СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ МУЖСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ НА БАЗЕ ОЦЕНКИ ДИСПЕРСИИ ДНК-ФРАГМЕНТОВ СПЕРМАТОЗОИДОВ
METHOD FOR LABORATORY DIAGNOSIS OF MALE REPRODUCTIVE FUNCTION BASED ON EVALUATION OF SPERMATOZOA DNA FRAGMENT DISPERSION

Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при диагностике нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, гинекологии, репродукции, дерматовенерологии, онкологии для выявления этиологии и патогенеза патозо-оспермии.
Уровень техники
Сперматозоиды человека легко подвержены оксидативному стрессу из-за влияния системных факторов (старение, коморбидность - сахарный диабет, рак, варикоцеле) и образа жизни (ожирение, курение, лекарства, ксенобиотики, экология, частота эякуляции). В 25-30% случаев, диагностированных как мужское идиопатическое бесплодие обнаруживаются высокий процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК (Agarwal et ah, 2017), что приводит к бесплодию, выкидышам и замершей беременности.
Упаковка ДНК в головке сперматозоида является результатом сложного процесса, требующего значительного уплотнения и перераспределения хроматина на заключительных стадиях сперматогенеза. Нормальная ДНК зрелых сперматозоидов обладает высокой устойчивостью к физической или химической денатурации.
Сегодня известны три механизма, которые могут объяснить повреждение ДНК сперматозоидов:
- дефектная конденсация хроматина во время сперматогенеза [1];
- апоптоз [2]
- окислительный стресс (ОС) [3], которому легко подвержены сперматозоиды человека из-за влияния системных факторов (пожилой возраст, коморбидность - сахарный диабет, рак, варикоцеле и др.) и образа жизни (ожирение, курение, лекарства, ксенобиотики, экология, частота эякуляции и др.) [4-7].
Базовый анализ эяулята (спермограмма) остается основным тестом для оценки мужского бесплодия, но прогностическая значимость обычных параметров спермограммы (количества сперматозоидов, подвижности, морфологии), невелика поскольку им присущи высокая внутри- и межлабораторная вариабельность и низкая предсказательная ценность [8].
Спермограмма не может оценить повреждение хроматина сперматозоидов, в то время как научные исследования и клиническая практика указывает на то, что целостность ДНК сперматозоидов влияет на их функциональные возможности, подчеркивая тем самым важность тестов на ФДНКС для оценки нарушений фертильности [9, 10].
В этой связи, наряду с базовым анализом эякулята Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендует проводить дополнительное исследование спермы с помощью тестов для выявления ОС и ФДНКС [11].
С времен зарождения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и по настоящее время ФДНКС считали одной из основных причин мужского бесплодия по причине нарушения оплодотворения, имплантации, продукции эмбрионов плохого качества, увеличения частоты самопроизвольных абортов и снижения частоты наступления беременности при ВРТ [8, 12-17].
Известны способы диагностики мужской репродуктивной функции и их недостатки. Для оценки целостности хроматина сперматозоидов известна линейка методов и тестов с различной степенью диагностических и прогностических возможностей:
1) тесты для оценки повреждений ДНК - структурный анализ хроматина сперматозоидов (SCSA/ sperm chromatin structure assay); идентификация фрагментов поврежденных ДНК (одиночный или двойной разрыв), меченных dUTP с помощью терминальной дезоксинуклеоти-дилтрансферазы (TUNEL/nick-end labeling of dUTP using terminal deoxynucleotidyl transferase); оценка дисперсии хроматина (SCD/sperm chromatin dispersion test) или Гало-тест (halo assay); гель-электрофорез отдельных клеток (SCGE/ single-cell gel electrophoresis или Comet assay);
2) тесты для оценки качества конденсации хроматина - окрашивание анилиновым синим (aniline alue/AB); окрашивание хромомицином A3 (chromomycin А3/СМА3); окрашивание акридин-оранжевым (acridine orange staying/AO) [10, 18-19].
Все эти методы различаются по своей диагностической точности (чувствительности, специфичности) и клинической ценности из-за присущих каждому из них преимуществ и недостатков, связанных с различными технологиями выявления повреждений ДНК сперматозоидов [10,20] (Таб. 1)
Существует также ряд методов диагностики мужского бесплодия.
Оценку и вычисление концентрации нейтрофильных гранулоцитов/пероксидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте осуществляют с помощью цитохимического окрашивания орто-толуидином (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработке эякулята человека. -издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.18.1.5-1.7; рис. 2.14; 3.11).
Недостатки данного способа следующие:
1. отсутствует коммерчески доступный набор для окрашивания, реактив: как правило предлагается 6 реагентов, которые сложно купить в виду того, что они являются прекурсорами,
2. сложно готовить к использованию, ввиду того, что современные лаборатории используют, как правило, исключительно готовые наборы реагентов и не имеет необходимого поверенного оборудования: весов, оборудования для титрования,
3. используемый орто-толуидин является особо опасным канцерогеном, что обуславливает риск для здоровья персоналу,
4. результаты считают в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, который отсутствует на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с необходимым регистрационным удостоверением,
5. формула подсчета адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра, что вызывает определенные трудности.
Известен способ оценки и вычисления концентрации нейтрофильных гранулоцитов (лейкоцитов)/пероксидазо-положительных клеток (ППК) в эякуляте. При его осуществлении используют полуколичественную оценку содержания лейкоцитов в эякуляте на тест-полоске с помощью иммунохроматографического метода, основанного на ферментативной активности лейкоцитарной эстеразы (без цитохимического окрашивания) (см. В.В. Долгов, С.А. Луговская, Н.Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. - 145 с., 199 ил., 5-94789-144-1. Стр. 70).
Недостатки данного способа заключаются в следующем:
1. Способ позволяет осуществить только приблизительное определение концентрации и только нейтрофильных гранулоцитов/перокисидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте,
2. Не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.
6
3. Метод определения - неколичественный (полуколичественный «на тест-полоске»: > или <1х10/мл), что противоречит рекомендациям ВОЗ.
4. Лейкоцитарная эстераза появляется в биожидкости при разрушении лейкоцитов, что может привести к ложноположительной диагностике (пиоспермии).
Известен способ количественной оценки содержания круглых клеток (нейтрофильных и других лейкоцитов, макрофагов, клеток сперматогенеза) (концентрации) без цитохимического окрашивания ППК в эякуляте (см. Е.Е. Брагина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и генитальная хирургия. - 2014, №1, с. 20).
Недостатки данного способа следующие.
1. Производится определение концентрации только круглых клеток (всех подряд), а не только ППК в эякуляте.
2. Метод не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.
3. Метод не приемлем для мониторинга содержания лейкоцитов в сперме.
4. Идентификация лейкоцитов происходит путем субъективной оценки («на глаз») по косвенным идентификационным признакам, что не соответствует рекомендациям ВОЗ.
Известен способ определения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработка эякулята человека, издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.7, 2.8.1, 2.8.4, стр. 34-47).
Недостатки данного способа следующие.
1. Вычисление концентрации осуществляется только сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята.
2. Подсчет проводят в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, которого нет на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с регистрационным удостоверением.
3. Фиксация и разведение образца спермы происходит рабочим раствором, состоящим из сложной прописи химических веществ - прекурсоров (п.2.7.5 руководства ВОЗ), которые не используются в современной клинико-диагностической лаборатории. Одним из таких прекурсоров является особо опасный канцероген - формалин.
4. Оценка требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов основана на сложных математических расчетах и также адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра (Руководство ВОЗ, стр. 40-41 глава 2.8.1).
5. Все формулы для подсчета адаптированы к гемоцитометру Нейбауэра.
Известен способ измерения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята, (см. Е.Е. Брагина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и ге-нитальная хирургия. - 2014, №1, с. 18-19).
Согласно данному способу производят подготовку препарата, фиксацию эякулята, приготовление счетной камеры, заполнение окошек гемоцитометра эякулятом, осаждение сперматозоида в камере, определение количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов, измерение количества сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята в препарате в камере Горяева и вынесение заключения.
Недостатки данного способа следующие.
1. Осуществляется только измерение концентрации сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята.
3
2. Фиксация и разведение образца спермы проводится несколькими рабочими растворами (50 г NaHCO, 10 мл 36-40% раствора формальдегида (насыщенный раствор)). Один из них - прекурсор и является особо опасный канцерогеном формальдегидом. Фиксация физиологическим раствором долгая (до полной остановки подвижных клеток), что отражается на времени оборота теста в лаборатории/ТАТ (время оборота теста/turn around time) и вносит дополнительные погрешности.
3. Оценка качества требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов многоэтапна и усложнена: при приготовлении препарата (10 мкл, покровное стекло 22x22 мм), глубина препарата примерно 20 мкм. Используется специальный подсчет сперматозоидов в поле зрения для определения оптимального разведения. При диаметре поля зрения микроскопа (измерять объективом - микрометром) 500 мкм обнаружение 4 сперматозоидов в поле зрения примерно соответствует 1 млн/мл. Если диаметр поля зрения 250 мкм - 1 сперматозоид в поле зрения соответствует 1 млн/мл. В этом случае пользоваться табл.2 следует после умножения количества обнаруженных сперматозоидов на 4).
4. Этап определения количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов также усложняет процесс исследования, что отражается на ТАТ.
Для идентификации микроорганизмов у бесплодных пар и у пациентов с подозрением на инфекции мужских добавочных половых желез (Male accessory gland infection/MAGI) клиническими рекомендациями (КР) Европейской ассоциации урологов/European Association of Urology (EAU, 2022) наряду с СПЖ и постмассажной порции мочи рекомендуется использовать эякулят [EAU Guidelines on Sexual and Reproductive Health A. Salonia (Chair), C. Bettocchi, J. Carvalho, G. Corona, Т.Н. Jones,  J.I. Martinez-Salamanca, S. Minhas (Vice-chair),  P. Verze; Guidelines Associates: L. Boeri, P. Capogrosso, A. Cocci, K. Dimitropoulos,  G. Hatzichristodoulou, A. Kalkanli, V. Modgil, U. Milenkovic, G. Russo, T. Tharakan, © European Association of Urology 2021; EAU Guidelines on urological Infections. 2022. Accessed January 28, 2022. https://d56bochluxqnz.cloudfront.net/documentd/full-guideline/EAU-JN-Urological-Infections-2022.pdf].
Нормативно-правовые акты (НПА) российских коллег рекомендуют для поиска возбудителей инфекций использовать уретральный соскоб (УС)/ уретральное отделяемое (УО) или эякулят [Приказ Минздрава России от 31.07.2020 N 803н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению"; "Клинические рекомендации "Мужское бесплодие" (утв. Минздравом России), разработчик: общероссийская общественная организация "Российское общество урологов", одобрено Научно-практическим Советом Минздрава РФ, 2021 г.; Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. - 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Деловой экспресс, 2016. - 768 с.; Приказ Минздрава России от 29.12. 2012, №1673 н «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при хроническом простатите (обследование в целях установления диагноза и лечения); Приказ Минздрава России №1675н от 29.12. 2012 «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при неспецифическом и другом уретрите»; Приказ Минздрава России от 9 ноября 2012 №696н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при острых простатите, орхите и эпидидимите»; Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 октября 2012 г. №556н "Об утверждении стандарта медицинской помощи при бесплодии с использованием вспомогательных репродуктивных технологий"].
В настоящее время на пути поиска этиологического фактора MAGI в сочетании с мужским бесплодием представляются сомнительными существующие лабораторные алгоритмы с участием УО/УС и секрета предстательной железы (СПЖ) ввиду низкой диагностический ценности заявленных локусов, а также по причине отсутствия возможности воспроизводства и стандартизации по количеству и качеству взятого биоматериала [Сапожкова Ж.Ю., Шабалова И.П., Касоян К.Т. Исследование осадка эякулята в диагностике инфекций, передаваемых половым путем: Учебное пособие. Москва, 2017; Сапожкова Ж.Ю., Милованова Г.Α., Пацап О.И. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. Маркеры и методы. Часть II // Лабораторная и клиническая медицина. Фармация. 2021. Т. 1, No 2. С.65 - 79. DOI: 10.14489/1 стр.2021.02.рр. 065-079].
Таким образом, известные способы являются низкоинформативными и малодостоверными. В этой связи стоит задача создания своевременной и правильной диагностики количественного состава биотопа осадка эякулята, которая наряду с известными дигностическими подходами позволит избежать назначение дополнительных дорогостоящих лабораторных и инструментальных методов и необоснованную антибиотикотерапию, что отражает концепцию управления здоровьем и долголетием на основе корректного планирования медицинской и экономической эффективности в организации здравоохранения.
Известен способ диагностики нарушения мужской репродуктивной функции на основе микробиологического (МБА) (культурального) исследования цельного эякулята и на основе молекулярного (МАНК/ПЦР-РВ) исследования УО/УС и СПЖ (Приказ Минздрава России от 29.12. 2012, №1673 н «Об утверждении стандарта первичной медико-санитарной помощи при хроническом простатите (обследование в целях установления диагноза и лечения)), который является наиболее близким к заявляемому способу и прият в качестве ближайшего аналога (прототипа).
К недостаткам известного способа относится:
- большинство этиологических агентов инфекционно-воспалительных процессов являются некультивируемыми или плохо культивируемыми в силу своих биологических свойств;
- существующие лабораторные алгоритмы с участием УО/УС и СПЖ имеют низкую эффективность ввиду отсутствия диагностический ценности перечисленных локусов, так как инвазивный процесс получения этих видов биоматериала связан с дискомфортом и, зачастую, болевыми ощущениями у пациента, что в результате не позволяет отобрать полноценный биологический образец для исследования.
Определение количества облигатно-анаэробных условно-патогенных микроорганизмов (ОАУПМО) и их соотношение в биотопе, а также выделение устойчивых типов бактериальных сообществ, связанных с нарушением мужской фертильности, не предоставляется возможным с помощью МБА в виду ограничения диагностических возможностей метода. Как следствие, имеет место риск ложноотрицательных результатов, что определяет трудности этиотропной терапии, переход заболевания в хроническую форму и рецидивирующий характер течения.
В настоящее время не определен идеальный метод измерения ФДНКС и его оптимальные пороговые значения, но четыре основных теста - TUNEL, SC-SA, SCGE / Comet assay и SCD/ halo assay/Гало-тест кажутся надежными для получения информации о качестве ДНК сперматозоидов, что важно для установления мужского фактора бесплодия [19, 21].
Сущность изобретения
Изобретение направлено на решение задачи повышения диагностической достоверности результатов диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии ДНК-фрагментов сперматозоидов.
Результат, достигаемый при использовании представленного способа, состоит в расширении спектра диагностики этиологических факторов инфекционной природы нарушения мужской репродуктивной функции, повышения информативности и достоверности диагностики.
Результат достигается за счет того, что в способе лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции, включающем сбор и обработку биологического материала, осуществление диагностики и на основе полученных данных формирование заключения о мужской репродуктивной функции, при этом в качестве биологического материала используют эякулят, обработку эякулята проводят следующим образом: аликвоту из 100 мкл свежего эякулята размещают на сухом одноразовом предметном стекле; помещают предметное стекло в термостат при 37°С на 25-30 минут до полного высушивания; достают предметное стекло с высохшей аликвотой и оставляют на 2 мин при комнатной температуре 22°С; помещают предметное стекло с высушенной аликвотой в герметичный пластиковый контейнер для хранения при температуре -22°С на срок 28 дней для последующего отсроченного исследования; через 28 дней хранения перед оценкой фрагментации ДНК сперматозоидов достают предметное стекло с замороженной высушенной на воздухе аликвотой, оставляют при температуре +22°С; добавляют в высушенную аликвоту эякулята 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора; перемешивают наконечником пипетки до образования однородной суспензии; полученную суспензию помещают в коническую микропробирку Эппендорфа объемом 0,5 мл; на предметное стекло наносят покрытие с положительно электрически заряженной поверхностью для обеспечения прикрепления клеточного материала к поверхности; суспензию эякулята смешивают с инертным агарозным микрогелем; охлаждают и подвергают воздействию денатурирующего агента и ли-зирующего раствора; наносят на предметное стекло; окрашивают и оценивают фрагментацию ДНК сперматозоидов путем подсчета на лабораторном счетчике 300 сперматозоидов на образец с помощью светопольной микроскопии под иммерсионным объективом x1000; фертильность эякулята оценивают с учетом фрагментации ДНК - сперматозоидов по формуле:
где
DFI - индекс фрагментации ДНК сперматозоидов,
S - число сперматозоидов с малым ореолом вокруг сперматозоида,
WH - число сперматозоидов без ореола,
WHD - число разрушенных сперматозоидов без ореола,
N - число исследуемых сперматозоидов,
при DFI<=15% выносят заключение о наличии нормальной репродуктивной функции, при DFI>15%, но <25% выносят заключение о сомнительной репродуктивной функции, а при DFI>25% - о наличии патологии.
Технический результат усиливается за счет того, что фрагментацию ДНК сперматозоидов классифицируют следующим образом: фрагменация отсутствует при отсутствии разрывов и/или повреждений ядерной ДНК сперматозоидов, при этом размер ореола больше или равен внутреннему диаметру ядра; имеет место частичная фрагментация ДНК, присутствуют разрывы и/или повреждения ядерной ДНК сперматозоидов, при этом размер ореола_меньше большого ореола и больше малого ореола сперматозоида; к сперматозоидам S с малым ореолом относят сперматозоиды, у которых фрагментация ДНК присутствует, при этом имеют место разрывы и/или повреждения ядерной ДНК сперматозоидов, размер ореола меньше 1/3 или такой же, как внутренний диаметр ядра; к сперматозоидам WH без ореола относят сперматозоиды с фрагментацией ДНК, разрывами и/или повреждениями ядерной ДНК сперматозоидов, без ореола; к спераматозоидам WHD относят те, у которых фрагментация ДНК присутствует, имеет место полная деградация ядерной ДНК сперматозоидов.
Перед проведением диагностики: образцы эякулята с повышенной вязкостью разжижалют фосфатно-солевым раствор Бромелайна и перемешивают без образования пены и пузырьков воздуха, определяют время выполнения теста для получения результата в интервале между 30-60 минутами после сбора спермы.
Для окрашивания предметного стекла с нанесенной аликвотой эякулята используют набор для окрашивания эякулята, включающий раствор для фиксирования и предокрашивания, окрашивающий раствор «розовый», окрашивающий раствор «синий».
В составе Набора для окрашивания эякулята используют следующие реагенты:
Описание графических материалов
Сущность изобретения и возможность достижения технического результата будут более понятны из последующего описания со ссылками на фигуры графических материалов, где показано:
фиг. 1 - Микроскопическая картина препарата, контрольная визуализация пяти оценочных категорий фрагментации ДНК сперматозоидов по Fernandez et al.
На фигуре использованы следующие обозначения:
1 - микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с большим гало (Large/L) (сперматозоид, размер гало которого больше или такой же, как внутренний диаметр ядра),
2 - Микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с гало среднего размера (Medium/M) (сперматозоид с гало, размер которого меньше большого гало и больше малого гало сперматозоида), некоторые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов,
3 - Микроскопическая картина препарата: сперматозоид с малым гало (Small/S) (сперматозоид, размер ореола которого меньше 1/3 или такой же, как внутренний диаметр ядра), значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов,
4 - Микроскопическая картина препарата: сперматозоид без гало (Without HALO /WH), значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов,
5 - Микроскопическая картина препарата: разрушенный сперматозоид без гало (Without HALO -Degraded/WHD) (сперматозоид без ореола и с ядром, которое неравномерно или слабо окрашено).
Осуществление способа
За период июль-август 2022 г. на клинической базе организаци «Международная Школа Цитологии&Медицинская Школа Инноваций» (г. Москва) проведено одномоментное исследование, в котором диагностический метод применялся в одинаковых условиях ко всем обследуемым добровольцам мужского пола в количестве 492 человека.
Средний возраст обследуемых мужчин 38, 28 лет (стандартное отклонение 8,64; медиана возраста 38 лет, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 59 лет).
Критерии включения в исследование:
- наличие у пациентов жалоб на неудачные попытки зачатия на протяжении 1-5 лет;
- соблюдение полового воздержания в течение 3-5 суток;
- отсутствие активных жалоб, характерных для MAGI (male accessory gland infections/инфекций мужских добавочных половых желез) и/или в анамнезе MAGI, а именно специфический или неспецифический уретрит, хронический или острый простатит, орхит, эпи-дидимит.
Критерии исключения:
- азооспермия,
- криптозооспермия,
- применение антибактериальных, противовирусных препаратов в последние 4 недели до обследования;
- использование местных лекарственных препаратов в течение 3-х недель, предшествующих обследованию,
- наличие у пациентов синдрома хронической тазовой боли,
- наличие симптомов нижних мочевых путей,
- наличие синдрома хронической мошоночной боли,
- наличие эректильной дисфункции,
- отсутствие нарушений кариотипа, микроделеций AZF локуса Y-хромосомы, мутаций гена CFTR;
- наличие у пациентов сексуальных партнеров - женщин с рецидивирующими нарушениями влагалищного биоценоза, с воспалительными заболеваниями органов малого таза.
Выбывших из исследования пациентов не было.
Все добровольцы подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.
За месяц до выполнения Гало-теста (гало или ореол вокруг сперматозоида, форма гало зависит от состояния сперматозоида), все обследуемые мужчины (n=492) получили результаты спермограммы, где были выявлены различные сценарии патоспермии, а также нормоспермия.
В рамках научных исследований и клинических разработок для установления причины бесплодия всем добровольцам было выполнено исследование эякулята на ФДНКС на предварительно подготовленных образцах препаратах спермы, собранных и доставленных в соответствии с рекомендациями ВОЗ 6-го издания (2021) [11].
Каждый образец эякулята разделяли на две части: одну часть в аликвоте 100 мкл использовали непосредственно для приготовления препаратов с последующим хранением и дальнейшим исследованием на ФДНКС, а оставшуюся часть использовали для спермограммы [22].
Обработку эякулята проводили согласно следующим этапам [22]:
1) аликвоту из 100 мкл свежего эякулята размещали на сухое одноразовое предметное
стекло;
2) помещали стекло в термостат при 37°С на 25-30 минут до полного высушивания аликвоты;
3) доставали из термостата предметное стекло с высохшей аликвотой и оставляли на 2 мин при комнатной температуре 22°С;
4) помещали стеклопрепарат в герметичный пластиковый контейнер для хранения при температуре -22°С на срок 28 дней для последующего отсроченного исследования;
5) через 28 дней хранения непосредственно перед оценкой ФДНКС доставали из пластикового контейнера замороженные высушенные на воздухе стеклопрепараты, оставляли их до комнатной температуры 22°С;
6) добавляли в высушенные аликвоты эякулята по 50 мкл восстанавливающей жидкости (фосфатно-солевого буферного раствора);
7) аккуратно перемешивали наконечником пипетки до образования однородной суспензии;
8) полученную суспензию помещали в коническую микропробирку типа Эппендорф объемом 0,5 мл;
9) использовали подготовленный образец эякулята для дальнейшего анализа с помощью В состав Набора входит:
1) Пробирка типа Эппендроф с легкоплавкой агарозой (Реагент №1) - 10 шт,;
2) Фосфатно-солевой буферный раствор (Реагент №2) 50 мл;
3) Денатурирующий раствор (Реагент №3) 100 мл;
4) Лизирующий раствор (Реагент №4) 100 мл;
5) Дегидратирующий раствор 1 (Реагент №5) 50 мл;
6) Дегидратирующий раствор 2 (Реагент №6) 50 мл;
7) Дегидратирующий раствор 3 (Реагент 7) 50 мл;
8) Раствор для фиксирования и предокрашивания (Реагент №8) 50 мл;
9) Окрашивающий раствор «розовый» (Реагент №9) 50 мл;
10) Окрашивающий раствор «синий» (Реагент №10) 50 мл.
Перед размещением на предметное стекло с предварительно нанесенным покрытием (с положительно заряженной поверхностью) для обеспечения наилучшего прикрепления клеточного материала к поверхности, образцы смешивали с инертным агарозным микрогелем, охлаждали и подвергали воздействию денатурирующего агента и лизирующего раствора. Затем предметные стекла окрашивали и оценивали ФДНКС путем подсчета на лабораторном счетчике 300 сперматозоидов на образец с помощью светопольной микроскопии под иммерсионным объективом х1000 [23, 24].
Принцип действия Набора следующий: интактные (неповрежденные/нефрагментированные/цельные) молекулы ДНК расширяются после денатурации и экстракции ядерных белков с образованием нуклеол с большими специфическими ореолами (гало) расплетенных петель ДНК, которые выходят из центрального ядра. При фрагментации ДНК (повреждении целостности) дисперсия не развивается или минимальна и сопровождается образованием нуклеол без ореола рассеивания, либо ореол (гало) слабо выражены.
Гало сперматозоидов в исследуемых препаратах классифицировали по 5 категориям (фиг. 1):
1. Фрагментация ДНК отсутствует - оптимальное качество эякулята - нет разрывов/повреждения ядерной днк сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с большим гало (large/l) (сперматозоид, размер гало которого больше или такой же, как внутренний диаметр ядра) (1).
2. Фрагментация ДНК присутствует, но без значимого влияния на эмбриогенез - некоторые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоиды с гало среднего размера (medium/m) (сперматозоид с гало, размер которого меньше большого гало и больше малого гало сперматозоида) (2).
3. Фрагментация днк присутствует, субоптимальное качество эякулята - значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоид с малым гало (small/s) (сперматозоид, размер ореола которого меньше 1/3 или такой же, как внутренний диаметр ядра) (3).
4. Фрагментация ДНК присутствует, неоптимальное качество эякулята - значимые разрывы/повреждения ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: сперматозоид без гало (without halo /wh) (4).
5. Фрагментация ДНК присутствует, эякулят низкого качества- полная деградация ядерной ДНК сперматозоидов микроскопическая картина препарата: разрушенный сперматозоид без гало (without halo -degraded/whd) (сперматозоид без ореола и с ядром, которое неравномерно или слабо окрашено) (5).
Производился подсчет процентного содержания сперматозоидов с фрагментированным ДНК согласно следующей формуле в соответствии с заявленной формулой изобретения:
где:
DFI (DNA Fragmentation Index) - индекс фрагментации ДНК сперматозоидов,
S - число сперматозоидов с малым гало,
WH - число сперматозоидов без гало,
WHD - число разрушенных сперматозоидов без гало,
N - число исследуемых сперматозоидов.
Результаты анализа на отчете пациента записывали согласно следующим категориям:
Число исследуемых сперматозоидов (N), %
Число сперматозоидов без фрагментации ДНК (L+M), %
Число сперматозоидов без фрагментации ДНК (L+M), %
Число сперматозоидов с фрагментацией ДНК (S+WH), %
Число разрушенных/деградированных сперматозоидов (WHD), %
Индекс фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI), %
Далее проводили оценку результатов лабораторного анализа согласно следующим пороговым значениям в соответствии с формулой изобретения:
- норма: DFI<=15%,
- сомнительный результат: от DFI>15% до <25%,
- патология: DFI>25%.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью стандартных компьютерных программ: GraphPad Prism 8.0.1 и Microsoft Excel для Microsoft 365 MSO (версия 2201 Сборка 16.0.14827.20158). Для оценки достоверности получаемых результатов, использовали коэффициент Пирсона (р) для параметрической статистики, коэффициент корреляции (г) и методы описательной статистики.
Результаты экспериментальных исследований
У 54,1% (266/492=54,1%) мужчин, средний возраст которых составил 36,58 лет (стандартное отклонение 8,12; медиана возраста 34 года, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 59 лет) ФДНКС не была выявлена (DFI<=15%).
Согласно корреляционной матрице, у данной категории добровольцев была отмечена слабая прямая корреляция между низким уровнем ФДНКС и астенозооспермией (r=0,20; ρ 0,0001) и вискозипатией (r=0,13; p 0,0001), а также слабая обратная корреляция с олигоасте-нотератозооспермией (r=-0,12; ρ 0,0001). Отмечено также отсутствие пиоспермии у мужчин без ФДНКС (Таблица 2).
В таблице 2 приведены результаты расчета следующих параметров:
Параметр 1/ Parameter 1 - Нормозооспермия/normozoospermia,
Параметр 2/ Parameter 2 - Олигоастенотератозооспермия/oligoasthenoteratozoopermia,
Параметр 3/ Parameter 3 - Астенозооспермия/asthenozoospermia,
Параметр 4/ Parameter 4 - Олигостенозооспермия/ologoasthenozoospermia,
Параметр 5/ Parameter 5 - Дискинезия/dyskinesia,
Параметр 6/ Parameter 6 - Вискозипатия/viscosipathia,
Параметр 7/ Parameter 7 - Лейкоспермия (Пиоспермия)/1еисозреггша,
Параметр 8/ Parameter 8 - Гемоспермия/hemospermia,
Параметр 9/ Parameter 9 - Олигоспермия/oligospermia,
Параметр 10/ Parameter 10 - Агглютинация/agglutination,
Параметр 11/ Parameter 11 - Некрозооспермия/necrozoospermia,
Параметр 12/ Parameter 12 - Индекс ФДНКС/DFI.
У 21,3% (105/492=21,3%) мужчин, средний возраст которых составил 38,71 лет (стандартное отклонение 8,33; медиана возраста 39 лет, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 56 лет) выявлены сомнительные значения ФДНКС (DFI в диапазоне >15% до <25%).
Согласно корреляционной матрице, у данной категории добровольцев была отмечена слабая прямая корреляция между сомнительным уровнем ФДНКС и олигоастенотератозоос-пермией (r=0,24; ρ 0,0001), олигоспермией (r=0,23; p 0,0001) и средним возрастом бесплодных мужчин 39 лет (r=0,17; ρ 0,0001); слабая обратная зависимость с астенозооспермией (r=-0,22; p 0,0001). (Табл. 3).
В таблице 3 приведены результаты расчета следующих параметров по результатам экспериментальных исследований:
Параметр 1/ Parameter 1 - Нормозооспермия/normozoospermia,
Параметр 2/ Parameter 2 - Олигоастенотератозооспермия/oligoasthenoteratozoopermia,
Параметр 3/ Parameter 3 - Астенозооспермия/asthenozoospermia,
Параметр 4/ Parameter 4 - Олигостенозооспермия/ologoasthenozoospermia,
Параметр 5/ Parameter 5 - Дискинезия/dyskinesia,
Параметр 6/ Parameter 6 - Вискозипатия/viscosipathia,
Параметр 7/ Parameter 7 - Лейкоспермия (Пиоспермия)/1еисо8репша,
Параметр 8 /Parameter 8 - Гемоспермия/hemospermia
Параметр 9/ Parameter 9 - Олигоспермия/oligospermia,
Параметр 10/ Parameter 10 - Агглютинация/agglutination,
Параметр 11/ Parameter 11 - Некрозооспермия/necrozoospermia,
Параметр 12/ Parameter 12 - Индекс ФДНКС/DFI.
У 24,6% (121/492=24,6%) мужчин, средний возраст которых составил 41,55 лет (стандартное отклонение 9,06; медиана возраста 43 года, минимальный возраст 23 лет, максимальный возраст 59 лет) была выявлена ФДНКС (DFI>25%).
Согласно корреляционной матрице, у данной категории добровольцев была отмечена слабая прямая корреляция между уровнем ФДНКС и средним возрастом бесплодных мужчин 44 года (г=0,28; ρ 0,0001) (Табл.4).
В таблице 3 приведены результаты расчета следующих параметров по результатам экспериментальных исследований:
Параметр 1/ Parameter 1 - Нормозооспермия/normozoospermia,
Параметр 2/ Parameter 2 - Олигоастенотератозооспермия/oligoasthenoteratozoopermia,
Параметр 3/ Parameter 3 - Астенозооспермия/asthenozoospermia,
Параметр 4/ Parameter 4 - Олигостенозооспермия/ologoasthenozoospermia,
Параметр 5/ Parameter 5 - Дискинезия/dyskinesia,
Параметр 6/ Parameter 6 - Вискозипатия/viscosipathia,
Параметр 7/ Parameter 7 - Лейкоспермия (Пиоспермия)Леисозреггта,
Параметр 8/ Parameter 8 - Гемоспермия/hemospermia,
Параметр 9/ Parameter 9 - Олигоспермия/oligospermia,
Параметр 10/ Parameter 10 - Агглютинация/agglutination,
Параметр 11/ Parameter 11 - Некрозооспермия/necrozoospermia,
Параметр 12/ Parameter 12 - Индекс ФДНКС/DFI.
Согласно анализу всей обследуемой выборке бесплодных мужчин (n=492) установлена слабая прямая корреляция между возрастом мужчин и уровнем ФДНКС (r=0,1563, р=0,0005) (Табл. 5).
Установлена слабая прямая корреляция между индексом ФДНКС и олиастенотератозо-оспермией (r=0,19; p<0,0001), пиоспермией (r=0,29; p<0,0001); некрозооспермией (r=0,16; p=0,0004) (Таб.6).
Заключение.
Отсутствие ФДНКС было установлено у 54,1% (266/492=54,1%) мужчин, средний возраст которых составил 36,58 лет (DFI<=15%); отмечена слабая прямая корреляция между нормальным уровнем ФДНКС и астенозооспермией (г=0,20; ρ 0,0001) и вискозипатией (r=0,13; p 0,0001); слабая обратная корреляция с олигоастенотератозооспермией (r=-0,12; ρ 0,0001); отмечено отсутствие пиоспермии.
Сомнительный результат по наличию ФДНКС установлен у 21,3% (105/492=21,3%) мужчин, средний возраст которых составил 38,71 лет (DFI в диапазоне >15% до <25%); отмечена слабая прямая корреляция между сомнительным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов (ФДНКС) и олигоастенотератозооспермией (r=0,24; ρ 0,0001), олигоспермией (r=0,23; ρ 0,0001) и средним возрастом 39 лет (r=0,17; p 0,0001); слабая обратная зависимость с астенозооспермией (r=-0,22; ρ 0,0001). ФДНКС была обнаружена у 24,6% (121/492=24,6%) мужчин, средний возраст которых составил 41,55 (DFI>25%); отмечена слабая прямая корреляция между высоким уровнем ФДНКС и средним возрастом 44 года (r=0,28; p 0,0001).
Во всей обследуемой выборке бесплодных мужчин (n=492) установлена слабая прямая корреляция между уровнем ФДНКС и возрастом (r=0,1563, р=0,0005), олиастенотератозоос-пермией (r=0,19; p<0,0001), пиоспермией (r=0,29; p<0,0001) и некрозооспермией (r=0,16; p=0,0004).
Результаты настоящего исследования показали, что предлагаемый способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии днк-фрагментов сперматозоидов дополняет рутинную спермограмму, предоставляя конкретную информацию клиницисту о качестве генетического материала эякулята, что значительно повышает информативность проводимой диагностики и позволяет повысить эффективность лечения..
Валидированный протокол выполнения теста способствует стандартизации технологии выявления теста на дисперсию ДНК-фрагментов сперматозоидов в российских клинико-диагностических лабораториях и в специализированных эмбриологических лабораториях в целях скрининга нарушений мужской репродуктивной функции.
Результаты быстрого и точного Гало-теста могут быть полезны клиницистам для разработки новых лечебно-диагностических стратегий и тактик у мужчин с нарушением фертильности как для естественного процесса репродукции, так и для ВРТ.
Таким образом, рассмотренные клинические случаи использования диагностики по заявляемому способу наглядно показывают преимущества использования заявляемого способа диагностики, которые позволяет позволяют расширить диапазон распознаваемых до 90%.
Анализ практикующих врачей лабораторной медицины и урологов-андрологов РФ по работе с осадком эякулята представляется ценным профессиональным кейсом для пересмотра протоколов лабораторного обследования пациентов мужского пола в прегравидарной подготовке супружеской пары, в том числе рекомендуемым для обсуждения и пересмотра действующих КР и НПА РФ.
Применение заявляемого способа диагностики позволяет избежать назначения дополнительных лабораторных методов, инструментальных диагностических процедур и необоснованной антибиотикотерапии, что отражает концепцию управления здоровьем и долголетием на основе корректного планирования медицинской и экономической эффективности в организации здравоохранения.
Таким образом, применение представленного способа позволяет исключить недостатки, присущие известным способам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Aitken RJ., Bronson R., Smith ТВ., et al. The source and significance of DNA damage in human spermatozoa; a commentary on diagnostic strategies and straw man fallacies // Mol Hum Reprod 2013. Vol. 19, P. 475-85.
2. Aitken RJ., De Iuliis GN. On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa // Mol Hum Reprod 2010. Vol. 16, N3.
3. Agarwal Α., Said TM. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility // Hum Reprod Update 2003. Vol. 9, P. 331-45.
4. Aitken RJ. Impact of Oxidative Stress on Male and Female Germ Cells: Implications for Fertility // Reproduction 2020. Vol.159, N4. P.189-201. doi:10.1530/REP19-0452.
5. Agarwal Α., Parekh N., Parmer Selvam MK., et al. Male Oxidative Stress Infertility (MOSI): Proposed Terminology and Clinical Practice Guidelines for Management of Idiopathic Male Infertility // World J. Mens Health 2019 Vol. 37, N3. P. 296-312. doi:10.5534/wjmh.190055.
6. EstevesT SC. Interventions to prevent sperm DNA damage effects on reproduction // Advances in Experimental Medicine and Biology 2019. Vol.1166, P.119-148. doi: 10.1007/978-3-030-21664-1_8.
7. McQueen DB., Zhang J., Robins JC. Sperm DNA fragmentation and recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis // Fertil Steril 2019. Vol. 112, P. 54-60.
8. Zheng WW., Song G., Wang QL., et al. Sperm DNA damage has a negative effect on early embryonic development following in vitro fertilization // Asian J Androl 2018. Vol.20. P.75-79. Доступно no: https://www.aiandrologv.eom/text.asp72018/20/l/75/209295. Ссылка активна на 28.08.2022.
9. Hamilton TRDS, Assumpcao MEOD. Sperm DNA fragmentation: causes and identification // Zygote 2020. Vol.28, N 1. P.l-8. doi:10.1017/S0967199419000595.
10. Dutta S., Henkel R., Agarwal A. Comparative analysis of tests used to assess sperm chromatin integrity and DNA fragmentation. // Andrologia 2021. Vol.53, N 2. doi:10.1111/and.13718.
11. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sixth Edition // World Health Organization 2021.
12. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M., et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology // Reprod Biomed Online 2003. Vol. 7, P. 477-484.
13. Seli E., Gardner DK., Schoolcraft WB., et al. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilization // Fertil Steril 2004. Vol.82, P. 378-383.
14. Lin MH., Kuo-Kuang LR., Li SH., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates // Fertil Steril 2008. Vol. 90, P. 352-9.
15. Lewis SE., Agbaje I., Alvarez J. Sperm DNA tests as useful adjuncts to semen analysis // Syst Biol Reprod Med 2008. Vol. 54, P. 111-25.
16. Evenson DP. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA): 30 years of experience with the SCSA // Sperm Chromatin: Biological and Clinical Applications in Male Infertility and Assisted Reproduction 2011. P. 125-149. DOI 10.1007/978-1-4419-6857-9_9.
17. Robinson L., Gallos ID., Conner SJ., et al. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and metaanalysis // Hum Reprod 2012. Vol. 27, P. 2908-2917.
18. Muratori M., De Geyter C. Chromatin condensation, fragmentation of DNA and differences in the epigenetic signature of infertile men // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2019. Vol. 33, N1. P. 117-26. DOI: 10.1016/j.beem.2018.10.004.
19. Esteves SC., Santi D., Simoni M. An update on clinical and surgical interventions to reduce sperm DNA fragmentation in infertile men // Andrology 2020. Vol. 8, N1. P. 53-81. https://doi.org/10.111 l/andr.12724.
20. Javed Α., Talkad MS., Ramaiah MK. Evaluation of sperm DNA fragmentation using multiple methods: a comparison of their predictive power for male infertility // Clin Exp Reprod Med 2019. Vol. 46. P. 14-21.
21. Sandro СЕ., Carmen LF., Mercedes GM., et al. Reliability of the sperm chromatin dispersion assay to evaluate sperm deoxyribonucleic acid damage in men with infertility // Fertility and Sterility 2022.Vol. 117. N1. P. 64-73. doi 10.1016/j.fertnstert.2021.08.045
22. McEvoy Α., Roberts P., Yap K. Development of a simplified method of human semen storage for the testing of sperm DNA fragmentation using the Halosperm G2 test kit // Fertil Steril 2014. Vol. 102. P. 981-988.
23. Fernandez JL., Muriel L., Goyanes V., et al. Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test // Fertil Steril 2005. Vol. 84. P. 833-42.
24. Fernandez JL., Cajigal D., Lopez-Fernandez C, et al. Assessing sperm DNA fragmentation with the sperm chromatin dispersion test // Methods Mol Biol 2011. Vol. 682. P. 291-301.