СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВАРИАНТНЫХ САЙТОВ РАСПОЗНАВАНИЯ ДЛЯ РЕДКОЩЕПЯЩИХ СКОНСТРУИРОВАННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ДВУНИТЕВОГО РАЗРЫВА И КОМПОЗИЦИИ С НИМИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ идентификации вариантного сайта распознавания для редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва, способного к введению редкого двунитевого разрыва в предполагаемом сайте распознавания, причем указанный способ включает:
a. приведение в контакт геномной ДНК с редкощепящим сконструированным средством для индукции двунитевого разрыва, способным к введению двунитевого разрыва в указанную геномную ДНК, где двунитевой разрыв приводит в результате к образованию нуклеотидного липкого конца;
b. лигирование первого адаптера с указанным нуклеотидным липким концом;
c. разрезание лигированной ДНК, полученной на стадии (b), и лигирование по меньшей мере одного второго адаптера с разрезанным нуклеотидным концом для осуществления амплификации и секвенирования фрагментов геномной ДНК, окружающих двунитевой разрыв;
d. выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, полученных в (c), с эталонной геномной последовательностью ДНК; и
e. идентификацию вариантного сайта распознавания, содержащего изменение по меньшей мере по одному нуклеотидному основанию по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания указанного сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва.
2. Способ по п. 1, где редкощепящее сконструированное средство для индукции двунитевого разрыва выбирают из группы, состоящей из мегануклеазы, нуклеазы "цинковые пальцы", TAL-эффекторной нуклеазы, транспозазы и сайт-специфической рекомбиназы.
3. Способ по п. 1, где нуклеотидный липкий конец представляет собой 3'-нуклеотидный липкий конец.
4. Способ по п. 1, где нуклеотидный липкий конец представляет собой 5'-нуклеотидный липкий конец.
5. Способ по. 1, где первый адаптер, лигированный с нуклеотидным липким концом, представляет собой нефосфорилированный по 5' адаптер.
6. Способ по п. 1, где геномную ДНК выбирают из группы, состоящей из прокариотической ДНК, эукариотической ДНК и синтетической ДНК.
7. Способ по п. 6, где эукариотическую ДНК выделяют из растения, дрожжей или животного.
8. Способ по п. 7, где растение выбирают из группы, состоящей из сои, подсолнечника, хлопчатника, люцерны, канолы, хлопчатника, табака, картофеля, Arabidopsis, сафлора, маиса, риса, сорго, ячменя, пшеницы, проса, овса, сахарного тростника, газонной травы и проса прутьевидного.
9. Способ по п. 1, где средство для индукции двунитевого разрыва получают из I-CreI.
10. Способ идентификации вариантного сайта распознавания с улучшенной активностью расщепления для редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва, способного к введению редкого двунитевого разрыва в предполагаемом сайте распознавания, причем указанный способ включает:
a. приведение в контакт геномной ДНК с редкощепящим сконструированным средством для индукции двунитевого разрыва, способным к введению двунитевого разрыва в указанную геномную ДНК, где двунитевой разрыв приводит в результате к образованию нуклеотидного липкого конца;
b. лигирование первого адаптера с указанным нуклеотидным липким концом;
c. разрезание лигированной ДНК, полученной на стадии (b), и лигирование второго адаптера с разрезанным нуклеотидным концом для осуществления амплификации и секвенирования фрагментов геномной ДНК, окружающих двунитевой разрыв;
d. выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, полученных в (c), с эталонной геномной последовательностью ДНК; и
e. идентификацию вариантного сайта распознавания, содержащего изменение по меньшей мере по одному нуклеотидному основанию по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания указанного редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва;
f. анализ активности редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва в вариантных сайтах распознавания из d); и
g. идентификацию вариантного сайта распознавания, который приводит в результате к повышенной активности редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва по сравнению с активностью в предполагаемом сайте распознавания.
11. Способ по п. 10, где о повышенной активности редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва свидетельствует:
a. более высокий процент (%) расщепления вариантного сайта распознавания по сравнению с процентом (%) расщепления предполагаемого сайта распознавания, где сайты распознавания расположены на геномной ДНК;
b. более высокий процент (%) расщепления вариантного сайта распознавания по сравнению с процентом (%) расщепления предполагаемого сайта распознавания, где сайты распознавания расположены на плазмидной ДНК;
c. более высокая оценка в анализе на дрожжах для вариантного сайта распознавания по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания; или
d. любая комбинация (a), (b) и (c).
12. Способ введения в геном клетки вариантного сайта распознавания для редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва, способного вводить редкий двунитевой разрыв в предполагаемый сайт распознавания, причем указанный способ включает:
a. предоставление донорной ДНК, содержащей вариантный сайт распознавания для редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва, способного к введению двунитевого разрыва в предполагаемый сайт распознавания, где указанное редкощепящее сконструированное средство для индукции двунитевого разрыва также способно к введению двунитевого разрыва в указанный вариантный сайт распознавания;
b. предоставление растительной клетки;
c. приведение в контакт растительной клетки с донорной ДНК; и
d. идентификацию по меньшей мере одной растительной клетки из (c), содержащей в своем геноме указанный вариантный сайт распознавания.
13. Способ по п. 12, где редкощепящее сконструированное средство для индукции двунитевого разрыва выбирают из группы, состоящей из мегануклеазы, нуклеазы "цинковые пальцы", TAL-эффекторной нуклеазы, транспозазы, эндонуклеазы Cas и сайт-специфической рекомбиназы.
14. Выделенный полинуклеотид, содержащий вариантный сайт распознавания с улучшенной активностью расщепления для сконструированной мегануклеазы, способной к введению двунитевого разрыва в предполагаемый сайт распознавания, где указанный вариантный сайт распознавания содержит нуклеотидную последовательность с заменой по меньшей мере 1 нуклеотидного основания по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания SEQ ID NO: 14.
15. Выделенный полинуклеотид по п. 14, где указанный вариантный сайт распознавания содержит последовательность с изменениями по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 пар оснований по сравнению с SEQ ID NO: 14.
16. Выделенный полинуклеотид по п. 14, где указанный вариантный сайт распознавания содержит:
a) аденин (A) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 9 в SEQ ID NO: 14;
b) гуанин (G) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 10 в SEQ ID NO: 14;
c) тимин (T) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 11 в SEQ ID NO: 14;
d) аденин (A) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 13 в SEQ ID NO: 14;
e) тимин (T) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 18 в SEQ ID NO: 14;
f) гуанин (G) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 19 в SEQ ID NO: 14;
g) гуанин (G) или аденин (A) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 22 в SEQ ID NO: 14 или
h) любую комбинацию из a)-g).
17. Выделенный полинуклеотид по п. 14, где указанная вариантная последовательность распознавания выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35.
18. Выделенный полинуклеотид по п. 14, где об улучшенной активности расщепления свидетельствует:
a) более высокий процент (%) расщепления вариантного сайта распознавания по сравнению с процентом (%) расщепления предполагаемого сайта распознавания SEQ ID NO:14, где сайты распознавания расположены на геномной ДНК;
b) более высокий процент (%) расщепления вариантного сайта распознавания по сравнению с процентом (%) расщепления предполагаемого сайта распознавания, где сайты распознавания расположены на плазмидной ДНК;
c) более высокая оценка в анализе на дрожжах для вариантного сайта распознавания по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания; или
d) любая комбинация (a), (b) и (c).
19. Рекомбинантный фрагмент ДНК, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 14.
20. Клетка, содержащая рекомбинантный фрагмент ДНК по п. 19.
21. Клетка по п. 20, где клетка представляет собой клетку дрожжей или растительную клетку.
22. Трансгенное растение или семя, содержащее растительную клетку по п. 21.
23. Трансгенное растение по п. 22, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, сахарного тростника, сорго, ржи, проса прутьевидного, сои, Brassica, подсолнечника, хлопчатника или люцерны.
24. Выделенный полинуклеотид, содержащий вариантный сайт распознавания с улучшенной активностью расщепления для сконструированной мегануклеазы, способной к введению двунитевого разрыва в предполагаемый сайт распознавания, где указанный вариантный сайт распознавания содержит нуклеотидную последовательность с заменой по меньшей мере 1 нуклеотидного основания по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания SEQ ID NO: 13.
25. Выделенный полинуклеотид по п. 24, где указанный вариантный сайт распознавания содержит последовательность с изменениями по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 пар оснований по сравнению с SEQ ID NO: 13.
26. Выделенный полинуклеотид по п. 24, где указанный вариантный сайт распознавания содержит:
a) цитозин (C) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 1 в SEQ ID NO: 13;
b) цитозин (C) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 5 в SEQ ID NO: 13;
c) гуанин (G) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 10 в SEQ ID NO: 13;
d) тимин (T) аденин (A) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 11 в SEQ ID NO: 13;
e) тимин (T) в положении, соответствующем нуклеотидному положению 19 в SEQ ID NO: 13; или
f) любую комбинацию из a)-e).
27. Выделенный полинуклеотид по п. 24, где указанная вариантная последовательность распознавания выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21.
28. Выделенный полинуклеотид по п. 24, где об улучшенной активности расщепления свидетельствует:
a) более высокий процент (%) расщепления вариантного сайта распознавания по сравнению с процентом (%) расщепления предполагаемого сайта распознавания SEQ ID NO: 13, где сайты распознавания расположены на геномной ДНК;
b) более высокий процент (%) расщепления вариантного сайта распознавания по сравнению с процентом (%) расщепления предполагаемого сайта распознавания, где сайты распознавания расположены на плазмидной ДНК;
c) более высокая оценка в анализе на дрожжах для вариантного сайта распознавания по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания; или
d) любая комбинация (a), (b) и (c).
29. Рекомбинантный фрагмент ДНК, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 24.
30. Клетка, содержащая рекомбинантный фрагмент ДНК по п. 29.
31. Клетка по п. 30, где клетка представляет собой клетку дрожжей или растительную клетку.
32. Трансгенное растение или семя, содержащее растительную клетку по п. 31.
33. Трансгенное растение по п. 32, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, сахарного тростника, сорго, ржи, проса прутьевидного, сои, Brassica, подсолнечника, хлопчатника или люцерны.
34. Способ нацеливания вставки полинуклеотида, представляющего интерес, в специфический хромосомный сайт в геноме растения, причем указанный способ включает:
a) трансформацию растительной клетки или растения фрагментом ДНК, содержащим полинуклеотид, представляющий интерес, где указанный геном указанных растительной клетки или растения содержит по меньшей мере один вариантный сайт распознавания, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21;
b) предоставление мегануклеазы, способной производить двунитевой разрыв в вариабельном сайте распознавания из (a); и
c) отбор указанных растительной клетки или растения, содержащих указанный полинуклеотид, представляющий интерес, интегрированный в указанный вариантный сайт распознавания.
35. Способ по п. 34, где предоставление указанной мегануклеазы включает интеграцию в геном указанных растительной клетки или растения нуклеотидной последовательности, кодирующей мегануклеазу SEQ ID NO: 1.
36. Растение или растительная клетка, полученные с помощью способа по п. 34.
37. Способ нацеливания вставки полинуклеотида, представляющего интерес, в специфический хромосомный сайт в геноме растения, причем указанный способ включает:
a) трансформацию растительной клетки или растения фрагментом ДНК, содержащим полинуклеотид, представляющий интерес, где указанный геном указанных растительной клетки или растения содержит по меньшей мере один вариантный сайт распознавания, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35;
b) предоставление мегануклеазы, способной производить двунитевой разрыв в вариабельном сайте распознавания из (a); и
c) отбор указанных растительной клетки или растения, содержащих указанный полинуклеотид, представляющий интерес, интегрированный в указанный вариантный сайт распознавания.
38. Способ по п. 37, где предоставление указанной мегануклеазы включает интеграцию в геном указанных растительных клеток нуклеотидной последовательности, кодирующей мегануклеазу SEQ ID NO: 3.
39. Растение или растительная клетка, полученные с помощью способа по п. 37.
40. Способ идентификации вариантного сайта распознавания для редкощепящего сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва, способного к введению редкого двунитевого разрыва в предполагаемом сайте распознавания, причем указанный способ включает:
a. приведение в контакт геномной ДНК с редкощепящим сконструированным средством для индукции двунитевого разрыва, способного к введению двунитевого разрыва в указанную геномную ДНК, где двунитевой разрыв приводит в результате к образованию тупого конца;
b. создание нуклеотидного липкого конца из тупого конца из (a);
c. лигирование первого адаптера с нуклеотидным липким концом из (b);
d. разрезание лигированной ДНК, полученной на стадии (c), и
лигирование по меньшей мере одного второго адаптера с разрезанным нуклеотидным концом для осуществления амплификации и секвенирования фрагментов геномной ДНК, окружающих двунитевой разрыв;
e. выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, полученных в (d), с эталонной геномной последовательностью ДНК; и
f. идентификацию вариантного сайта распознавания, содержащего изменение по меньшей мере по одному нуклеотидному основанию по сравнению с предполагаемым сайтом распознавания указанного сконструированного средства для индукции двунитевого разрыва.
41. Способ по п. 40, где редкощепящее сконструированное средство для индукции двунитевого разрыва представляет собой эндонуклеазу Cas.
42. Способ по п. 41, где эндонуклеаза Cas способна к образованию комплекса с направляющей РНК, где указанный комплекс позволяет эндонуклеазе Cas вводить двунитевой разрыв в указанную геномную ДНК.