КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СЦИРПУСИН А И СЦИРПУСИН В, И ЕЕ ПОТЕНЦИАЛ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ
COMPOSITION CONTAINING SCIRPUSIN A AND SCIRPUSIN B, AND ITS POTENTIAL AS ANTIOBESITY AGENT

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящее изобретение представляет собой заявку РСТ патентной заявки США 14705111, поданной 6 мая 2015 года, которая является частичным продолжением патентной заявки США 13944634, поданной 17 июля 2013 года, которая, в свою очередь, представляет собой обычную подачу предварительной патентной заявки 61672849, поданной 18 июля 2012 г., все из которых включены в настоящее нижеследующее описание для ссылки в полном объеме.
Предшествующий уровень техники Область техники
Изобретение в общем относится к композициям для ингибирования адипогенеза. Более конкретно, в настоящем изобретении раскрыта композиция, содержащая сцирпусин А и сцирпусин В, и ее потенциал в качестве средства против адипогенеза/ожирения.
Описание предшествующего уровня техники
Сцирпусин А в виде димера гидроксистильбена из винного сорта винограда Синьцзян ранее был описан Kong Q et al в J Sci Food Agric. 2010 Apr 15;90(5):823-8. Были отмечены ингибиторная активность сцирпусина А в отношении агрегации бета-амилоидного пептида (Riviere С et al (2010)), его роль в гашении синглетного кислорода, его защитная активность в отношении ДНК (Kong Q et al (2010)), а также ингибиторная активность в отношении бета-секретазы (Jeon SY et al (2007)).
Сцирпусин В является хорошо изученным сосудорасширяющим димером пикеатаннола и был получен в больших количествах из пассифлоры (Sano S et al, "Identification of the strong vaso- relaxing substance scirpusin B, a dimer of piceatannol, from passion fruit (Passiflora edulis) seeds, J Agric Food Chern. 2011 Jun 8; 59(11):6209-13. У сцирпусин В также отмечена мягкой активность в отношении системы глутатиона (GSH) (Maruki-Uchida Н et al (2013)) и активность против ВИЧ (Yang GX et al (2005)).
Ранее сообщалось, что гексановый экстракт корневищ Cyperus rotundus (сыть круглая) обладает способностью препятствовать ожирению. (Administration of Cyperus rotundus rhizomes extract prevents Weight Gain in Obese Zucker rats. Lemaure et al. 2007. Phytother Res. 21: 724 -730.). Гексановая фракция была охарактеризована содержанием а-циперона, ротундена, Р-селинена, каламенена, циперена, d-кадинена, циперотундона, кадалена, пачуленона, нооткатена, сугеонола, g-калакорена, кобусона, циперола, изокобусона и эпи-а-селинена (Yadav et al. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2010; 2(1): 20-22). Но в настоящем изобретении раскрыта способность этилацетатной фракции экстракта Cyperus rotundus препятствовать ожирению. Эта этилацетатная фракция не содержит ни одного из многочисленных компонентов гексановой фракции. Данная этилацетатная фракция содержит соединения, относящиеся к стильбеноидам - классу соединений, о присутствии которых в Cyperus rotundus до сих пор не сообщалось ни в одном исследовании. Следовательно, это уникальная комбинация неожиданного обнаружения присутствия соединений, относящихся к стильбеноидам, и, кроме того, их способности препятствовать ожирению. Также неожиданно обнаружено, что после основанного на данных о биоактивности фракционирования корневищ Cyperus rotundus, подфракция этилацетатного слоя была охарактеризована концентрированным содержанием двух димеров пикеатаннола, сцирпусина А и сцирпусина В, которые продемонстрировали превосходный антиадипогенный эффект по сравнению с другой подфракцией, которая содержала высокую концентрацию пикеатаннола наряду с димерами сцирпусином А и сцирпусином В. Таким образом, авторы настоящего изобретения впервые демонстрируют присутствие сцирпусина А и сцирпусина В в этилацетатной фракции корневищ Cyperus rotundus и их способности препятствовать адипогенезу/ожирению.
Таким образом, основной целью настоящего изобретения является раскрытие композиции, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В, и ее потенциала в качестве средства против адипогенеза/ожирения.
Другой целью настоящего изобретения является раскрытие способа ингибирования адипогенеза в клетках млекопитающих с использованием композиции, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В.
Еще одной целью настоящего изобретения является раскрытие способа контроля ожирения у млекопитающих с применением композиции, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В.
Еще одной целью настоящего изобретения является раскрытие способа получения композиций, содержащих А) сцирпусин А и сцирпусин В, и Б) пикеатаннол и его димеры сцирпусин А и сцирпусин В, путем основанного на данных о биоактивности фракционирования корневищ Cyperus rotundus.
Настоящее изобретение достигает вышеупомянутых целей и обеспечивает дополнительные соответствующие преимущества.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении раскрыты композиции, содержащие сцирпусин А и сцирпусин В, и их потенциал в качестве средств против адипогенеза/ожирения. В изобретении также раскрыт способ контроля ожирения у млекопитающих с применением композиции, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В. В настоящем изобретении дополнительно раскрыт способ получения композиций, содержащих А) сцирпусин А и сцирпусин В, и Б) пикеатаннол и его димеры сцирпусин А и сцирпусин В, посредством основанного на данных о биоактивности фракционирования корневищ Cyperus rotundus. Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего более подробного описания, приведенного в сочетании с сопроводительными изображениями, которые иллюстрируют, в качестве примера, принцип изобретения.
Подробное описание графических материалов
На Фиг. 1 показана принципиальная схема стадий экстракции активных компонентов из корневищ Cyperus rotundus.
На Фиг. 2, 2а, 2б и Фиг. 3, 3а, 3б, 3в показаны результаты ЖХ-МС (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией) анализа подфракций III и IV этилацетатного слоя, соответственно, естественно обогащенного димерами пикеатаннола сцирпусином А и сцирпусином В.
На Фиг. 4 и 5 показаны данные МСВР (масс-спектрометрия высокого разрешения), показывающие, что полученные в данном исследовании значения [М+Н] хорошо согласуются со структурой димера и опубликованным по нему данным (Sano et al., 2011).
На Фиг. 6 графически показано уменьшение массы тела у людей с ожирением, которым вводили этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%.
На Фиг. 6а графически показано уменьшение индекса массы тела у людей с ожирением, которым вводили этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%. На Фиг. 6б графически показано уменьшение окружности талии у людей с ожирением, которым вводили этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%.
На Фиг. 7 показаны фотографии уменьшения окружности талии у людей с ожирением (мужчин), которым вводили этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%.
На Фиг. 8а, 8б и 8в показаны фотографии уменьшения окружности талии у людей с ожирением (женщин), которым вводили этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%.
На Фиг. 9а, 9б, 9в, 9г и 9д показаны изменения в системных уровнях липидов у людей с ожирением, которым вводили этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%.
Описание наиболее предпочтительного варианта осуществления
В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции против адипогенеза/ожирения, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В, представленные STR#1 и STR#2, соответственно.
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования адипогенеза в клетках млекопитающих, включающему стадию приведения адипогенных клеток млекопитающих в контакт с композицией, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В, представленные STR#1 и STR#2, соответственно.
В еще одном наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу терапевтического ингибирования ожирения, вызванного адипогенезом, у млекопитающих, включающему стадию введения с пищей композиции, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В, представленные STR#1 и STR#2 соответственно, млекопитающему, нуждающемуся в указанном терапевтическом ингибировании.
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей сцирпусин А и сцирпусин В, представленные STR#1 и STR#2, для ингибирования адипогенеза в клетках млекопитающих.
В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу основанного на данных о биоактивности фракционирования корневищ Cyperus rotundus для получения композиций против адипогенеза/ожирения, содержащих А) сцирпусин А и сцирпусин В, представленные STR#1 и STR#2, и Б) пикеатаннол и его димеры сцирпусин А и сцирпусин В, представленные STR#1 и STR#2, соответственно, включающему стадии:
1. Высушивания корневищ Cyperus rotundus и их измельчения с образованием крупного порошка;
2. Экстракции порошка стадии 1 добавлением трех объемов гексана с последующим нагреванием, кипячением с обратным холодильником в течение 3 часов и фильтрацией, с получением растворимой в гексане фракции и остаточного материала;
3. Экстракции остаточного материала стадии 2 добавлением трех объемов метанола с последующим нагреванием, кипячением с обратным холодильником в течение 3 часов и фильтрацией, с получением растворимой в метаноле активной фракции и остаточного материала;
4. Растворения растворимой в метаноле активной фракции стадии 3 в водном растворе метанола и последовательного разделения хлороформом (СНСЬ), этилацетатом (ЕЮАс) и метанолом с получением, соответственно, хлороформного слоя, этилацетатного слоя и водно-метанольного слоя;
5. Дополнительного фракционирования хлороформного слоя, этилацетатного слоя и водно-метанольного слоя, основанного на данных о биоактивности, где показателем биоактивности является способность хлороформного слоя, этилацетатного слоя и водно-метанольного слоя ингибировать адипогенез в адипоцитах мыши 3T3-L1 (адипоцитах млекопитающих);
6. Вычисления значений ICso (концентрация полумаксимального ингибирования) (мкг/мл) ингибирования адипогенеза, демонстрируемогохлороформным слоем, этилацетатным слоем и водно-метанольным слоем (0, 9,39 и 66,42, соответственно);
7. Фракционирования этилацетатного слоя с помощью фракционирования на колонке для идентификации биомаркера биоактивности (ингибирования адипогенеза), где указанное фракционирование включает стадию, на которой фракции элюируют смесью метанол:хлороформ с увеличивающейся полярностью, с получением подфракций этилацетатного слоя (фракции);
8. Анализа подфракций стадии 7 на предмет биологической активности (способность препятствовать адипогенезу);
9. Идентификации наиболее биоактивных подфракций стадии 8 и их ЖХ-МС анализа для определения биоактивных компонентов сцирпусина А и сцирпусина В; и
10. Проведения препаративной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) подфракций стадии 7 с получением очищенного димера, и проведение МСВР, ЖХ-МС/МС (жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией) и ЯМР (спектроскопия ядерного магнитного резонанса) анализов подфракций для подтверждения массы и структуры биоактивных компонентов сцирпусина.
Авторы настоящего изобретения исследовали гексановый экстракт, упомянутый на стадии 2, и обнаружили, что сцирпусин А и сцирпусин В в нем отсутствовали. Следовательно, гексановый экстракт, полученный на стадии 1, структурно отличается от этилацетатной фракции, полученной на стадии 7. Таким образом, этилацетатный экстракт Cyperus rotundus сильно отличается от гексанового экстракта, который был предметом исследования в Lemaure et al. 2007. Phytother Res. 21: 724-730.
Следующие разделы этого описания состоят из иллюстративных примеров наиболее предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1: Основанное на данных о биоактивности фракционирование корневищ Cyperus rotundus (Фиг. 1) Методика:
Высушенные корневища Cyperus rotundus измельчали до образования крупного порошка. Затем измельченный порошок экстрагировали добавлением трех объемов гексана с последующим нагреванием, кипячением с обратным холодильником в течение 3 часов и фильтрацией с получением растворимой в гексане фракции и остаточного материала. Остаточный материал дополнительно экстрагировали добавлением трех объемов метанола с последующим нагреванием, кипячением с обратным холодильником в течение 3 часов и фильтрацией с получением растворимой в метаноле активной фракции и остаточного материала. Растворимую в метаноле фракцию растворяли в водном растворе метанола и последовательно разделяли хлороформом (СНОз), этилацетатом (ЕЮАс) и метанолом с получением, соответственно, хлороформного слоя, этилацетатного слоя и водно-метанольного слоя. Проводили дополнительное фракционирование хлороформного слоя, этилацетатного слоя и водно-метанольного слоя, основанное на данных о биоактивности, где показателем биоактивности была способность хлороформного слоя, этилацетного слоя и водно-метанольного слоя ингибировать адипогенез в адипоцитах мыши 3T3-L1 (адипоцитах млекопитающих). В примере 1А, приведенном ниже, объяснена технология окрашивания красителем Масляным красным О, основанная на Salazar Olivo et al (1995), Wu Z et al (1998), Fu M et al (2005), для изучения степени ингибирования адипогенеза. Результаты приведены в Таблице А.
ПРИМЕР 1А: Конечная дифференцировка адипоцитов сопровождается накоплением большого количества липидов в больших цитоплазматических везикулах. Стандартное исследование для измерения дифференцировки адипоцитов в клеточной культуре включает использование красителя Масляного красного О (ORO). ORO представляет собой липидорастворимый ярко-красный краситель, который является надежным индикатором дифференцировки адипоцитов.
Принцип: Масляный красный О (Растворитель красный 27, Судан красный 5В, СЛ. 26125 26125 и C26H24N40) представляет собой лизохром (жирорастворимый краситель) диазокраситель, используемый для окрашивания нейтральных триглицеридов и липидов на замороженных срезах и некоторых липопротеинов на парафиновых срезах. Он имеет вид красного порошка с максимумом поглощения при 518 (359) нм. Масляный красный О является одним из красителей, используемых для окраски Суданом. Схожие красители включают Судан III, Судан IV и Судан черный В. Окрашивание должно проводиться на свежих образцах, так как фиксация спиртом удаляет липиды. Масляный красный О в значительной степени заменил Судан III и Судан IV, поскольку он дает гораздо более насыщенный красный цвет, и поэтому окрашенные области намного легче просматривать. Масляный красный О является жирорастворимым красителем. Жирорастворимые красители проявляют большую растворимость в жироподобных веществах тканей/клеток, чем в обычных водно-спиртовых растворителях красителей. Следовательно, жирорастворимые красители глубоко окрашивают клетки.
4
3T3-L1 клетки количеством приблизительно 60х10 клеток высевали на 48-72 часов для достижения 70-80% конфлюентности. Через 48 часов добавляли 200 мкл свежеприготовленной AIM (среды, индуцирующей адипогенез). Через 72 часа к лункам добавляли 200 мкл АРМ (среда для прогрессирования адипогенеза) с тестируемыми соединениями в различных концентрациях. Клетки инкубировали в течение 48 часов во влажной атмосфере (37°С) с 5% СОг и 95% воздуха. Супернатант собирали и хранили для оценки содержания лептина, адипонектина, ИЛ-6 и TNF-альфа. Клетки фиксировали добавлением 100 мкл 10% формалина и проводили окрашивание ORO. Оптическую плотность считывали при 492 нм в ридере для микропланшетов.
Результаты выражали в виде значений IC50 с использованием программного обеспечения Graph Pad prism. Процент ингибирования адипогенеза вычисляли следующим образом.
% Ингибирования равен С-Т/Т * 100, где
С - поглощение красителя Масляного красного О в дифференцированных/недифференцированных клетках
Т - поглощение красителя Масляного красного О в обработанных образцом дифференцированных/недифференцированных клеток.
Этилацетатный  слой  проявил  наилучшую  биологическую активность в отношении ингибирования адипогенеза с величиной IC50 (мкг/мл), составляющей 9,39.
Эту фракцию затем фракционировали на колонке для идентификации биомаркера биоактивности (ингибирования адипогенеза). Фракционирование на колонке включало стадию элюирования подфракций этилацетатного слоя смесью метанол:хлороформ с увеличивающейся полярностью. Подфракций этилацетатного слоя маркировали как I, И, III и IV, анализировали на предмет биологической активности (способности препятствовать антиадипогенезу). Основные стадии анализа способности препятствовать адипогенезу включали процедуру, описанную в Примере 1А. Результаты приведены в Таблице В.
Подфракций III и IV затем анализировали с помощью ЖХ-МС, причем обе фракции были обогащены димерами пикеатаннола сцирпусином А и сцирпусином В (Фиг. 2 и 3). Анализ ЖХ-МС/МС проводили на спектрометре Thermo Electronics Finnigan LCQ Advantage MAX с использованием колонки RP CI8 (250 x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм). Система состояла из детектора Thermo-Finnigan surveyor с фотодиодной матрицей, ЖХ-насоса и автоматического пробоотборника. Подвижная фаза включала градиентное элюирование в течение 35 минут с Растворителем (А) 0,1% уксусной кислотой в воде и Растворителем (В) ацетонитрилом. Концентрацию Растворителя В увеличивали, начиная с 5% в течение 0-5 минут, 5 - 60% в течение 5-20 минут, 60-100% в течение 20-25 минут, 100-5% в течение 25-27 минут и поддерживали постоянной при 5% в течение 27-35 минут. Неподвижная фаза включала колонку С18 Thermo BDS hypersil (размеры - 250 мм х 4,6 мм); Скорость потока: 1 мл/мин; детектирование: 260 нм.
Параметры ионизации: положительный режим APCI (химическая ионизация при атмосферном давлении), напряжение источника - 4,50 кВ, температура капилляра - 225 градусов, напряжение на капилляре - 43,00 В.
Интерпретация данных: масса сцирпусина А согласно опубликованным данным составляет 470,13. Масса [М+Н], наблюдаемая при 18,77 мин. в режиме положительной ионизации с использованием вышеуказанного протокола, составляет 471,08. Масса сцирпусина В составляет 486. Масса [М+Н], наблюдаемая при 17,94 мин в режиме положительной ионизации, составляет 487,05.
Первый уровень подтверждения наличия димеров пикеатаннола в экстракте Cyperus был основан на этой предварительной информации о массе. Присутствие сцирпусина А было непосредственно подтверждено прямым сравнением с аутентичным образцом сцирпусина А.
Затем проводили препаративную ВЭЖХ подфракций с получением очищенного димера сцирпусина В, который затем исследовали с использованием аналитических инструментов масс-спектроскопии высокого разрешения (МСВР), жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для подтверждения, что полученный димер является сцирпусином В. Данные МСВР показали [М+Н], равное 487,138, что очень хорошо согласуется со структурой димера и опубликованными по нему данными (Sano et al., 2011) (Фиг. 4 и 5), и структуру сцирпусина В также подтверждали с использованием ЯМР с криогенным датчиком (Фиг. 6). Соединение идентифицировали после сравнения с данными, доступными из литературных источников (Sano et al., 2011). Данные ЯМР (CD30D): 6: 56,73, 93,50, 95,39, 100,79, 102,93, 105,87 X 2, 112,21, 112,63, 114,83, 114,91, 117,03, 118,42, 118,61, 122,17, 129,46, 129,53, 133,53, 135,60, 144.90, 145.01, 145,09, 145,21, 146,27, 158,36, 158,56 * 2, 161,46. Спектр ЯМР, полученный в APT (тест на присоединеные протоны) при 500 МГц, дополнительно подтвердил структуру сцирпусина В. Аутентичный образец сцирпусина В, выделенный из пассифлоры по методу Sano et al., 2011, также сравнивали непосредственно со сцирпусином В, выделенным авторами из Cyperus rotundus, как описано выше, и идентичность времен удерживания в ВЭЖХ, данных масс-спектроскопии и данных ЯМР подтвердили присутствие сцирпусина В в Cyperus rotundus самым убедительным образом.
ПРИМЕР 2
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ CYPRO-AF (активная этилацетатная фракция) И CYPRO-D1 (этилацетатная подфракция, естественно обогащенная димерами пикеатаннола сцирпусином А и сцирпусином В) КАК СРЕДСТВА ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ У МЫШЕЙ.
Цель исследования: Целью исследования было оценить эффективность экстрактов Cypro-AF и Cypro-Dl как средства против ожирения у мышей С57.
Подробности системы исследования:
Подробности проведения исследования УСЛОВИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВОТНЫХ
Группирование: Группирование животных проводили в последний день акклиматизации методом рандомизации по массе тела и стратификации. Группирование животных проводили таким образом, чтобы различие в массе тела животных не превышало ± 20% от средней массы тела в каждой группе.
План исследования: животных разделяли на 6 групп, а именно, группы 1, 2, 3, 4, 5 и 6, включавшие по 10 животных (5 самцов и 5 самок) каждая. Подробные сведения о группе, дозы и количество/поле животных по группам представлены в следующей Таблице:
Подробное описание и дозировка состава
Испытуемые образцы Cypro-AF и Cypro-Dl растворяли в дистиллированной воде для приготовления различных доз. Свежеприготовленные тестируемые образцы вводили перорально с помощью желудочного зонда. Объем дозировки на одно животное поддерживали на уровне 10 мл/кг массы тела для всех животных в течение периода исследования. В следующей таблице приведена подробная информация о тестируемом составе.
Индукция ожирения: животных контрольной группы G1 кормили нормальным контрольным кормом D12450В, содержащим 10 ккал% жира, а животных групп G2-G6 кормили кормом с высоким содержанием жира D12492, содержащим 60 ккал% жира, в ходе индукции ожирения и в ходе основного исследования.
Основное исследование:
Основное исследование было начато после индукции ожирения. 3 дозы Cypro-AF и 1 дозу Cypro-Dl вводили животным, начиная с 28-го дня, ежедневно в течение 27 дней. В ходе основного исследования животные получали те же корма, что и на стадии индукции ожирения. Животным контрольной группы G1 и животным контрольной группы G2, получавшей корм с высоким содержанием жира, вводили дистиллированную воду, в то время как другие группы животных получали тестируемые образцы с 28-го по 54-й дня исследования. Объем вводимой дозы поддерживали в соответствии с недельной массой тела отдельного животного. Общая продолжительность исследования составила 61 день (7 дней акклиматизационного периода + 27 дней индукции ожирения + 27 дней основного исследования).
НАБЛЮДЕНИЯ
В течение периода исследования наблюдали следующие показатели. Потребление пищи
Регистрировали потребление пищи каждым животным. Еженедельно вычисляли и фиксировали среднее потребление пищи.
Масса тела
Массу тела каждого животного регистрировали в день поступления, в первый день и после этого еженедельно (± 1 день), в течение периода исследования.
Клинические наблюдения
Всех животных наблюдали на предмет клинических проявлений два раза в день в течение периода исследования.
Лабораторная диагностика
По окончании периода исследования у животных брали образцы крови в пробирки с антикоагулянтом калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (K2-EDTA) для гематологического анализа, и в пробирки без антикоагулянта для биохимического анализа.
Образцы крови, отобранные в пробирки без антикоагулянта, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут с получением сыворотки. Образцы крови собирали гуманно, методом прокола ретроорбитального сплетения под легкой анестезией
эфиром, с помощью тонкой капиллярной трубки. Анализировали следующие гематологические и биохимические показатели.
Гематологические исследования
Следующие гематологические показатели были оценены с помощью Sysmex, КХ-21 (Transasia Bio-Medicals Ltd., Индия):
Биохимический анализ крови
Следующие биохимические показатели образцов сыворотки были проанализированы с помощью анализатора «Erba Mannheim Chern Touch» (Transasia Bio-Medicals Ltd., Индия).
Патологоанатомическое исследование
После окончания периода исследования, на 55-й день, всех животных гуманно умерщвляли путем воздействия избытка диоксида углерода в газовой камере, с
последующим внешним и внутренним макроскопическим исследованием после вскрытия.
Макроскопическое исследование после вскрытия
Животных подвергали внешнему и внутреннему макроскопическому исследованию.
Массы органов
Следующие органы всех животных отделяли в необходимой степени от прилегающих тканей и взвешивали влажными, как можно быстрее, чтобы избежать высыхания: мозг, тимус, печень, надпочечники, почки (парные органы), селезенку, сердце, яичники/тестикулы (парные органы).
Массы жировых отложений
Собирали и взвешивали следующие жировые отложения всех животных.
1. Эпидидимальный жир
2. Бурый жир
3. Овариальный жир
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Исходные данные, полученные в настоящем исследовании, подвергали компьютерной статистической обработке. Компьютерную распечатку данных (в виде приложения) сверяли с первичными данными. После проверки, данные анализировали методом однофакторного ANOVA (дисперсионного анализа) с апостериорным критерием Даннетта, для данных о массе тела, гематологических и биохимических показателях, массах органов с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 5.01, GraphPad. Все анализы и сравнения оценивали с доверительной вероятностью 95% (Р меньше 0,05), обозначенной надстрочными индексами: «а», где G1 сравнивают с G3, G4, G5 и G6, и «Ь», где G2 сравнивают с G3, G4, G5 и G6 на протяжении всего отчета, как указано ниже: *: статистически значимо (Р меньше 0,05), где это применимо.
Данные были подвергнуты однофакторному статистическому анализу ANOVA, путем сравнения следующего:
Группы G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)} с группой G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группой G4 {CYPRO-AF 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группой G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира) и группой G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, как представлено ниже:
РЕЗУЛЬТАТЫ
Группы G2 {контрольная группа, получавшая корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, с группой G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группой G4 {CYPRO-AF 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группой G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группой G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, как показано ниже:
Потребление пищи
Сводные данные по среднему за неделю потреблению пищи для самцов и самок животных представлены в Таблице 1 и Таблице 2, соответственно. Статистически значимые различия в потреблении пищи животными в течение периода исследования отсутствовали.
п равно 5; Значения представляют собой среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р больше 0,05
Масса тела
Сводные данные по еженедельной массе тела самцов и самок животных представлены в Таблице 3 и Таблице 4, соответственно.
п равно 5; Значения представляют собой среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р больше 0,05
п равно 5; Значения представляют собой среднее ± среднеквадратическое отклонение; * - значимая разница, Р меньше 0,05
У самцов животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений еженедельных масс тела на 21-й день в группе G3 {CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира}, группе G5 {CYPRO-AF -200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
У самцов животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений недельной массы тела на 28-й день в группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с
группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
У самцов животных наблюдали снижение средних значений еженедельной массы тела на 35-й, 42-й, 49-й и 55-й день в группе G3 {CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены введением тестируемых образцов.
У самок животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений еженедельной массы тела на 21-й день в группе G4 {CYPRO-AF -100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
У самок животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений недельной массы тела на 28-й день в группе G3 {CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO -D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
У самок животных наблюдали снижение средних значений недельной массы тела на 35-й, 42-й, 49-й и 55-й день в группе G3 {CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг + корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг + корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены введением тестируемых образцов.
Клинические наблюдения
Сводные данные по клиническим наблюдениям у самцов и самок животных представлены в Таблице 5 и Таблице 6, соответственно. В течение периода исследования животные были здоровы по данным клинических наблюдений.
п равно 5; N-Норма
п равно 5; N-Норма
Гематология
Сводные данные оценки гематологических показателей у самцов и самок животных представлены в Таблице 7 и Таблице 8, соответственно.
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р меньше
0,05
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р больше
0,05
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р меньше
0,05
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р больше
0,05
Сравнительный статистический анализ гематологических показателей группы G1 с группами G3, G4, G5 и G6
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) У самцов животных наблюдали статистически значимое увеличение среднего значения МСНС в группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Можно считать указанные изменения несущественными, т.к. дозозависимый ответ отсутствовал.
Средний объем эритроцита и среднее содержание гемоглобина в эритроците У самок животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений MCV и МСН в группе G3 {CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким
содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Можно считать указанные изменения несущественными, т.к. дозозависимый ответ отсутствовал.
Среднее содержание гемоглобина в эритроците и средняя концентрация гемоглобина в эритроците
У самок животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений МСН и МСНС в группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G2 (контрольная группа, получавшая корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}. Можно считать указанные изменения несущественными, т.к. дозозависимый ответ отсутствовал.
Биохимический анализ крови
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на запрос экспертизы от 15.01.2019
Сводные данные оценки биохимических показателей крови у самцов и самок животных представлены в Таблице 9 и Таблице 10, соответственно.
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р меньше
0,05
0,05
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р меньше
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р меньше
0,05
п равно 5; Значения - среднее ± среднеквадратическое отклонение; Р меньше
0,05
Сравнительный статистический анализ показателей биохимического анализа крови группы G1 с группами G3, G4, G5 и G6.
Общий белок
У самок животных наблюдали статистически значимое снижение средних значений общего белка в группе G3 {CYPRO-AF -50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1
{контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
Триглицериды
У самок животных наблюдали статистически значимое снижение средних значений триглицеридов в группе G3 {CYPRO-AF -50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
Общий холестерин
У самцов животных наблюдали статистически значимое увеличение среднего значения общего холестерина в группе G3 {CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группы G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
У самок животных наблюдали статистически значимое увеличение средних значений общего холестерина в группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
Липиды высокой плотности
У самцов животных наблюдали статистически значимое снижение среднего значения липидов высокой плотности в группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
Липиды низкой плотности
У самцов животных наблюдали статистически значимое увеличение среднего значения липидов низкой плотности в группе G3 (CYPRO-AF - 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF - 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 - 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
Липиды очень низкой плотности
У самок животных наблюдали статистически значимое увеличение среднего значения липидов очень низкой плотности в группе G5 {CYPRO-AF - 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал% жира)}. Предполагали, что эти изменения обусловлены различным содержанием жира в корме.
Сравнительный статистический анализ показателей биохимического анализа крови группы G2 с группами G3, G4, G5 и G6
Триглицериды
У самцов животных наблюдалось снижение средних значений триглицеридов в группе G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF -100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг + корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений триглицеридов может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
У самок животных наблюдали статистически значимое снижение средних значений триглицеридов в группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений триглицеридов может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
Было отмечено снижение средних значений триглицеридов в группе G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг + корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений триглицеридов может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
Общий холестерин
У самцов животных наблюдали снижение средних значений общего холестерина в группе G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF -100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений общего холестерина может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
У самок животных наблюдали средних значений общего холестерина в группе G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и диета с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF 100 мг/кг и диета с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и диета с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений общего холестерина может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
Липиды высокой плотности
У самцов животных наблюдали статистически значимое снижение средних значений липидов высокой плотности в группе G3 (CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF -100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Статистически значимое снижение средних значений липидов высокой плотности может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
У самок животных наблюдали статистически значимое снижение средних значений липидов высокой плотности в группе G3 (CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (С 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Эти снижения средних значений липидов высокой плотности могут быть обусловлены действием тестируемых образцов.
Липиды низкой плотности
У самцов животных наблюдали снижение средних значений липидов низкой плотности в группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений липидов низкой плотности может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
Значения липидов очень низкой плотности
У самцов животных наблюдали снижение средних значений липидов очень низкой плотности в группе G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF -100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G5 {CYPRO-AF 200 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Это снижение средних значений липидов очень низкой плотности может быть обусловлено действием тестируемых образцов.
У самок животных наблюдали незначительное снижение средних значений липидов очень низкой плотности в группе G3 {CYPRO-AF 50 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)}, группе G4 {CYPRO-AF 100 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} и группе G6 {CYPRO-D1 10 мг/кг и корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира)} по сравнению с контрольной группой G2, получавшей корм с высоким содержанием жира (с 60 ккал% жира). Эти
снижения значений среднего средних значений липидов очень низкой плотности могут быть обусловлены действием тестируемых образцов.
Выводы. На основании результатов настоящего исследования можно заключить, что тестируемые образцы Cypro-AF и Cypro-Dl оказывали воздействие на снижение таких показателей, как концентрации ЛПВП, триглицеридов, холестерина, ЛПНП и ЛПОНП при ожирении у самцов и самок мышей С57, индуцированном кормом с высоким содержанием жира в дозировках 50, 100 и 200 мг/кг массы тела Cypro-AF и 10 мг/кг массы тела Cypro-Dl. Не отмечено статистически значимых изменений в массе органов и жировых отложениях при паталогоанатомическом исследовании животных.
ПРИМЕР 3. Влияние этилацетатной фракции Cyperus rotundus, содержащей пикеатаннол и его димеры сцирпусин А и сцирпусин В, на контроль массы тела у человека. Исследования эффективности, безопасности и переносимости.
Подробности исследования
Первоочередные цели включали: (i) изучить эффективность экстракта Cyperus rotundus в отношении контроля массы тела у пациентов с ожирением; и (ii) изучить безопасность и переносимость экстракта Cyperus rotundus при контроле массы тела у пациентов с ожирением.
Второстепенная цель заключалась в изучении начала активности экстракта Cyperus rotundus в контроле массы тела у пациентов с ожирением.
Первичные показатели эффективности включали: (i) снижение массы тела и индекса массы тела; (ii) уменьшение окружности талии и индекса талия/бедра (антропометрические измерения); (ш) снижение значений холестерина, триглицеридов, ЛПНП и ЛПОНП от исходного уровня; (iv) увеличение значений ЛПВП от исходного уровня; и (v) доказательства, представляющие собой фотографии пациентов при первом и последнем визите, при этом его/ее личность скрыта.
Вторичные показатели эффективности включали оценку переносимости исследуемого вещества с точки зрения побочных действий и других физических признаков или симптомов у пациентов исследования.
Демографические показатели пациентов (Таблица 11)
Иллюстративные составы, использованные в исследовании с участием людей (Таблицы 12 и 13)
Таблица 12
Ингредиенты (активное исследуемое вещество)
Масса (мг)
1
Экстракт Cyperus rotundus(общее содержание стильбенов 5%) – экстракт, содержащий пикеатаннол, сцирпусин A и сцирпусин B
525
2
Двухосновный фосфат калия
30
3
Стеарат магния
5
Таблица 13
Ингредиенты (плацебо)
Масса (мг)
Микрокристаллическая целлюлоза
560
Активное исследуемое вещество и плацебо, описанные выше, были приготовлены в виде твердых коричневых/коричневых желатиновых капсул размером «00» с массой содержимого 560 мг. Так как исследование представляло собой двойное слепое исследование, как капсула с активным исследуемым веществом, так и капсула с плацебо были идентичными во всех физических аспектах, таких как размер, форма и вес. Случайно выбранная партия активного исследуемого вещества при анализе показала, что содержание пикеатаннола и сцирпусина В в среднем на капсулу составляло 36,18 мг. В более иллюстративных вариантах осуществления иллюстративные составы содержат экстракт Cyperus rotundus, нормализованный до общего содержания стильбенов, включающих пикеатаннол, сцирпусин А и сцирпусин В, более 3%. В иллюстративном примере, приведенном в Таблице 12, представлен экстракт Cyperus rotundus, нормализованный до общего содержания стильбенов, включающих пикеатаннол, сцирпусин А и сцирпусин В, составляющего 5%.
Исследование было проведено в Государственном Аюрведческом медицинском колледже (Government Ayurveda Medical College), Майсур, Индия. Исследование было начато только после получения письменного положительного мнения от институционального этического комитета. В ходе исследования не было внесено никаких дополнительных изменений или поправок в утвержденный протокол. Исследование проводили в соответствии с принципами, провозглашенными в Хельсинкской декларации (Эдинбург, 2000 г.) и согласованным трехсторонним стандартом ICH (Хельсинкской декларации) по надлежащей клинической практике (GCP). Письменная и устная информация об исследовании на языке, понятном пациенту, была предоставлена всем пациентам.
Это рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование с параллельными группами включало в общей сложности 5 визитов в клинику пациентов, участвовавших в исследовании, помимо скринингового визита. График проведения оценок представлен в Таблице 14.
Пациенты были включены в исследование, если было указано «Да» во всех критериях включения и «Нет» в любом из критериев исключения. Критерии включения: 1) пациенты мужского и/или женского пола; 2) возраст от 20 до 65 лет; 3)
2
повышенный уровень холестерина сыворотки - более 200 мг/дл; 4) повышенные триглицериды сыворотки - более 150 мг/дл; 5) повышенные ЛПНП сыворотки - более 130 мг/дл, и/или повышенные ЛПОНП сыворотки - более 40 мг/дл; 6) ИМТ от большего или равного 30 до 40 кг/м; 7) желание являться для регулярных последующих врачебных наблюдений; 8) возможность дать письменное информированное согласие. Критерии исключения: 1) прием отпускаемых без рецепта препаратов для снижения веса, препаратов для подавления аппетита центрального действия за последние шесть месяцев; 2) патофизиологические/генетические синдромы, связанные с ожирением (синдром Кушинга, синдром Тернера, синдром Прадера-Вилли); 3) пациенты с проявлениями злокачественных новообразований; 4) пациенты с плохо контролируемым сахарным диабетом (HbAlc (гликированный гемоглобин) более 10%); 5) пациенты с плохо контролируемой гипертензией (более 160/100 мм рт. ст.), 6) пациенты, получающие длительное (более 6 недель) лечение кортикостероидами, антидепрессантами, антихолинергиками и т.д., или любыми другими лекарственными средствами, которые могут влиять на результаты исследования; 7) пациенты, страдающие серьезными системными заболеваниями, требующими длительного медикаментозного лечения (ревматоидный артрит, ризомекулез (Rhizomeculosis), психонейроэндокринные расстройства и т.д.); 8) пациенты, имеющие в анамнезе предсердную фибрилляцию, острый коронарный синдром, инфаркт миокарда, инсульт или тяжелую аритмию за последние 6 месяцев; 9) симптоматичные пациенты с клиническими проявлениями сердечной недостаточности; 10) пациенты с сопутствующим серьезным заболеванием печени (определяемым по показателям аспартатаминотрансферазы (ACT) и/или аланинаминотрансферазы (АЛТ), общего билирубина; 11) щелочной фосфатазы (ЩФ) в 2,5 раза выше верхней границы нормы) или нарушением функции почек (определяемой по показателю креатинина сыворотки более 1,2 мг/дл), тяжелой легочной дисфункцией (неконтролируемая бронхиальная астма и/или хроническая обструктивная болезнь легких [ХОБЛ]), или любым другим состоянием, которое может поставить под угрозу исследование; 12) наличие в анамнезе ВИЧ и других вирусных инфекций; 13) алкоголики и/или наркоманы; 14) предшествующее хирургическое лечение ожирения; 15) история гиперчувствительности к любому из растительных экстрактов или пищевых добавок; 16) беременная/кормящая женщина; 17) пациенты, принимавшие участие в любом другом клиническом испытании за последние шесть (06) месяцев; 18) любое другое
состояние, которое, по мнению главного исследователя, может поставить под угрозу исследование.
Рандомизация, распределение лечения и процедуры исследования Поскольку данное исследование было пилотным, не был рассчитан формальный объем выборки. Каждому участнику был присвоен 6-значный код рандомизации, и исследуемые продукты были распределены персоналом клиники в соответствии со списком кодов рандомизации, созданным независимым статистиком. Двойная анонимность в отношении исследуемых продуктов достигалась путем независимого маскирования наборов дозирования, и поэтому как персонал клиники, так и участники оставались в неведении относительно лечения, получаемого на протяжении всего исследования. Демографические показатели всех вовлеченных пациентов были зафиксированы во время скринингового визита (Таблица 11). В исследование были включены пациенты с ожирением, не получавшие другого лечения за последние 3 месяца. Всем зарегистрированным пациентам было рекомендовано придерживаться графика мероприятий (Таблица 14) исследования. Зарегистрированные пациенты были распределены между активными и плацебо-группами в соотношении 1:1. Пациенты использовали настоящий продукт в амбулаторных условиях и самостоятельно принимали две желатиновые капсулы в день (каждая весом 560 мг), которые были либо активными, либо представляли собой плацебо, по меньшей мере за 30 минут до еды, предпочтительно утром и вечером, в качестве пищевой добавки в течение периода 90 дней. Они должны были приходить для клинических оценок на 15-й день, 30-й день, 60-й и 90-й день. Последующее наблюдение по телефону проводили по меньшей мере через 15 дней после последнего планового визита для определения самочувствия пациента. Ежедневную потребленную пищу и физическую активность пациенты регистрировали в дневниках, предоставленных им при 1-ом посещении. Они проверялись и контролировались исследователями при всех последующих визитах. Соблюдение режима приема добавок проверяли при каждом посещении путем проверки возвращаемых добавок. Сбор данных во время этого клинического исследования и статистический анализ были выполнены отдельными функциональными группами и сертифицированным независимым статистиком, соответственно. Никакие изменения или поправки не были внесены в утвержденный протокол после начала исследования, и никакого промежуточного анализа не проводили в течение периода исследования. Результаты в области безопасности были
измерены путем: 1) физического осмотра и оценки основных жизненных показателей; 2) оценки сообщенных нежелательных явлений (АЕ), если таковые имелись. Результаты эффективности измеряли по 1) массе, ИМТ, окружности талии, окружности бедер и индекса талия/бедра.
Статистический анализ
Для анализа данных клинического исследования с участием людей использовали программное обеспечение для статистического анализа (SAS) версии 9.2. Парный t-критерий Стьюдента, ковариационный анализ (ANCOVA) и критерий Уилкоксона для связных выборок были использованы для соответствующих переменных набора данных для достижения наилучшего статистического заключения о различии между группой, принимавшей активный исследуемый материал и группой, принимавшей плацебо. Значение «р» менее 0,05 считалось статистически значимым. Базовые показатели были суммированы как средние и среднеквадратические отклонения для непрерывных переменных, и как частоты и проценты для дискретных переменных. Метод замены недостающих данных последним документированным значением (LOCF), совокупность всех рандомизированных пациентов согласно назначенному лечению, были использованы для оценки эффективности предметов исследования.
Результаты
Ни один из включенных в исследование пациентов не имел аномального медицинского анамнеза или физических отклонений, выявленных во время скринингового визита или при последующих визитах в ходе исследования. Не было выявлено никаких статистически значимых изменений жизненно важных показателей в группах исследования при любом посещении в ходе исследования. Из 30 рандомизированных пациентов, 26 полностью прошли исследование. Соотношение пациентов мужского и женского пола, прошедших все визиты в ходе исследования, составило 7:19, 3 женщины выбыли из исследования в разные моменты времени, причем анализ в конце исследования показал, что 3 из 4 выбывших пациентов получали плацебо. Процент соблюдения режима лечения у 26 пациентов, полностью прошедших исследование, был хорошим. Минимальный процент соблюдения режима лечения составлял 87,22%, а максимальный составлял 100% и наблюдался у 19 пациентов. Исследование не было досрочно прекращено и было остановлено только после достижения  целевого  размера выборки  30.  Никаких  статистически значимых
изменений жизненно важных показателей (Таблица 15) и никаких клинически значимых аномальных лабораторных показателей (Таблицы 16 и 17) не наблюдали от первого до последнего визита и между экспериментальными группами. В течение всего периода исследования было отмечено единственное нежелательное явление, и, по мнению исследователя, оно не была связано с исследуемым продуктом. В данном исследовании не было отмечено серьезных нежелательных явлений или значительных нежелательных явлений. Анализ эффективности этих первичных параметров показывает, что масса, ИМТ и окружность талии достигли статистической значимого различия между двумя экспериментальными группами к концу исследования, в то время как другие два параметра (окружность бедер и индекс талия/бедра) не показали никакого значительного различия между двумя экспериментальными группами. Для нескольких биохимических показателей, таких как определение общего холестерина, триглицеридов, липопротеинов низкой плотности, липопротеинов высокой плотности и липопротеинов очень низкой плотности, было обнаружено статистически значимое (р меньше 0,01) различие между пациентами из двух экспериментальных групп (Таблица 18). Фотографии пациентов до и после периода исследования ясно указывают на эффективность продукта.
Величины представляют собой среднее ± стандартная ошибка *р-значение определено с помощью парного t-критерия Стьюдента
Величины представляют собой среднее ± СКО
Величины представляют собой среднее ± СКО
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения ожирения у людей, включающему стадию  введения указанным людям перорально  дважды  в  день композиции, содержащей этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%, для достижения эффектов уменьшения массы тела, индекса массы тела и окружности талии. В более конкретном варианте осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%, состоит, по существу, из пикеатаннола и его димеров. В еще более конкретных вариантах осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%, состоит, по существу, из пикеатаннола, сцирпусина А и сцирпусина В.
В еще одном наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения гиперхолестеринемии у людей, включающему стадию введения указанным людям перорально дважды в день композиции, содержащей этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%, для достижения эффектов (а) снижения системных уровней общего холестерина, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и триглицеридов сыворотки, и (б) повышения системных уровней липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В более конкретном варианте осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%, состоит, по существу, из пикеатаннола и его димеров. В еще более конкретных вариантах осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов 5%, состоит, по существу, из пикеатаннола, сцирпусина А и сцирпусина В.
В качестве дополнительного иллюстративного варианта осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения ожирения у людей, включающему стадию введения указанным людям перорально дважды в день композиции, содержащей этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов более 3%, для достижения эффектов уменьшения массы тела, индекса массы тела и окружности талии.
В более конкретном варианте осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов более 3%, состоит, по существу, из пикеатаннола и его димеров. В еще более конкретных вариантах осуществления композиция, содержащая
этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов более 3%, состоит, по существу, из пикеатаннола, сцирпусина А и сцирпусина В.
В качестве дополнительного иллюстративного примера настоящее изобретение также относится к способу лечения гиперхолестеринемии у людей, включающему стадию введения указанным людям перорально дважды в день композиции, содержащей этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов более 3%, для достижения эффектов (а) снижения системных уровней общего холестерина, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и триглицеридов сыворотки, и (б) повышения системных уровней липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В более конкретном варианте осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов более 3%, состоит, по существу, из пикеатаннола и его димеров. В еще более конкретных вариантах осуществления композиция, содержащая этилацетатную фракцию экстракта корневищ Cyperus rotundus, нормированную до общего содержания стильбенов более 3%, состоит, по существу, из пикеатаннола, сцирпусина А и сцирпусина В.
Несмотря на то, что изобретение было описано в отношении предпочтительного варианта осуществления, специалистам в данной области должно быть понятно, что изобретение им не ограничено. Скорее, объем настоящего изобретения следует толковать только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.