СПОСОБ ОКРАСКИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD OF COLORING AND DIFFERENTIATION OF MICROORGANISMS

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для окраски бактерий и дифференцировки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов при микроскопическом методе исследования.
Прототипом предлагаемого изобретения является способ окраски грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов по методу Грама (после фиксации бактериологического мазка над пламенем спиртовки через фрагмент фильтровальной бумаги наносят основной краситель генциановый фиолетовый на 1-2 мин, затем раствор Люголя на 1-2 мин, обесцвечивание осуществляется путем дифференцировки в 96% этиловом спирте в течение 30-60 с, после промывания водой производится докрашивание водным фуксином в течение 1-2 мин) [Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. Под ред. Л.Б. Борисова. М., 1979. С. 32]. Указанный способ широко применяется для бактериоскопии в диагностике инфекционных заболеваний и на практических занятиях по микробиологии в медицинских вузах. Метод основан на различиях окраски бактерий (грамположительные - фиолетовые, грамотрицательные - красные) вследствие отличий в химическом составе их клеточной стенки. Недостатком является высокая стоимость и ограниченная доступность используемых импортных красителей, таких как генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый и др.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение диагностической ценности и сокращение стоимости бактериоскопического исследования мазков с грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами за счет использования нового красителя на основе спиртового экстракта плодов черноплодной рябины.
Указанный технический результат достигается благодаря использованию нового альтернативного способа окраски бактерий с применением растительного красителя на основе 4-дневной настойки плодов черноплодной рябины на 90% этиловом спирте, к которой добавляют 2-2,5 г медного купороса на 40 мл раствора. Бактериологические мазки фиксируют над пламенем спиртовки, наносят новый краситель на основе экстракта плодов черноплодной рябины на 4,5-5 мин, смывают 2 раза 96% спиртом, наносят 96% спирт на 20 с, промывают водой и наносят 1% эозин на 1 мин, затем промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и изучают под микроскопом с объективом х90 и иммерсионным маслом. Грамположительные бактерии при этом окрашиваются в синий или сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в розовый или красный.
Изобретение поясняется чертежами.
Фиг. 1. Окраска стафилококков (Staphylococcus albus). Ув. х1000.
Фиг. 2. Окраска бацилл (В. cereus). Ув. х1000.
Фиг. 3. Окраска бацилл (В. subtilis). Ув. х1000.
Фиг. 4. Окраска кишечных палочек (Е. coli). Ув. х1000.
Фиг. 5. Окраска смеси музейных культур стафилококка (Staphylococcus albus) и кишечной палочки (Е. coli). Ув. х1000.
Фиг. 6. Окраска смеси музейных культур В. cereus и Е. coli. Ув. х1000.
Способ осуществляется следующим образом. Свежие или размороженные плоды черноплодной рябины разминают, сливают образовавшийся сок и заливают 90% этиловым спиртом в соотношении 1,25-1,3:1. Настаивание производится в защищенном от света месте в темной посуде при комнатной температуре в течение 4 дней, затем настой отжимают через 4-5-слойную марлю и получают густой темно-красный непрозрачный раствор. К 40 мл фильтрата добавляют 2-2,5 г медного купороса, размешивают, после чего он готов к употреблению в течение 1,5 месяцев. Бактериологические мазки фиксируют над пламенем спиртовки, наносят новый краситель на основе экстракта плодов черноплодной рябины на 4,5-5 мин, смывают 2 раза 96% спиртом, наносят 96% спирт на 20 с, промывают водой и наносят 1% эозин на 1 мин, затем промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и изучают под микроскопом с объективом х90 и иммерсионным маслом.
Пример 1 конкретного выполнения. На фиксированные мазки музейных культур стафилококка (Staphylococcus albus), бацилл (В. cereus, В. subtilis) и кишечной палочки (Е. coli) наносят новый краситель на основе спиртового экстракта плодов черноплодной рябины, содержащего медный купорос, на 4,5 мин, смывают 2 раза 96% спиртом, наносят 96% спирт на 20 с, промывают водой и наносят 1% эозин на 1 мин, затем промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Результат: стафилококки (фиг. 1) и В. cereus (фиг. 2) окрашиваются в темно-синий цвет, В. subtilis (фиг. 3) - в сине-фиолетовый, кишечные палочки - в красный (фиг. 4).
Пример 2. На фиксированный мазок из смеси музейных культур стафилококка (Staphylococcus albus) и кишечной палочки (Е. coli) наносят новый краситель на основе спиртового экстракта плодов черноплодной рябины, содержащего медный купорос, на 4,5 мин, смывают 2 раза 96% спиртом, наносят 96% спирт на 20 с, промывают водой и наносят 1% эозин на 1 мин, затем промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Результат: стафилококки окрашиваются в темно-синий цвет, кишечные палочки - в красный (фиг. 5).
Пример 3. На фиксированный мазок из смеси музейных культур В. cereus и Е. coli наносят новый краситель на основе спиртового экстракта плодов черноплодной рябины, содержащего медный купорос, на 4,5 мин, смывают 2 раза 96% спиртом, наносят 96% спирт на 20 с, промывают водой и наносят 1% эозин на 1 мин, затем промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Результат: бациллы В. cereus окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, кишечные палочки - в красный (фиг. 6).
Таким образом, проведенные исследования демонстрируют, что предложенный нами новый способ окраски бактерий является эффективным и экономичным и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.