Штамм бактерий Pseudarthrobacter equi S2 для повышения урожайности зерновых культур
PSEUDARTHROBACTER EQUI S2 BACTERIAL STRAIN FOR INCREASING THE PRODUCTIVITY OF GRAIN CROPS

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и касается получения штаммов бактерий, обладающих калийсолюбилизирующей, фитопротекторной и ростостимулирующей активностью. Штамм перспективен для получения бактериальных препаратов для улучшения питания растений, оздоровления биоценоза и повышения урожая зерновых культур.
Одним из аспектов положительного влияния микроорганизмов на растения является улучшение их минерального питания. Поэтому способность к переводу труднорастворимых соединений макро- и микроэлементов в растворимую форму, пригодную для поглощения корнями, является важным фактором стимуляции роста и развития растений.
Известен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 (п. РФ № 2289621, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/07, опубл. 20.12.2006), совместимый с некоторыми химическими пестицидами и способный трансформировать силикаты, апатиты, трикальцийфосфат, нуклеонат натрия.
Однако в патенте не приводятся сведения о возможности накоплении калия в растворенном виде.
Из уровня техники известно удобрение на основе штамма бактерий Bacillus mucilaginosus - Bac 1208, способного производить экзополисахарид, который создает полезную микрофлору ризосферы (п. РФ № 2081867, МПК C05F 11/08, C12N 1/20, опубл. 20.06.1997), и удобрение на основе штамма бактерий Bacillus mucilaginosus , способного трансформировать малорастворимые соединения фосфора и калия в доступную для растений форму, обладающего фитопатогенной активностью (п. РФ № 2408722, МПК C12N 1/20, C05F 11/08, опубл. 10.01.2011).
Однако авторами не приведены какие-либо сведения о качественном или количественном высвобождении калия, кроме того, не описана ростстимулирующая и фитопротекторная роль.
Известно использование в качестве удобрения (п. РФ № 2148571, МПК C05F 11/08, A01N 63/00, опубл. 10.05.2000) биодобавки, состоящей из ассоциаций азотфиксирующих бактерий Azotobacter chroococcum и Beijerinckia fluminensis, взятых в соотношении (1-0,5):(1-0,5) и разлагающих фосфор- и калийсодержащие соединения бактерий Bacillus megaterium и Bacillus mucilaginosus , взятых в соотношении (1-5:0,5-2).
Недостаток данного решения в многокомпонентности состава и малом количестве освобожденного калия. Не описано, также фитопротекторная и ростстимулирующая роль данных мокроорганизмов.
Наиболее близким является штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ В-12259 (п. РФ № 2626543, МПК C12N 1/20, C05F 11/08, опубл. 28.07.2017), способствующий образованию продуктов метаболизма, ускоряющих рост корневой и вегетативной системы растений и стимулирующих выработку растением фитогормонов. Данный штамм обладает способностью растворять в почве водонерастворимые соединения фосфора и калия, а также активно участвует в процессе нитрификации. Штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 обладает повышенной способностью к синтезу бактериционов с широким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры и способствует повышению стрессоустойчивости, приживаемости и урожайности широкого ассортимента сельскохозяйственных и декоративных культур.
Однако авторами не приведены какие-либо сведения о качественном или количественном высвобождении калия.
Таким образом, все известные штаммы, способные мобилизировать калий из труднорастворимых соединений или обладающие фитопротекторной и/или ростостимулирующей активностью, имеют ряд недостатков вследствие недостаточно высокой эффективности и трудоемкости способа получения биомассы, низким уровнем калийсолюбилизации и стимуляции роста растений. Кроме того, большинство известных штаммов, для достижения указанных свойств, используются, в основном, в составе консорциумов и не обладают самостоятельной фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Технической проблемой, поставленной перед изобретением, является расширение ассортимента штаммов, обладающих калийсолюбилизирущей, фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Поставленная техническая проблема решается выявлением нового природного штамма Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868, который обладает значительной калийсолюбилизирущей способностью, а также фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Штамм Pseudarthrobacter equi S2 выделен в естественных условиях из почвы (Приморский край, Россия) путем прямого высева на ГРМ-агар при 22-25°С и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-13868.
4
2
3
3
3
4
Штамм бактерий Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 обладает калийсолюбилизирущей способностью. Активность солюбилизации калия определяли методом посева микроорганизмов штрихом на на модифицированную среду Александрова следующего состава (на 1000 мл): агар – 20 г; пудра алюмосиликатов 3 г; глюкоза – 5 г; MgSo * 7 HO – 0,5 г; CaCO – 0,1 г; FeCl – 0,006 г; Ca(PO) - 2 г; + бромтимоловый синий – 2,5 г. Активность выявляется при наличии зоны просветления (растворении алюмосиликатов калия) вокруг выросших колоний микроорганизмов.
Штамм идентифицировали помощью анализа 16S РНК. Была проанализирована последовательность длинной 588 пар оснований. Для амплификации участка 16S рРНК образцов использовали пару праймеров BAK11w 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и BAK2 5’-GGACTACHAGGGTATCTAAT-3’, которые оптимизированы для идентификации широкого спектра бактериальной ДНК (Zucol et al., 2006). Реакцию амплификации проводили с помощью термоциклера iCycler (Bio-Rad Laboratories, USA), программированном на следующие условия реакции: предварительная денатурация 96 оС — 1 мин, 30 циклов, включавших 96 оС — 10 сек, 55 оС — 20 сек, 72 оС — 30 сек и финальная элонгация 55 оС — 20 сек, 72 оС — 3 мин. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл, содержащей по 0,3 мM праймеров BAK11w и BAK2, 0,2 мM каждого нуклеотида, 2,5 мкл 10X Encyclo буфера, 0,5 мкл 50X Encyclo полимеразы и 50 нг образца ДНК. Результат амплификации анализировали в 1 %-ном агарозном геле с добавлением бромида этидия. Полученный специфичный продукт размером 780 п.н. вырезали из геля, очищали и использовали в реакции секвенирования с помощью BigDye Terminator v3.1 согласно рекомендациям фирмы-производителя (Thermo Fisher Scientific, USA).
Культурально-морфологические и биохимические особенности штамма.
На агаризованном питательном агаре штамм образует однородные, точечные, глянцевые, плоские, гладкие колонии бледно-белого цвета с ровными краями, центр не выражен. В мазке суточной культуры обнаруживаются короткие одиночные палочки размером 0,4-0,7 мкм, в мазке 3-х суточной культуры кокки грамположительные. Спор и цист не образуют. Аэробы. Культивируются при температуре 24-27 0С. Оптимум рН 6,0-6,4. Каталазаположительные, оксидазоотрицатиельные. Гидролизуют казеин, тирозин, желатину и крахмал (медленно, 3 суток). Не восстанавливают нитрат, не продуцируют кислоту из глюкозы, гликогена, лактозы сахарозы, ксилозы, рибозы, маннита, мальтозы. Переносит до 2% NaCl.
Для длительного хранения культуру бактерий засевают в пробирки с полужидким питательным агаром. Через 3 дня заливают стерильным вазелиновым маслом слоем в 0,5-1 см. Затем культура помещается в холодильник при 4° С. (Метод хранения под вазелиновым маслом).
Для размножения штаммы высеваются в пробирки со скошенным питательным агаром. Культивируются при температуре 24-27 0С.
7
Ферментацию штамма проводили следующим путем: в пробирки с суточной культурой бактерий добавляют стерильный питательный бульон так, чтобы он полностью покрывал поверхность плотной питательной среды. Через 1 час полученные таким образом бактериальные смывы используют для инокуляции колб с питательным бульоном. Инокулированные колбы инкубируют при 24°С в течение 7 дней с периодическим (2 раза в сутки) встряхиванием  вручную до достижения численности бактерий не менее 1×10 м.кл./мл.
Пример 1. Солюбилизация калия культурой бактерий Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 (качественная оценка).
4
4
2
3
3
3
4
Способность штамма Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 к мобилизации неорганическго калия оценивали методом посева штрихом микроорганизмов на чашки с плотной агаризированной средой Александрова, следующего состава (на 1000 мл): агар – 20 г; пудра алюмосиликатов (KAlSiO) – 3 г; глюкоза – 5 г; MgSО * 7 HO – 0,5 г; CaCO – 0,1 г; FeCl – 0,006 г; Ca(PO) - 2 г; + бромтимоловый синий – 2,5 г. Активность выявляется при наличии зоны просветления (растворении алюмосиликатов калия) вокруг выросших колоний микроорганизмов в течение 7-10 дней. Калиймобилизующую активность бактерий оценивали количественно как площадь зон растворения фосфатов. В результате наблюдали диаметр зон растворения алюмосиликатов – 15-20 мм.
Пример 2. Солюбилизация калия культурой бактерий Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 (количественная оценка).
4
7
Количественную оценку способности штамма Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 мобилизовать труднодоступные соединения калия определяли в жидкой среде Александрова (без добавления агара). Источником нерастворимого калия служил алюмосиликат калия (KAlSiO). Среду разливали по 100 мл в колбы Эрленмейера (объем 250 мл). Посевной материал приготавливали, выращивая бактерии в течение 24 часов в пробирках на агаризованной среде Александрова. 1 мл суспензии бактерий в концентрации 1Х10 КОЕ/мл вносили в колбы с жидкой средой Александрова. Контроль - среда Александрова без инокуляции. Исследования проводили в трехкратной повторности.
4
Бактерии Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 культивировали в течение 5 суток при 24°С в периодических условиях на качалках (230 об/мин). После окончания культивирования опытные образцы центрифугировали в течение 10 минут при 6000 об/мин. Концентрацию растворимого калия определяли тетрафенилборатным методом. Содержание водорастворимого калия, накапливаемого культурой исследуемых бактерий, рассчитывали по разнице его концентрации в опытном (инокулированном) и контрольном (стерильном) вариантах. Результаты исследований свидетельствуют о том, что бактерии Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 активно мобилизует калий из труднорастворимых неорганических (KAlSiO) соединений. Выявлено, что в опытных образцах содержание растворимого калия колебалось в пределах 167-184 мг/л, а в контроле - 5,1-7,0 мг/л.
Ростостимулирующее и фитопротекторное действие  изучали посредством выявления потенциального эффекта исследуемых бактерий при воздействии на прорастание семян злаковых растений.
Пример 3. Оценка воздействия штамма Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 на энергию прорастания семян злаковых культур
9
Готовили рабочий раствор: Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23° С. На 3-и сутки определяли энергию прорастания. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение энергии прорастания семян пшеницы в среднем на 18%, семян ячменя — в среднем на 18% по сравнению с необработанным контролем.
Пример 4. Оценка воздействия штамма Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 на лабораторную всхожесть семян злаковых культур.
9
Готовили рабочий раствор: штамм Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23° С. На 7-е сутки оценивали лабораторную всхожесть семян. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение лабораторной всхожести семян ярового ячменя на 15%, яровой пшеницы – на 22%.
Пример 5. Оценка воздействия штамма Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 на длину побега и длину корней проростков семян злаковых культур.
9
Готовили рабочий раствор: штамм Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23° С. На 7-е оценивали длину побега и длину корней проростков. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение длины надземной части ярового ячменя на 21 %, яровой пшеницы – на 9%; увеличение длины корня ярового ячменя на 40%, яровой пшеницы – на 60%.
Пример 6. Протравка семян ячменя и пшеницы перед посевом штаммом бактерий Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868.
4
Семена опрыскивали из пульверизатора культурой бактерий Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868  в концентрации 1х10 КОЕ/мл из расчета 100 мл на 1 кг семян. Обработанные таким образом семена ячменя и пшеницы раскладывали, соблюдая стерильность, на чашки Петри с плотной средой Чапека. На одну чашку выкладывали 10 семян. Всего в эксперимент брали 100 семян ячменя и 100 семян пшеницы. Контроль – необработанные семена. В результате эксперимента наблюдали 100% фунгицидную и бактерицидную активность бактерий Pseudarthrobacter equi S2 ВКПМ В-13868.