Способ получения бактериального концентрата
METHOD FOR PRODUCTION OF BACTERIAL CONCENTRATE

Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности, в частности к микробиологии, и может быть использовано для производства пищевых продуктов, обогащенных молочнокислыми бактериями.
Известен способ приготовления сухой бактериальной закваски пропионовокислых бактерий, которая применяется для производства кисломолочного продукта «Целебный». Способ предусматривает последовательный пересев активизированной культуры пропионовокислых бактерий в стерильное обезжиренное молоко с получением первичной и пересадочной лабораторной закваски, нейтрализацию до рН 6,8-7,0, смешивание с защитной средой, розлив, замораживание, высушивание (см. Хамагаева И.С., Качанина Л.М., Тумурова С.М. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий. Улан-Удэ, 2006. - 172 с.).
Недостатками известного способа являются недостаточно высокая биохимическая активность и опасность загрязнения посторонней микрофлорой при пересевах.
9
Известен бактериальный препарат, предназначенный для производства ферментированных мясных изделий и биотрансформации мясного сырья. В его состав входят штаммы Lactobacillus sakei ВКПМ В-8936 (LSK-104), Lactobacillus plantarum ВКПМ В-1616 (22/2), Staphylococcus xylosus ВКПМ В-8945 (SPHYX-45), Pediococcus pentosaceus ВКПМ В-8955 (PDA-55). Известно, что штамм Lactobacillus sakei ВКПМ В-8936 (LSK-104) способен расти на MRS-arape с 2-4% хлорида натрия, наблюдается слабый рост на агаре с содержанием хлорида натрия 6-10%. Готовый бактериальный препарат содержит не менее 10 КОЕ (см. Патент RU №2367685, МПК C12N 1/20, опубл. 20.09.2009 г., Бюл. №26).
Недостатком известного способа являются трудоемкость получения и опасность инфицирования посторонней микрофлорой.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ производства бактериального концентрата пропионовокислых бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды, содержащей хлористый кобальт, внесение инокулята, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив, замораживание и сушку. Бактериальный концентрат применяется для биотехнологической обработки сырья животного происхождения (см. Патент RU №2309982, МПК C12N 1/20, А23С 9/12, C12R 1/15, опубл. 10.11.2007 г., Бюл. №31).
Также наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ производства бактериального концентрата молочнокислых бактерий, в котором в качестве питательной среды используют гидролизованную молочную сыворотку (см. Никифорова А.П., Хазагаева С.Н., Хамагаева И.С. Исследование биохимической активности штамма Lactobacillus sakei LSK-104 // Вестник ВСГУТУ. - №4. -2019. - С. 62-68).
Недостатком известных способов является недостаточная устойчивость применяемых микроорганизмов к высоким концентрациям хлорида натрия.
Технической задачей изобретения является получение замороженного и сухого бактериального концентрата.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в получении замороженного и сухого бактериального концентрата молочнокислых бактерий с высокой биохимической активностью, устойчивостью к хлориду натрия и количеством бактериальных клеток.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения бактериального концентрата, предусматривающем приготовление питательной среды на основе молочной сыворотки, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята, наращивание клеток, центрифугирование, смешивание с защитной средой, розлив, замораживание, сушку, согласно изобретению в качестве инокулята используют молочнокислые бактерии Lactobacillus sakei LSK-45 в количестве 3-5%, обладающие высокой устойчивостью к хлориду натрия, а осветленную молочную сыворотку предварительно гидролизуют ферментным препаратом β-галактозидазы.
3
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения бактериального концентрата, предусматривающем приготовление питательной среды на основе молочной сыворотки, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята, наращивание клеток, центрифугирование, смешивание с защитной средой, розлив, замораживание, сушку, согласно изобретению в качестве инокулята используют молочнокислые бактерии Lactobacillus sakei LSK-45 в количестве 3-5%, обладающие высокой устойчивостью к хлориду натрия, а в осветленную молочную сыворотку добавляют глюкозу в количестве 5 г/дм.
Отличительными признаками заявляемого изобретения являются:
- новые условия культивирования молочнокислых бактерий, а именно использование в качестве инокулята молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45, устойчивых к хлориду натрия;
- применение в качестве основы питательной среды молочной сыворотки, гидролизованной ферментным препаратом β-галактозидаза, при проведении гидролиза лактозы в молочной сыворотке ферментным препаратом β-галактозидаза штамм Lactobacillus sakei LSK-45, не ферментирующие лактозу, способны накапливать биомассу;
3
- добавление в питательную среду глюкозы в количестве 5 г/дм.
Большой научный интерес представляет применение стартовых культур молочнокислых бактерий для производства ферментированных рыбных продуктов. Очень перспективными для использования в составе бактериальных препаратов для производства ферментированных продуктов являются бактерии вида Lactobacillus sakei. Известно, что бактерии этого вида являются частью микрофлоры некоторых ферментированных рыбных продуктов, таких как ракфиск, jeotgal и другие.
При производстве мясных и рыбных продуктов обычно применяется хлорид натрия, который оказывает ингибирующее действие на большинство микроорганизмов.
В связи с этим экспериментальные исследования были направлены на изучение устойчивости бактерий Lactobacillus sakei к хлориду натрия. В качестве объектов исследований были выбраны следующие штаммы молочнокислых бактерий из фонда Национального биоресурсного центра - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (ГосНИИгенетика):
а) штамм Lactobacillus sakei LSK-45 (регистрационный номер В-8896 в коллекции ВКПМ);
б) штамм Lactobacillus sakei DSM 20017 (регистрационный номер В-10905 в коллекции ВКПМ);
Предлагаемый способ получения бактериального концентрата поясняется рисунками, где на фиг. 1 изображено влияние различных концентраций хлорида натрия на рост штамма Lactobacillus sakei LSK-45; на фиг. 2 - влияние различных концентраций хлорида натрия на рост штамма Lactobacillus sakei DSM 20017; на фиг. 3 - динамика накопления биомассы бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 в процессе культивирования на среде на основе гидролизованной сыворотки; на фиг. 4 - динамика накопления биомассы бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 в процессе культивирования на среде на основе сыворотки с добавлением глюкозы.
Данные о количестве жизнеспособных клеток бактерий и сведения о выживаемости бактерий приведены в таблице 1 и на фиг. 1 и 2.
9
3
8
3
Данные, представленные на фиг. 1, показывают, что с увеличением концентрации хлорида натрия до 6% динамика роста биомассы практически не отличается. При этом количество жизнеспособных клеток во всех образцах составляет 10 КОЕ/см (Таблица 1). Дальнейшее повышение концентрации NaCl до 10% приводит к незначительному замедлению накопления биомассы и снижению плотности клеток в популяции Lactobacillus sakei LSK-45 до 10 КОЕ/см.
В таблице 2 представлены данные о влиянии различных концентраций хлорида натрия на выживаемость бактерий вида Lactobacillus sakei.
Как видно из таблицы 2, выживаемость клеток Lactobacillus sakei LSK-45 при высоких концентрациях хлорида натрия значительно выше выживаемости клеток Lactobacillus sakei DSM20017 и составляет 91,2% при концентрации хлорида натрия 10%.
7
3
6
3
Что касается штамма Lactobacillus sakei DSM 20017, то при концентрации хлорида натрия в питательной среде, равной 6%, наблюдается резкое снижение активности наращивания биомассы, и в конце культивирования плотность клеток достигает 10 КОЕ/см (Таблица 1). Подобная динамика наблюдается при концентрации хлорида натрия 8%. При концентрации соли до 10% отмечается дальнейшее замедление прироста биомассы, о чем свидетельствует снижение плотности клеток в популяции до 10 КОЕ/см (См. фиг. 2). Следует отметить значительную гибель клеток Lactobacillus sakei DSM 20017 при высоких концентрациях хлорида натрия. При концентрациях хлорида натрия 6-8% выживает 72,2% клеток Lactobacillus sakei DSM 20017, а при 10%-66,8%.
Из анализа полученных экспериментальных данных следует, что штамм Lactobacillus sakei LSK-45 характеризуется более высокой стойкостью к солевому стрессу в сравнении с Lactobacillus sakei DSM 20017. В связи с этим, он является перспективным для применения в составе бактериальных препаратов для ферментации рыбы.
Дальнейшие экспериментальные исследования были направлены на создание бактериального концентрата с применением штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45.
Молочная сыворотка широко применяется в качестве основы для питательной среды при производстве бактериальных препаратов. Применение сыворотки для культивирования микроорганизмов обусловлено содержащимися в ней углеводами (моно-, олиго- и аминосахарами), минеральными солями, витаминами, органическими кислотами, ферментами и микроэлементами. Углеводы в сыворотке представлены, в основном, лактозой. Выбранный штамм Lactobacillus sakei LSK-45 не способен сбраживать лактозу. В связи с этим, в качестве питательной среды для наращивания биомассы применяют гидролизованную молочную сыворотку. Результатом гидролиза молочной сыворотки с применением фермента β-галактозидазы является расщепление лактозы до глюкозы и галактозы.
3
Гидролиз сыворотки проводят с применением ферментного препарата β-галактозидазы в количестве 1,5-2 Ед/см сыворотки при температуре (37±1)°С в течение 1,5-2 ч. (см. Патент SU №1686718, МПК А23С 9/12, опубл. 20.02.1996 г.). В качестве инокулята применяют культуру молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei LSK-45, культивирование которой проводят на полужидкой среде MRS в течение 20±4 ч.
На следующем этапе определяют оптимальную дозу внесения инокулята бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 на питательной среде на основе гидролизованной сыворотки (См. фиг. 3). Установлено, что оптимальный рост наблюдается при внесении 3-5% инокулята. При внесении инокулята в количестве 1% накопление биомассы происходит медленнее, а внесение 10% инокулята не приводит к значительному приросту биомассы бактерий.
Представленные данные свидетельствуют о том, что штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 имеет высокую биохимическую активность и способен расти на питательной среде на основе гидролизованной молочной сыворотки.
3
3
3
3
На следующем этапе экспериментальных исследований изучают рост бактерий на среде на основе молочной сыворотки с добавлением глюкозы. Глюкозу добавляют в следующих концентрациях: 3 г/дм, 5 г/дм, 10 г/дм, 15 г/дм. Результаты, отражающие рост бактерий на среде с добавлением глюкозы, представлены на фиг. 4.
3
3
3
В результате анализа полученных данных установлено, что при содержании глюкозы в питательной среде, равном 3 г/дм, оптическая плотность среды меньше, чем при содержании глюкозы 5 г/дм, что связано с исчерпанием источника энергии. Дальнейшее увеличение концентрации глюкозы в питательной среде незначительно влияет на динамику накопления биомассы бактерий. Таким образом, оптимальной дозой внесения глюкозы в питательную среду является 5 г/дм.
На следующем этапе определяют оптимальную дозу внесения инокулята Lactobacillus sakei LSK-45. Результаты представлены в таблице 3.
Установлено, что при внесении инокулята в количестве 1% от объема питательной среды наблюдается более медленное накопление биомассы молочнокислых бактерий. При внесении инокулята в количестве 10% значения оптической плотности среды и количество жизнеспособных клеток практически не отличаются от значений, полученных при внесении 3-5% инокулята. Таким образом, оптимальной дозой внесения инокулята является значение 3-5% от объема питательной среды.
11
3
Известно, что жидкий бактериальный концентрат не является стойким при хранении. Снижение количества клеток в жидком концентрате обусловлено кислой реакцией среды, высокой влажностью, отсутствием защитных веществ. Повысить срок хранения бакконцентрата можно с применением криоконсервации и высушивания. В связи с этим, на следующем этапе экспериментальных исследований проводят замораживание бактерий. Перед замораживанием питательную среду центрифугируют, полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 1:1. Смесь замораживают при температуре минус 18°С. Установлено, что после замораживания количество клеток бактерий составляет 1⋅10 КОЕ/см.
Далее полученный замороженный бактериальный концентрат подвергают сублимационной сушке при следующих технологических режимах: начальная температура сушки составляет минус 18°С, досушивание проводят при температуре 37-38°С. В процессе сушки остаточное давление поддерживают на уровне 0,13-1,3 Па. Продолжительность процесса сушки контролируют по остаточной влажности бактериального препарата.
Таким образом, установлено, что замороженный и сухой бактериальные концентраты молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei LSK-45 обладают высокой биохимической активностью. Способ позволяет получить бактериальный концентрат, который может применяться при производстве рыбных продуктов.
Качественные характеристики бактериального концентрата приведены в таблице 4.
Предлагаемый способ получения бактериального концентрата молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei LSK-45 осуществляется следующим образом.
3
Для получения замороженного и сухого бактериальных концентратов бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 применяют среду, в качестве основы которой служит гидролизованная молочная сыворотка. Гидролиз молочной сыворотки проводят с помощью фермента β-галактозидазы при дозе внесения фермента 1,5-2 Ед/см при температуре 37±1°С в течение 1,5-2 ч. Для обеспечения нормального роста микроорганизмов в основу питательной среды вносят ростовые компоненты (Хамагаева И.С., Качанина Л.М., Тумурова С.М. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий. Улан-Удэ, 2006. - 172 с.). Питательную среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до температуры (37±2)°С В качестве инокулята используют культуру молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 в количестве 3-5%, культивирование которой проводят на полужидкой среде MRS в течение 20±4 ч. Наращивание клеток бактерий проводят в течение 24 ч. Полученную бактериальную массу охлаждают до (4±2)°С, отделяют от культуральной среды, смешивают с защитной средой, разливают по флаконам, замораживают и высушивают сублимационным методом.
3
Для получения замороженного и сухого бактериальных концентратов бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 применяют среду с добавлением глюкозы в количестве 5 г/дм. Для обеспечения нормального роста микроорганизмов в основу питательной среды вносят ростовые компоненты (Хамагаева И.С., Качанина Л.М., Тумурова С.М. Биотехнология заквасок пропионовокислых бактерий. Улан-Удэ, 2006. - 172 с.). Питательную среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до температуры (37±2)°С В качестве инокулята используют культуру молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 в количестве 3-5%, культивирование которой проводят на полужидкой среде MRS в течение 20±4 ч. Наращивание клеток бактерий проводят в течение 24 ч. Полученную бактериальную массу охлаждают до (4±2)°С, отделяют от культуральной среды, смешивают с защитной средой, разливают по флаконам, замораживают и высушивают сублимационным методом.
При получении замороженного и сухого концентратов применяют защитную среду следующего состава: сахароза - 10%, натрий лимоннокислый - 2%, дистиллированная вода - остальное. Защитную среду стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 30 минут, затем среду охлаждают и хранят до использования.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Пример 1
3
При получении замороженного бактериального концентрата молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе гидролизованной молочной сыворотки. Для приготовления питательной среды творожную сыворотку осветляют, устанавливают рН 6,5, гидролизуют с помощью фермента β-галактозидазы при дозе внесения фермента 1,5-2 Ед/см при температуре 37±1°С в течение 1,5-2 ч. Готовят питательную среду следующего состава:
Магний хлористый - 0,3 г,
натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,
калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,
аскорбиновая кислота - 0,1 г,
пептон - 5 г,
агар-агар - 1,3 г,
гидролизованная сыворотка до 1 л.
рН среды устанавливают равным 6,78.
Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до (37±2)°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий (штамм Lactobacillus sakei LSK-45) в количестве 3% и наращивают клетки в течение 24 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С. Затем отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, добавляют защитную среду в соотношении 1:1. В составе среды используют следующие компоненты:
Сахароза - 10%;
Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 2%;
Дистиллированная вода - остальное.
Полученную смесь в стерильных условиях разливают в стеклянные флаконы по 2 мл и замораживают при температуре не менее минус 18°С. Флаконы закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженный концентрат хранят до 6 месяцев при температуре не менее минус 12°С.
Пример 2
3
При получении сухого бактериального концентрата молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе гидролизованной молочной сыворотки Для приготовления питательной среды творожную сыворотку осветляют, устанавливают рН 6,5, гидролизуют с помощью фермента β-галактозидазы при дозе внесения фермента 1,5-2 Ед/см при температуре 37±1°С в течение 1,5-2 ч. Готовят питательную среду следующего состава:
Магний хлористый - 0,3 г,
натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,
калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,
аскорбиновая кислота - 0,1 г,
пептон - 5 г,
агар-агар - 1,3 г,
гидролизованная сыворотка до 1 л.
рН среды устанавливают равным 6,78.
Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до (37±2)°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий (штамм Lactobacillus sakei LSK-45) в количестве 4% и наращивают клетки в течение 24 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С. Затем отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, добавляют защитную среду в соотношении 1:1. В составе среды используют следующие компоненты:
Сахароза - 10%;
Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 2%;
Дистиллированная вода - остальное.
Полученную смесь в стерильных условиях разливают в стеклянные флаконы по 2 мл и замораживают при температуре минус 18°С и высушивают в сублимационной установке в течение 24 ч. Флаконы с концентратом закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Сухой бактериальный концентрат хранят до 12 месяцев при температуре не менее минус 12°С.
Пример 3
При получении замороженного бактериального концентрата молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе молочной сыворотки с добавлением глюкозы. Для приготовления питательной среды творожную сыворотку осветляют, устанавливают рН 6,5. Готовят питательную среду следующего состава:
Глюкоза - 5 г,
магний хлористый - 0,3 г,
натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,
калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,
аскорбиновая кислота - 0,1 г,
пептон - 5 г,
агар-агар - 1,3 г,
гидролизованная сыворотка до 1 л.
рН среды устанавливают равным 6,78.
Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 мин и охлаждают до (37±2)°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий (штамм Lactobacillus sakei LSK-45) в количестве 5% и наращивают клетки в течение 32 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С. Затем отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, добавляют защитную среду в соотношении 1:1. В составе среды используют следующие компоненты:
Сахароза - 10%;
Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 2%;
Дистиллированная вода - остальное.
Полученную смесь в стерильных условиях разливают в стеклянные флаконы по 2 мл и замораживают при температуре не более минус 18°С. Флаконы закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженный концентрат хранят до 6 месяцев при температуре не менее минус 12°С.
Пример 4
При получении сухого бактериального концентрата молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе молочной сыворотки с добавлением глюкозы. Для приготовления питательной среды творожную сыворотку осветляют, устанавливают рН 6,5. Готовят питательную среду следующего состава:
Глюкоза - 5 г,
магний хлористый - 0,3 г,
натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,
калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,
аскорбиновая кислота - 0,1 г,
пептон - 5 г,
агар-агар - 1,3 г,
гидролизованная сыворотка до 1 л.
рН среды устанавливают равным 6,78.
Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 мин и охлаждают до (37±2)°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 в количестве 3% и наращивают клетки в течение 32 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С.
Затем отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, добавляют защитную среду в соотношении 1:1. В составе среды используют следующие компоненты:
Сахароза - 10%;
Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 2%;
Дистиллированная вода - остальное.
Полученную смесь в стерильных условиях разливают в стеклянные флаконы по 2 мл и замораживают при температуре минус 18°С и высушивают в сублимационной установке в течение 24 ч. Флаконы с концентратом закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Сухой бактериальный концентрат хранят до 12 месяцев при температуре не менее минус 12°С.
Предлагаемое изобретение «Способ получения бактериального концентрата» по сравнению с прототипами (см. Патент RU №2309982, МПК C12N 1/20, А23С 9/12, C12R 1/15, опубл. 10.11.2007 г., Бюл. №31, см. Никифорова А.П., Хазагаева С.Н., Хамагаева И.С. Исследование биохимической активности штамма Lactobacillus sakei LSK-104 // Вестник ВСГУТУ. - №4. - 2019. - С. 62-68) обладает следующими преимуществами:
- повышение биохимической активности и количества бактериальных клеток молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45;
- получение замороженного и сухого бактериального концентрата молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei LSK-45, обладающего высокой устойчивостью к хлориду натрия;
- возможность применения бактериального концентрата для производства ферментированных рыбных продуктов.