ANTI-CD26 ANTIBODIES AND USES THEREOF
АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD26 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым антителам, способным связываться с CD26, а также к их применению в качестве лекарственного средства. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам для применения в лечении и/или профилактике по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) и апластической анемии, а также к антителам для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
CD26 является широко распространенным гликопротеином поверхности клетки массой 110 кДа, изначально определенным как антиген активации T-клеток (Fox et al. (1984) J. Immunol. 133, 1250-1256, Fleischer (1987) J. Immunol. 138, 1346-1350, и Morimoto et al. (1989) J. Immunol. 143, 3430-3439). Показано, что эта молекула имеет активность дипептидилпептидазы IV (DPPIV; EC3.4.14.5) в своем внеклеточном домене и широкое распределение в тканях (Hegen et al. (1990) J. Immunol. 144, 2908-2914 и Ulmer et al. (1990) J. Immunol. 31, 429-435; WO 2007/014169 A2). CD26 обладает множеством функций в физиологии T-клеток человека. Например, доказательства позволяют предполагать, что CD26 может передавать костимуляторный сигнал для активации T-клеток (Morimoto et al. (1994) Immunologist 2: 4-7 и Fleischer (1994) Immunol. Today 15:180-184). Кроме того, CD26 идентифицирован как ADA-связывающий белок, и комплекс CD26/ADA может играть ключевую роль в регуляции функционирования иммунной системы (Dong et al. (1996) J Immunol. 156(4): 1349-55, Kameoka et al. (1993) Science. 261 (5120):466-9, и Morrison et al. (1993) J Exp Med. 177(4): 1135-43). Также сообщают о функциональной связи между CD26 и клеточным белком топоизомеразой II α (Aytac et al. (2003) British Journal of Cancer 88:455-462). Антитела против CD26 известны, например, из WO 2007/014169 A2.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) представляет собой важный способ терапии многих гематологических и некоторых эпителиальных злокачественных новообразований, а также значительного количества незлокачественных заболеваний (Ferrara et al., 2009, Lancet.; 373: 1550-1561; Sun et al., 2007, Transl. Res.; 150: 197-214). Реакция "трансплантат против хозяина" (GvHD) является основным осложнением трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) и, таким образом, ограничивает применение этих важных способов терапии.
Существует два основных типа трансплантации гемопоэтических клеток: аутологичная и аллогенная. Аутологичная трансплантация включает выделение гемопоэтических стволовых клеток (HSC) пациента, хранение стволовых клеток, лечение пациента, разрушающее стволовые клетки, оставшиеся в организме, и возвращение подвергавшихся хранению стволовых клеток пациента в его организм. Аутологичные трансплантаты обладают преимуществом меньшего риска отторжения трансплантата, инфекций и других связанных с ними заболеваний. Аллогенная трансплантация включает двух человек: одним является здоровый донор, а другим является пациент или реципиент. Доноры аллогенных HSC должны иметь тип ткани (лейкоцитарный антиген человека HLA), совпадающий с таковым реципиента, и, кроме того, для реципиента необходима иммуносупрессорная терапия. Существует три возможных источника гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации: костный мозг (BM), периферическая кровь (PB) и пуповинная кровь (UCB).
За последние несколько лет разработка новых стратегий помогла расширить показания для аллогенной HSCT (Sun et al., 2007, выше). Усовершенствования профилактики инфекций, иммуносупрессорной терапии, поддерживающей терапии и типирования тканей на основе ДНК также внесли свой вклад в улучшение исходов после аллогенной HSCT (Ferrara et al., 2009, выше). В результате, количество трансплантаций аллогенных гемопоэтических клеток продолжает расти. Однако, реакция "трансплантат против хозяина" (GvHD) остается основным осложнением аллогенной HSCT.
GvHD происходит, когда T-клетки донора идентифицируют генетически отличающиеся белки на клетках хозяина как чужеродные и запускают иммунный ответ для их разрушения (Ferrara et al., 2009, выше). В зависимости от времени, в которое она развивается после HSCT, GvHD может являться острой или хронической. Острая GvHD (aGvHD) ответственна за 15-40% смертности и является основной причиной заболеваемости после аллогенной HCT, в то время как хроническая GvHD (cGvHD) развивается у до 50% пациентов, выживающих в течение трех месяцев после HCT (Sun et al., 2007, Transl. Res.; 150: 197-214).
Как правило, острая реакция "трансплантат против хозяина" развивается после аллогенной HSCT как реакция иммунных клеток донора против тканей хозяина. Тремя основными тканями, повреждаемыми при острой GvHD, являются кожа, печень и желудочно-кишечный тракт. В клинических условиях диагноз предполагают, когда у реципиента HSCT развивается любой или все из следующих признаков или симптомов: дерматит (кожная сыпь), кожные волдыри, спастическая боль в животе с диареей или без нее, устойчивая тошнота и рвота, гепатит (с повышением уровня билирубина и/или печеночных ферментов). Симптомы чаще всего начинаются с приживления трансплантата донора до 100-го дня после HSCT, но могут развиваться и позже. Острая GvHD является клиническим диагнозом, подтверждаемым данными гистологического анализа.
Острую GvHD можно разделить на степени по количеству и степени вовлечения органов. Современная система разделения по степеням основана на первой шкале aGvHD Glucksberg 1974 года (Glucksberg et al., 1974, Transplantation; 18:4 295-304). Недавно полученные данные подтверждают применимость системы разделения по степеням, т.к. с помощью нее можно разделить пациентов по категориям риска осложнений и смертности. По этой системе пациентов распределяют в одну из четырех групп (I-IV) в зависимости от степени или стадии вовлечения трех органов. Степень поражения кожи определяют по проценту пораженной поверхности тела, степень поражения печени определяют по степени повышения билирубина, и степень поражения желудочно-кишечного тракта определяют по степени диареи. Используя эти критерии, каждого пациента приписывают в одну группу (Jacobsohn et al., 2007, Orphanet J. of Rare Diseases; 2:35).
Известны различные клинические проявления GvHD. Самым ранним и наиболее распространенным проявлением является кожная GvHD. По существу, она является макулопапулезной сыпью, которая может возникать где-либо на теле, но часто она начинается с ладоней и стоп. Пациент может жаловаться на зуд или болезненность пораженных областей. В тяжелых случаях могут возникать волдыри. Желудочно-кишечные проявления включают диарею, которая может становиться кровавой, спазмы, тошноту, рвоту и потерю веса. Кроме того, характерным признаком печеночной GvHD является желтуха в результате гипербилирубинемии (Jacobsohn et al., 2007, выше), хотя общепризнанным является гепатитный вариант GvHD с повышением печеночных ферментов, такой как острый вирусный гепатит, (Akpek et al., 2002, Blood; 100: 3903-3907). Даже если метилпреднизолон не зарегистрирован в любой европейской стране для этих показаний, его рассматривают в качестве современного стандарта терапии в лечении острой GvHD первой линии.
Лечение острой GvHD первой линии с использованием метилпреднизолона в дозе 2 мг/кг/день является эффективным у более 50% пациентов, но приводит к длительному эффекту только у 1/3 пациентов. Пациентам, не ответившим на лечение, предлагают терапию второй линии, основанную на комбинациях иммуносупрессирующих средств, не зарегистрированных для этих показаний. Терапия второй линии в значительной степени является неудовлетворительной с выживаемостью в течение одного года 30% по данным большинства обширных клинических испытаний. Ни одна из этих стратегий не достигает уровня успеха, необходимого для того, чтобы стать стандартом лечения. После 30 лет опыта трансплантаций резистентная к стероидам острая GvHD (aGvHD) в значительной степени остается неизлечимым заболеванием. Необходимо подчеркнуть, что пациенты с aGvHD, резистентные к терапии стероидами, имеют очень ограниченные возможные способы лечения, и что в настоящее время не существует официально признанного лечения для этой клинической ситуации. Это состояние является угрожающим жизни, в частности, по причине повышенной смертности в этой популяции пациентов, в частности, вторичной по отношению к инфекциям.
Любой клинически значимый результат в этой популяции пациентов будет приносить значительную пользу, т.к. он будет представлять собой клинически значимое преимущество для резистентных к стероидам пациентов с aGvHD.
et al
Кроме того, полезными будут подходы для облегчения приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Приживление трансплантата является процессом, при котором трансплантированные стволовые клетки находят путь в пространства костного мозга в центре больших костей организма. Только затем трансплантированные стволовые клетки могут начать продуцировать новые клетки крови. Эксперты не вполне уверены в том, как этот процесс происходит, но, как правило, считают, что это является длительным процессом: он занимает приблизительно от двух до четырех недель после инфузии костного мозга для осуществления приживления трансплантата. До приживления стволовых клеток крови пациент будет иметь риск развития инфекции. Причиной этого является то, что подвергаемого трансплантации пациента, как правило, подвергают облучению и/или химиотерапии, результатом которых является деструкция лейкоцитов в организме пациентов. В ожидании приживления трансплантата подвергнутый трансплантации пациент может страдать от серьезного осложнения в результате инфекции (вызываемой бактериями, вирусом или грибком), что является одной из основных причин связанной с трансплантацией смертностью после трансплантации костного мозга (BMT). Таким образом, в этой области существует потребность в средстве, способном улучшать приживление трансплантата. Такое средство будет иметь важное значение для пациентов с трансплантированным BM. Если можно повышать хоминг и приживление трансплантата, то можно снижать время восстановления гемопоэтических линий, что приводит к меньшим неблагоприятным исходам при приживлении трансплантата и лучшей общей выживаемости, особенно при трансплантации UCB (Broxmeyer, H. E. (2006). Umbilical Cord Blood Stem Cells: Collection, Processing, and Transplantation. Blood Banking and Transfusion Medicine: Basic Principles and Practice. C. D. Hillyer ., Churchill Livingston, an imprint of Elsevier, Inc.: 823-832; Lewis, 2002, Intern Med J 32(12): 601-9).
Апластическая анемия является типом анемии, при котором костный мозг не может продуцировать достаточные количества клеток крови для восполнения клеток крови. В частности, могут существовать врожденные и приобретенные формы апластической анемии. Приобретенная апластическая анемия (AA) является редким состоянием недостаточности костного мозга, отличающимся пониженной клеточностью костного мозга и низкими количествами клеток периферической крови [Young NS, Maciejewski JP. The pathophysiology of acquired aplastic anemia. N Eng J Med 1997, 336:1365-1372]. Доказательства аутоиммунного патогенеза, главным образом, являются косвенными, а характеристика лежащего в основе иммунного ответа является неполной, в основном, по причине технических затруднений в результате специфической для заболевания низкой клеточности. Считают, что приобретенная апластическая анемия является иммуноопосредованным заболеванием, и современным стандартом нетрансплантационной терапии является антитимоцитарный глобулин (ATG) с циклоспорином A (CsA). Неблагоприятные исходы включают пациентов, не отвечающих на терапию первой линии, (30%) и пациентов с рецидивом после первого ответа (30%), таким образом, бессобытийная выживаемость не превышает 30-40% (Bacigalupo A., Passweg J., 2009, Hematol Oncol Clin North Am. 23: 159-70).
Неподвергнутая лечению апластическая анемия может приводить к смерти, в некоторых случаях даже в течение короткого периода всего лишь нескольких месяцев. Современное лечение апластической анемии включает, например, трансплантацию костного мозга или терапию иммуносупрессирующими лекарственными средствами. Однако терапия иммуносупрессирующими лекарственными средствами приводит к неблагоприятному исходу в значительном количестве случаев, а трансплантация костного мозга невозможна в отсутствие подходящего донора. Таким образом, в этой области также существует потребность в получении альтернативных средств для лечения апластической анемии, которые, предпочтительно, могут являться эффективными для лечения пациентов, не отвечающих по меньшей мере на одну другую терапию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к предоставлению средства, которое можно использовать для лечения и/или профилактики заболеваний, нарушений и состояний, в частности, заболеваний, нарушений и состояний, относящихся к иммунной системе. В частности, авторы настоящего изобретения нацелены на предоставление средства, которое можно использовать для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) и апластической анемии или которое можно использовать для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Предпочтительно, это средство, кроме того, должно являться, по существу, хорошо переносимым пациентами. В частности, авторы настоящего изобретения нацелены на предоставление средства, с помощью которого осуществляют профилактику и/или лечение по меньшей мере одного из GvHD и апластической анемии или которое стимулирует приживление трансплантата у пациентов, в частности, в одной или нескольких группах пациентов, не отвечающих на другое лечение, в частности, на другое лечение с использованием иммуносупрессирующего средства, например, лечение стероидами, или демонстрирующих недостаточный ответ на них.
В качестве решения этих проблем авторы настоящего изобретения предоставляют, помимо прочего, антитело, фармацевтическую композицию, выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, композицию, содержащую смесь антител, рекомбинантную клетку-хозяина, составной набор и способ производства антитела.
Первый аспект настоящего изобретения относится к антителу, которое может специфически связываться с CD26, в частности, CD26 человека, указанное антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи может содержать последовательность WTVVGPGYFDV (SEQ ID NO: 1), и/или где указанная вариабельная область легкой цепи может содержать последовательность QQRSSYPNT (SEQ ID NO: 2) и/или последовательность GQGYSYPYT (SEQ ID NO: 3). Кроме того, антитело по настоящему изобретению может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6-21, варианта аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 и варианта аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47 и их вариантов. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:5.
По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую (a) нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению; или (b) нуклеотидную последовательность, комплементарную (a). Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128 и их вариантов, имеющих по меньшей мере 90% идентичности последовательности в отношении нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128. По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с последовательностью контроля экспрессии. Другой аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, продуцируемому гибридомной клеточной линией, депонированный на 11-е сентября 2012 года согласно Будапештскому договору в Centro di Biotecnologie Avanzate (CBA) - Interlab Cell line Collection (ICLC) Генуи (L.go R. Benzi, 10, Genoa, Italy) как PD 12002, или производным указанной гибридомной клеточной линии. Депонированный материал гибридомной клеточной линии также кратко обозначен в настоящем описании как гибридома, депонированная как PD 12002. Все ограничения в отношении известности этих депозитов будут сняты после первой публикации этой заявки или другой заявки, испрашивающей приоритет по этой заявке. По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют антитело, связывающееся с эпитопом, связываемым антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонированной в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу производства антитела по настоящему изобретению.
По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению и, необязательно, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), в частности, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении апластической анемии.
Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу или смеси антител по настоящему изобретению, в частности, композиции, содержащей смесь антител по настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства. По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют антитело по настоящему изобретению или смесь антител, в частности, композицию, содержащую смесь антител, для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии. Другой аспект настоящего изобретения относится к составному набору, содержащему: (i) по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, в частности, композицию, содержащую смесь антител по настоящему изобретению, и дополнительно (ii) a) по меньшей мере одно иммуносупрессирующее лекарственное средство или b) по меньшей мере один кортикостероид и/или по меньшей мере одно антигистаминное средство.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1a показана полная последовательность CD26 человека.
На фиг. 1b показана полная последовательность CD26 свиньи.
На фиг. 1c показано выравнивание полных последовательностей CD26 человека и свиньи.
На фиг. 2a показаны последовательности CDR3, которые могут присутствовать в антителе по настоящему изобретению.
На фиг. 2b показан список последовательностей CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL CD26-специфичных антител.
На фиг. 2c показан список последовательностей ABR1 VH, ABR2 VH, ABR3 VH, ABR1 VL, ABR2 VL и ABR3 VL CD26-специфичных антител.
На фиг. 3 показана схожесть последовательностей, наблюдаемая в различных областях VH и VL, которые могут присутствовать в антителе по настоящему изобретению. Последовательности VH в группе 1 VH и последовательности VL в группе 1 VL содержат идентичные CDR.
На фиг. 4a представлена диаграмма, иллюстрирующая разделение по степеням кожной GvHD у пациентов, включенных в исследование, связанное с введением CDina26.
На фиг. 4b представлена диаграмма, иллюстрирующая разделение по степеням печеночной GvHD у пациентов, включенных в исследование, связанное с введением CDina26.
На фиг. 4c представлена диаграмма, иллюстрирующая разделение по степеням кишечной GvHD у пациентов, включенных в исследование, связанное с введением CDina26.
На фиг. 5 представлена диаграмма, иллюстрирующая абсолютные значения CD4.
На фиг. 6 представлена диаграмма, иллюстрирующая прогнозируемый кумулятивный показатель связанной с трансплантацией смертности у 13 контрольных пациентов со степенью III-IV острой GvHD, подвергнутых лечению стероидами, циклоспорином и другими иммуносупрессирующими лекарственными средствами, по сравнению с 9 пациентами, подвергнутыми лечению стероидами, циклоспорином и CDina26.
На фиг. 7 представлена диаграмма, иллюстрирующая прогнозируемую актуариальную выживаемость у 13 контрольных пациентов со степенью III-IV острой GvHD, подвергнутых лечению стероидами, циклоспорином и другими иммуносупрессирующими лекарственными средствами, по сравнению с 9 пациентами, подвергнутыми лечению стероидами, циклоспорином и CDina26.
На фиг. 8 представлена структура предпочтительных антител по настоящему изобретению. На фигуре показаны две различные группы легкой цепи, которые могут образовывать антитело по настоящему изобретению (группа 1 VL и группа 3 VL).
На фиг. 9 представлен анализ с помощью проточной цитометрии, используемый для определения способности CDina26 связываться с CD26, экспрессирующимся на поверхности клетки.
Фиг. 10 - Обзор SEQ ID NO. Каждая из аминокислотных последовательностей VL может присутствовать в антителе по настоящему изобретению в комбинации с одной из аминокислотных последовательностей VH, необязательно, дополнительно в комбинации с аминокислотной последовательностью CL, содержащей SEQ ID NO:48, и последовательностью CH1-CH2-CH3, содержащей SEQ ID NO:49. На фиг. 10 также представлены нуклеотидные последовательности, содержащие SEQ ID NO: 50-128, соответствующие аминокислотным последовательностям, содержащим SEQ ID NO: 4-49.
На фиг. 11 показано связывание антигена (Ag) человека (слева) и свиньи (справа) с фиксированными CDina26, измеряемое в резонансных единицах Biacore (RU).
На фиг. 12 представлена столбиковая диаграмма сравнения связывания CDina26 с 7 идентифицированными областями связывания прерывистого типа в CD26: DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146); DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147); TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153); TFITKGTWEVIG (SEQ ID NO: 155); DYLYYISNE (SEQ ID NO: 156); SCELNPERCQYY (SEQ ID NO: 157) и SGPGLP (SEQ ID NO: 158).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
+
+
+
+
В течение многочисленных экспериментов, приведших к настоящему изобретению, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили антитело, которое можно использовать в качестве лекарственного средства с крайне благоприятным и многообещающим результатом, в частности, для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) и апластической анемии, а также для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Антитело по настоящему изобретению может демонстрировать специфическое связывание с CD26, в частности, CD26 человека, особенно, CD26 человека, присутствующего на стволовой клетке или экспрессирующегося на активированном T-лимфоците. Связывание антитела по настоящему изобретению с CD26 человека, экспрессирующегося на активированных T-лимфоцитах (в частности, субпопуляциях CD16 CD3 T-клеток и CD56 CD3 T-клеток), является особенно предпочтительным свойством антитела по настоящему изобретению, как описано ниже. Обоснование применения мышиного моноклонального антитела против CD26 для лечения резистентной к стероидам aGvHD, в основном, подкреплено его способностью блокировать активность CD26. Эксперименты, осуществленные авторами настоящего изобретения, показывают, что CD26 гиперэкспрессируется на стимулированных T-клетках и гиперэкспрессируется в меньших количествах на естественных киллерах. С другой стороны, эта молекула слабо экспрессируется на покоящихся клетках. B-клетки, моноциты и дендритные клетки никогда не экспрессируют CD26, как и мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты. Антитело против CD26 по настоящему изобретению специфически связывается с активированными регуляторными T-клетками, противодействуя их экспансии и функционированию в модуляции иммунного ответа. Не желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее время считают, что активированные лимфоциты являются мишенью антитела против CD26, и что частичная деплеция активированных лимфоцитов может приводить к клинически значимой модуляции по меньшей мере одного из GvHD, в частности, aGvHD, особенно, резистентной к стероидам aGvHD, апластической анемии и заболеваний, нарушений и/или состояний, присутствующих до, и/или в течение, и/или после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, а также может стимулировать приживление трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Не желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее время считают, что T-лимфоциты донора все равно могут запускать реакцию напрямую против опухолевых клеток.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HCT) представляет собой стандартное лечение гематологических заболеваний и злокачественных новообразований.
Не желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее время считают, что ингибирование или деплеция CD26 на донорских клетках посредством введения одного или нескольких антител по настоящему изобретению, в частности, CDina26, может повышать приживление трансплантата, в частности, кратковременное приживление трансплантата, а также может повышать репопуляцию, в частности, конкурентную репопуляцию, вторичную трансплантацию и выживаемость подвергнутых лечению индивидуумов, например, людей и мышей. Кроме того, не желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее время считают, что при повышении хоминга и приживления трансплантата, в частности, посредством введения по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, особенно CDina26, можно снижать время восстановления гемопоэтических линий, приводящее к меньшим неблагоприятным исходам в приживлении трансплантата и лучшей общей выживаемости, особенно при трансплантации hUCB (клеток пуповинной крови человека).
Антитело по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства или терапия с использованием этого антитела могут обеспечивать большему количеству пациентов лучшие шансы успешного исхода после трансплантации гемопоэтических клеток. Кроме того, одно или несколько антител по настоящему изобретению против антигена CD26, в частности, CDina26, могут обеспечивать клиническое преимущество пациентам, подвергнутым трансплантации гемопоэтических стволовых клеток по меньшей мере для одного из лечения резистентной к стероидам острой GvHD и улучшения приживления трансплантата, прямо коррелирующему с общей выживаемостью.
Не желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее время считают, что введение по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, в частности, CDina26, может обеспечивать благоприятную активность, в частности, стимуляцию приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и/или профилактику и/или лечение по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии, посредством связывания CD26, как мембранного гликопротеина, опосредующего путь передачи сигнала.
Неожиданно, авторы настоящего изобретения предоставляют одно или несколько антител, в частности, CDina26, позволяющих решать указанные выше проблемы.
+
+
+
+
+
+
+
+
По одному из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое может специфически связываться с гликопротеином CD26. В частности, это антитело может специфически связываться с CD26 человека, особенно с CD26 человека, присутствующим на стволовых клетках (в частности, стволовых клетках человека), и/или с CD26 человека, экспрессирующимся на T-лимфоцитах (в частности, субпопуляциях CD16 CD3 T-клеток и CD56 CD3 T-клеток), особенно на активированных T-лимфоцитах (в частности, субпопуляциях CD16 CD3 T-клеток и CD56 CD3 T-клеток). Если явно не указано иное, термины CD26 и гликопротеин CD26 в настоящем описании используют взаимозаменяемо.
Это антитело может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Вариабельная область тяжелой цепи этого антитела может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. Вариабельная область легкой цепи этого антитела может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, или обе из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 3. Вариабельная область тяжелой цепи может содержать CDR3, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. Вариабельная область легкой цепи может содержать CDR3, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, или обе из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, и последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 3. Вариабельная область тяжелой цепи, содержащая последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, в частности, содержащая CDR3, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, кроме того, может содержать CDR1 и CDR2, где аминокислотные последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи являются таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, указанной вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002, содержащей SEQ ID NO: 1, в частности, CDR3, содержащей SEQ ID NO: 1. Вариабельная область легкой цепи, содержащая последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, в частности, содержащая CDR3, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, кроме того, может содержать CDR1 и CDR2, где аминокислотные последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи и CDR2 вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002, указанной вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002, содержащей SEQ ID NO: 2, в частности, CDR3, содержащую SEQ ID NO: 2. Вариабельная область легкой цепи, содержащая последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, в частности, содержащая CDR3, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, кроме того, может содержать CDR1 и CDR2, где аминокислотные последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи и CDR2 вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002, указанной вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002, содержащей SEQ ID NO: 3, в частности, CDR3, содержащую SEQ ID NO: 3. В частности, CDR1 и CDR2 вариабельной области легкой цепи могут являться таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002, и CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи могут являться таковыми в вариабельной области тяжелой цепи указанного антитела, продуцируемого указанной гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC как PD 12002.
Дополнительно или альтернативно, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 (SEQ ID NO: 1), и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 (SEQ ID NO: 2 и/или 3), где аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи является таковой в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи является таковой в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать тяжелую цепь, содержащую эту вариабельную область тяжелой цепи, и легкую цепь, содержащую эту вариабельную область легкой цепи. Указанные выше последовательности CDR3 приведены на фиг. 2a.
Дополнительно или альтернативно, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, где аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи являются таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, это антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать тяжелую цепь, содержащую эту вариабельную область тяжелой цепи, и легкую цепь, содержащую эту вариабельную область легкой цепи. Указанные выше последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 приведены на фиг. 2b.
Дополнительно или альтернативно, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи являются таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи этого антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать тяжелую цепь, содержащую эту вариабельную область тяжелой цепи, и легкую цепь, содержащую эту вариабельную область легкой цепи. В частности, аминокислотные последовательности тяжелой цепи могут являться таковыми в тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, и/или аминокислотные последовательности легкой цепи могут являться таковыми в легкой цепи этого антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать те же последовательности тяжелой цепи и те же последовательности легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002.
Дополнительно или альтернативно, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи являются таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность ID NO: 4 и/или последовательность ID NO: 5. В частности, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать тяжелую цепь, содержащую эту вариабельную область тяжелой цепи, и легкую цепь, содержащую эту вариабельную область легкой цепи. В частности, аминокислотные последовательности тяжелой цепи являются таковыми в тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, и/или аминокислотные последовательности легкой цепи являются таковыми в легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002.
По предпочтительному варианту осуществления антитело по настоящему изобретению может связываться с областью аминокислот в положениях 290-550 последовательности CD26 человека, относящейся к последовательности CD26 человека, опубликованной в литературе современного уровня техники.
По дополнительному варианту осуществления изобретения антитело по настоящему изобретению не связывается специфически с CD26 свиньи. По одному из вариантов осуществления эпитоп для антитела против CD26 человека по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один, например, один, два, три, четыре, пять или более из 358 аминокислотных остатков, отличающихся в CD26 человека и свиньи. Таким образом, по этому варианту осуществления изобретения антитело распознает такую область, различающуюся в CD26 человека и свиньи.
По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, смесь антител по настоящему изобретению не содержит антитело, не связывающееся специфически с CD26 человека.
Дополнительно или альтернативно, антитело, которое может специфически связываться с CD26, может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую ABR1, ABR2 и ABR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую ABR1, ABR2 и ABR3, где аминокислотные последовательности ABR1, ABR2 и ABR3 вариабельной области тяжелой цепи являются таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотные последовательности ABR1, ABR2 и ABR3 вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Указанные выше последовательности ABR1, ABR2 и ABR3 приведены на фиг. 2c.
По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения в антителе по настоящему изобретению присутствуют следующие антигенсвязывающие области (ABR):
ABR1 (легкая цепь) содержит аминокислотную последовательность: SSVSYMN (SEQ ID NO: 135),
ABR2 (легкая цепь) содержит аминокислотную последовательность: LWIYSTSNLAS (SEQ ID NO: 136),
ABR3 (легкая цепь) содержит аминокислотную последовательность: QQRSSYPN (SEQ ID NO: 137), где, предпочтительно, ABR3 включена в SEQ ID NO:2,
или
ABR1 (легкая цепь) содержит аминокислотную последовательность: ENVVTYVS (ABR1*) (SEQ ID NO: 138),
ABR2 (легкая цепь) содержит аминокислотную последовательность: LLIYGASNRYT (ABR2*) (SEQ ID NO: 139),
ABR3 (легкая цепь) содержит аминокислотную последовательность: GQGYSYPY (ABR3*) (SEQ ID NO: 140), где, предпочтительно, ABR3 включают в SEQ ID NO:3.
По дополнительному варианту осуществления изобретения последовательности ABR1-3 или ABR1*-3* присутствуют в антителе по изобретению совместно со следующими антигенсвязывающими областями (ABR):
ABR1 (тяжелая цепь), содержащей аминокислотную последовательность: YTFRSYDIN (ABR1h) (SEQ ID NO: 141),
ABR2 (тяжелая цепь), содержащей аминокислотную последовательность: WIGWIFPGDGSTKY (ABR2h) (SEQ ID NO: 142),
ABR3 (тяжелая цепь), содержащей аминокислотную последовательность: RWTVVGPGYFDV (ABR3h) (SEQ ID NO: 143),
где, предпочтительно, ABR3 (тяжелая цепь) включена в SEQ ID NO:1.
H
L
По одному из вариантов осуществления ABR определяют в соответствии с "инструментом Paratome", как опубликовано в Kunik V, Peters B, Ofran Y (2012) "Structural Consensus among Antibodies Defines the Antigen Binding Site", PLoS Comput Biol 8(2): e1002388.doi:10,1371/journal.pcbi.1002388; издатель: Brian Baker, Университет Нотр-Дам, США; опубликованной 23 февраля 2012 года; см. также http://ofranservices.biu.ac.il/site/services/paratome/index.html. Указанные выше последовательности ABR V/V приведены на фиг. 2b.
+
+
+
+
Как применяют в настоящем описании, термин "антитело" может включать целые молекулы антитела, полноразмерные иммуноглобулиновые молекулы, в частности, природные полноразмерные иммуноглобулиновые молекулы или полноразмерные иммуноглобулиновые молекулы, образованные в результате процесса рекомбинации фрагментов генов иммуноглобулинов, а также фрагменты антител. Фрагменты антител, в частности, могут являться фрагментами антител, содержащими по меньшей мере один участок связывания антитело-антиген. Фрагменты антител, в частности, могут демонстрировать специфическое связывание с CD26, в частности, CD26 человека, который, например, может присутствовать на стволовой клетке (в частности, стволовой клетке человека) и/или экспрессироваться на T-лимфоцитах (в частности субпопуляциях CD16 CD3 T-клеток и CD56 CD3 T-клеток), в частности, на активированных T-лимфоцитах. Кроме того, как применяют в настоящем описании, термин "антитело" может включать слитные белки, в частности, демонстрирующие специфическое связывание с CD26, особенно CD26 человека, который может присутствовать на стволовой клетке и/или экспрессироваться на T-лимфоцитах, в частности, на активированных T-лимфоцитах. Участок связывания антитело-антиген, в частности, может являться антигенсвязывающим участком антитела, содержащим по меньшей мере одну последовательность CDR.
in vivo
in vitro
Термин "антитело" может включать, например, моноклональные, поликлональные, полиспецифические (например, биспецифические), рекомбинантные, человеческие, химерные и гуманизированные антитела. Кроме того, термин "антитело" также может включать рекомбинантно экспрессируемые антигенсвязывающие белки и антигенсвязывающие синтетические пептиды. В частности, термин "антитело", например, может включать миниантитела и диатела, все из которых, предпочтительно, могут проявляться специфическое связывание с CD26, особенно CD26 человека. Кроме того, как применяют в настоящем описании, термин "антитело" может включать иммуноглобулины, продуцируемые , а также продуцируемые , в частности, гибридомой. Кроме того, термины "антитело" или "по меньшей мере одно антитело" могут включать смеси антител. Термин "смесь антител", в частности, включает смесь, содержащую или состоящую из двух или более антител, демонстрирующих специфическое связывание с CD26, особенно CD26 человека, в частности, содержащую по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению. Два или более антител, присутствующих в смеси, могут являться двумя или более различными антителами, например, двумя или более антителами, не имеющими идентичных аминокислотных последовательностей. В частности, антитело, отличающееся от другого антитела, может являться антителом, имеющим аминокислотную последовательность, где по меньшей мере один аминокислотный остаток подвергнут делеции, инсерции или замене другим аминокислотным остатком по сравнению с аминокислотной последовательностью указанного другого антитела. Особенно подходящая смесь антител по изобретению содержит или состоит из антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, или содержит по меньшей мере одно из антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002.
Антитело по настоящему изобретению может являться рекомбинантно продуцируемым антителом. Антитело по настоящему изобретению может являться моноклональным и/или мышиным антителом, в частности, мышиным моноклональным антителом. Как указано выше, по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению может являться смесью антител, содержащей по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, в частности, содержащей или состоящей из антитела, продуцируемого гибридомой, депонируемой как PD 12002, CDina26.
2
Термин "моноклональное антитело" относится, по существу, к гомогенной популяции антител, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании одной антигенной детерминанты или эпитопа. Это является отличием от поликлональных антител, как правило, включающих различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант. Термин "моноклональное антитело" включает интактные и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab'), Fv), одноцепочечные (scFv) мутантные формы, слитные белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную иммуноглобулиновую молекулу, содержащую участок распознавания антигена. Кроме того, "моноклональное антитело" относится к таким антителам, полученным любым количеством способов, включая, в качестве неограничивающих примеров, получение с помощью гибридомы, фаговой селекции, рекомбинантной экспрессии и трансгенных животных.
Термин "гуманизированное антитело" относится к формам не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител, являющихся специфичными иммуноглобулиновыми цепями, химерными иммуноглобулинами или их фрагментами, содержащими минимальные не принадлежащие человеку (например, мышиные) последовательности. Как правило, гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека, в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) заменяют остатками из CDR не являющихся человеком видов (например, мыши, крысы, кролика и хомяка), обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и функцией (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками в антителе из не являющихся человеком видов, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и функцией. Гуманизированное антитело можно дополнительно модифицировать с помощью замены дополнительных остатков в каркасной области Fv и/или в замененных не принадлежащих человеку остатках для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности и/или функции антитела. В основном, гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все из по меньшей мере одного и, как правило, двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или, по существу, все из областей CDR, соответствующих не принадлежащему человеку иммуноглобулину, в то время как все или, по существу, все из областей FR являются таковыми из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина или домена (Fc), как правило, из иммуноглобулина человека.
Термин "химерные антитела" относится к антителам, где аминокислотную последовательность иммуноглобулиновой молекулы получают из двух или более видов. Как правило, вариабельная область легких и тяжелых цепей соответствует вариабельной области антител, полученных из одного из 60 видов млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с желаемой специфичностью, аффинностью и функцией, в то время как константные области гомологичны последовательностям в антителах, полученных из другого вида (как правило, человека), для избегания вызывания иммунного ответа у этого вида. Как правило, в химерных антителах используют вариабельные области (VH и VL) грызунов и константные области человека для получения антитела, преимущественно, с доменами человека. Получение таких химерных антител хорошо известно в этой области, и его можно осуществлять стандартными способами. Последовательности константных областей человека будут очевидны специалисту в этой области и/или они находятся в общедоступных базах данных (например, National center for Biotechnology Information (NCBI), U.S. National Library of Medicine).
2
2
Термин "фрагмент антитела" может относится к фрагменту, такому как F(ab'), Fab, F(ab), Fab', Fv, dAb, scFv, CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, CDR1 вариабельной области легкой цепи, CDR2 вариабельной области легкой цепи, CDR3 вариабельной области легкой цепи, одноцепочечному вариабельному фрагменту (scFv), VH, VL и т.п., все из которых, предпочтительно, могут проявлять специфическое связывание с CD26, особенно CD26 человека. "Фрагмент антитела" может специфически связываться с тем же антигеном, который распознает целое антитело или полноразмерное антитело. "Фрагмент антитела", в частности, может являться частью интактного антитела.
E. coli
B. subtilis
P. pastoris
K. lactis
et al.
et al.
Специалист в этой области может получать фрагменты антител, распознающие конкретные эпитопы, в частности, специфически связывающиеся с CD26, с использованием известных в этой области способов. Фрагменты антитела, в частности, фрагменты антитела, которое может специфически связываться с CD26, особенно CD26 человека, такие как, например, фрагменты одного или нескольких антител против CD26, продуцируемых гибридомой, депонируемой как PD 12002, CDina26, например, можно получать, ферментативно обрабатывая антитело для получения фрагментов антител. Кроме того, фрагмент антитела можно получать с помощью экспрессии ДНК, кодирующей фрагмент, в хозяине, таком как, например, , , , . Фрагмент антитела, например, можно получать протеолитическим гидролизом полноразмерного антитела. Ферменты, в частности, протеолитические ферменты, для получения фрагментов антител известны специалисту в этой области и включают, в качестве неограничивающих примеров, например папаин, пепсин и/или плазмин. В частности, фрагмент антитела, например, можно получать расщеплением полноразмерного антитела пепсином или папаином с использованием способов, известных специалисту в этой области, как указано, например, в US 2010/0196266 A1. Такие способы описывают, например, в Goldenberg, патентах США №№ 4036945 и 4331647, а также в цитируемых в них ссылках. Способы получения фрагментов антител известны в этой области и описаны, например, в Nisonoff , Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman, METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967), and Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, (John Wiley & Sons 1991), p. 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4.
Как применяют в настоящем описании, термин "тяжелая цепь" включает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты, предпочтительно, способные специфически связываться с CD26, особенно CD26 человека. Полноразмерная тяжелая цепь может включать вариабельную область тяжелой цепи, VH, и три области, CH1, CH2 и CH3.
Как применяют в настоящем описании, термин "легкая цепь", в частности, может относиться к полноразмерной легкой цепи и ее фрагментам, предпочтительно, способным специфически связываться с CD26, особенно CD26 человека. Полноразмерная легкая цепь может содержать вариабельную область легкой цепи, VL, и константную область легкой цепи, CL.
Как применяют в настоящем описании, термин "вариабельная область" антитела может относиться к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или комбинации указанных выше вариабельных областей. Каждая из вариабельных областей легкой и тяжелой цепи может содержать четыре каркасные области (FR), соединенные тремя определяющими комплементарность областями (CDR). В настоящее время в этой области используют две системы определения локализации CDR. Первой является определение "вариабельности последовательностей" по Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4th ed., Washington, D.C., Public Health Service, N.I.H., включенная в настоящее описание в качестве ссылки). По предпочтительному варианту осуществления в настоящей заявке используют определение по Kabat et al. Альтернативно, области CDR также можно определять с использованием определения структурной вариабельности по Chothia и Lesk (Chothia et al., J. Mol. Biol. 1987, 196(4):901-17, включенной в настоящее описание в качестве ссылки).
Как применяют в настоящем описании, термин "константная область" антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, или комбинации указанных выше константных областей.
Для получения антител, в частности, человеческих, гуманизированных, химерных антител и их фрагментов можно использовать, например, любой из способов, описываемых в US 2010/0196266 A1, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Фрагменты антител можно получать несколькими способами, включая, в качестве неограничивающих примеров, следующие способы, такие как, например, описываемые в US 2010/0196266 A1:
2
2
F(ab')-фрагменты можно получать расщеплением молекулы антитела пепсином. Fab'-фрагменты, например, можно получать, восстанавливая дисульфидные мостики фрагментов F(ab'). Альтернативно, например, можно конструировать экспрессионные библиотеки Fab', как описано, например, Huse et al. (Science 1989, 246:1274-1281). Экспрессионные библиотеки Fab' позволяют идентифицировать моноклональные Fab'-фрагменты, имеющие интересующую специфичность, в частности, фрагменты, связывающихся с CD26.
2
F(ab)-фрагменты можно получать расщеплением антитела папаином. Fab-фрагменты можно получать восстановлением дисульфидной связи. "Fab-фрагмент", в частности, представляет собой фрагмент, состоящий из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может связываться через дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.
Кроме того, фрагмент антитела также может являться одной вариабельной областью или пептидом, состоящим из или содержащим одну определяющую комплементарность область (CDR).
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может являться диателом. Как применяют в настоящем описании, с помощью термина "диатела" можно описывать, в частности, небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной полипептидной цепи (VH-VL). Если явно не указано обратное, термины "вариабельный домен" и "вариабельная область" в настоящем описании используют взаимозаменяемо. Диатела и способы их получения описывают, например, в EP 404 097, WO 93/11161, и в Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может являться одноцепочечной молекулой Fv. Одноцепочечная молекула Fv (сокращенно обозначаемая как scFv) содержит домен VL и домен VH, которые можно соединять для образования участка связывания, в частности, CD26. Эти два домена дополнительно ковалентно связывают пептидным линкером, таким как, например, пептид, содержащий от 1 до 25 аминокислотных остатков. Если явно не указано обратное, термины "домен VL" и "область VL" в настоящем описании используют взаимозаменяемо. Кроме того, если явно не указано обратное, термины "домен VH" и "область VH" в настоящем описании используют взаимозаменяемо. Способы получения молекул scFv описывают, например, в US 4704692, US 4946778, R. Raag and M. Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB Vol. 9:73-80 (1995) и R. E. Bird and B. W. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions," TIBTECH, Vol. 9: 132-137 (1991).
Кроме того, как применяют в настоящем описании, термин "антитело" также включает однодоменные антитела. Способы получения однодоменных антител (DAB) известны специалисту в этой области и описаны, например, в Cossins et al. (2006, Prot Express Purif 51:253-259), включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
По одному из вариантов осуществления антитело или его фрагмент по настоящему изобретению может содержать, по меньшей мере, CDR3 тяжелой цепи и, по меньшей мере, CDR3 легкой цепи; в частности, антитело или его фрагмент по настоящему изобретению может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, а также по меньшей мере одну из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 2 и 3.
Фрагменты антител могут содержать по меньшей мере 4 аминокислоты, по меньшей мере 5 аминокислот, по меньшей мере 7 аминокислот, по меньшей мере 9 аминокислот, в частности, по меньшей мере 15 аминокислот. Фрагмент антитела по настоящему изобретению может иметь любой верхний предел размера и может иметь, например, всего лишь на один аминокислотный остаток меньше, чем полноразмерное антитело, из которого его получают.
Антитело по настоящему изобретению может являться биспецифическим антителом, способным связываться с CD26, в частности, CD26 человека. Биспецифические антитела можно получать несколькими способами, включая, например, слияние гибридом или соединение Fab'-фрагментов. Такие способы описывают, например, в Songsivilai et al., 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553.
По варианту осуществления антитело по настоящему изобретению может являться моноклональным антителом. В этой области известны способы получения моноклональных антител против антигена-мишени, как описано, например, в Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, стр. 2.5.1 -2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), и US 2010/0196266 A1. Моноклональные антитела можно получать, например, способами, известными специалисту в этой области, такими, как описано в US 2010/0196266 A1. В частности, моноклональные антитела можно получать способами, включающими один или несколько, предпочтительно, все из следующих этапов: инъецирование млекопитающим, например, мыши, композиции, содержащей антиген, удаление селезенки у млекопитающих, которым делали инъекции, для получения B-лимфоцитов, слияние полученных таким способом B-лимфоцитов с миеломными клетками для получения гибридом, клонирование гибридом, селекция по меньшей мере одного позитивного клона, продуцирующего антитела против антигена, культивирование по меньшей мере одного позитивного клона, продуцирующего антитела против антигена, и выделение антител из гибридомных культур.
MAb (моноклональные антитела) можно выделять и очищать из гибридомных культур с использованием известных способов, таких, как описывают в US 2010/0196266 A1. В частности, можно использовать один или несколько способов выделения и/или очистки, выбранных из группы, состоящей из эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, в частности, с протеин A- сефарозой, и ионообменной хроматографии. Способы выделения и/или очистки антител описывают, например, в Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," в METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, стр. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992), а также в Coligan et al., выше, стр. 2.7.1-2.7.12 и стр. 2.9.1-2.9.3.
С помощью термина "моноклональное антитело", в частности, можно описывать антитело, получаемое из популяции, по существу, гомогенных антител, где отдельные антитела являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в малых количествах.
После исходного получения антител против иммуногена, в частности, после исходного получения антител, которые могут специфически связываться с CD26, антитела можно секвенировать, а затем получать с использованием рекомбинантных способов. Гуманизация и химеризация антител не относящихся к человеку млекопитающих (например, мышиных) и фрагментов антител хорошо известны специалисту в этой области.
et al.
et al.
et al.
et al
et al.
Антитело по настоящему изобретению может являться гуманизированным антителом, в частности, гуманизированным моноклональным антителом. Термин "гуманизированное антитело", в частности, может включать антитела, получаемые способами рекомбинантной ДНК, в которых некоторые или все из аминокислот легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, не являющиеся необходимыми для связывания антигена (такие как, например, некоторые или все из аминокислот константных областей и каркасных областей вариабельных доменов) используют для замены соответствующими аминокислотами из легкой или тяжелой цепи антитела не относящегося к человеку млекопитающего (например, мышиного). Способы получения гуманизированных моноклональных антител известны в этой области и описаны, например, в следующих публикациях: Jones , Nature 321: 522 (1986), Carter , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Riechmann , Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen ., Science 239: 1534 (1988), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), and Singer , J. Immun. 150: 2844 (1993). Антитело, такое как, например, химерное антитело или моноклональное антитело не относящегося к человеку млекопитающего (например, мышиное), в частности, химерное антитело или моноклональное антитело не относящегося к человеку млекопитающего (например, мышиное) по настоящему изобретению, можно гуманизировать, перенося CDR не относящегося к человеку млекопитающего (например, мыши) из вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина относящегося к человеку млекопитающего, например, иммуноглобулина мыши, в соответствующие вариабельные домены антитела человека, как описано, например, в US 2010/0196266 A1. Каркасные области (FR) не относящегося к человеку млекопитающего, например, каркасные области (FR) мыши, в химерном моноклональном антителе также можно заменять последовательностями FR человека. Например, антитело по настоящему изобретению, являющееся гуманизированной версией антитела против CD26 не относящегося к человеку млекопитающего (например, мышиного), может иметь на обоих тяжелых и легких цепях константные области антитела человека, и/или каркасные области из вариабельных доменов антитела человека, и/или CDR из антитела не относящегося к человеку млекопитающего (например, мышиного).
Для улучшения аффинности гуманизированного антитела, в частности, для улучшения его способности связываться с CD26, можно осуществлять дополнительные этапы модификации, как описано, например, в US 2010/0196266 A1. В частности, один или несколько аминокислотных остатков в областях FR человека можно заменять аминокислотными остатками, присутствующими в соответствующих положениях в не принадлежащем человеку, в частности, мышином, антителе для сохранения или улучшения аффинности связывания гуманизированного антитела с антигеном. Способы, которые может использовать специалист в этой области, описывают, например, в Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991), и Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988). Например, аминокислотные остатки FR (каркасной области) человека, отличающиеся от соответствующих остатков FR не принадлежащего человеку млекопитающего, например, соответствующих остатков FR мыши, и локализующиеся вблизи или непосредственно смежные с одним или несколькими аминокислотными остатками CDR, представляют собой кандидатов для замены.
Антитело по настоящему изобретению может являться антителом человека. Термин "антитело человека", в частности, может включать антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую таковой антитела, продуцируемого человеком и/или полученного с использованием известных способов получения антител человека. В частности, термин "антитело человека" может включать антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека.
В частности, антитело по настоящему изобретению может являться полностью человеческим антителом. В контексте настоящей заявки, термин "полностью человеческое антитело", в частности, может относиться к антителу, содержащему полипептиды тяжелой цепи человека и легкой цепи человека. Способы получения антител человека, в частности, полностью человеческих антител, с использованием, например, комбинаторных подходов или трансгенных животных, трансформированных с использованием локусов иммуноглобулинов человека, известны специалисту в этой области, например, как описано в US 2010/0196266 A1. Такие способы описывают, например, в Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:544-50). Полностью человеческое антитело, например, также можно получать с использованием способов генетической или хромосомной трансфекции или технологии фагового дисплея. Способы генетической или хромосомной трансфекции, а также технология фагового дисплея известны в этой области и описаны, например, в McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-553. В частности, антитела человека также можно получать, встраивая локусы иммуноглобулинов человека в трансгенных животных, таких как, например, мыши, козы или коровы, где полностью или частично инактивируют эндогенные гены иммуноглобулинов. Такие способы описывают, например, в US 5545806, US 5633425 и US 5661016. Согласно альтернативному способу, антитело человека можно получать, иммортализуя B-лимфоциты человека, продуцирующие антитело, направленное против антигена-мишени, в частности, продуцирующие антитело против CD26. Такие способы известны в этой области и описаны, например, в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol.,147 (1):86-95.
В частности, как известно в этой области и описано, например, в Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40 и US 2010/0196266 A1, для получения антитела человека можно использовать технологию фагового дисплея. Антитела человека можно получать из нормальных людей или людей, имеющих конкретное заболевание (Dantas-Barbosa et al., 2005). Этот способ позволяет конструировать антитела человека от индивидуума с заболеванием.
Например, можно конструировать библиотеку фагового дисплея Fab-фрагментов антител человека от пациентов с остеосаркомой, как описано в Dantas-Barbosa et al. (2005, выше) и, например, в US 2010/0196266 A1. В частности, из циркулирующих лимфоцитов крови можно получать тотальную РНК (Id.). Рекомбинантные Fab можно клонировать из репертуаров μ-, γ- и κ-цепей антител и встраивать в библиотеку фагового дисплея (Id.). РНК можно преобразовывать в кДНК и использовать для получения библиотек кДНК Fab с использованием специфичных праймеров к последовательностям тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97). На следующем этапе можно осуществлять конструирование библиотеки, как известно специалисту в этой области и описано, например, в Andris-Widhopf et al. (2000), Phage Display Laboratory Manual, 1st edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 9.1-9.22). Конечные Fab-фрагменты можно расщеплять эндонуклеазами рестрикции и встраивать в геном бактериофага для получения библиотеки фагового дисплея. В конечном итоге, полученные таким способом библиотеки можно подвергать скринингу с использованием стандартных способов фагового дисплея, как известно в этой области и описано, например, в Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366; Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162). Фаговый дисплей можно осуществлять в нескольких форматах, как описано, например, в Johnson and Chiswell, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571.
in vitro
Кроме того, антитела человека можно получать с помощью активированных  B-клеток. Этот способ описывают, например, в US 5567610 и US 5229275, включенных в настоящее описание в качестве ссылок.
Антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом. В частности, химерное антитело может являться рекомбинантным белком, где вариабельные области антитела человека заменяют вариабельными областями антитела не относящегося к человеку млекопитающего, такого как, например, антитело мыши или антитело кролика, включающее определяющие комплементарность области (CDR) антитела не относящегося к человеку млекопитающего, например, антитела мыши или антитела кролика. Способы клонирования вариабельных доменов иммуноглобулина не относящегося к человеку млекопитающего, в частности, вариабельных доменов иммуноглобулина мыши, известны в этой области и описаны, например, в Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989), и US 2010/0196266 A1. Способы получения химерных антител известны специалисту в этой области, как описано, например, в Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994), где описывают получение химеры LL2.
Антитела по настоящему изобретению, кроме того, могут содержать один или несколько дополнительных остатков для достижения желаемых функций. В частности, антитела могут включать один или несколько остатков токсина (таких как, например, столбнячного токсина) или радионуклиды, и/или один или несколько остатков (таких как, например, биотин, флуоресцентный остаток, радиоактивный остаток, гистидиновая метка или другие пептидные метки) для облегчения выделения, и/или определения, и/или направленности, где указанная метка предпочтительно не изменяет или, по существу, не изменяет специфичность связывания указанного антитела.
Термины "имеет специфичность к", "демонстрирует специфическое связывание с", "способно специфически связываться с" и "специфически связывается с" в настоящей заявке используют взаимозаменяемо, и, в частности, с помощью них указывают, что антитело реагирует или связывается чаще, быстрее, с большей длительностью, с большей аффинностью, или с некоторой комбинацией указанного выше, с эпитопом или белком, чем с альтернативными веществами, включая неродственные белки. По одному из вариантов осуществления "связывание" и "специфическое связывание", а также "антитело, связывающееся с" и "антитело, специфически связывающееся с" в контексте настоящего описания можно использовать взаимозаменяемо.
off
-3
-5
-1
-3
-4
-1
-3
-4
-1
-4
-1
В определенных вариантах осуществления антитело против CD26, представленное в настоящем описании, связывается с CD26 человека с кинетической скоростью диссоциации (K) приблизительно от 1⋅e до 1⋅e с, предпочтительно - от 5⋅e до 5⋅e с, более предпочтительно - от 8⋅e до 3⋅e с, в частности, приблизительно 1,32⋅e с.
D
-8
-10
-9
-10
-9
-9
-9
В определенных вариантах осуществления антитело против CD26, представленное в настоящем описании, связывается с CD26 человека с кинетической константой диссоциации (K) приблизительно от 5⋅e до 5⋅e M, предпочтительно - от 2⋅e до 1⋅e M, более предпочтительно - от 3⋅e до 7⋅e M, в частности, приблизительно 5,02⋅e M.
on
3
5
4
4
4
4
4
В определенных вариантах осуществления антитело против CD26, представленное в настоящем описании, связывается с CD26 человека с кинетической константой ассоциации (K) приблизительно от 5⋅e до 1⋅e 1/Мс, предпочтительно - от 1⋅e до 5⋅e 1/Мс, более предпочтительно - от 1,5⋅e до 3,5⋅e 1/Мс, в частности, приблизительно 2,63⋅e 1/Мс.
В определенных вариантах осуществления антитело против CD26, представленное в настоящем описании, связывается с CD26 человека с константой диссоциации приблизительно 1 нМ или менее, приблизительно 3 нМ или менее, приблизительно 6 нМ или менее, приблизительно 12 нМ или менее, приблизительно 30 нМ или менее, приблизительно 60 нМ или менее, приблизительно 200 нМ или менее.
В некоторых вариантах осуществления антитело против CD26, представленное в настоящем описании, связывается с CD26 человека с константой диссоциации от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 6 нМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 3 нМ или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 1 нМ.
Антитела по настоящему изобретению можно анализировать на специфическое связывание любым способом, известным специалисту в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, конкурентные и неконкурентные системы анализа с использованием способов, таких как анализ Biacore, анализ FACS, иммунофлуоресценция, иммуноцитохимия, Вестерн-блоттинг, радиоиммунологические анализы, ELISA, иммунологические анализы "сэндвич"-типа, анализы иммунопреципитации, реакции осаждения, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы и иммунологические анализы с использованием протеина A. Такие анализы описывают, например, в Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York и US 7982013 B2, включенных в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Предпочтительно, можно осуществлять анализ Biacore.
Можно получать нативные антитела из двух или более гетеродимерных субъединиц, каждая из которых содержит одну тяжелую (H) и одну легкую (L) цепь. Отдельное нативное антитело может иметь один тип L-цепи и один тип H-цепи, соединенных дисульфидными связями для образования гетеродимерной субъединицы.
Термин "пептид", в частности, может относиться к соединению, включающему две или более аминокислоты. Аминокислоты можно соединять пептидной связью. Пептид может содержать природные аминокислоты и/или неприродные аминокислоты; в частности, пептид может содержать L-аминокислоты и/или D-аминокислоты. Короткие пептиды, например, пептиды, имеющие менее десяти аминокислотных единиц, иногда обозначают как "олигопептиды". Другие пептиды, имеющие большое количество аминокислотных остатков, например, до 100 или более, можно обозначать как "полипептиды". Как применяют в настоящем описании, термин "полипептид" может относиться к любому пептиду, содержащему три или более аминокислот. Как применяют в настоящем описании, любая ссылка на "полипептид" также включает олигопептид, и любая ссылка на "пептид" включает полипептиды, олигопептиды и белки.
Антитело по настоящему изобретению может являться антителом любого класса. В частности, антитело по настоящему изобретению может иметь изотип антитела, выбранный из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD и IgE. В частности, антитело по настоящему изобретению может являться антителом класса IgG2, особенно класса IgG 2B. Как применяют в настоящем описании, термин "изотип", в частности, может относиться к классу антитела (такому как, например, IgG), кодируемого генами константной области тяжелой цепи. Последовательности константных областей иммуноглобулинов человека будет очевидна специалисту в этой области и/или находится в общедоступных базах данных (например, National Center for Biotechnology Information (NCBI), U.S. National Library of Medicine).
Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую вариант CDR1 VL, CDR2 VL или CDR3 VL вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую вариант CDR1 VH, CDR2 VH или CDR3 VH вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В одном из вариантов осуществления вариант CDR VH или VL может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к соответствующим CDR VH или VL антитела, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Альтернативно, вариант CDR VH или VL может являться CDR VH или VL антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, где не более 5, 4, 3, 2, более предпочтительно - 1 аминокислотного остатка, соответственно, подвергают делеции, инсерции или замене аминокислотным остатком, отличающимся от замененного аминокислотного остатка. В одном из вариантов осуществления замена аминокислоты является консервативной заменой. В одном из вариантов осуществления CDR VH и VL антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, приведены на фиг. 2b.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6-21, варианта аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 и варианта аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из вариантов аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-21. Вариант SEQ ID NO: 4 может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 4. Вариант SEQ ID NO: 5 может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 5. Вариант аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-21, может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-21. Альтернативно, вариант аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6-21, может иметь аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6-21, где не более 8, предпочтительно - не более 5, более предпочтительно - 1 аминокислотный остаток, соответственно, подвергают делеции, инсерции или замене аминокислотным остатком, отличающимся от замененного аминокислотного остатка. В одном из вариантов осуществления замена аминокислоты является консервативной заменой. В частности, антитело против CD26 по настоящему изобретению может являться антителом, где вариабельная область легкой цепи может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-21 или их вариантов, как показано, например, на фиг. 3. Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 8-104 SEQ ID NO: 4 или 5.
"Консервативная замена аминокислоты" является изменением, где один аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Термин используют взаимозаменяемо с "консервативной аминокислотной заменой" или "консервативным вариантом аминокислоты". В этой области известны семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, включая основные боковые цепи, кислые боковые цепи, незаряженные полярные боковые цепи, неполярные боковые цепи, бета-разветвленные боковые цепи и ароматические боковые цепи, как описывают, например, в US 7982013 B2, в частности, в колонке 22. Например, замена фенилаланина тирозином является консервативной заменой. Предпочтительно, антитело, получаемое после консервативной замены, специфически связывается с CD26, в частности, CD26 человека. В этой области известны способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, не устраняющих связывание антигена (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
По одному из вариантов осуществления в вариантах аминокислотных последовательностей, содержащих одну или несколько последовательностей CDR, все последовательности CDR или, по меньшей мере, все последовательности CDR3 могут оставаться неизмененными. В частности, в вариантах аминокислотных последовательностей, содержащих одну или несколько аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, одна или несколько аминокислотных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, могут оставаться неизмененными. По одному из вариантов осуществления в вариантах нуклеотидных последовательностей, содержащих секции, кодирующие одну или несколько последовательностей CDR, все секции, кодирующие последовательности CDR или, по меньшей мере, все секции нуклеотидной последовательности, кодирующие последовательности CDR3, могут оставаться неизмененными. В частности, в вариантах нуклеотидных последовательностей, содержащих одну или несколько последовательностей, кодирующих одну или несколько последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, по меньшей мере, секции нуклеотидной последовательности, кодирующие одну или несколько из SEQ ID NO: 1, 2 и 3, могут оставаться неизмененными. По одному из вариантов осуществления в антителе, содержащем вариант аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-21, вариабельная область легкой цепи может содержать аминокислотные остатки 8-104 SEQ ID NO: 4 или 5, и/или в антителе, содержащем вариант аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47, вариабельная область тяжелой цепи может содержать аминокислотные остатки 7-112 SEQ ID NO: 26.
"Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" в отношении полипептидной последовательности, как указано в настоящем описании, определяют как процентную долю аминокислотных остатков в подлежащей сравнению вероятной интересующей последовательности, идентичных аминокислотным остаткам в конкретной полипептидной последовательности, как указано в настоящем описании (например, конкретной полипептидной последовательности, охарактеризованной по SEQ ID NO в списках последовательностей), после выравнивания последовательностей и встраивания пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, не считая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание последовательностей, проводимое для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, можно осуществлять способами, известными в этой области, как описано например в EP 1 241 179 B1, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, включая, в частности, стр. 9 строку 35-стр. 10 строку 40 с используемыми в ней определениями и таблицу 1, касающуюся возможных консервативных замен. Например, специалист в этой области может использовать общедоступное компьютерное программное обеспечение. Способы с использованием компьютерных программ для определения идентичности последовательности включают, в качестве неограничивающих примеров, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). По одному из предпочтительных вариантов осуществления программным обеспечением, используемым для выравнивания, может являться BLAST. Специалист в этой области может определять подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания относительно всей длины последовательностей, подвергаемых сравнению. По предпочтительному варианту осуществления значения % идентичности можно получать с использованием компьютерной программы WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480, включенная в настоящее описание в качестве ссылки), как описано например в EP 1 241 179 B1. По предпочтительному варианту осуществления при выполнении компьютерной программы WU-BLAST-2 используют следующие параметры: Большинство параметров поиска WU-BLAST-2 устанавливают на значения по умолчанию. Настраиваемые параметры устанавливают на следующие значения: промежуток перекрывания = 1, доля перекрывания = 0,125, порог длины фрагмента (T) = 11, и матрица замен = BLOSUM62. Параметры HSP S и HSP S2, являющиеся динамическими значениями, используемыми в BLAST-2, устанавливаются самой программой в зависимости от композиции интересующей последовательности и композиции базы данных, по которой проводят поиск последовательности. Однако для повышения чувствительности параметры можно корректировать. Значение % идентичности последовательностей можно определять, разделяя (a) количество совпадающих идентичных аминокислотных остатков между конкретной аминокислотной последовательности, как указано в настоящем описании, подвергаемой сравнению (например, конкретной полипептидной последовательности, охарактеризованной по SEQ ID NO в списках последовательностей), и вероятной интересующей аминокислотной последовательностью, подлежащей сравнению, например, количество совпадающих идентичных аминокислотных остатков, определяемое с помощью WU-BLAST-2, на (b) общее количество аминокислотных остатков в полипептидной последовательности, как указано в настоящем описании, подвергаемой сравнению (например, конкретной полипептидной последовательности, охарактеризованной по SEQ ID NO в списках последовательностей).
"Процент (%) идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты" в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в настоящем описании, определяют как процентную долю нуклеотидов в вероятной интересующей последовательности, подлежащей сравнению, идентичных нуклеотидам в конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в настоящем описании (например, конкретной полипептидной последовательности, охарактеризованной по SEQ ID NO в списках последовательностей), после выравнивания последовательностей и встраивания пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты можно осуществлять способами, известными в этой области, как описано, например, в EP 1 241 179 B1. Например, специалист в этой области может использовать общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалист в этой области может определять подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания относительно полной длины последовательностей, подвергаемых сравнению. По предпочтительному варианту осуществления значения % идентичности можно получать с использованием компьютерной программы WU-BLAST-2, как описано, например, в EP 1 241 179 B1. По предпочтительному варианту осуществления используют следующую компьютерную программу и параметры: Значения идентичности, используемые в настоящем описании, генерируемые модулем BLASTN в WU-BLAST-2, устанавливают как параметры по умолчанию, при этом промежуток перекрывания и долю перекрывания устанавливают как 1 и 0,125, соответственно. Значение % идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты можно получать, разделяя (a) количество совпадающих идентичных нуклеотидов между конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты, как указано в настоящем описании, подвергаемой сравнению (например, конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты, охарактеризованной по SEQ ID NO в списках последовательностей), и интересующей молекулой нуклеиновой кислоты, подлежащей сравнению, например, количество совпадающих идентичных нуклеотидов, определяемое с помощью WU-BLAST-2, на (b) общее количество нуклеотидных остатков в конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в настоящем описании, подвергаемой сравнению (например, конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, охарактеризованной по SEQ ID NO в списках последовательностей).
В частности, идентичность последовательностей можно определять относительно полной длины соответствующей аминокислотной последовательности, приведенной в одной из SEQ ID NO: 1-49, или относительно полной длины соответствующей нуклеотидной последовательности, приведенной в одной из SEQ ID NO: 50-128.
Термин "положительные результаты" в отношении сравнения последовательностей, как описано выше и в EP 1 241 179 B1, включает остатки в сравниваемых последовательностях, не являющиеся идентичными, но обладающие схожими свойствами (например, в результате консервативных замен). Значение % положительных результатов определяют по доле остатков, получивших положительное значение в матрице BLOSUM 62, разделенной на общее количество остатков в выравниваемой области.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47 и их варианты. Вариант аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47, может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47. Альтернативно, вариант аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47, может являться аминокислотной последовательностью, где не более 8, предпочтительно - не более 5, более предпочтительно - 1 аминокислотный остаток, соответственно, подвергают делеции, инсерции или замене аминокислотным остатком, отличающимся от замененного аминокислотного остатка. В одном из вариантов осуществления замена аминокислоты является консервативной заменой. В частности, антитело против CD26 по настоящему изобретению может являться антителом, где вариабельная область тяжелой цепи может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47 или их вариантов. Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 7-112 SEQ ID NO: 26. В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константные области легкой цепи и тяжелой цепи человека.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может содержать константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48 и ее вариантов. Вариант аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 48, может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 48. Альтернативно, вариант SEQ ID NO: 48 может являться аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 48, где не более 8, предпочтительно - не более 5, более предпочтительно - 1 аминокислотный остаток, соответственно, подвергают делеции, инсерции или замене аминокислотным остатком, отличающимся от замененного аминокислотного остатка. В одном из вариантов осуществления замена аминокислоты является консервативной заменой. В частности, антитело по настоящему изобретению может являться антителом, где константная область легкой цепи может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 48 или ее варианта.
В альтернативном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константные области легкой цепи человека.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49 или ее вариант. Вариант аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 49, может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 49. Альтернативно, вариант SEQ ID NO: 49 может являться аминокислотной последовательностью, где не более 8, предпочтительно - не более 5, более предпочтительно - 1 аминокислотный остаток, соответственно, подвергают делеции, инсерции или замене аминокислотным остатком, отличающимся от замененного аминокислотного остатка. В одном из вариантов осуществления замена аминокислоты является консервативной заменой. В частности, антитело по настоящему изобретению может являться антителом, где цепь CH1-CH2-CH3 может содержать или состоять из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 49 или ее варианта.
В альтернативном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область тяжелой цепи человека.
В частности, антитело по настоящему изобретению может являться антителом класса IgG 2B и может содержать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49 или ее вариант, как определено выше.
Как можно видеть в прилагаемых списках последовательностей, идентифицировали группу последовательностей для вариабельной области тяжелой цепи (VH) и идентифицировали 2 различные группы последовательностей для вариабельной области легкой цепи (VL). Выравнивания последовательностей из каждой группы, демонстрирующие их схожесть, представлены на фиг. 3. Идентифицировали последовательность VL (SEQ ID NO: 4), присутствующую в антителах по настоящему изобретению с высокой частотой, и определяли соответствующую последовательность CL (SEQ ID NO: 48). Идентифицировали последовательность VH, присутствующую с высокой частотой (SEQ ID NO: 26) и определяли соответствующую последовательность CH1-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 49).
Антитело по настоящему изобретению может являться антителом специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или ее вариант и/или аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или ее вариант, и содержащим константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант. Антитело по настоящему изобретению может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26, или ее вариант, и содержащим цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант. Кроме того, антитело по настоящему изобретению может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или ее вариант, и, необязательно, дополнительно содержащим константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант, и, необязательно, дополнительно содержащим цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант, и, необязательно, дополнительно содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26, или ее вариант. В частности, антитело по настоящему изобретению может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или ее вариант, константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант, цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26, или ее вариант. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
В частности, антитело по настоящему изобретению может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 8-104 SEQ ID NO: 4, константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант, цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 7-112 SEQ ID NO: 26. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
В частности, антитело по настоящему изобретению может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или ее вариант, цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 7-112 SEQ ID NO: 22. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Антитело по настоящему изобретению, в частности, может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или их вариантов, и содержащим константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант, и содержащим цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант; необязательно, это антитело, кроме того, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или их вариантов. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Антитело по настоящему изобретению, в частности, может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, или ее варианты, и содержащим константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант, и содержащим цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант; необязательно, это антитело, кроме того, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или их вариантов. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Антитело по настоящему изобретению, в частности, может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, или ее варианты, и содержащим цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант; необязательно, это антитело, кроме того, может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или их вариантов. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Антитело по настоящему изобретению, в частности, может являться антителом, специфически связывающимся с CD26, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26, или ее варианты, и содержащим константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48, или ее вариант, и содержащим цепь CH1-CH2-CH3, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, или ее вариант; необязательно, это антитело, кроме того, может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или их вариантов. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Вариант любой из последовательностей, выбранных из группы последовательностей SEQ ID NO: 1-128, может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности, выбранной из указанной группы последовательностей.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению специфически связывается с CD26 и может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи являются таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи являются таковыми в вариабельной области легкой цепи этого антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, аминокислотные последовательности тяжелой цепи могут являться таковыми в тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, и/или аминокислотные последовательности легкой цепи могут являться таковыми в легкой цепи этого антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, антитело по настоящему изобретению, специфически связывающееся с CD26, может содержать те же последовательности тяжелой цепи и те же последовательности легкой цепи, что и антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Антитело против CD26 по настоящему изобретению (например, антитело, специфически связывающееся с CD26 и содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1, и/или содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3) может являться антителом, где, помимо прочего, аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи могут являться таковыми в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи могут являться таковыми в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Необязательно, аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи может являться таковой в вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Необязательно, аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи может являться таковой в вариабельной области легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может являться химерным антителом, содержащим константную область легкой цепи и/или тяжелой цепи человека.
Термин "гибридомная клеточная линия" также включает потомство гибридомной клеточной линии, является ли потомство идентичным по морфологии или генетическому строению или нет. Т.к. могут происходить конкретные модификации, например, по причине мутации и/или воздействий окружающей среды, такое потомство может не являться идентичным родительской клеточной линии. Предпочтительно, клеточное потомство этой гибридомной клеточной линии будет продуцировать антитело или фрагмент антитела, способный связываться с CD26, особенно с CD26 человека, в частности, будет продуцировать антитело по настоящему изобретению. Кроме того, термин "гибридомная клеточная линия" также может включать смеси гибридомных клеточных линий, продуцирующих смесь антител.
По другому аспекту настоящее изобретение относится к смеси антител. Настоящее изобретение также относится к композиции, в частности, выделенной композиции, содержащей смесь антител. Эта смесь антител может содержать по меньшей мере два различных антитела, которые, предпочтительно, могут специфически связываться с CD26, особенно CD26 человека. Необязательно, в смеси антител может присутствовать по меньшей мере одно антитело, не связывающееся с CD26. По одному из вариантов осуществления по меньшей мере два или все антитела из композиции могут специфически связываться с CD26, особенно CD26 человека. В частности, одно, или несколько или все антитела, присутствующие в смеси антител, могут являться антителами по настоящему изобретению и, необязательно, могут иметь дополнительные характерные черты антител по настоящему изобретению, как описано выше. Эта смесь антител может содержать первое антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, в частности, в SEQ ID NO: 3, и второе антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. Первое антитело и/или второе антитело могут являться антителами по настоящему изобретению и, необязательно, могут иметь одну или несколько дополнительных характерных черт антител по настоящему изобретению, как подробно описано выше. В одном из вариантов осуществления смесь антител содержит или состоит из антител, содержащих вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 VH SEQ ID NO: 133, CDR2 VH SEQ ID NO: 134 и CDR3 VH SEQ ID NO: 1.
По предпочтительному варианту осуществления изобретения смесь антител содержит по меньшей мере одно или содержит или состоит из двух антител, имеющих следующую комбинацию последовательностей (каждое антитело, содержащее одну из последовательностей легкой цепи, указанных ниже, вместе с последовательностью тяжелой цепи, указанной ниже):
Одну из следующих двух различных легких цепей, содержащих
a) Вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4 или вариант SEQ ID NO: 4, в частности, любую из SEQ ID NO: 6-21, вместе с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 48; или
b) Вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 5,
Вместе с тяжелой цепью, содержащей:
Вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 26 или вариант SEQ ID NO: 26, в частности, любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22-25 и SEQ ID NO: 27-47, вместе с константной областью тяжелой цепи (CH1-CH2-CH3), содержащей SEQ ID NO: 49.
В одном из вариантов осуществления смесь антител содержит или состоит из антител, продуцируемых гибридомой, депонируемой как PD 12002. В одном из вариантов осуществления выделенная композиция содержит по меньшей мере одно из антител, продуцируемых гибридомой, депонируемой как PD 12002, в частности, содержит антитела, продуцируемые гибридомой, депонируемой как PD 12002.
В течение многочисленных экспериментов, осуществленных авторами настоящего изобретения, антитела, продуцируемые гибридомой, депонируемой как PD 12002, демонстрировали неожиданно полезные свойства для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и/или профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии.
Депонируемая гибридомная клеточная линия PD 12002 является стабильной при хранении и культивировании, и ее культивировали и проверяли на стабильность и идентичность в течение более чем 5 лет.
in vitro
В другом аспекте изобретение относится к средству (в частности, антителу или его фрагменту), конкурирующему за специфическое связывание с CD26, в частности, с CD26 человека, с антителом в анализе конкурентного связывания (например, в анализе конкурентного связывания ), где антитело является антителом по настоящему изобретению; в частности, это средство может конкурировать за специфическое связывание с CD26, в частности, с CD26 человека, с антителом, которое может содержать
a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3;
b) вариабельную область тяжелой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD12002, и вариабельную область легкой цепи указанного антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD12002. По одному из вариантов осуществления антитело может являться антителом, которое может содержать
a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-47 и их вариантов, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6-21 и их вариантов, или антителом, которое может содержать
in vitro
b) тяжелую цепь и легкую цепь антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD12002. По предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к средству (в частности, антителу или его фрагменту), конкурирующему за специфическое связывание с CD26, в частности, с CD26 человека, в анализе конкурентного связывания (например, в анализе конкурентного связывания ) с антителом, содержащим последовательность вариабельной области тяжелой цепи ID NO: 26 и последовательность вариабельной области легкой цепи ID NO: 4 и/или ID NO: 5. Анализ конкурентного связывания можно использовать для определения того, связываются ли два антитела с одним и тем же эпитопом посредством распознавания идентичных или стерически перекрывающихся эпитопов (Dong et al., 1998). Для идентификации средства, конкурирующего за специфическое связывание с CD26 с антителом по настоящему изобретению, можно использовать любой анализ конкурентного связывания, известный специалисту. Например, можно использовать анализы, в которых антиген CD26 иммобилизуют на многолуночном планшете и измеряют способность немеченого антитела блокировать связывание меченых антител. Общепринятыми метками для таких конкурентных анализов являются радиоактивные метки и ферментные метки.
По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую (a) нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению, или (b) нуклеотидную последовательность, комплементарную (a).
В контексте настоящего изобретения термин "молекула нуклеиновой кислоты" используют, как известно в этой области, и, в частности, он может относиться к двум или более нуклеотидам или аналогам нуклеотидов, соединенным ковалентной связью. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" включает олигонуклеотиды, как правило, содержащие не более приблизительно пятидесяти нуклеотидов, и полинуклеотиды, которые могут иметь, по существу, любую длину. Кроме того, термин "молекула нуклеиновой кислоты" может включать ДНК, такую как кДНК или ген, или РНК. Нуклеотиды, составляющие молекулу нуклеиновой кислоты, например, можно выбирать из группы, содержащей природные дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги нуклеотидов, такие как неприродные синтетические нуклеотиды или модифицированные природные нуклеотиды. Аналоги нуклеотидов известны в этой области и описаны, например, в Lin et al., 1994, Nucl. Acids Res. 22:5220-5234; Jellinek et al., 1995, Biochem. 34:11363-11372; Pagratis et al., 1997, Nature Biotechnol. 15:68-73.
"Выделенное" соединение или композиция, такие как, например, полипептид, антитело, молекула нуклеиновой кислоты, вектор, клетка или их смесь, в частности, могут являться соединением или композицией, находящимися в форме, не обнаруживаемой в природе. Выделенные соединения (например, полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты, антитела, векторы, клетки) или композиции включают соединения или композиции, очищенные до такой степени, что они не могут находиться в форме, в которой их обнаруживают в природе.
Настоящее изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128 и их вариантов. Вариант нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128, может иметь по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 98%, более предпочтительно - по меньшей мере 99% идентичности последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128. Нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-77 или их варианта, может кодировать вариабельную область легкой цепи (VL) или ее секцию. Альтернативно, вариант нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128, может являться нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128, где не более 12, предпочтительно - не более 5, более предпочтительно - не более 1 нуклеотидного остатка, соответственно, подвергают делеции, инсерции или замене нуклеотидным остатком отличающимся от замененного нуклеотидного остатка. Нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 78-126 или их варианта, может кодировать вариабельную область тяжелой цепи (VH) или ее секцию. Нуклеотидная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 127, или ее вариант может кодировать константную область легкой цепи (CL) или ее секцию. Нуклеотидная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 128, или ее вариант может кодировать цепь CH1-CH2-CH3 или ее секцию. По варианту осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая цепь VL, может являться продуктивной реаранжированной последовательностью IGK (локуса каппа-цепи Ig) (соединение в рамке считывания и отсутствие стоп-кодонов). По варианту осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая цепь VH, может являться продуктивной реаранжированной последовательностью IGH (ген тяжелой цепи Ig) (соединение в рамке считывания и отсутствие стоп-кодонов).
Указанные выше варианты молекул нуклеиновой кислоты, например, можно получать посредством "экономного мутагенеза" (Shier, R., et al., 1996, Gene 169: 147) или другими способами случайного или направленного мутагенеза нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению (Marks, J. D., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 16007), осуществляемыми для улучшения некоторых из свойств антител, таких как, например, аффинность, предпочтительно, с одновременным сохранением специфичности связывания с CD26.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно клонировать в векторы, подходящие для их амплификации, дополнительного мутагенеза, или модификации или экспрессии. Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по настоящему изобретению. Предпочтительно, вектор способен эффективно экспрессировать антитело по настоящему изобретению. В частности, вектор нуклеиновой кислоты может содержать первую молекулу нуклеиновой кислоты, ковалентно и функционально связанную со второй молекулой нуклеиновой кислоты таким образом, что хозяин, содержащий вектор, экспрессирует полипептид, кодируемый первой молекулой нуклеиновой кислоты, являющейся молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, в частности, молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50-128 и их вариантов. Эти векторы можно использовать для получения рекомбинантных антител или химерных белков в подходящем хозяине и следующих способов, известных в этой области.
E. coli
B. subtilis
P. pastoris
K. lactis
По предпочтительному на настоящий момент варианту осуществления настоящего изобретения рекомбинантные антитела, предпочтительно, клонируют и экспрессируют в прокариотических клетках или эукариотических клетках-хозяевах: особенно предпочтительными являются , но также можно использовать другие прокариотические клетки, такие как , , , или эукариотические клетки растительного или животного происхождения, в частности, мышиного происхождения.
Другой аспект настоящего изобретения относится к экспрессирующему вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с последовательностью контроля экспрессии.
Термин "вектор", в частности, может относится к молекуле, например, молекуле нуклеиновой кислоты, плазмиде или вирусу, используемому для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина. В частности, "вектор" может являться молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно, самореплицирующейся, с помощью которой можно переносить встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и/или между клетками-хозяевами. Примеры векторов включают, в качестве неограничивающих примеров, вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном, экспрессирующие векторы депротеинизированной ДНК или РНК, экспрессирующие векторы ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомах, плазмиду, такую как, например, замкнутая кольцевая двухцепочечная ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК, космиду или фаговый вектор, вектор, способный к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую встраивают вектор, и экспрессирующие векторы ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими средствами. В частности, вектор можно встраивать в геном клетки-хозяина после встраивания в клетку-хозяина, что делает возможной его последующую репликацию вместе с геномом хозяина. В частности, термин "вектор" включает экспрессирующие векторы. Как применяют в настоящем описании, термин "экспрессирующий вектор", в частности, может относиться к вектору, способному регулировать экспрессию одного или нескольких генов, с которыми функционально связан экспрессирующий вектор. Экспрессирующие векторы, содержащие нуклеотидные последовательности, как представлено в настоящем описании, можно оптимизировать для экспрессии в клетке-хозяине, в частности, посредством инсерции подходящих регуляторных областей, промоторов, терминаторов или активаторов транскрипции или точек начала репликации.
В контексте настоящей заявки "функционально связанными" компонентами, в частности, могут являться компоненты, находящиеся во взаимосвязи, позволяющей компонентам функционировать предполагаемым образом. Последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с кодирующей последовательностью, в частности, можно лигировать таким образом, что достигают экспрессии кодирующей последовательности в условиях, совместимых с одной или несколькими последовательностями контроля экспрессии. Термин "последовательность контроля экспрессии" включает, в качестве неограничивающих примеров, одну или несколько нуклеотидных последовательностей, регулирующих экспрессию нуклеотидной последовательности, с которой функционально связана последовательность контроля экспрессии. Функционально связанные последовательности контроля экспрессии могут включать, в качестве неограничивающих примеров, последовательности контроля экспрессии, являющиеся смежными с интересующим геном, и последовательности контроля экспрессии, действующие в транс-положении или на расстоянии для контроля интересующего гена.
По одному из вариантов осуществления последовательность контроля экспрессии, функционально связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, может контролировать и регулировать транскрипцию и, при необходимости, трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты. Последовательности контроля экспрессии могут включать, в качестве неограничивающих примеров, одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из промоторных последовательностей, энхансерных последовательностей, терминаторов транскрипции, сигнала сплайсинга для интронов, если интроны присутствуют, инициаторного кодона, в частности, впереди гена, кодирующего белок, последовательностей, обеспечивающих правильную трансляцию мРНК, и стоп-кодонов. По одному из вариантов осуществления экспрессирующий вектор, например, может содержать участок начала репликации, промотор и, необязательно, один или несколько генов, делающих возможной фенотипическую селекцию трансформированных клеток.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
В контексте настоящей заявки термин "клетка-хозяин", в частности, может относиться к клетке, подвергнутой трансформации или способной быть трансформированной с использованием последовательности нуклеиновой кислоты. После трансформации клетка-хозяин может экспрессировать выбранный интересующий ген. Термин "клетка-хозяин" не только включает клетку, получаемую после трансформации, но также и потомство клетки, полученной после трансформации, является ли потомство идентичным по морфологии или генетическому строению исходной родительской клетке или нет. Т.к. могут происходить конкретные модификации, например, по причине мутации и/или воздействий окружающей среды, такое потомство может не являться идентичным родительской клетке. Предпочтительно, потомство продуцирует антитело или фрагмент антитела, способный связываться с CD26, особенно CD26 человека. Термин "клетка-хозяин" также может включать смеси клеток-хозяев. В смесях клеток-хозяев клетки-хозяева могут продуцировать одно антитело, или один его фрагмент, или два или более различных антител или их фрагментов.
Антитело по настоящему изобретению может являться антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, или производным указанной гибридомной клеточной линии. В частности, производным гибридомной клеточной линии, депонируемой как PD 12002, является клеточная линия, содержащая полинуклеотид, содержащий последовательность, являющуюся вариантом одной или нескольких из SEQ ID NO: 50-128. Антитело по настоящему изобретению может являться антителом, связывающимся с эпитопом, связываемым антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002. Как применяют в настоящем описании, термин "эпитоп", в частности, может относиться к части антигена, способной быть распознанной и специфически связанной конкретным антителом. Как правило, эпитоп может включать по меньшей мере 3, и чаще - по меньшей мере 4 или от 8 до 10 аминокислот в конкретной пространственной конформации. Т.к. антитело может распознавать антигенный пептид или полипептид в его третичной форме, аминокислоты, составляющие эпитоп, не обязательно должны являться смежными, и в некоторых случаях могут даже не находиться на одной пептидной цепи. В настоящем изобретении пептидный или полипептидный эпитоп, распознаваемый антителами по настоящему изобретению, содержит последовательность по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или от приблизительно 5 до приблизительно 30, от приблизительно 10 до приблизительно 30 или от приблизительно 15 до приблизительно 35 смежных или несмежных аминокислот CD26.
В одном из вариантов осуществления моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению способно связываться с эпитопом CD26, содержащим одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 146-159. В конкретных вариантах осуществления эпитоп может являться эпитопом непрерывного типа или эпитопом прерывистого типа. В одном из вариантов осуществления моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению способно связываться с эпитопом CD26, содержащим одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 146-148, 152, 154, 158 и 159. В одном из вариантов осуществления моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению способно связываться с эпитопом CD26, содержащим аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 146-148, 152, 154, 158 и 159. В другом варианте осуществления моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению способно связываться с эпитопом CD26, содержащим SEQ ID NO: 146. В дополнительном варианте осуществления моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению способно связываться с эпитопом CD26, содержащим SEQ ID NO: 146 и/или больше аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 147, 148, 152, 154 и 159. В конкретном варианте осуществления моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению способно связываться с эпитопом CD26, содержащим SEQ ID NO: 146, 147 и 148; или SEQ ID NO: 146, 147 и 152; или SEQ ID NO: 146 и 147; или SEQ ID NO: 146 и 152.
По другому аспекту авторы настоящего изобретения предоставляют антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002, или производным указанной гибридомной клеточной линии.
Другой аспект настоящего изобретения относится к антителу, связывающемуся с эпитопом, связываемым антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу производства антитела по настоящему изобретению. Этот способ включает этапы:
(i) получения клетки-хозяина по настоящему изобретению, в частности, гибридомной клеточной линии, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002;
(ii) культивирования клетки-хозяина по настоящему изобретению в среде для культивирования; и
(iii) получения антитела из среды;
(iv) необязательно, очистки антитела, например, с помощью фильтрации и/или нанофильтрации.
По одному из вариантов осуществления для получения антитела против иммуногенной мишени, как указано в настоящей заявке, в частности, антитела против CD26, можно использовать трансгенных животных, генетически сконструированных для получения антитела, в частности, антитела человека. Трансгенные животные и антитела, продуцируемые этими трансгенными животными, можно получать, используя известные в этой области способы, в частности, используя стандартные протоколы иммунизации, как описано, например, в US 2010/0196266 A1. Способы получения антител человека из трансгенных животных, в частности, трансгенных мышей, описывают, например, в Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), и Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Неограничивающим примером трансгенного животного, продуцирующего антитела, в частности, антитела человека, является трансгенная мышь, в частности, XenoMouse от Abgenix (Fremont, Calif., USA), как описано, например, в Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23). В трансгенном животном, таком как XenoMouse, гены антитела не относящегося к человеку млекопитающего, подвергнутые генетическому конструированию, например, гены антитела мыши, инактивируют и заменяют функциональными генами антитела человека, в то время как остальная часть иммунной системы не относящегося к человеку млекопитающего, подвергнутого генетическому конструированию, например, иммунной системы мыши, остается интактной.
Антитела человека, продуцируемые трансгенными животными, могут демонстрировать терапевтический потенциал, одновременно сохраняя фармакокинетические свойства нормальных антител человека (Green et al., 1999, выше, US 2010/0196266 A1). Использование системы XenoMouse представлено в настоящей заявке исключительно в качестве примера получения антител. С учетом общих знаний этой области, специалист в этой области также может использовать другое трансгенное животное, в частности, например, трансгенных грызунов, овец, коз или коров, для получения антител по настоящему изобретению, в частности, антител человека.
nd
et al.
et al.
et al.
et al.
Если явно не указано иное, все указанные выше способы являются примерами способов, и можно использовать любой известный способ получения антител или фрагментов антител. Если не указано иначе, для осуществления настоящего изобретения можно использовать общепринятые способы клеточной биологии, органической химии, биохимии, молекулярной биологии, культивирования клеток, микробиологии, химии белка, рекомбинантной ДНК и иммунологии. Такие общепринятые способы описывают, например, в: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 edition (Sambrook , Eds.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, Ed.), 1984; US 4,683,195 (Mullis ); Nucleic Acid Hybridization, (B. D. Hames ), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu ), Academic Press, New York; Transcription and Translation, (B. D. Hames and S. J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, 1986.
Если контекст не указывает на иное, термины в единственном числе должны включать множественное число, и термины во множественном числе должны включать единственное число.
По другому аспекту настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению являются антителами для применения в качестве лекарственного средства. В частности, антитела по настоящему изобретению являются антителами для применения в профилактике и/или лечении реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Кроме того, антитела по настоящему изобретению являются антителами для применения в профилактике и/или лечении апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии. Кроме того, антитело по настоящему изобретению может являться антителом для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Антитело по настоящему изобретению также может являться антителом, предназначенным для применения в профилактике и/или лечении реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и для применения в профилактике и/или лечении апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии, и для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Реакция "трансплантат против хозяина", апластическая анемия и состояние индивидуума до, и/или в течение, и/или после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток считают CD26-опосредованными заболеваниями, нарушениями или состояниями, т.е. заболеваниями, нарушениями или состояниями, которые можно подвергать лечению и/или профилактике посредством введения средств, в частности, одного или нескольких антител, которые могут специфически связываться с CD26, особенно CD26 человека.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к смеси антител по настоящему изобретению, в частности, композиции, особенно выделенной композиции, содержащей смесь антител по настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства. В частности, смесь антител, особенно выделенная композиция, содержащая смесь антител по изобретению, может быть предназначена для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии. В частности, смесь антител может содержать первое антитело по настоящему изобретению, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, в частности, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и второе антитело по настоящему изобретению, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов осуществления смесь антител содержит или состоит из антител, продуцируемых гибридомой, депонируемой как PD 12002. Кроме того, смесь антител может содержать антитело (например, человеческое или гуманизированное антитело) по настоящему изобретению, содержащее все 6 последовательностей CDR антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD12002.
Приобретенная апластическая анемия (AA) является редким состоянием недостаточности костного мозга, отличающимся низкой клеточностью костного мозга и низкими количествами клеток периферической крови [Young N.S. et al., 1997 N Eng J Med 336:1365-1372]. Аналогично другим аутоиммунным заболеваниям, антиген-специфичные T-клетки могут распространяться за пределы костного мозга пациентов с AA и, вероятно, опосредовать органо-специфичную цитотоксичность по отношению к гемопоэтическим стволовым клеткам и клеткам-предшественникам [Nakao S. et al., Blood 1997, 89:3691-3699].
+
Дифференциально экспрессируемые гены, обнаруживаемые исключительно в инфильтрующих BM T-клетках, классифицировали на несколько функциональных категорий. Эти дифференциально экспрессируемые гены включают молекулы, участвующие в иммунных ответах, такие PF-4, CD26, Ncf-1, CCR2 и другие рецепторы хемокинов и лиганды. Кроме того, полагают, что AA является результатом аутоагрессивной деструкции гемопоэтических стволовых клеток и предшественников, опосредуемой T-клетками, распознающими провоцирующие антигены-мишени [Young N.S. et al., 1997, выше]. Несколько групп определило клональную экспансию T-клеток [Zeng W. et al., Blood 1999, 93(9):3008-3016; Zeng W. et al., J Clin Invest 2001, 108(5)765-773; Risitano A.M. et al., Blood 2002, 100(1): 178-183], продукцию провоспалительных цитокинов [Maciejewski J. P. et al., Blood 1995, 85:3183-3190] и опосредуемую T-клетками цитотоксичность по отношению к CD34 стволовым клеткам [Nakao S. et al., 1997, выше; Maciejewski J. P., Selleri C, Sato T. et al., Br J Haematol 1995, 91:245-252], подтверждая запускаемый антигенами T-клеточный ответ. Регуляция 483 генов также показывает, что недостаточность костного мозга, вероятно, является результатом сложной генетической программы, включающей хемокины, цитокины, факторы роста и их рецепторы. Franzke с соавт. определили индукцию нескольких молекул, играющих ключевые роли в регуляции Th1-иммунных ответов [Anke Franzke et al., BMC Genomics 2006, 7:263], таких как CCR2 и CX3CR1 [Charo I.F. et al., Microcirculation 2003, 10(3-4):259-264; Fraticelli P. et al., J Clin Invest 2001, 107(9):1173-1181], также являющихся важными в других аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз [Lock C. et al., Nat Med 2002, 8(5):500-508; Jee Y. et al., J Neuroimmunol 2002, 128(1-2):49-57], и CD26, поверхностно-связанной эктопептидазы, экспрессируемой в больших количествах на Th1-дифференцированных T-клетках [Dang N.H. et al., Histol Histopathol 2002, 17(4):1213-1226; Willheim M. et al., J Allergy Clin Immunol 1997, 100:348-255].
Не желая быть связанными какой-либо теорией, в настоящее время считают, что антитело по настоящему изобретению, способное связываться с CD26, в частности, способное специфически связываться с CD26, особенно с CD26 человека, может играть ключевую роль в иммунопатогенезе AA и восстановлении гемопоэза после иммуносупрессии.
Таким образом, моноклональное антитело против антигена CD26 можно использовать для лечения апластической анемии (в частности, врожденной или приобретенной апластической анемии), особенно, тяжелой апластической анемии.
Как применяют в настоящей заявке, термины "лечение" и "профилактика", в частности, могут относиться к любому типу лечения или профилактики, приносящему пользу индивидууму, страдающему заболеванием, нарушением или состоянием или имеющему риск развития заболевания, нарушения или состояния, в частности, по меньшей мере, одного из реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD) и апластической анемии. Кроме того, термины "лечение" и "профилактика" также могут относиться к любому типу лечения или профилактики, приносящему пользу индивидууму в отношении приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Польза, приносимая лечением или профилактикой, может являться пользой привнесения улучшения в состояние индивидуума (например, одного или нескольких симптомов), пользой осуществления задержки прогрессирования заболевания, нарушения или состояния, подлежащего лечению и/или профилактике, пользой осуществления задержки дебюта одного или нескольких симптомов, пользой облегчения заболевания, нарушения или состояния, подлежащего лечению и/или профилактике, и/или пользой замедления прогрессирования симптомов и т.д. Кроме того, как применяют в настоящей заявке, термины "лечение" и "профилактика" не обязательно означают излечение или полное устранение симптомов.
Термин "реакция "трансплантат против хозяина"" включает острую и/или хроническую реакцию "трансплантат против хозяина", в частности, реакцию "трансплантат против хозяина" после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Термин "апластическая анемия" включает приобретенную и врожденную апластическую анемию, а также тяжелую апластическую анемию.
Применение антитела по настоящему изобретению может обеспечивать лечение и/или профилактику у людей, в частности, в медицинских целях, и животных, в частности, в ветеринарных целях и целях скрининга и разработки лекарственных средств. Подходящие животные включают млекопитающих, таких как, например, кролики, приматы, бычьи и т.д. Люди являются наиболее предпочтительными. Люди включают новорожденных, детей, подростков и взрослых. Термины "пациент" и "индивидуум" в настоящем описании используют взаимозаменяемо. Как применяют в настоящем описании, термин "пациент" может относиться к людям, но не ограничен людьми.
По другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению (например, одно антитело, или два или более, или три или более антител по настоящему изобретению), или смесь антител, содержащую по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, или выделенную композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, и, необязательно, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может содержать антитело (например, человеческое или гуманизированное антитело), содержащее 6 последовательностей CDR антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может содержать антитело (например, химерное антитело), содержащее области VH и VL антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция может содержать смесь антител, содержащую первое антитело по настоящему изобретению, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, в частности, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и второе антитело по настоящему изобретению, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. Первое и второе антитело могут являться различными антителами, в частности, второе антитело может иметь аминокислотную последовательность, где по меньшей мере один аминокислотный остаток подвергают делеции, инсерции или замене другим аминокислотным остатком по сравнению с аминокислотной последовательностью первого антитела. Фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, например, антитело по настоящему изобретению, или смесь антител, или выделенную композицию по настоящему изобретению в качестве эффективного ингредиента. В частности, фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина", предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве, эффективном для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, является фармацевтической композицией для применения в качестве лекарственного средства. В частности, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, является фармацевтической композицией для применения в стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в профилактике и/или лечении реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или для применения в лечении и/или профилактике апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, необязательно, может содержать один или несколько эксципиентов, предпочтительно - фармацевтически приемлемых эксципиентов, в частности, один или несколько дилюентов, предпочтительно - фармацевтически приемлемых дилюентов. Специалист в этой области может выбирать подходящие эксципиенты, в частности, фармацевтически приемлемые эксципиенты, с учетом общего знания этой области и с учетом описания, приведенного в настоящей заявке. Дилюент может являться, например, фармацевтически приемлемым растворителем или смесью фармацевтически приемлемых растворителей, таким как, например, вода. Примеры подходящих эксципиентов, в частности, дилюентов, хорошо известны в этой области, и их можно выбирать, например, из группы, содержащей жидкости, содержащие фармацевтически приемлемую буферную систему, в частности, растворы, содержащие фармацевтически приемлемую буферную систему, например, растворы фосфатно-солевого буфера, воду, физиологический раствор, эмульсии, такие как эмульсии "масло-в-воде", один или несколько увлажнителей, стерильные растворы и т.д. Фармацевтическая композиция также может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
2
4
4
По одному из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, такое по меньшей мере одно, например, моноклональное, или, например, мышиное, или например, моноклональное и мышиное антитело против CD26 по настоящему изобретению, и воду и фосфатный буфер, предпочтительно - буфер, содержащий Μ'HΡΟ и Μ''Μ'''HΡO, где M', M'' и M''' можно независимо выбирать из группы, состоящей из Na и K. Эта фармацевтическая композиция, необязательно, может содержать один или несколько из NaCl, KCl и смесей, содержащих NaCl и KCl. По меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению может содержать или состоять из антител, продуцируемых гибридомой, депонируемая как PD 12002, или по меньшей мере одно из антител. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для внутривенного введения, в частности, внутривенной инъекции или внутривенной инфузии. В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать или состоят из антител, продуцируемых гибридомой, депонируемой как PD 12002, и DPBS.
По одному из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, например, моноклональное антитело против CD26 по настоящему изобретению, в частности, антитела, продуцируемые гибридомой, депонируемой как PD 12002, или по меньшей мере одно из антител. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, например, антитела, продуцируемые гибридомой, депонируемой как PD 12002, или по меньшей мере одно из антител, один или несколько кортикостероидов, одно или несколько антигистаминных средств и физиологический раствор (особенно физиологический раствор, содержащий приблизительно 0,9% масс./об. NaCl). В частности, эти водные фармацевтические композиции можно вводить посредством инфузии, особенно - медленной инфузии, в частности, посредством внутривенного введения.
В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по изобретению содержит антитело по изобретению в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 10 мг/мл, от 1 мг/мл до 50 мг/мл, от 1 мг/мл до 100 мг/мл, от 10 мг/мл до 100 мг/мл или от 50 мг/мл до 100 мг/мл. В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция по изобретению может содержать по меньшей мере приблизительно 1 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 1 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 5 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 20 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 30 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 40 мг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 мг/мл или по меньшей мере приблизительно 100 мг/мл антитела по изобретению.
2
2
2
2
В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении и/или профилактике реакции "трансплантат против хозяина" или могут содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении и/или профилактике апластической анемии. Кроме того, по одному из вариантов осуществления фармацевтические композиции могут содержать предпочтительные в настоящее время диапазоны количеств и количества по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, как представлено в настоящем описании.
Как применяют в настоящем описании, с помощью термина "фармацевтически приемлемый", в частности, могут указывать, что "фармацевтически приемлемое" соединение или "фармацевтически приемлемая" композиция подходят для введения индивидууму для достижения лечения и/или профилактики заболевания, нарушения или состояния, в частности, по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии, или для достижения стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, без чрезмерно вредных побочных эффектов в отношении тяжести заболевания и потребности в лечении.
Как применяют в настоящем описании, с помощью термина "эффективное количество", в частности, могут указывать количество по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, например, антитела или смеси антител, достаточное для достижения желаемого эффекта у пациента, страдающего заболеванием, нарушением или состоянием, в частности, по меньшей мере одним из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии, или для достижения желаемого эффекта у пациента в отношении приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, включая улучшение состояния пациента (например, одного или нескольких симптомов), задержку прогрессирования заболевания и т.д. Эффективное количество антитела, представленного в настоящем описании, в частности, может являться количеством, достаточным для облегчения, реверсирования, стабилизации, замедления и/или задержки прогрессирования реакции "трансплантат против хозяина" и/или апластической анемии. Как известно в этой области, эффективное количество, например, антитела по настоящему изобретению, может варьироваться, помимо прочего, в зависимости от анамнеза пациента, введения в целях профилактики или лечения, целевого назначения (реакции "трансплантат против хозяина", апластической анемии и т.д.), а также других факторов, таких как тип (и/или доза) антитела.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может находиться в твердой или жидкой форме и, помимо прочего, может находиться в форме одного или нескольких порошков, одной или нескольких таблеток, одной или нескольких жидкостей, в частности, одного или нескольких растворов, или одного или нескольких аэрозолей. Фармацевтическая композиция по изобретению также может содержать одно или несколько дополнительных биологически активных средств, таких как, например, активные средства для применения в лечении и/или профилактике по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии или активные средства для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению может являться, например, введением, выбранным из группы, состоящей из интраперитонеального, внутривенного, парентерального, интраренального, подкожного, местного, внутрибронхиального, внутрилегочного и интраназального введения и, при желании в случае местного введения, введения в поврежденные ткани. Парентеральное введение может являться, например, интраперитонеальным, внутрикожным, внутримышечным, подкожным, внутривенным или интраартериальным введением. Композиции по изобретению также можно вводить непосредственно в целевой участок, например, посредством биолистической доставки в целевой участок, такой как конкретный орган, пораженный заболеванием, нарушением или состоянием, в частности, реакцией "трансплантат против хозяина".
В частности, указанное введение можно осуществлять посредством инъекции, и/или инфузии, и/или доставки, такой как, например, внутривенная или интраперитонеальная инъекция или инфузия. Фармацевтическая композиция может находиться в форме инъецируемой лекарственной формы или лекарственной формы для введения посредством инфузии, в частности, в форме инъецируемой лекарственной формы для внутривенной или интраперитонеальной инъекции или лекарственной формы для инфузии для внутривенного или интраперитонеального введения.
Фармацевтическая композиция, в частности, фармацевтическая композиция в форме инъецируемой лекарственной формы, может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых растворителей, таких как, например, вода, и/или может находиться в форме жидкости, например, в форме суспензии, эмульсии или раствора.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может содержать консерванты и другие добавки, такие как, например, консерванты и другие добавки, выбранные из группы, состоящей из противомикробных средств, антиоксидантов, хелатирующих средств, активных средств для применения в лечении и/или профилактике по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии или активных средств для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и инертных газов и т.п., и/или белковых носителей, таких как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, в частности, человеческого происхождения.
2
2
2
2
2
2
2
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить индивидууму в подходящей дозе. Режим дозирования может определять, например, лечащий врач. Как хорошо известно в этой области, дозы для пациента могут зависеть от многих факторов, таких как размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, масса тела, введение в целях профилактики или лечения, целевое назначение (реакция "трансплантат против хозяина", апластическая анемия и т.д.), конкретное соединение, подлежащее введению, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. По одному из вариантов осуществления по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению (например одно, или два, или три или более антител по настоящему изобретению), в частности, для применения в лечении и/или профилактике реакции "трансплантат против хозяина", можно вводить пациенту в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки, в частности, в количестве от 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки. В частности, пациенту можно вводить количество приблизительно 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки, или количество приблизительно 3 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки, или количество приблизительно 4,5 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки. По меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению может находиться в фармацевтической композиции в указанных выше количествах. Как применяют в настоящем описании, термин "по меньшей мере одно антитело" включает одно антитело или два или более (например, три или более) антител.
По одному из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может являться фармацевтической композицией, содержащей смесь антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, и необязательно, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
По одному из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может содержать антитела, продуцируемые гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, в частности, для применения в лечении и/или профилактике реакции "трансплантат против хозяина", для введения пациенту в количестве от 1 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки, в частности, в количестве от 2 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки. По одному из вариантов осуществления пациенту можно вводить количество приблизительно 2 мг указанной смеси антител/м площади поверхности тела в сутки, или количество приблизительно 3 мг указанной смеси антител/м площади поверхности тела в сутки, или количество приблизительно 4,5 мг указанной смеси антител/м площади поверхности тела в сутки. Количества 2, 3 или 4,5 мг смеси антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002/м площади поверхности тела в сутки успешно использовали в клинических условиях. По дополнительному варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция для введения пациентам содержит антитело в количестве от 0,1 до 10 мг/м площади поверхности тела в сутки.
По одному из вариантов осуществления введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению является внутривенным введением, например, внутривенной инфузией или внутривенной инъекцией. Необязательно, дополнительно, пациенту можно вводить по меньшей мере одно иммуносупрессирующее лекарственное средство, например, по меньшей мере, одно иммуносупрессирующее лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из кортикостероидов и циклоспорина (в частности, циклоспорина A), вместе с антителом или раздельно.
2
1/2
2
0,725
0,425
Площадь поверхности тела (BSA) можно вычислять любым известным способом. Например, площадь поверхности тела (BSA) пациента можно вычислять по формуле Мостеллера: BSA (м) = ([рост (см) × вес (кг)]/3600) (Mosteller R D., N Engl J Med 1987 Oct. 22; 317(17):1098, включенная в настоящее описание в качестве ссылки), или по формуле Дюбуа и Дюбуа: BSA (м) = 0,20247 × рост (м) × вес (кг) (DuBois D; DuBois E F., Arch Int Med 1916 17:863-71, включенная в настоящее описание в качестве ссылки). По предпочтительному варианту осуществления для вычисления площади поверхности тела (BSA) пациента используют формулу Мостеллера.
2
2
2
Фармацевтическая композиция для применения в лечении апластической анемии может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению и, необязательно, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. Указанное по меньшей мере одно антитело (например, одно, или два или более антител) по настоящему изобретению можно вводить пациенту в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки, в частности, в количестве приблизительно 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении апластической анемии. По меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению может находиться в фармацевтической композиции в указанных выше количествах или диапазонах количеств. В частности, фармацевтические композиции можно вводить посредством внутривенного введения, например, инфузии или инъекции. Необязательно, дополнительно, пациенту можно вводить по меньшей мере одно иммуносупрессирующее лекарственное средство, в частности, циклоспорин A, вместе с по меньшей мере одним антителом, или раздельно. По одному из вариантов осуществления фармацевтическая композиция для применения в лечении апластической анемии может содержать смесь антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, и, необязательно, по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
2
2
2
По одному из вариантов осуществления смесь антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, для применения в лечении апластической анемии можно вводить пациенту в количестве от 1 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки до 2 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки, в частности, в количестве приблизительно 2 мг указанной смеси антител (продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002)/м площади поверхности тела в сутки.
Кроме того, можно вводить дозы антитела по настоящему изобретению меньше или больше указанных выше примеров диапазонов, например, для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии или для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, особенно, учитывая указанные выше факторы. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно составлять как композицию кратковременного действия, быстрого действия, длительного действия или замедленного действия.
Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать дополнительные биологически активные средства в зависимости от предполагаемого применения фармацевтической композиции.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одно иммуносупрессирующее лекарственное средство, в частности, эффективное количество по меньшей мере одного иммуносупрессирующего лекарственного средства. Иммуносупрессирующее лекарственное средство может являться, например, по меньшей мере одним лекарственным средством, выбранным из группы, состоящей из кортикостероидов, в частности, 6-метилпреднизолона, и циклоспорина, в частности, циклоспорина A. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать комбинацию терапевтических средств, где второй активный ингредиент не включают в ту же композицию, что и антитело против CD26.
2
2
2
2
В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению (например, для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного из реакции "трансплантат против хозяина" и апластической анемии или для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток), содержащая по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, в частности, смесь антител по настоящему изобретению, может содержать один или несколько кортикостероидов, одно или несколько антигистаминных средств, воду и хлорид натрия. В частности, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или несколько кортикостероидов, одно или несколько антигистаминных средств и физиологический раствор (особенно физиологический раствор, содержащий приблизительно 0,9% масс./об. NaCl). В частности, эти водные фармацевтические композиции можно вводить посредством инфузии, особенно - медленной инфузии, в частности, посредством внутривенного введения. По меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, в частности, антитела, продуцируемые гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, один или несколько кортикостероидов и одно или несколько антигистаминных средств, каждое в отдельности или в комбинации, предпочтительно, могут присутствовать в терапевтически эффективном количестве. В частности, фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении и/или профилактике реакции "трансплантат против хозяина" или может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении и/или профилактике апластической анемии. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать предпочтительные в настоящее время диапазоны количеств и количества по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, в частности, смеси антител, как представлено в настоящем описании. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать комбинацию терапевтических средств, где второй активный ингредиент не включают в ту же композицию, что и антитело против CD26.
Кортикостероиды хорошо известны в этой области и могут включать, в частности, минералкортикоиды и глюкокортикоиды. Глюкокортикоиды могут являться противовоспалительными средствами. Как применяют в настоящем описании, термин "кортикостероиды" может включать стероиды, которые, в частности, могут продуцироваться в надпочечниках позвоночных, а также может включать синтетические кортикостероиды или синтетические или природные аналоги кортикостероидов, включая соединения, имитирующие активность природных стероидных гормонов, таких как, например, кортизон и гидрокортизон. Аналоги кортикостероидов, в частности, могут включать синтетические или природные химические соединения, похожие по структуре и/или функции на любой из природных стероидов, вырабатываемых надпочечниками.
Один или несколько кортикостероидов можно выбирать из группы, состоящей из дипропионата алклометазона, амцинонида, амцинафела, амцинафида, беклометазона, бетаметазона, дипропионата бетаметазона, валерата бетаметазона, пропионата клобетазона, хлорпреднизона, клокортелона, кортизола, кортизона, кортодоксона, диацетата дифлуорозона, десцинолона, дезонида, дефлупредната, дигидроксикортизона, дезоксиметазона, дексаметазона, дефлазакорта, дифлоразона, диацетата дифлоразона, дихлоризона, сложных эфиров бетаметазона, флуазакорта, флуцетонида, флуклоронида, флудротизона, фторкортизона, флуметазона, флунихолида, флуоцинонида, флуоцинолона, ацетонида флуоцинолона, флукортолона, флуперолона, флупреднизолона, ацетонида фторадренолона, ацетонида флуоцинолона, флурандренолида, флуорометолона, пропионата флутиказона, гидрокортизона, бутирата гидрокортизона, валерата гидрокортизона, гидрокортамата, лотепреднола, медризона, мепреднизона, метилпреднизона, метилпреднизолона, 6-метилпреднизолона, мометазона фуроата, параметазона, ацетата параметазона, преднизона, преднизолона, преднидона, предникарбата, ацетонида триамцинолона, триамцинолона гексакатонида, тиксокортола преднизолона и триамцинолона, их фармацевтически приемлемых солей, их производных и их смесей.
1
Антигистаминные средства известны в этой области и, в частности, могут являться фармацевтическими лекарственными средствами, которые могут снижать или противодействовать действию гистамина. В частности, антигистаминное средство может являться антагонистом H-рецепторов.
Одно или несколько антигистаминных лекарственных средств, в частности, можно выбирать из группы, состоящей из астемизола, азеластина, буклизина, бромфенирамина, хлорфенирамина, цетиризина, клемастина, циклизина, дезлоратадина, дексбромфенирамина, дифенгидрамина, доксиламина, эбастина, эмедастина, эпинастина, фексофенадина, гидроксизина, кетотифена, левокабастина, левоцетиризина, лоратадина, меквитазина, мизоластина, олопатадина, оксатомида, фениндамина, фенирамина, пириламина, терфенидина, трипролидина, их фармацевтически приемлемых солей, изомеров или пролекарств.
2
2
2
2
По другому аспекту настоящее изобретение относится к набору, содержащему: (i) по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, в частности, смесь антител по изобретению или композицию, содержащую смесь антител по настоящему изобретению; и, дополнительно, (ii) a) по меньшей мере одно иммуносупрессирующее лекарственное средство, например, по меньшей мере одно иммуносупрессирующее лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из кортикостероидов и циклоспорина, в частности, циклоспорина A, или b) по меньшей мере один кортикостероид и по меньшей мере одно антигистаминное средство. По меньшей мере одно антитело может содержать или состоять из антител, продуцируемых гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002. В частности, набор может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 4,5 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении и/или профилактики реакции "трансплантат против хозяина" или может содержать по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению в количестве от 1 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки до 2 мг указанного по меньшей мере одного антитела/м площади поверхности тела в сутки для применения в лечении и/или профилактике апластической анемии. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать предпочтительные в настоящее время диапазоны количеств и количества по меньшей мере одного антитела по настоящему изобретению, как представлено в настоящем описании.
Набор может являться набором для применения в качестве лекарственного средства, в частности, набором для профилактики и/или лечения реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD), предпочтительно, после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и/или набором для применения в лечении апластической анемии, предпочтительно, тяжелой апластической анемии, и/или набором для стимуляции приживления трансплантата после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Термины "составной набор" и "набор" в настоящем описании используют взаимозаменяемо.
in vivo
in vitro
Получение антител по изобретению  и  в трансгенных животных, полученных посредством генетических манипуляций из не относящихся к человеку животных, в частности, не относящихся к человеку млекопитающих, с использованием по меньшей мере одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в настоящем изобретении, способами, известными специалисту в этой области, также входит в объем настоящего изобретения.
Далее настоящее изобретение более подробно описывают со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Определение нуклеотидных последовательностей
Этот способ можно представить в виде трех фаз:
Фаза I - Клонирование генов, кодирующих цепи антитела
- Выделение тотальной РНК из гибридомных клеток, продуцирующих CDina26 (гибридомной клеточной линии, депонируемой как PD 12002, см. выше);
- Обратная транскрипция;
- Амплификация интересующего гена с использованием специфичных олигонуклеотидов в качестве праймеров;
- Клонирование гена с использованием прокариотического вектора;
- Трансформация бактерий;
- Контроль клонирования, селекция подходящих трансформированных клонов.
Фаза II - Секвенирование генов, кодирующих вариабельные области цепей антитела, и биоинформатический анализ:
- Выбор и секвенирование 100 колоний на цепи VH и VL;
- Биоинформатический анализ последовательностей;
- Получение консенсусной последовательности, при необходимости, для цепей VL и VH и определение различающихся оснований в консенсусной последовательности и их процентной доли.
Фаза III - Секвенирование генов, кодирующих константные области цепей антитела:
- Секвенирование соответствующей цепи CL для цепи VL;
- Секвенирование соответствующей цепи CH1-CH2-CH3 для цепи VH.
Результаты показали наличие в образцах мРНК трех групп последовательностей цепи VL (VL группы 1, VL группы 2 и VL группы 3) и двух групп последовательностей цепей VH (VH группы 1 и VH группы 2).
Определение аминокислотной последовательности
Для подтверждения аминокислотной последовательности, присутствующей в образце CDina26, использовали масс-спектрометрический анализ и N-концевое секвенирование. В образце CDina26 подтверждали наличие VL группы 1 и соответствующей ей последовательности CL, цепи VL группы 3 и VH группы 1, соответствующей ее цепи CH1-CH2-CH3. В образце антитела CDina26 в качестве аминокислотных последовательностей не определяли ни последовательности VL группы 2, ни последовательности VH группы 2.
Пример 2
Связывание CDina26 с CD26 человека и свиньи
Связывание CDina26 с CD26 человека сравнивали с его связыванием с CD26 карликовой свиньи с помощью анализа Biacore и проточной цитометрии с мультипараметрической оценкой. CDina26 не способно распознавать антиген свиньи ни как растворимый белок, ни как трансмембранный белок, экспрессирующийся на T-лимфоцитах.
1. Для определения способности CDina26 связываться с CD26, экспрессирующимся на поверхности клетки, использовали анализ с помощью проточной цитометрии.
Лимфоциты выделяли из образцов периферической крови человека или карликовой свиньи посредством центрифугирования в градиенте плотности. Связывание CDina26 с T-лимфоцитами человека анализировали с помощью проточной цитометрии с мультипараметрической оценкой.
Более 45% T-лимфоцитов человека, экспрессирующих маркер CD3, связывались с CDina26. В отличие от этого, только 2% T-лимфоцитов свиньи, экспрессирующих маркер CD3, связывались с CDina26. Это показано на фиг. 9.
2. Связывание CDina26 с антигеном человека или свиньи (приобретенных в Sigma, кат. №№ D4943 и D 7052) анализировали с помощью анализа Biacore.
CDina26 фиксировали на матрице с помощью поликлонального антитела Ig против мыши, предварительно иммобилизованного на проточной кювете сенсорного чипа Biacore T100. Антигены человека или свиньи инъецировали в раствор поверх фиксированного CDina26.
-5
-1
В случае антигена человека, инъецированного в двух концентрациях поверх фиксированного CDina26, определяли дозозависимый ответ с высокой аффинностью связывания, о чем свидетельствует кинетическая скорость диссоциации 2,8×10 с.
В случае антигена свиньи, инъецированного поверх фиксированного CDina26, не определяли связывание.
На фиг. 11 показано связывание антигена (Ag) человека (слева) и свиньи (справа) фиксированными CDina26, измеряемое в резонансных единицах (RU) Biacore.
Пример 3
Получение антител
CDina26 продуцируется гибридомной клеточной линией, депонируемой в CBA-ICLC Генуи (Италия) как PD 12002. Гибридомы можно культивировать в бессывороточной среде. CDina26 содержит смесь мышиных антител. В частности, CDina26 содержит мышиное моноклональное антитело, принадлежащее к классу IgG 2B и специфически связывающееся с CD26 человека.
Фармацевтическая композиция, содержащая CDina26, находится в форме прозрачного бесцветного раствора, содержащего CDina26, который можно использовать для внутривенной инфузии (например, 1 мг CDina26/1 мл раствора; раствор можно хранить в сосуде).
Пример 4
in vitro
Исследование фармакодинамики
in vitro
Исследования фармакодинамики  осуществляли для определения свойств мышиного моноклонального антитела против CD26, в частности, для определения свойств антител, продуцируемых гибридомной клеточной линии, депонируемой как PD 12002, обозначаемых в настоящем описании как CDina26.
Целью этих исследований являлась оценка экспрессии и специфического связывания с CD26 на поверхности популяции клеток, участвующих в иммунном ответе, в частности:
- T-лимфоцитов
- B лимфоцитов
- NK-клеток (естественных киллеров)
- Моноцитов
- Дендритных клеток
Пример 4a
CDina26
Candida albicans
0
Экспрессию антигена для  оценивали в покоящихся T-, B- и NK-клетках (T), выделенных из 5 здоровых доноров (соответствующих "ESP.1"-"ESP.5" в таблице 1), а затем в клетках, активированных аллогенными стимулами (смешанной культурой лимфоцитов (MLC)), митогенными стимулами (фитогемагглютинином (PHA)) или антигенными стимулами ().
В настоящей заявке сокращение MFIR используют для обозначения относительной интенсивности флуоресценции, как известно в этой области.
Таблица 1
Оценка процентной доли CDina26<sup>+</sup> клеток и индекса MFIR в субпопуляциях лимфоцитов здоровых доноров до и после митогенных стимулов с использованием PHA.В колонках, обозначенных как "% CD26" и "MFIR", соответственно, первое значение соответствует T0, второе значение после стрелки соответствует стимулированным клеткам: A, повышение значения или процентной доли экспрессии (MFIR) D, снижение значения или процентной доли экспрессии (MFIR)T0 является сокращением для времени 0, т.е. для момента времени, предшествующего стимуляции клеток.
<img file="00000001.jpg" he="142" wi="142" img-content="undefined" img-format="jpg" />
+
+
+
+
+
Как видно из таблицы 1, в случае экспрессии CD26 на активированных лимфоцитах наблюдали повышенную процентную долю CD26клеток после стимуляции PHA по сравнению с T0, за исключением CD3CD4 T-клеток и CD3CD8 T-клеток в эксперименте № 1 ("ESP 1"). Уровень экспрессии (значения индекса MFRI) варьировался среди различных субпопуляций T-, B- и NK-клеток и у 5 здоровых доноров.
Кроме того, митогенные стимулы, по-видимому, умеренно повышали значения MFIR (таблица 1).
Пример 4b
+
+
Анализ результатов, представленных в таблице 2, показал, что во всех анализируемых субпопуляциях, за исключением субпопуляций CD3 CD4 T-клеток всех здоровых доноров, повышалась процентная доля лимфоцитов, экспрессирующих антиген для CDina26 после антигенных стимулов.
Candida,
+
+
+
+
Во всех экспериментах, за исключением("ESP. 5"), наблюдали повышение значений MFIR. Также можно отметить, что повышение значений MFIR по сравнению со временем 0 являлось более высоким в культурах, стимулированных  чем стимулированных PHA. Стимуляция антигеном Candida значительно повышала экспрессию молекулы CD26 на мембране клеток, особенно в субпопуляциях CD3 CD16 T-клеток и CD56 CD3 T-клеток.
Таблица 2
Оценка процентной доли CDina26<sup>+</sup> клеток и индекса MFIR в субпопуляциях лимфоцитов здоровых доноров до и после антигенных стимулов с использованием <i>Candida albicans</i>. В колонках, обозначенных как "% CD26" и "MFIR", соответственно, первое значение соответствует T0, второе значение после стрелки соответствует стимулированным клеткам: A, повышение значения или процентной доли экспрессии (<u>MFIR</u>) D, снижение значения или процентной доли экспрессии (<u>MFIR</u>)
<img file="00000002.jpg" he="143" wi="145" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Пример 4c
+
+
В таблице 3 показано, что во всех экспериментах процентная доля лимфоцитов, положительных по антигену для CDina26, повышалась во всех присутствующих субпопуляциях лимфоцитов после стимуляции с использованием смешанной культуры лимфоцитов, за исключением субпопуляции CD3 CD4 T-клеток.
Таблица 3
Оценка процентной доли CDina26<sup>+</sup> клеток и индекса MFIR в субпопуляциях лимфоцитов здоровых доноров до и после аллогенных стимулов с использованием MLC (смешанной культуры лимфоцитов).В колонках, обозначенных как "% CD26" и "<u>MFIR</u>", соответственно, первое значение соответствует T0, второе значение после стрелки соответствует стимулированным клеткам:A, повышение значения или процентной доли экспрессии (<u>MFIR</u>)D, снижение значения или процентной доли экспрессии (<u>MFIR</u>)
<img file="00000003.jpg" he="150" wi="159" img-content="undefined" img-format="jpg" />
+
+
Индекс MFIR повышался после стимуляции по сравнению со временем 0 во всех субпопуляциях и во всех экспериментах, за исключением субпопуляции CD4 CD3 T-клеток в экспериментах № 2 ("ESP.2") и № 5 ("ESP.5").
Candida
+
+
+
+
Аналогично стимуляции с использованием , аллогенная стимуляция непрерывно повышала экспрессию антигена для CDina26 и индекс MFIR в большинстве субпопуляций лимфоцитов. Наблюдали значимое повышение, в основном, в субпопуляциях CD16 CD3 T-клеток и CD56 CD3 T-клеток в эксперименте №3 ("ESP.3").
Пример 4d
В конечном итоге, экспрессию антигена для CDina26 исследовали в субпопуляциях лейкоцитов у пациентов после аллогенной HSCT. В частности, двух пациентов оценивали в течение ранних тестов для мониторинга восстановления иммунной системы после трансплантации, в то время как для четырех пациентов, у которых развивалась острая GvHD, можно было осуществлять оценку при дебюте GvHD и после разрешения. По сравнению с контролями, пациенты демонстрировали крайне вариабельное распределение субпопуляций T-, NK- и B-клеток (таблица 4), соответствующее процессу восстановления гемопоэза, происходящему в течение месяцев после трансплантации.
Таблица 4
Распределение (измеряемое как %) субпопуляций лимфоцитов у 6 пациентов, подвергнутых HSCT, оцениваемое во время восстановления иммунной системы и сравниваемое с диапазоном, полученным при оценке 5 здоровых доноров.
<img file="00000004.jpg" he="94" wi="122" img-content="undefined" img-format="jpg" />
*На момент оценки у пациентов развивалась острая GvHD степени II.
+
+
+
+
При анализе процентной доли CD26 (таблица 5) у всех пациентов наблюдали повышение экспрессии этой молекулы в субпопуляциях CD16 CD3 T-клеток, CD56 CD3 T-клеток и NK-клеток по сравнению с контрольным диапазоном.
Таблица 5
Распределение (измеряемое как %) CDina26<sup>+</sup> клеток в субпопуляциях лимфоцитов у 6 пациентов, подвергнутых HSCT, оцениваемое во время восстановления иммунной системы и сравниваемое с диапазоном, полученным при оценке 5 здоровых доноров.
<img file="00000005.jpg" he="81" wi="150" img-content="undefined" img-format="jpg" />
*На момент оценки у пациентов развивалась острая GvHD степени II.
У пациентов, у которых развивалась aGvHD, в некоторых случаях значение процентной доли было выше, чем у двух пациентов без этого осложнения (CK, IP). Пациент DF демонстрировал значимо более высокие процентные доли CD26 во всех субпопуляциях, индекс клеточной активации являлся ярко выраженным, и невозможно было оценивать индекс MFIR молекулы CD26.
+
+
+
+
У двух пациентов без aGvHD индекс демонстрировал значения MFIR, попадающие в диапазон контроля, в то время как у трех пациентов с прогрессирующей aGvHD значения MFIR являлись повышенными почти во всех субпопуляциях и, особенно, в субпопуляциях CD3 CD16 T-клеток и CD3 CD56 T-клеток (таблица 6).
Таблица 6
Распределение (измеряемое как MFIR) CDina26<sup>+</sup> клеток в субпопуляциях лимфоцитов у 6 пациентов, подвергнутых HSCT, оцениваемое во время восстановления иммунной системы и сравниваемое с диапазоном, полученным при оценке 5 здоровых доноров.
<img file="00000006.jpg" he="98" wi="152" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Пример 4e
Также исследовали экспрессию CD26 на мезенхимальных стволовых клетках, эндотелиальных клетках и фибробластах.
in vitro,
Осуществляли три эксперимента с использованием мезенхимальных стволовых клеток (MSC), выращиваемых  полученных из костного мозга трех здоровых взрослых доноров. Анализ посредством проточной цитометрии показал, что клетки, положительные по CD13 и CD73, характерным маркерам MSC, однако, являлись отрицательными по экспрессии CD26 (антигена для CDina26). Осуществляли три эксперимента с использованием эндотелиальных клеток (DC) из пуповины трех здоровых индивидуумов. Эндотелиальные клетки являлись отрицательными по экспрессии CD26 (антигена для CDina26).
Осуществляли три эксперимента с использованием фибробластов кожи, полученных от трех здоровых взрослых доноров. Анализ посредством проточной цитометрии показал, что 40% фибробластов экспрессировали CD26 (диапазон 32%-45%) с индексом MFIR от 4 до 13.
in vitro
Осуществляли три эксперимента с использованием дендритных клеток, дифференцирующихся . Анализ с помощью проточной цитометрии показал, что клетки, положительные по CD1a, характерному маркеру дифференцирующихся in vitro DC, однако, являлись отрицательными по экспрессии CD26.
Анализ посредством проточной цитометрии показал, что моноцитарные клетки, положительные по CD14, являлись положительными по экспрессии CD26 (диапазон 97%-100%) с индексом MFIR, варьирующимся от 1 до 17.
Эти данные показали, что субпопуляции T- и NK-клеток имели повышенную процентную долю или экспрессию антигена для CDina26 (MFIR) на поверхности мембраны.
+
+
+
+
У пациентов с aGvHD повышенную экспрессию CD26 можно наблюдать в CD3CD16 T-клетках, CD3CD56 T-клетках и NK-клетках по сравнению со здоровыми донорами.
В этих данных суммируют способность моноклональных антител против CD26 CDina26 специфически связываться с активированными регуляторными T-клетками, мешая их экспансии и их функционированию в модуляции иммунного ответа при aGvHD.
Пример 5
Клинические исследования: Лечение реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD)
Проводили клиническое исследование для определения безопасности и эффективности CDina26 у пациентов с aGvHD (острой реакцией "трансплантат против хозяина").
Краткое изложение
2
2
2
Пациентам, включенным в исследование, вводили фиксированную дозу CDina26 2 мг/день (соответствующую в среднем 1,11 мг/м в сутки) в течение 5 последовательных дней. Композиция, вводимая пациентам, включала антитело по настоящему изобретению в диапазоне от 2 до 10 мг в соответствии с площадью поверхности их тела, разведенное в 100 мл стерильного физиологического раствора совместно с кортикостероидами и антигистаминным средством. Пациентам продолжали проводить их стандартное лечение GvHD (6-метилпреднизолон 1-2мг/кг/день i.v. и циклоспорин). Поддерживающей терапией являлась общепринятая антибактериальная, противогрибковая и противовирусная терапия. В настоящей заявке единицы мг/м и мг/(м площади поверхности тела) используют взаимозаменяемо.
Основной оценкой в этом исследовании являлась частота пациентов, "отвечающих" на исследуемое лечение, определяемая в день 10 после 5 дней терапии.
Определение отвечаемости основывалось на следующих критериях:
- ПОЛНЫЙ ОТВЕТ (CR) → разрешение всех признаков GvHD
- ЧАСТИЧНЫЙ ОТВЕТ (PR) → улучшение степени GvHD
- СТАБИЛЬНОСТЬ → отсутствие изменения степени GvHD
- УХУДШЕНИЕ → ухудшение степени GvHD
Пациентов с полным или частичным ответом считали отвечающими.
Таблица 7
Шкала острой GVHD по Glucksberg (Glucksberg et al., 1974)
Орган
Степень 1
Степень 2
Степень 3
Степень 4
Кожа: макулопапулезная сыпь
<25% поверхности тела
25-50% поверхности тела
Генерализованная эритродермия
Генерализованная эритродермия с образованием волдырей и десквамацией
Печень: Билирубин
2-3 мг/дл
3,1-6 мг/дл
6,1-15 мг/дл
>15 мг/дл
ЖКТ: Диарея
>500 мл/день
>1000 мл/день
>1500 мл/день
>1500 мл/день Сильная боль в животе с кишечной непроходимостью или без нее
Таблица 8
Шкала острой GVHD по Glucksberg (Glucksberg et al., 1974)
Общая степень
Кожа
Печень
ЖКТ
ECOG
I
1-2
0
0
0
II
1-3
1
и/или 1
0-1
III
2-3
2-4
и/или 2-3
2-3
IV
2-4
2-4
и/или 2-4
3-4
ЖКТ: желудочно-кишечный тракт
Общее состояние, определяемое согласно Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG):
Дополнительные оценки включали следующие:
- определение степени GvHD, орган за органом (Эту оценку проводили в день +10 и день +30.);
- частоту осложнений, таких как: инфекция, кровотечение, необходимость переливания крови (Эту оценку проводили до конца госпитализации в день +30.);
- во время посещения через 1 год регистрировали следующие параметры: статус выживаемости, индекс Карнофски, хроническую GvHD, возможный рецидив гематологического заболевания, по причине которого осуществляли трансплантацию, возможное возникновение новой опухоли.
Демографические и другие исходные характеристики
В набор данных для оценки эффективности включали одиннадцать пациентов. Семь пациентов имели aGvHD степени III, один пациент имел GvHD степени IV, и один пациент имел GvHD степени II.
Медиана времени до дебюта aGvHD составляла 10 дней (диапазон 4-73 дней).
Все эти пациенты имели aGvHD, которую считали aGvHD высокого риска по причине вовлечения внутренних органов.
Оценка эффективности: частота пациентов, "отвечающих" на 2 мг CDina26 i.v. в сутки, вводимых в течение пяти последовательных дней, с медианой времени последующего врачебного наблюдения к настоящему моменту 433 дней составляла 11 из 12 (90%): шесть (6) с полными ответами, пять (5) с частичными ответами и один (1) без ответа.
Далее следуют данные для четырех пациентов (pt. 01, 03, 12, 14) по шкале острой GvHD по Glucksberg. В представленной ниже таблице используют следующие сокращения:
"Пре-CDina26" означает степень GvHD пациентов до лечения с использованием CDina26; "лучшее для CDina26" означает лучшие значения степени GvHD пациентов после лечения с использованием CDina26; "Конечные значения для CDina26" означает недавно полученное значение степени GvHD пациентов; значения при последующем врачебном наблюдении означают дни после лечения с использованием CDina26.
Таблица 9
Пре-CDina26
Лучшее для CDina26
Конечные значения для CDina26
ID
GvHD Кожа
GvHD Печень
GvHD ЖКТ
Степень GvHD
GvHD Кожа
GvHD Печень
GvHD ЖКТ
Степень GvHD
GvHD Кожа
GvHD Печень
GvHD ЖКТ
Степень GvHD
Последующее врачебное наблюдение
Ответ
Pt01
2
0
2
3
0
0
0
0
0
0
0
0
365
CR
Pt03
2
0
3
3
0
0
0
0
2
0
0
1
365
PR
Pt12
2
0
0
2
0
0
0
0
1
0
1
1
341
PR
Pt14
0
0
2
2
0
1
0
0
0
1
0
0
208
CR
На фиг. 4a представлена шкала кожной GvHD в день 1, 10, 30 и последний день ("последний" на фиг. 4a) для пациента в исследовании. На фиг. 4b представлена шкала печеночной GvHD в день 1, 10, 30 и последний день для пациента в исследовании. На фиг. 4c представлена шкала GvHD ЖКТ в день 1, 10, 30 и последний день для пациента в исследовании.
Восстановление иммунной системы
Иммунодефицит является распространенным среди пациентов с острой GvHD, особенно после длительного лечения стероидами, и инфекции являются следствием тяжелого комбинированного иммунодефицита. На фиг. 5 представлены абсолютные значения CD4 у 6 пациентов. Значения CD4 чаще имеют тенденцию к повышению или остаются, по существу, стабильными после терапии CDina26, чем демонстрируют снижение, как и ожидали в случае сильной цитолитической активности антитела. Единица "количество/мкл" означает количество на микролитр крови пациента.
Краткое описание побочных эффектов
Безопасность CDina26 исследовали на предмет побочных эффектов. Сильную токсичность, затрагивающую гематологическую и респираторную системы, считали ожидаемым следствием кондиционирующей схемы лечения и процесса трансплантации. Всего 8 серьезных и 26 несерьезных побочных эффектов регистрировали как не относящиеся к лечению CDina26. Чаще всего регистрируемые побочные эффекты относились к SOC (классам систем органов) "Инфекции и инвазии" (n=5), "Почечные и мочевыделительные нарушения" (n=5), "Респираторные, торакальные и медиастинальные нарушения" (n=5) и "Нарушения кожи и подкожных тканей" (n=4).
Инфекции являются частым осложнением острой GvHD и терапии стероидами. Таким образом, наблюдение количества инфекционных эпизодов у пациентов являлось неожиданным.
Восемь фатальных побочных эффектов имели место после дня +100. Ни один из них не считали относящимся к лечению с использованием CDina26.
По причине того, что резистентная к стероидам острая реакция "трансплантат против хозяина" после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток связана с высоким показателем смертности, оценивали смертность, связанную с трансплантацией (смерти по причине осложнений, связанных с трансплантацией, большая часть которых связана с aGvHD).
При рассмотрении всех пациентов, подвергнутых лечению с использованием CDina26, показатель смертности, связанной с трансплантацией (TRM), через 6 месяцев после лечения составлял 25% (3 из 12). Среди TRM, два пациента умерли от GvHD. Ни одна из смертей не была связана с лечением с использованием CDina26.
На фиг. 6 представлен прогнозируемый кумулятивный показатель связанной с трансплантацией смертности у 13 контрольных пациентов с острой GvHD степени III-IV, подвергнутых лечению стероидами, циклоспорином и другими иммуносупрессирующими лекарственными средствами, по сравнению с 9 пациентами, подвергнутыми лечению стероидами, циклоспорином и CDina26.
Кумулятивный показатель связанной с трансплантацией смертности у 9 пациентов, которым вводили CDina26, к настоящему моменту составляет 12%, по сравнению с 62% для совпадающих контролей, которым не вводили CDina26 (p=0,02).
На фиг. 7 представлена прогнозируемая актуариальная выживаемость у 13 контрольных пациентов с острой GvHD степени III-IV, подвергнутых лечению стероидами, циклоспорином и другими иммуносупрессирующими лекарственными средствами, по сравнению с 9 пациентами, подвергнутыми лечению стероидами, циклоспорином и CDina26. Значение p составляет 0,2.
В заключение, пациенты, подвергнутые лечению CDina26, демонстрируют более низкую смертность, чем пациенты, которым не вводили CDina26, т.е. пациенты, не подвергнутые лечению с использованием CDina26.
Выводы
Результаты терапии мышиным моноклональным антителом против CD26 резистентной к стероидам острой GvHD у 11 пациентов являлись крайне обнадеживающими, как в отношении ответа, так и в отношении выживаемости. Учитывая отсутствие какой-либо эффективной терапевтической меры в этих обстоятельствах, и учитывая отсутствие какого-либо улучшения терапии и исходов за последние 3 десятилетия, CDina26 привело к высокому показателю ответов и высокой доле выживших пациентов. Необходимо отметить, что связанную с трансплантацией смертность (TRM) напрямую приписывают трансплантации, и ее осложнение составляет 62% для контрольных пациентов с GvHD III-IV степени, которым не вводили мышиное моноклональное антитело против CD26, и 25% для пациентов, которым вводили CDina26. Авторы настоящего изобретения считают, что эти результаты являются крайне многообещающими для врачей.
Пример 6
Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению, в частности, содержащая антитела, продуцируемые гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, CDina26, например, имеет следующую композицию:
Таблица 10
Компонент
Количество на сосуд
по меньшей мере одно антитело понастоящему изобретению, в частности,антитела, продуцируемые гибридомнойклеточной линией, депонируемой как PD 12002,CDina26
1 мг
DPBS (физиологический раствор, забуференныйфосфатом Дульбекко)
1 мл
1 мл DPBS, содержащий:
KClKH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>NaClNa<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> × 7 H<sub>2</sub>OВоду для инъекций
0,2 мг0,2 мг8 мг2,16 мгДо 1 мл
Эту фармацевтическую композицию можно вводить, в частности, посредством внутривенной инъекции.
Пример 7
Лечение SAA (тяжелой апластической анемии)
У одного пациента с приобретенной SAA развивалась панцитопения после аллогенной HSCT. Пациент имел смешанный химеризм CD3 (37% аутологичных), что позволяет предполагать персистирование аутоагрессивных T-клеток, вызывающих аплазию. Химеризм донора по клеткам костного мозга составлял 100%.
Пациенту проводили курс терапии моноклональными антителами против CD26 CDina26, 2 мг/день i.v. (2 мг CDina26, представленных в форме раствора для внутривенного введения) в течение 5 дней амбулаторно в дневном стационаре. Лечение являлось хорошо переносимым, без побочных эффектов.
Анализ крови пациента после лечения являлся таким, как приведено ниже:
Hb
WBC
Pt
120 дней до лечения
10
1,7
70
7 дней до лечения
8,9
1,6
12
В течение пяти дней проводили лечение антителами против CD26.
6 дней после лечения
8,4
2,6
22
20 дней после лечения
7,6
2,5
22
31 день после лечения
10,4
4,8
32
48 дней после лечения
9,2
3,9
42
87 дней после лечения
9,7
4,4
66
(Анализы крови делали через 87 дней после лечения, т.е. приблизительно через 3 месяца после лечения антителом против CD26). Использовали следующие сокращения: Hb (гемоглобин), WBC (лейкоциты), Pt (тромбоциты). Представленные выше данные показывают, что ингибирование CD26 может являться благоприятным для пациентов с приобретенной SAA по причине своего иммуномодулирующего эффекта и роли в хоминге стволовых клеток.
Пример 8
Картирование эпитопа PD 12002
тм
тм
тм
Эпитопы, распознаваемые антителом CDina26, продуцируемым гибридомной клеточной линией, депонируемой как PD 12002, идентифицировали с помощью технологии картирования эпитопов CLIPS. См., например, US 7863239 и US 7972993, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В кратком изложении, с помощью технологии CLIPS структурно фиксируют пептиды в определенных трехмерных структурах. Это приводит к функциональной имитации даже самых сложных участков связывания. Реакция CLIPS протекает между группами брома подложки CLIPS™ и тиоловыми боковыми цепями цистеинов. Реакция является быстрой и специфичной в мягких условиях (Timmerman et al., J. Mol. Recognit. 2007; 20: 283-29).
тм
тм
Скрининг библиотеки CLIPS начинают с преобразования белка-мишени CD26 человека в библиотеку перекрывающихся пептидных конструкций с использованием дизайна комбинаторных матриц. На твердом носителе синтезируют матрицу из линейных пептидов, которой затем придают форму пространственно определенных конструкций CLIPS. Конструкции, представляющие несколько частей эпитопа прерывистого типа в правильной конформации, связываются с антителом с высокой аффинностью, которую определяют и подсчитывают. Конструкции, представляющие неполный эпитоп, связываются с антителом с более низкой аффинностью, в то время как конструкции, не содержащие эпитоп, совсем не связываются. Данные об аффинности используют в повторяющихся скринингах для подробного определения последовательностей и конформации эпитопов.
Во-первых, для тщательного анализа выбирали домен связывания аденозиндезаминазы (остатки 356-522 SEQ ID NO: 144) в последовательности белка CD26 человека. Эта область CD26 являлась протяженной и разделенной на два перекрывающихся домена из остатков 260-400 и 380-538 SEQ ID NO: 144. С помощью анализов конкурентного связывания выявили, что CDina26 распознает эпитоп, локализующийся вблизи остатка R358 CD26 человека (SEQ ID NO: 144).
Во-вторых, синтезировали всего 5833 перекрывающихся пептида CD26 и тестировали их на специфическое связывание CDina26. С помощью анализа линейных пептидов идентифицировали многочисленные области, специфически распознаваемые CDina26. Четыре области CD26 демонстрировали значительное связывание:
WWSPNGTFLAYAQ (SEQ ID NO: 148, соответствующая остаткам 215-227 SEQ ID NO: 144),
QLRCSGPGLPLYTLH (SEQ ID NO: 149, соответствующая остаткам 466-483 SEQ ID NO: 144),
LNETKFWYQMILP (SEQ ID NO: 150, соответствующая остаткам 519-531 SEQ ID NO: 144),
MGFVDNKRIAIWGWSY (SEQ ID NO: 151, соответствующая остаткам 616-631 SEQ ID NO: 144).
Эти 4 области CD26, по-видимому, расположены на удалении друг от друга в опубликованной кристаллической структуре и, таким образом, не могут все образовывать единый эпитоп прерывистого типа CDina26. Кроме того, учитывая опубликованную кристаллическую структуру CD26, 3 из 4 областей, по-видимому, почти полностью погружены внутрь CD26. Исключением является WWSPNGTFLAYAQ (SEQ ID NO: 148), экспонируемый на поверхности, по меньшей мере, в отношении остатков PNGTF (SEQ ID NO: 152, соответствующая остаткам 218-222 SEQ ID NO: 144).
В-третьих, для анализа эпитопов прерывистого типа выбирали три различные области поверхности CD26. Матрица 1 покрывала каталитическую область и N-концевые области вблизи каталитической области (соответствующие остаткам 260-400 SEQ ID NO: 144). Матрица 2 покрывала каталитическую область и C-концевые области вблизи каталитической области, частично перекрывающиеся с набором для матрицы 1 (соответствующие остаткам 380-538 SEQ ID NO: 144). Наконец, матрица 3 покрывала специфическую выступающую петлю CD26, образующую иммунодоминантную структуру (соответствующую остаткам 226-252 SEQ ID NO: 144).
По сравнению с линейными пептидами пептиды прерывистого типа показали относительно более низкие сигналы, но сигналы лучше согласовались. При обобщении результатов, полученных с использованием всех трех матриц, идентифицировали многочисленные области связывания CD26 с CDina26.
С помощью матрицы 3, ориентированной на выступающей петле CD26, соответствующей остаткам 226-252 SEQ ID NO: 144, не идентифицировали какие-либо области со значительным связыванием CDina26.
С помощью матрицы 1 (N-конец интересующей области, соответствующей остаткам 260-400 SEQ ID NO: 144) получали 3 области связывания CDina26:
DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146, соответствующую остаткам 329-343 SEQ ID NO: 144).
DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147, соответствующую остаткам 302-316 SEQ ID NO: 144).
TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153, соответствующую остаткам 350-364 SEQ ID NO: 144).
Наиболее сильное связывание наблюдали в случае DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146). При рассмотрении только пептидов, содержащих DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146), лучше всего связывающимися пептидами являлись также содержащие RFRPSEPHF (SEQ ID NO: 154, соответствующую остаткам 356-364 SEQ ID NO: 144). RFRPSEPHF (SEQ ID NO: 154) включает указанный выше специфический остаток R358. Специфический аддитивный эффект в отношении связывания согласовался с антителом CDina26, направленным против эпитопа прерывистого типа, включающего DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146) и TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153). В другом варианте осуществления эпитоп дополнительно содержит DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147).
С помощью матрицы 2 получали 4 области связывания:
TFITKGTWEVIG (SEQ ID NO: 155, соответствующую остаткам 395-406 SEQ ID NO: 144)
DYLYYISNE (SEQ ID NO: 156, соответствующую остаткам 413-421 SEQ ID NO: 144)
SCELNPERCQYY (SEQ ID NO: 157, соответствующую остаткам 446-457 SEQ ID NO: 144)
SGPGLP (SEQ ID NO: 158, соответствующую остаткам 473-478 SEQ ID NO: 144)
Связывание CDina26 с областями матрицы 2 являлось более слабым, чем связывание с DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146). С учетом опубликованной кристаллической структуры CD26 определяли, что области DYLYYISNE (SEQ ID NO: 156) и SGPGLP (SEQ ID NO: 158), по-видимому, являются наиболее углубленными внутрь белка. Области TFITKGTWEVIG (SEQ ID NO: 155) и SAELNPERCQYY (SEQ ID NO: 157) экспонированы на поверхности и доступны для антитела.
Визуальное сравнение связывания CDina26 с 7 идентифицированными областями связывания прерывистого типа в CD26 представлены на фиг. 12, на которой показано среднее связывание со всеми пептидами прерывистого типа, содержащими одну из идентифицированных связывающих последовательностей. Среди них, DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146) являлась наиболее сильным связывающим средством, в то время как DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147) являлась немного более сильной, чем TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153).
Наиболее сильная область связывания, DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146), главным образом, экспонирована на поверхности с учетом опубликованной кристаллической структуры CD26. Область TTGWVGRFRPSEPHF (SEQ ID NO: 153) почти полностью погружена внутрь белка. Область DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147) частично экспонирована на поверхности в ATQER (SEQ ID NO: 159, соответствующей остаткам 306-310 SEQ ID NO: 144) и локализована смежно с DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146).
Результаты картирования эпитопа соответствовали CDina26, специфически связывающимся с эпитопом CD26 прерывистого типа, содержащим DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146). В одном из вариантов осуществления эпитоп прерывистого типа дополнительно содержит одну или обе из DVTWATQERISLQWL (SEQ ID NO: 147) и PNGTF (SEQ ID NO: 152). Хотя PNGTF (SEQ ID NO: 152) является консервативной для CD26 человека и свиньи, различий последовательностей в других компонентах эпитопа (таких как DYDESSGRWNCLVAR (SEQ ID NO: 146), не являющаяся консервативной между человеком и свиньей) достаточно для устранения связывания CDina26 с нативным CD26 свиньи. В другом варианте осуществления эпитоп дополнительно содержит WWSPNGTFLAYAQ (SEQ ID NO: 148).
Пример 9
Аффинность связывания CDina26 с CD26
Для определения аффинности CDina26 к CD26 человека использовали систему поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) по стандартным протоколам. Измерения аффинности проводили при 25°C, иммобилизуя антитело против IgG2b на чипе из карбоксиметилдекстрана (CM5) с 10000 RU (GE Healthcare, 22-0648-97 AC). CDina26 получали как стоковый раствор в подвижном буфере HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15M NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностно-активного вещества P20) в конечной концентрации 50 мкг/мл, и для каждого эксперимента 2000 RU обратимо иммобилизовывали на чипе с помощью инъекции со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 180 секунд.
-6
-9
-9
-9
-9
Очищенный рекомбинантный CD26 человека (rhDipeptidyl peptidase IV; Creative BioMart; кат. № DPP4-116H) получали в стоковой концентрации 5,8×10 M. CD26 инъецировали с увеличивающимися концентрациями 30×10M, 90×10 M, 270×10 M и 810×10 M. Образцы CD26 инъецировали со скоростью потока 10 мкл/мин; при этом буфер HBS-EP использовали в качестве подвижного буфера. Типичная запись включала 3-минутный период инъекции CD26 с последующим 8-минутным периодом диссоциации. Исходные данные о связывании анализировали стандартными способами. Чип CM5 с иммобилизованным антителом против IgG2b восстанавливали с помощью инъекции 10 мМ глицин-HCl, pH 1,7, со скоростью потока при инъекции 20 мкл/мин и в течение 60 секунд.
Результаты измерений аффинности CDina26 представлены ниже. Авторы настоящего изобретения считают, что CDina26 обладает лучшими характеристиками связывания по сравнению с антителами предшествующего уровня техники, и, таким образом, представляют собой значительное усовершенствование относительно предшествующего уровня техники.
Лиганд на CM5
Лиганд антитела против IgG2b
Аналит
K<sub>on</sub>(1/Мс)
K<sub>off </sub>(1/с)
K<sub>D </sub>(M)
Антитело против IgG2b
CDina26
CD26 человека
2,63 E+04
1,32E-04
5,02e-09
Различные модификации и варианты описываемых композиции и способа по изобретению будут очевидны специалистам в этой области без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение описывают применительно к конкретным вариантам осуществления, следует понимать, что изобретение, как оно заявлено, не должно быть ненадлежаще ограничено такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, различные модификации описываемых способов осуществления изобретения, являющиеся очевидными специалистам в родственных областях, предназначены для включения в объем следующей ниже формулы изобретения.
ССЫЛКИ
Все цитируемые в этом описании ссылки, включая, например, патентные публикации, патентные заявки, научные пособия, научные публикации, при условии, что они еще не включены, включены, таким образом, в качестве ссылок в полном объеме. Кроме того, следующие ссылки также включены в качестве ссылок в настоящее описание в полном объеме, включая, ссылки, цитируемые в таких ссылках:
et al
Hepatitic variant of graft versus host disease after donor lymphocyte infusion
Akpek G, Boitnott JK, Lee LA, . . Blood 2002; 100: 3903-3907.
et al
Altschul ., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480.
et al.
st
Andris-Widhopf  (2000), Phage Display Laboratory Manual, 1 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 9.1-9.22.
BMC Genomics
Anke Franzke, Robert Geffers, J Katrin Hunger, Susanne Pförtner, Wenji Piao, Philipp Ivanyi, Jens Grosse, Michael Probst-Kepper, Arnold Ganser and Jan Buer. Identification of novel regulators in T-cell differentiation of aplastic anemia patients. 2006, 7:263.
et al
Ausubel ., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York.
et al
Aytac . (2003) British Joumal of Cancer 88:455-462.
Bacigalupo A, Passweg J. Diagnosis and treatment of acquired aplastic anemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2009; 23: 159-70.
et al.
Baines , "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
Bird RE and Walker BW, "Single Chain Antibody Variable Regions," TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991).
et al.
Boerner , 1991, J. Immunol.,147 (l):86-95.
Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:544-50.
Broxmeyer, H. E. (2006). Umbilical Cord Blood Stem Cells: Collection, Processing, and Transplantation. Blood Banking and Transfusion Medicine: Basic Principles and Practice. C. D. Hillyer, Silberstein, L.E., Ness, P.M., Anderson, K.C., and Roback, J., Churchill Livingston, an imprint of Elsevier, Inc.: 823-832.
Broxmeyer, H. E., G. Hangoc, S. Cooper, T. Campbell, S. Ito and C. Mantel (2007). AMD3100 and CD26 modulate mobilization, engraftment, and survival of hematopoietic stem and progenitor cells mediated by the SDF-1/CXCL12- CXCR4 axis. Ann N Y Acad Sci 1106: 1-19. Epub 2007 Mar 14. PubMed PMID: 17360804.
et al
Brummell ., Biochem. 32: 1180-1187 (1993).
et al
Burks ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997).
et al
Busso N, Wagtmann N, Herling C . Circulating CD26 is negatively associated with inflammation in human and experimental arthritis. Am J Pathol 2005; 166: 433-442.
Campbell TB, Broxmeyer HE. CD26 inhibition and hematopoiesis: a novel approach to enhance transplantation. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1795-805. Review. PubMed PMID: 17981668.
Campbell TB, Hangoc G, Liu Y, Pollok K, Broxmeyer HE. Inhibition of CD26 in human cord blood CD34+ cells enhances their engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency mice. Stem Cells Dev. 2007 Jun;16(3):347-54. PubMed PMID: 17610364.
et al.
Carter , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992).
Microcirculation
Charo IF, Peters W. Chemokine receptor 2 (CCR2) in atherosclerosis, infectious diseases, and regulation of T-cell polarization. 2003, 10(3-4):259-264.
et al.
Chothia , J. MoI. Biol. 1987, 196(4): 901-17.
Christopherson KW 2nd, Hangoc G, Broxmeyer HE. Cell surface peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal cell-derived factor-1 alpha-mediated chemotaxis of human cord blood CD34+ progenitor cells. J Immunol. 2002 Dec 15;169(12):7000-8. PubMed PMID: 12471135.
Christopherson KW 2nd, Cooper S, Broxmeyer HE. Cell surface peptidase CD26/DPPIV mediates G-CSF mobilization of mouse progenitor cells. Blood. 2003 Jun 15;101(12):4680-6. Epub 2003 Feb 6. PubMed PMID: 12576320.
Christopherson KW, Cooper S, Hangoc G, Broxmeyer HE. CD26 is essential for normal G-CSF-induced progenitor cell mobilization as determined by CD26-/- mice. Exp Hematol. 2003 Nov;31(11):1126-34. PubMed PMID: 14585379.
Christopherson KW II, Hangoc G, Mantel CR, Broxmeyer HE. Modulation of haematopoietic stem cell homing and engraftment by CD26. Science 2004; 305: 1000-1003. PubMed PMID: 15310902.
Christopherson II, K. W., L. A. Paganessi, S. Napier and N. K. Porecha (2007). CD26 Inhibition on CD34(+) or Lineage() Human Umbilical Cord Blood Donor Hematopoietic Stem Cells/Hematopoietic Progenitor Cells Improves Long-Term Engraftment into NOD/SCID/Beta2(null) Immunodeficient Mice. Stem Cells Dev 16(3): 355-60.
et al.
Cole , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985).
et al.
Coligan  Eds. (1991) CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley & Sons, v. 1, pp. 2.5.1-2.6.7, 2.7.1-2.7.12, 2.8.1-2.8.10, 2.9.1-2.9.3 and 2.10.-2.10.4.
Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26.
et al.
Cossins  (2006, Prot Express Purif 51: 253-259.
Histol Histopathol
Dang NH, Morimoto C. CD26: An expanding role in immune regulation and cancer. 2002, 17(4):1213-1226.
et al.
Dantas-Barbosa , 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40.
et al
Dong . (1998), “Correlation ofthe Epitopes Defined by Anti-CD26 mAbs and CD26 Function”, Molecular Immunology 35(1):13-21.
et al
Dong . (1996) J Immunol. 156(4):1349-55.
Drucker DJ. Dipeptidyl peptidase-4 inhibition and the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care 2007; 30: 1335-1341.
DuBois D; DuBois E F., Arch Int Med 1916 17:863-71.
et al
Durinx C, Lambeir AM, Bosmans E . Molecular characterization of dipeptidylpeptidase activity in serum: soluble CD26/dipeptidylpeptidase IV is responsible for the release of X-Pro dipeptides. Eur J Biochem 2000; 267: 5608-5613.
et al.
Edelman  (1967) in Methods in enzymology, v. 1, p. 422.
Graft-versus-Host Disease
Ferrara JLM, Levine JE, Reddy P and Holler E. . Lancet 2009; 373: 1550-1561.
J Immunol
Fleischer B, Sturm E, De-Vries JE, Spits H. Triggering of cytotoxic T lymphocytes and NK cells via the Tp103 pathway is dependent on the expression of the T cell receptor/CD3 complex. 1988, 141:1103-1107.
Fleischer (1987) J. Immunol. 138, 1346-1350. Fleischer (1994) Immunol. Today 15:180-184.
et al
Fox . (1984) J. Immunol. 133, 1250-1256.
J Clin Invest
Fraticelli P, Sironi M, Bianchi G, D'Ambrosio D, Albanesi C, Stoppacciaro A, Chieppa M, Allavena P, Ruco L, Girolomoni G, Sinigaglia F, Vecchi A, Mantovani A. Fractalkine (CX3CL1) as an amplification circuits of polarized Th1 resonses. 2001, 107(9):1173-1181.
Freshney RI, ed. (1987) Culture of Animal Cells, AR Liss Inc.
Gait MJ, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis.
et al
Clinical manifestations of graft-versus-host disease in human recipients of marrow from HL-A-Matched sibling donors
Glucksberg H, Storb R, Fefer A, . . Transplantation 1974; 18: 295-304.
et al.
Green , Nature Genet. 7:13 (1994).
et al.
Green , 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23.
Guo Y, Hangoc G, Bian H, Pelus LM, Broxmeyer HE. SDF-1/CXCL12 enhances survival and chemotaxis of murine embryonic stem cells and production of primitive and definitive hematopoietic progenitor cells. Stem Cells. 2005 Oct;23(9):1324-32. Erratum in: Stem Cells. 2006 Jan;24(1):211. PubMed PMID: 16210409.
et al.
Hames BD  (1984) Nucleic Acid Hybridization.
et al
Hegen . (1990) J. Immunol. 144, 2908-2914.
Hogan B (1986) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory.
et al.
Hollinger , 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448.
Hopsu-Havu and Glenner, 1966, Histochemie; 7: 197-201.
et al.
Huse  (Science 1989, 246:1274-1281).
Diabetes 2010; 59(7):1739-50.
Inhibition of CD26 preserves pancreatic islet transplants through a pathway involving modulation of splenic CD4(+) T-cell migration in mice.
J Heart Lung Transplant 2006; 25(9):1109-16.
Inhibition of CD26 down regulates activated T cells and prevents lung graft rejection in rats.
J Immunol 2001; 166(3): 2041-8.
Inhibition of CD26 suppresses autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice.
Acute graft versus host disease
Jacobsohn DA and Vogelsang GB. . Orphanet Journal of Rare Diseases 2007; 2: 35-44.
J Neuroimmunol
Jee Y, Yoon WK, Okura Y, Tanuma N, Matsumoto Y. Upregulation of monocyte chemotactic protein-1 and CC chemokine receptor 2 in the central nervous system is closely associated with relapse of autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats. 2002, 128(1-2):49-57.
et al.
Jellinek , 1995, Biochem. 34:11363-11372.
Current Opinion in Structural Biology
Johnson and Chiswell, 1993,  3:5564-571.
et al.
Jones , Nature 321: 522 (1986).
et al.
Kabat  (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ed., Washington, D.C., Public Health Service, N.I.H.
et al
Kahne T, Lendeckel U, Wrenger S . Dipeptidyl peptidase IV: a cell surface peptidase involved in regulating T cell growth (review). Int J Mol Med 1999; 4: 3-15.
et al
Kameoka . (1993) Science. 261(5120):466-9.
Kawai, T., U. Choi, P. C. Liu, N. L. Whiting-Theobald, G. F. Linton and H. L. Malech (2007). Diprotin A Infusion into Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency Mice Markedly Enhances Engraftment of Human Mobilized CD34(+) Peripheral Blood Cells. Stem Cells Dev 16(3): 361-370.
et al
Kobayashi ., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999).
et al
Kobayashi ., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999).
Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975).
et al.,
Kostelny  1992, J. Immunol. 148: 1547-1553.
et al.
Leung , Hybridoma 13:469 (1994).
Lewis, I. D. (2002). Clinical and experimental uses of umbilical cord blood. Intern Med J 32(12): 601-9.
et al.
Lin , 1994, Nucl. Acids Res. 22:5220-5234.
Nat Med
Lock C, Hermans G, Pedotti R, Brendolan A, Schadt E, Garren H, Langer-Gould A, Strober S, Cannella B, Allard J, Klonowski P, Austin A, Lad N, Kaminski N, Galli SJ, Oksenberg JR, Raine CS, Heller R, Steinman L. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. 2002, 8(5):500-508.
et al.
Lonberg , Nature 1994 368:856.
Blood
Maciejewski JP, Selleri C, Anderson S, Young NS. Fas antigen expression on CD34+ human marrow cells is induced by interferon gamma and tumor necrosis factor alpha and potentiates cytokine mediated hematopoietic suppression in vitro. 1995, 85:3183-3190.
Br J Haematol
Maciejewski JP, Selleri C, Sato T, Anderson S, Young NS. Increased expression of Fas antigen on bone marrow CD34+ cells of patients with aplastic anemia. 1995, 91:245-252.
et al.
Mancini , 2004, New Microbiol. 27:315-28.
et al.
Marks , 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97.
et al.
J. Biol. Chem.
Marks, J. D., , 1992,  267: 16007.
Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology.
et al.
McCafferty , 1990, Nature 348:552-553.
Menthlein, 1999, Regulatory Peptides; 85: 9-24.
Miller JH and Calos MP, eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory.
et al.
Morimoto  (1989) J. Immunol. 143, 3430-3439.
et al.
Morimoto  (1994) Immunologist 2: 4-7.
et al.
Morrison  (1993) J Exp Med. 177(4):1135-43).
Mosteller R D., N Engl J Med 1987 Oct. 22; 317(17):1098.
Blood
Nakao S, Takami A, Takamatsu H, Zeng W, Sugimori N, Yamazaki H,Miura Y, Ueda M, Shiobara S, Yoshioka T, Kaneshige T, Yasukawa M, Matsuda T. Isolation of a T cell clone showing HLADRB1* 0405-restricted cytotoxicity for hematopoietic cells in a patient with aplastic anemia. 1997, 89:3691-3699.
et al.
Nisonoff , Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960).
et al.
Orlandi , 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833.
et al.
Pagratis , 1997, Nature Biotechnol. 15:68-73.
Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366.
Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162.
Perbal B (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons Inc.
et al
Peranteau WH, Endo M, Adibe OO . CD26 inhibition enhances allogeneic donor-cell homing and engraftment after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood 2006; 108: 4268-4274.
Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959).
Raag R and Whitlow M, "Single Chain Fvs." FASEB Vol 9:73-80 (1995).
et al.
Riechmann , 1988, Nature 332: 323.
Blood
Risitano AM, Kook H, Zeng W, Chen G, Young NS, Maciejewski JP. Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by V beta CDR3 spectratyping and flow cytometry. 2002, 100(1):178-183.
Roig MG (1986) Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press.
et al.
Sambrook , eds. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2. ed.
Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech. 12: 437.
et al.
Gene
Shier, R. , 1996,  169: 147.
et al.
Singer , 1993, J. Immun. 150: 2844.
et al.
Songsivilai , 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321.
Pathophysiology of Acute Graft-vs-Host Disease: Recent Advances
Sun Y, Tawara I, Tubai T, and Reddy P. . Transl Res. 2007; 150: 197-214.
et al.
Taylor , Int. Immun. 1994 6:579.
et al.,
Tempest  1991, Biotechnology 9:266.
Tian, C., J. Bagley, D. Forman and J. Iacomini (2006). "Inhibition of CD26 peptidase activity significantly improves engraftment of retrovirally transduced hematopoietic progenitors." Gene Ther 13(7): 652-8.
et al
Timmerman ., 2007, J. Mol. Recognit. 20: 283-290.
et al.
Ulmer  (1990) J. Immunol. 31, 429-435.
et al.
US 2010/0196266 A1, EP 404 097, WO 93/11161, Goldenberg, U.S. Pat. No.s 4,036,945 and 4,331,647, US 4,704,692, US 4,946,778, US 5,545,807, US 5,545,806, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,567,610, US 5,229,275, EP 1 241 179 B1, US 4,683,195 (Mullis ), US 7,863,239, US 7,972,993, US 7,982,013 B2.
et al
Vanham G, Kestens L, Demeester I . Decreased expression of the memory marker CD26 on both CD4+ and CD8+ T lymphocytes of HIV infected subjects. J Acquir Immune Defic Syndr 1993; 6: 749-757.
et al
Verhoeyen ., 1988, Science 239: 1534.
Weir DM and Blackwell CC, eds. (1986) Handbook of Experiment Immunology, vv. I-IV.
J
Allergy Clin Immunol
Willheim M, Ebner C, Baier K, Kern W, Schrattbauer K, Thien R, Kraft D, Breiteneder H, Reinisch W, Scheiner O. Cell surface characterization of T lymphocytes and allergen-specific T cell clones - correlation of CD26 expression with Th1 subsets. 1997, 100:348-255.
Wu (1986) in Methods in enzymology, v. 154, preface.
Wu (1987) in Methods in enzymology, v. 155, preface.
N Eng J Med
Young NS, Maciejewski JP. The pathophysiology of acquired aplastic anemia. 1997, 336:1365-1372.
Blood
Zeng W, Nakao S, Takamatsu H, Yachie A, Takami A, Kondo Y, Sugimori N, Yamazaki H, Miura Y, Shiobara S, Matsuda T. Characterization of T-cell repertoire of the bone marrow in immunemediated aplastic anemia: Evidence for the involvement of antigen-driven T-cell response in cyclosporine-dependent aplastic anemia. 1999, 93(9):3008-3016.
J Clin Invest
Zeng W, Maciejewski JP, Chen G, Young NS. Limited heterogeneity of T cell receptor BV usage in aplastic anemia.  2001, 108(5):765-773.