СПОСОБ РЕТРОСПЕКТИВНОГО ОБНАРУЖЕНИЯ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ДОПИНГОВОМ КОНТРОЛЕ СПОРТСМЕНОВ
METHOD FOR RETROSPECTIVE XENOBIOTIC DETECTION ACCOMPANYING SPORTSMEN DOPING CONTROL PROCEDURE

Изобретение относится к хроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в медицине, биологии, экологии и, в особенности, при допинговом контроле.
Известны способы анализа различных химических соединений методами газовой или жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией или тандемной масс-спектрометрией. [1-3]
В частности при идентификации неизвестных веществ методом жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией регистрируют хроматограмму как функцию времени удерживания и регистрируют масс-спектр в период времени, соответствующий выходу вещества из колонки, и сравнивают с масс-спектрами известных веществ, находящимися в базе данных, далее определяют индекс удерживания и сравнивают его с таковыми из базы данных и идентифицируют вещество по двум параметрам - масс-спектру и индексу удерживания. [4]
Недостатком указанного способа является проведение анализа на строго заранее определенные вещества, высокие значения граничных концентраций определяемых веществ, а также определенная вероятность получения недостоверных результатов.
-4
В последнее время разработана методика высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения с ионно-орбитальной ловушкой и аппаратурное оформление указанной методики. По указанной методике готовят пробу исследуемого образца, разделяют ее на компоненты пропусканием через монолитную хроматографическую колонку, компоненты исследуемой пробы подвергают химической ионизации в атмосфере азота в присутствии носителя метанол/вода и из ионно-орбитальной ловушки на детектирование последовательно отбирают и подают ионизированные компоненты с разностью масс не менее 10 а.е.м. с последующим определением принадлежности каждого иона конкретному веществу на основании его аналитических характеристик. [5].
Указанная методика позволяет с высокой точностью и достоверностью идентифицировать различные химические соединения, в том числе, естественно, и ксенобиотики. Следует особо отметить, что указанная методика определения ксенобиотиков может реализоваться как с привлечением эталонных образцов исследуемых веществ, так и без него.
Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является обеспечение возможности ретроспективного обнаружения ксенобиотиков и их метаболитов за счет высокой точности определения аналитических характеристик исследуемых веществ и соответственно практически полной достоверности определения исследуемых веществ при высокой оперативности определения.
Поставленный технический результат достигается тем, что при опубликовании в списке запрещенных к использованию препаратов нового вещества по его химической формуле вычисляют точную молекулярную массу и далее в массиве результатов предыдущих анализов проб биологической жидкости спортсмена на допинг по соответствующему классу ксенобиотиков на основе вычисленной молекулярной массы проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанному веществу и его метаболитам, и при нахождении указанных аналитических характеристик спортсмена переводят в группу риска, а для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.
Известно, что как атомная масса, так и молекулярная масса веществ выражается не целыми, а дробными числами и, зная по химической формуле органического соединения точную молекулярную массу его, может быть вычислен и элементный состав (программа Molecular Fragment Calculator). С другой стороны, если известна измеренная масса протонированной молекулы (m/z), то по этой массе можно установить брутто-формулу вещества. При этом следует подчеркнуть, что при определении массы с точностью до третьего знака (например 345,253) брутто-формула дает список из трех веществ, одно из которых соответствует станозололу, а при определении массы с точностью до четвертого знака (345,2533) брутто-формула дает только одно вещество - станозолол. Из вышеизложенного вытекает, что чем точнее в процессе проведения анализа определена масса протонированной молекулы, тем выше точность определения искомого вещества, и, что как раз положено в основу заявляемого технического решения, наоборот, чем точнее задана молекулярная масса искомого вещества, тем однозначнее будут результаты ретроспективного анализа.
К тому следует отметить, что недобросовестные спортсмены, нарушающие запрет на допинг, практически всегда «опережают» события, а WADA всегда опаздывает. Кроме того, важным фактором, облегчающим обнаружение нового ксенобиотика в пробе на допинг по заявляемому способу, является то, что ксенобиотики сгруппированы по классам, и поэтому новые запрещенные к применению вещества могут и быть и считаться «дженериками» и потому иметь аналитические характеристики, сходные с известными.
Изобретение может быть осуществлено следующим образом.
К исследуемому образцу биологической жидкости добавляют фосфатный буфер и раствор β-глюкуронидазы и подвергают образец ферментативному гидролизу, гидролизат охлаждают, добавляют смесь карбоната калия и гидрокарбоната натрия до рН 9-10, далее образец экстрагируют диэтиловым эфиром с добавлением сульфата натрия. Органический экстракт затем центрифугируют, эфирный слой упаривают досуха, сухой остаток растворяют в метаноле. Приготовленный таким образом для анализа экстракт далее направляют на хромато-масс-спектрометрическое определение, параметры которого будут представлены в примерах конкретного осуществления заявленного технического решения. В ходе анализа регистрируют отношение массы к заряду протонированных молекул определяемых веществ, время удерживания и ионный ток.
На основании этих аналитических характеристик определяют наличие известных как запрещенные ксенобиотиков и их метаболитов. Все данные анализа сохраняют. При опубликовании в списке запрещенных к использованию нового вещества по его известной химической формуле вычисляют точную молекулярную массу и далее на основе вычисленной молекулярной массы в массиве результатов предыдущего анализа пробы биологической жидкости спортсмена на допинг по соответствующему классу ксенобиотиков проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанному веществу и его метаболитам, и при нахождении указанных аналитических характеристик спортсмена переводят в группу риска и для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.
Применение спортсменом нового запрещенного к использованию вещества на момент взятия пробы в ретроспективном плане можно квалифицировать как «преждепользование».
Важным преимуществом заявляемого способа обнаружения ксенобиотиков является то, что он позволяет без проведения дополнительного весьма затратного анализа с вероятностью, близкой к единице, выделить из группы спортсменов подозреваемых в допинге.
Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующим примером его конкретного осуществления.
Пример 1
Проводят анализ биологической жидкости (моча) спортсмена на допинг (подозрение на применение оксандролона).
18
Анализ проводят на хромато-масс-спектрометрической системе Surveyor HPLC, совмещенный с ОИЛ-масс-спектрометром (Bremen, Германия) и оснащенный ионным источником для химической ионизации с генератором азота NM30LA (Peak Scientific, США). В качестве ХГК используют Onyx Monolith C.
Подготовка пробы и анализ исследуемой биологической жидкости
-1
К образцу мочи (5 мл) добавляют 1 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,0) и 50 мкл раствора β-глюкуронидазы и подвергают образец ферментативному гидролизу (57°С, 3 часа), гидролизат охлаждают до комнатной температуры, добавляют в него 100 мг смеси карбоната калия и гидрокарбоната натрия (2:1) до рН 9-10, далее образец экстрагируют 5 мл диэтилового эфира с добавлением 500 мг сульфата натрия. Органический экстракт затем центрифугируют в течение 5 минут при 2500 об/мин, эфирный слой упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 50 мкл метанола. Приготовленный таким образом для анализа экстракт далее направляют на хромато-масс-спектрометрическое определение при следующих параметрах: температура фокусирующего капилляра - 280°С, ток через иглу 5 мкА, скорость потока осушающего газа (азот) 20 л/час; скорость сканирования 1 скан/сек; диапазон сканирования 100-500 а.е.м.; точность определения масс ≤2 млн; разрешение 60000 (на половине высоты); объем вводимой пробы 10 мкл; подвижная фаза А: метанол-вода 80:20, В: метанол - вода 90:10; градиентное элюирование 0-8 мин: 50% В; 8-12 мин: 100% В; скорость потока 800 мкл/мин. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы.
Результаты анализа представлены в Таблице 1.
Таблица 1
№№ п/п
Найденные m/z
Найденный ксенобиотик
1
-
Оксандролон не обнаружен
2
313,2162
-
3
297,1849
-
В список препаратов, запрещенных к использованию, WADA вносит тетрагидрогестринон и экземестан.
Проверку преждепользования спортсменом указанных ксенобиотиков осуществляют следующим образом. На основании химических формул вычисляют точные теоретические молекулярные массы новых запрещенных ксенобиотиков (313,2167 и 297,1854 соответственно) и далее в зарегистрированных результатах предыдущего (см. Таблицу 1) анализа пробы биологической жидкости спортсмена на допинг проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанным веществам и их метаболитам.
Результаты проверки приведены в Таблице 2.
Таблица 2
№№ п/п
Молекул. масса теоретич.
Найденные m/z
Брутто-формула
Найденный ксенобиотик
1
-
-
-
2
313,2167
313,2162
C<sub>21</sub>H<sub>29</sub>O<sub>2</sub>
тетрагидрогестрион
3
297,1854
297,1849
С<sub>20</sub>Н<sub>24</sub>O<sub>2</sub>
экземестан
Найденные аналитические характеристики тетрагидрогестриона и экземестана подтверждают применение спортсменом новых запрещенных к использованию веществ на момент взятия пробы в ретроспективном плане (принцип преждепользования). В то же время, поскольку этические нормы не позволяют напрямую предъявить спортсмену обвинение в допинге, спортсмена переводят в группу риска и для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.
Сохраненную пробу биологической жидкости спортсмена подвергают анализу по патенту RU 2384846 (Пример 1) с использованием эталонных образцов тетрагидрогестриона и экземестана (получены от фирмы LPG Promochem). Анализ подтвердил наличие в пробе вышеуказанных ксенобиотиков, что дает однозначное толкование как преждепользование спортсменом новых запрещенных ксенобиотиков.
Как видно из описания и примера осуществления способа, заявляемое техническое решение обеспечивает возможность однозначной идентификации ксенобиотиков и их метаболитов в произвольных комбинациях за счет высокой точности определения аналитических характеристик исследуемых веществ и соответственно практически полной достоверности обнаружения исследуемых веществ при высокой оперативности проведения процесса.
Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки
1. RU 2093822 С1, М.кл. G01N 30/04, опубл. 1997 г.
2. RU 2069363 С1, М.кл. G01N 30/02, опубл. 1996 г.
3. WO 2004/104571, М.кл. G01N 30/00, опубл. 2004 г.
4. RU 2384846 С1, М.кл. G01N 33/493, опубл. 2010 г.
5. J. Mass Spectrom. 2008, 43: 949-957.