ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У НАСЕКОМЫХ К БИТОКСИБАЦИЛЛИНУ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗЫ СЕЛЕКТАНТА

УДК 632.95.025.8

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У НАСЕКОМЫХ К БИТОКСИБАЦИЛЛИНУ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗЫ СЕЛЕКТАНТА

М.П. Соколянская

Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа

Исследовали скорость формирования резистентности на личинках комнатной мухи к микробиологическому препарату битоксибациллину при трех режимах селекции, а также роль ферментов в формировании резистентности. Выявлено, что быстрее всего резистентность формировалась при дробной селекции препаратом. Основную роль в формировании этой резистентности играли протеазы, значительно меньшую -неспецифические эстеразы.

Ключевые слова: комнатная муха, резистентность, Bacillus thuringiensis, битоксибациллин, протеазы, неспецифические эстеразы, глутатион-Б-трансферазы.

Современное сельское хозяйство использует широкий спектр инсектицидов для борьбы с насекомыми-вредителями. Большинство из них являются химически синтезированными. Неразумное и неизбирательное применение инсектицидов привело к лавинообразному накоплению проблем, таких как развитие резистентности, повышение накладных расходов, уничтожение паразитов, хищников и других полезных насекомых, накопление пестицидов в растительных продуктах и окружающей среде. Поэтому использование различных экологически чистых биологических агентов становится важным компонентом интегрированной борьбы с вредителями. Из многих биологических средств борьбы хорошо зарекомендовали себя микробиологические препараты. Они не оказывают заметного отрицательного действия на полезную энтомофауну и эффективно уничтожают личинок младших возрастов чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых, паутинного клеща. Препараты малоопасны не только для окружающей среды, но и для человека, поэтому их можно применять за 3 -5 дней до уборки урожая. Основная масса микробиологических препаратов создана на основе грамположительных спорообразующих бактерий Bacillus thuringiensis. Эти бактерии обитают в верхнем слое почвы и на поверхности растений и их легко и сравнительно недорого можно культивировать в промышленных условиях. Характерной особенностью бактерий B. thuringiensis является их способность продуцировать специфические кристалловидные токсины, обладающие высокой энтомоцидной

Методика

Исследования проводились на личинках III возраста комнатной мухи Musca domestica (L.). Селекцию препара-

активностью. Кристаллы имеют ромбовидную форму, обнаруживаются внутри клеток в процессе споруляции с помощью обычной микроскопии живых препаратов бактерий и их часто именуют как параспоральные включения, или дельта-эндотоксины. Кроме кристалловидных токсинов, бактерии некоторых разновидностей В. thuringiensis выделяют в среду растворимые в воде энтомоцидные вещества, из которых наибольший интерес представляет термостабильный бета-экзотоксин. Он является сравнительно низкомолекулярным соединением нуклеотидной природы. Оба эти вида токсинов, а также споры бактерии составляют основу препарата битокси-бациллин (БТБ).

Наличие кристаллического белка в биток-сибациллине обусловливает его кишечный характер действия. Препарат, попадая в организм насекомого, вызывает нарушение функции кишечника, в результате чего сокращается объем питания, бета-экзотоксин подавляет синтез РНК в клетках насекомых. Массовая гибель вредителей наступает на 3-7 сутки. В сублетальных дозах битоксибациллин инги-бирует питание, нарушает сроки метаморфоза, снижает плодовитость самок и жизнеспособность следующих поколений, то есть обладает антифидантным и метатоксическим эффектами (Биол. препараты для защиты растений..., 2009) .

Цель данной работы - изучение скорости формирования резистентности комнатной мухи к БТБ при разных дозах селектанта, а также роли гидролитических ферментов в этом процессе.

исследований

том проводили путем добавления его в корм - пшеничные отруби. Селекция проводилась тремя способами: 1) обыч-

ным - когда обработка проводится максимально возможными концентрациями препарата, которые позволяют получить достаточное для дальнейших исследований потомство (в данном исследовании это ЭК50.60); 2) только малыми летальными концентрациями на уровне ЭК10, и 3) дробной селекцией: 4 поколения обрабатывались концентрациями препарата на уровне ЭК10, а затем отсекающей концентрацией, в 10 раз превышающей малую летальную концентрацию. В каждом 5-м поколении проверялось изменение чувствительности насекомого к препарату и активности гидролитических ферментов при этих способах селекции. Стаканчики содержали при 25°С, учет проводили после вылета имаго. Критерием чувствительности личинок мух к препаратам служила эффективная концентрация, приводящая к гибели 50% особей (ЭК50,%), которую рассчитывали покомпьютерной программе (Соколян-ская, 2007) на основе пробит-анализа (Беленький, 1990). Степень приобретенной устойчивости личинок комнатной

Вестник защиты растений. 1, 2014 мухи характеризовали показателем резистентности (ПР), который представляет собой отношение ЭК50 устойчивой линии к ЭК50 чувствительной линии (Методич. указания, 1990).

В биохимических исследованиях использовались го-могенаты целых личинок комнатной мухи. Активность неспецифических эстераз определяли по скорости гидролиза а-нафтилацетата (Van Asperen, 1962). Активность протеиназ оценивали по скорости гидролиза бензои-ларгининпиридиннуклеозида (Yoshida, Ashida, 1986). Активность глутатион^-трансфераз определяли по методу Habig (1974). Концентрацию белка определяли по Lowry (1951). Статистический анализ полученных данных проводили с использованием среднеарифметического значения и ошибки среднего, достоверность различия средних значений опре-деляли по параметрическому критерию - t-критерию Стъюдента (Лакин, 1990).

Результаты исследований У личинок комнатных мух, селектированных БТБ на уровне ЭК50_бо (линия R-БТБ6o), на протяжении 20 поколений происходило незначительное формирование резистентности к селектанту (рис. 1), оставаясь в рамках толерантности, обеспечиваемой, скорее всего, механизмами неспецифической устойчивости.

Активность протеиназ у личинок комнатной мухи при обычной селекции увеличилась незначительно (рис. 2).

F5 F10 F15 F 20

Рис. 1. Формирование резистентности у личинок комнатной мухи при разных

Протеиназы

способах селекции, F- поколения Неспецифические эстеразы

Рис. 2. Изменение активности гидролитических ферментов при трех режимах селекции

Слева на право Я-БТБ60, Я-БТБ10, Я-БТБ60др

Наибольшую активность эти ферменты проявили в линии, подвергнувшейся дробной селекции, проявившей и большую скорость формирования резистентности. Активность неспецифических эстераз повысилась на протяжении селекции во всех селектированных линиях, но в большей степени - в линиях R-БТБ60 и R-БТБl0. Активность глутатион^-трансфераз увеличилась в меньшей степени, чем активность протеиназ и эстераз, причем активность у личинок линии R-БТБl0 была несколько выше, чем у линии R-БТБдр (рис. 3).

При селекции малыми летальными концентрациями резистентность у личинок комнатной мухи (линия R-БТБ10) на начальных этапах формировалась медленно, как и в случае селекции концентрациями на уровне ЭК50-60, но в 15-м поколении произошел резкий скачок - до ПР=25, в 20-м поколении до ПР=29. При дробной селекции резистентность на начальных этапах формировалась намного быстрее (линия), а затем ее скорость замедлилась, но, тем не менее, ПР в 15-м и 20-м поколениях превышал значение такового у линии R-БТБl0.

Рис. 3. Изменение активности глютатион^-трансфераз при двух режимах селекции Слева R-БТБ10, справа R-БТБдр

Несмотря на многолетнее использование препаратов B. thuringiensis в полевых условиях довольно длительное время к ним не было обнаружено устойчивости. В ХХ в. только у одного вида, капустной моли Plutella xylostella (L.), развилась устойчивость впервые на Гавайях (Tabashnik et al., 1990) и на Филиппинах (Ferre et al., 1991), и, позднее, во Флориде, Японии, Малайзии, Таиланде (Tabashnik, 1994). В начале ХХ! в. была зафиксирована резистентность у совки ни Trichoplusia ni (Hübner) (Janmaat and Myers, 2003). Кроме этого, отмечены случаи устойчивости и к токсинам трансгенных растений у трех видов насекомых: кукурузной листовой совки Spodoptera frugiperda (J.E.Smith) в Пуэрто Ри-ко (US EPA, 2007), стеблевой кукурузной огневки Busseola fusca (Fuller) в Южной Африке (van Rensburg, 2007), выемчатокрылки хлопковой Pectinophora gossypiella (Saunders) в Индии (Tabashnik and Carrière, 2o1o; Dhurua and Gujar, 2011). В отличие от этого, при искусственном отборе в лаборатории был создан ряд устойчивых линий у многих видов: Plodia interpunctella (Hübner) (McGaughey, 1985), Heliothis virescens (Fabricius) (Gould et al., 1992), Leptinotarsa decemlineata (Say) (Whalon et al., 1993). В лабораторных экспериментах по изучению формирования резистентности используются различные препараты на основе B. thuringiensis: очищенные дельта-эндотоксины, их сочетания, споры бактерий, споро-кристаллические смеси, препараты на основе разных штаммов бактерии. В более чем 50 лабораторных экспериментах, проведенных в разных странах, были зафиксированы показатели резистентности от 1.1 до >1000. Значительные уровни резистентности были зафиксированы у девяти видов Lepidoptera, у двух видов Diptera (комары) и двух Coleoptera (Ferre, Van Rie,

2002).

Впервые значительную устойчивость в лабораторных условиях удалось получить у P. interpunctella при селекции дипелом (коммерческим препаратом на основе B. thuringiensis var. kurstaki) - ПР=100 за 15 поколений, а через три года довести ее до ПР=250 (McGaughey, 1985,1988). При селекции в лаборатории насекомых, взятых из устойчивых природных популяций, резистентность формируется еще быстрее. Например, у капустной моли, собранной в поле и обладающей 30-кратной устойчивостью к дипелу, удалось выработать 1000-кратную резистентность к препарату последующей селекцией в лабораторных условиях (Tabashnik et al., 1991). Наши результаты ближе к таковым, полученным U.Estada and J.Ferre (1994). У совки T. ni, подвергнутой в лаборатории селекции эндотоксином CryIA(b) в течение семи поколений, резистентность увеличилась в 31 раз за семь поколений.

В природных условиях постоянно происходит миграция насекомых, поэтому существует приток чувствительных особей на обработанные территории, что «размывает» гены устойчивости в популяции. В лаборатории такого явления не происходит, и степень формирующейся устойчивости зависит от гетерогенности лабораторной популяции, вида инсектицида, селекционного давления. В наших исследованиях ниже всего показатель резистентности был у линии, подвергшейся обычной селекции. Аналогичный эффект наблюдался и в более ранних исследованиях: при селекции в течение 30 поколений личинок комнатной мухи хлорфлуазуроном на уровне ЭК40-50 резистентность фактически не развивалась (ПР=1.55) (Соколянская, 2007). В данных случаях происходит простой отбор особей, имеющих устойчивость к препаратам. Невысокий уровень ПР говорит о том, что таких особей в исходной линии было мало. Кроме того, возможными причинами слабого формирования резистентности могли быть недостаточно высокая концентрация селектанта и пониженная, по сравнению с чувствительной линией, плодовитость имаго этих линий, снижающая генетическое разнообразие поколений. При селекции малыми летальными кон-

центрациями, видимо, происходят изменения в геноме, позволяющие особям повысить жизнеспособность организма, но отбора таких особей не происходит, поэтому на начальных этапах селекции показатель резистентности невысокий. Возрастание его при дальнейшей селекции, возможно, связано с иммунизационными процессами. Показано, что при действии сублетальных и невысоких концентраций различных микроорганизмов в их инактивацию включаются гемоциты насекомых, активизируется гуморальная система, синтезируются антибактериальные белки (Глупов, 2004). Кроме того, линия R-БТБщ как и R-БТБдр, отличались повышенной плодовитостью, что могло способствовать большему генетическому разнообразию поколений этих линий за счет спонтанных мутаций. При дробной селекции сочетание иммунизации насекомых с отбором приводит к большей скорости формирования устойчивости.

Так как основным действующим веществом битоксибациллина, как и многих других микробиологических препаратов, являются эндотоксины белковой природы, многие исследователи в качестве одного из механизмов резистентности изучают активность протеоли-тических ферментов. При этом было показано, что активность этих ферментов у резистентных насекомых может быть как снижена (Ferre et al., 1995), так и повышена (Loseva et al., 2002; Wagner et al., 2002), либо их активность одинакова у чувствительных и резистентных особей (Wagner et al., 2002).

В наших исследованиях на начальных этапах формирования резистентности активность протеиназ при всех режимах селекции коррелировала с ПР, но при дальнейшей селекции корреляция наблюдалась в линии, подвергшейся дробной селекции. Это позволяет сделать вывод о том, что при дробной селекции формируется специфическая резистентность,

Вестник защиты растений, 1, 2014 и она обусловлена в первую очередь повышением активности протеиназ.

Активность неспецифических эстераз возрастала при всех способах селекции, но корреляция с возрастанием ПР наблюдалась при селекции малой летальной концентрацией. Активность глутатион^-трансфераз также в большей степени увеличивалась в линии, подвергшейся обработке малой летальной концентрацией. Следовательно, в данном случае формируется неспецифическая устойчивость к препарату, что подтверждается большей устойчивостью личинок этих мух к экстремальной температуре:

Линии Температура, °C F0 (S), % F20, %

R-БТБ60 66.0

R-БТБш 60 100 91.7

R-БТБдр 100

R-БТБ60 35.4

R-БТБш 0 47 33

R-БТБдр 45

Таким образом, быстрее всего резистентность формируется при дробной селекции би-токсибациллином. Основную роль в формировании этой резистентности играют протеиназы, значительно меньшую - неспецифические эстера-зы. Последние активизируются в большей степени при воздействии высоких концентраций инсектицида, но обусловливают невысокий уровень неспецифической устойчивости.

Хотя лабораторные исследования по формированию резистентности у различных видов насекомых не всегда отражают темпы устойчивости, проявляющиеся в полевых условиях, лабораторные популяции позволяют изучать потенциальный риск возникновения резистентности, физиологические и поведенческие механизмы устойчивости, ее генетику, стабильность, перекрестную резистентность и, в конечном счете, использовать полученные данные для развития методов мониторинга, управления и преодоления резистентности.

Литература

Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта Л., Медгиз, 1963, с. 67.

Биологические препараты для защиты растений от насекомых-вредителей и болезней. Регуляторы роста. Новосибирск, Сиббиофарм, 2009, 8 ^

Глупов В.В. Основные механизмы конституционального иммунитета насекомых // Автореф. докт. дисс. Новосибирск, 2004, 40 ^

Лакин Г.Ф. Биометрия. М., Высшая школа, 1990, 352 с.

Методические указания. Определение резистентности вредителей с.-х. культур и зоофагов к пестицидам. М., ВАСХНИЛ, 1990, 9 c.

Соколянская М.П. Токсикологическая и биохимическая характеристика процесса формирования резистентности у комнатной мухи (Мшса domestica L.) к современным инсектицидам. Автореф. канд дисс. СПб, ВИЗР, 2007, 21 с.

Dhurua S., Gujar G.T. Field-evolved resistance to Bt toxin CrylAc in pink bollworm, Pectinophora gossypiella (Saunders) (Lepidoptera: Gelechiidae) from India // Pest Manag. Science, 2011, 67, 8, p. 898-903.

Estada U., Ferre J. Binding of insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis to the midgut brush border of the cabbage looper, Trichoplusia ni, (Hbner) (Lepidoptera: Noctuidae) and the selection for resistance to one of the crystal proteins // Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, p.3840 -3846.

Ferre J., Eacriche B., Bel Y., Van Rie J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis insecti-cidal crystal proteins // FEMS Microbiol. Lett., 1995, 132, p. 1-7.

Ferre J., Real M. D., Van Rie J., Jansens S., Peferoen M. Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in a field population of Plutella xylostella is due to a change in a midgut membrane receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1991, 88, p. 5119-5123.

Ferre J., Van Rie J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis // Annu. Rev. Entomol., 2002, 47, p. 501-533.

Habig W.H., Pabst H.J., Jacoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first engymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem., 1974, 249, 22, p.7130-7139.

Gould F., Martinez-Ramirez A., Anderson A., Ferre J., Silva F.J., Moar W.J. Broad-spectrum resistance to Bacillus thuringiensis toxins in Heliothis virescens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, 89, p. 7986-7990.

Janmaat A.F., Myers J.H. Rapid evolution and the cost of resistance to Bacillus thuringiensis in greenhouse populations of cabbage loopers, Trichoplusia ni // Proc. R. Soc. Lond., 2003, p. 2263-2270.

Loseva O., Ibrahim M., Candas M., Koller C.N., Bauer L.S., Bulla L.A. Changes in protease activity and Cry3Aa toxin binding in the Colorado potato beetle: implications for insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins // Insect Biochem. Molec. Biol., 2002, 32, p. 567-577.

Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Falin-phenol reagent // J. Biol. Chem., 1951, 193, p. 265.

McGaughey W.H. Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuyingiensis // Science, 1985, 229, p. 193-195.

McGaughey W.H., Beeman R.W. Resistance to Bacillus thuringiensis in colonies of Indianmeal moth and almond moth (Lepidoptera: Pyralidae) // J. Econ. Entomol., 1988, 81, c. 28-33.

Tabashnik B.E., Carrière Y. Field-evolved resistance to Bt cotton: bollworm in the U.S. and pink bollworm in India // Southwest. Entomologist., 2010, 35, p. 417-424.

Tabashnik B.E., Finson N., Johnson M.W. Managing resistance to Bacillus thuringiensis: lessons from the diamondback moth (Lepi-doptera: Plutellidae) // J. Econ. Entomol., 1991, 84, p. 49-55.

Tabashnik B.E. Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis // Annu. Rev. Entomol., 1994, 39, c. 47-79.

Tabashnik B.E., Cushing N.L., Finson N., Johnson M.W. Field development of resistance to Bacillus thuringiensis in diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) // J. Econ. Entomol., 1990, 83, p. 1671-1676.

US EPA (US Environmental Protection Agency). TC1507 maize and fall armyworm in Puerto Rico, MRID 47176001. USEPA, Washington, DC., 2007.

Van Asperen K. A study of housefly esterases by means of a sensetive calorimetric method // J. Insect. Physiol., 1962, 8, p. 401-416.

Van Rensburg, J.B.J. First report of field resistance by the stem borer, Busseola fusca (Fuller) to Bt-resistance maize // South African J. Plant Soil., 2007, 24, p. 147-151.

Wagner W., Mohrlen F., Schnetter W. Characterization of the proteolytic enzymes in the midgut of the European Cockchafer, Melolontha melolontha (Coleoptera: Scarabaidae) // Ins. Biochem. Molec. Biol., 2002, 32, p. 803-814.

Whalon M.E., Miller R., Hollingworth M., Grafius E.J, Miller J.R. Selection of a Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) strain resistant to Bacillus thuringiensis // J. Econ. Entomol., 1993, 86, p. 226-233.

Yoshida H., Ashida M. Microbial activation of two serine enzymes and prophenoloxidase in the plasma fraction of hemolymph of the silkworm, Bombyx mori // Insect Biochem., 1986, 3, p. 539-545.

PECULIARITIES OF THE FORMATION OF THE RESISTANCE IN INSECTS TO BITOXIBACILLIN DEPENDING ON THE DOSE OF SELECTANT M.P. Sokolyan skaya

The rate of formation of resistance in the house fly larvae to microbial drug bitoxibacillin with three modes of selection, and the role of enzymes in the development of resistance was investigated. It has been revealed that resistance is formed the fastest by the fractional drug selection. Proteases play the main role in the formation of this resistance, non-specific esterases do much less.

Keywords: housefly, resistance, Bacillus thuringiensis, bitoxibacillin, proteases, nonspecific esterases, glu-tathione-S-transferases.

M.n.CoKo^flHCKaa, K.6.H., sokolyanskaya-m@yandex.ru