Применение режима краткосрочного голодания в сочетании с ингибиторами киназ для усовершенствования традиционной химио-лекарственной эффективности и пригодности и обращения вспять побочных эффектов от киназ в нормальных клетках и тканях
APPLICATION OF SHORT-TERM FASTING MODE COMBINED WITH KINASE INHIBITORS FOR IMPROVEMENT OF TRADITIONAL CHEMO-MEDICINAL EFFECTIVENESS AND SUITABILITY AND REVERSAL OF SIDE EFFECTS OF KINASES IN NORMAL CELLS AND TISSUES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на выдачу патента США №61/948792, поданной 6 марта 2014 г., раскрытие которой включено во всей своей полноте в данный документ путем ссылки.
ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО СПОНСИРУЕМОГО ПРАВИТЕЛЬСТВОМ
ИССЛЕДОВАНИЯ ИЛИ РАЗРАБОТКИ
[0002] Данное изобретение было сделано при государственной поддержке согласно Контракту № 1PO1AG034906, заключенному с Национальным институтом здоровья. Правительство обладает определенными правами на данное изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] В по меньшей мере одном аспекте настоящее изобретение относится к способам специфического нацеливания и разрушения раковых клеток и уменьшения токсичного действия химиотерапии.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Рак - это повсеместно встречающееся заболевание, которое поражает млекопитающих и, в частности, человека. Прогресс в лечении рака идет неуклонно, хотя безоперационное излечение большинства раковых заболеваний достигнуто пока не было. Исследования показали, что рак представляет собой многостороннее заболевание, которое еще до конца не понятно. Поэтому будущие протоколы лечения без сомнения будут проводиться путями, которые в настоящее время не распознаны.
[0005] Относительно новый путь лечения рака привлекает кратковременное голодание (STS) и диеты, имитирующие голодание (FMD). Было показано, что кратковременное голодание и диеты, имитирующие голодание, эффективно повышают чувствительность раковых клеток различного типа к химиотерапии путем дифференцированного повышения чувствительности к стрессу (DSS), в то же время защищая нормальные клетки и ткани путем дифференцированной устойчивости к стрессу (DSR).
[0006] Соответственно, существует потребность в усовершенствовании способов лечения субъектов, страдающих раком.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0007] Настоящее изобретение решает одну или несколько проблем существующего уровня техники, предоставляя по меньшей мере в одном варианте осуществления способ, облегчающий или лечащий симптомы рака и/или эффекты от химиотерапии или ингибиторов киназ. Способ включает стадию выявления субъекта с раковым заболеванием. В первый временной период субъект получает малокалорийную диету. Обычно малокалорийная диета обеспечивает не более 1000 ккал в день. Субъект получает ингибитор киназы.
[0008] В другом варианте осуществления предложен способ лечения рака и/или облегчения симптома химиотерапии. Способ включает стадию выявления субъекта с раковым заболеванием. В первый временной период субъект получает малокалорийную диету. Обычно малокалорийная диета обеспечивает не более 1000 ккал в день. После первого временного периода субъект получает химиотерапевтическое средство.
[0009] В другом варианте осуществления предложен способ облегчения побочного эффекта лечения ингибитором киназы. Способ включает стадию выявления субъекта, получающего лечение ингибитором киназы. В первый временной период субъект получает малокалорийную диету. Обычно малокалорийная диета обеспечивает не более 1000 ккал в день. Субъект получает ингибитор киназы.
[0010] Преимущественно в вариантах осуществления изобретения STS или FMD в сочетании с ингибиторами киназ применяют для: а) предоставления безопасного и действенного средства в лечении рака без химиотерапии, b) усиления действия уже положительного действия кратковременного голодания в сочетании с химио-лекарственными средствами в терапии рака (Фиг. 3 и 4), и с) обращения вспять токсичного действия, наблюдаемого при введении только ингибиторов киназы в сочетании с традиционными химио-лекарственными средствами (Фиг. 2).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0011] На ФИГУРЕ 1А приведены диаграммы уровней глюкозы в крови для мышей, прошедших STS, получавших рапамицин и рапамицин с STS.
[0012] На ФИГУРЕ 1В приведены диаграммы уровней содержания кетоновых тел для мышей, прошедших STS, получавших рапамицин и рапамицин с STS.
[0013] На ФИГУРЕ 2А приведена схематическая временная шкала, показывающая план эксперимента по устойчивости к стрессу, проводимого на 12-недельных самках мышей C57B L/6.
[0014] На ФИГУРЕ 2В приведены результаты по выживанию на 20-ый день (конечная временная точка) эксперимента, представленного на Фигуре 3А.
[0015] На ФИГУРЕ 2С приведена диаграмма уровней глюкозы в крови для подтверждения эффективности STS на Фигуре 3А.
[0016] На ФИГУРЕ 3А приведены диаграммы жизнеспособности клеток клеточных линий человеческой нейробластомы, обработанных рапамицином и химиотерапевтическим лекарственным коктейлем TVD (топотекан + винкристин + доксорубицин) в условиях неограниченного питания или STS.
[0017] На ФИГУРЕ 3В приведены диаграммы жизнеспособности клеток клеточной линии мышиного рака молочной железы (4Т1), обработанных рапамицином и химиотерапевтическим лекарственным средством - доксорубицином (DXR) в условиях неограниченного питания или STS.
[0018] На ФИГУРЕ 3С приведены диаграммы жизнеспособности клеток клеточной линии мышиной меланомы (В16), обработанных рапамицином и химиотерапевтическим лекарственным средством - доксорубицином (DXR) в условиях неограниченного питания или STS.
[0019] На ФИГУРЕ 4А приведена временная шкала, показывающая план исследований развития опухоли с привлечением малокалорийной диеты и рапамицина.
[0020] На ФИГУРЕ 4В приведена диаграмма зависимости объема опухоли от времени для мышиной модели рака молочной железы 4Т1 у мышей BALB/c, получавших рапамицин и проходившие многократные циклы STS в сочетании с введением DXR.
[0021] ФИГУРА 4С представляет собой гистограмму, показывающую объем опухоли в конце эксперимента, представленного на Фигуре 4В.
[0022] На ФИГУРЕ 4D приведена диаграмма зависимости объема опухоли от времени для мышиной модели меланомы у мышей C57BL/6, получавших рапамицин и проходивших многократные циклы STS в сочетании с введением DXR.
[0023] ФИГУРА 4Е представляет собой гистограмму, показывающую объем опухоли в конце эксперимента, представленного на Фигуре 4D.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0024] Обратимся теперь к подробностям, касающимся предпочтительных в настоящее время композиций, вариантов осуществления и способов настоящего изобретения. Масштаб на Фигурах может не соблюдаться. Раскрываемые варианты осуществления всего лишь иллюстрируют изобретение, которое может быть выполнено в различных и альтернативных формах. Поэтому не предполагается, что специфические подробности, раскрываемые в данном документе, будут рассматриваться как ограничительные, а скорее как характерная основа любого аспекта изобретения и/или характерная основа, обучающая специалиста в данной области различным вариантам использования настоящего изобретения.
[0025] За исключением примеров или специально оговоренных случаев, все численные количества в данном описании, указывающие количества материала или условия реакции и/или применения, должны рассматриваться как модифицированные словом "примерно" при описании наиболее широкого объема изобретения. Практическая работа в указываемых численных пределах предпочтительна в общем случае. Кроме того, если специально не указано иное: в процентных долях, "частях" и соотношениях указаны массовые (весовые) значения; описание группы или класса материалов как пригодных или предпочтительных для установленной цели в соответствии с изобретением означает, что смеси любых двух или более представителей этой группы или класса одинаково пригодны или предпочтительны; описание составляющих с точки зрения химии относится к составляющим в момент введения в любую комбинацию, обозначенную в описании, и не обязательно исключает химическое взаимодействие между составляющими смеси после смешивания; первая расшифровка сокращения или другой аббревиатуры относится ко всем последующим употреблениям в данном докумете такой же аббревиатуры и с учетом соответствующих изменений относится к обычным грамматическим вариациям изначально обозначенной аббревиатуры; и, если специально не указано иное, измерение параметра проводится по такой же методике, которая ранее или позднее упоминается в связи с тем же параметром.
[0026] Данное изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления и способами, описанными ниже, поскольку конечно конкретные компоненты и/или условия могут изменяться. Кроме того, используемая в данном контексте терминология используется только в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и ни в коей мере не предназначена быть ограничительной.
[0027] В спецификации и следующей за ней формуле единственное число включает множественное, если только в контексте ясно не указано противоположное. Например, упоминание компонента в единственном числе предназначено включать в себя множество компонентов.
[0028] Термин "незаменимая аминокислота" относится к аминокислоте, которую организм не может синтезировать. В применении к людям незаменимые аминокислоты включают изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин. Кроме того, следующие аминокислоты также незаменимы для людей при определенных условиях: гистидин, тирозин и селеноцистеин.
[0029] Термин "килокалория" (ккал) и "калория" относится к калориям в пище. Термин "калория" относится к так называемой малой калории.
[0030] Термин "субъект" относится к человеку или животному, включая всех млекопитающих, таких как приматы (особенно высшие приматы), овца, собака, грызуны (например, мышь или крыса), морская свинка, коза, свинья, кошка, кролик и корова.
Сокращения:
[0031] "AL" означает ad lib (без ограничения).
[0032] "DSS" означает дифференцированное повышение чувствительности к стрессу.
[0033] "DXR" означает доксорубицин.
[0034] "FMD" означает диету, имитирующую голодание.
[0035] "KB" означает кетоновые тела.
[0036] "mTOR" означает цель рапамицина в млекопитающих.
[0037] "PKA" означает протеинкиназу А.
[0038] "Rapa" означает рапамицин.
[0039] "STS" означает кратковременное голодание.
[0040] "TVD" означает топотекан + винкристин + доксорубицин.
[0041] В варианте осуществления способ облегчения или лечения симптомов ракового заболевания и/или побочных эффектов химиотерапии или побочных эффектов ингибиторов киназ включает стадию выявления субъекта, нуждающегося в вышеуказанном. В первый временной период субъект получает малокалорийную диету. Обычно малокалорийная диета обеспечивает не более 1000 ккал в день. Ингибитор киназы субъекту вводят перед, после или в продолжение первого временного периода.
[0042] В другом варианте осуществления предложен способ облегчения побочного эффекта лечения ингибитором киназы. Способ включает стадию выявления субъекта, получающего лечение ингибитором киназы. В частности, ингибитор киназы представляет собой mTOR-протеинкиназу. В первый временной период субъект получает малокалорийную диету. Обычно малокалорийная диета обеспечивает не более 1000 ккал в день. Субъект получает ингибитор киназы. В некоторых случаях стадии получения малокалорийной диеты и введения ингибитора киназы состоят в цикле лечения, который можно повторять многократно, как изложено ниже.
[0043] Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения выявляют субъекта, страдающего раковым заболеванием и/или получающего химиотерапию. Ингибитор киназы (например, рапамицин) дают субъекту одновременно с малокалорийной диетой. Малокалорийная диета представляет собой либо кратковременное голодание (STS), либо диету, имитирующую голодание (FMD), которые дают в течение первого временного периода. В частности, ингибитор киназы представляет собой mTOR-протеинкиназу. В ходе кратковременного голодания субъект получает по сути 0 килокалорий в день. В общем случае диета FMD обеспечивает менее чем примерно 1000 килокалорий в день, если она предписана. В подробностях диета FMD изложена ниже. В другом варианте в ходе лечения субъекту также вводят химиотерапевтическое средство, отличное от ингибитора киназы. Примеры подходящих химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваются этим, топотекан, винкристин, доксорубицин и их комбинации. Используются дозировки химиотерапевтических средств, которые известны в уровне техники для лечения различных форм рака такими средствами. Было обнаружено, что настоящий вариант осуществления особенно полезен в лечении субъекта, имеющего меланому, нейробластому или рак молочной железы, или получающего лечение химиотерапией для этих состояний. Кроме того, результатом применения протокола лечения по настоящему варианту осуществления является меньший объем опухоли, чем при лечении химиотерапевтическими средствами, в котором не сочетают ингибиторы киназ с малокалорийной диетой, как изложено в данном документе. В других случаях стадии получения малокалорийной диеты, введения химиотерапевтического средства и введения ингибитора киназы состоят в цикле лечения, который можно повторять многократно. Способы данного изобретения, которые включают STS или FMD, благоприятно уменьшают или полностью исключают смертность, вызываемую доксорубицином и ухудшаемую сочетанием доксорубицина и рапамицина.
[0044] В контексте настоящих вариантов осуществления следует понимать, что в ходе STS и FMD на молекулярном и физиологическом уровнях происходят многочисленные изменения, включая (помимо прочего) снижение экспрессии факторов, таких как IGF-I, и белков-переносчиков сигнала, таких как mTOR и PKA. Способы настоящего изобретения вызывают благоприятное снижение уровней различных аминокислот, инсулина и глюкозы, в то же время повышая уровни кетоновых тел (КВ) (см. Фигуру 1, подробно описанную ниже). В частности, способы стимулируют раковые клетки, которые обычно находятся в гликолитическом состоянии (эффект Варбурга), переключаться и полагаться на дыхание для получения энергии и выживания. Все эти молекулы, акторы и белки модулируют нормальный рост клеток частично путем регулирования серин/треониновых протеинкиназ. Практически все раковые клетки характеризуются мутациями в онкогенезе, что делает их невосприимчивыми к внешним изменениям. Однако внутри себя раковые клетки могут в некоторых случаях переключаться на альтернативный путь. Это явление успешно поддерживает изобретательский замысел введения ингибиторов киназ в сопровождении STS/FMD, в котором STS/FMD предотвращают или ингибируют активизацию альтернативных путей.
[0045] Специфические киназы и другие ингибиторы роста могут снижать развитие ракового заболевания, особенно если ингибитор действует дальше по цепочке после онкогенной мутации. Многочисленные изменения, стимулированные STS и FMD, способствуют дополнительному эффекту ингибирования роста, который может влиять на пути, не подверженные влиянию ингибитора киназы. В частности, FMD ведет к значительному уменьшению широкого разнообразия питательных веществ, одновременно вызывая значительное увеличение в другом, например, в кетоновых телах и жирных кислотах. Поэтому сочетание STS и FMD с ингибиторами киназ создает синергическое действие, способствующее гибели, наряду с ингибиторами киназ и другими белками, влияющими на рост клеток. Эти эффекты могут происходить в ходе режима STS/FMD, но их действие может быть усилено химиотерапией (см. Фигуры 3 и 4, описанные ниже). Кроме того, киназы и другие ингибиторы переноса сигнала могут замедлять рост рака, но они также вызывают серьезные побочные эффекты и даже гибель (Фиг. 2D) нормальных клеток. STS или FMD обращает вспять повышенную смертность, вызываемую совместным введением ингибиторов киназ и химиотерапии, частично путем снижения активности путей, затронутых ингибитором киназы в нормальных клетках (см. Фигуру 2, описанную ниже).
[0046] Примеры протоколов STS и FMD, которые можно использовать в настоящих вариантах осуществления, можно найти в патентных заявках США №№12/430058 и 13/488590; полное раскрытие которых таким образом включено в данный документ ссылкой. В одном варианте малокалорийная диета предоставляет гипокалорийную или бескалорийную диету. Диета содержит диетические материалы, способные предоставить субъекту-человеку питательные вещества, в то время как они предоставляют не более чем 1000 ккал в день, и в частности, не более чем 813-957 ккал в день. В одном варианте малокалорийная диета предоставляет субъекту от примерно 100 до 1000 ккал в день. В частности, малокалорийная диета предоставляет субъекту не более, в порядке возрастания предпочтений - 1000, 957, 700, 500, 300 или 100 ккал в день. И в еще одном конкретном случае диета предоставляет 0 ккал в день.
[0047] В изложенных здесь вариантах осуществления малокалорийная диета предоставляет субъекту белок в количестве менее чем или равном 30-36 г в день. В частности, малокалорийная диета предоставляет субъекту белок в количестве менее чем или равном, в порядке возрастания предпочтений - 40, 35, 20, 10 или 5 г, или 0 г в день. Если в диетических материалах присутствуют углеводы, то они несут в себе не более чем половину энергии малокалорийной диеты. В частности, субъект может получать диету STS/FMD в течение периода 3-10 последовательных дней перед проведением химиотерапии субъекту. Субъект также может получать диету в течение 24 часов после проведения химиотерапии. Предпочтительно, чтобы субъект получал диету в течение периода 3-10 последовательных дней перед проведением химиотерапии субъекту и 24 часа после проведения.
[0048] В варианте каждого из изложенных здесь осуществлений ингибитор киназы можно вводить в течение недели с момента начала цикла малокалорийной диеты (т.е. первого временного периода). Еще в одном конкретном случае ингибитор киназы можно вводить в течение 1, 2, 3, 4 или 5 дней с момента начала цикла малокалорийной диеты. В другом варианте ингибитор киназы вводят после, но в течение недели с момента окончания цикла малокалорийной диеты. Еще в одном конкретном случае ингибитор киназы можно вводить после, но в течение 1, 2, 3, 4 или 5 дней с момента окончания цикла малокалорийной диеты. В другом варианте малокалорийную диету дают в течение суммарного периода, составляющего от 3 дней до 14 дней на цикл лечения. Еще в одном конкретном случае малокалорийную диету дают в течение всего периода каждого цикла лечения, составляющего от 3 дней до 10 дней. Как изложено выше, стадии получения малокалорийной диеты, введения химиотерапевтического средства (в случае его применения) и введения ингибитора киназы состоят в цикле лечения, который можно повторять многократно с заранее установленными интервалами. Например, этот цикл лечения можно повторять с интервалами от двух недель до двух месяцев. В частности, этот цикл лечения можно повторять с интервалами от двух недель до одного месяца.
[0049] В других вариантах изложенных здесь осуществлений малокалорийная диета предоставляет питательные вещества, в то время как она обеспечивает не более чем 11 ккал (например, не более чем 8, 5 или 2 ккал, или 0 ккал) энергии на кг веса тела субъекта в день и не более чем 0,4 г (например, 0,3, 0,2 или 0,1 г или 0 г) белка на кг веса тела животного или человека в день. Если в диете присутствуют углеводы, то они несут в себе не более чем половину энергии. В некоторых вариантах осуществления, диета может предоставлять не более чем 700 ккал (например, 600, 400 или 200 ккал или 0 ккал) суммарной энергии в день. Когда субъекту проводят химиотерапию, нормальные клетки, но не атипичные клетки, такие как раковые клетки, защищены в животном или человеке. Например, животное или человек может получать диету в течение 3-10 последовательных дней до проведения субъекту химиотерапии. Субъект также может получать диету в течение 24 часов после проведения химиотерапии. Предпочтительно, чтобы субъект получал диету в течение периода 3-10 последовательных дней перед проведением субъекту химиотерапии и 24 часа после проведения.
[0050] В другом варианте в протоколе STS/FMD, используемом для малокалорийной диеты, используют диеты, имитирующие голодание. Например, субъект, страдающий раковым заболеванием, может голодал 48-140 часов перед одной порцией химиотерапии или 4-56 часов после химиотерапии. Предпочтительно, чтобы субъект, страдающий раковым заболеванием, получал FMD за 48-140 часов перед одной порцией химиотерапии и 4-56 часов после химиотерапии.
[0051] Примеры диет FMD можно найти в патентных заявках США №№14060494 и 14178953; полное раскрытие которых таким образом включено в данный документ путем ссылок. Обычно протоколом FMD предусматривается, что диета субъекта заменяется в продолжение заранее определенного числа дней (т.е. 5 дней). В течение этого периода субъекты пьют много воды. Для здоровых субъектов с нормальным весом (Индекс массы тела или ИМТ в интервале 18,5-25) диету употребляют раз в месяц (5 дней диеты и 25-26 дней нормальной диеты) в течение первых 3-х месяцев и каждые 3 месяца после этого (5 дней каждые 3 месяца). Вес субъекта измеряют и субъекту необходимо снова набрать не менее 95% веса, потерянного в ходе диеты, перед началом следующего цикла. Субъекты с ИМТ менее 18,5 не должны предпринимать FMD, если только она не рекомендована лечащим врачом и проводится под его наблюдением. Такой же режим (раз в месяц в течение первых 3-х месяцев и один раз каждые 3 месяца после этого) можно применять для лечения или для поддержки лечения всех состояний, перечисленных в патентных заявках. Патентная заявка США №14178953 предлагает низкобелковый вариант диеты FMD.
[0052] Как изложено выше, варианты осуществления данного изобретения призывают к введению ингибитора киназы и, в частности, ингибитора mTOR-киназы. Рапамицин явлется особенно полезным ингибитором mTOR-киназы. Обычно, вводимая доза рапамицина составляет от 5 до 20 мг в день. Примеры других ингибиторов киназ включают Афатиниб (Гилотриф) (цель - EGFR/ErbB2, для лечения немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC) - 40 мг раз в день, перорально); Акситиниб (цель VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/C-KIT, для лечения почечно-клеточной карциномы - 5 мг дважды в день); Руксолитиниб (цель - JAK, для лечения миелофиброза - от 5 до 25 мг дважды в день, перорально, в зависимости от количества лейкоцитов); Иматиниб (Гливек) (цель - Bcr - Abl, для лечения хронического миелолейкоза (ХМЛ) - от 400 мг до 600 мг раз в день); Вемурафениб (Зелбораф) (цель - BRAF, для лечения последней стадии меланомы - 960 мг каждые 12 часов); Босутиниб (Босулиф) (цель - BcrAbl/SRC, для лечения хронического миелолейкоза - 500 мг раз в день с едой); и их комбинации.
[0053] FMD для млекопитающих субъектов и, в частности, людей, заменяет нормальную диету пациента, больного раком, на период от 5 до 21 дня, при этом 17 дней являются максимальной продолжительностью для основной части пациентов (см. ниже), а частоту определяют на основании частоты и эффективности других терапий, применение с большей частотой необходимо, если другие терапии не эффективны в лечении ракового заболевания. Способность пациента к восстановлению веса перед началом следующего цикла также должна приниматься во внимание, при этом пациенты с более тяжелыми симптомами, способные восстанавливать вес, получают диету с той же частотой, что и другие терапии, а пациентам, вес которых не восстанавливается, или которые не способны вынести весь период диеты, FMD предписывается только после набирания ими нормального веса (вес перед началом лечения, а также с ИМТ больше 18). FMD состоит из компонентов, которые относятся к группе RGAS и считаются безопасными для здоровья. Калории потребляются согласно весу тела субъекта. В 1-ый день суммарное потребление калорий составляет 4,5-7 калорий на фунт (или 10-16 калорий на килограмм). Диета по меньшей мере на 90% должна быть растительной. В 1-ый день диета должна содержать менее 30 г сахаров, менее 28 г растительных белков, 20-30 граммов растительных мононенасыщенных жиров, 6-10 г растительных полиненасыщенных жиров и 2-12 г растительных насыщенных жиров. Во 2-21-ый день суммарное потребление калорий составляет 3-5 калорий на фунт (или 7-11 калорий на килограмм). Во 2-21-ый день диета должна содержать менее 20 г сахаров, менее 18 г растительных белков, 10-15 г растительных мононенасыщенных жиров, 3-5 г растительных полиненасыщенных жиров и 1-6 граммов растительных насыщенных жиров, 10-30 граммов глицерина, разведенного в 1 литре воды/день, в пересчете на вес тела (10 граммов для лица весом 100 фунтов, 20 граммов для лица весом 200 фунтов и 30 граммов для лица весом 300 фунтов). Диета также должна иметь высокую питательность и содержать примерно 50% рекомендуемой суточной дозы (ежедневно) витаминов, минеральных веществ + незаменимых жирных кислот. Минимальная продолжительность будет 5-6 дней и максимальная продолжительность - 21 день (на основании данных о безопасности и нормативов практики ухода в клиниках голодания).
[0054] Следующие примеры предназначены проиллюстрировать, но не ограничивать объем изобретения. Хотя такие примеры являются типичными примерами, которые могут быть использованы, альтернативно могут применяться и другие методики, известные специалистам в данной области. Без сомнения средний специалист в данной области без излишнего экспериментирования и основываясь на приведенном здесь учении может легко представить себе и произвести дополнительные варианты осуществления.
Эксперименты по DSS и DSR
[0055] Способы настоящего изобретения прошли экстенсивные испытания in vitro и in vivo на мышиных моделях. STS и FMD также прошли испытания в различных клинических исследованиях, которые показали безопасность и пригодность соблюдения этих двух диет. Диета FMD вызывала как DSS, так и DSR, с такой же эффективностью, что и STS.
[0056] Способы: Кратковременное голодание (STS) или диету, имитирующую голодание (FMD), давали раз в две недели в течение периодов 48 ч или 4 дней, соответственно. Окончание соблюдения диеты происходило одновременно с внутривенным введением доксорубицина. Животным давали возможность восстанавливать вес в течение периода от 10 до 12 дней между одним циклом соблюдения диеты и следующим циклом. Рапамицин вводили внутрибрюшинно каждый день в продолжение кормления ad lib, но не в ходе соблюдения диеты, в течение всей длительности эксперимента. Наблюдали за физиологическими и молекулярными маркерами, такими как уровни циркулирующей глюкозы, кетоновых тел и S6K, с целью подтверждения эффективности лечения. На Фигуре 1А показано, что лечение рапамицином вызывает состояние, сходное с состоянием невосприимчивости к инсулину, приводя к повышению содержания глюкозы в крови. Снижение содержания глюкозы в крови у мышей в Rapa + STS/FMD подтверждает гипотезу о том, что мыши, получавшие Rapa и STS/FMD, более устойчивы, чем мыши, получавшие только один рапамицин. На Фигуре 1В показано, что, как и ожидалось, уровни кетоновых тел (КВ) значительно повышались в ходе STS/FMD, вне зависимости от введения рапамицина. Выполняли односторонний анализ ANOVA, причем различия с р-значением <0,05 считали значимыми (р-значение <0,05, 0,01 и 0,001 указаны как *, * и ***, соответственно).
[0057] Диета (для мышей): Мышей кормили облученным кормом TD.7912 для грызунов (Harlan Teklad). Вкратце, эта диета содержит 3.Т5ккал/г усвояемой энергии, причем калории поступают из белков, углеводов и жиров в процентном соотношении 25:58:17. Пищу предоставляли ad lib. В среднем мыши в контрольной группе потребляли 14,9 ккал/день (или 3,9 г/день). Наша экспериментальная диета FMD основывается на скрининге питания, который определил ингредиенты, обеспечивающие высокую питательность в продолжение периодов низкого потребления калорий (Brandhorst, Wei et al., 2013. Exp Gerontol. 2013 Oct; 48(10): 1 120-8. doi: 10.1016/j.exger.2013.02.016. Epub 2013 Feb 21). Перед началом диеты FMD животных переводили в чистые клетки, чтобы предотвратить подъедание ими остаточного корма и копрофагии. Диета FMD состоит из двух разных компонентов, обозначенных как диета 1-го дня и диета 2-4-го дней, которые скармливали в этом порядке, соответственно. Диета 1-го дня содержит 1,88 ккал/г и была предназначена подготовить мышь к периоду низкого потребления калорий в продолжение последующих дней кормления. Диета 2-4-го дней одинакова во все дни кормления и содержит 0,36 ккал/г. Диеты 1-го дня и 2-4-го дней скармливали в виде среднего потребления (~4 г) кормления ad lib контрольной группы каждые две недели. Вследствие разной калорийности предоставляемой диеты FMD мыши в этой когорте потребляли на ~50% меньше калорий в 1-ый день и потребляли 9,7% от потребляемых в контрольной когорте калорий на 2-4-ый дни. Мыши потребляли всю предоставленную им пищу в каждый из дней режима FMD и не проявляли каких-либо признаков неприятия еды. В конце диеты 2-4-го дней мы предоставляли корм TD.7912 ad lib в течение 10 дней перед началом другого цикла FMD.
[0058] На Фигурах 2А-С приведены экспериментальные результаты, показывающие возникшую устойчивость к стрессу у мышей. В этих экспериментах 12-недельных самок мышей C57BL/6 делили на следующие экспериментальные группы: ad lib (неограниченное ad libitum питание), STS/FMD, DXR, STS/FMD+DXR (Фиг. 2). С целью наблюдения ответной реакции на каждое лечение в присутствии или в отсутствие рапамицина каждую группу дублировали, но только одна получала лечение рапамицином. Введение рапамицина выполняли в течение периода 14 дней, в конце которого внутривенно вводили высокую дозу доксорубицина (24 мг/кг). Животным, входящим в группы STS + DXR, скармливали очень низкокалорийную и безбелковую FMD в течение 48 ч перед инъекцией доксорубицина. После инъекции доксорубицина за животными наблюдали каждый день и фиксировали выживаемость (Фиг. 2). На Фигуре 2А приведен план лечения для этого эксперимента по устойчивости к стрессу. На Фигуре 2В приведены данные по выживаемости на 20-ый день. На Фигуре 2С приведена диаграмма крови уровней содержания глюкозы для каждой из экспериментальных групп. Также наблюдалось, что введение рапамицина в ходе химиотерапии повышает чувствительность к лекарству у мышей, что приводит в повышению смертности. Однако эксперимент на Фигуре 2В показывает, что STS может повернуть вспять повышение чувствительности нормальных тканей к химиотерапии, вызванное рапамицином.
Эксперименты, относящиеся к раковым заболеваниям
[0059] Ингибитор mTOR-киназы - рапамицин в сочетании с STS и химиотерапевтическими лекарствами давали по предписанию животному, субъекту-человеку или раковым клетками с целью сдерживания роста рака и повышения выживаемости. Исследуемыми химиотерапевтическими лекарствами были антрациклин доксорубицин сам по себе или в смеси с двумя другими химио-лекарствами - топотеканом и винкристином (TVD), которые обычно применяют для лечения взрослых и детей, страдающих раковым заболеванием.
[0060] На Фигурах 3А-В приведены результаты экспериментов, в которых исследовали эффективность STS в сочетании с рапамицином в снижении роста опухоли in vitro в применении к клеточным линиям человеческой нейробластомы (SH-SY5Y), мышиного рака молочной железы (4Т1) и мышиной меланомы (В16). На Фигуре 3А приведены диаграммы жизнеспособности клеток клеточных линий человеческой нейробластомы, обработанных рапамицином и химиотерапевтическим-лекарственным коктейлем TVD (топотекан + винкристин + доксорубицин) в условиях неограниченного питания или STS. На Фигуре 3В приведены диаграммы жизнеспособности клеток клеточной линии рака молочной железы (4Т1), обработанных рапамицином и химиотерапевтическим лекарственным средством - доксорубицином (DXR) в условиях неограниченного питания или STS. На Фигуре 3В приведены диаграммы жизнеспособности клеток клеточной линии меланомы (В16), обработанных рапамицином и химиотерапевтическим лекарственным средством - доксорубицином (DXR) в условиях неограниченного питания или STS. В каждом из этих экспериментов определяли жизнеспособность клеток, используя окрашивание трипановым синим для всех исследуемых клеточных линий, и определяли эффективность каждого лечения в отношении жизнеспособности путем определения t-критерия Стьюдента (р-значение <0,05, 0,01 и 0,001 указаны как *, * и ***, соответственно). Результаты показывают, что кратковременное голодание (STS) увеличивает эффективность рапамицина и химиотерапии в снижении жизнеспособности клеток во многих клеточных линиях рака.
5
5
5
[0061] В мышином раке молочной железы (4Т1) и мышиной меланоме (В16) в мышиных моделях аллотрансплантата было показано, что STS и рапамицин имеют аддитивный эффект в снижении развития опухоли, что подтверждает то, что STS усиливает действие ингибитора mTOR-киназы - рапамицина на раковые клетки. На Фигурах 4А-Е приведены результаты исследований развития опухоли. На Фигуре 4А приведена временная шкала, показывающая план показывающая план исследований развития опухоли с привлечением малокалорийной диеты и рапамицина. В общем, мышам Balb/c и C57BL/6 проводили подкожные инъекции клеток 2×10 4Т1 или В16, соответственно. После того, как опухоль можно было прощупать, мышей делили на группы и их подвергали многократным циклам STS в сочетании с введением DXR. На Фигуре 4В приведен график зависимости объема опухоли от времени для мышиной модели рака молочной железы 4Т1 у мышей Balb/c, получавших рапамицин и проходивших многократные циклы STS (закрашенный столбик в А) в сочетании с введением DXR. Фигура 4С представляет собой гистограмму, показывающую объем опухоли в конце эксперимента, представленного на Фигуре 4В. На Фигуре 4D приведен график зависимости объема опухоли от времени для мышиной модели меланомы у мышей C57BL/6, получавших рапамицин и проходивших многократные циклы STS в сочетании с введением DXR. Фигура 4Е представляет собой гистограмму, показывающую объем опухоли в конце эксперимента, представленного на Фигуре 4D. Односторонний анализ ANOVA выполняли для определения значимости различия в размере опухоли и эффективности исследуемого лечения (р-значение <0,05, 0,01 и 0,001 указаны как *, * и ***, соответственно). В случае модели мышиного рака молочной железы 4Т1 самкам мышей Balb/c подкожно (п.к.) в правый бок вводили 2×10 раковых клеток 4Т1 и скармливали ad lib стандартную диету до тех пор, пока опухоль не начинала прощупываться. В случае нашей модели мышиной меланомы В16 самкам мышей C57BL/6 подкожно (п.к.) в правый бок вводили 2×10 раковых клеток В16 и скармливали стандартную диету ad lib до тех пор, пока опухоль не начинала прощупываться. В этот момент определяли объем опухоли и мышей распределяли в следующие экспериментальные группы: ad lib (неограниченное (ad libitum) питание), STS/FMD, DXR, STS/FMD+DXR. С целью наблюдения ответной реакции на каждое лечение в присутствии или в отсутствие рапамицина каждую группу дублировали, но только одна получала лечение рапамицином. Мыши получали ежедневную инъекцию рапамицина и многократные циклы лечения (общим числом 3), где каждый цикл состоял из следующего: мышей, входивших в группы STS/FMD и STS/FMD+DXR, подвергали полной пищевой депривации в продолжение от 48 до 72 ч при свободном доступе к воде, а затем им снова скармливали стандартную пищевую диету в течение ~10 дней между циклами для восстановления потерянного веса. Животным из группы STS/FMD+DXR также внутривенно вводили доксорубицин в конце первого, второго и третьего цикла, соответственно. Животных из группы DXR кормили ad lib и им также вводили доксорубицин. Эксперименты показали, что голодание усиливает эффект рапамицина, снижая развитие опухоли.
[0062] В заключение, комбинация STS/FMD с ингибитором mTOR - рапамицином имеет аддитивный эффект при задерживании роста и выживания широкого разнообразия раковых клеток и опухолей. Это комбинированное лечение также предотвращает зависящее от химиотерапии повышение чувствительности нормальных клеток, вызываемое введением рапамицина самого по себе. Результаты позволяют предположить, что STS/FMD может усиливать действие других ингибиторов зависящих от питания сигнальных путей, включая AKT-TOR-S6K и Ras-cAMP-PKA и МАРК. Благодаря широкому действию эффекта STS или эквивалентного ему FMD на различные молекулы, факторы роста и питательные вещества вне и внутри клеток, предполагается, что наблюдаемое усиление действия с рапамицином будет происходить и со многими другими ингибиторами киназ/роста, используемыми при лечении раковых заболеваний. Поскольку рапамицин и многие другие ингибиторы киназ/роста широко используются в лечении некоторых опухолей у людей, эти результаты имеют важное значение для безопасности и эффективности этих терапий.
[0063] Несмотря на то, что выше описаны иллюстративные варианты осуществления, не предполагается, что эти варианты осуществления описывают все возможные формы изобретения. Скорее слова, использованные в описании, являются словами описания, а не ограничения, и следует понимать, что можно производить различные изменения без отступления от идеи и объема изобретения. Кроме того, признаки различных вариантов осуществления можно объединять для получения дополнительных вариантов осуществления данного изобретения.