Изучение эффективности включения Фотосенса в пространственно стабилизированные липосомы

УДК 577.115:615.831:615.849.19

M. A. Kortava1, A. V. Ryabova2, E. V. Ignatyeva1, A. P. Polozkova1, O. L. Orlova1,

A. A. Stratonnikov2, Z. S. Smirnova1, N. A. Oborotova1, E. A. Lukyanets3, V M. Negreemovski3

THE INVESTIGATION OF PHOTOSENSE EFFICIENT INCLUSION INTO STERICALLY STABILIZED LIPOSOMES

1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

2 Natural Sciences Center of A. M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow

3 State Research Center «NIOPIK», Moscow

ABSTRACT

Photosense has been synthesized at the State Research Center «NIOPIK», it belongs to the second generation of Russian photosensitizers. Photosense is a mixture of sulfated aluminium phthalocyanine sodium salts. The aim of investigation was to develop the quality control strategies of Photosense sterically stabilized liposomal form in order to improve the treatment of malignancies. The spectrophotometric and fluorescence extinguishing methods of quantitative detection of drug inside the liposome are discussed.

Key words: Photosense, sterically stabilized liposomes, photodynamic therapy, spectrophotometry, fluorescence.

М. A. Kopmaea1, А. В. Рябова2, E. В. Игнатьева1, А. П. Полозкова1, О. Л. Орлова1, А. А. Стра-тонников2, 3. С. Смирнова1, Н. А. Оборотова1, E. А. Лукьянец3, В. М. Негримовский3

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВКЛЮЧЕНИЯ ФОТОСЕНСА В ПРОСТРАНСТВЕННО СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ ЛИПОСОМЫ

1 ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва

2 ЦЕНИ ИОФ им. А. М. Прохорова РАН, Москва 3 ФГУП ГНЦ «НИОПИК», Москва

РЕЗЮМЕ

Фотосенс — отечественный фотосенсибилизатор II поколения, синтезированный в ФГУП ГНЦ «НИОПИК», является смесью натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия. Работа посвящена созданию методов контроля качества Фотосенса в пространственно стабилизированной липосомальной лекарственной форме. В статье приведены два метода количественного определения Фотосенса в липосомальной лекарственной форме: спектрофотометрический и метод тушения флюоресценции при комплексообразовании.

Ключевые слова: Фотосенс, пространственно стабилизированные липосомы, фотодинамическая терапия, спектрофотометрический анализ, флюоресценция.

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие отмечается повышенный интерес к использованию фталоцианинов в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. Фотосенсибилизаторы обладают большим терапевтическим потенциалом, но их действие сопряжено с отрицательными побочными эффектами, которые обусловлены прежде всего недостаточной избирательностью действия [4-6]. Поэтому важным направлением повышения эффективности ФДТ, снижения токсичности и побочных реакций является совершенствование избира-

тельности действия фотосенсибилизаторов путем создания рациональных лекарственных форм. При этом препарат должен быть устойчив при хранении и введении в организм, обладать низкой токсичностью, включая нейротоксичность; быть опухолетропным, т. е. иметь высокую селективность накопления в опухолях по сравнению с окружающими нормальными тканями; сравнительно быстро выводиться из организма и слабо накапливаться в коже. Одним из путей решения этой задачи является создание системы направленного транспорта фотосенсибилизаторов в виде липосомальной лекарственной формы [1-3, 10].

В настоящее время для ФДТ широко применяется отечественный фотосенсибилизатор II поколения — Фотосенс, представляющий собой смесь натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия [4-6]. Однако при проведении ФДТ высокая эффективность 0,2% раствора Фотосенса для внутривенного введения сопровождается высокой кожной чувствительностью к прямому солнечному свету, обусловленной удерживанием препарата в коже в течение длительного времени.

Для увеличения селективности действия фотосенсибилизатора в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН разработана липосомальная лекарственная форма Фотосенса, позволившая снизить терапевтическую дозу препарата в 4 раза и уменьшить уровень его накопления в коже. Индекс селективности липосомальной лекарственной формы Фотосенса, приготовленной ex tempore, превосходит в 1,3-1,5 раза индекс селективности 0,2% раствора препарата [3]. Однако фармакокинетические исследования показали, что эта липосомальная форма быстро инактивируется РЭС. Поэтому целью настоящего исследования является совершенствование липосомальной лекарственной формы Фотосенса путем ее пространственной стабилизации, затрудняющей захват препарата макрофагами РЭС.

Учитывая, что контроль качества лекарственной формы является одним из основных компонентов системы создания готового лекарства, задача настоящего исследования состояла в разработке аналитических методик, позволяющих контролировать качество ли-посом в технологическом процессе, а также при определении условий их хранения и срока годности. Критерии и параметры качества липосомальной дисперсии выбраны, исходя из требований Государственной Фармакопеи (ГФ), предъявляемых к препаратам для инъекций, а также исходя из особенностей липосомальной лекарственной формы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Субстанция Фотосенса, катионные производные фталоцианина алюминия — октакис(пиридино-метил)фталоцианин хлоралюминия октохлорид (AlPcPym8) и производные кобальта, меди и цинка, ФГУП ГНЦ «НИОПИК», Москва; яичный фосфати-дилхолин и PEG2000DSPE, фирма Lipoid, Германия; холестерин, фирма Sigma, Германия; сахароза (ГОСТ 5833-75), Россия; хлороформ (ГОСТ 2001574), Россия.

Оборудование

В работе использовали: вакуумный насос ВН-464А (Россия), испаритель ротационный ИР-1М (Россия), спектрофотометр СФ-46 (Россия), лазерный электронный спектральный анализатор ЛЭСА-01-Био-спек, фирма «Биоспек» (Россия), фильтры Pall (Германия), фильтры Nuclepore, фирма Whatman (Германия), УЗ-ванну Transsonix T-310, фирма Elma (Германия), прибор, измеряющий размер наночастиц, Submicron Particale Sizer Nicomp 380, фирма PSS Nicomp (США),

мини-экструдер Avanti Mini-Extrude», фирма Avanti Lipids (США), хроматографическую колонку ХК26/20, фирма Amersham Biosciences AB (Швеция), сорбент Sephadex G-50 superfine, фирма Amersham Biosciences AB (Швеция).

Липосомы получали путем диспергирования 1% раствором Фотосенса тонкой липидной пленки, образованной упариванием в вакууме на роторном испарителе хлороформного раствора липидов. Дисперсию многослойных липосом измельчали на экструдере Avanti Mini-Extruder, последовательно пропуская дисперсию через фильтры Nucleopore с размерами пор 0,4, 0,2 и 0,1 мкм.

Для очистки липосомальной дисперсии от не включенного в липосомы Фотосенса использовали метод колоночной хроматографии (гель-фильтрацию) [7-9], в качестве сорбента — Sephadex G-50 s^e^rne. На выходе из колонки получали 2 фракции: липосомы с включенным Фотосенсом и свободный Фотосенс.

Количественное определение Фотосенса в липосомальной лекарственной форме

Для определения Фотосенса в липосомальной дисперсии применяли стандартную спектрофотометрическую методику количественного определения вещества с использованием величины удельного показателя поглощения (Е1 см1 %) и новый метод определения концентрации несвязанного Фотосенса в растворе через комплексообразование.

Спектрофотометрическая методика количественного определения вещества с использованием величиныы удельного показателя поглощения

В электронном спектре поглощения Фотосенса имеются полосы поглощения при длинах волн 293+2, 350,5+2, 608+2 и 678+2 нм. Максимум при ^=678 нм имеет аналитическое значение. Установлено, что спиртовой раствор препарата подчиняется закону Бугера— Ламберта—Бера в диапазоне концентрации от 0,003 до 0,008 мг/мл. Исследование влияния вспомогательных веществ на спектральные характеристики Фотосенса показало, что присутствие фосфатидилхолина, холестерина и PEG2000DSPE не изменяет положения характеристического максимума, однако эти липиды имеют небольшое собственное поглощение (0,01 при длине волны 678 нм). Поэтому для количественного определения Фотосенса в липосомах в качестве раствора сравнения был использован раствор «пустых» липосом в 95% этиловом спирте. Количество Фотосенса определяли в исходной липосомальной дисперсии и 2 фракциях, полученных после гель-фильтрации.

Методика

1 мл липосомальной дисперсии помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили до метки 95% этиловым спиртом (раствор А); 2,5 мл раствора А помещали в колбу вместимостью 50 мл и доводили до метки 95% этиловым спиртом (раствор Б). Определяли оптическую плотность раствора Б при длине волны 678+2 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 1 см относительно раствора «пустых» липосом в 95% этиловом спирте.

Количество Фотосенса (X) мг/мл вычисляли по формуле:

Э =

Х1х100

Х=

0,01хЭхК

С 1 %

Р1 см

где Б — оптическая плотность испытуемого раствора;

К — величина разбавления;

Р1 см1 % — удельный показатель поглощения, 2017+20;

0,01 — коэффициент пересчета.

Оценка эффективности включения препарата в липосомы

Для оценки эффективности включения препарата в липосомы определяли общее содержание Фотосенса в исходной липосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, а также в I и II фракциях, полученных на выходе из колонки.

1 мл I фракции (липосомы с Фотосенсом) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили до метки 95% этиловым спиртом. Определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 678+2 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 1 см относительно раствора «пустых» липосом в 95% этиловом спирте соответствующей концентрации.

Количество Фотосенса (Х1) в мг вычисляли по формуле:

0,01х0хКхУ,

Х1= -

Р1 1 %

Р1 см

где Б — оптическая плотность испытуемого раствора;

К — величина разбавления;

У1 — объем I фракции;

Е1 см1 % — удельный показатель поглощения, 2017+20;

0,01 — коэффициент пересчета.

1 мл II фракции (свободный Фотосенс) помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили до метки 95% этиловым спиртом. Определяли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 678+2 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 1 см относительно 95% этилового спирта.

Количество Фотосенса (Х2) в мг вычисляли по формуле:

0,01хЭхКхУ2

Х2 = -

Р 1 %

Р1 см

где Б — оптическая плотность испытуемого раствора;

К — величина разбавления;

У2 — объем II фракции;

Е1 см1 % — удельный показатель поглощения, 2017+20;

0,01 — коэффициент пересчета.

Эффективность включения Э (%) вычисляли по формуле:

ХхУ0

где Х1 — количество Фотосенса в I фракции (мг);

X — количество Фотосенса в исходной липосомальной дисперсии (мг/мл);

¥0 — объем липосомальной дисперсии, нанесенный на колонку (мл).

Содержание не включенного препарата по отношению к общему количеству Фотосенса (Ф) (%) во II фракции вычисляли по формуле:

Х2х100

Ф = —Х2—1—00—,

Ф = —Хх—У—0 —,

где Х2 — количество Фотосенса во II фракции (мг);

X — количество Фотосенса в исходной липосомальной дисперсии (мг/мл);

¥0 — объем липосомальной дисперсии, нанесенный на колонку (мл).

Определение включения Фотосенса в липосомы методом тушения флюоресценции при комплексообра-зовании

Водный раствор Фотосенса, как и некоторых катионных производных фталоцианинов, в частности А1РсРуш8, имеет значительную флюоресценцию. Однако если Фотосенс и катионное производное фталоциани-на (противоион) находятся в одном растворе, их молекулы образуют комплекс, что приводит к тушению флюоресценции. Некоторые противоионы не обладают собственной флюоресценцией, например производное кобальта, но, так же, как флюоресцирующие катионные производные цинка и меди, влияют на растворимость липидов, входящих в состав липосом, что приводит к повреждению нативности липосомальных сфер и выходу всего Фотосенса из липосом в раствор. Очевидно, что противоионы, разрушающие липосомы, не пригодны для определения степени включения Фотосенса внутрь липосом, с их помощью можно измерить лишь суммарную концентрацию препарата в липосомальной дисперсии. Количество Фотосенса в таком случае будет эквимолярно количеству противоиона, необходимого для полного тушения флюоресценции препарата, причем в случае флюоресцирующего противоиона его концентрацию для полного связывания Фотосенса при комплексообразовании следует определять из минимума на кривой интегральной флюоресценции при титровании липосомальной дисперсии этим флюоресцирующим противоионом. Из 4 противоионов (катионные производные фталоцианина кобальта, меди, цинка и алюминия) только катионное производное фталоцианина алюминия (А1РсРуш8) не вызывало нарушения нативности липосом. Таким образом, при добавлении А1РсРуш8 в липосомальную дисперсию препарата в образовании комплексов будут участвовать лишь те молекулы Фотосенса, которые находятся вне липосом, т. е. при постепенном добавлении А1РсРуш8 по минимуму интегральной флюоресценции представляется возможным определить долю препарата, находящегося вне ли-

посом (рис. 1). Концентрация Фотосенса в растворе составила 2 мг/л, суммарная концентрация в липосомаль-ной дисперсии — 2 мг/л. Возбуждение флюоресценции осуществлялось гелий-неоновым лазером с длиной волны 633 нм, измерение флюоресценции проводилось лазерным электронным спектральным анализатором ЛЭСА-01-Биоспек. Измерения флюоресценции проводились в кюветах для спектрофотометров объемом 1 мл.

Средний размер частиц однослойных липосом Фотосенса колебался от 100 до 180 нм (рис. 3).

Рис. 1. Зависимость интенсивности интегральной флюоресценции при титровании растворов (1) и липо-сомальной дисперсии (2) Фотосенса AlPcPym8

Кроме количественного содержания Фотосенса, липосомальную дисперсию оценивали по следующим параметрам: внешний вид, размер липосомальных везикул, рН дисперсии, эффективность включения в ли-посомы.

Определение среднего диаметра много- и однослойных везикул и стандартное отклонение их распределения проводили в проводящем лазерном луче с помощью фотонного корреляционного анализатора на приборе Submicron Particale Sizer Nicomp 380.

рН липосомальной дисперсии Фотосенса определяли потенциометрически (ГФ XI, вып. 1, с. 113).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследуемые образцы много- и однослойных везикул представляли собой водную непрозрачную дисперсию синего цвета. Средний размер частиц полученных образцов многослойной липосомальной дисперсии Фотосенса колебался от 250 до 550 нм (рис. 2). Для исследуемых образцов величина рН составляла 6,3-7,3.

Рис. 3. Размер однослойных липосом Фотосенса, средний размер липосом 102 нм

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВКЛЮЧЕНИЯ ФОТОСЕНСА В ЛИПОСОМЫ

При использовании метода колоночной хроматографии (гель-фильтрации) по мере прохождения препарата через колонку происходило отделение липосомальной дисперсии Фотосенса от невключившегося препарата. На выходе получали две фракции:

I фракция — непрозрачная липосомальная дисперсия синего цвета, объем которой составлял 30-40 мл (рН 6,1-6,5);

II фракция — свободный Фотосенс, голубой прозрачный раствор. Объем раствора 15-25 мл (рН 6,1-6,5).

В табл. 1 представлены результаты количественного определения Фотосенса во фракциях, собранных после гель-фильтрации. Определение проводили методом спектрофотометрии. Содержание Фотосенса в ли-посомах составило от 80 до 91 %.

Таблица 1

Количественное содержание Фотосенса в липосо-мах, определенное методом спектрофотометрии

№ Содержание фотосенса в липосомальной дисперсии, мг/мл Количество фото-сснсав исходной липосомальной дисперсии нанесенной на колонку, мг Количество фотосенса в 1 фракции, мг Количество фотосенса во II фракции, мг Эффективность включения. %

1 5,5 16.5 13Д 3,3 80.0

2 6.5 19.5 16.6 2,9 85.1

3 5,5 16.5 14.8 1,7 89.7

4 5.8 17.4 15,9 1,5 91.0

Рис. 2. Размер многослойных липосом Фотосенса, средний размер 490 нм

При разработке метода тушения флюоресценции при комплексообразовании в качестве противоионов использовали катионные производные фталоцианина кобальта, меди, цинка и алюминия, но только катионное производное фталоцианина алюминия ^lPcPymg) не вызывало нарушения нативности липосом. Таким образом, при добавлении AlPcPymg в липосомальную дисперсию препарата в образовании комплексов будут участвовать лишь те молекулы Фотосенса, которые находятся вне липосом, т. е. при постепенном добавле-

нии А1РсРуш8 по минимуму интегральной флюоресценции представляется возможным определить долю препарата, находящегося вне липосом (см. рис. 1).

Как видно на рис. 1, область минимума интегральной флюоресценции довольно растянута. Поскольку и Фотосенс, и А1РсРуш8 флюоресцируют, то при полном связывании Фотосенса вне липосом остается еще флюоресценция его внутри липосом (слабее по интенсивности вследствие концентрационного тушения), далее, при продолжении титрования раствора А1РсРуш8, к флюоресценции Фотосенса, находящегося внутри липосом прибавляется еще более слабая флюоресценция А1РсРуш8, которому не с чем связаться, поэтому четко визуально определить значение минимума представляется затруднительным. Дополнительным наблюдением в этом анализе является различие между максимумами флюоресценции Фотосенса вне липосом, высокой концентрации его внутри липосом и А1РсРуш (рис. 4).

1.8 693.5

1.6 *1 693

3 1.4 /г 692.5

в 1 691.5 1

| 0.4 690

0-2 А1РсРут8 [мг/литр] 689.5

О 689

0 5 10

Рис. 4. Зависимость интенсивности интегральной флюоресценции при титровании липосомальной дисперсии Фотосенса

Максимумы флюоресценции Фотосенса и А1РсРуш8 немного различны (при используемой конфигурации фильтров для Фотосенса — около 690 нм в зависимости от концентрации, для А1РсРуш8 — 696 нм), т. е. при ком-плексообразовании максимум суммарной флюоресценции будет сначала постоянен, т. к. флюоресцировать будет лишь Фотосенс, а затем, когда в растворе появится несвязанный А1РсРуш8, будет постепенно смещаться от 690 нм в сторону увеличения длины волны. Момент появления свободного А1РсРуш8 на кривой максимума флюоресценции визуально очень хорошо заметен и совпадает с половинной концентрацией А1РсРуш8, необходимой для полного тушения флюоресценции свободного Фотосенса в дисперсии. Этот факт свидетельствует о том, что в случае А1РсРуш8 происходит не димольное комплексообразование, а к одной молекуле Фотосенса присоединяются 2 молекулы А1РсРуш8 по типу сэндвича. В связи с этим уточнением при определении концентрации Фотосенса вне липосом с помощью А1РсРуш8 следует определять концентрацию свободного Фотосенса в растворе как в 2 раза меньшую, чем концентрация связавшегося А1РсРуш8.

В табл. 2 представлены результаты количественного определения Фотосенса, включенного в липосомы. Определение проводили методом тушения флюоресценции при комплексообразовании. Содержание препарата в липосомах составляло от 75 до 85 %.

Таблица 2

Количественное содержание Фотосенса в липосомах, определенное методом тушения флюоресценции при комплексообразовании

№ Содержание фотосенса в липосомальной дисперсии, мг/мл Эффективность включения, %

] 5,5 75,2

2 6,5 81,0

3 5,5 83,6

4 5,8 85,0

Метод тушения флюоресценции при комплексообразовании требует меньше затрат времени и поэтому может быть использован как экспресс-метод для оценки эффективности включения Фотосенса в липосомы при отработки технологии. Количественное определение Фотосенса методом УФ-спектрофотометрии после колоночной хроматографии дает более достоверные результаты и может применяться при контроле качества пространственно стабилизированной липосомальной лекарственной формы препарата.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны специфичные методики количественного определения Фотосенса в липосомах методами УФ-спектрофотометрии и тушения флюоресценции при комплексообразовании.

2. Предлагаемые методики могут быть использованы как в процессе получения лекарственной формы, так и при определении сроков годности готового препарата, а также в технологических исследованиях по усовершенствованию пространственно стабилизированной липосомальной лекарственной формы Фотосенса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Меерович И. Г., Оборотова НА. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ // Рос. биотер. журн. — 2003. — Т. 2, № 4. — С. 3-8.

2. Оборотова Н. А., Барышников А. Ю. Липосо-мальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. — 2001. — Т. 121, №5. — С. 464-475.

3. Смирнова 3. С., Кубасова И. Ю., Макарова О. А. и др. Доклиническое изучение эффективности липосомальной лекарственной формы фотосенса для фотоди-намической терапии // Рос. биотер. журн. — 2003. — Т. 2, № 4. — С. 40-44.

4. Соколов В. В., Филоненко Е. В., Карпова Е. С. и др. // Матер. 2-го Всероссийского симпозиума «Фото динамическая терапия злокачественных новообразований». — М., 1997. — С. 24-25.

5. Чиссов В. И., Соколов В. В., Филоненко Е. В. и др. Современные возможности и перспективы эндоскопической хирургии и фотодинамической терапии злокачественных опухолей // Рос. онкол. журн. — 1998. — №4. — С. 4-12.

6. Чиссов В. И., Соколов В. В., Филоненко Е. В. Фо-тодинамическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и опыт клинического применения в России // Рос. хим. журн. — 1998. — Т. XLII, № 5. — С. 5-9.

7. Grabielle-Madelmont C., Lesieur S., Ollivon M. Characterization of loaded liposomes by size exclusion chromatography // J. Biochem. Biophys. Meth. — 2003. — Vol. 56. — P. 189-217.

8. Lesieur S., Grabielle-Madelmont C., Paternostre M. T., Ollivon M. Size analysis and stability study of lipid vesicles by high-performance gel exclusion chromatography, turbidity, and dynamic light scattering // Anal. Biochem. — 1991. — Vol. 192. — P. 334-343.

9. LundahlP., Zeng C. M., Hagglund C., Gottschalk .I, Greijer E. Chromatographic approaches to liposomes, pro-teoliposomes and biomembrane vesicles // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. — 1999. — Vol. 722. — P. 103-120.

10. Snider J., Greco W., Bellnier D. et al. Photo-dinamic therapy: a means to enhanced drug delivery to tumors // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63, No. 1. — P. 8126-8131.