Диагностика герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста

Вопросы диагностики

Диагностика герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста

Т. В. Половцева1, Н. В. Каражас2, М. Ю. Калугина2, Е. А. Мамедова1, Н. А. Финогенова3, И. Н. Лаврентьева3

Морозовская детская городская клиническая больница1,

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи2, ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева3, Москва

Проведен анализ значимости лабораторных методов диагностики для выявления активных форм герпесвирусной инфекции в раннем возрасте. Обседовано 63 ребенка с нейтропенией и 48 детей из группы сравнения. Показано, что лабораторная диагностика должна проводится комплексно. На первый план в диагностике инфекций у детей раннего возраста выходят методы определения ДНК вируса в лейкоцитах крови и антигена вируса методом НРИФ. В качестве вспомогательного метода по-прежнему актуально определение специфических иммуноглобулинов методом ИФА. Ключевые слова: вирусы герпеса человека, диагностика, дети, ранний возраст

Diagnostics of Herpesvirus Infection in Children of Early Age

T. V. Polovtseva1, N. V. Karazhas2, M. Yu. Kalugina2, E. A. Mamedova1, N. A. Finogenova3, I. N. Lavrentyeva3

Morozov Children's City Clinical Hospital1

Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after N.F. Gamaleya2

Federal Research Clinical Center of Children's Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitriy Rogachev3, Moscow

The analysis of the significance of laboratory diagnostic methods for identification of active forms of herpes virus infection at an early age is carried out. 63 children with neutropenia and 48 children from the comparison group were examined. It is shown that laboratory diagnostics should be carried out comprehensively. Methods for determining the DNA of the virus in blood leukocytes and virus antigen by IIR become more significant in diagnosing infections in young children. As an auxiliary method determination of specific antibodies by ELISA is still valid. Key words: human herpes viruses, diagnosis, children, early age

Контактная информация: Половцева Татьяна Валентиновна — к.м.н., ст.н.с., врач гематолог гематологического отделения консультативно-диагностической поликлиники при МДГКБ; 119049, Москва, 4-й Добрынинский пер., д. 1/9; (499) 237-14-86

УДК 616.9:578.825.11

Вирусы герпетической группы (ВГГ) широко распространены в человеческой популяции, ими инфицировано от 60 до 90% взрослого населения земли, способны пожизненно персис-тировать в организме хозяина, пантропны, то есть способны поражать все органы и системы организма, вызывая острую, латентную и хроническую формы инфекции. При заражении другим штаммом вируса возникает суперинфекция.

Альфа-герпес вирусы (вирусы простого герпеса и варицел-ла-зостер) имеют преимущественную тропность к производным эктодермы (кожа и слизистые) и персистируют в нервных ганглиях.

Бета- и гамма-герпес вирусы (ЭБВ, ЦМВ и ВГЧ-6) имеют преимущественную тропность к клеткам иммунной системы: мононук-лерам, B и ^лимфоцитам, NK клеткам и персистируют в них пожизненно.

В большинстве случаев первичное инфицирование протекает субклинически и у иммунокомпетентных людей переходит в латентную форму.

В случаях иммунной недостаточности велика вероятность развития тяжелой клинической картины и формирования хронической рецидивирующей герпетической инфекции (ХРГИ). ХРГИ протекает в стертой, активной и генерализованной формах, может быть ассоциированна с различными синдромами: лимфопро-лиферативным, гемофагоцитарным, аутоиммунным, синдромом хронической усталости.

Восприимчивость к большинству инфекций наследуется поли-генно и развитие заболевания обусловливается тесным взаимодействием генетических и внешних факторов. Иммунопатологические аспекты вирусной персистенции мало изучены. Известно, что лимфотропные герпетические вирусы, уклоняясь от распознавания иммуннокомпетентными клетками организма, подавляют презентацию вирусных пептидов, активность НК-клеток, воздействуют на выработку цитокинов и апоптоз клеток мишеней, ускоряя или замедляя его. Усиление апоптоза может вызвать развитие миелодиспластического или иммунодефицитного состояния, а ослабление привести к развитию лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний, гемофагоцитарного синдрома. Исследо-

вания показали, что только латентная инфекция ВЭБ (а возможно и ВГЧИ-6) ассоциирована с различными типами неоплазм и гематологических расстройств. Таким образом, интерес гематологов в области диагностики, эпидемиологии герпетической инфекции и иммунопатологии вирусной персистенции очевиден.

К периодам естественной иммунной недостаточности, уязвимым по развитию ХРГИ, относится ранний детский возраст. Несмотря на то, что на этот период жизни приходится наибольшее число тяжелых, генерализованных, ассоциированных с гемофагоцитар-ным синдромом форм, у большинства детей инфекция протекает в стертой форме, часто под маской ОРВИ. Проспективные исследования, проведенные в Великобритании, Швеции, Канаде и США, для оценки отдаленных последствий врожденной ЦМВИ, показали, что менее 10% инфицированных детей имеют клинические симптомы в неонатальный период, однако в группе детей без симптомов велика вероятность, что в дальнейшем у них возникнут серьезные осложнения, такие как нейросенсорная глухота, церебральный паралич, эпилепсия, задержка психомоторного развития, хореорети-нит, атрофия зрительного нерва, задержка развития речи, неспособность к обучению [1—3]. Таким образом субклинические формы герпетической инфекции, не попадающие в поле зрения врачей, могут способствовать развитию патологии, значительно снижающей качество жизни ребенка.

Исследований, посвященных мониторингу возникновения гематологической патологии при персистенции герпетической инфекции, в доступной литературе мы не нашли.

В раннем возрасте распознавание как момента инфицирования, так и хронизации герпетической инфекции затруднено из-за отсутствия специфических клинических маркеров заболевания, четких критериев лабораторной диагностики и недостаточной информированности практических врачей.

Широко используемый в нашей стране метод иммунофер-ментного анализа (ИФА) для определения титров противогерпе-тических антител доступен, быстр (результаты через несколько часов), обладает высокими специфичностью — 95% и чувствительностью — 99%. Однако определение специфических антител

Таблица 1. Определение специфических противогерпетических антител методом ИФА

Маркер Фаза инфекции Ограничения

Специфические низкоавидные Факт острой инфекции от10—100 дней Детский возраст до 6 мес. (Ат матери), ранний детский возраст -отрицательный результат не свидетельствует об отсутствии инфекции

Специфические ^М Свидетельствует об определенной остроте процесса: первичная инфекция, ре-инфекция, реактивация Ранний детский возраст — отрицательный результат не свидетельствует об отсутствии инфекции, около 5% взрослых людей не продуцируют ^М при первичной инфекции, а у некоторых лиц ^М могут сохраняться на протяжении длительного времени после заражения, что дает ложную информацию об остроте процесса

Специфические Инфицированность Титр антител не всегда соответствует клиническим проявлениям инфекции: у части бессимптомных носителей выявляются антитела в высоких титрах, тогда как у части пациентов с выраженной симптоматикой титры антител остаются низкими

Специфические в парных сыворотках с интервалом 7—10 дней 4-х кратное нарастание антител класса считается показателем первичной инфекции Применим лишь для случаев первичного заражения или «свежей» реактивации

относится к впомогательным диагностическим методам, так как выявляет лишь инфицированность определенным типом вируса и может косвенно свидетельствовать об активности инфекционного процесса и специфического иммунного ответа. Метод имеет ряд ограничений (табл. 1).

Необходимо помнить, что при первичном инфицировании 1дМ антитела могут оставаться положительными в течение от 9 до 12 месяцев, в то время как в ситуации реактивации инфекции, специфические 1дМ антитела могут отсутствовать [4].

При выборе диагностически значимых для верификации инфекций лабораторных показателей у детей раннего возраста должны учитываться особенности их иммунной системы.

На инфекционный агент дети первого года жизни отвечают преимущественно выработкой 1дМ. Содержание сывороточных 1дМ достигает уровня взрослых лишь к 3—5 годам.

К году жизни уровень IgG ребенка составляет 50—60% от уровня взрослого. Уровни I gG 1 и IgG3 достигают «взрослых» значений к 8 годам, а IgG2 и IgG4 — к 10—12 годам.

Антитела класса lgG у детей первых месяцев жизни представлены материнскими иммуноглобулинами, попадающими к ребенку трансплацентарно, а в дальнейшем с грудным молоком. Определение активности инфекционного процесса по авидности IgG у детей первых месяцев жизни может иметь ложноположительный результат в случае, если мать перенесла первичную инфекцию в сроки до 100 дней от инфицирования, так как ее низкоавидные антитела могут поступать к ребенку.

Установлено, что у инфицированных ВЭБ детей в возрасте до 4-х лет уровень специфических УСА-АТ в сыворотке крови в 2—4 раза ниже, чем у взрослых больных [5].

Показано, что у детей до 3 месяцев жизни специфические ^М методом ИФА могут не определяться, даже в условиях клинически выраженной герпетической инфекции [6]. 50% новорожденных с признаками ЦМВИ не способны продуцировать анти-ЦМВ-^М [7].

Таким образом, на первый план в диагностике инфекций у детей раннего возраста выходят методы определения антигена и ДНК возбудителя.

«Золотым стандартом» диагностики являются культураль-ные методы, позволяющие оценить активность инфекции, обладающие выской специфичностью (100%) и чувствительностью (94%). Однако они редко используются в клинической практике из-за длительного ожидания результатов до 3 недель и высокой себестоимости. Высокоинформативным является модифицированный быстрый культуральный метод (БКМ), позволяющий выявить инфекционно активный вирус в культуре клеток через 24— 48 часов, с идентификацией антигенов моноклональными антителами к раннему и сверхраннему белкам [8].

Со специфичностью БКМ сопоставим метод непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ) с обнаружением АГ в цитологическом препарате [9]. Долгих Т.И. с савт., 2001 г., исследовав 1644 образца крови, ликвора и мочи детей первого года

жизни с подозрением на внутриутробную инфекцию методами ИФА, НРИФ и ПЦР показали, что наиболее информативными лабораторными тестами для диагностики ЦМВИ в этом возрасте являются НРИФ и ПЦР [10].

В работах В.И. Шахгильдяна с соавторами, на большой группе пациентов с ВИЧ инфекцией, показано, что наличие ДНК ЦМВ в лейкоцитах периферической крови свидетельствует об активности инфекционного процесса с высокой вероятностью его манифестации, хотя и не позволяет оценить интенсивность репликации вируса [11]. В то время как выявление ДНК ЦМВ в моче мало информативно для верификации активности инфекционного процесса и может отмечаться в течение 3—5 лет после перенесенной инфекции или ее реактивации [8]. Для оценки клинического прогноза, эффективности проводимой терапии используется количественная ПЦР. Малашен-кова И.К. с соавт., 2003 г., для клинических исследований у детей с хронической ЭБВИ использовали ПЦР-методику с заданной, более низкой чувствительностью.

Применение методики с чувствительностью 10 копий в пробе (1000 ГЭ/мл в 1 мл образца) позволяет выявлять здоровых носителей ВЭБ, снижение чувствительности метода до 100 копий (10000 ГЭ/мл в 1 мл образца) дает возможность диагностировать лиц с клинико-иммунологическими признаками ХА ЭБВИ. Чувствительность ПЦР при ЭБВИ (70-75%) ниже, чем при других герпесвирусных инфекциях (95-100%). Это связано с появлением ВЭБ в биологических жидкостях лишь при иммуноопосредо-ванном лизисе инфицированных В-лимфоцитов [12]. Симованьян Э.Н. с савт, 2006 г., при обследовании детей с хронической ЭБВИ получили положительный результат ПЦР у 12% детей в стадии реактивации, у 22% пациентов в стадии атипичной реактивации и у всех пациентов в стадии неполной ремиссии [13].

В настоящее время в практику внедряется ПЦР в реальном времени. Ее преимуществами являются мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов, что снижает вероятность ошибки и позволяет получить результат уже через 20—60 мин.

Большинство исследователей рекомендуют для верификации герпетической инфекции использование двух и более лабораторных методов [10, 14, 15].

Материалы и методы исследования

Обследовано 63 детей раннего возраста с нейтропе-нией и 48 детей из группы сравнения.

Методом ИФА в сыворотке крови определялись антитела различных классов ЦМВ, ВЭБ, ВПГЧ, ВГЧ-6 (ЗАО «Вектор-Бест»). Для выявления антигена (всех возбудителей) в лейкоцитах периферической крови применялась НРИФ (Лаборатория эпидемиологии оппортунистических инфекций ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи), в том же материале определялась ДНК ВГЧ-6 методом ПЦР (ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора).

Важно отметить, что у всех детей, имеющих маркеры активной герпетической инфекции, наличие ДНК и/или АГ вируса в лейкоцитах, специфического 1дМ в сывротке крови, не отмечалось выраженных клинических проявлений инфекционного процесса, что свидетельствовало о стертых, субклинических вариантах заболевания. Дети с маркерами активности инфекции были разлелены на две группы с нейтропенией и контрольная (без гематологических нарушений).

Результаты и их обсуждение

Для выявления активных форм герпетических инфекций в раннем возрасте мы проанализировали частоту обнаружения маркеров активности в исследуемых группах детей и получили следующие результаты.

Среди различных маркеров активной ВЭБ инфекции достоверно чаще отмечено выявление АГ в лейкоцитах периферической крови как в группе детей с нейтропениями (75%), так и в контрольной группе (83%) (р < 0,001). Частота выявления только 1дМ не значительна и в группе пациентов с нейтропениями составила 11%, а в контрольной группе детей только с маркерами 1дМ не выявлено вообще. Оба маркера (АГ + 1дМ) так же выявлены у малого числа детей, как среди пациентов с нейтропениями (14%), так и в контрольной группе (17%). Достоверных статистически значимых различий в выявляемости маркеров инфекций между контрольной группой и группой детей с нейтропениями не выявлено.

При анализе выявляемости маркеров активной ВГЧ-6 инфекции установлено, что в группе детей с нейтропениями наиболее значимым является одновременное определение как ДНК, так и АГ, при этом только АГ выявлялся у 11% пациентов, а только ДНК определялась у 18% . В контрольной группе только АГ не выявлен ни у одного ребенка, а ДНК определялась у 100% детей, при этом у 50% из них выявлялся и АГ. Таким образом, для достоверной диагностики активных форм ВГЧ-6 инфекции у детей раннего возраста необходимо определять и АГ (НРИФ) и ДНК.

При анализе частоты выявляемости различных маркеров активной ЦМВ-инфекции показано, что только 1дМ в контрольной группе выявлены у 18% детей, а в группе детей с нейтропениями не определялись ни у одного ребенка. При этом только АГ выявлен у 30% детей с нейтропениями и 37% детей контрольной группы. У остальных детей определялось сочетание серологических маркеров и АГ.

При выявлении маркеров активной ВПГ-инфекции АГ выявлялся у 100% детей как в группе детей с нейтропениями, так и в контрольной группе. 1дМ в сочетании с АГ выявлены только у 10% детей с нейтропениями, в контрольной группе 1дМ не выявлены ни у одного ребенка.

Заключение

Таким образом, для диагностики активности стертых форм герпетических инфекций у детей раннего возраста наиболее значимыми из использованных нами лабораторных методов, являются НРИФ с выявлением АГ и ПЦР с обнаружением ДНК вируса в лейкоцитах крови. Роль ИФА для определения активности ВГЧ 6 инфекции, ЦМВИ и ЭБВИ оказалась значительно ниже, о при выявлении ВПГ-инфекции мало значима.

Трудности лабораторной диагностики герпетической инфекции в раннем детском возрасте обусловлены особенностями их иммунной системы: неполноценным гуморальным ответом с отсутствием или невысокими титрами специфических иммуноглобулинов, а в первые 3—6 мес. жизни с наличием у ребенка материнских маркеров инфекции.

Необходимо заметить, что изолированное наличие специфических 1дМ в сыворотке не может служить подтверждением этиологии, а при субклиническом течении ГИ — активности заболевания из-за возможных ложноположительных результатов, в случаях микст-инфекции и при присутствии ревматоидного фактора (у старших детей).

Ложноположительные результаты вследствие перекрестных реакций могут быть получены при проведении НРИФ и ПЦР.

Лабораторная диагностика должна проводиться комплексно и включать: определение специфических иммуноглобулинов методом ИФА, определение ДНК вируса в лейкоцитах крови, определение антигена вируса методом НРИФ, а по возможности БКМ. Необходимо отслеживание лабораторных показателей в динамике.

В первом полугодии жизни анализ лабораторных маркеров инфекции должен проводиться в комлексе мать-ребенок.

Лабораторными критериями постановки диагноза активной фазы герпетической инфекции, вызванной ВПГ, ЦМВ, ВГЧ 6 у детей раннего возраста, являются:

выявление антител класса IgM в сочетании с наличием ДНК или АГ вируса в лейкоцитах;

наличие антигенов герпесвирусов;

для детей до 3 мес. — выявление низкоавидных IgG у ребенка при отсутствии таковых у матери,

для детей старше 3 мес. наличие низкоавидных IgG, высо-коавидных IgG в высоких титрах;

четырехкратное нарастание титров IgG в парных сыворотках, в интервале 1,5—2 недели.

Маркерами острой инфекции, вызванной ВЭБ, являются IgM, IgEA (к раннему антигену), IgGNA в титре 1 : 2000, и/или наличие антигенов ВЭБ в лейкоцитах.

Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций проводится для выяснения этиологии заболевания, для выявления инфи-цированности с дальнейшей оценкой динамики и стадии заболевания: у беременных, у пациентов с первичными и вторичными иммунодефицитными состояниями, у детей раннего возраста из групп риска (подозрение на внутриутробную или раннюю постна-тальную инфекцию).

Литература:

1. Ahlfors K. Report of a long-term study of maternal and congenital cytomegalovirus infection in Sweden. Review of prospective studies available in the literature / К. Ahlfors, S.A. Ivarsson, S. Harris // Scand. J. Infect. Dis. — 1999. — 31 (5). — Р. 443—457.

2. Damato E.J., Winnen C.W. Cytomegaloviras infection: perinatal implications // J. Obstet. Gynecol. Neonatal. Nurs. — 2002. — 31 (10). — Р. 86—92.

3. Newborn hearing screening: will children with hearing loss coursed by congenital cytomegalovirus infection be missed? / K.B. Fowler, AJ. Dahle, S.B. Boppana, R.F. Pass // J. Pediatr. — 1999. — 135 (1). — Р. 60—64.

4. Duff P.A. Thoughtful Algorithm for the Accurate Diagnosis of Primary CMV Infection in Pregnancy // American Journal of Obstetrics and Gynecology. — March 2007. — V. 196. — Р. 196—197.

5. Sumaya C.V Jenson H.B. / In: Manual of Clinical Lab. Immunology // Ed. Rose Nr., Masario E.C. et al. — Chapter, 1992. — V. 85. -P. 568—575.

6. Кравченко Л.В. Состояние иммунной системы у детей первых трех месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией // Педиатрия. — 2008. — Т. 87, №1. — С. 52—58.

7. Donner C. Prenatal diagnosis at risk for congenital cytomegalovirus infections / С. Donner, С. Liesnard, Content // J. Obstet. Gynecol. — 1993. — Р. 418—448.

8. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций: Методические рекомендации / А.А. Кущ, Н.Е. Федорова, Р.Р. Климова. — Москва, 2008. — 21 с.

9. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция — типичный представитель оппортунистических инфекций // Рос. мед. Вести. — 1997. — Т. 2. — № 2. — С. 34—38.

10 Клинико-лабораторные аспекты цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста / Т.И. Долгих, В.А. Черешнев, Д.В. Долгих, Е.А. Гашиш // Педиатрия. — 2001. — № 5. — С. 43—46.

11. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов / В.И. Шахгильдян и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2001. — № 1.

12. Клинические формы хронической Эпштейна-Барр-вирусной инфекции: вопросы диагностики и лечения / И.К. Малашенко-ва и др. // Лечащий врач. — 2003. — №9.

13. Хроническая Эпштейна-Барр вирусная инфекция у детей: комплексная терапия и возможности интенсификации лечения / Э.Н. Симованьян, Л.П. Сизякина, А. М. Сарычев, В.Б. Денисенко // Доктор.Ру. — 2006. — №2. — С. 37-44.

14. Эффективность методов лабораторной диагностики гениталь-ного герпеса / Е.Б. Никитина и др. // Росс. журнал кожных и венерических болезней. — 2001. — № 5. — С. 55—58.

15. Количественные лабораторные методы для диагностики цито-мегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей / Н.Е. Федорова и др. // Вопр. вирусологии. — 2005. — № 1. — С. 9—14.