СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ CRISPR/CAS-ИНДУЦИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАЦИИ С ЭКЗОГЕННОЙ ДОНОРНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ IN VIVO

1. Отличное от человека животное, содержащее CRISPR-репортер, подходящий для оценки CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации CRISPR-репортера с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, причем CRISPR-репортер интегрирован в целевой геномный локус и содержит последовательность-мишень для направляющей РНК и последовательность, кодирующую каталитически неактивный репортерный белок.
2. Отличное от человека животное по п.1, где последовательность-мишень для направляющей РНК находится в пределах последовательности, кодирующей каталитически неактивный репортерный белок.
3. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где кодирующая последовательность для каталитически неактивного репортерного белка может быть изменена с образованием кодирующей последовательности для каталитически активного репортерного белка путем изменения одного кодона.
4. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где каталитически неактивный репортерный белок представляет собой каталитически неактивную бета-галактозидазу.
5. Отличное от человека животное по п.4, где каталитически неактивный репортерный белок представляет собой мутант E538Q бета-галактозидазы.
6. Отличное от человека животное по п.5, где последовательность-мишень для направляющей РНК находится в пределах приблизительно 500 пар оснований от кодона, кодирующего мутацию E538Q в бета-галактозидазе.
7. Отличное от человека животное по любому из пп.4-6, где последовательность-мишень для направляющей РНК находится в пределах последовательности, кодирующей каталитически неактивную бета-галактозидазу, и содержит SEQ ID NO: 21.
8. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где CRISPR-репортер функционально связан с эндогенным промотором в целевом геномном локусе.
9. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где 5’-конец CRISPR-репортера дополнительно содержит 3’-последовательность для сплайсинга.
10. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где CRISPR-репортер дополнительно содержит селективную кассету.
11. Отличное от человека животное по п.10, где селективная кассета фланкирована сайтами распознавания рекомбиназы.
12. Отличное от человека животное по п.10 или 11, где селективная кассета содержит ген устойчивости к лекарственному средству.
13. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где отличное от человека животное представляет собой крысу или мышь.
14. Отличное от человека животное по п.13, где отличное от человека животное представляет собой мышь.
15. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где целевой геномный локус представляет собой локус «безопасная гавань».
16. Отличное от человека животное по п.15, где локус «безопасная гавань» представляет собой локус Rosa26.
17. Отличное от человека животное по п.16, где CRISPR-репортер вставлен в первый интрон локуса Rosa26.
18. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где отличное от человека животное представляет собой мышь, и
причем целевой геномный локус представляет собой локус Rosa26, и
причем CRISPR-репортер функционально связан с эндогенным промотором Rosa26, вставлен в первый интрон локуса Rosa26 и содержит, в направлении от 5’ к 3’:
(a) 3’-последовательность для сплайсинга; и
(b) последовательность, кодирующую каталитически неактивный мутант E538Q бета-галактозидазы, содержащую последовательность-мишень для направляющей РНК, содержащую SEQ ID NO: 21.
19. Отличное от человека животное по п.18, где CRISPR-репортер дополнительно содержит:
(c) селективную кассету, фланкированную сайтами loxP, причем селективная кассета содержит, в направлении от 5’ к 3’:
(i) промотор гена убиквитина человека;
(ii) последовательность, кодирующую неомицин-фосфотрансферазу; и
(iii) сигнал полиаденилирования.
20. Отличное от человека животное по любому из предыдущих пунктов, где отличное от человека животное является гомозиготным по CRISPR-репортеру в целевом геномном локусе.
21. Отличное от человека животное по любому из пп.1-19, где отличное от человека животное является гетерозиготным по CRISPR-репортеру в целевом геномном локусе.
22. Способ тестирования CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации геномной нуклеиновой кислоты с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой in vivo, предусматривающий:
(a) введение отличному от человека животному по любому из пп.1-21:
(i) направляющей РНК, сконструированной для нацеливания на последовательность-мишень для направляющей РНК в CRISPR-репортере;
(ii) белка Cas; и
(iii) экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, способной к репарации кодирующей последовательности для каталитически неактивного репортерного белка и способной делать репортерный белок каталитически активным; и
(b) измерение активности или уровня экспрессии репортерного белка.
23. Способ по п.22, в котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
24. Способ по п.22 или 23, в котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме белка.
25. Способ по п.22 или 23, в котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме матричной РНК, кодирующей белок Cas.
26. Способ по п.22 или 23, в котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей белок Cas, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток у отличного от человека животного.
27. Способ по любому из пп.22-26, в котором репортерный белок на стадии (b) представляет собой белок бета-галактозидазу, и стадия (b) предусматривает анализ с гистохимическим окрашиванием.
28. Способ по любому из пп.22-27, в котором экзогенная донорная нуклеиновая кислота представляет собой однонитевой дезоксинуклеотид.
29. Способ по любому из пп.22-28, в котором репортерный белок на стадии (b) представляет собой белок бета-галактозидазу, и экзогенная донорная нуклеиновая кислота содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
30. Способ по любому из пп.22-29, в котором направляющую РНК вводят в форме РНК.
31. Способ по любому из пп.22-29, в котором направляющую РНК вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей направляющую РНК, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток у отличного от человека животного.
32. Способ по любому из пп.22-31, в котором репортерный белок на стадии (b) представляет собой белок бета-галактозидазу, и направляющая РНК содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 14.
33. Способ по любому из пп.22-32, в котором введение предусматривает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку или гидродинамическую доставку.
34. Способ по п.33, в котором введение предусматривает AAV-опосредованную доставку.
35. Способ по п.34, в котором введение предусматривает AAV8-опосредованную доставку, и стадия (b) предусматривает измерение активности репортерного белка в печени отличного от человека животного.
36. Способ оптимизации способности CRISPR/Cas индуцировать рекомбинацию целевой геномной нуклеиновой кислоты с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой in vivo, предусматривающий:
(I) осуществление способа по любому из пп.22-35 первый раз у первого отличного от человека животного;
(II) изменение переменной и осуществление способа из стадии (I) второй раз с измененной переменной у второго отличного от человека животного; и
(III) сравнение активности или экспрессии репортерного белка на стадии (I) с активностью или экспрессии по меньшей мере одного из репортерных белков на стадии (II) и выбор способа, обеспечивающего более высокие активность или  экспрессию репортерного белка.
37. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является способ доставки для введения одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты отличному от человека животному.
38. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является путь введения для введения одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты отличному от человека животному.
39. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является концентрация или количество одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, вводимых отличному от человека животному.
40. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является экзогенная донорная нуклеиновая кислота, вводимая отличному от человека животному.
41. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является концентрация или количество направляющей РНК, вводимой отличному от человека животному, относительно концентрации или количества белка Cas, вводимого отличному от человека животному.
42. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является направляющая РНК, вводимая отличному от человека животному.
43. Способ по п.36, в котором измененной переменной на стадии (II) является белок Cas, вводимый отличному от человека животному.
44. Клетка отличного от человека животного, содержащая CRISPR-репортер, подходящий для оценки CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации CRISPR-репортера с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, причем CRISPR-репортер интегрирован в целевой геномный локус и содержит последовательность-мишень для направляющей РНК и последовательность, кодирующую каталитически неактивный репортерный белок.
45. Геном отличного от человека животного, содержащий CRISPR-репортер, подходящий для оценки CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации CRISPR-репортера с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, причем CRISPR-репортер интегрирован в целевой геномный локус и содержит последовательность-мишень для направляющей РНК и последовательность, кодирующую каталитически неактивный репортерный белок.
46. Направленный вектор, содержащий CRISPR-репортер, фланкированный плечами гомологии, причем CRISPR-репортер является подходящим для оценки CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации CRISPR-репортера с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, причем CRISPR-репортер содержит последовательность-мишень для направляющей РНК и последовательность, кодирующую каталитически неактивный репортерный белок, и причем плечи гомологии являются подходящими для управления рекомбинацией с требуемым целевым геномным локусом для содействия интеграции в геном.
47. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп.1-21, предусматривающий:
(a) модификацию генома плюрипотентной клетки отличного от человека животного для содержания CRISPR-репортера, интегрированного в целевой геномный локус, причем CRISPR-репортер является подходящим для оценки CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации CRISPR-репортера с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, и причем CRISPR-репортер содержит последовательность-мишень для направляющей РНК и последовательность, кодирующую каталитически неактивный репортерный белок;
(b) идентификацию или отбор генетически модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного, содержащей CRISPR-репортер;
(c) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного в эмбрион-хозяин отличного от человека животного; и
(d) имплантирование и обеспечение вынашивания эмбриона-хозяина отличного от человека животного суррогатной матерью.
48. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп.1-21, предусматривающий:
(a) модификацию генома одноклеточного эмбриона отличного от человека животного для содержания CRISPR-репортера, интегрированного в целевой геномный локус, причем CRISPR-репортер является подходящим для оценки CRISPR/Cas-индуцированной рекомбинации CRISPR-репортера с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, и причем CRISPR-репортер содержит последовательность-мишень для направляющей РНК и последовательность, кодирующую каталитически неактивный репортерный белок;
(b) отбор генетически модифицированного одноклеточного эмбриона отличного от человека животного; и
(c) имплантирование и обеспечение вынашивания генетически модифицированного одноклеточного эмбриона отличного от человека животного суррогатной матерью.