УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ

Полезная модель относится к медико-биологическим исследованиям, к устройствам для оценки биомеханических свойств, качественного и количественного состава эритроцитов периферической крови.
Известно устройство для изучения механической резистентности эритроцитов, включающее источник вибрации, на котором установлена ячейка с пробой крови, при этом ячейка снабжена крышкой и прижимным приспособлением, которое выполнено в виде подпружиненного штока, соосно установленного в крышке, а источник вибрации имеет центрирующий элемент, на котором установлена ячейка с пробой крови (АС СССР №1377046, кл. А 61 В 10/00, опубл. 29.02.88 г., бюл. №8).
Недостатком известного устройства является то, что расчеты по цитометрическим кривым, получаемым в результате анализа, приходилось делать вручную.
Наиболее близким к заявляемой полезной модели является способ исследования механической резистентности эритроцитов, включающий отбор пробы крови, в котором пробу подвергают воздействию вибрации и о резистентности затем судят по числу гемолизированных эритроцитов (АС СССР №1012887, кл. А 61 В 10/00, опубл. 23.04.83 г., бюл. №15).
Однако известный способ не предусматривает анализ объемного состава клеток и не позволяет выявлять процессы агрегации и фрагментации эритроцитов, поскольку измерения производились с помощью эритрогемометра. Кроме того, исследовались только эритроциты, находящиеся в крови в состоянии покоя. Установлено, что
наиболее информативными оказались параметры вибровоздействия 3 мин, 40 дБ, 250 Гц.
Цель полезной модели - создание устройства для определения функциональной активности эритроцитов, позволяющего увеличить информативность метода исследования путем анализа гемолитической устойчивости, агрегации и фрагментации различных субпопуляций клеток красной крови, находящихся в циркуляции в покое и после нагрузки.
Указанная цель достигается тем, что устройство для определения функциональной активности эритроцитов включает в себя ячейку с пробой крови, помещенную в устройство для изучения механической резистентности эритроцитов, которое функционально связано с анализатором кондуктометрического счетчика, выход которого соединен с портом компьютера, который вычисляет процент общего условного гемолиза клеток красной крови, гемолиза эритроцитов различных подфракций, изменение абсолютного и процентного содержания субпопуляций эритроцитов, а также среднего объема и показателя анизоцитоза под действием вибрации с помощью специальной программы, при этом устройство для изучения механической резистентности эритроцитов включает в себя таймер, генератор прямоугольных импульсов и усилитель мощности, соединенные последовательно, и запускающее реле.
Полезная модель иллюстрируется чертежами, где на фиг.1 представлена блок-схема предлагаемого устройства, на фиг.2 - схема соединения устройства с кондуктометрическим счетчиком и компьютером.
Предлагаемое устройство для определения функциональной активности эритроцитов (фиг.1) состоит из трех функциональных блоков, плюс запускающее реле:
1 - ключ, запускающий устройство,
2 - источник постоянного 12 В напряжения с силой тока порядка 100 mА, что вполне достаточно для стабильной работы устройства,
3 - контактная группа реле,
4 - обмотка реле, подключенная к входу (3) микросхемы (10) КР1006ВИ1,
Первый функциональный блок I (таймер):
5 - конденсатор, подключенный непосредственно к (2) и (6) входу (входы set и reset) микросхемы (10), а так же последовательно соединенный с переменным резистором (7) через сопротивления (8) и (9).
6 - конденсатор, заземляющий вход (5) (опора) микросхемы (10),
7 - переменный резистор, который совместно с емкостью (5) задает постоянную времени цепи,
8 - резистор, последовательно включенный с переменным сопротивлением (7) и сопротивлением (9), а также к входу (7 - «разряд») микросхемы (10),
9 - сопротивление, последовательно включенное с конденсатором (5),
10 - интегральная микросхема КР1006ВИ1, имеющая 8 ножек, выполняющая роль таймера,
Второй функциональный блок II (генератор прямоугольных импульсов):
11 - интегральная микросхема К561ЛЕ5, построенная на четырех последовательно включенных элемента ИЛИ-НЕ, она служит генератором прямоугольных импульсов,
12 - переменное сопротивление, задает частоту импульсов, соединенное с конденсатором (14) и сопротивлением (15),
13 - четыре последовательно включенных элемента ИЛИ-НЕ,
14 - конденсатор,
15 - сопротивление
Третий функциональный блок III (усилитель мощности):
16 - переменное сопротивление, подключенное к выходу микросхемы (11), для изменения амплитуды прямоугольных импульсов, поступающих с генератора, после подаваемых на вход усилителя мощности К174УН5 (20),
17 - конденсатор, подключенный к входу (7) микросхемы (20), для устранения постоянной составляющей,
18 - сопротивление,
19 - конденсатор,
21 - сопротивление,
20 - интегральная микросхема усилителя мощности К174УН5,
22 - конденсатор, подключенный между входами коррекции,
23 - конденсатор, заземляющий дополнительный вход (6),
24 - конденсатор, подключенный к выходу, для развязки по постоянному напряжению,
25 - сопротивление, подключенное параллельно с конденсатором (23), тоже заземляет дополнительный вход,
26 - сопротивление подключенное между дополнительным входом (6) и выходом (2),
27 - конденсатор.
Элементы 17-26 представляют собой типовую схему включения ИМСК174УН5.
28 - исполнительное устройство (динамик),
29 - ячейка с пробой крови, прикрепленная к (28).
Предлагаемое устройство работает следующим образом.
Схема устройства включает в себя три функциональных блока:
I - таймер, II - генератор прямоугольных импульсов, III - усилитель мощности, соединенных последовательно, плюс запускающее реле,
состоящее из обмотки (4) и контактной группы (3). Работа устройства начинается с кратковременного замыкания ключа (1), следом срабатывает реле и замыкает контактную группу (3), и питание к схеме поступает через нее. Начинает заряжаться конденсатор (5) через сопротивления (8), (9) и переменный резистор (7), подстройкой которого добиваются, чтобы таймер ровно через 3 минуты после запуска, подал сигнал на обмотку реле и разомкнул ее контактную группу, тем самым отключил схему от источника питания.
На протяжении трех минут, генератор будет вырабатывать прямоугольные импульсы с частотой 250 Гц, (эта частота была выявлена в ходе многочисленных экспериментов, как оптимальная для воздействия на форменные элементы крови - эритроциты) которую получают подстройкой переменного сопротивления (12). После импульсы подаются на вход усилителя (7), проходя через переменный резистор (16) (с его помощью можно изменять (уменьшать) амплитуду прямоугольных импульсов, поступающих с генератора), усилителем мощности импульсы усиливаются и поступают с выхода (2) на исполнительное устройство (динамик) (28), которое преобразует электрическую энергию в акустические волны. Так как к динамику (28) прикрепляется ячейка (29) с пробой крови, то акустические волны в ней распространяются и подвергают вибрационной нагрузке кровь, а в частности эритроциты, последние в свою очередь подвергаются гемолизу (разрушению). Кондуктометрический счетчик форменных элементов подсчитывает оставшееся количество эритроцитов.
Данное устройство стало гораздо мобильнее своих предшественников. Его вес составляет порядка 100 грамм, оно может запитываться, как от блока питания (12 В, 100 mA), так и от аккумулятора, в связи с недостатком электроснабжения в некоторых районах. Появился таймер, который значительно облегчает работу оператора.
Данное устройство, переносимое непосредственно к месту обследования пациента (больного), позволяет там же на месте произвести первое разведение крови 1:630, как непосредственно взятой у больного или пациента (исходная кровь), а так же и после вибровоздействия на 0,02 мкм крови (кровь после вибровоздействия). Кровь в первом разведении, может хорошо сохраняться в период доставки ее в лабораторию, где будет приготавливаться второе разведение необходимое для подсчета эритроцитов в 630000 раз. Такой подход к исследованиям позволяет при выходе или при выезде к больным или пациентам обслужить несколько адресов, ибо кровь в первом разведение вполне может храниться даже не в холодильнике в течение двух часов.
Предлагаемое устройство функционально связано с анализатором кондуктометрического счетчика 30 (фиг.2), выход 31 которого соединен с входом 32 переходного устройства 33, выход которого 34 соединен с портом 35 компьютера 36. В качестве кондуктометрического счетчика использован счетчик частиц «Laborscale» (производство «Medicor», Венгрия) или другой аналогичный счетчик. В качестве компьютера используется любой IBM-совместимый компьютер.
Предлагаемая полезная модель используется следующим образом. Из пальца пациента производится забор 0,04 мл капиллярной крови, после чего 0,02 мл крови помещается в предлагаемое устройство для определения функциональной активности эритроцитов и подвергается воздействию акустических колебаний следующих параметров: 3 мин, 40 дБ, 250 Гц.
Подсчет эритроцитов производится с помощью кондуктометрического счетчика 30, позволяющего, помимо этого, построить дифференциальную цитометрическую кривую, распределив все эритроциты на ряд каналов (диапазонов) согласно объему клеток.
Передача данных со счетчика на компьютер 36 осуществляется при помощи переходного устройства 33. Данное устройство пригодно для использования со счетчиком частиц «Laborscale» (производство «Medicor», Венгрия) и аналогичными счетчиками. Данные о распределении исследуемых частиц на каналы представлены на выходе счетчика в виде электрического напряжения, ступенеобразно изменяющегося в соответствии с номером канала (ось X) и числом частиц, попадающих в этот канал (ось Y). При поступлении сигнала с анализатора гематологического счетчика происходит изменение сопротивления, подключенного к порту компьютера, в котором имеется конденсатор, периодически разряжающийся через данный порт. Время разрядки конденсатора измеряется.
Компьютерная программа ERYTRO, разработанная для работы с заявляемым устройством, позволяет вычислить процент общего условного гемолиза клеток красной крови, гемолиза эритроцитов различных подфракций, изменение абсолютного и процентного содержания субпопуляций эритроцитов, а также среднего объема и показателя анизоцитоза под действием вибрации. Аналогичные показатели можно рассчитать и для оценки изменений, происходящих в эритроцитарной популяции при дозированной гипоксической нагрузке на человека (физическая нагрузка или дыхание с помощью специальных аппаратов). Имеется возможность строить цитометрические кривые красной крови в заданном масштабе, накладывать друг на друга две любые кривые. Программа предоставляет в распоряжение пользователя средства статистической обработки данных (расчет среднего, минимального и максимального значения любого из названных параметров, среднего квадратичного отклонения серии измерений). Можно оценить достоверность различий между одноименными показателями, полученными при исследовании двух групп людей, по параметрическим и непараметрическому
(Вилкоксона-Манна-Уитни) критериям. Наконец, программа строит вариационные ряды. При помощи упомянутого программного обеспечения все показатели помещаются в сводную таблицу, в которой, помимо этого, содержатся паспортные данные обследуемого, его диагноз и т.п. Имеются минимально необходимые утилиты обслуживания получаемой базы данных: копирование, редактирование, удаление, восстановление записей, сортировка их по любому критерию, отбор компонентов базы данных для обработки по заданному шаблону, а также произвольным образом. Программа компактна, не требовательна к системному программному и аппаратному обеспечению и может выполняться на любом IBM-совместимом компьютере. Необходимости использования стандартных табличных процессоров, различных пакетов статобработки, систем управления базами данных нет. Однако возможность передачи данных для обработки в другую программу в виде текстового файла (таблицы) пользователю предоставлена.
Для оценки изменений, происходящих с эритроцитами и их отдельными фракциями (субпопуляциями) при вибровоздействии, вводится понятие условного гемолиза (УГ). УГ соответствует проценту убыли (по отношению к исходному) числа клеток при вибрации, т.е.
где
УГ - условный «гемолиз»;
иcx.
RBC - число клеток той или иной субпопуляции до вибровоздействия;
вибр.
RВС - число клеток той или иной субпопуляции после вибровоздействия.
Оценка изменений содержания различных по объему клеток (9 субпопуляций эритроцитов) позволяет выявить процессы агрегации
вибр.
иcx
вибр.
иcx.
и фрагментации эритроцитов. Так, при вибровоздействии в большей степени подвержены гемолизу крупные клетки - макросфероциты, которые в результате возрастного угнетения метаболических процессов потеряли способность обеспечивать необходимый ионный градиент, стали накапливать натрий и воду. Если отмечается значительное снижение числа микроцитов при вибровоздействии, то это означает возникновение агрегации этих клеток. Одновременно при агрегации в ряде случаев наблюдается возрастание абсолютного числа макроцитов (ведь кондуктометрический счетчик воспринимает агрегат клеток как единое образование - макроцит), таким образом в этой ситуации оказывается, что для макроцитов RВС>RBC. Ранее это явление трактовалось как недостаток данной методики подсчета частиц, и при конструировании гематологических счетчиков разработчики старались всеми силами избежать подобного. Однако это позволяет охарактеризовать косвенным образом способность эритроцитов периферической крови к агрегации. Аналогично, при фрагментации происходит значительное уменьшение числа макроцитов (макроцитов 2 и 3), и отмечается малый условный гемолиз микроцитов, а иногда и возрастание их количества или же количества отдельных более мелких субпопуляций (микроцитов 2 или 3). Тогда для микроцитов RВС>RBC. Поэтому УГ может принимать отрицательные значения (УГ<0) (см. формулу).
Значительным преимуществом заявляемого устройства является не только возможность определения условного гемолиза эритроцитов испытуемого, находящегося в покое, но и после соответствующей нагрузки на организм, цель которой состоит в активации компенсаторно-приспособительных процессов, включая ожидаемый выход крови из всех форм депо (истинных и функциональных). Только благодаря последующему сравнению исходных показателей эритроцитов с показателями эритроцитов, находящихся в крови после
нагрузки, можно дать достоверное и информативное заключение о всех трех процессах, выявляющихся при определении механической резистентности с построением цитометрической кривой (гемолиз, агрегация, фрагментация). В качестве нагрузочных тестов используется велоэргометрия как наиболее распространенный и хорошо стандартизированный тест и дыхание через дыхательный тренажер ТДИ-02 как метод, имеющий минимальное число противопоказаний и использующийся при ряде заболеваний. Величина нагрузки определяется величиной внешней емкости при применении ТДИ-02 (0,7 л) и мощностью, устанавливаемой при велоэргометрии (24-48 Вт). Время нагрузки составляет 1,0-2,17 мин или 3-5 мин при педалировании велоэргометра или при дыхании через дыхательный тренажер соответственно. Показателем прекращения пробы служит индивидуальная реакция обследуемого (прежде всего отказ испытуемого от дальнейшей нагрузки, появление резкой общей слабости, бледности, головокружения, а также достижение частоты пульса, составляющей 60% максимальной для данного возраста и пола, неадекватная реакция АД и т.д.).
Результаты исследования биомеханических свойств эритроцитов у 22 здоровых молодых людей до и после нагрузки приведены в табл.1, а их усредненные цитометрические кривые - на рис.2.
Таблица 1.Популяционный состав и биомеханические свойства эритроцитов здоровых людей.
Показатель
Кровь, взятая до нагрузки на испытуемого
Кровь, взятая после нагрузки на испытуемого
Исходные показатели, ×10<sup>12</sup>/л
Условный «гемолиз», %
Исходные показатели, ×10<sup>12</sup>/л
Условный «гемолиз», %
Эритроциты
5,55±0,24
12,09±3,03
5,63±0,27
16,88±2,93*
Микроциты (до 75 фл)
0,50±0,07
17,00±4,91
0,47±0,06
-33,47±47,37
Нормоциты (75-95 фл)
2,56±0,13
14,36±3,36
2,58±0,14
14,83±6,26
Макроциты (более 75 фл)
2,50±0,29
4,69±8,15
2,58±0,29
15,74±4,56*
Микроциты 2 (65-70 фл)
0,03±0,01
30,91±9,79
0,03±0,01
-20,89±11,18
Микроциты 3 (70-75 фл)
0,47±0,07
14,91±5,15
0,44±0,06
33,55±47,30
Нормоциты 1 (75-80 фл)
0,80±0,08
18,01±4,55
0,76±0,08
0,26±18,48
Нормоциты 2 (80-85 фл)
0,60±0,04
13,26±3,99
0,61±0,04
14,49±7,39*
Нормоциты 3 (85-95 фл)
1,16±0,04
11,56±3,22
1,21±0,06
17,61±4,28*
Макроциты 1 (95-110 фл)
1,25±0,10
7,90±5,39
1,38±0,10
18,32±4,03*
Таблица 2.Условный «гемолиз» эритроцитов крови испытуемых 1-ой подгруппы.
Показатель
Кровь, взятая до нагрузки на испытуемого
Кровь, взятая после нагрузки на испытуемого
«Гемолиз» эритроцитов, %
0,11±2,04
19,13±3,30
«Гемолиз» микроцитов (до 75 фл), %
18,29±7,02
-95,81±103,08
«Гемолиз» нормоцитов (75-95 фл), %
8,35±4,61
8,94±12,26
«Гемолиз» макроцитов (более 75 фл), %
-19,39±13,61
24,83±5,33
«Гемолиз» микроцитов 2 (65-70 фл), %
34,91±16,45
6,74±16,96
«Гемолиз» микроцитов 3 (70-75 фл), %
14,94±8,28
-95,36±103,03
«Гемолиз» нормоцитов 1 (75-80 фл), %
17,54±6,17
-24,54±39,48
«Гемолиз» нормоцитов 2 (80-85 фл), %
7,49±5,81
6,74±14,66
«Гемолиз» нормоцитов 3 (85-95 фл), %
1,90±3,32
16,94±7,46
«Гемолиз» макроцитов 1 (95-110 фл), %
-10,25±6,97
24,94±4,59
«Гемолиз» макроцитов 2 (110-126 фл), %
-24,84±19,28
28,60±6,01
«Гемолиз» макроцитов 3 (более 126 фл), %
-103,58±61,66
25,41±15,45
При анализе биомеханических свойств и популяционного состава эритроцитов этих испытуемых выявлено, что их можно условно разделить на 2 подгруппы численностью 10 и 12 человек соответственно. Средние показатели условного «гемолиза» различных субпопуляций красной крови в этих подгруппах значительно отличаются. Для первой подгруппы (табл.2) в состоянии покоя характерен практически «нулевой» «гемолиз» эритроцитов (суммарно), что связано с резким возрастанием числа макроцитов на фоне уменьшения содержания микроцитов (вероятно, вследствие агрегации), в результате цитометрическая кривая смещается вправо по отношению к таковой до вибрации. Снижение общего числа клеток красной крови минимально, скорее всего, из-за того, что параллельно протекает процесс фрагментации клеток, компенсирующий убыль клеток в результате агрегации эритроцитов.
После нагрузки на организм, стимулирующей выход эритроцитов из депо, несмотря на выраженную виброфрагментацию, дающую значительный прирост микроцитов, отмечается и выраженный гемолиз (собственно гемолиз, т.е. разрушение) эритроцитов больших объемов, и это приводит к довольно значительному общему условному гемолизу эритроцитов. Возможно, имеет место и агрегация микроцитов 2, что ведет к уменьшению их количества. Таким образом, однозначную оценку состояния клеток красной крови, находящихся в циркуляции и в депо дать нельзя, у данных лиц существуют как субпопуляция функционально активных клеток, устойчивых к гемолизу и способных фрагментироваться при механическом воздействии, так и неактивные малоустойчивые эритроциты, склонные также и к агрегации.
Таблица 3.Условный «гемолиз» эритроцитов крови испытуемых 2-ой подгруппы.
Показатель
Кровь, взятая до нагрузки на испытуемого
Кровь, взятая после нагрузки на испытуемого
«Гемолиз» эритроцитов, %
22,08±3,08
15,00±4,69
«Гемолиз» микроцитов (до 75 фл), %
15,92±7,10
18,47±8,39
«Гемолиз» нормоцитов (75-95 фл), %
19,36±4,47
19,74±5,49
«Гемолиз» макроцитов (более 75 фл), %
24,76±5,07
8,17±6,47
«Гемолиз» микроцитов 2 (65-70 фл), %
27,58±12,19
32,68±14,63
«Гемолиз» микроцитов 3 (70-75 фл), %
14,87±6,78
17,97±7,98
«Гемолиз» нормоцитов 1 (75-80 фл), %
18,39±6,82
20,92±6,87
«Гемолиз» нормоцитов 2 (80-85 фл), %
18,07±5,30
20,94±6,03
«Гемолиз» нормоцитов 3 (85-95 фл), %
19,62±3,97
18,16±5,10
«Гемолиз» макроцитов 1 (95-110 фл), %
23,03±4,76
12,80±6,04
«Гемолиз» макроцитов 2 (110-126 фл), %
25,48±6,09
3,61±8,05
«Гемолиз» макроцитов 3 (более 126 фл), %
33,99±6,03
-8,25±16,87
Во второй подгруппе (табл.3) обнаруживается иное морфо-функциональное состояние периферического звена эритрона. При вибровоздействии на кровь таких людей, взятую у них в состоянии покоя, отмечается разрушение большого числа клеток (порядка 22%), преимущественно больших объемов, функционально малоактивных и малоустойчивых к механическим нагрузкам. Высокий процент условного гемолиза микроцитов 2 связан с агрегацией этих клеток.
После выхода части депонированных эритроцитов в кровоток процент условного общего механического гемолиза снижается до ≈15%, это обусловлено тем, что эритроциты не разрушаются при вибровоздействии, а агрегируются, что приводит к низкому условному гемолизу макроцитов и даже возрастанию содержания макроцитов 3 (на фоне высокого условного гемолиза микроцитов). Таким образом, в циркуляции, в истинных и функциональных депо у этих испытуемых содержатся малоактивные в функциональном отношении эритроциты, склонные к гемолизу и агрегации при механическом воздействии.
Предлагаемая полезная модель позволяет определить вибрационную резистентность эритроцитов быстро, экономично, с малой инвазивностью, высокой чувствительностью. Кроме того, склонность клеток к агрегации и фрагментации, определяемая наряду с вибрационной устойчивостью, точнее позволяет дифференцировать между собой молодые, функционально активные, и неактивные эритроциты. Таким образом, можно оценить не только газотранспортную, но и гемостатическую функцию эритроцитов. Сферы применения заявляемого устройства для определения функциональной активности эритроцитов: 1) в стационарах и медицинских учреждениях амбулаторного типа для определения компенсации/декомпенсации заболеваний, в основе патогенеза которых лежит гипоксия (ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, бронхиальная астма), для контроля динамики заболевания и эффективности лечения; 2) для оценки устойчивости эритроцитов при гемолитических и других анемических состояниях; 3) для оценки гемостатического потенциала клеток красной крови при патологии системы гемостаза; 4) для определения адаптационных возможностей перед предстоящими нагрузками на организм (например, перед оперативными вмешательствами); 5) в спортивной медицине для определения индивидуальной степени тренированности и готовности к соревнованиям у спортсменов; 6) в научных исследованиях; 7) для обследования всех желающих определить свои адаптационные возможности и степень тренированности.