Изучение хромосом в лейкоцитах культуры периферической крови подростков, подвергавшихся облучению в антенатальном периоде развития

ИЗ ИСТОРИИ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ РАДИАЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ

"Бюллетень радиационной медицины", 1972 год, № 2, сто. S6-91.

Изучение хромосом в лейкоцитах культуры периферической крови подростков, подвергавшихся облучению в антенатальном периоде развития

Окладникова Н.Д.

Проведено цитогенетическое исследование 54 подростков в возрасте 14-16 лет, подвергавшихся хроническому радиационному воздействию в антенатальном периоде развития. Суммарная доза внешнего облучения составила 7,5-150 р. Доза от инкорпорированных изотопов в организме матери не превышала ПДУ. В соматических клетках (лейкоциты культуры периферической крови) выявлены определенные нарушения хромосомного аппарата: повышение уровня структурных нарушений как хромосомного, так и хроматидного типа, увеличение числа клеток с эндоредупликацией хромосом, тенденция к гипер-диплоидии. Частота структурных нарушений хромосомного типа у антенатально облученных подростков в 4 раза превышает спонтанный уровень.

Study of chromosomes in leukocytes of peripheral blood culture of adolescents exposed to radiation in antenatal period

Okladnikova N.D.

A cytogenetic study was conducted for 54 adolescents at the age of 14-16 years exposed to chronic radiation in the antenatal development period. Their total external radiation dose ranged from 7.5 to150 R. The dose from incorporated isotopes in mother’s body was below the maximum permissible level. Some chromosome aberrations were found in somatic cells (leukocytes of peripheral blood culture): an increased level of structural disruptions of both chromosome and chromatid type, an increased number of cells with endoreduplication of chromosomes and a tendency for hyperdiploidia. The frequency of chromosome aberrations in the antenatally exposed adolescents exceeded the spontaneous level by a factor of 4.

Риск антенатального облучения (генетические эффекты, развитие злокачественных новообразований) может быть оценен лишь при всестороннем клиническом обследовании не только в период новорожденное™, но и в отдаленные сроки. Большой практический и теоретический интерес представляет оценка состояния хромосомного аппарата половых и соматических клеток.

Так, А.Д.Блюм с соавторами [1] отмечали, что у антенатально облученных детей (облученные матери были в первом триместре беременности и находились в 1400 м от гипоцентра взрыва в период атомной бомбардировки в Хиросиме и Нагаса-

ки) в клетках культуры лейкоцитов периферической крови частота клеток с хромосомными аберрациями почти в 4 раза превышает контрольный уровень (0,15 и 0,04% соответственно). По данным Р.Миллер [2], у лиц, подвергавшихся антенатальному облучению, в 39% случаев обнаруживаются нарушения генетических структур хромосомного типа.

Мы наблюдали 54 подростка в возрасте 14-16 лет, подвергавшихся хроническому радиационному воздействию в антенатальном периоде развития.

Суммарная доза внешнего облучения за антенатальный период развития* составила 7,5-150 р. Доза от инкорпорированных изотопов в организме матери не превышала ПДУ.

Контрольную группу составили 22 подростка соответствующего возраста, не подвергавшиеся другому радиационному воздействию, кроме диагностического рентгеновского облучения (рентгеноскопия грудной клетки).

При оценке клинического статуса более чем у половины подростков (65%) основной и контрольной групп выявлены сопутствующие заболевания: хронический холецистит и гастрит в фазе ремиссии, хронический ринофарингит и компенсированный тонзиллит, симптомы вегетативно-сосудистой дистонии. Клинических проявлений острого заболевания вирусной этиологии в момент обследования не имел ни один подросток.

Для цитогенетического исследования использован метод 3-суточной культуры лейкоцитов периферической крови (П.С.Мурхед и др., 1960).

Количество клеток с полиплоидным набором хромосом колебалось в пределах 0,0-6,1%о (в среднем 1,38%<>). Все полиплоидные клетки имели набор хромосом не более тетраплоидного. Встречались единичные клетки с эндоредупликацией хромосом (0,03%о).

Структурные нарушения были представлены в основном хроматидными аберрациями: гепами и хроматидными делециями с расположением фрагмента поблизости от места разрыва. Клетки с хроматидными аберрациями составляли 1,62%.

* За величину суммарной дозы антенатального облучения принимали дозу внешнего облучения, полученную матерью с момента зачатия ребенка (по сроку последней менструации) до прекращения контакта с ионизирующим излучением. С этой целью были проанализированы данные индивидуального фотоконтроля матерей по месяцам.

Хромосомные препараты готовили общепринятым методом. В каждом случае считали, как правило, не менее 100 метафазных пластинок. Хромосомы анализировали согласно Денверской системе классификации хромосом человека, учитывая их количество в метафазной пластинке, структурные нарушения хромосомного и хроматидного типа, характер и уровень полиплоидии.

В 3-суточной культуре лейкоцитов периферической крови подростков контрольной группы модальными были клетки с 46 хромосомами. Процент их варьировал в пределах 97,0-100,0, составив в среднем 98,99 (табл. 1). Анэуплоидные клетки имели преимущественно гиподиплоидный хромосомный набор. Потерянные хромосомы относились к группам Е, Р, С-Х, О, в-У. Гипердиплоидные метафазные пластинки встречались значительно реже, чем гиподиплоидные (в среднем 0,09%). Приобретенными были хромосомы малых и средних размеров (в-У, С-Х и Е).

Аберрации хромосомного типа обнаружены в культуре лейкоцитов периферической крови двух подростков (9,1% случаев) - свободно лежащие парные фрагменты с частотой 1,0%. Средняя частота клеток с аберрациями хромосомного типа в контрольной группе 0,09%.

Модальную линию в основной группе, как и в контрольной, составляли метафазные пластинки с числом хромосом 46 (98,54%). Анэуплоидные клетки встречались несколько чаще (1,46%), чем в контроле, но выявленное различие статистически незначимо (р>0,05). Основную часть анэуплоид-ных клеток также составляли гипердиплоидные метафазные пластинки с числом хромосом не менее 44. Потерянными были хромосомы из групп Е, Р, С-Х, О, в-У. Выявлена тенденция к увеличению числа гипердиплоидных клеток (0,09 и 0,29% в контрольной и основной группах соответственно). Все гипердиплоидные метафазные пластинки

Таблица 1

Цитогенетические изменения в клетках культуры лейкоцитов периферической крови подростков основной (54 человека) и контрольной (22 человека) групп

Показатели Основная группа Контрольная группа Значение р

Всего проанализировано метафаз 5569 2160

Процент эуплоидных клеток 93,0-100,0 (98,54) 97,0-100,0 (98,99) р>0,05

Процент анэуплоидных клеток 0,0-7,0 (1,46) 0,0-3,0 (1,01) р>0,05

в том числе гипердиплоидных 0,0-1,0 (0,29) 0,0-1,0 (0,09) 0,01<р<0,05

Количество полиплоидных клеток (%о) 0,0-5,0 (0,97) 0,0-6,1 (1,38) 0,01<р<0,05

в том числе клеток с эндоредупликацией хромосом 0,0-2,5 (0,15) 0,0-1,5 (0,03) 0,01<р<0,05

Процент клеток с хроматидными аберрациями 0,0-9,0 (2,8) 0,0-8,0 (1,62) 0,005<р<0,01

Процент клеток с аберрациями хромосомного типа 0,0-2,0 (0,38) 0,0-1,0 (0,09) 0,005<р<0,05

Примечание. Здесь и в таблице 2 в скобках даны средние значения.

имели набор хромосом не более 47. Приобретенные хромосомы относились к группам в-У, С-Х и Е.

Уровень полиплоидии в культуре лейкоцитов периферической крови подростков основной группы несколько ниже контрольного (0,97 и 1,38%о соответственно). Но у подростков основной группы чаще (0,15%о) обнаруживались метафазные пластинки с эндоредупликацией хромосом по сравнению с контролем (0,03%»).

Структурные нарушения были представлены аберрациями хроматидного и хромосомного типов. Число клеток с хроматидными аберрациями варьировало в пределах 0,0-9,0%, составив в среднем 2,8% (0,01<р<0,05). Доминировали, как и в контроле, ахромагические перерывы - гепы. Пятую часть хроматидных аберраций, как и в контроле, составляли хроматидные делеции. Единичными были изохроматидные разрывы, не обнаруженные в культурах лейкоцитов периферической крови подростков контрольной группы.

Структурные нарушения хромосомного типа

обнаружены у 17 подростков основной группы, т.е. в 31,5% случаев, в контроле - 9,1%. В каждом случае клетки с аберрациями хромосомного типа составляли не более 1%, лишь у одного подростка они составили 2%. Средняя частота клеток с аберрациями хромосомного типа 0,38%. Различия между основной и контрольной группами статистически значимы (р<0,05).

Имелись следующие виды аберраций: свободно лежащие парные фрагменты - 7, разрывы хромосом по центромере - 7, интерстициальные делеции - 4, реципрокные транслокации - 2, дицен-трическая хромосома - 1.

Суммарная доза антенатального облучения значительно варьировала (7,5-150 р). Для решения вопроса о возможной дозовой зависимости частоты хромосомных изменений основную группу разделили на 2 подгруппы: I - 22 подростка с суммарной дозой антенатального облучения 7,5-30 р; II - 32 подростка - 30,1-150 р.

Данные цитогенетического исследования по подгруппам представлены в таблице 2.

Таблица 2

Цитогенетические изменения в клетках культуры лейкоцитов периферической крови подростков основной группы с учетом суммарной дозы антенатального облучения

Показатели Суммарная доза облучения ребенка за антенатальный период, р

7,5-30,0 30,1-150,0

Всего проанализировано метафаз 2200 3369

Процент эуплоидных клеток 98,32 98,69

Процент анэуплоидных клеток 1,68 1,31

в том числе гипердиплоидных 045 0,18 (000-4150) <0,0-1,0> (и,и 1,0) 0,01<р<0,05

Количество полиплоидных клеток, %о оз5 1,12 (00-150) <0,0-5,0> (0,° 1,0) 0,001<р<0,005

в том числе клеток с эндоредупликацией хромосом 0,15 "

Процент клеток с аберрациями хроматидного типа 3,05 2,64

Процент клеток с аберрациями хромосомного типа 055 0,27 (0 0-20) (0,0“1,0) (0,02,0) 0,01<р<0,05

По уровню анэуплоидии не выявлено статистически значимых различий между двумя подгруппами, но гипердиплоидные клетки чаще встречались в культуре лейкоцитов периферической крови подростков I подгруппы. В этой же подгруппе довольно низок уровень полиплоидии по сравнению с контрольной группой и со II подгруппой. Кроме того, при подсчете 20 тыс. митозов ни одной мета-фазной пластинки с эндоредупликацией хромосом не обнаружено.

По частоте клеток со структурными нарушениями хроматидного типа различий между двумя подгруппами не выявлено.

Структурные нарушения хромосомного типа обнаружены у 10 человек I подгруппы (45,5%) и 7 человек II подгруппы (21,9%), а метафазные пластинки с хромосомными аберрациями составили

0,55 и 0,24% соответственно от общего числа проанализированных. Выявленные различия статистически значимы (0,01<р<0,05).

Таким образом, у подростков 14-16 лет, подвергшихся в антенатальном периоде развития внешнему облучению в суммарной дозе 7,5-150,0 р, в соматических клетках (лейкоциты культуры периферической крови) выявлены определенные нарушения хромосомного аппарата: повышение уровня структурных нарушений как хромосомного, так и хроматидного типа, увеличение

числа клеток с эндоредупликацией хромосом, тенденция к гипердиплоидии. Частота структурных нарушений хромосомного типа у антенатально облученных подростков в 4 раза превышает спонтанный уровень.

Литературные сведения о цитогенетических эффектах антенатального облучения малочисленны [1, 2] и касаются не хронического радиационного воздействия, а острого антенатального облучения в период атомной бомбардировки в Хиросиме и Нагасаки (доза облучения, как правило, более 100 р). Различие по характеру и уровню радиационного воздействия не позволяет сравнивать литературные данные с изложенными в настоящей работе результатами. Выявленные нами цитогенетические нарушения в клетках культуры периферической крови антенатально облученных подростков небольшие, но значимы при статистической обработке материала. Часть сдвигов можно рассматривать как результат нарушений в митотическом цикле клеток: увеличение числа клеток с эндоредупликацией хромосом, снижение уровня полиплоидии, тенденция к гипердиплоидии.

Увеличение числа клеток с эндоредупликацией хромосом после облучения показано исследованиями in vitro и in vivo [3-5]. В наших исследованиях повышение частоты клеток с эндоредупликацией хромосом в культуре лейкоцитов периферической крови было обнаружено у больных с хронической лучевой болезнью в отдаленные сроки после прекращения контакта с радиацией и у пациентов в отдаленные сроки острого внешнего у-нейтронного облучения [6, 7]. Вероятно, эндоредупликации - торможение митоза на стадии формирования веретена - имеют связь с облучением, которому подвергались обследованные подростки.

Небольшое снижение уровня полиплоидии отмечено при дозе антенатального облучения до 30 р. Известно, что полиплоидные клетки появляются в культуре лейкоцитов и их количество увеличивается в процессе культивирования. В трехсуточной культуре лейкоцитов периферической крови большинство клеток находится во втором митозе, и часть вступает в третий митоз [8, 9]. Уменьшение частоты полиплоидных клеток в культуре лейкоцитов периферической крови подростков основной группы может быть обусловлено тем, что за 72-часовой период культивирования из-за изменения продолжительности отдельных фаз митотического цикла число клеток, успевающих вступить во 2-й и 3-й митозы, меньше, чем в контрольных культурах. Это предположение в определенной мере подтверждается и отсутствием клеток с эн-

доредупликацией хромосом в I подгруппе (частота эндоредупликаций коррелирует с количеством полиплоидных клеток [10]). Выявленные небольшие нарушения в митотическом цикле клеток могли быть индуцированы облучением в антенатальном периоде развития и сохраняться в поколениях клеток.

Характер структурных нарушений хромосом (хроматидные аберрации, возникающие, как правило, в культуре или под действием механических факторов в процессе приготовления хромосомных препаратов, а также нестабильные хромосомные аберрации) позволяет расценивать их как проявление повышенной ломкости генетических структур, возможно, реализации радиационно индуцированных латентных нарушений, сохраняемых в поколениях клеток.

Реализации латентных хромосомных повреждений мог способствовать такой неспецифический фактор, как изменение условий в процессе культивирования изучаемых клеток.

Как количественные хромосомные изменения, так и структурные нарушения чаще обнаруживались при малой дозе антенатального облучения (до 30 р). По-видимому, при более высоких дозах индуцировались более грубые структурные повреждения и клетки с такими аберрациями элиминировались в процессе последующих клеточных делений.

Цитогенетические изменения в соматических клетках антенатально облученных подростков, возможно, сочетаются с нарушениями в геноме и половых клетках, что создает необходимость дальнейшего наблюдения за данным контингентом в генетическом аспекте.

Литература

1. Bloom A.D., Neriishi Sh., Kamado N., Jscki T. In Human Rad. Cytogenetics, Amsterdam, 1967, p. 136.

2. Miller R.W. Science, 1969, 166, 3905, p. 569.

3. Ohnuki I., Awa A., Pomerat C.M. Ann. New York Acad. Sci, 1961, 95, p. 862.

4. Bell A.G. Science, 1964, 143, p. 139.

5. Friedman B.I., Saenger E.L., Kleindler M.S. Lancet, 1964, 2, 7358, p. 494.

6. Окладникова Н.Д. Бюллетень радиационной медицины, 1969, №3. стр. 32.

7. Окладникова Н.Д. Генетика, 1970, VI, № 2, стр. 152.

8. Bender M.A., Prescott D.M. Exptl. Cell Res., 1962, 27, p. 221.

9. Sasaki M.S., Norman A. Nature, 1966, 210, p. 913.

10. Nasjleti C.E., Walden I.M., Spencer H.H. New England, J. Med., 1965, 272, p. 250.