ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ Legionella pneumophila
NUTRIENT MEDIUM FOR DETERMINING ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY OF Legionella pneumophila

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к получению плотной питательной среды, с помощью которой возможно определение антибиотикочувствительности культур возбудителя легионелеза - Legionella pneumophila.
Общепринятой средой для определения антибиотикочувствительности подавляющего большинства патогенных бактериальных видов является среда Мюллер-Хинтона (The Oxoid Manual, 1976, p.193), содержащая, г/л:. агар Дифко - 10; настой из говяжьего мяса - 300; гидролизат казеина - 17,5; крахмал растворимый - 1,5; дистиллированную воду до 1 л при pH 7,4.
Однако легионеллы на данной среде, в силу особенностей своего метаболизма, даже при введении различных добавок растут плохо, поэтому среда Мюллер-Хинтона для изучения антибиотикочувствительности легионелл не применяется.
За прототип выбрана питательная среда для выращивания и выделения легионелл среда ВСУЕАά (см. WHO. Legionella and prevention of legionellesis. WC 200. WHO. 2007), которая имеет следующий состав, г/л: дрожжевой экстракт - 10,0; агар Дифко 13,0; уголь Норит N - 2,0; ACES - 10; альфа-кетоглютаровая кислота - 1,0; L-цистеин - 0,4; пирофосфат железа - 0,25; глицин - 3,0; циклогексимид - 80,0-100,0 мг/л; ванкомицин - 1,0 мг/л; полимиксин В 80-100 тыс. ЕД/л; дистилированная вода до 1 л при pH 7,1.
Недостатком прототипа является то, что легионеллы весьма чувствительны к перекисным соединениям и рост единичных вирулентных клеток возбудителя на данной среде возможен только при наличии в среде высокоактивного адсорбента, блокирующего действие свободных радикалов, - активированого угля, приготовленного по специальной технологии.
Однако уголь сильно адсорбирует многие антибиотики, используемые в настоящее время, например такие как офлоксацин, ципрофлоксацин, рифампицин, клиндамицин и др. (см. статью К. Nilsen, J.V. Bangsborg, N. Hoiby Susceptibility of Legionella to five antibiotics and development of resistance by exposure to erythromycin, ciprofloxacin and rifampicin. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 36 (2000), 43-48).
Следовательно, по этой причине результаты, характеризующие антибиотикочувствительностьность культур легионелл, получаемые на данной среде, недостоверны, так как показатели ингибиции легионелл в большинстве случаев искусственно занижены.
Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в создании новой питательной среды с высокой степенью точности в определении антибиотикочувствительноти Legionella pneumophila.
Поставленная задача достигается тем, что в питательную среду для определения антибиотикочувствительности Legionella pneumophila, включающую агар микробиологический и L-цистеин, дополнительно введены ЭДТА железо(III) натриевая соль, стимуляторы роста - калия фосфат однозамещенный и калия фосфат двузамещенный, а в качестве осмопротекторов - мезоинозит и калия глюконат, при этом в качестве питательной основы в среде использованы ферментоаутолизат селезенки крупного рогатого скота и пищевой желатин, при следующем соотношении компонентов, г/л:
Ферментоаутолизат селезенки КРС
6-8,0
Агар микробиологический
14,0-16,0
Калия фосфат однозамещенный
1,5-1,7
Калия фосфат двузамещенный
3,3-3,6
Калия глюконат
2,4-2,6 г
Крахмал растворимый
2,4-2,6
Желатин
2,4-2,6
Мезоинозит
2,4-2,6
L-цистеин
0,3-0,5
ЭДТА железо (III) натриевая соль
0,026 -0,028
Тушь высококачественная
4-6 мл
Дистиллированная вода
при pH 7,1 до
1 л
2
4
2
4
Питательную среду готовят следующим образом. Исходные материалы для предлагаемой среды (обозначенной Б-2): агар микробиологический 14,0-16,0; L-цистеин 0,3-0,5 и крахмал растворимый 2,4-2,6; в качестве ростовой основы берут ферментоаутолизат селезенки крупного рогатого скота 6,0-8,0 и желатин пищевой 2,4-2,6; в качестве буфера используют смесь фосфатных солей: калия фосфат однозамещенный (KHPO) 1,5-1,7 и калия фосфат двузамещенный (KHPO) 3,3-3,6. Осмопротекторами выбраны мезоинозит 2,4-2,6 и калия глюконат 2,4-2,6, а в качестве источника железа используют комплекс ЭДТА железо(III) натриевая соль 0,026-0,028. Для придания среде темного оттенка, на котором четче визуализируются зоны ингибиции растущей культуры легионелл, используют высококачественную мелкодисперсную стерильную тушь 4-6 мл.
Все вышеуказанные компоненты, кроме L-цистеина и ЭДТА железо(III)натриевой соли, вносят в емкость и добавляют до 1 литра холодной дистиллированной воды. Смесь подогревают в паровом стерилизаторе и кипятят в течение 30 минут при 100°C при тщательном перемешивании. Затем жидкость автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 мин. В результате получают основу, которая хранится при температуре (2-8)°C в холодильнике в течение 2-х лет.
При необходимости приготовления рабочей среды основу растапливают и в нее вводят нужное количество остальных двух добавок: L-цистеина и ЭДТА железо(III) натриевая соль. Среду в растопленном состоянии (45°C) разливают в пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм в объеме 30 мл и с толщиной слоя 0,7 см. Чашки хранят в герметичном пакете при температуре холодильника в течение 1-2 мес.
Основные биологические показатели предлагаемой среды Б-2 определяют в сравнении с наилучшей для выращивания легионелл средой BCYEAά. Вначале характеризуют ее чувствительность, время прорастания колоний легионелл, а также эффективность среды (величину выросших колоний и степень развития газона культуры) - примеры 1, 2, 3, 4 и 5.
После этого, используя для сравнения ту же среду ВСУЕАά, определяют принципиальную пригодность среды Б-2 для определения антибиотикочувствительности культур легионелл с использованием дисков с антибиотиками (пример 6), стрипов с градациями антибиотиков (пример 7) и при помощи метода серийных разведений антибиотиков в среде (пример 8). В опытах использованы вирулентные и авирулентные штаммы легионелл, полученные из музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института:
5
1)  L.pneumophila Philadelphia АТСС 33152, 1 серогруппа, LD50 - 4 10 м.к. для морск. свинок (вирулентный)
2) тот же, но авирулентный штамм
3) L.pneumophila Blumington АТСС 33155, 3 серогруппа (авирулентный)
4) L.pneumophila Chicago АТСС 332 215, 6 серогруппа (авирулентный)
Пример 1
Для приготовления среды используют ингредиенты в следующих минимальных концентрациях, г/л: ферментоаутолизат селезенки КРС - 5,0; агар микробиологический - 12,0; калия фосфат однозамещенный - 1,0; калия фосфат двузамещенный - 3,0; калия глюконат - 2,0; крахмал растворимый - 2,0; желатин - 2,0; мезоинозит - 2,0; L-цистеин - 0,1; ЭДТА железо(III) натриевая соль - 0,01; тушь высококачественная - 3 мл; дистиллированная вода до 1 л, pH 7,1.
Состав среды сравнения ВСУЕАά аналогичен вышеуказанному (см. прототип).
5
В работе использовали стандартную методику определения чувствительности питательных сред для легионелл. Применяли типовой штамм легионелл - Legionella pneumophyila Philadelphia - 1 - вирулентный штамм, LD 50 - 4 10 м.к. для морских свинок и три авирулентных штамма. Приготовление инокулума: культуры выращивают в течение 2 суток на среде ВСУЕАά при температуре 35°C, потом смывают калий-фосфатным буфером (pH 7,1).
3
После этого готовят взвесь клеток с концентрацией 1 млрд м.к./ мл, которую разводят до рабочей концентрации 10 м.к/мл и засевают на чашки по 0,1 мл, т.е. по 100 м.к. Посевы инкубируют в течение трех суток при 35°C, подсчитывают количество выросших колоний, определяют время их появления, степень типичности морфологии легионеллезных колоний и сравнивают их диаметр на различных средах в различные сроки инкубации. Посевы совершали трехкратно, для сравнения используют средние величины. Статистическую достоверность сходства и различия величин определяют с помощью критерия Хи-квадрат.
В результате выявлено, что чувствствительность обоих сред статистически различалась: из 100 посеянных м.к. легионелл всех четырех штаммов на третьи сутки инкубации на среде Б-2 состава примера 1 вырастало до 20 колоний возбудителя, на контрольной среде - 50-60 типичных колоний легионелл (p - 0,05, Хи-квадрат 6,0), т.е. степень чувствительности первой среды недостаточна. Аналогичные различия зафиксированы и во времени появления колоний на средах - во всех случаях на предложенной среде они фиксировались с помощью стереомикроскопа на пятые сутки инкубации, визуально на шестые - в виде мелких росинчатых колоний до 1 мм в диаметре, стереомикроскопически с типичной мелкозернистостью и мелковолокнистостью с зеленоватым свечением. На среде-прототипе стереомикроскопически колонии легионелл были зарегистрированы на вторые сутки, визуально - на третьи, что соответствует стандартам. Эффективность среды ВСУЕАά была намного лучше, чем среда Б-2 примера 1, т.е. объем колоний на 5 сут роста в среднем на первой среде был 4-5 мм, на второй максимальный диаметр колоний на 6 сут роста составлял 2-3 мм. Рост газона культуры на среде-прототипе при засеве 0,1 мл взвеси культуры легионелл всех испытуемых штаммов через сутки инкубации при 35°C был достаточным для его визуальной регистрации, на предложенной был крайне слабым.
Таким образом, среда, приготовленная по примеру 1, не удовлетворяет требованиям, предъявляемым к качеству диагностических питательных сред для Legionella pneumophila, и не может использоваться для определения ее антибиотикочувствительности.
Пример 2
Для приготовления среды использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: ферментоаутолизат селезенки КРС - 6,0; агар микробиологический - 14,0; калия фосфат однозамещенный - 1,3; калия фосфат двузамещенный - 3,2; калия глюконат - 2,3; крахмал растворимый - 2,3; желатин - 2,3; мезоинозит - 2,3; L-цистеин - 0,3; ЭДТА железо(III) натриевая соль - 0,025; тушь высококачественная - 4 мл; дистиллированная вода до 1 л, pH - 7,1.
Методики определения и сравнения чувствительности, времени прорастания и эффективности предложенной питательной среды Б-2 и ВСУЕАά были идентичны описанным в примере 1.
Результаты сравнения: из посеянных 100 м.к. вирулентных и авируленетных штаммов легионелл на обоих средах вырастало на третьи сутки по 50-60 типичных колоний (р - 0,05, Хи-квадрат - 0,31), срок формирования колоний - 2 сутки при наблюдении в стереомикроскоп и 3 сутки при визуальном наблюдении. Но по эффективности роста колоний на 5-е сутки инкубации среда ВСУЕАά была несколько лучше приготовленной согласно примеру 2. В то же время выраженность газона культуры на предложенной среде была достаточной для визуальной регистрации на 2 сутки роста. Таким образом, состав среды, приготовленной по примеру 2, обеспечивает рост легионелл в той мере, чтобы данная среда рассматривалась как соответствующая общепринятым нормам ВОЗ.
Пример 3
Для приготовления среды использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: ферментоаутолизат селезенки КРС - 7,0; агар микробиологический - 15,0; калия фосфат однозамещенный - 1,6; калия фосфат двузамещенный - 3,4; калия глюконат - 2,5; крахмал растворимый - 2,5; желатин - 2,5; мезоинозит - 2,5; L-цистеин - 0,4; ЭДТА железо(III) натриевая соль - 0,027; тушь высококачественная - 5 мл; дистиллированная вода до 1 л, pH 7,1.
Методика сравнительного изучения чувствительности и эффективности обеих сред соответствовала вышеописанным. Полученные результаты (рост 45-65 типичных колоний всех испытанных штаммов на обоих средах, сроки появления колоний - на 2-3 сутки при инкубации при 35°C, достаточная эффективность роста колоний и газонов культур при некотором превышении этих показателей на среде сравнения) свидетельствуют, что среда, взятая в данном составе, полностью соответствует требованиям, предъявляемым к референтной диагностической питательной среде BCYEAά, используемой для культивирования и выделения Legionella pneumophila. Испытуемая среда в указанном составе по перечисленным признакам может использоваться для выявления антибиотикочувствительности культур легионелл и для обычного их выращивания.
Пример 4
Для приготовления среды использовали вышеозначенные ингредиенты в следующих концентрациях, г/л: ферментоаутолизат селезенки КРС - 8,0; агар микробиологический - 16,0; калия фосфат однозамещенный - 1,7; калия фосфат двузамещенный - 3,6; калия глюконат - 2,6; крахмал растворимый - 2,6; желатин - 2,6; мезоинозит - 2,6; L-цистеин - 0,5; ЭДТА железо(III) натриевая соль - 0,028; тушь высококачественная - 6 мл; дистиллированная вода до 1 л, pH 7,1.
Методика сравнительного изучения вышеуказанных показателей обеих сред соответствовала описанным. Полученные результаты (рост 50-65 типичных колоний всех испытанных штаммов на обеих средах, сроки появления колоний - на 2-3 сутки при инкубации при 35°C, достаточная эффективность роста колоний и газонов культур при некотором превышении этих показателей на среде сравнения) свидетельствуют, что среда, взятая в данном составе, полностью соответствует требованиям, предъявляемым к референтной диагностической питательной среде BCYEAά, используемой для культивирования и выделения легионелл. Испытуемая среда в данном составе по вышеуказанным признакам может использоваться для выявления антибиотикочувствительности культур Legionella pneumophila и для обычного их выращивания.
Пример 5
Среда в данном примере приготовлена с максимальными концентрациями ингредиентов, г/л: ферментоаутолизат селезенки КРС - 9,0; агар микробиологический - 17,0; калия фосфат однозамещенный - 1,8; калия фосфат двузамещенный - 4,0; калия глюконат - 2,8; крахмал растворимый - 2,8; желатин - 3,0; мезоинозит - 3,0; L-цистеин - 0,8; ЭДТА железо(III) натриевая соль - 0,03; тушь высококачественная - 10 мл; дистиллированная вода до 1 л, pH 7,1.
Методика сравнительного изучения вышеуказанных показателей обеих сред соответствовала описанным (см. пример 1). Полученные результаты: рост до 20 типичных колоний всех испытанных штаммов на испытуемой среде при значительно лучшем росте на среде сравнения (50-60 колоний при достоверной статистической разнице Р - 00,5 Хи-квадрат - 8,0), более длительные сроки появления колоний на среде данного состава - на 4-5 сутки при инкубации при 35°C. Вывод: недостаточная эффективность роста колоний и газонов культур на данной среде свидетельствуют, что среда, взятая в настоящем составе, не соответствует требованиям, предъявляемым к референтной диагностической питательной среде BCYEAά, используемой для культивирования и выделения легионелл. Испытуемая среда в данном составе по вышеуказанным признакам не может использоваться для выявления антибиотикочувствительности культур легионелл и для обычного их выращивания.
Пример 6
Подтверждение пригодности предложенной среды в определении антибиотикочувствительности культур легионелл методом дисков в сравнении со средой ВСУЕАά
9
Готовят среду по прописи примера 3 и среду ВСУЕАά согласно общеупотребимой прописи. Первая среда имеет темный цвет, другая -черный. Объемы сред в чашках Петри - 30 мл. Приготавливают односуточные культуры указанных штаммов легионелл, которые засевают на агаровые пластинки обоих сред по 0,1 мл взвеси клеток легионелл (по 4×10 м.к.), распределяют их по поверхности и подсушивают агар. Затем на агар накладывают диски с антибиотиками, чаще всего употребляемыми для лечения легионеллеза: рифампицин, офлоксацин, клиндамицин, эритромицин, доксициклин, моксифлоксацин, азитромицин, левофлоксацин и ципрофлоксацин (содержание антибиотика в диске 1-1,25 мкг). На каждую чашку выкладывают не более трех дисков. Посевы инкубируют в течение 48 ч при 35°C, первый учет проводят через 24 ч, замеряя зоны ингибиции роста культуры и сравнивают их диаметры на обоих средах. На вторые сутки данные показатели замеряют еще раз. Результаты сравнительного испытания в определении атибиотикочувствительности культур легионелл представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, зоны ингибиции роста газонов культур легионелл всех испытанных штаммов вокруг восьми дисков антибиотиков (рифампицин, офлоксацин, клиндамицин, эритромицин, моксициклин, левофлокасацин и ципрофлоксацин) на среде предложенной в 2-4 раза статистически достоверней (при среднем Хи-квадрате = 6,3) и превышают аналогичные зоны, полученные на контрольной среде BCYEAά, что объяснимо адсорбирующим действием активированного угля в последней. Небольшая зона ингибиции роста легионелл вокруг диска с доксициклином зависит от относительно слабой чувствительности легионелл к данному агенту, сопровождающейся полным отсутствием адсорбирующего эффекта. Таким образом, на предлагаемой среде чувствительность к антибиотикам легионелл выявляется более полно и точно, нежели на среде BCYEAά.
Пример 7
В данном примере представлены результаты сравнительного испытания среды, взятой в оптимальном составе (аналогично примеру 3), и среды BCYEAά для определения антибиотикочувствительности культур легионелл с помощью стрипов, содержащих градиент концентраций антибиотика - эритромицин и левофлоксацин (производство фирмы Оксоид, Е - тест). Культуры легионелл готовят, как указано в примере 6. Стрипы накладывют на засеянный газон культуры в количестве двух на чашку. Учет результатов проводят через сутки инкубации при 35°C, на другие сутки учет результатов повторяют. При наличии чувствительности культуры к испытуемому антибиотику вокруг стрипа образовывалась ракеткообразная зона ингибиции роста культуры легионелл, нижний край зоны ингибиции соответствовал МИК - минимальной ингибирующей концентрации. Результаты представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, зоны ингибиции роста газонов культур легионелл на среде предложенной примерно в 5 раз превышали по МИК аналогичные показатели на контрольной среде (средний Хи квадрат = 6,3). Следовательно, результаты определения антибиотикочувствительности легионелл с помощью стрипов более точны на предлагаемой среде.
Пример 8
Определение пригодности предлагаемой среды для определения антибиотикочувствительности культур легионелл методом серийных разведений антибиотиков в сравнении со средой ВСУЕАά
9
Готовят чашки с авторской средой и ВСУЕАα, как указано в предыдущем случае, за исключением того, что в среду вводят антибиотик в ступенчато повышающихся концентрациях: 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 05, 0,75, 1 мкг/мл. Засевают вышеуказанные культуры легионелл на поверхность агара с антибиотиками в дозе - большая петля взвеси с концентрацией 4×10 м.к., образуя посев в виде диска диаметром 1 см. Посевы подсушивают и инкубируют при тех же условиях, что и в предыдущем случае. Срок инкубации - 2 суток, учет - через 24 и 48 ч. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста культуры (см. таблицу 3). Показатели сравнивают для обеих сред.
Как видно из таблицы 3, минимальная ингибирующая концентрация антибиотиков, определенная для Legionella pneumophila, на предлагаемой среде в 5-10 раз меньше, чем на среде, содержащей активированный уголь.
Следовательно, испытания двух сред для определения антибиотикочувствительности легионелл различными методами, а именно: с помощью дисков, стрипов и серийных разведений, подтвердил что наиболее точно и достоверно работает среда Б-2.
Таким образом, при устранении сильного адсорбента - активированного угля, который связывает ряд антибиотиков, занижая этим показатели чувствительности, новая среда дает возможность точно определять антибиотикочувствительность Legionella pneumophila, не занижая показатели ингибиции, что имеет большое значение в клинической практике при лечении легионелеза.
Таблица 1
Штаммы легионелл
Среды
Диаметры зон ингибиции газона легионелл вокруг дисков с антибиотиками (мм):
эритромицин
азитромицин
кларитромицин
доксицин
левофлоксацин
моксифлоксацин
офлаксацин
клиндамицин
рифампицин
L.pneumophila Philadelphia - 1 (вирулентный), 1 серогруппа
BCYEAα
30
15
22
8
28
20
30
28
20
Б-2
38
20
36
10
0
35
40
40
40
L.pneumophila Philadelphia - 1 (авирулентный), 1 серогруппа
BCYEAα
32
20
23
8
30
20
31
25
30
Б-2
40
28
38
9
42
30
44
38
42
L.pneumophila Bloomington (авирулентный), 3 серогруппа
BCYEAα
28
16
20
8
26
21
30
26
19
Б-2
36
22
38
10
38
33
41
38
40
L.pneumophila Chicago (авирулентный), 6 серогруппа
BCYEAα
30
20
21
7
22
22
30
26
18
Б-2
40
30
32
8
32
36
41
42
38
Таблица 2
Штаммы легионелл
Среды
Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) антибиотиков, определенная с помощью «стрипов» (Е-тест)
Эритромицин (мкг)
Левофлоксацин (мкг)
L.pneumophila Philadelphia - 1 (вирулентный), 1 серогруппа
BCYEAα
0,5
0,12
Б-2
0,1
0,01
L.pneumophila Philadelphia - 1 (авирулентный), 1 серогруппа
BCYEAα
0,5
0,12
Б-2
0,1
0,01
L.pneumophila Bloomington (авирулентный), 3 серогруппа
BCYEAα
0,4
0,15
Б-2
0,1
0,01
L.pneumophila Chicago (авирулентный), 6 серогруппа
BCYEAα
0,5
0,12
Б-2
0,1
0,01
Таблица 3
Штаммы легионелл
Среды
Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) антибиотиков, определенная с помощью метода серийных разведений (мкг):
эритромицин
доксициклин
левофлоксацин
офлаксацин
рифампицин
L.pneumophila Philadelphia - 1 (вирулентный), 1 серогруппа
BCYEAα
0,5
0,5
0,1
0,25
0,25
Б-2
0,1
0,25
0,01
0,01
0,01
L.pneumophila Philadelphia - 1 (авирулентный), 1 серогруппа
BCYEAα
0,5
0,25
0,1
0,25
0,25
Б-2
0,12
0,1
0,01
0,01
0,02
L.pneumophila Bloomington (авирулентный), 3 серогруппа
BCYEAα
0,4
0,25
0,1
0,25
0,25
Б-2
0,1
0,1
0,01
0,01
0,01
L.pneumophila Chicago (авирулентный), 6 серогруппа
BCYEAα
0,5
0,5
0,1
0,25
0,25
Б-2
0,1
0,1
0,01
0,01
0,01