СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО СРЕДСТВА И ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО
ANTIVIRAL PREPARATION OBTAINING METHOD AND ANTIVIRAL PREPARATION

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения противовирусного средства путем культивирования штамма базидиомицета, в частности Flammulina velutipes (Curtis) Singer, на жидкой питательной среде в погруженной культуре и к противовирусному средству.
Известно, что базидиальный ксилотрофный гриб опенок зимний F. velutipes способен к синтезу биологически активных соединений, которые содержатся в плодовых телах и вегетативном мицелии. Выделенные активные метаболиты, относящиеся к различным классам соединений: полисахариды, тритерпены, жирные кислоты и др. Метаболиты F. velutipes способны оказывать выраженное противовирусное действие (X-h Не et al., 2008, M. Gong et al., 2009, V.P. Sharma et al., 2009, N.K. Sinha, 2011).
Известен способ получения противовирусной субстанции из плодовых тел и субстратного мицелия, выращенных на твердом питательном субстрате на основе отходов переработки сахарного тростника (US 4629627, 16.12.1986). Недостатками описанного способа являются длительность процесса культивирования гриба и сложность технологии выделения противовирусной субстанции. Точная длительность процесса в данном патенте не указывается. Однако известно, что сроки формирования плодовых тел F. velutipes составляют от 1 до 4 недель, длительность процесса освоения питательного субстрата вегетативным мицелием - не менее 3 недель. Кроме того, в технологической схеме присутствуют энергоемкие операции измельчения пророщенных грибным мицелием блоков субстрата и экстракции целевого продукта горячей водой с последующим отжимом и прямой сушкой водного экстракта.
Более близкими к описываемой группе изобретений являются способ получения противовирусного средства с использованием съедобного гриба и противовирусное средство (RU 2004130188, 2004). Способ получения противовирусного средства, содержащего в качестве активного вещества модифицированный водорастворимый лигнин-полисахаридный комплекс, включает разложение и модификацию лигнинов и полисахаридов из растительных отходов съедобным грибом Pleurotus ostreatus в условиях твердофазного культивирования, экстракцию, отделение жидкой фазы, ее подкисление, отделение осадка, его промывку. При этом пептидную составляющую осадка гидролизуют водным раствором соляной кислоты при 70°C в течение нескольких часов, остаточный осадок промывают до нейтрального pH, сушат, смешивают с NaOH в соотношении по сухой массе 100:21, растворяют при нагревании, добавляют HCl до pH 7,0.
Противовирусное средство широкого спектра действия для лечения инфекционных заболеваний, выделенное из водного экстракта растительных отходов, подвергнутых разложению съедобным грибом P. ostreatus, содержит в качестве активного вещества модифицированный водорастворимый лигнин-полисахаридный комплекс, не содержит пептиды, содержание лигнина в лигнин-полисахаридном комплексе по массе составляет не менее 90%.
Недостаток способа получения противовирусного средства заключается в длительности процесса твердофазного культивирования Р. ostreatus, сложности и многостадийности технологии выделения целевого продукта, в низком содержании в целевом продукте полисахаридов, ответственных в отличие от лигнина за противовирусные свойства получаемого комплекса. Получаемое при этом противовирусное средство обладает недостаточно высокой активностью.
Задачей группы изобретений в части способа является упрощение технологии процесса с получением целевого средства при его высоком выходе, в части вещества - повышение противовирусной активности средства.
Поставленная задача решается описываемым способом получения противовирусного средства путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло в количестве 19,0-27,0 г/л воды и мелассу в количестве 15-40 г/л воды, в качестве источника азота - кукурузную муку в количестве 7-15 г/л воды, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия в количестве 2,0-2,4 г/л воды и сульфат магния в количестве 0,18-0,20 г/л воды, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирования в ней базидиомицета в аэробных условиях с получением погруженной культуры, последующим разделением погруженной культуры на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость и выделением из последней посредством добавления к ней при температуре 4°C 96%-ного этилового спирта, при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:2-1:4, сгустка, который отжимают, высушивают при температуре 40°C до содержания влаги 6% и измельчают с получением противовирусного средства.
3
Предпочтительно жидкая питательная среда дополнительно содержит зеатин в количестве 0,0010-0,0015 г/л воды, витамин B в количестве 0,0060-0,0065 г/л воды, дрожжевой экстракт в количестве 0,050-0,055 г/л воды.
Поставленная задача решается также описываемым противовирусным средством, полученным вышеописанным способом.
Техническими результатами описываемой группы изобретений являются упрощение технологии процесса, получение с высоким выходом противовирусного средства, обладающего повышенной активностью.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретения, но не ограничивают их.
Пример 1.
-5
Готовят посевной мицелий базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer. Для этого готовят стерильную посевную жидкую питательную среду, состава, г/л: меласса - 30,0, соевая мука - 6,0, дигидрофосфат калия - 2,0, фосфат магния - 0,28, арахидоновая кислота -1,0×10 и засевают ее мицелием F. velutipes, выращенным на агаровой питательной среде. Процесс получения посевного мицелия проводят в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин, при 22°C в течение 4 суток при аэрации.
2
4
4
Затем готовят жидкую питательную среду, состава, г/л воды: растительное масло - 19,00, меласса - 40,00, кукурузная мука - 7,00, дигидрофосфат калия KHPO - 2,40, сульфат магния MgSO - 0,18, вода - до 1,00 л.
Данную среду разливают в колбы, стерилизуют и засевают мицелием, полученным вышеописанным способом.
Погруженное культивирование осуществляют в колбах на ротационной качалке в аэробных условиях при температуре 25°C в течение 4 суток с получением погруженной культуры. Погруженную культуру разделяют на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость. Культуральную жидкость охлаждают до температуры 4°C, затем при непрерывном перемешивании к последней добавляют 96% этиловый спирт той же температуры при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:2. Образовавшийся при осаждении сгусток отжимают, высушивают при температуре 40°C до содержания влаги 6%, измельчают и получают противовирусное средство. Очистку противовирусного средства осуществляют путем трехкратного перерастворения экзополисахарида в дистиллированной воде с последующим осаждением спиртом по описанной выше методике. Выход противовирусного средства - 0,65 г/л.
Пример 2.
Процесс получения противовирусного средства осуществляют по примеру 1.
4
При этом используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л воды: растительное масло - 27,00, меласса - 20,00, кукурузная мука -15,00, дигидрофосфат калия - 2,00, сульфат MgSO - 0,20, вода - до 1,00 л.
Погруженное культивирование осуществляют в колбах на ротационной качалке в аэробных условиях при температуре 25°C в течение 4 суток. Процесс выделения противовирусного средства осуществляют при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:4.
Выход противовирусного средства - 0,87 г/л.
Пример 3.
2
4
4
3
Процесс получения осуществляют по примеру 1, при этом состав жидкой питательной среды имеет следующее соотношение компонентов, г/л воды: растительное масло - 24,00, меласса - 15,00, кукурузная мука - 12,00, KHPO - 2,20, MgSO - 0,19, зеатин - 0,0010 г/л воды, витамин B - 0,0065 г/л воды, дрожжевой экстракт - 0,05 г/л воды, вода - до 1,00 л.
3
При этом компоненты зетаин, витамин B, дрожжевой экстракт вводят следующим образом.
Готовят раствор зеатина, для чего 100 мг вещества растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 112°C в течение 30 минут. Вносят из расчета 1 мл раствора на 1 л производственной питательной среды.
3
Готовят раствор витамина B, для чего 100 мг вещества (или 1 таблетку пантотената кальция в аптечной расфасовке) растворяют в 50 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 112°C в течение 30 минут. Вносят из расчета 3 мл раствора на 1 л производственной питательной среды.
Готовят раствор дрожжевого экстракта, для чего 5 г сухого препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 112°C в течение 30 минут. Вносят из расчета 1 мл раствора на 1 л производственной питательной среды.
Погруженное культивирование осуществляют в колбах на ротационной качалке при температуре 25°C в течение 4 суток, внося 5 порций мелассы по 5 г через 24, 36, 48, 60 и 72 часа культивирования.
Выделение противовирусного средства осуществляют согласно примеру 1.
Выход противовирусного средства - 1,2 г/л.
Пример 4.
Для оценки противовирусных свойств полученного средства на основе лекарственного базидиомицета F. velutipes вышеописанным способом проводят тест, оценивающий индукцию интерферона лейкоцитами донорской крови человека.
Для исследования используют сухой образец экзополисахаридов лекарственного базидиомицета F. velutipes, полученный по примеру 1. Готовят исходный раствор полученного образца экзополисахаридов с концентрацией 800 мкг/мл. С этой целью из образца берут навески массой по 4 мг. К навеске добавляют по 5 мл дистиллированной воды. Затем методом разведений готовят растворы экзополисахаридов с концентрацией 400, 200, 100, 50, 10, 5, 1 и 0,1 мкг/мл. Эти образцы используют в качестве индукторов интерферона.
6
50
Клетками-продуцентами служат лейкоциты донорской крови человека. Концентрация лейкоцитов составляла 1×10 /мл. В качестве среды использовали среду RPMI 1640, объем среды в каждой пробе составлял 1,0 мл. К взвеси лейкоцитов в каждой пробе добавляют по 0,1 мл соответствующего разведения исследуемой суммарной фракции. В качестве контроля используют вирус болезни Ньюкасла (ВБН) как индуктор α-интерферона и фитогемагглютинин P (ФГА) как индуктор γ-интерферона, а также взвесь лейкоцитов в среде без добавления индуктора. Синтез интерферона проводят при температуре 37°C. Образцы отбирают через 24, 48 и 72 часа. Активность интерферона определяют путем титрования в диплоидной культуре фирбобластов эмбриона человека против 10 и 1 ЦПД вируса энцефаломиокардита мышей. За титр интерферона принимают последнее его разведение, в котором наблюдается 50% защиты клеточного монослоя от цитопатического действия вируса.
Результаты теста на способность экзополисахаридов из культуральной жидкости F. velutipes, полученной по примеру 1, индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию интерферона приведены в таблице.
Таблица
Результаты теста на способность экзополисахаридов культуральной жидкости F. velutipes, полученных по примеру 1, индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию интерферона (ед/мл)
Концентрация препарата, мг/мл
Время после индукции
24 часа
48 часов
72 часа
50
<8
<8
<8
5
8
8
4
0,5
8
8
4
0,1
8
16
8-16
0,05
16
32
16
0,01
16
32
16
0,005
8
16
8
0,001
<2
16
8
0,0001
<2
8
8
контроль клеток
<2
<2
<2
контроль ВБН
160
80
8
контроль ФГА
16
16
16
При тестировании интерферона биологическим методом в культуре диплоидных фибробластов человека по подавлению репродукции индикаторного вируса описываемое противовирусное средство в концентрации от 0,0001 мг/мл до 5 мг/мл индуцирует в лейкоцитах человека продукцию интерферона. Наибольшая активность интерферона составляет 16-32 ед/мл и выявляется при использовании препарата в концентрации 0,005-0,1 мг/мл. Оптимальное время для выявления наибольшего титра интерферона составляет 48 часов. Средство индуцирует интерферон на уровне контрольного индуктора гамма интерферона ФГА.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии достаточно высокой противовирусной активности экзополисахаридов F. velutipes, полученных описываемым способом.