СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БОТУЛОТОКСИНА
METHOD OF PRODUCING BOTULINUM TOXIN

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения ботулотоксина с помощью процесса без использования животных продуктов (APF), и, более конкретно, к способу получения ботулотоксина, включающему следующие стадии: (а) обработки культуры ботулотоксин-продуцирующего штамма кислотой с образованием осадка, содержащего ботулотоксин; (b) добавления буфера к осадку, содержащему ботулотоксин, стадии (а), и затем кларификации одним или несколькими способами, выбранными из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильной фильтрации, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования; (c) проведения с раствором стадии (b), содержащим ботулотоксин, стадии UF-диафильтрации, осаждения сульфатом аммония или осаждения соляной кислотой, с последующим разбавлением ретентата, полученного в результате UF-диафильтрации, в буфере, или растворение осадка, полученного в результате осаждения сульфатом аммония или соляной кислотой, в буфере; и (d) проведения с разбавленным ретентатом, раствором после осаждения сульфатом аммония или раствором после осаждения соляной кислотой со стадии (с) анионообменной хроматографии (AEX), с очищением тем самым ботулотоксина.
Предшествующий уровень техники
Начиная с 1980-х годов, было обнаружено множество штаммов Clostridium sp., выделяющих нейротоксические токсины, и описание характеристик токсинов, выделяемых из этих штаммов, было осуществлено в течение последних 70 лет.
Нейротоксичные яды, полученные из штаммов Clostridium sp., то есть ботулотоксины, подразделяются на восемь типов (типы А-Н) в зависимости от их серологических свойств. Каждый из токсинов имеет белок токсина размером около 150 кДа, и в природе включает комплекс нескольких нетоксичных белков, связанных с ним. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка токсина и нетоксичного белка не-гемагглютинина, а большой комплекс (450 кДа) и очень большой комплекс (900 кДа) состоят из комплексов средних размеров, связанных с гемагглютинином (Sugiyama H., Rev., 44:419, 1980). Такие нетоксичные гемагглютининовые белки, как известно, действуют, выполняя роль защиты токсина от низкого рН и различных протеаз в кишечнике.
Токсин синтезируется в клетках в виде одиночного полипептида, имеющего молекулярную массу около 150 кДа, а затем расщепляется в позиции, отстоящей на 1/3 от N-конца, под действием внутриклеточной протеазы или при обработке искусственным ферментом, таким как трипсин, на две единицы: легкую цепь (L, молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелую цепь (Н; молекулярная масса: 100 кДа). Расщепленный токсин имеет существенно повышенную токсичность по сравнению с целым полипептидом. Два блока соединяются друг с другом дисульфидной связью и имеют различные функции. Тяжелая цепь связывается с рецептором клетки-мишени (Park. M.K. et al., FEMS Microbiol. Lett., 72: 243, 1990) и взаимодействует с биомембраной при низком рН (рН 4), образуя канал (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18: 324, 1993), а легкая цепь имеет фармакологическую активность, и, таким образом, придает клеткам проницаемость при использовании детергента или нарушает секрецию нейротрансмиттеров, когда вводится в клетки, например, путем электропорации или т.п. (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988).
Токсин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения, чтобы вызывает астению. Считается, что токсичность демонстрирует обработка очень небольшим количеством токсина, что позволяет предположить, что токсин имеет некую ферментативную активность (Simpson, LL et al., Ann. Rev. Pharmaeol.Toxicol., 26:427, 1986).
Согласно недавнему отчету, токсин обладает активностью металлопептидазы и его субстраты включают синаптобревин, синтаксин, cинаптосомально-ассоциированный белок, 25 кДа (SNAP-25) и т.д., которые являются единичными белками комплекса системы экзоцитоза. Каждый тип токсина использует один из описанных выше трех белков в качестве своего субстрата, и известно, что токсины типа B, D, F и G расщепляют синаптобревин в специфическом участке, токсины типа А и Е расщепляют SNAP-25 в специфическом участке, а типа C расщепляет синтаксин в специфическом участке (Binz, T.et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994).
В частности, ботулотоксин типа А, как известно, растворим в разбавленном водном растворе при рН 4,0-6,8. Известно, что стабильный нетоксичный белок отделяют от нейротоксина при рН около 7 или выше, и, как следствие, токсичность постепенно теряется. В частности, известно, что токсичность уменьшается по мере роста рН и температуры.
Ботулотоксин является смертельным для человеческого организма даже в небольших количествах и легко производится в больших количествах. Таким образом, этот токсин представляет собой один из четырех основных боевых средств биотеррора вместе с Bacillus anthracis, Yersinia pestis и вирусом натуральной оспы. Однако было обнаружено, что, когда ботулотоксин типа А вводят в дозе, которая систематически не влияет на человеческий организм, токсин может парализовать локальную мышцу в инъецируемом участке. На основании этой характеристики, ботулотоксин типа А может быть использован в широком диапазоне применений, включая агенты для удаления морщин, агенты для лечения спастической гемиплегии и церебрального паралича, и т.д. Таким образом, спрос на ботулотоксин типа А растет и активно проводятся исследования способов получения ботулотоксина для удовлетворения спроса.
Текущий типичный коммерческий продукт BOTOX (очищенный нейротоксиновый комплекс ботулотоксина типа А) коммерчески доступен у Allergan, Inc., США. Флакон BOTOX на 100 единиц состоит из примерно 5 нг очищенного нейротоксинового комплекса ботулотоксина типа А, 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия и восстанавливается с помощью стерильного физиологического раствора без консерванта (инъекция 0,9 % хлорид натрия). Другие коммерческие продукты включают Dysport (комплекс ботунилинического токсина А типа из Clostridium и гемагглютинин, который имеет лактозу и человеческий сывороточный альбумин в фармацевтической композиции, содержащей ботулотоксин и восстанавливается 0,9% хлоридом натрия перед использованием), который является коммерчески доступным у Ipsen Ltd., Великобритания, и Myobloc (инъекционный раствор (рН около 5,6), содержащий ботулотоксин типа В, человеческий сывороточный альбумин, сукцинат натрия и хлорид натрия), который коммерчески доступен у Solstice Neurosciences, Inc.
Обычные способы, используемые для получения ботулотоксинов, включают способ осаждения кислотой, способ осаждения солью и хроматографический способ.
Например, в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии № 1994-192296 раскрыт способ получения кристаллического ботулотоксина типа А путем культивирования бактерий Clostridium botulinum с последующим осаждением кислотой, экстракцией, добавлением нуклеазы и кристаллизацией. Кроме того, в патенте США № 5696077 раскрыт способ получения кристаллического ботулотоксина типа B путем культивирования бактерий Clostridium botulinum с последующим проведением осаждения кислотой, экстракции, ионообменной хроматографии, гель-фильтрационной хроматографией и кристаллизации.
Simpson et al. получали ботулотоксин типа А путем очистки ботулинического нейротоксина с помощью гравитационной хроматографии с последующей ВЭЖХ, захвата с использованием аффинной смолы, эксклюзионной хроматографии и ионо (анионо- и катионо-) обменной хроматографии, включая использование двух различных ионообменных колонок (Method in Enzymology, 165: 76, 1988), и Wang et al. использовали осаждение и ионную хроматографию для очистки ботулотоксина типа A (Dermatol Las Faci Cosm Surg., 2002: 58, 2002).
Кроме того, в патенте США № 6818409 описано использование ионообменных и лактозных колонок для очистки ботулотоксина, а в патенте США № 7452697 раскрыт способ получения ботулотоксина типа А с помощью ионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии. В опубликованной заявке на патент Кореи № 2009-0091501 раскрыт способ очистки ботулотоксина с помощью кислотного осаждения и анионообменной хроматографии, а в патентной публикации США № 2013-0156756 раскрыт способ очистки ботулотоксина с помощью анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии.
Однако обычные способы имеют проблемы, которые заключаются в том, что использование анионообменной хроматографии неблагоприятно влияет на паттерн полос ботулотоксинов в геле (патент США № 7452697) и в том, что эти обычные способы трудно применять коммерчески из-за длительного времени очистки. Кроме того, поскольку продуцирующий ботулотоксин штамм Clostridium botulinum является анаэробной бактерией, возникает проблема, которая заключается в том, что ферментация бактерии должна проводиться в анаэробной системе, и поэтому ботулотоксины в больших количествах продуцировать трудно. Кроме того, существует проблема, которая заключается в том, что активный ингредиент ботулотоксина, очищенный описанным выше способом очистки, полностью не разделяется и не идентифицируется четко и, следовательно, содержит примеси. Кроме того, обычные способы получения ботулотоксинов имеют проблему, которая заключается в том, что процесс фильтрации или диализа обязательно выполняется для очистки ботулотоксина высокой степени чистоты, что указывает на то, что процесс очистки является сложным и комплексным.
Кроме того, в обычных способах продуцирования ботулотоксина ферменты, такие как ДНКаза или РНКаза, используются для удаления нуклеиновых кислот, таких как ДНК или РНК (см., например, корейский патент № 10-1339349, и традиционный способ получения ботулотоксина, показанный на Фиг. 1). Однако, поскольку ферменты, такие как ДНКаза или РНКаза, имеют животное происхождение, эти ферменты могут содержать различные вызывающие болезнь вещества, особенно аномальные прионные белки животного происхождения, которые, как известно, вызывают трансмиссивную губчатую энцефалопатию и, следовательно, имеют проблемы с точки зрения безопасности.
Трансмиссивная губчатая энцефалопатия (TSE) известная как нейродегенеративное расстройство, вызывающее тяжелую дегенерацию нейронов, и его примеры включают коровью губчатую энцефалопатию (BSE), почесуху, болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, куру, трансмиссивную энцефалопатию норок, хроническую изнуряющую болезнь, кошачью губчатую энцефалопатию и т.д., которые влияют на людей и животных. Было сообщено, что BSE пересекает видовой барьер и поражает даже людей.
Агент, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию (TSE), имеет особенности, которые заключаются в том, что он не имеет иммуногенности, и инкубационный период является длинным. Из гистопатологического анализа BSE-пораженной ткани головного мозга крупного рогатого скота, можно видеть, что специальные губчатые вакуоли сформировались в головном мозге из-за повреждения нейронов и отложения аномальных белковых волокон.
Причиной TSE является инфекционный белок, известный как аномальный прион. В отличие от обычных вирусов, которым необходимы нуклеиновые кислоты, аномальный прион представляет собой инфекционную частицу, состоящую только из белка, без нуклеиновой кислоты. Что касается TSE, то известно, что, когда аномальный прион (PrPsc), который представляет собой инфекционную частицу, связывается с нормальным прионом (PrPc), то он превращается в патогенный прион, который затем накапливается в головном мозге (Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord., 3:52-78, 1989).
Болезнь Крейтцфельда-Якоба является редким нейродегенеративным расстройством, человеческой трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), при которой трансмиссивный агент представляет собой, по-видимому, аномальную форму прионного белка. У индивидуума с болезнью Крейтцфельда-Якоба кажущееся совершенное здоровье может ухудшиться в акинетический мутизм в течение шести месяцев. Таким образом, может иметь место потенциальный риск приобретения прион-опосредованного заболевания, такого как болезнь Крейтцфельда-Якоба, из-за введения фармацевтической композиции, которая содержит биологическое вещество, такой как ботулотоксин, полученное с использованием продуктов животного происхождения. Таким образом, если фармацевтическая композиция готовится с использованием лекарственного вещества, полученного с использованием компонентов животного происхождения, она может подвергать пациента потенциальному риску получения различных патогенов или инфекционных агентов.
Таким образом, срочно необходим способ получения ботулотоксина с помощью процесса без продуктов животного происхождения (APF) для решения проблем безопасности, таких как трансмиссивная губчатая энцефалопатия, вызванная такими компонентами животного происхождения во всем мире.
При таких технических предпосылках авторы настоящего изобретения предприняли значительные усилия для разработки способа, способного предотвращать риск заражения прион-опосредованным заболеванием (трансмиссивной губчатой энцефалопатией (TSE)) и для повышения чистоты ботулотоксина, и, как следствие, обнаружили, что когда культуру ботулотоксин-продуцирующего штамма обрабатывают кислотой с образованием осадка ботулотоксина и образовавшийся осадок ботулотоксина очищают, используя, по меньшей мере, один метод, выбранный из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильной фильтрации, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования, которые являются процессами предварительной обработки, с последующим выполнением процесса, выбранного из UF-диафильтрации, осаждения сульфатом аммония и осаждения соляной кислотой с последующей очисткой с использованием анионо-/катионообменной хроматографии, стадию ферментативной обработки, которая использует продукты животного происхождения, можно исключить для устранения риска возникновения прион-опосредованного заболевания, а чистота ботулотоксина может быть увеличена, что завершает настоящее изобретение.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является создание более эффективного и безопасного способа получения ботулотоксина, который может быть осуществлен в условиях без использования продуктов животного происхождения (APF).
Более конкретно, целью настоящего изобретения является создание способа получения ботулотоксина, в котором стадию ферментативной обработки с использованием продуктов животного происхождения (АР) заменяют очисткой ботулотоксина с использованием, по меньшей мере, одного метода, выбранного из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильной фильтрации, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования, которые являются процессами предварительной обработки, с последующим выполнением одного процесса, выбранного из числа UF-диафильтрации, осаждения сульфатом аммония и осаждения соляной кислотой с последующей очисткой с использованием анионо-катионообменной хроматографии, тем самым обеспечивая безопасность и очень высокий выход.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение относится к способу получения ботулотоксина, включающему стадии:
(а) обработку культуры ботулотоксин-продуцирующего штамма кислотой с образованием осадка, содержащего ботулотоксин;
(b) добавления буфера к осадку, содержащему ботулотоксин, стадии (а), с последующей очисткой одним или несколькими способами, выбранными из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильной фильтрации, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования;
(c) UF-диафильтрации раствора, содержащего ботулотоксин, стадии (b), осаждения сульфатом аммония или осаждения соляной кислотой, с последующим разбавлением ретентата, образующегося в результате UF-диафильтрации, в буфере, или растворения осадка, полученного в результате осаждения сульфатом аммония, или осадка, полученного в результате осаждения соляной кислотой, в буфере; и
(d) проведение анионообменной хроматографии (AEX) с разбавленным ретентатом, раствором осадка, полученного в результате осаждения сульфатом аммония, или осадка, полученного в результате осаждения соляной кислотой, стадии (с), с получением очищенного ботулотоксина.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму, сравнивающую способ получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением и обычный способ.
Фиг. 2 демонстрирует хроматограмму первой стадии очистки анионообменной хроматографией (AEX) и второй стадии очистки анионообменной хроматографией (AEX) для очистки ботулотоксина.
Фиг. 3 демонстрирует результаты анализа чистоты ботулотоксина с помощью SDS-PAGE после первой стадии очистки анионообменной хроматографией (AEX) и второй стадии очистки анионообменной хроматографией (AEX).
Фиг. 4 демонстрирует хроматограмму первой очистки анионообменной хроматографии (AEX), второй очистки анионообменной хроматографии (AEX, режим связывания) и стадий катионообменной хроматографии (CEX) для ботулотоксина.
Фиг. 5 демонстрирует результаты анализа чистоты ботулотоксина с помощью SDS-PAGE после стадий первой очистки анионообменной хроматографией (AEX), второй очистки анионообменной хроматографии (AEX, режим связывания) и катионообменной хроматографии (CEX).
Фиг. 6 демонстрирует хроматограмму первой очистки анионообменной хроматографией (AEX), вторая очистка анионообменной хроматографией (AEX, проточный режим) и стадии катионообменной хроматографии (CEX) ботулотоксина.
Фиг. 7 демонстрирует результаты анализа чистоты ботулотоксина с помощью SDS-PAGE после стадий первой очистки анионообменной хроматографией (AEX), второй очистки анионообменной хроматографией (AEX, проточный режим) и катионообменной хроматографии (CEX).
Наилучшее воплощение изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой относится изобретение. Как правило, номенклатура, используемая в данном документе, и экспериментальные техники, которые будут описаны ниже, являются хорошо известными и обычно используются в данной области.
В настоящем изобретении для разработки APF-способа очистки (без продуктов животного происхождения) низкомолекулярного ботулотоксина была предпринята попытка разработать способ замены стадии ферментативной обработки обычного процесса, в котором используется продукты животного происхождения (АР). Таким образом, проводили фильтрацию с использованием глубинного фильтра, обычного процесса осаждения соляной кислотой, процесса с использованием сульфата аммония и процесса с использованием UF-системы, и в результате было показано, что чистота полученного ботулотоксина была выше, чем ботулотоксина, полученного обычным способом. Это говорит о том, что использование вышеописанного способа в соответствии с настоящим изобретением позволяет безопасно получать ботулотоксин высокой чистоты из культуры штамма в условиях без TSE.
Термины «процесс» и «выделение», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к применению, по меньшей мере, одного способа или системы для достижения определенной цели (например, очистки ботулотоксина) в процессе очистки.
В примере настоящего изобретения, когда очистку проводили, по меньшей мере, одним способом, выбранным из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильной фильтрации, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования, с последующей UF-диафильтрацией, осаждением сульфатом аммония или осаждением кислотой, ботулотоксин, имеющий удовлетворительную чистоту, может быть получен даже только с помощью одного процесса анионообменной хроматографии (AEX).
Поэтому в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ботулотоксина и, более конкретно, к способу получения ботулотоксина, включающему стадии:
(а) обработки культуры ботулотоксин-продуцирующего штамма кислотой с образованием осадка, содержащего ботулотоксин;
(b) добавления буфера к осадку, содержащему ботулотоксин на стадии (а), и последующей очистки одним или несколькими способами, выбранными из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильного фильтрования, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования;
(c) проведения с раствором ботулотоксина стадии (b) UF-диафильтрации, осаждения сульфатом аммония или осаждения соляной кислотой, с последующим разбавлением ретентата, образующегося в результате UF-диафильтрации, в буфере, или растворения осадка, полученного в результате осаждения сульфатом аммония или осадка, полученного в результате осаждения соляной кислотой, в буфере; и
(d) проведения с разбавленным ретентатом, раствором осадка, полученного в результате осаждения сульфатом аммония или осадка, полученного в результате осаждения соляной кислотой, стадии (с) анионообменной хроматографии (AEX), с получением в результате очищенного ботулотоксина.
Ботулотоксин, очищенный в соответствии со способом получения по настоящему изобретению, может иметь форму 7S или 19S (молекулярная масса: 150-900 кДа).
В настоящем изобретении штамм, продуцирующий ботулотоксин, предпочтительно представляет собой Clostridium botulinum или его мутантный штамм, без ограничения перечисленным, и для специалистов в данной области будет очевидно, что может быть использован любой штамм, способный продуцировать ботулотоксин.
Используемый в данном документе термин «ботулотоксин» подразумевает включение не только нейротоксинов (NTX), продуцируемых штаммом Clostridium botulinum, либо его мутантным штаммом, но также модифицированных, рекомбинантных, гибридных и химерных ботулотоксинов. Рекомбинантный ботулотоксин может иметь легкую цепь и/или тяжелую цепь, продуцируемую рекомбинантным способом видами, не являющимися Clostridium. Кроме того, термин «ботулотоксин», используемый в данном документе, предназначен для включения серотипов ботулотоксина A, B, C, D, E, F и G, комплексов ботулотоксина (т.е. комплексов 300, 600 и 900 кДа) и чистого ботулотоксина (то есть нейротоксической молекулы 150 кДа), которые полезны при практическом осуществлении настоящего изобретения.
NTX (7S), которые являются основными компонентами ботулотоксинов, связываются с нетоксичными компонентами в культурах или в продуктах питания и превращаются в большие комплексы (Oguma et al., "Structure and function of Clostridium botulinum progenitor toxin.", J. Toxical-Toxin Reviews, 18:17-34, 1999). Штамм типа А, продуцирующий серотип ботулотоксина А, продуцирует три формы токсинов-предшественников, обозначенных как токсины LL (19S, 900 кДа), L (16S, 500 кДа) и M (12S, 300 кДа), все из которых считаются полностью активированными в то время как штаммы типа B, C и D производят две формы: L и M. Кроме того, типы E, F и G продуцируют только одну форму токсина; типы E и F продуцируют M-токсин, а тип G продуцирует L-токсин. M-токсин состоит из NTX (7S, 150 кДа) и нетоксичного компонента, не проявляющего активности гемагглютинина (HA), который описывается как нетоксичный не-HA (NTNH).
Используемый в данном документе термин «продуцируемый ботулотоксин» означает чистый ботулотоксин или комплекс ботулотоксина, который отделен или по существу отделен от других белков или примесей, которые могут сопровождаться ботулиническим токсином, когда ботулотоксин собирается после процесса культивирования или ферментации. Таким образом, полученный ботулотоксин имеет чистоту, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98%. В частности, полученный ботулотоксин в настоящем изобретении может представлять собой белок ботулотоксина типа A, имеющий чистоту, по меньшей мере, 98%.
Культура штамма Clostridium botulinum для продуцирования ботулотоксина может быть выполнена с использованием общепринятого способа, известного в данной области, и традиционной среды, которая может быть использована для культивирования.
В качестве неограничивающего примера среда для культивирования штамма Clostridium botulinum может включать гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и тому подобное, и культивирование проводят при температуре от 25 до 40°C в течение 90-180 часов, предпочтительно 100-150 часов.
Осаждение кислотой на стадии (а) может быть осуществлено путем добавления кислоты, предпочтительно серной кислоты или соляной кислоты, к культуре штамма после культивирования, так что рН культуры достигает 3,0-4,5, предпочтительно 3,3-4,0, наиболее предпочтительно 3,4-3,6.
Осаждение кислотой на стадии (а) основано на принципе, согласно которому добавление кислоты в культуру, содержащую много видов белков, снижает рН культуры при одновременном уничтожении ботулинических бактерий, оставшихся после культивирования, так что белки достигают изоэлектрической точки для осаждения. Этот процесс включает кристаллизацию в широком смысле, а способ осаждения представляет собой способ грубого разделения искомого материала в смешанном состоянии, в отличие от кристаллизации, сфокусированного на очистке искомого материала с высокой степенью чистоты. В способе осаждения также осаждаются примеси, имеющие структуру, аналогичную искомому материалу. В данном документе рН доводится до около 3,0-4,5. Степень извлечения ботулотоксина увеличивается с уменьшением рН. Если рН равен 3,0 или ниже, то это будет влиять на сам ботулотоксин, а при рН 4,5 или выше степень извлечения ботулотоксина будет снижаться. По этим причинам рН предпочтительно находится в пределах указанного выше диапазона. В частности, рН наиболее предпочтительно составляет 3,4-3,6, поскольку степень извлечения ботулотоксина является самой высокой в этом диапазоне рН. Когда рН культуры штамма ботулизма достигает подходящего диапазона после добавления кислоты, кислота добавляется в культуру до тех пор, пока изменение рН больше не проявляется, и затем культуру выдерживают при комнатной температуре в течение 10-30 часов, с последующим удалением надосадочной жидкости.
В настоящем изобретении осаждение кислоты на стадии (а) может выполняться один или несколько раз.
Используемый в данном документе термин «очистка» означает повторное растворение осадка или тому подобного в буфере и последующее удаление примесей из раствора в результате повторного растворения. Стадию «очистки» в настоящем изобретении можно, как правило, выполнять с использованием одной или нескольких стадий, включая любую из отдельных стадий или их комбинаций, например, фильтрации, осаждения, флокуляции и седиментации. Более конкретно, стадию очистки можно проводить, используя, по меньшей мере, один метод, выбранный из группы, состоящей из глубинной фильтрации (DF), микрофильтрации (MF), ультрафильтрации (UF), стерильной фильтрации, мембранной хроматографии (MC) и центрифугирования. На стадии очистки в настоящем изобретении могут быть удалены примеси, в частности примеси нуклеиновых кислот, HCD, клеточного дебриса и эндотоксина, содержащихся в повторно растворенном осадке токсина.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение обеспечивает улучшение по сравнению с обычной стадией очистки, обычно используемой в различных схемах очистки. Стадия очистки обычно включает удаление одного или нескольких нежелательных объектов и обычно выполняется до стадии, включающей захват искомой молекулы-мишени. Другим аспектом очистки является удаление растворимых и нерастворимых компонентов в образце, который впоследствии может привести к загрязнению стерильного фильтра в процессе очистки, тем самым делая общий процесс очистки более экономичным. Кроме того, могут быть использованы способы повышения эффективности очистки, например, осаждения. Осаждение примесей может быть осуществлено различными способами, такими как флоккуляция, регуляция рН (кислотное осаждение), температурные сдвиги, изменение фазы за счет использования стимул-респонсивных полимеров или небольших молекул или любых комбинаций этих способов.
Используемый в данном документе термин «глубинная фильтрация (DF)» означает удаление частиц (например, примесей) из раствора с использованием серии фильтров с уменьшением размера пор. Термин «глубинный фильтр» при использовании в данном документе обеспечивает фильтрацию в глубине фильтрующего материала. Такими фильтрами являются те, которые содержат случайную матрицу волокон, связанных с образованием сложного, извилистого лабиринта проточных каналов. Разделение частиц в этих фильтрах происходит за счет захвата или адсорбции в волокнистой матрице. Наиболее часто используемые материалы глубинных фильтров для биообработки культуральной среды клеточной культуры и других исходных материалов состоят из целлюлозных волокон, фильтрующего средства, такого как DE, и положительно заряженного связующего полимера. Материалы глубинного фильтра, в отличие от абсолютных фильтров, удерживают частицы по всей пористой среде, что позволяет удерживать частицы размером как больше, так и меньше размера пор. Считается, что удержание частиц связано как с отделением по размеру, так и с адсорбцией посредством гидрофобных, ионных и других взаимодействий. Коммерчески доступные глубинные фильтры включают систему глубинной фильтрации Millistak + Pod, XOHC media (Millipore Corporation), глубинный фильтр Zeta Plus™ (3M Purification Inc.) и т.д. В настоящем изобретении глубинная фильтрация может быть выполнена с использованием двух или более глубинных фильтров, расположенных параллельно друг другу. В этом случае коммерчески доступные глубинные фильтры могут включать Millistak+ mini DOHC (Millipore Corporation) и фильтры XOHC (Millipore Corporation).
В настоящем изобретении глубинный фильтр, как правило, имеет номинальный размер пор 0,01-20 мкм, предпочтительно 0,1-8 мкм, используется для удаления флокулированных клеточных дебрисов и коллоидных частиц, имеющих размер, больший, чем указанный размер пор и клеточной биомассы, включая частицы меньше, чем указанный размер пор, и может включать в себя пористую фильтрующую глубинного фильтра, имеющую пористые слои с изменяющимися порами.
Таким образом, если глубинная фильтрация используется в настоящем изобретении, то легко удалить примеси (например, нуклеиновые кислоты), клеточный мусор, эндотоксин и т.д. из осадка ботулотоксина.
Используемый в данном документе термин «микрофильтрация (MF)» или «ультрафильтрация (UF)» представляет собой процесс, который фракционирует целевое растворенное вещество (например, ботулотоксин) через поры мембраны под определенным давлением в соответствии с размером и структурой растворенного вещества из раствора смеси. Например, очистка раствора может проводиться при давлении 5-40 фунтов на квадратный дюйм и температуре от 4 до 60 °С с использованием PS-мембраны (полисульфон) для размера 0,1 мкм или отделения при отсечке молекулярной массы 750 кДа (MWCO).
5
Обычно микрофильтрация представляет собой процесс, который проводится до ультрафильтрации и используется для отделения частиц, имеющих размер 0,1-10 мкм от раствора. Обычно ее используют для отделения полимера, имеющего молекулярную массу 1 × 10 г/моль. Кроме того, микрофильтрация может быть использована для удаления осадков, простейших, крупных бактерий и т.д. В настоящем изобретении микрофильтрация может быть легко использована для удаления полимеров или клеточного дебриса. Как правило, процесс микрофильтрации осуществляется с помощью насоса под давлением или вакуумного насоса со скоростью 0,1-5 м/с, предпочтительно 1-3 м/сек, и давление 50-600 кПа, предпочтительно 100-400 кПа.
3
5
Ультрафильтрация используется для отделения частиц, имеющих размер 0,01-0,1 мкм от раствора, и частицы обычно соответствуют полимерам, имеющим молекулярную массу 1 × 10 -1 × 10 Да. Ультрафильтрация используется для удаления белков, эндотоксинов, вирусов, диоксида кремния и т.д. В настоящем изобретении, если используется ультрафильтрационная мембрана 100-300 кДа MWCO, то она может удалять примеси из осадка ботулотоксина и концентрировать ботулотоксин.
Используемый в данном документе термин «стерильная фильтрация» представляет собой процесс, который использует микрофильтр или мембранный фильтр, может заменить нагрев, облучение или химическую обработку и может безопасно очищать растворы, содержащие целевые вещества (например, биологические, ботулотоксины и т.д.). Для удаления микроорганизмов, которые могут содержаться в растворах, используют микрофильтр, имеющий размер пор 0,1-0,3 мкм, предпочтительно 0,15-0,25 мкм, наиболее предпочтительно 0,2-0,22 мкм, и для удаления и инактивации вируса нанофильтр, имеющий используется размер пор 20-50 нм. Кроме того, для удаления микроорганизмов, вирусов и т.д. способ очистки также может быть выполнен с использованием мембранного фильтра, который имеет определенный размер пор и который изготовлен из сложного эфира целлюлозы или PES (полиэфирсульфона).
В настоящем изобретении «мембранная хроматография (MC)» может быть использована в качестве способа отделения целевого вещества (например, ботулотоксина), который отличается от «хроматографии на смоле». Хроматография на смоле, для которой обычно используется сферическая пористая смола, основана больше на диффузии, чем на конвекции раствора, тогда как мембранная хроматография, для которой используется плоская макропористая мембрана, основана больше на конвекции, чем на диффузии раствора. Таким образом, при мембранной хроматографии эффективность разделения раствора относительно высока и, таким образом, доступ к мембране вирусов, плазмид, больших белковых комплексов и т.д., облегчается, что делает разделение более легким. Коммерчески доступная мембранная хроматография может включать капсулу для мембранной хроматографии Mustang Q (Pall Corporation), Sartobind Q (Sartorius Stedim Biotech GmbH), без ограничения перечисленным.
В настоящем изобретении центрифугирование предпочтительно может выполняться при центробежной силе, предпочтительно, при 12000-15000 g.
В настоящем изобретении осветление ботулотоксина на стадии (b) включает стадию растворения осадка токсина, полученного на стадии (а), путем добавления фосфатного буфера, предпочтительно натрий-фосфатного буфера и очистки осадка. В данном документе рН фосфатного буфера составляет примерно 3,0-8,0, предпочтительно около 4,0-7,0, и раствор доводят до конечного рН 4,5-6,5, предпочтительно 5,5-6,2, более предпочтительно 4,8-5,8. В этом диапазоне рН может быть проведена очистка токсина.
В настоящем изобретении разбавление или растворение ботулотоксина стадии (с) включает стадию добавления фосфатного буфера, предпочтительно натрий-фосфатного буфера, к токсину, полученному на стадии (b), для разбавления ретентата или растворения осадка. В этом случае рН фосфатного буфера предпочтительно составляет примерно 4,0-8,5, и основание может быть добавлено для достижения конечного рН до 4,5-8, предпочтительно 5,5-7,5, более предпочтительно 6-7. В этом диапазоне рН может быть проведено разбавление или растворение токсина.
В настоящем изобретении глубинная фильтрация (DF) ботулотоксина на стадии (b) может быть выполнена с использованием перистальтического насоса, а UF-диафильтрация, осаждение сульфатом аммония или осаждение соляной кислотой на стадии (с) может выполняться один или несколько раз.
Используемый в данном документе термин «UF-диафильтрация» означает проведение диафильтрации с использованием вышеописанной ультрафильтрации (UF), без ограничения перечисленным. «Диафильтрация» означает способ, который удаляет или собирает любой компонент (например, частицы) из целевого вещества (раствора) с использованием проницаемого фильтра, способного приводить к разделению в соответствии с молекулярной массой (молекулярным размером) компонента, тем самым повышая чистоту целевого вещества.
Стадия осаждения сульфатом аммония соответствует процессу высаливания, в котором соль (сульфат аммония и т.д.), которая легко растворяется в воде, добавляют к белковой смеси для увеличения ионной силы, чтобы таким образом формировать белковый осадок. Если искомый белок выпадает в осадок главным образом при насыщении сульфата аммония 30% (масс./об.), то искомый белок может осаждаться путем осаждения белков, отличных от искомого белка, при концентрации насыщения сульфата аммония 30% (масс./об.) или ниже, с последующим добавлением сульфата аммония до концентрации насыщения 30% (масс./об.) и может быть собран центрифугированием. Операция высаливания часто используется в качестве начального способа очистки. Используемый раствор сульфата аммония может иметь концентрацию сульфата аммония 10-50% (масс./об.), предпочтительно 20-40% (масс./об.). Кроме того, осаждение соляной кислоты на стадии (с) может быть выполнено добавлением соляной кислоты до достижения рН 2-5, предпочтительно 2,5-4,5.
Анионно-обменную хроматографию на стадии (d) можно проводить при рН 2-9, предпочтительно 3-8, и проводимости 2-40 мСм/см, предпочтительно 3-30 мСм/см. На стадии (d) ботулотоксин можно собирать в виде фракции, содержащей ботулотоксин (проточный режим) проточной фракции (FT), элюированной из анионообменной хроматографии или в виде фракции, содержащей ботулотоксин, связанный с анионообменной хроматографической смолой. Окончательно очищенный ботулотоксин может иметь форму 7S или 19S.
Термины «FT (проточный)», «проточный процесс» или «проточная очистка», используемые в данном документе взаимозаменяемо, означает процесс разделения, в котором, по меньшей мере, одна молекула-мишень (например, ботулотоксин), содержащаяся в биофармацевтической композиции вместе с одной или несколькими примесями, проходит через материал, и одна или несколько примесей обычно связываются с материалом, а молекула-мишень обычно не связывается с материалом (то есть протекает через материал).
Термин «проводимость» относится к способности водного раствора проводить электрический ток между двумя электродами. В растворе ток течет путем переноса ионов. Поэтому при увеличении количества ионов, присутствующих в водном растворе, раствор будет иметь более высокую проводимость. Основной единицей измерения проводимости является Сименс (или mho), mho/cm (мСм/см) и может быть измерена с помощью измерителя проводимости, такого как различные модели измерителей проводимости Orion. Поскольку электролитическая проводимость является емкостью ионов в растворе для переноса электрического тока, проводимость раствора может быть изменена путем изменения концентрации ионов в нем. Например, концентрация буферного агента и/или концентрация соли (например, хлорида натрия, ацетата натрия или хлорида калия) в растворе могут быть изменены для достижения искомой проводимости. Предпочтительно концентрацию соли в различных буферах можно модифицировать для достижения искомой проводимости.
В настоящем изобретении буфер колонки, которая используется для анионообменной хроматографии на стадии (d), может представлять собой фосфатный буфер, цитратный буфер или буфер Трис-HCl, без ограничения перечисленным. Концентрация колоночного буфера регулируется до 15-70 мМ, предпочтительно около 20-60 мМ. pН буфера колонки доводится до 2-9, предпочтительно 3-8, и скорость потока подвижной фазы контролируется до 0,5-5,0 мл/мин., предпочтительно 1,0-3,0 мл/мин. В данном документе проводимость буфера доводится до 2-40 мСм/см, предпочтительно 3-30 мСм/см, и образец загружают в колонку после завершения уравновешивания колонки.
Кроме того, в настоящем изобретении можно видеть, что, когда рН фракции анионообменной хроматографии, содержащей ботулотоксин, полученной на стадиях (а) - (d), повышают и когда анионообменную хроматографию проводят снова, с последующим проведением катионообменной хроматографии (CEX), то может быть получен ботулотоксин с очень высокой чистотой, в частности чистый ботулинический нейротоксин.
Поэтому в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ботулотоксина, дополнительно включающему после стадии (d) стадии:
(e) повышения рН фракции анионообменной хроматографии, содержащей ботулотоксин;
(f) очистку фракции анионообменной хроматографии со скорректированной рН, полученной на стадии (е), путем анионообменной хроматографии; и
(h) очистку разбавленного ботулотоксина, полученного на стадии (f), с использованием катионообменной хроматографии (CEX).
Предпочтительно, способ может дополнительно включать между стадией (f) и стадией (h), стадию (g) добавление буфера в очищенную фракцию после анионообменной хроматографии для разбавления ботулотоксина.
В настоящем изобретении, когда стадии (е) - (h) дополнительно выполняются, способ анионообменной хроматографии (AEX) на стадии (d) для удобства объяснения называют «первым процессом анионообменной хроматографии» и процесс AEX на стадии (f) называют «вторым процессом анионообменной хроматографии». Если не указано иное, процесс AEX на стадии (d) относится к первой анионообменной хроматографии на стадии (d). Кроме того, если не указано иное, TQ в примерах и т.п. означает первый процесс анионообменной хроматографии, HQ означает второй процесс анионообменной хроматографии, а XS означает процесс катионообменной хроматографии.
В настоящем изобретении «рН» раствора означает кислотность или щелочность относительно ионизации образца воды. pH воды является нейтральным, т.е. равен 7. Большинство значений рН колеблется от 0 до 14. Растворы с более высоким [Н+], чем у воды (рН менее 7) являются кислотными; растворы с более низким [Н+], чем у воды (рН более 7) являются основным или щелочным. pH можно измерить, используя pH-метр. pН буфера можно регулировать с использованием кислоты или основания, такого как HCl или NaOH.
В настоящем изобретении повышение рН фракции анионообменной хроматографии на стадии (е) может выполняться один или несколько раз, и повышение рН на стадии (е) может быть выполнено с использованием, по меньшей мере, одного способа, выбранного из группы, состоящей из UF-диафильтрации, титрования рН, диализа и колоночной хроматографии с заменой буфера. Предпочтительно, чтобы регулирование рН фракции анионообменной хроматографии стадии (е) осуществлялось с использованием буфера Tris-HCl. В данном случае буфер Tris-HCl имеет рН 7,0-8,5, предпочтительно 7,3-8,3. Таким образом, рН может быть доведен до 7,0-8,5, предпочтительно до 7,3-8,3, более предпочтительно до 7,7 ~ 7,9.
Вторая анионообменная хроматография на стадии (f) может быть выполнена при рН 2-9, предпочтительно 3-8, и проводимость 2-40 мСм/см, предпочтительно 3-30 мСм/см. На стадии (f) ботулотоксин может быть собран в виде фракции, содержащей ботулотоксин (проточный режим), из проточной фракции (FT), элюированной в ходе анионообменной хроматографии, или может быть собран в виде фракции, содержащей ботулотоксин связанный с анионообменной хроматографической смолой.
В настоящем изобретении буфер на стадии (g) предпочтительно представляет собой натрий-фосфатный буфер и имеет рН 6-8, предпочтительно 6,5-7,5.
В настоящем изобретении катионообменная хроматография на стадии (h) может быть выполнена при рН 2-9, предпочтительно 3-8. В катионообменной хроматографии на стадии (h) ботулотоксин можно собирать в виде фракции, содержащей ботулотоксин, связанный со смолой для катионообменной хроматографии, и окончательно очищенный ботулотоксин может иметь форму 7S (молекулярная масса: 150 кДа).
В способе получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением смола, которая используется в процессе анионообменной хроматографии, включает группы диэтиламиноэтила (DEAE), четвертичного аминоэтила (QAE) и четвертичного амина (Q), без ограничения перечисленным. Предпочтительно могут быть использованы TQ650, HQ, XQ и т.д.
В способе получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением, смола, которая используется в процессе катионообменной хроматографии, предпочтительно, включает карбоксиметил (КМ), сульфоэтил (SE), сульфопропил (SP), фосфат (Р), и сульфонат (S), без ограничения перечисленным. Более предпочтительно могут быть использованы HS, XS и т.д.
Целлюлозно-ионообменная смола, например, DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™ и CM-52™ доступна у производителя (GE Healthcare, Линдеснес, Норвегия) и также известные ионообменники на основе SEPHADEX и перекрестно-сшитые ионообменники. Например, DEAE-, QAE-, CM-, SP-SEPHADEX и DEAE-, Q-, CM- и S-SEPHAROSE и SEPHAROSE Fast Flow доступны у производителя (GE Healthcare Bio-Sciences). Кроме того, как DEAE, так и CM, дериватизированные этиленгликоль-метакрилатные сополимеры (например, TOYOPEARL™ DEAE-650S или M и TOYOPEARL™ CM-650S или M) доступны у производителя (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, Пенсильвания).
ПРИМЕРЫ
В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Будет очевидно для специалиста, имеющего обычный опыт в данной области техники, что эти примеры представлены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Пример 1: Культура штамма Clostridium botulinum
Среда для культивирования штамма Clostridium botulinum для продуцирования ботулотоксина имела состав, включающий 2% гидролизата казеина, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы и 0,5% тиогликолята и стерилизуется при 121°С в течение 30 минут. Затем 20 мкл Clostridium botulinum (Корейские центры по контролю и профилактике заболеваний, учетный номер 4-029-CBB-IS-001) инокулировали в культуральную пробирку, содержащую 10 мл среды, и культивировали для получения первичной культуры для посева (стационарная культура) при 35°С в течение 22-30 часов в анаэробных условиях. Когда рост бактерий в первичной посевной культуре был подтвержден, 8 мл первичной посевной культуры инокулировали в 1-литровую культуральную бутыль, содержащую 800 мл стерильной среды, имеющей такую же композицию среды, и подвергали культивированию для получения второй среды для посева (стационарная культура) при 35°С в течение 8-15 часов в анаэробных условиях. Когда был подтвержден рост штамма в процессе выращивания вторичной посевной культуры, 800 мл вторичной посевной культуры инокулировали в 10-литровую культуральную бутылку, содержащую 10 л стерильной среды, имеющей ту же самую композицию стерилизованной среды, и культивировали при 35 °С в течение 4-6 дней в анаэробных условиях.
Пример 2. Получение ботулотоксина
2-1: Осаждение серной кислотой и нейтрализация pH
Стадия осаждения серной кислотой представляет собой процесс разделения белков, в котором серную кислоту добавляют к культуре, содержащей много видов белков, для снижения рН культуры при уничтожении ботулинических бактерий, оставшихся после культивирования, так что белки достигают изоэлектрической точки для осаждения. Основная культура была выполнена, как описано в Примере 1, и после завершения основной культуры культуру собирали в 10-литровый контейнер для культивирования (10 л сосуд SUS). Затем к культуре добавляли 5N серную кислоту для достижения рН 3,4-3,6 и культуру оставляли при комнатной температуре в течение 12-20 часов, так чтобы произошло разделение надосадочной жидкости и осадка. Надосадочную жидкость удаляли и в конце оставалось 2,5-3,0 л осадка серной кислоты.
Нейтрализация рН (например, путем титрования рН) осадка серной кислоты, оставшегося после удаления надосадочной жидкости, проводилась следующим образом. К осадку серной кислоты добавляли 700 мл 1 М фосфата натрия (рН 5,3) с последующим перемешиванием. Добавляли 5N NaOH для доведения рН осадка серной кислоты до 5,9-6,1. Собирали осадок серной кислоты с нейтрализованным рН.
2-2: Процесс предварительной обработки
1) Обычный процесс
Осадки с серной кислотой, полученные в примере 2-1, обрабатывали в соответствии с обычным процессом. В частности, для удаления ДНК и РНК, оставшихся в осадке, добавляли 60 мл 0,4 М бензамидина HCl, 100 мг ДНКазы и 300 мг РНКазы и для экстракции ботулотоксина раствор осадка инкубировали в течение примерно 3-7 часов. Затем инкубированный раствор осадка центрифугировали при 4 °C и 12000 × g в течение 15 минут с последующим сбором надосадочной жидкости. pН надосадочной жидкости понижали до 3,4-3,6 путем добавления 1N соляной кислоты, а затем надосадочную жидкость оставляли при температуре от 3 до 5 °С в течение 12-20 часов, тем самым осуществляя процесс осаждения соляной кислотой. Осадок с соляной кислотой, полученный описанным выше способом, центрифугировали при 4 °C и 12000 × g в течение 15 минут для удаления надосадочной жидкости, а оставшиеся гранулы токсина растворяли в 30 мл натрий-фосфатного буфера (рН 6,5).
2) Процесс глубинной фильтрации
Осадки, полученные с помощью серной кислоты, полученные в соответствии с примером 2-1, фильтровали с использованием эффективной фильтрации глубинным фильтром Zeta Plus™ (3M, BC0025S60SP05A), соединенным с перистальтическим насосом.
i) UF после глубинной фильтрации
Глубинный фильтрат подвергали 10-кратной диафильтрации с помощью 50 мМ фосфата натрия (pH 6,5) с использованием системы UF (кассета PALL, TFF 30 кДа) и затем доводили до конечного объема 30 мл.
ii) Осаждение сульфатом аммония после глубинной фильтрации
Сульфат аммония добавляли к глубинному фильтрату до концентрации 30% (масс./об.), а затем фильтрат оставляли при температуре от 3 до 5°С в течение 12-20 часов. Затем раствор центрифугировали при 4°C и 12000×g в течение 15 минут для удаления надосадочной жидкости, а затем центрифугированные гранулы повторно растворяли в 30 мл 50 мМ фосфата натрия (рН 6,5).
iii) Осаждение соляной кислотой после глубинной фильтрации
1N HCl добавляли к глубинному фильтрату для снижения рН фильтрата до 3,4-3,6, а затем раствор оставляли при температуре от 3 до 5°С в течение 12-20 часов. Затем раствор центрифугировали при 4°C и 12000 × g в течение 15 минут для удаления надосадочной жидкости, и центрифугированные гранулы повторно растворяли в 30 мл 50 мМ фосфата натрия (pH 6,5).
2-3: Процесс очистки
Измерение чистоты ботулотоксина, очищенного методом TQ (первый процесс анионообменной хроматографии), проводили методом SEC (эксклюзионная хроматография) с использованием ВЭЖХ (Waters e2695). При этом в качестве подвижной фазы использовали 100 мМ фосфат натрия (pH 6,5), а колонку TSKgel G4000SWxl (Tosoh Bioscience, P/N 08542) соединяли с защитной колонкой (Tosoh Bioscience, P/N 08543) и 20 мкг белок ботулотоксина загружали в колонку и давали протечь со скоростью 1 мл/мин в течение 30 минут.
Для визуального изучения смешанного состояния/чистоты/содержания ботулотоксина в образце, собранном на каждой стадии очистки (процесса) для ботулотоксина, очищенного TQ-процессом (первый процесс анионообменной хроматографии), HQ-процессом (второй процесс анионообменной хроматографии) и XS-процессом (процесс катионообменной хроматографии), проводили белковый электрофорез (SDS-PAGE). В частности, образцы, которые считались как содержащие ботулотоксин, измеряли количественно по методу Брэдфорд, а затем определенное количество (например, 40 мкг белка) каждого образца брали и соответствующим образом нагревали и/или растворяли, и проводили 4-12% SDS-PAGE с использованием денатурированного белка. Гель после электрофореза окрашивали подходящим красителем (нитратом серебра или Кумасси синим), а затем визуально проверяли чистоту ботулотоксина на каждой стадии очистки.
2-3-1: TQ-Очистка (проточная анионно-обменная хроматография (AEX FT))
После завершения процесса предварительной обработки примера 2-2 для удаления большинства основных примесей, отличных от ботулотоксина, проводили хроматографию следующим образом с использованием ионообменной смолы.
(1) Смолу TQ упаковывали в колонку XK 26/40 высотой 30-34 см, а затем колонку устанавливали в AKTA Prime Plus.
(2) Колонку уравновешивали равновесным/элюирующим буфером (50 мМ фосфат натрия (рН 6,4-6,6 и 10 ± 5 мС/см)).
(3) 10 мл образца, предварительно обработанного обычным способом примера 2-2, загружали в колонку и пропускали со скоростью 2 мл/мин. После завершения инъекции загружали 160-180 мл равновесного/элюирующего буфера и фракции последовательно собирали до тех пор, пока пик с длиной волны ультрафиолетового излучения 280 нм не уменьшился до исходного уровня (фракции анализировали с помощью SDS-PAGE).
(4) Для регенерации колонки после сбора фракций загружали 200 мл или более промывочного буфера (50 мМ фосфата натрия, рН 6,4-6,6, 1 М NaCl) со скоростью потока 5 мл/мин для того, чтобы промыть колонку,
(5) В соответствии с процедурами (2) - (4) выше TQ-очистка проводилась с использованием образцов, предварительно обработанных другими тремя способами (UF после глубинной фильтрации, осаждения сульфатом аммония после глубинной фильтрации и осаждения соляной кислоты после глубинной фильтрации) вместо образца, предварительно обработанного обычным способом. В этом случае для очистки ботулотоксина высокой чистоты рН поддерживали на уровне 6,4-6,6, а проводимость поддерживали на уровне 10 ± 5 мСм/см.
В результате было показано, что ботулотоксин не адсорбируется на смоле TQ, и большинство основных примесей удаляются адсорбцией, и, таким образом, ботулотоксин может быть получен с высокой степенью чистоты. Кроме того, полученный ботулотоксин имел форму 19S (молекулярная масса: около 900 кДа).
2-3-2: HQ-очистка (анион-обменная хроматография: AEX, режим связывания)
После завершения TQ-очистки для дальнейшей очистки ботулотоксина проводили хроматографию с использованием ионообменной HQ-смолы (далее называемой «HQ-процесс»). В HQ-процессе образец, полученный в результате TQ-очистки, очищали в режиме связывания или FT-режиме (проточном). Используемый в данном документе термин «HQ (связывание)» относится к способу, который отделяет (или элюирует) целевое вещество (например, ботулотоксин) на основе разницы в количестве электрического заряда HQ-смолы, способной связываться с целевым веществом, а термин «HQ (FT)» относится к способу, в котором на основе разницы в количестве электрического заряда HQ-смола способна связываться с примесями, которые могут смешиваться с целевым веществом (например, ботулотоксином), а целевое вещество, которое протекает (FT) через HQ-смолу без связывания с HQ-смолой, отделяется от образца.
HQ-Очистка (связывание) (AEX, режим связывания)
(1) Образец, очищенный TQ после предварительной обработки в соответствии с обычным способом, подвергали 10 раз диафильтрации с помощью 25 мМ буфера Tris-HCl (pH 7,7-7,9) с использованием системы UF (кассета PALL, TFF 30 кДа MWCO). Конечный рН образца составлял 7,7-7,9, и объем доводили до 30 мл.
(2) Смолу HQ упаковывали в AKTA Prime Plus.
(3) Колонку уравновешивали 25 мМ буфером Трис-HCl (рН 7,7-7,9).
(4) Образец, полученный в (1), загружали в уравновешенную колонку со скоростью потока 2,5 мл/мин и промывали 40 мл 25 мМ буфера Трис-HCl (рН 7,7-7,9) и затем элюировали при 20°С и 10%-ном градиенте. Фракции, соответствующие первому пику, последовательно собирали (фракции анализировали с помощью SDS-PAGE).
(5) Для регенерации колонки после сбора фракций загружали 120 мл или более промывочного буфера (25 мМ Трис-HCl, pH 7,7-7,9, 1 М NaCl) при скорости потока 2,5 мл/мин для того, чтобы промыть колонку.
(6) Процедуры (1) - (5) выше были выполнены с использованием образцов, очищенных TQ после обработки в соответствии с другими тремя способами (TQ-очистка после UF следующей после глубинной фильтрации, осаждение сульфатом аммония после глубинной фильтрации и осаждение соляной кислотой после глубинной фильтрации) вместо образца, очищенного TQ после предварительной обработки в соответствии с обычным способом.
В результате было показано, что ботулотоксин может быть получен с высокой степенью чистоты и что полученный ботулотоксин имеет форму 7S (молекулярная масса: около 150 кДа) (Фиг. 2 и 3).
2-3-3: HQ-Очистка (AEX, режим связывания) и XS-Очистка (режим связывания)
После завершения HQ-очистки в соответствии с примером 2-3-2 для дальнейшей очистки ботулотоксина далее проводили катионообменную хроматографию XS (CEX, режим связывания).
В частности, XS-процесс осуществляли следующим образом.
(1) Образец, очищенный HQ после предварительной обработки в соответствии с обычным способом из примера 2-2, разбавляли до 1/4 с использованием 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,9-7,1).
(2) XS-cмолу упаковывали в AKTA Prime Plus.
(3) Колонку уравновешивали уравновешивающим/элюирующим буфером (50 мМ фосфатом натрия, рН 6,9-7,1).
(4) Разведенный и HQ-очищенный образец (1) загружали в уравновешенную колонку со скоростью потока 1,6 мл/мин и промывали 50 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,9-7,1). И затем образец элюировали при 20 CV в 12%-ном градиенте. Фракции, соответствующие первому пику, последовательно собирали (фракции анализировали с помощью SDS-PAGE).
(5) Для регенерации колонки после сбора фракций загружали 20 мл или более промывочного буфера (50 мМ фосфата натрия, рН 6,9-7,1, 1 М NaCl) при скорости потока 1,6 мл/мин, чтобы промыть колонку.
(6) Процедуры (1) - (5) выше выполнялись с использованием образцов, очищенных TQ и HQ после обработки в соответствии с другими тремя способами (TQ-очистка после UF, следующей за глубинной фильтрацией, осаждение сульфатом аммония после глубинной фильтрации и осаждение соляной кислотой после глубинной фильтрации) вместо образца, очищенного HQ после предварительной обработки в соответствии с обычным способом.
В результате было показано, что ботулотоксин может быть получен с высокой степенью чистоты и что полученный ботулотоксин имеет форму 7S (молекулярная масса: около 150 кДа) (Фиг . 4 и 5).
2-3-4: HQ-очистка (AEX, режим FT) и XS-Очистка (режим связывания)
Согласно cпособу получения ботулотоксина, описанному в примере 2-3-3 выше, ботулотоксин получали с использованием проточного режима вместо режима связывания в процессе HQ-очистки (AEX).
HQ-процесс (AEX, FT-режим)
HQ-Очистка (режим AEX, FT) выполнялась следующим образом.
Образец, очищенный TQ после предварительной обработки в соответствии с обычным способом, подвергали 10 раз диафильтрации с помощью 25 мМ буфера Tris-HCl (рН 7,7-7,9, проводимость 7,0-7,5 мС/см) с использованием системы UF (кассета PALL, TFF 30 кДа MWCO). Конечный рН образца составлял 7,7-7,9, а объем образца доводили до 30 мл. Затем образец подвергали HQ-процессу (FT-режим).
(1) HQ-Смолу упаковывали в AKTA Prime Plus.
(2) Колонку уравновешивали 25 мМ буфером Трис-HCl (рН 7,7-7,9, проводимость: 7,0-7,5 мСм/см).
(3) Образец, очищенный TQ, загружали со скоростью потока 1,5 мл/мин и элюировали 40 мл 25 мМ буфера Tris-HCl (рН 7,7-7,9, проводимость: 7,0-7,5 мСм/см). Собирали фракции, соответствующие пику (фракции анализировали с помощью SDS-PAGE).
(4) Для регенерации колонки после сбора фракций загружали 40 мл или более промывочного буфера (25 мМ Трис-HCl, pH 7,7-7,9, 1 М NaCl) со скоростью потока 1,5 мл/мин, для промывки колонки.
XS-Процесс с использованием образца HQ (FT)
Чтобы повысить чистоту ботулотоксина, образец, очищенный методом HQ (FT), дополнительно очищали с помощью XS-процесса (связывания).
(1) Образец, очищенный методом HQ (FT), разбавляли до 1/4 с использованием 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,9-7,1).
(2) XS-смолу загружали в AKTA Prime Plus.
(3) Колонку уравновешивали 50 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 6,9-7,1).
(4) Образец, очищенный HQ, разбавленный в (1) выше, загружали в колонку со скоростью потока 1,5 мл/мин и промывали 50 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,9-7,1). И затем образец элюировали при 60 CV и в 12% градиенте. Собирали фракции, соответствующие первому пику (фракции анализировали с помощью SDS-PAGE).
(5) Для регенерации колонки после сбора фракций загружали 20 мл или более промывочного буфера (50 мМ фосфата натрия, pH 6,9-7,1, 1 М NaCl) при скорости потока 1,5 мл/мин, чтобы промыть колонку.
В результате, как показано на Фиг. 6 и 7 было обнаружено, что ботулотоксин в форме 7S (молекулярная масса: около 150 кДа) может быть получен с чистотой 98% или выше.
В совокупности, как показано на Фиг. 2-7, в образце, содержащем ботулотоксин, полученном путем очистки анионообменной хроматографией (TQ (режим связывания или FT-режим)) после выполнения либо обычного способа Примера 2, либо процесса осаждения соляной кислотой после глубинной фильтрации, примеси, отличные от 138 кДа (NTNH), 98 кДа (тяжелая цепь), 52 кДа (легкая цепь), 50 кДа (НА), 33 кДа (НА), 20 кДа (НА) и 17 кДа (НА), которые в природе наблюдаются в токсине 19S, наблюдались в наименьшем количестве.
Кроме того, в образце, содержащем ботулотоксин, полученный анионообменной хроматографией (TQ (связывание или FT-режим)) после UF-диафильтрации после глубинной фильтрации наблюдалась полоса примесного белка около 13 кДа.
Кроме того, в образце, содержащем ботулотоксин, полученный анионообменной хроматографией (TQ (связывание или FT-режим)) после осаждения сульфатом аммония после глубинной фильтрации наблюдалась полоса примесного белка около 37 кДа.
Однако, как видно из результатов процессов HQ-и XS-очистки, после диссоциации комплекса токсинов для очистки низкомолекулярного ботулотоксина, полоса примесного белка не наблюдалась во всех образцах, содержащих ботулотоксин, независимо от типа одного из четырех процессов предварительной обработки (обычный процесс, UF после глубинной фильтрации, осаждение сульфатом аммония после глубинной фильтрации, и осаждение соляной кислотой после глубинной фильтрации), и наблюдались только низкомолекулярные ботулотоксины с 98 кДа (тяжелая цепь) и 52 кДа (легкая цепь).
В частности, наиболее эффективный способ, способный заменить процессы ферментативной обработки и экстракции образцов, содержащих ботулотоксин, для отделения ботулотоксина 19S, представляет собой очистку анионообменной хроматографией (TQ (режим связывания или FT-режим), выполняемой после любого процесса из осаждения серной кислотой, глубинной фильтрации и осаждения соляной кислотой.
С другой стороны, в процессе разделения ботулотоксина 7S (низкомолекулярный ботулотоксин) самая высокая эффективность очистки была продемонстрирована, когда анионообменная хроматография (HQ (режим связывания или FT-режим)) и катионообменная хроматография ( XS (режим связывания)) последовательно выполнялись после каждого из четырех процессов предварительной обработки (традиционный процесс, UF после глубинной фильтрации, осаждение сульфатом аммония после глубинной фильтрации и осаждение соляной кислотой после глубинной фильтрации).
Промышленная применимость
Новый способ получения ботулотоксина в соответствии с настоящим изобретением позволяет принципиально предотвратить проникновение компонентов животного происхождения, тем самым обеспечивая повышенную безопасность. Кроме того, использование способа по настоящему изобретению позволяет получать ботулотоксин высокой чистоты простым способом, что указывает на то, что этот способ является очень экономичным и эффективным. Ботулотоксин, полученный способом по настоящему изобретению, имеет относительно высокую чистоту по сравнению с ботулотоксинами, полученными обычными способами, и, таким образом, обладает повышенной способностью действовать в локальной области. Таким образом, системная циркуляция ботулотоксина, которая может привести к побочным эффектам, снижается, при этом повышается безопасность. Соответственно, ботулотоксин по настоящему изобретению может использоваться для различных целей, включая лечение нейромышечных расстройств, удаление морщин и лечение спастической гемиплегии и церебрального паралича.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на специфические признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание предназначено только для описания предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.