Пептиды восстанавливают иммуногенез в селезенке при ее старении

Materials of conference

УДК 616.411:612.017.1:612.67

ПЕПТИДЫ ВОССТАНАВЛИВАЮТ ИММУНОГЕНЕЗ В СЕЛЕЗЕНКЕ ПРИ ЕЕ СТАРЕНИИ

Е. П. Кузнецова, А. В. Костылев, Н. А. Червякова Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Россия

PEPTIDES RESTORE IMMGNOGENESIS IN SPLEEN DURING AGEING

E. P. Kuznetsova, A. V. Kostylev, N. A. Cherviakova Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia

© Е. П. Кузнецова, А. В. Костылев, Н. А. Червякова, 2013 г.

Показано увеличение количества лимфоцитов в селезенке крыс с возрастом, что отражает ее значимость в возрастной инволюции иммунной системы. Синтетические пептиды H-Lys-Glu-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH стимулируют пролиферацию В-лимфоцитов и недифференцированных Т-лимфоцитов в органо-типических культурах клеток селезенки молодых и старых крыс, что свидетельствует об их выраженном иммуномодулирующем действии.

Ключевые слова: пептиды, старение, селезенка, иммуногенез.

The number of lymphocytes is increased in rat's spleen during ageing, which confirmed it significant in immune system involution. Synthetic peptides H-Lys-Glu-OH and H-Lys-Glu-Asp-OH stimulate proliferation B-cells and naive T-cells in organothypic spleen cell cultures of young and old rats. Thus, these peptides have immunoprotective activity.

Keywords: peptides, ageing, spleen, immunogenesis.

Введение. Старение организма человека характеризуется постепенной гетерогенной инволюцией всех органов и тканей. С возрастом в норме наблюдается небольшая атрофия тканей, замена функциональной ткани на жировую или соединительную. Снижение эффективности иммунной системы приводит к повышению уровня заболеваемости [1].

Возрастные изменения в селезенке характеризуются как морфологической, так и функциональной картиной инволюции. В старческом возрасте в селезенке наблюдается атрофия белой и красной пульпы, вследствие чего ее трабекулярный аппарат вырисовывается более четко. Количество лимфатических узелков в селезенке и размеры их центров с возрастом уменьшаются. Ретикулярные волокна белой и красной пульпы грубеют и становятся более извилистыми, формируются узловатые утолщения волокон. При возрастной атрофии селезенки количество макрофагов и лимфоцитов в пульпе уменьшается, тогда как число зернистых лейкоцитов и тучных клеток возрастает. Как в старческом, так и в детском возрасте в селезенке обнаруживаются гигантские многоядерные клетки — мегакариоциты. С возрастом в селезенке возрастает количество гибнущих эритроцитов, что выражается в увеличении массы железосодержащего пигмента, имеющего межклеточную локализацию [2, 3]. Увеличение количества таких эритроцитов в кровяном русле, в свою оче-

редь, является одной из причин недостаточности газообменных процессов в тканях при старении. Сходные инволютивные изменения в селезенке наблюдаются и при ее ускоренном старении, индуцированном у-излучением.

Показано, что после облучения мышей в тканях селезенки наблюдались сокращение площади белой пульпы и атрофия периартериальных муфт. Лимфоидные фолликулы были замещены центральными артериями, окруженными тонким слоем перифолликулярной ретикулярной ткани, где обнаруживались единичные скопления распадающихся лимфоцитов, плазматических и ретикулярных клеток. При ускоренном старении в стенках кровеносных сосудов белой пульпы и соединительнотканных трабекулах наблюдалась отечность, они были частично гомогенизированы за счет плазматического пропитывания. Периферические синусы в селезенке переполнялись кровью, а строма в субкапсулярной зоне была практически оголена. Более чем в 2 раза снизилась клеточ-ность в субкапсулярной зоне, в то время как про-лиферативная активность клеток на периферии селезенки возрастала [4].

Важную роль в процессах старения селезенки играют кейлоны — высокомолекулярные белки, угнетающие пролиферацию иммунных клеток селезенки. С помощью хроматографического анализа из кейлонов были выделены низкомолекулярные пептиды — супрессоры активности иммун-

Материалы конференции

ных клеток — тафцин и спленин. Предшественник тафцина синтезируется в лимфоцитах селезенки в виде лейконина, который путем ограниченного протеолиза преобразуется в активную форму. Спленин по функциям и структуре напоминает гормон тимуса тимопоэтин, что свидетельствует о сходстве иммунологических процессов, а возможно, и механизмов старения указанных органов. Так, активные центры спленина и тимопоэти-на различаются лишь одним аминокислым остатком [5, 6].

Важную роль в механизмах старения селезенки, подобно другим органам иммунной системы, играет пептидная регуляция [7].

Наиболее выраженный геропротекторный эффект в отношении функциональной активности селезенки оказывает синтетический пептид Н-Lys-Glu-Asp-OH, сконструированный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии.

В работе проф. В. Х. Хавинсона и соавт. (2010) были изучены геропротекторные свойства пептида H-Lys-Glu-Asp-OH. Исследования были выполнены на крысах в возрасте 2,5 мес, которым после облучения был введен пептид Т-38. В исследовании селезенки крыс в модели ускоренного старения, индуцированного у-облучением, были получены следующие эффекты. По сравнению с контрольной группой под действием пептида H-Lys-Glu-Asp-OH у таких крыс наблюдалось относительное увеличение содержания белой пульпы и появление крупных гемопоэтических островков. Содержание крупных лимфобластов в лимфатических фолликулах и парафоллику-лярной зоне также повышалось, многие из которых находились в состоянии митотического деления, что косвенно предполагает активацию процессов репаративной регенерации в селезенке. В паренхиме селезенки верифицировались группы PCNA+-клеток, причем в зонах гемопоэза они формировали скопления [8].

Таким образом, пептидные биорегуляторы играют важную роль в поддержании функциональной активности селезенки при старении. Приведенные данные свидетельствуют о возможности повышения функциональной активности селезенки и замедлении ее старения под действием пептидных биорегуляторов.

Помимо морфофункциональных признаков старения селезенки как органа было показано изменение количества иммунных клеток в ней при старении. В Гуандунском медицинском колледже было проведено исследование иммунных клеток селезенки CD4+, CD25+ и выделяемого ими транскрипционного фактора Foxp3+ и концентрации интерлейкина-10 (^-10). Методом количественной ПЦР в режиме реального времени на мышах различного возраста было установлено, что уро-

вень экспрессии Foxp3+ и IL-10 в селезенке при старении возрастает. При этом количество клеток CD4+, CD25+ в селезенке при старении также возрастало [9].

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии было проведено исследование соотношения Т-хелперов в шишковидной и ви-лочковой железах у людей старше 60 лет. Реакцию иммуногистохимии проводили авидин-биотино-вым методом на аутопсийном материале людей пожилого, старческого возрастов и долгожителей. Установлено, что с возрастом количество Т-хел-перов в тимусе снижалось, а в шишковидной железе возрастало. У долгожителей соотношение регуляторных Т-клеток в шишковидной и вилоч-ковой железах составляло 2 : 1, что свидетельствовало о выраженной компенсаторной роли шишковидной железы в поддержании пула Т-лимфо-цитов при возрастной атрофии тимуса [10].

Целью исследования явилось сравнительное изучение влияния пептидов H-Lys-Glu-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH на экспрессию маркеров иммунных клеток в селезенке при старении.

Материалы и методы. Фрагменты селезенки, полученные от молодых (3 мес) и старых (2024 мес) крыс линии Wistar культивировали в питательной среде (45% раствора Хенкса, 45% среды Игла, 10% FBS, глюкоза 10 мг/мл, гентамицин 0,5 мг/мл) в стандартных условиях. Органотипи-ческие культуры были разделены на 3 группы — контрольную, с введением физиологического раствора, и 2 экспериментальных — с добавлением пептидов H-Lys-Glu-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH в концентрации 10 нг/мл. Культуры помещали в СО2-инкубатор (37 °С, 9% СО2) и через 3 сут фиксировали 95% этанолом для проведения иммуно-цитохимического исследования. В ходе исследования добавляли 5% Triton X-100 для улучшения пермеабилизации и использовали моноклональ-ные мышиные антитела к недифференцированным Т-лимфоцитам CD5 и В-лимфоцитам CD20 (1 : 30, Novocastra). Окрашенные культуры фотографировали и затем анализировали полученные изображения по показателю площади экспрессии (%) в программе Video Test-Morphology 5.2. Площадь экспрессии отражает количество клеток, экспрессирующих исследуемый маркер, она была рассчитана как отношение площади окрашенных клеток к площади зоны роста.

Результаты. В контрольной группе в культурах, полученных от старых животных, экспрессия CD5 составила 8,43 ± 0,80%, что в 20 раз больше по сравнению с молодыми культурами (0,42 ± 0,08%) (рис. 1).

Площадь экспрессии CD20 в контроле в старых (0,79 ± 0,04%) и молодых (0,7 ± 0,16%) культурах достоверно не различалась. Дипептид H-Lys-Glu-OH стимулировал увеличение числа

Materials of conference

Ю

Q

О

молодые

старые

*

Рис. 1. Площадь экспрессии маркера CD5 в селезенке молодых и старых крыс: *p < 0,05 по сравнению с аналогичным показателем у молодых животных; ^ < 0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контроле

Q

О

молодые

старые

Рис. 2. Площадь экспрессии маркера CD20 в селезенке молодых и старых крыс: *p < 0,05 по сравнению с аналогичным

показателем у молодых животных

*

*

*

CD5+-клеток в старых культурах в 2,4 раза (20,14 ± 4,40 %), а в молодых культурах — в 12,6 раз (5,28 ± 1,1%) и увеличение числа CD20+-клеток в старых культурах в 9,8 раза (7,76 ± 1,21%), а в молодых культурах — в 2,3 раза (1,62 ± 0,43%) (рис. 1 и 2).

Трипептид H-Lys-Glu-Asp-OH увеличивал количество клеток CD5+ в молодых культурах в 7,9 раза (3,3 ± 0,09%) и количество CD20+-клеток в старых культурах в 10,2 раза (8,02 ± 2,31%), но достоверно не влиял на количество CD5+-клеток в старых культурах (6,68 ± 1,38%) и количество CD20+-клеток в молодых культурах (0,83 ± 0,21%) по сравнению с контролем (рис. 1, 2).

Заключение. Увеличение площади экспрессии маркера CD5 в старых культурах в контроле отражает повышение количества недифференцированных Т-лимфоцитов в селезенке старых крыс. Таким образом, с возрастом в селезенке иммуно-

генез усиливается, что свидетельствует о ее выраженной компенсаторной роли в старении иммунной системы. Было показано, что пептид H-Lys-Glu-OH имеет выраженный иммуномоду-лирующий эффект. Данный пептид стимулировал пролиферацию недифференцированных Т-лим-фоцитов и В-лимфоцитов в органотипических культурах молодых и старых крыс. Трипептид H-Lys-Glu-Asp-OH также оказывал стимулирующее воздействие на рост иммунных клеток, однако его эффективность была ниже, чем у дипеп-тида. Трипептид стимулировал пролиферацию недифференцированных Т-лимфоцитов в молодых культурах и В-лимфоцитов в старых культурах. Таким образом, дипептид H-Lys-Glu-OH можно рассматривать как перспективный лекарственный препарат, предназначенный для повышения активности иммуногенеза в селезенке.

Материалы конференции

Литература

1. Линькова Н. С., Полякова В. О., Трофимов А. В., Севостьянова Н. Н., Кветной И. М. Влияние пептидов эпифиза на функции тимуса при старении // Успехи геронтологии. — 2010. — Т. 23. — № 4. — С. 543-546.

2. Perez S. D., Silva D., Millar A. B., Molinaro C. A., Carter J., Bassett K., Lorton D., Garcia P., Tan L., Gross J., Lubahn C., Thyagarajan S., Bellinger D. L. Sympathetic innervation of the spleen in male Brown Norway rats: a longitudinal aging study // Brain Res. — 2009. — Vol. 1302. — P. 106-117.

3. Yamate J., Izawa T., Kuwamura M., Mitsunaga F., Nakamura S. Vasoformative disorder, resembling littoral cell angioma, of the spleen in a geriatric Japanese macaque (Macaca fuscata) // Vet. Pathol. — 2009. — Vol. 46. — № 3. — P. 520-525.

4. Хавинсон В. Х. Тканеспецифическое действие пептидов // Бюл. экспер. биол. и мед. — 2001. — Т. 132. — № 8. — С. 228-229.

5. Севостьянова Н. Н., Трофимов А. В., Линькова Н. С., Полякова В. О., Кветной И. М. Индуцированное старение тимуса: радиационная модели перспективы применения низкоинтенсивного лазерного излучения // Успехи геронтологии. — 2010. — Т. 23. — № 4. — С. 547-553.

6. Khavinson V. Kh., Linkova N. S., Polyakova V. O., Dudkov A. V., Kvetnoy I. M. Age-Specific Dynamics of Human Thymus Immune Cell Differentiation // Bulletin of Experimental Biology and Medicine — 2011. — Vol. 151. — № 5. — P. 631-633.

7. Рыжак Г. А., Севостьянова Н. Н., Кветная Т. В., Трофимов А. В., Линькова Н. С., Гусельникова Е. А., Гра-бежев Л. А., Коновалов С. С. Репаративное действие пептида везугена на структуру двенадцатиперстной кишки в модели ускоренного старения // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. — 2010. — Т. 22. — № 93. — С. 53-56.

8. Хавинсон В. Х., Линькова Н. С., Кветной И. М., Полякова В. О., Трофимов А. В., Севостьянова Н. Н., Абду-лагимов Р. И. Пептидная регуляция репаративных процессов в органах иммунной системы при ускоренном старении // Научные ведомости. Серия: Медицина. Фармация. — 2010. — Т. 22. — № 93. — С. 57-61.

9. Zhao Y., Wang Y., Liu J. Z., Cai K. R. Changes of Foxp3 and IL-10 and TGF-beta in aging of mice // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. — 2010. — Vol. 26. — № 9. — P. 842-845.

10. Линькова Н. С. Баланс числа Т-хелперов в пинеальной и вилочковой железе у людей старше 60 лет // Сборник трудов юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии». — СПб., 2011. — С. 201-202.