Применение жидкостной хроматографии для исследования органических кислот и углеводов в сусле и бражке

физические и химические методы переработки сельхозпродукции

УДК 663.5

Применение жидкостной хроматографии для исследования органических кислот и углеводов в сусле и бражке

В. А. ПОЛЯКОВ, д-р техн. наук, академик РАН; И. М. АБРАМОВА, д-р техн. наук; М. Э. МЕДРИШ, канд. техн. наук; Д. А. ГАВРИЛОВА; С. В. ПАВЛЕНКО ВНИИ пищевой биотехнологии — филиал ФНЦ питания и биотехнологии, Москва

Современные технологии производства спирта из зернового сырья направлены на получение максимально возможного выхода готового продукта с хорошими органолептическими показателями [1]. Вследствие этого возникает необходимость в оперативной управляемости производством спирта. Контроль процесса осахаривания сусла является особенно важным, поскольку позволяет отслеживать степень осахаривания крахмала, количество образовавшихся сбраживаемых углеводов, а следовательно и выход конечного продукта.

В настоящее время известны различные методы определения углеводов в зерновом сусле и бражке: химические [2—4], физико-химические [5], спектро-фотомерия в видимой и УФ-областях спектра [6], ИК-спектроскопия и ЯМР, газовая хроматография [7, 8], капиллярный электрофорез [9, 10], высокоэффективная жидкостная хроматография [11, 12].

В России сбраживаемые углеводы определяют в основном фотоэлектроколориметрическим методом с использованием антронового реагента. Недостатками этого метода являются: большое число операций и кипячение с концентрированной серной кислотой. Данный метод позволяет определять суммарное количество углеводов в сусле и бражке.

Кислотность сусла и бражки определяют титри-метрическим способом [3]. Для него характерны: субъективность определения точки конца титрования, изменение во времени концентрации раствора щелочи, наличие димеров в растворах слаборазбав-ленных органических кислот, большие затраты времени на проведение анализа. Кроме того, с применением данного метода возможно лишь суммарное определение органических кислот. Метод капиллярного электрофореза с кондуктометрическим детектированием по ГОСТ Р 55761—2013 [13] не позволяет

определять анионы органических кислот в зерновом сусле и бражке, так как слабые органические кислоты (уксусная, яблочная, молочная) слабо диссоциируют в водном растворе, таким образом, основная часть кислот в растворе находится в недиссоциированной форме и лишь небольшая часть в виде солей органических кислот, которые и определяют данным методом.

Таким образом, возникает необходимость разработки новых высокочувствительных экспресс-методик для исследования изменения углеводного состава и органических кислот в зерновом сусле и бражке.

Наиболее высокочувствительным и точным для анализа углеводов и органических кислот в сусле и бражке является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефрактометрическим детектированием (для определения углеводов) и спектро-фотометрическим детектированием (для определения органических кислот) [14].

Массовые концентрации глюкозы, мальтозы, фруктозы, молочной и уксусной кислот в зерновом сусле и бражке определяли на хроматографе Shimadzu LC-2010 с дифференциальным рефрактометрическим детектором RID-10A и спектрофотометрическим детектором SPD-20A с использованием хроматогра-фической колонки Rezex ROA-Organic Acid H+, содержащей смолу с 8%-ной степенью сшивки в водородной ионной форме (300x7,8 мм, размер частиц 8 мкм). В качестве элюента применялась ультрачистая вода для ионной хроматографии (18 MOhm). Скорость потока подвижной фазы 0,6 мл/мин. Давление 2,3 MPa, максимальная температура в колонке 60 °С, объем 20 мкл.

Метод основан на процессах лигандного обмена и ионной эксклюзии, приводящих к разделению углеводов и органических кислот на разделительной хро-

Рис. 1. Образец сусла (тритикале). Массовые концентрации (г/100см3):мальтозы 11,81; глюкозы 2,81; фруктозы 0,78; молочной кислоты 0,003

Рис. 2. Образец бражки (кукуруза). Массовые концентрации (г/100см3):мальтозы 0,51; глюкозы 6,02; фруктозы 0,16; молочной кислоты 0,063

Содержание углеводов и органических кислот в образцах сусла и бражки, г/100 см3

Образец Мальтоза Глюкоза Фруктоза Молочная кислота

Время удерживания, мин 8,5 10,1 10,8 13,6

Сусло (пшеница) 7,50 7,53 0,47 0,0024

Бражка (пшеница) 66 ч 0,35 0,74 0,17 0,4

Сусло (рожь) 9,53 13,89 0,68 0,0035

Бражка (рожь) 1 сут 0,52 1,13 0,59 0,1

Бражка (рожь) 2 сут 0,46 0,80 0,50 0,15

Бражка (рожь) 3 сут 0,31 0,24 0,28 0,33

Бражка (рожь) 66 ч 0,41 0,22 0,11 0,801

Сусло (тритикале) 11,81 2,81 0,78 0,0027

Бражка (тритикале) 1 сут 0,48 1,57 0,58 0,059

Бражка (тритикале) 2 сут 0,52 0,90 0,55 0,084

Бражка (тритикале) 3 сут 0,24 0,23 0,18 0,424

Сусло (кукуруза) 9,59 15,31 0,66 0,0029

Бражка (кукуруза) 1 сут 0,51 6,02 0,16 0,063

Бражка (кукуруза) 2 сут 0,59 1,21 0,28 0,092

Бражка (кукуруза) 3 сут 0,35 0,28 0,15 0,509

матографической колонке и последующем детектировании и определении их концентрации в сусле и бражке.

Диапазон измерений массовой концентрации мальтозы, глюкозы, фруктозы 0,01—4,0 г/100 см3; уксусной, молочной кислот — 0,01—5,0 г/100 см3.

Для изучения динамики изменения углеводного состава и органических кислот в сырье были проанализированы образцы сусла и бражки из различного зернового сырья (рожь, пшеница, кукуруза, тритикале). Пробы сусла и бражки подвергали хроматогра-фическому анализу после предварительной пробо-подготовки. Образцы фильтровали через бумажный фильтр, затем центрифугировали в течение 7 мин при 13 000 мин-1. Для примера на рис. 1, 2 представлены хроматограммы образцов сусла и бражки, а в таблице приведены массовые концентрации углеводов и органических кислот.

16т

Пшеница Кукуруза Тритикале Рожь

| Мальтоза Щ Глюкоза Щ Фруктоза Щ Молочная кислота

Рис. 3. Содержание углеводов и органических кислот в образцах сусла из различного зернового сырья

0,9 -г 3 0,8-

Бражка Бражка Бражка Бражка Бражка (рожь) (тритикале) (кукуруза) (пшеница) (рожь) 3 сутки 3 сутки 3 сутки

| Мальтоза Щ Глюкоза Щ Фруктоза Щ Молочная кислота

Рис. 4. Содержание углеводов и органических кислот в образцах бражки из различного зернового сырья

По основе полученных данных построены диаграммы углеводного состава и состава органических кислот сусла и бражки (рис. 3, 4).

Из диаграмм видно, что преобладающим компонентом в сусле является глюкоза для всех видов сырья, за исключением тритикале. В бражках преобладает мальтоза, что, свидетельствует о неоконченном процессе брожения.

Таким образом, применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефрактометрическим детектированием (для определения углеводов) и спектрофотометрическим детектированием (для определения органических кислот) позволяет за короткое время проводить высокочувствительный анализ углеводов и органических кислот, а также прослеживать динамику изменения углеводного состава и органических кислот в зерновом сусле и бражке.

Литература

1. Абрамова, И. М. Научное обоснование методологии комплексного контроля спиртового и ликероводочного производства с целью повышения качества и безопасности алкогольной продукции: дисс. ... д-ра техн. наук. — Москва, 2014. — 51 с.

2. ГОСТ 31683-2012 Зерновое крахмалсодержащее сырье для производства этилового спирта. Методы определения массовой доли сбраживаемых углеводов. — Введ. 2013.07.01. — М.: Стандартинформ, 2013. — 24 с.

3. Абрамова, И. М. Инструкция по технохимическому и мик-

References

1. Abramova I. M. Nauchnoe obosnovanie metodologii komplek-snogo kontrolya spirtovogo i likerovodochnogo proizvodstva s tsel'yupovysheniya kachestva i bezopasnosti alkogol'noiproduk-tsii: Avtoref. dis. d-ra tekhn. nauk [Scientific substantiation of the methodology of integrated control of alcohol and distillery production with the purpose of improving the quality and safety of alcohol products: Dr. Diss. (Techn. Sci.)]. Moscow, 2014.

2. GOST 31683—2012 Grain starch-containing raw materials for the production of ethyl alcohol. Methods for determining the

робиологическому контролю спиртового производства / И. М. Абрамова. — М: Дели принт, 2007. — 480 с.

4. Deriy, E. Refinement of the physical and chemical methods for the determination of sugars / E. Deriy [et al] // Ukrainian Journal of Food Science. — 2013. — Vol. 1. — P. 54-58.

5. Алферов, В. А. Определение содержания углеводов и спиртов в полупродуктах спиртовых производств с использованием биосенсоров / В. А. Алферов, В. А. Арляпов, С. С. Каманин // Известия Тульского государственного университета. — 2010. — Вып. 2. — С. 247-255.

6. Goeij, S. Quantitative analysis methods for sugars / S. Goeij. — University of Amsterdam. — 2013. — P. 43.

7. Escudero, R. R. Optimization of carbohydrate silylation for gas chromatography / R. R. Escudero // J. of Chromatography A. — 2004. — V. 1027. — P. 117-120.

8. Fuzfai, Z. Simultaneous Identification and Quantification of the Sugar, Sugar Alcohol and Carboxylic Acid Contents of Sour Cherry, apple and Beer fruits as their Trimethylsilyl Derivates, by Gas-Chromatography-Mass Spectrometry / Z. Fuzfai [et al] // J. Agric Food Chem. — 2004. — Vol. 52. — Vol. 7444-7452.

9. RamiTrez, S. C. Indirect determination of carbohydrates in wort samples and dietetic products by capillary electrophoresis / S. C. Ramirrez [et al] // Journal of the Science of Food and Agriculture. — 2005. — Vol. 85. — P. 517-521.

10. Klampfl, C. W. Determination of carbohydrates by capillary electrophoresis with electro spray mass spectrometric detection / C. W. Klampfl, W. Buchberger // Electrophoresis. — 2001. — Vol. 22. — P. 2737-2742.

11. Jurkova, M. Determination of Total Carbohydrate Content in Beer Using Its Pre-column Enzymatic Cleavage and HPLC-RI / M. Jurkova, P. Cejka, K. Sterba // Food Anal. Methods. — 2014. — Vol. 7. — P. 1677-1686.

12. Stemmelen, A. Determining the sugar content in grape juice by HPLC-RID / A. Stemmelen // Master Analysis and Control. — 2012. — P. 39.

13. ГОСТ 55761-2013 Замесы, сусло, бражка из пищевого сырья. Определение массовой концентрации катионов, анионов органических и неорганических кислот методом капиллярного электрофореза. — Введ. 2013.11.08. — М.: 2014. — 13 с.

14. Абрамова, И. М. Применение метода ионной хроматографии в контроле ингредиентного состава алкогольной продукции / И. М. Абрамова, М. Э. Медриш, В. А. Поляков // Сб. материалов всероссийской научно-практ. конф. «Современные биотехнологии переработки сельскохозяйственного сырья и вторичных ресурсов». — М.: Рос-сельхозакадемия. — 2009. — С. 5.

mass fraction of fermentable carbohydrates. Enter. 2013.07.01. Moscow, Standardinform, 2013. 24 p.

3. Abramova I. M. Instruktsiyapo tekhnokhimicheskomu i mikro-biologicheskomu kontrolyu spirtovogo proizvodstva [Instruction on the technochemical and microbiological control of alcohol production]. Moscow, Deli print, 2007. 480 p.

4. Deriy E. et al. Refinement of the physical and chemical methods for the determination of sugars. Ukrainian Journal of Food Science, 2013, vol. 1, pp. 54—58.

5. Alferov V. A., Arlyapov V.A., Kamanin S. S. [Determination of carbohydrates and alcohols in semi alcohol productions using biosensors]. Izvestiya Tul'skogogosudarstvennogo univer-siteta, 2010, issue 2, pp. 247—255.

6. Goeij S. Quantitative analysis methods for sugars. University of Amsterdam, 2013.

7. Escudero R. R. Optimization of carbohydrate silylation for gas chromatography. J. of Chromatography A, 2004, vol. 1027, pp. 117-120.

8. Fuzfai Z. et al. Simultaneous Identification and Quantification of the Sugar, Sugar Alcohol and Carboxylic Acid Contents of Sour Cherry, apple and Beer fruits as their Trimethylsilyl Derivates, by Gas-Chromatography-Mass Spectrometry. J. Agric Food Chem, 2004, vol. 52, vol. 7444-7452.

9. Ramirrez S. C. et al. Indirect determination of carbohydrates in wort samples and dietetic products by capillary electropho-resis. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, vol. 85, pp. 517-521.

10. Klampfl C. W, Buchberger W Determination of carbohydrates by capillary electrophoresis with electro spray mass spectro-metric detection. Electrophoresis, 2001, vol. 22, pp. 27372742.

11. Jurkova M., Cejka P., Sterba K. Determination of Total Carbohydrate Content in Beer Using Its Pre-column Enzymatic Cleavage and HPLC-RI. Food Anal. Methods, 2014, vol. 7, pp. 1677-1686.

12. Stemmelen A. Determining the sugar content in grape juice by HPLC-RID. Master Analysis and Control, 2012.

13. GOST 55761-2013 Kneading, wort, brew from food raw materials. Determination of the mass concentration of cations, anions of organic and inorganic acids by the method of capillary electrophoresis. Enter. 2013.11.08. Moscow, 2014. 13 p.

14. Abramova I. M., Medrish M. E., Polyakov V.A. [Application of the method of ion chromatography in the control of the ingredient composition of alcohol products]. Sb. materialov vserossiiskoi nauchno-prakt. konf. «Sovremennye biotekhnologii pererabotki sel'skokhozyaistvennogo syrya i vtorichnykh resur-sov» [Collection of materials of All-Russian scientific and practical. Conf. «Modern biotechnologies for the processing of agricultural raw materials and secondary resources»]. Moscow, Rossel'khozakademiya Publ., 2009, p. 5.

Применение жидкостной хроматографии

для исследования органических кислот и углеводов

в сусле и бражке

Ключевые слова

высокоэффективная жидкостная хроматография; бражка; глюкоза; мальтоза; молочная кислота; органические кислоты; углеводы; уксусная кислота.

Реферат

Среди ключевых параметров технологического процесса производства спирта важное место занимает содержание сбраживаемых углеводов (глюкозы, мальты, фруктозы) и органических кислот (уксусной, молочной). В обычных условиях спиртового брожения из гексоз под действием ферментов наряду с этиловым спиртом образуются побочные продукты (глицерин, органические кислоты, спирты, альдегиды). Количество и скорость образования органических кислот зависят от многих факторов. Все нарушения, происходящие во время технологического процесса брожения, негативно сказываются на качестве готового продукта. Так, образование уксусной кислоты усиливается при увеличении нормы введения дрожжей, повышении температуры. Молочная кислота образуется как продукт обмена дрожжей при брожении. Меры по повышению качества испытаний алкогольной продукции и сырья для ее производства включают применение и внедрение современных инструментальных методов. Актуальным направлением современных исследований является разработка высокочувствительного, точного метода анализа, который бы позволил упростить и удешевить процедуру определения углеводов и органических кислот, обеспечить возможность постоянного мониторинга изменения состава углеводов и органических кислот зернового сусла при его сбраживании. Для исследования углеводного состава и органических кислот сусла и бражки из различного зернового сырья были использованы методы высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением рефрактометрического и спектрофотометричес-кого детектирования. Новые методики определения массовой концентрации углеводов (мальтозы, глюкозы, фруктозы) и органических кислот (уксусной, молочной) основаны на процессах лигандного обмена и ионной эксклюзии. Разработанные методики позволяют сократить время анализа углеводов и органических кислот, не требуют дорогих и токсичных реагентов. Диапазон измерений массовой концентрации мальтозы, глюкозы, фруктозы 0,01-4,0 г/100 см3; уксусной, молочной кислот — 0,01 — 5,0 г/100 см3.

Авторы

Поляков Виктор Антонович, д-р техн. наук, академик РАН;

Абрамова Ирина Михайловна, д-р техн. наук;

Медриш Марина Эдуардовна, канд. техн. наук;

Гаврилова Дарья Алексеевна;

Павленко Светлана Владимировна

ВНИИ пищевой биотехнологии —

филиал ФНЦ питания и биотехнологии,

111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4б, 4953624495@mail.ru

Аpplication of High-performance Liquid chromatography for Research organic Acids and carbohydrates in the Wort and Mash

Key words

high performance liquid chromatography; mash; glucose; maltose; lactic acid; organic acids; wort; carbohydrates; acetic acid.

abstract

Among the key parameters of the technological process of alcohol productioncontent of fermentable carbohydrates (glucose, maltose, fructose) and organic acids (acetic, lactic) occupies an important place. Under ordinary conditions of alcoholic fermentation of hexoses by enzymes together with ethanol formed by-products (glycerol, organic acids, alcohols, aldehydes). The number and rate of formation of organic acids depend on many factors. All violations that occur during the process of fermentation, have a negative impact on the quality of the finished product. Since the formation of acetic acid increases with increasing rate of introduction of yeast, the temperature rises. Lactic acid is formed as a product of metabolism of yeast during fermentation. Implementation of measures to improve the quality of alcoholic products testing and raw materials for its production involves the use and application of modern instrumental methods. The actual direction of current research is to develop a highly sensitive and precise method of analysis, which would allow to simplify and reduce the cost of the procedure for determining fermentable carbohydrates and organic acids, enable the continuous monitoring of changes in the composition of carbohydrates and organic acids of grain wort during fermentation. It has been used HPLC method withrefractometric and spectrophotometric detection for the study carbohydrateand organic acids composition of the wort and mash from different grain rawmaterials. New methods for determination of mass concentration of carbohydrate (maltose, glucose, fructose) and organic acids (acetic, lactic) processes based on ligand exchange and ion exclusion. The developedmethods can reduce the time of analysis of carbohydrates and organic acids, do not require the expensive and toxic reagents. The measuring range of the mass concentration of maltose, glucose, fructose — 0.01-4.0 g/100 cm3; acetic acid, lactic acid — 0.01-5.0 g/100 cm3.

Authors

Polyakov Victor Antonovich,

Doctor of Technical Science, Academician of RAS,

Abramova Irina Mikhailovna, Doctor of Technical Sciences;

Medrish Marina Eduardovna, Candidate of Technical Sciences;

Gavrilova Darya Alekseevna;

Pavlenko Svetlana Vladimirovna

All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology — branch of FRC of Nutrition, Biotechnologie and Food Safety, 4b Samokatnaya str., Moscow, 111033, Russia, 4953624495@mail.ru