]. Т-образный лабиринт, лабиринт Морриса используются для выявления данного нарушения - пища или платформа перемещается в другое место после того, как проведено обучение и воспроизведение навыка. В настоящем исследовании для оценки влияния вещества на аутичные проявления у мышей линии Balb/C использовалась методика, предложенная Моу и соавторами [Моу SS, Nadler J J, Young NB. et, al. Mouse behavioral tasks relevant to autism: phenotypes of ten inbred strains. Behav. Brain. Res. 2007; 176: 4-20 (Special Issue on Animal Models of Autism)]. Изучалось влияние соединения на процесс обучения пространственному навыку и на способность осуществить новое пространственное движение при переобучении в водном лабиринте Морриса.
Лабиринт Морриса представляет собой круглый бассейн диаметром 122 см, глубиной 25 см, заполненный водой температурой 25-28°C. В бассейн помещали круглую платформу диаметром 12 см. Центр платформы располагали на расстоянии 30 см от краев бассейна.
Процедура эксперимента:
1 этап. Ознакомление с условиями опыта.
Платформу располагают на 0,5 см выше уровня воды. Мышь помещают на платформу на 20 секунд. Затем мышь опускают в воду на противоположной стороне бассейна и позволяют в течение 60 секунд найти платформу и взобраться на нее, где оставляют животное на 20 секунд. Процесс повторяют, опуская мышь в воду с другой, отличной от предыдущей попытки, стороны бассейна (всего 4 попытки).
2 этап. Обучение животных пространственному навыку.
В течение 4-х последующих дней платформу погружают в воду на 0,5 см ниже ее уровня. Ежедневно животным предоставляют по 4 попытки найти платформу, опуская их в воду с 3-х различных областей бассейна, противоположных области расположению платформы. На каждый поиск отводится по 60 секунд. Интервал между попытками составляет 20 секунд, в течение которого мыши находятся на платформе. Перед каждой первой попыткой животное на 20 секунд помещают на платформу.
Регистрируют время, прошедшее от момента спуска животного в воду до подъема на платформу, и количество результативных попыток поиска платформы.
3-й этап. Воспроизведение пространственного навыка.
Через 48 часов после последнего дня обучения платформу убирают, и животных однократно помещают в бассейн на 60 секунд. Регистрируют время, в течение которого животное находится в квадранте, где в дни обучения располагалась платформа, что служит показателем эффективности обучения и воспроизведения пространственного навыка.
4-й этап. Сшибка пространственного навыка - переобучение и новое воспроизведение.
На следующий день после воспроизведения пространственного навыка платформу перемещают в область бассейна, диагонально противоположную прежнему ее местоположению, и погружают в воду на 0,5 см ниже ее уровня. Повторяются процедуры обучения (2 дня) и воспроизведения навыка по описанной выше схеме.
Эксперимент проводили на мышах-самцах линии Balb/C массой 22-25 г. Афобазол вводили внутрь в дозе 10 мг/кг за 40 минут до каждого тестирования. Контрольным животным линии Balb/C вводили внутрь физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,1 мл на 10 г массы мыши) за 40 минут до каждого тестирования.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы «Statistica V6.0.», используя однофакторный дисперсионный анализ и непараметрический анализ для независимых переменных (U-тест Манна-Уитни). Данные в таблицах представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
В процессе обучения мышей линии Balb/C пространственному навыку в водном лабиринте Морриса позитивного влияния афобазола (10 мг/кг, ежедневно, перорально) на оперативную и долговременную память не выявлено. Так, в дни обучения, время поиска платформы и количество результативных попыток в группе мышей, получавших афобазол, не отличались от соответствующих показателей группы контрольных животных, так же, как и не отличались показатели, регистрируемые при воспроизведении пространственного навыка через 48 часов после последнего дня обучения (Табл. 3).
Однако, после пространственной «сшибки» сформированного навыка (перенос положения платформы в противоположный квадрант бассейна) на фоне введения афобазола отмечено достоверное улучшение показателей переобучения и воспроизведения рефлекса в новых условиях у мышей линии Balb/C. Так, в первый день переобучения время поиска платформы мышами, получавшими афобазол, значимо снизилось на 46% при достоверном увеличении на 56,5% количества результативных попыток поиска платформы по сравнению с контрольной группой. Во второй день переобучения благоприятное влияние афобазола на поведение мышей было еще более выраженным: на его фоне количество результативных попыток поиска платформы равнялось 100%, а время ее поиска достоверно уменьшилось на 65,5% относительно группы контрольных животных (Табл. 4).
При повторном воспроизведении навыка после пространственной «сшибки», установлено, что изучаемый препарат улучшает долговременную память животных, достоверно увеличивая на 86,8% длительность пребывания мышей в квадранте, где находилась платформа при новом обучении навыку по сравнению с контрольной группой. При этом число животных в группе «Афобазол», находившихся в «правильном» квадранте дольше среднего времени пребывания в нем мышей контрольной группы, было на 50% больше, чем в контроле (Табл. 4).
Примечания: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о значимом благоприятном влиянии афобазола на способность мышей линии Balb/C к смене парадигмы поведения при изменении условия среды - смене положения платформы в водном лабиринте Морриса и способности к улучшению когнитивных показателей в условиях эмоционально-стрессового воздействия.
Пример 3.
В качестве экспериментальной модели аутизма у животных использовали модель дисфункции нервной системы, вызываемой пренатальным введением тератогенного агента - высокой дозы (500-800 мг/кг) вальпроевой кислоты (ВПК) и ее соли. Данное воздействие приводит к появлению фетального вальпроатного синдрома (ФВС) у потомства, который характеризуется комплексом признаков схожим с РАС, в том числе нарушениями в социальном взаимодействии [Gottfried С, Bambini-Junior V, Baronio D. et al. Valproic Acid in Autism Spectrum Disorder: From an Environmental Risk Factor to a Reliable Animal Model / in book: Recent Advances in Autism Spectrum Disorders // InTech, Chapters published. 2013. V. 1. Ch.8.: 143-163], и является пригодной для поиска новых терапевтических агентов для лечения данных расстройств [Foley AG, Gannon S, Rombach-mullan N, Prendergast A, Barry C, Cassidy AW. et al. Class I histone deacetylase inhibition ameliorates social cognition and cell adhesion molecule plasticity deficits in a rodent model of autism spectrum disorder // Neuropharmacology, 2012. V. 63(4): 750-760]. Воздействие ВПК на эмбрион является причиной дефектов развития нервной трубки и появления таких поведенческих отклонений как снижение социального взаимодействия (общительности), низкая болевая чувствительность, повышение тревожности и страха у щенят и взрослых животных [Kerr DM, Downey L, Conboy M, et al. Alterations in the endocannabinoid system in the rat valproic acid model of autism // Behav. Brain Research, 2013. V. 249: 124-132].
Исследования выполнены на самцах крыс линии Вистар. Родительское поколение (самки и самцы линии Вистар) было получено из питомника РАН «Столбовая». Животные содержались на стандартном корме и воде (ad libitum) в условиях, регламентированных нормативными документами (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. №199н "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики" и СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным Главным Государственным санитарным врачом 29.08.2014 г. №51).
ВПК (Sigma-Aldrich Company) вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 500 мг/кг на 13 день гестации (беременности) самкам крыс линии Вистар. Для получения животных пассивного контроля самкам крыс линии Вистар на 13 день гестации вводили воду для инъекций в эквивалентном объеме (0,2 мл на 100 г веса животного). Новорожденных крысят содержали в одной клетке с самкой до 21 дня постнатального развития, после чего проводили их отлучение от матери, равномерное распределение по экспериментальным группам. Начиная с 30 дня жизни крысята получали афобазол (10 мг/кг) или воду для инъекций (активный и пассивный контроль) перорально (внутрижелудочно) при помощи зонда однократно ежедневно.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью статистических пакетов "BioStat" для Windows, пакета Excel. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Достоверность различий рассчитывали, используя непараметрический анализ для независимых переменных (U-тест Манна-Уитни), критерий Уилкоксона и парный критерий Стьюдента для внутригрупповых сравнений. Различия между группами считали достоверными при р<0,05. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
Влияние афобазола (5-этокси 2-[2-(морфолино)этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида) на социальную общительность 36-дневных самцов крыс Вистар с ФВС изучали в тесте «Социальное взаимодействие».
Полученные данные подтвердили, что пренатальное введение высокой дозы ВПК вызывает выраженные отклонения в поведении крыс и обладает негативным воздействием на формирование их внутривидовых реакций, что выражалось в снижении социальных контактов, предпочтении несоциального объекта социальному (Табл. 5).
На фоне введения афобазола в дозе 10 мг/кг у крыс с ФВС отмечалось повышение уровня социального взаимодействия, что характеризовалось увеличением времени пребывания животных в отсеке с социальным объектом, увеличением коэффициента предпочтения отсека с социальным объектом до 0,62 и увеличением времени обследования социального объекта на 31% по сравнению с параметром группы ФВС (Табл. 5).
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой «ФВС»; # - р<0,05 относительно времени в отсеке с социальным объектом (внутригрупповое сравнение).
Влияние афобазола на локомоторную, исследовательскую и цикличную (стереотипную) активности крыс с ФВС на 36 день их постнатального развития, а также на тревожность, изучали в тесте «Открытое поле» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. и др. // «Гриф и К» ФГБУ «НЦЭМСП» Минздравсоцразвития России. 2012. Часть 1. С. 941]. Установка «Открытое поле» для мышей представляет собой арену круглой формы диаметром 63 см с бортом по всему периметру арены высотой 32 см. Пол арены расчерчен на 19 секторов, которые располагаются в 3 ряда (центр арены, прецентральная зона арены - 2/3 поля и периферия (прибортовая область арены), и имеет 13 круглых отверстий диаметром 1 см (МПО «Открытая наука», Россия). Регистрация поведения животных проводилась в течение 3-х минут в условиях обычной освещенности. Регистрировали вертикальную активность (число «стоек» животного), горизонтальную двигательную активность на периферии, в прецентральной зоне поля, число выходов в центр «поля» и число актов груминга (поведение животных, направленное на очистку поверхности тела: умывание, чесание и т.д.).
У животных с ФВС выявлено нарушение ориентировочно-исследовательского поведения, что выражалось в снижении горизонтальной двигательной активности, особенно в центральной (в 4 раза) и прецентральной (в 3 раза) зонах установки, в уменьшении на 62,6% вертикальной активности по сравнению с показателями контрольной группы крыс (Табл. 6). Кроме того, у крысят с экспериментальным РАС определяли индекс тревожности - соотношение показателя горизонтальной активности в центральном и прецентральном секторах поля к сумме показателей активности на периферии, прецентральном и центральном секторах поля [Калинина Т.С., Шимширт А.А., Кудряшов Н.В., Воронина Т.А, Середенин СБ. Нейростероидогенез и ориентировочно-исследовательское поведение грызунов // Экспер. и клин. фармак. 2014. Т. 77, №2:3-7], который в 3,7 раза отличался от показателя интактных крыс. Повышенный индекс тревожности крыс с ФВС коррелировал с увеличенным у них в 2 раза числом актов груминга по сравнению с интактными животными: что, также, свидетельствует о повышенной тревожности животных с ФВС (Табл. 6).
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой «ФВС».
Афобазол (10 мг/кг) оказал положительное влияние на ориентировочно-исследовательское поведение крыс с ФВС, что выразилось в достоверном увеличении в 1,7 раза вертикальной активности, в значимом росте в 2,2 раза числа пересечений прецентральной части поля, в увеличении на уровне тенденции (р<0,06) общей горизонтальной активности и в 3,5 раза числа заходов в центр поля, а также в уменьшении на 25% числа актов груминга относительно группы «ФВС» без терапии (Табл. 6). Индекс тревожности при введении афобазола был равен 1,61, что в 3,4 раза отличалось от соответствующего показателя группы крыс с ФВС (Табл. 6) и свидетельствует о явном снижении проявлений аутизма у животных с РАС на фоне введения афобазола, среди которых тревожность, повторяющееся обнюхивание одних и тех же мест в пространстве или объектов, а также чрезмерный груминг и повышенная нецеленаправленная двигательная активность.
Таким образом, на модели ФВС, вызванного введением большой дозы вальпроата натрия самкам крыс линии Вистар на 13-й день гестации, показано, что Афобазол при введении в дозе 10 мг/кг субхронически повышает уровень социального взаимодействия у крысят с РАС, оказывает положительное влияние на их ориентировочно-исследовательское поведение и снижает уровень тревожности.
Результаты опытов, проведенных на двух экспериментальных моделях РАС, где объектами служили, в первом случае, мыши линии Balb/C, обладающие фенотипическими особенностями, сходными с аутистическими проявлениями, а во втором - крысы линии Вистар с фетальным вальпроатным синдромом, вызывающим дисфункцию нервной системы, которая характеризуется комплексом признаков, схожим с РАС, показали способность Афобазола улучшать показатели социального взаимодействия, уменьшать тревожность, увеличивать зону интересов животных, уменьшать стереотипность поведения, облегчать приспособление к изменениям среды обитания.