УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ TNF

1. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD), имеющий
CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и
CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и
CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);
и имеющий
степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой С-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются при определении степени идентичности последовательности) по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;
и/или
не более 7, например, не более 5, предпочтительно не больше 3, например, всего лишь 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не учитывая любые из вышеперечисленных мутаций в положении (положениях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывая какое-либо С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (где указанные аминокислотные различия, если они имеются, могут присутствовать в каркасе и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасе, но не в CDR);
и при необходимости имеющий
n
С-концевое удлинение (X), в котором n составляет 1-10, предпочтительно 1-5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно, 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);
в котором
аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L или V; и
аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно подходящим образом выбран из T, V или L; и
аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно подходящим образом выбран из T, K или Q; и
аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно подходящим образом выбран из S, K или Q;
так что (i) положение 89 представлено T; или (ii) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V; или (iii) положение 89 представлено L, а положение 110 представлено K или Q; или (iv) положение 89 представлено L, а положение 112 представлено K или Q; или (v) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vi) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q.
2. ISVD по п.1, где аминокислотный остаток в положении 49 является аланином; и/или где аминокислотный остаток в положении 74 является серином; и/или где аминокислотный остаток в положении 73 представлен N, а аминокислотный остаток в положении 75 представлен К.
3. ISVD по любому из пп.1, 2, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 39, 36, 37, 38, 41 и 61-68, в частности, SEQ ID NO: 40, 39 и 36, более конкретно SEQ ID NO: 40.
4. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по п.3, имеющий D в положении 1 и С-концевое удлинение X(n), которое предпочтительно является С-концевым аланиновым остатком.
5. Соединение, включающее по меньшей мере один ISVD по любому из пп.1-4.
6. Соединение по п.5, включающее по меньшей мере два ISVD по любому из пп.1-4, где указанные по меньшей мере два ISVD могут быть одними и теми же или различными.
7. Соединение по п.6, где указанные по меньшей мере два ISVD независимо выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8-41, 61-66 и 69.
8. Соединение по любому из п.п.5-7, дополнительно включающее компонент, связывающий сывороточный белок, где указанный компонент, связывающий сывороточный белок, связывает сывороточный альбумин.
9. Соединение по п.8, где указанный компонент, связывающий сывороточный белок, является ISVD, связывающим сывороточный альбумин, и где указанный ISVD, связывающий сывороточный альбумин, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных областей (CDR1-CDR3, соответственно), где CDR1 является SFGMS, CDR2 является SISGSGSDTLYADSVKG, а CDR3 является GGSLSR.
10. Соединение по п.9, где указанный ISVD, связывающий сывороточный альбумин, включает Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 и Alb223.
11. Конструкция, которая включает или по существу состоит из ISVD по любому из предыдущих пп. 1-4, или соединения по любому из п.п.5-10, и которая дополнительно включает одну или несколько групп, остатков, компонентов или связывающих единиц, при необходимости соединенных вместе посредством одного или нескольких пептидных линкеров, в которой указанные одна или несколько групп, остатков, компонентов или связывающих единиц выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, сывороточных белков или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточными белками, Fc-части, и малых белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками.
12. Композиция, включающая ISVD по любому из пп.1-4, соединение по любому из пп.5-10, и/или конструкцию по п.11.
13. Композиция по п.12, которая является фармацевтической композицией, дополнительно включающая по меньшей мере один фармацевтически пригодный носитель, разбавитель или наполнитель и/или адъювант, и при необходимости включающая один или несколько фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.
14. Композиция по любому из пп.12-13, конструкция по п.11, ISVD по любому из пп.1-4, или соединение по любому из пп.5-10 для применения в качестве медикамента.
15. Композиция по любому из пп.12-14, конструкция по п.11, ISVD по любому из пп.1-4, или соединение по любому из пп.5-10 для применения в лечении заболевания и/или расстройства пищеварительного тракта.
16. Композиция по любому из пп.12-15, конструкция по п.11, ISVD по любому из пп.1-4, или соединение по любому из п.п.5-10 для применения в лечении воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), синдрома раздраженного кишечника, болезни Крона, язвенного колита, мукозита, афтозного стоматита, целиакии, травмы пищеварительного тракта и/или рака пищеварительного тракта.
17. Способ идентификации аминокислотного остатка, придающего устойчивость ISVD к деградации в желудке, включающий этапы
(а) расщепления ISVD одной или несколькими протеазами на фрагменты; и
(b) анализа фрагментов с этапа (а) подходящими средствами, например, такими как ЖХ-МС;
таким образом, определяя аминокислотный остаток (остатки), придающий устойчивость ISVD к деградации в желудке.
18. Способ повышения устойчивости ISVD к деградации в желудке, включающий этапы (а) и (b) из п.17, сопровождающиеся
(с) мутацией аминокислотного остатка (остатков), придающей устойчивость ISVD к деградации в желудке; и
(d) повторением этапов (а) и (b) из п.17;
где отсутствие одного или нескольких фрагментов указывает на повышенную устойчивость ISVD к деградации в желудке.