Смесь бактериальных штаммов, обладающая азотфиксирующей, фосфор- и калиймобилизующей активностью
MIXTURE OF BACTERIAL STRAINS WITH NITROGEN-FIXING, PHOSPHORUS- AND POTASSIUM-MOBILIZING ACTIVITY

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Касается новой композиции бактериальных штаммов, обладающих азотфиксирующей, фосфор- и калиймобилизующей активностью, а также фитопротекторными и ростостимулирующими свойствами.
Постоянно растущая потребность в высококачественных продуктах питания и сырье для промышленности вызывает острую необходимость разработки и внедрения научно обоснованных и устойчивых приемов, обеспечивающих повышение плодородия почв, урожайности и качества сельскохозяйственной продукции. В связи с этим являются актуальными работы, направленные на разработку приемов биологизации земледелия, широкого использования микробиологических препаратов на основе N-, P-, K-мобилизаторов, что позволит существенно уменьшить экологическую нагрузку на агроландшафты, рационально использовать плодородие почв, регулировать почвенные микробиологические процессы, повысить роль биологического азота и фосфора в питании растений, мобилизовать запасы калия и получать экологически чистую продукцию.
Известен штамм Paenibacillus mucilaginosus (RU2626543), депонированный в ВКПМ под номером В-12259, используемый в качестве удобрения и агента биологического контроля в профилактике или лечении грибкового заболевания растений.
9
Также известен препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, обладающий фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в составе он содержит культуральные жидкости штаммов бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicacearum ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008 в соотношении 1:1:1:1:1 с титром бактерий не менее 1⋅10 КОЕ/мл (RU2595405).
Общим недостатком известных биодобавок, используемых в качестве удобрений и/или для защиты растений от фитопатогенов, является отсутствие комплексного действия в обеспечении азотного, фосфорного и калиевого питания растений, а также существует ряд других недостатков, связанных с недостаточно высокой эффективностью, трудоемкостью получения удобрений и узким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры.
Технической задачей изобретения является разработка нового микробиологического удобрения для сельского хозяйства, предназначенного для внесения в почву, предпосевной (предпосадочной) обработки семян (посадочного материала), некорневых подкормок сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте для обогащения азотом, фосфором и калием.
9
Поставленная задача достигается за счет использования смеси бактериальных штаммов для улучшения азотно-фосфорно-калиевого питания, защиты от фитопатогенов и стимулирования роста и развития сельскохозяйственных растений, которая состоит из культур Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр жизнеспособных клеток не менее 1⋅10 КОЕ/мл.
Штамм Bacillus aryabhattai депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика с регистрационным номером ВКПМ В-13579; штамм Paenibacillus polymyxa депонирован в Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-747; штамм Paenibacillus mucilaginosus депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика с регистрационным номером ВКПМ В-13582.
Препарат получают путем смешивания жидких суспензий раздельно выращенных бактерий Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582 в соотношении 1:1:1.
Свойства штаммов-продуцентов:
Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579
1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма: крупные палочки бациллярной формы с округлыми концами; споры эллипсовидные; окраска по Граму - положительная; при культивировании на ГМФ образует бежевые блестящие колонии с ровным краем, 4-6 мм в диаметре; растворяет неорганические фосфаты (тест на среде Пиковской).
2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на ГМФ-агаре или среде R2A (pH 7,0-7,2).
3. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду ГМФ или R2A.
4. Продукт, синтезируемый штаммом: фосфатмобилизатор, продуцент ауксин подобных веществ.
Paenibacillus polymyxa ВКМ-747
1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма: палочки бациллярной формы с округлыми концами; споры овальные, раздувающие спорангий; окраска по Граму - положительная; при культивировании на ГМФ образует кремовые полупрозрачные блестящие колонии, 3-5 мм в диаметре; на R2A - белые блестящие слизистые колонии, с ровным краем, выпуклые; фиксирует атмосферный азот (рост на безазотистой среде Эшби).
2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на среде R2A или ГМФ агаре (pH 7,0-7,2).
3. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду R2A.
4. Продукт, синтезируемый штаммом: Азотфиксатор, продуцент антимикробных метаболитов (полимиксин), ауксин подобных веществ, эндо-1,4-β-глюканазы, протеаз, амилаз, целлюлаз.
Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582
1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма: палочки бациллярной формы с округлыми концами, образует капсулу; споры эллипсовидные. Окраска по Граму - положительная; при культивировании на R2A образует прозрачные слизистые блестящие выпуклые колонии с ровным краем, 4-6 мм в диаметре; растворяет силикаты (тест на среде Александрова).
2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на среде R2A (pH 7,0-7,2).
3. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду R2A.
4. Продукт, синтезируемый штаммом: Калиймобилизатор, продуцент антимикробных метаболитов, ауксин подобных веществ.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
9
Для лабораторных и полевых экспериментов, отраженных в примерах 1-7, предлагаемые бактериальные штаммы выращивали раздельно на жидких питательных средах в лабораторных ферментерах Biostat A (Sartorius, Германия) до достижения максимального выхода спор, после чего смешивали в соотношении 1:1:1, при этом титр бактериальной смеси составлял не менее 1,0⋅10 КОЕ/мл.
Пример 1: Ростостимулирующая активность заявляемой смеси штаммов (см. табл. 1)
Ростостимулирующую активность смеси штаммов анализировали в вегетационных опытах на семенах пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Дарья, ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Таловский и овса (Avena sativa L.) сорта Яков. Семена обрабатывали рабочим раствором смеси штаммов (расход - 1 л/т, расход рабочей жидкости - 10 л/т) и высевали в горшки, заполненные торфяным грунтом. Повторность 4-кратная. В контрольном варианте семена обрабатывали дистиллированной водой. Семена выращивали при температуре 24°C и 16/8-часовом периоде освещения в течение 36-68 суток, в течение которых фиксировали всхожесть и высоту растений, а по окончании опыта длину корневой системы, сухую и сырую биомассу и сравнивали с контрольными значениями.
Таблица 1 - Результаты анализа ростостимулирующей активности смеси штаммов
Вариант
Всхожесть, %
Средняя длина побегов, см
Средняя длина корней, см
Средняя биомасса, г/раст
Сырая
Сухая
Пшеница «Дарья» (36 суток выращивания)
Контроль
93
39,4±1,1
17,2±0,5
0,943
0,217
Смесь штаммов
93
41,3±0,8
18,8±0,8
1,018
0,234
Ячмень «Таловский» (36 суток выращивания)
Контроль
75
31,6±1,3
18,6±0,9
1,313
0,167
Смесь штаммов
88
38,6±1,4
19,8±1,4
1,432
0,219
Овес «Яков» (68 суток выращивания)
Контроль
80
71,2±1,9
19,7±1,1
6,46
1,42
Смесь штаммов
80
72,9±1,1
29,6±2,8
8,16
1,65
Было показано, что анализируемая смесь бактериальных штаммов обладает рострегуляторным действием, выражающемся в стимулировании роста побегов и корневой системы растений, а также увеличении их биомассы.
Пример 2: Фунгицидная активность смеси штаммов (см. табл. 2)
Фунгицидную активность смеси штаммов оценивали методом двухслойного агара с использованием 5 фитопатогенных грибов. Для опыта предварительно разливали по чашкам Петри стерильный 1,5%-ый по агару картофельно-сахарозный агар (КСА). Для анализа готовили суспензию спор и мицелия грибов. Для этого 1/8 часть агара, засеянного грибом, переносили в стерильную чашку Петри, добавляли 10 мл стерильной воды и смывали конидии и мицелии стерильным шпателем. После чего добавляли 20 мкл полученной суспензии в 4,98 мл остуженной до 45°С среды 1,0% КСА, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. После застывания в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл смеси культуральных жидкостей штаммов. Посевы культивировали 4-7 суток (в зависимости от скорости роста грибов) при температуре 20°C, после чего фиксировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогенов.
Обнаружено, что заявляемая бактериальная смесь обладает антагонистической активностью и способна ингибировать рост фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания сельскохозяйственных растений.
Таблица 2 - Результаты анализа фунгицидной активности
Фитопатоген
Средний диаметр зоны подавления роста фитопатогена, мм
Смесь штаммов
Контроль
Alternaria tenuis
34,4
0
Fusarium graminearum 58918
25,2
0
Fusarium sporotrichioides 58871
31,5
0
Fusarium oxysporum F-55071
27,8
0
Microdochium nivale
31,1
0
Пример 3: Бактерицидная активность смеси штаммов (см. табл. 3)
Бактерицидную активность смеси штаммов проверяли методом диффузии в двухслойный агар. Предварительно разливали по чашкам Петри по 20 мл стерильной среды КСА с 1,5% агара. Для анализа готовили суспензию бактериальных фитопатогенов (культивирование на жидком бульоне ГМФ в шейкере-инкубаторе при постоянном перемешивании 220 об/мин и температуре 30°C в течение 24 ч). После чего добавляли 1 мл полученной суспензии в 4 мл остуженной до 45°С среды КСА с 1% агара, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. После застывания в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл смеси культуральных жидкостей штаммов. Посевы культивировали 24 ч при температуре 30°C, после чего фиксировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогена.
Было выявлено, что анализируемая бактериальная смесь обладает также и бактерицидной активностью и способна защищать сельскохозяйственные культуры от развития бактериозов.
Таблица 3 - Результаты анализа бактерицидной активности
Фитопатоген
Средний диаметр зоны подавления роста фитопатогена, мм
Смесь штаммов
Контроль
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 101
14,5
0
Pectobacterium carotovorum 480
13,8
0
Pseudomonas syringae БИМ B-280
21,0
0
Pseudomonas syringae
14,3
0
Pseudomonas syringae pv. tomato
15,5
0
Xanthomonas arboricola B-614
19,0
0
Xanthomonas arboricola B-620
14,5
0
Xanthomonas arboricola B-624
12,8
0
Xanthomonas arboricola B-628
45,0
0
Xanthomonas campestris B-610
13,0
0
Xanthomonas pisi B-633
15,0
0
Xanthomonas vasicola B-618
24,5
0
Пример 4: Изучение совместимости бактериальной смеси штаммов с химическими протравителями (см. табл. 4 и 5)
9
Для изучения возможности совместного применения заявляемой смеси штаммов с химическими протравителями проводили настоящий опыт. В работе использовали протравитель на основе прохлораза, имазалила и тебуконазола (100 + 25 + 15 г/л) в форме микроэмульсии и анализируемую смесь штаммов с общим титром 2,9⋅10 КОЕ/мл. Из указанных препаратов готовили баковые растворы, выдерживали в течение фиксированного времени и анализировали изменение титра жизнеспособных бактериальных клеток методом последовательного разведения бакового раствора с последующим поверхностным посевом на среду R2A.
Показано, что химический протравитель не оказывает негативного влияния на бактериальные штаммы B. aryabhattai ВКПМ В-13579, P. polymyxa ВКМ В-747, P. mucilaginosus ВКПМ В-13582, и их титр в баковой смеси с пестицидом сохраняется на уровне контроля в течение всего периода наблюдения.
Таблица 4 - Результаты анализа совместимости смеси штаммов с химическим протравителем
Вариант
Расход препарата и рабочего раствора
Средний титр жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в рабочем растворе после экспозиции
0 ч
2 ч
4 ч
6 ч
Смесь штаммов(без протравителя)
1,0 л/т - 10 л/т
1,0⋅10<sup>8</sup>
1,2⋅10<sup>8</sup>
1,0⋅10<sup>8</sup>
1,1⋅10<sup>8</sup>
Смесь штаммов + протравитель, МЭ
1,0 + 1,5 л/т - 10 л/т
1,9⋅10<sup>8</sup>
2,1⋅10<sup>8</sup>
1,8⋅10<sup>8</sup>
2,7⋅10<sup>8</sup>
Дополнительно анализировали рострегуляторное влияние бакового раствора смеси штаммов с химическим протравителем в условиях вегетационного опыта на овсе (Avena sativa L.) сорта Яков. Условия проведения эксперимента - см. пример 1.
Выявлено, что совместное применение бактериальной смеси с протравителем положительно влияет на рост и развитие растений. Так, отмечалось увеличение всхожести, значительная прибавка роста растений, а также увеличение сухой и сырой биомассы.
Таблица 5 - Результаты анализа совместимости смеси штаммов с химическим протравителем в вегетационном опыте на овсе сорта Яков
Вариант
Всхожесть, %
Средняя длина побегов, см
Средняя длина корней, см
Средняя биомасса, г/раст
14 сутки
64 сутки
64 сутки
сырая
сухая
Контроль
96,3
29,2±0,9
55,1±2,4
17,7±0,8
2,55
0,282
Смесь штаммов + протравитель, МЭ (1,0 + 1,5 л/т)
100
29,7±0,6
63,4±1,3
17,7±0,6
2,78
0,312
Таким образом, было доказано возможное применение заявляемой смеси штаммов совместно с химическими протравителями в баковых растворах, характеризующееся отсутствием негативного влияния на титр жизнеспособных клеток штаммов, входящих в состав анализируемого консорциума, а также способствующее улучшению роста и развития сельскохозяйственных растений.
Пример 5: Изучение накопления свободных аминокислот и амидов в тканях растений под влиянием смеси штаммов (см. табл. 6)
Была проведена оценка количественных изменений в составе свободных аминокислот в листьях яровой пшеницы сорта Икар под влиянием обработки семян заявляемой смесью штаммов в условиях полевого опыта (по методике В.В. Церлинг). Для этого на сегменты обеззоленных фильтров наносили пробу сока 5 молодых листьев пшеницы из разных вариантов, а также образцовые растворы аминокислот, используемые в качестве метчиков. Связь интенсивности окраски и размера пятна с количеством аминокислот и амидов оценивали с помощью шкалы образцовых растворов метчиков. Дополнительно на хроматограммах листового сока оценивали площадь, форму и интенсивность окраски хлорофилловой «дуги», образовавшейся при разгонке хлорофиллового пятна в системе растворителей (н-бутанол + уксусная кислота).
Результаты хроматографического анализа степени накопления в листовом соке всходов пшеницы аминокислот и амидов, а также активности синтеза хлорофилла представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Результаты хроматографического анализа степени накопления аминокислот, амидов и хлорофилла в листьях всходов яровой пшеницы
Вариант
S<sub>пятен общая</sub>, мм<sup>2</sup>
R<sub>f</sub>, мм
S<sub>пятна пролина</sub>, мм<sup>2</sup>
S <sub>пятна хлорофилла</sub>, мм<sup>2</sup>
Контроль
363,5
26,8
47,4
68,2
Смесь штаммов(1,0 л/т)
1538,0
55,2
189,0
153,6
2
2
Наиболее высокий уровень накопления аминокислот и амидов в тканях листьев всходов пшеницы обеспечила анализируемая смесь штаммов. Помимо этого увеличивалась подвижность аминокислотных пятен на хроматограммах (величина Rf). Также обработка семян пшеницы смесью штаммов способствовала резкому повышению концентрации пролина в листьях растений. В условиях острой засухи это чрезвычайно важно, так как пролин является протекторной аминокислотой, защищающей в высоких концентрациях растения от теплового шока. Также было выявлено значительное увеличение размеров пятен хлорофилла в варианте обработки семян смесью штаммов (153,6 мм), при этом в контроле средний размер хлорофиллового пятна составил всего 68,2 мм.
Таким образом, было доказано положительное действие предлагаемой смеси штаммов на накопление аминокислот, амидов и хлорофилла, непосредственной влияющих на физиологию растений и их продуктивность.
Пример 6: Диагностика азотно-фосфорно-калиевого питания растений после обработки семян смесью штаммов (см. табл. 7-9)
В анализе использовали индикаторные органы (листья) яровой пшеницы сорта Икар для определения обеспеченности растений биогенными элементами (N, P, K) в разные фазы вегетации. Из каждого варианта отбирали свежие пробы листьев пшеницы, из которых выжимали сок с помощью ручного пресса Магницкого, который наносили на фрагменты фильтровальной бумаги, высушивали и подвергали химическому анализу.
Отмечается, что в фазу всходов обработка семян предлагаемой смесью штаммов формировала оптимальную обеспеченность растений в условиях стартового роста азотом, фосфором и калием, что является гарантией не только качества и величины урожая, но и повышенной стрессоустойчивости растений как к засухе, так и к болезням.
Таблица 7 - Средние показатели содержания NPK (мг/кг сырого вещества) в листьях яровой пшеницы (всходы)
Вариант
Азот нитратный(N - NO<sub>3</sub>)
Фосфор неорганич.(P - PO<sub>4</sub>)
Калий свободный(K)
Контроль
260
300
4205
Смесь штаммов (1,0 л/т)
500
500
5105
К моменту закладки узла кущения и вторичной корневой системы растений также значительно улучшалась обеспеченность надземной биомассы нитратным азотом, ортофосфатами и калием.
Таблица 8 - Средние показатели содержания NPK (мг/кг сырого вещества) в листьях яровой пшеницы (фаза кущения)
Вариант
Азот нитратный(N - NO<sub>3</sub>)
Фосфор неорганич.(P - PO<sub>4</sub>)
Калий свободный(K)
Контроль
300
250
3500
Смесь штаммов (1,0 л/т)
600
350
5000
В период выхода в трубку и начала формирования колоска тканевая диагностика обеспеченности биогенными элементами показала закономерное снижение уровня NPK в надземной части растений. В контроле в этот период наблюдалось слабое поступление биогенных элементов в надземную часть растений на уровне NPK-голодания, тогда как обработка семян смесью штаммов сформировала высокую обеспеченность растений нитратным азотом, ортофосфатами и калием.
Таблица 9 - Средние показатели содержания NPK (мг/кг сырого вещества) в листьях яровой пшеницы (фаза выхода в трубку)
Вариант
Азот нитратный(N - NO<sub>3</sub>)
Фосфор неорганич.(P - PO<sub>4</sub>)
Калий свободный(K)
Контроль
200
90
3000
Смесь штаммов (1,0 л/т)
400
200
4500
Таким образом, доказано, что предлагаемая смесь штаммов улучшает минеральное питание растений и формирует высокую обеспеченность растений основными биогенными элементами.
Пример 7: Влияние предпосевной обработки семян смесью штаммов на урожайность яровой пшеницы (см. табл. 10 и 11)
Культура: яровая пшеница Дарья;
Место проведения опыта: Орловская область, Малоархангельский район;
Схема опыта:
1. Контроль - без обработки микробиологическим препаратом;
2. Смесь штаммов (1:1:1) - обработка семян с нормой расхода 1,0 л/т, расход рабочей жидкости 10 л/т.
Была изучена роль консорциума микроорганизмов азот-, калий- и фосформобилизаторов в оптимизации минерального питания яровой пшеницы при интродукции на семена в условиях полевого эксперимента. Показано, что предпосевное применение смеси штаммов положительно влияет на морфологические показатели пшеницы и увеличивает ее урожайность. Прибавка при этом составила 11,87 ц/га.
Таблица 10 - Всхожесть пшеницы
Вариант
Норма высева, млн. шт /га
Количество растений, шт/м<sup>2</sup>
Количество стеблей, шт/м<sup>2</sup>
Коэффициент общей кустистости
Полевая всхожесть, %
Контроль
6,0
584
1932
3,3
96,7
Смесь штаммов
6,0
580
2012
3,5
97,3
Таблица 11 - Структура урожая и урожайность пшеницы
Вариант
Намолочено, кг
Бункерная урожайность, ц/га
Урожайность очищенного зерна, ц/га
Зачетная урожайность, ц/га
Натура, г/л
Масса 1000 зерен, г
Контроль
1420
32,86
32,60
33,70
728,0
27,6
Смесь штаммов
1960
44,44
44,08
45,57
743,0
34,6
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Бактериальная композиция представлена смесью трех высокоэффективных штаммов, в состав которой входят культуры с фосфатмобилизующей активностью (Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579), с азотфиксирующей активностью (Paenibacillus polymyxa ВКМ-747) и калиймобилизующей активностью (Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582). Все 3 штамма также обладают ростостимулирующим действием и выраженной антагонистической активностью против фитопатогенных грибов и бактерий, способствующей оздоровлению сельскохозяйственных почв и защите растений.
Высокая активность заявленной смеси штаммов подтверждается результатами лабораторных экспериментов, а также полевых опытов, где было отмечено улучшение минерального питания, роста и развития сельскохозяйственных культур и увеличение их урожайности.
Предлагаемая бактериальная смесь позволит повысить продуктивность зерновых агроценозов, получать в хозяйствах высокие урожаи за счет мобилизации азотно-фосфорно-калийного фонда почв, существенного расширения доли биологически фиксированного азота, подвижного фосфора и калия без затрат на минеральные удобрения и при минимальном расходе средств на создание благоприятного пищевого режима в корневой зоне растений.