СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ
METHOD FOR ASSESSING INDUCING ACTION OF CYTOMEGALOVIRAL INFECTION ON METHEMOGLOBIN CONCENTRATION IN PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTES OF PREGNANT WOMEN IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION

Цель работы - показать отрицательное влияние цитомегаловирусной инфекции на восстановление метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременных на третьем триместре гестации.
Как известно, в безъядерных эритроцитах широко представлен пентозный цикл утилизации глюкозы, в процессе которого происходит восстановление никотинамидадениннуклеотидфосфата (НАДФ) в восстановленную форму - НАДФ·Н (Федоров Н.А., 1976). За весь пентозный цикл образуется две молекулы НАДФ·Н (J. Murphy, 1960).
Образующиеся НАДФ·Н участвуют в разных клеточных процессах: синтезе жирных кислот, холестерина, восстановлении метгемоглобина. Нарушение пентозного цикла связано с разрушением структур эритроцитов и наступлением их гемолиза.
Особое место в функциональной деятельности эритроцита занимает метгемоглобин, являясь той формой гемоглобина, в которой железо гема окислено до Fe (III) и поэтому он не способен переносить кислород.
Формирование метгемоглобина в эритроцитах происходит при отравлении нитратами, анилином, полипептидами (Новицкий В.В., Сапрыкина Э.В. и др., 2006; Галоян А.А., Симонян М.А. и др., 2007).
Интенсивность реакций пентозного цикла в эритроцитах заметно увеличивается в присутствии метиленового синего, что способствует восстановлению метгемоглобина.
Вероятно, в безъядерных эритроцитах с утратой ядра произошла и утрата одного из факторов, участвующих в общей дыхательной системе -акцептора и переносчика водорода, который может быть заменен метиленовым синим (Энгельгардт В.А., 1943).
В норме восстановление метгемоглобина выполняется метгемоглобин-редуктазой. При подавлении ее функции могут ее заменить неферментативные системы; такие как глютатион, аскорбиновая кислота, метиленовый синий.
Однако на настоящее время в литературе нет сведений, указывающих на то, что в ингибировании метгемоглобин-редуктазы принимают участие антигены персистирующих инфекций, в том числе такие как антигены цитомегаловирусной инфекции.
В представленной работе мы остановились на следующих не освещенных в литературе факторах:
1. Содержание метгемоглобина в эритроцитах беременных изучалось в эритроцитах беременных при обострении во время гестации цитомегаловирусной инфекции, на третьем триместре беременности.
2. Процесс переноса электронов для восстановления метгемоглобина определяли путем окрашивания эритроцитов 0,1% раствором метиленового синего, предполагая, что ингибирование при цитомегаловирусной инфекции метгемоглобин-редуктазы приведет к повышенному включению в восстановление метгемоглобина метиленового синего как источника электронов.
Заявленный способ имеет следующие приемы:
1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 30 беременных, у которых на третьем триместре гестации появилось нарастание титра антител к цитомегаловирусу до 1:1600. Обследовано 15 беременных, у которых в период гестации не обнаружено антител к цитомегаловирусу.
2. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
3. Титр антител к цитомегаловирусу определяли иммуноферментным методом в периферической крови беременных на спектрофотометре «Stat Fax - 2100» (USA) с реагентами «Вектор-Бест» (Новосибирск).
4. Содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови определяли спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. (1968).
5. Активность метиленового синего в эритроцитах периферической крови определяли следующим образом:
гепаринизированную кровь, взятую из локтевой вены беременной в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл 0,1% раствора метиленового синего, приготовленного на фосфатном буфере с рН 7,4. Полученную взвесь эритроцитов в течение 5 мин содержали в термостате при температуре 37°С. Затем каплю взвеси помещали на предметное стекло и накрывали покровным стеклом, окатовав его парафином. Камеру со взвесью эритроцитов в 0,1% растворе метиленового синего помещали на микроскоп и изучали при увеличении 10×100. Полученные поля фотографировались на пленку «Кодак», с которой через сканер вносились в компьютер. В последующем производили подсчет количества эритроцитов, окрашенных метиленовой синькой, на 100 от общего числа подсчитанных как у здоровых беременных, так и беременных с обострением цитомегаловирусной инфекцией.
В процессе исследования были получены следующие результаты.
При обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации при титре 1:1600 в периферической крови количество окрашенных 0,1% раствором метиленового синего эритроцитов насчитывалось 12,0±0,9% (фигура 1), а количество метгемоглобина увеличивалось до 1,5±0,42%. У здоровых беременных содержание эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, составило 3,0±0,08% (фигура 2), а содержание метгемоглобина - 0,5±0,04%.
Таким образом, цитомегаловирусная инфекция подавляет восстановления метгемоглобина и создает угрозу насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом.
1. Галоян А.А., Симонян М.А. и др. Влияние обогащенного пролином полипептида на восстановление метгемоглобина и образование супероксида под действием металлопротеинов-цитохрома b558111 и супрола in vitro. // Нейрохимия. - 2007. - №1. - с.37-40.
2. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина. // Лен. отделение. - «Медицина». - 1968. - 324 с.
3. Новицкий В.В., Сапрыкина Э.В. и др. Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобино-образователей. // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - №1. - с.32-37.
4. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция.// М.:. - «Медицина». - 1976. - 543 с.
5. Энгельгардт В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта. // «Биохимия». - Т.8. - 1943. - С.9-12.
6. Murphy J.R. Erythrocyte metabolism I The equilibration of glucose - С between serum and erythrocytes // J. Lab. Clin. Med. - 1960. - vol.55. - p.281-286.
На фигуре 1 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови беременной на третьем триместре гестации 0,1% раствором метиленового синего при обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600. В силу ингибирования цитомегаловирусом процесса восстановления метгемоглобина число окрашенных эритроцитов остается высоким (12,0±0,9), так как блокируется перенос электронов с метиленовым синим.
На фигуре 2 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови здоровых беременных. В периферической крови определяется только 3,0±0,08% эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, поскольку путь для него к восстановлению метгемоглобина свободен.