МЕМБРАНА ИОНОСЕЛЕКТИВНОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ
ION-SELECTIVE ELECTRODE MEMBRANE FOR DETERMINING CEPHALOSPORIN ANTIBIOTICS IN MEDICINAL AND BIOLOGICAL MEDIA

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в контрольно-аналитических, клинических лабораториях для определения концентрации цефалоспориновых антибиотиков (цефазолина, цефотаксима, цефтриаксона, цефуроксима, цефалексина, цефиксима и др.) в исследуемых жидких средах, для стандартизации и контроля качества лекарственных средств, для определения антибиотиков в биосистемах (сыворотке крови, жидкости ротовой полости, моче и др.) с целью изучения фармакодинамики, лекарственного мониторинга для регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний.
Заявляемое устройство может быть также применено и для определения антибиотиков в пищевых продуктах, сточных водах фармацевтических производств.
Актуальным вопросом здравоохранения является контроль за качеством выпускаемых лекарственных средств. Эффективность контроля качества лекарственных препаратов, а также всестороннего их изучения обеспечивается внедрением в практику фармацевтических производств современных физико-химических методов, среди которых важное место занимает потенциометрия с ионоселективными электродами.
Объектами настоящего исследования являются цефалоспориновые антибиотики различных поколений, применяемые для лечения инфекционно-соматических патологий - инфекций мочевыводящих путей, инфекций верхних и нижних дыхательных путей и др.
Для определения цефалоспоринов: (цефазолин) в литературе предложено использовать масс-спектрометрию (плазма и моча), жидкостную хроматографию (биосреды), спектрофлуориметрию (цефалексин в плазме крови, моче), диффузию в агар (цефотаксим в сыворотке и околораневых тканях), ионную хроматографию - цефтриаксон (в крови и тканях здоровых крыс), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) (сыворотка крови, моча) [Кулапина Е.Г., Баринова О.В., Кулапина О.И. и др. Современные методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах. // Антибиотики и химиотерапия, 2009. - Т.54. - №9-10. - С.53].
Многие из этих методов требуют дорогостоящего оборудования, реактивов, высококвалифицированных операторов, отличающихся длительностью и не применимы в клинических и биохимических лабораториях для экспресс-контроля за содержанием антибиотиков.
Для определения антибиотиков в фармацевтических формах и биологических жидкостях наиболее перспективным является использование потенциометрических методов с применением различных сенсоров, например ионоселективных электродов (ИСЭ) с различными видами электродно-активных соединений (ЭАС). Метод отличается экспрессностью, селективностью, простотой и доступностью оборудования.
Для определения цефалоспориновых антибиотиков наиболее эффективным классом электродно-активных соединений (ЭАС) являются анионообменники.
Известно использование в качестве ЭАС мембран соединений бензилпенициллинтетрадециламмоний (в электродах для определения пенициллиновых антибиотиков), цефазолинтетрадециламмоний, цефотаксимтетрадециламмоний (в электродах для определения цефазолина и цефотаксима соответственно) [Кулапина Е.Г., В.Ф.Киричук, В.В.Барагузина и др. Экспрессное определение β-лактамных антибиотиков в биологических средах с применением потенциометрических сенсоров. // Антибиотики и химиотерапия, 2007. - №9-10, С.14-18].
Однако использование различных ЭАС в мембранах потенциометрических сенсоров является трудоемким: практически для каждой мембраны необходимо синтезировать собственное электродно-активное соединение (ЭАС), получать мембрану на его основе и изготавливать ионоселективный электрод для определения каждого конкретного антибиотика. Кроме того, многократный забор крови из вены практически здоровых лиц и больных через определенные промежутки времени является весьма травматичным. Определение цефалоспориновых антибиотиков в смешанной слюне (жидкости ротовой полости (ЖРП) также требует разработки эффективной мембраны для определения концентраций антибиотиков.
Известен «Состав мембраны ионоселективного электрода для определения димедрола» (АС СССР №1749813, G01N 27/333), включающий поливинилхлорид в качестве матрицы, дибутилфталат в качестве пластификатора и электродно-активное соединение. При этом с целью обеспечения прямого потенциометрического определения димедрола в водных растворах в качестве электродно-активного соединения использована соль димедрола с анионом 12-молибдофосфорной гетерополикислоты при следующем соотношении мембранных компонентов, мас.%: поливинилхлорид 53,05-51,68; дибутилфталат 41,64-40,57; соль димедрола с анионом 12-молибдофосфорной гетерокислоты остальное.
Известны также состав мембраны и устройство электродов для определения одного из антибиотиков цефалоспориновой группы, а именно, цефуроксима в лекарственных средах, описанное в статье авторов
Мембрана выполнена с использованием в качестве ЭАС - цефуроксимтетраоктиламмония, в качестве пластификатора - 2-нитрофенилоктилового эфира, в качестве добавки - 4-третоктилфенила.
-4
Недостатком данной мембраны является узкий спектр применения мембраны - для определения только одного вида антибиотиков цефалоспориновой группы (цефуроксима) и только в лекарственных средах. Кроме того, характерен высокий предел обнаружения цефуроксима, а именно 2,8×10 M, что не позволяет применять электрод для определения антибиотика в биосредах, где содержатся более низкие концентрации антибиотика.
Задачей изобретения является создание мембраны ионоселективного электрода (ИСЭ) для экспрессного определения цефалоспориновых антибиотиков, например цефуроксима, цефалексина, цефтриаксона, цефиксима в лекарственных и биологических средах (в т.ч. жидкости ротовой полости) и создание на основе полученной мембраны ионоселективного электрода, чувствительного ко всей группе цефалоспориновых антибиотиков, для их количественного определения как в лекарственных, так и в биологических средах (в том числе ЖРП).
Техническим результатом является сокращение времени определения за счет использования одного ионоселективного электрода, чувствительного ко всей группе цефалоспориновых антибиотиков, а также за счет снижения предела обнаружения при определении концентраций цефалоспоринов в биологических средах, снижение погрешности определения результата.
Изобретение поясняется чертежами.
На Фиг1 представлена конструкция жидкоконтактного электрода, где позициями обозначены:
1 - токоотвод;
2 - селективная мембрана;
3 - поливинилхлоридная трубка;
4 - внутренний электрод сравнения;
-3
-1
5 - внутренний раствор сравнения: 10 М р-р цефуроксима + 10 М NaCl.
На Фиг.2 представлена зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефалоспоринов (рС): 1 - цефазолин, 2 - цефуроксим, 3 - цефтриаксон, 4 - цефалексин ЭАС цефуроксим-диметилдистеариламмоний (Cefur - DMDSA).
На Фиг.3 - зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефиксима (pC).
На Фиг.4 - Зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефуроксима (pC) для смешанной слюны.
Поставленная задача решается тем, что в составе мембраны ионоселективного электрода для ионометрического определения цефалоспориновых антибиотиков в лекарственных и биологических средах, включающем поливинилхлорид в качестве матрицы, дибутилфталат в качестве пластификатора и электродно-активное соединение, согласно предлагаемому решению в качестве электродно-активного соединения использован цефуроксимдиметилдистеариламмоний при следующем соотношении компонентом:
Поливинилхлорид
24,31-23,87%,
Дибутилфталат
72,94-71,36%,
Электродно-активное соединение
2,74-4,5%.
Как правило, для измерения ЭДС используют стандартный и индикаторный ионоселективные электроды. Конструкция индикаторного ИСЭ содержит корпус электрода, представляющего собой поливинилхлоридную трубку, внутренний электрод сравнения, в качестве которого используется серебряная проволока, покрытая слоем хлорида серебра, внутренний раствор сравнения и мембрану.
Заявляемая мембрана представляет собой эластичную пленку, содержащую порошок поливинилхлорида, предварительно растворенного в циклогексаноне, пластифицированный дибутилфтолатом, и ЭАС, а именно один из его классов - анионообменник - ионный ассоциат цефуроксим-диметилдистеариламмоний. Для обеспечения контакта между мембраной и внутренним электродом сравнения внутри корпуса размещают раствор хлорида натрия и любой антибиотик цефалоспориновой группы.
Выбор оптимального состава мембраны осуществлялся посредством экспериментального исследования свойств ее компонентов при измерении содержания цефуроксима.
Выполнение мембраны с использованием в качестве электродно-активного соединения (ЭАС) сочетания цефуроксима с диметилдистеариламмонием обеспечивает универсальность электрода, который может быть использован для определения не одного вида, а всей группы цефалоспориновых антибиотиков. Выбор в качестве индикатора именно цефуроксима, а не любого другого цефалоспоринового антибиотика обусловлен тем, что только цефуроксим вводится как внутримышечно, так и перорально, то есть его возможно использовать для определения антибиотиков и в ротовой полости, избегая инъекций и лишней травматичности.
Сочетание цефуроксима с диметилдистеариламмонием препятствует вымыванию цефуроксима и обеспечивает устойчивость всего соединения, его малую растворимость, что подтверждают экспериментальные исследования и сравнение свойств анионообменников с другими солями тетраалкиламмония (см. Таблицу 1).
Таблица 1
ЭАС
K<sub>s</sub>
Линейность, М
Предел обнаружения, М
Угловой коэффициент
Цефуроксим + диметилдистеариламмоний
(3,5±0,4)·10<sup>-8</sup>
1·10<sup>-4</sup>-1·10<sup>-1</sup>
4,8·10<sup>-5</sup>
54-55
Цефуроксим + бензилдиметилтетрадециламмоний
(4,6±0,4)·10<sup>-5</sup>
1·10<sup>-3</sup>-1·10<sup>-1</sup>
6,9·10<sup>-4</sup>
51
Цефуроксим + бензилдиметилдодециламмоний
(1,44±0,2)·10<sup>-4</sup>
1·10<sup>-2</sup>-1·10<sup>-1</sup>
6,3·10<sup>-3</sup>
47
Где K<sub>s</sub> - произведение растворимости анионообменников.
В результате проведенных экспериментов и изучения свойств компонентов ЭАС сделан вывод о том, что при использовании, например, в качестве ЭАС бензилдиметилтерадециламмония результаты гораздо хуже как по произведению растворимости, так и по пределу обнаружения.
Примеры выполнения мембраны с различной концентрацией ЭАС:
ЭАС с=2,75%.
-2
-2
В делительную воронку помещали 2 мл раствора Cefur C=1,5·10 М и 4 мл диметилдистеариламмония (DMDSA) С=10. Смесь встряхивали в течение 2-х часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс и испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60°С с целью избежания разложения электродно-активного вещества.
Затем изготавливали мембрану с электродно-активным веществом по следующей технологии.
В бюкс емкостью 10 мл помещали 0,7966 г или 72,94% дибутилфталата, 2 мл циклогексанона и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при небольшом нагревании 50-60°С добавляли 0,03 г или 2,75% соединения цефалоспорин-диметилдистераиламмония и 0,2655 г или 24,31% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 67 см и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона (масса мембраны 1,0921 г)
Дибутилфталат
72,94%
Поливинилхлорид
24,31%
ЭАС
2,75%
ЭАС с=3,63%.
-2
-2
-2
В делительную воронку помещали 4 мл 1,5·10 М раствора цефуроксима и 8 мл 10 М диметилдистеариламмония (DMDSA) С=10 М. Смесь встряхивали в течение двух часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс, испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60°С.
Затем изготавливали мембрану с электродно-активным соединением (ЭАС) по следующей технологии:
В бюкс емкостью 10 мл помещали 0,7966 г. или 72,28% дибутилфталата, 2 мл циклогексанона и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при небольшом нагревании 50-60°С добавляли 0,04 г или 3,63% соединения цефалоспорин-диметилдистеариламмоний и 0,2655 г или 24,09% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 67 мм и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона. (Масса мембраны 1,1021 г).
Дибутилфталат
72,28%
Поливинилхлорид
24,09%
ЭАС
3,63%.
ЭАС с=4,5%:
-2
-2
В делительную воронку помещали 4 мл раствора Cefur C=1,5·10 M и 8 мл DMDSA С=10 М. Смесь встряхивали в течение 2-х часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс и испаряли хлороформ на водяной бане при температуре 50-60°C с целью избежания разложения электродно-активного вещества.
Затем изготавливали мембрану с электродно-активным веществом по следующей технологии.
В бюкс емкостью 10 мл помещали 0,7966 г или 71,63% дибутилфталата, 2 мл циклогексанона и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при небольшом нагревании 50-60°C добавляли 0,05 г или 4,5% соединения цефалоспорин-диметилдистеариламмоний и 0,2655 г или 23,87% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 67 см и оставляли на воздухе до полного удаления циклогексанона (масса мембраны 1,1221).
Дибутилфталат
71,63%
Поливинилхлорид
23,87%
ЭАС
4,5%
-1
-3
-3
Полученную мембранную композицию использовали для изготовления жидкоконтактных электродов: вырезали диски диаметром 7 мм и приклеивали их к зачищенному и отполированному поливинилхлоридному корпусу клеем, содержащим 0,5 г поливинилхлорида, 0,25 г дибутилфталата и 5 мл циклогексанона. После высыхания клея внутрь трубки заливали 1 мл стандартного 1·10 М раствора хлорида натрия и 1 мл 1·10 М раствора соответствующего антибиотика (соотношение по объему 1:1). Изготовленные таким образом электроды кондиционировали в течение суток в 1·10 М растворе соответствующего антибиотика.
При ионометрическом измерении концентрации антибиотиков цефалоспориновой группы используют индикаторный электрод, который размещают в растворе антибиотика, затем калибруют путем измерения электродных потенциалов (ЭДС) электрохимической цепи, составленной из индикаторного ИСЭ и стандартного хлоридсеребряного электрода по растворам антибиотика с известной концентрацией (стандартного), например цефуроксима.
Измеряли зависимость величины ЭДС от концентрации растворов цефалоспоринов при pH 6-7.
На Фиг.2 представлен график зависимости ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефалоспоринов (pC): 1 - цефазолин, 2 - цефуроксим, 3 - цефтриаксон, 4 - цефалексин) ЭАС цефуроксим-диметилдистеариламмоний (Cefur - DMDSA).
-1
-4
-5
При этом анионные функции выполняются в интервале концентраций цефалоспоринов 1*10-1*10 (1*10) М с угловыми коэффициентами 59±2 мВ/pC для цефазолина, цефалексина, цефуроксима, цефотаксима, цефиксима и 29±3 мВ/pC для цефтриаксона (динатриевая соль, содержащая двухзарядный анион). Эти показатели свидетельствуют, что электрод реагирует на цефалоспориновые антибиотики в соответствии с уравнением Нернста, лежащего в основе потенциометрического метода.
Чувствительность (селективность) электрода к цефалоспориновым антибиотикам и неорганическим анионам, входящим в состав биологических сред (жидкость ротовой полости, плазма крови), поясняется Таблицей 2, в которой представлены коэффициенты потенциометрической селективности: основной ион - цефуроксим, мешающие ионы - цефазолин (Cef), цефалексин (Cefl), неорганические ионы. ЭАС Cefur - DMDSA.
Таблица 2
Мешающий ион
К<sub>сел</sub>
Cl<sup>-</sup>
(6.61±0.25)·10<sup>-2</sup>
Br<sup>-</sup>
(8.92±0.10)10<sup>-2</sup>
НСО<sub>3</sub>
(6.31±0.15)10<sup>-2</sup>
Н<sub>2</sub>РО<sub>4</sub> <sup>-</sup>
(7.94±0.21)10<sup>-2</sup>
НРО<sub>4</sub> <sup>2-</sup>
(6.31±0.20)10<sup>-2</sup>
J<sup>-</sup>
(8.32±0.15)10<sup>-2</sup>
Cef
(1.78±0.10) 10<sup>-1</sup>
Cefl
(6.63±0.20) 10<sup>-1</sup>
Данные Таблицы 2 свидетельствуют о возможности применения электрода на основе выбранного ЭАС для определения цефалоспориновых антибиотиков в биологических средах.
Пример применения электрода с заявляемой мембраной в лекарственных средах
Наиболее показателен пример определения цефалоспориновых антибиотиков на примере определения цефиксима в суспензиях с целью установления срока его годности.
Для определения цефиксима, который используется в виде суспензии при лечении детей, также использвали электрод с ЭАС цефуроксим + диметилдистеариламмоний.
-2
-3
-5
-2
Навеску массой 2,835 г сухого цефиксима растворяли в мерной колбе объемом 25 мл (концентрация антибиотика 1·10 М). Растворы 1·10-1·10 М готовили из 1·10 М раствора последовательным разбавлением в мерных колбах вместимостью 25 мл. Проводили измерение ЭДС с индикаторным и хлоридсеребряным электродами.
На Фиг.3 представлена зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефиксима (pC).
Определение цефиксима в суспензии (СУПРАКС). Для приготовления трех проб различной концентрации отбирали 1; 1,5 и 2 мл суспензии и растворяли в мерных колбах вместимостью 25 мл. Проводили измерение ЭДС с индикаторным и хлоридсеребряным электродами и по зависимости ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефиксима (pC) определяли концентрацию цефиксима в суспензии. Расчет содержания цефиксима в суспензии проводили по формуле:
m=C·M,
x
где C - концентрация цефиксима, найденная по градуировочному графику, М;
ал
V - объем аликвоты, мл;
М - молярная масса цефиксима, 453,5 г/моль;
m - рассчитанная масса цефиксима, г.
Таким образом, применение в качестве ЭАС цефуроксим + диметилдистеариламмония позволяет определять основное вещество в лекарственных препаратах СУПРАКС, используемых в виде суспензии, что особенно важно из-за ограниченного срока хранения суспензии.
Пример применения электрода с заявляемой мембраной в жидкости ротовой полости
Выбор оптимального состава мембраны осуществлялся посредством экспериментального исследования свойств ее компонентов при измерении содержания цефуроксима в жидкости ротовой полости (ЖРП) больных с инфекционно-соматической патологией.
-2
-3
-5
При использовании электродов для определения цефуроксима в ЖРП индикаторный электрод предварительно кондиционировали в ЖРП практически здорового человека в течение 20-30 мин. Для приготовления 10 М раствора цефуроксима навеску 0,193 г растворяли в дистиллированной воде в мерной колбе на 25 мл. Последовательным разбавлением готовили растворы 10-10 М, отбирали 0,3 мл водных растворов цефуроксима и до 3 мл разбавляли ЖРП, перемешивали и измеряли ЭДС с индикаторным и хлоридсеребряным электродами.
-5
-4
-3
-4
-3
-2
Пробу ЖРП практически здоровых лиц отбирали спустя 1-2 часа после приема пищи, перед сбором ротовую полость ополаскивали водой. Смешанную слюну центрифугировали в течение 15 мин при 3500 об/мин. Для приготовления серии растворов антибиотиков V=3 мл на фоне ЖРП с внесенными добавками антибиотиков концентрации 5·10, 1·10, 1·10 М (с учетом разбавления) отбирали 2,7 мл надосадочной жидкости, переносили в стаканчики для измерения и добавляли по 0,3 мл раствора соответствующего антибиотика с концентрацией 5·10, 1·10, 1·10 М (внесенные добавки), перемешивали и проводили измерения ЭДС.
С учетом разбавления строили график зависимости ЭДС, мВ, от отрицательного логарифма концентрации антибиотика.
-3
-4
-5
Интервал линейности электродной функции составил: 10-10 М, а предел обнаружения цефуроксима 5·10 М. Полученные градуировочные характеристики являются воспроизводимыми и увеличение времени кондиционирования не влияет на них.
Установлено уменьшение интервала линейности и углового коэффициента электродной функции в ЖРП вследствие высокой ионной силы раствора и «белкового отравления» поверхности мембран. Зависимость ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефуроксима (pC) для смешанной слюны представлена на Фиг.4.
Аналогичным образом готовили жидкость ротовой полости больных с инфекционно-соматической патологией и по графику зависимости ЭДС (мВ) от отрицательного логарифма концентрации цефуроксима (pC) определяли концентрацию антибиотика. Расчет содержания цефуроксима в ЖРП проводили по следующей формуле:
x
C=C·M·1000,
где Сх - концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, М;
М - молярная масса антибиотика, 453,5 г/моль.
С учетом сложности анализируемых объектов и самого определяемого вещества достоверность полученных результатов при выборе оптимального состава мембраны оценивалась следующим образом. В пробу ЖРП здорового человека вводили определенную добавку стандартного раствора цефуроксима и далее пробу проводили через все операции пробоподготовки. Относительная погрешность определения не превышала 4-6%.
Заключительный вывод
3
2
4
4
Полученные значения коэффициентов потенциометрической селективности позволили сделать прогноз о возможности применения разработанных ионоселективных электродов на основе ионного ассоциата цефуроксим-диметилдистеариламмоний для определения цефуроксима, цефазолина, цефтриаксона, цефалексина, цефиксима в лекарственных формах и биологических жидкостях при высоких концентрациях ионов Cl, HCO, Br, HHO, НРО.
-8
Полученная мембрана ИСЭ благодаря изученным в результате проведенных экспериментов свойствам выбранных компонентов ЭАС характеризуется низкой растворимостью ЭАС (произведение растворимости равно 3,5+0,4)10). Это имеет большое значение, так как чем ниже растворимость ЭАС, тем выше чувствительность электрода.
-4
-1
-5
Полученная мембрана обеспечивает широкий диапазон определяемых содержаний антибиотика, а именно 10-10 М. При этом выявленные в результате проведенных экспериментов высокие свойства используемого в мембране ЭАС обеспечивают низкий предел обнаружения антибиотика, а именно 4,8×10 М. Это позволяет использовать электрод для анализа антибиотика не только в лекарственных препаратах, где концентрация антибиотика высокая, но и в биологических средах (в том числе для изучения фармакокинетики цефалоспоринов), где концентрация антибиотика предельно низкая.
В результате угловой коэффициент электродных функций в растворах цефуроксима составляет 54-55 мВ/pc.
Таким образом, полученная мембрана ИСЭ расширяет функциональные возможности экспрессного определения антибиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях за счет расширения спектра исследуемых объектов - цефалоспориновых антибиотиков. Полученная мембрана обеспечивает экспрессность, возможность определения активной концентрации антибиотиков в широком концентрационном интервале и дает возможность определения любого вида антибиотиков цефалоспориновой группы у больных с инфекционно-соматической патологией.
Благодаря устойчивости полученного ЭАС обеспечивается широкий интервал линейности функций и низкий предел обнаружения антибиотиков.