Средство для коррекции повреждений яичников, вызванных цитостатическим воздействием
MEANS FOR CORRECTION OF OVARY DAMAGE CAUSED BY CYTOSTATIC EFFECT

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается средства коррекции повреждений яичников, вызванных цитостатическим воздействием.
Важнейшим фактором, определяющим женскую фертильность, является овариальный резерв, фолликулярный запас - количество яйцеклеток, которые могут участвовать в оплодотворении. Сокращение количества фолликулов в яичниках и, прежде всего, пула примордиальных фолликулов, является одной из причин первичной недостаточности яичников [1, 2]. Следствием этого является прекращение функционирования яичников, что приводит к раннему бесплодию. Цитостатическая химиотерапия является одной из причин этой патологии [1, 3].
Успешные стратегии лечения целого ряда онкологических заболеваний способствовали тому, что поиск средств лечения первичной недостаточности яичников после использования цитостатической химиотерапии становится все более актуальным [4, 5, 6].
Известно, что эффективным средством защиты яичников от цитостатического воздействия, может быть лекарственное средство - агонист гонадотропин-рилизинг гормон (АГ-РГ). Однако данные о его эффективности достаточно противоречивы [5].
Известно, что к числу средств коррекции повреждения яичников от цитостатического воздействия принадлежит гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), представляющий собой плейотропный цитокин [3, 4, 5]. В экспериментальных исследованиях показано, что при совместном использовании Г-КСФ с цитостатическим препаратом (цисплатином) сохраняется достоверно большее количество фолликулов и повышается уровень антимюллерового гормона [4], Последний, как известно, характеризует уровень овариального резерва [7], Установлено также, что введение Г-КСФ крысам-самкам, получавших цитостатические препараты, способствует увеличению длительности фазы эструс [6], что приводит к увеличению длительности периода готовности к спариванию и расширению репродуктивного потенциала крыс-самок [8].
Данное средство является наиболее близким к заявляемому и выбрано в качестве препарата сравнения.
К числу недостатков Г-КСФ относится его невысокая эффективность, что побуждает к поиску способов усиления его терапевтического действия [9]. Кроме того, Г-КСФ обладает целым рядом побочных эффектов. Белковая природа Г-КСФ и его плейотропное действие определяют недостаточную избирательность его действия и большинство побочных эффектов [10].
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала лекарственных средств коррекции повреждений яичников, вызванных цитостатическим воздействием.
Поставленная задача решается путем применения в качестве средства для коррекции повреждений яичников, вызванных цитостатическим воздействием, принципиально нового, вещества - конъюгата ИМГ-КСФ, иммобилизованного на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза Г-КСФ воздействие потока ускоренных электронов с энергией 2.5 МэВ, поглощенной дозой 2-10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч.
Новым в предлагаемом изобретении является использование для лечения первичной недостаточности яичников, вызванного цитостатическим воздействием, иммобилизированного (с помощью нанотехнологии электронно-лучевото синтеза -воздействие потока ускоренных электронов с энергией 2.5 МэВ, поглощенной дозой 2-10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч) на низкомолекулярном полиэтиленгликоле Г-КСФ. При этом происходит образование принципиально нового вещества - конъюгата ИМГ-КСФ [11].
В проанализированной литературе средства для лечения первичной недостаточности яичников, вызванной цитостатическим воздействием, иммобилизированного (с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза - воздействие потока ускоренных электронов с энергией 2.5 МэВ, поглощенной дозой 2-10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч) на низкомолекулярном полиэтиленгликоле Г-КСФ не найдено, и предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».
В настоящее время установлено, что полиэтиленгликоль модифицирует свойства Г-КСФ, способствует повышению его стабильности, увеличению периода полувыведения, увеличивает избирательность действия за счет фармакокинетических и фармакодинамических параметров [11]. Однако, из отмеченных выше данных, факт более эффективного применения ИМГ-КСФ, по сравнению с Г-КСФ, для коррекции первичной недостаточности яичников, вызванных цитостатическим воздействием, с достижением нового результата: создания нового, высокоэффективного средства для коррекции этой патологии для специалиста не является очевидным. Это заключение основывается на том, что большинство лекарственных веществ, при попадании в кровь распределяются в разные органы и ткани неравномерно и не всегда удается достичь желаемой концентрации препарата в органе мишени. С кинетической точки зрения организм можно представить в виде совокупности камер, куда молекулы лекарственного вещества проникают с разной скоростью [12]. Существенное влияние на характер распределения ЛС оказывают гистогематические барьеры, встречающиеся на их пути [13]. Нормальная функция яичников осуществляется только благодаря наличию особого, обладающего селективной проницаемостью, гематофолликулярного барьера, в который входят: эндотелиоциты гемокапилляров теки, базальная мембрана эндотелия, интерстициальные элементы теки, базальная мембрана фолликулярного эпителия, фолликулярные клетки и блестящая зона. Он создает оптимальные условия для развития женских половых клеток и предохраняет яйцеклетку от иммунологических воздействий [14]. В настоящее время показано, что конъюгирование Г-КСФ с полиэтиленгликолем приводит к увеличению молекулярной массы соединения [11, 15], что может затруднить его проникновение через гематофолликулярный барьер. В доступной литературе данные о возможности проникновения ИМГ-КСФ через гематофолликулярный барьер не найдены.
Используемое в предлагаемом изобретении новое средство защищает ткань яичника от цитостатического воздействия. Подобранные нами условия введения являются оптимальными для эффективного предупреждения первичной недостаточности яичников. Отмеченный эффект, очевидно, связан со способностью ИМГ-КСФ проходить через гематофолликулярный барьер. Очевидно, благодаря этому новому свойству ИМГ-КСФ оказывает эффективное действие.
Совокупность отличительных признаков не является очевидной для специалиста и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области, что позволяет считать предлагаемое изобретение соответствующим условию патентоспособности «Изобретательский уровень». Предлагаемое изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении и соответствует условию «Промышленная применимость».
Таким образом, предлагаемое в качестве изобретения техническое решение соответствует условиям патентоспособности изобретения «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Данное изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур.
На фиг. 1 изображены результаты оценки концентрации антимюллерового гормона (АМГ) в сыворотке крови половозрелых крыс-самок, получавших этопозид в сочетании ИМГ-КСФ (концентрация АМГ, нг/мл): 1 - фон (интактные животные); 2 - контроль (этопозид); 3 - этопозид + Г-КСФ 100 мкг/кг; 4 - этопозид + ПЕГ-ГСФ 100 мкг/кг.
На фиг. 2 изображены результаты определения продолжительности фазы эструс эстрального цикла крыс-самок, получавших этопозид и ИМГ-КСФ (часы):): 1 - фон (интактные животные); 2 - контроль (этопозид); 3 - этопозид + Г-КСФ 100 мкг/кг; 4 - этопозид + ПЕГ-ГСФ 100 мкг/кг.
На фиг. 3 изображены результаты подсчета количества примордиальных фолликулов (а), количества двух и многослойных фолликулов (б), количества атретических фолликулов (в) в яичниках крыс, получающих этопозид в сочетании с ИМГ-КСФ (абсолютные значения):): 1 - фон (интактные животные); 2 - контроль (этопозид); 3 - этопозид + Г-КСФ 100 мкг/кг; 4 - этопозид + ПЕГ-ГСФ 100 мкг/кг.
Изобретение осуществляют следующим образом:
Лабораторным животным (крысы-самки) на следующий день после введения цитостатического препарата подкожно вводят препарат ИМГ-КСФ («Саентифик фьючер менеджмент») в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней.
Предлагаемый способ был апробирован в экспериментах на крысах-самках (сток SD) (n=80, массой 250-300 г.). Животные были получены из лаборатории биологического моделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга г. Томск. Содержание крыс осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Повреждение яичников моделировалось однократным внутривенным введением цитостатического препарата этопозид (этопозид, Teva, Израиль) в максимально переносимой дозе 30 мг/кг. Этопозид вводили крысам-самкам, находящимся на стадии проэструс. Препарат ИМГ-КСФ вводили крысам-самкам (n=10) в течение 5 дней, 1 раз в день подкожно в дозе 100 мкг/кг на следующий день после введения цитостатического препарата (этопозид). Животные контрольной группы получали этопозид (n=10) и по той же схеме эквиобъемное количество растворителя ИМГ-КСФ - буферный раствор, содержащий 20 мМ ацетат натрия, рН=4,4. В эксперименте также были использованы интактные животные (n=10, фон). В качестве препарата сравнения крысам-самкам (n=10) вводили препарат рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ - Нейпоген, F. Hoffmann-La Roche, Швейцария) в той же дозе и по той же схеме введения.
2
В стадии первого после введения этопозида эструса проводили эвтаназию животных (в СО камере), оценивали морфологическое и функциональное состояние яичников. В качестве показателей, характеризующих степень выраженности повреждения яичников, использовали: 1) уровень антимюллерового гормона; 2) продолжительность стадии эструс эстрального цикла крыс-самок; 3) количество примордиальных, двух и многослойных фолликулов, атретических фолликулов.
Концентрацию антимюллерова гормона (АМГ) в крови крыс-самок, получавших этопозид и ИМГ-КСФ, оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA, Cloud-Clone Corp. Wuhan). С этой целью у крыс-самок в стадии эструса проводили забор крови, которую центрифугировали в течение 20 минут при ускорении 1000 g. Далее выделяли сыворотку крови для анализа. Продолжительность фаз эстрального цикла определяли путем цитологического изучения вагинального мазка крыс-самок [8].
2
Для изучения морфологического состояния яичников, при регистрации наступления первого эструса после введения цитостатика, крыс-самок забивали (эвтаназия в СО камере), извлекали и фиксировали яичники в жидкости Карнуа, готовили парафиновые срезы (через весь орган) толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. На серийных срезах яичников (через весь орган) подсчитывали количество структурно-функциональных элементов: примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя- и более слоями гранулезных клеток, атретические фолликулы [16]. Указанные элементы подсчитывают по всей поверхности среза. Фолликулы примордиальные и с одним слоем гранулезных клеток учитывают в каждом 10-м срезе и результат умножали на 10, фолликулы зрелые с двумя и более слоями гранулезных клеток, атретические тела подсчитывали в каждом 5-м срезе. При количественной оценке микроструктуры яичника регистрировали только фолликулы, содержащие ядро и ядрышко [16].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрического критерия U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Пример.
Установлено, что уровень антимюллерового гормона в сыворотке крови крыс-самок интактных животных находился в пределах 920±149.53 нг/мл (фиг. 1). У животных, получавших этопозид, уровень АМГ составил 368.30±90.15, т.е. выявлялось существенное статистически значимое снижение (в 2,5 раза) этого показателя. Поскольку АМГ является специфическим продуктом делящихся клеток фолликулярного эпителия [7], то его снижение является, очевидно, результатом антипролиферативного действия этопозида, приводящего к гибели фолликулов. Полученные данные свидетельствует об истощении овариального резерва под действием этопозида. У животных, получавших этопозид и ИМГ-КСФ уровень АМГ составил 900,50±104,01 и статистически значимо (в 2,5 раза) превосходил этот показатель в группе контроля (этопозид) и не отличался от такового у интактных животных (фон). Уровень АМГ в группе животных, получавших препарат сравнения (Г-КСФ), также статистически значимо возрастал (в 1,8) раза и составил 675.13±65.79 по сравнению с контролем, но не достигал уровня интактных животных. Таким образом, судя по уровню АМГ, ИМГ-КСФ оказался эффективным средством защиты ткани яичников от повреждающего действия цитостатического препарата (этопозида). Его эффективность превосходила таковую у препарата сравнения.
Результаты изучения продолжительности фазы эструс эстрального цикла представлены на (фиг. 2). Установлено, что введение этопозида привело к статистически значимому сокращению продолжительности стадии эструс. Продолжительность стадии эструс на фоне сочетанного введения этопозида ИМГ-КСФ возрастала многократно. При сочетанном введения этопозида и Г-КСФ этот показатель достигал уровня интактных животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что ИМГ-КСФ приводит к увеличению длительности периода готовности к спариванию и, следовательно, расширению репродуктивного потенциала крыс-самок. Его эффективность превосходила таковую при введении препарата сравнения.
Результаты подсчета количества примордиальных и двух- и многослойных фолликулов, а также атретических фолликулов представлены на (фиг. 3). Установлено, что введение этопозида привело к статистически значимому сокращению количества примордиальных фолликулов (фиг. 3а). Их число составило 66,5% от фоновых значений. Оказалось сниженным (на 62,4% от фона) и количество двух- и многослойных фолликулов (фиг. 3б). Отмечалась тенденция к возрастанию количества атретических фолликулов (фиг. 3в). Полученные данные свидетельствуют о том, что этопозид приводил к гибели части источников пролиферативного пула оогенеза - примордиальных фолликулов и к сокращению количества созревающих фолликулов. Это свидетельствует об истощении под действием этопозида овариального резерва.
Введение этопозида в сочетании с ИМГ-КСФ способствовало сохранению большего количества примордиальных фолликулов. Их число не отличалось от фоновых значений. Эффективность препарата сравнения, судя по этому показателю, оказалась сопоставима с таковой при использовании ИМГ-КСФ. Введение ИМГ-КСФ способствовало сохранению пула двух- и многослойных фолликулов. Такой же эффект, сходный по степени выраженности, выявлялся и на фоне использования Г-КСФ. Ведение ИМГ-КСФ крысам, получавшим этопозид, приводило к статистически значимому сокращению количества атретических фолликулов. Их число сократилось на 37% от контроля (этопозид). При введении препарата сравнения также выявлялось снижение количества атретических фолликулов (до 23% от контроля).
Таким образом, ИМГ-КСФ является, судя по уровню АМГ, продолжительности эстрального цикла и количеству созревающих фолликулов, эффективным средством коррекции повреждения яичников, вызванных цитостатическим воздействием. Его эффективность по таким показателям, как уровень АМГ и продолжительность фазы эструс, превосходила таковую у препарата сравнения.
Применение в качестве средства коррекции повреждений яичников, вызванных цитостатическим воздействием ИМГ-КСФ позволяет защитить ткань яичника от повреждения.
Литература
1. De Vos M., Devroey P., C J M Fauser B. Primary ovarian insufficiency // The Lancet. 2010. Vol. 376. Issue 9744. p. 911-921.
2. Татарчук Т.Ф., Косей H.B., Тутченко Т.Н. Преждевременная недостаточность яичников: синдром или диагноз // Репродуктивная эндокринология. 2017. Выпуск 2. №34. с. 16-22.
3. Spears N, Lopes F, Stefansdottir A, Rossi V, Felici M De, Anderson R.A., Klinger F.G. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection // Hum Reprod Update. 2019. Vol. 25. Issue 6 p. 673-693.
4. Akdemir A., Zeybek, В., Zeybek A., Show L. et al. Granulocyte-colony stimulating factor decreases the extent of ovarian damage caused by cisplatin in an experimental rat model. // Journal of Gynecologic Oncology. 2014. Vol 25. 4. p. 328-333.
5. Xia H., Amandine А., Kui L.., Wallberg R. // Ovarian Follicle Depletion Induced by Chemotherapy and the Investigational Stages of Potential Fertility-Protective Treatments - Review // Int. J. Mol Sci. 2019. Vol. 20. Issue 19. p. 4720.
6. Oiuyan H., Bo L., Rufang J. et al. G-CSF-mobilized peripheral blood mononuclear cells combined with platelet-rich plasma accelerate restoration of ovarian unction in cyclophosphamide-induced POI rats // Biol Reprod. 2019. Vol. 101. Issue 1. p. 91-101.
7. Van Helden J., Weiskirchenb R. Age-independent anti-Miillerian hormone (АМН) standard deviation scores to estimate ovarian function // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 2017. Vol. 213. p. 64-70.
8. Ajayi, A.F., Akhigbe, R.E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update // Fertil Res and Pract (online format). 2020. Vol 6. №5.
9. Sameni HR., Seiri M., Safari M., Tabrizi Amjad MH., Khanmohammadi N., Zarbakhsh S., Bone M. stromal cells with the granulocyte colony-stimulating factor in the management of chemotherapy-induced ovarian failure in a rat model // Iran J. Med Sci. 2019. Vol 44. N 2. p. 911-921.
10. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов B.B., Мадонов П.Г., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Удут В.В. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2011. 149 с., С. 20.
11. Дыгай A.M., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г. Удут В.В. Нанотехнологии в фармакологии // Монография. Москва: Изд-во: РАМН. 2011. С. 36-37, 39, 55, 70, 79.
12. Каркищено Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. Ростов-на Дону. 2001. С. 25.
13. Клиническая фармакокинетика, теоретические, прикладные и аналитические процессы / под. Ред. В.Г. Кукеса. 2009. Глава 4.1. Савельева И.И., Сокова Е.А. Общие представления о распределении лекарственных средств с белками плазмы крови. С. 72
14. Билич Г.А. Справочник по андрологии и сексологии Г.Л. Билич, Е.Ю. зигалова. 4-е изд. Перераб. М: Практическая медицина. С. 96.
15. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Андреева Т.В., Мадонов П.Г., Верещагин Е.И. и др. Действие иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворные предшественники разных классов при цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2010. Т. 149. №3. С. 255.
16. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Часть первая. - М.: Гриф и К, 2013. 64-80 с.