ОСМОТИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ФУРОСЕМИДА И БЕТА-АДРЕНОБЛОКАТОРА ПРОПРАНОЛОЛА

Физиология

УДК 577 DOI: 10.34130/2306-6229-2021-3-18

ОСМОТИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ФУРОСЕМИДА И БЕТА-АДРЕНОБЛОКАТОРА ПРОПРАНОЛОЛА

OSMOTIC RESISTANCE OF HUMAN ERYTROCYTES UNDER THE FUROSEMIDE AND BETA-ADRENOPECEPTOR BLOCKER PROPRANOLOL

Н. Б. Петрова, А. Е. Терентьева

N. B. Petrova, A. E. Terentyeva

Исследовали действие петлевого диуретика фуросемида на осмотическую резистентность и ответ на бета-блокатор пропранолол эритроцитов доноров в опытах in vitro. Отмечены половые различия по осмотической резистентности эритроцитов. Фуросемид в опытах in vitro в дозе 2х10-8М/л ускорял гемолиз эритроцитов, усиливал мембраностабилизирующий эффект пропранолола и снижал величину адренореактивности мембран эритроцитов ф-АРМ). Предполагается, что этот эффект реализуется через изменение состояния ионных каналов и адренорецепторов.

The effect of the loop diuretic furosemide on osmotic resistance and the response to the beta-blocker propranolol of donor erythrocytes was investigated in vitro experiments. Sex differences in the osmotic resistance of erythrocytes were noted. Furosemide in vitro experiments at a dose of 2x10-8M / L accelerated hemolysis of erythrocytes, enhanced the membrane-stabilizing effect of propranolol and reduced the adrenergic reactivity of erythrocyte membranes ф-ARM). It is assumed that this effect is realized through a change in the state of ion channels and adrenergic receptors.

Ключевые слова: фуросемид, эритроциты, осмотическая резистентность, адренореактивность, бета-адреноблокатор.

Keywords: furosemide, erythrocytes, osmotic resistance, adrenoreactivity, beta-adrenoblocker.

Введение

Фуросемид - петлевой диуретик, широко применяемый в отечественной медицинской практике, обладает мощным и быстрым диуретическим эффектом, низкой стоимостью, что сделало этот препарат основным средством лечения отеков различного генеза, острых и хронических застойных явлений в легких, а также в лечении сердечно-сосудистых заболеваний (артериальной гипертензии, сердечной недостаточности) [1]. Эти заболевания широко распространены в регионах с жесткими климатическими и неблагоприятными социальными

условиями, в том числе на Севере. Известно, что фуросемид осуществляет свое действие через блокаду Na+/K+ /2Cl- котранспорта не только в восходящем колене петли Генли, но и в других органах и тканях: эритроцитах, кардиомиоцитах, гладкомышечных клетках и др. [2-4]. В эритроцитах (Эр) дополнительно фуросемид способен ингибировать белок полосы 3 (б.п.3) мембраны и влиять на газотранспортную функцию крови [5]. Механизм действия этого диуретика in vivo достаточно изучен. Известны и его негативные свойства, такие как непродолжительность диуретического воздействия, вторичная ренинангиотензин-и симпатоадреналовая активация, риск развития гиповолемии, гипокалиемии, тромбофилии, метаболических и других осложнений, что значительно ограничивает применение фуросемида для лечения сердечно-сосудистых заболеваний [1, 4]. Однако в отношении непосредственного действия диуретика на мембрану Эр информации мало. А. В. Муравьев и др. [6] в опытах in vitro отмечали снижение деформируемости мембраны Эр и его проагрегационный эффект.

Цель - изучить действие фуросемида на осмотическую резистентность и адренореактивность Эр человека.

Материал и методы

Исследования проводили на кафедре биологии Института естественных наук СГУ им. Питирима Сорокина. Материал исследования - венозная кровь 25 здоровых доноров: мужчин (n=13) и женщин (n=12) в возрасте от 20 до 35 лет. Экспериментальную часть работы проводили в летний (июнь-июль 2020 г.) период. Кровь получали в ГУ «Республиканская станция переливания крови» в г. Сыктывкаре.

Использованы два метода оценки функциональных свойств мембраны Эр. Первый основан на явлении гемолиза Эр при воздействии на них гипотонических растворов хлорида натрия убывающей концентрации от 0.9 до 0.2 % с интервалом 0.05 % [7]. Второй метод предполагает использование набора «Бета-АРМ АГАТ» и основан на факте торможения гемолиза эритроцитов, помещенных в гипоосмотическую среду, в присутствии Р-адреноблокатора -1-(1 -изопромиламино)-3 -(1 -нафталенил-окси)-2-пропанола гидрохлорида [8].

В кровь добавляли лекарственный препарат фуросемид (ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь) в дозе 2х10-8 М/л. Далее смесь в течение 30 мин. инкубировали при температуре 37°С. Степень гемолиза определяли по величине оптической плотности надосадочной жидкости проб против физиологического раствора электрофотоколориметром (КФК-2) при длине волны 540 нм. Процент гемолиза эритроцитов определяли, принимая за 100 % разность между надосадочными жидкостями в 0.9 % и 0.2 % растворе.

Величину бета-АРМ вычисляли по формуле:

— i —

Бета-АРМ = -о2 х 100 %,

Ек1 + -к2

где Бета-АРМ - величина показателя адренореактивности, усл.ед., Ео1 и Ео2 -оптические плотности опытных проб (с I II I), ед. опт. плотности, Ек1 и Ек2 -оптические плотности контрольных проб, ед. ОПн.ж. [8].

Показатель адренореактивности мембран Эр является надежным прогностическим критерием оценки функционального состояния организма. Нормальные показатели ß-АРМ у здоровых лиц, проживающих в средней полосе России, находятся в диапазоне от 2.0 до 20.0 усл. ед [8]. Величина бета-АРМ прямо пропорциональна активности симпатоадреналовой системы и обратно пропорциональна плотности адренорецепторов на мембранах клеток. Высокие значения бета-АРМ отражают высокую степень адренорецепторного обеднения мембраны в результате десенситизации при гиперадренергетических состояниях, а низкие показатели бета-АРМ характерны для гипосимпатикотонии [8].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали методом парных сравнений для зависимых выборок по непараметрическому Т-критерию Вилкоксона, для независимых выборок - по параметрическому критерию Стьюдента [9].

Результаты и обсуждение

Показатели гемолиза эритроцитов доноров мужчин отличаются от таковых у женщин (рис. 1).

Как видно из рис. 1, кривая гемолиза Эр женщин более пологая, расширенная по бокам, говорящая о неоднородности популяции Эр у женщин, что, вероятно, связано с гормональным фоном и разными фазами менструального цикла [10]. Начало гемолиза Эр женщин смещено в сторону более высоких величин гипотонического раствора. Эр мужчин наиболее интенсивно разрушаются в области 0.4 % NaCl (среднестойкие Эр). Интегральная характеристика, площадь под кривой гемолиза, составляет у мужчин 4.18, у женщин - 4.37 усл. ед2. Эти различия статистически значимые (p < 0.05 %).

Данные факты свидетельствуют, что ОРЭ у исследованных мужчин доноров выше, чем у женщин. Полученные результаты согласуются с данными литературы [10] и могут объясняться половыми различиями в липидном составе и количестве аквапоринов в мембране Эр, соответственно разной проницаемостью последней для воды и несколько отличающейся деформируемостью Эр [6, 10].

Рис. 1. Кривые осмотического гемолиза эритроцитов доноров (контрольные пробы без фуросемида).

Сплошная линия - женщины; пунктирная - мужчины.

Под действием фуросемида в случае женщин и мужчин происходит увеличение площади под кривой гемолиза на 8-9 % (различия значимы (р <0.05 %). У мужчин смещается в основном правое крыло кривой гемолиза (область высокостойких Эр) (рис. 2), у женщин более увеличивается гемолиз среднестойких Эр (рис. 3). Фуросемид уменьшает ОРЭ у испытуемых независимо от их половой принадлежности.

Рис. 2. Кривые осмотического гемолиза Эр мужчин в контроле и под действием фуросемида. Сплошная линия - контроль; пунктирная - фуросемид.

Рис. 3. Кривые осмотического гемолиза Эр женщин в контроле и под действием фуросемида. Сплошная линия - контроль; пунктирная - фуросемид.

Показано [6], что фуросемид, изменяя №+/К+ /2С1- котранспорта, способствует более интенсивному входу Са2+ в клетку, следствием чего может быть увеличение деформируемости и агрегации Эр. Авторы [6] отмечают, что изменение ионного баланса в Эр может значительно повлиять на микрореологические свойства крови и способствовать тромбообразованию.

Таблица 1

Параметры оптической плотности надосадочной жидкости (ОПн.ж.) крови доноров в контроле и под действием адреноблокатора

Количество проб ОПн.ж. контрольные пробы ОПн.ж. под действием адреноблокатора % снижения ОПн.ж в-АРМ, усл. ед.

25 0.26±0.03 0.062±0.01* 76 24.27±1.42

Примечание. * - Здесь и в табл. 2 различия между контролем и опытными пробами статистически значимы (р < 0.05 %).

Величины оптической плотности надосадочной жидкости (ОПн.ж.) в контроле и в присутствии адреноблокатора - 1111 показаны в табл. 1.

Опытные пробы достоверно отличаются от контроля. Отмечено повышение ОРЭ опытных проб на 76 % в сравнении с контролем.

Повышение ОРЭ в присутствии 1111 объясняется способностью Р-блокатора оказывать мембраностабилизирующее действие (уменьшение жидкостности мембраны), ингибируя Р1- и р2-адренорецепторы [11, 12]. Обусловлено это тем, что ПП снижает проницаемость мембраны Эр для воды и, как следствие, повышает ОРЭ [11]. Чем ниже значения оптической плотности надосадочной

жидкости и выше ОРЭ, тем сильнее мембраностабилизирующее действие адреноблокатора. Значительный эффект от воздействия 1111 на Эр (76 %) свидетельствует об неактивированной САС у исследованных доноров.

Показатель адренореактивности Эр ф-АРМ) в среднем составляет 24.27±1.42 усл.ед. Вариабельность от 12.5 до 39.1 усл.ед. Наши данные соответствуют региональным нормам адренореактивности Эр доноров для северных территорий (РК, г. Сыктывкар и г. Воркута) [13, 14].

Данные по влиянию раздельному и сочетанному с ПП действию фуросемида на ОРЭ и адренореактивность Эр мужчин и женщин представлены в табл. 2.

Таблица 2

Параметры оптической плотности надосадочной жидкости (ОПн.ж.) в контроле и при действии на кровь адреноблокатора и фуросемида

Количество ОПн.ж. ОПн.ж. % в-АРМ,

проб контрольные под действием снижения усл. ед.

пробы адреноблокатора и ОПн.ж

(с фуросемидом) фуросемида

22 0.25±0.01 0.043±0.004* 83 17.05±1.51

В результате исследования влияния фуросемида при совместном действии с Р-адреноблокатором установлено, что данная комбинация оказывает влияние на ОРЭ, повышая ее на 83 % по сравнению с контрольными пробами. При сочетании фуросемида и адреноблокатора отмечено усиление мембраностабилизирующего эффекта ПП на 31 %. Показатель Р-АРМ снижается на 30 %. Предполагается, что диуретик, изменяя ионный ток через мембрану, влияет на состояние бета-адренорецепторов или сопряженных с ними G-белков.

Кроме того, возможно оба вещества: фуросемид и бета-адреноблокатор ПП -действуют на Na-H-обменный механизм. В результате возникают изменения, играющие значительную роль в регуляции микрореологии крови.

Заключение

Исследовали действие петлевого диуретика фуросемида на осмотическую резистентность и ответ на бета-блокатор пропранолол эритроцитов доноров в опытах in vitro. Показано, что фуросемид оказывает непосредственное действие на мембрану Эр: снижает ОРЭ и значительно усиливает мембраностабилизирующее действие адреноблокатора -пропранолола. В результате возникают изменения в мембране, которые играют значительную негативную роль в регуляции микрореологии крови.

Список литературы

1. Кириченко А. А. Петлевые диуретики в практике терапевта. Рациональная фармакотерапия в кардиологии // Consilium medicinum. 2011. 13 (1). С. 58-63.

2. Greger R. Ion transport mechanisms in thick ascending limb of Henle loop mammalian nephron // Phisiol. Rev. 1985. Vol. 65. P. 760-767.

3. Dahm J., Gobel B. O. Role of furosemide -sensitive Na+/K+ - transport in determining the steady- state Na and K content and volume of human erythrocytes in vitro and in vivo // J. Memb. Biol. 1984. Vol. 77. P. 243-254.

4. Береснева О. Н., Барабанова В. В., Каюков И. Г. и др. Влияние фуросемида на сократительную активность воротной вены крыс с экспериментальной хронической почечной недостаточностью // Нефрология. 2000. Т. 4. № 2. С. 60-63.

5. Мищенко А. А., Иржак Л. И. Температурная зависимость транспорта Н+ через мембрану эритроцитов человека при действии фуросемида in vitro // Вестник Сыктывкарского университета. Сер. 2: Биология. Сыктывкар: Изд-во СГУ, 2003. С. 6-9.

6. Муравьев А. В., Комлев В. А., Баканова И. А. и др. Исследования срочных механизмов регуляции микрореологии эритроцитов: роль ионных мембранных каналов // Ярославский педагогический вестник. 2013. Т. 3. Естественные науки. С. 105-110.

7. Борисов Ю. А., Спиридонов В. Н., Суглубова Е. Д. Резистентность эритроцитарных мембран: механизмы, тесты, оценка (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 12. С. 36-40.

8. Длусская И. Г., Стрюк Р. И. Адренореактивность и сердечно-сосудистая система. М.: Медицина, 2003. 160 с.

9. Лакин Т. Ф. Биометрия : учеб.-метод пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

10. Крысова А. В., Куншин А. А., Циркин В. И. Половые особенности осмотической резистентности эритроцитов человека, выявляемые при экспозиции эритроцитов в дистиллированной воде // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2011. № 2 (2).С. 266-272.

11. Геворкян Н. А. Состояние мембранно-рецепторного комплекса эритроцитов у больных различными клинико-патогенетическими формами первичного хронического бронхита : автореф. дис... канд. мед. наук. СПб., 1995. 19 с.

12. Соминский В. Н., Окунь К. В. Повышение осмотической резистентности эритроцитов под влиянием пропранолола // Лабораторное дело. 1981. № 9. С. 525-527.

13. Петрова Н. Б., Азарова В. А., Бушля Т. А., Петрова П. А. Адренореактивность эритроцитов человека в условиях Севера при разных температурах in vivo и in vitro // В мире научных открытий. 2014. № 2 (50). С. 269-275.

14. Петрова Н. Б. Адренореактивность человека на Севере // Разнообразие, структура и функционирование биологических систем на севере : монография / под ред. С. В. Загировой и др. Сыктывкар: Изд-во СыктГУ им. П. Сорокина, 2015. С. 172-196.

References

1. Kirichenko A. A. Loop diuretics in the practice of a therapist. Rational pharmacotherapy in cardiology. Consilium medicinum. 2011. 13

2. Greger R. Ion transport mechanisms in thick ascending limb of Henle loop mammalian nephron. Phisiol. Rev. 1985. Vol. 65. P. 760-767.

3. Dahm J., Gobel B. O. Role of furosemide - sensitive Na+/K+ - transport in determining the steady- state Na and K content and volume of human erythrocytes in vitro and in vivo. J. Memb. Biol. 1984. Vol. 77. P. 243-254.

4. Beresneva O. N., Barabanova V. V., Kayukov I. G. i dr. Effect of furosemide on the contractile activity of the portal vein in rats with experimental chronic renal failure. Nefrologiya [Nephrology]. 2000. Vol. 4. No 2. P. 60-63.

5. Mishchenko A. A., Irzhak L. I. Temperature dependence of H + transport across the membrane of human erythrocytes under the action of furosemide in vitro. Vestnik SGU [Syktyvkar University Bulletin. Series 2. Biology, geology, chemistry, ecology]. 2003. No. 2. P. 6-9.

6. Murav'ev A. V., Komlev V. A., Bakanova I. A. i dr. Research of urgent mechanisms of regulation of microrheology of erythrocytes: the role of ionic membrane channel. Yaroslavskij pedagogicheskij vestnik [Yaroslavl Pedagogical Bulletin]. 2013. Vol. 3. Estestvennye nauki. P. 105-110.

7. Borisov Yu. A., Spiridonov V. N., Suglubova E. D. Resistance of erythrocyte membranes: mechanisms, tests, assessment

8. Dlusskaya I. G., Stryuk R. I. Adrenoreaktivnost' i serdechno-sosudistaya sistema. [Adrenoreactivity and cardiovascular system]. Moscow: Medicina, 2003. 160 p.

9. Lakin T. F. Biometriya: ucheb.-metodposobie dlya biol. spec. vuzov. 4-e izd., pererab. i dop. [Biometrics: study guide for biol. specialist universities]. 4th ed., rev. and add. Moscow: Vyssh. shk., 1990. 352 p.

10. Krysova A. V., Kunshin A. A., Cirkin V. I. Sexual characteristics of the osmotic resistance of human erythrocytes, detected during exposure of erythrocytes in distilled water. Vestnik Nizhegorodskogo universiteta im. N. I. Lobachevskogo [Bulletin of the Nizhny Novgorod University. N. I. Lobachevsky]. 2011. No 2

11. Gevorkyan N. A. Sostoyanie membranno-receptornogo kompleksa eritrocitov u bol'nyh razlichnymi kliniko-patogeneticheskimi formami pervichnogo hronicheskogo bronhita [The state of the membrane-receptor complex of erythrocytes in patients with various clinical and pathogenetic forms of primary chronic bronchitis: avtoref. dis... kand. med. nauk. Doct. Diss.]. St. Petersburg, 1995. 19 p.

12. Sominskij V. N., Okun K. V. Increase in osmotic resistance of erythrocytes under the influence of propranolol. Laboratornoe delo [Laboratornoe delo]. 1981. No 9. P. 525-527.

13. Petrova N. B., Azarova V. A., Bushlya T. A., Petrova P. A. Adrenoreactivity of human erythrocytes in the North at different temperatures in vivo and in vitro. Vmire nauchnyh otkrytij [In the world of scientific discoveries]. 2014. No 2

14. Petrova N. B. Human adrenoreactivity in the North. Raznoobrazie, struktura i funkcionirovanie biologicheskih sistem na severe [Diversity, structure and functioning of biological systems in the North], ed. S.V. Zagirova and others. Syktyvkar: Publishing house of SyktSU im. P. Sorokina, 2015. P. 172-196.