К вопросу о формировании полиэмбриоидов в культуре in vitroпыльников пшеницы

УДК 577.175.1

К ВОПРОСУ О ФОРМИРОВАНИИ ИОЛИЭМБРИОИДОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

ПЫЛЬНИКОВ ПШЕНИЦЫ

О 2011 O.A. Сельдимирова, И.Р. Галин

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа Поступила 04.04.2011

Методами световой и сканирующей электронной микроскопии получены данные, подтверждающие одноклеточное происхождение полиэмбриоидов в культуре in vitro пыльников пшеницы.

Ключевые слова: морфогенез, культура in vitro, пыльник, полиэмбриоид, пшеница.

Метод культуры in vitro изолированных пыльников основан на использовании феномена андрок-линии (или, в другой терминологии, андрогенеза in vitro). Андроклиния рассматривается как нетрадиционная система размножения растений, имеющая свои параллели и аналогии с другими системами размножения [2-4, 6, 10, 11, 13].

Феномен андроклинии состоит в переключении развития инициальных клеток пыльника в условиях in vitro с обычной гаметофитной программы, ведущей к образованию пыльцевого зерна, на споро-фитную программу, ведущую к образованию гаплоидного растения-регенеранта. При этом инициальные клетки реализуют свой морфогенетический потенциал различными путями морфогенеза [1, 7, 8, 10].

Установлено, что к образованию растений-регенерантов ведут два пути морфогенеза - эм-бриоидогенез (формирование эмбриоида - биполярной зародышеподобной структуры непосредственно из инициальной клетки пыльника (прямой эмбриоидогенез) или из клетки каллуса (непрямой эмбриоидогенез)) и гемморизогенез (сопряженное формирование в каллусе почек и корней) [7, 8, 10, 13].

Биотехнологически оптимальным путем регенерации растений считается прямой эмбриоидогенез, так как он не связан со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус, требующим трудоемкой процедуры пересадок, и предполагает работу с генетически однородным материалом [3, 5, 10, 12].

Основная проблема получения гаплоидов посредством эмбриоидогенеза в культуре in vitro изолированных пыльников - низкий выход растений-регенерантов. Один из способов решения этой проблемы - индукция образования особого типа эм-бриоидов, для которых характерно формирование в их апикальной части множественных точек роста. Как полагают Cistue et al. [16], что получение таких эмбриоидов позволит увеличить количество расте-ний-регенерантов.

Однако возникает вопрос о происхождении таких эмбриоидов - формируются ли они каждый из

Сельдимирова Оксана Александровна, канд. биол. наук, e-mail: seldimirova@anrb.ru; Галин Ильишт Рафкатович, e-mail: gir.87@mail.ru

отдельных инициальных клеток пыльника или же образуются в результате слияния нескольких эмбриоидов, сходных по строению с зиготическими зародышами. Этот вопрос имеет принципиальное значение. Действительно, если такие эмбриоиды имеют одноклеточное происхождение, то все полученные растения-регенеранты будут представлять собой клоны. Если же такие эмбриоиды формируются в результате слияния нескольких эмбриоидов, подобных зиготическим зародышам, особенно на ранних этапах развития, возникает риск получения химерных растений-регенерантов.

В литературных источниках имеются только единичные упоминания о формировании такого типа эмбриоидов андроклинного происхождения [3, 14-18, 21, 22] и полностью отсутствуют данные об их генезисе. В то же время изучение генезиса полиэмбриоидов имеет несомненное практическое значение, поскольку при условии одноклеточного происхождения полиэмбриоидов предоставляется возможность значительно увеличить количество дигаплоидных растений-регенерантов, являющихся клонами исходных родительских форм, обладающих хозяйственно-ценными признаками.

Следует отметить, что термин, касающийся названия таких эмбриоидов, отсутствует. Некоторые авторы называют их зародышеподобными структурами [18; 19,20], другие - эмбриоидами или каллусами [17]. Мы предлагаем называть эмбриоиды такого типа полиэмбриоидами.

Целью исследования был вопрос о происхождении полиэмбриоидов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования послужил сорт яровой мягкой пшеницы Жница, характеризующийся высокой частотой образования in vitro андроклинных структур и интенсивно использующийся в селекционной практике Башкирского НИИ СХ РАСХН. Морфологические и цито-гистологические особенности формирования полиэмбриоидов изучали методами световой (СМ) (nVizo-ЮЗ, ЛОМО ФОТОНИКА, г. Санкт-Петербург) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (JSM 35, Jeol, Japan и JSM-6390, Jeol, Japan, на базе БИН РАН, г. Санкт-Петербург).

Следует отметить, что изучение развития мик-роспориальных эмбриоидов в условиях in vitro со-

Биотехнология

ОГЛ с

2? мим

Рис. 1. Четьфехклеточный полиэмбриоид (9-е сут культивирования пыльников in vitro), а - СЭМ; б - СМ, постоянный препарат. Условные обозначения: Оп - оперкулум, ОбМс - оболочка микроспоры

пряжено с рядом трудностей методического характера, связанных, в первую очередь, со сложностью ориентации объектов при приготовлении срезов из-за их мелких размеров (особенно на ранних стадиях), частых отклонений в форме, а также отсутствия маркеров типа рубчика семени, имеющихся у зиготического зародыша. Существенную помощь в этом вопросе оказывает метод сканирующей электронной микроскопии, еще недостаточно широко используемый в исследованиях такого рода, но позволяющий получить точное представление о пространственной организации эмбриоидов в динамике их развития.

Последующий цито-гистологический анализ тех же эмбриоидов дает информацию о тонких деталях их строения в динамике развития, позволяя совместить объемное поверхностное изображение объекта с его внутренним строением.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее [9, 13] было установлено, что инициальная клетка андроклинии - сильновакуолизирован-ная микроспора. В результате воздействия низкими положительными температурами in situ сильнова-куолизированные микроспоры отрываются от стенки пыльника, теряют свою полярную организацию и приобретают типичную «звездчатую» структуру. На 3-е сут от момента инокуляции пыльников на индукционную среду in vitro в таких деполяризованных микроспорах отмечены равные (симметричные) митотические деления с образованием сначала двух равных ядер, а затем двух равных клеток.

Согласно полученным нами данным, на 9-е сут от начала культивирования in vitro в результате дальнейших равных делений обеих образовавшихся клеток формируются четырехклеточный (рис. 1), а на 11-е сут - многоклеточный полиэмбриоид (рис. 2).

Рис. 2. Многоклеточный полиэмбриоид (11-е сут культивирования пыльников in vitro), а - СЭМ; б - СМ, постоянный препарат. Условные обозначения: МП - многоклеточный полиэмбриоид, ОбМс - оболочка микроспоры, Св - связник, СтПл - стенка пыльника.

Все клетки полиэмбриоида на начальных этапах развития сходны по размерам и структуре (рис. 16, 26), а сам полиэмбриоид имеет глобулярную форму (рис. 1а, 2а).

Снаружи полиэмбриоиды окружены общей утолщенной оболочкой, наружная часть которой представляет собой оболочку микроспоры (рис. 1, 2).

В дальнейшем интенсивный рост полиэмбриои-дов приводит к растяжению и механическому разрыву сначала оболочки микроспоры, а затем и стенки гнезда пыльника. На 21-24 сут культивирования in vitro полиэмбриоид появляется на поверхности пыльника.

Проведенный нами детальный анализ морфогенеза полиэмбриоидов в динамике развития позволил установить, что эти структуры, так же как и

эмбриоиды, сходные по строению с зиготическими зародышами, имеют одноклеточное происхождение.

Такой вывод основан на следующих данных. Инициальными клетками и в том, и в другом случае являются сильновакуолизированные микроспоры. Дальнейшие деления приводят к формированию глобулярных многоклеточных структур. На начальных этапах развития такие многоклеточные структуры окружены единой оболочкой материнской микроспоры. Одноклеточное происхождение полиэмбриоидов также подтверждается развитием их сосудистой системы, которая с самого начала развивается как единое целое, объединяя все органы развивающегося полиэмбриоида, что было бы невозможным в случае формирования полиэмбриоидов как результата срастания нескольких эм-бриоидов.

Авторы выражают благодарность канд. биол. наук Г.Е. Титовой (БИН РАН) за методическую помощь при работе со сканирующим микроскопом.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 08-04-97045) и поддержана программой «Ведущие научные школы РФ» (грант № НШ 7637.2010.4, лидер Школы - член-корр. РАН Т.Б. Батыгина, БИН РАН, Санкт-Петербург).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметъева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro (эмбриоидогенез у покрытосеменных) // Ботан. журн. 1978. Т. 63. № 1. С. 87-111.

2. Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. СПб., 2000. 48 с.

3. Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофит-ного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro. Уфа, 1993. 101 с.

4. Круглоеа H.H. Унификация терминологии при разработке инновационной биотехнологии андроклинной гап-лоидии in vitro II Физиология и биохимия культурных растений. 2009. Т. 41. № 6. С. 476-486.

5. Круглоеа H.H. Инновационная биотехнология андроклинной гаплоидии яровой мягкой пшеницы // Аграрная Россия. 2009. № 1.С. 34-39.

6. Круглоеа H.H. Микроспора злаков как модельная система для изучения путей морфогенеза: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. СПб., 2002. 48 с.

7. Круглоеа H.H., Горбунова В.Ю. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи современной биологии. 1997. Т. 117. Вып. 1. С. 83-94.

8. Круглоеа H.H., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи современной биологии. 1995. Т. 115. Вып. 6. С. 692-705.

9. Круглоеа H.H., Куксо П.А. Инициальная клетка андрок-линии // Физиология и биохимия культурных растений. 2006. Т. 38. №3. С. 279-291.

10. От микроспоры - к сорту / Т.Б. Батыгина, H.H. Кругло-ва, В.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова, O.A. Сельдимирова. М.: Наука, 2010. 175 с.

11. Суханов В.М. Андроклиния и ее особенности у пшеницы: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 1983. 24 с.

12.Хохлов С.С. Общие вопросы гаплоидии // Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976. С. 5-14.

13. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы / H.H. Круглова, Т.Б. Батыгина, В.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова, O.A. Сельдимирова. М.: Наука, 2005. 99 с.

14. Aulinger I. Е., Peter S. О., Schmid J. Е., Stamp P. Gametic embryos of maize as a target for biolistic transformation: comparison to immature zygotic embryos // Plant Cell Repts. 2003. V. 21. №6. P. 123-129.

15. Brisibe E.A., Gajdosova A., Olesen A., Andersen S.B. Cyto-differentiation and transformation of embryogenic callus lines derived from anther culture of wheat // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. №343. P. 365-370.

16. Cistue L., Soriano M, Castillo A.M. et al. Production of doubled haploide in durum wheat (Triticum turgidum Г.) through isolated microspore culture // Plant Cell Rep. 2006. V. 25. №6. P. 193-199.

17. Dogramaci-Altuntepe M., Peterson T.S., Jauhar P.P. Anther culture-derived regenerante of durum wheat and their cyto-logical characterization // J. Hered. 2001. V. 92. № 1. P. 461-467.

18. Guzman M, Zapata-Arias F.J. Increasing anther culture efficiency in rice (Oryza sativa Г.) using anthers from ra-tooned plants//Plant Sei. 2000. V. 151. №2. P. 771-777.

19. Hänsch K.-T., SeyringM., Schütze К. Histologische Analyse der somatischen Embryogenese bei Pfingstrosen. http://www.pflanzen-

biotechnologie.de/veranstaltungen/workshop-gentechnik-und-somatische-embryogenese/abstracts

20. HeßD. Biotechnologie der Pflanzen. Stuttgart, 1992. 432 S.

21. Konieczny R, Czaplicki A.Z., Golczyk H., Przywara L. Two pathways of plant regeneration in wheat anther culture // Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 2003. V. 73. № 2. P. 861-867.

22. Wei Z., Qiang F., Xigang D., Manzhu B. The culture of isolated microspores of ornamental kale (Brassica oleracea var. acephala) and the importance of genotype to embryo regeneration// Sei. Hort. 2008. V. 117. № 1. P. 542-547.

ABOUT THE QUESTION ON FORMATION OF POLYEMBRYOIDS IN WHEAT ANTHER CULTURE IN VITRO

© 2011 O.A. Seldimirova, I.R. Galin

Institute of Biology, Ufa Sei. Centre of RAS, Ufa

By the methods of light and scanning electron microscopy the data confirm the one-cellular origin of polyembryoids in wheat anther culture in vitro were obtained.

Key words: morphogenesis, culture in vitro, polyembryoid, wheat.

Seldimirova Oksana Aleksandrovna, Candidate of Biology, e-mail: seldimirova@anrb.ru; Galin Ilshat Rqfkatovich, e-mail: gir.87@mail.ru