Эффективность криоконсервирования при -80°с тромбоцитных концентратов для клинического применения

Ф.С. Шерстнев, C.B. Утемов, A.A. Костяев, М.Е. Ковтунова, К.А. Ветошкин

Эффективность криоконсервирования при -80°С тромбоцитных концентратов для клинического применения

ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови» ФМБА России, г. Киров

F.S. Sherstnev, S.V. Utemov, A.A. Kostyaev, M.E. Kovtunova, K.A. Vetoshkin

Cryopreservation efficiency of platelet concentrate at -80°C,

for clinical application

«Kirov Scientific Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of Federal Medical-

Biological Agency», Kirov

Ключевые слова: тромбоцитные концентраты, Keywords: platelet concentrates, cryopreservation,

криоконсервирование, морфофункциональная со- morphofunctional cell integrity.

хранность клеток.

Оценили эффективность криоконсервирования тромбоцитных концентратов, полученных от 95 доноров с помощью аппаратного и дискретного трехкратного афереза, для клинического применения. После замораживания по экспоненциальной программе с использованием двух электроморозильников на —30°С и —80°С сохранялось не менее 89,7% тромбоцитов, полученных аппаратным методом, с высокой функциональной активностью. В тромбоцитных концентратах, заготовленных методом дискретного афереза, сохранялось не менее 83% функционально активных клеток. Показано, что функциональная активность тромбоцитов, полученных разными методами, сопоставима, за исключением восстановления их оптической плотности. В сепараторных клетках оно начинается раньше и более выражено.

Efficiency of platelet cryopreservation was studied. Therapeutic Platelet concentrates were obtained from 95 donors either with discrete or automated apheresis. After freezing according to exponential program with —30°C and —80°C refrigerators recovered 89.7% automated apheresis platelets and 83% discrete apheresis platelets with highfunctional characteristic. There were no significant quality differences between both types of concentrates, except reaction to osmotic stress, recovery in automated platelets started earlier and was more complete.

Применение трансфузий тромбоцитных концентратов (ТК) в настоящее время — единственный общепринятый во всем мире эффективный метод профилактики и лечения тромбоцитопенического геморрагического синдрома у онкогематологиче-ских больных. Такие трансфузии являются необходимым условием проведения программной химиотерапии при заболеваниях системы крови. В связи с этим гематологические клиники и отделения нуждаются

в постоянном наличии данной гемотранс-фузионной среды. Важность проблемы подчеркивается тем фактом, что на фоне снижения потребления эритроцитов в мире наблюдается ежегодный рост потребления ТК на 5-7% [7; 9].

Успех заместительной терапии тромбо-цитопенического геморрагического синдрома во многом зависит от количества перелитых тромбоцитов и их функциональной полноценности [1; 3; 7]. Известно, что тромбоци-

ты обладают коротким физиологическим сроком жизни (7—10 дней), поэтому для поддержания клинического эффекта необходимы частые их трансфузии (не реже чем через 3—5 дней).

Тромбоциты, помещенные в тромбо-миксер, следует хранить в гемоконтейне-рах, свободных для газообмена 02 и С02, при мягком горизонтальном перемешивании при температуре окружающей среды 20—24° С, чтобы максимально сохранить их качественные свойства. При этих условиях морфофункциональные характеристики кровяных пластинок не изменяются в течение 3—5 дней [4; 5]. Долгосрочное хранение этого гемокомпонента возможно только в условиях замораживания [10]. Для низкотемпературного консервирования используют концентраты тромбоцитов, полученные как с помощью клеточных сепараторов, так и с применением дифференцированного центрифугирования отдельных доз донорской крови [1; 9]. Наличие банка криокон-сервированных тромбоцитов ( в том числе ИЬЛ-типированных) позволяет решить организационные трудности обеспечения растущих потребностей клиник в лечебных дозах тромбоцитов, придает гибкость учреждениям службы крови в управлении ресурсами кровяных пластинок [2; 7].

Несмотря на множество разработанных методик криоконсервирования, оптимального решения до сих пор не найдено. В том числе не изучены клиническая эффективность и целесообразность приме -нения новых, более экономичных методов криоконсервирования тромбоцитов [3; 10]. В ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови» ФМБА России в эксперименте разработан метод консервирования тромбоцитов замораживанием по экспоненциальной программе при —80° С. Однако данный метод предназначен для криокон-сервирования малых объемов тромбоцитов (40-60 мл).

В целях определения эффективности указанного режима для объемов ТК не менее 200 мл, предназначенных для клинического применения, изучили морфофункцио-нальную сохранность замороженных/оттаянных кровяных пластинок.

Материалы и методы

ТК получали выделением из цельной донорской крови аппаратным методом (клеточный сепаратор «Amicus» фирмы «Baxter») [4], а также с помощью тройного дискретного тромбоцитафереза из обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) с использованием гемоконтейнеров «Teruflex 450/400/400» и центрифуг «Sorvall RC — 3C plus».

Статистическую обработку проводили с помощью программы Microsoft Office Excel 2007, STATISTICA. За достоверность принимали результаты при р<0,05.

От 95 доноров заготовили 102 ТК, в том числе 54 образца — с помощью аппаратного тромбоцитафереза и 48 — из цельной донорской крови методом трехкратного тромбоцитафереза. Хранение тромбоцитов до замораживания составило не более 2 часов. Полученные тромбоциты подвергали низкотемпературному замораживанию в пластикат -ных контейнерах «Компопласт 300» под защитой криоконсерванта «Тромбокриодмац». Для криоконсервирования биообъектов по двухэтапной экспоненциальной программе использовали электроморозильники на —30°С и —80°С. Первоначально ТК охлаждали в электроморозильнике «Криостат», разработанном Институтом проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины и ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови» ФМБА России [2]. Вторым этапом было замораживание с использованием электроморозильника «Sanyo» (Япония) при температуре -80°С.

Замораживание ТК осуществляли следующим образом: криоконсервант добавляли по каплям в равном объеме с тромбоцитами в течение 3—5 минут, постоянно перемешивая, затем смесь выдерживали при комнатной температуре 2—3 минуты (эквилибра-ция). После этого герметично закрытый пла-стикатный контейнер в металлическом хол-дере погружали в заполненную хладоносите-лем (96% этиловый спирт) 4-литровую ванну камеры электроморозильника «Криостат». Этиловый спирт в ванне был предварительно охлажден до —30°С. Одновременно в ванну помещали аналогичный полимерный контейнер в качестве имитатора ( смесь плаз-

Ф.С. Шерстнев, C.B. Утемов, A.A. Костяев, М.Е. Ковтунова, К.А. Ветошкин

мы с раствором криоконсерванта в конечной концентрации, соответствующей таковой при смешивании ТК с данным криопротектором 1:1) и с помощью датчика ТСМ 3-02, соединенного с измерительным прибором ГСП-04, контролировали температуру. На рисунке представлена температурная кривая двухступенчатого замораживания ТК до -80°С.

Как видно из представленного графика, температурная остановка происходила при —2 5° С через 21-23 минуты после начала охлаждения, что характеризовало быстрое замораживание. Такой график охлаждения позволял избежать дополнительного повреждающего воздействия холода. Размораживание ТК производили в 40-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 80—90 секунд при покачивании контейнера 2—3 раза в секунду.

Исследование функциональной активности тромбоцитов осуществляли трижды: непосредственно после выделения их из цельной крови, после смешивания с криоконсер-вантом перед замораживанием и после отогрева замороженных образцов. Отбор проб для анализа проводили из пробирок — спутников контейнера для хранения ТК через час после заготовки. Подсчет количества тромбоцитов до и после замораживания выполняли в камере Горяева в двух параллельных пробах с вычислением концентрации (х109/л) и общего содержания данных клеток в ТК.

Функциональную полноценность тромбоцитов исследовали методом определения ад-гезивности к стеклу; индуцированную агре-

гацию тромбоцитов — фотометрическим методом с помощью лазерного агрегометра «Биола» (модель ЬЛ-230) на 10-й минуте после добавления индукторов агрегации. Агрегацию тромбоцитов изучали с основными индукторами: аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 2,5 мкг/мл, коллаген — 2 мг/мл, ри-стомицин — 1,5 мг/мл, адреналин — 2,5 мкг/ мл (производитель — «Технология-Стандарт», г. Барнаул). Реакцию на гипотонический шок (РГШ) определяли по И. Налёт (1970) с помощью спектрофотометра СФ-46 в течение 10 минут при длине волны 610 нм [8]. Величины агрегации и РГШ исследовали в пробах при стандартном количестве тромбоцитов 250—350 тыс./мкл. Для исследования рН концентрата тромбоцитов и криоконсер-вирующих растворов использовали иономер универсальный ЭВ-74 и иономер рН-150.

Результаты исследования и их обсуждение

При выполнении процедуры аппаратного тромбоцитафереза получали от одного донора в зависимости от заданного режима 2,7—7,6x10й (4,8±0,24х1011) тромбоцитов. Их число в аферезных концентратах было достоверно выше, чем в образцах, полученных дискретным методом. Объем ТК, предназначенных для замораживания в соответствии с требованиями Технического регламента [4], составил 93±4,40 мл для аферезных и 72,6±6,60 мл для ТК, полученных дискретным способом (р<0,05). Уровень рН равнялся 7,7±0,12 и 7,9±0,25 соответствен-

Температурная кривая замораживания тромбоцитного концентрата с криоконсервантом в пластикатном контейнере по экспоненциальной программе

но. Различий между группами не выявлено. Объем ТК после смешивания с криопротек-тором достоверно увеличился за счет разведения клеточной массы. Необходимо отметить значимую разницу в количестве ТК при заготовке сепараторным и дискретным способами (р<0,05).

Во всех размороженных аппаратных ТК зарегистрировано число кровяных пластинок, соответствующее не менее одной терапевтической дозе. Для получения терапевтической дозы тромбоцитов, заготовленных дискретным методом, требовалось не менее двух ТК на трансфузию. Этим объясняется заметное увеличение объема последней ге-мотрансфузионной среды. Таким образом, количество размороженного ТК, полученного сепараторным способом, на одну трансфузию составило 188,0±9,5 мл, дискрет-

ным — 311,5±9,9 мл. В таблице представлена сравнительная характеристика функций ТК на различных этапах замораживания/оттаивания.

В подготовленных для криоконсер-вирования ТК определяли функциональные свойства тромбоцитов, характеризую -щие способность к активации и реорганизации мембраны, цитоскелета и цитоплазма-тических органелл клеток. Внешнее воздействие, которое оказывается на тромбоциты при их получении, смешивании с криопро-тектором, замораживании и оттаивании, неизбежно приводит к изменению их функциональных свойств. Вследствие этого при оценке таких функций, как агрегация и адгезия, обычно в качестве исходного показателя используют результат измерения свойств на-тивных клеток.

Сравнительная характеристика морфофункциональных свойств тромбоцитных концентратов на различных этапах замораживания/оттаивания

Параметры Нативные ТК Смешанные с консервантом ТК Размороженные ТК

Полученные аппаратным аферезом, п=54 Полученные дискретным аферезом, п=48 Полученные аппаратным аферезом, п=48 Полученные дискретным аферезом, п=42 Полученные аппаратным аферезом, п=48 Полученные дискретным аферезом, п=42

Количество тромбоцитов, хЮ11 4,75±0,24 1,14±0,15* 4,5±0,3 1,05±0,14* 4,26±0,23 0,95±0,15*

Объем ТК, мл 93±4,4 72,6±6,6* 188±9,4** 111,8±9,9*** 188,0±9,5** 311,5±9,9***

рН 7,66±0,12 7,85±0,25 7,5±0,2 8,1±0,2 - -

Адгезия тромбоцитов, % 44,6±3,6 49,9±6,4 43,14±3,74 43,13±7,0** 36,86±3,36** 44,68±5,16

Агрегация тромбоцитов с индукторами е Степень агрегации, % 13,3±2,9 27,8±7,6 10,7±1,9 12,8±3,6** 9,81±2,26 15,41±3,10

Радиус агрегатов, ед. 5,1±0,8 4,8±0,5 4,5±0,8 2,9±0,6** 3,42±0,60 3,06±0,47**

Ристомицин Степень агрегации, % 44,7±5,3 49,0±10,2 32,8±5,0** 47,6±11,4 28,73±4,15** 28,4±8,63

Радиус агрегатов, ед. 8,9±1,0 7,8±1,5 5,7±0,6** 5,0±1,4 6,11±0,65** 4,93±0,99

Коллаген Степень агрегации, % 50,6±6,4 52,3±10,1 38,9±5,6** 41,3±9,6** 31,19±5,5** 33,48±8,94**

Радиус агрегатов, ед. 8,6±0,85 3,5±0,8 7,9±0,9 3,1±0,7 4,57±0,56** 2,67±0,47

Адреналин Степень агрегации, % 27,1±4,5 28,7±6,9 23,6±4,3 25,3±6,1 21,09±3,87** 21,64±8,75

Радиус агрегатов, ед. 4,1±0,4 3,0±0,6 4,0±0,4 2,8±0,5 3,38±0,33* 2,28±0,39

РГШ 3 мин, % 76,54±2,76 58,2±4,63* 77,15±2,0 54,6±8,21 72,07±3,25 39,11±4,99**

5 мин, % 84,11±1,89 66,1±4,64* 80,07±1,76** 61,7±8,32 79,91±3,154** 46,44±6,02**

10 мин, % 86,9±1,6 79,5±4,9 83,6±1,82 71,3±7,85 77,19±2,7** 60,78±6,45**

Примечания: * — достоверность отличий показателей ТК, полученного методами аппаратного и дискретного афереза (р<0,05), критерий Стьюдента; ** — достоверное различие по сравнению с аналогичным показателем нативных тромбоцитов до смешивания с криопротектором, р<0,05, критерий сравнения Уилкоксона.

Ф.С. Шерстнев, С.В. Утемов, А.А. Костяев, М.Е. Ковтунова, К.А. Ветошкин

Как видно из данных таблицы, тенденция к снижению числа тромбоцитов отмечена на каждом этапе замораживания/оттаивания во всех исследуемых образцах (89,7 и 83% кровяных пластинок, полученных аппаратным и дискретным аферезом соответственно, сохранялись после размораживания), однако эти изменения недостоверны. Уровень рН во всех случаях соответствовал требованиям Технического регламента и не уменьшался ниже 7,0. В нативных клетках АДФ вызывал необратимую однофазную агрегацию на уровне 13,3±2,9 и 27,8±7,6 соответственно для аферезных ТК и тромбоцитов из ОТП (р>0,05). Между заготовленными различными способами нативными ТК не выявлено различий показателя свето-пропускания и среднего радиуса агрегатов, за исключением небольшого различия величины последнего при индукции коллагеном. Светопропускание по Борну после индукции ристомицином составило 44,7±5,31 для аферезных и 49,0±10,2 для дискретных тромбоцитов, сопоставимые результаты получены после индукции коллагеном — соответственно 50,6±6,4 и 52,3±10,1. Несколько меньше степень агрегации с адреналином — 25,9±4,5 и 28,7±6,9 (р>0,05).

При изучении влияния конечной концентрации криоконсерванта на тромбоциты во время эквилибрации не выявлено существенного уменьшения количества клеток, но отмечено некоторое снижение их функциональной активности. Так, степень агрегации пластинок с ристомицином и коллагеном уменьшилась по сравнению с ее значением у нативных в 1,3 раза, а радиус агрегатов ТК, полученных дискретным методом, с АДФ — почти в 1,7 раза (р<0,05).

Величина агрегации с АДФ, ристомицином и коллагеном размороженных клеток была снижена в сравнении с исходными в 1,4—1,8 раза в образцах, заготовленных как аппаратным, так и дискретным методом (р<0,005). Радиус агрегатов был в большей степени уменьшен при использовании в качестве индукторов ристомицина, коллагена и адреналина для тромбоцитов, полученных аппаратным аферезом, и АДФ — дискретным (р<0, 005). Параметры адгезивно -сти к стеклу оказались сопоставимы во всех

исследуемых образцах как для ТК, полученных как аппаратным, так и дискретным методом. Значения данного параметра не имели достоверных различий, за исключением размороженных ТК, полученных с помощью аппаратного афереза (р<0,05 в сравнении с на-тивными).

Важнейший показатель функциональной полноценности кровяных пластинок — реакция на гипотонический стресс (гипотонический шок), которая коррелирует с приживлением тромбоцитов при их введении в кровеносное русло. В нативных тромбоцитах процент восстановления оптической плотности был сопоставим с данными литературы [6; 8]. Процент восстановления к 10-й минуте не отличался значимо в тромбоцитах, полученных различными методами, однако в дискретных процесс протекал медленнее по сравнению с ТК, заготовленными сепараторным способом.

После оттаивания в ТК, полученных с помощью сепаратора и дискретного тромбоцитафереза, сохранилась высокая доля тромбоцитов — соответственно 89,7 и 83%. Статистически значимых различий в количестве кровяных пластинок после размораживания не получено.

Таким образом, воздействие различных внешних факторов на тромбоциты в процессе тромбоцитафереза, эквилибрации и замораживания/оттаивания оказывает влияние на степень их агрегации, вызывая разнонаправленные сдвиги агрегационной активности.

Заключение

Резюмируя полученные результаты, следует заключить, что аппаратный тромбо-цитаферез позволяет получить большее количество кровяных пластинок в ТК, стойких в отношении повреждающего воздействия замораживания/оттаивания, по сравнению с дискретным трехкратным аферезом. Это подтверждается достоверно высоким количеством кровяных пластинок в ТК на всех этапах криоконсервирования. Функциональная активность тромбоцитов, полученных разными методами, сопоставима, за исключением восстановления их оптической плотности. В сепараторных клетках оно начинается раньше и более выражено.

После криоконсервирования по экспоненциальной программе с использованием двух электроморозильников на —30°С и —80°С сохранялось не менее 89,7% тромбоцитов, полученных с помощью фракцио-наторов клеток крови, с высокой функциональной активностью. Важным является тот факт, что гемотрансфузионная среда может сохраняться в замороженном состоянии длительный период времени, это обеспечит ка-рантинизацию тромбоцитов. В ТК, полученном методом дискретного афереза, сохранялось не менее 83% функционально активных клеток.

Результаты криоконсервирования по использованной методике не зависели от способа заготовки тромбоконцентрата. Однако установлено, что ТК, полученные аппаратным методом, предпочтительнее для длительного низкотемпературного хранения, поскольку имеется возможность получения терапевтической дозы тромбоцитов от одного донора в меньшем объеме концентрата.

Литература

1. Багаутдинов Ш.М., Чечеткин A.B., Вилья-нинов В.Н., Кононенко С.Н. Совершенствование технологии криоконсервиро-вания тромбоцитного концентрата при сверхнизкой температуре // Гематология и трансфузиология. 2010. № 5. С. 37.

2. Кузнецов К. В. Консервирование тромбоцитов замораживанием по экспоненциальной программе при —80С (экспериментальное исследование): Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. СПб., 2006.

3. Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Высо-чин И.В. Биологическая полноценность и клиническая эффективность криокон-сервированных тромбоцитов человека // Молодой ученый. 2016. № 2. С. 357-360.

4. Технический регламент о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии (утв. Постановлением Правительства

Российской Федерации от 26 января 2010 г. № 29). Доступ: http://base. garant.ru/12172686/ (дата обращения: 12.06.2017).

5. Чечеткин А.В., Семелев В.Н., Гусев С.В., Вильянинов В.Н. Медико-технические особенности проведения автоматического тромбоцитафереза у доноров // Трансфузиология. 2012. № 2. Т. 13. С. 40-50.

6. Crimmins D., Flanagan P., Charlewood R., Ruggiero K. In vitro comparison between gamma-irradiated cryopreserved and Day 7 liquid-stored buffy coat-derived platelet components // Transfusion. 2016. Vol. 56. No. 11. P. 2799-2807.

7. Gerber B., Alberio L., Rochat S. et al. Safety and efficacy of cryopreserved autologous platelet concentrates in HLA-alloimmunized patients with hematologic malignancies // Transfusion. 2016. Vol. 56. No. 10. P. 2426-2437.

8. Handin R.I., Fortier N.X., Valeri C.R. Platelet response to hypotonic stress after storage // Transfusion. 1970. Vol. 10. No. 6. P. 305-309.

9. Milford E.M., Reade M.C. Comprehensive review of platelet storage methods for use in the treatment of active hemorrhage // Transfusion. 2016. Vol. 56. No. 2. P. 140148.

10. Slichter S.J. Jones M., Ransom J. et al. Review of in vivo studies of dimethyl sulf-oxide cryopreserved platelets // Transfusion Medicine Reviews. 2014. Vol. 2. No. 4. Р. 212-225.

Контакты:

Шерстнев Филипп Сергеевич,

заведующий отделением трансфузиологии и процес-

синга гемопоэтических стволовых клеток ФГБУН

«Кировский НИИ гематологии и переливания крови

ФМБА России»,

кандидат медицинских наук.

Тел. раб.: (8332)67 85 21.

E-mail: sherstnyov_phil@mail.ru

Ф.С. Шерстнев, С.В. Утемов, A.A. Костяев, М.Е. Ковтунова, К.А. Ветошкин