СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТОЙКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРОДУКТАХ
METHOD FOR DETECTION AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF HEAT-RESISTANT MICROORGANISMS IN PRODUCTS

Уровень техники
Существует целый ряд пищевых продуктов, стерилизация которых отрицательно сказывается на качестве и/или вкусе продуктов. Такие пищевые продукты, например молоко, часто подвергают пастеризации для уменьшения количества жизнеспособных болезнетворных микроорганизмов и для замедления микробного роста, не влияя отрицательно на вкус и качество продукта.
На сегодняшний день существует несколько методов пастеризации. Среди них ультрапастеризация при высокой температуре (UHT), кратковременная высокотемпературная пастеризация (HTST), пастеризация в ванне или пастеризация периодического действия (LTLT) и тепловая обработка для обеспечения длительного срока хранения (ESL). Согласно методу UHT пастеризации продукт нагревают до 135°C (275°F) минимум в течение одной секунды. Согласно методу HTST пастеризации продукт нагревают до 72°C (161°F) в течение 15-20 секунд. Согласно методу пастеризации в ванне или пастеризации периодического действия продукт нагревают до 63°C (146°F) в течение 30 минут. Метод ESL пастеризации основан на применении более низких температур, но в сочетании со стерилизующей фильтрацией.
Несмотря на то что пастеризация является эффективной для продления срока хранения и снижения микробиологических рисков, после пастеризации некоторые бактерии все же выживают. Такие бактерии известны как термостойкие бактерии и в основном связаны с каким-либо источником загрязнения. Стандартным тестом для обнаружения и подсчета термостойких бактерий является лабораторный подсчет числа бактерий на мл, выживших после пастеризации (LPC), который предназначен для определения эффективности санитарной очистки и поддержания гигиены на фермах. Обычно пастеризацию при низкой температуре проще проводить в лабораторных условиях. Однако использование низких температур пастеризации может приводить к опасности остаточного загрязнения и, следовательно, может потребовать более жесткого контроля.
Как правило, LPC заключается в нагреве штатива с пробами по приблизительно 5 мл, каждая из которых находится в емкости для проб, до 63°C в водяной ванне в течение 30 минут с последующим немедленным охлаждением. Затем аликвоту каждой отдельной пробы, подверженной воздействию температуры, отбирают из емкости и помещают в чашу с агаровой средой, после чего оставляют для длительного инкубирования (как правило, от 24 до 72 ч), а затем подсчитывают колонии.
Несмотря на общую эффективность обнаружения и подсчета термостойких бактерий LPC является относительно длительным и трудоемким процессом, поскольку включает большое количество стадий, включающих действия с пробами, и обеспечивает субъективные результаты. Соответственно, существует необходимость в усовершенствованном способе обнаружения и подсчета термостойких бактерий.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является обнаружение термостойких микроорганизмов в продукте с выполнением минимального количества действий над пробами. Первый вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ обнаружения присутствия в продукте термостойких микроорганизмов. Способ включает стадии (a) помещения аликвоты продукта в сосуд, содержащий оптический зонд, чувствительный к метаболиту термостойких микроорганизмов, (b) пастеризации аликвоты в сосуде, (c) инкубирования пастеризованной аликвоты в сосуде в течение периода инкубации и (d) периодического обращения к зонду в течение периода инкубации. В ходе таких обращений измеряют произошедшие в зонде изменения в ответ на изменения концентрации метаболита термостойких микроорганизмов в аликвоте, определяя тем самым присутствие жизнеспособных термостойких микроорганизмов в аликвоте.
Подсчет термостойких микроорганизмов в продукте перед инкубированием можно выполнить путем преобразования измеренных произошедших в зонде изменений концентрации термостойких микроорганизмов в пастеризованной аликвоте с помощью алгоритма преобразования (см. O’Mahony et al, Analysis of total aerobic viable counts in samples of raw meat using fluorescence-based probe and oxygen consumption assay, Food Control, v20(2) 2009, стр. 129-135, ISSN 0956-7135).
Обращение к зонду предпочтительно осуществляют дистанционно, через стенки сосуда, для того чтобы избежать физического контакта с аликвотой во время периода проведения теста.
Второй вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ обнаружения присутствия в продукте термостойких микроорганизмов и общего количества микроорганизмов для их сравнения. Способ включает стадии (a) взятия пробы продукта, (b) помещения первой аликвоты пробы в первую удерживающую камеру, содержащую первый оптический зонд, чувствительный к метаболиту термостойких микроорганизмов, (c) помещения второй аликвоты пробы во вторую удерживающую камеру, содержащую второй оптический зонд, чувствительный к аналиту-мишени, (d) пастеризации первой аликвоты, но не второй аликвоты, в первой удерживающей камере, (e) инкубирования пастеризованной первой аликвоты в первой удерживающей камере и второй аликвоты во второй удерживающей камере в течение периода инкубации, и (f) периодического обращения к обоим зондам в течение периода инкубации, причем в ходе таких обращений измеряют произошедшие в зонде изменения в ответ на изменения концентрации метаболита термостойких микроорганизмов в первой аликвоте и изменения концентрации аналита-мишени во второй аликвоте, при этом эти изменения концентрации указывают на присутствие жизнеспособных термостойких микроорганизмов в первой аликвоте и на присутствие общего количества жизнеспособных микроорганизмов во второй аликвоте.
Подсчет количества термостойких микроорганизмов и общего количества микроорганизмов в продукте перед инкубированием можно выполнить путем преобразования измеренных произошедших в первом зонде изменений в концентрацию термостойких микроорганизмов в пастеризованной первой аликвоте с помощью известного алгоритма преобразования и преобразования измеренных произошедших во втором зонде изменений в концентрацию общего количества микроорганизмов во второй аликвоте перед инкубированием с помощью известного алгоритма преобразования.
Обращение к зонду предпочтительно осуществляют дистанционно, через стенки сосуда, для того чтобы избежать физического контакта с аликвотой во время периода проведения теста.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлен вид сбоку одного варианта осуществления приспособления в соответствии с настоящим изобретением.
0
1
1
2
2
3
На фиг.2 представлен основной график зависимости температуры от времени для приведенного в качестве примера способа обнаружения термостойких микроорганизмов в продукте в соответствии с настоящим изобретением. Фаза 1 (t-t) представляет собой стадии подготовки пробы (c) (без температурного контроля и без обращений к зонду). Фаза 2 (t-t) представляет собой стадию пастеризации (диапазон температур для заданного временного интервала без обращений к зонду). Фаза 3 (t-t) представляет собой период инкубации (температура инкубирования с периодическим обращением к зонду).
2
3
2
3
2
3
На фиг.3 представлен основной график зависимости сигнала от зонда от времени для приводимого в качестве примера обнаружения термостойких микроорганизмов в продукте на Фазе 3 (t-t) в соответствии с настоящим изобретением. Приведенный в качестве примера сигнал описывает как положительную аликвоту (т.е., аликвоту с достаточным количеством термостойких микроорганизмов для роста после пастеризации и потребления практически всего аналита-мишени в аликвоте во время периода инкубации (Фаза 3 (t-t))), так и отрицательную аликвоту (т.е. аликвоту с недостаточным количеством термостойких микроорганизмов для роста после пастеризации и потребления практически всего аналита-мишени в аликвоте во время периода инкубации (Фаза 3 (t-t))).
Подробное описание изобретения
Определения
Используемый в настоящем документе, включая формулу изобретения, термин "пастеризация" означает нагрев продукта, как правило, жидкого пищевого продукта, подвергаемого разложению при температуре стерилизации, до определенной повышенной температуры, которая ниже температуры, требуемой для стерилизации, в течение заданного отрезка времени для замедления микробного роста.
Используемое в настоящем документе, включая формулу изобретения, выражение "пастеризация в ванне'" (VatP) или "пастеризация периодического действия" (LTLT) означает нагрев и выдерживание при 63°C (145°F) в течение 30 минут.
Используемое в настоящем документе, включая формулу изобретения, выражение "кратковременная высокотемпературная пастеризация" (HTST) означает нагрев и выдерживание при 72°C (162°F) в течение 15 секунд.
Используемое в настоящем документе, включая формулу изобретения, выражение "ультрапастеризация" (UP) означает нагрев и выдерживание при 138°C (280°F) в течение 2 секунд.
Используемое в настоящем документе, включая формулу изобретения, выражение "метаболит термостойких микроорганизмов" означает молекулу, поглощенную или произведенную в процессе метаболизма термостойких микроорганизмов.
Используемое в настоящем документе, включая формулу изобретения, выражение "отношение поверхности к объему" означает площадь поверхности на единицу объема.
Используемое в настоящем документе, включая формулу изобретения, выражение "увеличенное отношение поверхности к объему" означает отношение поверхности к объему более чем 12:1.
2
2
+
Используемый в настоящем документе, включая формулу изобретения, термин "аналит-мишень" относится к химическому веществу, как правило, O, CO или H, являющемуся метаболитом термостойких микроорганизмов и способному к модулированию оптического сигнал, испускаемого оптически активным материалом, таким как фотолюминесцентный зонд. Модулирующее действие может быть достигнуто посредством гашения, усиления, (де)протонирования или другими способами.
Список обозначений
10 Сосуд
11 Верхняя часть сосуда
12 Нижняя часть сосуда
13 Диатермические боковые стенки сосуда
18 Отверстие в удерживающую камеру
19 Удерживающая камера
1
19 Первая удерживающая камера
2
19 Вторая удерживающая камера
20 Крышка
30 Зонд
1
30 Первый зонд
2
30 Второй зонд
A Аликвота продукта
1
A Первая аликвота продукта
2
A Вторая аликвота продукта
Описание
Приспособление
Настоящее изобретение относится к приспособлению, специально предназначенному для применения при обнаружении присутствия микроорганизмов, в частности термостойких микроорганизмов, в продукте. Приспособление представляет собой небольшой сосуд 10, образующий удерживающую камеру 19 и содержащий зонд 30, чувствительный к аналиту-мишени, функционально соединенный с удерживающей камерой 19. Верхняя часть 11 сосуда 10 является открытой, обеспечивая доступ к удерживающей камере 19. Для герметизации верхней части 11 удерживающей камеры 19 может быть предоставлена крышка 20 или другое уплотнительное устройство.
К подходящим сосудам 10 относятся пробирки, кюветы, многолуночные планшеты (например, планшеты с 6, 12, 24, 48, 96 и 384 лунками) и т.п.
Сосуд 10 выполнен, сконфигурирован и предназначен выдерживать температуры пастеризации и изменения температур, а также позволяет осуществлять быстрый нагрев и охлаждение любого содержимого, помещенного в удерживающую камеру 19 сосуда 10, через диатермическую боковую стенку (стенки) 13 сосуда 10. Сосуд 10 предпочтительно выполнен, сконфигурирован и устроен таким образом, что тепловое равновесие аликвоты A, помещенной в удерживающую камеру 19 сосуда 10, может достигаться за ½ периода времени пастеризации, предпочтительно за ¼ периода времени пастеризации и наиболее предпочтительно еще быстрее.
Размер и конфигурация удерживающей камеры 19 предпочтительно способствуют быстрому нагреву и охлаждению любого содержимого посредством обеспечения увеличенного отношения поверхности к объему, наиболее предпочтительно высокого отношения поверхности к объему.
A
Зондом 30 может быть любое устройство, обладающее возможностью считывания и регистрации изменений концентрации аналита-мишени в замкнутом объеме. Согласно предпочтительному варианту осуществления зондом 30 является оптически активный, чувствительный к аналиту-мишени материал, сконфигурированный и предназначенный для отображения изменений концентрации аналита-мишени или парциального давления P в аликвоте A, находящейся в удерживающей камере 19 сосуда 10. Чувствительным к аналиту материалом предпочтительно является фотолюминесцентный краситель, заделанный в проницаемую для аналита полимерную матрицу. Поскольку предпочтительным типом зонда 30 является оптически активный, чувствительный к аналиту-мишени материал, а наиболее часто рассматриваемым аналитом-мишенью является кислород, далее в описании будет использоваться, но не исключительно, фотолюминесцентный гасимый кислородом зонд 30.
Чувствительный к кислороду фотолюминесцентный краситель может быть выбран из любых общеизвестных чувствительных к кислороду фотолюминесцентных красителей. Специалист в данной области техники способен выбрать подходящий краситель исходя из предполагаемого применения зонда 30. Неполный перечень подходящих чувствительных к кислороду фотолюминесцентных красителей включает, в частности, кроме прочего, комплексы рутения(II)-бипиридила и рутения(II)-дифенил-фенантролина, порфирин-кетоны, такие как платина(II)-октаэтилпорфин-кетон, платина(II)-порфирин, такой как платина(II)-тетракис(пентафторфенил)порфин, палладий(II)-порфирин, такой как палладий(II)-тетракис(пентафторфенил)порфин, фосфоресцирующие металлокомплексы тетрабензопорфиринов, хлоринов, азапорфиринов, и люминесцентные комплексы с длительным периодом распада иридия(III) или осмия (II).
Как правило, гидрофобный чувствительный к кислороду фотолюминесцентный краситель смешивают с подходящей проницаемой для кислорода и гидрофобной матрицей-носителем. Матрица-носитель, более того весь зонд 30, должна обладать способностью выдерживать условия пастеризации и инкубирования. И в этом случае специалист в данной области техники способен выбрать подходящую проницаемую для кислорода гидрофобную матрицу-носитель исходя из предполагаемого применения зонда 30 и выбранного красителя. Неполный перечень полимеров, подходящих для применения в качестве проницаемой для кислорода гидрофобной матрицы-носителя, включает, в частности, кроме прочего, полистирол, поликарбонат, полисульфон, поливинилхлорид и некоторые сополимеры.
Если зонд 30 основан на гашении фотолюминесценции посредством аналита, сосуд 10 или по меньшей мере часть сосуда 10, покрытая зондом 30, должна обеспечивать передачу к зонду 30 и получение от него излучения при возбуждении и испускания длин волн с минимальными помехами. Предпочтительно зонд 30 расположен внутри удерживающей камеры 19 рядом с нижним концом 12 сосуда 19.
Сосуд 10 может быть выполнен из широкого ряда материалов, например различных пластиковых материалов (например, полипропилена или полиэтилентерефталата), стекла и т.д.
Для излучения, испускаемого зондом 30 в возбужденном состоянии, можно измерить интенсивность и/или время жизни (скорость распада, фазовый сдвиг или анизотропию), при этом измерение времени жизни в целом считается наиболее точным и надежным методом измерения.
Средства (не показаны) опрашивания зондов 30, основанных на гашении фотолюминесценции посредством аналита, хорошо известны и доступны в продаже из различных источников, включая bioMerieux SA, Франция, и Mocon, Inc., Миннеаполис, Миннесота.
Способ
Согласно первому варианту осуществления настоящее изобретение предоставляет способ обнаружения присутствия термостойких микроорганизмов в продукте. Способ включает стадии (a) помещения аликвоты A продукта в сосуд 10, содержащий зонд 30, чувствительный к аналиту-мишени, (b) пастеризации аликвоты A в сосуде 10, (c) инкубирования пастеризованной аликвоты A в сосуде 10 в течение периода инкубации, как правило, при температуре от 30° до 55°C, и (d) периодического обращения к зонду 30 во время периода инкубации.
Аликвоту A в сосуде 10 можно пастеризовать любыми общепринятыми методами пастеризации, включая ультрапастеризацию при высокой температуре (UHT), кратковременную высокотемпературную пастеризацию (HTST) и пастеризацию в ванне или пастеризацию периодического действия. Для соблюдения соответствия предпочтительно использовать одинаковые значения времени и температуры, используемые для применяемого в настоящее время метода LPC (т.е. 63°C в течение 30 мин). Для того чтобы избежать проблем, связанных с применением водяной ванны для достижения температур пастеризации, предпочтительным является применение сухого блочного нагревателя для достижения и сохранения стабильных температур пастеризации и инкубирования.
В ходе обращений измеряют произошедшие в зонде 30 изменения в ответ на изменения концентрации аналита-мишени в аликвоте A, тем самым указывая на присутствие жизнеспособных термостойких микроорганизмов в аликвоте A. Алгоритмы преобразования, используемые для преобразования измеренных излучений от зонда в концентрацию кислорода, хорошо известны и широко применяются специалистами в данной области техники.
При необходимости концентрацию термостойких микроорганизмов в продукте перед инкубированием можно определить посредством анализа измеренных произошедших в зонде 30 изменений, связанных с пастеризованной аликвотой A. Алгоритмы преобразования для преобразования измеренных излучений в концентрацию микроорганизмов в пробе хорошо известны и широко применяются специалистами в данной области техники.
Для ускорения роста термостойких микроорганизмов (или их субпопуляций) в аликвоте A перед пастеризацией в аликвоту A можно добавлять питательные вещества. Такие питательные вещества, в основном называемые культурными средами, широко доступны из различных источников. Специалисты в данной области смогут определить и выбрать подходящие питательные вещества для введения в аликвоту A.
Как правило, предпочтительным является герметичное закрытие аликвоты A в удерживающей камере 19 для упрощения перемещения (например, для предотвращения выливания), предотвращения испарения и предотвращения как бактериального загрязнения, так и загрязнения аналита-мишени аликвоты A. Открытая верхняя часть 11 удерживающей камеры 19 может быть герметично закрыта любым из известных методов уплотнения, способных выдерживать тепловую обработку, включая, в частности, кроме прочего, навинчивающуюся крышку 20, герметичную термопленку или клейкую пленку (не показана), слой минерального масла (не показан) и т.д.
Способ, в частности, подходит для применения при испытаниях безопасности жидких пищевых продуктов, предназначенных для потребления человеком, таких как молоко, соки и напитки.
1
1
1
2
2
2
1
2
1
1
1
2
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Согласно второму варианту осуществления настоящее изобретение предоставляет способ обнаружения присутствия в продукте термостойких микроорганизмов и общего количества микроорганизмов для их сравнения. Способ включает стадии (a) взятия пробы продукта, (b) помещения первой аликвоты A пробы в первую удерживающую камеру 19, содержащую первый зонд 30, чувствительный к аналиту-мишени, (c) помещения второй аликвоты A пробы во вторую удерживающую камеру 19, содержащую второй зонд 30, чувствительный к аналиту-мишени, (d) пастеризации первой аликвоты A, но не второй аликвоты A, в первой удерживающей камере 19, (e) инкубирования пастеризованной первой аликвоты A в первой удерживающей камере 19 и второй аликвоты A во второй удерживающей камере 19 в течение периода инкубации, и (f) периодического обращения к обоим зондам 30 и 30 в течение периода инкубации, при этом в ходе этих обращений измеряют произошедшие в зонде 30 или 30 изменения в ответ на изменения концентрации аналита-мишени в аликвоте A или A соответственно, при этом такие изменения концентрации указывают на присутствие жизнеспособных термостойких микроорганизмов в первой аликвоте A и на присутствие общего количества жизнеспособных микроорганизмов во второй аликвоте A.
Аналогично первому варианту осуществления первая аликвота Ai может быть пастеризована любыми общепринятыми методами пастеризации, включая ультрапастеризацию при высокой температуре (UHT), кратковременную высокотемпературную пастеризацию (HTST) и пастеризацию в ванне или пастеризацию периодического действия. Для соблюдения согласованности предпочтительно использовать одинаковые значения времени и температуры, используемые для применяемого в настоящее время метода LPC (т.е. 63°С в течение 30 минут). Для того чтобы избежать проблем, связанных с применением водяной ванны для достижения температур пастеризации, предпочтительным является применение сухого блочного нагревателя для достижения и сохранения температур пастеризации.
1
2
В ходе обращений измеряют произошедшие в зонде 30 изменения в ответ на изменения концентрации аналита-мишени в аликвоте A, тем самым указывая на присутствие жизнеспособных термостойких микроорганизмов в первой аликвоте A и на присутствие общего количества микроорганизмов во второй аликвоте A. И в этом случае алгоритмы преобразования, используемые для преобразования измеренных излучений от зонда в концентрацию кислорода, хорошо известны и широко применяются специалистами в данной области техники.
1
1
2
2
При необходимости концентрацию термостойких микроорганизмов в продукте перед инкубированием можно определить посредством анализа измеренных произошедших в первом зонде 30 изменений по отношению к концентрации термостойких микроорганизмов в пастеризованной первой аликвоте A, а концентрацию общего количества микроорганизмов в продукте перед инкубированием можно определить посредством анализа измеренных произошедших во втором зонде 30 изменений по отношению к концентрации общего количества микроорганизмов в пастеризованной второй аликвоте A. Алгоритмы преобразования, используемые для преобразования измеренных излучений в концентрацию микроорганизмов (термостойких или их общего количества) в пробе, хорошо известны специалистам в данной области техники.
1
2
Для ускорения роста соответствующих микроорганизмов в продукте перед пастеризацией/инкубированием в обе аликвоты A и A можно добавлять питательные вещества.
1
2
1
2
1
2
Как и в первом варианте осуществления, предпочтительным является герметичное закрытие аликвот A и A в соответствующей удерживающей камере 19 и 19 для предотвращения как бактериального загрязнения, так и загрязнения аналита-мишени аликвоты A и A.
Как и в первом варианте осуществления, способ, в частности, подходит для применения при испытаниях безопасности жидких пищевых продуктов, предназначенных для потребления человеком, таких как молоко.