СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГКР-ЧИПА ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
METHOD OF PRODUCING GRC-CHIP FOR IMMUNOCHEMICAL ANALYSIS

Изобретение относится к созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).
В настоящее время иммуночипы находят применение в скрининге антител, обнаружении наркотических веществ, диагностических системах для многих заболеваний (малярии, СПИДа, туберкулеза и т.д.) и многих других областях.
В настоящее время развитие ИХА направлено не только в сторону повышения точности определения искомого вещества, но и на уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов и возможность проведения анализа вне стен лаборатории. На практике уже нашли широкое применение системы для быстрого скрининга - тест-полоски (стрип-тесты) [М.-С. Hennion, D. Barcelo «Strengths and limitations of immunoassays for effective and effcient use for pesticide analysis in water samples: A review», Analytica Chimica Acta, 1998, 362, 3-34]. Но, несмотря на высокую скорость получения аналитического отклика, они имеют относительно невысокую чувствительность и служат лишь для качественного определения вещества в пробе. Ограничения мобильности многих методов ИХА из-за громоздкости оборудования, применяемого для детекции иммунных комплексов, дали стимул многим исследователям к разработке портативных оптических систем, интегрированных с иммуночипами (иммуносенсорами) [D. Sugumar, L. Kong «Lab-on-Chip Devices for Immunoassays)), In: Li D. (eds) Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics, 2015, Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-5491-5_775].
Разработано большое количество различных ГКР-субстратов, предназначенных для решения разнообразных задач по идентификации веществ с применением ИХА. Например, в патентной заявке [GB 2439656 А, 2006 «Detection of enhanced multiplex signals by surface enhanced raman spectroscopy (sers)»] для таргетного захвата антигенов из аналита применяют чипы с иммобилизованными на их поверхностях меченными ГКР-репортерами антителами. Для получения сигнала используют детектирующие антитела, ковалентно связанные с наночастицами золота. Недостатком этого изобретения является трудновоспроизводимая методика синтеза конъюгатов антител и наночастиц серебра.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения взят способ получения ГКР-чипа, описанный в патенте [0587008 А1, 1994 «Surface-enhaced raman spectroscopy immunoassay))]. На очищенную поверхность предметных стекол осаждались частицы серебра, полученные путем восстановления реагента Толленса D-глюкозой. Таким образом была сформирована наноостровковая пленка металла толщиной порядка 100 нм. Чипы показали хорошее усиление сигнала комбинационного рассеяния на примере динитробензола и его конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Была продемонстрирована принципиальная возможность определения соединений на примере изменения ГКР-спектров 2-[4-гидроксифенилазо]бензойной кислоты вследствие ее специфического взаимодействия с авидином. К недостаткам изобретения следует отнести:
• достаточно сложную и трудновоспроизводимую методику получения ГКР-поверхности;
• наноостровковая серебряная пленка, получаемая на предметных стеклах, обладает неоднородными свойствами, что может привести к невоспроизводимости результатов анализа;
• не приведены статистические данные о воспроизводимости сигнала с применением получаемых ГКР-чипов, что ставит под сомнение возможность их реализации в количественном ИХА;
• короткий срок хранения - 1 неделя.
Техническим результатом предложенного изобретения является совершенствование способа получения ГКР-чипа для ИХА, повышение стабильности и воспроизводимости получаемых результатов анализа, а также увеличение срока хранения.
Технический результат достигается путем получения ГКР-чипа для ИХА, представляющего собой кремниевую подложку, модифицированную веществами следующей структуры:
3
2
5
2
где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН, -ОСН; Y=-NH, -CN, -SH; n=3-10, с иммобилизованными на ее поверхности в двух зонах коллоидными частицами серебра. Коллоидный раствор серебра для иммобилизации получен путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия и его последующим концентрированием. В качестве метки используют вещество, обладающее хорошо различимым ГКР-спектром и хорошо связывающееся с белковыми молекулами.
Изобретение характеризуется следующими графическими материалами:
• Фиг. 1 - Поверхность кремниевой подложки после иммобилизации на нее частиц серебра из коллоидного раствора;
• Фиг. 2 - ГКР-спектр тетраметилродаминизотиоцианата (ТРИТЦ), полученного на изготовленных ГКР-субстратах;
-1
• Фиг. 3 - Распределение величины относительной интенсивности сигнала первой и второй зон внутри партии ГКР-подложек. Интенсивность спектров оценена по величине пика спектра ТРИТЦ 1641 см. По оси абсцисс отложены отношения интенсивностей сигнала первой и второй зон, по оси ординат - количество подложек, соответствующих этим отношениям;
кр
• Фиг. 4 - График зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата иммуноглобулина кролика с ТРИТЦ (IgG-ТРИТЦ) в координатах lgI (-lgC).
Пример 1.
Приготовление коллоидного раствора нитрата серебра
5,1 мг нитрата серебра марки х.ч. растворяют в 30 мл деионизированной воды. 9,8 мг цитрата натрия растворяют в 300 мкл деионизированной воды. Раствор нитрата серебра доводят до кипения при интенсивном перемешивании и к нему по каплям добавляют раствор цитрата натрия. Реакцию проводят в течение 60 минут. После этого полученный коллоидный раствор охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в 2-50 раз в ячейке на мембране с размером пор 4 нм.
Пример 2
Модифицирование кремниевых подложек
Кремниевые подложки обрабатывают ультразвуком в аммиачной смеси в течение 30 минут, затем тщательно промывают деионизированной водой.
Промытые подложки обрабатывают ультразвуком в 0,1-15% водном растворе вещества структуры:
3
2
5
2
где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН, -ОСН; Y=-NH, -CN, -SH; n=3-10, после чего тщательно промывают деионизированной водой.
Пример 3
Иммобилизация частиц серебра на модифицированную кремниевую поверхность
На каждую кремниевую подложку из примера 2 наносят по 2 одинаковые капли коллоидного раствора серебра из примера 1. Иммобилизацию частиц серебра проводят в течение 2 часов в закрытой чашке Петри, после чего подложки высушивают и промывают водой. Поверхность полученных ГКР-субстратов охарактеризована при помощи двухлучевого просвечивающего электронного микроскопа (Фиг. 1).
Пример 4
Получение сигнала на ГКР-субстратах
Полученные ГКР-субстраты погружают в 0,02% водный раствор ТРИТЦ на 5 минут, после чего ополаскивают в воде, высушивают на воздухе и проводят измерение сигнала при длине волны возбуждающего лазера 523 нм (Фиг. 2).
Пример 5
Характеристика воспроизводимости сигнала
-1
Проводят статистическую обработку относительной интенсивности сигнала первой и второй зоны для 100 ГКР-подложек по величине пика 1641 см с применением методики, описанной в примере 4 (Фиг. 3). Из рисунка видно, что для ГКР-субстратов, полученных заявляемым способом, отклонение отношения интенсивностей сигналов двух зон не превышает 20% для каждой из подложек.
Пример 6
кр
Приготовление конъюгата IgG-ТРИТЦ
кр
IgG был выбран в качестве модели из-за того, что антитела, применяемые во всех известных схемах ИХА, относятся к этой фракции белков.
кр
кр
1 rp IgG растворяют в 5 мл физиологического раствора и доводят рН до 9,0, затем при интенсивном перемешивании к нему добавляют по каплям 6 мл свежеприготовленного раствора ТРИТЦ в ДМСО (с=2,5 мг/мл). Реакцию проводят 3 часа при рН 9,0. Реакционную смесь отделяют от непрореагировавшего ТРИТЦ диализом против PBS. В результате получается раствор меченого IgG-ТРИТЦ в PBS с концентрацией белка 1 мг/мл и соотношением белок/краситель - 1/4.
Пример 7
Определение зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG-ТРИТЦ
кр
кр
-3
-3
-3
Делают серию кратных разведений раствора IgG-ТРИТЦ из примера 6 путем его разбавления PBS в 2 раза. Таким образом получают растворы меченого белка с концентрациями от 1 до 2,0×10 мг/мл. В эти растворы погружают подложки аналогично примеру 4. На основании полученных данных построен график зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG-ТРИТЦ в логарифмических координатах (Фиг. 4). Из рисунка видно, что график имеет прямолинейный участок при значениях -lgC от 0 до 2, что соответствует диапазону концентраций белка от 1 до 8,0×10 мг/мл. Это говорит о том, что применение при таких условиях меченых иммунореагентов делает возможным реализацию различных схем твердофазного ИХА (прямой, сэндвич, конкурентный) в количественном анализе. В конкретном случае предел обнаружения белкового соединения будет составлять 8,0×10 мг/мл, так как после этой точки график выходит на плато. Этот предел можно будет впоследствии снизить путем подбора другого более чувствительного красителя или методики мечения иммунореагентов.