АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К BTN2, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODIES SPECIFIC TO BTN2 AND THEIR APPLICATIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, обладающим специфичностью к BTN2, и их применению.
Уровень техники
+
Лейкоциты – это клетки иммунной системы, участвующие в защите организма от патогенов. Наряду с обычными приуроченными к MHC класса I клетками CTL CD8 и NK-клетками, другие нестандартные T-клетки, в частности T-клетки γδ, обладают такой же чувствительностью и цитолитической силой, что и NK- и T-клетки. Основной подгруппой циркулирующих T-клеток γδ являются T-клетки Vγ9/Vδ2, составляющие 1-10% периферических T-клеток человека.
T-клетки Vγ9/Vδ2 являются важными эффекторами иммунной защиты. Они прямо лизируют инфицированные патогенами или аномальные клетки. Кроме того, они регулируют иммунные ответы, вызывая созревание дендритных клеток (DC), а также переключение изотипа и выработку иммуноглобулинов. Эта важная клеточная платформа иммунной системы строго регулируется поверхностными рецепторами, хемокинами и цитокинами. T-клетки Vγ9/Vδ2 активируются непептидными фосфорилированными метаболитами изопреноидного пути, так называемыми фосфоагонистами (PAg).
Примирование T-клеток модулируется при участии специализированных клеток и секрецией хемотаксических цитокинов. Теперь мы знаем, что активация T-клеток является результатом двух синергических событий. Первым является взаимодействие между T-клеточным рецептором (TCR) и главным комплексом гистосовместимости (MHC), конъюгированным с обработанным антигеном на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). Вторым событием является костимулирующий независимый от антигена сигнал с участием молекул B7. Отсутствие костимулирующего сигнала вызывает анергию, то есть ингибирование пролиферации T-клеток, секреции цитокинов и цитотоксической активности. Изучение этих путей может дать представление о запуске таких патологических явлений, как аутоиммунные или лимфопролиферативные заболевания.
Бутирофилины – семейство трансмембранных белков, включающее бутирофилин (BTN), BTN-подобные (BTNL), а также белки отбора и поддержания интраэпителиальных T-клеток (SKINT) (Arnett and Viney, 2014). Их внеклеточные части содержат домены IgV и IgC2, проявляющие гомологию с соответствующими доменами костимулирующих молекул B7 (Arnett and Viney, 2014), поэтому бутирофилины считаются представителями расширенного суперсемейства B7 или Ig.
BTN1A1, первый идентифицированный бутирофилин, необходим для образования, секреции и стабилизации глобул молочного жира (Ogg et al., 2004). Затем было высказано предположение, что гены B7 и гены MHC класса I и II могут иметь общий предковый ген и могут кодировать белки, имеющие сходные функции типа активации T-клеток (Rhodes et al., 2001).
+
+
Впоследствии появилось все больше свидетельств того, что бутирофилины играют различные роли в иммунной системе. Лучше всего установлены функции для SKINT1 мыши и BTN3A1 человека, которые не входят в число консервативных представителей семейства. SKINT1 управляет дифференцировкой T-клеток Vγ5Vδ1 в тимусе мыши (Boyden et al., 2008).
Подсемейство BTN2 у человека включает BTN2A1, BTN2A2 и псевдоген BTN2A3. Изоформы белков BTN2A1 и BTN2A2 проявляют внеклеточные домены IgV и IgC, трансмембранный домен и внутриклеточный домен B30.2, характерный для BTN3A1 и BTN3A3, но не для BTN3A2. У мышей ген BTN2A2 представлен единственной копией и является ортологом гена BTN2A2 человека. Рекомбинантный человеческий белок BTN2A1-Fc показал, что определенная гликоформа BTN2A1 связывается с молекулой лектина DC-SIGN, обнаруженного на дендритных клетках (DC). Связывание BTN2A1 с DC-SIGN зависит от гликозилирования белка с высоким содержанием маннозы при экспрессии в опухолевых клетках (Malcherek et al., 2007). Однако до настоящего времени не установлено четкой функции для BTN2A1/A2 у человека, хотя некоторые эксперименты проводились на мышах с использованием рекомбинантных Fc-белков.
Smith et al., 2010 показали, что рекомбинантные мышиные BTN2A2-Fc и BTN1A1-Fc связываются с активированными T-клетками, что свидетельствует о наличии одного или нескольких рецепторов на этих клетках. Иммобилизованные белки BTN2A2-Fc или BTN2A1-Fc, но не белок MOG-Fc, ингибировали пролиферацию T-клеток CD4 и CD8, активированных антителом к CD3. Мышиные BTN1A1 и BTN2A2 также ингибировали метаболизм T-клеток и секрецию IL-2 и IFN-γ.
+
reg
Amman et al., 2013 обнаружили, что связывание мышиного BTN2A2-Fc с первичными T-клетками CD3 мыши, стимулированными антителом к CD3 и антителом к CD28, снижало количество пролиферирующих клеток и вхождение клеток в клеточный цикл. Связывание BTN2A2-Fc со стимулированными антителом к CD3 T-клетками ингибировало CD3ε, Zap70 и последующую активацию Erk1/2. Мышиный BTN2A2-Fc также индуцирует экспрессию Foxp3 и дифференцировку T in vitro.
−/−
+
+
+
Sarter et al., 2016 показали, что у мышей Btn2a2 проявляется усиление ответов эффекторных T-клеток CD4 и CD8, нарушается индукция T-клеток CD4, усиливаются противоопухолевые реакции и обостряется экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.
Сейчас лечение аутоиммунных заболеваний и профилактика отторжения трансплантатов при заболеваниях типа трансплантат против хозяина (GVHD) зависит от иммунодепрессантов, которые имеют серьезные побочные эффекты или же не всегда эффективны. Поэтому требуются новые иммунодепрессанты.
Сейчас лечение аутоиммунных заболеваний и профилактика отторжения трансплантатов при заболеваниях типа трансплантат против хозяина (GvHD) просто зависят от иммунодепрессантов. Однако такие иммунодепрессанты могут быть не всегда эффективными и/или иметь серьезные побочные эффекты.
Следовательно, существует потребность в выявлении новых иммунодепрессантов и/или способов ингибирования иммунного ответа у нуждающихся в этом пациентов.
Cущность изобретения
Настоящее изобретение касается антител, обладающих специфичностью к BTN2, и их применения.
В частности, здесь представлены антитела, которое связываются с BTN2 (напр., с полипептидами BTN2A1 и BTN2A2 человека) и проявляют по меньшей мере одно из следующих свойств:
• они ингибируют продукцию IFN-γ и/или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 и/или
• они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 и/или
• они ингибируют пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению обладают специфичностью и к бутирофилину 2A1 человека (BTN2A1), и к бутирофилину 2A2 человека (BTN2A2).
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению конкурируют за связывание с BTN2A2 как минимум с одним из следующих эталонных мышиных антител:
i. mAb 4.15, получаемым из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5231;
ii. mAb 5.28, получаемым из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5232;
iii. mAb 7.28, получаемым из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5233;
iv. mAb 7.48, получаемым из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5234;
v. mAb 8.15, получаемым из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5235; или
vi. mAb 8.16, получаемым из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5236.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению содержат либо:
i. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 4.15, причем mAb 4.15 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5231;
ii. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 5.28, причем mAb 5.28 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5232;
iii. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 7.28, причем mAb 7.28 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5233;
iv. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 7.48, причем mAb 7.48 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5234;
v. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 8.15, причем mAb 8.15 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5235; или
vi. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 8.16, причем mAb 8.16 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5236.
В других конкретных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению содержат либо:
(i) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 от mAb 4.15 по SEQ ID NOs: 3-8, соответственно;
(ii) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 от mAb 5.28 по SEQ ID NOs: 11-16, соответственно;
(iii) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 от mAb 7.28 по SEQ ID NOs: 19-24, соответственно;
(iv) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 от mAb 7.48 по SEQ ID NOs: 27-32, соответственно;
(v) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 от mAb 8.15 по SEQ ID NOs: 35-40, соответственно; или
(vi) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 от mAb 8.16 по SEQ ID NOs: 43-48, соответственно.
В других конкретных воплощениях, которые могут комбинироваться с предыдущими воплощениями, антитела против BTN2 по изобретению содержат либо:
H
L
(i) тяжелую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:10;
H
L
(ii) тяжелую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:18;
H
L
(iii) тяжелую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 25, и легкую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:26;
H
L
(iv) тяжелую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:34;
H
L
(v) тяжелую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:42; или
H
L
(vi) тяжелую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 49, и легкую цепь, в которой область V по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:50.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению не дают перекрестной реакции с CD277 человека, в частности, они не дают перекрестной реакции ни с одним из BTN3A1, BTN3A2 и BTN3A3 человека.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 в присутствии агонистического антитела mAb20.1 против CD277.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2, к примеру, активированных при совместном культивировании с клетками целевой линии (т.е. клетками линии Daudi) и/или фосфоагонистами (PAg) и/или агентами, индуцирующими продукцию фосфоагонистов (PAg).
В определенных воплощениях данные антитела против BTN2 представляют собой человеческие, химерные или гуманизованные антитела.
Другой аспект настоящего изобретения касается молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелую цепь и/или легкую цепь какого-либо из антител против BTN2, как описано выше.
Изобретение также касается клеток-хозяев, содержащих такие нуклеиновые кислоты, в частности, для применения при получении какого-либо из антител против BTN2, как описано выше.
Другой аспект изобретения касается антител против BTN2, как описано выше, для применения в терапии, к примеру, в способе лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний и отторжения трансплантатов.
Другой аспект изобретения касается способа лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний и отторжения трансплантатов у нуждающихся в этом субъектов, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела против BTN2, как определено выше.
Как правило, данные аутоиммунные и воспалительные заболевания выбирают из группы, состоящей из: ревматоидного артрита (RA), инсулинозависимого сахарного диабета (диабета 1 типа), рассеянного склероза (MS), болезни Крона, системной красной волчанки (SLE), склеродермии, синдрома Шегрена, пузырчатки обыкновенной, пемфигоида, болезни Аддисона, анкилозирующего спондилита, апластической анемии, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного гепатита, целиакии, дерматомиозита, синдрома Гудпастура, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, болезни Хашимото, идиопатической лейкопении, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, мужского бесплодия, смешанного заболевания соединительной ткани, миастении, пернициозной анемии, белково-анафилактического увеита, первичного билиарного цирроза, первичной микседемы, синдрома Рейтера, синдрома ригидности, тиреотоксикоза, язвенного колита и гранулематоза Вегенера.
Изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих антитела против BTN2, как определено выше.
Изобретением также предусмотрен способ ингибирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антитела против BTN2, как изложено здесь.
Раскрытие сущности изобретения
Определения
В настоящем изобретении термин “BTN2” имеет общепринятое в данной области значение и относится к полипептидам BTN2 человека, включая BTN2A1 по SEQ ID NO: 1 либо BTN2A2 по SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 1. Предшественник изоформы-1 BTN2A (Homo sapiens)
MESAAALHFSRPASLLLLLLSLCALVSAQFIVVGPTDPILATVGENTTLRCHLSPEKNAE
DMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALVIHNITAQEN
GTYRCYFQEGRSYDEAILHLVVAGLGSKPLISMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRD
PYGGVAPALKEVSMPDADGLFMVTTAVIIRDKSVRNMSCSINNTLLGQKKESVIFIPESF
MPSVSPCAVALPIIVVILMIPIAVCIYWINKLQKEKKILSGEKEFERETREIALKELEKE
RVQKEEELQVKEKLQEELRWRRTFLHAVDVVLDPDTAHPDLFLSEDRRSVRRCPFRHLGE
SVPDNPERFDSQPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKGEVLLIPQNG
FWTLEMHKGQYRAVSSPDRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAF
SVPVRPFFRLGCEDSPIFICPALTGANGVTVPEEGLTLHRVGTHQSL
SEQ ID NO: 2. Предшественник изоформы-2 BTN2A (Homo sapiens)
MEPAAALHFSLPASLLLLLLLLLLSLCALVSAQFTVVGPANPILAMVGENTTLRCHLSPE
KNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRITFVSKDINRGSVALVIHNVT
AQENGIYRCYFQEGRSYDEAILRLVVAGLGSKPLIEIKAQEDGSIWLECISGGWYPEPLT
VWRDPYGEVVPALKEVSIADADGLFMVTTAVIIRDKYVRNVSCSVNNTLLGQEKETVIFI
PESFMPSASPWMVALAVILTASPWMVSMTVILAVFIIFMAVSICCIKKLQREKKILSGEK
KVEQEEKEIAQQLQEELRWRRTFLHAADVVLDPDTAHPELFLSEDRRSVRRGPYRQRVPD
NPERFDSQPCVLGWESFASGKHYWEVEVENVMVWTVGVCRHSVERKGEVLLIPQNGFWTL
EMFGNQYRALSSPERILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAFTVPV
RPFFRLGSDDSPIFICPALTGASGVMVPEEGLKLHRVGTHQSL
В настоящем изобретении термины “антитело” и “иммуноглобулин” имеют одинаковые значения и будут применяться равным образом в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении термин “антитело” относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулинов, то есть к молекулам, содержащим антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывает антиген. При этом термин антитело охватывает не только целые молекулы антител, но и фрагменты антител, а также варианты (включая производные) антител и фрагменты антител.
L
L
H
H
H
H
H
L
H
L
H
В природных антителах две тяжелые цепи соединяются друг с другом дисульфидными связями, и каждая тяжелая цепь соединяется с легкой цепью дисульфидной связью. Существует два типа легких цепей: лямбда (λ) и каппа (κ). Существует пять основных классов тяжелых цепей (или изотипов), которые определяют функциональную активность молекул антител: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Каждая цепь содержит отдельные домены последовательности. Легкая цепь включает в себя два домена: вариабельный домен (V) и константный домен (C). Тяжелая цепь включает в себя четыре домена: вариабельный домен (V) и три константных домена (C1, C2 и C3, которые совокупно именуются C). Вариабельные области легкой (V) и тяжелой (V) цепей определяют распознавание и специфичность связывания с антигеном. Домены константной области легких (C) и тяжелых (C) цепей придают такие важные биологические свойства, как ассоциация цепей антител, секреция, трансплацентарная подвижность, связывание комплемента и связывание с Fc-рецепторами (FcR).
Фрагмент Fv является N-концевой частью Fab-фрагмента иммуноглобулина и состоит из вариабельных частей одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Специфичность антитела заключается в структурной комплементарности между сайтом связывания антитела и антигенной детерминантой. Сайты связывания у антител состоят из остатков, происходящих в основном из гипервариабельных или определяющих комплементарность участков (CDR). Иногда остатки из негипервариабельных или каркасных участков (FR) могут участвовать в сайте связывания антитела или влиять на общую структуру домена и тем самым на сайт связывания. Определяющими комплементарность участками или CDR именуют такие аминокислотные последовательности, которые вместе определяют аффинность связывания и специфичность природного Fv-участка сайта связывания нативного иммуноглобулина. Каждая из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина содержит три CDR, которые обозначаются как L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 и H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий сайт обычно содержит шесть CDR, включающих участки CDR из каждой V-области тяжелой и легкой цепи. Каркасными участками (FR) именуют аминокислотные последовательности, вставленные между CDR. Соответствующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи обычно содержат 4 каркасных участка и 3 CDR в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
Остатки в вариабельных доменах антител обычно нумеруются по системе, разработанной Kabat et al. Эта система изложена в Kabat et al., 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (в дальнейшем “Kabat et al.”). Эта система нумерации и применяется в настоящем описании. Обозначения остатков по Kabat не всегда напрямую соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков в последовательностях по SEQ ID. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, чем при строгой нумерации по Kabat, соответствуя укорочению структурного компонента или вставке в каркасный или определяющий комплементарность участок (CDR) основной структуры вариабельного домена. Правильная нумерация остатков по Kabat для данного антитела может быть установлена путем выравнивания гомологичных остатков в последовательности антитела со “стандартной” последовательностью, пронумерованной по Kabat. Участки CDR вариабельного домена тяжелой цепи приходятся на остатки 31-35 (H-CDR1), остатки 50-65 (H-CDR2) и остатки 95-102 (H-CDR3) по системе нумерации Kabat. Участки CDR вариабельного домена легкой цепи приходятся на остатки 24-34 (L-CDR1), остатки 50-56 (L-CDR2) и остатки 89-97 (L-CDR3) по системе нумерации Kabat.
2
2
В определенных воплощениях предусмотренные здесь антитела представляют собой фрагменты антител, в частности, любые белки, содержащие антигенсвязывающие домены антител, как описано здесь. Фрагменты антител включают, без ограничения, Fv, Fab, F(ab′), Fab′, dsFv, scFv, sc(Fv) и диатела.
50
50
50
D
В настоящем изобретении термин “специфичность” относится к способности антител детектируемо связываться с эпитопом, представленным на антигене типа BTN2. В некоторых воплощениях это относится к антителам или белкам, которые связываются с BTN2A2 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 50 мкг/мл, более предпочтительно менее 10 мкг/мл и еще более предпочтительно менее 1 мкг/мл, как определено в примерах и на фиг. 1. В некоторых воплощениях это относится к антителам или белкам, которые связываются с BTN2A1 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, в которых были нокаутированы все изоформы BTN3 и BTN2, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 1 мкг/мл, к примеру, менее 0,1 мкг/мл; и/или это относится к антителам или белкам, которые связываются с BTN2A2 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, в которых были нокаутированы все изоформы BTN3 и BTN2, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 50 мкг/мл, к примеру, менее 1 мкг/мл или менее 0,02 мкг/мл. В других воплощениях они связываются с рекомбинантным полипептидом антигена со значением K в 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее, 100 пМ или менее, или же 10 пМ или менее.
“Выделенное антитело” в настоящем изобретении означает такое антитело, которое практически не содержит других антител с другой антигенной специфичностью (напр., выделенное антитело, которое специфически связывается с BTN2, практически не содержит таких антител, которые специфически связываются с другими антигенами, чем BTN2). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с BTN2, может давать перекрестную реакцию с другими антигенами типа родственных молекул BTN2 из других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободным от других клеточных материалов и/или химических веществ.
Термины “моноклональное антитело” или “композиция моноклонального антитела” в настоящем изобретении относятся к препаратам молекул антитела одного молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела проявляет единственную специфичность связывания и сродство к определенному эпитопу.
Выражения “антитело, распознающее антиген” и “антитело, обладающее специфичностью к антигену” применяются здесь взаимозаменяемо с термином “антитело, которое специфически связывается с антигеном”.
assoc
a
dis
d
Термин “K” или “K” в настоящем изобретении служит для обозначения скорости ассоциации при определенном взаимодействии антитело-антиген, тогда как термин “K” или “K” в настоящем изобретении служит для обозначения скорости диссоциации при определенном взаимодействии антитело-антиген.
D
d
a
d
a
D
D
D

Термин “K” в настоящем изобретении служит для обозначения константы диссоциации, которая получается из соотношения K и K (т.e. K/K) и выражается в виде молярной концентрации (M). Значения K для антител можно определить методами, хорошо известными в данной области. Предпочтительные методы определения значений K для mAb приводятся в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. и Wiley Interscience, N.Y. (1992, 1993); и Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983); которые полностью включены сюда в качестве ссылки. Один из методов определения K антител заключается в использовании поверхностного плазмонного резонанса или биосенсорной системы типа системы Biacore.
Специфичность также может выражаться, напр., в виде соотношения сродство/авидность примерно 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 10 000:1 и более при связывании со специфическим антигеном по сравнению с неспецифическим связыванием с другими посторонними молекулами (в данном случае специфическим антигеном является полипептид BTN2). Термин “сродство” в настоящем изобретении означает прочность связывания антитела с эпитопом.
В одном аспекте настоящее изобретение касается антител, обладающих специфичностью к BTN2, отличающихся тем, что они обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:
i. они ингибируют продукцию IFN-γ и TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 и/или
ii. они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 и/или
iii. они ингибируют пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
Антитела против BTN2 по настоящему изобретению, обладающие такими выгодными свойствами, можно выявить при скрининге среди антител против BTN2 клеточными методами, как описано в примерах, в частности, методом дегрануляции CD107 на клетках линии Daudi.
В настоящем изобретении под “ингибированием продукции IFN-γ или TNF-α” понимается то, что наблюдается значительное снижение продукции по крайней мере IFN-γ либо TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 по сравнению с контрольными активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 (с IgG1 или IgG2a в качестве контроля), причем данные T-клетки Vγ9/Vδ2 активируются либо при совместном культивировании с целевой линией клеток (клетками линии Daudi), либо при помощи фосфоагонистов (PAg). Как правило, ингибирование продукции IFN-γ или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 можно измерить клеточным методом путем внутриклеточного мечения антителами против IFNγ или TNFα и проточной цитометрии. Такой метод более подробно описан в приведенных ниже примерах.
В настоящем изобретении под “ингибированием цитолитической функции активированных T-клеток Vγ9/Vδ2” понимается то, что наблюдается значительное снижение цитолитической функции активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 человека по сравнению с контрольными активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 человека (с IgG1 или IgG2a в качестве контроля), причем данные T-клетки Vγ9/Vδ2 человека активируются либо при совместном культивировании с целевой линией клеток (клетками линии Daudi), либо при помощи фосфоагонистов (PAg). Как правило, ингибирование цитолитической функции активированных T-клеток Vγ9/Vδ2, к примеру, в присутствии агонистического антитела mAb20.1, можно измерить по ингибированию индукции дегрануляции T-клеток γδ на стандартной линии клеток и CD107 в качестве маркера дегрануляции для выявления положительных дегранулированных T-клеток γδ. Такой метод более подробно описан в приведенных ниже примерах.
В настоящем изобретении под “ингибированием пролиферации активированных T-клеток Vγ9/Vδ2” понимается то, что наблюдается значительное снижение пролиферации активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 по сравнению с пролиферацией T-клеток Vγ9/Vδ2 при активации с IgG1 или IgG2a в качестве контроля, причем данные T-клетки Vγ9/Vδ2 активируются либо при совместном культивировании с целевой линией клеток (клетками линии Daudi), либо при помощи фосфоагонистов (pAg). Как правило, пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 можно измерить клеточным методом путем окрашивания CFSE или Cell Trace Violet и проточной цитометрии.
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 до уровня, который практически равен или превосходит по меньшей мере одно из эталонных антител: mAb 4.15, mAb 5.28, mAb 7.28, mAb 7,48, mAb 8.15 и mAb 8.16, как описано ниже. В других конкретных воплощениях антитела против BTN2 ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 до уровня, который по меньшей мере равен или превосходит mAb 103.2, причем данное mAb 103.2 раскрыто в WO 2012/080351.
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения ингибируют продукцию по крайней мере IFN-γ или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 до уровня, который практически равен или превосходит по меньшей мере одно из эталонных антител: mAb 4.15, mAb 5.28, mAb 7.28, mAb 7,48, mAb 8.15 и mAb 8.16, как описано ниже. В других конкретных воплощениях антитела против BTN2 ингибируют продукцию по крайней мере IFN-γ или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2 до уровня, который по меньшей мере равен или превосходит mAb 103.2, причем данное mAb 103.2 раскрыто в WO 2012/080351.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по настоящему изобретению дополнительно отличаются тем, что они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 даже в присутствии агонистического антитела mAb20.1 против CD277.
Антитело mAb20.1 против CD277 было раскрыто в WO 2012/080351, причем это антитело усиливает цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2. Как правило, ингибирование цитолитической функции активированных T-клеток Vγ9/Vδ2 в присутствии mAb20.1 можно измерить по ингибированию индукции дегрануляции T-клеток γδ на стандартной линии клеток, к примеру, на клетках линии Daudi в качестве стандартной линии клеток и CD107 в качестве маркера дегрануляции для выявления положительных дегранулированных T-клеток γδ, используя mAb 20.1, к примеру, в концентрации 10 мкг/мл. Такой метод более подробно описан и в приведенных ниже примерах.
Эталонные антитела mAbs 1-6
Антитела по изобретению включают эталонные мышиные моноклональные антитела mAb1-mAb6, которые вырабатываются гибридомами, депонированными в Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) в соответствии с условиями Будапештского договора от 14 сентября 2017 г. под соответствующими номерами депозитов, как описано ниже в табл. 1.
Таблица 1. mAb1-mAb6
Антитело
Название клона
Номер депозита
mAb1
4.15
CNCM I-5231
mAb2
5.28
CNCM I-5232
mAb3
7.28
CNCM I-5233
mAb4
7.48
CNCM I-5234
mAb5
8.15
CNCM I-5235
mAb6
8.16
CNCM I-5236
H
L
Изобретение также касается любых антител, содержащих соответствующие области V и V каких-либо из приведенных выше эталонных антител.
Настоящее изобретение также касается гибридом, доступных в CNCM под номерами депозитов CNCM I-5231, CNCM I-5232, CNCM I-5233, CNCM I-5234, CNCM I-5235 или CNCM I-5236.
Другие антитела по изобретению включают антитела, содержащие аминокислоты, которые были мутированы путем делеции, вставки или замены аминокислот, но при этом у них участки CDR по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95 или 100% идентичны участкам CDR какого-либо из приведенных выше эталонных антител.
В некоторых воплощениях антитела по изобретению представляют собой мутантные варианты каких-либо из mAb1-mAb6, содержащие 6 участков CDR, на 100% идентичных соответствующим 6 участкам CDR одного из эталонных mAb1-mAb6, причем данный мутантный вариант антитела включает в себя мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были мутированы путем делеции, вставки или замены аминокислот в участках FR1, FR2, FR3 и FR4 по сравнению с соответствующими каркасными участками соответствующих эталонных антител.
В определенных воплощениях антитела против BTN2 по изобретению, предпочтительно гуманизованные антитела против BTN2, содержат либо:
i. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 4.15, причем mAb 4.15 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5231;
ii. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 5.28, причем mAb 5.28 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5232;
iii. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 7.28, причем mAb 7.28 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5233;
iv. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 7.48, причем mAb 7.48 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5234;
v. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 8.15, причем mAb 8.15 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5235; или
vi. тяжелую цепь и легкую цепь, включающие 6 участков CDR антитела mAb 8.16, причем mAb 8.16 получено из гибридомы, депонированной в CNCM под номером депозита CNCM I-5236.
Таким образом, антитела по изобретению также включают мышиные антитела против BTN2, выделенные и структурно характеризующиеся своими аминокислотными последовательностями вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, как описано ниже в табл. 2.
Таблица 2. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи мышиных эталонных антител по изобретению
Антитело
Аминокислотная последовательность V<sub>H</sub>
Аминокислотная последовательность V<sub>L</sub>
mAb1
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
mAb2
SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:18
mAb3
SEQ ID NO:25
SEQ ID NO:26
mAb4
SEQ ID NO:33
SEQ ID NO:34
mAb5
SEQ ID NO:41
SEQ ID NO:42
mAb6
SEQ ID NO:49
SEQ ID NO:50
Соответствующие аминокислотные и нуклеотидные кодирующие последовательности константных областей изотипа IgG4, IgG1 и их мутантных версий хорошо известны в данной области.
H
H
H
L
L
L
Примеры аминокислотных последовательностей участков CDR1 V (также называемых HCDR1), CDR2 V (также называемых HCDR2), CDR3 V (также называемых HCDR1), CDR1 V (также называемых LCDR1), CDR2 V (также называемых LCDR2), CDR3 V (также называемых HCDR3) некоторых антител по изобретению приведены в табл. 3.
В табл. 3 участки CDR некоторых антител по настоящему изобретению приводятся по системе Chothia (Chothia C, Lesk AM. 1987, J Mol Biol 196, 901-917).
Для удобства чтения участки CDR в дальнейшем именуются HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, соответственно.
Таблица 3. Участки CDR эталонных мышиных антител согласно определению Chothia
Исходное антитело
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCDR1
LCDR2
LCDR3
mAb1
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8
mAb2
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:14
SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16
mAb3
SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:20
SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22
SEQ ID NO:23
SEQ ID NO:24
mAb4
SEQ ID NO:27
SEQ ID NO:28
SEQ ID NO:29
SEQ ID NO:30
SEQ ID NO:31
SEQ ID NO:32
mAb5
SEQ ID NO:35
SEQ ID NO:36
SEQ ID NO:37
SEQ ID NO:38
SEQ ID NO:39
SEQ ID NO:40
mAb6
SEQ ID NO:43
SEQ ID NO:44
SEQ ID NO:45
SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:47
SEQ ID NO:48
В определенных воплощениях выделенные антитела против BTN2 по изобретению содержат либо:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 по SEQ ID NO:3, HCDR2 по SEQ ID NO:4, HCDR3 по SEQ ID NO:5, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 по SEQ ID NO:6, LCDR2 по SEQ ID NO:7 и LCDR3 по SEQ ID NO:8;
(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 по SEQ ID NO:11, HCDR2 по SEQ ID NO:12, HCDR3 по SEQ ID NO:13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 по SEQ ID NO:14, LCDR2 по SEQ ID NO:15 и LCDR3 по SEQ ID NO:16;
(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 по SEQ ID NO:19, HCDR2 по SEQ ID NO:20, HCDR3 по SEQ ID NO:21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 по SEQ ID NO:22, LCDR2 по SEQ ID NO:23 и LCDR3 по SEQ ID NO:24;
(d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 по SEQ ID NO:27, HCDR2 по SEQ ID NO:28, HCDR3 по SEQ ID NO:29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 по SEQ ID NO:30, LCDR2 по SEQ ID NO:31 и LCDR3 по SEQ ID NO:32;
(e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 по SEQ ID NO:35, HCDR2 по SEQ ID NO:36, HCDR3 по SEQ ID NO:37, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 по SEQ ID NO:38, LCDR2 по SEQ ID NO:39 и LCDR3 по SEQ ID NO:40; или
(f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1 по SEQ ID NO:43, HCDR2 по SEQ ID NO:44, HCDR3 по SEQ ID NO:45, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1 по SEQ ID NO:46, LCDR2 по SEQ ID NO:47 и LCDR3 по SEQ ID NO:48;
причем данные антитела против BTN2 обладают специфичностью к BTN2.
В других конкретных воплощениях выделенные антитела против BTN2 по изобретению содержат либо:
H
L
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:9, и вариабельную область легкой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:10;
H
L
(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:18;
H
L
(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:25, и вариабельную область легкой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:26;
H
L
(d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:34;
H
L
(e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:41, и вариабельную область легкой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:42; или
H
L
(f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую V по SEQ ID NO:50;
причем данные антитела против BTN2 обладают специфичностью к BTN2.
Функциональные варианты антител
В следующем воплощении функциональные варианты антител по изобретению имеют полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи; или аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи; или аминокислотные последовательности всех 6 участков CDR, которые гомологичны или предпочтительно идентичны соответствующим аминокислотным последовательностям антител mAb1-mAb6, описанных выше, в частности, в табл. 1, 2 и 3, причем такие функциональные варианты антител сохраняют требуемые функциональные свойства исходных антител mAb1-mAb6.
L
H
Функциональные варианты V, V или CDR в контексте моноклональных антител настоящего изобретения дают возможность антителам сохранять по крайней мере значительную долю (как минимум 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100%) сродства/авидности и/или специфичности/избирательности исходного антитела (т.е. любого из антител mAb1-mAb6), а в некоторых случаях такие моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть связаны и с большим сродством, избирательностью и/или специфичностью, чем у исходного Ab.
Требуемые функциональные свойства исходных антител mAb1-mAb6 могут быть выбраны из группы, состоящей из:
50
i. они обладают специфичностью к BTN2, в частности, они связываются с BTN2 человека, экспрессируемым в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, экспрессирующих BTN2A2 человека, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 50 мкг/мл, более предпочтительно менее 10 мкг/мл и еще более предпочтительно менее 1 мкг/мл, как определено в примерах и на фиг. 1;
50
ii. они связываются с BTN2A1 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, в которых были нокаутированы все изоформы BTN3 и BTN2, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 1 мкг/мл, к примеру, менее 0,1 мкг/мл;
50
iii. они связываются с BTN2A2 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, в которых были нокаутированы все изоформы BTN3 и BTN2, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 50 мкг/мл, к примеру, менее 1 мкг/мл или менее 0,02 мкг/мл;
iv. они ингибируют продукцию IFN-γ или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2;
v. они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2; и/или
vi. они ингибируют пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
H
L
Например, изобретение касается функциональных вариантов антител mAb1-mAb6, содержащих последовательности вариабельной области тяжелой цепи (V) и вариабельной области легкой цепи (V), в которых последовательности CDR, т.е. 6 участков CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 по меньшей мере на 60, 70, 90, 95 или 100% идентичны соответствующим последовательностям CDR по меньшей мере одного из антител mAb1-mAb6, причем функциональные варианты антител специфически связываются с BTN2, а антитела проявляют по меньшей мере одно из следующих функциональных свойств:
i. они ингибируют продукцию IFN-γ или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2;
ii. они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2; и/или
iii. они ингибируют пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
Оно также касается функциональных вариантов антител mAb1-mAb6, содержащих вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, которые по меньшей мере на 80%, 90% или по меньшей мере на 95% или 100% идентичны соответствующим вариабельным областям тяжелой и легкой цепи какого-либо из антител mAb1-mAb6, представленным, в частности, в табл. 2; причем функциональные варианты антител специфически связываются с BTN2 и проявляют по меньшей мере одно из следующих функциональных свойств:
i. они ингибируют продукцию IFN-γ или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2;
ii. они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2; и/или
iii. они ингибируют пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
В различных воплощениях антитела могут проявлять одно или два из требуемых функциональных свойств, приведенных выше. Антитела могут представлять собой, к примеру, человеческие антитела, гуманизованные антитела или химерные антитела. Предпочтительно антитела или белки представляют собой гуманизованные антитела человека, более предпочтительно гуманизованные молчащие антитела.
В настоящем изобретении термин “молчащее” антитело означает такое антитело, которое совсем или почти не проявляет активности ADCC при измерении по активности ADCC in vitro методом лизиса клеток мишени.
В одном воплощении термин “совсем или почти нет активности ADCC” означает, что молчащее антитело проявляет активность ADCC, которая составляет менее 50%, к примеру, менее 10% от активности ADCC, наблюдаемой с соответствующим антителом дикого типа (не молчащим), к примеру, с человеческим антителом IgG1 дикого типа. Предпочтительно отсутствие детектируемой активности ADCC выявляется при анализе активности ADCC in vitro с молчащим антителом по сравнению с Fab-фрагментом контрольного антитела.
Молчащие эффекторные функции можно получить путем мутации в константной Fc-части антител и были описаны в данной области: Strohl 2009 (LALA & N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J. Immunol. 181 (2008): 6664-69; Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91). Примеры молчащих антител IgG1 включают снижающие ADCC мутации в положениях 234, 235 и/или 331 в аминокислотной последовательности Fc IgG1 (по нумерации EU). Другое молчащее антитело IgG1 содержит мутацию N297A, которая дает агликозилированные или негликозилированные антитела.
Последовательности CDR у вариантов могут отличаться от последовательностей CDR исходного антитела (как показано, к примеру, в табл. 3) главным образом консервативными заменами; например, по меньшей мере 10 замен, как-то по меньшей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 у варианта представлены консервативными заменами аминокислотных остатков. В контексте настоящего изобретения консервативные замены можно определить как замены в пределах классов аминокислот, выраженных следующим образом:
алифатические остатки I, L, V и M
связанные с циклоалкенилами остатки F, H, W и Y
гидрофобные остатки A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W и Y
отрицательно заряженные остатки D и E
полярные остатки C, D, E, H, K, N, Q, R, S и T
положительно заряженные остатки H, K и R
небольшие остатки A, C, D, G, N, P, S, T и V
очень маленькие остатки A, G и S
остатки, участвующие в образовании изгибов A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P и T
гибкие остатки Q, T, K, S, G, P, D, E и R.
Более консервативные группировки замен включают: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Также в CDR вариантов практически сохраняется консервативность с точки зрения гидропатических/гидрофильных свойств и массы/размера остатков по сравнению с CDR любых из mAb 1-6. В данной области в целом понимается важность гидропатического индекса аминокислот для придания интерактивной биологической функции белкам. Принимается, что относительный гидропатический характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру образующегося белка, что в свою очередь определяет взаимодействие белка с другими молекулами, к примеру, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и т.п. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический индекс на основании их гидрофобности и характеристик заряда, а именно: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); и аргинин (-4,5). Сохранность сходных остатков также можно измерить и при помощи показателя сходства, который определяется с помощью программы BLAST (напр., BLAST 2.2.8, доступной от NCBI, используя стандартные настройки BLOSUM62, Open Gap = 11 и Extended Gap = 1). Подходящие варианты обычно проявляют идентичность с исходным пептидом по меньшей мере на 70%. Согласно настоящему изобретению то, что первая аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70% идентична второй аминокислотной последовательности означает, что первая последовательность идентична второй аминокислотной последовательности на 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или на 100%. Согласно настоящему изобретению то, что первая аминокислотная последовательность по меньшей мере на 50% идентична второй аминокислотной последовательности означает, что первая последовательность идентична второй аминокислотной последовательности на 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или на 100%.
H
L
H
L
H
L
В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению представляют собой химерные антитела, обычно химерные антитела мыши/человека. Термин “химерное антитело” означает такое моноклональное антитело, которое содержит домен V и домен V из антитела, полученного от животного, и домен C и домен C из антитела человека. В качестве животного можно использовать любых животных, как-то мышей, крыс, хомяков, кроликов и др. В частности, химерное антитело мыши/человека может содержать домены V и V любого из эталонных антител mAb1-mAb6.
В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению представляют собой гуманизованные антитела. В определенных воплощениях антитела по настоящему изобретению представляют собой гуманизованные антитела, которые содержат 6 участков CDR любого из эталонных антител mAb1-mAb6, к примеру, как показано в табл. 3. В настоящем изобретении термин “гуманизованное антитело” означает такое моноклональное антитело, у которого каркасные участки (FR) были модифицированы включением FR из донорного иммуноглобулина другого вида (к примеру, человека) по сравнению с таковыми у исходного иммуноглобулина (к примеру, мышиными CDR).
2
2
2
H
L
H
L
В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из Fab, F(ab′), Fab′ и scFv. В настоящем изобретении термин “Fab” обозначает фрагменты антител с молекулярной массой около 50000 и обладающие антиген-связывающей активностью, в которых около половины N-концевой стороны Н-цепи и вся L-цепь из числа фрагментов, полученных при обработке IgG протеазой папаином, соединяются вместе дисульфидной связью. Термин “F(ab′)” обозначает фрагменты антител с молекулярной массой около 100000 и обладающие антиген-связывающей активностью, которые немного больше, чем Fab, связанный дисульфидной связью с шарнирной областью, из числа фрагментов, полученных при обработке IgG протеазой пепсином. Термин “Fab′” обозначает фрагменты антител с молекулярной массой около 50000 и обладающие антиген-связывающей активностью, которые получаются при разрыве дисульфидной связи в шарнирной области F(ab′). Одноцепочечный полипептид Fv (“scFv”) представляет собой ковалентно связанный гетеродимер V::V, который обычно экспрессируется из слитого гена, включающего гены, кодирующие V и V, соединенные кодирующим пептид линкером. Фрагмент scFv человека по изобретению содержит участки CDR, которые удерживаются в надлежащей конформации, предпочтительно с использованием методов рекомбинации генов.
Функциональные варианты антител с мутантными аминокислотными последовательностями могут быть получены посредством мутагенеза (напр., сайт-направленного или опосредованного ПЦР мутагенеза) кодирующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на предмет сохранения функции (т.е. изложенных выше функций) с использованием описанных здесь функциональных анализов.
Антитела, которые перекрестно блокируют какие-либо из mAb1-mAb6 и/или связываются с тем же эпитопом, что и mAb1-mAb6
Можно идентифицировать дополнительные антитела с такими же выгодными свойствами, как у приведенных здесь эталонных антител mAb1-mAb6, на основании их способности к перекрестной конкуренции (напр., к конкурентному ингибированию связывания) статистически значимым образом с любым из эталонных антител mAb1-mAb6, как описано выше, при стандартном анализе связывания с BTN2.
Исследуемые антитела можно сначала подвергнуть скринингу на их сродство связывания с BTN2, к примеру, из библиотеки рекомбинантных антител человека, к примеру, по технологии фагового дисплея, или из трансгенных мышей, экспрессирующих антитела с вариабельными областями человека, иммунизированных антигенами BTN2.
Способность исследуемого антитела к перекрестной конкуренции или к ингибированию связывания антител по настоящему изобретению с BTN2 человека свидетельствует о том, что исследуемое антитело может конкурировать с этими антителами за связывание с BTN2 человека; такое антитело, в соответствии с неограничивающей теорией, может связываться с тем же или родственным (напр., похожим по структуре или пространственно близким) эпитопом на BTN2 человека (напр., BTN2A2 и/или BTN2A1), что и антитело, с которым оно конкурирует.
Для скрининга антител против BTN2 на их способность связываться с тем же эпитопом, что и одно из эталонных антител mAb1-mAb6, проводят окрашивание, к примеру, клеток HEK293, трансфецированных BTN2A2 человека, или клеток HEK293 с нокаутом по всем изоформам BTN2 или BTN3 и экспрессирующих BTN2A2 человека или BTN2A1 человека (как описано в примерах), при насыщающей концентрации (10 мкг/мл) одного из эталонных антител mAb1-mAb6 в течение 30 мин при 4°C. После 2 промывок тестируют различные дозы исследуемых mAb против BTN2 (30 мин при 4°C) на их способность конкурировать с любым из эталонных антител mAb1-mAb6. Те mAb, которые конкурируют за тот же сайт связывания, что и эталонное антитело, не смогут распознавать BTN2 в присутствии таких эталонных антител. Эти данные могут быть выражены в виде средней интенсивности флуоресценции.
Отобранные антитела можно подвергнуть дальнейшему тестированию на полезные свойства mAb1-mAb6, в частности, в отношении способности к ингибированию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
Соответственно, в одном воплощении изобретения предусмотрены выделенные антитела, которые перекрестно блокируют или же перекрестно блокируются по меньшей мере одним из антител mAb1-mAb6 по связыванию с BTN2, причем данные антитела:
50
i. обладают специфичностью к BTN2, в частности, они связываются с BTN2 человека, экспрессируемым в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, экспрессирующих BTN2A2 человека, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 50 мкг/мл, более предпочтительно менее 10 мкг/мл и еще более предпочтительно менее 1 мкг/мл, как определено в примерах и на фиг. 1;
50
ii. связываются с BTN2A1 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, в которых были нокаутированы все изоформы BTN3 и BTN2, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 1 мкг/мл, к примеру, менее 0,1 мкг/мл;
50
iii. связываются с BTN2A2 человека, экспрессированным в клеточной линии, к примеру, в клетках линии HEK293F, в которых были нокаутированы все изоформы BTN3 и BTN2, как описано в примерах, предпочтительно со значением EC менее 50 мкг/мл, к примеру, менее 1 мкг/мл или менее 0,02 мкг/мл;
iv. они ингибируют продукцию IFN-γ и/или TNF-α активированными T-клетками Vγ9/Vδ2;
v. они ингибируют цитолитическую функцию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2; и/или
vi. они ингибируют пролиферацию активированных T-клеток Vγ9/Vδ2.
В другом воплощении изобретения предусмотрены антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и по меньшей мере одно из антител против BTN2 mAb1-mAb6, как описано здесь.
В одном конкретном воплощении перекрестно блокирующие антитела, которые связываются с тем же эпитопом на BTN2 человека, что и какое-либо из mAb1-mAb6, представляют собой химерные, гуманизованные или человеческие рекомбинантные антитела.
Получение трансфектом, вырабатывающих моноклональные антитела
Антитела по настоящему изобретению получают любыми методами, известными в данной области, как-то, без ограничения, любыми химическими, биологическими, генетическими или ферментативными методами, как по отдельности, так и в комбинации. Как правило, зная аминокислотную последовательность требуемой последовательности, специалист в данной области может легко получить такие антитела стандартными методами получения полипептидов. Например, их можно синтезировать хорошо известным твердофазным методом, предпочтительно с использованием коммерчески доступного аппарата для синтеза пептидов (типа выпускаемых Applied Biosystems, Foster City, California) и согласно инструкциям производителя. С другой стороны, антитела по настоящему изобретению можно синтезировать методами рекомбинантной ДНК, хорошо известными в данной области. К примеру, антитела могут быть получены в виде продуктов экспрессии ДНК после включения последовательностей ДНК, кодирующих антитела, в экспрессирующие векторы и введения таких векторов в подходящие эукариотические или прокариотические клетки, которые будут экспрессировать требуемые антитела, из которых их можно впоследствии выделить хорошо известными методами.
H
L
H
L
Соответственно, следующим предметом изобретения являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по изобретению. В частности, молекулы нуклеиновой кислоты кодируют тяжелые цепи или легкие цепи антител настоящего изобретения. В частности, молекулы нуклеиновой кислоты содержат участки, кодирующие V или V, которые по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95% или 100% идентичны соответствующим нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельную область тяжелой цепи (область V) или вариабельную область легкой цепи (V) какого-либо из контрольных антител mAb1-mAb6.
Как правило, такая нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК или РНК, которая может быть включена в любой подходящий вектор типа плазмиды, космиды, эписомы, искусственной хромосомы, фагового или вирусного вектора. В настоящем изобретении термины “вектор”, “клонирующий вектор” и “экспрессирующий вектор” обозначают носитель, при помощи которого можно ввести последовательность ДНК или РНК (напр., чужеродный ген) в клетки-хозяева с тем, чтобы трансформировать их и вызвать экспрессию (напр., транскрипцию и трансляцию) введенной последовательности. Итак, следующим предметом изобретения является вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по изобретению. Такие векторы могут содержать регуляторные элементы типа промотора, энхансера, терминатора и т.п., чтобы вызвать или направлять экспрессию данного антитела при введении субъекту. Примеры промоторов и энхансеров, используемых в экспрессирующих векторах для клеток животных, включают ранний промотор и энхансер SV40, промотор LTR и энхансер вируса лейкемии Moloney мышей, промотор и энхансер H-цепи иммуноглобулина и т.п. Можно использовать любой экспрессирующий вектор для клеток животных, если только можно вставить и экспрессировать ген, кодирующий C-область антител человека. Примеры подходящих векторов включают pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 beta d2-4 и т.п. Другие примеры плазмид включают реплицирующиеся плазмиды, содержащие начало репликации, или встраивающиеся плазмиды, такие, к примеру, как pUC, pcDNA, pBR и т.п. Другие примеры вирусных векторов включают аденовирусные, ретровирусные, герпесвирусные и AAV-векторы. Такие рекомбинантные вирусы могут быть получены известными методами типа трансфекции упаковывающих клеток или краткосрочной трансфекции с помощью хелперных плазмид или вирусов. Типичные примеры пакующих вирусы клеток включают клетки PA317, клетки PsiCRIP, клетки GPenv+, клетки 293 и др. Подробные протоколы для получения таких дефектных по репликации рекомбинантных вирусов приведены, к примеру, в WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 и WO 94/19478.
Следующим предметом настоящего изобретения являются клетки-хозяева, которые были трансфецированы, инфицированы или трансформированы нуклеиновой кислотой и/или вектором, как описано выше. В настоящем изобретении термин “трансформация” означает введение “чужеродного” (т.е. постороннего или внеклеточного) гена, последовательности ДНК или РНК в клетку-хозяина с тем, чтобы клетка-хозяин экспрессировала введенный ген или последовательность для получения нужного вещества, обычно белка или фермента, кодируемого введенным геном или последовательностью. Клетки-хозяева, которые получают и экспрессируют введенную ДНК или РНК, являются “трансформированными”.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут применяться для получения антител настоящего изобретения в подходящей системе экспрессии. Термин “система экспрессии” означает клетки-хозяева и совместимый вектор в подходящих условиях, напр., для экспрессии белка, кодируемого чужеродной ДНК, перенесенной вектором и введенной в клетки-хозяева. Распространенные системы экспрессии включают клетки E. coli и плазмидные векторы, клетки насекомых и бакуловирусные векторы, клетки млекопитающих и векторы для них. Другие примеры клеток-хозяев включают, без ограничения, прокариотические клетки (типа бактерий) и эукариотические клетки (типа дрожжевых клеток, клеток млекопитающих, клеток насекомых, клеток растений и т.п.). Конкретные примеры включают E. coli, дрожжи Kluyveromyces или Saccharomyces, линии клеток млекопитающих (напр., клетки Vero, клетки CHO, клетки 3T3, клетки COS и др.), а также первичные или признанные культуры клеток млекопитающих (напр., полученные из лимфобластов, фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.д.). Примеры также включают мышиные клетки SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), мышиные клетки P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), клетки CHO с дефектным геном дигидрофолатредуктазы (в дальнейшем именуется как “ген DHFR”) (Urlaub G et al., 1980), крысиные клетки YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL1662, в дальнейшем именуются как “клетки YB2/0”) и др.
Настоящее изобретение также касается способа получения рекомбинантных клеток-хозяев, экспрессирующих антитела по изобретению, который включает стадии: (i) введения рекомбинантной нуклеиновой кислоты или вектора in vitro или ex vivo, как описано выше, в компетентные клетки-хозяева, (ii) культивирования полученных рекомбинантных клеток-хозяев in vitro или ex vivo и (iii) необязательно отбора клеток, экспрессирующих и/или секретирующих данные антитела. Такие рекомбинантные клетки-хозяева могут применяться для получения антител по настоящему изобретению.
Антитела по настоящему изобретению обычно отделяют от культуральной среды по стандартным методикам очистки иммуноглобулинов, таким, к примеру, как хроматография на сефарозе с белком А, гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
L
H
Н
L
H
L
В некоторых воплощениях химерные антитела человека по настоящему изобретению могут быть получены путем получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих домены V и V, как описано ранее, конструирования экспрессирующего вектора для химерных антител человека путем вставки их в экспрессирующий вектор для клеток животных, содержащий гены, кодирующие С антител человека и C антител человека, и экспрессирования кодирующей последовательности путем введения экспрессирующего вектора в клетки животных. В качестве домена C химерных антител человека это может быть любая область, которая принадлежит иммуноглобулину человека, но подходят таковые из класса IgG и также можно использовать любые из подклассов класса IgG типа IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. А в качестве C химерных антител человека это может быть любая область, которая принадлежит Ig, и можно использовать области из класса каппа или класса лямбда. Методы получения химерных антител включают стандартные методы рекомбинантной ДНК и трансфекции генов, хорошо известные в данной области (см. Morrison SL et al. (1984) и патентные документы US 5,202,238 и US 5,204,244).
Гуманизованные антитела человека по настоящему изобретению могут быть получены путем получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих домены CDR, как описано ранее, конструирования экспрессирующего вектора для гуманизованных антител путем вставки их в экспрессирующий вектор, содержащий гены, кодирующие (i) константную область тяжелой цепи и каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи, идентичные таковым у антител человека, и (ii) константную область легкой цепи и каркасные участки вариабельной области легкой цепи, идентичные таковым у антител человека, и экспрессирования генов путем введения экспрессирующего вектора в подходящую линию клеток. Экспрессирующий вектор для гуманизованных антител такого типа, в котором ген, кодирующий тяжелую цепь антитела, и ген, кодирующий легкую цепь антитела, находятся в отдельных векторах, или же такого типа, в котором оба гена находятся в одном и том же векторе (тандемного типа). В отношении легкости конструирования экспрессирующего вектора для гуманизованных антител, легкости введения в линии клеток и баланса между уровнями экспрессии H- и L-цепей антитела в данных клетках предпочтительным является экспрессирующий вектор для гуманизованных антител тандемного типа. Примеры экспрессирующих векторов для гуманизованных антител тандемного типа включают pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 и др.
Методы гуманизации антител на основе общепринятых методов рекомбинантной ДНК и трансфекции генов хорошо известны в данной области (напр., см., Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). Антитела можно гуманизировать различными методами, известными в данной области, включая, к примеру, пересадку CDR (EP 239,400; PCT publication WO 91/09967; US. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; и 5,585,089), облицовку или перелицовку (EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994) и перетасовку цепей (U.S. Pat. No. 5,565,332). Общая технология рекомбинантной ДНК для получения таких антител также известна (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Application WO 96/02576).
Fab-фрагменты по настоящему изобретению можно получить путем обработки антител, специфически реагирующих с AMH, протеазой папаином. Также Fab можно получить путем встраивания ДНК, кодирующей Fab антитела, в вектор для прокариотической системы экспрессии или для эукариотической системы экспрессии и введения вектора в прокариоты или эукариоты (как потребуется) для экспрессии Fab.
2
2
F(ab′)-фрагменты по настоящему изобретению можно получить путем обработки антител, специфически реагирующих с AMH, протеазой пепсином. Также F(ab′) можно получить путем связывания Fab′, описанных ниже, через тиоэфирную связь или дисульфидную связь.
2
Fab′-фрагменты по настоящему изобретению можно получить путем обработки F(ab′), специфически реагирующих с AMH, восстановителем дитиотреитолом. Также Fab′ можно получить путем встраивания ДНК, кодирующей Fab′-фрагмент антитела, в экспрессирующий вектор для прокариот или экспрессирующий вектор для эукариот и введения вектора в прокариоты или эукариоты (как потребуется) для его экспрессии.
H
L
scFv по настоящему изобретению можно получить путем получения кДНК, кодирующей домены V и V, как описано ранее, конструирования ДНК, кодирующей scFv, встраивания ДНК в экспрессирующий вектор для прокариот или экспрессирующий вектор для эукариот, а затем введения экспрессирующего вектора в прокариоты или эукариоты (как потребуется) для экспрессии scFv.
Для получения гуманизованных фрагментов scFv можно использовать хорошо известную технологию пересадки CDR, которая включает отбор определяющих комплементарность участков (CDR) из донорного фрагмента scFv и пересадку их в каркас фрагмента scFv человека с известной трехмерной структурой (напр., см., WO 98/45322; WO 87/02671; US 5,859,205; US 5,585,089; US 4,816,567; EP 0173494).
H
L
Инженерные антитела по настоящему изобретению также включают такие, у которых были внесены модификации в каркасные остатки в пределах V и/или V, напр., чтобы улучшить свойства антител. Обычно такие каркасные модификации проводятся для снижения иммуногенности антител. Например, один из подходов заключается в “обратной мутации” одного или нескольких каркасных остатков до соответствующей гаметной после довательности. В частности, антитело, которое подверглось соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от той гаметной последовательности, из которой получено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения каркасных последовательностей антитела с теми гаметными последовательностями, из которых получено антитело. Чтобы вернуть последовательности каркасных участков в гаметную конфигурацию, соматические мутации можно “подвергнуть обратной мутации” в гаметную последовательность, к примеру, с помощью сайт-направленного мутагенеза или опосредованного ПЦР мутагенеза. Такие “подвергнутые обратной мутации” антитела также охватываются изобретением. Другой тип каркасных модификаций включает мутацию одного или нескольких остатков в пределах каркасных участков или даже внутри одного или нескольких участков CDR для удаления T-клеточных эпитопов, чтобы тем самым уменьшить потенциальную иммуногенность антитела. Этот подход еще называют “деиммунизацией” и он более подробно описан в U.S. Patent Publication No. 2003/0153043 от Carr et al.
Инженерия Fc
Антитела по изобретению могут характеризоваться одним или несколькими функциональными или структурными признаками описанных выше аспектов или любой комбинацией выбранных функциональных и структурных признаков.
Антитела по изобретению могут быть любого изотипа. Выбор изотипа обычно определяется требуемыми эффекторными функциями типа сайленсинга ADCC. Типичными изотипами являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Можно использовать любые из константных областей легкой цепи человека: каппа или лямбда. При желании класс антител по настоящему изобретению можно переключать известными способами. Как правило, методы переключения класса могут применяться для преобразования одного подкласса IgG в другой, к примеру, из IgG1 в IgG2. Так, эффекторные функции антител по настоящему изобретению можно изменять путем переключения изотипа, напр., в антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различных терапевтических применений. В некоторых воплощениях антитела по изобретению представляют собой полноразмерные антитела. В некоторых воплощениях полноразмерные антитела представляют собой антитела IgG1. В некоторых воплощениях полноразмерные антитела представляют собой антитела IgG4. В некоторых воплощениях BTN2-специфичные антитела IgG4 представляют собой стабилизированные антитела IgG4. Примерами подходящих стабилизированных антител IgG4 являются антитела, в которых аргинин в положении 409 константной области тяжелой цепи IgG4 человека, который указан в индексе EU так же, как в Kabat et al. выше, заменен на лизин, треонин, метионин или лейцин, предпочтительно лизин (как описано в WO 2006/033386), и/или шарнирная область содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys. Другие подходящие стабилизированные антитела IgG4 раскрыты в WO 2008/145142.
H
H
2
В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению не содержат Fc-части, которая индуцирует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Термины “Fc-домен”, “Fc-часть” и “Fc-область” относятся к С-концевому фрагменту тяжелой цепи антител, напр., примерно от аминокислоты (а.к.) 230 до а.к. 450 тяжелой цепи гамма человека или к соответствующей последовательности в других типах тяжелых цепей антител (напр., α, δ, ε и μ для антител человека) либо их природных аллотипах. Если не указано иначе, в настоящем описании применяется общепринятая нумерация аминокислот для иммуноглобулинов по Kabat (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению не содержат Fc-домена, способного существенно связываться с полипептидом FcγRIIIA (CD16). В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению лишены Fc-домена (напр., лишены домена C2 и/или C3) или содержит Fc-домен изотипа IgG2 или IgG4. В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению состоят из или включают Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′), Fv, диатела, одноцепочечные фрагменты антител или же мультиспецифичные антитела, содержащие несколько различных фрагментов антител. В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению не связаны с токсичными молекулами. В некоторых воплощениях можно заменить одну или несколько аминокислот из числа аминокислотных остатков на другие аминокислотные остатки с тем, чтобы изменить связывание антитела с C2q и/или уменьшить или устранить комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Этот подход более подробно описан в U.S. Patent No. 6,194,551.
1
10
Другая модификация антител, предусмотренная настоящим изобретением, заключается в пегилировании. Антитела могут быть пегилированы, к примеру, для повышения биологического (напр., в сыворотке) периода полужизни антител. Для пегилирования антител обычно антитело или его фрагмент подвергают реакции с полиэтиленгликолем (ПЭГ) типа реакционноспособного эфира или альдегидного производного ПЭГ в условиях, при которых к антителу или фрагменту антитела присоединяется одна или несколько групп ПЭГ. Пегилирование может проводиться по реакции ацилирования или по реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В настоящем изобретении термин “полиэтиленгликоль” охватывает любые формы ПЭГ, которые используются для дериватизации других белков, типа моно-(C-C)-алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоля или полиэтиленгликоль-малеимида. В некоторых воплощениях подлежащие пегилированию антитела представляют собой агликозилированные антитела. Способы пегилирования белков известны в данной области и могут применяться к антителам по настоящему изобретению. К примеру, см. EP 0154316 на Nishimura et al. и ЕР 0401384 на Ishikawa et al.
Другая модификация антител, предусмотренная изобретением, заключается в конъюгировании или слиянии как минимум антигенсвязывающей области антитела по настоящему изобретению с сывороточным белком типа человеческого сывороточного альбумина или его фрагментом для повышения времени полужизни образующейся молекулы.
2
Н
H
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
H
В некоторых воплощениях изобретения также предусмотрены мультиспецифичные антитела. Типичные форматы для молекул мультиспецифичных антител по изобретению включают, без ограничения, (i) два антитела, сшитые вместе посредством химической гетероконъюгации, одно со специфичностью к BTN2, а другое со специфичностью ко второму антигену; (ii) одно антитело, содержащее два разных антигенсвязывающих участка; (iii) одноцепочечное антитело, содержащее два разных антигенсвязывающих участка, напр., два scFv, связанные в тандем через дополнительный пептидный линкер; (iv) антитело с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig), в котором каждая легкая цепь и тяжелая цепь содержит два вариабельных домена в тандеме через короткую пептидную связку (Wu et al., Generation and characterization of a dual variable domain immunoglobulin (DVD-Ig™) molecule. In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (v) химически связанный биспецифичный (Fab′)-фрагмент; (vi) Tandab, который представляет собой слияние двух одноцепочечных диател с образованием тетравалентного биспецифичного антитела, которое содержит два сайта связывания для каждого из целевых антигенов; (vii) флекситело, которое представляет собой комбинацию scFv с диателом с образованием поливалентной молекулы; (viii) так называемая молекула «замка на причале» (dock and lock) на основе “домена димеризации и стыковки” в протеинкиназе А, что в применении к Fabs дает тривалентный биспецифичный связывающий белок, состоящий из двух идентичных Fab-фрагментов, связанных с другим Fab-фрагментом; (ix) так называемая молекула Scorpion, содержащая, напр., два scFv, слитые с обоими концами Fab-плеча человека; и (х) диатело. Другим типичным форматом биспецифичных антител являются IgG-подобные молекулы с комплементарными доменами С3 для усиления гетеродимеризации. Такие молекулы могут быть получены по известной технологии, такой, напр., как технологии, известные как Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), кнопки в дырках (Genentech), CrossMAb (Roche) и электростатически подогнанные молекулы (Amgen), LUZ-Y (Genentech), сконструированные путем обмена нитей доменные антитела (SEED) (EMD Serono), технологии Biclonic (Merus) и DuoBody (Genmab A/S). В некоторых воплощениях биспецифичные антитела получают или получаемы путем контролируемого обмена Fab-плеча, как правило, по технологии DuoBody. В WO 2008/119353 и WO 2011/131746 (оба от Genmab A/S) описаны способы получения биспецифичных антител in vitro путем контролируемого обмена Fab-плеча. В одном типичном способе, описанном в WO 2008/119353, биспецифичное антитело образуется при обмене “Fab-плеча” или “половинки молекулы” (перестановке тяжелой цепи вместе с легкой цепью) между двумя моноспецифичными антителами, содержащими IgG4-подобные области C3, при инкубации в восстановительных условиях. Полученный продукт представляет собой биспецифичное антитело с двумя Fab-плечами, которые могут иметь разные последовательности. В другом типичном способе, описанном в WO 2011/131746, биспецифичные антитела по настоящему изобретению получают способом, включающим следующие стадии, причем по меньшей мере одно из первого и второго антител представляет собой антитело по настоящему изобретению: a) получение первого антитела, содержащего Fc-область иммуноглобулина, причем Fc-область содержит первый участок С3; b) получение второго антитела, содержащего Fc-область иммуноглобулина, причем Fc-область содержит второй участок С3; при этом последовательности первого и второго участков С3 различны, так что гетеродимерное взаимодействие между первым и вторым участками С3 будет сильнее, чем каждое из гомодимерных взаимодействий между первым и вторым участком С3; c) инкубирование первого антитела вместе со вторым антителом в восстановительных условиях; и d) получение соответствующего биспецифичного антитела, причем первое антитело представляет собой антитело по настоящему изобретению, а второе антитело обладает другой специфичностью связывания, или наоборот. Восстановительные условия могут быть обеспечены, к примеру, добавлением восстановителя, напр., из числа 2-меркаптоэтиламина, дитиотреитола и трис(2-карбоксиэтил)фосфина. Стадия d) может дополнительно включать возвращение условий до невосстановительных или менее восстановительных, к примеру, путем удаления восстановителя, напр., путем обессоливания. Предпочтительно последовательности первого и второго участка С3 являются различными, включающими лишь несколько довольно консервативных асимметричных мутаций, так что гетеродимерное взаимодействие между первым и вторым участком С3 будет более сильным, чем каждое из гомодимерных взаимодействий между первым и вторым участком C3. Более подробно об этих взаимодействиях и о том, как они могут осуществляться, изложено в WO 2011/131746, которая включена сюда путем ссылки во всей полноте. Далее представлены типичные варианты комбинаций таких ассиметричных мутаций, необязательно при этом одна или обе Fc-области имеют изотип IgG1.
Применения и способы по изобретению
Антитела или белки по настоящему изобретению имеют диагностические и терапевтические применения in vitro и in vivo. Например, эти молекулы можно вводить в клетки в культуре, напр., in vitro или in vivo, либо субъектам, напр., in vivo, для лечения, профилактики или диагностики различных заболеваний.
Способы особенно подходят для лечения, профилактики или диагностики связанных с BTN2 заболеваний и/или аутоиммунных, воспалительных заболеваний и отторжения трансплантатов.
Изобретение также касается способов изготовления лекарственных средств для применения при лечении воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов органов или тканей, причем лекарственные средства содержат антитела против BTN2 по настоящему изобретению, как описано в предыдущих разделах.
В настоящем изобретении “связанные с BTN2 заболевания” включают заболевания, связанные или характеризующиеся аномальным уровнем BTN2A1 или BTN2A2, и/или заболевания, которые можно лечить путем модулирования индуцированной BTN2A1 и/или BTN2A2 сигнальной активности в клетках крови человека, напр., путем ингибирования продукции IFNγ или TNFα в активированных T-клетках Vγ9/Vδ2 и/или цитолитической функции активированных T-клеток Vγ9/Vδ2. К ним относятся воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантатов органов или тканей.
Примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить, включают, без ограничения, ревматоидный артрит (RA), инсулинозависимый сахарный диабет (диабет 1 типа), рассеянный склероз (MS), болезнь Крона, системную красную волчанку (SLE), склеродермию, синдром Шегрена, пузырчатку обыкновенную, пемфигоид, болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, апластическую анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, целиакию, дерматомиозит, синдром Гудпастура, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, идиопатическую лейкопению, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, мужское бесплодие, смешанное заболевание соединительной ткани, миастению, пернициозную анемию, белково-анафилактический увеит, первичный билиарный цирроз, первичную микседему, синдром Рейтера, синдром ригидности, тиреотоксикоз, язвенный колит и гранулематоз Вегенера.
Антитела по изобретению можно вводить в качестве единственного активного ингредиента или в сочетании, напр., в качестве адъюванта или в сочетании с другими препаратами, напр., иммуносупрессивными или иммуномодулирующими средствами или с другими противовоспалительными средствами, напр., для лечения или профилактики приведенных выше заболеваний.
Предметом настоящего изобретения является способ ингибирования иммунного ответа у субъекта, в частности, ингибирования цитолитических свойств T-клеток Vγ9/Vδ2 у нуждающегося в этом субъекта, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении термин “лечение” или “лечить” относится и к профилактическому, и к лечебному или модифицирующему заболевание лечению, включая лечение субъектов, подверженных риску заболевания или с подозрением на заболевание, а также субъектов, болеющих или с диагнозом конкретного заболевания или медицинского состояния, и включает подавление клинических рецидивов. Лечение может назначаться субъектам с медицинским заболеванием или тем, кто в конечном итоге могут подхватить заболевание с тем, чтобы предотвратить, излечить, замедлить возникновение, уменьшить тяжесть или ослабить один или несколько симптомов заболевания или рецидива заболевания или же с тем, чтобы продлить срок жизни субъекта сверх ожидаемого в отсутствие такого лечения. Под “терапевтическим режимом” понимается схема лечения заболевания, напр., схема дозирования во время терапии. Терапевтический режим может включать вводный режим и поддерживающий режим. Выражение “вводный режим” или “вводный период” означает такой терапевтический режим (или часть терапевтического режима), который применяется для начального лечения заболевания. Общая цель вводного режима состоит в том, чтобы обеспечить высокий уровень препарата у субъекта в начальный период режима лечения. При вводном режиме может применяться (частично или полностью) “нагрузочный режим”, который может включать введение большей дозы препарата, чем врач использовал бы при поддерживающем режиме, введение препарата чаще, чем врач вводил бы препарат при поддерживающем режиме или то и другое. Выражение “поддерживающий режим” или “поддерживающий период” означает такой терапевтический режим (или часть терапевтического режима), который применяется для поддержания субъекта во время лечения заболевания, напр., для поддержания субъекта в состоянии ремиссии в течение длительного времени (месяцы или годы). При поддерживающем режиме может применяться непрерывная терапия (напр., введение препарата через регулярные интервалы, напр., еженедельно, ежемесячно, ежегодно и т.д.) либо прерывистая терапия (напр., лечение с перерывами, периодическое лечение, лечение при рецидиве или лечение по достижении определенных предустановленных критериев (напр., проявлений болезни и т.д.).
В настоящем изобретении термин “терапевтически эффективное количество” означает такое количество, которое при дозировках и в течение необходимого периода времени эффективно для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антител по настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивида, а также способности антител по настоящему изобретению вызвать требуемую реакцию у индивида. Также терапевтически эффективное количество – такое количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела перевешиваются терапевтически полезными эффектами. Эффективные дозировки и схемы дозировки для антител по настоящему изобретению зависят от подлежащего лечению заболевания и могут быть определены специалистами в данной области. Врач с рядовой квалификацией в данной области сможет легко определить и назначить эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач может начать дозы антител по настоящему изобретению, применяемых в фармацевтической композиции, с меньшего уровня, чем это нужно для достижения требуемого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозировку до достижения требуемого эффекта. В общем, подходящая доза композиции по настоящему изобретению должна составлять такое количество соединения, которое дает наименьшую дозу, эффективную для получения терапевтического эффекта в соответствии с данной схемой дозировки. Такая эффективная доза обычно зависит от вышеописанных факторов. Например, терапевтически эффективное количество для терапевтического применения можно измерить по его способности стабилизировать течение заболевания. Как правило, пригодность соединения для лечения, к примеру, аутоиммунных заболеваний оценивают в модельной системе на животных, прогнозирующей эффективность лечения аутоиммунных заболеваний. С другой стороны, это свойство композиции можно оценивать путем изучения способности соединения ингибировать индукцию иммунного ответа при анализах in vitro, известных специалистам в данной области. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может снижать иммунные или воспалительные реакции или иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Рядовой специалист в данной области сможет определить такое количество на основании таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная композиция или выбранный способ введения. Типичный, без ограничения, диапазон для терапевтически эффективного количества антител по настоящему изобретению составляет 0,1-100 мг/кг, как-то 0,1-50 мг/кг, к примеру, 0,1-20 мг/кг, как-то 0,1-10 мг/кг, к примеру, около 0,5, около 0,3, около 1, около 3 мг/кг, около 5 мг/кг или около 8 мг/кг. Типичный, без ограничения, диапазон для терапевтически эффективного количества антител по настоящему изобретению составляет 0,02-100 мг/кг, как-то 0,02-30 мг/кг, типа 0,05-10 мг/кг или 0,1-3 мг/кг, к примеру, 0,5-2 мг/кг. Введение, напр., может проводится внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно, к примеру, можно вводить проксимально к целевому участку. Схемы дозировки в вышеприведенных способах лечения и применения подбираются для получения оптимальной требуемой реакции (напр., терапевтической реакции). Например, можно вводить одним болюсом, можно вводить несколько дробных доз по времени или же можно пропорционально снижать или повышать дозу в зависимости от требований терапевтической ситуации. В некоторых воплощениях контролируется эффективность лечения во время терапии, напр., в заранее определенные моменты времени. В некоторых воплощениях эффективность может контролироваться путем визуализации пораженного участка или другими методами диагностики, описанными далее, напр., провести одно или несколько сканирований PET-CT, к примеру, используя меченое антитело по настоящему изобретению, фрагмент или мини-антитело, полученное из антитела по настоящему изобретению. При необходимости эффективную суточную дозу фармацевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более дробных доз, вводимых раздельно через соответствующие промежутки в течение дня, необязательно в стандартных дозовых формах. В некоторых воплощениях человеческие моноклональные антитела по настоящему изобретению вводятся путем медленного непрерывного вливания на протяжении длительного времени типа более 24 часов, чтобы минимизировать любые нежелательные побочные эффекты. Эффективная доза антител по настоящему изобретению также может вводиться по еженедельной, двухнедельной или трехнедельной схеме дозирования. Период дозирования может ограничиваться, напр., 8 неделями, 12 неделями или до установления клинического прогресса. В качестве неограничительных примеров, лечение по настоящему изобретению может проводиться в виде суточной дозы антител по настоящему изобретению в количестве 0,1-100 мг/кг, как-то 0,2, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в день, по меньшей мере в один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или же по меньшей мере в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения, или в любой комбинации, используя разовые или дробные дозы каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 часа или в любой комбинации.
Как правило, антитела по настоящему изобретению вводятся субъектам в виде фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в этих композициях, включают, без ограничения, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки типа человеческого сывороточного альбумина, буферные вещества типа фосфатов, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, частичные смеси глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты типа протаминсульфата, динатрийфосфата, монокалийфосфата, хлорида натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воск, блок-полимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин. Для применения при введении пациентам композиции составляют в виде лекарственных форм. Композиции по настоящему изобретению можно вводить перорально, парентерально, через ингалятор, топически, интраректально, назально, буккально, интравагинально или через имплантированный резервуар. В настоящем изобретении применяются подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутрисуставные, внутрисиновиальные, интрастернальные, интратекальные, внутрипеченочные, внутриочаговые и внутричерепные методы инъекции или инфузии. Стерильные формы для инъекции композиций по настоящему изобретению могут представлять собой водные или масляные суспензии. Эти суспензии могут быть составлены по известным методикам с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ. Стерильные препараты для инъекций также могут представлять собой стерильные растворы или суспензии для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, к примеру, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. К приемлемым носителям и растворителям, которые можно использовать, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно применяются стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любое пресное нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. При приготовлении препаратов для инъекций применимы жирные кислоты типа олеиновой кислоты и ее глицеридных производных, а также натуральные фармацевтически приемлемые масла типа оливкового масла или касторового масла, особенно в их полиоксиэтилированных вариантах. Эти масляные растворы или суспензии также могут содержать длинноцепочечный спиртовый разбавитель или диспергатор типа карбоксиметилцеллюлозы или аналогичные диспергирующие средства, которые обычно применяются в рецептурах фармацевтически приемлемых дозовых форм, включая эмульсии и суспензии. Также для получения лекарственных форм можно использовать и другие распространенные поверхностно-активные вещества типа Tween, Span и другие эмульгаторы или усилители биодоступности, которые обычно применяются при изготовлении фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других дозовых форм. Композиции по настоящему изобретению можно вводить перорально в любой перорально приемлемой дозовой форме, включая, без ограничения, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения распространенные носители включают лактозу и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют смазывающие вещества типа стеарата магния. Полезные разбавители для перорального введения в виде капсул включают, напр., лактозу. Когда для перорального применения требуются водные суспензии, то активный ингредиент смешивают с эмульгирующими и суспендирующими средствами. Если нужно, можно также добавлять определенные подсластители, ароматизаторы или красители. С другой стороны, композиции по настоящему изобретению можно вводить в виде свечей для ректального введения. Их можно получить путем смешивания агента с подходящим нераздражающим наполнителем, который будет твердым при комнатной температуре, но жидким при ректальной температуре и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением препарата. Такие материалы включают масло какао, пчелиный воск и полиэтиленгликоли. Композиции по настоящему изобретению также можно вводить топически, особенно когда мишень для лечения включает зоны или органы, легко доступные для местного нанесения, включая заболевания глаз, кожи или нижней части кишечного тракта. Подходящие топические формы легко готовятся для каждой из этих зон или органов. Для местного нанесения композиции могут быть составлены в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одном или нескольких носителях. Носители для местного введения соединений по настоящему изобретению включают, без ограничения, минеральное масло, вазелиновое масло, белый вазелин, пропиленгликоль, соединения полиоксиэтилена, полиоксипропилена, восковый эмульгатор и воду. С другой стороны, композиции могут быть составлены в виде подходящего лосьона или крема, содержащего активные компоненты, суспендированные или растворенные в одном или нескольких фармацевтически приемлемых носителях. Подходящие носители включают, без ограничения, минеральное масло, моностеарат сорбитана, полисорбат 60, воскообразные цетиловые эфиры, цетостеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду. Местное нанесение для нижней части кишечного тракта может осуществляться в виде ректальных свечей (см. выше) или в виде подходящей клизмы. Также можно использовать пластыри. Композиции по настоящему изобретению также можно вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции получают по методикам, хорошо известным в области лекарственных форм, и их можно получать в виде растворов в солевом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, усилителей всасывания для улучшения биодоступности, фторуглеродов и/или других стандартных солюбилизирующих или диспергирующих веществ.
2
2
Например, антитело в составе фармацевтической композиции по настоящему изобретению может поставляться в концентрации 10 мг/кг в одноразовых флаконах по 100 мг (10 мл) или 500 мг (50 мл). Продукт составлен для внутривенного введения в стерильной воде для инъекций с 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/кг цитрата натрия дигидрата и 0,7 мг/кг полисорбата 80. Его доводят до pH 6,5. Типичный подходящий диапазон доз для антитела в фармацевтической композиции по настоящему изобретению может составлять от 1 мг/м до 500 мг/м. Однако следует понимать, что эти схемы являются примерными, а оптимальный график и режим можно адаптировать с учетом сродства и переносимости конкретного антитела в фармацевтической композиции, что необходимо определить при клинических испытаниях. Фармацевтические композиции по изобретению для инъекций (напр., внутримышечно, в/в) можно приготовить так, чтобы они содержали стерильную забуференную воду (напр., 1 мл для внутримышечного) и от 1 нг до 100 мг, напр., от 50 нг до 30 мг, более предпочтительно от 5 мг до 25 мг антитела против BTN2 по изобретению.
Далее изобретение будет проиллюстрировано на следующих фигурах и примерах. Однако эти примеры и фигуры никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Связывание mAb к BTN2 на клетках HEK293F. Клетки HEK293F трансфецировали плазмидой BTN2A2-Flag. Через 1 день после трансфекции проводили окрашивание трансфецированных BTN2A2 клеток HEK293F (A) и нетрансфецированных клеток HEK293F (B) с помощью очищенных мышиных mAb против BTN2 человека в течение 20 мин при 4°C. В качестве положительного контроля на трансфекцию служило моноклональное антитело против Flag. После 2 отмывок клетки инкубировали со вторичным козьим антителом против IgG мыши c PE в течение 20 мин при 4°C и с маркером жизнеспособности клеток. Клетки регистрировали на LSRFortessa (BD) и анализировали с помощью FlowJo (TreeStar).
Фиг. 2. BTN2 экспрессируется в клетках раковых линий. Клетки раковых линий, полученные из солидных опухолей (A) или гематопоэтических новообразований (B), окрашивали с помощью очищенного mAb к BTN2 (8.16) (10 мкг/мл) 20 мин при 4°C. После 2 отмывок клетки инкубировали со вторичным козьим антителом против IgG мыши c PE в течение 20 мин при 4°C и с маркером жизнеспособности клеток. Клетки регистрировали на LSRFortessa (BD) и анализировали с помощью FlowJo (TreeStar). Клетки происходили из линий: рака простаты (PC3, DU145, LNCaP), меланомы (Gerlach), рака поджелудочной железы (L-IPC, Panc-1, Mia-PACA-2), колоректального рака (Caco-2), Hela (рака шейки матки), рака почек (A498), рака легких (A549), рака молочной железы (MDA-MB-134, MDA-MB-231, SKBR3), лимфомы Беркитта (Daudi, Raji), неходжкинской лимфомы (RL), хронического миелогенного лейкоза (K562), острого миелобластного лейкоза (U937).
Фиг. 3. mAb к BTN2 ингибируют цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2. T-клетки γδ размножали из PBMC от 6 здоровых доноров (см. Материалы и методы). Очищенные T-клетки γδ стимулировали в течение ночи с IL-2 (200 ед./мл). Затем T-клетки γδ культивировали при 37°C совместно с целевыми клетками линии Daudi (при соотношении эффектор:мишень (E:T) 1:1) с антителами против CD107a и антителами против CD107b и GolgiStop, в присутствии mAbs против BTN2 (4.15, 5.28, 7.28, 7.48, 8.15, 8.16, 8.33) (10 мкг/мл) или без них. Через 4 часа клетки собирали, фиксировали и пермеабилизировали, а затем окрашивали с помощью внутриклеточных mAb (IFN-γ, TNF-α) и анализировали методом проточной цитометрии. На фигуре представлена (А) дегрануляция T-клеток γδ и продукция воспалительных цитокинов (В) TNF-α, (С) IFN-γ. Нижняя пунктирная линия представляет базальную цитолитическую функцию T-клеток γδ против клеток линии Daudi.
Фиг. 4. mAb к BTN2 ингибируют агонистическое действие mAb против CD277 (20.1) на цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2. Очищенные T-клетки γδ стимулировали в течение ночи с IL-2 (200 ед./мл). Затем T-клетки γδ культивировали при 37°C совместно с целевыми клетками линии Daudi (при соотношении эффектор:мишень (E:T) = 1:1) с антителом против CD107a и антителом против CD107b и GolgiStop, в присутствии mAbs против BTN2 (4.15, 5.28, 7.28, 7.48, 8.15, 8.16, 8.33) или без них в сочетании с mAb 20.1 против CD277 или без него. Через 4 часа клетки собирали и анализировали методом проточной цитометрии. На фигуре представлен процент положительных по CD107 (маркер дегрануляции) клеток среди T-клеток γδ. Нижняя пунктирная линия представляет базальную дегрануляцию T-клеток γδ против клеток линии Daudi. Верхняя пунктирная линия представляет средний уровень дегрануляции в присутствии антитела 20.1 против CD277.
Фиг. 5. mAb к BTN2 не дают перекрестной реакции с клетками HEK293F, трансфецированными изоформами CD277 (BTN3A1, BTN3A2 или BTN3A3). Клетки HEK293F, трансфецированные BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3, и нетрансфецированные клетки HEK293F окрашивали с помощью очищенных мышиных mAb против BTN2 человека или мышиного mAb 20.1 против CD277 человека или изотипического контрольного IgG1 в течение 20 мин при 4°C. В качестве положительного контроля на трансфекцию служило антитело против Flag. После 2 отмывок клетки инкубировали со вторичным козьим антителом против IgG мыши с PE в течение 20 мин при 4°C и с маркером жизнеспособности клеток. Клетки регистрировали на LSRFortessa (BD) и анализировали с помощью FlowJo (TreeStar).
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Культуры клеток
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) получали от здоровых добровольных доноров (HV), предоставленных местным банком крови (EFS-Marseille-France), и выделяли с помощью градиента плотности (Eurobio).
6
Клетки лимфомы Беркитта линии Daudi получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и культивировали (0,5×10/мл) в среде RPMI 1640 с 10% FCS.
Размножение T-клеток γδ
6
Эффекторные T-клетки γδ получали, как описано ранее. В день 0 PBMC от HV стимулировали золедронатом (Sigma, 1 мкМ) и rhIL-2 (Proleukin, 200 МЕ/мл). Начиная с дня 5, rhIL-2 обновляли каждые два дня и хранили клетки при 1,15×10/мл в течение 15 дней. В последний день определяли чистоту T-клеток γδ методом проточной цитометрии. Для использования в функциональных тестах отбирали только те культуры клеток, которые достигли более 80% T-клеток γδ. Очищенные T-клетки γδ оттаивали перед использованием.
Получение моноклональных антител (mAbs)
Мышиные антитела против BTN2 человека (клоны 4.15, 5.28, 7.28, 7.48, 8.15, 8.16, 8.33 с изотипом IgG1) и мышиное антитело против CD277 человека (также известного как BTN3A; клон 20.1 с изотипом IgG1) выделяли из супернатантов клеточных культур.
Проточная цитометрии
PBMCs, очищенные T-клетки γδ или клетки раковых линий инкубировали с указанными mAb и проводили анализ на LSRFortessa (Becton Dickinson) с помощью программы DIVA (BD Bioscience). Антитела, использованные для анализа дегрануляции T-клеток γδ, использовали следующие антитела: против CD107a-FITC (BD Biosciences), против CD107b-FITC (BD Biosciences), против CD3-PeVio700 (Miltenyi), против Tgd-PE (Miltenyi), живые/мертвые в ближнем IR (ThermoFisher). Для скрининга на экспрессию BTN2 в клетках раковых линий использовали следующие антитела: очищенные против BTN2 (клон 8.16, 10 мкг/мл), реактив FcR Block (Miltenyi), козьи против PE мыши (Jackson Immunoresearch), живые/мертвые в ближнем IR (ThermoFisher).
Функциональные анализы на T-клетках γδ
Очищенные T-клетки γδ от HV культивировали в течение ночи с IL-2 (200 ед./мл). Затем T-клетки γδ культивировали при 37°C совместно с целевыми клетками линии Daudi (при соотношении эффектор:мишень (E:T) = 1:1) и проводили цитотоксические тесты в 4-часовых пробах в присутствии GolgiStop и растворимого CD107(a&b)-FITC, с mAbs против BTN2 (4.15, 5.28, 7.28, 7.48, 8.15, 8.16, 8.33) или без них и/или с mAb 20.1 против CD277 (10 мкг/мл), с активацией фосфоагонистами (Pag) или без нее. Через 4 часа клетки собирали, фиксировали и пермеабилизировали, а затем окрашивали с помощью внутриклеточных mAb (IFN-γ, TNF-α). Наконец, клетки ресуспендировали в PBS с 2% параформальдегида и сразу же анализировали на BD LSRFortessa (BD Biosciences, San Jose, CA). Измеряли уровень цитолитической функции T-клеток γδ на основе процента клеток, положительных по CD107a и CD107b (дегрануляция), и/или продукции воспалительных цитокинов (IFN-γ, TNF-α).
Тест на связывание mAb против BTN2 на экспрессирующих BTN2A1 и BTN2A2 клетках
Создавали клетки HEK-293F, несущие опосредованные CRISPR-Cas9 делеции всех изоформ BTN3 и BTN2 (293F BTN3/BTN2 KO) (данные не приводятся), культивировали их в DMEM (Life Technologies) с 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (ThermoFisher Scientific) и трансфецировали независимо pcDNA3-Zeo-BTN2A1-CFP или pcDNA3-Zeo-BTN2A2-CFP, кодирующими слитые с CFP(Nter) белки BTN2A1 и BTN2A2, с помощью реагента Lipofectamine 2000 (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя.
Проточная цитометрия
4
Через 24 часа после трансфекции собирали клетки (5×10 на 1 образец) и окрашивали в двух повторах при указанных концентрациях (2-кратные разведения, начиная с 20 мкг/мл и до 64 пг/мл) всех 7 очищенных антител против BTN2 человека в 50 мкл окрашивающего буфера (DPBS1X (ThermoFisher Scientific), 1% FBS, 1 мМ EDTA (ThermoFisher Scientific)) в течение 30 мин при 4°C. В качестве изотипного контроля на окрашивание использовали такие же концентрации мышиного антитела к IgG1 (Miltenyi). Затем клетки дважды промывали 200 мкл окрашивающего буфера и инкубировали с конъюгированным с PE козьим антителом против Ig мыши в разведении 1:200 (Jackson ImmunoResearch) в окрашивающем буфере в течение 30 мин при 4°C в темноте. Наконец, клетки дважды промывали в окрашивающем буфере, а затем фиксировали с помощью реагента BD Cytofix (BD Bioscience) согласно инструкциям производителя. Определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) на канале для PE в CFP-положительной популяции для каждого образца на Cytoflex LX (Beckman Coulter) и анализировали с помощью программы FlowJo v10.4.2 (FlowJo, LLC 2006-2018).
Статистика
50
Определяли EC очищенных mAbs против BTN2 человека на трансфецированных BTN2A1 и BTN2A2 клетках 293F BTN3/BTN2 KO на основе кривых лог(доза)-ответ после нелинейной регрессии на модели с переменным наклоном. Эти анализы проводились с помощью программы GraphPad Prism 7.04 (GraphPad).
Пролиферация T-клеток γδ
5
Выделяли T-клетки γδ из PBMCs от здоровых доноров с помощью набора с микрошариками против TCR γδ (Miltenyi Biotec). Чистота T-клеток γδ при оценке методом проточной цитометрии была cвыше 80%. T-клетки γδ метили CellTrace Violet в течение 20 мин при 37°C. Затем 5×10 помеченных CellTrace клеток культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в присутствии 200 МЕ/мл IL-2 с PAg или без них и с антителами против BTN2 или без них (10 мкг/мл). После 5 дней культивирования определяли разведение CellTrace методом проточной цитометрии на BD LSRFortessa (BD Biosciences, San Jose, CA).
Статистика
Результаты выражали в виде медианы ± SEM. Статистический анализ проводили с помощью корреляции Спирмена, критерия Уилкоксона и t-критерия Манна-Уитни. Значения p<0,05 считались значимыми. Анализы проводили с помощью программы GraphPad Prism.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Идентификация эталонных антител mAb1-mAb7
Эталонные антитела mAb1-mAb7 получали следующим образом.
Мышей иммунизировали антигеном BTN2A1-Fc. Собирали спленоциты мышей и сливали с миеломой, получая гибридомы. Проводили скрининг и выделяли гибридомы, вырабатывающие антитела с наивысшим сродством к BTN2, получая гибридомы, депонированные как CNCM I-5231, CNCM I-5232, CNCM I-5233, CNCM I-5234, CNCM I-5235, CNCM I-5236 и CNCM I-5237, способные вырабатывать mAb1-mAb7, соответственно.
Гибридома, вырабатывающая mAb7 (mAb 8.33), которая служит в качестве сравнительного контроля для антител по настоящему изобретению, была депонирована 14 сентября 2017 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Франция) в соответствии с условиями Будапештского договора.
Депонированная гибридома для mAb 8.33 имеет в CNCM номер депозита CNCM I-5237.
Связывание mAbs 1-6 с клетками HEK293F
На графиках из фиг. 1 представлены кривые титрования сродства мышиных mAb против BTN2 человека на клетках HEK293F, трансфецированных BTN2A2 человека (фиг. 1A), или нетрансфецированных клетках HEK293F (фиг. 1B).
50
В приведенной ниже таблице указаны значения EC каждого антитела. Все исследованные антитела были способны распознавать и связываться с BTN2A2 на клетках HEK, за исключением mAb 8.33 (mAb7), которое не связывается с BTN2A2 по данным проточной цитометрии.
Антитело
Название клона
EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
mAb1
mAb 4.15
0,07
mAb2
mAb 5.28
0,07
mAb3
mAb 7.28
31,3
mAb4
mAb 7.48
0,08
mAb5
mAb 8.15
0,10
mAb6
mAb 8.16
0,11
mAb7
mAb 8.33
-
Полипептид BTN2 экспрессируется в клетках раковых линий
Клетки раковых линий инкубировали с mAb6 (мышиное mAb 8.16 против BTN2), а затем со вторичным козьим антителом против IgG мыши с PE. Как видно из фиг. 2, наблюдалась широкая экспрессия белка BTN2 на панели клеток раковых линий, полученных из солидных опухолей или гематопоэтических новообразований, включая клетки линии Daudi (лимфома Беркитта), стандартной линии клеток, используемой при анализе дегрануляции T-клеток Vγ9Vδ2.
mAbs 1-6 ингибируют цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2
Размножали T-клетки Vγ9Vδ2, выделенные из РВМСs от здоровых доноров. T-клетки Vγ9Vδ2 культивировали совместно с целевыми клетками Daudi. Как видно из фиг. 3, добавление mAb 1-6 против BTN2 ведет к ингибированию цитолитической функции T-клеток Vγ9Vδ2 против целевых клеток линии Daudi при измерении по дегрануляции CD107 и продукции воспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ).
Контрольное антитело mAb7 (mAb 8.33), которое не связывается с BTN2A2 по данным проточной цитометрии, не влияет на дегрануляцию T-клеток Vγ9Vδ2 (цитолитическую функцию) или продукцию воспалительных цитокинов.
Агонистическое антитело 20.1 против CD277 служит контрольным примером антитела, активирующего дегрануляцию T-клеток Vγ9Vδ2, а антагонистическое антитело 103.2 против CD277 служит контрольным примером антитела, ингибирующего дегрануляцию T-клеток Vγ9Vδ2.
mAbs 1-6 ингибируют агонистическое действие mAb против CD277 (20.1) на цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2
Мы также проверяли действие комбинации mAbs 1-6 против BTN2 в присутствии агонистического mAb 20.1 против CD277 (как описано в WO 2012/080351), которое усиливает дегрануляцию T-клеток Vγ9Vδ2.
Как видно из фиг. 4, mAbs 1, 2 и 4 (соответственно, mAb 4.15, 5.28, 7.48 против BTN2) вне ожидания ингибируют агонистическое действие антитела 20.1 против CD277 на цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2 против целевых клеток линии Daudi.
mAbs 5 и 6 (соответственно, mAb 8.15, 8.16 против BTN2) частично ингибируют агонистический эффект антитела 20.1 против CD277 на цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2 против целевых клеток линии Daudi.
mAb3 (mAb 7.28 против BTN2) и mAb7 (mAb 8.33 против BTN2) не проявляют существенного ингибирования агонистического действия антитела 20.1 против CD277 на цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2 против целевых клеток линии Daudi.
Комбинация антагониста 103.2 и агониста 20.1 против CD277 служит в качестве контроля: антагонистическое антитело 103.2 ингибирует агонистическое действие антитела 20.1 на цитолитическую функцию T-клеток Vγ9Vδ2 против целевых клеток линии Daudi, как описано ранее.
Результаты по характеристике mAbs 1-6 (и контрольного mAb7) сведены в приведенной ниже таблице.
Клон
EC<sub>50</sub> (мкг/мл) на клетках HEK-BTN2
Эффект на T-клетки γδ/CD107
Эффект на T-клетки γδ/CD107 в прис. 20.1
4.15
0,07
ингибирование
ингибирование
5.28
0,07
ингибирование
ингибирование
7.28
31,30
ингибирование
нет
7.48
0,08
ингибирование
ингибирование
8.15
0,10
ингибирование
част. ингибирование
8.16
0,11
ингибирование
част. ингибирование
8.33
-
нет
нет
mAbs 1-6 не дают перекрестной реакции с клетками HEK293F, трансфецированными изоформами CD277 (BTN3A1, BTN3A2 или BTN3A3)
Связывание mAbs к BTN2 с клетками HEK293F, трансфецированными какой-либо изоформой CD277 (BTN3A1, BTN3A2 или BTN3A3), было близко тому, что наблюдается на нетрансфецированных клетках HEK293F (см. фиг. 5). Можно сделать вывод, что mAbs против BTN2 не дают перекрестной реакции ни с одной изоформой CD277.
mAbs 1-6 обладают специфичностью связывания с изоформами BTN2A1 и BTN2A2 человека
Связывание mAbs 1-6 на клетках HEK293F BTN3/BTN2 KO
50
Значения EC каждого антитела по BTN2A1 и BTN2A2 указаны в приведенной ниже таблице. Все исследованные антитела против BTN2 связывались с обеими изоформами, за исключением mAb 8.33 (mAb7), которое не проявляло окрашивания при проточной цитометрии.
Антитело
Название клона
BTN2A1:EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
BTN2A2:EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
mAb1
mAb 4.15
0,06
0,01
mAb2
mAb 5.28
0,04
0,01
mAb3
mAb 7.28
0,02
11,8
mAb4
mAb 7.48
0,02
0,01
mAb5
mAb 8.15
0,08
0,5
mAb6
mAb 8.16
0,08
2,4
mAb7
mAb 8.33
-
-
Сводная таблица
Дегрануляция Tγδ(ингибирование в %)
Антитело
Название клона
BTN2A1:EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
BTN2A2:EC<sub>50</sub> (мкг/мл)
на целевых клетках (Daudi)
на клетках Daudi + mAb к BTN3 (20.1)
mAb1
mAb 4.15
0,06
0,01
>90%
>90%
mAb2
mAb 5.28
0,04
0,01
mAb3
mAb 7.28
0,02
11,8
≤10%
mAb4
mAb 7.48
0,02
0,01
>90%
mAb5
mAb 8.15
0,08
0,5
≤50%
mAb6
mAb 8.16
0,08
2,4
mAb7
mAb 8.33
-
-
нет
нет
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности для осуществления заявленного изобретения
SEQ ID NO:
Краткое описание
Последовательность
1
а.к. последовательность BTN2A1
MESAAALHFS RPASLLLLLL SLCALVSAQF IVVGPTDPIL ATVGENTTLR CHLSPEKNAE DMEVRWFRSQ FSPAVFVYKG GRERTEEQME EYRGRTTFVS KDISRGSVAL VIHNITAQEN GTYRCYFQEG RSYDEAILHL VVAGLGSKPLISMRGHEDGG IRLECISRGW YPKPLTVWRD PYGGVAPALK EVSMPDADGL FMVTTAVIIR DKSVRNMSCS INNTLLGQKK ESVIFIPESF MPSVSPCAVA LPIIVVILMI PIAVCIYWIN KLQKEKKILS GEKEFERETR EIALKELEKERVQKEEELQV KEKLQEELRW RRTFLHAVDV VLDPDTAHPD LFLSEDRRSV RRCPFRHLGE SVPDNPERFD SQPCVLGRES FASGKHYWEV EVENVIEWTV GVCRDSVERK GEVLLIPQNG FWTLEMHKGQ YRAVSSPDRI LPLKESLCRVGVFLDYEAGD VSFYNMRDRS HIYTCPRSAF SVPVRPFFRL GCEDSPIFIC PALTGANGVT VPEEGLTLHR VGTHQSL
2
а.к. последовательность BTN2A2
MEPAAALHFS LPASLLLLLL LLLLSLCALV SAQFTVVGPA NPILAMVGEN TTLRCHLSPE KNAEDMEVRW FRSQFSPAVF VYKGGRERTE EQMEEYRGRI TFVSKDINRG SVALVIHNVT AQENGIYRCY FQEGRSYDEA ILRLVVAGLGSKPLIEIKAQ EDGSIWLECI SGGWYPEPLT VWRDPYGEVV PALKEVSIAD ADGLFMVTTA VIIRDKYVRN VSCSVNNTLL GQEKETVIFI PESFMPSASP WMVALAVILT ASPWMVSMTV ILAVFIIFMA VSICCIKKLQ REKKILSGEK KVEQEEKEIA QQLQEELRWR RTFLHAADVV LDPDTAHPEL FLSEDRRSVR RGPYRQRVPD NPERFDSQPC VLGWESFASG KHYWEVEVEN VMVWTVGVCR HSVERKGEVL LIPQNGFWTL EMFGNQYRAL SSPERILPLK ESLCRVGVFLDYEAGDVSFY NMRDRSHIYT CPRSAFTVPV RPFFRLGSDD SPIFICPALT GASGVMVPEE GLKLHRVGTH QSL
3
а.к. HCDR1mAb 4.15
SYDIN
4
а.к. HCDR2mAb 4.15
WIFPGDDSIIQNEKFKG
5
а.к. HCDR3mAb 4.15
LGPLRGFTY
6
а.к. LCDR1mAb 4.15
RASESVDRYGSSFMH
7
а.к. LCDR2mAb 4.15
RASNLES
8
а.к. LCDR3mAb 4.15
QQSNEDPWT
9
а.к. V<sub>H</sub> mAb 4.15
MGWSWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDDSIIQNEKFKGKATLTTDKSSSTVYMQLSRLTSEDSAVYFCARLGPLRGFTYWGQGTLVTVSA
10
а.к. V<sub>L</sub> mAb 4.15
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDRYGSSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK
11
а.к. HCDR1mAb 5.28
DYSMN
12
а.к. HCDR2mAb 5.28
RINTETGEPTYADDFKG
13
а.к. HCDR3mAb 5.28
DYAKR
14
а.к. LCDR1mAb 5.28
KASQDVITAVA
15
а.к. LCDR2mAb 5.28
STSYRYT
16
а.к. LCDR3mAb 5.28
LQHYTTPWT
17
а.к. V<sub>H</sub> mAb 5.28
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMNWVKQAPGKGLKWVGRINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQIKNLKNEDTATYFCVRDYAKRWGQGTSVTVSS
18
а.к. V<sub>L</sub> mAb 5.28
MGIKMESQIQVFVFVSLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVITAVAWYQQKPGQSPKLLIYSTSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCLQHYTTPWTFGGGTKLEIK
19
а.к. HCDR1mAb 7.28
SYWIE
20
а.к. HCDR2mAb 7.28
EILPGSGSTKYNEKFRG
21
а.к. HCDR3mAb 7.28
LKGYYGGGAMDY
22
а.к. LCDR1mAb 7.28
RASKSISKYLA
23
а.к. LCDR2mAb 7.28
SGSTLQS
24
а.к. LCDR3mAb 7.28
QQHNEYPWT
25
а.к. V<sub>H</sub> mAb 7.28
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGREWIGEILPGSGSTKYNEKFRGKATFAADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYYCARLKGYYGGGAMDYWGQGTSVTVSS
26
а.к. V<sub>L</sub> mAb 7.28
MRFQVQVLGLLLLWISGAQCDVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNELLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK
27
а.к. HCDR1mAb 7.48
DFYMY
28
а.к. HCDR2mAb 7.48
TISDGGSHTYYPDSVKG
29
а.к. HCDR3mAb 7.48
DTTIITPY
30
а.к. LCDR1mAb 7.48
RSSTGAVTTSNYAN
31
а.к. LCDR2mAb 7.48
GTNNRAP
32
а.к. LCDR3mAb 7.48
GLWYSNHWV
33
а.к. V<sub>H</sub> mAb 7.48
MNFGLSLIFLVLVLKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDFYMYWVRRTPEKRLEWVATISDGGSHTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMRSLKSEDTAMYYCGRDTTIITPYWGQGTLVTVSA
34
а.к. V<sub>L</sub> mAb 7.48
MAWISLILSLLALSSGAISQSVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCGLWYSNHWVFGGGTKLTVL
35
а.к. HCDR1mAb 8.15
GYWMT
36
а.к. HCDR2mAb 8.15
EINPDSSTINYTPSLRD
37
а.к. HCDR3mAb 8.15
GSYYPSY
38
а.к. LCDR1mAb 8.15
RASKSVSSSGYSYMN
39
а.к. LCDR2mAb 8.15
LASNLES
40
а.к. LCDR3mAb 8.15
QHSRELPHT
41
а.к. V<sub>H</sub> mAb 8.15
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSGYWMTWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLRDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYFCARGSYYPSYWGQGTLVTVSA
42
а.к. V<sub>L</sub> mAb 8.15
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMNWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEDEDAATYYCQHSRELPHTFGGGTKLEIK
43
а.к. HCDR1mAb 8.16
GYWMT
44
а.к. HCDR2mAb 8.16
EINPDSSTINYTPSLRD
45
а.к. HCDR3mAb 8.16
GSYYPSY
46
а.к. LCDR1mAb 8.16
RASKSVSSSGYSYMN
47
а.к. LCDR2mAb 8.16
LASNLES
48
а.к. LCDR3mAb 8.16
QHSRELPHT
49
а.к. V<sub>H</sub> mAb 8.16
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSGYWMTWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLRDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYFCARGSYYPSYWGQGTLVTVSA
50
а.к. V<sub>L</sub> mAb 8.16
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSSSGYSYMNWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEDEDAATYYCQHSRELPHTFGGGTKLEIK
51
а.к. HCDR1mAb 8.33
SGYYWN
52
а.к. HCDR2mAb 8.33
YISYDGNNNYNPSLKN
53
а.к. HCDR3mAb 8.33
PLYDGYYWYFDV
54
а.к. LCDR1mAb 8.33
ITSTDIDDDMN
55
а.к. LCDR2mAb 8.33
EANTLRP
56
а.к. LCDR3mAb 8.33
LQSDNLPYT
57
а.к. V<sub>H</sub> mAb 8.33
MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGNNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCASPLYDGYYWYFDVWGAGTTVTVSS
58
а.к. V<sub>L</sub> mAb 8.33
MTMFSLALLLSLLLLCVSDSRAETTVTQSPASLSLAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEANTLRPGVPSRFSSSGRGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPYTFGGGTKLEIK
59
нт. HCDR1mAb 4.15
AGCTATGATATAAAC
60
нт. HCDR2mAb 4.15
TGGATTTTTCCTGGAGATGATAGTATTATTCAGAATGAGAAGTTCAAGGGC
61
нт. HCDR3mAb 4.15
TTGGGCCCATTACGAGGGTTTACTTAC
62
нт. LCDR1mAb 4.15
AGAGCCAGTGAAAGTGTTGATCGTTATGGCAGTAGTTTTATGCAC
63
нт. LCDR2mAb 4.15
CGTGCATCCAACCTAGAATCT
64
нт. LCDR3mAb 4.15
CAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACG
65
нт. V<sub>H</sub> mAb 4.15
ATGGGATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACAAGCTATGATATAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTTTCCTGGAGATGATAGTATTATTCAGAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGTCTACATGCAGCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATTGGGCCCATTACGAGGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
66
нт. V<sub>L</sub> mAb 4.15
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATCGTTATGGCAGTAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
67
нт. HCDR1mAb 5.28
GACTATTCAATGAAC
68
нт. HCDR2mAb 5.28
AGGATCAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGA
69
нт. HCDR3mAb 5.28
GACTACGCTAAGCGG
70
нт. LCDR1mAb 5.28
AAGGCCAGTCAGGATGTGATTACTGCTGTAGCC
71
нт. LCDR2mAb 5.28
TCGACATCCTACCGGTACACT
72
нт. LCDR3mAb 5.28
CTGCAACATTATACTACTCCGTGGACG
73
нт. V<sub>H</sub> mAb 5.28
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCACAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAGACTATTCAATGAACTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGGTGGGCAGGATCAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAAAAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGTTAGAGACTACGCTAAGCGGTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
74
нт. V<sub>L</sub> mAb 5.28
ATGGGCATCAAAATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTCTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCTGCAACATTATACTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
75
нт. HCDR1mAb 7.28
AGCTACTGGATAGAG
76
нт. HCDR2mAb 7.28
GAGATTTTACCTGGAAGTGGAAGTACTAAGTACAATGAGAAGTTTAGGGGC
77
нт. HCDR3mAb 7.28
TTGAAGGGTTACTACGGAGGAGGTGCTATGGACTAC
78
нт. LCDR1mAb 7.28
AGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCC
79
нт. LCDR2mAb 7.28
TCTGGATCCACTTTGCAATCT
80
нт. LCDR3mAb 7.28
CAACAGCATAATGAATACCCGTGGACG
81
нт. V<sub>H</sub> mAb 7.28
ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCACCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCGTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGAAGTACTAAGTACAATGAGAAGTTTAGGGGCAAGGCCACATTCGCTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACGTGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTGAAGGGTTACTACGGAGGAGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTTACCGTCTCTTCA
82
нт. V<sub>L</sub> mAb 7.28
ATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATATCAGGTGCCCAGTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATGAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
83
нт. HCDR1mAb 7.48
GACTTTTACATGTAT
84
нт. HCDR2mAb 7.48
ACCATTAGTGATGGTGGTAGTCACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGG
85
нт. HCDR3mAb 7.48
GATACTACGATAATTACTCCTTAC
86
нт. LCDR1mAb 7.48
CGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAAC
87
нт. LCDR2mAb 7.48
GGTACCAACAACCGAGCTCCA
88
нт. LCDR3mAb 7.48
GGTCTTTGGTACAGCAACCATTGGGTG
89
нт. V<sub>H</sub> mAb 7.48
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTTTTACATGTATTGGGTTCGCCGGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTCACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTCTACCTACAAATGAGAAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGGAAGAGATACTACGATAATTACTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
90
нт. V<sub>L</sub> mAb 7.48
ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAGTCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGGTCTTTGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA
91
нт. HCDR1mAb 8.15
GGATACTGGATGACT
92
нт. HCDR2mAb 8.15
GAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAGGGAT
93
нт. HCDR3mAb 8.15
GGGAGCTACTATCCCTCTTAC
94
нт. LCDR1mAb 8.15
AGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTTCATCTGGCTATAGTTATATGAAC
95
нт. LCDR2mAb 8.15
CTTGCATCCAACCTAGAATCT
96
нт. LCDR3mAb 8.15
CAGCACAGTAGGGAGCTTCCGCACACG
97
нт. V<sub>H</sub> mAb 8.15
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTGGATACTGGATGACTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAGGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTTCTGTGCAAGAGGGAGCTACTATCCCTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
98
нт. V<sub>L</sub> mAb 8.15
ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGGGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTTCATCTGGCTATAGTTATATGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGATGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
99
нт. HCDR1mAb 8.16
GGATACTGGATGACT
100
нт. HCDR2mAb 8.16
GAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAGGGAT
101
нт. HCDR3mAb 8.16
GGGAGCTACTATCCCTCTTAC
102
нт. LCDR1mAb 8.16
AGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTTCATCTGGCTATAGTTATATGAAC
103
нт. LCDR2mAb 8.16
CTTGCATCCAACCTAGAATCT
104
нт. LCDR3mAb 8.16
CAGCACAGTAGGGAGCTTCCGCACACG
105
нт. V<sub>H</sub> mAb 8.16
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTGGATACTGGATGACTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAGGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTTCTGTGCAAGAGGGAGCTACTATCCCTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
106
нт. V<sub>L</sub> mAb 8.16
ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGGGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTTCATCTGGCTATAGTTATATGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGATGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
107
нт. HCDR1mAb 8.33
AGTGGTTATTACTGGAAC
108
нт. HCDR2mAb 8.33
TACATAAGCTACGACGGTAACAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAAT
109
нт. HCDR3mAb 8.33
CCTCTCTATGATGGTTATTACTGGTACTTCGATGTC
110
нт. LCDR1mAb 8.33
ATAACCAGCACTGATATTGATGATGATATGAAC
111
нт. LCDR2mAb 8.33
GAAGCCAATACTCTTCGTCCT
112
нт. LCDR3mAb 8.33
TTGCAAAGTGATAACTTGCCGTACACG
113
нт. V<sub>H</sub> mAb 8.33
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAACAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACGTCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCAAGTCCTCTCTATGATGGTTATTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
114
нт. V<sub>L</sub> mAb 8.33
ATGACCATGTTCTCACTAGCTCTTCTCCTCAGTCTTCTTCTCCTCTGTGTCTCTGATTCTAGGGCAGAAACAACTGTGACCCAGTCTCCAGCATCCCTGTCCCTGGCTATAGGAGAAAAAGTCACCATCAGATGCATAACCAGCACTGATATTGATGATGATATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGGAACCTCCTAAGCTCCTTATTTCAGAAGCCAATACTCTTCGTCCTGGAGTCCCATCCCGATTCTCCAGCAGTGGCCGTGGTACAGATTTTGTTTTTACAATTGAAAACATGCTCTCAGAAGATGTTGCAGATTACTACTGTTTGCAAAGTGATAACTTGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
Ссылки
В настоящей заявке различные ссылки описывают уровень техники, к которой относится данное изобретение. Содержание этих ссылок настоящим включено путем ссылки в настоящее описание.