СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННОЙ ТКАНИ ЛЕГКОГО
METHOD FOR DETECTING TUBERCULOSIS MYCOBACTERIA IN RESECTED LUNG TISSUE

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза.
Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание), то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры. Микобактерии туберкулеза (МБТ), выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизистых веществ, затрудняющих их выделение. В связи с этим мокроту и другие сходные материалы перед посевом подвергают разжижению и гомогенизации. Все препараты, используемые в настоящее время для разжижения и деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные, гнилостные микроорганизмы, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий [Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации». Приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» IV. Культуральные методы исследования микобактерий комплекса М. Tuberkulosis 257-258].
Известен способ выявления микобактерий туберкулеза из мокроты, получаемой от больных, включающий гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия с амплитудой 0,5-2,5 мм и частотой 40-60 Гц в течение 10-20 мин, инкубацию исследуемого материала в течение 18-20 ч, выделение осадка, нейтрализацию его карбоновой кислотой до достижения 6,8>рН>7,0 с последующим повторным выделением осадка и его посев на питательную среду [патент РФ № 2069698].
Нейтрализация осадка карбоновой кислотой является более щадящей обработкой по сравнению с нейтрализацией более сильными кислотами. Однако она приводит лишь к изменению рН исследуемого материала и тем самым сохраняет жизнеспособность микобактерий. Высокая концентрация фосфорнокислого натрия трехзамещенного обусловлена видом исходного материала - мокротой, являющейся по своей структуре раствором, снижающим при гомогенизации его концентрацию.
Наиболее близким к заявляемому является способ выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого (когда неизвестно, насколько при сборе материала соблюдались правила асептики), резецированный материал деконтаминируют по стандартному методу, включающему гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его со стеклянными бусами или битым стеклом, вторичную гомогенизацию путем встряхивания его с равным количеством десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и последующую инкубацию при комнатной температуре в течение 20-24 ч, после чего исследуемый материал центрифугируют, а выделенный осадок нейтрализуют пятипроцентным раствором соляной кислоты и засевают на питательную среду [Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации», Приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» с 266-267],
Нейтрализация осадка такой сильной кислотой, как соляная снижает жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий. При этом исследуемый материал, в отличие от мокроты, является, как правило, менее загрязненным посторонней микрофлорой.
Кроме того, обработка резецированной ткани от посторонней микрофлоры 10%-ным раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия также снижает жизнеспособность микобактерий, находящихся в ткани, а не в растворе.
В основу изобретения положена задача повышения точности лабораторной диагностики и сокращения сроков лабораторных исследований за счет повышения жизнеспособности и снижения количественных потерь микобактерий в исследуемом материале.
Поставленная задача решается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого, включающем подготовку исследуемого материала к обработке от посторонней микрофлоры, его обработку раствором тринатрий фосфата, получение осадка, нейтрализацию его кислотой и посев на питательную среду, согласно изобретению, тринатрий фосфат берут в концентрации 4-4,7%, а в качестве кислоты берут раствор аминоуксусной кислоты в концентрации 0,8±0,2%.
Ввиду того, что исследуемый материал - резецированная ткань легкого - не содержит жидкости (как мокрота) обработка тринатрий фосфатом в концентрации 4-4,7% позволяет обеспечить уничтожение посторонней микрофлоры при снижении количественных потерь микобактерий.
При нейтрализации осадка аминоуксусной кислотой помимо более щадящей его обработки в результате реакции последней с менее концентрированным раствором тринатрий фосфата и обеспечения нейтральной среды, аминоуксусная кислота, являясь источником азота, необходимого для роста микобактерий, уже на стадии нейтрализации создает условия для повышения их жизнеспособности, что в свою очередь ведет к повышению точности лабораторной диагностики и сокращению сроков лабораторных исследований.
Кроме того, образующаяся в результате реакции слабая фосфорная кислота обеспечивает уже на начальной стадии обработки фосфорное питание для микобактерий туберкулеза, так как у последних потребность в ионах фосфора значительно выше, чем в других ионах [Биология и биохимия микобактерий туберкулеза, М, 1952 г, с.71].
Способ осуществляют следующим образом:
В качестве исследуемого материала использовали резецированную ткань легких. Резецированный материал деконтаминируют по стандартному методу, включающему:
1) гомогенизацию и обеззараживание исследуемого материала путем соединения его с равным количеством 4,4% раствора тринатрий фосфата (трехзамещенного фосфорнокислого натрия) и растирания его со стеклянными бусами или битым стеклом;
2) последующую инкубацию при температуре 37°С в течение 18-24 часов;
3) после инкубации материал центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок нейтрализуют 1%-ным раствором аминоуксусной кислоты (в соотношении 1:1) и засевают поровну в 2 пробирки с питательными средами (например, со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая").
Сравнительные данные использования различных кислот для нейтрализации осадка приведены в таблице. Было проведено 133 исследования резецированной ткани легкого.
Из представленных данных таблицы следует отметить преимущество использования аминоуксусной кислоты для нейтрализации осадка, которое проявилось в большей высеваемости МБТ (на 2-3%) и в сокращении сроков роста (на 10-12%).
Таким образом, при выявлении микобактерий туберкулеза заявляемым способом точность лабораторной диагностики по сравнению с известным способом повышается при одновременном сокращении времени лабораторных исследований на 6±1 сутки.
Таблица
Материал исследования
Выявление МБТ
Прототип HCl
Карбоновая кислота
Заявляемый способ
1. Резецированная ткань
а) высеваемость МБТ, %
13
14
16
б) сроки роста МВТ, сут
43±6
42±7
36±5
2. Проросты посторонней микрофлоры, %
0,5
0,5
0,5