СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭСТРОГЕНОЗАВИСИМОСТИ ВЫСОКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHOD OF EVALUATING ESTROGEN DEPENDENCE OF HIGH-DIFFERENTIATED THYROID CANCER

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и онкологической эндокринологии.
Рак щитовидной железы (РЩЖ) принадлежит к числу тех злокачественных новообразований, которые, несмотря на относительную редкость, привлекают к себе внимание специалистов различного профиля, что объясняется как чисто медицинскими, так и некоторыми социальными причинами (включая роль дефицита йода, лучевого воздействия, связанного с деятельностью человека, и т.д.). Среди высокодифференцированных форм процесса ведущим морфологическим вариантом РЩЖ является папиллярный рак, варьирующий в пределах 55-75% от всех случаев заболевания. Существенно, что преимущественно за счет этой формы происходит и прирост заболеваемости, регистрируемый в целом ряде стран в течение конца ХХ-начала XXI века (Е.А.Валдина, 2005; L.Davies, H.G.Welsch, 2006).
Об определенных особенностях гормонозависимости РЩЖ на эпидемиологическом уровне говорит, в частности, то, что, во-первых, не менее 65% всех новообразований выявляется в возрасте до 55 лет (что нехарактерно для многих других локализаций опухолевого процесса (А.Ф.Романчишен и др., 2003; M.J.Schlumberger, 2007), во-вторых, среди заболевших доля женщин в 2-4 раза превосходит таковую у мужчин (Е.Ф.Лушников и др., 2003; В.М.Мерабишвили, 2007) и, в-третьих, средний возраст заболевших женщин на 2,5-3 года меньше, чем у мужчин (В.И.Чиссов, В.В.Старинский, 2006).
Хотя «классическая» концепция гормонального канцерогенеза в ткани щитовидной железы предполагает, в первую очередь, значимость тиреотропной гиперстимуляции (Л.М.Берштейн, 2000; Е.А.Валдина, 2005; M.Derwahl, H.Studer, 2002; M.J.Schlumberger, 2007), уже только что приведенные эпидемиологические данные свидетельствуют о возможности вовлечения и иных механизмов, ассоциированных, в частности, с ролью эстрогенов. В течение ряда лет наряду с косвенными наблюдениями такого рода появляются свидетельства, дополнительно характеризующие данную проблему и позволяющие делать на этом основании и некоторые предварительные выводы фундаментального и прикладного характера.
-6
-8
Так, в частности, в нормальной и малигнизированной ткани щитовидной железы выявлены цитоплазматические рецепторы эстрогенов и прогестерона, частота обнаружения и концентрация которых связана со степенью дифференцировки опухоли (W.Kawabata et al., 2003; Е.В.Цырлина, А.А.Порозова, 2008). По единичным сообщениям, в 50-60% случаев тиреоидных карцином иммуногистохимическим методом удается обнаружить ароматазу (эстрогенсинтетазу), что отражает способность к локальной продукции эстрогенов и может быть одним из факторов самоподдержания опухолевого роста (L.D.Valle et al., 1998). В экспериментах, проводившихся in vitro, эстрадиол в концентрации 10-10 М усиливал пролиферацию в ряде клеточных линий РЩЖ (D.Manole et al., 2001), а антиэстроген тамоксифен, по некоторым, но не всем данным, способен ограничивать этот эффект эстрогенов (M.L.Lee et al., 2005; A.Vivacqua et al., 2006). Наконец, по собственным данным (Л.М.Берштейн и др., 2008), прием в течение 6-12 дней эстрогенов (этинилэстрадиол, эстрадиол-валерат) или в течение 14 дней тамоксифена больными РЩЖ, ранее подвергавшимися экстирпации органа, примерно в каждом пятом случае сопровождался повышением уровня тиреоглобулина в крови. Это допускало вероятность прямого действия на синтез последнего в не уничтоженных клетках РЩЖ, но не исключало возможности воздействия через стимуляцию секреции тиреотропина (E.Marqusee et al., 2000; C.L.Garwood et al., 2006) и не отвечало на вопрос о том, оказывает ли тамоксифен в данной ситуации про- (как в эндометрии), или антиэстрогенный (как в эпителии молочной железы) эффект. Таким образом, существует целесообразность продолжения изучения роли эстрогенов и эстрогеноподобных веществ в поддержании роста опухолей щитовидной железы и поиска дополнительных критериев эстрогенозависимости ткани РЩЖ, доступных для оценки в клинических условиях, что и послужило стимулом для разработки предлагаемого способа. Поскольку в его основу легло определение активности тиреоидной пероксидазы (ТПО), отметим, что ТПО представляет собой фермент, локализующийся в ткани щитовидной железы, способствующий высвобождению йода и обеспечивающий тем самым связь последнего с тирозиновыми остатками тиреоглобулина в целях биосинтеза тиреоидных гормонов. Известные активаторы ТПО представлены тиреотропином, а инактиваторы - тионамидами, препаратами для лечения тиреотоксикоза (И.И.Дедов и др., 2000; L.Braverman et al., 1997).
В качестве прототипа предлагаемого способа следует рассматривать наблюдение, выполненное в эксперименте, в соответствии с которым эстрадиол, вводившийся интактным взрослым крысам в дозах 0,7 или 14 мкг/100 г массы тела в течение 10 дней, стимулировал у них активность ТПО в ткани щитовидной железы (Lima LP, Barros IA, Lisboa PC et al. Estrogen effects on thyroid iodide uptake and thyroperoxidase activity in normal and ovariectomized rats. Steroids. 2006; 71(8): 653-659). Определенным недостатком такого подхода является длительность введения препарата и возможный опосредованный характер его эффекта.
Техническим результатом заявляемого изобретения является установление показателя, ориентация на который позволит признать эстрогензависимым образец ткани рака щитовидной железы человека - таковым параметром является повышение активности тиреоидной пероксидазы в опухолевой ткани не менее чем на 50% от исходной в результате краткосрочного культивирования образца с эстрадиолом.
-6
-6
Для апробации заявляемого изобретения опухолевую ткань щитовидной железы максимально быстро после операции помещали в холодный физиологический раствор и транспортировали в лабораторию. В результате отработки процедуры остановились на следующем ее варианте. Ткань на холоду делили на три пробы массой по 100 мг, обозначая их «контроль» (К), «эстрадиол» (Е2) и «тамоксифен» (ТАМ) и используя последнюю пробу для сравнения с эффектом эстрадиола. Навески ткани тщательно промывали в холодном физиологическом растворе, промокали на фильтровальной бумаге, по отдельности переносили в чашки Петри, содержащие по 3 мл охлажденного физиологического раствора, и измельчали материал ножницами на мелкие кусочки размером приблизительно в 1-1,5 мм. В пробу К вносили 18 мкл 95% этанола, в пробу Е2-18 мкл 95% этанола, содержащего 1,8 мкг эстрадиола, «Fluka» (финальная концентрация - 2,21×10 М), в пробу ТАМ - 18 мкл 95% этанола, содержащего 1,8 мкг тамоксифена, «Sigma» (финальная концентрация - 1,62×10М).
Чашки Петри с пробами загружали в шейкер и помещали на 4 часа в термостат с температурой 37°С. По завершении этого этапа образцы вынимали из раствора, просушивали на фильтровальной бумаге и переносили в ступки, где перетирали в жидком азоте с добавлением стеклянного песка. Затем в каждую ступку вносили по 1,5 мл 50 мМ Трис-HCl буфера (рН=7,2), содержащего 1 мМ KI, и перетирали пробы еще раз. Гомогенаты переливали в пластиковые пробирки типа «эппендорф» и центрифугировали в течение 60 мин со скоростью 27000 g (13000 об/мин) при 4°С. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 1,5 мл 1% раствора дигитонина, тщательно перемешивали и оставляли на 16-18 час при 4°С.
На следующее утро пробы повторно центрифугировали при тех же условиях и приступали к оценке активности тиреоидной пероксидазы (ТПО). С этой целью 80 мкл полученной после повторного центрифугирования надосадочной жидкости вносили в 2 мл свежеприготовленного 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4), содержащего 24 мМ KI и 11 мМ глюкозу, и доводили объем до 4,0 мл, добавляя 50 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4). Измеряли экстинкцию проб на спектрофотометре при длине волны 353 нм против 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4), содержащего 24 мМ KI и 11 мМ глюкозу. Затем в каждую пробу добавляли по 10 мкл 0,1% раствора (1,87 ед.) глюкозоксидазы, Faizyme Labs., и через 4 мин измеряли экстинкцию при тех же условиях повторно. Параллельно в тестируемой надосадочной жидкости измеряли содержание белка по Лоури. Активность ТПО рассчитывали делением разницы экстинкций проб после и до добавления глюкозоксидазы на содержание белка (мг) и время (4 мин) и выражали результаты в ед. экстинкции/мг белка/мин.
Материал для исследования был получен во время операции от 12 больных высокодифференцированным раком щитовидной железы (9 женщин, 3 мужчин, ср. возраст 57,3±3,1 года). В 11 наблюдениях речь шла о первичной опухоли (10 случаев папиллярного РЩЖ и 1 случай фолликулярного варианта папиллярного рака), а в одном - о локальном рецидиве папиллярной карциномы. Во всех образцах ткани РЩЖ иммуногистохимическим методом параллельно определяли экспрессию рецепторов эстрогенов и прогестерона, используя, соответственно, мышиные моноклональные антитела («Novocastra») 6F11 и 16 в разведении 1:100. Основные результаты представлены в табл.1 и 2, первая из которых отражает активность ТПО в пробах К. Е2 и ТАМ, а вторая - сопоставление ответа ТПО на эстрадиол с содержанием цитоплазматических рецепторов стероидных гормонов в опухолевой ткани.
Табл.1
Активность тиреоидной пероксидазы, ТПО в исследованных образцах ткани рака щитовидной железы
Инициалы
Пол
Возраст
Диагноз
ТПО, ед. экстинкции/мг белка/мин
К
+Е2 (2,21×10<sup>-6</sup> М)
+ТАМ (1,62×10<sup>-6</sup> М)
М.В.Д.
Ж
61
ПК
156,25
1093,75 (+600)
-
М.Н.Б.
Ж
64
ПК
234,38
117,19 (-50)
26,04 (-89)
С.Т.В.
Ж
63
ПК
52,08
390,63 (+650)
104,17 (+100)
Б.Е.В.
Ж
39
ПК
137,06
93,75 (-31)
-
Н.Х.А.
М
46
ПК
729,2
319,4 (-56)
187,5 (-74)
Я.Л.М.
Ж
70
ПК
1759,3
925,9 (-47)
370,4 (-79)
К.А.К.
Ж
45
ПК
500,0
401,0 (-20)
-
К.В.В.
Ж
53
ПК
156,0
285,0 (+83)
375,0 (+140)
И.Ю.П.
М
57
ПК
560,0
838,0 (+50)
696,0 (+25)
Б.С.И.
Ж
62
ПК
468,7
208,0 (-55)
191,0 (-59)
С.Н.Н.
М
53
ФВПК
937,5
185,2 (-80)
283,0 (-70)
А.И.Н.
Ж
75
РПК
19,2
55,0 (+189)
41,7 (+117)
Примечания
1) Сокращения: Е2 - эстрадиол; ТАМ - тамоксифен; ПК - папиллярная карцинома; ФВПК - фолликулярный вариант папиллярной карциномы; РПК - рецидив папиллярной карциномы
2) В скобках - процент изменений активности ТПО по отношению к контрольной пробе
Табл.2
Сопоставление реакции активности тиреоидной пероксидазы на эстрадиол с содержанием рецепторов эстрогенов (ЭР) и прогестерона (ПР) в ткани рака щитовидной железы
Вид рецептора
Ответ ТПО
Стимуляция эстрадиолом (не менее 50%)
Отсутствие стимуляции эстрадиолом
Инициалы обследуемого
Рецепторы в баллах по Allred
Рецепторы в процентах окрашенных клеток
Инициалы обследуемого
Рецепторы в баллах по Allred
Рецепторы в процентах окрашенных клеток
ЭР
М.В.Д.
2
0,05
М.Н.Б.
3
13
С.Т.В.
2
0,01
Б.Е.В.
2
0,01
К.В.В.
2
0,01
Н.Х.А.
3
5
И.Ю.П.
0
0
Я.Л.М.
2
1
А.И.Н.
0
0
С.Н.Н.
2
1
К.А.К.
5
25
Б.С.И.
0
0
Среднее значение (М±m)
1,2±0,48
0,01±0,01
М±m
2,4±0,57
5,0±3,4
ПР
М.В.Д.
2
0,05
М.Н.Б.
5
10
С.Т.В.
4
1
Б.Е.В.
5
35
К.В.В.
4
20
Н.Х.А.
5
10
И.Ю.П.
2
0,01
Я.Л.М.
7
40
А.И.Н.
5
20
С.Н.Н.
7
35
К.А.К.
5
15
Б.С.И.
4
10
Среднее значение (M±m)
3,4±0,60
8,2±4,8
М±m
5,4±0,42
22,1±5,21
Приведенные в таблицах 1 и 2 материалы могут быть суммированы следующим образом:
1. Стимуляция активности ТПО эстрадиолом (50% и более) в ткани РЩЖ человека выявляется почти в половине наблюдений (в 5 из 12 случаев);
2. Имеется соответствие в направленности эффектов эстрадиола и тамоксифена (в 5 случаях, где активность ТПО стимулировалась эстрадиолом, оценка эффекта тамоксифена производилась в 4 наблюдениях и во всех них выявлялось повышение активности фермента; напротив, в 7 случаях, где под влиянием эстрадиола активность ТПО не стимулировалась, действие тамоксифена in vitro изучалось у 5 больных и во всех этих наблюдениях повышения активности тиреоидной пероксидазы выявлено не было);
3. Стимулирующее влияние эстрадиола на активность ТПО в ткани высокодифференцированного рака щитовидной железы не коррелирует с наличием в этой ткани цитоплазматических рецепторов стероидных гормонов; в частности, в тех случаях, где эстрогенной стимуляции не наблюдалось, содержание ЭР и ПР в опухоли по средним данным было даже более высоким.
Пример 1: больная С.Т.В., 63 лет, папиллярная карцинома щитовидной железы. Стимуляция активности ТПО эстрадиолом+650% (стимуляция тамоксифеном +100%), содержание рецепторов эстрогенов в ткани опухоли низкое (2 балла по Allred).
Пример 2: больная М.Н.Б., 64 года, папиллярная карцинома щитовидной железы. Реакция активности ТПО на эстрадиол - 50% (на тамоксифен - 89%), содержание рецепторов эстрогенов в ткани опухоли низкое-умеренное (3 балла по Allred).
Следует отметить дополнительно два важных обстоятельства: а) содержание рецепторов эстрогенов и прогестерона в ткани РЩЖ и по собственным наблюдениям, и по данным литературы относительно невысоко и значимо уступает величине этого показателя в таких новообразованиях, как рак молочной железы и эндометрия (W. Kawabata et al., 2003; Е.В.Цырлина, А.А.Порозова, 2008); б) эффекты эстрогенов подразделяются на геномные, вовлекающие участие цитоплазматических рецепторов, и негеномные, основанные на передаче сигнала через внешнюю (плазматическую) мембрану клетки (A.Pedram et al., 2002). Действие эстрогенов на клеточные линии РЩЖ, как оказалось, преимущественно является негеномным (A.Kumar et al., 2010), и определенное подтверждение этому на ткани опухолей щитовидной железы человека можно видеть в представленных выше материалах.
Таким образом, в заявляемом изобретении представлен способ оценки эстрогенозависимости рака щитовидной железы, основанный на динамике активности тиреоидной пероксидазы в опухолевой ткани в присутствии эстрадиола и по сравнению с нагрузочными тестами, проводившимися ранее in vivo (Л.М.Берштейн и др., 2008), не требующий длительного времени для оценки результатов. Отнесение случаев рака щитовидной железы к эстрогенозависимым или эстрогенонезависимым по предлагаемому критерию может быть использовано в предсказании прогноза и, не исключено, при выборе консервативной терапии заболевания.