СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРИСОСУДИСТОЙ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD FOR THROMBOCYTE INTRAVASCULAR ACTIVATION ANALYSIS

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам оценки функциональной активности тромбоцитов.
В качестве прототипа выбран способ определения внутрисосудистой активации тромбоцитов, включающий забор крови, ее фиксацию, получение обогащенной тромбоцитами плазмы и оценку степени диск-сферической трансформации тромбоцитов: их общего очертания в фас и профиль, четкости контуров, характера окраски и блеска, наличия отростков, их числа и длины (см. Шитикова А.С., Белязо О.Е., Тарковская Л.Р., Каргин В.Д. Метод определения внутрисосудистой активации тромбоцитов и его значение в клинической практике // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - №2. - С.23-35).
Однако известный способ субъективен, зависит от навыка врача-лаборанта, является качественным и не реализован в аппаратурном исполнении.
Задачей предлагаемого изобретения является объективизация и повышение точности исследования.
Поставленная задача решается за счет того, что кровь фиксируют этилен-диамин-тетрауксусной кислотой, определяют в искусственном сдвиговом потоке агрегацию тромбоцитов и при ее наличии оценивают выраженность внутрисосудистой активации тромбоцитов.
Способ определения внутрисосудистой активации тромбоцитов осуществляют следующим образом. Забирают кровь из вены, фиксируют ее этилен-диамин-тетрауксусной кислотой (ЭДТА) в концентрации 4,8 мкмоль/л, центрифугируют в режиме 1000 об/мин в течение 10 минут и получают обогащенную тромбоцитами плазму. Затем плазму, обогащенную тромбоцитами, помещают в камеру реоскопа и задают скорость сдвига 60 с-1.
IIb
3
2+
Под действием искусственного сдвигового потока рецепторы тромбоцитов, ответственные за их агрегацию (прежде всего - GP IIb/IIIa), переходят из низкоаффинного состояния в высокоаффинное, что дает им возможность взаимодействовать с лигандами, прежде всего с фибриногеном. Этот процесс происходит при наличии в среде двухвалентных ионов кальция, которые поддерживают целостность комплекса интегринов αβ и стабилизируют рецепторы GP IIb/IIIa в высокоаффинном состоянии. Переход рецепторов тромбоцитов GP IIb/IIIa из низкоаффинного в высокоаффинное состояние в отсутствие в среде ионов кальция невозможен, активация тромбоцитов происходит лишь в присутствии Ca. Определение агрегации тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме после стабилизации крови ЭДТА дает возможность судить о наличии на мембранах тромбоцитов рецепторов в высокоаффинном (наличие внутрисосудистой активации тромбоцитов) или низкоаффинном (отсутствие внутрисосудистой активации тромбоцитов) состояниях. Затем определяют суммарную оптическую плотность образовавшихся агрегатов и, если агрегация тромбоцитов в сдвиговом потоке не происходит, судят об отсутствии внутрисосудистой активации тромбоцитов, при наличии агрегации тромбоцитов оценивают ее выраженность, которая характеризует степень внутрисосудистой активации тромбоцитов. Степень агрегации тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке определяют максимальной величиной интегральной оптической плотности всех образовавшихся агрегатов, которая выражается в условных единицах (усл.ед.) оптической плотности.
Клинический пример 1.
Проведено исследование внутрисосудистой активации тромбоцитов предложенным способом у здорового донора И., 37 лет.
Установлено, что агрегация тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке не происходила, что характеризует отсутствие внутрисосудистой активации тромбоцитов.
Клинический пример 2.
Проведено исследование внутрисосудистой активации тромбоцитов тяжелообожженого больного Т., 31 года (история болезни №241896), в период токсемии (ожог 70% поверхности тела).
Установлено наличие агрегации тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке, ее степень составила 159,74 усл.ед.
Результаты исследования свидетельствовали о том, что у данного пациента часть рецепторов клеточных мембран экспрессирована, они находятся в высокоаффинном состоянии и имеется риск тромбоза, связанный с наличием в кровотоке активированных тромбоцитов. Учитывая это, пациенту следует назначать дезагрегантную терапию, прежде всего ингибиторы гликопротеиновых рецепторов.
Клинический пример 3.
Проведено исследование внутрисосудистой активации тромбоцитов у амбулаторной пациентки Г. (24 года), страдающей гидраденитом.
Установлено наличие агрегации тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке, ее степень составила 573,84 усл.ед.
Назначение антитромботической терапии не входило в общепринятую схему лечения гидраденита. В данном случае, основываясь на результатах проведенного исследования, пациентка Г. имела достаточно высокий риск тромбоза. Следовательно, она нуждалась в назначении дезагрегационной терапии на фоне общепринятой схемы лечения гидраденита.
Проанализировав результаты исследований приведенных примеров, можно сделать следующие выводы: риск тромбоза у здорового донора И. маловероятен; у ожогового больного Т. существует риск тромбоза; у пациентки Г., страдающей гидраденитом, тромбоопасность состояния выше, чем у ожогового больного Т.
2+
Преимуществами способа определения внутрисосудистой активации тромбоцитов являются объективность, точность исследования и возможность его цифровой реализации. Способ позволяет проанализировать, имеются ли экспрессированные рецепторы на мембранах тромбоцитов, а соответственно исключить либо выявить и спрогнозировать риск тромбоза у пациентов. Это особенно важно при обследовании больных с патологическими состояниями, сопровождающимися высоким риском внутрисосудистого тромбообразования, а также при проведении контроля эффективности проводимой дезагрегационной терапии. Использование ЭДТА для фиксации клеток крови, которая является хелатирующим агентом и, взаимодействуя с ионами кальция, образует растворимые соли. В результате этого связанный кальций не способен выполнять свою функцию агониста тромбоцитарной агрегации, что приводит к блокированию возможности перехода интегринов из низко- в высокоаффинное состояние. Однако если часть рецепторов тромбоцитарных мембран уже активирована, что и происходит при патологических состояниях с предрасположенностью к тромботическим осложнениям, блокада Ca не может полностью устранить агрегацию тромбоцитов в искусственном сдвиговом потоке. Поэтому наличие или отсутствие агрегации тромбоцитов, фиксированных ЭДТА, в сдвиговом потоке дает объективное представление о наличии или отсутствии внутрисосудистой активации тромбоцитов.