СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУРЫ АУТОЛОГИЧНЫХ ЛИМФОЦИТОВ
MEDIUM FOR GROWING AUTOLOGOUS LYMPHOCYTE CULTURE

Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, к среде для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, и может быть использовано как для лечения, так и для профилактики гнойно-воспалительных осложнений у пациентов в условиях хирургических, травматологических и других стационаров. Изобретение позволяет быстро и доступно получить безопасный для пациента материал для заместительной клеточной технологии.
Известна среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI - 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (см. патент РФ №2333243, МПК С12N 5/08, 2005 г.).
Однако известная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов при своем использовании обладает следующими недостатками:
9
- не обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с необходимым содержанием лимфобластов (содержание лимфомассы до 0,9×10/л),
- не обеспечивает надежного исключения аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии,
- не обеспечивает исключение появления чужеродного белка.
Задачей изобретения является создание среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов.
Техническим результатом является обеспечение надежного исключения аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключение появления чужеродного белка, обеспечение необходимой и достаточной стерильности за счет исключения прорастания бактерий, а также обеспечение выращивания аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов.
Технический результат достигается в предложенной среде для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов сочетанием компонентов использованных для ее изготовления, а также количественным соотношением входящих в нее компонентов.
Технический результат достигается тем, что предложена среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI - 1640 (Roswell Park Memorial Institute), а также 10% раствор фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640 и сыворотку собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, объемные %:
сыворотка собственной крови пациента
0,75-1,2
10%-ный раствор фитогемоагглютинина в
культурной среде RPMI - 1640
0,008-0,013
культуральная среда RPMI - 1640
остальное до 100%.
Культурная среда RPMI - 1640 используется следующего состава:
Компоненты
Мол.
Конц.
Молярность
Неорганические соли
Нитрат кальция (Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
236
100,00
0,424
Хлорид калия (KCI)
75
400,00
5,30
Сульфат магния (MgSO<sub>4</sub>)
120
48,84
0,407
Хлорид натрия (NaCl)
58
6000,00
103,44
Бикарбонат натрия (NaHCO<sub>3</sub>)
84
2000,00
23,800
Фосфат натрия (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)
142
800,00
5,63
Другие компоненты
Глюкоза
180
2000,00
11,10
Глутатион, восстановленный
307
1,50
0,0032
Феноловый красный
398
5,00
0,0125
Аминокислоты
L-аргинин
174
200,00
1,10
L-аспарагин
132
50,00
0,379
L-аспарагиновая кислота
133
20,00
0,150
Дигидрохлорид L-цистеина
313
65,00
0,206
L-глутаминовая кислота
147
20,00
0,136
L-глутамин
146
300,00
2,05
Глицин
75
10,00
0,133
L-гистидин
155
15,00
0,0967
L-гидроксипролин
131
20,00
0,153
L-изолейцин
131
50,00
0,382
L-лейцин
131
50,00
0,382
Гидрохлорид L-лизина
146
40,00
0,219
L-метионин
149
15,00
0,101
L-фенилаланин
165
15,00
0,0909
L-пролин
115
20,00
0,174
L-серин
105
30,00
0,286
L-треонин
119
20,00
0,168
L-триптофан
204
5,00
0,0245
Динатриевая соль L-тирозина,
261
29,00
0,110
L-валин
117
20,00
0,171
Витамины
Биотин
244
0,20
0,008
D-пантотенат кальция
477
0,25
0,0005
Холинхлорид
140
3,00
0,0214
Фолиевая кислота
441
1,00
0,0022
Изоинозит
180
35,00
0,194
Ниацинамид
122
1,00
0,0081
п-Аминобензойная кислота
137
1,00
0,0072
Пиридоксин HCl
206
1,00
0,0048
Рибофлавин
376
0,20
0,0005
Тиамин HCl
337
1,00
0,0029
Витамин В 12
1355
0,005
0,00000369
Среди существенных признаков, характеризующих предложенную среду для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, отличительными являются:
- дополнительное содержание в культурной среде 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640,
- дополнительное содержание в культурной среде сыворотки собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов,
- выбор содержания компонентов, объемные %:
сыворотка собственной крови пациента
0,75-1,2
10%-ный раствор фитогемоагглютинина в
культурной среде RPMI - 1640
0,008-0,013
культуральная среда RPMI - 1640
остальное до 100%.
9
Экспериментальные исследования предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов показали ее высокую эффективность. Предложенная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов при своем использовании в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечивает надежное исключение аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, обеспечивает повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов до 2×10/л, исключает появления чужеродного белка, обеспечивает необходимую и достаточную стерильность. Одновременно было установлено, что использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов.
Качественное и количественное содержание предложенной «Среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов» заявленного состава является оптимальным результатом проведения в Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н.Приорова Росмедтехнологий» (ЦИТО) комплекса научно-исследовательских работ.
3
Предложенная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов используется следующим образом. Осуществляют забор цельной крови пациента из любой его центральной или периферической вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл и отстаивают ее в течение 100-140 минут. Затем отбирают лейкоцитарную фракцию в количестве 0,5-1,5 мл и вводят в нее 5 мл культуральной среды RPMI - 1640, а также 5 мл собственной сыворотки пациента. Разливают полученную клеточную взвесь в стерильные емкости по 2 мл и вводят в каждую емкость по 5 мл культуральной среды RPMI - 1640 и по 0,01 мл 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культуральной среде RPMI - 1640. Емкости с культурой лимфоцитов размещают в термостате и выдерживают при температуре 37°С в течение 72 часов, затем полученную в каждой емкости клеточную культуру аутологичных лимфоцитов центрифугируют в физиологическом растворе (5 мл) 3-5 раз при скорости вращения 1000 об/мин по 10 минут, при этом после каждого центрифугирования сливают надосадочную жидкость и в каждую емкость добавляют по 5 мл физиологического раствора для повторения центрифугирования клеточной культуры аутологичных лимфоцитов. Клеточная масса аутологичных лимфоцитов готова для своего использования. Из 5 флаконов, в которых культивировались аутологичные лимфоциты, собирают клеточную взвесь, доводят до объема 10 см физраствором и вводят внутривенно пациенту в любую его центральную или периферическую вену.
Реализация предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациент П., 55 лет, поступил в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Сочетанная травма.
9
9
Закрытая черепно-мозговая травма. Сотрясение головного мозга. Закрытый оскольчатый перелом правой бедренной кости со смещением отломков». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 1,0×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,68×10/л.
Пациенту выполнили оперативное вмешательство - остеосинтез правой бедренной кости пластиной.
Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациента из его центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациента отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI - 1640, содержащей 0,75 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,013 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640.
9
9
9
9
9
9
9
Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,95×10/л культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов ввели внутривенно пациенту в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период - гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациента составило 1,3×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,8×10/л, количество Т-супрессоров составило 0,013×10/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациента составило 1,4×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 1,0×10/л, количество Т-супрессоров составило 0,018×10. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А.
У пациента после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациента хорошее.
9
9
Пример 2. Пациентка К., 65 лет, поступила в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Правосторонний гонартроз 3-4 степени, выраженная вальгусная деформация нижней конечности, анкилоз правого тазобедренного сустава». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 0,95×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,64×10/л.
Пациентке выполнили оперативное вмешательство - надмыщелковая остеотомия бедра и надкостный остеосинтез из расширенного латерального доступа.
Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациентки из ее центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациентки отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI - 1640, содержащей 1,2 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,010 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640.
9
9
9
9
9
9
9
Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,92×10/л, культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов, ввели внутривенно пациентке в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период - гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К 3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,25×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,75×10/л, количество Т-супрессоров составило 0,012×10/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,4×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 1,0×10/л, количество Т-супрессоров составило 0,017×10. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А.
У пациентки после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациентки хорошее.
9
9
Пример 3. Пациентка Д., 69 лет, поступила в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Левосторонний гонартроз 3-4 степени, выраженная вальгусная деформация нижней конечности, анкилоз левого тазобедренного сустава». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 0,9×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,60×10/л.
Пациентке выполнили оперативное вмешательство - надмыщелковая остеотомия бедра и надкостный остеосинтез из расширенного латерального доступа.
Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациентки из ее центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациентки отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI - 1640, содержащей 0,95 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,008 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640.
9
9
9
9
9
9
Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,92×10/л культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов, ввели внутривенно пациентке в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период - гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К 3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,25×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,78×10/л, количество Т-супрессоров составило 0,011×10/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,3×10/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,9×10%, количество Т-супрессоров составило 0,017×10. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А.
У пациентки после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациентки хорошее.