ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С СИРТУИНОМ (SIRT), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К СИРТУИНУ (SIRT)
TREATMENT OF SIRTUIN (SIRT) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO SIRTUIN (SIRT)

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/330427, поданной 03 мая 2010 г., предварительной заявке на патент США №61/409136, поданной 2 ноября 2010 г., предварительной заявке на патент США №61/412066, поданной 10 ноября 2010 г. и предварительной заявке на патент США №61/415,891, поданной 22 ноября 2010 г.
[0002] Варианты реализации настоящего изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию сиртуина (SIRT) и связанных с ней молекул.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] ДНК-РНК и РНК-РНК гибридизации играют важную роль во многих аспектах функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК. Гибридизация также играет ключевую роль в различных методиках для обнаружения конкретной нуклеиновой кислоты или изменения ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию гена, гибридизуясь с целевой РНК, тем самым вмешиваясь в сплайсинг, транскрипцию, трансляцию и репликацию РНК. Антисмысловая ДНК обладает дополнительным свойством: ДНК-РНК-гибриды служат субстратом для расщепления рибонуклеазой Н, активности, присутствующей в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как в случае с олигодезоксинуклеотидами (ОДН), или же они могут экспрессироваться эндогенными генами в виде молекул РНК. Управление США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) недавно одобрило антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE™ (для лечения цитомегаловирусного ретинита), признав возможность применения антисмысловых соединений в терапевтических целях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта с применением антисмыслового(ых) олигонуклеотида(ов), нацеленного(ых) на любой участок природного антисмыслового транскрипта, приводящим к позитивной регуляции соответствующего смыслового гена. Согласно настоящему изобретению также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью миРНК, рибозимов и малых молекул, которые включены в объем настоящего изобретения.
[0005] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида сиртуина (SIRT) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности, обратно комплементарной полинуклеотиду, содержащему от 5 до 30 последовательных нуклеотидов, выбранных в рамках от 1 до 1028 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 9 или от 1 до 429 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 10, или от 1 до 508 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 11, или от 1 до 593 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 12, или от 1 до 373 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 13, от 1 до 1713 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 14, от 1 до 660 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 15, от 1 до 589 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 16, от 1 до 726 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 17, от 1 до 320 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 18, от 1 до 616 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 19, от 1 до 492 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 20, от 1 до 428 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 21, от 1 до 4041 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 22 или от 1 до 705 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 23, или от 1 до 2714 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 141, или от 1 до 1757 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 142, или от 1 до 3647 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 143, с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида сиртуина (SIRT) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0006] Согласно еще одному варианту реализации действие олигонуклеотида нацелено на природную антисмысловую последовательность полинуклеотида сиртуина (SIRT), например, нуклеотидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 9-23, 141-143, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов, применимых при реализации способов согласно настоящему изобретению, представлены последовательностями SEQ ID NO: 24-127.
[0007] В другом варианте реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида сиртуина (SIRT) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности, обратно комплементарной антисмысловой последовательности указанного полинуклеотида сиртуина (SIRT); с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида сиртуина (SIRT) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0008] В другом варианте реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида сиртуина (SIRT) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную антисмысловому олигонуклеотиду к антисмысловому полинуклеотиду сиртуина (SIRT); с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида сиртуина (SIRT) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0009] Согласно одному из вариантов реализации композиция содержит один или несколько антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами сиртуина (SIRT).
[0010] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды содержат один или более модифицированный или замещенный нуклеотид.
[0011] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированную связь.
[0012] Согласно еще одному варианту реализации указанные модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, содержащие фосфоротиоат, метилфосфонат, пептидные нуклеиновые кислоты, 2’-O-метил-, фтор- или углерод, метиленовые или другие молекулы закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК). Предпочтительно, указанные модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы закрытой нуклеиновой кислоты, включая α-L-ЗНК.
[0013] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.
[0014] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды вводятся в составе фармацевтической композиции. Схема лечения предполагает введение указанных антисмысловых соединений пациенту по меньшей мере однократно; однако эта схема может быть изменена таким образом, что будет включать введение нескольких доз в течение определенного периода времени. Указанное лечение может сочетаться с одним или несколькими другими видами терапии.
[0015] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды заключают в липосомы или присоединяют к молекуле-носителю (например, холестерину или TAT-пептиду).
[0016] Другие аспекты описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0017] На Фигурах 1 и 2 показаны результаты ПЦР в режиме реального времени для экспериментов, в которых клетки HepG2 обрабатывали олигонуклеотидами, направленными на антисмысловой CV396200 SIRT. Указанные результаты показывают, что уровень иРНК (информационной РНК) SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышался в течение 48 часов после обработки одной из siРНК, направленной на sitras (sirtas_5, P=0,01). В тех же пробах уровень РНК sirtas значительно снижался после обработки sirtas_5, но оставался неизменным после обработки sirtas_6 и sirtas_7, которые также не оказывали никакого действия на уровень иРНК SITR1 (Фиг.2). sirtas_5, sirtas_6 и sirtas_7 соответствуют последовательностям SEQ ID NO: 47, 48 и 49, соответственно.
[0018] На Фигуре 3 показаны результаты для дорожки олигонуклеотидов напротив антисмысловых SIRT. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышался в течение 48 часов после обработки тремя из антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на sirtas (CUR-0292, CUR-0307 и CUR-0308). CUR-0292 - CUR-0309 соответствуют SEQ ID NO: 24-41, соответственно.
[0019] На Фигурах 4 и 5 показаны результаты для ПС, ЗНК или 2’-O-метил-модифицированных олигонуклеотидов в клетках HepG2 (Фиг.4) и Vero76 (Фиг.5). Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышался в течение 48 часов после обработки ПС, ЗНК или 2’-O-метил-модифицированными олигонуклеотидами к антисмысловой последовательности SIRT1. Уровень иРНК SIRT1 в клетках Vero повышался в течение 48 часов после обработки ПС или ЗНК-модифицированными антисмысловыми олигонуклеотидами к антисмысловой последовательности SIRT1. Столбцы, помеченные как CUR-0245, CUR-0736, CUR-0688, CUR-0740 и CUR-0664 соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 42-46, соответственно.
[0020] На Фигуре 6 показаны результаты ПЦР биопсии жировой ткани обезьян. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают увеличение уровня иРНК SIRT1 в биопсии жировой ткани, взятой у обезьян, получавших CUR-963, олигонуклеотид, направленный на антисмысловой CV396200.1. SIRT1. CUR-963 соответствует последовательности SEQ ID NO: 43.
[0021] На Фигуре 7 показаны результаты ПЦР для первичных гепатоцитов печени обезьян. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают увеличение уровня иРНК после обработки олигонуклеотидом к антисмысловой последовательности SIRT1. Столбец, помеченный как CUR-0245, соответствует SEQ ID NO: 42.
[0022] На Фигуре 8 показаны результаты для олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые CV396200 SIRT. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышался после обработки одним из антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые CV396200 SIRT1. Столбцы, помеченные как CUR-1230 - CUR-1233, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 50-53.
[0023] На Фигуре 9 показаны результаты для олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые CV428275 SDRT. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышался после обработки двумя из антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые CV428275 SIRT1. Столбцы, помеченные как CUR-1302, CUR-1304, CUR-1303 и CUR-1305, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 54-57.
[0024] На Фигуре 10 показаны результаты ПЦР в режиме реального времени. Указанные результаты показывают, что через 48 часов после обработки одним из антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые BE717453 SIRT происходит значительное увеличение уровня иРНК SIRT1 в клетках HepG2. Столбцы, помеченные как CUR-1264 - CUR-1266, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 58-60, соответственно.
[0025] На Фигуре 11 показаны результаты ПНР в режиме реального времени. Указанные результаты показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно увеличивается через 48 часов после обработки тремя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые AV718812 SIRT1. Столбцы, помеченные как CUR-1294, CUR-1297, CUR-1295, CUR-1296 и CUR-1298, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 61-65, соответственно.
[0026] На Фигуре 12 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT1 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что через 48 часов после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые AW 169958 SIRT1 происходит значительное увеличение уровня иРНК SIRT1 в клетках HepG2. Столбцы, помеченные как CUR-1381, CUR-1382, CUR-1383 и CUR-1384, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 66-69, соответственно.
[0027] На Фигуре 13 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT1 после обработки клеток 3T3 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках 3T3 через 48 часов после обработки тремя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые AK044604 SIRT1 мыши, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0949, CUR-0842, CUR-1098 и CUR-1099, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 76,70, 80 и 81, соответственно.
[0028] На Фигуре 14 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения+стандартное отклонение уровня иРНК SIRT1 после обработки клеток 3T3 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках 3T3 через 48 часов после обработки пятью из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые AK044604 SIRT1 мыши, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0948 to CUR-0951, CUR-0846 и CUR-0844, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 75-78, 74 и 72, соответственно.
[0029] На Фигуре 15 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT1 после обработки клеток 3T3 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках 3T3 через 48 часов после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые AK044604 SIRT1 мыши, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0842, CUR-0844 и CUR-0845, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 70, 72 и 73, соответственно.
[0030] На Фигуре 16 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT1 после обработки клеток 3T3 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 через 48 часов после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловые AK044604 SIRT1 мыши, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0843 и CUR-0846, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 71 и 74, соответственно.
[0031] На Фигуре 17 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня sirt3 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме PB показывают, что уровень иРНК SIRT1 в клетках HepG2 через 48 часов после обработки фосфоротиоатными антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными на антисмысловые Hs.683117 sirt3 мыши, увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0551, CUR-1552, CUR-1555, CUR-1556, CUR-1553, CUR-1554, CUR-1545, CUR-1546, CUR-1548, CUR-1549, CUR-1550 и CUR-1547, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 82-93, соответственно.
[0032] На Фигуре 18 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК Sirtuin3 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме PB показывают, что уровень sirt3 в клетках HepG2 через 48 часов после обработки фосфоротиоатными антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными на антисмысловые BQ024738 и BE164357 sirt3, увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-1869, CUR-1871 и CUR-1873 - CUR-1878, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 94, 95, 96 и 98, 99, 100, 101 и 102, соответственно.
[0033] На Фигуре 19 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT3 после обработки клеток Hek293 фосфоротиоатными и siРНК олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1883 и CUR-1884, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 126 и 127, соответственно.
[0034] На Фигуре 20 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT3 после обработки клеток Vero76 фосфоротиоатными и siPHK олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1883 CUR-1884 CUR-1873, CUR-1875, CUR-1878 и CUR-1546, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 126, 127, 96, 98, 100 и 92, соответственно.
[0035] На Фигуре 21 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT4 после обработки клеток HUVEC фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1832 и CUR-1835, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 105 и 107, соответственно.
[0036] На Фигуре 22 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT4 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1833 и CUR-1835, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 104-107, соответственно.
[0037] На Фигуре 23 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT5 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1828, CUR-1829, CUR-1831 и CUR-1830, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 108, 109, 111 и 110, соответственно.
[0038] На Фигуре 24 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT6 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT6 в клетках HepG2 через 48 часов после обработки одним олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT6 под номером доступа NM_133475, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0873, CUR-0869 to CUR-0871, CUR-0874 и CUR-0872, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 116, 112, 113, 114, 117 и 115, соответственно.
[0039] На Фигуре 25 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT6 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT6 в клетках HepG2 через 48 часов после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT6 bf772662, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0878, CUR-0876, CUR-0877 и CUR-0875, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 121, 119, 120 и 118, соответственно.
[0040] На Фигуре 26 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT6 после обработки клеток DBS-FCL-1 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровень иРНК SIRT6 в клетках DBS-FCL-1 через 48 часов после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT6 bf772662, и одним олигонуклеотидом, направленным на последовательность под номеролм доступа NM_133475, значительно увеличивается. Столбцы, помеченные как CUR-0876, CUR-0878, CUR-0875 и CUR-0874, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 119, 121, 118 и 117, соответственно.
[0041] На Фигуре 27 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT7 после обработки клеток Vero76 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1824 и CUR-1825, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 122 и 123, соответственно.
[0042] На Фигуре 28 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT7 после обработки клеток SK-N-AS фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1824 и CUR-1825, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 124 и 125, соответственно.
[0043] На Фигуре 29 представлен график результатов ПЦР в режиме реального времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение уровня иРНК SIRT7 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Столбцы, помеченные как CUR-1824 и CUR-1825, соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO: 122 и 123, соответственно.
[0044] Описание перечисления последовательностей -
SEQ ID NO:1: сиртуин человека (Homo sapiens) (молчащий регулятор информации о типе спаривания, гомолог 2) 1 (S.cerevisiae) (SIRT1), иРНК (номер доступа в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации): NM_012238.4)
SEQ ID NO: 133: сиртуин 1 (SIRT1) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 2, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_001142498.1)
SEQ ID NO: 2: Mus musculus сиртуин 1 (молчащий регулятор информации о типе спаривания, гомолог 2)) 1 (S.cerevisiae) (SIRT1) иРНК (номер доступа в NCBI: NM_001159589)
SEQ ID NO: 3: сиртуин 2 (SIRT2) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 1, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_012237.3).
SEQ ID NO: 134: сиртуин 2 (SIRT2) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 2, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_030593.2)
SEQ ID NO: 135: сиртуин 2 (SIRT2) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 3, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_001193286.1)
SEQ ID NO: 136: сиртуин 2 (SIRT2) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 4, некодирующая РНК (номер доступа в NCBI: NR_034146.1)
SEQ ID NO: 4: сиртуин человека (Homo sapiens) (молчащий регулятор информации о типе спаривания, гомолог 2)) 3 (S.cerevisiae) (SIRT3), транскрипционный вариант 1, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_012239.5).
SEQ ID NO: 137: сиртуин 3 (SIRT3) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 2, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_001017524.2)
SEQ ID NO: 5: сиртуин 4 (SIRT4) человека (Homo sapiens), иРНК (номер доступа в NCBI: NM_012240).
SEQ ID NO: 138: сиртуин 5 (SIRT5) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 2, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_031244.2)
SEQ ID NO: 139: сиртуин 5 (SIRT5) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 3, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_001193267.1)
SEQ ID NO: 6: сиртуин 5 (SIRT5) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 1, иРНК (NCBI Accession No.: NM_012241).
SEQ ID NO: 7: сиртуин 6 (SIRT6) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 1, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_016539).
SEQ ID NO: 140: сиртуин 6 (SIRT6) человека (Homo sapiens), транскрипционный вариант 2, иРНК (номер доступа в NCBI: NM_001193285.1)
SEQ ID NO: 8: сиртуин 7 (SIRT7) человека (Homo sapiens), иРНК (номер доступа в NCBI: NM_016538).
Природные антисмысловые последовательности - SEQ ID NO: 9: Расширенная природная антисмысловая последовательность (CV396200 - расширенная); SEQ ID NO: 10: природная антисмысловая последовательность (CV428275); SEQ ID NO: 11: природная антисмысловая последовательность (BE717453) SEQ ID NO: 12: природная антисмысловая последовательность (AV718812); SEQ ID NO: 13: природная SIRT1 антисмысловая последовательность (AW169958); SEQ ID NO: 14: антисмысловая последовательность природного SIRT1 мыши (AK044604); SEQ ID NO: 15: антисмысловая последовательность природного SIRT3 (Hs.683117); SEQ ID NO: 16: антисмысловая последовательность природного SIRT3 (DA645474)
SEQ ID NO: 17: антисмысловая последовательность природного SIRT3 (BQ024738); SEQ ID NO: 18: антисмысловая последовательность природного SIRT3 (BE164357); антисмысловая последовательность природного SIRT3 (RIC8A) SEQ ID NO: 141, антисмысловая последовательность природного SIRT3 (PMSD13) SEQ ID NO: 142, антисмысловая последовательность природного SIRT3 (DA246502) SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 19: антисмысловая последовательность природного SIRT4 (AA156947); SEQ ID NO: 20: антисмысловая последовательность природного SIRT5 (Hs.671550); SEQ ID NO: 21: антисмысловая последовательность природного SIRT6 (BF772662); SEQ ID NO: 22: антисмысловая последовательность природного SIRT6 (ANKRD24); SEQ ID NO: 23: антисмысловая последовательность природного SIRT7 (Hs.671550)
Антисмысловые олигонуклеотиды - SEQ ID NO: 24-127.* обозначает фосфотиоатную связь, + обозначает ЗНК, a m обозначает 2’O-метил, r обозначает РНК.
SEQ ID NO: 128-130 - SEQ ГО NO: 128 соответствует экзону 4 в антисмысловом CV396200 природного SIRT1, SEQ ID NO: 129, 130 и 131 соответствуют последовательности прямого праймера, последовательности обратного праймера и последовательности репортера, соответственно. SEQ ID NO: 132 соответствует CUR 962, * обозначает фосфотиоатную связь, + обозначает ЗНК.
SEQ ID NO: 144 и 145 соответствуют обратной комплементарной последовательности антисмыслового олигонуклеотида SEQ ID NO: 126 и 127, соответственно.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0045] Ниже описаны некоторые аспекты изобретения со ссылками на примеры применения для наглядности. Следует понимать, что многочисленные конкретные особенности, взаимосвязи и способы изложены с целью обеспечить полное понимание изобретения. Однако для специалиста в соответствующей области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено без одной или более конкретных особенностей или с применением других способов. Настоящее изобретение не ограничивается указанным порядком действий или процессов, так как некоторые действия могут осуществляться в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Кроме того, не все приведенные в качестве примеров действия или процессы необходимы для реализации методики согласно настоящему изобретению.
[0046] Все гены, названия генов и генные продукты, описанные в настоящей заявке, соответствуют гомологам из любых видов, для которых могут быть применены композиции и способы, описанные в настоящей заявке. Таким образом, указанные термины включают, не ограничиваясь перечисленными, гены и генные продукты человека и мыши. Следует понимать, что описание гена или генного продукта конкретного вида предназначено исключительно для наглядности и не должно быть истолковано как ограничение, если контекст, в котором оно приведено, четко не указывает на это. Таким образом, например, описанные в настоящей заявке гены, которые согласно некоторым вариантам реализации родственны последовательностям нуклеиновых кислот и аминокислот млекопитающих, включают гомологичные и/или ортологичные гены и генные продукты, полученные от других животных, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, других млекопитающих, рыб, амфибий, рептилий и птиц. Согласно вариантам реализации указанные гены или последовательности нуклеиновых кислот представляют собой гены и последовательности нуклеиновых кислот человека.
[0047] Номера доступа, указываемые в настоящей заявке, определяют общедоступные последовательности в базе данных Национального Института здоровья, GenBank (см. Nucleic Acids Research, 2008 Jan, 36 Database issue: D25-30), если не указано другое. Все последовательности, на которые есть ссылки посредством номера доступа, включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Определения
[0048] Терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации, а не для ограничения настоящего изобретения. В контексте настоящей заявки термины, используемые в единственном числе, включают также и множественное число, если из контекста ясно не следует обратное. Кроме того, в тех случаях, когда термины «включая», «включает», «имеющий», «имеет», «имеет в составе» или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, предполагается, что такие термины носят охватывающий характер, сходный с термином «содержащий».
[0049] Термин «приблизительно» или «примерно» означает значение в допустимых пределах ошибки для конкретной величины, как очевидно для специалиста в данной области техники, которая частично зависит от того, как измеряется или определяется значение, т.е. от ограничений системы измерений. Например, «приблизительно» может означать величину в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, в соответствии с принятой в данной области техники практикой. Как вариант, «приблизительно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5%, и еще более предпочтительно до 1% от заданного значения. Как вариант, особенно в отношении биологических систем или процессов, термин может означать порядок возрастания величин, предпочтительно в пределах 5-кратного возрастания, и более предпочтительно в пределах 2-кратного возрастания. При указании в настоящей заявке или формуле изобретения конкретных значений, если не указано иное, следует считать, что термин «приблизительно» охватывает величины внутри допустимого для конкретного значения интервала ошибок.
[0050] Используемый в настоящей заявке термин «иРНК» означает известный(е) на сегодняшний день иРНК транскрипт(ы) гена-мишени и любые транскрипты, которые могут быть обнаружены в дальнейшем.
[0051] Под «антисмысловыми олигонуклеотидами» или «антисмысловым соединением» подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (целевой РНК, ДНК). Например, если она представляет собой олигонуклеотид РНК, она связывается с другой целевой РНК посредством РНК-РНК взаимодействий и изменяет активность целевой РНК. Антисмысловой олигонуклеотид может повышающе или понижающе регулировать экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Указанное определение включает любые молекулы чужеродной РНК или ДНК, подходящие для целей терапии, диагностики или с любой другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, антисмысловые молекулы РНК или ДНК, интерферирующие РНК (РНКи), микроРНК, молекулы РНК-ловушек, миРНК, ферментативные РНК, терапевтические редактирующие РНК, РНК-агонисты и антагонисты, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), формы альтернативного сплайсинга, праймеры, зонды, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, такие соединения могут быть представлены в форме одноцепочечных, двуцепочечных, частично одноцепочечных, или кольцевых олигомерных соединений.
[0052] В контексте настоящего изобретения термин «олигонуклеотид» относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин «олигонуклеотид» также включает линейные или кольцевые олигомеры, состоящие из природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК), фосфоротиоатные, метилфосфонатные и т.п. Олигонуклеотиды способны специфически связываться с целевым полинуклеотидом посредством стандартных мономер-мономерных взаимодействий, таких как спаривание оснований по Уотсону-Крику, Хугстиновское или обратное Хугстиновское спаривание оснований или т.п.
[0053] Указанный олигонуклеотид может быть «химерным», то есть состоять из разнородных участков. В контексте настоящего изобретения «химерные» соединения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химических участка, например, участок(ки) ДНК, участок(ки) РНК, участок(ки) ПНК и т.д. Каждый химический участок состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где указанный олигонуклеотид модифицирован с целью приобретения одного или более необходимого свойства. Необходимые свойства указанного олигонуклеотида включают, например, но не ограничиваясь перечисленными: повышенную устойчивость к разложению нуклеазами, повышенное поглощение клетками и/или повышенную связывающую способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Различные участки указанного олигонуклеотида могут, таким образом, обладать различными свойствами. Указанные химерные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям.
[0054] Указанный олигонуклеотид может состоять из участков, которые могут быть связаны по «порядку», то есть мономеры связаны последовательно, как в нативной ДИК; или связаны через спейсеры. Спейсеры предназначены для формирования ковалентного «мостика» между указанными участками и имеют длину не более чем приблизительно 100 атомов углерода. Указанные спейсеры могут обладать различными функциональными свойствами, например, нести положительный или отрицательный заряд, иметь специфические для связывания нуклеиновых кислот особенности (интеркаляторы, связыватели бороздки, токсины, флуорофоры и т.д.), быть липофильными, включать особые вторичные структуры, например, аланин-содержащие пептиды, включающие альфа-спирали.
[0055] Используемые в настоящей заявке термины «Сиртуины (SIRT)» включают все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.
[0056] Используемые в настоящей заявке термины сиртуин 1, SIRT1, молчащий регулятор информации о типе спаривания 2 - гомолог 1, hSIR2, hSIRT1, НАД-зависимой деацетилазы сиртуин-1, SIR2L1, SIR2-подобный белок 1, в литературе считаются эквивалентными и применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0057] Используемые в настоящей заявке термины сиртуин 2, сиртуин-2, SIRT2, SIR2L и SIR2L2, в литературе считаются эквивалентными и применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0058] Используемые в настоящей заявке термины «Сиртуин 3», сиртуин 3, сиртуин-3, SIRT3, SIRT-3, hSIRT3, НАД-зависимой деацетилазы сиртуин-3, митохондриальный, SIR2L3, SIR2-подобный белок 3 применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0059] Используемые в настоящей заявке термины сиртуин4, SIRT4, MGC130046, MGC130047, MGC57437, НАД-зависимой АДФ-рибозилтрансферазы сиртуин-4, SIR2L4, SIR2-подобный белок 4, в литературе считаются эквивалентными и применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0060] Используемые в настоящей заявке термины сиртуин 5, SIRT5, FLJ36950, НАД-зависимой деацетилазы сиртуин-5, SIR2L5, SIR2-подобный белок 5, в литературе считаются эквивалентными и применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0061] Используемые в настоящей заявке термины «Сиртуин 6», сиртуин 6, сиртуин-6, SIRT6, SIRT-6, НАД-зависимой деацетилазы сиртуин-6, SIR2L6, SIR2-подобный белок 6 в литературе считаются эквивалентными и применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0062] Используемые в настоящей заявке термины сиртуин 7, SIRT7, MGC 126840, MGC 126842, НАД-зависимой деацетилазы сиртуин-7, SIR2L7, SIR2-подобный белок 7 в литературе считаются эквивалентными и применяются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0063] Используемый в настоящей заявке термин «олигонуклеотид, специфичный для» или «олигонуклеотид, нацеленный на» относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную формировать стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом иРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность указанных комплексов и дуплексов может быть определена посредством теоретических расчетов и/или in vitro анализов. Типовые способы анализа для определения стабильности гибридизации комплексов и дуплексов описаны в Примерах ниже.
[0064] Используемый в настоящей заявке термин «целевая нуклеиновая кислота» включает ДНК, РНК (включая пре-мРНК и иРНК), транскрибированные с таких ДНК, а также кДНК, полученные с помощью таких РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование указанной нуклеиновой кислоты. Такая модуляция функции целевой нуклеиновой кислоты посредством соединений, которые специфически гибридизуются с ней, обычно называется «антисмысловой». Изменяемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Изменяемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК в сайт трансляции белка, трансляция белка из указанной РНК, сплайсинг указанной РНК с получением одного или более вида иРНК, и каталитическая активность, с которой может быть связана указанная РНК, либо которой она может способствовать. Общим эффектом от такого изменения функции целевой нуклеиновой кислоты является модуляция экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.
[0065] РНК-интерференция «РНКи» опосредована молекулами двуцепочечной РНК (дцРНК), которые обладают сиквенс-специфичной гомологией с «целевыми» последовательностями нуклеиновых кислот. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанные посредники представляют собой дуплексы 5-25-нуклеотидных «малых интерферирующих» РНК (миРНК). Указанные миРНК синтезируются при процессинге дцРНК ферментом-РНКазой, известным как дайсер. Дуплексные продукты миРНК входят в состав мульти-белкового миРНК-содержащего комплекса, называемого RISC (PHK-индуцируемый комплекс сайленсинга). Без связи с какой-либо конкретной теорией, предполагается, что RISC переносится к целевой нуклеиновой кислоте (подходит иРНК), где указанный миРНК-дуплекс взаимодействует с ней сиквенс-специфичным образом, опосредуя каталитическое расщепление. Малые интерферирующие РНК, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и использованы в соответствии с известными в данной области техники методиками, знакомыми специалистам в данной области техники. Для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, подходят малые интерферирующие РНК, включающие от приблизительно 1 до приблизительно 50 нуклеотидов (нт). Согласно неограничивающим примерам реализации миРНК могут содержать от приблизительно 5 до приблизительно 40 нт, от приблизительно 5 до приблизительно 30 нт, от приблизительно 10 до приблизительно 30 нт, от приблизительно 15 до приблизительно 25 нт, или приблизительно 20-25 нуклеотидов.
[0066] Отбор подходящих олигонуклеотидов выполняют с применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, из баз данных, таких как GenBank, или секвенированием продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот различных видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, которым свойственна необходимая степень межвидовой идентичности. Для генов, которые не были секвенированы, выполняют саузерн-блоттинг, что позволяет провести определение степени идентичности генов у целевого вида и у других видов. Проводя саузерн-блоттинг в условиях различной степени жесткости, согласно известным в данной области техники методикам, возможно с достаточной точностью определить степень идентичности. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов, проявляющих значительную степень комплементарности целевым последовательностям нуклеиновых кислот регулируемого объекта, и более низкую степень комплементарности соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот из других видов. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения в настоящем изобретении.
[0067] Под «ферментативной РНК» подразумевается молекула РНК с ферментативной активностью Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) сначала связываются с целевой РНК. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает, а потом связывается с целевой РНК посредством спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК.
[0068] Под «РНК-ловушкой» подразумевается молекула РНК, имитирующая природный лиганд-связывающий домен. Указанная РНК-ловушка, таким образом, конкурирует с природной мишенью связывания специфического лиганда. Например, показано, что сверхэкспрессия РНК трансактивируемого регуляторного элемента (TAR) ВИЧ может функционировать в качестве «ловушки» и эффективно связывает tat белок ВИЧ, предотвращая таким образом его связывание с TAR-последовательностями, кодируемыми ВИЧ-РНК. Такой пример является частным. Специалистам в данной области техники будет понятно, что это всего лишь пример, и другие варианты реализации легко могут быть осуществлены с применением общеизвестных в данной области техники методик.
[0069] Используемый в настоящей заявке термин «мономеры» обычно означает мономеры, связанные фосфодиэфирными связями или их аналогами с образованием олигонуклеотидов, варьирующих в размерах от нескольких мономерных единиц, например, приблизительно 3-4, до приблизительно нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают: фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфорнаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п., более подробно описанные ниже.
[0070] Термин «нуклеотид» охватывает нуклеотиды природного происхождения, а также нуклеотиды, не встречающиеся в природе. Для специалиста в данной области очевидно, что различные нуклеотиды, ранее считавшиеся «не встречающимися в природе» впоследствии были найдены в природе. Таким образом, термин «нуклеотиды» включает не только известные молекулы, содержащие пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративные примеры других типов нуклеотидов представлены молекулами, содержащими аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этанцитозин, N6,N6-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(C3-C6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолопиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и «не встречающиеся в природе» нуклеотиды, описанные в патенте США 5432272. Под термином «нуклеотид» подразумеваются все и каждый из приведенных примеров, а также их аналоги и таутомеры. Особенный интерес представляют нуклеотиды, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые считаются нуклеотидами природного происхождения, в отношении терапевтического и диагностического применения у человека. Нуклеотиды включают природные 2’-дезокси и 2’-гидроксил-сахара, например, согласно описанию в Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), а также их аналоги.
[0071] Термин «аналоги» в отношении нуклеотидов включает синтетические нуклеотиды, содержащие фрагменты с модифицированными основаниями и/или модифицированные фрагменты Сахаров. Такие аналоги включают синтетические нуклеотиды, сконструированные с целью увеличения связывающей способности, например, стабильности дуплексов или триплексов, специфичности или т.п.
[0072] В контексте настоящей заявки «гибридизация» означает спаривание в значительной степени комплементарных цепей олигомерных соединений. В одном из механизмов спаривания задействованы водородные связи, которые могут представлять собой водородные связи по Уотсону-Крику, Хугстиновские или обратные Хугстиновские водородные связи, между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеотидами) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин представляют собой комплементарные нуклеотиды, спаривающиеся при помощи водородных связей. Гибридизация может происходить при различных условиях.
[0073] Антисмысловое соединение является «специфически гибридизуемым», если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[0074] В контексте настоящей заявки выражение «гибридизация в жестких условиях» или «жесткие условия» относится к условиям, при которых соединение, предложенное в настоящем изобретении, будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью и минимальным числом других последовательностей. Жесткие условия зависят от последовательностей и различаются в зависимости от обстоятельств; в контексте настоящего изобретения, «жесткие условия», при которых олигомерные соединения гибридизуются с целевой последовательностью, определяются природой и составом олигомерных соединений и методиками анализа, применяемыми для их исследования. Как правило, при гибридизации в жестких условиях используются низкие концентрации (<0,15М) солей с неорганическими катионами, такими как Na++ или K++ (т.е. с низкой ионной силой), температуры выше 20°C-25°C, но ниже температуры плавления комплекса указанного олигомерного соединения с целевой последовательностью, и присутствие денатурантов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид, или детергента додецилсульфата натрия (SDS). Например, скорость гибридизации снижается на 1,1% на каждый 1% формамида. Примером жестких условий гибридизации является 0,1X цитратно-солевой буфер (SSC)/0,1% (вес/объем) SDS при 60°C в течение 30 минут.
[0075] Используемый в настоящей заявке термин «комплементарный» относится к способности к точному спариванию двух нуклеотидов на одной или двух олигомерных цепях. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородные связи с нуклеиновым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, и при этом указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, РНК или олигонуклеотидную молекулу, тогда это положение водородной связи между указанным олигонуклеотидом и указанной целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным положением. Указанное олигомерное соединение и другая ДНК, РНК или олигонуклеотидная молекула комплементарны друг другу, если достаточное количество комплементарных положений в каждой молекуле заняты нуклеотидами, способными образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, термины «специфически гибридизуемый» и «комплементарный» используются для обозначения достаточной степени точности спаривания или комплементарности достаточного количества нуклеотидов обеспечивающих стабильное и специфическое связывание указанного олигомерного соединения и целевой нуклеиновой кислоты.
[0076] Специалистам в данной области техники будет понятно, что последовательность олигомерного соединения необязательно должна быть на 100% комплементарна последовательности ее целевой нуклеиновой кислоты, чтобы быть специфически гибридизуемой. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментом таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в гибридизации (например, петлеобразные структуры, некомплементарные или шпилькообразные структуры). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению содержат последовательности, по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 99% комплементарные целевому участку в составе целевой последовательности нуклеиновой кислоты, на которую они нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов указанного антисмыслового соединения комплементарны целевому участку, и которое, таким образом, будет специфически гибридизоваться, комплементарно на 90%. В данном примере остающиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть объединены или рассеяны между комплементарными нуклеотидами и не обязательно соседствуют друг с другом или с комплементарными нуклеотидами. Соответственно, антисмысловое соединение, составляющее в длину 18 нуклеотидов, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, фланкированное двумя участками с полной комплементарностью целевой нуклеиновой кислоте, будет обладать 77,8% общей комплементарности целевой нуклеиновой кислоте и, таким образом, будет входить в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с участком целевой нуклеиновой кислоты может быть определен по стандартной методике с применением программ BLAST (средств поиска основного локального выравнивания) и PowerBLAST, известных в данной области техники. Процент гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности может быть определен, например, при помощи программы Gap.
[0077] Используемый в настоящей заявке термин «температура плавления» относится к температуре, при определенной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных целевой последовательности, равновесно гибридизуются с целевой последовательностью. Как правило, жесткими условиями являются такие условия, при которых концентрация солей составляет по меньшей мере приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при pH 7,0-8,3 и температуре по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких олигонуклеотидов (например, из 10-50 нуклеотидов). Жесткие условия могут также достигаться посредством добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
[0078] В контексте настоящей заявки «модулирование» означает либо повышение (стимуляцию), либо снижение (ингибирование) экспрессии гена.
[0079] Термин «вариант» при использовании в отношении полинуклеотидной последовательности может охватывать полинуклеотидные последовательности, родственные генам дикого типа. Это определение может также включать, например, «аллельные,» «сплайс-» «видовые» или «полиморфные» варианты. Сплайс-вариант может обладать значительной степенью идентичности с шаблонной молекулой, но, как правило, состоит из большего или меньшего числа полинуклеотидов в результате альтернативного сплайсинга экзонов при процессинге иРНК. Соответствующий полипептид может включать дополнительные функциональные домены, или какие-то домены могут отсутствовать. Видовые варианты представляют собой полинуклеотидные последовательности, отличающиеся у разных видов. Особенно подходят для применения в настоящем изобретении варианты продуктов гена дикого типа. Варианты могут быть получены в результате по меньшей мере одной мутации в последовательности нуклеиновой кислоты и могут приводить к изменениям в иРНК или полипептидов, структура которых может быть изменена или не изменена. Любой природный или рекомбинантный ген может иметь ни одной, иметь одну или множество аллельных форм. Стандартные мутационные изменения, которые приводят к возникновению вариантов, как правило, происходят в результате природных делеций, добавлений или замен нуклеотидов. Каждое из таких изменений может происходить отдельно или в комбинации с другими, однократно или многократно в определенной последовательности.
[0080] Получаемые полипептиды, как правило, обладают значительной степенью идентичности аминокислотного состава. Полиморфный вариант представляет собой вариацию полинуклеотидной последовательности конкретного гена у индивидуумов определенного вида. Полиморфные варианты также могут включать «однонуклеотидные полиморфы» (снипы) или мутации одиночных оснований, в которых указанная полинуклеотидная последовательность отличается одним основанием. Присутствие снипов может свидетельствовать, например, о конкретной популяции с определенной склонностью к болезни, то есть предрасположенностью относительно сопротивляемости.
[0081] Производные полинуклеотидов включают нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, с заменой водорода на алкильную, ацильную или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотидов, могут содержать не встречающиеся в природе фрагменты, такие как видоизмененные фрагменты сахара или внутрисвязанные сахара. Типовыми являются фосфоротиоат и другие серосодержащие виды, известные в данной области техники. Производные нуклеиновых кислот могут также содержать метки, включая радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные агенты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы, и т.п.
[0082] - «Производное» полипептида или пептида представляет собой полипептид или пептид, модифицированный, например, гликозилированием, пегилированием, фосфорилированием, сульфатированием, восстановлением/алкилированием, ацилированием, реакцией сочетания или мягкой обработкой формалином. Производное может также быть модифицировано таким образом, чтобы содержать детектируемую метку, прямо или непрямо, включая, но не ограничиваясь перечисленными, радиоизотопные, флуоресцентные и ферментные метки.
[0083] Используемый в настоящей заявке термин «животное» или «пациент» включает, например, человека, овцу, вапити, оленя, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадь, рогатый скот, свинью, коз, собаку, кошку, крысу, мышей, птиц, кур, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.
[0084] Под «млекопитающими» понимаются теплокровные животные, как правило, получающие медицинскую помощь (например, люди и одомашненные животные). Примеры включают кошку, собаку, лошадь, крупный рогатый скот и человека, а также только человека.
[0085] «Лечение» относится к лечению болезненного состояния у млекопитающего, и включает: (а) предотвращение наступления болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к болезни, но еще не имеет соответствующего диагноза; (b) подавление болезненного состояния, например, остановку его развития; и/или (с) облегчение болезненного состояния, например, регрессия болезненного состояния до достижения нужной стадии. Лечение также включает смягчение симптомов заболевания (например, уменьшение боли или дискомфорта), причем такое смягчение может оказывать или не оказывать влияние на течение болезни (например, причину, передачу, проявления, и т.д.).
[0086] Используемый в настоящей заявке термин «рак» относится ко всем типам раковых заболеваний, новообразований или злокачественных опухолей млекопитающих, включая, но не ограничиваясь перечисленными: лейкемию, лимфому, меланому, карциному и саркому. Указанный рак проявляется в виде «опухоли» или ткани, содержащей злокачественные клетки указанного рака. Примеры опухолей включают саркомы и карциномы, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак груди, рак яичников, рак простаты, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальной железы, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемунгиобластому, нейрому слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и ретинобластому. Дополнительные виды рака, при лечении которых может быть применена композиция согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак груди, рак яичников, рак легких, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легких, первичные опухоли мозга, рак желудка, рак прямой кишки, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, злокачественную карциноидную опухоль, рак мочевого пузыря, предраковые повреждения кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, эзофагеальный рак, рак урогенитального тракта, злокачественную гиперкальциемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак простаты.
[0087] Термин «неврологические заболевания или расстройства» относится к любому заболеванию или расстройству нервной системы и/или зрительной системы. Термин «неврологические заболевания или расстройства» включает заболевания или расстройства, которые охватывают центральную нервную систему (головной мозг, ствол головного мозга и мозжечок), периферическую нервную систему (включая черепно-мозговые нервы) и вегетативную нервную систему (части которой расположены как в центральной, так и в периферической нервной системе). Примеры неврологических расстройств включают без ограничений головную боль, ступор и кому, деменцию, судороги, нарушения сна, травму, инфекции, новообразования, нейроофтальмологические нарушения, нарушения подвижности, димиелинизирующие заболевания, заболевания спинного мозга и заболевания периферических нервов, мышц и нервно-мышечных соединений. Зависимость и психические заболевания, которые включают без ограничений биполярные расстройства и шизофрению, также входят в определение неврологического расстройства. Ниже представлен перечень некоторых неврологических расстройств, симптомов, признаков и синдромов, которые можно лечить при помощи композиций и способов согласно настоящему изобретению: приобретенная эпилептиформная афазия; острый рассеянный энцефаломиелит; адренолейкодистрофия; возрастная дегенерация желтого пятна; врожденное недоразвитие мозолистого тела; агнозия; синдром Экарди; болезнь Александера; синдром Альперса; альтернирующая гемиплегия; сосудистая деменция; боковой амиотрофический склероз; анэнцефалия; синдром Ангельмана; ангиоматоз; аноксия; афазия; апраксия; арахноидальная киста; арахноидит; врожденный порок Арнольда-Киари; артерио-венозная мальформация; Синдром Аспергера; атаксия-телеангиэктазия; синдром дефицита внимания с гиперактивностью; аутизм; вегетативная дисфункция; боль в спине; болезнь Баттена; болезнь Бехчета; неврит лицевого нерва; доброкачественный идиопатический блефароспазм; доброкачественная очаговая амиотрофия; доброкачественная внутричерепная гипертензия; Болезнь Бинсвангера; блефароспазм, синдром Блоха-Сульцбергера, травма плечевого сплетения, абсцесс головного мозга, травма головного мозга, опухоли головного мозга (включая мультиформную глиобластому); опухоль спинного мозга, синдром Броун-Секара, болезнь Канавана, синдром канала запястья, каузалгия, таламический синдром, центральный миелинолиз моста; расстройства головного мозга; атеросклероз головного мозга; атрофия головного мозга; церебральный гигантизм; корковый паралич; амиотрофия Шарко-Мари-Тута; вызванная химиотерапией невропатия и невропатическая боль; мальформация Киари; хорея; хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия; хроническая боль; синдром хронической региональной боли; синдром Коффина-Лоури; кома, включая стойкое вегетативное состояние; врожденная лицевая диплегия; кортико-базальная дегенерация; гигантоклеточный артериит; краниосиностоз; болезнь Крейтцвельда-Якоба; кумулятивные травматические расстройства; синдром Кушинга; цитомегаловирнусная болезнь; цитомегаловирнусная инфекция; синдром «танцующие глаза-танцующие ноги»; синдром Денди-Уокера; болезнь Доусона; синдром де Морсье; паралич Дежерин-Клюмпке; деменция; дерматомиозит; диабетическая невропатия; рассеянный склероз; вегетативная дистония; дизграфия; дизлексия; дистонии; ранняя младенческая эпилептическая энцефалопатия; синдром пустого турецкого седла; энцефалит; мозговые грыжи; энцефалотригеминальный ангиоматоз; эпилепсия; болезнь Эрба; эссенциальное дрожание; диффузная ангиокератома туловища; Синдром Фара; обмороки; наследственный спастический паралич; фебрильные судороги; синдром Фишера; наследственная атаксия Фридрейха; лобно-височная деменция и другие «тауопатии»; болезнь Гоше; синдром Герстманна; гигантоклеточный артериит; гигантоклеточная цитомегалия; глобоидно-клеточная лейкодистрофия; синдром Джулиана-Барре; ассоциированная с HTLV-1 (вирус человеческого T-клеточного лейкоза) миелопатия; болезнь Галлервордена-Шпатца; травмы головы; головная боль; гемифациальный спазм; наследственная параплегия; атаксическая гетеродопатия с полиневритом; синдром Ханта; опоясывающий лишай; болезнь Хираямы; ВИЧ-ассоциированная деменция и невропатия (также неврологические проявления ВИЧ); аринэнцефалия; болезнь Хантингтона и другие болезни полиглутаминовых повторов; гидроанэнцефалия; водянка головного мозга; повышенный уровень кортизона; гипоксия; иммуно-опосредованный энцефаломиелит; миозит с включенными тельцами; синдром недержания пигмента; младенческая болезнь накопления фитановой кислоты; младенческая болезнь Рефсума; младенческие судороги; воспалительная миопатия; внутричерепные кисты; внутричерепная гипертензия; синдром Жубера; синдром Кимс-Сэйри; синдром Кеннеди; болезнь Кинсбоума; синдром Клиппеля-Фейля; болезнь Крабе; болезнь Кугельберга-Веландера; куру; болезнь Лафора; миастенический синдром Итона-Ламберта; Синдром Ландау-Клеффнера; латеральный спинномозговой синдром (Валленберга); необучаемость; болезнь Ли; синдром Леннокса - Гасто; синдром Леша-Найхана; лейкодистрофия; болезнь диффузных телец Леви; лиссэнцефалия; бодрствующая кома; болезнь Лу-Герига (т.е. болезнь двигательных нейронов или боковой амиотрофический склероз); болезнь дисков поясничного отдела; неврологические последствия болезни Лайма; болезхнь Мачадо-Джозефа; макроэнцефалия; мегалэнцефалия; синдром Мелькерссона-Розенталя; болезнь Меньера; менингит; болезнь Менкеса; метахроматическая лейкодистрофия; микроцефалия; мигрень; синдром Миллера-Фишера; мини-инсульты; митохондриальные миопатии; синдром Мебиуса; мономелическая амиотрофия; заболевания двигательных нейронов; болезни мойямойя; мукополисахаридозы; деменция при множественном инфаркте; мноочаговая двигательная невропатия; множественный склероз и другие демиелинизирующие заболевания; множественная системная атрофия с постуральной гипотензией; мышечная дистрофия; тяжелая псевдопаралитическая миастения; миелинокластический рассеянный склероз; миоклоническая энцефалопатия младенцев; миоклонические судороги; миопатия; миотония врожденная; нарколепсия; нейрофироматоз; злокачественный нейролептический синдром; неврологические проявления СПИДа; неврологические последствия системной красной волчанки; нейромиотония; неврональный цероид-липофусциноз; нарушения нейрональной миграции; болезнь Ниманна-Пика; синдром О’Салливан-МакЛеода; затылочная невралгия; последствия скрытой дизрафии спинного мозга; синдром Отахара; оливопонтоцеребеллярная атрофия; опсоклонус-миоклонус; неврит зрительного нерва; ортостатическая гипотензия; синдром злоупотребления; парестезия; нейродегенеративные заболевания или расстройства (болезнь Паркинсона; болезнь Хантингтона; болезнь Альцгеймера; боковой амиотрофический склероз (БАС); деменция; множественный склероз и другие заболевания и расстройства, связанные с гибелью нейронов); врожденная парамиотония; паранеопластический синдром; пароксизмальные приступы; синдром Парри-Ромберга; болезнь Пелицеуса-Мерцбахера; периодические параличи; периферическая невропатия; болезненная невропатия и невропатическая боль; стойкое вегетативное состояние; общее расстройство развития; световой чихательный рефлекс; болезнь накопления фитановой кислоты; атрофия Пика; защемление нерва; опухоли гипофиза; полимиозит; порэнцефалия; постполиосиндром; постгерпетическая невралгия; послеинфекционный энцефаломиелит; ортостатическая гипотензия; синдром Прадера-Вилли; первичный латеральный склероз; прионные болезни; прогрессирующая гемифациальная атрофия; прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия; прогрессирующая склерозирующая полиодистрофия; прогрессирующий надъядерный паралич; псевдоопухоль мозжечка; синдром Рамсея-Ханта (I и II типа); энцефалит Расмуссена; синдром дистрофической рефлекторной дистрофии; болезнь Рефсума; расстройства множественных движений; "туннельный синдром"; синдром беспокойных ног; ассоциированная с ретровирусами миелопатия; синдром Ретта; синдром Рейе; пляска святого Витта; болезнь Сандхоффа; болезнь Шильдера; шизэнцефалия; септо-оптическая дисплазия; синдром тряски младенца; опоясывающий лишай; синдром Шая-Дрейджера; синдром Сегрена; апное во время сна; синдром Сотоса; мышечная спастичность; расщелина позвоночника; опухоли спинного мозга; спинальная мышечная атрофия; синдром мышечной скованности; инсульт; синдром Стерджа-Вебера; подострый склерозирующий лейкоэнцефалит; субкортикальная артериосклеротическая энцефалопатия; хорея Сиденгама; обморок; сирингомиелия; поздняя дискинезия; болезнь Тея-Сакса; височный артериит; скрытая дизрафия спинного мозга; болезнь Томсена; компрессионный синдром верхней апертуры грудной клетки; невралгия тройничного нерва; паралич Тодда; синдром Туррета; преходящее нарушение мозгового кровообращения; трансмиссивные губчатые энцефалопатии; поперечный миелит; травматическое поражение головного мозга; тремор; невралгия тройничного нерва; тропический спастический парапарез; туберозный склероз; сосудистая деменция (мультиинфарктная деменция); васкулиты, включая висоный артериит; болезнь фон Гиппеля-Линдау; синдром Валленберга; болезнь Вердинг-Гоффмана; синдром Веста; хлыстовая травма; синдром Уильямса-Бойрена; болезнь Вильдона и синдром Целлвегера.
[0088] Термин «заболевание обмена веществ» относится к широкому спектру заболеваний и расстройств эндокринной системы, включая, например, резистентность к инсулину, виды диабета, ожирение, нарушение переносимости глюкозы, высокий уровень холестерина в крови, гипергликемию, дизлипидемию и гиперллипидемию.
[0089] Термин «воспаление» относится к системным воспалительным патологическим состояниям и состояниям, ассоциированным локально с миграцией и аттракцией моноцитов, лейкоцитов и нейтрофилов. Примеры воспаления включают без ограничений воспаление, возникающее вследствие инфицирования патогенными организмами (включая грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, вирусы, грибы и паразитов, таких как простейшие и гельминты), отторжения трансплантата (включая отторжение паренхиматозных органов, таких как почки, печень, легкие или роговица, а также отторжение трансплантатов костного мозга, включая реакцию «трансплантант против хозяина» (РТПХ)) или вследствие локализованных хронических или острых аутоиммунных реакций. Аутоиммунные заболевания включают острый гломерулонефрит; ревматоидный или реактивный артрит; хронический гломерулонефрит; воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, язвенный колит и некротизирующий энтероколит; синдромы, ассоциированные с переливанием гранулоцитов; воспалительные дерматозы, такие как контактный дерматит, атопический дерматит, псориаз; системная красная волчанка (СКВ), аутоиммунный тиреоидит, множественный склероз и некоторые формы диабета, или любые другие аутоиммунные состояния, при которых атаки собственной иммунной системы пациента приводит к патологическому разрушению ткани. Аллергические реакции включают аллергическую астму, хронический бронхит, гиперчувствительность острого и замедленного типа. Системные воспалительные заболевания включают воспаление, ассоциированное с травмой, ожоги, реперфузией после ишемических событий (т.е. событий тромбоза в сердце, головном мозге или периферических сосудах, включая инфаркт миокарда и инсульт), сепсис, синдром острой дыхательной недостаточности или синдром органной недостаточности. Привлечение воспалительных клеток также происходит в атеросклеротических бляшках. Воспаление включает без ограничений не-ходжкинскую лимфому, гранулематоз Вегенера, тиреоидит Хашимото, печеночно-клеточный рак, атрофию вилочковой железы, хронический панкреатит, ревматоидный артрит, реактивную лимфоидную гиперплазию, остеоартрит, язвенный колит, папиллярную карциному, болезнь Корна, язвенный колит, острый холецистит, хронический холецистит, цирроз, хронический сиаладенит; перитонит, острый панкреатит, хронический панкреатит, хронический гастрит, аденомиоз, эндометриоз, острый цервицит, хронический цервицит, лимфоидная гиперплазия, множественный склероз, гипертрофия, вторичная по отношению к геморрагической пурпуре, первичную Ig A-нефропатию, системную красную волчанку, псориаз, эмфизему легких, хронический пиелонефрит и хронический цистит.
[0090] Термин «сердечно-сосудистое заболевание или расстройство» включает расстройства, которые либо могут вызывать ишемию, или вызваны реперфузией сердца. Примеры включают без ограничений атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, гранулематозный миокардит, хронический миокардит (не-гранулематозный), первичную гипертрофическую кардиомиопатию, заболевание периферических артерий (ЗПА), инсульт, стенокардию, инфаркт миокарда, повреждение сердечно-сосудистой ткани вследствие остановки сердца, повреждение сердечно-сосудистой ткани вследствие сердечного шунтирования, кардиогенный шок, и близкие патологические состояния, которые могут быть известны специалистам в данной области техники, или которые подразумевают дисфункцию сердца или повреждение ткани сердца или сосуды, в частности, не без ограничения, повреждение ткани, связанное с активацией сиртуина 3. CC заболевания включают без ограничений атеросклероз, гранулематозный миокардит, инфаркт миокарда, фиброз миокарда, вторичный по отношению к порокам клапанов сердца, фиброз миокарда без инфаркта, первичную гипертрофическую кардиомиопати и хронический миокардит (не-гранулематозный).
Композиции и молекулы полинуклеотидов и олигонуклеотидов
[0091] Мишени (целевые последовательности): Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот сиртуина (SIRT), включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с сиртуином (SIRT).
[0092] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT1, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT1.
[0093] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT2, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT2.
[0094] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT3, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT3.
[0095] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT4, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT4.
[0096] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT5, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT5.
[0097] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT6, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT6.
[0098] Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот SIRT7, включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном SIRT7.
[0099] Термин «белок SIRT1» относится к члену семейства сиртуин-ацетилаз sir2. Согласно одному из вариантов реализации белок SIRT1 включает Sir2 дрожжей (№ доступа в GenBank 53685), Sir-2.1 С.elegans (№ доступа в GenBank NP.sub. - 501912), SIRT1 человека (№ доступа в GenBank NM.sub - 012238 и NP.sub. - 036370 (или AF083106)).
[00100] «Ситруины» SIRT1 представляют собой белки, которые включают домен SIR2, домен, определяемый как последовательности аминокислот, которые оцениваются как попадания в Pfam-семейства «SIR2» - PF02146 (присоединено к Приложению). В базе данных INTERPRO на данное семейство есть ссылка в виде описания INTERPRO (вход IPR003000). Для идентификации наличия домена «SIR2» в последовательности белка и для определения того, что рассматриваемый полипептид или белок обладает конкретным профилем, последовательность аминокислот в белке можно искать в базе данных Pfam НММ (например, база данных Pfam, выпуск 9) с применением параметров по умолчанию (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). Домен SIR2 в базе данных Pfam идет под индексом PF02146, а в базе данных INTERPRO под описанием INTERPRO (вход IPR003000). Описание базы данных Pfam можно найти в "The Pfam Protein Families Database" Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 and Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3): 405-420, а подробное описание НММ можно найти, например, в Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183: 146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 1501-1531; and Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2: 305-314.
[00101] Среди митохондриальных сиртуинов, SIRT3 обладает мощной деацетилазной активностью. Действительно, значительно более высокий уровень ацетилирования митохондриальных белков в печени мышей с нулевым SIRT3 по сравнению с мышами, нокаутными по SIRT4 или SIRT5. однако мало что известно о физиологической роли SIRT3, несмотря на тот факт, что было идентифицировано несколько субстратов SIRT3: ацетилКоА-синтетаза 2, Ku70, FOXO3a, 9 субъединица митохондриального комплекса I (NDUFA9), глутаматдегидрогеназа и изоцитратдегидрогеназа 2.
[00102] SIRT3 является основной митохондриальной деацетилазой. Митохондриальные белки демонстрируют гиперацетилирование у мышей, нокаутных по SIRT3, но не у мышей, нокаутных по SIRT4 или SIRT5. Ацетил-КоА-синтетаза (AceCS2) - митохондриальный фермент, который превращает ацетат в ацетил-КоА, был первым идентифицированным митохондриальным субстратом SIRT3. Деацетилирование AceCS2 по лизину-642 при участии SIRT3 приводит к активации ацетил-КоА-синтетазы, что приводит к увеличению поступления ацетил-КоА в цикл трикарбоновых кислот. Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) - другой митохондриальный белок, участвующий в выработке энергии, деацитилируется с участием SIRT3. ГДГ также может АДФ-рибозилироваться с участием SIRT4, что в свою очередь приводит к снижению активности указанного фермента. Это указывает на то, что SIRT3 может играть важную роль в метаболизме клетки. Также было показано, что SIRT3 участвует в путях селективного апоптоза и контроля роста клеток. Было показано участие SIRT3 и SIRT4, но не SIRT5, в пути реутилизации НАД+, который регулирует уровень НАД+, имеющий отношение к выживанию клеток. Кроме того, была установлена связь между вариабельностью гена hSIRT3 и долголетием у человека.
[00103] Ген регулятора «молчащей» информации -2 (Sir2) кодирует НАД-зависимую деацетилазу гистонов, которая связана с регуляцией хроматина, стабильностью генома и продолжительностью жизни у S. cerevisiae. Обеспечивая «молчание» хроматина, Sir2 ингибирует транскрипцию в нескольких генетических локусах и угнетает рекомбинацию на повторах рибосомальной ДНК (рДНК). Дрожжи с мутациями в гене Sir2, обладают повышенной нестабильностью генома в контексте рекомбинации рДНК, которая в свою очередь укорачивает репликативную продолжительность жизни - маркер репродуктивной зрелости у данного организма. Напротив, экстракопии Sir2, которые подавляют рекомбинацию рДНК, увеличивают репликативную продолжительность жизни. Указанные эффекты Sir2 подтверждают парадигму, согласно которой гены, способствующие стабилизации генома посредством модуляции хроматина, могут вносить важный вклад в регуляцию продолжительности жизни, старения организма и возрастных патологий.
[00104] В согласии с консервативной ролью факторов Sir2 в регуляции продолжительности жизни, повышенная активность белков Sir2 в многоклеточных организмах С.elegans и D.Melanogaster также приводит к увеличению продолжительности жизни. Однако указанные факторы Sir2 могут действовать посредством механизмов, которые не зависят от стабилизации генома, и их физиологические молекулярные субстраты все еще не известны. У млекопитающих существует семь членов семейства Sir2, SIRT1-SIRT7. К SIRT был проявлен большой интерес как к кандидатам в регуляторы продолжительности жизни млекопитающих и процессов, связанных со старением. В данном контексте несколько SIRT млекопитающих выполняют функции, влияющие на ассоциированные со старением молекулярные пути и заболевания. Однако первые исследования SIRT млекопитающих показали связь между указанными ферментами и биохимическими мишенями, а также позволили выявить клеточные функции, которые отличаются от функций Sir2 S.Cerevisiae.
[00105] Сиртуины гомологичны репрессору транскрипции дрожжей Sir2p и остаются консервативными от бактерий до человека. SIRT4 человека локализован в митохондриях. SIRT4 представляет собой белок матрикса и после импорта в митохондрию подвергается расщеплению по аминокислоте 28. Масс-спектрометрический анализ белков, которые образуют иммунопреципитат с SIRT4, позволил выявить разрушающий инсулин фермент и белки-переносчики АДФ/АТФ, ANT2 и ANT3. SIRT4 не проявляет деацитилирующей активности в отношении гистонов, но действует как эффективная АДФ-рибозилтрансфераза в отношении гистонов и бычьевого сывороточного альбумина. SIRT4 экспрессируется в островках Лангерганса и колокализован с экспрессирующими инсулин β-клетками. Истощение запасов SIRT4 в инсулин-продуцирующих клетках INS-1У приводит к повышению секреции инсулина в ответ на глюкозу.
[00106] Сиртуин (гомолог молчащего регулятора информации о типе спаривания-2) 5 (S.cerevisiae), также называемый SERT5, представляет собой белок, который у людей кодируется геном SIRT5, а у других видов - Sirt5, Указанный ген кодирует член семейства белков сиртуинов - гомологов белка Sir2 дрожжей. Члены семейства сиртуинов характеризуются сиртуиновым центральным доменом и подразделяются на четыре класса. Функции сиртуинов человека еще не определены; однако известно, что белки сиртуины у дрожжей регулируют эпигенетическое молчание генов и подавляют рекомбинацию рДНК. Результаты исследований указывают на то, что сиртуины человека могут действовать как внутриклеточные регуляторные белки с моно-АДФ-рибозилтрансферазной активностью. Белок, кодируемый указанным геном, включен в III класс семейства сиртуинов. Альтернативный сплайсинг указанного гена приводит к образованию двух вариантов транскриптов.
[00107] Генерирование мышей, дефектных по гену SIRT6 млекопитающих, позволило выявить потенциальную роль SIRT6 в регуляцию продолжительности жизни, стабильности хроматина и генома. В данном контексте дефект SIRT6 у мышей приводит к существенному сокращению продолжительности жизни и фенотипам с резкой дегенерацией, которые перекрываются с патологиями, характерными для преждевременного старения. Кроме того, мыши с нокаутированным геном SIRT6 характеризуются нестабильностью генома и гиперчувствительностью ДНК к повреждениям. При анализе с биохимическим фракционированием белок SIRT6 ассоциирован преимущественно с богатой хроматином клеточной фракцией. В совокупности указанные результаты указывают на то, что SIRT6 может сочетать регуляцию хроматина с репарацией ДНК. Однако физиологическая роль SIRT6 в таком процессе еще продемонстрирована не была.
[00108] Недавно было сделано предположение, что сиртуины млекопитающих (SIRT1-7), гомологи Sir2 дрожжей, участвуют в контроле критических метаболических путей, а также апоптоза, ответов на стресс, репарации ДНК, клеточного цикла, стабильности генома и экспрессии генов. Сиртуины, также обозначаемые как деацетилазы гистонов III класса, представляют собой деацетилазы белков/АДФ-рибозилтрансферазы. Указанные ферменты в высокой степени консервативны в ряду от прокариот до эукариот. Все они обладают общим НАД-зависимым каталитическим центральным доменом и обладают вариабельными N-концевыми и C-концевыми дополнительными фрагментами, которые способствуют их уникальной субклеточной локализации, а также могут регулировать их каталитическую активность. Субклеточное распределение, субстратная специфичность и функция сиртуинов в клетке весьма разнообразны. SIRT2 является преимущественно цитоплазматическим белком, SIRT3-5 - митохондриальные белки, a SIRT7, -6 и -7, локализованы в ядре. SIRT7 наиболее близок Sir2 дрожжей, и является наиболее хорошо охарактеризованным сиртуином, обладает большим числом субстратов, включая p53, Ku70, NF-κВ и транскрипционные факторы семейства Forkhead, которые регулируют окислительный и генотоксический стресс в клетке. SIRT6 участвует в важных функциях защиты клетки от геномной нестабильности и прогероидного фенотипа. Кроме того, SIRT6 является единственным сиртуином, проявляющим мощную ауто-АДФ-рибозилтрансферазную активность. SIRT7 является единственным сиртуином, локализованным в ядрышках. В ходе тестирования с ацетилированными гистонами и разными ацетилированными компонентами машинерии РНК-полимеразы I было показано, что он не проявляет активности ацетилазы или АДФ-рибозилтрансферазы. Что касается ядрышковой функции SIRT7, Ford et al. предположили, что SIRT7 мог бы быть положительным регулятором транскрипции рДНКза счет его взаимосвязи с РНК-полимеразой I. Его гиперэкспрессия усиливает транскрипцию рДНК, тогда как его ингибирование приводит к уменьшению транскрипции рДНК. Интересно, что экспрессия SIRT7 демонстрирует положительную корреляцию с ростом клеток: SIRT7 присутствует в большом количестве в метаболически активных тканях, таких как печень, селезенка и яички. К настоящему времени нет данных относительно регуляции клеточного цикла белком SIRT7, и его судьба в отношении митоза, когда подавляется транскрипция рДНК.
[00109] Согласно некоторым вариантам реализации антисмысловые олигонуклеотиды применяют для профилактики или лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с членами семейства сиртруинов (SIRT). Примеры опосредованных сиртуинами (SIRT) заболеваний и расстройств, которые можно лечить клетками/тканями, регенированными из стволовых клеток, полученных при помощи антисмысловых соединений, включают: заболевания или расстройства, ассоциированные с ненормальной функцией или экспрессией сиртуинов, рак (например, рак молочной железы, рак прямой и ободочной кишки, CCL, хронический миелолейкоз, рак предстательной железы), нейродегенеративные заболевания или расстройства (например, болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Хантигнтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), множественный склероз, а также расстройства, вызванные агрегацией полиглутаминовых белков), заболевания и расстройства, связанные с бета-амилоидом (например, расстройства, характеризующиеся накоплением бета-амилоида, такие как болезнь Альцгеймера), заболевания скелетных мышц (например, миодистрофия Дюшена, атрофия скелетных мышц, мышечная дистрофия Беккера или миотоническая дистрофия); заболевания или расстройства обмена веществ (например, резистентность к инсулину, диабет 2 типа, ожирение, сниженная переносимость глюкозы, метаболический синдром, диабет зрелого возраста, гипергликемия, диабетическая нефропатия, гиперхолестеринемия, дислипидемия, гиперлипидемия и возрастные заболевания обмена веществ, и пр.), заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушениями регуляции инсулина, невропатия (например, сенсорная невропатия, вегетативная невропатия, двигательная невропатия, ретинопатия), заболевание или расстройство, ассоциированное с кетогенными патологиями, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением энергетического гомеостаза, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением активности ацетил-КоА-синтетазы 2, заболевание или расстройство, ассоциированное с метаболическим гомеостазом, заболевания или расстройства обмена липидов, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушениями термогенеза, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушениями регуляции деления клеток, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением функции митохондрий, невропатия (например, сенсорная невропатия, вегетативная невропатия, двигательная невропатия, ретинопатия), фиброз, воспалительная кардиомиопатия, гипертрофия сердца, хроническое воспаление, атеросклероз, артрит, деменция, остеопороз, а также сердечно-сосудистое заболевания или расстройство, заболевание или расстройство печени (например, вследствие злоупотребления алкоголем или гепатита, стеатоза печени и пр.), возрастная макулярная дистрофия, заболевания костей (например, остеопороз), заболевания крови (например, лейкемия), резорбция кости, возрастная макулярная дистрофия, деменция вследствие СПИДа, БАС, паралич Белла, атеросклероз, сердечное заболевание или расстройство (например, аритмии сердца, хроническая застойная сердечная недостаточность, ишемический инсульт, ишемическая болезнь сердца и кардиомиопатия), хронические дегенеративные заболевания (например, заболевания сердечной мышцы), хроническая почечная недостаточность, диабет 2 типа, изъязвление, катаракта, пресбиопия, гломерулонефрит, синдром Джулиана-Барре, геморрагический инсульт, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, СКВ, болезнь Крона, остеоартрит, остеопороз, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), пневмония, старение кожи, заболевание или расстройство кожи, недержание мочи, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением функции митохондрий, (например, митохондриальная миопатия, энцефалопатия, синдром Лебера, подострая некротическая энцефаломиопатия, болезнь Пирсона, молочнокислый ацидоз, «митохондриальная энцефалопатия, и симптомы, напоминающие молочнокислый ацидоз и инсульт» (MELAS) и пр.), дегенерация печени, дегенерация скелетных мышц, заболевание или расстройство мышц, воспаление, заболевание или расстройство, ассоциированное с эктопическим отложением липидов, заболевание или расстройство, ассоциированное с окислительным стрессом, заболевание или расстройство, ассоциированное с клеточным стрессом, заболевание или расстройство, ассоциированное с гибелью нейронов, старение или другое состояние, характеризующееся нежелательной утратой клеток, дегенеративный синдром, заболевание или расстройство, ассоциированное с обезвреживанием аммиака, старение, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением функции теломер, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением регуляции хроматина, заболевание или расстройство, ассоциированное с преждевремнным клеточным старением, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением SIRT-опосредуемой репарации ДНК, а также патологические состояния, характеризующиеся нежелательной утратой клеток.
[00110] Сообщалось, что сиртуины регулируют активность ФНО-альфа (фактора некроза опухоли альфа), как описано, например, в публикации Заявки на Патент США №2010/0137345 "Prophylactic and therapeutic use of sirtuin inhibitors in TNF-alpha mediated pathologies," включенной в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию. Согласно вариантам реализации антисмысловые нуклеотиды согласно настоящему изобретению применяют для модулирования сиртуинов, например, SIRT6, с целью лечения заболеваний или расстройств, опосредуемых ФНО-альфа. Заболевания или расстройства, опосредуемые ФНО-альфа, включают, например, анкилозирующий спондилит, атеросклероз, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона и язвенный колит, псориаз, псориатический артрит или ревматоидный артрит, общее истощение, грамм-отрицательный сепсис, шок, вызываемый эндотоксинами, синдром септического шока, синдром системной воспалительной реакции (ССВР) или синдром множественной органной дисфункции (СМОД); и/или патологии типа «трансплантат против хозяина», включая реакцию "трансплантант против хозяина" (РТПХ) и отторжение трансплантированных ксеногенных или аллогенных тканей или органов; и/или острые или хронические инфекционные или паразитарные процессы, включая вирусные, бактериальные или грибковые инфекции и инвазии паразитов - простейших или многоклеточных паразитов, преимущественно, церебральную малярию или менингококковый менингит; и/или аллергические расстройства, включая аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, астму, экзему, крапивницу, контактный дерматит, системную аллергическую реакцию (анафилаксию) и анафилактический шок, аллергический ринит или астму, острый рассеянный энцефаломиелит (ОРЭМ); Адцисонову болезнь; анкилозирующий спондилит; синдром антифосфолипидных антител (САФА); апластическую анемию; атеросклероз; аутоиммунный гастрит; аутоиммунный гепатит; аутоиммунную тромбоцитопению; синдром Бехчета; глютеновая энтеропатия; дерматомиозит; сахарный диабет I типа; сахарный диабет II типа; семейная средиземноморская лихорадка; семейный холодовой аутовоспалительный синдром; синдром Гудпасчера; подагра; псевдоподагра; диффузный токсический зоб; синдром Джулиана-Барре (СДБ); болезнь Хашимото; наследственная перемежающаяся лихорадка; идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру; воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), включая болезнь Крона и язвенный колит; ишемически-реперфузионное повреждение; болезнь Кавасаки; смешанное заболевание соединительной ткани; синдром Макла-Уэлса; множественный склероз (МС); тяжелая миастения; опсоклонус-миоклонус (ОМ); неврит зрительного нерва; тиреоидит Орда; остеоартрит; пузырчатку; злокачественную анемию; узелковый полиартериит; полимиозит; послеоперационное или травматическое воспаление; первичный биллиарный цирроз; первичную микседему; псориаз; псориатический артрит; ревматизм; ревматоидный артрит; триада Рейтера; склеродерму; синдром Сегрена; ишемический инсульт; системную красную волчанку (СКВ); ювенильный идиопатический артрит с системным началом; синдром дуги аорты; височный аритериит; витилиго; тепловую аутоиммунную гемолитическую анемию и грануломатоз Вегенера.
[00111] Соглано еще одному варианту реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды модулируют нормальную экспрессию и/или нормальную функцию сиртуина (SIRT) у пациентов, страдающих заболеваниями или расстройствами, ассоциированными с сиртуином (SIRT), или находящихся в группе риска в отношении развития таких заболеваний или расстройств.
[00112] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения терапевтические и/или косметические режимы и связанные с ними специализированные средства лечения предоставляют лицам, нуждающимся в лечении кожи, или с риском развития патологических состояний, при которых они будут нуждаться в лечении кожи. Диагноз можно поставить, например, на основании статуса SIRT у конкретного лица. Уровень экспрессии SIRT у пациента в конкретной ткани, например, в коже, можно определить при помощи способов, известных специалистам в данной области техники и описанных в другом разделе настоящей заявки, например, посредством анализа ткани при помощи ПЦР или при помощи способов, основанных на антителах.
m
[00113] Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция для лечения и/или косметического применения, содержащая антисмысловые олигонуклеотиды к SIRT, например, для отрицательной регуляции экспрессии SIRT в коже. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов соответствуют последовательностям SEQ ID NOS: 24-127. В патенте США №7544497 «Compositions for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisms», включенном в настоящую заявку посредством ссылки описано потенциальное косметическое применение агентов, которые модулируют активность сиртуина путем снижения K белка сиртуина в отношении его субстрата. Согласно вариантам реализации клетки in vivo обрабатывают олигонуклеотидами согласно настоящему изобретению, увеличивая продолжительность жизни клеток или предотвращая апоптоз. Например, кожу можно защитить от старения, например, образования морщин, путем обработки кожи, например, эпителиальных клеток, как описано в настоящей заявке. Согласно примерному варианту реализации кожа контактирует с фармацевтической или косметической композицией, содержащей антисмысловое соединение к SIRT, как описано в настоящей заявке. Примеры заболеваний кожи или патологий кожи включают расстройства или заболевания, ассоциированные или вызванные воспалением, повреждением солнечными лучами или естественным старением. Например, композиции находят применение при профилактике или лечении контактного дерматита (включая контактный дерматит вследствие раздражения или аллергический контактный дерматит), атопического дерматита (также называемого аллергической экземой), актинического кератоза, нарушений кератинизации (включая экзему), буллезного эпидермоза (включая пузырчатку), эксфолиативного дерматита, себорейного дерматита, эритем (включая полиморфную эритему и узловую эритему), повреждений, вызванных солнцем или другими источниками света, дискоидной красной волчанки, дерматомиозита, рака кожи и эффектов естественного старения.
[00114] Сообщалось, что сиртуины препятствуют дигидротестостерон-индуцированной передаче сигнала с рецепторов андрогенов (см., например, Fu, et al., 2006, "Hormonal Control of Androgen Receptor Function through SIRT1," Molecular and Cellular Biology 26(21): 8122-8135, incorporated herein by reference.) Согласно вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая антисмысловые олигонуклеотиды к SIRT, например, для отрицательной регуляции экспрессии SIRT в коже головы и для ингибирования передаче сигнала с рецепторов андрогенов, что позволяет предупредить развитие андрогенной аллопеции (выпадение волос). Согласно вариантам реализации пациентам, страдающим аллопецией, вводят лекарственную форму либо местно, либо системно. Согласно одному варианту реализации антисмысловой олигонуклеотид, описываемый в настоящей заявке, включают в лекарственную форму для местного применения, содержащую основу для местного применения, которая в целом подходит для местного введения лекарственных препаратов и содержит любой из материале, известных в технике. Основу для местного применения можно выбирать таким образом, чтобы придать указанной композиции желаемую форму, например, форму мази, лосьона, крема, микроэмульсии, геля, масла, раствора или подобных, и указанная основа может содержать материал природного происхождения или полученный путем синтеза. Предпочтительно, чтобы выбранная основа не оказывала неблагоприятного действия на активный агент или другие компоненты лекарственной формы для местного применения. Примеры подходящих основ для местного применения в соответствии с настоящей заявкой включают воду, спирты и другие нетоксические органические растворители, глицерин, минеральные масла, силикон, вазелиновое масло, ланолин, жирные кислоты, растительные масла, эфиры пара-оксибензойной кислоты, воски и подобные. Лекарственные формы могут быть мазями, лосьонами, кремами, микроэмульсиями и гелями без цвета и без запаха.
[00115] Антисмыслове олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению можно включать в состав мазей, которые, как правило, являются мягкими лекарственными формами, которые обычно основаны на вазелине или других производных нефти. Специфической основой для мази, которую следует применять, поскольку она признана специалистами в данной области техники, является та основа, которая может обеспечить оптимальную доставку лекарственного вещества, и, предпочтительно, может обеспечить другие желаемые характеристики, например, смягчение и пр. Как и в случае других основ или носителей, основа мази должна быть инертной, стабильной, нераздражающей и не сенсетизирующей. Как объясняется в Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.), основы мазей можно классифицировать на 4 класса: маслянистые основы, эмульгируемые основы; эмульсионные основы и водорастворимые основы. Маслянистые основы мазей включают, например, растительные масла, жиры, полученные из животных и мягкие углеводороды, полученные из нефти. Эмульгируемые основы мазей, также называемые адсорбируемыми основами мазей, содержат небольшое количество воды, либо не содержат ее вообще, и включают, например, гидроксистеарат сульфат, безводный ланолин и гидрофильный вазелин. Эмульсионные основы мазей представляют собой либо эмульсии типа вода-в-масле, либо эмульсии типа масло-в-воде, и включают, например, цетиловый спирт, глицерил моностеарат, ланолин и стеариновую кислоту. Примеры водорастворимых основ для мазей готовят из полиэтиленгликолей (ПЭГ) с разной молекулярной массой (см., например. Remington’s, выше).
[00116] Антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению можно включать в состав лосьонов, которые, как правило, представляют собой препараты, которые можно наносить на поверхность кожи без втирания, и обычно они являются жидкими или мягкими препаратами, в которых твердые частицы, включая активный агент, находятся в водной или спиртовой основе. Обычно лосьоны представляют собой суспензии твердых частиц, и они могут содержать жидкую масляную эмульсию типа «масло-в-воде». Предпочтительно лосьоны представляют собой лекарственные препараты для обработки больших областей тела, поскольку более жидкие композиции наносятся легче. Обычно требуется, чтобы нерастворимое вещество в лосьоне было сильно измельчено. Лосьоны, как правило, должны содержать суспендирующие агенты для более успешной дисперсии, а также соединения, применяемые для локализации и удерживания активного агента в контакте с кожей, например, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или подобные. Пример лекарственной формы лосьона для применения в сочетании с настоящим способом содержит пропиленгликоль, смешанный с гидрофильным вазелином, такой, который можно получить под торговой маркой Aquaphor.sup.RTM от компании «Beiersdorf, Inc.» (г.Норуолк, Коннектикут).
[00117] Антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению можно включать в состав кремов, которые, как правило, представляют собой вязкие жидкие или мягкие эмульсии, типа масло-в-воде либо вода-в-масле. Основы кремов являются водносмываемыми, и они содержат масляную фазу, эмульгатор и водную фазу. Масляная фаза, как правило, состоит из вазелина, жирного спирта, такого как цетиловый или стеариловый спирт; водная фаза обычно, хотя и необязательно, превышает масляную фазу по объему, и, как правило, содержит увлажняющий компонент. Эмульгатор в лекарственной форме крема, как объясняется в Remington’s, выше, как правило, представляет собой неионное, катионное, анионное или амфотерное поверхностно-активное вещество.
[00118] Антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению можно включать в состав микроэмульсий, которые, как правило, представляют собой термодинамически стабильные, изотропно прозрачные дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, таких как масло и вода, стабилизированные поверхностной пленкой молекул поверхностно-активного вещества (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volume 9). Для приготовления микроэмульсий требуются поверхностно-активное вещество (эмульгатор), дополнительное поверхностно-активное вещество (дополнительный эмульгатор), водная фаза и масляная фаза. Подходящие поверхностно-активные вещества включают любые поверхностно-активные вещества, которые применимы при приготовлении эмульсий, например, эмульгаторы, которые обычно применяют для приготовления кремов. Дополнительное поверхностно-активное вещество (дополнительный эмульгатор), как правило, выбирают из группы производных полиглицерина и жирных спиртов. Предпочтительные сочетания эмульгатора/дополнительного эмульгатора, как правило, но не обязательно, выбирают из группы, состоящей из: глицерила моностеарата и полиоксиэтилена стеарата; полиэтиленгликоля и этиленгликоля пальмиостеарата; и триглицеридов каприловой и каприновой кислоты и олеоил-макроголглицеридов. Водная фаза включает не только воду, но также обычно буферы, глюкозу, пропиленгликоль, полиэтиленгликоли, предпочтительно низкомолекулярные полиэтиленгликоли (например, ПЭГ 300 и ПЭГ 400), и/или глицерин и подобные, тогда как масляная фаза может, как правило, содержать, например, эфиры жирных кислот, модифицированные растительные масла, силиконовые масла, смеси моно-, ди- и триглицеридов, моно- и ди- эфиры ПЭГ (например, олеоил-макрогол-глицериды), и др.
[00119] Антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению можно включать в состав форм гелей, которые, как правило, представляют собой мягкие системы, содержащие суспензии, образованные маленькими неорганическими частицами (двухфазные системы) или крупными органическими молекулами, распределенными по существу однородно в жидкой основе (однофазные гели). Однофазные гели можно получить, например, путем сочетания активного агента, жидкой основы и подходящего желирующего компонента, такого как трагакантовая камедь (от 2 до 5%), альгинат натрия (от 2 до 10%), желатин (от 2 до 15%), метилцеллюлоза (от 3 до 5%), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (от 2 до 5%), карбомер (от 0,3 до 5%) или поливиниловый спирт (от 10 до 20%) вместе и их перемешивания до получения характерного мягкого продукта. Другие подходящие желирующие агенты включают метилгидроксицеллюлозу, полиоксиэтилен-полиоксипропилен, гидроксиэтилцеллюлозу и желатин. Хотя в гелях обычно применяют водную жидкую основу, также в качестве основы можно применять спирты и масла.
[00120] В лекарственные формы, например формы для местного применения, можно включать разные вспомогательные вещества, известные специалистам в данной области техники. Примеры вспомогательных веществ включают без ограничений растворители, усилители проникновения через кожу, замутнители, консерванты (например, антиоксиданты), желирующие агенты, буферные агенты, поверхностно-активные вещества (в частности неионные и амфотерные поверхностно-активные вещества), эмульгаторы, смягчающие вещества, загустители, стабилизаторы, увлажнители, красители, ароматизаторы и подобные. Особенно желательно включение растворителей и усилителей проникновения через кожу, наряду с эмульгаторами, смягчающими веществами и консервантами. Оптимальная лекарственная форма для местного введения содержит приблизительно: от 2 до 60 массовых %, предпочтительно от 2 до 50 массовых % растворителя и/или усилителя проникновения через кожу;: от 2 до 50 массовых %, предпочтительно от 2 до 20 массовых % эмульгаторов;: от 2 до 20 массовых %, предпочтительно от 0,01 до 0,2 массовых % консерванта, вместе с активным агентом и основой (например, водой), составляющими остальную массу лекарственной формы.
[00121] Усилитель проникновения через кожу служит для облегчения прохождения терапевтического уровня активного агента на рациональной площади неповрежденной кожи. Подходящие усилители хорошо известны в технике и включают, например: низшие алканолы, такие как метанол, этанол и 2-пропанол; алкил-сульфоксиды, такие как диметилсульфоксид (DMSO), децилметилсульфоксид (C10-замещенный MSO) и тетрадецилметилсульфаксид; пирролидоны, такие как 2-пирролидон, N-метил-2-пирролидон и N-(-гидроксиэтил)пирролидон; мочевину; N,N-диэтил-m-толуамид; C2-C6-замещенные алкандиолы; смешанные растворители, такие как диметилформамид (LVA), N,N-диметилацетамид (ДМА) и тетрагидрофуриловый спирт; и 1-замещенные азациклогептан-2-оны, в частности 1-n-додецилциклоазациклогептан-2-он (лаурокапрам; продающиеся под торговой маркой Azone.sup.RTM компании «Whitby Research Incorporated», Ричмонд, Виргиния).
[00122] Примеры растворителей включают без ограничений следующие: гидрофильные эфиры, такие как диэтиленгликоль моноэтиловый эфир (этоксидигликоль, продающийся как Transcutol.sup.RTM) и диэтиленгликоль моноэтиловый эфиролеат (продающийся как Soficutol.sup.RTM); производные касторового масла и полиэтилена, такие как полиокси-35-касторовое масло, полиокси-40-гидрогенизированное касторовое масло и др.; полиэтиленгликоль, в частности низкомолекулярные полиэтиленгликоли, такие как ПЭГ 300 и ПЭГ 400, и производные полиэтиленгликоля, такие как ПЭГ-8 глицериды каприловой/каприновой кислоты (продающийся как Labrasol.sup.RTM); алкилметилсульфоксиды, такие как DMSO; пирролидоны, такие как 2-пирролидон и N-метил-2-пирролидон; и ДМА. Многие растворители также могут действовать как усилители абсорбции. В настоящем изобретении в лекарственную форму можно включать один растворитель или смесь растворителей.
[00123] Подходящие эмульгаторы и дополнительные эмульгаторы включают, без ограничений, те эмульгаторы и дополнительные эмульгаторы, которые описаны в связи с формами микроэмульсий. Смягчающие вещества включают, например, пропиленгликоль, глицерин, изопропил миристат, полипропиленгликоль-2 (ППГ-2), пропионат миристилового эфира и подобные.
[00124] Также в лекарственные формы можно включать другие активные компоненты, например, другие противовоспалительные агенты, анальгетики, противомикробные агенты, противогрибковые агенты, антибиотики, витамины, антиоксиданты и солнцезащитные средства, обычно присутствующие в солнцезащитных формах, включая без ограничений антранилаты, бензофеноны (в частности, бензофенон-3), производные камфары, циннаматы (например, окстилметоксициннамат), дибензоилметаны (например, бутилметоксидибензоил метан), p-аминобензойную кислоту (ПАБА) и ее производные, и салицилаты (например, окстилсалицилат).
[00125] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды специфичны для полинуклеотидов сиртуина (SIRT), включая без ограничений некодирующие области. Целевые последовательности сиртуина (SIRT) включают варианты сиртуина (SIRT); мутанты сиртуина (SIRT), включая SNP; некодирующие последовательности сиртуина (SIRT); аллели, фрагменты и т.п. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК.
[00126] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула нуклеиновой кислоты не ограничивается собственно полинуклеотидами сиртуина (SIRT) и может быть представлена любыми изоформами, рецепторами, гомологами, некодирующими участками и т.п., сиртуина (SIRT).
[00127] Согласно еще одному из вариантов реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность (природную антисмысловую последовательность для кодирующих и некодирующих областей) мишеней сиртуина (SIRT), включая без ограничений их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу РНК или ДНК.
[00128] Согласно еще одному из вариантов реализации олигомерные соединения, предложенные в настоящем изобретении, также включают варианты, в которых в одном или нескольких положениях нуклеотидов указанного соединения присутствуют различающиеся основания. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденин, могут быть получены варианты, которые содержат тимидин, гуанозин, цитидин или другие природные или синтетические нуклеотиды в этом положении. Такие варианты могут быть получены в любом положении антисмыслового соединения.
[00129] Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между указанным антисмысловым соединением и мишенью составляет от приблизительно 50% до приблизительно 60%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 60% до приблизительно 70%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 70% до приблизительно 80%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 80% до приблизительно 90%. Согласно некоторым вариантам реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляют приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
[00130] Антисмысловое соединение является специфически гибридизуемым, если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, вызывая потерю активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание. Такие условия включают, например, физиологические условия в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и условия, при которых проводится анализ в случае исследований in vitro.
[00131] Антисмысловое соединение, ДНК, РНК, химерное, замещенное и т.п., является специфически гибридизуемым, когда связывание указанного соединения с целевой ДНК или РНК нарушает нормальное функционирование указанной целевой ДНК или РНК, вызывая в результате утрату функций, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и, в случае исследований in vitro, в условиях, при которых проводится исследование.
[00132] Согласно еще одному из вариантов реализации нацеленное воздействие на сиртуины (SIRT), включая без ограничения антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскладываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д., одной или более последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9-23, 141-143, и т.п., модулирует экспрессию или функцию сиртуина (SIRT). Согласно еще одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются повышающе по сравнению с контролем. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются понижающе по сравнению с контролем.
[00133] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотиды включают последовательности нуклеиновых кислот, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 24-127, включая антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскладываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат или т.п. Согласно еще одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды содержат фосфорное производное. Указанное фосфорсодержащее производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к фрагменту сахара или аналога сахара в модифицированных олигонуклеотидах, предложенных в настоящем изобретении, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфоротиоат и т.п. Способы получения вышеупомянутых фосфатных аналогов и их встраивания в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, по сути, также известны, и нет необходимости описывать их в настоящей заявке.
[00134] Специфичность и чувствительность антисмысловых последовательностей также используются специалистами в данной области техники в терапевтических целях. Антисмысловые олигонуклеотиды применялись в качестве терапевтических фрагментов при лечении болезненных состояний у животных и человека. Антисмысловые олигонуклеотиды безопасно и эффективно вводились людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом, установлено, что олигонуклеотиды могут представлять собой подходящие терапевтические механизмы воздействия, которые могут быть подогнаны под схемы лечения клеток, тканей и животных, в особенности, человека.
[00135] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения олигомерные антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, связываются с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты и модулируют экспрессию и/или функцию молекул, кодируемых геном-мишенью. Изменяемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Изменяемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК в сайт трансляции белка, трансляция белка из указанной РНК, сплайсинг указанной РНК с получением одного или более вида иРНК, и каталитическая активность, с которой может быть связана указанная РНК, либо которой она может способствовать. Функции могут стимулироваться или подавляться в зависимости от желаемого результата.
[00136] Антисмысловые соединения включают антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), формы альтернативного сплайсинга, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, такие соединения могут быть представлены в форме одноцепочечных, двуцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
[00137] Нацеленное воздействие посредством антисмыслового соединения на конкретную молекулу нуклеиновой кислоты в контексте настоящего изобретения может представлять собой многоступенчатый процесс. Указанный процесс, как правило, начинается с идентификации целевой нуклеиновой кислоты, функцию которой необходимо модулировать. Такая целевая нуклеиновая кислота может представлять собой, например, клеточный ген (или иРНК, транскрибированную с этого гена), экспрессия которого связана с определенным заболеванием или болезненным состоянием, или молекулу нуклеиновой кислоты из инфекционного агента. Согласно настоящему изобретению указанная целевая нуклеиновая кислота кодирует сиртуины (SIRT).
[00138] Процесс нацеленного воздействия, как правило, также включает определение по меньшей мере одного целевого участка, сегмента или сайта в целевой нуклеиновой кислоте для достижения антисмыслового взаимодействия в форме нужного эффекта, например, модулирования экспрессии. В контексте настоящего изобретения термин «участок» определяется как фрагмент целевой нуклеиновой кислоты, обладающий по меньшей мере одной идентифицируемой структурой, функцией или характеристикой. В состав участков целевых нуклеиновых кислот входят сегменты. «Сегменты» определяются как более короткие участки или субфрагменты участков в целевой нуклеиновой кислоте. «Сайты» в контексте настоящей заявки определены как положения в целевой нуклеиновой кислоте.
[00139] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми последовательностями сиртуина (SIRT) и модулируют экспрессию и/или функцию сиртуина (SIRT) (SEQ ID NO: 1-23; 133-134). Примеры антисмысловых последовательностей включают последовательности SEQ ID NO: 24-127.
[00140] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с одним или более сегментом полинуклеотидов сиртуина (SIRT) и модулируют экспрессию и/или функцию сиртуина (SIRT). Указанные сегменты содержат по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов смысловых или антисмысловых полинуклеотидов сиртуина (SLRT).
[00141] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды являются специфическими для природных антисмысловых последовательностей сиртуина (SIRT), причем связывание указанных олигонуклеотидов с указанными природными антисмысловыми последовательностями сиртуина (SIRT) модулирует экспрессию и/или функцию сиртуина (SIRT).
[00142] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотидные соединения содержат последовательности, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 24-127, антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскладываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.п. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат или т.п. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды содержат фосфорное производное. Указанное фосфорсодержащее производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к фрагменту сахара или аналога сахара в модифицированных олигонуклеотидах, предложенных в настоящем изобретении, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфоротиоат и т.п. Способы получения вышеупомянутых фосфатных аналогов и их встраивания в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, по сути, также известны, и нет необходимости описывать их в настоящей заявке.
[00143] Поскольку, как известно специалистам в данной области техники, кодон инициации трансляции обычно представляет собой 5’-AUG (в транскрибируемых молекулах иРНК; 5’-ATG в соответствующей молекуле ДНК), указанный кодон инициации трансляции также называют «AUG-кодон», «стартовый кодон» или «стартовый кодон AUG». У небольшого числа генов кодон инициации трансляции имеет последовательность РНК 5’-GUG, 5’-UUG или 5’-CUG; показано, что 5’-AUA, 5’-ACG и 5’-CUG функционируют in vivo. Таким образом, термины «кодон инициации трансляции» и «стартовый кодон» могут включать различные последовательности кодонов, даже несмотря на то, что инициирующая аминокислота во всех случаях представляет собой, как правило, метионин (y эукариот) или формилметионин (y прокариот). Эукариотические и прокариотические гены могут иметь два или более альтернативных стартовых кодона, каждый из которых может преимущественно использоваться для инициации трансляции в том или ином типе клеток или тканей, или при наличии определенного ряда условий. В контексте настоящего изобретения «стартовый кодон» и «кодон инициации трансляции» относятся к кодону или кодонам, которые используются in vivo для инициации трансляции иРНК, транскрибируемой с гена, кодирующего сиртуин (SIRT), независимо от того, какую(ие) последовательностей) имеют такие кодоны. Кодон терминации трансляции (или «стоп-кодон») гена может быть представлен одной из трех последовательностей, а именно, 5’-UAA, 5’-UAG и 5’-UGA (соответствующих ДНК последовательностям 5’-TAA, 5’-TAG и 5’-TGA, соответственно).
[00144] Термины «область стартового кодона» и «область кодона инициации трансляции» относятся к фрагменту такой иРНК или гена, который включает приблизительно 25-50 последовательных нуклеотидов в каждом направлении (т.е. 5’ или 3’) от кодона инициации трансляции. Сходным образом, термины «область стоп-кодона» и «область кодона терминации трансляции» относятся к фрагменту такой иРНК или гена, который содержит приблизительно 25-50 последовательных нуклеотидов в каждом направлении (т.е., 5’ или 3’) от кодона терминации трансляции. Соответственно, указанная «область стартового кодона» (или «область кодона инициации трансляции») и указанная «область стоп-кодона» (или «область кодона терминации трансляции») представляют собой участки, которые могут быть эффективными мишенями антисмысловых соединений, предложенных в настоящем изобретении.
[00145] Открытая рамка считывания (ORF), или «кодирующая область», известная в данной области техники как участок между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, также представляет собой участок, который может быть эффективной мишенью. В контексте настоящего изобретения целевой участок (мишень) представляет собой внутригенный участок, охватывающий кодон инициации трансляции или кодон терминации открытой рамки считывания (ORF) гена.
[00146] Другой целевой участок включает 5’ нетранслируемый участок (5’UTR), известный в данной области техники как фрагмент иРНК в 5’ направлении от кодона инициации трансляции, и, таким образом, включающий нуклеотиды между 5’кэп-сайтом и кодоном инициации трансляции иРНК (или соответствующими нуклеотидами на указанном гене). Другой целевой участок включает 3’ нетранслируемый участок (3’UTR), известный в данной области техники как фрагмент иРНК в 3’ направлении от кодона терминации трансляции, и, таким образом, включая нуклеотиды между кодовом терминации трансляции и 3’ концом иРНК (или соответствующими нуклеотидами на указанном гене). 5’ кэп-сайт иРНК содержит N7-метилированный гуанозиновый остаток, присоединенный к крайнему 5’ остатку иРНК через 5’-5’-трифосфатную связь. 5’ кэп-участок иРНК предположительно включает саму 5’-кэп-структуру, а также первые 50 нуклеотидов, смежные с этим кэп-сайтом. Другой целевой участок согласно настоящему изобретению представлен 5’ кэп-участком.
[00147] Другие целевые области SIRT1 включают нуклеотиды 65-85 и 221-253 в антисмысловом транскрипте CV396200. Согласно некоторым вариантам реализации предложены способы модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида SIRT1, включающие контактирование клеток или тканей по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, который направлен на одну или более из указанных областей, частично или полностью. Согласно определенным вариантам реализации применяют сочетание антисмысловых олигонуклеотидов, которые направлены на одну или более из указанных областей, и одного или более антисмысловых транскриптов, направленных на сиртуин. Согласно некоторым вариантам реализации применяют антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на разные области SIRT в сочетании, или несколько антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на одну или более разных областей сиртуинов в сочетании.
[00148] Хотя некоторые эукариотические иРНК-транскрипты транслируются непосредственно, многие содержат один или несколько участков, известных как «интроны», которые вырезаются из транскрипта до трансляции. Остающиеся (и, следовательно, транслирующиеся) участки известны как «экзоны» и они сплайсируются с образованием непрерывной последовательности иРНК. Согласно одному из вариантов реализации целенаправленное воздействие на участки сплайсинга, т.е. участки соединения интрон-экзон или участки соединения экзон-интрон, особенно подходит для тех случаев, когда в заболевание вовлечены аберрантный сплайсинг или сверхсинтез конкретного генного продукта. Согласно другому варианту реализации целевой участок представляет собой сайт аберрантного слияния, возникший в результате перестановки или делеции. иРНК транскрипты, полученные в результате сплайсинга двух (или более) иРНК из различных источников генов, известны как «слитые транскрипты». Интроны могут быть эффективными мишенями антисмысловых соединений с нацеленным действием, например, на ДНК или пре-иРНК.
[00149] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с кодирующими и/или некодирующими участками целевого полинуклеотида и модулируют экспрессию и/или функцию целевой молекулы.
[00150] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию целевой молекулы.
[00151] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию целевой молекулы.
[00152] Альтернативные РНК-транскрипты могут быть получены с одного и того же геномного участка ДНК. Такие альтернативные транскрипты обычно называют «вариантами». В частности, «пре-иРНК варианты» представляют собой транскрипты, полученные из той же геномной ДНК, отличающиеся от других транскриптов, полученных из той же геномной ДНК, положениями старта или окончания, и содержащие как интронную, так и экзонную последовательности.
[00153] При вырезании одного или более экзонного или интронного участка или их фрагментов в процессе сплайсинга пре-варианты иРНК образуют более короткие «иРНК варианты». Соответственно, варианты иРНК представляют собой процессированные пре-варианты иРНК, и каждый уникальный вариант пре-иРНК в обязательном порядке всегда производит уникальный вариант иРНК в результате сплайсинга. Такие варианты иРНК также известны как «варианты альтернативного сплайсинга». Если сплайсинга варианта пре-иРНК не происходит, тогда вариант пре-иРНК идентичен иРНК-варианту.
[00154] Варианты могут быть получены с применением альтернативных сигналов начала и конца транскрипции. Пре-иРНК и иРНК могут содержать несколько стартовых кодонов и стоп-кодонов. Варианты, получаемые из пре-иРНК или иРНК и использующие альтернативные стартовые кодоны, известны как «варианты с альтернативной инициацией» указанных пре-иРНК или иРНК. Транскрипты, использующие альтернативный стоп-кодон, известны как «варианты с альтернативной терминацией» указанных пре-иРНК или иРНК. Одним из конкретных вариантов с альтернативной терминацией является «полиA-вариант», в котором многочисленные транскрипты синтезируются в результате альтернативного выбора одного из «полиA-стоп-сигналов» транскрипционным механизмом, в результате чего возникают транскрипты, заканчивающиеся уникальными полиA-сайтами. В контексте настоящего изобретения виды вариантов, описанные в настоящей заявке, также представляют собой варианты реализации целевых нуклеиновых кислот.
[00155] Положения на целевой нуклеиновой кислоте, с которыми гибридизуются указанные антисмысловые соединения, определены как по меньшей мере 5-нуклеотидные фрагменты участка-мишени, на который нацелено действие активного антисмыслового соединения.
[00156] Хотя в настоящей заявке и представлены конкретные последовательности некоторых типовых целевых сегментов, для специалиста в данной области будет очевидно, что они приведены для наглядности и описания конкретных вариантов реализации, входящих в объем настоящего изобретения. Дополнительные целевые сегменты могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области на основании настоящего описания.
[00157] Целевые сегменты, составляющие в длину 5-100 нуклеотидов, содержащие участок, составленный по меньшей мере пятью (5) последовательными нуклеотидами, выбранными из иллюстративных целевых сегментов, также считаются подходящими для нацеленного воздействия.
[00158] Целевые сегменты могут включать ДНК или РНК последовательности, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов из 5’-конца одного из иллюстративных целевых сегментов (остальные нуклеотиды представляют собой последовательный участок той же ДНК или РНК, начинающийся непосредственно над 5’-концом указанного целевого сегмента и продолжающийся, пока указанная ДНК или РНК не достигнет приблизительно 5-100 нуклеотидов). Сходные целевые сегменты представлены ДНК или РНК последовательностями, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов из 3’-конца одного из иллюстративных целевых сегментов (остальные нуклеотиды представляют собой последовательный участок той же ДНК или РНК, начинающийся непосредственно за 5’-концом и продолжающийся, пока указанная ДНК или РНК не достигнет приблизительно 5-100 нуклеотидов). Специалист в данной области техники, располагая целевыми сегментами, примеры которых приведены в настоящей заявке, сможет, не прибегая к значительным объемам экспериментов, идентифицировать другие целевые сегменты.
[00159] После того как один или более целевой участок, сегмент или сайт идентифицированы, отбирают антисмысловые соединения, обладающие значительной степенью комплементарности указанной мишени, т.е. достаточно хорошо и специфически гибридизующиеся с ней с получением необходимого эффекта.
[00160] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения указанные олигонуклеотиды связываются с антисмысловой цепью конкретной мишени. Длина указанных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 5 нуклеотидов и они могут быть синтезированы таким образом, что каждый олигонуклеотид будет нацелен на перекрывающиеся последовательности, т.о., полученные олигонуклеотиды будут покрывать целевой полинуклеотид по всей длине. Мишени также включают и кодирующие, и некодирующие области.
[00161] Согласно одному из вариантов реализации воздействие на специфические нуклеиновые кислоты оказывают посредством антисмысловых олигонуклеотидов. Нацеленное воздействие посредством антисмыслового соединения на конкретную нуклеиновую кислоту представляет собой многоступенчатый процесс. Указанный процесс, как правило, начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функцию которой необходимо модулировать. Она может представлять собой, например, клеточный ген (или иРНК, транскрибированную с этого гена), экспрессия которого связана с определенным заболеванием или болезненным состоянием, или некодирующий полинуклеотид, такой как, например, некодирующая РНК (нкРНК).
[00162] РНК могут быть подразделены на (1) информационные РНК (иРНК), транслируемые с образованием белков, и (2) не кодирующие белки РНК (нкРНК). нкРНК включают микроРНК, антисмысловые транскрипты и другие транскрипционные единицы (ТЕ), содержащие большое количество стоп-кодонов и не включающие сколько-нибудь обширную «открытую рамку считывания». Многие нкРНК начинаются с сайтов инициации транскрипции в 3’ нетранслируемых участках (3’UTR) кодирующих белки локусов. НкРНК часто довольно малочисленны, и по меньшей мере половина нкРНК, секвенированных консорциумом FANTOM, по-видимому, не полиаденилированы. Большинство исследователей по понятным причинам уделяют основное внимание полиаденилированным иРНК, которые подвергаются процессингу и экспортируются в цитоплазму. Недавно было показано, что пул неполиаденилированных ядерных РНК может быть очень обширен, и что многие из таких транскриптов происходят из межгенных участков. Механизм, посредством которого нкРНК могут регулировать генную экспрессию, заключается в спаривании оснований с целевыми транскриптами. РНК, функционирующие за счет спаривания оснований, могут быть разделены на следующие группы: (1) цис-кодируемые РНК, кодируемые генным участком в том же расположении, но на противоположной цепи относительно РНК, с которыми они взаимодействуют и, таким образом, демонстрирующие безупречную комплементарность своей мишени, и (2) транс-кодируемые РНК, кодируемые хромосомным участком, отличным от кодирующего РНК, с которыми они взаимодействуют и, как правило, не обладающие безупречным потенциалом для спаривания оснований со своими мишенями.
[00163] Без связи с какой-либо конкретной теорией модификация антисмыслового полинуклеотида антисмысловыми олигонуклеотидами, описанными в настоящей заявке, может влиять на экспрессию соответствующих смысловых информационных РНК. При этом такая регуляция может быть как дискордантной (антисмысловой нокдаун приводит к повышению уровней информационной РНК), так и конкордантной (антисмысловой нокдаун приводит к сопутствующему понижению уровней информационной РНК). В таких случаях антисмысловые олигонуклеотиды могут быть нацелены на перекрывающиеся или неперекрывающиеся части указанного антисмыслового транскрипта, что приводит к нокдауну или изоляции. Нацеленное действие как на кодирующие, так и на некодирующие антисмысловые последовательности может осуществляться одинаковым образом и любая из этих категорий способна к регуляции соответствующих смысловых транскриптов - либо конкордантным, либо дискордантным образом. Стратегии, применяемые для идентификации новых олигонуклеотидов для взаимодействия с мишенями, могут быть основаны на нокдауне антисмысловых РНК-транскриптов антисмысловыми олигонуклеотидами или любыми другими способами модулирования нужной мишени.
[00164] Стратегия 1: В случае дискордантной регуляции, нокдаун антисмыслового транскрипта повышает экспрессию обычного (смыслового) гена. В том случае, если этот последний ген кодирует мишень известного или предполагаемого лекарственного средства, то нокдаун его антисмыслового эквивалента может предположительно имитировать действие агониста рецептора или ферментного стимулятора.
[00165] Стратегия 2: В случае конкордатной регуляции возможно одновременно осуществить нокдаун и антисмыслового и смыслового транскриптов и тем самым добиться синергистического снижения обычной (смысловой) генной экспрессии. Если, например, антисмысловой олигонуклеотид используют для нокдауна, тогда эта стратегия может применяться для нацеленного воздействия одним антисмысловым олигонуклеотидом на смысловой транскрипт и другим антисмысловым олигонуклеотидом на соответствующий антисмысловой транскрипт, или одним энергетически симметричным антисмысловым олигонуклеотидом, одновременно нацеленно действующим на перекрывающиеся смысловые и антисмысловые транскрипты.
[00166] Согласно настоящему изобретению антисмысловые соединения включают антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), миРНК соединения, одно- или двуцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как миРНК соединения, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДИК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двуцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть объединены или получены иным способом для получения кольцевых или и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, формирующих полностью или частично двуцепочечное соединение или одиночную цепь с достаточной самокомплементарностью для гибридизации и формирования полностью или частично двуцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3’ или 5’ концы, или могут связываться с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец на 5’ либо на 3’ конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двуцепочечные соединения в некоторых случаях могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Как вариант, указанные две цепи могут быть связаны посредством ненуклеинового фрагмента или линкерной группы. Сформированная одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двуцепочечными. Специфическая модуляция генной экспрессии может быть достигнута стабильной экспрессией шпилек дцРНК в трансгенных клеточных линиях, при этом согласно некоторым вариантам реализации указанные генная экспрессия или функция регулируются повышающе. При формировании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с формированием дуплекса, указанные две цепи (или формирующие дуплекс участки одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются по Уотсону-Крику.
[00167] При введении в систему соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут приводить к активации одного или более фермента или структурного белка, влияя на расщепление или иные модификации целевой нуклеиновой кислоты, либо могут действовать через механизмы «заполнения». Как правило, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть названы «ДНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2’-дезокси-сахар и, как правило, преимущественно T, а не U, основания) или «РНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'- гидроксил или 2’-модифицированные сахара и, как правило, преимущественно T, а не U, основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего A- и B-формами. Предполагают, что, как правило, олигонуклеотиды, имеющие структуру типа B-формы, «ДНК-подобны», а имеющие структуру типа A-формы, «РНК-подобны». Согласно некоторым вариантам реализации (с химерами) антисмысловое соединение может содержать участки как A-, так и B-формы.
[00168] Согласно еще одному из вариантов реализации требуемые олигонуклеотиды или антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одно из перечисленных: антисмысловая РНК, антисмысловая ДНК, химерные антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие модифицированные связи, интерферирующая РНК (РНКи), малая интерферирующая РНК (миРНК); микроинтерферирующая РНК (микроРНК); малые временные РНК (stPHK, мвРНК); или малые образующие шпильки РНК (shPHK); малые активирующие РНК (аРНК); короткие активирующие РНК (каРНК) или их комбинации.
[00169] дцРНК также может активировать генную экспрессию посредством механизма, названного «активация генов малыми (короткими) РНК» или аРНК. дцРНК, нацеленные на промоторы генов, индуцируют мощную активацию транскрипции связанных с ними генов. Наличие аРНК в клетках человека было продемонстрировано с применением синтетических дцРНК, называемых «короткие активирующие РНК» (каРНК).
[00170] Обнаружено, что малые двуцепочечные РНК (дцРНК), такие как малые интерферирующие РНК (миРНК) и микроРНК (микроРНК), являются триггерами эволюционно консервативного механизма, известного как РНК-интерференция (РНКи). РНКи неизбежно ведет к сайленсингу генов. Тем не менее в случаях, подробно описанных в нижеследующем разделе «Примеры», олигонуклеотиды, как показано, увеличивают экспрессию и/или функцию указанных полинуклеотидов сиртуина (SIRT) и кодируемых ими продуктов. дцРНК могут также работать как короткие активирующие РНК (каРНК). Без связи с какой-либо конкретной теорией, посредством нацеленного взаимодействия с промоторами генов каРНК индуцируют экспрессию гена-мишени в результате явления, называемого дцРНК-индуцированной активацией транскрипции (аРНК).
[00171] Согласно другому варианту реализации «целевые сегменты», определенные в настоящей заявке, могут быть использованы для отбора дополнительных соединений, которые модулируют экспрессию полинуклеотидов сиртуина (SIRT). «Модуляторы» представляют собой соединения, понижающие или повышающие экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей сиртуин (SIRT), и содержащие по меньшей мере 5-нуклеотидный участок, комплементарный предпочтительному целевому сегменту. Способ отбора включает этапы контактирования предпочтительного целевого сегмента молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей смысловые или природные антисмысловые полинуклеотиды сиртуина (SIRT) с одним или несколькими потенциальными модуляторами, и отбор одного или более потенциального модулятора, понижающего или повышающего экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды сиртуина (SIRT), например, SEQ ID NO: 24-127. После того как подтверждена способность потенциального(ых) модулятора(ов) к модулированию (например, понижению или повышению) экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды сиртуина (SIRT), указанный модулятор может быть использован для дальнейших исследований функций полинуклеотидов сиртуина (SIRT), или для применения в качестве агента для исследований, диагностики или лечения согласно настоящему изобретению.
[00172] Нацеленное воздействие при помощи природной антисмысловой последовательности предпочтительно модулирует функцию гена-мишени. Например, сиртуина (SIRT) (в частности, под номером доступа NM_012238.4, NM_001159589, NM_012237.3, NM_012239, NM_012240, NM_012241, NM_016539, NM_016538, NM_001142498.1, NM_030593.2, NM_001193286.1, NR_034146.1, NM_001017524.2, NM_031244.2, NM_001193267.1, NM_001193285.1). Согласно одному из вариантов реализации мишень представляет собой антисмысловой полинуклеотид сиртуина (SIRT). Согласно одному из вариантов реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на смысловые и/или природные антисмысловые последовательности полинуклеотидов сиртуина (SIRT) (в частности, под номером доступа NM_01223 8.4, NM_001159589, NM_012237.3, NM_012239, NM_012240, NM_012241, NM_016539, NM_016538, NM_001142498.1, NM_030593.2, NM_001193286.1, NR_034146.1, NM_001017524.2, NM_031244.2, NM_001193267.1, NM_001193285.1), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу, и указанные мишени включают кодирующие и некодирующие участки антисмысловых и/или смысловых полинуклеотидов сиртуина (SIRT).
[00173] Целевые сегменты согласно настоящему изобретению могут также быть скомбинированы с соответствующими комплементарными антисмысловыми соединениями, предложенными в настоящем изобретении, с формированием стабилизированных двуцепочечных (дуплексных) олигонуклеотидов.
[00174] В данной области техники показано, что такие двуцепочечные олигонуклеотидные фрагменты модулируют экспрессию мишеней и регулируют трансляцию, а также процессинг РНК, посредством антисмыслового механизма. Кроме того, указанные двуцепочечные фрагменты могут подвергаться химическим модификациям. Например, показано, что такие двуцепочечные фрагменты ингибируют мишень посредством классической гибридизации антисмысловой цепи указанного дуплекса с мишенью, запуская тем самым ферментное расщепление мишени.
[00175] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на полинуклеотиды сиртуина (SIRT) (в частности, под номером доступа NM_012238.4, NM_001159589, NM_012237.3, NM_012239, NM_012240, NM_012241, NM_016539, NM_016538, NM_001142498.1, NM_030593.2, NM_001193286.1, NR_034146.1, NM_001017524.2, NM_031244.2, NM_001193267.1, NM_001193285.1), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.
[00176] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула нуклеиновой кислоты не ограничивается собственно сиртуином (SIRT) и может быть представлена любыми изоформами, рецепторами, гомологами и т.п. молекулами сиртуина (SIRT).
[00177] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов сиртуина (SIRT), например, полинуклеотидов, представленных в последовательности SEQ ID NO: 9-23; 141-144, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены последовательностями SEQ ID NO: 24-127.
[00178] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны или связываются с нуклеиновыми кислотами антисмысловых последовательностей сиртуина (SIRT), включая, не ограничиваясь указанными, некодирующие смысловые и/или антисмысловые последовательности, связанные с полинуклеотидами сиртуина (SIRT), и модулируют экспрессию и/или функцию молекул сиртуина (SIRT).
[00179] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны природным антисмысловым последовательностям нуклеиновых кислот сиртуина (SIRT), представленным в последовательности SEQ ID NO: 9-23, 141-143 или связываются с ними, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул сиртуина (SIRT).
[00180] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотиды содержат последовательности, состоящие по меньшей мере из 5 последовательных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO: 24-127 и модулируют экспрессию и/или функцию молекул сиртуина (SIRT).
[00181] Указанные полинуклеотидные мишени включают сиртуин (SIRT), в том числе представителей этого семейства, варианты сиртуина (SIRT); мутанты сиртуина (SIRT), в том числе SNP; некодирующие последовательности сиртуина (SIRT); аллели сиртуина (SIRT); видовые варианты, фрагменты и т.п.
Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.
[00182] Согласно еще одному из вариантов реализации указанный олигонуклеотид, нацеленный на полинуклеотиды сиртуина (SIRT), включает: антисмысловую РНК, интерферирующую РНК (РНКи), малую интерферирующую РНК (миРНК); микроинтерферирующую РНК (микроРНК); малые временные РНК (stPHK, мвРНК); или малые образующие шпильки РНК (shPHK); малые активирующие РНК (аРНК); или короткие активирующие РНК (каРНК).
[00183] Согласно еще одному из вариантов реализации направленное воздействие на полинуклеотиды сиртуина (SIRT), например, SEQ ID NO: 9-23, 141-143 модулирует экспрессию или функцию таких мишеней. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются повышающе по сравнению с контролем. Согласно еще одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются понижающе по сравнению с контролем.
[00184] Согласно еще одному из вариантов реализации антисмысловые соединения включают последовательности, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 24-127. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п.
[00185] Согласно еще одному из вариантов реализации последовательности SEQ ID NO: 24-127 содержат один или более ЗНК-нуклеотид. В таблице 1 приведены типовые антисмысловые олигонуклеотиды, подходящие для применения в способах согласно настоящему изобретению.
[00186] Модуляция нужной целевой нуклеиновой кислоты может быть осуществлена несколькими известными в данной области техники способами. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК и т.д. Молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты (например, рибозимы) представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, способные катализировать одну или несколько разнообразных реакций, включая способность многократно расщеплять другие отдельные молекулы нуклеиновой кислоты чувствительным к последовательности нуклеиновых оснований сиквенс-специфичным образом. Такие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты могут применяться, например, для нацеленного действия на практически любой РНК-транскрипт.
[00187] Из-за сиквенс-специфичности транс-расщепляющие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты являются многообещающими потенциальными терапевтическими агентами для лечения заболеваний человека. Молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, чтобы расщеплять специфические целевые РНК из совокупности клеточных РНК. Такое расщепление переводит указанную иРНК в нефункциональное состояние и подавляет экспрессию белка с этой РНК. Таким образом, синтез белка, связанный с болезненным состоянием, может быть селективно ингибирован.
[00188] Как правило, ферментативные нуклеиновые кислоты с РНК-расщепляющей активностью сначала связываются с целевой РНК. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает целевую РНК, а потом связывается с ней посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК. Стратегическое расщепление такой целевой РНК уничтожит ее способность к прямому синтезу кодируемого белка. После того, как ферментативная нуклеиновая кислота связала и расщепила целевую РНК, она отсоединяется от этой РНК, освобождается для другой мишени и может повторно связывать и расщеплять новые мишени.
[00189] Ряд подходов, таких как in vitro стратегии отбора (извлечения) был использован для получения новых нуклеиновых катализаторов, способных катализировать различные реакции, такие как расщепление и лигирование фосфодиэфирных связей и амидных связей.
[00190] Получение рибозимов, обладающих оптимальной каталитической активностью, внесет существенный вклад в любую стратегию, включающую применение РНК-расщепляющих рибозимов для регулирования генной экспрессии. Рибозим типа «головка молотка», например, функционирует со скоростью каталитической реакции (kcat) приблизительно 1 мин-1 в присутствии насыщающих (10 мМ) концентраций кофактора Mg2+. Показано, что синтетический «РНК-лигазный» рибозим катализирует соответствующую реакцию самоизменения со скоростью приблизительно 100 мин-1. Кроме того, известно, что определенные модифицированные рибозимы типа «головка молота», имеющие субстрат-связывающие ДНК-«ручки», катализируют расщепление РНК со скоростями оборотов, достигающими 100 мин-1. Наконец, замещение специфического остатка каталитического ядра «головки молота» определенными нуклеотидными аналогами дает модифицированные рибозимы, демонстрирующие повышение скорости каталитической реакции вплоть до 10-кратного. Эти результаты показывают, что рибозимы могут обеспечивать химические преобразования с каталитическими скоростями, значительно превышающими таковые, демонстрируемые in vitro большинством природных саморасщепляющих рибозимов. Далее, возможно, что структуры определенных саморасщепляющих рибозимов могут быть оптимизированы для получения максимальной каталитической активности, или что могут быть получены совершенно новые РНК мотивы, демонстрирующие значительно увеличенные скорости фосфодиэфирного расщепления РНК.
[00191] Внутримолекулярное расщепление РНК-субстрата РНК катализатором, соответствующим модели «головка молота», впервые было показано в 1987. Указанный РНК катализатор был выделен и вступал в реакцию с различными РНК-молекулами, подтверждая, что он действительно является катализатором.
[00192] Каталитические РНК, сконструированные на основе мотива «головка молота», применялись для расщепления специфических целевых последовательностей осуществлением подходящего спаривания оснований в каталитической РНК для обеспечения необходимого спаривания оснований с целевыми последовательностями. Это позволило применить указанную каталитическую РНК для расщепления специфических целевых последовательностей и показать, что каталитические РНК, сконструированные согласно модели «головка молота», предположительно способны расщеплять специфические субстратные РНК in vivo.
[00193] РНК-интерференция (РНКи) стала мощным инструментом модулирования генной экспрессии у млекопитающих и в клетках млекопитающих. Этот подход предполагает получение малых интерферирующих РНК (миРНК) в виде самой РНК или в виде ДНК, с применением экспрессионной плазмиды или вируса и кодирующей последовательности малых шпилькообразующих РНК, в результате процессинга дающих миРНК. Эта система обеспечивает эффективный транспорт пре-миРНК в цитоплазму, где они проявляют активность, и позволяет применение регулируемых и тканеспецифичных промоторов генной экспрессии.
[00194] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотид или антисмысловое соединение содержит олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметик, химеру, аналог или гомолог. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из встречающихся в природе нуклеотидов, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей, а также олигонуклеотиды, содержащие не встречающиеся в природе фрагменты, функционирующие сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее нативных форм, так как они обладают необходимыми свойствами, такими как, например, увеличенное поглощение клетками, увеличенная связывающая способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
[00195] Согласно настоящему изобретению указанные олигонуклеотиды или «антисмысловые соединения» включают антисмысловые олигонуклеотиды (например, РНК, ДНК, их миметики, химеры, аналоги или гомологи), рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), миРНК соединения, одно- или двуцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как миРНК соединения, каРНК, аРНК, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двуцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть объединены или получены иным способом для получения кольцевых или и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, формирующих полностью или частично двуцепочечное соединение, или одиночная цепь с достаточной самокомплементарностью для гибридизации и формирования полностью или частично двуцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3’ или 5’ концы, или могут связываться с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец на 5’ или на 3’ конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двуцепочечные соединения в некоторых случаях могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Как вариант, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Сформированная одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двуцепочечными. Специфическое модулирование генной экспрессии может быть достигнуто стабильной экспрессией дцРНК-шпилек в трансгенных клеточных линиях. При формировании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с формированием дуплекса, указанные две цепи (или формирующие дуплекс участки одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются по Уотсону-Крику.
[00196] При введении в систему соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут приводить к активации одного или более ферментов или структурных белков, влияя на расщепление или иные модификации целевой нуклеиновой кислоты, либо могут действовать через механизмы «заполнения». Как правило, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть названы «ДНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2’-дезокси-сахар и, как правило, преимущественно T, а не U, основания) или «РНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2’-гидроксил или 2’-модифицированные сахара и, как правило, преимущественно T, а не U, основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего A- и B-формами. Предполагают, что, как правило, олигонуклеотиды, имеющие структуру типа B-формы, «ДНК-подобны», а имеющие структуру типа A-формы, «РНК-подобны». Согласно некоторым вариантам реализации (с химерами) антисмысловое соединение может содержать участки как A-, так и B-формы.
[00197] Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению могут содержать антисмысловой фрагмент приблизительно от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов (т.е. приблизительно от 5 до приблизительно 80 связанных нуклеозидов) длиной. Это относится к длине указанной антисмысловой цепи или части указанного антисмыслового соединения. Иными словами, одноцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, содержит от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов, а двуцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, (такие как, например, дцРНК) содержит смысловую и антисмысловую цепь или фрагменты от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что под этим понимаются антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.
[00198] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты 10-50 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены олигонуклеотиды, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, или 50 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного. Согласно некоторым вариантам реализации длина указанных олигонуклеотидов составляет 15 нуклеотидов.
[00199] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые или олигонуклеотидные соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты, составляющие от 12 или 13 до 30 нуклеотидов в длину. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены антисмысловые соединения, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.
[00200] Согласно еще одному из вариантов реализации олигомерные соединения, предложенные в настоящем изобретении, также включают варианты, в которых в одном или нескольких положениях нуклеотидов указанного соединения присутствуют различающиеся основания. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденозин, могут быть получены варианты, которые содержат тимидин, гуанозин или цитидин в этом положении. Это может быть осуществлено в любом положении указанного антисмыслового или дцРНК-соединения. Такие соединения затем тестируют с применением способов, описанных в настоящей заявке, для определения их способности ингибировать экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
[00201] Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между указанным антисмысловым соединением и мишенью составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 60% до приблизительно 70%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 70% до приблизительно 80%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 80% до приблизительно 90%. Согласно некоторым вариантам реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляют приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
[00202] Согласно еще одному из вариантов реализации антисмысловые олигонуклеотиды, такие как, например, молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 24-127, включают одну или более чем одну замену или модификацию. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды заменены закрытыми нуклеиновыми кислотами (ЗНК).
[00203] Согласно еще одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды нацеленно взаимодействуют с одним или более участком молекул нуклеиновой кислоты смысловых и/или антисмысловых кодирующих и/или некодирующих последовательностей, связанных с SIRT, и последовательностей, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 1-23 и 133-144. Мишенями указанных олигонуклеотидов также являются перекрывающиеся области SEQ ID NO: 1-23 и 133-143.
[00204] Некоторые предпочтительные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, представляют собой химерные олигонуклеотиды. «Химерные олигонуклеотиды» или «химеры» в контексте настоящего изобретения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химически отличных участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одного нуклеотида. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок модифицированных нуклеотидов, обеспечивающий одно или более полезное свойство (такое как, например, увеличенная устойчивость к нуклеазам, увеличенное поглощение клетками, повышенная связывающая способность по отношению к мишени) и участок, который представляет собой субстрат для ферментов, способных к расщеплению РНК:ДНК или РНК:РНК гибридов. Как пример, РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет РНК-цепь РНК:ДНК дуплекса. Активация РНКазы Н, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, тем самым значительно повышая эффективность антисмыслового модулирования генной экспрессии. Соответственно, сопоставимые результаты часто могут быть получены с более короткими олигонуклеотидами при использовании химерных олигонуклеотидов, по сравнению с фосфоротиоатными дезоксиолигонуклеотидами, гибридизующимися с тем же целевым участком. Расщепление целевой РНК может быть определено стандартным способом посредством гель-электрофореза и, при необходимости, сопутствующих методик гибридизации нуклеиновых кислот, известных в данной области техники. Согласно одному из вариантов реализации химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один участок, модифицированный для увеличения способности связываться с мишенью, и, как правило, участок, функционирующий как субстрат РНКазы H. Связывающая способность олигонуклеотида по отношению к мишени (в данном случае, нуклеиновой кислоте, кодирующей ras) определяется стандартным способом измерением температуры плавления пары олигонуклеотид/мишень, представляющим собой температуру, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируют; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше температура плавления, тем больше связывающая способность указанного олигонуклеотида по отношению к мишени.
[00205] Химерные антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде составных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или миметиков олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям. Такие соединения также известны в данной области техники как гибриды или гапмеры. Примеры патентов США, в которых описано получение таких гибридных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; и 5700922, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00206] Согласно еще одному из вариантов реализации модифицируемый участок указанного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный по 2’ положению сахара, наиболее предпочтительно 2’-O-алкил, 2’-O-алкил-O-алкил или 2’-фтор-модифицированный нуклеотид. Согласно другим вариантам реализации РНК модификации включают 2’-фтор, 2’-амино и 2’-O-метильные модификации рибозы пиримидинов, лишенные азотистого основания остатки или обратное основание на 3’-конце указанной РНК. Такие модификации олигонуклеотидов осуществляют стандартными способами; показано, что такие олигонуклеотиды имеют более высокую температуре плавления (т.е. большую способность связываться с мишенью), чем 2’-дезоксиолигонуклеотиды, относительно определенной мишени. В результате такой повышенной связывающей способности значительно усиливается ингибирование генной экспрессии РНКи-олигонуклеотидом. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, расщепляющую РНК цепь РНК:ДНК дуплексов; активация этого фермента, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, и, следовательно, может значительно увеличивать эффективность РНКи ингибирования. Расщепление целевой РНК может быть подтверждено обычным способом посредством гель-электрофореза. Согласно еще одному из вариантов реализации указанный химерный олигонуклеотид также модифицирован для увеличения устойчивости к нуклеазе. Клетки содержат множество экзо- и эндонуклеаз, способных разлагать нуклеиновые кислоты. Показано, что некоторые нуклеотидные и нуклеозидные модификации придают олигонуклеотиду, в состав которого они входят, большую устойчивость к нуклеазному расщеплению по сравнению с нативным олигодезоксинуклеотидом. Устойчивость к нуклеазам измеряют обычным способом, инкубируя олигонуклеотиды с клеточными экстрактами или растворами с выделенными нуклеазами и измеряя содержание интактных олигонуклеотидов спустя определенное время, как правило, посредством гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, модифицированные для увеличения устойчивости к нуклеазам, остаются интактными на протяжении более длительного времени по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами. Показано, что ряд модификаций олигонуклеотидов усиливают или придают им устойчивость к нуклеазам. Олигонуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию, на настоящий момент более предпочтительны. В некоторых случаях модификации олигонуклеотидов, усиливающие способность связываться с мишенью также, независимым образом, способны повышать устойчивость к нуклеазам. Некоторые желательные модификации можно найти в De Mesmaeker et al. (1995) Асе. Chem. Res., 28: 366-374.
[00207] Специфические примеры некоторых олигонуклеотидов, предусмотренных настоящим изобретением, включают содержащие модифицированные остовы, например, фосфоротиоаты, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, алкильные с короткой цепью или циклоалкильные связи между сахарами или гетероатомные с короткой цепью или гетероциклические связи между сахарами. Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и с гетероатомными остовами, в частности, CH2 -NH-O-CH2, CH,-N(CH3)-O-CH2 [известный как метилен(метилимино) или MMI остов], CH2-O-N (CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 и O-N(CH3)-CH2-CH2 остовы, где нативный фосфодиэфирный остов представлен в виде O-P-O-CH,). Амидные остовы, описанные в De Mesmaeker et al. (1995) Асе. Chem. Res. 28: 366-374, также являются предпочтительными. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы (Summerton and Weller, патент США 5034506). Согласно другим вариантам реализации, такому как остов на основе пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида заменен полиамидным остовом, нуклеотиды связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп полиамидного остова. Олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей в положении 2’: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 или O(CH2)nCH3, где n принимает значения от 1 до приблизительно 10; C1-C10 низшие алкилы, алкоксиалкокси, замещенные низшие алкилы, алкарил или аралкил; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, или N-алкил; O-, S-, или N-алкенил; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенные силилы; РНК расщепляющую группу; репортерную группу; интеркалятор; группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида; или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Модификация включает 2’-метоксиэтокси [2’-O-CH2CH2OCH3, также известный как 2’-O-(2-метоксиэтил)]. Другие модификации включают 2’-метокси (2’-O-CH3), 2’-пропокси (2’-OCH2CH2CH3) и 2’-фтор (2’-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3’ положению сахара 3’ концевого нуклеотида и 5’ положению 5’ концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики Сахаров, такие как циклобутилы, вместо пентофуранозильной группы.
[00208] Олигонуклеотиды могут также содержать, дополнительно или альтернативно, модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области техники просто «основанием»). Используемые в настоящей заявке термины «немодифицированные» или «природные» нуклеотиды включают аденин (A), гуанин (G), тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды, обнаруживаемые в природных нуклеиновых кислотах редко или временно, например, гипоксантин, 6-метиладенин, 5-Ме пиримидины, в частности, 5-метилцитозин (также называемый 5-метил-2’ дезоксицитозин и часто упоминаемый в данной области техники как 5-Me-C), 5-гидроксиметилцитозин (ГМЦ), гликозил ГМЦ и гентобиозил ГМЦ, а также синтетические нуклеотиды, например, 2-аминоаденин, 2-(метиламино)аденин, 2-(имидазолилалкил)аденин, 2-(аминоалкиламино)аденин или другие гетерозамещенные алкиладенины, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6 (6-аминогексил)аденин и 2,6-диаминопурин. «Универсальное» основание из известных в данной области техники, например, инозин, может также быть включено. Показано, что 5-Me-C замещения увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., in Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278) и на настоящий момент являются замещениями оснований.
[00209] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, увеличивающих активность или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, фрагмент холестерила, тиоэфир, например, гексил-S-триотиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-рак-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-рак-глицеро-3-H-фосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту. Олигонуклеотиды, содержащие липофильные фрагменты, и способы получения таких олигонуклеотидов известны в данной области техники, см., например, патенты США 5138045, 5218105 и 5459255.
[00210] Необязательно, чтобы все положения конкретного нуклеотида были модифицированы единообразно, и на самом деле в одном олигонуклеотиде, или даже в одном нуклеозиде в составе олигонуклеотида может содержаться более одной из упомянутых выше модификаций. Настоящее изобретение также включает олигонуклеотиды, которые представляют собой химерные олигонуклеотиды согласно данному выше определению.
[00211] Согласно другому варианту реализации молекула нуклеиновой кислоты, предложенная в настоящем изобретении, конъюгирована с другим фрагментом, включая, но не ограничиваясь перечисленными, лишенные оснований нуклеотиды, полиэфиры, полиамины, полиамиды, пептиды, углеводороды, липиды или полиуглеводородные соединения. Специалистам в данной области техники будет ясно, что такие молекулы могут быть связаны с любым одним или более чем одним нуклеотидом, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, в нескольких положениях на сахаре, основании или фосфатной группе.
[00212] Олигонуклеотиды, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть удобно и просто получены с применением общеизвестной техники твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза коммерчески доступно от ряда поставщиков, включая Applied Biosystems. Могут также быть использованы любые другие способы такого синтеза; фактический синтез указанного олигонуклеотида не представляет трудностей для среднего специалиста в данной области техники. Также общеизвестна возможность использования сходных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные и алкилатные производные. Также общеизвестна возможность использования сходных техник и коммерчески доступных модифицированных амидитов и продуктов на основе стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как биотин-, флуоресцеин-, акридин- или псорален-модифицированные амидиты и/или CPG (доступные от Glen Research, Sterling VA) для синтеза флуоресцентно меченых, биотинилированных или других модифицированных олигонуклеотидов, таких как холестерин-модифицированные олигонуклеотиды.
[00213] В соответствии с настоящим изобретением подразумевается применение модификаций, например, применение мономеров ЗНК для усиления силы, специфичности и продолжительности действия и расширение диапазона путей введения олигонуклеотидов, состоящих из конкретных компонентов, таких как МОЭ, АНК, ФАНК, ФТ и т.д. Это может быть достигнуто замещением некоторых мономеров в конкретных олигонуклеотидах ЗНК-мономерами. ЗНК-модифицированный олигонуклеотид может иметь размер, соответствующий исходному соединению, или может быть больше, либо, предпочтительно, меньше. Такие ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды должны содержать менее чем приблизительно 70%, более предпочтительно менее чем приблизительно 60%, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 50% мономеров ЗНК, и чтобы их размеры составляли приблизительно от 5 до 25 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 12 до 20 нуклеотидов.
[00214] Модифицированные олигонуклеотидные остовы включают, не ограничиваясь перечисленными: фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3’алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3’-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, и боранофосфаты, включающие нормальные 3’-5’ связи, 2’-5’ связанные аналоги, и имеющие обращенную полярность, где соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3’-5’ к 5’-3’ или 2’-5’ к 5’-2’. Различные соли, смешанные соли и свободные кислоты также включены.
[00215] Примеры патентов США, раскрывающих получение вышеприведенных фосфорсодержащих связей, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563 253; 5571799; 5587361; и 5625050, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00216] Модифицированные олигонуклеотидные остовы, не включающие атомы фосфора, образованы алкильными с короткой цепью или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или более гетероатомными с короткой цепью или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (образованными частично сахаром нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, содержащие смешанные N, О, S и CH2-компоненты.
[00217] Примеры патентов США, содержащие указание по получению описанных выше олигонуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00218] В других миметиках олигонуклеотидов и сахара, и межнуклеозидная связь, т.е. остов, нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Основания сохраняют для гибридизации с подходящим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерных соединений, олигонуклеотидный миметик, продемонстрировавший прекрасную способность к гибридизации, называют пептидной нуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях сахарный остов олигонуклеотида заменен амидсодержащим остовом, например, аминоэтилглициновым остовом. Основания нуклеиновых кислот сохранены и связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп амидной части остова. Примеры патентов США, в которых описано получение ПНК-соединений, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5539082; 5714331; и 5719262, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Дальнейшее описание ПНК-соединений можно найти у Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500.
[00219] Согласно еще варианту реализации изобретения олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами, и в частности- CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, известным как метилен (метилимино) или MMI остов, - CH2-O-N (CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) CH2- и -O-N(CH3)-CH2-CH2-, где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -O-P-O-CH2- согласно упомянутому выше патенту США 5489677, и амидные остовы согласно упомянутому выше патенту США 5602240. Также существуют олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы согласно вышеупомянутому патенту США 5034506.
[00220] Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2’: OH; F; O-, S-, или N-алкил; O-, S-, или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или О алкил-O-алкил, где указанные алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C→CO алкил или C2→CO алкенил и алкинил. В частности, существуют O(CH2)n OmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2nON(CH2)nCH3)2, где n и m могут принимать значения от 1 до приблизительно 10. Другие олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2’: C→CO, (низшие алкилы, замещенные низшие алкилы, алкарил, аралкил, O-алкарил или O-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенные силилы, РНК расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Определенная модификация включает 2’-метоксиэтокси (2’-O-CH2CH2OCH3, также известную как 2’-O-(2-метоксиэтил) или 2’-МОЭ), т.е. алкоксиалкокси группу. Еще одна модификация включает 2’-диметиламинооксиэтокси, т.е. O(CH2)2ON(CH3)2 группу, также известную как 2’-ДМАОЭ, согласно описанию в приведенных ниже в настоящей заявке примерах, и 2’-диметиламиноэтоксиэтокси (также известной в данной области техники как 2’-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2’-ДМАЭОЭ), т.е. 2’-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.
[00221] Другие модификации включают 2’-метокси (2’-OCH3), 2’-аминопропокси (2’-OCH2CH2CH2NH2) и 2’-фтор (2’-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3’ положению сахара 3’ концевого нуклеотида или в 2’-5’ связанных олигонуклеотидах и 5’ положению 5’ концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики сахаров, например, циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильного сахара. Примеры патентов США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; и 5700920, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00222] Олигонуклеотиды могут также содержать модифицированные или замещенные нуклеиновые основания (часто называемое в данной области техники просто «основания»). В контексте настоящей заявки «немодифицированные» или «природные» нуклеотиды включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают другие синтетические и природные нуклеотиды, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксимегил цитозин, ксантин, гипоксантин, 2- аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил урацил и цитозин, 6-азо урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдо-урацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
[00223] Далее, нуклеотиды включают описанные в патенте США 3687808, описанные в The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering’, стр.858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, описанные у Englisch et al., ‘Angewandle Chemie, International Edition’, 1991, 30, стр.613, и описанные у Sanghvi, Y.S., Chapter 15, ‘Antisense Research and Applications’, стр.289-302, Crooke, S.T. и Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидов подходят, в частности, для увеличения связывающей способности олигомерных соединений, предложенных в настоящем изобретении. Такие включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. 5-метилцитозиновые замещения, как было показано, повышают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T., Lebleu, В., eds, ‘Antisense Research and Applications’, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278) и на настоящий момент существуют замещения оснований, в частности, в комбинации с 2’-O-метоксиэтиловыми модификациями сахаров.
[00224] Примеры патентов США, в которых описано получение вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов, а также других модифицированных нуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808, а также 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5596091; 5614617; 5750692 и 5681941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00225] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, подразумевает химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагмента или конъюгата, стимулирующего активность, распределение в клетках или поглощение клетками указанного олигонуклеотида.
[00226] Такие фрагменты содержат, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-3-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-гас-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, или октадециламиновый или гексиламино-карбонил-t оксихолестериновый фрагмент.
[00227] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082 830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00228] Поиск новых лекарственных средств: Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут также применяться для поиска новых лекарств и валидации мишеней. Настоящее изобретение включает применение описанных в настоящей заявке соединений и целевых сегментов при поиске новых лекарственных средств для выяснения взаимосвязей, существующих между полинуклеотидами сиртуина (SIRT) и болезнью, фенотипом или состоянием. Такие способы включают определение или модуляцию полинуклеотидов сиртуина (SIRT), включая контактирование образца, ткани, клетки или организма с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, измерение уровня нуклеиновой кислоты или белка полинуклеотидов сиртуина (SIRT) и/или оценка соответствующего фенотипического или химического конечного состояния через некоторое время после лечения, и, в некоторых случаях, сравнение измеряемой величины с необработанными образцами или образцами, обработанными другими предложенными в настоящем изобретении соединениями. Эти способы могут применяться параллельно или в комбинации с другими экспериментами по определению функций неизвестных генов в процессе валидации мишеней или для определения обоснованности применения конкретного генного продукта в качестве мишени для лечения или предотвращения конкретного заболевания, состояния или фенотипа.
Оценка положительной регуляции или ингибирования генной экспрессии:
[00229] Перенос экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или в организм-хозяина может быть оценен прямым определением присутствия указанной нуклеиновой кислоты в указанных клетке или организме. Такое определение может быть проведено несколькими известными специалистам в данной области техники способами. Например, присутствие экзогенной нуклеиновой кислоты может быть определено посредством саузерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности, связанные с указанной нуклеиновой кислотой. Экспрессия указанных экзогенных нуклеиновых кислот также может быть измерена с применением общепринятых способов, в том числе анализа генной экспрессии. Например, иРНК, полученная из экзогенной нуклеиновой кислоты, может быть обнаружена и количественно определена с применением нозерн-блоттинга и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
[00230] Экспрессия РНК с указанной экзогенной нуклеиновой кислоты может также быть определена измерением ферментативной активности или активности репортерного белка. Например, антисмысловая модулирующая активность может быть непрямо измерена через понижение или повышение экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в качестве показателя того, что экзогенная нуклеиновая кислота производит эффекторную РНК. Используя консервативность последовательностей, возможно сконструировать праймеры и использовать для амплификации кодирующих участков указанных генов-мишеней. Сначала может быть использована наиболее активно экспрессируемая кодирующая область каждого гена для построения модели контрольного гена, хотя может быть использована любая кодирующая или некодирующая область. Каждый контрольный ген получен встраиванием каждой кодирующей области между кодирующей репортер областью и ее поли(A)-сигналом. Эти плазмиды производят иРНК с репортерным геном в вышележащей части гена и потенциальной мишенью РНКи в 3’ некодирующей области. Эффективность индивидуальных антисмысловых олигонуклеотидов может быть проанализирована по модулированию репортерного гена. Репортерные гены, подходящие для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, включают гены синтазы ацетогидроксикислот (АГКС), щелочной фосфатазы (ЩФ), бетагалактозидазы (LacZ), бета глюкоронидазы (GUS), хлорамфеникол ацетилтрансферазы (ХАТ), зеленого флуоресцентного белка (GFP), красного флуоресцентного белка (RFP), желтого флуоресцентного белка (YFP), голубого флуоресцентного белка (CFP), пероксидазы хрена (ПОХ), люциферазы (Luc), нопалин синтазы (NOS), октопин синтазы (OCS) и их производных. Доступны различные селективные маркеры, придающие устойчивость к ампициллину, блеомицину, хлорамфениколу, гентамицину, гигромицину, канамицину, линкомицину, метотрексату, фосфинотрицину, пуромицину и тетрациклину. Способы определения модулирования репортерного гена хорошо известны в данной области техники, и включают, не ограничиваясь перечисленными: флуорометрические способы (например, флуоресцентная спектроскопия, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), флуоресцентная микроскопия), определение устойчивости к антибиотику.
[00231] Экспрессия белка и иРНК SIRT1, SIRT2 и SIRT3 может быть проанализирована с применением известных специалистам в данной области техники способов, описанных в любом из разделов настоящей заявки. Например, для измерения уровней белка могут применяться методы иммуноанализа, такие как ELISA. Антитела для ELISA для анализа сиртуина (SIRT) коммерчески доступны, например, от R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота), Abeam, Кембридж, Массачусетс.
[00232] Согласно вариантам реализации экспрессия SIRT1, SIRT2 и SIRT3 (например, иРНК или белка) в образце (например, в клетках или тканях in vivo или in vitro), обработанном с применением антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, оценивается посредством сравнения с экспрессией сиртуина (SIRT) в контрольном образце. Например, экспрессия белка или нуклеиновой кислоты может сравниваться с применением известных специалистам в данной области техники способов с таковой в плацебо-образце или в необработанном образце. Как вариант, может быть проведено сравнение с образцом, обработанным контрольным антисмысловым олигонуклеотидом (например, имеющим измененную или иную последовательность), в зависимости от того, какую информацию необходимо получить. Согласно другому варианту реализации различие в экспрессии белка или нуклеиновой кислоты сиртуина (SIRT) между необработанным и обработанным образцами может сравниваться с различием в экспрессии различных нуклеиновых кислот (включая любые стандартные, признанные исследователем подходящими, например, конститутивный ген) в обработанном и необработанном образцах.
[00233] Наблюдаемые различия могут быть выражены в удобной форме, например, в виде пропорции или доли, для сравнения с контролем. Согласно вариантам реализации уровень иРНК или белка сиртуина (SIRT) в образце, обработанном антисмысловым олигонуклеотидом, предложенным в настоящем изобретении, повышается или снижается приблизительно 1,25-кратно-10-кратно или более относительно необработанного образца или образца, обработанного контрольной нуклеиновой кислотой. Согласно вариантам реализации уровень иРНК или белка сиртуина (SIRT) повышается или снижается по меньшей мере приблизительно 1,25-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,3-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,4-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,6-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,7-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,8-кратно, по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей мере приблизительно 2,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 3,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере приблизительно 4,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей мере приблизительно 6,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 7,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере приблизительно 8,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 9,5-кратно, или по меньшей мере приблизительно 10-кратно или более.
Наборы, реагенты для исследований, диагностики и терапии [00234] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть использованы для диагностики, лечения и профилактики, а также в качестве реагентов для исследований и компонентов наборов. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, способные ингибировать генную экспрессию с высокой специфичностью, часто используются специалистами в данной области техники для выяснения функций отдельных генов или распознавания функций различных компонентов биологических путей.
[00235] Для применения в наборах и для диагностики, и в различных биологических системах, соединения, предложенные в настоящем изобретении, по отдельности или в комбинации с другими соединениями или терапевтическими средствами подходят в качестве инструмента дифференциального и/или комбинаторного анализа для определения паттернов экспрессии части или всего набора генов, экспрессируемых в клетках и тканях.
[00236] Используемый в настоящей заявке термин «биологическая система» или «система» определен как любой организм, клетка, клеточная культура или ткань, экспрессирующая, или с приобретенной способностью экспрессировать, продукты генов сиртуина (SIRT). Они включают, не ограничиваясь перечисленными: человека, трансгенных животных, клетки, культуры клеток, ткани, ксенотрансплантаты, трансплантаты и их комбинации.
[00237] Согласно одному из неограничивающих примеров паттерны экспрессии в клетках или тканях, обработанных одним или несколькими антисмысловыми соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными антисмысловыми соединениями, и исходя из полученных паттернов анализируют дифференциальные уровни генной экспрессии, так как они связаны, например, с болезнью, сигнальными путями, локализацией в клетках, уровнями экспрессии, размером, структурой или функцией изучаемых генов. Эти исследования могут быть выполнены на стимулированных или не стимулированных клетках в присутствии или в отсутствие других соединений, которые влияют на паттерны экспрессии.
[00238] Примеры способов анализа генной экспрессии, известных в данной области техники, включают анализ на ДНК-чипах или на микрочипах, SAGE (серийный анализ экспрессии генов), READS (рестриктазная амплификация расщепляемых кДНК), TOGA (полный анализ генной экспрессии), белковые чипы и протеомику, секвенирование меток экспрессируемой последовательности (EST), вычитающий РНК фингерпринтинг (SuRF), вычитающее клонирование, дифференциальный дисплей (DD), сравнительная геномная гибридизация, FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) и масс-спектрометрические методы.
[00239] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, подходят для исследований и диагностики, поскольку такие соединения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими сиртуин (SIRT). Например, олигонуклеотиды, гибридизующиеся с эффективностью и в условиях, описанных в настоящей заявке, являясь эффективными модуляторами сиртуина (SIRT), представляют собой эффективные праймеры или зонды в условиях, благоприятных для амплификации или определения гена, соответственно. Такие праймеры и зонды подходят для способов, требующих специфического определения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих сиртуин (SIRT), и для амплификации указанных молекул нуклеиновой кислоты для определения или для применения в дальнейших исследованиях сиртуина (SIRT). Гибридизация указанных антисмысловых олигонуклеотидов, в частности, праймеров и зондов, предложенных в настоящем изобретении, с нуклеиновой кислотой, кодирующей сиртуин (SIRT), может быть определена при помощи известных в данной области техники способов. Такие способы могут включать конъюгирование фермента с указанным олигонуклеотидом, радиоактивное мечение указанного олигонуклеотида и любые другие подходящие способы детекции. Могут также быть подготовлены наборы для определения уровней сиртуина (SIRT) в образце при помощи таких способов определения.
[00240] Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используются специалистами в данной области техники для терапевтических целей. Антисмысловые соединения применялись в качестве терапевтических компонентов при лечении болезненных состояний у животных, в том числе человека. Лекарственные средства на основе антисмысловых олигонуклеотидов безопасно и эффективно вводили людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом, установлено, что антисмысловые соединения могут применяться в качестве терапевтических средств, которые могут быть модифицированы под терапевтические схемы для лечения клеток, тканей и животных, в особенности, человека.
[00241] В случае терапевтических средств животное, предпочтительно человек, у которого, предположительно, имеется заболевание или расстройство, лечение которого может проводиться модуляцией экспрессии полинуклеотидов сиртуина (SIRT), получает лечение в виде введения антисмысловых соединений в соответствии с настоящим изобретением. Например, согласно одному из неограничивающих вариантов реализации указанные способы включают этап введения животному, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества модулятора сиртуина (SIRT). Модуляторы сиртуина (SIRT), предложенные в настоящем изобретении, эффективно модулируют активность сиртуина (SIRT) или модулируют экспрессию белка сиртуина (SIRT). Согласно одному из вариантов реализации указанные активность или экспрессия сиртуина (SIRT) у животного подавлены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия сиртуина (SIRT) у животного подавлены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия сиртуина (SIRT) у животного подавлены приблизительно на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения модулируют экспрессию иРНК сиртуина (SIRT) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.
[00242] Согласно одному из вариантов реализации указанные активность и/или экспрессия сиртуина (SIRT) у животного повышены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия сиртуина (SIRT) у животного повышены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия сиртуина (SIRT) у животного повышены на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения изменяют экспрессию иРНК сиртуина (SIRT) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.
[00243] Согласно некоторым вариантам реализации модуляция сиртуина выявляют путем измерения уровня иРНК сиртуина, антисмысловой РНК, белка, биомаркеров сиртуинов или их сочетания, в биологической пробе. Биомаркеры сиртуинов включают, например, MCP-1, BMP рецептора 1A, Smpd13a, CD14, ApoE, FAS, транстиреин, FABP1, Ацил-КоА-тиоэстеразу 1, Ацил-КоА-тиоэстеразу 2, аквапорин 4, Rrad, CXCL9, CCL8, Ppplr3g, ApoA-I, ApoA-II и ApoB. Биомаркеры экспрессии сиртуинов и их применение при отслеживании экспрессии сиртуина описано, например, в Публикации заявки на патент США No. 2010/0215632, «Biomarkers of Sirtuin Activity and Methods of Use Thereof» ("Биомаркеры активности Сиртуина и способы их применения"), включенной в настоящую заявку посредством ссылки.
[00244] Анализ активности сиртуинов включает анализ ацетилтрансферазной/деацетилазной активности. Такой анализ был описан в литературе, например, в Публикации заявки на патент США No. 2009/02221020, «Mass Spectrometry Assays for Acetyltransferase/Deacetylase Activity» ("Масс-спектрометрический анализ активности ацетилтрансферазы/деацетилазы"), включенной в настоящую заявку посредством ссылки. Любой способ анализа активности сиртуина, известный специалистам в данной области техники, подходит для применения при измерении активности сиртуина в сочетании со способами согласно настоящему изобретению.
[00245] Согласно определенным вариантам реализации модуляцию экспрессии сиртуина выявляют по увеличению (положительной регуляции) или снижению (отрицательной регуляции) числа копий иРНК сиртуина, концентрации иРНК, биомаркеров иРНК или экспрессии или активности белков, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 100%, по меньшей мере приблизительно на 125%, по меньшей мере приблизительно на 150%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 250%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 3500%, по меньшей мере приблизительно на 400%, по меньшей мере приблизительно на 450%, or по меньшей мере приблизительно на 500%, по меньшей мере приблизительно на 600%, по меньшей мере приблизительно на 700%, по меньшей мере приблизительно на 800%, по меньшей мере приблизительно на 900%, or no меньшей мере приблизительно на 1000%, по сравнению с контролем, например, необработанной или ложно-трансфецированной пробой. Согласно некоторым вариантам реализации число копий иРНК сиртуина, концентрация иРНК или биомаркера иРНК, или активность или экспрессия белка увеличивается или уменьшается приблизительно от 10% приблизительно до 500%. Согласно некоторым вариантам реализации число копий иРНК сиртуина, концентрация иРНК или биомаркера иРНК, или активность или экспрессия белка увеличивается или уменьшается приблизительно от 10% приблизительно до 50%, приблизительно от 10% приблизительно до 100%, приблизительно от 10% приблизительно до 150%, приблизительно от 10% приблизительно до 200%, приблизительно от 10% приблизительно до 250%, приблизительно от 10% приблизительно до 300%, приблизительно от 10% приблизительно до 350%, приблизительно от 10% приблизительно до 400%, приблизительно от 10% приблизительно до 450%, приблизительно от 10% приблизительно до 500%, приблизительно от 10% приблизительно до 600%, приблизительно от 10% приблизительно до 700%, приблизительно от 10% приблизительно до 800%, приблизительно от 10% приблизительно до 900%, приблизительно от 10% приблизительно до 1000%, приблизительно от 50% приблизительно до 100%, приблизительно от 50% приблизительно до 150%, приблизительно от 50% приблизительно до 200%, приблизительно от 50% приблизительно до 250%, приблизительно от 50% приблизительно до 300%, приблизительно от 50% приблизительно до 350%, приблизительно от 50% приблизительно до 400%, приблизительно от 50% приблизительно до 450%, приблизительно от 50% приблизительно до 500%, приблизительно от 50% приблизительно до 600%, приблизительно от 50% приблизительно до 700%, приблизительно от 50% приблизительно до 800%, приблизительно от 50% приблизительно до 900%, приблизительно от 50% приблизительно до 1000%, приблизительно от 100% приблизительно до 150%, приблизительно от 100% приблизительно до 200%, приблизительно от 100% приблизительно до 250%, приблизительно от 100% приблизительно до 300%, приблизительно от 100% приблизительно до 350%, приблизительно от 100% приблизительно до 400%, приблизительно от 100% приблизительно до 450%, приблизительно от 100% приблизительно до 500%, приблизительно от 100% приблизительно до 600%, приблизительно от 100% приблизительно до 700%, приблизительно от 100% приблизительно до 800%, приблизительно от 100% приблизительно до 900%, приблизительно от 100% приблизительно до 1000%, приблизительно от 150% приблизительно до 200%, приблизительно от 150% приблизительно до 250%, приблизительно от 150% приблизительно до 300%, приблизительно от 150% приблизительно до 350%, приблизительно от 150% приблизительно до 400%, приблизительно от 150% приблизительно до 450%, приблизительно от 150% приблизительно до 500%, приблизительно от 150% приблизительно до 600%, приблизительно от 150% приблизительно до 700%, приблизительно от 150% приблизительно до 800%, приблизительно от 150% приблизительно до 900%, приблизительно от 150% приблизительно до 1000%, приблизительно от 200% приблизительно до 250%, приблизительно от 200% приблизительно до 300%, приблизительно от 200% приблизительно до 350%, приблизительно от 200% приблизительно до 400%, приблизительно от 200% приблизительно до 450%, приблизительно от 200% приблизительно до 500%, приблизительно от 200% приблизительно до 600%, приблизительно от 200% приблизительно до 700%, приблизительно от 200% приблизительно до 800%, приблизительно от 200% приблизительно до 900%, or приблизительно от 200% приблизительно до 1000%. [00246] Например, снижение экспрессии сиртуина (SIRT) может быть определено в сыворотке, крови, жировой ткани, печени или любой другой жидкости организма, ткани или органе указанного животного. Предпочтительно, клетки, содержащиеся в указанных анализируемых жидкостях, тканях или органах, содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды сиртуина (SIRT) и/или собственно белок сиртуина (SIRT).
[00247] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть использованы для фармацевтических композиций посредством добавления эффективного количества соединения к подходящему фармацевтически приемлемому разбавителю или носителю. Применение соединений и способов, предложенных в настоящем изобретении, может также подходить для профилактики.
[00248] Конъюгаты: Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, усиливают клеточное распределение или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты или конъюгаты могут включать конъюгированные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгированные группы, предложенные в настоящем изобретении, включают интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, улучшающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, улучшающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типовые конъюгированные группы включают холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы, усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, повышающие сопротивление разрушению и/или усиливающие сиквенс-специфичную гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой. Группы, улучшающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, распределение, метаболизм или выведение соединений, предложенных в настоящем изобретении. Типовые конъюгированные группы описаны в международной заявке на патент PCT/US92/09196, поданной 23 октября 1992, и патенте США 6287860, включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Конъюгированные фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными: липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевую кислоту, тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-Нфосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, октадециламин или фрагмент гексиламино-карбонил-оксихолестерина. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом, хлортиазидом, диазепином, индометицином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфамидным препаратом, антидиабетическим средством, антибактериальным веществом или антибиотиком.
[00249] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.
[00250] Составы: Соединения, предложенные в настоящем изобретении, также могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Примеры патентов США, в которых описано получение таких способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции составов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543165; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00251] Хотя указанные антисмысловые олигонуклеотиды не обязательно должны вводиться при помощи вектора, чтобы модулировать экспрессию и/или функцию мишени, варианты реализации настоящего изобретения включают векторные конструкции для экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов, включая промоторы, последовательности генов составных промоторов и обладающие выраженной конститутивной промоторной активностью, или промоторной активностью, которая может быть индуцирована при необходимости.
[00252] Согласно одному из вариантов реализации осуществление изобретения включает введение по меньшей мере одного из вышеуказанных антисмысловых олигонуклеотидов при помощи подходящей системы доставки на основе нуклеиновой кислоты. Согласно одному из вариантов реализации такая система включает невирусный вектор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом. Примеры таких невирусных векторов включают собственно олигонуклеотид (например, любая(ые) из последовательностей SEQ ID NO: 24-127) или его комбинацию с подходящим белковым, полисахаридным или липидным составом.
[00253] Дополнительно, подходящие системы доставки нуклеиновой кислоты включают вирусные векторы, как правило, на основе последовательности одного или нескольких аденовирусов, аденоассоциированного вируса (ААВ), хелпер-зависимого аденовируса, ретровируса, или липосомального комплекса с японским гемагглютинирующим вирусом (HVJ). Предпочтительно, указанный вирусный вектор содержит сильный эукариотический промотор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом, например, промотор цитомегаловируса (ЦМВ).
[00254] Дополнительные векторы включают вирусные векторы, белки слияния и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают вирусы мышиного лейкоза Молони и ВИЧ-вирусы. Один из ВИЧ-вирусных векторов содержит по меньшей мере два вектора, где гены gag и ро1 происходят из генома ВИЧ, а ген env - из другого вируса. Предпочтительными являются ДНК-вирусные векторы. Такие векторы включают рох-векторы, такие как ортопокс- или авипокс-векторы, герпесвирусные векторы, такие как векторы на основе вируса простого герпеса (HSV) I, аденовирусные векторы и векторы на основе аденоассоциированного вируса.
[00255] Антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое при введении животному, включая человека, способно обеспечить получение (прямо или непрямо) биологически активного метаболита или его компонента.
[00256] Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений, предложенных в настоящем изобретении: т.е. солям, сохраняющим необходимую биологическую активность исходного соединения и, кроме того, не дающих нежелательных токсических эффектов. Примеры фармацевтически приемлемых солей олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00257] Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, содержащие антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут вводиться различными способами в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от того, на какую область необходимо воздействовать. Введение может быть местным (в том числе через глаза и через слизистые оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), через легкие, например, посредством вдыхания или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи небулайзера; интратрахеально, интраназально, эпидермально и трансдермально), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное, введение.
[00258] При лечении тканей центральной нервной системы введение может осуществляться, например, инъекцией или инфузией в спинномозговую жидкость. Введение антисмысловой РНК в спинномозговую жидкость описано, например, в заявке на патент США, опубликованной под номером 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression» («Способы замедления развития наследственного заболевания БАС»), включенной в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00259] Если предполагается введение антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, в клетки центральной нервной системы, введение может осуществляться совместно с одним или несколькими агентами, способными обеспечить проникновение указанного антисмыслового олигонуклеотида через гематоэнцефалический барьер. Инъекция может быть сделана, например, в энторинальную область коры или гиппокамп. Доставка нейротрофических факторов введением аденовирусного вектора в двигательные нейроны мышечной ткани описана, например, в патенте США 6632427, «Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons» («Перенос генов в двигательные нейроны мозга, опосредованный аденовирусным вектором»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Доставка векторов непосредственно в мозг, например, в стриатум, таламус, гиппокамп или черную субстанцию известна в данной области техники и описана, например, в патенте США 6756523, «Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain» («Аденовирусные векторы для переноса чужеродных генов в клетки центральной нервной системы, в частности, клетки мозга»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Введение может быть быстрым в случае инъекции или осуществляться в течение некоторого промежутка времени в случае медленной инфузии или введения составов с замедленным высвобождением.
[00260] Рассматриваемые антисмысловые олигонуклеотиды могут быть связаны или конъюгированы с агентами, обеспечивающими необходимые фармацевтические или фармакокинетические свойства. Например, указанный антисмысловой олигонуклеотид может сочетаться с любым веществом, которое, как известно в данной области техники, способствует проникновению или транспорту через гематоэнцефалический барьер, таким как антитело к рецептору трансферрина, и вводимому путем внутривенной инъекции. Указанное антисмысловое соединение может быть связано с вирусным вектором, например, придающим указанному антисмысловому соединению большую эффективность и/или усиливающим транспорт указанного антисмыслового соединения через гематоэнцефалический барьер. Осмотическое преодоление гематоэнцефалического барьера может также быть достигнуто, например, инфузией сахаров, включая, но не ограничиваясь перечисленными, мезоэритрит, ксилит, D(+) галактозу, D(+) лактозу, D(+) ксилозу, дульцит, миоинозитол, L(-) фруктозу, D(-) маннит, D(+) глюкозу, D(+) арабинозу, D(-) арабинозу, целлобиозу, D(+) мальтозу, D(+) раффинозу, L(+) рамнозу, D(+) мелибиозу, D(-) рибозу, адонит, D(+) арабит, L(-) арабит, D(+) фукозу, L(-) фукозу, D(-) ликсозу, L(+) ликсозу и L(-) ликсозу, или аминокислот, включая, но не ограничиваясь перечисленными, глутамин, лизин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, тирозин, валин и таурин. Способы и материалы для повышения проникновения через гематоэнцефалический барьер описаны, например, в патенте США 4866042, «Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier» («Способы доставки генетического материала через гематоэнцефалический барьер»), патенте США 6294520, «Material for passage through the blood-brain barrier» («Материал для прохождения через гематоэнцефалический барьер») и патенте США 6936589, «Parenteral delivery systems» («Парентеральные системы доставки»), включенных в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00261] Рассматриваемые антисмысловые соединения могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Например, катионные липиды могут также быть включены в указанный состав для облегчения поглощения олигонуклеотидов. Одной из таких композиций, как показано, способствующей поглощению, является LIPOFECTIN (доступный у GIBCO-BRL, Bethesda, MD).
[00262] Олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну 2’-O-метоксиэтильную модификацию, предположительно подходят, в частности, для перорального введения. Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармакологические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимы или желательны. Подходящие применения включают также покрытия для презервативов, перчаток и т.п.
[00263] Фармацевтические составы, предложенные в настоящем изобретении, которые могут быть представлены в виде удобной единичной дозированной формы, могут быть получены согласно общепринятым методикам, хорошо известным в области фармацевтической индустрии. Такие техники включают этап соединения активных ингредиентов с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами. Как правило, указанные составы получают равномерным глубоким соединением активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкомолотыми твердыми носителями, или с ними обоими, и затем, при необходимости, придают продукту форму.
[00264] Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, включая, но не ограничиваясь перечисленными, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также быть получены в виде суспензий на основе водных, неводных или смешанных сред. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Указанная суспензия может также содержать стабилизаторы.
[00265] Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленными: растворы, эмульсии, пены и содержащие липосомы составы. Фармацевтические композиции и составы, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать один или более усилители проникновения, носители, вспомогательные вещества или другие активные или неактивные ингредиенты.
[00266] Эмульсии представляют собой, как правило, гетерогенные системы, где одна жидкость распределена в другой в виде капель, как правило, более 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты помимо дисперсных фаз, и активное лекарственное вещество может присутствовать в растворе в водной фазе, масляной фазе или быть представлено отдельной фазой. Микроэмульсии также относятся к вариантам реализации настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны в данной области техники и подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00267] Составы, предложенные в настоящем изобретении, включают липосомальные составы. В контексте настоящего изобретения термин «липосома» означает пузырьки, состоящие из амфифильных липидов, образующих один или более чем один сферический бислой. Липосомы представляют собой однослойные или многослойные пузырьки с мембраной, образованной липофильными веществами и водной внутренней фазой, где содержится композиция, которую необходимо доставить. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые предположительно взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. pH-чувствительные или отрицательно заряженные липосомы, предположительно, скорее захватывают ДНК, чем образуют с ней комплексы. Как катионные, так и некатионные липосомы применялись для доставки ДНК в клетки.
[00268] Липосомы также включают «стерически стабилизированные» липосомы, что при использовании в настоящей заявке относится к липосомам, содержащим один или более специализированный липид. После включения в липосомы эти специализированные липиды образуют липосомы с увеличенной продолжительностью существования по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примеры стерически стабилизированных липосом являются такие, в которых часть образующего пузырек липидного компонента липосомы содержит один или более гликолипид или дериватизирован одним или несколькими гидрофильными полимерами, таких как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Липосомы и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00269] Фармацевтические составы и композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также включать поверхностно-активные вещества. Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и эмульсиях хорошо известно в данной области техники. Поверхностно-активные вещества и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00270] Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение включает различные усилители проникновения, способствующие эффективной доставке нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Кроме способствования диффузии нелипофильных препаратов через клеточные мембраны, усилители проникновения повышают проникающую способность липофильных препаратов. Усилители проникновения могут быть разделены на пять больших категорий, а именно, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие агенты, и нехелатирующие не-ПАВ-вещества. Усилители проникновения и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00271] Специалисту в данной области техники будет понятно, что составы получают согласно стандартным методикам в соответствии с их назначением, т.е. способом введения.
[00272] Составы для местного применения включают такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, смешаны с агентами для местного введения, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеилфосфатидил DOPE этаноламин, димиристоилфосфатидил холин DMPC, дистеаролфосфатидилхолин) отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидил глицерина DMPG) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеилфосфатидил этаноламин DOTMA).
[00273] Для местного или другого применения олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомы или входить в состав липосомальных комплексов, в частности, с катионными липосомами. Как вариант, олигонуклеотиды могут входить в состав липидных комплексов, в частности с катионными липидами. Жирные кислоты и сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли, и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00274] Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, содержащие микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, порционные упаковки, таблетки или минитаблетки. Присутствие загустителей, вкусоароматических агентов, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих агентов или связующих веществ может быть желательным. Составами для перорального приема являются такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, вводятся совместно с одним или несколькими усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами и хелатирующими веществами. Поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Желчные кислоты/соли и жирные кислоты и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Также существуют сочетания усилителей проникновения, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. В частности, предпочтительной является комбинация натриевой соли лауриновой кислоты, каприновой кислоты и УДХК. Другие усилители проникновения включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть введены перорально, в гранулированной форме, включая высушенные распылением частицы, или в составе комплексов микро- или наночастиц. Комплексообразующие агенты для олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00275] Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, включая, но не ограничиваясь перечисленными, усилители проникновения, переносчики и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.
[00276] Определенные варианты реализации настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие одно или более олигомерное соединение в сочетании с одним или более дополнительными агентами. Дополнительные агенты могут действовать по не-антисмысловому механизму. Вторым агентом является, например, агент в настоящее время применяемый для лечения заболеваний или расстройств, связанных с ситруинами. В качестве альтернативы вторым агентом может быть агент, не модулирующий сиртуины, например, химиотерапевтический агент. Например, при лечении рака, один или более химиотерапевтических агентов, применимых при лечении конкретного типа рака, можно вводить в сочетании по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению. Режим комбинированной терапии включает режимы лечения, при которых введение антисмыслового олигонуклеотида к SIRT начинают до, во время или после лечения вторым агентом, и продолжают до любого момента времени во время лечения вторым агентом или после прекращения лечения вторым агентом. Также они включают режимы лечения, при которых агенты, которые следует применять в сочетании, вводят одновременно или в разное время и/или с увеличивающимися или уменьшающимися интервалами во время периода лечения. Комбинированная терапия включает периодическое лечение, которое начинают и прекращают в разные моменты времени, чтобы улучшить клиническое ведение пациента. Например, агент в сочетании можно вводить раз в неделю вначале лечения, снижая частоту до одного раза в две недели, и снижая частоту далее при необходимости.
[00277] Другие сиртуин-модулирующие агенты. Которые можно вводить пациенту в сочетании с антисмысловыми олигонуклеотидами согласно настоящему изобретению, были описаны в литературе, например, в Публикации заявки на патент США №2009/016476 «N-Phenyl Benzamide Derivatives as Sirtuin Modulators» ("Производные N-фенил-бензамида в качестве модуляторов сиртуина"), включенной в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию. В указанной публикации сообщается о применении определенных сиртуин-модулирующих соединений для лечения нейродегенеративных заболеваний, травматического и механического повреждения центральной нервной системы (ЦНС), спинного мозга или периферической нервной системы (ПНС). Также в ней перечислены дополнительные терапевтические агенты, которые можно применять в сочетании с сиртуин-модулирующими агентами. Некоторые другие сиртуин-модулирующие агенты, которые можно вводить пациентам в сочетании с антисмысловыми олигонуклеотидами согласно настоящему изобретению, описаны в: Патенте США №7855289 «Sirtuin modulating compounds» ("Соединения-модуляторы сиртуина") и; Патенте США №7829556 «Sirtuin modulating compounds» ("Соединения-модуляторы сиртуина"); Публикации заявки на патент США №2009/0143376, «Fused Heterocyclic Compounds and Their Use as Sirtuin Modulators» ("Конъюгаты гетероциклических соединений и их применение в качестве модуляторов сиртуина"); Публикации заявки на патент США №2009/0069301, «Acridine and Quinoline Derivatives as Sirtuin Modulators» ("Производные акридина и хинолина в качестве модуляторов сиртуина"); Публикации заявки на патент США №2007/0037865, «Sirtuin modulating compounds» ("Соединения-модуляторы сиртуина"); Публикации заявки на патент США №2007/0149466, «Methods and related compositions for treating or preventing obesity, insulin resistance disorders, and mitochondrial-associated disorders» ("Способы и композиции для лечения или предотвращения ожирения, инсулиновой резистентности и заболеваний, связанных с функцией митохондрий"); каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки на их полные версии.
[00278] Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, химиотерапевтические лекарственные средства для лечения рака, такие как даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозина арабинозид, бис-хлорэтил-нитрозомочевина, бусульфан, митомицин C, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевина, мустарген, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевина, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксицикло-фосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстильбэстрол (DES). При применении с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, такие химиотерапевтические агенты могут применяться индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение некоторого времени, затем МТХ и олигонуклеотид), или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид, или 5-FU, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и противовирусные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, рибавирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, могут также быть скомбинированы в композициях, предложенных в настоящем изобретении. Комбинации антисмысловых соединений и других неантисмысловых лекарственных средств также входят в объем настоящего изобретения. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
[00279] Согласно другому сходному варианту осуществления композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту. Например, первой мишенью может быть конкретная антисмысловая последовательность сиртуина (SIRT), а второй мишенью может быть участок другой нуклеотидной последовательности. Как вариант, композиции, предложенных в настоящем изобретении, могут содержать два антисмысловых соединения или более, нацеленных на разные участки одной и той же целевой нуклеиновой кислоты сиртуина (SIRT). Многочисленные примеры антисмысловых соединений приведены в настоящей заявке, другие могут быть выбраны из подходящих соединений, известных в данной области техники. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
Дозировки:
[00280] Получение фармацевтических композиций и их последующее введение (дозирование) должны быть знакомы специалистам в данной области техники. Дозы зависят от тяжести и чувствительности к лечению болезненного состояния-мишени терапии, курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких месяцев, или до излечения, или до облегчения болезненного состояния. Оптимальный режим дозирования может быть рассчитан на основании измерений накопления препарата в организме пациента. Специалист без труда определит оптимальные дозировки, методологию дозировок и частоту повторения. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной эффективности конкретных олигонуклеотидов, и, как правило, могут быть рассчитаны исходя из EC50, эффективных для животных моделей in vitro и in vivo. Как правило, доза составляет от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, и может вводиться однократно или чаще ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже каждые 2-20 лет. Специалист без труда может рассчитать частоту введения доз, основанную на времени удержания и концентрациях лекарства в жидкостях или тканях организма. После проведения эффективного лечения может быть желательно применение поддерживающей терапии у пациента для предотвращения рецидива заболевания, при этом указанный олигонуклеотид вводится в поддерживающих дозах, варьирующих от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, от однократного или более частого ежедневного приема до однократного приема один раз в 20 лет.
[00281] Согласно вариантам реализации пациент получает дозу лекарственного средства, составляющую по меньшей мере приблизительно 1, по меньшей мере приблизительно 2, по меньшей мере приблизительно 3, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 6, по меньшей мере приблизительно 7, по меньшей мере приблизительно 8, по меньшей мере приблизительно 9, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 35, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90, или по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг массы тела. Некоторые вводимые дозировки антисмысловых олигонуклеотидов описаны, например, в патенте США 7563884, «Antisense modulation of PTP1B expression» («Антисмысловое модулирование экспрессии PTP1B»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00282] Хотя выше и были описаны различные варианты реализации настоящего изобретения, следует понимать, что они представлены только в качестве примеров, а не для ограничения. Многочисленные модификации раскрытых вариантов реализации могут быть осуществлены согласно описаниям в настоящей заявке, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, объем и сущность настоящего изобретения не ограничены какими-либо из приведенных выше вариантов реализации.
[00283] Все упоминаемые здесь документы включены в настоящую заявку посредством ссылок. Все публикации и патентные документы, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылок в том же объеме, как если бы каждая публикация или каждый патентный документ были упомянуты в индивидуальном порядке. Цитируя различные источники в данном документе, заявители не признают, что какой-либо из источников представляет «предшествующий уровень техники» относительно настоящего изобретения. Варианты реализации предложенных в изобретении композиций и способов проиллюстрированы приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
[00284] Следующие неограничивающие Примеры предназначены для иллюстрации некоторых вариантов реализации настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что вариации содержания и вариантов элементов описанных компонентов очевидны специалистам в данной области и входят в объем настоящего изобретения. Пример 1: Конструирование антисмысловых олигонуклеотидов, специфических для молекулы нуклеиновой кислоты, антисмысловой к сиртуину (SIRT) и/или смысловой цепи полинуклеотида сиртуина (SIRT)
[00285] Как указано выше, термин «олигонуклеотид, специфичный для» или «олигонуклеотид с нацеленным действием» относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную формировать стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом иРНК транскрипта гена-мишени.
[00286] Отбор подходящих олигонуклеотидов упрощается при применении компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, из баз данных, таких как GenBank, или секвенированием продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот различных видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, которым свойственна необходимая степень идентичности между генами у целевых видов. В том случае, если гены не были секвенированы, проводят Саузерн-Блоттинг, что позволяет определить степень идентичности между генами у целевых видов и другими видами. Путем проведения Саузерн-Блоттинга с разной степенью строгости, хорошо известной в технике, можно получить приблизительный показатель идентичности. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов, проявляющих значительную степень комплементарности целевым последовательностям нуклеиновых кислот и более низкую степень комплементарности соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот у другого вида. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения согласно настоящему изобретению.
[00287] Антисмысловое соединение является «специфически гибридизуемым», если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[00288] Характеристики гибридизации олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть определены с применением одного или более in vitro способа анализа из известных специалистам в данной области техники. Например, указанные характеристики олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть получены путем определения силы связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекул потенциального лекарственного средства с применением анализа кривых плавления.
[00289] Сила связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекулы потенциального лекарственного средства (далее - Молекулы) может быть оценена с применением любых стандартных способов измерения силы межмолекулярных взаимодействий, например, анализа кривых плавления.
[00290] Анализ кривых плавления определяет температуру, при которой происходит быстрый переход от двуцепочечной к одноцепочечной конформации комплекса природной антисмысловой последовательности/Молекулы. Эта температура широко используется как надежная мера силы взаимодействия между двумя молекулами.
[00291] Анализ кривых плавления может быть выполнен с применением кДНК-копии актуальной природной антисмысловой молекулы РНК или синтетического нуклеотида ДНК или РНК, соответствующего связывающему сайту Молекулы. Доступны многочисленные наборы, включающие все необходимые реагенты для проведения анализа (например, набор MeltDoctor от Applied Biosystems Inc.). Такие наборы содержат подходящий буферный раствор, содержащий один из связывающих двуцепочечную ДНК (дцДНК) красителей (таких как красители HRM от ABI, SYBR Green, SYTO и т.д.). Свойства дцДНК красителей таковы, что они практически не флуоресцируют в свободной форме, но очень выражение флуоресцируют при связывании с дцДНК.
[00292] Для проведения анализа указанную кДНК или соответствующий олигонуклеотид смешивают с Молекулой в концентрациях, определенных согласно протоколам конкретных производителей. Смесь подогревают до 95°C для диссоциации пре-формированных комплексов дцДНК, затем медленно охлаждают до комнатной температуры или другой более низкой температуры, указанной производителем набора, для ренатурации молекул ДНК. Вновь сформировавшиеся комплексы затем медленно нагревают до 95°C, одновременно непрерывно измеряя интенсивность флуоресценции в результате реакции. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству присутствующих в реакции дцДНК. Информация может быть получена с применением инструмента на основе ПЦР в реальном времени, совместимого с набором (например, StepOne Plus Real Time PCR System от ABI или инструмент HghtTyper от Roche Diagnostics, Lewes, UK).
[00293] Пики плавления получают построением графика зависимости отрицательной производной флуоресценции по температуре (-d(Флуоресценция)/dT) по оси y) от температуры (ось x) с применением подходящего программного обеспечения (например, lightTyper (Roche) или SDS Dissociation Curve, ABI). Информацию анализируют с целью определить температуру быстрого перехода комплекса дцДНК в одноцепочечные молекулы. Эту температуру называют температурой плавления и она прямо пропорциональна силе взаимодействия между двумя молекулами. Как правило, температура плавления превышает 40°C.
Пример 2: Модулирование полинуклеотидов SIRT
Обработка клеток HepG2 антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
[00294] Клетки HepG2 из ATCC (каталожный № HTB-22) выращивали на ростовой среде (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024 или Mediatech cat #MT-10-010-CV)+10% ЭБС (Mediatech каталожный № MT35-011-CV) + пенициллин/стрептомицин (Mediatech каталожный № MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За день до эксперимента клетки пересевали с плотностью 1,5×10/мл в 6-луночные планшеты и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в 6-луночных планшетах заменяли на свежую ростовую среду. Все антисмысловые олигонуклеотиды, полученные от производителя в лиофилизированной форме, разводили до концентрации 20 мкмоль. Два мкл этого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco cat#31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 мин, затем добавляли в каждую лунку 6-луночного планшета с клетками HepG2. Сходную смесь, содержащую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для имитации трансфекции контроля. После 3-18 ч инкубации при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую культуральную среду. Через 48 ч после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду удаляли и РНК выделяли из клеток с применением SV Total RNA Isolation System от Promega (cat #Z3105) или набора RNeasy Total RNA Isolation от Qiagen (каталожный №74181), следуя инструкциям производителя. 600 нг РНК добавляли к реакции обратной транскрипции, проводимой с применением кДНК-набора Verso от Thermo Scientific (cat #AB1453B) или High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (каталожный №4368813) согласно описанию в протоколе производителя. кДНК, полученные в результате этой реакции обратной транскрипции, использовали для мониторинга генной экспрессии при помощи ПЦР в реальном времени с применением ABI Taqman Gene Expression Mix (cat #4369510) и праймеров/зондов, сконструированных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00953479_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 и Hs00213029 от Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Использовали следующий цикл ПЦР: 50°c в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов при (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) с применением аппарата для ПЦР в реальном времени StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems). Изменение кратности генной экспрессии после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
Результаты:
[00295] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки некоторыми олигонуклеотидами, направленными на антисмысловую последовательность SIRT1 CV396200 (Фиг.3, 4).
[00296] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 CV396200 (Фиг.8).
[00297] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 CV V428275 (Фиг.9).
[00298] Результаты показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT BE717453. (Фиг.10).
[00299] Результаты показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки тремя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 AV718812, соответственно. (Фиг.11).
[00300] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 AW 169958. (Фиг.12).
[00301] Результаты ПЦР в режиме PB показывают, что уровни иРНК sirt3 в клетках HepG2 повышаются в течение 48 ч после обработки фосфотиоатными олигонуклеотидами, направленными на антисмысловую последовательность sirt3 Hs.683117 (CUR-1545-1550). (Фиг.17).
[00302] Результаты ПЦР в режиме PB показывают, что уровни иРНК sirt3 в клетках HepG2 повышаются в течение 48 ч после обработки фосфотиоатными олигонуклеотидами, направленными на антисмысловую последовательность sirt3 BQ024738 и BE164357. (Фиг.18).
[00303] Результаты ПЦР в режиме PB показывают, что уровни иРНК sirt3 в клетках HepG2 повышаются в течение 48 ч после обработки олигонуклеотидами siРНК, направленными на антисмысловую последовательность sirt3 RIC8A и PMSD13. (Фиг.19).
[00304] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT4 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT4 (Фиг.22).
[00305] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT5 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT5 (Фиг.23).
[00306] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT6 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT6 NM_133475 (Фиг.24).
[00307] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT6 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT6 bf772662 (Фиг.25).
[00308] Результаты ПНР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT7 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT7 (Фиг.29).
Обработка клеток 3T3 антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
[00309] Клетки 3T3 из ATCC/Американская коллекция типовых культур / (каталожный №CRL-1658) выращивали на питательной среде (MEM/EBSS (Hyclone, каталожный номер SH30024, или Mediatech, каталожный № MT-10-010-CV)+10% ЭБС (эмбриональная бычья сыворотка) (Mediatech, каталожный № MT35-011-CV) + пенициллин/стрептомицин (Mediatech, каталожный № MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За один день до эксперимента клетки пересаживали с плотностью 1,5×10/мл в планшеты на 6 лунок и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей питательной средой. Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. Два мкл такого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, и наносили в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками 3T3. Аналогичную смесь, включающую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для ложно-трансфектированного контроля. После инкубации в течение 3-18 часов при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую питательную среду. Через 48 часов после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный №Z3105) или набора для изолирования РНК RNeasy Total от компании «Qiagen» (каталожный №74181) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «Thermo Scientific» (каталожный №АВ 1453 В) или набора для обратной транскрипции High Capacity cDNA (каталожный №4368813), как описано в протоколе производителя. кДНК из реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПЦР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_ml от компании «Applied Biosystems Inc.», Фостер-Сити, Калифорния). Применяли следующие циклы ПНР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) при помощи ПНР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems»). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
Результаты:
[00310] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках 3T3 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки тремя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 мыши AK044604. (Фиг.13).
[00311] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках 3T3 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки пятью из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 мыши AK044604. (Фиг.14).
[00312] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках 3T3 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 мыши AK044604. (Фиг.15).
[00313] Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках 3T3 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT1 мыши AK044604. (Фиг.16).
Обработка клеток Vero76 антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
[00314] Клетки Vero76 из ATCC (каталожный №CRL-1587) выращивали на питательной среде (MEM/EBSS (Hyclone, каталожный номер SH30024, или Mediatech, каталожный № MT-10-010-CV)+10% ЭБС (фосфатно-солевой буфер) (Mediatech, каталожный № MT35-011-CV) + пенициллин/стрептомицин (Mediatech, каталожный № MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За один день до эксперимента клетки пересаживали с плотностью 1,5×10/мл в планшеты на 6 лунок и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей питательной средой. Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. 2 мкл такого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, и наносили в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками Vero76. Аналогичную смесь, включающую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для ложно-трансфектированного контроля. После инкубации в течение 3-18 часов при при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую питательную среду. Через 48 часов после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный №Z3105) или набора для изолирования РНК RNeasy Total от компании «Qiagen» (каталожный №74181) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «Thermo Scientific» (каталожный № AB1453B) или набора для обратной транскрипции High Capacity cDNA (каталожный №4368813), как описано в протоколе производителя. кДНК из реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПЦР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1 от компании «Applied Biosystems Inc.», Фостер-Сити, Калифорния). Применяли следующие циклы ПЦР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) при помощи ПЦР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems»). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
Результаты:
Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках Vero значительно повышаются в течение 48 ч после обработки олигонуклеотидами, направленными на антисмысловую последовательность SIRT1 CV396200 (Фиг.5).
Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT3 в клетках Vero76 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT3 PSMD13 (Фиг.20).
Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT7 в клетках Vero76 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT7 CA308253 (Фиг.27).
Обработка клеток HUVEC антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
[00315] Клетки HUVEC из ATCC (Promo Cell, каталожный №С-12253) выращивали на питательной среде для роста эпителия (Promo Cell, каталожный номер C-22010) при 37°C и 5% CO. За один день до эксперимента клетки пересаживали при помощи набора Promo Cell Detach Kit (каталожный номер C-41200) с плотностью 1,5×10/мл в планшеты на 6 лунок и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей питательной средой для роста эпителия. Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. Два мкл такого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, и наносили в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками HUVEC. Аналогичную смесь, включающую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для ложно-трансфектированного контроля. После инкубации в течение 3-18 часов при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую питательную среду. Через 48 часов после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный №Z3105) или набора для изолирования РНК RNeasy Total от компании «Qiagen» (каталожный №74181) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «Thermo Scientific» (каталожный № AB1453B), как описано в протоколе производителя. кДНК из реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПНР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1 от компании «Applied Biosystems Inc.», Фостер-Сити, Калифорния). Применяли следующие циклы ПЦР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) при помощи ПЦР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems») или термоциклер Mx4000 (Stratagene). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
[00316] Результаты: Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT4 в клетках HUVEC значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT4 AA1569947 (Фиг.21).
Обработка клеток DBS антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
[00317] Клетки DBS из ATCC (каталожный №CCL-161) выращивали на питательной среде (MEM/EBSS (Hyclone, каталожный номер SH30024, или Mediatech, каталожный № MT-10-010-CV) + 10% ЭБС (фосфатно-солевой буфер) (Mediatech, каталожный № MT35-011-CV) + пенициллин/стрептомицин (Mediatech, каталожный № MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За один день до эксперимента клетки пересаживали с плотностью 1,5×10/мл в планшеты на 6 лунок и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей питательной средой. Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. Два мкл такого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, и наносили в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками 3T3. Аналогичную смесь, включающую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для ложно-трансфектированного контроля. После инкубации в течение 3-18 часов при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую питательную среду. Через 48 часов после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный № Z3105) или набора для изолирования РНК RNeasy Total от компании «Qiagen» (каталожный №74181) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «Thermo Scientific» (каталожный № AB1453B) или набора для обратной транскрипции High Capacity cDNA (каталожный №4368813), как описано в протоколе производителя. кДНК из реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПЦР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 и Hs00213029_m1 от компании «Applied Biosystems Inc.», Фостер-Сити, Калифорния). Применяли следующие циклы ПЦР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) при помощи ПЦР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems»). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
Результаты: Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT6 в клетках DBS значительно повышаются в течение 48 ч после обработки двумя из олигонуклеотидов, направленных на антисмысловую последовательность SIRT6 bf772662, и одним олигонуклеотидом, направленным на антисмысловую последовательность NM_133475 (Фиг.26).
Обработка клеток SK-N-AS антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
Клетки SK-N-AS из ATCC (каталожный № CRL-2137) выращивали на питательной среде DMEM (Mediatech, каталожный № MT-10-013-CV) + 10% ЭБС (Mediatech, каталожный № MT35-011-CV) + пенициллин/стрептомицин (Mediatech, каталожный № MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За один день до эксперимента клетки пересаживали с плотностью 3×10/лунку в планшеты на 6 лунок и инкубировали при 37°С и 5% CO в течение ночи. В день эксперимента среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей питательной средой. В момент дозирования клетки были приблизительно на 75% конфлюентны. Для введения дозы среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей средой DMEM + 10% ЭБС + пенициллин + стрептомицин (1,5 мл/лунку). Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ в стерильной воде, не содержащей ДНКаз/РНКаз (рабочий стоковый раствор). При дозировании в одной лунке инкубировали 2 мкл такого раствора с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, затем переносили по капле в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками SK-N-AS (конечная концентрация олигонуклеотидов = 20 нМ). В качестве контроля применяли инактивированный олигонуклеотид в той же концентрации. Дополнительно в одну из лунок каждого планшета вносили смесь из 400 мкл среды Opti-MEM, 4 мкл липофектамина 2000, а 2 мкл стерильной воды, не содержащей ДНКаз/РНКаз, применяли как ложно-трансфектированный контроль. После инкубации приблизительно в течение 18 часов при 37°C и 5% CO среду заменяли свежей средой DMEM + 10% ЭБС + пенициллин + стрептомицин. Приблизительно через 48 часов после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный № Z3105) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «from Applied Biosystems» (каталожный №4368813) как описано в протоколе производителя. кДНК из указанной реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПЦР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (ГО анализа Hs00213029_ml for SIRT7). Применяли следующие циклы ПЦР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) при помощи ПЦР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems»). Проба на 18S была произведена ABI (каталожный №4319413E). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
Результаты: Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК SIRT7 в клетках SK-N-AS значительно повышаются в течение 48 ч после обработки олигонуклеотидами, направленными на антисмысловую последовательность SIRT7 (Фиг.28).
Пример 3: Модуляция экспрессии генов SIRT
Материалы и методы
Обработка клеток HepG2 антисмысловыми олигонуклеотидами
2
2
2
5
[00318] Клетки HepG2 из ATCC (каталожный № HB-8065) выращивали на питательной среде (MEM/EBSS (Hyclone, каталожный номер SH30024, или Mediatech, каталожный № MT-10-010-CV) + 10% ЭБС (фосфатно-солевой буфер) (Mediatech, каталожный № MT35-011-CV) + пенициллин/стрептомицин (Mediatech, каталожный № MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За один день до эксперимента клетки пересаживали с плотностью 0,5×10/мл в планшеты на 6 лунок и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в планшетах на 6 лунок заменяли на 1,5 мл/лунку свежей питательной среды. Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. 2 мкл такого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, и наносили в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками HepG2. Аналогичную смесь, включающую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для ложно-трансфектированного контроля. После инкубации в течение 3-18 часов при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую питательную среду. Через 72 часа после добавления антисмысловых олигонуклеотидов клетки подвергали повторному воздействию олигонуклеотидов, как описано выше. Через 48 часов после повторного дозирования антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный № Z3105) или набора для изолирования РНК RNeasy Total от компании «Qiagen» (каталожный №74181) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «Thermo Scientific» (каталожный №АВ 1453 В), как описано в протоколе производителя. кДНК из реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПНР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 и Hs00213029_m1 от компании «Applied Biosystems Inc.», Фостер-Сити, Калифорния). Применяли следующие циклы ПНР: 50°С в течение 2 мин, 95°С в течение 10 мин, 40 циклов (95°С в течение 15 секунд, 60°С в течение 1 мин) при помощи ПНР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems») или термоциклер Mx4000 (Stratagene). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
[00319] Праймеры и зонды для индивидуально разработанного Taqman анализа для экзона 4: AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA (SEQ ID NO: 128) природная антисмысловая последовательность SIRT1 CV396200.
Последовательность прямого праймера: CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA (SEQ ID NO: 129)
Последовательность обратного праймера: ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (SEQ ID NO: 130)
Последовательность репортера: CAGAGTTTCAATTCCC (SEQ ID NO: 131)
Результаты: Результаты показывают, что уровни иРНК SIRT1 в клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки siPHK, направленными на последовательности to sirtas (sirtas_5, P=0,01). В тех же пробах уровень РНК sirtas значительно снижался после обработки sirtas_5, но оставался неизменным после обработки sirtas_6 и sirtas_7, которые также не оказывали никакого действия на уровень иРНК SITR1 (Фиг.2). sirtas_5, sirtas_6 и sirtas_7 соответствуют последовательностям SEQ ID NO: 47,48 и 49, соответственно. Обработка первичных гепатоцитов обезьян
2
[00320] Первичные гепатоциты обезьяны вводили в культуру при помощи компании «RxGen Inc.» и засевали в планшеты на 6 лунок. Их обрабатывали олигонуклеотидами следующим образом. Среду в планшетах на 6 лунок заменяли свежей питательной средой с 5% ЭБС, 50 Е/мл пенициллина и 50 нг/мл стрептомицина, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкг/мл фунгина («InVivogen», Сан-Диего, Калифорния). Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. 2 мкл такого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco, каталожный №31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный №11668019) при комнатной температуре в течение 20 минут, и наносили в каждую лунку планшетов на 6 лунок с клетками. Аналогичную смесь, включающую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для ложно-трансфектированного контроля. После инкубации в течение 3-18 часов при 37°C и 5% CO среду заменяли на свежую питательную среду. Через 48 часов после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду отбирали, и из клеток экстрагировали РНК при помощи системы для изолирования РНК SV Total от компании «Promega» (каталожный № Z3105) или набора для изолирования РНК RNeasy Total от компании «Qiagen» (каталожный №74181) в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли в реакцию обратной транскрипции, проводимую при помощи набора Verso cDNA от компании «Thenno Scientific» (каталожный № AB1453B), как описано в протоколе производителя. кДНК из реакции обратной транскрипции применяли для отслеживания экспрессии генов при помощи ПНР в режиме реального времени с применением Смеси для экспрессии генов ABI Taqman (каталожный №4369510) и праймеров/зондов, разработанных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 и Hs00213029_m1 от компании «Applied Biosystems Inc.», Фостер-Сити, Калифорния). Применяли следующие циклы ПНР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) при помощи ПЦР-аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus («Applied Biosystems») или термоциклер Mx4000 (Stratagene). Изменение кратности экспрессии генов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.
Результаты: Результаты показаны на Фигуре 7. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают увеличение уровня иРНК SIRT1 после обработки олигонуклеотидом на антисмысловую последовательность SIRT1.
Пример 4: Исследование эффективности и длительности действия CUR 963 у африканской зеленой мартышки
[00321] Задачей настоящего исследования была оценка и сравнение эффекта антисмыслового выбивания несоответствующих некодирующих антисмысловых последовательностей, которые регулируют гены SIRT1, после внутривенного введения в модели низших приматов. Тестируемые соединения антисмысловых олигонуклеотидов, разработанные в целях ингибирования регуляторных последовательностей SIRT1, были разработаны в форме CUR 963.
CUR 963: +G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A (SEQ ID NO: 43).
CUR 962 (контроль): +G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*-G (SEQ ID NO: 132).
НОРМАТИВНЫЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ТЕСРИРОВАНИЮ
[00322] Данное исследование соответствовало по своему дизайну принятым токсикологическим принципам и удовлетворяло Согласованному трехстороннему руководству Международной конференции по гармонизации (Доклинические исследования безопасности для проведения клинических исследований фармацевтических препаратов у человека ICH M3 (m), 9 ноября 2000 г.), и общепринятым процедурам тестирования
терапевтических агентов.
ТЕСТИРУЕМЫЕ И КОНТРОЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Природа и приготовление тестируемого препарата
[00323] Тестируемый препарат, CUR-963, представляет собой химически стабилизированный антисмысловой олигонуклеотид. Основой для внутривенного введения является фосфатно-солевой буфер (ФСБ).
Характеристика основы
[00324] Для основы ФСБ у поставщика была получена информация о составе, номере партии, дате истечения срока годности и условиях хранения (температура и свет/темнота).
Хранение и обращение с тестируемым препаратом
[00325] Тестируемое вещество и основу хранили в соответствии с полученной от спонсора и производителя, соответственно, информацией об условиях хранения.
Анализ лекарственных форм тестируемого препарата
[00326] Пробы лекарственной формы тестируемого препарата будут заморожены для анализа концентрации, стабильности и однородности лекарственных форм тестируемого вещества.
ОБОСНОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
[00327] Приматы представляют собой подходящий вид, отличный от грызунов, приемлемый для контрольно-надзорных органов в качестве индикатора потенциальной опасности, и для которого существуют обширные исходные данные. Африканская зеленая мартышка в особенности представляет собой в значительной степени клинически адекватную модель для изучения многих физиологических и патологических состояний, характерных для человека.
[00328] Внутривенный путь введения соответствует возможному пути введения при терапии у людей. Дозу тестируемых препаратов выбирали на основании результатов исследований по подбору доз для аналогичных соединений, ранее проводимых на африканской зеленой мартышке.
[00329] Африканская зеленая мартышка была выбрана в качестве примата выбора, поскольку целевые последовательности для тестируемых веществ являются консервативными для всех видов со 100% гомологии у приматов. Кроме того, указанное тестируемое вещество представляет собой синтетический олигонуклеотид. Следовательно, введение его приматам позволяет провести более успешную оценку эффективности указанных соединений, которая, будет более точно отражать захват, вероятно, наблюдаемый у человека, чем у других видов.
ЖИВОТНЫЕ
[00330] Вид: Chlorocebus sabaeus, низший примат
[00331] Род: африканская зеленая мартышка, характерная для Сент-Китса.
[00332] Источник: RxGen, Lower Bourryeau, Сент-Китс, Вест-Индия.
[00333] Предполагаемый возраст: Тестируемые животные были взрослыми.
[00334] Предполагаемая масса тела: Обезьяны весят приблизительно 3-4 кг. Реальный диапазон может варьировать, но он задокументирован в записи данных.
[00335] Пол: Тестируемые животные были взрослыми самками.
[00336] Количество животных: Десять животных подвергли скринингу с целью выявления 8 животных, подходящих для включения в исследование.
[00337] Количество, вошедшее в исследование: Самки: 8
[00338] Обоснование количества животных, участвующих в исследовании: Настоящее исследование было разработано так, чтобы в нем участвовало наименьшее из возможного количества животных, в соответствии с основной целью оценки терапевтической эффективности тестируемого препарата у африканской зеленой мартышки на основании данных предшествующих исследований системного введения указанного типа олигонуклеотидов указанному виду.
[00339] Характеристики животных: В исследование вошли десять врослых африканских зеленых мартышек с массой тела в диапазоне от 3 до 4 кг. Указанные обезьяны являлись животными, ранее не получавшими лекарственных препаратов, гуманно изъятыми из дикой популяции, обитающей на указанном острове. Изъятых из дикой среды животных обрабатывали гельминтоцидами, чтобы исключить любую возможную паразитарную нагрузку на кишечник, и наблюдали в карантине по меньшей мере в течение 4 недель до проведения скрининга для включения в исследование. Возраст изъятых из дикой среды обезьян оценивали по размеру и состоянию зубов, и более зрелых животных исключали из исследования. Перед включением в исследование у каждой обезьяны проводили клиническое обследование, включающее оценку двигательной активности и ловкости. Пробы крови отбирали и отправляли в «Antech Diagnostics» (г.Мемфис, Теннесси) для всестороннего биохимического анализа и развернутого клинического анализа, а также оценки липидного профиля (см. раздел 9.2 и 319567928 для описания). Обезьян с ненормальными результатами лабораторных исследований, определенными по сравнению с установленным диапазоном нормы для обезьян из колонии Сент-Китса, исключали из исследования. Чтобы выявить 8 обезьян, удовлетворяющих указанному критерию, скринингу подвергли 10 обезьян, поскольку требовался скрининг дополнительных животных. Перед началом исследования отобранных обезьян рассаживали в индивидуальные клетки на акклиматизацию к отдельному содержанию в течение одной-двух недель. В исследования включали только тех животных, которые, как представлялось, подходили для экспериментирования. Диапазон реального (или оценочного) возраста и массы в начале исследования будет указан в исходных данных и в итоговом отчете.
[00340] Состояние здоровья и самочувствие животных: Соблюдались высочайшие стандарты обращения с животными и выполнялись рекомендации, установленные Отделом сельского хозяйства Сент-Китса и Министерства здравоохранения и социальных служб США (D.H.H.S). Все исследования проводили в соответствии с указанными требованиями, и всеми применимыми сводами правил по уходу и содержанию лабораторных животных, всеми применимыми стандартами ветеринарного лечения, операций и осмотров, содержащихся в Руководстве NIH по уходу и применению животных. В учреждении Сент-Китса была собрана комиссия по исследованиям на животных, которая оценивала протоколы и проверяла помещения в соответствии с требованиями Руководства. У указанного Фонда есть одобренная страховка, выданная Службой благополучия лабораторных животных, как требуется в Руководстве #A4384-01 (Axion Research Foundation/St. Kitts Biomedical Foundation). Никаких особых проблем ветеринарного лечения низших приматов и проблем биологической опасности, связанных с описываемым здесь исследованием, не возникло.
[00341] Размещение животных и окружающая среда: Для создания возможности выявления любых связанных с лечением признаков животных размещали отдельно до операции и после операции до момента умерщвления. Помещение, в котором были расположены индивидуальные клетки с приматами, полностью освещались естественным освещением, который на 17 градусах северной широты длится приблизительно 12 ч; 12 ч цикл свет-темнота, рекомендуемый D.H.H.S США. Помещение для приматов RxGen полностью вентилировалось с улицы. Дополнительное движение воздуха обеспечивали при помощи потолочных вентиляторов, поддерживая постоянную целевую температуру 23-35°C, которая типична для Сент-китса на протяжении всего года. Суточные экстремумы температуры и относительной влажности (которую также держали под контролем), измеряли ежедневно. Во время исследования клетки чистили с регулярными интервалами.
[00342] Рацион питания и вода: Каждому животному предлагали приблизительно 90 г типичной для обезьян пищи в день (TekLad, Мэдисон, Висконсин). Регистрировался специфический состав питательных веществ. Воду периодические оценивали на предмет микробиологической чистоты. Критерии для приемлемых уровней примесей в основном рационе и подаваемой воде были взяты из спецификаций анализа, установленных производителем пищи и периодических проверок водоснабжения, соответственно. Вода удовлетворяла всем критериям, необходимым для сертификации, которая принята для потребления людьми. СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТОВ
[00343] Идентификация и рандомизация животных: Распределение проводили посредством стратифицированной процедуры рандомизации, основанной на массе тела и профилях холестерина в плазме крови. До распределения в группы и после распределения каждое животное идентифицировали путем нанесения татуировки на животе. Татуировки наносят всем животным в колонии как средство идентификации в ходе стандартных проверок здоровья. Зарисовывали схему расположения клеток в целях идентификации животных, находящихся в них, и отдельных обезьян в дальнейшем идентифицировали при помощи маркированных бирок, привязанных к соответствующим клеткам.
[00344] Размер групп, дозы и идентификационные номера: Животных распределили в 2 группы лечения, по 4 обезьяны в каждую группу. Каждой обезьяне присвоили специальный идентификационный номер в соответствии с системой нумерации в учреждении. Данная система позволяет присвоить уникальный номер каждой обезьяне из одной буквы и последующих трех букв, например, Y032.
[00345] Путь и частота введения: Животным вводили препарат один раз в день в дни 1, 3 и 5, внутривенно путем инфузии вручную в течение ~10 мин. Скорость инфузии должна быть 24 мл/кг/ч. Животных подвергали седации при помощи кетамина и ксилазина перед процедурой введения и во время нее. В подкожную вену вводили венозный катетер (Terumo mini vein infusion set, игла 20 калибра, или сходный подходящий набор для инфузии). Введение препарата каждой обезьяне проводили с 8:00 до 10:00 вскоре после пробуждения животных и до кормления. Пробы крови для оценки уровня холестерина и других липидов в плазме крови, как описано в разделе «Отбор крови», ниже, отбирали непосредственно перед каждой инфузией. Отбор крови предшествовал кормлению для обоих интервалов отбора проб для минимизации эффектов питания на измерения холестерина.
[00346] Клиническое обследование: Все видимые признаки реакции на лечение регистрировали в каждый из дней введения препарата. Кроме того, животных обследовали по меньшей мере раз в неделю для оценки физических свойств, таких как внешний вид и общее состояние.
[00347] Масса тела: Массу тела регистрировали с недельными интервалами во время лечения и в периоды после лечения.
[00348] Потребление пищи: Потребление пищи отдельными животными количественно не оценивали.
Однако характер питания отслеживали, и отмечали любые значительные изменения в нем.
[00349] Смертность и заболеваемость: Регистрировали смертность и заболеваемость. Любое решение о преждевременном умерщвлении принимали после консультации с руководителем исследования и с научным монитором исследования, если было возможно. Животных, которых нашли мертвыми или умерщвили преждевременно, подвергали вскрытию с забором печени, почек, сердца и селезенки, а также ткани легких для гистопатологического исследования. В случае преждевременного умерщвления также брали пробы крови (по возможности), и определяли параметры. Животных, которых находили мертвыми после окончания стандартных часов работы, держали в холодильнике в течение ночи, и проводили вскрытие в начале следующего рабочего дня. Если состояние животного требовало преждевременного умерщвления, его подвергали эвтаназии путем внутривенной передозировки пентобарбитала натрия. Все исследование проводили в соответствии с Политикой использования лабораторных животных и ухода за ними. По закону, чтобы удовлетворить стандартам Министерства здравоохранения и социальных служб США по помещениям для приматов, требуется RxGen, который диктует уровень тяжести процедур в рамках исследования, которые допустимы.
КЛИНИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
[00350] Биопсия жировой ткани: Биопсию подкожной жировой клетчатки проводили у всех исследуемых обезьян, за исключением Y775 в день исследования 26, путем извлечения ткани диаметром 1 см через срединный разрез ниже пупка. Биопсию незамедлительно помещали в маркированную крипробирку, содержащую 2 мл RNAlater («Qiagen») и инкубировали при 4°C в течение ночи, после чего RNAlater отсасывали, и мгновенно замораживали пробирку с пробой в жидком азоте. После транспортировки в жидком азоте общую РНК выделяли для проведения кПЦР целевых генов в режиме реального времени.
[00351] Результаты: Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают увеличение уровня иРНК SIRT1 в биопсии жировой ткани, взятой у обезьян, получавших CUR-963, олигонуклеотид, направленный на антисмысловой CV396200.1. SIRT1. CUR-963 по сравнению с обезьянами, получавшими CUR-962 (SEQ ID NO.: 132) - олигонуклеотид, который не оказывает действия на экспрессию SIRT1 in vitro (направлен на антисмысловую последовательность ApoAl DA327409, данные не показаны). Уровень иРНК определяли посредством ПЦР в режиме реального времени (Фиг.6).
Пример 5: Модуляция сиртуина (SIRT) in vivo антисмысловыми олигонуклеотидами к ДНК
[00352] Лечение антисмысловыми олигонуклеотидами к ДНК (ASO): Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), специфичные для SIRT1 AS вводили мышам C57B 1/6J, которые получали диету с высоким содержанием жиров в течение 12 недель с целью индукции ожирения и диабета. Лечение мышей ASO следовало начинать во время содержания их на диете с высоким содержанием жиров. ASO, приготовленные в физиологическом растворе в концентрации 5 мг/кг, вводили мышам внутриперитонеально (в/п) один раз в неделю.
[00353] Измерение массы тела и потребления пищи: Массу тела и потребление пищи мышами измеряли два раза в неделю, до в/п инъекции ASO.
[00354] Измерения уровня глюкозы в крови: Концентрации глюкозы в крови натощак и после приема пищи измеряли каждую неделю путем отбора проб из хвостовой вены.
[00355] Проба на переносимость глюкозы (GTT): GTT проводили всего два раза у каждой мыши, в середине периода содержания на диете с высоким содержания жира (через 4 недели) и ближе к концу (через 10 недель). GTT может предоставить информацию о переносимости глюкозы мышью, которая представляет собой способность к быстрому выведению болюсов глюкозы из кровотока. Данный показатель служит мерой диабета. Мыши оставались без пищи в течение 16 часов. Мышам в/п вводили глюкозу 2 г/кг. Это можно перевести в конечный объем 30% (массовых) раствора глюкозы 0,2 мл на мышь массой 30 г. Измерение уровня глюкозы проводили до введения глюкозы, а также через 5, 15, 30, 60, 90 и 120 минут после инъекции. Уровень глюкозы измеряли путем надреза на кончике хвоста на расстоянии 1 мм от конца под анестезией изофлураном перед в/в инъекцией глюкозы. Каплю крови впитывали в полоску, и концентрацию глюкозы измеряли при помощи глюкометра. GTT проводили всего два раза у каждой мыши, в середине периода содержания на диете с высоким содержанием жира (через 4 недели) и ближе к концу (через 10 недель). GTT может предоставить информацию о переносимости глюкозы мышью, которая представляет собой способность к быстрому выведению болюсов глюкозы из кровотока. Данный показатель служит мерой диабета.
[00356] Проба на переносимость инсулина (ITT): Мыши оставались без еды в течение 6 часов с 9.00 до 15.00. Затем мышам в/в вводили 0,5-1 E инсулина/кг. Концентрацию инсулина корректировали так, чтобы конечный вводимый альбом составлял 0,1-0,15 мл. Измерения уровня глюкозы в крови проводили перед инъекцией и через 5, 15, 30, 45 и 60 минут после инъекции. Кровь отбирали точно так же, как и при GTT. Помимо отслеживания уровня глюкозы в ходе ITT постоянно наблюдали за поведением мышей. Гипогликемия может проявляться как изменение поведения, при котором животные становятся слишком спокойными и демонстрируют чувство дискомфорта. Для предупреждения гипогликемии в/п вводили глюкозу (1 г/кг) в конечном объеме 0,1-0,15 мл вскоре после того, как концентрация глюкозы в крови опускалась ниже 50 мг/мл, или появлялись признаки дискомфорта.
[00357] Отбор крови путем прокола лицевой вены: Мышей удерживали за загривок и основание хвоста, слегка надавливали на кровеносные сосуды шеи путем натяжения складки кожи на шее. Участок для отбора пробы был на челюсти, немного спереди от угла нижней челюсти. Кожу в участке для отбора пробы прокалывали иглой 18G или ланцетом под углом 90° до тех пор, пока кончик иглы/ланцета не проходил через кожу. Пробы крови отбирали при помощи гематокритных микропробирок. После завершения отбора крови кожную складку на шее ослабляли, и прикладывали давление к участку введения марлевым тампоном, чтобы обеспечить остановку крови. Таким способом отбирали 0,05-0,2 мл крови. Данную процедуру проводили только один раз в неделю 5 содержания на диете с высоким содержанием жира, и в конце, в неделю 12, если внутрисердечный прокол не действовал (см. ниже). Уровень гормонов, регулирующих обмен глюкозы и липидов (таких как инсулин, адипонектин и лептин) измеряли при помощи коммерческих наборов на основе ELISA (например, «R&D Systems», Миннеаполис, Миннесота, «Assay Pro St. Charles», Миссури, Mabtech, Мариемонт, Огайо)
[00358] Внутрисердечный прокол: В конце 12 недельного периода содержания на диете с высоким содержанием жиров мышей подвергали анестезии путем длительной ингаляции изофлурана. Анестезию индуцировали путем помещения мышей в индукционный бокс, в который подавали изофлуран и кислород. Мышь клали на спину. Сердце прокалывали иглой диаметром 27G. После кровопускания животное декапитировали, чтобы гарантировать гибель. Ткани (печень, поджелудочную железу, белую и бурую жировую ткань, скелетные мышцы) отбирали для дальнейших исследований (измерение уровня белков и РНК, и гистология). Приблизительно 0,5-1 мл крови получали и применяли для определения нескольких критических параметров обмена глюкозы и липидов (глюкоза, инсулин, холестерин, триглицериды, свободные жирные кислоты, лептин, адипокины, кортикостероиды, гормоны щитовидной железы). Если возникали трудности с указанным способом, мы отбирали кровь через прокол лицевой вены под анестезией изофлураном (см. выше).
[00359] Хотя настоящее изобретение было иллюстрировано и описано посредством ссылок на один или несколько вариантов реализации, эквивалентные изменения и модификации будут очевидны для специалистов после прочтения и понимания настоящего описания и прилагаемых чертежей. Кроме того, хотя конкретные свойства согласно настоящему изобретению могут раскрываться только в одном из нескольких вариантов реализации, такие свойства могут быть скомбинированы с одним или несколькими другими свойствами других вариантов реализации, что может быть необходимо и полезно для любого или частного случая применения.
[00360] Реферат настоящего изобретения позволит читателю быстро понять техническую суть изобретения. Подразумевается, что он не будет использован для целей толкования или ограничения сути и объема приведенной ниже формулы изобретения.