Исследование механизма транспорта радахлорина плазмой крови человека

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • №2 • 2012

Рис. 1. Влияние Са2+ на относительные значения 1/Т50 РХ-ини-циированного фотогемолиза (658 нм, 1,2 Дж/см2, 6,25 мкг/мл

РХ). Концентрация Са2+ в инкубационной среде превышает физиологическую: 1 - 2 раза; 2 - 5 раз; 3 - 10 раз; 4 - 50 раз;

5 - 100 раз

ражению свободными радикалами Са2+-АТФ-аза, при этом происходит окисление БИ-групп, входящих в активной центр фермента и изменение конформации белка при контакте с мембранными липидами, подвергшимися пе-рекисному окислению. Поврежденная АТФ-аза не только перестает откачивать ионы кальция, но и превращается в канал для Са2+, позволяя ему входить в цитоплазму. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+, последующая активация Са2+-зависимых калиевых каналов, выход К+, С1- и воды приводит к апоптотическому уменьшению объема клетки, превращению их в эхиноциты, что делает лизис клетки неизбежным.

По нашим данным добавление в инкубационную среду ЭГТА (10 мМ), не оказывало существенного влияния на скорость индуцированного гемолиза. Однако предварительной инкубации эритроцитарной взвеси с раствором ЭГТА в течение 30 минут уже было достаточно для существенного замедления процесса (на 40-60 %). Это указывает на важность примембранной концентрации Са2+ в изменении деформационных характеристик мембраны и последующего гемолиза.

Рис. 2. Влияние дилтиазема на относительные значения 1/Т50

РХ-инициированного фотогемолиза (658 нм, 1,2 Дж/см2, 6,25 мкг/мл РХ) в зависимости от времени предварительной инкубации эритроцитов с препаратом. Время инкубации: 1 - 0 мин; 2 - 60 мин; 3 - 90 мин; 4 - 120 мин

Ионы кальция при концентрациях в 100, 50, 10, 5 и 2 раза превышающих физиологическую норму ускоряли гемолиз на87, 85, 27, 16и 3 % соответственно (рис. 1). Предварительная инкубация (0,5-1,5 часа) эритроцитов в среде с концентрацией Са2+, в 10 и 5 раз превышающей физиологическую, также приводила к ускорению гемолиза, но степень ускорения была достоверно ниже, чем без инкубации. Степень ускорения фотогемолиза зависела от концентрации Са2+, но не зависела от времени инкубации. Ингибитор кальциевых каналов дилтиазем оказывал инги-бирующее действие на фотогемолиз, но лишь после инкубации с ним в течение часа (рис. 2).

ВЫВОДЫ

Факторы, вовлеченные в механизмы эриптоза, а именно - Са2+ и кальциевые каналы, оказывают существенное влияние на фотоиндуцированный лизис эритроцитов. Ингибирование гемолиза под действием ЭГТА и ингибитора кальциевых каналов, а также его ускорение при повышении концентрации Са2+ свидетельствуют о потенцировании эриптозом процесса фотогемолиза.

© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 611.018.54:546.131

В. П. Фаенкова, И. Л. Соловцова, Е. А. Воробьев, А. Д. Денисенко, Л. В. Галебская

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА РАДАХЛОРИНА ПЛАЗМОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Препарат радахлорин (ООО «РАДАФАРМА») является мощным фотосенсибилизатором и находит все большее применение в фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и других патологических состояний человека. Преобладающим компонентом препарата является растительный тетрапиррол хлорин е.

Для проведения процедуры ФДТ препарат вводят в кровь, после чего он разносится по всему организму и поглощается различными тканями. От взаимодействий фотосенсибилизатора с компонентами крови зависит его распределение в организме и, следовательно, эффективность ФДТ. Целью настоящей работы явилось выявление транспортных форм препарата среди белков плазмы крови человека.

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлась цитратная плазма, сыворотка крови здоровых доноров и очищенные плазменные белки: липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), липопротеины низкой плотности (ЛНП), окисленные ЛНП (ЛНПох) и липопротеины высокой плотности (ЛВП). Связывание радахлорина с плазмой крови или ее компонентами исследовали методом электрофореза (ЭФ) в полиактриламидном геле (ПААГ). Электрофорез проводился на приборе для вертикального электрофореза фирмы «ИеИкоп» (Москва, РФ) в 10 % ПААГ в 0,025 М трис - ИС1-буфере, рН 8,6 и 7,4. Раствор радахлорина (10 мкл) смешивали с пробой компонента крови и доводили объем до 100 мкл растворителем для проб. Смесь инкубировали 15 минут при 4 оС в темноте. В гель наносилась проба 10 мкл, электрофорез проводился в течение 6 часов при температуре 4 оС. Часть пластин геля окрашивались на белок в красителе Кумасси бриллиантовом в течение 4 часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Радахлорин выявляется в геле для электрофореза благодаря своей окраске и по яркой флуоресценции при ультрафиолетовом облучении пластин.

Проба радахлорина, содержащая 4,4 мкг препарата, давала по одной полосе при рИ 7,4 (ЯГ=0,064) и 8,6 (Ш= 0,63). Так как радахлорин был добавлен к компонентам крови в значительном избытке, свободный препарат с характерными величинами ЯГ выявлялся во всех дорожках. В присутствии компонентов крови появлялись новые полосы уже связанного препарата. В таблице приведены величины ЯГ свободного и связанного радахлорина. Все

Влияние компонентов крови на относительную подвижность при электрофорезе в 10 % ПААГ, рН 8,6

Компонент крови И! радахлорина

0,63

ЛОНП Старт

0,63

ЛНП 0,35

0,63

ЛНП ох 0,35

0,63

ЛВП 0,16

0,63

Плазма крови 0,35

0,63

Сыворотка крови 0,35

0,63

исследованные компоненты крови связывали только часть препарата. В гелях, окрашенных на белок, положение связанного радахлорина совпадало с полосами белка. В сыворотке и плазме крови связанный радахлорин давал четкую полосу с ЯГ= 0,35, что совпадало с ЯГ липопротеинов низкой плотности (как интактных, так и окисленных). При рИ 7,4 электрофоретическая подвижность радахлорина и белков была снижена, но связывание препарата со всеми фракциями липопротеинов и соответствие величины его относительной подвижности полосам белка не отличались от результатов, полученных в более щелочной среде. Результаты исследования показали, что все фракции липопротеинов обладают способностью к связыванию радахлорина. В плазме и сыворотке крови основным переносчиком (из числа липопротеинов) являются липопротеины низкой плотности. Поскольку опухолевые клетки экспрессируют повышенные количества рецепторов к ЛНП, можно предположить, что накопление в них радахлорина осуществляется при посредничестве ЛНП.