КОМБИНИРОВАННЫЙ СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ КОСТНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ
COMBINED METHOD OF BONE GRAFT STERILISATION

60
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в травматологии, ортопедии и в других областях восстановительной хирургии. Известны различные способы стерилизации костной ткани, применяемой с пластической целью в травматологии и ортопедии, нейрохирургии, челюстно-лицевой хирургии, офтальмологии. Их общая особенность: одноэтапность процедуры стерилизации и однородность (химическая или физическая) применяемых для этого средств (1, 2, 3, 4, 5). Известен способ стерилизации кости гамма-лучами, он же прототип (9), при котором стерилизацию трансплантатов осуществляют в специальной установке с источником гамма-излучения Со. До стерилизации образцы тканей подвергают либо замораживанию, либо высушиванию путем вымораживания, что предупреждает, по мнению специалистов, развитие нежелательных изменений, нарушающих в тканях их полезные качества. Оптимальной дозой при этом считают дозу в 2,5 Мрад, после использования которой гибнут бактерии, грибки, плесень и вирусы. Однако биологические ткани также не остаются интактными. В них возникают морфологические и биохимические нарушения, которые в зависимости от вида тканей могут привести к их полной клинической непригодности (6, 7, 8).
Чтобы снизить дозу радиации и предотвратить тем самым вредное влияние облучения на биологические объекты, предлагаем комбинированный способ двухэтапной лучевой стерилизации костных трансплантатов, при котором на первом этапе трансплантаты обрабатывают 24 часа при +5…+7°С в растворе, содержащем этанол, димексид и тимол при следующем соотношении компонентов, мас.%: этанол 70% - 15,0; димексид - 10,0; тимол - 0,25; дистиллированная вода - остальное; на втором - трансплантаты в стерильной упаковке замораживают при -70°С и облучают гамма-лучами дозой в 1,2 Мрад.
Техническим результатом изобретения являются: а) значительное снижение уровня радиоактивного облучения трансплантатов (с 2,5 до 1,2 Мрад), что способствует лучшему сохранению их морфологических и биопластических качеств; б) усиление стерилизующей активности способа за счет комбинированного использования гамма-лучей и антисептических средств химического происхождения.
60
Результат изобретения достигается следующим образом. Подготовленные к стерилизации образцы костной ткани (не деминерализованные и деминерализованные) помещают в общую тару и заливают стерилизующим раствором. Для приготовления последнего в колбу с дистиллированной водой на каждые 75 мл вносят 15,0 этанола (70%), 10,0 димексида, 0,25 г тимола. Раствор тщательно перемешивают и используют по назначению. Емкость с залитыми раствором трансплантатами герметизируют и помещают в бытовой холодильник с температурным режимом +5…+7°С. Через 24 часа в стерильных условиях бокса трансплантаты извлекают из раствора, подсушивают салфетками и размещают в индивидуальные стерильные пластиковые пакеты. Последние герметизируют и подвергают замораживанию в холодильной камере при температуре - 70°С. В день лучевой стерилизации пакеты с трансплантатами помещают в сумку-холодильник и подвергают обработке в установке, содержащей Со. После стерилизации трансплантаты в том же контейнере возвращаются в лабораторию, где часть из них направляется в бактериологическую лабораторию для исследования на стерильность. Остальные трансплантаты перекладывают в низкотемпературный холодильник для дальнейшего хранения и, если отсутствуют противопоказания, клинического использования.
В таблице показаны результаты стерилизации биологических тест-объектов различными способами.
Примечание: + рост микрофлоры; - отсутствие роста.
На чертежах изображены:
Фиг.1. Рентгенологический результат эктопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у крыс через 15 суток после операции.
Фиг.2. Рентгенологический результат эктопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у крыс через 90 суток после операции.
Фиг.3. Рентгенологический результат ортотопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у кролика через 30 суток после операции.
Фиг.4. Рентгенологический результат ортотопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у кролика через 180 суток после операции.
Фиг.5. Рентгенограмма левой пяточной кости больного И. до операции.
Фиг.6. Компьютерная томограмма левой пяточной кости до операции.
Фиг.7. Рентгенограмма левой пяточной кости через 7 месяцев после операции.
60
Таким образом, новизна способа состоит в комбинированном двухэтапном применении комплекса химических (этанол, димексид, тимол) и физических (гамма-лучи) стерилизующих средств, что позволяет значительно (с 2,5 до 1,2 Мрад) снизить дозу лучевого воздействия на костную ткань, обеспечить надежный стерилизующий эффект и сохранить ее высокие трансплантационные качества. Двухэтапная комбинированная стерилизация позволяет накапливать пластический материал после первого этапа и стерилизовать его гамма-лучами по мере необходимости, в плановом порядке, сокращая тем самым число обращений в учреждения, имеющие радионуклидную установку с источником гамма-излучения Со.
Для обоснования способа были проведены бактериологические, гистологические исследования и опыты на животных.
1. Стерилизующая активность способа.
Для проведения бактериологических исследований до и после стерилизации предлагаемым способом были использованы образцы тканей, наиболее инфицированные в естественных условиях смешанной микрофлорой, в которой наиболее часто встречались стафилококки, споровая и кишечная палочки, стрептококк, плесень и др. Речь идет о кожных тест-объектах, полученных у трупов-доноров, хранившихся в условиях морга при комнатной температуре, а также о хвостовых фрагментах крыс, забитых после выполнения тех или иных операций. В общем итоге бактериологическому исследованию было подвергнуто 600 тест-объектов, разделенных в зависимости от вида стерилизации на 3 серии, а от времени стерилизации - на 4 группы (Таблица 1). При химической стерилизации одна часть тест-объектов направлялась в бактериологическую лабораторию, другая хранилась в холодильнике при минус 70°С. Стерилизация накопленных таким образом тест-объектов гамма-лучами была выполнена дважды (по 200 образцов тканей на каждый сеанс).
Результаты исследований, приведенные в таблице, показали, что при раздельном использовании химической (этанол, димексид и тимол) и физической (гамма-лучи) стерилизации необходимого бактерицидного эффекта получено не было. Во все сроки наблюдался рост микрофлоры, преимущественно того же состава, что был обнаружен в контрольных посевах. Правда, при химической стерилизации, начиная с первых суток, наблюдалось постепенное повышение бактерицидной активности антисептического комплекса к концу третьих суток. После изолированной гамма-стерилизации тест-объектов такой закономерности отмечено не было.
При комбинированном использовании химических и физического агентов стерилизующий эффект был установлен только при 24-часовой экспозиции. Аналогичный результат сохранялся и дальше (на 2 и 3 сутки после начала опыта).
Таким образом, результаты эксперимента свидетельствуют о том, что раздельное применение использованных в заявке способов стерилизации биологических тканей не эффективно. Лишь при комплексном двухэтапном применении в установленные сроки они, действуя как синергисты, обеспечивают надежный стерилизующий эффект и могут быть рекомендованы для заготовки костных трансплантатов, полученных от трупов-доноров в условиях морга.
2. Гистологические исследования.
Проведены на 5 образцах костной ткани, взятой посмертно у донора 40 лет, умершего от обширного инфаркта стенки левого желудочка. Для гистологического исследования фрагменты кости до (контроль) и после стерилизации (опыт) помещали в фиксирующий раствор Кайзерлинга и декальцинировали в 10% растворе селектона. После этого препараты заливали либо в целлоидин, либо в целлоидин-парафин по общепринятой методике. Полученные из препаратов срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Результаты исследований не обнаружили в стерилизованной костной ткани морфологических нарушений, которые могли бы явиться противопоказанием для их применения в качестве трансплантатов.
3. Остеоиндуктивная активность деминерализованных костных трансплантатов, стерилизованных предлагаемым способом.
Эксперименты проведены на 11 беспородных белых крысах и 5 кроликах. Первым производили эктопические пересадки в мышечный массив бедра, вторым - ортотопические в дефект лучевой кости. Деминерализацию костных трансплантатов осуществляли в 0,6 н. растворе соляной кислоты на протяжении 24-48 часов при температуре +7°С. Стерилизацию трансплантатов выполняли в два этапа: на первом - в растворе, содержащем (мас.%): этанол 70% - 15,0; димексид - 10,0; тимол - 0,25; дистиллированную воду - остальное. Время стерилизации при +7°С составляло 24 часа. После стерилизации в боксе трансплантаты извлекали из раствора, осушали салфетками и помещали в стерильную тару. Последнюю герметично опечатывали и переносили в низкотемпературный холодильник для замораживания и хранения при минус 70°С.
60
На втором этапом препараты в замороженном виде стерилизовали гамма-лучами Со и вновь помещали на хранение в низкотемпературный холодильник до момента операции. После операции полученные у животных макропрепараты подвергали рентгенологическому и гистологическому изучению. Максимальный срок наблюдения за животными составлял: для крыс - 3 месяца, для кроликов - 6 месяцев. Проведенные исследования показали, что через три месяца у 9 из 11 крыс на месте пересадки были обнаружены очаги индукционного остеогенеза, состоящие в основном из спонгиозной костной ткани, содержащей элементы миелоидного и жирового костного мозга (Фиг.1 и 2).
При ортотопической пересадке у всех кроликов в области бывшего дефекта лучевой кости через 6 месяцев после операции была выявлена новообразованная костная ткань органотипического строения, полностью замещающая дефект. В ее толще еще попадались мелкие фрагменты перестраивающегося трансплантата, к этому времени практически полностью рассосавшегося и заместившегося новыми костными структурами (Фиг.3 и 4).
Эксперимент подтвердил, таким образом, что предлагаемый способ стерилизации костной ткани не нарушает ее остеоиндуктивных и биопластических свойств, что позволяет рекомендовать его для изготовления трансплантатов, используемых в клинической практике.
4. Клинический пример.
Больной И., 18 лет. Поступил в РосНИИТО им. Р.Р.Вредена с диагнозом: киста левой пяточной кости (Фиг.5 и 6). Выполнена операция экскохлеация, комбинированная пластика замороженными и деминерализованными костными трансплантатами, которые были стерилизованы предлагаемым способом. Конечность фиксирована гипсовой повязкой. Послеоперационный период протекал гладко. Рана зажила первичным натяжением. Нагрузка была разрешена через 3 месяца после операции. При контрольном осмотре больной жалоб не предъявлял. Движения в голеностопном суставе восстановились полностью. На рентгенограммах через 7 месяцев после операции видны признаки перестройки костных трансплантатов с формированием полноценной костной структуры (Фиг.7).
Список литературы
1. Савельев В.И. Заготовка и консервация биологических тканей на современном этапе // Вестник хирургии. - 1979. - Т.122. N5 - С.131-137.
2. Иванкин Д.Е. Стерилизация и консервация костных трансплантатов слабыми растворами формальдегида в сочетании с другими антисептиками. / Автореф. канд. дисс., Санкт-Петербург, 1999. - 21 с.
3. Савельев В.И. Аллотрансплантация формалинизированной костной ткани в травматологии и ортопедии. / В.И.Савельев, Н.В.Корнилов, Д.Е.Иванкин, С.А.Линник. СПб.: «Морсар АВ», 2001. - с.48-54.
4. Губин А.В. Костная пластика аллогенным фетотрансплантатом в хирургии позвоночника у детей. / Автореф. канд. дисс., Санкт-Петербург, 2001. - 24 с.
5. Савельев В.И. Газовая стерилизация тканевых трансплантатов и стационарная установка для этой цели. / Ортопед. травматол. - 1971. - N3. - С.76-78.
6. Мощная радиационная техника (основы радиационной технологии). / Под ред.С.Джеферсона, пер. с англ. - М.: «Атомиздат», 1967. - С.40-56, 58-63.
7. Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. М.: Медицина, - 1973. - 368 с. (С.124-154).
8. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с.
9. Cornu О. Effect of freeze-drying and gamma irradiation on the mechanical properties of human cancellous bone. / O.Cornu, X.Banse, P.L.Docquier et al. // J.Orthop.Res. - 2000. - Vol.18, N 3. - P.426-431.
Комбинированный способ стерилизации костных трансплантатов.
Таблица 1
Вид стерилизации
Время (часы)
12
24
48
72
+
-
+
-
+
-
+
-
Химическая (этанол, димексид, тимол)
50
0
24
26
12
38
7
43
Физическая (гамма-лучи)
50
0
21
29
19
31
22
28
Комбинированная
23
27
0
50
0
50
0
50
Количество тест-объектов
150
150
150
150