ПРИМЕНЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЦИКЛОСПОРИНОВ
USE OF MODIFIED CYCLOSPORINES

Настоящее изобретение относится к новому применению неиммуносупрессорных циклоспоринов.
Циклоспорины представляют собой класс отличающихся характерной структурой циклических поли-N-метилированных ундекапептидов, которые, как правило, обладают фармакологической, в частности иммуносупрессорной или противовоспалительной, активностью. Идентифицированы циклоспорины, которые обладают выраженной способностью связываться с циклофилином, но не обладают иммуносупрессорным действием. В WO 2005021028 А1 описано применение неиммуносупрессорных циклоспоринов, обладающих ингибирующим действием в отношении вируса гепатита С (HCV).
6
50
Циклоспорин считается неиммуносупрессорным, когда его активность в реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR) не превышает 5%, предпочтительно не превышает 2% по сравнению с циклоспорином А. Реакция лимфоцитов в смешанной культуре описана у Т.Мео, Immunological Methods, под ред. Lefkovits и Peris, Academic Press, NY, 1979, c.227-239. Селезеночные клетки (0,5×10), полученные из мышей линии Balb/c (самки возрастом 8-10 недель), совместно инкубируют в течение 5 дней с 0,5×10 облученных (2000 рад) или обработанных митомицином С селезеночных клеток мышей линии СВА (самки возрастом 8-10 недель). Облученные аллогенные клетки индуцируют пролиферативный ответ в селезеночных клетках линии Balb/c, который можно оценивать по включению в ДНК меченого предшественника. Поскольку клетки-стимуляторы облучены (или обработаны митомицином С), они не отвечают на клетки линии Balb/c пролиферативным ответом, но сохраняют свою антигенность. Значение IC, установленное в MLR для тестируемых соединений, сравнивают со значением, установленным для циклоспорина А в параллельном эксперименте. Кроме того, у неиммуносупрессорных циклоспоринов отсутствует способность ингибировать CN (кальцинеурин) и расположенный далее по ходу передачи сигнала путь фактора транскрипции NF-АТ.
Фиброз представляет собой образование и развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в результате восстановительного или реактивного процесса. Одна из форм фиброза, а именно цирроз, рассматривается как последствие хронического заболевания печени, отличающееся заменой ткани печени на фиброзную рубцовую ткань, а также образованием регенеративных узлов, что приводит к прогрессивной потери печеночной функции. Печеночные звездчатые клетки (HSC) представляют собой непаренхимные печеночные клетки, которые характеризуются звездчатой морфологией и локализованы в перисинусоидальном пространстве Диссе. После повреждения печени HSC подвергаются трансдифференциации, приобретая активированный миофибробластический фенотип, и экспрессируют гладкомышечный α-актин. Затем происходит пролиферация активированных HSC, и они образуют внеклеточные матричные белки, такие как коллагены. Проведенные ранее исследования воздействия иммуносупрессорных лекарственных средств, таких как циклоспорин и такролимус, на клеточную пролиферацию и производство коллагена в HSC позволили установить, что циклоспорин подавляет клеточный рост и производство коллагена, в то время как такролимус не обладает такими действиями, что свидетельствует о том, что циклоспорин может обладать антифиброгенной активностью.
Существующие в настоящее время антифиброзные терапии направлены на подавление воспаления печени, а не на снижение фиброза. Существует необходимость в системах лечения, которые оказывают целенаправленное воздействие на устранение вредных стимулов, подавление печеночного воспаления, на понижающую регуляцию активации звездчатых клеток и усиление деградации матрикса.
Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение неиммуносупрессорного связывающего циклофилин циклоспорина для предупреждения или лечения болезней печени, таких как связанный с трансплантацией цирроз, хронический гепатит, цирроз, рак печени, например печеночно-клеточная карцинома или ее развитие. Кроме того, неиммуносупрессорные связывающие циклофилин циклоспорины можно применять также, например, в качестве профилактического лечения новорожденных с врожденным фиброзом печени или реципиентов трансплантатов, например реципиентов трансплантата органа или ткани, например трансплантата печени.
50
50
50
Считается, что циклоспорин связывается с циклофилином, если его связывание с человеческим рекомбинантным циклофилином составляет по меньшей мере 1/5 по сравнению со связыванием циклоспорина А при оценке с помощью конкурентного анализа ELISA, описанного у Quesniaux в Eur. J. Immunol., 17, 1987, c.1359-1365. В этом анализе циклоспорин, подлежащий тестированию, вносят в процессе инкубации циклофилина с сенсибилизированным БСА циклоспорином и рассчитывают концентрацию, необходимую для 50%-ного ингибирования контрольной реакции без конкурирующего агента (IC). Результаты выражают в виде коэффициента связывания (BR), который представляет собой десятичный логарифм (log) отношения значения IС тестируемого соединения и значения IС, полученного в параллельном опыте с использованием только циклоспорина А. Так, значение BR, равное 1,0, свидетельствует о том, что тестируемое соединение связывается с человеческим циклофилином в 10 раз слабее, чем циклоспорин А, а отрицательное значение свидетельствует о более сильном связывании по сравнению с циклоспорином А. Циклоспорины, обладающие активностью в отношении HCV, характеризуются значением BR ниже 0,7, предпочтительно равным нулю или ниже нуля.
Примерами неиммуносупрессорных связывающихся с циклофилином циклоспоринов являются, например, соединения формулы I
в которой
1
W обозначает MeBmt, дигидро-MeBmt, 8'-гидрокси-МеВmt или O-ацетил-MeBmt,
Х обозначает αAbu, Val, Thr, Nva или O-метилтреонин (MeOThr),
R обозначает Pro, Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla или (D)-МеSеr(O-ацетил),
Y обозначает MeLeu, тиоМеLеu, γ-гидрокси-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle или MeaThr; N-этилVаl, N-этилIlе, N-этилТhr, N-этилРhе, N-этилТуr или N-этилТhr(О-ацетил),
Z обозначает Val, Leu, MeVal или MeLeu,
Q обозначает MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu, MeAla или Pro,
1
T обозначает (D)Ala или Lys,
2
Т обозначает MeLeu или γ-гидрокси-MeLeu и
3
Т обозначает MeLeu или MeAla.
Предпочтительными соединениями формулы I являются, например, соединения формулы Iа
в которой
W' обозначает MeBmt, дигидро-MeBmt или 8'-гидрокси-МеВmt,
Х обозначает αAbu, Val, Thr, Nva или O-метилтреонин (MeOThr),
R' обозначает Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAla или (D)-МеSеr(O-ацетил),
Y' обозначает MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle или MeaThr, N-этилVаl, N-этилIlе, N-этилТhr, N-этилРhе, N-этилТуr или N-этилТhr(О-ацетил),
Z обозначает Val, Leu, MeVal или MeLeu и
Q' обозначает MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu или MeAla.
Группы W', X, Y', Z, Q' и R' независимо друг от друга имеют следующие предпочтительные значения:
W' предпочтительно обозначает W'', где W'' обозначает MeBmt или дигидро-MeBmt,
Х предпочтительно обозначает Х', где X' обозначает αAbu или Nva, более предпочтительно X'', где X'' обозначает αAbu,
R' предпочтительно обозначает R'', где R'' обозначает Sar,
Y' предпочтительно обозначает Y'', где Y'' обозначает γ-гидpoкcи-MeLeu, MeVal, MeThr, MeIle, N-этилIlе или N-этилVаl,
Z предпочтительно обозначает Z', где Z' обозначает Val или MeVal, и
Q' предпочтительно обозначает Q'', где Q'' обозначает MeLeu.
Предпочтительная группа соединений формулы Iа включает соединения, в которых W' обозначает W'', Х обозначает X', Y' обозначает Y'', Z обозначает Z', Q' обозначает Q'' и R' обозначает R''.
Примерами предпочтительных соединений формулы Iа являются, например:
1
4
а) [дигидро-MeBmt]-[γ-гидрокси-MeLeu]-циклоспорин; BR*=0,1; IR<1%,
4
б) [МеVаl]-циклоспорин; BR=0,1; IR<1%,
4
в) [МеIlе]-циклоспорин; BR=-0,2; IR<1%,
4
г) [MeThr]-циклоспорин,
4
д) [γ-гидрокси-MeLeu]-циклоспорин; BR=0,4; IR<1%,
4
е) [этил-Ile]-циклоспорин; BR=0,1; IR<2%,
4
ж) [этил-Val]-циклоспорин; BR=0; IR<2%,
2
4
з) [Nva]-[γ-гидрокси-MeLeu]-циклоспорин,
4
6
и) [γ-гидрокси-MeLeu]-[γ-гидрокси-MeLeu]-циклоспорин,
5
к) [МеVаl]-циклоспорин; BR=0,4; IR=5,3%,
2
3
5
л) [MeOThr]-[(D)MeAla]-[MeVal]-циклocпopин,
1
м) [8-гидрокси-МеВmt]-циклоспорин; BR=0,35; IR=1,8%,
6
н) [МеАla]-циклоспорин; BR=-0,4; IR=3,2,
9
о) [γ-гидрокси-МеLеu]-циклоспорин; BR=0,15; IR=2,9.
IR обозначает иммуносупрессорный коэффициент, выраженный в виде процента активности относительно активности циклоспорина А.
Дополнительными примерами неиммуносупрессорных циклоспоринов являются соединения, описанные в WO 98/28330, WO 98/28329 и WO 98/28328, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки, например соединения формулы II
в которой
a
W обозначает
a
где R обозначает остаток формулы Iс или Id
или
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
4
1
4
в которой R обозначает С-Салкилтиогруппу, амино-C-Салкилтиогруппу, С-Салкиламино-С-Салкилтиогруппу, ди-С-Салкиламино-С-Салкилтиогруппу, пиримидинилтиогруппу, тиазолилтиогруппу, N-С-Салкилимидазолилтиогруппу, гидрокси-С-Cалкилфенилтиогруппу, гидрокси-С-Салкилфеноксигруппу, нитрофениламиногруппу или 2-оксопиримидин-1-ил и R' обозначает С-Салкил,
а
Х обозначает Abu;
a
b
b
0
0
2
6
3
6
0
2
5
1
2
1
2
1
4
2
4
3
6
1
4
2
5
1
4
1
4
1
2
1
4
1
2
R обозначает -NMe-CH(R)-CO-, где R обозначает Н или -S-Alk-R, где Alk-R обозначает метил; или Alk обозначает С-Салкилен или С-Сциклоалкилен с прямой или разветвленной цепью и R обозначает Н; ОН; СООН; С-Салкоксикарбонил; NRR, где R и R, каждый, независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, С-С алкил, С-Салкенил, С-Сциклоалкил и фенил, каждый из которых необязательно замещен галогеном, С-С алкоксигруппой, С-Салкоксикарбонилом, аминогруппой, С-Салкиламиногруппой и/или диС-С алкиламиногруппой, и бензильный и гетероциклический радикал, где бензильные и гетероциклические радикалы могут быть насыщенными или ненасыщенными и содержат 5 или 6 кольцевых членов и 1-3 гетроатома, или R и R вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют 4-6-членный гетероцикл, который может содержать другой гетероатом, выбранный из азота, кислорода и серы, и который необязательно может быть замещен С-С алкилом, фенилом или бензилом; или R и R, каждый, независимо друг от друга обозначают радикал формулы Ib
1
2
3
1
4
в которой R и R имеют указанные выше значения, R обозначает Н или С-Салкил и n обозначает целое число от 2 до 4,
a
Y обозначает MeLeu или γ-гидрокси-МеLеu,
a
Z обозначает Val и
a
Q обозначает MeLeu,
b
a
при условии, что R не обозначает Н, когда Y обозначает MeLeu, или их фармацевтически приемлемые соли.
1
2
1
2
В формуле II, когда R и/или R обозначает гетероциклический остаток, он может представлять собой пиридил, тетрагидропиридил, пиперидил, имидазолил, оксазолил или тиазолил. Когда R и R образуют гетероциклический остаток с атомом азота, с которым они связаны, гетероциклический остаток может представлять собой, например, азетидинил, пиперидил, пиперазинил, N-метилпиперазинил, N-фенилпиперазинил, N-бензилпиперазинил, пиридил, имидазолил, морфолиногруппу, тиоморфолиногруппу, тетрагидропиридил, метилтетрагидропиридил (например, 4-метилтетрагидропиридил) или фенилтетрагидропиридил (например, 4-фенилтетрагидропиридил).
Соединения формулы I, Ia или II можно получать различными путями, которые можно классифицировать как:
1) ферментация;
2) биотрансформация;
3) дериватизация;
4) частичный синтез;
5) полный синтез,
согласно методам, описанным в ЕР 0484281 Al, WO 00/01715, WO 98/28330, WO 98/28329 или WO 98/28328, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В числе дополнительных конкретных или альтернативных вариантов осуществления в настоящем изобретении предложены также:
1.1 Способ предупреждения или лечения состояний, ассоциированных с болезнями печени, у индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединения формулы I, Ia или II.
Согласно изобретению неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин можно вводить в количестве, эффективном для облегчения или элиминации одного или нескольких признаков, симптомов или состояний, ассоциированных с болезнями печени, например, в количестве, эффективном в отношении подавления производства коллагена, по данным оценки в полученном с помощью биопсии образце из организма индивидуума.
1.2 Способ подавления роста HSC в среде, заключающийся в том, что в эту среду вносят в эффективном количестве неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединение формулы I, Ia или II.
1.3 Способ подавления состояний, ассоциированных с болезнями печени, у пациента, который нуждается в этом, заключающийся в том, что индивидууму вводят в терапевтически эффективном количестве неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединение формулы I, Ia или II.
1.4 Способ предупреждения или лечения рецидива состояний, ассоциированных с болезнями печени, у реципиента трансплантата, который нуждается в этом, заключающийся в том, что вводят реципиенту в терапевтически эффективном количестве неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединение формулы I, Ia или II.
2. Применение неиммуносупрессорного связывающегося с циклофилином циклоспорина, например соединения формулы I, Ia или II, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для применения в любом из указанных выше способов.
3. Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения в любом из указанных выше способов, которая содержит неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединение формулы I, Ia или II, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми разбавителями или носителями.
Применимость неиммуносупрессорных связывающихся с циклофилином циклоспоринов (далее обозначены как «циклоспорины, предлагаемые в изобретении») для лечения указанных выше болезней и состояний можно продемонстрировать с помощью стандартных опытов на животных или клинических опытов, например, с использованием описанных ниже методик.
А. Анализ in vitro на клеточных культурах: HSC выделяли из печени самцов крыс линии Wistar путем последовательной перфузии in situ с использованием коллагеназы и расщепления с помощью проназы, а затем центрифугировали в состоящем из двух слоев (17%/11,5%) растворе метризамида (фирма Sigma Chemical, Сент-Луис, шт. Миссури) согласно методу, описанному у Kato и др., J. Hepatol, 31, 1999, с. 91-99. HSC культивировали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Эксперименты осуществляли с использованием клеток между третьим и четвертым серийным пассажем. Для оценки мышиной матриксной металлопротеиназы (ММР-1) и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы (TIMP-1), получали клетки линии TWNT-4, представляющие собой человеческую линию клеток, выведенную из HSC, согласно методу, описанному у Shibata и др., Cell Transplant, 12, 2003, с. 499-507, которую применяли для оценки воздействий фасудила на ММР-1 и TIMP-1. Клетки линии TWNT-4 культивировали в DMEM, дополненной 10% FCS, согласно описанному ранее методу (Id). NIM811 (фирма Novartis Pharma AG, Базель, Швейцария) растворяли в DMEM и добавляли в культуры. Жизнеспособность HSC-клеток составляла более 90% в бессывороточных условиях в течение 24 ч в присутствии 2 мкМ NIM811.
Анализ коллагена типа I: Культивируемые HSC инкубировали в течение 24 ч в бессывороточной среде в присутствии NIM811 или без него. Коллаген типа I определяли в культуральной среде с помощью ELISA согласно методу, описанному у Iwamoto и др., J. Hepatol, 32, 2000, с. 762-770. Антитело к крысиному коллагену типа I (фирма LSL, Токио, Япония) можно применять в качестве первичного антитела. Конъюгированное с пероксидазой козье антикроличье антитело типа IgG (фирма Organon Teknika Corporation, Дурхам, шт. Северная Каролина) применяли в качестве вторичного антитела. Коллаген типа I из сухожилия хвоста крыс (фирма Advance Biofactwes Corporation, Лимбрук, шт. Нью-Йорк) применяли в качестве стандартного контроля.
Анализ ММР-1, TIMP-1 и коллагеназы: Культивируемые клетки линии TWNT-4 инкубировали в течение 24 ч в бессывороточной среде в присутствии NIM811 или без него. Производство ММР-1 и TIMP-1 определяли в культуральных средах с помощью ELISA, используя систему Biotrak ELISA для человеческой ММР-1 (фирма Amersham Biosciences, Пискатавей, шт. Нью-Джерси, США), набор hTIMP-1 (фирма Daiichi Fine Chemical Co. Ltd., Тояма, Япония) соответственно, согласно методам, описанным у Fukushima и др., Liver Int, 25, 2005, с. 829-838. Активность ММР-1 и про-ММР-1 в культуральных средах определяли с помощью системы для анализа активности ММР-1 типа Biotrak Activity Assay System (фирма Amersham).
Анализ генной экспрессии с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени:
2
Общую РНК получали из клеток TWNT-4, которые поддерживали в течение 24 ч в присутствии NIM811 или без него в 10% FCS, используя реагент Trizol (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США). кДНК синтезировали, используя 1,0 мг РНК с помощью системы для ПЦР GeneAmpTM RNA PCR (фирма Applied Biosystems, Брансбург, шт. Нью-Джерси, США) с помощью произвольных гексамеров. ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1 (фирма Roche, Токио, Япония) согласно методу, описанному у Nakamuta и др., Int J. Mol Med 16(4), 2005, с.631-635. Применяли реакционную смесь (20 мкл), содержащую LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1,4 мМ MgCl, 0,5 мкм «обратного» и «прямого» ПЦР-праймера и 2 мл первой цепи кДНК в качестве матрицы. Для контроля вариаций в реакциях все ПЦР стандартизовали относительно уровня экспрессии глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH). Праймеры, которые можно применять, представляли собой: 5'-AGGGTGAGACAGGCGAACAG-3' («прямой» праймер) (SEQ ID NO. 1) и 5'-CTCTTGAGGTGGCTGGGGCA-3' («обратный» праймер) (SEQ ID NO. 2) для al-цепи человеческого коллагена типа I (GenBankTM, регистрационный номер NM-000088) (21); 5'-AATGAGATGGCCACTGCCGC-3' («прямой» праймер) (SEQ ID NO. 3) и 5'-CAGAGTATTTGCGCTCCGGA-3' («обратный» праймер) для человеческого антитела против гладких мышц (a-SMA) (GenBankTM, регистрационный номер NM-000088); 5'-GATCATCGGGACAACTCTCCT-3' («прямой» праймер) и 5'-TCCGGGTAGAAGGGATTTGTG-3' («обратный» праймер) для ММР-1 (GenBankTM, регистрационный номер NM 002421); 5'-TTCTGCAATTCCGACCTCGT-3' («прямой» праймер) и 5'-TCCGTCCACAAGCAATGAGT-3' («обратный» праймер) (SEQ ID NO. 4) для TIMP-1 (GenBankTM, регистрационный номер NM003254); 5'-GGATCTCAGGCATTCCTCGG-3' («прямой» праймер) (SEQ ID NO. 5) и 5'-CAGTATGCCACCACGCACCA-3' («обратный» праймер) (SEQ ID NO. 6) для Smad7 (Quan и др., J Biol Chem. 80, 2005, с.8079-8085); 5'GGCCGTTTGTATGTGCACCCTC-3' («прямой» праймер) (SEQ ID NO. 7) и 5'-GGGCGATCTAATGAAGGGTCC-3' («обратный» праймер) (SEQ ID NO. 8) для рецептора I трансформирующего фактора роста β (TGFβRI) (Woszcyk и др., Med Sci Monit, 10, 2004, с.33-37)).
Анализ включения BrdU (5-бромдезоксиуридин): Включение в HSC BrdU определяли, используя ELISA, предназначенный для оценки клеточной пролиферации (фирма Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия), согласно методу, описанному у Higashi и др., J. Lab Clin Med, 145(6), 2005, с.316-322. В целом, метод состоял в следующем: субконфлюэнтные HSC выдерживали в условиях сывороточного голодания в течение 24 ч. Затем их отмывали DMEM и инкубировали в течение 24 ч с BrdU в DMEM, дополненной 10% FCS, в присутствии NIM811 или без него. После мечения клеток с помощью BrdU клеточную ДНК расщепляли и инкубировали с антителом к BrdU, конъюгированным с пероксидазой. Включение BrdU определяли, измеряя интенсивность флуоресценции при длине волны 450 нм (возбуждение) и 690 нм (испускание).
Анализ апоптоза: HSC поддерживали в бессывороточной среде в течение 24 ч в присутствии NIM811 или без него. Клетки фиксировали в течение 30 мин в смеси 4% параформальдегида/ЗФР при комнатной температуре и повышали проницаемость, выдерживая в течение 5 мин в ЗФР, содержащем 0,2% Тритон X-100, при 4°С. Затем клетки окрашивали с помощью Hoechst 33342 и анализировали TUNEL-методом, используя набор для выявления клеточной гибели (In Situ Cell Death Detection) (фирма Roche), согласно инструкциям производителя. Образцы визуализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 (фирма Zeiss). Для каждого состояния подсчитывали по меньшей мере по 100 клеток при осуществлении трех независимых экспериментов и с использованием трех различных клеточных препаратов.
Анализ методом Вестерн-блоттинга форсфорилированных и нефосфорилированных МАРК: Анализ методом Вестерн-блоттинга осуществляли согласно описанному у Uchimuran др., Hepatology, 33, 2001, с.91099. HSC выдерживали в условиях голодания в течение 24 ч, затем в течение 2 ч обрабатывали NIM811 или оставляли без обработки. Лизаты целых клеток, содержащие 1×10 клеток линии TWNT-4, готовили в 100 мкл буфера для образцов, применяемого для ДСН-ПААГ. Белковые лизаты подвергали 12% ДСН-ПААГ, переносили на мембрану или поливинилдифторида (фирма Millipore, Бедфорд, шт. Массачусетс) и зондировали первичным антителом к ERK1/2 МАРК, фосфор-ЕРК1/2 МАРК (Thr202/Tyr204), JNK, фосфо-JNK (Thr183/Tyr185), p38 МАРК или фосфо-р38 МАРК (Thr180/Туr182) (фирма New England Biolabs, Беверли, шт. Массачусетс). Связывание антител выявляли с помощью конъюгированного с пероксидазой антикроличьего IgG (фирма Amersham Pharmacia Biotech, Пискатавей, шт. Нью-Джерси) в качестве вторичного антитела. Блоты обрабатывали ECL-plus (фирма Amersham Pharmacia Biotech, Пискатавей, шт. Нью-Джерси) для визуализации антител. Уровни ERK1/2 МАРК, фосфорилированной ERK1/2 МАРК, JNK, фосфорилированной JNK, p38 МАРК и фосфорилированной p38 МАРК определяли количественно с помощью денситометрии, используя оптическую сканирующую систему. Для сравнения рассчитывали соотношения фосфорилированных ERK1/2, JNK и p38 МАРК и нефосфорилированных ERK1/2, JNK и p38 МАРК соответственно, полученные на основе денситометрических данных.
Анализ методом Вестерн-блоттинга форсфорилированных и нефосфорилированных Smad2 и Smad3: Анализ методом Вестерн-блоттинга осуществляли согласно описанному выше для анализа МАРК и зондировали первичным антителом к Smad2, фосфо-Smad2 (Thr/Tyr), Smad3 или фосфо-Smad3 (Thr/Tyr) (фирма Cell Signaling Technology, Danvers, шт. Массачусетс). Для сравнения рассчитывали соотношения фосфорилированных Smad2 и Smad3 и нефосфорилированных Smad2 и Smad3 соответственно, полученные на основе денситометрических данных.
Статистический анализ: Все результаты представлены в виде средних значений±СКО. Сравнения осуществляли с помощью однонаправленного дисперсионного анализа с использованием критерия Шеффа или критерия Манна-Уитни.
Пример 1. Воздействие NIM811 на накопление коллагена типа I, производство ММР-1 и TIMP-1 и активность коллагеназы
Для анализа воздействия NIM811 на производство ЕСМ (внеклеточный матрикс) HSC-клетками определяли концентрации коллагена типа I в культуральных средах после регулирования количества крысиных HSC согласно описанному выше методу. Обработка клеток возрастающими концентрациями NIM81, а также циклоспорином приводила к зависящему от концентрации ингибированию накопления коллагена; при применении в концентрации 0,5 мкМ NIM811 снижал накопление коллагена примерно на 50%. Это ингибирование регулировалось по меньшей мере против хода передачи сигнала на транскрипционном уровне, поскольку обработка NIM811 подавляла экспрессию коллагена. Как описано ранее у Nakamuta и др., Transplant Рrос., 37, 2005, с. 4598-4602, циклоспорин в приемлемых для клинического применения концентрациях порядка 0,125 мкМ (150 нг/мл) снижал концентрацию коллагена примерно на 50%, в то время как такролимус в приемлемой для клинического применения концентрации 12,5 нМ (10 нг/мл) не вызывал заметного снижения производства коллагена.
Накопление коллагена помимо определенного по скорости производства коллагена регулировалось коллагеназной активностью, а именно балансом между ММР1 и TMIP-1. NIM811 приводил к зависящему от концентрации повышению коллагеназной активности (активность ММР-1) и уровням про-ММР-1; в присутствии 0,5 мкМ NIM811, коллагеназная активность повышалась примерно в 2 раза. Однако NIM811 даже в концентрации 2,0 мкМ не приводил к существенному снижению производства TIMP-1.
Пример 2. Воздействие NIM811 на экспрессию генов коллагена типа I, ММР-1 и TIMP-1
Осуществляли ОТ-ПЦР согласно описанному выше протоколу для оценки воздействий NIM811 или циклоспорина на уровни мРНК коллагена типа I, ММР-1 и TIMP-1. Экспрессия коллагена типа I снижалась в присутствии 0,5 мкМ NIM811 примерно на 30%. В противоположность этому при применении в концентрации 0,5 мкМ NIM811 повышал уровень экспрессии ММР-1 примерно в 2 раза, но не изменял уровень экспрессии TIMP-1. Эти результаты свидетельствуют о том, что воздействие NIM811 на генную экспрессии сходно с его воздействием на производство белка.
Пример 3. Воздействие фасудила на клеточную пролиферацию и апоптоз
В проведенных ранее исследованиях продемонстрировано, что помимо стимуляции производства коллагена активированные HSC ингибируют расщепление интерстициальных коллагенов с помощью интерстициальных коллагеназ, таких как ММР-1, это свидетельствует о том, что расщепления матрикса ингибируется в процессе развития фиброза (см. Веnуоn и др., Gastroenterology, 110, 1996, c.821-831, Iredale и др., Hepatology, 24, 1996, c.15-17-184, Iredale и др., J. Clin Invest, 90, 1992, c.282-287). Установлено, что TIMP-1 регулирует клеточный рост и апоптоз вне зависимости от ингибирования расщепления матрикса (см. Murphy и др., J. Biol Chem, 277, 2002, c.11069-11076). NIM811 подавляет рост HSC-клеток в зависимости от концентрации без апоптоза.
Включение BrdU оценивали согласно методу, представленному в настоящем описании, для оценки воздействия NIM811 на клеточную пролиферацию. Количественный анализ позволил установить, что обработка 2,0 мкМ NIM811 снижала синтез новой ДНК примерно на 30%, хотя это не имело место при обработке более низкой концентрацией. Кроме того, в присутствии 2 мкМ NIM811 не выявлено апоптоза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что NIM имеет терапевтический потенциал в отношении фиброза печени благодаря подавлению производства коллагена и повышению коллагеназной активности.
Пример 4. Воздействие NIM811 на пути передачи сигнала МАРК
Для объяснения механизма, с помощью которого NIM811 подавляет производство коллагена и клеточную пролиферацию и повышает коллагеназную активность с помощью описанного выше метода, оценивали воздействия NIM811 на каскады внутриклеточных путей передачи сигналов, такие как МАРК, в том числе ERK1/2, JNK и р38, которые играют важную роль в производстве коллагена и клеточной пролиферации в HSC (Маrr и др., Hepatology, 1, 2000, с.428-434). NIM811 в концентрации 0,5 мкМ повышал фосфорилирование JNK и р38 МАРК примерно в 3,6 и 2,3 раза соответственно. Обработка NIM811 существенно повышала фосфорилирование JNK и р38 МАРК в зависимости от концентрации, но не подавляла ERK1/2. Было продемонстрировано, что циклоспорин проявляет свое иммуносупрессорное действие как через кальцинеуринзависимый путь NFAT, так и через кальцинеуриннезависимый путь активации JNK и р38 (Mastuda и др., EMPO Reports 1, 2000, с.428-434)). NIM811, аналог циклоспорина, не активирует путь NFAT, поскольку он не связывается с циклофилином A (Waldmeier и др., Mol Pharmacol, 62(1), 2002, с.22-29). Различное воздействие на JNK и р38 между NIM811 и циклоспорином может быть связано с отсутствием участия NIM811 пути NFAT при использовании.
Пример 5. Воздействие NIM811 на пути передачи сигнала TGFβ
Кроме МАРК на производство коллагена HSC сильное стимулирующее действие оказывают каскады передачи сигнала TGF-β (Friedman и др., J Biol Chem., 269, 1994, с.10551-10558). TGF-β связывается с TGFβRII на клеточной мембране, а затем TGFβRII фосфорилирует TGFβRI на остатках серина и треонина, локализованных в богатом глицином/серином домене (Wrana и др., Cytokine Growth Factor Rev, 11, 2000, с.5-13). Фосфорилированный TGFβRI фосфорилирует Smad2 и Smad3 на С-концевом мотиве SSXS, который образует комплекс с общим партнером Smad4. Указанные белки Smad траслоцируются в ядро и активируют транскрипцию генов-мишеней, таких как кодирующий коллаген ген (Id). Поскольку каскады сигналов TGFβ, в которых участвуют Smad2 и Smad3, оказывают сильное регулирующее действие на экспрессию гена коллагена типа I, что описано у Friedman и др., J Biol Chem, 269, 1994, с.10551-10558, оценивали воздействие NIM811 на фосфорилирование Smad2 и Smad3. Обработка NIM811 существенно ингибировала фосфорилирование Smad2 и Smad3 в зависимости от концентрации; в концентрации 0,5 мкМ NIM811 ингибировал фосфорилирование Smad2 и Smad3 примерно на 70% и 60% соответственно. Экспрессия Smad7 оказывает негативное регулирующее действие на пути передачи сигналов TGFβ путем ингибирования фосфорилирования TGFβRII (Hayashi и др., Cell, 1997, с.1165-1173). В концентрации 0,5 мкМ NIM 811 повышал экспрессию Smad7 примерно в 2 раза и ингибировал TGFβRI примерно на 50%. Эти результаты позволяют предположить, что NIM811 может ингибировать киназную активность TGFβRII и/или TGFβRI. Smad7 (Id), иммунофилин FKBP (FК506-связывающий белок) 12 (40) и SARA (якорь Smad для рецепторной активации) (41) связаны с TGFβR и регулируют передачу сигналов TGFβ. NIM811 повышал экспрессию Smad7 и ингибировал экспрессию TGFRI, это свидетельствует о том, что NIM811 ингибирует пути передачи сигналов TGFβ по меньшей мере частично посредством блокады на рецепторном уровне. Циклоспорин оказывал также аналогичные воздействия на Smad2, Smad3, Smad7 и TGFRRI (неопубликованные данные).
Как описано выше, NIM811 оказывал противоположное циклоспорину воздействие на JNK и р38, хотя оба соединения обладали сходными воздействиями на производство коллагена и клеточную пролиферацию, это позволяет предположить, что NIM и циклоспорин проявляют антифиброгенное действие главным образом путем блокады путей передачи сигналов TGFβ.
Циклофилины являются представителями семейства ППИаз (пептидил-пролил цис-транс-изомераз), которые катализируют цис-транс интерконверсию пептидных связей аминоконца с остатками пролина, облегчая изменения белковой конформации (Waldmeier, выше). Известно более 10 подтипов циклофилина, и они участвуют в многочисленных клеточных процессах, включая регуляцию транскрипции, иммунный ответ, секрецию белка и функцию митохондрий (Waldmeier выше, Duina и др., Science, 274, 1996, с.1713-1715). В последние годы Watashi и др., Hepatology, 38, 2003, с.1282-1288 продемонстрировали, что NIM811 подавляет репликацию HCV in vitro, в то время как такролимус не обладает таким действием. Поскольку у NIM811 отсутствует способность связываться с циклофилином А (14), NIM811, вероятно, проявляет фармакологические действия путем связывания с другим циклофилином, таким как циклофилин В или D. Важно отметить, что NIM811 проявляет антивирусное действие посредством связывания циклофилина В, который является функциональным регулятором РНК-полимеразы HCV (Watashi и др., Mol Cell, 19, 2005, с.111-122). Установлено также, что NIM811 обладает цитозащитными свойствами, зависящими от взаимодействия с циклофилином D, который регулирует влияющую на митохондриальную проницаемость транзицию (Waldmeie и др., Mol Pharmacol, 62, 2002, с.22-29). Коn и др., Hepatology, 40, 2004, с.1170-1179, описали, что NIM811 предупреждал индуцируемый ацетаминофеном некроз и апоптоз в культуре мышиных гепатоцитов.
Б. Клинический опыт
4
Всего в опыте, который проводили в течение 2 недель, участвовали 15 пациентов, страдающих фиброзом/циррозом печени. Каждому пациенту вводили циклоспорин, предлагаемый в изобретении, например [MeIle]-циклоспорин, в дозе 7-15 мг/кг р.о. Уровни в сыворотке антигенов вируса гепатита С у каждого пациента определяли в день 0 и день 14.
У пациента, страдающего фиброзом/циррозом печени, прежде всего повреждением печени, может проявляться один или несколько из следующих признаков или симптомов: (а) повышенный уровень АЛТ (аланинаминотрасфераза), (б) положительный ответ на антитела к HCV, (в) присутствие HCV, продемонстрированное положительным ответом на РНК HCV, (г) клинические характерные признаки хронического заболевания печени, (д) гепатоцеллюлярное поражение. Указанные критерии можно использовать не только для диагностики фиброза/цирроза печени, вызываемого вирусом гепатита, но их можно применять также для оценки ответа пациента на лечение лекарственным средством.
Известно, что для гепатита С при отсутствии лечения характерны повышенные уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT), и полным ответом на лечение, как правило, считается нормализация этих сывороточных ферментов, прежде всего АЛТ (Davs и др., New Eng. J. Med. 321, 1989, с.1501-1506). АЛТ представляет собой фермент, который высвобождается, когда разрушаются клетки печени, и он является симптоматическим признаком заражения HCV.
Для оценки изменения репликации HCV у пациентов при лечении лекарственным средством можно измерять уровень РНК HCV в образцах сыворотки, например, с помощью гнездовой полимеразной цепной реакции, в которой применяют два набора праймеров, выведенных из неструктурных генных областей N53 и N54 генома HCV (Farci и др., New Eng. J. Med. 325, 1991, с.98-104, Ulrich и др., J. Clin. Invest, 86, 1990, с.1609-1614).
Гистологическую оценку полученных с помощью биопсии образцов печени можно использовать в качестве второго критерия оценки (см., например, Knodell и др., Hepatology, 1, 1981, с. 431-435, авторы предложили индекс гистологической активности (воспаление воротной вены, частичный некроз или некроз межклеточных мостиков, поражение долек и фиброз), представляющий собой балльную систему для оценки активности заболевания).
Суточные дозы, необходимые при воплощении на практике настоящего изобретения, могут варьироваться в зависимости, например, от применяемого неиммуносупрессорного связывающегося с циклофилином циклоспорина, хозяина, пути введения, серьезности состояния, подлежащего лечению. Предпочтительные суточные дозы составляют примерно от 1 до 50 мг/кг в день при использовании в виде однократной дозы или разделенных доз.
4
Приемлемые суточные дозы для пациентов находятся в диапазоне, например, 1-20 мг/кг р.о. или i.v. Приемлемые формы стандартных доз для орального введения содержат примерно от 0,25 до 10 мг/кг действующего вещества, например [MeIle]-циклоспорина, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми разбавителями или носителями.
Циклоспорины, предлагаемые в изобретении, можно вводить любым общепринятым путем, в частности энтерально, например орально, например в форме растворов для питья, таблеток или капсул, или парентерально, например в форме инъецируемых растворов или суспензий. Предпочтительными фармацевтическими композициями могут быть, например, композиции на основе микроэмульсий, описанные в UK 2222770 А.
R
R
R
R
R
Циклоспорины, предлагаемые в изобретении, можно вводить в виде единственного ингредиента или в сочетании с другими лекарственными средствами, например с лекарственными средствами, обладающими активностью в отношении HCV, такими как интерферон, например интерферон-α-2а или интерферон-α-2b, например Intron A, Roferon, Avonex, Rebif или Betaferon, или интерферон, конъюгированный с водорастворимым полимером или человеческим альбумином, такой, например, как альбуферон, противовирусным агентом, таким, например, как рибавирин, ламивудин, NV08 или NM283, ингибитором кодируемых HCV факторов типа NS3/4А-протеазы, геликазы или РНК-полимеразы, или пролекарством такого ингибитора, антифиброзным агентом, например N-фенил-2-пиримидинаминным производным, таким, например, как иматиниб, иммуномодулятором, таким, например, как микофенольная кислота, или ее соль или пролекарство, например, микофенолят натрия или микофенолят мофетила, или агонистом рецептора S1P, таким, например, как FTY720 или его аналог, необязательно фосфорилированный, например, с агентами, которые описаны в ЕР 627406 А1, ЕР 778263 А1, ЕР 1002792 А1, WO 02/18395, WO 02/76995, WO 02/06268, JP 2002316985, WO 03/29184, WO 03/29205, WO 03/62252 и WO 03/62248. Подразумевается, что конъюгаты интерферона с водорастворимым полимером прежде всего представляют собой конъюгаты с гомополимерами полиалкиленоксида, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоли, полиоксиэтилированные полиолы, их сополимеры и блок-сополимеры. В качестве альтернативы полимерам на основе полиалкиленоксидов можно применять не обладающие антигенной эффективностью материалы, такие как декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов и т.п. Такие конъюгаты интерферон-полимер описаны в US 4766106, 4917888, заявке на европейский патент 0236987, заявке на европейский патент 0510356 и в опубликованной международной заявке на патент WO 95/13090. Поскольку связанная с введением полимера модификация существенно снижает антигенные ответы, отсутствует необходимость в том, чтобы чужеродный интерферон был полностью аутологичным. Интерфероны, которые применяют для создания конъюгатов с полимерами, можно получать из экстрактов из организма млекопитающих, например человеческий интерферон, интерферон жвачных животных или бычий интерферон, или их можно получать рекомбинантно. Предпочтительными являются конъюгаты интерферона с полиэтиленгликолем, которые известны также как пэгилированные интерфероны.

Особенно предпочтительными конъюгатами интерферона являются пэгилированные альфа-интерфероны, например пэгилированный интерферон-α-2а, пэгилированный интерферон-α-2b; пэгилированный консенсусный интерферон или пэгилированный продукт очищенного интерферона-α. Пэгилированный интерферон-α-2а описан в ЕР 593868, и он поступает в продажу, например, под товарным знаком PEGASYS (фирма Hoffmann-La Roche). Пэгилированный интерферон-α-2b описан, например, в ЕР 975369, и он поступает в продажу, например, под товарным знаком PEG-INTRON А (фирма Schering Plough). Пэгилированный консенсусный интерферон описан в WO 96/11953. Предпочтительными пэгилированными интерферонами являются пэгилированный интерферон-α-2а и пэгилированный интерферон-α-2b. Также предпочтительным является пэгилированный консенсусный интерферон.
Суточные дозы применяемого коагента могут варьироваться в зависимости, например, от применяемого соединения, хозяина, пути введения и серьезности заболевания, подлежащего лечению. Например, ламивудин можно применять в суточной дозе 100 мг.
Пэгилированный интерферон можно вводить парентерально 1-3 раза в неделю, предпочтительно 1 раз в неделю, в общей недельной дозе 2-10 миллионов ME, более предпочтительно 5-10 миллионов ME, наиболее предпочтительно 8-10 миллионов ME.
Согласно вышеизложенному объектами настоящего изобретения являются также:
4. Фармацевтическая комбинация, содержащая а) первый агент, который представляет собой неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединение формулы I, Ia или II, и б) коагент, например второе указанное выше лекарственное средство, например, для применения согласно описанному выше способу.
5. Указанный выше способ, заключающийся в том, что совместно вводят, например одновременно или последовательно, в терапевтически эффективном количестве неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин, например соединения формулы I, Ia или II, и коагент, например указанное выше второе лекарственное средство.
Понятия «совместное введение» или «комбинированное введение» или т.п. в контексте настоящего описания означают введение выбранных терапевтических агентов одному пациенту, и подразумевается, что они включают схемы введения, при которых агенты необязательно применять с помощью одного и того же пути введения или в одно и то же время.
Применение фармацевтической комбинации, предлагаемой в изобретении, обеспечивает благоприятное действие, например синергетическое терапевтическое действие, по сравнению с монотерапией, основанной на применении только одного из этих фармацевтических действующих веществ. Предпочтительная синергетическая комбинация представляет собой комбинацию неиммуносупрессорного связывающегося с циклофилином циклоспорина и интерферона, необязательно конъюгированного с полимером.
Еще одна предпочтительная комбинация представляет собой комбинацию неиммуносупрессорного связывающегося с циклофилином циклоспорина с микофенольной кислотой или ее солью или пролекарством или с агонистом рецептора S1P, например FTY720.
4
4
[MeIle]-циклоспорин или [MeVal]-циклоспорин представляет собой предпочтительный неиммуносупрессорный связывающийся с циклофилином циклоспорин для применения согласно изобретению.