СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ С ПОМОЩЬЮ МАГНИТНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В УКАЗАННОМ СПОСОБЕ
METHOD FOR TREATMENT OF MALIGNANT NEW-FORMATIONS BY MAGNETIC HYPERTHERMIA AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR APPLICATION IN INDICATED METHOD

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии и применению в указанном способе магнитных наночастиц из группы магнитных оксидов металлов, включающей ферриты, обладающих повышенной теплопроизводительностью и оптимальным значением удельного коэффициента поглощения (Specific Absorption Rate, SAR). Способ обеспечивает селективный нагрев области опухоли и последующее повреждение или разрушение раковых клеток или злокачественных новообразований без повреждения здоровой окружающей ткани. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции для магнитного гипертермического лечения злокачественных новообразований, содержащей магнитные наночастицы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Магнитная гипертермия (МГ) представляет собой перспективный метод лечения рака, включающий подвергание всего тела, его локальной области или ткани повышенным температурам под воздействием электромагнитного поля для повреждения или уничтожения раковых клеток или для разрушения опухолей. Два различных подхода к гипертермическому нагреву включают (а) гипертермические способы с использованием температур между 41 и 45°С и (b) способы термоабляции с повышением температуры выше 45°С для локальной индукции некроза ткани [1].
Различные технологии и способы МГ включают локальную гипертермию, регионарную гипертермию и гипертермию всего тела. Гипертермия всего тела может быть вызвана эндогенными или экзогенными источниками тепла и, как правило, обеспечивает нагрев всего тела до температур, составляющих примерно 39-43°С [1, 2]. Такой способ обычно используется для лечения карцином с отдаленными метастазами [1, 3]. Регионарная гипертермия воздействует на область тела человека или целый орган. Как правило, целью такого лечения является ослабление раковых клеток, облегчающее их уничтожение с помощью облучения и химиотерапевтических препаратов [3]. Способы локальной гипертермии, как правило, включают введение ферромагнитных или металлических частиц в область опухоли с последующим подверганием воздействию магнитного или электромагнитного поля: высокой частоты (ВЧ), ультравысокой частоты (УВЧ), сверхвысокой частоты (СВЧ), постоянного магнитного поля и т.д. Согласно некоторым вариантам, при локальной МГ вводимые частицы объединяют или присоединяют к другим противораковым лекарственным средствам или лигандам, специфичным для раковых клеток. Основные проблемы, связанные с доступными на сегодняшний день способами индукции гипертермии, включают необходимость локализации лечебного воздействия в области-мишени, а также максимального повышения нагрева в пределах патологически измененной ткани без повреждения нормальной ткани и снижения токсических побочных эффектов [2].
Магнитные наночастицы (МНЧ) привлекали внимание в качестве, например, контрастирующих агентов для магнитно-резонансной визуализации (МРВ), носителей систем доставки лекарственных средств и источников тепла при гипертермии для различных способов биомедицинского применения [4]. Они обладают уникальными свойствами, такими как способность к магнитной транспортировке, магнитному выделению и самонагреванию в магнитном поле переменного тока (ПТ) [5].
Применение МНЧ в качестве минимально инвазивных агентов впервые было описано Джилкристом и соавторами (Gilchrist et al.) в 1957, что привело к появлению способов МГ [6]. При подвергании воздействию магнитного поля ПТ магнитные наночастицы могут проявлять выраженные термические эффекты, связанные с потерями в ходе перемагничивания частиц [7]. Помимо обеспечения возможности сильно локализованного теплообразования применение МНЧ дает возможность самоограничения повышения температуры путем использования магнитного материала с подходящей температурой Кюри [7]. Одной из основных проблем, связанных с применением магнитных наночастиц в способах МГ, является необходимость максимально возможного высвобождения тепла при наименьшей дозе частиц (из-за их возможных токсических эффектов на живые организмы).
Наночастицы можно разделить на основе их размера на многодоменные МНЧ, размер которых составляет более чем примерно 40 нм в зависимости от параметров магнитного поля, и однодоменные наночастицы, или «суперпарамагнитные наночастицы», с диаметром менее 40 нм. В зависимости от указанных выше типов наночастиц за доставку тепла отвечают два различных механизма. В случае многодоменных магнитных наночастиц тепло доставляется в результате смещения границы домена (гистерезисные потери) [1]. Однодоменные частицы вызывают нагрев в результате потерь при переориентации векторов намагниченности в магнитном поле, или потерь на трение, где указанная наночастица способна вращаться в окружающей среде [1, 8].
2
4
2
4
3
4
3
4
2
3
3
4
3
4
2
4
Широкий диапазон синтезируемых в настоящее время магнитных наночастиц включает, среди прочих, МНЧ на основе металлов (Fe, Со, Ni), МНЧ на основе ферритов (MgFeO, CoPt, MnAl, CoFeO и т.д.) и наночастицы типа оксида железа. Наночастицы типа оксида железа, несмотря на их относительно слабые магнитные свойства, широко используются в биомедицине в качестве гипертермических агентов благодаря низкой токсичности и стабильным магнитным характеристикам. Например, наночастицы на основе FeO были одобрены Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA) для применения в гипертермических способах. Однако наночастицы на основе FeO склонны к фазовому превращению в α-FeO, γ-FeO или кристаллы FeO в зависимости от окружающих условий, при этом характеристики теплообразования и, соответственно, магнитные характеристики таких наночастиц меняются, что ограничивает их клиническое применение [9]. Кроме того, несмотря на то что наночастицы на основе Со, Ni или Mg также исследовались, их нельзя применять для тела человека из-за низкой температуры теплообразования (Со: 25°С, другие: ниже 25°С). В частности, частицы на основе MgFeO трудно синтезировать, и они имеют низкую температуру теплообразования из-за низкой магнитной анизотропии [9]. Таким образом, существует необходимость в наночастицах, применимых в качестве новых высоко функциональных гипертермических агентов.
При разработке наночастиц для магнитной гипертермии следует учитывать следующие параметры:
- размер;
- форма;
- токсичность и биосовместимость;
- способность модифицировать поверхность;
- сложность синтеза и воспроизводимость полученных свойств;
- теплоотдача (SAR);
- требуемое внешнее магнитное поле и скорость реакции на воздействие указанного поля;
- стоимость.
0
Одним из наиболее важных параметров при создании магнитных наночастиц для МГ является SAR, или удельный коэффициент поглощения [6, 10]. SAR дает количественную оценку эффективности превращения магнитной энергии в тепло коллоидами МНЧ. Указанный параметр определяется как поглощенная энергия, нормированная к массе МНЧ, в переменном магнитном поле определенной частоты и интенсивности Н [6]:
SAR является критичным параметром, влияющим на температуру ткани во время гипертермического лечения. Перегрев опухоли может приводить к серьезному повреждению окружающих здоровых клеток или неконтролируемому некрозу. С другой стороны, желаемый терапевтический эффект не может быть достигнут при недостаточно высоком подъеме температуры. SAR МНЧ сильно зависит от частоты и интенсивности прилагаемого магнитного поля, а также от химических, физических и магнитных свойств материала [6].
Основные недостатки способов гипертермии на основе наночастиц включают:
- возможный перегрев (должна быть рассчитана точная продолжительность воздействия);
- токсичность лекарственных форм;
- сложность селективной доставки к области применения;
- неравномерное распределение МНЧ в области опухоли;
- высокая стоимость изготовления.
Таким образом, последние разработки способов МГ, включающих применение МНЧ, направлены на обеспечение быстрого и равномерного нагрева злокачественных опухолей со снижением риска термального повреждения здоровой ткани и повышением селективности лечения гипертермией. Другая существенная проблема заключается в создании новых типов магнитных частиц и наночастиц, обеспечивающих повышенную биосовместимость и эффективность лечения и облегчение тяжелых неблагоприятных явлений благодаря повышению значений SAR и снижению дозы указанных частиц, а также в разработке наночастиц, комбинированных или присоединенных к противораковым лекарственным средствам, лигандам или антителам, специфичным к раковым клеткам.
Согласно публикации патента США 4983159 [11] описан способ, обеспечивающий некроз новообразований у теплокровных животных в результате гипертермии, включающий инъекцию частиц в околоопухолевую область тела теплокровных животных. Частицы способны к гистерезисному нагреву при подвергании воздействию переменного магнитного поля. Кроме того, размер частиц составляет по меньшей мере два микрона или более для невозможности их внутриклеточной абсорбции в любой жизнеспособной или неопластической ткани животного. После инъекции частиц в опухолевую ткань область опухоли подвергают воздействию переменного магнитного поля. Частота указанного поля превышает частоту, достаточную для индукции какой-либо поддающейся выявлению нервно-мышечной реакции в ответ на переменное магнитное поле, но ниже частоты, способной вызывать какой-либо неблагоприятный нагрев жизнеспособной здоровой ткани теплокровного животного, вызванный вихревым током и/или диэлектрическим нагревом. Опухоль находится в пределах поля в течение времени, достаточного для нагрева частиц и опухоли, с которой связаны указанные частицы, до температуры, составляющей по меньшей мере 42°С, для индукции некроза указанной опухоли. Однако относительно большие частицы нельзя вводить путем инъекции в солидные опухоли, а применение более мелких ферромагнитных частиц неэффективно из-за отсутствия их нагрева в поле ВЧ. Кроме того, указанный подход не обеспечивает равномерный нагрев опухолевой ткани, что вызывает риск последующей стимуляции опухолевого роста.
Согласно другому подходу в евразийском патенте ΕА 019412 [12] описан способ локальной гипертермии злокачественных опухолей на основе поглощения энергии переменного магнитного поля с использованием ферромагнитных частиц с высокой коэрцитивной силой, вводимых в область опухоли. Указанный способ можно использовать для термического разрушения опухолей без повреждения здоровой ткани. В частности, изобретение позволяет решить проблему эффективности повышения магнитной гипертермии с помощью контроля амплитуды поля с учетом изменения температуры опухоли в процессе гипертермии, а также взаимосвязанной оптимизации свойств частиц (размера и коэрцитивной силы) и параметров переменного магнитного поля (регуляция частоты и диапазона амплитуд). Однако контроль температуры нагреваемой области осуществляют с помощью инвазивных термопарных датчиков, при этом достоверные данные распределения температуры в нагреваемой области отсутствуют, поскольку измерение температуры опухоли происходит в непосредственной близости от сенсоров.
(1-i)
i
2
4
2
В изобретении согласно заявке на японский патент JP 2013256405 [13] описаны ферритные магнитные наночастицы на основе Ni-Zn для термотерапии, имеющие ядро, содержащее магнитные наночастицы NiZnFeO (0,2≤i≤0,6), и оболочку, содержащую аморфный SiO для покрытия указанного ядра. Средний размер частиц составляет 10-20 нм. Указанные наночастицы обеспечивают подъем температуры до 4-15°С при приложении магнитного поля ПТ с частотой 15 кГц и интенсивностью 210 Э. Однако указанные наночастицы имеют высокую стоимость изготовления. Кроме того, ранее было описано, что наночастицы на основе Ni имеют низкую температуру теплообразования, что ограничивает их применение в гипертермии [9].
II
III
II
III
2
4
1
2
n
2
1
2
2
2
1-6
Магнитная система, подходящая для доставки лекарственных средств с помощью гипертермии, описана в русском патенте RU 2481125 [14]. Структура указанной магнитной системы включает магнитные частицы наноразмеров формулы MMO, где M=Fe, Со, Ni, Ζn, Μn; M=Fe, Cr, или маггемит, фунционализированные бифункциональными соединениями формулы R-(CH)-R (где n=2-20, R выбран из: CONHOH, CONHOR, PO(OH), PO(OH)(OR), СООН, COOR, SH, SR; R представляет собой внешнюю группу и выбран из: ОН, NH, СООН, COOR; R представляет собой алкильную группу или щелочной металл, выбранный из C-алкила и K, Na или Li соответственно). Структура также содержит полимер, необязательно содержащий фармакологически активную молекулу, которая может быть выбрана из противораковых агентов, противомикробных агентов, противовоспалительных агентов, иммуномодуляторов и молекул, действующих на центральную нервную систему или способных метить клетки для возможности их идентификации с помощью стандартных диагностических детекторов. Магнитная система характеризуется как биосовместимая и стабильная. Однако указанные магнитные системы и, в частности, магнитные наночастицы сильно варьируют по размеру (например, средний диаметр наночастиц может находиться в диапазоне от 4 до 200 нм). Известно, что указанные частицы малого размера находятся в однодоменном состоянии, и их способность нагреваться при конкретной амплитуде и частоте магнитного поля определяется магнитной восприимчивостью. Повышение размера частиц приводит к возникновению другого механизма нагрева на основе гистерезисных потерь, и значение нагрева определяется областью петли гестерезиса, т.е. намагниченностью насыщения и коэрцитивной силой. Кроме того, повышение диаметра частиц приводит к возникновению механизмов, опосредованных вязкостным трением во врем вращения и движения частиц в магнитном поле. Таким образом, для частиц различного размера характерны разные механизмы нагрева, что в свою очередь может приводить к определенным трудностям в контроле температуры и последующему неравномерному нагреву злокачественных опухолей.
0,49
0,51
Согласно другому подходу в русском патенте RU 2295933 [15] описан способ магнитного лечения злокачественных новообразований, включающий введение частиц в опухоль и последующий нагрев в результате магнетокалорического эффекта, вызванного энергией электромагнитного поля. Частицы состоят из вещества, имеющего высокое значение магнетокалорического эффекта, с температурой магнитного фазового перехода, близкой к температуре тела человека, и выбраны из группы, включающей щелочно-земельные, переходные и благородные металлы, а также их сплавы и интерметаллические соединения (например, частицы на основе сплава железо-родий, в частности, FeRh). Однако прилагаемое магнитное поле имеет высокое значение силы (до 60 Э и более), что может вызывать ряд негативных эффектов в живых организмах. Таким образом, применение такого магнитного поля в способах гипертермии нельзя считать абсолютно безопасным.
0,5
0,5
2
4
Согласно публикации патента США 7842281 [16] описана улучшенная композиция магнитных наночастиц, обеспечивающая внутренний регулятор температуры, для применения в магнитном нагреве, в частности, для применения в медицинском лечении с помощью магнитной гипертермии. Композиция содержит магнитные наночастицы, температура Кюри которых составляет между 40 и 46°С, и может дополнительно содержать полимерный материал и необязательно лекарственное средство или радиосенсибилизирующий агент. Указанная композиция уменьшает или устраняет проблему неравномерного нагрева и обладает способностью к саморегуляции максимальной достигаемой температуры, что делает способ магнитной гипертермии более перспективной терапевтической возможностью. Один из вариантов реализации изобретения относится к композиции, содержащей МНЧ, температура Кюри которых составляет 47°С, где указанная композиция наночастиц содержит сплав формулы MnZnFeO, и эффективный средний диаметр наночастиц составляет между 10 нм и 400 нм.
Изобретение также обеспечивает способы гипертермического лечения пациента, нуждающегося в указанном лечении, включающие стадии введения пациенту композиции, содержащей МНЧ, температура Кюри которых составляет между 40 и 46°С; и подвергание МНЧ в теле пациента воздействию переменного магнитного поля, эффективного для индукции гистерезисного нагрева наночастиц. Однако размер указанных магнитных наночастиц существенно варьирует (эффективный средний диаметр частиц составляет между 10 нм и 400 нм). Как было упомянуто выше, для частиц различного размера характерны разные механизмами нагрева, что в свою очередь может приводить к определенным трудностям в контроле температуры, затрудняя, таким образом, равномерный нагрев злокачественных опухолей. Более того, указанный подход не учитывает характеристики опухоли, подлежащей лечению, такие как ее расположение, плотность и гидродинамические свойства.
Таким образом, существует необходимость в разработке улучшенных способов магнитного гипертермического лечения с устранением одного или более недостатков согласно предшествующему уровню техники. Авторы считают, что будущий успех в области разработки способов МГ и их применения для лечения рака зависит от возможности создавать индивидуальные протоколы для каждого типа рака, подлежащего лечению с помощью гипертермии у субъектов, вместо разработки общего универсального способа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является улучшенный способ гипертермического лечения различных заболеваний и расстройств, в частности, злокачественных новообразований, обеспечивающий регулирование количества и локальной концентрации магнитных наночастиц в области опухоли в зависимости от желаемых предварительно определенных для каждого типа опухоли значений и равномерный нагрев и повышенную эффективность гипертермии при снижении нежелательных явлений. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что способ магнитного гипертермического лечения злокачественных новообразований, включающий стадии доставки в область опухоли магнитных наночастиц, выбранных из группы магнитных оксидов металлов, включающей ферриты, средний размер которых составляет менее 40 нм, и подвергания области опухоли воздействию магнитного поля ПТ с предварительно определенными параметрами, обеспечивает сопутствующее и/или последующее селективное повреждение или по меньшей мере частичное разрушение опухолевых клеток в области опухоли без повреждения здоровой окружающей ткани.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии включает следующие стадии:
x
1-x
2
4
(i) доставка в область опухоли магнитных наночастиц, выбранных из группы магнитных оксидов металлов, включающей Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO (х=0-0,9), средний размер которых составляет менее 40 нм, температура Кюри составляет от 39°С до 550°С, и среднее значение коэрцитивной силы составляет от 5 до 250 Э, и
(ii) подвергание области опухоли воздействию магнитного поля ПТ с амплитудой от 14 Э до 300 Э и частотой от 80 кГц до 1000 кГц, где время подвергания указанному воздействию при температуре от 38°С до 51°С составляет от 15 до 60 мин, для обеспечения:
(iii) сопутствующего и/или последующего селективного повреждения или по меньшей мере частичного разрушения опухолевых клеток селективно в области опухоли без повреждения здоровой окружающей ткани.
Согласно одному варианту реализации изобретения сила и/или частота электромагнитного поля ПТ выбраны на основе предварительно определенной зависимости эффективности гипертермии от типа опухоли и доставляемой концентрации и/или типа наночастиц для обеспечения повреждения или частичного разрушения по меньшей мере от 80 до 90%, предпочтительно 95% опухолевых клеток.
Согласно одному варианту реализации изобретения магнитные наночастицы выбраны на основе предварительно определенной зависимости эффективности магнитной гипертермии для определенного типа опухоли по меньшей мере от одного параметра, выбранного из концентрации, среднего размера частиц, распределения частиц по размеру, температуры Кюри, среднего значения коэрцитивной силы и покрытия частиц, для обеспечения повреждения или частичного разрушения по меньшей мере от 80 до 90%, предпочтительно 95% опухолевых клеток.
Согласно одному варианту реализации изобретения продолжительность и количество циклов подвергания магнитной гипертермии выбраны на основе предварительно определенной зависимости эффективности гипертермии от типа опухоли и/или характеристик частиц для обеспечения повреждения или частичного разрушения по меньшей мере от 80 до 90%, предпочтительно 95% опухолевых клеток.
x
1-x
2
4
Согласно одному варианту реализации изобретения магнитные наночастицы представляют собой Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO, где x составляет 0-0,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения частицы могут содержать защитную оболочку или покрытие, где указанная защитная оболочка или покрытие состоит из биосовместимого полимерного материала.
Согласно другому варианту реализации изобретения способ магнитного гипертермического лечения злокачественных новообразований включает стадию выбора параметров магнитного поля (сила, частота) и характеристик магнитных наночастиц (размер, форма) для каждого типа опухоли с обеспечением оптимальных значений SAR, коэрцитивной силы и температуры нагрева для повреждения или частичного разрушения по меньшей мере 50, предпочтительно от 75 до 90%, более предпочтительно 95% опухолевых клеток.
x
1-x
2
4
Согласно другому варианту реализации изобретения изобретение относится к применению Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO, где x равен 0-0,9, для лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии.
x
1-x
2
4
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии, содержащая Ζn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO (х=0-0,9), фармацевтически приемлемый носитель и необязательно биологически активную молекулу.
x
1-x
2
4
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO (х=0-0,9) для магнитной гипертермии злокачественных новообразований. Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ экспериментального повреждения опухолевых клеток с помощью магнитной гипертермии, включающий следующие стадии:
x
1-x
2
4
(i) обеспечение магнитных наночастиц, выбранных из группы магнитных оксидов металлов, включающей Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO (х=0-0,9), средний размер которых составляет менее 40 нм, температура Кюри составляет от 39°С до 550°С, и среднее значение коэрцитивной силы от 5 до 250 Э.
(ii) добавление магнитных наночастиц в клеточную культуру;
(iii) подвергание указанной клеточной культуры магнитному полю ПТ с амплитудой от 14 Э до 300 Э и частотой от 80 кГц до 1000 кГц, где время подвергания указанному воздействию при температуре от 38°С до 51°С составляет от 15 до 60 мин, для обеспечения:
(iv) сопутствующего или последующего повреждения или по меньшей мере частичного разрушения опухолевых клеток.
Указанные и другие варианты реализации изобретения подробно описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Прилагаемые графические материалы иллюстрируют варианты реализации описанного в настоящей заявке изобретения и вместе с описанием изобретения раскрывают некоторые из неограничивающих примеров изобретения.
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
x
1-x
2
4
а
На Фигуре 1 показаны изображения образцов соединений ZnMnFeO с различным содержанием Zn, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии:  - ZnMnFeO, x=0; b - ZnMnFeO, x=0,1; с - ZnMnFeO, x=0,2; d - ZnMnFeO, x=0,4; e - ZnMnFeO, x=0,5; f - ZnMnFeO, x=0,6; g - ZnMnFeO, x=0,9.
x
1-x
2
4
На Фигуре 2 показано распределение по размеру наночастиц ZnMnFeO в зависимости от степени Zn-замещения.
а
На Фигуре 3 показана конструкция экспериментального устройства с системой охлаждения воздуха для проведения экспериментов in vitro с использованием МГ () и его блок-схема (b): 1 - генератор, 2 - преобразователь, 3 - система охлаждения, 4, 5, 6 - источник питания, L - катушка.
x
1-x
2
4
На Фигуре 4 показаны результаты измерения намагниченности для ΖnΜnFeO с различным содержанием Ζn (x) [18].
На Фигуре 5 показана зависимость коэрцитивности от концентрации Zn при комнатной температуре.
x
1-x
2
4
На Фигуре 6 показана эффективность нагрева образцов МНЧ ZnMnFeO как график зависимости температуры от времени для различных концентраций Zn (x).
На Фигуре 7 показаны значения удельного коэффициента поглощения (SAR) в зависимости от размера МНЧ.
0,2
0,8
2
4
На Фигуре 8 показана эффективность нагрева частиц ZnMnFeO как график зависимости температуры от времени для различных значений напряженности поля Η при частоте f=100 кГц.
x
1-x
2
4
3
4
x
1-x
3
На Фигуре 9 показан график зависимости температуры от времени, включающий отношение эффективности нагрева ZnMnFeO МНЧ (х=0,1) к эффективности нагрева других композиций: покрытых полимером и не покрытых полимером магнитных частиц (FeO) и частиц LSMO (LaSrMnO, x=0,75); Η=95 Э.
а
а
На Фигуре 10 показаны изображения контрольных () и экспериментальных (b) клеток лейкемии линии K562, которые инкубировали при 37°С () и 43°С (b) в присутствии Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца (10 мг). Исходное увеличение х250.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В целом, настоящее изобретение описывает способ лечения злокачественных новообразований или тканей-мишеней с помощью локальной гипертермии с использованием магнитных наночастиц, обладающих улучшенными характеристиками нагрева для повышения теплопроизводительности и снижения нежелательных явлений.
I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
На всем протяжении настоящей заявки и формулы изобретения термины «включает» и «содержит» и их вариации, такие как «содержащий», «включающий», «имеет» и «имеющий» следует интерпретировать как инклюзивные. Употребление предметов в единственном числе в контексте описанного изобретения относится как к единственному, так и множественному числу указанных предметов, если иное не указано в настоящей заявке или явно не следует и контекста.
Следует понимать, что каждый диапазон, описанный в настоящей заявке, представляет собой ряд чисел, принадлежащих указанному диапазону. Таким образом, каждый диапазон включает все и каждое значение, принадлежащее указанному диапазону, а также любой из его поддиапазонов. Если иное не указано, предполагается, что пограничные точки диапазона являются частью указанного диапазона.
При использовании в настоящей заявке термин «магнитная гипертермия» (аббревиатура «МГ») обозначает способ медицинского лечения, включающий подвергание всего тела, его локальной области или ткани повышенным температурам под воздействием электромагнитного поля для повреждения или уничтожения раковых клеток или для разрушения опухолей.
Термин «магнитные наночастицы» (аббревиатура «МНЧ») при использовании в настоящей заявке относится к классу наночастиц, которыми можно управлять с помощью градиентов магнитного поля. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения указанный термин относится к Zn-замещенным магнитным наночастицам на основе феррита марганца.
При использовании в настоящей заявке термины «магнитное поле переменного тока (ПТ)» или «переменное магнитное поле» означают магнитное поле, вызванное переменным током.
При использовании в настоящей заявке термины «злокачественная неоплазма», «злокачественное новообразование», «раковая клетка», «опухолевая клетка» или «опухоль» относятся к любому неопластическому росту у пациента, включая любые метастазы. Конкретные типы рака, которые можно лечить с использованием способов согласно настоящему изобретению, описаны в настоящей заявке.
В целом, термин «эффективность нагрева» означает отношение тепла, образующего в ходе процесса, к общей затраченной энергии или поглощенному теплу. При использовании в настоящей заявке указанный термин определяет способность магнитных наночастиц нагреваться до оптимальной температуры в описанном способе магнитной гипертермии. Указанная оптимальная температура обеспечивает быстрый и равномерный нагрев злокачественных новообразований, снижая риск термального повреждения здоровой ткани.
с
с
Термин «температура Кюри» (или «Т») означает температуру, при которой конкретные материалы утрачивают свойства постоянного магнита с приобретением индуцированного магнетизма. Размер частиц в кристаллической решетке материала изменяет температуру Кюри. Благодаря малому размеру частиц колебания спина электрона становятся более значительными, что приводит, таким образом, к снижению Т при снижении размера частиц, поскольку колебания вызывают разупорядоченность [17].
При использовании в настоящей заявке термин «удельный коэффициент поглощения» (или «SAR») представляет собой количество энергии, поглощаемой образцом на единицу массы. Частицы должны иметь высокие значения SAR для быстрого нагрева под воздействием прилагаемого переменного магнитного поля. SAR МНЧ сильно зависит от частоты и интенсивности прилагаемого магнитного поля, а также от химических, физических и магнитных свойств материала. Ожидается, что частицы, имеющие оптимальное значение удельного коэффициента поглощения (SAR), не вызывают перегрева опухолевой ткани при прилагаемом магнитном поле и обеспечивают желаемый терапевтический эффект благодаря достаточному подъему температуры.
Более конкретно, указанные частицы обеспечивают нагрев области опухоли до желаемой температуры, составляющей от примерно 40 до примерно 46°С, при использовании их низкой концентрации и без перегрева областей с высокой концентрацией частиц при минимальных значениях частоты и амплитуды прилагаемого поля.
Термины «коэрцитивная сила» или «коэрцитивность», используемые в отношении ферромагнитного материала, означают интенсивность прилагаемого магнитного поля, необходимую для снижения намагниченности указанного материала до нуля после доведения намагниченности образца до насыщения. Другими словами, указанный параметр измеряет устойчивость ферромагнитного материала к размагничиванию.
eff
Термин «константа анизотропии» или «магнитная константа анизотропии» отражает реализацию эффекта магнитной анизотропии в материале, где расположение ядерных магнитных моментов в определенном направлении кристалла является энергетически более эффективным по сравнению с другими направлениями. Под воздействием прилагаемого магнитного поля магнитный момент однодоменной наночастицы может вращаться. В твердом теле вращение происходит внутри частицы (релаксация Нееля). В магнитной жидкости оно может происходить посредством броуновской диффузии. Важными факторами, влияющими на время релаксации Нееля, являются константа анизотропии K и объем частицы V. Когда диаметр частицы составляет менее 15 нм, доминирует быстрая релаксация Нееля. Если диаметр частицы составляет более 15 нм, на ее характеристики влияет медленная броуновская релаксация.
При использовании в настоящей заявке термины «селективно» и «селективность» (например, «селективность лечения») означают влияние с высоко специфичной активностью, обеспечивающее строго локализованный эффект. Термин «коэффициент повреждения клеток» означает процент раковых клеток, претерпевающих видимые морфологические изменения через 24 часа после их подвергания воздействию магнитного поля ПТ в присутствии магнитных наночастиц.
При использовании в настоящей заявке термин «введение» означает введение магнитных наночастиц в соответствии с изобретением или содержащей их фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в указанном введении. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения указанный термин относится к внутривенному или внутриопухолевому введению.
Термины «субъект» и «пациент» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к животному, такому как млекопитающее, более предпочтительно к человеку.
При использовании в настоящей заявке термины «лечить» и «лечение» относятся к подавлению или снижению развития патологического состояния, расстройства или заболевания или его клинических симптомов с помощью конкретной терапии.
Термин «биологически активная молекула» используется для определения молекулы вещества, которую вводят субъекту, способной вызывать конкретный клеточный ответ. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения биологически активная молекула выбрана из противоракового агента, распознающего опухолевые клетки антитела или аптамера.
II. ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно одному варианту реализации изобретения предложен способ лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии, включающий следующие стадии:
(i) доставка в место опухоли магнитных наночастиц, выбранных из группы магнитных оксидов металлов,
(ii) подвергание области опухоли магнитному полю ПТ,
(iii) последующее селективное повреждение или разрушение опухолевых клеток в области опухоли без повреждения здоровой окружающей ткани.
x
1-x
2
4
Согласно одному варианту реализации изобретения магнитные наночастицы представляют собой Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO, где x равен 0-0,9.
0,2
0,8
2
4
Согласно конкретным вариантам реализации изобретения магнитные наночастицы представляют собой Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили в ходе эксперимента, что вводимые магнитные наночастицы обладают повышенной эффективностью нагрева и высоким значением удельного коэффициента поглощения (SAR). SAR МНЧ сильно зависит от частоты и интенсивности прилагаемого магнитного поля, наряду с химическими, физическими и магнитными свойствами материала. В результате исследования, проведенного изобретателями, было обнаружено, что наночастицы с оптимальным значением SAR, описанные согласно изобретению, обеспечивают желаемый терапевтический эффект благодаря достаточному подъему температуры без перегрева опухолевой ткани под воздействием прилагаемого магнитного поля. На основе экспериментального исследования изобретатели определили размер наночастиц для применения согласно настоящему изобретению для обеспечения максимального коэффициента повреждения клеток и выбора состава МНЧ, например, степени Zn-замещения, и параметров магнитного поля, таких как частота и/или сила магнитного поля. Размер измеряли, как показано в Примере 2.
Согласно одному варианту реализации изобретения предпочтительный средний размер наночастиц составляет менее 40 нм. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения средний размер наночастиц находится в диапазоне от 1 до 100 нм, от 2 до 50 нм, от 4 до 40 нм или от 5 до 30 нм. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения средний размер наночастиц составляет от 5 до 25 нм. Авторы обнаружили, что указанный диапазон размеров является решающим фактором для повышения эффективности нагрева наночастиц.
Согласно одному варианту реализации изобретения температура Кюри МНЧ для применения в описанном способе может составлять от 39°С до 550°С. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения температура Кюри наночастиц составляет от 40 до 100°С, от 45 до 150°С, от 50 до 200°С, от 60 до 250°С, от 65 до 300°С, от 70 до 350°С, от 80 до 400°С, от 85 до 450°С, или от 90 до 550°С. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения температура Кюри наночастиц составляет от 42°С до 45°С. Изобретатели обнаружили, что конкретный указанный диапазон температур обеспечивает самую высокую эффективность и скорость повреждения клеток, составляющую более чем 50%.
Согласно одному варианту реализации изобретения магнитные наночастицы для применения согласно настоящему изобретению характеризуются средним значением коэрцитивной силы, составляющим от 5 до 250 Э. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения среднее значение коэрцитивной силы составляет от 5 до 40 Э, от 10 до 45 Э, от 17 до 35 Э, от 20 до 50 Э, от 24 до 48 Э, от 30 до 90 Э, от 45 до 120 Э, от 60 до 110 Э, от 78 до 190 Э или от 95 до 250 Э. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения значение коэрцитивной силы составляет от 10 до 30 Э. Авторы показали, что значение коэрцитивной силы сильно зависит от степени Zn-замещения (см. Пример 5).
МНЧ, используемые в способе согласно настоящему изобретению, можно легко синтезировать с помощью способов получения, известных специалисту в данной области техники. Способы, подходящие для получения МНЧ, включают ко-преципитацию, гидротермальный синтез, термальную декомпозицию, микроэмульсионные методы, синтез методом золь-гель, синтез пламенным распылением. Например, магнитные наночастицы для применения в описанном способе можно синтезировать с помощью способа ко-преципитации в атмосфере Ar (Пример 1, [18]).
Согласно одному варианту реализации изобретения магнитные наночастицы для применения в описанном способе могут содержать защитную оболочку или покрытие. Изобретатели обнаружили, что указанная защитная оболочка или покрытие обеспечивает повышение биосовместимости МНЧ. Согласно одному варианту реализации изобретения защитная оболочка или покрытие состоит из биосовместимого полимерного материала. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения биосовместимый полимерный материал представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропилен, декстран, поливинилдифторид (ПВДФ), поливинилпирролидон (ПВП) или полиакриловую кислоту. Согласно одному варианту реализации изобретения биосовместимый полимерный материал представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ) или декстран. Изобретатели удачным образом обнаружили, что нековалентная иммобилизация ПЭГ на поверхности наночастиц повышает время циркуляции наночастиц в кровотоке и эффективность их всасывания клетками, и, таким образом, повышает коэффициент повреждения раковых клеток. Подобным образом, изобретатели обнаружили, что покрытые декстраном частицы проявляют более высокую стабильность в коллоидном растворе наночастиц и повышенное время циркуляции в кровотоке. Согласно другому варианту реализации изобретения биосовместимый полимерный материал представляет собой полипропилен и/или поливинилдифторид (ПВДФ) (см. Пример 3).
В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения магнитное поле представляет собой переменное магнитное поле, созданное внешним источником и имеющее амплитуду от 14 Э до 300 Э и частоту от 80 кГц до 1000 кГц. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения амплитуда магнитного поля ПТ составляет от 14 до 90 Э, от 30 Э до 150 Э, от 50 Э до 200 Э, от 60 Э до 230 Э, от 80 Э до 250 Э, от 40 до 200 Э, от 70 до 290 Э или от 90 Э до 300 Э. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения частота магнитного поля ПТ составляет от 1 кГц до 100 кГц, от 50 кГц до 300 кГц, от 80 кГц до 500 кГц, от 100 кГц до 700 кГц, от 150 кГц до 900 кГц или от 90 кГц до 1000 кГц. Изобретатели обнаружили, что магнитное поле ПТ с амплитудой 100 Э и частотой 100 кГц, обеспечивает эффективное повреждение клеток. В Примере 4 описано экспериментальное устройство для создания магнитного поля. Магнитное поле прилагается к предварительно определенной области и в течение предварительно определенного времени для обеспечения нагрева магнитных наночастиц до температуры, достаточной для повреждения или разрушения опухолевых клеток без повреждения здоровой окружающей ткани.
Согласно одному варианту реализации изобретения магнитное поле ПТ создается с помощью внешнего источника поля со значением градиента поля от 3 до 100 Т/м для точного определения движения и расположения наночастиц в месте опухоли во время лечения, в частности, после стадии доставки магнитных наночастиц в опухоль. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения внешний источник поля, создающий магнитное поле ПТ, помещают внутри или снаружи тела пациента, нуждающегося в указанном лечении.
Согласно конкретным вариантам реализации изобретения способ, описанный в настоящей заявке, может необязательно включать стадию локализации и регулирования концентрации наночастиц в области опухоли с помощью внешнего источника поля на основе системы щелочно-земельных постоянных магнитов с использованием цилиндров Халбаха. Такой подход позволяет максимизировать силы, прилагаемые к магнитным наночастицам, направленным на глубоко расположенные ткани, обеспечивая, таким образом, возможность лечения более широкого класса пациентов, например пациентов с более глубокими опухолями [19]. Стадия локализации и регулирования концентрации наночастиц в месте опухоли предпочтительно осуществляют после стадии доставки магнитных наночастиц в опухоль. Авторы предполагают, что точная локализация и регулирование концентрации наночастиц в опухоли может существенно повышать селективность лечения.
В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения время подвергания воздействию магнитного поля ПТ может варьировать от 15 до 60 мин. Указанное время, как правило, является достаточным для нагрева опухолевой ткани до терапевтических температур и/или температур абляции (предпочтительно, 38-51°С). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения время подвергания воздействию магнитного поля ПТ составляет от 15 до 30 мин, от 20 до 40 мин, от 30 до 50 мин, или от 40 до 60 мин. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения время подвергания воздействию магнитного поля ПТ составляет от 30 до 45 мин. Изобретатели обнаружили, что указанный временной диапазон является достаточным для эффективного нагрева области опухоли до терапевтических температур, составляющих 42-45°С, при сниженном риске термального повреждения здоровой ткани.
Согласно одному варианту реализации изобретения область опухоли нагревают до 38-51°С под воздействием переменного магнитного поля. Температуры, превышающие 45-50°С, обычно применяют для локальной индукции некроза ткани (способы термоабляции), при этом температуры в диапазоне от 41 до 45°С можно использовать для повреждения раковых клеток (что является предпочтительным для малых опухолей), связанного с дефектами мембран, конформационными изменениями, ингибированием синтеза РНК, ДНК и белка и т.д. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения область опухоли нагревают до температуры от 39 до 45°С, от 40 до 42°С, от 41 до 45°С, от 43 до 47°С или от 45 до 51°С. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения область опухоли нагревают до температуры от 42°С до 45°С. Авторы показали, что указанный диапазон температур обеспечивает эффективное повреждение раковых клеток с коэффициентом повреждения более 50% (см. Пример 7).
В целом, клеточная гибель представляет собой каскадный процесс, который включает ряд стадий, от ранних морфологических изменений до апоптоза, которые имеют разную продолжительность. Согласно одному варианту реализации изобретения стадия селективного повреждения или разрушения опухолевых клеток в области опухоли может варьировать от 1 часа до 96 часов. Продолжительность указанной стадии зависит от конкретных факторов, таких как тип, размер и расположение опухоли, температура нагрева, время подвергания воздействию и т.д. Изобретатели обнаружили, что экспериментальное повреждение или разрушение раковых клеток с коэффициентом повреждения клеток более 50% занимает примерно 24 часа (Пример 7).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии, описанный в настоящей заявке, может включать стадию неинвазивного измерения температуры опухоли. Возможные пути измерения температуры опухоли при МГ включают, например, инвазивные и неинвазивные подходы, такие как применение термопарного зонда, измерение температуры с помощью магнитно-резонансной визуализации или температурной зависимости высших гармоник намагниченности. Согласно одному варианту реализации изобретения на стадии неинвазивного измерения температуры опухоли используется измерение температуры с помощью магнитно-резонансной визуализации или температурной зависимости высших гармоник намагниченности. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения стадия неинвазивного измерения температуры опухоли включает измерение температуры с помощью магнитно-резонансной визуализации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения указанный способ необязательно включает стадию инвазивного измерения температуры опухоли, например с применением термопарного зонда. Измерение температуры опухоли предпочтительно осуществляют во время стадии подвергания области опухоли воздействию магнитного поля ПТ.
В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения способ лечения злокачественных новообразований путем магнитной гипертермии также может включать выбор параметров электромагнитного поля (сила, частота), характеристик магнитных наночастиц (концентрация, средний размер, распределение по размеру, температура Кюри, среднее значение коэрцитивной силы, покрытие), продолжительности и количества циклов подвергания воздействию магнитного поля ПТ и способа инъекции, локализации и времени удерживания наночастиц для каждого типа опухоли. Необязательно указанный подход учитывает другие параметры, такие как объем наночастиц, SAR и константа анизотропии; размер, плотность и расположение опухоли; состояние пациента и т.д., обеспечивая, таким образом, повышенную эффективность и селективность лечения.
В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения МНЧ, используемые в описанном способе, можно вводить любым эффективным удобным способом, включая внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутриопухолевое, пероральное, интраназальное, ингаляционное, ректальное, интравагинальное или местное введение. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения магнитные наночастицы вводят внутривенно или внутрь опухоли в конкретные участки тела пациента, нуждающегося в указанном введении.
3
Дозировка, режим и продолжительность лечения зависят от типа опухоли, подвергаемой гипертермии, а также возраста, массы тела и ответа на лечение конкретного пациента и должны определяться специалистом в индивидуальном порядке для каждого клинического случая. Однако необходимо отметить, что концентрация наночастиц, составляющая между 20 и 80 мг/см, способна приводить к температуре абляции (>50°С). Таким образом, гомогенные магнитные материалы с относительно низким значением SAR могут являться подходящими для магнитной гипертермии, если объем раствора частиц, подлежащего введению, меньше размера опухоли.
Согласно другому аспекту изобретения заболевание или расстройство, подлежащее лечению у субъекта с помощью способа, описанного в настоящей заявке, может включать, но не ограничивается указанными, рак молочной железы, рак легких, рак глотки, рак гортани, рак пищевода, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак матки, рак шейки матки, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак яичка, рак предстательной железы, рак кости и рак мозга.
x
1-x
2
4
0,2
0,8
2
4
Согласно другому варианту реализации изобретения изобретение относится к применению Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO, где x равен 0-0,9, для лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения изобретение относится к применению в описанном способе Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO.
x
1-x
2
4
0,2
0,8
2
4
Согласно одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии, содержащая Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO (х=0-0,9) и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения магнитные наночастицы представляют собой Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO. Фармацевтически приемлемый носитель относится к фармацевтически приемлемому материалу или носителю, такому как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество или растворитель, и может включать сахара (лактозу, глюкозу, сахарозу и т.д.), крахмал (кукурузный крахмал или картофельный крахмал), целлюлозу и ее производные, солод, желатин, гликоли (например пропиленгликоль), полиолы (глицерин, сорбит, маннит и т.д.), буферные агенты, изотонический солевой раствор, этиловый спирт и другие нетоксичные биосовместимые вещества.
Указанная фармацевтической композиции может необязательно содержать биологически активную молекулу, где указанная биологически активная молекула выбрана из противоракового агента, распознающего опухолевые клетки антитела или аптамера. Примеры биологически активных молекул, подходящих для применения в фармацевтической композиции в соответствии с изобретением включают, но не ограничиваются указанными, противораковые агенты, такие как карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, метотрексат, паклитаксел, тамоксифен, винкристин; антитела, такие как алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, матузумаб, обинутузумаб, офатумумаб, панитумумаб, пертузумаб, ритуксимаб, трастузумаб; аптамеры, такие как агонисты толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR) или лиганды рецептора GCC. Авторы пердполагают, что применение МНЧ в комбинации с биологически активными веществами в описанном способе может существенно повышать эффективность и селективность лечения.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению для лечения злокачественных новообразований с помощью МГ может быть представлена в виде раствора для инфузии, раствора для инъекций, порошка или лиофилизата. Специалист в области медицины должен определить дозировку, режим и продолжительность лечения в индивидуальном порядке для каждого клинического случая в зависимости от характеристик пациента, подлежащего лечению. Фармацевтическую композицию, описанную в настоящей заявке, можно вводить субъекту с помощью различных способов, включая внутрисосудистое, внутримышечное, подкожное, внутриопухолевое, пероральное, интраназальное, ингаляционное, ректальное, интравагинальное или местное введение.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению подходит для лечения с помощью МГ заболевания или расстройства, такого как злокачественное новообразование или рак у пациента, нуждающегося в указанном лечении. Примеры включают, но не ограничиваются указанными, рак молочной железы, рак легких, рак глотки, рак гортани, рак пищевода, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак матки, рак шейки матки, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак яичка, рак предстательной железы, рак кости и рак мозга.
Далее следуют неограничивающие примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение.
ПРИМЕРЫ ПРИМЕР 1. ПОЛУЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ.
x
1-x
2
4
2
3
3
Магнитные наночастицы, используемые в описанном способе, можно легко получить с помощью способов, известных специалисту в данной области техники. МНЧ формулы ZnMnFeO (х=0-0,9) для применения в способе магнитной гипертермии синтезировали с помощью метода ко-преципитации в атмосфере Ar [18]. Для синтеза образца с 50% Zn-замещением растворы 0,5М MnCl, ZnNO и 1М FeCl смешивали в отношении 1:1:2 и нагревали до 85°С, перемешивали, затем добавляли 0,64М раствор NaOH в качестве катализатора. Смесь нагревали до 95°С в течение часа, затем промывали и охарактеризовали. Оставшиеся образцы с Zn-замещением на 10%, 20%, 90% получали подобным образом. Следующая формула описывает указанный процесс:
Полученные наночастицы (х=0,5) имеют размер, составляющий примерно 10 нм, и соответствуют узкому пику на диаграмме распределения по размеру, а также характеризуются высокой монодисперсностью.
ПРИМЕР 2. АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ С ПОМОЩЬЮ ФОТОКОРЕЛЛЯЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ И ТРАНСМИССИОННОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ.
Полученные образцы наночастиц анализировали с помощью следующих далее способов. Фотокорелляционная спектроскопия (ФКС) представляет собой способ определения размера частиц в растворе с помощью коэффициента диффузии. Броуновское движение частиц в растворе и последующая локальная гетерогенность их концентрации приводит к корреляции коэффициента преломления конкретной среды и колебаний интенсивности рассеянного света при прохождении через среду. Таким образом, можно определить коэффициент диффузии, так как он пропорционален постоянной времени экспоненциально затухающего ослабления интенсивности рассеянного света. Гидродинамический радиус наночастицы рассчитывают с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна, связывающего коэффициент диффузии и вязкость жидкости с размером частиц.
Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) основана на принципе прохождения/отражения пучка электронов через тонкую (примерно 0,1 мкм) поверхность с последующим увеличением изображения. Образцы наносили на сетку путем разведения раствора до очень низкой концентрации частиц. Каплю (примерно 1-2 мкл) наносили на сетку-подложку (медную сетку, покрытую формваром) и сушили при комнатной температуре в отсутствие источников магнитного поля. Для анализа образцов использовали трансмиссионный электронный микроскоп Hitachi Н-7000 (100 кВт, 0,5 Т).
Результаты представлены на Фигурах 1 и 2. На Фигуре 1 показаны изображения образцов с различным содержанием Zn, полученные с помощью ТЭМ. На Фигуре 2 показано распределение наночастиц по размеру в зависимости от степени Zn-замещения.
ПРИМЕР 3. СПОСОБ ПОСЛОЙНОГО НАНЕСЕНИЯ МНЧ НА ПОЛИПРОПИЛЕНОВОЕ И ПОЛИВИНИЛДИФТОРИДНОЕ ПОКРЫТИЕ.
Магнитные наночастицы для применения в описанном способе могут содержать защитную оболочку или покрытие, состоящее из биосовместимого полимерного материала, позволяющего повышать биосовместимость МНЧ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения биосовместимый полимерный материал представляет собой полипропилен и/или поливинилдифторид (ПВДФ). Исходный способ послойного нанесения МНЧ на указанное покрытие основан на электростатическом притяжении противоположно заряженных слоев, которые наносят последовательно. На первом стадии поверхность полипропилена и поливинилдифторида покрывали слоем положительно заряженного полиэлектролитного геля (полиаллиламина гидрохлорида). Затем поверхность промывали дистиллированной водой. Далее отрицательно заряженные МНЧ осаждали на поверхность с последующим промыванием в дистиллированной воде. Осуществляли несколько циклов описанного процесса в соответствии с требуемым количеством слоев. После последнего нанесения поверхность сушили.
ПРИМЕР 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ УСТРОЙСТВО.
Экспериментальное устройство с охлаждением воздуха для экспериментальной МГ in vitro состоит из: 1) системы генерации магнитного поля, включающей источник энергии, генератор, магнитную катушку (соленоид) и контрольную цепь, 2) систему измерения температуры, включающую термопару и контролирующий вольтметр, 3) систему охлаждения, включающую систему водяного охлаждения спирали, дополнительные охлаждающие вентиляторы генератора и источника энергии и 4) систему внешнего управления, включающую персональный компьютер и переключающее устройство. На Фигуре 3 показана схема устройства.
Внутренний диаметр рабочего отверстия катушки магнитного поля составляет 50 мм, и высота составляет 80 мм. Устройство создает магнитное поля ПТ с амплитудой 100 Э и частотой 100 кГц.
Система генерации магнитного поля состоит из источника электропитания, генератора и магнитной катушки (соленоида). Напряжение электрической сети снижается при прохождении через источник питания и достигает генератора, создающего сигнал частотой 100 кГц в соленоиде. Это приводит к возникновению магнитного поля с напряженность 100 Э в рабочем отверстии катушки.
Скорость нагрева МНЧ измеряли с помощью системы для измерения температуры, выявляющей изменения температуры, вызванные воздействием поля. Система измерения температуры состояла из дифференциальной термопары и вольтметра Agilent 3441 OA, соединенного с управляющим компьютером через USB-порт. Далее с помощью модельного уравнения рассчитывали термические параметры материала.
ПРИМЕР 5. ИЗМЕРЕНИЕ МАГНИТНЫХ СВОЙСТВ.
x
1-x
2
4
Магнитные свойства МНЧ, используемых в способах согласно изобретению, исследовали с помощью магнитометра с вибрирующим зондом Lake Shore 7407 в условиях магнитного поля с напряженностью до 16 кЭ при комнатной температуре. На Фигуре 4 показаны результаты измерения намагничивания для частиц ZnMnFeO с различным содержанием Zn [18]. Было обнаружено, что намагничивание является максимальным для образца с 20% Zn-замещением и затем снижается с повышением концентрации Zn. Результаты измерения коэрцитивной силы представлены на Фигуре 5. Степень Zn-замещения также влияет на значение коэрцитивности. В целом, намагничивание и коэрцитивная сила снижаются с повышением степени Zn-замещения. Это обусловлено тем, что феррит цинка обладает парамагнитными свойствами в наноструктурированном состоянии.
ПРИМЕР 6. НАГРЕВ В МАГНИТНОМ ПОЛЕ ПТ.
x
1-x
2
4
Эффективность нагрева МНЧ формулы ZnMnFeO (х=0-0,9), которые можно использовать в описанном способе, оценивали с помощью графика зависимости температуры от времени для различных концентраций Zn (x) (Фигура 6). Максимальное изменение температуры, превышающее 50°С, наблюдали для МНЧ с 20% Zn-замещением, тогда как для образцов с более высоким или более низким содержанием Zn наблюдался средний нагрев. Анализировали различные факторы, предположительно влияющие на эффективность нагрева (размер, намагниченность насыщения, коэрцитивность). Было показано, что первые два фактора являются критичными для эффективности нагрева [18].
На Фигуре 7 показаны значения удельного коэффициента поглощения (SAR) в зависимости от размера МНЧ, и в Таблице 1 суммированы значения SAR для различных концентраций Zn. Для расчета SAR использовали следующее уравнение:
p
w
где С представляет собой удельную теплоемкость воды, m представляет собой массу порошка, m представляет собой массу воды, dT/dt представляет собой производную температуры по времени на начальной линейной стадии нагрева. Значения SAR рассчитывали для безводных ферритных порошков и для магнитных жидкостей на основе 3 ферритных образцов [18].
0,2
0,8
2
4
Как следует из Таблицы 1 и Фигур 4-6, образец с 20% Zn нагревается лучше по сравнению с другими благодаря его максимальной коэрцитивности и магнитному насыщению. На Фигуре 8 показана эффективность нагрева частиц ZnMnFeO в виде графика зависимости температуры от времени для различных значений напряженности Н при частоте f=100 кГц. Результаты также суммированы в Таблице 2.
x
1-x
2
4
3
4
3
4
x
1-x
3
Эффективность нагрева МНЧ формулы ZnMnFeO (х=0-0,9), используемых в способе согласно настоящему изобретению, также сравнивали с эффективностью нагрева других композиций, таких как композиции покрытых полимером частиц FeO [20], частиц FeO без покрытия [21] и LaSrMnO [22]. Результаты представлены в виде графика зависимости температуры от времени (Фигура 9) и суммированы в Таблице 3.
Значения SAR с сопутствующим приближением линейных участков графика рассчитывали в соответствии с уравнением:
где С представляет собой удельную теплоемкость суспензии, dT/dt представляет собой коэффициент наклона линейного участка,  представляет собой отношение масса суспензии/масса МНЧ.
В Таблице 4 показаны результаты экспериментального измерения нагрева, которое проводили для различных типов МНЧ в физиологическом растворе.
0,2
0,8
2
4
Таким образом, можно заключить, что Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца формулы ZnMnFeO являются наиболее перспективными композициями для применения в описанном способе магнитной гипертермии.
ПРИМЕР 7. НАГРЕВ РАКОВЫХ КЛЕТОК.
2
0,2
0,8
2
4
2
5
Клетки лейкемии человека линии K562 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, пенициллина в концентрации 100 Ед/мл и стрептомицина в концентрации 100 мкг/мл при температуре 37°С в присутствии 5% СО. Клетки (2×10 в 1 мл указанного раствора) инкубировали в 100 мкл солевого раствора при 43°С в присутствии Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца ZnMnFeO (10 мг) под воздействием переменного магнитного поля (100 Э) в течение 60 мин. Контрольные клетки (в такой же плотности) инкубировали при 37°С, 5% СО в увлажненной атмосфере в течение 60 мин.
2
Контрольные клетки включали: интактные клетки (не подверженные воздействию наночастиц и магнитного поля); клетки, которые инкубировали в присутствии Zn-замещенных магнитных наночастиц на основе феррита марганца (10 мг) (без воздействия магнитного поля); клетки, подвергаемые воздействию переменного поля с напряженностью 100 Э (без наночастиц). Как нагреваемые, так и контрольные образцы ресуспендировали в 3 мл свежей среды и дополнительно инкубировали при 37°С, 5% СО в течение дополнительных 24 часов. Контрольные клетки росли в логарифмической прогрессии и оставались жизнеспособными без морфологических признаков цитотоксичности, выявляемых при указанных выше условиях (Фигура 10а). Напротив, выявлялось тяжелое повреждение клеток, подверженных опосредованной МНЧ гипертермии (Фигура 10b). Количество клеток было значительно меньше; все клетки выглядели сжатыми, а их контуры -неровными. Наблюдалось большое количество разрушенных клеток.
Полученные результаты указывают, что Zn-замещенные магнитные наночастицы на основе феррита марганца можно успешно использовать для подавления роста раковых клеток или их разрушения в способах магнитной гипертермии, обеспечения высокой теплопроизводительности и, как ожидается, снижения частоты тяжелых нежелательных явлений благодаря низкой токсичности указанных наночастиц.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
[1] Hilger I. In vivo applications of magnetic nanoparticle hyperthermia. Int J Hyperthermia 2013; 29(8): 828-834.
[2] Gray BN, Jones SK. Targeted hysteresis hyperthermia as a method for treating diseased tissue. US6565887 (2003).
[3] Mallory M, Gogineni E, Jones GC, Greer L, Simone СВ. Therapeutic hyperthermia: the old, the new, and the upcoming. Crit Rev Oncol Hematol 2016; 97: 56-64.
[4] Arruebo M, Fernandez-Pacheco R, Ibarra MR, Santamaría J. Magnetic nanoparticles for drug delivery. Nanotoday 2007; 2: 22-32.
3
4
[5] Tomitaka A, Yamada T, Takemura Y. Magnetic nanoparticle hyperthermia using pluronic-coated FeO nanoparticles: An in vitro study. Journal of Nanomaterials 2012; 2012: 1-5.
[6] Périgo EA, Hemery G, Sandre О, Ortega D, Garaio E, Plazaola F, Teran FJ. Fundamentals and advances in magnetic hyperthermia. Applied Physic Reviews 2015; 2(4): 1-35.
[7] Hergt R, Dutz S, Muller R, Zeisberger M. Magnetic particle hyperthermia: nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. J Phys: Condens Matter 2006; 18: S2919-S2934.
[8] Hergt R, Andra W, d'Ambly CG, Hilger I, Kaiser WA, Richter U, et al. Physical limits of hyperthermia using magnetite fine particles. IEEE Transactions on Magnetics 1998; 34(5): 3745-54.
[9] Bae ST, Chung KW. Method for preparing engineered Mg doped ferrite superparamagnetic nanoparticle exhibiting AC magnetic induction heating at high temperature and Mg doped ferrite superparamagnetic nanoparticles engineered by the method. EP2377811 (2011).
[10] Ortega D, Pankhurst QA. Magnetic hyperthermia, in Nanoscience: Volume 1: Nanostructures through Chemistry. Nanoscience 2013; 1: 60-88.
[11] Rand RW. Inductive heating process for use in causing necrosis of neoplasms at selective frequencies. US 4983159 (1991).
[12] Kashevskij BE, Kashevskij SB, Prokhorov IV, Istomin YP, Ulaschik VS. Method of local hyperthermia of malignant tumor. EA019412 (2014).
[13] Nat. Univ. Yokohama. Ni-Zn-based ferrite magnetic nanoparticle for thermotherapy, and drug-bound complex for thermotherapy using the same. JP 2013256405 (2013).
[14] Baldi D, Bonakki D, Innocenti F, Lorentsi D, Bitossi M, Ferruti P, Ranuchchi E, Richchi A, Komes FM. Magnetic nanoparticles to be used in hyperthermia, preparation and use thereof in magnetic systems for pharmacological application. RU 2481125 (2013).
[15] Tishin AM. Method for carrying out malignant neoplasm magnetic therapy. RU 2295933 (2007).
[16] Haik Y, Chen С J. Magnetic particle composition for therapeutic hyperthermia. US 7842281 (2010).
[17] Lopez-Dominguez V, Hernandez JM, Tejada J, Ziolo RF. Colossal reduction in curie temperature due to finite-size effects in CoFeO nanoparticles. Chemistry of Materials 2013; 25(1): 6-11.
[18] Elkhova TM, Yakushechkina AK, Semisalova AS, Gun'ko YK, Spichkin YI, Pyatakov AP, Kamilov KI, Perov NS, Tishin AM. Heating of Zn-substituted manganese ferrite magnetic nanoparticles in alternating magnetic field. Solid State Phenomena 2015; 233-234: 761-765.
[19] Sarwar A, Nemirovski A, Shapiro B. Optimal Halbach permanent magnet designs for maximally pulling and pushing nanoparticles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2012; 324: 742-754.
[20] Dutz S, Andrä W, Hergt R, Millier R, Oestreich C, et al. Influence of dextran coating on the magnetic behavior of iron oxide nanoparticles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2007; 311: 51-54.
[21] Müller R, Hergt R, Zeisberger M, Gawalek W. Preparation of magnetic nanoparticles with large specific loss power for heating applications. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2005; 289: 13-16.
0,6
0,4
3
[22] Andrade VM, Caraballo Vivas RJ, Costa-Soares T, Pedro SS, Rocco DL, Reis MS, Campos APC, Coelho AA. Magnetic and structural investigations on LaSrMnO nanostructured manganite: Evidence of a ferrimagnetic shell. J Sol St Chem 2014; 219: 87-92.