Состав и способ получения реагента для радионуклидной диагностики на основе меченной технецием-99m 1-тио-D-глюкозы
COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCTION OF 99M TC LABELLED 5-THIO-D-GLUCOSE AGENT FOR RADIONUCLIDE DIAGNOSIS

Изобретение относится к медицине, в частности к разработке составов и способов получения радиоактивных диагностических препаратов, которые могут быть использованы для гамма-сцинтиграфических исследований в онкологии.
В существующей мировой практике наиболее перспективными радиофармпрепаратами (РФП) для ранней диагностики злокачественных новообразований являются меченные радиоактивными изотопами производные глюкозы. Это связано с тем, что в клетках опухоли отмечается повышенный уровень метаболизма глюкозы по сравнению с нормальными клетками. Поэтому при введении в организм меченой глюкозы в этих клетках наблюдается увеличенное количество радиоактивного маркера, что позволяет получать информацию о местоположении и размерах опухоли за счет высокого соотношения концентраций изотопа «опухоль/фон».
18
18
В настоящее время в России и за рубежом для диагностики опухолей и оценки эффективности противоопухолевой терапии применяется, главным образом, метод позитрон-эмиссионной томографии (ПЭТ) с РФП 2-фтор-2-дезокси-D-глюкоза (F-ФДГ), содержащий позитрон-излучающий радионуклид фтор-18 [Baum R.P., Schmuecking М., Bonnet R. et all. F-18 FDG PET for metabolic 3D-radiation treatment planning of non-small cell lung cancer. // Eur. J. Nucl. Med. and Mol. Imag. - 2002. Vol. 43. - P. 96-99]. Несмотря на высокую диагностическую информативность метода ПЭТ, его широкое применение в России ограничено из-за высокой стоимости, а также малой распространенности ПЭТ-центров. Так стоимость одного обследования с F-ФДГ (в зависимости от исследуемой области) колеблется от 20 тыс. рублей и более, а ориентировочная стоимость строительства ПЭТ-центра составляет около 1 миллиарда рублей. В данное время в России реально функционируют около 15 центров позитронно-эмиссионной томографии, половина которых расположены в Москве и Санкт-Петербурге.
1/2
99m
99m
Вместе с тем, в стране существует более 250 центров, оснащенных гамма-камерами для проведения однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), где диагностика чаще всего осуществляется с использованием РФП на основе наиболее доступного для медицины радионуклида короткоживущего (T=6,02 ч) технеция-99 м (Tc). Как правило, технециевые РФП изготавливаются в виде стандартных наборов реагентов (лиофилизатов) к генератору технеция-99 м, которые представляют собой смеси, приготовленные методом сублимационной сушки при низких температурах [Лыков А.В. Сублимационная сушка // В кн.: Теория сушки. - М., Энергия. - 1968. - С. 334-362]. При их смешивании с элюатом технеция-99м (раствор натрия пертехнетата, Тс), выделенного из генератора, получается готовый РФП с заданными свойствами. Срок годности лиофилизатов обычно составляет 1 год.
99m
Разработка для ОФЭКТ в качестве диагностического средства лиофилизатов для приготовления меченых Tc тех или иных производных глюкозы позволила бы во много раз увеличить количество исследований в онкологии и значительно снизить потери трудоспособного населения от социально значимых заболеваний. Однако до настоящего времени такие препараты до практического применения в России и в мире не доведены.
99m
123
18
99m
99m
99m
99m
99m
4-
99m
2
2
Основные проблемы, с которыми сталкиваются исследователи при получении меченных Tc производных глюкозы, связаны с химическими свойствами этого радионуклида. В отличие от РФП на основе таких изотопов, как I и F, которые могут быть получены в результате простых реакций нуклеофильного (изотопного) замещения стабильных изотопов йода или фтора в структуре лиганда, РФП с Tc обычно получают только через координационную связь с определенным лигандом, что является гораздо более трудным. Тем более, что глюкоза имеет в молекуле только кислород и атомы углерода, и здесь сложно сформировать устойчивую координационную связь с Tc. Решением указанной проблемы является введение в молекулы производных глюкозы азота или серы, так как Tc в степени окисления +4, +5 может образовывать стабильную координационную связь с этими атомами. Как известно, Tc, выделяемый из генератора в виде пертехнетат-ионов TcO, имеет степень окисления +7. Поэтому для образования координационных связей с производными глюкозы, содержащими в молекуле атом азота или серы, необходимо снизить валентность Tc, например, с помощью восстанавливающего агента - олова (II) хлорида дигидрата (SnCl⋅2HO).
99m
188
186
99m
В настоящее время имеется достаточно много работ, посвященных получению меченных технецием-99м различных производных глюкозы. Например, способы приготовления меченных радионуклидами комплексов производных глюкозы рассматриваются в работе [Zhu Lin Liu. Glucose Derivative complex marked with Tc, Re or Re and its prepn process // CN Заявка №101020697 МПК A61K 51/04; C07F 13/00; A61K 103/10 - 22.08.2008]. Отмечается, что комплексы глюкозы с Tc имеют низкую стоимость в сочетании с удобным периодом полураспада и энергией излучения для проведения ОФЭКТ исследований.
99m
99m
Известен относительно простой способ получения 5-тио-D-глюкозы с технецием-99м [Suleyman Kutlan Ozker, Bert David Collier. Imaging methods and compositions // United States Patent No.: 60998222003 A61K 51/00 - 08.08.2000], в соответствии с которым препарат Tc-5-тио-D-глюкозу готовят путем смешивания 10 мг 5-тио-D-глюкозы с 74 мкг хлорида олова (II) дигидрата с последующим введением в полученную смесь 2-4 мл раствора пертехнетата, Tc с активностью 50-100 мКи (1,85-3,7 ГБк) и инкубацией в течение 30 мин. При этом эффективность мечения составляет 98,5±0,8% и остается стабильной 24 ч. Авторы предполагают, что реакция мечения будет хорошо проходить в присутствии 0,01-2 мг ионов олова (II) в виде хлорида дигидрата или фторида. Недостатком предложенного способа является то, что, в отличие от лиофилизатов, исходная смесь реагентов для получения препарата не может храниться более 1-2 часов, вследствие окисления олова (II) до 4-х валентного состояния.
2
2
99m
4-
Такой же недостаток имеет методика мечения 5-тио-D-глюкозы, предложенная в [Hee-Kyung Lee, Dae-Hybk Moon, Jin-Sook Ryu et al. Radioisotope-labeled complexes of glucose derivatives and kits for the preparation thereof // Patent United States Pub. No.: 2003/0120046 A1 - 26.06.2003]. Здесь во флакон, содержащий смесь 5-тио-D-глюкозы (5 мг, 0,51 ммоль) и SnCl⋅2HO (80 мкг), добавляют 20 мКи/мл TcO. После перемешивают в течение 10 мин. Затем проводят исследования.
99m
99m
Наиболее близким к заявляемому является состав и способ получения реагента для приготовления меченной Tc производной 1-тио-D-глюкозы, приведенный в этой же работе и выбранный нами в качестве прототипа. Согласно этому способу смесь, содержащую 1 мг 1-тио-β-D-глюкозы, 80 мкг хлорида олова (II), 100 мкл 0,02 М HCl и 0,5 мг аскорбиновой кислоты, используемой в качестве добавки, препятствующей восстановлению олова (II), растворяют в 1 мл физиологического раствора. Затем полученный раствор пропускают через стерильный фильтр (размер пор 0,22 мкм) и вносят во флакон вместимостью 10 мл. После содержимое флакона замораживают в жидком азоте и лиофилизируют. По окончании обезвоживания, флакон запечатывают алюминиевой крышкой под вакуумом и выдерживают при комнатной температуре. Для приготовления РФП во флакон с реагентом (лиофилизатом) вносят 1,5 мл элюата Tc с активностью 50 мКи (1,85 ГБк) и перемешивают при комнатной температуре в течение 10 минут. В результате получаемый препарат имеет следующий состав:
Недостатком способа прототипа является завышенное содержание в получаемом препарате натрия хлорида, за счет его присутствия в составе реагента. В результате общее количество этого компонента превышает нормативное значение 8,0-10,0 мг/мл для препаратов, используемых для внутривенного введения. Кроме того, в состав входит соляная кислота в сочетании с большим количеством аскорбиновой кислоты. Завышенным также является содержание в радиофармпрепарате хлорида олова (II), используемого для восстановления технеция-99м. С технологической точки зрения, способ включает стадию замораживания смеси реагентов в жидком азоте, что усложняет процесс приготовления лиофилизата.
99m
Новый технический результат - получение более радиохимически чистого радиофармпрепарата Tc-1-тио-D-глюкозы, имеющего более простой состав, упрощение способа его изготовления.
Для достижения нового технического результата в способе получения реагента для радионуклидной диагностики на основе меченной технецием-99m 1-тио-D-глюкозы включающем приготовление реакционной смеси, состоящей из производной глюкозы, олова (II) хлорида дигидрата и аскорбиновой кислоты в 1 мл раствора, фильтрующую стерилизацию полученного раствора с последующей лиофилизацией реагента и его герметизацией во флаконе, реакционная смесь имеет состав: 2,5 мг 1-тио-D-глюкозы, 0,175 мг олова (II) хлорида дигидрата и 0,5 мг аскорбиновой кислоты в 1 мл воды, при этом, лиофилизацию смеси проводят без предварительного замораживания в жидком азоте.
Сущность изобретения поясняется примерами его конкретного выполнения.
Пример 1. Во флакон вместимостью 10 мл вносят 1 мл водного раствора, содержащего 2,5 мг 1-тио-D-глюкозы. Затем последовательно добавляют 50 мкл водного раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 10 мг/мл (0,5 мг) и 25 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией - 7 мг/мл (0,175 мг). Полученную смесь пропускают через стерилизующий фильтр (размер пор 0,22 мкм) во флакон вместимостью 10 мл. После флакон без предварительного замораживания смеси помещают в холодильную камеру лиофилизатора и проводят процесс лиофилизации в автоматическом режиме при заданных параметрах: Р=0,2 Па, t=-50°С в течение 24 часов.
99m
Для приготовления препарата во флакон с реагентом (лиофилизатом) вводят 4 мл элюата Tc с активностью 3,7-5,0 ГБк (100-135 мКи) и инкубируют в ультразвуковой ванне в течение 30 мин.
2
5
4
2
99m
Радиохимическую чистоту (РХЧ) полученного продукта оценивают путем снятия хроматограмм в двух подвижных фазах: в ацетоне с использованием пластин силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) и в смеси СНОН: 25% NHOH: HO÷2:5:5 на полосках ватмана Filtrak-17 (Германия) с последующим изучением распределения активности Tc по длине радиохроматограмм.
99m
99m
99m
99m
99m
99m
99m
99m
2
2
В среде ацетона комплекс Tc-1-тио-D-глюкоза остается на линии старта, а непрореагировавшие ионы Tc(VII) поднимаются с фронтом растворителя, что позволяет сделать количественную оценку этой примеси. Напротив, в среде этанола с фронтом элюента вместе с ионами Tc(VII) поднимается и комплекс Tc-1-тио-D-глюкоза, а на линии старта остается примесь несвязанного с субстанцией гидролизированного оксида технеция (TcO), что также позволяет сделать ее количественную оценку. Хроматограммы меченой Tc-1-тио-D-глюкозы, полученные в ацетоне и в смеси этанола с аммиаком, представлены на фиг. 1 и 2, соответственно. Расчеты, сделанные по этим хроматограммам, показывают, что общее содержание примесей Tc(VII) и гидролизованного оксида (TcO) в препарате не превышает 1,5%, а его радиохимическая чистота составляет более 97% и остается на этом уровне в течение 24 ч. Приготовленный препарат имеет состав, приведенный в таблице.
2
2
В отличие от прототипа, при равном количестве 1-тио-D-глюкозы, содержание SnCl⋅2HO в готовом препарате составляет 0,044 мг/мл против 0,053 мг/мл. Кроме того, в нем отсутствует соляная кислота. Содержание NaCl составляет 8,0-10,0 мг/мл против 13,5-16,5 мг/мл, а аскорбиновой кислоты - 0,125 мг/мл против 0,330 мг/мл.
99m
Пример 2. Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 1, с тем отличием, что после ее фильтрации через стерилизующий фильтр во флакон, проводят предварительное замораживание флакона в жидком азоте с последующим его помещением в холодильную камеру лиофилизатора и проводят лиофилизацию смеси в том же режиме. Для приготовления препарата во флакон с реагентом также вводят 4 мл элюата Tc с активностью 3,7-5,0 ГБк и инкубируют в ультразвуковой ванне в течение 30 мин.
2
n
Способ основан на анализе результатов экспериментальных исследований. Как известно [Зайцева Л.Л., Величко А.В., Виноградов И.В. Соединения технеция и области их применения // Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1984. - Т. 9. - С. 180] от количества хлорида олова (II) напрямую зависит радиохимическая чистота (РХЧ)получаемого радиофармпрепарата и количество образующего в нем коллоида типа (-О-TcO-O-SnCl-O-TcO-), где n=2, 3 … - число, зависящее от pH раствора.
99m
В этой связи были проведены предварительные исследования для установления необходимого и достаточного количества Sn (II) в составе лиофилизата, которое бы обеспечивало практически полное восстановление Tc(VII) при минимальном количестве, образующегося коллоида. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.
99m
К
Ф
Исх
Активность Tc, связанного на коллоиде С, определяли путем фильтрации препарата через фильтрующие насадки типа Minisart с диаметром пор 50 нм с последующим измерением активности фильтрата А и ее сопоставлением с исходной активностью препарата А. Для расчета вклада активности коллоида использовали соотношение:
2
2
Радиохимическую чистоту препаратов, полученных из лиофилизатов с различным содержанием SnCl⋅2HO, определяли методом тонкослойной хроматографии в двух подвижных фазах по методике, приведенной в Примере 1.
2
2
Из представленных в таблице 1 результатов следует, что оптимальной концентрацией SnCl⋅2HO в составе смеси является 0,0438 мг/мл (п. 3), при которой достигается максимальное значение радиохимической чистоты препарата при минимальном содержании радиоактивного коллоида. В смеси п. 4, где количество Sn(II) составляет 0,053 мг/мл, такое же, как и в способе прототипе, содержание коллоида больше в 4 раза, вследствие чего возможно нецелевое накопление радиоактивности в печени.
Изобретение, также, поясняется фигурами, на которых представлено:
99m
Фиг. 1. Радиохроматограмма препарата Tc-1-тио-D-глюкоза. Подвижная фаза: ацетон.
99m
2
5
4
2
Фиг. 2. Радиохроматограмма препарата Tc-1-тио-D-глюкоза. Подвижная фаза - смесь СНОН : 25% NHOH : HO ÷ 2:5:5 (по объему).
99m
Фиг. 3. Сцинтиграмма мыши линии C57BL/6 с привитой в область бедра карциномой Льюиса (LLC) через 30 мин после инъекции препарата Tc-1-тио-D-глюкоза.
В целом предлагаемый способ позволяет получать реагент для приготовления меченного технецием-99м препарата на основе 1-тио-D-глюкозы, пригодный для проведения гамма-сцинтиграфических исследований в онкологии, о чем свидетельствует сцинтиграмма на фиг. 3, полученная через 30 минут после введения радиофармпрепарата экспериментальному животному (мыши).