ПРОАДРЕНОМЕДУЛЛИН В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА, УКАЗЫВАЮЩЕГО НА НЕБЛАГОПРИЯТНОЕ СОБЫТИЕ
PROADRENOMEDULLIN AS MARKER INDICATING UNFAVORABLE EVENT

Настоящее изобретение относится к диагностике, прогнозированию, оценке риска и/или стратификации риска неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у субъекта. Изобретение относится к способу, включающему определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце субъекта, где уровень проАДМ указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта, и/или определение уровня по меньшей мере одного гистона, в частности, гистона H2B, H4, H2A и/или H3 в образце субъекта, где уровень по меньшей мере одного гистона указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта. Изобретение, кроме того, относится к наборам для осуществления способов согласно изобретению.
Уровень техники
Отделение интенсивной терапии (ОИТ) в больнице обычно является отделением с наиболее тяжелыми больными и самой высокой смертностью (Kaneko-Wada Fde, Dominguez-Cherit et al. 2015). Оно является очень дорогим компонентом для любой системы здравоохранения, в основном из-за длительного пребывания в ОИТ, современных и дорогостоящих технологий и общей сложности проведения интенсивной терапии (Halpern and Pastores 2010). Несмотря на большие усилия в области интенсивной терапии, смертность в ОИТ варьирует от 6,4% до 40%, в зависимости от анализируемой популяции пациентов и степени их тяжести (Mayr, Dunser et al. 2006). Основные причины неблагоприятного исхода и смерти в ОИТ связаны с органной недостаточностью, такой как синдром полиорганной недостаточности (СПОН), и сепсисом (Vincent 2008; Ferreira and Sakr 2011). Смертность подгруппы пациентов с сепсисом в Европе еще выше и варьирует от 27% до 54% (Vincent 2008).
Для выявления пациентов с факторами высокого риска с неблагоприятными или летальными событиями/исходами (i), для помощи клиницистам в принятии ранних решений после поступления в ОИТ (ii), для оптимизации клинического лечения и ресурсов (iii) и, наконец, для снижения смертности в ОИТ (iv), имеет большое значение знание об определяющих параметрах, таких как краткосрочные и долгосрочные исходы (Mayr, Dunser et al. 2006). До настоящего времени шкалы оценки степени тяжести в основном использовались для оценки риска и степени тяжести, а также для прогнозирования исхода у пациентов в критическом состоянии. Наиболее часто используемыми в ОИТ шкалами оценки являются шкала оценки острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья (APACHE), упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний (SAPS) и шкала динамической оценки органной недостаточности (SOFA), основанные на 17, 14 или 6 физиологических параметрах или специфических параметрах нарушения функции органных систем, соответственно (Bouch and Thompson 2008). Несмотря на способность прогнозировать исход пациента, такие шкалы также имеют различные недостатки. Например, необходимо определить и оценить каждый отдельный параметр шкал. Таким образом, определение результатов по шкалам занимает много времени (≥1 дня), что особенно нежелательно при лечении в ОИТ, где высоко ценятся быстро проводимые тесты. Кроме того, такие шкалы зависят от субъективности каждого оценивающего клинициста, их необходимо часто пересматривать, и они полагаются на несколько параметров, определяемых по отдельности.
Соответственно, существует необходимость в простых, быстрых и объективных критериях для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, в частности у субъекта в критическом состоянии.
Следовательно, технической задачей, лежащей в основе изобретения, является обеспечение средств и способов, обеспечивающих быстрый и надежный способ прогнозирования неблагоприятного события, в частности, летального события, например, летального исхода/смерти, у субъекта.
Техническая задача решается путем обеспечения вариантов осуществления, представленных ниже в настоящей заявке и охарактеризованных в прилагаемой формуле изобретения.
Описание изобретения
Изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающему определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта, где данный уровень проАДМ или его данного фрагмента указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
Кроме того, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающему определение уровня по меньшей мере одного гистона или его фрагмента в образце данного субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона или его данного фрагмента указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
Кроме того, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающему определение уровня по меньшей мере одного гистона и уровня проадреномедуллина (проАДМ) и/или их фрагмента(ов) в образце данного субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона и данный уровень проАДМ и/или их фрагмента(ов) указывают на данное неблагоприятное событие у данного субъекта. В контексте настоящей заявки термин «проАДМ» также охватывает фрагменты, такие как СР-проАДМ и зрелый АДМ, если не указано иное.
Настоящее изобретение решает вышеданную техническую задачу. Как изложено ниже в настоящей заявке и в прилагаемых примерах, в клиническом исследовании неожиданно было обнаружено, что уровни по меньшей мере одного гистона, в частности, гистона H2B, H4, H2A и H3, и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, демонстрирует(ют) тесную статистическую взаимосвязь с неблагоприятным событием, например, летальным исходом, у субъектов; см. иллюстративный пример 1. Соответственно, в настоящей заявке показано, что данный по меньшей мере один гистоновый белок и/или данный проАДМ, например, СР-проАДМ, могут применяться в качестве маркера для прогнозирования неблагоприятного события. В частности, в примерах подтверждено, что такие маркеры могут применяться для прогнозирования выживания или невыживания, то есть летального исхода субъекта.
В прилагаемых примерах неожиданно было продемонстрировано, что уровень проАДМ (в частности, СР-проАДМ) субъекта, меньший или равный приблизительно референсному (контроьному) уровню, например, приблизительно 0,9 нмоль/л, указывает на то, что неблагоприятное событие не наступит в течение приблизительно 28 дней. Референсный уровень, составляющий приблизительно 0,9 нмоль/л проАДМ, обеспечивает 100% чувствительность при выявлении невыживших пациентов, то есть уровень ниже этого порога надежно выявляет пациентов, которые выживут в течение 28-дневного периода. Референсный уровень, составляющий приблизительно 1,8 нмоль/л проАДМ, также надежно прогнозирует неблагоприятное событие, например, летальный исход, в прилагаемых примерах. Соответственно, уровень проАДМ показывает, выживет ли субъект или нет, например, в течение приблизительно 28 дней.
Также было продемонстрировано, что проАДМ (в частности, СР-проАДМ) надежно дискриминирует невыживших или выживших, если субъекты были стратифицированы по степени тяжести заболевания и/или состояния, например, органной недостаточности. Способ прогнозирования работает в целом для субъектов, имеющих недостаточность любого числа органов, то есть для любой оценки по шкале SOFA. Детектирование уровня проАДМ (в частности, СР-проАДМ) позволяет выявлять невыживших во всех группах тяжести, то есть для любой оценки по шкале SOFA. Это особенно важно для менее тяжело больных пациентов (оценка по шкале SOFA < 6), поскольку эта группа представляет собой или самое раннее проявление в клиническом течении сепсиса, и/или менее тяжелую форму этого заболевания в клинических условиях (в частности, ОИТ или ОСП). Таким образом, проАДМ (в частности, СР-проАДМ) является надежным маркером для контроля течения сепсиса на ранней стадии, поскольку он обеспечивает быстрое получение прогностического значения и помогает направлять диагностические вмешательства и принимать решения о лечении.
В прилагаемых примерах показано, что субъекты могут быть классифицированы на менее тяжело больных субъектов (например, с оценкой по шкале SOFA ≤ 6), умеренно тяжелых больных субъектов (например, с оценкой по шкале SOFA от 7 до 12) или тяжелобольных субъектов (например, с оценкой по шкале SOFA ≥ 13). Соответственно, субъекты могут быть классифицированы на основании оценки по шкале SOFA. Прогностическая ценность проАДМ (в частности, СР-проАДМ) может быть улучшена путем его сочетания с определением оценки субъекта по шкале SOFA. Однако прогностическая ценность этого маркера такова, что определение оценки по шкале SOFA не является необходимым; другими словами, в некоторых аспектах способа согласно изобретению определяют уровень проАДМ (предпочтительно СР-проАДМ) субъекта, но не определяют оценку по шкале SOFA. В прилагаемых примерах было показано, что уровень проАДМ (в частности, СР-проАДМ) демонстрирует наилучшую эффективность среди исследованных маркеров у пациентов с низкой степенью тяжести заболевания (менее тяжело больных). Такие субъекты могут иметь оценку по шкале SOFA ≤ 6. В частности, было продемонстрировано, что уровень проАДМ (в частности, СР-проАДМ) у менее тяжело больных субъектов, находящийся ниже референсного уровня, составляющего приблизительно 1,8 нмоль/л, указывает на то, что данное неблагоприятное событие не происходит, в частности, летального исхода, в течение приблизительно 28 дней; см. пример 2, таблицу 9. Кроме того, проАДМ также обладает преимуществами при прогнозировании неблагоприятного события по сравнению с другими маркерами, такими как лактат, в случае умеренно тяжело больных субъектов. Такие субъекты могут иметь оценку по шкале SOFA от 7 до 12. В частности, было продемонстрировано, что уровень проАДМ у умеренно тяжело больных субъектов, находящийся ниже референсного уровня, составляющего приблизительно 3,2 нмоль/л, указывает на то, что данное неблагоприятное событие не происходит, в частности, летального исхода, в течение приблизительно 28 дней; см. пример 2, таблицу 9. Наконец, уровень проАДМ также надежно прогнозирует неблагоприятное событие у тяжелобольных субъектов. В частности, было продемонстрировано, что уровень проАДМ у тяжелобольных субъектов, находящийся ниже референсного уровня, составляющего 5,6 нмоль/л, указывает на то, что данное неблагоприятное событие не происходит, в частности, летального исхода, в течение приблизительно 28 дней; см. пример 2, таблицу 9.
Соответственно, уровень проАДМ (в частности, СР-проАДМ) прогнозирует риск для субъекта и, таким образом, помогает клиницисту принять решение о том, какой вид терапии будет наиболее подходящим. Таким образом, уровень проАДМ улучшает лечение пациента в клинике. Следовательно, уровень проАДМ также может применяться для контроля течения заболевания в отделении интенсивной терапии, в частности, для выявления субъектов, не нуждающихся в дальнейшем проведении интенсивной терапии, например, лечении в ОИТ или отделении скорой помощи (ОСП). В частности, референсное значение проАДМ менее приблизительно 0,9 нмоль/л (предпочтительно 0,88 нмоль/л) позволяет «исключить» летальный исход в течение 28 дней после поступления в ОИТ или ОСП. Таким образом, этот порог отсечения подходит для направления ранних клинических решений, когда клинические проявления явной органной недостаточности еще не очевидны. Следовательно, способ согласно изобретению может применяться для этой цели. Выявление субъектов, которые не нуждаются в (дальнейшем) проведении интенсивной терапии (например, в ОИТ или ОСП), но могут, например, быть переведены в общую палату, снижает расходы для несущего их лица и освобождает койки в ОИТ или ОСП.
В конкретном аспекте способ согласно изобретению применяется для прогнозирования летального исхода или стратификации субъектов, у которых клинические признаки органной недостаточности еще не проявились (например, пациенты, соответствующие субъектам с низкой оценкой по шкале SOFA, такой как ≤ 6, предпочтительно ≤ 4, более предпочтительно ≤ 3).
Кроме того, в прилагаемых примерах показано, что уровень проАДМ (в частности, СР-проАДМ) также может применяться для модификации оценки данного субъекта по шкале SOFA. Например, SOFA может быть адаптирована, например, увеличена, на основании уровня проАДМ данного субъекта, где данная модифицированная оценка по шкале SOFA указывает на данное неблагоприятное событие.
В частности, оценка по шкале SOFA субъекта может быть увеличена на единицу, если уровень проАДМ у субъекта превышает приблизительно 1,8 нмоль/л. Такая модифицированная оценка по шкале SOFA дополнительно улучшает прогнозирование; см., например, пример 2.
Вместо или в дополнение к оценке по шкале SOFA также может быть определена оценка по ускоренной шкале SOFA (qSOFA).
В прилагаемых примерах также было неожиданно показано, что уровень по меньшей мере одного гистона, в частности, H2B, H4, H2A и H3, тесно связан с неблагоприятным событием, например, летальным исходом, у субъекта. В частности, в прилагаемых примерах показано, что уровни гистонов статистически связаны с наступлением неблагоприятного события, например, летального исхода, в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. В прилагаемых примерах было установлено, что повышение уровня маркера указывает на то, что у субъекта наступит неблагоприятное событие, например, летальный исход; см. прилагаемый пример 1, например, таблицы 1-6. Более того, было продемонстрировано, что уровни гистонов особенно тесно коррелируют с краткосрочными неблагоприятными событиями, например, наступающими в течение 7 дней или 3 дней. Кроме того, было обнаружено, что уровень по меньшей мере одного гистона в образцах субъектов, страдающих от заболевания органов дыхания, коррелирует с наступлением неблагоприятного события, например, летального исхода, в течение 7 дней; см., например, таблицу 4. Кроме того, было обнаружено, что уровень по меньшей мере одного гистона в образцах субъектов, страдающих от инфекции мочевыводящих путей, коррелирует с наступлением неблагоприятного события, например, летального исхода, в течение 28 дней; см., например, таблицу 5. Кроме того, было обнаружено, что уровень по меньшей мере одного гистона в образце субъекта, страдающего от злокачественных новообразований, коррелирует с наступлением неблагоприятного события, например, летального исхода, в течение 28 дней; см., например, таблицу 6.
Кроме того, в прилагаемых примерах также неожиданно было показано, что уровень проАДМ, например, уровень фрагмента СР-проАДМ, тесно коррелирует с неблагоприятным событием, например, летальным исходом, у субъекта. В частности, в прилагаемых примерах показано, что уровень проАДМ статистически связан с наступлением неблагоприятного события, например, летального исхода, в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней; см., например, таблицы 2 и 3. В частности, в прилагаемых примерах показано, что уровень проАДМ указывает на неблагоприятное событие, например, летальный исход, наступающее в течение 28 дней или в течение 7 дней; см., например, таблицы 2 и 3.
Кроме того, в прилагаемых примерах показано, что прогнозирование дополнительно улучшается, если определяется комбинация уровней маркеров. В частности, определение уровня по меньшей мере одного гистона в дополнение к уровню проАДМ дополнительно улучшило прогнозирование неблагоприятного события, например летального исхода; см. таблицы с 1 по 3. В прилагаемых примерах показано, что определение уровня дополнительного маркера и/или параметра в дополнение к уровню по меньшей мере одного гистона или проАДМ дополнительно улучшает прогнозирование неблагоприятного события, например, летального исхода; см. пояснительные таблицы с 1 по 3. Например, в прилагаемых примерах показано, что определение оценки по клинической шкале также улучшает прогнозирование на основании уровня проАДМ или гистонов. Кроме того, определение уровня биомаркера, такого как альдолаза B, улучшает прогнозирование на основании уровня проАДМ или гистонов. Соответственно, изобретение также относится к способу, включающему определение уровня дополнительного маркера и/или параметра, то есть применение панели маркеров.
Настоящее изобретение имеет, среди прочего, следующие преимущества по сравнению с традиционными способами: способы и наборы согласно изобретению являются быстрыми, объективными, простыми в применении и точными при прогнозировании неблагоприятного события: способы и наборы согласно изобретению относятся к маркерам, которые легко измеримы в повседневной практике в больницах, поскольку уровни гистонов и проАДМ могут быть определены в получаемых обычным способом образцах крови или других биологических жидкостях, полученных от субъекта. Кроме того, определение уровней гистонов или проАДМ происходит очень быстро. Следовательно, способы и наборы согласно изобретению пригодны для быстрой оценки, а также для диагностики и прогнозирования неблагоприятного события, например, летального исхода. Соответственно, быстрое определение также подходит для быстрого принятия решения о лечении, позволяющего избежать или снизить риск возникновения неблагоприятного события. Кроме того, благодаря простому результату измерения биомаркера, представляющего собой одно конкретное значение, при применении этого способа или наборов согласно изобретению нет ошибки оценки, основанной на субъективном восприятии медицинским персоналом. Воспроизводимость, таким образом, улучшается по сравнению с субъективной оценкой физиологических параметров, которые используются, например, в оценке по шкале SOFA. Уровень гистона или проАДМ также можно сочетать с другим(и) маркером(ами) и/или параметром(ами), например, оценками по клиническое шкале, такими как оценка по шкале SOFA, для дополнительного улучшения прогнозирования и адаптации анализа к конкретной чувствительности и специфике для оценки общего состояния пациентов в критическом состоянии.
Соответственно, предложенные в настоящей заявке способы и наборы обладают преимуществами для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска наступающего неблагоприятного события, например, летального исхода/смерти, у субъекта.
Как описано выше в настоящей заявке и в прилагаемых примерах, было неожиданно обнаружено, что уровень гистонов и уровень проАДМ коррелируют с неблагоприятным событием, таким как летальный исход, у субъектов. Соответственно, изобретение относится к способам и наборам для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у субъекта.
Кроме того, изобретение относится к способам и наборам для мониторинга, направления терапии и/или контроля терапии субъектов, где уровень по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ указывает на неблагоприятное событие, в частности, летальный исход. Определения, приведенные выше и ниже в настоящей заявке, также применимы к таким аспектам.
В частности, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у субъекта, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие, в частности, летальном исходе, у данного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта, где данный уровень проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие, в частности, летальном исходе, у данного субъекта.
В контексте настоящей заявки термин «определение уровня по меньшей мере одного гистона» или тому подобное относится к определению уровня гистона или его фрагмента в образце субъекта или определению уровня более чем одного гистона или его фрагментов в образец субъекта. В частности, «определение уровня по меньшей мере одного гистона» может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта, где предпочтительно гистон выбран из группы, состоящей из гистона H2B, H4, H2A и H3. В частности, определяют уровень гистона H2B. Кроме того, «определение уровня по меньшей мере одного гистона» может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта, где, в частности, определяют уровень гистона Н4. Кроме того, «определение уровня по меньшей мере одного гистона» может относиться к определению уровня двух гистонов в образце субъекта, где предпочтительно определяют уровни гистонов H2B и H4. Кроме того, «определение уровня по меньшей мере одного гистона» может относиться к определению уровня трех гистонов в образце субъекта, где предпочтительно определяют уровни гистонов H2B, H4 и H2A. Кроме того, «определение уровня по меньшей мере одного гистона» может относиться к определению уровня четырех гистонов в образце субъекта, где предпочтительно определяют уровни гистонов H2B, H4, H2A и H3.
Соответственно, в контексте настоящего изобретения «определение уровня по меньшей мере одного гистона» может относиться к определению уровня гистона H2B, уровня гистона H4, уровня гистона H2A и/или уровня гистона H3.
В частности, термин «определение уровня по меньшей мере одного гистона» или тому подобный может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта. Соответственно, изобретение также относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска и/или мониторинга неблагоприятного события у субъекта, включающему определение уровня гистона или его фрагмента в образце данного субъекта, где данный уровень гистона или его данного фрагмента указывает на данное неблагоприятное событие, в частности, летальном исходе.
В контексте настоящей заявки термин «гистон», или «гистоновый белок», или «гистоны», или «гистоновые белки» относится к каноническому(ым) гистону(ам), таким как H1, H2A, H2B, H3 или H4, а также к варианту(ам) гистона, таким как H3.3, H2A.Z и т. д., или их фрагменту(ам). Гистоны образуют октамерную частицу, вокруг которой оборачивается ДНК, создавая структуру хроматина (Luger, Nature. 1997 Sep 18; 389(6648):251-60). Например, гистоновые белки H2A, H2B, H3 и H4 (по два каждого) образуют октамер, вокруг которого оборачивается 165 пар оснований ДНК, образуя базовую субъединицу хроматина - нуклеосому. Гистоны также обнаруживаются вне ядра при многих патофизиологических процессах (WO 2009/061918). Было описано присутствие внеклеточных гистонов в крови пациентов, страдающих от заболеваний различной этиологии, характеризующихся воспалительными процессами. Высвобождение гистонов из активированных иммунных клеток может быть опосредовано внеклеточными ловушками. Активированные нейтрофилы, как основной механизм контроля и устранения инфекции, могут высвобождать внеклеточные волокна, так называемые нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) (Brinkmann V., et al. Science 2004; 303(5663): p. 1532-5). Другие механизмы, посредством которых гистоны могут высвобождаться в кровоток пациента, включают апоптоз, некроз, пироптоз или некроптоз клеток.
В частности, по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4, H2A и H3. Соответственно, уровень гистона, подлежащий определению в способах и наборах согласно изобретению, представляет собой, в частности, уровень гистона(ов) H2B, H4, H2A и/или H3. Последовательности гистонов известны специалисту в данной области техники. Примеры последовательностей гистонов приведены в SEQ ID NO: 1-4. Пример аминокислотной последовательности гистона Н4 приведен в SEQ ID NO: 1. Пример аминокислотной последовательности гистона H2A приведен в SEQ ID NO: 2. Пример аминокислотной последовательности гистона Н3 приведен в SEQ ID NO: 3. Пример аминокислотной последовательности гистона H2B приведен в SEQ ID NO: 4. В частности, по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4, H2A и H3. Более конкретно, по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4 и H2A. Более конкретно, по меньшей мере один гистон представляет собой H2B и H4. Более конкретно, по меньшей мере один гистон представляет собой H2B или H4.
Подразумевается, что «определение уровня по меньшей мере одного гистона» или тому подобное относится к определению уровня по меньшей мере одного гистона или фрагмента по меньшей мере одного гистона в образце. В частности, в образце определяют уровень гистона H2B, H4, H2A и/или H4. Соответственно, по меньшей мере один гистон, определенный в образце, может представлять собой свободный гистон, или по меньшей мере один гистон, определенный в образце, может встречаться и может находиться в составе макромолекулярного комплекса, например, октамера, нуклеосомы и/или NET. Следовательно, уровень по меньшей мере одного гистона в образце может включать уровень свободного гистонового белка и/или гистонового белка, находящегося в составе макромолекулярного комплекса.
В частных аспектах изобретения в образце может быть определен уровень гистона или его фрагмента, не находящегося в составе макромолекулярного комплекса, такого как нуклеосома, октамер или нейтрофильная внеклеточная ловушка (NET). Такой(ие) гистон(ы) в настоящей заявке называют «свободным(и) гистоном(ами)». Соответственно, уровень по меньшей мере одного гистона может, в частности, представлять собой уровень по меньшей мере одного свободного гистона.
Уровень таких свободных гистонов может быть определен путем детектирования аминокислотных последовательностей или эпитопов в структуре гистонов, которые недоступны в составе стехиометрического макромолекулярного комплекса, такого как мононуклеосома или октамер. В таких структурах определенные области гистонов закрыты и, таким образом, стерически недоступны, как показано для нейтрофильных внеклеточных ловушек («NET») (Brinkmann V., et al. Science 303(5663): p. 1532-5, 2004). Кроме того, в октамере или нуклеосоме области гистонов также участвуют во внутримолекулярных взаимодействиях, например, между отдельными гистонами. Соответственно, область/пептид/эпитоп гистона, подлежащего определению в контексте изобретения, позволяет идентифицировать, является ли гистон свободным или находится в составе макромолекулярного комплекса. Например, в способе, основанном на иммуноанализе, используемые антитела могут не детектировать гистоны, например, Н4, когда они являются частью октамерного ядра нуклеосом, поскольку эпитопы в этом случае структурно недоступны. Ниже в качестве примеров приведены области/пептиды/эпитопы гистона, которые могут применяться для определения свободного гистона. Например, области/пептиды/эпитопы N-концевого или С-концевого хвоста гистонов могут применяться для определения гистонов независимо от того, находятся ли они в составе макромолекулярного комплекса или являются свободными гистонами согласно настоящему изобретению.
Подразумевается, что определение гистонов может включать посттрансляционно модифицированные гистоновые белки. Соответственно, посттрансляционные модификации могут включать деацетилирование или ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквитилирование и цитруллинирование аминокислот.
«Стехиометрический» в данном контексте относится к интактным комплексам, например, мононуклеосоме или октамеру. «Свободные гистоновые белки» также могут включать не связанные с хроматином гистоны. Например, «свободные гистоновые белки» также могут включать отдельные гистоновые белки или неоктамерные гистоновые комплексы. Свободные гистоны могут (например, временно) связываться с отдельными гистонами, например, гистоны могут образовывать гомо- или гетеродимеры. Свободные гистоны также могут образовывать гомо- или гетеротетрамеры. Гомо- или гетеротетрамер может состоять из четырех молекул гистонов, например, H2A, H2B, H3 и/или H4. Типичный гетеротетрамер образован двумя гетеродимерами, где каждый гетеродимер состоит из Н3 и Н4. В настоящей заявке также подразумевается, что гетеротетрамер может быть образован H2A и H2B. В настоящей заявке также предусмотрено, что гетеротетрамер может быть образован одним гетеродимером, состоящим из H3 и H4, и одним гетеродимером, состоящим из H2A и H2B. Таким образом, свободные гистоны в настоящей заявке называются и могут представлять собой мономерные, гетеродимерные или тетрамерные гистоновые белки, которые не находятся в составе («стехиометрического») макромолекулярного комплекса, состоящего из гистонового октамера, связанного с нуклеиновой кислотой, например, нуклеосомы. Кроме того, свободные гистоны также могут быть связаны с нуклеиновыми кислотами, и при этом данные свободные гистоны не находятся в составе («стехиометрического») макромолекулярного комплекса, например, интактной нуклеосомы. Предпочтительно свободный(ые) гистон(ы) по существу не содержит(ат) нуклеиновых кислот.
Фрагмент по меньшей мере одного гистона может иметь любую длину, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот, при условии, что фрагмент позволяет однозначно определить уровень конкретного гистона. Фрагмент по меньшей мере одного гистона относится к независимому фрагменту гистонов, например, гистонов H2B, H4, H2A и H3. Ниже в настоящей заявке приведены различные примеры фрагментов гистонов, подходящие для определения уровня гистона в образце субъекта. В настоящей заявке также подразумевается, что уровень гистонов может быть определен путем определения фрагмента, охватывающего N-концевой или С-концевой хвост гистонов. Кроме того, гистон или его фрагмент, подлежащий определению в контексте настоящего изобретения, также может быть модифицирован, например, путем посттрансляционной модификации. Примеры посттрансляционных модификаций могут представлять собой ацетилирование, цитруллинирование, деацетилирование, метилирование, деметилирование, деиминирование, изомеризацию, фосфорилирование и убиквитинирование.
В контексте настоящей заявки термин «проадреномедуллин» или «проАДМ» относится к проадреномедуллину или его фрагменту, в частности, СР-проАДМ. Подразумевается, что «определение уровня проАДМ» или тому подобное относится к определению проАДМ или его фрагмента. Фрагмент может иметь любую длину, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот, при условии, что фрагмент позволяет однозначно определить уровень проАДМ. В частных предпочтительных аспектах изобретения «определение уровня проАДМ» относится к определению уровня среднерегионального (срединного) проадреномедуллина (СР-проАДМ). СР-проАДМ представляет собой фрагмент проАДМ. Пептид адреномедуллин (АДМ) был открыт как гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, который был выделен из человеческой феохромоцитомы (Kitamura et al., 1993). Адреномедуллин (АДМ) кодируется в виде пептида-предшественника, содержащего 185 аминокислот («препроадреномедуллин» или «пре-проАДМ»). Пример аминокислотной последовательности АДМ приведен в SEQ ID NO: 5. АДМ содержит положения 95-146 аминокислотной последовательности пре-проАДМ и представляет собой продукт его сплайсинга. «Проадреномедуллин» («проАДМ») относится к пре-проАДМ, не содержащему сигнальную последовательность (аминокислоты с 1 по 21), то есть к аминокислотным остаткам пре-проАДМ с 22 по 285. «Среднерегиональный проадреномедуллин» («СР-проАДМ») относится к аминокислотам 42-95 пре-проАДМ. Пример аминокислотной последовательности СР-проАДМ приведен в SEQ ID NO: 6. В настоящей заявке также предусмотрено, что пептид пре-проАДМ или СР-проАДМ и его фрагмент могут применяться для описанных в настоящей заявке способов. Например, пептид или его фрагмент могут содержать аминокислоты 22-41 пре-проАДМ (пептид РАМР) или аминокислоты 95-146 пре-проАДМ (зрелый адреномедуллин). С-концевой фрагмент проАДМ (аминокислоты с 153 по 185 пре-проАДМ) называется адренотензином. Фрагменты пептидов проАДМ или фрагменты СР-проАДМ могут содержать, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30 или более аминокислот. Соответственно, фрагмент проАДМ может, например, быть выбран из группы, состоящей из СР-проАДМ, PAMP, адренотензина и зрелого адреномедуллина, предпочтительно в настоящей заявке фрагмент представляет собой СР-проАДМ.
В настоящей заявке также подразумевается, что могут быть определены полипептиды, обладающие идентичностью последовательности с проАДМ или с по меньшей мере одним гистоном. Например, в способах и наборах согласно изобретению могут быть определены полипептиды, последовательность которых по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 5 или 6, или соответственно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, где более высокие значения идентичности последовательностей являются предпочтительными. Согласно настоящему изобретению термины «идентичность последовательности», «гомология» или «процент гомологии», или «идентичый», или «процент идентичности», или «процентная идентичность» в контексте двух или более аминокислотных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислот, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения (предпочтительно по всей длине) или в определенной области, при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательностей, известного в данной области техники, или путем ручного выравнивания и визуального осмотра. Последовательности, идентичные на, например, от 70% до 90% или более (предпочтительно на 95% или более), можно считать по существу идентичными. Такое определение также применимо к комплементу исследуемой последовательности. Предпочтительно описанная идентичность имеет место на протяжении области, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 10 до приблизительно 15 аминокислот, более предпочтительно на протяжении области, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 20 до приблизительно 35 аминокислот, наиболее предпочтительно по всей длине. Специалистам в данной области техники известно, как определить процент идентичности между/среди последовательностей с использованием, например, алгоритмов, такие как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), как известно в данной области техники.
В контексте настоящей заявки термин «уровень» маркера относится к количеству молекулы маркера в образце. Другими словами, в образце определяют концентрацию маркера. Например, в образце субъекта определяют концентрацию проАДМ или его фрагмента, предпочтительно СР-проАДМ, и/или концентрацию гистона(ов) H2B, H4, H3 и/или H2A или их фрагмента(ов).
В контексте настоящей заявки термин «уровень по меньшей мере одного гистона» относится к количеству молекулы по меньшей мере гистона, например, количеству H2B, H4, H2A и/или H3, или его фрагмента, в образце, полученном от субъекта. Другими словами, в образце определяют концентрацию по меньшей мере одного гистонового белка или его фрагмента.
В контексте настоящей заявки термин «уровень маркера проадреномедуллина (проАДМ)» или «уровень маркера проадреномедуллина (проАДМ) или его фрагмента» относится к количеству молекулы маркера проадреномедуллина или его фрагментов в образце, полученном от субъекта. Другими словами, в образце определяют концентрацию маркера. Следовательно, термин «уровень маркера среднерегионального проадреномедуллина (СР-проАДМ)» относится к количеству молекулы маркера среднерегионального проадреномедуллина (СР-проАДМ) в образце, полученном от субъекта. Как описано выше, в настоящей заявке также подразумевается, что может быть детектирован и количественно определен фрагмент проадреномедуллина (проАДМ), предпочтительно СР-проАДМ. Также могут быть детектированы и количественно определены фрагменты СР-проАДМ. Подходящие способы определения уровня проАДМ или его фрагмента (предпочтительно СР-проАДМ) или определения уровня по меньшей мере одного гистона или его фрагмента описаны ниже в настоящей заявке.
В контексте настоящей заявки «неблагоприятное событие» означает состояние здоровья/статус субъекта, который является угрожающим или будет угрожать жизни. Следовательно, неблагоприятное событие относится к критическому ухудшению состояния здоровья/статуса субъекта по сравнению с более ранним состоянием здоровья того же субъекта, например, диагностированному и подтвержденному, например, приблизительно за 28 дней, 14 дней, 7 дней, 3 дня, 1 день, 12 часов, 5 часов, 1 час или менее до ухудшения состояния; или по сравнению с состоянием здоровья субъектов, страдающих от схожего(их) заболевания(ий) или медицинского(их) состояния(ий), т. е. прогрессирование заболевания(ий) или медицинского(их) расстройства (расстройств) является или становится угрожающим жизни исследуемого субъекта. Неблагоприятное событие также может относиться к критическому ухудшению состояния здоровья/статуса субъекта по сравнению с состоянием здоровья здоровых субъектов. В настоящей заявке подразумевается, что критическое ухудшение состояния здоровья/статуса, угрожающее жизни состояние/статус субъекта или угрожающее жизни прогрессирование может означать, что субъект подвержен повышенному риску смерти, то есть вероятен смертельный исход субъекта. Критическое ухудшение, критическое состояние здоровья/статус или угрожающее жизни состояние здоровья/статус также могут быть оценены/диагностированы с помощью оценок по клинической шкале, например, с помощью оценки по шкале SOFA. Например, оценка по шкале SOFA выше 14 указывает на очень тяжелое состояние здоровья, указывающее на критическое состояние здоровья субъекта. Оценка по шкале SOFA от 0 до 6 указывает на менее тяжелое состоянии здоровья, а оценка по шкале SOFA от 7 до 14 указывает на тяжелое состояние здоровья. Например, состояние здоровья субъекта может критически ухудшаться из-за нарушения функции органа, нарушения функции нескольких органов, заболевания(ий) или медицинского(их) расстройства (расстройств), таких как инфекция. Соответственно, термин «неблагоприятное событие» может относиться к нарушению функции органа, нарушению функции нескольких органов, заболеванию или медицинскому состоянию, такому как инфекция, которое является угрожающим или будет угрожать жизни. Например, нарушение функции органа или нарушение функции нескольких органов может привести к такому критическому ухудшению, и, таким образом, термин «неблагоприятное событие» также может относиться к нарушению функции органа или нарушению функции нескольких органов, в частности, недостаточности органа или недостаточности нескольких органов. Например, заболевание или медицинское расстройство может привести к такому критическому ухудшению, и, таким образом, термин «неблагоприятное событие» также может относиться к заболеванию(ям) или медицинскому(им) расстройству (расстройствам), где данные заболевание(ия) или медицинское(ие) расстройство (расстройства) могут означать заболевание(ия) или медицинское(ие) расстройство (расстройства), которые угрожают жизни. Субъект также может страдать от заболевания(ий) и/или медицинского(их) расстройства (расстройств), и неблагоприятным событием в такой ситуации является состояние, при котором прогрессирование заболевания(ий) или медицинского(их) расстройства (расстройств) становится(ятся) угрожающим(и) жизни, то есть неблагоприятное событие также может относиться к угрожающему жизни прогрессированию заболевания или расстройства. Заболевание или расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из заболевания органов дыхания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной(ых) недостаточности(ей), сердечно-сосудистого заболевания, гематологического заболевания, диссеминированного свертывания крови, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек, иммунодепрессии, вирусной инфекции, грибковой инфекции, бактериальной инфекции, грамотрицательной бактериальной инфекции, грамположительной бактериальной инфекции, абдоминальной инфекции и угнетению иммунитета. Заболевание также может представлять собой инфекцию(ии). В частных аспектах субъект страдает от вирусной инфекции, грибковой инфекции, бактериальной инфекции, грамотрицательной бактериальной инфекции и/или грамположительной бактериальной инфекции. Заболевание органов дыхания также может относиться к респираторной инфекции (такой как внебольничная пневмония (ВБ) или инфекции нижних дыхательных путей (ИНДП)). В отдельном частном аспекте субъект страдает от грибковой инфекции.
В контексте настоящей заявки термин «субъект с угнетенным иммунитетом» относится к субъекту с угнетенной иммунной системой по сравнению с по меньшей мере одним здоровым субъектом. Такой субъект с угнетенным иммунитетом может страдать от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или может представлять собой субъекта, проходящего радиационную терапию и/или получающего иммуносупрессивные препараты.
Предпочтительно в настоящей заявке субъекты страдают от тяжелого сепсиса или септического шока, предпочтительно на основании определения СЕПСИС-2, принятого Американской коллегией специалистов в области торакальной медицины/Консенсусной конференцией Общества медицины критических состояний.
В частных аспектах изобретения неблагоприятное событие представляет собой летальный исход. Другими словами, в частных аспектах изобретения неблагоприятное событие представляет собой смерть субъекта. Соответственно, термин «неблагоприятное событие», в частности, означает «летальный исход» или «смерть». В контексте настоящего документе термин «летальный исход» означает, что субъект умирает, то есть означает смертельный исход. Соответственно, способы и наборы согласно изобретению позволяют определить/спрогнозировать, умрет ли субъект и/или подвержен ли он повышенному риску смерти.
В контексте настоящей заявки общий термин «нарушение функции органа» также может означать, что может иметь место нарушение функции более чем одного органа, то есть он также может относиться к нарушению функции органов, если не указано иное. Термин «нарушение функции органа» или «нарушение функции органов» относится к состоянию у субъекта, при котором орган или более чем один орган не выполняет(ют) свою/свои нормальную(ые) функцию(ии) по сравнению с незатронутым органом, таким как, например, орган(ы) по меньшей мере одного здорового субъекта. Например, орган(ы) могут иметь сниженную активность, или орган(ы) могут характеризоваться патологической активностью у субъекта с нарушением функции органа по сравнению с органом(ами) по меньшей мере одного здорового субъекта. Предпочтительно орган(ы) с нарушением функции органа(ов) может (могут) иметь сниженную или повышенную активность по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100% или 200% по сравнению с незатронутым(и) органом(ами), например, по меньшей мере одного здорового субъекта. В частности, нарушение функции органа(ов) может привести к органной(ым) недостаточности(ям). Соответственно, «нарушение функции органа(ов)» предпочтительно также может относиться к органной(ым) недостаточности(ям). «Органная(ые) недостаточность(и)» относится к нарушению функции органа(ов) до степени, при которой нормальный гомеостаз больше не может поддерживаться, например, без внешнего клинического вмешательства. «Органная(ые) недостаточность(и)» может относиться к нарушению функции органа(ов) до степени, при которой нормальный гомеостаз органа(ов) больше не может поддерживаться, например, без внешнего клинического вмешательства. «Органная(ые) недостаточность(и)» также может относиться к нарушению функции органа(ов) до степени, при которой нормальный гомеостаз субъекта больше не может поддерживаться, например, без внешнего клинического вмешательства. В частных аспектах изобретения нарушение функции органа представляет собой органную недостаточность или недостаточность по меньшей мере одного органа. Общий термин «органная недостаточность» также может означать, что имеет место недостаточность более чем одного органа, то есть он также может относиться к органным недостаточностям, если не указано иное. В настоящей заявке подразумевается, что нарушение функции органов также может называться нарушением функции нескольких органов. В настоящей заявке подразумевается, что органные недостаточности также могут называться недостаточностью нескольких органов. Примерами нарушений функций органов или органных недостаточностей являются циркуляторный шок, гематологическая недостаточность, печеночная недостаточность, неврологическая недостаточность, почечная недостаточность, дыхательная недостаточность и метаболический ацидоз. Соответственно, в контексте изобретения нарушение функции органа или нарушение функции по меньшей мере одного органа предпочтительно может быть выбрано из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза. В настоящей заявке подразумевается, что субъект также может иметь нарушение функции или недостаточность более чем одного органа, например, комбинацию нарушений функции или недостаточностей двух, трех, четырех органов, выбранных из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза.
В частных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывает(ют) на наступление данного неблагоприятного события в течение приблизительно 28 дней. В контексте настоящей заявки термин «наступление неблагоприятного события в течение» означает, что субъект вероятно будет испытывать/иметь/страдать от, будет испытывать/иметь/страдать от, или испытывает/имеет/страдает от неблагоприятного события в течение этого конкретного периода времени.
В контексте настоящей заявки термин «ненаступление неблагоприятного события» означает, что событие не наступает, например, в течение приблизительно 28 дней. Например, смерть субъекта не наступает в течение этого временного диапазона. Соответственно, это указывает на выживание субъекта, например, в течение приблизительно 28 дней.
Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности СР-проАДМ, также указывает(ют) на наступление данного неблагоприятного события в течение приблизительно 28 дней, приблизительно 25 дней, приблизительно 20 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, также может указывать на наступление данного неблагоприятного события в течение 14 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, также может указывать на наступление данного неблагоприятного события в течение 7 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, также может указывать на наступление данного неблагоприятного события в течение 3 дней.
В особенно предпочтительных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывает(ют) на наступление летального исхода субъекта в течение приблизительно 28 дней. Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности СР-проАДМ, также могут указывать на наступление летального исхода в течение приблизительно 28 дней, приблизительно 25 дней, приблизительно 20 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, также может указывать на наступление летального исхода в течение 14 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, также может указывать на наступление летального исхода в течение 7 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, также может указывать на наступление летального исхода в течение 3 дней.
В предпочтительных аспектах изобретения данный уровень СР-проАДМ данного субъекта указывает на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у данного субъекта в течение приблизительно 28 дней или в течение приблизительно 7 дней.
В частных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона указывает на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода, в течение приблизительно 7 или, предпочтительно, в течение приблизительно 3 дней. В частности, уровень H2B указывает на наступление неблагоприятного события даже в течение приблизительно 7 или, предпочтительно, в течение приблизительно 3 дней.
В частных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона указывает на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода, в течение приблизительно 7 или, предпочтительно, в течение приблизительно 3 дней. В частности, уровень H4 указывает на наступление неблагоприятного события даже в течение приблизительно 7 или, предпочтительно, в течение приблизительно 3 дней.
В частных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона и уровень проАДМ указывают на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у данного субъекта в течение приблизительно 28 дней.
Термин «указывает на данное неблагоприятное событие» означает, что субъект имеет или, вероятно, будет испытывать/иметь/страдать от данного неблагоприятного события, например, летального исхода. Следовательно, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ субъекта указывает(ют) на неблагоприятное событие, например, летальный исход, у субъекта.
Способ согласно изобретению также относится к способу, в котором определяют уровень по меньшей мере одного гистона в образце субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона, и где данный уровень по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие.
Предпочтительно, изобретение также относится к способу, в котором определяют уровень проадреномедуллина (проАДМ), в частности, СР-проАДМ, в образце субъекта, где данный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, сравнивают с референсным уровнем проАДМ, и где данный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывает на данное неблагоприятное событие.
Способ также относится к способу, в котором определяют уровень по меньшей мере одного гистона и определяют уровень проадреномедуллина (проАДМ), в частности, СР-проАДМ, в образце субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона, и где данный уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ, и где данное неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании стадии сравнения.
В контексте настоящей заявки термин «сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона» или его грамматические варианты означает, что уровень по меньшей мере одного гистона субъекта сравнивают с референсным уровнем данного по меньшей мере одного гистона. Таким образом, уровень гистона субъекта сравнивают с соответствующим референсным уровнем того же гистона. Например, уровень гистона H2B, определенный в образце субъекта, сравнивают с референсным уровнем гистона H2B. Этот же принцип аналогичным образом применяется и к другим гистонам. Референсный уровень по меньшей мере одного гистона представляет собой, в частности, уровень гистона H2B, уровень гистона H4, уровень гистона H2A и/или уровень гистона H3.
В контексте настоящей заявки термин «сравнивают с референсным уровнем проАДМ» или его грамматические варианты означает, что уровень проАДМ субъекта сравнивают с референсным уровнем проАДМ. При определении уровня фрагмента(ов) по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ референсный уровень также может представлять собой уровень соответствующего(их) фрагмента(ов).
В контексте настоящей заявки «референсный уровень» может отражать нормальный уровень соответствующего маркера, указывающий на отсутствие неблагоприятного события в предпочтительных аспектах изобретения. Соответственно, такой референсный уровень отражает нормальный уровень соответствующего маркера, не указывающий на угрожающее жизни состояние или, в частности, смерть/летальный исход субъекта. Соответственно, референсный уровень может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где референсный(ые) субъект(ы) не имеет/не имеют никаких неблагоприятных событий в течение приблизительно 28 дней, предпочтительно в течение приблизительно 14 дней, более предпочтительно в течение приблизительно 7 дней или особенно предпочтительно в течение приблизительно 3 дней.
Референсный уровень может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ группы здоровых субъектов (например, когорты). Соответственно, референсный уровень предпочтительно представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, в частности СР-проАДМ, здоровых субъектов. Здоровый субъект - это субъект, не имеющий диагностированного (и подтвержденного) заболевания и/или расстройства. Здоровые субъекты предпочтительно могут иметь нормально функционирующие органы, то есть не иметь нарушения функции и/или органной(ых) недостаточности(ей), и/или не иметь диагностированного(ых) заболевания(ий) или медицинского(их) расстройства (расстройств), таких как описанные выше. Соответственно, референсный(ые) уровень (уровни) может(гут) представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ, определяемый в образцах здоровых субъектов. Референсные субъекты или здоровые субъекты в настоящей заявке предпочтительно определены как группа субъектов или группа здоровых субъектов, например, когорта субъектов. Здоровые референсные субъекты не имеют нарушения функции органа или органной недостаточности. Соответственно, референсный уровень может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ субъектов, не имеющих нарушения функции органа или органной недостаточности. Соответственно, референсный уровень может представлять собой уровень, указывающий на отсутствие нарушения функции органа или органной недостаточности.
В предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ (предпочтительно в настоящей заявке СР-проАДМ) составляет от приблизительно 0,7 нмоль/л до приблизительно 2,0 нмоль/л. В более предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ составляет от приблизительно 0,8 нмоль/л до приблизительно 1,9 нмоль/л. В более предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ составляет от приблизительно 0,9 нмоль/л до приблизительно 1,8 нмоль/л. В более предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ составляет от приблизительно 0,88 нмоль/л до приблизительно 1,79 нмоль/л. В более предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 0,9 нмоль/л или приблизительно 1,8 нмоль/л. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 0,88 нмоль/л или приблизительно 1,79 нмоль/л. Применяемый референсный уровень зависит от желаемой специфичности и чувствительности прогнозирования, то есть более низкий порог, такой как приблизительно 0,9 нмоль/л (предпочтительно 0,88 нмоль/л) проАДМ (предпочтительно СР-проАДМ), надежно выявляет субъектов, не испытывающих неблагоприятного события (в частности, летального исхода, то есть специфично выявляет выживших в течение 28 дней).
В частных вариантах осуществления уровень проАДМ субъекта, (i) меньший или равный референсному уровню проАДМ (например, приблизительно от 0,9 нмоль/л до 1,8 нмоль/л), указывает на то, что данное неблагоприятное событие не происходит, в частности, летального исхода, в течение 28 дней; или (ii) превышающий референсный уровень проАДМ (например, приблизительно от 0,9 нмоль/л до 1,8 нмоль/л), указывает на то, что неблагоприятное событие, в частности, летальный исход, наступает или наступит в течение 28 дней.
Чувствительность и специфичность предложенных способов зависят не только от аналитического качества теста. Чувствительность и специфичность также зависят от определения того, что представляет собой отклоняющийся от нормы (например, летальный исход) или нормальный результат. Распределение уровней по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ, предпочтительно уровня СР-проАДМ, для субъектов с неблагоприятным событием и без него могут перекрываться. В таких условиях тест не всегда позволяет отличить нормальное состояние от состояния, характеризующегося нарушением функции, со 100% точностью. Специалисту известно, что состояние субъекта как таковое или по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр субъекта могут помочь в интерпретации данных, и что эта дополнительная информация позволяет получать более надежный прогноз в областях перекрытия. Состояние как таковое может относиться к общему состоянию здоровья субъекта. Общее состояние здоровья субъекта может влиять на решение о выборе референсного уровня. В прилагаемых примерах показано, какие референсные уровни оказались наиболее подходящими для конкретного состояния. С учетом этих сведений референсный уровень может быть дополнительно адаптирован.
Например, оптимальный референсный уровень может зависеть от общего состояния здоровья субъекта. Общее состояние здоровья может быть определено на основании оценки по шкале SOFA. Например, референсный уровень проАДМ, составляющий приблизительно 1,8 нмоль/л, может быть использован для менее тяжело больных субъектов, например, субъектов с оценкой по шкале SOFA ≤ 6. Референсный уровень проАДМ, составляющий приблизительно 3,2 нмоль/л, может быть использован для умеренно тяжело больных субъектов, например, для субъектов с оценкой по шкале SOFA от 7 до 12. Референсный уровень проАДМ, составляющий приблизительно 5,5 нмоль/л, может быть использован для тяжелобольных субъектов, например, субъектов с оценкой по шкале SOFA ≥ 13.
В предпочтительных вариантах осуществления референсный уровень проАДМ может составлять приблизительно 1,8 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет ≤ 6, референсный уровень проАДМ может составлять приблизительно 3,2 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет от 7 до 12; или референсный уровень проАДМ может составлять приблизительно 5,6 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет ≥ 13. В наиболее предпочтительных аспектах референсный уровень проАДМ может составлять приблизительно 1,8 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет ≤ 6, или референсный уровень проАДМ может составлять приблизительно 3,2 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет 7 до 12.
Соответственно, оптимальный референсный уровень может быть выбран путем определения уровня (уровней) по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра (например, пола, группы и возраста). Уровни по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра также могут быть сравнены с референсными уровнями, где схожие или идентичные значения/уровни данного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра субъекта по сравнению с соответствующими уровнями данного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра данных референсных уровней указывает на то, что риск субъекта испытать/иметь/страдать от неблагоприятного события снижается, и/или где более высокие или более низкие уровни/значения данного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра по сравнению с соответствующими уровнями данного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра данных референсных уровней указывает на то, что риск испытать/иметь/страдать от неблагоприятного события повышается.
Кроме того, для выбора оптимального референсного уровня, обеспечивающего наиболее подходящий прогноз, могут быть использованы тесты ROC, как описано ниже и в прилагаемых примерах.
На оптимальный референсный уровень также может влиять заболевание/расстройство, от которого страдает субъект. Например, в прилагаемых примерах показано, что субъекты, страдающие от грибковой инфекции, демонстрируют самые высокие уровни проАДМ. Соответственно, если субъект страдает от грибковой инфекции, референсный уровень проАДМ может составлять 5,6 нмоль/л.
Кроме того, референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства, и где прогрессирование заболевания или расстройства не угрожает жизни. Другими словами, референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства, и где неблагоприятное событие, в частности, летальный исход, не наступает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней.
Кроме того, референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства и инфекции (такой как сепсис или септические расстройства), и где неблагоприятное событие, в частности, летальный исход, не наступает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней. Другими словами, неблагоприятное событие у референсного субъекта не наступает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней. В частности, референсный субъект страдает от того же заболевания или медицинского состояния/расстройства, что и исследуемый субъект.
Кроме того, референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства и не страдает(ют) от инфекции, и где неблагоприятное событие, в частности, летальный исход, не наступает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней.
Кроме того, референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства, включая ССВО, где данный(ые) субъект(ы) не страдает(ют) от инфекции, и где неблагоприятное событие, в частности, летальный исход, не наступает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней.
В контексте настоящей заявки по меньшей мере один референсный субъект относится к более чем одному референсному субъекту. В частности, по меньшей мере один референсный субъект представляет собой группу или когорту референсных субъектов. Как описано ниже в настоящей заявке, средства и способы для определения уровней маркеров описаны, например, в цитируемых источниках.
Референсный уровень в контексте настоящей заявки обычно представляет собой заранее определенный уровень, то есть он был заранее определен в качестве референсного для последующего использования в месте оказания медицинской помощи, например, ОИТ или ОСП.
В предпочтительных аспектах изобретения неблагоприятное событие представляет собой летальный исход. В этих аспектах референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где референсный(ые) субъект(ы) не умирает(ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства, и где референсный(ые) субъект(ы) не умирает(ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства и инфекции, и где референсный(ые) субъект(ы) не умирает(ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства и не от инфекции, и где референсный(ые) субъект(ы) не умирает(ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах референсный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта, где данный(ые) референсный(ые) субъект(ы) страдает(ют) от заболевания и/или медицинского расстройства, включая ССВО, где данный(ые) субъект(ы) не страдает(ют) от инфекции, и где референсный(ые) субъект(ы) не умирает(ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней.
Как описано в настоящей заявке, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона (или повышение уровня по меньшей мере одного гистона) и/или повышенный уровень проАДМ (или повышение уровня проАДМ), в частности, СР-проАДМ по сравнению с референсным уровнем указывает на неблагоприятное событие, в частности, летальный исход. В частности, неблагоприятное событие наступает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней, как описано выше. Соответственно, данный уровень по меньшей мере одного гистона и/или данный уровень проАДМ, указывающий на данное неблагоприятное событие, может представлять собой повышенный уровень по сравнению с референсным уровнем.
Соответственно, способ согласно изобретению включает способ, включающий определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта, где повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона данного субъекта по сравнению с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие, в частности, летальном исходе, у данного субъекта.
Кроме того, изобретение включает способ, включающий определение уровня проАДМ, в частности, СР-проАДМ, в образце данного субъекта, где повышенный уровень данного проАДМ, в частности, СР-проАДМ, у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем данного проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывает на данное неблагоприятное событие, в частности, летальном исходе, у данного субъекта.
Кроме того, изобретение включает способ, включающий определение уровня проАДМ, в частности, СР-проАДМ, в образце данного субъекта, где повышенный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, по сравнению с референсным уровнем проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта, где предпочтительно данное неблагоприятное событие наступает в течение приблизительно 28 дней; или где пониженный уровень или эквивалентный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ, по сравнению с референсным уровнем проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывает на то, что данное неблагоприятное событие у данного субъекта не наступает, предпочтительно в течение приблизительно 28 дней.
Кроме того, изобретение включает способ, включающий определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта и определение уровня проАДМ, в частности, СР-проАДМ, в образце данного субъекта, где повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона у данного субъекта и повышенный уровень данного проАДМ, в частности, СР-проАДМ, у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем данного по меньшей мере одного гистона и референсным уровнем данного проАДМ, в частности, СР-проАДМ, указывают на данное неблагоприятное событие, в частности, летальном исходе, у данного субъекта.
Изобретение также относится к способу, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта,
где данный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона,
и где повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта,
где данный уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ
и где повышенный уровень данного проАДМ у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
Другими словами, изобретение также относится к способу, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта,
где данный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона,
и где повышения уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта,
где данный уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ,
и где повышение уровня проАДМ по сравнению с референсным уровнем проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
Изобретение также может относиться к способу, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта,
где данный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона этого же субъекта, полученным из ранее проведенного анализа,
и где повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с данным референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта,
где данный уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ этого же субъекта, полученным из ранее проведенного анализа,
и где повышение уровня проАДМ по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
В контексте настоящей заявки термин «полученный из ранее проведенного анализа» относится к ранее проведенному определению уровня маркера в образце одного и того же субъекта, например, за 28 дней, 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня или 1 день до следующего анализа, и где в таких аспектах данный ранее определенный уровень маркера рассматривают в качестве референсного уровня.
В контексте настоящей заявки термин «повышение уровня (данного) маркера» означает, что уровень маркера повышен, то есть относится к повышенному уровню маркера. Соответственно, термин «повышение уровня (данного) маркера» в настоящей заявке используется взаимозаменяемо с термином «повышенный уровень (данного) маркера». Повышенный уровень маркера или повышение уровня маркера субъекта означает, что уровень маркера по меньшей мере приблизительно на 15%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25% или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30% выше референсного уровня маркера.
В контексте изобретения термин «повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с референсным уровнем» или тому подобное используется в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином «повышенный уровень по меньшей мере одного гистона у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем» или термином «повышенный уровень по меньшей мере одного гистона по сравнению с данным референсным уровнем», или тому подобными. Такие термины означают, что уровень по меньшей мере одного гистона, например, уровень H2B, уровень H4, уровень H2A и/или уровень H3 у субъекта по меньшей мере приблизительно на 15%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70% более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100% выше, чем референсный уровень по меньшей мере одного гистона. Другими словами, в наиболее предпочтительных аспектах повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона (или повышение данного уровня) может быть приблизительно в два раза выше, чем данный референсный уровень по меньшей мере одного гистона. Повышение уровня приблизительно в два раза дополнительно повышает риск неблагоприятного события, например, летального исхода. Например, отношение рисков, равное 1,45, при определении с помощью H4, как указано в таблице 1, означает, что риск неблагоприятного события дополнительно повышается на 45%. Следовательно, такие значения также являются указанием на тесную корреляцию и оптимальные маркеры для диагностики.
В контексте настоящей заявки термин «повышение уровня проАДМ по сравнению с референсным уровнем» или тому подобные используется взаимозаменяемо с термином «повышенный уровень проАДМ у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем» или термином «повышенный уровень проАДМ по сравнению с данным референсным уровнем», или тому подобными. Такие термины означают, что уровень проАДМ, в частности, уровень СР-проАДМ, у субъекта по меньшей мере приблизительно на 10%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 15%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25%, или еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100% выше, чем референсный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ. Другими словами, в наиболее предпочтительных аспектах повышенный уровень данного проАДМ может быть приблизительно в два раза выше, чем данный референсный уровень проАДМ.
В контексте настоящей заявки термин «понижение уровня проАДМ по сравнению с референсным уровнем» или тому подобные используется взаимозаменяемо с термином «пониженный уровень проАДМ у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем» или термином «пониженный уровень проАДМ по сравнению с данным референсным уровнем», или тому подобными. Такие термины означают, что уровень проАДМ, в частности, уровень СР-проАДМ, у субъекта по меньшей мере приблизительно на 10%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 15%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25%, или еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100% ниже, чем референсный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ. Другими словами, в наиболее предпочтительных аспектах пониженный уровень данного проАДМ может быть приблизительно в два раза ниже, чем данный референсный уровень проАДМ.
Термин «равный» также включает уровень, который может быть схож с референсным уровнем. Соответственно, термин «равный» относится к уровню проАДМ у субъекта, составляющему +/- 10%, предпочтительно +/- 5%, более предпочтительно +/- 2% или наиболее предпочтительно такому же или одинаковому по сравнению с референсным уровнем проАДМ.
В контексте настоящей заявки термин «снижение уровня или равный уровень проАДМ по сравнению с референсным уровнем» означает, что уровень проАДМ, в частности, уровень СР-проАДМ, у субъекта составляет +/- 10%, +/-5%, +/- 2%, или является таким же или одинаковым по сравнению с референсным уровнем, или по меньшей мере приблизительно на 10%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25% или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 100% ниже, чем референсный уровень проАДМ, в частности, СР-проАДМ.
В настоящей заявке подразумевается, что референсные уровни и определяемые уровни маркеров (то есть уровни, определяемые для отдельного субъекта в месте оказания медицинской помощи, например, ОИТ или ОСП) могут варьировать в зависимости от анализа/метода, с помощью которого определяют уровни. Например, референсный уровень и определяемый уровень маркера, определенные масс-спектрометрическими методами, могут отличаться от соответствующих уровней, определенных с помощью иммуноанализов. В прилагаемых примерах продемонстрировано, что уровни маркеров могут быть определены несколькими методами, например, методами иммуноанализа и масс-спекрометрическими методами. Референсные уровни могут быть оптимизированы статистическими методами, как показано в прилагаемых примерах, такими как регрессионный анализ Кокса. Также могут быть рассчитаны отношения рисков. Например, и как показано в прилагаемых примерах, отношения рисков, превышающие 0 (HR>0), указывают на худший прогноз, то есть вероятно неблагоприятное событие наступит, а отношения рисков, меньшие 0, указывают на хороший прогноз, то есть вероятно неблагоприятное событие не наступит. Соответственно, специалисту в данной области техники известно, как определять референсные уровни. Например, уровни (включая референсные уровни) могут быть определены с помощью иммуноанализа, например, путем определения уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проАДМ, например, СР-проАДМ, в образцах субъектов (или референсных субъектов).
В отдельных аспектах изобретения референсный уровень по меньшей мере одного гистона может составлять приблизительно 100 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 80 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 70 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 50 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 45 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл. В отдельных аспектах изобретения референсный уровень по меньшей мере одного гистона может составлять приблизительно 10 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 15 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 20 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 25 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 30 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл.
В отдельных аспектах изобретения референсный уровень по меньшей мере одного гистона может составлять от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно от приблизительно 20 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл.
В отдельных аспектах изобретения референсный уровень проАДМ может составлять приблизительно 4 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 5 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 7 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 8 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 9 нмоль/л или особенно предпочтительно приблизительно 6 нмоль/л.
Более того, уровни (включая референсные уровни) могут быть определены с помощью масс-спектрометрических методов, таких как методы, определяющие относительное количество или определяющие абсолютное количество представляющего интерес белка или его фрагмента.
Определение относительного количества «SRM» может быть осуществлено путем:
1. Определения повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади характеристического пика SRM (мониторинга выбранных реакций) данного целевого фрагментированного пептида, детектированного в образце, с площадью этого же характеристического пика SRM целевого фрагментированного пептида по меньшей мере во втором, третьем, четвертом или более биологических образцах.
2. Определения повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади характеристического пика SRM данного целевого пептида, детектированного в образце, с площадями характеристических пиков SRM, полученных от фрагментированных пептидов других белков, в других образцах, полученных из других и отдельных биологических источников, где сравнение площади характеристического пика SRM двух образцов в отношении фрагментированного пептида нормировано, например, к количеству белка, анализируемого в каждом образце.
3. Определения повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади характеристического пика SRM для данного целевого пептида с площадями характеристических пиков SRM других фрагментированных пептидов, полученных из разных белков в одном и том же биологическом образце, чтобы нормировать изменяющиеся уровни гистоновых белков к уровням других белков, которые не меняют свои уровни экспрессии в различных клеточных условиях.
4. Эти анализы могут применяться как к немодифицированным фрагментированным пептидам, так и к модифицированным фрагментированным пептидам целевых белков, где модификации включают, не ограничиваясь перечисленным, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и где относительные уровни модифицированных пептидов определяют таким же образом, как и определение относительных количеств немодифицированных пептидов.
Определение абсолютного количества данного пептида может быть осуществлено путем:
1. Сравнения площади характеристического пика SRM/MRM для данного фрагментированного пептида из целевых белков в отдельном биологическом образце с площадью характеристического пика SRM/MRM внутреннего стандарта фрагментированного пептида, добавленного в лизат белка из биологического образца. Внутренним стандартом может быть меченая синтетическая версия фрагментированного пептида из исследуемого целевого белка, или меченый рекомбинантный белок. Этот стандарт добавляют в образец в известных количествах до (обязательно для рекомбинантного белка) или после расщепления, и площадь характеристического пика SRM/MRM может быть определена как для внутреннего стандарта фрагментированного пептида, так и для нативного фрагментированного пептида в биологическом образце по отдельности с последующим сравнением площадей обоих пиков. Этот метод может применяться к немодифицированным фрагментированным пептидам и модифицированным фрагментированным пептидам, где модификации включают, не ограничиваясь перечисленным, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (например, моно-, ди- или триметилирование), цитруллинирование, убиквитинилирование, и где абсолютные уровни модифицированных пептидов могут быть определены таким же образом, как и абсолютные уровни немодифицированных пептидов.
2. Пептиды также могут быть количественно определены с использованием внешних калибровочных кривых. В подходе с использованием нормальной кривой используется постоянное количество тяжелого пептида в качестве внутреннего стандарта и изменяющееся количество легкого синтетического пептида, добавленного в образец. Для построения стандартных кривых с учетом влияния матрицы необходимо использовать репрезентативную матрицу, аналогичную матрице исследуемых образцов. Кроме того, метод обратной кривой (метод внутреннего стандарта) позволяет обойти проблему эндогенного аналита в матрице, где постоянное количество легкого пептида добавляется к эндогенному аналиту для получения внутреннего стандарта, а различные количества тяжелого пептида добавляются для получения набора стандартных концентраций. В исследуемые образцы для сравнения с нормальными или обратными кривыми добавляют количество стандартного пептида, равное количеству внутреннего стандарта, добавляемого в матрицу, использованную для создания калибровочной кривой.
Соответственно, специалисту в данной области техники известно, как определить уровни маркеров и, в частности, оптимальные референсные уровни, что также проиллюстрировано в прилагаемых примерах.
Способы и наборы согласно настоящему изобретению также могут включать определение по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра, в дополнение к по меньшей мере одному гистону и/или проАДМ.
В контексте настоящей заявки параметр представляет собой характеристику, признак или измеримый показатель, который может помочь в определении конкретной системы. Параметр является важным элементом оценок состояния здоровья и физиологии, таких как риск заболевания/расстройства/клинического состояния, предпочтительно неблагоприятного события. Кроме того, параметр определяется как характеристика, которая объективно измеряется и оценивается как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. Пример параметра может быть выбран из группы, состоящей из шкалы оценки острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья (шкалы APACHE I-IV), оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний (шкала SAPS I-III), оценки по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA), оценки по ускоренной шкале SOFA (qSOFA), оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний II (шкале SAPSII), модели вероятности наступления смертельного исхода (MPM I-III), оценки по шкале полиорганной недостаточности (MODS), оценки по шкале эффективности лечения (TISS), оценки по шкале девяти эквивалентов сестринского ухода (NEMS), оценки по шкале Всемирной федерации нейрохирургических обществ (WFNS) и оценки по шкале комы Глазго (GCS), оценки по шкале тяжести пневмонии CURB-65, индекса тяжести пневмонии (PSI), возраста, пола, семейного анамнеза, этнической принадлежности, массы тела, индекса массы тела (ИМТ), цистоскопического отчета, количества лейкоцитов, скана компьютерной томографии, артериального давления, частоты сердечных сокращений, противогипертонического лечения, потребления жидкости, дистанционных хрипов, температуры тела, наличия сахарного диабета и текущей привычки к курению.
В контексте настоящей заявки такие термины, как «маркер», «имитатор», «прогностический маркер», «показатель» или «биомаркер», или «биологический маркер», используются взаимозаменяемо и относятся к поддающимся измерению и количественной оценке биологическим маркерам (например, концентрации определенного белка или фермента или их фрагмента, концентрации определенного гормона или его фрагмента, или присутствию биологических веществ или их фрагмента), которые служат показателями для оценок состояния здоровья и физиологии, таких как риск заболевания/расстройства/клинического состояния, предпочтительно неблагоприятного события. Маркер определяется как характеристика, которая может быть объективно измерена и оценена как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут быть измерены в образце (таком как анализ крови, плазмы, мочи или ткани). По меньшей мере один дополнительный маркер данного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из прокальцитонина, кальцитонина, эндотелина-1 (ET-1), аргинина-вазопрессина (AVP), предсердного натрийуретического пептида (ANP), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), тропонина, мозгового натрийуретического пептида (BNP), C-реактивного белка (СРБ), белка панкреатических камней (PSP), триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 (TREM1), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-1, интерлейкина-24 (ИЛ-24), других интерлейкинов, пресепсина (sCD14-ST), липополисахарид-связывающего белка (LBP), альфа-1-антитрипсина, матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), матриксной металлопротеиназы 7 (MMP9), хромогранина А, белка S100A, белка S100B и фактора некроза опухоли-α (TNFα), или их фрагмента.
В частных аспектах изобретения по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр данного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из уровня альдолазы В в данном образце, уровня копептина в данном образце, уровня проэндотелина-1 в данном образце, уровня лактата в данном образце, уровня прокальцитонина (ПКТ) в данном образце, оценки по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA) данного субъекта, оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний (шкале SAPSII), оценки по шкале острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья II (APACHE II) данного субъекта и уровня растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) в данном образце.
В отдельных аспектах изобретения по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр данного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из прокальцитонина, кальцитонина, эндотелина-1 (ET-1), аргинина-вазопрессина (AVP), предсердного натрийуретического пептида (ANP), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), тропонина, мозгового натрийуретического пептида (BNP), C-реактивного белка (СРБ), белка панкреатических камней (PSP), триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 (TREM1), интерлейкина-6 (ИЛ-6), интерлейкина-1, интерлейкина-24 (ИЛ-24), других интерлейкинов, пресепсина (sCD14-ST), липополисахарид-связывающего белка (LBP), альфа-1-антитрипсина, матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), матриксной металлопротеиназы 7 (MMP9), хромогранина А, белка S100A, белка S100B, фактора некроза опухоли-α (TNFα), возраста, пола, семейного анамнеза, этнической принадлежности, массы тела, индекса массы тела (ИМТ), цистоскопического отчета, количества лейкоцитов, скана компьютерной томографии, артериального давления, частоты сердечных сокращений, противогипертонического лечения, потребления жидкости, дистанционных хрипов, температуры тела, наличия сахарного диабета, текущей привычки к курению, оценки по шкале острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья (шкале APACHE I-IV), оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний (шкале SAPS I-III), оценки по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA), модели вероятности наступления смертельного исхода (MPM I-III), оценки по шкале полиорганной недостаточности (MODS), оценки по шкале эффективности лечения (TISS), оценки по шкале девяти эквивалентов сестринского ухода (NEMS), оценки по шкале Всемирной федерации нейрохирургических обществ (WFNS) и оценки по шкале комы Глазго (GCS).
В контексте настоящей заявки термин «альдолаза В» относится к фруктозобисфосфат-альдолазе В или альдолазе печеночного типа, представляющей собой один из трех изоферментов (А, В и С) фермента фруктозо-1,6-бисфосфат-альдолазы класса I. Уровень альдолазы В в образце субъекта может быть определен масс-спектрометрическими методами.
«Копептин» также называют «CT-proAVP» или «С-концевой частью вазопрессина». Вазопрессин является мощным вазоконстриктором. Уровень CT-proAVP может быть измерен в плазме или сыворотке субъекта с помощью иммуноанализов, как описано ниже.
В контексте настоящей заявки термин «лактат» относится к максимальной концентрации лактата, измеренной в крови. Обычно концентрацию лактата оценивают ежедневно или даже чаще. Концентрация лактата в крови может быть определена путем анализа лактатоксидазы спектрофотометрическими методами.
В контексте настоящей заявки термин «прокальцитонин» или «ПКТ» относится к пептиду, охватывающему аминокислотные остатки 1-116, 2-116, 3-116 или их фрагменты. Таким образом, длина фрагментов прокальцитонина составляет по меньшей мере 12 аминокислот, предпочтительно более 50 аминокислот, более предпочтительно более 110 аминокислот. ПКТ может содержать посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, липидирование или дериватизация. Прокальцитонин является предшественником кальцитонина и катакальцина. Таким образом, в нормальных условиях уровни ПКТ в кровотоке являются очень низкими (менее приблизительно 0,05 нг/мл). Уровень ПКТ в образце субъекта может быть определен с помощью иммуноанализов, как описано ниже.
В контексте настоящей заявки термин «шкала динамической оценки органной недостаточности» или «шкала SOFA» представляет собой одну из шкал оценки, используемых для отслеживания состояния пациента во время пребывания в отделении интенсивной терапии (ОИТ) или отделении скорой помощи (ОСП). Шкала SOFA представляет собой систему балльной оценки, определяющую степень нарушения функции или органной недостаточности у пациента. Шкала основана на шести различных оценках, по одной для дыхательной, сердечно-сосудистой, печеночной, коагуляционной, почечной и неврологической систем. Как средние, так и самые высокие оценки по шкале SOFA прогнозируют исход. Повышение оценки по шкале SOFA в течение первых 24-48 часов пребывания в ОИТ или ОСП прогнозирует смертность от по меньшей мере 50% до 95%. Оценки менее 9 прогнозируют летальный исход на уровне 33%, тогда как оценки выше 14 могут быть близки к 95% или выше.
JAMA
В контексте настоящей заявки «SAPS II» или «упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II» относится к системе классификации тяжести заболевания или расстройства (см. Le Gall JR et al., A new Simplified Acute Physiology Score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study. . 1993;270(24):2957-63.). Шкала SAPS II состоит из 12 физиологических параметров и 3 параметров, связанных с заболеванием. Балльная оценка рассчитывается на основе 12 рутинных физиологических измерений, информации о предшествующем состоянии здоровья и некоторой информации, получаемой при поступлении в ОИТ или ОСП. Оценка по шкале SAPS II может быть определена в любое время, предпочтительно на 2 день. «Худшее» измерение определяется как мера, которая соответствует наибольшему количеству баллов. Оценка по шкале SAPS II составляет от 0 до 163 баллов. Система классификации включает следующие параметры: возраст, частота сердечных сокращений, систолическое артериальное давление, температура, оценка по шкале комы Глазго, искусственная вентиляция легких или CPAP (вентиляция постоянным положительным давлением), PaO2, FiO2, диурез, азот мочевины крови, натрий, калий, бикарбонат, билирубин, лейкоциты, хронические заболевания и тип госпитализации. Существует сигмоидальная взаимосвязь между летальным исходом и общей оценкой по шкале SAPS II. Летальный исход субъекта составляет 10% при оценке по шкале SAPSII, составляющей 29 баллов, 25% при оценке по шкале SAPSII, составляющей 40 баллов, 50% при оценке по шкале SAPSII, составляющей 52 балла, 75% при оценке по шкале SAPSII, составляющей 64 балла, и 90% при оценке SAPSII, составляющей 77 баллов (Le Gall loc. cit.).
В контексте настоящего документа термин «APACHE II» или «шкала оценки острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья II» представляет собой систему оценки тяжести заболевания (Knaus et al., 1985). Она может применяться в течение 24 часов после поступления пациента в отделение интенсивной терапии (ОИТ) или отделение скорой помощи (ОСП) и может быть определена на основе 12 различных физиологических параметров.
В контексте настоящего документа термин «ускоренная шкала SOFA» или «шкала qSOFA» представляет собой систему оценки, которая указывает на нарушение функции органа или риске летального исхода у пациента. Шкала оценки основана на трех критериях: 1) изменение психического статуса, 2) снижение систолического артериального давления до уровня менее 100 мм рт. ст., 3) частота дыхательных движений более 22 вдохов в минуту. Пациенты с двумя или более из этих состояний подвергаются большему риску нарушения функции органа или смерти.
В контексте настоящей заявки термин «растворимая fms-подобная тирозинкиназа-1» или «sFlt-1» представляет собой тирозинкиназный белок, который дезактивирует белки, вызывающие рост кровеносных сосудов. Растворимый Flt-1 (sFlt-1) представляет собой сплайс-вариант рецептора 1 VEGF (Flt-1), который вырабатывается различными тканями. Уровень sFLT1 в образце субъекта может быть определен масс-спектрометрическими методами и посредством иммуноанализов.
В контексте настоящей заявки шкала «CURB-65» (Lim et al., 2003) относится к следующим факторам риска субъекта:
Впервые развившаяся спутанность сознания (определяется как оценка в сокращенном тесте оценки умственных способностей (AMTS) (Hodkinson, 1972), равная 8 или менее),
Азот мочевины крови более 7 ммоль/л (19 мг/дл),
Частота дыхательных движений, равная 30 вдохов в минуту или более,
Артериальное давление менее 90 мм рт. ст., систолическое или диастолическое артериальное давление, равное 60 мм рт. ст. или менее,
Возраст 65 лет и старше.
Каждому фактору риска присуждается один балл, максимальный балл равен 5.
В контексте настоящей заявки «индекс тяжести пневмонии» (PSI) относится к правилу клинического прогнозирования для расчета вероятности заболеваемости и летального исхода среди пациентов с внебольничной пневмонией (Fine et al., 1997).
Способы или наборы согласно изобретению могут включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проАДМ и уровня дополнительного маркера и/или параметра, как описано выше.
В предпочтительных аспектах данные способы или наборы согласно изобретению могут включать определение данного уровня проАДМ и данной оценки по шкале SOFA. Кроме того, данные способы или наборы согласно изобретению могут включать определение данного уровня проАДМ, данной оценки по шкале SOFA и данного уровня лактата у данного субъекта.
Способы и используемые наборы согласно настоящему изобретению также могут включать определение по меньшей мере одного дополнительного параметра, такого как оценка по шкале SAPS II, оценка по шкале SOFA и/или оценка по шкале APACHE II. Например, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проАДМ в образце субъекта и оценки по шкале SAPS II субъекта. Предпочтительно способ включает определение данного уровня по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта и данной оценки по шкале SAPSII данного субъекта. Уровень по меньшей мере одного гистона и оценка по шкале SAPSII могут указывать на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у данного субъекта течение 28 дней.
Предпочтительно способ включает определение уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и данной оценки по шкале SAPSII данного субъекта. Уровень проАДМ и оценка по шкале SAPSII могут указывать на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у данного субъекта в течение 28 дней или в течение 7 дней.
Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проАДМ в образце субъекта и оценку субъекта по шкале SOFA.
Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проАДМ в образце субъекта и уровня ПКТ в образце субъекта. Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проАДМ в образце субъекта и уровня альдолазы B в образце субъекта.
В контексте настоящей заявки термин «субъект» (или «пациент») может относиться к позвоночному. В контексте настоящего изобретения термин «субъект» включает как людей, так и животных, в частности, млекопитающих, и другие организмы. Таким образом, предложенные в настоящей заявке способы применимы в отношении как людей, так и животных. Соответственно, данный субъект может представлять собой животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик, морская свинка, хорек, кошка, собака, курица, овца, крупный рогатый скот, лошадь, верблюд или примат. Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее. Более предпочтительно субъект представляет собой человека.
Способ, предложенный в настоящей заявке, может применяться в отношении любого субъекта, представляющего собой здорового субъекта или субъекта, страдающего от какого(их)-либо заболевания(ий) или расстройства (расстройств). В предпочтительных аспектах субъект страдает от заболевания, расстройства или медицинского состояния. Подлежащий исследованию субъект может представлять собой пациента в критическом состоянии, предпочтительно где данный субъект поступил в отделение интенсивной терапии. В контексте настоящей заявки термин «в критическом состоянии» означает, что субъект или пациент находится в угрожающей жизни ситуации.
Субъект или референсный(ые) субъект(ы) могут страдать от заболевания или медицинского состояния/расстройства, где данное заболевание или медицинское состояние/расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из заболевания органов дыхания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной(ых) недостаточности(ей), сердечно-сосудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного(ых) новообразования(ий), заболевания печени, заболевания почек, иммунодепрессии, вирусной инфекции, грибковой инфекции, бактериальной инфекции, грамотрицательной бактериальной инфекции, грамположительной бактериальной инфекции и угнетения иммунитета. В настоящей заявке способ согласно изобретению, основанный на детектировании уровня проАДМ (в частности, уровня СР-проАДМ), особенно эффективен для прогнозирования неблагоприятного события у субъектов, страдающих от грибковой инфекции. Он также особенно эффективен у субъектов, страдающих от инфекции дыхательных путей, в частности, нижних дыхательных путей.
Субъект также может страдать от инфекции, последовавшей за дефектом кости и/или ткани, например, переломом кости.
Кроме того, субъект также может быть выбран для проведения хирургического вмешательства. Это означает, что у субъекта будет проведено хирургическое вмешательство. Это хирургическое вмешательство может быть связано с заболеванием и/или расстройством, являющимся причиной или симптомом при поступлении в больницу.
В частности, субъект страдает от заболевания органов дыхания, инфекции мочевыводящих путей и/или злокачественного(ых) новообразования(ий).
«Системное воспаление» в контексте изобретения предпочтительно относится к состоянию, характеризующемуся высвобождением провоспалительных цитокинов и активацией врожденной иммунной системы, которое может быть вызвано биологическими факторами, химическими факторами или генетическими факторами. Тяжелое «системное воспаление» может привести к органной недостаточности и смерти.
2
3
3
«ССВО» в контексте изобретения представляет собой синдром системного воспалительного ответа без признаков инфекции. Он включает, не ограничиваясь перечисленным, более одного из следующих клинических проявлений: (1) температура тела выше 38°C или ниже 36°C; (2) частота сердечных сокращений более 90 ударов в минуту; (3) тахипноэ, проявляющееся частотой дыхательных движений более 20 вдохов в минуту, или гипервентиляцией, на что указывает PaCO менее 32 мм рт. ст.; и (4) изменение количества лейкоцитов, например, количество более 12000/мм, количество менее 4000/мм или присутствие более 10% незрелых нейтрофилов (Bone et al., CHEST 101(6): 1644-55, 1992).
«Сепсис» в контексте изобретения относится к системному ответу на инфекцию. В качестве альтернативы, сепсис может рассматриваться как комбинация ССВО с подтвержденным инфекционным процессом или инфекцией. Сепсис может быть охарактеризован как клинический синдром, определенный наличием как инфекции, так и системного воспалительного ответа (Levy MM et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med. 2003 Apr;31(4):1250-6). Термин «сепсис» в контексте настоящей заявки включает, не ограничиваясь перечисленным, сепсис, тяжелый сепсис, септический шок. Тяжелый сепсис в данном контексте означает сепсис, связанный с нарушением функции органа, патологией, связанной с гипоперфузией, или гипотензией, вызванной сепсисом. Патологии, связанные с гипоперфузией, включают лактоацидоз, олигурию и острое изменение психического статуса. Гипотензия, вызванная сепсисом, определяется наличием систолического артериального давления менее приблизительно 90 мм рт. ст. или его снижением приблизительно на 40 мм рт. ст. или более относительно исходного уровня в отсутствие других причин гипотензии (например, кардиогенного шока). Септический шок определен как тяжелый сепсис с вызванной сепсисом гипотензией, сохраняющейся несмотря на надлежащую инфузионную терапию, наряду с наличием патологий, связанных с гипоперфузией, или нарушения функции органа (Bone et al., CHEST 101(6): 1644-55, 1992).
Термин «сепсис» также включает тяжелый сепсис или септический шок, основанный на определении СЕПСИС-2 (Bone et al., 2009). Термин «сепсис» также включает субъектов, попадающих под определение СЕПСИС-3 (Singer et al., 2016).
Термин «сепсис» в контексте настоящей заявки относится ко всем возможным стадиям развития сепсиса.
В контексте настоящей заявки термин «инфекция» в объеме изобретения означает патологический процесс, вызванный проникновением в нормальную стерильную ткань или жидкость патогенных или потенциально патогенных микроорганизмов, и относится к инфекции(ям) бактериями, вирусами, грибами и/или паразитами. Соответственно, инфекция может представлять собой бактериальную инфекцию, вирусную инфекцию и/или грибковую инфекцию. Инфекция может представлять собой местную или системной инфекцию. Кроме того, субъект, страдающий от инфекции, может страдать от более чем одного источника инфекции одновременно. Например, субъект, страдающий от инфекции, может страдать от бактериальной инфекции и вирусной инфекции; от вирусной инфекции и грибковой инфекции; от бактериальной и грибковой инфекции, и от бактериальной инфекции, грибковой инфекции и вирусной инфекции.
В частности, субъект страдает от сепсиса. Кроме того, субъект может предпочтительно страдать от заболевания органов дыхания, предпочтительно инфекции нижних дыхательных путей. В контексте настоящей заявки заболевание органов дыхания включает патологические состояния, поражающие органы и ткани, делающие возможным газообмен у высших организмов, а также включает состояния верхних дыхательных путей, трахеи, бронхов, бронхиол, альвеол, плевры и плевральной полости, а также нервов и мышц, участвующих в дыхании.
В частности, в способах и наборах согласно изобретению уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, страдающего от данного заболевания органов дыхания, указывает на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода в течение 7 дней.
В частности, в способах и наборах согласно изобретению субъект страдает от инфекции мочевыводящих путей, где данный уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, страдающего от данной инфекции мочевыводящих путей, указывает на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода в течение 28 дней.
В частности, в способах и наборах согласно изобретению субъект страдает от злокачественного новообразования, где данный уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, страдающего от данного злокачественного новообразования, указывает на наступление неблагоприятного события, в частности, летального исхода в течение 7 дней.
В контексте настоящей заявки термин «образец» означает биологический образец, полученный от субъекта. В контексте настоящей заявки «образец» может, например, относиться к образцу биологической жидкости или ткани, полученному с целью диагностики, прогнозирования или оценки представляющего интерес субъекта, такого как пациент. Предпочтительно в настоящей заявке образец представляет собой образец биологической жидкости, такой как кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, мокрота и плевральные выпоты. В частности, образец представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу. Образцы могут быть обработаны (предварительно обработаны), например, путем фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на компоненты сыворотки или плазмы. Такие предварительные обработки также могут включать, не ограничиваясь перечисленным, разбавление, фильтрацию, центрифугирование, концентрирование, седиментацию, осаждение или диализ. Предварительные обработки также могут включать добавление химических или биохимических веществ к раствору, таких как кислоты, основания, буферы, соли, растворители, химически активные красители, детергенты, эмульгаторы, комплексообразующие вещества. Предпочтительно образец представляет собой образец крови, более предпочтительно образец сыворотки или образец плазмы.
«Плазма» в контексте настоящего изобретения представляет собой практически бесклеточный супернатант крови, содержащий антикоагулянт, полученный после центрифугирования. Примеры антикоагулянтов включают соединения, связывающие ионы кальция, такие как ЭДТА или цитрат, и ингибиторы тромбина, такие как гепаринаты или гирудин. Бесклеточная плазма может быть получена путем центрифугирования антикоагулированной крови (например, цитратной, ЭДТА- или гепаринизированной крови), например, в течение по меньшей мере 15 минут при 2000-3000 g.
«Сыворотка» в контексте настоящего изобретения представляет собой жидкую фракцию цельной крови, которую собирают после того, как крови дают свернуться. При центрифугировании коагулированной крови (свернутой крови) сыворотку можно получить в качестве супернатанта.
В контексте настоящей заявки «моча» представляет собой жидкий продукт организма, выделяемый почками в процессе, называемом уринацией (или мочеиспусканием), и выводимый через мочеиспускательный канал.
Как описано выше, в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ. Специалисту в данной области техники известны способы/анализ, которые могут быть использованы для определения уровня биомаркеров в образце.
Как описано выше, определяют уровень по меньшей мере одного гистона, в частности, определяют уровень (уровни) гистонов H2B, H4, H2A и/или H3. В частности, может быть определен гистон или фрагмент гистона. Примеры таких фрагментов приведены ниже в настоящей заявке.
Такой гистон или его фрагмент также может представлять собой свободный гистон. Например, способы, наборы и антитела согласно настоящему изобретению могут, в частности, обеспечивать детектирование пептидов или эпитопов свободных гистонов. Такие участки аминокислот в настоящей заявке также называются центральными областями или частями гистонов. Далее описаны пептиды или эпитопы, которые также могут быть использованы для детектирования свободных гистонов с использованием способов, предложенных в настоящей заявке.
В частности, по меньшей мере один гистон может представлять собой гистон H4, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В частности, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, охватывающих остатки с 60 по 67 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 56 SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 30 SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 102 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 55 SEQ ID NO: 1, остатки с 80 по 91 SEQ ID NO: 1, остатки с 24 по 35 SEQ ID NO: 1 и остатки с 68 по 77 SEQ ID NO: 1. Например, могут быть определены два пептида.
В частности, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, при этом определяют пептиды с аминокислотными последовательностями, охватывающими остатки с 46 по 56 SEQ ID NO: 1 и остатки с 67 по 78 SEQ ID NO: 1.
Кроме того, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2. В частности, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, охватывающих остатки с 21 по 53 SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 SEQ ID NO: 2, остатки со 120 по 129 SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 SEQ ID NO: 2, остатки с 82 по 88 SEQ ID NO: 2, остатки 89 до 95 SEQ ID NO: 2 и остатки с 100 по 118 SEQ ID NO: 2.
Кроме того, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3. Кроме того, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 37 SEQ ID NO: 3 и/или охватывающей аминокислотные остатки с 52 по 62 SEQ ID NO: 3.
Кроме того, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, при этом определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 41 по 69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4.
Кроме того, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, при этом определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.
Кроме того, по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, при этом определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16.
В настоящей заявке подразумевается, что могут быть определены один, два, три, четыре или более пептидов.
Уровень маркеров, например, по меньшей мере одного гистона или его фрагмента и/или проАДМ или его фрагмента, может быть определен с помощью любого анализа, который надежно определяет концентрацию маркера. В частности, могут быть использованы масс-спектрометрия (МС) и/или иммуноанализы, как показано в прилагаемых примерах. В контексте настоящей заявки иммуноанализ представляет собой биохимический тест, в котором измеряют присутствие или концентрацию макромолекулы/полипептида в растворе с помощью антитела или связывающего фрагмента антитела или иммуноглобулина.
В качестве альтернативы вместо антител в объем настоящего изобретения могут входить другие молекулы захвата или молекулярные каркасы, которые специфично и/или селективно распознают последовательности гистонов, эпитопы гистонов и структурные конформации гистонов. В контексте настоящей заявки термин «молекулы захвата» или «молекулярные каркасы» включает молекулы, которые могут быть использованы для связывания целевых или представляющих интерес молекул, то есть аналитов (например, гистона(ов) и/или проАДМ), из образца. Таким образом, молекулы захвата должны иметь подходящую форму, как пространственную, так и с точки зрения характеристик поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, чтобы специфически связывать целевые или представляющие интерес молекулы. Таким образом, связывание может, например, быть опосредовано взаимодействиями на основе ионных, ван-дер-ваальсовых, пи-пи, сигма-пи, гидрофобных или водородных связей, или комбинацией двух или более вышеупомянутых взаимодействий, или ковалентными взаимодействиями между молекулами захвата или молекулярными каркасами и целевыми или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения молекулы захвата или молекулярные каркасы могут, например, быть выбраны из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, молекулы углевода, молекулы ПНК, белка, пептида и гликопротеина. Молекулы захвата или молекулярные каркасы включают, например, аптамеры, DARpin (сконструированные белки с анкириновым повтором), аффимеры и тому подобное.
В контексте настоящей заявки термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина (Ig), то есть молекулам, содержащим антигенсвязывающий участок, специфически связывающий антиген (вступающий с ним в иммунную реакцию). Согласно изобретению антитела могут представлять собой как моноклональные, так и поликлональные антитела. В частности, применяют антитела, специфически связывающиеся с по меньшей мере одним гистоном и/или специфически связывающиеся с проАДМ. Антитело считается специфичным, если его аффинность по отношению к представляющей интерес молекуле, например, по меньшей мере одному гистону и/или проАДМ, или ее фрагменту, по меньшей мере в 50 раз выше, предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем по отношению к другим молекулам, содержащимся в образце, содержащем представляющую интерес молекулу. В данной области техники хорошо известно, как разрабатывать и отбирать антитела с заданной специфичностью. В контексте изобретения предпочтительными являются моноклональные антитела. Антитело или его связывающий фрагмент специфически связывается с определенными в настоящей заявке маркерами или их фрагментами. В частности, антитело или его связывающий фрагмент связывается с определенными в настоящей заявке пептидами по меньшей мере одного гистонового белка. Таким образом, определенные в настоящей заявке пептиды также могут представлять собой эпитопы, с которыми специфически связываются антитела. Кроме того, в способах и наборах согласно изобретению применяют антитело или его связывающий фрагмент, специфически связывающиеся с проАДМ, в частности, с СР-проАДМ. Примеры иммуноанализов могут представлять собой люминесцентный иммуноанализ (LIA), радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализы, иммуноферментный анализ (EIA), метод на основе иммуносорбентов, связанных с ферментами (ELISA), матрицы на основе гранул с люминесцентными метками, матрицы на основе магнитных гранул, анализы на основе белковых микрочипов, ускоренные методы исследований, анализ с применением криптатов редкоземельных элементов. Кроме того, могут быть использованы анализы, подходящие для проведения тестов в местах оказания медицинской помощи, и ускоренные методы исследований, такие как, например, иммунохроматографические тест-полоски.
В отдельных аспектах изобретения способ представляет собой способ диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающий
(i) получение образца у субъекта;
(ii) детектирование уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта путем приведения образца в контакт с антителом(ами) или его (их) антигенсвязывающим(и) фрагментом(ами) или производным(и), специфичными к эпитопу данного по меньшей мере одного гистона и/или данного проАДМ, и детектирование связывания между антителом(ами) или его (их) антигенсвязывающим(и) фрагментом(ами) или производным(ами) и данным по меньшей мере один гистоном и/или данным проАДМ;
(iii) где данный уровень по меньшей мере одного гистона и/или данный уровень проадреномедуллина (проАДМ) указывают(ют) на данное нежелательное явление у данного субъекта.
В отдельных аспектах изобретения способ представляет собой иммуноанализ, включающий следующие стадии:
а) приведение образца в контакт с
(i) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, специфичным к первому эпитопу гистона или проАДМ, и
(ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, специфичным ко второму эпитопу гистона или проАДМ; и
b) детектирование связывания первого и второго антител или их антигенсвязывающих фрагментов или производных с гистоном или с проАДМ.
Предпочтительно одно из антител может быть мечено, а другое антитело может быть связано с твердой фазой или может быть селективно связано с твердой фазой. В особенно предпочтительном аспекте анализа одно из антител мечено, в то время как другое либо связано с твердой фазой, либо может быть селективно связано с твердой фазой. Первое антитело и второе антитело могут присутствовать в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, где первый метящий компонент, который является частью системы мечения на основе гашения или усиления флуоресценции или хемилюминесценции, связан с первым антителом, и второй метящий компонент данной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с детектируемым данным по меньшей мере одним гистоном и/или данным проАДМ генерируется измеримый сигнал, позволяющий детектировать полученные в результате сэндвич-комплексы в растворе для измерения. Система мечения может содержать криптат или хелат редкоземельного элемента в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности, цианинового типа.
В предпочтительном варианте осуществления способ проводят в виде гетерогенного сэндвич-иммуноанализа, в котором одно из антител иммобилизовано на произвольно выбранной твердой фазе, например, на стенках пробирок с покрытием (например, полистирольных пробирок; пробирок с покрытием; CT) или планшетах для микротитрования, например, состоящих из полистирола, или на частицах, таких как, например, магнитные частицы, при этом другое антитело имеет группу, напоминающую детектируемую метку или позволяющую избирательно прикрепляться к метке, и которая служит для детектирования образованных сэндвич-структур. Также возможна временная отсрочка иммобилизации или ее последующее проведение с использованием подходящих твердых фаз.

Способ согласно настоящему изобретению, кроме того, может быть осуществлен в виде гомогенного способа, где сэндвич-комплексы, образованные антителом/антителами и маркером, например, детектируемым гистоном или проАДМ или их фрагментом, остаются суспендированными в жидкой фазе. В этом случае предпочтительно, чтобы в случае использовании двух антител оба антитела были мечены частями системы детектирования, что приводит к генерации сигнала или запуску сигнала, если оба антитела объединены в один сэндвич. Такие методики должны быть осуществлены, в частности, как способы детектирования усиления флуоресценции или гашения флуоресценции. Особенно предпочтительный аспект относится к применению реагентов для детектирования, применяемых попарно, таких как, например, описанные в патентах US 4 882 733 A, EP-B1 0 180 492 или EP-B1 0 539 477 и цитируемых в них документах уровня техники. Таким образом становятся возможными измерения, при которых детектируются только продукты реакции, содержащие оба метящих компонента в одном иммунном комплексе непосредственно в реакционной смеси. Например, такие технологии предлагаются под товарными знаками TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) или KRYPTOR, в которых реализуются идеи цитируемых выше патентных заявок. Следовательно, в частных предпочтительных аспектах для осуществления предложенного в настоящей заявке способа применяют диагностическое устройство. Например, определяют уровень гистона или проАДМ или их фрагмента, и/или уровень любого другого маркера из предложенного в настоящей заявке способа. В частных предпочтительных аспектах устройство для диагностики представляет собой KRYPTOR.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению предпочтительно может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ. Например, ниже и выше в настоящей заявке описаны пептиды, которые могут подходить для определения уровня проАДМ и/или по меньшей мере одного гистона.
Например, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может предпочтительно применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H4, где первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона Н4, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 SEQ ID NO: 1.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона Н4, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 46 по 56 SEQ ID NO: 1, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона Н4, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 67 по 78 SEQ ID NO: 1.
Например, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может предпочтительно применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H2B, где первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2B, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 41 по 69 SEQ ID NO: 4.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может предпочтительно применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H2A, где первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2A, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H2A, где первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2A, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, с 20 по 118 или со 120 по 129 SEQ ID NO:2.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H3, где первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H3, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 SEQ ID NO: 3.
Более предпочтительно, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H4, где эпитоп(ы) выбран(ы) из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 22 по 30 SEQ ID NO:1, остатки с 46 по 56 SEQ ID NO:1, остатки с 67 по 78 SEQ ID NO:1, остатки с 92 по 102 SEQ ID NO:1, остатки с 22 по 34 SEQ ID NO: 1 и остатки с 46 по 102 SEQ ID NO: 1.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H2A, где эпитоп(ы) выбран(ы) из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 21 по 53 SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 SEQ ID NO: 2 и остатки со 120 по 129 SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H2B, охватывающему (охватывающим) остатки с 41 по 69 SEQ ID NO: 4.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы) или производное(ые), специфичные к эпитопу(ам) гистона H3, охватывающему (охватывающим) остатки с 27 по 37 SEQ ID NO: 3 и/или охватывающему (охватывающим) остатки с 52 по 62 SEQ ID NO: 3.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело и/или второе антитело, или их антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичные к эпитопу гистона H2A, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53 и/или со 120 по 129 последовательности гистона H2A, представленного SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона Н4, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 SEQ ID NO: 1, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу свободного гистона H2A, H2B или предпочтительно H3.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона H2B, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 41 по 69 SEQ ID NO: 4, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу свободного гистона H2A, H4 или H3.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона H2B, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 SEQ ID NO: 2, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу свободного гистона H2B, H4 или H3.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона H2B, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 SEQ ID NO: 3, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу свободного гистона H2B, H4 или H2A.
Кроме того, в способах иммуноанализа согласно настоящему изобретению может применяться первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу гистона H2A, присутствующему в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, со 120 по 129 или с 20 по 118 SEQ ID NO: 2, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичное к эпитопу свободного гистона H3, H4 или предпочтительно H2B.
Изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту или производному, специфичному к эпитопу гистонового белка или его фрагмента, как подробно описано выше. Примеры антител, успешно применяемых для детектирования гистонов или проАДМ, предпочтительно СР-проАДМ, приведены в прилагаемых примерах. Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу(ам), его (их) антигенсвязывающему(им) фрагменту(ам) или производному(ам), специфичному(ым) к эпитопу гистона H2B, H4, H2A, H3 и/или проАДМ, предпочтительно СР-проАДМ. Примеры эпитопов или пептидов, с которыми специфично связываются антитела, приведены выше и ниже в настоящей заявке.
Уровень маркера, например, по меньшей мере, одного гистона и/или проАДМ, также может быть определен с помощью масс-спектрометрического (МС) анализа, как описано в прилагаемых примерах. Такой способ может включать детектирование присутствия, количества или концентрации одного или более модифицированных или немодифицированных фрагментированных пептидов, например, проАДМ и/или гистона, в данном биологическом образце или продукте расщепления белка (например, трипсинового расщепления) из данного образца, и, необязательно, разделение образца хроматографическими методами и подвергание подготовленного и необязательно разделенного образца МС анализу. Например, в МС анализе могут применяться масс-спектрометрия с мониторингом выбранных реакций (SRM), мониторингом множественных реакций (MRM) или мониторингом параллельных реакций (PRM), в частности для определения количеств по меньшей мере одного гистонового пептида. В настоящей заявке термин «масс-спектрометрия» или «МС» относится к аналитической методике, позволяющей идентифицировать соединения по их массе. Чтобы улучшить возможности масс-спектрометрии по разрешению и определению массы, образцы перед проведением МС анализа могут быть подвергнуты обработке. Соответственно, изобретение относится к МС способам детектирования, которые можно сочетать с технологиями иммунообогащения, способами, связанными с пробоподготовкой и/или хроматографическими способами, предпочтительно с жидкостной хроматографией (ЖХ), более предпочтительно с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) или ультра высокоэффективной жидкостной хроматографией (УВЭЖХ). Способы пробоподготовки включают методики лизиса, фракционирования, расщепления образца до пептидов, обеднения, обогащения, диализа, обессоливания, алкилирования и/или восстановления пептидов. Однако эти стадии являются необязательными. Селективное детектирование ионов аналита может быть проведено с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Тандемная масс-спектрометрия характеризуется стадией отбора по массе (в контексте настоящей заявки термин «стадия отбора по массе» обозначает выделение ионов, имеющих определенное m/z или узкий диапазон m/z) с последующей фрагментацией отобранных ионов и анализом массы (фрагментированных) ионов полученного продукта.
Специалисту в данной области техники известно, как количественно определить уровень маркера в образце с помощью масс-спектрометрических методов. Например, может быть использовано определение относительного количества «rSRM» или определение абсолютного количества, как описано выше.
В контексте настоящей заявки «диагностика» в контексте настоящего изобретения относится к распознаванию и (раннему) детектированию (обнаружению) неблагоприятного события, в частности, летального исхода, у субъекта, и также может включать дифференциальную диагностику. Термин «диагностика» также может охватывать оценку тяжести неблагоприятного события. Например, оценку того, насколько критическим является состояние и насколько вероятно возникновение неблагоприятного события. Кроме того, диагностика означает, что может быть спрогнозировано время, когда у субъекта наступит неблагоприятное событие, например, в течение по меньшей мере приблизительно 28, 7 или 3 дней.
«Прогноз» относится к прогнозированию исхода субъекта или определенного риска испытать/иметь/страдать от неблагоприятного события, в частности, летального исхода. Он также может включать оценку вероятности выздоровления или вероятности неблагоприятного исхода для данного субъекта.
Изобретение также относится к способам и наборам для мониторинга, направления терапии и/или контроля терапии субъектов, где способ включает
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта, где данный уровень проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
Способы и наборы согласно изобретению также могут применяться для мониторинга. «Мониторинг» относится к отслеживанию уже диагностированного заболевания или медицинского состояния, например, к анализу прогрессирования заболевания или медицинского состояния или влияния конкретного вида лечения на прогрессирование, и к прогнозированию неблагоприятного исхода, например, угрожающего жизни состояния или даже летального исхода.
Термин «контроль терапии» в контексте настоящего изобретения относится к мониторингу и/или корректировке терапевтического лечения субъекта. Корректировка терапевтического лечения также может включать решение о том, будет ли дальнейшее лечение субъекта проводиться так, как это делалось ранее, или же лечение будет адаптировано. Например, корректировка терапевтического лечения может заключаться в том, будет ли субъект находиться в ОИТ или ОСП, или же он будет выписан.
В настоящей заявке термины «оценка риска» и «стратификация риска» относятся к группированию субъектов в различные группы риска в соответствии с их дальнейшим прогнозом. Оценка риска также относится к стратификации для применения профилактических и/или терапевтических мер.
В контексте настоящей заявки термин «направление терапии» относится к применению определенных видов терапии или медицинских вмешательств, основанных на значении одного или более биомаркеров, и/или клинических параметров, и/или оценок по клиническим шкалам.
Способы согласно настоящему изобретению могут быть частично компьютеризированы. Например, стадия сравнения детектированного уровня маркера, например, уровня проАДМ и/или уровня гистона, с референсным уровнем может быть проведена в компьютерной системе. В компьютерной системе определенный уровень маркера(ов) можно сочетать с уровнями другого маркера и/или параметрами субъекта для вычисления оценки, используемой для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска. Например, определенные значения могут быть введены (либо вручную медицинским работником, либо автоматически с устройства (устройств), в которых уровень (уровни) соответствующего(их) маркера(ов) был(и) определены) в компьютерную систему. Компьютерная система может находиться непосредственно в пункте оказания медицинской помощи (например, ОИТ или ОСП) или в отдаленном месте с подключением через компьютерную сеть (например, через Интернет). Как правило, компьютерная система будет хранить значения (например, уровень маркера или параметры, такие как возраст, артериальное давление, масса тела, пол и т. д.) на машиночитаемом носителе и рассчитывать оценку на основании предварительно определенных и/или предварительно сохраненных референсных уровней или референсных значений. Полученная оценка будет отображаться и/или распечатываться для пользователя (обычно им является медицинский работник, такой как врач). В качестве альтернативы или дополнительно, связанный прогноз, диагноз, оценка или стратификация будут отображаться и/или распечатываться для пользователя (обычно им является медицинский работник, такой как врач).
Следовательно, настоящее изобретение в дополнительном аспекте относится к системе для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающей
(i) анализатор образца для определения уровня проАДМ и/или гистона в образце субъекта (и, необязательно, уровней дополнительных маркеров); и
(ii) компьютерную подсистему, запрограммированную для вычисления диагноза, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, обычно на основании сравнения определенного(ых) уровня(ей) с референсным(и) уровнем(ями).
Компьютерная подсистема может сочетать детектируемый(ые) уровень(и) маркера с дополнительным(и) уровнем(ями) и/или параметром(ами), как описано в настоящей заявке. Выходные данные устройства могут представлять собой оценку или непосредственный диагноз, прогноз, оценку риска и/или стратификацию риска неблагоприятного события у субъекта.
В связанном аспекте изобретение относится к компьютерному программному продукту, воплощенному в машиночитаемом носителе, который при выполнении на компьютере выполняет стадии, включающие определение диагноза, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта на основании определенного уровня проАДМ и/или гистона в образце субъекта. Обычно эта стадия основана на сравнении определенного(ых) уровня(ей) с референсным(и) уровнем(ями), как описано в настоящей заявке.
Изобретение также относится к наборам, применению наборов и способам, в которых применяются такие наборы. Изобретение относится к наборам для осуществления способов, представленных выше и ниже в настоящей заявке. Представленные в настоящей заявке определения, например, представленные в отношении способов, также применимы к наборам согласно изобретению. В частности, изобретение относится к наборам для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска, где данный набор содержит
(i) реагенты для детектирования для определения данного уровня по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, и
референсные данные, включающие данный референсный уровень по меньшей мере одного гистона, где повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта, и
референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и
где повышенный уровень данного проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта.
Кроме того, изобретение предпочтительно относится к набору и его применению для осуществления способа согласно изобретению, где данный набор содержит реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и где повышение уровня проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта.
Кроме того, изобретение предпочтительно относится к набору и его применению для осуществления способа согласно изобретению, где данный набор содержит реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и где снижение уровня проАДМ или близкий уровень проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на то, что неблагоприятное событие у данного субъекта не наступит в течение приблизительно 28 дней.
Изобретение также относится к набору и его применению в диагностике, прогнозе, оценке риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,
(i) где определяют уровень по меньшей мере одного гистона в образце субъекта,
где уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона, и
где неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании сравнения уровня по меньшей мере одного гистона, определенного в образце, и референсного уровня по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii) где определяют уровень проАДМ в образце субъекта,
где уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ, и
где неблагоприятное событие у субъекта идентифицируют на основании сравнения уровня проАДМ, определенного в образце, и референсного уровня проАДМ.
Изобретение также относится к набору и его применению в диагностике, прогнозе, оценке риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,
(i) где набор содержит реагенты для детектирования для определения уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта, и
где уровень по меньшей мере одного гистона указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) где набор содержит реагенты для детектирования для определения уровня проАДМ в образце субъекта, и
где данный уровень данного проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
В контексте настоящей заявки «референсные данные» включают референсный(ые) уровень(и) по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ, в частности, СР-проАДМ. Уровни по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ в образце субъекта могут быть сравнены с референсными уровнями, содержащимися в референсных данных в составе набора. Повышенный уровень определяемого(ых) маркера(ов) указывает на неблагоприятное событие, в частности, летальный исход. Сниженный уровень или равный уровень определяемого(ых) маркера(ов) указывает на то, что неблагоприятное событие, в частности, летальный исход, не наступит. Референсные уровни описаны выше в настоящей заявке. Референсные данные также могут включать референсный образец, с которым сравнивают уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ. Референсные данные также могут включать руководство по использованию наборов согласно изобретению.
В контексте настоящей заявки термин «реагент для детектирования» или тому подобное представляет собой реагенты, подходящие для определения описанного(ых) в настоящей заявке маркера(ов), например, по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ. Примерами таких реагентов для детектирования являются, например, лиганды, например антитела или их фрагменты, специфично связывающиеся с пептидом или эпитопами описанного(ых) в настоящей заявке маркера(ов). Такие лиганды могут применяться в иммуноанализах, как описано выше. Дополнительные реагенты, применяемые в иммуноанализах для определения уровня маркера(ов), также могут быть включены в набор и рассматриваются в настоящей заявке как реагенты для детектирования. Реагенты для детектирования также могут относиться к реагентам, используемым для детектирования маркеров или их фрагментов МС методами. Таким образом, такой реагент для детектирования также может представлять собой реагенты, например, ферменты, химические вещества, буферы и т. д., применяемые для подготовки образца к проведению МС анализа. Масс-спектрометр также можно рассматривать в качестве реагента для детектирования. Реагенты для детектирования согласно изобретению также могут представлять собой калибровочный(ые) раствор(ы), например, который(ые) может (могут) быть использован(ы) для определения и сравнения уровня маркера(ов).
Данные определения и пояснения аналогичным образом также применимы к следующим объектам. Настоящее изобретение также относится к следующим объектам:
1. Способ диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающий
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта, где данный уровень по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта, где данный уровень проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
2. Способ согласно п. 1, где данное неблагоприятное событие наступает в течение 28 дней, или где данное неблагоприятное событие не наступает в течение 28 дней.
3. Способ согласно п. 1 или 2, где
(i1) данный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii1) где данный уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ; и
(iii) где данное неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании сравнения на стадии (i1) и/или (ii1), соответственно.
4. Способ согласно любому из объектов 1-3, где
(i) повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) повышение уровня проАДМ по сравнению с референсным уровнем проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта, где предпочтительно данное неблагоприятное событие наступает в течение приблизительно 28 дней, или
снижение уровня или равный уровень данного проАДМ у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем данного проАДМ указывает на то, что неблагоприятное событие не наступает, предпочтительно в течение приблизительно 28 дней.
5. Способ согласно любому из объектов 1-4, где данное неблагоприятное событие выбрано из группы, состоящей из летального исхода, нарушения функции органа, нарушения функции нескольких органов и заболевания или медицинского расстройства, такого как инфекция.
6. Способ согласно любому из объектов 1-5, где данное неблагоприятное событие представляет собой летальный исход.
7. Способ согласно любому из объектов 3-6, где референсный уровень проАДМ составляет от приблизительно 0,9 нмоль/л до приблизительно 1,8 нмоль/л.
8. Способ согласно любому из объектов 1-7, где
(i) повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона приблизительно в два раза превышает данный референсный уровень по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii) повышенный уровень данного проАДМ приблизительно в два раза превышает данный референсный уровень проАДМ.
9. Способ согласно любому из объектов 3-8, где данный референсный уровень по меньшей мере одного гистона и/или референсный уровень проАДМ представляет(ют) собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень проАДМ по меньшей мере одного референсного субъекта.
10. Способ согласно любому из объектов 3-9, где референсный(ые) субъект(ы) представляет(ют) собой здорового(ых) субъекта(ов), не имеющего(их) неблагоприятного события.
11. Способ согласно любому из объектов 3-10, где данный референсный уровень по меньшей мере одного гистона и/или референсный уровень проАДМ представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ, полученный(ые) из ранее проведенного анализа данного субъекта.
12. Способ согласно любому из объектов 1-11, где данный проАДМ представляет собой среднерегиональный проадреномедуллин (СР-проАДМ).
13. Способ согласно любому из объектов 1-12, где данный уровень проАДМ у данного субъекта указывают на данное неблагоприятное событие, предпочтительно летальный исход,, у данного субъекта в течение 28 дней.
14. Способ согласно любому из объектов 1-13, где данный уровень проАДМ у данного субъекта указывают на данное неблагоприятное событие, предпочтительно летальный исход,, у данного субъекта в течение 7 дней.
15. Способ согласно любому из объектов 1-14, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, гистон H2A, гистон H3 и/или гистон H4.
16. Способ согласно любому из объектов 1-15, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B.
17. Способ согласно любому из объектов 1-16, где данный уровень по меньшей мере одного гистона у данного субъекта указывают на данное неблагоприятное событие, предпочтительно летальный исход,, у данного субъекта в течение 7 дней или в течение 3 дней.
18. Способ согласно любому из объектов 1-17, дополнительно включающий определение по меньшей мере одного маркера и/или параметра данного субъекта, выбранного из группы, состоящей из уровня лактата в данном образце, уровня по меньшей мере одного гистона, уровня альдолазы В в данном образце, уровня копептина в данном образце, уровня лактата в данном образце, уровня прокальцитонина (ПКТ) в данном образце, оценки по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA) данного субъекта, оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний (шкала SAPSII), оценки по шкале острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья II (APACHE II) данного субъекта и уровня растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) в данном образце.
19. Способ согласно любому из объектов 1-18, где дополнительно определяют оценку по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA) данного субъекта.
20. Способ согласно любому из объектов 3-19, где
референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 1,8 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет ≤ 6;
референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 3,2 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет от 7 до 12; или
референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 5,5 нмоль/л, если оценка по шкале SOFA субъекта составляет ≥ 13.
21. Способ согласно любому из объектов 1-20, где
снижение уровня или равный уровень проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 1,8 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≤ 6 указывают на то, что данное неблагоприятное событие не происходит;
снижение уровня или равный уровень проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 3,2 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта от 7 до 12 указывают на то, что данное неблагоприятное событие не происходит; или
снижение уровня или равный уровень проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 5,6 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≥ 13 указывают на то, что данное неблагоприятное событие не происходит; и
где предпочтительно данное неблагоприятное событие не наступает в течение приблизительно 28 дней.
22. Способ согласно любому из объектов 1-20, где
повышение уровня проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 1,8 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≤ 6 указывают на неблагоприятное событие у данного субъекта;
повышение уровня проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 3,2 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта от 7 до 12 указывают на неблагоприятное событие у данного субъекта; или
повышение уровня проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 5,6 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≥ 13 указывают на неблагоприятное событие у данного субъекта,
где предпочтительно данное неблагоприятное событие наступает в течение приблизительно 28 дней.
23. Способ согласно любому из объектов 19-23, где оценку по шкале SOFA данного субъекта увеличивают на основании уровня проАДМ данного субъекта, и где данная модифицированная оценка по шкале SOFA указывает на данное неблагоприятное событие.
24. Способ согласно п. 23, где оценку по шкале SOFA субъекта увеличивают на единицу, если уровень проАДМ у субъекта превышает приблизительно 1,8 нмоль/л.
25. Способ согласно любому из объектов 1-24, включающий определение данного уровня по меньшей мере одного гистона и данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта.
26. Способ согласно п. 25, где данный уровень по меньшей мере одного гистона и данный уровень проАДМ указывают на наступление данного неблагоприятного события, предпочтительно летального исхода, у данного субъекта в течение 28 дней.
27. Способ согласно любому из объектов 1-26, включающий определение данного уровня по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта и данной оценки по шкале SAPSII данного субъекта.
28. Способ согласно п. 27, где данный уровень по меньшей мере одного гистона и данная оценка по шкале SAPSII указывают на наступление данного неблагоприятного события, предпочтительно летального исхода, у данного субъекта в течение 28 дней.
29. Способ согласно любому из объектов 1-28, включающий определение данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и данной оценки по шкале SAPSII данного субъекта.
30. Способ согласно п. 29, где данный уровень проАДМ и данная оценка по шкале SAPSII указывают на наступление данного неблагоприятного события, предпочтительно летального исхода, у данного субъекта в течение 28 дней или в течение 7 дней.
31. Способ согласно любому из объектов 1-30, включающий определение данного уровня проАДМ, данной оценки по шкале SOFA и данного уровня лактата у данного субъекта.
32. Способ согласно любому из объектов 1-31, где данный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния.
33. Способ согласно любому из объектов 1-32, где данный субъект представляет собой пациента в критическом состоянии, предпочтительно где данный субъект поступил в отделение интенсивной терапии.
34. Способ согласно любому из объектов 1-33, где указанный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния, выбранного из группы, состоящей из заболевания органов дыхания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной(ых) недостаточности(ей), сердечно-сосудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек, иммунодепрессии, вирусной инфекции, грибковой инфекции, бактериальной инфекции, грамотрицательной бактериальной инфекции, грамположительной бактериальной инфекции и угнетения иммунитета.
35. Способ согласно любому из объектов 1-34, где данный субъект страдает от сепсиса.
36. Способ согласно любому из объектов 1-35, где данный субъект представляет собой субъекта с угнетенным иммунитетом, такого как субъект, страдающий от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), субъект, проходящий радиационную терапию, и/или субъект, получающий иммуносупрессивные препараты.
37. Способ согласно любому из объектов 1-36, где данный субъект страдает от заболевания органов дыхания, предпочтительно инфекции нижних дыхательных путей.
38. Способ согласно п. 37, где данный уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, страдающего от данного заболевания органов дыхания, указывает на наступление летального исхода в течение 7 дней.
39. Способ согласно любому из объектов 1-38, где данный субъект страдает от инфекции мочевыводящих путей.
40. Способ согласно п. 39, где данный уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, страдающего от данной инфекции мочевыводящих путей, указывает на наступление летального исхода в течение 28 дней.
41. Способ согласно любому из объектов 1-40, где данный субъект страдает от злокачественного новообразования.
42. Способ согласно п. 41, где данный уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, страдающего от данного злокачественного новообразования, указывает на наступление летального исхода в течение 7 дней.
43. Способ согласно любому из объектов 1-42, где уровень маркера или параметра определяют в течение приблизительно 12 часов после поступления данного субъекта.
44. Способ согласно любому из объектов 1-43, где данный образец представляет собой биологическую жидкость, кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу.
45. Способ согласно любому из объектов 1-44, где данный уровень по меньшей мере одного гистона и/или проАДМ определяют с применением способа, выбранного из группы, состоящей из масс-спектрометрии (МС), люминесцентного иммуноанализа (LIA), радиоиммуноанализа (RIA), хемилюминесцентного и флуоресцентного иммуноанализов, иммуноферментного анализа (EIA), твердофазных методов иммуноферментного анализа (ELISA), матриц на основе гранул с люминесцентными метками, матриц на основе магнитных гранул, анализов на основе белковых микрочипов, ускоренных методов исследований и анализа с применением криптатов редкоземельных элементов.
46. Способ согласно п. 45, где способ представляет собой иммуноанализ, и где анализ проводят в гомогенной фазе или в гетерогенной фазе.
47. Способ согласно п. 45 или 46, где способ представляет собой иммуноанализ, включающий следующие стадии:
а) приведение образца в контакт с
(i) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, специфичным к первому эпитопу гистона или проАДМ, и
(ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, специфичным ко второму эпитопу гистона или проАДМ; и
b) детектирование связывания первого и второго антител или их антигенсвязывающих фрагментов или производных с данным первым гистоном или с проАДМ.
48. Способ согласно п. 47, где одно из первого или второго антител мечено, а другое антитело связано или может быть селективно связано с твердой фазой.
49. Способ согласно п. 47 или 48, где первое антитело и второе антитело присутствуют в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, и где первый метящий компонент, который является частью системы мечения на основе гашения или усиления флуоресценции или хемилюминесценции, связан с первым антителом, и второй метящий компонент данной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с данным по меньшей мере с одним детектируемым гистоном или данным проАДМ генерируется измеримый сигнал, позволяющий детектировать полученные в результате сэндвич-комплексы в растворе для измерения.
50. Способ согласно п. 49, где система мечения содержит криптат или хелат редкоземельного элемента в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности цианинового типа.
51. Способ согласно п. 45, где МС метод анализа представляет собой мониторинг реакций (SRM), мониторинг множественных реакций (MRM) или мониторинг параллельных реакций (PRM).
52. Способ согласно любому из объектов 1-51, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1.
53. Способ согласно любому из объектов 1-52, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, охватывающих остатки с 47 по 59 SEQ ID NO: 1, остатки с 68 по 79 SEQ ID NO: 1, остатки с 60 по 67 SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 30 SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 102 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 55 SEQ ID NO: 1, остатки с 80 по 91 SEQ ID NO: 1, остатки с 24 по 35 SEQ ID NO: 1 и остатки с 68 по 77 SEQ ID NO: 1.
54. Способ согласно любому из объектов 1-53, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2.
53. Способ согласно любому из объектов 1-54, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, охватывающих остатки с 21 по 53 SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 SEQ ID NO: 2, остатки со 120 по 129 SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 SEQ ID NO: 2, остатки с 82 по 88 SEQ ID NO: 2, остатки с 89 по 95 SEQ ID NO: 2 и остатки с 100 по 118 SEQ ID NO: 2.
56. Способ согласно любому из объектов 1-55, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3.
57. Способ согласно любому из объектов 1-56, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 37 SEQ ID NO: 3 и/или охватывающей аминокислотные остатки с 52 по 62 SEQ ID NO: 3.
58. Способ согласно любому из объектов 1-57, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, и где определяют по меньшей мере пептид с последовательностью, охватывающей аминокислотные остатки с 41 по 69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4.
59. Способ согласно любому из объектов 1-59, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и где определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.
60. Способ согласно любому из объектов 1-59, где данный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и где определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16.
61. Набор для осуществления способа согласно любому из объектов 1-60, содержащий
(i) реагенты для детектирования для определения данного уровня по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта, и
референсные данные, включающие данный референсный уровень по меньшей мере одного гистона, где повышение уровня по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта, и
референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и
где повышение уровня проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта.
62. Набор для осуществления способа согласно любому из объектов 1-29, содержащий реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и где снижение уровня проАДМ или близкий уровень проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на то, что неблагоприятное событие у данного субъекта не наступит, предпочтительно в течение приблизительно 28 дней.
63. Применение набора согласно п. 61 или 62 в способе согласно любому из объектов 1-60.
64. Применение набора согласно п. 63 для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,
(i) где определяют данный уровень по меньшей мере одного гистона в данном образце данного субъекта,
где данный уровень данного по меньшей мере одного гистона сравнивают с данным референсным уровнем по меньшей мере одного гистона, и
где данное неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании сравнения данного уровня по меньшей мере одного гистона, определенного в данном образце, и данного референсного уровня по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii) где определяют данный уровень проАДМ в данном образце данного субъекта,
где данный уровень проАДМ сравнивают с данным референсным уровнем проАДМ, и
где данное неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании сравнения данного уровня проАДМ, определенного в данном образце, и данного референсного уровня проАДМ.
65. Применение набора для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,
(i) где данный набор содержит реагенты для детектирования для определения уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта, и
где данный уровень по меньшей мере одного гистона указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; и/или
(ii) где данный набор содержит реагенты для детектирования для определения уровня проАДМ в образце субъекта, и
где данный уровень данного проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
Настоящее изобретение в предпочтительных вариантах осуществления также относится к следующим объектам:
1. Способ диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, включающий
определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта, где данный уровень проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
2. Способ согласно п. 1, где
данный уровень проАДМ сравнивают с референсным уровнем проАДМ; и
где данное неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании сравнения.
3. Способ согласно п. 1 или 2, где
где снижение уровня, или более низкий уровень, или равный уровень данного проАДМ у данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем данного проАДМ указывает на то, что данное неблагоприятное событие не происходит, предпочтительно в течение приблизительно 28 дней; или
где повышение уровня проАДМ или более высокий уровень проАДМ по сравнению с референсным уровнем проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта, где предпочтительно данное неблагоприятное событие наступает в течение приблизительно 28 дней.
4. Способ согласно любому из объектов 1-3, где референсный уровень проАДМ составляет от приблизительно 0,7 нмоль/л до приблизительно 2,0 нмоль/л, предпочтительно от приблизительно 0,8 нмоль/л до приблизительно 1,9 нмоль/л.
5. Способ согласно любому из объектов 1-4, где данное неблагоприятное событие представляет собой летальный исход.
6. Способ согласно п. 5, где уровень проАДМ, превышающий приблизительно 0,9 нмоль/л, предпочтительно превышающий приблизительно 1,9 нмоль/л, более предпочтительно превышающий приблизительно 2,0 нмоль/л, указывает на невыживание субъекта в течение приблизительно 28 дней.
7. Способ согласно п. 1 или 2, где уровень проАДМ ниже приблизительно 1,0 нмоль/л, предпочтительно ниже приблизительно 0,9 нмоль/л, наиболее предпочтительно ниже приблизительно 0,88 нмоль/л указывает на выживание субъекта в течение приблизительно 28 дней.
8. Способ согласно любому из объектов 1-7, где дополнительно определяют оценку по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA) данного субъекта.
9. Способ согласно любому из объектов 2-5, где
референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 1,8 нмоль/л для субъектов, имеющих симптомы, соответствующие оценке по шкале SOFA ≤ 6;
референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 3,2 нмоль/л для субъектов, имеющих симптомы, соответствующие оценке по шкале SOFA от 7 до 12; или
референсный уровень проАДМ составляет приблизительно 5,5 нмоль/л для субъектов, имеющих симптомы, соответствующие оценке по шкале SOFA ≥ 13.
10. Способ согласно любому из объектов 1-5 или 9, где
снижение уровня или равный уровень проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 1,8 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≤ 6 указывают на то, что данное неблагоприятное событие не происходит;
снижение уровня или равный уровень данного проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 3,2 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта от 7 до 12 указывают на то, что данное неблагоприятное событие не происходит; или
снижение уровня или равный уровень данного проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 5,6 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≥ 13 указывают на то, что данное неблагоприятное событие не происходит; и
где предпочтительно данное неблагоприятное событие не наступает в течение приблизительно 28 дней.
11. Способ согласно любому из объектов 1-5 или 9, где
повышение уровня проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющий приблизительно 1,8 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≤ 6 указывают на данное неблагоприятное событие у данного субъекта;
повышение уровня проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 3,2 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта от 7 до 12 указывают на данное неблагоприятное событие у данного субъекта; или
повышение уровня проАДМ у данного субъекта по сравнению с референсным уровнем проАДМ, составляющим приблизительно 5,6 нмоль/л, и оценка по шкале SOFA данного субъекта ≥ 13 указывают на данное неблагоприятное событие у данного субъекта,
где предпочтительно данное неблагоприятное событие наступает в течение приблизительно 28 дней.
12. Способ согласно любому из объектов 8-11, где оценку по шкале SOFA данного субъекта увеличивают на основании уровня проАДМ данного субъекта, и где данная модифицированная оценка по шкале SOFA указывает на данное неблагоприятное событие.
13. Способ согласно п. 12, где оценку по шкале SOFA субъекта увеличивают на единицу, если уровень проАДМ у субъекта превышает приблизительно 1,8 нмоль/л.
14. Способ согласно любому из объектов 3-5 и 9-13, где повышенный уровень данного проАДМ приблизительно в два раза превышает данный референсный уровень проАДМ.
15. Способ согласно любому из объектов 1-14, где данный проАДМ представляет собой среднерегиональный проадреномедуллин (СР-проАДМ) или зрелый АДМ.
16. Способ согласно любому из объектов 1-15, где данный уровень проАДМ у данного субъекта указывают на данное неблагоприятное событие, предпочтительно летальный исход,, у данного субъекта в течение 28 дней.
17. Способ согласно любому из объектов 1-16, дополнительно включающий определение по меньшей мере одного маркера и/или параметра данного субъекта, выбранного из группы, состоящей из уровня по меньшей мере одного гистона, уровня прокальцитонина (ПКТ) в данном образце, оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний (шкале SAPSII), оценки по шкале острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья II (APACHE II) данного субъекта, оценку индекса тяжести пневмонии (PSI) данного субъекта и оценку по шкале CURB-65 данного субъекта.
18. Способ согласно п. 17, где уровень маркера или параметра определяют в течение приблизительно 12 часов после поступления данного субъекта.
19. Способ согласно любому из объектов 1-18, где уровень проАДМ определяют в течение приблизительно 12 часов после поступления данного субъекта.
20. Способ согласно любому из объектов 1-19, включающий определение данного уровня проАДМ и оценки по шкале SOFA данного субъекта.
21. Способ согласно любому из объектов 1-20, где данный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния.
22. Способ согласно любому из объектов 1-21, где данный субъект представляет собой пациента в критическом состоянии, предпочтительно где данный субъект поступил в отделение интенсивной терапии или в отделение скорой помощи, предпочтительно где данный субъект поступил в отделение интенсивной терапии.
23. Способ согласно любому из объектов 1-22, где данный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния, выбранного из группы, состоящей из заболевания органов дыхания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной(ых) недостаточности(ей), сердечно-сосудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек, иммунодепрессии, вирусной инфекции, грибковой инфекции, бактериальной инфекции, грамотрицательной бактериальной инфекции, грамположительной бактериальной инфекции и угнетения иммунитета.
24. Способ согласно любому из объектов 1-23, где данный субъект страдает от сепсиса.
25. Способ согласно любому из объектов 1-24, где данный субъект представляет собой субъекта с угнетенным иммунитетом, такого как субъект, страдающий от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), субъект, проходящий радиационную терапию, и/или субъект, получающий иммуносупрессивные препараты.
26. Способ согласно любому из объектов 1-25, где данный образец представляет собой биологическую жидкость, кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу.
27. Способ согласно любому из объектов 1-26, где данный уровень проАДМ определяют с применением способа, выбранного из группы, состоящей из масс-спектрометрии (МС), люминесцентного иммуноанализа (LIA), радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентного и флуоресцентного иммуноанализов, иммуноферментного анализа (EIA), твердофазных методов иммуноферментного анализа (ELISA), матриц на основе гранул с люминесцентными метками, матриц на основе магнитных гранул, анализов на основе белковых микрочипов, ускоренных методов исследований и анализа с применением криптатов редкоземельных элементов.
28. Способ согласно п. 27, где способ представляет собой иммуноанализ и где анализ проводят в гомогенной фазе или в гетерогенной фазе.
29. Способ согласно п. 28, где способ представляет собой иммуноанализ, включающий следующие стадии:
а) приведение образца в контакт с
(i) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, специфичным к первому эпитопу проАДМ, и
(ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, специфичным ко второму эпитопу проАДМ; и
b) детектирование связывания первого и второго антител или их антигенсвязывающих фрагментов или производных с проАДМ.
30. Способ согласно п. 29, где одно из первого или второго антител мечено, а другое антитело связано или может быть селективно связано с твердой фазой.
31. Способ согласно п. 29 или 30, где первое антитело и второе антитело присутствуют в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, и где первый метящий компонент, который является частью системы мечения на основе гашения или усиления флуоресценции или хемилюминесценции, связан с первым антителом, и второй метящий компонент данной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с данным детектируемым проАДМ генерируется измеримый сигнал, позволяющий детектировать полученные в результате сэндвич-комплексы в растворе для измерения.
32. Способ согласно п. 31, где система мечения содержит криптат или хелат редкоземельного элемента в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности цианинового типа.
33. Набор для осуществления способа согласно любому из объектов 1-32, содержащий реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и где повышение уровня проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на неблагоприятное событие у данного субъекта.
34. Набор для осуществления способа согласно любому из объектов 1-32, содержащий реагенты для детектирования для определения данного уровня проАДМ в данном образце данного субъекта и референсные данные, включающие данный референсный уровень проАДМ, и где снижение уровня проАДМ или близкий уровень проАДМ в данном образце данного субъекта по сравнению с данным референсным уровнем проАДМ указывает на то, что неблагоприятное событие у данного субъекта не наступит в течение приблизительно 28 дней.
35. Применение набора согласно п. 33 или 34 в способе согласно любому из объектов 1-29.
36. Применение набора согласно п. 33 или 34 для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,
где определяют данный уровень проАДМ в данном образце данного субъекта,
где данный уровень проАДМ сравнивают с данным референсным уровнем проАДМ, и
где данное неблагоприятное событие у данного субъекта идентифицируют на основании сравнения данного уровня проАДМ, определенного в данном образце, и данного референсного уровня проАДМ.
37. Применение набора для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,
где данный набор содержит реагенты для детектирования для определения уровня проАДМ в образце субъекта, и
где данный уровень данного проАДМ указывает на данное неблагоприятное событие у данного субъекта.
38. Способ согласно любому из объектов 2-32, где данное сравнение проводят в компьютерной системе.
39. Способ согласно любому из объектов 1-32, где определенное значение проАДМ применяют при вычислении оценки, указывающей на данный диагноз, прогноз, оценку риска и/или стратификацию риска неблагоприятного события у субъекта.
40. Способ согласно п. 40, где дополнительно для вычисления данной оценки применяют по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр субъекта.
41. Способ согласно п. 40, где по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр данного субъекта выбран из группы, состоящей из уровня по меньшей мере одного гистона, уровня прокальцитонина (ПКТ) в данном образце, оценки по упрощенной шкале острых физиологических состояний (шкале SAPSII), оценки по шкале острых физиологических состояний и хронического состояния здоровья II (APACHE II) данного субъекта, оценки индекса тяжести пневмонии (PSI) данного субъекта и оценки по шкале CURB-65 данного субъекта.
В контексте настоящей заявки термины «содержащий» и «включающий» или их грамматические варианты следует понимать как обозначающие по меньшей мере данные признаки, целые числа, стадии или компоненты, но не исключающие добавления одного или более дополнительных признаков, целых чисел, стадий, компонентов или их групп. Этот термин включает в себя термины «состоящий из» и «состоящий по существу из», которые, как подразумевается, обозначают только упомянутые признаки, целые числа, стадии или компоненты, исключая любые дополнительные признаки.
Таким образом, термины «содержащий»/«включающий»/«имеющий» означают, что может присутствовать любой дополнительный компонент (или, аналогично, признаки, целые числа, стадии и тому подобное).
Термин «состоящий из» означает, что не присутствует никаких дополнительных компонентов (или, аналогично, признаков, целых чисел, стадий и тому подобного).
Термин «состоящий по существу из» или его грамматические варианты при использовании в настоящей заявке следует понимать как обозначающий упомянутые признаки, целые числа, стадии или компоненты, но не исключающий добавления одного или более дополнительных признаков, целых чисел, стадий, компонентов или их групп, но только в том случае, если дополнительные признаки, целые числа, стадии, компоненты или их группы существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленной композиции, устройства или способа.
Таким образом, термин «состоящий по существу из» означает, что могут присутствовать такие конкретные дополнительные компоненты (или, аналогично, признаки, целые числа, стадии и тому подобное), а именно, такие, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики композиции, устройства или способа. Другими словами, термин «состоящий по существу из» (который может использоваться в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином «содержащий по существу»), допускает присутствие других компонентов в композиции, устройстве или способе помимо обязательных компонентов (или, аналогично, признаков, целых чисел, стадий и тому подобного), при условии, что присутствие других компонентов не оказывает существенного влияния на существенные характеристики устройства или способа.
Термин «способ» относится к приемам, средствам, методикам и процедурам для выполнения данной задачи, включая, не ограничиваясь перечисленным, те приемы, средства, техники и методики, которые или являются известными, или легко могут быть получены из известных приемов, средств, техник и методик практикующими специалистами в области химии, биологии и биофизики.
Термин «приблизительно» предпочтительно относится к ±10% от данного числового значения, более предпочтительно к ±5% от данного числового значения и, в частности, к точному данному числовому значению.
В контексте настоящей заявки термин «приблизительно» относится к ±10% от данного числового значения и, в частности, к ±5% от данного числового значения. Каждый раз при использовании термина «приблизительно» также указывается конкретная ссылка на точное числовое значение. Если термин «приблизительно» используется применительно к параметру, который количественно определяется в целых числах, такому как количество нуклеотидов в данной нуклеиновой кислоте, числа, соответствующие ± 10% или ± 5% от данного числового значения, должны быть округлены до ближайшего целого числа. Например, выражение «приблизительно 25 аминокислот» относится к диапазону от 23 до 28 аминокислот, в частности к диапазону от 24 до 26 аминокислот, и предпочтительно относится к конкретному значению 25 аминокислот.
Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависит не только от аналитического «качества» теста, но и от определения того, что представляет собой отклоняющийся от нормы результат. На практике кривые операционных характеристик приемника (кривые ROC), как правило, рассчитывают путем построения графика зависимости значения переменной от ее относительной частоты в «нормальных» (то есть, по-видимому здоровых людях, не имеющих пренатальных расстройств или состояний) и "больных" популяциях, например, субъектах, испытывающих/имеющих/страдающих от неблагоприятного события, например, летального исхода. Для любого конкретного маркера (такого как СР-проАДМ) распределение уровней маркеров для субъектов с заболеванием/состоянием или без него, скорее всего, будет перекрываться. В таких условиях тест не всегда позволяет отличить нормальное состояние от заболевания со 100% точностью, и область перекрытия может показывать, где тест не позволяет отличить нормальное состояние от заболевания. Выбирается пороговое значение, ниже которого тест считается отклоняющимся от нормы и выше которого тест считается нормальным, или ниже или выше которого тест указывают на определенное состояние, например, отклоняющееся от нормы событие. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что наблюдаемое измерение позволит правильно идентифицировать состояние. Кривые ROC могут использоваться, даже если результаты теста не обязательно дают точное число. Пока можно ранжировать результаты, кривая ROC может быть создана. Например, результаты теста образцов «с заболеванием» (или неблагоприятное событие) могут быть ранжированы в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Это ранжирование может быть связано с результатами в «нормальной» популяции и может быть создана кривая ROC. Эти способы хорошо известны в данной области техники; см., например, Hanley et al. 1982. Radiology 143: 29-36. Предпочтительно пороговое значение выбирают так, чтобы обеспечить площадь под кривой ROC более приблизительно 0,5, более предпочтительно более приблизительно 0,7, еще более предпочтительно более приблизительно 0,8, еще более предпочтительно более приблизительно 0,85 и наиболее предпочтительно более приблизительно 0,9. Термин «приблизительно» в данном контексте относится к +/- 5% от данного измерения.
Горизонтальная ось кривой ROC представляет собой (1-специфичность), которая возрастает со степенью ложноположительных результатов. Вертикальная ось кривой представляет собой чувствительность, которая возрастает со степенью истинных положительных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного порога отсечения может быть определено значение (1-специфичность) и может быть получена соответствующая чувствительность. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что измеренный уровень маркера позволит правильно идентифицировать неблагоприятное событие, в частности, летальный исход. Таким образом, площадь под кривой ROC может быть использована для определения эффективности теста.
В других вариантах осуществления в качестве меры способности теста прогнозировать риск или диагностировать расстройство или состояние (неблагоприятный исход), то есть «больную группу», применяют отношение правдоподобия положительного результата, отношение правдоподобия отрицательного результата, отношение шансов или отношение рисков. В случае отношения правдоподобия положительного результата значение, равное 1, указывает на то, что положительный результат одинаково вероятен среди субъектов как в «больной», так и в «контрольной» группах; значение больше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в больной группе; и значение меньше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в контрольной группе. В случае отношения правдоподобия отрицательного результата значение, равное 1, указывает на то, что отрицательный результат одинаково вероятен среди субъектов как в «больной», так и в «контрольной» группах; значение больше 1 указывает на то, что отрицательный результат более вероятен в исследуемой группе; и значение меньше 1 указывает на то, что отрицательный результат более вероятен в контрольной группе.
В случае отношения шансов значение, равное 1, указывает на то, что положительный результат одинаково вероятен среди субъектов как в «больной», так и в «контрольной» группах; значение больше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в больной группе; и значение меньше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в контрольной группе.
В случае отношения рисков значение, равное 1, указывает на то, что относительный риск конечного состояния (например, смерти) в "больной" и в «контрольной» группах равен; значение больше 1 указывает на то, что риск выше в больной группе; и значение меньше 1 указывает на то, что риск выше в контрольной группе.
Специалисту в данной области техники будет ясно, что соотнесение диагностического или прогностического показателя с диагнозом или с прогнозиуемым риском будущего клинического исхода является статистическим анализом. Например, уровень маркера, меньший X, может сигнализировать о том, что пациент с большей вероятностью будет страдать от неблагоприятного события/исхода, чем пациенты с уровнем, превышающим или равным X, что определяется уровнем статистической значимости. Кроме того, изменение концентрации маркера по сравнению с исходными уровнями может отражать прогноз пациента, а степень изменения уровня маркера может быть связана с тяжестью неблагоприятных событий. Статистическую значимость часто определяют путем сравнения двух или более популяций и определения доверительного интервала и/или p-значения; см., например, Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Предпочтительные доверительные интервалы согласно изобретению составляют 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% и 99,99%, а предпочтительные p-значения составляют 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 и 0,0001.
Если не указано иное, признанные методы генной инженерии использовали, как описано, например, в источнике Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), полностью включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
Настоящее изобретение далее описано со ссылкой на следующие неограничивающие фигуры.
Фиг. 1
: Анализ Каплана-Мейера для прогнозирования летального исхода через 28 дней
Фиг. 2
: Анализ AUROC для выявления невыживших через 28 дней (вся когорта)
Фиг. 3
: Анализ AUROC для выявления невыживших через 28 дней, в зависимости от уровней биомаркеров в трех группах тяжести.
Фиг. 4
: Анализ AUROC для выявления невыживших через 28 дней на основании оценки по шкале SOFA.
Настоящее изобретение далее описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Пример 1
МЕТОДЫ:
Исследуемая популяция
С 1 июня 2013 г. по 14 июня 2014 г. в клиническое исследование были последовательно включены двести тридцать семь пациентов в критическом состоянии, поступивших в отделение интенсивной терапии Университетской клиники г. Дижон региона Бургундии («Centre hospitalier universitaire (CHU) de Dijon Bourgogne»). Пациенты моложе 18 лет были исключены из исследования. Исследование было одобрено местным институтским наблюдательным советом. До включения в исследование у пациентов или их ближайших родственников получали письменное информированное согласие. Все пациенты имели широкий спектр заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, злокачественные новообразования, заболевания органов дыхания, заболевания печени, заболевания почек и иммунодепрессию, и находились под наблюдением до выписки или смерти в больнице. На основании ретроспективного анализа медицинских карт, результатов диагностических исследований с визуализацией и результатов микробиологических исследований два независимых врача классифицировали пациентов в день поступления как не имеющих сепсиса (с синдромом системного воспалительного ответа (ССВО) или без ССВО), имеющих тяжелый сепсис или имеющих септический шок в соответствии с международными стандартными критериями (Bone, Balk et al. 1992). Образец крови брали в день поступления, то есть в течение первых 24 часов. Регистрировали исходные анкетные и клинические данные, включая медицинский анамнез, результаты физического осмотра, рутинные анализы крови (например, посев крови), нелабораторные диагностические исследования (например, критерии ССВО, критерии недостаточности органов), терапевтические вмешательства (например, искусственную вентиляцию легких (ИВЛ), вазопрессорные агенты и заместительную почечную терапию (ЗПТ)), а также показатели исхода (например, длительность пребывания, общую смертность). При поступлении рассчитывали оценку по шкале динамической оценки органной недостаточности (SOFA), основанной на шести параметрах органов, и оценку по упрощенное шкале острых физиологических состояний (SAPS II), основанной на 17 преимущественно физиологических параметрах (Le Gall, Lemeshow et al. 1993; Vincent, Moreno et al. 1996).
Биомаркеры
Уровни лактата в сыворотке измеряли с помощью колориметрического анализа с использованием модульного анализатора e501 от Roche Diagnostics, Мейлан, Франция. Референсное предельное значение для лактата составляло 0,5-2,2 ммоль/л.
Уровни СР-проАДМ (среднерегионального проадреномедуллина), копептина и ПКТ (прокальцитонина) определяли в образцах плазмы с использованием сверхчувствительных анализов, таких как анализатор произвольного доступа KRYPTOR (Thermo Scientific B⋅R⋅A⋅H⋅M⋅S). Уровни гистона H2A, H2B, H3 и H4, а также уровень альдолазы B определяли в образцах плазмы, например, с помощью анализов методом мониторинга выбранных реакций или мониторинга множественных реакций (SRM/MRM), как описано ниже. Специфические пептиды, полученные из маркеров, измеряли с помощью технологии ЖХ-МС/МС (масс-спектрометр (МС) TSQ Quantiva; ThermoFisher Scientific). Было обнаружено, что выявленные пептидные последовательности и их фрагментированные ионы, так называемые переходы, для каждого пептида являются подходящими стандартами-имитаторами для мониторинга уровней маркерных белков в образце крови. Оптимизацию проводили на синтетических пептидах, которые могут быть в высокой степени мечены изотопами. Были выбраны лучшие пептиды в части соотношения сигнал-шум. Для каждого пептида были установлены оптимальное время удерживания и по меньшей мере 4 лучших перехода.
Пример МС количественной оценки и выбор пептидов и переходов
5 мкл каждого клинического препарата плазмы добавляли к 20 мкл 8 М мочевины/2,5% н-пропанола/300 мМ Трис/10 мМ DTT, рН 8,5, и инкубировали при 37°С в течение одного часа. В каждую лунку с образцом добавляли 500 мМ иодоуксусной кислоты, приготовленной в 1 М бикарбонате аммония, и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. В каждую лунку добавляли 113 мкл 50 мМ Трис/5 мМ CaCl2, pH 8,0. Трипсин (Thermo Fisher Scientific) регидратировали с помощью 150 мкл 25 мМ уксусной кислоты и добавляли в соотношении 1:10 (общее содержание белка:протеаза), и инкубировали при 37°С в течение 20 часов. Наконец, расщепление останавливали добавлением еще 2 мкл муравьиной кислоты. Затем перед введением добавляли глюкагон (1 нг/мкл) и стандартные тяжелые пептиды.
Анализы SRM были разработаны на тройном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Quantiva в сочетании с ВЭЖХ Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Разделение с помощью обращенно-фазовой хроматографии проводили в 20-минутном линейном градиенте концентрации от 5 до 40% В, с общим временем анализа 40 мин (растворитель А: водная 0,2% FA (муравьиная кислота), растворитель В: ACN 0,2% FA). Скорость потока во время линейного градиента концентрации была установлена равной 240 мкл/мин.Общий объем вводимой пробы составлял 160 мкл для всех образцов и точек на кривой.Колонку Accucore aQ размером 150 мм × 2,1 мм (ThermoFisher Scientific) эксплуатировали при температуре 50°С.
Оптимизацию проводили на тяжелых меченых синтетических пептидах, содержащих меченые 13C и 15N аргинин или лизин (ThermoFisher Scientific или New England Peptide). Отдельные параметры прибора, такие как энергия столкновения, линза трубки и время измерения, автоматически проверялись для каждого перехода. После нескольких прогонов был получен оптимизированный список пептидов и переходов (т. е. сигнал с наивысшей интенсивностью и наименьшим перекрытием с другими переходами) и соответствующие времена удерживания с выбором по меньшей мере четырех переходов фрагмента на выбранный пептид.
Пептиды идентифицировали путем совместного элюирования легких и тяжелых меченых переходов при хроматографическом разделении. Программное обеспечение Pinpoint (Thermo Fisher Scientific) и Skyline (MacCoss Lab) использовали для выравнивания времени, относительного количественного определения переходов и количественного определения целевого белка.
Относительные и абсолютные количественные определения маркеров были выполнены с использованием иллюстративных способов, как описано ниже.
Определение относительного количества:
1. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади характеристического пика SRM данного пептида, детектированного в биологическом образце, с площадью этого же характеристического пика SRM этого же фрагментированного пептида по меньшей мере во втором, третьем, четвертом или более биологических образцах.
2. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади характеристического пика SRM данного пептида, детектированнного в биологическом образце, с площадями характеристического пика SRM, полученных от фрагментированных пептидов других белков, в других образцах, полученных из других и отдельных биологических источников, где сравнение площади характеристического пика SRM двух образцов в отношении фрагментированного пептида нормировано к количеству белка, анализируемого в каждом образце.
3. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади характеристического пика SRM для данного пептида с площадями характеристических пиков SRM других фрагментированных пептидов, полученных из разных белков в одном и том же биологическом образце, чтобы нормировать изменяющиеся уровни маркера к уровням других белков, которые не меняют свои уровни экспрессии в различных клеточных условиях.
4. Эти анализы применяли как к фрагментированным пептидам, так и к модифицированным фрагментированным пептидам, например, гистоновым белкам, где модификации включали, не ограничиваясь перечисленным, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и где относительные уровни модифицированных пептидов определяли таким же образом, как и определение относительных количеств немодифицированных пептидов.
Определение абсолютного количества данного пептида:
Сравнение площади характеристического пика SRM/MRM для данного фрагментированного пептида из маркера в отдельном биологическом образце с площадью характеристического пика SRM/MRM внутреннего стандарта фрагментированного пептида, добавленного в лизат белка из биологического образца.
Внутренним стандартом была меченая синтетическая версия фрагментированного пептида из исследуемого маркерного белка, или меченый рекомбинантный белок. Этот стандарт добавляли в образец в известных количествах до или после расщепления, и площадь характеристического пика SRM/MRM определяли как для внутреннего стандарта фрагментированного пептида, так и для нативного фрагментированного пептида в биологическом образце по отдельности с последующим сравнением площадей обоих пиков.
Такой анализ проводили с немодифицированными фрагментированными пептидами и модифицированными фрагментированными пептидами, где модификации включали, не ограничиваясь перечисленным, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и где абсолютные уровни модифицированных пептидов определяли таким же образом, как и абсолютные уровни немодифицированных пептидов.
Гистон H4 также измеряли с помощью иммуноанализа. Иммуноанализ на гистон H4 (ИА H4) состоит из мышиного моноклонального антитела (mAb), сконструированного против синтетического пептида (аминокислоты 46-56 SEQ ID NO: 1), связанного с микросферами MagPlex-C (Luminex, Austin Texas), и биотинилированного поликлонального овечьего антитела (pAb), сконструированного против синтетического пептида (аминокислоты 67-78 SEQ ID NO 1). В качестве стандартного образца использовали синтетический пептид (аминокислоты 46-102 SEQ ID NO: 1). Образцы измеряли на MAgPix с помощью системы xPonent 4.2 (Luminex, Остин, Техас). Данные анализировали с использованием 5-параметрической логистической регрессии из JMP-12 (статистическое программное обеспечение SAS, Великобритания).
Статистический анализ
Все анализы проводили с использованием программного обеспечения R 3.0.2.
Данные выражены в виде медианы и межквартильного размаха [МКР] в скобках.
Поскольку все анализируемые биомаркеры демонстрируют значительно скошенные вправо распределения, значения были преобразованы путем взятия десятичного логарифма до включения в регрессионные модели, чтобы уменьшить влияние экстремальных значений на подбор модели.
Значения ниже предела количественного определения (LoQ) были заменены небольшим значением ниже LoQ. Недостающие значения не были заменены. Каждая модель включает всех пациентов с полными данными по всем переменным в модели.
P-значения <0,05 считались статистически значимыми.
Для анализа выживаемости последующее наблюдение было цензурировано через 3, 7 или 28 дней после поступления в ОИТ (максимальный период последующего наблюдения (FUP)), в зависимости от ситуации. Пациентов, недоступных для последующего наблюдения до оцениваемого FUP (то есть из-за ранней выписки или перемещения в другое отделение), цензурировали в день последнего посещения ими ОИТ. Пациентов, живых при максимальном FUP, цензурировали в этот день. Для переменных исхода, зависящих от времени, использовали модели регрессии Кокса. Показанные результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел (Harrel)) и стандартизированные отношения рисков (HR). Отношения рисков в настоящей заявке относятся к двукратному изменению уровня биомаркеров (верхний квартиль биомаркеров по сравнению с нижним). В скорректированных моделях в модель были включены корректирующие переменные для определения дополнительного влияния биомаркеров на работу модели.
Результаты:
Исследованная популяция составила 237 пациентов. Двух пациентов (один пациент без ССВО, один пациент с сепсисом) потребовалось исключить из анализа из-за противоречивых данных о летальном исходе. Сто семьдесят два пациента (73%) имели тяжелый сепсис или септический шок, 15 пациентов (6%) с ССВО и 49 пациентов (21%) без ССВО. Медианный возраст составил 67 [59-77 лет] лет. Большинство пациентов были мужчинами (60%). Наиболее частыми сопутствующими заболеваниями были сердечно-сосудистые заболевания (35%), сахарный диабет (31%) и злокачественные новообразования (27%), за которыми следовали заболевания органов дыхания (16%), заболевания печени (12%), заболевания почек (12%) и иммунодепрессия (7%). Наиболее частым очагом заражения были нижние дыхательные пути (46%) и мочевыводящие пути (45%). Оценка по шкале SAPS II (56 [40-69 баллов] баллов) и оценка по шкале SOFA (9 [6-12 баллов] баллов) были увеличены при поступлении. Наиболее часто наблюдаемыми органными недостаточностями были дыхательная недостаточность (61%), циркуляторный шок (56%) и почечная недостаточность (41%). Соответственно, многие пациенты нуждались в ИВЛ (78%), вазопрессорных агентах (68%) и ЗПТ (37%) во время пребывания в ОИТ. Общая смертность в ОИТ составила 32%, средняя продолжительность пребывания в ОИТ составила 5,4 [2,5-10,6] дней.
Авторы проанализировали краткосрочный (например, на 3-й и 7-й день, т. е. 3-дневный и 7-дневный) и долгосрочный (на 28-й день, т. е. 28-дневный) летальный исход у всех 235 пациентов в критическом состоянии с использованием одно- и двумерных моделей регрессии Кокса, скорректированных с учетом возраста и пола. Двадцать три пациента (10%) умерли к 3 дню, 49 пациентов (21%) умерли к 7 дню, и 74 пациента (32%) умерли к 28 дню после поступления в ОИТ. Кроме того, летальный исход анализировали в подгруппах пациентов с инфекцией нижних дыхательных путей, инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) и злокачественными новообразованиями с использованием одномерных регрессионных моделей Кокса, скорректированных с учетом возраста и пола. Двадцать семь пациентов (25%) из 109 пациентов с инфекцией нижних дыхательных путей умерли к 7 дню, 34 пациента (36%) из 94 пациентов с ИМП умерли к 28 дню и 16 пациентов (25%) из 64 пациентов со злокачественными новообразованиями умерли к 7 дню после поступления в ОИТ. Способность каждой модели регрессии Кокса дискриминировать выживших от невыживших отражена индексом C в диапазоне от 0 до 1, где наилучшие прогностические модели регрессии Кокса дают индекс C, близкий к 1. Кроме того, рассчитывают HR, где HR>0 указывает на худший прогноз, а HR<0 указывают на защитный эффект переменной.
Среди всех проанализированных переменных оценка по шкале SAPS II при поступлении в ОИТ показывает лучший прогноз 3-дневного (индекс C 0,876, HR на МКР 8,42), 7-дневного (индекс C 0,809, HR на МКР 5,15) и 28-дневного (индекс C 0,776, HR на МКР 4,19) летального исхода, за ней следует оценка по шкале SOFA при поступлении в ОИТ с прогнозом 3-дневного (индекс C 0,866, HR на МКР 6,68) и 7-дневного летального исхода (индекс C 0,778, HR на МКР 3,82) у всех 235 пациентов в критическом состоянии (таблица 1 - таблица 3). Аналогичные результаты получены в подгруппе пациентов с сепсисом и для прогнозирования 7-дневного летального исхода у пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей при оценке по шкале SAPS II (индекс C 0,773, HR на МКР 3,47) (таблица 4).
Для сравнения, СР-проАДМ лучше всего из биомаркеров дискриминирует выживших и не выживших на 7 день (индекс C 0,769, HR на МКР 4,53) и на 28 день (индекс C 0,765, HR на МКР 4,86) после поступления в ОИТ у всех пациентов в критическом состоянии. (таблица 2, таблица 3). Он превосходит оценку по шкале SOFA при прогнозировании 28-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии (таблица 3). Аналогичные результаты получены в подгруппе пациентов с сепсисом. В двумерном анализе СР-проАДМ улучшает эффективность SAPS II или SOFA при прогнозировании 7-дневного летального исхода (индекс C 0,832 для комбинированной модели SAPS II и СР-проАДМ по сравнению с индексом C 0,809 только для SAPS II) и эффективность SAPS II при прогнозировании 28-дневного летального исхода (индекс C 0,810 для комбинированной модели SAPS II и СР-проАДМ по сравнению с индексом C 0,776 только для SAPS II) у всех пациентов в критическом состоянии (таблица 2, таблица 3). В комбинированной модели SAPS II или SOFA и СР-проАДМ отсутствует улучшение прогностической ценности при прогнозировании 3-дневного летального исхода у этих пациентов (таблица 1).
По сравнению с другими биомаркерами и шкалами оценки, ПКТ (например, индекс C 0,689, HR на МКР 1,90 при прогнозировании 28-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии) и альдолаза B (например, индекс C 0,667, HR на МКР 1,47 при прогнозировании 28-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии) при поступлении в ОИТ демонстрируют умеренную связь с летальным исходом у всех пациентов в критическом состоянии или их подгрупп (например, таблица 1). Однако в двумерной модели регрессии Кокса ПКТ улучшает прогностическую ценность SAPS II или SOFA при прогнозировании 28-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии (например, комбинированная модель SAPS II и ПКТ дает индекс C 0,786 по сравнению с 0,776 для SAPS II в одномерном анализе) (например, таблица 3). Кроме того, двумерная модель регрессии Кокса, включающая альдолазу B, улучшает связь СР-проАДМ с 7-дневным летальным исходом у всех пациентов в критическом состоянии (комбинированная модель СР-проАДМ и альдолазы B с индексом C 0,780 по сравнению с одномерной моделью СР-проАДМ с индексом C 0,769) (таблица 2). Прогноз не был дополнительно улучшен с помощью ПКТ или альдолазы B в дополнение к SAPS II, СР-проАДМ или гистонам в других анализах летального исхода (таблица 1 - таблица 3).
Уровни гистонов H2A, H2B, H3 и H4 при поступлении в ОИТ были тесно связаны с 3-дневным (например, индекс C H2B 0,793, HR на МКР 2,76), 7-дневным (например, индекс C H2B 0,768, HR на МКР 2,40) и 28-дневным (например, индекс C H2B 0,752, HR на МКР 2,40) летальным исходом у всех пациентов в критическом состоянии (таблица 1 - таблица 3). Аналогичные результаты получены в подгруппе пациентов с сепсисом. Среди всех гистонов H2B является наиболее эффективным, затем следуют H4, H2A и H3 (таблица 1 - таблица 6). При сравнении эффективности гистонов H2A, H2B, H3 и H4 с другими биомаркерами видна поразительная прогностическая ценность гистонов при оценке краткосрочного (3- и 7-дневного) летального исхода, хотя H2B может уступать СР-проАДМ в прогнозировании 28-дневного летального исхода (индекс C СР-проАДМ 0,765 по сравнению с индексом C H2B 0,752). H2B и СР-проАДМ сопоставимо связаны с 7-дневным летальным исходом (индекс C H2B 0,793 по сравнению с индексом C СР-проАДМ 0,786), и H2B превосходит СР-проАДМ при прогнозировании 3-дневного летального исхода (индекс C H2B 0,768 по сравнению с индексом C СР-проАДМ 0,769) у всех пациентов в критическом состоянии (таблица 1 - таблица 3).
В двумерных регрессионных моделях Кокса гистоны H2A, H2B, H3 и H4 улучшают эффективность SAPS II или SOFA (например, комбинированная модель H2B и SAPS II с индексом C 0,811 по сравнению с одномерной моделью SAPS II с индексом C 0,776 при прогнозировании 28-дневной летального исхода) и СР-проАДМ (комбинированная модель H2B и СР-проАДМ с индексом C 0,795 по сравнению с одномерной моделью СР-проАДМ с индексом C 0,765 при прогнозировании 28-дневного летального исхода) (таблица 1 - таблица 3). У пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей гистоны H2A, H2B, H3 и H4 при поступлении в ОИТ являются лучшим среди биомаркеров прогностическим фактором 7-дневного летального исхода (например, индекс C H2B 0,785, HR на МКР 2,56) (таблица 4). У пациентов в критическом состоянии с ИМП гистоны H2A, H2B, H3 и H4 наиболее тесно связаны с 28-дневным летальным исходом среди всех переменных при поступлении в ОИТ (например, индекс C H2B 0,764, HR на МКР 2,52) (таблица 5). Гистоны H2A, H2B, H3 и H4 при поступлении в ОИТ демонстрируют наиболее тесную связь с 7-дневным летальным исходом (например, индекс С H2B 0,815, HR на МКР 4,79) среди всех переменных у пациентов в критическом состоянии, поступивших в ОИТ со злокачественными новообразованиями (таблица 6).
Таблица 1: одно- и двумерный регрессионный анализ Кокса для 3-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии
Двадцать четыре пациента из общего числа (n) 235 пациентов в критическом состоянии умерли на 3-й день после поступления в ОИТ (события). Оценки по шкалам или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ, включены в модели. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и корректировок. Отображаемые результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел) и стандартизированные отношения рисков (HR) плюс 95% доверительный интервал (CI), либо на межквартильный размах (МКР), либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II; SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности; СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин; ПКТ: прокальцитонин; гистоны представлены гистоном H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (ИА)).
Таблица 1
HR [95% CI] на…
Модель
N
События
L.R.χ²
df
p-значение
индексC
… МКР
… 2-кратноеизменение
SAPS II
235
24
55,11
3
<0,001
0,876
8,42 [4,38-16,19]
SOFA
235
24
41,78
3
<0,001
0,866
6,68 [3,33-13,39]
Н2В
235
24
29,31
3
<0,001
0,793
2,76 [1,77-4,29]
1,47 [1,24-1,73]
H4
235
24
28,24
3
<0,001
0,786
2,70 [1,72-4,25]
1,45 [1,23-1,72]
H2A
235
24
28,14
3
<0,001
0,787
2,45 [1,63-3,66]
1,45 [1,23-1,72]
ИА H4
228
23
26,61
3
<0,001
0,779
14,35 [3,26-63,19]
1,39 [1,16-1,66]
СР-проАДМ
235
24
24,99
3
<0,001
0,786
4,82 [2,08-11,18]
2,05 [1,40-3,01]
H3
235
24
19,68
3
<0,001
0,740
3,45 [1,54-7,70]
1,23 1,08-1,41]
Альдолаза B
235
24
14,65
3
0,002
0,721
1,65 [1,05-2,59]
1,16 [1,02-1,32]
ПКТ
235
24
12,08
3
0,007
0,705
1,49 [0,85-2,62]
1,09 [0,97-1,23]
H2B+SAPS II
235
24
61,95
4
<0,001
0,885
H4+SAPS II
235
24
61,83
4
<0,001
0,884
H2A+SAPS II
235
24
61,70
4
<0,001
0,884
ИА H4+SAPS II
228
23
61,51
4
<0,001
0,898
H3+SAPS II
235
24
57,02
4
<0,001
0,878
СР-проАДМ+SAPS II
235
24
56,79
4
<0,001
0,884
ПКТ+SAPS II
234
24
55,10
4
<0,001
0,875
Альдолаза В+SAPS II
234
24
54,97
4
<0,001
0,876
СР-проАДМ+Н2В
235
24
36,15
4
<0,001
0,828
ИА H4+SOFA
228
23
50,05
4
<0,001
0,887
H2B+SOFA
235
24
47,98
4
<0,001
0,876
H4+SOFA
235
24
47,56
4
<0,001
0,876
H2A+SOFA
235
24
47,30
4
<0,001
0,874
H3+SOFA
235
24
43,63
4
<0,001
0,863
СР-проАДМ+SOFA
235
24
42,27
4
<0,001
0,872
ПКТ+SOFA
234
24
42,04
4
<0,001
0,866
Альдолаза В+SOFA
234
24
41,60
4
<0,001
0,865
СР-проАДМ+H4
235
24
35,29
4
<0,001
0,826
СР-проАДМ+H2A
235
24
35,16
4
<0,001
0,825
СР-проАДМ+ИА H4
228
23
32,60
4
<0,001
0,809
СР-проАДМ+H3
235
24
29,15
4
<0,001
0,806
H2B+Альдолаза B
234
24
31,35
4
<0,001
0,799
ПКТ+H2B
234
24
29,29
4
<0,001
0,791
Таблица 2: одно- и двумерный регрессионный анализ Кокса для 7-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии
Сорок девять пациентов из общего числа (n) 235 пациентов в критическом состоянии умерли на 7-й день после поступления в ОИТ (события). Оценки по шкалам или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ, включены в модели. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и корректировок. Отображаемые результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел) и стандартизированные отношения рисков (HR) плюс 95% доверительный интервал (CI), либо на межквартильный размах (МКР), либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II; SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности; СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин; ПКТ: прокальцитонин; гистоны представлены гистоном H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (ИА)).
Таблица 2
HR [95% CI] на …
Модель
N
События
L.R.χ²
df
p-значение
индексC
… МКР
… 2-кратноеизменение
SAPS II
235
49
68,07
3
<0,001
0,809
5,15 [3,26-8,13]
SOFA
235
49
50,64
3
<0,001
0,778
3,82 [2,39-6,09]
СР-проАДМ
235
49
45,88
3
<0,001
0,769
4,53 [2,55-8,04]
1,99 [1,53-2,59]
Н2В
235
49
45,33
3
<0,001
0,768
2,40 [1,76-3,28]
1,39 [1,24-1,57]
H4
235
49
42,81
3
<0,001
0,761
2,32 [1,68-3,18]
1,37 [1,22-1,55]
H2A
235
49
40,91
3
<0,001
0,755
2,09 [1,57-2,78]
1,36 [1,21-1,54]
H3
235
49
38,22
3
<0,001
0,742
3,62 [2,07-6,34]
1,24 [1,13-1,37]
ИА H4
228
48
35,98
3
<0,001
0,741
5,57 [2,40-12,96]
1,23 [1,11-1,37]
Альдолаза B
235
49
26,66
3
<0,001
0,697
1,69 [1,22-2,33]
1,17 [1,06-1,28]
ПКТ
235
49
23,57
3
<0,001
0,698
1,66 [1,12-2,46]
1,12 [1,02-1,22]
H2B+SAPS II
235
49
83,39
4
<0,001
0,839
H4+SAPS II
235
49
82,29
4
<0,001
0,834
H2A+SAPS II
235
49
80,74
4
<0,001
0,830
H3+SAPS II
235
49
79,27
4
<0,001
0,835
СР-проАДМ+SAPS II
235
49
76,75
4
<0,001
0,832
ИА H4+SAPS II
228
48
75,64
4
<0,001
0,834
Альдолаза В+SAPS II
234
49
70,32
4
<0,001
0,809
ПКТ+SAPS II
234
49
68,47
4
<0,001
0,811
H2B+SOFA
235
49
61,45
4
<0,001
0,810
H4+SOFA
235
49
60,08
4
<0,001
0,804
ИА H4+SOFA
228
48
59,58
4
<0,001
0,803
СР-проАДМ+H2B
235
49
59,50
4
<0,001
0,804
H2A+SOFA
235
49
58,66
4
<0,001
0,800
H3+SOFA
235
49
58,44
4
<0,001
0,800
СР-проАДМ+H4
235
49
57,83
4
<0,001
0,801
СР-проАДМ+SOFA
235
49
57,26
4
<0,001
0,800
СР-проАДМ+H2A
235
49
56,25
4
<0,001
0,796
СР-проАДМ+H3
235
49
55,10
4
<0,001
0,795
СР-проАДМ+ИА H4
228
48
52,66
4
<0,001
0,780
Альдолаза В+SOFA
234
49
51,39
4
<0,001
0,781
ПКТ+SOFA
234
49
50,77
4
<0,001
0,778
СР-проАДМ+альдолаза B
234
49
49,84
4
<0,001
0,780
ПКТ+H2B
234
49
46,55
4
<0,001
0,769
СР-проАДМ+ПКТ
234
49
46,37
4
<0,001
0,768
H2B+альдолаза В
234
49
46,13
4
<0,001
0,765
Таблица 3: одно- и двумерный регрессионный анализ Кокса для 28-дневного летального исхода у всех пациентов в критическом состоянии
Семьдесят четыре пациента из общего числа (n) 235 пациентов в критическом состоянии умерли на 3-й день после поступления в ОИТ (события). Оценки по шкалам или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ, включены в модели. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и корректировок. Отображаемые результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел) и стандартизированные отношения рисков (HR) плюс 95% доверительный интервал (CI), либо на межквартильный размах (МКР), либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II; SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности; СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин; ПКТ: прокальцитонин; гистоны представлены гистоном H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (ИА)).
Таблица 3
HR [95% CI] на …
Модель
N
События
L.R.χ²
df
p-значение
индексC
… МКР
… 2-кратноеизменение
SAPS II
235
74
76,19
3
<0,001
0,776
4,19 [2,89-6,07]
СР-проАДМ
235
74
66,81
3
<0,001
0,765
4,86 [3,05-7,73]
2,06 [1,66-2,54]
SOFA
235
74
59,04
3
<0,001
0,753
3,33 [2,27-4,88]
Н2В
235
74
58,04
3
<0,001
0,752
2,40 [1,84-3,11]
1,39 [1,26-1,54]
H4
235
74
53,89
3
<0,001
0,742
2,28 [1,75-2,99]
1,37 [1,23-1,51]
H2A
235
74
53,09
3
<0,001
0,742
2,11 [1,66-2,70]
1,37 [1,24-1,52]
ИА H4
228
70
48,71
3
<0,001
0,734
6,04 [2,97-12,27]
1,25 [1,14-1,36]
H3
235
74
45,95
3
<0,001
0,720
3,33 [2,10-5,29]
1,22 [1,13-1,32]
ПКТ
235
74
33,87
3
<0,001
0,689
1,90 [1,37-2,64]
1,15 [1,07-1,24]
Альдолаза B
235
74
25,91
3
<0,001
0,667
1,47 [1,11-1,95]
1,12 [1,03-1,22]
H2B+SAPS II
235
74
100,75
4
<0,001
0,811
H4+SAPS II
235
74
98,37
4
<0,001
0,806
H2A+SAPS II
235
74
97,64
4
<0,001
0,805
СР-проАДМ+SAPS II
235
74
97,47
4
<0,001
0,810
H3+SAPS II
235
74
93,05
4
<0,001
0,801
ИА H4+SAPS II
228
70
90,73
4
<0,001
0,804
СР-проАДМ+H2B
235
74
83,70
4
<0,001
0,795
ПКТ+SAPS II
234
74
81,63
4
<0,001
0,786
СР-проАДМ+H4
235
74
81,25
4
<0,001
0,792
СРпроАДМ+H2A
235
74
80,39
4
<0,001
0,789
H2B+SOFA
235
74
77,41
4
<0,001
0,785
СР-проАДМ+SOFA
235
74
77,32
4
<0,001
0,783
Альдолаза B+SAPS II
234
74
77,24
4
<0,001
0,774
СР-проАДМ+H3
235
74
76,68
4
<0,001
0,786
СР-проАДМ+ИА H4
228
70
76,13
4
<0,001
0,784
H4+SOFA
235
74
74,89
4
<0,001
0,778
H2A+SOFA
235
74
74,08
4
<0,001
0,776
ИА H4+SOFA
228
70
72,78
4
<0,001
0,778
H3+SOFA
235
74
71,09
4
<0,001
0,770
СР-проАДМ+альдолаза B
234
74
68,19
4
<0,001
0,771
СР-проАДМ+ПКТ
234
74
66,57
4
<0,001
0,766
ПКТ+SOFA
234
74
62,80
4
<0,001
0,756
ПКТ+H2B
234
74
62,73
4
<0,001
0,757
H2B+альдолаза В
234
74
62,54
4
<0,001
0,753
Альдолаза В+SOFA
234
74
59,13
4
<0,001
0,753
Таблица 4: одномерный регрессионный анализ Кокса для 7-дневного летального исхода у пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей
Двадцать семь пациентов из общего числа (n) 109 пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей умерли на 7-й день после поступления в ОИТ (события). Оценки по шкалам или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ, включены в модели. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и корректировок. Отображаемые результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел) и стандартизированные отношения рисков (HR) плюс 95% доверительный интервал (CI), либо на межквартильный размах (МКР), либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II; SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности; СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин; ПКТ: прокальцитонин; гистоны представлены гистоном H2A, H2B, H3, и H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (ИА)).
Таблица 4
HR [95% CI] на …
Модель
N
События
L.R.χ²
df
p-значение
индексC
… МКР
… 2-кратноеизменение
SAPS II
109
27
29,14
3
<0,001
0,773
3,47[1,86-6,49]
Н2В
109
27
27,70
3
<0,001
0,785
2,56[1,59-4,12]
1,39[1,18-1,64]
H4
109
27
26,36
3
<0,001
0,778
2,39[1,49-3,84]
1,36[1,15-1,61]
H2A
109
27
25,40
3
<0,001
0,774
2,16[1,40-3,33]
1,35[1,14-1,60]
ИА H4
105
26
22,06
3
<0,001
0,752
5,64 [1,66-19,13]
1,23 [1,06-1,41]
SOFA
109
27
21,84
3
<0,001
0,742
2,72 [1,38-5,36]
1,05 [1,02-1,09]
СР-проАДМ
109
27
21,54
3
<0,001
0,752
2,86[1,37-5,94]
1,67[1,17-2,39]
H3
109
27
21,48
3
<0,001
0,760
2,89[1,36-6,13]
1,19[1,05-1,35]
Альдолаза B
109
27
17,16
3
0,001
0,721
1,49[1,00-2,22]
1,14[1,00-1,29]
ПКТ
109
27
14,81
3
0,002
0,716
1,47[0,77-2,80]
1,08[0,95-1,22]
Таблица 5: одномерный регрессионный анализ Кокса для 28-дневного летального исхода у пациентов в критическом состоянии с инфекцией мочевыводящих путей
Тридцать четыре пациента из общего числа (n) 94 пациентов в критическом состоянии с инфекцией мочевыводящих путей умерли на 28-й день после поступления в ОИТ (события). Оценки по шкалам или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ, включены в модели. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и корректировок. Отображаемые результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел) и стандартизированные отношения рисков (HR) плюс 95% доверительный интервал (CI), либо на межквартильный размах (МКР), либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II; SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности; СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин; ПКТ: прокальцитонин; гистоны представлены гистоном H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (ИА))
Таблица 5
HR [95% CI] на …
Модель
N
События
L.R.χ²
df
p-значение
индексC
… МКР
… 2-кратноеизменение
Н2В
94
34
25,79
3
<0,001
0,764
2,52[1,75-3,65]
1,39[1,22-1,59]
H4
94
34
25,46
3
<0,001
0,761
2,47[1,70-3,60]
1,38[1,21-1,58]
H3
94
34
24,98
3
<0,001
0,756
4,52[2,34-8,75]
1,29[1,15-1,44]
H2A
94
34
24,65
3
<0,001
0,759
2,32[1,64-3,28]
1,39[1,21-1,59]
SAPS II
94
34
23,69
3
<0,001
0,737
3,00[1,85-4,89]
ИА H4
90
31
22,52
3
<0,001
0,751
8,43 [2,79-25,45]
1,29 [1,13-1,47]
SOFA
94
34
16,07
3
0,001
0,696
2,28 [1,39-3,76]
1,05 [1,02-1,08]
СР-проАДМ
94
34
14,93
3
0,002
0,689
2,28[1,36-3,81]
1,65[1,21-2,25]
Альдолаза B
94
34
11,96
3
0,008
0,679
1,82[1,19-2,78]
1,18[1,05-1,33]
ПКТ
94
34
5,54
3
0,136
0,594
1,30[0,74-2,29]
1,05[0,94-1,17]
Таблица 6: одномерный регрессионный анализ Кокса для 7-дневного летального исхода у пациентов в критическом состоянии со злокачественными новообразованиями
Шестнадцать пациентов из общего числа (n) 64 пациентов в критическом состоянии со злокачественными новообразованиями умерли на 7-й день после поступления в ОИТ (события). Оценки по шкалам или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ, включены в модели. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и корректировок. Отображаемые результаты представляют собой тест отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и p-значение), индекс C (Харрел) и стандартизированные отношения рисков (HR) плюс 95% доверительный интервал (CI), либо на межквартильный размах (МКР), либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: упрощенная шкала оценки острых физиологических состояний II; SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности; СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин; ПКТ: прокальцитонин; гистоны представлены гистоном H2A, H2B, H3 и H4. Н4 также измеряли с помощью иммуноанализа (ИА)).
Таблица 6
HR [95% CI] на …
Модель
N
События
L.R.χ²
df
p-значение
индексC
… МКР
… 2-кратноеизменение
Н2В
64
16
22,32
3
<0,001
0,815
4,79 [2,44-9,43]
1,60 [1,31-1,96]
H2A
64
16
22,28
3
<0,001
0,811
4,35 [2,31-8,20]
1,61 [1,31-1,98]
H4
64
16
21,99
3
<0,001
0,812
4,53 [2,33-8,81]
1,60 [1,30-1,97]
ИА H4
61
16
21,95
3
<0,001
0,803
5,52 [2,24-13,58]
1,64 [1,26-2,13]
H3
64
16
17,59
3
0,001
0,767
7,95 [2,70-23,45]
1,40 [1,17-1,67]
SAPS II
64
16
15,16
3
0,002
0,755
4,76 [1,99-11,38]
1,02 [1,01-1,03]
СР-проАДМ
64
16
10,20
3
0,017
0,737
3,15 [1,38-7,17]
1,88 [1,20-2,96]
SOFA
64
16
9,84
3
0,020
0,722
3,36 [1,42-7,95]
1,06 [1,02-1,11]
Альдолаза B
64
16
7,30
3
0,063
0,644
2,05 [1,15-3,64]
1,25 [1,05-1,50]
ПКТ
64
16
4,75
3
0,191
0,661
1,95 [0,92-4,14]
1,15 [0,98-1,34]
Пример 2: Превосходная точность проадреномедуллина при прогнозировании летального исхода при сепсисе с различными уровнями тяжести заболевания
Предпосылки:
в последние годы возросло применение новых биомаркеров сепсиса. Однако их прогностическая ценность в отношении тяжести заболевания не была изучена. В данной работе авторы исследовали способность среднерегионального проадреномедуллина (СР-проАДМ) прогнозировать летальный исход у пациентов с сепсисом с различной степенью органной недостаточности по сравнению с прокальцитонином, С-реактивным белком и лактатом.
Методы:
исследование представляло собой двухцентровое проспективное обсервационное когортное исследование, включающее пациентов с тяжелым сепсисом или септическим шоком, поступивших в ОИТ. Биомаркеры в плазме измеряли в течение первых 12 часов после поступления. Связь между биомаркерами и 28-дневным летальным исходом оценивали с помощью регрессионного анализа Кокса и кривых Каплана-Мейера. Пациентов делили на три группы в соответствии с оценкой по шкале динамической оценки органной недостаточности (SOFA). Точность биомаркеров в отношении летального исхода определяли по площади под кривой операционных характеристик приемника (AUROC).
Результаты:
p
p
p
p
<
<
<
висследование были включены 326 пациентов с тяжелым сепсисом (21,7%) или септическим шоком (79,3%), 28-дневная смертность составила 31,0%. Вмногомерном анализе только СР-проАДМ и лактат были связаны со летальным исходом: отношение рисков (HR): 8,5 по сравнению с 3,4 ( < 0,001). СР-проАДМ показал лучшую AUROC при прогнозировании летального исхода через 28 дней в анализе всей когорты (AUROC [95% CI]: 0,79 [0,74-0,84]) ( <0,001). После стратификации пациентов в соответствии со степенью органной недостаточности СР-проАДМ был единственным биомаркером, прогнозировавшим летальный исход во всех группах тяжести (SOFA  6, SOFA=7-12 и SOFA ≥ 13), AUROC [95% CI] 0,75 [0,61-0,88], 0,74 [0,66-0,83] и 0,73 [0,59-0,86], соответственно ( 0,05). Все пациенты с концентрациями СР-проАДМ  0,88 нмоль/л выживали до 28 дней. У пациентов с SOFA  6 добавление СР-проАДМ к оценке по шкале SOFA повысило способность SOFA выявлять невыживших, AUROC [95% CI]: 0,70 [0,58-0,82] и 0,77 [0,66-0,88], соответственно ( < 0,05 для обоих).
Выводы:
эффективность прогностических биомаркеров при сепсисе сильно зависит от тяжести заболевания. Точность СР-проАДМ при прогнозировании летального исхода не зависит от степени органной недостаточности. Как следствие, он является хорошим кандидатом для раннего выявления пациентов с сепсисом с умеренной степенью тяжести заболевания, но с повышенным риском летального исхода.
Предпосылки
Сепсис остается основной причиной смерти у пациентов в отделении интенсивной терапии (ОИТ), несмотря на улучшения в лечении антибиотиками и ранней коррекции гемодинамики. В Европе сепсис у пациентов с острым заболеванием приводит к смертности в ОИТ от 27% до 54% в зависимости от степени тяжести [1]. В Соединенных Штатах, по оценкам Центра по контролю заболеваний, у 500 000 человек развивается сепсис и 200 000 умирают каждый год [2] [3]. Поэтому очень желательна быстрая диагностика и оценка пациентов с сепсисом высокой степени риска, что повышает вероятность начала раннего и специфичного лечения. Таким образом, клинические шкалы оценки тяжести, такие как шкала динамической оценки органной недостаточности (SOFA), могут играть решающую роль [4]. Однако отдельное применение этих систем оценки для помощи в принятии решений при сепсисе подверглось значительной критике [5]. Стандартизированный инструмент оценки для раннего выявления пациентов с сепсисом при поступлении с различными уровнями тяжести будет иметь огромное значение для содействия принятию клинических решений и оптимизации использования ресурсов здравоохранения. Соответственно, за последние несколько десятилетий был предложен ряд прогностических биомаркеров в области сепсиса - намного больше, чем при других заболеваниях. Большинство из этих молекул представляют собой гормоны, цитокины или циркулирующие белки, связанные с воспалением или системой коагуляции, и их измерение может требовать значительного времени, усилий и затрат [6].
Адреномедуллин (АДМ) представляет собой пептид, способный выполнять функцию гормона и вырабатываемый несколькими тканями в ходе физиологического и инфекционного стресса с различными физиологическими функциями, включая сосудорасширяющую, противовоспалительную и противомикробную активность, которая дополнительно усиливается за счет его регуляции и модуляции комплементарной активности [7]. Таким образом, АДМ считается «гормокином», характеризующимся гормоноподобным поведением при невоспалительных состояниях, когда он вырабатывается только эндокринными клетками, и цитокиноподобным поведением при сепсисе, когда он повсеместно гиперэкспрессируется. Кроме того, было показано, что экзогенный АДМ снижает острое повреждение легких, проницаемость сосудов и смерть на животных моделях сепсиса; в то время как эндогенная сверхэкспрессия аналогичным образом ослабляет поражение в результате сепсиса [8] [9]. Измерение циркулирующего АДМ осложняется быстрым распадом и выведением из кровообращения и дополнительно маскируется связывающим белком (фактором комплемента H), что препятствует его детектированию посредством стандартного иммуноанализа. Среднерегиональный фрагмент проадреномедуллина (СР-проАДМ), состоящий из аминокислот 45-92, более стабилен и напрямую отражает уровни быстро распадающегося активного пептида АДМ [10]. Повышенные концентрации СР-проАДМ были выявлены в плазме пациентов с внебольничной пневмонией (ВП) и широко используются при оценке риска и тяжести этого состояния [11] [12] [13]. Тем не менее, доступно мало данных в отношении пациентов с тяжелым сепсисом и септическим шоком. Кроме того, влияние степени тяжести заболевания на эффективность прогностических биомаркеров при сепсисе еще недостаточно изучено.
В данном исследовании авторы преследовали цель оценить способность уровней СР-проАДМ прогнозировать 28-дневный летальный исход у пациентов с сепсисом по сравнению с другими стандартными биомаркерами (прокальцитонин (ПКТ), С-реактивный белок (СРБ) и лактат) при трех разных уровнях степени тяжести заболевания, измеренных по шкале SOFA.
Методы
Пациенты, критерии включения и исключения
>
: это исследование представляло собой проспективное обсервационное исследование когорты пациентов, набранных последовательно из двух отделений интенсивной терапии (ОИТ) в Испании и Франции. Взрослые пациенты возрастом ≥ 18 лет, поступившие в ОИТ с апреля 2013 г. по январь 2016 г., были включены в течение 12 часов после соответствия критериям тяжелого сепсиса или септического шока, основанным на определении СЕПСИС-2, принятом Американской коллегией специалистов в области торакальной медицины/Консенсусной конференцией Общества медицины критических состояний [14]. Включенные в исследование пациенты также имели оценку по шкале SOFA  2 и, следовательно, соответствовали критериям нового определения сепсиса СЕПСИС-3 [15]. Пациенты с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и пациенты, проходившие радиационную терапию или получавшие иммуносупрессивные препараты, включая химиотерапию или системные стероиды, в течение последних 3 месяцев до поступления в ОИТ, считались имеющими угнетенный иммунитет. Критерии исключения представляли собой возраст < 18 лет, наличие беременности, отсутствие образца крови, доступного для определения профиля биомаркера в течение первых 12 часов после поступления в ОИТ, или отсутствие информированного согласия. Клинические данные, зарегистрированные из медицинских карт, включали демографические данные, сопутствующие заболевания, лабораторные анализы, микробиологический анализ и уровни биомаркеров. Тяжесть заболевания оценивали при поступлении путем расчета оценки по шкале динамической оценки органной недостаточности (SOFA).
Оценка биомаркеров
Образцы плазмы для определения профилей биомаркеров отбирали как можно ближе к моменту поступления в ОИТ и всегда в течение первых 12 часов. Измерение СР-проАДМ в плазме проводили с помощью технологии TRACE (усиленное излучение криптата с временным разрешением) с использованием нового сэндвич-иммуноанализа (Kryptor Compact Plus Analyser, BRAHMS, Хеннигсдорф, Германия); предел детектирования составлял 0,05 нмоль/л. Измерение ПКТ проводили с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа (ECLIA) на биохимическом анализаторе (Cobas 6000, Roche Diagnostics, Мелан, Франция); предел детектирования составлял 0,02 нг/мл. СРБ и лактат в сыворотке измеряли с помощью иммунотурбидиметрического анализа, усиленного частицами, и колориметрического анализа, соответственно (модульный анализатор e501, Roche Diagnostics, Мелан, Франция); предел детектирования составлял 0,15 мг/дл и 0,2 ммоль/л, соответственно.
Статистический анализ
p
Различия в демографических и клинических характеристиках между выжившими и невыжившими были оценены с использованием критерия χ2 для категориальных переменных. Для сравнения непрерывных переменных на основе наличия или отсутствия нормального распределения использовали соответственно t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни.Связь между биомаркерами и риском летального исхода была оценена с помощью регрессионного анализа Кокса с поправкой на искажающие факторы. Время было цензурировано через 28 дней после поступления в ОИТ. Первые 24 часа после поступления в ОИТ считали первым днем анализа. Переменные, дающие  < 0,05 в одномерном регрессионном анализе, были дополнительно включены в многомерный анализ. Биомаркеры были логарифмически преобразованы для достижения нормального распределения. Влияние биомаркеров на среднее время выживания оценивали с использованием кривых Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия Мантеля-Хензеля. Как и в случае регрессионного анализа Кокса, время было цензурировано через 28 дней после поступления в ОИТ. Точность и прогностические ценности биомаркеров при определении летального исхода оценивали путем расчета площади под кривой операционных характеристик приемника (AUROC). Пациентов распределяли на три группы в зависимости от тяжести заболевания, оцененной по шкале SOFA, с использованием двух предварительно определенных порогов отсечений: одного с чувствительностью, близкой к 90%, и другого, демонстрирующего специфичность, близкую к 90%, для выявления невыживших через 28 дней (фиг. 4). Данные анализировали с использованием программного обеспечения IBM SPSS 20.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс).
Результаты
Характеристики пациентов и концентрации биомаркеров
:
р
p
триста двадцать шесть пациентов (326) с тяжелым сепсисом (21,7%) или септическим шоком (79,3%) были включены в исследование, при этом 28-дневная смертность составила 25,5% и 34,9% в Вальядолиде и Дижоне, соответственно, и общая смертность в обоих местах проведения исследования составила 31,0% (таблица 7). Медианный возраст составлял 65 лет, и 54,3% пациентов являлись мужчинами. По сравнению с выжившими невыжившие были старше и имели более высокие оценки по шкале SOFA и повышенную частоту септического шока, искусственной вентиляции легких, заместительной почечной терапии, новообразований, сердечно-сосудистых заболеваний, хронической почечной недостаточности, угнетения иммунитета и заболеваний органов дыхания (все <0,05). Наиболее распространенным источником инфекции была инфекция респираторного и урологического происхождения, независимо от исхода. Показатели смертности в зависимости от источника инфекции были следующими: 37,2% у пациентов, страдающих от респираторной инфекции, 32,4% у пациентов с урологической инфекцией, 28,6% у пациентов с абдоминальной инфекцией, 35,5% у пациентов с первичной или вторичной бактериемией и 25,6% у пациентов с инфекцией другого происхождения. Что касается микробиологической идентификации, то как выжившие, так и невыжившие пациенты демонстрировали соразмерное присутствие грам (-), грам (+) и вирусных патогенов. Грибковые инфекции чаще встречались у невыживших. Наиболее частой причиной смерти был синдром полиорганной недостаточности (n=58; 57,4%), за которым следовал рефрактерный шок (n=9, 8,9%) и рефрактерная гипоксемия (n=8, 7,9%). Ограничение уровня терапевтического вмешательства было применено к 21 пациенту. Все из концентраций СР-проАДМ, ПКТ и лактата были значительно повышены у невыживших пациентов по сравнению с выжившими (все  < 0,01), тогда как уровни СРБ оставались схожими в обеих группах. Уровни СР-проАДМ в зависимости от источника инфекции были следующими [медиана (межквартильный размах)]: респираторная инфекция [3,6 нмоль/л (5,6)], урологическая инфекция [4,6 нмоль/л (5,4)], абдоминальная инфекция [4,9 нмоль/л (6,5)], бактериемия [3,8 нмоль/л (5,1)] и [3,5 нмоль/л (5,8)] при инфекциях другого происхождения. Уровни СР-проАДМ в зависимости от инфицирующего микроорганизма были следующими [медиана (межквартильный размах)]: грибковая инфекция [6,1 нмоль/л (5,6)], грам (-) бактерии [4,9 нмоль/л (5,9)], грам (+) бактерии [4,1 нмоль/л (6,2)] или вирусы [1,2 нмоль/л (3,4)].
Таблица 7. Клинические характеристики пациентов:
данные представлены как среднее (СКО) или медиана (МКР), в соответствующих случаях. Значения, выраженные в процентах (%), указывают на долю выживших и невыживших за 28 дней для конкретных переменных
Выжившиеn =225
Невыжившиеn=101
Всегоn=326
p
Пациенты из Вальядолида (n,%)
102 (45,3%)
35 (34,7%)
137
0,071
Пациенты из Дижона (n,%)
123 (54,7%)
66 (65,3%)
189
Мужчины (n, %)
133 (59,1%)
68 (67,3%)
201 (61,4%)
0,098
Возраст (лет) (среднее, СКО)
63 (14)
69 (12)
65,4 (14)
<0,001
SOFA (среднее, СКО)
8 (3,4)
11 (3,5)
9 (3,7)
<0,001
Септический шок (n,%)
152 (67,5%)
87 (86,1%)
239 (73,3%)
0,020
Искусственная вентиляция (n,%)
150 (66,7%)
89 (88,1%)
239 (73,3%)
<0,001
ЗПТ (n,%)
40 (17,7%)
45 (44,6%)
85 (26,2%)
<0,001
Пребывание в ОИТ (дней) (среднее, СКО)
12,9 (18)
7,7 (6,7)
11,2 (15,6)
0,012
Новообразование (n, %)
47 (21%)
35 (34,7%)
82 (25,2%)
0,007
Диабет (n, %)
58 (25,8%)
29 (28,7%)
87 (26,7%)
0,330
ХОБЛ (n, %)
33 (14,7%)
16 (15,8%)
49 (15%)
0,450
Сердечно-сосудистое заболевание (n, %)
56 (25%)
41 (40,6%)
97 (29,8%)
0,030
Хроническая почечная недостаточность (n, %)
16 (7,1%)
16 (15,8%)
32 (9,8%)
0,014
Угнетение иммунитета (n, %)
21 (9,3%)
25 (24,8%)
46 (14,1%)
<0,001
Респираторная инфекция (n, %)
98 (43,6%)
58 (57,4%)
156 (48%)
0,014
Урологическая инфекция (n, %)
75 (33,3%)
36 (35,6%)
111 (34%)
0,380
Абдоминальная инфекция (n, %)
25 (11,1%)
10 (9,9%)
35 (10,7%)
0,450
Другая инфекция (n, %)
32 (14%)
11 (10,9%)
43 (13%)
0,40
Первичная или вторичная бактериемия (n, %)
69 (30,7%)
38 (37,6%)
107 (32,8%)
0,130
Грам (-) бактерии (n, %)
62 (27,6%)
28 (27,7%)
90 (27,6%)
0,975
Грам (+) бактерии (n, %)
47 (20,9%)
22 (21,8%)
69 (21,2%)
0,855
Грибы (n, %)
3 (1,3%)
5 (5%)
8 (2,5%)
0,050
Вирус (n, %)
15 (6,7%)
5 (5%)
20 (6,1%)
0,550
СР-проАДМ (нмоль/л) (медиана, МКР)
2,68 (3,56)
7,44 (6,84)
3,62 (5,6)
<0,001
Лактат (ммоль/л) (медиана, МКР)
2,00 (1,54)
3,60 (5,53)
2,12 (2,28)
<0,001
СРБ (мг/дл) (медиана, МКР)
147,8 (193,6)
163,0 (181,9)
155,0 (189)
0,200
ПКТ (нг/мл) (медиана, МКР)
2,9 (17,5)
5,8 (36,7)
3,54 (27,5)
0,001
Анализ выживаемости
р
<
СР-проАДМ, ПКТ и лактат показали значительную связь с летальным исходом в одномерном регрессионном анализе Кокса (таблица 8). После поправки на искажающие факторы и по сравнению с ПКТ, СРБ и лактатом СР-проАДМ продемонстрировал наиболее тесную независимую связь с риском летального исхода (отношение рисков: 8,5; 95% доверительный интервал: 4,2-17,4;  < 0,001) (таблица 8). Кроме того, анализ Каплана-Мейера показал, что ни один из пациентов со значением СР-проАДМ  0,88 нмоль/л не умер в первые 28 дней после поступления в ОИТ (фиг. 1). Был выбран этот порог отсечения, так как он обеспечивал 100% чувствительность при выявлении невыживших в AUROC (фиг. 2).
Таблица 8. Одно- и многомерный регрессионный анализ Кокса для прогнозирования летального исхода через 28 дней после поступления в ОИТ.
Одномерный
Многомерный
HR (95% CI)
p
HR (95% CI)
p
СР-проАДМ
11,2 (6,3-19,8)
< 0,001
8,5 (4,2-17,4)
< 0,001
Лактат
3,8 (2,6-5,5)
< 0,001
3,4 (2,0-5,8)
< 0,001
СРБ
1,3 (0,8-1,9)
0,266
-
-
ПКТ
1,4 (1,2-1,8)
0,001
1,1 (0,9-1,4)
0,326
SOFA
1,2 (1,2-1,3)
< 0,001
1,2 (1,1-1,3)
< 0,001
Проводили коррекцию в отношении следующих переменных:возраст, септический шок, сердечно-сосудистое заболевание, угнетение иммунитета, хроническая почечная недостаточность, новообразование, респираторный источник инфекции, заместительная почечная терапия, больница (Вальядолид/Дижон),наличие грибковой инфекции, ограничение уровня терапевтического вмешательства.
Влияние тяжести заболевания на эффективность биомаркера
p
>
СР-проАДМ показал лучшую AUROC для прогнозирования летального исхода через 28 дней в анализе всей когорты, даже лучше, чем при оценке по шкале SOFA (фиг. 2). После стратификации пациентов в соответствии со степенью органной недостаточности СР-проАДМ был единственным биомаркером, способным дискриминировать невыживших от выживших через 28 дней у пациентов с самой низкой степенью тяжести заболевания (оценка по шкале SOFA ≤ 6) (AUROC [95% доверительный интервал (95% CI):]: 0,75 [0,61-0,88]), (=0,006) (фиг. 3). У умеренно тяжело больных пациентов (оценка по шкале SOFA 7-12) СР-проАДМ продемонстрировал более высокую AUROC, чем наблюдаемая для лактата (0,74 [0,66-0,83] по сравнению с 0,61 [0,52-0,71], соответственно) (фиг. 3). У наиболее тяжелобольных пациентов (оценка по шкале SOFA  13) СР-проАДМ и лактат имели схожую AUROC (0,73 [0,59-0,86] по сравнению с 0,72 [0,59-0,86], соответственно) (фиг. 3). Ни СРБ, ни ПКТ не прогнозировали 28-дневный летальный исход ни в одной группе тяжести на основании оценки по шкале SOFA.
<
>
Пороговые значения (порог отсечения) СР-проАДМ для выявления невыживших представляли собой значения, показавшие самую высокую специфичность среди значений с предварительно фиксированной чувствительностью, составляющей по меньшей мере 0,80. Для пациентов с оценками по шкале SOFA  6, 7-12 и  13 порог отсечения СР-проАДМ составил 1,79, 3,25 и 5,58 нмоль/л, соответственно (таблица 9).
Таблица 9
Порог отсечения СР-проАДМ (нмоль/л) с высочайшей точностью прогнозирования 28-дневного летального исхода на основании оценки по шкале SOFA.
.  PPV - прогностическая ценность положительного результата, NPV - прогностическая ценность отрицательного результата, +LR - отношение правдоподобия для положительного результата, -LR - отношение правдоподобия для отрицательного результата.
Порог отсечения
Чувствительность
Специфичность
PPV
NPV
+LR
-LR
SOFA < 6
1,79
83,0
61,0
23,8
96,2
2,14
0,27
SOFA 7-12
3,25
83,0
52,0
43,4
87,0
1,74
0,33
SOFA > 13
5,58
83,8
60,0
75,6
71,4
2,09
0,27
Продолжительность пребывания в ОИТ в каждой группе тяжести составила [среднее, (СКО)]: SOFA ≤ 6: 11,0 дней (18,3); SOFA 7-12: 12,4 дня (16,0); SOFA ≥ 13: 8,4 дня (7,6). Смертность для каждой группы тяжести составила 12,8%, 30,6% и 59,7%, соответственно.
СР-проАДМ улучшает прогнозирование летального исхода у менее тяжело больных пациентов
<
Авторы оценили комбинацию СР-проАДМ и оценки по шкале SOFA при прогнозировании летального исхода, так что пациентов с концентрациями СР-проАДМ > 1,79 нмоль/л считали имеющими увеличение оценки по шкале SOFA на 1 балл. У пациентов с SOFA  6 комбинация СР-проАДМ и модифицированной оценки по шкале SOFA (АДМ-SOFA) показала повышенную способность выявлять невыживших по сравнению с SOFA по отдельности, AUROC [95% CI]: SOFA 0,70 [0,58-0,82] и АДМ-SOFA 0,77 [0,66-0,88].
Обсуждение
Тяжесть сепсиса зависит от степени органной недостаточности, оцениваемой по шкале SOFA, которая, в свою очередь, напрямую связана с риском летального исхода [15]. Тем не менее, появление все большего числа биомаркеров может обеспечить новый путь, позволяющий просто и быстро повысить точность прогноза. В этой связи исследование авторов дает основания полагать, что СР-проАДМ может быть перспективным биомаркером. Тем не менее, предыдущие исследования, оценивающие прогностическую роль СР-проАДМ при сепсисе, дали противоречивые результаты. Christ-Crain и соавторы обнаружили, что СР-проАДМ давал AUROC, составляющую 0,81, при определении летального исхода в ОИТ в группе из 53 пациентов с сепсисом [16]. Напротив, Suberviola и соавторы обнаружили ограниченную ценность СР-проАДМ при прогнозировании больничного летального исхода у 137 пациентов с сепсисом, где AUROC составила 0,62 [17]. Тем не менее, Marino и соавторы показали, что у 101 пациента с сепсисом, тяжелым сепсисом или септическим шоком уровень адреномедуллина в плазме крови был тесно связан с тяжестью заболевания, потребностью в вазопрессорных агентах и 28-дневным летальным исходом[18]. Эти противоречивые результаты в отношении прогностической роли СР-проАДМ могут быть объяснены различиями в характеристиках пациентов, степени тяжести заболевания, источнике инфекции, хирургическим или медикаментозным лечением и небольшими размерами выборки в различных исследованиях.
<
В настоящем исследовании авторы впервые продемонстрировали, что эффективность биомаркеров при прогнозировании летального исхода при сепсисе сильно зависит от степени органной недостаточности при поступлении в ОИТ. Стратификация пациентов на основании их оценки по шкале SOFA позволила авторам продемонстрировать, что СР-проАДМ был единственным биомаркером, способным выявлять невыживших во всех группах тяжести. Это особенно важно для менее тяжело больных пациентов (оценка по шкале SOFA  6), поскольку эта группа представляет собой или самое раннее проявление в клиническом течении сепсиса, и/или менее тяжелую форму этого заболевания в условиях ОИТ. Таким образом, СР-проАДМ может являться хорошим кандидатом для включения в протокол контроля течения сепсиса на ранней стадии, поскольку он может обеспечить быстрое прогностическое значение и помочь в выборе диагностических вмешательств и принятии решений по лечению, что схоже с ролью тропонина при инфаркте миокарда или d-димера при легочной эмболии. В этой связи может быть очень полезным порог отсечения СР-проАДМ, определенный для этой группы пациентов (1,79 нмоль/л). Этот порог отсечения способен определять летальный исход с хорошей чувствительностью и высокой прогностической ценностью отрицательного результата. Наконец, СР-проАДМ может помочь стратифицировать пациентов в клинических испытаниях, где исследуются новые методы лечения сепсиса.
СР-проАДМ показал более высокую прогностическую ценность при определении риска летального исхода, чем другие, более часто используемые биомаркеры, в том числе лактат, у пациентов со средней степенью органной недостаточности (оценка по шкале SOFA 7-12). В то же время, как СР-проАДМ, так и лактат показали одинаковую эффективность у наиболее тяжелобольных пациентов (SOFA ≥ 13). Таким образом, полученные авторами результаты подтверждают важность учета степени органной недостаточности при разработке исследований для детектирования прогностических биомаркеров при сепсисе.
Консенсусом СЕПСИС-3 было недавно предложено применять оценку органной недостаточности с помощью шкалы SOFA для выявления пациентов с высоким риском с подозрением на наличие инфекции [15]. Полученные авторами результаты показывают, что «положительное» значение СР-проАДМ может улучшить способность SOFA прогнозировать летальный исход при сепсисе. Интересно, что комбинация СР-проАДМ с клиническими шкалами, такими как PSI или CURB-65, также показала лучшие результаты, чем клинические шкалы по отдельности у пациентов с внебольничной пневмонией (ВП) или инфекциями нижних дыхательных путей (LRTI) [12] [19] [20] [21]. Таким образом, СР-проАДМ можно было бы применять в качестве надежного инструмента для стратификации риска, способного прогнозировать летальный исход или неблагоприятные события и направлять клинические решения. Поэтому необходимы дальнейшие клинические исследования по оценке стратегий, сочетающих СР-проАДМ с другими классическими шкалами оценки тяжести и/или биомаркерами для улучшения диагностики и прогнозирования сепсиса [22] [23].
Наконец, авторы установили, что значение СР-проАДМ менее 0,88 нмоль/л может позволить «исключить» летальный исход в течение 28 дней после поступления в ОИТ. Этот порог отсечения может быть особенно эффективным для определения ранних клинических решений, когда клинические проявления явной органной недостаточности еще не очевидны.
Мониторинг СР-проАДМ с течением времени может дополнительно проиллюстрировать тенденцию во времени, которая может указывать на успех конкретных видов лечения и видов терапии и, следовательно, повысить его прогностическую ценность при прогнозировании исходов [25]. Наконец, в исследованной авторами когорте уровни СР-проАДМ немного различались в зависимости от источника инфекции. Грибковые инфекции вызывали самые высокие уровни СР-проАДМ, тогда как вирусные инфекции вызывали самые низкие. Вероятно, это связано с тем, что грибковые инфекции приводили к более высокой степени тяжести заболевания (медианная оценка по шкале SOFA, равная 12, по сравнению с 9 баллами у пациентов без грибковой инфекции), в то время как вирусные инфекции приводили к более умеренной степени тяжести заболевания (медианная оценка по шкале SOFA, равная 6,5, по сравнению с 9 баллами у пациентов без вирусной инфекции).
Выводы
Полученные авторами результаты демонстрируют, что на эффективность биомаркеров при определении риска летального исхода при сепсисе влияет степень тяжести заболевания. У пациентов со средней степенью тяжести СР-проАДМ превзошел по эффективности другие стандартные биомаркеры. Как следствие, СР-проАДМ может помочь в раннем выявлении пациентов с сепсисом, нуждающихся в срочной госпитализации в ОИТ, а также облегчить последующее клиническое ведение этих пациентов.
Список сокращений
АДМ: адреномедуллин
СР-проАДМ: среднерегиональный проадреномедуллин
СРБ: C-реактивный белок
ПКТ: прокальцитонин
SOFA: шкала динамической оценки органной недостаточности
CI: доверительный интервал
AUROC: площадь кривой рабочей характеристики приемника
PPV: прогностическая ценность положительного результата
NPV: прогностическая ценность отрицательного результата
LR: отношение правдоподобия
HR: отношение рисков
PSI: индекс тяжести пневмонии
ЗПТ: заместительная почечная терапия
Все источники, цитируемые в настоящей заявке, полностью включены в нее посредством ссылки.
Albrich, W. C. and S. Harbarth (2015). " Intensive Care Med 41(10): 1739-1751.
Bone, R. C., R. A. Balk, et al. (1992). Chest 101(6): 1644-1655.
Bouch, D. C. and J. P. Thompson (2008). Continuing Education in Anaesthesia, Critical Care & Pain 8(5): 181-185.
Breslow, M. J. and O. Badawi (2012). Chest 141(1): 245-252.
Ferreira, A. M. and Y. Sakr (2011). Semin Respir Crit Care Med 32(5): 543-551.
Fine, MJ; Auble, TE; Yealy, DM; Hanusa, BH; Weissfeld, LA; Singer, DE; Coley, CM; Marrie, TJ; Kapoor, WN; et al. (1997). N Engl J Med. 336 (4): 243-250
Hodkinson, HM (1972). Age and Ageing 1 (4): 233-8
Halpern, N. A. and S. M. Pastores (2010). Crit Care Med 38(1): 65-71.
Kaneko-Wada Fde, J., G. Dominguez-Cherit, et al. (2015). Gac Med Mex 151(5): 628-634.
Le Gall, J. R., S. Lemeshow, et al. (1993). JAMA 270(24): 2957-2963.
Lim WS, van der Eerden MM, Laing R, et al. (2003). Thorax. 58 (5): 377-82
Mayr, V. D., M. W. Dunser, et al. (2006). Crit Care 10(6): R154.
Vincent, J. L. (2008). Langenbecks Arch Surg 393(6): 817-824.
Vincent, J. L., R. Moreno, et al. (1996). Intensive Care Med 22(7): 707-710.
Источники, цитируемые в примере 2 и в описании:
ADDIN ZOTERO_BIBL {"custom":[]} CSL_BIBLIOGRAPHY 1. Vincent J-L. Clinical sepsis and septic shock--definition, diagnosis and management principles. Langenbecks Arch. Surg. Dtsch. Ges. Für Chir. 2008;393:817-24.
2. Jean-Baptiste E. Cellular mechanisms in sepsis. J. Intensive Care Med. 2007;22:63-72.
3. Hoyert DL, Xu J. Deaths: preliminary data for 2011. Natl. Vital Stat. Rep. Cent. Dis. Control Prev. Natl. Cent. Health Stat. Natl. Vital Stat. Syst. 2012;61:1-51.
4. Vincent JL, Moreno R, Takala J, Willatts S, De Mendonça A, Bruining H, et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med. 1996;22:707-10.
5. Vincent J-L, Opal SM, Marshall JC. Ten reasons why we should NOT use severity scores as entry criteria for clinical trials or in our treatment decisions. Crit. Care Med. 2010;38:283-7.
6. Pierrakos C, Vincent J-L. Sepsis biomarkers: a review. Crit. Care Lond. Engl. 2010;14:R15.
7. Hirata Y, Mitaka C, Sato K, Nagura T, Tsunoda Y, Amaha K, et al. Increased circulating adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in sepsis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996;81:1449-53.
8. Müller-Redetzky HC, Will D, Hellwig K, Kummer W, Tschernig T, Pfeil U, et al. Mechanical ventilation drives pneumococcal pneumonia into lung injury and sepsis in mice: protection by adrenomedullin. Crit. Care Lond. Engl. 2014;18:R73.
9. Pugin J. Adrenomedullin: a vasodilator to treat sepsis? Crit. Care Lond. Engl. 2014;18:152.
10. Struck J, Tao C, Morgenthaler NG, Bergmann A. Identification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma of sepsis patients. Peptides. 2004;25:1369-72.
11. Huang DT, Angus DC, Kellum JA, Pugh NA, Weissfeld LA, Struck J, et al. Midregional proadrenomedullin as a prognostic tool in community-acquired pneumonia. Chest. 2009;136:823-31.
12. Albrich WC, Dusemund F, Rüegger K, Christ-Crain M, Zimmerli W, Bregenzer T, et al. Enhancement of CURB65 score with proadrenomedullin (CURB65-A) for outcome prediction in lower respiratory tract infections: derivation of a clinical algorithm. BMC Infect. Dis. 2011;11:112.
13. Krüger S, Ewig S, Giersdorf S, Hartmann O, Suttorp N, Welte T, et al. Cardiovascular and inflammatory biomarkers to predict short- and long-term survival in community-acquired pneumonia: Results from the German Competence Network, CAPNETZ. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2010;182:1426-34.
14. Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger RP, Fein AM, Knaus WA, et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. 1992. Chest. 2009;136:e28.
15. Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, Shankar-Hari M, Annane D, Bauer M, et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016;315:801-10.
16. Christ-Crain M, Morgenthaler NG, Struck J, Harbarth S, Bergmann A, Müller B. Mid-regional pro-adrenomedullin as a prognostic marker in sepsis: an observational study. Crit. Care Lond. Engl. 2005;9:R816-824.
17. Suberviola B, Castellanos-Ortega A, Ruiz Ruiz A, Lopez-Hoyos M, Santibañez M. Hospital mortality prognostication in sepsis using the new biomarkers suPAR and proADM in a single determination on ICU admission. Intensive Care Med. 2013;39:1945-52.
18. Marino R, Struck J, Maisel AS, Magrini L, Bergmann A, Di Somma S. Plasma adrenomedullin is associated with short-term mortality and vasopressor requirement in patients admitted with sepsis. Crit. Care Lond. Engl. 2014;18:R34.
19. Christ-Crain M, Morgenthaler NG, Stolz D, Müller C, Bingisser R, Harbarth S, et al. Pro-adrenomedullin to predict severity and outcome in community-acquired pneumonia [ISRCTN04176397]. Crit. Care Lond. Engl. 2006;10:R96.
20. Courtais C, Kuster N, Dupuy A-M, Folschveiller M, Jreige R, Bargnoux A-S, et al. Proadrenomedullin, a useful tool for risk stratification in high Pneumonia Severity Index score community acquired pneumonia. Am. J. Emerg. Med. 2013;31:215-21.
21. Renaud B, Schuetz P, Claessens Y-E, Labarère J, Albrich W, Mueller B. Proadrenomedullin improves Risk of Early Аdmission to ICU score for predicting early severe community-acquired pneumonia. Chest. 2012;142:1447-54.
22. Guignant C, Voirin N, Venet F, Poitevin F, Malcus C, Bohé J, et al. Assessment of pro-vasopressin and pro-adrenomedullin as predictors of 28-day mortality in septic shock patients. Intensive Care Med. 2009;35:1859-67.
23. Travaglino F, De Berardinis B, Magrini L, Bongiovanni C, Candelli M, Silveri NG, et al. Utility of Procalcitonin (PCT) and Mid regional pro-Adrenomedullin (MR-proADM) in risk stratification of critically ill febrile patients in Emergency Department (ED). A comparison with APACHE II score. BMC Infect. Dis. 2012;12:184.
24. Bello S, Lasierra AB, Mincholé E, Fandos S, Ruiz MA, Vera E, et al. Prognostic power of proadrenomedullin in community-acquired pneumonia is independent of aetiology. Eur. Respir. J. 2012;39:1144-55.
25. Andaluz-Ojeda D, Cicuéndez R, Calvo D, Largo E, Nogales L, Muñoz MF, et al. Sustained value of proadrenomedullin as mortality predictor in severe sepsis. J. Infect. 2015;71:136-9.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> B.R.A.H.M.S GmbH
<120> проАДМ И/ИЛИ ГИСТОНЫ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ, УКАЗЫВАЮЩИХ
НА НЕБЛАГОПРИЯТНОЕ СОБЫТИЕ
<130> Z1852 PCT/A BLN
<150> EP 17 15 4348.1
<151> 2017-02-02
<160> 16
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 102
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность человеческого гистона H4,
идентификационный номер uniprot P62805.2, исходный метионин
не включен
<400> 1
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys
1               5                   10                  15
Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys Pro
20                  25                  30
Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Gly
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu Asn
50                  55                  60
Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys Thr
65                  70                  75                  80
Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg Thr
85                  90                  95
Leu Tyr Gly Phe Gly Gly
100
<210> 2
<211> 130
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность человеческого гистона H2A
тип 1, идентификационный номер uniprot Q96QV6, исходный
метионин не включен
<400> 2
Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ser Lys Ser
1               5                   10                  15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Ile His Arg
20                  25                  30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Ile Gly Ala Gly Ala Pro
35                  40                  45
Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu Glu
50                  55                  60
Leu Ala Gly Asn Ala Ser Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile Pro
65                  70                  75                  80
Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu
85                  90                  95
Leu Gly Gly Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile Gln
100                 105                 110
Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His His Lys Ala Gln
115                 120                 125
Ser Lys
130
<210> 3
<211> 135
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность человеческого гистона H3.1,
идентификационный номер uniprot P68431.2, исходный метионин
не включен
<400> 3
Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro
1               5                   10                  15
Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr
20                  25                  30
Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu
35                  40                  45
Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys
50                  55                  60
Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr
65                  70                  75                  80
Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Cys
85                  90                  95
Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala Ile
100                 105                 110
His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg
115                 120                 125
Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala
130                 135
<210> 4
<211> 126
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность человеческого гистона H2B,
идентификационный номер uniprot P62807
<400> 4
Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys
1               5                   10                  15
Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg
20                  25                  30
Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
35                  40                  45
Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn
50                  55                  60
Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln
85                  90                  95
Thr Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val
100                 105                 110
Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys
115                 120                 125
<210> 5
<211> 185
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность пре-проАДМ
<400> 5
Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys
20                  25                  30
Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met
35                  40                  45
Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala
50                  55                  60
Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg
85                  90                  95
Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe
100                 105                 110
Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
115                 120                 125
Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln
130                 135                 140
Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly
145                 150                 155                 160
Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro
165                 170                 175
Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
180                 185
<210> 6
<211> 48
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность СР-проАДМ (аминокислоты
45-92 пре-проАДМ)
<400> 6
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1               5                   10                  15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20                  25                  30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35                  40                  45
<210> 7
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> положения 21-29 SEQ ID NO:2
<400> 7
Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg
1               5
<210> 8
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 82-88 SEQ ID NO:2
<400> 8
His Leu Gln Leu Ala Ile Arg
1               5
<210> 9
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 89-95 SEQ ID NO:2
<400> 9
Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
1               5
<210> 10
<211> 19
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 100-118 SEQ ID NO:2
<400> 10
Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile Gln Ala Val Leu
1               5                   10                  15
Leu Pro Lys
<210> 11
<211> 57
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 46-102 SEQ ID NO:1
<400> 11
Ile Ser Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe
1               5                   10                  15
Leu Glu Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys
20                  25                  30
Arg Lys Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln
35                  40                  45
Gly Arg Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly
50                  55
<210> 12
<211> 10
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 46-55 SEQ ID NO:1
<400> 12
Ile Ser Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg
1               5                   10
<210> 13
<211> 8
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 60-67 SEQ ID NO:1
<400> 13
Val Phe Leu Glu Asn Val Ile Arg
1               5
<210> 14
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 80-91 с
ацетилированным K91 SEQ ID NO:1
<400> 14
Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys
1               5                   10
<210> 15
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 24-35 SEQ ID NO:1
<400> 15
Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys Pro Ala Ile Arg
1               5                   10
<210> 16
<211> 10
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 68-77 SEQ ID NO:1
<400> 16
Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys
1               5                   10
<---