ЛЕЧЕНИЕ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ
TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISORDERS

Настоящее изобретение относится к композициям для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Протеинкиназа mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих) является интегрирующим фактором в энергетическом обмене, дифференцировке, росте и выживании клетки. Кроме того, mTOR выполняет принципиально важные функции в нейрон-специфических механизмах, таких как синаптическая пластичность, обучение и развитие коры головного мозга (Wong, М., Biomed J, 2013.36(2): p. 40-50). Сигнальный путь mTOR активируется при многих заболеваниях. В частности, различные неврологические расстройства, такие как болезнь Хантингтона и эпилептические приступы, были связаны с путем фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)/mTOR.
На сегодняшний день доступные ингибиторы mTOR, такие как рапамицин - макролидный антибиотик с иммуносупрессивной и противовоспалительной активностью - и близкородственные рапалоги, аллостерически связываются с FKBP-связывающим карманом mTORC1 (Laplante, М. and D.M. Sabatini, Cell, 2012. 149(2): p. 274-93.). Значимыми нижерасположенными эффекторами mTOR являются S6-киназа (S6K), рибосомальный белок S6 (S6rP) и 4Е-связывающий белок (4Е-ВР). Ингибирующие действия, оказываемые на mTORC2, представляются незначительными, вызывая частичное ингибирование действий mTOR при неврологических расстройствах. Кроме того, эти соединения проявляют нежелательные физико-химические свойства. Было разработано первое поколение ингибиторов mTOR, направленных на АТФ-связывающий сайт, таких как INK128. Эти ингибиторы ингибируют mTORC1 и mTORC2 и блокируют все функции mTOR, но, с другой стороны, не имеют высокой специфичности к мишени, что может привести к снижению переносимости. Кроме того, неблагоприятный фармакокинетический профиль ограничивает проникновение через гематоэнцефалический барьер и, следовательно, ингибирование мишеней в ЦНС, что необходимо для лечения расстройств ЦНС.
Агрегация белков может приводить к различным заболеваниям. Некоторые белки токсичны в центральной нервной системе (ЦНС), несмотря на то, что они экспрессируются повсеместно. Эти нейродегенеративные заболевания включают расстройства, при которых патологические белки могут накапливаться в ядре, как это имеет место при заболеваниях с расширением полиглютамина (таких как болезнь Хантингтона и спиноцеребеллярная атаксия), нарушения, характеризующиеся цитоплазматическими включениями (такими как α-синуклеин при болезни Паркинсона), а также нарушения, при которых патологические белки накапливаются вне клетки (например, при прионных болезнях), или как внутри, так и вне клетки (например, тау и амилоид-β (Aβ) при болезни Альцгеймера) (Aguzzi, A. and Т. O'Connor, Nat Rev Drug Discov, 2010. 9(3): p. 237-248).
Болезнь Хантингтона, аутосомно-доминантное расстройство, включает относительно селективную нейродегенерацию в базальных ганглиях и коре головного мозга, связанную с повторным расширением тринуклеотида полиглютамина на белке хантингтине (НТТ). Мутантный белок хантингтин (mHTT) неэффективно выводится из нейронов, что приводит к накоплению токсичных внутриклеточных агрегатов и связанной с этим гибели нейронов. Снижение уровней mHTT или превращение mHTT в менее токсичные виды являются наиболее перспективными стратегиями для разработки эффективных методов лечения. Помимо подходов к сайленсингу гена НТТ, были предприняты попытки улучшить клиренс белка mHTT, в частности, посредством аутофагии (Nopoulos, Р.С., Dialogues Clin Neurosci, 2016. 18(1): p. 91-98).
Аутофагия представляет собой клеточный путь, с помощью которого поврежденные или патологические белки и органеллы поглощаются двухмембранной аутофагосомой, которая сливается с лизосомой, что приводит к расщеплению груза (Nyfeler, В., et al., Methods Mol Biol, 2012. 821: p. 239-250.). Аутофагия может играть ключевую роль в нейродегенеративных протеинопатиях, таких как болезнь Хантингтона, которые характеризуются накоплением неправильно уложенных белков. Было также показано, что нарушения аутофагии и агрегация белков связаны с другими неврологическими расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера и Паркинсона.
Известно, что активация сигнального пути мишени рапамицина у млекопитающих (mTOR) уменьшает макроаутофагию (Jung, С.Н., et al., FEBS Lett, 2010. 584(7): p. 1287-95), a mHTT способствует передаче сигналов mTOR (Pryor, W.M., et al., Sci Signal, 2014. 7(349): p. ra103). На головном мозге и в мышиных моделях болезни Хантингтона было показано, что mTOR секвестрируется в полиглютаминовых агрегатах. Кроме того, было показано, что ингибиторы mTOR усиливают аутофагию и, следовательно, уменьшают накопление mHTT и связанную гибель нейронов в клеточных и животных моделях болезни Хантингтона (Ravikumar В. et al., Nat Genet, 2004. 36: p. 585-595.; Floto RA et al., Autophagy, 2007. 3: p. 620-622). Аллостерические ингибиторы mTOR (например, рапамицин/рапалоги) опосредуют клиренс фрагментов mHTT и защищают от токсичности, вызванной mHTT, в ненейронных клетках путем стимуляции аутофагии (Ravikumar, В. et al., Hum Mol Genet, 2002. 11(9): p. 1107-1117). Однако недавние исследования показали, что рапалоги неэффективны в предупреждении нейродегенерации в модели БХ на мышах R6/2 (Fox, J.H., et al., Mol Neurodegener, 2010. 5: p. 26).
Недавно было показано, что по сравнению с аллостерическими ингибиторами mTOR каталитические ингибиторы mTOR, направленные на АТФ-связывающий сайт, более эффективны в индукции аутофагического потока и уменьшении накопления mHTT в ненейронных клетках (Roscic, A., et al., J Neurochem, 2011. 119(2): p. 398-407), а также в уменьшении накопления и токсичности агрегатов mHTT и предотвращении дегенерации средних шипиковых нейронов в кортикостриатальных срезах мозга мышей R6/2 (Proenca, С.С., et al., PLoS One, 2013. 8(7): p. e68357.). К сожалению, существующие в настоящее время ингибиторы каталитической mTOR характеризуются недостаточной проницаемостью в мозг и могут быть слишком токсичными для долгосрочных in vivo исследований для подтверждения концепции (РоС).
Самые современные терапевтические подходы на сегодняшний день основаны на сайленсинге гена НТТ с использованием антисмысловых олигонуклеотидов или миРНК путем центрального введения. В животной модели БХ эти подходы убедительно продемонстрировали сильное снижение прогрессирования заболевания. Ключевыми проблемами подхода с использованием антисмысловых олигонуклеотидов являются его инвазивное центральное введение, а также то, достаточно ли эти антисмысловые молекулы распространяются в мозге человека.
30-40% из 50 миллионов человек со спровоцированной эпилепсией во всем мире являются невосприимчивыми к терапии (, W. et al., Nat Rev Drug Discov, 2013. 12(10): p. 757-776.). Примерами используемого в настоящее время стандартного лечения являются фенобарбитал и леветирацетам. Фенобарбитал - это противоэпилептический препарат первого поколения с выраженной противосудорожной эффективностью, но также с серьезными побочными эффектами, такими как сильное седативное действие на пациентов и в животных моделях. Леветирацетам относится к противоэпилептическим препаратам второго поколения и является одним из наиболее широко используемых препаратов для лечения эпилепсии.
Несколько генетических дефектов, связанных с повышенной передачей сигналов mTOR («TORопатии»), приводят к эпилептическим приступам. Приступы TSC (туберозно-склерозного комплекса) являются формой эпилепсии, вызванной аутосомно-доминантной мутацией инактивации TSC1 или TSC2, которая индуцирует конститутивную активацию mTOR, приводящую к образованию доброкачественных опухолей, умственной отсталости и приступам. В клинических исследованиях лечение эверолимусом снижало частоту приступов у пациентов с TSC и у пациентов с TSC-ассоциированной SEGA (субэпендимальной гигантоклеточной астроцитомой). Другие «TORопатии», вызывающие эпилепсию, представляют собой полигидрамниоз, мегалэнцефалию, синдром симптоматической эпилепсии, PMSE (полигидрамниоз, мегалинцефалия и синдром симптоматической эпилепсии), фокальную кортикальную дисплазию (FCD) и «TORопатии», связанные с мутациями в гене PTEN (Cardamone, М., et al., J Pediatr, 2014. 164(5): p. 1195-200; Sadowski, K., et al., Pharmacol Rep, 2015. 67(3): p. 636-46).
Эпилептогенез - это период между возникновением проэпилептического повреждения (например, черепно-мозговой травмы или генетического дефекта) и первым спонтанным приступом. Было описано много факторов, связанных с различными типами эпилептогенеза, и активация mTOR является одним из факторов, наблюдавшихся во многих типах эпилепсий (Sadowski, K., K. Kotulska-Jozwiak, and S. Jozwiak, Pharmacol Rep, 2015. 67(3): p. 636-46.). Все используемые в настоящее время противоэпилептические средства действуют симптоматично и не изменяют эпилептогенез. Активация mTOR вовлечена в различные процессы в ходе эпилептогенеза: рост нейронов и образование гипертрофированных нервных клеток, ингибирование аутофагии и нейровоспаление. Кроме того, имеются данные, свидетельствующие о том, что ингибитор mTOR рапамицин влияет на эпилептогенез и число/силу приступов в различных животных моделях эпилепсии.
Основным недостатком современных методов лечения является ограниченная способность или даже неспособность зарегистрированных ингибиторов mTOR или двойных ингибиторов mTOR/PI3K пересекать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), не говоря уже о цитотоксическом потенциале соединений, известных из уровня техники, что обуславливает их ограниченный терапевтический эффект для лечения неврологических расстройств.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Неожиданно было обнаружено, что соединения согласно изобретению пригодны для лечения неврологических расстройств. В частности, было обнаружено, что соединения согласно настоящему изобретению являются специфичными ингибиторами mTOR или двойными ингибиторами PI3K/mTOR, и что они способны проникать через гематоэнцефалический барьер, то есть, было обнаружено, что они ингибируют путь PI3K/mTOR в головном мозге. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что соединения согласно изобретению являются нецитотоксичными и перорально биодоступными. А именно, неожиданно было обнаружено, что соединения согласно изобретению индуцируют аутофагию in vitro и in vivo. Кроме того, было обнаружено, что соединения согласно изобретению уменьшают образование нейротоксичных агрегатов мутантного хантингтина in vitro и снижают вызванные электрошоком приступы у мышей.
Из-за доказанной эффективности в доклинических моделях из хорошо переносимых и проникающих через гематоэнцефалический барьер ингибиторов mTOR согласно настоящему изобретению могут быть разработаны клинические кандидаты для лечения или предупреждения неврологических расстройств, таких как БХ и эпилепсия, которые на сегодняшний день являются изнуряющими и часто смертельными заболеваниями, для которых не разработано каких-либо вариантов лечения.
Таким образом, в первом аспекте изобретения предложено соединение формулы (I),
где
1
2
3
1
2
3
X, X и X независимо друг от друга представляют собой N или СН, при условии, что по меньшей мере два из X, X и X представляют собой N;
Y представляет собой N или СН;
1
2
R и R независимо друг от друга представляют собой
(i) морфолинил формулы (II)
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и
3
4
3
4
5
6
1
3
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой H, C-Cалкил, необязательно замещенный одним или двумя OH, C-Cфторалкил, C-Cалкокси, C-CалкоксиC-Cалкил, CN или C(O)O-C-Cалкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Cалкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН-, -СН-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II); или
7
7
7
8
9
1
3
1
2
1
2
1
3
3
6
1
3
2
2
2
2
(ii) насыщенное 6-членное гетероциклическое кольцо Z, выбранное из тиоморфолинила и пиперазинила, необязательно замещенное 1-3 R; где R в каждом случае независимо представляет собой C-Cалкил, необязательно замещенный одним или двумя ОН, С-Сфторалкил, С-СалкоксиС-Салкил, С-Сциклоалкил; или два заместителя R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН- или -О-СНСН-О-;
1
2
при условии, что по меньшей мере один из R и R представляет собой морфолинил формулы II;
и его пролекарства, метаболиты, таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли,
для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта.
Дальнейшие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны при дальнейшем изучении настоящего описания.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1А: Фармакокинетический анализ соединения 3 («соед. 3») у крыс Спрег-Доули (СД). После однократного перорального введения соединения 3 (10 мг/кг) образцы тканей анализировали на уровни соединения в различные моменты времени с помощью ЖХ-МС. n=3
ФИГ. 1В: Фармакокинетический анализ уровней соединения 3 и соединения 8 (соед. 8) у мышей balb 6. После однократного перорального введения соединения 3 или соединения 8 (50 мг/кг) образцы тканей анализировали на уровни соединения в различные моменты времени с помощью ЖХ-МС. n=3
ФИГ. 2А: Фармакодинамический анализ соединения 3, введенного мышам balb 6 за одно пероральное введение в дозе 50 мг/кг. Лизаты мозга анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Передача сигналов mTOR ингибировалась соединением 3, на что указывает снижение фосфорилирования S6 в моменты времени от 30 минут до 8 часов. Количественная оценка полос вестерн-блоттинга показывает значимость снижения передачи сигналов по пути mTOR. n=3, дисперсионный анализ (ANOVA), ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 2В: Фармакодинамический анализ соединения 8, введенного мышам balb 6 за одно пероральное введение в дозе 50 мг/кг. Лизаты мозга анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Передача сигналов mTOR ингибировалась соединением 8, на что указывает снижение фосфорилирования S6 в моменты времени от 30 минут до 8 часов. Количественная оценка полос вестерн-блоттинга показывает значимость снижения передачи сигналов по пути mTOR. n=3, дисперсионный анализ (ANOVA), ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 2С: Фармакодинамический анализ соединения 3, введенного мышам balb 6 за одно пероральное введение в дозе 50 мг/кг. Лизаты мозга анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Передача сигналов mTOR ингибировалась соединением 3, на что указывает снижение фосфорилирования S6 в моменты времени от 30 минут до 8 часов. Количественная оценка полос вестерн-блоттинга показывает значимость снижения передачи сигналов по пути mTOR. n=3, дисперсионный анализ (ANOVA), ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 2D: Фармакодинамический анализ соединения 8, введенного мышам balb 6 за одно пероральное введение в дозе 50 мг/кг. Лизаты мышцы бедра анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Передача сигналов mTOR ингибировалась соединением 8, на что указывает снижение фосфорилирования S6 в моменты времени от 30 минут до 8 часов. Количественная оценка полос вестерн-блоттинга показывает значимость снижения передачи сигналов по пути mTOR. n=3, дисперсионный анализ (ANOVA), ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 3А: Вестерн-блоттинг лизированного мозга мышей с эпилепсией, предварительно получавших пилокарпин, и таких же мышей, не получавших его. Передача сигналов mTOR повышена в пилокарпиновой модели эпилептического статуса (SE). n=9 (наивные мыши), n=8 (мыши с эпилепсией), ANOVA *р<0,05
ФИГ. 3В: Вестерн-блоттинг лизированного мозга мышей от мышей с эпилепсией/предварительно получавших пилокарпин и наивных мышей, получавших одну пероральную дозу соединения 3 и 8, показал значительное ингибирование фосфорилирования S6 в головном мозге. Более сильное действие наблюдалось у наивных мышей. Эверолимус не продемонстрировал значительного ингибирования передачи сигналов mTOR в головном мозге. СРЕДНЕЕ ± SEM, ANOVA, *р<0,05, #р<0,05, n=5
ФИГ. 4: После лечения страдающих и не страдающих эпилепсией мышей ингибиторами mTOR, фенобарбиталом или леветирацетамом, был проведен тест индукции судорог максимальным электрошоком (МЭШ). Наблюдалось противоэпилептическое действие ингибиторов.
ФИГ. 4А, В: МЭШ наивных мышей.
ФИГ. 4С, D: МЭШ получавших пилокарпин мышей с эпилепсией.
50
50
50
Pheno=фенобарбитал, LEV=леветирацетам, Evero=эверолимус, Rapa=рапамицин, скобки: доза, приведенная в мг/кг, время предварительного лечения в ч, способ введения - пероральный (п/о) или внутрибрюшинный (в/б). А, С: СС в мА ± стандартная ошибка среднего (SEM); В, D: изменение СС в % от носителя СС, ANOVA и апостериорный критерий Даннетта, *р<0,05
Q7/Q7
Q111/Q111
ФИГ. 5: Жизнеспособность клеток и белковый синтез в иммортализованных клетках полосатого тела, полученных из модели на мышах с нокином, экспрессирующей полноразмерный НТТ с 7 (STHdh) или 111 CAG-повторами (STHdh) после инкубирования с различными концентрациями соединения 3 и соединением 8, и ингибитором mTORC1/2 INK 128 (Sapanisertib) (100 нМ) и рапамицином (400 нМ).
Q7/Q7
Q111/Q111
ФИГ. 5 А+В Анализ лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в A: STHdh. В: STHdh. Как соединение 3, так и соединение 8 снижали продукцию ЛДГ в моменты времени между 24 ч и 48 ч; n=3-6
Q7/Q7
Q111/Q111
ФИГ. 5 C+D Анализ PrestoBlue, определяющий митохондриальную активность STHdh и STHdh в различные моменты времени после инкубации с соединением 3, соединением 8 и контрольными соединениями INK128 (100 нМ) и рапамицином (400 нМ). Соединения хорошо переносились, вызывая лишь небольшое ингибирование после 72 часов инкубации с 1230 нМ соединения 3. n=6-9
ANOVA ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
Q7/Q7
Q111/Q111
ФИГ. 6: Ингибирование сигнального пути mTOR и индукция аутофагии в клетках STHdh и STHdh после обработки соединением 3 (200 нМ, 400 нМ, 1230 нМ), соединением 8 (130 нМ, 1230 нМ), INK 128 (100 нМ), рапамицином (400 нМ) или контролем ДМСО в течение 4 часов. Вестерн-блоттинг клеточных лизатов.
ФИГ. 6 А+В: Снижение фосфорилирования сигнальных молекул mTOR: mTOR, S6rp и 4Е-РВ, зависит от концентрации. n=3
ФИГ. 6 C+D: индукция аутофагии, выраженная увеличением LC3-II. n=3
ANOVA ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 7: Снижение образования агрегатов mHTT на человеческих эмбриональных клетках почек (HEK293), трансфицированных экзоном 1 mHTT с расширением Q51 или Q19, соответственно.
ФИГ. 7 А+В: Анализ методом ловушки на фильтре лизированной клетки HEK293, трансфицированной экзоном 1 mHTT с Q51, предварительно обработанной соединением 8 (130 нМ, 1230 нМ), соединением 3 (400 нМ), 1230 нМ), INK128 (100 нМ), рапамицином (400 нМ) или контролем ДМСО, и расширением Q19, обработанной контролем ДМСО. Обработка ингибиторами mTOR значительно уменьшала образование агрегатов. n=3, ANOVA ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
Фиг. 7 C+D: Иммуноокрашивание клетки HEK293, трансфицированной экзоном 1 mHTT, с Q51, предварительно обработанной соединением 8 (130 нМ, 1230 нМ), соединением 3 (400 нМ), 1230 нМ), INK128 (100 нМ), рапамицином (400 нМ) или контролем ДМСО. Агрегаты вручную подсчитывали в 10000 клетках на образец. ANOVA ****р<0,00005, ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 8А: Индукция аутофагии в мозге мышей BALB/C через 0,5 ч, 4 ч, 8 ч, соответственно, после однократного перорального введения соединения 3,50 мг/кг. Лизаты мозга анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Маркеры аутофагии LC3-II и р62 подвергались изменениям в моменты времени от 30 минут до 8 часов. Количественная оценка полос вестерн-блоттинга показывает индукцию аутофагии. n=3, ANOVA, ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 8В: Индукция аутофагии в мозге мышей BALB/C после однократного перорального введения соединения 8, 50 мг/кг. Лизаты мозга анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Маркеры аутофагии LC3-II и р62 подвергались изменениям в моменты времени от 30 минут до 8 часов. Количественная оценка полос вестерн-блоттинга показывает индукцию аутофагии. n=3, ANOVA, ***р<0,0005, **р<0,005, *р<0,05
ФИГ. 9А: Масса тела мышей TSC1 GFAP, получавших лечение носителем, соединением R, соединением 3 и соединением 8 в различные дни постнатального периода до (Р21) и во время (Р22-Р50) лечения. Среднее ± SEM. Поскольку некоторые животные погибли в течение периода наблюдения, n варьировало от 6 до 14.
ФИГ. 9В: Действие определенных режимов лечения на спонтанные электрографические приступы у мышей Tsc1 GFAP. Соединение 3 и соединение 8 сильно уменьшают спонтанные приступы, тогда как референсная молекула соединение R оказывала более слабое действие. Данные представлены как среднее ± SEM (N=27-48 записей/группа) для каждой недели тестирования. Статистическая значимость отмечена р<0,05 с поправкой на множественность с носителем в качестве компаратора (непараметрический тест Вилкоксона).
ФИГ. 10: ИГХ анализ полосатого тела от мышей R6/2 и одного животного дикого типа. Мыши получали лечение носителем, соединением 3 и соединением 8 в течение 11,5 недель, после чего получали срезы полосатого тела. После окрашивания на агрегаты mutHTT подсчитывали количество агрегатов и анализировали площадь агрегатов в 4 образцах. Хотя количество агрегатов mutHTT не изменилось, площадь, охваченная этими агрегатами, была значительно уменьшена после лечения соединением 3, что указывает на то, что агрегаты mutHTT были меньше после проведения лечения. (ANOVA, р<0,05)
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее будет приведено подробное описание представленных и дополнительных аспектов изобретения, а также представленные и дополнительные варианты его осуществления, примеры которых проиллюстрированы в сопроводительных структурах и формулах. В то время как изобретение будет описано совместно с перечисленными вариантами осуществления, следует понимать, что они не приведены с целью ограничения изобретения этими вариантами осуществления. Специалисту в данной области техники известно множество способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в настоящем документе, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничивается описанными в настоящем документе способами и материалами.
Следует понимать, что признаки, целые числа и характеристики, описанные совместно с конкретным аспектом, вариантом осуществления или примером изобретения, применимы к любому другому аспекту, варианту осуществления или примеру, описанным в настоящем документе, кроме случаев, когда они с ними несовместимы. Все раскрытые в настоящем документе признаки (включая любую прилагаемую формулу изобретения, реферат и графические материалы) и/или все стадии любого раскрытого в нем способа или процесса могут быть объединены в любую комбинацию, за исключением комбинаций, в которых по меньшей мере некоторые из таких признаков и/или стадий являются взаимоисключающими. Изобретение не ограничивается содержанием любых вышеприведенных вариантов осуществления. Изобретение распространяется на любой новый признак или любую новую комбинацию признаков, раскрытых в настоящем описании (включая любую прилагаемую формулу изобретения, реферат и графические материалы), или на любую новую стадию или любую новую комбинацию стадий любого раскрытого в нем способа или процесса.
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют значения, совпадающие с общепринятыми для специалиста в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Для толкования настоящего описания будут применяться следующие определения, при необходимости термины, используемые в единственном числе, также будут включать множественное число и наоборот. Следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не является ограничивающей.
Определения:
Термины «содержащий», «имеющий» и «включающий» следует толковать как неограничивающие термины (т.е. как означающие «включая, но не ограничиваясь перечисленным»), если не указано иное.
Термины «индивидуум», «субъект» или «пациент» в настоящем документе используются взаимозаменяемо. В предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека.
В контексте настоящего документа термины «лечение»/»лечить» включают: (1) предупреждение или задержку появления клинических симптомов состояния, расстройства или заболевания, развивающегося у субъекта, который может быть поражен этим состоянием, расстройством или заболеванием, или быть предрасположен к нему, но еще не испытывают или не демонстрирует клинических или субклинических симптомов состояния, расстройства или заболевания; (2) ингибирование состояния, расстройства или заболевания (например, остановка, уменьшение или замедление развития заболевания или его рецидива в случае поддерживающей терапии, или по меньшей мере одного его клинического или субклинического симптома); и/или (3) облегчение заболевания (то есть, обеспечение регрессии состояния, расстройства или заболевания, или по меньшей мере одного его клинического или субклинического симптома). Польза для пациента, подлежащего лечению, является статистически значимой или по меньшей мере ощутимой для пациента или лечащего врача. Тем не менее, следует иметь в виду, что при введении пациенту лекарственного средства для лечения заболевания результатом не всегда может быть эффективное лечение. В одном из вариантов осуществления термины «лечение»/»лечить» в контексте настоящего документа относятся к терапевтическому лечению. В другом варианте осуществления термины «лечение»/»лечить» в контексте настоящего документа относятся к профилактическому лечению.
Термин «хиральный» относится к молекулам, обладающим свойством несовпадения при наложении на их зеркальное отражение, в то время как термин «ахиральный» относится к молекулам, которые совпадают с их зеркальным отражением.
Термин «стереоизомеры» относится к соединениям, имеющим одинаковый химический состав, но различающимся пространственным расположением атомов или групп.
«Диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности, в которых соединения не являются зеркальными отражениями друг друга. Диастереомеры имеют разные физические свойства, например, температуры плавления, температуры кипения, спектральные свойства и химическую и биологическую реакционную способность. Смеси диастереомеров могут быть разделены с использованием аналитических процедур высокого разрешения, таких как электрофорез и хроматография.
«Энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединения, которые являются зеркальными отражениями друг друга, не совпадающими при наложении. Стереохимические определения и условные обозначения, используемые в настоящем документе, обычно соответствуют источникам S.P. Parker, Ed., MeRaw-Hiff Dictionary of Chemical Terms (1984), McGraw-Hill Book Company, New York and Eliel, E. и Wilen, S., «Stereochemistry of Organic Compounds», John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения согласно изобретению могут содержать асимметрические или хиральные центры и, следовательно, существуют в различных стереоизомерных формах. Подразумевается, что все стереоизомерные формы соединений согласно изобретению, включая, но не ограничиваясь перечисленным, диастереомеры, энантиомеры и атропизомеры, а также их смеси, такие как рацемические смеси, являются частью настоящего изобретения. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. способны вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения приставки D и L, или R и S, используются для обозначения абсолютной конфигурации молекулы вокруг ее хирального центра(ов). Приставки d и I или (+) и (-) используются для обозначения знака направления вращения соединением плоскополяризованного света, где (-) или 1 означает, что соединение является левовращающим. Соединение с приставкой (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры идентичны, за исключением того, что они являются зеркальными отражениями друг друга. Конкретный стереоизомер также может называться энантиомером, а смесь таких изомеров часто называют энантиомерной или скалемической смесью. Смесь энантиомеров с соотношением 50:50 называется рацемической смесью или рацематом. Термин «таутомер» или «таутомерная форма» относится к структурным изомерам с разной энергией, взаимопревращаемых при преодолении низкоэнергетического барьера. Например, протонные таутомеры включают взаимопревращения посредством миграции протона, такие как кето-енольная и имин-енаминная изомеризации.
В контексте настоящего документа фраза «фармацевтически приемлемая соль» относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения согласно изобретению, в частности, к кислотно-аддитивным солям. Примеры солей включают, но не ограничены перечисленным, сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, иодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат (мезилат), этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат. Фармацевтически приемлемая соль может содержать включение другой молекулы, такой как ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоионом может быть любой органический или неорганический фрагмент, стабилизирующий заряд на исходном соединении. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь в своей структуре более одного заряженного атома. В случаях, когда частью фармацевтически приемлемой соли являются несколько заряженных атомов, первая может иметь несколько противоионов. Таким образом, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или более заряженных атомов и/или один или более противоионов.
Если соединение согласно изобретению представляет собой основание, требуемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, известным в данной области техники, например, обработкой свободного основания неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и тому подобными, или органической кислотой, такой как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидиловая кислота, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, альфа-гидроксикислота, такая как лимонная кислота или винная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или коричная кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота, или тому подобными.
Фраза «фармацевтически приемлемый» означает, что вещество или композиция должны быть химически и/или токсикологически совместимы с другими ингредиентами в составе препарата, и/или с млекопитающим, получающим лечение этим препаратом.
«Сольват» относится к ассоциату или комплексу одной или более молекул растворителя и соединения согласно изобретению. Примеры растворителей, образующих сольваты, включают, но не ограничены перечисленным, воду, изопропанол, этанол, метанол, диметилсульфоксид (ДМСО), этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин. Термин «гидрат» относится к комплексу, в котором молекула растворителя представляет собой воду.
Термин «защитная группа» относится к заместителю, который обычно используется для блокирования или защиты определенной функциональной группы во время реакции других функциональных групп на соединении. Например, «аминозащитная группа» представляет собой заместитель, присоединенный к аминогруппе, который блокирует или защищает функциональную аминогруппу в соединении. Подходящие аминозащитные группы включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Общее описание защитных групп и информацию по их применению см. в Т.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Термины «соединение согласно настоящему изобретению» и «соединения согласно настоящему изобретению», и «соединения формулы (I)» включают их стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, фармацевтически приемлемые соли и сольваты их солей.
Термин «млекопитающее» включает, но не ограничен перечисленным, людей, мышей, крыс, морских свинок, обезьян, собак, кошек, лошадей, коров, свиней и овец. В контексте настоящего документа термин «млекопитающее» предпочтительно относится к людям.
Термины «болезнь Альцгеймера» и «morbus Alzheimer» в настоящем документе используются взаимозаменяемо.
Термин «неврологическое расстройство» в общем относится к расстройству, поражающему нервную систему, включая центральную нервную систему и периферическую нервную систему. Неврологические расстройства, в частности, расстройства центральной нервной системы (ЦНС), объединяют множество патологий, включая, в частности, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Хантингтона, и большое количество нарушений функции центральной нервной системы, таких как эпилепсия.
Термин «нейродегенеративное заболевание» относится к заболеванию, которое вызвано повреждением центральной нервной системы и может быть выявлено по прогрессирующему нарушению функции, дегенерации и гибели специфических популяций нейронов, которые часто взаимосвязаны через синапсы. Нейродегенерация вызывает нарушении двигательной и/или когнитивной функции. Кроме того, термином «нейродегенеративное заболевание» в контексте настоящего документа понимаются нейродегенеративные заболевания, связанные или вызванные неправильной укладкой и/или агрегацией белка. Примерами нейродегенеративных заболеваний являются болезнь Хантингтона, спиноцеребеллярные атаксии, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS), кистозный фиброз, семейная амилоидная полинейропатия, губчатые энцефалопатии, деменция с телами Леви, лобно-височная деменция с паркинсонизмом, спиноцеребеллярные атаксии, спинальная и бульбарная мышечная атрофия, наследственная денторубропаллидолуизиановая атрофия, семейная британская деменция, семейная датская деменция и прионная болезнь.
В контексте настоящего документа термины «эпилепсия» относятся к любому хроническому неврологическому расстройству, характеризующемуся периодическими приступами. Каждый приступ может казаться неспровоцированным или может быть вызван или спровоцирован стрессом, беспокойством, недостатком сна, болезнью, воздействием химических веществ (например, злоупотреблением наркотиками или употреблением алкоголя), фотостимуляцией (например, мигающим/мерцающим светом) и/или тому подобным. Расстройство может иметь неизвестную причину («идиопатическая эпилепсия») или может быть вызвано, например, травмой головы, опухолью головного мозга, генетической предрасположенностью, инфекцией, дефектом развития или любой их комбинацией («симптоматическая эпилепсия»). Примеры типов эпилептических приступов включают парциальные или фокальные приступы, локализованные (по меньшей мере изначально) в мозге, и генерализованные приступы, широко распространенные в мозге. Парциальные приступы могут быть дополнительно классифицированы на простые парциальные приступы, которые не влияют на сознание, и сложные парциальные приступы, которые влияют на сознание. Генерализованные приступы, которые приводят к потере сознания, могут включать, среди прочего, абсансные, атонические, клонические, миоклонические, тонические и тонико-клонические приступы. Эпилепсия и/или эпилептический приступ могут быть диагностированы с помощью любой подходящей методики или комбинации методик, включая, среди прочего, электроэнцефалографию (ЭЭГ), магнитоэнцефалографию, магнитно-резонансную томографию (МРТ), позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ) или видео-ЭЭГ мониторинг.
В контексте настоящего документа термин «приступ» означает неврологическое явление, характеризующееся атипичной электрической активностью в мозге, которая приводит к по меньшей мере одному клиническому симптому. Электрическая активность может характеризоваться гиперсинхронией, гиперактивностью и/или гипервозбудимостью нейронов во всем мозге или его части. Примеры симптомов, вызванных приступами, могут включать внезапное и непроизвольное сокращение мышц (например, судороги), онемение части или всего тела, потерю памяти, потерю сознания, невозможность сосредоточиться, галлюцинации и/или тому подобное. Таким образом, приступы могут влиять, среди прочего, на двигательные, вегетативные, когнитивные, сенсорные (зрительные, слуховые, обонятельные, вкусовые, чувственные) и/или эмоциональные функции. Каждый приступ может быть охарактеризован либо как эпилептический приступ, вызванный эпилепсией, либо неэпилептический приступ с любой другой причиной.
Как указано выше, классификация эпилепсии как «симптоматической» указывает на то, что существует вероятная причина, и можно попробовать провести определенный курс терапии для устранения этой причины, тогда как классификация эпилепсии как «идиопатической» указывает на то, что причина не может быть выявлена.
Термин «TSC» относятся к форме эпилепсии, вызванной аутосомно-доминантной мутацией инактивации TSC1 или TSC2, которая вызывает конститутивную активацию mTOR, приводящую к образованию доброкачественных опухолей, умственной отсталости и судорожным приступам. Таким образом, TSC является моделью эпилепсии для исследования действий ингибиторов mTOR на эпилептогенез и эпилептические приступы. Субэпендимальные гигантоклеточные астроцитомы (SEGA) возникают у 90% пациентов с TSC. Нарушения нормального клеточного развития и функции в мозге могут приводить к эпилепсии и нейрокогнитивным, поведенческим и психическим нарушениям. Эпилепсия встречается у 80-90% пациентов с TSC, при этом часто встречается лекарственная устойчивость (Curatolo, P., R. Moavero, and P.J. de Vries, The Lancet Neurology. 14(7): p. 733-745). Ингибирование mTOR рапамицином оказывает положительное действие на поведение, уменьшает онкогенез и подавляет приступы в мышиных моделях TSC. Раннее лечение рапамицином предотвращает развитие эпилепсии и преждевременную смерть (Meikle, L., et al., J Neurosci, 2008. 28(21): p. 5422-5432). Кратковременное лечение рапамицином у взрослых мышей не только восстановило синаптическую пластичность, но и устранило поведенческое нарушение в модели TSC у гетерозиготного животного (Ehninger, D., et al., Nat Med, 2008. 14(8): p. 843-848.). Кроме того, лечение рапамицином может способствовать устранению клеточных нарушений нейронов с мутацией TSC (Goto, J., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011. 108(45): p. E1070-E1079.).
Другие «TORопатии», то есть, первичные заболевания, вызванные активацией mTOR, вызывающие эпилепсию, представляют собой полигидрамниоз, мегалинцефалию, синдром симптоматической эпилепсии, PMSE, фокальную кортикальную дисплазию (FCD) и «TORопатии», связанные с мутациями PTEN.
Термин «PMSE» относится к полигидрамниозу, мегалинцефалии и симптоматической эпилепсии и представляет собой редкий синдром, диагностируемый у некоторых детей амишей, характеризующийся аномально большим мозгом, нарушением когнитивных функций и тяжелой, устойчивой к лечению эпилепсией.
Термин «PTEN» относится к гомологу фосфатазы и тензина, фосфатазе, дефосфорилирующей 3-фосфат инозитольного кольца PIP3. PTEN является опухолевым супрессором, который часто является мутированным при раке, что приводит к усилению передачи сигналов по пути mTOR. Делеция PTEN в ЦНС может быть связана с приступами.
Термин «эпилептогенез» относится к периоду между возникновением проэпилептического повреждения (например, черепно-мозговой травмы или генетического дефекта) и первым спонтанным приступом. «Эпилептогенез» подразделяется на первичный эпилептогенез (до первого приступа) и вторичный эпилептогенез (прогрессирование эпилепсии после наступления первого приступа). Соединения согласно изобретению могут применяться как во время первичного эпилептогенеза, так и во время вторичного эпилептогенеза (парциальные приступы), а также при полностью развившихся эпилептических расстройствах (генерализованных приступах).
Лечение эпилепсии означает, например, подавление одного или более приступов и/или подавление судорожной активности, т.е. уменьшение частоты приступов; уменьшение тяжести, физического проявления и/или продолжительности по меньшей мере одного приступа; в значительной степени предупреждение по меньшей мере одного приступа; или замедление/уменьшение/препятствование эпилептогенезу; или любую комбинацию вышеперечисленного. Подавление приступа для конкретного субъекта может быть измерено непосредственно у субъекта (например, если приступ происходит во время лечения), и/или, преимущественно, может представлять собой статистически предсказуемый результат на основании результатов контролируемых испытаний или клинических исследований, проведенных на группе субъектов.
Выражение «эффективное количество» означает количество соединения согласно настоящему изобретению, которое (i) лечит или предупреждает конкретное заболевание, состояние или расстройство, (ii) ослабляет, улучшает или устраняет один или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, или (iii) предотвращает или задерживает начало проявления одного или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, описанных в настоящем документе.
В случае эпилепсии эффектное количество лекарственного средства может снижать силу или число приступов, а также явлений во время эпилептогенеза, приводящие к развитию эпилепсии.
В случае нейродегенеративных заболеваний эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество агрегатов белка в нейронах или других клетках, и в ЦНС в целом, а также связанные с ними когнитивные, психологические и двигательные симптомы. Для терапии нейродегенеративных заболеваний эффективность может быть измерена, например, путем оценки количества агрегатов белка, когнитивных и моторных функций.
Термин «максимально переносимая доза» (МПД) относится к самой высокой дозе лекарственного препарата или лечения, которая не вызывает неприемлемых побочных действий. Как правило, максимальная переносимая доза определяется у видов, лечение которых необходимо осуществить, например, у грызунов или у людей, в ходе клинических исследований путем изучения воздействия увеличения дозы на разные группы данного вида до тех пор, пока не будет найдена самая высокая доза с приемлемыми побочными действиями. Было обнаружено, что соединения согласно настоящему изобретению имеют МПД, находящуюся в терапевтическом окне (см. примеры 3 и 4).
В контексте настоящей заявки термин «пролекарство» относится к предшественнику или производной форме соединения согласно изобретению, которое может обладать улучшенными свойствами, такими как лучшая растворимость, уменьшенная цитотоксичность или повышенная биодоступность, по сравнению с исходным соединением или лекарственным средством, и способно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. Пролекарства согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленным, производные аминогруппы, связанные с пиридиновым или пиримидиновым ядром, в котором один или два атома водорода заменены подходящим заместителем, или производные кольцевой аминогруппы, если R2 представляет собой пиперазин-1-ил. Примерами таких пролекарств являются соединения, ацилированные аминокислотой, выбранной из 20 наиболее часто встречающихся природных L-альфа-аминокислот, ацилированных дипептидом, таким как L-Ala-L-Ala, угольной кислотой, серной кислотой или фосфорной кислотой, а также их фармацевтически приемлемые соли.
«Метаболит» представляет собой продукт, полученный в результате метаболизма определенного соединения или его соли в организме. Метаболиты соединения могут быть идентифицированы с использованием обычных методов, известных в данной области техники, и их активности определяют с помощью тестов, таких как описанные в настоящем документе. Такие продукты могут быть получены, например, в результате окисления, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, эстерификации, деэстерификации, ферментативного расщепления и т.п. вводимого соединения. В частности, соединения формулы (I), как определено выше в настоящем документе, окисленные или гидроксилированные в любом положении морфолинового, пиперазинового или тиоморфолинового кольца R1 и/или R2, считаются метаболитами. Также рассматриваются метаболиты, представляющий собой S-оксиды тиоморфолина и S,S-диоксиды тиоморфолина. Соответственно, изобретение также направлено на метаболиты соединений согласно изобретению, включая соединения, полученные способом, включающим приведение соединения согласно настоящему изобретению в контакт с млекопитающим в течение периода времени, достаточного для получения продукта его метаболизма.
В первом аспекте настоящего изобретения предложено соединение формулы (I),
где
1
2
3
1
2
3
X, X и X независимо друг от друга представляют собой N или СН, при условии, что по меньшей мере два из X, X и X представляют собой N;
Y представляет собой N или СН;
1
2
R и R независимо друг от друга представляют собой
(i) морфолинил формулы (II)
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и
3
4
3
4
5
6
1
3
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой Н, C-Салкил, необязательно замещенный одним или двумя ОН, C-Сфторалкил, С-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или С(O)O-С-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II); или
7
7
7
8
9
1
3
1
2
1
2
1
3
3
6
1
3
2
2
2
2
(ii) насыщенное 6-членное гетероциклическое кольцо Z, выбранное из тиоморфолинила и пиперазинила, необязательно замещенное 1-3 R; где R в каждом случае независимо представляет собой С-Салкил, необязательно замещенный одним или двумя ОН, C-Сфторалкил, С-СалкоксиС-Салкил, С-Сциклоалкил; или два заместителя R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из С-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН- или -О-СНСН-О-;
1
2
при условии, что по меньшей мере один из R и R представляет собой морфолинил формулы II;
и его пролекарства, метаболиты, таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли, для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта.
В другом аспекте изобретения предложено соединение формулы (I),
где
1
2
3
1
2
3
Х, Х и X независимо друг от друга представляют собой N или СН, при условии, что по меньшей мере два из Х, Х и X представляют собой N; Y представляет собой N или СН;
1
R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и
2
R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил; для применения в предупреждении или лечении поражения кожи у субъекта.
1
3
1
2
Каждый алкильный фрагмент, по отдельности или в виде части большей группы, такой как алкокси, представляет собой линейную или разветвленную цепь и предпочтительно представляет собой C-Салкил, более предпочтительно C-Салкил. Примеры включают, в частности, метил, этил, н-пропил и проп-2-ил (изопропил). Примеры алкокси включают, в частности, метокси, этокси, н-пропокси и изопропокси. Как описано в настоящем документе, алкокси может включать дополнительные заместители, такие как атомы галогена, обеспечивающие галогеналкоксигруппы.
Термин «алкоксиалкил» относится к группе R-O-R', в которой группы R и R' представляют собой алкильные группы, как определено в настоящем документе. Примеры включают метоксиметил, метоксиэтил, этоксиэтил и метоксипропил.
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
Каждый алкиленовый фрагмент представляет собой линейную или разветвленную цепь и, в частности, представляет собой, например, -CH-, -СН-СН-, -СН(СН)-, -СН-СН-СН-, -СН(СН)-СН- или -СН(СНСН)- предпочтительно -СН-, -СН-СН- или -СН(СН)-
Каждый галогеналкильный фрагмент, по отдельности или в виде части большей группы, такой как галогеналкоксигруппа, представляет собой алкильную группу, замещенную одним или более одинаковыми или разными атомами галогена. Галоалкильные фрагменты включают, например, от 1 до 5 галогеновых заместителей или от 1 до 3 галогеновых заместителей. Примеры включают, в частности, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлордифторметил и 2,2,2-трифторэтил.
Каждый галогеналкенильный фрагмент, по отдельности или в виде части большей группы, такой как галогеналкенилоксигруппа, представляет собой алкенильную группу, замещенную одним или более одинаковыми или разными атомами галогена. Примеры включают 2-дифторвинил и 1,2-дихлор-2-фторвинил. Галогеналкенильные фрагменты включают, например, от 1 до 5 галогеновых заместителей или от 1 до 3 галогеновых заместителей.
Каждый циклоалкильный фрагмент может быть в моно- или бициклической форме, обычно и предпочтительно в моноциклической форме, и предпочтительно содержит от 3 до 6 атомов углерода. Предпочтительные примеры моноциклических циклоалкильных групп включают, в частности, циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
Термин «гетероциклическое кольцо» относится к насыщенному или частично ненасыщенному карбоциклическому кольцу, содержащему в качестве членов кольца от одного до трех гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Такие кольца не содержат смежных атомов кислорода, смежных атомов серы или смежных атомов кислорода и серы в кольце. Предпочтительные примеры включают, в частности, тетрагидрофуранил, пирролидинил, пиразолидинил, имидазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, диоксанил, морфолинил, оксазолидинил и изооксазолидинил.
Если указано, что группа является необязательно замещенной, предпочтительно она имеет необязательно 1-3 заместителя, более предпочтительно необязательно 1-2 заместителя.
Некоторые соединения формулы (I) могут содержать один, или два, или более центров хиральности, и такие соединения могут быть представлены в виде чистых энантиомеров или чистых диастереоизомеров, а также в виде их смесей в любом соотношении. Соединения согласно изобретению также включают все таутомерные формы соединений формулы (I).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено соединение формулы (I), как определено в настоящем документе, и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
1
2
3
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено соединение формулы (I), где X, X и X представляют собой N.
1
2
3
1
3
2
2
3
1
1
2
3
2
3
1
1
3
2
В другом предпочтительном варианте осуществления (i) указанные X и X представляют собой N, и указанный X представляет собой СН; (ii) указанные X и X представляют собой N, и указанный X представляет собой СН; или (iii) указанные X и X представляют собой N, и указанный X представляет собой СН, и предпочтительно его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. В другом варианте осуществления (i) указанные X и X представляют собой N, и указанный X представляет собой СН; или (ii) указанные X и X представляют собой N, и указанный X представляет собой СН, и предпочтительно его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. В другом предпочтительном варианте осуществления указанные X и X представляют собой N, и указанный X представляет собой СН; и предпочтительно его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный Y представляет собой N, и предпочтительно его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. В другом предпочтительном варианте осуществления указанный Y представляет собой СН, и предпочтительно его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанные R и R независимо друг от друга выбраны из
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанные R и R независимо друг от друга выбраны из
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанные R и R независимо друг от друга выбраны из
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(2,6-диморфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амина;
4'-(дифторметил)-2,6-диморфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолинопиримидин-2-ил)пиридин-2-амина;
4'-(дифторметил)-4,6-диморфолино-[2,5'-бипиримидин]-2'-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолиио-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолинопиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-4'-(дифторметил)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
5-(2,6-бис((S)-3-метилморфолино)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4'-(дифторметил)-2,6-бис((S)-3-метилморфолино)-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(6-(3-метилморфолино)-2-морфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4'-(дифторметил)-6-(3-метилморфолино)-2-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
5-(4-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-6-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(2,2-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(2-(3-метилморфолино)-6-морфолинопиримндин-4-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4'-(дифторметил)-2-(3-метилморфолино)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(2S,6R)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(2R,6S)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(3-окса-6-азабицикло[3.1.1]гептан-6-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(6-окса-3-азабицикло[3.1.1]гептан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-[(1R,4R)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-[(1S,4S)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R)-3-изопропилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
[(3R)-4-[4-[6-амино-4-(дифторметил)-3-пиридил]-6-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]морфолин-3-ил]метанола;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-6-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
[(3R)-4-[4-[6-амино-4-(дифторметил)-3-пиридил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]морфолин-3-ил]метанола;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5R)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-морфолино-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3S)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-l,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(2,6-диморфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амина;
4'-(дифторметил)-2,6-диморфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолинопиримидин-2-ил)пиридин-2-амина;
4'-(дифторметил)-4,6-диморфолино-[2,5'-бипиримидин]-2'-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолинопиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-4'-(дифторметил)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
5-(2,6-бис((S)-3-метилморфолино)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4'-(дифторметил)-2,6-бис((S)-3-метилморфолино)-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(6-(3-метилморфолино)-2-морфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4'-(дифторметил)-6-(3-метилморфолино)-2-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
5-(4-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-6-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(2,2-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(2-(3-метилморфолино)-6-морфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амина;
(S)-4'-(дифторметил)-2-(3-метилморфолино)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(2S,6R)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(2R,6S)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.1.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3S)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-[4,6-бис(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
5-[4,6-бис[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3S)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амина.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1)октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина; и
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина; и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение выбрано из
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина; и
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение формулы (I) представляет собой 4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение формулы (I) представляет собой 4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение формулы (I) представляет собой 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение формулы (I) представляет собой 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение формулы (I) представляет собой (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин.
В другом особо предпочтительном варианте осуществления указанное соединение формулы (I) представляет собой (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
1
2
1
2
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанные R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II). В одном из предпочтительных вариантов осуществления указанный R идентичен R. В другом предпочтительном варианте осуществления указанный R не идентичен R.
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанные R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II) и указанное насыщенное 6-членное гетероциклическое кольцо Z.
В другом предпочтительном варианте осуществления в указанном морфолиниле формулы (II)
3
4
3
4
5
6
1
3
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
2
2
2
2
R и R независимо друг от друга представляют собой Н, C-Салкил, необязательно замещенный одним или двумя ОН, С-Сфторалкил, C-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или С(O)O-С-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН-, -СН-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
3
4
3
4
3
4
В случае, когда R и R вместе образуют двухвалентный остаток и связаны с вицинальными атомами углерода, образуются кольцеобразные морфолинильные заместители. В случае, когда R и R вместе образуют двухвалентный остаток и охватывают морфолиновое кольцо, образуются мостиковые морфолинильные заместители. В случае, когда R и R вместе образуют двухвалентный остаток и связаны с одним и тем же атомом углерода морфолина, образуются спиро-морфолинильные заместители.
3
4
5
6
1
3
2
2
2
2
В предпочтительном варианте R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -CH-O-CH-, -CH-NH-СН- или любой из структур
и образуют мостиковый морфолинильный заместитель.
1
2
3
4
3
4
5
6
1
3
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанные R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II), где R и R вместе образуют двухвалентный остаток, приводящий к мостиковому морфолинилу, где R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, предпочтительно С-Салкилена, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-, -CH-O-CH-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанный морфолинил формулы (II)
3
4
3
4
5
6
1
3
2
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
независимо друг от друга представляет собой морфолинил указанной формулы (II), где R и R независимо друг от друга представляют собой Н, C-Салкил, СНОН, СНСНОН, CHF, CHF, CF, CHCF, С-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или C(O)O-C-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, предпочтительно C-Салкилена, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-, -СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
3
4
3
В другом предпочтительном варианте указанный морфолинил формулы (II) независимо друг от друга представляет собой морфолинил указанной формулы (II), где R и R независимо друг от друга представляют собой Н или СН.
3
4
3
4
5
6
2
3
2
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
2
1
3
1
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В другом предпочтительном варианте указанный морфолинил формулы (II) независимо друг от друга представляет собой морфолинил указанной формулы (II), где R и R независимо друг от друга представляют собой С-Салкил, СНОН, СНСНОН, CHF, CHF, CF, CHCF, С-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или С(О) O-C-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из -СН- или Салкилена, предпочтительно -СН-, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-, -СН-O-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанный морфолинил формулы (II) независимо друг от друга выбран из
В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанный морфолинил формулы (II) независимо друг от друга выбран из
7
7
7
8
9
1
3
2
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
3
3
6
1
3
2
2
2
2
В еще одном предпочтительном варианте указанное гетероциклическое кольцо Z представляет собой насыщенное 6-членное гетероциклическое кольцо Z, выбранное из тиоморфолинила и пиперазинила, необязательно замещенное 1-3 R; где R в каждом случае независимо представляет собой C-Салкил, СНОН, СНСНОН, CHF, CHF, CF, CHCF, С-СалкоксиС-Салкил, С-Сциклоалкил; или два заместителя R вместе образуют двухвалентный остаток-RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН- или -О-СНСН-О-;
В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное гетероциклическое кольцо Z выбрано из
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II)
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и
3
4
3
4
5
6
1
3
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой Н, C-Салкил, необязательно замещенный одним или двумя ОН, C-Сфторалкил, C-Салкокси, С-С алкоксиС-Салкил, CN или C(O)O-C-C алкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток-RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
1
2
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный R идентичен указанному R, и указанные R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II)
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и
3
4
3
4
5
6
1
3
1
2
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой Н, С-Салкил, необязательно замещенный одним или двумя ОН, C-Сфторалкил, С-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или С(O)O-С-С алкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из C-Салкилена, необязательно замещенного 1-4 F, -СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
1
2
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II)
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и
3
4
3
4
5
6
1
3
2
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
1
2
2
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой Н, C-Салкил, СНОН, СНСНОН, CHF, CHF, CF, CHCF, С-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или С(O)O-С-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из С-Салкилена, предпочтительно С-Салкилена, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-,
2
2
2
2
-СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
1
2
1
2
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R идентичен R, и указанные R и R представляют собой морфолинил формулы (II)
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и
3
4
3
4
5
6
1
3
2
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
2
1
3
1
2
1
3
1
2
2
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой Н, C-Салкил, СНОН, СНСНОН, CHF, CHF, CF, CHCF, С-Салкокси, С-СалкоксиС-Салкил, CN или С(O)O-С-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из С-Салкилена, предпочтительно С-Салкилена, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-,
2
2
2
2
-СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
В другом аспекте и предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено соединение формулы (I),
где
1
2
3
1
2
3
X, X и X независимо друг от друга представляют собой N или СН; при условии, что по меньшей мере два из X, X и X представляют собой N; Y представляет собой N или СН; и где
1
2
R и R независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II)
1
2
1
2
где стрелка обозначает связь в формуле (I); и R не идентичен R, и по меньшей мере один из указанных R и R представляет собой морфолинил формулы (II),
3
4
3
4
5
6
2
3
2
2
2
2
2
3
2
3
1
2
1
2
1
3
1
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
где R и R независимо друг от друга представляют собой С-Салкил, СНОН, СНСНОН, CHF, CHF, CF, CHCF, С-Салкокси, С-CалкоксиС-Cалкил, CN или С(О) O-С-Салкил; или R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из -СН-или Салкилена, предпочтительно -СН-, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-, -CH-O-CH-, -CH-NH-CH- или любой из структур
где стрелки обозначают связи в формуле (II).
3
4
5
6
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Предпочтительно указанные R и R вместе образуют двухвалентный остаток -RR-, выбранный из -СН- или Салкилена, предпочтительно -СН-, -CHCF-, -CHFCHF-, -CHCFCH-, -СН-О-СН-, -CH-NH-CH- или любой из структур
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза -8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил.
1
2
1
2
3
1
2
В другом предпочтительном варианте осуществления R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил, и X, X и X представляют собой N; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. Предпочтительно, Y представляет собой N или СН; R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
1
2
1
3
2
1
2
В еще одном предпочтительном варианте осуществления R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил, и X и X представляют собой N, и X представляет собой СН; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. Предпочтительно, Y представляет собой N или СН; R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
1
2
1
2
3
1
2
В предпочтительном варианте осуществления R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил, и X и X представляют собой N, и X представляет собой СН; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. Предпочтительно, Y представляет собой N или СН; R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза -8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
1
2
2
3
1
1
2
В предпочтительном варианте осуществления R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил, и X и X представляют собой N, и X представляет собой СН; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли. Предпочтительно, Y представляет собой N или СН; R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил или 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил; и R представляет собой 4-морфолинил, 2-метил-4-морфолинил, 3-метил-4-морфолинил, октадейтерий-4-морфолинил, 8-аза-3-оксабицикло[3.2.1]окт-8-ил, 3-аза-8-оксабицикло[3.2.1]окт-3-ил, 4-пиперазин-1-ил, 4-метилпиперазин-1-ил или 4-тиоморфолинил; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или нейродегенеративное заболевание.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении нейродегенеративного заболевания у субъекта.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта, где соединение формулы (I) вводят указанному субъекту во время первичного эпилептогенеза или во время вторичного эпилептогенеза, или при полностью развившейся эпилепсии.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта, где эпилепсия представляет собой симптоматическую эпилепсию или идиопатическую эпилепсию.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта, где эпилепсия представляет собой симптоматическую эпилепсию.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта, где эпилепсия представляет собой идиопатическую эпилепсию.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении симптоматической эпилепсии у субъекта, где указанная симптоматическая эпилепсия вызвана черепно-мозговой травмой, опухолью головного мозга, инфекцией головного мозга, адренолейкодистрофией, синдромом Расмуссена, синдромом Стерджа-Вебера, мегалэнцефалией, полигидрамниозом, туберозно-склерозным комплексом (TSC), синдромом симптоматической эпилепсии, PMSE, мутациями PTEN или фокальной кортикальной дисплазией (FCD).
В одном из вариантов осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении симптоматической эпилепсии у субъекта, где указанная симптоматическая эпилепсия обусловлена заболеванием, характеризующимся активацией mTOR («ТORопатией»).
В одном из вариантов осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении симптоматической эпилепсии у субъекта, где указанная симптоматическая эпилепсия обусловлена заболеванием, характеризующийся активацией mTOR («ТORопатией»), где указанная «ТORопатия» выбрана из группы, состоящей из TSC, полигидрамниоза, мегалэнцефалии, синдрома симптоматической эпилепсии, PMSE, фокальной кортикальной дисплазии (FCD) и «ТORопатии», связанной с мутациями PTEN.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении симптоматической эпилепсии у субъекта, где указанная симптоматическая эпилепсия вызвана черепно-мозговой травмой, инфекцией головного мозга, адренолейкодистрофией, синдромом Расмуссена, синдромом Стерджа-Вебера, мегалэнцефалией, полигидрамниозом, туберозно-склерозным комплексом (TSC), синдромом симптоматической эпилепсии, PMSE, мутациями PTEN или фокальной кортикальной дисплазией (FCD).
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) для применения в предупреждении или лечении симптоматической эпилепсии у субъекта, где указанная симптоматическая эпилепсия вызвана черепно-мозговой травмой, инфекцией головного мозга, адренолейкодистрофией, синдромом Расмуссена или синдромом Стерджа-Вебера.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении симптоматической эпилепсии у субъекта, где указанная симптоматическая эпилепсия вызвана TSC.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении идиопатической эпилепсии у субъекта, где указанная идиопатическая эпилепсия выбрана из группы, состоящей из синдрома Дузе (юношеская эпилепсия с миоклонически-астатическими приступами), синдрома Веста, доброкачественной роландической эпилепсии, синдрома Леннокса-Гасто, синдрома Ландау-Клеффнера, синдрома симптоматической эпилепсии, PMSE и ювенильной миоклонической эпилепсии.
Как указано выше, эпилепсия может быть парциальной или генерализованной. Таким образом, в одном из вариантов осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта, где эпилепсия представляет собой парциальную эпилепсию или генерализованную эпилепсию.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта, где эпилепсия представляет собой парциальную идиопатическую эпилепсию, парциальную симптоматическую эпилепсию, генерализованную идиопатическую эпилепсию или генерализованную симптоматическую эпилепсию.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) для применения в предупреждении или лечении парциальной эпилепсии у субъекта, где указанная парциальная эпилепсия представляет собой височную эпилепсию.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении кожной нейродегенеративного заболевания у субъекта, где указанное нейродегенеративное заболевание связано с или вызвано неправильной укладкой белка и/или агрегацией белков.
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении нейродегенеративного заболевания у субъекта, где указанное нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Хантингтона, спиноцеребеллярных атаксий, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза (ALS), кистозного фиброза, семейной амилоидной полинейропатии, губчатых энцефалопатии, деменции с телами Леви, лобно-височной деменции с паркинсонизмом, спиноцеребеллярных атаксий, спинальной и бульбарной мышечной атрофии, наследственной денторубропаллидолуизиановой атрофии, семейной британской деменции, семейной датской деменции и прионной болезни.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении нейродегенеративного заболевания у субъекта, где указанное нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера и прионной болезни.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, выбранное из:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей,
для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, выбранное из:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей, для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, выбранное из:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей, для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где указанное соединение выбрано из 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6- (3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина; и (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где указанное соединение выбрано из 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6- (3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина; и (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где указанное соединение выбрано из 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6- (3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина; и (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предложено соединение 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предложено соединение 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления предложено соединение 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и их фармацевтически приемлемые соли для применения в профилактике или лечении неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предложено соединение (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и их фармацевтически приемлемые соли для применения в профилактике или лечении эпилепсии у субъекта.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления предложено соединение (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин; и его таутомеры, сольваты и их фармацевтически приемлемые соли для применения в профилактике или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 и R2 независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II); и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 и R2 независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II); и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 и R2 независимо друг от друга представляют собой морфолинил формулы (II); и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 идентичен R2; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 идентичен R2; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 идентичен R2; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 не идентичен R2; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 не идентичен R2; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении эпилепсии у субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления предложено соединение формулы (I) согласно изобретению, где R1 не идентичен R2; и его таутомеры, сольваты и фармацевтически приемлемые соли для применения в предупреждении или лечении болезни Хантингтона у субъекта.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы (I) согласно изобретению.
В одном из вариантов осуществления предложен способ лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы (I) согласно изобретению, где неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В предпочтительном варианте осуществления предложен способ лечения или предупреждения эпилепсии, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы (I) согласно изобретению.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления предложен способ лечения или предупреждения эпилепсии у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы (I) согласно изобретению, где указанное эффективное количество соединения формулы (I) согласно изобретению вводят во время первичного эпилептогенеза или во время вторичного эпилептогенеза, или при полностью развившейся эпилепсии.
В еще более предпочтительном варианте осуществления предложен способ лечения или предупреждения болезни Хантингтона у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы (I) согласно изобретению.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предложен способ лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения формулы (I) согласно изобретению, где указанное соединение выбрано из: 4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина; 5-(4-(3-окса-8-азабициклох[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина; (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и его таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей; и где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение соединения формулы (I) согласно изобретению для лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта.
В одном из вариантов осуществления предложено применение соединения формулы (I) согласно изобретению для лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В предпочтительном варианте осуществления предложено применение соединения формулы (I) согласно изобретению для лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, где указанное соединение выбрано из:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей; и где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение соединения формулы (I) согласно изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения неврологического расстройства субъекта.
В одном из вариантов осуществления предложено применение соединения формулы (I) согласно изобретению для изготовления лекарственного средства лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предложено применение соединения формулы (I) согласно изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения неврологического расстройства у субъекта, где указанное соединение выбрано из:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амина;
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амина;
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амина; и их таутомеров, сольватов и фармацевтически приемлемых солей; и где указанное неврологическое расстройство представляет собой эпилепсию или болезнь Хантингтона.
Наиболее предпочтительными для настоящего изобретения являются следующие соединения, показанные посредством формул: (Названия соответствующих структур были получены с использованием ChemDraw Ultra, версия 13.0.1, а также более ранних и поздних версий этого программного обеспечения, CambridgeSoft Corp., Кембридж, Массачусетс).
Соединение 1:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин
Соединение 2:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин
Соединение 3:
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 4:
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 5:
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин
Соединение 6:
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 7:
5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин
Соединение 8:
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин
Соединение 9:
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин
Соединение 10:
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-4-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 11:
5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин
Соединение 12:
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин
Соединение 13:
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин
Соединение 14:
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин
Соединение 15:
(S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пидеразин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин
Соединение 16:
4-(дифторметил)-5-(2,6-диморфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин
Соединение 17:
4'-(дифторметил)-2,6-диморфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин
Соединение 18:
4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолинопиримидин-2-ил)пиридин-2-амин
Соединение 19:
4'-(дифторметил)-4,6-диморфолино-[2,5'-бипиримидин]-2'-амин
Соединение 20:
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин
Соединение 21:
4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин
Более предпочтительными являются следующие соединения:
Соединение 22:
5-(6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 23:
5-(2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолинопиримидин-4-ил)-4-
(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 24:
2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-4'(дифторметил)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин1-2'-амин
Соединение 25:
5-(2,6-бис((S)-3-метилморфолино)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 26:
4'-(дифторметил)-2,6-бис((S)-3-метилморфолино)-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин
Соединение 27:
(S)-4-(дифторметил)-5-(6-(3-метилморфолино)-2-морфолинопиримидин-4-ил)пирвдин-2-амин
Соединение 28:
(S)-4'-(дифторметил)-6-(3-метилморфолино)-2-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин
Соединение 29:
5-(4-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-6-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 30:
5-[4,6-бис(2,2-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 31:
(S)-4-(дифторметил)-5-(2-(3-метилморфолино)-6-морфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин
Соединение 32:
(S)-4'-(дифторметил)-2-(3-метилморфолино)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин
Соединение 33:
4-(дифторметил)-5-[4-[(2S,6R)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 34:
5-[4,6-бис[(2R,6S)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 37:
5-[4,6-бис(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 38:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 39:
5-[4,6-бис(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 40:
5-[4,6-бис[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 41:
5-[4,6-бис[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 42
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 44:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 45:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 46:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 47:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 50:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(3-окса-6-азабицикло[3.1.1]гептан-6-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 51:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(6-окса-3-азабицикло[3.1.1]гептан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 52:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-[(1R,4R)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 53:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-[(1S,4S)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 54:
5-[4,6-бис[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 55:
5-[4,6-бис(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 56:
5-[4,6-бис[(3R)-3-изопропилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 66:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 67:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 68:
[(3R)-4-[4-[6-амино-4-(дифторметил)-3-пиридил]-6-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]морфолин-3-ил]метанол
Соединение 69:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 70:
5-[4-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-6-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 71:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 77:
[(3R)-4-[4-[6-амино-4-(дифторметил)-3-пиридил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]морфолин-3-ил]метанол
Особенно предпочтительными соединениями являются:
Соединение 78:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5R)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 79:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 80:
4-(дифторметил)-5-[4-морфолино-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 82:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 83:
5-[4,6-бис[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин
Соединение 84:
4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 85:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3S)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 86:
4-(дифгорметил)-5-[4-[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Соединение 88:
4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин
Получение соединений согласно изобретению
Соединения согласно изобретению могут быть синтезированы путями, включающими процессы, аналогичные тем, которые хорошо известны в области химии, особенно в свете описания, содержащегося в настоящем документе. Исходные вещества обычно доступны из коммерческих источников или легко метут быть получены с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.
При получении соединений согласно изобретению может потребоваться защита дальней функциональной группы (например, первичной или вторичной аминогруппы) в промежуточных соединениях. Необходимость такой защиты будет зависеть от природы дальней функциональной группы и условий, при которых проводится синтез. Подходящие аминозащитные группы включают трет-бутилоксикарбонил (ВОС), бис-трет-бутилоксикарбонил или диметиламинометиленил. Необходимость в такой защите легко устанавливается специалистом в данной области техники. Общее описание защитных групп и информацию по их применению см. в Т.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Способы разделения
В способах получения соединений согласно настоящему изобретению может быть целесообразным отделять продукты реакции друг от друга и/или от исходных веществ. Целевые продукты каждой стадии или серии стадий разделяют и/или очищают до желаемой степени однородности с помощью методик, общепринятых в данной области техники. Обычно такие разделения включают многоступенчатую экстракцию, кристаллизацию из растворителя или смеси растворителей, дистилляцию, сублимацию или хроматографию. Хроматография может включать любое количество способов, включая, например, способы и установки для обращенно-фазовой и нормально-фазовой хроматографии; жидкостной хроматографии высокого, среднего и низкого давления; мелкомасштабнаую аналитическую хроматографию и препаративную тонкослойную или толстослойную хроматографию, а также методики мелкомасштабной тонкослойной и флэш-хроматографии.
Выбор подходящих способов разделения зависит от природы используемых веществ, например, наличия или отсутствия полярных функциональных групп при хроматографии, стабильности веществ в кислотных и основных средах при многоступенчатой экстракции и тому подобного. Специалист в данной области техники будет применять методики, с его точки зрения наиболее подходящие для достижения желаемого разделения.
ПРИМЕРЫ
Примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения без его ограничения.
Химические реакции, описанные в примерах, могут быть легко адаптированы для получения ряда других ингибиторов липидкиназ согласно изобретению, и альтернативные способы получения соединений согласно настоящему изобретению считаются входящими в его объем. Например, синтез непроиллюстрированных соединений согласно изобретению может быть успешно выполнен с помощью модификаций, очевидных для специалистов в данной области техники, например, путем надлежащей защиты мешающих групп, путем использования других подходящих реагентов, известных в данной области техники, отличных от описанных, и/или путем рутинной модификации условий взаимодействия. В качестве альтернативы, другие реакции, раскрытые в настоящем документе или известные в данной области техники, будут считаться подходящими для получения других соединений согласно изобретению.
1
1
1
-1
-1
-1
19
19
1
3
3
2
3
3
2
3
3
Как правило, для полученных соединений были получены Н ЯМР и масс-спектры. В приведенных ниже примерах, если не указано иное, все температуры указаны в градусах Цельсия (°С). Реагенты были приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Sigma Aldrich, Fluorochem, Acros, Lancaster, TCI шли Maybridge, и использовались без дополнительной очистки, если не указано иное. Реакции, приведенные ниже, проводились обычно при положительном давлении азота или с осушительной трубкой (если не указано иное) в безводных растворителях, а реакционные колбы обычно были снабжены резиновыми мембранами для введения субстратов и реагентов через шприц. Лабораторную посуду сушили в сушильном шкафу. Колоночную хроматографию проводили с использованием силикагеля Merck. Спектры Н ЯМР регистрировали на приборе Bruker, работающем на частоте 400 МГц. Спектры Н ЯМР получали для растворов в различных дейтерированных растворителях, таких как CDCl, (CD)SO, CDOD или (CD)СО. Значения химического сдвига δ были получены в млн и скорректированы по сигналу дейтерированных растворителей (7,26 млн для CDCl) или ТМС (тетраметилсилан) (0 млн). Спектры F ЯМР калибровали относительно CFCl (δ=0 ppm) в качестве внешнего стандарта. Спектры F ЯМР регистрировали с развязкой по Н. При указании мультплетов используются следующие сокращения: s (синглет), d (дублет), t (триплет), m (мультиплет), quint (квинтет), br (уширенный). Константы взаимодействия, если они приведены, указаны в герцах (Гц). Масс-спектры (MS) MALDI-TOF получали на Voyager-DeTM Pro, измеряя в m/z.
Далее используются следующие сокращения: BSA (бычий сывороточный альбумин), ДМСО (диметилсульфоксид), ЭСИ (электроспрей ионизация), HCl (соляная кислота), М (молярный), МАЛДИ (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация), МС (масс-спектрометр ия), PBS (натрий-фосфатный буфер), ТСХ (тонкослойная хроматография), н/о (не определено).
ПРИМЕР 1
Получение промежуточных соединений и соединений согласно изобретению
Получение промежуточных соединений
Следующие способы были использованы для получения промежуточных соединений, использованных для получения соединений формулы (I).
Способ 1: 8-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-хлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан (i1)
1
+
3
3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан⋅HCl (Advanced ChemBlocks Inc, номер продукта А-861, 2,00 г, 13,4 ммоль, 2,0 экв.) и N,N-диизопропилэтиламин (4,80 мл, 27,6 ммоль, 4,1 экв.) загружают в колбу и растворяют в дихлорметане (20 мл). Колбу помещают на ледяную баню и затем охлаждают раствор до 0°С. Этот раствор затем по каплям добавляют к раствору цианурхлорида в дихлорметане (20 мл) при 0°С. Полученную смесь перемешивают в течение ночи, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры. Добавляют дополнительное количество дихлорметана (100 мл) и промывают органический слой насыщенным водным раствором бисульфата натрия. Затем органический слой суша над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате очистки с помощью флэш-хроматографии (циклогексан/этилацетат 4:1) получают требуемое промежуточное соединение i1 в виде бесцветного твердого вещества (выход 79%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4.70-4.54 (m, 4Н), 3.80-3.58 (m, 8Н), 2.14-1.89 (m, 8Н); МС МС (МАЛДИ): m/z = 338.4 ([М+Н]).
Способ 1 также используют для получения следующих промежуточных соединений i2 - i10 и промежуточных соединений i79 - i81 и i90.
Способ 2: 2,4-дихлор-6-морфолино-1.3.5-триазин (i11)
1
3
К раствору цианурхлорида (18,1 г, 0,100 моль, 1,0 экв.) в дихлорметане (200 мл) по каплям добавляют раствор морфолина (17,4 г, 0,200 моль, 2,0 экв.) при - 78°С в течение 2 часов. Полученной смеси дают нагреться до 0°С при перемешивании и смешивают с ледяным насыщенным водным раствором бисульфата натрия. Фазы разделяют и промывают органическую фазу полуконцентрированным рассолом, сушат над сульфатом натрия и выпаривают с получением указанного в заголовке соединения i11 в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 3,90-3,86 (m, 4Н), 3,77-3,72 (m, 4Н).
Способ 3: 8-(4-хлор-6-морфолино-1.3.5-триазин-2-ил)-3-окса-8-азабицикло-[3.2.1]-октан (i12)
1
+
3
3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан⋅HCl (Advanced ChemBlocks Inc, номер продукта А-861, 200 мг, 1,34 ммоль, 1,1 экв.) и N,N-диизопропилэтиламин (470 мкл, 2,69 ммоль, 2,1 экв.) загружают в колбу и растворяют в этаноле (3 мл). Колбу помещают на ледяную баню. К полученному выше раствору добавляют раствор соединения i11 (300 мг, 1,28 ммоль, 1,0 экв.) в этаноле (2 мл) при 0°С. Полученную смесь перемешивают в течение ночи, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры. Добавляют деионизированную воду (20 мл) и экстрагируют водный слой этилацетатом (3×30 мл). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате очистки с помощью флэш-хроматографии (циклогексан/этилацетат 9:1→8:2) получают требуемое промежуточное соединение i12 в виде бесцветного твердого вещества (выход 78%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4,69-4,56 (m, 2Н), 3,86-3,59 (m, 12Н), 2,12-1,91 (m, 4Н); МС (МАЛДИ): m/z = 312,7 ([М+Н]).
Способ 3 также используют для получения следующих промежуточных соединений i13 - i16 и промежуточных соединений i87 и i91.
Способ 4: (S)-4-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолин (i17)
i17
1
3
К раствору цианурхлорида (450 мг, 2,44 моль, 1,0 экв.) в дихлорметане (4 мл) медленно добавляют раствор (S)-3-метилморфолина (Activate Scientific, номер продукта AS3424, 0,28 мл, 2,44 моль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,35 мл, 2,51 моль, 1,02 экв.) в дихлорметане (2 мл) при - 50°С. Полученную смесь перемешивают в течение 2 часов при - 50°С, затем дают ей нагреться до 0°С при перемешивании и смешивают с ледяным насыщенным раствором бисульфата натрия в воде. Фазы разделяют и промывают органическую фазу рассолом, сушат над сульфатом натрия и выпаривают с получением указанного в заголовке соединения i17 в виде бесцветного твердого вещества (выход 95%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4,78-4,69 (m, 1Н), 4,43-4,39 (m, 1Н), 3,98-3,96 (m, 1Н), 3,78-3,76 (m, 1Н), 3,67-3,65 (m, 1Н), 3,51-3,47 (m, 1Н), 3,40-3,37 (m, 1Н), 1,36 (m, 3Н).
Способ 5: 8-(4-хлор-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан (i18)
1
3
3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан⋅HCl (Advanced ChemBlocks Inc, номер продукта А-861, 383 мг, 2,55 ммоль, 1,1 экв.) и N,N-диизопропилэтиламин (1,0 мл, 5,60 ммоль, 2,4 экв.) загружают в колбу и растворяют в этаноле (4 мл). Колбу помещают на ледяную баню. К полученному выше раствору добавляют раствор соединения i17 (580 мг, 2,33 ммоль, 1,0 экв.) в этаноле (2 мл) при 0°С. Полученную смесь перемешивают в течение 4 часов, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры. Добавляют деионизированную воду (20 мл) и экстрагируют водный слой этилацетатом (3×30 мл). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате очистки с помощью флэш-хроматографии (циклогексан/этилацетат 9:1→8:2) получают требуемое промежуточное соединение i18 в виде бесцветного твердого вещества (выход 88%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4,75-4,52 (m, 3Н), 4,37-4,24 (m, 1Н), 3,95-3,92 (m, 1Н), 3,73-3,70 (m, 3Н), 3,64-3,61 (m, 3Н), 3,52-3,42 (m, 1Н), 3,29-3,17 (m, 1Н), 2,11-1,89 (m, 4Н), 1,31 (m, 3Н).
Способ 6: трет-бутил-4-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилат (i19)
1
3
К охлажденному (- 50°С) раствору цианурхлорида (1,0 г, 5,42 ммоль, 1,0 экв.) в дихлорметане (4 мл) по каплям добавляют раствор трет-бетилпиперазин-1-карбоксилата (Sigma, номер продукта 343536, 1,02 г, 5,48 ммоль, 1,01 экв.) и триэтиламина (0,767 мл, 5,53 ммоль, 1,02 экв.) в дихлорметане (2 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают при - 50°С в течение 4 часов. Добавляют насыщенный водный раствор бисульфата натрия (10 мл) и дихлорметан (20 мл). Смесь переносят в разделительную воронку. Органический слой отделяют, промывают насыщенным водным раствором бисульфата натрия (20 мл), сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и затем выпаривают растворитель при пониженном давлении с получением чистого промежуточного соединения i19 (выход 80%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 3,88-3,85 (m, 4Н), 3,53-3,51 (m, 4Н), 1,49 (m, 9Н).
Способ 7: трет-бутил-4-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-хлор-1,3,5-триазин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилат (i20)
1
+
3
3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-HCl (Advanced ChemBlocks Inc, номер продукта А-861, 235 мг, 1,57 ммоль, 1,0 экв.) и N,N-диизопропилэтиламин (592 мкл, 3,14 ммоль, 2,1 экв.) загружают в колбу и растворяют в этаноле (6 мл). Колбу помещают на ледяную баню. К полученному выше раствору добавляют раствор соединения i19 (500 мг, 1,5 ммоль, 1,0 экв.) в этаноле (2 мл) при 0°С. Полученную смесь перемешивают в течение ночи, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры. Добавляют деионизированную воду (10 мл) и экстрагируют водный слой этилацетатом (3×30 мл). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате очистки с помощью флэш-хроматографии (циклогексан/этилацетат 8:2) получают требуемое промежуточное соединение i20 в виде бесцветного твердого вещества (выход 77%). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4,68-4,60 (m, 2Н), 3,76-3,70 (m, 6Н), 3,64-3,62 (m, 2Н), 3,47-3,45 (m, 4Н), 2,08-1,95 (m, 4Н), 1,48 (br s, 9Н); МС (МАЛДИ): m/z = 411,8 ([М+Н]).
Способ 7 также используется для получения следующего промежуточного соединения i21.
Способ 8: 4,4'-(6-хлорпиримидин-2,4-диил)диморфолин (i22) и 4,4'-(2-хлорпиримидин-4,6-диил)диморфолин (i23)
2,4,6-трихлорпиримидин (Manchester Organics, номер продукта Y17832, 11,2 г, 61 ммоль, 1,0 экв.), N,N-диизопропилзтиламин (23,3 мл, 134,2 ммоль, 2,2 экв.) и морфолин (11,7 мл, 134,2 ммоль, 2,2 экв.) загружают в колбу и растворяют в этаноле (120 мл). Колба оборудована обратным холодильником, и ее помещают на масляную баню, предварительно нагретую до 100°С. Реакционную смесь перемешивают при этой температуре в течение 18 часов. По прошествии этого времени реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и удаляют летучие компоненты при пониженном давлении. Полученную смесь растворяют в дихлорметане (100 мл) и дважды промывают водным раствором бисульфата натрия (2×80 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении с помощью ротационного испарителя. Продукты i22 и i23 выделяют с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат 3:1 - 1:1). Фракции продукта объединяют и выпаривают с получением i22 в виде бесцветного порошка (13,8 г, 80%) и i23 в виде бесцветного порошка (2,2 г, выход 13%).
1
+
3
4,4'-(6-хлорпиримидин-2,4-диил)диморфолин (i22): H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 5,85 (s, 1Н), 3,71-3,75 (m, 12Н), 3,52-3,55 (m, 4Н); МС (МАЛДИ): m/z: 285,4 ([М+Н]).
1
+
3
4,4'-(2-хлорпиримидин-4,6-диил)диморфолин (i23): Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 5,38 (s, 1Н), 3,73-3,76 (m, 8Н), 3,52-3,54 (m, 8Н); МС (МАЛДИ): m/z: 285,2 ([М+Н]).
Способ 9: 8-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-хлорпиримидин-2-ил)-3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан (i24)
1
2
2
+
3
H,H
H,H
Раствор 2,4,6-трихлорпиримидина (0,676 мл, 5,88 ммоль, 1,0 экв.), 3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октана гидрохлорида (1,76 г, 11,8 ммоль, 2,0 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (4,10 мл, 23,5 ммоль, 4,0 экв.) в этилацетате (18 объемов) нагревают в течение 16 часов (100°С). Затем растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток растворяют в дихлорметане (60 объемов) и промывают насыщенным водным бисульфатом натрия (3×60 объемов). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. В результате очистки с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат 3:1-1:1) получают требуемое промежуточное соединение i24 в виде бесцветного твердого вещества (1,23 г, 62%). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 5,80 (s, 1Н), 4,59 (s, 2H), 4,35 (m, 2Н), 3,76 (t, J = 10,8 Гц, 4Н), 3,59 (d, J = 10,8 Гц, 4Н), 2,03 (m, 8Н); МС (МАЛДИ): m/z = 337,7 ([М+Н]).
Способ 9 также используют для получения следующего промежуточного соединения i25.
Способ 10: 4-(4,6-дихлорпиримидин-2-ил)морфолин (i26) и 4-(2,6-дихлорпиримидин-4-ил)морфолин (i27)
2
К раствору 2,4,6-трихлорпиримидина (14,0 мл, 122 ммоль, 1,0 экв.) в EtOH (150 мл) по каплям добавляют раствор морфолина (11,2 мл, 256 ммоль, 2,1 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (44,6 мл, 256 ммоль, 2,1 экв.) в EtOH (150 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенный продукт экстрагируют дихлорметаном (3×100 мл) и последовательно промывают органическую фазу насыщенным водным бисульфатом натрия (3×400 мл). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают при пониженном давлении. Неочищенную смесь очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии (SiO, циклогексан/этилацетат 9:1-3:1) с получением i26 (5,02 г, 18%) и i27 (16,7 г, 59%), оба с виде бесцветных твердых веществ.
1
3
4-(4,6-дихлорпиримидин-2-ил)морфолин (i26): Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 6,56 (s, 1Н), 3,78 (m, 4Н) 3,74 (m, 4Н).
1
3
4-(2,6-дихлорпиримидин-4-ил)морфолин (i27): Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 6,41 (s, 1Н), 3,78 (m, 4Н), 3,65 (m, 4Н).
Способ 11; (S)-4-(2-хлор-6-морфолинопиримидин-4-ил)-3-метилморфолин (i28)
2
3
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
1
2
3
2
3
2
3
3
2
3
2
MC
+
Раствор i27 (694 мг, 2,97 ммоль, 1,0 экв.), (S)-3-метилморфолина (0,500 мл, 4,46 ммоль, 1,5 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (1,29 мл, 7,43 ммоль, 2,5 экв.) в EtOH (5,0 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 3 дней. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в дихлорметане (60 объемов) и промывают насыщенным водным бисульфатом натрия (3×60 объемов). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Неочищенную смесь очищают с помощью флэш-хроматографии (SiO, циклогексан/этилацетат 3:1-1:1) с получением указанного в заголовке соединения (S)-4-(2-хлор-6-морфолинопиримидин-4-ил)-3-метилморфолина (i28) в виде бесцветного твердого вещества (425 мг, 48%). H ЯМР (400 МГц. CDCl): δ 5,85 (s, 1H), 4,62 (dd, J=13,6 Гц, J=2,9 Гц, 1H), 4,25 (dd, J=13,6 Гц, J=2,9 Гц, 1H), 3,93 (dd, J=11,4 Гц, J=3,8 Гц, 1H), 3,75, (t, J=5,0 Гц, 4H), 3,71 (s, 1H), 3,66 (dd, J=11,3 Гц, J=3,2 Гц, 1H), 3,53 (m, 5H), 3,23 (m, 1H), 1,26 (d, J=11,3 Гц, 3H); (МАЛДИ): m/z=299,4 ([М+Н]).
Способ 11 также используется для получения следующего промежуточного соединения i29.
Способ 12: (S)-4-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-3-метилморфолин (i30)
2
3
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
1
2
3
2
3
3
+
Раствор (S)-3-метилморфолина (194 мг, 1,32 ммоль, 1,5 экв.), i26 (300 мг, 1,28 ммоль, 1,0 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (3,0 экв.) в ДМФА (17 объемов) нагревают в течение 16 часов (130°С). Затем растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в дихлорметане (100 объемов) и промывают насыщенным водным бисульфатом натрия (3×100 объемов). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Неочищенную смесь очищают с помощью флэш-хроматографии (SiO, циклогексан/этилацетат 5:1) с получением указанного в заголовке соединения i30 в виде бесцветного твердого вещества (257 мг, 67%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 5,84 (s, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,94 (m, 2H), 3,71 (m, 10H), 3,53, (dt, J=12,0 Гц, J=3,1 Гц, 1H), 3.20 (dt, J=12,8 Гц, J=3,8 Гц, 1H), 1,27 (d, J=6,8 Гц, 3H); MC (МАЛДИ): m/z=298,4 ([М]).
Способ 14: 8-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан (i32)
1
3
3
H,H
Раствор цианурхлорида (1,97 г, 10,7 ммоль, 1,0 экв.) в дихлорметане (10 мл) охлаждают до - 50°С. Медленно добавляют раствор 3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октана гидрохлорида (1,60 г, 10,7 ммоль, 1,0 экв.) и N,N-диизопропилэтиламин (3,73 мл, 21,4 ммоль, 2,0 экв.) в дихлорметане (40 мл) в течение 5 часов. Смесь перемешивают в течение еще 5 часов при этой температуре. Затем добавляют дихлорметан (20 мл) и насыщенный водный бисульфат натрия (50 мл) и дают смеси нагреться до комнатной температуры. Слои разделяют и промывают органический слой насыщенны водным бисульфатом натрия (2×50 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенную смесь перекристаллизовывают из н-гептана/дихлорметана (20 мл/13 мл) с получением указанного в заголовке соединения 8-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октана (i32) в виде бесцветного твердого вещества (2,47 г, 47%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 4,74 (m, 2H), 3,72 (d, J=1,5 Гц, 4Н), 2,08 (m, 4Н).
Способ 14 также используется для получения следующих промежуточных соединений i33 и i34.
Способ 15: 9-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-хлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан (i35)
1
+
3
2
К раствору 3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонана (184 мг, 0,700 ммоль, 1,0 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (0,170 мл, 0,970 ммоль, 1,4 экв.) в 1,4-диоксане (1,0 мл) добавляют раствор i32 (100 мг, 0,770 ммоль, 1,1 экв.) в 1,4-диоксане (2,0 мл). Полученную смесь нагревают в течение 1 часа при 70°С. Затем добавляют дихлорметан (50 мл) и воду (50 мл). Водный слой экстрагируют дихлдорметаном (3×50 мл), объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают растворитель. Неочищенную смесь очищают с помощью автоматизированной флэш-хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат 2:1-0:1) с получением указанного в заголовке соединения 9-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-хлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонана (i35) в виде бесцветного твердого вещества (192 мг, 77%). H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 4,70 (m, 1H), 4,55 (m, 2H), 4,44 (m, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,90 (m, 4H), 3,72 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 2,08 (m, 2H), 1,97 (m, 2H); МС (МАЛДИ): m/z=354,3 ([М]).
Способ 16: 9-(4-хлор-6-((R)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан (i36)
2
3
2
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
1
3
2
3
2
3
К раствору 3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонана (173 мг, 1,27 ммоль, 1,05 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (0,50 мл, 2,52 ммоль, 2,1 экв.) в тетрагидрофуране (5 мл) добавляют раствор i33 (300 мг, 2,52 ммоль, 2,1 экв.) в 1,4-диоксане (2,0 мл). Полученную смесь нагревают в течение 2 часов (70°С). Затем добавляют этилацетат (20 мл) и насыщенный водный бисульфат натрия (20 мл). Фазы разделяют и промывают органический слой насыщенным водным бисульфатом натрия (2×20 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенную смесь очищают с помощью автоматизированной флэш-хроматографии (SiO, циклогексан/этилацетат 2:1-0:1) с получением указанного в заголовке соединения i36 в виде бесцветного твердого вещества (316 мг, 76%). Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 4,55-4,53 (m, 1Н), 4,42 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,25-4,16 (m, 1H), 4,01-3,97 (m, 4H), 3,87 (dd, J=3,8 Гц, J=11,2 Гц, 1H), 3,73-3,65 (m, 5H), 3,53 (dd, J=3,0 Гц, J=11,6 Гц, 1H), 3,38 (m, 1H), 3,15 (m, 1H), 1,20 (d, J=6,9 Гц, 3H),
Способ 16 также используется для получения следующих промежуточных соединений i37-i53, промежуточного соединения i82 и промежуточных соединений i85, i86, i92, i93, i94.
Способ 17: 9-(4-хлор-6-(3,3-диметилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан (i54)
2
3
2
1
+
К раствору 3,7-дикоса-9-азабицикло[3.3.1]нонана (155 мг, 1,20 ммоль, 1,05 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (0,42 мл, 2,40 ммоль, 2,1 экв.) в 1,4-диоксане (5 мл) добавляют раствор i34 (300 мг, 1,14 ммоль, 1 экв.) в 1,4-диоксане (1 мл). Полученную смесь нагревают в течение 2 часов (70°С). Затем добавляют этилацетат (20 мл) и насыщенный водный бисульфат натрия (20 мл). Фазы разделяют и промывают органический слой насыщенным водным бисульфатом натрия (2×20 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенную смесь очищают с помощью автоматизированной флэш-хроматографии (SiO, циклогексан/этилацетат 2:1-0:1) с получением указанного в заголовке соединения i54 в виде бесцветного твердого вещества (178 мг, 44%), H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 4,32 (m, 2Н), 4,05-3,98 (m, 4H), 3,77 (m, 4H), 3,71 (m, 4H), 3,44 (m, 2H), 1,41 (s, 6H), МС (МАЛДИ): m/z=356,3 ([М+Н]).
Способ 17 также используется для получения следующих промежуточных соединений i55-i64.
Способ 18: 4-(дифторметил)пиридин-2-амин (i65)
2
3
3
H,H
H,H
H,F
3
1
2
2
2
19
Ацетат палладия (275 мг, 1,22 ммоль, 0,05 экв.) и 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенил (Sigma-Aldrich, номер продукта 638064, 1,17 г, 2,45 ммоль, 0,10 экв.) растворяют в 1,4-диоксане (10 мл) в атмосфере азота, и полученную смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 45 минут. Затем этот раствор добавляют к смеси трет-бутилкарбамата (Sigma, номер продукта 167398, 4,30 г, 36,7 ммоль, 1,5 экв.), CsCO (15,9 г, 48,8 ммоль, 2,0 экв.) и 2-хлор-4-дифторметилпиридина (Manchester Organics, номер продукта U15343, 4,00 г, 24,5 ммоль, 1,0 экв.) в 1,4-жиоксане (80 мл) в атмосфере азота. Затем полученную реакционную смесь нагревают при 90°С в течение 3 часов, в ходе этого процесса она приобретает коричневатый цвет. По прошествии этого времени смеси дают остыть до комнатной температуры. Затем ее разбавляют этилацетатом, промывают водным насыщенным раствором хлорида аммония (2×30 мл) и деионизированной водой. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлений. Коричневатый остаток смешивают с 4 М HCl в диоксане (50 мл, избыток) и метаноле (20 мл) и затем нагревают при 80°С в течение 45 минут. Добавляют деионизированную воду и промывают водный слой этилацетатом (3 х). Затем водный слой подщелачивают до pH=9 твердым гидроксидом натрия. Водный слой экстрагируют этилацетатом (3 х). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют до сухости при пониженном давлении. Требуемый продукт i65 получают в виде бесцветного твердого вещества, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки (выход 98%). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,16 (d, J=5,2 Гц, 1Н), 6,74 (d, J=4,8 Гц, 1Н), 6,59 (s, 1H), 6,51 (t, J=56 Гц, 1Н), 4,61 (br s, 2H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 116,0 (s, 2F).
Способ 19: 5-бром-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (i66)
1
2
19
3
H,H
3
К раствору соединения i65 (3,00 г, 20,8 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (60 мл) добавляют N-бромсукцинимид (3,89 г, 21,9 ммоль, 1,05 экв.) при 0°С на ледяной бане. Полученную смесь перемешивают в течение ночи, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры. Добавляют этилацетат и промывают органический слой водным карбонатом натрия (8%). Затем органический слой отделяют и подкисляют водным 3 М раствором HCl. Водный слой промывают этилацетатом (3×50 мл) и затем подщелачивают до рН=10 твердым гидроксидом натрия. Водный слой экстрагируют этилацетатом (3×50 мл). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют до сухости при пониженном давлении. Требуемый продукт i66 получают в виде коричневатого твердого вещества, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки (выход 79%). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,20 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,71 (t, J=54 Гц, 1Н); 4,62 (br s, 2H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 118,9 (s, 2F).
Способ 20: N'-(5-бром-4-(дифторметил)пиридин-2-ил)-N,N-диметилформимидамид (i67)
1
2
19
+
3
H,F
3
К раствору соединения i66 (3,68 г, 16,5 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (50 мл) добавляют N,N-диметилформамид диметилацеталь (Manchester Organics, номер продукта 005030, 3,30 мл, 24,8 ммоль, 1,5 экв.) и перемешивают полученную смесь 60°С в течение 3 часов. Смеси дают остыть до комнатной температуры и выпаривают растворитель при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (циклогексан/этилацетат 1:1) с получением требуемого продукта i67 в виде желтоватого твердого вещества (выход 82%). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,43 (s, 1H), 8,34 (br s, 1H), 7,17 (s, 1H), 6,73 (t, J=54 Гц, 1H), 3,12 (s, 3H), 3,10 (s, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 118,6 (s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=278,5 ([M+H]).
Способ 21: N'-(4-(дифторметил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-ил)-N,N-диметилформимидамид (i68)
1
19
+
3
3
К 2 М раствору изопропилмагния хлорида (Sigma, номер продукта 230111, 3,10 мл, 6,20 ммоль, 1,15 экв.) в тетрагидрофуране (6 мл) медленно добавляют раствор соединения i67 (1,50 г, 5,39 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (5 мл) при 0°С. Полученную коричневатую смесь перемешивают при 0°С в течение 45 минут и затем при комнатной температуре в течение 15 минут. По прошествии этого времени ТСХ (тонкослойная хроматография)-контроль (циклогексан/этилацетат 1:1) показал полное поглощение исходных веществ. Добавляют 2-изопропокси-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (Manchester Organics, номер продукта W23343, 1,43 мл, 7,00 ммоль, 1,3 экв.) и нагревают смесь при 60°С в течение 3 часов. Затем смесь помещают в колбу Эрленмейера, охлаждают до 0°С с помощью ледяной бани и прерывают реакцию добавлением 15% водного раствора хлорида аммония. Слои разделяют и экстрагируют водный слой этилацетатом (3×40 мл). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. Добавляют гептан и промывают органический слой насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и затем концентрируют до сухости при пониженном давлении. Требуемый продукт i68 получают в виде коричневатого масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки (выход 94%). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,66 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,34-7,04 (m, 2H), 3,12 (s, 3H), 3,12 (s, 3H), 1,34 (s, 12H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,6 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=326,0 ([М+Н]).
Способ 22: 4-(дифторметил)пиримидин-2-амин (i69)
К раствору этилвинилового эфира (4,00 мл, 41,8 ммоль, 1,0 экв.) в смеси пиридина (4,10 мл, 50,7 ммоль, 1,2 экв.) и дихлорметана (40 мл), по каплям добавляют раствор 2,2-дифторуксусного ангидрида (Manchester Organics, (номер продукта L24754, 5,90 мл, 50,1 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (5 мл) при - 70°С на бане с сухим льдом/изопропанолом. Полученному раствору дают нагреться до комнатной температуры в течение ночи. Затем смесь промывают деионизированной водой, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении с получением оранжевого масла.
В это же время суспензию гуанидин-HCl (Sigma, номер продукта 50940, 4,80 г, 50,2 ммоль, 1,2 экв.) в этаноле (20 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. К этому раствору добавляют гранулы гидроксида натрия (2,00 г, 50,0 ммоль, 1,2 экв.) за один раз. Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение ночи.
1
2
2
2
19
3
H,H
H,H
H,F
3
Оранжевое масло разбавляют дихлорметаном (20 мл) и по каплям в течение 1 часа добавляют к суспензии в этанол. Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Дихлорметан выпаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют деионизированную воду (25 мл). Полученную смесь интенсивно перемешивают в течение 2 часов и затем оставляют при комнатной температуре в течение ночи. Образовавшееся твердое вещество отфильтровывают, промывают деионизированной водой (2х) и гептаном (1х), и затем сушат в вакууме. Требуемый продукт i69 получают в виде бесцветного твердого вещества (выход 65%). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,43 (d, J=4,8 Гц, 1Н), 7,02 (br s, 2H), 6,76 (d, J=5,2 Гц, 1Н), 6,67 (t, J=55 Гц, 1Н); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 120,5 (s, 2F).
Способ 23: 5-бром-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин (i70)
1
2
19
3
2
H,F
3
2
К раствору соединения i69 (3,00 г, 20,7 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (90 мл) по частям добавляют N-бромсукцинимид (3,86 г, 21,7 ммоль, 1,0 экв.) при 0°С. Реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры в течение ночи. По прошествии этого времени растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток разводят в этилацетате (200 мл), промывают водным насыщенным раствором карбоната натрия (4х), сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и затем концентрируют до сухости при пониженном давлении. Требуемый продукт i70 получают в виде желтоватого твердого вещества, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки (выход 98%). Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,50 (s, 1Н), 7,30 (br s, 2Н), 6,87 (t, J=53 Гц, 1Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 121,4 (s, 2F).
Способ 24: N-трет-бутилкарбоксилат-N-(5-бром-4-(дифторметил)пиримидин-2-ил)карбамат (i71)
Соединение i70 (4,35 г, 19,4 ммоль, 1,0 экв.) и 4-(диметиламино)пиридин (480 мг, 3,92 ммоль, 0,20 экв.) растворяют в тетрагидрифуране (50 мл). Затем добавляют N,N-диизопропилэтиламин (7,50 мл, 42,1 ммоль, 2,2 экв.) и ди-трет-бутилдикарбонат (9,33 г, 42,7 ммоль, 2,2 экв.) при 0°С и дают полученному раствору нагреться до комнатной температуры в течение ночи. Выпаривают растворитель при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат 9:1→4:1) с получением требуемого продукта i71 в виде бесцветного твердого вещества (выход 85%).
1
2
19
3
H,F
3
Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,92 (s, 1H), 6,73 (t, J=53 Гц, 1Н), 1,47 (s, 18H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 120,4 (s, 2F).
Общая методика 1:
Замещенный монохлортриазин или замещенный монохлорпиримидин (1,0 экв.), соединение i68 (1,1 экв.), ортофосфат калия (2,0 экв.) и хлор(2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил) [2-(2'-амино-1,1'-бифенил)]-палладий(II) (Sigma-Aldrich, номер продукта 741825,0,05 экв.) загружают в колбу. В атмосфере азота добавляют 1,4-диоксан (30 объемов) и деионизированную воду (1,5 объема), после чего полученную смесь непосредственно помещают на масляную баню, предварительно нагретую до 95°С. Реакционную смесь перемешивают при этой температуре в течение 2 часов. Добавляют 5 М водный раствор HCl (20 экв.). Полученную смесь нагревают до 60°С в течение ночи. pH полученной смеси доводят до значения 8-9 добавлением 2 М водного раствора гидроксида натрия, затем смесь экстрагируют этилацетатом (3×20 объемами). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате очистки с помощью флэш-хроматографии получают требуемые продукты структуры (I).
Общая методика 2:
Соединение i71 (1,0 экв.), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би(1,3,2-диоксаборолан) (Manchester Organics, номер продукта М23170, 1,5 экв.), ацетат калия (3,0 экв.) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)-ферроцен]-дихлорпалладий(II) (Sigma-Aldrich, номер продукта 697230, 0,099 экв.) растворяют в 1,4-диоксане (12,5 объемов) в атмосфере азота. Полученную смесь нагревают при 100°С в течение 15 минут (раствор приобретает черный цвет). Для демонстрации полного поглощения исходных веществ используют ТСХ-контроль (циклогексан/этилацетат 3:1).
К полученной смеси добавляют замещенный хлортриазин или замещенный хлорипиримидин (1,1 экв.), водный раствор карбоната калия (2 М, 3,0 экв.) и ранее полученный раствор трифенилфосфина (0,12 экв.) и ацетата палладия (0,04 экв.) в тетрагидрофуране (100 объемов). Полученную смесь нагревают при 60°С в течение 2 часов и затем дают ей остыть до комнатной температуры.
Добавляют 5 М водный раствор HCl (20 экв.). Полученную смесь нагревают до 60°С в течение ночи. pH полученной смеси доводят до значения 8-9 добавлением 2 М водного раствора гидроксида натрия, затем смесь экстрагируют этилацетатом (3×20 объемами). Объединенные органические слои сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате очистки с помощью флэш-хроматографии получают требуемые продукты.
Способ 27: трет-бутил-N-трет-бутоксикарбонил-N-(5-(4-хлор-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-ил)карбамат (i74)
2
3
4
Промежуточное соединение i71 (2,00 г, 4,71 ммоль, 1,0 экв.), бис(пинаколато)дибор (1,80 г, 7,09 ммоль, 1,5 экв.), KOAc (1,60 г, 16,3 ммоль, 3,4 экв.) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]-дихлорпалладий(II) (350 мг, 478 мкмоль, 0,10 экв.) смешивают в 1,4-диоксане в атмосфере азота и нагревают при 95°С в течение 45 минут. Также получают раствор предкатализатора ацетата палладия (II) (43,0 мг, 192 мкмоль, 0,04 экв.) и трифенилфосфина (148 мг, 564 мкмоль, 0,12 экв.) в тетрагидрофуране (2 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем этот раствор добавляют к охлажденному полученному выше раствору при комнатной температуре, после чего добавляют 4-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)морфолин i11 (1,65 г, 7,05 ммоль, 1,5 экв.) и водный раствор KCO (2,4 М, 5,90 мл, 14,2 ммоль, 3,0 экв.). Полученную смесь нагревают при 55°С в течение ночи. По прошествии этого времени смесь выливают в водный раствор NHCl (15%) и экстрагируют этилацетатом (3х). Объединенный органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. В результате очистки с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (циклогексан/этилацетат 1:0-4:1) получают продукт i74 в виде бесцветного твердого вещества (выход 36%).
1
2
19
3
H,F
3
H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,57 (s, 1Н), 7,55 (t, J=54 Гц, 1Н), 3,99-3,91 (m, 4H), 3,84-3,76 (m, 4Н), 1,49 (s, 18H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 121,0 (s, 2F).
Способ 32: (Е)-4-этокси-1,1-дифторбут-3-ен-2-он (i83)
1
3
2
3
3
3
19
3
2
H,H
H,F
H,H
H,H
H,H
3
2
К охлажденному (-70°С) раствору пиридина (61,5 мл, 760,5 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (500 мл) добавляют этилвиниловый эфир (60 мл, 626,5 ммоль, 1 экв.), затем добавляют раствор дифторуксусного ангидрида (88,5 мл, 760,5 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (75 мл). Затем смесь медленно нагревают до комнатной температуры в течение ночи. Смесь переносят в разделительную ворону и промывают органический слой водой (6×800 мл) до тех пор, пока pH водного слоя не станет нейтральным. Органический слой сушат над сульфатом натрия и удаляют растворитель при пониженном давлении с получением требуемого продукта i83 в виде оранжевого масла (76,7 г, 81%). H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 7,92 (d, J=12,5 Гц, 1Н), 6,34 (t, J=53,6 Гц, 1Н), 5,87 (d, J=12,5 Гц, 1Н), 4,14 (q, J=7,1 Гц, 2Н), 1,28 (t, J=7,1 Гц, 3Н); F ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ - 127,39 (s, 2F).
Способ 33: (E)-3-(дифторметил)-5-этокси-3-гидроксипент-4-еннитрил (i84)
1
3
2
3
3
3
3
3
19
2
2
3
2
H,H
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
2
F,F
F,F
К охлажденному (-70°С) 2,5М раствору н-бутиллития (102,9 мл, 256,7 ммоль, 1 экв.) в тетрагидрофуране (435 мл) добавляют ацетонитрил (13,4 мл, 256,7 ммоль, 1 экв.). Образуется белая суспензия, которую перемешивают при -70°С в течение 1,5 часов. К белой суспензии добавляют раствор (E)-4-этокси-1,1-дифторбут-3-ен-2-она (i83) (38,5 г, 256,7 ммоль, 1 экв.) в тетрагидрофуране (65 мл) (смесь превращается в оранжевый раствор). Смесь перемешивают при -70°С в течение 1 часа и медленно нагревают до комнатной температуры. Добавляют воду (400 мл). Затем добавляют этилацетат (600 мл). Слои разделяют и экстрагируют водный слой этилацетатом (3×600 мл). Объединенные органические слои сушат над сульфатом натрия и выпаривают растворитель при пониженном давлении. В результате фильтрования через тонкую силикагелевую прокладку с использованием в качестве элюента смеси циклогексан/этилацетат (3:1), получают требуемый продукт i84 в виде темно-оранжевого масла (43,4 г, 88%). Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 6,66 (d, J=12,8 Гц, 1H), 6,20 (s, 1H), 5,79 (t, J=55,8 Гц, 1Н), 4,75 (d, J=12,8 Гц, 1H), 3,74 (q, J=7,0 Гц, 2Н), 2,88 (d, J=16,8 Гц, 1H), 2,81 (d, J=16,8 Гц, 1H), 1,21 (t, J=7,0 Гц, 3Н); F ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ - 129,32 (d, J=311,2 Гц, 1F), - 130,05 (d, J=311,2 Гц, 1F).
Способ 34: 4-(дифторметил)пиридин-2-амин (i65)
К раствору (Е)-3-(дифторметил)-5-этокси-3-гидроксипент-4-еннитрила (i84) (8,1 г, 42,4 ммоль, 1 экв.) в уксусной кислоте (80 мл) добавляют O-метилгидроксиламина гидрохлорид (Fluorochem, номер продукта 078603) (10,6 г, 127,2 ммоль, 3 экв.). Смесь перемешивают при 50°С в течение 7 часов. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют бромистоводородную кислоту в уксусной кислоте (33%) (14,2 мл, 84,8 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь обезгаживают и помещают в атмосферу азота. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре на водяной бане со льдом, при этом по частям добавляя порошок цинка (8,12 г, 127,2 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют через тонкую целитовую прокладку и промывают фильтровальный осадок этилацетатом. Затем большую часть растворителя удаляют при пониженном давлении. Добавляют 60 мл водного гидроксида аммония (28%). Водный слой экстрагируют дихлорметаном (3×150 мл). Объединенные органические слои сушат над сульфатом натрия. Соединение i65 перекристаллизовывают из дихлорметана и гептана в качестве антирастворителя (смена растворителя в ротационном испарителе). С помощью фильтрации собирают соединение i65 в виде светло-желтого твердого вещества (5,12 г, 84%).
Способ 35: 9-[4-хлор-6-(3-окса-9-азаюицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1] (i89)
2
3
2
1
+
К раствору 3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонана гидрохлорида (176 мг, 1,20 ммоль, 1,05 экв.) и N,N-диизопропилэтиламина (0,42 мл, 2,40 ммоль, 2,1 экв.) в 1,4-диоксане (5 мл) Добавляют раствор i88 (300 мг, 1,14 ммоль, 1 экв.) в 1,4-диоксане (1 мл). Полученную смесь нагревают в течение 3 часов (75°С). Затем добавляют этилацетат (20 мл) и насыщенный водный бисульфат натрия (20 мл). Фазы разделяют и промывают органический слой насыщенным водным бисульфатом натрия (2×20 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенную смесь очищают с помощью автоматизированной флэш-хроматографии (SiO, циклогексан/этилацетат 2:1-0:1) с получением указанного в заголовке соединения i89 в виде бесцветного твердого вещества (297 мг, 75%). Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 4,58 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,00-3,97 (m, 4H), 3,94-3,90 (m, 2H), 3,72-3,64 (m, 6H), 2,46 (m, 1H), 1,90-1,70 (m, 4H), 1,53 (m, 1H), MC (МАЛДИ): m/z=368,0 ([M+H]).
Получение соединений согласно изобретению
Соединение 1: 4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин (1)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 1 из исходных веществ i2 и i68 с выходом 73% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,02 (s, 1H), 7,65 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (s, 1H), 4,85 (br s, 2H), 3,89-3,79 (m, 8H), 3,77-3,72 (m, 8H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,9 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=393,9 ([M+H]).
Соединение 2: 4-(дифторметил)-5-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин (2)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 2 из исходных веществ i2 и i71 с выходом 74% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl); δ 9,20 (s, 1H), 7,62 (t, J=54 Гц, 1H), 5,97 (br, s 2H), 3,91-3,68 (m, 16H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 121,5 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=395,2 ([М+Н]).
Соединение 3: 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин(3)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 3 из исходных веществ i1 и i68 с выходом 75% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,04 (s, 1H), 7,71 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (s, 1H), 4,89 (br s, 2H), 4,71-4,64 (m, 4H), 3,79-3,76 (m, 4H), 3,67-3,62 (m, 4H), 2,09-1,98 (m, 8H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,4-(-117,3) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=446,3 ([M+H]).
Соединение 4: 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (4)
1
19
+
3
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 4 из исходных веществ i12 и i68 с выходом 57% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,03 (s, 1H), 7,68 (m, 1H), 6,83 (s, 1H), 4,94 (br s, 2H), 4,70-4,65 (m, 2H), 3,93-3,57 (m, 12H), 2,14-1,92 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 116,0-(- 116.2) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=420,6 ([M+H]).
Соединение 5: 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин (5)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 5 из исходных веществ i71 и i12 с выходом 50% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,23 (s, 1H), 7,65 (t, J=54 Гц, 1H), 5,66 (br s, 2H), 4,68 (m, 2H), 3,90-3,61 (m, 12H), 2,13-1,92 (4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 120,4-(-121,5) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=420,9 ([М+Н]).
Соединение 6: 5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (6)
1
2
3
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 6 из исходных веществ i3 и i68 с выходом 79% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,87 (s, 1H), 7,70 (t, J=55 Гц, 1Н), 6.86 (s, 1H), 5,48 (br s, 2Н), 4,73-4,72 (m, 2H), 4,41-4,38 (m, 2H), 3,98 (dd, J=11,6, 3,8 Гц, 2H), 3,78 (d, J=12 Гц, 2H), 3,67 (dd, J=12, 3,2 Гц, 2H), 3,52 (td, J=12, 3,0 Гц, 2H), 3,27 (td, J=13, 3,8 Гц, 2H), 1,33 (d, J=6,8 Гц, 6H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,4-(-116,2) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=421,9 ([M+H]).
Соединение 7: 5-(4,6-бис((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин (7)
1
2
3
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 7 из исходных веществ i71 и i3 с выходом 52% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,24 (s, 1H), 7,66 (t, J=54 Гц, 1Н), 5,77 (br s, 2H), 4,73 (br s, 2H), 4,45-4,32 (m, 2H), 3,98 (dd, J=12, 3,6 Гц, 2Н), 3,78 (d, J=12 Гц, 2Н), 3,67 (dd, J=11, 2,8 Гц, 2Н), 3,52 (td, J=12, 2,8 Гц, 2Н), 3,27 (td, J=13, 3,2 Гц, 2Н), 1,33 (d, J=6,8 Гц, 6Н); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 120,5-(-122,7) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=423,3 ([M+H]).
Соединение 8: (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин (8)
1
2
3
19
+
3
H,F
H,H
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 8 из исходных веществ i13 и i68 с выходом 47% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,03 (s, 1Н), 7,70 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (s, 1H), 4,78 (br s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,42-4,38 (m, 1H), 4,00-3,96 (m, 1H), 3,84-3-66 (m, 10H), 3,55-3,50 (m, 1H), 3,30-3,25 (m, 1H), 1,33 (d, J=6,8 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 116,1-(-115,9) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=408,9 ([М+Н]).
Соединение 9: (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин (9)
1
2
3
19
+
3
H,F
H,H
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 9 из исходных веществ i71 и i13 с выходом 60% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,24 (s, 1Н), 7,66 (t, J=54 Гц, 1Н), 5,67 (br s, 2H), 4,74 (m, 1H), 4,41-4,38 (m, 1H), 4,00-3,97 (m, 1H), 3,90-3,72 (m, 9H), 3,68-3,36 (m, 1H), 3,56-3,49 (m, 1H), 3,32-3,25 (m, 1H), 1,33 (d, J=6,9 Гц, 3Н); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 121,3-(- 121,6) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=409,4 ([М+Н]).
Соединение 10: 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (10)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 10 из исходных веществ i18 и i68 с выходом 42% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,04 (s, 1H), 7,69 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (s, 1H), 4,85 (br s, 2H), 4,71-4,65 (m, 3H), 4,42-4,39 (m, 1H), 3,98-3,95 (m, 1H), 3,79-3,76 (m, 3H), 3,70-3,65 (m, 3H), 3,56-3,53 (m, 1H), 3,30-3,27 (m, 1H), 2,10-1,99 (m, 4H), 1,33 (m, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,9-(-116,2) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=434,2 ((М+Н]).
Соединение 11: 5-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-((S)-3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиримидин-2-амин (11)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 11 из исходных веществ i71 и i18 с выходом 46% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,25 (s, 1H), 7,68 (t, J=55 Гц, 1Н), 5,81 (br s, 2H), 4,71-4,65 (m, 3H), 4,42-4,38 (m, 1H), 4,00-3,96 (m, 1H), 3,81-3,60 (m, 6H), 3,55-3,50 (m, 1H), 3,31-3,24 (m, 1H), 2,11-2,00 (m, 4H), 1,37-1,28 (m, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 121,5-(-121,7) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=434,6 ([M+H]).
Соединение 12: 4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин (12)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 12 из исходных веществ i68 и i14 с выходом 86% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,85 (s, 1H), 7,74 (t, J=55 Гц, 1H), 6,84 (s, 2H), 6,75 (s, 1H), 3,82-3,70 (m, 8H), 3,69-3,60 (m, 4H), 2,88-2,80 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,4 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=393,8 ([М+Н]).
Соединение 13: 4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин (13)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 13 из исходных веществ i71 и i14 с выходом 55% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,23 (s, 1Н), 7,64 (t, J=55 Гц, 1Н), 5,60 (br s, 2H), 3,83-3,75 (m, 12H), 2,94-2,88 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 111,4 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=394,1 ([M+H]).
Соединение 14: (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-амин (14)
1
2
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 14 из исходных веществ i21 и i68 с выходом 47% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,02 (s, 1H), 7,67 (t, J=56 Гц, 1Н), 6,84 (s, 1H), 4,90 (br s, 2H), 4,74 (s, 1H), 4,40 (d, J=16 Гц, 1Н), 3,98 (dd, J=4,0 Гц, 12 Гц, 1Н), 3,91 (m, 4H), 3,78 (d, J=12 Гц, 1Н), 3,68 (dd, J=4,0, 12 Гц, 1Н), 3,56 (t, J=4,0 Гц, 1Н), 3,26 (dt, J=4,0, 12 Гц, 1Н), 2,99 (t, J=4,0 Гц, 4Н), 1,32 (d, J=8,0 Гц, 3Н); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,9 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=407,2 ([M+H]).
Соединение 15: (S)-4-(дифторметил)-5-(4-(3-метилморфолино)-6-(пиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)пиримидин-2-амин (15)
1
2
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 15 из исходных веществ i71 и i21 с выходом 30% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,24 (s, 1Н), 7,66 (t, J=56 Гц, 1Н), 5,69 (br s, 2H), 4,74 (s, 1H), 4,40 (d, J=16 Гц, 1H), 4,38 (dd, J=4,0, 12 Гц, 1Н), 3,83 (m, 4H), 3,78 (d, J=12 Гц, 1Н), 3,68 (dd, J=4,0, 12 Гц, 1Н), 3,54 (dt, J=4,0, 12 Гц, 1Н), 3,28 (dt, J=4,0, 12 Гц, 1Н), 2,92 (t, J=8,0 Гц, 4Н), 1,33 (t, J=8,0 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 121,4 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=408,7 ([M+H]).
Соединение 16: 4-(дифторметил)-5-(2,6-диморфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин (16)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 16 из исходных веществ i22 и i68 с выходом 73% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,31 (s, 1H), 7,30 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (s, 1Н), 6,04 (s, 1H), 4,73 (br s, 2H), 3,81-3,72 (m, 12H), 3,65-3,59 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115.1 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=393,3 ([М+Н]).
Соединение 17: 4'-(дифторметил)-2,6-диморфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин (17)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 17 из исходных веществ i71 и i22 с выходом 7% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,60 (s, 1Н), 7,11 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,02 (s, 1H), 5,46 (br s, 2H), 3,80-3,74 (m, 12H), 3,64-3,60 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 119,5 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=394,3 ([М+Н]).
Соединение 18: 4-(дифторметил)-5(4,6-диморфолинопиримидин-2-ил)пиридин-2-амин (18)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 18 из исходных веществ i23 и i68 с выходом 89% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,94 (s, 1H), 7,61 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (s, 1H), 5,50 (s, 1H), 4,74 (br s, 2H), 3,82-3,78 (m, 8H), 3,61-3,57 (m, 8H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,4 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=393,3 ([M+H]).
Соединение 19: 4'-(дифторметил)-4,6-диморфолино-[2,5'-бипиримидин]-2'-амин (19)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 19 из исходных веществ i71 и i23 с выходом 7% в виде бесцветного твердого вещества, Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,16 (s, 1Н), 7,58 (t, J=55 Гц, 1Н), 5,75 (br s, 2H), 5,50 (s, 1H), 3,82-3,79 (m, 8H), 3,61-3,58 (m, 8H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 121,1 (s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=395,3 ([M+H]).
Соединение 20: 4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-пиридин-2-амин (20)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 20 из исходных веществ i15 и i68 с выходом 77% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,02 (s, 1H), 7,65 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (s, 1H), 4,83 (br s, 2H), 4,23-4,07 (m, 4H), 3,90-3,79 (m, 4H), 3,79-3,71 (m, 4H), 2,71-2,62 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 116,0 (s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=410,3 ([M+H]).
Соединение 21: 4-(дифторметил)-5-(4-морфолино-6-тиоморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)-пиримидин-2-амин (21)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 21 из исходных веществ i71 и i15 с выходом 70% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,21 (s, 1H), 7,60 (t, J=54 Гц, 1H), 5,90 (br s, 2H), 4,22-4,06 (m, 4H), 3,91-3,78 (m, 4H), 3,78-3,71 (m, 4H), 2,71-2,62 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 120,5-(- 121,5) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=411,2 ([M+H]).
Соединение 22: 5-(6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.]октан-8-ил)-2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (22)
1
2
19
МС
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 22 из исходных веществ i24 и i68 с выходом 61% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,34 (s, 1H), 7,55 (t, J=55 Гц, 1H), 6,76 (s, 1H), 6,60 (br s, 2H), 6,36 (s, 1H), 4,64-4,47 (m, 4H), 3,67-3,49 (m, 4H), 3,56-3,49 (m, 4H), 1,98-1,79 (m, 8H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9-(-115,2) (m, 2F);  (МАДДИ): m/z=445,3 ([M+H]).
Соединение 23: 5-(2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-морфолинопиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (23)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 23 из исходных веществ i29 и i68 с выходом 54% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,30 (s, 1H), 7,30 (t, J=55 Гц, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,04 (s, 1H), 4,85 (br s, 2H), 4,62 (br s, 2H), 3,82-3,74 (m, 6H), 3,65-3,56 (m, 6H), 2,09-2,00 (m, 2H), 2,00-1,91 (m, 2H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,2-(-116,2) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=419,0 ([M+H]).
Соединение 24: 2-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-4'-(дифторметил)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин (24)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 2 получают соединение 24 из исходных веществ i29 и i71 с выходом 72% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,71 (s, 1Н), 7,35 (s, 2H), 7,32 (t, J=54 Гц, 1Н), 6,45 (s, 1H), 4,54 (br s, 2H), 3,71-3,50 (m, 12H), 1,95-1,78 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 119,2 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=420,6 ([М+Н]).
Соединение 25; 5-(2,6-бис((S)-3-метилморфолино)пиримидин-4-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (25)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 25 из исходных веществ i25 и i68 с выходом 57% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,31 (s, 1Н), 7,52 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,76 (s, 1H), 6,59 (br s, 2H), 6,30 (s, 1H), 4,60-4,50 (m, 1H), 4,44-4,33 (m, 1H), 4,24-4,15 (m, 1H), 4,12-4,04 (m, 1H), 3,94-3,83 (m, 2H), 3,74-3,64 (m, 2H), 3,59-3,51 (m, 2H), 3,45-3,35 (m, 2H), 3,14-3,02 (m, 2H), 1,18 (t, J=7,2 Гц, 6 Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 113,7-(-115,9) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=421,1 ([М+Н]).
Соединение 26: 4'-(дифторметил)-2,6-бис((S)-3-метилморфолино)-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин (26)
1
2
2
3
19
+
3
H,F
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 26 из исходных веществ i25 и i71 с выходом 56% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8.60 (s, 1Н), 7,14 (t, J=54 Гц, 1Н), 5,98 (s, 1H), 5,48 (br s, 2H), 4,71-4,62 (m, 1H), 4,34-4,23 (m, 2H), 4,08-3,92 (m, 3H), 3,83-3,65 (m, 4H), 3,61-3,49 (m, 2H), 3,25 (dt, J=13 Гц, J=3,6 Гц, 2Н), 1,33-1,27 (m, 6H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 119,5 (s, 1F), 119,7 (m, 1F); MC (МАЛДИ): m/z=422,2 ([M+H]).
Соединение 27: (S)-4-(дифторметил)-5-(6-(3-метилморфолино)-2-морфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин (27)
1
2
2
3
2
3
3
19
МС
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 27 из исходных веществ i30 и i68 с выходом 74% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,31 (s, 1Н), 7,30 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (s, 1Н), 6,02 (s, 1H), 4,75 (br s, 2H), 4,35-4,25 (m, 1H), 4,06-3,96 (m, 2H), 3,83-3,69 (m, 10Н), 3,58 (dt, J=12 Гц, J=3,2 Гц, 1Н), 3,25 (dt, J=13 Гц, J=3,8 Гц, 1Н), 1,31 (d, J=6,8 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 114,9-(-115,0) (m, 2F);  (МАЛДИ): m/z=407,1 ([M+H]).
Соединение 28: (S)-4'-(дифторметил)-6-(3-метилморфолино)-2-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин (28)
1
2
2
3
2
3
3
3
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 2 получают соединение 28 из исходных веществ i30 и i71 с выходом 53% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,60 (s, 1Н), 7,13 (t, J=54 Гц, 1Н), 6,01 (s, 1H), 5,47 (br s, 2H), 4,71-4,63 (m, 1H), 4,31 (dd, J=14 Гц, J=2,4 Гц, 1Н), 3,97 (dd, J=11 Гц, J=3,4 Гц, 1Н), 3,79 (t, J=4,6 Гц, 4Н), 3,72-3,66 (m, 2H), 3,65-3,58 (m, 3H), 3,58-3,50 (m, 2H), 3,30-3,21 (m, 1H), 1,30 (d, J=6,8 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 119,7 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=408,9 ([M+H]).
Соединение 29: 5-(4-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-6-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (29)
1
2
19
+
3
H,F
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 29 из исходных веществ i68 и i81 с выходом 89% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,03 (s, 1Н), 7,69 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (s, 1H), 4,85 (br s, 2H), 4,50-4,24 (m, 8H), 3,28-3,12 (m, 4H), 1,94 (br s, 4H), 1,86-1,71 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,1-(-117,2) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=446,3 ([M+H]).
Соединение 30: 5-[4,6-бис(2,2-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (30)
1
2
МС
+
3
2
H,F
Согласно общей методике 1 получают соединение 30 из исходных веществ i68 и i80 с выходом 63% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,86 (s, 1H), 7,71 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 3,81-3,56 (m, 12H), 1,14 (s, 12H);  (МАЛДИ): m/z=450,0 ([M+H]).
Соединение 31: (S)-4-(дифторметил)-5-(2-(3-метилморфолино)-6-морфолинопиримидин-4-ил)пиридин-2-амин (31)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 31 из исходных веществ i28 и i68 с выходом 58% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,31 (s, 1Н), 7,52 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,74 (s, 1H), 6,59 (br s, 2H), 6,35 (s, 1H), 4,59-4,51 (m, 1Н), 4,22-4,14 (m, 1H), 3,91-3,84 (m, 1H), 3,72-3,50 (m, 10H), 3,44-3,35 (m, 1H), 3,14-3,03 (m, 1H), 1,16 (d, J=6,7 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 113,7-(-115,3) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=407,1 ([M+H]).
Соединение 32: (S)-4'(дифторметил)-2-(3-метилморфолино)-6-морфолино-[4,5'-бипиримидин]-2'-амин (32)
1
2
2
3
2
3
3
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
2
Согласно общей методике 2 получают соединение 32 из исходных веществ i28 и i71 с выходом 63% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,60 (s, 1H), 7,13 (t, J=54 Гц, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,46 (br s, 2H), 4,34-4,25 (m, 1H), 4,06-3,97 (m, 2H), 3,82-3,68 (m, 10H), 3,58 (dt, J=12 Гц, J=3,2 Гц, 1H), 3,26 (dt, J=13 Гц, J=3,7 Гц, 1H), 1,31 (d, J=6,8 Гц, 3Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 119,5 (s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=408,7 ([M+H]).
Соединение 33: 4-(дифторметил)-5-[4-[(2S,6R)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (33)
1
2
3
3
МС
+
3
2
H,F
H,H
H,H
Согласно общей методике 1 получают соединение 33 из исходных веществ i68 и i82 с выходом 71% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,87 (s, 1H), 7,74 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,71-4,62 (m, 1H), 4,45-4,34 (m, 2H), 4,31-4,09 (m, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,71 (m, 1H), 3,55 (m, 3H), 3,38 (m, 1H), 3,13 (m, 1H), 2,55 (m, 2H), 1,20 (d, J=6,9 Гц, 3Н), 1,19 (d, J=6,9 Гц, 6Н);  (МАЛДИ): m/z=436,1 ([М+Н]).
Соединение 34: 5-[4,6-бис[(2R,6S)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (34)
1
2
МС
+
3
2
H,F
Согласно общей методике 1 получают соединение 34 из исходных веществ i68 и i79 с выходом 75% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,86 (s, 1H), 7,71 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4.64-4,46 (m, 4H), 3,60-3,48 (m, 4H), 2,63 (m, 4H), 1,14 (m, 12H);  (МАЛДИ): m/z=450,0 ([М+Н]).
Соединение 37: 5-[4,6-бис(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (37)
1
3
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 37 из исходных веществ i7 и i68 с выходом 39% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,85 (s, 1H), 7,68 (t, J=55 Гц, 1H), 6,87 (br s, 2H), 6,74 (s, 1H), 4,51 (br s, 2H), 4,45 (br s, 2H), 4,07-3,93 (m, 8H), 3,79-3,67 (m, 8H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,8 (s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=478,1 ([М+Н]).
Соединение 38: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2амин (38)
1
3
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 38 из исходных веществ i35 и i68 с выходом 67% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,87 (s, 1H), 7,73 (t, J=55 Гц, 1H), 6,87 (br s, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,70-4,54 (m, 2H), 4,53-4,43 (m, 2H), 4,05-3,97 (m, 4H), 3,79-3,67 (m, 4H), 3,63-3,55 (m, 4H) 2,00-1,83 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,8 (s, 1F), - 115,9 (s, 1F); МС (МАЛДИ): m/z=462,1 ([M+H]).
Соединение 39: 5-[4,6-бис(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (39)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 39 из исходных веществ i4 и i68 с выходом 28% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,78 (s, 1H), 7,70 (t, J=55 Гц, 1H), 6,82 (br s, 2H), 6,77 (s, 1H), 3,87-3,75 (m, 8H), 3,45 (br s, 4H), 1,49 (s, 12H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9-(-115,1) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=450,1 ([M+H]).
Соединение 40; 5-[4,6-бис[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (40)
1
2
2
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 40 из исходных веществ i6 и i68 с выходом 42% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,90 (s, 1H), 7,82 (t, J=55 Гц, 1H), 6,84 (br s, 2H), 6,77 (s, 1H), 4,59-4,43 (m, 4H), 3,82-3,73 (m, 4H), 3,60-3,51 (m, 4H), 1,29 (d, J=6,9 Гц, 12H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9-(-115,0) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=450,2 ([М+Н]).
Соединение 41: 5-[4,6-бис[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (41)
1
2
2
2
3
2
2
3
2
3
2
3
2
19
+
3
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
Согласно общей методике 1 получают соединение 41 из исходных веществ i5 и i68 с выходом 98% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 9,04 (s, 1H), 7,70 (t, J=52,0 Гц, 1Н), 6,84 (s, 1H), 4,88 (br s, 2H), 4,77-4,72 (m, 2H), 4,41 (d, J=12,0 Гц, 2H), 3,98 (dd, J=12,0 Гц, J=4,0 Гц, 2H), 3,78 (d, J=12,0 Гц, 2H), 3,68 (dd, J=12,0 Гц, J=4,0 Гц, 2H), 3,53 (dt, J=12,0 Гц, J=4,0 Гц, 2H), 3,28 (dt, J=12,0 Гц, J=4,0 Гц, 2H), 1,33 (d, J=8,0 Гц, 6H); F ЯМР (376 МГц, CDCl): δ - 115,9 (s, 1F), - 116,0 (s, 1F); МС (МАЛДИ): m/z=421,7 ([M+H]).
Соединение 42: 4-(дифторметил)-5[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-5-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (42)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 42 из исходных веществ i16 и i68 с выходом 35% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,83 (s, 1H), 7,73 (t, J=55 Гц, 1H), 6,84 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 3,85-3,76 (m, 4H), 3,76-3,63 (m, 8H), 3,45 (br s, 2H), 1,49 (s, 6H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 116 (s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=422,1 ([М+Н]).
Соединение 44: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2--ил]пиридин-2-амин (44)
1
2
3
3
3
3
19
+
3
2
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 44 из исходных веществ i37 и i68 с выходом 75% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,89 (s, 1Н), 7,79 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,65 (br s, 1H), 4,50 (br s, 2H), 4,37-4,25 (m, 1H), 3,93 (dd, J=11 Гц, J=3,2 Гц, 1Н), 3,79-3,67 (m, 3H), 3,59-3,51 (m, 3H), 3,45-3,36 (m, 1H), 3,22-3,11 (m, 1H), 1,30 (d, J=6,7 Гц, 6Н), 1,24 (d, J=6,7 Гц, 3Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=436,1 ([M+H]).
Соединение 45: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (45)
1
2
2
3
2
3
3
19
+
3
2
H,F
H,H
H,H
H,H
H,H
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 45 из исходных веществ i38 и i68 с выходом 71% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,84 (s, 1Н), 7,74 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,58 (br s, 1H), 4,31-4,19 (m, 1H), 3,93 (dd, J=12 Гц, J=3,9 Гц, 1Н), 3,84-3,81 (m, 4H), 3,76-3,69 (m, 1H), 3,58 (dd, J=11 Гц, J=3,2 Гц, 1Н), 3,46-3,38 (m, 3H), 3,23-3,13 (m, 1H), 1,50 (br s, 6H), 1,23 (d, J=6,7 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,8-(-115,5) (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=436,0 ([M+H]).
Соединение 46: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (46)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 46 из исходных веществ i39 и i68 с выходом 67% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,87 (s, 1H), 7,77 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,67 (br s, 2H), 4,44-4,24 (m, 2H), 3,96-3,83 (m, 3H), 3,75-3,63 (m, 2H), 3,60-3,36 (m, 5H), 3,31 (s, 3H), 3,21-3,04 (m, 2H), 1,23 (d, J=6,7 Гц, 3Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=452,3 ([M+H]).
Соединение 47: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (47)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 47 из исходных веществ i36 и i68 с выходом 85% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,86 (s, 1H), 7,72 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,64 (br s, 1H), 4,53-4,42 (m, 2H), 4,37-4,25 (m, 1H), 4,05-3,96 (m, 4H), 3,92-3,84 (m, 1H), 3,77-3,66 (m, 5H), 3,60-3,52 (m, 1H), 3,44-3,35 (m, 1H), 3,22-3,10 (m, 1H), 1,23 (d, J=6,7 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9-(-117,1) (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=450,0 ([M+H]).
Соединение 50: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(3-окса-6-азабицикло[3.1.1]гептан-6-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (50)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 50 из исходных веществ i40 и i68 с выходом 52% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,90 (s, 1H), 7,82 (t, J=55 Гц, 1H), 6,87 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,55-4,51 (m, 1H), 4,34-4,14 (m, 3H), 4,12-4,25 (m, 2H), 3,92-3,80 (m, 1H), 3,76-3,68 (m, 3H), 3,55-3,51 (m, 1H), 3,38 (m, 1H), 3,20-3,13 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,20 (d, J=6,9 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=420,6 ([M+H]).
Соединение 51: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(6-окса-3-азабицикло[3.1.1]гептан-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (51)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получает соединение 51 из исходных веществ i41 и i68 с выходом 36% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,99 (s, 1H), 7,89 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2H), 6,77 (s, 1H), 4,69 (m, 3H), 4,37 (m, 1H), 3,91-3,85 (m, 3H), 3,75-3,53 (m, 4H), 3,42-3,35 (m, 1H), 3,22-3,15 (m, 1H), 3,12-3,08 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,24 (d, J=6,9 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 116,0 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=420,6 ([M+H]).
Соединение 52: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-[(1R,4R)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (52)
1
3
19
+
3
2
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 52 из исходных веществ i42 и i68 с выходом 44% в виде бесцветного твердого вещества (смесь ротамеров в соотношении 1:1). H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,89 (m, 1H), 7,77 (m, 1H), 6,84 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 5,02-4,97 (m, 1H), 4,68-4,66 (m, 2H), 4,31 (m, 1H), 3,89-3,85 (m, 1H), 3,79-3,57 (m, 3H), 3,57-3,44 (m, 4H), 3,22 (m, 1H), 1,90-1,83 (m, 2H), 1,21 (d, J=6,9 Гц, 3 H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,5 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=420,2 ([М+Н]).
Соединение 53: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-[(1S,4S)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил]-1,3,5-триазин-2-ил1пиридин-2-амин (53)
1
3
19
+
3
2
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 53 из исходных веществ i43 и i68 с выходом 53% в виде бесцветного твердого вещества (смесь ротамеров в соотношении 1:1). Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,90 (m, 1H), 7,77 (m, 1H), 6,84 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 5,02-4,96 (m, 1H), 4,68-4,62 (m, 2H), 3,90 (m, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,70 (m, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,45 (m, 3H), 3,20 (m, 1H), 1,90-1,83 (m, 2H), 1,21 (d, J=6,9 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=420,2 ([М+Н]).
Соединение 54: 5-[4,6-бис[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (54)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 54 из исходных веществ i8 и i68 с выходом 61% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,87 (s, 1H), 7,77 (t, J=55 Гц, 1H), 6,83 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,47 (m, 4H), 3,89-3,81 (m, 4H), 3,51-3,34 (m, 4H), 3,12 (m, 2H), 1,71 (m, 4H), 0,86 (m, 6H), F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=450,3 ([M+H]).
Соединение 55: 5-[4,6-бис(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (55)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 55 из исходных веществ i9 и i68 с выходом 59% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,74 (s, 1H), 7,65 (t, J=55 Гц, 1H), 6,81 (br s, 2H), 6,75 (s, 1H), 3,68 (m, 8H), 3,49 (m, 4H), 2,46-2,38 (m, 4H), 2,25-2,16 (m, 4H), 1,72-1,66 (m, 4H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,5 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=474,3 ([M+H]).
Соединение 56: 5-[4,6-бис[(3R)-3-изопропилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (56)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 56 из исходных веществ i10 и i68 с выходом 59% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,87 (s, 1Н), 7,76 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,82 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,50 (m, 2Н), 4,29 (m, 2Н), 4,02-3,84 (m, 4Н), 3,40 (m, 4Н), 3,08 (m, 2Н), 2,34 (m, 2Н), 1,02 (m, 6Н), 0,77 (m, 6Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=478,4 ([М+Н]).
Соединение 66: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (66)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 66 из исходных веществ i55 и i68 с выходом 61% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,87 (s, 1Н), 7,77 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,46 (m, 2Н), 3,81-3,77 (m, 6Н), 3,55 (m, 2Н), 3,44 (m, 2Н), 1,49 (s, 6Н), 1,28 (d, J=6,9 Гц, 6H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,0 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=450,4 ([M+H]).
Соединение 67: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[(3R)-3-(метоксиметил)морфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (67)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 67 из исходных веществ i56 и i68 с выходом 37% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,84 (s, 1Н), 7,89 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,60 (m, 1Н), 4,31 (m, 1Н), 3,92 (m, 2Н), 3,83 (m, 4Н), 3,65 (m, 1Н), 3,51-3,41 (m, 5Н), 3,28 (s, 3Н), 3,12 (m, 1Н), 1,49 (s, 3Н), 1,48 (s, 3Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,5 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=466,4 ([M+H]).
Соединение 68: [(3R)-4-[4-[6-амино-4-(дифторметил)-3-пиридил]-6-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]морфолин-3-ил]метанол (68)
1
19
+
3
2
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 68 из исходных веществ i57 и i68 с выходом 58% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,83 (s, 1Н), 7,77 (m, 1Н), 6,84 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,91 (m, 1Н), 4,35 (m, 2Н), 4,05 (m, 1Н), 3,97-3,70 (m, 6Н), 3,54-3,38 (m, 5Н), 3,12 (m, 1Н), 1,49 (s, 3Н), 1,48 (s, 3H) F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,5 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=452,2 ([M+Н]).
Соединение 69: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-(3,7-диокси-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (69)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 69 из исходных веществ i54 и i68 с выходом 57% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,83 (s, 1Н), 7,69 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,47-4,37 (m, 2Н), 4,01 (m, 4Н), 3,80-3,71 (m, 8Н), 3,45 (m, 2Н), 1,48 (s, 6Н); F ЯМР (376 МГЦ, (CD)SO): δ - 115,7 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=464,3 ([M+H]).
Соединение 70: 5-[4-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-6-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (70)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 70 из исходных веществ i58 и i68 с выходом 12% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,82 (s, 1Н), 7,72 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 3,82 (m, 4Н), 3,71 (m, 4Н), 3,44 (m, 2Н), 2,58 (m, 4Н), 1,64 (m, 1Н), 1,44 (s, 6Н), 0,45 (m, 2Н), 0,36 (m, 2Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,4 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=460,4 ([М]).
Соединение 71: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,3-диметилморфолин-4-ил)-6-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (71)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 71 из исходных веществ i59 и i68 с выходом 42% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,82 (s, 1Н), 7,73 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,83 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 3,88-3,69 (m, 10Н), 3,47-3,44 (m, 4Н), 3,24 (m, 3Н), 2,52-2,45 (m, 4Н), 1,44 (s, 6Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,4 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=478,4 ([M]).
Соединение 77: [(3R)-4-[4-[6-амино-4-(дифторметил)-3-пиридил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]морфолин-3-ил]метанол (77)
1
2
3
МС
+
3
2
H,F
H,H
Согласно общей методике 1 получают соединение 77 из исходных веществ i53 и i68 с выходом 31% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,88 (s, 1H), 7,78 (t, J=55 Гц, 1H), 6,84 (br s, 2H), 6,76 (s, 1H), 4,96 (m, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,58-4,24 (m, 3H), 4,05 (m, 1H), 3,90 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,59 (m, 1H), 3,51-3,36 (m, 4H), 3,23-3,02 (m, 2H), 1,23 (d, J=6,9 Гц, 3H); (МАЛДИ): m/z=438,3 ([M+H]).
Соединение 78: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R,5R)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (78)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 78 из исходных веществ i85 и i68 с выходом 71% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,90 (s, 1Н), 7,82 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,66 (m, 1Н), 4,32 (m, 3Н), 4,15-4,11 (m, 2Н), 3,92 (m, 1Н), 3,70 (m, 3Н), 3,57 (m, 1Н), 3,40 (m, 1Н), 3,18 (m, 1Н), 1,37 (m, 6Н), 1,24 (d, J=6,9 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=435,4 ([M]).
Соединение 79: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (79)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 79 из исходных веществ i86 и i68 с выходом 65% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,91 (s, 1Н), 7,82 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,66 (m, 1Н), 4,32 (m, 3Н), 4,15-4,11 (m, 2Н), 3,92 (m, 1Н), 3,70 (m, 3Н), 3,57 (m, 1Н), 3,40 (m, 1Н), 3,19 (m, 1Н), 1,37 (m, 6Н), 1,24 (d, J=6,9 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9 (br s, 2 F); МС (МАЛДИ): m/z=434,3 ([M]).
Соединение 80: 4-(дифторметил)-5-[4-морфолино-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (80)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 80 из исходных веществ i87 и i68 с выходом 57% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,85 (s, 1Н), 7,73 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2H), 6,75 (s, 1Н), 4,61-4,57 (m, 2Н), 3,95 (m, 2Н), 3,75-3,65 (m, 10Н), 2,48 (m, 1Н), 1,88-1,72 (m, 4Н), 1,57 (m, 1Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,4 (m, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=434,3 ([М+Н]).
Соединение 82: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-(3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (82)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 82 из исходных веществ i89 и i68 с выходом 51% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,84 (s, 1Н), 7,70 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (br s, 2Н), 6,75 (s, 1Н), 4,62 (m, 1Н), 4,54 (m, 1Н), 4,52 (m, 1Н), 4,44 (m, 1Н), 4,04-3,92 (m, 6H), 3,75-3,62 (m, 6H), 2,45 (m, 1H), 1,89-1,75 (m, 4H), 1,57 (m, 1H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,7 (m, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=476,2 ([M+H]).
Соединение 83: 5-[4,6-бис[(3S,5S)-3,5-диметилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]-4-(дифторметил)пиридин-2-амин (83)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 83 из исходных веществ i90 и i68 с выходом 56% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,92 (s, 1Н), 7,87 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2Н), 6,77 (s, 1Н), 4,32 (m, 4Н), 4,14 (m, 4Н), 3,70 (m, 4Н), 1,39 (d, J=6,9 Гц, 12H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,5 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=448,3 ([M]).
Соединение 84: 4-(дифторметил)-5-[4-(3,7-диокса-9-азабицикло[3.3.1]нонан-9-ил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (84)
1
2
19
+
3
2
H,F
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 84 из исходных веществ i91 и i68 с выходом 63% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,86 (s, 1Н), 7,71 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,87 (br s, 2Н), 6,75 (s, 1Н), 4,49 (m, 2Н), 4,02 (m, 4Н), 3,74-3,65 (m, 12Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,6 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=436,4 ([M+H]).
Соединение 85: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3S-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (85)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 85 из исходных веществ i92 и i68 с выходом 52% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,88 (s, 1Н), 7,77 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,70-4,25 (m, 4Н), 3,90 (m, 3Н), 3,72 (m, 1Н), 3,60-3,45 (m, 4Н), 3,16 (m, 2Н), 1,73 (m, 2Н), 1,22 (d, J=6,9 Гц, 3H), 0,86 (m, 3Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9 (br s, 2F); MC (МАЛДИ): m/z=436,9 ([M+H]).
Соединение 86: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-этилморфолин-4-ил]-6-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (86)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 86 из исходных веществ i93 и i68 с выходом 47% в виде бесцветного твердого вещества. Н ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,88 (s, 1Н), 7,77 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,85 (br s, 2Н), 6,76 (s, 1Н), 4,65 (m, 1Н), 4,49-4,30 (m, 3Н), 3,93-3,82 (m, 3Н), 3,72 (m, 1Н), 3,57 (m, 1Н), 3,50 (m, 1Н), 3,43-3,37 (m, 2Н), 3,19-3,14 (m, 2Н), 1,73 (m, 2Н), 1,22 (d, J=6,9 Гц, 3H), 0,86 (m, 3Н); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 115,3 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=436,9 ([M+H]).
Соединение 88: 4-(дифторметил)-5-[4-[(3R)-3-метилморфолин-4-ил]-6-(8-окса-5-азаспиро[3.5]нонан-5-ил)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-амин (88)
1
2
3
19
+
3
2
H,F
H,H
3
2
Согласно общей методике 1 получают соединение 88 из исходных веществ i94 и i68 с выходом 50% в виде бесцветного твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, (CD)SO): δ 8,82 (s, 1Н), 7,71 (t, J=55 Гц, 1Н), 6,84 (br s, 2Н), 6,75 (s, 1Н), 4,55 (m, 1Н), 4,23 (m, 1Н), 3,91 (m, 1Н), 3,78 (m, 2Н), 3,69 (m, 3Н), 3,56 (m, 1Н), 3,50 (m, 2Н), 3,41 (m, 1Н), 3,16 (m, 1Н), 2,50 (m, 2Н), 2,26 (m, 2Н), 1,73 (m, 2Н), 1,21 (d, J=6,9 Гц, 3H); F ЯМР (376 МГц, (CD)SO): δ - 114,9 (br s, 2F); МС (МАЛДИ): m/z=446,8 ([M+H]).
ПРИМЕР 2
Анализ связывания mTOR in vitro и вестерн-блоттинг с использованием фиксированных клеток
Анализ связывания mTOR in vitro
2
mTOR, меченую GST по N-концу (кат. № PR8683B; 0,45 мг/мл; усеченная версия: аминокислоты 1360-2549), киназный «трейсер» Tracer 314, меченый Alexa Fluor  647 (кат. № PV6087), Eu-меченое антитело к GST LanthaScreen (кат. № PV5594) были приобретены у Life Technologies. 1х буфер для киназы mTOR состоит из 50 мМ HEPES рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1 мМ EGTA и 0,01% Pluronic F-127 (кат. № Sigma № P2443-250G).
Тестировали серию из 10 4-кратных последовательных разбавлений (самая высокая концентрация - 10 мкмоль/л и самая низкая - 40 пмоль/л) каждого соединения на связывание mTOR в двух параллельных определениях в 384-луночном планшете. Для проведения анализа связывания киназы LanthaScreen 5 мкл тестируемых соединений концентрировали до концентрации, в 3 раза превышающей конечную, смешивали 5 мкл смеси 9 нМ GST-mTOR/6 нМ Eu-меченого антитела к GST и 5 мкл 30 нМ раствора Tracer 314 с получением конечной концентрации 3 нМ GST-mTOR, 2 нМ Eu-меченого антитела к GST и 10 нМ Tracer 314 на лунку. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре проводили FRET (флуоресцентный индуктивно-резонансный перенос энергии) с временным разрешением с помощью мультирежимного ридера микропланшетов Synergy 4 (Biotek Instruments), используя следующие настройки: задержка в 100 микросекунд перед сбором данных, время сбора данных 200 микросекунд, по 10 измерений на каждую экспериментальную точку. Эмиссионный фильтр: 665 нм/8 нм с чувствительностью, установленной на 190, и 620 нм/10 нм с чувствительностью, установленной на 130; Фильтр возбуждения: 340 нм/30 нм; Дихроичное зеркало 400 нм.
50
Для анализа данных вычитали средний фон (лунки, содержащие только буфер для киназы mTOR) и вычисляли отношение эмиссии путем деления сигнала, испускаемого акцептором (Tracer 314, меченый Alexa Fluor 647) при 665 нм, на сигнал, испускаемый донором (Eu-меченое антитело) при 620 нм. Значения IC каждого соединения определяли путем построения кривой зависимости отношения эмиссии от концентраций соединений (в логарифмическом масштабе), а затем путем аппроксимации данных сигмоидальной кривой доза-ответ с переменным наклоном с помощью GraphPad™ Prism.
Вестерн-блоттинг с использованием фиксированных клеток
Клетки А2058 высевают с плотностью 20 000 клеток/лунка в 96-луночный планшет (Perkin Elmer, кат. №6005558) и через 24 часа обрабатывают различными соединениями в течение 1 часа. Клетки обрабатывают 7 различными концентрациями каждого соединения (5 мкМ, 1,25 мкМ, 0,625 мкМ, 0,3125 мкМ, 0,155 мкМ, 0,08 мкМ и 0,04 мкМ). Клетки фиксируют 4% параформальдегидом на 30 минут при комнатной температуре, дважды промывают 1% BSA в PBS, пермеабилизуют 0,1% Triton Х-100 в PBS/1% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре и блокируют 5% козьей сывороткой в PBS/1% BSA/0,1% Triton Х-100 в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки окрашивают первичным антителом с кроличьим антителом к pPKB S473 (1:500, Cell Signaling Technology, кат. №4058) в сочетании с мышиным антителом к α-тубулину (1:2000, использовалось для нормализации; Sigma, кат. №Т9026), или с кроличьим антителом к pS6 S235/S236 (1:500; Cell Signaling Technology, кат. №4856) в сочетании с мышиным антителом к α-тубулину (1:2000, использовалось для нормализации) в течение ночи при 4°С. После 3-кратной 5-минутной промывки PBS/1% BSA/0,1% triton клетки обрабатывают вторичным козьим антимышиным IRDye680 (LICOR, кат. №926-68070) и козьим антикроличьим IRDye800 антителом (LICOR, 926-32211) (каждое разбавленное 1:500 в PBS/1% BSA/0,1% triton) в течение 1 часа при встряхивании в темноте. Клетки 3 раза по 5 минут промывают PBS/1% BSA/0,1% triron и сканируют планшет с помощью инфракрасной системы сканирования Odyssey, используя оба канала 700 и 800 нм. В качестве контроля 0% ингибирования к клеткам добавляют носитель (0,2% ДМСО). Для коррекции фонового окрашивания в анализе данных лунки обрабатывают только вторичными антителами.
Для анализа данных средний фоновый сигнал от канала 700 нм и 800 нм вычитают из каждого сигнала в каналах 700 нм и 800 нм, соответственно. Сигналы в каждом канале нормализуют к 0% ингибирования, а затем рассчитывают отношение сигнала при 800 нм к сигналу при 700 нм для получения значений для pPKB S473 или pS6 S235/S236, нормированных к α-тубулину.
50
Значения IC каждого соединения определяют путем построения кривой зависимости нормализованных сигналов pPBK S473 и pS6 S235/S236, соответственно, от концентраций соединений (в логарифмическом масштабе), а затем путем аппроксимации данных сигмоидальной кривой доза-ответ с переменным наклоном с помощью GraphPad™ Prism.
ПРИМЕР 3
Переносимость соединения 3 и соединения 8 у мышей
Максимальная переносимая доза (МПД) соединения 3 и соединения 8 у голых мышей BALB/c
Чтобы установить дозу, которая может быть использована для дальнейших экспериментов, и чтобы продемонстрировать переносимость соединений согласно настоящему изобретению, самок голых мышей BALB/c голых подвергали обработке соединением 3 и соединением 8 посредством вводимого через рот (п/о) желудочного зонда дважды в течение пяти дней с двухдневным перерывом в дозировании между ними. Соединения вводят в следующем носителе: 20% гидроксипропил-β-циклодекстрин (HPBCD), 10% ДМСО и 70% воды. Основной конечной точкой была оценка потери массы тела и выживаемости животных. Массы тела регистрировали ежедневно в течение периода дозирования и по меньшей мере два раза в неделю после его окончания. Ежедневно проверяли наличие погибших животных для установления выживаемости. Животных оценивали в течение 7 дней после введения заключительной дозы. Переносимую дозу определяли как дозу, приводящую к потере массы тела менее чем на 20%, и не приводящую к смерти, связанной с лечением, в ходе исследования. Для распределения экспериментальных животных в группы использовали схему рандомизированных блоков. Сначала экспериментальных животных разделяли на однородные блоки в соответствии с их первоначальной массой тела. Затем в каждом блоке проводили рандомизацию экспериментальных животных в группы лечения.
Поставщик животных: Shanghai Lingchang Bio-Technology Co. Ltd (LC, Шанхай, Китай). № сертификата для животных: 2013001803305. Мышей содержали в системах клеток с индивидуальной вентиляцией (IVC) при постоянной температуре и влажности, по 5 животных в каждой клетке.
Рацион: рацион мышей, корм в сухих гранулах, стерилизованный излучением С060. У животных был свободный доступ в течение всего периода исследования. Вода: обратноосмотическая вода, автоклавированная перед использованием. У животных был свободный доступ к стерильной питьевой воде.
Голые мыши BALB/c, несущие опухоли OVCAR-3 и SUDHL/6, получали лечение соединением 3, п/о в дозе 100 мг/кг в течение 21 или 15 дней подряд, соответственно, при одинаковых условиях. Масса тела мышей была стабильной.
У мышей BALB/c были определены следующие МПД: соединение 3: 100 мг/кг, соединение 8: 25 мг/кг. Таким образом, как соединение 3, так и соединение 8 хорошо переносятся в терапевтически эффективных дозах (см. пример 4).
ПРИМЕР 4
Фармакокинетика (ФК) соединения 3 и соединения 8
Чтобы определить распределение соединений в организме, определяли ФК профиль соединений у крыс и мышей. Для лечения неврологических расстройств обязательно использовать соединения, которые пересекают гематоэнцефалический барьер и достигают эффективных концентраций в головном мозге.
А. ФК у крыс Спрег-Доули (СД)
После однократного перорального введения соединения 3, самкам крыс СД давали 10 мг/кг в носителе, состоящем из ДМСО/HPBCD 20% Животных содержали в контролируемой среде, а в камерах было обеспечено стерильное и достаточное пространство с подстилками, пищей и водой, обогащением среды и социальным обогащением (размещение в группах). Крыс случайным образом распределяли на группы в соответствии с их индивидуальной массой тела, подвергали лечению и собирали образцы крови, мозга и печени и подвергали быстрой заморозке в следующие моменты времени: 0,5, 2,4 и 8 часов. Кровь (приблизительно 500-700 мкл, собранную посредством пункции сердца под наркозом) незамедлительно переносили в пробирки, содержащие литий-гепарин в качестве антикоагулянта (идентификатор: Т MLH, Venoject, Terumo). Пробирки центрифугировали при 1300 g в течение 10 минут при +4°С. Полученную плазму собирали и подвергали быстрой заморозке в жидком азоте, и хранили при -80°С до проведения анализа.
Концентрации соединений определяли с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Калибровочные кривые строили с помощью стандартов известных концентраций.
Результаты показаны на фиг. 1А. Соединение 3 демонстрирует хорошую пероральную биодоступность и превосходное проникновение в мозг. Cmax, составляющая 1,4 нг/мл в плазме и 1,3 нг/мл в мозге, указывает на достаточно высокие экспозиции для целевого взаимодействия (таблица 1).
В. ФК у мышей B57BL/6J
Мышам B57BL/6J однократно вводили 50 мг/кг соединения 3 и соединения 8 перорально, через желудочный зонд. Животных содержали в комнатах с контролируемым температурным режимом, и они имели свободный доступ к пище и воде. Исследуемые вещества взвешивали в стеклянных флаконах и сначала растворяли в ДМСО. Затем добавляли Твин 80 и, наконец, завершали приготовление препарата добавлением HPPCD 20%. Препараты вводили через желудочный зонд в t=0 ч и в каждый из 8 моментов времени, трем мышам из каждой группы лечения давали наркоз изофлураном для взятия проб крови путем прокола ретробульбарного венозного сплетения. Кровь отбирали в пробирки, содержащие К3-ЭДТА, и хранили на льду до проведения центрифугирования при 3000xg (10 мин, 4°С). Супернатант плазмы отделяли и хранили при -20°С до проведения анализа. Образцы мышцы бедра и мозга мышей были подвергали быстрой заморозке. Образцы мозга и мышц гомогенизировали в PBS с по мощно гомогенизатора Precellys 24/Dual.
Образцы анализировали с помощью ЖХ-МС. Калибровочные стандарты готовили путем внесения в 20 мкл не содержащей лекарственного средства холостой плазмы добавок калибровочного раствора. Объем 40 мкл ацетонитрила, содержащий внутренний стандарт (150 нг/мл диазепама для образцов 2015PQR002 и 300 нг/мл гризеофульвина для образцов 2015PQR004), затем добавляли к 20 мкл гомогената мозга или мышцы, калибровочному стандарту для мозга/мышцы и контрольному образцу мозга/мышцы. Образцы интенсивно встряхивали и центрифугировали в течение 10 минут при 6000 g и 20°С. Супернатант, не содержащий частиц, разбавляли 1 объемом воды. Аликвоту переносили в виалы для образцов объемом 200 мкл и затем проводили ЖХ-МС с объемом пробы 1,5 мкл.
Как соединение 3, так и соединение 8 имеют хорошую пероральную биодоступность у мышей (фиг. 1В). Распределение между плазмой и мозгом указывает на проникновение через гематоэнцефалический барьер. Период полувыведения соединений у мышей был оценен примерно в 4,7-4,8 часа. Фармологические параметры представлены в таблице 1.
ПРИМЕР 5
Целевое взаимодействие соединения 3 и соединения 8 в мозге и мышцах
У мышей B57BL/6J, использованных для ФК анализа, брали образцы мозга и мышц бедра (пример 4). Ткань подвергали быстрой заморозке в жидком азоте и хранили при -80°С. Ткань размораживали оттаиванием и лизировали в буфере RIP А в количестве 1 мл/половина мозга. До проведения лизиса в буфер добавляли ингибитор протеазы Complete и ингибитор фосфатазы PhosStop (Roche). Ткань гомогенизировали вручную и дважды центрифугировали при 16000 об/мин, 4°С в течение 20 минут. Супернатант замораживали с помощью 10% глицерина при -80°С. Определение концентрации белка проводили с использованием реактива Брэдфорда. Для анализа фосфорилирования АКТ и S6rP с помощью вестерн-блоттинга 30 мкг белка денатурировали β-меркаптоэтанолом при 95°С и разделяли на гелях SDS-PAGE (электрофорез белков в полиакриламидном геле) при 100 В. Затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США) при 80 В. Неспецифическое связывание блокировали 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma-Aldrich, США). Мембраны инкубировали в течение ночи с первичным антителом, растворенным в TBST, 5% BSA при 4°С, и со вторичным антителом, связанным с пероксидазой хрена (GE Healthcare, Великобритания), в течение 1 часа при комнатной температуре, и промывали. Визуализацию полос белков осуществляли с помощью Luminol (Biozym, Гамбург, Германия) на ридере Li-Cor Odyssey FC. Количественное определение фосфорилирования S6 определяли с помощью этой же системы визуализации.
Использовали следующие антитела:
АКТ, Р-АКТ (S473), S6rP, P-S6rP (S235/236): Cell Signaling (Великобритания)
β-актин: Sigma Aldrich, США
Целевое взаимодействие соединения 3 и соединения 8 могло было продемонстрировано в мозге и мышцах бедра после однократного перорального введения мышам (фиг. 2). Соединения пересекают гематоэнцефалический барьер и ингибируют сигнальный каскад mTOR, о чем свидетельствует значительно сниженное фосфорилирование S6rP и АКТ. Передача сигналов подвергалась изменениям через 30 мин после введения и продолжалась по меньшей мере 8 часов.
ПРИМЕР 6
Активация пути mTOR у мышей с эпилепсией
Чтобы оценить, была ли активирована передача сигналов mTOR в модели эпилепсии, используемой для данного исследования, вызывали хроническую эпилепсию введением пилокарпина, агониста мускариновых ацетилхолиновых рецепторов. Системные инъекции пилокарпина у крыс или мышей приводят к генерализованному конвульсивному эпилептическому статусу (SE) с последующим развитием спонтанных эпилептических приступов в течение следующих нескольких недель. Через шесть недель после индукции SE с помощью пилокарпина у почти 100% мышей развивалась хроническая эпилепсия.
Использовали протокол увеличения дозирования, который имеет то преимущество, что пилокарпин может быть индивидуально применен в соответствии с восприимчивостью каждой мыши. Пилокарпин (Sigma-Aldrich, Германия) вводили самкам мышей NMRI внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг (группа Pilo-SE). Если мыши не демонстрировали SE, дальнейшие инъекции 100 мг/кг пилокарпина проводи каждые 20 мин до развития SE. Как только мышь демонстрировала генерализованную судорожную активность, инъекции пилокарпина прекращали. Чтобы уменьшить периферические побочные действия пилокарпина, за 30 минут до первой инъекции пилокарпина вводили метилскополамин (Sigma-Aldrich, Германия). За животными непрерывно наблюдали и регистрировали продолжительность судорожного SE согласно шкале Расина. Начало SE определяли как непрерывную судорожную активности после появления одного или двух генерализованных тонико-клонических приступов [этап 4 или 5 по шкале Расина]. SE характеризовался киванием головой в вертикальном (сидячем) положении тела, хвостом Штрауба и судорогами передних конечностей от легкой до умеренной степени, иногда прерываемых более генерализованными тонико-клоническими судорогами. В целях снижения смертности SE прекращали с помощью диазепама (10 мг/кг в/б, диаэепам-ратиофарм 10, раствор для инъекций) через 90 мин после начала SE. Следующие 2-5 дней мышам вводили 0,9% раствор хлорида натрия два раза в сутки и кормили детским питанием, потому что большинство мышей не ели и не пили самостоятельно в первые дни после SE. В группе sham-SE мыши получали лечение по такой же схеме, как и в группе pilo-SE, но пилокарпин заменяли 0,9% раствором хлорида натрия. Смертность в мышиной модели pilo-SE у мышей является относительно высокой (в целом около 50%) и может заметно различаться между экспериментальными группами/днями. Поэтому авторы должны были начать исследование с большим количеством мышей для индукции SE, чтобы гарантированно получить группу размером 20-22 животных для MEST.
А. передача сигналов mTOR в образцах мозга
Образцы головного мозга мышей, получавших пилокарпин, и мышей, не получавших пилокарпин, подвергали быстрой заморозке и лизировали ткань в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, рН 8, 50 мМ NaCl, 0,5% (масс./об.) дезоксихолата натрия (DOC) и 0,5% (масс./об.) Triton Х-100 с добавками ингибитора протеазы Complete (Roche, Мангейм, Германия) и Phosphostop (NEB, США). Дезинтеграцию клеточных лизатов проводили путем набора клеточной суспензии двадцать раз в шприц с помощью маленькой калибровочной иглы (21G) на льду. Концентрации белка в лизатах определяли с использованием набора Pierce ВСА Protein Assay kit (Thermo Scientific, Бонн, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Равные количества общего белка отделяли на 4-20% гелях SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF, которые блокировали в течение ночи в 5% молоке в натрий-фосфатном буфере с добавкой Твин-20 (PBST: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, рН 7,3, 0,05% (масс./об.) Твин-20) при 4°С. Мембраны инкубировали с первичными антителами против S6 1:1000, против S6 фосфосерин (240/244) 1:000, против S6 фосфосерин (235/236) 1:2000 (NEB) и против актина 1:100 (Sigma-Aldrich) в течение 1 ч в 2% молоке в PBST при комнатной температуре (комн. темп.) и трижды промывали в течение 10 минут в PBS-T. Вторичные антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, 1:000 (Дако, Гамбург, Германия) инкубировали в течение 1 ч в 2% молоке в PBST при комнатной температуре и трижды промывали в течение 10 минут в PBST. Белки детектировали посредством усиленного хемилюминесцентного анализа с помощью хемилюминесцентного субстрата Supersignal West Femto (Thermo Scientific) и системы ChemiDoc (Bio-Rad, Мюнхен, Германия) с программным обеспечением QuantityOne (Bio-Rad) в соответствии с протоколом производителя. Относительные экспрессии белка количественно оценивали денситометрически с помощью программного обеспечения QuantityOne (Bio-Rad) и рассчитывали путем нормализации к референсным сигналам актина с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США).
Мыши с индуцированной эпилепсией демонстрировали значительно повышенные уровни общего белка S6, а также P-S6rP (Ser 240/244) (фиг. 3) в образцах головного мозга. Поскольку фосфорилирование S6rP является нисходящим событием активации mTOR, передача сигналов mTOR была гиперактивирована у мышей, получавших предварительную обработку пилокарпином для индукциия эпилептических приступов. В заключение, данные показывают, что повышенная активация mTOR вовлечена в эпилептогенез в модели пилокарпина.
В. Передача сигнала mTOR в образцах головного мозга после введения соединения 3, соединения 8 и эверолимуса
Получавшие предварительную обработку пилокарпином и наивные мыши получали одну пероральную дозу соединения 3 (40 мг/кг), соединения 8 (25 мг/кг), эверолимуса (5 мг/кг) или носителя. Использовали 5 мышей на группу и умерщвляли их через 3 часа. Получали лизаты головного мозга и анализировали их с помощью вестерн-блоттинга, как описано в примере 6А. Фосфорилирование S6 (S235/236) количественно определяли с помощью программного обеспечения QuantityOne (Bio-Rad) в соответствии с протоколом производителя.
Как у наивных, так и у страдающих эпилепсией мышей фосфорилирование S6 (S235/236) было значительно снижено по сравнению с контролем при лечении соединением 3 (в 4,6 раз, в 4,3 раз, соответственно) и соединением 8 (10,9 раз, в 2,8 раз, соответственно) (фиг. 3В). Никаких значительных изменений в передаче сигналов mTOR не наблюдалось у мышей, получавших лечение эверолимусом, что указывает на то, что как соединение 3, так и соединение 8 проникают в мозг в эффективных дозах и ингибируют передачу сигналов mTOR в мозговой ткани как у страдающих эпилепсией, так и у наивных мышей. Эверолимус, по-видимому, не достигает эффективных концентраций в головном мозге в данных условиях, поскольку передача сигналов mTOR не ингибируется соединением.
ПРИМЕР 7
Соединение 3 и соединение 8 ингибируют судороги в тесте индукции судорог максимальным электрошоком (МЭШ)
Исследовали противоэпилептическое действие соединения 3 и соединения 8 с помощью теста индукции судорог максимальным электрошоком (МЭШ) - мышиной модели эпилепсии. Ранее было показано, что рапамицин увеличивает порог индукции судорог в этой модели (Macias, М., et al., PLoS One, 2013. 8(5): p. e64455.).
Использовали в общей сложности 166 взрослых самок мышей NMRI, полученных в Charles River (Зульцфельд, Германия) с массами тела в диапазоне 21-25 г (мыши). Животных содержали в следующих условиях: размещение: животных содержали в группах, содержащих не более 8 мышей, в контролируемых условиях (температура: 22±1°С, влажность: 50% 60%), с 12-часовым циклом «день-ночь» (свет загорался в 6:00 утра). Кормление: стандартный лабораторный корм (стандартная диета Altromin 1324, Altromin Spezialfutter GmbH, Лаге, Германия) был предоставлен без ограничений. Питьевая вода: водопроводная вода была предоставлена без ограничения.
Эпилепсию вызывали у половины животных путем введения пилокарпина (см. пример 4). МЭШ определяет порог индукции судорог в популяции в группах по примерно 20 животных, а не порог для отдельного животного. В настоящем исследовании МЭШ определяли по лестничной процедуре, как описано выше. Использовался стимулятор (ВМТ Medizintechnik, Берлин, Германия), который обеспечивал постоянный ток (регулируемый от 1-200 мА независимо от электрического импенданса животного) с синусоидальными импульсами (50/сек) в течение 0,2 с.
Ток подавали с помощью двусторонней транскорнеальной стимуляции (с помощью медных электродов). До применения транскорнеальной стимуляции мышам в глаза вводили каплю раствора тетракаина (2%) для местной анестезии. Через две минуты мышь удерживали рукой, чтобы прижать медные электроды к обеим роговицам, подавая стимул нажатием педальный переключатель, соединенный со стимулятором. Электроды были покрыты мягкой кожей и пропитывались физиологическим раствором перед каждым применением. Непосредственно после стимуляции мышь освобождали, чтобы обеспечить наблюдение за проявляемыми судорогами. Интенсивность стимула варьировалась по методу «вверх-вниз», в котором ток понижали или повышали на 0,06 мА логарифмических интервалов в зависимости от того, проявляла ли предыдущая мышь стимулированную экстензию задних конечностей. Первую стимуляцию начинали с током вблизи контрольного порога.
Готовили свежие растворы лекарственные препаратов перед каждым экспериментом:
Данные, полученные из групп, содержащих 20-22 контрольных мышей, не страдающих эпилепсией (sham-SE), и 20-25 мышей, страдающих эпилепсией (pilo-SE), использовали для расчета СС50 (вызывающий судороги ток, индуцирующий стимулированные судороги задних конечностей у 50% мышей на группу с доверительными интервалами для 95% вероятности). Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Все использованные критерии были двусторонними; Р<0,05 считалось значимым.
Эксперименты проводили в группах по 20-25 мышей. Средние контрольные значения СС50 (без инъекции носителя) составляли 15,8±0,36 мА у мышей, не страдающих эпилепсией (среднее ± SEM из 5 определений порога в 3 различных группах мышей), и 15,6±0,45 мА у мышей, страдающих эпилепсией (среднее ± SEM из 5 определений порога в 3 различных группах мышей). Из соединений, протестированных в этом исследовании, фенобарбитал оказал наиболее выраженное противосудорожное действие. СС50 составлял 25,7 мА у не страдающих эпилепсией и 26,56 мА у страдающих эпилепсией мышей, что представляет собой увеличение порога на 69% и 66%, соответственно. Не было существенной разницы между не страдающими эпилепсией и страдающими эпилепсией мышами (фиг. 4). Леветирацетам (50 мг/кг) значительно увеличивал СС50 у не страдающих эпилепсией мышей на 21%, тогда как действие у страдающих эпилепсией мышей не наблюдалось (таблица 2, фиг. 4).
5 мг/кг рапамицина значительно увеличили порог судорог в МЭШ на 13% у не страдающих эпилепсией, и лишь на 5% у страдающих эпилепсией мышей (фиг. 4), как показано ранее Hartman et al. [25]. После внутрибрюшинных инъекций рапамицин увеличивал порог только у не страдающих эпилепсией мышей на 20%, тогда как у страдающих эпилепсией мышей действия не наблюдалось (фиг. 4). 10 мг/кг и 5 мг/кг эверолимуса значительно увеличивали СС50 на 10% и 13% у не страдающих эпилепсией мышей, соответственно. У страдающих эпилепсией мышей только более низкая доза увеличивала СС50 на 16%, тогда как доза 10 мг/кг не была эффективной (таблица 3 и фиг. 4).
При применении 40 мг/кг соединения 3 только за 1 час до определения порога, СС50 значительно снижался как у страдающих эпилепсией, так и у не страдающих эпилепсией мышей. Когда время предварительной обработки было продлено до 3 часов, СС50 был значительно увеличен на 6% только у не страдающих эпилепсией мышей, тогда как СС50 у страдающих эпилепсией мышей больше не уменьшался, а оставался на контрольном уровне. Применение более высокой дозы (100 мг/кг) привело к значительному увеличению СС50 на 9% у страдающих эпилепсией, но не у не страдающих эпилепсией мышей (табл. 2 и фиг. 4).
В целом, соединение 3 продемонстрировало небольшое, но непоследовательное противосудорожное действие при параметрах проведения данного исследования. По-видимому, увеличение времени предварительного лечения оказывает положительное действие. Использование суспензии может объяснять краевой эффект и кажущуюся непоследовательность данных.
Соединение 8 демонстрировало выраженное дозозависимое противосудорожное действие у не страдающих эпилепсией мышей. СС50 был увеличен на 30% (25 мг/кг) и 8% (12,5 мг/кг). Это сравнимо с противосудорожным действием леветирацетама. Сокращение времени предварительного лечения до 1 ч уменьшало противосудорожное действие. Когда время предварительной обработки было увеличено до 24 ч, противосудорожное действие пропало (табл. 3 и фиг. 4). На страдающих эпилепсией мышей соединение 8 не оказывало противосудорожного действия при любой исследованной дозе или времени предварительного лечения. Когда время предварительного лечения сократилось до 1 часа, соединение 8 уменьшило СС50 на 9%, аналогично соединению 3 (табл. 3 и фиг. 4A-D).
Авторы не проводили каких-либо специальных тестов для определения побочных действий. Мышей наблюдали примерно через 30 мин после инъекции в их домашних клетках на признаки явной седации или ухудшения состояния. За пять минут до проведения электростимуляции мышей вновь наблюдали в их домашних клетках, и за две минуты до стимуляции во время осуществления манипуляций для проведения лечения с местной анестезией. Каждое очевидное отклонение от нормального поведения было отмечено. Только фенобарбитал вызвал заметную седацию, которая длилась более 60 мин. Все другие испытанные лекарственные средства (включая растворы носителя) переносились без каких-либо очевидных побочных действий.
Таблица 2
Пороги приступов, вызываемых соединением 3, по сравнению с эверолимусом/леветирацетамом. Для каждого порога указывается ток, необходимый для индукции приступа с полным тонусом задних конечностей у 50% мышей соответствующей группы (СС50), и среднеквадратическое отклонение.
Кроме того, показано изменение порога в тестах с лекарственными средствами в процентах относительно порога носителя, и разница порогов у не страдающих эпилепсией и страдающих эпилепсией мышей в процентах для каждого теста. *: р<0,05; Тест ANOVA + апостериорный критерий Даннета всегда сравнивался с группой носителя (желтый). Значимые различия между не страдающими эпилепсией и страдающими эпилепсией мышами не указаны.
Таблица 3
Пороги приступов, вызываемых соединением 8 по сравнению с эверолимусом. Для каждого порога указывается ток, необходимый для индукции приступа с полным тонусом задних конечностей у 50% мышей соответствующей группы (СС50), и среднеквадратическое отклонение.
Кроме того, показано изменение порога в тестах с лекарственными средствами в процентах относительно порога носителя, и разница порогов у не страдающих эпилепсией и страдающих эпилепсией мышей в процентах для каждого теста. *: р<0,05; Тест ANOVA + апостериорный критерий Даннета всегда сравнивался с группой носителя (желтый). Значимые различия между не страдающими эпилепсией и не страдающими эпилепсией мышами не указаны.
ПРИМЕР 8
Жизнеспособность и белковый синтез клеток STHdh, обработанных ингибиторами mTOR
Q111/Q111
Q7/Q7
Клетки STHdh представляют собой иммортализованные клетки стриарной коры, полученные из модели на мышах с нокином, экспрессирующей полноразмерный НТТ с 111 CAG-повторами (STHdh). Контрольные клетки STHdh были получены из эмбрионов мыши дикого типа. Клетки могут быть дифференцированы в нейронные клетки посредством содержащего дофамин коктейля.
А. Анализ ЛДГ
ЛДГ представляет собой цитоплазматический фермент, который выделяется при повреждении плазматической мембраны, например, во время апоптоза. Цитотоксичность тестируемых соединений измеряли с помощью анализа на лактатдегидрогеназу (ЛДГ) фирмы Roche, Швейцария в соответствии с инструкциями производителя.
Q111/Q111
Q7/Q7
4
Q7/Q7
Q111/Q111
STHdh и STHdh (Институт медицинских исследований Кориэлла, США) культивировали в DMEM (Invitrogen, США) с добавками FBS (Invitrogen, США) 10%, генитицина (G418, Biochrom, Германия)) 1% и антигрибкового антибиотика (Invitrogen, США) 1% в увлажненном инкубаторе при 37°С и с 5% CO2. Для всех примеров, описанных для настоящего изобретения, клетки STHdh были дифференцированы во время добавления соединения с помощью конечной концентрации 50 мкМ форсколина, 750 мкМ IBMX, 200 нМ TPA, 10 мкМ допамина, 10 мкг/мкл α-FGF в культуральной среде. По 10 клеток STHdh и STHdh на лунку высевали на 96-луночный планшет, инкубировали с соединением 3 (130 нМ, 1230 нМ), соединением 8 (400 нМ и 1230 нМ), INK128 (100 нМ) и рапамицином (400 нМ), и измеряли ЛДГ через 8 ч, 24 ч, 34 ч, 48 ч и 72 ч (фиг. 5А, В).
Ни одно из тестируемых соединений не индуцировало повышенную активность ЛДГ в средах, что указывает на то, что ингибиторы mTOR не вызывали цитотоксичность. При более высоких концентрациях соединения 3 и соединения 8 активность ЛДГ была снижена по сравнению с контролем. Ингибиторы mTOR хорошо переносились клетками STHdh, и количество апоптотических клеток не увеличивалось при обработке клеток вплоть до 72 часов. В заключение, соединения согласно настоящему изобретению пригодны для оценки в этих клеточных линиях, и, кроме того, соединения, как представляется, не оказывают прямого влияния на метаболическую активность нейронных клеток в целом.
В. Анализ PrestoBlue
4
Q7/Q7
Q111/Q111
Q111/Q111
Q7/Q7
Жизнеспособность/метаболическую активность клеток выявляли с помощью реагента для определения жизнеспособности PrestoBlue (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя. По 10 клеток STHdh и STHdh на лунку высевали на 96-луночный планшет, инкубированный с Cpd. 3 (130 нМ, 1230 нМ), соединением 8 (400 нМ и 1230 нМ), INK128 (100 нМ) и рапамицином (400 нМ), и измеряли PrestoBlue через 8 ч, 24 ч, 34 ч, 48 ч и 72 ч. Определенные нетоксичные концентрации переносили на первичные нейроны, используемые в дальнейшем в этом исследовании. Клетки не проявляли изменений метаболической активности через 8 ч, 24 ч, 34 ч и 48 ч для каждого из тестируемых соединений (фиг. 5С, D). При более низкой концентрации соединения 3 и соединения 8 может быть обнаружено даже небольшое увеличение митохондриальной активности. Через 72 часа наблюдалось снижение метаболической активности в STHdh после обработки 1230 нМ соединения 3 и (незначительно) также соединения 8. Это действие не наблюдалось в клетках STHdh, указывая на то, что 1. Клетки дикого типа менее чувствительны к ингибированию mTOR и 2. Соединения хорошо переносятся и поэтому пригодны для тестирования в качестве индукторов аутофагии в этих клеточных линиях.
ПРИМЕР 9
Q7/Q7
Q111/Q111
Соединение 3 и соединение 8 ингибируют передачу сигналов mTOR в клетках STHdh и STHdh
Q111/Q111
Q7/Q7
Q111/Q111
Q7/Q7
Чтобы проверить, ингибируют ли соединение 3 и соединение 8 передачу сигналов mTOR и индуцируют ли они аутофагию в моделях БХ на нейронных клетках, использовали обработку клеток STHdh и STHdh. Клетки STHdh и STHdh поддерживали, как описано в примере 6. Клетки высевали в чашки размером 10 см. Когда клетки достигали примерно 80% конфлюэнтности, клетки были дифференцированы и одновременно Обработаны соединениями. Клетки обрабатывали соединением 3 (200 нМ, 400 нМ, 1230 нМ), соединением 8 (130 нМ, 1230 нМ), INK 128 (100 нМ), рапамицином (400 нМ) или контролем ДМСО в течение 4 часов. По окончании инкубации клетки времени промывали холодным буфером PBS и лизировали 200 мкл буфера RIPA с добавкой 4% ингибитора протеазы Complete (Roche, Швейцария) и 10% PhosStop (Roche, Швейцария). После 30 мин инкубации на льду лизаты перемешивали, центрифугировали (20 мин, 4°С, 16000 об/мин) и собирали супернатанты. Концентрацию белка определяли, как описано выше. 30 мкг белка на образец анализировали с помощью вестерн-блоттинга, как описано выше, используя следующие первичные антитела:
4Е-РВ1 (1:1000), Р-4Е-ВР1 (Т37/46) (1:1000), mTOR (1:1000), P-mTOR (S2448) (1:1000), S6rP (1:1000), P-S6rP (S235/236) (1:1000) Cell Signaling, Великобритания
бета-актин (1:50000) Sigma-Aldrich, США
LC3 (1:200) Nanotools, Германия
Q111/Q111
Q7/Q7
Q7/Q7
Соединение 3 ингибировало передачу сигналов mTOR, о чем свидетельствует уменьшение фосфорилирования S6rP и фосфорилирования 4Е-ВР как в клетках STHdh, так и в клетках STHdh зависимым от концентрации образом. Исходные соединения/положительные контроли INK128 и рапамицин показали схожую степень ингибирования сигнального пути (фиг. 6А). Соединение 8 также ингибировало передачу сигналов mTOR. Действие можно было наблюдать уже при низкой концентрации в 130 нМ в клетках STHdh (фиг. 6В).
Q111/Q111
Для обнаружения уровней LC3-II, маркера аутофагии в аутофагосомах, обработку клеток проводили в присутствии и в отсутствие бафиломицина А, ингибитора деградации аутофагосом. Таким образом, соединения приводили к накоплению уровней LC3-II при индукции аутофагии. Соединение 3 (фиг. 6С) и соединение 8 (фиг. 6D) индуцируют аутофагию в клетках полосатого тела. Для соединения 3 наблюдалось более сильное действие на аутофагию в клетках STHdh. Индукция аутофагии не была значимой у аналога, не мутантного по НТТ, но признаки увеличения также LC3II в этих клетках также наблюдались. Соединение 8 также индуцировало аутофагию в клетках полосатого тела на уровне, сравнимом с INK 128.
Данные показывают, что соединение 3 и соединение 8 ингибируют передачу сигналов mTOR в линиях клеток полосатого тела, несущих мутантный НТТ или немутантный расширенный по Q7 хантингтин. Ингибирование пути mTOR приводит к индукции аутофагии. Основной механизм клиренса агрегированного хантингтина посредством макроаутофагии был индуцирован ингибитором mTOR или PI3K/mTOR, соединением 3 и соединением 8 в нейронной среде.
ПРИМЕР 10
Соединение 3 и соединение 8 ингибируют образование агрегатов в клетках HEK, экспрессирующих Exon1 mutHTT
Клетки HEK (DSMZ, Германия) поддерживали в DMEM/Glutamax (Invitrogen, США), 1% антибиотика/противогрибкового средства (Invitrogen, США), 10% FBS в увлажненном инкубаторе при 37°С и с 5% СО2. Клетки HEK транзиентно трансфицировали вектором pcDNA3.1/V5-His от Clontech (Маунтин-Вью, США), содержащим экспрессионную последовательность Exon1 НТТ с расширением 19Q (без агрегации) или 51Q и маркером усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) с использованием реагента для трансфекции Attractene (Qiagen, Нидерланды). 1×106 клеток высевали в 6-луночный планшет. На следующий день 2 мкг ДНК смешивали с 95,5 мкл трансфекционной среды и 4,5 мкл трансфекционного реагента. После инкубации в течение 15 мин смесь добавляли к клеткам. Через 72 часа клетки собирали или фиксировали для анализа.
А. Соединение 3 и соединение 8 уменьшают образование агрегатов в трансфицированных клетках HEK, как показано в анализе методом ловушки на фильтре
Клетки HEK, трансфицированные 19Q- или 51Q-HTT-Exon1-eGFP, обрабатывали ДМСО-контролем. Клетки HEK 51Q-HTT-Exon1-eGFP образуют агрегаты. Эти клетки обрабатывали соединением 3 (400, 1230 нМ), соединением 8 (130, 1230 нМ), INK128 (100 нМ) или рапамицином (400 нМ) в течение 8 часов, а затем лизировали буфером RIPA. После 30-минутной инкубации на льду клетки гомогенизировали (гомогенизатор Dounce, Thermo Fisher, США). 50 мкг раствора белка в PBS обогащали 2% SDS (Рот, Германия). Образцы всасывали через нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мим) и дважды промывали буфером PBS. Агрегированные белки не растворяются в растворе SDS и связываются с мембраной. mutHTT детектировали на мембране с помощью антитела ployQ (1С2, Millipore, Германия), разбавленного 1:1000 в TBST, с добавкой 5% сухого молока и конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антимышиного антитела (фиг. 7А, В). Полосы количественно оценивали с помощью системы Odyssey LI-CORE (Li-Core, США) (фиг. 7В).
Данные демонстрируют, что обработка клеток 51Q-HTT-Exon1 HEK ингибиторами mTOR (соединением 3, соединением 8, INK128 и рапамицином) приводит к значительному снижению цитотоксических агрегатов mutHTT в этих клетках. 130 нМ соединения 8 было недостаточно для того, чтобы вызвать значительное уменьшение агрегатов. Клиренс агрегатов, приводивший к уменьшению их количества, не достигал полного клиренса (по сравнению с 19Q-HTT). Поскольку индукция аутофагии была продемонстрирована ранее, можно предположить, что клиренс агрегатов происходит с помощью макроаутофагии.
В. Соединение 3 и соединение 8 уменьшают образование агрегатов в трансфицированных клетках HEK, как показано иммунной цитохимией
Клетки HEK высевали в покрытые поло-L-лизином (Sigma-Aldrich, США) покровные стекла в 24-луночных планшетах с плотностью 104 клеток на лунку и транзиентно трансфицировали 19Q- или 51Q-HTT-Exon1-eGFP. Клетки обрабатывали соединениями, как описано в части А, в течение 8 или 24 часов. Эту инкубацию завершали через 72 часа после трансфекции. Клетки фиксировали с помощью 4% (параформальдегид) PFA. Покровные стекла представляли собой зафиксированные стекла с заливочной средой, содержавшей 4',6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI) (фиг. 7С). Ядра и агрегаты, содержавшие HTT-Exon1-eGFP, подсчитывали вручную. Подсчитывали 10000 клеток на образец (фиг. 7D).
Поскольку флуоресценция НТТ, меченого eGFP, является очень яркой, образцы, обработанные ДМСО, выглядят более темными. Ингибитор mTOR уменьшил количество агрегатов mutHTT в клетках HEK путем макроаутофагии, что указывает на то, что этот механизм может также способствовать клиренсу агрегатов хантингтина в нейронах на животных моделях или у пациентов. Действие было более выраженным через 24 часа (снижение на 77%, соединение 8, 130 нМ; снижение на 73%, соединение 3, 400 нМ) по сравнению с 8 часами (снижение на 55% соединение 8, 130 нМ; снижение на 66% соединение 3, 400 нМ). Что же касается установления дозы, более низкие концентрации соединения 3 (400 нМ) и соединения 8 (130 нМ), по-видимому, не менее эффективны, чем высокие концентрации. Таким образом, можно было бы лечить пациентов при более низких, нетоксичных дозах.
ПРИМЕР 11
Соединение 3 и соединение 8 индуцируют аутофагию в мозге мышей дикого типа
Чтобы установить, индуцирует ли ингибирование mTOR соединением 3 и соединением 8 аутофагию - существенный механизм клиренса агрегатов хантнгтина - в мозге, голых мышей BALB/c обрабатывали соединением 3 и соединением 8, как описано в примере 5.
Лизаты мозга анализировали с помощью вестерн-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием антитела LC3 (1:20, Nanotools, Германия) и антитела р62 (SQTS1/p62 1:1000, Cell Signaling, США), и соответствующих вторичных связанных с пероксидазой хрена антител (Фиг. 8А, В).
Индукция аутофагии была подтверждена зависящим от времени увеличением маркера аутофагии LC3II (верхняя полоса) и уменьшением маркера аутофагии р62 после однократного перорального введения как соединения 3, так и соединения 8. Данные показывают, что концентрация соединений в головном мозге достаточна для индукции аутофагии в нейронных клетках. Показано, что индукция аутофагии приводит к клиренсу агрегатов хантингтина в моделях клеток, соединение 3 и соединение 3, а также другие ингибиторы mTOR, вероятно, индуцируют аутофагическое уменьшение агрегатов mutHTT у животных или людей.
ПРИМЕР 12
Влияние хронического лечения соединением 3 и соединением8 на электрографические приступы у нокаутных мышей TSC1GFAP
flox/flox
GFAP
Это исследование было проведено для проверки действия соединения 3, соединения 8 и контрольного соединения (соединение R, CAS-№1225037-39-7) на спонтанным приступы и смертность по сравнению с лечением носителем у нокаутных мышей Tsc1GFAP. Tsc1 (Tsc1-GFAP-Cre (условный нокаут Tsc1) представляет собой мышиную модель TSC с условной инактивацией гена Tsc1 в GFAP-позитивных клетках (мыши Tsc1GFAPCKO), в которой развивается прогрессирующая эпилепсия, энцефалопатия и преждевременная смерть, а также клеточные и молекулярные аномалии мозга, которые, вероятно, способствуют эпилептогенезу.
А: животные и лечение
Мышей Tsc1 любого пола адаптировали к окружающей среде, исследовали, обрабатывали и взвешивали до начала исследования для обеспечения требуемого состояния здоровья и пригодности и для сведения к минимуму неспецифического стресса, связанного с обработкой человеком. В ходе исследования поддерживали циклы «день-ночь» 12/12. Температуру в помещении поддерживали между 20 и 23°С, с относительной влажностью около 50%. Пища и вода на время исследования были предоставлены без ограничения. Каждая мышь была случайным образом распределена в назначенную группу лечения. Введение доз проводили во время дневной фазы животных.
Во всех хирургических процедурах, описанных ниже, использовали асептическую технику. Мышам давали наркоз с помощью изофлурана (3% для индукции и 1-2% для поддержания кислорода в качестве газа-носителя, с приблизительной скоростью потока 1 литр в минуту) и помещали их на гомеостатическую обогревающую подушку для поддержания температуры тела при 37±1°С. Надлежащий уровень наркоза проверяли по отсутствию реакции отдергивания при нажатии на палец ноги и заметного изменения скорости дыхания. Голова мыши была обездвижена в стереотаксической раме с носовой частью, которая непрерывно подавала анестетик. На глаза наносили офтальмологическую мазь для предотвращения высыхания роговицы. Устанавливали область хирургического разреза и очищали ее хлоргексидином с последующей обработкой спиртом. Делали разрез кожи с задней стороны головы в рострокаудальном направлении и отворачивали кожу, чтобы обнажить череп. Подкожные ткани отделяли тупым путем с помощью стерильного аппликатора с хлопковым наконечником и физиологического раствора. В результате очищения черепа была обнажена брегма. Используя зубную дрель или иглу 20-23 калибра, делали небольшое отверстие, позволяющее имплантировать электрод или черепные винты. Использовалось головное крепление 8201-EEG (Pinnacle Technology, Inc., Лоренс, Канзас) с двуполусферными проходами в лобной и теменной доле и имплантированным электродом с локальным полевым потенциалом, ориентированным на область выше СА1. Первоначальная фиксация этого крепления к черепу была выполнена суперклеем. Затем головное крепление закрепляли на черепе зубным пломбировочным материалом. Головное крепление и винты покрывали зубным цементом. Применение зубного цемента также служит для закрытия раны. Как правило, кожу натягивают вокруг импланта/головного крепления, и только кожа, расположенная у нижней части импланта, остается ненатянутой. После отверждения зубного пломбировочного материала поток изофлурана перекрывали и удаляли животное из стереотаксического аппарата.
После операции животное помещали в чистую клетку для восстановления, помещенную на нагретую теплой циркулирующей водой нагревательную подушку, находящуюся под половиной клетки, до тех пор, пока мышь не начнет двигаться. До, во время и после операции животным вводили жидкости, питание, антибиотики и анальгетики по мере необходимости/в соответствии с рекомендациями команды Программы ветеринарного ухода (PVC) и IACUC (Американской ассоциации по исследованиям на лабораторных животных), действуя в координации со штатным ветеринаром и/или в соответствии с Руководящими принципами IACUC. Животных ежедневно и в течение 7 дней после операции проверяли сотрудники, осуществляющие уход за животными. В экспериментах использовались только животные, полностью восстановившиеся после операции (здорового вида и демонстрирующие нормальное поведение, такое как прием пищи, уход за собой, исследование и гнездование). После операции мышей размещали по отдельности. Животных размещали по отдельности, чтобы другие животные не загрязняли место операции или не повредили имплант. Мышам имплантировали электроды в возрасте от Р22 до Р27 и позволяли восстановиться вплоть до возраста 4 недель (Р35). В общей сложности 56 мышам были установлены импланты с получением четырех групп из приблизительно 10 мышей для проведения исследования.
ЭЭГ регистрировали непрерывно, используя систему формирования и регистрации измерительных сигналов (DCAS) Pinnacle Technology 8206, которая выполняет вторичное усиление и фильтрацию перед отправкой данных в программное обеспечение Sirenia Acquisition от Pinnacle для сбора данных через USB-соединение. ЭЭГ регистрировали с использованием предусилителей с 10- или 100-кратным усилением. Для судорожной активности, которая вызывает большие всплески по амплитуде, коэффициент 10-кратного усиления обычно является оптимальным. Снабженный предусилителем кабель был соединен с преобразователем с низким крутящим моментом, установленным над клеткой, и обеспечивал необремененную свободу движения и уменьшенные артефакты движения. Визуализацию в режиме реального времени всех каналов ЭЭГ у всех мышей наблюдали с помощью программного обеспечения Sirenia или PAL-8400. За время записи ЭЭГ были собраны синхронизированные видеозаписи.
Соединения растворяли в носителе, состоящем из 20% Dexolve-7 (Davos Pharma, Либерти, Массачусетс, США) в воде с рН 3. Мышей в исследовании случайным образом относили к одной из следующих групп лечения: носитель 10 мл/кг (группа D, послеродовый день (PND) 21-53, п/о р/сут), соединение R 50 мг/кг (группа С, PND21-53, п/о р/сут), соединение 8 25 мг/кг (группа A, PND21-53, п/о р/сут), соединение. 3 100 мг/кг (группа В, PND21-53, п/о р/сут).
В: Запись и анализ электроэнцефалограмм
После завершения послеоперационного восстановления мышей индивидуально привязывали к системе регистрации пиков в их домашних клетках и записывали спонтанную ЭЭГ в течение следующих двух недель (PND 35-48, недели 6 и 7). Одновременно в течение этого периода осуществляли видеозапись, чтобы обеспечить поток данных для поведенческой оценки мышей по мере необходимости. По завершении периода оценивали отдельные записи ЭЭГ на предмет аберрантной активности ЭЭГ. Электрографические приступы были идентифицированы по их характерному рисунку дискретных периодов ритмических пиковых разрядов, возрастающих по частоте и амплитуде, продолжающихся не менее 10 секунд, обычно заканчивающихся повторяющимися всплесками разрядов и подавлением напряжения. Они были определены как имеющие очень шаблонное начало, конец и развитие в середине, начиная с низкоамплитудной быстрой активности и высокочастотных пиков (стимуляция), которые постепенно развивались в более медленную, разрывную (клоническую) фазу, за которой следовало сильное подавление напряжения, часто с наложенным ритмическим артефактом, который представляет собой дыхательные движения и четко выделяется, поскольку ЭЭГ сама по себе подавлена. Наиболее типичные приступы у мышей TS продолжаются по меньшей мере 30-40 секунд. Следует отметить, что эти мыши имеют аномальные графики ЭЭГ, часто демонстрирующие частые серии межприпадочных пиков, которые также можно назвать последовательностями пиков, но авторы не рассматривали их как приступы на основании приведенных выше критериев (обычно нет стереотипного развития). Частота припадков каждой мыши была занесена в таблицу и обобщена для каждой группы лечения для 6 недели (PND36), 7 недели и 8 недели (PND55).
Данные анализировали путем дисперсионного анализа (ANOVA). Если один или несколько из этих факторов были значимыми (Р<0,05), проводили дальнейшие апостериорные критерии (Даннета или Вилкоксона) для установления того, какие именно противопоставления (например, носитель по сравнению с соединением R для 6 недели) были значимыми. Р-значения корректировали для множественных сравнений и р<0,05 считалось значимым. Сводные данные представлены как среднее по группе ± стандартная ошибка среднего (SEM).
Масса тела
Массы тела отдельных субъектов, определенных в различные группы лечения до проведения какого-либо лечения, показаны на фиг. 9А. Односторонний ANOVA не выявил статистической разницы между группами. Масса тела животных, получавших лечение соединением 3 и соединением 8, была выше к концу исследования. В это время обычная продолжительность жизни мышей TSC близка к концу. Они больше теряют в весе и умирают. Поскольку подвергшиеся лечению животные характеризуются более высокой массой тела, у них, по-видимому, улучшилось состояние здоровья и, следовательно, могут они иметь увеличенную продолжительность жизни.
Электрографические приступы и смертность
В то время как мыши генотипа Tsc1, ежедневно получавшие лечение носителем начиная с PND21-55, испытывали сильным электрографические приступы (n=150), мыши, получавшие лечение 25 мг/кг соединения 8 с PND21-53, продемонстрировали значительно меньшее количество приступов (n=8), и мыши, получавшие лечение 100 мг/кг соединения 3 с PND21-53, продемонстрировали значительно меньшее количество приступов (n=2) за тот же период. Референсная группа, получавшая соединение R с PND21-55, продемонстрировала умеренное сокращение количества приступов (n=76), которое значительно отличалось от носителя во всех временных точках. Использовали парный критерий Вилкоксона для определения того, какие именно противопоставления были значимыми (фиг. 9В). Частота приступов между носителем и соединением 8/соединением 8 на 6 неделе (PND35-42, р=0,0009 и р=0,0005, соответственно), на 7 неделе (PND43-48, р=0,0427 и р=0,0023), и на 8 неделе (PND49-55, р=0,0017 и р=0,0002) значительно различалась (фиг. 9В).
Могло быть показано защитное действие соединения 3 и соединения 8 от приступов у мышей с условным нокаутом Tsc1 GFAP. Соединение R обладает более слабым действием подавления приступов по сравнению с новыми исследованными соединениями. Вероятно, это можно объяснить более коротким периодом полувыведения соединения R (1 час) по сравнению с соединением 3 (5 часов) и соединением 8 (5 часов).
ПРИМЕР 13
Лечение мышей R6/2 и мышей zQ175
Мыши R6/2 представляют собой мышиную модель B6CBA-Tg (HDExon1) 62Gbp/1J, экспрессирующую экзон 1 гена хантингтина человека с расширением 160±5 повторов CAG. Мыши имеют тяжелое нарушение фенотипа, которое развивается от 4 до 12 недель. Проводится исследование ФК/ФД у мышей R6/2, чтобы определить дозу, которая является как можно более низкой и при этом все еще взаимодействует с мишенью в разных областях мозга (полосатое тело, кора, мозжечок). Мышей R6/2 и их аналоги дикого типа подвергали лечению в следующих группах лечения, состоящих из 19 животных: 1. Дикий тип, носитель; 2. R6/2 носитель; 3. R6/2 соединение 3; 4. R6/2 соединение 8. Пероральное введение доз проводят в течение 5 дней, за которыми следует перерыв в дозировании на 2 дня, в общей сложности в течение 8 недель. Через 4 и 8 недель проводят два теста фенотипа животных: LabMaster и Rotarod. После этого мышей умерщвляют и анализируют мозг в отношении передачи сигналов mTOR и индукции аутофагии с помощью вестерн-блоттинга, а также в отношении уровней растворимого и агрегированного mHTT с помощью анализов TR-FRET (времяразрешенный флуоресцентный индуктивно-резонансный перенос энергии).
Мыши с нокином (KI) zQ175 характеризуются поведенческими, гистопатологическими и молекулярными фенотипами, аналогичными человеческому заболеванию. У этих мышей наблюдается связанное с возрастом увеличение количества включений mHTT с возраста 2-12 месяцев в полосатом теле и коре. 10 мышей на группу будут получать лечение 1. Носителем; 2. Соединением 3; 3. Соединением 8 в возрасте от 3 месяцев до 5 месяцев. Мышам будут перорально введены дозы соединений или носителя в течение 5 последовательных дней, за которыми следует перерыв в дозировании на 2 дня. Ключевыми показаниями являются: 1) Определить образование агрегатов mHTT в гомогенате из полосатого тела и четырехглавой мышцы бедра с помощью Singulex (сравнение центрального и периферического действия).
Уровни соединения в плазме, мозге и четырехглавой мышце бедра в последний день дозирования (через 2 ч после введения дозы) у экспериментальных животных. Сателлитные животные будут использоваться на первый день исследования для определения ФК и исходных уровней НТТ.
ПРИМЕР 14
Лечение мышей R6/2 в in vivo модели болезни Хантингтона
Для оценки эффективности соединения 3 и соединения 8 в уменьшении образования агрегатов mutHTT в полосатом теле использовали in vivo модель болезни Хантингтона. Мыши R6/2 представляют собой мышиную модель B6CBA-Tg (HDExon1)62Gbp/3J болезни Хантингтона, экспрессирующую экзон 1 гена хантингтина человека с расширением 160±5 повторов CAG. Мыши имеют тяжелое нарушение фенотипа, которое развивается от 4 до 12 недель. Поскольку эти животные чрезвычайно уязвимы, потребовалось уменьшить дозы до 65% от доз, используемых в более устойчивых животных моделях.
Мыши B6CBA-Tg(HDExon1)62Gpb/3J (R6/2) были получены из 40 размножающихся пар самцов дикого типа с самками с трансплантатами яичников, приобретенными у Charles River (Charles River Laboratories, Зульцфельд, Германия). Потомство было трансгенным в отношении человеческого N-концевого фрагмента гена НТТ. Для этого исследования использовали самцов мышей, которых держали в отдельных клетках, чтобы уменьшить стресс от боев за место в иерархии и отлучения. Использовали стандартные клетки с 12-часовым циклом «день-ночь». Стандартный корм и воду предоставляли без ограничения.
Фармакокинетика R6/2
Чтобы проверить экспозицию зон мозга, мышам R6/2 давали одну пероральную дозу соединения 3 (75 мг/кг, 50 мг/кг, 25 мг/кг) или соединения 8 (25 мг/кг, 16 мг/кг, 8 мг/кг), по 3 животных на группу. Через один час собирали плазму, а животных умерщвляли. Полосатое тело, мозжечок и кору головного мозга по отдельности подвергали быстрой заморозке и анализировали на концентрацию соединения с помощью ЖХ/МС/МС.
Достигнутые концентрации в тканях хорошо попадали в эффективный диапазон для всех концентраций соединения 3. Для соединения 8 достаточные уровни были достигнуты при всех концентрациях, хотя 8 мг/кг может дать несколько недостаточный охват цели (фиг. 10А).
Долгосрочное лечение мышей R6/2 соединением
Группы лечения устанавливали на основании генотипа и измерений массы тела, теста вращающегося стержня и потомства. Мышей поровну распределяли по четырем группам, каждая группа содержала 12 животных. Мышам R6/2 и их аналогам дикого типа вводили дозы в следующих группах лечения: 1. Дикий тип, носитель (20% SBECD в воде, рН 3); 2. R6/2 носитель (20% SBECD в воде, рН 3); 3. R6/2 соединение 3 (65 мг/кг); 4. R6/2 соединение 8 (16,25 мг/кг). Пероральное введение доз проводили в течение 6 дней, за которыми следовал перерыв в дозировании в течение 1 дня, в общей сложности в течение 11,5 недель.
Иммуногистохимия
Для обнаружения агрегатов mutHTT проводили иммуноокрашивание полосатого тела. Мозг фиксировали в 4% параформальдегиде (SAV LP GmbH, Флинтсбах-ам-Инн, Германия). Перед внедрением в О.С.Т (Sakura Finetek Germany GmbH, Штауфен-им-Брайсгау, Германия)) цельный мозг пропитывали раствором сахарозы (30% масс. об.) В течение 3 дней и последовательно разрезали на корональные срезы размером 25 мкм на криостате (Leica CM- 3050-S, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Германия). Срезы хранили в PBS с добавкой 0,03% ацетата натрия при 4°С. Для окрашивания свободноплавающих срезов, срезы полосатого тела помещали в свежий PBS. Все стадии проводили при комнатной температуре. Блокирование проводили в 0,5% борогидриде натрия в PBS в течение 30 минут, после чего осуществляли промывку. Инкубацию первичных антител с ЕМ48 (МАВ5374, Merck Chemicals GmbH, Дармштадт, Германия), разведенных 1:1000, проводили в течение ночи. На следующий день секции промывали TBST и инкубировали с биотинилированным козьим антимышиным IG-G (Vecta ВА9200, Vector Laboratories, Берлингейм, Калифорния) в разведении 1:1000 в течение 2 часов. Авидин-биотиновый комплекс (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, Берлингейм) использовали в разведении 1:400. Время инкубации составляло 1 час. Для дальнейшего усиления сигнала инкубацию с ABC повторяли после того, как еще на 8 минут вводили биотинилированный тирамин с добавкой 0,001% Н202. Для развития цвета срезы инкубировали в течение 4 минут в буфере, содержащем никель-DAB-Н202 (0,6% никеля, 0,01% DAB и 0,001% Н202 в 0,05 М Tris, 0,05 М имидазола). Реакцию останавливали помещением срезов в буфер TI (0,05 М Tris, 0,05 М имидазола) и закрепляли в воде в свободноплавающем виде. Срезы обезвоживали рядами разбавления этанолом и серией разбавленного ксилола и запечатывали под покровные стекла с закрепляющей средой (CV, Leica).
Изображения получали с помощью микроскопа Zeiss Axioplan (объектив Plan-NEOFLUAR × 40/0,75, AxioCam MRc) и программного обеспечения Axiovision 4.8 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Иена, Германия). У каждого животного были проанализированы три следующих друг за другом среза полосатого тела, всего было проанализировано 4 животных. Положительные на ЕМ48 структуры анализировали с помощью анализа частиц, встроенного в ImageJ, с установленным порогом для всех изображений (ImageJ 1.47v, NIH, Бетесда, Мэриленд, США). Статистический анализ выполнялся с помощью GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., Ла-Холья, Калифорния, США). Односторонний ANOVA был проведен с множественными сравнениями с группой плацебо и методом коррекции Даннета.
Анализ изображений окрашенных образцов полосатого тела показал специфичность окрашивания, поскольку не было обнаружено никаких агрегатов у животных дикого типа (фиг. 10В). Кроме того, количество подсчитанных агрегатов не было изменилось в случае мышей R6/2, получавших лечение соединением 3 или соединением 8, по сравнению с контролями носителем. Но захват агрегатов mutHTT был немного (хотя и незначимо) уменьшен у животных, получавших лечение соединением 8, и уменьшилось на 40% у животных, получавших лечение соединением 3 (фиг. 10В). Это снижение числа агрегатов может влиять на прогрессирование заболевания у пациентов с БХ.