КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА
COMPOSITION FOR APPLICATION IN PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER

Изобретение относится к медицине, в частности к фотодинамической терапии (ФДТ) рака, конкретно к новой терапевтической композиции, представляющей собой фторуглеродную эмульсию, включающую фотосенсибилизатор, растворенный во фторуглеродной фазе.
Фотодинамическая терапия является высокоэффективным способом избирательного разрушения опухолей, который не уступает традиционным методам лечения. Фотодинамическая терапия известна с 1975 г. (Dougherty, T.G.; Grindey, G.B.; Fiel, R. Photoradiation therapy II. Culture of animal tumors with hematoporphyrin and light. J. Natl. Cancer Inst., 55, 155, 1975) и в последующие годы получила широкое распространение в США, Европе, Китае и Японии. В Российской Федерации ФДТ применяют с 1996 г.
Фотодинамическая терапия является разновидностью химиотерапии и заключается в локальной активации фотосенсибилизатора (ФС), введенного в опухоль, видимым красным светом, что в присутствии кислорода тканей приводит к развитию фотохимической реакции, разрушающей опухолевые клетки. ФДТ позволяет избежать системного (общего) воздействия на организм, характерного для обычной химиотерапии.
Механизм цитотоксического действия ФДТ описан в работах (Clifton, N.J., Methods in molecular biology, 2010, ISBN 978-1-60761-696-2, ISSN 1064-3745; J. Fuchs, J. Thiele, Free Radical Biology & Medicine, 1998, Vol. 24, No. 5, pp. 835-847). При облучении фотосенсибилизированной опухолевой ткани лазером в красном диапазоне происходит переход нетоксичного триплетного кислорода, содержащегося в опухолевой ткани, в синглетное состояние, обладающее выраженным цитотоксическим действием. Биомолекулы, входящие в состав мембран опухолевых клеток (ненасыщенные жирные кислоты, холестерин, боковые цепи альфа-аминокислот - триптофана, метионина, гистидина), активно реагируют с синглетным кислородом, что позволяет рассматривать их в качестве наиболее вероятных мишеней. Таким образом, ФДТ - трехкомпонентный метод лечения, составными частями которого являются фотосенсибилизатор, кислород, присутствующий в опухоли, и световое воздействие.
Известно, что в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ успешно используются соединения порфиринового ряда (хлорины, бактериохлорины, порфирины и др.) (М. Ethirajan, Y. Chen, P. Joshi, R.К. Pandey. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 340362). Фотосенсибилизаторы, представляющие собой соединения порфиринового ряда, способны селективно накапливаться в тканях злокачественных опухолей и практически не задерживаются в нормальных клетках; они обладают низкой темновой токсичностью, устойчивы при хранении и введении в организм, стабильны при световом воздействии, характеризуются высоким квантовым выходом триплетного состояния с энергией не меньше 94 кДж/моль, имеют интенсивный максимум поглощения в области 650-900 нм; являются коммерчески доступными соединениями или легко синтезируются.
Известно, что в настоящее время в клинике в качестве порфириновых ФС для ФДТ широко используются препараты, которые являются производными порфиринов и родственных соединений, такие как Amphinex, ADPM06, Chlorine еб, Fimaorfin (TPCS2a), Lemuteporfin, MPPa, Motexafin gadolinium, Motexafin lutetium, Padoporfin, Rostaporfin, Porfimer sodium, Stannsoporfin, Sonoflora 1, Talaporfin sodium, Temoporfin, WST11 (Stakel) и другие.
Одним из основных требований к современным ФС является хорошая растворимость в воде или в жидкостях и плазмозаменителях, разрешенных для внутривенного введения. В частности, для введения и транспортировки ФС используют различные эмульсионные системы типа масло/вода или вода/масло, в которых ФС находится внутри микрокапсулы, липосомы или в адсорбционном слое наночастицы. Особый интерес вызывают наноэмульсии перфторуглеродов, которые не только доставляют ФС в опухоль, но и увеличивают содержание кислорода в ней (S. Khatri, Р. Lohani, S. Gandhi, Indo Global, Nanoemulsions in Cancer Therapy. Journal of Pharmaceutical Sciences, 3 (2), 124-133, 2013).
2
Одним из факторов, способствующих повышению чувствительности опухолей к воздействию ФС, является повышение содержания в них кислорода. Большинство солидных опухолей находятся в состоянии гипоксии в результате нарушений микроциркуляции в клетках и повреждений в диффузионных каналах. С этой точки зрения использование перфторуглеродов, обладающих значительной кислородной емкостью (40-56 мл O в 100 мл при атмосферном давлении), в качестве среды для ФС, которые одновременно доставляют ФС в опухоль и выполняют газотранспортную функцию, повышая содержание кислорода в опухоли, остается одним из наиболее перспективных направлений при разработке новых препаратов для ФДТ (Urgen Fuchs, Jens Thiele, The role of oxygen in cutaneous photodynamic therapy, Free Radical Biology and Medicine, v. 24, №5, 835-847, 1998).
19
Существенными преимуществами применения перфторуглеродов в ФДТ является их инертность в биологических системах, увеличенное время жизни синглетного кислорода, которое во фторуглеродных средах на 3-4 порядка больше, чем в воде, и возможность визуализации фторуглеродных систем в организме методом МРТ F.
Известны фармацевтически приемлемые перфторуглеродные эмульсии, насыщенные кислородом, при введении которых в гипоксическую зону опухоли повышается эффективность применяемой лучевой терапии за счет локальной оксигенации (US 4781676, 01.11.1988; US 5567765, 22.10.1996). Такое применение ограничивается необходимостью достижения опухолью размеров, позволяющих провести ее четкую локализацию, но при этом содержание кислорода повышается во всех тканях организма и цитотоксические лекарственные вещества поступают не только в опухоль, но и другие ткани организма, что вызывает усиление побочных эффектов.
Уменьшение побочных эффектов химиотерапии и ФДТ при сохранении их эффективности в настоящее время является одним из наиболее актуальных направлений. Особое внимание уделяется развитию направленной фотодинамической терапии рака (НФДТ), основанной на таргетной доставке активной субстанции, проводятся исследования по применению фторуглеродных эмульсий, включающих противоопухолевые средства или фотосенсибилизаторы.
Известны композиции для лечения солидных опухолей, содержащие стволовые мезенхимальные клетки и вещества с противоопухолевым действием и включающие наночастицы перфторуглеродов. Приготовление таких композиций проводят путем инкубации в среде фармацевтически приемлемой водной наноэмульсии перфторуглеродов с диаметром частиц не более 300 нм (Патент РФ №2437692, 12.03.2010).
Известна композиция для использования в ФДТ, полученная путем совместного культивирования эмульсии перфторуглеродов с Радохлорином в качестве ФС и стволовых клеток костного мозга (Патент РФ №2440158, 25.02.2010).
Недостатками вышеуказанных композиций является необходимость использования генетически модифицированных клеток, процедура получения которых является трудоемкой и дорогостоящей.
Известна композиция для ФДТ, представляющая собой эмульсию перфторгексана и фотосенсибилизатора IR780, стабилизированную смесью лецитина и холестерина [Yuhao Cheng, Нао Cheng, Chenhiao Jiang. Xuefeng Qiu, Kaikai Wang, Wei Huan, Ahu Yuan, Jinhui Wu, Yiqiao Hu, Perfluorocarbon nanoparticles enhance reactive oxygen levels and tumor growth inhibition in photodynamic therapy, Nature communications, 2015). Указанная композиция является наиболее близкой к заявляемой по совокупности существенных признаков и была выбрана в качестве прототипа.
Наночастицы такой композиции со средним диаметром 200 нм состоят из фторуглеродного ядра и липидного монослоя, в котором содержится липофильный фотосенсибилизатор IR780.
Недостатком композиции-прототипа является высокая темновая токсичность используемого ФС, что отчасти нивелируется нанесением его на частицы эмульсии. Однако в условиях кровотока в присутствии эндогенных ПАВ высока вероятность вымывания ФС с поверхности наночастиц эмульсии. В этом случае нарушается одновременная локализация в раковой клетке фотосенсибилизатора и фторуглерода, используемого в качестве депо кислорода, что требует использования высоких доз фотосенсибилизатора для подавления роста 50% клеток и в целом снижает эффективность таргетного применения ФДТ.
Создание композиций в виде фторуглеродных эмульсий, содержащих фотосенсибилизатор, растворенный непосредственно во фторуглеродной фазе эмульсии, позволило бы обеспечить доставку ФС и одновременное насыщение опухоли кислородом за счет введения газопереносящей среды и повысить эффективность ФДТ.
Однако до сих пор не известны композиции для применения в ФДТ, представляющие собой фторуглеродные эмульсии, во фторуглеродной фазе которых растворен фотосенсибилизатор. Предлагаемое в настоящем изобретении техническое решение обеспечивает создание вышеуказанных композиций.
Задачей настоящего изобретения является создание композиции для применения в ФДТ, обладающей противоопухолевой активностью и представляющей собой эмульсию фторуглеродов в воде, включающую фотосенсибилизатор, способный растворяться во фторуглеродной фазе эмульсии.
Задача решается заявляемой композицией для применения в фотодинамической терапии рака, обладающей противоопухолевой активностью, которая представляет собой эмульсию фторуглеродов в воде, включающую фотосенсибилизатор и стабилизатор эмульсии, причем фотосенсибилизатор растворен во фторуглеродной фазе эмульсии; в качестве фотосенсибилизатора используют порфирин, способный растворяться во фторуглеродной фазе, имеющий в своей структуре полифторсодержащие заместители, в качестве фторуглеродной фазы используют смесь фторуглеродов перфтордекалина (ПФД) и перфтор-N-(4-метилциклогексил)пиперидина (ПМЦП), а в качестве стабилизатора эмульсии используют проксанол-268. При этом композиция имеет следующий состав (мас. %):
Смесь фторуглеродов ПФД и ПМЦП
при массовом соотношении 2:1
5-30
Проксанол-268
2-8
Фотосенсибилизатор
0.01-0.04
NaCl
0.7-0.9
Вода
остальное
При разработке заявляемой композиции учтены требования, предъявляемые к эмульсии фармацевтического назначения, а также в отдельности к каждому ее компоненту. По современным представлениям необходимыми требованиями к эмульсионным композициям фармацевтического назначения для ФДТ являются размер частиц, не превышающий 200 нм, значительный срок хранения, отсутствие токсичности, приемлемый период полувыведения из организма.
2
2
m
3
2
n
2
2
m
Указанным требованиям в полной мере удовлетворяет официально зарегистрированный препарат «Перфторан» (номер регистрационного удостоверения Р N001962/01-2002), используемый в качестве кровезаменителя с газотранспортной функцией (RU 2393849, Вестник Российской академии наук 1997, том 67, №11, с. 998-1013, Г.Р. Иваницкий, С.И. Воробьев «Кровезаменитель «Перфторан»). Препарат представляет собой эмульсию фторуглеродов (цис- и транс- изомеры перфтордекалина (ПФД), перфтор-N-(4-метилциклогексил)пиперидин (ПМЦП) в физиологическом растворе, стабилизированную проксанолом-268 (блок-сополимер окиси этилена и окиси пропилена Н-(-CHCHO-)-(-СН(CH)CHO-)-(-CHCHO-)-Н, где n~45, m~118). Состав препарата «Перфторан» взят за основу при разработке настоящего изобретения.
Известны фторуглеродные эмульсии «Oxygent» и «Fluosol-DA», разрабатываемые в качестве препаратов-кровезаменителей и отличающиеся от «Перфторана» характером фторуглеродных компонентов и их концентрацией. Состав этих препаратов также может быть основой при создании композиции для ФДТ, при условии соблюдения вышеуказанных требований.
В качестве предлагаемой в изобретении фторуглеродной фазы могут использоваться любые другие фторуглероды, обладающие подходящими свойствами, такими как химическая инертность, кислородная емкость, отсутствие токсичности, способность образовывать устойчивые эмульсии с использованием нетоксичных эмульгаторов.
Техническим результатом изобретения является новая композиция для ФДТ, которая представляет собой фторуглеродную эмульсию в воде, включающую полифторсодержащий фотосенсибилизатор, структура которого обеспечивает его растворение во фторуглеродной фазе эмульсии; повышение фототоксичности фотосенсибилизатора по отношению к клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека (НСТ116) при введении его в составе заявляемой композиции.
Технический результат достигается при использовании заявляемой композиции, которая обеспечивает доставку фотосенсибилизатора в опухоль и повышение содержания кислорода в опухоли за счет одновременного введения газопереносящей фторуглеродной среды, в которой растворен ФС.
Для достижения результата необходимо соблюдение ряда требований к индивидуальным компонентам эмульсии, а также к способу ее приготовления.
-4
К фторуглеродным компонентам предъявляются требования по контролируемому содержанию примеси фторид-иона, которое не должно превышать 10 М. Таким образом достигается нетоксичность и апирогенность предлагаемых эмульсий [«Клеточный тест на токсичность эмульсий ПФОС и их компонентов: корреляция между химическим и биологическим тестированием», сборник научных трудов под ред. проф. Ф.Ф. Белоярцева. «Фторуглеродные газопереносящие среды», Пущино. 1984, с. 51].
Приготовление эмульсии для создания заявляемой композиции может осуществляться любым известным способом диспергирования, обеспечивающим получение коллоидной системы с размером частиц до 200 нм. В качестве компонентов используется 10%-ный раствор Проксанола-268 и раствор соответствующего фторсодержащего ФС во фторуглероде или в смеси фторуглеродов.
Хранение полученных образцов эмульсии следует осуществлять в замороженном состоянии при температуре не выше -18°C. Кристаллизация дисперсионной среды (водного раствора) незначительно влияет на морфологию частиц эмульсии. Более важным фактором является количество циклов заморозки/разморозки.
-4
В качестве ФС используют химические соединения, обладающие необходимым комплексом физико-химических свойств - способностью к поглощению света в диапазоне длин волн 650-780 нм, способностью к генерации активных форм кислорода, растворимостью во фторуглеродных компонентах эмульсии в количестве не менее 10 М, отсутствием темновой токсичности по отношению к клеткам и тканям организма, фототоксичностью по отношению к клеткам и тканям раковой опухоли.
4
8
Известно, что для обеспечения достаточной растворимости во фторуглеродных жидкостях необходимо наличие в молекуле порфирина не менее четырех перфторалифатических фрагментов с длиной цепи C-C [Pozzi, G.; Banfi, S.; Manfredi, A.; Montanari, R; Quid, S. Tetrahedron 1996, 52, 11879-11888].
Получен ряд порфиринов, имеющих в своей структуре фторалифатические фрагменты, например соединения общей формулы I и II. Показано, что полученные соединения поглощают свет при длине волны 650 нм, обладают способностью к генерации синглетного кислорода, не имеют темновой токсичности, обладают фототоксичностью по отношению к клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека (НСТ116) и клеточной линии миелоидного лейкоза человека (K562). Синтез порфиринов формулы I осуществляют из фторсодержащих 1-пирролил-карбинолов циклизацией в присутствии n-толуолсульфокислоты и последующим окислением дихлордицианохинолином или другими подходящими окислителями [Goll, J.G.; Moore, К.Т.; Ghosh, A.; Therien, М.J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8344-8354]. Синтез порфиринов формулы II осуществляли прямым замещением атома фтора в 4-м положении пентафторфенильного или 4-фторфенильного фрагмента в мезо-положении порфирина, а также путем конденсации 4- или 2,4,6-фторалкилзамещенных бензальдегидов с пирролом в присутствие эфирата трехфтористого бора [Belyaeva E.V., Sigan A.L., Druzhinina I.E., Ikonnikov N.S., Chkanikov N.D. Fluorine Notes, 2015, 5 (102).].
Результаты клеточных тестов свидетельствуют о том, что указанные фотосенсибилизаторы, специально сконструированные для введения во фторуглеродную фазу эмульсии, обладают пренебрежительно малой темновой токсичностью по отношению к раковым клеткам как сами по себе, так и в составе заявляемой композиции. При световом лазерном воздействии на раковые клетки, предварительно инкубированные с растворами ФС и с эмульсиями, содержащими ФС, наблюдается выраженное цитотоксическое действие. Сравнение показателей гибели раковых клеток показало, что фототоксичность указанных фотосенсибилизаторов усиливается при использовании ФС в составе заявляемой композиции.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами. В примерах 1 и 2 описан синтез фотосенсибилизаторов (полифторалкилзамещенных порфиринов) и способ приготовления фторуглеродных эмульсий на их основе. Образцы заявляемой композиции в виде эмульсий с фотосенсибилизаторами 1 и 2 (ФС-1 и ФС-2) были протестированы на опухолевых клетках человека при облучении светом лазера с длиной волны 633 нм.
Пример 1
ФС-1 (мезо-тетракис(2,3,5,6-тетрафтор-4-(1,1-Н,Н-перфторгептилокси)фенил)порфирин) получают в одну стадию из коммерчески доступного мезо-тетракис(пентафторфенил)порфирина путем замещения атомов фтора в 4-м положении пентафторфенильных фрагментов на остаток 1,1-Н,Н-перфторгептанола-1 в присутствии сильного основания (гидрооксида калия) [Belyaeva E.V., Sigan A.L., Druzhinina I.E., Ikonnikov N.S., Chkanikov N.D. Fluorine Notes, 2015, J (102)].
3
2
К раствору мезо-тетракис(пентафторфенил)порфирина (0.5 г, 0.51 ммоль) и 1,1-Н,Н-перфторгептанола-1 (2.16 г, 6.2 ммоль) в ТГФ (200 мл) прибавляют KOH (2,86 г, 51 ммоль) и кипятят в инертной атмосфере 4 часа. Реакционную массу помещают в воду и экстрагируют диэтиловым эфиром. Органическую фазу промывают насыщенным водным раствором NaHCO (2×40 мл) и сушат над CaCl. После удаления растворителя полученную массу очищают колоночной хроматографией (силикагель, хлороформ). Получено 0.55 г порошка фиолетового цвета (выход 47%).
1
3
1
2
2
H
H
H
ЯМР Н (300.13 МГц, CDCl, δ, м.д.): -2.86 (с, 2Н, N), 5.11 (т, 8Н, J=12.79 Гц, J=12.56 Гц, OC, 8.97 (с, 8Н, Pyr-).
19
орто
мета
3
-1
-1
1
1
3
Ar
1
2
Ar
2
2
2
2
2
2
2
F
F
F
F
F
ЯМР F (282.38 МГц, CDCl, δ, м.д.): -78.48 (м, 8F, C-F), -59.44 (дд, 8F, J=13.79 Гц, J=8.19 Гц, C-F), -48.38 (м, 8F, C), -45.14 (м, 8F, C), -44.33 (м, 8F, C), -42.73 (м, 8F, C, -2.98 (т, 12F, J=9.05 Гц, C). УФ (перфтордекалин) (λ, нм (ε, 10 М*см)): 406 (137,2), 501 (13,9), 583 (4,7), 654 (2,3). Относительная квантовая эффективность фосфоресценции O (ϕ(O)), 0.83 (в бензоле).
72
18
68
4
4
Вычислено для CHFNO (%): С, 35.00; Н, 0.43; N, 2.00; F, 56.50. Найдено (%): С, 37.68; Н, 0.79; N, 2.44; F, 56.30.
Приготовление эмульсии с ФС-1 проводят следующим образом.
-3
В толстостенную стеклянную пробирку на 20 мл со сферическим дном помещают 1.3 г раствора ФС-1 в ПФД (с=3,65×10 моль/л), 0.65 г ПМЦП, 4.0 г 10% раствора проксанола-286 и 10 мл раствора для инфузий. Приготовление эмульсии осуществляют методом ультразвукового диспергирования на диспергаторе фирмы Heat system-ultrasonics, модель Sonicator W-375. Полученная эмульсия представляет собой полупрозрачную опалесцирующую субстанцию, слабо окрашенную в желтый цвет.
Полученная эмульсия имеет следующее соотношение компонентов: ПФД - 8.46%, ПМЦП - 4.06%, проксанол-286 - 2.50%, ФС-1 - 0.037%, NaCl - 0.75%, остальное - вода.
Пример 2
ФС-2 (мезо-тетракис(6-Н-перфторгексил-1)порфирин) получают в две стадии исходя из пиррола и 7-Н-перфторгептаналя. На первой стадии происходит присоединение альдегида к пирролу под действием гидрооксида натрия с образованием 1-(2-пирролил)-7-Н-перфторгептанола-1 [Sigan, Andrei L, Gusev, Dmitrii V, Chkanikov, Nikolai D, Shmidt, Elena Yu., Ivanov, Andrei V, Mihaleva, Al'bina I, Tetrahedron Letters 52 (2011) 5025-5028]. Затем полученный пирролил-карбинол вводят в реакцию циклизации в присутствии п-толуолсульфокислоты и окисляют дихлордицианохинолином (DDQ) с образованием
ФС-2.
Стадия 1
7-Н-перфторгептаналь (6.0 г, 20 ммоль) помещают в сосуд Шленка на 50 мл, дегазируют и заполняют аргоном. Прибавляют пиррол (2.68 г, 40 ммолей) и измельченный NaOH (2.08 г, 52 ммоль), полученную смесь интенсивно перемешивают в течение 2-х часов до прекращения разогрева, оставляют на ночь при комнатной температуре. Затем полученную пастообразную массу помещают в воду (30 мл) и экстрагируют продукт хлористым метиленом (2×20 мл). Органическую фазу сушат над сульфатом натрия. После удаления растворителя получен твердый продукт-сырец темно-красного цвета. После перекристаллизации из бензола получают 3.24 г белого кристаллического вещества, (выход 37%).
1
3
1
HF
HF
2
Н
Н
H
H
H
H
H
Н ЯМР (300.13 МГц, CDCl, δ, м.д.): 2.51 (д, 1H, J=4.77 Гц, О); 5.31 (дм,1H, J=16.75 Гц, С(ОН)); 6.07 (тт, 1H, J=51.98 Гц, J=5.25 Гц, CF); 6.24 (м, 1H, Pyr-); 6.35 (м, 1H, Pyr-)), 6.90 (м, 1Н, Pyr-) ); 8.55 (с, 1H, N).
19
3
F ЯМР (282.38 МГц, CDCl, δ, м.д.): -59.37 (д, 2F, J=30.52 Гц); -51.89 (с, 2F); -46.85 (д, 1F, J=280.43 Гц, А часть АВ-системы); -45.76 (д, 2F, J=70.19 Гц); -44.39 (д, 2F, J=42.72 Гц); -43.89 (с, 2F); -40.97 (дт, 1F, J=280.43 и 15.78 Гц, В часть АВ-системы).
Стадия 2
Моногидрат толуолсульфокислоты (0.057 г, 0.3 ммоль) растворяют в сухом бензоле (650 мл) и кипятят с насадкой Дина-Старка, заполненной свежепрокаленными молекулярными ситами  и эффективным холодильником в течение 30 минут. Пропускают через реакционную смесь аргон в течение 20 минут. Прибавляют 7-Н-1-(1-Н-пиррол-2-ил)-перфторгептанол-1 (0.4 г, 1.0 ммоль) и кипятят 45 минут, прибавляют DDQ (0.59 г, 2.6 ммоль) и продолжают кипячение еще 30 минут. Прибавляют триэтиламин (0.04 мл, 0.3 ммоля) при перемешивании и удаляют растворитель. Растворяют остаток в хлороформе и пропускают через слой силикагеля. Полученный твердый остаток (0.2 г) промывают метанолом на фильтре до бесцветного раствора, нерастворенный остаток очищают хроматографически (силикагель, элюент гексан-хлороформ = 2-1). Получают 80 мг фиолетово-коричневого порошка (выход 21%).
1
19
3
HF
2
3
H
H
H
Н ЯМР (300.13 МГц, CDCl, δ, м.д.): -2.28 (с, 2Н, N); 6.28 (т, 4Н, J=52.30 Гц, CF); 9.55 (с, 8Н, Pyr-). F ЯМР (CDCl, δ, м.д.): -61.10 (с, 2F); -53.37 (с, 2F); -47.15 (с, 2F); -45.27 (с, 2F); -37.96 (с, 2F). УФ (в перфтордекалине) (λ, нм): 410, 514, 547, 598, 654.
1
1
2
2
Относительная квантовая эффективность фосфоресценции O (ϕ(О)), 0.72 (в бензоле).
Приготовление эмульсии с ФС-2 осуществляют так же, как описано в Примере 1 для эмульсии с ФС-1.
-3
В толстостенную стеклянную пробирку на 20 мл со сферическим дном помещают 1.3 г раствора ФС-2 в ПФД (с=1,81×10 моль/л), 0.65 г ПМЦП, 4.0 г 10% раствора проксанола-286 и 10 мл раствора для инфузий. Приготовление эмульсии осуществляют методом ультразвукового диспергирования. Полученная эмульсия представляет из себя полупрозрачную опалесцирующую субстанцию, слабо окрашенную в желтый цвет.
Полученная эмульсия имеет следующее соотношение компонентов: ПФД - 8.15%, ПМЦП - 4.08%, проксанол-286 - 2.51%, ФС-2 - 0.012%, NaCl - 0.77%, остальное - вода.
Образцы заявляемой композиции в виде эмульсий, полученных в примерах 1 и 2, а именно эмульсии ФС-1 и ФС-2, были протестированы на фототоксичность.
2
Для экспериментов использовали клеточную линию НСТ116 - аденокарцинома толстой кишки человека. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением следующих компонентов до конечных концентраций: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Условия культивирования: 37°C, 5% CO в увлажненной атмосфере. В экспериментах использовали культуру в логарифмической фазе роста.
3
2
2
Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar, США) в концентрации 5-10×10 клеток в 190 мкл культуральной среды. В лунки с клетками вносили образцы эмульсии из примеров 1 и 2, а также ФС-1 и ФС-2 из 10 мМ растворов ДМФ до конечных концентраций ФС-1 и ФС-2 в культуральной среде 5,10, 20 мкМ. В контролях - клетки с эмульсией, не содержащей ФС (соотношение эмульсия: клеточная среда 1:2 по объему) и интактные клетки. Планшеты с данными пробами готовили для исследования темновой и фототоксичности - по 1 планшету на измерение в соответствующем режиме. Каждую концентрацию исследовали при 3 повторах. Культуры инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO в течение 24 часов. После окончания инкубации планшеты для исследования темновой токсичности оставляли в темноте, остальные - освещали 10 минут красным лазером (633 нм), после чего инкубировали еще 1 час при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO.
2
Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ-теста (цветная реакция, развивающаяся при восстановлении МТТ в формазан митохондриями живых клеток). В лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия), инкубировали 1,5 часа при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO. После окончания инкубации культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 591 нм. Процент клеток, выживших в экспериментальных лунках, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в этих лунках к средней оптической плотности контрольных интактных лунок (значения последних приняты за 100%). Результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Результаты определения темновой токсичности показали, что ФС-1 и ФС-2 как в ДМФ растворах, так и в составе композиций в виде эмульсии являются нетоксичными для клеток (выживаемость больше 90%). Кроме того, эмульсия, не содержащая фотосенсибилизаторов, благотворно влияет на жизнеспособность клеток, под ее действием в условиях эксперимента прирост клеток составил 30% относительно контрольной интактной пробы (% выживаемости - 130).
Результаты определения фототоксичности образцов фотосенсибилизаторов (ФС-1 и ФС-2) показывают, что цитотоксическое действие ФС усиливается, когда ФС вводят в составе заявляемых композиций в виде эмульсий. Доказано, что эффект гибели клеток обусловлен именно действием фотосенсибилизатора, поскольку эмульсия, не содержащая ФС не обладает фототоксичностью (% выживаемости - 97 относительно интактной пробы). Дополнительным доказательством служит различие в процентах выживаемости клеток под действием разных фотосенсибилизаторов, вводимых как в составе эмульсии, так и в ДМФ растворе. Например, ФС-2 обладает большим фототоксическим эффектом, чем ФС-1, он в большей степени вызывает гибель опухолевых клеток при введении в составе эмульсии, чем ФС-1. При введении всех исследуемых ФС в составе заявляемой композиции в виде эмульсии их цитотоксическое действие выше, чем при введении в растворе.