Способ дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита с использованием раман-флюоресцентной спектроскопии
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF FORMS OF CHRONIC TONSILLITIS USING RAMAN-FLUORESCENCE SPECTROSCOPY

Изобретение относится к медицине: к оториноларингологии, и может быть использовано при проведении дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита. Способ экспресс-диагностики с использованием раман-флюоресцентных медицинских технологий заключается в применении лазерного излучения различных длин волн (405 нм, 532 нм) для регистрации метаболических, морфометрических и функциональных показателей ткани небных миндалин в норме и при патологии. Лазерное излучение, при взаимодействии с тканью, конвертируется в другие его виды и несет всю информацию об изучаемом биологическом объекте в динамике и со «скоростью света». Эффект Рамана (комбинационного рассеяния света) позволяет регистрировать изменения, происходящие в ткани на молекулярном уровне и может применяться для проведения диагностики воспалительного процесса в глотке. Данный эффект может быть использован для повышения эффективности диагностики воспалительных заболеваний глотки; для проведения ускоренной идентификации формы хронического тонзиллита.
Способ направлен на проведение качественной, высокочувствительной, высокоспецифичной, точной, малоинвазивной экспресс-диагностики хронического тонзиллита, как in vitro, так и in vivo.
Способ по изобретению позволяет с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью (близкой к 100%) охарактеризовать физиологические изменения, происходящие в ткани при воспалении и зарегистрировать структурные ее особенности, а также наличие определенных метаболитов в ней с целью немедленной (быстрой)  диагностики и ранней идентификации патологического процесса (для проведения профилактических мер, использования данного метода в качестве скринингового, а также проведения мониторинга лечения и его коррекции на различных этапах патологического процесса).
На сегодняшний день известно множество способов диагностики хронического тонзиллита. Основным недостатком каждого из них является относительно невысокая специфичность, чувствительность применяемой методики.
Известен также способ диагностики различных форм хронического тонзиллита (Брудастов Ю.А., Гончар-Зайкин А.П., Дюков Л.А., Рязанов В.Д., Шульга И.А., 2009, патент №2429477). Сущность данного способа заключается в том, что у пациента определяют комплекс показателей микробиоценоза кишечника: содержание бифидобактерий, лактобактерий, кишечной палочки с нормальными свойствами, кишечной палочки с гемолитическими свойствами, кишечной палочки с лактозонегативными свойствами, энтерококков, сапрофитных стафилококков, золотистого стафилококка, грибов рода Сапсиеа, сопоставляя их с показателями относительной нормы по балльной шкале. Рассчитывают индекс дисбиоза по специальной формуле. По индексу дисбиоза судят о форме хронического тонзиллита: компенсированной либо декомпенсированной.
Недостатком указанного способа является то, что о форме хронического тонзиллита можно судить косвенно, на основе функции кишечника. Кроме того, способ является довольно трудоемким в выполнении и длительным.
Также известен способ диагностики хронического тонзиллита (патент 2004134651/14, Ливенец В.П., 2006). Способ заключается в регистрации активного сопротивления и электрического параметра с поверхности небных миндалин, по которому проводят диагностику формы хронического тонзиллита. Способ позволяет исследовать функциональное состояние ткани миндалин. Основным недостатком является сложностьвыполнения техники; также чувствительность и специфичность данной методики значительно уступают таковым при использовании метода раман-флюоресцентной спектроскопии.
Известен способ диагностики хронического тонзиллита, основанный на измерении изменений импеданса сосудистой системы в области небных миндалин (реотонзиллография) (RU 2014103 С1 от 15.06.94). В данном случае электроды накладываются на кожу в зачелюстной области в проекции небных миндалин и на твердое небо по средней линии, записывается реограмма и по величине реографического индекса определяют степень выраженности хронического тонзиллита и тактику лечения. Недостатками этого способа является опосредованное измерение импеданса, на который могут оказывать влияние пульсация со стороны близлежащих крупных сосудов. Использование одного параметра, характерного для функциональных нарушений в небных миндалинах при хроническом тонзиллите, а именно снижения кровоснабжения небных миндалин, может косвенно свидетельствовать о нарушении функции небных миндалин частично либо полностью.
Расположение электродов непосредственно на небных миндалинах при реографии не получило распространения из-за трудоемкости процесса и необходимости длительной их фиксации, необходимой для записи реограммы.
Известен способ измерения электрического параметра непосредственно слизистой оболочки небных миндалин с помощью посеребренных электродов. В данном случае проводится исследование функционального состояния ткани миндалин с целью качественной ее оценки.  Существенным свойством данного способа является то, что накладывают пассивный электрод под язык по средней линии, а активный поочередно на поверхность правой и левой небной миндалины и производится измерение электрического параметра. При этой методике производится исследованиеактивного сопротивления при расположении пассивного электрода под языком по средней линии, а активного поочередно на поверхности правой, затем левой небной миндалин. При этом происходит исключение влияния изменений на кожных покровах и в сосудисто-нервном пучке, проходящем в непосредственной близости с небными миндалинами. Также импеданс определяется на частотах 1 кГц и 100 кГц.
Значения активного сопротивления определяются и отображаются на цифровом индикаторе. Используются электроды, изготовленные из латуни с посеребрением и регистрирующий блок, определяющий активное биологическое сопротивление. К описанным в литературе недостаткам относятся небольшие чувствительность и специфичность метода, невозможность применения у пациентов с изменениями реологии крови (О.Я. Плепис. Реография в оториноларингологии. - Л.: Медицина, 1988. С. 50-62.; руководство по оториноларингологии. // Под ред. И.Б. Солдатова. М.: Медицина, 1994. 574 с; патент 1Ш 2014103 С1 от 15.06.94. Способ диагностики хронического тонзиллита).
Ближайшим прототипом предлагаемого нового способа является способ диагностики компенсированной и декомпенсированной форм хронического тонзиллита на основе метода инфракрасной спектрометрии слюны (Портенко Г.М. И соавт., 2005, патент №2261048). Данный метод основан на применении вероятностно-логического обучающего алгоритма бинарного дерева решений CART по показателям инфракрасного спектра слюны. Данный способ относится к экспресс-методам идентификации и проведения дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита, в сочетании с вероятностной нейронной сетью по энергоинформационному показателю пробы слюны. Однако данный метод является косвенным в дифференциальной диагностике форм хронического тонзиллита, так как проводится исследование биологической жидкости-слюны, о биохимических изменениях, происходящих в организме, такимобразом, можно судить лишь косвенно, то есть диагностика in situ биологического объекта, в данном случае, небных миндалин и других структур глотки, в данной работе не предусмотрена, что не может нести полную информацию об исследуемом объекте.
Все вышеперечисленные методы обладают значительными полезными свойствами и преимуществами, однако основной недостаток приводимых способов заключается в трудоемкости выполнения, длительности, относительно невысокой чувствительности и специфичности, а также невозможности использовать метод in vivo (внутри организма, органа) малоинвазивно и быстро (со «скоростью света»). Предлагаемый новый метод раман-флюоресцентной спектроскопии является высокочувствительным, высокоспецифичным и точным методом диагностики, так как позволяет регистрировать минимальные изменения в физиологии, морфометрических и метаболических показателях малоинвазивно и быстро (в течение нескольких секунд). Кроме того, данный способ является наискорейшим по сравнению с остальными методами. Таким образом, используемая нами методика раман-флюоресцентной спектроскопии в диагностике форм хронического тонзиллита, является универсальным, точным, малоинвазивным, высокочувствительным, высокоспецифичным, ускоренным методом диагностики воспалительного процесса, в данном случае, форм хронического тонзиллита, каждая из которых (компенсированная и декомпенсированная) характеризуются определенным набором метаболических, структурных, а также функциональных изменений изучаемого биологического объекта (в данном случае, тканей глотки). Однако применяемая нами методика раман-флюоресцентной спектроскопии на основе аппаратно-программных комплексов «EnSpectr М405» и «Enshtctr R532» (устройство и метод для раман-флюоресцентной идентификации вещества, И. Кукушкин и соавт., 2011; средство для измерения RU. С. 37.003. А №44570) может бытьиспользована для регистрации и интерпретации спектров рамановского рассеяния ткани небных миндалин, а также крови при хроническом тонзиллите компенсированной и декомпенсированной форм. Кроме того, с использованием методики in vitro могут быть зарегистрированы спектральные характеристики микроорганизмов и/или их ассоциатов при хроническом тонзиллите различных форм, что является дополнительным фактором, свидетельствующим о возможности применения данного метода в диагностике форм хронического тонзиллита, поскольку известно, что при различных формах хронического тонзиллита встречаются различные микроорганизмы и/или их ассоциаты («Воспалительные заболевания глотки: руководство для врачей. В.Т. Пальчун и соавт., 2013).
Способ дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита с использованием раман-флюоресцентных медицинских технологий заключается в регистрации спектральных данных с поверхности небных миндалин как in vivo, так и in vitro, а также спектров плазмы крови пациентов с хроническим тонзиллитом и крови здоровых добровольцев.
Проблемой, решаемой изобретением, является сложность установления точного диагноза при хроническом тонзиллите для определения показаний к хирургического или консервативному лечению. С использованием предложенного нового способа представляется возможным обеспечить ускорение диагностики формы хронического тонзиллита, так как способ позволяет за минимальное время с высокой чувствительностью и специфичностью малоинвазивно как in vivo, так и in vitro с использованием портативного аппаратно-программного комплекса раман-флюоресцентной спектроскопии осуществлять идентификацию природы процесса, а также его разновидность.
Технический результат - осуществление способа дифференциальной диагностики хронического тонзиллита компенсированной и декомпенсированной форм в совокупности с данными объективного осмотра, а также регистрацией спектральных характеристик ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите в ускоренном режиме (со «скоростью света»), с использованием высокочувствительного, высокоспецифичного и малоинвазивного экспресс-метода.
Способ осуществляется следующим образом: для регистрации спектральных данных используется устройство раман-флуоресцентной диагностики состояния тканей человека в норме и при патологии (ENSpectr R532, ENSpectr М405), которое включает в себя включает лазер с лазерным фильтром, систему зеркал и линз; систему собирающую сигнал, исходящий от исследуемого объекта, и отрезающий фильтр; спектрометр с CCD-камерой, отличающийся тем, что спектрометр содержит дополнительно специальные насадки и/или приспособления для экспресс - пробоподготовки объектов для их исследования в жидком, сыпучем, твердом состоянии и/или мазка- «отпечатка». Спектрометр соединен с компьютером, на котором установлено специальное программное обеспечение, реализующее алгоритмы мониторинга, диагностики и коррекции состояния субъекта и/или биологических тканей человека в норме и при патологии, с помощью специального программного обеспечения производится калибровка, нормировка, вычитание фона и масштабирование получаемых данных и осуществляется установление диагноза состояния субъекта и/или биологических тканей человека, спектрометр соединен с лазером обратной связью, устройство также содержит волоконно-оптический кабель для воздействия лазерным излучением, микроскоп для прецизионной визуализации изображения, а также цифровой флеш-микроскоп с автофокусировкой и подсветкой для микро- и макрообъектов для одновременной визуализации изображения и картины распределенияфлуоресценции, для исследований in vitro и in vivo. При проведении дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита in vivo проводится подведение лазерного излучения с длиной волны 405 нм с использованием специального оптоволоконного световода к ткани небных миндалин. Измерение проводится контактным способом после предварительной обработки световода раствором антисептика.
С использованием аппаратно-программного комплекса ENSpectr R532 представляется возможным анализировать в экспресс-режиме метаболические, морфометрические и функциональные особенности ткани небных миндалин, а также биологических жидкостей пациентов (крови) при хроническом тонзиллите компенсированной и декомпенсированной форм in vitro. Проведение способа заключается в подведении лазерного излучения с длиной волны 532 нм (использование данной длины волны основано на рамановском эффекте) к изучаемому биологическому объекту, в данном случае, тканям глотки (небные миндалины); регистрации как основного (зондирующего) сигнала, так и обратно отраженного сигнала. Время экспозиции- 1-5 секунд.
4
5
С использованием нового способа проводится ускоренная дифференциальная диагностика формы хронического тонзиллита:  компенсированной формы либо декомпенсированной формы  (классификация И. Б. Солдатова, 1975 г). Также используются метод главных компонент, линейный дискриминантный анализ, принцип наименьших квадратов для выделения наиболее информативных рамановских линий на различных длинах волн у спектров интактной ткани, а также ткани,  задействованной в воспалительный процесс. Был применен комбинированный способ анализа спектральных характеристик для описания различий в норме, при воспалении в случае хронического тонзиллита  (компенсированной и декомпенсированной форм). В данный способ входят все вышеперечисленные параметры, а также описание самого спектра вцелом, флюоресцентной его составляющей, рамановских пиков, их высоты, ширины, полуширины, отношения длины волны, на величине которой выделяются одинаковые метаболиты при воспалении к величине, которая является строго индивидуальной в данных случаях, в том числе при различных формах хронического тонзиллита. Также проводилось описание наиболее образцового спектра для данного гистологического диагноза, как «золотого стандарта диагностики». В соответствии с данным образцовым спектром проводилось сравнение различных спектров с поверхности интактной области. Было выявлено, что в зависимости от различных метаболических, морфометрических, функциональных особенностей ткани можно провести дифференциальную диагностику формы хронического тонзиллита: компенсированной либо декомпенсированной,- с использованием раман-флюоресцентных медицинских технологий с высокой точностью, специфичностью, чувствительностью, малоинвазивно и в экспресс-режиме. Существующие на сегодняшний день методы диагностики воспалительных заболеваний глотки являются либо длительными, либо дорогими, либо дают лишь косвенное представление о происходящих процессах в организме, не позволяя проводить диагностику in vivo in situ, либо сложными в исполнении. Также они не настолько чувствительные и специфичные, как применяемая нами раман-флюоресцентная спектроскопия, которая является не только высокочувствительной, высокоспецифичной, но и малоинвазивной, а также быстрой. Для определения морфологических, функциональных и метаболических характеристик лимфоидной ткани в норме и при патологии, в том числе на основе регистрации раман-аутофлюоресцентных характеристик, необходимо выбрать наиболее оптимальный способ диагностики, к которому относится метод раман-флюоресцентной диагностики. Разработка и внедрение представленной технологии в широкую клиническую практику являются перспективными и клинически целесообразными и позволят в дальнейшем существенно повысить качество диагностики воспалительных заболеваний глотки исвоевременно назначить рациональное лечение. Применение программно -аппаратного комплекса ENSpectr R532 также позволяет обеспечить достоверное, высокочувствительное (10 - 10 КОЕ/мл) обнаружение этиологического фактора при различных формах хронического тонзиллита, так как помогает выявлять вид, концентрацию микроорганизма либо ассоциатов микроорганизмов.
Результаты проведения экспресс-диагностики формы хронического тонзиллита, представлены на соответствующих рисунках, расположенных ниже.
Изобретение относится к области медицины, а именно оториноларингологии, и может использоваться для диагностики форм хронического тонзиллита.
т
beta
Проведение способа дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита осуществлялось с использованием аппаратно-программных комплексов «ENSpectr R532» и «ENSpectr М405» как in vivo, так и in vitro го и заключалось в регистрации измерений- спектральных характеристик ткани в норме и при патологии контактным, стабильным способом, без освещения, с предварительной обработкой световода. Измерения были проведены нами в нескольких точках небных миндалин: у верхнего полюса, у нижнего полюса, в лакуне. Всего проводилось от 4 до 10 измерений для получения более точного результата и воспроизводимости спектральных характеристик. Перед каждым измерением проводилась обработка оптоволоконного световода раствором антисептика. Регистрируемые данные, которые являются многомерными (волновой сдвиг рассеянного излучения, интенсивность флюоресценции и рамановского рассеяния) были проанализированы при помощи регрессионного метода проекций на латентные структуры (PLS-DA). Суть метода состоит в том, что дискриминационные правила для классов задаются линейнымирегрессионными уравнениями. Из регистрируемых данных, интенсивности раман-флюоресцентных спектров на определенных сдвигах волн, составляется матрица, где для каждого спектра от образца присваивается значение 0 или 1, в зависимости от принадлежности классу, например, здоровая ткань и воспаление. Регрессионная задача решается методом проекций на латентные структуры, что позволяет в дальнейшем предсказывать принадлежность новых образцов. Также методом проекций на латентные структуры в совокупности с линейным дискриминантным анализом позволяет выявить спектральные особенности для классов, которые определяют специфические колебания связей или молекул для каждого типа изучаемой ткани, в данном случае, ткани небных миндалин. Перед применением метода проекций на латентные структуры с линейным дискриминантным анализом регистрируемые данные были избавлены от шума методом Савицкого-Голея и фонового излучения методом коррекции опорной линии с использованием ассиметричных наименьших квадратов. Все методы предобработки и многомерный анализ данных были реализованы в онлайн программном обеспечении ТРcioud. Выбор метода раман-флюоресцентной спектроскопии и его программной реализации в аппаратно-программных комплексах «ENSpectrR532» и «ENSpectr М405» при хроническом тонзиллите обоснован необходимостью повышения чувствительности и специфичности диагностики с последующей интерпретацией информативных критериев индивидуальных спектральных характеристик. Для выявления и подтверждения диагностической информативности раман-флюоресцентной спектроскопии было проведено сравнение двух групп- на основании анализа 33 спектров небных миндалин пациентов из группы больных хроническим тонзиллитом, компенсированной формы (9 спектров) и хронического тонзиллита декомпенсированной формы (24 спектра). Полученные результаты представлены на рисунках, описание которых приведено ниже (см. приложение «Чертежи и рисунки»):
На Фиг. 1. представлены спектральные характеристики ткани небных миндалин пациента с хроническим тонзиллитом, компенсированной формы до обработки спектров с использованием метода проекции на латентные структуры, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов и метода главных компонент. Основные рамановские пики регистрировались на величинах волновых чисел: 831, 1029, 1148, 1214, 1337, 1368, 1538, 1636, 2604, 2938, 3171, 3259/ см.
На Фиг. 2. изображены спектральные характеристики ткани небных миндалин пациента с хроническим тонзиллитом, декомпенсированной формы до обработки спектров с использованием метода проекции на латентные структуры, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов и метода главных компонент. Основные рамановские пики регистрировались на величинах волновых чисел: 1150, 1515/ см.
На Фиг. 3. приведены спектральные характеристики крови пациента с хроническим тонзиллитом, компенсированной формы (при нормальных показателях ревмопроб- антистрептолизина-О, ревматоидного фактора, С-реактивного белка) до обработки спектров с использованием метода проекции на латентные структуры, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов и метода главных компонент. Основные рамановские пики регистрировались на величинах волновых чисел: 1354, 1469, 3580/см.
На Фиг. 4. изображены спектральные характеристики крови пациента с хроническим тонзиллитом, декомпенсированной формы (при повышенных показателях ревмопроб- антистрептолизина-О, ревматоидного фактора, С-реактивного белка) до обработки спектров с использованием метода проекции на латентные структуры, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов и метода главных компонент. Основныерамановские пики регистрировались на величинах волновых чисел: 478, 672, 751,997, 1002, 1151, 1217, 1349, 1512, 1635,2308, 2888, 3170/см
На Фиг. 5. представлены спектры ткани небных миндалин здорового добровольца (изображены на рисунке под цифрой 3) и пациента с хроническим тонзиллитом (изображены на рисунке под цифрой 1 и 2) без предварительной обработки спектров с использованием метода проекции на латентные структуры, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов и метода главных компонент. Отмечается значительное увеличение интенсивности флюоресценции при хроническом тонзиллите, появление дополнительных пиков, отсутствующих у здоровых добровольцев, что отчетливо видно на рисунке (Фиг. 5).
На Фиг. 6. изображена модель (сглаживание, выделение рамановского сигнала на общем фоне, нормирование, центрирование). Представлены данные после предобработки
На Фиг. 7. приведен результат построения модели при анализе спектральных характеристик ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите компенсированной и декомпенсированной форм.
Обозначения на графике: 0 - воспаление при хроническом тонзиллите декомпенсированной формы, 1 - воспаление при хроническом тонзиллите компенсированной формы, NMC - non missed classified, то есть неправильно определенные спектры. Разделение проведено со специфичностью 100%, чувствительностью 100%, точностью 100%.
-1
-1
На Фиг. 8. представлены наиболее информативные полосы комбинационного рассеяния (рамановского рассеяния) (метод проекции на латентные структуры и линейный дискриминантный анализ): 573 см, 1092 см.
Дифференциальная диагностика хронического тонзиллита декомпенсированной формы и хронического тонзиллита компенсированной формы является одной из самых важных задач, стоящих перед оториноларингологами и врачами-общей практики. С использованием метода раман-флюоресцентной спектроскопии на изученной выборке гистологических и цитологических образцов удалось провести анализ спектральных данных. Разделение между данными классами было проведено со специфичностью 100%, чувствительностью 100% и точностью 100%, что подтверждает заявленные преимущества способа.