Способ получения биологически активной субстанции с пребиотическим эффектом на основе Medusomyces gysevii
METHOD OF OBTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE WITH PREBIOTIC EFFECT BASED ON MEDUSOMYCES GYSEVII

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности способу получения биологически активной субстанции на основе плотной биомассы (зооглеи) Medusomyces gysevii (чайный гриб), обладающей пребиотическим эффектом, и может быть использовано в качестве компонента кормов и премиксов для теплокровных животных с целью нормализации состава и функций собственной микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Уровень техники
Известен способ получения биологически активного напитка на основе культуральной жидкости Medusomyces gysevii и его концентрата, который включает инкубацию зооглеи чайного гриба в аэробных условиях на питательной среде из раствора сахаросодержащего продукта в настое чая при температуре 12…40°С в течение 2-110 суток. После удаления зооглеи полученную культуральную жидкость инкубируют в аэробных условиях, перемешивая ее со скоростью 0,1…2 м/сек при температуре 12-40°С в течение 40-80 часов. Далее готовый биологически активный напиток выпаривают в диапазоне температур 45…55°С до получения массовой доли сухих веществ более 60 масс. % (см. патент на изобретение RU 2500299, кл. A23L 2/395).
Недостатком данного способа является наличие большого количества отходов при производстве и отсутствии пребиотического эффекта у продукта.
Известен способ приготовления напитка, обладающего биологической активностью, и напиток, полученный данным способом. Способ заключается в сбраживании первоначально сахаросодержащей жидкости с помощью дрожжевой культуры (хлебопекарных дрожжей, или винных дрожжей, или иных дрожжевых культур) в течение времени от 1 часа до 14 суток при температуре от 20 до 40°С, а затем повторного сбраживания в присутствии культуры чайного гриба в течение времени от 10 часов до 30 суток (см. патент на изобретение RU 2337592, кл. A23L 2/38, A23L 2/70).
Недостатком данного способа является сложность технологического процесса и отсутствие пребиотического эффекта у продукта.
Известен способ получения композиции, обладающей биологической активностью, и способ получения зооглеи чайного гриба. По первому варианту получение биологически активной композиции происходит путем смешивания сахаросодержащего вещества, культуральной жидкости чайного гриба и настоя чаги и сбраживания полученной смеси. При этом сброженную смесь целесообразно дополнительно выдерживать в анаэробных условиях и/или при температуре не выше 10°С. По второму варианту получение биологически активной композиции происходит путем смешивания состава, содержащего сахар, компонента, содержащего культуру чайного гриба, и настоя чаги и сбраживания полученной смеси, согласно которому в качестве состава, содержащего сахар, используют предварительно сброженный состав. При этом предпочтительно в качестве предварительно сброженного состава использовать квас. Целесообразно также сброженную смесь дополнительно выдерживать в анаэробных условиях и/или при температуре не выше 10°С. По третьему варианту получение биологически активной композиции происходит путем предварительного приготовления зооглеи чайного гриба, смешивания сахаросодержащего вещества с жидкостью и с настоем чаги и сбраживания полученной смеси в присутствии зооглеи чайного гриба. Предпочтительно при этом приготовление зооглеи осуществлять путем выращивания в жидкой среде, отличной от жидкости, применяемой при смешивании. Он заключается в том, что в раствор черносмородинового сока (100 грамм ягод протертых с добавлением 1000 мл воды) было добавлено 100 грамм сахара и в полученную композицию была внесена культура чайного гриба. После 7 дней брожения при температуре 25°С на поверхности образовалась зооглея чайного гриба толщиной 5 мм, которая представляла собой пленку красного оттенка. Пленка была отделена от культуральной жидкости, отжата на прессе и высушена в течение 3 часов при температуре 40°С. При этом перед высушиванием производилось измельчение зооглеи на мини-куттере (не являющееся обязательным). Также целесообразно сброженную смесь дополнительно выдерживать в анаэробных условиях и/или при температуре не выше 10°С (см. патент на изобретение RU 2280394, кл. A23L 2/52, A23L 2/38).
Недостатком данного способа является сложность технологического процесса и отсутствие пребиотического эффекта у продукта.
Наиболее близким по технической сущности и принятый авторами за прототип, является способ получения биологически активного биоматериала, который заключается в том, что в качестве природного соединения выбрана зооглея чайного гриба, получаемая ее инкубацией в аэробных условиях на питательной среде при комнатной температуре в течение 14…160 суток. При этом питательная среда представляет собой раствор сахаросодержащего продукта в настое чая. Далее из питательной среды извлекают полученную зооглею и высушивают при температуре не более 55°С до содержания массовой доли сухих веществ более 70 мас. %. Инкубация зооглеи проводится в традиционных условиях. Время роста зооглеи определяется в зависимости от получения количества необходимой биомассы. Также существенным отличием является уровень ее влажности, требуемый для изделия, которое собираются изготовлять далее из данного биоматериала, а именно кожзаменителя, стелек, бактерицидного пластыря, биологически активной добавки к пище (абсорбент), применяемой в качестве наполнителя при изготовлении лекарств, а также в пищевой отрасли - как добавка в хлебобулочных и кондитерских изделиях (для замедления очерствения, снижения калорийности), в качестве стабилизатора пищевых эмульсий, для улучшения текучести продукта, как агента для уменьшения загущающих свойств крахмала (см. патент на изобретение RU 2500198, кл. A23L 2/00, A23L 2/30, A23F 3/16).
Недостатком данного способа является отсутствие информации о способах стерилизации, высушивания и стандартизации готовой субстанции, длительные сроки культивирования зооглеи, отсутствие пребиотического эффекта у продукта и не до конца раскрытый потенциал сырья.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения биологически активной субстанции на основе Medusomyces gysevii, обладающей пребиотическим эффектом на организм теплокровных животных.
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого способа, сводится к получению дешевой и эффективной биологически активной субстанции из побочного продукта производства напитков, заквасок, концентратов из Medusomyces gysevii - плотной биомассы (зооглеи), применение которой теплокровными животными приводит к избирательной стимуляции роста и развитию нормальной микрофлоры кишечника, в результате чего оказывается благоприятное воздействие на организм в целом.
Технический результат достигается с помощью способа получения биологически активной субстанции с пребиотическим эффектом из плотной биомассы (зооглеи) Medusomyces gysevii, включающей ее извлечение, непрерывное промывание под проточной водой в течение 10-15 минут, измельчение на отдельные фрагменты размером 2…3 см и последующую лиофилизацию, для этого фрагменты плотной биомассы (зооглеи) Medusomyces gysevii помещают в низкотемпературную холодильную камеру при температуре -38…-40°С на 48-50 часов, после чего высушивают до содержания влаги 8…10% при рабочем давлении в сублиматоре 70…80 Па, температуре конденсора -45…-50°С и общей длительности цикла сушки 30-35 часов. Затем сухую субстанцию измельчают до размеров частиц 50…150 мкм, помещают в стеклянную тару, после чего плотно закупоривают и стерилизуют в автоклаве при температуре 110°С в течение 15 минут.
Таким образом, технический результат достигается за счет оптимальных параметров получения биологически активной субстанции, при этом изобретение позволяет утилизировать зооглею, неминуемо образующуюся при производстве напитков, заквасок и концентратов из чайного гриба.
Плотная биомасса (зооглея) Medusomyces gysevii состоит из микробной массы (уксуснокислые бактерии, дрожжи) и метаболитов микробного происхождения: слизистой основы, лигнина, клетчатки, которая включает в себя бактериальную целлюлозу, гемицеллюлозу (Даниелян Л.Т., 2005: Jayabalan R. 2007: Kozyrovska N.O., 2012) и ферментативной жидкости, составляющей до 90% от общего объема. На практике именно зооглея остается неиспользованным побочным сырьем после получения культуральной жидкости, которая широко применяется в пищевой промышленности. Бактериальная целлюлоза Medusomyces gysevii синтезируется бактериями в форме химически чистого материала (гель-пленка). Она имеет трехмерную структуру, образованную волокнами, которые переплетаются в сеть, в которой находятся бактерии. Ячейки бактериальной целлюлозы спасают клетки от ультрафиолетового излучения, защищают их от нападения других микроорганизмов, а также от ядовитого воздействия металлов, например меди. Бактериальная целлюлоза не токсична, не вызывает аллергии, обладает большой поглотительной способностью, стимулирует пищеварение и действует в качестве адсорбента. Диетические свойства бактериальной целлюлозы намного выше, чем чистой растительной целлюлозы (Шамолина И.И., 1997; Пиневич А.В. 2007).
1,
Кроме того, выбор способа высушивания, а именно, лиофилизация позволяет получить субстанцию без потери ее исходной биологической активности и сохранить богатый химический состав, присущий ферментативной жидкости: органические кислоты (яблочная, молочная, уксусная, глюкуроновая, глюконовая, лимонная, щавелевая, пировиноградная, фосфорная), этиловый спирт, сахара (моносахариды, дисахариды), витамины (С, В РР, D), ферменты (амилаза, сахараза, протеаза, каталаза), липиды (фосфатиды, стерины, жирные кислоты), пигменты, пуриновые основания, дубильные вещества, смолистые вещества, альдегиды, белки, кофеин, сапонины (Даниелян Л.Т., 2005: Jayabalan R. 2007: Kozyrovska N.O., 2012). Все вещества, присутствующие в зооглее, обеспечивают стимулирующий эффект субстанции, способствующий самовосстановлению микробиоценоза.
В связи с вышеизложенным в качестве потенциального сырьевого объекта, за счет широкого спектра биохимических составляющих микробного происхождения, нами рассмотрена плотная биомасса (зооглея) симбионта Medusomyces gysevii (чайный гриб), как способная отвечать всем требованиям, предъявляемым к субстанции для определения ее как пребиотической: не гидролизоваться пищеварительными ферментами и не всасываться в верхних отделах желудочно-кишечного тракта; являться селективным субстратом для одного и/или нескольких родов полезных бактерий; обладать способностью изменять баланс кишечной микрофлоры в сторону более благоприятного для организма хозяина состава; индуцировать полезные эффекты не только на уровне желудочно-кишечного тракта, но и на уровне организма в целом, т.е. системные эффекты.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа получения биологически активной субстанции на основе плотной биомассы (зооглеи) Medusomyces gysevii, обладающей пребиотическим эффектом.
Пример 1. Зооглею Medusomyces gysevii извлекают из культуральной жидкости, промывают под проточной водой, фасуют.
Полученная субстанция обладает недостатками, которые заключаются в высоком проценте влаги в продукте, невозможности точного расчета необходимой дозы, невозможности длительного хранения, малой концентрации биологически активных веществ, низком пребиотическом эффекте.
Пример 2. Зооглею Medusomyces gysevii извлекают из культуральной жидкости, промывают под проточной водой, принудительно освобождают от влаги под прессом, затем сушат в термостате при температуре 55°С до содержания влаги не более 30-40%.
Полученная субстанция обладает недостатками, которые заключаются в долгом периоде высушивания, высокой жесткости и липкости готового продукта, трудном измельчении, низкой концентрации биологически активных веществ, низком пребиотическом эффекте.
Пример 3. Зооглею Medusomyces gysevii извлекают из культуральной жидкости, непрерывно промывают под проточной водой в течение 10-15 минут, измельчают на отдельные фрагменты размером 2…3 см, помещают в низкотемпературную холодильную камеру при температуре -38…-40°С на 48-50 часов, после чего высушивают с помощью сублимационной сушилки до содержания влаги 8…10% при рабочем давлении в сублиматоре 70-80 Па, температуре конденсора минус 45-50°С и общей длительности цикла сушки 30-35 часов, сухую субстанцию измельчают.
Полученная субстанция обладает недостатками, которые заключаются в том, что в ней содержатся живые бактерии и грибы, входящие в симбионт Medusomyces gysevii, в количестве, превышающем допустимые нормы, установленные согласно стандартам и требованиям РФ, предъявляемым к кормам и кормовым добавкам.
Пример 4. Проводят аналогично примеру 3, но после высушивания сухую субстанцию измельчают до размеров частиц 50…150 мкм, помещают в стеклянную тару, после чего плотно закупоривают и стерилизуют в автоклаве при температуре 110°С в течение 15 минут.
Субстанция, полученная данным способом, не содержит живых микроорганизмов, легко транспортируется и долго хранится, обладает высокой биологической активностью и высоким пребиотическим эффектом.
Таким образом, наиболее оптимальным является способ получения биологически активной субстанции на основе Medusomyces gysevii с пребиотическим эффектом по примеру 4.
Проведены испытания биологически активной субстанции на основе Medusomyces gysevii с целью подтверждения ее пребиотического действия на организм теплокровных животных. Для этого производили исследование состава микрофлоры кишечника белых крыс при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе.
Все эксперименты на животных были выполнены согласно Директиве ЕС 86/609/ЕЕС и в соответствии с законодательством Российской Федерации, регулирующим проведение экспериментов на животных.
Исследование было проведено на 60 самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 9 месяцев, со средней массой тела 250 г, которые были рандомизированы и разделены на 2 группы, контрольную и опытную, по 30 особей в каждой. Животные содержались в виварии в стандартных условиях, со свободным доступом к воде и корму. Температура воздуха в помещении составляла плюс 20…22°С, влажность воздуха - 40…45%, цикл освещения 12:12.
Материалом для бактериологического исследования послужили фекалии крыс. Сбор фекалий производили в стерильную, герметически закрывающуюся посуду стерильным шпателем. Время от момента взятия материала до его обработки в лаборатории не превышало 5 часов. Для проведения бактериологического анализа кала использовали отраслевой стандарт по дисбактериозу кишечника.
На начальном этапе эксперимента у всех животных, вошедших в опытную и контрольную группы, было проведено фоновое бактериологическое исследование содержимого толстого кишечника. После чего у них инициировали развитие нарушений микробиоциноза путем перорального введения им гентамицина шприцем посредством иглы с оливой на конце в дозах 10 мг 2 раза в сутки в пересчете на вес тела, исходя из среднесуточных доз антибиотика для людей, в течение 10-ти дней. Животные контрольной группы при этом получали стандартный рацион, рекомендуемый НИИ питания РАМН, а животным опытной группы каждый день на протяжении эксперимента в дополнение к нему скармливали по 120 мг биологически активной субстанции из зооглеи Medusomyces gysevii на крысу с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела.
Следующий отбор фекалий для проведения бактериологического исследования у подопытных животных производили на 5-й день и 10-й день.
Подсчитывали количество Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli, Candida spp. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что у животных контрольной группы, находящихся в состоянии антибиотико-ассоциированного дисбактериоза на стандартном питании, уже на 5-е сутки наблюдается достоверное снижение количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli, которое продолжается вплоть до окончания эксперимента, в то время как у животных, получавших биологически активную субстанцию из зооглеи Medusomyces gysevii, подобных достоверных изменений не происходит. Количество Candida spp. у животных контрольной группы на фоне антибиотико-ассоциированного дисбактериоза, напротив, достоверно увеличивается вплоть до окончания эксперимента, в то время как у животных, получавших биологически активную субстанцию из зооглеи Medusomyces gysevii на крысу в сутки, оно остается неизменным на протяжении всего эксперимента.
Патогенные микроорганизмы и микроорганизмы рода Proteus, Klebsiella, Citrobacter, гемолизирующая флора у всех экспериментальных крыс до начала и после окончания эксперимента нами не были обнаружены.
Кроме того, применение биологически активной субстанции из зооглеи Medusomyces gysevii положительно отражается и на общем состоянии животных: во время эксперимента они охотно принимали корм, пили воду, активно двигались в клетке. В то время как животные контрольной группы, напротив, демонстрировали снижение активности и пассивное состояние, ухудшение аппетита, у некоторого числа особей (11 крыс) этой группы была замечена частая дефекация с выделением жидких фекальных масс.
После прекращения перорального введения гентамицина животные контрольной группы были разделены на 2 подгруппы по 15 крыс в каждой. Животные первой подгруппы (контрольной) в течение следующих 7-ми дней получали стандартный рацион, рекомендуемый НИИ питания РАМН, а животным второй подгруппы (опытной) каждый день на протяжении эксперимента в дополнение к основному рациону скармливали по 120 мг биологически активной субстанции из зооглеи Medusomyces gysevii на крысу с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела. Отбор фекалий для проведения бактериологического исследования у животных обеих подгрупп производили на 3-й и 7-й день (по окончании эксперимента).
Подсчитывали количество Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli, Candida spp. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что после прекращения введения гентамицина у животных 1-й подгруппы (контрольной), находящихся на стандартном питании, снижение количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli и повышение количества Candida spp. продолжается вплоть до 3-х суток. По окончании эксперимента на 7-е сутки зафиксировано достоверное увеличение количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, что свидетельствует о естественном самовосстановлении микрофлоры.
У животных второй подгруппы (опытной), получавших биологически активную субстанцию из зооглеи Medusomyces gysevii, уже на 3-ьи сутки эксперимента прослеживается устойчивая тенденция к увеличению количества Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp, Escherichia coli и снижению Candida spp, которая продолжается вплоть до окончания эксперимента и приближает показатели группы к первоначальным данным, характерным для здоровых животных.
У крыс 2-й подгруппы (опытной) улучшение общего состояния организма наблюдалось уже на 2-й день после начала применения им биологически активной субстанции из зооглеи Medusomyces gysevii, животные возобновили свою активность, улучшился прием корма, нормализовался стул. В то время как у животных 1-й подгруппы улучшения начали проявляться лишь на 5-й день эксперимента.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что биологически активная субстанция из зооглеи Medusomyces gysevii, полученная предложенным способом, благоприятно влияет на показатели кишечной микрофлоры теплокровных животных и их общее состояние.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- биологически активная субстанция, полученная с помощью предлагаемого изобретения, обладает пребиотическим действием на организм теплокровных, способствует стимуляции роста и развития нормальной микрофлоры кишечника, в результате чего оказывается благоприятное воздействие на организм в целом;
- благодаря оптимальным условиям обработки субстанция сохраняет свой первоначальный богатый биохимический состав;
- основные методики, препараты, аппараты, используемые в приготовлении препарата, легко доступны;
- продукт, полученный с помощью предложенного способа, имеет низкую себестоимость, т.к. в его производстве используется зооглея, неминуемо образующаяся при производстве напитков, заквасок и концентратов из чайного гриба и являющаяся отходом производства;
- экологическая чистота, отсутствие вредных примесей.
Литература
Патент RU 2280394. Композиция ингредиентов, обладающая биологической активностью (варианты), способ ее получения (варианты) и способ получения зооглеичайного гриба / Д.А. Зайцев. - Опубл. 16.12.2004.
Патент RU 2337592. Способ приготовления напитка, обладающего биологической активностью, и напиток, полученный этим способом / Д.А. Зайцев. - Опубл. 14.04.2005.
Патент RU 2500198. Способ получения биологически активного биоматериала и биоматериал, полученный данным способом / В.Х. Хачатрян. - Опубл. 10.12.2013.
Патент RU 2500299. Способ получения биологически активного напитка, напиток, полученный данным способом, способ получения концентрата биологически активного напитка и концентрат, полученный данным способом / В.Х. Хачатрян. - Опубл. 21.08.2012.
Даниелян, Л.Т. Чайный гриб и его биологические особенности / Л.Т. Даниелян. - М.: Медицина, 2005. - 83 с.
Пиневич А.В. Чудо-пленки, или Слово о бактериальной целлюлозе / А.В. Пиневич // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2007. - №3. - С. 33-39.
Тарасенко, Н.А. Кратко о пребиотиках: История, классификация, получение, применение / Н.А. Тарасенко, Е.В. Филиппова // Фундаментальные исследования. - 2014. - №6. - С. 45-48.
Шамолина И.И. Перспективы использования микробного сырья при получении волокнистых и пленочных материалов / И.И. Шамолина // Химические волокна. - 1997. - №1. - С. 3-10.
Jayabalan, R. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation / R. Jayabalan, S. Marimuthu, K. Swaminathan // Food Chemistry. - 2007. P. 392-398.
Kozyrovska, N.O. Kombuchamicrobiome as a probiotic: a view from the perspective of post-genomics and synthetic ecology / N.O., Kozyrovska, O.M., Reva, V.B., Goginyan, J.P. de Vera // Biopolymers and Cell. - 2012. - Vol. 28., №2. - P. 103-113.