КЛЕТОЧНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ НАГРУЗКИ И АКТИВАЦИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
CELL PRODUCT FOR LOADING AND ACTIVATION OF HUMAN DENDRITE CELLS

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к созданию клеточных продуктов из клеточных линий клеток линий меланомы кожи человека, и может быть использовано для нагрузки и активации дендритных клеток (ДК) человека.
Известно, что свободные (несвязанные) антигены не распознаются Т-лимфоцитами даже в том случае, если эти клетки экспрессируют рецепторы, соответствующие антигену. Для того чтобы инициировать иммунный ответ, антиген должен быть представлен на поверхности антиген-презентирующей клетки в контексте с HLA молекулами и в ассоциации с другими поверхностными молекулярными структурами (костимулирующие, адгезивные и др.). Это событие является определяющим как в стимуляции Т-клеток, так и в формировании эффективного иммунного ответа [Guinan Е.С., Gribben J.G., Boussiotis V.A., Freeman G.J., Nadler L.M. Pivotal role of the B7:CD28 pathway in transplantation tolerance and tumor immunity // Blood. 1994 Nov 15; 84(10):3261-82].
Как показали исследования, количество дендритных клеток (ДК) в организме больных злокачественными опухолями снижено, а сами они функционально неполноценны. ДК, выделенные из периферических лимфоидных и нелимфоидных тканей и периферической крови как экспериментальных животных с опухолями, так и онкологических больных не способны стимулировать специфический ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и слабо стимулируют Т-хелперы [Zitvogel L., Robbins P.D., Storkus W.J. etal. Interleukin-12 and B7.1 co-stimulation cooperate in the induction of effective antitumor immunity and therapy of established tumors // Eur J Immunol. 1996 Jun; 26(6):1335-41]. Кроме того, на их поверхности было выявлено снижение экспрессии адгезивных и костимулирующих молекул, а также критическое снижение экспрессии HLA-молекул, особенно I класса. Предполагается, что уменьшение количества ДК и потеря ими ряда функций может быть одной из главных причин отсутствия полноценного иммунного ответа на развивающуюся опухоль.
Культивирование периферических ДК invitro в условиях, позволяющих получить их максимальный рост и активацию, приводило к увеличению экспрессии поверхностных молекул, но уровень их часто оказывался недостаточным для индукции устойчивого ответа специфических ЦТЛ [Veglia F., Gabrilovich D.I. Dendritic cells in cancer: the role revisited // Curr Opin Immunol. 2017 Apr; 45:43-51. doi: 10.1016/j.coi.2017.01.002]. Наибольшей способностью по сравнению с периферическими ДК к представлению специфического опухолевого антигена Т-лимфоцитам обладают костномозговые предшественники ДК, а также сингенные или аллогенные ДК из периферической крови здоровых индивидуумов, активированные invitro опухолеассоциированными антигенами (ОАА) [Palmer Е.М., van Seventer G.A. Human T helper cell differentiation is regulated by the combined action of cytokines and accessory cell-dependent costimulatory signals // J Immunol. 1997 Mar 15; 158(6):2654-62]. Только такие ДК в большинстве случаев стимулировали нормальный ответ ЦТЛ. Это позволяет считать активированные ДК перспективными кандидатами для активной специфической иммунотерапии пациентов с распространенными формами злокачественных опухолей, в том числе и резистентных к стандартному лечению.
В настоящее время хорошо известно, что опухолевые клетки отличаются от нормальных по своему антигенному составу, и распознавание клеток опухолей иммунной системой отличается от такового для клеток нормальных тканей и существенно зависит от распознавания Т-лимфоцитами ОАА. Многочисленные исследования последних десятилетий убедительно показали, что опухолевые клетки экспрессируют антигенные детерминанты (эпитопы), которые могут распознаваться аутологичными цитоксическими Т-лимфоцитами. Эти эпитопы, являющиеся мишенями для клеток иммунной системы, представляют собой результат эпигенетических, транскрипционных, трансляционных и пост-трансляционных модификаций опухолевых клеток [Arenas-Ramirez N., Sahin D., Boyman О. Epigenetic mechanisms of tumor resistance to immunotherapy // Cell Mol Life Sci. - 2018. -Aug 23. doi: 10.1007/s00018-018-2908-7].
Обнаружение ОАА стало толчком к их использованию для нагрузки ДК. Сейчас известны ОАА многих типов опухолей, в частности, меланомы (gp100, Melan-A/Mart-1, тирозиназа, MAGE-1), рака предстательной железы (PSA, PSCA) и др. [Марков О.В., Миронова Н.Л., Власов В.В., Зенкова М.А. Противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток: от экспериментов на животных моделях до клинических испытаний // Acta naturae. - 2017. - Т. 9. - №3(34). - С. 29-41].
Кроме уникальных антигенов, опухолевые клетки имеют широкий спектр молекул, которые экспрессированы многими гистологическими типами злокачественных новообразований, а также могут встречаться в клетках нормальных тканей.
Раково-тестикулярные антигены (РТА) представляют собой кластер опухоле-ассоциированных белков, которые не эксперссируются в нормальных соматических клетках, за исключением клеток семенников и плаценты, но широко представлены в разнообразных злокачественных новообразованиях. В настоящее время известно 228 РТА, объединяемых в семейства по ряду родственных признаков, которые классифицируют обычно в две основные группы: антигены СТ-Х, локализующиеся на Х-хромосоме, и составляющие 52% (120), и остальные, так называемые «non-Х СТ», закодированные в аутосомах и в Y-хромосоме [Salmaninejad А., Zamani M.R., Pourvahedi М. etal. Cancer/Testis Antigens: Expression, Regulation, Tumor Invasion, and Use in Immunotherapy of Cancers // Immunol Invest. 2016 Oct; 45(7):619-40. doi: 10.1080/08820139.2016.1197241]. Факт, что РТА экспрессируются многими злокачественными новообразованиями позволяет использовать их для нагрузки и активации ДК.
Опухолевые лизаты признаны превосходным источником ОАА для дендритных клеток. Экспериментальные работы на животных моделях показали, что дендритные клетки, нагруженные опухолевым лизатом, способны индуцировать иммунный ответ через генерацию ЦТЛ, специфически активированных против опухолевых антигенов, что приводит к регрессу опухолей у животных [Rainone V., Martelli С., Ottobrini L., Biasin M., Texido G., Degrassi A., Borelli M., Lucignani G., Trabattoni D., Clerici M. Immunological Characterization of Whole Tumour Lysate-Loaded Dendritic Cells for Cancer Immunotherapy // PLoS One. - 2016. - 11(1): e0146622. doi: 10.1371/journal.pone.0146622]. Тестирование разных способов нагрузки и активации ДК, в частности, лизатами на основе аутологичных и аллогенных опухолевых клеток, цельными опухолевыми клетками и мРНК, выделенной из опухолевых клеток, показало, что наиболее эффективный иммунологический ответ вызывали именно ДК, активированные цельными или лизированными клетками опухоли [Nathenson M.J., Conley А.Р., Sausville Е. Immunotherapy: A New (and Old) Approach to Treatment of Soft Tissue and Bone Sarcomas // The Oncologist. - 2018. - 23:71-83. doi: 10.1634/theoncologist.2016-0025]. Одними из первых были разработаны вакцины на основе аутологичных ДК, выращенных из моноцитов периферической крови и активированных лизатом аллогенных клеток меланомы кожи и рака предстательной железы, применение которых показало формирование опухолеспецифической реакции гиперчувствительности замедленного типа и увеличение показателей выживаемости пациентов с диссеминированными формами заболевания, то есть продемонстрировало иммунологический и клинический ответ [Lopez M.N., Pereda С., Segal G., Munoz L., Aguilera R., Gonzalez F.E., Escobar A., Ginesta A., Reyes D., Gonzalez R. etal. Prolonged survival of dendritic cell-vaccinated melanoma patients correlates with tumor-specific delayed type IV hypersensitivity response and reduction of tumor growth factor β-expressing T cells // J Clin Oncol. - 2009. - 27:945-952. doi: 10.1200/JCO.2008.18.0794].
В начале 2000-х годов уже было отмечено, что опухоли разной гистотипической принадлежности могут иметь сходный антигенный профиль, например антигены семейства MAGE или ТА-90, что позволяет в данном случае использовать противоопухолевые вакцины на основе клеток меланомы кожи для лечения больных другими типами онкологических заболеваний, при условии, что их опухолевые клетки экспрессируют соответствующие антигены [Habal N., Gupta R.K., Bilchik A.J., Yee R., Leopoldo Z., Ye W., Elashoff R.M., Morton D.L. CancerVax, an allogeneic tumor cell vaccine, induces specific humoral and cellular immune responses in advanced colon cancer // Ann Surg Oncol. - 2001. - 8(5):389-401. PMID: 11407512].
Большинство РТА представлены мультиантигенными семействами, состоящими из родственных антигенов. Другие РТА могут не иметь аналогов, например, SCP-1. Разнообразие родственных антигенов позволяет полагать, что стимулирование иммунного ответа против одного члена семейства будет способствовать распознаванию и элиминации клеток, экспрессирующих родственные антигены. Таким образом, чтобы оценить иммуногенные свойства опухоли, достаточно определить активность только некоторых генов-представителей семейств.
В процессе опухолевой прогрессии опухолевые клетки реализуют разнообразные механизмы, позволяющие им «ускользать» от воздействия клеток иммунной системы. Один из подобных механизмов - это синтез и экскреция в микроокружение опухоли различных молекул, оказывающих локальное блокирующее воздействие на функционирование опухолеассоциированных компонентов иммунной системы, а также способных оказывать системное иммуносупрессивное действие [Wu А.А., Drake V., Huang H.S., Chiu S., Zheng L. Reprogramming the tumor microenvironment: tumor-induced immunosuppressive factors paralyze T cells // Oncoimmunology. - 2015. - Apr 1; 4(7):е1016700].
Таким образом, разработка клеточного продукта, содержащего широкий спектр основных изученных семейств РТА, лишенного специфического иммуносупрессивного действия на клетки иммунной системы, имеет большое значение для совершенствования дендритно-клеточных вакцин.
Известны иммуностимулирующие и вакцинные композиции, суть которых заключается в использовании маннанов с молекулярным весом более чем приблизительно 1000 кДа, применяемых как самостоятельный агент, так и в комплексе с по меньшей мере одним опухолевым антигеном или кодирующей его нуклеиновой кислотой (патент RU 2578420, опубл. 22.10.2015).
Недостатком данных композиций является их моноспецифичность.
Известны композиции для активации ДК человека, содержащие интерферон гамма и аутологичные опухолевые клетки больного, в присутствии которых происходит созревание активированных дендритных клеток (Заявка на изобретение 2008122550, опубл. 20.01.2010).
Недостатком подобной композиции является невозможность учитывать гетерогенизацию опухоли in vivo, когда в результате опухолевой прогрессии появляются новые злокачественные клоны с измененным антигенным фенотипом.
Известны новые вакцинные адъюванты на основе адъювантов-антител, нацеливающих непосредственно на антигенпрезентирующие клетки, представляющие собой композицию, включающую специфическое к ДК антитело или его связывающий фрагмент, конъюгированные с агонистом TLR; и, по меньшей мере, один антиген, где антиген и агонист являются эффективными для вызова иммунного ответа у объекта-человека, нуждающегося в иммуностимуляции (Заявка на изобретение 2013110889/10, 12.08.2011). В качестве антигена могут выступать пептиды ОАА, выделенные из злокачественных новообразований.
Недостатком данной композиции является узкая иммуноспецифичность формируемого иммунного ответа, так как предполагается, что выделенные из организма ДК человека будут приведены в контакт с заявленной вакцинной композицией.
Известен клеточный продукт для нагрузки и активации дендритных клеток, представляющий собой клеточный лизат на основе 4 клеточных линий меланомы кожи человека, протестированных иммуноцитохимическим методом на присутствие шести меланомо-ассоциированных дифференцировочных антигенов и методом проточной цитометрии на присутствие трех раково-тестикулярных антигенов (Нехаева Т.Л. Оптимизация технологии и стандартизация получения противоопухолевых вакцин на основе аутологичных дендритных клеток: автореф. дис. канд. медицинских наук: 14.01.12, 14.03.09 / СПб, 2014. 24 с.) Данный продукт применялся для создания вакцин на основе дендритных клеток для лечения больных преимущественно меланомой кожи.
Недостатком данного клеточного продукта является незначительная выборка однотипных клеточных линий с продукцией антигенов, присутствующих исключительно на злокачественных меланоцитах и отсутствующих в клетках других солидных опухолей.
Техническим результатом изобретения является создание клеточного продукта (условное название IRTAN-2018), содержащего расширенный спектр РТА и проверенного на отсутствие продукции значительного количества факторов, участвующих в процессах неоангиогенеза, метастазирования, ингибирования свойств клеток иммунной системы, что приводит к повышению функциональной активности клеточного продукта в производстве дендритно-клеточных вакцин и универсализации получаемых лечебных препаратов для лечения солидных опухолей, несущих родственные РТА. Техническим результатом является также возможность использования заявляемого клеточного продукта для тестирования функциональной состоятельности дендритных клеток пациентов, которым показана клеточная иммунотерапия, а также для создания клонов опухоле-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (цитокин-активированных киллеров).
Указанный технический результат достигается в клеточном продукте для нагрузки и активации дендритных клеток человека, состоящем из равных долей лизатов клеточных линий меланомы кожи человека, депонированных в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под соответствующими регистрационными номерами:
226 АВ mel - под номером РККК(П)725Д,
283 mel - под номером РККК(П)726Д,
Mel 311 - под номером РККК(П)703Д,
515 mel - под номером РККК(П)757Д,
mel 520 DVA- под номером РККК(П)779Д,
685 mel GSN - под номером РККК(П)781Д,
686 mel FLA - под номером РККК(П)782Д,
860 mel BII - под номером РККК(П)783Д,
mel 929 SVU - под номером РККК(П)780Д,
обладающих хорошими ростовыми характеристиками, экспрессирующих гены основных семейств РТА и продуцирующих очень низкие количества иммуносупрессивных факторов, лизаты указанных клеточных линий приготовлены путем многократного замораживания-оттаивания с определением жизнеспособности клеток методом проточной цитометрии, одна аликвота клеточного продукта содержит суммарное число клеток 30 млн, которые находятся в 500 мкл физиологического раствора.
Изобретение сопровождается графическими изображениями на фиг. 1-13, где:
на фиг. 1 - табл. 1. Числовое выражение интенсивности экспрессии РТА клеточными линиями меланомы кожи, выраженное в процентах по отношению к референсному гену;
на фиг. 2 - табл. 2. Продукция иммуносупрессивных факторов 9 клеточными линиями меланомы кожи;
на фиг. 3 - табл. 3. Характеристика клеточных линий меланомы кожи, входящих в композицию клеточного препарата IRTAN-2018;
на фиг. 4 - табл. 4. Цитогенетическая характеристика клеточных линий МК, входящих в композицию клеточного препарата IRTAN-2018;
на фиг. 5 - табл. 5. Морфологические особенности клеточных линий МК, входящих в композицию клеточного препарата IRTAN-2018:
на фиг. 6 - определение жизнеспособности клеточного лизата, входящего в состав клеточного продукта IRTAN-2018;
на фиг. 7 - графическое изображение основных субпопуляций зрелых ДК, полученных в результате их активации клеточным препаратом IRTAN-2018;
на фиг. 8 - сравнение антигенного иммунофенотипа незрелых и зрелых ДК. Гистограммы, полученные методом проточной цитометрии. Незрелые ДК - зеленый цвет, зрелые ДК - красный;
на фиг. 9 - табл. 6. Сравнение экспрессии антигенов, присутствующих на незрелых и зрелых дендритных клетках, полученных в результате их активации клеточным препаратом IRTAN-2018:
на фиг. 10 - табл. 7. Результаты мультиплексного анализа продукции цитокинов незрелыми и зрелыми ДК, полученными в результате их активации клеточным препаратом IRTAN-2018 (пг/мл);
на фиг. 11 - относительное содержание активированных ЦТЛ в клеточной популяции, полученной в результате кокультивирования с ДК, нагруженными клеточным продуктом IRTAN-2018:
на фиг. 12 - графическое изображение результатов ММТ теста при кокультивировании активированных ЦТЛ и клеток меланомы кожи, полученных из операционного материала разных больных. * - р<0,005
Технический результат изобретения достигается за счет расширения используемой популяции клеток меланомы кожи путем создания клеточного продукта из 9 клеточных линий меланомы кожи человека, каждая из которых гиперэкспрессирует уникальный набор РТА (фиг. 1, табл. 1).
Каждая клеточная линия меланомы кожи человека, входящая в состав клеточного продукта, продуцирует низкое количество иммуносупрессивных факторов, определенных методом мультиплексного анализа на приборе BioPlex (BioRad, США) в супернатантах культивируемых клеток на поздних пассажах (фиг. 2, табл. 2).
Каждая клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под соответствующим регистрационным номером (фиг. 3, табл. 3).
Преимущество использования композиции клеточных линий меланомы кожи человека, экспрессирующих РТА, перед использованием отдельных клеточных линий заключается в том, что композиционное решение базируется на выявлении метаболических особенностей полученных клеточных линий меланомы кожи, и заявляемая клеточная композиция (клеточный продукт) содержит полный набор РТА, в том числе редко встречающихся активных генов (HAGE, SPANXA1), необходимых для активации дендритных клеток, что отсутствует в каждой клеточной линии по отдельности.
Клеточные линии меланомы кожи получены из операционного материала онкологических больных. Одна клеточная линия получена из первичной опухоли, остальные восемь имеют метастатическое происхождение.
Получение клеточных линий осуществлено следующим образом.
2
Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30-60 сек. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Пассажи, на которых были получены стабильно растущие клеточные линии, указаны в табл. 3 на фиг. 3.
Культуральные свойства клеточных линий представлены следующим образом.
2
Для изготовления клеточного продукта по изобретению клеточные линии меланомы кожи культивируются и наращиваются однотипным способом: с использованием питательной среды DMEM/F12 (80%), эмбриональной телячьей сыворотки 20%, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно); 37°С, 5% СО, 100% влажности. Культуры клеток имеют адгезионный монослойный тип роста, посевная доза и частота пересева указана в табл. 3 на фиг. 3.
Условия криоконсервации следующие.
Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%), DMSO10%; 3×106 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см2. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации указана в табл. 3 на фиг. 3.
Контаминация исследована следующим образом.
При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasmapneumonia, genitalium, hominis-тест на микоплазму отрицателен.
Цитогенетическая характеристика клеточных линий представлена в табл. 4, на фиг. 4
Морфологические характеристики клеточных линий представлены в табл. 5 на фиг. 5.
Изобретательский уровень настоящего изобретения обеспечивается тем, что девять заявленных клеточных линий меланомы кожи наращивают вышеописанным способом, снимают с субстрата, отмывают дважды в физиологическом растворе путем центрифугирования 10 мин при 1000 об/мин и соединяют в равных долях с общим количеством клеток 30 млн/ампула в 500 мкл физиологического раствора. Полученная клеточная суспензия подвергается шестикратному замораживанию до температуры -196°С и моментальному оттаиванию при комнатной температуре, в результате чего получают клеточный лизат. Проверку жизнеспособности клеточного лизата осуществляют методом проточной цитометрии с использованием флюоресцентного красителя 7-AAD (BD Bioscience, США) (рис. 2). Количество мертвых клеток в лизате составляет не менее 99,3-99,8%. Аликвоты клеточного продукта IRTAN-2018 помещают в криопробирки объемом 1,5 мл (BD Bioscience, США) и хранят при -30°С до использования.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Изучение антигенного иммунофенотипа ДК при использовании клеточного продукта IRTAN-2018 для их нагрузки и активации.
+
2
А) Для получения дендритных клеток CD14 моноциты, выделенные из периферической крови четырех практически здоровых человек методом позитивной магнитной сепарации с помощью набора STEMCELL Technologies Inc, США, помещали в плоскодонные культуральные флаконы 75 см с вентилируемыми пробками (Sarstedt, Германия).
Б) Дифференцировку моноцитов в незрелые ДК проводили в сбалансированной бессывороточной среде CellGro DC (CellGenix, Германия) с применением ростовых факторов и факторов дифференцировки - GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) (CellGenix, Германия), которые вносили на 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования.
В) На седьмые сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены (1 аликвота клеточного препарата IRTAN-2018, 30 млн клеток), исходя из соотношения 1 ДК:3 лизированные опухолевые клетки, ростовые факторы и факторы дифференцировки - GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл) и TNF-α (BD, США) (20 нг/мл).
6
Г) На 7-й и 9-й день отбирали ДК в количестве не менее 1×10, анализ поверхностных антигенов осуществляли на приборе BD FACS Canto™ II (BD, США).
Д) Производили оценку иммунофенотипа ДК по следующей схеме с использованием следующих реагентов:
- пробирка №1: 20 мкл CD14 FITC, 20 мкл CD11c РЕ, 5 мкл CD86 PerCP-Су5.5, 5 мкл CD83 РЕ-Су7, 20 мкл CD1a АРС, 5 мкл CD80 АРС-Н7.
- пробирка №2: 20 мкл CD14 FITC, 20 мкл CD40 РЕ, 20 мкл CD209 PerCP-Су5.5, 5 мкл CD83 РЕ-Су7, 20 мкл CD1a АРС, 5 мкл HLA-DR АРС-Н7.
- пробирка №3: 20 мкл CD14 FITC, 5 мкл CD83 РЕ-Су7, 20 мкл CD1a АРС, 5 мкл CD197 (CCR7) BV421. Все реагенты производства BD Bioscience, США.
Е) Полученные результаты отражены на фиг. 7, 8 и в табл. 6 на фиг. 9.
Из фиг. 7, 8 и табл. 6 на фиг. 9 видно, что в результате активации после инкубации с клеточным продуктом статистически значимо меняется иммунофенотип ДК: увеличивается присутствие на клеточной поверхности CCR7, CD83, CD86, CD80, CD40, в том числе коэкспрессия CD83/CD1a, CD83/CD86, CD83/CD80, CD83/CD209, CD83/CCR7; наблюдается уменьшение относительного содержания ДК, позитивных по CD83/CD1a, что свидетельствует об эффективном созревании ДК, их готовности мигрировать и презентировать ОАА.
Пример 2. Анализ продукции цитокинов ДК при использовании клеточного продукта IRTAN-2018 для их нагрузки и активации.
А) ДК получали и культивировали описанным выше способом. На 7-й и 9-й день культивирования отбирали надосадочную жидкость (супернатант) в количестве не менее 500 мкл и использовали для анализа количественного содержания цитокинов методом мультиплексного анализа на приборе Bio-Plex 200 (Bio-Rad, США) с программным обеспечением Bio-Plex Manager™ v. 6.1 (Bio-Rad, США) помощью набора Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-plex Assay(Bio-Rad, США).
Б) Полученные результаты отражены в табл. 7 на фиг. 10. В результате активации под воздействием клеточного препарата IRTAN-2018 в супернатантах культур ДК статистически значимо увеличивается количественное содержание цитокинов IL-2, IL-17 и уменьшаются концентрация цитокинов IL-5, IL-10, G-CSF, MIP-1b, что свидетельствует об эффективном созревании ДК, проявлении их способности синтезировать молекулы, привлекающие и активирующие Т-лимфоциты.
Пример 3. Получение специфически активированных ЦТЛ путем кокультивирования с ДК, активированными с помощью клеточного продукта IRTAN-2018.
2
А) Выделяли мононуклеарные клетки (МНК) методом лейкафереза периферической крови пациентов или центрифугирования периферической крови в градиенте плотности. Затем МНК вносили в плоскодонные культуральные флаконы 75 см для разделения фракций преимущественно моноцитов и преимущественно лимфоцитов методом адгезии к субстрату. Среду с не прилипшими клетками (преимущественно лимфоцитами) аккуратно отбирали, подсчитывали количество, отбирали пробу для анализа методом проточной цитофлуорометрии и криоконсервировали до использования. С прилипшей фракцией клеток работали для получения активированных ДК, нагруженных РТА. Для этого вносили в культуру полученных моноцитов ростовые факторы и факторов дифференцировки - GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) (CellGenix, Германия) в сбалансированной бессывороточной среде CellGro DC (CellGenix, Германия) на 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования.
Б) На седьмые сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены (1 аликвота клеточного препарата IRTAN-2018, 30 млн клеток), исходя из соотношения 1 ДК:3 лизированные опухолевые клетки, ростовые факторы и факторы дифференцировки - GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл) и TNF-α (BD, США) (20 нг/мл).
В) Фракцию лимфоцитов размораживали и кокультивировали со зрелыми ДК (9-й день культивирования) в присутствии цитокинов GM-CSF (72 нг/мл), IL-2 (12,5 МЕ/мл), IL-4 (15 нг/мл), IL-7 (10 нг/мл), TNF-α (20 нг/мл) (BD Bioscience, США) в течение 7 дней. Затем собирали лимфоциты и переносили их для кокультивирования со свежей порцией зрелых ДК в присутствии искомого коктейля цитокинов. Проводили кокультивирование лимфоцитов и зрелых ДК еще в течение 7 дней, добавляя цитокины каждые 48 часов.
+
+
Г) Сортировку клеток осуществляли методом негативной магнитной сепарации с использованием прибора EasySep™ Magnet. CD8 Т-лимфоциты были выделены из клеточной суспензии с помощью набора EasySep™ Human CD8 Т Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc., Канада). Полученные ЦТЛ анализировали на проточном цитометре BD FACS Canto™ II (BD, США).
Д) Полученные результаты представлены на фиг. 11.
+
+
Клеточная популяция, полученная в результате магнитной сепарации, содержала 95,8% CD3CD8ЦТЛ, среди которых 80,5% ЦТЛ несли на своей поверхности антиген HLA-DR, 90,5% - CD95, 40,3% - CD38, 55,2% ЦТЛ продуцировали гранзим В, 33,8% - перфорин, 20,0% - интерферон гамма.
2
2
Е) Полученные данные свидетельствуют об активации ЦТЛ, что подтверждается результатами ММТ теста при кокультивировании активированных ЦТЛ и клеток меланомы кожи, полученных из операционного материала разных больных. Для этого проводили оценку жизнеспособности опухолевых клеток с использованием набора Cell Proliferation Kit (МТТ) (Roche, Швейцария), представляющего собой колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Клетки высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в конечном объеме 100 мкл на лунку в количестве 5×104 клеток на лунку. Культивировали клетки меланомы кожи в стандартных условиях в течение времени, необходимого для эксперимента. После инкубационного периода добавляли в каждую лунку 10 мкл MTT-labeling reagent в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Инкубировали 4 часа в условиях CO-инкубатора. Затем добавляли в каждую лунку 100 мкл растворяющего компонента и помещали планшету снова на ночь в СО-инкубатор. После того, как кристаллы формазана полностью растворялись, использовали микропланшетный ридер Thermo ScienticMultiscan EX (Thermo LabSystems Inc., США) с блоком считывания и обработки информации при длине волны 620 нм для измерения спектрометрической поглощательной способности образцов.
Наблюдали в большинстве случаев статистически значимые различия значений оптической плотности между образцами клеток меланомы кожи без воздействия (контроль) и образцами, куда вносили активированные ЦТЛ (фиг. 12).
Заявляемое изобретение - это новый клеточный продукт, содержащий расширенный спектр РТА и проверенный на отсутствие продукции значительного количества факторов, участвующих в процессах неоангиогенеза, метастазирования, ингибирования свойств клеток иммунной системы. Созданный клеточный продукт обладает повышенной функциональной активностью при использовании его в производстве дендритно-клеточных вакцин и универсализации получаемых лечебных препаратов для лечения солидных опухолей, несущих родственные РТА. Появляется возможность использования заявляемого клеточного продукта для тестирования функциональной состоятельности дендритных клеток пациентов, которым показана клеточная иммунотерапия, а также для создания клонов опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (цитокин-активированных киллеров).