Оптимизация способов выявления у животных рецессивных мутаций

УДК 636.2.034:636.2.082.2

ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ВЫЯВЛЕНИЯ У ЖИВОТНЫХ РЕЦЕССИВНЫХ МУТАЦИЙ

Нургалиев Ф.М., Тюлькин С.В., Ахметов Т.М.

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: мутация, дефицит адгезии лейкоцитов у КРС, свиной, стрессовый синдром, ген, ПЦР, ДНК.

Key words: mutation, Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD), porcine, stress syndrome, gene, PCR, DNA.

Интенсивное использование мирового породного генофонда и биотехнологий репродукции (искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов) позволили значительно повысить генетический потенциал продуктивности животных за счет получения потомства производителей -лидеров породы. Вместе с тем в поголовье все чаще проявляются признаки генетической эрозии - накопления груза вредных рецессивных мутаций (Н.С. Марзанов и др., 2007; А.И. Жигачев, Л.К. Эрнст, А.С. Богачев, 2008).

Использование быков-производителей голштинской породы для «улучшения» популяций черно-пестрого скота в их генофонд одновременно с интродукцией полезных были введены рецессивные мутации, обусловливающий дефицит адгезии лейкоцитов (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency - BLAD, т.е. первая группа сцепления, ген CD 18, обозначаемый также как локус 2244). BLAD-синдром - это нарушение обусловлено мутацией гена интегрина и проявляется в подавлении клеточного иммунитета. У особей, гомозиготных по рецессивному аллелю, резко снижается устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям, замедляется рост. Большинство телят погибает в возрасте 3-7 мес. от кишечных и легочных инфекций (D.E. Shuster, M.E. Kehrli, M.R. Ackermann, 1992; А.И. Жигачев, Л.К. Эрнст, А.С. Богачев, 2008).

В последние десятилетия успешное развитие отрасли свиноводства связывают с интенсификацией селекционного процесса на получение животных с высокими мясными кондициями и улучшенным качеством мяса. В то же время данный процесс в условиях промышленной технологии сопровождается увеличением количества свиней с повышенной чувствительностью к стрессам. Главным геном, обусловливающим проявление этого признака, является рианодин-рецепторный ген RYR 1 и наличием в нем точечной мутации (E. Nakajima et al., 1996; Г.М. Гончаренко, 2009; О.В. Плужникова, 2009).

Генетически обусловленная чувствительность свиней к стрессу является существенной проблемой в животноводстве, изучаемой во многих лабораториях. Падежи в неблагоприятных окружающих условиях (высокая плотность содержания, транспортировка), сниженная плодовитость хряков

- это постоянные проблемы в свиноводстве. После убоя, процесс которого также является стрессогенным, ценность показателей качества мяса чувствительных животных (рН, водопоглощаемость, окраска) дисквалифицируют его как сырье для переработки (В.И. Глазко и др., 2001).

Всё выше сказанное говорит о важности изыскания новых способов выявления рецессивных мутаций у животных.

Материал и методика исследований. Для проведения ДНК-диагностики у животных были отобраны пробы крови.

Кровь, полученную у животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом: 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Анализ BLAD-мутации. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы, по 0,5 мкМ праймеров BLAD-F: 5' - TCC GGA GGG CCA AGG GCT A - 3' и BLAD-R: 5' - GAG TAG GAG AGG TCC ATC AGG TAG TAC AGG - 3', сконструированных К.Е. Грир и др. (C.E. Greer et al., 1991) для амплификации фрагмента гена CD 18 длиной 58 пар нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

х1:94 0С - 4 мин; х40:94 0С - 20 сек, 69 0С - 20 сек, 72 0С - 20 сек;

х1:72 0С - 7 мин; хранение: 4 0С.

Для выявления BLAD-мутации 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1хбуфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.

Анализ локуса гена RYR 1. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера Ryr1-p-f: 5' - TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA - 3', 0,5 мкМ праймера Ryr1-p-r: 5' - TTC ACC GGA GTG GAG TCT CTG AGT -3', сконструированных В.М. Риоджас-Валдес (V.M. Riojas-Valdes et al., 2005) для амплификации фрагмента гена Ryr-1 длиной 659 пары нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

х1:94 0С - 4 мин; х40:94 0С - 1 мин, 52 0С - 1 мин, 72 0С - 1 мин;

х1:72 0С - 7 мин; хранение: 4 0С.

Для определения аллельного полиморфизма гена RYR 1 по вариантам N и n 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 2 ед. эндонуклеазы рестрикции Bbv12I в 1хбуфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи.

Детекция. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 4% (BLAD-мутация) и 2,5% (RYR 1) агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1 хТВЕ буфере.

После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР-ПДРФ.

Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы известных протоколов по выявлению у крупного рогатого скота BLAD-мутации нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: BLAD-F: 5 -TCCGGAGGGCCAAGGGCTA-3/ и BLAD-R: 5 -GAGTAGGAGAGGTCCATCAG GTAGTACAGG-3/, сконструированных К.Е. Грир и др. (C.E. Greer et al., 1991) по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «Материал и методика исследований»).

Праймеры BLAD-F+BLAD-R инициируют амплификацию фрагмента для выявления BLAD-мутации крупного рогатого скота длиной 58 bp (рис. 1), у здоровых животных ПДРФ-HaeIII профиль 49/9 bp, у больных животных 30/19/9 bp и у животных-носителей BLAD-мутации 49/30/19/9 bp.

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию свиней по гену RYR 1 нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: Ryr1-p-f: 5' - TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA - 3' и Ryr1-p-r: 5' - TTC ACC GGA GTG GAG TCT CTG AGT - 3', сконструированных В.М. Риоджас-Валдес (V.M. Riojas-Valdes et

аі., 2005) по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «Материал и методика исследований»).

12 3 4 5 М

1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ для выявления у крупного рогатого скота БЬЛО-мутации с праймерами

БЬЛО-Р+БЬЛО-К и эндонуклеазным расщеплением ферментом НаеІІІ Обозначения: 1) цельный ПЦР-фрагмент гена СБ 18 (58 Ьр); 2, 3, 4, 5) генотип с отсутствием БАЛБ-мутации; М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим).

Праймеры Яуг1-р-Г+Яуг1-р-г инициируют амплификацию фрагмента гена ЯУЯ 1 (стрессового синдрома) свиней длиной 659 Ьр, а / К//-ПДРФ-БЬ\12І профиль NN=524/135 Ьр (здоровые особи), N«=524/358/166/135 Ьр (особи-носители мутации, рис. 2) ««=358/166/135 Ьр (больные особи) идентифицирует его генотипы.

М I 2 3 +5

700 ^

600^

500 400

300^

200 -э

100^

2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена ЯУЯ 1 с праймерами Яуг1-р-Г+Яуг1-р-г и эндонуклеазным расщеплением

ферментом БЬу/2і

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим); 1, 2) генотип NN (524/135 bp); 3, 4) генотип Nn (524/358/166/135 bp); 5) цельный ПЦР-фрагмент гена RYR 1 (659 bp).

Вывод. Полученные результаты ПЦР-ПДРФ-анализа с праймерами (BLAD-F+BLAD-R) и (Ryr1-p-f+Ryr1-p-r) являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов рецессивных мутаций по генам CD 18 и RYR 1.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Глазко, В. И. Введение в ДНК-технологии / В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, Л.А. Калашникова // М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001. - 436 с. 2. Гончаренко, Г. М. Генетическая структура популяций сельскохозяйственных животных Западной Сибири и использование маркёров в селекции : автореф. дисс. ... докт. биол. наук: 06.02.01 / Гончаренко Галина Моисеевна. - Новосибирск, 2009. - 37 с.

3. Жигачев, А. И. О накоплении груза мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым признакам / А.И. Жигачев, Л.К. Эрнст, А.С. Богачев // С.-х. биология. - 2008. - № 6. - С. 25-32. 4. Марзанов, Н. С. Современная характеристика понятия порода / Н.С. Марзанов, [и др.] // С-х. биология. - 2007. - № 6. - С. 16-23. 5. Плужникова, О. В. Естественная резистентность, воспроизводительные и мясные качества свиней в связи с их аллельным состоянием по локусу Ryr-1 гена : автореф. дисс. ... канд. биол. наук : 06.02.01 / Плужникова Ольга Викторовна. - Ставрополь, 2009.

- 19 с. 6. Greer, C. R. PCR amplification from paraffin embedded tissues: Effects of fixative and fixation times / C.R. Greer, S.L. Peterson, N.B. Kiviat, M.M. Manos // American Journal of Clinical Pathology, 1991. - 95: 117-124. 7. Nakajima, E. Technical note: use of a PCR-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) for detection of a point mutation in the swine ryanodine receptor (RYR1) gene / E. Nakajima [et al.] // Journal of Animal Science. - 1996. - V. 74. - P. 2904-2906. 8. Shuster, D. E. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion in Holstein cattle / D.E. Shuster, M.E. Kehrli, M.R. Ackermann // PNAS. - 1992. - 89: 9225-9229. 9. Riojas-Valdes, V. M. Allele frequency of porcine stress syndrome in Nuevo Leon by PCR-RFLP analysis / V.M. Riojas-Valdes [et al.] // Veterinaria Mexico. - 2005. - V. 36. - № 003. - P. 261-267.

ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ВЫЯВЛЕНИЯ У ЖИВОТНЫХ РЕЦЕССИВНЫХ

МУТАЦИЙ

Нургалиев Ф.М., Тюлькин С.В., Ахметов Т.М.

Резюме

В данной работе представлены результаты оптимизированных протоколов по индикации и идентификации генотипов по генам CD 18 и

RYR 1. Исследования показали, что ПЦР-ПДРФ-анализ с праймерами (BLAD-F +BLAD-R) и (Ryr1-p-f+Ryr1-p-r) является удовлетворительным в плане воспроизводимости и идентификации генотипов рецессивных мутаций у крупного рогатого скота и свиней.

OPTIMIZATION OF WAYS OF REVEALING AT ANIMAL RECESSIVE MUTATIONS

Nurgaliev FM., Tjulkin S.V., Ahmetov T.M.

Summary

In the given work results are presented of the optimized reports on indication and identification of genotypes on genes of CD 18 and RYR 1. Researches have shown that the PCR-RFLP-analysis with primers (BLAD-F+BLAD-R) and (Ryr1-p-f+Ryr1-p-r) are satisfactory in respect of reproducibility and identification of genotypes of recessive mutations at a cattle and pigs.

УДК 619:616.982

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ДРУГИХ

МИКОБАКТЕРИЙ

Нуруллин А.А.*, Ахметов Т.М.

Филиал ГОУ ВПО «Камская государственная инженерно-экономическая

академия» в г. Чистополе*

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана»

Ключевые слова: микобактерии, туберкулез, возбудитель,

вертикальный гель-электрофорез, дифференциальная диагностика.

Key words: micobacteria, tuberculosis, originator, vertical gel-

electrophoresis, differential diagnostics.

Наукой и практикой достигнуты определенные успехи в борьбе с туберкулезом сельскохозяйственных животных, однако эта инфекция остается одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии (Н.А. Донченко, 2008).

В настоящее время туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее актуальных медико-биологических и социально-экономических проблем, стоящих перед мировым сообществом (А. А. Шурыгин, 2009).