МОДУЛЯЦИЯ hUTC ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ МЕДИАТОРОВ ЛЕГОЧНЫХ И ПУЛЬМОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ
HUTC MODULATION OF PRO-INFLAMMATORY MEDIATORS OF LUNG AND PULMONARY DISEASES AND DISORDERS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к клеточной терапии для модуляции провоспалительных медиаторов легочных и пульмональных заболеваний и расстройств.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Легочные заболевания (как хронические, так и острые), расстройства и/или травмы по-прежнему являются серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) является четвертой по значимости причиной смерти в мире (Spurzem and Rennard, Semin Respir Crit Care Med, 2005 г.; 26: 142–153) и может быть вызвано анатомическим сужением дыхательных путей или блокадой дыхательных путей из-за слизи, препятствующей нормальному дыханию. Кроме того, интерстициальное заболевание легких, также известное как легочный фиброз, относится к категории рестриктивных заболеваний, которая включает самые различные хронические легочные расстройства. Лечение хронических заболеваний легких включает в себя лекарственную терапию, кислородную терапию, хирургию и легочную реабилитацию.
Несмотря на то, что 90% пациентов с COPD являются курильщиками, только у 10% курильщиков развивается заболевание, а значит, генетическая предрасположенность может быть важным прогностическим фактором (Siafakas and Tzortzaki, Respir Med, 2002 г.; 96: 615–24). Заболевание легких у курильщиков характеризуется хроническимактивным воспалением, гиперсекрецией слизи в дыхательных путях и эмфиземой (MacNee, Proc Am Thorac Soc. 2005 г.; 2: 258–66), которые лишь частично обратимы после отказа от курения (Spurzem and Rennard, Semin Respir Crit Care Med, 2005 г.; 26: 142–153). Воспаление дыхательных путей и паренхимы легких играет основнуюроль в патогенезе COPD. Было показано, что курение сигарет вызывает легочное воспаление и, в конечном счете, приводит к COPD даже в случае прекращения воздействия сигаретного дыма.
Эмфизема является одним из основных факторов, определяющих заболеваемость и смертность при COPD. Эмфиземой называют увеличение периферической воздушной полости в легком (включая дыхательные бронхиолы и альвеолы), которое сопровождается разрушением структур стенок альвеол и характеризуется, например, потерей эластичности ткани легкого из-за разрушения структур, поддерживающих ткани легких, например, альвеол, и разрушения капилляров, питающих альвеолы. Такое разрушение может быть следствием воздействия воспалительных ферментов, например, эластина. Заболеваемость эмфиземой увеличивается по причине растущего числа загрязнителей в окружающей среде, курения сигарет и других воздействий вредных веществ. В настоящее время единственным средством лечения тяжелой эмфиземы является трансплантация легкого. Поэтому существует огромная потребность в надлежащем и эффективном подходе для лечения, восстановления и/или облегчения последствий повреждений легкого у пациентов, страдающих эмфиземой, например, эмфиземой, вызванной эластазой.
Острое повреждение легких (ALI) и синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS) относятся к значимым причинам заболеваемости и смертности в блоках интенсивной терапии и характеризуются внезапным развитием гипоксемии с диффузным легочным отеком в ответ на непосредственное повреждение (например, утопление, пневмония, вдыхание токсических газов и ушиб легкого) или косвенное повреждение (например тяжелый сепсис, трансфузия, шок и панкреатит). В настоящее время для лечения ALI и ARDS применяются механическая вентиляция и поддерживающая терапия.
Рестриктивный легочный процесс является одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности и имеет три первичные этиологии: рак легких, пневмония и легочный фиброз. Идиопатический легочный фиброз (IPF) является приводящим к инвалидности заболеванием, которое характеризуется прогрессирующей одышкой и связано с высоким уровнем смертности, прогрессирующим фиброзом фиксированных тканей, структурными искажениями и потерей функциональности (Ortiz L.A. et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2003 г.; 100:8407–11). В настоящее время не существует эффективных способов лечения, которые позволяли бы обратить или замедлить ход IPF. Большинство способов лечения, например, с применением кортикостероидов, иммунодепрессантов, иммуномодуляторов или противофиброзных средств, призваны подавить воспаление, но ни один из них не показал способность остановить прогрессирование заболевания. Поэтому существует серьезная потребность в новых способах лечения, направленных на замедление или остановку фиброза при одновременной активизации эндогенного восстановления и регенерации легких.
В патологии легочных заболеваний, расстройств и/или травм, например, при респираторных заболеваниях, предполагается участие множества провоспалительных медиаторов. Например, при легочном фиброзе, хронической форме фиброзирующей интерстициальной пневмонии, предполагается наличие избытка профиброзных цитокинов или недостатка противофиброзных цитокинов в патологическом процессе заболевания. (Zhao F. et al. Transplant Proceedings, 2008 г.; 40(5):1700–1705).
Поэтому снижение продукции и/или ингибирование таких цитокинов и провоспалительных медиаторов может приводить к смягчению симптомов и/или патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы. Таким образом, в настоящее время существует острая потребность в способах лечения, которые снижают продукцию или ингибируют продукцию таких провоспалительных медиаторов. Применяемые в настоящее время способы лечения легочных заболеваний, расстройств и/или травм, например, COPD, предусматривают ингаляцию или пероральный прием кортикостероидов, бронхолитиков и холиноблокаторов. Кроме того, исследуется применение антагонистов интерлейкинов и антител против интерлейкинов, в том числе в ходе клинических испытаний, например, при астме. Вместе с тем ни один из указанных способов лечения не обеспечивает снижение продукции и/или ингибирование провоспалительных медиаторов, участвующих в симптомах и/или патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы.
Трансплантацию стволовых клеток можно использовать в качестве клинического инструмента для восстановления целевой ткани, таким образом восстанавливая ее физиологическую и анатомическую функциональность. При лечении легочных заболеваний (как хронических, так и острых), расстройств и/или травм основное внимание уделяется использованию технологии стволовых клеток для регенерации или восстановления легочной ткани, поврежденной в результате легочного заболевания, расстройства и/или травмы.
Поэтому существует потребность в способе лечения легочных заболеваний, расстройств и/или травм посредством модулирования медиаторов, связанных с патологией легочного заболевания, расстройства и/или травмы. В частности, необходим способ постоянного модулирования провоспалительных медиаторов, связанных с патологией легочного заболевания, расстройства и/или травмы.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один из аспектов изобретения касается способов модулирования (например, снижения) продукции провоспалительного медиатора, участвующего в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы у пациентов, имеющих легочные заболевания, расстройства и/или травмы. К таким заболеваниям, расстройствам и/или травмам, среди прочих, относятся хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (например, хронический бронхит, эмфизема), легочный фиброз, острое повреждение легких (ALI), синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS) и связанные с ними нарушения.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является способ модулирования продукции одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы у пациентов, имеющих легочные заболевания, расстройства и/или травмы, включающий введение пациенту эффективного количества клеток, полученных из ткани пуповины. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ снижения продукции одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы у пациентов, имеющих легочные заболевания, расстройства и/или травмы, включающий введение пациенту эффективного количества клеток, полученных из ткани пуповины (например, количества, необходимого для снижения продукции одного или более провоспалительных медиаторов).
В данном способе используются клетки, выделенные из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, которые способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 или CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. В одном из вариантов осуществления клетки не продуцируют CD117 и CD45, а также, что необязательно, не экспрессируют hTERT и теломеразу. В другом варианте осуществления клетки не экспрессируют hTERT и теломеразу. Еще в одном варианте осуществления клетки, выделенные из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 или CD45, не экспрессируют hTERT или теломеразу и имеют одну из следующих характеристик: экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90; не экспрессируют CD31 или CD34; экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; имеют потенциал дифференцироваться в клетки по меньшей мере легочной ткани.
Способы подходят для модулирования (например, снижения) продукции многих провоспалительных медиаторов легочных заболеваний, расстройств и/или травм. В одном из вариантов осуществления провоспалительными медиаторами являются TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β и их комбинации. Провоспалительные медиаторы могут участвовать в развитии легочного заболевания, расстройства и/или травмы.
В одном из вариантов осуществления клетки вводят по меньшей мере вместе с клетками одного другого типа и/или по меньшей мере с одним другим агентом. Клеткой другого типа может быть клетка легких, такая как клетка-предшественник, клетка гладких мышц сосудов, клетка-предшественник гладких мышц сосудов, периваскулярная клетка, клетка эндотелия сосудов, клетка-предшественник эндотелия сосудов или другая мультипотентная или плюрипотентная стволовая клетка. Агент можно выбирать из числа антитромбогенных агентов, противовоспалительных агентов, иммунодепрессантов, иммуномодуляторов, проангиогенных агентов или антиапоптозных агентов.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ модулирования (например, снижения) продукции одного или более провоспалительных медиаторов хронического обструктивного заболевания легких (такого как, например, эмфизема или хронический бронхит) у пациента, имеющего хроническое обструктивное заболевание легких, и такой способ включает введение эффективного количества клеток, полученных из тканей пуповины, где упомянутый провоспалительный медиатор опосредует прогрессирование хронического обструктивного заболевания легких, и где клетки выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны самообновляться и размножаться в клеточной культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Одним из вариантов осуществления является способ снижения продукции одного или более провоспалительных медиаторов хронического обструктивного заболевания легких (такого как, например, эмфизема или хронический бронхит) у пациента, имеющего хроническое обструктивное заболевание легких, и такой способ включает введение эффективного количества клеток, полученных из ткани пуповины, где упомянутый провоспалительный медиатор опосредует прогрессирование хронического обструктивного заболевания легких, и где клетки выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны самообновляться и размножаться в клеточной культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Одним или более провоспалительными медиаторами могут быть TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β и их комбинации.
В другом варианте осуществления клетки дополнительно могут обладать одной или более из перечисленных ниже характеристик: экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90; не экспрессируют CD31 или CD34; экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; имеют потенциал дифференцироваться в клетки по меньшей мере легочной ткани.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, включают в состав фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В альтернативном варианте клетки входят в набор, который содержит фармацевтически приемлемый носитель. Приведенные способы в состоянии ингибировать продукцию одного или более провоспалительных медиаторов.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ ингибирования продукции одного или более провоспалительных медиаторов хронического обструктивного заболевания легких у пациента, имеющего хроническое обструктивное заболевание легких, причем такой способ включает введение эффективного количества клеток, полученных из ткани пуповины. Один или более провоспалительных медиаторов можно выбирать из группы, состоящей из TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β и их комбинации. В одном из вариантов осуществления под COPD понимают хронический бронхит или эмфизему.
Клетки, полученные из ткани пуповины, выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Клетки дополнительно могут обладать одной или более из перечисленных ниже необязательных характеристик: экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90; не экспрессируют CD31 или CD34; экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; имеют потенциал дифференцироваться в клетки по меньшей мере легочной ткани.
В одном из вариантов осуществления клетки вводят в области, пораженные хроническим обструктивным заболеванием легких.
В определенных вариантах осуществления перед введением пациенту клетки in vitro для дифференцировки по линиям дифференцировки клеток легочной ткани, например, клеток гладких мышц сосудов, периваскулярных клеток или клеток эндотелия сосудов. В других вариантах осуществления клетки модифицируют методами генной инженерии, с тем чтобы продуцировать генетический продукт, способствующий лечению легочного заболевания, расстройства и/или травмы.
В некоторых вариантах осуществления способов клетки вводят с клетками по меньшей мере одного другого типа, которые могут включать в себя клетки легочной ткани, такие как клетки-предшественники клеток легких, клетки гладких мышц сосудов, клетки-предшественники клеток гладких мышц сосудов, периваскулярные клетки, клетки эндотелия сосудов, клетки-предшественники клеток эндотелия сосудов или другие мультипотентные или плюрипотентные стволовые клетки. Клетки другого типа можно вводить одновременно, до или после клеток, полученных из ткани пуповины.
В других вариантах осуществления клетки вводят по меньшей мере с одним другим агентом, который может представлять собой, например, антитромбогенный агент, противовоспалительный агент, иммуносупрессорный агент, иммуномодулирующий агент, проангиогенный агент или антиапоптозный агент. Другой агент можно вводить одновременно, до или после клеток, полученных из ткани пуповины.
Клетки предпочтительно вводят в области или в зоны, проксимальные по отношению к областям, пораженным легочным заболеванием, расстройством и/или травмой, но могут также вводиться в зоны, дистальные по отношению к таким областям. Клетки можно вводить путем инъекции, инфузии, имплантации устройства пациенту, либо путем имплантации матрицы или каркаса, содержащих клетки. Клетки могут оказывать трофическое воздействие, например, вызывать пролиферацию легочной ткани пациента. Клетки могут индуцировать миграцию клеток легочной ткани, таких как клетки гладких мышц сосудов, клетки эндотелия сосудов, клетки-предшественники клеток легких, периваскулярные клетки, клетки-предшественники клеток гладких мышц сосудов или клетки-предшественники клеток эндотелия сосудов, к месту или местам заболевания, расстройства и/или повреждения легких.
Другим аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для модулирования продукции одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы, содержащая клетки, полученные из тканей пуповины, где клетки выделены из ткани пуповины человека, по существу не содержащей крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция снижает продукцию одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочных заболеваний, расстройств и/или травм, и содержит клетки, полученные из ткани пуповины. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция ингибирует продукцию одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочных заболеваний, расстройств и/или травм, и содержит клетки, полученные из ткани пуповины. Другие аспекты настоящего изобретения относятся к лечению фармацевтическими композициями и наборами, содержащими производные клеток, полученных из ткани пуповины.
Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или буферный раствор. Легочным заболеванием может быть хроническое обструктивное заболевание легких, например хронический бронхит или эмфизема.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является набор для модулирования продукции одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и клетки, полученные из ткани пуповины. Другим вариантом осуществления является набор для снижения продукции одного или более провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы, содержащий фармацевтически приемлемый носитель и клетки, полученные из ткани пуповины. В одном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Легочным заболеванием может быть хроническое обструктивное заболевание легких, например хронический бронхит или эмфизема.
Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут понятны после изучения следующего подробного описания и примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Приведенное выше краткое описание, а также приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения, будут более понятны при изучении вместе приложенными рисунками. Для целей иллюстрирования настоящего изобретения на рисунках представлены варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами.
На Фиг. 1 приведена суммарная концентрация белка в BALF. Суммарная концентрация белка измерялась с помощью набора Pierce BCA Protein Assay. Каждая точка данных отражает измерения для одного животного. Горизонтальная линия соответствует среднему всех измерений. Проводился анализ T-критерия по Стьюденту. Данные в табличной форме представлены ниже в таблице 1.2.
На Фиг. 2 приводятся результаты анализа цитокинов/хемокинов. На Фиг. 2A приводятся результаты анализа цитокинов/хемокинов в гомогенате легочной ткани: концентрации двадцати двух различных цитокинов/хемокинов определяли для легочного гомогената с использованием набора для мультиплексного анализа 22 мышиных цитокинов на микросферах (Millipore) в соответствии с инструкциями изготовителя и анализировали на приборе BioRad Bioplex. Гистограммы представляют средние значения шести образцов. Данные в табличной форме приведены в таблице 1-3 и 1-4. На Фиг. 2В приведены результаты анализа цитокинов/хемокинов в BALF. Концентрации двадцати двух различных цитокинов/хемокинов определяли в BALF (жидкость бронхоальвеолярного лаважа) с использованием набора для мультиплексного анализа 22 мышиных цитокинов на микросферах (Millipore) в соответствии с инструкциями изготовителя и анализировали на приборе BioRad Bioplex. Гистограммы представляют средние значения шести образцов. Данные в табличной форме приведены в таблице 1-5 и 1-6.
На Фиг. 3 отображен эффект воздействия инфузии hUTC и/или обработки эластазой из поджелудочной железы свиней (PPE) на композицию жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL) на 1, 6, 10 и 14-й день после введения клеток, полученных из ткани пуповины человека (hUTC). На Фиг. 3A приводятся результаты для мышей NSG, а на Фиг. 3B отражены результаты для мышей BALB/c. Отрицательным контролем была имитация инфицирования/сенсибилизации с использованием физиологического раствора и/или несущей среды. Подсчитывали полное количество клеток в жидкости BAL. В каждом случае оценивали 5 (пять) животных. Результаты приводятся в форме среднее ± СОС для количества клеток (*, p<0,05, ***, p<0,001).
На Фиг. 4 отображен эффект воздействия инфузии hUTC и/или обработки эластазой из поджелудочной железы свиней (PPE) на композицию жидкости BAL на 1, 6, 10 и 14-й день после введения hUTC. Отрицательным контролем была имитация сенсибилизации с использованием физиологического раствора и/или несущей среды. Анализировали наличие нейтрофилов и макрофагов в жидкости BAL. В каждом случае оценивали 5 (пять) животных. Результаты приводятся в форме среднее ± СОС для количества клеток (*, p<0,05, ***, p<0,001).
На Фиг. 5 отображен эффект воздействия инфузии hUTC и/или обработки эластазой из поджелудочной железы свиней (PPE) на композицию цитокинов в супернатанте BAL на 1, 6, 10 и 14-й день после введения hUTC мышам NOD/SCIDγ. На Фиг. 5A приведен отклик цитокинов на MCP-1. На Фиг. 5B приведен отклик цитокинов на TNF-α. На Фиг. 5C приведен отклик на TNF-α, и на Фиг. 5D приведен отклик на IL-1β. Ответную реакцию определяли независимо для пяти мышей из группы, и результаты выражены как среднее ± СОС (*, p<0,05).
На Фиг. 6 отображен эффект воздействия инфузии hUTC и/или обработки эластазой из поджелудочной железы свиней (PPE) на композицию супернатанта BAL на 1, 6, 10 и 14-й день после введения hUTC мышам BALB/c. Отклик цитокинов приведен для MCP-1 (см. Фиг. 6A), TNF-α (см. Фиг. 6B), RANTES (см. Фиг. 6C) и IL-1β (см. Фиг. 6D). Ответную реакцию определяли независимо для 5 (пяти) мышей из группы, и результаты выражены как среднее ± СОС (*, p<0,05).
На Фиг. 7 приводятся среднее линейное отсечение (А) и число альвеол (В), полученные при увеличении ×100 и выраженные как среднее ± среднеквадратичное отклонение по 5 (пяти) животным на группу и по периодам времени. Символами обозначены результаты статистического анализа: *p<0,01, **p, 0,005, ***p, 0,001 по сравнению с группой эластазы.
На Фиг. 8 приводятся результаты оценки масштабов эмфизематозного повреждения с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) фиксированных срезов легкого (n = 5 на группу) у контрольных мышей (PBS) или мышей, получавших эластазу (El), терапию эластазой + hUTC (El+hUTC) или только hUTC. Для каждого примера приведено 3 (три) репрезентативных препарата. Исходное увеличение ×100.
На Фиг. 9 показано, что hUTC снижали тяжесть вызванной эластазой эмфиземы у иммунодефицитных мышей (NOD/SCIDγ) на 1, 6, 10 и 14-й день. Эмфизематозное повреждение регистрировали с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) фиксированных срезов легких (n=5 на группу). Исходное увеличение x100.
На Фиг. 10 показано, что hUTC снижали тяжесть вызванной эластазой эмфиземы у иммунокомпетентных мышей (BALB/c) на 1, 6, 10 и 14-й день. Эмфизематозное повреждение регистрировали с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) фиксированных срезов легких (n=5 на группу). Исходное увеличение x100.
На Фиг. 11 отображен эффект воздействия инфузии hUTC и/или обработки эластазой из поджелудочной железы свиней (PPE) на функцию легких на 1, 6, 10 и 14-й день после введения hUTC мышам NOD/SCIDγ (см. Фиг. 11A) и мышам BALB/c (см. Фиг. 11B). Отрицательным контролем была имитация обработки с использованием физиологического раствора и/или несущей среды.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В приведенном ниже подробном описании примерных вариантов осуществления содержатся ссылки на соответствующие рисунки, которые являются частью настоящего изобретения. Такие варианты осуществления описаны достаточно подробно, чтобы дать возможность специалистам в данной области практически использовать настоящее изобретение, и следует понимать, что могут использоваться и другие варианты осуществления и что логические структурные, механические, электрические и химические изменения можно вносить без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. С тем чтобы исключить чрезмерную детализацию, которая не требуется для практического использования специалистами в данной области описанных в настоящем документе вариантов осуществления, в описании может быть опущена определенная информация, известная специалистам в данной области. Поэтому приведенное ниже подробное описание не следует рассматривать как ограничивающее.
Настоящая заявка опирается на открытие способности клеток, полученных из ткани пуповины человека, in vivo модулировать (например, снижать) продукцию провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы, например COPD. В частности, заявители обнаружили, что введение клеток, полученных из ткани пуповины человека, приводит к снижению или даже ингибированию продукции провоспалительных медиаторов заболевания дыхательной системы (например, легочного заболевания, расстройства и/или травмы), например, TNF-α, RANTES, MCP-1 и IL-1β.
Соответственно, в настоящем изобретении приводятся способы использования клеток, полученных из тканей пуповины человека, для модуляции (например, снижения) продукции провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, например COPD, у пациента, страдающего легочным заболеванием. В одном варианте осуществления изобретение относится к снижению или даже ингибированию провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, а потому вызывает смягчение симптомов заболевания. В оптимальном варианте настоящее изобретение относится к постоянной модуляции (например, снижению) продукции и/или ингибированию провоспалительных медиаторов, участвующих в симптомах и/или патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы, в частности, по сравнению с традиционной лекарственной терапией, хирургией и легочной реабилитацией.
I. Определения
В приведенном ниже описании и формуле изобретения применяются различные термины. Такие термины считаются имеющими общепринятое в данной области значение, если не указано иное. Другие явно определенные термины следует толковать согласно приведенным в настоящем документе определениям.
Термин «легочная ткань» может включать в себя, без ограничений, все структуры легочных тканей и связанные с ними ткани, в том числе, среди прочего, вены, артерии, сосуды, капилляры и клетки такого типа, которые являются частью или связаны с такими структурами; легочные и плевральные ткани; гладкие мышцы сосудов, периваскулярные клетки и сосудистые эндотелиальные линии и/или фенотипы.
Применяемая в настоящем документе формулировка «респираторные или легочные заболевания, расстройства и травмы» включает, среди прочего, обструктивные заболевания легких, рестриктивные заболевания легких, инфекции дыхательных путей (верхних и нижних), опухоли дыхательных путей, заболевания плевральной полости и легочные сосудистые заболевания. Повреждение легочной ткани, вызванное такими заболеваниями, расстройствами и/или травмами, может относиться к легочным повреждениям, включенным в объем настоящего изобретения. Кроме того, поврежденная легочная ткань, входящая в объем настоящего изобретения, включает все структуры легочной ткани и связанные с ними ткани, в том числе вены, артерии, сосуды, капилляры и клетки такого типа, которые являются частью или связаны с такими структурами.
«Обструктивные заболевания легких» могут включать хронические обструктивные заболевания легких (COPD) (например хронический бронхит и эмфизему), муковисцидоз, бронхоэктаз, бронхиолит и аллергический бронхолегочный аспергиллез. Например, COPD вызывается токсическими частицами или газами (чаще всего из-за курения), которые приводят к аномальному воспалительному ответу в легких. Воспалительный ответ в крупных дыхательных путях называют хроническим бронхитом, который диагностируется клинически, если пациенты периодически отхаркивают мокроту. В альвеолах воспалительный ответ вызывает разрушение ткани легких, процесс, известный как эмфизема. Следует понимать, что к таким аспектам относятся проблемы, связанные с COPD, поскольку они затрагивают сущность настоящего изобретения. Этиология COPD включает, среди прочего, табакокурение, профессиональные заболевания, связанные с запыленными рабочими местами (например, угледобыча, золотодобыча, хлопковая текстильная промышленность и химическая промышленность), загрязнение воздуха и генетические факторы.
Применяемый в настоящем документе термин «рестриктивные заболевания легких» также подразумевает интерстициальные заболевания легких (ILD). Многие из них являются идиопатическими. К примерам относятся идиопатический легочный фиброз, идиопатическая интерстициальная пневмония (для которой известны несколько типов), саркоидоз, эозинофильная пневмония, лимфангиолейомиоматоз, легочный лангергансоклеточный гистиоцитоз и легочный альвеолярный протеиноз. ILD поражают интерстиций легких: альвеолярный эпителий, легочный капиллярный эндотелий, базальную мембрану, периваскулярные и перилимфатические ткани. Большинство типов ILD связано с фиброзом.
К опухолям дыхательной системы относятся злокачественные и доброкачественные опухоли. К злокачественным опухолям, например, относятся мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких (аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома и крупноклеточная недифференцированная карцинома), лимфома, а также другие формы рака. Доброкачественные опухоли встречаются редко, но к ним могут, например, относиться гамартома легкого и врожденные пороки.
Применяемый в настоящем документе термин «острое повреждение легких» (ALI) относится к диффузному неоднородному повреждению легких, которое характеризуется гипоксемией, некардиогенным отеком легких, низкой податливостью легких и обширной капиллярной утечкой. ALI вызывается любым стимулом локального или системного воспаления. Синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS) относится к более тяжелым нарушениям по сравнению с ALI. Применяемые в настоящем документе термины ALI и ARDS могут характеризоваться резким развитием гипоксемии с диффузным легочным отеком в ответ на прямое или косвенное повреждение. Применяемый в настоящем документе термин «прямое повреждение» включает, среди прочего, повреждения легких, связанные с утоплением, пневмонией, вдыханием токсичных газов и легочными контузиями. Применяемый в настоящем документе термин «косвенное повреждение» предполагает такие причины, как острый сепсис, трансфузия, шок и панкреатит. Такие повреждения, которые приводят к ALI и ARDS, вызывают нарушения границы альвеола-капилляр, утечку богатой белками жидкости в интерстициальную и альвеолярную полости, массовый выброс цитокинов и миграцию нейтрофилов.
Специалистам в данной области известны легочные заболевания, расстройства и травмы, входящие в сферу способов настоящего изобретения. Специалистам в данной области также известны характеристики каждого из них, в том числе осложнения, этиология и лечение. Сюда относятся легочные заболевания, расстройства и травмы, которые специально не обсуждаются в настоящем документе, поскольку они связаны с обструктивными и рестриктивными легочными заболеваниями, расстройствами и травмами.
Клетки, применяемые в настоящем изобретении, обычно называют постнатальными клетками или клетками, полученными в постнатальный период (PPDC). Более конкретно, данные клетки являются «клетками, полученными из пупка», «клетками, полученными из пуповины» (UDC) или «клетками, полученными из ткани пуповины» (UTC). Кроме того, клетки могут быть описаны как являющиеся стволовыми клетками или клетками-предшественниками, причем последний термин применяется в широком смысле. Термин «полученный из» применяется для указания того, что клетки были получены из их биологического источника и были выращены или иным образом обработаны in vitro (например, культивированы в ростовой среде для размножения популяции и/или получения клеточной линии). Манипуляции in vitro над пуповинными стволовыми клетками и уникальные характеристики клеток, полученных из пуповины, которые составляют предмет настоящего изобретения, более подробно описаны ниже.
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяющиеся по способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться для получения клеток-потомков, включая самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и способствовать образованию по существу большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
По своему потенциалу развития стволовые клетки разделяются на: (1) тотипотентные; (2) плюрипотентные; (3) мультипотентные; (4) олигопотентные; (5) унипотентные. Тотипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных и внеэмбриональных клеток. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток. Мультипотентные клетки содержат клетки, способные преобразовываться в подмножество клеточных линий дифференцировки, но только в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы. Например, гемопоэтические стволовые клетки (HSC) могут порождать клетки-потомки, которые включают в себя HSC (самообновление), рестриктированные олигопотентные клетки-предшественники клеток крови и все типы и элементы клеток (например, тромбоциты), представляющие собой стандартные компоненты крови. Клетки, которые являются олигопотентными, способны преобразовываться в более ограниченное подмножество клеточных линий дифференцировки, чем мультипотентные стволовые клетки. Клетки, которые являются унипотентными, способны преобразовываться в единственную клеточную линию дифференцировки (например, сперматогенные стволовые клетки).
Стволовые клетки также разделяются на категории по источнику их получения. Взрослая стволовая клетка по существу представляет собой мультипотентную недифференцированную клетку, присутствующую в ткани, содержащей множество дифференцированных видов клеток. Взрослая стволовая клетка способна к самообновлению. В нормальных условиях они также могут дифференцироваться для получения специализированных типов клеток той ткани, в которой они находятся, и, возможно, тканей других типов. Эмбриональная стволовая клетка представляет собой плюрипотентную клетку из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты. Фетальная стволовая клетка представляет собой клетку, происходящую из фетальных тканей или мембран. Постнатальная стволовая клетка является мультипотентной или плюрипотентной клеткой, которая по существу происходит из внеэмбриональной ткани, доступной после родов, а именно из пуповины. Известно, что данные клетки обладают признаками, характерными для плюрипотентных стволовых клеток, включая быструю пролиферацию и потенциал дифференцировки в клетки многих линий дифференцировки. Постнатальные стволовые клетки могут быть получены из крови (например, из пуповинной крови) или не из крови (например, из отличных от крови тканей пуповины).
Для описания клеток в процессе культивирования применяются различные термины. «Культура клеток» по существу обозначает клетки, взятые из живого организма и выращенные «в условиях культуры» или «культивированные». Первичная культура клеток обозначает культуру клеток, тканей или органов, взятых непосредственно из организма (-ов) до первого пересева. Клетки размножают в культуре, когда их помещают в ростовую среду в условиях, облегчающих рост и/или деление клеток, что приводит к большей популяции клеток. При размножении клеток в культуре скорость пролиферации клеток иногда измеряют по количеству времени, которое необходимо клеткам для удвоения численности. Данное время называют «временем удвоения».
Термин «клеточная линия» по существу относится к популяции клеток, полученной в результате одного или более пересевов первичной клеточной культуры. Каждый цикл пересева называют пассажем. Когда клетки пересеиваются, их называют «пассированными». Конкретная популяция клеток, или клеточная линия, иногда описывается или характеризуется числом выполненных с ней пассирований. Например, пассированная 10 раз культивируемая популяция клеток может описываться как культура десятого пассажа, или культура P10. Первичная культура, т.е. первая культура после выделения клеток из ткани, обозначается P0. После первого пересева клетки описываются как вторичная культура (P1, или культура первого пассажа). После второго пересева клетки превращаются в третичную культуру (P2, или культура второго пассажа) и т.д. Специалист в данной области определит, что за промежуток времени между последовательными пассированиями популяция клеток может многократно удваиваться; следовательно, количество удвоений популяции в культуре больше номера пассажа. Степень размножения клеток (т.е. число удвоений популяции) за промежуток времени между пассированиями зависит от многих факторов, включая, без ограничений, плотность посева, тип подложки, тип среды, условия роста и продолжительность времени между пассированиями.
«Дифференцировка» представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная «некоммитированная» или менее специализированная клетка приобретает характеристики специализированной клетки, например, такой как нервная клетка или мышечная клетка. «Дифференцированная» клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное «коммитированное» положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированной (или коммитированной) позиции в клеточной линии дифференцировки. Применяемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» означает наследственность клетки, т.е. из каких клеток произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки.
В широком смысле «клетка-предшественник» представляет собой клетку, обладающую способностью образовывать клетки-потомки, которые будут более дифференцированы по сравнению с ней, и при этом сохраняющую способность к восполнению пула клеток-предшественников. Согласно данному определению, стволовые клетки также сами являются клетками-предшественниками, как и более непосредственные предшественники окончательно дифференцированных клеток. При описании клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, как более подробно описано ниже, можно применять данное широкое определение клетки-предшественника. В более узком смысле клетку-предшественника часто определяют как клетку, которая является промежуточным предшественником в процессе дифференцировки, т.е. она происходит из стволовой клетки и является промежуточным звеном при продукции зрелого вида клеток или подмножества видов клеток. Клетки-предшественники данного типа по существу не способны к самообновлению. Соответственно, при отсылке к клетке данного типа в настоящем документе она будет называться «необновляющейся клеткой-предшественником» или «промежуточной клеткой-предшественником».
В отношении трансплантации клеток или тканей, или заместительной клеточной терапии в настоящем документе применяется несколько терминов. В настоящем документе термины «аутогенный перенос», «аутогенная трансплантация», «аутогенный трансплантат» и т.п. относятся к лечению, в котором донор трансплантата также является получателем трансплантата или клетки. В настоящем документе термины «аллогенный перенос», «аллогенная трансплантация», «аллогенный трансплантат» относятся к трансплантации, в которой донор трансплантата является представителем того же биологического вида, что и получатель трансплантата, но не является получателем. Клеточный трансплантат, в котором клетки донора были подобраны с точки зрения гистосовместимости с телом получателя, иногда называют «сингенным переносом». В настоящем документе термины «ксеногенный перенос», «ксеногенная трансплантация», «ксеногенный трансплантат» и т.п. относятся к трансплантации, в которой донор трансплантата является представителем другого биологического вида по сравнению с получателем трансплантата.
Термины «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемая среда», которые можно применять взаимозаменяемо с терминами «биологически совместимый носитель» или «биологически совместимая среда», по существу относятся к реагентам, клеткам, соединениям, материалам, композициям и/или дозированным формам, которые не только совместимы с вводимыми в терапевтических целях клетками и другими агентами, но которые также могут применяться в контакте с тканями людей или животных, не вызывая чрезмерную токсичность, раздражение, аллергическую реакцию или другое осложнение, соразмерное с разумным соотношением пользы/риска от применения.
«Кондиционированная среда» представляет собой среду, в которой культивируют и из которой затем удаляют конкретную клетку или популяцию клеток. При культивировании в среде клетки могут секретировать клеточные факторы, которые обеспечивают трофическую поддержку для других клеток. Такие трофические факторы включают, помимо прочего, гормоны, цитокины, внеклеточный матрикс (ECM), белки, везикулы, антитела и гранулы. Среду, содержащую клеточные факторы, называют кондиционированной средой.
По существу, «трофический фактор» определяют как вещество, стимулирующее выживаемость, рост, пролиферацию и/или созревание клетки или стимулирующее повышенную активность клетки.
Применяемый в настоящем документе термин «ростовая среда» по существу относится к среде, достаточной для культивирования постнатальных клеток. В частности, одной предпочтительной в настоящее время средой для культивирования клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, является модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM). Особенно предпочтительной является среда DMEM с низким содержанием глюкозы (DMEM-LG) (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния). В среду DMEM-LG предпочтительно добавляют сыворотку, наиболее предпочтительно - фетальную бычью сыворотку или сыворотку человека. Как правило, добавляют 15% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (например фетальной бычьей сыворотки определенного состава, Hyclone, г. Логан, штат Юта) вместе с антибиотиками/антимикотиками, предпочтительно 100 единиц/миллилитр пенициллина, 100 миллиграмм/миллилитр стрептомицина и 0,25 микрограмма/миллилитр амфотерицина B; (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) и 0,001% (об./об.) 2-меркаптоэтанола (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). В некоторых случаях применяют другие ростовые среды или добавляют в них другие компоненты; обычно они указаны в тексте в качестве добавок в ростовую среду. В некоторых химически определенных средах клетки можно выращивать вообще без наличия сыворотки. В таких случаях клеткам могут потребоваться определенные факторы роста, которые можно добавить в среду для поддержки и подпитывания клеток. В настоящее время предпочтительные факторы для добавления при выращивании в бессывороточной среде включают в себя один или более из bFGF, EGF, IGF-I и PDGF. В более предпочтительных вариантах осуществления в бессывороточную или химически определенную среду добавляют два, три или все четыре фактора. В других вариантах осуществления для поддержания или улучшения роста клеток в бессывороточную среду добавляют фактор, ингибирующий лейкоз (LIF).
2
Применяемый в настоящем документе термин «стандартные условия роста» относится к культивированию клеток при 37°C в стандартной атмосфере, содержащей 5% CO, и при относительной влажности около 100%. Хотя описанные выше условия можно применять при культивировании клеток, следует понимать, что специалист в данной области, принимая во внимание возможности культивирования клеток, известные в данной области, вполне может варьировать такие условия.
Применяемый в настоящем документе, термин «приблизительно», когда он относится к измеряемому значению, такому как количество, длительность времени и т. п., означает колебания в пределах ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1% от установленного значения, в зависимости от того, какие колебания подходят для осуществления раскрываемых способов.
3
11
4
Термин «эффективное количество» относится к концентрации или количеству соединения, материала или композиции, как описано в настоящем документе, которое позволяет эффективно достигать определенного биологического результата. К таким результатам, среди прочего, относятся регенерация, восстановление или улучшение скелетной ткани, улучшение кровотока и/или стимулирование и/или обеспечение ангиогенеза у пациентов с повреждением легких вследствие таких заболеваний, расстройств и травм, которые входят в объем настоящего изобретения. Такое эффективное воздействие может достигаться, например, при введении клеток и/или композиций настоящего изобретения пациентам, страдающим заболеваниями, которые описаны в настоящем документе. В отношении вводимых пациенту клеток UTC in vivo эффективное количество может означать диапазон от нескольких сотен или менее до нескольких миллионов или более. В конкретных вариантах осуществления эффективное количество может находиться в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 10, более конкретно, составлять по меньшей мере приблизительно 10 клеток. Следует понимать, что количество подлежащих введению клеток будет меняться в зависимости от специфики провоспалительного медиатора, участвующего в патологии модулируемого легочного заболевания, расстройства или травмы, в том числе, без ограничений, от размера и/или суммарного объема/площади поверхности обрабатываемой области и от близости места введения к обрабатываемой области, среди прочих факторов, известных медицинскому биологу.
Термины «лечить» или «лечение» относятся к любому успеху или признаку успеха в ослаблении или облегчении симптомов травмы, патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как ослабление боли, ремиссия, ослабление симптомов или перевод травмы, патологии или состояния в легче переносимую пациентом форму, замедление скорости развития дегенеративных изменений или угасания функции, перевод итоговой точки дегенеративных изменений в менее угнетающую для пациента форму, улучшение общего физического или умственного состояния пациента или продление выживаемости. Лечение или облегчение симптомов может основываться на объективных или субъективных параметрах, включая результаты врачебного осмотра или неврологического осмотра.
В настоящем документе термины «эффективный период», «эффективный период времени» или «эффективные условия» по существу обозначают период времени или другие контролируемые условия (например температуру, влажность для способов in vitro), необходимые или предпочтительные для получения предполагаемых результатов от применения агента или фармацевтической композиции.
Термины «индивид», «пациент» или «субъект» в настоящем документе применяются как взаимозаменяемые и относятся к животным, предпочтительно млекопитающим, более предпочтительно - к человеку, на которых направлено лечение с использованием фармацевтических или терапевтических композиций или в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.
Применяемый в настоящем документе термин «матрица» по существу относится к биологически разлагаемым и/или биорассасывающимся материалам, которые вводят пациенту вместе с клетками. Матрица также может выполнять функцию временного каркаса до ее замены вновь выросшими клетками, такими как клетки скелетной мышцы, периваскулярные клетки, гладкие мышцы сосудов или ткань эндотелия сосудов. В некоторых вариантах осуществления матрица может обеспечивать замедленное высвобождение трофических функций или других агентов, применяемых вместе с клетками, и может формировать структуру для роста формирующейся ткани в организме у пациента. В других вариантах осуществления матрица просто обеспечивает временный каркас для развивающейся ткани. Матрица может быть выполнена в форме отдельных частиц (макрочастицы диаметром более 10 микрон или микрочастицы диаметром менее 10 микрон), либо она может иметь форму структурно устойчивого трехмерного имплантата (например, каркаса). Матрица может представлять собой взвесь, гидрогель или трехмерную структуру, например, куб, цилиндр, трубку, блок, пленку, лист или соответствующую анатомическую форму.
Применяемый в настоящем документе термин «каркас» обычно относится к трехмерной пористой структуре, которая обеспечивает шаблон для роста клеток. Каркас изготавливается из биологически разлагаемых и/или биорассасывающихся материалов, которые со временем распадаются внутри организма. Продолжительность времени распада каркаса может зависеть от молекулярного веса материалов. Поэтому материал с более высоким молекулярным весом может образовывать полимерные каркасы, которые сохраняют свою структурную целостность в течение более продолжительных периодов времени; тогда как в случае более низких молекулярных весов высвобождение будет более медленным при более коротком времени жизни каркаса. Каркас можно изготавливать с помощью любых способов, известных специалистам в данной области. К примерам полимеров, которые могут применяться для формирования каркаса, относятся природные и синтетические полимеры.
Применяемый в настоящем документе термин «выделенная» по существу относится к клетке, которая была отделена от ее естественной среды. Данный термин включает грубое физическое отделение от естественной среды, например, путем удаления у животного-донора. В предпочтительных вариантах осуществления выделенная клетка не находится в ткани, т.е. клетка отделена или разобщена с соседними клетками, с которыми она контактирует в нормальных условиях. Предпочтительно вводить клетки в виде клеточной суспензии. Применяемый в настоящем документе термин «клеточная суспензия» включает клетки, которые контактируют со средой и были разобщены, например, путем осторожного измельчения фрагмента ткани.
Применяемый в настоящем документе термин «модуляция» по существу означает коррекцию или регулирование продукции, активности и/или количеств провоспалительного медиатора, участвующего в патологиях (например, проявлениях заболевания, таких как изменения легочной ткани) легочного заболевания, расстройства и/или травмы. В одном варианте осуществления термин модуляция включает снижение продукции провоспалительного медиатора. В другом варианте осуществления термин модуляция включает ингибирование продукции провоспалительного медиатора.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем изобретении, рассматриваются способы и фармацевтические композиции для модулирования (например, снижения или ингибирования) продукции провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочных заболеваний, расстройств и/или травм, которые используют клетки-предшественники и клеточные популяции, полученные из постнатальных тканей, в частности, тканей пуповины. Такие способы и фармацевтические композиции призваны модулировать (снижать и/или ингибировать) продукцию таких провоспалительных медиаторов. Кроме того, в некоторых случаях они могут предназначаться для стимулирования и обеспечения ангиогенеза для улучшения кровотока, регенерации, восстановления и улучшения тканей легких, поврежденных легочным заболеванием, расстройством и/или травмой, и/или для защиты легочной ткани от таких заболеваний, расстройств и/или травм.
Клетки, популяции клеток и препараты, содержащие клеточные лизаты, кондиционированные среды и т.п., применяемые в фармацевтических препаратах и способах, составляющих предмет настоящего изобретения, подробно описаны в публикациях патентов США №№ 7524489 и 7510873, и в опубликованной заявке на патент США № 2005/0058634, и в настоящем документе.
II. Выделение и рост клеток, полученных из ткани пуповины
В соответствии со способами, описанными в настоящем документе, пуповину млекопитающего получают по завершении доношенной или недоношенной беременности, например, после отделения последа или вскоре после родов. Ткань постнатального материала можно транспортировать с места родов в лабораторию в стерильном контейнере, например, в колбе, лабораторном стакане, чашке для культивирования или пакете. Контейнер может содержать раствор или среду, включая, без ограничений, солевой раствор, такой как модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) (также известный как минимальная эссенциальная среда Игла) или фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), либо любой раствор, применяемый для транспортировки органов, применяемых для трансплантации, например, раствор, разработанный в Висконсинском университете, либо перфторированный раствор. В среду или буферный раствор можно добавить один или более антибиотиков и/или антимикотиков, включая, без ограничений, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B, гентамицин и нистатин. Ткань постнатального материала можно промыть в растворе антикоагулянта, таком как гепаринсодержащий раствор. До извлечения клеток UTC ткань предпочтительно следует хранить при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 10°C. Еще более предпочтительно не замораживать ткань до извлечения клеток UTC.
Выделение клеток UTC предпочтительно проводить в асептических условиях. Пуповину можно отделить от плаценты с использованием средств, известных специалистам в данной области. Перед выделением клеток UTC из ткани постнатального материала предпочтительно удалить кровь и продукты распада клеток. Например, ткань постнатального материала можно промыть в буферном растворе, включая, без ограничений, фосфатно-солевой буферный раствор. Промывочный буферный раствор также может содержать один или более антимикотиков и/или антибиотиков, включая, без ограничений, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B, гентамицин и нистатин.
Ткань постнатального материала, представляющую собой цельную пуповину, или ее фрагмент, или часть, предпочтительно механически измельчают (используя разрезающее или сдвиговое усилие). В предпочтительном в настоящее время варианте осуществления в процедуре выделения клеток также используют способ ферментативного расщепления. Специалистам в данной области известно множество ферментов, которые можно использовать для выделения отдельных клеток из сложных тканевых матриц для облегчения их выращивания в культуре. В продаже доступны следующие расщепляющие ферменты: от слабо расщепляющих (например, дезоксирибонуклеазы и диспаза (нейтральная протеаза)) до сильно расщепляющих (например, папаин и трипсин). Неполный перечень таких ферментов содержит ферменты с муколитической активностью, металлопротеазы, нейтральные протеазы, серинпротеазы (такие как трипсин, химотрипсин или эластаза) и дезоксирибонуклеазы. В настоящее время предпочтительными являются ферменты с активностью, выбранные из металлопротеаз, нейтральных протеаз и ферментов с муколитической активностью. Например, известно использование коллагеназ для выделения различных клеток из тканей. Дезоксирибонуклеазы могут расщеплять одноцепочечные ДНК и позволяют свести к минимуму агглютинацию клеток в процессе выделения. Предпочтительные способы включают ферментативную обработку с использованием коллагеназы и диспазы, либо коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы. Специалисту в данной области будет очевидно, что многие из вариантов такой ферментативной обработки хорошо известны в области и применяются для выделения клеток из различных источников тканей, и он будет в состоянии провести оценку новых или дополнительных ферментов или их комбинаций с точки зрения их пригодности для выделения клеток настоящего изобретения. Предпочтительная ферментативная обработка может проводиться в течение примерно от 0,5 до 2 часов или дольше. В некоторых вариантах осуществления ткань инкубируют при температуре приблизительно 37°C в процессе ферментативной обработки на стадии диссоциации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань постнатального материала разделяют на части, содержащие различные аспекты ткани, такие как, например, неонатальный, неонатальный/материнский и материнский аспекты плаценты. Разделенные части затем диссоциируют с использованием механической и/или ферментативной диссоциации в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. Клетки неонатальных или материнских линий можно идентифицировать любыми средствами, известными специалистам в данной области, например, с использованием анализа кариотипа или гибридизации in situ на Y-хромосому.
Выделенные клетки можно применять для того, чтобы инициировать или провести посев клеточных культур. Выделенные клетки переносят в стерильные сосуды для культивирования ткани без покрытия или с покрытием внеклеточным матриксом или лигандами, такими как ламинин, коллаген (нативный, денатурированный или сшитый), желатин, фибронектин и другие белки внеклеточного матрикса. Клетки культивируют в любой культуральной среде, способной поддерживать рост клеток, такой как, без ограничений, среда DMEM (с высоким или низким содержанием глюкозы), улучшенная среда DMEM, среда DMEM/MCDB 201, основная среда Игла, среда Хэма F10 (F10), среда Хэма F12 (F12), модифицированная по способу Искова среда Дульбекко, ростовая среда для мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM), среда DMEM/F12, среда RPMI 1640 и среда, не содержащая сыворотку/субстрат, доступная в продаже под торговым наименованием CELL-GRO-FREE (MediatechGRO, г. Херндон, штат Вирджиния). В культуральную среду можно дополнительно ввести один или более компонентов, включая, например, фетальную бычью сыворотку (FBS), предпочтительно в количестве около 2–15% (об/об); сыворотку лошади (ES); сыворотку человека (HS); бета-меркаптоэтанол (BME или 2-ME), предпочтительно в количестве около 0,001% (об/об); один или более факторов роста, например, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор ингибирования лейкоцитов (LIF) и эритропоэтин (EPO); аминокислоты, включая L-валин; и один или более из антибиотиков и/или антимикотиков для борьбы с микробактериальным заражением, таких как, например, пенициллин G, сульфат стрептомицина, амфотерицин B, гентамицин и нистатин, индивидуально или в комбинации. Культуральная среда предпочтительно содержит ростовую среду (например, DMF-M с низким содержанием глюкозы, сыворотку, BME и антибиотик).
2
2
2
Клетки высевают в сосуды для культивирования с плотностью, позволяющей клеткам расти. В одном варианте осуществления клетки культивируют в атмосфере с содержанием CO от приблизительно 0% до приблизительно 5% об. В некоторых других вариантах осуществления клетки культивируют в атмосфере с содержанием O от приблизительно 2% до приблизительно 25%, предпочтительно в атмосфере с содержанием O от приблизительно 5% до приблизительно 20%. Клетки предпочтительно культивируют при температуре от приблизительно 25°C до приблизительно 40°C и более предпочтительно культивируют при температуре 37°C. Клетки предпочтительно культивируют в инкубаторе. Среда в сосуде для культивирования может быть неподвижной или возбужденной, например, с применением биореактора. Клетки UTC предпочтительно выращивают в условиях низкого окислительного стресса (например, с добавлением глутатиона, витамина C, каталазы, витамина E, N-ацетилцистеина). При использовании в настоящем документе, термин «условия низкого окислительного стресса» обозначает условия отсутствия или минимального свободнорадикального повреждения культивируемых клеток.
Способы выбора наиболее предпочтительной культуральной среды, подготовки среды и методик культивирования клеток хорошо известны в данной области и описаны в ряде источников, включая руководства Doyle et al., (ред.), 1995 г., Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, г. Чичестер; и Ho and Wang (ред.), 1991 г., Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, г. Бостон, которые включены в настоящий документ путем ссылки.
В некоторых вариантах осуществления клетки UTC пассируют или переносят в отдельный сосуд для культивирования, содержащий свежую среду того же типа или другого типа по сравнению с первоначально примененной, в котором популяцию клеток можно митотически размножить. Клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, можно применять на любой стадии от пассажа 0 до старения. Клетки предпочтительно пассируют от приблизительно 3 до приблизительно 25 раз, более предпочтительно пассируют от приблизительно 4 до приблизительно 12 раз и предпочтительно пассируют 10 или 11 раз. Для подтверждения выделения клональной популяции клеток можно провести клонирование и/или субклонирование.
В некоторых аспектах настоящего изобретения различные типы клеток, присутствующие в постнатальной ткани, фракционируют на субпопуляции, из которых можно выделить клетки UTC. Фракционирование или отбор можно осуществить с применением стандартных методик разделения клеток, включая, без ограничений, ферментативную обработку для диссоциации ткани постнатального материала на составляющие ее клетки с последующим клонированием и отбором определенных видов клеток, включая, без ограничений, отбор на основе морфологических и/или биохимических маркеров; селективный рост желательных клеток (положительный отбор); селективное разрушение нежелательных клеток (отрицательный отбор); разделение на основе различной способности клеток в смешанной популяции к агглютинации, например с соевым агглютинином; процедуры заморозки-разморозки; различие адгезионных характеристик клеток в смешанной популяции; фильтрование; стандартное и зональное центрифугирование; элютриационное центрифугирование (противоточное центрифугирование); разделение при нормальном поле тяжести; противоточное распределение; электрофорез; сортировку флуоресцентноактивированных клеток (FACS).
Культуральную среду меняют по необходимости, например, путем осторожной аспирации среды из чашки с помощью пипетки и добавления требуемого количества свежей среды. Инкубацию продолжают до накопления в чашке достаточного количества или плотности клеток. После этого можно удалить срезы любой исходной эксплантированной ткани и отделить остальные клетки от чашки трипсинизации с применением стандартных методик или скребка для клеток. После трипсинизации клетки собирают, переносят в свежую среду и инкубируют, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления среду заменяют по меньшей мере один раз приблизительно через 24 часа после трипсинизации для удаления плавающих клеток. Оставшиеся в культуре клетки считают клетками UTC.
Клетки UTC могут криоконсервироваться. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления, более подробно описанном ниже, клетки UTC для аутогенного переноса (либо для матери, либо для ребенка) могут быть получены из соответствующих постнатальных тканей после рождения ребенка и затем криоконсервировать их таким образом, чтобы впоследствии они были доступны в случае возникновения необходимости в трансплантации.
III. Характеристики клеток, полученных из ткани пуповины
Примеры клеток UTC, полученных из ткани пуповины, которые пригодны для применения в способах формулы изобретения, применениях, фармацевтических композициях и наборах, депонированы в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) (10801 University Blvd., г. Манассас, штат Виргиния 20110) 10 июня 2004 года, и им присвоены следующие номера доступа ATCC: (1) штамму UMB 022803 (P7) присвоен № доступа PTA-6067; (2) штамму UMB 022803 (P17) присвоен № доступа PTA-6068.
Клетки UTC могут быть охарактеризованы, например, по ростовым характеристикам (например, способности к удвоению популяции, времени удвоения, количеству пассажей до старения), анализу кариотипа (например, нормальный кариотип; материнская или неонатальная линия), проточной цитометрии (например, анализ FACS), иммуногистохимически и/или иммуноцитохимически (например на обнаружение эпитопов), по профилю экспрессии генов (например с использованием генных чипов; полимеразной цепной реакции (например, ПЦР с обратной транскриптазой, ПЦР в реальном времени и стандартной ПЦР)), по белковым чипам, по секреции белков (например по анализу коагулирующей активности плазмы или анализу среды, кондиционированной плазмацитоидными дендритными клетками (ПДК), например, с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА)), реакции смешанной культуры лимфоцитов (например как меры стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)) и/или другими способами, известными в данной области.
Поэтому клетки UTC, пригодные для применения в настоящем изобретении, определяются сочетанием одной или нескольких следующих характеристик: (1) параметры роста; (2) продукция определенных белков; (3) экспрессия гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышена для определенных генов; (4) экспрессия гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, снижена для определенных генов; (5) секреция или отсутствие секреции трофических факторов; (6) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения для клеток UCT могут быть характерны один или несколько следующих параметров роста: для роста в культуре им требуется L-валин; они способны к росту в атмосферах, содержащих от приблизительно 5% до приблизительно 20% кислорода; они имеют потенциал по меньшей мере для приблизительно 40 удвоений в культуре до старения; они закрепляются и развиваются на сосудах тканевой культуры, которые не покрыты или покрыты желатином, ламинином, коллагеном, полиорнитином, витронектином или фибронектином. В определенных вариантах осуществления клетки UTC также могут обладать нормальным кариотипом, который поддерживается при пассировании клеток. Способы кариотипирования доступны и известны специалистам в данной области.
В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по продукции определенных белков, включая (1) продукцию по меньшей мере одного из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц; и (2) продукцию по меньшей мере одного из маркеров клеточной поверхности CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, PD-L2 и HLA-A, B, C по результатам анализа с использованием проточной цитометрии. В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по отсутствию продукции по меньшей мере одного из маркеров клеточной поверхности CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G и HLA-DR, DP, DQ по результатам анализа с использованием проточной цитометрии. В одном варианте осуществления для клеток характерно отсутствие продукции CD45 и CD117. В некоторых вариантах осуществления клетки продуцируют по меньшей мере два из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц. В других вариантах осуществления клетки продуцируют все три из тканевого фактора белков, виментина и альфа-актина гладких мышц.
В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по экспрессии гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышена для гена, кодирующего по меньшей мере один из интерлейкина-8; ретикулона-1; CXCL1 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд-1/стимулятор активности роста меланомы, альфа); CXCL6 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд-6/хемотаксический белок гранулоцитов 2); CXCL3 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд-3); TNFAIP3 (индуцируемый фактором некроза опухоли альфа белок 3). В одном варианте осуществления клетки UTC можно охарактеризовать по экспрессии гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышена для гена, кодирующего по меньшей мере один из интерлейкина-8; ретикулона-1 и хемокинового (мотив С-Х-С) лиганда-3; фактор некроза опухоли.
В еще одном варианте осуществления клетки UTC также можно охарактеризовать по экспрессии гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, понижена для гена, кодирующего по меньшей мере один из: SHOX2 (содержащий гомеобокс ген низкорослости 2); HSPB2 (27 кДа белок теплового шока 2); CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд-12/стромальный фактор 1); эластина (надклапанный аортальный стеноз, синдром Вильямса-Бойрена); мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp586M2022 (из клона DKFZp586M2022); Meox2 (содержащий мезенхимальный гомеобокс ген 2, содержащий гомеобокс блокировки роста ген); SIX1 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 1) (Drosophila); кристаллина, альфа B; DAAM2 (ассоциированный с белком Disheveled активатор морфогенеза 2); белка DKFZP586B2420; аналога нейтралина 1; тетранектина (связывающийся с плазминогеном белок); STAC (ген, содержащий домен src-гомологии 3 (SH3) и богатый цистеином домен); холестерин-25-гидроксилазы; RUNX3 (связанный с карликовостью фактор транскрипции 3); рецептора интерлейкина-11, альфа; PCOLCE (усилитель проколлаген-C-эндопептидазы); FZD7 (гомолог frizzled-7) (Drosophila); гипотетического гена BC008967; коллагена, тип VIII, альфа 1; TNC (тенасцин C, гексабрахион); IRX5 (содержащий гомеобокс IRX белок 5); гефестина; интегрина, бета 8; SV2A (гликопротеин синаптической везикулы 2); NBL1 (нейробластома, ген подавления онкогенности 1); IGFBP2 (связывающийся с инсулиноподобным фактором роста белок 2), 36 кДа; кДНК FLJ12280 fis Homo sapiens, клон MAMMA1001744; CRLF1 (подобный цитокиновому рецептору фактор 1); KCNN4 (активируемый кальцием калиевый канал средней/низкой проводимости, подсемейство N, член 4); интегрина, бета 7; транскрипционного коактиватора с мотивом связывания с PDZ (TAZ); SIX2 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 2) (Drosophila); белка KIAA1034; VAMP5 (везикуло-ассоциированный мембранный белок 5/миобревин); EFEMP1 (содержащий EGF фибулинподобный белок внеклеточного матрикса 1); EGR3 (белок раннего ростового ответа 3); DLX5 (содержащий гомеобокс distal-less ген 5); гипотетический белок FLJ20373; AKR1C3 (альдокеторедуктаза семейства 1, член C3/3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназа, тип II); бигликана; транскрипционного коактиватора с мотивом связывания с PDZ (TAZ); фибронектина 1; проэнкефалина; интегрина, бета-подобного 1 (с доменами EGF-подобных повторов); мРНК Homo sapiens, полноразмерная вставка кДНК, клон EUROIMAGE 1968422; EphA3; белка KIAA0367; NPR3 (рецептор натрийуретического пептида C/гуанилатциклаза C/рецептор атрионатрийуретического пептида C); гипотетического белка FLJ14054; мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564B222 (из клона DKFZp564B222); генома белка, подобного белку 3, взаимодействующему с BCL2/белком аденовируса E1B 19 кДа; AE-связывающего белка 1; COX7A1 (полипептид 1 субъединицы VIIa цитохром c оксидазы) (мышечный).
В других вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать секрецией по меньшей мере одного из MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1β, I309, MDC, RANTES и TIMP, которые определялись при культивировании клеток in vitro в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления клетки UTC можно охарактеризовать отсутствием секреции по меньшей мере одного из TGF-бета2, ANG2, PDGFbb, MIP1α и VEGF, которые определялись, например, по ИФА, при культивировании клеток in vitro в клеточной культуре.
В предпочтительных вариантах осуществления клетки не экспрессируют hTERT или теломеразу. Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой клетки, полученные из пуповины, которые не экспрессируют hTERT или теломеразу (hTert) и которые обладают одной или более из характеристик, раскрытых в настоящем документе.
В предпочтительных вариантах осуществления клетки включают одну или более из перечисленных выше характеристик. Более предпочтительны клетки, включающие три, четыре, пять или более характеристик. Еще более предпочтительны клетки UTC, которые включают шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или более характеристик. Еще более предпочтительны клетки, включающие все из перечисленных выше характеристик.
В одном варианте осуществления клетки UTC получают из ткани пуповины, по существу свободной от крови; эти клетки способны к самообновлению и размножению в культуре, требуют для роста L-валин, могут расти в атмосфере с содержанием кислорода по меньшей мере приблизительно 5% и включают по меньшей мере одну из следующих характеристик: (1) потенциал для по меньшей мере приблизительно 40 удвоений в культуре; (2) способность закрепляться и развиваться на сосудах тканевой культуры, которые не покрыты или покрыты желатином, ламинином, коллагеном, полиорнитином, витронектином или фибронектином; (3) продукция виментина и альфа-актина гладких мышц; (4) продукция CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90; (5) экспрессия гена, которая, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышена для гена, кодирующего интерлейкин-8 и ретикулон-1. В некоторых вариантах осуществления подобные клетки UTC не продуцируют CD45 и CD117.
В одном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессируют CD31, CD34 или CD45; и/или (iii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В другом варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 или CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Данные клетки UTC необязательно экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или не экспрессируют CD31 или CD34; и/или экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В другом варианте осуществления изобретения клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Данные клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессируют CD31 или CD34; и/или (iii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В альтернативном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT и теломеразу. Данные клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессируют CD31 или CD34; и/или (iii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В другом варианте осуществления клетки выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117, CD34, CD31 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Данные клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессируют CD45; и/или (iii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В еще одном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117, CD45, CD34, CD31 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iii) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (iv) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В альтернативном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117, CD45, CD34, CD31 и не экспрессируют hTERT и теломеразу. Клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iii) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (iv) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В еще одном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре и обладают следующими характеристиками: отсутствие продукции CD117 и CD45; отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы; экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3; экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В другом варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре и обладают следующими характеристиками: отсутствие продукции CD117 и CD45; отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы; экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В еще одном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре и обладают следующими характеристиками: отсутствие продукции CD117 и CD45; отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы; экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90.
В еще одном варианте осуществления клетки UTC выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре и обладают следующими характеристиками: потенциал к по меньшей мере 40 удвоениям в культуре; продукция CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, PD-L2 и HLA-A, B, C; отсутствие продукции CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G и HLA-DR, DP, DQ по результатам анализа с использованием проточной цитометрии; повышенная экспрессия интерлейкина-8, ретикулона-1 и хемокинового (мотив С-Х-С) лиганда-3 по сравнению с клеткой человека, которая представляет собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости; отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы.
Описанные выше клетки UTC можно применять в способах модулирования (например, снижение и/или ингибирование) продукции провоспалительных медиаторов легочных заболеваний у пациента, страдающего легочным заболеванием. Они также могут применяться в фармацевтических композициях для модулирования (снижения и/или ингибирования) продукции провоспалительных медиаторов легочных заболеваний у пациента, страдающего легочным заболеванием, при этом такие составы, например, содержат клетки, обладающие перечисленными характеристиками, и фармацевтически приемлемый носитель, и могут применяться в наборах для получения, использования и практического применения таких способов и фармацевтических композиций, которые описаны и приводятся в примерах в настоящем документе. Кроме того, описанные выше клетки UTC можно применять для получения препаратов, таких как клеточные экстракты и субклеточные фракции, которые можно применять для получения, использования и применения на практике таких способов и фармацевтических композиций, которые описаны и приводятся в примерах в настоящем документе.
Определенные клетки, обладающие потенциалом к дифференцировке по линиям, ведущим к различным фенотипам, неустойчивы и, таким образом, могут спонтанно дифференцироваться. В настоящее время предпочтительны для применения в целях настоящего изобретения клетки UTC, которые не дифференцируются спонтанно, например, в линиях миобластов, клеток скелетных мышц, клеток гладких мышц сосудов, периваскулярных клеток, гемангиогенных клеток, ангиогенных клеток, васкулогенных клеток или клеток эндотелия сосудов. Предпочтительные клетки, при их выращивании в ростовой среде, являются по существу устойчивыми по отношению к клеточным маркерам, продуцируемым на их поверхности, и по отношению к схемам экспрессии различных генов, например, по результатам медицинского диагностического теста, доступного в продаже под торговым наименованием GENECHIP (Affymetrix, Inc., г. Санта-Клара, штат Калифорния). Клетки остаются по существу постоянными, например, в отношении характеристик маркеров клеточной поверхности при пассировании и на протяжении множества удвоений популяции.
IV. Популяции клеток, полученных из ткани пуповины
В другом аспекте настоящего изобретения рассматриваются популяции клеток UTC, описанные выше, для снижения продукции (или даже ингибирования продукции) провоспалительных медиаторов у пациента, имеющего легочное заболевание. В некоторых вариантах осуществления клеточная популяция может быть неоднородной. Неоднородная популяция клеток, составляющая предмет настоящего изобретения, может содержать по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% клеток UTC, составляющих предмет настоящего изобретения. Неоднородная популяция клеток, составляющая предмет настоящего изобретения, может дополнительно содержать стволовые клетки или другие клетки-предшественники, такие как миобласты или другие мышечные клетки-предшественники, гемангиобласты, или клетки-предшественники кровеносных сосудов; или она может дополнительно содержать полностью дифференцированные клетки скелетных мышц, клетки гладких мышц, перициты или эндотелиальные клетки кровеносных сосудов. В некоторых вариантах осуществления популяция является по существу однородной, т.е. содержит по существу только клетки UTC (предпочтительно по меньшей мере приблизительно 96%, 97%, 98%, 99% или более клеток UTC). Однородные популяции клеток настоящего изобретения содержат клетки, полученные из пуповины. Однородные популяции клеток, полученных из пуповины, предпочтительно свободны от клеток материнской линии дифференцировки. Однородность популяции клеток можно получить при помощи любого способа, известного в данной области, например, путем сортировки клеток (например, с использованием проточной цитометрии) или путем клонального размножения в соответствии с известными способами. Однородные популяции клеток UTC могут содержать клональную линию клеток из постнатально полученных клеток. Такие популяции особенно полезны в тех случаях, когда выделен клеточный клон с крайне необходимыми характеристиками.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения применяется по существу однородная популяция клеток UTC. В одном варианте осуществления данная по существу гомогенная популяция содержит клетки UTC, которые выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессируют CD31, CD34 или CD45; и/или (iii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В другом варианте осуществления популяция содержит клетки UTC, которые выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и CD45 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Клетки UTC необязательно (i) экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессируют CD31 или CD34; и/или (iii) экспрессируют, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеют потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В другом варианте осуществления изобретения популяция содержит клетки UTC, которые выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117, CD34 и CD31 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. В другом варианте осуществления популяция содержит клетки UTC, которые выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117, CD45, CD34, CD31 и/или теломеразу. В альтернативном варианте осуществления по существу однородная популяция клеток, полученных из пуповины, выделена из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способна к самообновлению и размножению в культуре и обладает следующими характеристиками: потенциал к по меньшей мере 40 удвоениям в культуре; продукция CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, PD-L2 и HLA-A, B, C; отсутствие продукции CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G и HLA-DR, DP, DQ; повышенная экспрессия интерлейкина-8, ретикулона-1 и хемокинового (мотив С-Х-С) лиганда-3 по сравнению с клеткой человека, которая представляет собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости; не экспрессирует hTERT или теломеразу.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения применяется однородная популяция клеток UTC. В одном варианте осуществления данная однородная популяция содержит клетки UTC, которые выделены из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, не продуцируют CD117 и не экспрессируют hTERT или теломеразу. Популяция необязательно (i) экспрессирует рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (ii) не экспрессирует CD31, CD34 или CD45; и/или (iii) экспрессирует, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) обладает потенциалом дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессирует CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В еще одном варианте осуществления однородная популяция клеток UTC выделена из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способна к самообновлению и размножению в культуре, не продуцирует CD117 и CD45 и не экспрессирует hTERT или теломеразу. Популяция необязательно (i) экспрессирует рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок; и/или (и/или (ii) не экспрессирует CD31 или CD34; и/или (iii) экспрессирует, по отношению к фибробластам человека, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина-8 или ретикулона-1; и/или (iv) имеет потенциал дифференцировки в клетки по меньшей мере легочной ткани; и/или (v) экспрессирует CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В альтернативном варианте осуществления однородная популяция клеток UTC выделена из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способна к самообновлению и размножению в культуре и не продуцирует CD117, CD34, CD31 и/или теломеразу. В еще одном варианте осуществления однородная популяция выделена из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способна к самообновлению и размножению в культуре, не продуцирует CD117, CD45, CD34 и CD31 и не экспрессирует hTERT или теломеразу. В альтернативном варианте осуществления по существу однородная популяция клеток, полученных из пуповины, выделена из ткани пуповины человека, по существу свободной от крови, способна к самообновлению и размножению в культуре и обладает следующими характеристиками: потенциал к по меньшей мере 40 удвоениям в культуре; продукция CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, PD-L2 и HLA-A, B, C; отсутствие продукции CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G и HLA-DR, DP, DQ; повышенная экспрессия интерлейкина-8, ретикулона-1 и хемокинового (мотив С-Х-С) лиганда-3 по сравнению с клеткой человека, которая представляет собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости; не экспрессирует hTERT или теломеразу.
В настоящем документе также описано применение популяций клеток, инкубированных в присутствии одного или более факторов или в условиях, которые стимулируют дифференцировку стволовых клеток по линиям дифференцировки клеток гладких мышц сосудов, клеток эндотелия сосудов или периваскулярных клеток. Такие факторы известны в данной области, и специалист определит, что подбор подходящих условий для дифференцировки можно провести стандартными экспериментами. Оптимизацию таких условий можно получить путем статистического построения эксперимента и его анализа, например, методология поверхности отклика позволяет одновременно провести оптимизацию по множеству переменных в биологической культуре. В настоящее время предпочтительные факторы включают в себя, без ограничений, факторы роста или трофические факторы, хемокины, цитокины, клеточные продукты, деметилирующие агенты и другие стимулы, которые, как уже известно или как будет установлено позднее, стимулируют дифференцировку, например, стволовых клеток по путям или линиям дифференцировки ангиогенных клеток, гемангиогенных клеток, васкулогенных клеток, клеток скелетных мышц, клеток гладких мышц сосудов, периваскулярных клеток или клеток эндотелия сосудов.
V. Генетические модификации клеток, полученных из ткани пуповины
Клетки UTC также можно генетически модифицировать для продукции терапевтически полезных продуктов генов, например, для продукции ангиогенных агентов для облегчения или поддержки формирования и роста дополнительных кровеносных сосудов либо для продукции факторов для привлечения клеток-предшественников эндотелия в область повреждения легких. Клетки-предшественники эндотелия способствуют развитию кровеносных сосудов и улучшают кровоток, особенно после ишемического события (Urbich C and Dimmeler S., Circ. Res., 2004 г.; 95:343–53). Факторы, участвующие в привлечении клеток эндотелия, включают в себя, без ограничений, VEGF, стромальный фактор-1 (SDF-1), эритропоэтин (EPO), G-CSF, статины, эстроген, PPAR-γ, CXCR4, FGF и HGF. Генетическую модификацию можно провести с применением любого из доступных векторов, включая, без ограничений, интегрирующие вирусные векторы, например, ретровирусный вектор или векторы, связанные с аденовирусами; неинтегрирующие реплицирующиеся векторы, например, векторы вируса папилломы, векторы SV40, аденовирусные векторы или вирусные векторы с нарушенной репликацией. Другие способы введения ДНК в клетки включают применение липосом, электропорации, генной пушки или прямую инъекцию ДНК.
Клетки-хозяева предпочтительно трансформируют или трансфицируют ДНК под управлением или в функциональной связи с одним или более соответствующими элементами управления экспрессией, такими как промоторные или усилительные последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.п., и селектируемым маркером. Для индуцирования экспрессии вставленного гена можно применить любой промотор. Например, вирусные промоторы включают в себя, без ограничений, промотор/усилитель CMV, SV40, папилломавирус, вирус Эпштейна-Барра или промотор гена эластина. В некоторых вариантах осуществления управляющие элементы, применяемые для контроля над экспрессией рассматриваемого гена, могут позволять осуществление регулируемой экспрессии гена таким образом, чтобы в условиях in vivo продукт синтезировался только в случае необходимости. При необходимости временной экспрессии предпочтительно применяют конститутивные промоторы в неинтегрирующем векторе и/или векторе с нарушенной репликацией. В альтернативном варианте осуществления, при необходимости, для активации экспрессии вставленного гена можно применить индуцируемые промоторы. Индуцируемые промоторы включают, без ограничений, промоторы, связанные с металлотионеином и белками теплового шока.
После введения экзогенной ДНК клетки, полученные методами генетической инженерии, можно оставить для роста в обогащенных средах и затем перевести в селективные среды. Селектируемый маркер в экзогенной ДНК придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать экзогенную ДНК, например, вводимую на плазмиде, в свои хромосомы и вырасти с образованием очагов, которые затем можно клонировать и размножить в клеточные линии. Данный способ можно эффективно применять для конструирования клеточных линий, экспрессирующих продукт гена.
Клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, можно модифицировать методами генной инженерии для «выключения» или «выбивания» экспрессии факторов, стимулирующих воспаление или отторжение имплантата в месте введения. Ниже описаны методики отрицательной модуляции для снижения уровней экспрессии целевого гена или активности продукта целевого гена. В настоящем документе «отрицательная модуляция» обозначает снижение уровня и/или активности продукта целевого гена по отношению к уровню и/или активности продукта целевого гена в отсутствие модулирующей обработки. Экспрессию гена, нативного для клеток скелетных мышц, клеток гладких мышц сосудов, периваскулярных клеток, клеток эндотелия сосудов или их клеток-предшественников можно понизить или выключить с применением нескольких методов, включая, например, ингибирование экспрессии путем инактивации гена с использованием методики гомологичной рекомбинации. Как правило, экзон, кодирующий важную область белка (или экзон в положении 5’ к данной области), прерывают положительно селектируемым маркером, например, neo, тем самым блокируя продукцию нормальной мРНК из целевого гена, что приводит к инактивации гена. Ген также можно инактивировать путем создания делеции в части гена или путем удаления всего гена. Применение конструкта с двумя областями гомологии к целевому гену, находящимися в геноме далеко от друга, позволяет вырезать соединяющие эти две области последовательности (Mombaerts et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1991 г.; 88:3084–87). Для снижения уровня активности целевого гена также можно применять антисенсы, ДНК-ферменты, рибозимы, малые интерферирующие РНК (миРНК) и другие такие молекулы, которые ингибируют экспрессию целевого гена. Например, показано, что молекулы антисмысловой РНК, ингибирующие экспрессию главных комплексов генов гистосовместимости (HLA), являются наиболее универсальными в отношении иммунных ответов. Кроме того, для снижения уровня активности целевого гена можно дополнительно использовать трехцепочечные молекулы.
VI. Лизаты клеток и растворимые клеточные фракции, приготовленные из клеток, полученных из ткани пуповины.
В других аспектах настоящего изобретения используют лизаты клеток и растворимые клеточные фракции, приготовленные из клеток UTC, или однородные или неоднородные клеточные популяции, содержащие клетки UTC, а также клетки UTC или их популяции, которые были генетически модифицированы или которые стимулировали для дифференцировки по линиям дифференцировки клеток скелетных мышц, клеток гладких мышц сосудов, периваскулярных клеток или клеток эндотелия сосудов. Такие лизаты и их фракции имеют множество применений. Применение растворимой фракции лизата клеток UTC (например, по существу свободной от мембран) in vivo, например, позволяет применять полезное внутриклеточное вещество аллогенно для пациента без введения значительного количества белков клеточной поверхности, которые скорее всего могут спровоцировать отторжение или другие нежелательные иммунные ответы. Способы лизиса клеток хорошо известны в данной области и включают различные способы механического разрушения, ферментативного разрушения или химического разрушения или их комбинации. Такие лизаты клеток можно приготовить из клеток непосредственно в их ростовой среде таким образом, чтобы они содержали секретированные факторы роста и т.п., либо их можно приготовить из отмытых от среды клеток, например, с использованием фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) или другого раствора. Отмытые клетки можно повторно растворить в концентрациях, превышающих плотность исходной популяции.
В одном варианте осуществления получают цельноклеточные лизаты, например, путем разрушения клеток без последующего разделения клеточных фракций. В другом варианте осуществления фракцию клеточных мембран отделяют от растворимой клеточной фракции стандартными способами, известными в данной области, например, центрифугированием, фильтрованием или аналогичными способами.
Лизаты клеток или растворимые клеточные фракции, приготовленные из популяций постнатальных клеток, можно использовать непосредственно, в дополнительно сконцентрированном виде, например, с использованием ультрафильтрации, или лиофилизации, или даже в высушенном виде, частично высушенном виде, в сочетании с известными специалистам фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, или в сочетании с другими соединениями, такими как биологические соединения, например, фармацевтически эффективными белковыми композициями. Клеточные лизаты или их фракции можно использовать in vitro или in vivo, индивидуально или, например, вместе с аутогенными или сингенными живыми клетками. При использовании in vivo лизаты можно вводить локально в месте обработки или удаленно, например, чтобы обеспечить пациента необходимыми клеточными факторами роста. Применение лизатов клеток in vivo известно в данной области, и специалисту в данной области будут очевидны необходимые шаги по использованию лизатов в рамках объема настоящего изобретения.
VII. Фармацевтические композиции и матрицы, содержащие клетки, полученные из ткани пуповины
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, в которых используются клетки UTC, популяции клеток UTC, компоненты и продукты клеток UTC в различных способах для модуляции провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочного заболевания, расстройства и/или травмы. Некоторые варианты осуществления охватывают фармацевтические композиции, содержащие живые клетки (только клетки UTC или их смесь с клетками других типов). Другие варианты осуществления охватывают фармацевтические композиции, содержащие клеточные компоненты клеток UTC (например, лизаты клеток, растворимые клеточные фракции, кондиционированную среду, ECM или компоненты любого из перечисленных выше вариантов) или продукты (например, трофические и другие биологические факторы, продуцируемые естественно клетками UTC или путем генетической модификации, кондиционированную среду после культивирования клеток UTC). Компоненты и продукты клеток UTC, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в патентах США №№ 7524489 и 7510873 и в публикации заявки на патент США № 2005/0058634 и включены в текст настоящего документа путем ссылки. В любом случае фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие известные в данной области активные агенты, такие как противовоспалительные агенты, антиапоптозные агенты, антиоксиданты, факторы роста, миотропные факторы или миорегенерирующие или миопротекторные лекарственные средства.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции содержат hUTC и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие для целей настоящего изобретения фармацевтически приемлемые носители включают жидкости, полутвердые (например, гели) и твердые материалы (например, клеточные каркасы и матрицы, трубки, листы и другие такие материалы, известные в данной области и более подробно описанные в настоящем документе). Данные полутвердые и твердые материалы могут быть выполнены с возможностью сопротивления деструкции внутри организма (небиоразлагаемые) или могут быть выполнены с возможностью деструкции внутри организма (биоразлагаемые, биоразрушаемые). Биоразлагаемый материал может дополнительно быть саморассасывающимся или биорассасывающимся, т.е. он может растворяться и всасываться жидкостями организма (одним из примеров являются водорастворимые имплантаты) или разлагаться и, в конце концов, выводиться из организма либо путем превращения в другие материалы, либо путем расщепления и устранения естественными процессами. Скорость биоразложения может варьироваться в соответствии с необходимой скоростью высвобождения после имплантации в тело.
Фармацевтические композиции, содержащие живые клетки UTC, как правило, готовят в виде жидкостей, полутвердых композиций (например, гелей) или твердых композиций (например, матриц, каркасов и т.п., как требуется для восстановления сосудистой или легочной ткани). Жидкие композиции готовят для введения любым приемлемым путем, который, как известно в данной области, обеспечивает доставку живых клеток в целевые ткани сосудов или легких. Как правило, такие пути включают в себя инъекцию или инфузию, либо диффузным образом, либо целевым образом для доставки в место травмы, повреждения или нарушения легких, с использованием пути введения, который включает в себя, без ограничений, внутримышечное, внутривенное или внутриартериальное введение с использованием шприцев с иглами и/или катетеров с использованием или без использования нагнетающих устройств.
Фармацевтические композиции, содержащие живые клетки в полутвердом или твердом носителе, как правило, готовят для хирургической имплантации в месте легочной травмы, повреждения или нарушения. Следует понимать, что жидкие композиции также можно вводить с использованием хирургических процедур. В конкретных вариантах осуществления полутвердые или твердые фармацевтические композиции могут включать полупроницаемые гели, решетки, клеточные каркасы и т.п., которые могут быть биоразлагаемыми или биологически неразлагаемыми. Например, в определенных вариантах осуществления бывает желательно или уместно изолировать экзогенные клетки от их окружения, но при этом позволить клеткам секретировать и доставлять биологические молекулы (например, миотрофические факторы, ангиотрофические факторы или факторы привлечения клеток-предшественников эндотелия) в окружающие клетки легочной ткани или сосудов. В таких вариантах осуществления клетки можно приготовить в виде автономных имплантатов, содержащих живые клетки UTC, или содержащих клетки UTC клеточных популяций, окруженных неразлагаемым, селективно проницаемым барьером, который физически отделяет трансплантированные клетки от ткани-хозяина. Такие имплантаты иногда называются «иммунопротекторными», поскольку они обладают способностью не допускать, чтобы клетки и макромолекулы иммунной системы убивали трансплантированные клетки в отсутствие фармакологически индуцированной иммуносупрессии.
В других вариантах осуществления фармацевтические композиции могут использовать различные варианты разлагаемых гелей и сетей. Например, разлагаемые материалы, особенно подходящие для получения составов с замедленным высвобождением, включают в себя биосовместимые полимеры, такие как полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, коллаген и т.п.
В других вариантах осуществления бывает желательно или уместно вводить клетки в или на биоразлагаемом, предпочтительно саморассасывающемся либо биорассасывающемся каркасе или матрице. Такие биоматериалы, как правило, с объемной структурой, содержат живые клетки, прикрепленные к каркасу, распределенные внутри каркаса или встроенные во внеклеточный матрикс, удерживаемый в каркасе. После имплантирования в целевую область тела эти имплантаты интегрируются в ткань-хозяина, в которой трансплантированные клетки постепенно укореняются (см. например, работу Tresco, P A et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2000 г.; 42:3–27; см. также Hutmacher, D.W., J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2001 г.; 12:107–174).
Биосовместимая матрица может содержать природные, модифицированные природные или синтетические биоразлагаемые полимеры, включая гомополимеры, сополимеры и блок-полимеры и их комбинации. Следует отметить, что полимер по существу получает название на основе мономера, из которого он синтезируется.
К примерам подходящих биологически разлагаемых полимеров или классов полимеров относятся фибрин, коллаген, эластин, желатин, витронектин, фибронектин, ламинин, тромбин, поли(аминокислота), окисленная целлюлоза, тропоэластин, шелк, рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты, белки, полинуклеотиды, матрицы из ресуспендированных базальных мембран, крахмалы, декстраны, альгинаты, гиалурон, хитин, хитозан, агароза, полисахариды, гиалуроновая кислота, полимер молочной кислоты, полигликолевая кислота, полиэтиленгликоль, бесклеточная ткань, самособирающиеся пептиды, полипептиды, гликозаминогликаны, их производные и смеси. Как для гликолевой, так и для молочной кислоты перед полимеризацией, как правило, готовят и очищают промежуточный циклический димер. Эти промежуточные димеры называются гликолид и лактид соответственно. Другие подходящие биоразлагаемые полимеры или классы полимеров включают в себя, без ограничений, алифатические полиэфиры, полиалкиленоксалаты, поликарбонаты на основе тирозина, полииминокарбонаты, полиортоэфиры, полиоксаэфиры, полиамидоэфиры, полиоксаэфиры с аминными группами, полипропиленфумарат, полидиоксаноны, поликарбонаты, полиоксалаты, поли(альфа-гидроксикислоты), полиэфиры, полиуретаны, полиэфируретаны с простыми и сложными эфирами, полиангидриды, полиацетаты, поликапролактоны, полиортоэфиры, полиаминокислоты, полиамиды и их смеси и сополимеры. Дополнительные подходящие биоразлагаемые полимеры включают в себя, без ограничений, стереополимеры L- и D-молочной кислоты, сополимеры бис(пара-карбоксифенокси)пропана и себациновой кислоты, сополимеры себациновой кислоты, сополимеры капролактона, сополимеры молочной кислоты/гликолевой кислоты/полиэтиленгликоля, сополимеры полиуретана и молочной кислоты, сополимеры альфа-аминокислот, сополимеры альфа-аминокислот и капроновой кислоты, сополимеры альфа-бензилглутамата и полиэтиленгликоля, сополимеры сукцината и полигликолей, полифосфазен, полигидроксиалканоаты и их смеси. Также предусматривается возможность использования двойных и тройных систем.
В общем случае подходящий биологически разлагаемый полимер для применения в качестве матрицы желательно выбирать таким образом, чтобы он: обладал механическими характеристиками, которые подходят для предполагаемого применения; оставался достаточно интактным вплоть до прорастания и заживления ткани; не вызывал бы воспалительного или токсического ответа; метаболизировался в организме после выполнения своей функции; легко трансформировался в искомый конечный формуемый продукт; обладал достаточным сроком хранения; легко стерилизовался.
В одном аспекте настоящего изобретения биосовместимый полимер, применяемый для образования матрицы, имеет форму гидрогеля. По существу, гидрогели представляют собой поперечно-сшитые полимерные материалы, которые могут впитывать более 20% от своего веса воды, сохраняя при этом заданную трехмерную структуру. Это определение включает в себя сухие поперечно-сшитые полимеры, которые разбухают в водной среде, а также разбухшие в воде материалы. Гидрогели можно получить поперечной сшивкой гидрофильных полимеров, при этом полимер может быть биологического происхождения, полусинтетический или полностью синтетический. Гидрогель можно получить из синтетического полимерного материала. Такие синтетические полимеры можно получать с заданными свойствами и предсказуемой воспроизводимостью от партии к партии, и они представляют собой надежный источник материала, для которого по существу не стоит проблема иммуногенности. Матрицы могут содержать гидрогели, образованные из самособирающихся белков, подобных обсуждаемым в патентах США №№ 5670483 и 5955343, в публикации заявки на патент США № 2002/0160471 и в публикации заявки по ДПК № WO 02/062969, описание которых включается в текст настоящего документа путем ссылки, поскольку они относятся к образующим гидрогель самособирающимся пептидам.
Свойства, которые делают гидрогели ценными при доставке лекарственных средств, включают в себя равновесную степень разбухания, кинетику сорбции, проницаемость к растворенным веществам и их характеристики in vivo. Проницаемость к соединениям зависит частично от степени разбухания или содержания воды и скорости биоразложения. Поскольку механическая прочность геля падает прямо пропорционально степени его разбухания, в рамках настоящего изобретения также предусматривается, что гидрогель можно закрепить на субстрате таким образом, что полученная композитная система будет иметь повышенную механическую прочность. В некоторых вариантах осуществления гидрогель можно импрегнировать внутрь пористого субстрата, с тем чтобы обеспечить механическую прочность субстрата и полезные свойства гидрогеля как системы доставки.
Не имеющие ограничительного характера примеры каркаса или матрицы (иногда собирательно называемых «каркас»), которые можно применять в настоящем изобретении, включают в себя текстильные структуры, такие как тканые материалы, вязаные материалы, плетеные материалы, сетки, нетканые материалы и скрученные вязаные материалы; пористые пеноматериалы, полупористые пеноматериалы, перфорированные пленки или листы, микрочастицы, гранулы, и сферы, и композитные структуры, представляющие собой комбинацию перечисленных выше структур. Например, нетканые маты можно образовать с применением волокна, состоящего из синтетического разлагаемого сополимера гликолевой и молочной кислот (PGA/PLA), доступного в продаже под торговым наименованием нитей VICRYL (Ethicon, Inc., г. Сомервилл, штат Нью-Джерси). Также можно использовать пены, состоящие из, например, сополимера эпсилон-капролактона/гликолевой кислоты (PCL/PGA), сформированные с использованием таких процессов, как лиофильная сушка или лиофилизация, как описано в патенте США № 6355699. Также можно применять гидрогели, такие как самособирающиеся пептиды (например, RAD16). In situ-формирующиеся разлагаемые сетки также пригодны для применения в настоящем изобретении (см., например, Anseth, K S et al., J. Controlled Release, 2002 г.; 78:199–209; Wang, D. et al., Biomaterials, 2003 г.; 24:3969–3980; публикация заявки на патент США № 2002/0022676). Эти образуемые in situ материалы готовят в виде подходящих для инъекции текучих сред, которые затем можно активировать различными способами, например, изменением температуры, pH или освещенности in situ или in vivo для образования гидрогеля.
В другом варианте осуществления каркас представляет собой войлок, который может состоять из мультифиламентной пряжи, изготовленной из биорассасывающегося материала, например, сополимеров или смесей PGA, PLA, PCL или гиалуроновой кислоты. Пряжу сваливают в войлок с применением стандартных методик обработки текстильных материалов, состоящих из обжатия, нарезки, чесания и простегивания. В другом варианте осуществления клетки высевают на каркасы из пеноматериалов, которые могут представлять собой композитные структуры.
Во многих из указанных выше вариантов осуществления каркасу можно придать подходящую геометрическую форму, такую как форма кровеносного сосуда. Кроме того, следует понимать, что клетки UTC можно культивировать на заранее образованных, неразлагающихся хирургических или имплантируемых устройствах, например, способом, соответствующим способу, применяемому для получения содержащих фибробласты разделяемых эндоваскулярных спиралей Гульельми (Marx, W. F. et al., Am. J. Neuroradiol., 2001 г.; 22:323–333).
Перед посевом клеток матрикс, каркас или устройство можно обработать для улучшения клеточной адгезии. Например, перед посевом клеток нейлоновые матрицы можно обработать 0,1 молярным раствором уксусной кислоты и инкубировать в полилизине, PBS и/или коллагене для покрытия нейлона. Полистирол можно аналогичным образом обработать серной кислотой. Можно также модифицировать внешние поверхности каркаса для улучшения клеточной адгезии или роста клеток и дифференцировки ткани, используя, например, плазменное покрытие каркаса или добавление одного или более белков (например, коллагенов, эластичных волокон, ретикулярных волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, гепаринсульфата, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата, кератинсульфата), генетических материалов, таких как цитокины и факторы роста, клеточного матрикса и/или других материалов, включая, без ограничений, желатин, альгинаты, агар, агарозу и растительные камеди и т.п., помимо прочих факторов, влияющих на выживаемость и дифференцировку клеток.
Каркасы, содержащие клетки UTC, готовят в соответствии со способами, известными в данной области. Например, клетки можно растить свободно в сосуде для культивирования до получения субконфлюэнтной или конфлюэнтной культуры, затем изъять из культуры и засеять на каркас. При необходимости, в культуральную среду можно добавить факторы роста до, во время или после высевания клеток для инициирования дифференцировки клеток и формирования ткани. В альтернативном варианте осуществления сами каркасы можно модифицировать таким образом, чтобы улучшить рост клеток на них или снизить риск отторжения имплантата. Таким образом, в каркас можно добавить одно или более биологически активных соединений, включая, без ограничений, противовоспалительные соединения, иммуносупрессоры или факторы роста, для их местного высвобождения.
Клетки UTC, части клеток UTC или популяции клеток, содержащих клетки UTC, или компоненты или продукты, продуцированные клетками UTC, можно применять самым различным образом, чтобы способствовать восстановлению, регенерации и коррекции клеток и тканей легких, для улучшения кровотока и стимуляции и/или поддержки ангиогенеза, в частности, у пациентов, страдающих легочным заболеванием. Такие возможности охватывают способы in vitro, ex vivo и in vivo.
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения направлены на непосредственное восстановление, регенерацию или замещение либо на поддержку восстановления, регенерации или замещения кровеносных сосудов для лечения травмы или повреждения легких.
Клетки UTC можно вводить отдельно (например, в виде по существу однородных популяций) или в смеси с другими клетками. Как описано выше, клетки UTC можно вводить в составе фармацевтического препарата на основе матрикса или каркаса либо в стандартных фармацевтически приемлемых носителях. При введении клеток UTC вместе с другими клетками их можно вводить одновременно или последовательно с другими клетками (перед другими клетками или после них). Клетки, которые можно вводить вместе с клетками UTC, включают в себя, без ограничений, миоциты, клетки легочной ткани, клетки-предшественники скелетных мышц, клетки гладких мышц сосудов, клетки-предшественники гладких мышц сосудов, периваскулярные клетки, клетки эндотелия сосудов или клетки-предшественники эндотелия сосудов и/или другие мультипотентные или плюрипотентные стволовые клетки. Клетки других типов можно смешивать с клетками UTC непосредственно во время или незадолго перед введением, либо эти клетки можно совместно культивировать в течение некоторого времени перед введением.
Клетки UTC можно вводить вместе с другими благоприятными лекарственными средствами или биологическими молекулами, либо другими активными агентами, такими как противовоспалительные агенты, антиапоптозные агенты, антиоксиданты, факторы роста, ангиогенные факторы или миорегенеративные или миопротекторные лекарственные средства, известные в данной области. При введении клеток UTC совместно с другими агентами их можно вводить вместе в виде одной фармацевтической композиции или в отдельных фармацевтических композициях, одновременно или последовательно с другими агентами (перед введением других агентов или после него). Другие агенты могут быть частью курса лечения, который либо начинают перед трансплантацией и затем продолжают на протяжении всего курса восстановления, либо начинают его в момент трансплантации, или даже после трансплантации, на усмотрение врача с опытом в данной области.
В одном варианте осуществления клетки UTC вводят в виде недифференцированных клеток, т.е. в том виде, который получен при культивировании в ростовой среде. В альтернативном варианте осуществления клетки UTC можно вводить после их обработки в культуре в условиях, которые стимулируют их дифференцировку в направлении необходимых фенотипов легочной ткани, например, фенотипов клеток гладких мышц сосудов, периваскулярных клеток или клеток эндотелия сосудов.
Клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, можно имплантировать хирургическим путем, вводить шприцом, доставлять (например, с помощью катетера, шприца, шунта, стента, микрокатетера или насоса) или иным образом вводить напрямую или опосредованно в место легочной травмы, повреждения или нарушения. Способы введения клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, или содержащих их композиций включают в себя, без ограничений, внутривенный, внутримышечный, подкожный, интраназальный, подоболочечный, внутриполостной способ или способ введения с использованием шприцев с иглами или катетеров с помощью нагнетающих устройств или без них.
При введении клеток в составе полутвердых или твердых устройств подходящим средством введения, как правило, является хирургическая имплантация в требуемое местоположение в организме. При этом жидкие или фармацевтические композиции могут вводиться через кровь или непосредственно в пораженные ткани легких (например, в диффузно пораженную область, например, в случае диффузных ALI или ARDS). Миграцию клеток UTC можно направлять с помощью химических сигналов, факторов роста или кальпаинов.
Клетки, полученные из ткани пуповины, или композиции и/или матрицы, содержащие клетки, полученные из ткани пуповины, можно вводить в необходимое место посредством микрокатетера, интракатетеризации или посредством мини-насоса. В качестве используемого эксципиента или носителя можно выбрать любой фармацевтически приемлемый для введения пациенту эксципиент или носитель, в частности, локально в месте, где будет проводиться индукция клеточной дифференцировки. Примеры включают в себя жидкие среды, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), стерильный физиологический раствор, стерильный фосфатно-солевой буферный раствор, среду Лейбовица (L15, Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния), раствор декстрозы в стерильной воде и любую другую физиологически приемлемую жидкость.
К другим вариантам осуществления относятся способы модулирования провоспалительных медиаторов, участвующих в патологии легочной травмы или повреждения, посредством введения составов, содержащих фармацевтически приемлемый носитель и клеточные компоненты UTC (например, клеточные лизаты или их компоненты) или продукты (например, трофические и другие биологические факторы, которые естественным образом продуцируются клетками UTC, или посредством генетической модификации, кондиционированную среду культуры клеток UTC), или среду роста клеток UTC или продуктов, выделенных из среды роста. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления биологические факторы представляют собой FGF и HGF. Данные способы могут дополнительно содержать введение других активных агентов, таких как факторы роста, ангиогенные факторы, миорегенераторы или миопротекторы, известные в данной области.
Дозированные формы и режимы введения клеток UTC или любых других терапевтических или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, разрабатывают в соответствии с надлежащей медицинской практикой, принимая во внимание состояние конкретного пациента, например, природу и степень травмы или повреждения в результате события легочного повреждения, возраст, пол, вес тела, и общее состояние пациента, и другие известные медицинским работникам факторы. Таким образом, эффективное количество фармацевтической композиции для введения пациенту определяется с учетом этих соображений, как известно в данной области.
Результаты показали, что клетки UTC не стимулируют аллогенные МКПК в реакции смешанной культуры лимфоцитов. Поэтому в некоторых случаях может допускаться аллогенная или даже ксеногенная трансплантация клеток UTC. В некоторых вариантах осуществления клетки UTC сами по себе оказывают иммунодепрессантное воздействие, тем самым препятствуя отторжению хозяином трансплантированных клеток UTC. В таких случаях можно обойтись без фармакологического подавления иммунитета в ходе клеточной терапии.
Однако в других случаях может быть необходимо или уместно фармакологическое подавление иммунитета у пациента перед началом клеточной терапии. Этого можно достичь применением местных или системных иммуносупрессорных агентов, или же этого можно достичь доставкой клеток в инкапсулированном устройстве, как описано выше. В данной области известны эти и другие способы снижения или устранения иммунного ответа на трансплантированные клетки. В качестве альтернативы можно генетически модифицировать клетки UTC для снижения их иммуногенности, как указано выше.
Выживаемость трансплантированных клеток UTC у живого пациента можно определить путем применения различных методик сканирования, например, с помощью исследования компьютерной аксиальной томографией (КАТ или КТ), магниторезонансной томографией (МРТ) или позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ). Определение выживаемости трансплантированных клеток можно также провести post mortem путем извлечения легочной ткани или сосудистой ткани и изучения ее визуально или с помощью микроскопа. В альтернативном варианте осуществления клетки можно обработать красителем, специфичным к клеткам легочной ткани, клеткам гладких мышц сосудов, периваскулярным клеткам или клеткам эндотелия сосудов. Трансплантированные клетки также можно идентифицировать по предварительно введенным в них меткам-красителям, таким как меченные родамином или флуоресцеином микросферы, быстрый голубой, микрочастицы железа, бисбензамид или продукты генетически встроенного репортерного гена, такие как бета-галактозидаза или бета-глюкуронидаза.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам, которые используют клетки UTC, популяции клеток UTC, компоненты и продукты клеток UTC в различных способах для стимулирования и/или подавления ангиогенеза, для улучшения кровотока, для регенерации, восстановления и коррекции ткани легких, разрушенной или поврежденной в результате легочной травмы, как это описано выше. При применении для лечения повреждения или травмы, вызванных легочным заболеванием, расстройством и/или травмой, либо другого предписанного лечения наборы могут включать в себя одну или более клеточных популяций, включая по меньшей мере клетки UTC и фармацевтически приемлемый носитель (в жидком, полутвердом или твердом состоянии). Наборы также могут необязательно включать в себя средство для введения клеток, например, путем инъекции. Наборы могут дополнительно включать в себя инструкции по применению клеток. Наборы, приготовленные для применения в условиях полевого госпиталя, например, в условиях боевых действий, могут включать в себя комплект для проведения всей процедуры, включая каркасы тканей, хирургические нити и т. п., где клетки будут применяться в сочетании с восстановлением острых поражений. Наборы для анализов и способов in vitro, описанные в настоящем документе, могут содержать один или более из следующих компонентов: (1) клетки UTC или компоненты или продукты клеток UTC; (2) реагенты для практического осуществления способа in vitro; (3) другие клетки или популяции клеток, если это необходимо; (4) инструкции для осуществления способа in vitro.
Дополнительно, при применении в приведенных ниже примерах и в других местах настоящего описания, клетки UTC, которые можно применять в устройствах и способах настоящего изобретения, можно выделить и охарактеризовать в соответствии с описаниями патентов США №№ 7510873 и 7524489 и опубликованной заявки на патент США № 2005/0058634, которых включены путем ссылки в тех частях, где они относятся к описанию, выделению и характеризации клеток hUTC.
Без более подробного описания предполагается, что специалист в данной области может, применяя предыдущее описание и следующие иллюстративные примеры, реализовать и использовать настоящее изобретение и применять на практике заявленные способы. Следующие рабочие примеры, в связи с этим, специально указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, и не должны быть истолкованы как ограничивающие каким-либо образом остальную часть описания.
ПРИМЕР 1
Эффективность защиты легких в модели мышей для острого повреждения легких, вызванного гипероксией
В настоящем примере продемонстрирована эффективность человеческих клеток UTC (выделение и определение характеристик hUTC приводится в примерах 6–16) для активизации восстановления и регенерации легких в модели повреждения легких, вызванного гипероксией.
Культивирование и выделение клеток пуповины
Полученные из пуповины клетки (UDC, hUTC) готовили как описано в патентах США №№ 7524489 и 7510873 и в публикации заявки на патент США № 2005/0058634. Клетки культивировали до нужного пассажа, а затем передавали на криогенное хранение.
Модель животного
6
Самки мышей C57BL/6 (в возрасте семи недель) были получены от Ace Animals (г. Бойертаун, штат Пенсильвания). Непосредственно перед инъекцией hUTC размораживали при 37°C (водяная баня) и дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и повторно растворяли в 1 мл PBS. Подсчет клеток проводили на гемоцитометре. Жизнеспособность клеток определяли тестом на вытеснение трипанового синего. Клетки ресуспендировали при концентрации 1×10 клеток в 200 мкл PBS.
6
2
2
2
Общая процедура проведения исследования приведена ниже в таблице 1-1. На 0-й день клетки (1×10 hUTC в 200 мкл PBS) или несущую среду PBS медленно вводили мышам посредством внутривенной инъекции через хвостовую вену в 1 мл шприце с иголкой 26 калибра, а затем животным давали дышать комнатным воздухом или 90% O. Воздействие 90% Oобеспечивали, помещая животных в камеру BioSpherix (BioSpherix, LTD, г. Лакона, штат Нью-Йорк), которую продували и уравновешивали до 90% Oв течение 1 часа. Животным ежедневно обеспечивали поддерживающий уход (обогрев и NutriCal). Наблюдение за животными, смертность, выживаемость и процент концентрации кислорода в каждой камере регистрировали дважды в день. На четвертый день после обработки проводили эвтаназию крыс с применением 50 мг/мл нембутала (пентобарбитала).
Таблица 1-1Структура эксперимента
Экспериментальная группа
Обработка атмосферным воздухом
Обработка
Количество животных
1
Комнатный воздух
PBS
12
2
90% O<sub>2</sub>
PBS
12
3
90% O<sub>2</sub>
1e<sup>6</sup> клеток hUTC
12
Анализ суммарного белка в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF)
Для того чтобы определить суммарный белок в каждом образце, бесклеточную BALF анализировали с помощью набора BCA Protein Assay (Pierce). Результаты обрабатывали программой Softmax 4.0, и данные отображали на графике с помощью Graph Pad Prism Software.
Анализ цитокинов/хемокинов в BALF и гомогенате легких
Для приготовления BALF проводили эвтаназию 6 (шести) животных из каждой экспериментальной группы и промывали легкие однократно 1,0 мл стерильным PBS (Invitrogen), после чего пробирки хранили во льду. BALF центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, супернатант удаляли и применяли для дополнительного анализа.
Для приготовления гомогената легких проводили эвтаназию 6 (шести) животных из каждой группы, проводили полную перфузию организма PBS, после чего иссекали левое легкое и помещали на лед в пробирках Lysing Matrix D, а затем центрифугировали на FastPrep со скоростью 4,0 в течение 40 секунд.
Уровни цитокинов/хемокинов в BALF и супернатанте легочного гомогената определяли с применением набора для мультиплексного анализа 22 мышиных цитокинов на микросферах (Millipore) в соответствии с инструкциями изготовителя и анализировали на приборе BioRad Bioplex. Результаты отражали на графике и анализировали с помощью GraphPad Prism Software.
Детектирование клеток человека
Суммарную РНК выделяли из тканей мыши при участии Asuragen, Inc. в соответствии со стандартными процедурами компании. Чистоту и количество суммарной РНК в образце определяли по поглощению на 260 и 280 нм на УФ-спектрофотометре NanoDrop ND-1000. Целостность РНК контролировали с помощью Agilent Bioanalyzer.

Анализ специфичной для человека мРНК GAPDH (Hs99999905_m1_GAPDH) применяли для оценки количества hUTC в ткани легких мыши. Образцы для анализа с помощью количественной ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР) с применением разовых пробирок TaqMan Assays (Applied Biosystems) обрабатывали совместно с Asuragen, Inc., в соответствии со стандартными процедурами компании. Разведенные образцы суммарной РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора для синтеза кДНК TaqMan High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями изготовителя и в суммарном реакционном объеме 20 микролитров на каждое разведение. Затем 50 нг исходной кДНК анализировали по ПЦР. Все амплификации проводили трижды на стандартизованном термоциклере в реальном времени ABI 7500. После инкубирования при 95°C в течение 10 минут образцы амплифицировали в ходе 40 циклов при 95°C в течение 15 секунд, а затем при 60°C в течение 1 минуты. Суммарное количество hUTC в легких мыши оценивали по стандартной кривой, полученной при анализе суммарной РНК очищенных hUTC.
Общий белок в BALF
2
2
2
Воздействие 90% O в течение 4 дней приводило к увеличению суммарного содержания белка в BALF по сравнению с контрольными животными, вдыхавшими комнатный воздух (p<0,01, Фиг. 1, таблица 1-2). Кроме того, отмечалось статистически значимое снижение суммарного белка BALF в группе 90% O, получавшей hUTC, по сравнению с группой 90% O, получавшей PBS (p<0,05).
Таблица 1-2Суммарная концентрация белка в BALF: суммарная концентрация белка измерялась с помощью набора Pierce BCA Protein Assay
Экспериментальная группа
Номер животного
Суммарная концентрация белка в BALF (мкг/дл)
1
1
401,89
1
2
1006,68
1
3
660,67
1
4
494,49
1
5
1432,64
1
6
76,23
Среднее значение:
678,77
Ст. откл.
437,77
2
1
1701,60
2
2
1438,46
2
3
1197,13
2
4
2823,95
2
5
4482,76
2
6
3174,32
Среднее значение:
2469,70
Ст. откл.
1260,74
3
1
984,87
3
2
691,20
3
3
1172,41
3
4
893,28
3
5
695,56
3
6
1359,95
Среднее значение:
966,21
Ст. откл.
265,37
Анализ цитокинов в BALF и легочном гомогенате
2
2
В таблице с 1-3 по 1-6 приводятся данные анализа хемокинов/цитокинов в гомогенате легких (таблица 1-3 и 1-4) и BALF (жидкости бронхоальвеолярного лаважа) (таблица 1-5 и 1-6). Приведенные в них данные также отображены на графиках (Фиг. 2А и 2В). Статистически значимое снижение кератиноцитарного фактора (KC), гамма-интерферон-индуцируемого цитокина (IP-10), интерлейкина-1α (IL-1α) и моноцитарного хемотактического фактора-1 гомогената легких (MCP-1) в BALF наблюдалось у животных, получавших hUTC и вдыхавших 90% O, по сравнению с животными, получавшими несущую среду PBS и вдыхавшими 90% O (p<0,02) (Фиг. 2A и 2B, таблица 1-3 и 1-4). (Н/О: не обнаружено).
Таблица 1-3Анализ цитокинов в легочном гомогенате
Экспериментальная группа
Номер животного
MIP1-α
GMCSF
MCP-1
KC
RANTES
IFg
IL-1β
IL-1α
GCSF
IP-10
IL-2
1
1
0
0
0
53
36
52
22
0
6
840
0
1
2
0
0
0
77
18
76
17
10
6
720
0
1
3
0
0
0
45
24
59
14
29
4
524
9
1
4
0
0
0
67
28
58
31
34
7
621
9
1
5
0
0
0
101
14
83
20
0
6
824
25
1
6
0
0
0
66
32
63
14
198
7
755
16
Среднее значение:
0
0
0
68
25
65
20
45
6
714
10
Ст. откл.
0
0
0
20
9
12
6
76
1
122
10
2
1
0
0
139
149
9
70
13
37
23
1315
8
2
2
0
0
526
555
4
51
4
18
171
1146
5
2
3
0
0
111
103
9
62
24
56
8
712
7
2
4
0
0
143
322
0
34
8
9
59
503
0
2
5
0
0
143
334
7
68
11
28
20
1783
8
2
6
0
0
295
303
4
39
9
11
75
619
4
Среднее значение:
0
0
226
294
5
54
11
27
59
1013
5
Ст. откл.
0
0
161
160
4
15
7
18
60
492
3
3
1
0
0
0
115
7
50
16
30
16
1121
8
3
2
0
0
0
163
11
50
9
38
20
1105
8
3
3
0
0
0
157
13
56
7
25
24
1465
7
3
4
0
0
0
161
16
59
8
24
12
1647
7
3
5
0
0
0
337
7
41
16
26
49
711
8
3
6
0
0
88
318
17
40
9
15
45
1839
8
Среднее значение:
0
0
15
209
12
49
11
27
27
1315
8
Ст. откл.
0
0
36
94
4
8
4
8
15
413
1
t-критерий
Н/О
Н/О
0,02
0,26
0,08
0,57
0,86
1,00
0,28
0,45
0,10
Таблица 1-4Анализ цитокинов в легочном гомогенате
Экспериментальная группа
Номер животного
IL-4
IL-5
IL-6
IL-7
IL-10
IL-12p70
TNF-α
IL-9
IL-13
IL-15
IL-17
1
1
1
11
1
0
27
9
0
82
8
0
0
1
2
1
7
8
0
46
18
0
113
14
27
0
1
3
1
12
5
0
31
15
0
82
10
0
0
1
4
1
16
9
16
51
18
0
135
11
22
0
1
5
1
15
34
0
42
23
0
105
22
24
4
1
6
1
17
14
0
37
24
0
100
15
28
0
Среднее значение:
1
13
12
3
39
18
0
103
13
17
1
Ст. откл.
0
4
12
6
9
6
0
20
5
13
1
2
1
1
30
69
0
39
12
0
96
18
0
0
2
2
1
13
448
0
20
0
0
62
7
0
0
2
3
1
14
33
0
37
4
0
82
8
0
0
2
4
1
11
91
0
26
4
0
63
6
0
0
2
5
1
11
47
0
30
4
0
106
8
28
0
2
6
1
11
121
0
27
5
0
54
0
0
0
Среднее значение:
1
15
135
0
30
5
0
77
8
5
0
Ст. откл.
0
7
156
0
7
4
0
21
6
11
0
3
1
1
15
31
0
34
15
0
79
15
0
0
3
2
1
16
36
0
28
6
0
65
9
0
0
3
3
1
16
53
0
36
9
0
68
9
0
0
3
4
1
14
26
0
24
5
0
90
12
21
0
3
5
1
13
64
0
25
13
0
60
6
0
0
3
6
2
14
84
0
24
11
0
73
6
0
0
Среднее значение:
1
15
49
0
29
10
0
72
10
3
0
Ст. откл.
0
1
22
0
5
4
0
11
4
8
0
t-критерий
0,18
0,96
0,25
Н/О
0,63
0,01
Н/О
0,68
0,31
0,86
Н/О
Таблица 1-5Анализ цитокинов в гомогенате BALF (жидкости бронхоальвеолярного лаважа)
Экспериментальная группа
Номер животного
MIP1-α
GMCSF
MCP-1
KC
RANTES
IFg
IL-1β
IL-1α
GCSF
IP-10
IL-2
1
1
0
0
0
8
0
162
0
8
0
113
0
1
2
0
0
0
8
0
174
0
15
0
195
0
1
3
0
0
0
7
0
131
0
0
0
95
0
1
4
0
0
0
8
0
195
4
9
0
176
0
1
5
0
0
0
12
0
197
0
14
0
216
0
1
6
0
0
0
0
0
79
0
6
0
53
0
Среднее значение:
0
0
0
7
0
156
1
9
0
141
0
Ст. откл.
0
0
0
4
0
45
2
6
0
64
0
2
1
0
0
0
276
0
101
0
0
59
351
0
2
2
0
0
0
425
0
127
0
0
65
381
0
2
3
0
0
0
390
0
183
0
7
64
435
0
2
4
0
0
0
533
0
107
0
0
284
453
0
2
5
0
0
0
322
0
140
0
0
70
568
0
2
6
0
0
0
501
0
104
0
0
234
554
0
Среднее значение:
0
0
0
408
0
127
0
1
129
457
0
Ст. откл.
0
0
0
100
0
31
0
3
102
89
0
3
1
0
0
0
175
0
151
0
6
50
346
0
3
2
0
0
0
256
0
108
0
5
45
201
0
3
3
0
0
0
331
0
169
0
7
51
403
0
3
4
0
0
0
222
0
134
0
12
37
246
0
3
5
0
0
0
175
0
140
0
14
33
347
0
3
6
0
0
0
252
0
156
0
9
44
292
0
Среднее значение:
0
0
0
235
0
143
0
9
43
306
0
Ст. откл.
0
0
0
59
0
21
0
3
7
74
0
t-критерий
Н/О
Н/О
Н/О
0,01
Н/О
0,26
Н/О
0,01
0,10
0,02
Н/О
Таблица 1-6Анализ цитокинов в гомогенате BALF (жидкости бронхоальвеолярного лаважа)
Экспериментальная группа
Номер животного
IL-4
IL-5
IL-6
IL-7
IL-10
IL-12p70
TNF-α
IL-9
IL-13
IL-15
IL-17
1
1
0
0
1
0
39
0
0
63
6
0
0
1
2
0
0
1
0
19
0
0
170
4
0
0
1
3
0
0
0
0
26
0
0
82
0
0
0
1
4
0
0
1
0
35
4
0
175
5
0
0
1
5
0
0
1
0
39
0
0
221
6
0
0
1
6
0
0
1
0
11
0
0
82
4
0
0
Среднее значение:
0
0
1
0
28
1
0
132
4
0
0
Ст. откл.
0
0
0
0
11
1
0
65
2
0
0
2
1
0
4
24
0
14
0
0
41
4
0
0
2
2
0
0
36
0
24
0
0
46
5
0
0
2
3
1
0
27
0
35
0
0
102
7
0
0
2
4
0
4
384
0
14
0
0
49
0
0
0
2
5
0
0
84
0
23
0
0
84
11
0
0
2
6
0
4
347
0
13
0
0
121
7
0
0
Среднее значение:
0
2
150
0
21
0
0
74
6
0
0
Ст. откл.
0
2
169
0
9
0
0
34
4
0
0
3
1
0
0
67
0
32
0
0
60
0
0
0
3
2
0
0
33
0
23
0
0
41
4
0
0
3
3
0
0
37
0
35
4
0
110
6
0
0
3
4
0
0
61
0
24
0
0
69
4
0
0
3
5
0
4
150
0
25
0
0
76
4
0
0
3
6
0
0
35
0
28
0
0
77
4
0
0
Среднее значение:
0
1
64
0
28
1
0
72
4
0
0
Ст. откл.
0
2
45
0
5
2
0
23
2
0
0
t-критерий
0,36
0,40
0,29
Н/О
0,08
0,36
Н/О
0,88
0,27
Н/О
Н/О
Приживление трансплантата человеческих клеток
На четвертый день после введения животных умерщвляли, извлекали легкие и выделяли суммарную РНК для определения количества человеческих клеток. Результаты указывали на присутствие hUTC в легких получавших hUTC животных, но они отсутствовали в легких получавших PBS животных (таблица 1-3).
В таблице 1-7 приводятся результаты определения человеческих клеток. Присутствие hUTC в легких мыши на четвертый день после обработки устанавливали, измеряя транскрипты человеческой специфической мРНК GAPDH с помощью ПЦР в реальном времени. Значения порогового цикла (ПЦ) менее 34 указывают на наличие hUTC в ткани легких мыши. Отсутствие транскриптов мРНК hUTC в тканях легких мыши (отсутствует). Наличие транскриптов мРНК hUTC в тканях легких мыши (присутствует).
Таблица 1-7Определение клеток человека
Экспериментальная группа
Среднее значение ПЦ
HUTC в легких мыши
1
36,1
Отсутствует
1
36,5
Отсутствует
2
34,9
Отсутствует
2
34,4
Отсутствует
3
26,2
Присутствует
3
29,6
Присутствует
3
26,6
Присутствует
3
26,9
Присутствует
3
26,1
Присутствует
3
26,5
Присутствует
2
Оценивали воздействие профилактического внутривенного введения hUTC на развитие острого повреждения легких у мышей, вызванного гипероксией. Пониженный уровень суммарного белка в BALF после введения hUTC мышам, подвергавшимся воздействию 90% O, показывает, что hUTC были в состоянии снижать вызванную гипероксией утечку из сосудов/отек легких. Кроме того, данные показали, что hUTC вызывали снижение уровней трех важных хемокинов, что указывает на снижение воспаления в легких. Полученные данные являются свидетельством того, что hUTC могут быть важным лекарственным средством для лечения заболеваний легких.
ПРИМЕР 2 Оценка эффективности защиты легких с применением клеток, полученных из ткани пуповины человека (hUTC),
в новой гуманизированной модели мышей при индуцированной эластазой эмфиземе
В настоящем примере оценивается эффективность клеток, полученных их ткани пуповины человека (hUTC), в новой и классической модели COPD (эмфизема). В основе таких моделей лежала доставка эластазы в дыхательные пути, что приводило к эмфизематозному разрушению. В классической модели применялись мыши BALB/c; в новой модели применялись мыши NOD/SCID/с нефункциональной гамма-цепью рецептора цитокинов (NOD/SCIDγ) (в дальнейшем - NSG), которых получали в качестве экспериментальной модели для тестирования лечения человеческими клетками.
Дизайн исследования
6
Мышей анестезировали ингаляцией изофлуорана и проводили шесть интраназальных введений эластазы из поджелудочной железы свиньи (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение четырнадцати дней (1×30 мкг по 3 раза в неделю). Контрольные мыши получали интраназальные введения чистого физиологического раствора. Через два часа после обработки эластазой, 0,5×10 клеток ткани пуповины человека (hUTC) вводили инъекцией через хвостовую вену. hUTC вводили разовой дозой с общим объемом 100 мкл. Чистую несущую среду вводили точно так же, как и в группах, получавших лечение hUTC.
Исследование предусматривало биохимический анализ/анализ белка (часть 1) и (2) тестирование гистологии и функции легких (плетизмография) (часть 2).
Для данного исследования мышам интраназально (и/н) вводили эластазу из поджелудочной железы свиньи (PPE) и внутривенно (в/в) hUTC на 0-й день. На 2, 5, 7, 9 и 11-й день мыши получали дополнительные инъекции PPE. На 1, 6, 10 и 14-й день мышей отбирали для дополнительного анализа. 320 самок мыши в возрасте от 6 до 8 недель относились к следующим линиям/видам: NOD/SCIDγ (160) или дикого типа (BALB/C) Mus muscularis (160). В таблице 2-1 приводится структура эксперимента.
Таблица 2-1Общая структура эксперимента
Номер группы
Количество животных
Испытываемый материал
1
20 (n=5 при 4 точках по времени)
Дикий тип: физиологический раствор и/н + несущая среда
2
20
Дикий тип: эластаза и/н+несущая среда
3
20
Дикий тип: эластаза и/н+hUTC
4
16 (n=4 при 4 точках по времени
Дикий тип: физиологический раствор и/н + hUTC
5
4 (все отобранына 14-й день)
Без обработки
6
20
NOD/SCIDγ: физиологический раствор и/н + несущая среда
7
20
NOD/SCIDγ: эластаза и/н + несущая среда
8
20
NOD/SCIDγ: эластаза и/н + hUTC
9
16
NOD/SCIDγ: физиологический раствор и/н + hUTC
10
4
Без обработки
Культивирование и выделение клеток пуповины
Полученные из пуповины клетки (UDC или hUTC) готовили как описано в патентах США №№ 7524489 и 7510873 и в публикации заявки на патент США № 2005/0058634. Клетки культивировали до нужного пассажа, а затем передавали на криогенное хранение.
Приготовление дозы
Непосредственно перед введением hUTC размораживали при 37ºC (водяная баня). Подсчет клеток проводили на гемоцитометре. Жизнеспособность клеток определяли тестом на вытеснение трипанового синего. Жизнеспособность клеток на момент введения должна была быть 80% или выше. При жизнеспособности клеток ниже 80% клетки не использовались. Концентрацию клеток корректировали добавлением несущей среды до 100 мкл. Суспендированные в несущей среде клетки вводили через хвостовую вену шприцевым насосом, подходящим шприцом малого объема и иголкой калибра 28. Клетки вводили медленно, в течение примерно от 8 до 9 минут, так чтобы доставлять клетки со скоростью примерно 0,33 мл/мин/кг с регистрацией времени введения. Введение клеток производилось в течение 80 минут после приготовления. До введения клетки хранили на натуральном льду и регистрировали время введения.
Процедуры
Как обсуждалось выше, животные из части 1 исследования предназначались для биохимического анализа/анализа белка, тогда как животные из части 2 предназначались для тестирования гистологии и функции легких (плетизмография).
Для проведения биохимического анализа/анализа белка (часть 1) на 1, 6, 10 и 14-й день после инъекций несущей среды или hUTC умерщвляли четыре или пять животных из каждой группы. У каждого животного брали жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и хранили ее при –70°C до проведения анализа цитокинов, присутствовавших в BALF. Легкие, печень и селезенку быстро замораживали и хранили в RNAlater (Life Technologies, г. Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) при –70°C для последующего извлечения РНК. Фрагменты печени и селезенки хранили в RNAlater для дополнительного транскрипционного анализа.
Анализ трофических факторов в BALF
Клеточное содержание и уровни цитокинов/хемокинов (мышиные MCP-1, IL-1β, TNF-α, RANTES) определяли в BALF и супернатанте легочного гомогената с помощью мультиплексного анализа для мышей с набором микросфер (Becton Dickinson) с соблюдением протокола изготовителя и анализировали с применением проточной цитометрии для набора микросфер. Выбирали мышиные мишени, поскольку основное внимание уделялось патологическим механизмам. Среди кандидатов для мишеней человеческого эффектора были человеческий HGF, человеческий IL-1RA и VEGF. Человеческие факторы анализировали в собранном материале только в одной точке по времени, чтобы проверить наличие такой возможности. Суммарный белок в BALF количественно определяли с помощью набора BCA™ Protein Assay (Pierce, г. Рокфорд, штат Иллинойс), чтобы иметь возможность провести нормализацию в группах выборки.
Анализ трофических факторов в гомогенате легких
Образец клеток из легочного гомогената оценивали количественной ОТ-ПЦР для мышиных MCP-1, IL-1β, TNF-α, RANTES и человеческого HGF, человеческого IL-1RA и VEGF, чтобы установить наличие маркеров патологии (MCP-1, TNF-α, IL-1β и RANTES) или индикаторов терапевтической активности (человеческий HGF, IL-1RA или VEGF). ОТ-ПЦР для человеческого IL-1RA и VEGF в гомогенатах тканей легких не указывала на наличие любого из цитокинов в любой момент времени.
Часть 2 воспроизводила часть 1, но в ней использовалось считывание, не совместимое с процедурами части 1. На 1, 6, 10 и 14-й день после введения несущей среды или hUTC животных из каждой группы исследовали плетизмографией с ограничением движений. Кроме того, в каждый момент времени умерщвляли четыре или пять мышей, и образцы легких отбирали, как описано ниже.
Плетизмография
Плетизмографию мышей проводили в каждый момент времени и в конце эксперимента. Коротко говоря, функцию легких оценивали методами с ограничением движений, чтобы определить частоту дыхания, объем вдоха, время релаксации, пиковую скорость вдоха и выдоха, EF50 и изменение объема легких. Это указывает на воздействие клеточной терапии на легочную функцию в различные моменты времени.
Гистопатология
Образцы легких получали от каждой экспериментальной группы в каждый момент времени. Легкие фиксировали в нейтральном буферном растворе 10% формальдегида, обезвоживали последовательным вымачиванием в растворах этанола с нарастающей концентрацией, заливали парафином и готовили срезы толщиной 4 мкм. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином (H&E) для гистопатологического анализа. Анализировали наличие повреждений в гистологических срезах. Площадь поверхности альвеол определяли по гистопатологическим изображениям, которые анализировались с применением программы Image J, доступной в режиме онлайн в Национальных институтах здоровья. Для каждого среза легких измеряли площадь поверхности альвеол в пяти случайно выбранных полях зрения, а затем рассчитывали среднюю площадь поверхности. Хорошо известно, что уменьшение размера пространства альвеол в поврежденном легком коррелирует с повышением эластичности и растяжимости альвеол, что свидетельствует о воздействии клеточной терапии на такие параметры.
Результаты
Ресуспендирование клеток для инъекции
Из 10 флаконов hUTC, примененных в настоящем эксперименте, ни один не был исключен из исследования по критериям качества. Во всех случаях жизнеспособность была >80%. Параметры восстановления для клеток приводятся ниже в таблице 2-2 и 2-3. Показатели восстановления были высокими и несколько превысили 100% от ожидаемого значения (возможно, по причине восстановления несколько более высокого объема, чем это предполагалось для флаконов).
Таблица 2-2Показатели восстановления
Партия флаконов FV23L10B
Кол-во клеток во флаконе (×10<sup>6</sup>)
Дата
Время размораживания
Время подсчета
1
267
5
12 апр.
11,43
11,55
2
252
5
12 апр.
11,43
11,55
3
288
5
12 апр.
11,43
11,55
4
265
5
12 апр.
11,43
11,55
5
257
5
12 апр.
11,43
11,55
Итого
25
Таблица 2-3Показатели восстановления
Партия флаконов FV23L10B
Кол-во клеток во флаконе (×10<sup>6</sup>)
Дата
Время размораживания
Время подсчета
1
249
5
19 апр.
10,15
10,2
2
264
5
19 апр.
10,15
10,2
Итого
10
3
260
5
19 апр.
11,57
12,03
4
278
5
19 апр.
11,57
12,03
5
263
5
19 апр.
11,57
12,03
Итого
15
Отчеты по животным и наблюдения
У некоторых мышей на хвостах появлялись белые пятна во время внутривенной инъекции. Это было связано не с клеточной терапией, а со смещением иглы в процессе введения. В этих случаях иглу извлекали и вводили правильным образом в вену, после чего продолжали введение клеток/несущей среды. В ходе обработки эластазой или введения клеток не погибло ни одно животное. В результате введения hUTC ни у одного из животных не наблюдались какие-либо заметные неблагоприятные побочные эффекты.
Анализ жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF)
В каждый выбранный момент времени мышей умерщвляли летальной инъекцией пентобарбитала натрия и собирали BALF. На клеточном осадке проводили подсчет суммарных лейкоцитов (Фиг. 3) и дифференцированный подсчет клеток (Фиг. 4). Полученный супернатант использовали для дополнительного анализа активности цитокинов (Фиг. 5 и 6) и уровней суммарного белка (таблица с 2.4 по 2.7).
Суммарные лейкоциты в BALF
У контрольных мышей отмечалась минимальная инфильтрация клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, тогда как введение эластазы приводило к значительной инфильтрации клеток. Общая инфильтрация клеток у мышей, получавших эластазу, снижалась при введении hUTC в обеих линиях мышей.
Дифференциальное окрашивание клеток в BALF
BALF цитоцентрифугировали и окрашивали на основе модифицированного протокола окрашивания по Гимза. Образцы анализировали на присутствие лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов. Проводили подсчет по ста клеткам на каждый цитоспин, и результаты корректировали в соответствии с объемом BALF. Результаты представляли в форме средние ± стандартные ошибки. Сопоставления по трем или более группам производили с помощью ANOVA. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты анализа дифференциального окрашивания. У мышей NSG терапия hUTC приводила к значительному снижению макрофагов на 10-й день для получавших эластазу мышей по сравнению с получавшими эластазу мышами, которым не вводили hUTC. Аналогичным образом, заметное снижение уровня нейтрофилов наблюдалось на 6 и 10-й день у получавших эластазу мышей, которым вводили hUTC. Напротив, ни в один из моментов времени какого-либо заметного снижения уровня макрофагов или нейтрофилов не наблюдалось у получавших эластазу мышей дикого типа, которым вводили hUTC.
Анализ цитокинов
BALF и гомогенат тканей легких экстрагировали и анализировали с применением набора мультиплексного анализа на микросферах для воспалительных медиаторов MCP-1, TNF-α, RANTES и IL-1β, поскольку они играют надежно установленную роль в гиперсекреции слизи, разрушении паренхимы дыхательных путей, фиброзе, повреждении и воспалении тканей, которые ассоциируются с COPD.
hUTC модулировали отклик цитокинов в супернатанте жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) у получавших эластазу мышей NSG (NOD/SCIDγ) (Фиг. 5). У не получавших эластазу контрольных мышей регистрировали незначительные уровни или полное отсутствие MCP-1, TNF-α, RANTES и IL-1β, тогда как получавшие эластазу мыши демонстрировали характерный рост по всем целевым цитокинам в каждый момент времени. При этом значительное снижение уровня воспалительных медиаторов (*p<0,05) отмечалось в BALF мышей, получавших hUTC (см. Фиг. 5) для RANTES на 1/10-й день; IL-1β на 1-й день; TNF-α (d) на 1, 6, 10-й день; MCP-1 на 1-й день, 10-й день.
Реакцию на hUTC и цитокиновый отклик в супернатанте жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) определяли у получавших эластазу мышей дикого типа линии BALB/c (Фиг. 6). Приводится эффект воздействия вливания hUTC и/или эластазы из поджелудочной железы свиней (PPE) на композицию супернатанта BAL на 1, 6, 10 и 14-й день после введения hUTC. Коротко говоря, отклик был более изменчивым для данной линии, и не удалось зарегистрировать последовательных или заметных различий.
Общая концентрация белка
Общую концентрацию белка в извлеченной BALF и гомогенате тканей легких определяли по Брэдфорду (Bio-Rad, г. Геркулес, штат Калифорния), при этом калибровка производилась с применением альбумина из бычьей сыворотки (BSA) (см. ниже таблицу с 2-4 по 2-7).
Таблица 2-4Концентрация белка в BALF мышей NSG
Общий белок (мкг/мл) ±СОС
n
1-й день
6-й день
10-й день
14-й день
PBS
5
1,051±0,173
1,040±0,167
1,505±0,121
0,600±0,140
Эластаза
5
1,512±0,284
0,852±0,0453
1,929±0,213
0,542±0,188
Эластаза + hUTC
5
1,571±0,353
1,639±0,236
1,232±0,259
1,037±0,180
Клетки hUTC
4
0,880±0,1028
1,201±0,144
1,129±0,265
0,692±0,013
Таблица 2-5Концентрация белка в BALF мышей BALB/c
Общий белок (мкг/мл) ±СОС
n
1-й день
6-й день
10-й день
14-й день
PBS
5
9,302±1,401
7,446±0,189
4,632±0,239
3,993±0,156
Эластаза
5
9,872±0,317
7,058±0,0444
3,604±0,530
3,226±0,765
Эластаза + hUTC
5
8,844±0,989
6,340±0,361
3,617±0,677
3,514±0,309
Клетки hUTC
4
5,388±0,560
4,581±0,123
3,755±0,306
2,165±0,198
Таблица 2-6Концентрация белка в гомогенате тканей легких мышей NSG
Общий белок (мкг/мл) ± СОС
n
1-й день
6-й день
10-й день
14-й день
PBS
5
0,558±0,157
2,845±0,749
2,272±0,346
2,171±0,756
Эластаза
5
0,309±0,031
1,623±0,458
2,360±0,522
2,298±0,425
Эластаза + hUTC
5
0,602±0,094
1,730±0,448
3,465±0,549
1,592±0,525
Клетки hUTC
4
0,872±0,180
0,403±0,147
2,491±0,647
1,214±0,481
Таблица 2-7Концентрация белка в гомогенате тканей легких у мышей BALB/c
Общий белок (мкг/мл) ± СОС
n
1-й день
6-й день
10-й день
14-й день
PBS
5
1,277±0,403
0,955±0,281
0,428±0,089
0,283±0,071
Эластаза
5
1,781±0,424
0,852±0,0453
0,897±0,248
0,250±0,037
Эластаза + hUTC
5
1,057±0,256
1,639±0,236
0,624±0,070
0,198±0,068
Клетки hUTC
4
1,399±0,318
1,201±0,144
0,461±0,111
0,192±0,069
Между экспериментальными группами в обеих линиях не было зарегистрировано каких-либо значимых различий по суммарной концентрации белка.
Гистология
Количественный анализ. Удаляли легкие у мышей без лаважа и фиксировали в 10% (об/об) формалин/PBS, заливали в парафин, готовили срезы и окрашивали гематоксилином/эозином (H&E) (см. Фиг. 7). Количественно оценивали увеличение воздушного объема. Измеряли линейные отсечения для альвеол, и среднее линейное отсечение (Lm) применяли в качестве морфометрического параметра эмфиземы. Для каждого образца легких отбирали 3 (три) репрезентативных неперекрывающихся поля зрения. Сетку со случайным распределением накладывали на изображение среза, окрашенного H&E. Рассчитывали следующие количественные показатели: среднее линейное отсечение (Lm) и количество альвеол. Lm отражает средний размер альвеол. Измерения не включали бронхи и кровеносные сосуды.
Гистопатология
Удаляли легкие у мышей без лаважа и фиксировали в 10% (об/об) формалин/PBS, заливали в парафин, готовили срезы и окрашивали гематоксилином/эозином (H&E). На Фиг. 8 приведены репрезентативные микрофотографии для каждой экспериментальной группы на 1-й день. Получавшие эластазу мыши, которым впоследствии вводили hUTC, демонстрировали значительное снижение патологии по сравнению с получавшими эластазу мышами, которым в тот же момент времени вводили физиологический раствор. Увеличение воздушного объема из-за воздействия эластазы сглаживалось при введении hUTC (Фиг. 8 и подпись к ней на с. 17). На Фиг. 9 показано, что hUTC снижали тяжесть вызванной эластазой эмфиземы у иммунодефицитных мышей (NOD/SCIDγ) на 1, 6, 10 и 14-й день. На Фиг. 10 показано, что hUTC снижали тяжесть вызванной эластазой эмфиземы у иммунокомпетентных мышей (BALB/c) на 1, 6, 10 и 14-й день.
Функция легких
Плетизмографию проводили для каждой мыши в каждый момент времени и в конце эксперимента, как описано для предыдущего исследования. Функцию легких оценивали методами с ограничением движений, чтобы определить частоту дыхания, объем вдоха, время релаксации, пиковую скорость вдоха и выдоха, EF50 и изменение объема легких. Между группами не было выявлено каких-либо значимых различий (статистический анализ с помощью однофакторного метода ANOVA). Все параметры представлены на Фиг. 11А и 11В.
Анализ трофических факторов в гомогенате легких
Образец клеток из легочного гомогената анализировали с помощью количественной ОТ-ПЦР для измерения количества мРНК для человеческих HGF, IL-1RA и VEGF, чтобы оценить индикаторы терапевтической активности. Описанными здесь способами не удалось обнаружить человеческих HGF, VEGF или IL-1RA в гомогенате легких.
Заключение
В настоящем исследовании оценивалась эффективность hUTC в стандартной и новой моделях мышей для эмфиземы, которая относится к хроническим заболеваниям легких. Эластазу вводили в легкие обеих линий мыши, вызывая изменения, характерные для человеческой и экспериментальной эмфиземы: расширенные, но меньшие по количеству альвеолы и сокращение поверхности альвеол из-за разрушения альвеолярных стенок; повышенная продукция воспалительных медиаторов; миграция клеток воспалительных типов в жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Введение hUTC ингибировало такие эффекты в моделях, препятствуя развитию или сглаживая симптомы эмфиземы (т.е. COPD), что также указывает на возможность достижения подобного эффекта у человека.
Полученные данные позволяют сделать ряд выводов. Во-первых, hUTC проявляют эффективность для предупреждения основных эмфизематозных проявлений COPD в новой модели человек-мышь. hUTC ингибировали продукцию провоспалительных медиаторов (TNF-α, RANTES, MCP-1 и IL-1β), которые обычно ассоциируются с патологией, в модели NSG. Более важно то, что hUTC значительно уменьшали степень индуцированной эластазой эмфиземы в легких мышей, и получавшие hUTC мыши с COPD (обе модели) демонстрировали значительно меньшее среднее линейное отсечение (Lm) между альвеолами (т.е. меньшее разрушение) по сравнению с не получавшим лечения эмфизематозным контролем. Аналогичным образом, обработка hUTC сохраняла повышенное количество альвеол и снижала инфильтрацию воспалительными клетками в жидкости BAL в модели COPD гуманизированных NSG. Таким образом, hUTC эффективно устраняли основные проявления патологии.
Модель NSG также является удобной экспериментальной моделью для исследования препаратов клеток человека и предоставляет возможность проводить будущие исследования в поддержку hUTC в качестве эффективной клеточной терапии. Данная модель также создает возможности для более фундаментального исследования механизмов терапевтического воздействия и важных вопросов, связанных со сроками и частотой введения.
В целом, различия в патологии и снижение воспалительных медиаторов после разового введения hUTC убедительно подтверждают эффективность hUTC в новой модели.
Таким образом, по результатам данного эксперимента можно сделать следующие основные выводы:
hUTC ингибируют продукцию провоспалительных медиаторов (TNF-α, RANTES, MCP-1 и IL-1β) в «гуманизированной» (NSG) модели COPD и не модулируют такие цитокиновые отклики в модели иммунокомпетентных мышей.
hUTC значительно снижали степень поражения индуцированной эластазой эмфиземы в легких мышей в обеих моделях.
Получавшие hUTC мыши с COPD (обе модели) демонстрировали значительно меньшее среднее линейное отсечение (Lm) между альвеолами (т. е. меньшее разрушение) по сравнению с не получавшим лечения эмфизематозным контролем. Аналогичным образом, обработка hUTC позволяла сохранять повышенное количество альвеол.
hUTC снижали инфильтрацию клеток в жидкости BAL в гуманизированной модели (NSG) COPD.
ПРИМЕР 3
ВЫДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
2
Выделение клеток пуповины. Пуповины получили в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания). Ткани были получены после нормально прошедших родов. Протоколы выделения клеток проводили в асептических условиях в ламинарном боксе. Для удаления крови и продуктов распада клеток пуповину промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS; Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) в присутствии пенициллина в концентрации 100 единиц/миллилитр, и стрептомицина в концентрации 100 миллиграмм/миллилитр, и амфотерицина В в концентрации 0,25 микрограмм/миллилитр (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния). Затем ткани механически диссоциировали в планшетах для культивирования тканей площадью 150 см в присутствии 50 миллилитров среды (среды DMEM с низким содержанием глюкозы или среды DMEM с высоким содержанием глюкозы; Invitrogen) до измельчения ткани в мелкую пульпу. Размельченные ткани перенесли в конические пробирки объемом 50 миллилитров (приблизительно по 5 грамм ткани в пробирку).
Затем ткань была расщеплена в среде DMEM с низким содержанием глюкозы или среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, каждая из которых содержала пенициллин в дозе 100 единиц/миллилитр, стрептомицин в дозе 100 миллиграмм/миллилитр, амфотерицин B в дозе 0,25 микрограмм/миллилитр и расщепляющие ферменты. В некоторых вариантах осуществления применяли смесь ферментов из коллагеназы и диспазы («C:D») (коллагеназа (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), 500 единиц/миллилитр; и диспаза (Invitrogen), 50 единиц/миллилитр, в среде DMEM с низким содержанием глюкозы). В других экспериментах применяли смесь из коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы («C:D:H») (C:D:H = коллагеназа, 500 единиц/миллилитр; диспаза, 50 единиц/миллилитр; и гиалуронидаза (Sigma), 5 единиц/миллилитр, в среде DMEM с низким содержанием глюкозы). Конические пробирки, содержащие ткань, среду и расщепляющие ферменты, инкубировали при температуре 37°C на орбитальном шейкере (Environ, г. Бруклин, штат Нью-Йорк) при скорости 225 об/мин в течение 2 часов.
После расщепления ткани центрифугировали при 150 x g в течение 5 минут и отсасывали супернатант. Осадок повторно растворяли в 20 миллилитрах ростовой среды (среда DMEM с низким содержанием глюкозы (Invitrogen), 15 процентов (об/об) фетальной бычьей сыворотки (FBS; фетальная бычья сыворотка определенного состава; партия № AND18475; Hyclone, г. Логан, штат Юта), 0,001% (об/об) 2-меркаптоэтанол (Sigma), пенициллин в концентрации 100 единиц/миллилитр, и стрептомицин в концентрации 100 микрограмм/миллилитр, и амфотерицин В в концентрации 0,25 микрограмм/миллилитр (все от Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния)). Клеточную суспензию фильтровали через нейлоновый клеточный фильтр BD FALCON с размером поры 70 микрон (BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния). Фильтр дополнительно промыли 5 миллилитрами жидкости, содержащей ростовую среду. Затем клеточную суспензию пропустили через нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 40 микрометров (BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния), после чего фильтр дополнительно промыли 5 миллилитрами ростовой среды.
Фильтрат повторно растворяли в ростовой среде (до общего объема 50 миллилитров) и центрифугировали при 150 x g в течение 5 минут. Супернатант отсасывали и клетки повторно растворяли в 50 миллилитрах свежей ростовой среды. Описанную процедуру повторили еще дважды.
После последнего центрифугирования супернатант отсосали и клеточный осадок повторно растворили в 5 миллилитрах свежей ростовой среды. Число жизнеспособных клеток определили окрашиванием трипановым синим. Затем клетки культивировали в стандартных условиях.
2
2
Клетки, выделенные из ткани пуповины, высевали с плотностью 5000 клеток/смна покрытые желатином колбы T-75 (Corning Inc., г. Корнинг, штат Нью-Йорк) в ростовой среде. Через два дня из колб аспирировали использованную среду и неприкрепившиеся клетки. Закрепившиеся клетки трижды промывали PBS для удаления продуктов распада клеток и клеток крови. Затем клетки снова заливали ростовой средой и давали культуре расти до конфлюентности (приблизительно 10 суток от пассажа 0) до пассажа 1. При последующих пассированиях (от пассажа 1 до пассажа 2 и т. д.) клетки достигали субконфлюентности (75–85 процентов конфлюентности) за 4–5 суток. Для данных последующих пассирований клетки высевали с плотностью 5000 клеток/см. Клетки растили в увлажняемом инкубаторе в атмосфере с 5 процентами диоксида углерода при 37°C.
В некоторых вариантах осуществления клетки выделяли из тканей постнатального материала в среду DMEM с низким содержанием глюкозы после расщепления с использованием LIBERASE (2,5 миллиграмм/миллилитр, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, г. Индианаполис, штат Индиана) и гиалуронидазы (5 единиц/миллилитр, Sigma). Расщепление ткани и выделение клеток проводили описанным выше способом для расщепления с использованием других протеаз, при этом применяли смесь LIBERASE/гиалуронидазы вместо ферментативной смеси C:D или C:D:H. Расщепление ткани с использованием LIBERASE позволило выделить из тканей постнатального материала популяции клеток, которые легко размножались.
Сравнили между собой процедуры выделения клеток из пуповины с применением разных комбинаций ферментов. Ферменты, которые сравнивали на расщепление, включали в себя: коллагеназу; диспазу; гиалуронидазу; смесь из коллагеназы и диспазы (C:D); смесь из коллагеназы и гиалуронидазы (C:H); смесь из диспазы и гиалуронидазы (D:H); смесь из коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы (C:D:H). При выделении клеток с использованием данных разных условий ферментативного расщепления наблюдали различия, представленные в таблице 3-1.
Предпринимали другие попытки выделения пулов клеток из пуповины различными способами. В одном случае пуповину нарезали и промывали ростовой средой для отделения сгустков крови и студенистого материала. Смесь крови, студенистого материала и ростовой среды собирали и центрифугировали при 150×g. Дебрис повторно растворяли и высевали в ростовой среде на покрытые желатином колбы. Данные эксперименты позволили выделить популяцию клеток, которые легко размножались.
Клетки также выделили из образцов пуповинной крови, полученных из NDRI. Был применен протокол выделения, соответствующий международной заявке на патент PCT/US2002/029971 Ho et al. Образцы (50 миллилитров и 10,5 миллилитров соответственно) пуповинной крови (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания) смешивали с лизирующим буферным раствором (стерилизованным посредством фильтрации 155 мМ хлоридом аммония, 10 мМ бикарбонатом калия, 0,1 мМ буферным ЭДТА с pH 7,2 (все компоненты были приобретены у компании Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури)). Клетки лизировали при соотношении пуповинной крови к лизирующему буферному раствору 1:20. Полученную суспензию клеток в течение 5 секунд перемешивали на вортексе и затем инкубировали в течение 2 минут при температуре окружающей среды. Лизат центрифугировали (10 минут при 200×g). Клеточный осадок повторно растворяли в полной минимальной поддерживающей среде (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния), содержащей 10 процентов фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, г. Логан, штат Юта), 4 мМ глутамина (Mediatech, г. Херндон, штат +Вирджиния), пенициллин 100 единиц на миллилитр и стрептомицин 100 микрограмм на миллилитр (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния). Повторно растворенные клетки центрифугировали (10 минут при 200×g), супернатант отсасывали и клеточный осадок промывали в полной среде. Клетки высевали непосредственно либо в колбы T75 (г. Корнинг, штат Нью-Йорк) либо в покрытые ламинином колбы T75, либо в покрытые фибронектином колбы T175 (все колбы производства Becton Dickinson, г. Бедфорд, штат Массачусетс).
Для того чтобы определить возможность выделения популяций клеток в разных условиях и их размножения в разных условиях сразу после выделения, клетки расщепляли в ростовой среде с добавлением или без добавления 0,001 процента (об/об) 2-меркаптоэтанола (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) с применением комбинации ферментов C:D:H в соответствии с описанными выше процедурами. Все клетки культивировали в присутствии пенициллина в концентрации 100 единиц/миллилитр и стрептомицина в концентрации 100 микрограмм/миллилитр. Клетки закреплялись и хорошо размножались между пассажами 0 и 1 при всех исследуемых условиях (таблица 2-2). Для клеток при условиях 5–8 и 13–16 наблюдали хорошую пролиферацию вплоть до 4 пассажей после посева, после чего их криоконсервировали.
Комбинация ферментов C:D:H обеспечила наилучший выход клеток после выделения и дала клетки, которые размножались в культуре в течение большего количества поколений, чем при использовании других условий (таблица 3-1). При применении только коллагеназы или только гиалуронидазы не удавалось получить способную к размножению популяцию клеток. Попытки проверить, специфичен ли этот результат к конкретной исследуемой коллагеназе, не предпринимались.
Таблица 3-1Выделение клеток из ткани пуповины с применением различных комбинаций ферментов
Расщепляющая ферментативная смесь
Выделенные клетки
Размножение клеток
Коллагеназа
X
X
Диспаза
+ (>10 ч)
+
Гиалуронидаза
x
X
Коллагеназа/диспаза
++ (<3 ч)
++
Коллагеназа/гиалуронидаза
++ (<3 ч)
+
Диспаза/гиалуронидаза
+ (>10 ч)
+
Коллагеназа/диспаза/гиалуронидаза
+++ (<3 ч)
+++
Обозначения: + = хорошее, ++ = очень хорошее, +++ = отличное, X = нет результата
Клетки закреплялись и хорошо размножались между пассажами 0 и 1 при всех исследуемых условиях по ферментативному расщеплению и условиям роста (таблица 3-2). Для клеток при экспериментальных условиях 5–8 и 13–16 наблюдали хорошую пролиферацию вплоть до 4 пассажей после посева, после чего их криоконсервировали. Все клетки криоконсервировали для проведения дополнительного анализа.
Таблица 3-2Выделение и размножение в культуре клеток постнатального материала при различных условиях
Условие
Среда
15% FBS
BME
Желатин
20% O<sub>2</sub>
Факторы роста
1
DMEM-Lg
Да
Да
Да
Да
Нет
2
DMEM-Lg
Да
Да
Да
Нет (5%)
Нет
3
DMEM-Lg
Да
Да
Нет
Да
Нет
4
DMEM-Lg
Да
Да
Нет
Нет (5%)
Нет
5
DMEM-Lg
Нет (2%)
Да
Нет (ламинин)
Да
EGF/FGF (20 нг/мл)
6
DMEM-Lg
Нет (2%)
Да
Нет (ламинин)
Нет (5%)
EGF/FGF (20 нг/мл)
7
DMEM-Lg
Нет (2%)
Да
Нет (фибронектин)
Да
PDGF/VEGF
8
DMEM-Lg
Нет (2%)
Да
Нет (фибронектин)
Нет (5%)
PDGF/VEGF
9
DMEM-Lg
Да
Нет
Да
Да
Нет
10
DMEM-Lg
Да
Нет
Да
Нет (5%)
Нет
11
DMEM-Lg
Да
Нет
Нет
Да
Нет
12
DMEM-Lg
Да
Нет
Нет
Нет (5%)
Нет
13
DMEM-Lg
Нет (2%)
Нет
Нет (ламинин)
Да
EGF/FGF (20 нг/мл)
14
DMEM-Lg
Нет (2%)
Нет
Нет (ламинин)
Нет (5%)
EGF/FGF (20 нг/мл)
15
DMEM-Lg
Нет (2%)
Нет
Нет (фибронектин)
Да
PDGF/VEGF
16
DMEM-Lg
Нет (2%)
Нет
Нет (фибронектин)
Нет (5%)
PDGF/VEGF
Ядросодержащие клетки быстро закреплялись и росли. Данные клетки анализировали методом проточной цитометрии, и они оказались аналогичны клеткам, полученным методом ферментативного расщепления.
Препараты содержали эритроциты и тромбоциты. Ядросодержащие клетки не закреплялись и не делились в течение первых 3 недель. Среду заменили через 3 недели после посева, не наблюдали никакого закрепления и роста клеток.
Популяции клеток можно успешно выделять из ткани пуповины при помощи комбинации ферментов, содержащей коллагеназу (металлопротеиназу), диспазу (нейтральную протеазу) и гиалуронидазу (фермент с муколитической активностью, который разрушает гиалуроновую кислоту). Также можно применять смесь LIBERASE, которая представляет собой смесь из коллагеназы и нейтральной протеазы. Для выделения клеток также применяли смесь Blendzyme 3, которая представляет собой смесь из коллагеназы (4 единицы Вунша/грамм) и термолизина (1714 единиц казеина/грамм), вместе с гиалуронидазой. Данные клетки легко размножались на протяжении многих пассирований при культивировании в ростовой среде для размножения на покрытом желатином пластике.
Клетки также выделяли из остаточной крови в пуповинах, но не из пуповинной крови. Присутствие клеток в сгустках крови, смытых с ткани, которые закрепляются и растут в применяемых условиях, может быть обусловлено клетками, высвобожденными в процессе рассечения.
ПРИМЕР 4
ХАРАКТЕРИСТИКИ РОСТА КЛЕТОК
Потенциал размножения клеток, полученных из ткани пуповины, сравнили с потенциалом размножения других популяций выделенных стволовых клеток. Процесс размножения клеток до их старения называют пределом Хейфлика (Hayflick L., J. Am. Geriatr. Soc., 1974 г.; 22(1):1–12; Hayflick L., Gerontologist, 1974 г.; 14(1):37–45).
Полимерные флаконы для тканевых культур покрывали добавлением 20 миллилитров 2% (вес/об) желатина (тип В: 225 Bloom; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) во флакон T75 (Corning Inc., г. Корнинг, штат Нью-Йорк) с выдерживанием 20 минут при комнатной температуре. После сливания раствора желатина добавляли и затем отсасывали 10 миллилитров фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния).
2
Для сравнения потенциала роста размножения использовали следующие популяции клеток: i) мезенхимальные стволовые клетки (MSC; Cambrex, г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд); ii) клетки, полученные из жировой ткани (патент США № 6555374; заявка на патент США № 2004/0058412); iii) нормальные фибробласты дермы кожи (cc-2509, партия № 9F0844; Cambrex, г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд); iv) клетки, полученные из пуповины. Клетки изначально высевали с плотностью 5000 клеток/см на покрытые желатином колбы T75 в ростовой среде. Для последующих пассирований клеточные культуры обрабатывали следующим образом. После трипсинизации подсчитывали жизнеспособные клетки после окрашивания трипановым синим. Суспензию клеток (50 микролитров) смешивали с трипановым синим (50 микролитров, Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). Количество жизнеспособных клеток оценивали с помощью гемоцитометра.
2
После подсчета клетки высевали с плотностью 5000 клеток/см на покрытые желатином колбы T75 в 25 миллилитрах свежей ростовой среды. Клетки растили в стандартной атмосфере (5 процентов двуокиси углерода (об/об)) при 37°C. Ростовую среду меняли дважды в неделю. Клетки пассировали при достижении ими степени конфлюентности приблизительно 85 процентов; данный процесс повторяли до достижения клетками старения.
При каждом пассировании клетки трипсинизировали и подсчитывали. Рассчитывали выход жизнеспособных клеток, количество удвоений популяции [ln (конечное количество клеток/исходное количество клеток)/ln2] и время удвоения (время в культуре/количество удвоений популяции). Для целей определения оптимального размножения клеток определяли общий выход клеток за пассаж путем умножения общего выхода клеток для предыдущего пассажа на фактор размножения для каждого пассажа (т.е. фактор размножения = конечное количество клеток/исходное количество клеток).
2
2
Также тестировали потенциал размножения клеток, депонированных в банк на пассаже 10. Применялся другой набор условий. Тестировали нормальные фибробласты дермы кожи (cc-2509, партия № 9F0844; Cambrex, г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд) и клетки, полученные из пуповины. Данные популяции клеток ранее депонировали в банк на пассаже 10 после культивирования при плотности 5000 клеток/см на каждом предыдущем пассаже. Эффект плотности клеток на популяции клеток определяли после размораживания клеток на пассаже 10. Клетки размораживали в стандартных условиях и подсчитывали с применением окрашивания трипановым синим. Размороженные клетки высевали с плотностью 1000 клеток/см в ростовой среде. Клетки растили в стандартных атмосферных условиях при 37°C. Ростовую среду меняли дважды в неделю. Клетки пассировали при достижении ими степени конфлюентности приблизительно 85%. Клетки последовательно пассировали до старения, т.е. до момента, когда их дальнейшее размножение становилось невозможным. При каждом пассировании клетки трипсинизировали и подсчитывали. Рассчитывали выход жизнеспособных клеток, количество удвоений популяции (ln (конечное количество клеток/исходное количество клеток)/ln2) и время удвоения (время в культуре/количество удвоений популяции). Определяли общий выход клеток за пассаж путем умножения общего выход клеток для предыдущего пассажа на фактор размножения для каждого пассажа (т.е. фактор размножения = конечное количество клеток/исходное количество клеток).
2
Потенциал размножения свежевыделенных культур клеток из пуповины в условиях низкой плотности высевания клеток исследовали в другом эксперименте. Клетки из пуповины выделяли, как описано в предыдущем примере. Клетки высевали с плотностью 1000 клеток/см и пассировали до старения, как описано выше. Клетки растили в стандартных атмосферных условиях при 37°C. Ростовую среду меняли дважды в неделю. Клетки пассировали при достижении ими степени конфлюентности приблизительно 85%. При каждом пассировании клетки трипсинизировали и подсчитывали окрашиванием трипановым синим. Для каждого пассажа рассчитывали выход клеток, количество удвоений популяции [ln (конечное количество клеток/исходное количество клеток)/ln 2] и время удвоения (время в культуре/количество удвоений популяции). Определяли общий выход клеток за пассаж путем умножения общего выхода клеток для предыдущего пассажа на фактор размножения для каждого пассажа (т.е. фактор размножения = конечное количество клеток/исходное количество клеток). Клетки растили на покрытых желатином и не покрытых желатином колбах.
2
2
2
Было показано, что условия культивирования клеток при низком O в определенных обстоятельствах могут улучшать размножение клеток (публикация заявки на патент США № 2004/0005704). Для того чтобы установить, можно ли улучшить размножение клеток для клеток, полученных из пуповины, за счет изменения условий культивирования клеток, культуры клеток, полученных из пуповины, выращивали в условиях с низким содержанием кислорода. Клетки высевали с плотностью 5000 клеток/см в ростовой среде на покрытых желатином колбах. Клетки первоначально культивировали в стандартных атмосферных условиях вплоть до пассажа 5, на котором их перенесли в условия культивирования с низким содержанием кислорода (5% O).
В других экспериментах клетки размножали на планшетах без покрытия, покрытых коллагеном, покрытых фибронектином, покрытых ламинином и покрытых Matrigel. Результаты показали, что культуры хорошо размножаются на данных разных матрицах.
2
Клетки, полученные из пуповины, размножались в течение более 40 пассажей, с выходом клеток >1E17 клеток за 60 дней. Напротив, старение MSC и фибробластов отмечалось через <25 дней и <60 дней, соответственно. Несмотря на то что клетки, полученные из жировой и сальниковой ткани, выращивались почти 60 дней, суммарный выход клеток для них составлял 4,5E12 и 4,24E13, соответственно. Таким образом, при посеве с плотностью 5000 клеток/см в используемых экспериментальных условиях клетки, полученные из пуповины, размножались намного лучше, чем клетки других типов, выращиваемые в тех же условиях (таблица 4-1).
Таблица 4-1Ростовые характеристики различных популяций клеток, выращиваемых до старения
Тип клеток
Старение
Общее количество удвоений популяции
Выход (всего клеток)
Клетки MSC
24 сут.
8
4,72 E7
Адипозная клетка
57 сут.
24
4,50 E12
Фибробласты
53 сут.
26
2,82 E13
Пуповина
65 сут.
42
6,15 E17
Клетки, полученные из пуповины, и фибробласты размножались в течение более чем 10 пассажей, причем на выходе через 60 суток получалось >1E11 клеток (таблица 4-2). В этих условиях популяции фибробластов и полученных из пуповины клеток старели через 80 суток после >50 и >40 удвоений популяции, соответственно.
Таблица 4-2Ростовые характеристики различных популяций клеток, выращиваемых в условиях размножения при низкой плотности роста от пассажа 10 до старения
Тип клеток (№ пассажа)
Старение
Общее количество удвоений популяции
Выход (всего клеток)
Фибробласт (P10)
80 сут.
43,68
2,59 E11
Клетки пуповины (P10)
80 сут.
53,6
1,25 E14
В условиях с пониженным содержанием кислорода отмечалось эффективное размножение клеток; вместе с тем, культивирование при пониженном содержании кислорода, по-видимому, не оказывает заметного воздействия на размножение полученных постнатально клеток. Приведенные результаты носят предварительный характер, поскольку любые окончательные выводы относительно воздействия пониженного содержания кислорода лучше всего формулировать на основе экспериментов по выращиванию клеток при низком содержании кислорода сразу после первоначального выделения. Стандартные атмосферные условия уже доказали свою эффективность для успешного выращивания достаточного количества клеток, и культура с низким содержанием кислорода не требуется для выращивания полученных постнатально клеток.
2
2
Текущие условия размножения клеток, подразумевающие выращивание клеток, выделенных из пуповины, с плотностями приблизительно 5000 клеток/см в ростовой среде на покрытых желатином или непокрытых колбах, в условиях стандартного атмосферного кислорода, достаточны для получения большого количества клеток на пассаже 11. Кроме того, полученные данные показывают, что клетки могут с легкостью размножаться в условиях низкой плотности культуры (например, 1000 клеток/см). Размножение клеток, полученных из пуповины, в условиях с низким содержанием кислорода также способствует размножению клеток, хотя пока что при использовании подобных условий для роста не наблюдалось нарастающего улучшения потенциала размножения клеток. В настоящее время для получения больших пулов клеток предпочтительным является культивирование клеток, полученных из пуповины, в стандартных атмосферных условиях. Однако изменение условий культивирования также может изменить размножение клеток, полученных из пуповины. Данную стратегию можно применять для повышения пролиферативной и дифференцирующей способности этих клеточных популяций.
Хотя при используемых условиях потенциал размножения клеток MSC и адипозных клеток оказывается ограниченным, клетки, полученные из ткани пуповины, легко размножаются до большого количества.
ПРИМЕР 5
РОСТ КЛЕТОК В СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ D-ВАЛИН
Как известно, применение среды, содержащей D-валин вместо нормальной изоформы L-валина, позволяет избирательно ингибировать рост фибробластоподобных клеток в культуре (Hongpaisan, J. Cell Biol. Int., 2000 г.; 24:1–7; Sordillo et al., Cell Biol. Int. Rep., 1988 г.; 12:355–64). Были проведены эксперименты с тем, чтобы определить, могут ли клетки, полученные из пуповины, расти в среде, содержащей D-валин.
2
Клетки, полученные из пуповины (P5), и фибробласты (P9) высевали с плотностью 5000 клеток/см в покрытые желатином флаконы T75 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк). Через 24 часа среду удаляли и клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) для удаления остатков среды. Среду заменяли модифицированной ростовой средой (DMEM с D-валином (специальный заказ Gibco), 15% (об/об) диализованной фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, г. Логан, штат Юта), 0,001% (об/об) бета-меркаптоэтанола (Sigma), пенициллин в концентрации 50 единиц/миллилитр и стрептомицин 50 миллиграмм/миллилитр (Gibco)).
Клетки, полученные из пуповины, и клетки фибробластов после посева в содержащую D-валин среду не пролиферировали в отличие от клеток, высеянных в ростовую среду, содержащую диализованную сыворотку. Клетки фибробластов изменились морфологически, увеличившись в размере и изменив форму. Все клетки погибали и, в конечном счете, отделялись от поверхности флакона через четыре недели. Поэтому можно сделать вывод о том, что клеткам, полученным из ткани пуповины, требуется L-валин для роста клеток и поддержания их долгосрочной жизнеспособности. L-валин предпочтительно не удалять из ростовой среды для клеток, полученных из ткани пуповины.
ПРИМЕР 6
АНАЛИЗ КАРИОТИПА КЛЕТОК
Применяемые в клеточной терапии клеточные линии предпочтительно должны быть однородными и свободными от любых примесей клеток других типов. Клетки человека, которые применяются в терапевтических целях, должны иметь нормальное количество (46) хромосом с нормальной структурой. Был проведен анализ кариотипов образцов клеток для определения линий, полученных из пуповины клеток, однородных и свободных от клеток, происходящих не из ткани пуповины.
Клетки UTC, полученные из ткани постнатального материала новорожденного мальчика, культивировали в ростовой среде. Ткань постнатального материала новорожденного мальчика (X, Y) выбрали для возможности различения неонатальных клеток и материнских клеток (X, X). Клетки высевали с плотностью 5000 клеток на кв. сантиметр в ростовой среде в колбе T25 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк) и размножали до степени конфлюентности 80%. Затем содержащую клетки колбу T25 заполнили по горлышко ростовой средой. Образцы доставили курьером в лабораторию клинической цитогенетики (оцениваемое время транспортировки из лаборатории в лабораторию составляет один час). Хромосомный анализ проводился Центром молекулярной генетики человека при Медицинской школе Нью-Джерси, г. Ньюарк, штат Нью-Джерси. Клетки анализировали во время метафазы, когда хромосомы видны лучше всего. Из двадцати подсчитанных в метафазе клеток пять проанализировали на количество кариотипов для нормальной однородной популяции клеток (два). Образец клеток характеризовали как однородный при наблюдении двух кариотипов. Образец клеток характеризовали как неоднородный при наблюдении более двух кариотипов. При определении количества кариотипов (четыре), характерного для неоднородной популяции клеток, подсчитывали и анализировали дополнительные клетки в метафазе.
Все образцы клеток, отправленные для проведения хромосомного анализа, были интерпретированы персоналом цитогенетической лаборатории как нормальные. Три из шестнадцати проанализированных клеточных линий продемонстрировали неоднородный фенотип (XX и XY), указывающий на присутствие клеток как неонатального, так и материнского происхождения (таблица 6-1). Каждый из образцов клеток характеризовался как однородный (таблица 6-1).
Таблица 6-1Результаты по кариотипам клеток UTC
Ткань
Пассаж
Подсчитано метафазных клеток
Проанали-зировано метафазных клеток
Количество кариотипов
Кариотип ISCN
Пуповина
23
20
5
2
46, XX
Пуповина
6
20
5
2
46, XY
Пуповина
3
20
5
2
46, XX
В результате хромосомного анализа идентифицировали клетки UTC, полученные из пуповины, кариотипы которых интерпретировали в лаборатории клинической цитогенетики как нормальные. В результате кариотипического анализа также идентифицировали клеточные линии, свободные от материнских клеток, что было определено по однородному кариотипу.
ПРИМЕР 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МАРКЕРОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ
МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Характеризацию белков, или «маркеров», клеточной поверхности методом проточной цитометрии можно применять для определения отличительных признаков клеточной линии. Стабильность экспрессии можно определить по множеству доноров и в клетках, которые культивировали и обрабатывали в разных условиях. Линии клеток постнатального материала, выделенных из пуповины, охарактеризовали методом проточной цитометрии, получив профиль экспрессии для установления отличительных признаков данных клеточных линий.
Клетки культивировали в ростовой среде в обработанных плазмой колбах для культивирования тканей T75, T150 и T225 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк) до конфлюентности. Ростовые поверхности колб покрывали желатином инкубацией с 2% (вес/об) раствором желатина (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение 20 минут при комнатной температуре.
7
Закрепившиеся клетки в колбах промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS); (Gibco, г. Карлсбад, штат Миссури) и отделяли трипсином/ЭДТА (Gibco). Клетки собирали, центрифугировали и повторно растворяли в 3% (об/об) FBS в PBS при концентрации 1×10 клеток на миллилитр. В соответствии с инструкциями производителя добавляли антитело на рассматриваемый маркер клеточной поверхности (см. ниже) к 100 микролитрам клеточной суспензии и инкубировали смесь в темноте в течение 30 минут при температуре 4ºC. После инкубации клетки промывали PBS и центрифугировали для удаления несвязавшихся антител. Клетки повторно растворяли в 500 микролитрах PBS и анализировали методом проточной цитометрии. Анализ методом проточной цитометрии проводил на анализаторе FACScalibur (Becton Dickinson, г. Сан-Хосе, штат Калифорния). Применяли следующие маркеры взаимодействия антител с клеточной поверхностью (см. таблицу 7-1).
Таблица 7-1Антитела, примененные в характеризации маркеров клеточной поверхности клеток UDC
Антитело
Производитель
Номер по каталогу
CD10
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
555375
CD13
BD Pharmingen
555394
CD31
BD Pharmingen
555446
CD34
BD Pharmingen
555821
CD44
BD Pharmingen
555478
CD45RA
BD Pharmingen
555489
CD73
BD Pharmingen
550257
CD90
BD Pharmingen
555596
CD117
BD Pharmingen
340529
CD141
BD Pharmingen
559781
PDGFr-альфа
BD Pharmingen
556002
HLA-A, B, C
BD Pharmingen
555553
HLA-DR, DP, DQ
BD Pharmingen
555558
IgG-FITC
Sigma (г. Сент-Луис,штат Миссури)
F-6522
IgG-PE
Sigma
P-4685
Клетки, полученные из пуповины, анализировали на пассажах 8, 15 и 20. Для сравнения различий доноров сравнивались клетки, полученные из пуповины, от различных доноров. Клетки, полученные из пуповины, культивировавшиеся на покрытых желатином колбах, сравнили с клетками, полученными из пуповины, культивировавшимися на непокрытых колбах.
Сравнили результаты четырех процедур выделения и подготовки клеток. Клетки получили из постнатальных тканей посредством обработки 1) коллагеназой; 2) коллагеназой/диспазой; 3) коллагеназой/гиалуронидазой; 4) коллагеназой/гиалуронидазой/диспазой.
Все проанализированные методом проточной цитометрии клетки, полученные из пуповины, на пассажах 8, 15 и 20 экспрессировали CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Все проанализированные методом проточной цитометрии клетки, полученные из пуповины и выделенные у разных доноров, показали положительную продукцию CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении продукции CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Все проанализированные методом проточной цитометрии клетки, полученные из ткани пуповины и размножаемые на покрытых желатином и на непокрытых колбах, были положительными в отношении продукции CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, при этом значения флуоресценции были повышены по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении продукции CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Анализ клеток, полученных из пуповины, методом проточной цитометрии позволил установить отличительные особенности данных клеточных линий. Клетки, полученные из ткани пуповины, положительны в отношении экспрессии CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, HLA-A, B, C и отрицательны в отношении экспрессии CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ. Данные отличительные признаки были стабильными при изменении различных переменных, включая донора, номер пассажа, покрытие поверхности сосуда для культивирования, расщепляющие ферменты и плацентарный слой. Наблюдались некоторые вариации в средних значениях и диапазонах изменения кривых гистограмм значений флуоресценции, но все положительные кривые при всех исследуемых условиях имели нормальный вид и значения флуоресценции, превышающие значения для используемого в качестве контроля IgG, тем самым подтверждая, что клетки включают однородную популяцию с положительной экспрессией маркеров.
ПРИМЕР 8
АНАЛИЗ КЛЕТОК ПРИ ПОМОЩИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЧИПОВ
Для сравнения профилей экспрессии генов клеток, полученных из пуповины и плаценты, с профилями экспрессии для фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток человека и другой клеточной линии, полученной из костного мозга человека, применяли олигонуклеотидные чипы. Данный анализ позволил охарактеризовать полученные из постнатального материала клетки и идентифицировать уникальные молекулярные маркеры данных клеток.
2
Клетки, полученные из ткани постнатального материала. Пуповины и плаценту человека получили в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания) после нормально прошедших родов при доношенной беременности с согласия пациента. Ткани получили и клетки выделили способом, описанным в Примере 6, после расщепления смесями C:D:H. Клетки культивировали в ростовой среде на покрытых желатином пластиковых колбах для культивирования тканей. Культуры инкубировали при 37 ºC в атмосфере с 5% CO.
Фибробласты. Фибробласты дермы человека приобретали у компании Cambrex Incorporated (г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд; партия № 9F0844) и ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Обе линии культивировали в среде DMEM/F12 (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) и пенициллина/стрептомицина (Invitrogen). Клетки растили на стандартном обработанном тканью пластике.
2
Человеческие мезенхимальные клетки (hMSC). Клетки hMSC приобретали у Cambrex Incorporated (г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд; партии №№ 2F1655, 2F1656 и 2F1657) и культивировали в соответствии с техническими требованиями производителя в среде MSCGM (Cambrex). Клетки растили на стандартном культивированном тканью пластике при 37ºC в атмосфере с 5% CO.
4
3
2
2
2
4
2
Клетки костного мозга гребня подвздошной кости человека (ICBM). Костный мозг гребня подвздошной кости человека получили из NDRI с согласия пациента. Костный мозг обработали в соответствии со способом, описанном Ho et al. (WO 03/025149). Костный мозг смешивали с лизирующим буферным раствором (155 мМ NHCl, 10 мМ KHCO и 0,1 мМ ЭДТА, pH 7,2) в соотношении 1 часть костного мозга к 20 частям лизирующего буферного раствора. Суспензию клеток перемешали на вортексе, инкубировали в течение 2 минут при температуре окружающей среды и центрифугировали в течение 10 минут при 500 x g. Супернатант удалили, а клеточный осадок повторно растворили в минимальной поддерживающей среде-альфа (Invitrogen) с добавлением 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки и 4 мМ глутамина. Клетки еще раз центрифугировали и клеточный осадок повторно растворили в свежей среде. Количество жизнеспособных мононуклеарных клеток определили тестом на вытеснение трипанового синего (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). Мононуклеарные клетки высевали в пластиковые колбы для культивирования тканей в количестве 5×10 клеток/см. Клетки инкубировали при 37ºC в атмосфере с 5% CO либо в условиях стандартной атмосферы O, либо при 5% O. Клетки культивировали в течение 5 дней без замены среды. Среду и незакрепившиеся клетки удаляли после 5 дней культивирования. Закрепившиеся клетки поддерживали в культуре.
Активно растущие культуры клеток удаляли из колб при помощи скребка для клеток в холодный фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 300×g. Супернатант удаляли, а клетки повторно растворяли в свежем PBS и центрифугировали еще раз. Супернатант удаляли, а клеточный осадок немедленно замораживали и хранили при температуре –80ºC. Клеточную мРНК экстрагировали и выполняли транскрипцию на кДНК. Затем кДНК транскрибировали в кРНК и пометили биотином. Меченую биотином кРНК гибридизировали с олигонуклеотидными чипами Affymetrix GENECHIP HG-U133A (Affymetrix, г. Санта-Клара, штат Калифорния). Гибридизации и сбор данных проводили в соответствии с техническими требованиями производителя. Анализ данных проводили при помощи программного обеспечения версии 1.21 «Достоверность микроматричных анализов» (SAM) (Tusher, V.G. et al., 2001 г., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116–5121). Лицензии для аналитического программного обеспечения можно приобрести в Управлении лицензирования технологий Стэнфордского университета, а более подробную информацию можно получить в интернете на веб-сайте профессора Тибширани с кафедры статистики Стэнфордского университета (www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/).
В рамках данного исследования анализу подвергли четырнадцать различных популяций клеток. Типы клеток, а также информация о пассажах, культуральном субстрате и культуральной среде перечислены в таблице 8-1. Клеточные линии перечислены согласно идентификационным номерам, со сведениями о пассаже на момент анализа, субстрате для роста клеток и ростовой среде.
Таблица 8-1Клетки, проанализированные на микрочипах
Популяция клеток
Пассаж
Субстрат
Среда
Клетки пуповины (022803)
2
Желатин
DMEM, 15% FBS, βME
Клетки пуповины (042103)
3
Желатин
DMEM, 15% FBS, βME
Клетки пуповины (071003)
4
Желатин
DMEM, 15% FBS, βME
Клетки плаценты (042203)
12
Желатин
DMEM, 15% FBS, βME
Клетки плаценты (042903)
4
Желатин
DMEM, 15% FBS, βME
Клетки плаценты (071003)
3
Желатин
DMEM, 15% FBS, βME
Клетки ICBM (070203) (5% O<sub>2</sub>)
3
Пластик
MEM 10% FBS
ICBM (062703) (стд. O<sub>2</sub>)
5
Пластик
MEM 10% FBS
ICBM (062703) (5% O<sub>2</sub>)
5
Пластик
MEM 10% FBS
Клетки hMSC (партия 2F1655)
3
Пластик
MSCGM
Клетки hMSC (партия 2F1656)
3
Пластик
MSCGM
Клетки hMSC (партия 2F1657)
3
Пластик
MSCGM
Фибробласты человека (9F0844)
9
Пластик
DMEM-F12, 10% FBS
Фибробласты человека (CCD39SK)
4
Пластик
DMEM-F12, 10% FBS
Данные были оценены при помощи анализа главных компонентов с использованием программного обеспечения SAM описанным выше способом. В ходе анализа выявили 290 генов, которые экспрессировались в исследуемых клетках в различных сравнительных количествах. Данный анализ позволил провести сравнительное сопоставление популяций друг с другом.
В таблице 8-2 представлены евклидовы расстояния, рассчитанные для сравнения клеточных пар. Евклидовы расстояния были основаны на сравнении клеток на основе 290 генов, которые дифференциально экспрессировались в клетках разных типов. Евклидово расстояние обратно пропорционально схожести в экспрессии 290 генов. Евклидово расстояние рассчитывали для видов клеток при помощи 290 генов, которые по-разному экспрессировались в этих видах клеток. Схожесть клеток обратно пропорциональна евклидовому расстоянию.
Таблица 8-2Евклидовы расстояния для клеточных пар
КЛЕТОЧНАЯ ПАРА
Евклидово расстояние
ICBM-HMSC
24,71
ПЛАЦЕНТА-ПУПОВИНА
25,52
ICBM-ФИБРОБЛАСТ
36,44
ICBM-ПЛАЦЕНТА
37,09
ФИБРОБЛАСТ-MSC
39,63
ICBM-ПУПОВИНА
40,15
ФИБРОБЛАСТ-ПУПОВИНА
41,59
MSC-ПЛАЦЕНТА
42,84
MSC-ПУПОВИНА
46,86
ICBM-ПЛАЦЕНТА
48,41
В таблице 8-3, 8-4 и 8-5 показана экспрессия генов, повышенная в клетках, полученных из плаценты (таблица 8-3), повышенная в клетках, полученных из пуповины (таблица 8-4) и пониженная в клетках, полученных из пуповины и плаценты (таблица 8-5).
Таблица 8-3Гены со специфически повышенной экспрессией в клетках, полученных из плаценты, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями (гены с повышенной экспрессией в клетках, полученных из плаценты)
ИД набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
209732_at
CLEC2B (C-типа (кальцийзависимый, домен распознавания углеводов) лектин, член 2 суперсемейства (индуцируемый активацией))
AF070642
206067_s_at
WT1 (белок опухоли Вильмса 1)
NM_024426
207016_s_at
ALDH1A2 (белок 1 семейства альдегиддегидрогеназ, член A2)
AB015228
206367_at
Ренин
NM_000537
210004_at
Ox-LDL R1 (рецептор 1 окисленных ЛПНП (лектинподобных))
AF035776
214993_at
Homo sapiens, клон IMAGE:4179671, мРНК, частичная кодовая последовательность
AF070642
202178_at
Протеинкиназа C, дзета
NM_002744
209780_at
Гипотетический белок DKFZp564F013
AL136883
204135_at
DOC1 (понижаемый при раке яичника белок 1)
NM_014890
213542_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp547K1113 (из клона DKFZp547K1113)
AI246730
Таблица 8-4Гены, экспрессия которых специфически повышена в клетках, полученных из пуповины, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями (гены с повышенной экспрессией в клетках, полученных из пуповины)
ИД набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
202859_x_at
Интерлейкин-8
NM_000584
211506_s_at
Интерлейкин-8
AF043337
210222_s_at
Ретикулон-1
BC000314
204470_at
CXCL1 (хемокиновый (мотив C–X–C) лиганд-1 (стимулятор активности роста меланомы))
NM_001511
206336_at
CXCL6 (хемокиновый (мотив C–X–C) лиганд-6 (белок хемотаксиса гранулоцитов 2))
NM_002993
207850_at
CXCL3 (хемокиновый (мотив C–X–C) лиганд-3)
NM_002090
203485_at
Ретикулон-1
NM_021136
202644_s_at
TNFAIP3 (индуцируемый фактором некроза опухоли альфа белок 3)
NM_006290
Таблица 8-5Гены, экспрессия которых специфически снижена в клетках, полученных из пуповины и плаценты, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями (гены с пониженной экспрессией в клетках, полученных из пуповины и плаценты)
ИД набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
210135_s_at
SHOX2 (содержащий гомеобокс ген низкорослости 2)
AF022654.1
205824_at
HSPB2 (27 кДа белок теплового шока 2)
NM_001541.1
209687_at
CXCL12 (хемокиновый (мотив C–X–C) лиганд-12/стромальный фактор 1)
U19495.1
203666_at
CXCL12 (хемокиновый (мотив C–X–C) лиганд-12/стромальный фактор 1)
NM_000609.1
212670_at
Эластин (надклапанный аортальный стеноз, синдром Вильямса-Бойрена)
AA479278
213381_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp586M2022 (из клона DKFZp586M2022)
N91149
206201_s_at
Мезенхимальный гомеобокс 2 (гомеобокс блокировки роста)
NM_005924.1
205817_at
SIX1 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 1) (Drosophila)
NM_005982.1
209283_at
Кристаллин, альфа B
AF007162.1
212793_at
DAAM2 (ассоциированный с белком Disheveled активатор морфогенеза 2)
BF513244
213488_at
Белок DKFZP586B2420
AL050143.1
209763_at
Аналог нейтралина 1
AL049176
205200_at
Тетранектин (связывающийся с плазминогеном белок)
NM_003278.1
205743_at
STAC (ген, содержащий домен src-гомологии 3 (SH3) и богатый цистеином домен)
NM_003149.1
200921_s_at
BTG1 (ген транслокации B-клеток 1, антипролиферативный)
NM_001731.1
206932_at
Холестерин-25-гидроксилаза
NM_003956.1
204198_s_at
RUNX3 (связанный с карликовостью фактор транскрипции 3)
AA541630
219747_at
Гипотетический белок FLJ23191
NM_024574.1
204773_at
Рецептор интерлейкина-11, альфа
NM_004512.1
202465_at
PCOLCE (усилитель проколлаген-C-эндопептидазы)
NM_002593.2
203706_s_at
FZD7 (гомолог frizzled-7) (Drosophila)
NM_003507.1
212736_at
Гипотетический ген BC008967
BE299456
214587_at
Коллаген, тип VIII, альфа-1
BE877796
201645_at
TNC (тенасцин C, гексабрахион)
NM_002160.1
210239_at
IRX5 (содержащий гомеобокс IRX белок 5)
U90304.1
203903_s_at
Гефестин
NM_014799.1
205816_at
Интегрин, бета-8
NM_002214.1
203069_at
SV2A (гликопротеин синаптического пузырька 2)
NM_014849.1
213909_at
Homo sapiens кДНК FLJ12280 fis, клон MAMMA1001744
AU147799
206315_at
CRLF1 (подобный цитокиновому рецептору фактор 1)
NM_004750.1
204401_at
KCNN4 (активируемый кальцием калиевый канал средней/низкой проводимости, подсемейство N, член 4)
NM_002250.1
216331_at
Интегрин, альфа-7
AK022548.1
209663_s_at
Интегрин, альфа-7
AF072132.1
213125_at
Белок DKFZP586L151
AW007573
202133_at
Транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ)
AA081084
206511_s_at
SIX2 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 2) (Drosophila)
NM_016932.1
213435_at
Белок KIAA1034
AB028957.1
206115_at
EGR3 (белок раннего ростового ответа 3)
NM_004430.1
213707_s_at
Гомеобокс distal-less 5
NM_005221.3
218181_s_at
Гипотетический белок FLJ20373
NM_017792.1
209160_at
AKR1C3 (альдокеторедуктаза, семейства 1, член C3/3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназа, тип II)
AB018580.1
213905_x_at
Бигликан
AA845258
201261_x_at
Бигликан
BC002416.1
202132_at
Транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ)
AA081084
214701_s_at
Фибронектин 1
AJ276395.1
213791_at
Проэнкефалин
NM_006211.1
205422_s_at
Интегрин, бета-подобный 1 (с доменами EGF-подобных повторов)
NM_004791.1
214927_at
мРНК Homo sapiens, полноразмерная вставка кДНК, клон EUROIMAGE 1968422
AL359052.1
206070_s_at
EphA3
AF213459.1
212805_at
Белок KIAA0367
AB002365.1
219789_at
NPR3 (рецептор натрийуретического пептида C/гуанилатциклаза C/рецептор атрионатрийуретического пептида C)
AI628360
219054_at
Гипотетический белок FLJ14054
NM_024563.1
213429_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564B222 (из клона DKFZp564B222)
AW025579
204929_s_at
VAMP5 (везикуло-ассоциированный мембранный белок 5/миобревин)
NM_006634.1
201843_s_at
EFEMP1 (содержащий EGF фибулинподобный белок внеклеточного матрикса 1)
NM_004105.2
221478_at
BNIP3L (ген белка, подобного белку 3, взаимодействующему с BCL2/белком аденовируса E1B 19 кДа)
AL132665.1
201792_at
AE-связывающий белок 1
NM_001129.2
204570_at
COX7A1 (полипептид 1 субъединицы VIIa цитохром c оксидазы) (мышечный)
NM_001864.1
201621_at
NBL1 (нейробластома, ген подавления онкогенности 1)
NM_005380.1
202718_at
IGFBP2 (связывающийся с инсулиноподобным фактором роста белок 2, 36 кДа)
NM_000597.1
В таблице 8-6, 8-7 и 8-8 показана экспрессия генов, повышенная в фибробластах человека (таблица 8-6), клетках ICBM (таблица 8-7) и клетках MSC (таблица 8-8).
Таблица 8-6Гены, экспрессия которых повышена в фибробластах человека, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями (гены с повышенной экспрессией в фибробластах)
DUSP2 (фосфатаза двойной специфичности 2)
Белок KIAA0527
кДНК Homo sapiens: FLJ23224 fis, клон ADSU02206
Динеин, цитоплазматический, промежуточный полипептид 1
ANK3 (анкирин 3, перехват Ранвье (анкирин G))
INHBA (ингибин, бета A (активин A, активин AB-альфа-полипептид))
ENPP4 (эндонуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза 4 (предполагаемая функция))
Белок KIAA1053
MAP1A (белок, ассоциированный с микротрубочками 1A)
ZNF41 (цинк-пальцевый белок 41)
Белок HSPC019
кДНК Homo sapiens: FLJ23564 fis, клон LNG10773
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564A072 (из клона DKFZp564A072)
LIM-белок (аналогичный связывающемуся с протеинкиназой C крысы, класс enigma)
IKBKAP (ингибитор усилителя гена легкого полипептида каппа в B-клетках, ассоциированный с киназным комплексом белок)
Гипотетический белок FLJ22004
Человеческая (клон CTG-A4) последовательность мРНК
ESTs, умеренно сходные с CRLF2 (подобный цитокиновому рецептору фактор 2); Предшественник цитокинового рецептора CRL2 [Homo sapiens]
TGF-бета2 (трансформирующий фактор роста бета-2)
Гипотетический белок MGC29643
Антиген, идентифицируемый моноклональным антителом MRC OX-2
Предполагаемый белок, связанный с X-хромосомой ретинопатией
Таблица 8-7Гены, экспрессия которых повышена в клетках ICBM, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
Гены с повышенной экспрессией в клетках ICBM
•CARP (белок с повторами сердечного анкирина)
•MHC, класс I, область ORF
•Интегрин, альфа-10
•Гипотетический белок FLJ22362
•UDP-N-ацетил-альфа-D-галактозамин:полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 3 (GalNAc-T3)
•Зависимый от интерферона белок 44
•SRY (определяющий пол участок Y)-бокс 9 (кампомелическая дисплазия, аутосомная реверсия пола)
•Ассоциированный с кератином белок 1-1
•Гиппокальцин-подобный 1
•JAG1 (jagged 1 (синдром Алажиля))
•Протеогликан 1, секреторная гранула
Таблица 8-8Гены, экспрессия которых повышена в клетках MSC, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями (гены с повышенной экспрессией в клетках MSC)
•Интерлейкин-26
•Мальтаза-глюкоамилаза (альфа-глюкозидаза)
•NR4A2 (ядерные рецепторы, подсемейство 4, группа A, член 2)
•v-fos FBJ гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы
•Гипотетический белок DC42
•NR4A2 (ядерные рецепторы, подсемейство 4, группа A, член 2)
•FBJ гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы B
•WISP1 (индуцируемый WNT1 белок сигнального пути 1)
•MCF.2 полученная из клеточной линии трансформирующая последовательность
•KCNK15 (калиевый канал, подсемейство K, член 15)
•CART1 (хрящевой гомеобелок 1)
•кДНК Homo sapiens FLJ12232 fis, клон MAMMA1001206
•кДНК Homo sapiens FLJ34668 fis, клон LIVER2000775
•JUNB (прото-онкоген jun B)
•BCL6 (B-клеточный CLL/лимфома 6 (цинк-пальцевый белок 51))
•ZFP36 (цинк-пальцевый белок 36, тип C3H, гомолог (мышиный))
Настоящий пример провели для получения молекулярной характеризации клеток, полученных из пуповины и плаценты. Анализ включал клетки, полученные из трех различных пуповин и трех различных плацент. Исследование также включало две различные линии фибробластов дермы, три линии мезенхимальных стволовых клеток и три линии клеток костного мозга гребня подвздошной кости. Экспрессируемую данными клетками мРНК подвергли анализу с использованием олигонуклеотидного чипа GENECHIP, который содержал олигонуклеотидные зонды для 22000 генов.
Анализ позволил обнаружить транскрипты 290 генов, которые присутствуют в различных количествах в пяти различных видах клеток. Данные гены включают десять генов, экспрессия которых специфически повышается в клетках, полученных из плаценты, и семь генов, экспрессия которых специфически повышается в клетках, полученных из пуповины. Было обнаружено пятьдесят четыре гена со специфически сниженными уровнями экспрессии в клетках, полученных из плаценты, и клетках, полученных из ткани пуповины.
Экспрессию выбранных генов подтвердили с использованием ПЦР, как показано в примере 9. Клетки, полученные постнатально, в общем случае, и клетки, полученные из пуповины, в частности, обладают различными профилями экспрессии генов, например, по сравнению с другими клетками человека, например, исследованными в настоящем эксперимента клетками, полученными из костного мозга, и фибробластами.
ПРИМЕР 9
КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ
Профили экспрессии генов для клеток, полученных из пуповины человека и плаценты человека, сопоставляли с профилями для клеток, полученных из других источников, с использованием Affymetrix GENECHIP. Идентифицировали шесть «характерных» генов: рецептор 1 окисленных ЛПНП, интерлейкин-8 (IL-8), ренин, ретикулон, CXCL3 (лиганд хемокинового рецептора 3) и GCP-2 (гранулоцитарный хемотаксический белок-2). Эти «характерные» гены экспрессировались в клетках, полученных из пуповины, на относительно высоком уровне.
Описанные в данном примере процедуры проводили для верификации данных анализа на микрочипах и сравнения данных экспрессии генов и белков, а также для создания серии надежных анализов для выявления уникальных идентификаторов клеток, полученных из пуповины.
Клетки, полученные из пуповины (четыре изолята), клетки, полученные из плаценты (три изолята, в том числе один изолят, содержащий в основном неонатальные клетки, что было подтверждено кариотипическим анализом) и нормальные фибробласты кожи человека (NHDF; неонатальные и взрослые) выращивали в ростовой среде в покрытых желатином флаконах T75. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) выращивали в среде для выращивания мезенхимальных стволовых клеток BulletKit (MSCGM; Cambrex, г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд).
2
Для выполнения экспериментов IL-8 клетки размораживали из жидкого азота и высевали в покрытые желатином колбы с плотностью 5000 клеток/см, растили в течение 48 часов в ростовой среде и затем растили дополнительно в течение 8 часов в 10 миллилитрах бессывороточной среды [среда DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния), пенициллин (50 единиц/миллилитр, стрептомицин (50 микрограмм/миллилитр) (Gibco) и 0,1% (вес/об) бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури)]. Затем экстрагировали РНК и супернатанты центрифугировали при 150 x g в течение 5 минут для удаления продуктов распада клеток. Супернатанты замораживали при –80°C до анализа ИФА.
2
Клетки, полученные из ткани пуповины, клетки, полученные из ткани плаценты, а также фибробласты человека, полученные из неонатальной человеческой крайней плоти, культивировали в ростовой среде в покрытых желатином флаконах T75. На пассаже 11 клетки замораживали в жидком азоте. Клетки размораживали и переносили в пробирки для центрифугирования объемом 15 миллилитров. После центрифугирования при 150×g в течение 5 минут супернатант удалили. Клетки повторно растворяли в 4 миллилитрах культуральной среды и подсчитывали. Клетки выращивали в течение 24 часов в колбе с площадью поверхности 75 см, содержащей 15 миллилитров ростовой среды, при посеве 375000 клеток/колбу. Среду на 8 часов заменили на бессывороточную среду. В конце инкубации бессывороточную среду собрали, центрифугировали при 14000×g в течение 5 минут и хранили при температуре –20°C.
Для оценки количества клеток в каждую колбу добавляли по 2 миллилитра трипсина/ЭДТА (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) на колбу. После открепления клеток от стенок колбы активность трипсина нейтрализовали добавлением 8 миллилитров ростовой среды. Клетки перенесли в пробирку для центрифугирования объемом 15 миллилитров и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант удалили и в каждую пробирку добавили по 1 миллилитру ростовой среды для повторного растворения клеток. Количество клеток устанавливали при помощи гемоцитометра.
Количество IL-8, секретированного клетками в бессывороточную среду, анализировали с использованием наборов для анализа ИФА (R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота). Все анализы проводили в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем.
РНК экстрагировали из конфлюентных культур клеток, полученных из пуповины, и фибробластов, или, для оценки экспрессии IL-8, из клеток, обработанных как описано выше. Клетки лизировали 350 микролитрами буферного раствора RLT, содержащего бета-меркаптоэтанол (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), в соответствии с инструкциями производителя (набор RNeasy Mini Kit; Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния). РНК экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя (набор RNeasy Mini Kit; Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния) и обрабатывали ДНКазой (2,7 единицы/образец) (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). РНК элюировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре –80°C. РНК также экстрагировали из пуповины человека. Ткань (30 миллиграмм) суспендировали в 700 микролитрах буферного раствора RLT, содержащего 2-меркаптоэтанол. Образцы механически гомогенизировали и проводили экстракцию РНК в соответствии с рекомендациями производителя. РНК экстрагировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре –80°C.
Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием случайных гексамеров, применяя реагенты для обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния) при 25°C в течение 10 минут, при 37°C в течение 60 минут и при 95°C в течение 10 минут. Пробы хранили при температуре –20°C.
Гены, идентифицированные кДНК-микрочипом как уникально регулируемые в клетках из пуповины и плаценты (характерные гены, включая рецептор окисленных ЛПНП, интерлейкин-8, ренин и ретикулон), дополнительно исследовали с использованием ПЦР в реальном времени и стандартного ПЦР.
ПЦР проводили для образцов кДНК с использованием продуктов экспрессии генов, доступных в продаже под торговым названием ASSAYS-ON-DEMAND (Applied Biosystems) для продукции экспрессии генов. Рецептор окисленных ЛПНП (Hs00234028); ренин (Hs00166915); ретикулон (Hs00382515); CXCL3 (хемокиновый лиганд-3) (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); и GAPDH смешивали с кДНК и универсальным мастер-миксом для ПЦР TaqMan в соответствии с инструкциями производителя (Applied Biosystems), используя секвенатор 7000 с программным обеспечением ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). Использовали следующие условия термоциклирования: сначала 50°C в течение 2 минут и 95°C в течение 10 минут, затем 40 циклов по 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Данные ПЦР анализировали в соответствии с рекомендациями производителя (Бюллетень пользователя № 2 компании Applied Biosystems для секвенатора ABI Prism 7700).
Стандартную ПЦР проводили на секвенаторе ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, г. Бостон, штат Массачусетс) для подтверждения результатов ПЦР в реальном времени. ПЦР проводили с использованием 2 микролитров раствора кДНК (1 × Taq полимераза (торговое название AMPLITAQ GOLD), универсальной смеси реакционного буфера ПЦР (Applied Biosystems) и с первоначальной денатурацией при 94°C в течение 5 минут. Амплификацию оптимизировали для каждого набора праймеров. Для IL-8, лиганда-3 CXC и ретикулона (94°C в течение 15 секунд, 55°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд для 30 циклов); для ренина (94°C в течение 15 секунд, 53°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд для 38 циклов); для окисленного рецептора ЛПНП и GAPDH (94°C в течение 15 секунд, 55°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд для 33 циклов). Примененные для амплификации праймеры перечислены в таблице 9-1. Концентрация праймеров в конечной реакционной смеси ПЦР составляла 1 мкМ за исключением GAPDH, для которого она составляла 0,5 мкМ. Для GAPDH использовали те же праймеры, что и для ПЦР в реальном времени, за исключением того, что в конечную реакционную смесь ПЦР не добавляли прилагаемый производителем зонд TaqMan. Образцы разделяли, нанося на 2% (вес/об) агарозный гель, и окрашивали бромидом этидия (Sigma, г. Сент-Луис, штат Монтана). Изображения получали с использованием пленки 667 (Universal Twinpack, VWR International, г. Саут-Плэйнфилд, штат Нью-Джерси) и камеры с фиксированным фокусным расстоянием POLAROID (VWR International, г. Саут-Плэйнфилд, штат Нью-Джерси).
Таблица 9-1Примененные праймеры
Наименование праймера
Праймеры
Рецептор окисленных ЛПНП
S: 5’-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)А: 5’-AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3’ (SEQ ID NO:2)
Ренин
S: 5’-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3’ (SEQ ID NO:3)А: 5’-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3’ (SEQ ID NO:4)
Ретикулон
S: 5’-TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3’ (SEQ ID NO:5)А: 5’-AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3’ (SEQ ID NO:6)
Интерлейкин-8
S: 5’-TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3’ (SEQ ID NO:7)А: 5’-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC-3’ (SEQ ID NO:8)
CXCL3 (хемокиновый лиганд-3)
S: 5’-CCCACGCCACGCTCTCC-3’ (SEQ ID NO:9)А: 5’-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC -3’ (SEQ ID NO:10)
Клетки, полученные из пуповины, и клетки, полученные из ткани плаценты, фиксировали в холодном 4% (вес/об) параформальдегиде (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение 10 минут при комнатной температуре. Применяли по одному изоляту для каждых из полученных из пуповины клеток пассажа 0 (P0) (непосредственно после выделения) и пассажа 11 (P11) (два изолята клеток, полученных из пуповины) и для фибробластов (P11). Иммуноцитохимический анализ проводили с использованием антител к следующим эпитопам: виментин (1:500, Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), десмин (1:150; Sigma - выработанные на кролика; или 1:300; Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния - выработанные на мышь), альфа-актин гладких мышц (SMA; 1:400; Sigma), цитокератин 18 (CK18; 1:400; Sigma), фактор фон Виллебранда (vWF; 1:200; Sigma) и CD34 (CD34 человека, класс III; 1:100; DAKOCytomation, г. Карпинтерия, штат Калифорния). Кроме того, следующие маркеры тестировали на пассаже 11 клеток, полученных из пуповины: античеловеческий GROальфа-PE (1:100; Becton Dickinson, г. Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси), античеловеческий GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, г. Санта-Круз, штат Калифорния), античеловеческий рецептор 1 окисленных ЛПНП (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech) и античеловеческий NOGA-A (1:100; Santa Cruz Biotech).
Культуры промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и обрабатывали белковым блокирующим раствором, содержащим PBS, 4% (об/об) козьей сыворотки (Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния) и 0,3% (об/об) Тритона (Triton X-100; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение 30 минут для доступа к внутриклеточным антигенам. Когда рассматриваемый эпитоп размещали на клеточной поверхности (CD34, ox-LDL R1), Тритон X-100 исключали на всех стадиях процедуры, чтобы не допустить потери эпитопа. Кроме того, когда первичное антитело вырабатывали на козу (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), в течение всего процесса вместо козьей сыворотки применяли 3% (об/об) ослиную сыворотку. Затем культуры в течение 1 часа обрабатывали при комнатной температуре разбавленными в блокирующем растворе первичными антителами. Растворы первичных антител удаляли и культуры промывали PBS перед добавлением растворов вторичных антител (1 час при комнатной температуре), содержащих блокирующий раствор вместе с конъюгатом козьего антимышиного IgG-Texas Red (1:250; Molecular Probes, г. Юджин, штат Орегон) и/или конъюгатом козьего антикроличьего IgG-Alexa 488 (1:250; Molecular Probes) или конъюгатом ослиного антикозьего IgG-FITC (1:150, Santa Cruz Biotech). Затем культуры промывали и обрабатывали 10-микромолярным раствором DAPI (Molecular Probes) в течение 10 минут для визуализации клеточных ядер.
После иммунного окрашивания получали флуоресцентные изображения с использованием соответствующего фильтра для флуоресценции на инвертированном эпи-флуоресцентном микроскопе (Olympus, г. Мелвилл, штат Нью-Йорк). Во всех случаях положительное окрашивание соответствовало сигналу флуоресценции выше сигнала для контрольного окрашивания, при котором выполняли всю описанную выше процедуру за исключением обработки раствором первичных антител (контроль № 1). Репрезентативные изображения получали с использованием цветной цифровой видеокамеры и программного обеспечения Image-Pro (Media Cybernetics, г. Карлсбад, штат Калифорния). Для образцов с тройным окрашиванием каждое изображение получали с использованием только одного фильтра на эмиссию. Затем получали послойные монтажи с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop (Adobe, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
7
Закрепившиеся клетки в колбах промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) и отделяли с помощью трипсина/ЭДТА (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния). Клетки собирали, центрифугировали и повторно растворяли в 3% (об/об) растворе FBS в PBS при концентрации клеток 1x10 на миллилитр. Отбирали аликвоты по сто микролитров в конические пробирки. Клетки, окрашиваемые на внутриклеточные антигены, пермеабилизировали буферным раствором Perm/Wash (BD Pharmingen, г. Сан-Диего, штат Калифорния). Антитела добавляли к аликвотам согласно рекомендациям производителя и инкубировали клетки в темноте в течение 30 минут при 4ºC. После инкубации клетки промывали PBS и центрифугировали для удаления избытка антител. Клетки, требующие вторичных антител, повторно растворяли в 100 микролитрах 3% раствора FBS. Вторичные антитела добавляли к аликвотам согласно рекомендациям производителя и инкубировали клетки в темноте в течение 30 минут при 4ºC. После инкубации клетки промывали PBS и центрифугировали для удаления избытка вторичных антител. Промытые клетки повторно растворяли в 0,5 миллилитра PBS и анализировали методом проточной цитометрии. Применяли следующие антитела: рецептор 1 окисленных ЛПНП (sc-5813; Santa Cruz Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, г. Бедфорд, штат Массачусетс), мышиный IgG1 каппа, (P-4685 и M-5284; Sigma), и ослиного антикозьего IgG (sc-3743; Santa Cruz Biotech). Проточную цитометрию проводили на анализаторе FACScalibur (Becton Dickinson, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Результаты ПЦР в реальном времени для выборочных сигнатурных генов, проводившейся для кДНК клеток, полученных из пуповины человека, ткани плаценты человека, взрослых и неонатальных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток, показывают, что экспрессия ретикулона была выше в клетках, полученных из пуповины, по сравнению с другими клетками. Данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, проанализировали методом ΔΔCT и отразили на логарифмической шкале. Каких-либо существенных отличий в уровнях экспрессии CXCL3 (хемокинового лиганда-3) и GCP-2 между клетками постнатального материала и контролями не обнаружено. Результаты ПЦР в реальном времени подтвердили стандартной ПЦР. Данные результаты дополнительно подтвердили секвенированием продуктов ПЦР. Каких-либо существенных отличий в уровнях экспрессии CXCL3 (хемокинового лиганда-3) между клетками постнатального материала и контролями при использовании перечисленных в таблице 9-1 праймеров на CXCL3 стандартной ПЦР не обнаружено.
Экспрессия цитокина, IL-8 в клетках пуповины была повышенной в клетках, полученных из пуповины и культивированных в ростовой среде и бессывороточной среде. Все данные ПЦР в реальном времени подтвердили стандартной ПЦР и секвенированием продуктов ПЦР.
После роста в бессывороточной среде кондиционированную среду проверяли на предмет наличия IL-8. В таблице 9-2 приводятся результаты анализа ИФА для интерлейкина-8 (IL-8) на клетках, полученных из плаценты и пуповины, а также фибробластах человеческой кожи. Результаты представлены в единицах пикограмм/миллион клеток, n = 2, sem. Н/О: не обнаружено.
Наибольшие количества IL-8 детектировали в среде, где культивировались клетки пуповины (таблица 9-2). IL-8 не обнаруживали в среде, где культивировались фибробласты человеческой кожи.
Таблица 9-2Экспрессия белка IL-8 по результатам ИФА
Тип клеток
IL-8
Фибробласты человека
Н/О
Изолят плаценты 1
Н/О
Изолят UMBC 1
2058,42±144,67
Изолят плаценты 2
Н/О
Изолят UMBC 2
2368,86±22,73
Изолят плаценты 3 (нормальная конц. O<sub>2</sub>)
17,27±8,63
Изолят плаценты 3 (низкий O<sub>2</sub>, без BME)
264,92±9,88
Клетки пассажа 0, полученные из пуповины человека, проверили на продукцию выбранных белков с использованием иммуноцитохимического анализа. Немедленно после выделения (пассаж 0) клетки зафиксировали 4% раствором параформальдегида и обработали антителами на шесть белков: фактор фон Виллебранда, CD34, цитокератин 18, десмин, альфа-актин гладких мышц и виментин. Клетки, полученные из пуповины, оказались положительными на альфа-актин гладких мышц и виментин, причем данная тенденция окрашивания сохранялась вплоть до пассажа 11.
С использованием иммуноцитохимических методов исследовали продукцию GROальфа, GCP-2, окисленного рецептора ЛПНП 1 и ретикулона (NOGO-A) в клетках, полученных из пуповины, на пассаже 11. Клетки, полученные из пуповины, были положительными по GCP-2, но этот метод не позволял детектировать продукцию GRO альфа. Кроме того, клетки были положительными по NOGO-A.
Соответствие между уровнями экспрессии генов, измеряемыми с помощью микрочипов и ПЦР (в реальном времени и стандартной), устанавливалось для четырех генов: окисленный рецептор ЛПНП 1, ренин, ретикулон и IL-8. Экспрессию данных генов дифференциально регулировали на уровне мРНК в клетках, полученных из пуповины, при этом IL-8 также дифференциально регулировали на уровне белка. Дифференциальную экспрессию GCP-2 и лиганд-3 CXC не подтвердили на уровне мРНК. Хотя этот результат не подтверждает данных, первоначально полученных в эксперименте с микрочипом, это может быть связано с различиями в чувствительности данных методик.
Клетки пассажа 0, полученные из пуповины человека, проверили на экспрессию альфа-актина гладких мышц и виментина, и они оказались положительными на оба белка. Данная тенденция по окраске сохранялась вплоть до пассажа 11.
В заключение, данные по полной мРНК по меньшей мере частично подтверждают данные, полученные из экспериментов с микрочипами.
ПРИМЕР 10
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ФЕНОТИПОВ
Провели иммуногистохимический анализ фенотипов клеток, обнаруженных в ткани пуповины человека.
Ткань пуповины человека собирали и фиксировали погружением в 4% (вес/об) растворе параформальдегида в течение ночи при температуре 4°C. Иммуногистохимический анализ проводили с использованием антител к следующим эпитопам (см. таблицу 10-1): виментин (1:500; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), десмин (1:150, выработанные на кролика; Sigma; или 1:300, выработанные на мышь; Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния), альфа-актин гладких мышц (SMA; 1:400; Sigma), цитокератин 18 (CK18; 1:400; Sigma), фактор фон Виллебранда (vWF; 1:200; Sigma) и CD34 (CD34 человека, класс III; 1:100; DAKOCytomation, г. Карпинтерия, штат Калифорния). Кроме того, тестировали следующие маркеры: античеловеческий GRO-альфа-PE (1:100; Becton Dickinson, г. Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси), античеловеческий GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, г. Санта-Круз, штат Калифорния), античеловеческий рецептор 1 окисленных ЛПНП (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech) и античеловеческий NOGO-A (1:100; Santa Cruz Biotech). Фиксированные препараты иссекли скальпелем и поместили в герметизирующий реактив OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, Торранс, штат Калифорния) на бане из сухого льда с этанолом. Затем замороженные блоки нарезали на части толщиной 10 микрон с использованием стандартного криостата (Leica Microsystems) и установили на предметные стекла для окрашивания.
Иммуногистохимический анализ провели аналогично предыдущим исследованиям (например, Messina et al. Exper. Neurol., 2003 г.; 184: 816–829). Части тканей промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и обрабатывали белковым блокирующим раствором, содержащим PBS, 4% (об/об) козьей сыворотки (Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния) и 0,3% (об/об) Тритона (Triton X-100, Sigma), в течение 1 часа для доступа к внутриклеточным антигенам. Когда рассматриваемый эпитоп находился на клеточной поверхности (CD34, ox-LDL R1), тритон исключали на всех стадиях процедуры, чтобы не допустить потери эпитопа. Кроме того, когда первичное антитело было выработано на козу (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), в течение всей процедуры вместо козьей сыворотки применяли 3% (об/об) ослиную сыворотку. Затем части обрабатывали в течение 4 часов при комнатной температуре первичными антителами, разбавленными в блокирующем растворе. Растворы первичных антител удаляли, а культуры промывали PBS перед добавлением растворов вторичных антител (1 час при комнатной температуре), содержащих блокирующий раствор вместе с конъюгатом козьего антимышиного IgG-Texas Red (1:250; Molecular Probes, г. Юджин, штат Орегон) и/или конъюгатом козьего антикроличьего IgG-Alexa 488 (1:250; Molecular Probes), либо конъюгатом ослиного антикозьего IgG, меченого флуоресцеинизотиоцианатом (1:150; Santa Cruz Biotech). Культуры промывали и обрабатывали 10-микромолярным раствором DAPI (Molecular Probes) в течение 10 минут для визуализации клеточных ядер.
После иммунного окрашивания получали флуоресцентные изображения с использованием соответствующего фильтра для флуоресценции на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе (Olympus, г. Мелвилл, штат Нью-Йорк). Положительное окрашивание представляло собой флуоресцентный сигнал выше сигнала окрашивания контроля. Репрезентативные изображения получали с использованием цветной цифровой видеокамеры и программного обеспечения ImagePro (Media Cybernetics, г. Карлсбад, штат Калифорния). Для образцов с тройным окрашиванием каждое изображение получали с использованием только одного фильтра на эмиссию. Затем получали послойные монтажи с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop (Adobe, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Таблица 10-1Обзор примененных первичных антител
Антитело
Концентрация
Производитель
Виментин
1:500
Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури
Десмин (rb)
1:150
Sigma
Десмин (m)
1:300
Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния
Альфа-актин гладких мышц (SMA)
1:400
Sigma
Цитокератин 18 (CK18)
1:400
Sigma
Фактор фон Виллебранда (vWF)
1:200
Sigma
CD34 III
1:100
DakoCytomation, г. Карпинтерия, штат Калифорния
GRO-альфа-PE
1:100
BD, г. Франклин-Лейкс, штат Нью-Джерси
GCP-2
1:100
Santa Cruz Biotech
Ox-LDL R1
1:100
Santa Cruz Biotech
NOGO-A
1:100
Santa Cruz Biotech
Маркеры виментин, десмин, SMA, CK18, vWF и CD34 экспрессировались подмножеством клеток, присутствующих в пуповине (данные не приведены). В частности, экспрессия vWF и CD34 ограничивалась кровеносными сосудами, находящимися внутри пуповины. Клетки CD34+ находились на самом внутреннем слое (со стороны просвета). Экспрессию виментина обнаружили по всему матриксу и кровеносным сосудам пуповины. Присутствие SMA ограничивалось матрицей и внешними стенками артерии и вены, но он не содержался в самих сосудах. CK18 и десмин наблюдали только внутри сосудов, причем экспрессия десмина ограничивалась только средними и внешними слоями.
Ни один из данных маркеров не обнаружили в ткани пуповины (данные не приведены).
Маркеры виментин, десмин, альфа-актин гладких мышц, цитокератин 18, фактор фон Виллебранда и CD 34 экспрессируются в клетках пуповины человека. На основании исследований, посвященных характеризации in vitro, было показано, что экспрессируются только виментин и альфа-актин гладких мышц, причем данные свидетельствуют о том, что текущий процесс выделения клеток из пуповины приводит к созданию субпопуляции клеток или что в выделенных клетках изменяется экспрессия маркеров, вследствие чего в клетках начинают экспрессироваться виментин и альфа-актин гладких мышц.
ПРИМЕР 11
СЕКРЕЦИЯ ТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ КЛЕТОК UTC В КУЛЬТУРЕ
Оценивалась секреция выборочных трофических факторов из клеток, полученных из пуповины, выращенных в культуре. Были выбраны факторы, имеющие ангиогенную активность (например, фактор роста гепатоцитов (HGF) (Rosen et al. Ciba Found. Symp. 1997 г.; 212:215–26), моноцитарный хемотаксический белок 1 (также известный как моноцитарный хемоаттрактант-1) (MCP-1) (Salcedo et al. Blood, 2000 г.; 96;34–40), интерлейкин-8 (IL-8) (Li et al. J. Immunol., 2003 г.; 170:3369–76), кератиноцитарный фактор роста (KGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Hughes et al. Ann. Thorac. Surg., 2004 г., 77:812–8), тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы 1 (TIMP1), ангиопоэтин-2 (ANG2), фактор роста тромбоцитов (PDGFbb), тромбопоэтин (TPO), связывающийся с гепарином эпидермальный фактор роста (HB-EGF), нейротрофическая/нейропротекторная активность (нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) (Cheng et al. Dev. Biol., 2003 г.; 258;319–33), стромальный фактор 1 альфа (SDF-1альфа), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарный хемотаксический белок-2 (GCP-2), трансформирующий фактор роста бета 2 (TGFбета2)) или хемокиновую активность (макрофагальный белок воспаления 1 альфа (MIP1альфа (MIP1α)), макрофагальный белок воспаления 1 бета (MIP1бета (MIP1β)), RANTES (хемокин, экспрессируемый и выделяемый нормальными T-клетками при активации), I309, выделяемый при активации хемокин тимуса (TARC), эотаксин, хемокин макрофагов (MDC).
2
Клетки, полученные из ткани пуповины, а также фибробласты человека, полученные из неонатальной крайней плоти человека, культивировали в ростовой среде в покрытых желатином колбах T75. На пассаже 11 клетки криоконсервировали и замораживали в жидком азоте. После размораживания в клетки добавляли ростовую среду, переносили их в пробирку для центрифугирования объемом 15 миллилитров и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Клеточный осадок повторно растворяли в 4 миллилитрах ростовой среды и подсчитывали клетки. Клетки высевали в количестве 5000 клеток/см в колбы T75, каждая из которых содержала 15 миллилитров ростовой среды, и культивировали в течение 24 часов. Среду меняли на бессывороточную среду (DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco), 0,1% (вес/об), альбумин бычьей сыворотки (Sigma), пенициллин (50 единиц/миллилитр) и стрептомицин (50 микрограмм/миллилитр, Gibco) в течение 8 часов. В конце инкубации кондиционированную бессывороточную среду собрали центрифугированием при 14 000×g в течение 5 минут и хранили при температуре –20°C.
Для определения количества клеток в каждой колбе клетки промыли фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и отделили при помощи 2 миллилитров трипсина/ЭДТА (Gibco). Активность трипсина ингибировали добавлением 8 миллилитров ростовой среды. Клетки центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант удалили и клетки повторно растворили в 1 миллилитре ростовой среды. Количество клеток устанавливали при помощи гемоцитометра.
Клетки выращивали при 37°C в присутствии 5% диоксида углерода и атмосферного кислорода. Количество MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1-альфа, GCP-2, IL-8 и TGF-бета-2, продуцируемое каждым образцом клеток, определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота). Все анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Представленные значения выражены в пикограммах на миллилитр на миллион клеток (n = 2, сканирующая электронная микроскопия).
Хемокины (MIP1альфа (MIP1α), MIP1бета (MIP1β), MCP-1, RANTES, I309, TARC, Eotaxin, MDC, IL-8), BDNF и ангиогенные факторы (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGFbb, TPO, HB-EGF) определяли с использованием чипов SearchLight™ Proteome Arrays (Pierce Biotechnology Inc.). Протеомные массивы представляют собой мультиплексные твердофазные иммуноферментные сэндвич-системы для количественного определения от 2 до 16 белков на лунку. Массивы получают, нанося матрицу 2×2, 3×3 или 4×4 от 4 до 16 разных антител захвата в каждую лунку 96-луночного планшета. После проведения процедуры сэндвич-ИФА снимают изображение всего планшета для получения сигнала хемилюминесценции, генерируемого в каждой точке матрицы в каждой лунке планшета. Сигнал, генерируемый в каждой точке матрицы, пропорционален количеству целевого белка в исходном стандартном или анализируемом образце.
MCP-1 и IL-6 секретировались клетками PPDC, полученными из ткани пуповины, и фибробластами дермы (таблица 11-1). SDF-1альфа (SDF-1α) и GCP-2 секретировались фибробластами. GCP-2 и IL-8 секретировались клетками PPDC, полученными из ткани пуповины. При использовании анализа ИФА во всех видах клеток не обнаружили TGF-бета-2.
Таблица 11-1Результаты анализа ИФА: обнаружение трофических факторов
MCP-1
IL-6
VEGF
SDF-1α
GCP-2
IL-8
TGF-бета2
Фибробласт
17+1
61+3
29+2
19+1
21+1
Н/О
Н/О
Клетки пуповины (022803)
1150+74
4234+289
Н/О
Н/О
160+11
2058+145
Н/О
Клетки пуповины (071003)
2794+84
1356+43
Н/О
Н/О
2184+98
2369+23
Н/О
Обозначения: Н/О: не обнаружено, =/- сканирующая электронная микроскопия
Мультиплексный анализ ИФА Searchlight™. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1бета, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC и IL-8 секретировались полученными из пуповины PPDC (см. таблицы 11-2 и 11-3 ниже) при выращивании в культуре. Ang2, VEGF или PDGFbb не были обнаружены.
Таблица 11-2Результаты мультиплексного анализа ИФА Searchlight™
TIMP1
ANG2
PDGFbb
TPO
KGF
HGF
FGF
VEGF
HBEGF
BDNF
Hfb
19306,3
Н/О
Н/О
230,5
5,0
Н/О
Н/О
27,9
1,3
Н/О
U1
57718,4
Н/О
Н/О
1240,0
5,8
559,3
148,7
Н/О
9,3
165,7
U3
21850,0
Н/О
Н/О
1134,5
9,0
195,6
30,8
Н/О
5,4
388,6
Обозначения: hFB (фибробласты человека), U1 (клетки PPDC, полученные из пуповины (022803)), U3 (клетки PPDC, полученные из пуповины (071003))Н/О: не обнаружено
Таблица 11-3Результаты мультиплексного анализа ИФА Searchlight™
MIP1α
MIP1β
MCP1
RANTES
I309
TARC
Эотаксин
MDC
IL8
Hfb
Н/О
Н/О
39,6
Н/О
Н/О
0,1
Н/О
Н/О
204,9
U1
Н/О
8,0
1694,2
Н/О
22,4
37,6
Н/О
18,9
51930,1
U3
Н/О
5,2
2018,7
41,5
11,6
21,4
Н/О
4,8
10515,9
Обозначения: hFB (фибробласты человека), U1 (клетки PPDC, полученные из пуповины (022803)), U3 (клетки PPDC, полученные из пуповины (071003))Н/О: не обнаружено
Клетки, полученные из пуповины, секретировали ряд трофических факторов при выращивании в культуре. Некоторые из данных трофических факторов, такие как HGF, bFGF, MCP-1 и IL-8, играют важную роль в ангиогенезе. Другие трофические факторы, такие как BDNF и IL-6, играют важную роль в регенерации или защите нервной ткани.
ПРИМЕР 12
Иммунология in vitro
+
Провели оценку линий клеток, полученных из пуповины, in vitro, на иммунологические характеристики в попытке прогнозировать возможный иммунологический ответ на данные клетки при их трансплантации in vivo. Постнатальные линии клеток анализировали проточной цитометрией на предмет экспрессии HLA–DR, HLA–DP, HLA–DQ, CD80, CD86 и B7–H2. Данные белки экспрессируются антиген-представляющими клетками (АПК) и необходимы для прямой стимуляции интактных CD4 Т-клеток (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5-е изд. (2003 г.), г. Саундерс, штат Филадельфия, стр. 171). Клеточные линии также анализировали методом проточной цитометрии на экспрессию HLA–G (Abbas & Lichtman, supra), CD178 (Coumans, et.al., (1999 г.) Journal of Immunological Methods 224, 185–196) и PD–L2 (Abbas & Lichtman, supra; Brown, et. al. The Journal of Immunology 170, 2003 г.; 1257–1266). Для прогнозирования степени, в которой полученные из плаценты клеточные линии вызывают иммунный ответ in vivo, клеточные линии тестировали в однонаправленной реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ-реакция).
Клетки культивировали в ростовой среде во флаконах Т75 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк), покрытых 2% желатином (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) до конфлюентности.
7
Клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) и отделяли с помощью трипсина/ЭДТА (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния). Клетки собирали, центрифугировали и повторно растворяли в 3% (об/об) FBS в PBS при концентрации 1×10 клеток на миллилитр. Антитело (таблица 12-1) добавляли к ста микролитрам клеточной суспензии в соответствии с инструкциями производителя и инкубировали в темноте в течение 30 минут при 4ºC. После инкубации клетки промывали PBS и центрифугировали для удаления несвязавшихся антител. Клетки повторно растворяли в пятистах микролитрах PBS и анализировали с использованием проточной цитометрии на анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Таблица 12-1Антитела
Антитело
Производитель
Номер по каталогу
HLA-DR, DP, DQ
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
555558
CD80
BD Pharmingen
557227
CD86
BD Pharmingen
555665
B7-H2
BD Pharmingen
552502
HLA-G
Abcam (Кембриджшир, Великобритания)
ab 7904-100
CD178
Santa Cruz (г. Санта-Круз, штат Калифорния)
sc-19681
PD-L2
BD Pharmingen
557846
Мышиный IgG2альфа
Sigma (г. Сент- Луис, штат Миссури)
F-6522
Мышиный IgG1каппа
Sigma
P-4685
3
3
Криоконсервированные флаконы с полученными из пуповины PPDC после пассажа 10, помеченные как клеточная линия «A», помещали на сухой лед и отправляли в CTBR (г. Сенвиль, Квебек) для проведения реакции смешанной культуры лимфоцитов согласно стандартному протоколу CTBR SOP № CAC-031. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) собрали у множества добровольных доноров мужского и женского пола. Проанализировали шесть человек, добровольных доноров крови, для выявления одного аллогенного донора, который показал бы устойчивый пролиферативный ответ в реакции смешанной культуры лимфоцитов с остальными пятью донорами крови. Данного донора выбрали в качестве аллогенного донора, положительного контроля. Остальных пять доноров выбрали как получателей. Аллогенные МКПК стимулятора (донора), аутогенные МКПК и клетки полученных из постнатального материала клеточных линий обработали митомицином C. Аутогенные и обработанные митомицином C стимуляторные клетки добавили к МКПК респондера (получателя) и культивировали в течение 4 дней. После инкубации в каждый образец добавили [H]-тимидин и культивировали смесь в течение 18 часов. Затем клетки собрали, экстрагировали радиоактивно меченную ДНК и измерили потребление [H]-тимидина с использованием сцинтилляционного счетчика. Реакции повторяли три раза, используя два планшета для культивирования клеток с тремя получателями на планшет.
Коэффициент стимулирования для клеток аллогенного донора (SIAD) рассчитали как сумму средней пролиферации клеток получателя и обработанных митомицином C клеток аллогенного донора, деленную на базовую пролиферацию клеток получателя. Коэффициент стимулирования для клеток постнатального материала рассчитали как сумму средней пролиферации клеток получателя и обработанной митомицином C клеточной линии из постнатального материала, деленную на базовую пролиферацию клеток получателя.
Проанализировали шесть человек, добровольных доноров крови, для выявления одного аллогенного донора, который показал бы устойчивый пролиферативный ответ в реакции смешанной культуры лимфоцитов с остальными пятью донорами крови. Данного донора выбрали в качестве аллогенного донора, положительного контроля. Остальных пять доноров выбрали как получателей. Клетки аллогенного донора, положительного контроля, и клетки полученных из пуповины клеточных линий обработали митомицином C и культивировали в реакции смешанной культуры лимфоцитов с индивидуальными клетками каждого из пяти аллогенных получателей. Реакции повторяли три раза, используя два планшета для культивирования клеток с тремя получателями на планшет (таблица 12-2). Средний коэффициент стимулирования для тестируемых клеток находился в диапазоне от 6,5 (планшет 1) до 9 (планшет 2), а для клеток аллогенного донора, положительного контроля, - в диапазоне от 42,75 (планшет 1) до 70 (планшет 2) (таблица 12-3).
Таблица 12-2Реакция смешанной культуры лимфоцитов. Клеточная линия A (клетки пуповины)
DPM для анализа пролиферации (планшет 1)
Аналитический номер
Культуральная система
Репликаты
Среднее значение
Среднеквадратичное отклонение
Коэффициент вариации
1
2
3
IM04-2478
Базовая пролиферация получателя
1074
406
391
623,7
390,07
62,5
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенныеклетки)
672
510
1402
861,3
475,19
55,2
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
43777
48391
38231
43466,3
5087,12
11,7
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
2914
5622
6109
4881,7
1721,36
35,3
SI (донор)
70
SI (клеточная линия)
8
IM04-2479
Базовая пролиферация получателя
530
508
527
521,7
11,93
2,3
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
701
567
1111
793,0
283,43
35,7
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
25593
24732
22707
24344,0
1481,61
6,1
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
5086
3932
1497
3505,0
1832,21
52,3
SI (донор)
47
SI (клеточная линия)
7
IM04-2480
Базовая пролиферация получателя
1192
854
1330
1125,3
244,90
21,8
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
2963
993
2197
2051,0
993,08
48,4
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
25416
29721
23757
26298,0
3078,27
11,7
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
2596
5076
3426
3699,3
1262,39
34,1
SI (донор)
23
SI (клеточная линия)
3
IM04-2481
Базовая пролиферация получателя
695
451
555
567,0
122,44
21,6
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
738
1252
464
818,0
400,04
48,9
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
13177
24885
15444
17835,3
6209,52
34,8
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
4495
3671
4674
4280,0
534,95
12,5
SI (донор)
31
SI (клеточная линия)
8
DPM для анализа пролиферации (планшет 2)
Аналитический номер
Культуральная система
Репликаты
Среднее значение
Среднеквадратичное отклонение
Коэффициент вариации
1
2
3
IM04-2482
Базовая пролиферация получателя
432
533
274
413,0
130,54
31,6
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
1459
633
598
896,7
487,31
54,3
СКЛ-реакция, аллогенный донорIM04-2477 (обработанный митомицином C)
24286
30823
31346
28818,3
3933,82
13,7
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
2762
1502
6723
3662,3
2724,46
74,4
SI (донор)
70
SI (клеточная линия)
9
IM04-2477 (аллогенный донор)
Базовая пролиферация получателя
312
419
349
360,0
54,34
15,1
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
567
604
374
515,0
123,50
24,0
Клеточная линия типа A
Базовая пролиферация получателя
5101
3735
2973
3936,3
1078,19
27,4
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
1924
4570
2153
2882,3
1466,04
50,9
Таблица 12-3Средний индекс стимулирования для клеток пуповины и аллогенного донора в реакции смешанной культуры лимфоцитов с пятью индивидуальными аллогенными получателями
Реципиент
Пуповина
Планшет 1 (получатели 1–4)
42,75
6,5
Планшет 2 (получатель 5)
70
9
+
Гистограммы проанализированных с использованием проточной цитометрии клеток, полученных из ткани пуповины, показали отрицательную экспрессию HLA–DR, DP, DQ, CD80, CD86 и B7–H2, на что указывают значения флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG, а значит, у полученных из пуповины линий клеток отсутствуют поверхностные молекулы, необходимые для прямого стимулирования аллогенных PBMC (например, CD4 T клетки).
Полученные из пуповины клетки, которые анализировались проточной цитометрией, демонстрировали положительную экспрессию PD–L2, что отражалось в увеличении флуоресценции относительно контроля IgG. Данные клетки были отрицательными по экспрессии CD178 и HLA–G, на что указывали значения флуоресценции, согласующиеся с контролем IgG.
+
В реакциях смешанной культуры лимфоцитов, проведенных с клетками полученных из пуповины клеточных линий, средний коэффициент стимулирования для тестируемых клеток находился в диапазоне от 6,5 до 9, а для клеток аллогенного донора, положительного контроля, в диапазоне от 42,75 до 70. Полученные из пуповины линии клеток не экспрессировали регистрируемые количества стимулирующих белков HLA–DR, HLA–DP, HLA–DQ, CD80, CD86 и B7–H2, как показали измерения проточной цитометрией. Полученные из пуповины клетки также не экспрессировали иммуномодулирующие белки HLA–G и CD178, но экспрессия PD–L2 была зарегистрирована с помощью проточной цитометрии. МКПК аллогенного донора содержат антиген-представляющие клетки, экспрессирующие HLA–DR, DQ, CD8, CD86 и B7–H2, позволяя тем самым стимулировать аллогенные лимфоциты. Отсутствие на клеточной поверхности полученных из пуповины клеточных линий антиген-представляющих молекул, требуемых для прямой стимуляции интактных CD4 T клеток, и присутствие иммуномодулирующего белка PD–L2 может объяснить низкий коэффициент стимулирования, показанный данными клетками в СКЛ-реакции по сравнению с аллогенными контролями.
ПРИМЕР 13
Анализ теломеразной активности
Функция теломеразы состоит в синтезе теломерных повторов, которые защищают целостность хромосом и продлевают репликативно-активную жизнь клеток (Liu, K. et al., PNAS, 1999 г.; 96:5147–5152). Теломераза состоит из двух компонентов - теломеразного РНК-шаблона (hTER) и теломеразной обратной транскриптазы (hTERT). Регулирование теломеразы определяется транскрипцией hTERT, но не hTER. Таким образом, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени для мРНК hTERT является общепринятым способом определения теломеразной активности клеток.
Выделение клеток
Для определения продукции теломеразы в клетках, полученных из ткани пуповины человека, провели эксперименты по ПЦР в реальном времени. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, были подготовлены в соответствии с приведенными выше примерами и примерами, изложенными в патенте США № 7510873. По существу, пуповины, полученные в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания) после нормально прошедших родов, промывали для удаления крови и продуктов распада клеток и механически диссоциировали. Затем ткань инкубировали с расщепляющими ферментами, включая коллагеназу, диспазу и гиалуронидазу, в культуральной среде при 37°C. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, культивировали в соответствии со способами, изложенными в примерах заявки ‘012. Мезенхимальные стволовые клетки и нормальные фибробласты дермы кожи (cc-2509 партия № 9F0844) получили от компании Cambrex, г. Уолкерсвилль, штат Мэриленд. Клеточную линию плюрипотентных клеток тестикулярной эмбриональной карциномы (тератокарциномы) человека nTera-2 (NTERA-2 cl.Dl) (см. Plaia et al., Stem Cells, 2006 г.; 24(3):531–546) приобрели в Американской коллекции клеточных культур (г. Манассас, штат Вирджиния) и культивировали в соответствии со способами, изложенными в патенте США № 7,510,873.
Выделение всей РНК
o
РНК экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy (Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния). РНК элюировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре –80C. Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием случайных гексамеров, применяя реагенты для обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния) при температуре 25°C в течение 10 минут, температуре 37°C в течение 60 минут и температуре 95°C в течение 10 минут. Пробы хранили при температуре –20°C.
ПЦР в реальном времени
ПЦР проводили на образцах кДНК с использованием продуктов для экспрессии генов Assays-on-Demand™ компании Applied Biosystems (также известные как наборы для определения экспрессии генов TaqMan) в соответствии с инструкциями производителя (Applied Biosystems). Данный доступный в продаже набор широко применяют для анализа клеток человека на теломеразу. Вкратце, hTert (ген теломеразы человека) (Hs00162669) и GAPDH человека (внутренний контроль) смешивали с кДНК и универсальным мастер-миксом для ПЦР TaqMan, при этом использовали секвенатор 7000 с программным обеспечением ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). Использовали следующие условия термоциклирования: сначала 50°C в течение 2 минут и 95°C в течение 10 минут, затем 40 циклов по 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Данные ПЦР анализировали в соответствии с рекомендациями производителя.
Клетки, полученные из ткани пуповины человека (номер доступа ATCC PTA-6067), фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки анализировали на hTert и 18S РНК. Как показано в таблице 13-1, hTert и, следовательно, теломеразу не обнаружили в клетках, полученных из ткани пуповины человека.
Таблица 13-1
hTERT
18S РНК
Клетки пуповины (022803)
Н/О
+
Фибробласты
Н/О
+
Н/О: не обнаружено; + сигнал обнаружен
Проанализировали клетки, полученные из ткани пуповины человека (изолят 022803, номер доступа ATCC PTA-6067), и клетки nTera-2, и результаты показали отсутствие экспрессии теломеразы в двух партиях клеток, полученных из ткани пуповины человека, тогда как клеточная линия тератомы экспрессировала теломеразу на высоком уровне (таблица 13-2).
Таблица 13-2
Тип клеток
hTERT
GAPDH
hTERT норм.
Эксп. 1
Эксп. 2
Эксп. 1
Эксп. 2
nTera2
25,85
27,31
16,41
16,31
0,61
022803
-
-
22,97
22,79
-
Следовательно, можно сделать вывод о том, что клетки, полученные из ткани пуповины человека, которые составляют предмет настоящего изобретения, не экспрессируют теломеразу.
Хотя изобретение было описано и проиллюстрировано ссылками на различные конкретные материалы, процедуры и примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными комбинациями материалов и процедур, выбранными для этой цели. Многочисленные изменения, касающиеся таких деталей изобретения, будут очевидными для специалистов в данной области. Подразумевается, что все описания и примеры представлены только в качестве иллюстрации и находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, что отражено в нижеприведенной формуле изобретения. Все ссылки, патенты и заявки на патенты, приведенные в этой заявке, полностью включены в настоящий документ путем ссылки.