ПЕПТИД CDCA1 И ВКЛЮЧАЮЩЕЕ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО
CDCA1 PEPTIDE AND PHARMACEUTICAL DRUG CONTAINING IT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые эффективны в качестве вакцин против типов рака, в высокой степени экспрессирующих пептид 1, связанный с циклом деления клетки (CDCA1), таких как рак легких и холангиоцеллюлярная карцинома, и к фармацевтическим средствам, которые включают эти пептиды, для лечения и профилактики опухолей.
Известный уровень техники
В последние годы количество больных раком легких продолжает расти по всему миру и в настоящее время в мире приблизительно один миллион человек умирает от рака легких ежегодно. Также и в Японии смертность от рака легких увеличивается и по оценке достигнет 123000 в 2015 г. Рак легких более характерен для мужчин и отношение мужчин к женщинам составляет три к одному. Рак легких в 1993 г. опередил рак желудка, являясь лидирующей причиной смерти от рака у мужчин. Более того, с ростом количества курящих женщин число больных женского пола, как ожидается, возрастет. Рак легких является лидирующей причиной смерти от рака с 2000 г. и при старении общества количество больных, как предполагается, будет дополнительно расти в будущем. Курение рассматривается как главная причина развития рака легких, а другие причины представляют собой вдыхание асбеста, загрязнение воздуха и тому подобное. Раннее выявление и срочное лечение важны для лечения рака легких. Однако недавно отмечалось, что простой рентген грудной клетки и тестирование мокроты, выполняемые при медицинском обследовании, не эффективны для раннего выявления рака легких, и они не ведут к снижению смертности от рака. Так как количество смертей от рака легких, как предполагается, будет продолжать расти в будущем, неотложной задачей является разработка новых терапевтических стратегий.
В Японии количество смертей от рака желчевыводящих путей возрастает и в 2005 г. 16586 человек умерли от рака желчевыводящих путей. В большинстве случаев рака желчевыводящих путей никаких субъективных симптомов на ранних стадиях не выявляется. По сравнению с типами рака, которые возникают в полости пищеварительного тракта, такими как рак желудка и рак ободочной кишки, рак желчевыводящих путей трудно выявить и диагностировать на ранних стадиях. Следовательно, во многих случаях рак уже прогрессировал и является неоперабельным при выявлении. В дополнение к хирургическому вмешательству при раке желчевыводящих путей проводят лучевую терапию и химиотерапию, но они не являются терапевтически эффективными и необходимо создание нового терапевтического метода.
С другой стороны, последние разработки в молекулярной биологии и иммунологии опухолей показали, что цитотоксические Т-клетки (киллеры) и хелперные Т-клетки узнают пептиды, образованные при деградации белков, которые специфически и в высокой степени экспрессируются в раковых клетках и которые презентируются на поверхности раковых клеток или антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул HLA, и вызывают иммунологическую реакцию с разрушением раковых клеток. Более того, многие опухолевые белки-антигены и производные от них пептиды, которые стимулируют такую иммунологическую реакцию для борьбы с раком, идентифицированы, и антигенспецифическая терапия опухолей применяется клинически.
Молекула класса I HLA экспрессируется на поверхности всех имеющих ядро клеток организма. Она связывается с пептидом, появляющимся в результате внутриклеточной деградации белков, продуцируемых в цитоплазме или ядре, и экспрессирует пептид на клеточной поверхности. На поверхности нормальной клетки с молекулами класса I HLA связаны пептиды, происходящие от нормальных аутологичных белков, и они не узнаются и не разрушаются Т-клетками иммунной системы. С другой стороны, в процессе превращения в рак раковые клетки иногда экспрессируют большое количество белков, которые почти не экспрессируются или незначительно экспрессируются в нормальных клетках. Когда молекулы класса I HLA связываются с пептидами, возникшими в результате внутриклеточной деградации белков, специфически и в высокой степени экспрессирующихся в раковых клетках, и затем экспонируют пептиды на поверхности раковых клеток, цитотоксические Т-клетки (киллеры) узнают и разрушают только раковые клетки. С помощью введения таких специфичных для рака антигенов или пептидов индивидууму раковые клетки могут быть разрушены, и рост раковой опухоли может быть подавлен без вреда для нормальных клеток. Это называется иммунотерапией рака с использованием канцероспецифичных антигенов. Молекулы класса II HLA экспрессируются главным образом на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Молекулы связываются с пептидами, происходящими от канцероспецифичных антигенов, которые возникают в результате внутриклеточной деградации канцероспецифических антигенов, включенных в антигенпрезентирующие клетки после поступления из внеклеточного окружения, и затем экспонируют пептиды на поверхности клеток. Хелперные Т-клетки, которые их узнают, активируются и индуцируют или усиливают иммунную реакцию против опухолей с помощью продукции различных цитокинов, которые активируют другие иммунокомпетентные клетки.
Соответственно, если разрабатывается иммунотерапия, которая направлена на антигены, специфически и в высокой степени экспрессирующиеся при типах рака, такая терапия может эффективно уничтожать только типы рака, не вызывая какого-либо вредного эффекта в нормальных аутологичных органах. Предполагается также, что терапия может быть полезна для любых больных с терминальной стадией рака, к которым не могут быть применены другие способы лечения. Кроме того, с помощью введения канцероспецифического антигена и пептида в виде вакцины заранее индивидуумам с высоким риском развития рака развитие рака может быть предотвращено.
Хотя существуют различные терапевтические методы лечения рака легких, рак легких имеет плохой прогноз по сравнению с другими типами рака и он является одним из неподатливых типов рака. Причина заключается, например, в быстрой прогрессии и во многих случаях рак находится в прогрессирующей форме к моменту обнаружения. Более того, так как хирургическое вмешательство является высоко инвазивным, количество больных, которым показано хирургическое вмешательство, является ограниченным и полное лечение с помощью лучевой терапии или химиотерапии затруднено. Если разрабатывается иммунотерапия, направленная на антигены, которые в высокой степени и специфически экспрессируются в клетках рака легких, то только рак может быть эффективно уничтожен с помощью такого терапевтического метода без какого-либо повреждения нормальных аутологичных органов. Более того, такой терапевтический метод, как ожидается, применим для любого больного с терминальной стадией рака и для больных, для которых не применимы другие методы лечения из-за крайне плохой функции легких. Кроме того, так как риск развития рака легких высок среди курильщиков, иммунотерапия может быть применима для профилактики рака легких у группы с высоким риском развития рака легких.
С помощью широкого геномного анализа экспрессии генов с использованием микроматриц кДНК авторы настоящего изобретения проанализировали экспрессионный профиль 27648 генов человека в 37 клинических случаях немелкоклеточного рака легких и в эмбриональных органах, и в различных нормальных органах взрослого человека. В результате авторы обнаружили, что CDCA1 (пептид 1, связанный с циклом деления клетки, также известный как гомологи человека Nuf2 (hNuf2)) (GenBank No. поступления NM_145697) в высокой степени экспрессируется во многих случаях рака легких, в то время как он едва экспрессируется в эмбриональной печени или нормальных органах взрослого человека, за исключением семенников, недоступных для иммунной системы. Более того, CDCA1 в высокой степени экспрессируется во всех случаях холангиоцеллюлярной карциномы, раке мочевого пузыря и почечно-клеточной карциноме. Высокая экспрессия CDCA1 обнаружена также в раковых тканях в 40% или более случаев рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей и рака ободочной кишки. Этот факт предполагает, что CDCA1 может служить в качестве канцероспецифического антигена при многих карциномах.
HLA-A2 часто наблюдается в популяциях людей независимо от расы и имеется у приблизительно 30% японцев. Следовательно, если можно было бы идентифицировать пептид-антиген рака, который презентируется цитотоксическим Т-клеткам (киллерам) с помощью HLA-A2, он мог бы широко применяться не только у японцев, но и у белой расы и других. Соответственно, важной задачей является идентификация пептидов-антигенов рака, которые презентируются Т-клеткам-киллерам с помощью HLA-A2. Было бы крайне удачно, если бы такие пептиды-антигены рака применялись для иммунотерапии рака легких, который характеризуется высокой заболеваемостью и смертностью по всему миру.
Документы предшествующего уровня техники, относящиеся к настоящему изобретению, представлены ниже.
[Непатентный документ 1] DeLuca J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V., and Salmon, E.D., hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells J. Cell Biol. 159: 549-555, 2002.
[Непатентный документ 2] DeLuca, J.G., Dong, Y., Hergert, P, Strauss, J., Hickey, J.M., Salmon, E.D., McEwen, B.F., Hec1 and Nuf2 Are Core Components of the Kinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites., Mol. Biol. Cell 16: 519-531, 2005.
[Непатентный документ 3] Hayama, S., Daigo, Y., Kato, T., Ishikawa, N., Yamabuki, T., Miyamoto, M., Ito, T., Tsuchiya, E., Kondo, S., and Nakamura, Y., Activation of CDCA1-KNTC2, Members of Centromere Protein Complex, Involved in Pulmonary Carcinogenesis., Cancer Res. 66: 10339-10348, 2006.
[Непатентный документ 4] Liu, S.T., Rattner, J.B., Jablonski, S.A., and Yen, T.J., Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells., J. Cell Biol. 175: 41-53, 2006.
[Непатентный документ 5] DeLuca, J.G., Howell, B.J., Canman, J.C., Hickey, J.M., Fang, G., and Salmon, E.D., et al. Nuf2 and Hec1 Are Required for Retention of the Checkpoint Proteins Mad1 and Mad2 to Kinetochores., Current Biology 13: 2103-2109, 2003.
[Непатентный документ 6] Liu, D., Ding, D., Du, J., Cai, Xin., Huang, Y., Ward, T., Shaw, A., Yang, Y., Hu, R., Jin, C., and Yao, X., Human NUF2 Interacts with Centromere-associated Protein E and Is Essential for a Stable Spindle Microtubule-Kinetochore Attachment. J.Biol.Chem.282: 21415-21424, 2007.
Раскрытие изобретения
[Задачи, решаемые изобретением]
Целью, достигаемой настоящем изобретением, является разработка средств для осуществления иммунотерапии, которая подавляет рост рака посредством стимуляции иммунитета раковых больных против рака, как терапевтического метода для метастазирующего или трудноизлечимого типов рака, которые трудно лечить путем хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии, для лечения рака легких, рака желчевыводящих путей и т.д. Авторы настоящего изобретения идентифицировали пептиды, которые происходят от белков, специфически и в высокой степени экспрессируемых при раке, и которые презентируются Т-клеткам-киллерам с помощью HLA-A2, тем самым обеспечивая возможность применения иммунотерапии у 30% японцев, больных различными типами рака, которые в высокой степени экспрессируют CDCA1.
[Способы осуществления]
Авторы настоящего изобретения при анализе тканей рака легких с использованием микроматриц кДНК идентифицировали ген CDCA1 (GenBank No. поступления NM_145697), который в высокой степени экспрессируется в раке легких. В нормальных тканях экспрессия CDCA1 обнаружена только в семенниках, недоступных для иммунной системы. Для проверки того, будет или нет противоопухолевый иммунитет индуцироваться Т-клетками-киллерами, специфичными по отношению к CDCA1, использовали HLA-A2 трансгенных мышей, экспрессирующих HLA-A2, который имеется у приблизительно 30% японцев. Конкретно в настоящем изобретении авторы проверили, будут индуцироваться или нет ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры, специфичные по отношению к пептиду, когда HLA-A2 трансгенных мышей иммунизируют дендритными клетками, происходящими из костного мозга мыши, пульсированными пептидами CDCA1 человека, обладающими мотивом связывания HLA-A2. Будут Т-клетки-киллеры, специфичные по отношению к пептиду CDCA1, индуцироваться в клетках селезенки иммунизированных мышей или нет, проверяли с использованием теста ELISPOT с определением интерферона-γ (IFN-γ), продуцируемого Т-клетками-киллерами, активированными распознаваемыми пептидами, презентируемыми с помощью HLA-A2. В результате идентифицировано два типа новых пептидов CDCA1, которые могут быть применены для иммунотерапии, направленной на HLA-A2-позитивный рак у больных. Более того, было подтверждено, что CTL, происходящие от больных раком и от здоровых доноров, активированные этими пептидами, проявляют цитолитическую активность против клеток, экспрессирующих CDCA1. Это значит, что пептиды, как ожидалось, узнаются ограниченными HLA-A2 Т-клетками-киллерами человека и применимы для иммунотерапии рака у больных с HLA-A2 позитивным раком.
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается следующее:
[1] пептид (A) или (B) ниже:
(A) пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;
(B) пептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;
[2] пептид по [1], где вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин;
[3] пептид по [1], где C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин;
[4] средство для индукции иммунитета против рака, которое содержит один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[5] средство для лечения и/или профилактики рака, которое содержит один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[6] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, которое проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[7] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, которое проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает в качестве активного ингредиента один или более полинуклеотидов, кодирующих пептиды по [1];
[8] средство для индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[9] антитело против пептида по [1];
[10] хелперная Т-клетка, цитотоксическая (киллерная) Т-клетка или включающая их популяция иммуноцитов, которые индуцируются с использованием пептида по [1];
[11] антигенпрезентирующая клетка, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;
[12] антигенпрезентирующая клетка по [11], которая индуцируется средством по [6] или [7];
[13] экзосома, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;
[14] экзосома по [13], где антиген HLA представляет собой HLA-A2 (HLA-A2*0201);
[15] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию контактирования антигенпрезентирующей клетки с пептидом по [1];
[16] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию введения полинуклеотида, кодирующего пептид по [1], в антигенпрезентирующую клетку;
[17] способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, который включает стадию контактирования Т-клетки с пептидом по [1];
[18] способ индукции иммунитета против рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;
[19] способ лечения и/или профилактики рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;
[20] применение пептида по [1] для получения средства для индукции иммунитета против рака;
[21] применение пептида по [1] для получения средства для лечения и/или профилактики рака;
[22] пептид по [1] для индукции иммунитета против рака;
[23] пептид по [1] для лечения и/или профилактики рака.
Краткое описание фигур
На фиг. 1A представлен протокол идентификации пептидов CDCA1, узнаваемых ограниченными HLA-A2 киллерными Т-клетками. День, когда клетки селезенки отбирали у иммунизированных мышей, обозначен как «день 0». На фиг. 1B представлены результаты теста ELISPOT. Тест ELISPOT использовали для проверки того, будут или нет киллерные Т-клетки, полученные от иммунизированных мышей, специфически отвечать на пульсированные пептидом CDCA1 клетки и продуцировать IFN-γ. В результате киллерные Т-клетки, индуцированные пептидом CDCA1-1 или CDCA1-4, специфически узнавали клетки T2A2, пульсированные пептидом CDCA1, и продуцировали IFN-γ. Однако никакого специфичного для CDCA1 иммунного ответа киллерных Т-клеток не наблюдалось у киллерных Т-клеток, индуцируемых другими пептидами. Следовательно, установлено, что пептиды CDCA1-1 и CDCA1-4 являются эпитопными пептидами, способными индуцировать специфичные для CDCA1 ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры. Номера пептидов CDCA1, представленных на фигуре 1B, соответствуют номерам пептидов, представленным в графе «ПОЛОЖЕНИЕ ПЕПТИДА» таблицы 1, но не номерам последовательностей ID, описанным в настоящем документе.
65-73
351-359
351-359
На фиг. 2 представлен результат теста ELISPOT по определению IFN-γ, продуцируемому Т-клетками-киллерами, активированными в результате специфического узнавания пептидов CDCA1. На фиг. 2A представлен результат индукции Т-клеток-киллеров путем стимуляции пульсированных пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) дендритных клеток, происходящих из костного мозга HLA-A2 трансгенных мышей. Когда в качестве стимулированных клеток использовали пульсированные пептидом CDCA1 клетки T2A2, количество в пятне и суммарная область пятна были значительно больше, чем таковые когда в качестве стимулированных клеток использовали HLA-A2 позитивные пульсированные не CDCA1 клетки T2A2. Таким образом, установлено, что пептид CDCA1-1 представляет собой эпитопный пептид, способный индуцировать ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры. На фиг. 2B представлен результат индукции Т-клеток-киллеров путем стимуляции пульсированных пептидом CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NО:2) дендритных клеток, происходящих из костного мозга HLA-A2 трансгенных мышей. Когда в качестве стимулированных клеток использовали пульсированные пептидом CDCA1 клетки T2A2, количество в пятне и суммарная область пятна были значительно больше, чем таковые, когда в качестве стимулированных клеток использовали HLA-A2 позитивные пульсированные не CDCA1 клетки T2A2. Таким образом, установлено, что пептид CDCA1 (No. 4) представляет собой эпитопный пептид, способный индуцировать ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры.
+
+
+
65-73
351-359
351-359
На фиг. 3 представлен специфический иммунный ответ CDCA1 индуцированных CTL от здорового донора. На фиг. 3A представлен протокол индукции специфических для CDCA1 CTL из PBMC. PBMC получали от здорового донора и CD8 Т-клетки и CD14 клетки отделяли с использованием микрошариков. Затем продуцировали взаимодействующие с пептидом CD8 CTL, и DC получали из CD14-позитивных клеток путем культивирования в течение пяти дней в присутствии GM-CSF и ИЛ-4. DC культивировали в присутствии β2 микроглобина при 37°С в течение четырех часов и пульсировали HLA-A2 связывающими пептидами. Пульсированные пептидом DC затем облучали и смешивали с аутологичными CD8-позитивными Т-клетками в отношении 1:20. Клетки культивировали в содержащей AIM-V 2% аутосыворотке, снабженной ИЛ-7. Через три дня в культуральную среду добавляли ИЛ-2. На 12 и 19 дни Т-клетки повторно стимулировали пульсированными пептидом аутологичными DC. DC получали по использованию. Тест ELISPOT на IFN-γ и тест высвобождения Cr выполняли через пять и шесть дней после третьей пептидной стимуляции. На фиг. 3B и C представлены результаты теста ELISPOT, выполненного после совместного культивирования клеток-мишеней с CTL, от донора, индуцированных с использованием пептида CDCA1 (No. 1) и пептида CDCA1 (No. 4), соответственно. Продукция IFN-γ против пульсированных пептидом T2 клеток была существенно выше, чем против пульсированных не пептидом T2 клеток. На фиг.3D представлена индуцированная цитотоксичность CTL от PBMC донора 1, больного раком и здорового донора 1 против пульсированных пептидом CDCA1 клеток Т2. На фиг. 3E представлен дозозависимый ответ CTL, происходящих от здорового донора 1, индуцированный пептидом CDCA1. CTL продуцировали большое количество IFN-γ в ответ на T2 клетки, пульсированные пептидом в концентрации 0,2 мкг/мл или боле при отношении E/T равном 5.
51
На фиг. 4 представлена индуцированная цитотоксическая активность CTL от здорового донора против CDCA1-позитивных раковых клеток. На фиг. 4A представлена экспрессия в клетках COLO201, когда экспрессионный вектор гена CDCA1 введен в клетки. Лентивирус, в котором индуцируется экспрессия CDCA1-HA под контролем промотора EF-1α и промотора CMV, использовали для инфицирования линии раковых клеток (COLO201), которые экспрессируют HLA-A2, но не CDCA1, три раза. Лизат клеток подвергали анализу вестерн-блоттингом с использованием антитела против HA (в середине) или антитела против CDCA1 (вверху). На фиг. 4B, C и D представлена продукция IFN-γ против COLO201/CDCA1. Продукция IFN-γ была значительно выше в трансформированной линии раковых клеток COLO201, чем в нетрансформированной COLO201. Более того, продукция IFN-γ против PANC1, эндогенно экспрессирующих как CDCA1, так и HLA-A2, была существенно выше, чем продукция против A549, не экспрессирующих ни CDCA1, ни HLA-A2. На фиг. 4E и F представлены результаты теста высвобождения Cr, когда индуцированные CTL донора и клетки-мишени культивировали совместно. Цитотоксичность была обнаружена для PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не для A549 (CDCA1+, HLA-A2-) и COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+). На фиг. 4G представлена корреляция между реагирующими на пептид CDCA1 CTL и позитивными по тетрамеру HLA-A2-CDCA1 CTL среди CD8-позитивных клеток. На левой диаграмме представлен тест ELISPOT с использованием пульсированных пептидом клеток T2 в качестве клеток-мишеней и отношение E/T составляло 5. На правой диаграмме представлен результат анализа FACS. Клетки, проанализированные на левой диаграмме, представляют собой происходящие от здорового донора 1 CTL из PBMC три раза подвергавшихся стимуляции пульсированными пептидом DC. Клетки, проанализированные на правой диаграмме, представляют собой наивные CD8-позитивные клетки, выделенные из PBMC здорового донора 1.
Способ осуществления изобретения
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Пептиды по настоящему изобретению представляют собой эпитопы, ограниченные HLA-A2, который является аллелем HLA, часто обнаруживаемым в популяциях японцев и людей белой расы. Конкретно, используя связывающее сродство к HLA-A2 в качестве показателя, отбирали кандидатные пептиды, связывающие HLA-A2, происходящие от CDCA1. У отобранных пептидов оценивали, будут или нет индуцироваться Т-клетки-киллеры в организме HLA-A2-трансгенных мышей под действием дендритных клеток, происходящих из клеток костного мозга HLA-A2-трансгенной мыши (BM-DC), пульсированных отобранными пептидами. Цитотоксические (киллерные) Т-клетки индуцировали in vivo у HLA-A2-трансгенных мышей под действием CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEQ ID NO:1)) и CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEQ ID NO:2)). Т-клетки-киллеры, индуцированные этими пептидами, проявляли реакцию иммунного ответа на T2A2 клетки, пульсированные этими пептидами. Однако эти Т-клетки-киллеры не демонстрировали реакцию иммунного ответа на T2A2 клетки, не пульсированные пептидом. Более того, CTL, происходящие от больного раком и происходящие от здорового донора, которые были индуцированы с использованием CDCA1-1 и CDCA1-4, проявляли цитолитическую активность против клеточных линий, экспрессирующих CDCA1. Эти результаты демонстрируют, что пептиды, происходящие от CDCA1, пригодны в качестве пептидов, индуцирующих иммунную реакцию против CDCA1-презентирующих клеток, и что пептиды, происходящие от CDCA1, представляют собой ограниченные HLA-A2 эпитопные пептиды. Показано, что CDCA1 в высокой степени экспрессируется в канцерогенных тканях в большинстве случаев рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей и рака ободочной кишки. На основе этих фактов CDCA1 рассматривается как пригодный в качестве иммунотерапевтической мишени для различных типов рака.
(1) Пептиды по настоящему изобретению и средства для индукции иммунитета против рака, которые содержат пептиды
Пептид по настоящему изобретению является любым из от (A) до (D) ниже.
(A) Пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2.
(B) Пептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки.
(C) Пептид по (B), где вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин.
(D) Пептид по (B), где C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.
В настоящем документе «пептид, который проявляет активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры», означает «пептид, обладающий индуцирующей Т-клетки активностью, который стимулирует Т-клетки-киллеры (цитотоксические Т-клетки/CTL)».
Пептид по настоящему изобретению является эпитопным пептидом, содержащим менее приблизительно 40 аминокислот, предпочтительно менее приблизительно 20 аминокислот, более предпочтительно менее приблизительно 15 аминокислот, и включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 и проявляющим активность в виде индукции Т-клеток-киллеров. Более того, пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут включать пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены до тех пор, пока сохраняется способность индуцировать Т-клетки-киллеры. Количество замененных, удаленных, вставленных и/или добавленных остатков обычно составляет пять аминокислот или менее, предпочтительно четыре аминокислоты или менее, более предпочтительно три аминокислоты или менее, даже более предпочтительно одну аминокислоту или две аминокислоты.
.
Варианты пептидов (т.е. пептиды, включающие аминокислотные последовательности, полученные в результате модификации исходных аминокислотных последовательностей путем замены, делеции, вставки и/или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков), как известно, сохраняют исходную биологическую активность (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). Аминокислотная модификация предпочтительно сохраняет свойства исходных аминокислотных боковых цепей. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей включают: гидрофобную аминокислоту (A, I, L, M, F, P, W, Y, V); гидрофильную аминокислоту (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T); и боковые цепи, обладающие следующими функциональными группами или свойствами в целом: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильные группы (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбоновые кислоты и амиды (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основания (R, K, H); и боковые цепи, содержащие ароматические кольца (H, F, Y, W). Буквы в скобках представляют собой однобуквенные коды аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению (иммуногенные пептиды) представляют собой нонапептиды (9-членные) или декапептиды (10-членные).
Для получения пептидов с высоким связывающим сродством и активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры, аминокислотная последовательность пептида - части природного CDCA1 может быть модифицирована путем замены, делеции, вставки и/или добавления одной, двух или нескольких аминокислот. В настоящем документе термин «несколько» относится к пяти или менее, предпочтительно к трем или менее, более предпочтительно к двум или менее. Более того, так как известна упорядоченность пептидных последовательностей, которые обладают высоким сродством к антигенам HLA, (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут быть модифицированы на основе упорядоченности для того, чтобы повысить их сродство к антигенам HLA. Например, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин. Сходно, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть также получены путем замены C-концевой аминокислоты на валин или лейцин.
Когда последовательность эпитопного пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего отличной функцией, могут вызываться побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические симптомы против конкретного вещества. Для того, чтобы избежать таких побочных эффектов модифицированный эпитопный пептид не должен быть идентичным аминокислотным последовательностям известных белков. Для этой цели необходимо осуществить поиск гомологии с использованием доступных баз данных для подтверждения того, что не существует эндогенного или экзогенного белка с отличной функцией, который имеет 100% гомологию с модифицированным эпитопным пептидом. С помощью этой процедуры можно избежать рисков, обусловленных указанной выше модификацией аминокислотной последовательности для повышения связывающего сродства к антигенам HLA и/или повышения активности, индуцирующей Т-клетки-киллеры.
51
Хотя указанные выше пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигенам HLA, как предполагается, являются высокоэффективными в качестве вакцин против рака, кандидатные пептиды, отобранные с использованием в качестве показателя высокое связывающее сродство, необходимо проверить, обладают ли они действительно активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Активность, индуцирующая Т-клетки-киллеры, может быть подтверждена с помощью: индукции антигенпрезентирующих клеток, обладающих антигеном MHC человека (например, В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток), более конкретно индукции дендритных клеток, происходящих от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; стимуляции их интересующим пептидом; затем смешивания их с CD8-позитивными клетками; и измерения цитотоксической активности в отношении клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые экспрессируют антиген HLA человека (как описано, например, в BenMohamed L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79, относящихся к этому статьях, книгах и адресах связи). Например, для измерения цитотоксической активности клетки-мишени метят радиоактивным изотопом Cr или тому подобным. Цитотоксическая активность на клетках-мишенях может быть проверена с помощью измерения IFN-γ, продуцируемого и секретируемого Т-клетками-киллерами в присутствии антигенпрезентирующих клеток, обладающих иммобилизованным пептидом; и визуализации зоны продукции IFN-γ в культуральной среде с использованием моноклонального антитела против IFN-γ.
Как показано в примерах, данные по тестированию активности пептидов, индуцирующей Т-клетки-киллеры, продемонстрировали, что пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигену HLA не обязательно обладают высокой активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Однако пептиды, содержащие аминокислотные последовательности CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEQ ID NO:1)) и CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEQ ID NO:2)) проявили особенно высокую активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры.
Как описано выше, в настоящем изобретении предлагаются пептиды, проявляющие активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, более конкретно, пептиды, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 и их варианты (т.е. аминокислотные последовательности, в которых одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены). Предпочтительно, аминокислотные последовательности пептидов, включающие девять аминокислот SEQ ID NO: 1 или 2, или их варианты не идентичны последовательностям других эндогенных белков. Особенно пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин и/или путем замены C-концевой аминокислоты на валин или лейцин.
Пептиды по настоящему изобретению могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи и фосфорилирование, до тех пор, пока пептиды не потеряют свою активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры. Другие модификации включают, например, D-аминокислоты и другие аминокислотные аналоги, которые могут быть использованы для повышения периода полужизни пептидов в сыворотке.
Методы получения и продукции пептидов по настоящему изобретению особенно не ограничены. Пригодны химически синтезированные пептиды или рекомбинантные пептиды, продуцируемые с помощью методов рекомбинации генов.
Химически синтезированные пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы в соответствии с методами химического синтеза, такими как метод Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный метод) и метод t-Boc (трет-бутилоксикарбонильный метод). Пептиды по настоящему изобретению могут быть также синтезированы с использованием различных имеющихся в продаже пептидных синтезаторов.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде рекомбинантных белков с помощью получения ДНК, обладающих нуклеотидными последовательностями, кодирующими пептиды или их варианты или гомологи, и введения их в подходящую экспрессионную систему.
Используемые экспрессионные векторы могут быть предпочтительно любыми векторами, которые могут автономно дуплицироваться в клетках-хозяевах или могут быть включены в хромосому клеток-хозяев и содержат промотор в положении, подходящем для разрешения экспрессии гена, кодирующего пептид. Трансформированные клетки, обладающие геном, кодирующим пептид по настоящему изобретению, могут быть получены путем введения указанного выше экспрессионного вектора хозяину. Хозяин может представлять собой любое из бактерий, дрожжей, животных клеток и клеток насекомых, и экспрессионный вектор может быть введен хозяину с использованием известных способов в зависимости от хозяина.
В настоящем изобретении рекомбинантные пептиды могут быть выделены путем культивирования трансформированных клеток, полученных, как описано выше, продукции и накопления пептидов в культуре и получения пептидов по настоящему изобретению из культуры.
Когда трансформированной клеткой является прокариот, такой как E. coli, или эукариот, такой как дрожжи, культуральная среда для этих микроорганизмов может быть либо природной, либо синтетической средой, до тех пор, пока она содержит источник углерода, источник азота, неорганические соединения и тому подобное, что может быть использовано микроорганизмами и позволяет эффективно культивировать трансформированную клетку. Условия культивирования могут быть условиями, традиционно используемыми для культивирования микроорганизмов. После культивирования пептиды по настоящему изобретению могут быть выделены из культуры трансформированных клеток и очищены с использованием общепринятых методов выделения и очистки пептидов.
nd
nd
Пептиды, включающие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 могут быть подходящим образом продуцированы или получены специалистом в данной области техники на основе информации о последовательности нуклеотидов в ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2. Конкретно, ген, который кодирует пептид, включающий аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и проявляющий активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, может быть получен с помощью любых методов, известных специалистам в данной области техники, таких как химический синтез, методы генной инженерии и мутагенез. Например, пригоден метод сайт-направленного мутагенеза, который является одним из методов генной инженерии, так как с его помощью можно вводить конкретную мутацию в конкретное положение. Он может быть осуществлен в соответствии с методами, описанными в руководствах Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (обозначаемом в настоящем документе далее как Molecular Cloning, 2 Ed.) и Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (обозначаемом в настоящем документе далее как Current Protocols in Molecular Biology) и т.д.
Описанные выше пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать иммунитет против рака, как показано в примерах ниже. Следовательно, в настоящем изобретении предлагаются средства для индукции иммунитета против рака, включающие пептиды по настоящему изобретению.
Индуцирующие иммунитет средства по настоящему изобретению могут быть получены в виде смешанного состава, объединенного с двумя или более эпитопными пептидами. Индуцирующие иммунитет средства, приготовленные путем объединения множественных типов пептидов, могут представлять собой коктейль или могут быть совместно связаны с использованием стандартных методов. Эпитопные пептиды, предназначенные для объединения, могут представлять собой пептиды, обладающие различными аминокислотными последовательностями, происходящими от одного и того же гена, или могут представлять собой пептиды, обладающие различными аминокислотными последовательностями, происходящими от разных генов. Когда вводят пептиды по настоящему изобретению, вводимые пептиды презентируются на антигенах HLA антигенпрезентирующих клеток с высокой плотностью, и затем индуцируются Т-клетки-киллеры, которые специфически взаимодействуют с комплексами, образованными вводимыми пептидами и антигенами HLA. Альтернативно, путем контактирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, с пептидами по настоящему изобретению (т.е. путем пульсирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, пептидами по настоящему изобретению) могут быть получены антигенпрезентирующие клетки, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. С помощью введения этих антигенпрезентирующих клеток обратно индивидууму в организме индивидуума могут быть индуцированы Т-клетки-киллеры и в результате иммунный ответ на клетки-мишени, презентирующие пептиды по настоящему изобретению, может быть увеличен.
При использовании in vitro или in vivo, предпочтительно in vitro, средства для индукции иммунитета против рака по настоящему изобретению могут индуцировать Т-клетки-хелперы, Т-клетки-киллеры или популяции иммуноцитов, включающие эти клетки, тем самым обеспечивая иммунитет против рака.
(2) Средства по настоящему изобретению для лечения и/или профилактики рака (вакцины против рака)
В примерах показано, что пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать in vivo Т-клетки-киллеры, специфичные в отношении раковых клеток. С другой стороны, в предшествующем изобретении было показано, что CDCA1 в высокой степени экспрессировался в большинстве случаев рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей, рака ободочной кишки и тому подобное. Соответственно, индуцирующие иммунитет средства, включающие один или более пептидов по настоящему изобретению, как ожидается, являются эффективными в качестве активного ингредиента как средства для лечения и/или профилактики рака. Это значит, что можно ожидать индукцию и активацию Т-клеток-киллеров, атакующих опухоль, в результате введения в организм пептидов по настоящему изобретению совместно с подходящим адъювантом или в результате пульсирования антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, пептидами и затем их введения в организм. Таким образом, в конечном итоге могут ожидаться противоопухолевые эффекты. Более того, ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению, может быть введен в подходящий вектор. Антигенпрезентирующие клетки человека (дендритные клетки и т.д.) и бактерии, такие как BCG, Mycobacterium tuberculosis, которые трансформированы рекомбинантной ДНК или вирусами, такими как вирусы коровьей оспы, которые содержат ДНК, кодирующую пептид по настоящему изобретению, включенную в их геном, можно эффективно использовать в качестве живых вакцин для лечения и/или профилактики рака человека. Дозировки и методы введения вакцин против рака являются такими же, что и для обычных вакцин против оспы и вакцин BCG.
В настоящем изобретении термин «вакцина» (также называемая «иммуногенной композицией») относится к веществу, которое индуцирует противоопухолевый иммунитет или подавляет различные типы рака при инокуляции животному. По настоящему изобретению предполагается, что пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, представляет собой ограниченный HLA-A2 эпитопный пептид, который может индуцировать сильный и специфичный иммунный ответ против клеток, презентирующих CDCA1. Соответственно, настоящее изобретение также включает способы индукции противоопухолевого иммунитета с помощью использования пептидов, включающих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 или ее варианты, которые включают замену, делецию или добавление одной, двух или нескольких аминокислот. В целом, противоопухолевый иммунитет включает следующие иммунные ответы:
(1) индукцию Т-клеток-киллеров против опухолей, содержащих клетки, экспрессирующие CDCA1,
(2) индукцию антител, которые узнают опухоли, содержащие клетки, экспрессирующие CDCA1, и
(3) индукцию продукции противоопухолевых цитокинов.
Когда конкретный пептид индуцирует любой из этих иммунных ответов при инокуляции животному, пептид определяется как обладающий эффектом, индуцирующим противоопухолевый иммунитет. Индукция пептидом противоопухолевого иммунитета может быть определена по обнаружению in vivo или in vitro ответа иммунной системы хозяина на пептид.
+
+
+
Например, хорошо известны методы определения индукции Т-клеток-киллеров. Чужеродное вещество, которое вторгается в живой организм, представляется Т-клеткам и В-клеткам под действием антигенпрезентирующих клеток (APC). Т-клетки, которые отвечают на антигены, презентируемые антигенпрезентирующими клетками специфическим для антигена образом, дифференцируются в Т-клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-лимфоцитами или CTL) путем стимуляции антигенами и последующей пролиферации. В настоящем документе этот процесс называется «активацией» Т-клеток. Индукция Т-клеток-киллеров специфическим пептидом может быть оценена путем презентации пептида Т-клеткам с использованием пульсированных пептидом антигенпрезентирующих клеток и последующего определения индукции Т-клеток-киллеров. Более того, антигенпрезентирующие клетки обладают эффектом в отношении активации CD4 Т-клеток, CD8 Т-клеток, макрофагов, эозинофилов и NK-клеток. Так как CD4 Т-клетки также важны для противоопухолевого иммунитета, действие пептида, индуцирующее противоопухолевый иммунитет, может быть оценено при использовании в качестве показателя действия на активацию этих клеток.
51
3
Метод оценки эффекта индукции Т-клеток-киллеров, которые индуцируются с использованием в качестве антигенпрезентирующих клеток дендритных клеток (DC), хорошо известен в данной области техники. Среди антигенпрезентирующих клеток DC обладают наиболее сильным эффектом на индукцию Т-клеток-киллеров. При этом методе первоначально тестируемый пептид вводят в контакт с DC и затем DC вводят в контакт с Т-клетками. В Т-клетках, контактировавших с DC, определяют Т-клетки, которые обладают цитотоксическим эффектом на клетки-мишени. Если Т-клетки проявляют цитотоксическую активность против клеток-мишеней, это означает, что тестируемый пептид обладает активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Активность Т-клеток-киллеров против клеток-мишеней, таких как клетки опухолей, может быть определена, например, с использованием в качестве показателя лизиса клеток опухолей, меченных Cr. Альтернативно, степень повреждения опухолевых клеток может быть оценена с использованием в качестве показателя активность включения H-тимидина или секрецию LDH (лактатдегидрогеназы).
Тестируемые пептиды, для которых этими методами подтверждена активность, индуцирующая Т-клетки-киллеры, представляют собой пептиды, которые обладают эффектом активации DC и последующей активностью в отношении индукции Т-клеток-киллеров. Следовательно, пептиды, которые индуцируют Т-клетки-киллеры против опухолевых клеток, пригодны в качестве вакцин против типов рака, презентирующих CDCA1. Более того, антигенпрезентирующие клетки, которые приобрели способность индуцировать Т-клетки-киллеры против типов рака в результате контакта с пептидами, пригодны в качестве вакцин против типов рака. Кроме того, Т-клетки-киллеры, которые приобрели цитотоксичность в результате презентации пептидов антигенпрезентирующими клетками, также могут быть использованы в качестве вакцин против типов рака, презентирующих CDCA1. Методы лечения рака с использованием противоопухолевого иммунитета, вызываемого антигенпрезентирующими клетками и Т-клетками-киллерами, называются цитоиммунотерапией.
В целом, при использовании пептидов для цитоиммунотерапии эффективность индукции Т-клеток-киллеров может быть повышена путем объединения многих пептидов, имеющих различную структуру. Следовательно, при стимуляции DC фрагментами белка выгодно использовать смесь многих типов пептидных фрагментов.
Индукция противоопухолевого иммунитета пептидами может быть также оценена с помощью выявления индукции продукции антител против опухолей. Например, когда индуцируются антитела против пептидов путем иммунизации лабораторных животных пептидами, и они подавляют рост, пролиферацию и/или метастазирование опухолевых клеток, это свидетельствует о том, что пептиды индуцируют противоопухолевый иммунитет.
Противоопухолевый иммунитет может быть индуцирован путем введения вакцины по настоящему изобретению, и индукция противоопухолевого иммунитета дает возможность лечить и/или предотвращать типы рака. Эффекты лечения рака и/или профилактики развития рака могут включать ингибирование роста раковых клеток, регрессию раковых клеток и подавление развития раковых клеток. Снижение степени смертности индивидуумов от рака, снижение маркеров опухоли в крови и снижение определяемых симптомов, связанных с раком, также включаются в эффекты лечения и/или профилактики рака. Терапевтические или профилактические эффекты вакцины против рака являются предпочтительно статистически значимыми по сравнению с эффектами в контроле без введения вакцины. Например, наблюдаются эффекты предпочтительно с уровнем значимости 5% или менее. Для определения статистической значимости могут быть использованы статистические методы, такие как t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни и ANOVA.
В настоящем изобретении индивидуум представляет собой предпочтительно млекопитающее. Примеры млекопитающих включают людей, нечеловекообразных приматов, мышей, крыс, собак, кошек, лошадей и крупный рогатый скот, но не ограничиваются этим.
Пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму in vivo или ex vivo. Более того, для получения иммуногенной композиции для лечения и/или профилактики рака могут быть использованы иммуногенные пептиды по настоящему изобретению, которые представляют собой нонапептиды, выбранные из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2 и их мутантные пептиды.
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические средства для лечения опухоли и/или профилактики опухолевого роста, метастазирования и тому подобное, которые включают в качестве активного ингредиента один или более пептидов по настоящему изобретению. Пептиды по настоящему изобретению особенно пригодны для лечения опухолей, таких как рак легких, холангиоцеллюлярная карцинома, рак мочевого пузыря, почечно-клеточная карцинома, рак простаты, хронический миелогенный лейкоз, злокачественная лимфома, рак шейки матки, остеосаркома, рак молочной железы, саркома мягких тканей и рак ободочной кишки.
Пептиды по настоящему изобретению можно вводить непосредственно индивидууму в качестве фармацевтических средств, приготовленных с помощью традиционных методов составления. Такие составы могут при необходимости содержать в дополнение к пептидам по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые носители, наполнители и тому подобное. Фармацевтические средства по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики различных опухолей.
Более того, для установления эффективного клеточного иммунитета можно смешивать адъюванты с иммуногенными композициями для лечения и/или профилактики опухолей, включающими один или более пептидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Средства можно вводить совместно с другими активными ингредиентами, такими как противоопухолевые средства. Подходящие составы включают также гранулы. Подходящие адъюванты описаны в литературе (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89). Примеры адъювантов включают неполный адъювант Фрейнда, BCG, трегалозы димиколат (TDM), липополисахарид (LPS), адъювант квасцовой муки, адъювант диоксида кремния, фосфат алюминия, гидроксид алюминия и квасцы, но не ограничиваются этим. Кроме того, можно легко использовать липосомные составы, гранулярные составы, в которых лекарство связано с шариками, имеющими диаметр несколько микрометров, и составы, в которых липиды связаны с упомянутыми выше пептидами. Методами введения могут быть пероральное введение, внутрикожная инъекция, подкожная инъекция, внутривенная инъекция или тому подобное и могут включать системное введение и местное введение рядом с опухолью-мишенью.
Доза пептидов по настоящему изобретению может быть приведена в соответствие с подлежащим лечению заболеванием, возрастом и массой тела больного, методом введения и тому подобным. Доза обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, предпочтительно от 0,01 мг до 100 мг и наиболее предпочтительно от 0,1 мг до 10 мг. Предпочтительно введение производят от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев, но специалисты в данной области техники могут легко выбрать подходящую дозу и метод введения; выбор и оптимизация этих параметров полностью входят в объем традиционных методов. Форма составов не является особенно ограниченной, и они могут быть высушенными замораживанием или гранулированными путем добавления наполнителей, таких как сахар.
К фармацевтическим средствам по настоящему изобретению могут быть добавлены вспомогательные средства для повышения индуцирующей киллерную T-клеточную активность, которые включают бактериальные компоненты бактерий BCG и тому подобного, включающие мурамиловый дипептид (MDP), ISCOM, описанный в Nature, vol. 344, p873 (1990), QS-21 ряда сапонина, описанный в J. Immunol. vol. 148, p1438 (1992), липосому и гидроксид алюминия. Более того, в качестве вспомогательных средств также могут быть использованы иммуностимуляторы, такие как лентинан, сизофиран и пицибанил. В качестве вспомогательных средств также могут быть использованы цитокины и им подобное, которые повышают рост и дифференцировку T-клеток, такие как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО, а также α-галактозилцерамид, который активирует NK T-клетки, и CpG и липополисахариды (LPS), которые активируют систему врожденного иммунитета путем связывания с Toll-подобными рецепторами, и тому подобное.
Композиции вакцины по настоящему изобретению содержат компонент, который примирует киллерные T-клетки. В качестве веществ, которые примируют против вирусных антигенов in vivo, были идентифицированы липиды. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут связываться с ε-аминогруппой и α-аминогруппой остатка лизина и затем присоединяться к иммуногенному пептиду по настоящему изобретению. Содержащие липиды пептиды можно прямо вводить путем их включения в мицеллу или частичку или их инкапсулирования в липосому или их эмульгирования в адъюванте. Другим примером примирования липидом является примирование липопротеидом E. coli, таким как трипальмитоил-S-глицерил-цистеинилсерил-серин (P3CSS), ковалентно связанным с подходящим пептидом (Deres K., et al., (1989) Nature 342:561-4).
Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы с помощью вирусных векторов или бактериальных векторов. Примеры подходящих экспрессионных векторов включают авирулентные вирусы-хозяева, такие как вирус коровьей оспы и птичьей оспы. Например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, может быть использован вирус коровьей оспы. Путем введения рекомбинантного вируса коровьей оспы в клетки-хозяева осуществляется экспрессия иммуногенных пептидов, вызывающих иммунный ответ. Метод иммунизации с использованием векторов коровьей оспы описан, например, в патенте США No. 4722848. Можно также использовать бациллу Кальметта-Герина (BCG). Векторы BCG описаны в Stover CK, et al., (1991) Nature 31:456-60. В данной области техники известно множество других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, включая аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы бациллы тифа (Salmonella typhi) и детоксифицированные токсиновые векторы сибирской язвы. См., например, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; и Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.
Киллерные T-клетки можно эффективно индуцировать в организме больного путем добавления in vitro антигенного пептида к клеткам, выделенным из больного, или клеткам от другого индивидуума, имеющим некоторые общие аллели HLA (аллогенным клеткам) и презентирующим антиген, с последующим введением клеток больному в сосуды, местно в опухоль или тому подобное. Альтернативно, после индукции in vitro киллерных T-клеток добавлением пептида к лимфоцитам периферической крови больного и их культивирования in vitro клетки можно вводить больному в сосуды, местно в опухоль или тому подобное. Такое лечение переносом клеток уже проводилось в качестве противораковой терапии и является хорошо известным для специалистов в данной области техники методом.
Тип рака в настоящем изобретении не является особо ограниченным, и конкретные примеры включают рак легких, холангиоцеллюлярную карциному, рак мочевого пузыря, карциному клеток почки, рак простаты, хронический миелогенный лейкоз, злокачественную лимфому, рак шейки матки, остеосаркому, рак молочной железы, саркому мягких тканей, рак прямой кишки и т.д. Примеры рака, к которому применимо настоящее изобретение, включают рак легких.
(3) Антитела по настоящему изобретению
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые узнают упомянутый выше полноразмерный пептид по настоящему изобретению или его часть в качестве эпитопа (антигена), и относится к киллерным T-клеткам, которые индуцируются путем стимуляции in vitro белками или пептидами. В целом, киллерные T-клетки проявляют большую противоопухолевую активность по сравнению с антителами.
Более того, подобно пептидам по настоящему изобретению, антитела по настоящему изобретению пригодны в качестве профилактических и/или терапевтических средств против типов рака, экспрессирующих CDCA1, поскольку они могут ингибировать активность ракового антигена CDCA1. При практическом использовании пептиды или антитела по настоящему изобретению можно вводить в том виде, в котором они находятся, или путем инъекции с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем вместе с адъювантом, если это необходимо. Альтернативно, их можно вводить путем чрескожного всасывания через мембраны слизистой с помощью метода распыления или тому подобного. Конкретнее, в настоящем описании примером носителей является человеческий сывороточный альбумин; и PBS, дистиллированная вода и тому подобное служат примерами разбавителей.
Антителами по настоящему изобретению могут быть поликлональные антитела или моноклональные антитела и их можно получать с помощью методов, известных специалистам в данной области техники.
Например, поликлональные антитела могут быть получены путем иммунизации видов млекопитающих или птиц пептидом по настоящему изобретению в качестве антигена, отбора крови от видов млекопитающих или птиц и отделения и очистки антител из собранной крови. Например, можно иммунизировать млекопитающих, таких как мышь, хомячок, морская свинка, цыпленок, крыса, кролик, собака, коза, овца и корова, или виды птиц. Методы иммунизации известны специалистам в данной области техники, и антиген можно вводить, например, два или три раза с интервалом от 7 до 30 дней. Доза может составлять, например, приблизительно от 0,05 мг до 2 мг антигена на введение. Путь введения не является особо ограниченным и может быть подходящим образом выбран из подкожного введения, внутрикожного введения, внутрибрюшинного введения, внутривенного введения, внутримышечного введения и тому подобного. Более того, антиген можно использовать после растворения в подходящем буфере, например, буфере, содержащем традиционный адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда и гидроксид алюминия.
Иммунизированные виды млекопитающих или птиц можно растить в течение определенного периода времени, и после увеличения титра антитела их можно дополнительно иммунизировать, например, от 100 мкг до 1000 мкг антигена. Кровь у иммунизированных видов млекопитающих или птиц можно отбирать на протяжении от одного до двух месяцев после последнего введения, и кровь может быть отделена и очищена традиционными методами, такими как центрифугирование, осаждение сульфатом аммония или полиэтиленгликолем, хроматография, такая как хроматография гельфильтрацией, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное, для получения поликлональных антител, которые узнают пептиды по настоящему изобретению, в виде поликлональной антисыворотки.
С другой стороны, могут быть получены моноклональные антитела путем получения гибридом. Например, гибридомы могут быть получены слиянием клеток, продуцирующих антитело, с клеточными линиями миеломы. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела по настоящему изобретению, могут быть получены методами слияния клеток, такими, как указанные ниже.
В качестве продуцирующих антитело клеток используют клетки селезенки, клетки лимфатического узла, B-лимфоциты и тому подобное от иммунизированных животных. В качестве антигенов используют пептиды по настоящему изобретению. В качестве иммунизируемых животных можно использовать таких животных, как мышь и крыса, а введение антигенов этим животным производят традиционными методами. Например, животных иммунизируют введением суспензии или эмульсии пептида по настоящему изобретению, являющегося антигеном, с адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, животным несколько раз внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутрибрюшинно или тому подобное. Продуцирующие антитело клетки, такие как клетки селезенки, получают от иммунизированных животных, и они могут быть слиты с миеломными клетками с помощью известных методов (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)) с образованием гибридом.
В случае мышей примеры линий клеток миелом, используемых для слияния клеток, включают, например, линии P3X63Ag8, P3U1, Sp2/0 и т.д. Для слияния клеток используют стимулирующее слияние средство, такое как полиэтиленгликоль и вирус Сендай, а для селекции гибридом с помощью традиционного метода после слияния клеток используют среду гипоксантин/аминоптерин/тимидин (HAT). Гибридомы, полученные слиянием клеток, клонируют методом серийных разведений или тому подобное. При необходимости клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, которые специфически узнают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием пептидов по настоящему изобретению для скрининга с помощью иммуноферментного метода.
В дополнение к указанным выше методам иммунизированные клетки можно модулировать стимулирующими лимфоцитами человека, такими как инфицированные вирусом EB лимфоциты, in vitro с использованием пептидов по настоящему изобретению, клеток, экспрессирующих пептиды, или их лизатов. Человеческие антитела, которые связывают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены слиянием иммунизированных лимфоцитов с клетками костного мозга от человека, такими как U266 (патентная заявка Японии, публикация Kokai No. (JP-A) S63-17688 (нерассмотренная опубликованная Японская патентная заявка)).
Для получения представляющих интерес моноклональных антител из полученных таким образом гибридом гибридомы можно культивировать с помощью традиционных методов культивирования или методов образования асцитов, и моноклональные антитела могут быть очищены из культурального супернатанта или асцитов. Очистка моноклональных антител из культуральных супернатантов или асцитов может быть осуществлена традиционными методами. Например, могут быть подходящим образом объединены и использованы фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное.
Трансгенных животных, содержащих группу генов человеческих антител, можно иммунизировать с использованием пептидов по настоящему изобретению, экспрессирующих пептиды клеток или их лизатов. Продуцирующие антитело клетки можно собрать из иммунизированных трансгенных животных и слить с описанными выше миеломными клеточными линиями для получения гибридом. Затем из гибридом можно получить интересующие моноклональные антитела (WO92/03918; WO94/02602; WO94/25585; WO94/33735; WO96/34096).
Более того, продуцирующим антитело иммунным клеткам, таким как иммунизированные лимфоциты, может быть придано бессмертие с помощью онкогенов, и их можно использовать для получения моноклональных антител.
Полученные таким образом моноклональные антитела можно также модулировать с помощью методов генной манипуляции (Borrbaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies). Например, рекомбинантные антитела могут быть получены клонированием ДНК, кодирующей антитело из продуцирующих антитело клеток, таких как гибридомы и иммунизированные лимфоциты, ее вставкой в подходящий вектор и его введением в клетки-хозяева.
Антителами по настоящему изобретению могут быть фрагменты антител или модифицированные антитела, если они связывают пептиды по настоящему изобретению. Фрагментами антител могут быть Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), где фрагменты Fv, берущие начало от H и L цепей, соединены друг с другом с помощью походящего линкера (Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83). Конкретнее, фрагменты антител могут быть получены обработкой антител ферментом, таким как папаин и пепсин (Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121:663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).
Антитела по настоящему изобретению включают модифицированные антитела, полученные путем присоединения антител к различным молекулам, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Антитела могут быть модифицированы традиционными методами химической модификации, известными в данной области техники.
Антитела по настоящему изобретению включают химерные антитела, включающие вариабельную область, берущую начало от антитела, отличного от человеческого, и константную область из антитела человека, и гуманизированные антитела, включающие область, определяющую комплементарность (CDR), берущую начало от антитела, отличного от человеческого, каркасную область (FR) из человеческого антитела и константную область из антитела человека. Такие антитела могут быть получены традиционными методами, известными в данной области техники. Гуманизированные антитела могут быть получены заменой области последовательности CDR антитела человека областью CDR грызуна, обладающей желаемой связывающей активностью (Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6). Соответственно, по сравнению с химерными антителами гуманизированные антитела представляют собой антитела, в которых меньшая область человеческого антитела заменена соответствующей областью с происхождением, отличным от человеческого.
Может быть также получено полностью человеческое антитело, содержащее человеческую вариабельную область в дополнение к человеческим каркасным и константным областям. Например, в методе in vitro может быть проведен скрининг с помощью рекомбинантной библиотеки бактериофагов, в которой представлены фрагменты человеческих антител (Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). Сходным образом человеческие антитела могут быть получены введением иммуноглобулиновых локусов человека трансгенным животным, у которых эндогенные иммуноглобулиновые гены были частично или полностью инактивированы (патенты США No. 6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016).
Полученные как описано выше антитела могут быть очищены до гомогенности традиционными для данной области техники методами. Например, могут быть использованы общие методы выделения и очистки белков. Антитела могут быть выделены и очищены с помощью сочетания колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в полиакриламидном геле с SDS, электрофокусирования и тому подобного; однако методы выделения и очистки этим не ограничиваются (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). В качестве аффинных колонок могут быть использованы колонки протеина A и колонки протеина G. Примеры колонок протеина A включают HyperD, POROS, и сефарозу F.F (Pharmacia).
Примеры хроматографии, отличной от аффинной хроматографии, включают ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гельфильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и тому подобное (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). Для хроматографии может быть также использована жидкостная хроматография, такая как ВЭЖХ и FPLC.
Сродство связывания антигена антителами по настоящему изобретению может быть измерено с помощью, например, измерения поглощения, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммунологического анализа (RIA) и иммунофлуоресцентного анализа; однако, методы этим не ограничиваются. В ELISA антитела по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете и добавляют пептиды по настоящему изобретению, после чего добавляют образец, содержащий культуральный супернатант продуцирующих антитело клеток или очищенные антитела. Затем добавляют вторые антитела, которые содержат выявляемую метку и узнают антитело, сродство которого к связываемому антигену измеряют. После промывки планшета добавляют реагенты для выявления метки второго антитела и измеряют поглощение или тому подобное. Например, в качестве метки для второго антитела могут быть использованы ферменты, такие как щелочная фосфатаза, а в качестве реагентов для выявления могут быть использованы субстраты ферментов, такие как п-нитрофенилфосфат. Для оценки активности антител может быть также использован BIAcore (Pharmacia).
Антитела по настоящему изобретению могут определять пептиды по настоящему изобретению, содержащиеся в образцах. Конкретно, наличие пептидов по настоящему изобретению в раковых тканях может быть подтверждено, например, введением в контакт биоптатов раковых тканей с антителами по настоящему изобретению.
Перед использованием пептидов по настоящему изобретению в терапии для лечения и/или профилактики рака возможно предсказание перспективности действия для тестируемого индивидуума до начала лечения путем оценки экспрессии пептидов по настоящему изобретению в раковой ткани, подлежащей лечению с помощью антител по настоящему изобретению.
Более того, поскольку антитела по настоящему изобретению узнают пептидные фрагменты CDCA1, экспрессия которого усилена в различных раковых клетках, ожидается, что их использование применимо не только для диагностики, но и для лечения.
(4) Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов
Настоящее изобретение также относится к хелперным T-клеткам и киллерным T-клеткам, индуцированным путем стимуляции in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению, а также к популяциям иммуноцитов, включающим хелперные T-клетки и киллерные T-клетки. Например, T-клетки с активированным ответом на опухоль индуцируются, когда лимфоциты периферической крови или инфильтрованные в опухоль лимфоциты стимулируют in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению, и эти активированные T-клетки могут быть эффективно использованы для адоптивной иммунотерапии. Альтернативно, дендритные клетки, которые являются эффективными антигенпрезентирующими клетками, могут быть пульсированы пептидами по настоящему изобретению или генетически трансформированы для экспрессии пептидов, и противоопухолевый иммунный ответ может быть индуцирован стимуляцией T-клеток in vivo или in vitro с использованием дендритных клеток.
Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов могут быть предпочтительно индуцированы стимуляцией in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению и адъюванта. Используемые в настоящем описании адъюванты включают факторы роста клеток и цитокины.
Опухоли могут быть подавлены и рак может быть предотвращен и/или излечен путем трансфузии полученных таким образом хелперных T-клеток, киллерных T-клеток или включающих их популяций иммуноцитов больному раком внутрь сосудов, местно в опухоль или тому подобного.
Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов, которые способны подавлять опухоли, как описано выше, могут быть получены с помощью пептидов по настоящему изобретению. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются среды клеточных культур, содержащие пептиды по настоящему изобретению. Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов, способные подавлять опухоли, могут быть получены с помощью сред клеточных культур. Более того, в настоящем изобретении предлагается набор для клеточной культуры, включающий упомянутую выше среду для клеточной культуры и сосуд для клеточной культуры, для получения хелперных T-клеток, киллерных T-клеток или включающих их популяций иммуноцитов.
(5) Антигенпрезентирующие экзосомы
В настоящем изобретении дополнительно предлагается эндоцитозная везикула, называемая «экзосомой», которая презентирует на своей поверхности комплекс, образованный из пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Экзосомы могут быть получены, например, с помощью методов, подробно описанных в Японских переводах патентных заявок Японии, публикации Kokai No. (JP-A) H11-510507 (нерассмотренной публикации национальной фазы, соответствующей отличной от Японской международной публикации) и JP-A (Kohyo) 2000-512161. Предпочтительно экзосомы получают с использованием антигенпрезентирующих клеток, полученных от индивидуума, подлежащего лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению можно инъецировать в качестве противораковой вакцины способом, сходным с введением пептидов по настоящему изобретению.
Антигенный тип HLA, используемый в настоящем изобретении, должен совпадать с антигенным типом HLA индивидуума, нуждающегося в лечении и/или профилактике. Например, антигенный тип HLA представляет собой HLA-A02 и, предпочтительно, HLA-A2 (HLA-A*0201). “HLA-A2” означает белок, тогда как “(HLA-A*0201)” означает ген, соответствующий сегменту белка, из-за отсутствия в настоящее время терминологии для экспрессии сегментов белка.
(6) Методы индукции антигенпрезентирующих клеток и киллерных T-клеток
В настоящем изобретении предлагаются способы индукции антигенпрезентирующих клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Антигенпрезентирующие клетки могут быть индуцированы путем введения в контакт дендритных клеток, индуцированных из моноцитов периферической крови, с одним или более пептидами по настоящему изобретению для стимуляции дендритных клеток. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, антигенпрезентирующие клетки, презентирующие пептиды по настоящему изобретению на своей поверхности, могут быть индуцированы в организме индивидуума. Альтернативно, может быть использован метод ex vivo, в котором антигенпрезентирующие клетки пульсируют пептидами по настоящему изобретению, после чего клетки вводят индивидууму в качестве вакцины. Например, введение ex vivo может включать стадии:
(1) сбора антигенпрезентирующих клеток от индивидуума; и
(2) введения в контакт антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) с пептидом по настоящему изобретению (пульсирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) пептидом по настоящему изобретению).
Антигенпрезентирующие клетки, полученные на стадии (2), можно вводить индивидууму в качестве вакцины.
В настоящем изобретении также предлагаются способы индукции антигенпрезентирующих клеток, которые проявляют высокий уровень индуцирующей активности киллерных T-клеток. Методы включают стадию трансфекции антигенпрезентирующих клеток in vitro геном, включающим полинуклеотид, кодирующий один или более пептидов по настоящему изобретению. Предназначенный для трансфекции ген может представлять собой ДНК или РНК. Для трансфекции могут быть соответствующим образом использованы различные методы, традиционно применяемые в данной области техники, такие как липофекция, электропорация и метод фосфата кальция, но этим методы не ограничиваются. Конкретнее, трансфекцию можно произвести, как описано в Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; и WO99/08521. Когда гены трансфицируют в антигенпрезентирующие клетки, они транскрибируются и транслируются в клетках. Полученные белки затем подвергаются процессингу через пути MHC класса I и класса II и презентируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток в виде частичных пептидов посредством пути презентации антигена.
В настоящем изобретении также предлагаются способы индукции киллерных T-клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Путем введения одного или более пептидов по настоящему изобретению индивидууму киллерные T-клетки могут быть индуцированы в организме индивидуума, что тем самым усиливает иммунную систему против раковых клеток, презентирующих CDCA1 в опухолевых тканях. Альтернативно, активированные киллерные T-клетки могут быть индуцированы путем введения в контакт антигенпрезентирующих клеток и CD8-позитивных клеток от индивидуума с одним или более пептидами по настоящему изобретению in vitro и путем введения в контакт мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с антигенпрезентирующими клетками in vitro для стимуляции клеток. В терапевтических методах ex vivo иммунная система, которая направлена против раковых клеток, презентирующих CDCA1 в опухолевых тканях у индивидуума, может быть усилена возвращением активированных киллерных T-клеток в организм индивидуума. Например, методы включают стадии:
(1) сбора антигенпрезентирующих клеток от индивидуума;
(2) введения в контакт антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) с пептидом по настоящему изобретению (пульсирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) пептидом по настоящему изобретению);
+
(3) смешивания и совместного культивирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (2) с CD8 T-клетками для индукции цитотоксических T-клеток; и
+
(4) сбора CD8 T-клеток из совместной культуры стадии (3).
+
CD8 T-клетки с цитотоксической активностью, полученные на стадии (4), могут быть введены индивидууму в качестве вакцины.
В настоящем изобретении также предлагаются выделенные киллерные T-клетки, индуцированные с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно киллерные T-клетки, индуцированные методом по настоящему изобретению, получают от индивидуума, который подвергается лечению и/или профилактике. Клетки можно вводить в сочетании с другими средствами, содержащими антигенпрезентирующие клетки или экзосомы, презентирующие один или более пептидов по настоящему изобретению. Полученные киллерные T-клетки специфичны в отношении клеток-мишеней, презентирующих тот же пептид, который использовался для индукции. Клетками-мишенями являются клетки, эндогенно экспрессирующие CDCA1, или клетки, трансфицированные геном CDCA1. Путем стимуляции пептидом по настоящему изобретению клетки, презентирующие пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, такие как раковые клетки из рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, карциномы клеток почки, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей, рака прямой кишки и тому подобного, могут стать мишенью для атаки.
(7) Рецепторы T-клеток (TCR)
В настоящем изобретении дополнительно предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые формируют субъединицы рецепторов T-клеток (TCR), узнающих CDCA1-1 и CDCA1-4, и методы их использования. TCR содержит, по меньшей мере, семь трансмембранных белков. Связанный дисульфидной связью (α, β) гетеродимер формирует клонотипичную узнающую антиген единицу, тогда как инвариантные цепи CD3, которые состоят из цепей ε, γ, δ, ζ и η, сопрягают связывание лиганда с путем сигнализации, что тем самым вызывает активацию T-клеток и клеточный иммунный ответ. Субъединицы α и β, которые отвечают за узнавание антигена, как упомянуто выше, необходимы T-клеткам для приобретения специфичности в узнавании конкретной мишени. Следовательно, для синтеза TCR, которые специфически узнают пептиды по настоящему изобретению, последовательности нуклеиновых кислот α и β, являющихся субъединицами TCR, которые берут начало от CTL, индуцируемых с помощью пептидов по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы с помощью методов, известных специалистам в данной области техники (WO2007/032255; и Morgan et al., J. Immunol., 171, 3288 (2003)). Поскольку TCR, образуемые из идентифицированных субъединиц TCR, могут связываться с презентирующими пептид CDCA1 клетками-мишенями, TCR полезны при их введении в клетки, обладающие вызывающим гибель клеток действием.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, могут быть включены в подходящие векторы (например, ретровирусные векторы). Векторы могут быть получены методами, известными специалистам в данной области техники. Векторы, включающие субъединицы TCR, могут быть использованы для введения в T-клетки. В частности, путем трансформации T-клеток от больного могут быть получены T-клетки (CTL), которые специфически узнают и атакуют экспрессирующие CDCA1 клетки. Полученные таким образом CTL с введенным TCR можно культивировать и выращивать с помощью общепринятых методов (Kawakami et al., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL, полученные упомянутым выше методом, можно использовать для клеточной иммунотерапии.
В настоящем изобретении также предлагаются антигенпрезентирующие клетки, презентирующие комплекс, образованный из антигена HLA и одного или более пептидов по настоящему изобретению. Антигенпрезентирующие клетки, с которыми контактируют один или более пептидов по настоящему изобретению или нуклеотиды, кодирующие такие пептиды, предпочтительно получают от индивидуума, подлежащего лечению и/или профилактике. Пептиды по настоящему изобретению, антигенпрезентирующие клетки, презентирующие пептиды, экзосомы или активированные киллерные T-клетки можно вводить в качестве вакцины в сочетании с другими лекарствами.
Все ссылки на предшествующий уровень техники, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Настоящее изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на примеры ниже; однако их не следует рассматривать ограничивающие его.
Примеры
[Пример 1]
(1) Отбор репертуара пептидов CDCA1, которые проявляют сродство к HLA-A2
Аминокислотную последовательность CDCA1 человека исследовали с помощью системы BIMAS, и был отобран 41 тип пептидов в порядке снижения оцененного сродства связывания с HLA-A2 (таблица 1).
Подчеркнуты выявленные в настоящем изобретении ограниченные HLA-A2 эпитопы киллерных T-клеток.
[Пример 2]
5
+
+
Во-первых, из клеток костного мозга трансгенных HLA-A2 мышей индуцировали дендритные клетки (DC) с помощью ранее описанного метода (Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006). Полученные таким образом BM-DC пульсировали пептидом CDCA1 (10 мкМ) и затем вводили внутрибрюшинно трансгенным HLA-A2 мышам в количестве 5×10 клеток на мышь. Мышей иммунизировали дважды с однонедельным интервалом с использованием того же метода введения, и клетки их селезенки собирали и использовали для выявления киллерных T-клеток. Для тщательной проверки индукции киллерных T-клеток, берущих начало от CD8 T-клеток, CD4 T-клетки удаляли из клеток селезенки с помощью шариков MACS после выделения селезенки, и использовали оставшиеся клетки.
На фиг. 1 показан протокол определения пептидов CDCA1, узнаваемых ограниченными HLA-A2 киллерными T-клетками у трансгенных HLA-A2 мышей. День, когда были собраны клетки селезенки от иммунизированных мышей, обозначен как «день 0».
День -21: (1) Индукцию дендритных клеток из костного мозга (в настоящем описании ниже обозначаемых как BM-DC) инициировали добавлением GM-CSF к клетками костного мозга HLA-A2 трансгенных мышей.
5
День -14: (2) К индуцированным BM-DC добавляли смесь четырех типов пептидов CDCA1, и через два часа их вводили внутрибрюшинно в количестве 5×10 клеток на мышь.
(1) и (2) повторяли дважды с однонедельным интервалом.
День 0: Клетки селезенки от иммунизированных HLA-A2 трансгенных мышей и культивировали совместно с BM-DC, которые ранее были инкубированы с пептидами CDCA1 в течение двух часов. Их затем культивировали в течение шести дней.
День 6: Для выявления киллерных T-клеток, которые специфически узнают пептиды CDCA1, T-клетки, продуцирующие интерферон гамма после антигенной стимуляции, количественно определяли с помощью анализа ELISPOT. В качестве клеток-мишеней использовали BM-DC, пульсированные каждым отдельным пептидом CDCA1, и BM-DC без пульсирования.
Оценка активности специфичных в отношении CDCA1 киллерных клеток с помощью анализа ELISPOT:
65-73
351-359
С помощью анализа ELISPOT было определено, действительно ли среди индуцированных киллерных T-клеток имеются киллерные T-клетки, которые специфически реагируют на CDCA1 продукцией IFN-γ. IFN-γ определяли с помощью набора ELISPOT для IFN-γ мыши (BD Biosciences). Когда киллерные T-клетки (эффекторы) отвечают на стимулирующие клетки (мишени) и продуцируют IFN-γ, они выявляются в виде красных точек. В качестве клеток-мишеней использовали HLA-A2 позитивные клетки T2A2, которые не экспрессируют CDCA1, и клетки T2A2, пульсированные пептидом CDCA1. Клетки T2A2 клеточной линии, полученной введением гена HLA-A2 в мышиную клеточную линию T2, дефектную по экспрессии гена TAP, были получены от RIKEN Cell Bank. Из-за недостаточности TAP в этих клетках комплексы, образованные между молекулами HLA-A2 и экзогенно добавленными пептидами, экспрессируются на клеточной поверхности только тогда, когда пептиды обладают способностью связываться с молекулами HLA-A2. Сначала планшеты ELISPOT (BD Biosciences) покрывали антителом против IFN-γ мыши в течение 18 часов. Затем планшеты блокировали 10% FCS/RPMI в течение двух часов. Эффекторные клетки (100 мкл/лунку) и клетки-мишени (100 мкл/лунку) смешивали и культивировали в течение 22 часов при 37°С. Эксперимент проводили при соотношении эффектор/мишень (отношение E/T) 5:1. Планшеты затем промывали стерилизованной водой и вводили во взаимодействие с биотинилированным антителом против IFN-γ мыши в течение двух часов и дополнительное взаимодействие со стрептавидин-HRP в течение одного часа. Позитивные в отношении IFN-γ точки выявляли с помощью раствора субстрата. Для подсчета точек использовали программу автоматизированного анализа от MINERVA TECH. Результаты для пептидов с номерами с 1 по 20 показаны на фиг. 1B. По данным сходных экспериментов специфичный в отношении CDCA1 иммунный ответ киллерных T-клеток наблюдался у киллерных T-клеток, индуцированных пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2) из 41 пептида (фиг. 2).
65-73
351-359
Анализ результатов с киллерными T-клетками, индуцированными пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2), показаны на фиг. 2A и 2B, соответственно.
[Пример 3]
Больные, образцы крови и клеточные линии:
Образцы крови от больных NSCLC были получены во время обычных диагностических обследований по информированному согласию. Негативная в отношении CDCA1 клеточная линия рака ободочной кишки человека COLO201 была предоставлена Health Science Research Resources Bank. Экспрессия HLA-A2 в этих образцах была подтверждена проточной цитометрией с использованием моноклонального антитела BB7.2 против HLA-A2 (One Lambda Inc., Canoga Park, CA).
Лентивирусный перенос генов:
4
Опосредованный лентивирусным вектором перенос генов проводили с использованием метода, описанного в Tahara-Hanaoka S, et al. Exp. Hematol. 2002;30:11-17. Вкратце, 17 мкг несущих кДНК CDCA1 самоинактивирующих векторов CSII-CMV-RfA и CSIIEF-RfA (Miyoshi H, et al. J. Virol. 1998;72:8150-8157) и 10 мкг pCMV-VSV-G-RSV-Rev и pHIVgp трансфицировали в клетки 293T в 10-см культуральной чашке с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Через 60 часов культуральную среду собирали, и вирусные частицы осаждали ультрацентрифугированием (50000×g, два часа). Осадок суспендировали в 50 мкл раствора RPMI 1640, и 10 мкл вирусной суспензии добавляли в каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета, содержащего 5×10 клеток COLO201 на лунку. Экспрессия трансфицированного гена CDCA1 была подтверждена с помощью иммуноблоттинга.
Индукция реактивных в отношении CDCA1 человеческих CTL:
4
5
В качестве антигенпрезентирующих клеток для индукции CTL в ответ на презентируемые HLA пептиды использовали DC клетки, берущие начало от моноцитов. DC получали с помощью ранее сообщавшихся методов in vitro (Suda T, et al. Cancer Sci. 2007; Nakahara S, et al. Cancer Res. 2003;63:4112-8). Вкратце, моноциты периферической крови (PBMC), выделенные из позитивных по HLA-A*0201 здоровых добровольцев и больных NSCLC с помощью раствора Ficoll-Paque (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, UK), подвергали скринингу на CD8 позитивные CD14 позитивные популяции с использованием MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). Для получения DC позитивную по CD14 популяцию культивировали в AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% аутологичную плазму в присутствии 100 нг/мл колоние-стимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и 10 нг/мл интерлейкина (ИЛ)-4 (PeproTec Inc., New Jersey, USA). Через четыре дня после инкубации в чашку добавляли OK-432 для получения зрелых DC. Через пять дней после начала культивирования индуцированных цитокинами DC клетки пульсировали 20 мкг/мл связываемого HLA-A2 пептида в течение двух часов при 37°С в AMI-V в присутствии 4 мкг/мл β2-микроглобулина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Эти пульсированные пептидом DC облучали (3500 cGy (сантигрей) (=3500 рад=35 дж/кг) и смешивали в соотношении 1:50 с аутологичными CD8-позитивными T-клетками, полученными из PBMC с помощью MicroBeads (Miltenyi Biotec) против CD8. Инкубацию проводили с использованием 48-луночных планшет, которые получали таким образом, чтобы они содержали в каждой лунке 0,5 мл AMI-V, содержащей 2% аутологичной плазмы, 1×10 пульсированных пептидом DC, 5×10 CD8-позитивных T-клеток и 10 нг/мл ИЛ-7 человека (Wako, Osaka, Япония). Через три дня после инкубации добавляли ИЛ-2 человека (PeproTec Inc.) в концентрации 20 МЕ/мл. Кроме того, T-клетки повторно стимулировали пульсированными пептидом аутологичными DC на 12 и 19 дни. DC получали соответствующим образом с помощью упомянутого выше метода. Через шесть дней после третьей стимуляции пептидом, на 25 день специфичный для антигена ответ CTL оценивали с помощью теста выделения хрома (Cr) и анализа IFN-γ с помощью ELISPOT.
Ответ CTL против клеток-мишеней:
51
51
51
.
2
4
2
CTL совместно культивировали при различных соотношениях эффекторные клетки/клетки-мишени при использовании клеток-мишеней, представленных разными линиями раковых клеток, и клеток T2, пульсированных и непульсированных пептидом, и производили анализ высвобождения Cr и анализ IFN-γ с помощью ELISPOT с использованием традиционных методов (Komori H, et al., Clin. Cancer Res. 2006;12:2689-2697; Makita M, et al Clin. Cancer Res. 2002;8:2626-31; Yokomine K, et al. Cancer Sci. 2007;98:1930-5). Вкратце, клетки-мишени метили 3,7 кБк Na Cr (Perkin Elmer Life Sciences) при 37ºС в течение одного часа в CO-инкубаторе. Меченые клетки-мишени промывали три раза, и готовили пульсированные пептидом клетки путем инкубации клеток с 20 мкг/мл пептида в течение трех часов при 37ºС. Клетки-мишени смешивали с эффекторными клетками в конечном объеме 200 мкл в планшете для микротитрования с плоским дном, после чего инкубировали. Через шесть часов инкубации из каждой лунки отбирали 50 мкл супернатанта и измеряли радиоактивность с помощью гамма-счетчика. Специфическую цитотоксическую активность оценивали путем расчета скорости специфического высвобождения Cr в соответствии с имеющимся методом (Suda T, et al. Cancer Sci. 2007;98:1803-8). Анализ ELISPOT также проводили в соответствии с имеющимся методом (Komori H, et al. Clin. Cancer Res. 2006;12:2689-97).
Индукция реагирующих на CDCA1 CTL из PBMC, полученных от позитивных в отношении HLA-A2 здоровых доноров:
+
+
65-73
351-359
PBMC выделяли из позитивных в отношении HLA-A2 (A*0201) здоровых доноров. CD8 T-клетки совместно культивировали с DC из моноцитов, пульсированными пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2), и CD8 T-клетки стимулировали три раза в неделю (фиг. 3A).
65-73
351-359
65-73
351-359
65-73
351-359
51
51
Индуцированные CTL от раковых больных или здоровых доноров совместно культивировали с клетками-мишенями. В качестве мишени использовали T2 клетки, пульсированные пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2), и производили анализ ELISPOT и анализ высвобождения Cr. Как показано на фиг. 3B для донора-больного раком 1, продукция IFN-γ CTL была значительно выше, когда клетки стимулировали пульсированными пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) T2 по сравнению с непульсированными T2. Индуцированные CTL от здорового донора 1 продуцировали большое количество IFN-γ в ответ на пульсированные пептидом CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2) T2 клетки (более 300 точек на лунку) (фиг. 3C). Более того, CTL от донора-ракового больного 1 и здорового донора 1 проявили цитотоксическую активность против T2 клеток, пульсированных пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2) в тесте высвобождения Cr (фиг. 3D). Как показано на фиг. 3E, когда CTL стимулировали T2 клетками, пульсированными пептидом CDCA1 при различных концентрациях, CTL отвечали на пульсированные пептидом CDCA1 T2 клетки дозозависимо. По сравнению с ответом на непульсированные T2 клетки или на T2 клетки, пульсированные связываемым HLA-A2 пептидом из ВИЧ, CTL, как было обнаружено, продуцируют большее количество IFN-γ в ответ на T2 клетки, пульсированные пептидом в концентрации 0,2 мкг/мл или более. Упомянутые выше результаты показывают, что эти CTL обладают специфичной для пептида цитотоксичностью.
65-73
351-359
Для оценки специфичного в отношении CDCA1 иммунного ответа CTL в качестве клеток-мишеней использовали COLO201, в которые был введен CDCA1 (COLO201/CDCA1, CDCA1+, HLA-A2+; фиг. 4A). Как показано на фиг. 4B, CTL от здорового донора, стимулированные пептидом CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1), продуцировали большее количество IFN-γ в ответ на COLO201/CDCA1 по сравнению с трансфицированными пустым вектором COLO201, которые не экспрессируют CDCA1. CTL от здорового донора 2, стимулированные пептидом CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2), также проявляли специфический иммунный ответ против COLO201/CDCA1 (фиг. 4C). Более того, эти CTL проявляли иммунный ответ против клеток PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не против клеток A549 (CDCA1+, HLA-2-) (фиг. 4D).
65-73
351-359
Для использования пептидов из CDCA1 в противораковой терапии важнее всего, чтобы отвечающие на пептид CDCA1 CTL были способны проявлять специфическую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток, которые эндогенно экспрессируют CDCA1. Как показано на фиг. 4E для донора 1, больного раком, реагирующие на CDCA1 CTL, полученные с использованием пептида CDCA1 (No. 1) (SEQ ID NO:1), проявляли цитотоксическую активность против клеток PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не против клеток A549 (CDCA1+, HLA-2-) или клеток COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+). Сходным образом, CTL от здорового донора 1, стимулированные пептидом CDCA1 (No. 4) (SEQ ID NO:2), проявляли цитотоксическую активность против клеток PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не против клеток A549 (CDCA1+, HLA-2-). Эти результаты показывают, что эти пептиды подвергаются естественному процессингу в раковых клетках, презентируются на поверхности раковых клеток вместе с HLA-A2 и могут узнаваться CTL.
351-359
351-359
Для выявления ограниченных HLA-A2, специфичных в отношении CDCA1 CTL был приобретен тетрамер, связанный с пептидом CDCA1 меченный PE HLA-A*0201 от Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. (Nagoya, Япония). Как показано на фиг. 4G, среди CD8-позитивных клеток наблюдалась сильная корреляция между реагирующими на пептид CDCA1 CTL и позитивными в отношении тетрамера CTL. Этот результат подтверждает, что среди CD8-позитивных T-клеток, использованных в этом исследовании, имелись ограниченные HLA-A2, специфичные в отношении CDCA1 CTL.
Обсуждение:
Идентификация пептидов, берущих начало от TAA, которые подвергаются естественному процессингу и презентируются на опухолевых клетках, важна для создания противораковой терапии на основе пептидов. CDCA1, который является новым антигеном рака/семенников, был идентифицирован с помощью анализа кДНК микроматрицами с использованием NSCLC и нормальных тканей. CDCA1 сильно экспрессируется в NSCLC и нормальных семенниках, но его мРНК или белок не экспрессировалась в других исследованных нормальных тканях. Поскольку семенник представляет собой ткань, изолированную от иммунной системы, отвечающие на CDCA1 CTL должны атаковать только NSCLC. Поэтому CDCA1 был выбран в качестве TAA для иммунотерапии больных NSCLC.
Для сведения к минимуму риска делеции, мутации или сниженной экспрессии TAA в качестве способов уклонения раковых клеток от иммунной защиты в результате терапии с индукцией иммунитета было желательно идентифицировать TAA, существенные для пролиферации или выживания NSCLC, которые могут быть использованы в качестве мишеней для иммунотерапии (Yoshitake Y, et al. Clin. Cancer Res. 2004;10:6437-48). Сообщалось, что CDCA1 действует, оказывая влияние на присоединение веретенообразных микротрубочек к кинетохорам, и играет важную роль в поддержании клеточного цикла (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002;159:549-55). Более того, CDCA1 является компонентом комплекса цикла деления ядра (NDC), который играет важную роль в правильном расхождении хромосом во время митоза, и является чрезвычайно консервативным в видовом плане (DeLuca JG, et al. Curr. Biol. 2003;13:2103-9). CDCA1 существенен для кинетохорной локализации центромерного белка E (CENP-E) в клетках HeLa. Подавление экспрессии CDCA1 с помощью siRNA приводит к аномальному расхождению хромосом путем блокирования митоза и последующей индукции гибели клеток (Liu D, et al. J. Biol. Chem. 2007;282:21415-24). Этот аберрантный выход из митоза обладает признаками и апоптоза, и катастрофы (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002;159:549-55). То есть, CDCA1 существенен для функционирования клетки и играет важную роль в пролиферации и выживании раковых клеток.
.
.
CDCA1 и белок 2, ассоциированный с кинетохором (KNTC2), являются членами эволюционно консервативного белкового комплекса центромеры (Hayama S, et al Cancer Res 2006;66:10339-48). Иммуноокрашивание показывает, что их повышенная экспрессия связана с плохим прогнозом для больных NSCLC (Hayama S, et al Cancer Res 2006;66:10339-48). Поэтому уровень экспрессии CDCA1 в тканях NSCLC является хорошим маркером для вынесения прогноза для больных после хирургической операции. Предполагается участие CDCA1 в прогрессии NSCLC. Таким образом, иммунотерапия, которая направлена против CDCA1, может быть эффективной для больных NSCLC с плохим прогнозом.
В настоящем изобретении с помощью трансгенных HLA-A2 мышей были идентифицированы два ограниченных HLA-A2 эпитопных пептида CDCA1, которые способствуют образованию ограниченных HLA-A2 мышиных CTL. Кроме того, из PBMC от здорового донора, стимулированных этими пептидами, можно было получить CTL человека, реагирующие на CDCA1. Эти линии CTL, специфичные в отношении пептидов CDCA1, уничтожали раковые клетки, которые экспрессируют CDCA1, ограниченным HLA-A2 образом (фиг. 4).
65-73
351-359
V
S
M
I
Q
R
Пептиды из CDCA1 с предсказанным высоким связывающим сродством к молекуле HLA-A0201 были отобраны с помощью программы BIMAS; однако некоторые из аминокислотных последовательностей не являются консервативными для CDCA1 человека и мыши. Имеются различия в двух аминокислотах между последовательностями пептида CDCA1 (No. 1) человека и мыши (человек: YMMPNEV/мышь: YMMPNEV), и различие в одной аминокислоте в пептиде CDCA1 (No. 4) (человек KLATAFKI/мышь KLATAFKI). Однако в настоящем изобретении была подтверждена индукция реагирующих на упомянутые выше эпитопные пептиды CTL от здоровых доноров.
CTL, реагирующие на CDCA1, индуцировали из PBMC от здорового донора путем стимуляции in vitro с использованием пептидов CDCA1. CTL, индуцированные презентирующими пептид DC, проявляли цитотоксическую активность в отношении экспрессирующих CDCA1 раковых клеток ограниченным HLA-A2 образом. Индукция специфических в отношении CDCA1 CTL от здорового донора указывает на необходимость продолжения дальнейшего поиска TAA. Более того, в настоящее время предпринимаются попытки индукции реагирующих на CDCA1 CTL из PBMC, выделенных от больных NSCLC, мелкоклеточным раком, холангиоцеллюлярной карциномой, раком мочевого пузыря и раком клеток почки. Существует несколько опосредуемых клетками методов иммунотерапии рака, включая вакцинацию пептидом или белком (Rosenberg SA, et al. Nat Med 1998;4:321-7), иммунизацию дендритными клетками, пульсированными пептидами, белками или лизатами опухоли (Kugler A, et al. Nat Med 2000;6:332-6), и ex vivo адоптивный перенос с использованием специфичных в отношении опухоли линий CTL (Falkenburg JH, et al. Blood 1999;94:1201-8). Пептиды CDCA1, идентифицированные в настоящем изобретении, могли бы быть применены в этих методах иммунотерапии.
Если исследовательской медицине удастся показать безопасность и эффективность раковой иммунотерапии с использованием пептидов, идентифицированных в настоящем изобретении, которые презентируются киллерным T-клеткам посредством HLA-A2, то станет возможным клиническое применение в отношении европейцев. Более того, путем идентификации пептидов, презентируемых киллерным T-клеткам посредством HLA-A2, которые часто имеются не только у Японцев, но и у европейцев, можно было бы с высокой вероятностью создать противораковые иммунотерапевтические средства, применимые в отношении 30% Японских и европейских больных раком легких.
Промышленная применимость
HLA-A2 представляет собой аллель HLA класса I, имеющийся у приблизительно 30% населения Японии. Пептиды CDCA1 по настоящему изобретению могут индуцировать цитотоксические T-клетки человека, которые разрушают раковые клетки, экспрессирующие комплексы пептидов и молекул HLA-A2. Поэтому пептиды по настоящему изобретению могут быть применены для иммунотерапии рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, карциномы клеток почки, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей и рака ободочной кишки у позитивных по HLA-A2 больных. Таким образом, пептиды пригодны для создания терапевтических средств для подавления пролиферации и прогрессии этих типов рака.