АКТИВАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА КОСТНОГО МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО БЕЛКА (ВМР) В КОСТНЫХ КЛЕТКАХ ПОСРЕДСТВОМ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ СИГНАЛОВ
ACTIVATION OF BONE MORPHOGENETIC PROTEIN (BMP) GENE EXPRESSION IN BONE CELLS BY MEANS OF ELECTROMAGNETIC SIGNALS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка на патент представляет собой частичное продолжение заявки на патент США с серийным №10/257126, которая является заявкой PCT/US01/05991, поданной на национальной фазе США 23 февраля 2001 года, которая, в свою очередь, претендует на приоритет по Предварительной заявке на патент США с серийным №60/184491, зарегистрированной 23 февраля 2000 года. Настоящая заявка также претендует на приоритет по Предварительной заявке США №60/535755, зарегистрированной 12 января 2004 года. Содержание указанных патентных заявок включено в настоящее описание посредством ссылок во всей их полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение связано со способом активации экспрессии гена костного морфогенетического белка (BMP) в костных клетках под действием полей, генерируемых специфическими и селективными электрическими и электромагнитными сигналами, для лечения поврежденной или пораженной болезнью кости, а также с устройствами для генерирования таких сигналов.
ОСНОВЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Считается, что биоэлектрические взаимодействия и биоэлектрическая активность имеют место в различных биологических тканях и клетках и являются одним из наименее понятных физиологических процессов. Однако в последнее время проведено много исследований таких взаимодействий и активности, касающихся роста и репарации определенных тканей и клеток. В частности, проведено много исследований стимуляции электрическими и электромагнитными полями и их воздействия на рост и репарацию кости и хряща. Предполагают, что такие исследования могут быть полезны в развитии новых способов лечения различных медицинских проблем.
При заболевании, в целом известном как остеопороз, кость деминерализуется и становится аномально менее плотной. Кость содержит органический компонент клеток и матрикса, а также неорганический или минеральный компонент. Клетки и матрикс содержат остов из коллагеновых волокон, которые заполнены минеральным компонентом фосфата кальция (85%) и карбоната кальция (10%), которые придают кости жесткость. Наряду с мнением, что остеопороз обычно причиняет страдания пожилым людям, определенные разновидности остеопороза могут поражать людей всех возрастов, кости которых не подвержены функциональной нагрузке. В таких случаях пациенты могут испытывать значительную потерю кортикальной и губчатой кости в течение длительного периода иммобилизации. Известно, что пациенты пожилого возраста испытывают потерю костной массы, вызванную малоподвижностью при иммобилизации после перелома кости, и такая потеря костной массы может, в конце концов, привести ко вторичному перелому в уже остеопорозной костной системе. Уменьшение плотности кости может привести к коллапсу позвоночника, переломам тазобедренных суставов, лучевых костей, запястья, голеностопных суставов, а также к болям, ограничивающим дееспособность. Для таких заболеваний необходима альтернативная консервативная терапия.
Пульсирующие электромагнитные поля (PEMF) и емкостную связь (CC) широко применяют для лечения трудно поддающихся лечению (несрастающих) переломов и подобных проблем при лечении костей после одобрения Управления по контролю за продуктами и лекарствами (США) в 1979 году. Первоначально основой для испытаний такой формы терапии стало наблюдение того факта, что физическая нагрузка на кость вызывает появление очень малых электрических токов, которые, совместно с механической нагрузкой, считаются лежащими в основе механизмов преобразования физических нагрузок в сигнал, стимулирующий формирование кости. Вместе со стимуляцией постоянным электрическим полем, которая успешно используется в лечении несращений, обнаружено, что должны быть эффективны также неинвазивные технологии с использованием PEMF и емкостной связи (где электроды располагают на коже в подвергаемой лечению зоне). PEMF генерирует малые, индуцируемые токи (токи Фарадея) в высокопроводящей внеклеточной жидкости, наряду с тем, что емкостная связь напрямую вызывает токи в тканях; таким образом, и PEMF, и CC имитируют эндогенные электрические токи.
Первоначально предполагали, что токи вызваны феноменом, возникающим на поверхности кристаллов в кости, однако показано, что эндогенные электрические токи вызваны главным образом движением жидкости, содержащей электролиты, в каналах кости, содержащей органические составляющие с фиксированными отрицательными зарядами, генерирующими так называемые “движущиеся потенциалы”. Исследования электрического феномена в кости продемонстрировали механизм механико-электрической трансдукции, проявляющийся, когда кость механически сжимали, вызывая движение жидкости и электролитов над поверхностью фиксированных отрицательных зарядов в протеогликанах и коллагене костного матрикса. Такие движущиеся потенциалы в кости имеют целевое назначение и вместе с механическим усилием приводят к трансдукции (или передаче) сигнала, который может стимулировать синтез костной клетки кальциевого матрикса и, следовательно, формирование кости.
В ортопедии основное применение постоянного тока, емкостной связи и PEMF находило для залечивания несрастающих костных переломов (Brighton et al., J.Bone Joint Surg 63: 2-13, 1981; Brighton and Pollack, J.Bone Joint Surg. 67: 577-585, 1985; Bassett et al., Crit. Rev. Biomed. Eng. 17: 451-529, 1989; Bassett et al., JAMA 247:623-628, 1982). Сообщалось о клинических реакциях в случае аваскулярного некроза тазобедренных суставов у взрослых людей и заболевании Легга-Кальве-Пертеса у детей (Bassett et al., Clin.Orthop. 246: 172-176,1989; Aaron et al., Clin. Orthop. 249: 209-218, 1989; Harrison et al., J. Pediatr. Orthop. 4: 579-584, 1984). Также было показано, что PEMF (Mooney, Spine 15: 708-712, 1990) и емкостная связь (Goodwin, Brighton et al., Spine 24: 1349-1356, 1999) могут значительно повышать успешность лечения срастания поясничных позвонков. Есть также сообщения об улучшении регенерации и функции периферических нервов и активации ангиогенеза (Bassett, Bioessays 6: 36-42, 1987). У пациентов с тендинитом вращающей манжеты плеча, не восприимчивых к инъекциям стероидов и другим традиционным мерам, показано значительное облегчение по сравнению с теми пациентами, которым вводили плацебо (Binder et al., Lancet 695-698,1984). Наконец, Brighton et al. показали на крысах способность соответствующего электрического поля емкостной связи и предотвращать, и обращать позвоночный остеопороз в поясничном отделе спинного мозга (Brighton et al., J Orthop. Res. 6: 676-684,1988; Brighton et al., J. Bone Joint Surg 71: 228-236, 1989).
Позднее исследования в данной области фокусировались на эффектах, которые вызывает стимуляция, на уровне тканей и клеток. Например, были сделаны предположительные выводы, что постоянные токи не проникают через клеточные мембраны и что контроль достигается путем дифференцировки внеклеточного матрикса (Grodzinsky, Crit. Rev. Biomed. Eng. 9: 133-199,1983). Было показано, что, в противоположность постоянным токам, PEMF может пронизывать клеточные мембраны и либо стимулировать их, либо напрямую действовать на внутриклеточные органеллы. При проверке действия PEMF на внутриклеточный матрикс и in vivo эндохондриальное образование костного вещества обнаружено увеличение синтеза молекул хряща и созревания костной трабекулы (Aaron et al., J. Bone Miner. Res. 4: 227-233,1989). Недавно сообщалось - Lorich et al. (Clin. Orthop. Related Res. 350: 246-256,1998) и Brighton et al. (J. Bone Joint Surg. 83-A, 1514-1523, 2001), - что передача сигнала электрической емкостной связи происходит при помощи регуляции напряжения кальциевых каналов, хотя передача сигналов PEMF или комбинированных электромагнитных полей происходит благодаря высвобождению кальция из внутриклеточных депо. При всех трех типах электрической стимуляции наблюдается увеличение цитозольного кальция с последующим увеличением активированного (цитоскелетного) кальмодулина.
1
1
В 1996 году авторы настоящего изобретения сообщили, что периодическое биаксиальное 0,17% механическое напряжение продуцирует значительное увеличение мРНК TGF-β в культивируемых клетках кости MC3T3-E1 (Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 449-453, 1996). Несколько значительных исследований последовало в 1997 году. В одном исследовании было обнаружено, что подобное периодическое биаксиальное 0,17% механическое напряжение продуцирует значительное увеличение мРНК PDGF-A в подобных клетках кости (Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 43: 339-346,1997). Также сообщалось, что электрическое поле емкостной связи в 60 кГц и 20 мВ/см продуцирует значительное увеличение TGF-β в подобных клетках кости (Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 225-229, 1997). Однако в литературе не было данных о действии такого поля на другие гены.
В предыдущей ссылке на исходную заявку на патент, называемую “Регуляция генов при помощи применения специфических и селективных электрических и электромагнитных сигналов”, были описаны способы установления специфических и селективных электрических и электромагнитных сигналов для применения в создании полей, регулирующих гены-мишени пораженных болезнью или травмированных тканей. Настоящее изобретение в этом отношении строится на описании технических приемов путем описания способа регуляции экспрессии одного семейства генов-мишеней, а именно, экспрессии гена костного морфогенетического белка(ов) путем приложения поля, генерируемого специфическим и селективным электрическим или электромагнитным сигналом, для лечения свежих переломов, риска перелома, замедленного срастания, несрастающих переломов, дефектов кости, артродеза позвонков, остеонекрозов или аваскулярных некрозов, в качестве вспомогательного средства при других видах терапии при лечении одного или всех из перечисленных выше состояний и при лечении остеопороза.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение связано с регуляцией экспрессии гена костного морфогенетического белка в клетках кости путем приложения полей, генерируемых специфическими и селективными электрическими и/или электромагнитными сигналами. Путем построения кривых доза-ответ в зависимости от продолжительности действия электрического поля, амплитуды, частоты и циклического режима выявили оптимальный сигнал для активации мРНК костного морфогенетического белка в костных клетках. Оптимальный сигнал генерировался электрическим полем емкостной связи при амплитуде 20 мВ/см, продолжительности 24 часа, частоте 60 кГц, 50% циклическом режиме и синусоидальной конфигурации волны. В частности, настоящее изобретение связано с активацией экспрессии гена костного морфогенетического белка (BMP) в костных клетках путем приложения полей, генерируемых такими сигналами.
Согласно изобретению способы обеспечивают специфичность и селективность активации экспрессии гена (измеряемой по мРНК) белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и ВМР-7 электрическими полями емкостной связи, электромагнитными полями или комбинированными полями. Свежие переломы, риск переломов, замедленное срастание, несрастающие переломы, дефекты кости, остеонекроз, остеопороз и подобное поддаются лечению электрическим полем емкостной связи приблизительно в 20 мВ/см, электрическим полем продолжительностью приблизительно в 24 часа, частотой в 60 кГц, 50% циклическим режимом и синусоидальной конфигурацией волны, что вызывает активацию экспрессии мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7. Согласно способу изобретения "специфический и селективный" сигнал является сигналом, который имеет заранее определенные характеристики амплитуды, продолжительности, циклического режима, частоты и формы волны, которые активируют экспрессию генов BMP (специфичность). Это позволяет выбрать различные сигналы для активации экспрессии генов BMP с тем, чтобы достичь заданного биологического или терапевтического ответа (селективность). Изобретение, кроме того, связано с устройствами, используемыми в способах, описанных в данном документе, для генерации специфических и селективных сигналов, которые создают поля для активации экспрессии генов BMP.
В связанных аспектах, настоящее изобретение относится к способам и устройствам для лечения свежих переломов, риска переломов, замедленных срастаний, несрастающих переломов, дефектов кости, ортродеза позвонков, остеонекрозов в качестве вспомогательного средства к другим видам терапии при лечении одного или более из указанных выше состояний и при лечении остеопороза. Способ согласно изобретению включает в себя также методологию для определения "специфического и селективного" сигнала для экспрессии гена BMP с помощью методических вариаций продолжительности стартового сигнала, про который известно, что он увеличивает или предположительно увеличивает продуцирование BMP в клетках. После определения оптимальной продолжительности варьировали амплитуду сигнала для данной выявленной оптимальной продолжительности, что определяли по экспрессии гена белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7. Циклический режим, частоту и форму волны варьировали методически таким образом по кривой доза-ответ, как и выше, при этом поддерживая неизменными другие характеристики сигнала. Этот процесс повторяли до тех пор, пока не устанавливали оптимальный сигнал, продуцирующий наибольшее увеличение экспрессии BMP.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут разъяснены в последующем подробном описании изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение станет более убедительным после следующего далее подробного описания изобретения, снабженного соответствующими чертежами.
Фиг.1 является графическим представлением экспрессии мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7 при воздействии на клетки кости электрического поля емкостной связи в 20 мВ/см в течение различных промежутков времени. Как установлено, максимальная экспрессия мРНК для различных белков BMP проявляется при продолжительности сигнала в 24 часа.
Фиг.2 является графическим представлением экспрессии мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7 при воздействии на клетки кости электрического поля емкостной связи различной амплитуды продолжительностью в 24 часа. Как установлено, максимальная экспрессия мРНК для различных белков BMP проявляется при амплидуде поля в 20 мВ/см.
Фиг.3 является графическим представлением экспрессии мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7 при воздействии на клетки кости электрического поля емкостной связи различной частоты с амплитудой в 20 мВ/см и продолжительностью сигнала в 24 часа. Как установлено, максимальная экспрессия мРНК для различных белков BMP проявляется при частоте 60 кГц.
Фиг.4 является графическим представлением экспрессии мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7 при воздействии на клетки кости электрического поля емкостной связи при различном циклическом режиме с частотой в 60 кГц, амплитудой поля в 20 мВ/см и продолжительностью сигнала в 24 часа. Как установлено, максимальная экспрессия мРНК для различных белков BMP проявляется при 50% циклическом режиме.
Фиг.5 является графическим представлением экспрессии мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7 при экспозиции клеток кости в электрическом поле емкостной связи с 50% циклическим режимом с различными интервалами включения-выключения, при амплитуде поля в 20 мВ/см и частоте 60 кГц. Как установлено, максимальная экспрессия мРНК для различных белков BMP проявляется при 50% циклическом режиме с 1-минутным включением, 1-минутным выключением.
Фиг.6 является графическим представлением экспрессии мРНК белка BMP-2 при воздействии на клетки кости сигнала емкостной связи с 50% продолжительностью циклического режима (20 мВ/см, 60 кГц, синусоидальная волна) против пульсирующего 50% циклического режима сигнала. Как установлено, оба режима сигналов показывают, по существу, одинаковое 5-кратное увеличение экспрессии мРНК белка ВМР-2.
Фиг.7 является графическим представлением продуцирования белка BMP-2 и активности щелочной фосфатазы при воздействии на клетки кости сигнала емкостной связи с 50% циклическим режимом (20 мВ/см, 60 кГц, синусоидальная волна) в течение 24 часов. Как установлено, наблюдается 1,9-кратное увеличение продуцирования BMP-2 и 1/6-кратное увеличение активности щелочной фосфатазы.
Фиг.8 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую устройство для активации экспрессии гена костного морфогенетического белка в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
Ниже будет представлено подробное описание изобретения со ссылкой на фиг.1-8. Специалист в данной области поймет в полной мере, что приведенное здесь описание указанных чертежей представлено только с целью иллюстрации и никоим образом не должно ограничивать объем, охватываемый настоящим изобретением. Все вопросы, относящиеся к объему, охватываемому настоящим изобретением, могут быть разрешены на уровне прилагаемой формулы изобретения.
Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что экспрессию определенных генов можно регулировать, используя поля, генерируемые специфическими и селективными электрическими и/или электромагнитными сигналами. Другими словами, авторами настоящего изобретения открыто существование специфического электрического и/или электромагнитного сигнала, который генерирует поле, регулирующее каждый ген в клетках кости, хряща и ген клеток другой ткани, и что эти специфические сигналы способны специфически и селективно регулировать гены в таких клетках. В частности, согласно изобретению можно регулировать экспрессию гена, управляющего ростом, поддержанием, репарацией и дегенерацией или разрушением тканей или клеток, с использованием полей, генерируемых специфическими и селективными электрическими и/или электромагнитными сигналами, так чтобы продуцировался благотворный клинический эффект. Такие открытия полезны в развитии способов лечения, направленных на определенные медицинские проблемы, включая свежие переломы кости, риск переломов, замедленное срастание, несрастание, дефекты кости, остеонекрозы в качестве вспомогательных средств для лечения одного из или более из перечисленного выше и для лечения остеопорозов.
Используемый в настоящем документе термин "сигнал" применим в отношении различных сигналов, включая механические сигналы, ультразвуковые сигналы, электромагнитные сигналы и электрические сигналы, выходящие из устройства. Следует понимать, что здесь термин “поле” относится к электрическому полю в пределах ткани-мишени либо к комбинированному полю или импульсному электромагнитному полю, или полю, генерируемому постоянным током, емкостной связью или индуктивной связью.
Термин "отдаленный" используется в том смысле, что оказывает действие или контролирует на расстоянии. "Отдаленная" регуляция относится к контролированию экспрессии гена на расстоянии. Обеспечить "отдаленно" означает обеспечить на расстоянии. Например, обеспечение специфическим и селективным сигналом от удаленного источника может относиться к обеспечению сигналом от источника на расстоянии от ткани или клетки или от источника, лежащего вне или наружно по отношению к организму.
Термин "специфический и селективный" сигнал означает сигнал, который продуцирует электрическое поле, имеющее заданные характеристики амплитуды, продолжительности, циклического режима, частоты и формы волны и которое активирует или подавляет ген-мишень или функционально комплементарные гены-мишени (специфичность). Это позволяет выбрать различные "специфические и селективные" сигналы для активации или подавления экспрессии разных генов с тем, чтобы достичь заданного биологического или терапевтического ответа (селективность).
Термин "регулировать" означает контролировать экспрессию гена. Под термином регулировать подразумеваются оба понятия: и активировать, и подавлять. Активировать означает увеличивать экспрессию гена, тогда как подавлять означает ингибировать или предотвращать экспрессию гена.
"Функционально комплементарный" относится к двум или более генам, экспрессия которых комплементарна или синергична в данной клетке или ткани.
“Ткань” относится к агрегату клеток, вместе с их внеклеточной субстанцией, которая составляет один из структурных материалов пациента. Здесь под термином "ткань" подразумевается мышечная ткань или ткань органа, опухолевая ткань, а также костная или хрящевая ткань. Здесь термин "ткань" можно отнести также и к отдельной клетке.
"Пациент" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно к человеку.
Настоящее изобретение предоставляет способы лечения и устройства, нацеленные на определенные ткани, клетки или заболевания. В частности, экспрессию гена, ассоциированную с процессом репарации в травмированных или пораженных болезнью тканях или клетках, можно регулировать путем приложения полей, генерируемых электрическими сигналами, которые специфичны и селективны для генов, которые будут регулироваться, в тканях или клетках-мишенях. Экспрессию гена можно активировать или подавить путем применения сигналов, которые специфичны и селективны для каждого гена или каждого набора комплементарных генов, таких, которые производят благотворный клинический эффект. Например, конкретный специфический и селективный сигнал может создавать электрическое поле, которое активирует экспрессию определенного желаемого гена, в то время как тот же или другой конкретный специфический и селективный сигнал может создавать электрическое поле, которое подавляет экспрессию определенного, нежелательного гена. Определенный ген может быть активирован полем, генерируемым одним конкретным специфическим и селективным сигналом, и подавлен полем, генерируемым другим специфическим и селективным сигналом. Специалист в данной области поймет, что определенные пораженные болезнью или травмированные ткани могут стать мишенью для лечения путем регуляция генов, управляющих ростом, поддержанием, репарацией, дегенерацией или разрушением ткани.
Способы и устройства согласно изобретению основаны на идентификации таких сигналов, которые генерируют поля, являющиеся специфичными и селективными для экспрессии гена, ассоциированного с определенной пораженной болезнью или травмированной тканью-мишенью. Например, электричество во всех его различных формах (то есть емкостная связь, индуктивная связь, комбинированные поля) может специфически и селективно регулировать экспрессию гена в тканях или клетках-мишенях организма пациента при варьировании частоты, амплитуды, формы волны или циклического режима прикладываемого поля для каждого отдельного гена. На продолжительность времени воздействия электричеством также может влиять способность электричества специфически и селективно регулировать экспрессию гена в тканях или клетках-мишенях организма пациента. Специфические и селективные сигналы могут генерировать электрические поля для систематического применения к каждому гену, до тех пор, пока не будет найдена подходящая комбинация частоты, амплитуды, формы волны, циклического режима и продолжительности, которая производит желаемый эффект на экспрессию гена.
Нужно понимать, что целью лечения могут быть различные пораженные болезнью или травмированные ткани или стадии заболевания, поэтому на специфичность и селективность электрического поля для экспрессии определенного гена может влиять несколько факторов. В частности, электрическое поле надлежащей частоты, амплитуды, формы волны и/или циклического режима может быть специфичным и селективным для экспрессии определенных генов и, следовательно, обеспечит целевое лечение. Временные факторы (то есть продолжительность времени воздействия электрического поля) также могут оказывать влияние на специфичность и селективность электрического поля для экспрессии конкретного гена. Регуляция экспрессии гена может быть более эффективной (или возможной) благодаря применению электрического поля в течение времени конкретной продолжительности. Следовательно, специалист в данной области поймет, что настоящее изобретение предоставляет вариации частоты, амплитуды, формы волны, циклического режима и/или продолжительности применяемого электрического поля, до тех пор, пока электрическое поле будет специфическим и селективным для экспрессии определенного гена, с тем, чтобы обеспечить лечебный эффект, направленный на различные пораженные болезнью или травмированные ткани или заболевания.
Таким образом, настоящее изобретение может обеспечить направленный лечебный эффект, потому что есть возможность регулировать экспрессию определенных генов, ассоциированных с конкретной пораженной болезнью или травмированной тканью, благодаря применению полей, генерируемых специфическими и селективными сигналами надлежащей частоты, амплитуды, формы волны и/или циклического режима при надлежащей продолжительности во времени. Специфичность и селективность сигнала, генерирующего электрическое поле, может таким образом влиять так, чтобы регулировать экспрессию определенных генов, с тем, чтобы направлять лечение на определенные пораженные болезнью или травмированные ткани или стадии заболевания. В частности, настоящее изобретение обеспечивает направленное лечение свежих переломов кости, рисков переломов, несрастаний, дефектов кости, артродеза позвонков, остеонекрозов в качестве дополнительного средства при лечении одного или любого из указанных выше состояний, а также при лечении остеопороза.
Настоящее изобретение предоставляет устройство, которое включает в себя источник по меньшей мере единичного сигнала, специфичного и селективного для экспрессии гена BMP. Устройства согласно изобретению могут обеспечивать продуцирование таких сигналов для применения к костным клеткам, по меньшей мере одного электрода, адаптированного к применению поля, генерируемого специфическим и селективным сигналом.

С помощью устройств согласно настоящему изобретению можно воздействовать полем, генерируемым специфическими и селективными сигналами, непосредственно на пораженную болезнью или травмированную ткань, кости и/или кожу пациента. Устройства согласно настоящему изобретению могут обеспечить также и дистанционное применение специфических и селективных полей (то есть применение поля на расстоянии от пораженной болезнью или травмированной ткани), хотя нужно иметь в виду, что устройства с емкостной связью должны контактировать с кожей больного. Устройства согласно настоящему изобретению могут включать в себя средства для присоединения электродов к организму пациента вблизи травмированной или пораженной болезнью ткани, в случае емкостной связи. Например, как показано на фиг.8, самоклеящиеся емкостные электроды могут быть прикреплены к коже пациента по обеим сторонам от сломанной кости 18 или артроза 20. Устройство согласно изобретению может включать в себя самоклеящиеся электроды для прикрепления устройства к телу пациента. Например, устройство 10 согласно изобретению может включать в себя электроды 12, присоединенные к источнику питания 14, который имеет застежку 16 на липучке типа WELCRO на обратной стороне, таким образом, что источник питания 14 может быть присоединен к ремню VELCRO (не показано), пристроенному вокруг гипсовой повязки пациента. В случае индуктивной цепи устройство согласно изобретению может включать в себя катушку или соленоид, прикрепленный к источнику питания вместо электродов.
Устройство 10 согласно изобретению можно применять различными способами. Устройство 10 может быть портативным, или оно может быть временно или постоянно присоединено к организму пациента. Устройство 10 согласно изобретению предпочтительно является неинвазивным. Например, устройство 10 согласно изобретению может прикладываться к коже пациента с применением электродов 12, адаптированных для контакта с кожей пациента, для приложения полей, генерируемых заданными специфическими и селективными сигналами. Такие сигналы могут также быть приложены с помощью катушек или соленоидов (не показано), в которых есть изменяющийся во времени ток, продуцируя таким образом специфические и селективные электромагнитные поля, проникающие в ткань. Устройство 10 согласно настоящему изобретению также может быть имплантировано пациенту, включая имплантацию под кожу для непосредственного контакта с костной тканью пациента.
Специалист в данной области поймет в дальнейшем, что устройство согласно изобретению может быть представлено различными формами, включая источник питания емкостной связи с программным управлением, с повторяющимися, переключаемыми специфическими и селективными сигналами для применения с одной парой или несколькими парами электродов, или электромагнитные катушки или соленоиды, соединенные с источником питания с переключаемыми, повторяющимися, специфическими и селективными сигналами, и ультразвуковой стимулятор с приложенным питанием для генерирования специфических и селективных сигналов. Вообще говоря, предпочтительность того или иного устройства определяется отношением к нему пациента и используется с согласия пациента. Устройство наименьшего размера и наиболее портативное, которое в настоящее время имеется в наличии, - это устройство с емкостной связью; однако пациенты с очень чувствительной кожей могут предпочесть использовать устройство с индуктивной связью. С другой стороны, для применения ультразвуковых устройств необходимо согласование с пациентом, но для определенных пациентов они могут быть подходящими.
Пример
Изобретение наглядно показано в следующем примере, который приведен для иллюстративных целей и не должен ограничивать объем настоящего изобретения.
Материалы и методы
5
2
2
Клетки кости MC3T3-E1 (5 x 10 клеток/см) помещали в специально модифицированные чашки Купера. Клетки культивировали до семи дней в среде, которую меняли непосредственно перед началом эксперимента. Экспериментальная культура клеток повсеместно в данных исследованиях подвергалась действию импульсного электрического поля емкостной связи в 60 кГц, с синусоидальной формой волны, с амплитудой на выходе, составляющей от пика к пику 44,81 В. Это продуцирует поле расчетной мощности в культуральной среде в чашках в 20 мВ/см с плотностью тока 300 мкА/см. Контрольные чашки культуры клеток были идентичны стимулируемым чашкам, за исключением того, что в них электроды не были соединены с функциональным генератором.

По окончании эксперимента выделяли все количество РНК, используя TRIzol, согласно инструкциям фирмы-производителя, и проводили обратную транскрипцию (RT), используя обратную транскриптазу SuperScript II. Олигонуклеотидные праймеры, используемые в технике реального времени RT-PCR, были отобраны из имеющихся в литературе последовательностей кДНК или сконструированы с использованием программного обеспечения Primer Express. Количественные анализы в реальном времени продуктов RT-PCR проводили, используя Систему определения последовательности ABI Prism 7000.
Оптимальный сигнал для желаемой активации генов (BMP), включая, помимо прочего, и гены BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7, был найден путем систематических исследований следующим образом. Электрический сигнал, о котором известно, что он увеличивает (или даже только предполагается, что увеличивает) клеточное продуцирование данного белка (то есть синусоидальная волна в 60 кГц), брали в качестве стартового сигнала для определения специфического сигнала, генерирующего поле для экспрессии гена (мРНК) данного белка. Кривую доза-ответ сначала получали путем варьирования продолжительности сигнала, пока все другие характеристики сигнала удерживались постоянными (амплитуда, циклический режим, частота и форма волны) (фиг.1). При этом определяли оптимальную продолжительность стартового сигнала для экспрессии гена данного белка. Как показано на фиг.1, максимальная экспрессия мРНК для различных белков BMP имеет место при продолжительности сигнала в 24 часа. Затем получали вторую кривую доза-ответ и на этот раз варьировали амплитуду электрического поля (в мВ/см), при этом оптимальная продолжительность и другие характеристики сигнала удерживались постоянными (фиг.2). Как показано, максимальная экспрессия мРНК для различных BMP имеет место при амплитуде поля в 20 мВ/см. Получали третью кривую доза-ответ и на этот раз варьировали частоту сигнала, пока поддерживали неизменными оптимальную продолжительность и оптимальную амплитуду, которые были определены ранее (фиг.3). Как показано, максимальная экспрессия мРНК для различных BMP имеет место при частоте 60 кГц. Четвертую кривую доза-ответ получали, варьируя циклический режим от 100% (постоянная) до 10% или менее, пока поддерживали неизменными оптимальную продолжительность, амплитуду, частоту, которые были определены ранее (фиг.4). Как показано, максимальная экспрессия мРНК для различных BMP имеет место при 50% циклическом режиме. В заключение пятую кривую доза-ответ получали, варьируя параметры времени включения/времени выключения, при этом поддерживая неизменными 50% циклический режим, и амплитуду, и частоту при 20 мВ/см и 60 кГц соответственно, как было определено ранее (фиг.5). Как показано, максимальная экспрессия мРНК для различных BMP наблюдалась при параметрах включения/выключения, составляющих по 1 минуте, при 50% циклическом режиме.
Таким способом определяли оптимальный сигнал для продуцирования наибольшего увеличения экспрессии гена различных белков BMP.
Шестой цикл эксперимента проводили, сравнивая непрерывный 50% циклический режим (емкостная связь, 20 мВ/см, 60 кГц, синусоидальная волна) с пульсирующим 50% циклическим режимом (емкостная связь, 20 мВ/см, 60 кГц). Как было показано, увеличение мРНК белка BMP-2 было приблизительно 5-кратным под действием каждого из этих сигналов (фиг.6).
Последний эксперимент проводили с целью демонстрации увеличения продуцирования мРНК белков BMP, а именно белка BMP-2, а также увеличения активности щелочной фосфотазы, которая может быть индуцирована уровнями белка BMP-2. После 24-часовой стимуляции при 50% циклическом режиме (емкостная связь, 20 мВ/см, 60 кГц, синусоидальная волна) сигнала наблюдали 1,9-кратное и 1,6-кратное увеличение BMP-2-продукта и активности щелочной фосфатазы соответственно (фиг.7).

Фиг.8 иллюстрирует устройство 10 согласно изобретению, которое применяется для лечения пациента с остеоартритом колена. На иллюстрации два круглых, мягко контактирующих, самоклеящихся электрода 12 располагали на коже по обеим сторонам колена на уровне линии артроза 20. Электроды 12 присоединяли к источнику питания 14, который имеет застежку на липучке 16 типа VELCRO  на обратной стороне, таким образом, что источник питания 14 может быть присоединен к ремню VELCRO (не показано), пристроенному вокруг задней части голени, бедра или пояса. Электроды 12 можно расположить на коже перед тем, как пациент ложится спать каждый вечер или в другое удобное время. Конечно, можно также применять и другие типы подходящих электродов 12.
Источник питания 14, предпочтительно маленький (то есть 6-8 унций), приводится в действие 9-вольтовой батарейкой, подающей 5-вольт от пика до пика, 6-10 мА, 20 мВ/см, 60 кГц сигнал синусоидальной волны на электроды 12, расположенные на коже. Когда указанный сигнал обеспечивается приблизительно 24 часа в сутки с надлежащим циклическим режимом (50%), с 1-минутным включением и 1-минутным выключением, показано значительное возрастание активации генов, кодирующих белки BMP.
Настоящее изобретение ясно показало, что оптимальное электрическое поле, описанное в примере, может очень значительно активировать мРНК белков BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 и BMP-7 и, следовательно, усиливать процесс формирования костной ткани. Специалист в данной области должен принимать во внимание, что соответствующее электрическое поле, как описано в данном документе, с емкостной связью, также одинаково эффективно с индуктивной связью и всеми электромагнитными системами, которые продуцируют эквивалентные или почти эквивалентные характеристики электрического поля. Специалист в данной области также должен иметь в виду, что более точные характеристики сигнала можно получить на основе проведения большого количества экспериментов с большим количеством данных (например, 100±3% циклический режим за 30±3 минут), но считается, что такие относительно минорные вариации каждой из характеристик сигнала находятся в пределах уровня компетенции специалистов в данной области.
Специалист в данной области также должен оценить, что множество других модификаций изобретения возможно в пределах объема изобретения. Например, оптимальное поле, описанное в данном документе, можно приложить к любой костной ткани с помощью двух или более подходящих поверхностных электродов, в паре или в виде шины, включенных в ортопедический аппарат, манжеты или гипсовую повязку, и подать посредством емкостной связи. Таким же образом, оптимальное поле, описанное в данном документе, можно приложить к любой костной ткани с помощью контура(катушки) или соленоидов, включенных в ортопедический аппарат, манжеты или гипсовую повязку, и подать посредством индуктивной цепи. Таким образом, рамки изобретения не должны быть ограничены предпочтительным воплощением, описанным выше, и определяются только объемом, охватываемым прилагаемой формулой изобретения.