УСТРОЙСТВО ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ В ЗАКРЫТОЙ СИСТЕМЕ
DEVICE FOR CRYOPRESERVATION IN CLOSED SYSTEM

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники
[0001] Устройство, описанное и заявленное в настоящем документе, относится к устройствам для криоконсервации биологических образцов.
Описание проблемы и связанного с ней уровня техники
[0002] Криоконсервация применяется в науках о жизни с целью остановки биологической активности в ценных клетках в течение длительного периода времени. Одним из способов, используемых для криоконсервации, является витрификация.
2
[0003] Витрификация включает переход раствора, состоящего из биологического образца, то есть ооцита или эмбриона, в стеклообразное аморфное твердое вещество, не имеющее какой-либо кристаллической структуры, с последующим чрезвычайно быстрым охлаждением. Одной из основных проблем этого способа является предотвращение образования кристаллов льда из внутриклеточной жидкости внутри ооцита или эмбриона. Соответственно, первый этап заключается в обезвоживании клетки или клеток в максимально возможной степени с использованием криопротектора, содержащего жидкости, называемые «средой витрификации». Затем биологический образец быстро охлаждают путем погружения в криогенную жидкость, такую как жидкий азот (LN). При правильном сочетании скорости охлаждения и концентрации криопротектора внутриклеточная вода приобретает твердое, безопасное, стеклообразное (витрифицированное) состояние, а не упорядоченное, повреждающее состояние кристаллического льда. Витрификация может быть описана как быстрое увеличение вязкости жидкости, которое захватывает молекулы воды в случайной ориентации. Однако среда витрификации может содержать относительно высокие уровни криопротектора, которые могут быть токсичными для клеток, за исключением витрифицированного состояния. В результате, время воздействия клеток на среду витрификации во время обезвоживания и нагревания должно быть тщательно контролируемым, чтобы избежать повреждения клеток, и соответственно желательно охлаждать образец как можно быстрее.
2
[0004] Этот побудительный мотив привел к разработке способа, в котором биологический образец непосредственно погружается в криогенное вещество для достижения быстрого охлаждения. Криоконтейнерные устройства, используемые в этом способе, классифицируются как «открытые» для использования в «открытой системе», поскольку биологический образец находится в непосредственном контакте с криогенным веществом, например, LN. В качестве примера можно привести сетки для электронной микроскопии, открытые вытянутые соломинки, Cryoloop™ от компании Hampton Research Corp., Алисо Вьехо, Калифорния, США и Cryotop, предлагаемые компанией KitaZato Biopharma Co. Ltd, Фудзи, Сидзуока, Япония. Открытые носители также позволяют быстрое нагревание биологического образца.
2
2
2
[0005] Однако LN не является асептическим. Он может содержать бактериальные и грибковые виды, которые являются жизнеспособными при нагревании. Кроме того, сообщалось, что верифицированные клетки, удерживаемые при длительном хранении в LN, могут быть инфицированы вирусными возбудителями заболеваний, искусственно помещенными в указанный LN. Следовательно, существует вероятность заражения биологических образцов, верифицированных в открытых носителях. В результате, во многих странах запрещены открытые системы из-за высокого риска загрязнения образцов.
2
2
[0006] Возможность заражения привела к разработке герметичных криоконтейнеров, в которых биологический образец помещается в криоконтейнер и герметизируется перед охлаждением в LN. Криоконтейнер также служит в качестве устройства хранения для изолирования его от криогенного вещества при длительном хранении. «Закрытая» система относится к системе витрификации, которая предотвращает прямой контакт между LN и биологическим материалом. Примеры закрытых криоконтейнеров включают Cryotip, предлагаемый компанией Irvine Scientific, и «Cryotop SC» от компании KitaZato. В обоих случаях контейнеры термосвариваются, чтобы закрыть образец.
[0007] Другой пример криоконтейнерного устройства для использования в закрытой системе приводится в патенте США №7316896, авторов Kuwayama и др., «Egg freezing and storing tool and method», в котором описан закрытый криоконтейнер для витрификации. Это устройство содержит тонкую пластмассовую трубку (с номинальным наружным диаметром 0,25 мм и толщиной стенки 0,02 мм). Типичный биологический образец будет содержать ооцит человека с наружным диаметром 0,125 мм. Его обезвоживают средой витрификации, а затем втягивают в трубку. Затем оба конца трубки запечатываются термосваркой с помощью термосваривающего устройства для создания асептического контейнера. Поскольку один из сварных швов создается очень близко к биологическому образцу, есть опасения, что тепло повредит клетку.
[0008] Аналогичным образом патент США №8372633 «Kit for Packaging Predetermined Volume of Substance to be Preserved by Cryogenic Vitrification», авторов Clairaz и др., описывает концепцию закрытого криоконтейнера с трубкой в трубке. Обе трубки изготовлены из пластмассы. Внутренняя трубка видоизменена для создания канала на одном конце, на котором размещается биологический образец. Загруженная внутренняя трубка затем помещается во внешнюю трубку. Затем внешнюю трубку запечатывают термосваркой на загрузочном конце для создания асептического криоконтейнера. Однако для термосваривания требуется дорогостоящее сваривающее устройство, выполненное с возможностью сплавления пластика криоконтейнера для витрификации. Это также добавляет еще один этап в процесс, который требует скорости для безопасного выполнения.
2
[0009] Для решения этой проблемы контейнерное устройство для закрытой системы представлено заявкой на патент США №20090123996, автора Chin, озаглавленной «Vitrification Device With Shape Memory Seal». Раскрыто устройство, которое содержит пробирку для сбора образцов, на одном конце которой установлена пробка. Пробирку для сбора с образцом вставляют в трубчатую оболочку до тех пор, пока пробка не наденется на оболочку. Затем, вместо термосваривания на закупоренной оболочке устанавливается отдельное закрывающее устройство. Закрывающее устройство содержит колпачок из материала с памятью формы, который натягивается на пробку и сжимается при воздействии низких температур, например, при погружении в LN. Проблема в этом подходе заключается в том, что он увеличивает сложность криоконтейнерного устройства и из-за того, что компоненты изготавливаются из разных материалов, каждый из которых имеет свой собственный коэффициент теплового расширения, они расширяются или сжимаются с разными скоростями, что также может нарушить герметичность.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0010] Настоящее устройство описывается со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых подобные ссылочные позиции указывают идентичные или функционально подобные элементы.
[0011] На фиг. 1 приведен вид сбоку иллюстративного варианта осуществления раскрытого устройства для криоконсервации;
[0012] на фиг. 2А показан стержневой элемент;
[0013] на фиг. 2В показан колпачок для варианта осуществления, показанного на фиг. 1;
[0014] на фиг. 3А приведен детализированный вид одного конца стержневого элемента;
[0015] на фиг. 3В приведен детализированный вид конца стержневого элемента, показанного на фиг. 3А, при этом стержневой элемент повернут на 90° относительно продольной оси;
[0016] на фиг. 4 приведен детализированный фрагментированный вид, иллюстрирующий колпачок, надетый на стержневой элемент; и
[0017] на фиг. 5A-5D показаны различные иллюстративные формы, в виде которых может быть выполнено перпендикулярное поперечное сечение устройства.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0018] Различные варианты осуществления устройства хранения для криоконсервации в закрытой системе, описанные ниже, и их преимущества лучше всего понятны со ссылкой на фиг. 1-5D. Элементы чертежей необязательно показаны с соблюдением масштаба, вместо этого акцент делается на четкую иллюстрацию новых признаков и принципов работы. На всех чертежах подобные позиции используются для подобных и соответствующих частей различных чертежей.
[0019] Кроме того, упоминание в описании «варианта осуществления», «одного варианта осуществления», «различных вариантов осуществления» или любой разновидности этого означает, что конкретный признак или аспект, описанный в отношении конкретного варианта осуществления, включен по меньшей мере в один вариант осуществления. Таким образом, появление фраз «в одном варианте осуществления», «в другом варианте осуществления» или вариациях этого в различных местах в пределах описания необязательно относится ко всему соответствующему им варианту осуществления.
[0020] Обращаясь к фиг. 1, 2А и 2В, устройство 100 для криоконсервации в закрытой системе содержит удлиненный стержень 101 и колпачок 102. Стержень содержит корпус 108, имеющий в целом равномерное поперечное сечение, резко переходящее приблизительно посередине стержня 101 к усеченному конусу 103. При переходе от корпуса 108 к конусу 103 образуется заплечик 115, имеющий в целом плоскую поверхность, ориентированную приблизительно перпендикулярно продольной оси стержня 101. Наконечник 104 для сбора образцов проходит от узкого конца конуса 103. Колпачок 102 содержит открытый конец 116, имеющий в целом плоскую поверхность, в которой образовано круглое отверстие 117. Отверстие 117 сообщается с удлиненной полой камерой 105, образованной вдоль продольной оси колпачка 102 и имеющей размеры, обеспечивающие размещение наконечника 104 и конуса 103. Колпачок 102 предпочтительно имеет такую же форму поперечного сечения, что и стержень 101, например, шестиугольную (фиг. 5А), треугольную (фиг. 5В), квадратную (фиг. 5С, круглую (фиг. 5D), или тому подобную, и приблизительно равные размеры в поперечном сечении. Кроме того, необязательным преимущественным конструктивным признаком является кольцевая выемка 118а, b, расположенная вблизи концов стержня 101 и колпачка 102 соответственно, посредством которой устройство 100 может быть зажато с помощью щипцов, что делает устройство 100 более удобным для удерживания устройства 100.
[0021] Когда образец (ооцит или эмбрион) подлежит витрификации, его собирают и обрабатывают в соответствии, например, с вышеописанным протоколом, и затем помещают на наконечник 104 для сбора образцов. Затем наконечник 104 вставляют в удлиненную камеру 105 через отверстие 117, а колпачок 102 прижимают на место до тех пор, пока плоская поверхность открытого конца 116 не упрется в плоскую поверхность заплечика 115. Соответственно, следует понимать, что одна плоская поверхность должна быть по существу параллельной противоположной плоской поверхности.
[0022] На фиг. 3А и 3В приведены детализированные виды, повернутые на 90° один относительно другого, части стержня 101, содержащей конус 103 и наконечник 104. Конус 103 имеет первый наружный диаметр 106 (O.D.) у основания усеченной части смежно с заплечиком 115 и второй O.D. 107 на дальнем конце конуса 103.
[0023] Обращаясь теперь к фиг. 4, колпачок 102 показан плотно прижатым к заплечику 115 стержневого элемента 101, так что наконечник 104 и конус 103 размещаются внутри полой камеры 105. Следует иметь в виду, что пропорции, показанные на этом виде, являются увеличенными, а не выполненными в масштабе, чтобы наглядно показать размерные характеристики колпачка 102 и конуса 103 и взаимное соединение двух деталей. Соответственно, пропорции или размеры, которые могут быть предложены на фиг. 4, не должны рассматриваться как ограничивающие любой размер конкретным значением, если он явно не определен в настоящем документе.
[0024] Как показано, конус 103 имеет первый O.D. 106, который больше, чем второй O.D. 107, при этом диаметр конуса сужается от первого O.D. 106 ко второму O.D. 107 под углом 114А. Полая камера 105 содержит первую секцию, образованную от открытого конца 116 колпачка 102, и которая выполнена с первым внутренним диаметром 111 (I.D.), расположенным в отверстии 117, и вторым I.D. 112 так, что первый I.D. 111 больше второго I.D. 112, уменьшающегося под углом 1114 В. Вторая секция камеры 105 содержит удлиненную часть, имеющую третий I.D. 113, который рассчитан для размещения наконечника 104. Поэтому внутренняя поверхность первой секции полой камеры 105 образует усеченное коническое пространство.
2
[0025] В этом варианте осуществления углы 114А и 114В приблизительно равны, предпочтительно, с допуском 0,1%. Степень конусности должна быть относительно небольшой, не более чем приблизительно 1,5° и предпочтительно приблизительно 0,5°. Таким образом, первый I.D. 111 больше, чем первый O.D. 106, а второй I.D. 112 больше, чем второй O.D. 107, в обоих случаях не более чем на 0,1%. Соответственно, усеченное коническое пространство, образованное внутренней поверхностью полой камеры 105, соответствует объему усеченного конуса 103, так что при размещении колпачка 102 на корпусе 108, наконечник 104 для сбора образцов помещается внутри второй секции полой камеры 105, и по существу вся внутренняя поверхность усеченной конической секции камеры 105 соприкасается с наружной поверхностью конуса 103. Таким образом, полая камера 105 герметизируется от проникновения LN при правильной установке колпачка 102 без применения дополнительного этапа термосваривания устройства.
2
[0026] Кроме того, нет необходимости в уплотнительной прокладке. В основном такие уплотнительные прокладки выполняются из гибкого упругого материала, подходящего для использования с LN, такого как кремний. Однако кремний обладает коэффициентом теплового расширения, отличным от жесткого материала, используемого для выполнения корпуса и колпачка.
[0027] С другой стороны, стержень 101 и колпачок 102 изготавливаются из одинакового жесткого материала, который подходит для погружения в криогенные вещества так, чтобы обе части имели одинаковый коэффициент теплового расширения. Могут быть использованы различные полимеры: полиэфир (например, полиэтилентерефталат, полибутилентерефталат); полиолефин (например, полиэтилен, полиэтилен сверхвысокой молекулярной массы, полипропилен, сополимер этилена и пропилена, сополимер этилена и винилацетата), стирольная смола (например, полистирол, сополимер метакрилата и стирола, метакрилат-бутилен-стирольный сополимер) и полиамид (например, найлон-6, найлон-66). Предпочтительно, как стержень 101, так и колпачок 102 выполнены из кристалла полистирола для использования в медицине. Таким образом, объемы обеих деталей расширяются или сжимаются под влиянием температуры с одинаковой скоростью, обеспечивая по существу полный контакт внутренней поверхности усеченной конической части полой камеры с наружной поверхностью конуса 103, поддерживая герметичность, обеспечиваемую колпачком. Таким образом, устройство одинаково сохраняет надежную герметичность как при комнатной температуре, так и при низких криогенных температурах, обеспечивая по существу равномерную температурную проводимость по всему объему устройства.
[0028] Как описано выше и показано на соответствующих чертежах, настоящее изобретение включает устройство для криоконсервации в замкнутой системе. Хотя были описаны конкретные варианты осуществления, однако следует понимать, что любое изобретение, относящееся к описанному устройству, не ограничивается этим, так как специалистами в данной области техники могут быть выполнены модификации, особенно в свете вышеизложенных идей. Поэтому предусмотрено, что прилагаемая формула изобретения охватывает любые такие модификации, которые описанные признаки или описанные усовершенствования, которые воплощают сущность и объем изобретения.