СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОЛОГИЧНОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
METHOD FOR DETERMINING AUTOLOGOUS ANTICANCER ACTIVITY OF BLOOD NEUTROPHILS IN ONCOLOGICAL DISEASES

Изобретение относится к медицине, а именно к онкоиммунологии, и представляет собой способ определения противоопухолевой активности нейтрофилов крови у больных онкологическими заболеваниями.
Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности, при этом в России, как и во всем мире, отмечается рост заболеваемости на 1,5% в год [2,5]. Важным фактором противоопухолевой резистентности организма является функциональная активность нейтрофилов, которая в динамике заболевания может меняться от противоопухолевой до проопухолевой, тем самым меняя прогноз характера течения и исхода заболевания [8]. В связи с этим, появляется необходимость разработки новых методов лабораторной диагностики, характеризующих противоопухолевую активность нейтрофилов у больных онкологическими заболеваниями.
Известен способ определения количества нейтрофилов в крови с противоопухолевой и проопухолевой активностью в зависимости от их разделения по градиенту плотности на фиколле [10]. Нейтрофилы с высокой плотностью (HDNs) определяются как противоопухолевые, нейтрофилы с низкой плотностью (LDNs) являются проопухолевыми. Недостатками способа являются: необходимость идентификации фракции LDNs среди мононуклеарных клеток и необходимость сепарации фракций нейтрофилов крови на фиколле, что повышает ошибку метода.
Известен способ определения количества нейтрофилов с противоопухолевой и проопухолевой активностью в зависимости от степени их зрелости [9]. Незрелые нейтрофилы проявляют проопухолевую активность. В эту фракцию включают и миелоидные супрессорные клетки, которые осуществляют супрессию адаптивного противоопухолевого иммунитета. Зрелые нейтрофилы являются клетками с противоопухолевой активностью. Недостатки способа: наличие широкого спектра методов, оценивающих зрелость нейтрофилов, и отсутствие конкретных величин маркеров, позволяющих дифференцировать стадию созревания клеток и, соответственно, переход нейтрофилов от проопухолевой активности к противоопухолевой.
6
3
Известен способ количественной оценки цитолитической активности нейтрофилов опухолевых клеток [4]. Опухолевые клетки линии YAC-1 (5×10 клеток/мл) предварительно метят в течение 3 часов 3 мкКи/мл [Н] dUrd (49,7 Ки/мМ). Затем проводят совместное инкубирование опухолевых клеток и нейтрофилов в течение 16 часов, взвесь отмывают от клеток, и в супернатанте определяют радиоактивность с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Minaxi Beta (United Technologies, Downers Grove. IL). Недостатки способа: длительность выполнения анализа и применение радиоактивных реагентов, что снижает возможность его применения в клинико-лабораторной практике.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ определения противоопухолевой цитотоксичности нейтрофилов у больных раком молочной железы [6]. Сущность способа: в 96-луночный планшет для культивирования с плоским дном из белого полистирола вносят 5000 клеток на лунку клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231, меченных люциферазой. Через 4 часа в эти же лунки вносят выделенные из крови нейтрофилы и осуществляют совместное культивирование в течение ночи. После культивирования лунки промывают физиологическим раствором, лизируют клетки и измеряют активность люциферазы. Недостатками способа являются длительное выполнение анализа и определение противоопухолевой активности нейтрофилов по отношению к культуральным опухолевым клеткам, а не к аутологичным опухолевым клеткам пациента.
Задачей изобретения является создание нового информативного способа определения противоопухолевой активности нейтрофилов больных с онкологическими заболеваниями к аутологичным опухолевым клеткам.
Поставленную задачу осуществляют за счет того, что у больных с онкологическими заболеваниями во время операции забирают кровь и опухолевую ткань, и с помощью хемилюминесцентного анализа определяют индекс аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов (ИАПАН), представляющий собой отношение площади под кривой люцигенин-зависимой зимозан-индуцированной хемилюминесценции (Sзим) к площади под кривой люцигенин-зависимой хемилюминесценции, индуцированной аутологичными опухолевыми клетками. При ИАПАН 2,0 и меньше определяют высокий уровень противоопухолевой активности нейтрофилов к аутологичным опухолевым клеткам у больных онкологическими заболеваниями, при ИАПАН выше 2,0 - низкую аутологичную противоопухолевую активность нейтрофилов.
Значение 2,0 получено опытным путем на основании сопоставления значений рассчитываемого ИАПАН и данных послеоперационного стадирования рака по классификации TNM. Известно, что на ранних стадиях онкогенеза нейтрофилы проявляют высокий уровень противоопухолевой активности, тогда как на поздних стадиях заболевания противоопухолевая активность нейтрофилов снижается, и они проявляют проопухолевую активность [12, 13].
Нейтрофилы являются высокореактивными клетками иммунной системы, функциональная активность которых реализуется преимущественно в рамках противоинфекционного иммунитета. Однако, в настоящее время установлено, что нейтрофилы также принимают активное участие в реакциях иммунной системы на опухоль [1]. Доказано, что контакт нейтрофила с опухолевой клеткой может приводить к лизису последней, причем могут быть различные механизмы, включая фагоцитоз [7, 11]. В то же время, на поздних стадиях онкологического заболевания нейтрофилы снижают свою противоопухолевую активность и становятся проопухолевыми [12]. Причем, изменение функциональной активности нейтрофилов по отношению к опухолевым клеткам влияет на прогноз течения и исхода заболевания [1, 13]. Функциональная активность нейтрофилов характеризуется интенсивностью дыхательного взрыва (индуцированный синтез активных форм кислорода - АФК), который является обязательным компонентом фагоцитоза и внешнего киллинга [1, 3]. Люцигенин является хемилюминесцентным индикатором, который вступает в хемилюминесцентную реакцию с первичной АФК - супероксидным анион-радикалом. Площадь под кривой (S) хемилюминесценции является интегральным показателей и характеризует суммарное количество супероксидного анион-радикала, синтезированного за время измерения [3]. Зимозан (полисахарид клеточной стенки дрожжей) является стандартным индуктором дыхательного взрыва нейтрофилов, что широко используется при оценки их функциональной активности. Таким образом, соотношение площадей под кривыми хемилюминесценции, индуцированных зимозаном и аутологичными опухолевыми клетками, позволяет определить противоопухолевую активность нейтрофилов.
Способ выполняется следующим образом.
3
3
-5
-5
У пациентов с онкологическими заболеваниями во время проведения операции по поводу хирургического удаления опухоли забирают венозную кровь в количестве 2 мл из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином и опухолевую ткань (объем - не менее 0,5 см), помещают во флаконы с физиологическим раствором. Нейтрофилы выделяют из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см - для отделения лимфоцитов, ρ=1,119 г/см - для выделения нейтрофилов. Подсчитывают количество нейтрофилов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода нейтрофилов, которая составляет не менее 97%. Опухолевую ткань гомогенизируют и трижды отмывают центрифугированием для отделения крупных клеточных агрегатов. Подсчитывают количество аутологичных опухолевых клеток (например, в камере Горяева). Хемилюминесцентный анализ осуществляется в двух кюветах. Реакционная смесь для хемилюминесцентной реакции в первой кювете состоит из 10 мкл донорской сыворотки AB(IV)Rh(-), 50 мкл люцигенина (Sigma. США) в концентрации 10 М, 200 мкл взвеси нейтрофилов (2 млн/мл), 190 мкл раствора Хенкса (ПанЭко, Россия) и 50 мкл зимозана (Sigma. США). Реакционная смесь для хемилюминесцентной реакции во второй кювете состоит из 10 мкл донорской сыворотки AB(IV)Rh(-), 50 мкл люцигенина (Sigma, США) в концентрации 10 М, 200 мкл взвеси нейтрофилов (2 млн/мл), 190 мкл раствора Хенкса (ПанЭко, Россия) и 50 мкл взвеси аутологичных опухолевых клеток (10 млн/мл). Оценку хемилюминесцентной активности нейтрофилов осуществляют в течение 90 минут на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе БЛМ-3607 (ООО «МедБиоТех». Красноярск) и определяют Sзим (по первой кювете) и Sок (по второй кювете).
Затем рассчитывают индекс аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов (ИАПАН), представляющий собой отношение площади под кривой люцигенин-зависимой зимозан-индуцированной хемилюминесценции (Sзим) к площади под кривой люцигенин-зависимой хемилюминесценции, индуцированной аутологичными опухолевыми клетками (Sок): ИАПАН = Sзим / Sок.
ИАПАН 2,0 и меньше свидетельствует о высоком уровне противоопухолевой активности нейтрофилов к аутологичным опухолевым клеткам у больных онкологическими заболеваниями, ИАПАН выше 2,0 - о низкой аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов.
Данный способ апробирован на 25 больных раком почки и мочевого пузыря (табл. 1).
По результатам обследования по заявленному способу установлено, что из 25 больных раком почки и мочевого пузыря у 11 (44,0%) пациентов выявляется ИПАН ниже 2,0 и, соответственно, определяется высокий уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов. У 14 (56,0%) пациентов выявляется ИПАН выше 2,0 и, соответственно, определяется низкий уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов.
Последующие динамические наблюдения (не менее 3-х лет) за пациентами, вошедшими в группу обследования, позволили установить, что в группе прооперированных больных с высоким уровнем аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов не были выявлены случаи рецидива онкологического заболевания, метастазирования рака почки или мочевого пузыря не обнаружено. У 11 из 14 пациентов (78,6%) с низким уровнем аутологичной противоопухолевой активности в течение 3-х лет послеоперационного наблюдения выявлялись случаи рецидива онкологического заболевания или метастазирования рака.
Клинический пример 1.
3
0
0
Больной Т.. 52 года. Находился на стационарном лечении в урологическом отделении КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с 27.06.2016 по 05.08.2016 с диагнозом: рак правой почки, TNM. Операция 12.07.2016, проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия слева, дренирование забрюшинного пространства. Результаты гистологического исследования: светлоклеточный рак почки. Течение послеоперационного периода гладкое.
Проведено исследование заявленным способом. Установлено, что Sзим составляет 3016000 о.е. × сек.(отн. ед. × сек.), Sок - 2758000 о.е. × сек. ИПАН равен 1,09 (меньше 2,0), что определяет высокую аутологичную противоопухолевую активность нейтрофилов.
Последующие динамические наблюдения, проводимые в течение 3-х лет, не выявили случаев рецидива рака почки, метастазирования рака почки не обнаружено.
Клинический пример 2.
3
0
0
Больной Б., 48 лет. Находился на стационарном лечении в урологическом отделении КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с 12.09.2016 по 28.10.2016 с диагнозом: рак левой почки, TNM. Операция 04.10.2016. проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия слева, дренирование забрюшинного пространства. Результаты гистологического исследования: светлоклеточный солидно-тубулярный тип с инвазией в капсулу. Течение послеоперационного периода гладкое.
Проведено исследование заявленным способом. Установлено, что S3HM составляет 2384000 о.е. × сек., Sок - 733500 о.е. × сек. ИПАН равен 3,25 (больше 2,0), что определяет низкую аутологичную противоопухолевую активность нейтрофилов.
Последующие динамические наблюдения позволили выявить, что у больного Б. на 2-ом году послеоперационного периода развился рецидив рака почки.
Технический результат предлагаемого способа:
- способ позволяет определить уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов крови у больных онкологическими заболеваниями;
- инвазивное вмешательство ограничено однократным забором из вены малого объема крови (2 мл);
- возможность своевременной профилактики развития рецидивов онкологических заболеваний и метастазирования опухоли.
Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет определить уровень аутологичной противоопухолевой активности нейтрофилов у больных онкологическими заболеваниями и может быть рекомендован для применения в клинической практике.
Разработка способа выполнена в рамках проекта «Механизмы метаболического репрограммирования клеток врожденного иммунитета при опухолевом росте», финансируемого Краевым государственным автономным учреждением «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности».
Источники информации.
1. Куртасова Л.М., Савченко А.А., Шкапова Е.А. Клинические аспекты функциональных нарушений нейтрофильных гранулоцитов при онкопатологии. - Новосибирск: Наука, 2009. - 183 с.
2. Петрова Г.В., Грецова О.П., Старинский В.В. Сравнение данных государственной онкологической статистики и ракового регистра России // Сибирский онкологический журнал. - 2019. - Т. 18, №5. - С. 5-17.
3. Савченко А.А., Здзитовецкий Д.Э., Борисов А.Г., Лузан Н.А. Хемилюминесцентная и энзиматическая активность нейтрофильных гранулоцитов у больных распространенным гнойным перитонитом в зависимости от исхода заболевания // Вестник РАМН. - 2014. - №5-6. - С. 23-28.
4. Ackermann MF, Lamm KR, Wiegand GW, Luster MI. Antitumor activity of murine neutrophils demonstrated by cytometric analysis. Cancer Res. 1989 Feb 1; 49(3):528-32.
5. Cerrone M., Cantile M., Sacco O., Botti G. Geo-location of Oncological Diseases in the Extra-urban Areas of Naples and Creation of Territorial Biobanks: An Important Tool to Study Potential Connections Between Environmental Factors and Cancer // Anticancer Res. - 2018. - Vol. 38, no. 11. - P. 6459-6463.
6. Comen E., Wojnarowicz P., Seshan V.E., Shah R., Coker C., Norton L., Benezra R. TNF is a key cytokine mediating neutrophil cytotoxic activity in breast cancer patients // N.P.J. Breast Cancer. - 2016. - Vol. 2. - P. 16009.
7. Finisguerra V., Di Conza G., Di Matteo M., Serneels J., Costa S., Thompson A.A., Wauters E., Walmsley S., Prenen H., Granot Z., Casazza A., Mazzone M.. MET is required for the recruitment of anti-tumoural neutrophils // Nature. - 2015. - Vol. 522, no. 7556. - P. 349-353.
8. Lecot P., Sarabi M., Pereira Abrantes M., Mussard J., Koenderman L., Caux C., Bendriss-Vermare N., Michallet M.C. Neutrophil Heterogeneity in Cancer: From Biology to Therapies // Front Immunol. - 2019. - Vol. 10. - P. 2155.
9. Mackey J.B.G., Coffelt S.B., Carlin L.M. Neutrophil Maturity in Cancer // Front Immunol. - 2019. - Vol. 10. - P. 1912.
10. Sionov R.V., Assi S., Gershkovitz M., Sagiv J.Y., Polyansky L., Mishalian I., Fridlender Z.G., Granot Z. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties // J. Vis. Exp. - 2015. - Vol. 100. - e52933.
11. Strizova Z., Vachtenheim J.Jr., Bartunkova J. The potential role of neutrophil trogocytosis and G-CSF in the loss of HER2 expression // Breast Cancer Res Treat. - 2019. - Vol. 178, no. 10. - P. 247-248.
12. Tazzyman S., Barry S.T., Ashton S., Wood P., Blakey D., Lewis C.E. Inhibition of neutrophil infiltration into A549 lung tumors in vitro and in vivo using a CXCR2-specific antagonist is associated with reduced tumor growth // International Journal of Cancer. - 2011. - Vol. 129, no. 4. - P. 847-858.
13. Trellakis S., Bruderek K., Dumitru C.A., Gholaman H., Gu X., Bankfalvi A. Polymorphonuclear granulocytes in human head and neck cancer: enhanced inflammatory activity, modulation by cancer cells and expansion in advanced disease // International Journal of Cancer. - 2010. - Vol. 129, no. 9. - P. 2183-2193.