Способ прогнозирования почечного ответа на противомиеломную терапию у пациентов с миеломной каст-нефропатией, острым почечным повреждением и потребностью в диализе
METHOD FOR PREDICTING A RENAL RESPONSE TO AN ANTI-MYELOMA THERAPY IN THE PATIENTS WITH MYELOMA CASTE-NEPHROPATHY, ACUTE RENAL DAMAGE AND THE NEED FOR DIALYSIS

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования почечного ответа на противомиеломную терапию при миеломной каст-нефропатии с острым почечным повреждением (ОПП) с потребностью в диализе.
У 13% пациентов множественной миеломой (ММ) развивается ОПП с потребностью в диализе, обусловленное миеломной каст-нефропатией [Knudsen LM, Nielsen В, Gimsing Р, Geisler С. Autologous stem cell transplantation in multiple myeloma: outcome in patients with renal failure. Eur J Haematol 2005; 75:27-33]. Стандартом лечения в подобных ситуациях являются трехкомпонентные бортезомибсодержащие программы с высокими дозами дексаметазона, обеспечивающие достижение гематологического ответа у 71% пациентов. Однако, несмотря на высокую частоту общего гематологического ответа, почечный ответ при диализзависимой почечной недостаточности не превышает 30-38% [Рехтина И.Г., Менделеева Л.П., Варламова Е.Ю., Бирюкова Л.С. Сравнение эффективности бортезомибсодержащих программ в достижении раннего гематологического и почечного ответа у больных миеломной нефропатией с диализзависимой почечной недостаточностью. Гематол. и трансфузиол., 2015, 4:4-7]. С целью повышения эффективности терапии ОПП предпринимались попытки сочетания химиотерапии с экстракорпоральной элиминацией легких цепей. Однако, несмотря на раннее начало терапии и быструю редукцию моноклональных легких цепей функция почек улучшается только у 33-66% пациентов. А у части пациентов почечная недостаточность необратима, несмотря на самые эффективные методы лечения. Важно отметить, что интенсивные протоколы терапии у пациентов с тяжелыми ОПП, сопряжены с частыми и тяжелыми инфекционными осложнениями, приводящими к высокой ранней летальности. В этой связи возникает вопрос об оправданности столь интенсивного лечения у всех пациентов, так как у части из них имеются необратимые изменения в почках.
Несмотря на то, что морфологические изменения в почках при миеломной каст-нефропатии хорошо изучены, критерии необратимости почечной недостаточности не известны. Сложность решения этой проблемы обусловлена рядом причин. Во-первых, почечный ответ зависит от гематологического ответа на химиотерапию, которая существенно изменилась с появлением таргетных препаратов. Во-вторых, стандартным подходом к оценке изменений в почках остается полуколичественный анализ, основанный на приблизительной (визуальной) оценке. Некоторые исследователи неблагоприятным фактором считают распространенный интерстициальный фиброз и тубулярную атрофию, другие - количество белковых цилиндров (30 и более в 10 полях зрения) в просветах канальцев [ L, Thierry A, Debiais-Delpech С, Chevret S, Javaugue V, Desport E, et al. Prognostic value of kidney biopsy in myeloma cast nephropathy: a retrospective study of 70 patients. Nephrol Dial Transpl. 2015; 0:1-9]. При этом остается не ясным, что следует относить к распространенному фиброзу интерстиция. По принятой полуколичественной градации, вторая степень включает диапазон от 25% до 50% от площади интерстиция, а 3-я - более 50%. Таким образом, имеющиеся данные противоречивы, их прогностическое значение не изучалось.
Одним из ключевых патогенетических механизмов формирования интерстициального фиброза и тубулярной атрофии является эпителиально-мезенхимальная трансформация (ЭМТ) эпителия проксимальных канальцев. В предыдущих исследованиях показана выраженность и значимость этого процесса при миеломной каст-нефропатии [Hertig A, Bormard G, Ulinski Т, Colombat М, Jouanneau С, Baugey Е, et al. Tubular nuclear accumulation of Snail and epithelial phenotypic changes in human myeloma cast nephropathy. Hum. Pathol. 2011. 42(8):1142-1148]. Однако данные о влиянии ЭМТ на возможность улучшения функции почек не изучались.
С применением цифровых технологий стала доступна методика компьютерной морфометрии, позволяющая провести точный количественный анализ патологических изменений в нефробиоптате. Однако компьютерная морфометрия нефробиоптатов пациентов миеломной каст-нефропатией с отдельной оценкой всех патологических изменений ранее не проводилась.
Таким образом, в настоящее время отсутствуют проспективные многоцентровые исследования прогноза почечного ответа на противомиеломную терапию у больных с миеломной каст-нефропатией, острым почечным повреждением и потребностью в диализе. Существующие рекомендации в основном основаны на опыте отдельных исследователей. Наибольшую проблему представляют пациенты с тяжелым ОПП, так как именно у больных этой категории реже отмечается улучшение функции почек, выше ранняя летальность, короче общая выживаемость. Именно эта группа больных нуждается в разработке новых подходов к терапии, направленных на быстрое достижение максимального гематологического ответа, что возможно, позволит улучшить функцию почек у большинства пациентов.
Следовательно, выявление предикторов почечного ответа при ОПП с потребностью в диализе имеет большое практическое значение для разработки индивидуальных подходов к терапии, что позволило бы избежать неоправданного риска тяжелых осложнений.
Технический результат заключается в высокой достоверности прогноза почечного ответа на противомиеломную терапию у пациентов с миеломной каст-нефропатией, острым почечным повреждением и потребностью в диализе.
Технический результат достигается тем, что прогнозирования почечного ответа на противомиеломную терапию у пациентов с миеломной каст-нефропатией, острым почечным повреждением и потребностью в диализе проводят путем исследования биоптатов пораженной почки, при этом осуществляют окрашивание не менее двух биоптатов пораженной почки, один из которых окрашивают по Массону, другой иммуногистохимически, исследуя с антителом к Е-кадгерину, после чего количественный анализ морфологических изменений в биоптатах пораженных почек проводят методом компьютерной морфометрии, определяют площадь интерстиция, площадь фиброза интерстиция и площадь экспрессии Е-кадгерина, затем рассчитывают индекс фиброза интерстиция (ФИ), как отношение площади ФИ к площади интерстиция ×100, в % и индекс площади экспрессии Е-кадгерина, как отношение площади экспрессии Е-кадгерина к площади интерстиция ×100, % и при значении индекса площади экспрессии Е-кадгерина менее 10% в сочетании со значением индекса площади фиброза интерстиция более 40% прогнозируют отсутствие почечного ответа на эффективную противомиеломную терапию у пациентов с миеломной каст-нефропатией, острым почечным повреждением и потребностью в диализе.
Прогностическую модель вероятности почечного ответа при миеломной каст-нефропатии с ОПП с потребностью в диализе ранее не разрабатывали.
Способ осуществляется следующим образом.
Стандартный протокол исследования биоптатов пораженных почек включает исследование не менее двух биоптатов пораженных почек. Полученные биоптаты фиксируют в формалине (10% раствор), далее производят проводку по спиртам восходящей концентрации и заключение в парафин. Затем готовят срезы с парафиновых блоков толщиной 3-4 мкм. Одни из которых окрашивают трихромом по Массону, а другие окрашивают иммуногистохимически, исследуя с антителами к Е-кадгерину (клон NCH-38). Методику иммуногистохимического исследования выполняют классическим способом. Срезы с парафиновых блоков, толщиной 3-4 мкм, монтируют на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. После этапа высушивания и депарафинизации проводят демаскировку антигенов методом высокотемпературного нагревания. С целью блокирования появления фонового окрашивания стекла промывают в проточном Tris-солевом буфере (рН 7) в течение 10 минут, снова промывают дистиллированной водой, не допуская подсыхания срезов. На этапе иммунного окрашивания на срезы наносят первичные антитела. Титр антител и время инкубации предварительно подбирают опытным путем индивидуально для каждого антитела. Для выявления связавшихся антител используют систему детекции на полимерной основе фирмы Leica в течение 30 мин. Далее срезы обрабатывают раствором диаминобензидина от 1 до 3 минут и промывают в дистиллированной воде. Перед заключением под покровное стекло срезы инкубируют последовательно в этаноле, затем в ксилоле. В завершении подготовленные препараты заключают под покровное стекло с использованием специальной бальзамической среды фирмы Leica. Для определения экспрессии белков просматривают корковое вещество нефробиоптатов при 100-кратном увеличении.
Количественный анализ морфологических изменений в биоптатах пораженных почек проводят методом компьютерной морфометрии. Методика состоит из нескольких этапов и подробно изложена в свободном для доступа файле [http://links.lww.com/TP/A493]. Используемый алгоритм количественной оценки площади ФИ и площади экспрессии Е-кадгерина основан на анализе цветного цифрового изображения, полученного при световой микроскопии, с помощью специальной оптической системы и программного обеспечения. Использовалась цветная камера Nikon DXM1200, установленная на Микроскоп Nikon Eclipse E1000 М (Nikon, Япония), сканер Zeiss Mirax Scan (Zeiss, Германия) с объективом 20, NA 0,8 и камерой CCD Marlin, для экспортирта оптического изображение в цифровой формат (tiff).
Методом количественного анализа определяют следующие показатели:
1. Площадь интерстиция, (ПИ)
2. Площадь фиброза интерстиция (ПФИ)
3. Площадь экспрессии Е-кадгерина (ПЭ Е-кадгерина)
4. Индекс фиброза интерстиция, %.
(Отношение площади ФИ к площади интерстиция ×100).
5. Индекс площади экспрессии Е-кадгерина, %
(Отношение площади экспрессии Е-кадгерина к площади интерстиция ×100).
Для этого расчет ПИ проводят путем цифровой обработки и компьютерного морфометрического анализа оптического изображения коркового вещества биоптата пораженной почки, окрашенных по Массону, при этом последовательно измеряют площадь коркового вещества почки (sКВ), а также составляющие его следующие структуры: площадь всех клубочков, в том числе склерозированных (sКлуб), площадь просвета канальцев (sПКан), площадь цилиндров, в том числе и патологических в просветах канальцев (sЦил), затем рассчитывают ПИ по формуле: ПИ=sКВ-(sКлуб+sПКан+sЦил).
Расчет ПФИ проводят путем вычисления площади фиброзной патологической ткани в интерстиции на всем протяжении коркового вещества биоптата почки, с помощью компьютерной морфометрии - автоматически выделяя пораженную зону, окрашенную анилиновым синим трихромом по Массону, (синий цвет) согласно заданному цветовому диапазону, после чего проводят автоматический подсчет площади всей выделенной области.
Расчет площади экспрессии Е-кадгерина проводят путем вычисления на всем протяжении коркового вещества биоптата почки зоны экспрессии антитела, с помощью компьютерной морфометрии - автоматически выделяя данную зону, окрашенную иммуногистохимически в коричневый цвет, согласно заданному цветовому диапазону, после чего проводят автоматический подсчет площади всей выделенной области.
На основании полученных данных осуществляют расчет индекса фиброза интерстиция, %, как отношение ПФИ к ПИ ×100 и индекса площади экспрессии Е-кадгерина, %, как отношение ПЭ Е-кадгерина к ПИ ×100.
В обследование было включено 25 пациентов с миеломной каст-нефропатией и ОПП с потребностью в диализе, у которых в результате индукционной химиотерапии был достигнут гематологический ответ. Диагноз миеломной каст-нефропатии был установлен на основании световой и иммунофлуоресцентной микроскопии биоптатов почек. У всех пациентов биопсия пораженных почек выполнялась до начала противомиеломной терапии. Помимо основных показателей индекса фиброза интерстиция, % и индекса площади экспрессии Е-кадгерина, % было проведено исследование показателей числа склерозированных клубочков, %, (отношение числа склерозированных клубочков к общему числу клубочков ×100); числа белковых цилиндров в 1 поле зрения (отношение числа белковых цилиндров во всех полях зрения к числу полей зрения); индекса площади клеточной воспалительной инфильтрации, % (отношение площади клеточной инфильтрации к площади интерстиция ×100); индекса площади экспрессии виментина, % (отношение площади экспрессии виментина к площади интерстиция ×100); индекса площади экспрессии альфа-гладкомышечного актина, % (отношение площади экспрессии альфа-гладкомышечного актина к площади интерстиция ×100). Медиана времени от диагностики ОПП до выполнения биопсии почки составила 14 дней (0-73). Из 25 пациентов у 17 был достигнут почечный ответ (независимость от гемодиализа), у 8 - почечный ответ отсутствовал. Методом компьютерной морфометрии был проведен количественный анализ патологических изменений в биоптате почки. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Из всех анализируемых параметров статистически значимые различия были выявлены по индексам площади экспрессии Е-кадгерина и площади ФИ.
Для определения значимости показателя ФИ, определяемого методом компьютерной морфометрии, в качестве прогностического маркера вероятности почечного ответа был проведен ROC-анализ (см. фиг 1). Полученная кривая позволяет сделать вывод о том, что количественный показатель ФИ обладает хорошей надежностью прогноза почечного ответа, с учетом значения площади под кривой. Таким образом, данный диагностический признак может быть использован в прогностической оценке.
На фиг. 1 показана ROC-кривая прогноза почечного ответа по индексу фиброза интерстиция. ФИ - фиброз интерстиция. Значения над ROC-кривой - оценка вероятности почечного ответа, соответствующая выбранному порогу ФИ. Показатель площади под кривой (0,79) указывает на достоверность прогноза почечного ответа по значениям ФИ.
Методом ROC-анализа доказана также высокая надежность (p<0,05) распространенности экспрессии Е-кадгерина в прогнозировании почечного ответа (см фиг. 2). На фиг. 2 показана ROC-кривая прогноза почечного ответа по индексу площади экспрессии Е-кадгерина в нефробиоптате. Показатель площади под кривой равен 0,75 (существенно выше чем 0,5), что указывает на хорошую надежность прогноза почечного ответа по численным значениям экспрессии Е-кадгерина. Числовые значения над ROC-кривой - оценка вероятности почечного ответа, соответствующая выбранному порогу экспрессии Е-кадгерина.
Корреляционный анализ не выявил статистически значимой связи между индексами площади экспрессии Е-кадгерина и ФИ (Rs=-0,335, р=0,065).
При объединении этих двух наиболее значимых факторов площадь под ROC-кривой увеличилась до 0,84 (у каждого признака в отдельности было 0,79 и 0,75), что говорит об увеличении точности прогноза почечного ответа или его отсутствия (см. фиг. 3). На фиг. 3 показана ROC-кривая прогноза почечного ответа по двум морфометрическим параметрам (индексу площади фиброза интерстиция и индексу площади экспрессии Е-кадгерина). Показатель площади под кривой равен 0,84 (существенно выше чем 0,5), что указывает на очень хорошую надежность прогноза почечного ответа по численным значениям площади фиброза интерстиция и экспрессии Е-кадгерина. Числовые значения над ROC-кривой -оценка вероятности почечного ответа, соответствующая выбранному порогу измерений.
Далее с помощью метода двумерного дискриминантного анализа была разработана прогностическая модель для двух признаков: площади ФИ и экспрессии Е-кадгерина. Определены их пороговые значения - для индекса площади Е-кадгерина менее 10%, для индекса площади ФИ более 40%. На основании чего создано логическое правило (новый комплексный признак), которое определяет неблагоприятную группу по почечному ответу среди всех пациентов: почечного ответ не достигается с вероятностью 93,3%, если индекс площади Е-кадгерина менее 10% и индекс площади ФИ более 40% (отношение шансов (OR)=24.5).
На фиг. 4 показана модель прогнозирования почечного ответа у больных миеломной каст-нефропатией с ОПП с потребностью в диализе. Характеристика этого правила. Если пациент отнесен в неблагоприятную группу, то его вероятность отсутствия почечного ответа на эффективную противомиеломную терапию в 24 раза больше, чем у пациента, отнесенного к благоприятной группе. Из пациентов, которые по индексам площади экспрессии Е-кадгерина и ФИ оказались в неблагоприятной группе, только в 6,67% (1 из 14 человек) был получен почечный ответ в результате противомиеломной терапии.
Площадь экспрессии эпителиального маркера Е-кадгерина менее 10% в сочетании с площадью фиброза интерстиция более 40% от площади интерстиция - прогностические факторы отсутствия почечного ответа при эффективности противомиеломной терапии у больных миеломной каст-нефропатией с острым почечным повреждением с потребностью в диализе.
Примеры осуществления способа
Пример 1.
Пациент П., 70 лет. Множественная миелома у данного пациента дебютировала с развития острого почечного повреждения (креатинин крови 960 мкмоль/л, олигурия 300 мл/сут, СКФ <5 мл/мин), в связи с чем, пациенту был начат экстренный гемодиализ. С диагностической целью выполнена биопсия почек, по результатам которой выявлена миеломная каст-нефропатия. Клинический диагноз: Множественная миелома, протекающая с парапротеинемией B-J-каппа, III стадия по R-ISS. Миеломная каст-нефропатия. Острое почечное повреждение стадия L (по классификации RIFLE); Сопутствующее заболевание: Ишемическая болезнь сердца: постинфарктный кардиосклероз. Пароксизмальная форма мерцательной аритмии. Недостаточность кровообращения ПА стадии. При полуколичественном морфологическом исследовании степень выраженности ФИ была определена как II степень. Было проведено исследование биоптатов пораженных почек путем световой микроскопии, окрашенных анилиновым синим трихромом по Массону и иммуногистохимического окрашивания и исследования с антителами к Е-кадгерину описанного выше. Количественный анализ морфологических изменений в биоптатах пораженных почек методом компьютерной морфометрии показал следующее: площадь интерстиция (ПИ), мкм=3832391,6; площадь фиброза интерстиция (ПФИ), мкм=1366241,8. Отсюда индекс фиброза интерстиция, % равен 1366241,8/3832391,6×100=35,6%.
Площадь интерстиция, (ПИ), мкм=3832391,6; площадь экспрессии Е-кадгерина (ПЭ Е-кадгерина), мкм=552235,2. При этом индекс площади экспрессии Е-кадгерина составил 552235,2/3832391,6×100=14,4%.
С учетом представленной нами модели пациент относится к благоприятной группе почечного ответа на противомиеломную терапию. Нами проведено лечение по стандартной 3-х компонентной схеме XT (бортезомиб, циклофосфамид, дексаметазон), без редукции доз препаратов. Лечение осложнилось развитием двусторонней пневмонии, рецидивирующим нарушением ритма. В результате терапии после 2-х курсов получен гематологический ответ. Через 1,5 месяца от начала лечения функция почек улучшилась, и удалось полностью отказаться от заместительной почечной терапии.
Таким образом, прогнозирование почечного ответа повлияло на выбор терапии. Восстановление функции почек и прекращение гемодиализа оправдывает выбор тактики интенсивной терапии, несмотря на развитие тяжелых осложнений у пациента пожилого возраста с тяжелой сопутствующей патологией.
Пример 2.
Пациентка М., 58 лет. На фоне развития тяжелого острого почечного повреждения (креатинин крови 1500 мкмоль/л, СКФ <5 мл/мин) был экстренно начат гемодиализ. С диагностической целью была выполнена биопсия пораженных почек, установлен диагноз миеломной каст-нефропатии. В последующем диагноз множественной миеломы был подтвержден. При морфологическом полуколичественном исследовании степень выраженности ФИ соответствовала 2 степени, т.е. неопределенному для прогноза обратимости почечного повреждения интервалу. Было проведено исследование биоптатов пораженных почек путем световой микроскопии, окрашенных анилиновым синим трихромом по Массону и иммуногистохимического окрашивания и исследования с антителами к Е-кадгерину описанного выше. Количественный анализ морфологических изменений в биоптатах почек методом компьютерной морфометрии показал следующее: площадь интерстиция (ПИ), мкм=2417793,8; площадь фиброза интерстиция (ПФИ), мкм=1308802,5. Отсюда индекс фиброза интерстиция, % равен 1308802,5/2417793,8×100=54,1%.
Площадь интерстиция, (ПИ), мкм=2417793,8; площадь экспрессии Е-кадгерина (ПЭ Е-кадгерина), мкм=213795,4. При этом индекс площади экспрессии Е-кадгерина составил 213795,4/2417793,8×100=8,8%.
На основании прогностической модели прогнозируют отсутствие почечного ответа на эффективную противомиеломную терапию, почечное повреждение необратимо даже при быстром и эффективном химиотерапевтическом воздействии.
Больной проведено 2 курса химиотерапии по стандартной бортезомибсодержащей программе (бортезомиб, циклофосфамид, дексаметазон), в результате чего был достигнут глубокий гематологический ответ (ОхЧР). Лечение осложнилось развитием двусторонней пневмонии, сепсисом, что потребовало перевода в отделение реанимации. Несмотря на быстрое достижение глубокого гематологического ответа, функция почек не улучшилась (и в дальнейшем тоже), на основании чего констатирована терминальная стадия хронической болезни почек с потребностью в гемодиализе.
Использование прогностической модели позволило установить крайне низкую вероятность почечного ответа. Более правильной тактикой в данном случае было бы проведение химиотерапии в менее интенсивном режиме, что позволило бы избежать развития жизнеугрожающих осложнений.