СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА С ПРОБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD OF PRODUCING BACTERIAL PREPARATION WITH PROBIOTIC ACTIVITY

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности изобретение касается бактериального препарата с пробиотической активностью, и может быть использовано для создания функциональных продуктов питания для онкологических больных в период реабилитации.
Пробиотики - это живые физиологически функциональные пищевые ингредиенты в виде полезных для человека (непатогенных и нетоксикогенных) живых микроорганизмов, обеспечивающие при систематическом употреблении человеком в пищу непосредственно в виде препаратов или биологически активных добавок (БАД) к пище либо в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (Бондаренко, В.М. Пробиотики и механизмы их лечебного действия / В.М. Бондаренко, Р.П. Чупринина, Ж.И. Аладышева, Т.В. Мацулевич // Эксперим. и клин. Гастроэнтерол. - 2004. - №3. - С. 83-87).
Систематическое использование пробиотиков в питании повышает колонизационную резистентность кишечника, усиливает иммунитет, предотвращает развитие аллергических осложнений, оказывает гипохолестеринемический, противоопухолевый и другие положительные эффекты на человека. Исходя из этого, создание продуктов функционального питания на основе пробиотических штаммов микроорганизмов, обладающих специфическим позитивным действием на организм человека, рассматривают как стратегическое направление альтернативной медицины, направленное на поддержание и восстановление здоровья человека (Янковский, Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека // Здоровье женщины. - 2003. - №4(16). - С. 145-158).
Пробиотики являются неотъемлемой частью диеты онкологических больных. Цитостатическая и лучевая терапия, применяемая у больных онкологическими заболеваниями, имеющая небольшой порог между лечебным и токсическим дозами, приводит к повреждению гастроинтестинального тракта, его слизистых оболочек, являющихся наиболее чувствительными к повреждающему воздействию, поскольку являются активно пролиферирующими тканями организма, а также к нарушению в микробной флоре кишечника, также являющейся быстро пролиферирующим сообществом. Происходит гибель нормальной кишечной микрофлоры, расширяется спектр потенциально-патогенных микроорганизмов, изменяется видовой и количественный состав. Все это усиливает повреждение гастроинтестинального тракта и печени, что диктует необходимость поиска и включения в комплекс реабилитационных мероприятий препаратов, направленных на восстановление нормального микробиоценоза кишечника, что может быть достигнуто включением в рацион питания продуктов, обогащенных пробиотиками.
В настоящее время известно большое число пробиотических препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных. Такой препарат, как правило, содержит клетки бактерий, остатки культуральной жидкости, жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Технология их получения включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, сублимационное высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.
Так, известны препарат и способ его получения (RU, патент 2080795, опубл. 10.06.1997). Данный препарат содержит живые клетки Lactobacillus acidophilus, желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, воду, остатки культуральной жидкости. Способ его получения предусматривает культивирование бактерий Lactobacillus acidophilus в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу, обезжиренное молоко, замораживание при температуре -30-(-)35°C в течение 18-12 часов, сублимационную сушку в течение 45-52 часов.
Недостатком препарата является относительно невысокая эффективность, ограниченная область применения, а также невозможность длительного хранения.
В настоящее время одним из перспективных направлений для обеспечения оздоровляющего воздействия на ЖКТ является применение препаратов, содержащих несколько штаммов микроорганизмов, обладающих синергетическим действием.
Известен препарат (RU, патент 2160992, опубл. 27.12.2000), содержащий жизнеспособные клетки 2-х симбиотических штаммов Lactobacillus acidophilus, остатки культуральной жидкости и вспомогательные вещества - желатин, сахарозу, обезжиренное молоко. Способ его получения предусматривает культивирование бактерий в жидкой питательной среде, введение защитной среды, содержащей желатин, сахарозу и обезжиренное молоко, замораживание при температуре минус 25-30°C в течение 2-3 часов и сублимационную сушку в течение 45-48 часов.
Недостатком препарата является его недостаточная эффективность в отношении повышения резистентности организма к неблагоприятным условиям внешней среды, недостаточная термоустойчивость.
9
9
Известен (RU, патент 2471864, опубл. 10.01.2013) пробиотический препарат против вирусных и бактериальных инфекций «токсиспорин», содержащий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3679 и Bacillus licheniformis ВКПМ - 4161 в споровой форме с титром не менее 10 спор/г, и глауконит. Оптимальное содержание спор бактерий Bacillussubtilis в их смеси со спорами Bacillus licheniformis составляет 50%. Препарат получают раздельным культивированием вышеоговоренных бактерий в глюкозо-мелассной среде при рН - 6,8-7,0, получают смесь спор в количестве 0,1-1 мас. % от массы препарата и смешивают ее с глауконитом до содержания КОЕ не менее 10 спор/г. Для приготовления препарата используют штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-4161.
Недостатком известного способа можно признать относительно узкий спектр воздействия на организм.
Известен (ЕР, патент 2848681, опубл. 18.03.2015) способ получения бактериального препарата с пробиотической активностью, согласно которому проводят выделение бифидобактерий и лактобактерий из фекалий человека, культивирование их на жидкой питательной среде в анаэробных условиях при температуре 37°C с последующим центрифугированием и выделением бактериального препарата.
Указанный источник информации принят в качестве ближайшего аналога.
Недостатком известного способа следует признать недостаточную пробиотическую активность, обусловленную низкой концентрацией микроорганизмов в готовом продукте.
Техническая задача, решаемая использованием разработанного способа, состоит в расширении ассортимента пробиотических препаратов.
Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в получении пробиотического препарата с выраженными антагонистическими свойствами по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, а также антиоксидантной, гепатопротекторной и противоопухолевой активностью.
8
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ получения бактериального препарата с пробиотической активностью, согласно которому проводят выделение бифидобактерий и лактобактерий из фекалий человека, культивирование их на жидкой питательной среде в анаэробных условиях при температуре 37°C с последующим центрифугированием и выделением бактериального препарата, причем используют фекалии взрослого здорового субъекта, который в течение 3 месяцев перед выделением не принимает ни антибиотические, ни пробиотические препараты, из фекалий дополнительно выделяют стрептококки и энтерококки, культивирование осуществляют до достижения концентрации микроорганизмов 1,0·10 КОЕ/мл, либо на среде 1, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; папаиновый перевар соевой муки - 10,0; натрия гидрофосфат - 1,0; Твин-80 - 0,2; аммония цитрат - 1,0; цистеина гидрохлорид - 0,5; магния хлорид - 0,5; кислота аскорбиновая - 0,5; глюкоза - 10,0; мясной экстракт - 20,0; марганца сульфат - 0,05; натрия азид - 0,2, либо на среде 2, содержащей (г/л): протеозопептон - 15,0; папаиновый перевар соевой муки - 10,0; натрия гидрофосфат - 1,5; Твин-80 - 1,0; аммония цитрат - 2,0; цистеина гидрохлорид - 1,0; магния хлорид - 0,5; кислота аскорбиновая - 0,2; натрия хлорид - 2,5; глюкоза - 10,0; мясной экстракт - 10,0; натрия азид - 0,2, либо на среде 3, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт - 10,0; панкреатический гидролизат казеина - 20,0; натрия гидрофосфат - 2,5; Твин-80 - 0,7; лактоза - 5,0; аммония цитрат - 0,5; цистеина гидрохлорид - 1,0; магния хлорид - 1,0; кислота аскорбиновая - 0,1; натрия ацетат - 0,2; натрия хлорид - 3,0; глюкоза - 5,0; мясной экстракт - 15,0; марганца сульфат - 0,1; натрия азид - 0,2.
Разработанный способ реализуют следующим образом.
Источником выделения пробиотических бактерий являются фекалии взрослого здорового субъекта, который в течение 3 месяцев перед выделением не принимает ни антибиотические, ни пробиотические препараты. Критерием включения для здоровых лиц является отсутствие острых заболеваний, очагов гнойно-воспалительных инфекций, сахарного диабета, онкопатологии, первичного и вторичного иммунодефицита.
2
3
4
5
3
4
5
Подготовку содержимого кишечника проводят следующим образом: 1 г фекалий вносят в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (NaCl) и тщательно суспендируют путем встряхивания в течение 20-30 минут. Затем отстаивают и через 1 час из надосадочной жидкости готовят разведения в изотоническом растворе хлорида натрия 10, 10, 10, 10. Из разведений 10, 10, 10 делают посев бактериологической петлей на питательные среды.
8
Для первичного выделения бактерий используют бифидум-среду, среду МРС, селективный агар для стрептококков, среду Сланец-Бартли для энтерококков. Культивирование бактерий осуществляют на агаризованных питательных средах в анаэробном режиме при температуре 37°C в течение 24,0 часов. С суммарных газонов на чашках Петри с видимым ростом микроорганизмов проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют в жидких питательных средах в анаэробном режиме при температуре 37°C в течение 1,20-24,0 часов до достижения концентрации микроорганизмов 1,0·10 КОЕ/мл.
По окончании культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 минут.
2
Культуры микроорганизмов, выделенных из желудочно-кишечного тракта человека, хранятся в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°C не менее 24 месяцев. Параметры сублимационной сушки бактериального препарата: температура замораживания в защитной среде, содержащей 5% глицерина, -25°C при продолжительности 90 минут; температура сушки 30°C; продолжительность сушки 6 часов; тепловая нагрузка 5,45 кВт/м; остаточное давление 0,6-0,8 кПа; толщина слоя сушки 2 мм.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
2
3
4
5
3
4
5
1 г фекалий вносят в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (NaCl) и тщательно суспендируют путем встряхивания в течение 20-30 минут. Затем отстаивают и через 1 час из надосадочной жидкости готовят разведения в изотоническом растворе хлорида натрия 10, 10, 10, 10. Из разведений 10, 10, 10 делают посев бактериологической петлей на питательную среду.
8
Бактерии культивируют в анаэробном режиме при температуре 37°C в течение 1,20-24,0 часов до достижения концентрации микроорганизмов 1,0·10 КОЕ/мл в жидкой питательной среде состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; папаиновый перевар соевой муки - 10,0; натрия гидрофосфат - 1,0; Твин-80 - 0,2; аммония цитрат - 1,0; цистеина гидрохлорид - 0,5; магния хлорид - 0,5; кислота аскорбиновая - 0,5; глюкоза - 10,0; мясной экстракт - 20,0; марганца сульфат - 0,05; натрия азид - 0,2; pH среды - 6,8±0,2.
По окончании культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 минут.
2
Пробиотические бактерии подвергают сублимационной сушке при следующих параметрах: температура замораживания в защитной среде, содержащей 5% глицерина, -25°C при продолжительности 90 минут; температура сушки 30°C; продолжительность сушки 6 часов; тепловая нагрузка 5,45 кВт/м; остаточное давление 0,6-0,8 кПа; толщина слоя сушки 2 мм.
Сублимационно-высушенный бактериальный препарат хранят в ампулах при температуре 4±2°C не менее 24 месяцев.
Для полученного бактериального препарата определяли ингибиторную активность в отношении широкого круга грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов диффузионным методом на твердой питательной среде (таблица 1).
Для предлагаемого бактериального препарата с пробиотической активностью в экспериментах in vitro установлена антиоксидантная, гепатопротекторная, противоопухолевая активность.
Антиоксидантные свойства бактериального препарата изучали в соответствии с методом, описанным Cao, et al (1995) путем определения степени защиты от окисления β-фикоэритрином по измерению относительной флуоресценции при 595 нм и при 535 нм в течение 70-минутного периода.
Гепатопротекторные свойства бактериального препарата оценивали по его ингибирующему эффекту на образование β-глюкуронидазы тест-штаммом Е. coli HGU-3.
Противоопухолевые свойства бактериального препарата тестировали in vitro на раковых клеточных линиях: лимфомы Беркитта ЛБР2, рака предстательной железы человека DU 145, рака молочной железы человека MDAMB-231 и MCF7, гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, рака головного мозга U-87, рака поджелудочной железы человека PANC-1.
Количество живых раковых клеток по окончании периода инкубации с бактериальным препаратом определяли с помощью МТТ-колориметрического метода, основанного на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) до фиолетовых кристаллов формазана, растворимых в диметилсульфоксиде.
Результаты определения антиоксидантной активности бактериального препарата представлены на фиг. 1.
Результаты определения гепатопротекторной активности бактериального препарата представлены на фиг. 2.
Результаты определения противоопухолевой активности бактериального препарата представлены в таблице 2.
Пример 2
2
3
4
5
3
4
5
1 г фекалий вносят в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (NaCl) и тщательно суспендируют путем встряхивания в течение 20-30 минут. Затем отстаивают и через 1 час из надосадочной жидкости готовят разведения в изотоническом растворе хлорида натрия 10, 10, 10, 10. Из разведений 10, 10, 10 делают посев бактериологической петлей на питательную среду.
8
Бактерии культивируют в анаэробном режиме при температуре 37°C в течение 1,20-24,0 часов до достижения концентрации микроорганизмов 1,0·10 КОЕ/мл в жидкой питательной среде состава (г/л): протеозопептон - 15,0; папаиновый перевар соевой муки - 10,0; натрия гидрофосфат - 1,5; Твин-80 - 1,0; аммония цитрат - 2,0; цистеина гидрохлорид - 1,0; магния хлорид - 0,5; кислота аскорбиновая - 0,2; натрия хлорид - 2,5; глюкоза - 10,0; мясной экстракт - 10,0; натрия азид - 0,2; рН среды - 7,0±0,2.
По окончании культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 минут.
Пробиотические бактерии подвергают сублимационной сушке при параметрах, указанных в примере 1. Сублимационно-высушенный бактериальный препарат хранят в ампулах при температуре 4±2°C не менее 24 месяцев.
Для полученного бактериального препарата определяли ингибиторную активность в отношении широкого круга грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов диффузионным методом на твердой питательной среде (таблица 1).
Для предлагаемого бактериального препарата с пробиотической активностью в экспериментах in vitro установлена антиоксидантная, гепатопротекторная, противоопухолевая активность.
Результаты определения антиоксидантной активности бактериального препарата представлены на фиг. 1.
Результаты определения гепатопротекторной активности бактериального препарата представлены на фиг. 2.
Результаты определения противоопухолевой активности бактериального препарата представлены в таблице 2.
Пример 3
2
3
4
5
3
4
5
1 г фекалий вносят в 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия (NaCl) и тщательно суспендируют путем встряхивания в течение 20-30 минут. Затем отстаивают и через 1 час из надосадочной жидкости готовят разведения в изотоническом растворе хлорида натрия 10, 10, 10, 10. Из разведений 10, 10, 10 делают посев бактериологической петлей на питательную среду.
8
Бактерии культивируют в анаэробном режиме при температуре 37°C в течение 1,20-24,0 часов до достижения концентрации микроорганизмов 1,0·10 КОЕ/мл в жидкой питательной среде состава (г/л): дрожжевой экстракт - 10,0; панкреатический гидролизат казеина - 20,0; натрия гидрофосфат - 2,5; Твин-80 - 0,7; лактоза - 5,0; аммония цитрат - 0,5; цистеина гидрохлорид - 1,0; магния хлорид - 1,0; кислота аскорбиновая - 0,1; натрия ацетат - 0,2; натрия хлорид - 3,0; глюкоза - 5,0; мясной экстракт - 15,0; марганца сульфат - 0,1; натрия азид - 0,2; pH среды - 7,0±0,2.
По окончании культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 минут.
Пробиотические бактерии подвергают сублимационной сушке при параметрах, указанных в примере 1. Сублимационно-высушенный бактериальный препарат хранят в ампулах при температуре 4±2°C не менее 24 месяцев.
Для полученного бактериального препарата определяли ингибиторную активность в отношении широкого круга грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов диффузионным методом на твердой питательной среде (таблица 1).
Для предлагаемого бактериального препарата с пробиотической активностью в экспериментах in vitro установлена антиоксидантная, гепатопротекторная, противоопухолевая активность.
Результаты определения антиоксидантной активности бактериального препарата представлены на фиг. 1.
Результаты определения гепатопротекторной активности бактериального препарата представлены на фиг. 2.
Результаты определения противоопухолевой активности бактериального препарата представлены в таблице 2.
9
Фиг. 1 позволяет сделать вывод о том, что бактериальные препараты с пробиотической активностью, полученные по трем описанным примерам, характеризуются выраженными антиоксидантными свойствами (величина тролокс-эквивалента/10 клеток находится в диапазоне от 1346 до 2728). При этом максимальная антиоксидантная активность обнаружена у бактериального препарата по примеру 2 (2728).
Из фиг. 2 следует, что бактериальные препараты с пробиотической активностью, полученные по трем описанным примерам, проявляют гепатопротекторные свойства (ингибирующий эффект на образование β-глюкуронидазы Е. coli HGU-3 составляет от 75,0 до 83,0%). Наиболее ярко гепатопротекторные свойства проявляются у бактериального препарата по примеру 3 (83,0%).
7
Из таблицы 2 следует, что бактериальные препараты с пробиотической активностью, полученные по трем описанным примерам, характеризуются противоопухолевой активностью по отношению к тестируемым клеточным линиям, однако наиболее выраженные противоопухолевые свойства характерны для бактериального препарата по примеру 1. Бактериальный препарат по примеру 1 в концентрации 10 КОЕ/мл наибольшую активность проявляет в отношении клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 (выживаемость 16,4%) и рака молочной железы человека MDAMB-231 (выживаемость 19,6%).
Таким образом, заявляемый способ получения бактериального препарата с пробиотической активностью позволяет получить продукт с выраженными антагонистическими свойствами по отношению к широкому кругу патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также антиоксидантной, гепатопротекторной и противоопухолевой активностью.
Предлагаемый бактериальный препарат с пробиотической активностью может быть использован для создания функциональных продуктов питания для онкологических больных в период реабилитации.