Микробный препарат на основе штамма клубеньковых бактерий Mesorhizobium ciceri H-12 для повышения урожайности семян нута (Cicer arietinum L.) и улучшения их качества
MICROBIAL PREPARATION BASED ON A STRAIN OF NODULE BACTERIA MESORHIZOBIUM CICERI H-12 TO INCREASE THE YIELD OF CHICKPEA SEEDS (CICER ARIETINUM L.) AND IMPROVE THEIR QUALITY

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии, растениеводству, а именно к новым микробным удобрительным препаратам для повышения урожайности семян нута и улучшения их качества.
Нут (Cicer arietinum L.) - древнейшая культура мирового земледелия, которая в настоящее время по площади посевов (12 млн. га) занимает третье место среди зернобобовых культур после сои и фасоли. Ценность нута как продукта питания определяется высокими вкусовыми и кормовыми качествами зерна, в котором содержится 20-32% белка, сбалансированного по аминокислотному составу и близкого к идеальному белку ФАО, 43-59% углеводов, 4-8% жира, витамины группы А, В, С, Д, Е, каротин, минеральные вещества (фосфор, калий, магний, сера, железо, кальций) и другие ценные соединения (Химия и биохимия бобовых растений / Пер. с англ. К.С. Спектрова; Под ред. М.Н. Запрометова. - М.: Агропромиздат, 1986. - 336 с.).
Растения нута в симбиозе с клубеньковыми бактериями вида Mesorhizobium ciceri способны усвоить за вегетацию до 80-150 кг/га азота атмосферы и сформировать высокие урожаи дешевого растительного белка без применения дорогостоящих, энергоемких и экологически небезопасных минеральных азотных удобрений. До 30% биологического фиксированного азота остается в послеукосных и корневых остатках и используется последующими культурами (Бушулян О.В., Сiчкар B.I. Нут: генетика, селекцiя, насiнництво, технологiя вирощування / Монографiя. - Одеса, 2009. - 248 с).
В почвах Крыма отсутствуют аборигенные клубеньковые бактерии нута, и растения формируют урожай за счет минерального азота почвы и удобрений. В местах длительного возделывания формируются почвенные популяции ризобий нута, однако они часто обладают невысокой азотфиксирующей активностью или их количества недостаточно в зоне прорастания семян для нодуляции растений, что ограничивает азотфиксирующий потенциал бобово-ризобиального симбиоза (Дидович С.В. Формирование и функционирование симбиоза Mesorhizobium ciceri - Cicer arietinum в агроценозах южной Степи Украины: автореф. дис.… канд. с.-х. наук: 03.00.07. - Чернигов, 2007. - 22 с). В связи с этим, обязательным агроприемом в технологиях выращивания нута должна быть предпосевная обработка (нитрагинизация / инокуляция / бактеризация) семян микробными препаратами на основе селекционных штаммов соответствующих клубеньковых бактерий, которая позволяет повысить потенциал бобово-ризобиального взаимодействия до 50%, а остальной резерв может быть реализован при оптимизации условий функционирования симбиоза.
Известны штаммы клубеньковых бактерий нута Rhizobium spp. (Cicer) 522 (А.с. SU 1128545 А, опубл. 30.05.1985), Mesorhizobium cicer Ю-2Н (Патент KZB 30605, опубл. 16.11.2015), Mesorhizobium ciceri ND-64 (Патент UA 141783 U, опубл. 27.04.2020), образующие симбиоз с растениями нута (Cicer arietinum L.), а также способы выращивания нута (Патент RU 2477942 С2, опубл. 27.03.2013; Патент RU 2661815 С2, опубл. 07.03.2018 г.). Недостатком данных штаммов и способов применения является снижение эффективности в зависимости от их биотехнологии, агроклиматических условий, сорта, а также потребности в дополнительных приемах (использование прилипателей, механизмов), что приводит к повышению затрат.
В России производятся микробные препараты на основе клубеньковых бактерий, специфичных определенным видам бобовых культур, такие как Нитрагин (ФГБНУ «ВНИИСХМ», Санкт-Петербург), РизоБаш (НВП БашИнком, Уфа) и другие. Основой данных препаратов для нута являются штаммы Mesorhizobium ciceri, выделенные из различных почвенно-климатических условий, комплементарных определенному спектру сортов, что может ограничить их эффективность на новых сортах в условиях юга России.
В основу изобретения поставлена задача получения микробного препарата на основе высокоэффективного с современными сортами Cicer arietinum и высокотехнологичного штамма Mesorhizobium ciceri для предпосевной бактеризации семян и повышения урожайности нута.
Техническим результатом изобретения является повышение урожайности семян нута и улучшение их качества.
Поставленная задача решена путем создания микробного препарата для повышения урожайности семян нута и улучшения их качества на основе штамма клубеньковых бактерий Mesorhizobium ciceri Н-12 с титром 44,2-44,8 млрд КОЕ/мл для жидкой формы препарата и 5,3-6,5 млрд КОЕ/г для сыпучей формы препарата.
Заявляемый микробный препарат получают на основе штамма Mesorhizobium ciceri Н-12. Штамм выделен из клубеньков нута сорта Совхозный 14, который инокулировали почвенной суспензией, приготовленной из образцов почвы из семенных посевов Селекционно-генетического института НЦСС НААН (г. Одесса, Украина). Первичная идентификация проведена, основываясь на морфологических, культуральных и биохимических свойствах штамма. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05211.
Для разработки микробного препарата были изучены культуральные и физиолого-биохимические свойства данного штамма.
Культурально-морфологические особенности штамма.
Установлено, что клетки пяти-семи суточной культуры штамма М. ciceri Н-12 имеют палочковидную форму размером 2,0-2,2 × 0,5-0,6 мкм, грамотрицательные, спор не образуют, облигатные аэробы. Колонии клеток на плотных средах (нутовом, гороховом, манитно-дрожжевом агаре) однотипные, круглые с ровным четким контуром, блестящие, беловато-прозрачные, выпуклые, слизистые до 1,0-1,5 мм в диаметре, появляются на пятые - седьмые сутки.
Физиолого-биохимические свойства штамма.
Данный штамм использует в качестве источника углерода сахарозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, лактозу, манит, сорбит, дульцит; источника азота - аммонийный, нитратный, амидный азот. На МПА, ГПА растет умеренно, не имеет протеолитического фермента желатиназы, не гидролизует крахмал, казеин и агар, не имеет амилазной, оксидазной активности, характеризуется денитрифицирующей способностью, уреазной и каталазной активностью, подкисляет среду при культивировании на стерильном обезжиренном молоке, хорошо развивается на картофельном ломтике, вызывая легкое побурение и образуя слизистый налет беловато-желтоватого цвета. Штамм не имеет флуоресцирующих и феназиновых пигментов. Температурный интервал роста штамма на плотных и в жидких средах составляет 15-37°С, а температурный оптимум - 26-30°С, штамм отнесен к мезофилам. Рост наблюдается в диапазоне рН 4,5-8,5, оптимальной для развития клеток штамма является близкая к нейтральной реакция среды рН 6,5-7,5, штамм отнесен к нейтрофилам. Признаки штамма устойчивы. Культуру хранят на манитно-дрожжевом или на бобовом агаре с сахарозой при температуре 4-5°С, пересевают штамм один раз в 7 месяцев. Штамм образует активные клубеньки на корнях различных сортов культурного и диких видов нута. На сое, люпине, фасоли, нуте, горохе, бобах, эспарцете, люцерне клубеньков не образует.
2
4
4
3
Штамм растет при поверхностном посеве на питательной среде следующего состава: гороховый отвар (1:10), сахароза - 20 г/л, KHPO - 0,5 г/л, MgSO - 0,2 г/л, СаСО - 1 г/л, агар - 20 г/л, смесь микроэлементов по Федорову - 1 мл/л, рН 6,8-7,0. Режим стерилизации 0,7-0,8 атм. Культивирование при 26-28°С в течение 3 суток. Для долгосрочного хранения штамм хранится на питательной среде в холодильнике при +5°С и пересевается каждые 7 месяцев.
Разработка препарата на основе штамма М. ciceri Н-12.
Микробный препарат на основе предлагаемого штамма был произведен в условиях периодического глубинного культивирования с получением маточной и рабочей культур. Последняя используется как жидкий препарат или инокулянт для засева сыпучего субстрата. Маточную культуру получают путем смыва со скошенного горохового агара биомассы клеток штамма в жидкую питательную среду, условно названную реактивационной, следующего состава (г/л):
Гороховый отвар
10,0
Сахароза
20,0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
1,0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,5
MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
0,3
СаСО<sub>3</sub>
1,0
Эта среда используется для активации клеток штамма М. ciceri Н-12 при длительном хранении в коллекции.
Для получения рабочей культуры (препарата) оптимизированы компоненты среды, условно названной - производственная, (г/л):
Меласса
20
Кукурузный экстракт
15
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
0,5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,5
NaCl
0,2
MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
0,2
СаСО<sub>3</sub>
1,0
Дрожжевой экстракт
2,0
Установлена технологичность штамма, который по накоплению титра в производственной среде превышал референтный штамм М. ciceri 2102 в 2,4 раза с титром 44,5 млрд колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл (таблица 1). Рост культур характеризуется подкислением сред, что объясняется образованием органических кислот в процессе метаболизма углеводов. Жизнеспособность клеток на уровне, необходимом для инокуляции семян нута, сохраняется в течение 14 дней.
Для получения сыпучего препарата на основе предлагаемого штамма в подготовленный субстрат-носитель вермикулит или торф вносят жидкую культуру М. ciceri Н-12, питательные добавки и оставляют на доращивание на 7 дней при температуре 27°С. Титр культуры в сыпучем препарате сохраняется до 3 месяцев (таблица 2).
Штамм М. ciceri Н-12 отличается лучшей адаптацией в сыпучих субстратах и менее требователен к условиям хранения в препаративных формах, что позволяет увеличить срок эффективного действия биопрепарата.
Жидкая и вермикулитная формы препарата удобны в применении для механизированной обработки, которую осуществляют машинами для протравливания семян. Перед использованием протравочных машин необходимо очистить их емкости от остатков ядохимикатов и промыть чистой водой. Кроме того, для обработки можно использовать погрузчики семян со шнековыми и ленточными транспортерами, но при этом необходимо равномерно дозировать препарат с помощью опрыскивателей или других приспособлений. Можно провести обработку семян вручную на брезенте или пленке, увлажняя водным раствором препарата и перемешивая поочередным подниманием противоположных концов до равномерного распределения рабочего раствора на поверхности семян.
Перед применением жидкий препарат 1-га порцию (100 мл) необходимо развести проточной водой 1:10, равномерно перемешать и обработать в количестве 1,0-1,5% от массы семян (1,0-1,5 л раствора на 100-1 50 кг семян). Вермикулитную форму препарата в количестве 1 га-порции (200 г) необходимо тщательно перемешать в 1 л воды или обрата с добавлением мелассы или патоки для прилипания, после отфильтровать осадок через двойную марлю и залить в емкость протравочной машины, отжатый осадок нужно разбросать на семена после обработки.
Бактеризацию нужно проводить в тени навеса или в складе, чтобы избежать действия прямых солнечных лучей, которые губительны для клубеньковых бактерий. После восстановления сыпучести семена можно тарировать и высевать в течении суток в почву. Хранить жидкий препарат необходимо не более 2 месяцев, вермикулитный - не более 6 месяцев в темном и прохладном
Изобретение характеризуется следующими примерами применения для обработки семян:
Пример 1. Влияние бактеризации семян суспензией штамма М. ciceri Н-12 на симбиотическую эффективность нута сорта Розанна в условиях безазотного субстрата.
В вегетационном опыте на безазотном субстрате - вермикулите в контрольном варианте с поверхностно стерилизованными семенами растения нута сорта Розанна не образовывали азотфиксирующих клубеньков (таблица 3). По фенологическим наблюдениям отмечали более слабый рост и развитие растений с признаками азотного голодания в этом варианте опыта. Растения имели фитомассу на 52,8-62,3% меньше, чем инокулированные другими штаммами М. ciceri.
На основе анализа количества, биомассы, нитрогеназной активности клубеньков и фитомассы растений сорта Розанна штамм М. ciceri Н-12 по эффективности был на уровне показателей референтного штамма М. ciceri 2102 и не уступал показателям перспективных штаммов.
Пример 2. Эффективность применения бактеризации семян микробным препаратом на основе штамма М. ciceri Н-12 при выращивании сортов нута на черноземе южном по фону почвенной популяции М. ciceri.
В вегетационном опыте на черноземе южном на фоне почвенной популяции клубеньковых бактерий нута численностью 102 клубенькообразующих единиц / г почвы изучали эффективность обработки микробным препаратом на основе штамма М. ciceri Н-12 на двух сортах нута. В контрольном варианте опыта наблюдали наличие азотфиксирующих клубеньков, сформированных представителями клубеньковых бактерий из состава почвенной популяции (таблица 4, фиг. 1).
Результаты опыта свидетельствуют о том, что бактеризация обеспечила увеличение количества клубеньков в 1,5-1,6 раза, надземной фитомассы растений двух изучаемых сортов - в 1,3 раза в сравнении с такими же показателями по фону почвенной популяции нутовых ризобий. Это свидетельствует о наличии высокой эффективности и конкурентоспособности микробного препарата на основе штамма М. ciceri Н-12.
Пример 3. Эффективность применения бактеризации семян микробным препаратом на основе штаммов М. ciceri при выращивании нута сорта Триумф на черноземе в степной зоне Крыма.
В полевом опыте на черноземе южном со средним содержанием легкогидролизуемого азота исследовали эффективность применения микробного препарата на основе штаммов М. ciceri на сорте нута Триумф, который выращивали по предшественнику озимая пшеница. Клубеньковых бактерий нута в почве не было выявлено. Урожайность зерна нута в контроле быда - 30,4 ц/га, а сбор «сырого» протеина составлял 767 кг/га (таблица 5). Вариант с препаратом на основе референтного штамма М. ciceri 2102 существенно отличался от контроля по симбиотическим показателям (количеству, биомассе и нитрогеназной активности азотфиксирующих клубеньков) в фазе начала цветения растений и превышал по урожайности семян на 4,8 ц/га, однако был на уровне контроля по сбору «сырого» протеина. Заявляемый препарат на основе штамма М. ciceri Н-12 оказался лучшим. Он обеспечил повышение урожайности зерна и сбор «сырого» протеина соответственно на 5,5 ц/га (15,6%) и 216 кг/га (29,2%) по сравнению с препаратом на основе референтного штамма М ciceri 2102.
Таким образом, предлагаемый микробный препарат на основе штамма клубеньковых бактерий М. ciceri Н-12 может быть использован для предпосевной обработки семян нута с целью повышения урожайности семян и улучшения их качества.