ОБНАРУЖЕНИЕ СВЯЗАННЫХ С ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ

1. Способ идентификации геномной ДНК в образце, включающий
- выделение мРНК из выбранного организма и получение из указанной мРНК малых одноцепочечных фрагментов кДНК с одним адаптором, содержащим аффинную метку;
- выделение геномной ДНК из того же самого или родственного организма и получение из указанной геномной ДНК одноцепочечных фрагментов геномной ДНК, лигированных с адапторными молекулами;
- гибридизацию указанных одноцепочечных фрагментов геномной ДНК с указанными одноцепочечными фрагментами кДНК и амплификацию указанных гибридов; и
- высокопроизводительное секвенирование указанных гибридов.
2. Способ по п.1, предусматривающий стадии:
a) выделения и очистки мРНК из образцов ткани организма;
b) синтеза кДНК с использованием указанной мРНК в качестве матрицы;
c) необязательно уменьшения сложности указанной кДНК;
d) фрагментации указанной кДНК;
e) необязательно отбора по размеру указанных фрагментов;
f) необязательно удаления полиА-содержащих фрагментов связыванием с покрытыми стрептавидином аффинными гранулами;
g) шлифовки указанных фрагментов кДНК;
h) лигирования указанных фрагментов с одним адаптором, содержащим сайт узнавания для редко-щепящего фермента, и другим адаптором, содержащим биотиновую метку;
i) необязательно отбора по размеру указанных фрагментов;
j) ник-репарации указанных фрагментов;
k) отбора указанных фрагментов, которые содержат последовательности обоих адапторов;
l) амплификации указанных фрагментов с использованием праймеров, отжигающихся с адапторными последовательностями, описанными на стадии h), где один праймер является комплементарным адаптору с редким рестрикционным сайтом, а другой праймер содержит биотиновую метку;
m) связывания указанных фрагментов с покрытыми стрептавидином аффинными гранулами;
n) удаления адапторов, содержащих редкий рестрикционный сайт, с использованием соответствующего рестрикционного фермента из указанных фрагментов;
о) удаления одиночных цепей, не присоединенных к аффинным гранулам взаимодействием биотин-стрептавидин, из двухцепочечных фрагментов ДНК, присоединенных к аффинным гранулам через взаимодействие биотин-стрептавидин, приводящего к одиночным цепям ДНК, связанным со стептавидиновыми аффинными гранулами;
р) выделения и очистки геномной ДНК, например из организма со стадии а);
q) фрагментации указанной геномной ДНК;
r) необязательно шлифовки указанной геномной ДНК;
s) лигирования указанной геномной ДНК с одним единственным типом адаптора или с двумя разными типами адапторов (предпочтительно);
t) плавления указанной геномной ДНК до одноцепочечной ДНК;
u) гибридизации геномной ДНК со стадии t) с кДНК на гранулах со стадии о);
v) удаления несвязанной геномной ДНК промыванием;
w) удлинения гибрида кДНК-геномная ДНК полимеразой с созданием двухцепочечной матрицы;
х) проведения ПЦР на указанном гибриде геномная ДНК-кДНК;
y) отбора фрагментов, больших, чем приблизительно 100 пар оснований, из указанной ПЦР фракционированием по размеру;
z) необязательно очистки указанных фрагментов и
аа) высокопроизводительного секвенирования указанных фрагментов.
3. Способ по п.2, в котором последовательности со стадии аа) объединяют в контиги перекрывающихся индивидуальных последовательностей.
4. Способ по п.3, в котором контиги аннотируют автоматическим аннотированием.
5. Способ по п.1, в котором последовательности получают из индивидуумов, принадлежащих к одному виду, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.
6. Способ по п.1, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов, принадлежащих к родственным видам, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.
7. Способ по п.1, в котором последовательности получают из двух или более индивидуумов, принадлежащих к одному и тому же виду, и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.
8. Способ по п.1, в котором последовательности получают из одного или нескольких индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.
9. Способ по п.1, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления консервативных участков в геномной ДНК.
10. Способ по п.1, в котором адаптор, содержащий сайт узнавания для редко-щепящего фермента со стадии h), содержит сайт узнавания для фермента Sapl.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором фрагментацию нуклеиновых кислот достигают распылением.
12. Способ идентификации полиморфизмов, предусматривающий все стадии способа по п.2 и дополнительно стадию ab) сравнения данных по последовательностям из двух или более образцов для идентификации полиморфизмов.
13. Способ по п.12, в котором последовательности со стадии аа) объединяют в контиги перекрывающихся индивидуальных последовательностей.
14. Способ по любому из пп.12-13, в котором последовательности со стадии ab) или контиги, охарактеризованные в п.13, аннотируют автоматическим аннотированием.
15. Способ по п.12, в котором последовательности получают из индивидуумов, принадлежащих к одному виду, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.
16. Способ по п.12, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов, принадлежащих к родственным видам, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.
17. Способ по п.12, в котором последовательности получают из двух или более индивидуумов, принадлежащих к одному и тому же виду, и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.
18. Способ по п.12, в котором последовательности получают из одного или нескольких индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.
19. Способ по п.12, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления консервативных участков в геномной ДНК.
20. Способ по п.12, в котором адаптор, содержащий сайт узнавания для редко-щепящего фермента со стадии h), содержит сайт узнавания для фермента SapI.
21. Способ по п.12, в котором фрагментацию нуклеиновых кислот достигают распылением.
22. Набор для осуществления способа по п.1 или 2, содержащий один или несколько адапторов и инструкции по применению и необязательно один или несколько праймеров, комплементарных указанным адапторам, лигазу и/или рестрикционные ферменты, которые являются специфическими в отношении разрезания этих адапторов, общепринятые компоненты для наборов для амплификации per se, такие как dNTP и полимераза.
23. Набор по п.22, в котором адаптеры получают отжигом олигонуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из:
5'-AGTCCGTCGCATCGCTCTTC-3'
5'-GAAGAGCGATGCGACG-3
5'-Биотин-TEG-AGTGGGTGTCCTGGGTCAAC-3'
5'-GTTGACCCAGGACACC-3'
5'-CTTGTAGGGCACGGGTCGAGAG-3'
5'-AATTCTCTCGACCCGTGCCCTA-3'
5'-CTTGTAGGGCACGGGTCGGAGA-3'
5'-AGCTTCTCCGACCCGTGCCCTA-3'
5'-GAATGGCTGGGAGAGTGCTGAG-3'
5'-GATCCTCAGCACTCTCCCAGCC-3' и
5'-GTAGGGCACGGGTCGGAGAAGC-3'.