СПОСОБ ГЕНОМНОЙ СЕЛЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD FOR GENOMIC CATTLE BREEDING

Изобретение относится к области геномной селекции и может быть использовано в сельском хозяйстве для определения племенной ценности генотипа животных в популяциях или породах крупного рогатого скота.
Основным методом определения племенной ценности крупного рогатого скота является бонитировка - комплексная оценка животных по совокупности признаков, распределение их по классам в соответствии с полученной оценкой и разработка на ее основе плана селекционно-племенной работы. По результатам бонитировки определяется дальнейшее назначение животного: отбор в воспроизводительную (племядро) или товарную группы, на выранжировку или выбраковку.
Известны традиционные методы селекции крупного рогатого скота по его фонетипическим признакам, по показателю надоя (Инструкция по бонитировке крупного рогатого скота молочных и молочно-мясных пород. М.: Колос, 1975), включающие зоотехнический и племенной учет, ежемесячное определение количества и качества молока у матерей, дочерей и сверстниц за все лактации и организацию испытания быков по качеству потомства в стадах, регионах и породах (RU 2279216 C1, RU 2313939 C1, RU 2266643 C1).
Однако традиционные методы не дают возможности точно рассчитать племенную ценность животных в раннем возрасте, сократить время и затраты, связанные с содержанием племенного молодняка, и отбирать только лучших животных для молочного стада и воспроизводства.
Известно использование генетической информации для племенной оценки сельскохозяйственных животных. Так, известен способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока, включающий выделение ДНК, амплификацию с использованием специфичных праймеров, рестрикционный анализ полученных ампликонов с установлением генотипов отдельно по каждому гену, а затем сопряженных генотипов по обоим генам, которые сравнивают с установленными генотипами, определяющими качество молока, причем в качестве праймеров используют праймеры, специфичные для фрагмента экзона III гена пролактина и фрагмента экзона V гена гормона роста, анализ полученных ампликонов проводят RsaI- и AluI-рестриктазами соответственно, а в качестве установленных генотипов, обуславливающих повышенное содержание жира и белка в молоке, используют генотипы abVV, bbVL и aaVV, abLL, bbLL соответственно, а генотипов, обуславливающих пониженное содержание жира и белка в молоке, - генотипы abLL, bbVV и aaLL, abVV, bbVV соответственно (RU 2317704 C1).
Использование известного способа позволяет на ранних этапах жизни животных оценивать их потенциал по признакам молочной продуктивности (жир и белок), причем для исследования берутся только особи женского пола.
Однако оценка животных известным способом проводится по малому количеству маркеров, что значительно снижает ее точность, не позволяет выявлять генетические дефекты (оценка благополучия) и проводить подтверждение происхождения без дополнительных мероприятий, временных или экономических затрат.
2
(X, Y)
Наиболее близким к предлагаемому способу является известный способ геномной селекции крупного рогатого скота, включающий отбор биологического материала у части особей поголовья для создания референтной популяции, создание референтной популяции и генотипирование особей референтной популяции, отбор биологического материала и генотипирование особей анализируемой популяции, определение достоверности геномной оценки особей анализируемой популяции, равной r , где r - коэффициент линейной корреляции Пирсона, X, Y - переменные, генетическую паспортизацию и выдачу рекомендаций по их хозяйственному использованию (Mogens S Lund, Adrianus PW de Roos, Alfred G de Vries, Tom Druet, Vincent Ducrocq, Sébastien Fritz, François Guillaume, Bernt Guldbrandtsen1, Zenting Liu, Reinhard Reents, Chris Schrooten, Franz Seefried and Guosheng Su // A common reference population from four European Holstein populations increases reliability of genomic predictions. // Genetics Selection Evolution 2011, 43:43 - прототип).
В отличие от способа по RU 2317704 C1 способ-прототип дает возможность изучать большое количество маркеров ДНК одновременно. При наличии равномерно распределенных генетических маркеров у одного животного можно оценить его племенную ценность, основываясь на взаимосвязях между их генотипами и большим количеством хозяйственно-полезных признаков, таких как молочная продуктивность, живая масса, развитие телосложения, пригодность к машинному доению, воспроизводительная способность дочерей и т.д.
Способ-прототип основан на использовании полиморфных однонуклеотидных замен (SNP), как маркеров для определения племенной ценности генотипа животных. В результате ресиквенса генома КРС было выявлено 444792 SNP, из которых отобрали 54000 SNP с высокой степенью детектирования. При использовании SNP был сконструирован чип (Matukumalli L.K., Lawley С.Т., Schnabel R.D. et al. Development and characterization of a high density SNP genotyping assay for cattle // PLoS ONE. 2009). Способ основан на регрессии фенотипа особи на все имеющиеся маркеры с помощью линейных и нелинейных математических моделей. При этом маркеры должны находиться в неравновесии по сцеплению Linkage Disequilibrium (LD) с локусами количественных признаков Quantitative Trait Loci (QTL). В таком случае основной проблемой при выборе математической модели геномной оценки Genome Value (GV) является значительное превышение числа маркеров над числом животных в референтной популяции. Причем GV должна быть максимально точной. Используемая модель - геномный наилучший линейный несмещенный прогноз Genomic Best Linear Unbiased Prediction (G-BLUP). Геномная селекция проводится на основании данных о весомости вклада всех SNP в искомый хозяйственно полезный признак.
Процесс геномной селекции крупного рогатого скота условно состоит из 2-х этапов: 1) создание референтной популяции, отбор биологического материала и генотипирование особей референтной популяции и 2) непосредственная оценка животных из анализируемой популяции - отбор биологического материала и генотипирование особей анализируемой популяциии, генетическая паспортизация и выдача рекомендаций по их хозяйственному использованию.
Для проведения оценки молодых особей по определенному продуктивному показателю (признаку), не имеющих оценку по генотипу и традиционную оценку, требуется база данных о весомости ассоциации определенных SNP с искомым хозяйственно-полезным признаком у данной популяции животных. База данных SNP создается на основании генотипирования особей уже прошедших традиционную оценку. На первом этапе способа для таких особей проводятся следующие процедуры:
отбор биологического материала (кровь, сперма, ушной выщип);
из полученного материала любым апробированным методом выделяется ДНК (предпочтительно, фенольным методом);
пробы ДНК с массой не менее 200 нг амплифицируют;
материал, полученный в ходе предыдущего этапа, наносят на чипы (Illumina BeadChip, Affimetrix GeneChip и аналогичные) и проводят гибридизацию; на сканере iScan или аналогичных сканерах осуществляют считывание информации (информация на чипах представлена в виде флуоресцентного свечения разной длины волны, вызываемого лазером сканера);
обработку полученной информации осуществляют при помощи программ, поставляемых производителем оборудования (Bead Studio и тд.).
В результате обработки происходит выявление аллелей маркеров, предположительно ассоциированных с хозяйственно-полезным признаком. Математические модели, такие как G-BLUP, на основании данных об аллелях SNP и племенной ценности каждого животного в референтной популяции позволяют определять веса ассоциации с признаком для каждого SNP. При этом чем больше размер референтной популяции, тем выше точность.
2
(Х, Y)
Второй этап включает в себя оценку животных, не включенных в референтную популяцию. Сюда попадают как и вновь рожденные животные, так и взрослые животные без геномной оценки. Процедура второго этапа аналогична первому - построение генетического профиля животного и его анализ. Обработанная информация благодаря статическим моделям сравнивается с матрицей весов каждого аллеля SNP, полученной с помощью референтной популяции, и определяется достоверность геномной оценки особей анализируемой популяции, равной r , где r - коэффициент линейной корреляции Пирсона, X и Y - переменные, причем X = данные геномной племенной оценки (GEBV); Y = данные традиционной племенной оценки (EBV). Далее в паспорте животного производится отметка о проведении геномной оценки, указывается геномная племенная ценность и достоверность геномной оценки. При этом определяется его происхождение. Если SNP чип содержит маркеры заболеваний, то они также выявляются.
2
(x, y)
Недостатком способа-прототипа является то, что используют референтные популяции, состоящие только из особей мужского пола, что обоснованно более точным определением традиционной племенной ценности, чем у особей женского пола, так как каждая особь мужского пола оценивается через 50 и более дочерей. В связи с этим способ-прототип не может быть использован в малых популяциях или породах вследствие нехватки особей мужского пола. В результате оценки особей женского пола способом-прототипом происходит искажение достоверности геномной оценки особей анализируемой популяции, возможная и/или недооценка молодых особей в связи с тем, что определение достоверности геномной оценки особей анализируемой популяции, равной r , осуществляется с использованием X=GEBV и Y=EBV, где GEBV - данные геномной племенной оценки, a EBV - данные традиционной племенной оценки. Способ-прототип довольно точно обеспечивает определение достоверности геномной оценки по особям мужского пола, однако его использование на женских особях крупного рогатого скота приводит к ошибкам вследствие отсутствия точной (адекватной требуемому уровню) племенной оценки коров в хозяйствах по следующим причинам.
Имеется значительное различие в традиционной племенной оценке между мужской и женской особью, заведомо оценивающей меньше критериев для женской особи ввиду недостаточного количества потомков. Накопление этих критериев и их зависимость от субъективных факторов (заведомо ложные отчеты, недостаток и низкая квалификация персонала, низкий интерес к особям женского пола ввиду их значительного превосходства по количеству, старые методики оценки особей женского пола) ведет к ошибкам при работе с геномной оценкой.
Технической задачей предлагаемого изобретения является создание способа геномной селекции крупного рогатого скота, лишенного указанного недостатка.
Технический результат предлагаемого изобретения состоит в обеспечении возможности осуществления геномной селекции при нехватке особей мужского пола и повышение точности оценки.
2
2
(X, Y)
(Х, У)
Указанный технический результат достигается тем, что в способе геномной селекции крупного рогатого скота, включающем отбор биологического материала у части особей поголовья для создания референтной популяции, создание референтной популяции и генотипирование особей референтной популяции, отбор биологического материала и генотипирование особей анализируемой популяциии, определение достоверности геномной оценки особей анализируемой популяции, равной r , где r - коэффициент линейной корреляции Пирсона, X, Y - переменные, генетическую паспортизацию и выдачу рекомендаций по их хозяйственному использованию, референтную популяцию создают из особей женского пола, определяют геномную ценность DGV по результатам сравнения полученной информации о генотипе особи с Библиотекой признаков, накопленной в ходе обработки животных из референтной популяции, а достоверность геномной оценки особей анализируемой популяции, равную r , определяют при X=DGV и Y=РА, где РА - средний показатель от всех известных предков для данной особи, взятый из индивидуальной карточки животного.
Достоверность геномной оценки в предлагаемом способе и способе-прототипе определяют с использованием коэффициента линейной корреляции Пирсона (http://www.tsput.ru/res/math/mop/lections/lection_7.htm; Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. М., Высшая школа, 2004). Однако если в способе-прототипе в качестве переменных использованы GEBV - данные геномной племенной оценки и EBV - данные традиционной племенной оценки, то в предлагаемом способе переменными являются DGV - непосредственная геномная ценность, рассчитанная по результатам сравнения полученной информации о генотипе особи с Библиотекой признаков, накопленной в ходе обработки животных из референтной популяции, и РА - средний показатель от всех известных предков для данной особи, взятый из индивидуальной карточки животного.
В качестве биологического материала особей женского пола, предпочтительно, используют нативную или размороженную (после хранения) кровь. Выделение ДНК производится с помощью стандартных сертифицированных наборов, например Fermentas GeneJET (http://www.laboratorii.com/reaktivy/reaktivy-fermentas/723/) или любого другого, пригодного для этих целей. Количество биологического материала, требуемого для проведения выделения, может варьироваться и зависит исключительно от требований производителя реактива, но, как правило, не превышает 1 мл, процедура выполняется согласно наставлению к набору и как правило, не превышает 1 мл; процедура выполняется согласно руководству к набору. Возможно выделение биологического материала с помощью автоматических станций. Выделенный материал ДНК обрабатывается, например, с помощью набора реактивов Illumina Infinium HD Assay (http://www.interlabservice.ru/catalog/oborud/index.php?sid=1780) или аналогичных, согласно приложенным к ним руководствам. Для математической обработки используются соответствующие стандартные компьютерные программы, находящиеся в открытом доступе.
Согласно предлагаемому способу в популяции крупного рогатого скота с малым количеством особей мужского пола проводят отбор биологического материала (3-9 мл крови в пробирку с ЭТДА) от особей женского пола соответствующих требуемым критериям включения в референтную популяцию. Данным критерием является: наличие данных о продуктивных качествах коровы: количество молока, % жира, % белка, возраст не моложе второй лактации, согласно данным бонитировки - общий вид и развитие не ниже 2 баллов, вымя не ниже 4 баллов, ноги не ниже 2 баллов; класс элита-рекорд, элита. После отбора биологического материала животное условно закрепляется в референтную популяцию. Используя нативную или размороженную кровь, производят выделение ДНК, например, с помощью набора Fermentas GeneJET (производства Thermo Fisher Scientific Inc). Выделенный материал ДНК в виде водного раствора с количеством ДНК не меньше 500 нг обрабатывается, например, с помощью набора реактивов Illumina Infinium HD Assay (производства Illumina Inc.). Пробы проходят следующие этапы обработки в пробирках (микропланшетах): преамплификационная обработка (бисульфитные преобразования), денатурация и нейтрализиция, амплификация, фрагментация, осаждение изопропанолом, ресуспензия осадка в буфере. Далее материал переносится на «чипы» высокой плотности (например, Illumina BeadChip Bobine SNP50K; производства Illumina Inc.) и помещается в гибридизационную печь. Проводится отмывка чипа, окраска и помещение в прибор сканирования для спектрального анализа фрагментов (например, Illimina iScan; Illumina Inc.). Информация с прибора переносится на компьютер, где обрабатывается в программе GenomeStudio (Illumina Inc). Информация кодируется по принципу: 0 - гомозигота, 1 - гетерозигота, 2 - гомозигота по другой аллели. Полученная информация сохраняется в базе данных компьютера. С помощью вычислительных программ, работающих на основании статистических моделей, например G-BLUP (геномная модель лучшего линейного несмещенного прогноза), происходит поиск взаимосвязи аллелей SNP с признаком. Таким образом, создается Библиотека признаков.
От особей, не имеющих геномную оценку и включенных в анализируемую популяцию, проводят отбор крови и ее последующую обработку аналогично референтной популяции. Полученную информацию о генотипе особи сравнивают с Библиотекой признаков, накопленной в ходе обработки животных из референтной популяции, и определяют ее непосредственную геномную ценность (DGV) при помощи соответствующей компьютерной программы (например, программы G3, находящейся в свободном доступе).
2
(DGV, PA)
Определение достоверности осуществляют в программе SAS/STAT (производства SAS Institute corp.), как равной r , учитывающей корреляцию геномной оценки и среднего значения по родителям. Показатель DGV получают в результате вышеизложенных действий, РА рассчитывается селекционерами как средний показатель от всех известных предков для данной особи, указываемый в индивидуальной карточке животного.
После проведения генотипирования в паспорт животного вносят сведения о проведении генетической оценки с указанием достоверности оценки животного. На основании полученных сведений выдаются рекомендации по хозяйственному использованию животных, сообщается о рациональности использования высокоценных кормов для выращивания данного животного, об ожидаемой молочной продуктивности с поправкой на процент достоверности, племенном использовании.
Пример
Выбрана популяция голштинизированного черно-пестрого скота, проживающая на территории Ленинградской Области примерной численностью 50000 особей. Популяцию составляют 100 быков и 49900 коров. Популяция была разбита на референтную и анализируемую. Для создания референтной популяции было выделено 9000 особей женского пола (коров). В состав анализируемой популяции вошли все оставшиеся животные - 41000 особей. От 9000 коров референтной популяции были отобраны пробы крови и проведено генотипирование согласно методике с использованием чипов Illumina BeadChip Bovine50K. Полученные данные использовались для создания Библиотеки признаков, которая позволила определить основные SNP, ассоциированные с признаком молочной продуктивности.
2
(DGV, PA)
Из анализируемой популяции случайным подбором были выбраны 1000 нетелей и проведено их генотипирование с использованием чипов Illumina BeadChip Bovine50K. Полученные данные были обработаны программой G3 и сопоставлены с Библиотекой признаков, полученной от референтной популяции. В результате этих вычислений получена геномная ценность DGV. Используя программу SAS/STAT определяют достоверность, равную r  по удою, которая составила 56%. В результате были внесены записи в племенные карточки животных о прохождении геномной оценки, по признаку молочной продуктивности с указанием процента достоверности. Зоотехнической службе хозяйств, где содержаться животные, были выданы рекомендации по дальнейшему использованию животных: примерный удой с учетом процента достоверности, выделены группы высокоценных животных по результатам исследования, требующих рационы для высокопродуктивных коров.
(GEBV; EBV)
Для сравнения была осуществлена геномная селекция той же популяции животных по способу-прототипу с использованием коэффициента линейной корреляции Пирсона r, но референтную популяцию создавали, как и в предложенном способе, только из особей женского пола. Альтернативное исследование показало, что предложенный способ по сравнению со способом-прототипом обладает большей достоверностью, что снижает потери ценного генетического материала, исключает недополучение высокопродуктивных животных и выбраковку высокопродуктивных неоправданно забракованных животных.