ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СУЛЬГЛИКОТИД ИЛИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМУЮ СОЛЬ, ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ СУХОСТИ ГЛАЗ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SULGLYCOTIDE OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALT FOR PREVENTING OR TREATING DRY EYES SYNDROME

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения синдрома сухости глаз, содержащей сульгликотид или его фармацевтически приемлемую соль.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Синдром сухости глаз является офтальмологическим заболеванием, называемым кератоконъюнктивитом, который встречается во всем мире у 5,5-15% взрослых. Синдром сухости глаз, который рассматривается как многофункциональное расстройство в слезной пленке и поверхности глаза, вызывает дискомфорт, ухудшение зрения и даже повреждения поверхности глаза из-за нестабильности слезной пленки.  Основной физиологической функцией слезной пленки является смазка поверхности глаза и внутреннего века. Слезная пленка также обеспечивает питательные вещества для поверхности глаза, обеспечивает гладкую, ровную оптическую поверхность глаза и защищает поверхность глаза. Слезная пленка состоит из компонентов слизи, водных компонентов и липидов. Проблема слезной секреции приводит к синдрому сухости глаз. Синдром сухости глаз вызывает не только отсутствие слез, но и неудобства с глазами и нестабильность слезного слоя из-за воспаления в слезном канале и на поверхности глаза (роговицы и конъюнктивы), тем самым вызывая повреждения глазной поверхности, что приводит к глазной боли, анормальной кривизне роговицы, язве роговицы и снижению зрения. Измененная проницаемость роговицы при хроническом синдроме сухости глаз вызывает воспаление и увеличивает цитокины, которые опосредуют воспаление слезного канала. В зависимости от тяжести заболевания у пациента часто развивается обратимая плоскоклеточная метафаза и точечные эрозии в глазной эпителии. Вторичные заболевания, которые могут быть вызваны синдромом сухости глаз, включают в себя грибковый кератит, микробный кератит, ангиогенез роговицы и кератинизацию поверхности глаза.
Были испробованы несколько подходов к лечению синдрома сухости глаз. Обычный подход заключается в добавлении и стабилизации слезного слоя в глаз с помощью буферного изотонического солевого раствора или искусственных слез, содержащих водорастворимый полимер.  Искусственные слезы содержат, например, карбоксиметилцеллюлозу и ее натриевую соль (КМЦ, кармеллозу), поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ, гипромеллозу), гиалуроновую кислоту или ее натриевую соль, гидроксипропилгуаровую камедь и так далее. Другой подход включает в себя нанесение смазочного материала вместо искусственных слез. Например, патент США № 4818537 раскрывает применение композиции, смазывающей липосомы, а патент США № 5800807 раскрывает композицию для лечения синдрома сухости глаз, содержащую глицерин и пропиленгликоль.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Автором настоящего изобретения проведены различные исследования с целью разработки терапевтического средства, способного эффективно профилактировать или лечить синдром сухости глаз. Удивительно, что настоящим изобретением было установлено, что введение сульгликотида (который обычно используется в качестве терапевтического средства для лечения язвенной болезни, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и т. д.) животной модели с сухостью глаз значительно увеличивает выработку слезы, улучшает неровности поверхности роговицы, увеличивает плотность конъюнктивальных бокаловидных клеток и уменьшает воспалительные цитокины на поверхности глаза и слезной железы; и поэтому, этот сульгликотид может быть с пользой применен для лечения синдрома сухости глаз.
Таким образом, целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции для профилактики или лечения синдрома сухости глаз, содержащей сульгликотид или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента.
Техническое решение
В соответствии с объектом настоящего изобретения, предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения синдрома сухости глаз, содержащая сульгликотид или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента.
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, сульгликотид или его фармацевтически приемлемая соль могут присутствовать в концентрации в диапазоне от 0,01 вес/об. % до 30 вес/об. %. Фармацевтическая композиция может иметь лекарственную форму препарата для закапывания в глаза. Препарат для закапывания в глаза может представлять собой водный раствор или водную суспензию.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько носителей, либо наполнителей, выбранных из группы, состоящей из буферного вещества, вещества, регулирующего вязкость, изотонического вещества, антиоксиданта, хелатирующего вещества и вещества, регулирующего рН, в добавление к сульгликотиду или его фармацевтически приемлемой соли в водной среде.
В варианте осуществления вещество, регулирующее вязкость, может быть одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из поливинилового спирта, поливинилпирролидона, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы и гидроксипропилцеллюлозы, предпочтительно может представлять собой поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении было обнаружено, что введение сульгликотида животной модели с сухостью глаз значительно увеличивает выработку слезы, улучшает неровности поверхности роговицы, повышает плотность конъюнктивальных бокаловидных клеток и уменьшает воспалительные цитокины на поверхности глаза и слезной железы. Соответственно, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно эффективно применять для профилактики или лечения синдрома сухости глаз.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показано влияние растворов глазных капель, содержащих сульгликотид, на выработку слез на животных моделях с сухостью глаз (DED).
На фиг.2 показано влияние растворов глазных капель, содержащих сульгликотид, на неровности поверхности роговицы на животных моделях с сухостью глаз (DED).
На фиг.3 показано влияние растворов глазных капель, содержащих сульгликотид, на окрашивание роговицы флуоресцеином на моделях животных с сухостью глаз (DED).
На фиг.4 показано влияние растворов глазных капель, содержащих сульгликотид, на отслоение эпителиальных клеток роговицы на животных моделях с сухостью глаз (DED).
На фиг.5 показано влияние растворов глазных капель, содержащих сульгликотид, на плотность бокаловидных клеток конъюнктивы на моделях животных с сухостью глаз (DED).
На фиг.6 показано влияние растворов глазных капель, содержащих сульгликотид, на воспаление на животных моделях с сухостью глаз (DED).
ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает создание фармацевтической композиции для профилактики или лечения синдрома сухости глаз, содержащей сульгликотид или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента.
Сульгликотид представляет собой материал, известный как серный полиэфир гликопептида, полученный экстракцией из слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи. Сульгликотид, который используется в качестве желудочно-защитного вещества и противоязвенного вещества, не всасывается в желудочно-кишечный тракт и, как известно, оказывает свое действие только в желудочном просвете.  Сульгликотид обычно вводят в качестве гастрозащитного средства субъектам, на стенки желудка которых воздействуют лекарства, такие как аспирин и таурохолевая кислота, или нестероидные противовоспалительные средства (NSAID).  В настоящем изобретении было вновь обнаружено, что введение сульгликотида животной модели с сухостью глаз значительно увеличивает выработку слезы, улучшает неровности поверхности роговицы, увеличивает плотность конъюнктивальных бокаловидных клеток и уменьшает воспалительные цитокины на поверхности глаза и слезной железы.
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, сульгликотид может быть использован в несолевой форме. А также, упомянутый сульгликотид может быть использован в форме его фармацевтически приемлемой соли, которая может быть соответствующим образом приготовлена специалистом в данной области.
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению дозировку сульгликотида или его фармацевтически приемлемой соли можно изменять в соответствии с возрастом пациента, массой тела, полом, лекарственной формой, состоянием здоровья и серьезностью заболеваний. Например, дозировка может составлять от 0,1 до 300 мг / сутки, предпочтительно от 0,5 до 100 мг / сутки, более предпочтительно от 1 до 60 мг / сутки, в расчете на взрослых пациентов, имеющих массу тела 70 кг. Введение может осуществляться через соответствующий интервал, например, в виде однократной дозы или в виде разделенных доз в день в соответствии с указаниями врача или фармацевта. В одном варианте осуществления, сульгликотид или его фармацевтически приемлемая соль могут присутствовать в концентрации в диапазоне от 0,01 до 30 вес/об. %, предпочтительно от 0,1 до 10 вес /об. %, но не ограничиваться этим.
Предпочтительно, что фармацевтическая композиция может иметь лекарственную форму препарата для закапывания в глаза. Препарат для закапывания в глаза может представлять собой водный раствор или водную суспензию.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать носитель или наполнитель, обычно используемые в области препарата для закапывания в глаза. Например, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько носителей, или наполнителей, выбранных из группы, состоящей из буферного вещества, вещества, регулирующего вязкость, изотонического вещества, антиоксиданта, хелатирующего вещества и регулирующего pH-вещества, в дополнение к сульгликотиду или его фармацевтически приемлемой соли, в водной среде.
Примеры буферного вещества включают в себя буферные вещества, обычно используемые в области препарата для закапывания в глаза, например, фосфорную кислоту или ее соль, борную кислоту или ее соль, угольную кислоту или ее соль, лимонную кислоту или ее соль, уксусную кислоту или ее соль, малеиновую кислоту или ее соль, янтарную кислоту или ее соль, винную кислота или ее соль и так далее. А также, буферное вещество может находиться в форме буферного раствора, такого как фосфорная кислота / фосфатный буфер (фосфатный буферный раствор), борная кислота / боратный буфер (боратный буферный раствор) и так далее.
Примерами вещества, регулирующего вязкость, может быть один или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из поливинилового спирта, поливинилпирролидона, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы и гидроксипропилцеллюлозы. Вещество, регулирующее вязкость, может предпочтительно представлять собой поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу, более предпочтительно гидроксипропилметилцеллюлозу.
Примеры изотонического вещества включают в себя хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбит, маннит и так далее.
Примеры антиоксиданта включают в себя аскорбиновую кислоту или ее сложный эфир, бисульфит натрия, бутилированный гидрокситолуол, бутилированный гидроксианизол, токоферол и так далее.
Примеры хелатирующего вещества включают в себя этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), этилендиамин и так далее.
Примеры регулирующего рН вещества включают в себя соляную кислоту, аминокислоту, гидроксид щелочного металла, гидроксид щелочноземельного металла и так далее.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать гидратирующее вещество, подслащивающее вещество, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующее вещество, консервант и так далее, обычно используемые в области препарата для закапывания в глаза, в дополнение к упомянутым носителям, или наполнителям. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению в форме препарата для закапывания в глаза может быть приготовлена, например, путем растворения сульгликотида или его фармацевтически приемлемой соли в водной среде (например, воде или буферном растворе) при перемешивании и растворении или суспендировании указанных носителей, или наполнителей дополнительно. Как правило, полученный раствор или суспензию подвергают стерильной фильтрации, чтобы получить препарат для закапывания в глаза.
Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры и экспериментальные примеры. Эти примеры и экспериментальные примеры предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1
После того, как фосфорную кислоту (0,0425 г), гидрофосфат натрия (4,43 г) и дигидрофосфат калия (0,29 г) растворили в очищенной воде (400 мл) при перемешивании со скоростью 50 об / мин, в ней был растворен сульгликотид (5 г). В полученном растворе растворили хлорид натрия (2,6 г).  К полученному раствору добавили очищенную воду, чтобы довести ее конечный объем до 500 мл. Полученный раствор подвергли стерильной фильтрации с помощью шприцевого фильтра PVDF с размером пор 0,22 мкм, чтобы приготовить 1 вес/ об. % раствор глазных капель.
Пример 2
После того, как фосфорную кислоту (0,0425 г), гидрофосфат натрия (4,43 г) и дигидрофосфат калия (0,29 г) растворили в очищенной воде (400 мл) при перемешивании со скоростью 50 об / мин, в ней был растворен сульгликотид (10 г). В полученном растворе растворили хлорид натрия (2,4 г). К полученному раствору добавили очищенную воду, чтобы довести его конечный объем до 500 мл. Полученный раствор подвергли стерильной фильтрации с помощью шприцевого фильтра PVDF с размером пор 0,22 мкм для приготовления 2 % вес/об. раствора глазных капель.
Пример 3
После того, как фосфорную кислоту (0,0425 г), гидрофосфат натрия (4,43 г) и дигидрофосфат калия (0,29 г) растворили в очищенной воде (400 мл) при перемешивании со скоростью 50 об / мин, в ней был растворен сульгликотид (15 г). В полученном растворе растворили хлорид натрия (2,2 г). К полученному раствору добавили очищенную воду, чтобы довести его конечный объем до 500 мл. Полученный раствор подвергли стерильной фильтрации с помощью шприцевого фильтра PVDF с размером пор 0,22 мкм для приготовления раствора 3 вес/об. % глазных капель.
Пример 4
После того как фосфорную кислоту (0,0425 г), гидрофосфат натрия (4,43 г) и дигидрофосфат калия (0,29 г) растворили в очищенной воде (400 мл) при перемешивании со скоростью 50 об / мин, в ней растворили сульгликотид (20 г). В полученном растворе растворили хлорид натрия (2,0 г).  К полученному раствору добавили очищенную воду, чтобы довести его конечный объем до 500 мл. Полученный раствор подвергли стерильной фильтрации с помощью шприцевого фильтра PVDF 0,22 мкм для приготовления раствора 4 вес/об. % глазных капель
Пример 5
После того, как фосфорную кислоту (0,0425 г), гидрофосфат натрия (4,43 г) и дигидрофосфат калия (0,29 г) растворили в очищенной воде (400 мл) при перемешивании со скоростью 50 об / мин, в ней был растворен сульгликотид (10 г). В полученном растворе растворили гидроксипропилметилцеллюлозу (1 г) и хлорид натрия (2,4 г). К полученному раствору добавили очищенную воду, чтобы довести его конечный объем до 500 мл. Полученный раствор подвергли стерильной фильтрации с помощью шприцевого фильтра PVDF с размером пор 0,22 мкм для приготовления 2 вес/об. % раствора глазных капель.
Примеры 6-15
Растворы глазных капель готовили в соответствии с компонентами и количествами, показанными в таблице 1. После того как буферное вещество растворили в очищенной воде (800 мл) при перемешивании со скоростью 50 об / мин, в нем растворили сульгликотид. В полученном растворе растворили изотоническое вещество, вещество, регулирующее вязкость (примеры 9 и 14), и антиоксидант (примеры 10 и 15). После того как рН полученного раствора довели до рН около 7 с помощью корректирующего рН вещества, к полученному раствору добавили очищенную воду, чтобы довести его конечный объем до 1000 мл. Полученный раствор подвергли стерильной фильтрации с помощью шприцевого фильтра PVDF 0,22 мкм для приготовления растворов глазных капель.
Таблица 1
Экспериментальный пример
1. Способы
(1) Мышиная модель сухости глаз и экспериментальные процедуры
Мыши NOD.B10.H2b были приобретены в лаборатории Джексона (Бар Харбор, Мэн, США). Самцы мышей NOD.B10.H2b в возрасте от 12 до 16 недель подвергались стрессу высыхания из-за воздействия воздушной тяги от вентилятора при влажности окружающей среды 30-40% в течение 18 часов в день в течение 10 дней и подкожной инъекции 0,2 мл. инъекция 0,5 мг / 0,2 мл скополамина гидробромида (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в чередующиеся задние конечности четыре раза (8, 11, 14 и 17 часов) в день, чтобы вызвать сухость глаз. Во время этих экспериментов поведение животных и потребление пищи и воды не ограничивались. После вызывания сухости глаз, стресс высыхания снимали путем прекращения инъекций скополамина и помещения мышей в среду с нормальной влажностью и температурой.
Необработанные нормальные мыши NOD.B10.H2b были отнесены к контрольной группе (контроль, n = 3). Каждая группа от SOS 1 до SOS 5 была разделена на группу с вызванной сухостью глаз, и группу, получавшую глазные капли, соответственно, как показано в следующей таблице 2. В группе, которой вводили глазные капли, из каждой группы от SOS 1 до SOS 5, растворы глазных капель примеров 1-5 (5 мкл / глаз) соответственно закапывали с двух сторон четыре раза (8 часов утра, 11 часов утра, 14 часов дня и 17 часов дня) в день в течение 10 дней после снятия стресса высыхания.
Таблица 2
Группа с вызванной сухостью глаз(DS 10D, n=3)
Группа, получавшая глазные капли(n=3)
SOS 1
Мыши с вызванной сухостью глаз
Мышам закапывали глазной раствор из Примера 1
SOS 2
Мыши с вызванной сухостью глаз
Мышам закапывали глазной раствор из Примера 2
SOS 3
Мыши с вызванной сухостью глаз
Мышам закапывали глазной раствор из Примера 3
SOS 4
Мыши с вызванной сухостью глаз
Мышам закапывали глазной раствор из Примера 4
SOS 5
Мыши с вызванной сухостью глаз
Мышам закапывали глазной раствор из Примера 5
(2) Измерение образования слез
Образование слез измеряли с помощью ватных ниток, пропитанных красным фенолом, как описано ранее (Oh HN, Kim CE, Lee JH, Yang JW. Эффекты кверцетина на мышиной модели экспериментального сухого глаза. Cornea.2015; 34: Хлопчатобумажные нитки, пропитанные красным феноловом (Zone-quick, Oasis, Glendora, CA), держали ювелирными щипцами и помещали в боковой кантус на 20 секунд.  Объемы слез были выражены в миллиметрах мокрой нити, которая покраснела от слез при измерении под микроскопом (SZX7; Olympus Corp., Токио, Япония). Поглощение слезной жидкости измерили в миллиметрах и сравнили со стандартной кривой, которая была приготовлена из хлопковых нитей с известными объемами поглощения исходного основного раствора (1500 мл 0,9% солевого раствора и 5 мл 5 н. NaOH) в течение 20 секунд и находилась в пределах диапазона, ожидаемого для слез мыши (Villareal AL, Farley W, Pflugfelder SC. Влияние актуальных офтальмологических эпинастина и олопатадина на объем слезы у мышей. Eye Contact Lens. 2006; 32: 272-6; Chen Z, Li Z, Basti S, Farley WJ, Pflugfelder SC. Измененная морфология и функция слезной функциональной единицы по протеинкиназе C альфа у мышей в бессознательном состоянии. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010; 51: 5592-600). Образование слез измерили на обоих глазах и проанализировали среднее значение для обоих глаз.
(3) Оценка гладкости роговицы
Отраженные изображения белого кольца волоконно-оптического кольцевого осветителя микроскопа со стереоскопическим зумом были получены сразу после эвтаназии. Гладкость роговицы оценивали два невидящих наблюдателя, которые оценивали искажение белого кольца как отражение от эпителия роговицы на цифровых изображениях, как описано ранее (De Paiva CS, Corrales RM, Villarreal AL, Farley W, Li DQ, Stern ME, Pflugfelder SC. Разрушение апикального роговичного барьера у экспериментальных мышей с сухостью глаз прекращается метилпреднизолоном и доксициклином. Инвест Офтальмол Vis Sci. 2006; 47: 2847-56). Гладкость роговицы измерили на обоих глазах, и измерили среднее значение для обоих глаз. Оценки степени неравномерности роговицы были рассчитаны с использованием пятибалльной шкалы, которая основывалась на количестве искаженных четвертей в отраженном кольце и классифицировалась следующим образом: 0 - нет искажения; 1, искажение в одной четверти; 2, искажение в двух четвертях; 3, искажение в трех четвертях; 4, искажение во всех четырех четвертях; и 5 - искажение настолько сильное, что ни одна часть кольца не была распознана.
(4) Измерение окрашивания флюоресцеина роговицы
Окрашивание роговицы флуоресцеином проводили, как описано у Rashid et al. (Rashid S, Jin Y, Ecoiffier T, Barabino S, Schaumberg DA, Dana MR.  Актуальные омега-3 и омега-6 жирные кислоты для лечения сухости глаз. Arch Ophthalmol. 2008 ; 126: 219-25).  Флюоресцеин натрия (1%), 1 мкл, наносили на роговицу мышей под наркозом. Через три минуты глаза промыли PBS для удаления избытка флуоресцеина, и окрашивание роговицы оценивали и фотографировали с помощью биомикроскопа с щелевой лампой (SL-D7; Topcon, Токио, Япония) с использованием кобальтово-синего света. Окрашивание пунктатом регистрировали с использованием стандартизированной системы оценок Национального института глаз от 0 до 3 для каждой из пяти областей роговицы (Lemp MA. Отчет Национального института глаз / Промышленный семинар по клиническим испытаниям на сухих глазах. Clao J. 1995; 21: 221-32).
(5) Гистология
Глаза и придатки каждой группы вырезали хирургическим путем, фиксировали в 10% формалине и погружали в парафин. Шести микрометровые срезы окрашивали H & E (гематоксилинанд и эозин) и PAS (периодический-Шифф).  В случае конъюнктивита, количество отслоившихся эпителиальных клеток на их площади 0,1 мм2 рассчитывали путем окрашивания H & E.  В случае конъюнктивных тканей, количество бокаловидных клеток в нижнем своде конъюнктивита оценивали в области 0,1 мм2 с помощью окрашивания PAS. Количество отслоившихся эпителиальных клеток роговицы и количество бокаловидных клеток конъюнктивы измерили путем усреднения данных из трех непоследовательных образцах поперечного сечения для каждой мыши и 3 или 4 мышей на группу. Срезы из каждой группы исследовали и визуализировали с использованием виртуального микроскопа (NanoZoomer 2.0 RS, Хамамацу, Япония).
(6) Иммуногистохимия
Глаза и придатки вырезали хирургическим путем, погружали в парафин и мгновенно замораживали в жидком азоте. Шести микрометровые срезы были вырезаны с помощью криостата. Срезы фиксировали предварительно охлажденным ацетоном в течение 5 минут и первичными антителами к TNF-α (Abcam Inc., Cambridge, MA), MMP-2 (Abcam Inc., Cambridge, MA), MMP-9 (Lifespan Biosciences Inc., Сиэтл, Вашингтон), ICAM-1 (Bioss Inc., Woburn, MA) и VCAM-1 (Bioss Inc., Woburn, MA) наносили и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки срезы инкубировали со вторичным антителом (DAKO Corp, Glostrup, Дания) в течение 30 минут. Иммунореакции визуализировали с помощью диаминобензидинового хромогена, и срезы контрастно окрашивали с помощью гематоксилина Майера (Sigma) в течение 30 секунд при комнатной температуре. Изображения срезов фотографировали с помощью виртуального микроскопа (NanoZoomer 2.0 RS, Хамамацу, Япония).
(7) Статистический анализ
Данные были проанализированы с использованием SPSS версии 18.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США) и выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Различия между группами анализировали с использованием двустороннего дисперсионного анализа (дисперсионный анализ с помощью критерия Тьюки), а статистическую значимость определяли как P <0,05.
2. Результаты
(1) Влияние сульгликотидсодержащих растворов глазных капель на изменения при образовании слез
Как показано на фиг. 1, группа SOS 1 показала 6,7-кратное увеличение после 10 дней (0,165 ± 0,027 мкл) по сравнению с группой DS 10D (0,025 ± 0,008 мкл) (P <0,05); группа SOS 2 показала 7,6-кратное увеличение через 10 дней (0,157 ± 0,027 мкл) по сравнению с группой DS 10D (0,021 ± 0,009 мкл) (P <0,05); группа SOS 3 показала 8,5-кратное увеличение после 10 дней (0,176 ± 0,030 мкл) по сравнению с группой DS 10D (0,021 ± 0,009 мкл) (P <0,05); группа SOS 4 показала 14,6-кратное увеличение после 10 дней (0,246 ± 0,022 мкл) по сравнению с группой DS 10D (0,017 ± 0,008 мкл) (P <0,05); и группа SOS 5 показала увеличение в 15,5 раза через 10 дней (0,262 ± 0,018 мкл) по сравнению с группой DS 10D (0,017 ± 0,008 мкл) (P <0,05). Инстилляция сульгликотидсодержащих растворов глазных капель после снятия стресса высыхания привела к объемам слез, которые постепенно улучшались по сравнению с группой DS 10D. В частности, наблюдалось увеличение объемов слезы до контрольных уровней в группах SOS 4 и 5.
(2) Влияние сульгликотидсодержащих растворов глазных капель на неровности поверхности роговицы
Как показано на фиг. 2, показатель неравномерности роговицы в группе DS 10D (3,375 ± 0,479 балла) показал 13,5-кратное увеличение по сравнению с контролем (0,250 ± 0,289 балла), а снижение, наблюдаемое в группе SOS 1, составило 7,4% через 10 дней (3,125 ± 0,250 балла) (р <0,05). Кроме того, неровности поверхности роговицы, наблюдаемые в группах SOS 2 и SOS 3, уменьшились на 8% и 20,7% через 10 дней (2,875 ± 0,250 и 2,875 ± 0,250 балла) соответственно, по сравнению с группой DS 10D (P <0,05), Нарушения в группах SOS 4 и SOS 5 снизились на 83,3% и 87,9% через 10 дней (0,625 ± 0,479 и 0,500 ± 0,408 балла), соответственно, по сравнению с группой DS 10D (P <0,05). В частности, искажение белого кольца в группах SOS 4 и SOS 5 улучшилось до контрольного уровня, наблюдаемого к 10 дням.
(3) Влияние сульгликотидсодержащих растворов глазных капель на окрашивание роговицы флуоресцеином
Как показано на фиг. 3, контрольная роговица не показала поглощения флуоресцентного красителя, что указывает на неповрежденный эпителиальный барьер. Тем не менее, DS 10D роговицы показал пятнистую картину окрашивания, показывая поврежденный эпителиальный барьер роговицы. Показатель флуоресцеина роговицы в группе DS 10D (9,333 ± 1,155 балла) показал 28-кратное увеличение по сравнению с контролем (0,333 ± 0,577 балла) и не уменьшился в группе SOS 1 через 10 дней (балл 9,333 ± 0,577) (Р <0,05). Однако показатель флуоресцеина роговицы, наблюдаемый в группах SOS 2 и SOS 3, снизился на 3,4% и 10% через 10 дней (9,333 ± 0,577 и 9,0 ± 0 баллов), соответственно, по сравнению с группой DS 10D (P <0,05). А также, показатель флуоресцеина роговицы, наблюдаемый в группах SOS 4 и SOS 5, снизился на 72,4% и 83,3% через 10 дней (2,667 ± 0,577 и 1,667 ± 0,577 балла) соответственно по сравнению с группой DS 10D (P <0,05), В частности, повреждение эпителиального барьера роговицы в группах SOS 4 и SOS 5 через 10 дней улучшилось до контрольного уровня.
(4) Влияние сульгликотидсодержащих растворов глазных капель на отслоение эпителиальных клеток роговицы
Как показано на фиг. 4, количество отслоившихся эпителиальных клеток роговицы увеличилось в 8,5 раз в группе DS 10D (1,619 ± 0,165 клеток / 0,1 мм2) по сравнению с контролем (0,190 ± 0,165 клеток / 0,1 мм2) (P <0,05). Количество отслоившихся эпителиальных клеток роговицы увеличилось в 1,1 раза в группе SOS 1 (1,810 ± 0,165 клеток / 0,1 мм2) по сравнению с группой DS 10D (P <0,05). Напротив, количество отслоившихся эпителиальных клеток роговицы, наблюдаемое в группах SOS 2 и SOS 3 (1,238 ± 0,165 и 1,238 ± 0,165 клеток / 0,1 мм2), уменьшилось на 23,5% и 23,5% соответственно по сравнению с группой DS 10D (Р <0,05). Кроме того, количество отслоений эпителиальных клеток роговицы уменьшилось на 70,6% и 76,5% в группах SOS 4 и SOS 5 (0,476 ± 0,165 и 0,381 ± 0,165 клеток / 0,1 мм2) соответственно по сравнению с группой DS 10D (Р <0,05).
(5) Влияние сульгликотидсодержащих растворов глазных капель на конъюнктивальные бокаловидные клетки.
Как показано на фиг. 5, количество конъюнктивальных бокаловидных клеток уменьшилось на 57,7% в группе DS 10D (7,333 ± 1,288 клеток / 0,1 мм2) по сравнению с контролем (17,333 ± 0,873 клеток / 0,1 мм2), но увеличилось в 1,1 раза в SOS. 1 группа (8,095 ± 0,165 клеток / 0,1 мм2) по сравнению с группой DS 10D (P <0,05). Количество конъюнктивальных бокаловидных клеток было увеличено в 1,2 и 1,4 раза в группах SOS 2 и SOS 3 (8,762 ± 0,825 и 10,381 ± 0,436 клеток / 0,1 мм2), соответственно, по сравнению с группой DS 10D (P <0,05)). Кроме того, группы SOS 4 и SOS 5 (14,286 ± 1,143 и 17,714 ± 2,268 клеток / 0,1 мм2) продемонстрировали увеличение в 1,9 раза и 2,4 раза соответственно по сравнению с группой DS 10D (P <0,05).
(6) Противовоспалительное действие сульгликотидсодержащих растворов для глазных капель на мышиной модели с сухостью глаз
Как показано на фиг. 6, срезы слезной железы иммуноокрашивали TNF-α, MMP-2, MMP-9, ICAM-1 и VCAM-1.  Воспалительный маркер TNF-α был значительно сверхэкспрессирован в слезной железе после снятия стресса высыхания. Однако экспрессия TNF-α была снижена в группах SOS 4 и SOS 5.  Кроме того, иммуноокрашивание MMP-2 и MMP-9 также вызвало интенсивное окрашивание в слезной железе, но это окрашивание было значительно снижено в группах SOS 4 и SOS 5.  Окрашивание ICAM-1 и VCAM-1 было сильно ограничено слезной железой в группе DS 10D. Эти положительные маркеры слезной железы были подавлены в группах SOS 4 и SOS 5 по сравнению с группой DS 10D.