ШТАММ МИКРОВОДОРОСЛИ Bracteacoccus aggregatus - ПРОДУЦЕНТ СМЕСИ НАТУРАЛЬНОГО БИОАНТИОКСИДАНТА АСТАКСАНТИНА И ПРОВИТАМИНА А
BRACTEACOCCUS AGGREGATUS MICROALGAE STRAIN - PRODUCER OF A MIXTURE OF NATURAL BIOANTIOXIDANT OF ASTAXANTHIN AND PROVITAMIN A

Область применения
Изобретение относится к фотобиотехнологии и представляет собой новый штамм микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens), предназначенный для одновременного получения натуральных биоантиоксидантов астаксантина и β-каротина (провитамина А). Данное изобретение возможно применять при получении сырья для изготовления косметики, БАД, функционального питания, кормовых и пищевых добавок, а также, при биотехнологической очистке сточных вод с попутным получением ценных каротиноидов (астаксантин и β-каротин).
Уровень техники
-1
-1
Известно, что род Bracteacoccus Tereg 1923 является типовым для семейства Bracteacoccaceae, расположенный в системе у основания филогенетического древа порядка Scenedesmales. Примечательной особенностью порядка является наличие во всех без исключения 9 семействах видов, обладающих специфическим, генетически обусловленным признаком - способностью к вторичному каротиногенезу. Как правило, это - обитатели солоноватых и временных пресноводных водоемов, а также почвенные и аэрофитные водоросли [Чубчикова И.Н. и др. Хлорококковые микроводоросли как потенциальный источник природных кетокаротиноидов. Экология моря. 2009, Вып. 77, с. 77-83; Abe K., Hattori Н., Hirano М. Accumulation and antioxidant activity of secondary carotenoids in the aerial microalga Coelastrella striolata var. multistriata. Food Chem. 2007, т. 100, №2, p. 656-661; Fujii K., Imazato E., Nakashima H. et al. Isolation of non fastidious microalgae with astaxanthin-accumulation property and its potential for application to aquaculture. Aquaculture. 2006, т. 261, р. 285-293]. Известны зеленые микроводоросли Bracteacoccus minor и Bracteacoccus giganteus у которых среднесуточный выход суммарных каротиноидов из литра исходной культуры может составлять 2,3 мг⋅л⋅сут и относительное содержание в них всех форм астаксантина достигает 50% от суммы [Чубчикова И.Н. и др., Скрининг одноклеточных зеленых водорослей как потенциальных источников природных кетокаротиноидов. Особенности роста и вторичного каротиногенеза у представителей рода Bracteacoccus (Chlorophyceae). Морск. экол. журн. 2011, т. 10, №1, с. 91-97].
2
Известно, что зеленая микроводоросль Coelastrella rubescens (ранее Scotiellopsis rubescens Vinatzer) [Kaufnerova V., Elias M. The demise of the genus Scotiellopsis Vinatzer (Chlorophyta). Nova Hedwigia. 2013, 97, pp. 415-428] относится к группе экстремобионтных одноклеточных эукариот, способных при неблагоприятных условиях внешней среды переходить из вегетативного состояния в стадию покоя и накапливать в образующихся апланоспорах коммерчески значимое количество (1-2% сухого веса) специфических защитных кетокаротиноидов - продуктов многостадийного ферментативного окисления β-каротина в астаксантин [Lemoine, Y., Schoefs, В. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunctional response to stress. Photosynth. Res. 2010, 106, pp. 155-177; Чубчикова И.Н. Влияние состава среды на содержание вторичных каротиноидов у микроводоросли Scotiellopsis rubescens (Chlorophyceae). Морск. экол. журн. 2012, т. 11, №4, с. 95-101; Минюк Г.С. и др. Влияние рН и CO на рост и метаболизм микроводоросли Coelastrella (Scotiellopsis) rubescens. Физиология растений. 2016, т. 63, с. 601-610].
2
2
Астаксантин - кетокаротиноид красного цвета, наиболее эффективный природный антиокислитель, оказывающий благотворное влияние на организм человека и животных. Астаксантин широко востребован как компонент косметических формул, лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок [Guerin, М. et al. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol. 2003, 21, pp. 210-216.; Han, D. et al. Biology and commercial aspects of Haematococcus pluvialis. In Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology. 2 ed.; Richmond, A.; Hu, Q., Eds. Blackwell: 2013; pp. 388-405]. Единственным источником астаксантина у животных является пища [Lorenz, R.T., Cysewski, G.R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends Biotechnol. 2000, 18, 160-167]. В настоящее время значительная доля астаксантина синтезируется химическим путем, но синтетический пигмент, в отличие от натурального, является рацематом с большим содержанием стереоизомеров, не обладающих биологической активностью. Для промышленного получения натурального астаксантина используют преимущественно штаммы зеленой микроводоросли Haematococcus pluvialis Flotow, способной накапливать астаксантин до 3-6% сухого веса [Lemoine, Y., Schoefs, В. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunctional response to stress. Photosynth. Res. 2010, 106, pp. 155-177] благодаря способности к образованию богатых астаксантином неподвижных коккоидных клеток, устойчивых к неблагоприятным условиям среды [Boussiba, S. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: cellular physiology and stress response. Physiol. Plant. 2000, 108, pp. 111-117; Solovchenko, A. Physiology and adaptive significance of secondary carotenogenesis in green microalgae. Russ. J. Plant Physiol. 2013, 60, pp. 1-13]. Известно изобретение [RU 2573944 C1, 27.01.2016]: штамм микроводорослей Haematococcus pluvialis ВМ1, пригодный для получения астаксантина и характеризующийся способностью расти на средах, содержащих до 27% хлорида натрия, высокой способностью к накоплению астаксантина - до 3-6% сухой биомассы и обладающий высокой продуктивностью (до 300 мг сухой биомассы в сутки с 1 л культуры). Известен способ культивирования Haematococcus pluvialis для промышленного производства биомассы, обогащенной астаксантином [патент US 6022701 С16Р] (культивирование при освещении в диапазоне 30-140 мкЕ ФАР/(м⋅с) и температуре 15-28°С с использованием в качестве среды водопроводной воды и барботированием культуры газо-воздушной смесью с 1,5% CO). Также, известен способ эффективного производства каротиноидов, включая астаксантин, путем получения мутантных штаммов Haematococcus pluvialis [ЕР 1995325 А1, 26.11.2008] ССАР 34/8 и SAG 34-1b с повышенной способностью к накоплению каротиноидов.
Однако для известных штаммов микроводорослей Haematococcus pluvialis характерна невысокая скорость роста, узкий диапазон физико-химических параметров культивирования и высокий риск контаминации, требующий применения дорогостоящих закрытых систем культивирования, чрезмерно повышающих цену на натуральный астаксантин.
Также известен штамм дрожжей Phaffia rhodozyma [RU 2385925 C1, 10.04.2010] ВКПМ Y-2982, способный продуцировать астаксантин (7,0-8,0 мг/г сухой биомассы в условиях оптимальной (60 лк) освещенности). Доля астаксантина в общем пуле каротиноидов может составлять до 70%. Описан штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella zofingiensis АТСС 30412 [US 7063957 B2, 20.06.2006], способный к гетеротрофному росту в темноте и после 2-х недель роста способный накапливать до 10 мг/л астаксантина.
β-каротин - оранжевый пигмент, непредельный углеводород из группы каротиноидов. Встречается во всех зеленых растениях и достаточно давно используется в качестве красителя в пищевой промышленности и кормах для животных [L.J. Borowitzka, М.А. Borowitzka, Т.Р. Moulton. The mass culture of Dunaliella salina for fine chemicals: From laboratory to pilot plant. Hydrobiologia. 1984, 1, pp. 115-121]. Кроме этого, β-каротин используется в качестве компонента биологически активных добавок и витаминных комплексов. Общий объем мирового рынка β-каротина оценивается примерно в 270-300 млн. долл. США, из них 20-30% - доля природного β-каротина [Borowitzka М.А. High-value products from microalgae-their development and commercialisation. Journal of Applied Phycology. 2013, V. 25, Issue 3, pp. 743-756].
В настоящее время известны микроводоросли - перспективные продуценты натурального β-каротина, особенно Dunaliella salina (до 10% β-каротина от сухого веса клеток) [Oren, A. Adaptation to life at high salt concentrations in Archaea, Bacteria, and Eukarya (Gunde-Cimerman, N., Oren A., and Plemenitas, A., eds), Springer. N.Y., 2005, pp. 493-502]. Известен штамм водоросли Dunaliella salina Teod. CALU - 834, выделенный из прибрежной зоны лимана Сасык [SU 1324627 A1], который используется в микробиологической промышленности как продуцент белка и β-каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных, а также для утилизации отходов. Также известен штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina - продуцент биоантиоксидантов [RU 2497945 C2, 20.06.2012] и способ культивирования Dunaliella salina [RU 2541446 C1, 10.02.2015]. Известно изобретение, охватывающее сразу несколько новых галотолерантных гипераккумулирующих каротиногенных штаммов микроводоросли Dunaliella salina DF15, DF17 и DF40 [WO 2018141978, 09.08.2018] с коммерчески значимым потенциалом накопления β-каротина. В последние годы гриб Blakeslea trispora стал важным альтернативным источником природного β-каротина, конкурирующего с водорослевым продуктом [ЕР 1367131 А1, 03.12.2003].
Основными недостатками перечисленных выше примеров являются отсутствие способности к одновременному накоплению коммерчески значимых количеств астаксантина и β-каротина.
Известна зеленая почвенная микроводоросль Bracteacoccus minor (Chodat)  накопливающая смесь вторичных кетокаротиноидов с доминированием диацильных эфиров астаксантина (37-42% суммы) [Г.С. Минюк и др. Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры. Algologia. 2015, 25(1): 21-34].
Недавно описан штамм Scenedesmus sp. CCALA 1074 который был выделен из планктона реки Силь (Швейцария, 47°10'47.982''N, 8°41'33.504''Е) [Pavel  et al. The role of light and nitrogen in growth and carotenoid accumulation in Scenedesmus sp. Algal Research. 2016, 16, pp. 69-75]. Сумма каротиноидов на ранней стационарной фазе роста культуры Scenedesmus sp. CCALA 1074 составляла 2,3% от сухого веса, при этом доля астаксантина составляла 9%, а β-каротина 5,4% от суммы каротиноидов. Scenedesmus sp. CCALA 1074 успешно выращивают в открытом тонкослойном фотобиореакторе объемом 150 л., при этом, он демонстрирует превосходный рост, высокую продуктивность каротиноидов и термотолерантность, что делает этот штамм перспективным кандидатом для биотехнологического производства богатой каротиноидами биомассы.
Известен штамм микроводоросли Coelastrella striolata var. multistriata, который был выделен с поверхности горной породы в Шизуоке, Япония [Katsuya Abe et al. Accumulation and antioxidant activity of secondary carotenoids in the aerial microalga Coelastrella striolata var. multistriata. Food Chemistry. 2007, 100, pp. 656-661]. Авторы заявляют о способности данной микроводоросли синтезировать значительное количество смеси каротиноидов, таких как кантаксантин, астаксантин и β-каротин. Красновато-оранжевые клетки микроводоросли могут накапливать до 56,0 мг вторичных каротиноидов на 1 г. биомассы. По содержанию в клетках каротиноиды кантаксантин, астаксантин и β-каротин составляли 47,5, 1,5 и 7,0 мг/г.сух.веса соответственно.
-1
-1
6
-1
-1
-1
-1
Наиболее близким аналогом (прототипом) является микроводоросли Coelastrella rubescens и способ их культивирования для получения каротиноидов и липидов [RU 2661086 С1, 11.07.2018]. Для реализации предлагаемого способа получения биомассы Coelastrella rubescens используют штамм Coelastrella (Scotiellopsis) rubescens IPPAS H-350 (Vinatzer/Innsbruck V195=CCALA475), который выращивают методом двухстадийной накопительной культуры. Полученную в конце «зеленой» стадии биомассу С. rubescens, состоящую из метаболически активных делящихся клеток, авторы предлагают использовать (частично или целиком) как самостоятельное сырье для получения смеси ксантофиллов (лютеина, зеаксантина, неоксантина и β-каротина) и незаменимых ЖКС18:2ω и С18:3ω пищевого назначения, а также (частично или целиком) в качестве инокулята для проведения II («красной») стадии культивирования с целью получения кетокаротиноидов группы астаксантина и технических липидов. Содержание суммарных каротиноидов в биомассе в конце «зеленой» стадии роста культуры, собранной на 11-е сутки, достигало 2,1±0,17% СВ при продуктивности 2,2±0,08 мг⋅л⋅сут. В составе каротиноидов доминировали лютеин/зеаксантин (51,9% от суммы), неоксантин (18,1%), α- и β-каротины (10,6%). Астаксантин и интермедиаты его биосинтеза в биомассе отсутствовали. При условии использования для проведения «красной» стадии всей «зеленой» биомассы выход суммарных каротиноидов из литра исходной культуры с начальной плотностью 1,1×10 кл⋅мл (или 0,17 г/л СВ) за 19 суток составил 52,3 мг⋅л, средняя продуктивность - 2,75 мг⋅л⋅сут, содержание суммарных каротиноидов в биомассе 0,9-1,0% СВ, доля астаксантина составляла 26%. К недостаткам прототипа можно отнести незначительное содержание β-каротина в биомассе на «красной» стадии культивирования и недостаточно высокую долю астаксантина, а также весьма скромные показатели по содержанию суммарных каротиноидов.
-1
-1
-1
-1
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма микроводоросли с высоким уровнем одновременного накопления астаксантина и β-каротина (не менее 55 масс. % астаксантина и 35 масс. % β-каротина) при сохранении высокой продуктивностью культуры (не менее 3,6 мг⋅л⋅сут по сумме каротиноидов), способностью к биоизъятию фосфатов из среды (не менее 2,3 мг⋅л⋅сут).
Раскрытие изобретения
Техническая проблема была решена штаммом микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) BM 5/15 IPPAS C-2045, выделенным из водоема на севере России, республика Карелия, д. Лоухи, Проток между Белым морем и Нижним Ершовским озером, 66°32'07''N, 33°03'59''Е, депонированным в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS С-2045.
Впервые был получен штамм микроводоросли, способный к высокому уровню одновременного накопления смеси астаксантина и β-каротина, обеспечивающий высокую продуктивность при выращивании, обладающий способностью к биоизъятию фосфатов из среды.
-1
-1
Сущность изобретения заключается в том, что для достижения цели используют зеленую микроводоросль Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) штамм IPPAS C-2045, выделенный и идентифицированный авторами заявки из водоема на севере России, республика Карелия, д. Лоухи, Проток между Белым морем и Нижним Ершовским озером (66°32'07''N, 33°03'59''Е). В результате полученный штамм характеризуется высокой способностью к одновременному накоплению астаксантина и β-каротина (55-60 масс. % и 35-40 масс. %, соответственно от суммы каротиноидов на «красной» стадии культивирования), при этом сумма каротиноидов оценивается в 2,4-2,6% сухого веса, культура обладает высокой продуктивностью (100-200 мг сухой биомассы и 3,6-3,8 мг каротиноидов в сутки с 1 л культуры), способностью к биоизъятию фосфатов из среды (2,3-2,6 мг⋅л⋅сут).
Для достижения технического результата изобретения культуру водоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) штамм IPPAS C-2045 выращивают двухстадийным методом, направленным на достижение коммерчески значимого выхода целевых продуктов (смеси астаксантина и β-каротина).
-1
-1
-1
В результате получают в сутки 100-200 мг⋅л биомассы (по сухому весу) и 3,6-3,8 мг каротиноидов в сутки с 1 л культуры, биомасса содержит 2,4-2,6% каротинодоиов, в которых доля астаксантина 55-60 масс. % и β-каротина 35-40 масс. %. Предлагаемый штамм культуры микроводоросли характеризуется способностью к биоизъятию фосфатов из среды (2,3-2,6 мг⋅л⋅сут).
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На Фиг. 1 представлены клетки микроводорослей Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) штамм IPPAS C-2045 в условиях вегетативного культивирования и накопления каротиноидов - светлопольная микроскопия.
На Фиг. 2 Накопление сухой массы Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 при культивировании на среде BG-11 в условиях вегетативного роста показаны средние значения и стандартные отклонения (2 биологические повторности).
На Фиг. 3 показано содержание каротиноидов в клетках культуры Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) штамм IPPAS C-2045.
На Фиг. 4 показано филогенетичское дерево штамма Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 на основании последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ITS2) ядерного рибосомального кластера генов, полученное при помощи алгоритма максимального правдоподобия. Точность различных элементов топологии, определенная при помощи bootstrap-теста, указана около них (в процентах). Масштаб - число нуклеотидных замен в расчете на число позиций в множественном выравнивании.
Осуществление изобретения
Штамм Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 выделен из водоема на севере России, республика Карелия, д. Лоухи, Проток между Белым морем и Нижним Ершовским озером (66°32'07''N, 33°03'59''Е). Отселектирован в результате скрининга по способности к биосинтезу каротиноидов (смеси астаксантина и β-каротина).
Способ выделения - из накопительной культуры, полученной путем инокуляции среды BG-11 отобранными клетками с последующим рассевом по твердой среде BG-11.
Морфологические признаки.
Характер роста на среде хранения: гомогенный, на поздних стадиях возможна агрегация. Цитологическое описание:
форма клеток, размер: штамм В. aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 представлен небольшими коккоидными клетками (до 9 мкм диаметром) или эллиптическими (Фиг. 1). При росте на среде BG-11 часто формируются многоклеточные кластеры. При снижении скорости роста или переносе в неблагоприятные условия клетки существенно увеличиваются в размере (до 20 мкм) и приобретают оранжевую окраску (Фиг. 1). Пиреноид отсутствует.
а) хроматофор (форма, цвет): один крупный париетальный хроматофор, с увеличением размеров появляются более мелкие хлоропласты зеленого цвета.
б) при культивировании жгутиковые стадии не обнаружены (однако по литературным данным в редких случаях встречаются зооспоры с двумя жгутиками [ et al., 2013]).
в) особенности морфологии в условиях оптимального роста: клетки мелкие, имеют зеленую окраску, коккоидные (Фиг. 1).
г) при длительном хранении клетки увеличиваются в размерах, приобретают оранжевую окраску (Фиг. 1).
д) особенности морфологии в условиях, обеспечивающих максимальный выход продукта: клетки приобретают оранжевую окраску. Наблюдается редукция фотосинтетического аппарата, уменьшение объема занимаемого пластидами, в строме пластид появляются многочисленные пластоглобулы.
Физиологические свойства штамма.
Оптимальные условия культивирования:
Для культивирования используют жидкую питательную среду BG-11 [Stanier, R. et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1971, 35(2): 171-205], готовится из стоковых растворов; все компоненты можно автоклавировать.
Среда BG-11 следующего состава:
2
4
3
4
2
KНРO - 0,04 г/л, NaNO - 0,3 г/л, MgSO⋅7HO - 0,075 г/л,
2
2
СаСl⋅2Н0 - 0,036 г/л, лимонная кислота - 0,006 г/л,
4
2
2
3
FeSO⋅7H0 - 0,006 г/л, NaCO - 0,2 г/л, ЭДТА- 0,001 г/л,
4
2
раствор FeSO⋅7H0 (7,45 г/л)+ЭДТА (5,57 г/л) - 1 мл/л,
3
3
2
2
4
2
4
2
2
4
2
3
2
2
раствор микроэлементов (НВО - 2,86 г/л, MnCl⋅4Н0 - 1,86 г/л, ZnSO⋅7H0 - 0,22 г/л, CuSO⋅5H0 - 0,08 г/л, NaMoO⋅7H0 - 0,39 г/л, Co(NO)⋅6H0 - 0,05 г/л) - 1 мл/л,
рН в начале культивирования - 7,4-7,7
рН в конце культивирования 6,9-7,2
скорость барботажа воздухом 0,8-1,2 л/мин
температура 23-25°С
2
освещение круглосуточное, освещенность 60-80 моль квантов /м/сек
тип ламп: светодиодные, 4700 К
0
-2
-1
Для индукции каротиногенеза и перехода на «красную» стадию культивирования, клетки, находящиеся на экспоненциальной фазе роста, дважды промывают безазотной средой BG-11 [Rippka, R. et al. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 1979, 111, 1-61), ресуспензируют в 300-400 мл этой среды и инкубируют при освещении 460-480 мкмоль фотонов ФАР м⋅с в течение 7-10 суток.
После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием с ускорением не менее 3000 g в течение 4-5 минут.
Продуктивность в оптимальных условиях культивирования:
по накоплению биомассы (сухой вес, мг/л в сутки): 100-200;
выход полезного продукта: сумма каротиноидов оценивается в 2,4-2,6% сухого веса, продуктивность по каротиноидам 3,6-3,8 мг в сутки с 1 л культуры, одновременное накопление астаксантина и β-каротина (55-60 масс. % и 35-40 масс. %, соответственно от суммы каротиноидов).
Биотехнологическая характеристика штамма.
-1
-1
Штамм микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045, депонированный в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS С-2045, продуцент смеси натурального биоантиоксиданта астаксантина и β-каротина (провитамина А) в соотношении 55-60 масс. % и 35-40 масс. % от суммы каротиноидов соответственно, которая составляет 2,4-2,6% сухого веса, при продуктивности по сумме каротиноидов 3,6-3,8 мг в сутки с 1 л культуры, способный к биоизъятию фосфатов из среды со скоростью 2,3-2,6 мг⋅л⋅сут.
-2
-1
Условия культивирования, обеспечивающие максимальный уровень (выход) полезного свойства (продукта): любой стрессор, снижающий скорость деления клеток (освещение 460-480 мкмоль фотонов ФАР м⋅с, исключение азота из состава среды культивирования).
Генотипирование.
Выделение ДНК.
Для выделения ДНК отбирают 5-10 мг биомассы культуры микроводоросли. Выделение ДНК проводят методом фенол-хлороформной экстракции. Перед выделением проводят трехкратное замораживание образцов при -4°С с последующим оттаиванием. Это необходимо для разрушения прочных клеточных стенок водорослей. Образцы инкубируют в течение часа в 300 мкл ТЕ буфера (10 mM Tris-Cl (рН 7.5), 1 mM EDTA), содержащего 10 мг/мл лизоцима при 37°С. Затем добавляют 2% додецилсульфата натрия и инкубируют в течение часа при 40°С и интенсивном перемешивании. Далее добавляют 1 М NaCl и оставляют на ночь на льду для высаливания белков. После чего проводят процедуру фенол-хлороформной экстракции. Чистоту образцов ДНК оценивают методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полученные образцы ДНК хранят в ТЕ-буфере при -4°C.
Филогенетический анализ.
Филогенетические взаимоотношения штамма IPPAS С-2045 и близких штаммов оценивают по сходству частичной последовательности гена 18s pРНК. Представленное филогенетическое дерево получено методом NJ (Фиг. 4). Филогенетический анализ проведен в программе BioNJ. Визуализация проведена в программе TreeDyn 198.3. Процент репликативных деревьев, в которые были объединены таксоны в бустрап-тесте показаны рядом ветками.
В результате проведенного филогенетического анализа установлена видовая принадлежность исследуемого изолята. Изолят идентифицирован как Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) и получил идентификатор IPPAS С-2045; после депонирования в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) ему присвоен идентификатор IPPAS С-2045.
Кинетика поглощения фосфатов
-1
-2
-1
-1
-1
-1
Кинетику поглощения фосфатов культурой микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) штамм IPPAS C-2045 оценивают по остаточному содержанию ортофосфата в среде методом ионной хроматографии. Начальная плотность культуры - 0,5 г с.в.⋅л, освещенность - 60-80 мкмоль фотонов ФАР м⋅с. При добавлении ортофосфата до конечной концентрации 400 мкмоль⋅л к культуре штамма IPPAS С-2045, предварительно проинкубированной в течение 10 суток на среде BG-11, не содержащей источника фосфора, наблюдается быстрое поглощение ортофосфата. В результате способность штамма микроводоросли IPPAS С-2045 к биоизъятию фосфатов из среды составляет 2,3-2,6 мг⋅л⋅сут в пересчете на ортофосфат.
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.
Для культивирования использовали жидкую питательную среду BG-11 [Stanier, R. et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1971, 35(2): 171-205], готовилась из стоковых растворов.
Среда BG-11 следующего состава:
2
4
3
4
2
KНРO - 0,04 г/л, NaNO - 0,3 г/л, MgSO⋅7H0 - 0,075 г/л,
2
2
СаСl⋅2Н0 - 0,036 г/л, лимонная кислота - 0,006 г/л,
4
2
2
3
FeSO⋅7H0 - 0,006 г/л, NaCO - 0,2 г/л, ЭДТА - 0,001 г/л,
4
2
раствор FeSO⋅7H0 (7,45 г/л)+ЭДТА (5,57 г/л) - 1 мл/л,
3
3
2
2
4
2
4
2
2
4
2
3
2
2
раствор микроэлементов (НBO - 2,86 г/л, MnCl⋅4Н0 - 1,86 г/л, ZnSO⋅7H0 - 0,22 г/л, CuSO⋅5H0 - 0,08 г/л, NaMoO⋅7H0 - 0,39 г/л, Co(NO)⋅6H0 - 0,05 г/л) - 1 мл/л,
рН в начале культивирования - 7,4-7,7
рН в конце культивирования 6,9-7,2
скорость барботажа воздухом 0,8-1,2 л/мин
-2
-1
Штамм культивировали при температуре 23-25°С и круглосуточном освещении (освещенность 60-80 мкмоль фотонов ФАР м⋅с, тип ламп: светодиодные, 4700 К).
Культивирование проводилось в течении 10-14 суток.
0
-2
-1
Для индукции каротиногенеза и перехода на «красную» стадию культивирования, клетки, находящиеся на экспоненциальной фазе роста, дважды промывают безазотной средой BG-11 [Rippka, R. et al. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 1979, 111, 1-61), ресуспензируют в 300-400 мл этой среды и инкубируют при освещении 460-480 мкмоль фотонов ФАР м⋅с в течение 7-10 суток.
После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием с ускорением не менее 3000 g в течение 4-5 минут.
Анализ каротиноидов проводят сразу после отделения биомассы, либо через 30 суток, сохраняя образцы при -80°С. Для пигментного анализа, используют спектрофотометрические и хроматографические методы [Chekanov K. et al. Accumulation of Astaxanthin by a New Haematococcus pluvialis Strain BM1 from the White Sea Coastal Rocks (Russia). Marine Drugs. 2014, 12, 4504-4520].
Продуктивность в оптимальных условиях культивирования:
по накоплению биомассы (сухой вес, мг/л в сутки): 100-200;
выход полезного продукта: сумма каротиноидов оценивается в 2,4-2,6% сухого веса, продуктивность по каротиноидам 3,6-3,8 мг в сутки с 1 л культуры, одновременное накопление астаксантина и β-каротина (55-60 масс. % и 35-40 масс. %, соответственно от суммы каротиноидов). Результаты представлены на фиг. 2 и 3.
-1
-1
Таким образом штамм микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 демонстрирует высокую способность к одновременному накоплению астаксантина и провитамина А (β-каротина), что не встречается у известных аналогов. Накопление астоксантина и β-каротина составляет 55-60 масс. % и 35-40 масс. % соответственно от суммы каротиноидов на «красной» стадии культивирования, что в 2 раза превосходит аналогичный показатель у известного прототипа. Сумма каротиноидов составляет 2,4-2,6% сухого веса, что в 2,5 раза выше, по сравнению с прототипом. Штамм Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 сохраняет высокую продуктивность (100-200 мг сухой биомассы и 3,6-3,8 мг каротиноидов в сутки с 1 л культуры) и одновременную способность к биоизъятию фосфатов из среды со скоростью 2,3-2,6 мг⋅л⋅сут, что превышает уровень известных аналогов, не способных к одновременному накоплению астаксантина и β-каротина.
Штамм микроводоросли Bracteacoccus aggregatus (syn. cohaerens) IPPAS C-2045 успешно прошел предварительное тестирование и этап пробного культивирования в экспериментальных и полупромышленных фотобиореакторах объемом до 50 л.