КОМБИНИРОВАННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО, КАРДИОПРОТЕКТОРНОГО И ПЛАЦЕНТОПРОТЕКТИВНОГО, УТЕРОЛИТИЧЕСКОГО И NO-МИМЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
HEPATOPROTECTIVE, CARDIOPROTECTIVE AND PLACENTAPROTECTIVE, UTEROLITH AND NO-MIMETIC COMBINED DRUG

Изобретение относится к фармации и медицине и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства медикаментозных средств с комбинированным составом активных компонентов, которые оказывают гепатопротекторное действие; комбинированных лекарственных средств для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, а также средств, которые могут быть использованы в акушерстве и гинекологии.
Лечение и профилактика заболеваний печени является одной из актуальных проблем современной медицины. Этиологическую роль в развитии заболеваний печени могут играть разнообразные факторы, в частности вирусы, гормональные и метаболические нарушения, токсические поражения, вызванные самыми разными веществами (алкоголь, эфиры и эпоксидные соединения, ароматические амины, лекарственные противогрибковые и противотуберкулезные препараты, нестероидные противовоспалительные средства, пестициды и др.). Ассортимент лекарственных средств, который используется в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, насчитывает больше 1000 наименований. Однако среди такого многообразия препаратов выделяют сравнительно небольшую группу таких, которые оказывают избирательное действие на печень, - гепатопротекторов. В настоящее время преимущественно используют средства растительного происхождения (до 54%), тогда как на фосфолипидные препараты приходится 16%, а на другие синтетические средства - 30% от общего количества "действительных" гепатозащитных препаратов. К сожалению, на сегодняшний день ни один из тех гепатопротекторов растительной и фосфолипидной природы, которые используются в медицинской практике, не удовлетворяет в полной мере всем требованиям клинической гепатологии. В последнее время интерес клиницистов привлекают препараты, действие которых направлено на повышение активности эндогенной детоксицирующей системы печени, улучшение энергетического метаболизма гепатоцита и повышение активности антиоксидантной системы.
Известен ряд средств гепатопротекторного действия, например фармацевтическая композиция, имеющая гепатопротекторную активность и нормализующая обменные процессы (патент Украины №85500, МПК A61K 9/08 (2006.01), опубл. 26.01.2009, бюл. №2/2009), которая содержит незаменимую аминокислоту при суммарном содержании фосфолипида и аминокислоты 15-80 мас. % и их массовом соотношении 2:1, при этом как незаменимую аминокислоту она содержит α-амино-γ-метилтиомасляную кислоту (метионин) или α-амино-β-оксимасляную кислоту (треонин), а как фосфолипид растительного происхождения содержит фосфолипид из сои.
Однако такое средство не оказывает детоксицирующего действия, являющегося необходимым компонентом гепатопротекции; не влияет на синтез NO, который играет большую роль в повышении адаптационных возможностей гепатоцита; не имеет антиоксидантного эффекта, что, в целом, делает средство недостаточно эффективным.
Известен также гепатопротектор, который содержит кверцетин и инулин (патент Украины №71429, МПК А61Р 1/16 (2006.01), опубл. 10.07.2012, бюл. №13/2012).
Упомянутое средство также не оказывает детоксицирующего действия, не влияет на синтез NO, не имеет энерготропного эффекта.
Известно применение соединения (S)-2-амино-5-гуанидинопентановой кислоты (S)-2-аминоглутарат (L-аргинина L-глутамат) в качестве фармацевтического препарата, который обладает гепатопротекторным и детоксицирующим действием (патент Украины №54880, МПК C07C 229/02 (2006.01), A61K 31/195 (2006.01), опубл. 17.03.2003, бюл. №3/2003).
Однако такое средство не оказывает энерготропного действия. Также NO, который образуется из L-аргинина L-глутамата, быстро превращается в пероксинитрит и не оказывает защитного действия.
Еще одной актуальной проблемой на сегодняшний день является разработка средств для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, которые занимают второе место в структуре инвалидизации и смертности населения промышленно развитых стран. Невзирая на достигнутые успехи в области медикаментозной кардиопротекции, смертность от заболеваний сердца остается высокой. Поэтому разработка средств для лечения патологий сердечно-сосудистой системы является актуальной задачей современной фармации и медицины. В настоящее время в комплексе с адреноблокаторами, антиагрегантами, блокаторами кальциевых каналов широко применяются метаболитотропные кардиопротекторы, которые способны уменьшить каскад неблагоприятных молекулярно-биохимических реакций, инициированных ишемией, оказывают защитное действие на миокард и имеют бесспорные перспективы в клинической практике.
Однако современный арсенал средств для кардиопротекторной терапии не отвечает всем требованиям клиницистов. Так, большинство средств имеют побочные эффекты, что ограничивает их использование в клинике, также они не всегда оказывают действие достаточной силы. Все это обусловливает необходимость создания новых комбинированных высокоэффективных и малотоксичных препаратов кардиопротекторного действия, которые бы совмещали в себе позитивные эффекты активных действующих веществ или же даже усиливали бы их терапевтический эффект.
Известен ряд комбинированных лекарственных средств, которые обладают кардиопротекторным действием.
Одним из них является «Комбинированное средство для лечения сердечно-сосудистых заболеваний для перорального применения» (патент Украины №36998, МПК (2006) A61K 31/00 // Промислова власнiсть. - 2008. - №21). Средство содержит L-аргинина аспарагинат, калия аспарагинат, магния аспарагинат, ди-L-аргинина сукцинат, консервант, подсластитель, ароматизатор пищевой и воду очищенную.
Но использование такого комбинированного средства не обеспечивает высокую биодоступность оксида азота, потому что оксид азота, который образовался из аргинина, легко превращается в пероксинитрит в условиях ишемии. Кроме этого, такая комбинация компонентов проявляет невысокую противоишемическую, антиоксидантную и энерготропную активность.
Известно также «Комбинированное средство для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний», которое используют в виде капсул или таблеток, и которое содержит дипиридамол, тиотриазолин (как вещество антитромботического действия), экстракты боярышника и мелиссы и вспомогательные вещества (Патент Украины №44115, МПК (2009) A61K 36/00 // Промислова власнiсть. - 2009. - №18).
В этом средстве для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, как и в предлагаемом, в состав входит тиотриазолин.
Следует отметить, что создание этой комбинации направлено на потенцирование антиагрегантного и антитромботического действия дипиридамола.
При применении данного средства дефицит азота, который имеет место при ишемии, не восполняется, не повышаются защитные свойства клеток, что особенно необходимо при таких заболеваниях, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда.
Известно средство Тивортин, которое представляет собой 4,2% раствор для инъекций (аргинина гидрохлорид, вода для инъекций) (Компендиум - лекарственные препараты online http://compendium.com.ua/info/l71576/jurija-farm/tivortin-sup-sup-). Аргинина гидрохлорид представляет собой левовращающий изомер (L-аргинин).
Это лекарственное средство обладает как гепатопротекторным, так и кардиопротекторным действием, и его как наиболее близкого по назначению и эффективности мы считаем прототипом.
Общим существенным признаком изобретения и заявляемого средства является наличие в составе средства L-аргинина.
Однако следует отметить, что тивортин (L-аргинин) не имеет выраженного самостоятельного гепатопротекторного действия, так как он не влияет на такие звенья гепатодеструкции, как энергодефицит, оксидативный стресс, цитолиз, нарушение белкового обмена, нарушение липидного обмена. A NO, образующийся из L-аргинина, быстро превращается в пероксинитрит и не обладает защитным действием относительно гепатоцитов.
Недостатком прототипа также является его недостаточно высокая кардиопротективная активность. Кроме этого, он не полностью обеспечивает восстановление энергетических ресурсов в клетке, что является очень важным в условиях острой ишемии. Тивортин (L-аргинин) имеет низкую антиоксидантную активность, не обеспечивая достаточную продолжительность жизни оксида азота, который является необходимым для сохранения кардиоцитов и нормальной сократительной функции сердца.
В основу изобретения поставлена задача разработки комбинированного лекарственного средства, которое будет иметь высокую гепатопротекторную и кардиопротекторную активность по сравнению с известными средствами и будет обладать дополнительным спектром биологического действия.
Поставленная задача решается тем, что в комбинированном лекарственном средстве, которое содержит L-аргинин, новым является то, что средство дополнительно содержит тиотриазолин.
Новым является также то, что средство содержит L-аргинин с тиотриазолином в соотношении: L-аргинин - в пределах от 1 до 6 массовых долей, и тиотриазолин - 1 массовая доля.
Новым также является то, что средство имеет форму таблеток, капсул, инъекционных и инфузионных растворов.
Причинно-следственная связь между совокупностью заявляемых признаков и техническим результатом заключается в следующем.
Особую роль в регуляции эндогенной детоксицирующей и антиоксидантной систем печени, а также в регуляции ее кровоснабжения отводится NO. Препарат L-аргинин является прекурсором синтеза NO. Однако NO, образующийся из L-аргинина, в условиях патологии печени быстро «погибает» под действием свободных радикалов, что снижает клиническую эффективность L-аргинина. Нами, в частности для стабилизации NO, который образуется из экзогенного L-аргинина, и в целом для повышения эффективности средства был скомбинирован L-аргинин с тиотриазолином, который повышает время жизни и биодоступность NO за счет образования с ним S-нитрозотиольного комплекса, который потенцирует гепатопротекторное действие.
Также в последнее время активно обсуждается вопрос о роли системы оксида азота, а также веществ, связанных с его обменом, в профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Метаболический прекурсор NO - L-аргинин, увеличивая концентрацию оксида азота в тканях, вызывает расширение сосудов и может оказывать противоишемическое и кардиопротективное действие. Кроме того, L-аргинин, за счет повышения концентрации NO, может обладать антиагрегационным действием, подавляя экспрессию молекул адгезии и хемотаксис лейкоцитов. Однако данные о кардиопротективном действии L-аргинина немногочисленны и противоречивы и требуют экспериментального обоснования. Существующие теоретические предпосылки эндотелиопротективного действия L-аргинина при ишемии-реперфузии также требуют экспериментального обоснования. Бесспорный интерес представляет поиск возможностей усиления протекторных свойств L-аргинина за счет комбинирования с веществами, способными улучшать энергообеспечение ишемизированного миокарда и повышать биодоступность образуемого из L-аргинина NO. К таким веществам относят тиотриазолин. Тиотриазолин способен усилить кардиопротективное действие L-аргинина, потенцируя его NO-миметический механизм. Так, тиотриазолин обладает уникальными свойствами оказывать протективное действие относительно транспорта NO за счет сохранения восстановленных тиолов. Тиотриазолин оказывает положительное воздействие на активность глутатион-зависимых ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатион-8-трансферазы и тем самым повышает уровень восстановленных тиолов. Это важное звено фармакологического действия тиотриазолина лежит в основе его взаимопотенцирующего эффекта с L-аргинином, так как в условиях дефицита тиольных соединений (оксидативный стресс, ишемия, интоксикации, гипертоническая болезнь и т.д.) нарушается транспорт NO, поскольку он поддается атаке таких АФК, как супероксидрадикал и гидроксилрадикал с превращением в цитотоксический продукт - пероксинитрит. При этом наблюдается усиление ишемического повреждения кардиоцитов в реакциях оксидативного и нитрозирующего стрессов.
Подобное совместное действие L-аргинина и тиотриазолина, направленное на синтез, стабилизацию и повышение биодоступности NO, можно использовать в лечении заболеваний, важным звеном патогенеза которых является дефицит NO, а это - заболевания гепато-билиарной системы, болезни сердечно-сосудистой системы (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и т.д.).
К патологическим состояниям, которые обусловлены дефицитом NO, также относится и ряд акушерских патологий, например дисфункция плаценты.
Проблема осложнений, вызванных дисфункцией плаценты, с учетом ее определяющего влияния на развитие плода, новорожденного и детей более старшего возраста продолжает оставаться одной из проблем, очень важных для педиатрии. Известно, что в странах СНГ ежегодно больше 500 тыс. беременных не вынашивают ребенка к сроку родов, а мероприятия по медикаментозному сохранению беременности во многих случаях не дают желаемого результата, что негативно отражается на здоровье плода и новорожденного (хроническая внутриутробная гипоксия, недоношенность, гипотрофия, перинатальная смертность, двигательные нарушения, поражения ЦНС, отставание в развитии). Установлено, что длительная дисфункция плаценты приводит к нарушению нормального функционирования системы «мать - плацента - плод» со значительными изменениями основных видов обмена веществ между матерью и плодом. В организме плода на фоне неизбежных явлений гипоксии и других нейроиммунноэндокринных нарушений наблюдаются дистрофические явления, отставание в росте и развитии, возникают серьезные расстройства мозгового кровообращения, которые приводят к стойким нарушениям энергетического метаболизма нервной ткани, глутаматной эксайтотоксичности, оксидативному стрессу, апоптозу и гибели нейронов. В последующем у детей наблюдаются снижение интеллекта, отставание в психомоторном развитии, симптомы вегетососудистой дистонии с дыхательными нарушениями и другие патологические нарушения здоровья. Важность проблемы обусловлена тем, что тяжелые последствия для здоровья ребенка, которые вызываются патологией плаценты, не удается предупредить в надлежащем объеме средствами, имеющимися в арсенале современной педиатрии. В настоящее время для коррекции таких состояний используют препараты, которые способствуют расслаблению мускулатуры матки (адреномиметики, спазмолитики); препараты, которые улучшают микроциркуляцию и реологические свойства крови (антиагреганты, ангиопротекторы, антикоагулянты); препараты, корректирующие обменные процессы (смеси аминокислот); гепатопротекторы, антиоксиданты. В последнее время особый интерес в лечении дисфункции плаценты и ее последствий представляют препараты разных фармакологических групп, действие которых направлено на улучшение метаболических процессов в плаценте, снижение оксидативного стресса, улучшение кровоснабжения плаценты, снижение дисфункции эндотелия сосудов плаценты и на нормализацию в системе L-аргинин - NO-синтаза, что в итоге приводит к нормализации тонуса матки и сохранению плода.
Исходя из изученных нами механизмов действия обоих компонентов предлагаемого комбинированного средства, а именно L-аргинина и тиотриазолина, и допустив возможность того, что предлагаемое комбинированное средство может иметь плацентопротективное и утеролитическое действие и в результате этого положительно влиять на вынашиваемость беременности, нами было проведено экспериментальное исследование в этом направлении.
При проведении нами экспериментальных исследований, которые подтвердили наше предположение, нами было обнаружено дополнительное неочевидное свойство комбинации L-аргинина и тиотриазолина - ее плацентопротективное и утеролитическое действие.
Следует отметить, что, хотя тиотриазолин и L-аргинин оказывают каждый в отдельности широкий спектр положительных фармакологических эффектов, для специалиста априори не является очевидной возможность использовать тиотриазолин или L-аргинин в сочетании с любыми другими лекарственными средствами. Как известно (Кукес В.Г. Клиническая фармакология, 4 издание, Москва, «ГЕОТАР-медиа», 2008, с. 164-169; Гилман А.Г. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману, Москва, «Практика», 2006, с. 57), фармакодинамическое взаимодействие лекарственных средств может быть направлено как в сторону усиления их фармакологических эффектов (синергизм), так и на их ослабление (антагонизм).
Что касается физической несовместимости лекарственных средств, то она обусловливается физическими свойствами ингредиентов, которые входят в состав лекарств. Она может вызываться нерастворимостью, отволаживанием ингредиентов и другими процессами.
Химическая несовместимость лекарственных средств обусловлена химическим взаимодействием компонентов лекарств, что приводит, как правило, к снижению или полной потере терапевтической активности лекарственного средства.
Фармакологическая несовместимость лекарственных средств обусловливается сочетанием лекарственных веществ, которые действуют антагонистично или взаимно усиливают побочное или токсическое действие друг друга. Фармакологическая несовместимость лекарственных веществ во многих случаях исключает возможность их одновременного применения. Несовместимые сочетания компонентов делают фиксированную лекарственную комбинацию неполноценной в терапевтическом отношении, а в некоторых случаях даже опасной для жизни пациента.
Таким образом, лишь экспериментальное исследование может подтвердить или опровергнуть возможность создания определенного комбинированного лекарственного средства, в нашем случае - сочетание L-аргинина с тиотриазолином.
Говорить о положительном результате взаимодействия упомянутых компонентов комбинированного лекарственного средства можно только на основании проведенных экспериментальных исследований. Без изучения результатов таких исследований мысль о возможном высоком терапевтическом эффекте комбинированного средства является лишь теоретической предпосылкой. В нашей заявке приведены результаты наших оригинальных исследований заявляемой комбинации, которые являются подтверждением высокой гепатопротекторной, кардиопротекторной, плацентопротективной, утеролитической и NO-миметической активности препарата, который содержит в своем составе тиотриазолин и L-аргинин.
Нами были изучены разные комбинации L-аргинина с тиотриазолином -1:1; 2:1; 3:1; 4:1; 5:1; 6:1 и 7:1 соответственно в условиях моделей токсического гепатита, питуитрин-изадринового инфаркта миокарда и дисфункции плаценты у самок крыс. Была обнаружена оптимальная комбинация L-аргинина с тиотриазолином - 4:1 соответственно.
Пример 1. Гепатопротекторное действие комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином
4
4
Исследования гепатопротекторной активности заявляемого лекарственного препарата осуществлялись на модели токсического гепатита. В работе использовали белых беспородных крыс обоего пола, массой 160-180 г, полученных из питомника Института фармакологии и токсикологии АМН Украины. Для создания модели крысам вводили четыреххлористый углерод (CCl), подкожно, в виде 50%-ного раствора в вазелиновом масле в дозе 0,4 мл на 100 г массы тела животного. Введение четыреххлористого углерода осуществляли в течение 4 суток. Параллельно с CCl за один час до его введения вводили исследуемый комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином (4:1) 1 раз в сутки первые 4 дня, затем еще три дня в дозе 250 мг/кг/сут внутрибрюшинно, L-аргинин в дозе 500 мг/кг/сут внутрибрюшинно и эссенциале 250 мг/кг/сут внутрибрюшинно. На 8-е сутки от начала затравки животные были декапитированы с учетом требований этического комитета. В результате был произведен забор крови для получения сыворотки, в которой определяли активность печеночных трансаминаз (АлТ, АсТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на автоматическом биохимическом анализаторе Prestige 24i, используя набор фирмы Cormay. Также определяли в сыворотке крови уровень аммиака, используя наборы фирмы Sentinel CH. Так, 7-дневная интоксикация крыс тетрахлоридом углерода вызывала значительное повышение активности печеночных трансаминаз в сыворотке крови, являющихся, как известно, маркерами печеночного цитолиза. В результате лабораторных исследований в условиях токсического поражения печени тетрахлорметаном было выявлено повышение активности АлТ и АсТ, а также ЛДГ. У этих же крыс регистрировалась выраженная гипераммониемия, сопровождающаяся повышением по сравнению с интактной группой уровня аммиака. Положительное влияние комбинированного препарата на биохимические показатели сыворотки крови при экспериментальном токсическом поражении печени отражено в таблице 1. Введение предлагаемого комбинированного препарата животным на протяжении 7 суток приводило к снижению АлТ на 84%, АсТ на 68% и ЛДГ на 46% достоверно по отношению к аналогичным показателям группы контроля и к группам животных, получавших курсом L-аргинин и эссенциале. Введение комбинированного препарата животным на протяжении 7 суток на 44% уменьшало гипераммониемию, достоверно снижая концентрацию аммиака в крови, по сравнению с группой контроля, и к группам животных, получавших курсом L-аргинин и эссенциале. Полученные данные свидетельствуют о наличии выраженного гепатопротективного и детоксицирующего действия у комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином (4:1). По силе гепатопротективного и детоксицирующего действия комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином (4:1) достоверно превосходит как L-аргинин, так и эссенциале.
Пример 2. Кардиопротекторное действие комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином
Исследование кардиопротекторного, эндотелиопротекторного и NO-миметического действия предлагаемого средства - комбинации L-аргинина с тиотриазолином (4:1) в сравнении с 4,2% раствором для инъкций тивортина (L-аргинина) (ТОВ «Юрия-Фарм», Украина) проведено на модели питуитрин-изадринового инфаркта миокарда у лабораторных крыс по таким показателям, как предупреждение ишемического поражения кардиоцитов, уменьшение проявлений эндотелиальной дисфункции, оксидативного стресса, оптимизация энергетического метаболизма миокарда.
Исследования проведены в соответствии с «Методическими рекомендациями по представлению документации на лекарственные средства в Фармакологический центр МЗ Украины». Исследования выполнены на достаточном количестве экспериментальных животных, и все манипуляции были проведены согласно положению об использовании животных в биомедицинских опытах (Страсбург, 1986 г., с изменениями, внесенными в 1998 г.) та «Загальних етичних принципiв експериментiв на тваринах» (Киïв, 2001), которые согласованы с положениями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, которых используют для экспериментальных и научных целей».
В настоящее время для доклинической оценки кардиопротективного действия лекарственных средств используется коронарогенно-метаболическая модель острой ишемии миокарда, которая воспроизводится введением питуитрина и изадрина и характеризуется изменениями ЭКГ, активности ферментов и уровня интермедиатов энергетического обмена, метаболизма оксида азота, обмена белка, гистоморфологическими изменениями миокарда.
Настоящие исследования проводили на модели острого инфаркта миокарда у крыс. Инфаркт миокарда (ИМ) моделировали поэтапным введением изадрина и питуитрина по схеме: питуитрин - 0,5 Ед/кг - внутрибрюшинно, через 20 мин изадрин - 100 мг/кг - подкожно, через 6 часов инъекция изадрина повторялась и через 24 часа вводились оба агента в тех же дозах. В работе использовался питуитрин для инъекций производства АВ «Endokrininiai» (Литва) и изадрин производства Sigma-Aldrich (Lot#BCBB9618 (USA). Эта модель воспроизводит мелкоочаговый инфаркт миокарда. Животных выводили из эксперимента через 60 мин. после последней инъекции изадрина под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). Кардиопротективную активность препаратов оценивали по снижению биохимических маркеров ишемического повреждения миокарда, оксидативного стресса, эндотелиальной дисфункции, улучшению гистологической картины миокарда и энергетического обмена миокарда и системы NO.
Исследуемые препараты вводили 3-кратно в течение суток параллельно с формированием инфаркта внутрибрюшинно за 30 мин до инъекции питуитрина и изадрина: Тивортин (L-аргинин) в дозе 200 мг/кг, предлагаемое средство (L-аргинин + тиотриазолин (4:1)) - 200 мг/кг (в пересчете на L-аргинин). Интактная и контрольная группы получали физиологический раствор по аналогичной схеме в эквивалентных объемах.
Полученные результаты проведенных исследований приведены в таблицах 2, 3 и 4.
Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о нарушениях в сопряженных системах NO и восстановленных тиолов в миокарде экспериментальных животных с инфарктом миокарда. Так, в миокарде контрольной группы регистрировали дефицит восстановленных тиолов на фоне угнетения активности ГР, снижение активности NO-синтазы и уменьшение образования NO (снижение содержания нитритов) и повышение уровня маркера нитрозирующего стресса - нитротирозина. Введение животным с ИМ Тивортина (L-аргинин) и предлагаемого средства оказывало позитивное действие на показатели сопряженной системы NO/восстановленные тиолы. Так, в миокарде животных, получавших Тивортин (L-аргинин) и предлагаемое средство, регистрировали достоверное повышение активности NO-синтазы на фоне увеличения продукции NO и снижения уровня нитротирозина. Параллельно наблюдали увеличение содержания восстановленных тиолов и повышение активности ГР в миокарде этих групп животных.
Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что предложенное средство в отличие от Тивортина (L-аргинина) не только интенсифицирует синтез NO, но и повышает его биодоступность, предотвращая его преобразование в цитотоксическую форму - пероксинитрит (о чем свидетельствует снижение в этих группах нитротирозина). Предлагаемое средство оказывает прямое стимулирующее действие на активность NO-синтазы и уровень L-аргинина, т.е. повышает продукцию оксида азота и оказывает протективное действие в отношении транспорта NO в условиях ишемии за счет сохранения восстановленных тиолов. Подобное действие очень важно в острый период ишемии миокарда и играет первостепенную роль в реализации кардиопротективного эффекта этих препаратов. По силе воздействия на показатели сопряженной системы NO/восстановленные тиолы лидером оказалось предлагаемое средство. Таким образом, разработанный комбинированный препарат оказывает двойную защиту в отношении системы NO в условиях ишемии. Так, первый компонент предлагаемого средства L-аргинин - повышает продукцию NO, второй компонент - тиотриазолин - повышает биодоступность NO за счет образования стабильных S-нитрозильных комплексов, сохраняя тем самым физиологические и кардиопротективные свойства этого молекулярного трансмиттера.
Данные, представленные в табл.3, свидетельствуют об ишемическом изменении гистоструктуры миокарда при моделировании ИМ. Так, в миокарде животных этой группы регистрировали достоверное по отношению к группе интакта уменьшение плотности и площади кардиоцитов, уменьшение содержания РНК в цитоплазме, а также увеличение плотности апоптически и некротически измененных кардиоцитов. Назначение животным с ИМ Тивортина (L-аргинина) и предлагаемого средства приводило к уменьшению ишемического изменения морфо-функциональных показателей кардиоцитов. В миокарде животных этих групп регистрировали достоверное повышение плотности ядер кардиоцитов, что свидетельствовало об уменьшении гибели клеток и сохранности здоровой структуры миокарда. Также о снижении гибели кардиоцитов свидетельствовало снижение плотности ядер апоптических и деструктивно измененных миокардиоцитов. Наиболее выраженное кардиопротективное действие наблюдалось у предлагаемого средства, которое параллельно с уменьшением гибели кардиоцитов повышало содержание РНК в цитоплазме кардиоцитов, что свидетельствовало об усилении трансляционных процессов в клетке и активации репарационных процессов под действием предлагаемого препарата.
Результаты, представленные в таблице 4, демонстрируют ишемические нарушения гистоструктуры эндотелия сосудов миокарда при моделировании ИМ. Так, в миокарде животных контрольной группы наблюдали уменьшение плотности ядер эндотелиоцитов сосудов на фоне снижения содержания РНК по сравнению с группой интакта. Введение животным с ИМ Тивортина (L-аргинина) и предлагаемого средства оказывало эндотелиопротективный эффект. Однако предлагаемое средство оказывает достоверно более выраженное влияние на морфофункциональные показатели эндотелиоцитов сосудов миокарда - оно повышает выживаемость эндотелиоцитов (плотность ядер) и их транскрипционную активность (содержание РНК).
Пример 3. Плацентопротективное, утеролитическое и NO-миметическое действие
Все исследования выполнены на беременных крысах линии Вистар массой 180-200 г. При уходе за животными, питании и проведении экспериментов руководствовались базисными нормативными документами: рекомендациями комитета по биоэтике МЗ Украины по экспериментальной работе с использованием животных, рекомендациями ВОЗ, рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей. Дисфункцию плаценты моделировали введением четыреххлористого углерода беременным крысам. С этой целью с 10-11-го дня беременности в течение 7 дней животным вводили подкожно 50% масляный раствор четыреххлористого углерода в дозе 0,1 мл/кг. Срок беременности определяли, считая со дня обнаружения спермиев в вагинальном мазке. В каждой экспериментальной группе было по 7 беременных самок. Комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином вводили внутрибрюшинно в дозе 250 мг/кг за 2 часа до и через 2 часа после инъекции четыреххлористого углерода в течение 7 дней. L-аргинин вводили по такой же схеме внутрибрюшинно в дозе 500 мг/кг. На 17-18-й день беременности крыс выводили из эксперимента под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг) после голодания в течение 14-16 часов. Для исследования забирались плоды (подсчитывалось количество мертвых плодов, масса тела живых), матка и плацента. Кусочки плацент крыс фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и после обычной проводки заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, для обнаружения гликогена и гликопротеидов проводили ШИК-реакцию, белки плазмы выявляли при окраске срезов методом Пикро-Маллори II.
В результате эксперимента было установлено, что плацента на 17 сутки беременности на фоне введения четыреххлористого углерода имела микроскопические признаки вторичной дисфункции плаценты. Так, в материнской части плаценты выявлено расширение кровяных лакун. В просвете лакун в изобилии выявляются гликогеновые клетки. Назначение комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином приводило к значительному уменьшению этих клеток (единицы в поле зрения). В группе крыс, принимавших комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином, наблюдается умеренное расширение лакун спонгиотрофобласта, часть из которых содержит форменные элементы крови. Назначение L-аргинина не оказывало выраженного плацентопротективного действия.
2
В матке животных с дисфункцией плаценты на 17 сутки беременности регистрировалось угнетение процессов синтеза оксида азота, о чем свидетельствовало уменьшение активности NO-синтазы на фоне выраженного дефицита субстрата синтеза- L-аргинина. Параллельно регистрировалось и нарушение транспорта оксида азота - снижение уровня суммарного количества восстановленных тиольных соединений. Общеизвестно, что NO является нестабильным, короткоживущим радикалом и для его стабилизации и последующей транспортировки предусмотрены такие механизмы, как образование с тиосодержащими низкомолекулярными соединениями (глутатион, цистеин, метионин) устойчивых тионитрозольных комплексов. В условиях дефицита тиольных соединений нарушается транспорт NO, т.к. он подвергается атаке активных форм кислорода с превращением в цитотоксический продукт - пероксинитрит. При моделировании дисфункции плаценты наблюдается усиление продукции «паразитарной» формы NO-пероксинитрита, о чем свидетельствовало повышение в матке маркерного продукта - нитротирозина. Таким образом, в матке крыс с дисфункцией плаценты наблюдается развитие эндотелиальной дисфункции за счет угнетения метаболизма оксида азота и снижения его биодоступности. В последние годы большинство исследователей в патогенезе дисфункции плаценты основную роль отводят дисфункции эндотелия, вследствие которой происходит снижение синтеза вазодилататоров и гиперпродукция вазопрессоров. Все это запускает сложную цепь патологических реакций, таких как экспрессия фактора активации тромбоцитов, тромбоксана А, вазоконстрикторных эйкозаноидов, гиперпродукция АФК и пероксинитрита, способствующих десенситации в-адренорецепторов, окситоциновых рецепторов, активации проапоптических факторов. Следствием этих реакций является генерализованный спазм мелких сосудов в организме беременной, нарушение проницаемости капилляров, выход жидкости и белков в ткани, снижение онкотического давления и объема циркулирующей плазмы, усиление гипоксических явлений, энергодефицита. Клиническими симптомами этих процессов являются отеки, протеинурия. В последнее время прогностическое значение в протекании беременности при дисфункции плаценты получили стабильные метаболиты оксида азота и уровень восстановленных тиолов. Назначение комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином оказывало влияние на синтез оксида азота в матке (активность NO-синтазы повышалась на 80,2%, уровень метаболитов NO на 120,5%). Кроме того, у комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином обнаружено уникальное свойство оказывать защитное действие в отношении транспорта NO и тем самым повышать его биодоступность за счет сохранения достаточного количества для защиты и транспорта NO тиосодержащих молекул. Введение крысам с дисфункцией плаценты комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином приводило к достоверному увеличению в матке уровня восстановленных тиолов до 72,2% (Табл. 5).
О сохранении NO в матке крыс с дисфункцией плаценты под действием предлагаемого комбинированного препарата свидетельствует и снижение уровня нитротирозина на 51,0% - маркера продуктов окислительной модификации NO. Таким образом, комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином способен как усиливать синтез NO, так и повышать его биодоступность. L-аргинин обнаружил менее выраженное NO-миметическое действие.
4
Плацентопротективное действие комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином положительно влияло на жизнеобеспечение плодов. Так, масса выживших плодов из группы нелеченых животных с дисфункцией плаценты, вызванной введением CCl (контроль) на 17-18 сутки беременности значительно отставала от массы плодов здоровых крыс (интактная группа) (табл. 6). Отставшие в развитии плоды отличались от интактных и некоторыми другими внешними признаками. У них отмечалась вялость в движении после извлечения из матки и освобождения от оболочек, кожа их была морщинистой и более прозрачной. В отличие от них, плоды от матерей с дисфункцией плаценты, которым назначали комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином, были подвижнее, розовыми, масса их тела была достоверно больше, чем в группе контроля. Назначение комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином приводило к достоверному снижению пренатальной смертности. Так, в группе животных с дисфункцией плаценты, которым назначался комбинированный препарат, количество живых плодов на 1 самку составило 7,55, а в группе нелеченых животных этот показатель составлял 4,28. Назначение L-аргинина животным с дисфункцией плаценты не демонстрировало достоверного действия на этот показатель.
Повышение синтеза и биодоступности оксида азота, который обладает утеролитическим действием, приводит к нормализации тонуса матки и повышению вынашивания плодов, о чем свидетельствовало количество плодов на 1 самку в группе животных с дисфункцией плаценты, получавших комбинированный препарат L-аргинина с тиотриазолином (Табл. 6).
Таким образом, проанализировав полученные результаты проведенных исследований, можно сделать вывод, что предлагаемое комбинированное средство обеспечивает более высокую гепатопротекторную и кардиопротекторную активность в сравнении с прототипом. Кроме того, предлагаемое средство проявило новые виды активности - плацентопротективное, утеролитическое и NO-миметическое действие.
Таблетки, содержащие L-аргинин и тиотриазолин, изготавливают как покрытыми оболочкой, так и без оболочки. Ядро таблеток изготовляют разными способами, например путем получения порошкообразной смеси этих активных ингредиентов с добавлением достаточного количества вспомогательных веществ и последующего прессования. В состав таблеток входят разные вспомогательные вещества, которые влияют на физико-химические свойства, например, полифункциональные вспомогательные вещества, наполнители, разрыхлители, антифрикционные вещества и другие.
Капсулы изготавливают путем дозирования смеси активных компонентов L-аргинина и тиотриазолина и вспомогательных веществ в капсулы, которые могут содержать разовую или наивысшую терапевтическую дозу предлагаемого средства.
Раствор для инъекций, содержащий как активные вещества L-аргинин и тиотриазолин, готовят как с использованием стабилизатора, так и без него. Возможно использование веществ, которые дают возможность достичь изотоничности раствора. Раствор может быть приготовлен в разных концентрациях, которые содержат терапевтическую дозу предлагаемого комбинированного лекарственного средства.
Для приготовления инфузионного раствора комбинированного препарата L-аргинина с тиотриазолином могут использоваться физрастворы разного состава.
Таким образом, использование предлагаемого средства позволит расширить арсенал лекарственных средств, которые можно применять в гепатологии, кардиологии и акушерстве и гинекологии и которые являются безопасными и обладают высокой эффективностью. Положительным эффектом использования предлагаемого средства также является то, что в случаях лечения совмещенной патологии такое средство позволит избежать полипрагмазии.