Современные подходы в профилактике и лечении гриппа: перспективы применения ингибиторов протеолиза

2013

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 11

Вып. 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

УДК 613.22:517.156:576.858/8.0947

В. А. Дивоча, О. В. Лагода, А. И. Гоженко, В. Н. Михальчук, Т. М. Кобрин

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ГРИППА: ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕОЛИЗА

В течение последних 10 лет существенно изменилось представление о роли про-теолитических ферментов в организме. Стало очевидным, что протеолиз является особой формой биологического контроля [1]. Анализ обширного материала показал, что ограниченный протеолиз служит пусковым и/или ключевым патогенетическим механизмом многих биологических и патобиологических процессов (свертывание крови, фибринолиз, апоптоз, воспаление, шок, ответ острой фазы, активация ряда гормонов и иных биорегуляторов) и обеспечивает быстрый физиологический ответ организма на меняющиеся условия или поступающий извне сигнал [2].

С биологией возбудителей вирусных заболеваний связаны трудности в направленном создании препаратов избирательного противовирусного действия. Достижения биохимии и молекулярной биологии последних лет, раскрывающие особенности репродукции вирусов, обеспечивают создание новых подходов направленного вмешательства в цикл вирусной репродукции [3, 4].

Протеолитическая активация широко распространена среди вирусов разных таксономических групп. У пикорна и тогавирусов расщепление белка-предшественника является основным механизмом, приводящим к образованию функциональных белков. Протеолитическая активация есть у большинства других вирусов и касается, в основном, вирусных гликопротеидов, осуществляющих функции адсорбции и слияния. В результате ограниченного протеолиза белковая молекула расщепляется на две субъединицы, как, например, гемагглютинин вируса гриппа, либо от нее отщепляется небольшой фрагмент, у обоих гликопротеидов парамиксовирусов, HN и F [5, 6].

Дивоча Валентина Афанасьевна — д-р мед. наук, старший научный сотрудник, ГП Украинский НИИ медицины транспорта МЗУ г. Одесса; e-mail: divocha09@ukr.net

Лагода Оксана Викторовна — научный сотрудник, ГП Украинский НИИ медицины транспорта МЗУ, г. Одесса; e-mail: lagoda09@ukr.net

Гоженко Анатолий Иванович — д-р мед. наук, профессор, ГП Украинский НИИ медицины транспорта МЗУ, г. Одесса; e-mail: medtrans2@rambler.ru

Михальчук Василий Николаевич — д-р мед. наук, доцент, НМАПО им. П. Л. Шупика, г. Киев; e-mail: shepit@ukr.net

Кобрин Тарас Михайлович — научный сотрудник, ГП Украинский НИИ медицины транспорта МЗУ, г. Одесса; e-mail: tarkob@gmail.com

© В. А. Дивоча, О. В. Лагода, А. И. Гоженко, В. Н. Михальчук, Т. М. Кобрин, 2013

Протеолитическая активация является высоко специфическим процессом, осуществляемым определенными протеиназами клеточного или вирусного происхождения [7, 8]. Так, протеолитическую активацию вирусов гриппа и парамиксовирусов осуществляют трипсиноподобные протеиназы клетки, которые гидролизуют пептидную связь между аргинином и лизином. Химотрипсин и гемолизин расщепляют белок-предшественник со сдвигом на 3 и 1 аминокислоту соответственно, и при этом протеолитическая активация и слияние вириона с клеткой не происходит [9].

Белки слияния вирусов гриппа и парамиксовирусов активизируются многими протеиназами. Сериновые протеиназы находятся в хорионаллантоисной жидкости куриного эмбриона, но при фракционировании ее могут быть разделены [10]. Для максимального расщепления гемагглютинина вируса гриппа и F-белка вируса Сендай in vitro требовалось около 4 ч инкубации при t +37°C.

Протеолитическая активация является важным событием в инфекционном цикле вирусов. При ее нарушении сборка вирусных частиц будет происходить, однако образующиеся вирионы будут неинфекционными, поскольку в их составе отсутствуют активные белки слияния, обеспечивающие проникновение вируса в здоровые клетки. Поэтому протеолитическая активация обусловливает инфекционную активность вируса и способность его к генерализации инфекции. По-видимому, свойства вируса поражать определенные ткани организма определяются наличием в органах и тканях ферментов, необходимых для протеолитической активации вирусного потомства.

Значение протеолитической активации в инфекционном процессе, ее универсальность для ингибиторов протеолиза являются предпосылками для использования ее в качестве мишени с целью лечения вирусной инфекции. Такой подход к терапии вирусных заболеваний открывает перспективу для создания препаратов широкого антивирусного спектра действия, поскольку для определенных вирусов можно подобрать специфические ингибиторы протеолиза, эффективно блокирующие протеолитичес-кий процессинг. Сейчас протеолитическими ферментами интересуются практически во всех областях медицины. Это связано с тем, что в настоящее время известен целый ряд заболеваний, в патогенезе которых участвуют протеиназы. В данной статье представлен обзор 25-летних авторских исследований роли протеазно-антипротеазных взаимоотношений в патогенезе гриппа и перспективы применения достигнутых результатов в лечении и профилактике.

Цель исследований — изучить состояние и роль антипротеиназных систем вируса и реципиента в развитии гриппозной инфекции для получения и использования принципиально новых лечебных препаратов на основе ингибиторов трипсиноподоб-ных протеиназ.

Задачи исследования:

1. Очистить вирус гриппа до гомогенного состояния.

2. Изучить природу протеиназы, ассоциированной с вирусом гриппа.

3. Изучить роль протеиназ и их ингибиторов на разных, особенно ранних стадиях развития гриппозной инфекции.

4. Проверить наличие трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора в зарубежных коммерческих препаратах.

5. Выделить и очистить протеиназу и ее ингибитор из легких здоровых и зараженных вирусом гриппа мышей.

6. Получить специфические антитела к изоформам трипсиноподобной протеи-назы и изучить их защитное действие при гриппе в эксперименте.

7. Изучить защитное действие клеточного ингибитора при заражении животных смертельной дозой вируса гриппа.

8. Определить биоматериал для получения ингибитора протеиназ, обладающего противовирусным свойством.

9. Изучить наличие трипсиноподобных протеиназ в промышленных отходах получения гамма-глобулина.

Материалы и методы исследования

1. Штаммы вируса гриппа: А^/8/34 (Н1М), А/АШ/2/68 (Н3Ш), А/USSR/90/77 (Н1М), А (Экстра Х-31), А^Ш33 (Н1М), А/РЬШррте8/2/82 (H3N2), АО/32 (Н0N1), выращенные на 9-дневных куриных эмбрионах; В-штамм PR-109, полученный рекомбинацией вирусов В^ее/40 и В/USSR/100/83; клетки МДСК (MDCK) — получены в НИИ вирусологии им. И. Д. Ивановского АМН России, штамм АО/32 (НОШ) — из НИИ гриппа Санкт-Петербурга, Россия.

2. Белые мыши линии BALB/с и беспородные.

3. Куриные эмбрионы.

4. Перевиваемая культура клеток МДСК.

5. Белые крысы линии Ш1з1аг.

6. Отходы промышленного получения гамма-глобулина и альбумина.

7. Отечественные коммерческие лекарственные препараты: интерферон, иммуноглобулин человеческий; герпетическая, гонококковая и туляремийная вакцины.

8. Зарубежные лекарственные препараты: Инфлувак, Флюарикс, Ваксигрип, Авак-сим, Фраксипарин, Солкосерил.

Биохимические методы. Определение содержания белка проводили по методу О. Н. Lowry [11], определение активности ингибитора трипсина — по гидролизу казеина по методу К. М. Веремеенко [12] в модификации А. П. Левицкого [13]. Электрофо-ретический анализ проводили по методу и. К. Laemli [14]. Для выделения и очистки ингибитора из отходов сывороточной промышленности использовали хроматографи-ческие методы исследования.

Вирусологические методы. Заражение и накопление вируса гриппа А/PR/8/34 на куриных эмбрионах. Адаптация вируса гриппа А /PR/8/34 к белым мышам. Получение смертельной дозы вируса гриппа на мышах. Выбор дозы ингибиторов для лечения мышей, зараженных вирусом гриппа, полученными ингибиторами трипсиноподоб-ных протеиназ. Для изучения природы протеолитической активности, ассоциированной с вирусом гриппа, использовали вирус гриппа А0/32(Н0Ш) с инфекционным титром 7 ^ ЭИД50/0,2 и ГА-1:256. Для получения препаратов вируса гриппа использовали 10-11-суточные куриные эмбрионы. Вирус накапливали путем заражения куриных эмбрионов в объеме 0,2 мл, разведенным до 10-3 инфекционным материалом. Зараженные куриные эмбрионы инкубировали 48 ч при температуре +36°С. Затем охлаждали 18 ч при температуре +4°С, после чего собирали содержащую вирус жидкость.

Иммунологические методы. Для получения гипериммунных антипротеиназных сывороток использовали белых крыс весом 170-200 г линии '^81аг. Иммунизацию белых крыс проводили четырехкратно (1 раз в неделю) каждой изоформой трипсинопо-добных протеиназ, выделенных из нормальных и зараженных легких белых мышей,

с полным адьювантом Фрейнда. Каждая крыса получила 560 ед. белка и 890 ед. проте-иназы. Тотальный забор крови гипериммунных сывороток был проведен на 7-е сутки после последней иммунизации. Нейтрализующие свойства иммунных сывороток изучали на 3-дневной перевиваемой культуре клеток МДСК. Наличие антител определяли в РСК и методом встречного иммуноэлектрофореза.

Статистические методы. Результаты проводимых исследований обрабатывались методами вариационной статистики с использованием программы «Microsoft Excel».

Результаты исследования. Еще в начале 80-х годов при очистке и концентрации разных штаммов вируса гриппа для получения поливалентных противогриппозных вакцин мы впервые столкнулись с тем, что не можем освободить вирус гриппа [15] от протеолитической активности (рис. 1). Для решения данного вопроса мы усовершенствовали методы очистки, однако освободить вирус гриппа от протеолитической активности нам не удалось.

Исходная аллантоисная вируссодержащая жидкость

Центрифугирование при 6000 мин *,30 мин при t +4°С,

J _

Надосадочная жидкость (НОЖ) ^^ИОсадок отбрасывается

I

Центрифугирование при 10000 мин \ 20 мин при t +4°С, (ЦВР-1 J

Надосадочная жидкость (НОЖ) ^^^Осадок отбрасывается

J .

Центрифугирование при 20000 мин \2 ч при I +4°С,

Осадок

НОЖ отбрасывается

Осаждение очищенного и концентрированного нативного аллантоисного вируса при 20000 мин1, через 20%-ую сахарозу 2 ч г +4°С,

I

НОЖ отбрасывается

Осадок

Очищение в градиенте плотности сахарозы на ВАК-602 при 28000 мин _1и4 ч

НОЖ отбрасывается

Концентрация фракций при 20000 мин1^ часа при 1 +4°С на ЦВР-1 с. буфером ЭТЕ

± I

НОЖ отбрасывается Осадок /вирус/ растворяется в минимальном количестве буфера №?Е

1

Реультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы на ультрацентрифуге «Spinko», rotor-SV, при 33000 мин_1р 3 ч

Ï

Очищение и разделение вирусных полипептидов препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле

Осадок /вирус/ растворяется в минимальном количестве буфера NTE

Обработка вируса 0,1%-ным раствором додецилсульфата Na при при t +20°С 20 мин

1/2 блока на элюцию

1/2 блока на окраску

Рис. 1. Схема очистки вируса гриппа

Анализ очищенных препаратов вируса гриппа на наличие протеолитической активности в наших исследования показал, что очистка вируса гриппа методами ультрацентрифугирования не освобождает вирус гриппа от протеолитической активности. В градиенте сахарозы (15-60%) протеолитическая активность [16] четко разделилась на несколько изоформ (табл. 1).

Таблица 1. Очистка вируса гриппа АО/32 в градиенте сахарозы и при ультрацентрифугировании

28000 мин-1, 4 ч

о Опыты

г о н 1 ВСЖ 2 ВСЖ 3 ВСЖ 4 НАЖ

Фракциии сахароз градиента % сахарозы РГА протеиназа, мг/мл % сахарозы РГА протеиназа, мг/мл % сахарозы РГА протеиназа, мг/мл % сахарозы РГА протеиназа, мг/мл

1 5 0 1,6 3 0 1,5 6 0 2,6 6 0 0,58

2 15 1:8 36 11 1:2 13,6 15 1:8 41,3 17 0 1,01

3 32 1:16 9,6 24 1:16 8,2 23 1:16 0,45 27 0 0,37

4 42 1:2048 33,6 24 1:16 10,2 30 1:64 0,9 29 0 0,59

5 49 1:2048 4,4 38 1:512 25,4 37 1:512 13,8 37 0 0,80

6 52 1:64 37 41,5 1:1024 26,2 44 1:16000 38 41 0 1,43

7 55 1:64 37,4 46,5 1:512 12,2 47 1:16000 3,29 49 0 0,64

8 57 1:62 6,8 53 1:16 7,9 51 1:256 0,3 53,5 0 1,28

9 57 1:512 56 0 1,08

Примечание: РГА — реакция гемагглютинации; ВСЖ — вируссодержащая жидкость; НАЖ — нормальная аллантоисная жидкость.

Ко всем изоформам были получены антипротеиназные иммунные сыворотки, которые нейтрализовали протеиназы в зоне 35-45% сахарозы, где локализовался весь очищенный вирус, а гемагглютинирующая активность сохранилась.

Полученные результаты позволили нам сделать вывод, что с вирусом гриппа ассоциирована серинсодержащая протеиназа трипсиноподобного типа клеточного происхождения, которая имеет молекулярную гетерогенность.

В связи с тем, что мы не смогли освободить вирус гриппа от трипсиноподобной протеиназы, следующим этапом была проверка зарубежных противогриппозных вакцин на наличие в их составе трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора, т. е. мы стремились выяснить, как производители очищают вирус гриппа до гомогенного состояния.

Как показали исследования, результаты которых представлены в таблице 2, все коммерческие препараты, выпущенные зарубежными фирмами, содержали как ингибитор, так и трипсиноподобную протеиназу.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что и зарубежные препараты не очищены на 100% от белковых примесей, и предположить, что невозможно отделить вирусные белки от компонентов клетки. Вирусные белки прочно ассоциированы с компонентами клетки, поэтому структуру вируса гриппа следует рассматривать с учетом взаимодействия с клеточными ферментами и их ингибиторами.

Таблица 2. Наличие трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора в коммерческих иммунобиологических препаратах, выпускаемых фирмами зарубежных стран

№п/п Название препарата Фирма, страна Содержание белка, г белка/л* Активность протеиназы, ммоль аргинина / мин х мг белка Активность ингибитора (ИА), у.о.**

1. Инфлувак Solvay, Нидерланды 16,34±1,20 1,53±0,14 180,86±17,34

2. Флюарикс Сми Клейн, Германия 9,60±0,81 0,61±0,054 96,52±9,24

3. Ваксигрип Пастер, Франция 2,92±0,30 0,31±0,03 101,73±9,01

4. Аваксим Пастер, Франция 14,73±1,32 0,24±0,02 8,924±0,77

5. Фраксипарин Sanofi, Франция 4,81±0,042 0,28±0,03 111,30±10,24

6. Солкосерил Солко, Швейцария 18,69±1,70 0,26±0,02 84,34±8,27

Примечания: * — г белка на 1,0 л водной суспензии; ** у.о. — 1 условная единица соответствует 1 мкг инак-тивированного кристаллического трипсина.

Система протеиназ и ингибиторов представлена в организме животных большой группой белков. Ингибиторы протеолитических ферментов выполняют роль регуляторов оптимального уровня соответствующих ферментов в организме, находятся с последними в постоянном динамическом равновесии [17]. Нарушение баланса между ферментами и ингибиторами имеет значение для развития патологических процессов [18].

Проведенные нами исследования показывают, что в легких и сыворотке крови незараженных животных и куриных эмбрионах уровень протеиназной активности и ингибирующей протеиназу активности находятся в равновесии, которое нарушается при заражении вирусом гриппа А.

В инфекционном процессе наиболее глубокие изменения происходят в первые часы после заражения (рис. 2). Так, через 6 ч после заражения снижается количество протеиназы в легких и в сыворотке зараженных животных и возрастает ингибирую-щая активность [19]. Зараженные вирусом гриппа клетки индуцируют появление ингибитора протеиназ как в легочной ткани, так и в сыворотке крови. Следовательно, ингибиторы протеолиза в легких относятся к первой линии обороны органа при действии различных штаммов вируса гриппа.

а

Дни после заражения

б

IV

а

о

I—

Ю ^

х

ш

х

ге £ а.

ш ^

о о

1000

900

800

700 ♦

600

500

1 2 3 4 5

Дни после заражения

"Ингибитор протеиназы у незараженных мышей весом 7-9 г Ингибитор протеиназы у незараженных мышей весом 16-17 г Ингибитор протеиназы у зараженных мышей весом 7-9 г Ингибитор протеиназы у зараженных мышей весом 16-17 г

0

6

Рис. 2. Ингибирующая активность трипсиноподобной протеиназы в легких (а) и в сыворотке крови (б) белых мышей, зараженных вирусом гриппа A/PR/8/34

При изучении динамики протеиназной и ингибирующей активности в куриных эмбрионах под действием больших и малых заражающих доз вируса гриппа А/РЯ/8/34 установлено, что в них происходили изменения, подобные таковым в организме белых мышей (рис. 3). В период максимального накопления инфекционной и гемагглютини-рующей активности (24 часа) не обнаруживалась ни протеиназная, ни ингибирующая активность [20].

Из легких здоровых мышей было выделено, методом ионообменной хроматографии 6 изоформ трипсиноподобной протеиназы, а из легких зараженных мышей —

Ингибиторная активность (ИА) — 1 ед. равна 1 мг кристаллического трипсина. Активность протеиназы (А) — 1 ед. активности равна 1 мкг аргинина /мин.

Рис. 3. Изменение протеиназной и ингибирующей активности в куриных эмбрионах при большой заражающей дозе вируса гриппа A/PR/8/34

8 изоформ, у которых удельная протеолитическая активность резко возрастала по сравнению с исходным материалом (табл. 3). Полученные изоформы протеиназ обладали широкой субстратной специфичностью и были способны гидролизовать субстраты как природного, так и синтетического происхождения [21].

Концепция физиологического аутоиммунитета, разработанная школой А. А. Богомольца, видит в аутоантителах специфические регуляторы жизнедеятельности клеток

Таблица 3. Очистка на ДЭАЭ-целлюлозе трипсиноподобной протеиназы из легких незараженных мышей

Номера фракций Номера изоформ Удельная протеолити-ческая активность на мг белка % выхода протеиназы % очистки по белку

33 I 4,285 2,09 96,8

53 II 83,75 5,84 99,07

65 III 22,42 2,703 98,38

75 IV 40,00 6,279 97,92

121-130 V 32,6 136,74 99,98

161-189 VI 0,787 421,74 64,90

Таблица 4. Влияние антипротеиназных иммунных сывороток на выживаемость мышей при заражении летальной дозой вируса гриппа A/PR/8/34

№ гр. Изоформы протеиназ Группа сывороток Срок после заражения, сутки

6 ч 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 Выжило % выживаемости

1 I I 2/10 2/10 2/10 2/10 2 20

2 I II 2/10 2/10 4/10 2 20

3 II III 2/10 2/10 2/10 2/10 2 20

4 III IV 2/10 2/10 6 60

5 IV V 2/10 2/10 2/14 2 20

6 V VI 5/10 3/10 2/10 0 100

7 VI VII 7/10 1/10 1/10 1 10

6 Физ. раствор 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 10 100

7 Вирус без сыворотки 2/10 6/10 0 0

8 Нормальная крысиная сыворотка 2/10 3/10 5/10 0 0

9 Иммунная сыворотка г^гр. без вируса, токсичность 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 10 100

Примечание; числитель — число погибших мышей; знаменатель — число мышей в эксперименте.

в норме и при патологии. В русле этой концепции накоплены многочисленные данные об антителах (в том числе, естественных), способных регулировать активность ферментов, включая протеазы [22, 23]. Ввиду этого нами экспериментально изучена возможность получения иммунологических регуляторов протеиназной активности. Ко всем изоформам трипсиноподобных протеиназ были получены антипротеиназные гипериммунные крысиные сыворотки. При изучении защитных свойств антипротеиназных сывороток и преиммунной крысиной сыворотки на белых мышах, зараженных интра-назально, летальной дозой вируса гриппа А/PR/8/34 (IV пассаж), было установлено, что 100% гибель контрольных мышей наступала на 4-5 сутки (табл. 4). Животные, которым шесть раз закапывали нормальную крысиную сыворотку, погибали на 7-е сутки. При лечении мышей пулами иммунных сывороток I, II, IV, V и VI группы смертность животных снижалась и наступала существенно позже, чем в контрольной группе, 20% животных не погибало, а выздоравливало [24].

Наиболее эффективным явился четвертый пул иммунной сыворотки к Ш-й изо-форме, в присутствии которого выживало 60% зараженных мышей, и на 14 день после заражения в сыворотке крови и в легких мы не обнаруживали ни гемагглютинина, ни инфекционного вируса.

Иммунная сыворотка к VI-й изоформе вообще не защищала мышей от гибели, хотя Ш-я изоформа от VI-й отличалась только одним белком, с молекулярной массой 32 кДа [25].

Из легких здоровых мышей нами был выделен ингибитор трипсиноподобных про-теиназ с молекулярной массой 47,5 кДа, с высокой степенью чистоты и незначительным количеством примесей, причем была разработана и запатентована методика получения и очистки ингибитора трипсиноподобных протеиназ [26].

Выделенный ингибитор похож на а1-ингибитор протеиназ сыворотки крови человека (м.м. 48-55 кДа) и ингибитор трипсина из яичного белка (м.м. 49 кДа), но не похож на ингибитор трипсина, выделенный из легких крупного рогатого скота (ингибитор типа Кунитца—Нортропа), который имел молекулярную массу 65 кДа. При изучении его действия на протеолитическую активность изоформ трипсиноподобных протеиназ пробирочным методом выяснилось, что он подавлял активность почти всех изоформ, за исключением четвертой (41,8%) и восьмой (28,3%).

В наших исследованиях [27] при использовании клеточного ингибитора для подавления развития вируса гриппа в куриных эмбрионах установлено, что он подавлял развитие инфекционной и гемагглютинирующей активности и образование общего белка. В то же время, ингибитор трипсиноподобных протеиназ, выделенный из легких мышей, предварительно зараженных вирусом гриппа, не обладал данной способностью. В дальнейших исследованиях [28] для лечения гриппозной инфекции у животных мы использовали ингибитор, который выделяли из легких здоровых мышей. Введение этого ингибитора мышам, предварительно зараженным летальной дозой вируса гриппа, снижало процент гибели от этой болезни, по-видимому, при участии ряда механизмов: торможения расщепления гемагглютинина (НА) при репродукции вируса в легких, недопущения генерализации процесса, а также в результате предотвращения повышения протеолиза в легких, предупреждения альтерации аэрогематического барьера и усиления некоторых реакций местной защиты (табл. 5).

Для получения противовирусного препарата, который бы обладал наименьшей аллергенностью для человека, мы использовали отходы донорской крови, остающиеся при выделении гамма-глобулина и альбумина (рис. 4).

Таблица 5. Действие клеточного ингибитора трипсиноподобных протеиназ на выживаемость мышей, зараженных летальной дозой вируса гриппа А/PR/8/34

№ Название группы Кол-во животных в группе Доза вируса в группе Доза ингибитора на мышь по белку Кол-во животных % защищенных от вируса животных

пало выжило

1. Вирус гриппа 40 10-3 - 40 - 0

2. Вирус гриппа + трипсин кристаллический 40 10-3 18 мкг 40 - 0

3. Вирус гриппа + ингибитор из здоровых легких 40 10-3 18 мкг 7 33 82,5

4. Клеточный ингибитор 40 10-3 18 мкг - 40 100

5. Трипсин кристаллический 10 - 18 мкг - 10 100

6. Фосфатный буфер 10 - 0,2 мл - 10 100

Стадия I. Отмывка осадка II + III (осадок А) физиологическим раствором с

охлаждением и добавлением 15°-20° спирта.

4 \

центрифугат выбрасывается осадок Б

Стадия II. Выделение протромбина (осадок Б) добавлением буферного фосфатно-

уксусного раствора № 1 и № 2 и центрифугированием.

i V

центрифугат 1 осадок протромбина

Стадия III. Выделение профибринолизина с помощью охлажденного 95% этилового

спирта и центрифугированием.

i V

центрифугат 2 осадок профибринолизина

I

Стадия IV. Охлаждение гамма-глобулина с добавлением 5М раствора хлористого

натрия, 4,2% раствора бикарбоната натрия и охлажденного 95% этилового спирта.

центрифугат 3

осадок гамма-глобулина

Стадия V. Обработка осадка гамма-глобулина 0,1% раствором хлорида натрия.

Стадия VI. Стерильная фильтрация и розлив раствора гамма-глобулина.

I

Стадия VII. Контроль препарата.

Стадия VIII. Маркировка, упаковка.

Рис. 4. Схема технологического процесса выделения гамма-глобулина из донорской крови человека методом Кона

На первом этапе получения гамма-глобулина и альбумина из фракции 11+111 по Кону осаждается фибриноген, который утилизируется. По нашим исследованиям, отходы содержат 481,11 мг ингибитора трипсиноподобных протеиназ на килограмм веса. В этом центрифугате находится а1 — антитрипсин, который является основным

ингибитором сериновых протеиназ плазмы крови человека. На его долю в норме приходится 90% антитрипсиновой активности плазмы крови человека [29].

На второй стадии получения гамма-глобулина на утилизацию идет осадок, содержащий протромбин, а- и ß-глобулины и липиды. В этом осадке, по нашим результатам [30], содержится 469,87 мг ингибитора трипсиноподобных протеиназ на килограмм массы. В этот осадок входит антитромбин-3 (АТ-3) или фактор гепарина — регулятор свертывающей системы крови. По данным О. А. Маркова и соавт. [31], в норме содержание АТ-3 у доноров варьировалось от 160 до 250 мкг/мл. В зону а-глобулинов входит также а 1-антитрипсин и а 2-макроглобулин [31-33].

На третьей стадии получения гамма-глобулина в отходы идет осадок, содержащий профибринолизин (плазминоген). В отходах этой стадии, по нашим данным, содержание ингибитора трипсиноподобных протеиназ составляет 137,40 мг на килограмм массы.

На четвертой стадии при осаждении гамма-глобулина на утилизацию идет цен-трифугат № 3. По нашим данным, в материале центрифугата № 3 содержится 166,37 мг ингибитора трипсиноподобных протеиназ.

Таким образом, сырьем для получения ингибитора трипсиноподобных протеиназ могут служить отходы после первой и второй стадии технологического процесса, при которых идет отмывка осадка II+III и выделение протромбина. Эти отходы содержали самое большое количество ингибитора трипсиноподобных протеиназ.

Обсуждение. Эволюция создала механизм регуляции протеолиза в виде ингибиторов протеолиза (ИП), которые имеются даже у микроорганизмов [34]. Поэтому можно говорить о двух взаимозависимых системах регуляции — системе протеолиза и системе антипротеиназной защиты. В настоящее время установлено, что нарушение равновесия протеиназно-ингибиторной системы организма имеет огромное значение и ведет к развитию различных заболеваний: рак толстой кишки [35], цирроз печени [36], туберкулез легких [37], псориаз [38], доброкачественные и злокачественные новообразования [39], гломерулонефрит у детей [40], эмфизема легких [41-43] и др. Особенно важна роль подобного дисбаланса при вирусных инфекциях.

Данные, полученные на модели ряда вирусов, свидетельствуют о том, что механизм протеолитической активации имеет общебиологическое универсальное значение [44-48]. У вирусов гриппа и парамиксовирусов протеолитическая активация связана с расщеплением гликопротеидов, обусловливающих проникновение вируса в клетку. Ингибиторы блокируют процесс расщепления вирусных белков путем подавления активности клеточных энзимов. В присутствии ингибиторов клеточных протеиназ после одного цикла репродукции исходного вируса с расщепленными белками образуется вирусное потомство с нерасщепленными, функционально не активными вирусными белками. Дочерние вирионы не способны инициировать инфекционный процесс в связи с блоком ранних стадий цикла репродукции — адсорбции и проникновения вируса [49, 50].

Ингибиторы протеолиза применяются при многих заболеваниях. Так, арбидол подавляет репродукцию вируса ТОРС [51], осельтамивир, занамивир, апротинин — при гриппе [52-54], ингибитор вирусной протеазы блокирует созревание вирионов вируса иммунодефицита [55]. Новым подходом антивирусной стратегии к лечению СПИДа является ингибирование клеточных механизмов, вовлеченных в инфекционный процесс [56].

Ранее нами был разработан метод выделения ингибитора трипсиноподобных протеиназ из легких белых мышей [57]. Учитывая, что получение ингибитора из ткани легких мышей не может иметь промышленного значения, мы видоизменили метод и разработали новый способ получения ингибитора трипсиноподобных протеиназ из промышленных отходов сывороточного производства донорской крови человека для апробации его в качестве лечебного препарата [58].

В результате исследований мы пришли к следующим выводам:

1. Очистка и концентрирование вируса гриппа методом центрифугирования в градиенте сахарозы не освобождали вирус гриппа от белков с протеиназной активностью.

2. Протеиназа, ассоциированная с вирусом гриппа, является клеточным ферментом.

3. При заражении животных (белых мышей) вирусом гриппа А происходило нарушение ферментно-ингибиторного равновесия. Самые глубокие изменения происходили в первые часы после заражения.

4. Из легких незараженных мышей выделено шесть, а из зараженных вирусом гриппа — восемь изоформ протеиназ, которые имели высокую протеолитическую активность.

5. Получены гетерологичные антипротеиназные иммунные сыворотки ко всем изоформам трипсиноподобных протеиназ и установлено снижение летальности мышей, зараженных смертельной дозой вируса гриппа, на 60% только при действии антисывороток к третьей изоформе, выделенной из легких здоровых мышей.

6. Из легких здоровых мышей выделен ингибитор трипсиноподобных протеиназ, который блокировал развитие гриппозной инфекции у белых мышей в общей дозе 0,126 мкг/мышь.

7. Отходы производства донорских человеческих гамма-глобулина и альбумина могут служить сырьем для выделения ингибиторов протеиназ.

Таким образом, нами предложена новая концепция патогенеза гриппа, основанная на роли протеиназно-ингибиторной системы [5, 29]. Применение иммунологических и неиммунологических ингибиторов протеиназ оказывает лечебный эффект и снижает летальность от гриппа в эксперименте. С этим связан лечебно-профилактический потенциал разрабатываемой нами концепции.

Литература

1. Дiвоча В. П., Гоженко А. I., Михальчук В. Н., Кобрт Т. М. Протеолитична теорм патогенезу гри-пу та удосконалення його лжування // Загальна патолопя та патолопчна фiзiологiя 2011. Т. 6, № 4. С. 47-62.

2. Жанг Х., Чанг З. Протеиназа человека HtrA2: температурная зависимость протеиназной активности и структурные свойства // Биохимия. 2004. Т. 69, № 6. С. 843-850.

3. Бурцева Е. Н., Шевченко Е. С., Ленева И. А. и др. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 гг. // Вопр. вирусол. 2007. Т. 52, № 2. С. 24-29.

4. Савинова О. В., Павлова Н. И., Бореко Е. И. Индивидуальное и совместное применение новых производных бетулина и ремантадина для ингибирования репродукции вируса гриппа // Современные проблемы инфекционной патологии человека: сб. науч. тр. Вып. 1. Минск: Белпринт, 2008. С. 137-141.

5. Дивоча В. А., Михальчук В. Н., Гоженко А. И. и др. Трипсиноподобная протеиназа и ее ингибиторы в вакцинах и иммунобиологических препаратах крови // Журнал АМН Украши. 2009. Т. 15, № 3. С. 609-625.

6. Zhirnov O. P., Klenk H. D. Intracellular cleavage of human influenza a virus hemagglutinin аnd its inhibition // Virology. 2003. Vol. 31. P. 198-212.

7. Krauslich H.-G., Wimmer E. Kard viral protienases // Ann. Rev. Biochem. 1988. Vol. 57. Р. 701-754.

8. Ying C. Tian, Ding S. Shin. Cleavage of a viral polyprotein by a cellular proteolytic activity // J. Virol. 1986. Vol. 32. Р. 547-551.

9. Bosch F., Orlich M., Klenk H. D., Rott R. The structure of the hemagglutinin a determinant for the pathogenicity of influenza viruses // Virology. 1979. Vol. 95. Р. 197-207.

10. Жирное О. П., Сырцев В. В., Воробьева И. В., Klenk Н. D. Направленная модификация участков каспазного распределения в белках вируса гриппа // Вопросы вирусологии. 2008. № 6. С. 16-20.

11. Lowry O. H., Rosenbrough N. Y., Farr A. L., Randai R. Y. Protein measurement with the Folin phenol reagent // The Journal of Biological Chemisrty. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

12. Веремеенко К. Н. Ферменты в отоларингологии. Киев: Здоровье, 1980. 147 c.

13. Левицкий А. П. Методы определения ингибиторов трипсина // Биохимические методы исследования селекционного материала: сб. науч. работ. Вып. XV. Одесса, 1979. C. 68-73.

14. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage // Nature. 1970. T. 4, № 277. Р. 680-685.

15. Дивоча В. А., Дегтяренко В. И., Зеваков В. Ф. Клеточная протеаза вируса гриппа // Тезисы докладов 2-го съезда инфекционистов УССР. Киев, 1983. С. 36-38.

16. Дiвоча В. О. Вивчення протеолиично! активноси у процеа очищення вiрусу грипу шляхом центрифугування // Одеський медичний журнал. 2003. № 1. C. 16-19.

17. Жданов В. М., Гайдамович С. Я. Семейство Orthomyxoviridae // Частная вирусология: руководство. Т. 2. М., 1982. С. 139-185.

18. Зорин Н. А., Зорина В. Н. Роль белков семейства макроглобулинов в механизмах инфицирования // ЖМЭИ. 2004. Т. 3. С. 105-112.

19. Деребин П. Г., Кашина Э. Н., Носик Д. Н. и др. Противовирусная активность препаратов Фер-ровир и Деринап в отношении инфекции, вызванной патогенным вариантом вируса гриппа А птиц (H5N1) // Мед. каф. 2006. № 1. С. 62-65.

20. Дiвоча В. О. Змши у курячому ембрюш шд дieю вiрусу грипу // Одеський медичний журнал. 2000. № 2. С. 100-105.

21. Дiвоча В. О., Сова Ю. Г., Михальчук В. М. Видшення та очищення трипсиноподiбно'i протеази з легешв бших мишей // Медична хiмiя. 2001. Т. 3, № 3. С. 73-77.

22. Zaichik A. Sh., Churilov L. P., Utekhin V. J. Autoimmune regulation of genetically determined cell functions in health and disease // Pathophysiology. № 15(3). 2008. С. 191-207.

23. Ильчевич Н. В., Лисяный Н. И., Янчий Р. И. Антитела и регуляция функций организма. Киев: Наук. думка, 1986. 248 с.

24. Дивоча В. А., Сова Ю. Г., Микелашвили М. Т. Защитная роль антипротеазных иммунных сывороток при экспериментальном гриппе // Идеи И. И. Мечникова и развитие современного естествознания: науч. конф., 28-30 ноября 1995 г.: сб. науч. работ. Харьков, 1995. С. 102-103.

25. Дiвоча В. О., Сова Ю. Г., Михальчук В. М. Вивчення фiзико-хiмiчних властивостей iзофермен-тв трипсиноподiбних протеаз // Медична хiмiя. 2001. Т. 3, № 4. С. 31-34.

26. Дiвоча В. А. Споаб одержання шибиору трипсiноподiбних протеаз // Пат. 23548 А Укра'на, МПК6 А 61 К 35/00. Заявник та патентодержатель Дiвоча В. А. № 97052520; заявл. 30.05.97; опубл. 02.06.98.

27. Дiвоча В. О., Мiкелашвiлi М. Т., Михальчук В. М. Дiя шибиора трипсиноподiбних протеаз на грипозну шфекцш в експеримени // 1нфекцшш хвороби. 2001. № 2. С. 35-39.

28. Дiвоча В. А. 1нпбиор трипсiноподiбних протеаз як антивiрусний зааб // Пат. 37324 А Укра'на, МПК6 А 61 К 31/14. / опубл. 15.05.2001, Бюл. № 4.

29. Bin Goton, Tomohiko Ogasawara, Tetsuya Tojoda еt al. An endoprotease homologons to the blood clotting factor X as a determinant of viral tropism in chick embryon // J. EMBO. 1990. Vol. 9, N 12. P. 41894195.

30. Михальчук В. Н., Дiвоча В. П., Гоженко А. I. Наявшсть трипсиноподiбно'i протеази та п шибио-рiв у ввдходах отримання гамма-глобулшу // Медична хiмiя. 2006. Т. 8, № 1. С. 60-63.

31. Маркова О. А., Калашникова В. В., Хватова В. Б. Иммуноферментный метод определения антитромбина 3 // Вопросы медицинской химии. 1989. № 5. С. 127-130.

32. Подярене С. М., Лецкене М. Н., Маурицае М. М. и др. Иммуноаффинная очистка а! — ингибитора протеаз из плазмы крови человека // Вопр. вирусол. 1989. № 5. С. 96-99.

33. Дивоча В. А., Михальчук В. Н., Гоженко А. И. Молекулярно-биологическое обоснование анти-протеиназной терапии гриппа // Журнал АМН Укра'ни. 2009. Т. 15, № 1. С. 19-21.

34. Веремеенко К. Н., Голобородько О. П., Кизим А. И. Протеолиз в норме и при патологии. Киев: Здоровье, 1988. 200 с.

35. Воробьев П. А., Шилова А. Н., Ходоренко С. А. и др. Клинико-экономический анализ профилактического применения нефракционированного и низкомолекулярного гепаринов при хирургическом лечении онкологических больных. Сообщение 1. Критерии эффективности // Совр. онкология. 2002. Т. 4, № 2. С. 99-109.

36. Aoki N., Yamanaka T. The alpha2-plasmin inhibitor level sin liver diseases // Clin. Chim. Acta. 1978. Vol. 1, N 84. P. 99-105.

37. Esmedliaeva D. S., Titarenko O. T., Skvortsova L. A. et al. The activity of alpha2-macroglobulin and its forms in patients with destructive pulmonary tuberculosis // Probl. Tuberk. Bolezn. Legk. 2004. N 11. P. 40-43.

38. Chodorowska G., Wojnowska D., Juszkiewicz-Borowiec M. C-reactive protein and alpha2-macroglob-ulin plasma activity in medium-severe and severe psoriasis // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2004. Vol. 18, N 2. P. 180-183.

39. Alexandrakis M. G., Kyriakou D. S., Bouros D. et al. Interleukin-6 and its relationships to acute phase proteins in serous effusion differentiation // Oncol. Rep. 2001. Vol. 8, N 2. P. 415-420.

40. Lubec G., Weissenbacher G., Balzar E. Alpha-2-macroglobulin in children with glomerular diseases // Wien Klin. Wochenschr. 1977. Vol. 89, N 2. P. 49-53.

41. Fagerhol M. K. The incidence of alpha-antitrypsin variants in chronic obstructive pulmonary disease // Pulmonary emphysema and proteolysis / ed. by Ch. Mittman. N 4. London: Acad. Press, 1972. P. 51-54.

42. Glauser M. P. Alpha 1 antitrypsin deficiency. Physiopathological consequences // Schweiz. Med. Wochenschr. 1975. Vol. 105, N 31. P. 970-972.

43. Evald T., Dirksen A., Keittelmann S. et al. Pulmonary function and survival of patients with alpha 1-antitrypsin deficiency, residents of Copenhagen // Ugeskr. Laeger. 1990. Vol. 152, N 13. P. 909-912.

44. Sharp J. L. The current of a1-antitrypsin, a protease inhibitor in gastrointestinal disease // Gastroenterology. 1976. Vol. 70, N 4. P. 611-621.

45. Nagai Y., Klenk H.-D. Activation of precursors to both glycoproteins of Newcastle disease virus by proteolytic cleavage // Virology. 1977. Vol. 77. P. 125-134.

46. Ромоданов А. П., Веремеенко К. Н., Мельниченко В. А. Исследование протеолитических ферментов и их ингибиторов в крови и ликворе у больных с черепно-мозговой травмой // Вопросы нейрохирургии. 1972. № 6. C. 18-21.

47. Жирное О. П., Конакова Т. Е., Garten W., Klenk H.-D. Характеристика протеолитического нарезания нуклеокапсидного белка NP вирусов гриппа в зараженных клетках // Вопр. вирусологии. 1999. № 6. C. 275-279.

48. Rott R., Orlich M., Klenk H.-D., Wang M. L. et al. Studies on the adaptation of influenza viruses to MDCK cells // EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 3329-3332.

49. Cao Tin M., Sung Michael T. A protamine — line domain in basic adenovirus core protein // Biochem. and Biophys. Res. Commun.1988. Vol. 108, N 3. P. 1061-1066.

50. Scheid A., Choppin P. W. Activation of cell fusion and infectivity by proteolytic cleavage of a Sendai virus glycoprotein // Proteasis and Biological Control / eds E. Reich, R. D. Ritkin and E. Shaw. Cold Spring Harbor. 1975. N 4. P. 645-659.

51. Хамитов Р. А., Логинова С. Я., Щукина В. Н. и др. Противовирусная активность арбидола и его производных в отношении возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома в культурах клеток // Вопросы вирусологии. 2008. Т. 53, № 4. С. 9-13.

52. Дерябин П. Г., Галегов Г. А., Ботиков А. Г., Бурцева Е. И. и др. Действие субстанции занамивир на инфекцию, вызванную высоковирулентным вирусом гриппа птиц a/h5n1 в культурах клеток // Вопросы вирусологии. 2011. Т. 56, № 1. С. 21-24.

53. Жирнов О. П., Малышев Н. А. Апротинин, ингибитор протеаз — новая альтернатива в лечении гриппа // Российский медицинский журнал. 2012. № 2. С. 52-56.

54. Жирнов О. П., Klenk H. D. Ингибирование репродукции пандемического вируса гриппа H1N1 апротинином // Вопросы вирусологии. 2011. № 3. С. 24-28.

55. Букринская А. Г. и др. Ступени созревания вируса иммунодефицита человека и роль протеоли-за // Вопросы вирусологии. 2010. Т. 55, № 1. С. 10-15.

56. Букринская А. Г. Роль клеточных белков в жизненном цикле вируса иммунодефицита человека // Вопросы вирусологии. 2009. № 1. С. 4-6.

57. Патент 23548 А Украша, МПК6 А 61 К 35/00. Споаб одержання шибиору трипсiноподiбних протеаз / Дiвоча В. А.; заявник та патентодержатель Дiвоча В. А. — № 97052520; заявл. 30.05.97; опубл.02.06.98.

58. Патент 21599 Украша, МПК (2006), А 61 К 36/00. Споаб видшення шпбиора трипсиноподiбних протеаз iз вiдходiв одержання гаммаглобулшу та альбумшу донорсько! кровi людини / Дiвоча В. П., Михальчук В. М., Гоженко А. I.; заявник та патентодержатель Дiвоча В. П., Михальчук В. М., Гожен-ко А. I. — № u 200611233; заявл. 25.10.2006; опубл. 15.03.2007, Бюл. № 3.

Статья поступила в редакцию 19 февраля 2013 г.