АНАЛИЗЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ВЫБОРА СХЕМЫ ЛЕЧЕНИЯ ДЛЯ ИНДИВИДУУМА С ЛЕЙКОЗОМ
ANALYSES AND METHODS FOR SELECTION OF TREATMENT SCHEME FOR INDIVIDUAL WITH LEUKEMIA

Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США №62/254109, зарегистрированной 11 ноября 2015. Содержание этой заявки включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники
[0002] Настоящей изобретение относится к области диагностики и лечения злокачественных новообразований. Более конкретно, оно касается идентификации индивидуумов, которые получат пользу от лечения с использованием синергической липосомной комбинации даунорубицина и цитарабина.
Предшествующий уровень техники
[0003] СРХ-351 является низкохолестериновым липосомным составом наномасштаба (диаметр 100 нм), содержащим цитарабин и даунорубицин, совместно инкапсулированные в молярном отношении 5:1 (патенты США №№8022279 и 8431806), который, как показано, является оптимально синергическим и ex vivo, и in vivo. В нескольких доклинических исследованиях наблюдали значительное повышение эффективности по сравнению с общепринятой комбинацией свободных лекарственных средств, и, что более важно, СРХ-351 обеспечивает повышение показателей полной ремиссии и выживаемости по сравнению со стандартом лечения в клинических исследованиях, одно из которых проведено на пациентах пожилого возраста с недавно диагностированным острым миелогенным лейкозом (AML), а другое - на взрослых пациентах с первым рецидивом AML. Существующее лечение AML представляет собой "стандарт лечения", также обозначаемый как лечение "7+3".
[0004] Настоящее изобретение сфокусировано на идентификации популяций пациентов, которым лечение с использованием СРХ-351, в отличие от существующего "стандарта лечения", приносит пользу, и на анализах, в которых учитывают гетерогенность злокачественных новообразований, т.к. они возникают у разных пациентов.
[0005] Эффективность, наблюдаемую в клинических исследованиях с использованием СРХ-351, можно приписывать 1) повышенным концентрациям цитарабина : даунорубицина, поддерживаемым в кровотоке в синергическом соотношении в течение длительных периодов времени (таким образом, избегают антагонистических соотношений), 2) повышенному накоплению и персистированию СРХ-351 в костном мозге, и 3) селективному накоплению и цитотоксичности интактных липосом СРХ-351 в лейкозных клетках по сравнению с нормальными клетками в костном мозге. Показано, что СРХ-351 очень эффективен в быстрой элиминации лейкозных клеток из кровотока и костного мозга у большой части пациентов с высоким риском AML, включая тех, кто не ответил на "стандарт лечения" 7+3 цитарабин: даунорубицин непосредственно перед терапией СРХ-351, а также у взрослых пациентов с острым лимфоцитарным лейкозом (ALL) на поздней стадии и миелодиспластическим синдромом (MDS).
50
90
[0006] Быстрые анализы цитотоксичности ex vivo с использованием свежевыделенных лейкозных клеток от пациентов с гемобластозами иногда могут быть полезными для определения спектра активности терапевтических средств против гемобластозов. В связи с этим, авторы настоящего изобретения разрабатывали способ сбора и очистки циркулирующих бластных клеток из свежеполученных образцов крови пациентов с широким диапазоном гемобластозов, включая острый миелогенный лейкоз (AML), ALL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), миелопролиферативные неоплазии (MPN) и лимфомы для оценки антинеопластической активности у отдельных пациентов. Заявители также определяли профиль антипролиферативной/цитотоксической активности для многих новых исследовательских средств, классифицируемых с учетом типа гемобластоза, а также специфических фенотипических профилей подтипов пациентов с такими злокачественными новообразованиями. В таких анализах концентрации пятидесяти- и девяностопроцентного ингибирования роста (IC и IC, соответственно) используют для прогнозирования того, отражает ли чувствительность к лечению концентрации лекарственного средства, являющиеся подходящими, и какая доля указанного класса пациентов в достаточной степени чувствительна, чтобы сделать возможным тестирование в условиях клинического исследования. Таким образом, корреляция между чувствительностью к лекарственным средствам и фенотипами субпопуляций позволяет идентифицировать биомаркеры, которыми можно руководствоваться в выборе пациентов.
[0007] Однако, исторически сложилось так, что оценку составов лекарственных средств на основе наночастиц (например, липосом и наночастиц) ex vivo на цитотоксичность в отношении злокачественных клеток, как правило, не осуществляют по причине того, что такие составы, как правило, получают таким образом, чтобы они действовали как инфузионный резервуар лекарственного средства in situ, при этом средства накапливаются преимущественно в участках роста злокачественного новообразования и, находясь здесь, они медленно высвобождают свободные лекарственные средства, затем захватываемые злокачественными клетками. Т.к. скорости высвобождения лекарственного средства ex vivo, как правило, гораздо ниже наблюдаемых in vivo, цитотоксические активности инкапсулированных противоопухолевых лекарственных средств часто имеют порядок величины ex vivo, ниже наблюдаемого в случае соответствующих свободных лекарственных средств, и тестирование ex vivo является менее надежным в прогнозировании успеха in vivo.
50
[0008] Однозначно, в случае СРХ-351 заявители показали, что лейкозные клетки человека захватывают цитарабин и даунорубицин в инкапсулированной в липосоме форме ex vivo и in vivo с помощью энергозависимого механизма. После захвата вакуолями в цитоплазме, липосомы генерируют биодоступное лекарственное средство, что приводит к цитолитической активности. Это не только обеспечивает доставку синергического молярного отношения 5:1 цитарабина : даунорубицина, но также приводит к цитотоксической активности СРХ-351 ex vivo (с учетом значений IC), сравнимой, а в некоторых случаях и большей, с активностью свободных лекарственных средств, как представлено в настоящем описании.
50
[0009] В пилотных исследованиях цитотоксичности СРХ-351 ех vivo против свежих лейкозных бластов от пациентов с различными лейкозными состояниями получали значения IC всего 50 нМ цитарабина: 10 нМ даунорубицина в условиях инкубации, в которых высвобождение лекарственных средств из липосом в среде являлось неопределимым (Tyner, J., et al., Blood (2010) 116: Abstract 2886). Это подтверждало, что прямая противолейкозная активность интактных липосом СРХ-351, задокументированная ранее в отношении линий лейкозных клеток, была значимой в отношении бластов, недавно полученных от пациентов. Это также позволяет разделять влияние генотипических/фенотипических клеточных признаков на чувствительность бластов к СРХ-351, независимо от РК.
[0010] Таким образом, в отличие от свойств композиций наночастиц, как правило, исследование цитотоксичности СРХ-351 ех vivo против свежих образцов от пациентов и/или захвата СРХ-351 свежими образцами от пациентов предоставляет возможность прогнозирования антинеопластической активности СРХ-351 у отдельных пациентов и типов популяций.
[0011] Общепринятый стандарт лечения лейкоза оставался постоянным в течение более 40 лет, и в нем используют антрациклин и цитарабин последовательно в их свободных формах в виде терапии "7+3". Хотя это лечение является "стандартным", у некоторых пациентов наблюдают побочные эффекты и/или неблагоприятный прогноз. СРХ-351 может представлять собой положительную альтернативу для таких пациентов. Таким образом, существует необходимость стратификации пациентов с гемобластозами таким образом, чтобы им можно было вводить СРХ-351 в качестве подходящей терапии. Т.к. СРХ-351 и/или общепринятые схемы лечения могут быть неэффективными для каждого индивидуума, существует потребность в определении диагностических тестов, средств и/или маркеров, которые могут облегчать выбор подходящей схемы лечения для индивидуума со злокачественными новообразованиями кроветворной системы.
Описание изобретения
[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение основано на оценке ex vivo цитотоксичности СРХ-351 и/или захвата широким спектром типов бластов, недавно полученных от пациентов с гемобластозами, включая клетки основных групп гемобластозов, таких как AML и CLL, а также других подтипов заболеваний. Результаты коррелируют с исходами у пациентов после лечения in vivo.
[0013] Гемобластоз включает острый миелогенный лейкоз (AML), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), миелопролиферативные неоплазии (MPN) и лимфомы.
[0014] Таким образом, в этом аспекте изобретение относится к способу прогнозирования вероятности того, что введение СРХ-351 человеку будет эффективным в лечении гемобластоза у индивидуума, при этом способ включает
подвергание злокачественных клеток указанного индивидуума обработке СРХ-351 в культуре клеток ex vivo; и
измерение отвечаемости указанных клеток на указанное лечение;
50
90
где индивидуума, чьи клетки демонстрируют ответ на указанную обработку, идентифицируют как индивидуума, для которого лечение СРХ-351, вероятно, будет эффективным. Отвечаемость можно измерять как цитотоксичность, например, посредством определения IC или IC или измерения захвата СРХ-351.
[0015] Индивидуумам, идентифицированным таким образом, вводят СРХ-351 в эффективном количестве.
[0016] Во втором аспекте изобретение относится к идентификации индивидуумов, которые получат наибольшую пользу от замены более дорогого лечения СРХ-351 стандартом лечения, что, таким образом, потенциально приведет к разрешению контролирующего органа на использование СРХ-351 для этих индивидуумов. Этих индивидуумов идентифицируют с помощью конкретных генетических и фенотипических характеристик, описанных ниже.
[0017] В конкретных вариантах осуществления способ идентификации включает определение наличия или отсутствия мутации гена Fms-подобной рецепторной тирозинкиназы 3 (FLT-3) у указанного индивидуума, посредством чего индивидуума, имеющего мутацию в указанном гене FLT-3, идентифицируют как индивидуума, который получит пользу от лечения СРХ-351, и в некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение эффективного количества СРХ-351 указанному индивидууму и/или определение наличия или отсутствия мутации гена нуклеофозмина 1 (NPM-1) у указанного индивидуума, посредством чего индивидуума, имеющего мутацию в указанном гене NPM-1, идентифицируют как индивидуума, который получит пользу от лечения СРХ-351, и в некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение эффективного количества СРХ-351 указанному индивидууму и/или определение наличия или отсутствия мутации гена ССААТ-энхансерного связывающего белка альфа (СЕВРα) у указанного индивидуума, посредством чего индивидуума, имеющего мутацию в указанном гене СЕВРα, идентифицируют как индивидуума, который получит пользу от лечения СРХ-351, и в некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение эффективного количества СРХ-351 указанному индивидууму.
[0018] В случае мутаций FLT-3 мутация может являться активирующей мутацией этого гена, в частности, повреждением FLT3-IDT.
[0019] Один биомаркер или комбинация биомаркеров, таких как описанные выше, которые могут свидетельствовать о том, что пациент (например, с лейкозом или риском лейкоза) для схемы лечения, включающей СРХ-351, включает, в качестве неограничивающих примеров, по меньшей мере одну или несколько мутаций гена FLT-3, включая повреждение FLT3-ITD или повреждение FLT3-TKD и любую комбинацию их мутаций или комбинацию с другими генетическими маркерами, такими как мутации гена NPM-1 и/или гене СЕВРα. В случае одобрения, СРХ-351 можно использовать в отсутствие или при наличии другого противоопухолевого лечения (например, лучевой терапии, хирургического вмешательства) злокачественного новообразования кроветворной системы у индивидуумов, выбранных по носительству по меньшей мере одного или нескольких биомаркеров, представленных в настоящем описании. В альтернативных вариантах осуществления, в случае одобрения, СРХ-351 можно использовать в качестве кондиционирующего средства для костного мозга для лечения такого злокачественного новообразования у индивидуумов, выбранных по носительству по меньшей мере одного или нескольких биомаркеров, представленных в настоящем описании.
[0020] В дополнение к маркерам FLT-3, NPM-1 и СЕВРα, другие кариотипы могут содержать один или два СРХ-351-респонсивных аллеля в соответствии с европейским руководством LeukemiaNet (ELN), описанными в примере 1 ниже.
[0021] Таким образом, изобретение также относится к способу идентификации индивидуума, имеющего злокачественное новообразование, который получит пользу от лечения СРХ-351, где способ включает определение генотипа индивидуума в соответствии с системой ELN для классификации индивидуума как имеющего благоприятный риск, промежуточный-I, промежуточный-II или неблагоприятный риск. Индивидуумов, имеющих промежуточный-II или неблагоприятный риск, идентифицируют как тех, кто, вероятно, получит пользу от лечения СРХ-351, и которых будут лечить таким образом. Система ELN основана на ответе на стандартное лечение 7+3, и пациенты с неблагоприятным риском плохо на него отвечают.
[0022] Следует понимать, что классификацию ELN можно комбинировать с упомянутыми выше генетическими маркерами для определения индивидуумов, которые получат пользу от лечения.
[0023] Таким образом, в основном, настоящее изобретение в указанных выше аспектах относится к анализам, способам, системам и наборам для выбора схемы лечения для индивидуума со злокачественным новообразованием кроветворной системы (например, лейкозом) или риском развития злокачественного новообразования кроветворной системы (например, лейкоза), лечения индивидуума со злокачественным новообразованием кроветворной системы (например, лейкозом) и/или улучшения эффективности схемы лечения, рекомендованной или используемой в отношении индивидуума со злокачественным новообразованием кроветворной системы (например, лейкозом) или риском развития злокачественного новообразования кроветворной системы (например, лейкоза).
[0024] Тестируемый образец для использования в анализах, способах, системах или наборах, представленных в настоящем описании, можно получать из биологического образца индивидуума, например, образца костного мозга, или крови, или плазмы, или сыворотки индивидуума.

[0025] В зависимости от выбора по меньшей мере одного биомаркера, представленного в настоящем описании, тестируемый образец можно подвергать одному или нескольким анализам, например, включая, в качестве неограничивающих примеров, анализы генотипирования, анализы экспрессии (например, уровней белка и/или транскрипта), другие анализы, с помощью которых можно определять генотип, или любые их комбинации. В этой области известно множество таких анализов, и многие из них коммерчески доступны, такие как микрочипы (например, Affymetrix) и секвенирование (например, Illumina).
[0026] Гемобластоз включает острый миелогенный лейкоз (AML), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), миелопролиферативные неоплазии (MPN) и лимфомы.
[0027] В другом аспекте изобретение относится к способу повышения эффективности лечения СРХ-351 у имеющего гемобластоз индивидуума, имеющего активирующую мутацию гена FLT-3, при этом способ включает введение эффективного количества ингибитора FLT-3 в комбинации с СРХ-351. Комбинацию можно вводить одновременно, или в одной композиции, или СРХ-351 вводят первым. Краткое описание чертежей
50
50
[0028] Фигура 1А является схемой, на которой представлена чувствительность ex vivo клеток пациентов с AML к СРХ-351. IC значения коррелируют с более конкретными подтипами риска AML, аннотированными на схеме. Приведены значения IC СРХ-351 для пациентов в каждой из этих групп риска.
50
50
[0029] На фигуре 1В показана корреляция категорий риска с ответом ex vivo в терминах IC. Как видно, хотя большинство индивидуумов в группах промежуточного-I, промежуточного-II и неблагоприятного риска демонстрировали благоприятные значения IC; индивидуумы в группе благоприятного риска, преимущественно, этого не демонстрировали. В каждом случае наблюдали некоторые аномальные значения, указывающие на важность индивидуальных ответов.
50
50
[0030] На фигуре 1С показана корреляция между клиническим ответом на стандартную схему лечения 7+3 и отвечаемостью, определяемой по IC ex vivo. Наблюдали небольшое различие между группами с IC ex vivo в низком диапазоне в отношении их ответа на стандартное лечение 7+3.
50
[0031] На фигурах 2А-2С, соответственно, показаны чувствительности клеток пациентов с ALL, MDS/MPN и CLL ex vivo к СРХ-351. Анализировали лейкозные клетки из образцов периферической крови или костного мозга 127 пациентов с ALL, MDS/MPN или CLL. Значения IC для этих случаев приведены вместе с конкретными диагнозами.
[0032] Фигура 3А является графиком, на котором показано, что клетки AML с FLT3-ITD демонстрируют повышенную чувствительность к индуцируемой СРХ-351 цитотоксичности. FLT3-ITD был положительным у 14 пациентов и отрицательным у 28. На фигурах 3В и 3С, соответственно, представлены результаты для индивидуумов с мутантными NPM-1 и СЕВРα. Инсерции в NPM-1 идентифицировали у 13 пациентов и не наблюдали у 29; инсерции/делеции СЕВРα наблюдали у 4 пациентов и не определяли у 34. Значения представляют собой среднее ±SEM, при этом значения р приведены на каждой схеме.
[0033] На фигурах 4А-4С представлен проточный цитометрический анализ захвата лекарственного средства СРХ-351 и полученные результаты, свидетельствующие о корреляции между захватом лекарственного средства и цитотоксичностью.
[0034] На фигурах 5А-5С представлен захват интактного СРХ-351 лейкозными клетками в костном мозге по сравнению с нормальными клетками костного мозга; на фигурах 5А и 5В, соответственно, представлен захват цитарабина и даунорубицина из СРХ-351, и на фигуре 5С представлен захват липида.
[0035] На фигуре 6 представлены доли отвечающих среди пациентов с мутантным FLT-3, NPM-1 и СЕВРα, которых лечили СРХ-351, в клинических исследованиях при сравнении со стандартным лечением 7+3.
[0036] На фигурах 7А-7С представлено сравнение коэффициентов выживаемости пациентов, которых лечили СРХ-351, по сравнению с пациентами, подвергнутыми стандартному лечению 7+3, с мутациями FLT-3, NPM-1 и СЕВРα, соответственно.
50
[0037] На фигурах 8А и 8В представлено сравнение значений IC (фигура 8А) и нормализованных измерений захвата СРХ-351 (фигура 8В) для различных линий клеток, включая линии с мутациями FLT-3 и без них.
[0038] На фигурах 9A-9D представлено сравнение захвата СРХ-351 в присутствие и отсутствие предварительной обработки квизартинибом для двух разных линий клеток с мутациями FLT-3.
[0039] На фигурах 10А-10С представлены результаты определения синергического взаимодействия между СРХ-351 и квизартинибом или мидостаурином. На фигуре 10А показан образец диаграмм, которые будут строить с учетом различных концентраций этих лекарственных средств, как показано. На фигуре 10В представлено изображении синергии в соответствии с алгоритмом аддитивности по шкале Блисса (ЕОВА) (Berenbaum, М. С, Adv. Cancer Res. (1981) 35: 269-335). На фигуре 1С представлены результаты, касающиеся жизнеспособности отдельных линий клеток, и различные протоколы введения комбинаций вместе с результатами анализа ЕОВА.
[0040] На фигурах 11A-11D представлены результаты определения синергии с использованием алгоритма Чоу-Талалай (Chou and Talalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22: 27-55). На фигуре 11А показаны положения многолуночного планшета для различных комбинаций концентраций лекарственных средств, подвергнутых анализу. На фигуре 11В представлен пример диаграммы, применимой для построения графика результатов для каждой комбинации. На фигурах 11С и 11D представлены результаты для тестируемых комбинаций.
Способы осуществления изобретения
[0041] Т.к. злокачественные новообразования кроветворной системы являются гетерогенными, т.е. не все пациенты с AML или другими гемобластозами имеют одинаковый прогноз или основной генотип, важно тестировать отдельные образцы людей для определения благоприятного лечения для конкретного индивидуума.
[0042] Как указано выше, в отличие от предшествующего опыта с составами липосом и наночастиц лекарственного средства, СРХ-351 успешно подвергается захвату лейкозными клетками (преимущественно, нормальным клеткам костного мозга) вместе с инкапсулированным цитарабином и даунорубицином во вводимом соотношении. (Lim, W. S., et al., Leuk. Res. (2010) 34: 1214-1223.) Это позволяет тестировать ex vivo отдельные гемобластозы на восприимчивость к лечению СРХ-351. Анализ может включать способность клеток захватывать значительные количества СРХ-351 и/или цитотоксичность СРХ-351 в отношении образцов пациентов. Это важно по причине гетерогенности ответа отдельных пациентов на лечение в целом и преимущества заблаговременного выявления того, будет ли лечение СРХ-351 полезным для конкретного индивидуума. Как правило, такое тестирование ex vivo ограничено свободными лекарственными средствами в отличие от лекарственных средств, доставляемых в составах наночастиц, т.к. эти составы созданы для накопления в кровотоке и высвобождения содержащихся терапевтических средств таким образом, что только сами средства проникают в злокачественные клетки.
50
90
[0043] Таким образом, один из аспектов изобретения относится к анализам ex vivo для определения того, будет ли конкретный пациент успешно отвечать на СРХ-351. Таким образом, злокачественные клетки получают из пациента с гемобластозом для тестирования ex vivo посредством приведения клеток в контакт с СРХ-351 и определения цитотоксичности, например, определения IC или IC, в отношении эти клеток и/или измерения захвата липосомной системы любыми общепринятыми способами. Как показано ниже, СРХ-351 доставляется в лейкозные клетки в интактной форме, таким образом, обеспечивая надежность этого тестирования ех vivo. Цитотоксичность СРХ-351 ex vivo в отношении свежих бластов пациентов с AML и бластов пациентов с острым лимфоцитарным лейкозом (ALL), лимфомой и миелопролиферативной неоплазией коррелирует с генотипическими и фенотипическими профилями, а также клиническими исходами для пациентов, из которых получали образцы бластов.
[0044] Также обнаружено, что мутации в конкретных генах, в частности, FLT-3, NPM-1 и СЕВРα, повышают восприимчивость гемобластоза к СРХ-351, если у индивидуума наблюдают эти мутации, и, в частности, по сравнению со стандартным лечением 7+3. Таким образом, эти мутации можно использовать в качестве маркеров злокачественных новообразований, которые будут успешно лечить in vivo с использованием СРХ-351 в отличие от стандартной схемы лечения 7+3. Наличие этих мутаций можно измерять напрямую посредством анализа гена или оценки маркеров, свидетельствующих о мутации, с помощью последующих продуктов экспрессии. Например, мутации, активирующие FLT-3, можно определять по повышенной активности FLT-3 у индивидуума или в злокачественных клетках. Подходящие субстраты для этого определения включают кровь, плазму, сыворотку и слюну.
[0045] Например, в некоторых вариантах осуществления подходящий анализ может включать подвергание тестируемого образца от человека, имеющего диагноз лейкоз или риск развития лейкоза, по меньшей мере одному анализу генотипирования, адаптированному для определения генотипов мутаций гена FLT-3 (например, FLT3-ITD) и необязательное использование схемы лечения, включающей введение человеку эффективного количества СРХ-351.
[0046] Схожие исходы наблюдали в случае мутаций гена NPM-1, мутаций гена СЕВРα и у индивидуумов, попадающих в категории промежуточного-II и неблагоприятного риска по системе ELN.
[0047] Как указано выше, для улучшения анализа можно использовать комбинации мутаций, определяемые любым подходящим способом. В частности, известно, что конкретные кариотипы в комбинации с мутационным статусом этих генов можно использовать для группирования пациентов в соответствии с их ответом на стандартное лечение 7+3. Эту классификацию описывают в Rollig, С, et al., J. Clin. Oncol. (2011) 29: 1-7, и она опубликована он-лайн как 10.1200/JCO.210.32.8500 31 мая 2011 года. Эта система классификации названа Европейская система LeukemiaNet (ELN), в которой индивидуумов с AML классифицируют как имеющих благоприятный риск, промежуточный-I, промежуточный-II и неблагоприятный риск. Индивидуумы, классифицируемые как имеющие промежуточный-II или неблагоприятный риск, по определению, плохо отвечают на стандартную схему лечения 7+3. В отличие от этого, заявители обнаруживали, что в клинических исследованиях эти пациенты отвечают на СРХ-351. Таким образом, идентификация злокачественных клеток конкретного пациента, как имеющего промежуточный-II или неблагоприятный риск, четко свидетельствует о желательности лечения пациента с использованием СРХ-351. Результаты, представленные заявителями, являются неожиданными в свете опыта использования стандартного лечения.
[0048] Во всех из указанных выше случаев, после идентификации подходящего индивидуума, соответствующим образом, следует введение СРХ-351 в соответствии с одобренным протоколом этих исследований. В результате, СРХ-351 можно вводить в эффективном количестве для снижения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с гемобластозом. Как указано выше, гемобластоз может быть одним из ряда таких злокачественных новообразований, включающих острый миелогенный лейкоз (AML), ALL, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), миелопролиферативные неоплазии (MPN) и лимфомы.
[0049] Эффективное количество СРХ-351 можно вводить выбранному человеку с помощью подходящего способа введения, например, введения I.V., в соответствии со схемой введения СРХ-351. Протоколы лечения с использованием СРХ-351 описаны в патенте США №8092828, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
[0050] Другой аспект изобретения относится к дизайну улучшенной системы лечения гемобластозов у индивидуумов с мутациями FLT-3, такими как ITD, с использованием комбинации СРХ-351 с ингибитором FLT-3. Ингибиторы FLT-3 доступны в этой области и включают квизартиниб, мидостаурин, тандутиниб, сорафениб, сунитиниб, лестауртиниб, креноланиб, гилтеритиниб, AST-487, довитиниб и линифаниб. Однако неожиданно обнаруживали, что важно время введения: два лекарственных средства необходимо вводить одновременно, в некоторых случаях - в одной композиции, или СРХ-351 необходимо вводить перед ингибитором, включая введение за 10-24 часа до введения СРХ-351 или в этом временном промежутке. Показано, что длительное воздействие ингибитора FLT-3 перед введением СРХ-351 контрпродуктивно.
[0051] Настоящее изобретение также относится к компьютерным системам для использования в любых аспектах анализов и/или способов, представленных в настоящем описании. Например, один из вариантов осуществления, представленный в настоящем описании, относится к компьютерной системе для получения данных по меньшей мере из одного тестируемого образца, полученного по меньшей мере из одного индивидуума.
[0052] В некоторых вариантах осуществления определяющий модуль компьютерной системы можно конфигурировать для анализа по меньшей мере одного тестируемого образца для определения наличия или отсутствия по меньшей мере двух условий, представленных выше.
[0053] В некоторых вариантах осуществления определяющий модуль может дополнительно содержать сравнительный модуль, адаптированный для сравнения данных, поступающих из определяющего модуля, с референсными данными, хранящимися устройстве хранения.
[0054] В некоторых вариантах осуществления устройство хранения можно дополнительно конфигурировать для хранения физической информации по меньшей мере об одном индивидууме, например, содержащем указания о том, имеет ли тестируемый индивидуум одну или несколько определяемых мутаций гена FLT-3, и/или гена NPM-1, и/или гена СЕВРα, и/или кариотипов ELN.
[0055] Анализы, способы, системы и/или наборы, представленные в настоящем описании, можно осуществлять и/или использовать более чем одним лицом под руководством одного руководителя, санкционирующего и регулирующего эти функции. Такие лица могут взимать плату за предоставленную услугу определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного условия, представленного в настоящем описании, в тестируемом образце человека, например, для облегчения выбора схемы лечения человека с гемобластозом, как элемента способа выбора схемы лечения для человека. В одном из примеров подходящий анализ включает (а) получение тестируемого образца от человека, имеющего диагноз AML или риск его развития; (b) подвергание тестируемого образца по меньшей мере одному анализу биомаркеров (например, включая, в качестве неограничивающих примеров, анализы генотипирования, анализы экспрессии (например, уровней белка и/или транскрипта), другие анализы, с помощью которых можно идентифицировать активированный FLT-3, или любые их комбинации) для определения параметров по меньшей мере одного биомаркера, представленного в настоящем описании (например, в качестве неограничивающих примеров, FLT3-ITD); (с) определение, с учетом параметров выбранных биомаркеров, наличия по меньшей мере одного указанного условия; и (d) получение результата (например, в качестве неограничивающих примеров, списка мутаций гена FLT3), указывающего на то, определяют ли по меньшей мере одно из указанных условий в тестируемом образце. Если присутствует по меньшей мере одно условие, руководитель может дополнительно выбирать и осуществлять схему лечения, включающую введение человеку эффективного количества СРХ-351.
[0056] В некоторых вариантах осуществления одну или несколько из указанных выше стадий способа осуществляет не являющееся человеком устройство.
[0057] Цитирование публикаций или документов в настоящем описании не является ни признанием того, что любой из них имеет отношение к предшествующему уровню техники, ни признанием относительно их содержимого или даты публикации. Все документы, процитированные в настоящем описании, таким образом, включены в него в качестве ссылки.
ПРИМЕРЫ
[0058] Следующие примеры представлены в иллюстративных целях, а не для ограничения изобретения.
Препарат А
Состав СРХ-351 и простой препарат
[0059] СРХ-351 (липосомы цитарабина : даунорубицина для инъекций) получали в виде стерильного, несодержащего пирогены, фиолетового, лиофилизированного продукта в сосудах 50 мл. Каждый сосуд содержит 100 единиц, где 1 единица равна 1,0 мг цитарабина и 0,44 мг даунорубицина (в качестве основания). Материал восстанавливали 19 мл воды для инъекций и осторожно переворачивали в течение 10 минут при комнатной температуре. Рабочие аликвоты восстановленного продукта хранили замороженными в течение не более 12 месяцев при -20°С.
[0060] Для сбора и подготовки образцов от пациентов образцы периферической крови (РВ) или костного мозга (ВМ) получали перед терапией от пациентов с диагнозом AML, ALL, MPN или CLL. Все образцы получали при наличии информированного согласия на протокол, одобренный Экспертным советом Oregon Health & Science University. Образцы крови или костного мозга разделяли с использованием градиента фиколла с последующим лизисом эритроцитов с использованием буфера хлористого аммония-калия (ACK).
Пример 1
Определение цитотоксичности СРХ-351 ex vivo в отношении лейкозных клеток пациентов

-4

-4
[0061] Тестирование чувствительности к лекарственным средствам осуществляли стандартными, известными способами. В кратком изложении, мононуклеарные клетки из образцов от пациентов с миелоидным лейкозом культивировали в R10 (среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), L-глутамином, пенициллином/стрептомицином (Invitrogen, Carlsbad, CA) и Fungizone (Invitrogen)), дополненной 10 M 2-меркаптоэтанолом (Sigma). Клетки из образцов от пациентов с лимфоидным лейкозом культивировали в R20 (среде RPMI-1640, дополненной 20% FBS (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), L-глутамином, пенициллином/стрептомицином (Invitrogen, Carlsbad, CA) и Fungizone (Invitrogen)), дополненной 10 M 2-меркаптоэтанолом (Sigma) и инсулином-трансферрином-селенитом натрия (Invitrogen).

50
[0062] Клетки культивировали в 96-луночных планшетах (50000 клеток на лунку) и подвергали воздействию ступенчатых концентраций СРХ-351 в течение 3 дней, при этом для оценки относительных количеств жизнеспособных клеток в каждой лунке использовали анализ MTS на основе тетразолия (анализ пролиферации клеток 96AQueous One Solution, Promega). Жизнеспособность клеток, высеянных в отсутствие какого-либо лекарственного средства, принимали за 100%-ную жизнеспособность и каждую точку кривой доза СРХ-351-ответ нормализовали по значениям жизнеспособности клеток для этих условий отсутствия лекарственных средств. Для получения значений IC для каждого образца использовали полиномиальную аппроксимацию третьего порядка.
50
[0063] Т.к. AML в настоящее время является целевым показанием для введения СРХ-351, демонстрирующим многообещающие признаки эффективности во множестве клинических исследований когорт пациентов с AML с различными клиническими характеристиками, бласты AML из образцов периферической крови или костного мозга от 53 пациентов с AML культивировали со ступенчатыми концентрациями СРХ-351 (10:2 мкМ; 1:0,2 мкМ; 0,1:0,02 мкМ; 0,01:0,002 мкМ) или без лекарственных средств в течение 3 дней и оценивали относительные количества жизнеспособных клеток с использованием анализа MTS на основе тетразолия. Значения MTS клеток, культивируемых в отсутствие лекарственного средства, принимали за 100% и значения MTS для каждой дозы нормализовали по значениям MTS для этих необработанных клеток. Для вычисления значений IC для каждого образца использовали полиномиальную аппроксимацию третьего порядка. Полные демографические и клинические данные были доступны для 42 из этих случаев и приведены в таблице 1. Полные цитогенетические данные для оценки групп риска AML были доступны для 40 пациентов, при этом 3, 21, 12 и 4 пациента попадали в группы благоприятного, промежуточного-I, промежуточного-II и неблагоприятного риска, соответственно, в соответствии с классификацией с использованием руководств European LeukemiaNet (ELN).
[0064] Благоприятный риск включает t(8;21) (q22;q22), inv(16) (p13,1q22) или t(16;16) (p13.1q22), мутантный NPM1 с нормальным кариотипом и мутантный СЕВРα с нормальным кариотипом.
[0065] Промежуточный-I риск включает мутантный NPM1 с FLT3-ITD и нормальным кариотипом, NPM1 дикого типа с FLT3-ITD и нормальным кариотипом, NPM1 дикого типа без FLT3-ITD и нормального кариотипа.
[0066] Промежуточный-II риск включает t(9;11) (p22;q23) и любые цитогенетические показатели, не классифицируемые как благоприятные или неблагоприятные.
[0067] Неблагоприятный риск включает inv(3) (q21q26.2) или t(3;3) (q21q26.2), t(6;9) (p23;q34), t(v;11) (v;q23), моносомию 5 или del(5q), моносомию 7, аномалию 17p и комплексный кариотип (≥3 аномалий).
50
[0068] Большинство образцов получали от пациентов с недавно диагностированным AML de novo (34/42; 81%) и большинство пациентов лечили с использованием схемы лечения 7+3 после получения образцов (32/42; 76%). Тридцать пять (35) из пациентов с AML в исследовании лечили с использованием схемы лечения 7+3 после получения образца. Двадцать четыре (24) из этих пациентов достигали начального полного ответа, в то время как у 11 пациентов наблюдали прогрессирование заболевания. Представлены значения IC СРХ-351 для пациентов, у которых наблюдали полный ответ или прогрессирование заболевания. Доли основных демографических признаков, а также клинические параметры, такие как лейкоцитарная формула в начале и при генетической-цитогенетической стратификации риска были типичными для генеральной совокупности пациентов с AML.
50
50
[0069] Как свидетельствуют данные, представленные на фигуре 1А и в таблице 2, первичные бласты пациентов с AML, как правило, были чувствительны к цитотоксичности СРХ-351 ex vivo. Значения IC находились в диапазоне от 0,035:0,007 мкМ до 9,77:1,95 мкМ. Во всех, кроме одного образца, (98%) наблюдали IC ниже 1/10 концентрации СРХ-351 в плазме человека через 72 часа после введения (60:12 мкМ цитарабина : даунорубицина), что позволяет предполагать, что клинического ответа потенциально можно достигать при лечении этих пациентов СРХ-351.
50
[0070] Как показано на фигуре 1В, наблюдали мощный антипролиферативный ответ на обработку СРХ-351 ex vivo (низкая IC) в клетках, имеющих цитогенетические аномалии промежуточного-II или неблагоприятного риска, как правило, ассоциированные с более плохим прогнозом и резистентностью к общепринятым формам химиотерапии.
[0071] Как указано в таблице 2, всего получали 17 образцов от пациентов в категориях промежуточного-II или неблагоприятного цитогенетического риска. Как показано на фигуре 1В, общий ответ ex vivo на СРХ-351 в этой подгруппе пациентов схож с ответом у пациентов с промежуточным-II и благоприятным риском без значимых различий ответа ex vivo на СРХ-351 в четырех группах риска. Эти ответы ex vivo хорошо коррелировали с наблюдаемой клинической активностью СРХ-351, при этом возникновение полных ответов наблюдали среди широких, разнообразных подгрупп пациентов с AML, независимо от общепринятой стратификации риска.
[0072] Клинический ответ на общепринятое лечение 7+3 цитарабином : даунорубицином сравнивали с ответом ex vivo на СРХ-351 среди 35 пациентов с AML, которых лечили с использованием схемы лечения 7+3 после того, как также оценивали их полученные бласты. Из этих 35 пациентов, 24 достигали полного ответа (CR) и у 11 наблюдали прогрессирование заболевания (PD), как показано на фигуре 1С. У лейкозных бластов от этих пациентов наблюдали схожую чувствительность к цитотоксичности СРХ-351 ex vivo, независимо от того, отвечали ли они исходно на схему 7+3.
50
50
50
50
50
[0073] Также охарактеризовывали чувствительность ex vivo к СРХ-351 при разных подтипах гемобластозов. Использовали сто двадцать семь (127) дополнительных образцов от пациентов, включая пациентов с ALL (38), MPN/MDS (18) и лимфомой (71). Цитотоксические активности СРХ-351, оцениваемые по IC, определяли для каждого отдельного образца от пациента ex vivo, и они представлены на фигурах 2А-2С. Наблюдали широкий диапазон значений IC в каждой диагностической категории (0,03/0,006 мкМ - 10/2 мкМ). Медиана IC для всех 180 тестируемых образцов от пациентов (включая 53 случая AML) составляла 0,558:0,112 мкМ, и в подавляющем большинстве случаев (153/180, 85%) наблюдали значения IC ниже 2,0:0,4 мкМ, что в 30 раз ниже зарегистрированных концентраций лекарственных средств 60:12 мкМ в плазме через 72 ч., наблюдаемой у пациентов с лейкозом (Gordon, М., et al., Proceedings of the AACR (Apr 2016) 57: Abstract #287). Наблюдаемая низкая медиана IC СРХ-351 относительно концентраций лекарственных средств в кровотоке, как правило, свидетельствовала о высокой активности СРХ-351 в потенциальном ингибировании пролиферации или выживаемости лейкозных клеток при широком диапазоне диагнозов.
Пример 2
Эффект мутаций генов
50
50
3
3
[0074] Более высокую активность СРХ-351 наблюдают в бластах пациентов с AML с фенотипом FLT3-ITD: FMS-подобная рецепторная тирозинкиназа (FLT3) играет важную роль в нормальном гемопоэзе и лейкемогенезе и экспрессируется в большинстве бластов при AML. У 20-25% пациентов с AML в гене FLT3 возникает дупликация внутреннего тандема в околомембранном домене FLT3 (FLT3-ITD), и она ассоциирована с плохим прогнозом у пациентов. Среди 42 пациентов с AML в исследовании из примера 1 с известным статусом FLT3-ITD 14 пациентов идентифицировали как носителей мутации FLT3-ITD, и остальные 28 были отрицательными по FLT3-ITD. Результаты исследования цитотоксичности ex vivo свидетельствовали о том, что носительство FLT3-ITD, неожиданно, было ассоциировано с более высокой чувствительностью к индуцированной СРХ-351 цитотоксичности (как показано на фигуре 3А). В частности, у лейкозных бластов, имеющих FLT3-ITD, наблюдали значимо более низкие значения IC (0,29:0,058 мкмоль) по сравнению с образцами от FLT3-ITD-отрицательных пациентов (IC=1, 32:0,26 мкмоль). Это различие в ответе на цитотоксичность СРХ-351 между FLT3-ITD-положительными и отрицательными образцами являлось статистически значимым (р=0,047). Также необходимо отметить, что FLT3-ITD-положительные пациенты имели значимо более высокое количество лейкоцитов (WBC) со средним результатом 91000/мм по сравнению с 29000/мм при постановке диагноза, р=0,0002.
[0075] Другие распространенные мутации, включая мутации нуклеофозмина (NPM1) и ССААТ-энхансерного связывающего белка альфа (СЕВРα), также обнаруживали у 13 и 4 пациентов, соответственно. Однако ни одна из этих двух распространенных мутаций не оказывала значительного влияния на ответ на обработку СРХ-351 ex vivo, хотя наблюдали тенденцию в сторону более высокой чувствительности в СЕВРα-положительных случаях (фигуры 3В и 3С).
Пример 3
Корреляция между чувствительностью ex vivo и захватом СРХ-351 в лейкозных бластах пациентов
[0076] В доклинических моделях лейкоза на животных наблюдали, что после инъекции СРХ-351 лейкозные клетки в пересаженном костном мозге у этих животных легко могли захватывать цитарабин и даунорубицин, в большей мере, в интактной липосомной форме с поддерживаемым синергическим соотношением лекарственных средств, что приводило к повышенному и длительному накоплению лекарственных средств в лейкозных клетках по сравнению с введением смеси свободных лекарственных средств. Представленные ниже данные свидетельствуют о повышенном захвате СРХ-351 по сравнению со свободными лекарственными средствами. Таким образом, захват и цитотоксичность СРХ-351 ех vivo можно использовать для прогнозирования клинического успеха СРХ-351.
[0077] Витально замороженные клетки из образцов от пациентов, ранее подвергнутые скринингу на чувствительность к СРХ-351 ex vivo, подвергали воздействию максимальной тестируемой концентрации СРХ-351 (10:2 мкМ цитарабина : даунорубицина) в течение 24 часов. Затем клетки 3 раза промывали PBS и анализировали на захват даунорубицина по флуоресценции с использованием проточного цитометра BD FACSAria.
50
[0078] Проточный цитометрический анализ осуществляли на 12 образцах от пациентов, как описано выше, с использованием собственной флуоресценции даунорубицина как полуколичественного показателя внутриклеточно биодоступного лекарственного средства. Образцы получали от 6 пациентов с AML и 6 пациентов с CLL, и наблюдали широкий диапазон значений IC при исходном скрининге ex vivo. Клетки подвергали воздействию ступенчатых концентраций СРХ-351 в течение 24 часов перед анализом на захват даунорубицина с помощью проточного цитометра BD FACSAria. Живые клетки идентифицировали на диаграмме рассеяния FSC vs. SSC и вычисляли общую интенсивность флуоресценции (фигура 4А, слева). Соотношение средней интенсивности флуоресценции клеток, подвергнутых воздействию СРХ-351, относительно необработанных клеток использовали для получения показателя захвата лекарственного средства, при этом показатель 1 свидетельствует об отсутствии захвата, а числа выше 1 свидетельствуют о захвате даунорубицина.
[0079] Статистический анализ: для сравнения активности СРХ-351 в группах мутантных FLT3 (ITD), NPM1 и СЕВРα и FLT3 (ITD), NPM1 и СЕВРα дикого типа использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок с односторонним значением р. Значение р<0,05 считали значимым. Для сравнения исходов в различных группах генетического-цитогенетического риска использовали односторонний анализ ANOVA. Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения Prism версии 5.0а.
50
50
[0080] По сравнению с необработанными клетками, клетки, обработанные СРХ-351, демонстрировали значительное повышение степени интенсивности внутриклеточной флуоресценции, свидетельствующей о наличии свободного даунорубицина, т.к. флуоресценция даунорубицина, инкапсулированного в СРХ-351, полностью гасится. Различия захвата даунорубицина между обработанными и необработанными образцами клеток представлены в виде кратного сдвига средней интенсивности флуоресценции (MFI) (фигура 4А, справа). На фигуре 4В представлено сравнение захвата и цитотоксичности. Когда строили график значений IC СРХ-351 для этих 12 образцов относительно соответствующих значений MFI, наблюдали сильную корреляцию между чувствительностью клеток к СРХ-351 (IC) и эффективностью захвата СРХ-351 (MFI) с коэффициентом корреляции 0,703 (фигура 4С).
3
14
[0081] Селективный захват лейкозными клетками костного мозга, оставляющий СРХ-351 интактным, демонстрировали следующим образом: клетки костного мозга бедренной кости мышей с пересаженным CCRF-CEM (лейкозом), которым вводили 1 дозу СРХ-351, собирали через 18 часов после введения лекарственного средства. Лейкозные и нормальные клетки костного мозга разделяли с помощью специфичных к CD45 человека магнитных частиц и анализировали на захват СРХ-351. Цитарабин и липосомные липиды метили с помощью Н и С, соответственно, и количественно анализировали посредством жидкостной сцинтилляции. Даунорубицин анализировали посредством ВЭЖХ. Результаты представлены на фигурах 5А-5С. Каждый столбик представляет собой среднее ±SE для 3 параллелей с 10 бедренными костями (5 мышами) на параллель.
6
6
6
6
6
6
[0082] Как показано на фигуре 5С, лейкозные клетки захватывали приблизительно 225 пмоль липосомного меченого липида на 10 клеток, но нормальный костный мозг захватывал лишь приблизительно 110 пмоль/10 клеток. Лекарственные средства, содержащиеся в липосомах, также преимущественно захватывались лейкозными клетками, где цитарабин демонстрировал захват 24 пмоль/10 клеток, а даунорубицин - приблизительно 16 пмоль/10клеток в случае лейкозных клеток и, в каждом случае, в меньшем количестве нормальным костным мозгом (приблизительно 3 пмоль/10клеток в случае цитарабина и приблизительно 7 пмоль/10 клеток в случае даунорубицина). Молярное соотношение липосомного липида и лекарственного средства, содержащегося в нем, составляет приблизительно 10:1 таким образом, что эти результаты свидетельствуют о том, что лекарственные средства оставались в липосомах при захвате этими клетками.
Пример 4
СРХ-351 демонстрирует превосходную противоопухолевую эффективность у FLT3-ITD+ пациентов с AML
[0083] В этом примере осуществляли клиническое исследование фазы 3, где пациентов с AML подвергали скринингу для определения носительства активирующей мутации гена FLT-3. Этим пациентам с AML, которые, как обнаружено, имеют активирующую мутацию AML-ITD+, вводили 3 дозы СРХ-351 в цикле введения, состоящем из первой стадии введения в день 1, второй стадии введения в день 3 и третьей стадии введения в день 5. Протоколы лечения с использованием СРХ-351 описывают в патенте США №8092828. Ответ пациента, включая анализ образцов плазмы и/или костного мозга, измеряли и подвергали мониторингу, а также измеряли доли отвечающих и выживаемость. Также включали подгруппы пациентов, положительных на мутацию NPM1 и/или СЕВРα. Исходное исследование, сфокусированное на мутациях FLT-3, также включало индивидуумов с мутациями NPM-1 и СЕВРα. Пациенты, участвующие в исследовании, представлены в таблице 3.
*гипометилирующее средство
[0084] Ответы индивидуумов с мутациями FLT-3 и без них представлены в таблице 4.
[0085] На фигуре 6 представлены доли отвечающих в виде сравнения лечения СРХ-351 и 7+3 в случае носителей этих мутаций. Как показано на фигуре 6, среди носителей мутации ITD или TKD в FLT-3 наблюдали долю отвечающих 68,2% в случае СРХ-351 и лишь 25,0% в случае 7+3. Среди пациентов с мутацией NPM-1 наблюдали долю отвечающих 92,3% в случае СРХ-351, но лишь 58,3% в случае 7+3. В случае индивидуумов с мутациями СЕВРα доля отвечающих в случае СРХ-351 составляла 33,3%, а в случае 7+3-20,0%.
[0086] Коэффициенты выживаемости для участников с мутациями FLT-3 и без них в этом исследовании представлены в таблице 5.
[0087] Коэффициенты выживаемости для различных когорт также представлены на фигурах 7А-7С. Во всех случаях, у носителей мутаций в значительной степени улучшалась выживаемость; в частности, у 2 5% индивидуумов с мутацией в СЕВРα наблюдали выживаемость более 27 месяцев при лечении СРХ-351, в то время как ни у одного из пациентов, которых лечили с помощью 7+3, выживаемость не превысила 3 месяца.
Пример 5
Восприимчивость мутантных по FLT-3 клеток к СРХ-351 и комбинированное лечение: СРХ-351+ингибитор FLT-3
[0088] В этом примере жизнеспособность клеток и внутриклеточный захват с учетом флуоресценции даунорубицина, определяемой посредством проточной цитометрии, измеряли, как описано в примерах 1 и 3.
50
50
50
[0089] А. Определяли восприимчивость линий клеток AML (включая MOLM-13 и MOLM-14, содержащие FLT-3-ITD, и МЕ-1 (содержащие мутантный, активированный FLT-3)) к СРХ-351 и захват СРХ-351 этими клетками. Также сравнивали клетки, не содержащие мутации FLT-3, включая U-937, HL-60, KG-1 и GDM-1. Культуры этих клеток обрабатывали СРХ-351 и анализировали на IC и захват СРХ-351. На фигуре 8А представлены результаты, касающиеся IC, в виде графика процента клетка жизнеспособность относительно концентрации СРХ-351 в нМ. Как показано на фигуре 8А, FLT-3-мутантные клетки имели более низкие IC, чем немутантные по FLT-3 клетки. На фигуре 8В представлены результаты определения захвата; график концентрации СРХ-351 в нМ построен относительно средней интенсивности флуоресценции (MFI), нормализованной с учетом собственной флуоресценции. Клетки, содержащие мутации FLT-3, эффективнее захватывали СРХ-351, чем клетки без мутаций.
[0090] В. Для определения эффекта комбинированного лечения ингибиторами FLT-3 клетки подвергали воздействию СРХ-351 с обработкой квизартинибом или мидостаурином (ингибиторами FLT-3) или без нее. По одному протоколу клетки МЕ-1 и MOLM-14 подвергали предварительной обработке 10 нМ квизартиниба в течение 0, 2, 8, 16 и 24 часов, после чего добавляли 100 мкМ СРХ-351 на 2 часа. Захват СРХ-351 измеряли по флуоресценции даунорубицина, определяемой посредством проточной цитометрии, нормализованной по необработанному контролю. Результаты представлены на фигурах 9A-9D. По оси х на графиках отложен захват СРХ-351 в стандартных единицах флуоресценции, а по оси у отложены нормализованные количества клеток. Как представлено на фигурах 9А и 9В, все необработанные клетки демонстрировали отсутствие захвата, в то время как клетки, обработанные СРХ-351, в конечном итоге, сортировали на две популяции клеток, одна из которых захватывает СРХ-351 эффективнее, чем другая. Из фигур 9А и 9В очевидно, что, т.к. увеличивали время предварительной обработки, способность некоторых клеток захватывать СРХ-351 снижалась. Результаты, представленные на фигурах 9С и 9D, представляют собой сочетания различных временных точек до 24 часов.
[0091] С. Для определения синергии линии клеток высевали на 384-луночные планшеты и подвергали воздействию индивидуальных повышающихся концентраций СРХ-351 и ингибитора FLT-3. СРХ-351 и ингибиторы FLT-3 добавляли (а) одновременно (C+Q или С+М), (b) с 24-часовой предварительной обработкой СРХ-351 (C→Q или С→М), или (с) 24-часовой предварительной обработкой ингибитором FLT-3 (Q→C или М→С). Для определения синергии для каждой комбинации лекарственных средств использовали алгоритм ЕОВА.
[0092] На фигуре 10А представлена схема протокола вместе с числовыми значениями соответствующих концентраций в нМ СРХ-351 или ингибитора FLT-3. На фигуре 10В представлены результаты в виде антагонистического, аддитивного или синергического эффекта, которые можно получать посредством измерения жизнеспособности при различных концентрациях двух используемых лекарственных средств с использованием алгоритма ЕОВА. На фигуре 1°С представлены результаты экспериментов, касающиеся жизнеспособности, в виде данных для различных комбинаций концентраций и различных протоколов, описанных выше, и итоговое определение синергии на основе алгоритма ЕОВА. Результаты для KG-1, МЕ-1, MOLM-13 и MOLM-14 при указанных выше протоколах представлены на фигуре 10С. Как указано, конкретные комбинации СРХ-351 и квизартиниба или мидостаурина демонстрировали высокую синергию, если введение СРХ-351 предшествовало введению ингибитора FLT-3, или если их вводят одновременно.
[0093] D. Также использовали альтернативный способ определения синергии, в котором сравнивали различные комбинации ингибиторов FLT-3 и протоколов с использованием двух линий клеток. Осуществляли эксперимент, описанный в параграфе С, и в этом случае для анализа результатов использовали алгоритм Чоу-Талалай. Как показано на фигуре 11А, различные комбинации СРХ-351 и ингибитора FLT-3 тестировали в лунках, представленных закрашенными ячейками. На фигуре 11В представлен образец изоболограммы, на которой представлен график результата анализа Чоу-Талалай, т.е. показателя аддитивности (CI), для каждой из концентраций, представленных на фигуре 11А, для всех трех из протоколов, описанных выше. На фигуре 11С представлены результаты для клеток GDM-1 и клеток MOLM-14 для этих трех протоколов и уровней концентраций, представленных на фигуре 11А. Кругами на каждом графике указаны комбинации концентраций для каждой из ячеек, представленных на фигуре 11А. Как видно, в случае клеток MOLM-14 введение СРХ-351 одновременно с квизартинибом или мидостаурином или перед ними приводило к наблюдению синергии в большом количестве лунок, в то время как в случае введения этих лекарственных средств до СРХ-351 наблюдают более антагонистические результаты. Результаты в случае клеток GDM-1 значимо не отличались. Фигура 11D представляет собой серию графиков, на которых показано количество точек данных, попадающих в различные категории с учетом их значений показателя аддитивности комбинация (CI) для каждого из протоколов, представленных на фигуре 11С.
[0094] Е. В заключение, линии клеток, содержащие FLT-3-ITD или активирующую мутацию FLT-3, были более чувствительными к СРХ-351 и демонстрировали повышенный захват СРХ-351 по сравнению с линиями клеток с другими генетическими аномалиями.
[0095] Предварительная обработка квизартинибом в течение 16 часов приводила к тому, что у приблизительно 50% общей популяции клеток наблюдали сниженную флуоресценцию даунорубицина, свидетельствующую о том, что длительное предшествующее воздействие ингибитора FLT-3 может снижать захват СРХ-351 в этой субпопуляции.
[0096] Однако наблюдали устойчивую синергию, когда СРХ-351 и ингибиторы FLT-3 вводили одновременно или когда клетки подвергали воздействию СРХ-351 за 24 часа до воздействия ингибитора FLT-3.