СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРАЛГЕЗИИ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING HYPERALGESIA

Перекрестные сведения на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 разделом Свода законов США, §119(е), на основе предварительной заявки на патент США 60/775519, поданной 21 февраля 2006 г. Описание приоритетной заявки включено в настоящее описание в виде ссылки на ее целостность для разных целей.
Положение, касающееся государственной поддержки
Настоящее изобретение частично совершено при государственной поддержке грантами NINDS № NS42822 и NS046303, выданными Национальным институтом здоровья США. Таким образом, правительство США может обладать несомненными правами на настоящее изобретение.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в основном относится к способам и композициям для противодействия ионным каналам, участвующим в восприятии вредных химических, термических и механических раздражителей. Точнее настоящее изобретение относится к соединениям, которые специфически ингибируют механотрансдукцию, опосредуемую ионным каналом TRPA1, и способам применения таких соединений для лечения механической гипералгезии.
Предпосылки создания изобретения
Сенсорные нейроны ганглиев задних корешков спинного мозга (ГЗК) могут выявлять изменения во внешней среде через проекции с кожи. Ноцицепция является процессом, с помощью которого вредные раздражители, например тепло и касание, стимулируют сенсорные нейроны в коже (ноцицепторы) посылать сигналы в центральную нервную систему (ЦНС). Некоторые из этих нейронов обеспечивают либо чувствительность к механическим стимулам (с высоким или низким порогом), либо чувствительность к температуре (реагируя на жар, тепло или холод). Некоторые другие нейроны, называемые полимодальными ноцицепторами, улавливают и опасные термические (холод или тепло), и опасные механические стимулы.
Ионные каналы играют центральную роль в нейробиологии, выступая в качестве мембрано-стягивающих белков, регулирующих поток ионов. Классифицируя по механизму пропускания сигнала, ионные каналы могут быть активированы сигналами, например, специфическими лигандами, электрическим напряжением или механическим воздействием. Каналы подгруппы семейства катионных каналов кратковременного рецепторного потенциала (Transient Receptor Potential - TRP) дублируют термоТРР, участвующие в формировании ощущения холода, например TRPM8 и TRPA1. TRPM8 активируется при 25°С. Он также является рецептором ментола, что является молекулярным объяснением того обстоятельства, что многие мятные запахи обычно воспринимаются в качестве освежающей прохлады. Ионный канал TRPA1, также называемый ANKTM1, активируется при 17°С. Это ионный канал, экспрессируемый в полимодальных сенсорных нейронах, который может быть активирован вредным воздействием холода и различными природными жгучими соединениями, которые вызывают чувство жжения/боли. См., например, Patapoutian и др., Nat. Rev. Newosci. 4, 2003, сс.529-539, Story и др. Cell, 112, 2003, сс.819-829, Bandell и др. Neuron, 41, 2004, сс.849-857.
Восприятие механических раздражителей сложным образом связано с проявлением боли при многих заболеваниях и медицинских состояниях. Например, механотрансдукция является важным компонентом чувства боли, связанного с артритом и нейропатической болью. Однако, в противоположность чувствительности к вредным термическим раздражителям, не известна молекулярная идентичность каналов механотрансдукции, ответственных за восприятие вредных механических воздействий, которые были бы важны для формирование чувства боли. Настоящее изобретение нацелено на решение этой и других важных задач, имеющихся в данной области.
Краткое описание изобретения
Один из объектов настоящего изобретения предусматривает способы лечения гипералгезии у субъекта. Эти способы включают введение субъекту фармацевтической композиции, которая включает эффективное количество антагониста TRPA1, который за счет специфического блокирования активирования TRPA1 устранят или подавляет у субъекта вредную чувствительность к химическим, термическим и механическим раздражителям. В некоторых из этих способов используемый антагонист TRPA1 не блокирует активирование одного или нескольких из других каналов термоТКР, выбранных из группы, включающей TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 и TRPM8. В некоторых способах используемым антагонистом TRPA1 является (Z)-4-(4-хлорофинил)-3-метилбут-3-ен-2-оксим. В некоторых других способах используемым антагонистом TRPA1 является N,N'-бис-(2-гидроксибензил)-2,5-диамино-2,5-диметилгексан. В некоторых других способах используют антитело-антагонист TRPA1.
Некоторые из терапевтических способов настоящего изобретения направлены на лечение субъектов с воспалительными состояниями или нейропатическими болями. В некоторых из этих способов субъект, подвергаемый лечению, страдает от механической или термической гипералгезии. В некоторых способах субъектом, подвергаемым лечению, является человек. Помимо антагониста TRPA1, второй понижающий боль агент вводят субъекту одним из известных в терапии способов. Например, второй понижающий боль агент может быть анальгетиком, выбранным из группы, включающей ацетаминофен, ибупрофен и индометацин, а также опиоиды.
Второй понижающий боль агент также может быть анальгетическим агентом, выбранным из группы, состоящей из морфина и моксонидина.
Другой объект настоящего изобретения предусматривает способы идентификации агента, который подавляет или устраняет вредную чувствительность к механическим раздражителям. Эти способы предусматривают: (а) контактирование исследуемых соединений с клеткой, которая экспрессирует ионный канал кратковременного рецепторного потенциала TRPA1, и (б) идентификацию соединения, которое ингибирует сигнальную активность активированного TRPA1 в клетке в ответ на механический стимул. В некоторых из этих способов у выявленного соединения затем исследуют способность воздействовать на активирование или сигнальное действие одного или нескольких каналов термоТRР, выбранных из группы, состоящей из TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 и TRPM8. В некоторых способах идентифицированное соединение устраняет или понижает сигнальную активность активированного ионного канала TRPA1 относительно сигнальной активности ионного канала TRPA1 в отсутствие этого соединения. В некоторых из этих способов идентифицированное соединение не блокирует активирования одного или нескольких каналов термоТРР, выбранных из группы, включающей TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 и TRPM8.
В некоторых из указанных способов скрининга ионный канал TRPA1 активируется агонистом TRPA1, выбранным из группы, включающей циннамальдегид, эвгенол, гингерол, метилсалицилат и аллицин. Примерами клеток, которые могут быть использованы в данных способах, являются TRPA1 - экспрессирующие клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка - Chinese hamster ovary, СНО), TRPA1-экспрессирующие ооциты лягушки-быка Xenopus и культивируемые нейроны ГЗК (сенсорные нейроны ганглиев задних корешков спинного мозга - ГЗК). Сигнальной активностью, подвергаемой мониторингу в этих способах, могут быть, например, TRPA1-индуцируемый электрический ток через мембрану клетки или поступление кальция в клетку. Механическим стимулом, применяемым при скрининге, может быть, например, давление всасывания или гиперосмотический стресс.
Настоящее изобретение также предусматривает применение TRPA1 -специфического ингибитора для получения лекарственного средства для лечения термической или механической гипералгезии у субъекта. Соответствующими TRPA1-специфическими ингибиторами являются, например, (Z)-4-(4-хлорофинил)-3-метилбут-3-ен-2-оксим или N,N'-бис-(2-гидроксибензил)-2,5-диамино-2,5-диметилгексан. В настоящем изобретении также предусмотрены фармацевтические композиции, включающие такие TRPA1-специфические ингибиторы.
Дополнительные сведения о сути и преимуществах настоящего изобретения приведены в настоящем описании ниже и в формуле настоящего изобретения.
Описание чертежей
Фиг.1а-1г показывают, что канал TRPA1 активируется механическими стимулами. (а) Запись электрического тока от клеток, экспрессирующих TRPA1, в ответ на холод (справа, n=62), гипертоническую осмолярность (в центре, n=8) и (-) давление (слева, n=10), отображенная с помощью пера самописца; (б) типичная связь тока-напряжения в ответ на разные стимулы, которые активируют канал TRPA1; (в) клетки, экспрессирующие TRPA1 показывают четкие ответы в виде тока на отрицательное давление -90 мм рт. ст. или выше. Указанные сверху дроби означают число респондеров от общего числа пэтчей, исследованных при соответствующем давлении; (г) предварительная обработка холодом, температура которого является подпороговой, сенсибилизирует ответ клеток, экспрессирующих TRPA1, на низкий пороговый механический стимул (n=5).
3+
Фиг.2а-2г показывают, что ответы TRPA1 на механические импульсы блокируются различными известными агентами. (а) катионы Gd полностью блокируют активирование тока в TRPA1 при гиперосмолярности (n=5 из 5 клеток), которая вызывается 5 мкМ рутения красного (n=5 из 5 клеток для (-) давление и n=6 из 6 клеток для гиперосмолярности). (б) циннамальдегид-чувствительный нейрон ГЗК отвечают на давление -200 мм рт. ст. и на капсаицин. Показано соотношение тока-напряжения в ответ на отрицательное давление (соотношение установлено в том месте, которое отмечено «*»). (в) камфора в концентрации 2 мМ полностью блокирует активирование тока в канале TRPA1 при (-) давлении в клетках СНО (n=5). (г) камфора в концентрации 2 мМ полностью блокирует ответ в виде тока на (-) давление в нейронах ГЗК (n=15 из 18 клеток, исследованных на (-) давление). В 12 из 15 клеток электрический ток также активируется циннамальдегидом в концентрации 500 мкМ.
50
50
50
50
Фиг.3а-3г показывают, что соединение 18 блокирует активирование TRPA1. (а) химическая структура соединения 18 (вверху) и циннамальдегида (внизу), (б) взаимосвязи дозы-ответа для блокирования соединением 18 поступления кальция в клетки СНО, экспрессирующие TRPA1 мыши и человека, под воздействием циннамальдегида в концентрации 50 мкМ (левая панель). Поступление кальция измеряют, используя стандартный метод FLIPR, причем данные представлены в виде среднего значения по 4 лункам (~8000 клеток/лунку), а планки погрешностей показывают стандартную ошибку. Величины нормируют для получения максимального ответа (наблюдаемого в отсутствие соединения 18). Величины IC составляют 3,1 мкмолей и 4,5 мкмолей для TRPA1 человека и мыши соответственно. Соединение 18 сдвигает вправо величину ЕС для циннамальдегида у мышей, экспрессирующих TRPA1, в зависимости от концентрации (правая панель). Данные получают, применяя метод FLIPR для оценки поступления кальция, n=3 лункам (~8000 клеток/лунку), и нормализуют по максимальному ответу. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку, а сплошные кривые означают вычерченные по точкам уравнения, производными от которых являются величины EC. Величины ЕС для циннамальдегида составляют 50 мкМ (контроль), 111 мкМ (10 мкМ соединения 18) и 220 мкМ (25 мкМ соединения 18). Максимальные ответы во всех случаях составляют близкие величины. (в) соотношение тока-напряжения канала TRPA1. Внешние выпрямляющие токи, которые вытягиваются циннамальдегидом (левая панель) изнутри наружу в макропэтчах ооцитов Xenopus, экспрессирующих TRPA1, устраняются соединением 18 при совместных применениях (правая панель). (г) соединение 18 устраняет острые болевые проявления под воздействием циннамальдегида, но не капсаицина. Время, затраченное на резкие движения и зализывания задней лапы, в которую вводили инъекцией циннамальдегид (16,4 мМ) или капсаицин (0,328 мМ), измеряют в течение 5 мин и сопоставляют с задней лапой другого животного, которое одновременно инъецировали также соединением 18 (1 мМ). Число случаев для каждого эксперимента, начиная слева, составляет 8, 8, 6 и 6 соответственно (***р<0,001, *р<0,05, двусторонний критерий Стьюдента).
Фиг.4а-4г показывают, что TRPA1 опосредует гиперчувствительность к механическим воздействиям или холоду при воспалении (а-б). Соединение 18 - новый блокатор, который реверсирует ПАФ- (n=8) или БК-индуцированные (n=12) ноцицептивные механические реакции, но не термические (тепловые) реакции (n=8 и для ПАФ, и для БК) у мышей. Красные значки обозначают ответы на инъекцию в заднюю лапку ПАФ (а) или БК (б), а синие значки обозначают ответы от других не ноцицептивных задних лапок у тех же животных. Кружками отмечены ответы на лечение соединением 18, а треугольниками отмечены ответы на лечение наполнителем (а-в). Пороговые значения фон Фрея измеряют и усредняют. (***р<0,001, *р<0,05, двусторонний критерий Стьюдента). (в) соединение 18 реверсирует восприятие холода у крыс после инъекции ПАФ. Красные значки обозначают ответы на инъекцию ПАФ в заднюю лапку, а синие значки обозначают ответы от других, не подвергнутых инъекции задних лапок у тех же животных. Число резких движений, зализываний, подъемов лап в течение 10 мин в каждой временной точке подсчитывают и усредняют (n=8, *р<0,05, двусторонний критерий Стьюдента). (г) предварительная обработка 1 нмолем брадикинина (БК) сенсибилизирует ответ клеток СНО, экспрессирующих TRPA1, а также экспрессирующих рецептор В2, на низкий пороговый механический стимул. Во время обработки брадикинином (БК) клетки инкубируют с 2 ммолями камфоры для защиты умеренного активирования и последующей десенсибилизации TRPA1 брадикинином. Эти результаты показывают, что порог механического стимула для клеток снижается до -60 мм рт. ст.
Подробное описание изобретения
Общее представление
Настоящее изобретение, в частности, основывается на результатах, полученных в настоящем изобретении, которые заключаются в том, что канал TRPA1, помимо того, что он является важным компонентом восприятия боли, сигнализирующей о вредном воздействии низкой температуры, также является сенсором вредных механических раздражителей. В настоящем изобретении также были выявлены соединения, которые специфически ингибируют активирование TRPA1,
но не другие ионные каналы семейства TRP. В приводимых ниже примерах подробно описано установленное в настоящем изобретении обстоятельство, заключающееся в том, что TRPA1 активируется вредными механическими воздействиями и что такое активирование облегчается при воспалениях. Также было установлено, что низкомолекулярные ингибиторы TRPA1 могут существенно понизить ноцицептивное поведение в виде реакции мышей на циннамальдегид, но не на капсаицин. Кроме того, ингибиторы блокируют гипералгезию в ответ на механическую и холодовую гипералгезию, но не на тепловую гипералгезию.
В соответствии с этими установленными данными настоящее изобретение предусматривает способы скрининга терапевтических агентов, которые могут применяться для устранения или подавления вредной механической чувствительности. В настоящем изобретении также предусмотрены способы применения TRPA1-специфических ингибиторов для ослабления боли, связанной с вредными механическими воздействиями при различных заболеваниях или состояниях. Последующие разделы представляют руководство по получению и применению композиций настоящего изобретения и выполнению способов настоящего изобретения.
Определения
Если не указано иначе, все технические и научные термины, применяемые в настоящем изобретении, имеют те же значения, которые обычно подразумеваются специалистами в той области, к которой относится настоящее изобретение. С основными определениями специалисты могут ознакомиться в следующих книгах: Singleton и др. «Dictionary of Microbiology and Molecular Biology», 2-е изд., 1994; «The Cambridge Dictionary of Science and Technology» под ред. Walker, 1988; Hale, Marham, «The Harper Collins Dictionary of Biology», 1991. Кроме того, приводимые ниже определения предусмотрены для того, чтобы помочь читателю в практике применения настоящего изобретения.
Понятия «агент» или «исследуемый агент» означают какие-либо вещества, молекулы, элементы, соединения, объекты или их комбинации. К ним относятся, но ими не ограничиваются, например, белки, полипептиды, низкомолекулярные органические молекулы, полисахариды, полинуклеотиды и др. Это может быть природный продукт, синтезированное соединение, химическое соединение или комбинация двух или нескольких веществ. Если не указано иначе, понятия «агент», «вещество» и «соединение» применяются в настоящем изобретении взаимозаменяемо.
В контексте настоящего изобретения понятие «аналог» относится к молекуле, которая структурно схожа с контрольной молекулой, но которую модифицируют направленным и контролируемым способом - путем замены специфического заместителя контрольной молекулы на другой заместитель. При сравнении с контрольной молекулой специалист в данной области может ожидать, что аналог проявляет те же, схожие или улучшенные полезные свойства. Синтез и скрининг аналогов для идентификации вариантов известных соединений, обладающих улучшенными свойствами (например, повышенным связывающим сродством с молекулой-мишенью), являются подходом, хорошо известным в фармацевтической химии.
В контексте настоящего изобретения понятие «контактирующий» относится к комбинированию двух или нескольких агентов (например, полипептидов или низкомолекулярных соединений) или к комбинированию агентов и клеток. Контактирование может происходить in vitro, например, комбинирование двух или нескольких агентов или комбинирование исследуемого агента и клеток или клеточного лизата в пробирке или другом контейнере. Контактирование также может происходить в клетке или in situ, например, контактирование двух полипептидов в клетке путем совместной экспрессии в клетке рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих два полипептида, или в клеточном лизате.
В контексте настоящего изобретения понятия «гипералгезия» или «состояние гипералгезии» относятся к состоянию, при котором теплокровное животное чрезвычайно чувствительно к механическому, химическому или термическому стимулированию, которое вне такого состояния может быть безболезненным. Известно, что гипералгезия сопровождает некоторые физические повреждения организма, например повреждения, неизбежно связанные с физическими травмами. Также известно, что гипералгезия сопутствует определенным воспалительным состояниям у человека, например артриту и ревматизму. Таким образом, гипералгезия связана с болью, выраженной слабо, умеренно или сильно, например с болью при воспалительных состояниях, но не только при них (например, при ревматоидном артрите и остеоартрите), с послеоперационной болью, послеродовой болью, зубной болью (например, при кариесе и гингивите), с болью, связанной с ожогами, включая, но, не ограничиваясь ими, с солнечные ожоги, ссадинами, контузиями и т.п., с болью, связанной со спортивными травмами и растяжениями, воспалениями кожи, включая, но, не ограничиваясь ими, воспаление от ядовитого плюща, с аллергическими высыпаниями и дерматитами, а также с другими видами боли, которые повышают чувствительность к умеренным стимулам, например к вредному для здоровья холоду.
Понятие «модулировать» по отношению к контрольному белку (например, TRPA1) относится к ингибированию или активированию биологической активности контрольного белка (например, боли, сигнализирующей о связанной с ее проявлением активности TRPA1). Модулирование может приводить к повышению (т.е. активированию или стимулированию) или понижению регуляции (т.е. подавлению или устранению). Механизм действия может быть прямым, например, за счет связывания контрольного белка в качестве лиганда. Модулирование также может быть непрямым, например, через связывание с другой молекулой и/или ее модификацию, которая, в свою очередь, связывается с контрольным белком или модулирует его.
Понятие «невропатическая боль» означает боль, возникающую при состояниях или обстоятельствах, при которых происходит повреждение нервов. Понятие «невропатия» означает процесс заболевания, приводящий к повреждению нервов. Понятие «жгучая боль или каузалгия» означает состояние хронической боли после повреждения нерва, или состояние или заболевание, например, инфаркт миокарда, которое вызывает отраженную боль. Понятие «аллодиния» означает состояние, при котором субъект испытывает боль в ответ на нормальные не связанные с болью, стимулы, например легкое прикосновение. Понятие «анальгезирующий или обезболивающий агент» означает молекулу или комбинацию молекул, которые вызывают снижение боли. Анальгезирующий агент действует по механизму, отличному от ингибирования TRPA1, если его механизм действия (за счет электростатических или химических взаимодействий) не включает прямого связывания с TRPA1 и понижения функции TRPA1.
Понятия «полинуклеотид» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относятся к полимерной форме нуклеотидов (полирибонуклеотидам или полидезоксирибонуклеотидам). Иногда понятие «полинуклеотид» относится к последовательности, которая непосредственно не соприкасается с любой из двух кодирующих последовательностей, с которыми она непосредственно соприкасается (с 5'-конца и с 3'-конца) в естественном геноме организма, к которому этот полинуклеотид относится. Таким образом, настоящий термин обозначает, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК) независимо от других последовательностей. Полинуклеотиды могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами или модифицированными формами других нуклеотидов.
Понятия «полипептид» или «белок» (например, TRPA1) обозначают полимер, в котором мономерами являются остатки аминокислот, которые соединены друг с другом амидными связями. Если аминокислоты являются альфа-аминокислотами, они могут быть или L-оптическими изомерами, или D-оптическими изомерами, типичными являются L-изомеры, Фрагмент полипептида или белка (например, TRPA1) может иметь ту же или в существенной степени идентичную аминокислотную последовательность, что и у природного белка. Понятие «полипептид или пептид, в существенной степени идентичный» означает, что аминокислотная последовательность в большей своей части, но не целиком, такая же и сохраняет функциональную активность той родственной последовательности, с которой ее сравнивают.
Полипептиды в основном могут возникать в результате консервативных замещений, например, TRPA1 и варианты TRPA1, содержащие такие замены. Консервативная вариация означает замену аминокислотного остатка на другой, биологически близкий остаток. К примерам консервативных вариаций относятся замещения гидрофобного остатка, например изолейцина, валина, лейцина или метионина, на другой, или замещение одного полярного остатка на другой, например замещение аргинина на лизин, глутамина на аспарагиновые кислоты или глутамина на аспарагин и д.п. К другим иллюстративным примерам консервативных замещений относятся следующие замещения: аланина на серин, аргинина на лизин, аспарагина на глутамин или гистидин, аспартата на глутамат, цистеина на серин, глутамина на аспарагин, глутамата на аспартат, глицина на пролин, гистидина на аспарагин или глутамин, изолейцина на лейцин или валин, лейцина на валин или изолейцин, лизина на аргинин, глутамин или глутамат, метионина на лейцин или изолейцин, фенилаланина на тирозин, лейцин или метионин, серина на треонин, треонина на серин, триптофана на тирозин, тирозина на триптофан или фенилаланин, валина на изолейцин или на лейцин.
К понятию «субъект» относятся млекопитающие, особенно люди, а также другие животные, например лошади, собаки и кошки.
Понятие «вариант» применительно к контрольной молекуле (например, молекуле полипептида TRPA1 или модулятора TRPA1) относится к молекуле, которая в значительной степени схожа по структуре и биологическому действию с целой контрольной молекулой или ее фрагментом. Таким образом, в контексте настоящего изобретения две молекулы, которые проявляют сходное действие, рассматриваются в качестве вариантов, даже если композиция или вторичная, третичная или четвертичная структуры молекул не идентичны или если последовательности аминокислотных остатков не идентичны.
TRPA1-специфические ингибиторы
Поскольку TRPA1 является рецептором вредных химических, термических и механических стимулов, соединения - антагонисты TRPA1 применимы для снижения боли, связанной с соматическим восприятием, в том числе с механической чувствительностью, например с механической гипералгезией и аллодинией. Соединения, которые специфически ингибируют или устраняют механическую чувствительность, опосредованную TRPA1, могут иметь различные терапевтические или профилактические (например, антиноцицептивные) применения. Какая-либо молекула, которая ингибирует ионный канал TRPA1, может быть способна уменьшить боль, опосредованную вредными воздействиями, например механической чувствительностью. Однако молекулы, которые могут ингибировать другие термоТRР (например, TRPV1, TRPV2, TRPV3 и TRPM8) помимо TRPA1, могут оказывать воздействие на различные функции, выполняемые этими молекулами. Такие неизбирательные ингибиторы TRPA1, хотя они способны уменьшить боль, вероятно, обладают многими нежелательными побочными эффектами. Таким образом, молекулы, которые селективно ингибируют ионные каналы TRPA1, являются предпочтительными для таких терапевтических применений. С помощью специфического ингибирования передачи сигнала, опосредованной TRPA1, но не затрагивающего передачу сигнала другими каналами термоТКР, симптомы, проявляемые у субъекта с механической гиперестезией, могут быть уменьшены или подавлены.
К ингибиторам TRPA1, которые могут применяться в практике настоящего изобретения, относятся соединения, которые интерферируют с экспрессией, модификацией, регуляцией или активированием TRPA1, или соединения, которые понижают одну или несколько нормальных биологических активностей белка TRPA1 (например, его ионный канал). Селективный ингибитор TRPA1 в существенной степени блокирует активирование TRPA1 или ингибирует сигнальные активности TRPA1 в концентрации, при которой активирование или сигнальные активности других термоТRР (например, TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 и/или TRPM8) значительно не изменяются. Различные TRPA1-специфические антагонисты могут применяться по настоящему изобретению. Некоторые из таких TRPA1-специфических ингибиторов были идентифицированы в настоящем изобретении согласно описанному в приводимых ниже примерах. Эти соединения могут быть коммерческими или иным образом известными в данной области. Одним из таких соединений является соединение 18 ((Z)-4-(4-хлорофинил)-3-метилбут-3-ен-2-оксим). Это соединение может быть коммерческим, получаемым фирмой Maybridge (Корнуолл, Великобритания). Другим примером является соединение 40 (N,N'-бис-(2-гидроксибензил)-2,5-диамино-2,5-диметилгексан), описанное в US 4129556. В примерах, приводимых ниже, показано, что эти два соединения могут специфически ингибировать активирование или функцию TRPA1 и, таким образом, подавлять TRPA1-опосредованную механическую ноцицепцию. Они не обладают или обладают небольшим воздействием на активирование или проявление активностей других термоТRР, например TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 или TRPM8. Таким образом, эти два соединения могут применяться для лечения или облегчения механической гипералгезии, о чем подробно описано ниже.
Помимо указанных выше в качестве примера TRPA1-специфических антагонистов, дополнительные TRPA1-специфические ингибиторы могут быть легко идентифицированы с помощью способов, описанных в настоящем изобретении, или способов, описанных в данной области техники. К новым антагонистам TRPA1, которые могут быть идентифицированы данными способами скрининга, относятся низкомолекулярные органические соединения и антагонистические антитела, которые специфически ингибируют активность TRPA1 при распознавании механического стимула. Антагонистические антитела TRPA1, предпочтительно моноклональные антитела, могут быть получены, используя способы, хорошо известные в данной области. Например, моноклональные антитела, не являющиеся антителами человека, например антитела мышей или крыс, могут быть получены, например, иммунизацией животного полипептидом TRPA1 или его фрагментом (см., кн. Harlow и Lane: «Antibodies, A Laboratory Manual», изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, 1988). Такой иммуноген может быть получен из природного источника, пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией.
Новые низкомолекулярные TRPA1 могут быть идентифицированы скринингом исследуемых соединений по способности ингибировать активности ионного канала TRPA1. Для скрининга соединений, которые проявляют антагонизм в отношении сигнальных активностей TRPA1, сначала следует активировать TRPA1. Один из методов, позволяющих это осуществить, заключается в применении холода. Однако такой подход непрактичен при больших объемах скрининга. В способах, описанных в патентной заявке РСТ WO 05/089206, соединение - агонист TRPA1, например брадикинин, эвгенол, гингерол, метилсалицилат, аллицин и циннамальдегид, применяют для активирования TRPA1. Исследуемые соединения затем могут быть подвергнуты скринингу для обнаружения способности блокировать активирование TRPA1 каким-либо из этих агонистов TRPA1 или ингибировать сигнальные активности активированного ионного канала TRPA1.
В качестве примера, способы скрининга настоящего изобретения, обычно включающие контактирование TRPA1-экспрессирующих клеток с исследуемыми соединениями, и выявление соединения, которое устраняет или подавляет биологическую или сигнальную активность активированного TRPA1 в клетках в ответ на механическое воздействие. В клетке TRPA1 может быть активирован добавлением одного из указанных выше соединений - агонистов TRPA1 до, одновременно или после контакта клеток с исследуемыми соединениями. Может проводиться скрининг соединений для выявления способности модулировать поступление в клетки кальция или уровень содержания свободного межклеточного кальция у TRPA1-экспрессирующих клеток или культивируемых нейронов ГЗК в ответ на механический стимул. Ниже в примерах описано, что модулирующее действие исследуемых соединений на TRPA1-опосредованную чувствительность к механическим стимулам, может быть исследовано методом с применением планшет-ридера для флуориметрической визуализации (Fluormetric Imaging Plate Reader - FLIPR), используя TRPA1-экспрессирующие клетки СНО или культивируемые нейроны ГЗК крысы, в ответ на механическое давление (например, сосание) или гиперосмотический стресс. Они также могут быть оценены по способности модулировать токи мембран целых TRPA1 - экспрессирующих клеток, например, путем записи циннамальдегид-индуцированных TRPA1 токов в иссеченных пэтчах ооцитов Xenopus. Предпочтительно эти способы скрининга выполняют в формате высокой пропускной способности. Например, каждое исследуемое соединение может быть приведено в соприкосновение с TRPA1-экспрессирующими клетками в разных лунках планшета для микротитрований. Агонист TRPA1 находится в каждой из этих лунок для активирования TRPA1.
Если исследуемое соединение устраняет или подавляет действие активированных TRPA1 (например, действие ионного канала), исследуемый антагонист или ингибитор TRPA1 является выявленным. В качестве контроля у исследуемого антагониста TRPA1 также исследуют какое-либо воздействие на передачу сигнала или активность ионного канала одного или нескольких других термоТRР каналов, что показано в примерах, приводимых ниже. Это позволяет идентифицировать TRPA1-специфические ингибиторы, которые могут не влиять на нормальные функции других термоТRР каналов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выявленный TRPA1-специфический антагонист может быть дополнительно исследован на применимых моделях животных in vivo, например, путем исследования поведения (изучения отдергивания лапки) крыс или мышей, согласно приводимому ниже описанию в примерах. Дополнительные указания по проведению исследований гипералгезии описаны в литературе, например, Morqrich и др. Science 307, 2005, с.1468, Caterina и др. Science 288, 2000, с.306. В качестве контроля также могут применяться сходные модели животных чтобы удостовериться, что исследуемые TRPA1-специфические антагонисты не оказывают какого-либо существенного воздействия на другие термоТRР in vivo.
К исследуемым соединениям, которые могут быть подвергнуты скринингу для выявления новых модуляторов TRPA1 (например, ингибиторов), относятся полипептиды, миметики с бета-спиралью, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины, олигокарбаматы, полинуклеотиды (например, ингибиторные нуклеиновые кислоты, например, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты - миРНК), полипептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, производные, структурные аналоги или их комбинации. Некоторые исследуемые соединения являются искусственными, другие природными. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения исследуемые агенты являются низкомолекулярными органическими соединениями (например, соединениями с молекулярной массой примерно не более 500 или 1000). Предпочтительно исследования большой пропускной способности адаптируют и применяют для скрининга таких низкомолекулярных соединений. В некоторых методах комбинаторные библиотеки низкомолекулярных соединений-тестов могут быть легко применимы для скрининга низкомолекулярных модуляторов TRPA1. Ряд исследований в данной области техники может быть легко модифицирован или адаптирован к практике применения методов скрининга настоящего изобретения, например, описанных Schultz и др. в Bioorg Med Chem Lett 8, 1998, сс.2409-2414, Weller и др. Mol Divers. 3, 1997, сс.61-70, Fernandes и др. Curr Opin Chem Biol 2, 1998, сс.597-603, Sittampalam и др. Curr Opin Chem Biol 1, 1997, сс.384-391.
IV. Лечение механической гипералгезии TRPA1-специфическоми ингибиторами
Настоящее изобретение предусматривает способы снижения болевой чувствительности при физиологических и патофизиологических условиях (например, при аллодинии и гипералгезии), особенно восприятия боли, которая связана или опосредована механической чувствительностью через TRPA1. Например, механическая гипералгезия наблюдается при многих медицинских расстройствах. Например, воспаление может индуцировать гипералгезию. Примерами воспалений являются остеоартрит, колит, кардит, дерматит, миозит, неврит, коллагеновые болезни сосудов, например, ревматоидный артрит и волчанка. Субъекты с какими-либо из указанных состояний часто проявляют повышенную чувствительность к боли, причем механическая гипералгезия является составляющей этой чувствительности. К другим медицинским состояниям или процедурам, которые могут вызывать сильную боль, относятся травмы, хирургические вмешательства, ампутации, абсцессы, каузалгия, демиелинизирующие заболевания, тригеминальная невралгия, хронический алкоголизм, удар, синдром таламической боли, диабет, вирусные инфекции, вызывающие рак, и химиотерапия. Механическая чувствительность может играть важную роль в ноцицепции каких-либо из этих состояний.
Обычно способы предусматривают введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, которая содержит TRPA1-специфический ингибитор настоящего изобретения. TRPA1-специфический ингибитор может применяться отдельно или в соединении с другими известными анальгетическими агентами для облегчения боли у субъекта. Примерами таких известных анальгетических агентов являются морфин и моксонидин (US 6117879). К субъектам, которых можно лечить способами настоящего изобретения, относятся те субъекты, которые болеют механической гиперестезией (особенно гипералгезией), или те субъекты, у которых в медицинском состоянии или расстройстве принимает участие механическая чувствительность. К таким субъектам относятся люди, другие млекопитающие, а также другие субъекты или организмы, которые экспрессируют TRPA1. Субъекты могут находиться в таком состоянии, которое в настоящее время вызывает боль и, вероятно, будут продолжать вызывать боль. Они также были или могут длиться на протяжении процедуры или события, которые обычно имеют болезненные последствия. Например, у субъекта могут быть хронические болезненные состояния, например диабетическая невропатическая гипералгезия или коллагеновая болезнь сосудов. У субъекта также может быть воспаление, повреждение нервов или экспозиция токсином (включая экспозицию химиотерапевтическими агентами). Лечение или вмешательство предназначены для снижения боли у субъекта таким образом, что уровень боли у субъекта ощущается пониженным относительно уровня боли у субъекта, который ощущался до лечения.
Обычно лечение воздействует на субъект, ткань или клетку и для получения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим на основе полного или частичного предупреждения заболевания, его признаков или симптомов. Оно также может быть терапевтическим на основе полного или частичного излечения гипералгезии и ноцицептивной боли, связанных с расстройствами и/или побочными эффектами (например, болью, которая является признаком расстройств). Если субъектом является человек, уровень боли у пациента может быть оценен путем опроса для описания боли или сравнения ее с другими накопленными сведениями о боли. В другом варианте уровни боли могут быть калиброваны путем измерения у субъекта физических ответов на боль, например, высвобождения связанных со стрессом факторов или активности боль-трансдуцирующих нервов в периферической нервной системе или в ЦНС. Уровни боли также можно калибровать по измерению количества хорошо охарактеризованного анальгетика, необходимого для человека, чтобы он мог сказать, что симптомы боли прекратились.
Предпочтительно способы направлены на облегчение или острой, или хронической боли, которые имеют компонент механической гипералгезии. Различие между «острой» и «хронической» болью зависит от времени: острая боль проходит быстро (предпочтительно примерно за 48 ч, более предпочтительно примерно за 24 ч, наиболее предпочтительно примерно за 12 ч) после проявления состояния (например, при воспалении или при повреждении нерва), которое приводит к такой боли. Напротив, при этом отсутствует существенный временной промежуток между проявлением хронической боли и событием, которое приводит к такой боли. Такое отставание по времени составляет, по меньшей мере, 48 ч после каждого такого события, предпочтительно, по меньшей мере, примерно через 96 ч после такого события, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно через одну неделю после такого события. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяют TRPA1-специфический ингибитор для лечения субъекта, страдающего от боли, связанной с воспалением. Такая связанная с воспалением боль может быть острой или хронической и может быть вызвана рядом каких-либо связанных с воспалением состояний, к которым относятся, но которыми перечень не ограничивается, солнечный ожог, ревматоидный артрит, остеоартрит, колит, кардит, дерматит, миозит, неврит и коллагеновая болезнь сосудов.
В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрено лечение субъектов с невропатической болью. Таких субъектов по невропатической классификации можно разделить на радикулопатических, мононевропатических, множественных монопатических, полиневропатических или плексопатических. По такой классификации заболевания могут быть вызваны разными состояниями или процедурами, приводящими к повреждению нервов, включая, но, не ограничиваясь ими, травмы, удар, демиелинизирующие заболевания,, абсцесс, хирургические вмешательства, ампутацию, воспаления нервов, жгучую боль, диабет, коллагеновые болезни сосудов, тригеминальную невралгию, ревматоидный артрит, токсины, рак (который может вызвать прямое или удаленное (например, паранеопластическое) повреждение нервов), хронический алкоголизм, герпесные инфекции, СПИД, химиотерапию. Нервы, повреждение которых приводит к гипералгезии, могут быть периферическими или могут относиться к ЦНС. Такой вариант осуществления настоящего изобретения основывается на экспериментах, показывающих, что введение ингибитора TRPA1 существенно снижает гипералгезию, вызванную диабетом, химиотерапией или повреждением нервов из-за травмы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения субъектам, нуждающимся в лечении или облегчении механической гипералгезии, вводят композиции, в которых ингибитор TRPA1 комбинируют с одним или несколькими дополнительными обезболивающими агентами. Это связано с тем, что лекарственное средство для лечения определенного типа боли часто обеспечивает только частичное эффективное ослабление боли, поскольку оно взаимодействует только с одним из многих боль-трансдуцирующих метаболических путей. Однако боль, связанная с заболеваниями или медицинскими состояниями, часто включает множественные ноцицепторы и различные сигнальные пути, например, связанные и с механической чувствительностью, и с термочувствительностью. Следовательно, при таких состояниях обычно требуется более одного агента, понижающего боль, для облегчения ноцицепции. В некоторых других вариантах применения ингибиторы TRPA1 могут вводиться в комбинации с обезболивающими агентами, которые действуют на разные точки в процессе восприятия боли. Например, анальгетики одного класса, например нестероидные противовоспалительные средства (например, ацетаминофен, ибупрофен, индометацин), понижают регуляцию химических мессенджеров стимулов, которые выявляются ноцицепторами. Лекарственные средства другого класса, например опиоиды, изменяют процессинг болевой информации в ЦНС. Также могут быть применены другие анальгетики, например, местного действия, например противосудорожные средства и антидепрессанты. Введение лекарственных средств одного или нескольких классов помимо ингибиторов TRPA1 может обеспечить более эффективное ослабление боли.
V. Фармацевтические композиции и способы введения
Субъектам, нуждающимся в лечении или ослаблении боли, опосредованной вредной чувствительностью к механическим стимулам, может быть введено только одно TRPA1-специфическое ингибирующее соединение. Однако введение фармацевтической композиции, которая содержит TRPA1-специфический ингибитор, является более предпочтительным. Примерами TRPA1-специфических ингибиторов, которые могут быть применены в составе фармацевтических композиций, являются соединение 18 и соединение 40, описанные ниже в примерах. Новые ингибиторы TRPA1, которые могут быть выявлены в соответствии со способами скрининга настоящего изобретения, также могут быть применены. Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую комбинацию, например набор. Такая фармацевтическая комбинация может содержать действующий агент, являющийся TRPA1-ингибирующим соединением, описанным в настоящем изобретении, в свободной форме или в композиции, по меньшей мере, с одним сопутствующим агентом, а также инструкции по введению этих агентов.
Фармацевтические композиции, которые включают TRPA1-ингибирующее соединение, могут быть приготовлены в различных формах. Приемлемыми формами твердых или жидких фармацевтических препаратов являются, например, гранулы, порошки, таблетки с покрытием (филм-таблетки), (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, мази, аэрозоли, капли или инъекционные растворы в ампулах, а также препараты с длительным высвобождением действующих соединений. Они могут быть приготовлены в соответствии со стандартными протоколами, хорошо известными в данной области, например, см. кн.: Remington «The Science and Practice of Pharmacy, под ред. Gennaro, изд-во Lippincott Williams & Wilkins, изд. 23-e, 2003. Фармацевтические композиции обычно содержат эффективное количество TRPA1-ингибирующего соединение, которое достаточно для понижения или облегчения боли, связанной с TRPA1 или опосредовано TRPA1. Помимо TRPA1-ингибирующих соединений, фармацевтические композиции также могут содержать определенные носители, которые повышают или стабилизируют композицию или облегчают приготовление композиции. Например, TRPA1-ингибирующее соединение может быть объединено с белками-носителями, например, яичным альбумином или сывороточным альбумином, перед их введением для повышения стабильности или усиления фармакологических свойств. Различные формы фармацевтических композиций также могут содержать эксципиенты и добавки и/или дополнительные средства, например разрыхлители, связующие агенты, покрывающие агенты, агенты набухания, агенты скольжения, ароматизаторы, подсластители и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно применяемые в данной области техники, например очищенную воду.
Фармацевтически приемлемые носители определяют частично в зависимости от вводимой композиции, частично в зависимости от применяемого способа введения композиции. Они также могут быть и фармацевтически, и физиологически приемлемыми с точки зрения совместимости с другими ингредиентами и не вредны для субъекта. Носитель может быть представлен в широком диапазоне форм в зависимости от формы препарата, требуемого для введения, например, перорального, подъязычного, ректального, назального, внутривенного или парентерального. Например, неводными растворителями могут быть пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, например оливковое, и органические сложные эфиры, которые могут быть введены инъекцией, например этилолеат. Носители для герметической повязки могут применяться для повышения кожной проницаемости и повышения абсорбции антигена. Жидкие дозированные формы для перорального введения обычно могут включать липосомный раствор, содержащий жидкую дозированную форму.
Фармацевтическая композиция, содержащая TRPA1-ингибирующее соединение, может быть введена местно или системно в терапевтически эффективном количестве или дозе. Она может быть введена парентерально, энтерально, инъекцией, быстрой инфузией, носоглоточной адсорбцией, кожной адсорбцией, ректально или перорально. Эффективное количество означает количество, достаточное для снижения или подавления ноцицептивной боли или ноцицептивного ответа у субъекта. Такое эффективное количество может варьировать у разных субъектов в зависимости от индивидуальной чувствительности к боли, роста, массы тела, возраста и состояния здоровья, а также от источника боли, способа введения ингибитора TRPA1, конкретного введенного ингибитора и других факторов. В результате целесообразно эмпирически определить эффективное количество для определенного субъекта при определенном наборе обстоятельств.
Для конкретного соединения, являющегося ингибитором TRPA1, специалист в данной области может легко определить эффективное количество агента, который модулирует ноцицептивный ответ с помощью обычных фармацевтических методов. Обычно дозировки, применяемые in vitro, могут быть полезны в качестве отправных данных для определения количеств, эффективных для введения фармацевтической композиции in situ, а модели животных могут быть определены для выявления эффективных дозировок для лечения определенных расстройств. Чаще соответствующую терапевтическую дозу можно определить путем клинических исследований, которые проводят на млекопитающих для определения максимально переносимой дозы и на здоровых людях для определения безопасной дозы. За исключением определенных обстоятельств, при которых могут потребоваться повышенные дозировки, предпочтительная дозировка TRPA1-специфического ингибитора обычно находится в диапазоне примерно от 0,001 до примерно 1000 мг, чаще примерно от 0,01 до примерно 500 мг в сутки. Основное правило заключается в том, что введенное количество TRPA1-специфического ингибитора является наименьшей дозировкой, которая эффективно и надежно предупреждает или минимизирует состояние субъектов. Следовательно, указанные выше дозовые диапазоны предназначены для того, чтобы предоставить общее указание для подбора доз, но не ограничивают области охвата настоящего изобретения. Дополнительные указания по приготовлению и введению фармацевтических композиций настоящего изобретения также известны в данной области техники. См., например, кн.: «Goodman & Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics», 2001, под ред. Hardman и др., изд-во McGraw-Hill Professional, 10-е изд., кн.: Remington «The Science and Practice of Pharmacy», 2003, под ред. Gennaro, 20-е издание, изд-во Lippincott Williams & Wilkins, кн.: «Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems», 1999, под ред. Ansel и др., 7-е издание, изд-во Lippincott Williams & Wilkins.
Примеры
Приводимые ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но никоим образом не ограничивают его.
Пример 1. Ионный канал TRPA1 является полимодальным сенсором вредных механических или термических стимулов
Исследуют, может ли канал TRPA1 активироваться под воздействием механических сил. Электрофизиологическую реакцию термоТRР-экспрессирующих клеток яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary-СНО) исследуют двумя разными методами изучения механического стресса: применением давления, используя отсасывающую пипетку, и изменением внешней осмолярности. При записях на целых клетках TRPA1-экспрессирующие клетки показывают ответы в виде жесткого тока на стимул, который вызывает сжатие клетки (либо отсасывание с отрицательным давлением -100 мм рт. ст. (n=10), либо гиперосмотический раствор 450 мОсм (n=8)) (фиг.1а), но не набухание клетки [либо при давлении +100 мм рт. ст. (n=11), либо при применении раствора 220 мОсм (n=8)]. Токи, вызванные давлением, гипертоничностью и холодом (n=62), показывают схожую десенсибилизацию, а также обладают сходными потенциалами реверсии и очистительными свойствами, подтверждая, что такие токи, вызванные чувствительностью к механическим стимулам, являются следствием активирования канала TRPA1 (фиг.1б). Также установлено, что нетрансфицированные контрольные клетки СНО и другие клетки СНО, экспрессирующие термоТRР (TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPM8), не отвечают на механические стимулы (данные не представлены), подтверждая, что ответ канала TRPA1 является специфическим.
3+
3+
Известно, что TRPV4 и другие представители семейства Drosophila TRPV отвечают на гипотонические растворы и что исследования по выбиванию TRPV4 показывают, что этот канал необходим для ответов на нормальное остаточное давление. Нейроны чувствительности к механическим стимулам часто классифицируются на нейроны с высоким или низким порогом, характерным для ответов на боль и прикосновение, соответственно (фиг.1в). TRPA1-экспрессирующие клетки СНО активируют при -90 мм рт.ст. или выше в соответствии с нативными механическими рецепторами с высоким порогом, участвующими в ощущении боли (Cho и др., J Neurosci, 22, 2002, с.1238). Интересно, что предварительная обработка холодом (20°С) сенсибилизирует ответ TRPA1 на низкий механический порог -30 мм рт.ст. (n=5), показывая, что порог активирования TRPA1 может модулироваться (фиг.1г). Было установлено, что применение 5 мкМ рутения красного - известного блокатора TRPA1, полностью блокирует токи чувствительности к механическим стимулам (для -100 мм рт.ст., n=8; для 450 мОсм, n=5, данные не представлены) в соответствии с ответами на механические стимулы, возникающие в канале TRPA1. Гадолиний (Gd) рассматривают в качестве блокатора нативных открываемых под воздействием механических стимулов ионных каналов в тканях животных (Martinac и др. Physiol Rev 81, 2001, с.685). Установлено, что вымачивание в 10 мкМ Gd полностью и обратимо блокирует токи TRPA1 в ответ на 2-минутную обработку раствором 450 мОсм (n=5) (фиг.2а) или давлением -100 мм рт. ст. (n=6). FM1-43 является красителем-стирилом, который специфически метит сенсорные клетки за счет поступления через открытые каналы трансдукции. В настоящем изобретении установлено, что обработка FM1-43 приводит к мечению клеток СНО, трансфицированных TRPA1 и обработанных циннамальдегидом. Напротив, в TRPA1-экспрессирующие клетки, которые не были активированы циннамальдегидом, краситель не поступал (данные не представлены). Кроме того, было установлено, что FM1-43 в концентрации 10 мкМ способен блокировать индуцированные циннамальдегидом токи в TRPAl-экспрессирующих клетках СНО (n=8). Эти результаты подтверждают, что TRPA1 является каналом сенсорной трансдукции.
Для того чтобы убедиться, что наблюдаемый ответ на механическое воздействие не является артефактом, связанным с гетерологичной системой экспрессии, в настоящем изобретении исследуют, могут ли нативные TRPA1-экспрессирующие нейроны также отвечать на такой стимул. 5/6 циннамальдегид-чувствительных нейронов ГЗК (предположительно экспрессирующих TRPA1) отвечают на приложение отрицательного давления (-200 мм рт. ст.) при отсасывании, причем у нейронов, не чувствительных к циннамальдегиду, эта величина составляла 0/21 (16 из 21 были капсаицин-чувствительными) (фиг.2б). Ранее сообщалось, что миллимолярные концентрации камфоры ингибируют основные токи и активирование холодом или агонистом канала TRPA1. Было установлено, что камфора в концентрации 2 мМ также способна полностью блокировать механический ответ TRPA1 в клетках СНО до применяемого давления -100 мм рт. ст. (n=5, фиг.2в). Сходным образом токи в нейронах ГЗК в ответ на давление -150 мм рт. ст. полностью ингибируются применением камфоры в той же концентрации (фиг.2г) (n=15, 12 из 15 являются циннамальдегид-чувствительными). Эти данные четко подтверждают, что нативные TRPA1-экспрессирующие нейроны ГЗК являются механочувствительными, проявляющими свойства, сопоставимые с механочувствительностью TRPA1 в клетках СНО.
Пример 2. TRPA1 играет важную роль в восприятии механической боли in vivo
3+
На следующем этапе в настоящем изобретении выясняют, может ли сильная блокировка TRPA1 оказывать какое-либо физиологическое воздействие на восприятие боли. RR, Gd или камфора не являются специфическими соединениями и не могут применяться in vivo. В настоящем изобретении с применением метода FLIPR, определяющего истечение кальция, исследуют способность 43648 низкомолекулярных соединений блокировать активирование циннамальдегидом TRPA1 человека в клетках линии СНО. Установлено, что несколько наилучших соединений являются аналогами циннамальдегида.
50
50
Предпринимают углубленное исследование одного из таких аналогов, соединения 18, (Z)-4-(4-хлорофинил)-3-метилбут-3-ен-2-оксим (фирма Maybridge, Корнуолл, Великобритания). Соединение 18 блокирует активирование TRPA1, осуществляемое 50 мкМ циннамальдегида в клетках СНО методом FLIPR при величине IC 3,1 мкМ и 4,5 мкМ для человеческих и мышиных клонов соответственно (фиг.3Б). Напротив, оно не блокирует TRPV1, TRPV3, TRPV4 и TRPM8 в концентрации 50 мкМ (данные не представлены). Соединение 18 изменяет величину ЕС для циннамальдегида в зависимости от концентрации в диапазоне от 50 мкМ (контроль) до 220 мкМ (при концентрации соединения 18, равной 25 мкМ), подтверждая, что два структурных аналога способны связываться с одним и тем же сайтом связывания, но оказывают разное воздействие на активность канала (фиг.3Б). Соединение 18 блокирует индуцированные циннамальдегидом токи TRPA1 в иссеченных пэтчах ооцитов Xenopus (фиг.3В) и ответы TRPA1 в клетках СНО, индуцированные холодом или давлением (данные не представлены). Для определения эффективности и специфичности соединения 18 in vivo осуществляют совместные инъекции циннамальдегида и соединения 18 в задние лапки мышей. Соединение 18 в концентрации 1-10 мМ не вызывает какой-либо поведенческой реакции (данные не представлены). Однако соединение 18 в существенной степени блокирует болевые реакции, индуцированные циннамальдегидом, но не капсаицином, что подтверждает эффективность и специфичность этого соединения по блокированию восприятия боли (фиг.3Г).
Понятие «гипералгезия» означает повышенный ответ на болевой стимул (температурный и/или механический) в ходе травмы или воспаления. Установили, что ноцицептивные ответы на сильную боль или сильное давление, оказываемые на лапку, не меняются под воздействием соединения 18 (данные не представлены). Однако соединение 18 облегчает механическую гипералгезию, индуцированную инъекцией полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в заднюю лапку, при введении в заднюю лапку через 24 ч после ПАФ (фиг.4а). Сходное снижение механического ноцицептивного поведения устанавливают на модели кратковременной гипералгезии (после инъекции брадикинина - БК) (фиг.4б). В результате был получен важный результат, заключающийся в том, что соединение 18 не блокирует ПАФ- или БК-индуцированную тепловую гипералгезию (данные не представлены), предоставляя дополнительное подтверждение специфичности данного соединения. Описанные в настоящем изобретении исследования поведения также проводят с соединением, блокирующим TRPA1, но имеющим отличную химическую структуру (соединение 40: N,N'-бис-(2-гидроксибензил)-2,5-диамино-2,5-диметилгексан), причем получают весьма схожие результаты. Эти данные, полученные in vivo, показывают, что блокирование TRPA1 облегчает гипералгезию, вызываемую механическим воздействием, но не нагреванием.
Пример 3. Дополнительное доказательство функции TRPA1 при механической или холодовой гипералгезии
В настоящем изобретении высказывают предположение, что на мышах нельзя исследовать ответ на вредный для организма холод. Например, мыши не проявляют ноцицептивных ответов на низкие температуры, например на 0°С, а также индуцированной холодом аллодинии в ответ на ПАФ. Ранее обсуждалась активация холодом TRPA1, а на крысах in vivo ранее была подтверждена гипералгезия холодом (Jordt и др. Nature 427, 2004, с.260, Obata и др., J Clin Invest 115, 2005, с.2393). В связи с этим в настоящем изобретении используют крыс для выяснения роли TRPA1, используя соединение 18. Было установлено, что канал TRPA1 крыс также блокируется соединением 18, наподобие TRPA1 человека или мыши (данные не представлены). Наблюдают жесткое блокирование ПАФ-индуцированной гипералгезии холодом у крыс соединением 18 при 5°С (фиг.4В). Совместно представленные данные подтверждают, что TRPA1 выступает в качестве рецептора холода и механорецептора in vivo, но только после сенсибилизации признаками, сопутствующими воспалению или травме. Также было установлено, что мыши, не экспрессирующие TRPV1, четко проявляют фенотип термической гипералгезии, но они не проявляют или проявляют умеренно фенотип при острой чувствительности к температуре (Davis и др. Science 405, 2000, с.183, Caterina и др. Science 288, 2000, с.306). Роль TRPA1 при механической гипералгезии может быть объяснена, если TRPA1 сенсибилизируется в ответ на более низкое пороговое значение механического стимула в ответ на воспаление. Это напоминает модулирование тепловой сенсибилизации TRPV1. В норме TRPV1 обладает порогом активирования при 43°С, но разнообразие сигналов при воспалении сенсибилизирует TRPV1 для активирования при более низких температурах.
Для исследования этой возможности определяют, может ли передача сигнала БК понизить порог механического раздражителя для канала TRPA1. Через 3 мин предварительной обработки 1 нмолем БК клетки СНО, трансферированные совместно рецептором брадикинина В2 и TRPA1, показывают ответы на механический стимул до - 60 мм рт. ст. (фиг.4г). Сенсибилизированный ответ TRPA1 обеспечивает мощный молекулярный механизм для физиологической роли TRPA1 в механической гипералгезии. В клетках СНО ответ TRPA1 на давление не является мгновенным (начало ответа варьирует и измеряется в секундах), следовательно, TRPA1 прямо не активируется растяжением и, возможно, активируется через второй сигнал. Интересно, что применение БК снижает порог активирования и укорачивает задержку.
Пример 4. Основные материалы и способы
+
2+
2
2
2
2
Электрофизиология клеток млекопитающих: термоТRР-экспрессирующие клетки СНО (экспрессирующие TRPV1 крысы, TRPV2 крысы, TRPV3 мыши, TRPV4 крысы, TRPM8 мыши и TRPA1 мыши), контрольные клетки СНО и культивируемые нейроны ГЗК приготовляют по методу, описанному в работах Story и др. Cell 112, 2003, с.819, и Bandell и др. Neuron 41, 2004, с.849. Электрофизиологические записи проводят по методике, описанной в работе Bandell и др. Neuron 41, 2004, с.849. Вкратце, клетки СНО фиксируют при -60 мВ и каждые 4 сек проводят измерения длительностью 0,8 сек при изменении напряжения от -80 мВ до +80 мВ. Токи от нейронов ГЗК записывают при напряжении -60 мВ и для соответствующей кривой тока-напряжения стадию напряжения при +20 мВ на протяжении 300 мсек используют за 40 мсек перед подъемом длительностью 800 мсек от -80 мВ до +80 мВ для минимизации контаминации пропускаемого обусловленного напряжением тока Na или Са. Пипеточный раствор для экспериментов по температуре и гиперосмотическому давлению состоит из (в мМ) 140 CsCl, 5 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATФ, 0,2 NaГTФ, pH доводят до величины 7,4 с помощью CsOH. Основной внешний раствор для этих экспериментов состоит из (в мМ) 140 NaCl, 5 КС1, 10 HEPES, 2 СаСl, 1 MgCl, pH доводят до величины 7,4 с помощью NaOH. Маннит применяют для изменения осмолярности гипертонических растворов. Для TRPV3 мышей и TRPV2 крыс внешний кальций замещают 5 ммолями EGTA. Глюконат замещают на хлорид при (+)-давлении и гипотонических экспериментах для элиминации потенциала для эндогенных активированных набуханием токов хлорида. Для этих экспериментов закапываемый раствор (295 мОсм) состоит из (в мМ) 125 Cs-глюконата, 15 CsCl, 5 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATФ, 0,2 NaГТФ, pH доводят до величины 7,4 с помощью CsOH. Внешний раствор состоит из (в мМ) 90 Na-глюконата, 10 NaСl, 5 К-глюконата, 10 HEPES, 2 СаСl, 1 MgCl, pH доводят до величины 7,4 с помощью NaOH. Осмолярность изменяют маннитом до 220 мОсм (до гипотонического раствора) или до 298 мОсм (до изотонического раствора). (±)-Давление нагнетают гидростатически с помощью регистрирующей пипетки, используя давление шприца (Hamill и др. Annu Rev Physiol 59, 1997, с.621), и подвергают мониторингу с помощью прибора мониторинга давления (фирма World Precision Instruments). Приборы регуляции температуры Warner (приборы ТС-324В и CL-100) применяют для нагревания или охлаждения разбрызгиваемых растворов для бани. Отбраковывают эксперименты, в которых контактные разности потенциалов/устойчивости доступа существенно варьируют или развивается ток покоя выше -100 пА при -60 мВ без каких-либо стимулов. В отличие от TRPA1 все другие исследованные каналы термоТRР не реагируют на механические стимулы. Число клеток (n), исследуемых в диапазоне от -100 мм рт. ст. до -300 мм рт. ст., при ~+100 мм рт. ст., при 450 мОсм и 220 мОсм, для каждого типа клеток соответственно составляет: для клеток СНО n=7, 14, 5, 12; для клеток TRPV1 n=6, 5, 7, 5; для клеток TRPV2 n=4, 5, 3, 5; для клеток TRPV3, n=3, 2, 3, 0; для клеток TRPM8 n=12, 4, 10, 0. Известно, что клетки TRPV3 и TRPM8 не реагируют на гипотонические растворы.
2
2
2
4
2
2
4
Эксперименты с FM1-43: клетки СНО, меченные FM1-43, трансфицируют TRPA1 мыши (м TRPA1) по известной методике (Meyers и др. J Neurosci 23, 2003, с.4054). Вкратце, клетки СНО трансфицируют, используя реагент Fugene (фирма Roche) с плазмидой мTRPAl-pCDNA5. Для ложной трансфекции клетки СНО обрабатывают реагентом Fugene, но без какой-либо плазмидной ДНК. Через 24 ч после трансфекции клетки инкубируют в течение 5 мин с 200 мкмолями циннамальдегида в физиологическом буфере (включающем (в мМ) 130 NaCl, 3 КСl, 2 MgCl, 2 СаСl, 10 HEPES, 10 глюкозы) при комнатной температуре, затем инкубируют 3 мин с 10 мкмолями FM1-43. Затем клетки энергично промывают и исследуют. мTRPA1- и чТRРА1-экспрессирующие клетки СНО исследуют при конфигурации фиксирования пэтчей целых клеток, используя систему PatchXpress (фирма Axon Instruments) для воздействия красителя FM1-43 на активирование TRPA1. Клетки выращивают в течение суток перед тестированием и индуцируют применением 0,5 мкг/мл тетрациклина согласно ранее описанному методу (Story и др. Cell 112, 2003, с, 819). Непосредственно перед тестированием клетки обрабатывают трипсином и повторно суспендируют в средах DMEM, не содержащих кальция (фирма Invitrogen). Записи проводят во внеклеточном растворе, содержащем (в мМ) 2,67 КСl, 1,47 КНРO, 0,5 MgCl, 138 NaCl, 8 NaHPO, 5,6 глюкозы. Межклеточный раствор содержит (в мМ) 140 КСl, 10 HEPES, 20 глюкозы, 10 HEDTA и 1 мкМ забуференного свободного кальция. Поддерживаемые токи при -80 мВ применяют для количественного анализа активирования и подавления канала TRPA1. Эксперименты включают первоначальное применение 100 мкмолей циннамальдегида для ослабления тока в клетках с последующим вторым добавлением циннамальдегида и 10 мкмолей FM1-43. Подавление тока наблюдают у 7/8 клеток, экспрессирующих TRPA1 мыши (м TRPA1), и 3/4 клеток, экспрессирующих TRPA1 человека (чТRРА1). В среднем наблюдают блокирование тока на 50%.
Скрининг с применением планшет-ридера для флуориметрической визуализации (FLIPR): клетки СНО, экспрессирующие TRPA1 человека, вносят в планшеты с 384 лунками при концентрации ~8000 клеток/лунку. Клетки переносят в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) и нагружают красителем FLUO-4, чувствительным к кальцию, используя набор для исследования FLIPR Calcium 3 Assay Kit (фирма Molecular Devices, Sunnyvale, Калифорния), за 1 ч до проведения исследования. Исследования проводят, используя набор FLIPR2 Kit (фирма Molecular Devices, Sunnyvale, Калифорния). Все соединения разводят в ФСБ, первоначально используя исходные высоко концентрированные растворы в ДМСО, и вносят по мере сбора данных с помощью FLIPR2 внутренней головки пипетки. Конечная концентрация ДМСО никогда не превышает 0,5%.
2
2
Пэтчи, иссеченные из ооцитов Xenopus: TRPA1 человека клонируют в экспрессирующем векторе рОХ (Jegla и др. J Neurosci 17, 1997, с.32) и получают транскрипты кРНК, используя набор Т3 mMessage Machine kit (фирма Ambion, Техас). 17 зрелых дефолликулированных ооцитов Xenopus вводят инъекцией в 50 нлитрах кРНК TRPA1 человека в концентрации ~1 мкг/мл. Ооциты инкубируют в среде ND96 (96 ммолей NaСl, 2 ммоля КС1, 1 ммоль MgCl, 1,8 ммоля СаСl, 5 ммолей HEPES, рН 7,4), обогащенной пируватом натрия (2,5 ммоля), пенициллином (100 Ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) в течение 3-5 суток для обеспечения экспрессии. Желточные оболочки механически удаляют перед проведением регистрации. Регистрацию проводят при фиксации напряжения (вольт-клампе) от иссеченных пэтчей при конфигурации изнутри наружу при комнатной температуре пипетками 1-1,5 MΩ. Основание бани выделяют, используя агаровый мостик. Емкостное сопротивление и последовательное сопротивление компенсируют и применяют растворы, которые элиминируют нативные кальций-активированные хлоридные токи (пэтч-электрод (в ммолях): 140 NaMES, 4 NaCl, 1 EGTA, 10 HEPES, рН 7,2, раствор для бани: 140 KMES, 4 KCl, 1 EGTA, 10 HEPES, рН 7,2). Соединения вносят в раствор для бани. Токи записывают, используя амплификатор Multiclamp 700B и приобретенный набор pCLAMP.
Исследования поведения: мышей (линия С57В16 вида Mus musculus) в возрасте 8-10 недель и крыс линии Sprague Dawley массой 150-250 г используют для всех исследований поведения. Животных подвергают акклиматизации в течение 20-60 мин, чтобы они могли исследовать окружающую среду перед проведением всех экспериментов. Для всех статистических расчетов применяют критерий Стьюдента. Все величины ошибок обозначают среднюю величину стандартной ошибки (SEM). Используют термические пластины, метод Hargreaves (прибор Plantar Analgesia meter) и аппарат фон Фрея (прибор Dynamic Plantar Aesthesiometer) фирм UGO Basile и Columbus instruments. Механическую или термическую гипералгезию исследуют согласно методу, изложенному в работе Morqrich и др. Science 307, 2005, с.1468, Caterina и др. Science 288, 2000, с.306). Вкратце, мышей подвергают акклиматизации в течение 60 мин к среде, в которой проводится исследование, перед проведением всех экспериментов. Сначала измеряют ответы на исходном уровне, а затем инъецируют 10 нмолей брадикинина (БК) в кожу левой задней лапки. Порог фон Фрея или задержку отдергивания лапки измеряют через 5, 15 и 30 мин после инъекции. Иногда совместно вводят инъекцией 1 ммоль соединения 18 в левую заднюю лапку для изучения его обезболивающего эффекта. Для теста ПАФ-индуцированной гипералгезии мышам инъецируют 5 мкг ПАФ в 10 мкл (Caterina и др. Science 288, 2000, с.306; Сао и др. Nature 392, 1998, с.390) и 50 мкг в 100 мкл (эмульсия 1:1 вазелинового масла и физиологического раствора; Obata и др. J Clin Invest 115, 2005, с.2393) инъецируют крысам и на протяжении 24 ч проводят измерения. Перед измерением животных подвергают повторной акклиматизации к внешней среде в течение 20-60 мин. Различные временные точки используют для экспериментов с ПАФ-инфицированными животными (30 мин, 1, 1½, 2 и 4 ч после инъекции соединения 18).
Соединения: все химические реактивы получены от фирмы Sigma-Aldrich, в противном случае принадлежность другой фирмы указана. Капсаицин получен от фирмы Fluka. Исходные растворы рутения красного (10 мМ) или гадолиния хлорида (100 мМ) приготовляют в виде водных растворов и разводят перед применением исследуемыми растворами.
Следует иметь ввиду, что описанные примеры и варианты осуществления настоящего изобретения предназначены только для иллюстрации, и специалистам в данной области очевидно, что различные модификации или изменения настоящего изобретения, произведенные в рамках охвата описания и формулы настоящего изобретения. Хотя в настоящем изобретении могут применяться какие-либо способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем изобретении, предпочтительными являются способы и материалы, описанные в настоящем изобретении.
Все публикации, последовательности GenBank, штаммы коллекции АТСС, патенты и патентные заявки, упоминаемые в настоящем изобретении, включены в него в виде ссылок на их целостность для всех конкретных установленных целей.