Многоцентровое исследование лекарственной устойчивости штаммов бактерий рода Klebsiella в Центральном Казахстане

ЭКОЛОГИЯ И ГИГИЕНА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579:57.063.8

И. А. Беляев1, Д. Б. Бабенко1, А. В. Лавриненко1, Е. А. Захарова1, Д. М. Алибекова2, А. К. Байжуанова2, Г. О. Бейсембаева3, В. К. Терехова4, И. С. Азизов1

МНОГОЦЕНТРОВОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA В ЦЕНТРАЛЬНОМ КАЗАХСТАНЕ

Лаборатория коллективного пользования Карагандинского государтвенного медицинского университета, 2Областной медицинский центр, 3Областная клиническая больница

I. А. Belyaev, D. B. Babenko, А. V. Lavrinenko, Ye. А. Zakharova, D. М. AHbekova, А. К. Baizhuanova, G. О. Beisembayeva, V К. Terekhova, I. S. Аzizov

MULTICENTER STUDY OF DRUG-RESISTANT BACTERIA OFKLEBSIELLA GENUS IN CENTRAL KAZAKHSTAN

The objects of the study were the clinical isolates of Klebsiella sp. The aim of this work was to obtain the modern data on epidemiology and dynamics of drug sustainability of nosocomial strains of Klebsiella sp. producers of extended-spectrum beta-lactamase in hospitals of Central Kazakhstan. The strains were gathered in Regional Medical Center of Karaganda, Regional Clinical Hospital of Karaganda, Medical Center of «Kazakhmys Corporation» (Zhezkazgan). The authors performed the reidentifiction of strains. The sensitivity to antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method. ESBL-production was phenotypically defined by double discs synergy test. It was formed the collection of antibiotic-resistant strains. 300 strains were reidentified, drugs resistance was defined. It was identifined ESBL-production among 37 strains of Klebsiella strains.

Key words: drug resistance, ESBL-producing strains, multicenter study, antimicrobial resistant strains, nosocomial strains, bacteria of Klebsiella genus, molecular-genetic typing, extend spectrum ß-lactamases

И. А. Беляев, Д. Б. Бабенко, А. В. Лавриненко, Е А. Захарова, Д. М. Алибекова, А. К. Байжуанова, Г. О. Бейсембаева, В. К. Терехова, И С. Азизов

KLEBSIELLA ТЕКТЕС БАКТЕРИЯ ШТАММДАРЫНЫЦ ОРТАЛЫК КАЗАКСТАНДА ДЭРЛ1К Т¥РАКТЫЛЫРЫН КбПОРТЛЫфЫ ЗЕРТТЕУ

Зерттеу нысандары Klebsiella sp клиникалык изоляттары болып табылады. Осы жумыстыц максаты Klebsiella тектес нозокомиалды штаммдардыц, Орталык Казакстан стационарларындаFы кецейттген спек^ бета-лактамаз продуценттерУц дэрьглк турактыльрыныц эпидемиологиясы жэне динамикасы туралы казiргi заманFы мэлiметтердi алу болып табылады жэне болып табылды. Klebsiella spp штаммдары Облыстык медицина орталы^ынан, КараFанды к. Облыстык клиникалык ауруханасынан, ЖезказFан к. «Казакмыс корпорациясы» ЖШС филиалыныц медициналык орталырынан жиналды. Штаммдарды ретепирлеу жYргiзiлдi. Дифуззиондык эд^пен микробка карсы препараттарFа сезгiштiгi аныкталды. Кос дискi эдiсiмен Klebsiella тектес бактериялардыц ESBL-eнiмi фенотиптi турде аныкталды. Фенотипт белгiлер бойынша антибиотикорезистенттi штаммдардыц топтамасы курылды. 300 штамм ретепирлендiрiлдi, микробка карсы препараттарFа тeзiмдiлiгi аныкталды. 37 Klebsiella тектес бактерия штамында фенотипт эдiспен ESBL-eнiмнiн бар-жоктыFы аныкталды.

Клт сездер: дэрьглк турактылык, ESBL-eршiмелi штаммдар, кепорталыкты зерттеу, антибиотикорезистенттi штаммдар, нозокомиалды штаммдар, Klebsiella тектес бактериялар, молекулярлы-генетикалык типтеу, кецейттген спектрдщ ß-лактамаздары.

Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием их широкого клинического применения. В зависимости от структуры применения антибиотиков наиболее распространенными являются те или иные механизмы резистентности [4]. В настоящее время очень часто антибактериальные препараты назначаются в случае заболеваний, при которых эта категория лекарственных средств неэффективна. При этом, несмотря на необоснованные материальные затраты и прогрессирование антибиотикорези-стентности, назначение антибиотиков широкого спектра действия продолжает увеличиваться. Эмпирическое применение антибиотиков является необходимостью, вопрос заключается только в их рациональном использовании.

Цель исследования - получение современных данных об эпидемиологии и динамике лекарственной устойчивости нозокомиальных штаммов рода Klebsiella, продуцентов бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), в стационарах Центрального Казахстана.

Задачи исследования:

1. Формирование коллекции нозокомиальных ESBL-продуцирующих штаммов бактерий рода Klebsiella в Центальном Казахстане;

2. Оценка динамики экстенсивных (%RIS) показателей эпидемиологии лекарственной устойчивости нозокомиальных ESBL-продуцирующих штаммов бактерий рода Klebsiella в стационарах Центрального Казахстана.

Дизайн исследования. Исследование является проспективным, кросс-секционным, многоцентровым, микробиологическим. В рамках исследования на базе научно-исследовательской микробиологической лаборатории Карагандинского государственного медицинского университета проводилось определение чувствительности госпитальных штаммов Klebsiella sp. (ESBL+) к основным антимикробным препаратам. Критерий включения штаммов бактерий в исследование - выделение от пациента с инфекционным заболеванием после 48 часов пребывания пациента в стационаре. Критерием исключения было выделение штамма от больного, посту-

пившего в стационар с уже имеющейся клиникой инфекционного заболевания, либо с инфекционным заболеванием, развившимся ранее чем через 48 ч пребывания пациента в стационаре.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были госпитальные штаммы бактерий рода Klebsiella, выделенные в 5 крупных стационарах Центрального Казахстана: Национальный научный медицинский центр (г. Астана), Областная клиническая больница (г. Караганда), Областной медицинский центр (г. Караганда), Многопрофильная клиника корпорации «КазахМыс» (г. Жезказган), Научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (г. Астана). Это клиники регионального значения, в которые поступают пациенты со всего Центрально-Казахстанского региона, в связи с чем данные этих стационаров позволяют экстраполировать полученную информацию на весь Центрально-Казахстанский регион.

Бактериологический метод индикации и идентификации нозокомиальных штаммов является «золотым стандартом» в микробиологической диагностике внутрибольничных инфекций. Первичный посев и идентификация микроорганизмов проводился в лабораториях по месту забора материала по стандартным схемам на основании морфологических, биохимических и культуральных свойств [2, 3,

15]. Реидентификация штаммов осуществлялась методом времяпролетной масс-спектрометрии с использованием MALDI-TOF спектрометра Microflex и программного комплекса Biotyper фирмы Bruker Daltoniks.

Выделенные штаммы хранили в микропробирках Eppendorf на глицериновой среде в холодильнике при -80Со. Перед использованием штаммы восстанавливали на мясопептонном бульоне в течение 18-24 ч.

Внутренний контроль качества осуществляли с использованием референс-штаммов E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, Kl. pneumoniae 16CDC/WHO-1

Определение динамики роста оценивали ден-ситометрическим методом с использование планшетного фотометра MultiScan Ascent. Ведение базы данных по чувствительности к антибиотикам осуществляли с использованием программы WhoNet 5.6.

Определение чувствительности к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом [13,

16] и методом серийных разведений [14]. При определении чувствительности диско-диффузионным методом использовали стандартные диски с антибиотиками. Определение чувствительности методом серийных разведений проводилось в 2-кратных микроразведениях на 96-луночных планшетах (от 512 мкг/мл до 0,1 мкг/мл). Учет осуществлялся визуально и автоматизированно с использованием планшетного фотометра MultiScan Ascent (ThermoElectron) и программы Ascent Software. Результаты интерпретировались диско-диффузионным методом и методом серийных разведений в соответ-

ствии со стандартом CLSI [14].

Идентификация бета-лактамаз проводилась по субстратным профилям в соответствии с европейскими рекомендациями [9]. Определение b-лактамаз расширенного спектра (ESBL) проводили путем выявления эффекта расширения зон задержки роста рядом с диском, содержащим ингибитор (комбинированный препарат клавулановая кислота/ амоксициллин) [7]. МПК90, МПК50 и средние показатели чувствительности к антибиотикам определяли с использованием программы WhoNet 5.6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе кросс-секционного, многоцентрового, микробиологического исследования было собрано 302 госпитальных штамма из стационаров Центрального Казахстана. После этапа субкультивирования все штаммы были ретипированы методом масс-спектромерического профилирования (MALDI-TOF) рибосомальных белков с помощью времяпро-летного масс-спектрометра Microflex фирмы Bruker Daltonics. Результаты реидентификации показали, что 87% штаммов являлись представителями Klebsiella pneumoniae, 10% - Klebsiella oxytoca, 3% были представителями других видов.

Фенотипическим методом из обследованных штаммов было выделено 92 (30,46%) штамма продуцента бета-лактамаз расширенного спектра (ДИ 95% 23,83-37,72%). По сравнительным данным исследования SMART, имеющего схожую методологию, распространенность продуцентов БЛРС среди представителей Klebsiella sp. составляет в Китае, по данным Chi-Chang Huanga et al., 33,7% [11], и 34,4% - по результатам исследования Po-Ren Hsue-ha et al. [9], в Индии - 46,8% [9], 56,8% [6]. Доля продуцентов БЛРС среди представителей Klebsiella sp., по данным D. Hobana et al., составила в Европе 39%, в Северной Америке - 8,8% [5], в Латинской Америке, по результатам исследования M. V. Villegas et al., - 37,7% [12].

Проанализирована чувствительность 200 штаммов Klebsiella sp. к антибактериальных препаратам методом дисков. Определена чувствительность к следующим препаратам: ампицилин/ сульбактам, амикацин, цефтриаксон, цефтазидим, цефотаксим, ципрофлоксацин, цефепим, эртапенем, имипенем, левофлоксацин (табл. 1).

Устойчивость к цефалоспоринам третьего поколения в соответствии с международным стандаром EUCAST [10] по оценке результатов чувствительности к антимикробным препаратам может расцениваться как продукция БЛРС. В качестве подтверждающего теста может применяться метод двойных дисков. Однако чувствительность и специфичность метода не позволяет выявить низкоэкспрессируе-мые гены БЛРС, что требует дополнительного скрининга изученных штаммов методом пЦр-типирования.

Как видно из представленных данных, доля штаммов, устойчивых к цефалоспоринам третьего поколения, превышала 50%. Однако фенотипиче-ски метод двойных дисков позволил выявить БЛРС лишь в 32% случаев. В остальных случаях эффекта

Таблица 1.

Чувствительность к антибактериальным препаратам штаммов Klebsiella sp.

Препарат Чувствительность (%) ДИ 95%

Ампицилин/сульбактам 38,89 30,2-48,3%

Амикацин 98,61 94,62-99,83

Цефтриаксон 55,56 46,1-64,58%

Цефтазидим 56,94 47,6-66%

Цефотаксим 55,56 46,1-64,58%

Ципрофлоксацин 63,89 54,7-72,5%

Цефепим 56,94 47,6-66%

Эртапенем 97,22 93-99,4%

Имипенем 94,44 88,9-97,8%

Левофлоксацин 69,44 60,4-77,58%

ингибиции бета-лактамаз вокруг дисков, содержащих клавуланат, не наблюдалось. В то же время, устойчивость к цефалоспоринам может быть обусловлена продукцией хромосомных бета-лактамаз класса С. В связи с этим в последующем будет проведен дополнительный скрининг.

Обращает на себя внимание отсутствие абсолютной чувствительности к антимикробным препаратам группы карбапенемов, что может быть связано либо с гиперпродукцией белков системы эф-флюкса OprD или с дефектом транспортной системы белков ABC-транпортеров клеточной мембраны. Более точная детекция данных механизмов будет проведена на следующем этапе исследования.

Результаты исследования показали, что в нашей стране значительно увеличилось распространение микроорганизмов продуцентов БЛРС, в связи с чем возникла необходимость изучения распространенности БЛРС. В эпидемиологически значимых стационарах Центрального Казахстана распространенность БЛРС продуцентов составляет 30,46% от общего количества исследуемых бактерий рода Klebsiella. Бактерии, продуцирующие БЛРС, следует считать бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.

Результаты проведенного исследования позволят повысить эффективность планирования лабораторного контроля нозокомиальных инфекции в лечебно-профилактических учреждениях. Данные по эпидемиологии БЛРС дадут возможность более эффективно проводить мероприятия по инфекционному контролю за нозокомиальными заболеваниями. При выявлении у больного с нозокомиальной инфекцией, вызванной бактериями рода Klebsiella, не следует использовать в качестве антибактериальной терапии бета-лактамные антибиотики за исключением карбапенемовой группы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вейант Р. Определитель нетривильаных гра-мотрицательных бактерий /Р. Вейант, У. Мосс, Р. Уивер. - М: Мир, 1999. - 314 с.

2. Клиническая лабораторная аналитика /Под ред. В. В. Меньшикова. - М: Агат-Мед, 2003. - Т. 4.

- 815 с.

3. Практические аспекты современной клинической микробиологии /Л. З. Скала, С. В. Сидоренко, А. Г. Нехорошева и др. - М.: Агат, 1997. - 312 с.

4. Сидоренко С. В. Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое зна-чение и методы детекции //Инфекции и антимикробная терапия. - 2002.

- №4 (6). - С. 112-120.

5. Antimicrobial susceptibility of Enterobacteri-aceae, including molecular charac-terization of extended-spectrum beta-lactamase-producing species, in urinary tract isolates from hospitalized patients in North America and Europe: results from the SMART study 2009-2010 /D. Hobana, C. Lascolsa, L. Nicolleb et al. // Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. -2012. - 74 (1). - P. 62-65.

6. Antimicrobial susceptibility profiles of aerobic and facultative Gram-negative bacilli isolated from patients with intra-abdominal infections in the Asia-Pacific region according to currently established susceptibility interpretive criteria /Y. H. Chenab, P. Ren, R. Hsuehc et al. //Journ. of Infection. - 2011. - V. 62, №4. - P. 280-291.

7. Detection of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli Strains Producing Ex-tended-Spectrum p-lactamases /J. Spargo, J. Ferraro, L. Sutton et al. //J. Clin. Microbiol. - 1994. - №32. - P. 691-697.

8. Disk Diffusion Eleventh informational Suppl. // National Committee for Clinical Laboratory Standarts. -2001. - Р. 100-111.

9. Epidemiology and antimicrobial susceptibility profiles of aerobic and faculta-tive Gram-negative bacilli isolated from patients with intra-abdominal infections in the Asia-Pacific region: 2008 results from SMART (Study for Monitoring Antim-icrobial Resistance Trends) /Po-Ren Hsueha, Robert Badalb, P. Stephen et al. //In-ternational Journal of Antimicrobial Agents. -2010. - V. 36, №5. - P. 408-414.

10. EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing /R. Leclercq, R. Canton, D.F.J. Brown et al. //EUCAST. - 2011. - P. 13-14.

11. Impact of revised CLSI breakpoints for susceptibility to third-generation cephalosporins and car-bapenems among Enterobacteriaceae isolates in the Asia-Pacific region: results from the Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART), 20022010 /Chi-Chang Huanga, Yao-Shen Chenb, Han-Siong Tohc et al. //International Journal of Antimicrobial Agents. - 2012. - V. 40 (1). - P. 4-10.

12. Increasing prevalence of extended-spectrum-beta-lactamase among Gram-negative bacilli in Latin

America - 2008 update from the Study for Monitoring An-timicrobial Resistance Trends (SMART) /M. V. Villegas, M. G. Blanco, J. S. Osornio, F. Rossi //Braz. J. Infect. Dis. - 2011. - 15(1). - P. 86-92.

13. Jorgensen J. H. Antimicrobial Susceptibility Testing: General Con-siderations /J. H. Jorgensen, D. F. Sahm //Manual of Clinical Microbiology. - Salvador, 1995. - P. 1277-1280.

14. National Committee for Clinical Laboratory Standarts. Perfomance standard for antimicrobial susceptibility testing //National Committee for Clinical Laboratory Standarts. - 2009. - V. 3(13). - P. 100-119.

15. Speciment Processing /B. S. Reisner, G. L. Woods, R. B. Thompson et al. //Manual of Clinical Microbiology. - Washington, 1999. - P. 64-104.

16. Woods G. L. Antibacterial Susceptibility Tests: Dilution and Disk Diffusion Methods /G. L. Woods, J. A. Washington //Manual of Clinical Microbiology. - Washington, 1995. - P. 1327- 1341.

Поступила 11.06.2013 г.