Средство для консервации донорской роговицы
AGENT FOR PRESERVATION OF DONOR CORNEA

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для вирусной деконтаминации, профилактики передачи герпесвирусов от донора к реципиенту и улучшения трансплантационных качеств для сквозной кератопластики.
Известно средство для консервации донорских роговиц глаза (Патент РФ №2450515), содержащее: среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержит препарат NeyDIL №37 St.III (Р/У ЛРС-008827/08-061108) при следующем соотношение компонентов, масс. %: Среда 199 25,0, Среда Хэма F-10 25,0, Хондроитин-сульфат А 0,5, Декстран-40 5,0, Гентамицин-сульфат 0,00014, Амфотерицин В 0,00015, NeyDIL №37 St.III 0,00015, Среда Дюльбекко-Игла остальное.
Недостатком этой среды является то, что использованные регуляторные пептиды NeyDIL №37 St.III не являются индукторами β-интерфероногенеза, не способствуют выработке эндогенного интерферона для деконтаминации герпесвирусов, не обеспечивают эффективную профилактику передачи герпесвирусной инфекции от донора к реципиенту.
Задачей изобретения является создание многокомпонентного средства для консервации донорской роговицы в режиме органотипической консервации (при температуре 37°С), способствующего выработке эндогенного интерферона для деконтаминации герпесвирусов.
Техническим результатом является предупреждение репликации герпесвирусов и обеспечение эффективной предоперационной профилактики передачи герпесвирусной инфекции от донора к реципиенту из-за способности кератоцитов вырабатывать эндогенный интерферон при помощи индукторов β-интерфероногенеза.
Технический результат достигается тем, что данное средство для консервации донорской роговицы, в режиме органотипической консервации, содержащее среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, Гентамицин-сульфат, амфотерицин В и среду Дюльбекко-Игла, дополнительно содержит препарат Полудан.
Средство для консервации донорской роговицы глаза человека содержит на 100 мл раствора:
среду 199
25,0 мл
среду Хэма F-10
25,0 мл
хондроитин-сульфат А
0,5 г
декстран-40
5,0 г
гентамицин-сульфат
0,00014 г
амфотерицин В
0,00015 г
Полудан
1000 ЕД
среда Дюльбекко-Игла
остальное.
При этом среда 199 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 25; Л-аргинина хлорид 70; аспарагиновая кислота 30; Л-цистеина хлорид - 0,0987; Л-цистина двунатриевая соль; Л глютаминовая кислота 66,82; Л-глютамин 100; глютатион 0,05; глицин 50; Л гистидина хлорид одноводный 21,88; Л гидрооксипролин 10; Л-изолейцин 20; Л-лейцин 60; Л лизина хлорид 70; Л-метионин 15; Л-фенилаланин 25; Л-пролин 40; Л-серин 25; Л-треонин 30; Л-триптофан 10; Л-тирозина двунатриевая соль - 49,72; Л-валин 25; Л-аскорбиновая кислота 0,05; биотин 0,01; кальциферол 0,1; Д-кальция пантотенат 0,01; холина хлорид 0,5; фолиевая кислота - 0,01; и-инозитол 0,05; менафтона натрия бисульфат трехводный 0,019; никотиновая кислота 0,025; никотинамид 0,025; пара-амино-бензойная кислота 0,05; пиридоксальхлорид 0,025; пиридоксинхлорид 0,025; рибофлавин 0,01; тиамина хлорид 0,01; Д-Л--токоферола фосфата двунатриевая соль 0,01; витамина А-ацетат 0,1147; кальция хлорид двухводный 185,5; железа нитрат девятиводный 0,01; калия хлорид 400; калия дегидроортофосфат 60; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 8000; натрия гидроортофосфат 47,5; аденина сульфат 10; 5-АМФ 0,2; АТФ двунатриевая соль 10; холестерол 0,2; 2-дезоксирибоза 0,5; Д-глюкоза 1000; гуанина хлорид - 0,3; гипоксантин 0,3; Д-рибоза 0,5; натрия ацетата 36,71; натриевая соль фенола красного 17; тимин 0,3; твин 80-5; урацил 0,3; ксантин 0,3.
Среда Хэма F-10 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 8,91; Л-аргинина хлорид 210,7; Л-аспарагин 1-водный - 15,01; Л-аспарагиновая кислота 13,31; Л-цистеина хлорид 31,53; Л-глютаминовая кислота 14,71; Л-глютамин 146,2; глицин 7,51; Л-гистидина хлорид одноводный 20,96; Л-изолейцин 2,62; Л-лейцин 13,12; Л-лизин 29,3; Л-метионин 4,48; Л-фенилаланин 4,96; Л-пролин 11,51; Л-серии 10,5; Л-треонин 3,57; Л-триптофан 0,61; Л-тирозина натриевая соль 2,25; Л-валин 3,51; биотин 0,024; Д кальция пантотенат 0,715; хлорид холина 0,698; фолиевая кислота 1,32; и-инозитол 0,541; никотинамид 0,611; пиридоксин-хлорид 0,206; рибофлавин 0,376; тиамина хлорид 1,012; витамин В12 1,36; кальция хлорид двухводный 44,1; сульфат меди пятиводный 0,0025; сульфат железа семиводный 0,8346; хлорид калия - 285; калия дегидрофосфат 83; магния сульфат семиводный 152,7; натрия хлорид 7400; натрия гидроортофосфат 156,2; цинка сульфат семиводный 0,0288; Д-глюкоза 1100; гипоксантин 4,08; липоевая кислота 0,206; натриевая соль фенола красного 12; натрия пируват 110; тимидин 0,727.
Среда Дюльбекко-Игла имеет следующий состав, мг/л: Л-аргинин 84; Л-цистина двунатриевая соль 56,78; Л-глютамин 584; глицин 30; Л-гистидина хлорид одноводный 42; Л-изолейцин 104,8; Л-лейцин 104,8; Л-лизина хлорид 146,2; Л-метионин 30; Л-фенилаланин - 66; Л-серии 42; Л-треонин 95,2; Л-триптофан 16; Л-тирозина двунатриевая соль 89,5; Л-валин 93,6; Д кальция пантотенат 4; холина хлорид 4; фолиевая кислота 4; и-инозитол 7; никотинамид 4; пиридоксаль-хлорид 4; рибофлавин 0,4; тиамина хлорид 4; кальция хлорид двухводный 264,9; нитрат железа девятиводный 0,1; калия хлорид 400; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 6400; натрия бикарбонат 3700; натрия дигидроортофосфат двухводный 141,3; Д-глюкоза 4500; натриевая соль фенола красного 15; натрия пируват 110.
Полудан (ЛС-002205), содержит полирибоадениловой кислоты калиевую соль (калия полирибоаденилат) 0,1 мг, полирибоуридиловой кислоты калиевую соль (калия полирибоуридилат) 0,107 мг; Вспомогательные вещества: натрий гидрофосфат (натрия фосфорнокислого 2-замещенного) 2,0 мг, калий дигидрофосфат (калия фосфорнокислого 1-замещенного безводного) 0,408 мг, натрий хлорид 8,5 мг.
Каждая в отдельности взятая среда, как-то: среда 199 как наиболее сложная по своему составу, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла как наиболее универсальные, поддерживает высокую жизнеспособность чувствительных клеток перевиваемых линий. Однако для органных культур, которые в процессе культивирования остаются интактными и не относятся к перевиваемым линиям, требуется экспериментальный подбор соотношений нескольких сред, в зависимости от гистогенетической характеристики органной культуры. В этой связи для эндотелия трупной донорской роговицы, который относится к глиальной ткани, наиболее оптимальным является выбор трех сред - среда 199, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла, в заявленных соотношениях, имитирующих аминокислотный и метаболический состав водянистой влаги передней камеры интактного глаза.
Хондроитин-сульфат А относится к цитопротекторам - вискоэлластикам, обладая соответствующим знаком и электронным зарядом, он образует поверхностную защитную пленку на клетках эндотелиального пласта роговицы. Тем самым предотвращается механическое повреждение и десквамация клеток эндотелия роговицы в процессе гипотермической консервации донорского материала.
Декстран с молекулярной массой 40000 D относится к высокомолекулярным онкотическим компонентам среды и, таким образом, подобранный в заявленной концентрации создает в среде онкотическое давление равное 320 млОсм/л, при котором предотвращается процесс набухания клеток и коллоидного вещества стромы донорской роговой оболочки в процессе длительной гипотермической консервации.
Для предотвращения роста патогенной микрофлоры добавлены: гентамицин-сульфат, оказывающий бактерицидное действие в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, и амфотерицин В, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действиями.
Иммуностимулирующий препарат Полудан представляет собой биосинтетический полирибонуклеотидный комплекс полирибоадениловой и полирибоуридиловой кислот, является индуктором синтеза эндогенного интерферона. Обладает выраженной противовирусной и иммуномодулирующей активностью. Разрешен к применению в офтальмологии.
Заявленное средство для консервации донорской роговицы благодаря входящим в его состав компонентам в обозначенных концентрациях обладает выраженной иммуномодулирующей и противовирусной активностью, стимулирует функцию естественных иммунокомпетентных клеток.
В результате этого создаются условия для вирусной деконтаминации трупных донорских роговиц человека на этапе консервации, способствующие эффективной профилактике передачи герпесвирусной инфекции реципиентам после кератопластики.
Это подтверждают результаты исследования, в котором использовались жизнеспособные трупные роговицы человека, полученные из Глазного банка МНТК «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова в количестве 16 роговиц от 8 доноров, с наличием вируса простого герпеса типа I, верифицированного методом полимеразной цепной реакции (ПНР). Одна роговица от каждого донора являлась опытной, другая, парная, служила контрольным образцом.
Роговицы из опытной группы подвергались краткосрочной органотипической консервации при 33-38°С в течение 24 часов в заявленном средстве с Полуданом (препарат разрешен к применению в офтальмологии) для индукции кератоцитами β-интерфероногенеза. Через 24 часа роговицы подвергались гипотермической консервации в среде для консервации роговицы, полученной по патенту РФ №2069951, при 4°С в течение 2-х (n=4) и 6-ти (n=4) суток, затем выводились из эксперимента для проведения гистохимического анализа жизнеспособности эндотелия и анализа на наличие вирусов методом клеточного цитопатического эффекта (золотой стандарт). Контрольная группа роговиц подвергалась идентичному алгоритму исследования, за исключением состава среды, в которой вместо добавленного в опытной группе препарата Полудан, были использованы регуляторные пептиды, которые, по данным литературы, потенциально способны стимулировать интерфероногенез. Из всех консервационных сред 16-ти образцов роговиц до начала опыта и через 24 часа после нормотермической консервации отбирались аликвоты для проведения анализа на количественное содержание β-интерферона.
Эндотелий всех опытных и контрольных роговиц, по данным иммуноцитохимического анализа, оставался жизнеспособным в течение всех сроков наблюдения. Его потеря через 24 часа нормотермической консервации и через 2 и 6 сут гипотермической консервации была незначительной и не превышала 1,5%. Во всех опытных образцах после нормотермической консервации при сокультивировании роговиц на конфлуэнтном слое эпителиальных клеток не было получено цитопатического эффекта, что подтверждало полную вирусную деконтаминацию. В контрольных роговицах от тех же доноров при сокультивировании в 6 случаях из 8-ми был получен выраженный клеточный цитопатический эффект. Во всех опытных аликвотах сред после гипертермической консервации определялось наличие β-интерферона в 8-кратной концентрации по сравнению с аликвотами от контрольных роговиц, что экспериментально показало неспособность ближайшего аналога средства для консервации донорских роговиц, за счет входящих в его состав регуляторных пептидов, вырабатывать кератоцитами эндогенный β-интерферон.
Средство для консервации роговицы получают следующим образом: в условиях ламинарной комнаты в химически чистую и стерильную мерную колбу сливают вместе две среды: 25 мл среды 199 и 25 мл среды Хэма F-10. Далее последовательно вносят 0,00014 г гентамицин-сульфата, 0,00015 г амфотерицина В. Состав разделяют на две равные части по 25 мл и растворяют в первой части 5 г декстрана-40, а во второй части 0,5 г хондроитин-сульфата А путем медленного нанесения сухого вещества на поверхность жидкой смеси. После внесения указанных компонентов растворы оставляют до полного набухания на 80-120 минут, после чего полностью растворяют. Затем оба раствора сливают вновь вместе в мерную колбу, добавляют Полудан в количестве 1000 ЕД и добавляют среду Дюльбекко-Игла до метки 100 мл. Затем, после префильтрации через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, полученные 100 мл средства для консервации роговицы, разливают по 20 мл во флаконы, с одновременной «Глубинной стерилизацией» через систему миллипоровых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Флаконы укупориваются стерильными крышками и помещаются в холодильник для хранения при температуре +4°С не более суток, либо используются сразу при температуре +37°С.
Средство используют следующим образом. В условиях стерильного бокса выкраивают роговицу с ободком склеры диаметром 16 мм и помещают во флакон с предварительно подготовленным заявленным средством, плотно закрывают и консервируют при температуре +37°С в течение 24-х часов, после чего переносят в среду для консервации роговицы, полученную по патенту №2069951, в условия гипотермии (4-8°С) и хранят в ней.
Использование предлагаемого средства для консервации донорской роговицы в Глазном банке ФГАУ МНТК «Микрохирургия глаза» позволило обеспечить эффективную предоперационную профилактику передачи герпесвирусной инфекции от донора к реципиенту, благодаря способности вырабатывать эндогенный интерферон при помощи индуктора β-интерфероногенеза.