СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ СИНТЕЗА ЦЕФАЛОСПОРИНОВ-КИСЛОТ
METHOD OF PRODUCING BIOCATALYST EXHIBITING CEPHALOSPORIN ACID SYNTHESIS ACTIVITY

Заявляемое изобретение относится к получению гетерогенных биокатализаторов (БК) на основе бактериальных клеток, а именно биокатализатора на основе клеток Esherichia coli, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот.
1
1
Известен способ иммобилизации клеток E.coli, обладающих пенициллинацилазной активностью, состоящий во включении сшитых глутаровым альдегидом клеток со специально повышенной проницаемостью клеточных стенок в пористые сферические шарики полиакриламидного геля [1]. При получении шариков геля полимеризацию инициируют окислительно-восстановительной парой, в которой катализатором процесса служит N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, а инициатором - персульфат аммония [2]. Получают биокатализатор, предназначенный для ферментативного гидролитического расщепления бензилпенициллина (БП) с целью производства 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Его ферментативная активность по гидролизу БП очень низка - менее 8 МЕ/г ( За международную единицу (ME) ферментативной активности препарата в отношении какой-либо биокаталитической трансформации принимают такое количество этого препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата (или образование 1 мкмоля продукта) в выбранных условиях за 1 минуту).
Известен способ иммобилизации микробных клеток, в том числе клеток E.coli, путем их ковалентного присоединения к активным группам сшитых полимеров (гелей), получаемых путем сополимеризации различных мономеров, в основном акрилатной природы [3]. При этом клетки приводят в контакт либо с уже готовым полимером, либо с мономерами, которые затем подвергают полимеризации. До контакта с полимером или мономерами клетки могут быть обработаны полифункциональным сшивающим агентом, в том числе глутаровым альдегидом. Полимеризацию мономеров инициируют парой бета-диметиламинопропионитрил - персульфат аммония. Данный патент не содержит примеров получения биокатализатора на основе клеток E.coli, однако описаны способы иммобилизации клеток Proteus rettgeri, содержащих пенициллинацилазу, с целью получения биокатализаторов для получения 6-АПК ферментативным гидролизом БП. Даже лучший из описанных биокатализаторов обладает очень низкой операционной стабильностью, характеризующейся двукратным падением активности за 20 циклов использования в процессе гидролиза БП, что соответствует 60 часам.
БМК
Наиболее близким к заявляемому способу получения биокатализатора на основе иммобилизованных клеток E.coli является способ получения биокатализатора для гидролитического расщепления БП, осуществляемый путем включения в полиакриламидный гель клеток E.coli, содержащих пенициллинамидазу (пенициллинамидогидролазу) [4]. Согласно ближайшему аналогу процедура получения биокатализатора состоит в следующем. Глубинное культивирование штамма E.coli АТСС 9637 осуществляют при 30°C на среде, содержащей органические источники углерода и азота, а также неорганические соли. Процесс биосинтеза проводят в течение 24 часов; использование каких-либо специальных критериев для выбора момента остановки биосинтеза не описано. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля (акриламид и N,N'-метиленбисакриламид) и проводят процесс гелеобразования, добавляя в реакционную смесь катализатор полимеризации (бета-диметиламинопропионитрил) и ее инициатор (персульфат калия). Биомассу клеток используют в количестве, необходимом для создания ее концентрации в полимеризационной смеси (п.см) С=33 мг сух./г п.см. Полученный гель измельчают и промывают.
Основными недостатками способа согласно ближайшему аналогу являются отсутствие ковалентной фиксации клеток при иммобилизации, влекущее за собой возможность загрязнения целевого продукта ферментативной трансформации примесями органической природы, в первую очередь белками, вымываемыми из биокатализатора, а также низкая активность иммобилизованных по этому способу клеток. Так, биокатализатор, получаемый согласно ближайшему аналогу, в отношении гидролиза БП имеет активность лишь 22 МЕ/г; его активность в отношении синтеза бета-лактамных антибиотиков, в частности в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, не контролировалась.
Воспроизведение способа иммобилизации клеток согласно ближайшему аналогу (Пример 3) с использованием штамма E.coli VKPM В-10182, продуцирующего синтетазу цефалоспоринов-кислот, позволило получить биокатализатор, обладающий активностью по синтезу цефазолина около 40 МЕ/г влажн. (300 МЕ/г сух.) при выходе активности процесса иммобилизации 50%. Низкая активность такого биокатализатора не позволяет использовать его для синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторе периодического действия с перемешиванием. Так, для процесса синтеза цефазолина в таком реакторе необходим биокатализатор с активностью не ниже 60 МЕ/г влажн., 330 МЕ/г сух. Стабильность биокатализатора, полученного согласно прототипу, тоже низка. В условиях ускоренной инактивации (40°C, рН 6,5) период его полуинактивации составляет всего 20 часов, что является результатом не только термической инактивации фермента, но и его физического вымывания из гелевой матрицы. Потери синтетазной активности при однократной промывке биокатализатора 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 в мягких условиях (1 г влажного БК в 3 мл буфера, 20°C, 1 час) составляют около 30%. Наблюдается вымывание белка в надосадочную жидкость в количестве 5 мг с 1 г БК. Неизбежное загрязнение целевого продукта процесса биокаталитической трансформации веществами белковой природы делает невозможным использование такого биокатализатора для производства антибиотиков.
Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа получения биокатализатора на основе клеток Escherichia coli, иммобилизованных в полиакриламидном геле, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, характеризующегося высокими активностью и стабильностью и не содержащего слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.
Поставленную задачу решают путем совокупного использования в процессе получения биокатализатора ряда приемов, осуществляемых в выбранных оптимизированных условиях.
расп
Согласно заявляемому способу исходным материалом для получения биокатализатора служит штамм E.coli, продуцирующий фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот. Культивирование данного продуцента осуществляют на жидкой ферментационной среде, содержащей органические источники углерода и азота. В качестве критерия остановки процесса используют константу распределения целевого фермента между биомассой клеток (БМК) и внешним раствором К, характеризующую прочность связывания фермента с клеточными структурами. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля, модифицируют глутаровым альдегидом, а затем добавляют инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты. Внесение в реакционную смесь катализатора полимеризации не требуется. Полученный гель измельчают и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ (белки, мономеры).
расп
paсп
расп
расп
Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот останавливают в фазе стационарного роста клеток E.coli при константе распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот К≥350 и значении рН культуральной жидкости 7,9÷8,2. Временные рамки наступления выбранного оптимального для иммобилизации состояния клеток могут сдвигаться в зависимости от используемого штамма E.coli, что влияет на продолжительность биосинтеза (см. Таблицу 1 в Примере 4). Получаемые в выбранных условиях клетки сочетают высокую активность по целевому ферменту (не менее 1600 МЕ/г сух.) и прочное связывание синтетазы цефалоспоринов-кислот клеточными структурами, остающимися в стационарной фазе интактными. Сохранение естественного клеточного микроокружения целевого фермента предохраняет его от неблагоприятных воздействий процессов иммобилизации и последующей эксплуатации биокатализатора, поэтому иммобилизация клеток E.coli с K≥350 обеспечивает получение биокатализатора с высокой активностью по синтезу цефалоспоринов-кислот и хорошей стабильностью. При рН культуральной жидкости ниже 7,9 синтетаза цефалоспоринов-кислот прочно связана с клеточными структурами (K≥350), однако использование таких клеток для иммобилизации нецелесообразно из-за недостаточно высокой активности получаемой биомассы клеток. Использование для иммобилизации клеток со слабо связанным целевым ферментом (К<350, рН>8,2), находящихся в состоянии ограниченного цитолиза (разрушение цитоплазмы клеток) или следующего за ним автолиза (разрушение цитоплазмы и клеточных мембран), приводит к снижению стабильности биокатализатора, а также потерям активности в процессе иммобилизации (Пример 5).
БМК
п.см
Использование высоких концентраций биомассы клеток (густоты клеточной суспензии) C=100÷150 мг сух./г п.см. (в 3-5 раз выше, чем в методе согласно ближайшему аналогу) позволяет получать высокоактивный биокатализатор, благодаря введению в полимеризационную смесь большого количества активных клеток. Последующая модификация глутаровым альдегидом предотвращает их вымывание из геля в процессе получения и отмывки биокатализатора. Верхний предел густоты клеточной суспензии (150 мг сух./г п.см.) ограничен возможностью внесения в полимеризационную смесь влажной БМК с содержание сухих веществ 20-23% в количестве не более 70% от ее общего веса (W). Использование густоты суспензии менее 100 мг сух./г п.см. не обеспечивает получение биокатализатора с достаточно высокой активностью (см. Таблицу 2 в Примере 6).
ГА
мод=
-3
-3
-3
-3
Модификация клеток глутаровым альдегидом при осуществлении заявляемого способа имеет два положительных последствия. Во-первых, это приводит к необратимой фиксации в биокатализаторе белкового содержимого клеток, включая целевой фермент. Результатом являются повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток, а также отсутствие вымывания белков из готового биокатализатора. Во-вторых, промежуточные продукты взаимодействия глутарового альдегида с белками выступают катализаторами процесса полимеризации мономеров полиакриламидного геля, что делает ненужным внесение в реакционную смесь обычно используемых для этой цели веществ (бета-диметиламинопропионитрил или N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин). Возможность такой замены была продемонстрирована ранее при иммобилизации свободных белков в акрилатных гелях [5]. Согласно заявляемому способу глутаровый альдегид используют в относительной концентрации С=1·10÷9·10 ммоль/мг белка, проводя модификацию в течение τ5÷30 мин. Использование модификатора в концентрации выше 9·10 ммоль/мг белка приводит к получению недостаточно активного биокатализатора, а при концентрации глутарового альдегида ниже 1·10 ммоль/мг белка и/или времени модификации меньше 5 мин снижается стабильность биокатализатора и возникает возможность вымывания из него белков. При времени модификации глутаровым альдегидом больше 30 мин в реакционной смеси снижается концентрация промежуточных продуктов взаимодействия белков с глутаровым альдегидом, являющихся катализаторами полимеризации акрилатных мономеров, поэтому последующий процесс гелеобразования протекает медленно, а механические свойства получаемого биокатализатора ухудшаются (см. Таблицу 3 в Примере 7).
Способ в общем виде
расп
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот осуществляют путем культивирования штамма E.coli, продуцирующего соответствующий фермент, на жидкой ферментационной среде следующего состава (мас.%): кукурузный экстракт (2% по сухому весу) и тиофен-2-уксусная кислота (0,1%). Ферментацию останавливают при константе связывания целевого фермента К≥350 и значении рН культуральной жидкости в диапазоне 7,9÷8,2. Выращенную клеточную биомассу отделяют центрифугированием (5-8 тыс. об/мин), промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 и вновь отделяют центрифугированием в тех же условиях. Осадок, представляющий собой биомассу клеток (БМК), используют для иммобилизации путем включения модифицированных клеток в полиакриламидный гель, получаемый сополимеризацией акриламида (АА) и N.N'-метилен-бис-акриламида (БИС).
БМК
мoн
ГА
мод
1/2
-3
-3
Биомассу клеток, взятую из расчета С=100÷150 мг сух./г п.см., суспендируют в фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем мономеры полиакриламидного геля в весовом соотношении АА:БИС=20:1 при общей их концентрации в полимеризационной смеси C=9%. При постоянном перемешивании и охлаждении клеточной суспензии на ледяной бане проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации C=1·10÷9·10 ммоль/мг белка, содержащимся в клетках. Время модификации глутаровым альдегидом τ=5÷30 мин. По окончании модификации в реакционную смесь вносят инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты, например персульфат аммония или персульфат калия, в концентрации, необходимой для осуществления гелеобразования в течение 20-120 сек. Полученный блок геля выдерживают на холоду еще 20-30 мин, а затем измельчают, дважды продавливая сквозь металлическое сито с размером ячеек 0,5 мм, и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ. Иммобилизованные клетки отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией на пористом стеклянном фильтре. Получают биокатализатор с активностью в отношении синтеза цефазолина не менее 100 МЕ/г влажн., 600 МЕ/г сух., периодом полуинактивации (τ) не менее 800 часов (40°C и рН 6,5). Биокатализатор устойчив в отношении вымывания из него веществ белковой природы и может быть использован в процессах синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторах периодического действия с перемешиванием.
Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот (Примеры 1, 2, 6, 7), имеет ряд преимуществ по сравнению с контролем - способом, выполненным согласно ближайшему аналогу и осуществленным с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182 (Пример 3):
- повышение активности получаемого биокатализатора в отношении синтеза цефазолина в 2-3 раза (600÷950 МЕ/г сух. по заявляемому способу и 300 МЕ/г сух. согласно контролю);
1/2
1/2
- повышение стабильности получаемого биокатализатора в условиях ускоренной инактивации не менее чем в 40 раз (τ=800-2000 час по заявляемому способу и τ=20 час согласно контролю);
- отсутствие вымывания целевого фермента и других белков из биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу, в отличие от биокатализатора, полученного согласно ближайшему аналогу.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами осуществления способа получения биокатализатора с использованием двух штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот, а именно VKPM В-10182 из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) и CGMCC No.3508 из Китайской Коллекции Культур Микроорганизмов (CGMCC).
Во всех приведенных примерах приведена активность ферментных препаратов по синтезу цефалоспорина-кислоты цефазолина из 3-метил-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) и метилового эфира 1(Н)-теразолилуксусной кислоты (МЭТЗУК). Ее определяют по начальной скорости образования цефазолина в следующих условиях: рН 7,5, температура (30±1)°C, концентрации субстратов - (0,059±0,002) моль/л ММТД-7-АЦК и (0,23 6±0,004) моль/л МЭТЗУК. Содержание цефазолина в реакционной смеси определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Содержание сухих веществ в биомассе клеток и биокатализаторах определяют весовым методом после высушивания препарата при (105±1)°C до постоянной массы.
расп
БМК
р-р
расп
БМК
р-р
Константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот (К) между биомассой клеток и внешним раствором определяют путем анализа ферментативной активности биомассы клеток (А, МЕ/г влажн.) и надосадочной жидкости (А, МЕ/мл) после суспендирования 1 г влажной БМК в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,5 и рассчитывают по формуле: К=А/А.
1/2
Содержание белка в биомассе клеток и растворах определяют методом Лоури [6]. За динамикой инактивации биокатализаторов следят, контролируя их остаточную активность после инкубации в течение различного времени в условиях ускоренной инактивации при 40°C и рН 6,5 в 0,1 М фосфатном буфере. Стабильность образцов характеризуют по времени их полуинактивации в данных условиях (τ, час).
Потери белков и целевого фермента при промывке биокатализаторов контролируют путем определения содержание белков и определения синтетазной активности в надосадочной жидкости после суспендирования 1 г влажного биокатализатора в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,5 в течение 1 часа при 20°C.
Пример 1. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli VKPM В-10182 проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих по 100 мл ферментационной среды следующего состава:
- кукурузный экстракт - 2% (на сухой вес)
- тиофен-2-уксусная кислота - 0,1%
- вода водопроводная - до нужного объема.
рН после стерилизации 6,9-7,1.
расп
Культивирование продуцента фермента ведут при температуре 25-26°C на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот проводят в течение 18 часов и останавливают при рН 8,1, К=380. Выращенную биомассу клеток отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге с охлаждением, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5 и повторно отделяют центрифугированием в тех же условиях.
С 3,70 л культуральной жидкости получают 46,6 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:
БМК
- синтетазная активность (А) - 460 МЕ/г влажн.; 2009 МЕ/г сух.;
БМК
- содержание сухих веществ (β) - 22,9%;
- содержание белка - 114 мг/г влажн.
Полученную биомассу клеток E.coli, штамм VKPM В-10182, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.
Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:
п. см
БМК
ГА
мод
мон
-3
W=7,0 г; С=37 мг сух./г п.см; С=1,7·10 ммоль/мг белка; τ=15 мин; С=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.
Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,2 г влажной биомассы клеток суспендируют в 1,4 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,32 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 30 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.
Получают 7,01 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
БК
- синтетазная активность (А) - 165 МЕ/г влажн.; 900 МЕ/г сух.;
БК
- содержание сухих веществ (β) - 18,3%;
1/2
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ) - 1200 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 59,9%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- синтетазная активность - не обнаружено
- белок - не обнаружено.
Пример 2. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры Е. соli, штамм CGMCC No.3508
расп
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм CGMCC No.3508, осуществляют, как описано в примере 1 для штамма E.coli VKPM В-10182, с той лишь разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 16 часов и останавливают при рН 8,05, К=370. Выращенную биомассу клеток отделяют и отмывают в соответствии с описанием, приведенным в примере 1.
С 1,2 л культуральной жидкости получают 13,1 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:
БМК
- синтетазная активность (А) - 380 ME/г влажн.; 1820 МЕ/г сух.;
БМК
- содержание сухих веществ (β) - 23,0%;
- содержание белка - 90 мг/г влажн.
Полученную биомассу клеток E.coli, штамм CGMCC No.3508, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.
Иммобилизацию проводят в следующих условиях:
п.cм
БМК
ГА
мод
мон
-3
W=7,0 г; С=145 мг сух./г п.см; С=5,0·10 ммоль/мг белка; τ=10 мин; С=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.
Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,4 г влажной биомассы клеток суспендируют в 0,7 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,79 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 10 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 20 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.
Получают 6,95 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
БК
- синтетазная активность (А) - 150 МЕ/г влажн.; 840 МЕ/г сух.;
БК
- содержание сухих веществ (β) - 17,8%;
1/2
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ) - 1250 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 62,4%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- синтетазная активность - не обнаружено
- белок - не обнаружено.
Пример 3. Осуществление способа получения биокатализатора согласно ближайшему аналогу с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182, (контроль)
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм VKPM В-10182, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1. Полученную биомассу клеток, охарактеризованную в примере 1, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель согласно процедуре, описанной в ближайшем аналоге.
Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:
п.см
БМК
мон
W=7,0 г; С=33 мг сух./г п.см; С=12,7%; катализатор полимеризации бета-диметиламинопропионитрил - 0,36%; инициатор полимеризации персульфат калия - 0,07%.
1,0 г влажной биомассы клеток суспендируют в 4,0 мл 0,9% раствора хлористого натра, затем растворяют в этой суспензии 0,75 г акриламида и 0,40 г N,N'-метилен-бис-акриламида (АА:БИС=18:1). Последовательно вносят по 0,5 мл 5% раствора бета-диметиламинопропионитрила и 1% раствора персульфата калия. Образовавшийся гель выдерживают 20 минут, затем измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают 0,9% раствора хлористого натра.
Получают 6,20 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
БК
- синтетазная активность (А) - 38 МЕ/г влажн.; 300 МЕ/г сух.;
БК
- содержание сухих веществ (β) - 12,7%;
1/2
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ) - 20 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 51,4%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- смыв синтетазной активности - 11 ME с 1 г БК (29% от исходной активности БК)
- смыв белка - 5 мг белка с 1 г БК.
Пример 4. Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli
расп.
расп
БМК
Культивирования продуцента E.coli, штамм VKPM В-10182 или CGMCC No.3508, осуществляют в колбах Эрленмейера в условиях согласно примеру 1. По ходу процесса выводят из опыта по две колбы, объединяют содержащуюся в них культуральную жидкость, контролируют в ней значение рН, а затем отделяют биомассу клеток центрифугированием и промывают ее 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5, используемым в количестве 5 мл на 1 г БМК. Анализируют промывные воды и полученную биомассу клеток и рассчитывают константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот КПолученные данные о взаимосвязи рН культуральной жидкости, К и активности получаемой биомассы клеток (А, МЕ/г сух.) представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот
Время, час
E.coli VKPM B-10182
E.coli CGMCC No.3508
pH
А<sub>БМК</sub>, МЕ/г сух.
К<sub>расп</sub>
pH
А<sub>БМК</sub>, МЕ/г сух.
К<sub>расп</sub>
10
7,61
1490
350
7,55
1250
390
12
7,75
1640
360
7,65
1360
380
14
7,80
1770
370
7,95
1620
410
16
7,92
2140
350
8,05
1840
370
17
8,04
2180
360
8,10
1670
360
18
8,11
2000
380
8,18
1700
400
19
8,13
2060
420
8,28
1650
340
20
8,17
1980
420
8,38
1590
320
21
8,25
1990
340
22
8,32
1980
330
23
8,46
1855
300
24
8,58
1666
290
25
8,70
1600
270
26
8,95
1540
190
Пример 5. Использование для иммобилизации клеток со слабосвязанным целевым ферментом
pacп
Культивирование продуцента синтетазы цефалоспоринов-кислот, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1, с той разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 22,5 часов и останавливают при pH 8,38, K=320.
С 0,70 л культуральной жидкости получают 8,1 г влажной биомассы клеток E.coli VKPM В-10182, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:
- синтетазная активность - 440 МЕ/г влажн.; 1900 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ - 23,2%;
- содержание белка - 95 мг/г влажн.
Полученную биомассу клеток используют для иммобилизации в полиакриламидном геле, осуществляемой в условиях согласно Примеру 1.
Получают 6,91 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
БК
- синтетазная активность (А) - 113 МЕ/г влажн.; 750 МЕ/г сух.;
БК
- содержание сухих веществ (β) - 15,1%;
1/2
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ) - 750 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 42,2%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- синтетазная активность - не обнаружено
- белок - не обнаружено.
Пример 6. Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатора
Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя содержание биомассы клеток в полимеризационной смеси (густоту клеточной суспензии) при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера. Для инициирования полимеризации используют различные соли надсерной кислоты. Свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 2.
Таблица 2
Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатора
№
С<sub>БМК</sub>, мг сух./г п.см.
Инициатор полимеризации
β<sub>БК</sub>, %
А<sub>БК</sub>
τ<sub>1/2</sub>, час
МЕ/г влажн.
МЕ/г сух.
1
75
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>S<sub>2</sub>O<sub>8</sub>
13,0
63
485
-
2
100
K<sub>2</sub>S<sub>2</sub>O<sub>8</sub>
16,1
108
670
1100
3 (Пример 1)
137
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>S<sub>2</sub>O<sub>8</sub>
18,3
165
900
1200
4
150
Na<sub>2</sub>S<sub>2</sub>O<sub>8</sub>
19,4
185
950
1340
Пример 7. Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатора
полим
Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя время модификации клеток глутаровым альдегидом, а также его относительную концентрацию (при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера). Времена гелеобразования (полимеризации, τ, сек) и свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 3.
Таблица 3
Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатора
№
С<sub>ГА</sub>, ммоль/мг белка
τ<sub>мод</sub>, мин
τ<sub>полим</sub>, сек
β<sub>БК</sub>, %
А<sub>БК</sub>
τ<sub>1/2</sub>, час
Смыв с 1 г БК
МЕ/г влажн.
МЕ/г сух.
ME
мг белка
1
0,5·10<sup>-3</sup>
15
60
14,1
121
870
500
0,26
0,15
2
1,0·10<sup>-3</sup>
30
120
17,0
150
880
810
нет
нет
3
1,7·10<sup>-3</sup>
1
45
13,8
130
950
620
0,2
0,1
4 (Пример 1)
1,7·10<sup>-3</sup>
15
30
18,3
165
900
1200
нет
нет
5
1,7·10<sup>-3</sup>
45
600 (слабый гель)
6,8
52
760
-
-
-
6
9,0·10<sup>-3</sup>
5
90
19,1
118
620
2000
нет
нет
7
14,0·10<sup>-3</sup>
15
60
18,7
95
510
2200
нет
нет
Таким образом, разработан способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, на основе клеток E.coli, иммобилизованных в полиакриламиднрм геле. Способ позволяет получать стабильный биокатализатор с активностью не менее 600 МЕ/г сух., не содержащий слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.
Особенностями способа являются:
- использование штаммов культуры E.coli, продуцирующих фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот;
расп
- выбор момента остановки культивирования продуцента при К не менее 350 и значении рН в диапазоне 7,9÷8,2;
- проведение модификации клеток, суспендированных в растворе мономеров полиакриламидного геля, глутаровым альдегидом в оптимизированных условиях, обеспечивающих фиксацию клеточных белков в биокатализаторе, а также участие промежуточных продуктов взаимодействия глутарового альдегида с белками в процессе гелеобразования в качестве катализатора полимеризации мономеров.
Источники информации
1. Prubhune A.A., Rao B.S., Pandle A.V., SivaRaman H.: Immobilization of permeabilized Escherochia coli cells with penicillin acylase activity. Enzyme Microb Technol. 14: 161-163 (1992).
2. Pandle A., Prubhune A., SivaRaman H.: Immobilization of Saccharomyces uvarum cells in porous beads of polyacrylamide gel for ethanolic fermentation. Appi Microbiol Biotechnol 29:426-429 (1988).
3. US3957580 "Immobilized microbial cells"; SU608495 «Способ иммобилизации микробных клеток».
4. Sato Т., Tosa Т., Chibata I.: Continous production of 6-Aminopenicillanic acid from Penicillin by immobilized microbial cells. European J Appi Microbiol 2:153-160 (1976).
5. RU 1389296 «Способ получения биологически активных веществ, иммобилизованных в акрилатных гелях».
6. Sapan C.V., Lundblad R.L., Price С.: Review. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appi Biochem 29: 99-108 (1999).