Способ индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов с пролонгированием действия гипофизарных гонадотропинов
METHOD OF INDUCTION OF SUPEROVULATION IN COWS-DONORS EMBRYONES WITH PROLONGATION OF ACTIVITY OF HYPOPHYSICAL GONADOTROPINS

Изобретение относится к области репродуктивных биотехнологий в животноводстве, в частности, к методам получения и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (далее - КРС).
Максимально возможная воспроизводственная продуктивность коровы заключается в рождении, как правило, одного теленка в год, что не позволяет проводить в короткие сроки селекционную работу, создавать и формировать высокопродуктивные племенные стада с заданными хозяйственно-полезными признаками.
Одной из технологий ускоренного воспроизводства и тиражирования племенного потомства КРС является получение от животных-доноров эмбрионов с последующей их трансплантацией животным-реципиентам (далее - технология трансплантации эмбрионов). Такая технология позволяет более эффективно использовать генетический потенциал животных при значительном сокращении интервала между поколениями, и включает в себя следующие основные этапы: отбор животных-доноров эмбрионов, в качестве которых используют телок и коров с высокими хозяйственными и племенными характеристиками (далее - доноры), и отбор животных-реципиентов (далее - реципиенты); индукция суперовуляции (полиовуляции) у доноров; синхронизация половых циклов у доноров и реципиентов; искусственное осеменение доноров; извлечение (вымывание) эмбрионов у доноров; оценка по морфологии и жизнеспособности полученных эмбрионов; пересадка эмбрионов реципиентам; криоконсервация извлеченных эмбрионов. Благодаря данной технологии существует возможность ежегодно получать от одного донора до 80 эмбрионов и за счет последующей их пересадки реципиентам достигать выхода около 40 генетически ценных телят (при средней приживляемости, в среднем, 50%).
Биологически определено, что в яичниках коров содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), но, несмотря на такой огромный репродуктивный резерв, у данного вида млекопитающих в условиях физиологической нормы в течение одного полового цикла созревает, как правило, один фолликул (остальные подвергаются атрезии), и, как следствие, может быть оплодотворена одна яйцеклетка, что обуславливает рождение одного теленка. Поэтому для максимального использования биологического репродуктивного потенциала яичников у самок КРС существует необходимость индуцировать синхронный рост множества фолликулов, их созревание с последующей овуляцией. В этой связи, метод индукции суперовуляции (полиовуляции) является одним из важнейших этапов в технологии трансплантации эмбрионов.
Проведение процедуры индукции суперовуляции у доноров включает в себя введение одного из гонадотропных препаратов, содержащих фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), внутримышечно либо подкожно в зависимости от схемы гормональной стимуляции, введение препаратов клопростенола (препараты эстрофан, магэстрофан, броэстрофан и т.п.), являющихся синтетическими аналогами природного простагландина F2α. Наиболее используемыми на практике по эффективности индукции суперовуляции являются препараты, содержащие гонадотропины гипофизарного происхождения. В настоящее время производят препараты, содержащие ФСГ и ЛГ, полученные из гипофиза животных (свиней, овец) или рекомбинантным способом, например, промышленно выпускаемые препараты «ФСГ-супер», «Плюсет», «Follitropin-V», «R-Follitropin» и т.д. В отличие от гонадотропных препаратов, полученных, например, из сыворотки крови жеребых кобыл, гипофизарные гонадотропины имеют короткий период полураспада, не нарушают воспроизводительную функцию коров после проведения процедуры индукции суперовуляции, сохраняют чувствительность яичников к вводимым гонадотропинам, не вызывают аллергических реакций. ФСГ вызывает и стимулирует рост и созревание фолликулов в яичниках, а ЛГ инициирует, в последующем, их овуляцию, поэтому для достижения успеха при проведении индукции суперовуляции одномоментное присутствие экзогенных ФСГ и ЛГ необходимо в организме животного для полноценного протекания интроовариальных процессов. Соотношение ФСГ/ЛГ имеет большое значение для проведения качественной индукции суперовуляции. При этом, возможным диапазоном их соотношений, необходимых для индукции успешной суперовуляции у доноров, является соотношение ФСГ/ЛГ в известных коммерческих препаратах, которое составляет 1/0,001-1/1 (Инструкция к препарату «ФСГ-супер», сайт Интернет http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/, 2016 г.; В.В. Мадисон, В.Л. Мадисон. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. - М: ВО «Агропромиздат", 1988 г., стр. 58).
Общепринятым является способ гормональной обработки животного для индукции суперовуляции у доноров, включающий 8-10-кратное введение препарата, содержащего ФСГ и ЛГ, каждые 12 часов в течение 4-5 дней (4-х или 5-ти дневная схема введения гонадотропных препаратов) в связи с тем, что ФСГ имеет короткий период полураспада, и, как следствие, короткий период его инактивации в организме животного. Данный промежуток времени (4-5 дней) является достаточным для полного созревания множества фолликулов с образованием полноценных качественных яйцеклеток.
При этом, одним из серьезных недостатков ФСГ, используемого при проведении индукции суперовуляции в качестве вещества, вызывающего рост и созревание большого количества фолликулов, является короткий период его инактивации, что определяет необходимость его многократного введения в организм животного для постоянного поддержания эффективного уровня гормона в крови, необходимого для роста и созревания такого количества фолликулов.
Недостатком многократного введения является трудоемкий процесс, так как на постоянной основе в строго определенное время необходимо привлекать обслуживающий персонал для отбивки животного от общего стада, фиксировать животное и инъецировать ему препарат. При этом появляются условия для колебания концентрации вводимых гонадотропинов в сыворотке крови животного, которые создают стрессы, негативно влияющие на физиологические и метаболические процессы в организме доноров эмбрионов (телок и коров), и, как следствие, возникают предпосылки к получению низкого результата суперовуляции. В связи с этим возникает целесообразность однократного введения препарата, содержащего гипофизарные гонадотропины. Возможность отказаться от многократного введения такого препарата появляется в случае пролонгирования действия ФСГ с помощью различных вспомогательных веществ (пролонгаторов), увеличивающих время нахождения этого экзогенного гонадотропина в организме и обеспечивающих равномерное его высвобождение, приводящее к поддержанию необходимого уровня этого гормона в крови.
Проблема повышения эффективности результата суперовуляции с предпочтительным однократным введением гонадотропинов в настоящее время остается актуальной и решается в разных направлениях: совершенствуются протоколы индукции суперовуляции с использованием различных схем введения гонадотропинов в сочетании с известными и апробированными на практике вспомогательными веществами (пролонгаторами), ведется поиск новых, более эффективных вспомогательных веществ или их композиций, имеющих различную природу происхождения.
Известен способ продления действия однократной инъекции ФСГ с использованием в качестве пролонгаторов карбокси-метил-целлюлозы и поливинилпирролидона, 3,2%-го раствора желатина (Smith L.E., Sitton G.D., Vincent C.K. Limited inqection of follicle stimulating hormone for multiple births in beef cattle. // J. Anim. Sci., 1973, 37, 523-527). Известен пролонгатор пролонгон, позволяющий при однократной инъекции ФСГ вызывать суперовуляцию у 75% животных при числе овуляций от 9,9 до 10,7 (при использовании различных препаратов ФСГ) и выходе качественных эмбрионов от 2,9 до 3,5 на донора. При этом был отмечен более высокий уровень приживляемости эмбрионов, полученных от коров, обработанных ФСГ с пролонгоном. (Довгопол В.Ф., Осташко Ф.И., Исаченко И.И. Совершенствование нехирургического метода трансплантации эмбрионов. // Зоотехния, 1992, 2, 14-17). Однако вышеуказанные пролонгаторы не обеспечивают оптимального времени эффективного действия фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), необходимого для вызывания множественного роста фолликулов, либо обеспечивают высокое число овуляций, но при этом количество полученных пригодных эмбрионов ниже на 50% от среднестатистического, либо вызывают поликистоз яичников, который может привести к вынужденной выбраковке животного.
Известен способ стимулирования пролонгации ФСГ для индукции суперовуляции у коров-доноров (прототип - патент BY12490), включающий однократное введение коровам-донорам в лютеиновую фазу полового цикла препарата «ФСГ-супер», содержащего гипофизарные гонадотропины фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), сочетанно с пролонгатором, с последующим введением через 48 часов простогландина двухкратно с интервалом в 12 часов в дозах 500 и 250 мкг/голову по клопростенолу, который является синтетическим аналогом природного простагландина F2α. Животных двукратно искусственно осеменяют спермой проверенного быка-производителя через 48 и 60 часов после первой инъекции простагландина F2α. Извлечение эмбрионов осуществляют на 7-й день полового цикла. Полученные эмбрионы подвергают подсчету, оценке их жизнеспособности и пригодности к эмбриопересадкам. Согласно патенту BY12490, в качестве пролонгатора используют порошкообразный полимер поливинилового спирта (ПВС), который разводят в физиологическом растворе с температурой 50-60°С до концентрации 12-процентной суспензии, которую охлаждают до 40-42 градусов и в количестве 5-7 мл смешивают с 50 мг натурального ФСГ. Полученный рабочий раствор однократно вводят подкожно коровам-донорам в область лопатки по 5-7 мл/голову. Все животные-доноры были обработаны натуральным гормональным препаратом российского производства торговой марки «ФСГ-супер» согласно его инструкции (Сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/, 2016 г.). Данный препарат представляет собой гипофизарные гонадотропины, содержащие ФСГ и ЛГ, полученные из передней части гипофиза свиней, и имеет оптимальное для животных соотношение ФСГ к ЛГ - 1000-1500 ед. ФСГ/1 ед. ЛГ. Согласно инструкции производителя, препарат действует пролонгировано, сохраняясь в крови в течение 48-72-х часов, и обладает высокой физиологической активностью при малых дозах и однократном введении, благодаря высокой степени хроматографической очистки.
Недостатком прототипа является низкая эффективность пролонгирующего действия поливинилового спирта на ФСГ, используемый в соответствии со способом-прототипом при индукции суперовуляции у коров-доноров в виде препарата торговой марки «ФСГ-супер». В этой связи, недостаточно индуцируется синхронный рост, созревание и овуляция множества фолликулов, что приводит к получению большого количества эмбрионов с дегенерированными формами развития на разных стадиях, неоплодотворенных яйцеклеток, и, как следствие, к недополучению качественных эмбрионов.
Кроме того, недостатком является сложность приготовления рабочего раствора, содержащего препарат «ФСГ-супер» с пролонгатором, из-за многоэтапности его приготовления, необходимости контроля температуры растворителя (физраствор), охлаждения полученной суспензии, в результате чего образуется гелеобразный, трудноинъекцируемый рабочий раствор.
Задачей изобретения является создание способа индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов с пролонгированием действия гипофизарных гонадотропинов, позволяющего повысить количество синхронно созревших фолликулов с последующей их овуляцией и выходом качественных зрелых яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, а после их оплодотворения - к повышению количества получаемых качественных эмбрионов, так как этот показатель является главным показателем эффективности проведения индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов.
Техническим результатом изобретения является повышение количества качественных эмбрионов, полученных от коров-доноров в результате проведения индукции суперовуляции.
Технический результат достигается тем, что способ индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов с пролонгированием действия гипофизарных гонадотропинов включает однократное введение коровам-донорам в лютеиновую фазу полового цикла препарата, содержащего гипофизарные гонадотропины фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), сочетанно с пролонгатором, с последующим введением через 48 часов простогландина F2α, в котором согласно изобретению, дополнительно вводят 0,25-1% раствор новокаина в количестве 3-15 мл, причем данный раствор новокаина вводят одномоментно в сочетании с препаратом, содержащим гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ, сочетанным с пролонгатором, при этом в качестве пролонгатора используют биологически деградируемый полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ) с массой от 6000 до 70000 Да в количестве 0,5-7 г, а препарат, содержащий гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ, вводят в общей дозе, рекомендуемой инструкцией этого препарата для индукции суперовуляции.
Патентуемый способ применяют как один из этапов при проведении технологии трансплантации эмбрионов у коров-доноров эмбрионов. У телки или коровы, отобранной в качестве донора эмбрионов, выявляют признаки половой охоты, которая может быть как естественной, так и вызванной искусственно посредством введения животному гормональных препаратов. Факт выявления признаков половой охоты, которая длится у самок крупного рогатого скота, в среднем, 12-24 часа (примечание: в данный период времени животное не подлежит осеменению), регистрируют как условно нулевой день полового цикла у донора, с которого начинают отсчет дней этого полового цикла. С 9-го по 12-й день полового цикла (в лютеиновую фазу), предпочтительно, на 10-й день, проводят индукцию суперовуляции у доноров согласно патентуемому способу.
Однократное введение препарата, содержащего гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ (активные вещества), в сочетании с пролонгатором и с раствором новокаина, являющимися вспомогательными веществами, производят донору следующим образом. Непосредственно перед данным введением при комнатной температуре готовят рабочую смесь из указанных компонентов с учетом ветеринарно-санитарных требований и с учетом доз в соответствии с изобретением, при этом последовательность смешивания ингредиентов не принципиальна:
- препарат, содержащий гипофизарные гонадотропины фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) в общей дозе, рекомендуемой инструкцией к применяемому препарату гипофизарных гонадотропинов, необходимой для индукции суперовуляции;
- пролонгатор: биологически деградируемый полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ) с высокомолекулярной массой от 6000 до 70000 Да - 0,5-7 г;
- 0,25-1% раствор новокаина - 3-15 мл.
В патентуемом способе применяют препараты, содержащие гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ, представленные на рынке ветеринарной Фарминдустрии, например, препарат российского производства «ФСГ-супер» (сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/ 2016 г.), препарат Плюсет (Испания) (сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/1568/, 2016 г.). В инструкциях по применению к данным препаратам для стимуляции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов регламентированы дозы для многократного ежедневного введения с интервалом в 12 часов в течение 4-5 дней. Суммированное количество всех этих доз, указанных в инструкциях по применению для каждого из используемых препаратов, является, так называемой, «общей дозой» препарата, которую включают в вышеуказанную рабочую смесь. При этом, совокупность «общей дозы» препарата, содержащего гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ, и остальных компонентов рабочей смеси, которая подлежит однократному введению, способствует индуцированному физиологическому процессу роста и созреванию множества фолликулов в течение необходимого периода времени (4-5 дней).
Полученную рабочую смесь в полном объеме однократно инъецируют животному либо в подкожную клетчатку, либо внутримышечно (в область лопатки, шеи, тазобедренной части и т.д.). Через 48 часов вводят один из препаратов-аналогов простогландина F2α (эстрофан, магэстрофан, броэстрофан и т.п.) в соответствии с инструкцией по применению. Простогландин F2α способствует рассасыванию желтого тела и индукции половой охоты, которая наступает через 48-72 часов после введения простогландина F2α. На этом процедура проведения индукции суперовуляции согласно патентуемому способу является завершенной. В итоге, биологическая доступность и терапевтический эффект активных веществ ФСГ и ЛГ сохраняется в течение периода времени, который составляет 4-5 дней (96-120 часов) и соответствует общепринятым временным параметрам, достаточным для синхронного созревания полноценных яйцеклеток, которые в последующем способны оплодотвориться и развиться до качественных эмбрионов.
Для того, чтобы получить качественные эмбрионы, через 48-72 часов после введения простогландина F2α, т.е. после завершения патентуемого способа, проводят следующий этап при выполнении технологии трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота, который заключается в проведении процедур по осеменению коров-доноров эмбрионов. Осеменение проводят согласно общепринятым технологиям искусственного либо естественного осеменения коров-доноров эмбрионов. На 7-й день после осеменения у донора проводят ректальное либо ультразвуковое обследование яичников на наличие и количество желтых тел, что условно считается идентичным числу созревших и овулировавших фолликулов. При положительной реакции яичников, т.е. при наличии от 3-х и более желтых тел на одном или двух яичниках проводят извлечение (вымывание) эмбрионов. Полученные в процессе вымывания эмбрионы подвергают подсчету, оценке их жизнеспособности и пригодности к эмбриопересадкам, при этом, количество качественных эмбрионов является основным показателем эффективности патентуемого способа индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов.
В таблице приведены показатели эффективности применения патентуемого способа по сравнению с прототипом. При этом, были сформированы 5 групп животных, состоящих из коров и телок молочного направления продуктивности. Все группы формировались по принципу пар-аналогов. Первая группа животных была обработана в соответствии со способом-прототипом (контрольная), а в группах 2-5 была проведена индукция суперовуляции в соответствии с патентуемым способом. В группах 2 и 3 применяли препарат российского производства «ФСГ-супер» (сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/ 2016 г.), а в группах 4 и 5 - препарат Плюсет (Испания) (сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/1568/, 2016 г.). При этом, для объективного выявления эффективности пролонгатора ПЭГ, доноры в группах 2 и 4 были обработаны рабочей смесью без новокаина, а в группах - 3 и 5 рабочая смесь использовалась с новокаином.
Как видно из таблицы, на основании полученных нами результатов исследований можно сделать вывод о том, что введение препарата, содержащего гипофизарные гонадотропины ФСГ и ЛГ, пролонгатора ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да и 0,25-1% раствора новокаина, используемых в рабочей смеси с однократным введением донорам в лютеиновую фазу полового цикла, обеспечивает синергический эффект, приводящий к повышению количества качественных эмбрионов.
ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да в дозе 0,5-7 г способствует наиболее эффективному достижению технического результата - повышению количества качественных эмбрионов. Нами была исследована эффективность пролонгирующего действия ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да, оказываемого на ФСГ в организме животного, при введении этого полиэтиленгликоля в смеси с препаратом, содержащим ФСГ и ЛГ, в соответствии с патентуемым способом, но без использования раствора новокаина во 2-й и 4-й группах, в которых численность животных составляла по 20 голов (см. таблицу). Было выявлено, что ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да как пролонгатор ФСГ, демонстрирует хорошие результаты по количеству полученных качественных эмбрионов, в среднем, на одного донора, по сравнению с прототипом (см. таблицу, столбцы 2, 3 и 5).
Полиэтиленгликоль с молекулярной массой менее 6000 Да при его использовании в качестве пролонгатора ФСГ, в организме животного не оказывает необходимого пролонгирующего действия не только у коров крупных пород (голштинская, айрширская, аббердин-ангусская, герефордская и т.д.), но и у коров мелких пород (джерсейская и т.д.). Молекулярная масса ПЭГ более 70000 Да приводит к очень долгому высвобождению ФСГ, при этом, введенное количество ФСГ не успевает высвободиться в течение того промежутка времени, который необходим для полного созревания фолликулов с образованием полноценных качественных яйцеклеток (4-5 дней), и, кроме того, не достигается уровень концентрации ФСГ в организме животного, достаточный для стимулирования яичников при проведении индукции суперовуляции. Даже у высокопродуктивных животных с завышенной скоростью метаболизма введение ПЭГ с молекулярной массой более 70000 Да приводит к морфо-функциональным нарушениям яичников со снижением их активности, и, как следствие, к нарушению воспроизводительной функции у животного с образованием различного рода патологий в репродуктивных органах, приводящих к вынужденной выбраковке животных.
Количество вводимого ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да в дозе 0,5-7 г способствует наиболее эффективному достижению технического результата - повышению количества качественных эмбрионов. Это объясняется тем, что введение указанного ПЭГ в количестве менее 0,5 г приводит к снижению активности и пролонгирующего свойства ПЭГ, при этом он не удерживает необходимый уровень ФСГ в тот период времени, в течение которого проводится индукция суперовуляции в соответствии с патентуемым способом. Данное снижение эффективности действия ПЭГ приводит к преждевременному высвобождению ФСГ в организме животного и к дегенерации и атрезии образовавшихся фолликулов. Введение указанного полиэтиленгликоля в количестве более 7 г приводит к превышению времени, необходимого для высвобождения ФСГ, к отсутствию овуляции образовавшихся фолликулов и их последующему росту с образованием поликистозов яичников в тот период времени, в течение которого проводится индукция суперовуляции в соответствии с патентуемым способом.
Раствор новокаина, согласно патентуемому способу, дополнительно введенный в организм коровы-донора одномоментно в сочетании с препаратом, содержащим ФСГ и ЛГ, и с пролонгатором ПЭГ с молекулярной массой от 6000 до 70000 Да, в свою очередь, также способствует достижению технического результата - повышению количества качественных эмбрионов. Результаты исследований показали, что в количественном и процентном соотношении показатели полученных качественных эмбрионов, в среднем, на одного донора, в группах 3 и 5 (таблица, столбцы 4 и 6) превышают аналогичные показатели по сравнению с группой 1 (прототип) (таблица, столбец 2), а также по сравнению с группами животных 2 и 4 (таблица, столбцы 3 и 5). Холинолитические свойства новокаина позволяют купировать негативные явления, которые возникают вследствие инъекции экзогенных веществ (в патентуемом способе - инъецирование смеси, состоящей из новокаина, препарата, содержащего ФСГ и ЛГ, и ПЭГ) и выражаются в виде спазма гладкой мускулатуры и периферических сосудов, возникающего в месте инъецирования и ограничивающего биодоступность введеной смеси веществ. Новокаин позволяет улучшить кровоснабжение в месте инъецирования, оказывая дилятационное действие как на артериолы и венулы, так и на лимфатические капилляры. В этой связи, элиминация возможных вазоспазмов периферических сосудов и спазма гладкой мускулатуры в месте инъекции позволяет осуществить непрерывную доставку гонадотропинов из интерсициального пространства подкожной клетчатки, обеспечивая биодоступность и терапевтический эффект гонадотропинов. Таким образом, новокаин, воздействуя не только на кровеносную систему, но и на лимфатическую, оказывает триггерное влияние, позволяющее одномоментно побудить и усилить синхронный физиологический рост множества фолликулов, для которых первые 5-12 часов от момента введения смеси являются «подготовительным периодом» для последующего воздействия на них более высоких доз ФСГ и ЛГ, концентрация которых в крови увеличивается с уменьшением действия новокаина. В результате этого, уровень концентрации ФСГ и ЛГ, достаточный для синхронного созревания «подготовленных ранее» (в первые 5-12 часов от момента введения смеси) множества фолликулов достигается через 36-48 часов от момента введения смеси, и удерживается примерно на том же уровне до 96 часов от момента введения смеси.
Введение раствора новокаина в процентном выражении в диапазоне 0,25-1% обеспечивает наиболее эффективную нарастающую волну высвобождения ФСГ/ЛГ/ПЭГ в организме животного. При введении раствора новокаина в концентрации менее 0,25%, новокаин выполняет функцию обычного растворителя и не оказывает замедляющего свойства высвобождения сочетанных с ним ФСГ/ЛГ/ПЭГ. При введении раствора новокаина в концентрации более 1% замедляется местное кровоснабжение в точке инъецирования, снижается степень всасываемости ФСГ/ЛГ/ПЭГ, при этом новокаин выполняет функцию только анестетика, и не позволяет в полной мере высвобождать ФСГ/ЛГ/ПЭГ, что приводит к недостатку уровня фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови и прерыванию роста фолликулов. При смешивании 0,25-1% раствора новокаина в дозе менее 5 мл с ФСГ/ЛГ/ПЭГ происходит частичная связка между указанными ингредиентами, и после введения в организм животного распределение ФСГ/ЛГ/ПЭГ будет непропорциональным, и уровень ФСГ будет колебаться. Это приводит к нестабильной реакции яичников с низким выходом качественных яйцеклеток при овуляции. При смешивании 0,25-1% раствора новокаина в дозе более 15 мл с ФСГ/ЛГ/ПЭГ консистенция смеси становится настолько жидкой, что после введения смеси она распределяется в месте инъецирования, увеличивая площадь всасываемости, и дает обратный результат, снижая эффективность пролонгирующего действия ПЭГ, и ФСГ и ЛГ всасываются гораздо быстрее (в течение 2-3 суток) от необходимого времени, достаточного для полноценного процесса суперовуляции (4-5 дней).
Пример 1. Телке-донору эмбрионов джерсейской породы №14573, возраст 13 месяцев, провели индукцию суперовуляции в соответствии с патентуемым способом, при этом на 10-й день полового цикла (в лютеиновую фазу) однократно подкожно вводили смесь, которая была приготовлена непосредственно перед введением путем смешивания следующих ингредиентов и их соотношений: препарат «ФСГ-супер» в общей дозе, рекомендуемой инструкцией этого препарата для индукции суперовуляци, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 Да - 0,5 г, 0,25% раствор новокаина - 3 мл. На 7-й день после процедуры искусственного осеменения провели извлечение эмбрионов. Было получено 13 зародышей, из которых 9 штук были качественными и пригодными к трансплантации или к криоконсервации, при этом 7 из них находились на стадии развития бластоцисты и 2 - на стадии морулы. Также были вымыты 4 неоплодотворенные яйцеклетки.
Пример 2. Корове-донору эмбрионов черно-пестрой породы №85343, возраст 5 лет, провели индукцию суперовуляции в соответствии с патентуемым способом, при этом на 10-й день полового цикла (в лютеиновую фазу) однократно подкожно вводили смесь, которая была приготовлена непосредственно перед введением путем смешивания следующих ингредиентов и их соотношений: препарат «ФСГ-супер» в общей дозе, рекомендуемой инструкцией этого препарата для индукции суперовуляции, ПЭГ с молекулярной массой 40000 Да - 4,5 г, 0,5%, раствор новокаина - 10 мл. На 7-й день после процедуры искусственного осеменения провели извлечение эмбрионов. При этом, было получено 19 зародышей, из которых 13 штук были качественными и пригодными к трансплантации или к криоконсервации, при этом, 1 эмбрион находился на стадии развития экспондированной бластоцисты, 7 находились на стадии развития бластоцисты и 5 - на стадии морулы. Также были вымыты 3 непригодных эмбриона с остановкой развития и 2 неоплодотворенные яйцеклетки.
Пример 3. Корове-донору эмбрионов айрширской породы №1714, возраст 7 лет, провели индукцию суперовуляции в соответствии с патентуемым способом, при этом на 10-й день полового цикла (в лютеиновую фазу) однократно подкожно вводили смесь, которая была приготовлена непосредственно перед введением путем смешивания следующих ингредиентов и их соотношений: препарат «Плюсет» в общей дозе, рекомендуемой инструкцией этого препарата для индукции суперовуляции, ПЭГ с молекулярной массой 70000 Да - 7 г, 1%, раствор новокаина - 15 мл. На 7-й день после процедуры искусственного осеменения провели извлечение эмбрионов. При этом, было получено 21 зародышей, из которых 15 штук были качественными и пригодными к трансплантации или к криоконсервации, при этом, 3 эмбриона находились на стадии развития экспондированной бластоцисты, 9 - на стадии развития бластоциста и 3 - на стадии морулы. Также были вымыты 5 непригодных эмбрионов с остановкой развития на стадии 4-16 бластомеров и 1 неоплодотворенная яйцеклетка.