Идентификация NO-синтазной активности у лактобацилл методами ЭПР-спектроскопии и флуоресцентного окрашивания

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 148, кн. 1 Естественные науки 2006

УДК 579.22

ИДЕНТИФИКАЦИЯ NO-СИНТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У ЛАКТОБАЦИЛЛ МЕТОДАМИ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОКРАШИВАНИЯ

Д.Р. Яруллина, О.Н. Ильинская, Н.И. Силкин, Д.Г. Зверев, А.В. Аганов

Аннотация

Изучена способность бактерий рода Lactobacillus синтезировать оксид азота (NO). Методом ЭПР-спектроскопии и флуоресцентного окрашивания показано, что изучаемые микроорганизмы обладают NO-синтазной активностью. Установлено, что у данных бактерий отсутствует активность фермента нитритредуктаза. Впервые установлено, что бактерии L. plantarum № 8Р-А3 не образуют NO в процессе денитрификации, однако обладают, подобно клеткам млекопитающих, NO-синтазным механизмом образования оксида азота из L-аргинина. Предполагается, что NO-синтаза лактобацилл связана с цитоплазматической мембраной. Подчеркнуто значение исследований регуляторной роли NO у бактерий-симбионтов.

Введение

Оксид азота (N0) обладает широким спектром биологического действия. Являясь одним из мессенждеров, N0 участвует в регуляции систем внутри- и межклеточной сигнализации. Он играет важную роль в реализации таких функций, как нейротрансмиссия, вазодилатация, регуляция тонуса гладких мышц, снижение агрегации тромбоцитов, реакции иммунной системы, состояние памяти и др. Наряду с регуляторными функциями N0 также присущи ци-тотоксические, цитостатические и многие другие свойства. Синтез оксида азота в организме человека и животных осуществляется в результате окисления аминокислоты Ь-аргинина с помощью семейства ферментов, определяемых как N0-синтазы (N08). Идентифицировано три изоформы этого фермента - нейрональная (N08-1, или ^08), индуцибельная (N08-11, или iN0S) и эндотелиальная (N08-111, или €N08). Функционально выделяют конститутивные и ин-дуцибельные N0-синтазы. ^08 и €N08 постоянно присутствуют в клетках и относятся к конститутивным N08, вторая изоформа N0-синтазы синтезируется в ответ на определенное внешнее воздействие на клетку и является индуци-бельной. После экспрессии iN0S образует в 100-1000 раз большие, чем конститутивные N0-синтазы, количества оксида азота [1].

До последнего времени взаимодействие оксида азота и бактерий рассматривалось исключительно с точки зрения антимикробного действия продуцируемого макрофагами N0, основанного прежде всего на подавлении процессов клеточного деления и энергетического обмена через ингибирование синтеза ДНК и белков электронно-транспортной цепи [2]. Сегодня точно известно, что некоторые бактерии, подобно клеткам эукариот, способны синтезировать оксид

азота при участии фермента NO-синтаза. Ферментативная реакция окисления L-аргинина до L-цитруллина и NO у этих бактерий не имеет ничего общего с традиционным для прокариот NO-продуцирующим процессом - денитрификацией [3]. Бактериальные NO-синтазы, функционально гомологичные NOS млекопитающих, впервые были обнаружены и изучены у микроорганизмов рода Nocardia [4, 5]. Позднее в геномах таких бактерий, как Bacillus subtilis [6], Staphylococcus aureus [7], Deinococcus radiodurans [8], B. halodurans [9], были обнаружены гены, кодирующие протеины, гомологичные оксигеназному домену NOS млекопитающих. Это отчасти подтвердило полученные ранее данные об NO-синтазной активности клеточных экстрактов бактерий [4, 10].

У Lactobacillus plantarum и L. fermentum предполагается наличие NO-синтазы [11, 12]. Об активности NO-синтазы судят по включению 15N из аргинина в общий состав окисленных форм азота (TON: total oxidised nitrogen) [12]. Однако у бактерий обнаружен метаболический путь, в ходе которого из L-аргинина с помощью фермента L-аргининдеиминаза образуется NH4+, который затем окисляется до TON в процессе нитрификации [13]. Кроме того, NO является интермедиатом денитрификации [3]. Поэтому выводы о наличии у L. plantarum и L. fermentum NO-синтазы, основанные на данных по включению N в состав TON, а также полученные без учета нитратредукции, должны быть подтверждены другими методами. Интенсивное использование лактобацилл в производстве пробиотических препаратов, а также известная регуляторная роль оксида азота стимулируют развитие этих методов и открывают новые перспективы для изучения способности этих промышленно важных микроорганизмов синтезировать NO.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась регистрация NO-синтазной активности у представителей рода Lactobacillus методами ЭПР-спектроскопии и флуоресцентного окрашивания.

1. Материалы и методы исследования

В работе использовали бактерии L. plantarum № 8Р-А3 препарата «Лакто-бактерин сухой», произведенного ФГУП «Пермское НПО «Биомед», коллекционный штамм L. fermentum AL1, любезно предоставленный Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, и коммерческий штамм L. plantarum № 52, полученный из Санкт-Петербургского НИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН. Содержимое одного флакона препарата «Лактобактерин сухой» растворяли в 25 мл среды МРС с pH 6.2-6.6, содержащей следующие компоненты (г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт - 5, мясной экстракт - 10, Bacto-Pepton - 10, глюкоза - 20, аммоний лимоннокислый - 2, натрий уксуснокислый - 5, цистеин HCl - 0.4, твин 80 - 1, K2HPO4 - 2, MgSO4  7H2O - 0.2, MnSO4  H2O - 0.04, сорбиновая кислота - 0.4. Суспензию инкубировали в колбах объемом 100 мл, содержащих 25 мл среды, в течение 24 ч при 37°С, после чего высевали колонии на агаризованной среде МРС. В качестве посевного материала использовали отдельные колонии бактерий.

Для определения способности к денитрификации культуры лактобацилл выращивали 7 суток при 37°С на среде МРС с добавлением 1% KNO3 (в/о), раз-

литой в пробирки высоким столбиком. Нитриты обнаруживали в культуральной жидкости спектрофотометрически с помощью реактива Грисса. Концентрацию нитритного азота в пробах определяли по калибровочной кривой. Калибровочные растворы готовили из рабочего раствора NaN02 100 мг/л путем последовательных разведений в концентрациях 0-100 мкг/л. Измеряли оптическую плотность при X = 543 нм на спектрофотометре СФ-26 [14]. Газообразные продукты денитрификации обнаруживали по накоплению газа в поплавке. Нитраты определяли пробой с дифениламином и концентрированной серной кислотой [15].

Для ЭПР-исследования L. plantarum № 8Р-А3 выращивали на глюкозо-пеп-тонной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 5, пептон - 10, №С1 - 5. Для подготовки ЭПР-образцов 30 мл культуры на стадии стационарного роста осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин. Клетки трижды отмывали от среды 50 мМ трис-НС1-буфером, pH 7.2, и концентрировали до

0.1 мл центрифугированием.

На способность формировать с оксидом азота, продуцируемым L. planta-rum № 8Р-А3, комплексы, детектируемые методом ЭПР, исследовали аскорбиновую кислоту (АА), дающую с N0 характерный сигнал ЭПР с g-фактором около 2.02 [16] и комплекс диэтилдитиокарбамата (БЕТС) с Бе2+ (Ре2+(БЕТС)2) с характерной линией при g = 2.035 [17]. Для изучения способности железосерных центров белков лактобацилл образовывать с оксидом азота нитрозильные комплексы проведено ЭПР-исследование проб, не содержащих экзогенных ловушек N0 [18].

Опытный вариант для N0-синтазы содержал Ь-аргинин и NADPH в конечных концентрациях 20 мМ. Опытный вариант для нитритредуктазы содержал К^03 в конечной концентрации 20 мМ. Контрольный вариант отличался отсутствием бактерий. Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение 0.51 ч, после чего регистрировали спектры ЭПР на спектрометре Бгцкег Е8Р-300 (Германия) при температуре жидкого азота, микроволновой мощности 50 мВт, амплитуде модуляции 1 Гс. Для регистрации N0 в процессе денитрификации реакционную смесь выдерживали в анаэробных условиях в атмосфере углекислого газа.

Для нахождения количества образовавшегося нитрозильного комплекса (БЕТС)2-Бе2+-К0 в исследуемых образцах определяли зависимость интегральной интенсивности сигнала модельного комплекса бис^^-диэтилдитиокарба-мата)меди (II) (Си2(БЕТС)2) от его концентрации. На первом этапе работы осуществляли синтез Сц2(БЕТС)2. Для этого к водному раствору 0.05 моля Е1^КС82№ в 100 мл воды добавляли по каплям при перемешивании 25 мл слегка подкисленного раствора 0.025 моля Си804. Выпавший черный осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали. После перекристаллизации из СС14 выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали СС14 и высушивали. Для получения калибровочной зависимости относительной интегральной интенсивности линий ЭПР от содержания меди (II) готовили серию растворов различной концентрации Си (БЕТС)2 в толуоле. Использовали перегнанный толуол, который высушивался и хранился над молекулярными ситами 4А. Базовый раствор готовили путем продолжительного растворения точной навески

Рис. 1. Зависимость интегральной интенсивности сигнала комплекса Cu2(DETC)2 от его концентрации

кристаллов Cu2(DETC)2 в фиксированном объеме толуола в плотно закупоренной посуде. Остальные растворы получали из базового последовательным разбавлением и использовали в свежеприготовленном состоянии. Концентрации Cu (DETC)2 в калибровочной серии изменялись от 10- моль/л до 10- моль/л. Все полученные растворы замораживались при температуре жидкого азота для получения спектров ЭПР. Зависимость интегральной интенсивности линии с g = 2.005 от концентрации использовали для расчета концентрации комплекса (DETC)2-Fe2+-NO (рис. 1).

Для экспериментов по определению NO с помощью флуоресцентных красителей культуры L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52, выращенные на среде BHI (Brain Heart Infusion) (Sigma) до стационарной фазы роста, отмывали от среды Hanks’ буфером с кальцием и магнием (PAA Laboratories GmbH) и концентрировали центрифугированием. NO определяли с помощью NO-чувствительных флуоресцентных красителей: позволяющего визуализировать только внутриклеточный NO диацетильного производного 4-амино-5-метиламино-2’,7’-дифторфлуоресцеина (DAF-FM DA) (Molecular Probes) и детектирующего весь оксид азота пробы 1,2-диаминоантрахинона (DAA) (Molecular Probes) в концентрациях 10 мкМ и 100 мкг/мл соответственно. Бактерии ресуспендиро-вали в Hanks’ буфере c добавлением флуоресцентных красителей и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. В контрольном варианте исследуемые микроорганизмы инкубировали в буфере, не содержащем красителей. По истечении срока инкубации клетки отмывали от красителей буфером и микроскопировали под флуоресцентным микроскопом Leica DMIRE2 (Германия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы “Microsoft Excel”.

2. Результаты и обсуждение

Основная задача нашей работы была связана с определением методом ЭПР оксида азота у лактобацилл. Этому предшествовал подбор подходящей химической ловушки, которая связывает КО, образуя стабильные парамагнитные нитрозильные комплексы, детектируемые методом ЭПР. Использование в качестве спиновой ловушки N0 аскорбиновой кислоты не приводило к формированию ЭПР-определяемого сигнала нитрозильного комплекса Бе -АА-КО с g = 2.02. В спектре ЭПР пробы, не содержащей экзогенных ловушек N0, сигнала от комплекса N0 с железосерными центрами белков с g = 2.03 также не обнаружили. При инкубации клеток L. plantarum № 8Р-А3 с 30 мМ БЕТС наблюдался характерный для мононитрозильного комплекса (ВБТС)2-Ре2+-К0 ЭПР-сигнал в виде триплета с четко различимой сверхтонкой структурой и с положением центральной линии при g = 2.035 (рис. 2).

g = 2.035

Рис. 2. Спектр ЭПР клеток Ь. plantarum № 8Р-А3, зарегистрированный с использованием комплекса Бе2+(БЕТС)2 в качестве спиновой ловушки N0. Запись проводили при -196оС, частоте микроволнового излучения 9,4 ГГц, микроволновой мощности 50 мВт и амплитуде модуляции 1 Гс

Таким образом, среди исследованных спиновых ловушек N0 (аскорбиновая кислота, Бе (БЕТС)2, железосерные центры белков лактобацилл) в качестве наиболее подходящей для улавливания оксида азота бактериального происхождения отобран комплекс Бе2(БЕТС)2. Недостатком данного комплекса в качестве спиновой ловушки является его низкая растворимость в воде [19]. Тем не менее, использование в настоящем исследовании водорастворимого аналога БЕТС N-метил-D-глюкаминдитиокарбамата (МОБ) представляется нецелесообразным, поскольку комплекс Бе (МОБ)2 не обладает специфичностью в отношении N0. Кроме того, комплекс (DETC)2-Fe2+-N0 значительно более стабильный, чем (MGD)2-Fe2+-N0 [17].

Основным источником оксида азота в мире прокариот долгое время считали денитрификацию. В этом процессе NO образуется при восстановлении нитрита ферментом нитритредуктазой (NIR), а затем восстанавливается до N2O. Избежать токсического эффекта активных форм азота, образующихся из NO, например, пероксинитрита, бактериям-денитрификаторам позволяет тонко регулируемая последовательная работа ферментов нитрит- и NO-редуктаз, благодаря которой концентрация NO в клетках поддерживается на постоянном на-номолярном уровне [20]. Для того чтобы исключить возможность нитритре-дуктазного происхождения регистрируемого методом ЭПР оксида азота, L. plantarum № 8Р-А3, L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52 исследовали на способность к денитрификации. После 7 дней инкубации в культуральной жидкости L. plantarum № 8Р-А3 нитриты обнаружены в следовых количествах порядка 6-7 мкг/л, L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52 не восстанавливали добавленные в среду культивирования нитраты до нитритов. Накопление газа в поплавке не происходило ни в одной из проб, что свидетельствует об отсутствии образования газообразных продуктов денитрификации, а именно N2O и N2. Отметим, что NO, как интермедиат денитрификации, в данной смеси газов накапливаться не может вследствие высокой токсичности. Таким образом, при изучении способности к денитрификации было установлено, что L. plantarum № 8Р-А3, L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52 не способны вести полный процесс денитрификации. Среди исследованных штаммов бактерий только L. plantarum № 8Р-А3 проявлял способность восстанавливать нитраты до нитритов. Это согласуется с данными литературы о наличии у лактобацилл нит-ратредуктазы [13].

Наличие оксида азота в L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52 было показано методом флуоресцентного окрашивания и микроскопии, в основе которого лежит использование специальных NO-чувствительных соединений (флуорофо-ров), способных взаимодействовать с NO с образованием флуоресцирующего комплекса. Данный метод сочетает высокую чувствительность порядка 2-5 нМ, специфичность и простоту реализации. Наряду с этим он позволяет непосредственно визуализировать оксид азота в местах его образования, оценить пространственные и временные аспекты синтеза и распределения NO [21]. Используемый в настоящем исследовании индикатор NO диацетат 4-амино-5-метила-мино-2’,7’-дифторфлуоресцеина (DAF-FM DA), разработанный группой Nagano, способен проникать в клетку (пассивная диффузия через клеточную мембрану), где он под действием внутриклеточных эстераз деацетилируется и переходит в непроницаемую для клеточных мембран форму 4-амино-5-метилами-но-2’,7’-дифторфлуоресцеина (DAF-FM). DAF-FM не флуоресцирует, пока не прореагирует с NO в присутствии кислорода с образованием триазофлуорес-цеина (DAF-2T) с максимумами возбуждения флуоресценции и излучения около 495 нм и около 515 нм соответственно [22]. Таким образом, DAF-FM DA не позволяет визуализировать внеклеточный NO.

Для экспериментов, направленных на изучение пространственного распределения NO, используется флуоресцентный индикатор NO нового поколения 1,2-диаминоантрахинон (DAA). Темно-фиолетовый DAA не имеет автофлуоресценции. Его взаимодействие с NO ведет к образованию водонерастворимого

и флуоресцирующего красным Щ-антра-[1,2^-[1,2,3]-триазоль-6,11-диона (ATD), который может быть легко визуализирован под флуоресцентным микроскопом с использованием родаминового фильтра (X > 580 нм) [23].

Окрашивание флуоресцентными индикаторами NO DAF-FM DA и DAA клеток L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52, результаты которого представлены на рис. 3, свидетельствует о том, что в исследуемых бактериях присутствует оксид азота. Следует отметить, что при одинаковой плотности клеток и одинаковых концентрациях флуорофоров клетки L. fermentum AL1 окрашены слабее, чем L. plantarum № 52, следовательно, содержание NO в них ниже по сравнению с L. plantarum № 52. Последнее означает, что из двух исследованных методом флуоресцентного окрашивания штаммов лактобацилл NO-синтазная активность сильнее выражена у L. plantarum № 52.

Наличие флуоресцентных сигналов в случае использования обоих красителей свидетельствует о том, что и DAF-FM DA, и DAA пригодны для визуализации оксида азота бактерий. Для L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52 наблюдали сходное пространственное распределение NO. Однако следует подчеркнуть, что для двух используемых индикаторов NO наблюдаемая при микроскопии препаратов лактобацилл картина отличалась. На рис. 3, а видно, что у некоторых клеток, обработанных DAA, под микроскопом флуоресцирует только примембранная область. Оставшаяся часть клеток аналогично клеткам, окрашенным DAF-FM DA, флуоресцирует полностью (рис. 3). По-видимому, бактерии, находящиеся на разных этапах клеточного цикла, различаются по внутриклеточному распределению оксида азота.

Наличие флуоресцентного сигнала в примембранной области клеток исследуемых лактобацилл позволяет предположить, что NO-синтаза у них связана с мембраной. Известно, что в активном состоянии все изоформы NOS представляют собой димеры, образованные двумя идентичными субъединицами. Субъединицы состоят из двух доменов: N-терминального каталитического ок-сигеназного домена, связывающего протопорфирин IX (гем), тетрагидробиоп-терин (H4B) и субстрат L-аргинин, и С-терминального электрон-поставляюще-го редуктазного домена. Редуктазный домен осуществляет перенос электронов от восстановительного субстрата - никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) по цепи электронов, включающей флавинадениндинуклеотид и фла-винмононуклеотид (FAD и FMN), на оксигеназный домен [1]. Выделенная из Nocardia sp. и очищенная бактериальная NO-синтаза также проявляла потребность в NADPH, FAD и FMN [5]. Однако в NOS-подобных белках S. aureus, D. radiodurans и некоторых других бактерий С-терминальный редуктазный домен, отвечающий за связывание NO-синтазы с FMN, FAD и NADPH и поставляющий электроны на N-терминальный оксигеназный домен, в котором происходит каталитическая реакция NADPH- и O2-зависимого окисления L-аргинина до цитруллина и NO, отсутствует [24, 25]. Поскольку прокариотические клетки не содержат цитозольных мембранных структур, транспорт электронов осуществляется в них на цитоплазматической мембране. Можно предположить, что именно это обусловливает примембранное положение зависимой от восстановленных кофакторов NO-синтазы в исследуемых клетках L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52.

Pис. 3. Визуализация оксида азота в культуре Lactobacillus plantarum № 52 (a, b) и Lactobacillus fermentum AL1 (d, e) флуоресцентным окрашиванием: a, d - окраска клеток, содержащих NO, 1,2-диаминоантрахиноном (DAA), b, e - окраска клеток, содержащих NO, диацетильным производным 4-амино-5-метиламино-2,7-дифторфлуорес-цеина (DAF-FM DA), c - отрицательный контроль. Масштабная линейка - 5 мкм

С другой стороны, в мире прокариот оксид азота может также образовываться в ходе денитрификации. Точная пространственная локализация ферментов денитрификации у грамположительных бактерий, к которым относятся лактобациллы, не известна, хотя для грамотрицательных микроорганизмов установлено, что процесс диссимиляционной нитратредукции протекает на цито-

плазматической мембране [26]. В ходе изучения способности к денитрификации было продемонстрировано отсутствие способности к денитрификации у L. fermentum AL1 и L. plantarum № 52. Только L. plantarum № 8Р-А3 восстанавливал нитраты до нитритов. Чтобы исключить возможность образования оксида азота у этого штамма в процессе нитратредукции, проведена ЭПР-спектро-скопия проб, инкубируемых анаэробно и содержащих 20 мМ KNO3. При определении оксида азота в пробах на активность нитритредуктазы регистрировали сигнал от комплекса (DETC)2-Fe2+-NO. Однако увеличение времени инкубации проб приводило к снижению концентрации парамагнитных комплексов, а удаление из реакционной смеси бактерий не влияло на концентрацию NO в пробах (рис. 4, б). Полученные данные свидетельствуют о небиологическом происхождении обнаруженного в этом случае оксида азота. Известно, что NO может образовываться химическим путем из нитритов в кислой среде [27]. Именно этот процесс, вероятно, объясняет присутствие неферментативно образованного NO в пробах на активность нитритредуктазы.

Таким образом, при исследовании способности L. plantarum № 8Р-А3 к денитрификации было установлено, что данные микроорганизмы способны вести лишь первый этап диссимиляционной нитратредукции. В условиях, благоприятных для денитрификации (дефицит кислорода и наличие нитратов в среде культивирования), оксид азота не образуется биологическим путем, что свидетельствует об отсутствии активности фермента нитритредуктаза.

Проведенная ЭПР-спектроскопия проб на активность NO-синтазы в присутствии кислорода и L-аргинина показала, что бактерии L. plantarum № 8Р-А3 обладают NO-синтазной активностью. В суспензии лактобацилл регистрировали интенсивный ЭПР сигнал комплекса (DETC)2-Fe2+-NO, свидетельствующий о присутствии в реакционной смеси оксида азота. Концентрация NO повышалась с течением времени инкубации от 30 до 60 мин. с 37.2 мМ до 95.8 мМ (рис. 4, а), что характерно для ферментативных реакций и подтверждает биологическое происхождение регистрируемого NO.

Следует отметить, что в пробах, не содержащих бактерий, также обнаружили оксид азота, однако количество образованного NO в данном случае значительно меньше по сравнению с опытным вариантом на активность NO-синтазы (рис. 4, а). Образование NO неэнзиматическим путем вероятно можно объяснить известным фактом его синтеза из L-аргинина и H2O2 [28]. Физиология лактобацилл действительно предполагает их устойчивость к значительным количествам H2O2 [29].

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что бактерии рода Lactobacillus не образуют NO в процессе денитрификации, однако обладают, подобно клеткам млекопитающих, NO-синтазным механизмом образования оксида азота из L-аргинина. NO-синтазный механизм образования NO микроорганизмами данной группы был подтвержден методами ЭПР и окрашивания NO-чувствительными флуоресцентными красителями. Результаты окрашивания DAA указывают на то, что NO-синтаза лактобацилл связана с мембраной.

Биологические функции прокариотической NO-синтазы в целом остаются неизвестными. Поскольку NO является плейотропным регулятором клеточных

100 -

80 -

60 -

40 -

20

б)

30 мин.

60 мин.

60 мин., без бактерий

Вариант опыта

Рис. 4. Содержание N0

0

функций млекопитающих, предполагают, что оксид азота, синтезируемый патогенными микроорганизмами, играет критическую патофизиологическую роль во время инфекционного процесса [10]. Помимо этого, NOS S. aureus приписывают роль стрессорного белка, синтезируемого бактериями в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды [30]. Обнаружено, что гомолог NOS в Streptomyces turgidiscabies, S. scabies и S. acidiscabies участвует в нитровании дипептидного фитотоксина, определяющего патогенность данных микроорганизмов по отношению к растениям, что свидетельствует об участии бактериальной NOS в биосинтезе вторичных метаболитов [31]. Только для нокардиаль-ного фермента показана регуляторная роль, аналогичная NOS эукариот и связанная в основном с активированием оксидом азота фермента гуанилатциклазы [32].

Благодаря своему стерилизующему и консервирующему действию, основанному на подкислении среды, бактерии рода Lactobacillus находят широкое применение в сельском и домашнем хозяйстве, а также в молочной промышленности. Технологическая и коммерческая значимость микроорганизмов этой группы связана также с их использованием в производстве пробиотических препаратов. Предпосылкой к этому послужили антагонистические свойства лактобацилл по отношению к патогенным микроорганизмам в кишечнике и урогенитальном тракте, где они входят в состав естественной микрофлоры [33]. В связи с известной биологической активностью бактерий рода Lactobacillus, обусловливающей их широкое использование в производстве продуктов питания и промышленно важных пробиотических препаратов, представляются перспективными дальнейшие исследования регуляторной функции оксида азота у микроорганизмов этой группы.

Авторы выражают благодарность К. Бойерляйну (Институт фармакологии Университета г. Гиссен, Германия) за постановку и обсуждение экспериментов с флуоресценцией и кандидату химических наук, доценту В.Г. Штырлину (НИЛ координационных соединений, кафедра неорганической химии Химического института им. А.М. Бутлерова КГУ) за приготовление концентрационной серии Cu2+(DETC)2.

Работа выполнена в рамках программы «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП.2.1.1.1005 и Госконтракта «Центр коллективного пользования КГУ» 02.451.11.7019.

Summary

D.R. Yarullina, O.N. Ilinskaya, N.I. Silkin, D.G. Zverev. NO-synthase activity of lactobacilli confirmed by EPR spectroscopy and fluorescent imaging.

Due to its pivotal biological activities nitric oxide (NO) is a molecule of high interest. Although NO biosynthesis through denitrification has been well studied in microorganisms, the formation of NO from L-arginine by the enzyme nitric oxide synthase (NOS) has rarely been investigated. The functional importance of Lactobacillus species in the mammalian intestine highlights the need for detailed studies of the occurrence of NO synthesis in this bacteria.

Three strains of Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum were investigated for nitric oxide production. NO-synthase activity was detected by NO-specific fluorescent probes 4-amino-5-methylamino-2 ,7’-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM DA) and 1,2-diaminoanthraquinone (DAA) and confirmed by electron paramagnetic resonance (EPR). None of the strains of L. fermentum and L. plantarum examined had denitrifying nitrite reductase activity under anaerobic conditions. The possibility of nonenzymatic NO generation was also demonstrated. We propose, that NOS is a membrane-associated enzyme. Overall, the results strongly support, that Lactobacillus produce NO through nitric oxide synthase system.

Литература

1. Alderton W.K., Cooper C.E., KnowlesR.G. Nitric oxide synthases: structure, function, inhibition // Biochem. J. - 2001. - V. 357. - P. 59З-б15.

2. Ступакова М.В., Лобышева И.И., Микоян В.Д., Ванин А.Ф., Васильева С.В. Роль ионов железа в индукции оксидом азота SOS-ответа в клетках Escherichia coli // Биохимия. - 2000. - Т. б5, Вып. б. - С. 810-81б.

3. CutruzzolaF. Bacterial nitric oxide synthesis // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. -V. 1411. - P. 231-249.

4. Chen Y., Rosazza J.P.N. A bacterial nitric oxide synthase from a Nocardia species // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - V. 203, No 2. - P. 1251-125S.

5. Chen Y., Rosazza J.P.N. Purification and characterization of nitric oxide synthase (NOSNoc) from a Nocardia species // J. Bacteriol. - 1995. - V. 177, No 17. - P. 5122512S.

6. KunstF., Ogasawar N., Moszer I., Albertini A.M., Alloni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessieres P., Bolotin A., Borchert S. et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis // Nature. - 1997. - V. 390. - P. 249-25б.

7. Kuroda M., Ohta T., Uchiyama I., Baba T., Yuzawa H., Kobayashi I., Cui L., Oguchi A., Aoki K., Nagai Y. et al.. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus // Lancet. - 2001. - V. 357. - P. 1225-1240.

S. White O., Eisen J.A., Heidelberg J.F., Hickey E.K., Peterson J.D., Dodson R.L.,

Haft D.H., Gwinn M.L., Nelson W.C., Richardson D.L. et al. Genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans R1 // Science. - 1999. - V. 28б. -P. 1571-1577.

9. Takami H., Nakasone K., Takaki Y., Maeno G., Sasaki R., Masui N., Fuji F., Hirama C., Nakamura Y., Ogasawara N., Kuhara S., Hirikoshi K. Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and genomic sequence comparison with Bacillus subtilis // Nucleic Acids Res. - 2000. - V. 28. - P. 4317-4331.

10. Choi W.S., Chang M.S., Han J.W., Hong S.Y., Lee H. W. Identification of nitric oxide synthase in Staphylococcus aureus // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1997. - V. 237. -P. 554-55S.

11. Adawi D., Kasravi F.B., Molin G., Jeppsson B. Effect of Lactobacillus supplementation with and without arginine on liver damage and bacterial translocation in an acute liver injury model in the rat // Hepatology. - 1997. - V. 25, No 3. - P. б42-б47.

12. Morita H., Yoshikawa H., Sakata R., Nagata Y., Tanaka H. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidino nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum // J. Bacteriol. - 1997. - V. 179, No 24. - P. 7812-7815.

13. Xu J., Verstraete W. Evaluation of nitric oxide production by lactobacilli // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2001. - V. 5б. - P. 504-507.

14. Герхардт Ф. (ред.) Методы общей бактериологии. - М.: Мир, 1984. - 472 с.

15. Сайманова Р.А., Захарова Н.Г. Выделение чистых культур бактерий и их идентификация. - Казань: Изд-во Казан. ун-та, 1980. - 24 с.

16. Kuropteva Z.V., Kudryavtsev M.E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide // Gen. Physiol. Biophys. - 1997. - V. 16, No 1. - P. 91-96.

17. Mikoyan V.D., Kubrina L.N., Serezhenkov V.A., Stukan R.A., Vanin A.F. Complexes of Fe2+ with diethyldithiocarbamate or N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate as traps of nitric oxide in animal tissues: comparative investigations // Biochim. Biophys. Acta. -1997. - V. 1336, No 2. - P. 225-234.

18. Жумабаева Т.Т., Байдер Л.М., Володина Л.А., Куроптева З.В. Исследование методом ЭПР взаимодействия клеток Е. coli с аскорбиновой кислотой и нитритом натрия // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т. 37, № 6. - С. 742-746.

19. Zhang D., Xiong J., Hu J., Li Y., Zhao B. Improved method to detect nitric oxide in biological systems // Appl. Magn. Reson. - 2001. - V. 20. - P. 345-356.

20. Goretski J., Zafiriou O.C., Holloche T.C. Steady-state nitric oxide concentrations during denitrification // J. Biol. Chem. - 1990. - V. 265. - P. 11535-11538.

21. von Bohlen und Halbach O. Nitric oxide imaging in living neuronal tissues using fluorescent probes // Nitric oxide. - 2003. - V. 9. - P. 217-228.

22. Kojima H., Nakatsubo N., Kikuchi K., Kawahara S., Kirino Y., Nagoshi H., Hirata Y., Nagano T. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins // Anal. Chem. - 1998. - V. 70. - P. 2446-2453.

23. Heiduschka P., Thanos S. NO production during neuronal cell death can be directly assessed by a chemical reaction in vivo // Neuroreport. - 1998. - V. 9. - P. 4051-4057.

24. BirdL.E., Ren J., Zhang J., Foxwell N., Hawkins A.R., Charles I.G., Stammers D.K. Crystal structure of SANOS, a bacterial nitric oxide synthase oxygenase protein from Staphylococcus aureus // Structure. - 2002. - V. 10. - P. 1687-1696.

25. Adak S., Bilwes A.M., Panda K., HosfieldD., Aulak K.S., McDonald J.F., Tainer J.A., Getzoff E.D., Crane B.R., Stuehr D.J. Cloning, expression, and characterization of a nitric oxide synthase protein from Deinococcus radiodurans // PNAS. - 2002. - V. 99, No 1. - P. 107-112.

26. YeR.W., AverillB.A., Tiedje J.M. Denitrification: production and ^nsumption of nitric oxide // Applied and Environmental Microbiology. - 1994. - V. 60, No 4. - P. 10531058.

27. WeitzbergE., Lundberg J.O.N. Nonenzymatic nitric oxide production in humans // Nitric Oxide. - 1998. - V. 2, No 1. - P. 1-7.

28. Nagase S., Takemura K., Ueda A., Hirayama A., Aoyagi K., Kondoh M., Koyama A. A novel nonenzymatic pathway for the generation of nitric oxide by the reaction of hydrogen peroxide and D- or L-arginine // Biochem Biophys Res Commun. - 1997. -V. 233, No 1. - P. 150-153.

29. Lee J., Hwang K.T., Heo M.S., Lee J.H., Park K.Y. Resistance of Lactobacillus planta-rum KCTC 3099 from Kimchi to oxidative stress // J. Med. Food. - 2005. - V. 8, No 3. -P. 299-304.

30. Hong I.-S., Kim Y.K., Choi W.S., Seo D.W., Yoon J.W., Han J.-W., Lee H.Y., Lee H.W. Purification and characterization of nitric oxide synthase from Staphylococcus aureus // FEMS Microbiology Letters. - 2003. - V. 222. - P. 177-182.

31. Kers J.A., Wach M.J., Krasnoff S.B., Widom J., Cameron K.D., BukhalidR.A., Gibson D.M., Crane B.R., Loria R. Nitration of a peptide phytotoxin by bacterial nitric oxide synthase // Nature. - 2004. - V. 429. - P. 79-82.

32. Son J.K., Rosazza J.P.N. Cyclic guanosine-3',5'-monophosphate and biopteridine biosynthesis in Nocardia sp. // J. Bacteriol. - 2000. - V. 182, No 13. - P. 3644-3648.

33. Orrhage K., Nord C.E. Bifidobacteria and lactobacilli in human health // Drugs Exp. Clin. Res. - 2000. - V. 26, No 3. - P. 95-111.

Поступила в редакцию 20.01.06

Яруллина Дина Рашидовна - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: yadinka@mail.ru

Ильинская Ольга Николаевна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Olga.Ilinskaya@ksu.ru

Силкин Николай Иванович - кандидат физико-математических наук, доцент кафедры электроники и радиоспектроскопии Казанского государственного университета.

E-mail: Nikolai.Silkin@ksu.ru

Зверев Дмитрий Германович - электроник кафедры электроники и радиоспектроскопии Казанского государственного университета.

E-mail: dzverev@mail.ru

Аганов Альберт Вартанович - доктор химических наук, профессор, декан физического факультета, заведующий кафедрой общей физики Казанского государственного университета.

E-mail: Albert.Aganov@ksu.ru