Генетическое разнообразие вируса гепатита в на территории Республики Саха (Якутия)

Генетическое разнообразие вируса гепатита В на территории Республики Саха

С.Н. Кузин, Н.Н. Забелин, Е.И. Самохвалов, С.И. Семенов, Н.Н. Павлов,

М.В. Терехова, И.К. Зверяева, Л.Е. Кузина, А.А. Кожевников

ФГУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва

Вирус гепатита В (ВГВ) - один из самых изменчивых ДНК-содержащих вирусов, что обусловлено сложным циклом репликации, включающим этап обратной транскрипции РНК-прегенома [1]. В настоящее время в мире ведется активный поиск мутантных штаммов ВГВ, то есть таких вариантов вируса, которые отличаются по нуклеотидным последовательностям ДНК от прото-типных штаммов. Актуальность таких исследований продиктована тем, что в результате действия различных селективных факторов в популяции появляются и закрепляются штаммы ВГВ, называемые ускользающими. Первыми сообщили об обнаружении мутанта ВГВ, способного ускользать от вакцин-индуцированного ответа, W.F. Carman et al. [3]. По мнению B. Weber, обобщившего результаты многих исследователей, особую важность имеет выявление мутантов ВГВ, сформировавшихся и закрепившихся в популяции под давлением внешних факторов отбора, таких как вакцинопрофилактика, а также лечение интерферонами и противовирусными препаратами [2]. В результате выполненных исследований уже описаны многочисленные варианты мутаций во всех генах ВГВ. В Западной Европе и США мутантные штаммы ВГВ выявлены главным образом у пациентов после трансплантации печени и у инфицированных детей, рожденных от HBsAg-позитивных матерей, несмотря на вакцинацию [4]. Сегодня уже опубликованы данные о наличии большого количества мутаций в S-гене ВГВ, причем три из них (G145R, K141E и T131I) существенно нарушают антигенную структуру HBsAg, что влияет на диагностические возможности иммуноферментных тест-систем [6].

Исследования по данной проблеме в России единичны и касаются главным образом определения серотипов HBsAg и генотипов ВГВ. И.Г. Нетесова с соавт. показали, что у пациентов с хроническим гепатитом В в Центральном ФО наиболее часто выявляется субтип HBsAg ayw2 (57%)[5]. Кроме того, в рамках этого исследования обнаружены также субтипы HBsAg ayw3var A и B, adw2.

Наиболее интересны, с нашей точки зрения, такие исследования в регионах с высоким уровнем распространенности ВГВ и наличием других факторов (многонациональное население, активная миграция и др.), влияющих на эпидемический процесс. К числу таких территорий можно отнести Республику Саха (Якутия).

Цель данной работы - изучение структуры генотипов ВГВ у пациентов с хронической ГВ-вирусной инфекцией и определение гетерогенности преS1/ преS2/S-генов у естественно встречающихся вариантов ВГВ на территории Республики Саха (Якутия).

Материалы и методы

Материалом для выделения ДНК вируса ГВ служила сыворотка крови пациентов с хроническим гепатитом В. Образцы сыворотки крови хранились при минус 20 оС до момента исследования. Вирусную ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови производства ООО НПФ «Литех», Москва (Россия), согласно инструкции производителя. Детекцию вирусной ДНК ГВ осуществляли методом «гнездовой» ПЦР в сыворотках крови, положительных на HBsAg или на анти-HBc, с помощью двух пар праймеров: S1-1, S1-2; S2-1, S2-2 [7].

Генотипирование и изучение гетерогенности 16 изолятов ВГВ проводили с использованием участка преS1/преS2/S-генов. С этой целью проведена амплификация фрагментов генома ВГВ, соответствующих преS1/преS2/S-генам, методом «гнездовой» ПЦР в сыворотках крови, положительных на ДНК ВГВ. Выбор данной области для изучения генетических свойств выделенных изо-лятов был продиктован тем, что на этом участке расположены структурные гены вируса, анализ которых наиболее информативен в филогенетических исследованиях, и тем, что эти гены кодируют оболочечные белки вируса, изменения в которых влияют на детекцию HBsAg с помощью иммуноферментных тест-систем. Для получения ПЦР-фрагментов, соответствующих преS1/ преS2/S-генам, на матрице ДНК каждого изо-лята был амплифицирован участок длиной 1562 н.о. с праймерами 2805F (2805 - 2827) и 1208R (1208 - 1192), а также 2817F (2817 - 2836) и 1197R (1197 - 1174) - позиции праймеров указаны для изолята AJ344117. Используемые при этом праймеры были разработаны нами с помощью пакета программ DNASTAR V 5.00 (Lasergene, Inc., США) по выровненным нуклеотидным последовательностям различных изолятов вируса гепатита В, представленных в базе данных DDBJ/ EMBL/GenBank (DNA Data Bank of Japan, Mishima, Япония; EMBL - Nucleotide Sequence Database, Cambridge, Великобритания; GenBank - NCBI,

epid 5 (42).indd 10

10/17/08 1:55:14 PM

^

Bethesda, MD, США). Секвенирование фрагментов было проведено с использованием праймеров 2817F, 323R (323 - 303) и 242F (242 - 264) и набора Big Dye Terminator Сус^ Sequencing Kit, согласно инструкции производителя на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 DNA sequencer (Applied Biosystems, США), что позволило получить информацию о нуклеотидной последовательности участка генома размером около 1143 н.о. Нуклеотидные последовательности анализировали методом Clustal W с помощью программы Megaling (DNAStar V 5.00, Lasergen Inc., США).

Результаты и обсуждение

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16 штаммов, выделенных у хронически инфицированных лиц в Республике Саха (Якутия), показал наличие трех генотипов ВГВ. Генотипы D и А обнаружены в семи случаях каждый (по 44%), генотип С - в двух изолятах (12%). Кроме того, в этой группе были идентифицированы субге-

нотипы каждого изолята. Из семи образцов, принадлежащих генотипу ВГВ D, в шести определен субгенотип D3 (86%) и в одном - D2 (14%). В случаях принадлежности ВГВ к генотипам А и С определены только субгенотипы А2 и С2 (рис. 1).

Анализ нуклеотидных последовательностей изученных изолятов по локализации замен и деле-ций в том или ином участке преS1/преS2/S-генов позволил выявить значительное количество замен. В таблице 1 приведены замены, выявленные в изолятах, принадлежащих к генотипу D.

Следует отметить, что изолят 4 ассоциируется с субгенотипом D2 и серотипом ayw3, тогда как остальные изоляты этой группы принадлежат к субгенотипу D3 и серотипу ayw2. Изолят 4, относящийся к субгенотипу D2, в сравнении с изоля-тами данного субгенотипа (АВ090269; АВ090270; АВ078032; АВ078033; АВ090268; Х72702;

Х80925) имел шесть нуклеотидных замен. Нуклеотидные последовательности изолятов субгенотипа D3 сравнивались с одиннадцатью изолята-

Рисунок 1.

Субгенотиповая принадлежность исследуемых изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической ГВ-вирусной инфекцией в Республике Саха (Якутия). Дендрограмма, построенная на основе сравнения нуклеотидных последовательностей преS1/преS2/S-генов (2874 - 835 н.о.) различных изолятов ВГВ

rd:

6.8

39

260

42

2

Y2

Ya1

Х51970

AJ309371

176

АВ116083(А1) DQ315784(A1) АВ194952(АЗ) АВ194951 (АЗ) 55 162

AF330110

АВ205124

Х75656

AY217371

АВ048704

81

Y1

12

362

11

61 п

АВ188245

4

AY161157

Y07587

DQ315779

AB048703

Нуклеотидные замены

11

epid 5 (42).indd 11 10/17/08 1:55:15 PM

Таблица 1.

Нуклеотидные замены в участках преS1/преS2/S-генов ВГВ у изолятов, принадлежащих к генотипу D, выделенных в Республике Саха

№ изолятов Замены в 5’-конце преS1 Замены

в сайте, кодирующем вход вируса в клетку в преS2/ S-гена промоторе в 5’-конце преS2-гена в 5’-конце S-гена в MHR* S-гена в З’-конце S-гена

Субгенотип D2

4 Т3102С С3111Т С289Т С357Т Т472С Т507С

Субгенотип D3

11 С2928Т Т2934С С3067А А3151С С16Т С111А T150G С373Т Т592С

12 Т2934С А2965Т Т3037С T3129G А3151С G3168A Т1С С4А С16Т A43G С111А Т176С G241A С373Т Т393С С732Т С767А Т770С А771Т Т814А

61п Т2934С С2967Т G3024A С3067А G3123A А3151С A3154G Т1С С14А С16Т С111А С373Т С400А А773С Т780С

81 Т2934С G3010A Т3013С С3067А Т3115А А3151С A3154G 1 с \ н Он (Вюои с* Т176С С373Т С732Т C762G Т791А

362 Т2934С А3072С T3076G А3151С Т1С С16Т С111А С373Т

Y1 Т2934С С3018Т С3067А Т3076С A3120G С3132А А3144Т А3151С A3154G Т1С С16Т A43G Т52С С55Т С111А Т113А G148T С154Т Т195С Т198С А201Т Т213С С373Т A456G А482С С732Т G748A G750T G765A А77^ G774A С786Т С795А Т825С А828С

* МНЯ - главный гидрофильный регион

ми данного субгенотипа, взятыми из GenBank (АВ188245; AY373430; DQ315777; AY233296; AY902776; DQ315776; Х85254; AY902777;

AY233295; AY233291; AJ344117), в результате констатировано, что эти изоляты имели от восьми (изолят 362) до 35-ти (изолят Y1) замен. Из приведенных данных видно, что среди изолятов генотипа D большинство замен группируется

в промоторной области преS2/S, 5'-конце преS2 и в З'-конце S-гена.

В таблице 2 приведены замены, обнаруженные в изолятах, принадлежащих к генотипам А и С. Нуклеотидные последовательности штаммов генотипа А (субгенотип А2) были сравнены с десятью изолятами данного субгенотипа, взятыми из GenBank (АІ309371; АІ344115; AY152726;

12

еріи 5 (42).іпии 12 Ф 10/17/08 1:55:15 РМ

М54923; Х02763; Х70185; Z35717; Z72478; S50225; Х51970). В результате констатировано отсутствие замен у изолята № 2. В изоляте № 39 выявлены восемь замен, № 42 - две замены, № 176 - семь замен и одна трехнуклеотидная делеция, № Y2 - девять замен, № 260 - шесть замен и № Ya1 - три замены. Обращает на себя внимание тот факт, что у изолятов генотипа А, по сравнению с генотипом D, замен выявлено существенно меньше и их большая часть сосредоточена в 5'-конце S-гена и участке, соответствующем главному гидрофильному региону (MHR).

Нуклеотидные последовательности изолятов субгенотипа С2 (55 и 162) оказались идентичными. Их сравнение проводили с пятнадцатью изолятами субгенотипа С2, взятыми из GenBank (АВ074755 АВ205123; АВ205124; AF068756; AF223960 AF330110; AF473543; AY217376; AF223955 АВ074756; АВ014360; АВ042282; AY641558 D50520; Х75665). Оба изолята (55 и 162) имели

по одиннадцать нуклеотидных замен относительно референтных изолятов. У изолятов генотипа С замены были локализованы преимущественно в 5'-конце преS2 и в З'-конце S-гена. Обращает на себя внимание отсутствие замен в главном гидрофильном регионе S-гена.

Идентичность изолятов на изученном участке генома ВГВ, вероятно, связана с тем, что они были выделены у инфицированных лиц, проживающих в одном и том же селе Усть-Алданского района Якутии. Представляется возможным наличие общего источника инфекции у этих лиц. Такой подход, по нашему мнению, может быть использован как элемент эпидемиологического анализа при установлении источника инфекции.

Анализ нуклеотидных замен позволил констатировать, что наибольший удельный вес замен наблюдался у штаммов ВГВ генотипа D - 111 замен на семь образцов (в среднем 15,86 замены на один образец). У штаммов, принадлежащих к генотипу А,

Таблица 2.

Нуклеотидные замены в участках преS1/преS2/S-генов ВГВ у изолятов, принадлежащих к генотипам А и С, выделенных в Республике Саха

№ изолятов Замены в 5’-конце преS1 Замены

в сайте, кодирующем вход вируса в клетку в преS2/ S-гена промоторе в 5’-конце преS2-гена в 5’-конце S-гена в MHR S-гена в З’-конце S-гена

Генотип А, субгенотип А2

2

39 T195G T287G T380C C433A A514T G553A T580A T784G

Y2 C2925T C2952T C2964T G3177A C17A G20A C354A A514T T705C

42 Т176С A514T

176 делеция 53-55 C150A T357C G375C T505C T565C A636T T784G

260 C2874T A3066G T177C A233G A514T T784G

Ya1 C2952T C354A A355G

Генотип С, субгенотип С2

55 и 162 C2871A T3162C C23T A85G T109A A115C T123C C135T G162A T705C A753T

13 —

epid Б (42).indd 13 ф 10/17/08 1:55:15 PM

ф

Эпидемиология

выявлено значительно меньше замен - 36 на семь образцов (в среднем 5,14 на один образец). У двух штаммов ВГВ генотипа С обнаружено по 11 одинаковых замен.

Сравнение полученных аминокислотных последовательностей (табл. 3) с референтными штаммами из GenBank в пределах одного генотипа показало, что 111 нуклеотидных замен приводили к 53-м аминокислотным заменам у изолятов

Таблица 3.

Аминокислотные замены в преS1/преS2/S-белках у изолятов вируса гепатита В, выделенных в Республике Саха

генотипа D (48%), 36 нуклеотидных замен у генотипа А - к 22-м аминокислотным заменам (61%) и у изолятов генотипа С 22 нуклеотидные замены приводили к пяти аминокислотным (22%).

Из выявленных аминокислотных замен следует выделить замену T40S (12), расположенную в участке, взаимодействующем с клеточным рецептором, а также замену N103D (61п, 81, Y1) - в матриксном домене L-белка, участвующем в мор-

Генотип Штамм Замены

в N’-конце преS1 в N’-конце преS2 в N’-конце S-гена в MHR S-гена в C’-конце S-гена всего замен

D 4 T68I V118A 53

11 L74I P41H; L54R

12 T40S P41H F8L; F80S S193L; L205M; Y206L; F220L

61п L74I; N103D H9N; P41H S207R; L209S

81 G55S; F56L; L74I; S90T; N103D 22-делеция; P41H F8L S193L; P203R; L213I

362 Q75H; L77V P41H

Y1 L74I; N103D P41H; L42I V14A; L15S; Q16L; F20S Q101R; I110L S193L; M198I; W199L; S204N; Y206C; S207N; P211L; P214Q; V224A; Y225S

А 2 22

39 V14G; S45A; C76R; F93L M133I S210R

42 F8L

176 22-делеция; T54K I68T; W74S Y161F; S210R

Y2 Q10K; A11T P67Q V184A

260 I84M F8S; T27A S210R

Ya1 P67Q

C 55 и 162 I45T; T49I S3N V184A; Y200F 5

Ф

Цветом отмечены повторяющиеся замены.

14

epid Б (42).indd 14 Ф 10/17/08 1:55:16 PM

фогенезе вирионов. В области цитозольной петли S-белка (33 - 80аа), которая, как полагают, участвует в сборке и секреции вирионов и пустых суб-вирусных частиц, обнаружены следующие замены: Т681 (4); F80S (12); S45A, C76R (39); 168Т, W74S (176); P67Q (У2, Ya1) [8].

В главном гидрофильном регионе S-белка выявлены следующие замены: V118A (4); Q101R, 1110Ь (У1) и М1331 (39). Из них замены Q101R и 1110Ь ранее выявлялись из сывороток крови с негативным тестом на HBsAg, а замена М1331 была описана в случае получения расходящихся результатов детекции HBsAg разными тест-системами ИФА [9, 10].

В С-концевом участке S-белка обнаружены замены, описанные в комбинации с другими заменами при отрицательном тесте на HBsAg [9], среди них - S207R (61п); P203R (81); М1981, У206С, S207N (У1); V184A (У2, 55, 162).

Таким образом, показано, что на территории Республики Саха (Якутия) в структуре циркулирующих генотипов ВГВ обнаружены три варианта: А (44%), С (12%) и D (44%). Выявлено значительное генетическое многообразие вирусов гепатита В, особенно изолятов, принадлежащих к генотипам ВГВ А и D. Обнаружены аминокислотные замены, обусловливающие способность ВГВ к «диагностическому ускользанию».

Литература

1. Yamamoto K., Horikita M., Tsuda F. et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis В virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis В surface antigen // J. Virol. 1994; 68: 2671 - 2676.

2. Weber B. The diagnostic and clinical impact of the genetic variability of the S (surface) gene of hepatitis B virus II J. Lab. Med. 2004; 28 (1): 56 - 69.

3. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis F et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus II Lancet 1990; 336: 325 - 329.

4. Weber B., Melchior W., Gehrke R. et al. Hepatitis B virus markers in anti-HBc only positive individuals // J. Med. Virol. 2001; 64: 312 - 319.

5. Нетесова И.Г., Баженов А.И., Купцова В.Э. и др. Субтипы HBsAg в образцах крови доноров Центрального федерального округа России / В кн.: Вирусный гепатит В - диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HBsAg). - М., 2004. С. 128, 129.

6. Seddigh-Tonekaboni S., Waters J.A., Jeffers S. et al. Effect of variation in the common a determinant on the antigenicity of hepatitis B surface antigen // J. Med. Virol. 2000; 60: 113 - 121.

7. Okamoto H., lizuka H., Ohmura K. et al. Correlation between anti-HBc titers and HBV DNA in blood units without detectable HBsAg // Vox. Sang. 1992; 63: 107 - 111.

8. Loffler-Mary H., Dumortier J., Klentsch-Zimmer C. et al. Hepatitis B virus is sensitive to changes in the cytosolic S loop of the envelope proteins // J. Virol. 2000; 270: 358 - 367.

9. Weinberger K.M., Bauer T., Bohm S. et al. High genetic variability of the group-specific a-determinant of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and the corresponding fragment of the viral polymerase in chronic virus carriers lacking detectable HBsAg in serum // J. General. Virol. 2000; 81: 1165 - 1174.

10. Echevarria J.M., Avellon A. Hepatitis B virus genetic diversity // J. Med. Virol. 2006; 78: S36 - S42.

Эпидемиологическая ситуация по дифтерии на современном этапе

И.Э. Борисова1, С.Е. Батаева2, С.В. Шабалина1

1 ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва

2 ГОУ «ВПО «Астраханская государственная академия» Росздрава

Дифтерия относится к числу инфекций, имеющих повсеместное распространение. Уровень заболеваемости в отдельных странах и регионах значительно колеблется - в зависимости от социальных условий и качества постановки прививочного дела [31, 32, 62].

Основным фактором вирулентности возбудителя дифтерии является экзотоксин, который был открыт в 1888 году.

Взгляд на эпидемический процесс как на многоуровневую систему, состоящую из взаимодействующих между собой популяций паразита и хозяина, позволяет по-новому оценить этот процесс при дифтерии, вскрыть внутренние закономерности его развития. Значительная гетерогенность (то есть генотипическая и фенотипическая неоднородность) свойственна популяциям, входящим в паразитарную систему дифтерии. Изменения в характере эпидемического процесса дифтерии, наблюдаемые в течение последних десятилетий

(вплоть до 60 - 70-х годов прошлого столетия, когда произошло резкое сокращение популяции возбудителя), указывают на значительные сдвиги в паразитарной системе, утрату популяцией паразита своих прежних позиций [20, 34].

Анализируя эпидемический процесс дифтерии, можно видеть, что существенные изменения произошли во второй составной части паразитарной системы - популяции хозяина. Накоплены материалы, свидетельствующие о ее неоднородности как по антитоксическому, так и по антимикробному иммунитету. Обнаруживается, что упущения в работе по иммунопрофилактике населения приводят к появлению значительной прослойки лиц, у которых отсутствует защитный уровень противодифтерийных антител. Существенная роль взрослого населения в эпидемическом процессе дифтерии обусловлена, с одной стороны, его высокой социальной активностью, а с другой - снижением у него уровня антитоксического иммунитета, таким обра-

15

epid Б (42).indd 15 Ф 10/17/08 1:55:16 PM