СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ
METHOD OF DETERMINING ADHESION OF Staphylococcus spp TO FIBRONECTIN AND FIBRINOGEN

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков к белкам человека фибронектину (Fn) и фибриногену (Fb), для характеристики вирулентных свойств in vitro no уровню специфической адгезии к данным белкам.
Вирулентные виды стафилококков, в частности патогенный вид S. aureus, экспрессируют на поверхности микробной клетки рецепторы к фибронектину и фибриногену.
Прототипом данного изобретения является "Способ определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам" (патент на изобретение №2393229 от 27.06.2010, приоритет от 29.12.2008 г.).
Отличительной особенностью данного способа от прототипа является определение адгезии к двум протеинам и определение уровня специфической адгезии к этим белкам в сравнении с контролем (неспецифической адгезии к полистиролу). Данный способ адгезии не требует поддержания условий и расходных реагентов, необходимых для работы с клеточными культурами тканей, на модели которых проводится оценка адгезии условно-патогенных бактерий, которые предложены в качестве подобных способов определения адгезии, например, Способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae путем контакта срезов легких мышей с пневмококком (RU, (21) 96100972 МПК C12Q 1/14, 1/20. (22) 1996.01.16. (54) Способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae и ее блокирования.
Целью заявленного изобретения является разработка стандартизуемого способа, позволяющего количественно определять показатель специфической адгезии стафилококков к белкам человека (фибронектину и фибриногену) для характеристики их вирулентного потенциала.
Сущность изобретения состоит в том, что исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками фибронектином, фибриногеном и в лунках, не содержащих иммобилизованных белков, в жидкой среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют адгезированные стафилококки:
1) путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды, или
2) путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или
3) путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа количественной оценки специфической адгезии к фибронектину и фибриногену, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, удобством проведения реакции непосредственно в лунках планшета и возможностью определения показателя специфической адгезии штаммов к фибронектину и фибриногену.
Преимущества заявленного к патентованию способа определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену является определение показателя специфической адгезии штаммов стафилококка, принадлежащих к различны вирулентным или авирулентным типам к данным белкам человека, высокая чувствительность способа за счет регистрации ферментативной активности адгезированных бактерий.
Способ осуществляется следующим образом: суспензию культуры стафилококка в концентрации 1 млн. м.т./мл инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными фибронектином и фибриногеном, а также в лунках полистиролового планшета, не содержащих иммобилизованные белки, в жидкой питательной среде 199 в течение 1 часа, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и последующим определением количества адгезированных стафилококков путем учета выросших клеток в питательной среде, или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведении, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Адгезивная активность выражается в условных единицах.
На базе лаборатории иммунологии и микробиологии ФБУН «КНИИЭМ» Роспотребнадзора проведен анализ адгезивности клинических изолятов стафилококков, выделенных со слизистой носа, кожи и из мокроты пациента с очаговой бронхопневмонией (штамма S. aureus И-78) и эталонного штамма S. aureus ATCC №25923 патентуемым способом. Было установлено, что клинические штаммы золотистого стафилококка, выделенные со слизистой носа, кожи и мокроты пациента с очаговой бронхопневмонией, характеризуются достоверно высокими показателями адгезии к данным протеинам по сравнению со штаммами, выделяемыми с поверхности кожи и слизистых в норме.
Примеры осуществления способа определения адгезии staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену:
2
2
2
2
Пример 1. Определение адгезивной способности стафилококков, выделенных со слизистых, кожи и мокроты при воспалительных процессах. Исследуемую культуру стафилококка разводили до концентрации 1 млн м.т. на 1 мл 199 средой и вносили в объеме 200 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета с иммобилизованным фибронектином (Fn), фибриногеном (Fb), и в лунки полистиролового планшета, не иммобилизованные белками (К-контроль), инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 часа, далее удаляли содержимое лунок и отмывали трехкратно 199 средой, содержащей 0,05% твин-20, и физиологическим раствором, лунки осушали и в каждую лунку вносили по 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор HO), через 10 минут вносили 50 мкл 4% раствора молибдата аммония и исследовали фотометрически при 414 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан», определяли показатели: ОП (Fn), ОП (Fb) и ОП (К) контроль. Параллельно трем пробам определяли фоновую оптическую плотность - ОП (Ф), для этого в лунки полистиролового планшета, не иммобилизованные белками, не вносили пробы культуры стафилококка, а добавляли 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор HO) и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония, фотометрировали при 414 нм. Установка на ноль фотометра проводилась по лункам, содержащим 150 мкл дистилированной воды и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония.
Расчет показателя адгезии штаммов проводили по формуле:
ПА (Fb)=(ОП (Fb)-ОП (К))-ОП (Ф) - показатель специфической адгезии к фибриногену.
ПА (Fn)=(ОП (Fn)-ОП (К))-ОП (Ф) - показатель специфической адгезии к фибронектину.
Результаты испытания адгезии клинических штаммов стафилококков и эталлоного штамма S. aureus ATCC №25923 данным способом представлены в таблице 1.
Пример 2. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации лунки фотометрировали при 595 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан». Определяли показатели оптической плотности, в исследуемых лунках: ОП (Fn), ОП (Fb) и ОП (Ф) - оптическую плотность в лунке, в которую клеточная культура не вносилась. Показатель адгезии (ПА) рассчитывали по формуле:
ПА(Fn)=(OП(Fn)-ОП(К))-ОП(Ф)
ПА(Р)=(ОП(Pb)-ОП(К))-ОП(Ф)
Результаты представлены в таблице 2.
Пример 3. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки средой 199 с твином-20 в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации в термостате из лунки отбирали по 50 мкл питательной среды, готовили десятикратные разведения на стерильном физиологическом растворе и из каждого разведения высевали методом газона на кровяной агар. Через 12 часов подсчитывают количество колоний на чашках и рассчитывают количество КОЕ/мл в соответствии с разведением. Результаты исследования адгезии изолятов стафилококка представлены в таблице 3.
Таблица 1
Показатели адгезии штаммов стафилококка, к примеру 1
Вид микроорганизма
ПА(Fn), М±m
ПА(Fb), М±m
S. aureus (со слизистой носа носителей)
0,81±0,07
0,52±0,06
S. aureus (кожа пациентов с АтД)
0,9±0,06
0,76±0,05
S. aureus (со слизистой пациентов с CAP)
0,73±0,05
0,63±0,05
S. aureus И-78
0,87±0,09
0,71±0,07
S. aureus ATCC N 25923
0,48±0,07
0,5±0,02
S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц)
0,28±0,07
0,42±0,3
S. epidermidis (с кожи здоровых лиц)
0,82±0,05
0,91±0,05
Таблица 2
Показатели адгезии штаммов стафилококка, к примеру 2
Вид микроорганизма
ПА(Fn), М±m
ПА(Fb), М±m
S. aureus (со слизистой носа носителей)
0,67±0,07
0,71±0,02
S. aureus (со слизистой пациентов с CAP)
0,54±0,05
0,5±0,02
S. aureus И-78
0,88±0,09
0,75±0,03
S. aureus ATCC N 25923
0,68±0,04
0,7±0,02
S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц)
0,35±0,07
0,27±0,2
S. epidermidis (кожа здоровых лиц)
0,22±0,05
0,31±0,03
S. hominis (кожа здоровых лиц)
0,14±0,02
0,15±0,02
Таблица 3
Показатели адгезии штаммов стафилококка к примеру 3
Вид микроорганизма
ПА(Fn) (КОЕ/на мл)
ПА(Fb) (КОЕ/на мл)
ПА(Ф) (КОЕ/на мл)
S. aureus (со слизистой носа носителей)
2,3×10<sup>6</sup>
2,8×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>2</sup>
S. aureus (кожа пациентов с АтД)
3,3×10<sup>6</sup>
2,1×10<sup>6</sup>
1,2×10<sup>2</sup>
S. aureus (со слизистой пациентов с CAP)
4,0×10<sup>6</sup>
3,6×10<sup>6</sup>
2,0×10<sup>2</sup>
S. aureus И-78
4,0×10<sup>6</sup>
5,1×10<sup>6</sup>
2,0×10<sup>2</sup>
S. aureus ATCC N 25923
3,8×10<sup>6</sup>
4,0×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>2</sup>
S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц)
1,0×10<sup>6</sup>
2,0×10<sup>6</sup>
1,2×10<sup>2</sup>
S. epidermidis (кожа здоровых лиц)
1,1×10<sup>6</sup>
2,0×10<sup>6</sup>
1,2×10<sup>2</sup>