ОСНАСТКА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЗАГОТОВКИ МИКРОФЛЮИДНОГО ЧИПА, ЗАГОТОВКА МИКРОФЛЮИДНОГО ЧИПА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ACCESSORIES FOR MANUFACTURING OF MICROFLUIDIC CHIP PREFORM, MICROFLUIDIC CHIP PREFORM AND METHOD OF ITS PRODUCTION, MICROFLUIDIC CHIP AND METHOD OF ITS PRODUCTION

Область техники, к которой относится изобретение
Группа изобретений относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно, к способам и устройствам, предназначенным для изготовления микрофлюидных чипов, которые могут быть использованы для культивирования и/или исследования клеток человека, животных, растений и/или культур вирусов, например, изучения миграции клеток или совместимости культивирования нескольких типов клеток, а также для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro, в частности, могут применяться для проведения исследований токсичности и метаболизма лекарственных препаратов, реализации процессов метастазирования опухолевых клеток в среде культивирования и др.
Уровень техники
На сегодняшний день микрофлюидные чипы широко применяются в различных областях науки и техники. При этом в литературе активно используются и другие термины, характеризующие данную конструкцию - микрофлюидные системы, модули, микрофлюидные платформы, микрофлюидные устройства, микробиореакторы.
Наиболее эффективно микрофлюидные чипы используются в химических, биологических и медицинских исследованиях, например, для культивирования клеток, моделирования тканей и органов человека, и, в отличие от промышленных биореакторов, предназначены для максимально полного и правдоподобного воспроизведения in vitro физиологических условий in vivo (pH культуральной среды, концентрации кислорода, удаления продуктов метаболизма, поддержания состава культуральной среды, формирования физиологичных механических воздействий).
В зависимости от решаемой задачи из уровня техники известно использование микрофлюидных платформ различной конструкции и топологии, например, ONIX CellASIC, MicroSlide, MOP (Microfluidic Organ-on-chip Pack) и др. В простейшем случае, конструкция микрофлюидного чипа представляет собой две герметично соединенные пластины, на одной из которой (основа) формируются микроканалы, ячейки, клапаны и другие активные элементы, а другая является защитной. При этом распространены чипы с ячейками для культивирования клеток объемом менее 1 мл, объединенными сетью каналов диаметром менее 1 мм.
При изготовлении микрофлюидных чипов используют различные методы активного воздействия на основу чипа с целью формирования на ее поверхности микроструктур. Из уровня техники известны различные способы формирования микроструктур, например, метод фотолитографии, метод лазерной абляции, метод «мягкой» литографии (микропечать), метод горячей штамповки микрошаблоном и другие. Кроме того, используют различные комбинации методов. Выбор метода обусловлен, в том числе, материалом основы чипа. В большинстве случаев микрофлюидные чипы изготавливают из полидиметилсилоксана (ПДМС) или полистирола.
Известные методы характеризуются высокой стоимостью, сложностью и длительностью процесса изготовления микрофлюидных чипов, что ограничивает широкое применение чипов для исследования биологических объектов. Тем не менее, несомненные преимущества микрофлюидных чипов по сравнению с традиционными аналитическими системами свидетельствуют об актуальности задачи изготовления доступных микрофлюидных чипов (устройств), направленных на широкий спектр применений, связанных с клеточными исследованиями, в том числе, обеспечивающих исследование процесса метастазирования. Данная задача, очевидно, влечет за собой необходимость разработки технологии, включающей как сам способ изготовления чипа, так и конструктивные решения, применяемые в способе, которые могли бы обеспечить увеличение количества выпускаемых чипов с использованием стандартных производственных мощностей при сохранении высокого уровня качества и снижении их себестоимости.
Из международной заявки WO 2011044116 известен способ изготовления микрофлюидного устройства, который предполагает горячую штамповку полимерного слоя с одной из его сторон мастер-шаблоном, выполненным, например, из эпоксидной смолы, кремния или металла, для формирования в слое полимера микрофлюидной системы. Затем на поверхность со сформированным рельефом наклеивают полимерную пластину для герметизации микрофлюидного контура. Согласно данному способу, микрофлюидную систему формируют в слое твердого полимера, например, поликарбоната, полистирола и др. При этом мастер-шаблон может быть изготовлен из эпоксидной смолы следующим образом. На кремниевую пластину, покрытую фоторезистом, фотолитографическим способом наносят рельеф, определяющий структуру будущей микрофлюидной системы. Полученный таким образом рельеф используют в качестве шаблона для отливки слоя полидиметилсилоксана (ПДМС). После отливки ПДМС вакуумируют в течение около 30 минут, а затем выдерживают при температуре 80°C более двух часов. После отверждения ПДМС, его используют в качестве шаблона для изготовления мастер-шаблона. Процесс изготовления мастер-шаблона из эпоксидной смолы включает выдерживание при температуре 120°C в течение 6 часов ПДМС-шаблона с нанесенной на его поверхность эпоксидной смолой. Изобретение предполагает также возможность изготовления металлического шаблона путем вытачивания на нем заданного микро-рельефа. В качестве металла может быть использован никель. Далее, с помощью полученного мастер-шаблона микрофлюидная система может быть изготовлена методом горячей штамповки на твердом полимере, например, с помощью пресса. После горячей штамповки в слое твердого полимера могут быть просверлены технологические отверстия. Затем микрофлюидную систему герметизируют путем наклеивания на нее тонкого слоя полимера.
Использование твердого полимера для формирования микрофлюидной системы обеспечивает ей высокую прочность и износостойкость. Однако это влечет за собой ряд существенных недостатков. В частности, необходимость этапа просверливания отверстий обусловливает возникновение погрешностей в размерах самих отверстий и в элементах микрофлюидного контура. Кроме того, для реализации ряда микрофлюидных элементов, таких как клапаны и насосы, необходимо отдельным этапом формировать эти элементы и размещать их на заготовке микрофлюидной системы до ее герметизации. Это, безусловно, влечет нежелательный контакт с заготовкой и существенное увеличение времени изготовления чипа.
Из международной заявки WO 2002053290 известен способ изготовления микрофлюидного чипа, включающий использование мастер-шаблона для формирования с его помощью микрофлюидной системы в слое формовочного материала с дальнейшим его присоединением к основе. При этом сам мастер-шаблон предложено изготавливать, например, фотолитографическим способом. На мастер-шаблон помещают формовочный материал в жидкой форме и дают ему отвердеть. В качестве формовочного материала, предпочтительно, выбирают ПДМС. При необходимости, до отверждения слоя формовочного материала, может быть использован второй мастер-шаблон для формирования микрофлюидной системы на второй стороне слоя или для формирования сквозных отверстий в слое. После формирования микрофлюидной системы, к слою формовочного материала приклеивают основу. Основа может быть приклеена как перманентно, так и только для извлечения микрофлюидной системы из мастер-шаблона. В последнем случае основу приклеивают не крепко и, после извлечения слоя формовочного материала из мастер-шаблона, отклеивают с помощью растворителя. После извлечения из мастер-шаблона, микрофлюидную систему герметизируют путем наклеивания на нее стеклянной пластины или склеивают с другой микрофлюидной системой.
Использование ПДМС, ввиду его эластичности, позволяет интегрировать клапаны и насосы в слой формовочного материала на этапе отливки, а использование второго мастер-шаблона позволяет исключить погрешности, характерные для сверления, при формировании отверстий в слое формовочного материала. Однако, этап приклеивания основы к слою ПДМС увеличивает время изготовления чипа и требует дополнительного контакта с микрофлюидным чипом в процессе его изготовления, что сильно повышает вероятность попадания инородных частиц и появления брака. Помимо этого, в данном способе не решена задача удаления пузырьков газа из слоя ПДМС, формирующихся в жидкой фазе ПДМС из растворенного в нем газа, что отрицательно сказывается на качестве получаемых изделий. Использование формовочного материала в жидкой фазе создает сложности в формировании слоя равномерной толщины.
Из патентного документа US 9022775 известны устройство и способ для получения микрофлюидного чипа, решающие проблему удаления пузырьков газа из формовочного материала. Предлагаемый в данной публикации способ предполагает отдельно изготовление микрофлюидной системы в слое формовочного материала с последующим его приклеиванием на твердое основание. Способ включает следующие этапы. Форму для отливки в виде контейнера с микроструктурированным рельефом, выполненным на его внутренней поверхности, заполняют формовочным материалом. Затем контейнер центрифугируют. В процессе центрифугирования формовочный материал утрамбовывается и приобретает высокую плотность, в результате чего на нем четко отпечатывается микроструктура. Пузырьки газа, растворенного в формовочном материале, удаляются в результате центрифугирования вследствие изменения плотности формовочного материала. Затем, после отверждения формовочного материала, его извлекают из контейнера. Для реализации описанного выше способа также предложено устройство, включающее контейнер, в который помещают формовочный материал и который затем может быть размещен в центрифуге. Микрофлюидный чип, изготовленный известным способом, включает слой отвердевшего формовочного материала со сформированной на его поверхности микрофлюидной системой, наклеенный на твердое основание, при этом микрофлюидная система герметизирована, например, предметным стеклом.
Однако способ, предложенный в патенте US 9022775, предполагает получение слоя формовочного материала в виде тонкой пластины с микроканалами, которую необходимо крепить на какое-либо основание, что составляет отдельный этап в технологии, существенно увеличивающий время изготовления чипа. Такой подход делает затруднительным формирование сложной микрофлюидной системы, включающей, например, каналы, клапаны, клеточные ячейки и другие микрофлюидные элементы. Кроме того, согласно способу, описанному в US 9022775, формы для отливки при центрифугировании крепят под углом к оси вращения, что влечет возникновение разности давлений в нижней и верхней частях формы в процессе центрифугирования. С одной стороны, это действительно позволяет избавиться от пузырьков газа, однако с другой - за счет разного давления возникает различная плотность формовочного материала в конечном изделии, что, в свою очередь, ведет к неравномерности механических характеристик микрофлюидной системы, препятствующей точному контролю над течением жидкости. Наконец, решение, описанное в патенте US 9022775, требует изготовление специального ротора для центрифуги, в который будут закладываться формы для отливки. Необходимо отметить, что изготовление ротора для центрифуги - это сложный технологический процесс, требующий математических расчетов, высококачественного процесса изготовления и последующей балансировки, что влечет значительное усложнение и удорожание процесса изготовления чипа.
Наиболее близким к предлагаемому решению являются способ и устройство изготовления заготовки микрофлюидного чипа, известные из патента RU 2612904. При этом заготовка чипа представляет собой основу в виде пластины, выполненную, преимущественно, из поликарбоната, на одной из сторон которой расположена эластичная пластина в виде отлитого слоя ПДМС со сформированной в нем микрофлюидной системой. В основе пластины выполнены резьбовые отверстия, соответствующие расположению микрофлюидных элементов чипа (например, клеточных ячеек, микронасосов, включающих клапаны, рабочие камеры), а также служащие для подключения к нему различных емкостей (емкости с питательной средой, емкости сбора среды, емкости сбора фильтрата) и внешних модулей (например, средства создания постоянного давления). Для изготовления заготовки чипа используют устройство, включающее форму для литья, рамку, пуансоны и крышку. При этом форма выполнена в виде мастер-шаблона с рисунком микрофлюидных каналов и цилиндрическим выступом, формирующим при литье полость емкости сбора фильтрата в слое ПДМС. Рамка выполнена с возможностью формирования периметра эластичной пластины и задания ее толщины, а крышка выполнена с возможностью фиксации пуансонов и основы заготовки относительно рамки и мастер-шаблона. При этом все детали устройства выполнены с возможностью скрепления посредством соединительных элементов.
При изготовлении заготовки чипа ПДМС вводят в форму под давлением, формируя при этом на нижней стороне основы слой отливаемого формовочного материала, который затем подвергают отверждению с получением эластичной пластины. При этом пуансоны формируют каналы, отверстия в эластичной пластине, а также мембраны рабочей камеры и различных клапанов. Готовую отливку эластичной пластины извлекают из формы вместе с основой и сформированные в эластичной пластине микрофлюидные каналы герметизируют предметным стеклом, предварительно обработав поверхности в плазменной камере для прочного герметичного соединение стекла и ПДМС.
Однако известное техническое решение обладает рядом существенных недостатков. В частности, известный способ изготовления предполагает этап формирования резьбы в отверстиях пластины, характеризующихся различным диаметром. Данная процедура значительно увеличивает время изготовления заготовки чипа. С наличием резьбы в отверстиях также связан еще один этап, замедляющий производство - чистка резьбы от ПДМС после его отверждения. Целый ряд недостатков известного решения связан с использованием пуансонов. Само по себе, их применение замедляет процесс изготовления: на установку и удаление каждого из них необходимо затратить определенное время. Срок службы пуансонов крайне ограничен в связи с их быстрым изнашиванием, что ведет к необходимости изготовления эксклюзивных пуансонов под каждую партию изделий. Более того, технология применения пуансонов, их позиционирование, не обеспечивает высокого уровня точности при формировании мембран микрофлюидной системы, что крайне негативно сказывается на качестве изделия. При установке пуансонов необходимо дополнительно уплотнять места их соединений для исключения проливания ПДМС. Это, с одной стороны, значительно замедляет процесс производства, а с другой - повышает вероятность брака при погрешностях в установке уплотнителей. Наконец, большое количество различных соединений элементов конструкции ведет к повышенной вероятности образования пузырьков воздуха в слое ПДМС, что также повышает уровень брака в производстве. Таким образом, перечисленные выше недостатки не позволяют масштабировать производство и кардинально повысить качество изделия. С другой стороны, ввиду сложности известного способа, невозможно существенно снизить себестоимость изготавливаемого с его помощью изделия.
Конструкция изделия, изготовленного согласно известному способу, также обладает рядом недостатков, вытекающих из технологии изготовления. Во-первых, микрофлюидный чип затруднительно стерилизовать ввиду разнородности используемых в процессе его эксплуатации материалов: поликарбонат (материал основы), резина (материал уплотнителей), металл (материал фитингов). Во-вторых, поскольку для герметичного подключения к чипу различных модулей управления и герметизации клеточных ячеек требуется применение пробок, уплотнительных прокладок и манжет, конструкция не может обеспечить необходимый уровень эргономичности и удобства эксплуатации, а также препятствует поддержанию стерильности в процессе эксплуатации чипа.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема, решаемая настоящей группой изобретений, заключается в разработке технологии изготовления микрофлюидного чипа (способов и устройств) с различной структурой расположения микрофлюидных элементов, обеспечивающей получение высококачественного чипа при оптимизации времени и повышении технологичности процесса его изготовления (т.е. упрощении процесса производства), позволяющих осуществлять серийное производство чипов на стандартных производственных мощностях.
Техническим результатом группы изобретений является упрощение конструкции оснастки и технологии изготовления микрофлюидного чипа при повышении производительности и технологичности процесса изготовления чипа (заготовки чипа) при сохранении высокого качества получаемого изделия, обусловленного в т.ч. исключением возможности образования пузырьков газа в слое формовочного материала в процессе изготовления чипа.
Заявляемое изобретение позволяет устранить недостатки, характерные для перечисленных выше аналогов. В частности, предлагаемое изобретение обеспечивает на одном этапе технологического процесса формирование на поверхности основы с одной из ее сторон слоя формовочного материала с микрофлюидной системой, а с другой, при необходимости, уплотнительного слоя в виде единой монолитной детали, обеспечивающей герметичность примыкания дополнительных элементов, используемых в процессе эксплуатации готового чипа (например, пневматических трубок, обеспечивающих работу клапанной группы, а также пробки, закрывающей клеточные ячейки и технологическое отверстие) и заменяющий множество отдельных уплотнительных деталей (прокладок, уплотнительных колец и др.). Кроме того, сформированный уплотнительный слой характеризуется, с одной стороны, повышенной прочностью и долговечностью по сравнению с отдельными уплотнителями и прокладками, а с другой стороны, - существенно упрощает процесс стерилизации: уплотнительный слой не нужно отсоединять от основы микрофлюидного чипа перед стерилизацией и устанавливать его обратно после стерилизации в отличие от отдельных прокладок и уплотнителей. Минимизация количественного состава деталей и предотвращение нежелательного контакта с микрофлюидными элементами в процессе работы с чипом обеспечивают длительное сохранение стерильности в процессе эксплуатации. Более того, при использовании предлагаемого изобретения исключаются погрешности в размерах при формировании микрофлюидных элементов (например, мембран микронасоса), что также дает возможность воспроизведения чипа в рамках серийного производства. Оптимизация времени изготовления позволяет добиться снижения себестоимости готового образца.
Технический результат достигается тем, что оснастка для получения заготовки микрофлюидного чипа, содержащей основу с размещенным на одной из ее сторон слоем формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии, выполнена в виде объемной детали из первой и второй частей, снабженной, по меньшей мере, одним отверстием для заливки формовочного материала, при этом обе части выполнены с возможностью образования при их соединении полости для размещения основы заготовки и возможностью формирования по меньшей мере на одной из сторон основы микрофлюидной системы в слое формовочного материала, при этом внутренняя поверхность первой части оснастки содержит рельеф, соответствующий топологии микрофлюидной системы.
Для формирования на поверхности основы микрофлюидной системы в слое формовочного материала, полость в оснастке при размещении в ней основы заготовки может быть выполнена с возможностью образования зазора между соответствующей поверхностью основы и внутренней поверхностью первой части оснастки, при этом толщина слоя с микрофлюидной системой определяется величиной упомянутого зазора.
Оснастка может быть выполнена с возможностью формирования уплотнительного слоя из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем формовочного материала, содержащим микрофлюидную систему.
Для формирования уплотнительного слоя из формовочного материала на поверхности основы, полость в оснастке при размещении в ней основы заготовки может быть выполнена с возможностью образования зазора между соответствующей поверхностью основы и внутренней поверхностью второй части оснастки, при этом толщина уплотнительного слоя определяется величиной упомянутого зазора.
Для размещения основы заготовки и возможности формирования, по меньшей мере, на одной из сторон основы микрофлюидной системы в слое формовочного материала, обе части оснастки могут быть выполнены с углублениями со стороны их внутренних поверхностей.
Оснастка может быть выполнена с возможностью формирования уплотнительного слоя из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем формовочного материала, содержащим микрофлюидную систему, при этом углубление, расположенное во второй части оснастки выполнено размерами, соответствующими размерам основы заготовки с уплотнительным слоем из формовочного материала, а углубление, расположенное в первой части оснастки, выполнено размерами, соответствующими размерам слоя формовочного материала с микрофлюидной системой.
Оснастка может быть дополнительно снабжена, по меньшей мере, одним отверстием для удаления излишков формовочного материала.
При этом отверстие для заливки формовочного материала и отверстие для удаления излишков формовочного материала могут быть расположены на противоположных сторонах оснастки. Кроме того, отверстие для заливки формовочного материала и отверстие для удаления излишков формовочного материала могут быть расположены в одной из частей оснасти и выполнены сообщающимися с полостью оснастки.
Внутренняя поверхность второй части оснастки может быть снабжена, по меньшей мере, одним выступом в соответствии с топологией микрофлюидной системы, при этом в качестве основы может быть использована пластина с, по меньшей мере, одним отверстием, соответствующим расположению выступа второй части оснастки.
Количество и расположение отверстий в пластине может соответствовать количеству и расположению выступов второй части оснастки.
Выступы могут быть выполнены длиной, обеспечивающей требуемую толщину слоя формовочного материала в зоне контакта формовочного материала с торцевой поверхностью выступа в соответствии с топологией микрофлюидной системы.
Оснастка может быть выполнена с возможностью формирования уплотнительного слоя из формовочного материала на поверхности основы и, по меньшей мере, на части внутренней поверхности, по меньшей мере, части отверстий основы. При этом уплотнительный слой из формовочного материала может представлять собой единую эластичную деталь.
По меньшей мере, часть выступов оснастки может быть выполнена ступенчатой формы в продольном сечении, при этом поперечные размеры ступеней могут быть выполнены с уменьшением по мере удаления ступени от основания выступа для формирования заданной толщины и рельефа уплотнительного слоя в отверстиях основы.
По крайней мере, один выступ оснастки может быть выполнен с количеством ступеней, равным 3, при этом его средняя ступень может быть выполнена в форме «звездочки» в поперечном сечении с обеспечением формирования соответствующего рельефа уплотнительного слоя формовочного материала в отверстии заготовки при заливке формовочного материала в оснастку; остальные ступени данного выступа и все ступени остальных выступов могут быть выполнены цилиндрической формы.
Оснастка может содержать патрубок, выполненный с возможностью соединения с отверстием для заливки формовочного материала.
Рельеф внутренней поверхности первой части оснастки может быть выполнен с возможностью формирования микрофлюидной системы, содержащей микрофлюидные элементы в виде, по крайней мере, одной клеточной ячейки для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, микронасоса для обеспечения движения питательной среды по микроканалам и технологического отверстия для доступа к питательной среде, объединенных микрожидкостными каналами с образованием, по крайней мере, одного замкнутого контура для циркуляции питательной среды.
Обе части оснастки могут быть снабжены крепежными элементами, обеспечивающими плотное соединение частей оснастки.
Технический результат достигается также тем, что способ получения заготовки микрофлюидного чипа, содержащей основу с размещенным на одной из ее сторон слоем формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии, с использованием предлагаемой оснастки, включает размещение основы заготовки микрофлюидного чипа в полости оснастки, заливку в оснастку формовочного материала с образованием слоя формовочного материала, по меньшей мере, в объеме между внутренней поверхностью первой части оснастки и поверхностью основы, с последующим центрифугированием оснастки, отверждением формовочного материала и извлечением полученной заготовки из оснастки со слоем затвердевшего формовочного материала с микрофлюидной системой заданной топологии.
При этом для центрифугирования оснастку с основой заготовки размещают с обеспечением перпендикулярности вектора ускорения поверхности слоя формовочного материала, а центрифугирование осуществляют со скоростью и в течение времени, обеспечивающих равномерное распределение формовочного материала в оснастке.
В качестве формовочного материала может быть использован газопроницаемый эластичный органический материал, например, полидиметилсилоксан.
В процессе заливки формовочного материала может быть осуществлено удаление его излишков из оснастки.
При заливке в оснастку формовочного материала может быть дополнительно сформирован уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем формовочного материала, содержащим микрофлюидную систему, при этом уплотнительный слой может быть сформирован в объеме между внутренней поверхностью второй части оснастки и поверхностью основы.
В качестве основы может быть использована пластина с отверстиями, а в качестве оснастки - оснастка, внутренняя поверхность второй части которой снабжена выступами, при этом основу размещают в полости таким образом, что отверстия в основе заготовки совпадают с выступами оснастки.
Дополнительно может быть сформирован уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы и, по меньшей мере, на части внутренней поверхности, по меньшей мере, части отверстий основы.
Перед центрифугированием может быть осуществлен нагрев оснастки, обеспечивающий снижение вязкости формовочного материала, а центрифугирование оснастки может быть осуществлено при скорости, обеспечивающей ускорение от 15g до 25g, где g - ускорение свободного падения, в течение 3-8 минут.
Отверждение формовочного материала может быть осуществлено путем выдерживания оснастки при температуре 70-90°C в течение не менее 40 минут и ее последующим охлаждением.
Перед размещением в оснастке могут быть осуществлены очистка и обезжиривание поверхности основы заготовки, а также обработка основы в плазменной установке с образованием химически активных групп на ее поверхности и последующей обработкой поверхности праймером для усиления адгезии со слоем формовочного материала.
Технический результат достигается также тем, что заготовка микрофлюидного чипа, полученная вышеописанным способом, содержит основу и размещенный на одной из ее сторон слой формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии.
При этом в качестве основы заготовки может быть использована пластина из поликарбоната или полистирола.
Заготовка может содержать уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем формовочного материала, содержащим микрофлюидную систему.
Основа заготовки со стороны, противоположной стороне со слоем формовочного материала с микрофлюидной системой, может быть снабжена бортиками, определяющими толщину слоя формовочного материала. При этом бортики могут быть расположены по периметру основы и снабжены выемками для заливки формовочного материала на поверхность основы, расположенными с противоположных сторон основы.
Основа может быть выполнена в виде пластины с, по меньшей мере, одним отверстием. При этом, по меньшей мере, часть внутренней поверхности отверстия основы может быть покрыта уплотнительным слоем из формовочного материала.
Оснастка может содержать уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы и, по меньшей мере, на части внутренней поверхности, по меньшей мере, части отверстий основы, образующий единую эластичную деталь.
По меньшей мере, часть отверстий в основе заготовки может быть выполнена ступенчатой формы в продольном сечении.
Заготовка может быть снабжена выемками, выполненными сквозными по всей толщине основы с одной из ее сторон, с возможностью подключения к чипу внешних измерительных модулей в процессе его эксплуатации.
Технический результат достигается также тем, что способ изготовления микрофлюидного чипа включает формирование вышеописанным способом заготовки микрофлюидного чипа, и последующую фиксацию на ее поверхности со стороны микрофлюидной системы пластины из оптически прозрачного материала с обеспечением герметизации микрофлюидной системы.
В качестве пластины из оптически прозрачного материала может быть использовано предметное стекло.
Перед фиксацией пластины из оптически прозрачного материала может быть осуществлена подготовка поверхностей заготовки и пластины посредством продувки воздухом с последующей их обработкой в плазменной установке с образованием химически активных групп на упомянутых поверхностях.
После фиксации пластины может быть осуществлено тестирование пропускной способности микрофлюидной системы чипа посредством ее заполнения водой.
Технический результат достигается также тем, что микрофлюидный чип, изготовленный вышеописанным способом, включает заявляемую заготовку, полученную предлагаемым способом, и пластину из оптически прозрачного материала, зафиксированную на поверхности основы заготовки со стороны микрофлюидной системы с обеспечением герметизации микрофлюидной системы.
Микрофлюидный чип может содержать уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем формовочного материала, содержащего микрофлюидную систему.
Основа заготовки чипа может быть снабжена отверстиями, расположение которых соответствует расположению микрофлюидных элементов, и выполненными сообщающимися с микрофлюидными элементами.
Микрофлюидный чип может содержать пробку, выполненную с возможностью герметизации отверстий основы заготовки.
Микрофлюидный чип может содержать уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы и, по меньшей мере, на части внутренней поверхности, по меньшей мере, части отверстий основы, образующий единую эластичную деталь.
Микрофлюидная система может содержать микрофлюидные элементы в виде, по крайней мере, одной клеточной ячейки для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, микронасоса для обеспечения движения питательной среды по микроканалам и технологического отверстия для доступа к питательной среде, объединенные микрожидкостными каналами с образованием, по крайней мере, одного замкнутого контура для циркуляции питательной среды. При этом микронасос может представлять собой рабочую камеру, ограниченную с двух сторон нормально закрытыми клапанами.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлено конструктивное решение одного из вариантов выполнения оснастки в сборе, общий вид, на фиг. 2 - вид сверху на оснастку, представленную на фиг. 1, на фиг. 3 - поперечный разрез оснастки по линии А-А на фиг. 2, на фиг. 4 - вариант выполнения основы заготовки чипа, общий вид, на фиг. 5 - вариант выполнения первой (нижней) части оснастки, общий вид, на фиг. 6 - вариант выполнения второй (верхней) части оснастки, общий вид, на фиг. 7 - общий вид варианта выполнения заготовки микрофлюидного чипа, на фиг. 8 - микрофлюидный чип, вид снизу, где представлен один из вариантов топологии микрофлюидной системы, на фиг. 9 - изображение верхней части оснастки, вид сверху, на фиг. 10 - детализированное изображение фрагмента фиг. 9 в поперечном разрезе по линии А-А, где представлен выступ для формирования клеточной ячейки, на фиг. 11 детализированное изображение фрагмента фиг. 9 в поперечном разрезе по линии Б-Б, где представлены выступы для формирования микронасоса, на фиг. 12 - детализированное изображение фрагмента фиг. 9 в поперечном разрезе по линии В-В, где представлен выступ для формирования лунки для смены среды, на фиг. 13 - вариант выполнения основы заготовки в виде пластины с отверстиями, вид сверху, на фиг. 14 - изображение фрагмента фиг. 13 в поперечном разрезе по линии А-А, где представлено отверстие, соответствующее клеточной ячейке, на фиг. 15 - изображение фрагмента фиг. 13 в поперечном разрезе по линии Б-Б, где представлены отверстия, соответствующие микронасосу, на фиг. 16 - изображение фрагмента фиг. 13 в поперечном разрезе по линии В-В, где представлено отверстие, соответствующее лунке для смены среды, на фиг. 17 - схема сборки оснастки для изготовления чипа, на фиг. 18 -схема фиксации стекла на заготовке чипа, на фиг. 19 - общий вид варианта выполнения микрофлюидного чипа, снабженного пробкой, где на местном разрезе представлен фрагмент, показывающий внутреннюю структуру чипа со слоями из формовочного материала на поверхностях основы заготовки и уплотнительным слоем в отверстии основы, на фиг. 20 - вариант выполнения микрофлюидного чипа, вид сверху, на фиг. 21 - поперечный разрез лунки для смены среды по линии А-А микрофлюидного чипа на фиг. 20, на фиг. 22 - поперечный разрез клеточных ячеек и микронасоса по линии Б-Б микрофлюидного чипа на фиг.20, на фиг. 23 - вариант выполнения пробки для герметизации отверстий микрофлюидного чипа, соответствующих клеточным ячейкам и лунке для смены среды, вид сверху, на фиг. 24 - вариант выполнения пробки для герметичной установки шприцов при тестировании микрофлюидного чипа, вид сверху, на фиг. 25 - вид сбоку на пробку, представленную на фиг. 23, с местным разрезом, показывающим углубление, выполненное в выступе пробки, на фиг. 26 - фото оснастки в сборе, установленной в роторе центрифуги, на фиг. 27 - фото оснастки в разобранном виде с заготовкой чипа, на фиг. 28 - фото варианта готового микрофлюидного чипа с окрашенной для наглядности микрофлюидной системой и уплотнительными элементами в отверстиях основы, на фиг.29 - фото процесса тестирования варианта готового микрофлюидного чипа с установленными на нем пробкой и двумя шприцами, на фиг. 30 - фото процесса тестирования готового микрофлюидного чипа в держателе (кейсе), на фиг. 31 - фото готового микрофлюидного чипа в держателе (кейсе) с подключенным модулем клапанной группы и подведенными к нему пневматическими трубками, на фиг. 32 - фото держателя (кейса) с установленным на нем модулем для измерения импеданса монослоя клеток.
Позициями на чертежах обозначены:
1 - оснастка в сборе;
2 - основа заготовки микрофлюидного чипа;
3 - заготовка микрофлюидного чипа;
4 - отверстие в основе заготовки;
5 - отверстие для заливки формовочного материала в оснастку;
6 - первая (нижняя) часть оснастки;
7 - вторая (верхняя) часть оснастки;
8 - полость в оснастке для размещения основы заготовки;
9 - микрофлюидная система чипа;
10 - слой формовочного материала с микрофлюидной системой;
11 - углубление первой части оснастки;
12 - углубление второй части оснастки;
13 - рельеф внутренней поверхности первой части оснастки;
14 - выступ в рельефе 13 для формирования микронасоса;
15 - выступ в рельефе 13 для формирования клеточной ячейки;
16 - выступ в рельефе 13 для формирования лунки для смены среды;
17 - выступ в рельефе 13 для формирования микроканала;
18 - группа выступов верхней части оснастки для формирования микронасоса (двух клапанов и рабочей камеры);
19 - выступ верхней части оснастки для формирования клеточной ячейки;
20 - выступ верхней части оснастки для формирования лунки для смены среды (технологического отверстия);
21 - отверстие для удаления излишков формовочного материала из оснастки;
22 - уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем 10;
23 - уплотнительный слой из формовочного материала, расположенный на, по крайней мере, части поверхности отверстий 4 основы заготовки;
24 - клеточная ячейка микрофлюидной системы;
25 - клапан микронасоса;
26 - рабочая камера микронасоса;
27 - лунка для смены среды микрофлюидной системы (технологическое отверстие);
28 - микроканал, соединяющий микрофлюидные элементы;
29 - отверстие в пластине заготовки чипа, соответствующее клеточной ячейке;
30 - отверстие в пластине заготовки чипа, соответствующее лунке для смены среды;
31 - отверстие в пластине заготовки чипа, соответствующее клапану микронасоса;
32 - отверстие в пластине заготовки чипа, соответствующее рабочей камере микронасоса;
33 - бортик для формирования уплотнительного слоя, расположенный по периметру основы заготовки;
34 - выемка в бортике основы для подачи формовочного материала на поверхность основы;
35 - выемка (паз) по краю основы заготовки, предназначенная для подключения измерительного модуля;
36 - первая ступень выступа верхней части оснастки, соответствующего клеточной ячейке (часть выступа 19 большего диаметра);
37 - вторая ступень выступа верхней части оснастки, соответствующего клеточной ячейке (часть выступа 19 меньшего диаметра);
38 - промежуточная ступень выступа верхней части оснастки, соответствующего клеточной ячейке, выполненная в форме «звездочки» в поперечном сечении;
39 - скосы на торцевой поверхности выступа, соответствующего клеточной ячейке, для формирования утолщений (усиленных «ушек») в слое формовочного материала для поддержки трансвелла;
40 - первая ступень группы выступов верхней части оснастки, соответствующих микронасосу (часть выступов 18 большего диаметра);
41 - вторая ступень группы выступов верхней части оснастки, соответствующих микронасосу (часть выступов 18 меньшего диаметра);
42 - первая ступень выступа верхней части оснастки, соответствующего лунке для смены среды (часть выступа 20 большего диаметра);
43 - вторая ступень выступа верхней части оснастки, соответствующего лунке для смены среды (часть выступа 20 меньшего диаметра);
44 - верхняя ступень отверстия основы, соответствующего клеточной ячейке (часть отверстия 29 большего диаметра);
45 - нижняя ступень отверстия основы, соответствующего клеточной ячейке (часть отверстия 29 меньшего диаметра);
46 - верхняя ступень отверстия основы, соответствующего микронасосу (часть отверстий 31, 32 большего диаметра);
47 - нижняя ступень отверстия основы, соответствующего микронасосу (часть отверстий 31, 32 меньшего диаметра);
48 - верхняя ступень отверстия основы, соответствующего лунке для смены среды (часть отверстия 30 большего диаметра);
49 - нижняя ступень отверстия основы, соответствующего лунке для смены среды (часть отверстия 30 меньшего диаметра);
50 - уплотнительный слой формовочного материала в отверстии заготовки в форме «звездочки»;
51 - пробка для герметизации отверстий заготовки чипа;
52 - отверстие, предназначенное для соединения верхней и нижней частей оснастки;
53 - область контакта верхней и нижней частей оснастки при их соединении;
54 - винт с гайкой для соединения частей оснастки;
55 - воронка для заливки формовочного материала в оснастку;
56 - отверстие в верхней части оснастки, предназначенное для крепления воронки;
57 - рамка для установки воронки;
58 - винт для крепления рамки на поверхности оснастки;
59 - фаска, выполненная в отверстии для заливки формовочного материала;
60 - трубка для удаления излишков формовочного материала из оснастки;
61 - паз, предназначенный для удобства разъединения верхней и нижней частей при разборке оснастки;
62 - паз, предназначенный для удобства извлечения заготовки чипа из оснастки;
63 - паз, предназначенный для удобства установки основы заготовки чипа в оснастку;
64 - выступ для дополнительного уплотнения основы 2 при отливке;
65 - выступ (островок) на внутренней поверхности нижней части оснастки, предназначенный для формирования воздушной прослойки в слое формовочного материала;
66 - центрифуга;
67 - оптически прозрачная пластина, герметизирующая микрофлюидную систему;
68 - верхняя часть приспособления для фиксации стекла на поверхности заготовки чипа;
69 - нижняя часть приспособления для фиксации стекла на поверхности заготовки чипа;
70 - пробка для заливки жидкости в процессе тестирования чипа;
72 - выступ пробки для герметизации отверстий заготовки чипа;
73 - зубцы, расположенные на выступе пробки для ее фиксации и центрирования в отверстиях заготовки чипа;
74 - держатель (кейс) для микрофлюидного чипа;
75 - модуль подачи воздуха к микронасосу;
76 - модуль измерения сопротивления монослоя клеток.
Осуществление изобретения
Терминам и выражениям, используемым в настоящей заявке, придают следующие значения.
«Микрофлюидная система» - набор микрофлюидных элементов, объединенных системой микроканалов.
«Микрофлюидный элемент» - составная часть микрофлюидного контура, реализующая определенную функцию, например, соединительный канал, клапан, клеточная ячейка, технологическое отверстие и т.д. При этом микрофлюидные элементы характеризуются объемами порядка микро-, нано- и пиколитров.
«Микрофлюидный чип» - структура, содержащая основу в виде пластины с отверстиями, на одной стороне которой размещен слой затвердевшего формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии, герметизированной нижним слоем в виде оптически прозрачной пластины.
«Заготовка микрофлюидного чипа» - часть микрофлюидного чипа, содержащая основу в виде пластины с отверстиями и размещенным на одной из ее сторон слоем затвердевшего формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии.
«Основа заготовки микрофлюидного чипа» - часть микрофлюидного чипа в виде пластины, служащая твердым основанием для размещения на нем слоя формовочного материала с микрофлюидной системой.
«Оснастка» - деталь для производства заготовки микрофлюидного чипа, содержащая две части, одна из которых предназначена для формирования топологии микрофлюидной системы (мастер-шаблон), а другая - для размещения основы заготовки чипа (форма для отливки), при этом в литературе могут встречаться и другие названия детали, например, контейнер, форма, равно как и другие названия частей, составляющих оснастку.
Остальным терминам и выражениям придается обычное для своего контекста значение, известное специалистам в данной сфере. Однако настоящее изобретение не следует ограничивать выбранной специальной терминологией. Специалисты в соответствующей области должны понимать, что можно использовать и другие термины, равно как и другие известные из уровня техники средства и методы для реализации изобретения.
Ниже представлено более детальное описание заявляемой группы изобретений.
Оснастка для формирования заготовки микрофлюидного чипа (слоя формовочного материала с микрофлюидной системой заданной топологии на поверхности основы).
Заявляемая оснастка 1 (фиг. 1-3) предназначена для формирования микрофлюидной системы в слое формовочного материала на одной из сторон основы 2 заготовки микрофлюидного чипа. При этом микрофлюидная система может быть выполнена с произвольной топологией - проточной, замкнутой, одноконтурной, многоконтурной, кроме того микрофлюидная система может содержать одну или несколько ячеек для культивирования различных клеточных моделей. Оснастку 1 и основу 2, размещаемую в оснастке в процессе получения заготовки 3 микрофлюидного чипа, изготавливают в соответствии с дизайном микрофлюидного чипа и топологией его микрофлюидной системы. При этом основа 2 представляет собой пластину из твердого полимера, которая может быть выполнена различной формы и размеров (определяемых назначением чипа и топологией его микрофлюидной системы), а также может быть снабжена отверстиями 4 (в частном случае может быть только одно отверстие), соответствующими элементам микрофлюидной системы (фиг. 4). Одновременно со слоем формовочного материала с микрофлюидной системой, с помощью предлагаемой оснастки может быть сформирован уплотнительный слой на стороне основы заготовки, противоположной стороне с микрофлюидной системой, а также уплотнительный слой, расположенный, по крайней мере, на части поверхности отверстий 4 основы 2.
В частном варианте конструктивное решение оснастки в собранном виде представлено на фиг. 1-3, конструктивное решение отдельных частей оснастки представлено на фиг. 5, 6 и 9.
В общем виде оснастка 1 для изготовления заготовки микрофлюидного чипа представляет собой объемную деталь (фиг. 1-3), преимущественно, металлическую, снабженную, по меньшей мере, одним отверстием 5 для заливки формовочного материала. При этом одна из частей оснастки является мастер-шаблоном, далее - первая (нижняя) часть 6, и предназначена для формирования заданной структуры микрофлюидной системы на поверхности слоя формовочного материала при его заливке в оснастку (фиг. 5), а другая - формой, далее - вторая (верхняя) часть 7, и предназначена для размещения основы 2 заготовки микрофлюидного чипа (фиг. 6). Части 6 и 7 выполнены с возможностью соединения между собой с образованием единой детали, снабженной полостью 8 для размещения основы 2 заготовки, а также с возможностью формирования по меньшей мере на одной из сторон основы 2 микрофлюидной системы 9 в слое 10 формовочного материала (фиг. 7, 8). Для этого в частях 6 и 7 со стороны их внутренних поверхностей могут быть выполнены углубления 11 и 12, соответственно, которые обеспечивают образование полости 8 при соединении частей оснастки (фиг. 5, 6). При этом размеры углубления 11 первой части оснастки могут быть выполнены соответствующими размерам слоя 10 формовочного материала с микрофлюидной системой, а размеры углубления 12 второй части - соответствующими размерам основы 2 формируемой заготовки 3 чипа.
Внутренняя поверхность первой 6 части оснастки содержит рельеф 13 (фиг. 5), который в результате отливки на нем слоя формовочного материала формирует структуру микрофлюидной системы 9, в т.ч. траекторию транспорта питательной среды в чипе (фиг. 8). В частном варианте выполнения изобретения, рельеф 13 может содержать выступы 14 для формирования микронасоса (соответствующие клапанам и рабочей камере микронасоса), по меньшей мере, по одному выступу 15, 16 для формирования клеточной ячейки и лунки для смены среды чипа, соответственно, и, по меньшей мере, один выступ 17 для формирования микроканала, соединяющего микрофлюидные элементы.
Внутренняя поверхность второй 7 части оснастки может быть снабжена группой выступов 18, 19, 20 (спейсеров, фиг. 6), расположение которых соответствует расположению отверстий 4 в основе 2 и соответствует топологии микрофлюидной системы 9. При этом выступы и отверстия могут иметь различные размеры и форму, обеспечивающие при центрировании выступа в отверстии 4 основы, образование зазора между поверхностью выступа и внутренней поверхностью отверстия, который в процессе эксплуатации оснастки заполняется формовочным материалом, формирующим уплотнительный слой 23.
Оснастка 1 также может быть снабжена, по меньшей мере, одним отверстием 21 для удаления излишков формовочного материала. При этом отверстия 5 и 21 могут быть расположены в одной из частей оснасти, предпочтительно во второй части 7, и выполнены сообщающимися с углублением 12 в верхней части оснастки (фиг. 6), что обеспечивает в технологическом процессе равномерное распределение формовочного материала по поверхности основы заготовки. В частном варианте осуществления изобретения отверстия 5, 21 могут быть расположены с противоположных сторон оснастки за пределами зоны формирования микрофлюидной системы (например, на противолежащих коротких сторонах оснастки) (фиг. 9). В другом варианте выполнения изобретения отверстия могут быть расположены вдоль одной из сторон верхней части оснастки. Возможны и другие варианты расположения отверстий, обеспечивающие равномерное распределение формовочного материала в оснастке, а также возможно выполнение в оснастке нескольких отверстий, как для заливки, так и для удаления излишков формовочного материала.
В качестве формовочного материала при отливке заготовки 3 чипа могут быть использованы эластичные термопласты или реактопласты, например, силоксаны, полиуретаны, полимеры OSTE+. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве формовочного материала используют газопроницаемый эластичный органический материал - полидиметилсилоксан (ПДМС).
Заявляемая оснастка 1 может обеспечивать выполнение заготовки 3 чипа, позволяющей подключать к нему различные средства коммуникаций, измерений и управления, например, системы подачи воздуха, модуля измерения импеданса клеток и др.
Использование оснастки для формирования уплотнительных слоев и слоя формовочного материала с микрофлюидной системой на поверхности основы заготовки.
С использованием заявляемой оснастки 1 может быть изготовлена заготовка 3 чипа, содержащая уплотнительный слой 22 формовочного материала, расположенный на поверхности основы 2 заготовки, противоположной поверхности со слоем 10 формовочного материала с микрофлюидной системой 9, а также уплотнительный слой 23, расположенный, по крайней мере, на части внутренних поверхностей отверстий 4 в пластине основы (фиг. 7).
При заливке формовочного материала в оснастку 1 выступы верхней части оснастки, с одной стороны, могут обеспечивать формирование уплотнительного слоя 23 формовочного материала, по крайней мере, на части внутренних поверхностей отверстий 4 в пластине основы 2, а с другой - ограничивать толщину слоя 10 формовочного материала в области, по крайней мере, части элементов формируемой микрофлюидной системы. При этом поперечные размеры выступов 18-20 определяют толщину уплотнительного слоя 23 на внутренней поверхности отверстий 4 основы, а их длина обеспечивает требуемую толщину слоя 10 формовочного материала в местах расположения, по меньшей мере, части элементов микрофлюидной системы 9. При этом возможны варианты выполнения оснастки, при которых выступы 18-20 оснастки, по крайней мере, частично соприкасаются с внутренней поверхностью отверстий 4 в пластине основы 2 и/или с поверхностью рельефа 13 оснастки, определяющего топологию микрофлюидной системы. В этом случае в местах контакта выступов с внутренней поверхностью отверстий не образуется уплотнительный слой, а в местах контакта выступов с рельефом 13 оснастки, соответствующие микрофлюидные элементы формируются сообщающимися с отверстиями 4 в пластине основы 2.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения уплотнительные слои 22, 23, сформированные при заливке формовочного материала в оснастку на поверхности пластины основы 2 и на внутренних поверхностях отверстий 4 пластины основы, соответственно, выполнены в виде единой эластичной детали.
При этом уплотнительный слой 22 на поверхности основы 2 заготовки может служить, например, для герметичного подключения системы подачи воздуха к чипу и/или уплотнения размещаемых в отверстиях заготовки крышек или пробок (фиг. 19), что позволяет заменить множество отдельных уплотнительных деталей, например, уплотнительных колец. Сформированные в процессе изготовления заготовки уплотнения 23 внутри отверстий 4 могут обеспечивать, в частности, исключение образования пузырей воздуха при погружении в них клеточных вставок (трансвеллов).
Слой 10 затвердевшего формовочного материала с микрофлюидной системой, сформированный на основе 2 заготовки, может иметь толщину, например, от 0,1 до 5 мм, при этом в местах расположения таких элементов, как клапаны, толщина слоя может лежать в диапазоне от 0,05 до 1 мм (толщина мембран клапанов или рабочей камеры). Размер микрофлюидных каналов (высота) может составлять от 0,1 до 2 мм. Толщина уплотнительного слоя 22 на поверхности основы заготовки (со стороны, противоположной расположению микрофлюидной системы) может составлять от 0,5 до 10 мм. Толщина уплотнительного слоя 23 внутри отверстий может составлять от 0,1 до 1 мм. При этом толщина основы 2 заготовки может варьироваться от 2 до 16 мм.
Варианты структуры микрофлюидной системы, формируемой в оснастке.
Микрофлюидная система 9 (фиг. 8), формируемая на поверхности заготовки 3 чипа, может представлять собой набор различных микрофлюидных элементов (например, 24-27), назначение которых определяется в зависимости от целей использования чипа. Микрофлюидные элементы объединены системой микрожидкостных каналов 28 (микроканалов). В качестве микрофлюидных элементов могут выступать, например, клеточные ячейки 24 для культивирования клеточных моделей, различные клапаны 25 и рабочие камеры 26 (мембраны), обеспечивающие движение питательной среды по микроканалам, а также обеспечивающие гашение скачков давления и скорости движения питательной среды (демпфирующие элементы), технологические отверстия 27 (лунки) для доступа к питательной среде чипа. При этом клапаны могут быть выполнены с возможностью уменьшения просвета микрофлюидного канала вплоть до его герметичного перекрытия, или могут обеспечивать «отключение» ответвления микрофлюидного канала.
В одном из вариантов, формируемая микрофлюидная система 9 (фиг. 8) может содержать рабочую камеру 24 с мембраной, выполненной с возможностью изменения объема рабочей камеры, которая в совокупности с подключенными к ней клапанами 25, может реализовывать функцию насоса-маршрутизатора (микронасоса), обеспечивающего перекачивание жидкостей в заданном направлении между любой парой клапанов.
В частности, микрофлюидная система может содержать несколько (от 1 до 5) клеточных ячеек и микронасос, объединенные микроканалами, образующими как минимум, один контур для циркуляции питательной среды. При этом в различных ячейках могут располагаться различные модели, например, на основе различных линий клеток. Данный вариант позволяет бесконтактно сокультивировать до 5 типов клеток.
В другом варианте выполнения микрофлюидная система может содержать микронасос, две клеточные ячейки, демпфирующий элемент и технологическое отверстие, объединенные микрожидкостными каналами с образованием замкнутого контура для циркуляции питательной среды. Использование чипа с данной структурой микрофлюидных элементов позволяет осуществлять бесконтактное сокультивирование, а также комплексное моделирования этапов метастазирования, как на стороне первичной опухоли, так и на стороне метастаза.
Система микрофлюидных каналов может иметь более одного контура циркуляции.
Предлагаемая оснастка позволяет формировать заготовку и с другими топологиями микрофлюидной системы 9. При этом, для другой микрофлюидной системы выбирают нижнюю часть 6 оснастки с соответствующим микрорельефом и верхнюю часть 7 оснастки с соответствующими размерами и расположением выступов. В частности, конструктивные решения микрофлюидной системы могут быть выполнены по аналогии с описанными в патентах РФ №№2612904, 171690, 2584598.
В зависимости от требуемой структуры микрофлюидной системы осуществляют подготовку основы 2 заготовки чипа и частей 6, 7 оснастки, обеспечивающих получение данной микрофлюидной структуры.
Ниже представлены возможные варианты выполнения основы заготовки микрофлюидного чипа, а также отдельных конструктивных элементов оснастки для получения заготовки.
Предлагаемая группа изобретений может быть воплощена во многих различных формах, и не должна рассматриваться как ограниченная вариантами осуществления, изложенными в материалах заявки. Данные варианты осуществления представлены для того, чтобы раскрытие изобретения было полным и завершенным и в полной мере передавало объем изобретения для специалистов в данной области техники.
Варианты решения основы заготовки микрофлюидного чипа.
Основа 2 заготовки чипа, размещаемая в верхней части 7 оснастки, представляет собой пластину (фиг. 4), преимущественно выполненную фрезерованием из оптически прозрачного материала, например, из листа полистирола или поликарбоната, и обеспечивающую жесткость и прочность конструкции микрофлюидного чипа. Возможны и другие известные из уровня техники варианты изготовления основы заготовки - например, литьем или штамповкой.
Размеры и форма пластины определяются топологией и составом микрофлюидной системы. Пластина может быть снабжена отверстиями 4, количество и расположение которых соответствует количеству и расположению микрофлюидных элементов микрофлюидной системы 9 чипа. При этом отверстия 4 в пластине могут быть выполнены различной геометрической формы, например, цилиндрической или представлять собой усеченный конус, прямоугольник, и могут быть выточены посредством фрезерного станка с ЧПУ. Возможно также использование пластины без отверстий - например, в случае формирования проточной микрофлюидной системы в слое формовочного материала на поверхности основы.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве основы 2 заготовки используют пластину с отверстиями, выполненную прямоугольной формы и размерами, соответствующими размеру стандартного предметного стекла по ГОСТ 9284-75 «Межгосударственный стандарт стекла предметные для микропрепаратов», например, размером 26×76 мм, что обеспечивает оптимальное расположение на пластине по меньшей мере, пяти отверстий, соответствующих микрофлюидным элементам, объединенным по меньшей мере, одним контуром циркуляции, а также обеспечивает возможность проведения исследований методами оптической микроскопии. При этом часть отверстий пластины могут быть предназначены для ячеек, по крайней мере, одно отверстие может являться технологическими и служить для замены среды в ячейках, другая часть отверстий может быть предназначена для клапанов и рабочих камер микронасосов и служить для подключения, например, систем подачи воздуха к микронасосам. Кроме того, пластина может содержать отверстия, предназначенные для подключения к чипу различных датчиков и измерительных приборов.
В частности, отверстие для ячейки может быть выполнено с возможностью герметичного размещения в нем клеточной вставки (например, мембранной вставки Transwell), частично или полностью заполненной моделью (слоем клеток, фрагментом ткани, скаффолдом с клетками и т.д.).
В одном из вариантов, для формирования микрофлюидной системы 9, представленной на фиг.8 и предназначенной для сокультивирования нескольких различных моделей, например, на основе различных линий клеток, объединенных одним контуром циркуляции, основа 2 заготовки может представлять собой пластину с, по крайней мере, шестью отверстиями 4 (фиг. 4), по меньшей мере, два из которых (отверстия 29) соответствуют клеточным ячейкам 24 чипа, одно является технологическим (отверстие 30) и соответствует лунке 27 для смены среды, и, по меньшей мере, три отверстия, выполненные меньшего диаметра (отверстия 31, 32), служат для подключения системы подачи воздуха к микронасосу (соответствуют клапанам 25 и рабочей камере 26 микронасоса). При этом малые отверстия 31, 32 могут быть сгруппированы в ряд вдоль одной из длинных сторон пластины (основы 2) симметрично поперечной центральной оси пластины, а большие отверстия 29, 30 - могут быть расположены вдоль другой длинной стороны пластины симметрично этой же оси. Расположение отверстий в основе 2, как правило, продиктовано технологичностью эксплуатации чипа и удобством подключения внешних элементов.
Одна из сторон основы 2 заготовки, противоположная стороне со слоем 10 формовочного материала с микрофлюидной системой, может быть выполнена с бортиком 33 (фиг. 4), расположенным по периметру основы, и обеспечивающим формирование на ней уплотнительного слоя 22 (фиг. 7) из формовочного материала при заливке его в оснастку, при этом высота бортика соответствует толщине формируемого уплотнительного слоя. При этом бортик может быть образован выступающей частью основы 2 и снабжен, по меньшей мере, одной выемкой 34, обеспечивающей подачу формовочного материала для формирования уплотнительного слоя на поверхности пластины. В частном варианте, в бортике 33 может быть выполнено две выемки, расположенными предпочтительно друг напротив друга, каждая в средней части короткой стороны пластины основы 2 (фиг. 4).
Основа 2 заготовки может быть также снабжена выемками 35, обеспечивающими подключение к чипу измерительных модулей. На фиг. 4, 7 представлен вариант выполнения пластины с двумя выемками, расположенными с ее длинной стороны, для подключения измерительного модуля, например, устройства измерения сопротивления монослоя клеток. При этом выемки 35 выполнены сквозными по всей толщине пластины в форме прямоугольника со скругленными углами (сквиркла) в проекции на плоскость стороны пластины с уплотнительным слоем. Данные размер и форма выемок выбраны в соответствии с размерами и формами подключаемого модуля для измерения сопротивления клеток.
Варианты решения выступов верхней части оснастки и отверстий в основе заготовки чипа.
В частном варианте конструктивные решения выступов верхней 7 части оснастки и отверстий 4 основы 2 заготовки представлены на фиг. 9-12 и фиг. 13-16, соответственно.
В одном из вариантов, по меньшей мере, часть выступов верхней части 7 оснастки может быть выполнена в виде стержней ступенчатого продольного сечения. При этом поперечные размеры ступеней выполнены с уменьшением по мере удаления ступени от основания выступа для формирования заданной толщины и рельефа уплотнительного слоя в отверстиях основы (фиг. 10-12).
Возможен вариант, при котором, по крайней мере, часть выступов, соответствующих клеточным ячейкам (выступы 19), выполнена по меньшей мере с тремя ступенями 36, 37, 38 (фиг. 10), при этом средняя (промежуточная) ступень 38 каждого выступа 19 может быть выполнена сложной формы, например, в форме «звездочки» в поперечном сечении (фиг. 9), обеспечивающей формирование соответствующего рельефа уплотнительного слоя формовочного материала в отверстии 29 заготовки при заливке формовочного материала в оснастку, что позволяет исключить образование пузырьков воздуха при погружении клеточной вставки в данное отверстие. Остальные ступени 36, 37 данного выступа 19 и все ступени остальных выступов 18, 20 могут быть выполнены цилиндрической формы.
На торцах выступов 19 верхней части 7 оснастки могут быть выполнены дополнительные скосы 39 для формирования утолщений в слое формовочного материала для поддержки трансвелла (фиг. 9).
В частном варианте выполнения отверстия 29, 30, 31, 32 в основе 2 заготовки также могут быть выполнены ступенчатой формы в продольном сечении (фиг. 14-16), что обеспечивает в процессе отливки формирование уплотнительного слоя 23 на внутренней поверхности отверстий в основе (фиг. 7, 21, 22). На фиг. 14-16 представлены местные поперечные сечения пластины, изображенной на фиг. 13, где видна форма отверстий 29 под клеточную ячейку (фиг. 14), форма отверстий 31, 32 под клапаны и рабочую камеру микронасоса (фиг. 15) и форма отверстия 30 под лунку для смены среды (фиг. 16).
Отверстия 31, 32 сечение которых представлено на фиг. 15, выполнены с двумя ступенями 46, 47, причем в части отверстий, соответствующей верхней ступени 46, возможно размещение подводящих коммуникаций (например, пневматических трубок, обеспечивающих управление микронасосами пневматически через управляющие выходы путем формирования на выходах давления, пониженного или повышенного относительно атмосферного). Поперечный размер верхней ступени 46 отверстий незначительно (например, на 0,5-4 мм) превышает поперечный размер ступени 40 выступов 18 (ступени, ближней к внутренней поверхности соответствующей части оснастки), а глубина части отверстий 31, 32, соответствующей верхней ступени 46 отверстий превышает длину ступени 40 выступов 18 (например, на 0,5-10 мм). Сечение данных выступов представлено на фиг. 11. При заливке формовочного материала на поверхности верхней ступени 46 отверстий 31, 32 из него формируется уплотнительный слой 23 толщиной, равной разности диаметра части отверстий, соответствующей верхней ступени 46 и диаметра части выступов 18, соответствующей первой ступени 40, а также разности глубины верхней ступени 46 отверстий и длины первой ступени 40 выступов (фиг. 22). Нижняя ступень 47 отверстий 31, 32 выполнена меньшего диаметра и соответствует диаметру ступени 41 выступов 18, дальней от внутренней поверхности соответствующей части оснастки (вторая ступень 41). Длина второй ступени 41 выступов 18 выбрана такой, что расстояние от вершины выступа до поверхности рельефа 13, соответствующего топологии микрофлюидной системы при соединении обеих частей оснастки, обеспечивает формирование участка слоя формовочного материала с толщиной, необходимой для использования данного участка в качестве клапана и/или рабочей камеры насоса микрофлюидной системы.
Отверстие 30, сечение которого представлено на фиг. 15, также выполнено с двумя ступенями (48, 49), но верхняя ступень 48 предназначена для обеспечения доступа к лунке микрофлюидного чипа. Ее диаметр (диаметр части отверстия 30, соответствующей ступени 48) также незначительно (например, на 3-3,5 мм) превышает диаметр первой ступени 42 соответствующего выступа 20 (ступени, ближней к внутренней поверхности соответствующей части оснастки), а глубина верхней ступени 48 отверстия превышает длину первой ступени 42 выступа 20 (например, на 6-6,5 мм). Сечение данного выступа представлено на фиг. 12. При заливке формовочного материала из него на поверхности верхней ступени 48 отверстия 30 формируется уплотнительный слой 23 толщиной, равной разности диаметра верхней ступени 48 отверстия (диаметра части отверстия, соответствующей верхней ступени 48) и диаметра первой ступени 42 выступа 20, а также разности глубины верхней ступени 48 отверстия и длины первой ступени 42 выступа 20 (фиг. 21). Нижняя ступень 49 отверстия 30 выполнена меньшего диаметра и соответствует диаметру второй ступени 43 выступа 20 (ступени, дальней от внутренней поверхности соответствующей части оснастки). Длина второй ступени 43 выступа 20 выбрана такой, что при соединении обеих частей оснастки, данный выступ 20 упирается в определяющий топологию микрофлюидной системы рельеф 13 на внутренней поверхности противоположной части оснастки. Это обеспечивает возможность использования данного участка готовой микрофлюидной системы в качестве лунки.
На фиг. 10 представлено сечение выступа 19 верхней части оснастки, соответствующего клеточной ячейке чипа и характеризующегося наличием третьей, промежуточной ступени 38. В поперечном сечении промежуточная ступень 38 этого выступа выполнена в виде «звездочки» (например, упрощенной октограммы). Использование промежуточной ступени позволяет получить соответствующий рельеф уплотнительного слоя 50 на внутренней поверхности соответствующего отверстия 29 в основе 2 заготовки (фиг. 20, 22). Данное отверстие также может использоваться для доступа к лунке микрофлюидного чипа и иметь форму сечения, аналогичную отверстию 30 основы (фиг. 14). При этом верхняя ступень 44 данного отверстия может быть предназначена для размещения в отверстии 29 пробки 51, герметизирующей микрофлюидный контур (фиг. 19), а сформированный рельеф уплотнительного слоя 50 обеспечивает наиболее плотное примыкание и исключение образования пузыря при погружении клеточной вставки в рабочий чип.
Варианты выполнения элементов оснастки.
Ниже представлены конструктивные решения элементов оснастки, содержащих различные варианты выполнения пазов, отверстий, выступов, крепежных и других отдельных элементов оснастки, обеспечивающих технологичность и удобство ее эксплуатации.
Для неподвижной фиксации частей 6 и 7 оснастки друг относительно друга при их соединении, обе части могут быть снабжены соосно расположенными отверстиями 52 с резьбой, расположенными в области контакта 53 верхней и нижней частей оснастки, по ее периметру, и предназначенными для размещения в них соединительных элементов (фиг. 9), например, в виде винтов с гайками 54. Возможно также выполнение соединения верхней и нижней частей оснастки альтернативными методами, например, с помощью фиксаторов, защелок, петель и магнитных соединений. При этом первая 6 и вторая 7 части оснастки могут быть выполнены из алюминия (например, сплавы Д16, АМГ), композиционного материала или любого другого материала, обеспечивающего прочный заливочный каркас.
Оснастка 1 также может содержать крепежные элементы для установки в отверстие 5 емкости (патрубка) для заливки формовочного материала, например, выполненного в виде воронки 55 или любого другого приспособления, позволяющего обеспечить подачу материала в оснастку.
В одном из вариантов, верхняя часть 7 оснастки снабжена, по крайней мере, двумя дополнительными отверстиями 56 с резьбой для закрепления воронки 55 в отверстии 5 посредством, например, рамки 57, удерживающей верхнюю часть воронки. При этом рамка 57 может быть размещена по периметру верхней стороны воронки и закреплена на верхней части 7 оснастки посредством винтов 58, закручивающихся в дополнительные отверстия 56, прижимая воронку 55 к верхней части 7 оснастки (фиг. 17). Отверстия 56 могут быть расположены по краям оснастки симметрично относительно отверстия 5 (фиг. 9). Рамка 57 может быть выполнена, например, из алюминия, стали или любых твердых пластиков.
Отверстие 5 для заливки формовочного материала в оснастку может быть выполнено с глубокой фаской 59 по периметру, обеспечивающей дополнительную герметичность (фиг. 17).
В отверстие 21 оснастки может быть установлена трубка 60 (фиг. 1-3), например, выполненная из полиуретана, обеспечивающая слив излишков формовочного материала из оснастки. При этом трубку устанавливают в отверстие таким образом, что один ее конец выступает снаружи оснастки, а другой находится вровень с дном углубления 12 в верхней части 7 оснастки.
Область контакта 53 верхней и нижней частей оснастки при их соединении может содержать различные пазы, предназначенные для удобства эксплуатации оснастки в процессе изготовления чипа. В одном из частных вариантов, верхняя часть 7 оснастки с внешней стороны может содержать угловые пазы 61 (фиг. 6, 9), предназначенные для удобства разъединения частей оснастки. Со стороны углубления 12 в верхней части оснастки по его короткой стороне могут быть выполнены пазы 62, предназначенные для удобства извлечения заготовки, а со стороны углубления по его длинной стороне - пазы 63, предназначенные для удобства размещения основы 2 заготовки в углубление 12 верхней части оснастки.
Вдоль длинной стороны углубления 12 верхней части 7 оснастки может быть выполнен выступ 64 (фиг. 9), который обеспечивает, при размещении основы 2 заготовки микрофлюидного чипа в полости оснастки, плотное примыкание бортика 33 основы 2 к поверхности верхней части 7 оснастки, не допускающее вытекание формовочного материала через бортики при его заливке в оснастку.
Поверхности оснастки, контактирующие со слоем формовочного материала, могут быть выполнены шероховатыми, в частности, внутренняя поверхность нижней части 6 оснастки может быть выполнена шероховатой, что обеспечивает повышенные адгезионные свойства поверхности слоя формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой. Кроме того, на внутренней поверхности нижней части оснастки может быть выполнен по меньшей мере, один выступ («островок» или часть поверхности) 65, предназначенный для формирования воздушной прослойки (воздушного канала) в слое формовочного материала, для лучшего распределения нагрузки при приклеивании к заготовке оптически прозрачной пластины, герметизирующей микрофлюидную систему, в процессе изготовления чипа. Преимущественно, данный выступ 65 располагают в центральной части внутренней поверхности нижней части 6 оснастки симметрично относительно ее центра (фиг. 5), при этом не затрагивая микрофлюидную систему (на допустимом расстоянии от микрофлюидных элементов не менее 0,5 мм и не более 3 мм). Поверхность «островка» также может быть выполнена шероховатой.
Способ изготовления заготовки и заготовка микрофлюидного чипа.
Предварительно осуществляют подготовку основы 2 заготовки чипа, для чего, например, в пластине из оптически прозрачного материала, предпочтительно, полистирола, посредством, например, фрезерного станка вытачивают (при необходимости) отверстия 4 в местах, соответствующих расположению микрофлюидных элементов чипа, формируют форму пластины и изготавливают пазы и выемки (например, выемки 34, 35).
Заготовку 3 микрофлюидного чипа изготавливают посредством отливки слоя формовочного материала на поверхности подготовленной пластины с использованием оснастки 1, описанной выше. В качестве формовочного материала преимущественно используют полидиметилсилоксан (ПДМС).
Для осуществления способа пластину основы 2 заготовки микрофлюидного чипа размещают в полости 8 оснастки и осуществляют заливку в отверстие 5 оснастки формовочного материала с образованием слоя формовочного материала 10, по меньшей мере, в объеме между внутренней поверхностью первой части 6 оснастки и поверхностью основы 2.
При этом в одном из частных вариантов, при использовании в качестве основы 2- пластины с отверстиями, а в качестве оснастки - оснастки, внутренняя поверхность второй части которой снабжена выступами, пластину 2 размещают в углублении 12 верхней части 7 оснастки таким образом, что отверстия 29, 30 совпадают с выступами 19, 20 верхней части 7 оснастки, а отверстия 31, 32 - с группой выступов 18, соответственно. Части оснастки 6 и 7 соединяют крепежными элементами, например, винтами 54 (фиг. 17). Заливку формовочного материала в отверстие 5 осуществляют, например, с помощью воронки 55, при этом объем заливаемого материала может превышать объем, необходимый для заполнения полости оснастки, например, на 3-5 мл. В этом случае излишки формовочного материала удаляют из отверстия 21, например, с помощью трубки 60.
Затем осуществляют центрифугирование оснастки, при этом оснастку размещают в центрифуге 66 (фиг. 26) горизонтально, в плоскости ее вращения, что позволяет получить одинаковые давления во всех точках отливки (слоя формовочного материала), и, как следствие, одинаковую плотность формовочного материала. Обработку в центрифуге проводят при скорости и в течение времени, обеспечивающих удаление пузырьков воздуха из формовочного материала и его равномерное распределение в оснастке (без образования наплывов при формировании слоя формовочного материала). В одном из частных вариантов осуществления изобретения, обработку проводят при скорости, обеспечивающей ускорение в 15-25g, где g-ускорение свободного падения, в течение 3-8 минут. После центрифугирования осуществляют отверждение формовочного материала, например, путем выдерживания оснастки в термошкафу (при температуре и в течение времени, обеспечивающих отверждение формовочного материала). В частном варианте, температура в термошкафу может достигать 70-90°C, при этом оснастку выдерживают при данной температуре не менее 40 минут. Затем оснастку извлекают из термошкафа, остужают, после чего осуществляют ее разборку и извлечение заготовки чипа.
В одном из вариантов, перед центрифугированием оснастки, осуществляют ее нагрев, обеспечивающий снижение вязкости формовочного материала. Например, оснастку разогревают в термошкафу до температуры 50°C.
В другом частном варианте, перед размещением в оснастке, осуществляют очистку и обезжиривание поверхности основы заготовки, обработку основы в плазменной установке с образованием химически активных групп на ее поверхности (активация поверхности заготовки) с последующей обработкой поверхности праймером. При этом активация поверхности основы заготовки в плазменной установке может быть осуществлена, например, по методике, описанной в публикации Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices, Jinwen Zhou, Amanda Vera Ellis, Nicolas Hans Voelcker, Electrophoresis, vol. 31, no. 1 (2010), pp. 2-16.
Заготовка 3 чипа, извлеченная из оснастки, представляет собой пластину 2, на одной из сторон которой расположен отвержденный слой 10 формовочного материала с микрофлюидной системой со стороны нижней поверхности слоя.
В частном варианте, при использовании пластины 2 с бортиками 33, расположенными по периметру основы со стороны верхней части оснастки, в процессе заливки и отверждения формовочного материала по вышеописанной технологии, заготовка чипа может представлять собой заготовку 3 с микрофлюидной системой с одной ее стороны, выполненной в слое затвердевшего формовочного слоя 10, и уплотнительным слоем 22 - с противоположной стороны, представляющим собой слой затвердевшего формовочного материала. В зависимости от формы отверстий в пластине и формы выступов, отверстия сформированной заготовки также могут содержать уплотнительный слой 23 из формовочного материала (фиг. 7).
В предпочтительном варианте, при изготовлении заготовки с уплотнительными слоями, осуществляют их формирование в виде единой, монолитной эластичной детали, объединяющей уплотнительные слои 22, 23, сформированные на поверхности пластины 2 со стороны верхней части 7 оснастки и на внутренних поверхностях отверстий 4 пластины основы 2, соответственно.
При этом в процессе заливки формовочного материала в оснастку осуществляется постепенное заполнение полостей, образованных собранной оснасткой с установленной в ней пластиной основы, в следующем порядке. Сначала заполняется полость, образованная углублением 11 в нижней части оснастки, нижней поверхностью пластины основы 2 и выступами 18, 19, 20 верхней части оснастки (фиг. 3, 21, 22). Затем заполняются каналы, образованные сквозными отверстиями 5, 21 в верхней части 2 оснастки и боковой поверхностью пластины 2 основы (фиг. 3). Далее через выемки 34 в бортиках 33 основы формовочный материал заливается на поверхность основы, образуя уплотнительный слой 22, ограниченный бортиками 33 основы (фиг. 7). После этого, формовочный материал проливается в отверстия 4 основы и заполняет полости, образованные выступами 18-20 верхней части оснастки и внутренними поверхностями отверстий 4 в пластине основы.
Микрофлюидный чип и способ его изготовления. Процесс изготовления микрофлюидного чипа включает этап получения заготовки 3, описанный выше, и этап фиксации на заготовке, со стороны расположения микрофлюидной системы, пластины 67 из оптически прозрачного материала, обеспечивающей герметизацию микрофлюидных элементов и микроканалов и формирующую нижний слой чипа. При этом в качестве фиксируемой пластины преимущественно используют стандартное предметное стекло.
Перед фиксацией пластины может быть осуществлена очистка и активация поверхностей заготовки чипа и стекла, например, посредством продувки воздухом и обработкой в плазменной установке аналогично обработке основы заготовки.
Фиксация пластины на поверхности заготовки может быть осуществлена любым известным из уровня техники методом.
В одном из частных вариантов, для фиксации стекла на поверхности заготовки 3, может быть использовано приспособление, включающее верхнюю часть 68 с углублением (центрирующим вырезом) для размещения стекла и нижнюю часть 69 для размещения заготовки чипа (фиг. 18). При этом фиксацию стекла осуществляют следующим образом.
В верхней 68 и нижней 69 частях приспособления для фиксации создают отрицательное давление (например, -30 кПа). В нижней части 69 размещают заготовку 3 чипа нижней поверхностью наружу (вверх). При этом, за счет созданного отрицательного давления, мембраны клапанов и рабочей камеры микронасоса выгибаются (оттягиваются) вниз.
В центрирующий вырез верхней части приспособления устанавливают стекло обработанной поверхностью наружу (вниз). За счет отрицательного давления стекло плотно фиксируется в верхней части приспособления. Затем верхнюю часть приспособления для фиксации опускают на нижнюю и снимают отрицательное давление. В результате этого, обработанная в плазменной установке поверхность стекла плотно фиксируется на обработанной поверхности слоя формовочного материала, обеспечивая герметизацию микрофлюидной системы. Затем снимают верхнюю часть приспособления для фиксации и извлекают чип. После фиксации стекла чип может быть дополнительно помещен в нижнюю часть приспособления с целью проверки клапанов микронасоса. Если, после снятия отрицательного давления, мембраны микронасоса не вернулись в исходное положение, в нижней части приспособления для фиксации стекла создают положительное давление.
Тестирование микрофлюидного чипа.
Через несколько минут (1-2 минуты) после фиксации пластины 67 из оптически прозрачного материала на заготовке 3 проводят тестирование пропускной способности микрофлюидной системы чипа путем заливки в него воды. В одном из вариантов, для проведения тестирования чипа, в двух его отверстиях, соответствующих клеточным ячейкам, герметично устанавливают шприцы. В целях обеспечения герметичности, на чип предварительно устанавливают, например, пробку 70 (крышку) для заливки (фиг. 24), в которой размещают два шприца - один для заливки воды, наполненный водой в объеме 2 мл, другой - для удаления воды из отверстия, являющийся пустым (фиг. 29). Путем надавливания на поршень полного шприца с одновременным вытягиванием поршня пустого шприца, весь объем воды несколько раз пропускают через микрофлюидную систему до исчезновения пузырьков. При этом допустимым является сохранение до 2-3 пузырьков под клапанами микронасоса размерами не более 0,8 мм. После завершения описанных выше действий чип продувают воздухом и помещают в ламинарный шкаф до его полного высыхания.
Таким образом, микрофлюидный чип, изготовленный описанным выше способом, включает заготовку 3, полученную заявляемым в настоящем изобретении способом, и пластину 67 из оптически прозрачного материала, зафиксированную на поверхности основы заготовки со стороны микрофлюидной системы с обеспечением герметизации микрофлюидной системы (фиг. 19).
При этом в предпочтительном варианте осуществления изобретения основа 2 заготовки чипа снабжена отверстиями 4, расположение которых соответствует расположению микрофлюидных элементов, и выполненными сообщающимися с микрофлюидными элементами, а также содержит уплотнительный слой 22 из формовочного материала на поверхности, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем 10 формовочного материала, содержащего микрофлюидную систему, и уплотнительный слой 23 из формовочного материала, по меньшей мере, на части внутренней поверхности, по меньшей мере, части отверстий основы (фиг. 19, 20).
На фиг. 28 представлено фото одного из изготовленных микрофлюидных чипов с окрашенной для наглядности микрофлюидной системой и уплотнительным слоем, сформированными в отверстиях пластины чипа.
Эксплуатация микрофлюидного чипа.
Конструкция готового микрофлюидного чипа допускает использование специальной пробки 51 для герметизации отверстий основы заготовки, например, отверстий 29, 30, соответствующих клеточным ячейкам и лунке для смены среды (фиг. 19). В частном варианте, данная пробка представляет собой монолитную полистирольную деталь (фиг. 23, 25), одновременно закрывающую технологическое отверстие и клеточные ячейки микрофлюидного чипа, которая заменяет несколько отдельных крышек и уплотнителей к ним, создающих избыточное давление при закручивании. Данная деталь может быть выполнена в виде пластины, снабженной тремя выступами 72 на нижней стороне (фиг. 25). Форма и взаимное расположение данных выступов соответствуют внутренней форме и взаимному расположению технологического отверстия и отверстий клеточных ячеек микрофлюидного чипа. Выступы пробки могут быть выполнены с углублениями (например, круглого сечения) в торцевых частях, что предотвращает возникновение избыточного давления в микрофлюидной системе чипа при установке на него данной пробки. Кроме того, выступы могут быть дополнительно снабжены зубцами 73 для фиксации и центрирования выступов пробки в отверстиях чипа.
Таким образом, использование данной пробки предотвращает возникновение избыточного давления, а также существенно упрощает стерилизацию микрофлюидного чипа, предотвращая попадание загрязнений и нежелательных микроорганизмов внутрь лунок. Пробка может иметь и другое конструктивное выполнение в зависимости от количества и расположения отверстий основы, требующих герметизации.
Конструкция готового микрофлюидного чипа также позволяет использовать его совместно с держателем 74 (кейсом). Держатель микрофлюидного чипа представляет собой металлическое прижимное устройство, которое может удерживать пробку 70, выполняет защитную функцию и допускает подключение дополнительных модулей к чипу (фиг. 30, 31, 32). Кроме того, применение кейса способствует поддержанию стерильности микрофлюидного чипа за счет исключения непосредственного контакта с чипом.
Чип и кейс являются модульной системой, допускающей подключение дополнительных модулей, одним из которых может являться модуль 75 подачи воздуха к микронасосу (фиг. 31), представляющий собой совокупность клапанов и фитингов для подключения модульной системы «чип + кейс» к системе подачи воздуха, что необходимо для работы мембранного насоса микрофлюидной системы. При этом уплотнение клапанной группы может обеспечиваться слоем ПДМС, сформированным на верхней стороне чипа.
Модульная система «чип + кейс» позволяет также интегрировать ее, например, в модуль измерения сопротивления монослоя клеток 76 (фиг. 32). В этом случае микрофлюидную систему заготовки герметизируют стеклом с нанесенными на него электродами, что позволяет измерять трансэпителиальное электрическое сопротивление в режиме реального времени.
Осуществление изобретения подтверждено примером конкретного выполнения, описанным ниже, и содержащим указания конкретных параметров элементов и режимов, которые не ограничивают настоящее изобретение, а предназначены лишь для лучшего понимания его сущности.
Пример конкретного выполнения
Заявляемое изобретение было апробировано на серии из 20 микрофлюидных чипов. Заготовки чипов и сами чипы были изготовлены с использованием оснастки по вышеописанной технологии.
Изготовление частей оснастки осуществляли на фрезерном станке из листа алюминия марки Д16Т толщиной 10 мм, при этом использовали фрезу 2 мм - для снятия верхних слоев материала, фрезу 0,3 мм - для формирования гладкой поверхности микроканалов на поверхности нижней части оснастки, фрезу 4 мм - для вырезания контуров верхней и нижней частей оснастки и формирования отверстий под винтовые соединения, резьбофрезу с шагом 1 мм - для формирования резьбы М6 во всех отверстиях. Размеры оснастки в проекции на горизонтальную плоскость составляли 118×55 мм. Размеры углублений ее верхней и нижней частей - 9,5 мм.
В качестве механической основы 2 конструкции микрофлюидных чипов выступала пластина из полистирола размером 80×30 мм, толщиной 8 мм, также обработанная фрезерованием. В пластине было изготовлено шесть сквозных отверстий 4 (фиг. 4). С одной из длинных сторон пластины были изготовлены П-образные пазы 35, обеспечивающие подключение к чипу устройства для измерения сопротивления монослоя клеток 76. Пластина была снабжена бортиками 33 высотой 1 мм, при этом в бортиках были выполнены выемки 34 шириной 5 мм и глубиной 2 мм с коротких сторон пластины, для обеспечения равномерного заполнения материала.
Нижняя часть 6 оснастки включала в себя мастер-шаблон с рисунком микрофлюидных элементов и микрофлюидных каналов, представленным на фиг. 5. Верхняя часть 7 оснастки содержала шесть выступов, три из которых (группа выступов 18) соответствовали микронасосу (двум клапанам и рабочей камере микронасоса), два (выступы 19) - клеточным ячейкам и один (выступ 20) - технологическому отверстию для замены среды (фиг. 6).
В продольном сечении отверстия пластины и выступы оснастки, соответствующие данным отверстиям, были выполнены ступенчатой формы (фиг. 10-12, 14-16). Наружный диаметр отверстий пластины, соответствующих клеточным ячейкам и лунке для смены среды составлял 12 мм, а отверстий, соответствующих мембранам микронасоса - 6 мм. Отверстия, соответствующие мембранам (клапанам и рабочей камере) микронасоса и лунке для смены среды (технологическое отверстие) были выполнены двухступенчатыми. Вторые ступени отверстий для клапанов микронасоса были выполнены с диаметром 3 мм, для рабочей камеры - 3.4 мм, для технологического отверстия - 5.7 мм. Отверстия, соответствующие клеточным ячейкам, были выполнены аналогично лунке для смены среды. Поперечные размеры выступов оснастки были выбраны обеспечивающими зазор 0,4 мм между внутренними поверхностями отверстий и поверхностями соответствующих выступов для формирования уплотнительного слоя формовочного материала.
По периметру оснастки было выполнено шесть отверстий 52 для соединения частей оснастки диаметром 6 мм. Части оснастки скреплялись винтами. В верхней части оснастки были выполнены два отверстия 56 под крепежные элементы, предназначенные для крепления заливочной воронки 55, а также два отверстия 5, 21 для заливки и удаления излишков формовочного материала из оснастки диаметром 6 мм. С левой и правой стороны оснастки (по короткой стороне) были выполнены четыре паза 62 шириной 6×4,5 мм и высотой 3,5 мм, обеспечивающие легкое извлечение («поддевание») заготовки, в случае, если после разборки оснастки заготовка осталась в ее верхней части. Также были выполнены 4 паза 63 глубиной 3,5 мм для удобного размещения заготовки и 4 паза 61 по углам оснастки глубиной 0,2 мм для удобства «поддевания» формы лопаткой при разборке оснастки. Для заливки формовочного материала в оснастку использовали воронку объемом 50 ml.
В качестве формовочного материала был использован полидиметилсилоксан (ПДМС) Dow Corning Sylgard 184 в составе 10 массовых частей основания на 1 часть отвердителя. При этом перед заливкой в оснастку смесь тщательно перемешивали и помещали в вакуумный шкаф для предварительной дегазации.
Заготовку изготавливали следующим образом.
Для очистки и обезжиривания пластину основы 2 замачивали в спирте, после чего продували сжатым воздухом. Затем пластину помещали в плазменную установку нижней поверхностью вверх и обрабатывали для создания активированной поверхности в течение 90 секунд. Сразу после извлечения пластины из плазменной установки (поскольку время жизни активированной поверхности ограничено) ее поверхности (контактирующие с ПДМС в процессе изготовления чипа) обрабатывали праймером Dow Corning PR-1200. После прохождения реакции между праймером и поверхностью (через 1-2 мин.), осуществляли удаление остатков праймера.
Далее осуществляли подготовку и сборку оснастки для изготовления чипа. При этом перед сборкой форму 7 и мастер 6 обрабатывали для удаления возможных загрязнений, в т.ч. остатков ПДМС от предыдущей отливки.
В верхнюю часть 7 оснастки вставляли кусок полиуретановой трубки 60 в отверстие 21 для удаление формовочного материала, при этом внутри оснастки срез трубки шел вровень с уровнем внутренней поверхности верхней части 7 оснастки, а снаружи выступал на 3-4 см.
Обработанную праймером пластину помещали в углубление 12 верхней части 7 оснастки (не затрагивая при этом нижнюю поверхность пластины), которую затем прикручивали к нижней части 6 винтами. Далее в отверстие 5 оснастки, предназначенное для заливки формовочного материала, устанавливали воронку 55, которую прикручивали к верхней части оснастки рамкой 57 с двумя винтами 58 (фиг. 17). В воронку заливали объем подготовленной смеси ПДМС, больше необходимого для заполнения всей полости оснастки на 3-5 мл. Затем оснастку прогревали в термошкафу (нагревательной печи марки Binder) с температурой 50°C в течение 2 минут для снижения вязкости формовочного материала, и размещали ее в роторе центрифуги 66 марки eppendorf centrifuge 5810, устанавливая скорость вращения 270 об/мин (обеспечивающую ускорение в 20g), на 8 минут (фиг. 26). После завершения работы центрифуги оснастку переносили в термошкаф, где была выставлена температура 70°C. Оснастку выдерживали в термошкафу в течение 40 минут для отверждения ПДМС (допускается и большее время выдержки, например, 1 час, но не менее 40 минут).
Далее оснастку извлекали из термошкафа, остужали и извлекали заготовку чипа (фиг. 27). После извлечения заготовки чипа, ее помещали в ламинарный шкаф для предотвращения попадания на нее пыли, грязи (при этом исключали касания нижней поверхности чипа с расположенной на ней микрофлюидной системой).
Заготовка чипа представляла собой пластину, размеры которой соответствовали размерам предметного стекла - 76×26 мм, на нижней стороне которой располагался слой отвержденного ПДМС толщиной 1,5 мм, содержащий микрофлюидную систему, а на верхней стороне и в отверстиях - уплотнительный слой из отвержденного ПДМС толщиной 1 мм. При этом высота микрофлюидных каналов составляла 300 мкм, толщина мембран из ПДМС в местах расположения клапанов и рабочей камеры насоса составляла 400 мкм.
Далее на нижней поверхности заготовки чипа осуществляли фиксацию стекла по технологии, описанной выше, и осуществляли тестирование полученного чипа (фиг. 18, 29).
Изготовленные микрофлюидные чипы характеризовались высоким качеством за счет исключения образования пузырьков воздуха в каналах, отличным показателем повторяемости отливки, быстротой и удобством эксплуатации, минимальным количеством элементов при стерилизации. Изделия были подвержены успешной стерилизации на поглощенных дозах в 15 кГр и максимальной допустимой в 45 кГр. Готовый микрофлюидный чип может поставляться в комплекте с пробками в стерильном пакете.
Применение заявляемой оснастки в процессе изготовления чипа позволило снизить процент брака до 1-5% (брака, связанного с не доливкой ПДМС, образованием пузырьков воздуха в микроканалах при отливке, формированием отливаемых мембран клапанов разной высотой, приклеиванием стекла после отливки).
Были проведены тесты по посадке в чип различного рода клеточных культур. Чипы продемонстрировали свою работоспособность в процессе непрерывной эксплуатации в течение месяца.
При этом на изготовление одного чипа было затрачено до 1 часа. При наличии 8 оснасток возможно изготовление до 30 заготовок в день (силами одного рабочего при наличии производственного оборудования по одной единице). Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет снизить себестоимость и сделать микрофлюидные чипы более доступными.
Конструкция предлагаемого чипа позволяет подбирать оптимальные режимы для культивирования различных типов клеток. Наличие открытых лунок позволяет проводить с чипом манипуляции, аналогичные манипуляциям с обычным культуральным планшетом. Кроме того, конструкция чипа позволяет проводить все виды микроскопических исследований, включая прижизненную визуализацию клеток в течение длительного времени. Возможность использования мембранных вставок позволила получать монослои эпителиальных клеток, в том числе и клеток кишечника (была показана жизнеспособность клеток линии Сасо-2 (модель кишечника человека) в предлагаемом чипе (+-30 кПа, 3 Гц) в течение 3 недель).