СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ИМПРИНТИРОВАННОГО ПОЛИМЕРА
METHOD OF PRODUCING MOLECULAR IMPRINTED POLYMER

Изобретение относится к химии и молекулярной биологии и может быть использовано для получения полимера, содержащего отпечатки (импринтинг) молекул, с последующим его применением для анализа молекулярного материала.
Молекулярно импринтированные полимеры (МИПы) - это полимеры, в структуре которых присутствуют отпечатки молекул, или полимеры, обладающие способностью к молекулярному распознаванию (или молекулярной памятью) [Hilt et al. Advanced drug delivery reviews. V.56. P.1599-1620 (2004)]. Под термином «молекула» принято подразумевать как индивидуальные, так и сложные соединения с низкой и высокой молекулярной массой соответственно. В последнее десятилетие получение молекулярно импринтированных полимеров является одним из бурно развивающихся направлений научных исследований [Alexander et al. J. Mol. Recogn. V.19. P.106-180 (2006)], позволяющее, в идеале, применять такие полимеры на микро- и наноуровнях для выделения, очистки и анализа молекулярного материала.
Процесс получения МИПа включает в себя три основные стадии (см. чертеж):
1) образование комплекса между молекулой-шаблоном и остатками функциональных мономеров;
2) полимеризация (поликонденсация) полученного комплекса и сшивающего агента, приводящая в результате к образованию жесткого полимерного каркаса, содержащего участки с фиксированным расположением функциональных групп, задаваемым шаблоном;
3) удаление шаблона и получение полимера с отпечатком шаблона.
Способы получения молекулярно импринтированного полимера могут быть подразделены на два подхода, отличающиеся по типу взаимодействия между шаблоном и функциональными остатками: ковалентный или нековалентный. При возможности использования широкого круга функциональных мономеров и шаблонов основной недостаток ковалентного подхода - это сложность удаления шаблона из пор полимера путем разрушения прочной ковалентной связи.
Чаще для получения МИПов используют нековалентный импринтинг, который основан на методе радикальной полимеризации органических функциональных мономеров, содержащих группировки с С=С связью, например акриловые или виниловые, в присутствии сшивающих агентов. Функциональные мономеры могут быть кислотной (метакриловая, винилбензойная кислоты) или основной (винилпиридин) природы, иметь постоянный заряд (N,N,N-этиламиноэтилметакрилат) или быть незаряженными (акриламид, винилпирролидон) [Cormack et al. J. Chromatogr. В V.804, P.173-182 (2004)]. Внедрение и удаление шаблона проводят, как правило, в неполярных органических растворителях, поскольку полярные растворители мешают образованию прочного предгибридизационного комплекса и ослабляют нековалентные связи.
Известны способы получения и использования МИПов для небольших органических соединений, таких как нуклеотид [Mathew et al. Bioconjug. chem. V.6, P.524-528 (1995)], морфин [Lars. I. Andersson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.92, P.4788-4792 (1995)], кофеин [Dexian Wang et al. Korean J. Chem. Eng., V.21, P.853-857 (2004)] и др. [Cameron Alexander et al. J. Mol. Recognit. V.19, P.106-180 (2006)]. Однако получение полимеров с отпечатками высокомолекулярных соединений, в частности белков, до сих пор остается сложной задачей. В единичных работах предлагаются нестандартные протоколы для импринтинга белков, например, на тонкой пленке полимера с поверхностным дисахаридным слоем [Shi H. et al. Nature, V.398, P.593-597]. Стоит отметить, что такие методы получения МИПов имеют высокую стоимость и, что самое главное, не являются универсальными для разных типов шаблонов.
Основная трудность при получении белково импринтированного полимера заключается в сохранении пространственной структуры белка в процессе синтеза МИПа, поскольку от конформации белка впрямую зависит его биологическая активность. Кроме того, необходимыми условиями при получении МИПа являются простота и дешевизна его синтеза, для чего пытаются объединять первые две стадии синтеза МИПа. Для рутинного применения молекулярно-импринтированный полимер измельчают в гранулы и частицы или наносят слоем на поверхность твердофазного носителя, или используют в качестве мембраны.
Наиболее близким к предлагаемому способу - прототипом - является способ получения МИПа, включающий приготовление реакционной смеси, содержащей горячий раствор уксусной кислоты, содержащей 20% (по весу) капрона и 8% L-глутамина (шаблон), перемешивание (полимеризацию) смеси, нанесение последней на твердофазный носитель (стекло) с последующим погружением стеклянного носителя в водяную баню, содержащую дистиллированную воду [Reddy P.S. et al. European Polymer Journal, V.38, P.521-529 (2002)]. Условия приготовления горячего раствора: 24 часа при 50°С, удаления шаблона - промывка полимера 2%-ной уксусной кислотой, температурный режим в водяной бане составлял 21°С. Контрольный полимер, не несущий молекулярный отпечаток шаблона, получали в аналогичных условиях в отсутствие L-глутамина. О том, что МИП обладает молекулярным отпечатком по отношению к L-глутамину, судили после повторной обработки L-глутамином первого и контрольного полимеров и сравнения их инфракрасных спектров.
Недостатками прототипа являются следующие.
1) использование уксусной кислоты в качестве растворителя для капрона при синтезе МИПа, что исключает использование больших сложноорганизованных доменных белков;
2) термическая обработка (50°С), что может приводить к изменению конформации белка;
3) длительная процедура синтеза МИПа.
Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение качества целевого продукта.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Готовят реакционную смесь, содержащую 0,5-10% капрона (водонерастворимый полиамид), 0,5-5% порообразующей добавки и растворитель, в которую добавляют молекулу-шаблон, преимущественно нуклеотидной или белковой природы, до конечной концентрации 0,001-0,5 г/л. Полученный раствор перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Для получения индивидуального молекулярно импринтированного полимера данную смесь добавляют в дистиллированную воду, а для получения полимера, прикрепленного к твердой поверхности носителя, данную смесь распределяют либо сплошным непрерывным тонким слоем, либо в виде пятен. Толщина слоя, размер и количество пятен зависят от размера твердого носителя, в качестве которого могут быть использованы стекло, кремний или полипропилен. Полученный МИП высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 2-20 минут. Шаблон из состава МИПа удаляют путем последовательных промывок водой и этиловым спиртом.
2
В качестве растворителя используют моноспирт общей формулы R-CHal-CHX-OH, где Hal - атом галогена, a R и/или Х - атом водорода, атом галогена, гидроксильная группа, цианогруппа, линейные алкильные заместители, в том числе прерывающиеся гетероатомами, например кислородом, серой, азотом.
В качестве порообразующей добавки используют полимерные соединения, выбранные из группы: полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин, поливинилпирролидон или растворители, скорость испарения которых отличается от скорости испарения используемого моноспирта (протонные: вода, бутанол, или апротонные: пиридин, диметилсульфоксид, глицерин, диметилформамид).
Синтезированный таким образом молекулярно импринтированный полимер содержит молекулярный отпечаток шаблона. Форма пространственной организации МИПа (индивидуальный или прикрепленный к поверхности носителя) зависит от задач исследования и практического использования полимера. Так, индивидуальный МИП имеет бóльшую емкость шаблона, что обеспечивает бóльший выход новых исследуемых молекул при анализе молекулярного материала. Прикрепленный к поверхности носителя МИП удобен при проведении промывочных процедур. Акт вторичного распознавания (взаимодействие новой (исследуемой) молекулы с молекулярным отпечатком шаблона в МИПе) фиксируют с помощью репортерной группы, которая входит в состав новой молекулы или может быть введена в ее состав с помощью ферментов, а также (в случае белка-фермента) после проведения и демонстрации ее неизменившегося биологического действия. Детекция новой молекулы может быть осуществлена как с помощью радиоактивной метки, так и колориметрически.
Определяющими существенными отличиями предлагаемого способа от прототипа являются следующие.
1. В качестве растворителя для капрона используют моноспирт, в то время как в прототипе в качестве растворителя для капрона используют уксусную кислоту, т.е. агрессивные кислые условия. Кроме этого, моноспирты обладают стабилизирующими свойствами относительно пространственной структуры белковых молекул [Lu Z.X. et al. J. Biol. Chem., V.259, P.7367-7370 (1984)], что позволяет повысить качество МИПа.
2. Реакционная смесь для получения МИПа содержит порообразующую добавку в количестве 0.5-5%, что позволяет повысить качество МИПа.
3. Процесс формирования МИПа проводят при комнатной температуре в течение 5-10 минут, что на порядок уменьшает время приготовления МИПа (24 часа в прототипе) и позволяет исключить нарушение пространственной структуры высокомолекулярных соединений, в частности белков.
4. Процесс удаления шаблона включает только водную и спиртовую промывки, что не влияет на структуру полученного полимера, в то время как в прототипе удаление шаблона осуществляют раствором уксусной кислоты, что может приводить к частичной деградации полимера или к изменению его структуры.
Химически стабильные молекулярно импринтированные полимеры могут быть использованы в области выделения веществ в индивидуальном состоянии, в частности в хроматографии МИПы используются в качестве стационарной фазы, в иммунологических анализах - в качестве искусственных антител, а также как распознающий элемент в биосенсорных устройствах [Nisino et al. Angew. Chem. Int. Ed. V.45. P.2392-2396 (2006)].
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Получение МИПа I, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с небольшой молекулярной массой (аденозинтрифосфат), на твердофазном стеклянном носителе.
Приготавливали реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 2 мг водонерастворимого полиамида капрона, 1 мкл диметилформамида в качестве порообразующей добавки, 2 мкл воды и моноспирт-растворитель на основе смеси 2,2,2,-трифторэтанола и 2-цианэтанола в соотношении 1:1 (остальное), в которую добавляли 0,01 мг аденозинтрифосфата в качестве шаблона. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем наносили в виде точек на поверхность стеклянного носителя (размером 2×2 см), высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 20 минут (или при 80°С в течение 2 минут). Удаление шаблона осуществляли последовательными промывками водой (2 мл × 3 раза) и спиртом (2 мл × 3 раза). Готовый МИП I высушивали на воздухе.
Пример 2. Получение контрольного полимера KI, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона, на твердофазном стеклянном носителе.
Контрольный полимер KI, не содержащий молекулярного отпечатка, готовили аналогично примеру 1 в отсутствие шаблона.
Пример 3. Получение МИПа II, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с небольшой молекулярной массой (аденозинтрифосфат), на твердофазном стеклянном носителе.
Полимер МИП II, готовили аналогично примеру 1, при этом в качестве растворителя использовали смесь 2,2,2,-трифторэтанола и глицерина в соотношении 3:2, а в качестве порообразующей добавки 1 мкл диметилсульфоксида.
Пример 4. Получение контрольного полимера KII, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона, на твердофазном стеклянном носителе.
Контрольный полимер KII, не содержащий молекулярного отпечатка, готовили аналогично примеру 3 в отсутствие шаблона.
Пример 5. Получение МИПа III, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с небольшой молекулярной массой (аденозинтрифосфат), на твердофазном стеклянном носителе.
Полимер МИП III готовили аналогично примеру 1, при этом в качестве растворителя использовали 2,2'-сульфонилдиэтанол.
Пример 6. Получение контрольного полимера KIII, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона, на твердофазном стеклянном носителе.
Контрольный полимер KIII, не содержащий молекулярного отпечатка, готовили аналогично примеру 5 в отсутствие шаблона.
Пример 7. Получение МИПа IV, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с небольшой молекулярной массой (аденозинтрифосфат), на твердофазном стеклянном носителе.
Полимер МИП IV, готовили аналогично примеру 1, при этом в качестве растворителя использовали 2-пропин-1-ол ацетиленкарбинол.
Пример 8. Получение контрольного полимера KIV, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона, на твердофазном стеклянном носителе.
Контрольный полимер KIV, не содержащий молекулярного отпечатка, готовили аналогично примеру 7 в отсутствие шаблона.
Пример 9. Получение МИПа V, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с высокой молекулярной массой (стрептавидин-щелочная фосфатаза), на твердофазном стеклянном носителе.
-5
Полимер МИПа V готовили аналогично примеру 1, при этом в качестве порообразующей добавки использовали 0,1 мг полиэтиленгликоля, в качестве шаблона 2·10 мг стрептавидин-щелочной фосфатазы, в качестве моноспирта - 2,2,2,-трифторэтанол. Полученную смесь после полимеризации наносили на поверхность в виде сплошного слоя.
Пример 10. Получение контрольного полимера KV, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона, на твердофазном носителе.
Контрольный полимер KV, не содержащий молекулярного отпечатка высокомолекулярного шаблона, готовили аналогично примеру 9 в отсутствие шаблона.
Пример 11. Получение МИПа VI, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с высокой молекулярной массой (бычий сывороточный альбумин), на твердофазном кремниевом носителе.
Полимер МИПа VI готовили аналогично примеру 1, при этом в качестве порообразующей добавки использовали 0,1 мг поливинилпирролидона, в качестве шаблона 1 мкг бычий сывороточный альбумин (БСА), в качестве моноспирта - смесь 2,2,2,-трифторэтанола и 1,1,2,2,4,4,5,5-октафтор-3-пентанола, при соотношении компонентов, равном 4:1. Полученную смесь после полимеризации наносили на кремниевую поверхность в виде сплошного слоя.
Пример 12. Получение контрольного полимера KVI, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона.
Контрольный полимер KVI, не содержащий молекулярного отпечатка высокомолекулярного шаблона, готовили аналогично примеру 11 в отсутствие шаблона.
Пример 13. Получение МИПа VII, содержащего отпечаток молекулярного шаблона с высокой молекулярной массой (стрептавидин-щелочная фосфатаза), в растворе.
-5
Полимер МИПа VII готовили аналогично примеру 1, при этом в качестве порообразующей добавки использовали 0,4 мкл пиридина, а в качестве шаблона 2·10 мг стрептавидин-щелочной фосфатазы, в качестве моноспирта - смесь 2,2,2,-трифторэтанола и 2,2,3,3-тетрафторпропанола, при соотношении компонентов, равном 3:2. К 10 мкл реакционной смеси добавляли 500 мкл воды, полимер выпадал в осадок в виде прозрачных хлопьев. Удаление шаблона осуществляли аналогично примеру 1. Готовый МИП VII высушивали на воздухе.
Пример 14. Получение контрольного полимера KVII, не содержащего молекулярного отпечатка шаблона, в растворе.
Контрольный полимер KVII, не содержащий молекулярного отпечатка высокомолекулярного шаблона, готовили аналогично примеру 13 в отсутствие шаблона.
Пример 15. Получение МИПа VIII, содержащего отпечаток высокомолекулярного шаблона нуклеотидной природы (ДНК) на твердофазном полипропиленовом носителе.
Приготавливали раствор объемом 100 мкл, содержащий 0,5 мг водонерастворимого полиамида капрона и молекулу-шаблон ДНК тимуса теленка, в концентрации 0,5 мг/мл, 10 мкл порообразующей добавки - воды - и в качестве растворителя смесь 2,2,2,-трифторэтанола, 2,2,3,3-тетрафторпропанола и 2-пропин-1-ол ацетиленкарбинола при соотношении компонентов, равном 12:8:5. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем наносили тонким слоем на поверхность полипропиленовой чашки Петри (диаметром 2 см), высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 20 минут (или при 80°С в течение 2 минут). Удаление шаблона осуществляли последовательными промывками водой (2 мл × 3 раза) и спиртом (2 мл × 3 раза). Готовый МИП VIII высушивали в течение 20 минут при 80°С.
Пример 16. Получение контрольного полимера KVIII, не содержащего молекулярного отпечатка на твердофазном полипропиленовом носителе.
Контрольный полимер KVIII получали в условиях аналогичных примеру 15, но без добавления молекулы-шаблона.
Пример 17. Сравнение молекулярной памяти KI и МИПа I.
-4
К полученным полимерам KI и МИП I добавляли 50 мкл водного раствора аденозинтрифосфата (10 мг), несущего радиоактивную метку (300 импульсов/сек), инкубировали в течение 30 минут. Затем отмывали 3 М раствором хлорида натрия (1 мл × 3 раза). Об эффективности связывания шаблона с полимерами судили по остаточной радиоактивности на полимере: для KI (30 импульсов/сек), для МИПа I (100 импульсов/сек). Таким образом, для МИПа I эффективность связывания с анализируемой молекулой аденозинтрифосфата в 3 раза выше относительно контрольного полимера KI, т.е. МИП I обладает молекулярной памятью к аденозинтрифосфату.
Пример 18. Сравнение молекулярной памяти KII и МИПа II.
Сравнение молекулярной памяти KII и МИПа II проводили аналогично примеру 17.
Пример 19. Сравнение молекулярной памяти KIII и МИПа III.
Сравнение молекулярной памяти KIII и МИПа III проводили аналогично примеру 17.
Пример 20. Сравнение молекулярной памяти KIV и МИПа IV.
Сравнение молекулярной памяти KIV и МИПа IV проводили аналогично примеру 17.
Пример 21. Сравнение молекулярной памяти KV и МИПа V.
-5
К полученным полимерам KV и МИП V добавляли белок (стрептавидин-щелочная фосфатаза 2·10 мг, в 50 мкл стандартного буферного раствора), инкубировали в течение 30 минут, затем последовательно промывали буферным раствором PBS (1 мл × 2 раза), 20% этиловым спиртом (1 мл × 2 раза). Визуализацию связавшегося на полимере конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза проводили с помощью хромогеных субстратов NBT и BCIP (появление темно-синего окрашивания), по интенсивности окрашивания полимеров судили об эффективности связывания с анализируемой молекулой. Интенсивность окрашивания МИПа V была в 4 раза выше относительно контрольного KV. Таким образом, МИП V обладает молекулярной памятью к белку стрептавидин-щелочная фосфатаза.
Пример 22. Сравнение молекулярной памяти KVI и МИПа VI.
К полученным полимерам KVI и МИП VI добавляли бычий сывороточный альбумин, меченный флуоресцеином (конъюгат БСА-ФИТЦ) (10 мкг в 50 мкл стандартного буферного раствора), инкубировали в течение 30 минут, затем последовательно промывали буферным раствором PBS (1 мл × 2 раза), 20% этиловым спиртом (1 мл × 2 раза). Визуализацию связавшегося на полимере конъюгата БСА-ФИТЦ проводили с помощью флуоресцентной микроскопии. По интенсивности флуоресценции полимеров судили об эффективности связывания с анализируемой молекулой. Интенсивность флуоресценции МИПа V была в 10 раза выше относительно контрольного KVI. Таким образом, МИП VI обладает молекулярной памятью к белку - бычьему сывороточному альбумину.
Пример 23. Сравнение молекулярной памяти KVII и МИПа VII.
Сравнение полимеров KVII и МИПа VII проводили аналогично примеру 21. Интенсивность окрашивания МИПа VII была в 6 раз выше относительно контрольного KVII. Таким образом, МИП VII обладает молекулярной памятью к белку - стрептавидин-щелочная фосфатаза.
Пример 24. Сравнение молекулярной памяти KVIII и МИПа VIII.
В плашки с полученными полимерами KVIII и МИП VIII добавляли используемый в качестве молекулярного шаблона фрагмент ДНК в концентрации 1 мг/мл в 100 мкл стандартного буферного раствора, инкубировали в течение 30 минут, затем последовательно промывали буферным раствором PBS (1 мл × 2 раза), 20% этиловым спиртом (1 мл × 2 раза). Визуализацию связавшегося на полимере ДНК-фрагмента проводили с помощью красителя Stain all (специфическое окрашивание нуклеиновых кислот, появление темно-синего окрашивания), по интенсивности окрашивания полимеров судили об эффективности связывания с анализируемой молекулой. Интенсивность окрашивания МИПа VIII была в 5 раза выше относительно контрольного KVIII.
Использование предлагаемого способа позволит сократить время получения МИПа и обеспечить условия для получения целевого продукта высокого качества.