МЕТОДЫ ПЦР ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ 5,-НЕТРАНСЛИРУЕМОГО УЧАСТКА ГЕНОВ FMR1 И FMR2

1. Способ анализа по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка, включенного по меньшей мере в одну матрицу в образце, включающий:
(a) получение по меньшей мере двух разных праймеров, включающих первый праймер, содержащий повторы CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC, и второй праймер, который отжигается по положению, выходящему за пределы CGG-обогащенного участка;
(b) проведение ПЦР с использованием по меньшей мере двух разных праймеров и по меньшей мере одной матрицы, включающей по меньшей мере один CGG-обогащенный участок, где в результате ПЦР образуется набор продуктов;
(c) разделение набора продуктов методом высокого разрешения с целью получения формы представления продукта по размеру и встречаемости и
(d) получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность по меньшей мере на одном CGG-обогащенном участке или где в пределах по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность.
2. Способ анализа по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка, включенного по меньшей мере в одну матрицу в образце, включающий:
(а) получение по меньшей мере трех разных праймеров, включающих первый праймер, содержащий CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC повторы и 5'-флэп, второй праймер, который отжигается по положению, выходящему за пределы CGG-обогащенного участка, и третий праймер, имеющий последовательность, входящую в 5'-флэп первого праймера, где первый праймер представлен в более низкой концентрации, чем третий праймер;
(b) проведение ПЦР с использованием по меньшей мере трех разных праймеров и по меньшей мере одной матрицы, где в результате ПЦР образуется набор продуктов;
(с) разделение набора продуктов методом высокого разрешения с целью получения формы представления продукта по размеру и встречаемости и
(d) получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность по меньшей мере на одном CGG-обогащенном участке или где в пределах по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта.
3. Способ по п.1 или 2, включающий получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке в указанной форме представления продукта.
4. Способ по п.1 или 2, где указанная прерывающая последовательность представляет собой элемент AGG.
5. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий получение информации о количестве повторов CGG в указанной форме представления продукта.
6. Способ по п.5, в котором указанная информация о количестве повторов CGG позволяет определить, больше или меньше чем 200 повторов CGG включает CGG-обогащенный участок.
7. Способ по п.6, в котором указанная информация о количестве повторов CGG позволяет определить количество повторов CGG, присутствующих на CGG-обогащенном участке.
8. Способ по п.1 или 2, осуществляемый при условии, что внешний стандарт или калибратор не используется при получении информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке или где в пределах CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта.
9. Способ по п.1 или 2, в котором CGG-обогащенный участок входит в 5'-UTR FMR1.
10. Способ по п.1 или 2, в котором CGG-обогащенный участок входит в 5'-UTR FMR2.
11. Способ по п.1 или 2, в котором метод высокого разрешения позволяет разделять продукты, различающиеся по длине на 3 нуклеотида или пары оснований.
12. Способ по п.1 или 2, в котором метод высокого разрешения представляет собой капиллярный электрофорез.
13. Способ по п.1 или 2, в котором формой представления продукта является электроферограмма.
14. Способ по п.1 или 2, в котором получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке или где в пределах CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта, включает определение положений, где связывание первого праймера значительно снижено.
15. Способ по п.1 или 2, в котором получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке или где в пределах CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта, включает определение одного или нескольких значений длины продукта, для которых количество продукта значительно снижено, в сравнении с количеством продукта с близкими значениями длины.
16. Способ по п.1 или 2, в котором получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке или где в пределах CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта, включает определение одного или нескольких значений длины продукта, для которых количество продукта снижено по меньшей мере на 50%, в сравнении с количеством продуктов с близкими значениями длины.
17. Способ по п.1 или 2, в котором получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке или где в пределах CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта, включает определение одного или нескольких значений длины продукта, для которых количество продукта снижено по меньшей мере на 90%, в сравнении с количеством продуктов с близкими значениями длины.
18. Способ по п.1 или 2, в котором получение информации о том, присутствует ли прерывающая последовательность на CGG-обогащенном участке, или где в пределах CGG-обогащенного участка локализована прерывающая последовательность в указанной форме представления продукта, включает определение одного или нескольких значений длины продукта, для которых количество продукта снижено по меньшей мере на 25%, в сравнении с количеством продуктов с близкими значениями длины, где CGG-обогащенный участок получен от индивидуума, гетерозиготного по аллелю, включающему CGG-обогащенный участок.
19. Способ по п.1 или 2, в котором первый праймер включает четыре или пять повторов CGG или CCG.
20. Способ по п.1 или 2, в котором второй праймер выбран из SEQ ID No: 1-38.
21. Способ по п.1 или 2, в котором по меньшей мере один из праймеров включает радиоактивно или электромагнитно детектируемый фрагмент.
22. Способ по п.1 или 2, в котором по меньшей мере один из праймеров включает флуорофор.
23. Способ по п.1 или 2, представляющий собой фиксированный тест.
24. Способ по п.23, в котором первый праймер включает подпоследовательность, выбранную из A, T, AG, CT, AGG и CCT среди или на 3'-конце повторов CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC.
25. Способ по п.24, в котором первый праймер включает A на 3'-конце повторов CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC.
26. Способ по п.24, в котором первый праймер включает CCT на 3'-конце повторов CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC.
27. Способ по п.23, дополнительно включающий детекцию по меньшей мере одного прерывающего элемента, входящего по меньшей мере в один CGG-обогащенный участок.
28. Способ по п.27, дополнительно включающий определение, включает ли образец основные и минорные алели с расположенными по разному прерывающими элементами.
29. Способ по п.1 или 2, представляющий собой нефиксированный тест.
30. Способ по п.2, в котором первый праймер и третий праймер представлены в таких концентрациях, что третий праймер по меньшей мере в 100 раз превосходит по молярности первый праймер.
31. Способ по п.2, в котором первый праймер и третий праймер представлены в таких концентрациях, что третий праймер по меньшей мере в 500 раз превосходит по молярности первый праймер.
32. Способ по п.2, в котором первый праймер и третий праймер представлены в таких концентрациях, что третий праймер по меньшей мере в 900 раз превосходит по молярности первый праймер.
33. Способ по п.2, в котором второй праймер отжигается ниже CGG-обогащенного участка, а третий праймер отжигается выше CGG-обогащенного участка.
34. Способ по п.2, в котором второй праймер отжигается выше CGG-обогащенного участка, а третий праймер отжигается ниже CGG-обогащенного участка.
35. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий получение по меньшей мере первого дополнительного праймера и, необязательно, второго дополнительного праймера, где первый дополнительный праймер включает повторы CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC; проведение второй ПЦР с по меньшей мере первым дополнительным праймером, праймером, выбранным из второго праймера стадии (а) и второго дополнительного праймера, и по меньшей мере одной матрицей, где вторая ПЦР приводит к получению второго набора продуктов; и разделение второго набора продуктов методом высокого разрешения с получением второй формы представления продукта по размеру и встречаемости;
где первый праймер стадии (a) обладает предпочтительной связывающей активностью в отношении сайтов на CGG-обогащенном участке, который не включает прерывающий элемент, и где первый дополнительный праймер обладает предпочтительной связывающей активностью в отношении сайтов на CGG-обогащенном участке, который включает прерывающий элемент.
36. Способ по п.35, в котором первый дополнительный праймер включает A на 3'-конце повторов CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC.
37. Способ по п.35, в котором первый дополнительный праймер включает Т на 3'-конце повторов CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC.
38. Способ по п.35, дополнительно включающий определение по меньшей мере одного значения длины по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка.
39. Способ по п.38, в котором образец включает генетический материал из клеток, обладающих плоидностью по меньшей мере 2 относительно CGG-участка, где способ включает определение по меньшей мере двух значений длины по меньшей мере двух CGG-обогащенных участков.
40. Способ по п.38, в котором образец включает аллель, содержащий CGG-обогащенный участок, включающий по меньшей мере 100 повторов CGG.
41. Способ по п.35, дополнительно включающий определение, содержит ли образец основные и минорные алели с расположенными по-разному прерывающими элементами.
42. Способ по п.35, в котором первый дополнительный праймер характеризуется противоположной ориентацией относительно первого праймера.
43. Способ по п.42, в котором первый праймер связывается с CGG-обогащенным участком с его 3'-концом, ориентированным ниже, а первый дополнительный праймер связывается с CGG-обогащенным участком с его 3'-концом, ориентированным выше.
44. Способ по п.43, включающий детекцию по меньшей мере одного прерывающего элемента и определение размера CGG-обогащенного участка, включающего по меньшей мере один прерывающий элемент.
45. Способ по п.44, в котором образец включает по меньшей мере первый и второй аллели, и указанные первый и второй аллели включают CGG-обогащенные участки разной длины.
46. Способ по п.35, дополнительно включающий получение по меньшей мере третьего дополнительного праймера и, необязательно, четвертого дополнительного праймера, где третий дополнительный праймер включает повторы CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC; проведение третьей ПЦР с по меньшей мере третьим дополнительным праймером, праймером, выбранным из второго дополнительного праймера и четвертого дополнительного праймера, и по меньшей мере одной матрицей, где третья ПЦР приводит к получению третьего набора продуктов; и разделение третьего набора продуктов методом высокого разрешения с получением третьей формы представления продукта по размеру и встречаемости;
где третий дополнительный праймер характеризуется противоположной ориентацией относительно первого праймера стадии (а) и отличается от первого дополнительного праймера.
47. Способ по п.46, дополнительно включающий определение, присутствуют или отсутствуют прерывающие элементы среди 150 п.о. на любом конце по меньшей одного аллеля, содержащегося в образце.
48. Способ по п.47, дополнительно включающий определение по меньшей мере одного положения по меньшей мере одного прерывающего элемента, содержащегося по меньшей мере в одном аллеле.
49. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий получение по меньшей мере первого дополнительного праймера и второго дополнительного праймера, где первый дополнительный праймер включает повторы CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC; проведение второй ПЦР с по меньшей мере первым дополнительным праймером и вторым дополнительным праймером и по меньшей мере одной матрицей, где вторая ПЦР приводит к получению второго набора продуктов; и разделение второго набора продуктов методом высокого разрешения с получением второй формы представления продукта по размеру и встречаемости;
где первый дополнительный праймер характеризуется противоположной ориентацией относительно первого праймера стадии (а).
50. Способ по п.49, в котором по меньшей мере один из первого праймера и первого дополнительного праймера обладает предпочтительной связывающей активностью в отношении сайтов на CGG-обогащенном участке, который не включает прерывающие элементы.
51. Способ по п.50, в котором первый праймер обладает предпочтительной связывающей активностью в отношении сайтов на CGG-обогащенном участке, который не включает прерывающие элементы, и первый дополнительный праймер обладает предпочтительной связывающей активностью в отношении сайтов на CGG-обогащенном участке, который включает прерывающие элементы.
52. Способ по п.51, в котором образец включает по меньшей мере два аллеля, содержащих CGG-обогащенные участки разной длины, где способ дополнительно включает определение значений длины по меньшей мере двух аллелей.
53. Способ по п.52, дополнительно включающий детекцию по меньшей мере одного прерывающего элемента и определение значения длины аллеля, в который входит по меньшей мере один прерывающий элемент.
54. Способ анализа по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка, входящего по меньшей мере в одну матрицу в образце, включающий:
(а) получение по меньшей мере двух разных праймеров, где первый праймер включает повторы CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC, и второй праймер отжигается по положению, выходящему за пределы CGG-обогащенного участка;
(b) проведение ПЦР с использованием по меньшей мере двух разных праймеров и матрицы, включающей CGG-обогащенный участок, где ПЦР приводит к получению набора продуктов;
(с) разделение набора продуктов методом высокого разрешения с получением формы представления продукта по размеру и встречаемости, в котором разделяются продукты, различающиеся по длине на три нуклеотида; и
(d) получение информации о количестве повторов CGG в указанной форме представления продукта.
55. Способ анализа по меньшей мере одного CGG-обогащенного участка, входящего по меньшей мере в одну матрицу в образце, включающий:
(а) получение по меньшей мере трех разных праймеров, где первый праймер включает повторы CGG, CCG, GCG, CGC, GCC или GGC и 5'-флэп, второй праймер отжигается по положению, выходящему за пределы CGG-обогащенного участка, третий праймер имеет ту же последовательность 5'-флэпа первого праймера, и первый праймер представлен в более низкой концентрации в сравнении с третьим праймером;
(b) проведение ПЦР с использованием трех разных праймеров и матрицы, включающей CGG-обогащенный участок, где ПЦР приводит к получению набора продуктов;
(c) разделение набора продуктов методом высокого разрешения с получением формы представления продукта по размеру и встречаемости, в котором разделяют продукты, различающиеся по длине на три нуклеотида; и
(d) получение информации о количестве повторов CGG в указанной форме представления продукта.
56. Способ по п.54 или 55, в котором указанная информация о количестве повторов CGG позволяет определить, больше или меньше чем 200 повторов CGG включает CGG-обогащенный повторяющийся участок.
57. Способ по п.54 или 55, в котором указанная информация позволяет определить количество повторов CGG, присутствующих на CGG-обогащенном участке.
58. Способ по п.54 или 55 с условием, что внешний стандарт или калибратор не используется для получения информации о количестве повторов CGG.
59. Способ по п.54 или 55, в котором CGG-обогащенный участок входит в 5'-UTR FMR1.
60. Способ по п.54 или 55, в котором CGG-обогащенный участок входит в 5'-UTR FMR2.
61. Способ по п.54 или 55, в котором метод высокого разрешения позволяет разделять продукты, различающиеся по длине на 3 нуклеотида или пары оснований.
62. Способ по п.54 или 55, в котором метод высокого разрешения представляет собой капиллярный электрофорез.
63. Способ по п.54 или 55, в котором формой представления продукта является электроферограмма.
64. Способ по п.54 или 55, в котором первый праймер включает четыре или пять повторов CGG или CCG.
65. Способ по п.54 или 55, в котором второй праймер выбран из SEQ ID NO: 1-38.
66. Способ по п.54 или 55, в котором по меньшей мере один из праймеров включает флуорофор.
67. Способ по п.55, в котором первый праймер и третий праймер представлены в таких концентрациях, что третий праймер превышает по молярности первый праймер по меньшей мере в 100 раз.
68. Способ по п.55, в котором первый праймер и третий праймер представлены в таких концентрациях, что третий праймер превышает по молярности первый праймер по меньшей мере в 500 раз.
69. Способ по п.55, в котором первый праймер и третий праймер представлены в таких концентрациях, что третий праймер превышает по молярности первый праймер по меньшей мере в 900 раз.
70. Способ по п.55, в котором второй праймер отжигается ниже CGG-обогащенного участка, а третий праймер отжигается выше CGG-обогащенного участка.
71. Способ по п.55, в котором второй праймер отжигается выше CGG-обогащенного участка, а третий праймер отжигается ниже CGG-обогащенного участка.
72. Олигонуклеотид, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45.