Влияние метаболитов бактериальной микробиоты кишечника на временную организацию биологических свойств Candida albicans

Результаты исследований позволили выявить общие закономерности морфологии и функционирования желудка, свойственные жвачным животным и особенности, свидетельствующие о соответствии между типом питания и морфологией камер желудка, и функциональных структур, а также особенностями эндосимбиоза.

Несмотря на принадлежность к одному роду и общность ареала, морфологическая дифференцировка камер желудка у безоарового козла и тура на всех уровнях структурной организации существенно различается. Этот факт наглядно показывает, что желудок у дагестанских козлов структурно адаптирован к утилизации различных типов пищи.

На основании проведенных исследований камер желудка безоарового козла и дагестанского тура можно предположить, что особенности морфологии и симбиоце-нозов этих органов позволяют им избежать конкуренции

из-за кормовых ресурсов и благополучно сосуществовать в одном ареале. Экологическая приспособленность диких козлов, свойственная многим жвачным, к проявлению избирательности в питании, обеспечивает им необходимый уровень метаболизма в суровых условиях существования с резкими сезонными колебаниями кормовых ресурсов и благополучно выживать в определенных условиях обитания.

Список литературы:

1. Давлетова Л.В., Хацаева Р.М. Особенности гистогенеза отделов желудка сайгака в сравнении с овцами разных пород. Европейский сайгак: развитие, морфология, экология. Монография. М.: Наука, 1997. С. - 72-96.

2. Хацаева Р.М. Эколого-морфологическая характеристика желудка диких и домашних жвачных. М.: Зоол. журн., 2002. Т. 81. № 10. - С. 1265 - 1270.

ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА НА ВРЕМЕННУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

CANDIDA ALBICANS

Инфекционные заболевания, связанные с грибковыми поражениями органов человека, обычно возникают и развиваются в условиях микробных ассоциаций [1]. Известно, что в микросимбиоценозе между разными видами складываются сложные - конкурентные или кооперативные взаимоотношения [2]. Эти влияния обусловлены чаще действием легко экстрагируемых метаболитов, которые могут стимулировать или тормозить размножение, усиливать вирулентность возбудителя или способствовать появлению новых факторов, отягощающих болезнь [1].

В настоящее время проводятся фундаментальные исследования и получены доказательные результаты по изучению механизмов взаимо-отношений бактерий и грибов рода Candida [3,4]. Однако, открытым остается вопрос изменения биологических свойств грибов в ассоциациях на протяжении суток. Решение его могло бы раскрыть один из механизмов межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание ассоциативного симбиоза.

Цель исследования - изучить влияние метаболитов бактериальной микробиоты на пространственно - временную организацию биологических свойств Candida albi-cans (C. albicans). - изучить суточную динамику пленкообразующей активности грибов рода Candida

Экспериментальные исследования in vitro проводили на модели музейного штамма C. albicans 24433 и клинических изолятов C. albicans 147и C. albicans 192, выделенных из кишечника при Candida-носительстве и кандидозе. Выделение и идентификацию грибов проводили по комплексу признаков: изучению внешнего вида колоний, хла-мидоспорообразованию, тесту на образование ростовых трубок, определению чувствительности дрожжевых организмов к антифунгальным препаратам методом дисков, по ассимиляционной способности культуры [5]. Музейные штаммы перед исследованием инкубировали 24 часа на кровяном агаре при t=370 C.

Биологические свойства микромицетов изучали в течение суток с 4-х часовым интервалом по адгезивной

Николенко Марина Викторовна,

д.б.н., доцент кафедры микробиологии, г. Тюмень Тимохина Татьяна Харитоновна, д.б.н., доцент кафедры микробиологии, г. Тюмень Костырина Жанна Болеславовна

ассистент кафедры товароведения, г. Тюмень

[6], пролиферативной [7], морфологической [5], фосфоли-пазной [8], протеазной [9] и каталазной активности [10]. Регулирующее действие экзометаболитов микробов - ас-социантов на биологические свойства C. albicans изучали при добавлении в питательный бульон стерильных супер-натантов Вifidumbacterium bifidum (В. bifidum), Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli) [11]. Эти микроорганизмы наиболее часто высевались с C. albicans из биологического материала кишечника в отделениях ГЛПУ ТО ОКБ г. Тюмени за календарный год.

Данные обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p<0,05 [12]. Для каждого штамма определены основные параметры ритмов: мезор - среднесуточные значения показателя, амплитуда ритма - расстояние от максимума функции до мезора и акрофаза - момент времени, соответствующий регистрации максимального значения параметра. Для выявления степени межиндивидуальной синхронизации ритмов использован популяционный косинор - анализ.

В первой серии проведенных экспериментов была выявлена суточная динамика биологических показателей всех изучаемых свойств у музейного штамма и клинических изолятов C. albicans. Музейный вариант был выбран в качестве контроля не случайно. Он достаточно длительное время культивируется in vitro. А в искусственных условиях периоды ритмов физиологических процессов отклоняются от периодов окружающей среды. При такой изоляции биоритмы могут переходить на собственную частоту, проявляя тем самым свой собственный период, закрепленный в генетической структуре. У С. albicans 24433 последовательность проявления физиологической активности закономерна и может быть представлена с учетом блуждания фазы следующим образом: в утренние часы -секреция ферментов патогенности и формирование ростовых трубок; в дневное время - максимальная пролифера-тивная активность, в вечерние часы - максимальная адгезивная активность (рис. 1; А).

Рис.1. Временная организация биологических свойств C. albicans.

Примечание:

А) С. albicans 24433; Б) C. albicans 147; В) C. albicans 192

1) пролиферация; 2) адгезия; 3) морфогенез; 4) фосфолипаза; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства - амплитуд и фаз) отражают максимальную временную область проявления биоритмов по результатам популяционного косинор - анализа.

Временные ряды C. albicans 147 (Candida - носи-тельство) мало отличались от временной организации музейного штамма. Ферменты агрессии и показатели морфогенеза сохранили дневной тип суточной активности, акрофазы регистрировались в 04.00-08.00 часов (р<0,05). Время проявления максимальной адгезивной активности совпадало с акрофазой музейного штамма. Но наблюдалось изменение ритмометрических параметров пролиферации со смещением акрофазы на ночное время 23.0024.00 часов (рис.1; Б).

У С. albicans 192, выделенной из исследуемого материала при кандидозе кишечника, периоды физиологической активности равномерно распределены в течение суток и имели два и более всплесков. Так факторы адгезии, пролиферации, морфогенеза и каталазы характеризовались утренним и вечерним типом ритмичности. Активность фосфолипазы и протеазы демонстрировала ночной и дневной тип. У грибов при кандидозе наблюдалась четкая синхронизация факторов адгезии, колонизации с одной стороны и синхронизация факторов инвазии с другой. Активность адгезии и пролиферации характеризовалась

стабильностью и постоянством, о чем свидетельствует небольшая площадь эллипсов. А факторов инвазии и агрессии наоборот, имели высокую лабильность биоритмов, так как у них достаточно широкие доверительные интервалы акрофаз (рис. 1; В).

Во второй серии экспериментов изучали влияние экзометаболитов бактериальной микробиоты на пространственно-временную организацию изучаемых культур C. albicans. Под влиянием экзометаболитов S. aureus и E. coli хроноинфраструктура биологических свойств музейного штамма изменилась и стала похожа на временные ряды изолята, выделенного из организма здорового человека. А именно: ферменты агрессии и показатели морфогенеза сохраняли дневной тип суточной активности в 04.00-08.00 часов, а в вечернее время регистрировалась адгезивная активность (р<0,05). акрофазы пролиферации регестрирова-лась с 22.00 до 03.00 часов. Физиоло-гическая активность музейного штамма в присутствии данных метаболитов начинались с прикрепления грибов, затем микроорганизмы увеличивали численность популяции и выделяли ферменты защиты и агрессии (рис.1; Б; рис.2). Анализ полученных результатов позволил предположить, что продукты жизнедеятельности S. aureus и E. coli, изменяя биологические свойства грибов способствуют их заселению в кишечный биотоп при Candida - носительстве.

Рис.2. Временная организация биологических свойств C. albicans 24433 АТССпод влиянием экзометаболитов

микробов - ассоциантов

Примечание:

А) S. aureus; Б) E. coli; В) В. bifidum

1) пролиферация; 2) адгезия; 3) морфогенез; 4) фосфолипаза; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Культуры, полученные из кишечника Candida - носителей не изменяли хроноинфраструктуру и согласованность биологических свойств под влиянием супернатан-

тов S. aureus, E.coli и B. bifidum.

На ритмометрические показатели физиологической активности микромицетов, полученных при кандидозе кишечника, модифицирующее действие оказывали суперна-танты E. coli (рис. 1; В; рис. 3).

/// \ N\\

vV /z , 'S

А

Рис.3. Временная организация биологических свойств C. albicans 192 под влиянием экзометаболитов микробов -

ассоциантов

Примечание:

А) S. aureus; Б) E. coli; В) В. bifidum

1) пролиферация; 2) адгезия; 3) морфогенез; 4) фосфолипаза; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Максимальные значения биологических свойств регистрировались в ранние утренние часы и дневное время. Последовательность проявления физиологической активности стала похожа на последовательность музейного штамма.

Биопленкообразующую активность (БПО) изучали по способности микроорганизмов к адгезии на поверхности 96-луночного полистеролового стерильного планшета

[13]. Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов проводили с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2010.

У всех изучаемых культур выявлена суточная динамика биопленкоообразования. В спектральном составе биоритмов изолятов грибов, полученных от здоровых людей, установлены достоверные циркадианные (околосуточные) ритмы активности со стабильными положениями акрофаз в утренние часы (табл. 1). Рассматривая мезор как величину, позволяющую игнорировать случайные отклонения в виде резких подъемов и спадов, установлено, что у C. glabrata этот показатель составил 1,32±-0,23ед., что достоверно ниже по сравнению с другими видами (р<0,05).

Высокие значения амплитуды пленкообразующей активности зафиксированы у грибов вида C. krusei (р<0,05). Амплитуда имеет важное биологическое значение, поскольку служит признаком мощности ритма. Установлено, что высокая циркадианная амплитуда (особенно морфологических и метаболических показателей) сопровождается меньшими изменениями в течение нескольких дней, т.е. ритм более стабилен во времени, и чем больше амплитуда, тем труднее индуцировать сдвиг акрофазы

[14]. Величина амплитуды, как правило, коррелирует с устойчивостью ритмического колебания и косвенно свидетельствует о биологической ценности компонента хро-нома - комплексной временной организации живых систем [15]. Многократно проведенные исследования дали идентичные результаты. Следовательно, выявленный тип ритмичности закономерен для грибов данных видов.

У культур Candida sp.,выделенных из клинического материала при кандидозе, выявлен ультрадианный (около 12-ти часовой) ритм изучаемой функции (р<0,05) с максимальными значениями показателя в утреннее и ночное время (табл. 2).

Полученные результаты позволили сделать ряд заключений:

1. Изменение ритмометрических показателей физиологической активности клинических изолятов C. albicans можно считать проявлением фенотипиче-ской адаптации к условиям макроорганизма.

2. Временная самоорганизация грибной клетки обусловлена не только проявлением генетически детерминированных ритмов жизнедеятельности культуры, но и влиянием внешних управляющих параметров.

3. В процессе адаптации дрожжевых грибов in vivo отдельные группы бактерий играют одну из ключевых ролей. Экзометаболиты аэробной микробиоты кишечника регулируют временную организацию биологи-ческих свойств C. albicans.

4. период ритма и амплитудно-фазовые закономерности являются универсальными показателями, которые подчёркивают различия изолятов Candida sp. здоровых людей от культур, полученных из организма больных острой кандидозной инфекцией.

5. соотношения ультра- и циркадианных компонентов в спектральном составе, которое при различных воздействиях окружающей среды не является стационарным, дает возможность отличать патологические нарушения хроноинфраструктуры от приспособительных изменений.

Поэтому изучение механизмов симбиотических взаимодействий является актуальным и перспективным направлением дальнейших исследований.

Литература:

1. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В., Фассахов Р.С. Влияние экстрактов мицелиальных грибов на адгезивные свойства Candida albicans // Проблемы медицинской микологии, 2010, Т.12, № 1. С. 34-37.

2. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцова Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН, 2007, - 264 с.

3. Перунова Н.Б. Биорегуляция микросимбионтов в микросимбиоценозе кишечника человека // Авто-реф.....докт. мед. наук, Оренбург, 2011- 43 с.

4. Тимохина Т.Х. Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов //Авто-реф.....докт. биол. наук, Оренбург, 2011- 43 с.

5. Елинов Н.П. Candida. Кандидозы. Лабораторная диагностика. // Елинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова А.А., Чилина Г.А. Под редакцией проф. Н.П. Елинова - СПб.: Коста, 2010.-224 с.

6. Брилис В. И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. /В. И. Брилис, Т. А. Бри-лене, Х. П. Ленцнер. // Лабораторное дело. - 1986. -№ 4. - С. 210-212.

7. Патент на изобретение № 2285258. Способ диагностики госпитальных штаммов. 2006. 11 с.

8. Суплотов С.Н., Журавлева Т.Д. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и ее регуляция. Методы лабораторной диагностики. Тюмень: ООО Печатник. 2009. 104 с.

9. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Не-трусова М.: Издательский центр «Академия». 2005. 608 с.

10. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. Влияние микробных метаболитов на активность ката-лазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р // Бюлл. эксп. Биологии. 2000. Т. 130. № 7. С. 80-82.

11. Перунова Н.Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника // Автореф..... канд.

мед. наук, Оренбург, 2003- 25 с.

12. Nelson W., Tong Y.L., Lee J.K Methods for cosinor-rhymometry

// Chronobiologia.1979. Vol. 6. N. 4. P. 305-323.

13. O' Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Annu. Rev. Microbiol. -2000. - N. 54. - P. 49-79.

14. Cornelissen G. Impeachment of Casual Blood Pressure Measurements and the fixed limits for Their Interpretation and Chronobiologic Recommendations / G. Cornelissen, F. Halberg // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1996. -Vol.8. - P. 69-85.

15. Загускин С.Л. Специфический для живой природы многочастотный параллельный резонансный захват и возможная его роль в аномальных явлениях / С.Л. Загускин, Н.Н. Федоренко // М-лы шестой Всероссийкой науч.-практ. конф. по квантовой медицине. - М., 2000. - С. 74-80

ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИОКОМПЛЕКСОВ "НОРМОФЛОРИНЫ" И ПРОБИОТИКА МЕТАБОЛИТНОГО ТИПА ХИЛАК ФОРТЕ В ОТНОШЕНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ

ИЗ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ

Куликова Л.Е.,

ФГБОУ ВПО Вятский Государственный университет, г.Киров

Погорельский И.П.,

ФГБОУ ВПО Вятский Государственный университет, г.Киров

Мокрецова И.М.,

ФГБОУ ВПО Вятский Государственный университет, г.Киров

Чичерин И.Ю.,

ФГБОУ ВПО Вятский Государственный университет, г.Киров

Биокомплексы "Нормофлорины", а также препарат Хилак форте входят в арсенал средств, предназначенных для коррекции микробиоценоза кишечника при дисбиозах у людей различного генеза. Сам дисбиоз является следствием патологического процесса, что предполагает комплексный подход для его купирования [8].

Биокомплексы "Нормофлорины" это жидкие комплексные синбиотические (т.е. комбинация про- и пребио-тиков) препараты, созданные на основе лактобацилл и би-фидобактерий [4]. Биокомплекс "Нормофлорин-Л"приготовлен на основе штаммов лактобацилл L.aci-dophilus, биокомплекс "Нормофлорин - Б" - на основе штаммов бифидобактерий B.bifidum и B.longum, биокомплекс "Нормофлорин - Д" - на основе штаммов бифидобактерий B.bifidum, B.longum и лактобацилл L.casei.

Хилак форте - представитель пробиотиков метабо-литного типа, содержит "беззародышевый водный субстрат продуктов обмена веществ"(т.е. метаболитов) кишечной палочки E.coli DSM 4087, стрептококка S.faecalis DSM 4086, лактобацилл L.acidophilus DSM 4149 L.helvet-icus DSM 4183[3].

Синбиотики "Нормофлорины" и метабиотик Хи-лак форте способствуют, согласно результатам клинических испытаний, восстановлению нормальной микро-биоты кишечника биологическим путем и сохранению физиологических и биологических функций слизистой оболочки кишечника. Пробиотический

Эффект биокомплексов "Нормофлорины"связывают с размножением в кишечнике лактобацилл, бифидобактерий и синтезируемых витаминов, аминокислот, ферментов, а также пребиотика лактита и микроэлементов. Входящая в состав препарата Хилак форте биосинтетичемская молочная кислота и ее буферные соли восстанавливают физиологическую кислотность желудочно-кишечного тракта, а короткоцепочечные жирные кислоты обеспечивают восстановление баланса кишечной микробиоты, стимулирует регенерацию эпителия кишечной стенки [5].

Относительно антибактериальной активности известно следующее: биокомплексы "Нормофлорины" активны в отношении бацилл, стафилококков, клостридий, энтеротоксигенных кишечных палочек, клебсиелл, протея, цитробактера, кандид и др. Препарат Хилак форте, как это достоверно известно [3,4], обладает антагонистическим воздействием на сальмонеллы. Особо следует указать на то, что, согласно клиническим наблюдениям, биокомплексы "Нормофлорины" и препарат Хилак форте оказывают положительное воздействие с первых минут попадания на слизистую оболочку рта, носоглотки и верхних отделов пищеварительного тракта.Именно здесь, во рту и носоглотке, встречаются стафилококки, стрептококки, энтерококки, лактобациллы, актиномицеты, клостридии, псевдомонады, трепонемы, нейсерии, неферментирующие энтеробактерии [6,7].

В тоже время, именно полость рта и носоглотка являются местом аппликации и первичного воздействия