Разработка протокола иммуноферментного анализа для индикации Т-2 токсина

УДК619.615.33 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-3-67-72

РАЗРАБОТКА ПРОТОКОЛА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ Т-2 ТОКСИНА

Штыров И.Н. - аспирант, Мишина Н.Н. - кандидат биологических наук, Валиев А.Р. - кандидат биологических наук, Тарасова Е.Ю. - кандидат биологических наук, Семёнов Э.И. - кандидат

биологических наук

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

В данной статье представлены результаты сравнения различных объемов растворов, использованных в постановке непрямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения микотоксина Т-2 в кормах. В связи с высокой опасностью и распространенностью микотоксинаТ-2 требуется его незамедлительное обнаружение в кормах и продуктах растительного происхождения. Вследствие этого, методы, основанные на высокочувствительных трудоемких лабораторных определениях и скрининговых анализах, приобрели высокую актуальность. Методы представленных групп продолжают улучшаться с каждым днем, давая преимущество в скорости, специфичности, пределах обнаружения, дешевизне и простоте анализа.В идентичных условиях ELISA сравнивались объемы для сенсибилизации планшета, калибровочного раствора микотоксина Т-2, растворов антител, антивидовых антител и раствора субстратного реагента. Это помогло бы снизить стоимость иммуноферментных тест-систем для обнаружения токсина Т-2 без потери в специфичности. Было обнаружено, что использование всех разведений сыворотки крови обеспечивает надлежащую дозозависимую абсорбцию и диагностическую эффективность (среднее значение между чувствительностью и специфичностью), которая определяет линейность калибровочной кривой для обнаружения микотоксина Т-2. При постановке первого протокола (вводили большие объемы реагентов), больший дозозависимый эффект наблюдался при разбавлении сыворотки крови 1: 8000, второго протокола (вводили меньшие объемы реагентов) - 1: 4000. Для дальнейших исследований был выбран 1 протокол, поскольку при создании большей площади для реакции в лунке планшета происходит больше иммунохимических реакций, а также с учетом того факта, что получение иммуноглобулинов является дорогостоящим процессом.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ, микотоксины, трихотецены, Т-2 токсин, антиген, антитело.

Микотоксины являются низкомолекулярными токсичными вторичными метаболитами микроскопических грибов, оказывающими патологическое воздействие на организм животных [3, 5, 12]. В настоящее время уже выявлено несколько сотен микотокси-нов, и большинство из них являются причиной токсикозов животных [4, 6]. Загрязнение микотоксинами сельскохозяйственной продукции происходит по всему миру. До 80% зерна загрязнено микотоксинами в России и до 25% в Европе, что является серьезной проблемой для экономики и здравоохранения [10, 2]. Одним из наиболее распространенных и опасных микотоксинов является мико-токсин Т-2. Микотоксин Т-2 является трихо-теценом типа А, продуцируемым штаммами Fusarium sporotrichioides, Fusarium poae и

Fusarium acuinatum [13, 14]. Исходя из этого, существует необходимость в быстром обнаружении и нейтрализации микотоксина Т-2 в корме. Система иммуноферментного анализа отвечает всем требованиям для использования в анализе с точки зрения чувствительности, степени извлечения токсина из образца, простоты и скорости пробоподготовки [9, 8]. Только конкурентный формат ELISA подходит для определения микотоксинов, поскольку микотоксины являются низкомолекулярными соединениями с одним сайтом связывания антител [5, 14]. Следовательно, низкомолекулярный антиген не может быть связан с другими антителами. Исследования по обнаружению микотоксина T-2 различными вариантами твердофазногоиммунофермент-ногоиммуноферментного анализа были про-

ведены отечественными авторами. Существующие тестовые системы постоянно совершенствуются и обновляются, чтобы снизить стоимость, повысить специфичность и скорость реакции [1, 7].

Цель исследования - сравнение использования разных объемов используемых компонентов с разработкой протокола постановки иммуноферментного обнаружения Т-2 токсина.

Материал и методы. Непрямой конкурентный ИФА проводили с использованием специфических поликлональных антител к конъюгату бычий сывороточный альбумин (БСА). В предватирельных экспериментах титр антител был установлен в диапазоне 1: 2000, 1: 4000, 1: 8000. Для непрямого конкурентного ИФА планшеты «Costar» сенсибилизировали приготовленном на 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (КББ) в рН 9,5 конъюгатом Т-2-БСА. 0,1 мл или 0,15 мл полученного раствора добавляли в каждую лунку планшета и инкубировали в холодильнике при температуре 2-8 ° C в течение 16 часов. Промывали планшет 3 раза. 0,05 мл или 0,1 мл калибровочных растворов микотоксина Т-2 в концентрациях 0,0; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 160,0 нг / мл добавляли в готовые планшеты. Далее вносили 0,05 мл или 0,1 мл раствора антител.

Критерием оценки преимуществ каждого из методовбыла линейность калибровочного графика в анализе, проведенном на подготовленныхмикропланшетах. Средние значения оптической плотности, измеренной

Все разведения антител были выполнены на ФСБ (рН 7,4) с добавлением Твин-20 (0,1%) и БСА (1%). Планшет инкубировался при постоянном встряхиваниив течение 1 часа при температуре 25°С (250 об / мин). После трехкратной промывки в лунки добавляли 0,1 мл или 0,15 мл конъюгата пероксидазы хрена против кроличьегоJgG (Sigma) в рабочих разведениях от 1: 2000 до 1: 8000. После инкубации и промывки планшета при тех же условиях вносили субстратный раствор для-пероксидазы хрена (3,3', 5,5'-тетраметилбензидин) (ТМБ). Проводили инкубацию в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте, после чего реакцию останавливали путем добавления равного количества 1М раствора серной кислоты (H2SO4). Регистрацию показаний ИФА проводили при длине волны 450 нм на спектрофотометре Multiscan FC. Средняя величина оптической плотности, измеренная в лунках с исследуемыми растворами, делилась на среднюю оптическую плотность, измеренную в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножен на 100, что выражает процент поглощения сигнала. Постановку ИФА проводили три раза.

Схемы протоколов постановки ИФА по обнаружению Т-2 токсина представлены в таблице 1.

в лунках с исследуемыми растворами была разделена на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат был умножен на 100, что выражает процент поглоще-

Таблица 1 - Схемы протоколов постановки ИФА по обнаружению Т-2 токсина

Общие условия постановки анализа Протокол 1 Протокол 2

Этап постановки Тип раствора Объем, Инкубация Объем, Инкубация

анализа мкл мкл

Сенсибилизация Т-2 БСА 2 мкг на 100 мкл в 150 16ч./2-80С 100 16ч./2-80С

планшета растворе КББ

Внесение токсина В растворе 70% метанола 100 не требуется 50 не требуется

Внесение раствора В 1% растворе БСА в ФСБ 100 1ч./250С 50 1ч./250С

антител с добавлением глицерина и 0,05% твина-20

Внесение Раствор пероксидазы хрена 150 1ч./250С 100 1ч./250С

антивидовых антител в растворе для стабилизации конъюгатов антител

Внесение ТМБ 150 20мин./250С 100 20мин./250С

субстратного раствора

Внесение стоп- 1М серная кислота 50 10мин./250С 50 10мин./250С

реагента

ния сигнала. Критерием оценки растворов микотоксина Т-2 было построение графика калибровочной кривой.

Результаты исследований. Результаты обнаружения Т-2 токсина в непрямом

конкурентном ИФА с использование раствора антител, полученных от животных, иммунизированных антигенами Т-2 БСА представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 - Эффективность обнаружения Т-2 токсина при использовании 1 протокола постановки ИФА

Наслойка Концентрация Т-2 токсина, нг/мл Процент поглощения сигнала лунки / разведения раствора антител

1:2000 1:4000 1:8000

Т-2 БСА 2,0 мкг/ 100 мкл 0 100,00 100,00 100,00

2,5 92,76±1,4 91,63±1,2 81,99±1,6

5 86,14±1,9 79,01±1,8 71,34±1,5

10 84,36±1,5 75,48±1,6 66,21±0,7

20 72,26±1,0 70,24±1,2 62,85±0,8

40 68,30±0,7 60,91±1,9 50,54±1,0

80 60,47±1,2 59,13±1,9 43,48±0,7

160 54,95±1,2 49,60±1,3 42,51±0,8

На основании полученных данных были построены график зависимости поглощения сигнала от концентрации токсина.

Исходя из данных таблицы 2 и рисунка 1, следует, что при постановке ИФА с условиями 1 протокола постановки, указан-

ной ранее - достоверное поглощение сигнала наблюдается при всех концентрациях Т-2 токсина. Оптимальное дозозависимое поглощение с данными условиями, наблюдается при разведении сыворотки крови в концентрации 1:8000.

Рисунок 1 - Зависимость поглощения сигнала при использовании 1 протокола постановки ИФА

Таблица 3 - Эффективность обнаружения Т-2 токсина при использовании 2 протокола постановки ИФА

Наслойка Концентрация Т-2 токсина, нг/мл Процент поглощения сигнала лунки / разведения раствора антител

1:2000 1:4000 1:8000

Т-2 БСА 2,0 мкг/ 100 мкл 0 100,00 100,00 100,00

2,5 97,79±0,6 86,21±1,0 89,79±0,7

5 87,63±1,0 73,04±1,8 94,09±1,9

10 82,48±0,9 68,55±1,8 69,20±1,3

20 79,25±1,5 63,01±0,6 63,56±1,4

40 72,75±1,6 51,93±1,3 55,42±0,9

80 59,44±1,9 44,67±1,6 54,34±0,7

160 58,38±1,9 46,76±1,8 45,12±0,9

120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00

Рисунок 2 постановки ИФА

х

01

о о.

50

1:2000 1:4000 1:8000

100 150

Концентрация токсина, нг/мл

200

- Зависимость поглощения сигнала при использовании 2 протокола

Как следует из данных таблиц и на основании данных графиков 1 -2, достоверное поглощение сигнала наблюдали при всех концентрациях токсина и полученные конъюгаты и сыворотки обеспечивали возможность обнаружения Т-2 токсина. Так как основным критерием оценки выбора протокола ИФА стала линейность калибровочной прямой в анализе, можно сделать вывод, что при постановке 1 протокола больший дозоза-висимый эффект наблюдали при рабочем разведении сыворотки 1:8000, во 2 протоколе - 1:4000.

Заключение. Установлено, что использование всех разведений сывороток крови обеспечивает должное дозозависимое по-

глощение и диагностическую эффективность (среднее значение между чувствительностью и специфичностью), обеспечивающую линейность калибровочной кривой для обнаружения Т-2 токсина. При постановке первого протокола больший дозозависимый эффект наблюдали при разведении сыворотки крови 1:8000, второго протокола - 1:4000.

Для дальнейших исследований был выбран 1 протокол, так как при создании большей площади для проведения реакции в лунке планшета происходит больше иммунохимических реакций, а также учитывая тот факт, что получение иммуноглобулинов - дорогостоящий процесс.

0

Литература

1. Буркин, А.А. Иммуноферментный анализ альтернариола для оценки риска контаминации агропродукции / А.А. Буркин, Г.П. Кононенко // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. -Т. 47. - №. 1. - С. 79-83.

2. Матросова, Л.Е. Мониторинг микроскопических грибов в сельскохозяйственной продукции Республики Татарстан / Л.Е. Матросова, О.К. Ермолаева, А.А. Иванов // Ветеринарный врач. - 2009. - №. 3. - С. 52-53.

3. Матросова, Л.Е. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса свиней при афлатоксикозе / Л.Е. Матросова, Э.И. Семенов, С.А. Танасева, С.Ю. Смоленцев // Мясная индустрия. - 2015. - №. 5. -С. 51-52.

4. Мишина, Н. Н. Влияние комплекса цеолита и шунгита на резистентность и продуктивность цыплят-бройлеров при смешанноммикотоксикозе / Н. Н. Мишина, Э. И. Семенов, К. Х. Папуниди, Р. М. Потехина, С. А. Танасева, О. К. Ермолаева, Д. Х. Гатауллин // Ветеринарный врач. - 2018. №6. - С. 3-7.

5. Мишина, Н.Н. Применение конъюгата Т-2 токсина с полилизином для обнаружения Т-2 токсина в конкурентном ИФА / Н.Н. Мишина, Э.И. Семёнов, К.Х. Папуниди // Ветеринарный врач. - 2017. - №. 4. - С. 23-26.

6. Семенов, Э. И. Сравнительная оценка адсорбирующей активности дрожжей по отношению к микотоксинам / Э.И. Семенов, Л.Е. Матросова, Е.Ю. Тарасова, З.А. Канарская // Вестник КНИТУ. - 2013. - № 10. - С. 195-198.

7. Arola, H. A simple and specific noncompetitive ELISA method for HT-2 toxin detection / H. Arola, A. Tullila, A. Nathanail, T. Nevanen // Toxins. - 2017. - Т. 9. - №. 4. - С. 145.

8. Kumar, N. Hyper Immune Response against T-2 Mycotoxin in Oryctolaguscuniculus / N. Kumar, L. Hiremath, P. K. Gupta, A. K. Srivastava, A. Jain, A. R. Hegde, L. Hamsa, // Research Journal of Pharmacy and Technology. - 2019. - Т. 12. - №. 1. - С. 237-240.

9. Mishina, N.N. Plant Matrix Reducing Effect of the Object in the Aflatoxin В1 Defined by SolidPhase Enzyme Immunodetection. / N.N. Mishina, I. N. Shtyrov, O. K. Ermolaeva, Z. K. Sagdeeva, R. M. Potekhina, Kh. D. Gataullin, Yu. S. Smolentsev // J. Pharm. Sci. & Res. - 2018. -Vol. 10(12). - Р. 34613463.

10. Moretti, A. Mycotoxin risks under a climate change scenario in Europe / A. Moretti, M. Pascale, A. F. Logrieco // Trends in Food Science & Technology. - 2019. - Т. 84. - P. 38-40.

11. Palomo, C. Mycotoxins multi detection by ELISA / C. Palomo, S. Hamad // Biosaia. - 2016. -№. 5. - С. 28.

12. Semenov, E.I. Systemic Anaphylaxis Due to Combined Mycotoxicosis in Wister Rats / E. I. Semenov, N.N. Mishina, S. A. Tanaseva, I. R. Kadikov, A. M. Tremasova, K. K. Papunidi, S. Y. Smolentsev // Indian Vet. J. - 2018. - Vol. 95. - P. 16 - 19.

13. Semenov, E. Joint effect of the mycotoxins T-2 toxin, deoxynivalenol and zearalenone on the weaner pigs against a background of the infection load / E. Semenov, M. Tremasov, V. Korosteleva, L. Matrosova, M. Kryuchkova, S. Smolentsev, E. Tarasova // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2016. - Vol. 7. - P. 1860-1868.

14. Yang, X. A review of the reproductive toxicity of T-2 toxin / X. Yang, P. Liu, Y. Cui, B. Xiao, M. Liu, M. Song, Y. Li // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2020.

DEVELOPMENT OF THE PROTOCOLIMMUNO-ENZYMAL ANALYSIS FOR THE T-2 TOXIN INDICATION

Shtyrov I.N. - Postgraduate, Mishina N.N. - Candidate of Biological Sciences,

Valiev A.R. - Candidate of Biological Sciences, Tarasova E.Yu. - Candidate of Biological Sciences,

Semenov E.I. - Candidate of Biological Sciences

:FSBSI "Federal Center for Toxicology, Radiation and Biological Safety"

The research presents the results of comparing the different volumes of the solutions used in the formulation of indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the determination of T-2 mycotoxin in feed. Due to the high danger and prevalence of T-2 toxin, its rapid detection in feed and

plant products is required. Thereby, methods based on highly sensitive labor-intensive laboratory determinations and screening analyzes have gained high relevance. The methods of the presented groups continue to improve every day, giving the advantage of speed, specificity, detection limits, cheapness and simplicity of the analysis. Under identical conditions of ELISA, volumes were compared for the sensitization of the tablet, calibration solution of T-2 toxin, solutions of antibodies, antispecies antibodies and substrate solution. This would help reduce the cost of ELISA-based test systems for the detection of T-2 toxin, without loss in specificity. It was found that the use of all dilutions of blood serum provides proper dose-dependent absorption and diagnostic efficiency (average value between sensitivity and specificity), which determines the linearity of the calibration curve for the detection of T-2 toxin. When setting the first protocol (introduced large volumes of reagents), a greater dose-dependent effect was observed when diluting blood serum 1: 8000, the second protocol (introduced smaller volumes of reagents) - 1: 4000. For further studies, 1 protocol was chosen, since when creating a larger area for the reaction, more immunochemical reactions take place in the plate well, and also taking into account the fact that obtaining immunoglobulins is an expensive process.

Keywords: enzyme immunoassay, mycotoxins, trichotetcenes, T-2 toxin, antigen, antibody.

References

1. Burkin, A.A. An enzyme-linked immunosorbent assay to assess the risk of contamination of agricultural products / A. A. Burkin, G. P. Kononenko // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2011.

- T. 47. - No. 1. - P. 79-83.

2. Matrosova, L.E. Monitoring of microscopic fungi in agricultural products of the Republic of Tatarstan / L. E. Matrosova, O. K. Ermolaeva, A. A. Ivanov // Veterinarian. - 2009. - No. 3. - S. 52-53.

3. Matrosova, L.E. Veterinary sanitary examination of pig meat with aflatoxicosis / L.E. Matrosova, E.I. Semenov, S.A. Tanaseva, S.Yu. Smolentsev // Meat industry. - 2015. - No. 5. - P. 51-52.

4. Mishina, N.N. The effect of the zeolite and shungite complex on the resistance and productivity of broiler chickens with mixed mycotoxicosis / N. N. Mishina, E. I. Semenov, K. Kh. Papunidi, R. M. Potekhina, S. A. Tanaseva, O.K. Ermolaeva, D. Kh. Gataullin // Veterinarian. - 2018. - No. 6. - P. 3-7.

5. Mishina, N.N. The use of T-2 toxin conjugate with polylysine for the detection of T-2 toxin in competitive ELISA / N. N. Mishina, E. I. Semenov, K. Kh. Papunidi // Veterinarian. - 2017. - No. 4.

6. Semenov, E.I. Comparative evaluation of the adsorbing activity of yeast in relation to mycotoxins / E. I. Semenov, L. E. Matrosova, E. Yu. Tarasova, Z. A. Kanarskaya // Vestnik KNITU. - 2013. - No. 10.

- P. 195-198.

7. Arola, H. A simple and specific noncompetitive ELISA method for HT-2 toxin detection / H. Arola, A. Tullila, A. Nathanail, T. Nevanen // Toxins. - 2017. - T. 9. - No. 4. - P. 145.

8. Kumar, N. Hyper Immune Response against T-2 Mycotoxin in Oryctolaguscuniculus / N. Kumar, L. Hiremath, PK Gupta, AK Srivastava, A. Jain, AR Hegde, L. Hamsa // Research Journal of Pharmacy and Technology - 2019. - T. 12. - No. 1. - P. 237-240.

9. Mishina, N.N. Plant Matrix Reducing Effect of the Object in the Aflatoxin B1 Defined by SolidPhase Enzyme Immunodetection. / N. N. Mishina, I. N. Shtyrov, O. K. Ermolaeva, Z. K. Sagdeeva, R. M. Potekhina, Kh. D. Gataullin, Yu. S. Smolentsev // J. Pharm. Sci. &Res. - 2018. - Vol. 10 (12). - P. 34613463.

10. Moretti, A. Mycotoxin risks under a climate change scenario in Europe / A. Moretti, M. Pascale, A. F. Logrieco // Trends in Food Science & Technology. - 2019. - T. 84. - P. 38-40.

11. Palomo, C. Mycotoxins multi detection by ELISA / C. Palomo, S. Hamad // Biosaia. - 2016. - No. 5. - P. 28.

12. Semenov, E.I. Systemic Anaphylaxis Due to Combined Mycotoxicosis in Wister Rats / E. I. Semenov, N.N. Mishina, S. A. Tanaseva, I. R. Kadikov, A. M. Tremasova, K. K. Papunidi, S. Y. Smolentsev // Indian Vet. J. - 2018. - Vol. 95. - P. 16 - 19.

13. Semenov, E. Joint effect of the mycotoxins T-2 toxin, deoxynivalenol and zearalenone on the weaner pigs against a background of the infection load / E. Semenov, M. Tremasov, V. Korosteleva, L. Matrosova, M. Kryuchkova, S. Smolentsev, E. Tarasova // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2016. - Vol. 7. - P. 1860-1868.

14. Yang, X. A review of the reproductive toxicity of T-2 toxin / X. Yang, P. Liu, Y. Cui, B. Xiao, M. Liu, M. Song, Y. Li // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2020.