СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD FOR LEUKOSIS DIAGNOSIS IN CATTLE

Изобретение относится к области химии. Описан способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Способ включает в себя использование прямого и обратного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления гена провируса лейкоза крупного рогатого скота. выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающей прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для выявления фрагмента гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота с электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, в качестве праймеров используют олигонуклеотиды следующей структуры -
При постановке ПЦР этим способом размер продукта на выходе составляет 438 пар нуклеотидов.
Однако, данный способ требует проведение дополнительной стадии электрофоретической детекции, что повышает вероятность возникновения контаминации (пат. RU №2445370, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.12 г.).
Известен также способ выделения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени, включающий прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота с определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. В качестве праймеров используют - Pol (nested, sense)  и Pol (nested, antisense)  и добавляют в реакционную смесь синтезированный зонд - Pol (molecular beacon)  с флуоресцентной меткой. Размер продукта на выходе составляет 202 п.н. (Гулюкин М.И. и др. Применение ПЦР для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота. Харьков, «Ветеринарная медицина», вып. 92. с. 145-150).
В этом способе выявления ДНК провируса крупного рогатого скота методом ПЦР, наиболее близком к предлагаемому, из-за низкой консервативности и малой вариабельности снижается специфичность и эффективность обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus:prospects for novel antiretroviral therapies in human. N. Gillet, A. Florins, M.Boxus, C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers, H. Balon, Amel-BayaBouzar, J. Defoichel, A. Burny, M. Reichert, R. Kettmann and Luc Willems. Rerovirology 2007, 4:18).
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании более специфичного и чувствительного способа обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР путем использования другой нуклеотидной последовательности генома вируса лейкоза крупного рогатого скота, а именно области гена р24.
Для достижения этого технического результата в способе экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера, с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена провируса лейкоза крупного рогатого скота, выявляют фрагмент гена р24 провируса лейкоза крупного рогатого скота и используют в качестве праймеров олигонуклеотиды структуры:
а в качестве олигонуклеотидного зонда-зонд
F
R
RT  меченный с 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и с 3'-конца гасителем RTQ2, которые имеют следующие характеристики: отсутствие самокомплементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, температура отжига составляет 61,0°С для P, 62,2°С для P 66,4°С для RT и фланкируют область консервативного гена р24 ВЛКРС размером 140 пар нуклеотидов консервативного гена р24 провируса лейкоза КРС, который обнаруживают за счет детекции сигнала флуоресценции.
В результате ПЦР на стадии отжига происходит комплементарное присоединение праймеров и зонда к молекуле ДНК-мишени. Во время стадии элонгации происходит разрушение зонда за счет 3'-нуклеазной активности полимеразы, а флуоресцентная метка (краситель) выходит в реакционную смесь. Детектирующий амплификатор фиксирует свободную флуоресценцию реакционной смеси и по уровню флюоресценции можно контролировать прохождение ПЦР в режиме реального времени.
Отличительными признаками предлагаемого способа экспресс диагностики лейкоза крупного рогатого скота от прототипа, являются использование другой нуклеотидной последовательности генома ВЛКРС, а именно области гена р24, которая отличается более высокой степенью консервативности и использование олигонуклеотидного зонда меченного 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и 3'- конца гасителем RTQ2, что позволяет получить достоверный, высокочувствительный, высокоспецифичный способ выявления фрагмента провирусной ДНК ВЛКРС в биологическом материале в течение 4 часов.
F
R
Предложенный способ осуществляли с помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0 (Introgen, США). На основании информации, представленной в базах данных Интернет ресурсов EMBL (Германия), GenBank(CIIIA), по генотипам ВЛКРС была выбрана референс последовательность - К02120. Для оценки вариабельности и поиска консервативных участков нуклеотидных последовательностей, ограничивающих эту область, был произведен с использованием компьютерной программы BioEdit. В результате анализа была выбрана консервативная нуклеотидная последовательность гена р24. Подборка оптимальных к последовательности гена р24 праймеров и зонда. Проверка качеств, термодинамический анализ выбранных олигонуклеотидов был выполнен с помощью программы Vector NTI 9.0 (Introgen, США). Праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью web-pecypca Национального центра биологической информации (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Оценка специфичности подтвердила гомологичность выбранных праймеров и зонда с нуклеотидной последовательностью гена р24 и отсутствие значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других видов вирусов. Расчетная длина специфического фрагмента составила 140 пар нуклеотидов (п.н.) Схема фланкируемого участка гена р24 генома вируса лейкоза крупного рогатого скота праймерами P р24_140 и P р24_140 представлена на рис. 1.
В таблице 1 приведены нуклеотидные последовательности праймеров и зонда, предлагаемые для обнаружения возбудителя лейкоза крупного рогатого скота по гену р24, кодирующего нуклеотидный белок.
F
R
F
R
Представленные праймеры и зонд имеют следующие характеристики: комплементарность к области гена р24 ВЛКРС, отсутствие самокоплементарных участков внутри каждого олигонуклеотида и между собой. Температура отжига составляет 61,0°С для P p24, 62,2°С для P р24 и 66,4°С для probe_RTp24. GC состав: 61,9% для Pp24, 63,6% - Pp24, 46,9% для probe_RTp24. Праймеры фланкируют фрагментконсервативного гена р24 ВЛКРС размером 140 пар нуклеотидов. Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре. Характеристика разработанных праймеров приведена в таблице 2.
В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции, с использованием разработанных праймеров. Состав реакционной смеси представлен в таблице 3.
Как видно из таблицы 3, полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК.
Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в таблице 4.
В качестве положительного контроля прохождения полимеразной цепной реакции с применением разработанных праймеров, используют лиофилизированный препарат положительного контрольного антигена (АГ) ВЛКРС. Препарат получен из вируса, накопленного в вируспродуцирующей культуре клеток почки эмбриона овцы (FLK). Предварительно препарат АГ был испытан в ПЦР анализе с помощью коммерческих наборов для детекции ДНК провируса лейкоза КРС отечественных производителей.
Детекцию результатов проводили в процессе амплификации на стадии «отжига» праймеров посредством детектирующего амплификатора ДТ-96 производства «ДНК-технология». Учет результатов вели по каналу флуоресценции ROX. Результаты анализа показаны в таблице 5 и на рис. 2, показана зависимость флуоресценции канала ROX от номера цикла по накоплению провируса лейкоза, где С 7 - положительный контроль (лиофилизированный препарат положительного контрольного антигена ВЛКРС), С 3 - отрицательный контроль.
Из таблицы 5 видно, положительное значение Ср по каналу ROX равное 23,9 свидетельствует о накоплении в процессе ПЦР ожидаемого продукта реакции - участка провирусной ДНК ВЛКРС.
Также учет результатов ПЦР был выполнен с помощью горизонтального электрофореза в 1,8% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
В процессе ПЦР получены продукты амплификации ДНК провируса лейкоза КРС длиной 140 п.н. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов. Электрофореграмма результатов полимеразной цепной реакции представлена на рис. 3, где 1 трэк - маркер молекулярного веса (от 100 до 1000 п. н.); 2 трэк - специфичный ампликон провирусной ДНК ВЛКРС; 3 трэк - ОКО (контрольный отрицательный образец).
В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю (К+), присутствовала светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность соответствовала длине ампликона 140 п.н. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю (К-), такая полоса отсутствовала. Это свидетельствует о наличии искомого участка провирусной ДНК ВЛКРС.
-5
1
-
-4
-5
-6
-1
-2
-3
Для определения чувствительности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда был проведен анализ проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений суспензии клеток FLK (вирус продуцирующая культура клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированная вирусом лейкоза КРС). Анализ показал, что последним разведением, в котором проходила ПЦР, является 5 разведение (10), что составляет 1,3×10в.к./мл. Результаты ПЦР в реальном времени представлены в таблице 6 и на рис. 4 по определению чувствительности и специфичности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда, где D 1 - К - отрицательный контрольный образец; D 2- разведение (10); D 3- разведение (10); D 4- разведение (10); D 5- разведение (10); D 6 -разведение (10); D 7- разведение (10).
Для проверки специфичности, разработанные праймеры и зонд проверяли методом ПЦР в реальном времени с использованием следующих образцов ДНК:
1. провирусная ДНК FLK-BLV, выделенной из вирус продуцирующей культуры клеток почки эмбриона овцы (FLK), образец №1;
2. ДНК от здоровых коров, образец №2;
3. провирусная ДНК возбудителя иммунодефицита КРС, образец №3;
4. ДНК герпес вируса возбудителя инфекционного ринотрахеита КРС, образец №4;
5. ДНК Е. coli, образец №5;
6. ДНК бактерий рода Salmonella, образец №6.
Положительный результат в ПЦР получили только с образцами ДНК провирусной ДНК FLK-BLV. В остальных пробах ДНК продукт амплификации отсутствовал, приведены В таблице 7 и на рис. 5 представлены результаты ПЦР по определению специфичности разработанных праймеров и зонда, где С 3- провирусная ДНК FLK-BLV, выделенной из вирус продуцирующей культуры клеток почки эмбриона овцы (FLK), образец №1; С 2-отрицательный контрольный образец; С 4 ДНК от здоровых коров, образец №2; С 5 -провирусная ДНК возбудителя иммунодефицита КРС, образец №3; С 6 -ДНК герпес вируса возбудителя инфекционного ринотрахеита КРС, образец №4; С 7-ДНК Е. coli, образец №5; С 8-ДНК бактерий рода Salmonella, образец №6.
Как видно, из вышеописанных примеров, предложенный способ полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием оригинальных праймеров и зонда позволяет обнаруживать провирусную ДНК возбудителя лейкоза крупного рогатого скота.
Выбор высоко консервативной области гена р24 позволяет повысить специфичность данного способа диагностики лейкоза КРС.
1
Использование предлагаемых специфических праймеров и зонда повышает чувствительность метода ПЦР по сравнению с прототипом до 1,3×10в.к./мл.
-
+
Предложенный способ апробирован с 2009-2015 гг на многих животноводческих фермах Республики Татарстан на более 500 пробах ДНК, полученных из крови крупного рогатого скота. Приводим один из примеров в таблице - 8 и на рис. 6 по амплификации специфических фрагментов ДНК провируса лейкоза КРС с помощью разработанных праймеров и олигонуклеотидного зонда для диагностики лейкоза КРС, где С 3-К - отрицательный контрольный образец; С7 - отрицательная проба (кровь теленка неинфицированная вирусом лейкоза КРС); С 5-положительная проба (кровь коровы инфицированная вирусом лейкоза крс); С 9 - К- положительный контрольный образец.
Как видно из таблицы 8, предлагаемый способ экспресс-диагностики лейкоза КРС позволяет достоверно обнаруживать провирус лейкоза КРС в клинических образцах.
Предложенный способ неоднократно апробирован на базе лаборатории биохимии и молекулярно-генетического анализа ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).
Таким образом, предлагаемый достоверный и высокочувствительный способ позволяет сократить время, упростить процесс ранней диагностики лейкоза КРС и выявления вируса лейкоза КРС.