СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВОГО ОЛИГОМЕРА
METHOD OF OBTAINING PROANTHOCYANIDIN OLIGOMER

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения проантоцианидинового олигомера, с помощью которого можно уменьшить молекулярную массу проантоцианидинового полимера, содержащегося в растении, до значения, при котором он может всасываться в живом организме (без затруднений - в желудочно-кишечном тракте).
Точнее, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей проантоцианидиновый олигомер, обладающий степенью полимеризации, равной от 2 до 4, и содержащий флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, присоединенную к его концу, которую получают путем нагревания материала, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, содержащим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в растворе кислоты, к способу ее получения, к применению композиции и к новому проантоцианидиновому олигомеру, содержащему присоединенную к нему флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру.
Композицию, содержащую проантоцианидиновый олигомер, полученную в соответствии с настоящем изобретением, можно использовать в пищевых продуктах, в пищевых продуктах здорового питания, в пищевых продуктах для улучшения состояния здоровья, в косметических продуктах и в медицинских продуктах. Композиция является особенно подходящей для использования в качестве композиции в пищевых продуктах здорового питания и в медицинских продуктах, предназначенных для предупреждения связанных с образом жизни заболеваний, обусловленных выработкой реакционно-способных кислородсодержащих частиц, предупреждения и лечения заболеваний головного мозга или предупреждения старения.
Уровень техники
Вследствие избыточного потребления жиров, что обусловлено изменением нашего привычного пищевого рациона, увеличенного воздействия ультрафиолетового излучения из-за изменения состояния окружающей среды, разрушения озонового слоя и т.п., усиления загрязнения окружающей среды и т.п., также увеличивается распространенность так называемых связанных с образом жизни заболеваний, таких как гиперлипидемия, гиперхолестеринемия, повышенное артериальное давление, диабет и раковые заболевания, а также увеличивается количество пациентов, страдающих от аллергии или заболеваний головного мозга, таких как слабоумие. Вызывает опасение то, что в связи с быстрым старением населения в будущем увеличится количество пациентов, страдающих слабоумием и болезнью Альцгеймера. Отмечено, что участие реакционно-способных кислородсодержащих частиц, образующихся in vivo, является фактором, способствующим проявлению этих заболеваний (Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol.10 (2002), р.р.2497-2509; непатентный документ 1). Однако, поскольку пока не разработаны эффективные методики подавления или устранения образования реакционно-способных кислородсодержащих частиц, не разработаны и достаточно надежные медицинские методики, применимые для лечения и предупреждения связанных с образом жизни заболеваний, заболеваний головного мозга и т.п.
В последнее время привлекли внимание натуральные вещества, находящиеся в растениях и содержащие физиологически активные вещества, в особенности полифенолы. Можно полагать, что полифенолы, которые обычно содержатся в чае, овощах, фруктах, травянистых растениях и т.п., можно потреблять в пищевых продуктах и напитках в течение длительного периода времени и они выступают в качестве средства лечения/предупреждения, не приводящего к побочным эффектам.
Полифенолы, вторичные метаболиты растений, которые повсеместно в больших количествах находятся в растениях и для которых известно, что они обладают разнообразной физиологической активностью, давно привлекали внимание в области фармацевтики и фитохимии и в настоящее время привлекли внимание в области продуктов здорового питания. Например, известно, что полифенолы чая, в особенности катехины, обладают широким спектром физиологической активности, например антибиотической, противовирусной, противомутагенной, антиокислительной, снижающей артериальное давление, снижающей содержание холестерина в крови, препятствующей старению, противоаллергической, улучшающей кишечную флору, устраняющей запахи активностью и т.п.
Относящиеся к полифенолам проантоцианидины содержатся в более широкой группе растений. Для того чтобы проантоцианидины проявили различную физиологическую активность, проантоцианидин должен всасываться в живом организме в желудочно-кишечном тракте. Однако молекулярные массы проантоцианидинов обычно составляют порядка от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч. Вещество, обладающее такой большой молекулярной массой, с трудом всасывается в желудочно-кишечном тракте и во многих случаях даже после проглатывания не всасывается в живом организме и не используется в качестве питательного вещества.
Термин "проантоцианидины" является родовым названием процианидина, продельфинидина, пропеларгонидина и т.п., т.е. полимеров, димеров, тримеров, тетрамеров, декамеров и высших олигомеров, содержащих структурное звено флафан-3-ол (также называющихся катехинами), и продуктов их этерификации галловой кислотой, и их стереоизомеров, которые являются полифенолами, образующими антоцианидины при обработке кислотой. Указанные структурные звенья связаны друг с другом связью углерод-углерод между положением 4 и положением 8 углеродного скелета или между положением 4 и положением 6, или иногда, в дополнение к связи углерод-углерод, простой эфирной связью между положением 2 и положением 7.
Проантоцианидин обладает превосходной антиокислительной способностью (Arch. Biochem. Biophys., Vol.374, p.p.347-355, 2000: непатентный документ 2) и кроме того, поскольку оказывает другие воздействия, такие как улучшение кровотока, противострессовое воздействие, гипотензивное воздействие, антибиотическое воздействие, противоопухолевое воздействие, противокатарактальное воздействие и противодиарейное воздействие, его применяют в качестве вещества природного происхождения, оказывающего оздоравливающее воздействие.
Проантоцианидины выделяют в виде смеси из коры сосны, незрелых яблок, виноградных косточек и т.п. и в настоящее время прибавляют в напитки, кондитерские изделия, пищевые продукты здорового питания, косметические продукты, средства для роста волос и т.п., которые имеются в продаже.
Во многих растениях, содержащих проантоцианидин, различные проантоцианидины от обладающих низкой степенью полимеризации до обладающих большой молекулярной массой содержатся в виде смеси и многие из них являются растениями, в основном содержащими проантоцианидины, обладающие высокой степенью полимеризации, такими как хурма, банан и хеномелес китайская. Однако из числа проантоцианидинов проантоцианидиновый полимер, обладающий высокой степенью полимеризации, обладает худшей фармакологической активностью, чем проантоцианидиновые олигомеры, обладающие степенью полимеризации, равной от 2 до 4, что является следствием плохой всасываемости в кишечнике. Кроме того, предпочтительно, чтобы такой проантоцианидиновый полимер, обладающий сильной вяжущей способностью и плохой растворимостью в воде, был удален, если растение используется в пищевых продуктах (Free Radical Res., Vol.29, p.p.351-358, 1998: непатентный документ 3). На основании этих данных проантоцианидиновый олигомер, обладающий степенью полимеризации, равной от 2 до 4, привлек особое внимание как обладающий превосходной способностью сохранять здоровье и полученный из коры сосны используется в напитках и пищевых продуктах здорового питания.
Для получения только проантоцианидина из экстракта растения используют методику поглощения (см., например, Н06-49053: патентный документ 1) и т.п. Однако трудно разделить продукты, различающиеся по степени полимеризации. Чтобы получить только проантоцианидиновые олигомеры, обладающие степенью полимеризации, равной от 2 до 4, методику распределения между растворителями с использованием этилацетата, методику твердофазной экстракции с использованием метилацетата и хроматографическую методику (Публикация РСТ WO 00/64883: патентный документ 2), методику поглощения хитином (Публикация РСТ WO 03/091237: патентный документ 3) и т.п. используют для выделения только обладающих низкой молекулярной массой проантоцианидинов путем экстракции. Однако в этих методиках отбрасывается большое количество обладающих большой молекулярной массой проантоцианидиновых полимеров, что приводит к низкому выходу.
В качестве альтернативной методики, заменяющей методики выделения проантоцианидиновых олигомеров, обладающих степенью полимеризации, равной от 2 до 4, из растений, содержащих проантоцианидиновые полимеры, авторы настоящего изобретения ранее предложили способ реакции содержащего проантоцианидиновый полимер материала с SH-содержащим соединением, таким как цистеин, для уменьшения молекулярной массы проантоцианидинового олигомера (Публикация РСТ WO 2004/103988: патентный документ 4). По этой методике можно получить проантоцианидиновый олигомер, содержащий связанный с ним цистеин, обладающий уменьшенной молекулярной массой и превосходно подвергающийся системному всасыванию. Подтверждено, что проантоцианидиновый олигомер нетоксичен и его можно использовать без опасений. Однако в настоящее время в некоторых странах (включая Японию) существует затруднение, заключающееся в том, что необходимо выполнение строгих процедур для получения разрешения на использование пищевых продуктов здорового питания, содержащих проантоцианидин, с которым связан цистеин, и такое соединение не является природным химическим веществом.
[Патентный документ 1] Japanese Patent Application Laid-Open No. Н06-49053.
[Патентный документ 2] Публикация РСТ No. WO 00/64883.
[Патентный документ 3] Публикация РСТ No. WO 03/091237.
[Патентный документ 4] Публикация РСТ No. WO 2004/103988.
[Непатентный документ 1] Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol.10 (2002), p.p.2497-2509.
[Непатентный документ2] Arch. Biochem. Biophys., Vol.374, p.p.347-355, 2000.
[Непатентный документ 3] Free Radical Res., Vol.29, p.p.351-358, 1998.
Описание изобретения
Задачи изобретения
В основу настоящего изобретения положена задача разработки удобного и эффективного способа уменьшения молекулярной массы проантоцианидинового олигомера, широко распространенного в природе в виде проантоцианидинового полимера, но не ограничиваясь веществами природного происхождения в качестве олигомера, путем использования в качестве исходного вещества проантоцианидинового полимера, растения, содержащего проантоцианидиновый полимер, или его экстракта и связывания материала с веществом, содержащим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру.
Пути решения задачи
Для решения указанной задачи выше авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования и на основании полученных результатов обнаружили, что проантоцианидин можно фракционировать и уменьшить его молекулярную массу и одновременно можно превратить в проантоцианидиновый олигомер, к концу которого присоединен катехин, путем медленного кипячения плодов, кожуры плодов, коры, листьев или их экстрактов, содержащих проантоцианидиновый полимер, таких как хурма обыкновенная, банан, виноград, сосна, Chamaecyparis obtuse (кипарисовик туполистный), камфарное дерево, восковник восконосный, хеномелес китайская, личи, Myrica rubra (восковница красная) и Cinnamomi Cortex (коричное дерево), вместе с зеленым чаем или зелеными листьями чая, содержащими большое количество обладающих низкой молекулярной массой катехинов, в растворе кислоты в течение от 2 до 3 ч.
Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что проантоцианидин можно фракционировать, уменьшить его молекулярную массу и превратить в проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, путем использования вещества, содержащего флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, и других растительных материалов (таких как виноградные косточки и виноградная кожица), содержащих такое вещество, вместо зеленого чая или зеленых листьев чая, и на основании этих данных завершили настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим разделам 1-14, композиции, содержащей в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к концу которого присоединено вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, путем нагревания растения, содержащего проантоцианидиновый полимер, или его экстракта с зеленым чаем или зелеными листьями чая в водном растворе кислоты (1-5), способам ее получения (6-9), применению композиции (10-12) и к новому проантоцианидиновому олигомеру (13-14).
1. Композиция, содержащая в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к концу которого присоединено вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, и молекулярная масса которого уменьшена, которую получают путем нагревания растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их экстрактов с веществом, содержащим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, растением, содержащим такое вещество, или его экстрактом в водном растворе кислоты.
2. Композиция, содержащая в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 1, в которой растение, содержащее проантоцианидиновый полимер, представляет собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, включающей виноград, сосну, Chamaecyparis obtuse (кипарисовик туполистный), камфарное дерево, восковник восконосный, какао, хурму обыкновенную, банан, хеномелес китайскую, яблоню, боярышник, личи, Myrica rubra (восковница красная) и Cinnamomi Cortex (коричное дерево).
3. Композиция, содержащая в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 1, в которой вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, представляет собой по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, включающей ресвератрол, флороглюцин, флавоноид и флаваноид (галлоиловый эфир катехина).
4. Композиция, содержащая в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 1, в которой вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, представляет собой по меньшей мере один материал, выбранный из группы, включающей зеленый чай, зеленые листья чая, виноградные косточки, оболочки виноградных косточек, прессованный экстракт Uncaria gambir Roxb., красные водоросли и их экстракты.
5. Композиция, содержащая в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 1, обладающий степенью полимеризации, равной от 2 до 4.
6. Способ получения композиции, содержащей в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в любом из разделов 1-5, включающий стадию нагревания растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их экстрактов с растениями, содержащими флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, или их экстрактами в водном растворе кислоты и стадию концентрирования реакционного раствора, содержащего проантоцианидиновый олигомер, содержащий флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, присоединенную к концам, и молекулярная масса которого уменьшена, и сушку раствора.
7. Способ получения композиции, содержащей в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в любом из разделов 1-5, включающий стадию концентрирования реакционного раствора, содержащего проантоцианидиновый олигомер, содержащий вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, присоединенную к концам, и молекулярная масса которого уменьшена, и стадию фракционирующей обработки концентрированного раствора.
8. Способ получения композиции, содержащей в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 6 или 7, в котором кислую среду создают с помощью неорганический кислоты, органический кислоты или их обеих.
9. Способ получения композиции, содержащей в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 8, в которой по меньшей мере одно вещество выбрано из группы, включающей хлористоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту и яблочную кислоту.
10. Композиция, содержащая проантоцианидиновый олигомер, описанный в любом из разделов 1-5, применяющаяся в пищевых продуктах здорового питания, предназначенных для лечения/предупреждения связанных с образом жизни заболеваний, обусловленных выработкой реакционно-способных кислородсодержащих частиц, и заболеваний головного мозга или для предупреждения старения.
11. Композиция, содержащая проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 10, применяющаяся в фармацевтических продуктах для лечения/предупреждения связанных с образом жизни заболеваний, обусловленных выработкой реакционно-способных кислородсодержащих частиц, и заболеваний головного мозга или для предупреждения старения.
12. Композиция, содержащая проантоцианидиновый олигомер, описанный в разделе 10, применяющаяся в косметических продуктах для предупреждения старения, обусловленного выработкой реакционно-способных кислородсодержащих частиц.
13. Проантоцианидиновый олигомер, описывающийся приведенной ниже формулой (1).
(В формуле n равно 0, 1 или 2.)
14. Проантоцианидиновый олигомер, описывающийся приведенной ниже формулой (2).
(В формуле n равно 0, 1 или 2.)
Результаты применения изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей в качестве главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к концам которого присоединено вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, и молекулярная масса которого уменьшена, композицию получают концентрированием и сушкой реакционного раствора, полученного нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их экстрактов с веществом или растениями, содержащими флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, или их экстрактами в водном растворе кислоты. В контексте настоящего изобретения проантоцианидиновый олигомер, к концам которого присоединено вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, и молекулярная масса которого уменьшена, и который применим в качестве композиции для пищевых продуктов здорового питания и фармацевтических продуктов, предназначенных для лечения/предупреждения связанных с образом жизни заболеваний, обусловленных выработкой реакционно-способных кислородсодержащих частиц, и заболеваний головного мозга или для предупреждения старения, можно эффективно получить из содержащих проантоцианидиновый полимер материалов.
Наилучший вариант осуществления изобретения
Настоящее изобретение подробнее описано ниже.
Сырьем, использующимся для получения проантоцианидинового олигомера, предлагаемого в настоящем изобретении, являются содержащие проантоцианидиновый полимер растения (такие как плоды, кожура плодов, кора и листья) или их экстракты.
В настоящем изобретении примеры содержащих проантоцианидиновый полимер растений включают плодовые растения, такие как вяжущая хурма, банан, яблоня, груша, виноград, земляника, авокадо, черника, боярышник, корень лотоса, гречиха, личи и Myrica rubra (восковница красная), травянистые растения, пряные растения, древесину, Cinnamomi Cortex (коричное дерево) и кору сосны. Из них предпочтительно использовать вяжущую хурму, банан, виноград, сосну, Chamaecyparis obtuse (кипарисовик туполистный), камфарное дерево, восковник восконосный, хеномелес китайскую, личи и Myrica rubra (восковница красная).
В настоящем изобретении эти растения, содержащие проантоцианидиновый олигомер, нарубают (нарезают) или раздавливают и затем используют экстракты, полученные путем нагревания этих материалов в водном растворителе, которые затем концентрируют и сушат.
Отсутствуют специальные ограничения на вещество, содержащее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, применяющееся в реакции, предлагаемой в настоящем изобретении, если только это вещество представляет собой растение, содержащее ресвератрол, флороглюцин, флавоноид и флаваноид (галлоиловый эфир катехина) или их экстракты. Их примеры включают зеленый чай, зеленые листья чая, виноградные косточки, оболочки виноградных косточек, прессованный экстракт Uncaria gambir Roxb., красные водоросли и их экстракты. Из них с учетом того, что в настоящем изобретении основными областями применения проантоцианидинового олигомера являются пищевые продукты здорового питания, ингредиенты пищевых продуктов для улучшения состояния здоровья, косметические продукты и фармацевтические продукты, в особенности пищевые продукты для улучшения состояния здоровья, косметические продукты, которые обычно используются для питья и безопасность которых подтверждена, предпочтительными являются виноградные косточки, оболочки виноградных косточек, зеленый чай, зеленые листья чая и их экстракты.
Соотношение содержащих проантоцианидиновый полимер растительных материалов и вещества, содержащего флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, использующихся в реакции, выбирают произвольно. Предпочтительно, чтобы количество последнего было достаточным для связывания с фрагментами проантоцианидинового полимера, молекулярная масса которого уменьшена. Если количество вещества, содержащего флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, слишком мало, то проантоцианидин, обладающий большой молекулярной массой, может не вступить в реакцию и в этом случае оставшийся проантоцианидин, обладающий большой молекулярной массой, можно легко удалить с помощью колоночной хроматографии.
Реакцию между проантоцианидинами, содержащимися в растении, или проантоцианидинами, содержащимися в их экстракте, и веществом, содержащим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру (далее иногда кратко называющимся "вещество, содержащее флоро/резорциновое кольцо"), проводят в растворителе при нагревании.
В качестве растворителя для проведения реакции используют воду, метанол, этанол и смеси двух или большего количества из них. С учетом того что продукт применяется в пищевых продуктах или фармацевтических продуктах, предпочтительными являются вода и этанол.
Реакцию предпочтительно проводить в кислой среде. Кислоту предпочтительно выбрать из числа неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, серная кислота и азотная кислота, и органических кислот, таких как уксусная кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, и их используют при концентрации, равной от 0,1 до 1,0 н., предпочтительно примерно 0,5 н.
Реакцию между растением или экстрактом растения, содержащим проантоцианидины и вещество, содержащее флоро/резорциновое кольцо, проводят при температуре от комнатной до 100°С в течение от 0,5 ч до 1 недели, предпочтительно от 90 до 100°С в течение от 1 до 4 ч.
Реакционный раствор после проведения реакции фильтруют или подвергают аналогичной обработке для удаления твердых веществ и выделения жидкости. Полученный экстракт (жидкость), содержащий проантоцианидиновый олигомер, после конденсации и сушки можно использовать в различных формах, таких как жидкость, порошок, гель, твердый расплавленный продукт и т.п. Реакционный раствор после проведения реакции можно сконцентрировать и высушить или сконцентрировать и подвергнуть фракционированию. По этим методикам искомое вещество выделяют из реакционного раствора, концентрируют и очищают по обычным методикам. Например, остатки отделяют фильтрованием и после концентрирования фильтрата концентрированную жидкость можно очистить путем обработки экстракта с помощью пленочных технологий (таких как ультрафильтрование и обратный осмос) или обработки адсорбентом или аналогичной обработки, позволяющей сконцентрировать и выделить искомое вещество.
Примеры адсорбентов включают стирол-дивинилбензольный адсорбент, адсорбент на основе метакриловой кислоты, гидрофильный виниловый полимер, модифицированный гель декстрана, полиакриламидный гель, обращенно-фазовый силикагель и ионообменную смолу. В случае использования адсорбента проантоцианидиновые олигомеры, молекулярная масса которых уменьшена по реакции с веществом, содержащим флоро/резорциновое кольцо, содержатся во фракции, адсорбированной на адсорбенте (далее называющейся "адсорбированной фракцией (фракциями"). Путем элюирования адсорбированной фракции смесью воды со спиртом, спиртом, ацетоном и т.п. можно получить компоненты, обладающие разными молекулярными массами. В этом случае путем выделения искомого проантоцианидинового олигомера, обладающего степенью полимеризации, равной от 2 до 4, из реакционного раствора с помощью колоночной хроматографии с использованием синтетического адсорбента на основе ароматического соединения можно отделить проантоцианидин, обладающий большой молекулярной массой, и концентрирование элюата проводится легко, что является предпочтительным. Предпочтительные примеры синтетического адсорбента на основе ароматического соединения включают пористый полимер на основе сшитого полистирола, такой как SEPABEADS.
1
По результатам исследований с помощью Н-ЯМР, УФ (ультрафиолетовой) спектроскопии, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), ГПХ (гельпроникающая хроматография) и ТСХ (тонкослойная хроматография) подтверждено, что полученный таким образом проантоцианидиновый олигомер содержит олигомеры проантоцианидина от димеров до тетрамеров, и их типичная структура описывается формулами (1) и (2).
1
2
2
(В формуле R обозначает атом водорода или гидроксигруппу и R обозначает атом водорода или гидроксигруппу, R обозначает атом водорода или галлоильную группу,
и n равно 0, 1 или 2.)
Хотя в формулах (1) и (2) представлены только структуры, содержащие связи между положением 4 и положением 8, существуют и структуры, содержащие связи между положением 4 и положением 6, и связи 2-0-7.
Путем реакции между проантоцианидиновым полимером и веществом, содержащим флоро/резорциновое кольцо, предлагаемыми в настоящем изобретении, проантоцианидиновый полимер, обладающий большой молекулярной массой (степенью полимеризации 5) и не всасывающийся в живом организме, можно легко фрагментировать и получить полимер, обладающий низкой молекулярной массой, который всасывается, и одновременно получить композицию, в основном содержащую проантоцианидиновые олигомеры от димера до тетрамера.
Проантоцианидиновый олигомер, к концу которого присоединено вещество, содержащее флоро/резорциновую кольцевую структуру, полученный в соответствии с настоящем изобретением, который обладает сильной антиокислительной активностью по данным исследований антиокислительной активности по методикам ДФПГ, ААЭТ и СААЖ (снижение антиокислительной активности соединениями железа(III)), обладает антиокислительной способностью, сравнимой со способностью других полифенолов. Кроме того, путем проводимых на животных исследований заболеваний, связанных с образом жизни, и исследования показателя антиокислительной активности для людей можно получить данные о том, что воздействия можно объяснить антиокислительной активностью.
В соответствии с этим продукты, содержащие в качестве активного ингредиента проантоцианидиновый олигомер, предлагаемый в настоящем изобретении, не только подавляют образование пероксида липида in vivo, но и влияют на заболевания, вызванные окислением вследствие наличия активного кислорода. Поэтому продукты, которые обладают способностью предупреждать поражения различных органов, вызванные образованием пероксида липида или активного кислорода, а также предупреждать старение, эффективны для предупреждения и лечения различных заболеваний, вызванных поражением таких органов и старением. Кроме того, можно полагать, что эти продукты эффективны для подавления/предупреждения/лечения нарушений функций головного мозга, таких как слабоумие, вероятно, вызванных старением головного мозга. Одновременно, наряду с улучшением состояния головного мозга, можно ожидать улучшения способности к обучению, ослабления раздражения, ослабления инсомнии, ослабления нарушения самообладания и т.п. Таким образом, продукты, содержащие в качестве активного ингредиента проантоцианидиновый олигомер, предлагаемый в настоящем изобретении, можно использовать в пищевых продуктах здорового питания, фармацевтических продуктах, косметических продуктах и т.п.
При использовании продуктов, содержащих в качестве активного ингредиента проантоцианидиновый олигомер, предлагаемый в настоящем изобретении, не обнаружено проявлений токсичности, и эти продукты можно использовать без опасений. Эти продукты вводят перорально или парентерально. В случае перорального введения доза меняется в зависимости от возраста, массы тела, симптомов, необходимого терапевтического эффекта, пути введения и т.п. Обычно для взрослых доза находится в диапазоне от 50 до 1000 мг. В случае перорального введения продукты, предлагаемые в настоящем изобретении, используют в виде таблеток, шариков, капсул, порошка, гранулированного порошка, сиропа и т.п. В случае парентерального введения их используют в виде растворов для инъекций и т.п. Для приготовления гранулированных продуктов, таблеток или сиропов можно использовать подходящие вспомогательные вещества (такие как крахмалы, декстрин, подсластители, красители и ароматизаторы).
ПРИМЕРЫ
Ниже настоящее изобретение специально описано с помощью примеров. Настоящее изобретение ни в коей мере не ограничивается примерами.
Пример 1
1
Процианидин В4 (100 мг) и эпигаллокатехин-3-О-галлат (100 мг) растворяли в 40 мл 2% раствора лимонной кислоты и нагревали при 100°С в течение 2 ч. После охлаждения реакционный раствор с помощью колоночной хроматографии с использованием MCI-gel CHP20P (водный метанол) и затем с помощью колоночной хроматографии с использованием Sephadex LH-20 (60% метанол) и в качестве неочищенного вещества получали процианидин В4 (10 мг) и эпигаллокатехин-3-О-галлат (59,2 мг), а также получали вновь образовавшийся (-)-эпикатехин (25,4 мг) и (+)-катехин(4β→8)-(-)-эпигаллокатехин-3-O-галлат (17,3 мг). Идентификацию полученных композиций проводили путем сопоставления Н-ЯМР спектров образовавшихся катехина и проантоцианидина с данными для композиций предшествующего уровня техники. (См. приведенные выше структурные формулы.)
Пример 2
0,5 г процианидинового полимера, экстрагированного из бетельного ореха и (-)-эпигаллокатехин-3-О-галлат (0,5 г) растворяли в 200 мл 2% раствора лимонной кислоты и нагревали при 95°С в течение 3 ч. Реакционный раствор хроматографировали на колонке таким же образом, как в примере 1, получали эпигаллокатехин-3-О-галлат (403 мг), вновь образовавшийся (+)-катехин (48,6 мг) и (-)-эпикатехин(4β→8)-(-)-эпигаллокатехин-3-O-галлат (148,3 мг), который представляет собой проантоцианидин (см. приведенные выше структурные формулы).
Пример 3
5 г коры кипариса японского, содержащей смесь катехина и процианидина, и 1 г зеленого чая растворяли в 100 мл 2% раствора лимонной кислоты и нагревали при 95°С в течение 3 ч. После охлаждения к раствору прибавляли 100 мл этанола и раствор фильтровали с отсасыванием. Фильтрат анализировали с помощью ВЭЖХ. Условия проведения ВЭЖХ являлись следующими.
Колонка: Cosmosil 5C18 ARII (4,6×250 мм),
Температура колонки: 35°С,
Подвижная фаза: А: 50 мМ фосфорная кислота,
3
В: CHCN,
В от 4 до 30% (в течение 39 мин),
от 30 до 75% (в течение 15 мин),
Скорость потока: 0,8 мл/мин,
Детектирование: Детектирование с помощью фотодиодной решетки
5 г коры кипариса японского и 1 г зеленого чая по отдельности нагревали в растворе лимонной кислоты при таких же условиях и затем экстрагировали. Анализ с помощью ВЭЖХ проводили таким же образом (см. ВЭЖХ на фиг.1). В растворе экстракта, полученном путем обработки смеси коры кипариса японского и зеленого чая в растворе лимонной кислоты, обнаруживали пики многих новых соединений, которые не обнаруживались в случае обработки коры кипариса японского и зеленого чая по отдельности. На основании сопоставления пиков в ультрафиолетовых спектрах поглощения, полученных в настоящем примере и в примерах 1 и 2, сделан вывод о том, что все эти соединения являются проантоцианидинами.
Экстракт, полученный в примере 3 путем нагревания коры кипариса японского и зеленого чая в растворе лимонной кислоты, концентрировали и 5 раз подвергали распределению с 50 мл воды и 50 мл этилацетата 5. Полученные этилацетатные слои объединяли и также концентрировали и получали 0,67 г экстрагированного этилацетатом продукта. Экстракты, полученные из обработанных по отдельности коры кипариса японского и зеленого чая, таким же образом подвергали распределению с растворителем и получали 0,30 г экстрагированного этилацетатом продукта из коры кипариса японского и 0,37 г экстрагированного этилацетатом продукта из зеленого чая. Полученные таким образом 3 экстракта этилацетатом анализировали с помощью ТСХ. Условия проведения ТСХ являлись следующими.
Силикагель 60,
Проявляющий растворитель:
бензол-этилформиат-муравьиная кислота (1:7:1, об./об.).
Окрашивающий реагент: реагент ванилин - хлористоводородная кислота (см. ТСХ на фиг.2.)
Реагент ванилин - хлористоводородная кислота, который является реагентом для обнаружения катехинов и проантоцианидинов, при наличии этих веществ приобретает характерный красный цвет. Для экстракта, полученного обработкой коры кипариса японского и зеленого чая в растворе лимонной кислоты, обнаружены пятна проантоцианидина димера и тримера.
В водном слое, оставшемся после распределения с этилацетатом в примере 3, остается проантоцианидин, обладающий большей молекулярной массой, чем молекулярная масса проантоцианидина, перенесенного в этилацетатный слой. Затем молекулярные массы ацетилированных проантоцианидинов, содержащихся в водном слое, сопоставляли с помощью анализа посредством гельпроникающей хроматографии. Водный слой после обработки коры кипариса японского и зеленого чая раствором лимонной кислоты и водный слой коры кипариса японского концентрировали и сушили досуха. После растворения в смеси уксусный ангидрид-пиридин раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 8 ч. Реакционные растворы выливали в воду со льдом и осадившееся нерастворенное вещество отделяли путем фильтрования и сушили в вакууме. Полученное ацетилированное вещество анализировали на колонке TSK-GEL G4000H6 с использованием тетрагидрофурана в качестве растворителя и с детектированием по поглощению в УФ-области при 254 нм. По данным оценок молекулярной массы полученных продуктов с помощью калибровочных графиков, построенных путем использования бензола и полистиролов, обладающих молекулярными массами, равными 4000, 25000 и 50000, вершины пиков для проантоцианидина, содержащегося в водном слое после обработки коры кипариса японского и зеленого чая лимонной кислотой соответствовали примерно 1300, а вершины пиков для проантоцианидина, содержащегося в водном слое коры кипариса японского, соответствовали примерно 2000. Обнаружено, что прибавление зеленого чая при обработке лимонной кислотой приводит к уменьшению молекулярной массы.
Пример 4
100 г кожуры свежих бананов измельчали в 300 мл смеси ацетон-вода (4:1, об./об.) с помощью вихревого измельчителя и фильтровали с отсасыванием. Ацетон отгоняли из фильтрата с помощью испарителя и получали водный раствор, нерастворенное вещество отфильтровывали и к раствору прибавляли воду до полного объема, равного 200 мл. Отдельно 3 г листьев зеленого чая при кипячении экстрагировали с помощью 300 мл воды и затем фильтровали с отсасыванием, прибавляли воду до полного объема, равного 300 мл. 100 мл экстракта бананов (полученного с использованием 50 г кожуры бананов) и 100 мл экстракта зеленого чая (полученного с использованием 1 г зеленого чая) смешивали и 2 г лимонной кислоты растворяли в смеси. Затем смесь нагревали при 95°С в течение 3 ч. После охлаждения водный раствор 3 раза экстрагировали этилацетатом и получали 0,312 г экстрагированного этилацетатом продукта. Таким же образом экстракт бананов и экстракт зеленого чая по отдельности подвергали распределению с этилацетатом и получали 0,015 г и 0,18 г этилацетатных экстрактов соответственно. Полученные этилацетатные экстракты анализировали с помощью ТСХ (см. ТСХ на фиг.3). Вследствие большой молекулярной массы проантоцианидина в экстракте кожуры бананов положительная реакция с реагентом ванилин - хлористоводородная кислота наблюдалась только в начале полосы, полученной при анализе с помощью ТСХ, тогда как для продукта, полученного обработкой экстракта кожуры бананов и экстракта зеленого чая лимонной кислотой, обнаруживались пятна новых димера и тримера проантоцианидина, не обнаруживающиеся для исходных экстрактов до обработки.
Пример 5
4
Вяжущий компонент, содержащийся в большом количество в вяжущей хурме, представляет собой проантоцианидин, который обладает очень большой молекулярной массой и содержит четыре типа катехинов чая (Tanaka et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 1013-1022, 1994). 100 г свежих незрелых плодов хурмы измельчали в 500 мл 1% раствора лимонной кислоты с помощью вихревого измельчителя и затем прибавляли и измельчали 500 мл 1% раствора лимонной кислоты и 20 г зеленого чая и смесь медленно кипятили в течение 3 ч. Реакционный раствор фильтровали с отсасыванием в горячем виде и получали 950 мл фильтрата. Половину фильтрата, 475 мл, 4 раза подвергали распределению с этилацетатом и получали 2,56 г этилацетатного слоя. Оставшуюся половину, 475 мл, пропускали через колонку Sepabeads SP850 (200 мл) и затем промывали водой для удаления сахара и адсорбированные полифенолы элюировали с помощью 40-60% этанола. Элюат концентрировали и получали 3,26 г фракции, содержащей катехин и проантоцианидин. С другой стороны, 200 г незрелых плодов хурмы измельчали в 900 мл смеси ацетон-вода (4:1, об./об.) и экстрагировали. Ацетон полностью отгоняли из фильтрата и полученный раствор экстракта пропускали через колонку Sepabeads SP850 (200 мл). В результате большая часть проантоцианидинов хурмы (таннин хурмы) не адсорбировалась, но элюировалась только водой. Количество полифенольной фракции, адсорбированной в колонке и элюированной водным раствором спирта, составляло лишь 0,76 г. Молекулярная масса проантоцианидина в хурме принята равной примерно 1,38×10 (Mastuo, Т. et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1637-1643, 1978), и она является слишком большой, чтобы вещество проникло в поры Sepabeads. С другой стороны, проантоцианидин хурмы, обработанный зеленым чаем, фракционированный и обладающий уменьшенной молекулярной массой, может проникнуть в поры Sepabeads и адсорбироваться. Настоящий пример показывает, что Sepabeads может отделить проантоцианидины, обладающие большими молекулярными массами. Экстрагированный этилацетатом продукт, полученный обработкой хурмы зеленым чаем и лимонной кислотой, и вещество, адсорбировавшееся на Sepabeads SP825, с помощью ТСХ сопоставляли с продуктом, экстрагированным этилацетатом из зеленого чая, и с продуктом, экстрагированным водным раствором ацетона из незрелой хурмы (см. ТСХ на фиг.4). Порцию, адсорбировавшуюся на Sepabeads SP825, исследовали с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой и провели сопоставление с полифенольной фракцией (содержащей мономер катехина, димер, тример и тетрамер процианидина и процианидин, обладающий большей молекулярной массой), полученной разделением продукта экстракции кипариса японского горячей водой, с помощью колоночной хроматографии DIAION HP20SS (см. ВЭЖХ на фиг.5). Условия проведения анализа с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой являлись следующими.
Колонка: LiChroCART Superspher Si 60 (4,6×250 мм),
Температура колонки: 28°С,
Подвижная фаза: гексан: метанол: тетрагидрофуран: трифторацетат (45:40:13,5:1,5),
Скорость потока: 1,0 мл/мин,
Детектирование: 254 нм.
1
В качестве контрольных веществ использовали (-)-эпикатехин (мономер), процианидин В4 (димер), процианидин Cl (тример) и циннамтаннин А2 (тетрамер). Эти контрольные вещества выделяли из семян мушмулы японской и идентифицировали путем сопоставления спектров Н-ЯМР с литературными данными. Хотя при исследовании с помощью ВЭЖХ обнаружен пик кофеина и одновременно подтверждено, что содержатся полимеры, включающие до 4 мономерных звеньев, все же количество побочных пиков меньше, чем в случае проантоцианидина кипариса японского.
Пример 6
1
1 кг свежих незрелых плодов хурмы измельчали в 2 л воды и смешивали с 200 г зеленого чая и 80 г лимонной кислоты. Прибавляли воду до полного объема, равного 8 л, и затем смесь медленно кипятили в течение 3 ч. После нагревания фильтровали в горячем виде. Полученный фильтрат охлаждали, пропускали через колонку Sepabeads SP825 и промывали водой. Адсорбированное вещество элюировали водным раствором этанола, концентрировали и сушили вымораживанием и получали 59,0 г смеси катехин-проантоцианидин. 6 г полученной смеси пропускали через колонку Sephadex LH-20 и разделяли на 8 фракций (ФР) (см. фиг.6). Полученное количество ФР 1, которая в основном содержала эпикатехин и эпигаллокатехин, составляло 0,79 г. Полученное количество ФР 2, которая в основном содержала эпикатехин-3-O-галлат, составляло 0,15 г. Полученное количество ФР 3, которая в основном содержала эпигаллокатехин-3-О-галлат, составляло 0,87 г. Полученное количество ФР 4, которая являлась смесью эпигаллокатехин-3-О-галлата и димера проантоцианидина, составляло 0,2 г. Полученные количества ФР 5 и ФР 6, которые обе содержали димер проантоцианидина, составляли 0,25 г и 0,51 г соответственно. Полученное количество ФР 7, которая в основном содержала тример проантоцианидина, составляло 0,88 г. Полученное количество ФР 8, которая содержала тот же тример, что и ФР 7, или проантоцианидины, обладающие большей молекулярной массой, составляло 1,63 г. Из этих фракций ФР 5 и ФР 6 очищали с помощью колоночной хроматографии MCI-gel CHP20P и колоночной хроматографии Chromatorex ODS (в обоих случаях в качестве растворителя использовали водный раствор метанола) и получали 101,6 мг (-)-эпикатехин(4β→8)-(-)-эпигаллокатехин-3-O-галлата, 121,1 мг (-)-эпигаллокатехин (4β→8)-(-)-эпигаллокатехин-3-O-галлата и 24,3 мг (-)-эпигаллокатехин-3-O-галлат(4β→8)-(-)-эпигаллокатехин-3-0-галлата (см. приведенные ниже структурные формулы). Хотя содержались несколько типов димеров проантоцианидина, авторы настоящего изобретения смогли выделить в чистом виде указанные выше три типа и путем сопоставления спектров Н-ЯМР идентифицировать их структуры.
Пример 7: Пример получения соединения, связанного с ресвератролом
100 мг порошкообразного полифенола из виноградных косточек (Grape Seed P.E. продукция фирмы Guilin Layn Natural Ingredients Corp., содержание проантоцианидинов: 95% или более) и 120 мг ресвератрола вместе со 100 мг лимонной кислоты растворяли в 10 мл воды, выдерживали в горячей воде в течение 3 ч (от 87 до 93°С) для протекания реакции и затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Эту жидкость вводили в колонку Sephadex LH-20 (внутренний диаметр 2 см, длина 15 см, примерно 50 мл, 70% метанол). Через колонку последовательно пропускали 50 мл 70% метанола и затем 50 мл 100% метанола и таким образом получали концентрат фракции искомого вещества. После сушки вымораживанием получали 6,0 мг порошка (далее обозначающегося, как предлагаемое в изобретении вещество А).
1
+
29
25
9
29
25
9
Этот сухой порошок растворяли в 1 мл 70% метанола и этот раствор вводили в колонку MCI-gel CHP-20 (внутренний диаметр 2 см, длина 15 см, примерно 50 мл). Через колонку пропускали 50 мл того же растворителя и таким образом получали концентрат фракции искомого вещества. После сушки вымораживанием получали 2,4 мг порошка. Полученный порошок исследовали с помощью ВР-ББА-МС (масс-спектроскопия высокого разрешения с бомбардировкой быстрыми атомами) и Н-ЯМР (спектроскопия ядерного магнитного резонанса водорода, см. таблицу 1). В ВР-ББА-МС значение [М] полученной фракции соединения найдено равным m/z: 516,1404, что согласуется со значением 516,1420, соответствующим молекулярной формуле CHO, с погрешностью, составляющей 3,1 ч./млн. Поэтому принято, что фракция содержит соединение, описывающееся молекулярной формулой CHO, что приводит к химической структуре, в которой ресвератрол связан с катехином или эпикатехином связью углерод-углерод.
1
В Н-ЯМР соединения (см. таблицу 1) в дополнение к 5 сигналам протонов ароматического кольца, которые обычны для катехина и эпикатехина, обнаруживается группа сигналов протонов, связанных с атомами кислорода, при δ 5,04 (1H, br.s, 2-H) и δ 4,01 (1H, br.s, 3-H), что свидетельствует о присутствии стерической конфигурации эпикатехина. Сигнал при δ 4,64 (1Н, br.s) приписан положению 4а эпикатехинового фрагмента и сделан вывод о том, что ресвератрольный фрагмент расположен в положении 4b. Кроме того, обнаружена огибающая 2Н, обладающая такой же формой, как и огибающая сигнала, наблюдающегося при δ 6,55 для флороглюцина, сдвинутая на 0,56 ч./млн в сторону слабого поля, и это показывает, что вновь образовавшаяся связь С-С также обладает аналогичным стерическим окружением. Кроме того, обнаружена система АВ Е-типа сопряженных двойных связей, образовавшаяся из транс-стильбеновой структуры ресвератрола (δ 6,79, 6,97, все 1H, J=16,5 Гц), и сигнал А2В2 другого ароматического кольца (δ 6,80, 7,36, все 2H, J=8,6 Гц). На основании этой информации сделан вывод о том, что соединение представляет собой 4b-(4-ресвератроил)-(-)-эпикатехин, химическая структура которого имеет следующий вид.
В формуле Res означает ресвератрол.
Таблица 1
Отнесение сигналов <sup>1</sup>Н-ЯМР предлагаемого в изобретении вещества А (δ в ч./млн)
Количество H
2-Н
5,01 (br.s)
3-Н
3,96 (br.s)
4-Н
4,53 (br.s)
6-Н
6,01 (d, J=2,2 Гц)
8-Н
5,98 (d, J=2,2 Гц)
2'-Н
6,96 (d, J=1,7 Гц)
5'-Н
6,74 (d, J=8,3 Гц)
6'-Н
6,67(dd, J=8,3,1,7 Гц)
Ph4-H
5,99 (огибающая)
6-Н
5,99 (огибающая)
Примечание: 1) Предлагаемое в изобретении вещество исследовано в системе ацетон-d<sub>6</sub> - D<sub>2</sub>O.
Пример 8: Пример получения соединения, связанного с флороглюцином
По 1,00 г полифенола из виноградных косточек и флороглюцина растворяли вместе с 500 мг лимонной кислоты в 50 мл воды и смесь выдерживали в горячей воде (от 87 до 93°С) в течение 3 ч. После завершения реакции смесь оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Затем этот раствор вводили в колонку DIAION HP20 (внутренний диаметр 3 см, длина 14 см, примерно 100 мл) и промывали с помощью примерно 300 мл воды. Затем элюировали с помощью примерно 200 мл метанола и искомую фракцию концентрировали и сушили вымораживанием и получали 1,24 г порошка (далее обозначающегося как предлагаемое в изобретении вещество В).
1
+
1
13
21
18
9
21
18
9
Предлагаемое в изобретении вещество В растворяли в 5 мл 70% метанола и этот раствор вводили в колонку Sephadex LH-20 (внутренний диаметр 3 см, длина 25 см, примерно 180 мл). Через колонку пропускали 500 мл того же растворителя и искомую фракцию концентрировали и сушили вымораживанием и получали 62,2 мг порошка. Полученный порошок исследовали с помощью ВР-ББА-МС и Н-ЯМР. В полученной фракции, в основном содержащей соединение, значение [М] по данным ВР-ББА-МС равнялось m/z: 414,0941, что совпадало с рассчитанным значением, равным 414,0950, соответствующим молекулярной формуле CHO, с погрешностью, составляющей 2,2 ч./млн. (допустимой является погрешность, составляющая 10 ч./млн или менее). В соответствии с этим сделан вывод о том, что соединение обладает молекулярной формулой CHO, что свидетельствует о химической структуре, в которой флороглюцин связан с катехином или эпикатехином связью углерод-углерод. В Н-ЯМР соединения (см. таблицу 2) в дополнение к 5 сигналам протонов ароматического кольца, которые обычны для катехина и эпикатехина, обнаруживается группа сигналов протонов, связанных с атомами кислорода, при 5,01 (1H, br.s, 2-H) и 3,96 (1H, br.s, 3-H), что свидетельствует о том, что соединение обладает стерической конфигурацией эпикатехина. Сигнал протона при δ 4,53 (1H. br.s) приписан положению 4 эпикатехинового фрагмента, и сделан вывод о том, что флороглюциновый фрагмент расположен в положении 4. Кроме того, сигнал, приписанный с-4 и с-6 от флороглюцина в 2Н обнаружен при δ 5,99 в виде эквивалентной огибающей, и это показывает, что вновь образовавшаяся связь С-С приводит к барьеру вращения. На основании этой информации сделан вывод о том, что соединение представляет собой 4-(2-флороглюцин)-(-)-эпикатехин, химическая структура которого описывается приведенной ниже формулой. С-ЯМР (спектр ядерного магнитного резонанса углерода-13, см. таблицу 3) соединения, подтверждает эту химическую структуру.
Таблица 2
Отнесение сигналов <sup>1</sup>Н-ЯМР предлагаемого в изобретении вещества В (δ в ч./млн)
Количество Н
2-Н
5,04 (br.s)
3-Н
4,01 (br.s)
4-Н
4,64 (br.s)
6-Н
6,00 (d, J=2,2 Гц)
8-Н
6,02 (d, J=2,2 Гц)
2'-Н
6,97 (d, J=1,7 Гц)
5'-Н
6,74 (d, J=8,3 Гц)
6'-Н
6,67 (dd, J=8,3,1,7 Гц)
Ресвератрол 2 и 6-Н
6,55 (огибающая)
α-Н
6,79 (d, J=16,5 Гц)<sup>a)</sup>
β-Н
6,97 (d, J=16,5 Гц)<sup>a)</sup>
2' и 6'-Н
6,80 (d, J=8,6 Гц)<sup>с)</sup>
3' и 5'-Н
7,36 (d, J=8,6 Гц) <sup>с)</sup>
Примечания:
1) Предлагаемое в изобретении вещество В исследовано в системе ацетон-d<sub>6</sub> - D<sub>2</sub>O.
2) Если в правой части приведено такое же буквенное обозначение, то отнесения можно менять одно на другое.
Таблица 3
Отнесение сигналов <sup>13</sup>С-ЯМР предлагаемого в изобретении вещества В (δ в ч./млн)
Количество С
С-2
76,8
- 3
72,3
- 4
36,7
- 5
157,7<sup>a)</sup>
- 6
95,4
- 7
158,4<sup>b)</sup>
- 8
96
- 9
158,5<sup>b)</sup>
- 10
100,3
- 1'
132,2
- 2'
115
- 3'
145,0<sup>c)</sup>
- 4'
145.3<sup>c)</sup>
- 5'
115,1
- 6'
119
Ph - 1
157,7<sup>a)</sup>
- 2
100,3
- 3
157,5 <sup>а)</sup>
- 4
106,6
- 5
157,7 <sup>а)</sup>
- 6
106,6
Примечания:
1) Предлагаемое в изобретении вещество В исследовано в системе ацетон-d<sub>6</sub> - D<sub>2</sub>O.
2) Если в правой части приведено такое же буквенное обозначение, то отнесения можно менять одно на другое.
Пример 9: Пример получения соединения, содержащего связанный с ним эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ), полученный из виноградных косточек
5,00 г порошкообразного полифенола из виноградных косточек (Grape Seed Р.Е., LAYN, содержание проантоцианидина 95%) диспергировали и растворяли примерно в 100 мл воды и затем раствор вводили в колонку SEPABEADS SP850 (внутренний диаметр 3,8 см, длина 20 см, примерно 230 мл) и элюировали водой. Полученную фракцию концентрировали и сушили вымораживанием и получали 2,44 г порошкообразного полимера (48,8%).
По 1,00 г полученного из виноградных косточек порошкообразного полимера полифенола и ЭГКГ вместе с 500 мг лимонной кислоты растворяли в 50 мл воды и сосуд, содержащий смесь, выдерживали в горячей воде (от 87 до 93°С) в течение 3 ч. После завершения реакции смесь выдерживали до охлаждения до комнатной температуры. Эту жидкость вводили в колонку DIAION HP20 (внутренний диаметр 3 см, длина 14 см, примерно 100 мл) и промывали с помощью примерно 300 мл воды. Фракцию, полученную путем элюирования с помощью примерно 200 мл метанола, концентрировали и сушили вымораживанием и получали 1,85 г порошка (далее обозначающегося как предлагаемое в изобретении вещество С).
Пример 10: Пример получения соединения, содержащего связанный с ним полифенол, полученный из Myricae Cortex (полимер ЭГКГ) ЭГКГ
Кусок восковника восконосного (Myricaceae), кусок коры Myrica rubra (восковница красная) (Myricaceae), т.е. "Myricae Cortex" выдерживали в холодном 50% ацетоне, объем которого в 5-10 раз превышал объем куска, в течение 3-7 дней и получали темно-коричневый жидкий экстракт. Полученную жидкость концентрировали и желтые кристаллы мирицетина (мирицетин-3-О-α-L-рамнопиранозид) несколько раз отфильтровывали с помощью фильтровальной бумаги. После дополнительного концентрирования полученный фильтрат сушили вымораживанием и из куска смолы получали темно-коричневый порошок с выходом 14%. 14,0 г этого порошка растворяли примерно в 70 мл 50% метанола и этот раствор вводили в колонку Sephadex LH-20 (внутренний диаметр 5 см, длина 20 см, примерно 400 мл). Затем через колонку пропускали 1,5 л этого же растворителя и затем 0,7 л 70% метанола, затем через нее пропускали 1 л 70% ацетона для извлечения фракции полимера ЭГКГ. Полученную фракцию концентрировали и сушили вымораживанием и получали 9,37 г порошкообразного полимера ЭГКГ (66,9%). По 1 г полимера ЭГКГ, полученного из Myricae Cortex, и ЭГКГ вместе с 500 мг лимонной кислоты растворяли в 50 мл воды и сосуд, содержащий смесь, выдерживали в горячей воде (от 87 до 93°С) в течение 3 ч. После завершения реакции смесь выдерживали до охлаждения до комнатной температуры. Эту жидкость вводили в колонку DIAION HP20 (внутренний диаметр 3 см, длина 14 см, примерно 100 мл), промывали с помощью примерно 300 мл воды. Фракцию, полученную путем элюирования с помощью примерно 200 мл метанола, концентрировали и сушили вымораживанием и получали 1,85 г порошка (далее обозначающегося как предлагаемое в изобретении вещество D).
Пример 11: Пример получения соединения, образованного из кожуры хурмы и содержащего связанный с ним полифенол чая
1,00 г сухой порошкообразной кожуры хурмы и 300 мг экстракта чая (PF-ТР 90, выпускающийся фирмой Pharma Foods International со., Ltd., содержание полифенолов чая: 90% или более, полное содержание катехина: 80% или более (содержание ЭГКГ равно 50% или более) растворяли вместе с 500 мг лимонной кислоты в 50 мл воды и сосуд, содержащий смесь, выдерживали в горячей воде (от 87 до 93°С) в течение 3 ч. После завершения реакции смесь выдерживали до охлаждения до комнатной температуры. Затем эту жидкость вводили в колонку SEPABEADS SP850 (внутренний диаметр 3 см, длина 14 см, примерно 100 мл), промывали с помощью примерно 300 мл воды и элюировали с помощью примерно 200 мл метанола. Затем полученную фракцию вводили в колонку DIAION HP20 (внутренний диаметр 3 см, длина 14 см, примерно 100 мл), промывали с помощью примерно 300 мл воды. Затем полученную фракцию элюировали с помощью примерно 200 мл метанола, концентрировали и сушили вымораживанием и получали 464 мг порошка (далее обозначающегося как предлагаемое в изобретении вещество Е).
Пример 12: Пример получения соединения, содержащего связанный с ним эпигаллокатехингаллат, полученный из личи (ЭГКГ)
5,00 г порошкообразного полифенола из орехов личи (Litchi P.E., выпускающийся фирмой Guilin Layn Natural Ingredients Corp., содержание проантоцианидина: 90% или более) диспергировали и растворяли примерно в 100 мл воды и смесь вводили в колонку SEPABEADS SP850 (внутренний диаметр 3,8 см, длина 20 см, примерно 230 мл). Фракцию, полученную путем элюирования водой, концентрировали и сушили вымораживанием и получали 3,02 г порошкообразного полимера (60,4%).
По 1,00 г полученного из орехов личи порошкообразного полимера полифенола и ЭГКГ вместе с 500 мг лимонной кислоты растворяли в 50 мл воды и сосуд, содержащий смесь, выдерживали в горячей воде (от 87 до 93°С) в течение 3 ч. После завершения реакции смесь выдерживали до охлаждения до комнатной температуры. Затем эту жидкость вводили в колонку DIAION HP20 (внутренний диаметр 3 см, длина 14 см, примерно 100 мл), промывали с помощью примерно 300 мл воды. Фракцию, полученную путем элюирования с помощью примерно 200 мл воды, концентрировали и сушили вымораживанием и получали 1,80 г порошка (далее обозначающегося как предлагаемое в изобретении вещество F).
Пример исследования 1:
Для предлагаемых в изобретении веществ А-Е, полученных в примерах 7-11 соответственно, исследования антиокислительной способности проводили путем определения активности связывания радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ) и по методике ААЭТ.
Исследование с помощью ДФПГ
50
Для каждого образца активность связывания радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ) определяли следующим образом. В 96-луночный микропланшет помещали 100 мкл раствора ДФПГ (60 мкМ раствор в этаноле). К нему прибавляли 100 мкл этанольного раствора исследуемого образца или 100 мкл этанола в качестве контрольного образца и смесь осторожно перемешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем измеряли поглощение при 520 нм. Активность связывания радикала ДФПГ рассчитывали по приведенной ниже формуле и по значению активности связывания радикала ДФПГ при последовательном разбавлении и его концентрации рассчитывали эффективную концентрацию, необходимую для связывания 50% (ЕС).
Формула 1:
Активность связывания радикала ДФПГ (%) = (1 - поглощение образца исследуемого вещества)/(поглощение контрольного образцах 100)
В качестве веществ для сравнения с предлагаемым в изобретении веществом А использовали эпикатехин (ЕР) и ресвератрол (RS). В качестве вещества для сравнения с предлагаемым в изобретении веществом В использовали эпикатехин и флороглюцин (PL). В качестве вещества для сравнения с предлагаемыми в изобретении веществами С - Е использовали полимер полифенола из виноградных косточек (GP). Результаты исследований вместе с данными для веществ, с которыми проводили сравнение, приведены на фиг.7-9.
Для эпикатехина активность связывания ДФПГ найдена равной 48,7%, а для ресвератрола активность составляла лишь 23,1%. Для Предлагаемого в изобретении вещества А, в котором объединены эпикатехин и ресвератрол, активность достигала 76,1%, что являлось весьма хорошим значением (фиг.7).
Для эпикатехина активность связывания ДФПГ найдена равной 43,0%, а для флороглюцина активность невелика. Предлагаемое в изобретении вещество В, в котором объединены флороглюцин с эпикатехином, обнаруживало значительно более высокую активность связывания, чем оба вещества по отдельности (фиг.8).
Кроме того, предлагаемые в изобретении вещества С (41,3%) и D (35,1%) обнаруживали более высокую активность связывания, чем вещества, с которыми проводили сравнение (26,9%). Активность связывания предлагаемого в изобретении вещества Е (26,8%) близка к активности веществ, с которыми проводили сравнение (фиг.9).
Исследование с помощью ААЭТ
Методика: ААЭТ (антиокислительная активность, выраженная в эквивалентах соединения тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота)) является методикой определения относительной антиокислительной активности путем пересчета антиокислительной активности соединения в антиокислительную активность тролокса, который является производным α-токоферола, и методику широко используют для определения показателей антиокислительной активности.
К 36 мкл 70 мкМ раствора метмиоглобина 300 мкл прибавляли раствор 2,2'-азино-бис (3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) и 487 мкл 5 мМ забуференного фосфатом физиологического раствора. Затем прибавляли раствор образца или 1,25 мМ раствор Yrolox и осторожно перемешивали в течение 5 мин при 0°С. Затем прибавляли 167 мкл 450 мкМ раствора пероксида водорода и перемешивали в течение 10 с и реакции давали протекать в течение 5 мин при комнатной температуре. Измеряли поглощение при 734 нм и рассчитывали отношение поглощений образца и раствора тролокса, которое принимали за значение ААЭТ образца по сравнению с 1,00 мМ тролоксом.
Как и в описанном выше исследовании ДФПГ, в качестве веществ для сравнения с предлагаемым в изобретении веществом А использовали эпикатехин и ресвератрол и в качестве веществ для сравнения с предлагаемым в изобретении веществом В использовали эпикатехин и флороглюцин. В качестве вещества для сравнения с предлагаемыми в изобретении веществами С-Е использовали полимер полифенола из виноградных косточек. Результаты исследований вместе с данными для веществ, с которыми проводили сравнение, приведены на фиг.10-12.
Для эпикатехина активность ААЭТ найдена равной 1,2 мМ, а для ресвератрола активность составляла лишь 1,11 мМ. Для предлагаемого в изобретении вещества А, в котором объединены эпикатехин и ресвератрол, активность составляла 1,33 мМ, что являлось намного более значительным (фиг.10). Для флороглюцина активность ААЭТ составляла лишь 0,52 мМ, а для предлагаемого в изобретении вещества В, в котором объединены флороглюцин с эпикатехином, активность составляла 1,44 мМ, что было намного больше, чем для обоих веществ по отдельности (фиг.11).
Предлагаемые в изобретении вещества С (1,11), D (1,11) и Е (0,97) обнаруживали более высокую активность ААЭТ, чем вещество, с которым проводили сравнение (0,73) (фиг.12).
Пример исследования 2:
Дл проведения сравнительных исследований в качестве веществ для сравнения с предлагаемым в изобретении веществом F, полученным в примере 12, использовали полифенол из орехов личи (LP) и экстракт чая.
Исследование in vitro
Методика исследования: Клетки NIH3T3 высевали в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи при 37°С. На следующий день среду заменяли на бессывороточную культуральную среду и прибавляли исследуемое вещество и дополнительно культивировали в течение 1 ч. Затем облучали УФ-излучением в течение 20 мин, среду заменяли на содержащую сыворотку среду и культивирование проводили в течение ночи при 37°С. Жизнеспособность клеток оценивали по методике МТТ (в которой используют 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид). Клетки в среде без прибавления исследуемого вещества использовали в качестве контрольной группы (С).
Результаты приведены на фиг.13. В контрольной группе жизнеспособность клеток после облучения УФ-излучением составила примерно 20%, тогда как при добавлении предлагаемого в изобретении вещества F жизнеспособность была наибольшей, показывая, что предлагаемое в изобретении вещество F, значительно уменьшая количество погибших клеток по сравнению с веществом, с которым проводили, обладало способностью защищать от воздействия УФ-излучения.
Исследование in vivo
Методика исследования: Самцам мышей Slc:ddY в возрасте 9 недель ежедневно в течение 3 недель принудительно перорально вводили предлагаемое в изобретении вещество F, LP и ТЕ соответственно, каждое в количестве 50 мг/(кг массы тела). Мышам контрольной группы (С) вводили такое же количество воды. Через 2 ч после введения исследуемого вещества в последний день путем взятия крови из сердца при анестезии эфиром определяли антиокислительную активность ААЭТ и количество пероксида липида в сыворотке. Исследования ААЭТ проводили описанным выше образом. Количество пероксида липида определяли с помощью имеющегося в продаже набора (определение пероксида липида - Test Wako, выпускающийся фирмой Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и измеряли флуоресценцию при длине волны 553 нм и длине волны возбуждения 515 нм при реакции между осадком пероксида липида и реагентом на основе 2-тиобарбитуровой кислоты в растворе фосфорновольфрамовой кислоты в кислой среде, образованной с помощью серной кислоты.
Результаты приведены на фиг.14 и 15. Предлагаемое в изобретении вещество F обнаруживает значительно более сильное антиокислительное воздействие, чем вещество, с которыми проводили сравнение, и воздействие, наблюдающееся в контрольной группе. Кроме того, количество пероксида липида в сыворотке также было значительно меньшим, чем в случае вещества, с которыми проводили сравнение.
Исследование in vivo
Методика исследования: Самцам мышей Slc:ddY в возрасте 6 недель ежедневно в течение 3 недель принудительно перорально вводили Предлагаемое в изобретении вещество F, LP и ТЕ соответственно, каждое в количестве 50 мг/(кг массы тела). Мышам контрольной группы (С) вводили такое же количество воды.
За день до вскрытия внутрибрюшинно вводили 2-NP (70 мг/(кг массы тела)) и через 24 ч при анестезии эфиром брали кровь из сердца для определения содержания АсАТ (глутаматоксалоацетаттрансаминаза) и АлАТ (глутаматпируваттрансаминаза) в плазме. Затем извлекали печень и определяли количество пероксида липида в этом органе.
Результаты приведены на фиг.16 и 17. Вследствие введения 2-NP происходило нарушение функционирования печени, что приводило к повышению концентраций АсАТ и АлАТ. Однако предлагаемое в изобретении вещество F значительно подавляло это повышение, что не наблюдалось для контрольной группы при использовании веществ, с которыми проводили сравнение.
Краткое описание чертежей
На фиг.1(А) приведена полученная с помощью ВЭЖХ хроматограмма полученного в примере 3 продукта термической обработки коры кипариса японского и зеленого чая в кислой среде. На фиг.1(В) и (С) приведены полученные с помощью ВЭЖХ хроматограммы полученных в примере 3 продуктов термической обработки коры кипариса японского (фиг.1 (В)) и зеленого чая (фиг.1 (С)) соответственно, каждую из которых проводили по отдельности в кислой среде.
На фиг.2 приведена фотография ТСХ, показывающая, что новые проантоцианидины, которые не содержались в необработанных коре кипариса японского и зеленом чае, образовались после термической обработки материалов в примере 4. На этом чертеже А - это данные для этилацетатного экстракта зеленого чая после обработки, В - это данные для этилацетатного экстракта коры кипариса японского после обработки и С - это данные для этилацетатного экстракта коры кипариса японского и зеленого чая после обработки. Пятно М обусловлено негаллоилированным мономером, пятно MG обусловлено галлоилированным мономером проантоцианидина, пятно D обусловлено галлоилированным димером проантоцианидина и пятно Т в основном обусловлено галлоилированным тримером проантоцианидина.
На фиг.3 приведена фотография ТСХ, показывающая, что новые проантоцианидины, которые не содержались в необработанных экстрактах кожуры бананов и зеленом чае, образовались после термической обработки материалов в примере 6. На этом чертеже А - это данные для этилацетатного экстракта только зеленого чая после обработки, В - это данные для этилацетатного экстракта только кожуры бананов после обработки и С - это данные для этилацетатного экстракта кожуры бананов и зеленого чая после обработки.
На фиг.4 приведена фотография ТСХ, показывающая, что новые проантоцианидины, которые не содержались в необработанных плодах хурмы и зеленом чае, образовались после термической обработки материалов в примере 5. На этом чертеже А - это данные для этилацетатного экстракта только зеленого чая после обработки, В - это данные для этилацетатного экстракта только незрелых плодов хурмы после обработки, С - это данные для этилацетатного экстракта незрелых плодов хурмы и зеленого чая после обработки и D - это данные для продукта, полученного после пропускания жидкого экстракта, полученного обработкой незрелых плодов хурмы и зеленого чая, через колонку Sepabead 825 с последующим элюированием адсорбированного вещества смесью вода-этанол. Пятна М, MG, D и Т относятся к тем же веществам, что и на фиг.2.
На фиг.5(А) приведены результаты проведенного с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой анализа продукта, полученного после пропускания жидкого экстракта, полученного обработкой незрелых плодов хурмы и зеленого чая, через колонку Sepabead 825 с последующим элюированием адсорбированного вещества смесью вода-этанол в примере 5. На фиг.5(В) приведены результаты проведенного с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой анализа проантоцианидина кипариса японского, использованного для сопоставления.
На фиг.6 приведены результаты проведенного с помощью ТСХ анализа фракций (ФР1 - ФР8), полученных при термической обработке незрелых плодов хурмы и зеленого чая в кислой среде с последующей обработкой полученных катехинов и проантоцианидинов с помощью колоночной хроматографии Sephadex LH-20, и для смеси (Е) до разделения в примере 6.
На фиг.7 приведены данные по активности связывания радикала ДФПГ для предлагаемого в изобретении вещества А, полученного в примере 7.
На фиг.8 приведены данные по активности связывания радикала ДФПГ для предлагаемого в изобретении вещества В, полученного в примере 8.
На фиг.9 приведены данные по активности связывания радикала ДФПГ для предлагаемых в изобретении веществ С-Е, полученных в примерах 9-11.
На фиг.10 приведены полученные по методике ААЭТ данные об антиокислительной активности предлагаемого в изобретении вещества А, полученного в примере 7.
На фиг.11 приведены полученные по методике ААЭТ данные об антиокислительной активности предлагаемого в изобретении вещества В, полученного в примере 8.
На фиг.12 приведены полученные по методике ААЭТ данные об антиокислительной активности предлагаемых в изобретении веществ С-Е, полученных в примерах 9-11.
На фиг.13 приведены данные по способности защищать от воздействия УФ-излучения для предлагаемого в изобретении вещества F, полученного в примере 12.
На фиг.14 приведены полученные по методике ААЭТ данные об антиокислительной активности предлагаемого в изобретении вещества F, полученного в примере 12.
На фиг.15 приведены данные по содержанию ПОЛ (пероксид липида) в сыворотке, полученные при исследовании антиокислительной активности предлагаемого в изобретении вещества F, полученного в примере 12.
На фиг.16 приведены данные по содержанию АсАТ и АлАТ в сыворотке, полученные при исследовании антиокислительной активности предлагаемого в изобретении вещества F, полученного в примере 12.
На фиг.17 приведены данные по содержанию ПОЛ в печени, полученные при исследовании антиокислительной активности предлагаемого в изобретении вещества F, полученного в примере 12.