СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ АНОМАЛЬНОГО РОСТА КЛЕТОК
METHOD OF TREATING ABNORMAL CELL EXPANSION

Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на патент США № 60/742766, зарегистрированной 5 декабря 2005 г., и предварительной заявке на патент США № 60/864637, зарегистрированной 7 ноября 2006 г., включенных в данное описание в качестве ссылок.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов c-Met/HGFR для лечения аномального роста клеток у млекопитающих. В частности, изобретение относится к способам лечения млекопитающих, страдающих от рака.
Предпосылки создания изобретения
Соединение (R)-3-[1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(1-пиперидин-4-ил-1Н-пиразол-4-ил)пиридин-2-иламин, представленное формулой 1
является сильным низкомолекулярным ингибитором киназы c-Met/HGFR (рецептор фактора роста гепатоцитов) и активности ALK (киназа анапластической лимфомы). Соединение 1 обладает противоопухолевыми свойствами, которые фармакологически опосредуются через ингибирование с-Met/HGFR, вовлеченной в регуляцию роста и развития метастаза широкого ряда типов опухолей, и ALK, вовлеченной в патогенез ALCL (анапластическая крупноклеточная лимфома). Соединение 1 раскрывается в поданной в МПВ заявке № РСТ/IB2005/002837 и заявке на патент США № 11/212331, которые обе включены в данное описание в качестве ссылок. Кроме того, раскрывается рацемат соединения 1 в поданной в МПВ заявке № РСТ/IB05/002695 и заявке на патент США № 11/213039, которые обе включены в данное описание в качестве ссылок.
Онкозаболевания человека включают в себя разнообразные заболевания, в совокупности являющиеся одной из основных причин смерти в развитых странах во всем мире (American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2005. Atlanta: American Cancer Society; 2005). Распространение онкозаболеваний вызвано сложным рядом многих генетических и молекулярных событий, включая генные мутации, хромосомные транслокации и кариотипические аномалии (Hanahan D., Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell, 2000; 100: 57-70). Хотя лежащие в основе рака генетические причины являются и разнообразными, и комплексными, отмечено, что каждый тип онкозаболевания проявляет общие признаки и приобретенные возможности, которые облегчают его развитие. К таким приобретенным возможностям относятся нарушение регуляции роста клеток, длительная способность образования новых кровеносных сосудов (т.е. ангиогенез) и способность опухолевых клеток распространяться локально, а также метастазировать в другие органы (Hanahan D., Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell, 2000; 100: 57-70). Поэтому идентификация новых лечебных средств, которые 1) ингибируют молекулярные мишени, которые изменяются в ходе развития рака, или 2) воздействуют на множество процессов, общих для развития рака при разных опухолевых заболеваниях, является насущной потребностью.
Обширная литература показывает, что с-Met/HGFR является одной из наиболее часто мутируемых или, иначе, аномально активируемых RTK при различных онкозаболеваниях человека (Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human cancer and characterization of inhibitors for therapeutic intervention. Cancer Letters, 2005, 225: 1-26). Типы опухолей, при которых, как известно, киназа с-Met/HGFR изменена генетически в результате мутации или амплификации гена, включают в себя, но ими не ограничиваются, онкологические заболевания с весьма неудовлетворенной потребностью в лечении, такие как рак почек, метастазирующий колоректальный рак, глиальный рак, немелкоклеточный рак легких, онкозаболевания желудка, головы и шеи и другие онкозаболевания (Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human cancer and characterization of inhibitors for therapeutic intervention. Cancer Letters, 2005, 225: 1-26).
Мутации HGFR вовлечены в образование карциномы почек (см., например, L. Schmidt, K. Junker, N. Nakaigawa, T. Kinjierski, G. Weirich, M. Miller et al., Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Oncogene, 1999, 18: 2343-2350; L. Schmidt, F.M. Duh, F, Chen, T. Kishida, G. Glenn, P. Choyke et al., Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat. Genet., 1997, 16: 68-73; L. Schmidt, K. Junker, G. Weirich, G. Glenn, P. Choyke, L. Lubensky et al., Two North American famillies with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations of the MET proto-oncogene, Cancer Res., 1998, 58: 1719-1722). Мутации HGFR связывают с карциномой головы и шеи (см., например, M.F. Di Renzo, M. Olivero, T. Martone, A. Maffe, P. Maggiora, A.D. Stefani et al., Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene, 2000, 19: 1547-1555; D.M. Aebersold, O. Landt, S. Berthou, G. Gruber, K.T. Beer, R.H. Greiner, Y. Zimmer, Prevalence and clinical impact of Met Y1253D-activating point mutation in radiotherapytreated squamous cell cancer of the oropharynx, Oncogene, 2003, 22: 8519-8523). Мутации HGFR связывают с карциномой легких (см., например, P.C. Ma, T. Kijima, G. Maulik, E.A. Fox, M. Satter, J.D. Griffin et al., c-MET mutations analysis in small cell lung cancer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions, Cancer Res., 2003, 63: 6272-6281; P.C. Ma, S. Jagdeesh, R. Jagadeeswaran, E.A. Fox, J.G. Christensen, G. Maulik et al., c-MET expression/activation, functions, and mutations in non-small cell lung cancer, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 2004, 63: 1875).
Кроме того, мутации HGFR вовлечены в другие состояния, включая гепатоцеллюлярные карциномы у детей, рак желудка человека, рак желудка фиброзного типа, колоректальный рак и злокачественные меланомы, и пр. (см., например, W.S. Park, S.M. Dong, S.Y. Kim, E.Y. Na, M.S. Shin, J.H. Pi, Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte drouth factor receptor gene in cheildhood hepatocellular carcinomas, Cancer Res., 1999, 59: 307-310; J.H. Lee, S.U. Han, H. Cho, B. Jennigs, B. Gerrard, M. Dean et al., A novel germ line juxtamembrane Met mutation in human: gastric cancer, Oncogene, 2000, 19: 4947-4953; A. Lorenzato, M. Olivero, S. Patane, E. Rosso, A. Oliaro, P.M. Comoglio, M.F. Di Renzo, Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility and invasion, Cancer Res., 2002, 62: 7025-7030; H. Kuniyasu, W. Yasui, Y. Kitadai, H. Yokozaki, H. Ito, E. Tahara, Frequent amplification of the c-met gene scirhous type stomach cancer, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 189: 227-232; M.F. Di Renzo, M. Olivero, A. Glacomini, H. Porte, E. Chastre, L. Mirossay et al., Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer, Clin. Cancer Res., 1995, 1: 147-154; T. Hara, A. Ooi, M. Kobayashi, M. Mai, K. Yanagihara, Amplification of c-myc, K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization, Lab. Invest., 1998, 76: 1143-1153).
Установлена также взаимосвязь мутаций HGFR с функцией и онкогенным потенциалом (см., например, M. Jeffers, L. Schmidt, N. Nakaigawa, C.P. Webb, G. Weirich, T. Kishida et al., Activating mutations for the met tyrosine Kinase receptor in human cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 11445-11450; M. Jeffers, M. Fiscella, C.P. Webb, M. Anver, S. Koochekpour, G.F. Vande Woude, The mutationally activated Met receptor mediates motility and metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 14417-14422).
Наконец, мутации HGFR вовлечены и исследованы в опухолях мышей (см., например, H. Takayama, W.J. LaRochelle, R. Sharp, T. Otsuka, P. Kriebel, M. Anver et al., Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 701-706; T. Otsuka, H. Takayama, R. Sharp, G. Celli, W.J. LaRochelle, D.P. Bottero et al., c-Met autocrine activation induces development of malignant melanoma and acquisition of the metastatic phenotype, Cancer Res., 1998, 58: 5157-5167; M.I. Gallego, B. Bierie, L. Henighausen, Targeted expression of HGF/SF in mouse epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways, Oncogene, 2003, 22: 8498-8508; C.R. Graveel, Y. Su, L.M. Wang, M. Fiscella, T. Lino, C. Birchmeier et al., Tumorigenic effects of activating Met mutations in a knock-in mouse model, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 2004, 44: 5102).
NMP-ALK - вариант онкогенного слитого белка киназы анапластической лимфомы, который является результатом хромосомной транслокации, вовлекается в патогенез крупноклеточной анапластической лимфомы человека (Pulford K., Morris S.W., Turturro F., Anaplastic lymphoma kinase proteins in grouth control and cancer, J. Cell. Physiol., 2004, 199: 330-58). Роль аберрантной экспрессии конститутивно активных химерных белков ALK в патогенезе ALCL хорошо установлена (Weihua Wan et al., Anaplastic lymphoma kinase activity is essential for the proliferation and survival of anaplastic large cell lymphoma cells, Blood First Edition Paper, интерактивная публикация 27 октября 2005, DOI 10.1182/blood-2005-08-3254).
Несоответствующая активация c-Met/HGFR (включая с-Met дикого типа) также вовлечена в разрегулирование многих опухолевых онкогенных процессов, таких как митогенез, выживаемость, ангиогенез, инвазивный рост и, в особенности, метастатический процесс (Christersen et al., 2005). Кроме того, показано, что экспрессия c-Met и HGF - ее единственного высокоаффинного лиганда коррелирует с плохим прогнозом или развитием метастаза в случае ряда основных онкозаболеваний человека (Christersen et al., 2005). NMP-ALK вовлекается в разрегулирование клеточной пролиферации и апоптоза в клетках лимфомы ALCL (Pulford et al., 2004).
Сущность изобретения
В одном воплощении настоящее изобретение относится к способу лечения аномального роста клеток у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающему введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения формулы 1
или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом воплощении млекопитающим является человек. В еще одном воплощении млекопитающим является собака.
В другом воплощении аномальный рост клеток опосредован киназой рецептора фактора роста гепатоцитов (c-Met/HGFR) или киназой анапластической лимфомы (ALK). В другом воплощении аномальный рост клеток опосредован киназой рецептора фактора роста гепатоцитов (c-Met/HGFR). В другом воплощении аномальный рост клеток опосредован киназой анапластической лимфомы (ALK).
В другом воплощении аномальный рост клеток представляет собой онкозаболевание. В другом воплощении онкозаболевание выбирают из числа рака легких, рака костей, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной меланомы, рака матки, рака яичников, ректального рака, рака анальной области, рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, карциномы фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, карциномы вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкой кишки, онкозаболевания эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, рака предстательной железы, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарных лимфом, рака мочевого пузыря, рака почек или мочеточников, почечно-клеточного рака, карциномы почечных лоханок, неоплазм центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы ЦНС, опухолей позвоночника, глиомы мозгового ствола, аденомы гипофиза и их сочетаний.
В еще одном воплощении онкозаболевание выбирают из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легких (NSCLC), плоскоклеточного рака, гормонорезистентного рака предстательной железы, папиллярного почечно-клеточного рака, колоректальной аденокарциномы, нейробластом, анапластической крупноклеточной лимфомы (ALCL) и рака желудка.
В еще одном воплощении соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят в виде фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы 1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу ингибирования активности киназы c-Met/HGFR в клетке путем введения соединения формулы 1
или его фармацевтически приемлемой соли.
В еще одном воплощении клетку выбирают из группы, состоящей из клеток карциномы легких человека А549, карциномы желудка человека GTL-16, карциномы толстой кишки человека НТ29, карциномы толстой кишки человека Colo205, карциномы почки человека А498, карциномы почки человека 786-О, карциномы молочной железы человека МВА-MD-231, эпителиальных клеток Madlin-Darby почки собаки (MDCK), клеток MDCK, сконструированных для экспрессии Р-гликопротеина (MDCK-MDR1), эпителиальных клеток почки мыши mlMCD3, HUVEC (эпителиальные клетки пупочной вены человека), карциномы почек Caki-1 и клеток NIH-3T3, сконструированных для экспрессии человеческой c-Met/HGFR дикого типа и мутантных c-Met/HGFR, включая HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C и HGFR-М1250Т.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. АТФ-конкурентное ингибирование активности рекомбинантной киназы c-Met/HGFR человека соединением 1.
Фигура 2. Бестимусным мышам с полученными опухолями GTL-16 в течение 11 дней вводили перорально соединение 1 в указанной дозе или один носитель. Фигура 2А: исследование ингибирования фосфорилирования c-Met/HGFR в GTL-16. Фигура 2В: исследование ингибирования роста опухоли GTL-16.
3
Фигура 3. Бестимусным мышам с полученными опухолями U87MG (150 мм) в течение 9 дней вводили перорально соединение 1 в указанной дозе или один носитель. Фигура 3А: исследование ингибирования роста опухоли. Фигура 3В: исследование ингибирования фосфорилирования c-Met/HGFR.
Фигура 4. Бестимусным мышам с установленными трансплантатами опухоли GTL-16 ежедневно перорально вводили соединение 1. Фигура 4А: регрессия больших установленных трансплантатов опухоли GTL-16 у бестимусных мышей. Фигура 4В: масса тела мышей после ежедневного перорального введения соединения 1.
Фигура 5. Ежедневное пероральное введение соединения 1 бестимусным мышам с установленными трансплантатами опухоли NCI-H441 или РС-3. Фигура 5А: регрессия опухоли NCI-H441 у бестимусных мышей. Фигура 5В: регрессия опухоли у бестимусных мышей с установленными трансплантатами опухоли РС-3.
Фигура 6. Противоопухолевая эффективность соединения 1 на модели NPM-ALK-зависимой лимфомы (модель Karpas 299 ALCL). Фигура 6А: исследование ингибирования роста опухоли. Фигура 6В: исследование ингибирования фосфорилирования NPM-ALK.
Подробное описание изобретения
Если не указано иное, все упоминания соединений по изобретению включают их соли, сольваты, гидраты и комплексы и сольваты, гидраты и комплексы их солей, включая их полиморфы, стереоизомеры и варианты, меченные изотопами.
Определения
Используемый в данном описании, если не указано иное, термин “аномальный рост клеток” относится к росту клеток, который не зависит от нормальных регулирующих механизмов (например, утрата контактного ингибирования).
Используемый в данном описании, если не указано иное, термин “лечение” обозначает реверсию, облегчение, ингибирование развития или предупреждение расстройства или состояния, для которого применяется указанный термин, или одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния. Термин “лечение”, используемый в данном описании, если не указано иное, относится к действию лечения как “лечения”, имеющего вышеуказанное определение.
Используемый в данном описании термин “фармацевтически приемлемые соли” включает соли присоединения кислот и оснований (включая дисоли).
Подходящие соли присоединения кислот образуются с кислотами, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают соли ацетаты, аспартаты, бензоаты, безилаты, бикарбонаты/карбонаты, бисульфаты/сульфаты, бораты, камзилаты, цитраты, эдизилаты, формиаты, фумараты, глюцептаты, глюконаты, глюкуронаты, гексафторфосфаты, гибензаты, гидрохлориды/хлориды, гидробромиды/бромиды, гидроиодид/иодид, изэтионаты, лактаты, малаты, малеаты, малонаты, мезилаты, метилсульфат, нафтилаты, 2-напсилаты, никотинаты, нитраты, оротаты, оксалаты, палмитаты, памоаты, фосфаты/гидрофосфаты/дигидрофосфаты, сахараты, стеараты, сукцинаты, тартраты, тозилаты и трифторацетаты.
Подходящие соли оснований образуются с основаниями, которые образуют нетоксичные соли. Примеры включают соли алюминия, аргинина, бензатина, кальция, холина, диэтиламина, диоламина, глицина, лизина, магния, меглумина, оламина, калия, натрия, трометамина и цинка.
Обзор подходящих фармацевтически приемлемых солей см. в работе “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use”, Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002), включенной в данное описание в качестве ссылки.
Фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению можно легко получить, смешивая вместе растворы соединения и нужной кислоты или основания в соответствующем случае. Соль можно высадить из раствора, и ее можно собрать фильтрацией или можно извлечь выпариванием растворителя. Степень ионизации в соли можно изменять от полной ионизации до почти отсутствия ионизации.
2
6
6
Соединения по изобретению могут существовать как в сольватированной, так и в несольватированной форме. Термин “сольват” используется в данном описании для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение по изобретению и одну или несколько молекул фармацевтически приемлемого растворителя, например этанола. Термин “гидрат” используют тогда, когда растворителем является вода. Фармацевтически приемлемые сольваты по изобретению включают гидраты и сольваты, в которых в растворителе кристаллизации может быть заменен изотоп, как, например, в DO, d-ацетоне, d-ДМСО.
2
3
13
14
15
18
17
31
32
35
18
36
3
14
3
14
2
Изобретение также включает соединения, меченные изотопами, которые идентичны соединению 1, за исключением того, что один или несколько атомов заменены атомом с атомной массой или массовым числом, отличающимися от атомной массы или массового числа, обычно встречающихся в природе. Примеры изотопов, которые можно вводить в соединения по изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора и хлора, такие как Н, Н, С, С, N, O, O, P, P, S, F и Cl, соответственно. Соединения по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые соли указанных соединений, которые содержат вышеуказанные изотопы и/или другие изотопы других атомов, входят в объем данного изобретения. Некоторые меченные изотопами соединения по настоящему изобретению, например, соединения, в которые введены радиоактивные изотопы, такие как Н и С, применимы в анализах распределения лекарственных средств и/или субстрата в тканях. Тритиевый, т.е., Н, изотоп и изотоп углерод-14, т.е., С, особенно предпочтительны ввиду легкости их получения и обнаружения. Далее, замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, т.е., Н, может дать некоторое лечебное преимущество, следующее из большей устойчивости при метаболизме, например, повышенный период полувыведения in vivo или уменьшенные требования по дозировке, и, следовательно, может быть предпочтительным при некоторых обстоятельствах. Меченное изотопами соединение 1 по изобретению можно, как правило, получить, осуществляя процедуры, описанные для немеченного соединения, заменяя легкодоступным меченным изотопом реагентом реагент, не меченный изотопом.
В объем изобретения также входят комплексы, такие как клатраты, комплексы включения лекарственное средство-носитель, в которых, в отличие от вышеуказанных сольватов, лекарственное средство и носитель присутствуют в стехиометрических или нестехиометрических количествах. Также входят комплексы лекарственного средства, содержащие два или большее число органических и/или неорганических компонентов, которые могут присутствовать в стехиометрических или нестехиометрических количествах. Полученные комплексы могут быть ионизированы, частично ионизированы или неионизированы. Обзор по таким комплексам см. в работе Haleblian, J. Pharm. Sci., 64 (8), 1269-1288 (August 1975), включенной в данное описание в качестве ссылки.
Пероральное введение
Соединения по изобретению можно вводить перорально. Пероральное введение может включать проглатывание, так что соединение попадает в желудочно-кишечный тракт, или можно использовать трансбуккальное или сублингвальное введение, при которых соединение поступает в кровоток непосредственно через рот.
Препараты, подходящие для перорального введения, включают твердые препараты, такие как таблетки, капсулы, содержащие частички вещества, жидкости или порошки, лепешки (включая наполненные жидкостью), жвачки, поли- и наночастицы, гели, твердые растворы, липосомы, пленки (включая мукоадгезивы), овулы (ovules), спреи и жидкие препараты.
Жидкие препараты включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Такие препараты могут быть использованы как наполнители в мягких или твердых капсулах и типично включают фармацевтически приемлемый носитель, например воду, этанол, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу или подходящее масло, и один или несколько эмульгаторов и/или суспендирующих веществ. Жидкие препараты также можно получить восстановлением твердого вещество, например, из саше.
Соединения по изобретению также можно использовать в быстрорастворяющихся, быстрорассыпающихся лекарственных формах, таких, какие описаны в работе Liang and Chen, Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986 (2001), включенной в данное описание в качестве ссылки.
В случае таблеточных лекарственных форм, в зависимости от дозы, лекарственное средство может составлять от 1 до 80 мас.% лекарственной формы, типичнее, от 5 до 60 мас.% лекарственной формы. Кроме лекарственного средства, таблетки обычно содержат вещество, способствующее рассыпанию. Примеры веществ, способствующих рассыпанию, включают натрийкрахмалгликолят, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, натрийкроскармелозу, кросповидон, поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, алкилгидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, предварительно набухший крахмал и альгинат натрия. Как правило, вещество, способствующее рассыпанию, будет составлять от 1 до 25 мас.%, предпочтительно, от 5 до 20 мас.%, лекарственной формы.
Как правило, используют связующие вещества для придания таблеточному препарату когезивных свойств. Подходящие связующие вещества включают микрокристаллическую целлюлозу, желатин, сахара, полиэтиленгликоль, природные и синтетические смолы, поливинилпирролидон, предварительно набухший крахмал, гидроксипропилцеллюлозу и гидроксипропилметилцеллюлозу. Таблетки также могут содержать разбавители, такие как лактоза (моногидрат, высушенный распылением моногидрат, безводная и т.п.), маннит, ксилит, декстрозу, сахарозу, сорбит, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал и дигидрат двухосновного фосфата кальция.
Таблетки также могут включать, необязательно, поверхностно-активные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и полисорбат 80, и глианды, такие как диоксид кремния и тальк. Когда поверхностно-активные вещества присутствуют, они типично содержатся в таблетке в количествах от 0,2 до 5 мас.%, а глианды типично составляют от 0,2 до 1 мас.% таблетки.
Таблетки также, как правило, содержат смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеарилфумарат натрия и смеси стеарата магния с лаурилсульфатом натрия. Смазывающие вещества обычно присутствуют в количествах от 0,25 до 10 мас.%, предпочтительно, от 0,5 до 3 мас.%, от массы таблетки.
Другие обычные ингредиенты включают антиоксиданты, красители, корригенты, консерванты и вещества, маскирующие вкус.
Характерно таблетки содержат до примерно 80 мас.% лекарственного средства, от примерно 10 до примерно 90 мас.% связующего вещества, от примерно 0 до примерно 85 мас.% разбавителя, от примерно 2 до примерно 10 мас.% вещества, способствующего рассыпанию, и от примерно 0,25 до примерно 10 мас.% смазывающего вещества.
Смеси для таблеток можно прессовать непосредственно или с помощью прикатчика для формирования таблеток. С другой стороны, перед таблетированием смеси для таблеток или их части можно гранулировать в мокром, сухом или расплавленном состоянии, подвергать застыванию расплава или экструдировать. Конечный препарат может включать один или несколько слоев и может иметь или не иметь покрытие или может быть инкапсулированным.
Состав таблеток подробно обсуждается в работе “Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol.1”. H. Lieberman and L. Lachman, Marcel Dekker, N.Y., N.Y., 1980 (IBSN 0-8247-6918-X), включенной в данное описание в качестве ссылки.
Твердые препараты для перорального введения могут быть получены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты для отсроченного, пролонгированного, импульсного, регулируемого, направленного и программированного высвобождения.
Подходящие препараты с модифицированным высвобождением описаны в патенте США № 6106864. Подробности других подходящих технологий для высвобождения лекарственного средства, таких как высокоэнергетические дисперсии и осмотические частицы или частицы с покрытием, можно найти в Verma et al., Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14 (2001). Применение жевательной резинки для достижения регулируемого высвобождения описано в WO 00/35298. Указанные работы включены в данное описание в качестве ссылок.
Парентеральное введение
Соединения по изобретению также можно вводить непосредственно в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, интраперитонеальное, интратекальное, внутрижелудочковое, интрауретральное, внутристволовое, интракраниальное, внутримышечное и подкожное введение. Подходящие устройства для парентерального введения включают иглы (в том числе, микроиглы), шприцы, безигольные шприцы и средства для осуществления инфузии.
Парентеральные препараты типично представляют собой водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы и буферирующие вещества (предпочтительно, для рН от 3 до 9), но для некоторых применений они могут быть получены в виде стерильных неводных растворов или в сухой форме для использования в сочетании с подходящей средой, такой как стерильная апирогенная вода.
Получение парентеральных препаратов в стерильном состоянии, например, лиофилизацией, можно легко осуществить с использованием стандартных фармацевтических методов, хорошо известных специалистам в данной области техники.
Растворимость соединений по изобретению, используемых при получении парентеральных растворов, можно увеличить, используя подходящие методы получения композиций, такие как включение веществ, усиливающих растворимость.
Препараты для парентерального введения могут быть получены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты для отсроченного, пролонгированного, импульсного, регулируемого, направленного и программированного высвобождения. Так, соединения по изобретению можно ввести в композицию в виде твердого вещества, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантированного депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного соединения. Примеры таких препаратов включают стенты с покрытием из лекарственного средства и микросферы из PGLA.
Местное введение
Соединения по изобретению также можно вводить местно в кожу или слизистую оболочку, т.е., дермально или трансдермально. Типичные препараты для такой цели включают гели, гидрогели, лосьоны, растворы, кремы, мази, присыпки, перевязочные материалы, пенки, пленки, кожные пэтчи, пластины, имплантаты, тампоны, волокна, бандажи и микроэмульсии. Можно использовать липосомы. Типичные носители включают спирт, воду, минеральное масло, вазелиновое масло, глицерин, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль. Можно включать усилители пенетрации, см., например, Finnin and Morgan, J. Pharm. Soc., 88 (10), 955-958 (October 1999). Другие способы местного введения включают доставку электропорацией, ионофорезом, фонофорезом, сонофорезом и инъекцию микроиглой или безигольным способом (например, Powderject™, Bioject™, и т.д.). Указанные работы включены в данное описание в качестве ссылок.
Препараты для местного введения могут быть получены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты для отсроченного, пролонгированного, импульсного, регулируемого, направленного и программированного высвобождения.
Введение ингаляцией/интраназальным способом
Соединения по изобретению также можно вводить интраназально или ингаляцией, типично, в форме сухого порошка (или одного или в виде смеси, например сухой смеси с лактозой, или в виде смешанных частиц компонентов, например, смешанных с фосфолипидами, такими как фосфатидилхолин), из порошкового ингалятора, или в виде аэрозольного спрея из емкости под давлением, насоса, распылителя, пульверизатора (предпочтительно, пульверизатора с использованием электрогидродинамического устройства для получения тонкого аэрозоля) или небулайзера без пропеллента или с применением подходящего пропеллента, такого как 1,1,1,2-тетрафторэтан или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан. Для интраназального применения порошок может включать биоадгезивное средство, например хитозан или циклодекстрин.
Емкость под давлением, насос, распылитель, пульверизатор или небулайзер содержит раствор или суспензию соединения(й) по изобретению с включением, например, этанола, водного этанола или подходящего другого вещества для диспергирования, солюбилизации или длительного высвобождения активного средства, пропеллент(ы) в качестве растворителя и, необязательно, поверхностно-активное вещество, такое как триолеат сорбитана, олеиновая кислота или олигомолочная кислота.
Перед применением в сухом порошке или суспензии лекарственное средство измельчают до частиц размера, подходящего для доставки ингаляцией (типично менее 5 микрон). Этого можно достичь любым подходящим способом тонкого измельчения, таким как размол на спиральной струйной мельнице, струйной мельнице в псевдоожиженным слоем, обработка supercritical fluid с образованием наночастиц, гомогенизация под высоким давлением или распылительная сушка.
Капсулы (изготовленные, например, из желатина или НРМС), блистеры и картриджи для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут содержать порошковую смесь соединения по изобретению, подходящей основы, такой как лактоза или крахмал, и модификатора свойств, такого как 1-лейцин, маннит или стеарат магния. Лактоза может быть безводной или в форме моногидрата, предпочтительно последнее. Другие подходящие эксципиенты включают декстран, глюкозу, мальтозу, сорбит, ксилит, фруктозу, сахарозу и трегалозу.
Подходящий раствор для применения в пульверизаторе с использованием электродинамического устройства для получения тонкого аэрозоля, может содержать от 1 до 20 мкг соединения по изобретению на одно действие, и объем для действия может изменяться от 1 до 100 мкл. Типичный препарат включает соединение по изобретению, пропиленгликоль, стерильную воду, этанол и хлорид натрия. Другие растворители, которые можно использовать вместо пропиленгликоля, включают глицерин и полиэтиленгликоль.
В такие композиции по изобретению, предназначенные для введения ингаляцией/интраназальным способом, можно добавлять подходящие корригенты, такие как ментол и левоментол, или подслащивающие вещества, такие как сахарин или натрийсахарин.
Препараты для введения ингаляцией/интраназальным способом могут быть получены для немедленного и/или модифицированного высвобождения с использованием, например, сополимера DL-молочной и гликолевой кислоты (PGLA). Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты для отсроченного, пролонгированного, импульсного, регулируемого, направленного и программированного высвобождения.
В случае ингаляторов для сухих порошков и аэрозолей единица лекарственной формы определяется клапаном, который доставляет отмеренное количество. Единицы, согласно изобретению, типично устанавливают для введения отмеренной дозы или “пуффа”, содержащих нужное количество соединения по изобретению. Общую ежесуточную дозу можно вводить в виде одной дозы или, что более обычно, в виде разделенных доз на протяжении суток.
Ректальное/Интравагинальное введение
Соединения по изобретению можно вводить ректально или вагинально, например, в форме суппозитория, пессария или клизмы. Масло какао является традиционной основой суппозиториев, но в соответствующих случаях можно использовать различные другие средства.
Препараты для ректального/вагинального введения могут быть получены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты для отсроченного, пролонгированного, импульсного, регулируемого, направленного и программированного высвобождения.
Окулярное введение
Соединения по изобретению также можно вводить непосредственно в глаз или ухо, типично, в форме капель тонкой суспензии или раствора в изотоничном с отрегулированным рН стерильном физиологическом растворе. Другие препараты, подходящие для введения в глаза и введения в уши, включают мази, биоразлагаемые имплантаты (например, рассасывающиеся тампоны, коллаген) и неразлагаемые биологически имплантаты (например, силиконовые), пластины, линзы и системы из частиц или везикул, таких как ниосомы или липосомы. Можно включать полимер, такой как сшитая полиакриловая кислота, поливиниловый спирт, гиалуроновая кислота, целлюлоза, например гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза или метилцеллюлоза, или гетеросахарид, например gelan камедь, вместе с консервантом, таким как хлорид бензалкония. Такие препараты также можно доставлять ионофорезом.
Препараты для введения в глаза/уши могут быть получены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты для отсроченного, пролонгированного, импульсного, регулируемого, направленного и программированного высвобождения.
Другие технологии
Соединения по изобретению можно комбинировать с растворимыми макромолекулярными материалами, такими как циклодекстрин и их подходящие производные, или полимерами, содержащими этиленгликолевые звенья, для того, чтобы улучшить их растворимость, скорость растворения, улучшить вкус, биодоступность и/или устойчивость для применения в любом из вышеперечисленных способов введения.
Например, обнаружено, что комплексы лекарственных средств с циклодекстрином, как правило, применимы для большинства лекарственных форм и способов введения. Можно использовать как комплексы включения, так и невключения. Как альтернативу непосредственному образованию комплекса с лекарственным средством циклодекстрин можно использовать как вспомогательную добавку, т.е. как носитель, разбавитель или солюбилизатор. Наиболее часто для таких целей используют альфа-, бета- и гамма-циклодекстрины, примеры которых можно найти в публикациях РСТ №№ WO 91/11172, WO 94/02518 и WO 98/55148, включенных в данное описание в качестве ссылок.
Дозировка
Количество вводимого активного соединения будет зависеть от субъекта, которого лечат, тяжести расстройства или состояния, скорости введения, распределения соединения и предписания лечащего врача. Однако эффективная дозировка типично находится в интервале от примерно 0,001 до примерно 100 мг на кг массы тела в сутки, предпочтительно, от примерно 0,01 до примерно 35 мг/кг/сутки, в одной или разделенных дозах. Для 70-кг человека такое количество может составлять от примерно 0,07 до примерно 7000 мг/сутки, предпочтительно, от примерно 0,7 до примерно 2500 мг/сутки. В некоторых случаях более чем адекватными могут быть уровни дозировки меньше нижнего предела вышеуказанного интервала, в то время как в других случаях можно использовать еще большие дозы без появления какого-либо вредного побочного действия, и такие более крупные дозы типично делят на несколько более мелких доз для введения на протяжении суток.
Наборы из частей
Так как может быть желательно введение сочетания активных соединений, например, в целях лечения определенного заболевания или состояния, в объеме настоящего изобретения две или большее число фармацевтических композиций, из которых, по меньшей мере, одна содержит соединение по изобретению, можно удобно объединить в форме набора, подходящего для совместного введения композиций. Такой набор по изобретению включает две или большее число отдельных фармацевтических композиций, из которых, по меньшей мере, одна содержит соединение по изобретению, и средства для отдельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, пузырек с делениями или пакет из фольги с делениями. Примером такого набора является блистерная упаковка, используемая для упаковки таблеток, капсул и т.п.
Набор по изобретению особенно подходит для введения различных лекарственных форм, например пероральной и парентеральной, для введения отдельных композиций с различными интервалами между дозировками или для титрования отдельных композиций против друг друга. Для удобства набор типично включает указания по введению и может снабжаться памяткой.
Примеры
Анализы in vitro
Материалы и методы
Методы in vitro
Методы биохимического анализа киназ
i
Биохимические показатели K соединения 1 для ингибирования киназы c-Met/HGFR определяют с использованием общей процедуры контроля за окислением NADH, который соединяется с превращением в АТФ, следующим образом. Реагенты для анализа соединения и киназу вводят в лунки для испытаний и инкубируют в течение 10 минут при 37°С. Анализ инициируют, добавляя фермент c-Met/HGFR. Ингибиторы фермента уменьшают измеряемую активность фермента. В непрерывном анализе в сочетании со спектрофотометрией определяют зависящее от времени продуцирование АДФ киназой, анализируя скорость расходования NADH путем измерения снижения поглощения при 340 нм. Когда фермент киназа продуцирует АДФ, он снова превращается в АТФ взаимодействием с фосфоенолпируватом и пируваткиназой. В данной реакции также образуется пируват. Затем пируват превращается в лактат за счет взаимодействия с лактатдегидрогеназой, которая одновременно превращает NADH в NAD. NADH имеет поддающееся измерению поглощение при 340 нм в установленные моменты времени.
Методы биохимического анализа киназ по передачи сигнала клетками (Upstate)
32
Киназы предварительно разводят до 10х рабочей концентрации перед добавлением в смесь для анализа. Коротко, субстраты растворяют и разбавляют до рабочих исходных растворов деионизованной водой отдельно от гистона Н1 (10× рабочий раствор в 20 мМ MOPS, рН 7,4), PDKtide (10× рабочий раствор в 50 мМ трис, рН 7,0) и ATF2 (который типично хранят при 20× рабочего раствора в 50 мМ трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EGTA, 0,03% Brij-35, 50% глицерина, 1 мМ бензамидина, 0,2 мМ PMSF и 0,1% π-меркаптоэтанола). Затем представляющий интерес биохимический фермент анализируют в конечном объеме реакционной смеси 25 мкл, содержащей 5-10 мЕ выбранного фермента, инкубированного с 8 мМ MOPS, рН 7,0, 0,2 мМ ЭДТК, 50 мкМ EAIYAAPFAKKK, 10 мМ ацетата Mg и Р-АТФ (удельная активность приблизит. 500 cpm/пмоль, концентрация требуемая). Реакцию инициируют, добавляя смесь Mg-АТФ. После инкубации в течение 40 минут при комнатной температуре реакцию останавливают, добавляя 5 мкл 3% раствора фосфорной кислоты. Затем 10 мкл реакционной смеси наносят пятнами на filtermat Р30 и перед сушкой и подсчетом в сцинтилляционном счетчике промывают три раза в течение 5 минут в 75 мМ фосфорной кислоте и один раз в метаноле.
Клеточные линии
2
Клеточные линии, используемые для оценки соединения 1 в исследованиях in vitro, следующие: А549 карциномы легких человека, GTL-16 карциномы желудка человека, НТ29 карциномы толстой кишки человека, Colo205 карциномы толстой кишки человека, А498 карциномы почки человека, 786-О карциномы почки человека, МВА-MD-231 карциномы молочной железы человека, эпителиальные клетки Madlin-Darby почки собаки (MDCK), клетки MDCK, сконструированные для экспрессии Р-гликопротеина (MDCK-MDR1), эпителиальные клетки почки мыши mlMCD3, HUVEC (эпителиальные клетки пупочной вены человека), клетки NIH-3T3, сконструированные для экспрессии человеческой c-Met/HGFR дикого типа и мутантных c-Met/HGFR, включая HGFR-V10921, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C и HGFR-М1250Т. Клеточные линии, используемые для оценки ингибирования фосфорилирования других тирозинкиназ, следующие: KARPAS 299, SU-DHL-1 и клетки лимфомы Юрката человека, эпителиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), макроваскулярные эндотелиальные клетки человека (HMEVEC), клетки эндотелия аорты свиньи (РАЕ), сконструированные для экспрессии человеческих VEGFR2, PDGFRβ, TrkA и TrkB; клетки NIH-3T3, сконструированные для экспрессии человеческих Ron, Axl, Sky и химерных EGFR/Tie2; клетки НЕК293, сконструированные для экспрессии человеческой IRK, клетки яичника китайского хомячка (СНО-В), сконструированные для экспрессии человеческой Ron, клетки BaF3, сконструированные для экспрессии человеческой BCR-Abl. Все сконструированные клеточные линии получают в Pfizer, клетки GTL-16 карциномы желудка человека предоставлены д-ром Paolo Comoglio (University Torino Madical School, Candiolo, Italy), HUVEC и HMEVEC (макроваскулярные эндотелиальные клетки человека) закупают в Clonetics, Inc. (Walkersville, MD) и другие линии у АТСС (Manassas, VA). Если не указано иное, реагенты для клеточных культур получают от Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD). Клетки выдерживают при 37°С во влажной атмосфере с 5-10% СО и выдерживают с использованием стандартных методов культивирования клеток.
Антитела и факторы роста
Антитела используют для оценки соединения 1 в исследованиях in vitro ELISA и иммуноблоттингом, и это следующие антитела: против всех c-Met/HGFR человека и антифосфо-Zap70 от Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA; против всех Ron, против всех FGFR1, против всех PDGFRβ, против всех TrkA, против всех Tie-2 и антифосфотирозина (PY-20) от Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; против всех Axl и против всех мышиных c-Met/HGFR от R&D Systems, Minneapolis, MN; против всех IRK от BD Pharmingen, San Diego, CA; анти-VEGFR-2 от Novus Biologicals, Littleton, CO; анти-фосфо-c-Met/HGFR, против всех и фосфо-ALK, против всех c-ABL, против всех и фосфо-АКТ, против всех и фосфор-МАРК44/42, анти-фосфо-Raf, Mek1/2, P90RSK и STAT5 от Cell Signaling Technologies, Boston, MA.
Большинство факторов роста, используемых в анализах клеток, были от R&D Systems, Minneapolis, MN, за исключением BDGF от GibcoBRL/Invitrogen, Carlsbad, CA, и EGF от Roche Applied Science, Indianapolis, IN.
Анализы фосфорилирования киназ в клетках
Клеточные анализы (т.е., ELISA или иммуноблоттинг), используемые для прямого определения способности соединения 1 ингибировать лигандзависимое или конститутивное фосфорилирование киназ, осуществляют с использованием различных клеток, находящихся в бессывороточной среде.
Получение клеток
2
2
3
4
Клетки высевают в 96-луночные планшеты в питательных средах (среды с добавлением 10% сыворотки плода коровы - FBS) и культивируют в течение ночи при 37°С для облегчения прикрепления к аналитическим планшетам. После прикрепления питательные среды удаляют, и клетки культивируют в бессывороточных средах (с 0,04% BSA). Осуществляют серийные разведения соединения 1, в каждую лунку добавляют соответствующие контроль или определенные концентрации соединения 1, и клетки инкубируют при 37°С в течение 1 часа. В экспериментах по исследованию лигандзависимого фосфорилирования RTK к клеткам добавляют соответствующие факторы роста (например, HGF, MSP, Gas6, EGF, NGF, BDNF, инсулин, VEGF или PDGF BB) в течение 8-20 минут. Используют НО для стимуляции фосфорилирования человеческой Axl в клетках HUVEC, как уже описано (Konishi A., Aizawa T., Mohan A., Koshunov V.A. and Berk B.C., Hydrogen peroxide activates the Gas6-Axl pathway in vascular smooth muscle cells. The Journal of Biological Chemistry, 279: 28766-28770 (2004)). Конститутивное фосфорилирование киназ измеряют в отсутствие добавления экзогенного лиганда для клеточных линий с конститутивно активной киназной активностью (например, с-Met/HGFR в клетках GTL-16, NPM-ALK в клетках Karpas 299, Ron в клетках Ron-CHO-B и BCR-Abl в клетках BCR-Abl BaF3). После инкубации клеток с соединением 1 и/или соответствующими лигандами в течение установленного времени клетки промывают один раз 1 мМ раствором NaVO в HBSS и затем лизируют с использованием буфера для лизиса (Cell Signaling Technolodies, Boston, MA).
Анализ ELISA
2
4
50
Фосфорилирование представляющих интерес протеинкиназ оценивают методом сэндвич-ELISA с использованием захвата антител, специфичных для каждого белка, и детекции антител, специфичных для фосфорилированных тирозиновых остатков. В каждом анализе ELISA белковые лизаты, полученные из различных клеточных линий, обработанных соответствующими лигандами RTK и/или соединением 1, переносят в 96-луночный планшет, предварительно сенсибилизированный соответствующими антителами, включая антитела против с-Met/HGFR, Ron, Axl, Sky, IR, Tie2, KDR, PDGFRβ, Zap70 и т.д. Сенсибилизированные антителами планшеты инкубируют в присутствии белковых лизатов при 4°С в течение ночи и промывают 1% раствором твина 20 в PBS семь раз. HPR-PY20 (антитела против фосфотирозина, конъюгированные с пероксидазой из хрена, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) разбавляют 1:500 в буфере для блокировки (Pierce, Rockford, IL) и добавляют в каждую лунку в течение 30 минут. Затем планшеты снова промывают, и добавляют субстрат пероксидазы ТМВ (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA) для инициации HPR-зависимой колориметрической реакции. Реакцию останавливают, добавляя 0,09 N HSO. Планшеты считывают при 450 нм с использованием спектрофотометра. Величины IC вычисляют, проводя кривую зависимости реакции от концентрации по точкам с использованием четырехпараметрического метода анализа в форме на основе Excel.
Иммуноблоттинг
Способность соединения 1 ингибировать фосфорилирование клеточных киназ также оценивают методом иммуноблоттинга. Клетки обрабатывают разведениями соединения 1 в бессывороточных средах и лизируют для экстракции белков, как описано выше. Клеточные лизаты нормализуют в отношении концентрации белков анализом с BSA (Pierce, Rockford, IL) и используют специфические антитела для иммунопреципитации белков, представляющих интерес. Иммунопреципитированные белки разделяют SDS-PAGE и осуществляют иммуноблоттинг с антифосфотирозиновыми антителами для определения относительных уровней фосфорилированных белков при каждой концентрации лекарственного средства. Такой метод иммуноблоттинга также используют для определения общих уровней белков в случае молекул, представляющих интерес.
Анализы пролиферации и выживания клеток
Анализ клеточной пролиферации
50
Опухолевые клетки высевают в 96-луночные планшеты при низкой плотности в питательных средах (среды с добавлением 10% сыворотки плода коровы - FBS) и культивируют в течение ночи при 37°С. На следующий день питательные среды удаляют и клетки культивируют в бессывороточных средах (0% FBS и 0,04% BSA). Осуществляют серийные разведения соединения 1, соответствующие контроли или определенные концентрации соединения 1 добавляют в каждую лунку, и клетки инкубируют при 37°С в течение 24-72 часов. Затем осуществляют анализ с МТТ (Promega, Madison, WI) для определения относительного числа клеток. Величины IC вычисляют, проводя кривую зависимости реакции от концентрации по точкам с использованием четырехпараметрического метода анализа.
Анализ апоптоза/выживания клеток
2
Клетки GTL-16 высевают в 96-луночные планшеты при плотности 40000 клеток/лунку. В лунки в бессывороточных средах добавляют определенные концентрации PF-02341066 или носитель. Клетки инкубируют при 37°С, 5% СО, в течение 48 часов. Для детекции апоптоза используют набор для ELISA апоптоза с ссДНК (ssDNA Apoptosis ELISA kit, Chemicon International).
Анализ выживания HUVEC, стимулированных HGF
2
50
Клетки HUVEC (пассаж 3) выращивают до слияния в средах EGM2 (Walersville, MD). Клетки высевают в 96-луночные планшеты при высокой плотности (20000-30000/лунку) и инкубируют в течение 5-6 часов для прикрепления клеток. После прикрепления клетки культивируют в бессывороточных средах (Cell Applications, San Diego, CA) в течение ночи при 37°С, 5% СО. На следующий день на клетки воздействуют Starvation Media (Cell Applications, San Diego, CA) в течение 5 часов. Соединение 1 разводят серийно в бессывороточных средах, и соответствующие контроли или установленные концентрации соединения 1 добавляют в каждую лунку. Через 1 час в определенные лунки добавляют человеческий рекомбинантный HGF (R&D Systems, Minneapolis, MN) до достижения конечной концентрации 100 нг/мл. Затем через 48-72 часа осуществляют анализ с МТТ (Promega, Madison, WI) для определения относительного числа клеток. Величины IC вычисляют, проводя кривую зависимости реакции от концентрации по точкам с использованием четырехпараметрического метода анализа.
Анализы HGF-зависимой миграции и инвазии клеток
Анализы миграции клеток NCI-H441 и инвазии в матригель
50
Влияние соединения 1 на стимулируемую HGF миграцию и инвазии клеток NCI-H441 немелкоклеточной карциномы легких человека определяют с использованием коммерчески доступной системы для миграции и инвазии клеток (BD Biosciences, San Diego, CA). Клетки в логарифмической фазе роста трипсинизируют и суспендируют в бессывороточных средах (с 0,04% BSA) при плотности 400000 клетк/лунку. Соединение 1 разводят серийно в бессывороточных средах, добавляют установленные концентрации к суспендированным клеткам, и клетки инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Установленные контрольные или обработанные суспендированные клетки (0,5 мл) добавляют в каждую камеру для миграции или инвазии (т.е., во вставки в планшетах). Кроме того, в нижнюю лунку каждого нижнего планшета из пары планшетов добавляют 25 нг/мл HGF (0,75 мл) как хемоатрактант для привлечения клеток из камер для миграции или инвазии в планшетных вставках в верхнем планшете из пары планшетов, и клетки инкубируют при 37°С в течение 22 часов. Затем клетки, которые проникают или мигрируют в нижнюю лунку планшета, фиксируют, и окрашивают ядра (1 мкг/мл DAP1 в 100% МеОН) в течение 15 минут при 37°С. Затем клетки дважды промывают с использованием раствора TBS. Для каждой лунки получают под микроскопом пять изображений и определяют число клеток в случае миграции или инвазии в каждом состоянии с использованием программного обеспечения Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Величины IC вычисляют, проводя кривую зависимости реакции от концентрации по точкам с использованием четырехпараметрического метода анализа.
Анализ инвазии HUVEC в матригель
2
50
Используют систему ACEA RT-CES System (ACEA biologicals, San Diego, CA) для определения in vitro влияния соединения 1 на инвазию HUVEC в матригель. Чувствительные к электрическим сигналам 96-луночные планшеты ACEA сенсибилизируют 50 мкл 0,001% раствора фибриногена и 100 нг/мл HGF в PBS и инкубируют при 37°С в течение 1 часа и при 4°С в течение 30 минут. После промывки каждого планшета PBS при 4°С матригель (BD Biosciences, San Jose, CA) разбавляют 1:40 в Starvation Media (SM, Cell Applications, San Diego, CA) с добавлением HGF (100 нг/мл), и/или различных концентраций соединения 1, добавляют (50 мкл) в определенные лунки и оставляют отверждаться при 37°С на 2 часа. Клетки HUVEC культивируют в бессывороточных средах (Cell Applications, San Diego, CA) в течение 5 часов и затем в SM в течение 2 часов. Затем клетки собирают в SM при 60000 клеток/лунку и обрабатывают 100 нг/мл HGF и/или, соответственно, соединением 1 в течение 30 минут при 37°С. Суспензию клеток HUVEC (100 мкл) в определенных условиях переносят в верхнюю часть слоя матригеля в определенных лунках сенсибилизированного планшета ACEA. Затем планшет ACEA соединяют с устройством ACEA Device Station при 37°С, 95% воздуха, 5% СО, и контролируют в реальном времени анализатором ACEA Sensor Analyzer в течение 48 часов. Электронные датчики, установленные на дне планшетов АСЕА, обнаруживают клетки HUVEC, которые проникли сквозь матригель. Относительное число (клеточный индекс) проникших клеток HUVEC определяют с использованием интегрированного программного обеспечения АСЕА RT-CES™. Величины IC вычисляют, проводя кривую зависимости реакции от концентрации по точкам с использованием четырехпараметрического метода анализа.
Анализ рассеяния клеток MDCK
Клетки MDCK высевают при низкой плотности (25 клеток/лунку) в 96-луночный планшет в средах с добавлением 10% FBS и выращивают до тех пор, пока не появятся небольшие колонии из 10-15 клеток. Затем клетки стимулируют HGF (50 нг/мл) в присутствии различных концентраций соединения 1, разведенного в питательной среде. После инкубации в течение ночи колонии фиксируют и окрашивают 0,2% кристаллического фиолетового в 10% забуференном формалине, и оценивают визуально рассеяние при каждой концентрации.
Анализ васкулярного роста HUVEC
2
Пятьсот клеток HUVEC добавляют к среде EGM-2, содержащей 0,24% метилцеллюлозы, и переносят в 96-луночные планшеты с лунками с U-образным дном, и получают сфероиды в течение ночи. Сфероиды собирают и смешивают с 2 мг/мл раствором фибриногена, содержащим 4-8% FBS ± соединение, в 48-луночных планшетах, сенсибилизированных тромбином (2 мл раствора 5000 Е/мл). Полученный 3-D гель фибрина закрывают EGM-2, содержащей 4-8% FBS, и инкубируют при 37°С, 95% воздуха/5% СО. Ежедневно наблюдают образование эндотелиальных трубочек в инвертированном микроскопе. Изображения фиксируют на 7 день цифровой камерой (Olympus BX60), соединенной с микроскопом. Соединение 1 добавляют в нескольких концентрациях и визуально оценивают рост сосудов.
Анализ клеточного цикла и апоптоза проточной цитометрией
0
0
1
Влияние соединения 1 на NPM-ALK-зависимое распределение клеточного цикла и апоптоз клеток лимфомы человека оценивают анализом методом проточной цитометрии (FASCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Клетки лимфомы человека Karpas 299 и SU-DHL-1 обрабатывают соединением 1 в течение 24 и 48 часов в питательных средах (RPMI + 10% FBS). Клетки дважды промывают PBS, фиксируют и обрабатывают раствором BDCytofix/Cytoperm в течение 20 минут при 4°С. Распределение клеточного цикла и апоптоз клеток лимфомы оценивают с использованием набора CycloTest Plus DNA Reagent Kit (BD Biosciences). С использованием указанного набора клетки промывают два раза буфером 1× BD Perm/Wash, неионогенным поверхностно-активным веществом, и к изолированным ядрам добавляют трипсин, добавляют иодид пропидия для визуализации содержания ДНК, и клетки анализируют проточной цитометрией. Содержание ДНК (анализ плоидности для определения числа клеток, в процентах, в каждом клеточном цикле) оценивают с использованием программного обеспечения Cell Quest Pro и анализируют ModFit LT (BD Biosciences). Пик апоптоза (А) определяют как пик, который имеет место при числе каналов, меньшем, чем пик G/G, как описано (Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del-Bino G., Gorczyca W., Hotz M.S., Lassota P. and Traganos F., Cytometry, 13: 795-808 (1992)). Апоптоз также определяют цитометрическим анализом с использованием окрашивания Annexin V-FITC (BD Biosciences, San Jose, CA) и также анализируют с использованием FASCalibur.
Методы in vivo
Клеточные линии
2
Если не указано иное, реагенты клеточные культуры получают от Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD). Клетки поддерживают при 37°С во влажной атмосфере с 5-10% СО и пересевают с использованием стандартных методов культивирования клеток. Клетки U87MG (глиобластома человека), NCI-H441 (немелкоклеточная аденокарцинома легких человека) и РС-3 (аденокарцинома предстательной железы человека) получают из Американской коллекции типовых культур (Bethesda, MD) и культивируют в соответствии с их рекомендациями.
Модели с подкожными ксенотрансплантами у бестимусных мышей
6
2
Самок или самцов мышей nu/nu или SCID/Beige (в возрасте 5-8 недель) получают от Harlan (Madison, WI) или Charles River (Wilmington, MA). Животных выдерживают в условиях светлой комнаты в стерильных клетках с фильтрами наверху с подстилками Alpha-Dri/bed-o-cob, установленных на вентилируемых с фильтрами НЕРА полках. Животные получают стерильный корм для грызунов и воду ad libitum. Клетки для имплантации бестимусным мышам собирают и осаждают центрифугированием при 450×g в течение 5-10 минут. Клеточные осадки промывают один раз и ресуспендируют в стерильном забуференном фосфатом физиологическом растворе или бессывороточной среде. Опухолевые клетки снабжают 30-50% матригеля (BD Biosciences, San Jose, CA) для облегчения восприятия опухоли и роста опухолевых клеток, выбранных в качестве ксенотрансплантатов. В каждом эксперименте клетки (2-5 × 10 в 100 мкл) имплантируют мыши SC в заднюю боковую область и оставляют расти до установленного размера перед введением соединения. Размер опухоли определяют измерением электронным микрометром, и объем опухоли вычисляют как результат действия (длина опухоли) × (ширина) × 0,4.
Исследования направленной модуляции ex vivo (PK/PD)
Обработка опухоли и плазмы для фармакокинетических исследований in vivo
3
Опухолевые клетки, экспрессирующие конститутивно фосфорилированную c-Met/HGFR или ALK, имплантируют подкожно “голым” мышам и оставляют расти необработанными до размера 300-800 мм. Мышам вводят соединение 1 в виде однократной пероральной дозы (для исследований острого PK/PD) или нескольких пероральных доз (для исследований установившегося PK/PD) при определенных уровнях доз. В указанное время после введения соединения 1 отдельных мышей гуманно умерщвляют, извлекают образцы крови из левого желудочка сердца с использованием шприца, примированного сульфатом гепарина, и опухоли иссекают. Образцы плазмы анализируют на концентрацию соединения 1 с использованием анализа методом ЖХМС. Иссеченные опухоли сразу же замораживают на сухом льду, измельчают с использованием охлажденных в жидком азоте ступки и пестика и лизируют в холодном буфере для лизиса 1Х Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technologies, Boston, MT). Белки экстрагируют из опухолевого лизата, и определяют концентрацию белков с использованием анализа с BSA (Pierce, Rockford, IL). Содержание всех или/и фосфорилированных белков, представляющих интерес, в каждом образце опухоли определяют с использованием метода ELISA с захватом, описанного ниже.
Анализы ELISA для оценки фармакодинамического ингибирования киназ-мишеней
2
4
В каждом анализе ELISA белковые лизаты, полученные из опухолей, обработанных носителем или соединением 1, переносят в 96-луночный планшет, который предварительно сенсибилизируют иммобилизованными антителами или против c-Met/HGFR (Zymed Lab/Invitrogen, Carlsbad, CA) или против ALK (Cell Signaling Technologies, Boston, MT). Сенсибилизированные антителами планшеты инкубируют в присутствии лизатов опухолей при 4°С в течение ночи и промывают 1% раствором твина 20 в PBS семь раз. HPR-PY20 (антитела против фосфотирозина, конъюгированные с пероксидазой из хрена, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) разбавляют 1:500 в буфере для блокировки (Pierce, Rockford, IL) и добавляют в каждую лунку в течение 30 минут. Затем планшеты снова промывают, и добавляют субстрат пероксидазы ТМВ (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA) для инициации HPR-зависимой колориметрической реакции. Реакцию останавливают, добавляя 0,09 N HSO. Оптическую плотность (OD) в лунке с каждой средой или обработкой измеряют при 450 нм с использованием спектрофотометра. Общее фосфорилирование c-Met/HGFR или ALK в опухолях, иссеченных из животных, обработанных соединением 1, сравнивают с фосфорилированием в опухолях, иссеченных из животных, обработанных средой в один и тот же момент времени, основываясь на данных по OD. При такой оценке ингибирование фосфорилирования киназы-мишени в опухолях соединением 1 вычисляют с использованием следующего уравнения:
% ингибирования = 100 - [(средняя OD обработанных/средняя OD необработанных) × 100].
Иммуноблоттинг
Метод иммунноблоттинга также используют для определения относительного состояния фосфорилирования киназ и общих уровней белков в образцах опухолей в отношении белков, представляющих интерес. Мышей с опухолями обрабатывают определенными дозами соединения 1, и получают опухолевые лизаты и образцы белков так, как описано выше. Используют специфические антитела для иммунопреципитации белков, представляющих интерес. Иммунопреципитированные белки разделяют SDS-PAGE и проводят иммуноблоттинг с антителами против фосфотирозина или общими антелами.
Антитела, используемые в исследованиях иммуноблоттингом, следующие: против всех человеческих c-Mit/HGFR от Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA; анти-фосфо-c-Mit/HGFR, против всех и фосфо-ALK, против всех и фосфор-Gab1, против всех и фосфо-AKT, против всех и фосфор-МАРК44/42, STAT5 - от Cell Signaling Technologies, Boston, MA.
Имплантация осмотического мининасоса для исследований инфузии in vivo
Осмотические мининасосы Alzet 10030 и 1007D закупают у Durect Corporation (Cupertino, CA). Мининасосы загружают растворами соединения 1 определенной концентрации и примируют в стерильном физиологическом растворе при 37°С до тех пор, пока они не достигнут равновесия - 4-5 часов. Насосы хирургически имплантируют подкожно по инструкциям изготовителя в левую дорсальную торакальную область мышей с опухолями в области правого бока. Разрез закрывают с использованием хирургических скоб, которые удаляют через 5-7 дней, когда кожный разрез полностью заживет. Операцию по замене насоса проводят в установленное время в ходе исследований, когда требуется время инфузии и объем лекарственного средства, которые превосходят возможности насоса.
Гистология и иммуногистохимия (IHC) опухолей
Образцы опухолей, которые оценивают по иммуногистохимическим показателям, собирают и фиксируют в 10% забуференном формалине с ингибиторами протеаз и фосфотаз в течение 24 часов перед тем, как перенести в 70% этанол. Затем образцы опухолей заключают в парафин, делают 4-мкм срезы и сушат на предметных стеклах. Депарафинизацию и антигенное восстановление (на основе ЭДТК) осуществляют, следуя инструкциям изготовителя, с использованием коммерчески доступной камеры для снятия покрытия (Biocare Medical, кат.№ DC2001). Также собирают замороженные образцы опухоли ОСТ и делают срезы для окрашивания CD-31. Для иммуноокрашивания стекла инкубируют с первичными антителами, затем вторичными антителами и визуализируют с использованием или колориметрического метода (DAO Envision-HARP, набор DAB, DAO, Carpentaria, CA), или флюорометрического метода (Alexa 488 или Alexa 635, Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA). Все иммуноокрашенные срезы окрашивают контрастно с использованием гематоксилина. Также для проведения гистологического окрашивания используют автоматизированный модуль для окрашивания Ventana Discovery XT (Ventana Medical Systems, Tuscon, AZ), следуя инструкциям изготовителя. Окрашенные срезы анализируют с использованием микроскопа Olympus, и осуществляют количественный анализ срезов с использованием системы ACIS (Automated Cellular Imaging, Clarient, Irvine, CA). Слайды также анализируют штатные патоморфологи с использованием стандартных клинических методов.
Антитела, используемые в иммуногистохимических исследованиях, включают антитела анти-фосфо-c-Met/HGFR от Biosource International/Invitrogen, Carlsbad, CA; анти-Ki67 от Dacocytomation, Carpentaria, CA); и анти-CD31 от Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.
Данные и результаты
Ферментативная эффективность соединения 1 против c-Met/HGFR RTK
i
Показано, что соединение 1 является сильным АТФ-конкурентным ингибитором активности человеческой киназы c-Met/HGFR при среднем K 0,4 нМ.
i
i
Соединение 1 ингибирует активность c-Met/HGFR в биохимическом ферментном анализе с K 3 нМ. Для того чтобы исследовать киназную селективность относительно c-Met/HGFR, соединение 1 также оценивают в анализе биохимического скрининга киназ против панели из >120 рекомбинантных киназ. В таких предварительных скринингах биохимической активности киназ идентифицируют подмножество киназ, против которого соединение 1 обнаруживает активность, так что селективность в отношении c-Met/HGFR оценивают как в 100 раз меньшую по сравнению с c-Met/HGFR. Активность соединения 1 против таких возможных “удачных” киназ также оценивают в последующих исследованиях в анализах, определяющих селективность киназ на основе клеток (таблица 1). Значения биохимических K соединения 1 для ингибирования киназы c-Met/HGFR определяют, контролируя окисление NADH, которое сочетают с перестановкой АТФ. Реагенты для анализа соединения и киназы вводят в испытательные лунки и инкубируют в течение 10 минут при 37°С, и реакцию инициируют, добавляя c-Mit/HGFR. NADH определяют спектрофотометрически при 340 нм в установленные моменты времени.
Киназная селективность соединения 1 в анализах на основе клеток
50
99
50
Селективность соединения 1 оценивают в панели анализов киназной активности на основе клеток для выбранных киназ, которые оказались потенциально “удачными” в биохимических анализах, и других родственных RTK (например, RON, SKY, IR). В исследованиях на основе клеток соединение 1 более чем в 1000 раз селективно в отношении дополнительных RTK VEGFR2 и PDGFRβ, более чем в 200 раз селективно в отношении IR и Lck и приблизительно в 40-60 раз более селективно в отношении Axl, Tie2, TrkA и TrkB, все в сравнении с c-Met/HGFR (А549 IC = 8,6 нМ) (источника стандартной ошибки не обнаружено). Для того чтобы исследовать, будет ли 50-кратное окно достаточным для селективности в отношении c-Met/HGFR in vivo, соединение 1 оценивают на его способность ингибировать фосфорилирование Tie2 в ксенотрансплантатах С6 у голых мышей. В данном исследовании не наблюдают существенного ингибирования фосфорилирования Tie2 в любой момент времени после однократной дозы РЗ 50 мг/кг (представляющей IC для ингибирования c-Met/HGFR в течение 24 часов) или 100 мг/кг. Это показывает, что ингибирование Tie2, Axl или TrkA и В будет неудачным при дозах, до 2 крат больших, чем уровни доз, связанные с полным ингибированием c-Met/HGFR в течение 24 часов. Соединение 1 в 20-30 крат селективнее в отношении RON-киназы, которая представляет потенциально благоприятную онкологическую мишень из-за 1) сверхэкспрессии и мутации при выбранных онкозаболеваниях и 2) утраты вредного фенотипа у мышей без RON. В отличие от отношения к вышеуказанным RTK, соединение 1 показывает почти эквивалентное значение IC (24 нМ) против онкогенной формы слитого белка RTK ALK (киназа анапластической лимфомы), NPM-ALK - варианта онкогенного слитого белка RTK ALK (киназа анапластической лимфомы), что является результатом хромосомной транслокации, которая вовлечена в патогенез анапластической крупноклеточной лимфомы человека (ALCL, в клеточной линии лимфомы человека (источника стандартной ошибки не обнаружено)).
Фармакодинамическое ингибирование активности RTK c-Mit/HGFR в клетках
50
50
Для того, чтобы подтвердить, что сильная ферментативная активность транслируется в ингибирование c-Met/HGFR в клетках, оценивают способность соединения 1 ингибировать фосфорилирование c-Met/HGFR в панели опухолевых и эндотелиальных клеточных линий. Соединение 1 ингибирует HGF-стимулируемое или конститутивное полное тирозиновое аутофосфорилирование c-Met/HGFR дикого типа со средним значением IC 11 нМ по всей панели линий опухолевых и эндотелиальных клеток человека (таблица 1). Соединение 1 показывает подобное значение в мышиных эпителиальных клетках mlMCD3 (IC = 5 нМ) (таблица 1).
Возможности соединения 1 против мутаций активных сайтов c-Met/HGFR в клетках
50
50
50
Мутации, активирующие c-Met/HGFR, идентифицированы при некоторых онкозаболеваниях человека и дают серьезную причину проверенной концепции клинических исследований на основе как экспериментальных данных, так и клинической практики с другими RTK-мишенями. Хотя не прогнозировалось, что мутации c-Met/HGFR во внеклеточном или юкстамембранном домене влияют на связывание соединения с активным сайтом, возможно, что мутации киназного домена будут вызывать потерю активности. Для того, чтобы разобраться в таком результате, оценивают IC фосфорилирования RTK в соединении 1, обработанном клетками NIH3T3, созданными методами генной инженерии для экспрессии c-Mit/HGFR дикого типа или ряда характерных мутаций активных сайтов c-Met/HGFR. В таких исследованиях соединение 1 показывает улучшенную или схожую активность против мутантов в АТФ-связывающих сайтах (V10921 19 нМ, и H1094R 2,2 нМ) или мутантов в Р-петле (М1250Т 15 нМ) при сравнении с рецептором дикого типа (12,6 нМ) (таблица 1). Соединение 1 также потенциально проявляет сравнимую эффективность ингибирования фосфорилирования c-Met в клетках NCI-H69 (IC 13 нМ) и НОР92 (IC 16 нМ), которые экспрессируют эндогенные c-Met-юкстамембранные варианты R988C и Т10101, соответственно (таблица 1). Напротив, существенный сдвиг в эффективности (10 крат) наблюдают против активации мутантов в петле (Y1230C 127 нМ и Y1235D 92 нМ) при сравнении с рецептором дикого типа (12,6 нМ) (таблица 1).
Таблица 1
Анализ
IC<sub>50</sub>, нМ
Отношение селективностей
Биохимическая активность in vitro
Фермент c-Met/HGFR (Ki, нМ)<sup>а</sup>
4
NA
Клеточная активность in vitro
Фосфорилирование c-Met в линиях клеток опухолей человека (среднее IC<sub>50</sub>)<sup>b,c</sup>
11
NA
Фосфорилирование c-Met в мышиных эпителиальных клетках IMCD3 (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
5
NA
Фосфорилирование c-Met WT в клетках NIH3T3 (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
13
NA
Фосфорилирование c-Met мутанта V1092I в клетках NIH3T3 (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
19
NA
Фосфорилирование c-Met мутанта H1094R в клетках NIH3T3 (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
2
0,1X
Фосфорилирование c-Met мутанта Y1230C в клетках NIH3T3 (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
127
11X
Фосфорилирование c-Met мутанта Y1235D в клетках T47D (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
92
8X
Фосфорилирование c-Met мутанта М1250Т в клетках NIH3T3 (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
15
NA
Фосфорилирование c-Met в клетках NCI-H69, экспрессирующих вариант c-Met R988C (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
13
NA
Фосфорилирование c-Met в клетках НОР92, экспрессирующих вариант c-Met T1010I (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
16
NA
Фосфорилирование NPM-ALK в клетках Karpas299 лимфомы человека (IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
24
2Х
Клеточная активность против киназ-немишеней in vitro
Стимулированное MSP фосфорилирование RON в клетках NIH-3T3-RON (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
189
17Х
Фосфорилирование RON в клетках RON-GYRB (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
298
27Х
Стимулированное Gas6 фосфорилирование Axl в клетках NIH-3T3-Axl(средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
322
29Х
Лигандстимулированное фосфорилирование Tie-2 в клетках NIH-3T3-Tie-2/EGFR (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
448
41Х
Стимулированное NGF фосфорилирование TrkA в клетках TrkA-PAE(средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
580
53Х
Стимулированное BDNF фосфорилирование TrkB в клетках TrkB-PAE (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
399
36Х
Стимулированное BCR-Abl фосфорилирование TrkB в клетках BCR-Abl-BaF3 (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
1159
>100Х
Инсулинстимулированное фосфорилирование инсулинового рецептора в клетках 293-IRK (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
2887
>250Х
Стимулированное CD-3 Lck-зависимое фосфорилирование Zap70 в клетках Юрката (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
2741
>250Х
Стимулированное Gas6 фосфорилирование Sky в клетках NIH-3T3-Sky (средняя IC<sub>50</sub>)<sup>b</sup>
>10000
~1000Х
Определения
<sup>а </sup>K<sub>i</sub> для ингибирования фермента с-Met/HGFR, определенный контролем за окислением NADH в сочетании с перестановкой АТФ.
<sup>b</sup> Величины IC<sub>50</sub> определяют после воздействия на различные клеточные линии PF-02341066 в нескольких концентрациях в течение 1 часа и измерения фосфорилирования в лизатах клеточных белков ELISA. Величины IC<sub>50</sub> получают, вычерчивая кривую с использованием четырехпараметрического анализа.
<sup>с</sup> Среднюю величину IC<sub>50</sub> получают из средней величины IC<sub>50</sub> для фосфорилирования с-Met/HGFR по панели из 7 линий опухолевых клеток человека (т.е., А549, MDA-MB-231, GTL-16, HT29, 786-O, Colo-205, A498).
<sup>d</sup> Среднюю<sup>с</sup> IC<sub>50</sub> с-Met в клетках используют для вычисления отношения селективностей в случае клеточных анализов. Индекс селективности вычисляют как IC<sub>50</sub>(с-Met)/IC<sub>50</sub>(мишень).WT = дикий тип
Влияние соединения 1 на с-Met/HGFR- или NPM-ALK-зависимые онкогенные фенотипы в клетках
Анализы фенотипов
o
1
с-Met/HGFR вовлечена в разрегулирование роста клеток, миграцию и инвазию опухолевых клеток и опухолевых эндотелиальных клеток, в то время как NPM-ALK вовлечена в разрегулирование пролиферации клеток и апоптоза в клетках лимфомы ALCL. В серии функциональных анализов на основе клеток соединение 1 сильно ингибирует рост клеток карциномы желудка человека GTL-16, индуцирует апоптоз клеток GTL-16, ингибирует стимулируемую HGF миграцию клеток карциномы легких человека NCI-H441 и инвазию сквозь мадригелевый матрикс и ингибирует стимулируемые HGF подвижность/рассеяние клеток MDCK (таблица 2). Соединение 1 также ингибирует пролиферацию клеток Karpas 299 или SU-DHL-1 ALCL, которые экспрессируют слитый белок NPM-ALK благодаря хромосомной транслокации в t2;5. Ингибирование роста соединением 1 в таких NPM-ALK-положительных клетках лимфомы ассоциируется с задержкой клеточного цикла G/G и индукцией апоптоза. Также исследована потенциальная антиангиогенная активность, соединение 1 ингибирует HGF-опосредуемое выживание эндотелиальных клеток HUVEC и инвазию в матригель, а также тубулогенез эндотелиальных клеток HMVEC в фибриновых гелях. Такие данные показывают способность соединения 1 ингибировать как с-Met/HGFR-, так и NPM-ALK-зависимые функции в клетках, экспрессирующих активированные с-Met/HGFR или NPM-ALK, соответственно. Кроме того, такие данные предполагают, что противоопухолевая эффективность соединения 1 может быть опосредована как механизмами непосредственного воздействия на рост или выживание опухолевых клеток, так и ангиогенными механизмами.
Таблица 2
Анализ
Концентрация PF-02314066
нМ
нг/мл
Фенотипы опухолевых клеток
Пролиферация (анализ с МТТ) клеток карциномы желудка GTL-16 (средняя IC<sub>50</sub>)
9,7
4,4
Апоптоз (анализ ккДНК) клеток карциномы желудка GTL-16 (средняя IC<sub>50</sub>)
8,4
3,8
Стимулируемая HGF миграция клеток NCI-H441 NSCLC в камере Boyden (средняя IC<sub>50</sub>)
11
5
Стимулируемая HGF инвазия клеток NCI-H441 NSCLC в матригель (средняя IC<sub>50</sub>)
6,1
2,7
Стимулируемое HGF рассеяние колоний клеток MDCK (средняя IC<sub>50</sub>)
16
7
Фенотипы эндотелиальных клеток
Стимулируемое HGF выживание эндотелиальных клеток HUVEC (анализ с МТТ) (средняя IC<sub>50</sub>)
11
5
Стимулируемая HGF инвазия клеток HUVEC в матригель (средняя IC<sub>50</sub>)
35
16
Тубулогенез эндотелиальных клеток HMVEC в фибриновых гелях (оценка по IC<sub>50</sub>)
80
36
Определения: NSCLC = немелкоклеточный рак легких; MDCK = почки собаки Madin-Darby; ALCL = анапластическая крупноклеточная лимфома; HUVEC = эндотелиальные клетки пупочной вены человека; HMVEC = микроваскулярные эндотелиальные клетки человека
Исследования in vivo
Данные и результаты
Ингибирование киназы-мишени in vivo и ингибирование роста опухоли
Выбор модели опухоли
Модели с ксенотрансплантатами с-Met/HGFR-зависимых опухолей используют для оценки соотношения ингибирования с-Met/HGFR-мишени, ингибирования роста опухоли и воздействия на плазму соединения 1 in vivo. Из-за утраты паракринной активации человеческой с-Met/HGFR, экспрессированной опухолевыми трансплантатами мышиным HGF, экспрессированным мышиными мезенхимными клетками, используют следующие модели человеческих трансплантатов, показывающих конститутивную активность с-Met/HGFR: 1) модель карциномы желудка человека GTL-16 или карциномы почки Caki-1, которая экспрессируют повышенные уровни конститутивно активной с-Met/HGFR, 2) модель глиобластомы человека U87MG или карциномы предстательной железы человека РС-3, которая экспрессируют как HGF, так и с-Met/HGFR, содержащие аутокринную петлю, или 3) совместную имплантацию опухолевых клеток человека (например, NCI-H441 NSCLC) с фибробластами человека MRC5, для получения источника биоактивного HGF человека из опухолевого стромального компартмента для восстановления видоспецифической паракринной активации с-Met/HGFR.
Соотношение ингибрования с-Met/HGFR и противоопухолевой эффективности после перорального введения
Клетки GTL-16
3
Бестимусным мышам с установившимися опухолями GTL-16 (250 мм) вводят перорально соединение 1 в указанной дозе или один носитель в течение 11 дней. Для исследования ингибирования фосфорилирования с-Met/HGFR в GTL-16 (фигура 2А) мышей гуманно умерщвляют по окончании исследования в установленные моменты времени после введения, опухоли иссекают и замораживают, и определяют количественно ELISA фосфорилирование в группах с носителем и обработанных группах. Ингибирование фосфорилирования киназы-мишени соединением 1 в опухолях вычисляют в виде: % ингибирования = 100-[(среднее OD обработанных/среднее OD необработанных) × 100]. Для исследования ингибирования роста опухолей GTL-16 (фигура 2В) измеряют объем опухоли микрометром в указанные дни - средний объем опухоли ± SEM, указанный для групп из 15 мышей. Приведенные величины в процентах (%) представляют собой % ингибирования роста опухоли, измеренный на 20 день для мышей, обработанных лекарственным средством, в сравнении с мышами, обработанными носителем, и вычисленный как 100*{1-[(обработанные в день 20 - обработанные в день 10) / (контроль в день 20 - контроль в день 10)]}. Значок * означает, что средние объемы опухолей существенно меньше в обработанной группе в сравнении с контрольной (P < 0,001), что определяют с использованием однофакторного анализа дисперсии (см. фигуру 2В).
Для того, чтобы оценить реакцию с-Met/HGFR PD на соединение 1, опухоли GTL-16 собирают в некоторые моменты времени после перорального введения pf соединения 1 в исследовании как по однодозовой схеме, так и по схеме с повторными дозами (установившееся состояние). Состояние фосфорилирования с-Met/HGFR в опухолях определяют количественно ELISA в интервале доз. При сосредоточении на исследованиях PD в установившемся состоянии (11 день) для корреляции с ингибированием роста опухоли соединение 1 показывает описанное далее поведение, отображенное на фигуре 2А и 2В.
При 50 мг/кг/сутки 100% ингибирование роста опухоли коррелирует с полным ингибированием фосфорилирования с-Met/HGFR в опухолях GTL-16, длившееся 24 часа (25 мг/кг - почти полное ингибирование как фосфорилирования, так и роста опухоли). При 12,5 мг/кг/сутки 60% ингибирование роста опухоли коррелирует с 80-90% ингибированием фосфорилирования с-Met/HGFR в течение 1-8 часов, которое снижается до 50-60% ингибирования за 16-24 часа.
При 6,25 мг/кг/сутки не имеется заметной направленности на ингибирование роста опухоли, коррелирующего с 30-50% ингибированием фосфорилирования с-Met/HGFR за 1-8 часов с полным возвратом в исходное состояние за 16 часов.
Опухоли U87MG
3
Бестимусным мышам с установившимися опухолями U87MG (150 мм) вводят перорально соединение 1 в указанной дозе или один носитель в течение 9 дней. Для исследования ингибирования роста опухоли (фигура 3А) измеряют объем опухоли микрометром в указанные дни - средний объем опухоли ± SEM, указанный для групп из 10-12 мышей. Приведенные величины в процентах (%) представляют собой % ингибирования роста опухоли, измеренный на 14 день для мышей, обработанных лекарственным средством, в сравнении с мышами, обработанными носителем, и вычисленный как 100*{1-[(обработанные в день 14 - обработанные в день 6) / (контроль в день 14 - контроль в день 6)]}. Значок * означает, что средние объемы опухолей существенно меньше в обработанной группе в сравнении с контрольной (P < 0,001), что определяют с использованием однофакторного анализа дисперсии (см. фигуру 3А). Для исследования ингибирования фосфорилирования с-Met/HGFR в GTL-16 (фигура 3В) мышей гуманно умерщвляют по окончании исследования через 4 часа после введения соединения 1, опухоли иссекают и замораживают, и определяют количественно ELISA фосфорилирование в группах с носителем и обработанных группах. Ингибирование фосфорилирования киназы-мишени соединением 1 в опухолях вычисляют в виде: % ингибирования = 100-[(среднее OD обработанных/среднее OD необработанных) × 100].
Фармакологически релевантного ингибирования фосфорилирования Tie-2 не наблюдают в ксенотрансплантатах U87MG при уровнях доз до 100 мг/кг, что предполагает, что соединение 1 селективно в отношении своих предполагаемых мишеней при схожих уровнях доз.
Противоопухолевая эффективность соединения 1 на моделях человеческих ксенотрансплантатов
Противоопухолевую эффективность соединения 1 оценивают на различных моделях ксенотрансплантатов опухолей человека с характерными симптомами рака, в который вовлечено разрегулирование с-Met/HGFR, включая карциному желудка GTL-16, глиобластому U87MG, NCI-H441 NSCLC и карциному предстательной железы РС-3 (таблица 4).
Модель карциномы желудка GTL-16
3
С использованием модели карциномы желудка GTL-16 соединение 1 показывает возможность вызывать заметную регрессию крупных установившихся опухолей (>600 мм) (фигура 4). В данном исследовании обработанные 50 и 75 мг/кг/сутки соединения 1 группы животных показывают эквивалентную среднюю регрессию опухолей в течение 43-дневной схемы введения, что также свидетельствует о том, что 50 мг/кг/сутки представляет максимальный эффективный уровень дозы. Как показывает фигура 4, средняя регрессия опухолей при 50 и 75 мг/кг/сутки составляет 69% после 43-дневного введения соединения 1. В данном исследовании каждая опухоль уменьшается по массе во время 43-дневного цикла введения соединения 1 при каждом уровне дозы, причем у 9 из 14 мышей обнаружено уменьшение массы опухоли ≥30% (частичная реакция), и у одного животного обнаружено развитие полной реакции с отсутствием опухоли даже после прекращения обработки в течение 10 дней.
3
Регрессия крупных установившихся ксенотрансплантатов опухоли GTL-16 у бестимусных мышей (фигура 4А) и масса тела мыши (фигура 4В) после ежесуточного перорального введения соединения 1. Бестимусным мышам с установившимися опухолями GTL-16 (620 мм) вводят соединение 1 перорально в указанных дозах или один носитель в течение 43 дней. Для исследования противоопухолевой эффективности (фигура 4А) измеряют объем опухоли микрометром в указанные дни - средний объем опухоли ± SEM, указанный для групп из 6-8 мышей. Средняя масса мышей в группах, обработанных соединением 1, и контрольных группах, обработанных носителем, показана на фигуре справа.
Ксенотрансплантаты опухолей типа NCI-H441 NSCLC/Caki-1/PC-3
3
Бестимусным мышам с установившимися ксенотансплантатами опухолей NCI-H441 (100 мм) (фигура 5А), Caki-1 (таблица 3А, таблица 3В) или РС-3 (фигура 5В) вводят перорально соединение 1 в указанной дозе или один носитель в течение 38, 40 или 20 дней, соответственно. Объем опухоли измеряют микрометром в указанные дни - средний объем опухоли ± SEM. Значок * означает, что средние объемы опухолей существенно меньше в обработанной группе в сравнении с контрольной (P < 0,001), что определяют с использованием однофакторного анализа дисперсии (см. фигуру 5).
На модели NCI-H441 NSCLC наблюдают 43% среднюю регрессию установившихся опухолей при 50 мг/кг/сутки после 38-дневного введения соединения 1 (фигура 5). В данном исследовании каждая опухоль уменьшается по массе во время 33-дневного цикла введения соединения 1 при 50 мг/кг/сутки, причем у 3 из 11 мышей обнаружено уменьшение массы опухоли ≥30% (частичная реакция), и у 3 животных обнаружено развитие полной реакции с отсутствием опухоли (фигура 5). Противоопухолевая эффективность соединения 1 зависит от дозы с регрессией установившихся опухолей NCI-H441, наблюдаемой при 50 мг/кг/сутки, и частичном ингибировании роста опухолей (57% ингибирование роста опухолей), наблюдаемом при 15 мг/кг/сутки (фигура 5). Противоопухолевая эффективность соединения 1, наблюдаемая на модели NCI-H441, согласуется с ингибированием фосфорилирования с-Met-HGFR в опухолях в группах, обработанных соединением, в сравнении с контрольными группами, обработанными носителем. На модели карциномы почек Caki-1 наблюдают 53% уменьшение среднего объема опухолей при 50 мг/кг/сутки в течение 33-дневного цикла введения соединения 1 (фигура 5В). В исследовании с Caki-1 каждая опухоль уменьшается в объеме во время 33-дневного цикла введения соединения 1, по меньшей мере, на 30% (таблица 3В, таблица 4). Противоопухолевую эффективность соединения 1 также исследуют на модели с ксенотрансплантатом карциномы предстательной железы РС-3, и на данной модели наблюдают почти полное ингибирование роста опухолей (84% ингибирование роста).
Таблица 3А
Объемопухоли (мм<sup>3</sup>)
Контрольные субъекты
День
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Среднее значение
SEM
n
1
63
63
63
108
126
126
126
144
196
196
121
15.7
10
4
108
63
144
256
405
320
405
320
550
446
301.6
50.1
10
8
108
144
196
256
836
405
726
446
1268
700
518.4
120.7
10
12
126
365
196
256
1688
726
936
1008
1437
748.5
187.9
9
16
196
550
352
365
1008
1372
640.4
185.8
6
19
172
864
256
486
444.4
154.9
4
22
288
936
288
726
559.5
162.5
4
26
288
1268
365
650
642.5
222.4
4
29
221
405
1008
544.5
237.8
3
33
320
550
435
115
2
36
405
550
477.5
72.5
2
40
486
600
543
57
2
43
726
864
795
69
2
47
787
936
861.3
74.8
2
50
767
1008
897.3
110.8
2
54
787
786.5
1
Таблица 3В
Объем опухоли (мм<sup>3</sup>)
Подопытные субъекты (соединение 1, 50 мг/кг)
День
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Среднее значение
SEM
n
1
63
63
63
108
108
126
126
172
172
196
119.5
15.4
10
4
32
63
63
108
108
196
126
126
172
196
118.9
17.9
10
8
18
40
14
40
32
75
40
63
63
75
45.9
7
10
12
14
32
14
32
32
63
40
40
40
63
36.8
5.3
10
15
4
14
14
32
32
40
32
40
40
40
28.7.
4.2
10
19
14
18
14
32
32
40
18
32
63
63
32.4
5.8
10
22
14
14
14
14
32
63
14
32
108
108
41
12.2
10
26
14
14
14
18
32
40
32
63
75
75
37.5
7.9
10
29
14
32
18
32
63
40
40
108
108
108
56.2
12
10
33
14
32
18
32
63
40
40
108
108
108
56.2
12
10
36
32
40
32
63
75
75
63
75
126
126
70,6
10.7
10
40
32
63
32
63
75
75
63
75
172
172
82
15.7
10
43
32
32
14
63
63
63
32
63
256
63
67.8
21.7
10
47
32
40
32
63
75
108
63
75
196
108
79.1
15.6
10
50
32
63
40
63
108
108
63
108
196
172
95.1
17.2
10
54
63
63
40
14
108
75
40
75
172
172
82
16.9
10
Соотношение противоопухолевой эффективности и ингибирования с-Met/HGFR
Проводят ряд исследований зависимости противоопухолевой эффективности от дозы и фармакодинамики для того, чтобы показать соотношение между ингибированием мишени с-Met/HGFR и противоопухолевой эффективностью. Для того, чтобы оценить фармакодинамическое ингибирование с-Met/HGFR соединением 1, опухоли карциномы желудка GTL-16 собирают в определенные моменты времени после перорального введения соединения 1. Определяют количественно ELISA состояние фосфорилирования с-Met/HGFR в опухолях в интервале доз. В данных исследованиях соединение 1 показывает значительную корреляцию зависимого от дозы и времени ингибирования с-Met/HGFR и ингибирования роста опухолей. При определении соотношения PD мишени и эффективности на модели GTL-16 приходят к следующим выводам: 1)полное ингибирование активности с-Met/HGFR в течение 24 часов согласуется с полным ингибированием роста опухолей (50 мг/кг, 100% TGI), 2) сильное ингибирование активности с-Met/HGFR в случае только части схемы приема согласуется с оптимальной эффективностью (12,5 мг/кг, 60% TGI), 3) невозможность достижения >50% ингибирования активности с-Met/HGFR (3,125, 6,25 мг/кг) согласуется с отсутствием существенного ингибирования роста опухолей (TGI) (фигура 2А и 2В). Дополнительное исследование GTL-16 показывает, что обработка групп животных 50 и 75 мг/кг/сутки соединением 1 показывает равнозначную регрессию опухолей, что также свидетельствует о том, что 50 мг/кг/сутки представляют максимально эффективный уровень дозы (фигура 4 и таблица 4). Такие результаты предполагают, что длительность ингибирования с-Met/HGFR непосредственно связана с противоопухолевой эффективностью соединения 1.
Кроме того, подобное зависящее от дозы действие соединения 1 на рост опухолей и фосфорилирование с-Met/HGFR наблюдают с использованием моделей опухолей (GTL-16, U87MG и NCI-H441), и такие наблюдения также поддерживают схемы приема доз (таблица 4). В каждом из таких исследований уровень дозы 50 мг/кг/сутки приводит или к полному ингибированию роста опухолей или к регрессии опухолей (таблица 4). Кроме того, наблюдают зависящую от дозы корреляцию между ингибированием фосфорилирования с-Met/HGFR и противоопухолевой эффективностью на каждой модели, также поддерживающую концепцию максимизации степени и длительности ингибирования с-Met/HGFR для достижения полной эффективности. Все вместе такие исследования предполагают, что почти полное ингибирование фосфорилирования с-Met/HGFR на протяжении продолжения схемы введения необходимо для максимизации лечебного благоприятного действия, и степень и длительность ингибирования активности с-Met/HGFR напрямую связаны с уровнем противоопухолевой активности. Такие результаты подтверждают связь между ингибированием предполагаемой фармакологической мишени соединения 1 с-Met/HGFR и степенью противоопухолевой эффективности.
Противоопухолевая эффективность соединения 1 на модели NPM-ALK-зависимой лимфомы
Модель Karpas 299 ALCL
3
Мышам SCID-beige с установившимися опухолями Karpas 299 (220 мм) вводят перорально соединение 1 в указанной дозе или один носитель в установленные периоды времени. Для исследования ингибирования роста опухоли (фигура 6А) измеряют объем опухолей микрометром в указанные дни - средний объем опухоли ± SEM, указанный для групп из 8-12 мышей. Приведенные величины в процентах (%) представляют собой % ингибирования роста опухоли, измеренный на 23 день для мышей, обработанных лекарственным средством, в сравнении с мышами, обработанными носителем, и вычисленный как 100*{1-[(обработанные в день 23 - обработанные в день 12) / (контроль в день 23 - контроль в день 12)]}. Значок * означает, что средние объемы опухолей существенно меньше в обработанной группе в сравнении с контрольной (P < 0,001), что определяют с использованием однофакторного анализа дисперсии. Для исследования ингибирования фосфорилирования NPM-ALK (фигура 6В) мышей гуманно умерщвляют по окончании исследования через 4 часа после введения соединения 1, опухоли иссекают и замораживают, и определяют количественно ELISA фосфорилирование ALK в опухолях с носителем и обработанных опухолях. Ингибирование фосфорилирования киназы-мишени соединением 1 в опухолях вычисляют в виде: % ингибирования = 100-[(среднее OD обработанных/среднее OD необработанных) × 100].
3
3
С использованием модели Karpas 299 ALCL соединение 1 показывает способность вызывать заметную регрессию установившихся опухолей (>200 мм) (фигура 6А). В данном исследовании введение соединения 1 в дозе 100 мг/кг/сутки приводит к полной регрессии опухолей у всех мышей в группе с такой дозировкой в пределах 15 дней от начала введения соединения 1 (фигура 6А). Через 17 дней обработку соединением 1 прекращали, что приводит к повторному росту опухолей. Когда опухоли вырастают до большего размера (>600 мм), обработку соединением 1 возобновляют в течение еще 13 дней, и снова видят полную регрессию опухолей (фигура 6А, таблица 4). Циторедуктивное действие соединения 1 согласуется с наблюдением его антипролиферативного и апоптозного действия против клеток ALCL in vivo. Соотношение ингибирования фосфорилирования опухолевого NPM-ALK и противоопухолевой активности также определяют при нескольких уровнях доз и в несколько моментов времени. Подобно наблюдениям на моделях с-Met/HGFR-зависимых опухолей почти полное ингибирование (ингибирование >90%) активности NPM-ALK для всего интервала дозирования (24 часа) согласуется с максимальной противоопухолевой эффективностью (регрессией опухоли) при 100 мг/кг (фигура 6А и 6В). Неполное ингибирование фосфорилирования NPM-ALK (ингибирование <90% при 25 или 50 мг/кг) согласуется с субоптимальной противоопухолевой эффективностью (фигура 6А и 6В). Подобно исследованиям на моделях с-Met/HGFR-зависимых опухолей такие результаты подтверждают связь между ингибированием другой предполагаемой фармакологической мишени соединения 1 NPM-ALK и степенью противоопухолевой эффективности на модели NPM-ALK-зависимой опухоли.
Таблица 4
Модель (тип опухоли)
Начальный объем опухоли (мм<sup>3</sup>)
Доза и схема (мг/кг)
Общее действие
Величина Р
Ингиб. роста, % (день)<sup>1</sup>
Регрессия<sup>2</sup>
PR
CR
Vs
GTL-16 (карцинома желудка)
230
50, QD
100% (д.11)
Нет
2/15
Нет
<0,0001
230
25, QD
89% (д.11)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
230
12,5 QD
60% (д.11)
Нет
Нет
Нет
0,0013
230
6,25, QD
34% (д.11)
Нет
Нет
Нет
0,074
230
3,125, QD
29% (д.11)
Нет
Нет
Нет
0,144
230
25, BID
95% (д.11)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
230
12,5, BID
84% (д.11)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
230
6,25, BID
63% (д.11)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
GTL-16 (карцинома желудка)
620
75, QD
Регрессия
60% (д.43)
6/8
Нет
<0,0001
620
50, QD
Регрессия
60% (д.43)
3/6
1/6
<0,0001
U87 MG (глиобластома)
170
50, QD
97% (д.9)
Нет
1/12
Нет
<0,0001
170
25, QD
83% (д.9)
Нет
1/12
Нет
<0,0001
170
12,5, QD
71% (д.9)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
170
6,25, QD
50% (д.9)
Нет
Нет
Нет
0,0003
170
3,125, QD
34% (д.9)
Нет
Нет
Нет
0,0454
Н441 (NSCLC)
100
50, QD
Регрессия
48% (д.43)
3/11
3/11
<0,0001
100
15, QD
59% (д.9)
Нет
Нет
2/12
0,0013
РС-3 (карцинома простаты)
290
50, QD
84% (д.20)
Нет
Нет
Нет
0,001
Caki-1 (карцинома почек)
100
50, QD
Регрессия
53%
7/10
3/10
0,001
Karpas 299 (лимфома ALK)
220
100, QD
Регрессия
100% (д.16)
Нет
12/12
<0,0001
220
50, QD
96% (д.11)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
220
25, QD
57% (д.11)
Нет
Нет
Нет
<0,0001
540
100, QD
Регрессия
90% (д.13)
3/3
Нет
<0,0001
Синтез соединения 1
PLE представляет собой фермент, производимый Roche и продаваемый Biocatalytics Inc. в виде препарата сырой эстеразы из печени свиньи, обычно известного как PLE-AS (закупают у Biocatalytics как ICR-123, продается в виде суспензии сульфата аммония). Фермент классифицирован в реестре CAS как “карбоновая эфиргидролаза (“carboxylic-ester hydrolase”), CAS № 9016-18-6”. Соответствующий классификационный индекс фермента ЕС 3.1.1.1. Известно, что фермент имеет широкую субстратспецифичность для гидролиза широкого ряда сложных эфиров. Липазную активность определяют в рН-титраторе с использованием метода, основанного на гидролизе этилбутирата. Липазная единица 1 LU представляет собой количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль титруемой масляной кислоты в минуту при 22°С, рН 8,2. Описанный в данном описании препарат (PLE-AS, в виде суспензии) обычно транспортируют в виде непрозрачной коричнево-зеленой жидкости с объявленной активностью >45 LU/мг (содержание белка приблизительно 40 мг/мл).
(1S)-1-(2,6-Дихлор-3-фторфенил)этанол
(1S)-1-(2,6-Дихлор-3-фторфенил)этанол, обозначенный на приведенных ниже схемах как соединение (S-1), получают сочетанием ферментативного гидролиза рацемического 1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этилацетата, этерификацией и химическим гидролизом с инверсией согласно схеме В. Рацемический 1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этилацетат (соединение А2) получают согласно схеме А.
Схема А
1-(2,6-Дихлор-3-фторфенил)этанол (А1)
3
-
1
Борогидрид натрия (90 мг, 2,4 ммоль) добавляют к раствору 2',6'-дихлор-3'-фторацетофенона (Aldrich, каталож. № 52294-5) (207 мг, 1 ммоль) в 2 мл безводного СНОН. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, затем упаривают и получают бесцветный маслянистый остаток. Остаток очищают флэш-хроматографией (элюирование 0 → 10% EtOAc в гексане), и получают соединение А1 в виде бесцветного масла (180 мг; 0,88 ммоль, выход 86,5%). МС (APCI) (M-H) 208; Н-ЯМР (400 МГц, хлороформ-D) δ м.д. 1,64 (д, J=6,82 Гц, 3Н), 3,02 (д, J=9,85 Гц, 1Н), 6,97-7,07 (м, 1Н), 7,19-7,33 (м, 1Н).
1-(2,6-Дихлор-3-фторфенил)этилацетат (А2)
2
2
1
Уксусный ангидрид (1,42 мл, 15 ммоль) и пиридин (1,7 мл, 21 ммоль) последовательно добавляют к раствору соединения А1 (2,2 г, 10,5 ммоль) в 20 мл CHCl. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час и затем упаривают, и получают желтоватый маслянистый остаток. Остаток очищают флэш-хроматографией (элюирование 7 → 9% EtOAc в гексане), и получают соединение А2 в виде бесцветного масла (2,26 г; 9,0 ммоль, выход 85,6%). Н-ЯМР (400 МГц, хлороформ-D) δ м.д. 1,88 (д, J=6,82 Гц, 3Н), 2,31 (с, 3Н), 6,62 (кв, J=6,82 Гц, 1Н), 7,25 (т, J=8,46 Гц, 1Н), 7,49 (дд, J=8,84, 5,05 Гц, 1Н).
Схема В
В 50-мл колбу с кожухом, снабженную рН-электродом, вставленной сверху мешалкой и трубкой для добавления основания (1 М раствора NaOH), загружают 1,2 мл 100 мМ калийфосфатного буфера, рН 7, и 0,13 мл суспензии PLE-AS. Затем добавляют по каплям соединение А2 (0,13 г, 0,5 ммоль, 1,00 экв.), и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 часов, поддерживая рН реакционной смеси постоянным при 7,0 с использованием 1 М раствора NaOH. Как конверсию, так и эи (ее) реакционной смеси контролируют ОФ-ВЭЖХ, и реакцию останавливают после того, как израсходуется 50% исходного материала (приблизительно через 17 часов в указанных условиях). Затем смесь экстрагируют этилацетатом три раза по 10 мл, и извлекают как эфир, так и спирт в виде смеси R-1 и S-2.
1
Добавляют метансульфонилхлорид (0,06 мл, 0,6 ммоль) к раствору смеси R-1 и S-2 (0,48 ммоль) в 4 мл пиридина в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 час, затем упаривают и получают масло. К смеси добавляют воду (20 мл), и затем добавляют EtOAc (20 мл × 2) для экстракции водного раствора. Органические слои объединяют, сушат, фильтруют и упаривают, и получают смесь R-3 и S-2. Полученную смесь используют на следующей стадии реакции без дополнительной очистки. Н-ЯМР (400 МГц, хлороформ-D) δ м.д. 1,66 (д, J=7,1 Гц, 3Н), 1,84 (д, J=7,1 Гц, 3Н), 2,09 (с, 3Н), 2,92 (с, 3Н), 6,39 (кв, J=7,0 Гц, 1Н), 6,46 (кв, J=6,8 Гц, 1Н), 6,98-7,07 (м, 1Н), 7,07-7,17 (м, 1Н), 7,23-7,30 (м, 1Н), 7,34 (дд, J=8,8, 4,80 Гц, 1Н).
1
К смеси R-3 и S-2 (0,48 ммоль) в 4 мл ДМФА в атмосфере азота добавляют ацетат калия (0,027 г, 0,26 ммоль). Реакционную смесь греют при 100°С в течение 12 часов. К реакционной смеси добавляют воду (20 мл), и добавляют EtOAc (20 мл × 2) для экстракции водного раствора. Объединенный органический слой сушат, фильтруют и упаривают, и получают масло S-2 (72 мг, выход 61% в двух стадиях). Хиральность - эи 97,6%. Н-ЯМР (400 МГц, хлороформ-D) δ м.д. 1,66 (д, J=7,1 Гц, 3Н), 2,09 (с, 3Н), 6,39 (кв, J=6,8 Гц, 1Н), 7,02 (т, J=8,5 Гц, 1Н), 7,22-7,30 (м, 1Н).
2
2
4
1
В атмосфере азота при 0°С к соединению S-2 (4,64 г, 18,8 ммоль) постепенно добавляют метоксид натрия (19 ммоль; 0,5 М раствор в метаноле). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворитель выпаривают и добавляют НО (100 мл). Охлажденную реакционную смесь нейтрализуют буферным раствором ацетата натрия и уксусной кислоты до рН 7. Добавляют этилацетат (100 мл × 2) для экстракции водного раствора. Объединенные органические слои сушат над NaSO, фильтруют и упаривают, и получают S-1 в виде белого твердого вещества (4,36 г, выход 94,9%); SFC-МС: эи 97%. Н-ЯМР (400 МГц, хлороформ-D) δ м.д. 1,65 (д, J=6,8 Гц, 3Н), 5,58 (кв, J=6,9 Гц, 1Н), 6,96-7,10 (м, 1Н), 7,22-7,36 (м, 1Н).
5-Бром-3-[1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]пиридин-2-иламин (рацемат)
4
6
1
1. 2,6-Дихлор-3-фторацетофенон (15 г, 0,072 моль) перемешивают в ТГФ (150 мл, 0,5 М) в течение 10 мин при 0°С с использованием ледяной бани. Добавляют постепенно алюмогидрид лития (2,75 г, 0,072 моль). Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 3 часов. Реакционную смесь охлаждают на ледяной бане, и добавляют по каплям воду (3 мл), и затем разумно и постепенно добавляют 15% раствор NaOH (3 мл). Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 30 мин. Добавляют 15% раствор NaOH (9 мл) и MgSO, и смесь фильтруют для удаления твердых веществ. Твердые вещества промывают ТГФ (50 мл), фильтрат концентрируют, и получают 1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этанол (14,8 г, выход 95%) в виде желтого масла. Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 1,45 (д, 3Н), 5,42 (м, 2Н), 7,32 (м, 1Н), 7,42 (м, 1Н).
1
3
2. К раствору трифенилфосфина (8,2 г, 0,03 моль) и DEAD (13,65 мл 40% раствора в толуоле) в ТГФ (200 мл) при перемешивании при 0°С добавляют раствор 1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этанола (4,55 г, 0,021 моль) и 3-гидроксинитропиридина (3,35 г, 0,023 моль) в ТГФ (200 мл). Полученный ярко-оранжевый раствор перемешивают в атмосфере азота при температуре окружающей среды в течение 4 часов, когда израсходуются все исходные вещества. Растворитель удаляют, и неочищенное вещество в сухом состоянии загружают в силикагель и элюируют смесью этилацетат-гексан (20:80), и получают 3-(2,6-дихлор-3-фторбензилокси)-2-нитропиридин (6,21 г, 0,021 моль, 98%) в виде розового твердого вещества. Н-ЯМР (CDCl, 300 МГц) δ 1,8-1,85 (д, 3Н), 6,0-6,15 (кв, 1Н), 7,0-7,1 (т, 1Н), 7,2-7,21 (д, 1Н), 7,25-7,5 (м, 2Н), 8,0-8,05 (д, 1Н).
3
2
2
4
3
1
3. В смеси АсОН (650 мл) и EtOH (500 мл) при перемешивании суспендируют 3-(2,6-дихлор-3-фторбензилокси)-2-нитропиридин (9,43 г, 0,028 моль) и железную стружку (15,7 г, 0,28 моль). Реакционную смесь постепенного нагревают до температуры образования флегмы и перемешивают в течение 1 часа. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и затем добавляют диэтиловый эфир (500 мл) и воду (500 мл). Раствор осторожно нейтрализуют, добавляя карбонат натрия. Объединенные органические экстракты промывают насыщ. раствором NaHCO (2×100 мл), НО (2×100 мл) и рассолом (1×100 мл), затем сушат (NaSO), фильтруют и концентрируют досуха в вакууме, и получают 3-(2,6-дихлор-3-фторбензилокси)пиридин-2-иламин (9,04 г, 0,027 моль, 99%) в виде светло-розового твердого вещества. Н-ЯМР (CDCl, 300 МГц) δ 1,8-1,85 (д, 3Н), 4,9-5,2 (уш.с, 2Н), 6,7-6,84 (кв, 1Н), 7,0-7,1 (м, 1Н), 7,2-7,3 (м, 2Н), 7,6-7,7 (м, 1Н).
1
3
4. Раствор 3-(2,6-дихлор-3-фторбензилокси)пиридин-2-иламина (9,07 г, 0,03 моль) в ацетонитриле при перемешивании охлаждают до 0°С с использованием ледяной бани. К такому раствору добавляют по частям N-бромсукцинимид (NBS) (5,33 г, 0,03 моль). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 15 мин. Реакционную смесь концентрируют досуха в вакууме. Полученное темное масло растворяют в EtOAc (500 мл) и очищают хроматографией на силикагеле. Затем растворители удаляют в вакууме и получают 5-бром-3-(2,6-дихлор-3-фторбензилокси)пиридин-2-иламин (5,8 г, 0,015 моль, 51%) в виде белого кристаллического твердого вещества. Н-ЯМР (CDCl, 300 МГц) δ 1,85-1,95 (д, 3Н), 4,7-5,0 (уш.с, 2Н), 5,9-6,01 (кв, 1Н), 6,8-6,95 (д, 1Н), 7,01-7,2 (т, 1Н), 7,4-7,45 (м, 1Н), 7,8-7,85 (д, 1Н).
5-Бром-3-[1(R)-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]пиридин-2-иламин
1
6
Энантиомерно чистый R-изомер получают так, как описано выше для рацемата, но с использованием энантиомерно чистых исходных веществ, описанных выше. Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 1,74 (д, 3Н), 6,40 (м, 1Н), 6,52 (уш.с, 2Н), 7,30 (м, 1Н), 7,48 (м, 1Н), 7,56 (с, 1Н); МС m/z 382 (M+1).
трет-Бутиловый эфир 4-метансульфонилоксипиперидин-1-карбоновой кислоты (2)
2
2
3
2
2
2
4
3
1
К раствору трет-бутилового эфира 4-гидроксипиперидин-1-карбоновой кислоты (7,94 г, 39,45 ммоль) в CHCl (100 мл), охлажденному до 0°С, при перемешивании постепенно добавляют NEt (5,54 мл, 39,45 ммоль), а затем метансульфонилхлорид (3,06 мл, 39,45 ммоль) и DMAP (48 мг, 0,39 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К смеси добавляют воду (30 мл). Экстракция CHCl (3 × 30 мл) с последующей сушкой (NaSO) и удаление растворителя в вакууме дают трет-бутиловый эфир 4-метансульфонилоксипиперидин-1-карбоновой кислоты (11,00 г, выход >99%). Н-ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 4,89 (м, 1Н), 3,69 (м, 2Н), 3,31 (м, 2Н), 3,04 (с, 3Н), 1,95 (м, 2Н), 1,83 (м, 2Н), 1,46 (с, 9Н).
трет-Бутил-4-[4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пиперидин-1-карбоксилат
трет-Бутил-4-(4-иод-1Н-пиразол-1-ил)пиперидин-1-карбоксилат (3)
2
К раствору 4-иодпиразола (0,57 ммоль) в ДМФА (2 л) при перемешивании при 4°С добавляют по частям NaH (1,2 экв., 0,68 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 1 часа при 4°С и затем добавляют соединение 2 - трет-бутиловый эфир 4-метансульфонилоксипиперидин-1-карбоновой кислоты (1,1 экв., 0,63 ммоль). Полученную смесь греют при 100°С в течение 12 часов. Реакцию гасят НО и смесь экстрагируют несколько раз EtOAc. Объединенные органические слои сушат, фильтруют и концентрируют, и получают оранжевое масло. Остаток очищают хроматографией на силикагеле (элюирование смесью 5% EtOAc в пентане), и получают соединение 3 в виде белого твердого вещества (140 г, 66%).
трет-Бутил-4-[4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил]пиперидин-1-карбоксилат (4)
2
4
Бис(пинаколато)диборон (1,4 экв., 134 г, 0,52 моль) и ацетат калия (4 экв., 145 г, 1,48 моль) последовательно добавляют к раствору соединения 3 (140 г, 0,37 моль) в 1,5 л ДМСО. Смесь продувают азотом несколько раз и затем добавляют дихлорбис(трифенилфосфино)палладий(II) (0,05 экв., 12,9 г, 0,018 моль). Полученную смесь греют при 80°С в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через слой целита и промывают EtOAc. Фильтрат промывают насыщенным раствором NaCl (500 мл × 2), сушат над NaSO, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают хроматографией на силикагеле (элюирование смесью 5% EtOAc в гексане), и получают соединение 4 в виде белого твердого вещества (55 г, 40%).
3-[(R)-1-(2,6-Дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(1-пиперидин-4-ил-1Н-пиразол-4-ил)пиридин-2-иламин (1)
2
3
3
2
2
2
4
+
К раствору 3-[(R)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-иламина (15,22 г, 35,64 ммоль) и трет-бутилового эфира 4-(4-бромпиразол-1-ил)пиперидин-1-карбоновой кислоты (14,12 г, 42,77 ммоль) в DME (143 мл) при перемешивании добавляют раствор NaCO (11,33 г, 10692 ммоль) в воде (36 мл). Раствор обезгаживают и загружают три раза азотом. К раствору добавляют Pd(PPh)Cl (1,25 мг, 1,782 ммоль). Реакционный раствор снова обезгаживают азотом три раза. Реакционный раствор перемешивают на масляной бане, 87°С, в течение примерно 16 часов (или до тех пор, пока не израсходуется боранпинаколовый эфир), охлаждают до температуры окружающей среды и разбавляют EtOAc (600 мл). Реакционную смесь фильтруют через слой целита и промывают EtOAc. Раствор в EtOAc промывают рассолом, сушат над NaSO, фильтруют и концентрируют. Сырой продукт реакции очищают на колонке с силикагелем с элюированием системой EtOAc/гексан (колонка Biotage 90+, уравновешивается 600 мл 100% гексана, сегмент 1: 2250 мл 50% EtOAc/гексан линейный, сегмент 2: 4500 мл 75% EtOAc/гексан линейный, сегмент 3: 4500 мл 100% EtOAc), и получают трет-бутиловый эфир 4-(4-{6-амино-5-[(R)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]пиридин-3-ил}пиразол-1-ил)пиперидин-1-карбоновой кислоты (11,8 г, выход 60%, чистота ~95%) с Rf 0,15 (50% EtOAc/гексан). МС m/e 550 (M+1).
2
2
2
3
2
2
2
2
2
4
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
3
2
2
.
6
+
1
К раствору трет-бутилового эфира 4-(4-{6-амино-5-[(R)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]пиридин-3-ил}пиразол-1-ил)пиперидин-1-карбоновой кислоты (11,8 г, 21,45 ммоль) в CHCl (59 мл, 0,2 М) добавляют 4 N HCl/диоксан (21 мл). Раствор перемешивают в течение ночи с образованием твердого вещества. Твердое вещество измельчают стеклянной палочкой и обрабатывают ультразвуком для высвобождения исходного вещества, захваченного твердым веществом. Добавляют еще 4 N HCl/диоксан (21 мл) и смесь перемешивают еще в течение 2 часов при комнатной температуре, когда ЖХМС уже не показывает исходное вещество. Суспензию фильтруют на воронке Бюхнера со слоем фильтровальной бумаги. Маточную жидкость оставляют, поскольку она содержит <5% продукта реакции. Твердое вещество переносят в 500-мл химический стакан и добавляют воду для ВЭЖХ до тех пор, пока твердое вещество не растворится полностью. Доводят рН до 10, добавляя твердый NaCO. Водный раствор экстрагируют CHCl (5×200 мл) или до тех пор, пока ЖХМС не покажет отсутствие продукта реакции в водном слое. Раствор в CHCl сушат над NaSO и концентрируют. Сырой продукт реакции снова растворяют в CHCl (10 мл) и МеОН (1 мл), очищают на колонке с силикагелем с элюированием системой CHCl/МеОН/NEt (колонка Biotage 40+: уравновешивание 600 мл CHCl 100%, получение побочного продукта, сегмент 1: 1200 мл 10% МеОН/CHClлинейный, сегмент 2: 2400 мл 10% МеОН/CHClступенчатый, сегмент 3: 2400 мл 9% МеОН/1% NEt/CHCl) Нужные фракции собирают и получают 3-[(R)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(1-пиперидин-4-ил-1Н-пиразол-4-ил)пиридин-2-иламин (7,19 г, общий выход 75%, белое твердое вещество). МС m/e 450 (M+1). Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 7,92 (с, 1Н), 7,76 (с, 1Н), 7,58 (м, 1Н), 7,53 (с, 1Н), 7,45 (м, 1Н), 6,90 (с, 1Н), 6,10 (м, 1Н), 5,55 (уш.с, 2Н), 4,14 (м, 1Н), 3,05 (м, 2Н), 2,58 (м, 2Н), 1,94 (м, 2Н), 1,80 (д, 3Н), 1,76 (м, 2Н).
Твердый продукт реакции 3-[(R)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(1-пиперидин-4-ил-1Н-пиразол-4-ил)пиридин-2-иламин растворяют в дихлорметане и растворитель медленно выпаривают для получения кристаллического твердого вещества. После сушки в высоком вакууме подтверждают, что образец является одной кристаллической полиморфной формой А с температурой плавления 194°С.