Способ диагностики хронического эндометрита у женщин с бесплодием
METHOD FOR DIAGNOSING CHRONIC ENDOMETRITIS IN WOMEN WITH INFERTILITY

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для диагностики хронического эндометрита у женщин с бесплодием.
Хронический эндометрит (код N71.1 по Международной классификации болезней 10-го пересмотра) - это клинико-морфологический синдром, при котором в результате персистирующего повреждения эндометрия инфекционным агентом возникают множественные вторичные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую трансформацию и рецептивность слизистой оболочки тела матки [Хронический эндометрит: этиология, клиника, диагностика, лечение / Н.В. Зароченцева, А.К. Аршакян, Н.С.Меньшикова, Ю.П. Титченко // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2013. - №5. - С. 21-27].
Хронический эндометрит - одна из важных медико-социальных проблем современной гинекологии. Он занимает ведущее место в структуре причин бесплодия и привычного невынашивания беременности [Puenteetal Е. Chronic endometrit is: old problem, novel insights and future challenges // International journal off ertility&sterility. - 2020. - T. 13, №4. - C. 250]. Большинство (88%) пациенток с хроническим эндометритом - это женщины фертильного возраста [Петров Ю.А., Алехина А.Г., Блесманович А.Е. Актуальные нюансы патогенеза хронического эндометрита // Современные проблемы науки и образования. - 2018. - №6. - С.10]. Данные по распространенности хронического эндометрита у пациенток с бесплодием сильно варьируют в зависимости от используемого метода биопсии и исследуемой популяции. Так, в исследовании Kasius и соавторов распространенность хронического эндометрита у женщин с бесплодием составила лишь 2,8% [The reliability of the histological diagnosis of endometritis in asymptomatic IVF cases: a multicenter observer study / J.C. Kasius, F. J. Broekmans, D.M. Sie-Go et al. // Hum. Reprod. - 2012. - Vol.27, №1. - P. 153-158]. Cicinelli с соавторами выявили хронический эндометрит у 20% женщин с бесплодием [Chronic endometritis: correlation among hysteroscopic, histologic, and bacteriologic findings in a prospective trial with 2190 consecutive office hysteroscopies / E. Cicinelli, D. De Ziegler, R. Nicoletti et al. // Fertil Steril. - 2008. - Vol.89, №3. - P. 677-684].
Хронический эндометрит, как хроническое воспаление эндометрия, обычно протекает бессимптомно или проявляется неспецифическими клиническими симптомами, и часто является диагностической находкой при обследовании женщины, обратившейся к гинекологу по поводу бесплодия.
Диагностика хронического эндометрита основывается на гистологическом исследовании эндометрия, взятого во время диагностического выскабливания стенок полости матки или биопсии эндометрия. Однако, инвазивные вмешательства в полость матки сами являются фактором риска развития хронического эндометрита [Хронический эндометрит: этиология, клиника, диагностика, лечение / Н.В. Зароченцева, А.К. Аршакян, Н.С. Меньшикова, Ю.П. Титченко // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2013. - №5. - С.21-27].
Гистологической верификацией диагноза хронического эндометрита является наличие плазматических клеток в биоптатах эндометрия, которые в здоровой ткани эндометрия не содержатся [Kitaya К., Yasuo Т. Inter-observer and intra-observer variability in immunohistochemical detection of endometrial stromal plasmacytes in chronic endometritis // Experimental and therapeutic medicine. - 2013. - Vol. 5, №2. - P. 485-488, Возможности улучшения диагностики эндометрита / М.Г. Газазян, О.С. Хуцишвили, Т.С. Иванова, И.С. Лунева // Журнал акушерства и женских болезней. - 2002. - Т. 51, №5. - С.38-42].
Таким образом, актуальной задачей является разработка высокоточного неинвазивного скринингового способа диагностики хронического эндометрита у женщин с бесплодием, который позволит применить персонифицированный подход в тактике ведения данной категории пациенток и снизить частоту инвазивных вмешательств в полость матки.
Известен способ диагностики хронического эндометрита у женщин с аномальными маточными кровотечениями [Патент №2587720 Российская Федерация. Способ диагностики хронического эндометрита у женщин с аномальными маточными кровотечениями / Зоева А.Р., Дикарева Л.В., Теплый Д.Л., Аюпова А.К. // Изобретения. Полезные модели. - 2016. - №17.]. Сущность способа состоит в том, что исследуют биологическую жидкость, проводят количественное определение уровней церулоплазмина в супернатанте менструальных выделений иммунотурбидиметрическим методом. При значении церулоплазмина, равном или выше 850 мг/дл, диагностируют хронический эндометрит.
Данный способ имеет ряд недостатков:
1. Способ является инвазивным, так как менструальную кровь получают путем аспирации содержимого полости матки зондом Пайпеля.
2. Отсутствуют данные о возможности применения данного способа у женщин с бесплодием без аномальных маточных кровотечений.
3. Неизвестна точность способа.
Известен способ диагностики хронического эндометрита в среднюю стадию фазы секреции [Патент №2642621 Российская Федерация. Способ диагностики хронического эндометрита в среднюю стадию фазы секреции / Таболова В.К., Корнеева И.Е., Донников А.Е., Бурменская О.В. // Изобретения. Полезные модели. - 2018. - №3.].
Сущность способа заключается в том, что путем пайпель-биопсии эндометрия с помощью атравматической аспирационной кюретки производят забор фрагмента слизистой оболочки полости матки в среднюю стадию фазы секреции. Методом количественной ОТ-ГТЦР в режиме реального времени определяют уровень мРНК гена VEGFA. При уровне более 0,250 делают заключение о наличии хронического эндометрита у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Данный способ имеет ряд недостатков:
1. Способ может применяться только у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием и двумя неудачными попытками экстакорпорального оплодотворения.
2. Для определения дня менструального цикла, в который нужно выполнить биопсию эндометрия, необходимо использовать дополнительно мочевой тест Clear Blue («Unipath Ltd», Великобритания).
3. Способ является инвазивным.
4. Забор материала для исследования (биопсия эндометрия) производится врачом гинекологом в специально оборудованном кабинете для малых гинекологических операций.
5. Способ требует специализированного оборудования (амплификатор в режиме реального времени), наличие которого не предусмотрено в учреждениях родовспоможения I и II уровней.
6. Более низкая чувствительность и специфичность способа, по сравнению с заявляемым.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики хронического эндометрита, в котором в менструальной крови определяют уровень растворимого антигена лейкоцитов-2 (РАЛ-2). При уровне РАЛ-2, равном или выше 640 мкг/мл, диагностируют хронический эндометрит [Патент №2108750 Российская Федерация. Способ диагностики хронического эндометрита / Посисеева Л.В., Бойко Е.Л., Борзова Н.Ю., Малышкина А.И., Шехлова Н.В. // Изобретения. - 1998. - №11, Ч. II. - С. 160.].
Данный способ был выбран в качестве прототипа, однако он имеет ряд недостатков:
1. Способ является полуколичественным и не может точно определить уровень исследуемого маркера.
2. Выполнение способа продолжительна по времени (около 24 часов);
3. Более низкая точность способа (76,9%), по сравнению с заявленным.
Технический результат заявляемого способа направлен на расширение арсенала диагностических средств, повышение точности, а также упрощение диагностики хронического эндометрита у женщин с бесплодием.
Заявляемый технический результат достигается тем, что у женщин с бесплодием в менструальной крови на 2-й день менструального цикла определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и при ее значении более 4,5 нмоль/мл диагностируют хронический эндометрит с точностью 88,3%.
Способ осуществляется следующим образом:
Определение концентрации МДА проводится методом К. Jagi (1968), который основан на реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой, в результате которой образуется розовый хромоген, носящий название триметиновый комплекс. По значению оптической плотности триметинового комплекса, полученной на спектрофотометре, определяют концентрацию МДА.
На 2-й день менструального цикла женщина собирает менструальную кровь в объеме 5 мл в индивидуальную менструальную чашу.
Затем менструальную кровь помещают в стерильную одноразовую пробирку без добавления реагента и центрифугируют в течение 5 мин при скорости 2500 об/мин.
Для определения концентрации МДА используются следующие реактивы:
2
4
2
4
2
1. 1/12 Н раствор HSO (Приготовление: 0,42 мл концентрированной HSO довести до 100 мл дистиллированной НO).
2. 10% фосфатно-вольфрамовая кислота
2
3. 0,8% тиобарбитуровая кислота (ТБК) на уксусной кислоте (УК) (Приготовление: 80 мл ТБК+5 мл НO и довести до 10 мл УК)
2
4
2
2
К 0,3 мл надосадочной жидкости, получившейся после центрифугирования менструальной крови, добавить 2,4 мл 1/12 Н раствора HSO и перемешать. Затем добавить 0,3 мл 10% раствора фосфатно-вольфрамовой кислоты. Снова перемешать и оставить на 10 мин при комнатной температуре (липиды выпадают в белый осадок). Затем центрифугировать при скорости 3000 об/мин в течение 15 мин. После центрифугирования удалить надосадочную жидкость. Добавить к осадку 1 мл дистиллированной НO и перемешать палочкой. Снова центрифугировать 5 мин на скорости 3000 об/мин, процедуру повторить 2 раза. К промытому полученному осадку добавить 3 мл НO и 1 мл 0,8% тиобарбитуровой кислоты. Содержимое пробирки перемешать и поместить в кипящую водяную баню на 1 час. Затем охладить пробирки в холодной воде и центрифугировать 10 мин со скоростью 6000 об/мин. Определить интенсивность окраски на спектрофотометре Solar SM 2203 при длине волны 532 нм против воды. Окраска может быть от бесцветного до бледно розового цвета.
Расчет:
где Е оп. - экстинция опыта.
При концентрации МДА более 4,5 нмоль/мл диагностируют хронический эндометрит.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается диагностировать хронический эндометрит у женщин с бесплодием по концентрации МДА в менструальной крови.
Малоновый диальдегид- это эндогенный альдегид, образующийся в результате метаболизма арахидоновой и других полиненасыщенных жирных кислот. Вследствие дальнейших биохимических превращений он окисляется до диоксида углерода или вступает во взаимодействие с фосфолипидами, аминокислотами и нуклеиновыми кислотами. МДА является маркером оксидативного стресса.
Ранее определение концентрации МДА в периферической венозной крови использовалось для прогноза и контроля лечения ишемической болезни сердца, оценки тяжести поражения печени при вирусном гепатите С [Значение малоновогодиальдегида и глутатионтрансферазы в оценке поражения печени и мониторинге терапии при хроническом гепатите С / И.А. Булатова, А.П. Щекотова, А.В. Кривцов и др. // Фундаментальные исследования. - 2014. - №4-2. -С. 246-251], для диагностики обострения хронического панкреатита и оценки эффективности его лечения [Значение оксида азота и малоновогодиальдегида в диагностике обострения хронического панкреатита и эффективности его лечения / А.В. Петраков и др. // Гастроэнтерология. Коллоквиум. - 2011. - №2. - С.5], а также в качестве прогностического маркера острого нарушения мозгового кровообращения [Гипергликемия и свободнорадикальный дисбаланс как прогностические маркеры острого нарушения мозгового кровообращения / С.А. Румянцева, Е.В. Силина, А.С. Орлова и др. // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2012. - Т. 6, №4. - С. 26-29].
Ранее определение концентрации МДА в менструальной крови для диагностики хронического эндометрита у женщин с бесплодием не использовалось.
Хронический эндометрит представляет собой воспалительный процесс, направленный на защиту организма от возбудителей инфекции и приводящий к свободнорадикальной активации. Запуск процессов перекисного окисления липидов сопровождается повреждением клеточных мембран эндометрия и повышением концентрации МДА, что усиливает синтез тромбоксана А2 и запускает процесс тромбинообразования [Влияние процессов пероксидации в тромбоцитах на систему гемостаза при воздействии сероводородсодержащего газа / Е.В. Голубкина, О.С. Дюкарева, Н.Н. Тризно и др. // Журнал медико-биологических исследований. - 2019. - Т. 7, №1. - С.40-48. DOI: 10.17238/issn2542-1298.2019.7.1.40]. Это приводит к нарушению микроциркуляции и развитию тканевой гипоксии, к деструкции клеточных мембран с выделением свободных радикалов, которые являются эндотоксинами и инициируют свободно-радикальное окисление липидов. Возникает порочный круг, при котором нарушается прооксидантное равновесие, что, по-видимому, способствует прогрессированию воспалительного процесса. Отличительные признаки способа: определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и при ее значении более 4,5 нмоль/мл диагностируют хронический эндометрит
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1.
Пациентка П. 25 лет, обратилась к врачу акушеру-гинекологу по поводу первичного бесплодия в течение 2 лет.
При осмотре: наружные половые органы развиты правильно.
Слизистая оболочка влагалища бледно-розового цвета. Шейка матки коническая, эпителий не изменен. Наружный зев сомкнут. Матка не увеличена. Придатки с обеих сторон не пальпируются, при пальпации безболезненны. Выделения слизистые. В клинических и биохимических анализах крови и мочи патологии не выявлено. При ультразвуковом исследовании патологии со стороны органов малого таза не выявлено. По результатам гистеросальпингографии проходимость маточных труб сохранена.
Согласно предложенному способу во второй день менструального цикла в менструальной крови определена концентрация МДА, которая составила 4,8 нмоль/мл, что свидетельствует о наличии у женщины хронического эндометрита.
На 22-й день этого же менструального цикла пациентке проведена Пайпель-биопсия эндометрия: выявлена лимфоцитарная инфильтрации с плазматическими клетками, очаговый фиброз и гиповаскуляризация эндометрия. Дано заключение: хронический эндометрит с поствоспалительным фиброзом стромы.
Пример 2.
Пациентка М. 31 года, обратилась к врачу акушеру-гинекологу по поводу вторичного бесплодия в течение 6 лет. В анамнезе одни своевременные роды без осложнений.
При осмотре: наружные половые органы развиты правильно. Слизистая влагалища бледно-розового цвета. Шейка матки плотная, эпителий не изменен. Наружный зев закрыт.Матка не увеличена. Придатки с обеих сторон не пальпируются, область их безболезненная. Выделения слизистые.
В клиническом анализе крови признаки железодефицитной анемии легкой степени. В биохимическом анализе крови и общем анализе мочи патологии не выявлено. При ультразвуковом исследовании выявлены гиперэхогенные включения в базальном слое эндометрия, диффузно-очаговые изменения в субэндометриальной зоны миометрия, неровность линии смыкания. По результатам гистеросальпингографии проходимость маточных труб сохранена.
Согласно предложенному способу во второй день менструального цикла в менструальной крови определена концентрация МДА, которая составила 12,42 нмоль/мл, что свидетельствует о наличии у женщины хронического эндометрита.
На 22-й день этого же менструального цикла пациентке проведена Пайпель-биопсия эндометрия: выявлена перигландулярная и периваскулярная лимфоцитарная инфильтрация с плазматическими клетками и фиброз стромы эндометрия. Дано заключение: выраженный хронический эндометрит с фиброзом стромы.
Пример 3.
Пациентка Б. 27 лет, обратилась к врачу акушеру-гинекологу по поводу первичного бесплодия в течение 4 лет.
При осмотре: наружные половые органы развиты правильно. Слизистая влагалища бледно-розового цвета. Шейка матки плотная, эпителий не изменен. Наружный зев закрыт.Матка не увеличена. Придатки с обеих сторон не пальпируются, область их безболезненная. В клинических и биохимических анализах крови и мочи патологии не выявлено. При ультразвуковом исследовании патологии со стороны органов малого таза не выявлено. По результатам гистеросальпингографии проходимость маточных труб сохранена.
Согласно предложенному способу во второй день менструального цикла в менструальной крови определена концентрация МДА, которая составила 3,55 нмоль/мл, что свидетельствует об отсутствии у женщины хронического эндометрита.
На 22-й день этого же менструального цикла пациентке проведена Пайпель-биопсия эндометрия, по результатам которой дано заключение эндометрий средней стадии фазы секреции без воспалительной инфильтрации и фиброза эндометрия.
Проведено обследование 63 женщин в возрасте 18-40 лет: 51 женщины с хроническим эндометритом и бесплодием и 14 здоровых женщин, проходящих подготовку к экстракорпоральному оплодотворению в связи с мужским фактором бесплодия. У женщин с хроническим эндометритом и бесплодием мужской фактор бесплодия был исключен. Все женщины имели овуляторный менструальный цикл, проходимость маточных труб у всех была сохранена. Всем женщинам на 2 день менструального цикла проводили определение концентрации МДА в менструальной крови, затем на 22 день этого же менструального цикла проводилась Пайпель-биопсия эндометрия. По результатам гистологического исследования хронический эндометрит был верифицирован по наличию плазматических клеток. Согласно проведенному ROC-анализу высокая концентрация МДА ассоциирована с наличием плазматических клеток в эндометрии. Пороговым значением выбрана концентрация МДА, равная 4,5 нмоль/мл. Площадь под кривой составила 0,94 (0,851-0,983). Чувствительность и специфичность модели в области порогового значения составили 98% и 78,6% соответственно. Таким образом, концентрация МДА более 4,5 нмоль/мл в менструальной крови на 2 день менструального цикла ассоциирована с наличием хронического эндометрита (чувствительность 98%, специфичность 78,6%) (фиг.1.).
Преимущества способа:
1. Способ имеет высокую точность (88,3%), чувствительность (98%) и специфичность (79,6%).
2. Способ доступен для осуществления в учреждениях родовспоможения I и II уровня в связи с тем, что оборудование, необходимое для его осуществления, входит в стандартное оснащение биохимической лаборатории.
3. Представленный способ прост в исполнении, так как не подразумевает участие медицинского персонала в заборе материала для исследования. Женщина может собрать менструальную кровь для исследования в домашних условиях.
4. Предлагаемый способ оперативен в исполнении - для его проведения необходимо 2 часа.
5. Предложенный способ может использоваться в качестве скринингового для диагностики хронического эндометрита у женщин с бесплодием, так как прост и оперативен в исполнении, имеет высокую точность, чувствительность и специфичность.
6. Способ позволит применить персонифицированный подход в тактике ведения пациенток с бесплодием и снизить частоту инвазивных вмешательств в полость матки.