СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ФАБРИ

1. Способ экспрессии в клетке по меньшей мере одного белка α-галактозидазы A (α-Gal A) в клетке, при этом способ включает введение экспрессионной конструкции, содержащей мутированную последовательность WPRE, необязательно мутированную последовательность WRPE с мутацией mut6, и трансген GLA, кодирующий по меньшей мере один белок α-Gal A, в клетку таким образом, чтобы белок α-Gal A экспрессировался в клетке.
2. Способ по п. 1, в котором экспрессионная конструкция содержит последовательность GLA дикого типа или кодон-оптимизированную последовательность GLA.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором экспрессионная конструкция дополнительно содержит один или более из следующего: энхансер, промотор, интрон, последовательность, кодирующую сигнальный пептид, и/или сигнал полиаденилирования, при этом мутированная последовательность WPRE, необязательно мутированная последовательность WRPE с мутацией mut6 и трансген GLA, кодирующий по меньшей мере один белок α-Gal A, расположены между сигнальным пептидом и последовательностью, кодирующей сигнал полиаденилирования.
4. Способ по п. 3, в котором экспрессионная конструкция содержит последовательность SEQ ID №: 9.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором клетка находится в организме субъекта с болезнью Фабри.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором клетка находится в организме субъекта мужского пола.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором экспрессионную конструкцию вводят в фармацевтически приемлемом носителе.
2
2
8. Способ по п. 7, в котором фармацевтически приемлемый носитель включает забуференный фосфатом физиологический раствор, содержащий CaCl, MgCl, NaCl, сахарозу и коллифор (полоксамер) P 188.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором последовательность экспрессионной конструкции включает последовательность, приведенную в Таблице 1, и при этом экспрессионная конструкция доставляется в клетку вирусным вектором AAV.
10. Способ по п. 9, в котором серотип вирусного вектора AAV представляет собой AAV2/6.
11. Способ по любому из пп. 5-10, в котором экспрессионную конструкцию вводят субъекту в дозе от около 5,0E+12 до 1,0E+14 векторных геномов на килограмм (вг/кг).
12. Способ по любому из пп. 5-11, в котором экспрессионную конструкцию вводят в печень субъекта.
13. Способ по любому из пп. 5-12, в котором экспрессионный вектор вводят субъекту посредством внутривенной инфузии.
14. Способ по любому из пп. 5-13, в котором субъекту вводят только одну дозу экспрессионной конструкции.
15. Способ по любому из пп. 5-14, в котором субъекту вводят иммунодепрессант до и/или во время введения экспрессионной конструкции.
16. Способ по п. 15, в котором иммунодепрессант содержит преднизон.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором экспрессия по меньшей мере одного белка α-галактозидазы A (α-Gal A) сохраняется в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 12 месяцев.
18. Способ по любому из пп. 5-17, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый из трансгена, снижает количество гликосфинголипидов у субъекта по меньшей мере от около 2 до около 9 раз по сравнению с субъектами, не получавшими лечение.
19. Способ по любому из пп. 5-18, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый из трансгена, снижает количество гликосфинголипидов у субъекта по меньшей мере на около 80%.
20. Способ по любому из пп. 5-19, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый из трансгена, снижает количество гликосфинголипидов у субъекта в одном или более из следующего: плазма, печень, сердце, почки или селезенка.
21. Способ по любому из пп. 5-20, в котором экспрессионная конструкция, полученная в клеточной системе HEK293, обеспечивает уровни GLA у субъекта примерно в 21 раз выше по сравнению с уровнями GLA у субъектов, которым вводили экспрессионную конструкцию, полученную в клеточной системе Sf9.
22. Способ по любому из пп. 5-21, в котором активность белка α-Gal A у субъекта примерно в 100-1500 раз выше, чем у физиологического нормального/дикого типа.
23. Способ по любому из пп. 5-22, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый трансгеном, проявляет активность в почках, печени и сердце субъекта.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором трансген GLA поддерживается вне хромосом и не интегрируется в геном клетки.
25. Способ по любому из пп. 1-23, дополнительно включающий введение одной или более нуклеаз, которые расщепляют эндогенный ген альбумина в клетке печени субъекта, таким образом, что трансген интегрируется в ген альбумина и экспрессируется из него.
26. Генетически модифицированная клетка, содержащая экзогенный трансген GLA, полученная с помощью способа по любому из пп. 1-4.
27. Генетически модифицированная клетка по п. 26, причем клетка представляет собой стволовую клетку или клетку-предшественника.
28. Генетически модифицированная клетка по п. 27, причем клетка представляет собой клетку печени или мышечную клетку.
29. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 26-28, причем трансген GLA поддерживается вне хромосом и не интегрируется в геном клетки.
30. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 26-28, причем трансген GLA интегрируется в геном клетки.
31. Способ предотвращения, ингибирования или лечения болезни Фабри или одного или более симптомов, ассоциированных с болезнью Фабри, включающий введение экспрессионной конструкции нуждающемуся в этом субъекту, при этом экспрессионная конструкция содержит мутированную последовательность WPRE, необязательно мутированную последовательность WRPE с мутацией mut6 и трансген GLA, кодирующий по меньшей мере один белок α-Gal A.
32. Способ по п. 31, в котором симптомы включают один или более из следующего: уровни Gb3 выше нормального уровня, уровни лизо-Gb3 выше нормального уровня, заболевание почек, заболевание сердца, акропарестезию, ангиокератомы, боль в желудочно-кишечном тракте, помутнение роговицы и хрусталика или цереброваскулярное заболевание.
33. Способ по пп. 31 или 32, в котором субъект является мужчиной и при этом субъект имеет активность фермента α-Gal A менее чем около 5%.
34. Способ по п. 31, в котором экспрессионная конструкция содержит последовательность GLA дикого типа или кодон-оптимизированную последовательность GLA.
35. Способ по пп. 31, 33 или 34, в котором экспрессионная конструкция дополнительно содержит один или более из следующего: энхансер, промотор, интрон, последовательность, кодирующую сигнальный пептид, и/или сигнал полиаденилирования, при этом мутированная последовательность WPRE, необязательно мутированная последовательность WRPE с мутацией mut6 и трансген GLA, кодирующий по меньшей мере один белок α-Gal A, расположены между сигнальным пептидом и последовательностью, кодирующей сигнал полиаденилирования.
36. Способ по п. 31, в котором экспрессионную конструкцию вводят в фармацевтически приемлемом носителе.
2
2
37. Способ по п. 36, в котором фармацевтически приемлемый носитель включает забуференный фосфатом физиологический раствор, содержащий CaCl, Mg Cl, NaCl, сахарозу и коллифор (полоксамер) P 188.
38. Способ по п. 31, в котором последовательность экспрессионной конструкции включает последовательность, приведенную в Таблице 1, и при этом экспрессионная конструкция доставляется в клетки субъекта вирусным вектором AAV.
39. Способ по п. 38, в котором серотип вирусного вектора AAV представляет собой AAV2/6.
40. Способ по любому из пп. 31-39, в котором экспрессионную конструкцию вводят субъекту в дозе от около 5,0E+12 до 1,0E+14 векторных геномов на килограмм (вг/кг).
41. Способ по любому из пп. 31-40, в котором экспрессионную конструкцию вводят в печень субъекта.
42. Способ по любому из пп. 31-41, в котором экспрессионный вектор вводят субъекту посредством внутривенной инфузии.
43. Способ по любому из пп. 31-42, в котором субъекту вводят только одну дозу экспрессионной конструкции.
44. Способ по любому из пп. 31-43, в котором субъекту вводят иммунодепрессант до и/или во время введения экспрессионной конструкции.
45. Способ по п. 44, в котором иммунодепрессант содержит преднизон.
46. Способ по любому из пп. 31-45, в котором экспрессия по меньшей мере одного белка α-галактозидазы A (α-Gal A) сохраняется в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 12 месяцев.
47. Способ по любому из пп. 31-46, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый из трансгена, снижает количество гликосфинголипидов у субъекта по меньшей мере от около 3 до около 9 раз по сравнению с субъектами, не получавшими лечение.
48. Способ по любому из пп. 31-46, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый из трансгена, снижает количество гликосфинголипидов у субъекта по меньшей мере на около 80%.
49. Способ по любому из пп. 31-48, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый из трансгена, снижает субъекта количество гликосфинголипидов у субъекта в одном или более из следующего: плазма, печень, сердце, почки или селезенка.
50. Способ по любому из пп. 31-49, в котором экспрессионная конструкция, изготовленная в клеточной системе HEK293, обеспечивает уровни GLA у субъекта в 21 раз выше по сравнению с уровнями GLA у субъектов, которым вводили экспрессионную конструкцию, изготовленную в клеточной системе Sf9.
51. Способ по любому из пп. 31-50, в котором активность белка α-Gal A у субъекта примерно в 100-1500 раз выше, чем у физиологически нормальных индивидуумов.
52. Способ по любому из пп. 31-51, в котором белок α-Gal A, экспрессируемый трансгеном, проявляет активность в почках, печени и сердце субъекта.
53. Способ по любому из пп. 31-52, в котором трансген GLA поддерживается вне хромосом и не интегрируется в геном клетки субъекта.
54. Способ по любому из пп. 31-52, дополнительно включающий введение одной или более нуклеаз, которые расщепляют эндогенный ген альбумина в клетке печени субъекта таким образом, что трансген интегрируется в ген альбумина и экспрессируется из него.
55. Композиция, содержащая экспрессионную конструкцию, при этом экспрессионная конструкция содержит мутированную последовательность WPRE, необязательно мутированную последовательность WRPE с мутацией mut6 и трансген GLA, кодирующий по меньшей мере один белок α-Gal A, для лечения болезни Фабри.
56. Композиция по п. 55, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
2
2
57. Композиция по п. 56, причем фармацевтически приемлемый носитель содержит CaCl, Mg Cl, NaCl, сахарозу и коллифор (полоксамер) P 188.
58. Композиция по п. 55, в которой экспрессионная конструкция содержит последовательность GLA дикого типа или кодон-оптимизированную последовательность GLA.
59. Композиция по любому из пп. 55-58, в которой экспрессионная конструкция дополнительно содержит один или более из следующего: энхансер, промотор, интрон, последовательность, кодирующую сигнальный пептид, и/или сигнал полиаденилирования, при этом мутированная последовательность WPRE, необязательно мутированная последовательность WRPE с мутацией mut6 и трансген GLA, кодирующий по меньшей мере один белок α-Gal A, расположены между сигнальным пептидом и последовательностью, кодирующей сигнал полиаденилирования.
60. Композиция по любому из пп. 55-59, в которой последовательность экспрессионной конструкции включает последовательность, приведенную в Таблице 1, и при этом экспрессионная конструкция доставляется в клетку вирусным вектором AAV.
61. Композиция по любому из пп. 55-60, в которой серотип вирусного вектора AAV представляет собой AAV2/6.
62. Композиция по пп. 60 или 61, в которой экспрессионная конструкция содержит от около 5,0E+12 до 1,0E+14 векторных геномов на килограмм массы тела субъекта (вг/кг).
63. Композиция по п. 59, в которой экспрессионная конструкция содержит последовательность SEQ ID №: 9.
64. Способ продуцирования белка α-Gal A для лечения болезни Фабри, включающий экспрессию белка α-Gal A в выделенной клетке в соответствии со способом по любому из пп. 1-4 и выделение белка α-Gal A, продуцируемого клеткой.
65. Вектор доставки, содержащий мутированную последовательность WRPE, необязательно последовательность WPRE с мутацией mut6 и трансген GLA для применения в способе по п. 1.
66. Вектор по п. 65, причем вектор доставки представляет собой вирусный вектор или липидную наночастицу (LNP).
67. Вектор по п. 66, причем вирусный вектор содержит AAV2/6, при этом вирусный вектор доставляет экспрессионную конструкцию по меньшей мере в 50%, по меньшей мере в 60%, по меньшей мере в 70% или по меньшей мере в 80% клеток.
68. Применение экспрессионной конструкции, вектора AAV и/или генетически модифицированной клетки по любому из предшествующих пунктов для лечения болезни Фабри.
69. Способ по п. 3, в котором энхансер содержит SEQ ID №: 2, промотор содержит SEQ ID №: 3, интрон содержит SEQ ID №: 4, трансген GLA содержит SEQ ID №: 5, мутированная последовательность WPRE содержит SEQ ID №: 6, а сигнал полиаденилирования содержит SEQ ID № 7.
70. Композиция по п. 59, в которой энхансер содержит SEQ ID №: 2, промотор содержит SEQ ID №: 3, интрон содержит SEQ ID №: 4, трансген GLA содержит SEQ ID №: 5, мутированная последовательность WPRE содержит SEQ ID №: 6, а сигнал полиаденилирования содержит SEQ ID № 7.