Способ определения активности ботулотоксина с использованием клеток

1. Линия клеток N2-42F (регистрационный номер: KCTC 13712ВР), клонально выбранная из линии клеток Neuro-2a, которая является родительской нейрональной линией клеток.
2. Линия клеток по п. 1, отличающаяся тем, что указанная линия клеток может быть использована для определения активности ботулотоксина или для обнаружения ботулотоксина.
3. Линия клеток по п. 1, отличающаяся тем, что номер доступа указанной линии клеток Neuro-2a - KCTC АС28106.
4. Способ определения активности ботулотоксина с использованием клеток, включающий следующие стадии:
(а) культивирование линии клеток по любому из пп. 1-3;
(б) обработка культивируемой клеточной линии ботулотоксином; а также
(в) измерение чувствительности к ботулотоксину обработанной ботулотоксином клеточной линии.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что культивирование указанной линии клеток осуществляют в культуральной чашке, покрытой поли-D-лизином.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанным ботулотоксин является ботулотоксин серотипа А.
7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанное измерение чувствительности включает измерение степени расщепления эндогенного нейросекреторного белка, вызванного ботулотоксином.
8. Способ обнаружения ботулотоксина с использованием клеток, включающий следующие стадии:
(а) культивирование линии клеток по любому из пп. 1-3.;
(б) обработка культивируемой линии клеток представляющим интерес образцом; и
(в) измерение чувствительности к ботулотоксину линии клеток, обработанных указанным образцом.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что культивирование указанной линии клеток осуществляют в культуральной чашке, покрытой поли-D-лизином.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанным ботулотоксином является ботулотоксин серотипа А.
11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанное измерение чувствительности включает измерение степени расщепления эндогенного нейросекреторного белка, вызванного ботулотоксином.
FL
197
12. Антитело, специфически связывающееся с SNAP25 (белком, ассоциированным с синаптосомным нервом 25), отличающееся тем, что указанным SNAP25 является SNAP25 или SNAP25, и указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-13, 28-33, и 55-56;
участок CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 14-16, 34-39, и 57-58;
участок CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO. 17-19, 40-46, и 59-60;
участок CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 20-22, 47-49, и 61-62;
участок CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 23-24, 50-51, и 63-64; и
участок CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 25-27, 52-54, и 65-66.
FL
13. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 11;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 14;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 17;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 20;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 23; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 25.
FL
14. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 12;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 15;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 18;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 21;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 24; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 26.
FL
15. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 13;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 16;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 19;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 22;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 24; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 27.
197
16. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 28;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 34;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 40;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 47;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
197
17. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 29;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 35;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 41;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 48;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
197
18. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 29;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 36;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 42;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 47;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
197
19. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 33;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 35;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 43;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 48;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
197
20. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 30;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 37;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 44;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 48;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
197
21. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 31;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 38;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 45;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 47;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 53.
197
22. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 32;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 39;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 46;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 49;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 51; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 54.
FL
197
23. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и SNAP25, и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 55;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 57;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 59;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 61;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 63; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 65.
FL
197
24. Антитело по п. 12, отличающееся тем, что указанное антитело специфически связывается с SNAP25 и SNAP25, и содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 56;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 58;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 60;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 62;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 64; and
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 66.
25. Композиция антител, содержащая антитело по п. 12.
26. Чашка для культивирования, покрытая антителом по п. 12.
27. Набор, содержащий композицию антител по п. 25.
28. Клетка гибридомы - продуцента антитела по п. 12.
29. Клетка гибридомы по п. 28, отличающийся тем, что указанная клетка гибриды представляет собой слияние клетки селезенки и клетки миеломы мыши, инъецированной одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10.
30. Способ определения активности ботулотоксина, включающий следующие стадии:
(а) обработка нейрональной клетки указанным ботулотоксином; и
FL
197
(б) измерение содержания SNAP25 или SNAP25 в нейрональной клетке с помощью антитела по любому из пп. 12-24.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанным ботулотоксином является ботулотоксин серотипа А.
32. Способ обнаружения ботулотоксина, включающий стадии:
(а) обработка нейрональной клетки исследуемым образцом;
197
(б) измерение содержания SNAP25 в нейрональной клетке с помощью антитела по любому из пп. 16-24; и
(в) определение того, что если содержание SNAP25197 измеряется, ботулотоксин присутствует в указанном образце.
33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанным ботулотоксином является ботулотоксин серотипа А.
34. Способ анализа активности нейротоксина с использованием клеток, включающий следующие стадии:
(а) культивирование нейрональной линии клеток, полученной из Neuro-2a;
(б) обработка нейрональной линии клеток указанным нейротоксином;
FL
197
(в) обработка нейрональной линии клеток или образца, полученного из нейрональной линии клеток, антителом, которое специфически связывается с SNAP25 и SNAP25; и
197
FL
(г) обработка нейрональной линии клеток, полученных на стадии (в) антителом, которое специфически связывается с SNAP25 без связывания с SNAP25.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанной линией клеток, полученной из Neuro-2a, является линия клеток N2-42F (регистрационный номер: KCTC 13712ВР).
36. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанным нейротоксином является ботулотоксин.
37. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанный нейротоксин на стадии (б) разбавляют средой, содержащей GT1b (тринатриевую соль ганглиозида GT1b), и используют для обработки указанной линии клеток.
38. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанное антитело, используемое на стадии (в), содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 55 или 56;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 57 или 58;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 59 или 60;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 61 или 62;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 63 или 64; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 65 или 66.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 55;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 57;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 59;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 61;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 63; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 65.
40. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 56;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 58;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 60;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 62;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 64; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 66.
41. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанное антитело, используемое на стадии (г), содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 28-33;
участок CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 34-39;
участок CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 40-46;
участок CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 47-49;
участок CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 50-51; и
участок CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 52-54.
42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 28;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 34;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 40;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 47;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
43. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 29;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 35;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 41;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 48;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
44. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 29;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 36;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 42;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 47;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
45. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 33;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 35;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 43;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 48;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
46. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 30;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 37;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 44;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 48;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 52.
47. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 31;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 38;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 45;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 47;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 50; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 53.
48. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанное антитело содержит:
участок CDR1 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 32;
участок CDR2 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 39;
участок CDR3 тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 46;
участок CDR1 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 49;
участок CDR2 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 51; и
участок CDR3 легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 54.
49. Среда для культивирования клеток для обработки нейрональной клетки нейротоксином, содержащая GT1b (тринатриевую соль ганглиозида GT1b).
50. Среда для культивирования клеток по п. 49, отличающаяся тем, что концентрация указанного GT1b в указанной среде для культивирования клеток составляет от 30 до 70 мкг/мл.
51. Среда для культивирования клеток по п. 49, дополнительно содержащая креатин и аргинин.
52. Среда для культивирования клеток по п. 51, отличающаяся тем, что концентрация указанного креатина в среде для культивирования клеток составляет от 0,1 до 10 мМ, а концентрация указанного аргинина в среде для культивирования клеток составляет от 0,5 до 50 мМ.
53. Среда для культивирования клеток по п. 49, отличающаяся тем, что указанной средой для культивирования клеток является среда RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640).