СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF ORGANIC COMPOUNDS

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к инструментальным оптическим методам анализа.
Одним из инструментальных методов анализа является масс-спектрометрия - физический метод измерения отношения массы заряженных частиц (ионов) к их заряду (m/z), установлению атомов, составляющих молекулу, их молекулярной массы, а также структуры их расположения. На сегодняшний момент масс-спектрометрия является самым высокочувствительным физико-химическим методом анализа широчайшего спектра соединений. Одной из разновидностей масс-спектрометрии является метод MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization) - лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы, играющей роль переносчика энергии (Аналитическая химия: проблемы и подходы. Т.2 / Под ред. Р.Келнера. - М: «Мир» «act». - 2004. - С.271).
Особенно перспективен метод MALDI в анализе лекарственных веществ и органических соединений благодаря высокой чувствительности и специфичности.
Известен способ определения кокаина методом MALDI в мозговой ткани умерших больных кокаинистов с использованием внутреннего стандарта (Reich R.F., Cudzilo K., Levisky J.A., Yost R.A. Quantitative MALDI-MS(n) analysis of cocaine in the autopsied brain of a human cocaine user employing a wide isolation window and internal standards // J Am Soc Mass Spectrom. - 2010. - Apr; 21 (4). - P.564-71).
Существует способ определения препарата "Саквинавира" в плазме человека с использованием MALDI, заключающийся в использовании в качестве внутреннего стандарта дейтерийсодержащего саквинавира или резерпина. В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Количественное содержание саквинавира определяли по среднему отношению площадей пиков аналита и внутреннего стандарта (Wagner M., Hopfgartner G. Ultra-fast quantitation of saquinavir in human plasma by matrix-assisted laser desorption/ionization and selected reaction monitoring mode detection // J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2008. - Sep 1; 872(1-2). - P.68-76).
Недостатком известных способов является использование внутренних стандартов с мечеными атомами (изотопами), являющимися редкими и дорогостоящими реактивами.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ определения различных лекарственных веществ с помощью MALDI без использования меченых атомов во внутреннем стандарте. В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (Persike M., Karas M. Rapid simultaneous quantitative determination of different small pharmaceutical drugs using a conventional matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry system // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2009. - Vol.23. - P.3555-3562). Недостатком данного способа является необходимость предварительного выбора вещества, используемого в качестве внутреннего стандарта, и сложная система расчетов количественного содержания вещества с использованием логарифмических исчислений.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного способа количественного определения органических веществ, простого в исполнении, не требующего трудоемких расчетов и использования математических операций для интерпретации полученных данных.
Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа количественного определения органических соединений, включающего проведение анализа вещества методом масс-спектроскопии с лазерной десорбцией/ионизацией с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты и внутреннего стандарта, не содержащего изотопов, причем в качестве внутреннего стандарта используют вещество, наиболее близкое по строению молекулы к определяемому органическому соединению, кроме того, оценку количества органического соединения проводят с помощью калибровочного графика.
Отличительными признаками заявляемого изобретения являются:
- в качестве внутреннего стандарта используют вещество, наиболее близкое по строению молекулы к определяемому органическому соединению, что позволяет оптимизировать процесс анализа;
- оценку количества органического соединения проводят с помощью калибровочного графика, что позволяет избежать трудоемких расчетов и использования математических операций для интерпретации полученных данных.
Способ иллюстрируется следующим примером.
Количественное определение резвератрола методом MALDI.
Для количественного определения методом масс-спектрометрии необходимо выбрать некоторый пик, принадлежащий определенному компоненту, и измерить его интенсивность. Для исключения влияния условий эксперимента нужно использовать внутренний стандарт.
Для количественного определения методом масс-спектрометрии в качестве аналита использована субстанция природного биологически активного вещества стильбеновой структуры - резвератрола. В качестве внутреннего стандарта применено вещество сходной флавоноидной структуры, производное бензо-γ-пирона, кверцетин. Данные вещества друг с другом не взаимодействуют, имеют четко различающиеся молекулярные массы. Пик резвератрола (m/z=228) не накладывается на пик кверцетина (m/z=303) (фиг.1).
Для количественного определения резвератрола 0,1 г его субстанции помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 10 мл спирта этилового 96%-ного, тщательно взбалтывали до полного растворения и доводили до метки этим же растворителем (раствор А). Параллельно в аналогичных условиях готовили раствор внутреннего стандарта, в качестве которого был выбран стандартный образец кверцетина.
Из полученного раствора А далее готовили серию разведений, состоящую из 6 растворов. Для этого в 6 мерных колб вместимостью по 25 мл помещали по 3 мл аликвоты раствора А аналита и раствора внутреннего стандарта кверцетина в объемах: 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 и 6,0 мл, содержимое колб тщательно перемешивали и доводили спиртом этиловым 96% до метки (растворы Б).
Из каждого раствора Б микропипеткой отбирали по 0,05 мл аликвоты, помещали в пробирки градуированные емкостью 1,5 мл и разводили в два раза ацетонитрилом для удобства нанесения на мишень (растворы В).
Таким образом, пробы растворов В №1-6 в количестве по 0,5 мкл с помощью дозатора наносили на мишень «МТР 384 targen plate matt steel TF» в шесть лунок, высушивали и сверху наносили каплю матрицы - раствор кислоты α-циано-4-гидроксикоричной. Регистрацию масс-спектров проб №1-6 проводили на приборе масс-спектрометр «Autoflex II» «MALDI TOF/TOF» фирмы Bruker Daltonics. Обработку данных осуществляли в программе «Flex Analis» в режиме Reflex Positive. В результате получены объединенные спектры, на которых наблюдаются интенсивные пики ионов аналита - резвератрола с зарядом иона m/z=228,3 и пики внутреннего стандарта - кверцетина с зарядом иона m/z=303,2 (фиг.2-7).
Как видно из фиг.2-7, интенсивность пика иона аналита резвератрола плавно уменьшается, а внутреннего стандарта кверцетина увеличивается по мере нарастания его концентрации.
Каждую пробу регистрировали трехкратно и вычисляли среднее значение их интенсивности (I).
стандарта
st
an
Для оценки прямолинейности зависимости концентрации внутреннего стандарта от отношения интенсивностей внутреннего стандарта и аналита построен калибровочный график в координатах С, мкг/мл - I/I (фиг.8).
st
an
Из приведенного графика следует, что отношение I/t к концентрации стандартного раствора имеет прямолинейную зависимость. Это указывает на то, что отношение площадей пиков ионов аналита и внутреннего стандарта остается постоянным.
st
an
Когда отношение I/I приближается к единице, это является свидетельством совпадения концентраций внутреннего стандарта и исследуемого вещества. Тогда количественное содержание исследуемого вещества можно найти по приведенному калибровочному графику или вычислить по формуле:
Из рассчитанных данных следует, что содержание аналита (резвератрола) в пробе составило 0,1228 мкг/мл.
Относительную ошибку определяли в ходе 7 параллельных измерений разных образцов анализируемой смеси. Полученные данные обрабатывали статистически. Результаты статистической обработки количественного определения содержания резвератрола методом масс-спектрометрии представлены в таблице.
Метрологические характеристики
Х (мкг/мл)
<img file="00000002.tif" he="6" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000003.tif" he="6" wi="17" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,1228
0,0005
0,00000025
<img file="00000004.tif" he="6" wi="20" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,1303
-0,007
0,000049
<img file="00000005.tif" he="7" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,1301
0,0068
0,0000462
<img file="00000006.tif" he="14" wi="51" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,1219
0,0014
0,00000196
0,1194
0,0039
0,0000152
ΔX=S<sub>x</sub>·t<sub>x</sub>=0,0045
0,1189
0,0044
0,000019
ε=3,65%
0,1199
0,0034
0,000011
<img file="00000007.tif" he="6" wi="20" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000008.tif" he="7" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
-7
Как видно из данных таблицы, относительная ошибка единичного определения способа количественного определения резвератрола методом масс-спектрометрии с вероятностью 95% составляет ±3,65%. Нижний предел обнаружения составил 10 г/мл.
Таким образом, разработан высокочувствительный способ количественного определения органических соединений методом масс-спектроскопии с лазерной десорбцией/ионизацией простой в исполнении и интерпретации данных и пригодный для целей анализа органических соединений в объектах различного происхождения.