ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИГЕНА-МИШЕНИ, ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ СПЕЦИФИЧНЫХ ЭПИТОПОВ-МИШЕНЕЙ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ
TARGET ANTIGEN DISCOVERY, PHENOTYPIC SCREENS AND USE THEREOF FOR IDENTIFICATION OF TARGET CELL SPECIFIC TARGET EPITOPES

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По данной заявке испрашивают приоритет родственной предварительной заявки США № 61/840,583, поданной 28 июня 2013 года, которая озаглавлена «Target Antigen Discovery and Phenotypic Screens», содержание которой включено в настоящий документ в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Связывающие полипептиды, такие как антитела и их фрагменты, являются коммерчески важными в качестве терапевтических и диагностических средств. В традиционных способах скрининга для связывающего полипептида в целом используют растворимые антигены. Однако у определенных антигенов клеточной поверхности происходит изменение конформационных эпитопов на этих антигенах, когда антигены растворяются из плазматической мембраны, что ведет к невозможности создавать связывающие полипептиды, которые могут распознавать нативный антиген. Соответственно, в данной области существует необходимость в новых способах скрининга для связывающих полипептидов, которые могут специфически связываться с антигенами клеточной поверхности в их нативной конформации.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ
Изобретение относится к способам и композициям для идентификации связывающих полипептидов (например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов), которые специфически связываются с антигеном клеточной поверхности. Способы по изобретению в целом включают приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с антигеном клеточной поверхности, представленным на внешней поверхности клетки; и выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности на внешней поверхности клетки. Способы и композиции по изобретению, в частности, полезны тем, что они делают возможной быструю идентификацию связывающих полипептидов, которые связываются с нативными формами целевого антигена клеточной поверхности. Эти способы и композиции также делают возможной идентификацию новых терапевтически эффективных специфичных антигенов или эпитопов клеточного типа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 схематически представлены примерные композиции ДНК-дисплея и способы скрининга по изобретению.
На фиг. 2 схематически представлены примерные композиции ДНК-дисплея и способы скрининга по изобретению.
На фиг. 3 схематически представлены примерные стратегии скрининга целевых клеток, используемые в способах по изобретению.
На фиг. 4 схематически представлены примерные стратегии параллельного скрининга и глубокого секвенирования, используемых в способах по изобретению.
На фиг. 5 схематически представлены примерные стратегии параллельного скрининга и глубокого секвенирования, используемых в способах по изобретению.
На фиг. 6 схематически представлены примерные стратегии параллельного скрининга и глубокого секвенирования, используемые в способах по изобретению.
На фиг. 7 схематически представлены результаты примерных стратегий параллельного скрининга, используемых в способах по изобретению.
На фиг. 8 изображен график, показывающий результаты FACS анализа связывания молекул VH с высокой аффинностью, выбранных с использованием способов по изобретению.
На фиг. 9 изображены графики, показывающие дифференциальное связывание молекул VH, выбранных с использованием способов по изобретению.
На фиг. 10 изображены графики, показывающие дифференциальное связывание молекул VH, выбранных с использованием способов по изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
I. Определения
in vitro
Как используют в настоящем документе, термин «библиотека дисплея нуклеиновых кислот» относится к любому принятому в данной области бесклеточному дисплею со связью фенотип-генотип , без ограничения включая то, что изложено, например, в патентах США №№ 7195880; 6951725; 7078197; 7022479; 6518018; 7125669; 6846655; 6281344; 6207446; 6214553; 6258558; 6261804; 6429300; 6489116; 6436665; 6537749; 6602685; 6623926; 6416950; 6660473; 6312927; 5922545; и 6348315 и в WO2010/011944, все они включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.
Как используют в настоящем документе, термин «антиген» относится к молекуле, распознаваемой связывающим полипептидом.
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Как используют в настоящем документе, термин «специфически связывается с» относится к способности связывающей молекулы (например, домена VH или VL) связываться с антигеном с аффинностью по меньшей мере приблизительно 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M, 1×10 M или больше и/или связываться с мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем ее аффинность к неспецифическому антигену.
Как используют в настоящем документе, термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулинов, которые содержат четыре полипептидные цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанных дисульфидными связями, а также к их мультимерам (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, которые называют каркасными областями (FR).
2
Как используют в настоящем документе, термин «антигенсвязывающая часть» антитела включает какой-либо встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, которые специфически связывает антиген для того, чтобы формировать комплекс. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно извлекать, например, из целых молекул антител с использованием любых подходящих стандартных способов, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные способы генетической инженерии, в том числе манипуляции и экспрессия ДНК, кодирующих вариабельные и необязательно константные домены антител. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих частей включают: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab'); (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) молекулы одноцепочечных Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR)). Другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и миниантитела, также включены в выражение «антигенсвязывающая часть».
Как используют в настоящем документе, термины «домен VH» и «домен VL» относятся к отдельным вариабельным тяжелым и легким доменам антител, соответственно, которые содержат FR (каркасные области) 1, 2, 3 и 4 и CDR (определяющие комплементарность области) 1, 2 и 3 (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (публикация NIH № 91-3242, Bethesda).
II. Антигены клеточной поверхности
В определенных аспектах изобретение относится к способам идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности.
Любой антиген, который можно представлять на поверхности клетки, можно использовать в способах по изобретению, без ограничения включая, белковые, гликановые и/или липидные антигены. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой встречающуюся в природе молекулу. Подходящие неограничивающие примеры встречающихся в природе антигенов включают трансмембранные белки (например, сопряженные с G-белком рецепторы) и якорные белки GPI. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой не встречающийся в природе рекомбинантный или синтетический антиген. Подходящие неограничивающие примеры встречающихся в природе антигенов включают химерные антигены, содержащие части из различных антигенных молекул. В определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена известны до выполнения способов по изобретению. В определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена не известны до выполнения способов по изобретению.
Антигены клеточной поверхности, используемые в способах по изобретению, можно представлять на любой клетке или частице, похожей на клетку (например, липидной везикуле). В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой клетки того типа, который в природе экспрессирует антиген клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой рекомбинантную клетку, которую конструируют для того, чтобы гетерологично экспрессировать антиген клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой связанный с заболеванием вариант нормальной клетки (например, опухолевую клетку).
III. Связывающие полипептиды
В определенных аспектах изобретение относится к способам идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности.
Связывающий полипептид любого типа можно использовать в способах по изобретению, без ограничения включая антитела или их фрагменты и иммуноглобулиноподобные домены. Подходящие иммуноглобулиноподобные домены включают, без ограничения, домены фибронектина (см., например, Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95–109, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), DARPin (см., например, Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15–16): 695–701, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Z домены белка A (см., Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668–76, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), липокалины (см., например, Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677–83, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Affilin (см., например, Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172–85, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Affitin (см., например, Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058–68, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Avimer (см., например, Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556–61, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки), Fynomer (см., например, Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196–3204, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки) и пептиды домена Куница (см., например, Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261–8, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки). В определенных вариантах осуществления связывающий полипептид представляет собой домен VH или VL антитела.
IV. Способы дисплея на клеточной поверхности
В определенных аспектах изобретение относится к способу идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, способ включает: (a) приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с антигеном клеточной поверхности, представленным на внешней поверхности клеток первого типа; и (b) выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности на внешней поверхности клеток первого типа, тем самым идентифицируя связывающий полипептид, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления перед стадией (a) библиотеку дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов приводят в контакт с клетками второго типа, на которых не представлен антиген, представленный на внешней поверхности, для того, чтобы предварительно очищать библиотеку связывающих полипептидов, которые специфически не связываются с антигеном.
В определенных аспектах изобретение относится к способу идентификации связывающего полипептида, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, способ включает: (a) приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с клетками первого типа, экспрессирующими антиген клеточной поверхности, и выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с клетками первого типа; (b) приведение в контакт библиотеки дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов с клетками второго типа, которые не экспрессируют антиген клеточной поверхности, и выделение из библиотеки по меньшей мере одного элемента библиотеки, который специфически связывается с клетками второго типа; и (c) отбор элементов библиотеки, которые специфически связываются с клетками первого типа, но не с клетками второго типа, тем самым идентифицируя связывающий полипептид, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности.
Подходящие библиотеки дисплея нуклеиновых кислот для использования в способах по изобретению приведены, например, в патентах США №№ 7195880; 6951725; 7078197; 7022479; 6518018; 7125669; 6846655; 6281344; 6207446; 6214553; 6258558; 6261804; 6429300; 6489116; 6436665; 6537749; 6602685; 6623926; 6416950; 6660473; 6312927; 5922545; и 6348315 и в WO2010/011944, все они включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме. В определенных вариантах осуществления библиотека дисплея разнообразных нуклеиновых кислот представляет собой библиотеку ДНК-дисплея. В одном из вариантов осуществления дисплей нуклеиновых кислот библиотека представляет собой библиотеку ДНК-дисплея, описанную в настоящем документе или в WO2010/011944, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме.
В определенных вариантах осуществления каждый элемент библиотеки ДНК-дисплея содержит связывающий полипептид, соединенный через промежуточный ДНК линкер с кодирующей последовательностью ДНК, которая кодирует связывающий полипептид, где ДНК линкер содержит участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы (см. например, фиг. 1). Можно использовать любой участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы. В одном конкретном варианте осуществления участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы не присутствует в кодирующей последовательности ДНК элементов библиотеки ДНК-дисплея, таким образом избегая отщепления кодирующей последовательности ДНК при расщеплении элементов библиотеки рестрикционной эндонуклеазой. В одном конкретном варианте осуществления участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы представляет собой сайт Not1.
В определенных вариантах осуществления желательно физически отделять кодирующую последовательность ДНК выделенных элементов библиотеки от соединенного связывающего полипептида. Можно использовать любые способы физического разделения. Когда выделенные элементы библиотеки содержат ДНК линкер, содержащий участок узнавания рестрикционной эндонуклеазы (см. например, фиг. 1), физического разделения можно достичь посредством расщепления выделенных элементов библиотеки рестрикционной эндонуклеазой. Получаемые высвобожденные кодирующие последовательности ДНК дополнительно можно отделять от комплексов клетка/связывающий полипептид с помощью любого принятого в данной области способа, например, центрифугирования.
В определенных вариантах осуществления желательно физически отделять интактные выделенные элементы библиотеки от клеток первого и/или второго типа. Можно использовать любые способы физического разделения. В определенных вариантах осуществления выделенные элементы библиотеки отделяют от клеток первого или второго типа посредством ферментативного отщепления антигена клеточной поверхности. Можно использовать любые способы ферментативного отщепления антигена, например, протеазное, липидное и/или гликозидазное ферментативное отщепление. В определенных вариантах осуществления, когда антиген клеточной поверхности прикрепляют к клеточной поверхности с помощью гликолипидного якоря, выделенные элементы библиотеки отделяют от клеток первого или второго типа посредством фосфолипазного отщепления гликолипидного якоря. Получаемые высвобожденные выделенные элементы библиотеки дополнительно можно отделять от клеток первого или второго типа с помощью любого способа, принятого в данной области, например, центрифугирования.
Когда выделены элементы библиотеки, которые специфически связываются с клетками первого и/или второго типа, можно определять кодирующую последовательность ДНК этих молекул. Соответственно, в определенных вариантах осуществления способы по изобретению дополнительно включают стадию определения кодирующей последовательности ДНК по меньшей мере части выделенных элементов библиотеки. Можно использовать любые принятые в данной области средства для определения последовательности ДНК. В одном конкретном варианте осуществления кодирующую последовательность ДНК определяют с помощью способов глубокого секвенирования отдельных молекул (например, пиросеквенирования). Способы глубокого секвенирования отдельных молекул хорошо известны в данной области (см., например, те, что описаны в US6210891, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме). В определенных вариантах осуществления, где связывающие полипептиды представляют собой антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, определяют кодирующую последовательность ДНК области CDR3. В определенных вариантах осуществления определяют кодирующие последовательности ДНК элемента библиотеки, который связывается с клетками первого и второго типа. Считают, что элементы библиотеки, которые специфически связываются с клетками первого типа, но не с клетками второго типа, содержат связывающие полипептиды, которые специфически связываются с антигеном, специфичным для клеток первого типа.
in vitro
in vivo
in vitro
in vivo
Когда идентифицирован связывающий полипептид, который специфически связывается с антигеном клеточной поверхности, его можно гетерологично экспрессировать  (например, в клетках или в бесклеточной экспрессирующей системе) или  (например, в трансгенном животном). Соответственно, в определенных вариантах осуществления способы по изобретению дополнительно включают стадию гетерологичной экспрессии  (например, в клетках или в бесклеточной экспрессирующей системе) или  (например, в трансгенном животном) идентифицированного связывающего полипептида.
В определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена известны до выполнения способов по изобретению. Однако нет необходимости знать отличительные черты антигена. В действительности, в определенных вариантах осуществления отличительные черты антигена не известны до выполнения способов по изобретению. Таким образом, в последнем случае способы по изобретению позволяют идентифицировать новые антигены и эпитопы, присутствующие на поверхности клеток определенного типа, представляющего интерес (например, опухолевая клетка).
В определенных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, включают отбор связывающих полипептидов, которые способны к функциональной интернализации после связывания с антигеном клеточной поверхности. Такие связывающие полипептиды, в частности, можно использовать при получении конъюгатов лекарственных средств, поскольку они делают возможной доставку цитотоксического лекарственного средства внутрь целевой клетки. Можно использовать любой способ скрининга функциональной интернализации. Например, библиотеку дисплея разнообразных нуклеиновых кислот связывающих полипептидов можно приводить в контакт с клетками-мишенями в условиях, которые делают возможной интернализацию связывающего полипептида (например, в течение приблизительно 1-2 часов при 37°C). Затем клетки можно промывать и лизировать с использованием клеточного лизирующего буфера в присутствии ингибиторов протеаз. Затем интернализированные элементы библиотеки можно преципитировать этанолом и обогащать кодирующие последовательности ДНК с помощью ПЦР амплификации. Способы, описанные в настоящем документе, можно применять к любому процессу обнаружения эпитопа-мишени. Например, эпитопы-мишени могут включать: домены хоуминга для воспаления; опухолеспецифичные эпитопы-мишени из первичных опухолей с устойчивостью к лечению или без нее, линии опухолевых клеток и опухоли, которые несут какие-либо мутации, которые могут вести к неоэпитопам; и другие эпитопы, специфичные для заболеваний, которые опосредуют нарушение функции, специфичное для заболевания, и должны служить мишенью для биологической терапии,
Способы, описанные в настоящем документе, также можно применять для обнаружения биологических маркеров, чтобы осуществлять мониторинг присутствия или отсутствия конкретных эпитопов клеточной поверхности в ходе лечения пациентов лекарственными средствами. Антитела, полученные при обнаружении биологических маркеров, также можно использовать в качестве инструментов для обнаружения биологических маркеров. Дополнительно или альтернативно, способы, описанные в настоящем документе, можно применять к обнаружению мишеней или эпитопов у других биологических видов, например, у трансгенных животных и в моделях заболеваний на животных.
V. Примеры
A. Краткое изложение
Конструировали библиотеку VH полного антитела человека, полученного из костного мозга, периферической крови и спленоцитов людей-доноров и идентифицировали множество VH связывающих средств с высокой аффинностью и специфичностью к множеству мишеней с использованием технологии дисплея дцДНК. Специфичные к клеткам-мишеням эпитопы идентифицировали посредством отбора живых клеток и анализа глубокого секвенирования с использованием библиотеки VH человека и технологии дисплея дцДНК. В этих способах применяли стратегии параллельного дифференциального отбора и селективного отбора клеток-мишеней (см. фиг. 4, 5, 6). Табличное представление частоты CDR3 по глубокому секвенированию всех пулов по всем раундам предсказывает избирательность клонов VH. Идентифицировали VH с высокой аффинностью, которые избирательно связываются с клетками-мишенями и клетками родственных типов.
B. Способы конструирования библиотек и отбора для обнаружения эпитопов живых клеток
Разработаны два способа эффективного нахождения элементов библиотеки, которые связываются с живыми клетками.
Первый способ включает удаление связывающих средств с живых клеток посредством рестрикционного расщепления ДНК, слитой со связанными антителами. Этот способ делает возможным полное обнаружение VH, связанных со всеми эпитопами на клетках. C-концы в библиотеке ДНК VH конструировали так, чтобы нести участок рестрикции NotI (см. фиг. 1). В наивных каркасах VH сайты NotI отсутствуют и, следовательно, из клеток для последующей амплификации элюируют только полноразмерные VH связывающие средства. Буфер для рестрикционного расщепления NotI тестировали на живых клетках, и при инкубации в течение 2 часов при 37°C клетки были жизнеспособными. NotI расщепление имело высокую эффективность. После связывания библиотеки с клетками в течение 1 часа при 4°C, клетки промывали и расщепляли с использованием NotI буфера при 37°C в течение 1 часа, затем клетки осаждали, супернатант (содержащий связанную ДНК VH) собирали для ПЦР амплификации (см. фиг. 1).
Второй способ состоит в отщеплении VH связывающих средств от живых клеток посредством отщепления фосфолипазой C (PLC). Этот способ позволяет элюировать VH, которые связаны с эпитопами любого якорного мембранного белка GPI (т. е., с поднабором эпитопов). PLC отщепление имеет высокую эффективность, как подтверждали на FACS с использованием контрольной молекулы. После инкубации библиотеки с клетками в течение 1 часа при 4°C, клетки промывали и инкубировали с PLC при 37°C в течение 15 минут. Впоследствии клетки осаждали и супернатант, содержащий слитый VH в комплексе с внеклеточным доменом якорного мембранного белка GPI, подвергали ПЦР амплификации (см. фиг. 2).
C. Параллельный отбор, дифференциальный отбор и селективный отбор клеток-мишеней на клетках-мишенях и клетках родственных/нежелательных типов.
Исходную наивную слитую библиотеку получали в соответствии с протоколом, изложенным в WO2010/011944 (которая включена, таким образом, посредством ссылки в полном объеме). Для первого раунда отбора, очищенную слитую библиотеку равномерно делили на множество библиотек, которые несут то же разнообразие для всех ветвей отбора (см. фиг. 5).
Начальные клетки, полученные от нормальных доноров или пациентов, или размораживали свежими или выделяли из колб с клеточными культурами, придерживаясь стандартных протоколов клеточной биологии. Затем клетки восстанавливали в течение 1 часа в полных средах при 37°C, после чего следовало блокирование в буфере для отбора в течение 30 мин на льду. Весь отбор осуществляли на льду для того, чтобы предотвращать интернализацию антител и мишеней.
Для параллельного отбора библиотеки предварительно очищали с использованием 200 мкл предварительно блокированных стрептавидиновых гранул и 200 мкл предварительно блокированных гранул hIgG-Epoxy в течение 30 мин при комнатной температуре последовательно для того, чтобы удалять какие-либо неправильно уложенные и липкие элементы библиотеки. Затем предварительно очищенные библиотеки охлаждали на льду и подвергали воздействию предварительно блокированных клеток и инкубировали на льду в течение 1 часа.
Для селективного отбора клеток-мишеней осуществляли предварительную очистку на клетках нежелательных и близкородственных типов в течение 1 часа на льду для того, чтобы удалять какие-либо неизбирательные связывающие средства и затем подвергали воздействию клеток-мишеней.
На раунде отбора 4 способы дифференциального отбора применяли к ветвям отбора на клетках-мишенях (с предварительной очисткой на клетках и без нее). На этом раунде библиотеки делили на множество пробирок и связывали с клетками каждого типа и клетками пациентов с различных стадий заболеваний параллельно. Эта стратегия делала возможным непосредственное сравнение клеток-мишеней с клетками других типов посредством анализа глубокого секвенирования и идентификации связывающих средств, распознающих различные эпитопы, которые возникали при прогрессировании заболевания (см. фиг. 6).
Для всех ветвей отбора, после связывания, клетки промывали в 10 мл буфера для связывания и подвергали или NotI рестрикционному расщеплению, чтобы извлекать все связывающие средства для мембранного белка, или PLC отщеплению для того, чтобы извлекать связывающие средства для якорных мембранных белков GPI, как описано выше.
D. Анализ глубокого секвенирования для предсказания избирательных связывающих средств для клеток-мишеней
После каждого раунда отбора объединенные образцы связывающих средств подвергали ПЦР амплификации. HCDR3 каждого объединенного образца связывающих средств поднимали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов, праймирующих C-конец каркаса 3 и N-конец каркаса 4 фрагментов VH. Затем эти фрагменты HCDR3, полученные из отдельных раундов отбора и ветвей метили специфичным ДНК штриховым кодом, используемым для секвенирования Illumina, посредством ПЦР. Меченные HCDR3 объединяли и отправляли для высокопропускного секвенирования с использованием технологии Hi Seq. Объединенные образцы связывающих средств раунда 4 от клеток-мишеней также метили с использованием ДНК штрихового кода и подвергали 454 секвенированиям, чтобы получать полноразмерные последовательности VH.
После секвенирования последовательности развертывали на основании ДНК штрихового кода. Миллионы последовательностей, полученных из каждого раунда отбора и ветви отбора, представляли в виде таблицы посредством сравнения частоты конкретной последовательности CDR3, присутствующей в различных раундах и ветвях отбора. Использовали следующие критерии для идентификации избирательных связывающих средств: 1) специфичное обогащение CDR3 последовательности от более раннего раунда к более позднему раунду на клетках-мишенях, а не на клетках контрольных или близкородственных типов; 2) более высокая частота на клетках конкретного целевого типа и низкая на клетках контрольного или близкородственного типа на дифференциальном раунде отбора (см. фиг. 7); и 3) последовательности не присутствуют в других отборах мишеней или клеток из других программ в базе данных. Избирательные клоны, идентифицированные с помощью секвенирования Illumina, после этого синтезировали на основании информации о 454 полноразмерных последовательностях.
E. Получение, очистка и FACS анализ связывания
50
Затем объединенные образцы связывающих средств и синтезированные VH субклонировали в экспрессирующие векторы pET22b. VH получали в клетках E. coli BL-21 и очищали посредством использования стандартных протоколов с C-концевыми гистидиновыми метками. FACS анализ осуществляли для того, чтобы оценивать связывание и избирательность VH с клетками различных типов и EC связывающих средств. Высокоаффинные и избирательные VH связывающие средства идентифицировали посредством процесса отбора живых клеток (см. фиг. 8, 9 и 10).