КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ЭПИЛЕПСИИ
COMPOSITION FOR USE IN THE TREATMENT OF EPILEPSY

Область применения изобретения
Настоящее изобретение, по существу, относится к композициям для лечения расстройств, связанных с AMPA-рецептором. В частности, в настоящем изобретении предложены композиции для лечения эпилепсии.
Предпосылки создания изобретения
Эпилепсия включает широкий диапазон неврологических расстройств, которые характеризуются эпилептическими приступами. Эпилептические приступы возникают в результате патологической активности нейронов и проявляются различными способами, включая судороги и потерю сознания. Во многих случаях эпилепсию можно контролировать путем применения противосудорожных лекарственных препаратов. Однако у части пациентов с эпилепсией лечение стандартными лекарственными средствами может оказывать минимальное влияние на активность приступа. Хотя для лечения пациентов, страдающих определенным типом приступов, можно использовать хирургическое вмешательство, для многих людей успешное лечение можно обеспечить менее инвазивным образом с помощью кетогенной диеты.
Кетогенная диета на основе триглицеридов средней цепи (ТСЦ) была впервые использована в качестве средства для лечения рефрактерной эпилепсии в 1971 г. Она представляет собой один из наиболее эффективных терапевтических подходов для детей с резистентной к лекарственным средствам эпилепсией (Liu, Epilepsia 2008; 49 Suppl. 8: 33–36). В рандомизированном контрольном исследовании было показано, что кетогенная диета эффективна в случае детской эпилепсии (Neal et al., Epilepsia 2009; 50: 1109–1117). Однако диета имеет нежелательные побочные эффекты, связанные с желудочно-кишечным трактом, такие как диарея, рвота, вздутие живота и спазмы (Liu, Epilepsia 2008; 49 Suppl 8: 33–36). Кроме того, было показано, что в случае данной диеты наблюдается высокий коэффициент выбывания из-за того, что многим пациентам сложно ее выдерживать (Levy et al., Cochrane Database Syst Rev 2012; 3: CD001903).
Кетогенные диеты отличаются высоким содержанием жиров и низким содержанием углеводов, а также достаточным количеством белка для роста и восстановления. В случае кетогенных диет организм вынужден метаболизировать жиры вместо углеводов в качестве источника энергии. В условиях низкого содержания углеводов в диете жиры расщепляются до жирных кислот и кетоновых тел в печени, и эти соединения используются в дальнейших метаболических путях для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) в качестве источника химической энергии.
Хотя предполагается, что кетоновые тела, образующиеся при кетогенной диете, играют терапевтическую роль, подавление эпилептических приступов плохо коррелирует с концентрациями кетоновых тел (Likhodii et al., Epilepsia 2000; 41: 1400–1410; Thavendiranathan et al., Exp Neurol 2000; 161: 696–703). Кроме кетонов диета также вызывает увеличение плазменных концентраций двух жирных кислот, присутствующих в содержащем ТСЦ масле: прямоцепочечной декановой кислоты, содержащей десять атомов углерода, и октановой кислоты, содержащей восемь атомов углерода (Haidukewych et al., Clin Chem 1982; 28: 642–645). Недавно было установлено, что декановая кислота, но не октановая кислота, оказывает противоэпилептическое действие в клинически значимых концентрациях in vitro и in vivo (Chang et al., Neuropharmacology 2013; 69: 105–114; Wlaz et al., Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry 2014).
Рецепторы α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA-рецепторы) играют ключевую роль в формировании и развитии эпилептической активности и в долгосрочном периоде адаптивной клеточной пластичности, связанной с эпилептогенезом (Chapman, J Nutr 2000; 130: 1043S–1045S; Rogawski and Donevan, Adv Neurol 1999; 79: 947–963). Рецепторы присутствуют во всех областях, относящихся к эпилепсии, включая кору головного мозга, миндалевидное тело, таламус и гиппокамп. Кроме того, антагонисты AMPA-рецептора обладают широким спектром противосудорожной активности в различных моделях эпилепсии in vitro и in vivo (Rogawski., Epilepsy Curr 2011; 11: 56–63). Неконкурентный антагонист AMPA-рецептора перампанел был одобрен для лечения взрослых пациентов с парциальными припадками (French et al., 2012 Neurology. 79 (6): 589–96).
Недавно было продемонстрировано, что декановая кислота ингибирует AMPA-рецепторы и что степень антагонизма к AMPA-рецептору декановой кислоты является достаточной для объяснения ее противоэпилептического эффекта (Chang et al., Brain. 2016 Feb; 139(2): 431–443). Напротив, октановая кислота не оказывала влияния на токи AMPA-рецептора, и это указывает на то, что октановая кислота вряд ли оказывает прямое влияние на подавление эпилептических припадков за счет ингибирования AMPA-рецепторов.
Для облегчения дальнейшей разработки противосудорожных лекарственных препаратов сохраняется необходимость в дальнейшем понимании вклада среднецепочечных жирных кислот в ослабление эпилептических приступов.
Изложение сущности изобретения
Было исследовано влияние смесей декановой кислоты и октановой кислоты на ингибирование AMPA-рецепторов. Хотя предыдущие исследования показали, что декановая кислота, но не октановая кислота, скорее всего не оказывает прямого влияния на опосредованное AMPA-рецепторами подавление приступов, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что максимальное ингибирование AMPA-рецепторов наблюдалось при комбинировании декановой кислоты и октановой кислоты в конкретных соотношениях, упомянутых в настоящем документе.
Было дополнительно продемонстрировано, что декановая кислота и октановая кислота по-разному метаболизируются нейроноподобными клетками. Более того, октановая кислота может предпочтительно окисляться, таким образом предотвращая окисление декановой кислоты.
Концепции изобретения
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в лечении эпилепсии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в подавлении эпилептических припадков.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в снижении возбуждающих постсинаптических токов (EPSC) у субъекта с эпилепсией.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в ингибировании AMPA-рецепторов у нуждающегося в таком ингибировании субъекта. Указанный субъект может страдать от эпилепсии. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения указанный субъект может страдать от ишемии, амиотрофического бокового склероза (АБС), рака или болезни Альцгеймера.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в лечении ишемии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в лечении амиотрофического бокового склероза (АБС).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в лечении рака.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас., для применения в лечении болезни Альцгеймера (AD).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция для применения в лечении эпилепсии или подавлении эпилептических припадков у субъекта, в отношении которого было установлено, что он реагирует на ингибирование AMPA-рецепторов.
Композиция для применения в настоящем изобретении может содержать декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10, от 71 : 29 до 89 : 11, от 72 : 28 до 88 : 12, от 73 : 27 до 87 : 13, от 74 : 26 до 86 : 14, от 75 : 25 до 85 : 15, от 76 : 24 до 84 : 16, от 77 : 23 до 83 : 17, от 78 : 22 до 82 : 18 или от 79 : 21 до 81 : 19 мас./мас.
Предпочтительно композиция для применения в настоящем изобретении содержит декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении около 80 : 20 мас.%.
Декановая кислота и октановая кислота, упомянутые в настоящем документе, могут находиться в форме триглицеридов.
В одном варианте осуществления октановая кислота и декановая кислота составляют по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99 или 100% по массе от общего содержания жирных кислот в композиции. В одном варианте осуществления октановая кислота и декановая кислота находятся в форме триглицеридов средней цепи, причем указанные триглицериды составляют по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99 или 100% от общего содержания жиров в композиции. Предпочтительно, по существу, все фрагменты жирных кислот СЦТ представляют собой фрагменты октановой или декановой кислот.
В другом варианте осуществления композиция для применения в настоящем изобретении, по существу, не содержит моно- или полиненасыщенных жирных кислот.
В другом варианте осуществления композиция для применения в настоящем изобретении находится в форме эмульсии типа «масло в воде», порошка или продукта питания.
В другом варианте осуществления композиция для применения в настоящем изобретении находится в жидкой форме, причем декановая кислота присутствует в концентрации от 5 г/л до 500 г/л, от 5 г/л до 200 г/л, от 5 г/л до 100 г/л, от 5 г/л до 50 г/л, от 5 г/л до 30 г/л, от 5 г/л до 20 г/л, от 10 г/л до 500 г/л, от 10 г/л до 200 г/л, от 10 г/л до 100 г/л, от 10 г/л до 50 г/л, от 10 г/л до 30 г/л или от 10 г/л до 20 г/л.
Например, декановая кислота может присутствовать в концентрации около 5 г/л, около 10 г/л, около 15 г/л, около 20 г/л, около 30 г/л, около 40 г/л, около 50 г/л, около 60 г/л, около 70 г/л, около 80 г/л, около 90 г/л, около 100 г/л, около 110 г/л, около 120 г/л, около 130 г/л, около 140 г/л, около 150 г/л, около 175 г/л, около 200 г/л, около 225 г/л, около 250 г/л или около 500 г/л.
В другом варианте осуществления композиция для применения в настоящем изобретении не содержит или, по существу, не содержит углеводов и белков, например композиция имеет менее 2%, 0,5% или 0,1% углеводов и белков по массе.
В другом варианте осуществления массовые количества липидов к сумме белков и углеводов в композиции составляют 1–5 к 1. Например, массовые количества липидов к сумме белков и углеводов могут составлять от 1 к 1, 2 к 1, 3 к 1, 4 к 1, 5 к 1, 2,4–4,0 к 1 или 2,6–3,8 к 1.
Композиция может находиться в форме эмульсии типа «масло в воде». В одном варианте осуществления эмульсия содержит октановую кислоту и декановую кислоту в форме триглицеридов средней цепи, причем указанные триглицериды средней цепи составляют по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99 или 100% от общего содержания жиров в композиции. Предпочтительно все или, по существу, все фрагменты жирных кислот СЦТ представляют собой фрагменты октановой или декановой кислот. Эмульсия может, по существу, не содержать белков или углеводов. В одном варианте осуществления общее содержание жира в эмульсии типа «масло в воде» составляет от 5 до 40 г/100 мл, например от 5 до 30 г/100 мл, от 5 до 25 г/100 мл, 10–25 г/100 мл, или 10–20 г/100 мл, или от 15 до 25 г/100 мл. В одном варианте осуществления энергетическая ценность эмульсии составляет от 50 до 300 ккал на 100 мл, например от 100 до 300 ккал на 100 мл, от 50 до 200 ккал на 100 мл, от 150 до 250 ккал на 100 мл или от 170 до 200 ккал на 100 мл.
В одном варианте осуществления композиция, используемая в изобретении, представлена в форме порошка.
В другом варианте осуществления композиция представлена в лиофилизированной форме.
В другом варианте осуществления композиция представлена в форме, подходящей для обогащения продукта или напитка.
В другом варианте осуществления композиция представлена в форме продукта питания.
В другом варианте осуществления композиция представлена в форме продукта лечебного питания.
В другом варианте осуществления композиция представлена в форме продукта питания через зонд.
Композиция для применения в настоящем изобретении может находиться в форме напитка, майонеза, заправки для салата, маргарина, спреда с низким содержанием жира, молочного продукта, плавленого сыра, мягкого плавленого сыра, десертного молочного продукта, ароматизированного молока, сливок, ферментированного молочного продукта, творога, масла, конденсированного молочного продукта, смеси для мороженого, соевого продукта, пастеризованной яичной массы, хлебопекарного продукта, кондитерского изделия, кондитерского батончика, шоколадного батончика, батончика с высоким содержанием жира, обработанного сверхвысокой температурой пудинга, пастеризованного пудинга, геля, желе, йогурта или продукта с наполнителем на жировой основе или содержащим воду наполнителем.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение октановой кислоты для уменьшения или предотвращения окисления декановой кислоты в нейронах.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в лечении эпилепсии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в подавлении эпилептических приступов.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в ингибировании AMPA-рецепторов у нуждающегося в таком ингибировании субъекта. Указанный субъект может страдать от эпилепсии. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения указанный субъект может страдать от ишемии, амиотрофического бокового склероза (АБС), рака или болезни Альцгеймера.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в лечении ишемии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в лечении амиотрофического бокового склероза (АБС).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в лечении рака.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена октановая кислота для применения в уменьшении или предотвращении окисления декановой кислоты в нейронах, причем декановая кислота предназначена для применения в лечении болезни Альцгеймера (AD).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения эпилепсии у субъекта, включающий введение субъекту композиции, как определено в настоящем документе.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ подавления эпилептических приступов у субъекта, включающий введение субъекту композиции, как определено в настоящем документе.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ снижения возбуждающих постсинаптических токов (EPSC) у субъекта с эпилепсией, включающий введение субъекту композиции, как определено в настоящем документе.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ ингибирования AMPA-рецепторов у субъекта, включающий введение субъекту композиции, как определено в настоящем документе. Указанный субъект может страдать от эпилепсии.
Описание графических материалов
Фиг. 1. Прямое ингибирование генерируемых AMPA-рецепторами токов путем применения смеси декановой кислоты и октановой кислоты. В экспериментах использовали AMPA-рецепторы GluA2/3, экспрессированные в модели ооцита, с добавлением 100 мкМ глутамата. Соотношения декановой кислоты и октановой кислоты оценивали на наличие ингибирующего эффекта. Продемонстрировали высоко значимое увеличение ингибирования для соотношения 8 : 2 по сравнению с соотношением 4 : 6. **P > 0,01, ***P > 0,001, н/з = не значимое.
13
13
13
13
13
13
12
13
13
13
13
13
2
Фиг. 2. Окисление C-меченой 3 мМ глюкозы, 250 мкМ C8 и 250 мкМ C10 в клетках SH-SY5Y в течение 6 ч. Скорость высвобождения CO в среду из клеток в условиях обработки (a) 3 мМ [U-C]глюкозы и (b) 250 мкМ [1-C]декановой кислоты (C10) и [1C]октановой кислоты (C8), измеренная путем изменений соотношения dC / C во времени. (c) Абсолютные скорости окисления С-меченных соединений в клетках SH-SY5Y. Было обнаружено, что скорость окисления [1-C]C10 значимо ниже (*** p < 0,0001), чем скорость каждого случая из [U-C]глюкозы и [1-C]C8. Данные выражены в виде среднего значения ± станд. ош. среднего 5 независимых экспериментов (n = 5), каждый из которых проводили в 4 одинаковых лунках. (d) Влияние совместной инкубации C8 на окисление C10. Скорость окисления 250 мкМ [1-C]C10 значимо снижалась (*p < 0,05) в присутствии 62,5 мкМ немеченой C8. Данные выражены в виде среднего значения ± станд. ош. среднего 4 независимых экспериментов (n = 4), каждый из которых проводили в 4 одинаковых лунках.
Подробное описание
Композиция
В настоящем изобретении применяются композиции, содержащие декановую (C10) кислоту и октановую кислоту (C8).
3
2
6
Октановая кислота (также известная как каприловая кислота) представляет собой насыщенную жирную кислоту формулы CH(CH)COOH.
3
2
8
Декановая кислота (также известная как каприновая кислота) представляет собой насыщенную жирную кислоту формулы CH(CH)COOH.
Композиция, используемая в настоящем изобретении, содержит декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 70 : 30 до 90 : 10 мас./мас.
Композиция может содержать декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 71 : 29 до 89 : 11, от 72 : 28 до 88 : 12, от 73 : 27 до 87 : 13, от 74 : 26 до 86 : 14, от 75 : 25 до 85 : 15, от 76 : 24 до 84 : 16, от 77 : 23 до 83 : 17, от 78 : 22 до 82 : 18, от 79 : 21 до 81 : 19 мас./мас.
В предпочтительном варианте осуществления композиция может содержать декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении от 75 : 25 до 85 : 15, предпочтительно от 76 : 24 до 84 : 16, от 77 : 23 до 83 : 17, от 78 : 22 до 82 : 18, в предпочтительном варианте осуществления в соотношении от 79 : 21 до 81 : 19 мас./мас.
Композиция может содержать декановую кислоту и октановую кислоту в соотношении около 70 : 30, около 71 : 29, около 72 : 28, около 73 : 27, около 74 : 26, около 75 : 25, около 76 : 24, около 77 : 23, около 78 : 22, около 79 : 21, около 80 : 20, около 81 : 19, около 82 : 18, около 83 : 17, около 84 : 16, около 85 : 15, около 86 : 14, около 87 : 13, около 88 : 12, около 89 : 11 или около 90 : 10. В предпочтительном варианте осуществления соотношение составляет около 80 : 20 мас./мас.
Предпочтительно октановая кислота и декановая кислота составляют по меньшей мере 80, 85, 90, 95 или 99 или 100% от общего содержания жирных кислот в композиции.
Следует понимать, что декановая кислота и октановая кислота могут находиться в свободной форме (или ее соли) или в форме, например, триглицеридов, диацилглицеридов, моноацилглицеридов, причем триглицериды являются, по существу, предпочтительными.
Триглицерид средней цепи (ТСЦ) представляет собой триглицерид, в котором все три фрагмента жирных кислот представляют собой фрагменты среднецепочечных жирных кислот. Как определено в настоящем документе, среднецепочечные жирные кислоты (СЦЖК) представляют собой жирные кислоты, имеющие от 6 до 12 атомов углерода, хотя жирные кислоты с 8 и 10 атомами углерода (т.е. октановая кислота и декановая кислота) являются особенно предпочтительными в настоящем изобретении и называются в настоящем документе жирными кислотами C8 или C8 и жирными кислотами C10 или C10.
Термин «фрагмент жирной кислоты» относится к части ТСЦ, которую получают из жирной кислоты в реакции этерификации с глицерином. В одном примере реакция этерификации между глицерином и только октановой кислотой приводит к получению ТСЦ с фрагментами октановой кислоты. В другом примере реакция этерификации между глицерином и только декановой кислотой приводит к получению ТСЦ с фрагментами декановой кислоты.
Композиция, используемая в настоящем изобретении, может содержать гомотриглицериды (т.е. все фрагменты жирных кислот ТСЦ являются идентичными, например, гомотриглицерид С8 может содержать 3 фрагмента октановой кислоты, а гомотриглицерид С10 может содержать 3 фрагмента декановой кислоты). Композиция может содержать гетеротриглицериды (т.е. фрагменты жирных кислот в ТСЦ не являются идентичными).
В одном варианте осуществления композиция не содержит или, по существу, не содержит фрагментов жирных кислот, которые не являются октановой кислотой или декановой кислотой. В одном варианте осуществления композиция не содержит или, по существу, не содержит ТСЦ, содержащих фрагменты жирных кислот, которые не являются октановой кислотой или декановой кислотой. Однако могут присутствовать следы таких ТСЦ (например, менее 3, 2, 1 или 0,5 мас.%).
Примеры натуральных источников ТСЦ включают растительные источники, в частности кокосовые орехи, кокосовое масло, пальмовые ядра, пальмоядровые масла, а также источники животного происхождения, такие как молоко. Декановая кислота и октановая кислота образуют около 5–8% и 4–10% от композиции жирных кислот в кокосовом масле соответственно.
ТСЦ также можно синтезировать путем этерификации глицерина с одной или более среднецепочечными жирными кислотами (СЦЖК). Например, ТСЦ С8 можно синтезировать путем этерификации глицерина с октановой кислотой, а ТСЦ С10 можно синтезировать путем этерификации глицерина с декановой кислотой.
В настоящем изобретении можно использовать триглицериды длинной цепи (ТДЦ). ТДЦ предпочтительно находятся в концентрации 5%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% по массе. В одном варианте осуществления ТДЦ не присутствуют в композиции.
Кроме того, композиция может дополнительно содержать такие вещества, как минеральные вещества, витамины, соли, функциональные добавки, в том числе, например, усилители вкуса, красители, эмульгаторы, противомикробные средства или другие консерванты. Минеральные вещества, которые можно использовать в таких композициях, включают, например, кальций, фосфор, калий, натрий, железо, хлор, бор, медь, цинк, магний, марганец, йод, селен, хром, молибден, фтор и т.п. Примеры витаминов, которые можно использовать в композициях, описанных в настоящем документе, включают в себя водорастворимые витамины (например, тиамин (витамин B1), рибофлавин (витамин B2), ниацин (витамин B3), пантотеновую кислоту (витамин B5), пиридоксин (витамин B6), биотин (витамин B7), миоинозитол (витамин B8), фолиевую кислоту (витамин B9), кобаламин (витамин B12) и витамин С) и жирорастворимые витамины (такие как витамин А, витамин D, витамин E и витамин К), включая их соли, сложные эфиры или производные. В различные варианты осуществления могут быть включены инулин, таурин, карнитин, аминокислоты, ферменты, коферменты и т.п.
В одном варианте осуществления композиция находится в форме эмульсии типа «масло в воде». Эмульсия может, по существу, не содержать белков или углеводов. В одном варианте осуществления общее содержание жира в эмульсии типа «масло в воде» составляет от 5 до 40 г/100 мл, например от 5 до 30 г/100 мл, от 5 до 25 г/100 мл, 10–25 г/100 мл, или 10–20 г/100 мл, или от 15 до 25 г/100 мл. В одном варианте осуществления энергетическая ценность эмульсии составляет от 50 до 300 ккал на 100 мл, например от 100 до 300 ккал на 100 мл, от 50 до 200 ккал на 100 мл, от 150 до 250 ккал на 100 мл или от 160 до 200 ккал на 100 мл.
В другом варианте осуществления композицию доставляют в составе кетогенной диеты. Вкратце, в классической версии кетогенной диеты используются соотношения для определения и описания содержания жира. Таким образом, кетогенное соотношение представляет собой взаимосвязь между граммами жиров и объединенными граммами белков и углеводов. В соотношении 4 : 1 прослеживается в четыре раза больше граммов жиров на каждый объединенный 1 г белков и углеводов. Это соотношение традиционно используется для регулирования степени кетоза, при этом более высокие соотношения теоретически стимулируют больший кетоз. В варианте кетогенной диеты с ТСЦ для определения и описания содержания жиров используется процентная доля энергии от жиров. Другие два варианта кетогенной диеты представляют собой так называемую модифицированную диету Аткинса и диету с низким гликемическим индексом (ГИ), которые подразумевают потребление людьми большого количества жиров. В этих двух последних диетах формально не рассчитывают ни соотношение, ни процентное содержание жиров, хотя, как правило, кетогенное соотношение составляет около 1 : 1. Во всех 4 вариантах кетогенной диеты процентная доля жиров от общего количества энергии находится в диапазоне 50–92%, но обычно составляет 70–90%.
Если изобретение обеспечивается как часть кетогенной диеты, соотношение общего содержания жиров : содержания белков/углеводов во время терапии может изменяться для достижения относящихся к питанию целей и для оптимизации клинической пользы. Соотношение может находиться в диапазоне, например, от 1 : 1 до 7 : 1, от 1 : 1 до 5 : 1, например, 1 : 1, 1,5 : 1, 2 : 1, 2,5 : 1, 3 : 1, 3,5 : 1, 4 : 1, 4,5 : 1 или 5 : 1.
В одном варианте осуществления соотношение составляет от 2,25 : 1 до 3,9 : 1. В другом варианте осуществления соотношение составляет от 2,26 до 3,8 : 1 или 2,7–3,4 : 1. В дополнительных вариантах осуществления соотношение составляет 3,21 : 1, 3,23 : 1, 3,24 : 1, 3,25 : 1, 3,26 : 1, 3,27 : 1, 3,28 : 1 или 3,29 : 1.
Следует учитывать, что два разных человека одного возраста и веса при одинаковом соотношении или количестве жиров могут получать клиническую пользу в различной степени. Таким образом, врач, возможно, пожелает изменить соотношение для достижения оптимальной клинической пользы. Таким образом, точная регулировка соотношения или общего содержания жиров и изменение его в начале и в конце терапии, а также во время терапии, например, для улучшения соблюдения диеты, входят в объем настоящего изобретения.
Композиция может быть предназначена для энтерального или парентерального введения. В предпочтительном варианте осуществления композиция предназначена для перорального введения.
В одном варианте осуществления композиция изобретения представлена в форме таблетки, драже, капсулы, желатиновой капсулы, порошка, гранулы, раствора, эмульсии, суспензии, покрытой оболочкой частицы, высушенной распылением частицы или таблетки.
В другом варианте осуществления композиция может находиться в форме порошка. Порошок может, например, представлять собой высушенный распылением порошок или лиофилизированный порошок.
Композицию может быть пригодной для растворения в воде.
Композицию можно включать в состав или смешивать с продуктом питания. Композиция может находиться в форме пищевого продукта или продукта питания. В одном варианте осуществления пищевой продукт представляет собой человеческий пищевой продукт.
Композиция может находиться в форме продукта лечебного питания. Используемый в настоящем документе термин «продукт лечебного питания» относится к пищевому продукту, специально приготовленному для лечения диетой медицинского заболевания или состояния; например, медицинское заболевание или состояние может отличаться определенными потребностями в питании, которые не могут быть удовлетворены только нормальной диетой. Продукт лечебного питания можно вводить под медицинским наблюдением. Продукт лечебного питания может быть предназначен для перорального приема или кормления через зонд.
Композиция может быть представлена в форме продукта питания через зонд. Термин «продукт питания через зонд» относится к продукту, который предназначен для введения питательных веществ непосредственно в желудочно-кишечный тракт субъекта с помощью зонда. Продукт питания через зонд можно вводить, например, с помощью зонда, вставленного через нос субъекта (такого как назогастральный, назоденальный и назоеюнальный зонды), или зонда, вставленного непосредственно в брюшную полость субъекта (такого как гастростомический, гастроеюностомический или еюностомический зонд).
Композиция может находиться в форме питательной композиции или биологически активной добавки к пище. Термин «биологически активная добавка к пище» относится к продукту, который является дополнением к общей диете субъекта.
Композиция может находиться в форме полного питательного продукта. Термин «полный питательный продукт» относится к продукту, который способен быть единственным источником питания для субъекта.
В различных вариантах осуществления композиция может находиться в форме напитка, майонеза, заправки для салата, маргарина, спреда с низким содержанием жира, молочного продукта, плавленого сыра, мягкого плавленого сыра, десертного молочного продукта, ароматизированного молока, сливок, ферментированного молочного продукта, творога, масла, конденсированного молочного продукта, смеси для мороженого, соевого продукта, пастеризованной яичной массы, хлебопекарного продукта, кондитерского изделия, кондитерского батончика, шоколадного батончика, батончика с высоким содержанием жира, жидкой эмульсии, высушенного распылением порошка, лиофилизированного порошка, обработанного сверхвысокой температурой пудинга, пастеризованного пудинга, геля, желе, йогурта или продукта с наполнителем на жировой основе или содержащим воду наполнителем.
В еще одних вариантах осуществления композицию изобретения можно использовать для покрытия пищевого продукта.
Композиция может находиться в форме фармацевтической композиции и может содержать один или более подходящих фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или эксципиентов.
Примеры таких подходящих эксципиентов для композиций, описанных в настоящем документе, можно найти в издании Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), под ред. A Wade и PJ Weller.
Подходящие носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в издании Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985).
Примеры подходящих носителей включают лактозу, крахмал, глюкозу, метилцеллюлозу, стеарат магния, маннит, сорбит и т.п. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.
Выбор фармацевтического носителя, эксципиента или разбавителя может быть сделан в отношении предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики. В качестве или в дополнение к носителю, эксципиенту или разбавителю фармацевтические композиции могут содержать любое (-ые) подходящее (-ие) связующее (-ие) вещество (-а), смазывающее (-ие) вещество (-а), суспендирующий (-ие) агент (-ы), покрывающий (-ие) агент (-ы) и/или солюбилизирующее (-ие) вещество (-а).
Примеры подходящих связующих веществ включают крахмал, желатин, натуральные сахара, такие как глюкоза, безводная лактоза, сыпучая лактоза, бета-лактоза, кукурузные подсластители, натуральные и синтетические камеди, такие как аравийская, трагакантовая камедь или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза и полиэтиленгликоль.
Примеры подходящих смазочных веществ включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п.
В композицию могут быть включены консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизирующие агенты. Примеры консервантов включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Можно также применять антиоксиданты и суспендирующие агенты.
К приемлемым с точки зрения питания носителям, разбавителям и эксципиентам относятся те, что подходят для потребления человеком или животным и используются в качестве стандартных в пищевой промышленности. Типичные приемлемые с точки зрения питания носители, разбавители и эксципиенты будут известны специалистам в данной области.
AMPA-рецепторы
AMPA-рецепторы представляют собой глутамат-зависимые катионные каналы, которые опосредуют большую часть быстрой возбуждающей передачи в головном мозге. Они представляют собой лиганд-зависимые ионные каналы, состоящие из комбинаций из четырех отдельных субъединиц (GluA1–4). Большинство AMPA-рецепторов являются гетеротетрамерными, состоящими из симметричного «димера димеров» GluR2 и одного из GluR1, GluR3 или GluR4. AMPA-рецепторы представляют собой высокомобильные белки, которые подвергаются конститутивной и зависимой от активности транслокации для рециркуляции и удаления из синапсов (Henley et al., Trends Neurosci. 2011;34:258–268; Anggono et al., Curr Opin Neurobiol. 2012;22:461–469). Все субъединицы имеют общую топологию мембраны по отношению друг к другу и NMDAR и субъединицам каинатного рецептора.
Каждый AMPA-рецептор имеет четыре сайта, с которым может связываться агонист (такой как глутамат), по одному на каждой субъединице. Считается, что сайт связывания образован N-концевым хвостом и внеклеточной петлей между третьим и четвертым трансмембранными доменами. При связывании агониста эти две петли перемещаются друг к другу с открытием отверстия. Канал открывается, когда заняты два сайта, и ток через него увеличивается с повышением числа занятых сайтов связывания. После открытия канал может подвергаться быстрой десенсибилизации с остановкой тока. AMPA-рецепторы открываются и закрываются быстро (1 мс) и, таким образом, ответственны за большую часть быстрой возбуждающей синаптической передачи в центральной нервной системе.
Ингибиторы AMPA-рецепторов снижают возбуждающие постсинаптические токи (EPSC). Было показано, что декановая кислота уменьшает такие токи и является ингибитором AMPA-рецептора (Chang et al., Brain. 2016 Feb; 139(2): 431–443).
Благодаря способности композиций, упомянутых в настоящем документе, оптимально ингибировать AMPA-рецепторы, композиции можно применять для ингибирования AMPA-рецепторов у нуждающегося в таком ингибировании субъекта. Предпочтительно указанный субъект страдает от эпилепсии.
Лечение
При использовании в настоящем документе термин «лечение» означает введение субъекту, имеющему состояние, композиции, описанной в настоящем документе, для предотвращения, уменьшения, ослабления или улучшения по меньшей мере одного симптома, связанного с состоянием, и/или для замедления, снижения или прекращения прогрессирования состояния.
Термин «предотвращать» означает введение композиции, описанной в настоящем документе, субъекту, не имеющему симптомов заболевания, для уменьшения или предотвращения развития по меньшей мере одного симптома, связанного с данным состоянием.
Эпилепсия
Эпилепсия представляет собой неврологическое расстройство, при котором активность нервных клеток в головном мозге нарушается, вызывая приступы или периоды необычного поведения, ощущений и иногда потери сознания.
AMPA-рецепторы играют ключевую роль в инициировании и распространении эпилептических припадков (Rogawski et al., Acta Neurol. Scand. Suppl. 127 (197): 9–18). Рецепторы присутствуют во всех областях, относящихся к эпилепсии, включая кору головного мозга, миндалевидное тело, таламус и гиппокамп. Кроме того, антагонисты AMPA-рецептора обладают широким спектром противосудорожной активности в различных моделях эпилепсии in vitro и in vivo (Rogawski., Epilepsy Curr 2011; 11: 56–63). Неконкурентный антагонист AMPA-рецепторов перампанел (Файкомпа) был одобрен для вспомогательной терапии парциальных приступов и первичных тонико-клонических приступов. Другие антагонисты AMPA-рецепторов включают NBQX (2,3-дигидрокси-6-нитро-7-сульфамоилбензо[f]хиноксалин-2,3-дион).
Благодаря способности композиций, упомянутых в настоящем документе, оптимально ингибировать AMPA-рецепторы, композиции можно применять для лечения эпилепсии.
Амиотрофический боковой склероз
Амиотрофический боковой склероз (АБС), также известный как болезнь Лу Герига и болезнь моторных нейронов (MND), является наиболее распространенным заболеванием моторных нейронов с началом во взрослом возрасте и характеризуется прогрессирующей потерей как верхних, так и нижних моторных нейронов, что приводит к мышечной слабости и атрофии во всем теле. АБС может быть врожденным или спорадическим. Как правило, пациенты с АБС умирают от прогрессирующего паралича респираторных мышц в течение нескольких лет после начала заболевания. В качестве объяснения патогенеза АБС была предложена эксайтотоксичность, патологический процесс, при котором нейроны повреждаются и уничтожаются в результате избыточной активности AMPA-рецепторов. Перорально вводимый перампанел, селективный неконкурентный антагонист AMPA-рецепторов, препятствовал прогрессированию фенотипа АБС в мышиной модели АБС (Akamatsu et al., Sci. Rep (2017) 6:28649).
Ишемия
2+
2+
Ишемия представляет собой уменьшение кровотока к ткани, связанное с опасным сокращением подачи кислорода и глюкозы, например гипоксией и гипогликемией. Во время ишемии может возрастать проницаемость AMPA-рецепторов для Ca, что может приводить к эксайтотоксичности и связанной с ней гибели нервных клеток. Было показано, что Ca-проницаемые AMPA-рецепторы выраженно экспрессируются в пирамидальных нейронах CA1, т.е. в области гиппокампа, которая более уязвима к гибели клеток вследствие эпизода ишемии, чем другие области гиппокампа. Было показано, что антагонисты AMPA-рецепторов, такие как NBQX, способны предотвращать разрушение нейронов в животных моделях ишемии (Chang et al., (2012) European Journal of Neuroscience, 35, 1908–1916).
Рак
Связь между кетогенной диетой на основе ТСЦ, AMPA-рецепторами и лечением рака была установлена в исследованиях, демонстрирующих, что клетки глиобластомы человека экспрессируют повышенные уровни AMPA-рецепторов (Choi, J., et al., Glioblastoma cells induce differential glutamatergic gene expressions in human tumor-associated microglia/macrophages and monocyte-derived macrophages. Cancer Biol Ther, 2015. 16(8): p. 1205–13) и ингибирование AMPA-рецепторов подавляет миграцию и пролиферацию клеток мультиформной глиобластомы (GBM) (Ishiuchi, S., et al., Ca2+-permeable AMPA receptors regulate growth of human glioblastoma via Akt activation. J Neurosci, 2007. 27(30): p. 7987–8000, Ishiuchi, S., et al., Blockage of Ca(2+)-permeable AMPA receptors suppresses migration and induces apoptosis in human glioblastoma cells. Nat Med, 2002. 8(9): p. 971–8, Yoshida, Y., et al., Serum-dependence of AMPA receptor-mediated proliferation in glioma cells. Pathol Int, 2006. 56(5): p. 262–71.) и других раковых клеток (von Roemeling, C.A., et al., Neuronal pentraxin 2 supports clear cell renal cell carcinoma by activating the AMPA-selective glutamate receptor-4. Cancer Res, 2014. 74(17): p. 4796–810). Кроме того, показано, что недавно лицензированный специфичный ингибитор AMPA-рецепторов перампанел является потенциально химиотерапевтически активным вспомогательным веществом в исследовании одного случая лечения GBM (Rosche, J., et al., [Perampanel in the treatment of a patient with glioblastoma multiforme without IDH1 mutation and without MGMT promotor methylation]. Fortschr Neurol Psychiatr, 2015. 83(5): p. 286–9.) Таким образом, эти исследования позволяют предположить, что ингибирование AMPA-рецепторов посредством декановой кислоты может потенциально использоваться в качестве вспомогательного способа лечения рака.
Болезнь Альцгеймера
Существуют убедительные доказательства того, что амилоид β(Аβ) усиливает токи через AMPA-рецепторы и инициирует интернализацию субъединиц. Данная теория непосредственно связывает гиперактивность глутаматного рецептора с нейротоксичностью и потерей памяти при болезни Альцгеймера. Было показано, что Aβ взаимодействует с β-адренергическими рецепторами, которые регулируют экспрессию генов и активность различных рецепторов, включая глутаматные рецепторы типа AMPA, посредством сигнального каскада цАМФ/PKA (Wang, D., et al., Binding of amyloid beta peptide to beta2 adrenergic receptor induces PKA-dependent AMPA receptor hyperactivity. FASEB J, 2010. 24(9): p. 3511–21, Wisely, E.V., Y.K. Xiang и S. Oddo, Genetic suppression of beta2-adrenergic receptors ameliorates tau pathology in a mouse model of tauopathies. Hum Mol Genet, 2014. 23(15): p. 4024–34). Было показано, что фосфорилирование субъединиц GluA1 AMPA-рецептора посредством PKA увеличивает вероятность открытия канала, что приводит к увеличению проникновения кальция в клетку (Banke, T.G., et al., Control of GluR1 AMPA receptor function by cAMP-dependent protein kinase. J Neurosci, 2000. 20(1): p. 89–102). Более того, многочисленные исследования показали, что добавление Aβ к культурам нейронов приводит к нейротоксичности путем усиления токов, генерируемых кальций-зависимыми AMPA-рецепторами (Whitcomb, D.J., et al., Intracellular oligomeric amyloid-beta rapidly regulates GluA1 subunit of AMPA receptor in the hippocampus. Sci Rep, 2015. 5: p. 10934). Это говорит о том, что Aβ-индуцированная эксайтотоксичность может способствовать широкомасштабной смерти нейронов при болезни Альцгеймера. В дополнение к кетонам, обеспечивающим энергией резистентные к глюкозе нейроны, кетогенная диета на основе ТСЦ может, таким образом, увеличивать выживаемость нейронов за счет ингибирования AMPA-рецепторов декановой кислотой. Кроме того, есть доказательства того, что лечение Aβ вызывает интернализацию субъединиц GluA2, единственного типа субъединиц AMPA-рецептора, который обеспечивает непроницаемость для кальция. Таким образом, интернализация GluA2 может дополнительно увеличивать общий приток кальция в постсинаптическую клетку, что может дополнительно увеличивать воспаление и нейротоксичность (Beppu, K., et al., Expression, subunit composition, and function of AMPA-type glutamate receptors are changed in activated microglia; possible contribution of GluA2 (GluR-B)-deficiency under pathological conditions. Glia, 2013. 61(6): p. 881–91, Noda, M., Dysfunction of Glutamate Receptors in Microglia May Cause Neurodegeneration. Curr Alzheimer Res, 2016. 13(4): p. 381–6), что указывает на то, что антагонисты AMPA-рецепторов могут играть роль в лечении болезни Альцгеймера.
Введение
Композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить энтерально или парентерально.
Предпочтительно композицию вводят энтерально. Например, композицию можно вводить в форме пищевого продукта или добавки.
Энтеральное введение может быть пероральным, желудочным и/или ректальным.
В общем введение композиции, описанной в настоящем документе в желудочно-кишечный тракт может, например, осуществляться пероральным путем или другим путем, например, введение может осуществляться посредством зонда.
Субъект может представлять собой млекопитающее, такое как человек, собака, кошка, лошадь, козел, бык, овца, свинья, олень и приматы. Предпочтительно субъект представляет собой человека.
Примеры
При практическом применении настоящего изобретения, если не указано иное, будут использоваться стандартные методы, применяемые в химии, молекулярной биологии, микробиологии, методы рекомбинантной ДНК и иммунологии, известные специалистам в данной области. Такие методы описаны в литературе. См., например, J. Sambrook, E. F. Fritsch и T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree и A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak и James O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley и J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; и E. M. Shevach и W. Strober, 1992 and periodic supplements, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY. Каждый из этих общих текстов включен в настоящий документ путем ссылки.
Пример 1. Воздействие обработки смесью декановой кислоты и октановой кислоты на электрофизиологические данные ооцитов
Способы
Транскрипция РНК субъединиц AMPA-рецептора in vitro
кДНК AMPA-рецептора (перевернутая изоформа), вставленные в вектор экспрессии с полимеразой SP6 (pSP6T), были подарены компанией Prof Ralf Schoepfer (NPP, UCL). РНК транскрибировали in vitro из линеаризованных транскриптов Mlu I с использованием набора для синтеза РНК SP6 Promega RiboMax (г. Мадисон, штат Висконсин, США) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением добавления 0,75 мМ кэпирующего нуклеотида m7G(5’)ppp(5’)G (Promega, г. Мадисон, штат Висконсин, США) и 1,6 мМ GTP. Концентрации и целостность кРНК оценивали по интенсивности полос флуоресценции в денатурирующих ДНК гелях. кРНК AMPA-рецептора смешивали в номинальном соотношении 1 : 1 и вводили в один ооцит приблизительно 5 нг.
Получение и инъекция ооцита
3
2
2
Ооциты Xenopus laevis были приобретены в European Xenopus Resource Centre Портсмутского университета. Ооциты стадии V и VI механически рассекали, а затем подвергали легкому встряхиванию в течение приблизительно 30–50 мин при комнатной температуре с модифицированным раствором Барта (в мМ): NaCl 88, KCl 1, NaHCO 2,4, MgCl 0,82, CaCl 0,77, Tris-Cl 15, с pH, доведенным до 7,4 с помощью NaOH (Sigma-Aldrich, Великобритания), с добавлением 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen, Великобритания) и 50 мкг/мл тетрациклина (Sigma-Aldrich, Великобритания) и 1% коллагеназы (тип 1A). Здоровые ооциты вручную извлекали из фолликула и проводили инъекции кРНК только гомомерных субъединиц (GluA1) или гетеромерных смесей из двух субъединиц (GluA2/GluA3) с использованием автоматизированного инъектора Drummond Nanoinject II (г. Брумолл, штат Пенсильвания, США). Затем ооциты инкубировали при температуре 17°C в модифицированном растворе Барта в течение по меньшей мере 48 часов, а затем использовали для регистрации электрофизиологических данных.
Регистрация электрофизиологических данных ооцитов
2
2
Эксперименты проводили при комнатной температуре (приблизительно 21–23°C). Ооцит помещали в камеру для регистрации (объем 0,3–0,5 мл) и перфузировали раствором ND96 (96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCI, 1 мМ MgCl, 5 мМ HEPES, pH доводили до 7,5). Электроды тока и напряжения были наполнены 300 мМ KCl и изготовлены из тонкостенного боросиликатного стекла (GC150TF-7.5, Harvard Apparatus, г. Кент, Великобритания) с помощью устройства для вытягивания электродов PC-10 (Narashige Instruments, Япония) и имели сопротивление 0,5–2 МОм. Потенциал на мембране ооцитов был зафиксирован на уровне -50 мВ или -60 мВ с использованием усилителя Turbo TEC-03 (npi electronics, г. Тамм, Германия). Соединения растворяли в дистиллированной воде или DMSO и растворяли в промывочном растворе для достижения конечных концентраций во время экспериментов и в ходе эксперимента наносили под действием силы тяжести с использованием многоклапанной перфузионной системы (VC3-8C, ALA Scientific Instruments, г. Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США). Промывочные растворы перфузировали со скоростью 10 мл/мин. Полученные данные фильтровали при 20 Гц и оцифровали при 100 Гц (Digidata 1322A, Molecular Devices, г. Саннивейл, штат Калифорния, США), а затем записывали их на жесткий диск компьютера. Сбор данных осуществлялся с помощью программы на базе ПК с ОС Windows WinEDR v3.0.6 (John Dempster, Университет Стратклайд, Великобритания).
Результаты
Ранее было показано, что декановая кислота обладает острыми противоэпилептическими эффектами и что антагонизм к AMPA-рецептору декановой кислоты является достаточным для объяснения ее противоэпилептического эффекта (Chang et al., Neuropharmacology 2013; 69: 105–114); Wlaz et al., Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry 2014).
В предыдущих исследованиях авторов настоящего изобретения было выявлено, что декановая кислота является прямым ингибитором активности AMPA-рецептора (GluA 2/3; IC50 = 0,52 ± 0,02 мМ, n = 12); октановая кислота имеет схожий, но менее мощный эффект (GluA 2/3; IC50 = 3,82 ± 0,03 мМ, n = 10). Было продемонстрировано, что такое ингибирование с большой долей вероятности приводит к подавлению эпилептического приступа, поскольку концентрация декановой кислоты в периферической крови составляет около 87–552 мкМ со средним значением 157 мкМ, а октановой кислоты около 104–859 мкМ, в среднем около 306 мкМ. Более того, соотношение концентрации декановой кислоты в плазме крови к концентрации головном мозге в животных моделях составляет около 0,7, и это указывает на то, что декановая кислота с большой долей вероятности присутствует в головном мозге в концентрациях, обеспечивающих ингибирование AMPA-рецептора. Интересно, что октановая кислота в этих экспериментах вероятнее всего не оказывает прямого воздействия на подавление эпилептических припадков за счет ингибирования AMPA-рецептора.
Таким образом, было изучено влияние обеих жирных кислот на ингибирование AMPA-рецептора при использовании их в качестве смеси для расчета приблизительной дозировки, содержащейся в диетах на основе ТСЦ. В этих экспериментах были экспрессированы AMPA-рецепторы (GluA 2/3) в модели ооцита и проведено сравнение снижения токов через AMPA-рецепторы после введения глутамата с использованием декановой кислоты и октановой кислоты в соотношениях 0 : 1, 3 : 7, 4 : 6, 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3, 8 : 2, 9 : 1 и 1 : 0 с общим содержанием среднецепочечных жирных кислот 1 мМ (Фиг. 1). Эти эксперименты показали, что увеличение отношения декановой кислоты к октановой кислоте усиливало ингибирование AMPA-рецепторов в соотношениях ингибирования до 8 : 2 (декановая кислота : октановая кислота). При этом соотношении (8 : 2) ингибирование AMPA-рецепторов значительно повышалось по сравнению с соотношением 4 : 6, обычно используемым в современных маслах из ТСЦ. При соотношениях выше 8 : 2 (т.е. 9 : 1 и только декановая кислота (1 : 0)) не было продемонстрировано повышение ингибирования AMPA-рецепторов. Эти данные свидетельствуют о том, что максимальное ингибирование AMPA-рецепторов комбинацией декановой кислоты и октановой кислоты обеспечивается при соотношении 8 : 2.
Пример 2. Сравнение окисления декановой кислоты в нейронах и окисления декановой кислоты и октановой кислоты в нейронах
Способы
Клеточная культура
2
2+
2+
4
2
Клетки SH-SY5Y использовали между пассажами 20–24 для всех экспериментальных процедур. Клетки культивировали в смеси модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM) и среды F12 в соотношении 1 : 1, содержащей 17,5 мМ глюкозы, 100 мл/л термоинактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 10 мл/л 200 мМ L-глутамина. Все клетки поддерживали в увлажненной атмосфере при 37°C и 5% CO. Клетки субкультивировали путем промывки 10 мл/колба не содержащего Mg/ Ca фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS), поднимали 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и суспендировали в 8 мл культуральной среды для инактивации трипсина. Клеточную суспензию переносили в пробирку Falcon и центрифугировали в течение 4 минут при 500xg. Надосадочную жидкость удаляли и клетки суспендировали в известном объеме свежей культуральной среды. Клетки подсчитывали с использованием теста на жизнеспособность с окрашиванием трипановым синим. Известный объем клеточной суспензии смешивали в соотношении 1 : 1 с 0,4% раствором трипанового синего и выполняли подсчет с помощью автоматического счетчика клеток Bio-Rad TC20™ (г. Хемел-Хемпстед, Великобритания). Затем клетки высевали с плотностью 1 x 10 клеток/см в 6-луночные планшеты, доводили до конечного объема 2 мл свежей средой и культивировали в течение 5 дней перед всеми экспериментами. Для каждого исследования использовали то же самое исходное число клеток. Среду обновляли каждые два дня.
Глюкоза, деканоат и окисление октаноата в клетках SH-SY5Y
13
13
13
13
Все экспериментальные процедуры проводили с использованием специально приготовленной среды DMEM, содержащей конечную концентрацию 15 мМ HEPES, 2,9 мМ бикарбоната натрия, 2 мМ L-глутамина, 0,5 мМ пирувата натрия и 21,5 мкМ фенолового красного. Маточный раствор 134,3 мМ [U-C]глюкозы получали путем растворения глюкозы в растворе DMEM с последующим замораживанием при -20°C аликвотами. Маточные растворы 50 мМ [1-C]декановой кислоты ([1-C]C10) и 50 мМ [1-C]C8 получали в DMSO, подвергали их стерилизующей фильтрации, а затем хранили аликвотами при температуре -20°C.
2
2
13
13
13
13
На день 5 культивирования полноценную ростовую среду удаляли и клетки промывали один раз DPBS. Затем клетки инкубировали с 2 мл среды DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 3 мМ D-глюкозы в течение 20 ч при температуре 37°C и 5% CO. Через 20 ч среду удаляли и клетки промывали один раз DPBS. Затем в каждую лунку добавляли 3 мл DMEM, содержащей 3 мМ [U-C]-глюкозы и контрольной несущей среды DMSO, или 3 мМ D-глюкозы с 250 мМ [1-C]C10 или 250 мкМ [1-C]C8. Затем лунки герметизировали слоем 3 мл тяжелого минерального масла для предотвращения газового обмена между средой и атмосферой и потери CO. Клетки инкубировали при 37°C в течение 6 часов, причем 100 мкл среды отбирали из каждой лунки с часовыми интервалами. Отобранные среды немедленно помещали для хранения во флаконы с резиновой пробкой Exetainer™ (Labco Ltd, г. Кередигон, Великобритания) и хранили при -20°C до анализа.
Совместная инкубация C10 и C8
13
13
13
13
Исследовали также влияние совместной инкубации C10 и C8 на окисление C10 в клетках SH-SY5Y. Дополнительные маточные растворы 25 мМ C8 и 100 мМ [1-C]C10 получали в DMSO, подвергали их стерилизующей фильтрации и хранили аликвотами при -20°C. Клетки культивировали и инкубировали в течение 20 ч в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 3 мМ D-глюкозы, как описано выше. Затем среду удаляли и клетки промывали. Затем среду заменяли 3 мл DMEM, содержащей либо 3 мМ [U-C]глюкозы и контрольную несущую среду DMSO, либо 3 мМ немеченой D-глюкозы. В каждой лунке, в которую была добавлена D-глюкоза, клетки обрабатывали либо конечной концентрацией 250 мкМ [1-C]C10, либо 250 мкМ [1-C]C10 плюс 62,5 мкМ C8 в фиксированном общем объеме. Затем лунки герметизировали тяжелым минеральным маслом, клетки инкубировали и отбирали среды, как описано выше.
13
Получение [U-C]-пальмитиновой кислоты
13
13
13
13
[U-C]пальмитиновую кислоту нейтрализовали 0,35 М NaOH и доводили до концентрации 17,5 мМ в воде, а затем выдерживали при 70°C до полного растворения. После этого не содержащий жирных кислот бычий сывороточный альбумин (BSA) растворяли до концентрации 3,5 мМ в воде при 37°C. Затем при аккуратном перемешивании вихревыми движениями медленно добавляли [U-C]-пальмитат ([U-C]-C16) в соотношении 1 : 1 к BSA при 37°C с образованием комплекса 8,75 мМ [U-C]C16 : BSA (молярное соотношение жирная кислота : BSA 5 : 1). Кроме того, получали дополнительный маточный раствор 1,75 мМ BSA в воде. Оба раствора разделяли на аликвоты и хранили при -20°C до дальнейшего применения.
Анализ ингибирования CPT1
2
13
13
13
13
Маточный раствор 50 мМ этомоксира получали в стерильной воде для культивирования клеток и хранили аликвотами при температуре -20°C. На день 5 культивирования ростовую среду заменяли 2 мл среды DMEM, содержащей 3 мМ D-глюкозы и 10% FBS. Клетки инкубировали с 50 мкМ этомоксиром или без него в течение 20 ч при температуре 37°C и 5% CO. Затем среду удаляли и заменяли 3 мл среды DMEM, содержащей 3 мМ [U-C]глюкозы и контрольную несущую среду DMSO или 3 мМ D-глюкозы и 250 мкМ [1-C]C10, [1-C]C8 или [U-C]C16:BSA, к ранее обработанным клеткам также добавляли 50 мкМ этомоксира. Затем лунки герметизировали тяжелым минеральным маслом, а клетки инкубировали и отбирали среды, как описано выше.
13
2
Измерение высвобождения CO
2
2
2
2
2
13
12
13
12
13
12
Образцы размораживали при комнатной температуре и 100 мкл 1M соляной кислоты вводили через мембрану в каждый флакон для высвобождения из среды CO. Флаконы центрифугировали в течение 30 секунд при 500xg. Затем образцы анализировали на GasBench II, соединенном с масс-спектрометром изотопных соотношений Thermo Delta-XP. Для каждого образца проводили десять повторных инъекций, а соотношения dC / C измеряли по отношению к Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB) с использованием откалиброванного стандартного газа CO. Соотношения CO/ CO преобразовали в молярные проценты избытка с использованием абсолютного молярного отношения C к C (0,0111796) в VPDB. Затем изменение молярных процентов избытка преобразовывали в нмоль CO, образовавшегося с использованием объема среды и концентрации бикарбоната (2,9 мМ), затем корректировали на число меченых атомов углерода (1 для C8 и C10, 6 для глюкозы и 16 для пальмитата) с получением нмоль окисленного субстрата.
Жизнеспособность клеток
2
Клетки инкубировали в течение 20 ч при 37°C и 5% CO с 50 мкМ этомоксира в среде DMEM с добавлением 10% FBS, а затем дополнительно 6 ч при 37°C с 50 мкМ этомоксира в среде DMEM без FBS. Затем клетки поднимали из лунок с использованием 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА с суспендированием в 4 мл культуральной среды и центрифугировали в течение 4 минут при 500xg. Надосадочную жидкость удаляли и клетки суспендировали в 1 мл свежей культуральной среды. Затем тестировали жизнеспособность клеток с помощью теста с окрашиванием трипановым синим.
Статистический анализ
Данные выражены в виде среднего значения ± станд. ош. среднего, где число n указывает на число проведенных независимых экспериментов. Статистический анализ между двумя группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента, где p < 0,05 считали статистически значимым различием.
Результаты
Скорости окисления глюкозы, C8 и C10 в клетках SHSY5Y
13
13
13
13
13
2
2
C-меченные соединения позволяют измерять скорости клеточного окисления глюкозы, C8 или C10 посредством высвобождения CO, обусловленного активностью пируватдегидрогеназы и/или циклом Кребса. Для определения и количественной оценки скорости клеточного окисления каждого соединения применяли высвобождение CO в течение более 6 часов. Клетки обрабатывали 3 мМ C-меченной глюкозы, чтобы воспроизвести физиологические концентрации, наблюдаемые у пациентов, получающих кетогенную диету на основе ТСЦ. C-меченные C10 и C8 добавляли по отдельности до конечной концентрации 250 мкМ, которая представляет собой концентрацию C10, ранее определенную авторами изобретения, для оптимального воздействия на митохондрии и антиоксидантный статус. Более того, такая же концентрация достигается в головном мозге после периферического введения C10 (Hughes et al. 2014; Wlaz et al. 2015). 3 мМ немеченой глюкозы использовали в присутствии С-меченных C10 и C8.
13
2
Высвобождение CO для каждой исследуемой молекулы было линейным в течение 6 часов инкубации [фиг. 2a и 2b]. Как и ожидалось, скорость окисления глюкозы была заметно выше, чем C8 или C10 [фиг. 2c]. Однако было обнаружено, что в этих клетках C8 и C10 окисляются по-разному, при этом окисление C10 было значительно меньше, чем C8, приблизительно на 80% (фиг. 2с). Это позволяет предположить, что C8 может предпочтительно окисляться в клетках SH-SY5Y.
Влияние совместной инкубации на окисление C8 и C10
13
Текущие варианты кетогенной диеты на основе ТСЦ состоят из смеси C8 и C10. Таким образом, было изучено влияние на окисление [1-C]C10 обработки клеток SH-SY5Y 62,5 мкМ немеченой C8. Несмотря на относительно низкую концентрацию было обнаружено, что добавление C8 существенно снижает скорость окисления C10 на 29% (фиг. 2d, p < 0,05).
Окисление C10 после ингибирования CPT1
13
13
Для определения механизмов, лежащих в основе дифференцированного окисления C8 и C10, была изучена потенциальная роль карнитинового шаттла. В то время как для длинноцепочечных жирных кислот эта система необходима, среднецепочечные жирные кислоты, как считается, по существу, способны проникать в митохондриальный матрикс независимо от карнитина. Хотя это может относиться к C8, есть сведения, указывающие на то, что C10, в отличие от C8, может требовать наличия карнитиновой системы для полного митохондриального окисления. Карнитин-пальмитоилтрансфераза-1 (CPT1) отвечает за перенос ацильных групп жирных кислот на карнитин и является стадией, ограничивающей скорость карнитинозависимого β-окисления в митохондриях. Для оценки потенциальной роли CPT1 в окислении C8 и C10 использовали подробно описанный необратимый ингибитор CPT1 этомоксир. [U-C]пальмитиновую (C16) кислоту, которая, как хорошо известно, зависит от CPT I в отношении митохондриального окисления, использовали в качестве контроля, чтобы можно было определить максимальную концентрацию этомоксира, которую можно использовать для ингибирования CPT1, не влияя на жизнеспособность клеток. При использованных условиях окисление [U-C]C16 было почти полностью ингибировано (уменьшено на 99%), что указывает на полное необратимое ингибирование CPT1 [таблица 1]. Более того, обнаружено, что этомоксир не оказывает влияния на жизнеспособность клеток SH-SY5Y (данные не показаны). В тех же условиях обнаружено, что окисление C10 уменьшается на 95% в присутствии этомоксира [таблица 1], тогда как окисление C8 было ингибировано только на 34%.
Таким образом, декановая кислота и октановая кислота по-разному метаболизируются нейроноподобными клетками. Карнитиновая зависимость и замедленный метаболизм C10 дают объяснение того, как могут возникать критические концентрации, что обеспечивает возможность взаимодействий с основными противоэпилептическими мишенями. Напротив, C8 может предпочтительно метаболизироваться и обладает двумя ключевыми эффектами: сбережение C10 путем ингибирования окисления C10 и функционирование в качестве источника энергии для метаболизма головного мозга.
13
Таблица 1. Влияние ингибирования CPT1 на скорости окисления C8 и C10 в клетках SH-SY5Y Ингибирование CPT1 привело к значимому снижению (***p < 0,0001 по сравнению с необработанными клетками) окисления C10 на 95%. Скорость окисления C8 также значимо снизилась на 34% (**p < 0,01 по сравнению с необработанными клетками). Результаты выражены в виде среднего значения ± станд. ош. среднего 5 независимых экспериментов (n = 5), каждый из которых проводили в двух повторениях. Ингибирование CPT1 было подтверждено значимым ингибированием на 99% окисления [U-C]C16 (***p < 0,0001 по сравнению с необработанными клетками). Результаты выражены в виде среднего значения ± станд. ош. среднего 3 независимых экспериментов (n = 3), каждый из которых проводили в двух повторениях.
Скорость окисления (нмоль/ч)
Соединение
- Этомоксир
+ Этомоксир
[1-<sup>13</sup>C]C8
1,14 ± 0,11
0,75 ± 0,06**
[1-<sup>13</sup>C]C10
0,20 ± 0,02
0,01 ± 0,01***
[U-<sup>13</sup>C]C16
0,22 ± 0,05
0,002 ± 0,003***