ПРОТИВОБОЛЕВОЕ СОЕДИНЕНИЕ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ANALGETIC COMPOUND AND ITS PRODUCTION METHOD

Область техники
Настоящее изобретение относится к новому соединению для лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли и способу его получения и применения.
Предпосылки создания изобретения
Боль является распространенным заболеванием, и существует три категории боли: физиологическая боль, воспалительная боль и невропатическая боль (NPP).
Невропатическая боль является относительно распространенным типом заболевания в клинической практике. В 2008 году Международная ассоциация по изучению боли (IASP) определила ее как "боль, вызываемую повреждением или заболеванием соматосенсорной системы". Невропатическая боль вызывается, например, повреждением или дисфункцией периферической или центральной нервной системы и представляет собой упорную хроническую боль без эффективных средств лечения в клинике. Заболевания, связанные с невропатической болью, включают, например, заболевания, проявляющие симптомы гипералгезии или аллодинии, такие как постгерпетическая невралгия, невралгия тройничного нерва, диабетическая невралгия, и послеоперационную или посттравматическую боль. Как всемирная проблема, нейропатическая боль затрагивает миллионы пациентов во всем мире и серьезно влияет на качество жизни пациентов.
Хотя обе они относятся к хронической боли, между невропатической болью и воспалительной болью существует существенная разница. Способы лечения невропатической боли в предшествующем уровне техники включают использование традиционных анальгетиков, таких как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и опиоиды, а также других лекарственных средств, включая противосудорожные и трициклические антидепрессанты (Max, MB Ann. Neurol, 35 (Suppl): S50-S53 (1994); Raja, SN et al., Neurology, 59: 1015 (2002); Galer, BS et al., Pain, 80: 533 (1999)). Однако эти лекарственные средства не могут полностью облегчить боль или имеют нежелательные побочные эффекты, такие как резистентность к лекарственным средствам и риск зависимости.
Соединения солей спироциклопиперазиния представляют собой класс соединений, полученных исследовательской группой Ли Рунтао из Пекинского университета на основе структурной модификации йодида 1,1-диметил-4-фенилпиперазиния (DMPP). Сообщалось о том, что соединения солей спироциклопиперазиния обладают анальгетической активностью, и такие соединения не вызывают привыкания (см. Yue, CQ, Ye, J., Li, CL, Li, RT, Sun, Q., 2007. Antinociceptive effects of the novel spirocyclopiperazinium salt compound LXM-10 in mice. Pharmacol Biochem Behav 86, 643-650). Их анальгетический механизм может быть связан с агонистическими холинергическими рецепторами (см.: Zhao, X., Ye, J., Sun, Q., Xiong, Y., Li, R., Jiang, Y., 2011. Antinociceptive effect of spirocyclopiperazinium salt compound LXM-15 via activating peripheral alpha7 nAChR and M4 mAChR in mice. Neuropharmacology 60, 446-452).
Однако, что касается анальгетических эффектов этих солей спироциклопиперазиния, в отчетах предшествующего уровня техники просто раскрывается, что эти соединения солей спироциклопиперазиния (особенно соединение LXM-10) являются эффективными в ингибировании физиологической боли и воспалительной боли (см., например, WO2007/147346), но не описывают, являются ли эти соединения эффективными при лечении невропатической боли.
Следовательно, существует необходимость в разработке лекарственного средства, которое было бы более эффективным при лечении невропатической боли.
Содержание настоящего изобретения
В одном аспекте целью настоящего изобретения является предоставление нового соединения или его стереоизомера, таутомера, производного, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли для лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли.
В другом аспекте целью настоящего изобретения является предоставление способа получения вышеуказанного соединения.
Настоящее изобретение предоставляет соединение, представленное следующей формулой (I), или его стереоизомер, таутомер, производное, пролекарство или фармацевтически приемлемую соль:
1
где R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, циано и галогеналкила,
2
3
1
2
3
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила и нитро, и R, R и R одновременно не являются водородом;
2
3
1
2
3
и когда один из R и R представляет собой нитро или галоген, остальные два из R, R и R одновременно не являются водородом.
Термин "галоген" при использовании в настоящем изобретении относится к атому фтора, хлора, брома или йода, предпочтительно атому фтора, хлора или брома.
При использовании в настоящей заявке термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду.
Термин "алкил", используемый в настоящем изобретении, представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, более предпочтительно линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 3 атомов углерода, и особенно предпочтительно метил, этил или пропил.
Термин "галогеналкил" при использовании в настоящем изобретении относится к алкильной группе, определенной выше, которая замещена одним или несколькими, предпочтительно одним-пятью, атомами галогена, где атомы галогена являются такими, как определено в настоящей заявке. Галогеналкил включает моногалогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, пергалогеналкил, и т.д., такой как хлорметил, дихлорметил, дифторметил, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, перфторэтил, 2,2,2-трифтор-1,1-дихлорэтил и т.д. Из них, галогеналкил может предпочтительно представлять собой тригалогеналкил, и более предпочтительно трифторметил.
2
При использовании в настоящей заявке термин "нитро" относится к группе -NO.
Термин "циано" при использовании в настоящем изобретении относится к группе -CN.
2
3
1
В варианте осуществления формулы (I) настоящего изобретения R и R независимо выбраны из группы, состоящей из алкила, галогеналкила и нитро, и R представляет собой водород.
2
3
1
В варианте осуществления формулы (I) настоящего изобретения R и R каждый независимо выбран из метила, этила, трифторметила или нитро, и R представляет собой водород.
В варианте осуществления настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению представлено следующей формулой (II):
1
где R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, циано и галогеналкила,
2
1
2
R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, алкила, галогеналкила и нитро, и R и R одновременно не являются водородом.
1
2
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения R выбран из группы, состоящей из галогена, алкила, циано и галогеналкила, и R выбран из группы, состоящей из галогена, алкила, галогеналкила и нитро.
1
2
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения R выбран из группы, состоящей из фтора, хлора, брома, метила, этила, циано и трифторметила, и R выбран из группы, состоящей из фтора, хлора, брома, метила, этила, трифторметила и нитро.
1
2
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения R и R оба представляют собой галоген.
1
2
В варианте осуществления настоящего изобретения R представляет собой водород, галоген или галогеналкил; R представляет собой водород или нитро.
1
2
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения R представляет собой алкил, циано, галоген или галогеналкил, и R представляет собой водород.
1
2
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения R представляет собой галоген или галогеналкил, и R представляет собой водород.
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения алкил представляет собой метил, этил или пропил.
В варианте осуществления формулы (II) настоящего изобретения галогеналкил представляет собой трифторметил.
Предпочтительные соединения по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из:
Следующие предпочтительные соединения по настоящему изобретению выбраны из:
Соединения по настоящему изобретению можно получить в соответствии с обычным способом в данной области техники, предпочтительно в соответствии со следующей схемой реакции:
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ получения соединения общей формулы (I), при этом способ включает следующие стадии:
(1) растворение галогенированного бензольного реагента (A), металлического катализатора, лиганда и щелочи в качестве исходных веществ в растворителе, затем добавление 1-Вос-пиперазина (В) и взаимодействие в атмосфере аргона при температуре реакции от 40 до 140°С, с получением промежуточного соединения (C);
(2) добавление соляной кислоты-органического растворителя к промежуточному соединению (C) и перемешивание при комнатной температуре с получением незащищенного промежуточного соединения (D); и
3
(3) растворение незащищенного промежуточного соединения (D) в растворителе и взаимодействие с 1,4-дибромбутаном в присутствии NaHCO с получением соединения общей формулы (I) по настоящему изобретению.
В указанном выше способе галогенированный бензольный реагент может быть выбран из группы, состоящей из трифторметил-замещенного бромбензола, трифторметил-замещенного йодбензола; дифторметил-замещенного бромбензола, дифторметил-замещенного йодбензола; бромйодбензола; нитро-замещенного хлорбензола, нитро-замещенного бромбензола, нитро-замещенного йодбензола и т.д.
В указанном выше способе металлический катализатор может быть выбран из группы, состоящей из хлорида палладия, ацетата меди, йодида меди, трихлорида железа и т.п.; предпочтительным является йодид меди.
В указанном выше способе лиганд может быть выбран из группы, состоящей из различных α-аминокислот, о-гидроксибензамида, бинафтола и т.п. Из них предпочтительным лигандом является бинафтол.
В указанном выше способе щелочь может быть выбрана из группы, состоящей из органических щелочей и неорганических щелочей, таких как пиридин, триэтиламин, гидроксид калия, гидроксид натрия, карбонат калия, карбонат натрия, бикарбонат калия, бикарбонат натрия, карбонат цезия, фосфат калия, фосфат натрия и т.д. Из них предпочтительной щелочью является фосфат калия.
На стадии (1) вышеуказанного способа используемый растворитель представляет собой спирт, кетон, нитрил, хлорированный углеводородный растворитель, растворитель бензольного типа, ДМСО или ДМФА, где спиртовой растворитель представляет собой, например, метанол, этанол, изопропанол, этиленгликоль и т.д.; кетоновый растворитель представляет собой, например, ацетон, метилэтилкетон и т.д.; нитрильный растворитель представляет собой, например, ацетонитрил и т.д.; хлорированный углеводородный растворитель представляет собой, например, дихлорметан, хлороформ и т.д.; растворитель бензольного типа представляет собой, например, бензол, толуол, ксилол и т.д. Предпочтительным растворителем является метанол, этанол, изопропанол, ацетонитрил, ацетон, толуол, бензол, ДМСО, ДМФА, хлороформ или дихлорметан, и более предпочтительно растворитель представляет собой ДМФА.
На стадии (1) вышеуказанного способа предпочтительная температура реакции составляет 100°С.
На стадии (1) вышеуказанного способа время реакции может составлять от 6 до 48 часов, предпочтительно от 12 до 32 часов и более предпочтительно 24 часа.
На стадии (2) вышеуказанного способа органический растворитель представляет собой спиртовый или сложноэфирный растворитель, где спиртовый растворитель представляет собой, например, метанол, этанол, изопропанол, этиленгликоль и т.д.; где, сложноэфирный растворитель представляет собой, например, этилформиат, этилацетат, метилацетат, изопропилацетат и т.д. Предпочтительным органическим растворителем является этилацетат.
В настоящем изобретении комнатная температура может составлять от 0°С до 40°С, предпочтительно 10°С-30°С, более предпочтительно 15°С-25°С.
На стадии (3) вышеуказанного способа используемый растворитель представляет собой спирт, кетон, нитрил, хлорированный углеводородный растворитель, растворитель бензольного типа, ДМСО или ДМФА, при этом спиртовый растворитель представляет собой, например, метанол, этанол, изопропанол, этиленгликоль и т.д., кетоновый растворитель представляет собой, например, ацетон, метил этил кетон и т.д., нитрильный растворитель представляет собой, например, ацетонитрил и т.д., хлорированный углеводородный растворитель представляет собой, например, дихлорметан, хлороформ и т.д., растворитель бензольного типа представляет собой, например, бензол, толуол, ксилол и т.д., предпочтительно растворитель представляет собой метанол, этанол, изопропанол, ацетонитрил, ацетон, толуол, бензол, ДМСО, ДМФА, хлороформ, дихлорметан или этиленгликоль, более предпочтительно растворитель представляет собой этанол.
Целевой продукт, полученный вышеуказанным способом, можно улучшить и очистить обычным способом, например, он может быть выделен и очищен перекристаллизацией, а растворитель, используемый для перекристаллизации, может представлять собой этилацетат-этанол, ацетон-этанол, этилацетат-метанол, ацетон-метанол, ацетон-воду, метанол, этанол или изопропанол и т.д., предпочтительно этилацетат-этанол.
В еще одном аспекте целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению для лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли, которая, необязательно, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии с необходимостью, содержание активного ингредиента в фармацевтической композиции находится в диапазоне от 0,1% до 99%, а остальное составляет фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть сформулирована в виде различных необходимых фармацевтических дозированных форм в соответствии с общепринятыми способами в области фармацевтики, таких как пероральный препарат, инъекция, ректальный препарат, препарат для местного применения и т.д., например, таблетка, пилюля, диспергированный порошок, капсула, гранула, эмульсия, раствор, суспензия, сироп, твердый препарат в виде суппозитория для вагинального или ректального введения, пластырь для местного применения и т.д. Предпочтительно композицию формулируют в виде инъекционной, пероральной или трансдермальной лекарственной формы для местного применения, и особенно предпочтительно в виде соответствующей лекарственной формы с замедленным или контролируемым высвобождением.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению и различные препараты композиции могут быть получены в соответствии с обычными способами, известными в области фармацевтики.
Для того, чтобы получить подходящую лекарственную форму, при необходимости можно добавить фармацевтический носитель, включая различные подходящие фармацевтические адъюванты, такие как эксципиент, наполнитель, разбавитель, дезинтегрант, поверхностно-активное вещество, смачивающий агент, консервант, подсластитель, пигмент и т.д.
В зависимости от типа и тяжести заболевания и состояния пациента, такого как пол, возраст, масса тела и т.д., можно подобрать подходящую лекарственную форму и дозу для введения, и обычная доза для введения для взрослого человека составляет 1-200 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно 1-50 мг/кг массы тела/сутки.
В еще одном аспекте целью настоящего изобретения является предоставление применения соединения общей формулы (I) или его стереоизомера, таутомера, производного, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли для лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли, которое включает стадию формулирования вышеуказанного вещества в различные медицинские лекарственные формы, подходящие для введения.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к применению соединений DXL-A-16, DXL-A-19, DXL-A-21, DXL-A-22, DXL-A-23, DXL-A-24 или их стереоизомеров, таутомеров, производных, пролекарств или фармацевтически приемлемых солей для лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли.
В другом аспекте целью настоящего изобретения является предоставление применения соединения общей формулы (I) или его стереоизомера, таутомера, производного, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли для лечения воспаления, включающее формулирование вышеуказанного вещества в различные дозированные лекарственные формы, подходящие для введения.
В другом аспекте целью настоящего изобретения является предоставление применения соединения общей формулы (I) или его стереоизомера, таутомера, производного, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли.
В другом аспекте целью настоящего изобретения также является предоставление применения соединения общей формулы (I) или его стереоизомера, таутомера, производного, пролекарства или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения воспаления.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к применению соединений DXL-A-16, DXL-A-19, DXL-A-21, DXL-A-22, DXL-A-23 и DXL-A-24 или их стереоизомеров, таутомеров, производных, пролекарств или фармацевтически приемлемых солей для получения лекарственного средства для лечения воспаления.
Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа лечения невропатической боли и/или синдрома невропатической боли, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения общей формулы (I) или его стереоизомера, таутомера, пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа лечения воспаления, при этом способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения общей формулы (I) или его стереоизомера, таутомера, пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
В соответствии с настоящим изобретением, невропатическая боль представляет собой боль, индуцированную или вызванную первичным поражением или дисфункцией в центральной нервной системе.
Например, синдром невропатической боли включает постгерпетическую невралгию (которая вызвана опоясывающим герпесом), травматическую авульсию корешка, болезненную травматическую мононевропатию, болезненную полиневропатию (особенно вследствие диабета), центральный болевой синдром (который может быть вызван повреждением нервной системы практически на любом уровне), послеоперационный болевой синдром (например, постмастэктомический синдром, постторакотомический синдром, фантомная боль) и комплексный региональный болевой синдром (рефлекторная симпатическая дистрофия и жгучая боль).
В некоторых случаях невропатическая боль имеет типичный симптом, такой как дизестезия (спонтанная или индуцированная жгучая боль, часто сочетающаяся с пульсирующей болью), но боль также может быть глубокой и тупой болью. Также могут возникать другие ощущения (такие как гиперестезия, гипералгезия, аллодиния (боль из-за безопасной стимуляции) и гипералгезия (особенно неприятные, преувеличенные болевые реакции).
В соответствии с настоящим изобретением, невропатическую боль можно разделить на "периферическую" (исходящую из периферической нервной системы) и "центральную" (исходящую из головного или спинного мозга).
Центральная невропатическая боль представляет собой боль, причина которой выбрана из следующих: поражения головного мозга, главным образом, в таламусе; инфаркт, такой как инфаркт таламуса или инфаркт ствола мозга; опухоль головного мозга или абсцессы, которые сдавливают таламус или ствол мозга; рассеянный склероз; операция разделения левого и правого полушарий головного мозга, такая как разрез таламуса в случае дискинезии; поражения спинного мозга; травмы спинного мозга; операция на спинном мозге, такая как ампутация в передней латеральной части спинного мозга; изменения в крови; синдром передней спинномозговой артерии; латеральный медуллярный синдром; и сирингомиелия.
В соответствии с настоящим изобретением, невропатическая боль является синдромом центральной невропатической боли. Например, синдром центральной невропатической боли вызван повреждением спинного мозга и/или контузией спинного мозга.
В некоторых случаях невропатическая боль представляет собой синдром головной боли, вызванной центральным механизмом боли, такой как мигрень или боль при мигрени.
В некоторых случаях невропатическая боль представляет собой периферическую невропатическую боль. Например, периферическая невропатическая боль вызвана хроническим компрессионным повреждением или защемлением седалищного нерва.
В соответствии с настоящим изобретением основные периферические невропатические боли включают невропатические боли, выбранные из следующих типов, и/или невропатические боли с причинами, выбранными из следующих: системные заболевания, такие как диабетическая невропатия; вызванные лекарственными средствами заболевания, такие как невропатия, вызванная химиотерапией; посттравматический синдром и синдром сдавления; заболевания нервных корешков и ганглий; невропатия после ВИЧ-инфекции; невралгия после герпетической инфекции; разрыв нервного корешка; черепная невропатия; черепная невралгия, такая как невралгия тройничного нерва; невропатическая раковая боль; фантомная боль; сдавление периферического нерва, нервного сплетения и нервного корешка; паранеопластическая периферическая невропатия и ганглиозные заболевания; осложнения лечения рака, такие как химиотерапия, облучение и хирургия; комплексный региональный болевой синдром; повреждения типа I (ранее известные как симпатическая рефлекторная дистрофия); и повреждения типа II (примерно эквивалентные жгучей боли).
Соединение общей формулы (I) настоящего изобретения, или его стереоизомер, таутомер, пролекарство или фармацевтически приемлемая соль, имеет хороший эффект при лечении невропатической боли и/или синдрома невропатической боли и при лечении воспаления и не имеет побочного эффекта зависимости.
Конкретные модели для осуществления настоящего изобретения
Далее настоящее изобретение будет подробно описано при помощи следующих примеров.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Если конкретная технология или условия не были приведены в примерах, следует придерживаться технологии или условий, описанных в литературе в данной области техники или инструкциях к продукту. Если изготовители используемых реагентов или инструментов не указаны, то это обычные продукты, которые могут быть приобретены коммерческим путем.
Реагенты и растворители были коммерчески доступны в химически чистом или аналитически чистом виде. Если не указано иное, их использовали без дальнейшей очистки. Петролейный эфир представлял собой фракцию 60-90°C, безводный диоксан сушили с использованием активированного молекулярного сита, и безводный ТГФ обрабатывали натрием. Сырье и реагенты произведены в Китае, или компаниями Arcos Company, Saen Company, Innochem Company и т.д.
Колоночная хроматография: силикагель 200-300 меш от Qingdao Ocean Chemical Factory, цветопроявляющий агент, йод или УФ-детекция.
Устройство для ядерного магнитного резонанса: BrukerAVANCE III 400; масс-спектрометрия высокого разрешения: Waters Xevo G2 Q-TOF жидкостной хроматограф/масс-спектрометр.
Общий Способ I синтеза (На примере Соединения DXL-A-10)
3
2
В круглодонную колбу объемом 100 мл с 25 мл изопропанола, добавляли мета-йодтолуол (2,18 г, 0,01 моль), затем последовательно добавляли безводный пиперазин (1,76 г, 0,02 моль), йодид меди (0,5 г, 25 ммоль), фосфат калия (4,66 г, 17,5 ммоль) и этиленгликоль (1,5 мл) и подвергали взаимодействию при кипячении с обратным холодильником и в атмосфере аргона в течение 18 часов, пока ТСХ (PE:EA=20:1, DCM:MeOH=10:1) детекция не показала завершение реакции. После фильтрации растворитель удаляли при пониженном давлении, добавляли 20 мл воды и осуществляли экстракцию при помощи 30 мл хлороформа три раза. Экстракты объединяли, промывали насыщенным солевым раствором и водой, сушили над безводным сульфатом натрия, концентрировали досуха и подвергали колоночной хроматографии (EA:MeOH:NH⋅HO=25:3:2) с получением 0,5 г бесцветного маслянистого продукта 2-22, выход: 23%.
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 7,18 (т, J=7,7 Гц, 1H), 6,74 (дд, J=17,8, 8,7 Гц, 3H), 3,14 (с, 8H), 2,35 (с, 3H).
3
В круглодонную колбу объемом 50 мл добавляли 18 мл этанола и затем добавляли последовательно исходное вещество 3-1 (0,5 г, 2,84 ммоль), 1,4-дибромбутан (0,6 г, 2,84 ммоль). Брали NaHCO (1,67 г, 19,88 ммоль) и тонко измельчали, добавляли к вышеуказанной системе при перемешивании, нагревали и подвергали взаимодействию при перемешивании и кипятили с обратным холодильником при 80°C в течение 6 часов, и, когда ТСХ-детекция показала, что все еще оставалось исходное вещество, реакцию продолжали вплоть до 18 часов. После удаления фильтрацией твердого бикарбоната натрия фильтрат упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного белого твердого продукта (0,93 г). К вышеуказанному твердому веществу добавляли 20 мл этилацетата, обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут, фильтровали для удаления этилацетата, с получением неочищенного твердого продукта, который перекристаллизовывали из смеси этилацетат/этанол, с получением 730 мг белого твердого продукта, выход: 83%.
Общий Способ II синтеза (На примере Соединения DXL-A-08)
В круглодонную колбу объемом 250 мл, содержащую 40 мл 1,4-диоксана, добавляли последовательно исходное вещество 2-23 (метил мета-бромбензоат) (2,15 г, 10 ммоль), BINAP (622 мг, 1 ммоль), ацетат палладия (45 мг, 0,2 ммоль), карбонат цезия (6,5 г, 20 ммоль), Boc-пиперазин 2-24 (1,86 г, 10 ммоль) и подвергали взаимодействию в атмосфере аргона и кипятили с обратным холодильником при 100°C в течение 18 часов, пока ТСХ (PE:EA=10:1) детекция не показала, что реакция завершена. Фильтрацию осуществляли с использованием диатомита для удаления твердого вещества(веществ). Фильтрат упаривали при пониженном давлении и подвергали колоночной хроматографии (PE:EA=10:1) с получением 720 мг светло-желтого маслянистого продукта, выход: 23%.
Исходное вещество 2-25 (720 мг, 2,25 ммоль) добавляли в круглодонную колбу объемом 50 мл, добавляли соляную кислоту-этилацетат (2,8M), подвергали взаимодействию при перемешивании в течение 5 часов, и ТСХ-детекция показала завершение реакции исходного вещества. Продукт отфильтровывали для удаления соляной кислоты-этилацетата и промывали несколько раз этилацетатом до тех пор, пока ТСХ-детекция не показала, что присутствует только одно пятно продукта, и получали 570 мг белого твердого продукта 2-26. Выход: 99%.
3
3
Исходное вещество 2-26 (570 мг, 2,22 ммоль) растворяли в этаноле (15 мл), затем добавляли NaHCO (1,5 г, 17,76 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут (для диссоциации HCl), затем добавляли 1,4-дибромбутан (527 мг, 2,44 ммоль) и подвергали взаимодействию при кипячении с обратным холодильником в течение 6 часов, пока ТСХ-детекция не показала, что реакция завершена. После фильтрации для удаления твердого NaHCO фильтрат упаривали при пониженном давлении, добавляли 20 мл этилацетата и дважды промывали. После фильтрации получали неочищенный белый продукт, который перекристаллизовывали из смеси этилацетат/этанол, с получением 160 мг белого твердого продукта с выходом 20,3%.
Общий Способ III синтеза (На примере Соединения DXL-A-26)
3
4
Исходное вещество 4-йоданизол 2-27 (2,34 г, 10 ммоль), лиганд (430 мг, 1,5 ммоль), CuI (580 мг, 2 ммоль), KPO (5,32 г, 20 ммоль) растворяли в безводном ДМФА (30 мл), затем добавляли Boc-пиперазин 2-24 (2,8 г, 15 ммоль), подвергали взаимодействию в атмосфере аргона при 100°C в течение 24 часов. ТСХ-детекция (PE: EA=5: 1) показала, что реакция исходного вещества завершена. Экстракцию осуществляли три раза при помощи 50 мл дихлорметана и экстракты объединяли и промывали последовательно насыщенным раствором хлорида натрия и водой и сушили над безводным сульфатом натрия. После колоночной хроматографии (PE:EA=5:1) получали 720 мг твердого продукта желтого цвета. Выход: 24,6%.
Исходное вещество 2-28 (720 мг, 2,46 ммоль) добавляли в круглодонную колбу объемом 50 мл, затем добавляли соляную кислоту-этилацетат (3,8M), перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов и фильтровали с получением 600 мг белого твердого продукта, выход: 90%.
3
3
Исходное вещество 2-29 (600 мг, 2,62 ммоль) растворяли в этаноле (15 мл), затем добавляли NaHCO (1,76 г, 20,96 ммоль) и затем добавляли 1,4-дибромбутан (567 мг, 2,62 ммоль) при перемешивании. После осуществления реакции при кипячении с обратным холодильником в течение 6 часов ТСХ-детекция показала, что реакция завершена. NaHCO удаляли фильтрацией и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением твердого вещества. Полученное твердое вещество промывали дважды этилацетатом (20 мл) и фильтровали с получением твердого вещества. Полученное твердое вещество промывали дважды дихлорметаном при нагревании и фильтровали с получением неочищенного твердого вещества, которое перекристаллизовывали из смеси этилацетат/дихлорметан с получением 800 мг белого твердого продукта, выход: 93%.
Пример 1: Получение DXL-A-16
8-(4-фторфенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белое твердое вещество с выходом 43%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,24 (д, J=9,0 Гц, 2H), 6,94 (д, J=9,0 Гц, 2H), 3,61-3,26 (м, 12H), 2,10 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 159,26, 156,89, 145,41, 119,27, 119,19, 116,03, 115,81, 62,66, 59,01, 45,69, 21,08.
14
20
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 235,31985, Найдено 235,16041.
Пример 2: Получение DXL-A-19
8-(4-цианофенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и получали белое твердое вещество с выходом 37,1%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,54 (д, J=8,8 Гц, 2H), 6,97 (д, J=8,9 Гц, 2H), 3,54 (дд, J=17,0, 9,7 Гц, 12H), 2,11 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 152,22, 133,92, 120,55, 115,30, 100,85, 62,52, 58,55, 42,79, 21,03.
15
20
3
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrN [M-Br], 242,33885, Найдено 242,16511.
Пример 3: Получение DXL-A-21
8-(3,4-дифторфенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белое твердое вещество с выходом 59,3%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,10 (дд, J=19,3, 9,4 Гц, 1H), 6,89 (м, J=13,1, 6,8, 2,7 Гц, 1H), 6,72 (д, J=8,7 Гц, 1H), 3,69-3,44 (м, 8H), 3,38 (с, 4H), 2,11 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 151,37, 151,22, 148,93, 148,81, 146,35, 146,22, 146,09, 145,97, 143,96, 143,84, 117,65, 117,48, 113,06, 113,04, 113,01, 112,98, 106,61, 106,41, 62,61, 58,85, 45,08, 21,07.
14
19
2
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 253,31032, Найдено 253,15087.
Пример 4: Получение DXL-A-22
8-(4-бромфенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белое твердое вещество с выходом 86,9%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,38 (д, J=8,9 Гц, 2H), 6,89 (д, J=8,9 Гц, 2H), 3,50 (дд, J=12,4, 7,3 Гц, 8H), 3,39 (с, 4H), 2,10 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 148,30, 132,21, 118,64, 113,20, 62,56, 58,83, 44,37, 21,13.
14
20
2
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBRN [M-Br], 296,22545, Найдено 296,08329.
DXL-A-22 также может быть получен в соответствии со следующим способом:
1. Получение промежуточного соединения 4-(4-бромфенил)-1-Boc-пиперазина (C)
3
4
Исходное вещество 4-бромйодбензол A (10 ммоль), 1,1'-ди-2-нафтол (430 мг, 1,5 ммоль), CuI (580 мг, 2 ммоль) и KPO (5,32 г, 20 ммоль) растворяли в безводном ДМФА (30 мл), затем добавляли Boc-пиперазин B (2,8 г, 15 ммоль) и подвергали взаимодействию в атмосфере аргона при 100°C в течение 24 часов. ТСХ-детекция (PE:EA=5:1) показала, что реакция исходного вещества завершена. Экстракцию осуществляли три раза дихлорметаном (50 мл ×3), экстракты объединяли, последовательно промывали насыщенным раствором хлорида натрия и водой и сушили над безводным сульфатом натрия. После колоночной хроматографии (PE:EA=5:1) получали 4-(4-бромфенил)-1-Boc-пиперазин C в виде твердого продукта желтого цвета.
2. Получение промежуточного соединения 1-(4-бромфенил)пиперазина (D)
4-(4-бромфенил)-1-Boc-пиперазин C (2,46 ммоль) добавляли в круглодонную колбу объемом 50 мл, затем добавляли соляную кислоту-этилацетат (3,8M), перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов и фильтровали с получением незащищенного промежуточного соединения 1-(4-бромфенил)пиперазина (D) в виде белого твердого вещества.
3. Получение Ia
3
3
2
2
14
20
2
1
13
2
+
Незащищенное промежуточное соединение 1-(4-бромфенил)пиперазин D (2,62 ммоль) растворяли в этаноле (15 мл), добавляли NaHCO (1,76 г, 20,96 ммоль), добавляли 1,4-дибромбутан (567 мг, 2,62 ммоль) при перемешивании. Реакцию осуществляли при кипячении с обратным холодильником в течение 6 часов, и ТСХ-детекция показала завершение реакции. NaHCO удаляли фильтрацией и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением твердого вещества. Полученное твердое вещество последовательно промывали этилацетатом и дихлорметаном и затем перекристаллизовывали из смеси этилацетат/дихлорметан с получением белого твердого продукта Ia с выходом 86,9%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,38 (д, J=8,9 Гц, 2H), 6,89 (д, J=8,9 Гц, 2H), 3,50 (дд, J=12,4, 7,3 Гц, 8H), 3,39 (с, 4H), 2,10 (с, 4H). C ЯМР (101 МГц, DO) δ 148,30, 132,21, 118,64, 113,20, 62,56, 58,83, 44,37, 21,13. ES-HRMS: Рассчитано для CHBRN [M-Br], 296,22545, Найдено 296,08329.
Пример 5: Получение DXL-A-23
8-(4-хлорфенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белое твердое вещество с выходом 17,5%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,25 (д, J=8,8 Гц, 2H), 6,95 (д, J=8,9 Гц, 2H), 3,51 (дд, J=11,6, 7,1 Гц, 8H), 3,40 (с, 4H), 2,10 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 147,75, 129,23, 125,89, 118,38, 62,56, 58,85, 44,63, 21,08.
14
20
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrClN [M-Br], 251,77445, Найдено 251,13077.
Пример 6: Получение DXL-A-24
8-(4-(трифторметил)фенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белое твердое вещество с выходом 70,7%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,54 (д, J=8,7 Гц, 2H), 7,05 (д, J=8,6 Гц, 2H), 3,52 (д, J=11,3 Гц, 12H), 2,11 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 151,55, 126,66, 126,63, 125,83, 123,15, 121,91, 121,59, 121,25, 115,82, 62,52, 58,68, 43,62, 21,02.
15
20
3
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 285,32736, Найдено 285,15687.
DXL-A-24 также может быть получен в соответствии со следующим способом:
1
13
+
2
2
15
20
3
2
Способ получения был таким же, как второй способ получения DXL-A-22 в Примере 4, за исключением того, что А представлял собой 4-трифторметил-бромбензол, а белый твердый продукт Ib получали с выходом 70,7%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,54 (д, J=8,7 Гц, 2H), 7,05 (д, J=8,6 Гц, 2H), 3,52 (д, J=11,3 Гц, 12H), 2,11 (с, 4H). C ЯМР (101 МГц, DO) δ 151,55, 126,66, 126,63, 125,83, 123,15, 121,91, 121,59, 121,25, 115,82, 62,52, 58,68, 43,62, 21,02. ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 285,32736, Найдено 285,15687.
Пример 7: Получение DXL-A-27
8-(3,5-бис(трифторметил)фенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и получали белое твердое вещество с выходом 75%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,52 (с, 1H), 7,48 (с, 2H), 3,62 (с, 12H), 2,21 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 149,95, 132,36, 132,03, 131,71, 131,44, 124,86, 122,20, 116,17, 114,18, 114,10, 114,06, 114,02, 62,71, 58,78, 43,86, 21,16.
16
19
6
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 353,32533, Найдено 353,14369.
Пример 8: Получение DXL-A-28
8-(3-нитро-5-(трифторметил)фенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и желтое твердое вещество получали с выходом 43,2%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,88 (д, J=12,1 Гц, 2H), 7,54 (с, 1H), 3,59 (т, J=16,9 Гц, 12H), 2,18 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 150,36, 148,96, 132,63, 132,27, 131,83, 131,49, 124,47, 118,28, 113,33, 111,74, 62,70, 58,66, 43,53, 21,17.
15
19
3
3
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFNO [M-Br], 330,32492, Найдено 330,14195.
Пример 9: Получение DXL-A-29
8-(3-метил-5-нитрофенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и желтое твердое вещество получали с выходом 27,1%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,50 (с, 2H), 7,20 (с, 1H), 3,79-3,32 (м, 12H), 2,34 (с, 3H), 2,26 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 149,43, 148,38, 123,19, 116,18, 107,69, 62,63, 58,78, 43,99, 21,14, 20,64.
15
22
3
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrNO [M-Br], 276,35353, Найдено 276,17033.
Пример 10: Получение DXL-A-30
8-(4-метил-3-нитрофенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и желтое твердое вещество получали с выходом 18,2%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,31 (с, 1H), 7,10 (т, J=6,6 Гц, 2H), 3,67-3,49 (м, 8H), 3,40 (с, 4H), 2,19 (с, 4H), 2,17 (с, 3H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 148,67, 147,64, 133,68, 126,13, 121,81, 111,63, 62,70, 58,87, 44,16, 21,18, 18,78.
15
22
3
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrNO [M-Br], 276,35353, Найдено 276,17085.
Пример 11: Получение DXL-A-32
8-(4-циано-3-нитрофенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и желтое твердое вещество получали с выходом 32,6%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,58 (дд, J=10,9, 5,5 Гц, 2H), 7,14 (дт, J=33,4, 16,7 Гц, 1H), 3,73 (с, 4H), 3,66-3,51 (м, 8H), 2,16 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 152,27, 136,61, 118,50, 117,34, 110,52, 94,25, 62,60, 58,29, 42,14, 21,05.
15
19
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrN4O [M-Br], 287,33641, Найдено 287,15134.
Пример 12: Получение DXL-A-05
8-(3-хлорфенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белое твердое вещество с выходом 58,8%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,23 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,01 (д, J=1,8 Гц, 1H), 6,92 (дд, J=17,4, 8,1 Гц, 2H), 3,47 (дд, J=30,2, 26,7 Гц, 12H), 2,14 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 150,24, 134,62, 130,77, 121,34, 116,65, 115,14, 62,62, 58,81, 44,36, 21,09.
14
20
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrClN [M-Br], 251,77445, Найдено 251,13082.
Пример 13: Получение DXL-A-06
8-(3-(трифторметил)фенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ II и получали белое твердое вещество с выходом 23,7%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,46 (т, J=7,9 Гц, 1H), 7,31 (с, 1H), 7,26 (т, J=7,6 Гц, 2H), 3,58 (дд, J=13,8, 5,7 Гц, 12H), 2,17 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 149,37, 131,22, 130,90, 130,29, 125,46, 122,77, 120,24, 117,94, 113,20, 62,65, 58,87, 44,39, 21,11.
15
20
3
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 285,32736, Найдено 285,15715.
Пример 14: Получение DXL-A-10
8-(мета-толил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ I и получали белое твердое вещество с выходом 83%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,22 (т, J=7,8 Гц, 1H), 6,90 (с, 1H), 6,85 (д, J=6,8 Гц, 2H), 3,62-3,49 (м, 8H), 3,44 (с, 4H), 2,24 (с, 3H), 2,15 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 160,00, 150,52, 130,67, 110,01, 107,15, 103,40, 62,61, 58,90, 55,44, 44,80, 21,07.
15
23
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrN [M-Br], 231,35597, Найдено 231,18548.
Пример 15: Получение DXL-A-18
8-(2-фторфенил)-5,8-диазаспиро[4.5]декан-5-ий бромид
1
2
Применяли Общий Способ III и получали белый пластинчатый кристалл с выходом 91%. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,15-6,98 (м, 4H), 3,63-3,43 (м, 8H), 3,31 (с, 4H), 2,11 (с, 4H).
13
2
C ЯМР (101 МГц, DO) δ 156,72, 154,51, 137,09, 137,00, 125,09, 125,05, 125,02, 119,84, 116,47, 116,27, 62,82, 59,20, 45,73, 21,03.
14
20
2
+
ES-HRMS: Рассчитано для CHBrFN [M-Br], 235,31985, Найдено 235,16094.
Примеры эффектов
Для получения соединений LXM-21, LXM-22, см. WO 2007/147346 A1, которая включена в качестве ссылки во всей своей полноте.
Каждое соединение вводили в дозах 0,4, 1, 3, 4, 6, 9 и 12 мг/кг и, когда не было значительных различий в эффективности каждого соединения, вводимого в более низкой дозе, использовали последовательно увеличивающуюся дозу, то есть, когда доза 0,4 мг/кг не показывала существенной разницы по сравнению с контролем, дозу доводили до 1 мг/кг для повторения теста, и т.д.
Поскольку молекулярные массы соединений DXL-A-27, DXL-A-28, DXL-A-29, DXL-A-30, DXL-A-32 значительно отличались от других соединений, дозы этих соединений все составляли 4 мкмоль/кг.
Экспериментальные животные
Мыши ICR, 18-22 г, половина из которых самцы, а другая половина самки, предоставлены Департаментом лабораторных животных Пекинского университета (лицензия №SCXK (Пекин) 2016-0010).
Аналгетические эффекты соединений по настоящему изобретению измеряли с использованием следующих экспериментов.
Следующие примеры относятся к фармацевтическим экспериментам с соединениями по настоящему изобретению. В следующих экспериментах все результаты фармацевтических экспериментов были статистически обработаны, и результаты экспериментов были проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS 13.0; в тесте «корчей», вызванных введением уксусной кислоты, и эксперименте с формалином для сравнения между группами использовали однофакторный дисперсионный анализ; в тесте «горячей пластины» и тесте индуцированного ксилолом отека уха мыши использовали дисперсионный анализ с повторными измерениями, и стандартный критерий значимости был P <0,05.
Пример эффекта 1: Тест «горячая пластина»
Температуру горячей пластины доводили до 55°C и реакции мыши, такие как облизывание задних лап и прыжки, использовали в качестве показателей наблюдения. Время от размещения мышей на медной пластине до появления вышеуказанных ответов определяли как латентное время. Латентное время измеряли три раза за 30 минут до введения, и его среднее значение использовали в качестве базового порога или базовой латентности (BL). Животных с латентным временем более 15 сек. и менее 5 сек. удаляли, а оставшихся мышей случайным образом распределяли по группам, по 8 животных на группу. Была установлена контрольная группа введения носителя (дважды дистиллированная вода) и группы для испытываемых образцов (соединения и их дозы показаны в Таблице 1). Все лекарственные средства растворяли в физиологическом растворе перед введением и вводили внутрижелудочно (i.g.). Латентное время измеряли через 2,0 часа после введения. Процент повышения болевого порога (PTE%), вызываемого соединением у мышей, рассчитывали по следующей формуле:
PTE% = (латентное время тестируемой группы - латентное время контрольной группы введения носителя) / контрольной группы введения носителя × 100
Результаты экспериментов показаны в Таблице 1 ниже. Результаты соединений по настоящему изобретению показали P <0,05 по сравнению с группой введения носителя, где соединения DXL-A-16, DXL-A-19, DXL-A-21, DXL-A-22, DXL-A-23, DXL-A-24, DXL-A-27, DXL-A-28, DXL-A-29 и DXL-A-32 показали P <0,01 по сравнению с группой введения носителя.
Таблица 1Процент повышения болевого порога для соединений по настоящему изобретению
Соединение
Доза
PTE%
Носитель в качестве контроля (дважды дистиллированная вода)
-
0
LXM-21
3 мг/кг
4,78
LXM-22
3 мг/кг
25,03
DXL-A-05
3 мг/кг
19,5
DXL-A-06
3 мг/кг
16,67
DXL-A-10
3 мг/кг
11,18
DXL-A-16
1 мг/кг
31,44
DXL-A-19
1 мг/кг
34,34
DXL-A-21
1 мг/кг
36,63
DXL-A-22
1 мг/кг
52,57
DXL-A-23
1 мг/кг
39,24
DXL-A-24
1 мг/кг
48,64
DXL-A-27
4 мкмоль/кг
49
DXL-A-28
4 мкмоль/кг
36
DXL-A-29
4 мкмоль/кг
36
DXL-A-30
4 мкмоль/кг
21
DXL-A-32
4 мкмоль/кг
38
Пример эффекта 2: Тест «корчей», вызванных введением уксусной кислоты
Мышей ICR, половина из которых самцы, а другая половина самки, случайным образом распределяли по группам, по 8 животных на группу. Были установлены контрольная группа введения носителя (дважды дистиллированная вода), контрольная группа введения ибупрофена и группы для испытываемых образцов (соединения и их дозы показаны в Таблице 2). Все лекарственные средства растворяли в дважды дистиллированной воде перед введением и вводили внутрижелудочно в заранее установленных дозах. Через два часа после введения мышам внутрибрюшинно (ip) вводили 0,6% раствор уксусной кислоты (10 мл/кг, ip) и количество корчей мышей (живот вдавлен, ягодицы подняты, тело вытянуто), регистрировали в течение 5-20 минут. Процент ингибирования % соединением корчащей боли у мышей рассчитывали по следующей формуле.
Процент ингибирования % = (количество корчей в контрольной группе введения носителя - количество корчей в тестируемой группе)/количество корчей в контрольной группе введения носителя ×100
Аналгетические эффекты соединений по настоящему изобретению на боль, стимулированную уксусной кислотой, показаны в Таблице 2. Результаты соединений по настоящему изобретению показали P <0,05 по сравнению с контрольной группой введения носителя, где DXL-A-29 и DXL-A-30 показали P <0,01 по сравнению с контрольной группой введения носителя.
Таблица 2Аналгетические эффекты соединений по настоящему изобретению на боль, стимулированную уксусной кислотой
Соединение
Доза
Процент ингибирования (%)
Носитель в качестве контроля (дважды дистиллированная вода)
-
0
LXM-21
3 мг/кг
32,45
LXM-22
3 мг/кг
16,4
DXL-A-05
3 мг/кг
22,49
DXL-A-06
3 мг/кг
14,03
DXL-A-10
3 мг/кг
29,82
DXL-A-16
1 мг/кг
-
DXL-A-18
1 мг/кг
21,71
DXL-A-19
1 мг/кг
-
DXL-A-21
1 мг/кг
-
DXL-A-22
1 мг/кг
-
DXL-A-23
1 мг/кг
-
DXL-A-24
1 мг/кг
-
DXL-A-27
4 мкмоль/кг
-
DXL-A-28
4 мкмоль/кг
-
DXL-A-29
4 мкмоль/кг
75,97
DXL-A-30
4 мкмоль/кг
41,75
DXL-A-32
4 мкмоль/кг
-
Уровень ибупрофена
200 мг/кг
49,08
Примечание: символ "-" указывает, что данные, полученные при этой дозе, существенно не отличались от контрольной группы введения носителя
Пример эффекта 3: Эксперимент с формалином
Мышей ICR, половина из которых самцы, а другая половина самки, случайным образом группировали по 8 мышей на группу. Были установлены контрольная группа введения носителя (дважды дистиллированная вода) и группы для испытываемых образцов, в которых использовали соединения и дозы, показанные в Таблице 3. Все лекарственные средства растворяли в дважды дистиллированной воде перед введением и вводили внутрижелудочно в заранее установленных дозах. Через 2,0 часа после введения мышам вводили 20 мкл 2,5% раствора формалина в правую заднюю ногу и количество облизываний или кусания лапы регистрировали как показатель реакции на боль, где 0-5 минут определяли как фазу I, 10-60 минут определяли как фазу II, и общее время наблюдения составляло 60 минут. Процент ингибирования соединением фазы II боли у мышей рассчитывали по следующей формуле:
Процент ингибирования % = (время облизывания или кусания лапы в контрольной группе введения носителя - время облизывания или кусания лапы в тестируемой группе) / время облизывания или кусания лапы в контрольной группе введения носителя ×100
Эффекты соединений по настоящему изобретению на боль, стимулированную формалином, показаны в Таблице 3. Результаты соединений по настоящему изобретению показали P <0,05 по сравнению с группой введения носителя, где соединения DXL-A-05, DXL-A-10, DXL-A-16, DXL-A-19, DXL-A-21, DXL-A-22, DXL-A-23 и DXL-A-24 показали P <0,01 по сравнению с группой введения носителя.
Таблица 3Эффект соединений по настоящему изобретению на боль, стимулированную формалином
Соединение
Доза
Процент ингибирования (%) фазы II боли
Носитель в качестве контроля (дважды дистиллированная вода)
-
0
LXM-21
9 мг/кг
42,01
LXM-22
9 мг/кг
19,28
DXL-A-05
9 мг/кг
32,93
DXL-A-06
9 мг/кг
17,62
DXL-A-10
9 мг/кг
46,93
DXL-A-16
1 мг/кг
31,44
DXL-A-18
1 мг/кг
21,99
DXL-A-19
1 мг/кг
34,34
DXL-A-21
1 мг/кг
36,63
DXL-A-22
1 мг/кг
52,57
DXL-A-23
1 мг/кг
39,24
DXL-A-24
1 мг/кг
50,17
DXL-A-27
4 мкмоль/кг
20,07
DXL-A-28
4 мкмоль/кг
13,35
DXL-A-29
4 мкмоль/кг
17,29
DXL-A-30
4 мкмоль/кг
16,92
DXL-A-32
4 мкмоль/кг
2,64
Пример эффекта 4: Тест индуцированного ксилолом отека уха мыши
Мышей ICR случайным образом распределяли по группам, по 8 животных на группу, половина из которых были самцы, а другая половина самки. Контрольная группа введения носителя (дважды дистиллированная вода) и группы для образцов, которые должны быть испытаны (соединения и их дозы показаны в Таблице 4). Все лекарственные средства растворяли в дважды дистиллированной воде непосредственно перед введением и вводили внутрижелудочно в заранее установленных дозах. Через 2,0 часа после введения внутреннюю и внешнюю стороны правого уха мыши равномерно смазывали 50 мкл ксилола. Через 30 минут, левое и правое уши мыши отрезали и круглые кусочки уха одинакового размера перфорировали в одинаковом положении на левом и правом ушах и взвешивали. Процент ингибирования соединением отека уха у мышей рассчитывали по формуле.
Процент ингибирования % = (степень отека уха в контрольной группе введения носителя - степень отека уха в тестируемой группе) / степень отека уха в контрольной группе введения носителя ×100
Эффекты соединений по настоящему изобретению на индуцированный ксилолом отек уха у мышей показаны в Таблице 4. Результаты соединений по настоящему изобретению показали P<0,05 по сравнению с группой введения носителя, где соединения DXL-A-05, DXL-A-06, DXL-A-21, DXL-A-22, DXL-A-24 и DXL-A-29 показали P<0,01 по сравнению с группой введения носителя.
Таблица 4Эффекты соединений по настоящему изобретению на индуцированный ксилолом отек уха у мышей
Соединение
Доза
Процент ингибирования (%)
Носитель в качестве контроля (дважды дистиллированная вода)
-
0
LXM-21
3 мг/кг
10,85
LXM-22
3 мг/кг
-
DXL-A-05
3 мг/кг
30,81
DXL-A-06
3 мг/кг
45,85
DXL-A-10
3 мг/кг
27,37
DXL-A-16
1 мг/кг
-
DXL-A-18
1 мг/кг
-
DXL-A-19
1 мг/кг
-
DXL-A-21
1 мг/кг
42,46
DXL-A-22
1 мг/кг
46,97
DXL-A-23
1 мг/кг
-
DXL-A-24
1 мг/кг
53,37
DXL-A-27
4 мкмоль/кг
4,13
DXL-A-28
4 мкмоль/кг
9,27
DXL-A-29
4 мкмоль/кг
63,27
DXL-A-30
4 мкмоль/кг
-
DXL-A-32
4 мкмоль/кг
20,37
Примечание: символ "-" указывает, что данные, полученные при этой дозе, существенно не отличались от контрольной группы введения носителя
Пример эффекта 5: Исследование эффектов соединений DXL-A-22 и DXL-A-24 против невропатической боли
Материалы и метод
1 Материалы
1.1 Животные
Крысы SD, масса тела 180 г - 220 г, половина из которых были самцы, а другая половина самки, предоставлены Департаментом Лабораторных Животных Пекинского университета. Крыс выращивали в стандартной среде с температурой 22 ± 0,5°C и относительной влажностью 55 ± 5%, цикл чередования света и темноты 12 час/12 час, и кормили стандартным кормом.
1.2 Реагенты
Соединение DXL-A-22 и Соединение DXL-A-24 предоставлены кафедрой химической биологии Пекинского университета; Габапентин (Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.)
1.3 Инструменты
электронный тестер боли фон Фрея (IITC 2390, USA); тестер термически-вызванного болевого ответа (LE 7406, USA)
2 Способ
2.1 Модель хронического компрессионного повреждения седалищного нерва (CCI)
Крысу анестезировали пентобарбиталом натрия (60 мг/кг, i.p.), правую заднюю конечность хирургически сбривали, фиксировали в положении лежа, продольный разрез делали вдоль середины правой задней конечности крысы, мышцу резко отделяли, обнажали седалищный нерв и раздвоенный проксимальный конец седалищного нерва свободно лигировали 4-0 шелковым швом 4 раза с интервалом около 1 мм каждый раз, где степень сжатия была подходящей, когда было замечено, что правая задняя нога слегка тряслась. После лигирования последовательно зашивали мышцы и кожу. Для группы с имитацией операции седалищный нерв был только обнажен, но не лигирован. Успех моделирования определяли путем наблюдения за тем, была ли задняя конечность крысы с оперированной стороны закрытой, слегка вальгусной и часто освобождаемой, и путем измерения порога отдергивания лап при механической стимуляции и латентности отдергивания лап при термической стимуляции крысы.
Перед операцией определяли пороги отдергивания лап при механической стимуляции и латентности отдергивания лап при термической стимуляции у крыс, и крыс распределяли по следующим группам: группа с имитацией операции (sham), группа введения носителя (дважды дистиллированная вода, i.g.), группа DXL-A-22 (2 мг/кг, i.g.), группа DXL-A-24 (1 мг/кг, i.g.) и группа Габапентина (100 мг/кг, i.g.). Все соединения и лекарственные средства растворяли в дважды дистиллированной воде и вводили внутрижелудочно в концентрации 1 мл/100 г. С первого дня после операции введение осуществляли каждый день и порог отдергивания лап при механической стимуляции и латентность отдергивания лап при термической стимуляции измеряли через 2,0 часа после введения.
2.2 Определение порога отдергивания лап при механической стимуляции (MWT)
2
Порог отдергивания лап при механической стимуляции (MWT) крыс определяли при помощи электронного тестера боли фон Фрея. Измерения осуществляли на 5, 7 и 14 день после операции. Крыс помещали в прозрачный плексигласовый ящик (дно которого представляло собой проволочную сетку с зазором 1 мм) для адаптации к окружающей среде в течение 30 минут. После того, как крысы больше не производили поисковые действия, использовали электронный тестер боли фон Фрея для стимуляции среднего положения лапы на оперированной стороне крысы и регистрировали максимальную силу, вызванную реакцией отдергивания лапы крысы (т.е. MWT). Процент ингибирования соединением рассчитывали по следующей формуле:
Абсолютное увеличение в процентах (т.е. PTE%): PTE% = (MWT тестируемой группы - MWT группы введения носителя) / MWT группы введения носителя ×100
(1)
Относительное увеличение в процентах: Процент ингибирования % = (MWT тестируемой группы - MWT группы введения носителя) / (MWT группы с имитацией операции - MWT группы введения носителя) ×100
(2)
2.3 Определение латентности отдергивания лап при термической стимуляции (PWL)
Латентность отдергивания лап при термической стимуляции (PWL) измеряли методом горячей пластины. Измерения осуществляли на 5, 7 и 14 день после операции. Температура горячей пластины составляла 50,5°C. Измерения времени начинали, когда крысу помещали на горячую пластину, и прекращали, когда появлялись реакции крысы, такие как дрожание и лизание стопы, и на этот раз это был PWL крысы. Время отключения горячей пластины составляло 14 сек, и процент анальгезии (то есть MPE%) рассчитывали по формуле (3):
MPE% = (PWL тестируемой группы - PWL группы введения носителя) / (время отключения - PWL группы введения носителя) ×100
(3)
2.4 Статистическая обработка
Результаты выражали в виде среднего значения ± cтандартная ошибка среднего (SEM) и для анализа использовали программное обеспечение SPSS 19.0. Дисперсионный анализ с повторными измерениями использовали для сравнения групп в тесте механической стимуляции и для сравнения групп в тесте термической стимуляции. Стандартный критерий значимости был P <0,05.
3 Результаты экспериментов
3.1 Эффекты DXL-A-22 на порог отдергивания лап при механической стимуляции (MWT) у крыс CCI (среднее значение ± SEM, n=8)
Группа
Доза (мг/кг)
MWT/процент ингибирования (абсолютный %/относительный %)
День 5 после операции
День 7 после операции
День 14 после операции
Группа с имитацией операции
-
37,92±1,67**
37,87±0,67**
38,41±1,93**
Группа введения носителя
-
10,90±1,23
10,22±0,84
10,56±1,32
DXL-A-22
2
19,28±1,44**/(76,88/31,01)
22,16±0,79**/(116,83/43,18)
22,05±0,74**/(108,81/41,26)
Габапентин
100
21,73±0,49**/(99,36/40,08)
23,37±1,34**/(128,67/47,56)
21,27±0,82**/(101,42/38,46)
** P<0,01, по сравнению с группой введения носителя
3.2 Эффекты DXL-A-22 на латентность отдергивания лап при термической стимуляции (PWL) у крыс CCI (среднее значение ± SEM, n=8)
Группа
Доза (мг/кг)
PWL/MPE(%)
День 5 после операции
День 7 после операции
День 14 после операции
Группа с имитацией операции
-
11,34±0,46**
11,77±0,67**
11,45±0,47**
Группа введения носителя
-
7,47±0,43
7,38±0,19
7,67±0,23
DXL-A-22
2
10,84±0,32**/51,61
11,28±0,64**/58,91
11,19±0,52**/55,61
Габапентин
100
11,37±0,32**/59,72
11,76±0,34**/66,16
11,88±0,40**/66,51
** P<0,01, по сравнению с группой введения носителя
3.3 Эффекты DXL-A-24 на порог отдергивания лап при механической стимуляции (MWT) у крыс CCI (среднее значение ± SEM, n=8)
Группа
Доза (мг/кг)
MWT/процент ингибирования (абсолютный %/относительный %)
День 5 после операции
День 7 после операции
День 14 после операции
Группа с имитацией операции
-
36,34±1,82
36,29±1,16
37,80±1,90
Группа введения носителя
-
11,56±1,24
10,48±0,78
11,60±0,97
DXL-A-24
1
20,32±1,09**/(75,78/35,35)
22,84±1,64**/(117,94/47,89)
20,31±1,57**/(75,09/33,24)
Габапентин
100
21,73±0,49**/(87,98/41,04)
23,37±1,34**/(123,00/49,94)
21,27±0,82**/(83,36/36,91)
** P<0,01, по сравнению с группой введения носителя
3.4 Эффекты DXL-A-24 на латентность отдергивания лап при термической стимуляции (PWL) у крыс CCI (среднее значение ± SEM, n=8)
Группа
Доза (мг/кг)
PWL/MPE(%)
День 5 после операции
День 7 после операции
День 14 после операции
Группа с имитацией операции
-
12,43±0,55**
12,47±0,48**
13,17±0,25**
Группа введения носителя
-
8,28±0,67
8,03±0,49
7,40±0,37
DXL-A-24
1
11,29±0,57**/52,62
12,35±0,55**/72,36
13,26±0,43**/88,79
Габапентин
100
11,37±0,32**/54,02
11,76±0,34**/62,48
11,88±0,40**/67,88
** P<0,01, по сравнению с группой введения носителя
Пример эффекта 6: Исследование на противовоспалительные эффекты соединений DXL-A-22 и DXL-A-24
1 Материалы
1.1 Животные
Мыши ICR, масса тела 18 г - 22 г, половина из которых были самцы, а другая половина самки, предоставлены Департаментом Лабораторных Животных Пекинского университета. Животных выращивали в стандартной среде: температура 23 ± 1°С, относительная влажность 55 ± 5%, цикл чередования света и темноты 12час/12час, и кормили стандартным кормом в гранулах.
1.2 Реагенты
Соединения DXL-A-22 и DXL-A-24 синтезированы и предоставлены кафедрой химической биологии Пекинского университета; таблетки дексаметазона ацетата (Zhejiang Xianju Pharmaceutical Co., Ltd., номер партии: 120415); ксилол (Beijing Chemical Plant, номер партии: 20100513); каррагинан (Sigma-Adlrich Company of USA, номер партии: 015K0172).
1.3 Инструменты
Самодельный перфоратор (диаметр 6 мм). Прибор для измерения объема подошвы YLS-7B, Станция оборудования Шаньдунской академии медицинских наук.
2 Метод
2.1 Тест на вызванный ксилолом отек уха у мышей
Мышей случайным образом разделяли на 5 групп, по 8 мышей в группе, половина из которых были самцы, а другая половина самки. Были установлены контрольная группа введения носителя (дважды дистиллированная вода, i.g.), контрольная группа введения дексаметазона (2 мг/кг, i.g.), группа соединения DXL-A-22 (1 мг/кг, i.g.) и группа соединения DXL-A-24 (1 мг/кг, i.g.). Все лекарственные средства растворяли в дважды дистиллированной воде перед введением и вводили внутрижелудочно в концентрации 0,1 мл/10 г. Через один час после введения внутреннюю и внешнюю стороны правого уха мыши равномерно смазывали 30 мкл ксилола, чтобы вызвать воспаление. Через 0,5 часа левое и правое ушо мыши отрезали и круглые кусочки уха одинакового размера перфорировали в одинаковом положении на левом и правом ушах с использованием перфоратора (диаметр 6 мм), соответственно, и взвешивали для определения масс кусочков левого и правого уха. Разницу между массой правого уха после нанесения ксилола и массой левого уха без применения ксилола использовали в качестве индекса степени набухания (т.е. степени набухания). Степень набухания рассчитывали по формуле (1). Интенсивность противовоспалительного эффекта выражали в виде процента ингибирования (%), и процент ингибирования (%) рассчитывали по формуле (2).
Степень набухания=масса кусочка правого уха - масса кусочка левого уха
(1)
Процент ингибирования воспаления (%) = (степень набухания уха в контрольной группе введения носителя - степень набухания уха в группе введения лекарственного средства) / степень набухания уха в контрольной группе введения носителя ×100%
(2)
2.2 Индуцированный каррагинаном отек лап у мышей
Мышь фиксировали в специальном держателе, и обе задние лапы обнажали. Перед испытанием маркером проводили линию на 0,5 см ниже голеностопного сустава мыши и использовали в качестве метки для измерения объема подошвы. За 30 минут до введения объем правой задней лапы измеряли в качестве основного порогового значения. Мышей случайным образом разделяли на 5 групп, по 8 мышей в группе, половина из которых были самцы, а другая половина самки. Были установлены контрольная группа введения носителя (дважды дистиллированная вода, i.g.), контрольная группа введения дексаметазона (0,5 мг/кг, i.g.), группа введения DXL-A-22 (1 мг/кг, i.g.) и группа введения DXL-A-24 (1 мг/кг, i.g.). Все лекарственные средства растворяли в дважды дистиллированной воде перед введением и вводили в концентрации 0,1 мл/10 г. Сразу после внутрижелудочного введения вводили 20 мкл 5% раствора каррагенана в физиологическом растворе подкожно в правую заднюю лапу мышей, и объемы подошв измеряли в моменты времени 0,5 ч, 1 ч и 2 ч после инъекции. Разницу между объемом подошвы правой лапы после инъекции каррагинана и объемом подошвы правой лапы перед инъекцией использовали в качестве индекса степени набухания (т.е. степени набухания). Степень набухания рассчитывали по формуле (3). Интенсивность противовоспалительного эффекта выражали в виде процента ингибирования (%), и процент ингибирования (%) рассчитывали по формуле (4).
Степень набухания=объем подошвы правой лапы после инъекции - объем подошвы правой лапы перед инъекцией
(3)
Процент ингибирования воспаления (%) = (степень набухания подошвы в контрольной группе введения носителя - степень набухания подошвы в группе введения лекарственного средства) / степень набухания подошвы в контрольной группе введения носителя ×100%
(4)
2.3 Статистическая обработка
Результаты выражали в виде среднего значения ± SD. Для анализа использовали программное обеспечение SPSS 19.0. Однофакторный дисперсионный анализ использовали для сравнения групп в тесте индуцированного ксилолом отека уха мыши; и дисперсионный анализ с повторными измерениями использовали для сравнения групп в тесте индуцированного каррагинаном набухания подошвы у мышей. Стандартный критерий значимости был P <0,05.
3. Результаты экспериментов
3.1 Эффекты соединений DXL-A-22 и DXL-A-24 на индуцированное ксилолом набухание уха у мышей (среднее значение ± SD, n=8)
Группа
Доза (мг/кг)
Степень набухания (мг)
Процент ингибирования (%)
Носитель в качестве контроля
-
9,55 ± 0,34
-
Дексаметазон
2
2,93 ± 0,32<sup>**</sup>
69,28
DXL-A-22
1
5,48 ±0,16<sup>**</sup>
42,62
DXL-A-24
1
4,64 ± 0,11<sup>**</sup>
51,41
** P <0,01, по сравнению с группой введения носителя
3.2 Эффекты соединений DXL-A-22 и DXL-A-24 на индуцированное каррагинаном набухание подошвы у мышей (среднее значение ± SD, n=8)
Группа
Доза (мг/кг)
степень набухания (мкл) через 0,5 часа /процент ингибирования (%)
степень набухания (мкл) через 1 час /процент ингибирования (%)
степень набухания (мкл) через 2 часа /процент ингибирования (%)
Носитель в качестве контроля
-
85,38 ± 19,81
86,63 ± 28,32
111,50 ± 25,88
Дексаметазон
0,5
26,00 ± 14,21<sup>**</sup>/69,55
19,88 ± 10,09<sup>**</sup>/77,06
17,13 ± 11,54<sup>**</sup>/84,64
DXL-A-22
1
42,63 ± 16,98<sup>**</sup>/50,07
38,50 ± 11,40<sup>**</sup>/55,56
38,63 ± 11,67<sup>**</sup>/65,36
DXL-A-24
1
40,75 ± 13,34<sup>**</sup>/52,27
36,63 ± 16,12<sup>**</sup>/57,72
36,25 ± 9,60<sup>**</sup>/67,49
** P ＜ 0,01, по сравнению с группой введения носителя при том значении времени
Из приведенных выше результатов можно сделать вывод, что соединения по настоящему изобретению представляют собой класс соединений с очевидными анальгетическими эффектами, и ожидают, что они будут представлять собой новое поколение аналгезирующих лекарственных средств.