НОВЫЕ ПОЛНОСТЬЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ VAP-1
NEW COMPLETELY HUMAN VAP-1 MONOCLONAL ANTIBODIES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих полностью человеческие моноклональные антитела, распознающие белок адгезии эндотелиальных клеток, VAP-1, и, в частности, к полностью человеческому моноклональному антителу, обозначенному BTT-1023, которое распознает функциональный эпитоп VAP-1.
Известный уровень техники
Публикации и другой материал, используемый в настоящем описании для иллюстрации известного уровня техники и, в частности, фактов, предоставляющих дополнительные подробности в отношении практического использования, включены в настоящую заявку в качестве ссылки.
Обычно полноразмерные антитела обладают общей Y-образной структурой, состоящей из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Эти четыре полипептидные субъединицы составлены так, что две тяжелые цепи связаны, а легкая цепь присоединена к каждой тяжелой цепи с помощью дисульфидных связей. Каждый полипептид, составляющий антитело, состоит из вариабельной и константной области.
Вариабельная область локализована в плечах Y-образного антитела и определяет антиген-связывающую специфичность антитела. Эта область содержит короткие последовательности аминокислот, которые отвечают за связывание антитела с антигеном. Эти области называют областями, определяющими комплементарность (CDR). Остальные участки вариабельных областей важны для конформации антиген-связывающего кармана в целом.
Константная область антитела локализована в основе тяжелых цепей и определяет способность антитела активировать иммунные реакции путем взаимодействий со специфическими рецепторами. Эти области обычно высококонсервативны и их вариабельность ограничена пятью основными изоформами, IgA, IgD, IgE1 IgG и IgM.
Белок-1 адгезии сосудов (VAP-1) представляет собой неклассическую, индуцируемую воспалением молекулу адгезии, экспрессируемую на эндотелиальных клетках сосудов, где она опосредует перекатывание лейкоцитов при физиологическом сдвиге. В этой роли он вносит вклад в рециркуляцию лимфоцитов через венулы с высоким эндотелием (HEV) вторичной лимфоидной ткани как часть нормального процесса иммунологического надзора.
Однако в условиях воспаления VAP-1 способствует инфильтрации лейкоцитов в воспаленную ткань, тем самым способствуя и поддерживая воспалительный ответ. Эта инфильтрация сама может быть повреждающим фактором при хронических воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и многие аутоиммунные и другие воспалительные заболевания. В других случаях массивная инфильтрация провоспалительных клеток в ткань после тяжелого тканевого повреждения в результате инфаркта миокарда, удара и других заболеваний вносит вклад в деструкцию ткани, наблюдаемую при этих острых воспалительных ответах. Снижение инфильтрации клеток в места воспаления путем предотвращения функционирования VAP-1 с помощью блокирующих антител, вероятно, позволит воспалению разрешиться и приведет к улучшению клинических симптомов этих заболеваний.
В патенте США 5580780 описано моноклональное антитело (mAb) 1B2, которое распознает VAP-1 и которое может блокировать связывание лимфоцитов с HEV миндалин в тесте на замороженных срезах. MAb 1B2 представляет собой антитело IgM мыши и специфично для VAP-1.
Применение мышиных mAb в качестве терапевтических средств имеет ограниченный потенциал, так как иммунная система человека распознает мышиные антитела как чужеродное вещество и продуцирует антимышиные антитела (HAMA) для удаления их из организма. Эта иммунная реакция является основным ограничением использования мышиных антител при долговременной терапии, когда необходимо повторное введение. Использование мышиных антител против VAP-1 в клинической практике должно быть ограничено больными, получающими лечение иммуносупрессорами, и, следовательно, менее склонными к реакциям на HAMA, когда допустимо только одно введение антител, такими как при повреждении при ишемии-реперфузии при остром инфаркте или остром респираторном дистресс-синдроме.
Еще одним недостатком использования для лечения антител IgM мыши против VAP-1 является неблагоприятный кинетический профиль таких антител, т.е. короткий период полжизни, который делает их неподходящими для использования при хронических нарушениях, таких как ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и многие другие заболевания.
В данной области известно несколько методов создания менее иммуногенных моноклональных антител. Предпочтительные подходы включают «гуманизацию» антител. Часто используемыми стратегиями являются создание химерных mAb, гуманизированных mAb или полностью человеческих mAb. Химерные антитела представляют собой антитела, у которых вариабельная область является мышиной, а константная область является человеческой. В химерных антителах приблизительно 70% молекулы антитела грызуна обычно замещено соответствующими последовательностями человека, но при этом сохраняются антиген-связывающие сайты грызуна с их конкретной специфичностью и сродством. Гуманизированные антитела представляют собой антитела, в которых вариабельная область может быть мышиной, но которые подвергнуты мутации так, что более похожи на антитело человека и могут содержать человеческую константную область. Полностью человеческие антитела представляют собой антитела, в которых как вариабельная область, так и константная область являются человеческими.
В международной патентной публикации WO03/093319 раскрыто химерное моноклональное антитело BTT-1002 против VAP-1, которое отличается тем, что способно вызвать пониженный иммунный ответ по сравнению с соответствующими антителами мыши. Однако, будучи химерным антителом, BTT-1002 по прежнему имеет белковые последовательности, соответствующие вариабельные области антитела, которые непосредственно и без модификации являются мышиными. Это антитело сохраняет возможность распознаваться как чужеродное и быть иммуногенным при введении человеку. Его фармакологические свойства, такие как его полупериод выведения, и функциональные свойства также могут быть не удовлетворительными из-за его иммуногенности и, следовательно, продукции антител против него.
Таким образом, в данной области существует потребность в полностью человеческом антителе против VAP-1 с пониженной иммуногенностью и улучшенными фармакологическими свойствами.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение в широком смысле относится к новым полностью человеческим антителам против VAP-1, способам получения таких антител и применению антител. Настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, кодирующим указанные антитела против VAP-1.
Настоящее изобретение относится к полностью человеческому моноклональному антителу, которое можно использовать в диагностике и/или терапии in vivo, у которого понижен потенциал выработки иммунного ответа у больных и которое обладает эффективными фармакологическими характеристиками для терапевтических целей.
Также настоящее изобретение относится к тяжелой и легкой цепи полностью человеческих антител против VAP-1 или их фрагментов.
Дополнительно настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полностью человеческие антитела против VAP-1 или их фрагментам, а также экспрессионным векторам и клеткам-хозяевам, включающим эти нуклеиновые кислоты для рекомбинантной экспрессии антител против VAP-1.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения полностью человеческих антител против VAP-1 по настоящему изобретению рекомбинантными методами получения.
Описаны также фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела, и их терапевтическое применение.
Краткое описание фигур
Ниже изобретение описано более подробно с помощью предпочтительных вариантов осуществления со ссылкой на прилагаемые фигуры.
L
H
На фигурах с 1 по 5 представлены нуклеотидные последовательности и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельных областей антител против VAP-1 8C10 (фигура 1A-B), 8A4 (фигура 2A-B), 3F10 (фигура 3A-B), 5F12 (фигура 4A-B) и 4B3 (фигура 5A-B). Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи (V) (A) и вариабельных областей тяжелой цепи (V) (B) были выведены из клонированных кДНК. Три CDR в каждой аминокислотной цепи представлены жирным шрифтом с подчеркиванием соответствующих нуклеотидных последовательностей.
H
H
L
L
На фигуре 6 представлено выравнивание вариабельных областей белковой последовательности 8C10, 8A4, 3F10, 5F12 и 4B3 тяжелой цепи V, показывающее консенсусную последовательность (фиг. 6A). Выравнивание CDR с 1 по 3 тяжелой цепи V с консенсусной последовательностью представлено на фиг. 6B, фиг. 6C и фиг. 6D. На фигуре 6E представлено выравнивание вариабельных областей белковой последовательности 8C10, 8A4, 3F10, 5F12 и 4B3 легкой цепи V, показывающее консенсусную последовательность. Выравнивание CDR с 1 по 3 легкой цепи V с консенсусной последовательностью представлено на фиг. 6F, фиг. 6G и фиг. 6H.
На фигуре 7 проиллюстрировано связывание VAP-1 рекомбинантным полностью человеческим антителом r8C10 (BTT-1023) на клетках Ax, экспрессирующих на клеточной поверхности VAP-1 человека, продемонстрированное с помощью FACS анализа (сортировки клеток с помощью активации флуоресценции) окрашенных на BTT-1023 клеток Ax, экспрессирующих VAP-1, по сравнению с контрольными окрашенными клетками.
Фигура 8 иллюстрирует эффект BTT-1023 на трансмиграцию лейкоцитов in vitro. Представлено количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), трансмигрировавших через монослои эндотелиальных клеток, обработанных BTT-1023 или контрольными антителами. Величины ошибки представлены как стандартная ошибка среднего, N= 6.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к полностью человеческим, предпочтительно, полученным рекомбинантными способами, моноклональным антителам (mAb), специфически распознающим белок-1 адгезии сосудов, VAP-1, человека. Полностью человеческие моноклональные антитела по настоящему изобретению имеют пониженную иммуногенность по сравнению с соответствующими гуманизированными антителами и, следовательно, являются эффективными для лечения ряда аутоиммунных заболеваний, воспалительных состояний и заболеваний соединительной ткани, кожи и желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы и легочных систем, включая такие состояния, как хронический артрит, воспалительные заболевания кишечника и хронические дерматиты. Полностью человеческие антитела против VAP-1, кроме того, эффективны для использования в диагностике in vitro и in vivo, включая иммуносцинтиографическую визуализацию участков воспаления in vivo.
Используемый в настоящем описании термин «вариант консервативной последовательности» включает модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, которые существенно не изменяют связывающих свойств полностью человеческих антител против VAP-1 по настоящему изобретению. Варианты консервативной нуклеотидной последовательности включают варианты, возникающие из-за вырожденности генетического кода и из-за молчащих мутаций. Изобретение также охватывает нуклеотидные замены, делеции и добавки. Варианты консервативной аминокислотной последовательности включают варианты, возникающие из-за аминокислотных замен сходными аминокислотами, хорошо известными в данной области. Также изобретение включает делеции и добавки аминокислот.
Полипептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению включают полипептиды и полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны полностью человеческим антителам против VAP-1 или полинуклеотидам, кодирующим указанные антитела, описанным ниже.
Настоящее изобретение относится к тяжелой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей по меньшей мере одну консенсусную последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из:
1
2
3
4
5
a) последовательности XXXXX (SEQ ID NO:1), где
1
X представляет собой небольшую полярную или основную аминокислоту, такую как S, N или R,
2
X представляет собой ароматическую или небольшую полярную аминокислоту, такую как Y или S,
3
X представляет собой небольшую гидрофобную или ароматическую аминокислоту, такую как A, G или W,
4
X представляет собой гидрофобную аминокислоту, такую как M или I, и
5
X представляет собой небольшую полярную или основную аминокислоту, такую как H или S;
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
b) последовательности XXXXXGXXXXXXDSVXG (SEQ ID NO:2), где
1
X представляет собой небольшую аминокислоту, такую как V, A или N,
2
X представляет собой небольшую алифатическую аминокислоту, такую как I или L,
3
X представляет собой ароматическую, основную или гидрофобную аминокислоту, такую как W, G или K,
4
X представляет собой ароматическую или алифатическую гидрофобную, или полярную аминокислоту, такую как F, Q, V или Y,
5
X представляет собой небольшую кислую или небольшую аминокислоту, такую как D или G,
6
X представляет собой небольшую или алифатическую аминокислоту, такую как S, G или I,
7
X представляет собой полярную аминокислоту, такую как N, E или Y, или аминокислота отсутствует,
8
X представляет собой полярную аминокислоту, такую как E, K или T,
9
X представляет собой полярную аминокислоту, такую как Y, D или N,
10
X представляет собой ароматическую аминокислоту, такую как Y или H,
11
X представляет собой небольшую гидрофобную аминокислоту, такую как V или A, и
12
X представляет собой заряженную основную аминокислоту, такую как K или R; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
c) последовательности XXXXXXXXXXXXD Y (SEQ ID NO:3), где
1
X представляет собой заряженную кислую аминокислоту, такую как D или E,
2
X представляет собой небольшую или гидрофобную аминокислоту, такую как A, G, K, P или Y,
3
X представляет собой ароматическую или небольшую аминокислоту, такую как W, F, G или N,
4
X представляет собой ароматическую или небольшую аминокислоту, такую как F или G, или аминокислота отсутствует,
5
X представляет собой небольшую аминокислоту, такую как G или S, или аминокислота отсутствует,
6
X представляет собой небольшую аминокислоту, такую как G, или аминокислота отсутствует,
7
X представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как T, или аминокислота отсутствует,
8
X представляет собой полярную ароматическую аминокислоту, такую как Y, или аминокислота отсутствует,
9
X представляет собой заряженную кислую или ароматическую аминокислоту, такую как E или F, или аминокислота отсутствует,
10
X представляет собой ароматическую или небольшую аминокислоту, такую как F, G, S, V или W,
11
X представляет собой небольшую или полярную ароматическую аминокислоту, такую как Y или G, и
12
X представляет собой ароматическую или алифатическую гидрофобную аминокислоту, такую как F или I.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к тяжелой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей аминокислотную последовательность первой CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 4 по 8, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность второй CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 9 по 13, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность третьей CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 14 по 18, и консервативных вариантов их последовательностей. Конкретные тяжелые цепи антитела по настоящему изобретению включают вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 19 по 23, и консервативных вариантов их последовательностей.
Настоящее изобретение дополнительно относится к легкой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей по меньшей мере консенсусную последовательность одной CDR, выбранную из группы, состоящей из:
1
2
3
4
5
a) последовательности RASQXXSXXXLA (SEQ ID NO:24), где
1
X представляет собой небольшую аминокислоту, такую как G или S,
2
X представляет собой алифатическую аминокислоту, такую как I или V,
3
X представляет собой небольшую полярную или положительно заряженную аминокислоту, такую как S или R,
4
X представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как S, или аминокислота отсутствует, и
5
X представляет собой небольшую гидрофобную или ароматическую гидрофобную аминокислоту, такую как A, F, W или Y;
1
2
3
4
5
b) последовательности XASXXXX (SEQ ID NO:25), где
1
X представляет собой небольшую кислую или небольшую аминокислоту, такую как D или G,
2
X представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как S или N,
3
X представляет собой алифатическую или положительно заряженную аминокислоту, такую как L или R,
4
X представляет собой небольшую или полярную аминокислоту, такую как A, E или Q, и
5
X представляет собой полярную или положительно заряженную аминокислоту, такую как S, T или R; и
1
2
3
4
5
c) последовательности QQXXXXPXT (SEQ ID NO:26), где
1
X представляет собой ароматическую или положительно заряженную аминокислоту, такую как F, Y или R,
2
X представляет собой небольшую аминокислоту, такую как N, G или S,
3
X представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как S или N,
4
X представляет собой ароматическую или небольшую полярную аминокислоту, такую как Y, F, W или S, и
5
X представляет собой алифатическую или положительно заряженную аминокислоту, такую как L или R.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к легкой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей аминокислотную последовательность первой CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 27 по 31, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность второй CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 32 по 36, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность третьей CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 37 по 41, и консервативных вариантов их последовательностей. Конкретные тяжелые цепи антитела по настоящему изобретению включают вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 42 по 46, и консервативных вариантов их последовательностей.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к полностью человеческому антителу против VAP-1, включающему тяжелые и легкие цепи по настоящему изобретению. Молекулы антитела и цепи по настоящему изобретению могут включать полную природную молекулу антитела, обладающую полноразмерными тяжелыми и легкими цепями; их фрагмент, такой как Fab, Fab', F(ab')2 или Fv фрагмент; мономер или димер легкой или тяжелой цепи; или одноцепочечное антитело, например, одна цепь Fv, в которой вариабельные области тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером; или любой другой рекомбинантный продукт, или молекула внедренной CDR. Сходно, вариабельная область тяжелой и легкой цепей может подходящим образом объединяться с другими доменами антитела.
В данной области хорошо известно, что домен CDR3 независимо от домена(нов) CDR1 и/или CDR2 один может определять специфичность связывания антитела в отношении своего антигена и что множественные антитела с одной и той же специфичностью связывания могут быть прогнозируемо созданы на основе общей последовательности CDR3.
Соответственно, в настоящем описании раскрыты моноклональные антитела, включающие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела человека или животного, не являющегося человеком, где моноклональное антитело способно специфически связывать VAP-1. В определенных аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, включающим один или несколько доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела животного, не являющегося человеком, например, антитела мыши или крысы, где моноклональное антитело способно специфически связывать VAP-1. В некоторых вариантах осуществления такие антитела по изобретению, включающие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела животного, не являющегося человеком, (a) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (c) связываются с тем же самым эпитопом; и/или (d) имеют сходное связывающее сродство, что и соответствующее родительское антитело животного, не являющегося человеком.
В других аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела человека, такого как, например, антитело человека, полученное у животного, не являющегося человеком, где антитело человека способно специфически связывать VAP-1. В других аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей первого антитела человека, такого как, например, антитело человека, полученное у животного, не являющегося человеком, где первое антитело человека способно специфически связывать VAP-1 и где домен CDR3 первого антитела человека заменяет домен CDR3 антитела человека, которое не обладает специфичностью связывания в отношении VAP-1, с получением второго антитела человека, которое способно специфически связывать VAP-1. В некоторых вариантах осуществления такие антитела по изобретению, включающие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей первого антитела человека, (a) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (c) связываются с тем же самым эпитопом; и/или (d) имеют сходное связывающее сродство, что и соответствующее родительское первое антитело человека.
Антитела по настоящему изобретению могут дополнительно характеризоваться различными физическими свойствами антител против VAP-1. Для определения и/или дифференциации различных классов антител на основе их физических свойств могут быть использованы различные тесты.
В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области либо легкой, либо в тяжелой цепи. Присутствие одного или более сайтов гликозилирования в вариабельной области может приводить к повышенной иммуногенности антитела или изменению фармакокинетики антитела, обусловленной измененным связыванием антигена, как хорошо известно, в данной области. Как известно, гликозилирование возникает в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. Гликозилирование вариабельной области может быть протестировано с использованием теста Glycoblot, при котором антитело расщепляется с получением Fab и затем тестируется на гликозилирование с использованием теста, который измеряет окисление периодата и образование основания Шиффа. Альтернативно, гликозилирование вариабельной области может быть протестировано с использованием хроматографии Dionex light (Dionex-LC), при которой сахариды Fab расщепляются до моносахаридов, и анализируется индивидуальное содержание сахаридов. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело против VAP-1, вариабельная область которого негликозилирована. Это может быть достигнуто либо с помощью отбора антител, которые не содержат мотива гликозилирования в вариабельной области, либо с помощью мутации остатков в мотиве гликозилирования с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области.
В предпочтительном варианте осуществлении антитела по настоящему изобретению не содержат сайтов изомерии аспарагина. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты может происходить на последовательностях N-G или D-G соответственно. Образование изоаспарагиновой кислоты может быть измерено с использованием теста равных количеств, при котором для тестирования изоаспарагиновой кислоты используется ВЭЖХ с обращенной фазой.
Каждое антитело должно иметь однозначную изоэлектрическую точку (pI), но обычно антитела попадают в диапазон рН между 6 и 9,5. pI для антитела IgG1 обычно попадает в диапазон рН 7-9,5 и pI для антитела IgG4 обычно попадает в диапазон рН 6-8. Антитела могут иметь pI, находящуюся вне этого диапазона. Изоэлектрическая точка может быть протестирована с использованием теста капиллярного изоэлектрического фокусирования, при котором создается градиент рН и может использоваться лазерное фокусирование для увеличения точности, как хорошо известно в данной области. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело против VAP-1, которое имеет величину pI, которая попадает в нормальный диапазон. Это может быть достигнуто либо с помощью отбора антител с pI в нормальном диапазоне, либо с помощью мутации заряженных поверхностных остатков с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области.
Каждое антитело должно иметь температуру плавления, которая является показателем тепловой стабильности. Более высокая тепловая стабильность указывает на более высокую стабильность антитела in vivo в целом. Точка плавления антитела может быть измерена с использованием таких способов, как дифференциальная сканирующая калориметрия. TM1 указывает температуру исходного разворачивания антитела. TM2 указывает температуру полного разворачивания антитела. Обычно предпочтительно, чтобы TM1 антитела по настоящему изобретению составляла выше 60°С, предпочтительно выше 65°С, даже более предпочтительно выше 70°С. Альтернативно, тепловая стабильность антитела может быть измерена с использованием кругового дихроизма, как хорошо известно в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления антитела отбирают так, что они не разрушаются быстро. Фрагментация антитела против VAP-1 может быть измерена с использованием капиллярного электрофореза (CE) и масс-спектрометрии с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-МС), что хорошо известно из уровня техники.
В предпочтительном варианте осуществления антитела выбирают так, что они имеют минимальные агрегационные эффекты. Агрегация может вести к запуску нежелательного иммунного ответа и/или измененным неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. Обычно приемлемы антитела с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, даже более предпочтительно 15% или менее, даже более предпочтительно 10% или менее и даже более предпочтительно 5% или менее. Агрегация может быть измерена с помощью нескольких методов, хорошо известных в данной области, включая исключающую по размеру колоночную (SEC) высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и светорассеяние для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров.
Антитела по настоящему изобретению, предпочтительно, являются антителами IgG типа и, более предпочтительно, IgG4 типа. Изобретение также охватывает другие изотипы антител, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgM и IgE.
В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны аминокислотным последовательностям, описанным в настоящем документе предпочтительным антителам, и где антитела сохраняют желаемые функциональные свойства антител против VAP-1 по изобретению.
-7
Например, изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антиген-связывающей части, включающих вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где: (a) вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 19 по 23; (b) вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 42 по 46; (c) антитело связывает VAP-1 человека с Kd 1 × 10 М или ниже.
H
L
H
L
H
L
В других вариантах осуществления аминокислотные последовательности V и/или V на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичны последовательностям, указанным выше. Антитело, обладающее областями V и V, с более высокой гомологией (т.е. 80% или выше) с областями V и V указанных выше последовательностей, может быть получено с помощью мутагенеза (например, сайт-направленного или опосредуемого ПЦР мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих SEQ ID NO: с 19 по 23 и с 42 по 46, с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на сохранность функции.
При использовании в настоящем описании процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями эквивалентен проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию количества идентичных положений, используемых последовательностями (т.е. % гомологии = # идентичных положений/суммарное # положений × 100) с учетом числа пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимы ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей может быть осуществлено с использованием стандартных методов, известных в данной области.
В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению могут быть сконструированы с включением модификаций в области Fc, обычно с изменением одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с рецептором Fc и/или антигензависимая опосредуемая клетками цитотоксичность. Более того, антитело по изобретению может быть химически модифицировано (например, к антителу могут быть присоединены одна или более химических частей) или модифицировано для изменения его гликозилирования опять для изменения одного или более функциональных свойств антитела.
Например, область Fc может быть изменена путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 (нумерация остатков в области Fc соответствует ЕС индексу Кабата), которые могут быть заменены на отличный аминокислотный остаток, так что антитело будет обладать измененным сродством к эффекторному лиганду, но сохранит антиген-связывающую способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, сродство к которому изменяется, может представлять собой, например, рецептор Fc или компонент CI комплемента. Этот подход описывается более подробно, например, в патентах США 5624821 и 5648260.
Другой модификацией антител в настоящем описании, рассматриваемой изобретением, является пэгилирование. Антитело может быть пэгилировано, например, для повышения биологического периода полужизни антитела (например, в сыворотке). Для пэгилирования антитела антитело или его фрагмент обычно вводят в реакцию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционно-способное эфирное или альдегидное производное ПЭГ в условиях, при которых одна или более групп ПЭГ становятся присоединенными к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно, пэгилирование осуществляют путем реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционно-способной молекулой ПЭГ (или аналогичного реакционно-способного водорастворимого полимера). Используемый в настоящем описании термин «полиэтиленгликоль» предназначен для охвата любых форм ПЭГ, которые используются для дериватизации других белков, таких как моно (CI-CIO)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных вариантах осуществления антитело, предназначенное для пэгилирования, представляет собой антитело без гликозильных остатков. Методы пэгилирования белков известны в данной области и могут быть использованы в отношении антител по изобретению.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к специфическим полностью человеческим антителам против VAP-1 8C10, 8A4, 3F10, 4B3 и 5F12. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным полностью человеческим антителам против VAP-1, таким как 8C10, 8A4, 3F10, 4B3 и 5F12. В рекомбинантных r8C10 (BTT-1023) тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 47, и легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 48.
Таблица 1Аминокислотные последовательности полностью человеческих антител против VAP-1
SEQ ID NO
Описание последовательности
1
Консенсусная последовательность CDR1 тяжелой цепи
2
Консенсусная последовательность CDR2 тяжелой цепи
3
Консенсусная последовательность CDR3 тяжелой цепи
4
CDR1 тяжелой цепи 8C10
5
CDR1 тяжелой цепи 8A4
6
CDR1 тяжелой цепи 3F10
7
CDR1 тяжелой цепи 5F12
8
CDR1 тяжелой цепи 4B3
9
CDR2 тяжелой цепи 8C10
10
CDR2 тяжелой цепи 8A4
11
CDR2 тяжелой цепи 3F10
12
CDR2 тяжелой цепи 5F12
13
CDR2 тяжелой цепи 4B3
14
CDR3 тяжелой цепи 8C10
15
CDR3 тяжелой цепи 8A4
16
CDR3 тяжелой цепи 3F10
17
CDR3 тяжелой цепи 5F12
18
CDR3 тяжелой цепи 4B3
19
Вариабельная область тяжелой цепи 8C10
20
Вариабельная область тяжелой цепи 8A4
21
Вариабельная область тяжелой цепи 3F10
22
Вариабельная область тяжелой цепи 5F12
23
Вариабельная область тяжелой цепи 4B3
24
Консенсусная последовательность CDR1 легкой цепи
25
Консенсусная последовательность CDR2 легкой цепи
26
Консенсусная последовательность CDR3 легкой цепи
27
CDR1 легкой цепи 8C10
28
CDR1 легкой цепи 8A4
29
CDR1 легкой цепи 3F10
30
CDR1 легкой цепи 5F12
31
CDR1 легкой цепи 4B3
32
CDR2 легкой цепи 8C10
33
CDR2 легкой цепи 8A4
34
CDR2 легкой цепи 3F10
35
CDR2 легкой цепи 5F12
36
CDR2 легкой цепи 4B3
37
CDR3 легкой цепи 8C10
38
CDR3 легкой цепи 8A4
39
CDR3 легкой цепи 3F10
40
CDR3 легкой цепи 5F12
41
CDR3 легкой цепи 4B3
42
Вариабельная область легкой цепи 8C10
43
Вариабельная область легкой цепи 8A4
44
Вариабельная область легкой цепи 3F10
45
Вариабельная область легкой цепи 5F12
46
Вариабельная область легкой цепи 4B3
47
Тяжелая цепь рекомбинантного r8C10
48
Легкая цепь рекомбинантного r8C10
Полностью человеческие антитела против VAP-1, предпочтительно, получают путем иммунизации мышей, у которых природные гены иммуноглобулинов мыши инактивированы и функционально заменены на весь набор генов иммуноглобулинов человека или его часть. Таких мышей иммунизируют антигеном VAP-1 и затем от этих мышей создают гибридомы, продуцирующие антитела человека, с использованием обычных способов. Затем идентифицируют клонированные клетки гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, взаимодействующие с антигеном VAP-1, и наращивают их для получения очищенных полностью человеческих моноклональных антител.
Альтернативные способы получения антитела человека включают перенос специфичности антитела животного на иммуноглобулин человека. Например, мышей иммунизируют антигеном VAP-1 и затем от этих мышей создают продуцирующие антитела гибридомы с использованием обычных способов. Клонированные гибридомные клетки, которые продуцируют моноклональные антитела, взаимодействующие с антигеном VAP-1, затем идентифицируют и наращивают их для получения очищенных моноклональных антител. Определяют последовательности кДНК вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела и идентифицируют области, определяющие комплементарность (CDR). Аминокислотные последовательности CDR тяжелой и легкой цепей используются для замены соответствующими CDR антитела человека, перенося таким образом специфичность антитела против VAP-1 грызуна на антитело человека. Полученное антитело против VAP-1 является полностью человеческим в том смысле, что, хотя исходные аминокислотные последовательности CDR происходят от грызунов, те же самые аминокислотные последовательности способны генерироваться в человеческом антителе, и его невозможно точно определить как являющееся специфичным для грызунов.
5
Для создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека по изобретению, спленоциты и/или клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей могут быть выделены и слиты с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Может быть проведен скрининг полученных гибридом на продукцию антигенспецифических антител. Например, суспензии отдельных клеток лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей могут быть слиты с одной шестой частью по количеству P3X63-Ag8.653 несекретирующих клеток миеломы мыши (ATTCC, CRL 1580) с помощью 50% ПЭГ. Клетки высевают в количестве приблизительно 2×10 на плоскодонные планшеты для микротитрования с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей 20% фетальную сыворотку для клонирования, 18% кондиционные среды «653», 5% ориген (IGEN), 4 мМ L-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 единиц/мл пенициллин, 50 мг/мл стрептомицин, 50 мг/мл гентамицин и IX HAT (Sigma; HAT добавляют через 24 часа после слияния). Через приблизительно две недели клетки могут культивироваться в среде, в которой HAT замещен на HT. Затем с помощью ELISA может быть проведен скрининг индивидуальных лунок на моноклональные антитела IgM и IgG человека. Как только наступает экстенсивный рост гибридомы, среда может быть обследована обычно через 10-14 дней. Секретирующие антитела гибридомы могут быть пересеяны с повторным проведением скрининга и, если они все еще позитивны в отношении IgG человека, моноклональные антитела могут быть субклонированы по меньшей мере дважды путем лимитирующего разведения. Стабильные субклоны можно затем культивировать in vitro для выработки небольших количеств антитела в среде тканевой культуры для получения его характеристик. С целью очистки моноклональных антител человека отобранные гибридомы могут быть выращены в двухлитровых вращающихся колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы перед аффинной хроматографией на протеин А-сефарозе (Pharmacia, Piscataway, NJ.). Элюированные IgG могут быть протестированы с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для обеспечения чистоты. Буферный раствор может быть заменен на ЗФР, и концентрация может быть определена по ОП 280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80°С.
Полностью человеческие антитела могут быть также получены из библиотек фагового дисплея, которые используют генетически сконструированный фаг для демонстрации и продукции белков-антител человека на поверхности рекомбинантного фага. Одноцепочечные антитела с высоким сродством и специфичностью к любой данной мишени отбирают путем скрининга, и последовательности антител могут быть затем выделены из фага для продукции рекомбинантного полностью человеческого антитела. Такие методы фагового дисплея для выделения антител человека созданы в данной области.
Полностью человеческие антитела по настоящему изобретению могут быть также получены с использованием мышей SCID, у которых воссозданы иммунные клетки человека так, что при иммунизации может быть воспроизведен ответ антител человека. Такие мыши описаны, например, в патентах США 5476996 и 5698767.
Когда это желательно, ДНК, кодирующую вариабельные области легкой и тяжелой цепей антитела, можно выделить и гибридизовать с ДНК, кодирующей любую желаемую человеческую или модифицированную константную область, для получения конструкта ДНК, который может быть вставлен в экспрессионный вектор и трансфицирован в подходящего экспрессирующего хозяина для продукции рекомбинантного полностью человеческого антитела. Таким образом, антитела по настоящему изобретению могут быть получены также в трансфицированной клетке-хозяине с использованием, например, способов комбинаторики рекомбинантных ДНК и способов трансфекции генов, как хорошо известно в данной области.
H
H
K
L
Например, для экспрессии антител или их антительных фрагментов ДНК, кодирующие фрагменты или полноразмерные тяжелые и легкие цепи, могут быть получены стандартными молекулярно биологическими способами (например, ПЦР амплификацией или клонированием кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует интересующее антитело) и ДНК могут быть вставлены в экспрессионные векторы так, чтобы гены были оперативно связаны с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. В данном контексте «оперативно связанные» предназначены для обозначения того, что ген антитела лигирован в вектор так, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, служат предназначенной для них функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности, контролирующие экспрессию, выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельный вектор или более обычно оба гена вводят в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела вводят в экспрессионный вектор стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции во фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции не присутствуют). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей описанных в настоящем документе антител могут быть использованы для создания полноразмерных антительных генов любого изотипа антител путем введения их в экспрессионные векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и легкой цепи желаемого изотипа, так что сегмент V оперативно связывается с сегментом(тами) константной области тяжелой цепи (C) в векторе, а сегмент V оперативно связывается с сегментом константной области легкой цепи (C) в векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор, так что в гене сигнальный пептид связывается в рамке считывания с аминоконцом цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид белка, не являющегося иммуноглобулином).
В дополнение к генам цепей антител рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антител в клетке-хозяине. Термин «регуляторная последовательность» предназначен для включения промоторов, энхансеров и других элементов, контролирующих экспрессию (например, сигналов полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антител, как хорошо известно в данной области. Специалистам в данной области должно быть понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для клетки-хозяина млекопитающего включают вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белков в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие от цитомегаловируса (CMV), вируса обезьян 40 (SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Альтернативно, могут быть использованы невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор β-глобина. Более того, регуляторные элементы состояли из последовательностей от различных источников, таких как промоторная система SRальфа, которая содержит последовательности от раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор вируса типа 1 Т-клеточного лейкоза человека.
В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и гены маркеров селекции. Как хорошо известно в данной области, ген маркера селекции облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые ввелся вектор. Например, обычно ген маркера селекции придает устойчивость к лекарствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую введен вектор. Предпочтительные гены маркеров селекции включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в клетках-хозяевах dhfr- с селекцией/амплификацией метотрексатом) и ген neo (для селекции G418).
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионный(ные) вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными методами. Различные формы термина «трансфекция» предназначены для охвата широкого разнообразия методов, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяина, например, электропорации, преципитации фосфатом кальция, трансфекции с помощью ДЭАЭ-декстрана и тому подобное. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению либо в прокариотных, либо в эукариотных клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотных клетках и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, так как такие эукариотные клетки и, в частности, клетки млекопитающих с большей вероятностью, чем прокариотные клетки способны собирать и секретировать подходящим образом уложенное и иммунологически активное антитело. Экспрессия генов антитела у прокариот, как сообщалось, является неэффективной в плане продукции активного антитела с высоким выходом.
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO) (включая клетки CHO dhfr-, известные в данной области), клетки NSO миеломы, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах, или более предпочтительно для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белков.
В дополнительном аспекте настоящего изобретение относится к молекуле ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей первую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 49 по 53, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или вторую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 54 по 58, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или третью последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 59 по 63, и консервативных вариантов их последовательностей, причем указанные последовательности ДНК кодируют с 1 по 3 области CDR соответственно. В соответствии с конкретным аспектом настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи и включающей последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 64 по 68, и консервативных вариантов их последовательностей.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей первую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 69 по 73, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или вторую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 74 по 78, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или третью последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 79 по 83, и консервативных вариантов их последовательностей, причем указанные последовательности ДНК кодируют с 1 по 3 области CDR соответственно. В соответствии с конкретным аспектом настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи и включающей последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 84 по 88, и консервативных вариантов их последовательностей.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим рекомбинантные полностью человеческие антитела против VAP-1, такие как рекомбинантные 8C10, 8A4, 3F10, 4B3 и 5F12. В рекомбинантных r8C10 (BTT-1023) тяжелая цепь кодируется ДНК, включающей полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:89, и легкая цепь кодируется ДНК, включающей полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:90.
Таблица 2Нуклеотидные последовательности полностью человеческих антител против VAP-1
SEQ ID NO
Описание последовательности
49
CDR1 тяжелой цепи 8C10
50
CDR1 тяжелой цепи 8A4
51
CDR1 тяжелой цепи 3F10
52
CDR1 тяжелой цепи 5F12
53
CDR1 тяжелой цепи 4B3
54
CDR2 тяжелой цепи 8C10
55
CDR2 тяжелой цепи 8A4
56
CDR2 тяжелой цепи 3F10
57
CDR2 тяжелой цепи 5F12
58
CDR2 тяжелой цепи 4B3
59
CDR3 тяжелой цепи 8C10
60
CDR3 тяжелой цепи 8A4
61
CDR3 тяжелой цепи 3F10
62
CDR3 тяжелой цепи 5F12
63
CDR3 тяжелой цепи 4B3
64
Вариабельная область тяжелой цепи 8C10
65
Вариабельная область тяжелой цепи 8A4
66
Вариабельная область тяжелой цепи 3F10
67
Вариабельная область тяжелой цепи 5F12
68
Вариабельная область тяжелой цепи 4B3
69
CDR1 легкой цепи 8C10
70
CDR1 легкой цепи 8A4
71
CDR1 легкой цепи 3F10
72
CDR1 легкой цепи 5F12
73
CDR1 легкой цепи 4B3
74
CDR2 легкой цепи 8C10
75
CDR2 легкой цепи 8A4
76
CDR2 легкой цепи 3F10
77
CDR2 легкой цепи 5F12
78
CDR2 легкой цепи 4B3
79
CDR3 легкой цепи 8C10
80
CDR3 легкой цепи 8A4
81
CDR3 легкой цепи 3F10
82
CDR3 легкой цепи 5F12
83
CDR3 легкой цепи 4B3
84
Вариабельная область легкой цепи 8C10
85
Вариабельная область легкой цепи 8A4
86
Вариабельная область легкой цепи 3F10
87
Вариабельная область легкой цепи 5F12
88
Вариабельная область легкой цепи 4B3
89
Тяжелая цепь рекомбинантного r8C10
90
Легкая цепь рекомбинантного r8C10
Настоящее изобретение дополнительно относится к экспрессионным векторам, включающим нуклеотидные последовательности, описанные выше. Подходящие экспрессионные векторы включают векторы, содержащие элементы, важные для экспрессии и секреции белков в клетках-хозяевах млекопитающих. Вектор может включать ДНК, кодирующую константные области тяжелой цепи человека или константные области легкой цепи или обе. Один и тот же вектор можно использовать для экспрессии и тяжелой, и легкой цепей или, альтернативно, можно использовать разные векторы, содержащие константные области либо тяжелой, либо легкой цепи.
В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессионный вектор включает константную область тяжелой цепи IgG4 человека, модифицированную для снижения связывания с FcγRI и зависимой от антитела опосредуемой клетками цитотоксичности (ADCC) путем замены аминокислоты лейцина 235 аланином, как описано в патенте США 5624821. Нумерация остатков в области Fc соответствует нумерации ЕС индекса Кабата.
Настоящее изобретение также дополнительно относится к клеткам-хозяевам, трансфицированным экспрессионным векторам по настоящему изобретению. Для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих тяжелую и легкую цепи антитела человека, можно использовать любую подходящую систему клетка-хозяин/вектор. Можно использовать бактериальные, например, Escherichia coli, или другие микробные системы, в особенности для экспрессии фрагментов антитела, таких как фрагменты Fab и F(ab')2, и особенно фрагментов Fv и фрагментов одноцепочечного антитела, например, одноцепочечных Fv'. Для получения более крупных продуктов антитела, включая полноразмерные молекулы антитела и/или при необходимости гликозилированных продуктов можно использовать эукариотные экспрессионные системы, например, клетки-хозяева растений, дрожжей или млекопитающих или трансгенных растений и млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают клетки CHO (яичника китайского хомячка) и линии клеток миеломы или гибридомы, как изложено выше. Предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки CHO.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к методу получения рекомбинантных полностью человеческих антител против VAP-1 с помощью процесса, который включает трансфекцию клетки-хозяина экспрессионным вектором, включающим последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи полностью человеческого антитела по настоящему изобретению под контролем подходящих промоторов и сигналов секреции, и размножение указанной клетки-хозяина в таких условиях, что экспрессируется каждая цепь, и выделение указанного и собранного полностью человеческого антитела против VAP-1 или его биологически активных производных из культуры. Общие методы, с помощью которых могут быть сконструированы векторы, методы трансфекции и методы культивирования хорошо известны в данной области.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, в качестве активного ингредиента, полностью человеческое антитело против VAP-1 по настоящему изобретению. Композиция настоящего изобретения содержит полностью человеческие антитела против VAP-1 по настоящему изобретению в количествах, достаточных для противодействия (полного или частичного) связыванию нативного VAP-1 больных с биологическими лигандами VAP-1 у больных, нуждающихся в таком противодействии, и в особенности с лигандами VAP-1, находящихся на лейкоцитах.
Количества и схемы введения полностью человеческих антител против VAP-1 по настоящему изобретению могут быть легко определены специалистами в области клинического лечения связанных с воспалением нарушений. Обычно лечебная доза полностью человеческого антитела против VAP-1 должна варьировать с учетом таких факторов, как: возраст, пол и общее состояние здоровья подлежащего лечению больного; тип параллельного лечения, если оно производится; частота лечения и характер желаемого эффекта; степень повреждения ткани; продолжительность симптомов; и других переменных с доведением до необходимого уровня конкретным врачом. Желаемую дозу можно вводить путем одного или более нанесений для достижения желаемых результатов. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут предлагаться в виде единиц лекарственной формы.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в любом фармацевтически приемлемом носителе для введения. Их можно вводить в любой форме, которая оказывает профилактическое, паллиативное, превентивное или лечебное действие на опосредуемые VAP клинические состояния у больных людей или животных.
Фармацевтические композиции полностью человеческих антител против VAP-1 по настоящему изобретению для парентерального или местного введения включают стерильные водные или неводные растворители, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, рыбий жир и органические сложные эфиры для инъекций. Водные носители включают воду, водные растворы спирта, включая носители для парентерального введения на основе физиологического раствора и забуференной среды, включая раствор хлорида натрия, раствор Рингера, содержащий лактозу, или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкость и питательные добавки, электролитные добавки, такие как добавки декстрозы и тому подобного на основе раствора Рингера. Водные композиции по изобретению могут содержать подходящие буферные агенты, такие как фосфаты натрия и калия, цитратный, ацетатный, карбонатный или глициновый буферы в зависимости от желаемого диапазона pH. Приемлемо также использование хлорида натрия в качестве агента для доведения тоничности. Композиции могут включать другие наполнители, такие как стабилизаторы или консерванты. Подходящие стабилизирующие наполнители включают поверхностно-активные вещества (полисорбат 20 и 80, полоксамер 407), полимеры (полиэтиленгликоли, повидоны), углеводы (сахарозу, манит, глюкозу, лактозу), спирты (сорбит, глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль), подходящие белки (альбумин), подходящие аминокислоты (глицин, глутаминовую кислоту), жирные кислоты (этаноламин), антиоксиданты (аскорбиновую кислоту, цистеин и т.д.), хелатирующие агенты (соли ЭДТА, гистидин, аспарагиновую кислоту) или ионы металлов (Ca, Ni, Mg, Mn). В число пригодных консервантов входят бензиловый спирт, хлорбутанол, бензалкония хлорид и, возможно, парабены.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предложена в концентрированной форме или форме порошка для воссоздания по потребности. В таких случаях можно использовать составы порошка для раствора указанных выше наполнителей для инъекции/инфузии. В случае лиофилизации предпочтительны определенные криозащитные вещества, включая полимеры (повидоны, полиэтиленгликоль, декстран), сахара (сахарозу, глюкозу, лактозу), аминокислоты (глицин, аргинин, глутаминовую кислоту) и альбумин. Если раствор для воссоздания добавляют в упаковку, он может состоять, например, из чистой воды для инъекций или раствора хлорида натрия или растворов декстрозы или глюкозы.
Композиция по изобретению пригодна для диагностики или лечения любого состояния с вовлечением воспалительной реакции, при которой в опосредовании трансмиграции и инфильтрации лейкоцитов из крови в место воспаления играет роль адгезия VAP-1. Так, композиция пригодна для диагностики или лечения воспалительных поражений кожи ревматического или подагрического происхождения и заболеваний соединительной ткани, таких как реактивные артропатии, постинфекционные артропатии, воспалительные полиартропатии, системные нарушения соединительной ткани, воспалительные спондилопатии, миозит, синовит, болезнь Рейтера, серопозитивный ревматоидный артрит, другой ревматоидный артрит, внесуставное ревматоидное заболевание, псориазная и энтеропатическая артропатии, юношеский артрит, артрит с неустановленной причиной, нодозный полиартериит и близкие состояния, другие некротизирующие васкулопатии, дерматополимиозит, системный склероз, другие заболевания с системным вовлечением соединительной ткани, анкилозирующий спондилоартрит и другие воспалительные спондилопатии. Кроме того, диагностике и лечению композицией по изобретению могут подлежать воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона и язвенный колит, дерматозы, такие как буллезные нарушения, дерматит, папулосквамозные нарушения, эритема, склеротический атрофический лихен, крауроз вульвы, дискоидная красная волчанка, кольцевидная склеродермия, пузырчатка, пемфигоид, герпетиформный дерматит, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, раздражающий контактный дерматит, контактный дерматит с неустановленной причиной, псориаз, полиморфная эритема, другие воспалительные заболевания, такие как рассеянный склероз, воспалительная нейропатия, воспалительная миопатия, острый рассеянный энцефаломиелит, васкулит центральной нервной системы, синдром Шегрена, диабет, системная красная волчанка, астма и воспалительное заболевание печени, болезнь Грейвса и тиреоидит, атеросклероз, воспаление глаза, включая увеит, ирит, иридоциклит, алкогольный гепатит, аллотрансплантация, ксенотрансплантация, гломерулонефрит, повреждение при реперфузии и острые воспалительные состояния после инфаркта миокарда и удара.
Терапевтически пригодные полностью человеческие антитела против VAP-1 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы либо химически, либо с помощью генной инженерии с другими агентами, которые обеспечивают направление антител к желаемому месту действия. Альтернативно, с антителами по настоящему изобретению могут быть конъюгированы другие соединения либо химически, либо с помощью генной инженерии для усиления антител или придания им дополнительных свойств, в особенности свойств, которые повышают способность антител вызывать облегчение вредных эффектов, опосредуемых связыванием VAP-1.
Полностью человеческие антитела против VAP-1 по настоящему изобретению могут быть мечены либо химически, либо с помощью генной инженерии для получения выявляемых антител. Такие меченые антитела должны быть удобными инструментами для визуализации мест воспаления у человека, в особенности для in vivo иммуносцинтиграфической визуализации мест воспаления. Этот тип визуализации может заменить более громоздкий и дорогостоящий метод визуализации лейкоцитов, используемый в настоящее время. Для целей визуализации использование фрагментов антител должно быть предпочтительным по сравнению с подходом на основе полноразмерных антител для противовоспалительной терапии, и фрагменты, полученные из полностью человеческих антител, должны быть еще и безопаснее по сравнению с их химерными или мышиными эквивалентами.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к снижению или лечению воспаления in vivo в организме человека путем введения нуждающемуся в таком лечении больному человеку эффективного уровня полностью человеческого антитела против VAP-1 по настоящему изобретению. Термин «лечение» или «лечебная обработка» предназначен для включения введения полностью человеческих антител против VAP-1 индивидууму с целями, которые могут включать профилактику, облегчение, предотвращение или лечение нарушений, опосредуемых событиями адгезии VAP-1. Конкретные антитела против VAP-1, к которым относится изобретение, являются очищенными рекомбинантными полностью человеческими антителами против VAP-1 по настоящему изобретению.
Термин «эффективный уровень» полностью человеческого антитела против VAP-1 означает уровень, при котором вредные опосредуемые VAP-1 события, как минимум, смягчаются. Эффективное количество антитела по настоящему изобретению является таким количеством, которое достаточно для блокирования или частичного блокирования связывания лейкоцитов эндотелием для ингибирования инфильтрации лейкоцитов в места воспаления, в которых такая инфильтрация вредна или нежелательна. Количества и схемы введения полностью человеческих антител против VAP-1 могут быть легко определены специалистом в области клинического лечения связанных с воспалением нарушений. Предпочтительно полностью человеческие антитела против VAP-1 по настоящему изобретению предлагаются для введения в сосудистое русло с интервалами, варьирующими от одного раза в неделю до одного раза в три месяца, в дозах в диапазоне от 0,01 до 20 мг/кг, более предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 10 мг/кг, наиболее предпочтительно - от 0,5 до 5 мг/кг. Альтернативно, полностью человеческие антитела против VAP-1 по настоящему изобретению предлагаются для введения подкожно с интервалами, варьирующими от одного раза в неделю до одного раза в три месяца, в дозах в диапазоне от 0,1 до 20 мг/кг, более предпочтительно в диапазоне от 0,2 до 10 мг/кг, наиболее предпочтительно - от 0,5 до 5 мг/кг.
Следующие примеры даются для дополнительного более подробного разъяснения изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам в данной области, т.е. клиницистам, знакомым с воспалительными нарушениями и их лечением, вполне очевидны дополнительные варианты осуществления и применения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Выделение гибридом, экспрессирующих моноклональное антитело человека против VAP-1
Для создания гибридомных клеток, экспрессирующих моноклональное антитело человека против VAP-1, использовали линию мышей (HuMAb Mouse; Medarex Inc.) с трансгеном иммуноглобулина человека. HuMAb Mouse содержит минилокусы гена иммуноглобулина человека, которые кодируют неперегруппированные последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой κ цепей иммуноглобулина человека, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют локусы эндогенных μ и κ цепей (смотри, например, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Соответственно, мыши проявляют пониженную экспрессию мышиного IgM или κ, и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека подвергаются смене класса и соматической мутации с возникновением высокоаффинного моноклонального антитела человека IgG κ. Получение и использование мышей HuMAb и геномные модификации, носителями которых являются такие мыши, описаны, например, в патентах США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429, которые все принадлежат Lonberg и Kay; патенте США 5545807, принадлежащем Surani et al; публикациях PCT WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, которые все принадлежат Lonberg и Kay; и публикации PCT WO 01/14424, принадлежащей Korman et al.
При иммунизации рекомбинантным VAP-1 человека (rhVAP-1) трансгенная мышь продуцирует IgG антитела человека, специфичные в отношении VAP-1 человека.
Схема иммунизации была следующей: мышей иммунизировали множественными внутрибрюшинными и подкожными инъекциями rhVAP-1, очищенного из клеток CHO, стабильно трансфицированных экспрессионной плазмидой, содержащей кДНК VAP-1 человека и экспрессирующей VAP-1 человека (Smith et al., J. Exp. Med. (1998) 188:17-27), смешанного с полным адъювантом Фрейнда, и затем rhVAP-1, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, или rhVAP-1, смешанного с адъювантом Риби. Образцы сыворотки иммунизированных мышей анализировали для мониторинга иммунного статуса с помощью ELISA с захватом антитела при использовании иммобилизованного rhVAP-1 и технологии флуориметрического анализа для микрообъемов (FMAT) с применением клеток CHO, стабильно трансфицированных экспрессионной плазмидой, содержащей кДНК VAP-1 человека и экспрессирующей VAP-1 человека. Окончательные бустерные инъекции rhVAP-1 вводили внутривенно и внутрибрюшинно перед спленэктомией.
1
Экспрессирующие моноклональное антитело человека против VAP-1 гибридомы получали слиянием клеток миеломы P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) и спленоцитов мышей, иммунизированных, как описано выше, с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве агента слияния. Супернатанты гибридом сначала подвергали скринингу с помощью ELISA на наличие антител IgG человека с легкой цепью каппа. Позитивные по IgG человека клетки затем подвергали скринингу с помощью ELISA на наличие rhVAP-1 и с помощью FMAT на связывание с VAP-1, экспрессированного на поверхности клеток CHO, стабильно трансфицированных экспрессионной плазмидой, содержащей кДНК VAP-1 человека. Были отобраны пять гибридомных клонов с IgG человека против VAP-1, а именно 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10.
Пример 2
Связывающие VAP-1 свойства полностью человеческих антител 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10
3
Для исследования связывания 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10 с rhVAP-1 использовали количественный иммунофлуориметрический анализ с разрешением во времени. Планшет для микротитрования покрывали rhVAP-1 и затем блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина. Затем для связывания rhVAP-1 добавляли антитело в количестве от 2 до 4320 нг/мл, и связанное антитело выявляли с помощью конъюгированного с европием антитела мыши против человека (PerkinElmer Inc.). Метку определяли измерением флуоресценции с разрешением во времени (счетчик Victor для множественных меток, PerkinElmer Inc.) при 615 нм. Показатели флуоресценции прямо коррелируют с количеством антитела, связанного с его мишенью. Данные для образца затем анализировали в сравнении со стандартной кривой репера. Данные показывают, что 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10 связываются с rhVAP-1, и сродство (Kd) представлено в таблице 3.
Таблица 3Связывание mAb 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10 с rhVAP-1
mMab
Kd (нМ)
8C10
0,21
3F10
0,25
4B3
0,31
8A4
0,28
5F12
0,65
Пример 3
Получение, клонирование и секвенирование кДНК вариабельных областей полностью человеческих антител 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10
Для конструирования рекомбинантных антител кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека из антител, полученных в примере 1, выделяли и клонировали в плазмидные векторы для анализа секвенированием.
H
L
L
H
L
H
6
Клоны кДНК вариабельных областей тяжелой цепи (V) и легкой цепи (V) иммуноглобулина (Ig) человека были получены из гибридомных клеток 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10, экспрессирующих антитело против VAP-1, следующим образом. Суммарную РНК получали из 5 × 10 гибридомных клеток с помощью набора RNeasy от Qiagen. кДНК V и V получали обратной транскрипцией РНК с последующей процедурой «быстрой амплификации концов кДНК (RACE)» с использованием «набора для амплификации кДНК SMART RACE» и высокоточного «набора ПЦР Advantage-HF 2» от BD Biosciences Clontech. Амплифицированные ПЦР продукты затем очищали, клонировали в вектор pCR4-TOPO TA (Invitrogen) и трансформировали им штамм E. coli, TOP10 (Invitrogen). Минипрепараты ДНК плазмидных клонов V и V каждого из 5F12, 4B3, 3F10, 8A4 и 8C10 секвенировали, и нуклеотидные и выведенные соответственные белковые последовательности представлены на фигурах с 1 по 6.
Пример 4
Конструирование экспрессионного вектора для млекопитающих для экспрессии рекомбинантного mAb r8c10
Вариабельные области 8C10 вставляли в подходящий экспрессионный вектор для млекопитающих, содержащий подходящие константные области тяжелой и легкой цепей, как описано ниже, для получения функционального рекомбинантного антитела r8C10 (названного BTT-1023) в клетках CHO.
L
H
L
H
L
H
Известно, что область Fc антитела определяет способность комплексов антитело/антиген направлять иммунные ответы. Цель состояла в получении терапевтических антител, которые блокировали бы связывание лейкоцитов с эндотелием сосудов и не проявляли бы эффекторных функций. Поэтому в экспрессионном векторе использовали константную область тяжелой цепи IgG4 человека, модифицированную для снижения связывания с FcγRI и зависимой от антитела опосредуемой клетками цитотоксичности (ADCC) путем замены аминокислоты лейцина 235 аланином, как описано в патенте США 5624821. Амплифицировали кДНК V и V 8C10 с подходящими сайтами клонирования и оптимальной консенсусной последовательностью Козака на 5'-конце с использованием PCR Supermix (Invitrogen). Прямой и обратный праймеры для ПЦР были сконструированы для создания подходящих сайтов рестрикции для клонирования. Продукты ПЦР, которые включают природные сигнальные последовательности V и V, соответственно, очищали и клонировали в плазмидный вектор, несущий константную область легкой цепи каппа человека и тяжелую цепь гамма 4 человека, содержащую мутации с заменами серина 228 пролином и лейцина 235 аланином, и названный plCO-g4PA(VAP1.8C10) с получением плазмид, которыми затем трансформировали клетки TOP10 E. coli. Области V и V плазмиды секвенировали для подтверждения целостности клонированных продуктов ПЦР.
Легкую цепь 8C10, содержащую сайт клонирования HindIII, оптимальную консенсусную последовательность Козака на 5'-конце и сайт клонирования EcoRI на 3'-конце, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием плазмиды pICO-g4PA(VAP1.8C10) в качестве матрицы и PCR Supermix. Продукт ПЦР, который включает нативную сигнальную последовательность легкой цепи 8C10, гидролизовали HindIII и EcoRI, очищали и клонировали в экспрессионный вектор pEE12.4, который был получен от Lonza Biologics, по сайтам HindIII и EcoRI с получением плазмиды 2116. Плазмидой 2116 трансформировали компетентные клетки E.coli DH5α Max Efficiency (Invitrogen Inc.).
Тяжелую цепь 8C10, содержащую сайт клонирования HindIII, оптимальную консенсусную последовательность Козака на 5'-конце и сайт клонирования EcoRI на 3'-конце, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием плазмиды pICO-g4PA(VAP1.8C10) в качестве матрицы и PCR Supermix. Продукт ПЦР, который включает нативную сигнальную последовательность тяжелой цепи 8C10, гидролизовали HindIII и EcoRI. Фрагмент, содержащий тяжелую цепь 8C10, очищали и клонировали в экспрессионный вектор pEE6.4, который был получен от Lonza Biologics, по сайтам HindIII и EcoRI с получением плазмиды 2117. Плазмидой 2117 трансформировали компетентные клетки DH5α Max efficiency. Плазмиды 2116 и 2117 гидролизовали SalI и NotI, и наиболее крупный фрагмент каждого гидролизата лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы с получением плазмиды 2118 [2118-pEE12.4-VAP1(8C10)]. Плазмидой 2118 трансформировали компетентные клетки DH5α Max efficiency. Всю ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепи, секвенировали для подтверждения точности и целостности последовательности.
Пример 5
Экспрессия рекомбинантного полностью человеческого антитела BTT-1023 в клетках CHO
3
Полностью человеческое антитело BTT-1023 получали из клеток CHO следующим образом. Плазмиду 2118-pEE12.4-VAP1(8C10) линеаризовали с помощью PvuI. ДНК трансфицировали электропорацией в клетки CHOK1SV, полученные от Lonza Biologics. Клетки затем помещали в объеме 50 мкл/лунку в 96-луночные планшеты (2,5×10 клеток/лунку) в химически определенной (CD) среде для CHO (Каталожный номер #04-0119, Gibco Invitrogen Inc.) после трансфекции (CD CHO без L-глутамина + добавка 1X GS (глутаминсинтазы) + 2,16 мг/л тимидина). Через 24 часа после этого в планшеты добавляли 150 мкл/лунку селективной среды CD CHO (CD CHO без L-глутамина + добавка 1X GS + 2,16 мг/л тимидина + 66,6 мкМ MSX (метионинсульфоксимина) или 133,3 мкМ MSX) с получением конечной общей концентрации MSX 50 мкМ или 100 мкМ. Уровни продукции антитела резистентными к MSX колониями измеряли с помощью сэндвичного ELISA для IgG человека. Колонии, продуцирующие антитело на высоком уровне, были отобраны для размножения в среде размножения CD CHO (CD CHO без L-глутамина + добавка 1X GS + 2,16 мг/л тимидина + 50 мкМ MSX или 100 мкМ MSX) сначала в 24-луночных планшетах, затем в T-бутылях. Клетки размножали во встряхиваемых бутылях до получения банка клеток трансфектомы (TCB) из 5 сосудов. Клеточная линия 15B7 была отобрана из планшет с 50 мкМ MSX и поддерживалась в среде размножения CD CHO, содержащей 50 мкМ MSX. Антитело получали культивированием трансфицированных клеток CHO, как описано выше, с получением кондиционной среды, из которой можно было очистить BTT-1023 с помощью стандартных методов очистки моноклональных антител из культурального супернатанта.
Пример 6
Связывающие свойства рекомбинантного полностью человеческого антитела BTT-1023
3
Для количественной оценки связывания BTT-1023 с rhVAP-1 использовали иммунофлуориметрический анализ с разрешением во времени. Планшет для микротитрования покрывали rhVAP-1 и затем блокировали раствором бычьего сывороточного альбумина. Затем для связывания VAP-1 добавляли BTT-1023 в количестве от 2 до 4320 нг/мл, и связанное BTT-1023 выявляли с помощью конъюгированного с европием антитела мыши против человека (PerkinElmer Inc.). Метку определяли измерением флуоресценции с разрешением во времени (счетчик Victor для множественных меток, PerkinElmer Inc.) при 615 нм. Показатели флуоресценции прямо коррелируют с количеством BTT-1023, связанного с его мишенью. Данные для образца затем анализировали в сравнении со стандартной кривой репера. Данные показывают, что BTT-1023 связывается с рекомбинантным VAP-1 человека со сродством (Kd) 0,38 нМ.
Для анализа кинетики связывания rhVAP-1 с BTT-1023 использовали прямой анализ связывания с помощью теста плазмонного резонанса поверхности Biacore. Для захвата BTT-1023 из подвижной фазы использовали биотинилированный белок G' (Sigma), иммобилизованный на покрытой стрептавидином матрице (Biacore AB). Каждый цикл состоял из двух последовательных фаз: инъекции mAb BTT-1023 и инъекции лигандсвязывающего агента (rhVAP-1). В качестве агента использовали постоянное количество rhVAP-1 при насыщающей концентрации mAb (лигандов). Эксперименты проводили с использованием оборудования BIAlite (Biacore AB), и данные анализировали с помощью программы Biacore. Данные показывают, что рекомбинантный VAP-1 человека связывается с BTT-1023 со сродством (Kd) 0,13 нМ.
3
6
3
Связывание полностью человеческого BTT-1023 с VAP-1 человека анализировали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и проточной цитометрии. Для проточной цитометрии использовали трансфицированные клетки из линии эндотелиальных клеток крысы (клетки Ax), экспрессирующие кДНК VAP-1 человека (Smith et al., J. Ex. Med. (1998) 188:17-27). Эти клетки выращивали в 175 см сосудах в среде RPMI 1640 (Sigma) с добавлением 20% FCS (сыворотки плодов телят), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ Na-пирувата, 10 мкМ β-ME (бета-меркаптоэтанола), 1% незаменимых аминокислот, 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,75 мг/мл Генетицина™. Для отделения клеток их дважды промывали ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором) и инкубировали в 10 мл буфера для диссоциации клеток (GibcoBRL) в течение 3 мин при 37°С. После добавления 10 мл среды клетки осаждали (5 мин, 1000g, при комнатной температуре), ресуспендировали в буфере для промывки [ЗФР, 0,1% (масс./об.) БСА (бычий сывороточный альбумин), 0,1% (об./об.) NaN] в концентрации 10 клеток/мл и хранили на льду.
Клеточную суспензию (100 мкл/лунку) переносили в 96-луночные планшеты, клетки осаждали (4 мин, 1000г, 10°С), и в каждую лунку добавляли 100 мкл аликвоты раствора антитела. После 30-мин инкубации на льду клетки промывали 150 мкл промывочного буфера/лунку и затем инкубировали с 100 мкл конъюгированного с FITC (флуоресцеина изотиоцианатом) IgG против человека (специфичным в отношении Fc, Sigma) в течение 30 мин на льду. Наконец, клетки промывали, как описано выше, и фиксировали добавлением 100 мкл буфера для промывки с 1% (об./об.) формальдегида и оставляли при 4°С до анализа на проточном цитометре. Контрольные образцы окрашивали только конъюгированным с FITC вторичным антителом против IgG человека.
Все образцы для проточной цитометрии анализировали с помощью FACScan™ (Becton Dickinson). Для каждого образца получали данные по меньшей мере для 10000 стробированных событий, и с помощью программы Lysis II рассчитывали геометрически средний канал флуоресценции.
Как показано окрашиванием трансфицированных клеток Ax, которые экспрессируют VAP-1 на своей поверхности, BTT-1023 специфически связывается с VAP-1 человека (фигура 7).
Пример 7
Функциональные свойства BTT-1023
-1
-1
-1
-1
Для тестирования функциональной способности BTT-1023 ингибировать трансмиграцию лейкоцитов через монослой эндотелия использовали тест трансмиграции in vitro. Монослой эндотелиальных клеток Ax крысы, трансфицированных для экспрессии рекомбинантного VAP-1 на своей поверхности, выращивали в верхней камере аппарата Transwell (Becton Dickinson). Свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови человека помещали в верхние камеры и давали им двигаться в направлении хемоатрактантного пептида моноцитов fMLP (N-формил-метионил-лейцил-фенилаланина, 100 нМ) в нижних камерах в течение 2 час. Монослои обрабатывали либо BTT-1023, либо BTT-1008, несвязывающим антителом отрицательного контроля с константной областью человека (Kirton et al., Eur. J. Immunol. (2005) 35:3119-30), либо с BTT-1002, химерным mAb против VAP-1 положительного контроля, о котором известно, что оно блокирует опосредуемую VAP-1 адгезию и трансмиграцию. Клетки, мигрировавшие через монослой, собирали со дна камеры и подсчитывали микроскопически. BTT-1023 значительно снижало миграцию клеток через монослой эндотелиальных клеток в концентрации 10 нг мл и блокировало миграцию при 1 мкг мл. Антитело отрицательного контроля BTT-1008 не оказывало действия в концентрации 1 мкг мл, а положительный контроль BTT-1002 также полностью блокировал трансмиграцию при 1 мкг мл, как видно на фигуре 8.
Пример 8
Улучшенные фармакокинетические свойства рекомбинантного полностью человеческого антитела BTT-1023 по сравнению с химерным антителом BTT-1002
Двум мартышкам-самкам (нечеловекообразным приматам) вводили по 25 мг/кг BTT-1023 путем болюсной внутривенной инъекции. Образцы крови для анализа концентрации BTT-1023 собирали через 10 минут, 1, 3, 6, 24, 48, 72 и 144 часа после введения дозы.
3
В иммунофлуориметрическом анализе с разрешением во времени для количественного определения концентрации анализируемого агента (BTT-1002 или BTT-1023) в сыворотке мартышки используется конъюгированное с биотином специфичное в отношении анализируемого агента поликлональное антитело кролика в качестве агента захвата на покрытый стрептавидином планшет для микротитрования. Такие поликлональные антитела получали повторными иммунизациями кроликов либо BTT-1002, либо BTT-1023, сбором сыворотки и аффинной очисткой полученных поликлональных антител против BTT-1002 или BTT-1023. Определение связанного анализируемого агента проводили с помощью конъюгированного с европием вторичного антитела. Метку определяли измерением флуоресценции с разрешением во времени (счетчик Victor для множественных меток, PerkinElmer Inc.) при 615 нм. Показатели флуоресценции прямо коррелируют с количеством анализируемого агента в образце. Данные для образца затем анализировали в сравнении со стандартной кривой репера.
Фармакокинетические параметры определяли с помощью анализа без компартментализации. При сравнении с данными, полученными в сходном исследовании, выполненном с BTT-1002, в котором по 40 мкг/кг вводили внутривенно двум мартышкам-самкам, полностью человеческое антитело против VAP-1 проявляет улучшенные фармакокинетические свойства с улучшенным профилем концентрации в сыворотке во времени (AUC) и увеличенным периодом полужизни элиминации (таблица 4).
Таблица 4Фармакокинетические свойства BTT-1023 в сравнении с BTT-1002
Доза (мг/кг)
AUC <sub>(0-последняя) </sub>(мкг*час/мл)
AUC <sub>(0-∞) </sub>(мкг*час/мл)
t<sub>1/2</sub> (час)
V<sub>d</sub> (мл/кг)
25 BTT-1023
33200
55100
120
71
25 BTT-1023
20600
23900
53
69
40 BTT-1002
19100*
19100*
25*
75*
*среднее для n=2
Пример 9
Фармацевтические композиции полностью человеческих антител
Примеры фармацевтической композиции, содержащей полностью человеческое антитело против VAP-1 по настоящему изобретению, пригодной для парентерального введения, представлены в виде раствора для инъекции или инфузии или в виде концентрата для такого раствора.
Процентное содержание ингредиента на 1 мл
Антитело против VAP-1
0,1-10%
Хлорид натрия или хлорид калия
0,5-1,5%
Динатрийгидрофосфата дигидрат
0,1-2%
Натрия или калия дигидрофосфат
0,1-2%
Сахароза
0,5-10%
Полисорбат 20 или 80
0,01-1%
Вода для инъекций
до 1 мл
Процентное содержание ингредиента на 1 мл
Антитело против VAP-1
0,1-10%
Хлорид натрия
0,5-1,5%
ЭДТА/DTPA
0,01-1,5%
Маннит
0,1-5%
Полисорбат 20 или 80
0,01-1%
Цитрат натрия в виде дигидрата
0,5-5%
Вода для инъекций
до 1 мл
Пример 10
Эффективность полностью человеческих антител в моделях воспаления in vivo
Эффективность лечения полностью человеческим антителом против VAP-1 индуцированного коллагеном артрита у макаки резус
Действие полностью человеческих антител оценивают на модели индуцированного коллагеном артрита (CIA) у макак резус с целью сбора данных о пригодности антитела BTT-1023 при указаниях на артрит.
Для исследования отбирают взрослых макак резус, негативных в отношении MHC A26, с частотой CIA 99%, иммунизированных бычьим коллагеном типа II. Животных делят на две группы по пять особей. Артрит индуцируют инъекцией 3-5 мг бычьего коллагена в полном адъюванте Фрейнда в 10 точек на спине животного. При использовании этого подхода артрит клинически проявляется через 3-5 недель после иммунизации и обычно продолжается 7-9 недель.
Внутривенное лечение в течение четырех недель полностью человеческими антителами в дозах от 1 до 50 мг/кг дважды в неделю начинают при выявлении уровня CRP ≥ 20 мг/л в двух последовательных записях. Контрольным животным вводят раствор-носитель. Состояние животных оценивают с помощью общеклинической шкалы (0 = отсутствие клинических признаков артрита, 0,5 = жар (>0,5°С), 1 = апатия, сниженная подвижность и потеря аппетита, 2 = потеря в массе, горячие конечности и/или суставы, боль без отека мягких тканей (STS), 3 = умеренное покраснение и STS суставов, нормальная гибкость конечностей, 4 = сильное покраснение и STS конечностей с неподвижностью суставов, 5 = тяжелый артрит, при котором показана эвтаназия) и шкалы тяжести CIA (степень отека мягкой ткани, гибкости и потрескивания, оцениваемых по шкале от - до +++: - нет, ± сомнительно, + умеренная, ++ тяжелая, +++ предельная). Все эти параметры дают общеклинический показатель тяжести CIA, который представляет собой полуколичественный показатель.
Эффективность полностью человеческих антител против VAP-1 в лечении индуцированного антителом против коллагена артрита у гуманизированных VAP-1 мышей
-1
Можно оценить эффективность полностью человеческих антител в отношении индуцированного антителом против коллагена артрита у трансгенных мышей, экспрессирующих VAP-1 на эндотелии. Быстро развивающийся артрит индуцируют инъекцией смеси антител с последующим через три дня внутрибрюшинным введением липополисахарида. Мышам вводят полностью человеческое антитело в дозах 3, 10 или 30 мг кг на 1, 3 и 7 дни. Контрольным животным вводят носитель. Можно показать снижение заболевания артритом по результатам статистически значимого снижения показателя артрита по сравнению с контролем.
Эффективность лечения антителом против VAP-1 на модели псориаза у гуманизированных мышей
Недавнее создание и подтверждение модели гуманизированной ксенотрансплантации дало ценный инструмент для улучшения понимания этого заболевания и тестирования новых лекарственных препаратов (Nickoloff BJ. Expert Opin. Investig. Drugs. (1999) 8:393-401).
В этой модели неповреждающие биоптаты всей толщины кожи больных псориазом трансплантируют анестезированным мышам с тяжелым сочетанным иммунодефицитом (SCID) в возрасте приблизительно 7-9 недель, как описано ранее (Wrone-Smith T. et al. J. Clin. Invest. (1996) 98:1878-1887). Животным дают восстановиться после хирургической операции в течение по меньшей мере 2-3 недель перед индукцией заболевания. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) выделяют из образца крови, получаемого при биопсии, и активируют суперантигеном SEB (энтеротоксином B стафилококка). Заболевание индуцируют внутривенной или внутрикожной инъекцией активированных PBMC в ксенотрансплантат.
Полностью человеческое антитело против VAP-1 или носитель вводят внутривенно или подкожно. Возможны и профилактический, и лечебный режимы доз разной продолжительности. Кроме того, после лечения полностью человеческим антителом против VAP-1 можно ввести внутривенно меченые T-клетки человека для более детального исследования действия на инфильтрацию клеток.
В конце периода лечения мышей забивают, и трансплантаты вырезают вместе с окружающей кожей мыши и фиксируют в формалине или моментально замораживают в азоте. Для оценки патологических изменений типа изменений толщины эпидермиса, инфильтрации клеток и экспрессии молекул адгезии производят гистологический и иммуногистохимический анализ. Может быть показано ослабление заболевания псориазом, о чем свидетельствует статистически значимое снижение показателя по сравнению с контролем.
Эффективность полностью человеческого антитела против VAP-1 в лечении воспаления печени, вызванного введением CCl
гуманизированным VAP-1 мышам
4
4
4
4
Влияние полностью человеческого антитела против VAP-1 на воспаление печени и фиброз оценивают на мышиной модели фиброза печени, вызванного введением CCl. Трансгенным мышам, экспрессирующим VAP-1 человека на эндотелии, инъецируют 0,25 мкг/г CCl в/бр дважды в неделю в течение 12 недель. На протяжении 12 недель развиваются интенсивное воспаление и рубцевание печени, но после прекращения инъекций CCl рубцы полностью рассасываются. Эффективность полностью человеческого антитела, вводимого в/в или в/бр в дозах от 1 до 25 мг/кг дважды в неделю, для профилактики повреждения и рассасывания имеющегося фиброза при использовании этой модели исследуют путем оценки патологических и гистологических изменений в печени. Может быть показано ослабление заболевания псориазом, о чем свидетельствует статистически значимое снижение показателя по сравнению с контролем.
Эффективность лечения антителом против VAP-1 в модели острого инфаркта миокарда у анестезированного кролика
У анестезированных белых новозеландских кроликов с механической вентиляцией производят торакотомию слева. Сердце экспонируют, и левую коронарную артерию (LCA) пережимают. Полностью человеческое антитело против VAP-1 вводят внутривенно через 25 минут после начала окклюзии. Через 5 минут после введения антитела зажим удаляют и область затем реперфузируют до 6 часов. Животное умерщвляют передозировкой используемого анестетика, и сердце удаляют и промывают физиологическим раствором. LCA вновь пережимают, и через сердце перфузируют синий краситель Монастраля или Эванса с окрашиванием миокарда при сохранении области риска неокрашенной. Сердце замораживают, и левый желудочек режут на тонкие срезы. Срезы общей части и области риска определяют с помощью системы анализа изображения. Срезы затем инкубируют с 1% раствором хлорида трифенилтетразолия (TTC) в забуференном фосфатом физиологическом растворе с последующей инкубацией в 10% забуференном до нейтральной реакции формалине. Жизнеспособный миокард окрашивается в красный цвет инкубацией с TTC, и таким образом определяют область инфаркта путем измерения области неокрашенной ткани с представлением в виде процента выявленной области риска. Может быть показано снижение повреждения ткани, о чем свидетельствует статистически значимое уменьшение процента области риска по сравнению с контролем.
Эффективность лечения антителом против VAP-1 индуцированного mBSA артрита у кроликов
Метилированный бычий сывороточный альбумин (mBSA), растворенный в физиологическом растворе, смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и получают эмульсию. Новозеландских белых кроликов иммунизируют дважды внутрикожной инъекцией эмульсии с промежутком четырнадцать дней. Приблизительно через 10 дней после второй иммунизации от животных получают сыворотку и производят внутрикожную инъекцию раствора mBSA. Отбирают животных, проявляющих положительные кожные реакции, и их случайным образом разделяют на группы лечения на основе сывороточных титров IgG против mBSA.
Через 14 дней после второй иммунизации внутривенно или подкожно вводят антитело против VAP-1 или носитель, непосредственно перед инъекцией раствора mBSA в полость сустава правого колена. В левое колено каждого животного инъецируют физиологический раствор. Антитело против VAP-1 или инъекции отрицательного контроля вводят один или два раза в неделю на протяжении всего исследования.
Начиная со дня индукции (день 0), за кроликами наблюдают на предмет поведения и внешнего вида путем ежедневного обследования и пальпации, и массу тела регистрируют через определенные интервалы на протяжении всего исследования. Опухание коленного сустава оценивают в заранее определенные моменты времени путем сравнения диаметров воспаленного (правого) и невоспаленного (левого) коленей.
В конце экспериментальной части исследования (день 21) животных забивают. Собирают синовиальную жидкость для определения общего количества клеток белой крови и содержания белка. Из коленных суставов каждого животного вырезают синовиальную мембрану и разделяют продольно на два образца в области коленной чашечки. Один из них подвергают глубокой заморозке в жидком азоте для определения антитела против VAP-1 и экспрессии VAP-1, а другие образцы синовиальной мембраны и остальные ткани коленного сустава фиксируют в 10% забуференном до нейтральной реакции формалине для окрашивания гематоксилином и эозином (HE) и фосфовольфрамовой кислотой-гематоксилином (PTAH). Окрашенные HE срезы оценивают на предмет воспалительных реакций, а окрашенные PTAH срезы оценивают на предмет степени отложения фибрина на поверхности синовиальной мембраны. Может быть показано ослабление заболевания артритом, о чем свидетельствует статистически значимое снижение показателя по сравнению с контролем.
В заключение, эти примеры показывают, что полностью человеческие антитела против VAP-1 сохраняют свойства антител против VAP-1 специфического распознавания VAP-1 (примеры 2 и 6), блокируют зависимую от VAP-1 трансмиграцию лейкоцитов через эндотелий (пример 7) и обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с предшествующими моноклональными антителами против VAP-1 (пример 8).
Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что в соответствии с развитием технологии концепция по изобретению может быть реализована разными путями. Изобретение и варианты его осуществления не ограничиваются описанными выше примерами и могут варьировать в пределах объема формулы изобретения.