Способ прогнозирования развития FUS-ассоциированных нейродегенеративных нарушений у мышей
METHOD FOR PREDICTING THE DEVELOPMENT OF FUS-ASSOCIATED NEURODEGENERATIVE DISORDERS IN MICE

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования развития FUS-ассоциированных нейродегенеративных нарушений у мышей для и выявления групп риска развития у пациентов нейродегенеративных нарушений, в основе патогенеза которых лежит FUS-патия, в частности, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС).
Боковой амиотрофический склероз (БАС), также известный как болезнь Шарко, является третьим наиболее значимым нейродегенеративным заболеванием во всем мире, с частотой возникновения 1,5-2,5 на 10000 человек в год [Никитин С.С. Боковой амиотрофический склероз // Лечение нервных болезней. - 2006. - №2. - Р. 12] и распространенностью около 5,2 на 100000 человек [Worms P.M. The epidemiology of motor neuron diseases: a review of recent studies // J Neurol Sci. - 2001. - V. 191. - №1-2. - P. 3-9.]. БАС относится к группе болезней двигательного нейрона и характеризуется селективной гибелью верхних и нижних мотонейронов, которая приводит к нарастающей мышечной атрофии и прогрессирующему параличу поперечнополосатой мускулатуры. Разработка методов его эффективной терапии существенно затруднена из-за гетерогенной природы заболеванием.
Средняя продолжительность жизни больных после первого проявления клинических симптомов составляет всего от 2 до 5 лет [Бойко А.Н., Брылев Л.В., Васильев А.В., Гулевская Т.С., Завалишин И.А., Захарова М.Н., Меркулова Д.М., Моргунов В.А., Никитин С.С., Переседова А.В., Стойда Н.И. Боковой амиотрофический склероз / ред. Завалишина И.А. - М. Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2009]. Заболевание быстро ведет к тяжелой инвалидизации больных с высокой стоимостью их обслуживания и содержания [Левицкий Г.Н., Смирнов А.П., Анохин Д.Н., Лапшина Г.В., Скворцова В.И. Сроки диагностики, наступления фактической инвалидности и ее регистрации при боковом амиотрофическом склерозе в Москве и Московской области. - Москва. - 2007. - 165166]. Прогресс в области биомедицинской науки позволил выявить ряд важных механизмов, лежащих в основе селективной дегенерации двигательных нейронов, что, в свою очередь, активизировало работы по изучению патогенеза различных форм БАС и стимулировало практический интерес клиницистов к проблеме разработки патогенетических методов его лечения.
Болезнь двигательного нейрона (БДН) - синдром поражения мотонейронов - в 10% случаев носит семейный характер с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типом наследования. Этиология данного синдрома частично связана с наследственными факторами. Доказано, что 20% семейной БДН связано с мутациями в гене, кодирующем фермент медь-цинкзависимую супероксиддисмутазу (СОД) [Huai J., Zhang Z. Structural Properties and Interaction Partners of Familial ALS-Associated SOD1 Mutants. Frontiers in Neurology 2019; 10: 527]. Боковым амиотрофическим склерозом (БАС) называют форму БДН с относительно равномерным поражением и центрального, и периферического мотонейрона.
Развитие БАС ассоциировано также с большим количеством мутаций в генах, кодирующих ДНК/РНК-связывающие белки - FUS и TDP-43. У пациентов с БАС в двигательных нейронах, несущих мутации в гене FUS, происходит перераспределение этого белка, в норме имеющего ядерную локализацию, и значительная его часть обнаруживается в цитоплазме в виде характерных включений [Скворцова В.И., Смирнов А.П., Алехин А.В., Ковражкина Е.А. Клинико-эпидемиологическое исследование болезни двигательного нейрона в Москве. Журнал неврологии и психиатрии 2009; 109: 3: 53-55]. FUS-реактивные включения выявлены в двигательных нейронах также у пациентов со спорадическими формами БАС, лобно-височной деменцией, заболеваниями с атипичными включениями промежуточных филаментов, болезнью Лафоры, болезнью Унферрихта-Лундборга, что указывает на их важную роль в развитии нейродегенеративного процесса [Сердюк А.В., Левицкий Г.Н., Скворцова В.И. Изучение денервационно-реиннервационного процесса при болезни двигательного нейрона и доброкачественных заболевания мотонейронов. Журнал неврологии и психиатрии, 2006; 106: 2: 37-43]. Даже относительно низкий уровень экспрессии аберрантной формы FUS у трансгенных мышей инициирует развитие FUS-протеинопатии с последующим специфическим повреждением двигательных нейронов и появлением клинической картины БАС [Дейкин А.В., Ковражкина Е.А., Овчинников Р.К. и др. Модель бокового амиотрофического склероза на основе линии трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму FUS белка человека, Журнал Неврологии и психиатрии, 2014, №8, с. 62-69].
Таким образом, дисфункция белка FUS и изменение активности СОД играют ключевую роль в патогенезе БАС.
Имеются исследования у пациентов с БАС, где показано снижение уровня СОД в тканях головного мозга, при этом в крови его концентрация не изменялась, вследствие этого, авторы не рекомендуют использовать определение содержания СОД в крови в качестве биомаркера БАС [Wilson М.Е., Boumaza L, Bowser R., et al. A candidate biomarker for amyotrophic lateral sclerosis. PLOS ONE. 2010; 5(12)]. Однако в других исследованиях предлагается использовать определение концентрации СОД в ликворе как фармакодинамического биомаркера для контроля терапии, т.к. было обнаружено повышение содержание СОД в спинномозговой жидкости [Winer L., Srinivasan D., Chun S., et al. SOD1 in cerebral spinal fluid as a pharmacodynamic marker for antisense oligonucleotide therapy. JAMA Neurol. 2013; 70:201-207]. Недостатками данных исследований является то, что выявленный уровень СОД в крови, не коррелирует с уровнем в ликворе и в тканях головного мозга. Кроме того, определение содержания СОД в крови или ликворе на ранних стадиях у пациентов с БАС не проводилось. Забор крови, спинномозговой жидкости является инвазивной процедурой. При этом особые трудности представляет сбор ликвора, т.к. спинномозговую пункцию должны проводить компетентные специалисты в специально оборудованном помещении, а до проведения пункции требуется предварительно провести ряд анализов крови, мочи и исключить противопоказания к данной процедуре. Однако в этих случаях речь идет об определении СОД у пациентов с имеющимся БАС.
Необходимость изучения заболевания привела к созданию модели аберрантной формы FUS у трансгенных мышей. Даже относительно низкий уровень экспрессии аберрантной формы FUS у трансгенных мышей инициирует развитие FUS-протеинопатии с последующим специфическим повреждением двигательных нейронов и появлением клинической картины БАС [Дейкин А.В., Ковражкина Е.А., Овчинников Р.К., и др. Модель бокового амиотрофического склероза на основе линии трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму FUS белка человека, Журнал Неврологии и психиатрии, 2014, №8, с. 62-69].
Однако задача прогнозирования развития FUS-ассоциированных нейродегенеративных нарушений у трансгенных мышей ранее не ставилась.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования развития FUS-ассоциированных нейродегенеративных нарушений у трансгенных мышей.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение возможностей ранней диагностики FUS-ассоциированных заболеваний для своевременного начала их лечения, а также контроля эффективности терапии при экстраполяции экспериментальных данных на клинические условия.
Технический результат достигается за счет определения активности фермента СОД в слезной жидкости трансгенных мышей.
Мы впервые предлагаем проводить определение активности СОД в слезной жидкости, как маркера ранней стадии развития FUS-ассоциированных заболеваний, что должно позволить в перспективе проводить и контролировать лечение заболевания уже на ранних стадиях развития у людей.
Основанием для предлагаемого изобретения явились проведенные нами экспериментальные исследования.
В работу были включены мыши линии Thy-1/FUS1-359, созданной в лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов ИФАВ РАН. В нервной системе мышей этой линии под контролем Thy-1 промотора экспрессируется укороченная форма белка FUS человека, у которого удален участок молекулы с РНК-распознающим и РНК-связывающими доменами, а также сигналом ядерной локализации. Такой белок не способен эффективно транспортироваться в ядро и связываться со своими РНК-мишенями. В результате наблюдается перераспределение белка в цитоплазму клеток, и образование на его основе крупных агрегатов. Такие же патологические события наблюдаются в нейронах при FUS-ассоциированных заболеваниях ФТД и БАС. Вследствие агрегации FUS1-359 у трансгенных мышей развивается тяжелая форма нейродегенерации, с характерными моторными нарушениями. Развиваются парезы, на терминальной стадии тетраплегии, тремор и выраженная потеря мышечной массы. Симптоматическая стадия длится от 7 до 18 дней, и все мыши погибают, в среднем, в возрасте около 130 дней, при средней продолжительности жизни нормальных мышей 2 года и больше.
В работе использовали 13 самцов линия трансгенных мышей Thy-1/FUS на генетическом фоне CD1 в возрасте 6-12 недель и массой 20-25 г и 15 белых мышей контрольной группы. Животных содержали в стандартных условиях вивария (22±1°С, свет с 8.00 часов до 20.00 часов) со свободным доступом к пище и воде.
У животных собирали слезную жидкость с помощью стерильных полосок из фильтровальной бумаги (шириной 2,5 мм). Взятие слезы проводили без анестезии, слезную жидкость из обоих глаз объединяли для удобства проведения анализа.
Активность СОД измеряли принятым спектрофотометрическим методом Mizra Н. и Fridovich I., основанным на способности СОД ингибировать спонтанное окисление эпинефрина в адренохром при рН 10,2 и 30°С. Регистрировали увеличение абсорбции при 480 нм. Расчет активности фермента производили с помощью калибровочной кривой, которая представляет собой зависимость процента ингибирования окисления эпинефрина от концентрации СОД, внесенной в инкубационную среду. Активность СОД в крови выражали через эквивалентную концентрацию чистого фермента в мкг/мл пробы. При исследовании слезы оценивали удельную активность СОД в U/мг белка в образце. Измерения проводили на спектрофотометре UV 160А (Shimadzu, Япония). Содержание белка измеряли методом Lowry О.Н.
В результате проведенной работы было обнаружено статистически достоверное понижение активности СОД в слезе у мышей с FUS-патией, как в более раннем возрасте 6-7 недель, так и с отсутствием симптомов по сравнению с контролем, так и в возрасте 11-12 недель в группе с FUS-патией с имеющимися ранними симптомами (парез одной конечности), по сравнению с контролем. При сравнении данных опытной и контрольной группы оказалось, что в опытной группе показатель на 35% был ниже, чем в контрольной, таким образом, эта величина была принята в качестве критериальной. Содержание белка в слезе, как в группе с патологией, так и в контрольной не изменялось с возрастом.
Способ осуществляют следующим образом.
У трансгенных мышей определяют активность медь-цинкзависимой супероксиддисмутазы (СОД) в слезе. При ее активности на 35% ниже чем в контроле, прогнозируют развитие FUS-ассоциированных нейродегенеративных нарушений у трансгенных мышей.
Пример 1. Мышь №2545 из группы контроля. Возраст 6-7 недель. Молодая здоровая мышь с отсутствием неврологических симптомов. Активность СОД в слезе 79,01 U/мг.
У контрольной мыши в раннем возрасте обнаружена активность СОД в слезе, на уровне, соответствующем средним значениям в контрольной группе того же возраста.
Пример 2. Мышь №2545 из группы контроля. Возраст 11-12 недель. Более зрелая здоровая мышь с отсутствием неврологических симптомов. Активность СОД в слезе 72,05 U/мг.
Т.е. у той же контрольной мыши, рассмотренной в примере №1, через 6 недель после первого измерения активность СОД в слезе осталась на том же уровне, что указывает на устойчивую активность антиоксидантного фермента в динамике в течение определенного периода.
Пример 3. Мышь №2544 из группы с патологией. Возраст 6-7 недель. Молодая трансгенная мышь с агрегацией FUS1-359 на ранней стадии нейродегенерации с отсутствием неврологических симптомов. Активность СОД в слезе 29,72 U/мг.
У трансгенной мыши в раннем возрасте без симптомов активность СОД оказалась ниже на 34%, чем в сравнении со средними значениями у контрольных мышей.
Пример 4. Мышь №2544 из группы с ранними симптомными проявлениями. Возраст 11-12 недель. Более зрелая трансгенная мышь с агрегацией FUS1-359 с развившимися симптомами нейродегенерации в виде моторных нарушений - парез правой задней конечности. Активность СОД в слезе 25,44 U/мг.
У той же более зрелой трансгенной мыши, рассмотренной в примере №3, активность СОД сохранилась на том же низком уровне по сравнению с активностью СОД у контрольных мышей, а именно на 34%. Т.е. у трансгенной мыши, моделирующей развитие БАС, как на продромальной стадии, так и с ранними двигательными симптомами в динамике определяется низкая активность СОД в слезе.
В результате у мышей из группы досимптомной и ранней симптомной стадии FUS-ассоциированного патологии наблюдается достоверное понижение активности СОД в слезе по сравнению с контролем.
Таким образом, нами показано, что у мышей досимптомной и ранней симптомной стадией FUS-ассоциированной патологией, в слезной жидкости происходит снижение активности фермента СОД, что является одним из факторов патогенеза данной патологии. Определение активности СОД в слезной жидкости может явиться новым неинвазивным методом, позволяющим повысить возможность прогнозирования развития FUS-ассоциированных патологий у пациентов, выявлять группы риска их развития и проводить своевременное лечение и контролировать его эффективность.