СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНТИГЕННОГО ПОЛИМЕРНОГО ДИАГНОСТИКУМА
METHOD OF OBTAINING PSEUDOTUBERCULOSIS ANTIGEN POLYMER DIAGNOSTICUM

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике опасных инфекций при выявлении антител к возбудителю псевдотуберкулеза наиболее эпидемически значимых сероваров, распространенных среди людей, с использованием видоспецифических мембранных белков Yersinia pseudotuberculosis, сенсибилизированных на акролеиновых полимерных сферах.
Несмотря на большой арсенал средств в лабораторной практике, проблема диагностики псевдотуберкулеза (ПТ) в настоящее время остается актуальной.
Наиболее предпочтительным в клинике является метод определения антител к антигенам возбудителя в сыворотке крови, при этом особенностью псевдотуберкулеза является многообразие его клинических проявлений, вызываемых сероварами Y. pseudotuberculosis, а именно O:1a, O:1b, O:2b, O:2с, O:3, O:4а, O:4b, O:5a, O:5b, что затрудняет диагностику и лечение, так как отсутствуют тест-системы, которые достоверно и быстро идентифицируют антитела к псевдотуберкулезному микробу.
Известен диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный антигенный (см. Методические указания МУ 3.1.1.2438-09 «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза», Москва, 2009 г., стр.61), представляющий собой лиофилизированную взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных специфическим полисахаридом или протеинполисахаридным комплексом Y. pseudotuberculosis серовара O:1.
Однако официальный диагностикум не позволяет выявлять антитела в крови больных, если заболевание вызвано другим сероваром возбудителя псевдотуберкулеза.
В результате в связи с биологической лабильностью носителя наблюдается плохая воспроизводимость серий препарата, а использование полисахарида в качестве сенситина дает большое количество перекрестных реакций с другими представителями рода Yersinia, а также с возбудителями кишечных инфекций, тем самым затрудняя дифференциацию антител к возбудителю псевдотуберкулеза.
Наиболее близким по технологической сущности является способ диагностики псевдотуберкулеза (см. патент RU №2153172, кл. G01N33/53, опубликовано 20.07.2000 г.), представляющий собой тест-систему на основе высокоочищенного термостабильного токсина с мол. массой 45 кДа, где в качестве антигена используют видоспецифический белок порин из внешней мембраны Y. pseudotuberculosis, за диагностический титр принимают разведение сыворотки 1:400 и 1:800, в качестве реагента для предотвращения неспецифического связывания используют 0,1%-ный раствор медицинского желатина. Результат считают положительным при соотношении значений оптической плотности специфической сыворотки к оптической плотности нормальной сыворотки больше или равно 2,1.
Недостатком прототипа можно считать то, что используемый в качестве антигена токсин продуцируется 82,6% исследуемых разработчиками штаммов Y.pseudotuberculosis, независимо от серовара возбудителя псевдотуберкулеза, что делает возможным получение ложноотрицательных результатов.
Результаты исследования сыворотки крови больных (патент №215372) показали, что только на 3-4 неделе заболевания процент положительных реакций в ИФА при использовании тест-системы на основе порина составил 98,9% (средний показатель оптической плотности 1,34). Кроме того, в виду многостадийности, сложности и длительности проведения исследования данная тест-система не может относиться к препаратам для экспресс-диагностики псевдотуберкулеза, что делает невозможным ее использование при массовом исследовании, а также эпидемиологических угрозах.
Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке препарата для экспресс-диагностики псевдотуберкулеза, обладающего высокой видоспецифичностью и чувствительностью.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения псевдотуберкулезного антигенного полимерного диагностикума, включающем получение сенситина с использованием белков наружной мембраны Y. pseudotuberculosis с последующим применением их в серологической реакции, в качестве сенситина используют пул из 10 белковых антигенов с молекулярными массами в пределах 28-80 кДа, концентрацией общего белка 0,9-1,3 мг/мл, который растворяют в 1 мл 0,1 М бикарбонатного буферного раствора (рН 9,2) и проводят его иммобилизацию на носитель, представляющий собой суспензию микросфер, из расчета 1 мг белка на 100 мг носителя, при этом инкубацию проводят в течение 2-х часов при постоянном помешивании на мешалке, после чего суспензию оставляют на 16-18 часов при 4-6°С, затем блокируют свободные альдегидные группы, трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего суспендируют в 3% желатозно-сахарозной среде высушивания в соотношении 1:1 и разливают в инсулиновые флаконы по 1 мл, после чего проводят лиофилизацию.
При этом пул белков выделяют из грубых клеточных оболочек путем добавления к ним 33% водного раствора N-лаурил-саркозина-Nа до конечной концентрации его во взвеси 2% и инкубирования в течение 16 часов при комнатной температуре, затем раствор центрифугируют при 50000 об/мин на ультрацентрифуге в течение 1 часа, полученный осадок отмывают дистиллированной водой и проводят исследование белкового спектра методом SDS-дискэлектрофореза в ПААГ по методу Laemmly.
Кроме того, в качестве носителя сенситина используются сферические полимерные частицы диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп.
Причем грубые клеточные оболочки получают из предварительно выделенной бактериальной массы густотой 80-100 млрд кл. /мл, которую центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в 10 мМ Hepes-буфере, содержащем 20% (в/о) сахарозы (рН 7,2), после проводят пять циклов ультразвуковой дезинтеграции продолжительностью по 45 сек с минутным интервалом, при длине волны 585 мкм, после лизированные клетки обрабатывают ДНК-азой и РНК-азой из расчета 10 мкг фермента на 1 мл микробной взвеси в течение 10 мин, удаляют неразрушенные клетки центрифугированием при 50000 об/мин на ультрацентрифуге в течение 30 мин и полученный скпернатант разводят двумя объемами Hepes-буфера с последующим центрифугированием при 50000 об/мин на ультрацентрифуге в течение 1 часа, получают осадок, который отмывают дистиллированной водой, а затем ресуспендируют для получения препарата белков наружной мембраны.
При этом блокирование свободных альдегидных групп проводят путем добавления к суспензии носителя с сенситином 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) и оставляют при постоянном перемешивании на мешалке в течение 2-х часов при комнатной температуре.
Способ осуществляется следующим образом.
- На первом этапе получают бактериальную массу. Для этого бесплазмидный штамм Н 141/84 Y. pseudotuberculosis высевают на чашку Петри с 2% агаром Хоттингера и культивируют в течение 2-х суток при комнатной температуре. Затем двухсуточную культуру пересевают в бульон Хоттингера (рН 7,2). Через двое суток культивирования при температуре 24°С бактериальную взвесь пересевают на чашки Петри с 2% агаром Хоттингера. Далее через 2-е суток бактериальную массу Y. pseudotuberculosis в S-форме смывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и инактивируют 30 минут на водяной бане при 80°С. Затем проводят проверку полученной бактериальной массы на специфическую стерильность.
- Вторым этапом способа является получение грубых клеточных оболочек, которые получают из бактериальной массы густотой 80-100 млрд м.кл./мл. Для этого бактериальную массу центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 минут, а затем ресуспендируют в 10 мМ Hepes-буфере, содержащем 20% (в/о) сахарозы (рН 7,0). Далее проводят пять циклов ультразвуковой дезинтеграции продолжительностью по 45 секунд с минутным интервалом, при длине волны 585 мкм. Затем лизированные клетки обрабатывают ДНК-азой и РНК-азой из рассчета 10 мкг фермента на 1 мл микробной взвеси в течение 10 минут. После этого удаляют неразрушенные клетки центрифугированием при 10 тыс. об/мин. в течение 30 минут. Полученный супернатант разводят двумя объемами Hepes-буфера и центрифугируют при 50000 об/мин на ультрацентрифуге в течение 1 часа. Полученный осадок отмывают дистиллированной водой для удаления Hepes-буфера, ресуспендируют в дистиллированной воде и используют для получения препарата белков наружной мембраны.
- Третий этап заключается в выделении пула белков наружной мембраны Y. pseudotuberculosis. К одной взвеси грубых клеточных оболочек добавляют 33% водный раствор N-лаурил-саркозина-Nа до конечной концентрации его во взвеси 2% и инкубируют в течение 16 часов при комнатной температуре. После этого раствор центрифугируют при 50000 об/мин на ультрацентрифуге в течение 1 часа. Полученный осадок отмывают дстиллированной водой, а затем ресуспендируют в дистиллированной воде.
Содержание общего белка в полученном препарате белковой наружной мембраны определяют по методу Лоури. Концентрация белка составляет 0,9-1,3 мг/мл.
Исследование белкового спектра полученного препарата проводят методом SDS-диск-электрофореза в ПААГ по методу Laemmly. Результаты исследования подтверждают присутствие в препарате блока из 10 белковых антигенов с молекулярной массой 28-80 кДа.
Таким образом, полученный сенситин представляет собой пул белков, кодируемых хромосомными генами, порины наружной мембраны, а также термостабильный токсин. Данные белки обладают выраженными видоспецифическими свойствами и присутствуют даже у штаммов Y. pseudotuberculosis, лишенных плазмиды вирулентности pYV.
Оценка иммунохимической специфичности проводили по методу Western blot.
- Четвертый этап заключается в иммобилизации сенситина на носитель. В качестве носителя используют сферические полимерные частицы диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп. Носитель был получен путем анионной полимеризации акролеина в водно-щелочной среде. Окрашивание частиц производят добавлением красителя в полимеризационную смесь в процессе синтеза.
Суспензию микросфер в количестве 100 мг, что соответствует 2 мл суспензии микросфер, отмывают дважды 0,1 М бикарбонатным буферным раствором в объеме 5 мл (рН 9,2) центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут при температуре 20°С. Отмытый носитель суспендируют в 2 мл бикарбонатного буфера и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке соединяют с сенситином из расчета 1 мг белка/ 100 мг носителя, оставляя для контакта в течение 2 часов при комнатной температуре. Далее иммобилизация проводится при 4-6°С в течение 16-18 часов.
Для блокирования свободных альдегидных групп к суспензии носителя с сенситином добавляют 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) и оставляют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 2 часов при комнатной температуре.
После этого диагностикум трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Конечный осадок суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2). После этого определяют активность и специфичность жидкого антигенного диагностикума.
Готовый препарат суспендируют в 3% желатозо-сахарозной среде высушивания в соотношении 1:1 и разливают в инсулиновые флаконы по 1 мл. Лиофилизацию проводят в течение 15 часов.
Активность и специфичность диагностикума определяют в реакции агломерации объемной (РАО). Для ее проведения используют контрольную псевдотуберкулезную кроличью сыворотку против белков наружной мембраны, кроличью сыворотку против Y. pestis, кроличью сыворотку против Y. enterocolitica и гипериммунные сыворотки против возбудителей, ассоциированных с группой кишечных инфекций: эшерихиозная, сальмонеллезная, шигеллезная.
Для постановки реакции агломерации объемной в каждую лунку 96-луночного планшета для иммунологических реакций вносят по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки в разведении 1:50. Для определения специфической активности в первую лунку пипеткой-дозатором вносят по 50 мкл контрольной псевдотуберкулезной сыворотки в разведении 1:10 и двукратно титровали до конца ряда, до 1:2560. Из последней лунки 50 мкл удаляют.
Для определения специфичности в лунки каждого ряда после внесения нормальной кроличьей сыворотки вносят по 50 мкл гетерологичных сывороток в разведении 1:10 и делают последовательно двукратные разведения до 1:2560. Из последней лунки удаляют 50 мкл.
Затем во все лунки пипеткой-дозатором вносят по 25 мкл диагностикума в рабочем разведении. Для проверки диагностикума на спонтанную агглютинацию в две любые лунки вносят по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки и 25 мкл разведенного диагностикума. После добавления диагностикума содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 минуты и оставляют при комнатной температуре на 2-2,5 часа.
За положительный результат принимали цветной розовый агломерат, выстилающий все дно лунки равномерно или агломерат, выстилающий дно лунки с четко очерченными краями. В отрицательных случаях и в контроле образовывалось компактное колечко или «точка» в центре лунки.
Для определения чувствительности диагностикума использовали серии кроличьей иммунной сыворотки (контрольной) в объемной реакции агломерации (РАО) с титрами 1:2560.
После лиофильного высушивания активность диагностикума не менялась.
Применение полученного псевдотуберкулезного антигенного полимерного диагностикума подтверждено примерами (см. таблицу).
Проведен ряд исследований сывороток крови больных с кишечными инфекциями в реакции агломерации объемной (РАО) с применением антигенного псевдотуберкулезного диагностикума. Диагностический титр препарата 1:80.
Для постановки РАО проводят подготовку исследуемых сывороток. Исследуемую сыворотку человека перед исследованием разводят забуференным физиологическим раствором (рН 7,1) 1:10. Разведенную сыворотку прогревают в течение 30 мин при 56°С. После этого оставляют при комнатной температуре на 10 мин и затем исследуют в РАО.
Кроличью сыворотку гипериммунную псевдотуберкулезную также разводят 1:10 забуференным физиологическим раствором (рН 7,2).
Пример 1.
Ряд А - исследуют сыворотку больного (1) с подозрением на псевдотуберкулез. Предварительный диагноз поставлен на основе клинических проявлений. Симптомы заболевания наблюдают около 14 дней. Титр сыворотки в РА с живой культурой Y. pseudotuberculosis составил 1:320. Положительная реакция (+), наблюдаемая в 1-4 лунках (цветной ярко-розовый агломерат), указывает на содержание антител к возбудителю псевдотуберкулеза в титре 1:160. Полученные результаты подтверждают предварительный диагноз псевдотуберкулеза.
Пример 2.
Ряд В - сыворотка крови больного (2) с клиническим диагнозом псевдотуберкулез. Титр сыворотки в РА 1:1280. Положительная реакция (+) в 1-5 лунках соответствует титру 1:640, что согласуется с клиническим диагнозом.
Пример 3.
Ряд С - сыворотка крови больного (3) с диагнозом кишечный иерсиниоз. Титр в РА с живой культурой Y.enterocolitica 1:640. Отрицательная реакция (-), наблюдаемая во всех лунках, указывает на отсутствие антител к возбудителю псевдотуберкулеза.
Пример 4.
Ряд Д - сыворотка больного (4) с диагнозом сальмонеллез. Титр в РНГА с коммерческим сальмонеллезным диагностикумом 1:640. В РАО с псевдотуберкулезным антигенным диагностикумом наблюдается отрицательная реакция (-) во всех лунках.
Пример 5.
Ряд Е - сыворотка кроличья гипериммунная к возбудителю чумы. Рабочий титр сыворотки 1:1280. В реакции с псевдотуберкулезным антигенным диагностикумом во всех лунках ряда наблюдается отрицательный результат (-).
Пример 6.
Ряд F - сыворотка кроличья гипериммунная псевдотуберкулезная (позитивный контроль). В 8-ми лунках наблюдается положительная реакция (+), титр составляет 1:2560, что свидетельствует о высокой активности и специфичности предлагаемого диагностикума.
Ряд G - контроль диагностикума на спонтанную агглютинацию. В двух используемых лунках результат отрицательный (-).
Следовательно, разработанный диагностический препарат в РАО позволяет выявлять антитела к возбудителю псевдотуберкулеза, дифференцировать данное заболевание от чумы, кишечного иерсиниоза и прочих кишечных инфекций. Полученные результаты совпадают с данными дополнительных исследований и клиническим диагнозом. Таким образом, предлагаемый диагностикум перспективен для использования в клинической лабораторной диагностике, включая ранние сроки заболевания, а также проведения мониторинга в полевых условиях и научно-исследовательской работе.
Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет уникального сенситина, представленного в виде пула мембранных белков, кодируемых хромосомными генами, поринов наружной мембраны, а также термостабильного токсина выявлять антитела к возбудителю псевдотуберкулеза независимо от серовара Y. pseudotuberculosis, при этом не давая перекрестных реакций с другими представителями рода Yersinia, a также возбудителями кишечных заболеваний.
Преимуществом диагностикума является возможность проведения исследования в один этап с последующим визуальным учетом цветной реакции. Получение результата исследования в течение 2-х часов позволяет отнести предлагаемый диагностикум к средствам экспресс-диагностики, а отсутствие необходимости использования специального оборудования и подготовки персонала делают возможным его использование в полевых условиях.
Таблица
Ряд
Разведение исследуемых сывороток в планшете
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
1:1280
1:2550
1:5120
А
+
+
+
+
-
-
-
-
-
В
+
+
+
+
+
+
-
-
-
С
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Д
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Е
-
-
-
-
-
-
-
-
-
F
+
+
+
+
+
+
+
+
-
G
-
-