Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е

1. Способ получения высокого титра вируса гепатита Е (HEV), включающий:
а) культивирование клеточной линии in vitro в среде, содержащей концентрацию полибрена, и
б) инфицирование этой клеточной линии вирусом HEV.
2. Способ по п. 1, где клеточная линия представляет собой HepG2 (номер НВ-8065 в Американской коллекции типовых культур (АТСС)) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
3. Способ по п. 1, где концентрация полибрена составляет от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл.
8
10
4. Способ по п. 1, где высокий титр HEV составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
7
10
5. Способ по п. 1, где высокий титр HEV составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
6. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадии:
а) добавления концентрации полибрена к среде;
б) пассирование HEV-инфицированной клеточной линии в среде, содержащей полибрен; и
в) сбор среды и/или инфицированных клеток.
7. Способ по п. 6, где концентрация полибрена на стадии (б) составляет от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл.
8
10
8. Способ по п. 6, где высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
7
10
9. Способ по п. 6, где высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
10. Способ определения присутствия и/или уровня HEV в образце, включающий стадии:
а) внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию и культуральную среду, содержащую полибрен;
б) инкубирования смеси, содержащей образец, со стадии (а), для обеспечения размножения HEV в случае его присутствия в образце;
в) сбора порции со стадии (б), содержащей HEV в случае его присутствия и размножения во время осуществления стадии (б); и
г) измерения присутствия и/или уровня биологического вещества, ассоциированного с HEV, в собранной порции.
11. Способ по п. 10, где клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
12. Способ по п. 10, где биологическое вещество содержит полинуклеотидную и/или полипептидную последовательность HEV.
13. Способ по п. 10, где измерение присутствия и/или уровня биологического вещества включает стадии:
а) получения первой реакционной смеси путем смешивания собранной порции с первым раствором для обеспечения воздействия на полинуклеотид HEV в случае присутствия HEV в собранной порции, где полинуклеотид представляет собой РНК HEV;
б) получения второй реакционной смеси путем добавления к первой реакционной смеси первого реагента для получения комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), которая по меньшей мере частично комплементарна указанной РНК HEV;
в) получения третьей реакционной смеси путем добавления к второй реакционной смеси второго реагента, содержащего пару полинуклеотидов для амплификации последовательности кДНК, которая по меньшей мере частично комплементарна каждому из указанной пары полинуклеотидов;
г) получения четвертой реакционной смеси путем амплификации указанной последовательности; и
д) определения концентрации амплифицированной последовательности в указанной четвертой реакционной смеси.
14. Способ по п. 13, где указанное определение концентрации включает:
а) получение четвертой реакционной смеси;
б) получение одного или более контролей, содержащих предварительно определенное количество кДНК HEV;
в) добавление к указанной четвертой реакционной смеси и указанному(ым) одному или более контролям агента, где указанный агент является по меньшей мере частично специфичным к указанной амплифицированной последовательности в четвертой реакционной смеси и к кДНК HEV, содержащейся в указанном предварительно определенном количестве в указанном(ых) одном или более контролях; и
г) расчет уровня распознавания HEV указанным агентом в данной четвертой реакционной смеси относительно указанного(ых) одного или более контролей.
15. Способ по п. 13, где указанная пара полинуклеотидов включает:
а) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1),
б) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2).
16. Способ по п. 14, где указанный агент включает:
5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
17. Культуральная среда для получения высокого титра HEV, содержащая полибрен в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл.
8
10
18. Культуральная среда по п. 17, где высокий титр HEV составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
7
10
19. Культуральная среда по п. 17, где высокий титр HEV составляет от примерно 10 копий/мл до примерно 10 копий/мл.
20. Анализ титрования HEV, включающий использование полибрена в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл.