КРИОКОНСЕРВАНТ ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ
CRYOPRESERVING AGENT FOR BLOOD NUCLEOCYTE FREEZING

Изобретение относится к медицине и трансфузиологии и касается создания средства - протекторного раствора для криоконсервирования ядерных клеток крови - при низких и ультранизких температурах.
2
4
2
Комбинированный криопротекторный раствор для замораживания ядерных клеток крови имеет следующий состав: диметилацетамид (х.ч.) - 3,5 мл; гидроксиэтилкрахмал (в составе «Инфукола») - 46,3 мл; фосфатный буфер (NaHPO·2HO, моль) в количестве, необходимом для обеспечения pH раствора 6,5-7,0.
Экспериментальные исследования выполнены в лаборатории консервирования крови и тканей Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства».
В качестве прототипа нами выбран хладоограждающий раствор «Лейкокриодмац» для замораживания и хранения лейкоцитов при -196°C для клинических целей // Трошина В.М. и соавт. «Применение диметилацетамида в качестве криопротектора при замораживании гранулоцитов» (ж. Проблемы гематологии и переливания крови. М.: Медицина. - 1977. - №5. - с.50-54), включающий эндоцеллюлярный криопротектор диметилацетамид, глюкозу, динатриевую соль ЭДТА и воду для инъекций.
Существенным недостатком прототипа является то, что предложенный его авторами ограждающий раствор не содержит гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), который обладает рядом положительных эффектов: экстрацеллюлярный, иммунологически инертен и нетоксичен.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание криоконсерванта для замораживания ядерных клеток крови при -80°C и -196°C, обеспечивающего высокую морфологическую сохранность размороженных клеток.
Технический результат достигается тем, что криоконсервант дополнительно содержит криопротектор гидроксиэтилкрахмал (в составе «Инфукола»), 1) обладающий экстрацеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние диметилацетамида на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении до -80°C и -196°C выраженный криобиологический (технический) эффект, и 2) включение нетоксичного «Инфукола» и диметилацетнамида в нетоксичной для клеток концентрации в криоконсервант не требует отмывания перед применением и снижает риск посттрансфузионных осложнений. Криоконсервант имеет рН среды 6,5-7,0, благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны ядерным клеткам крови и производятся в Российской Федерации.
Пример приготовления криоконсерванта для замораживания 50 мл суспензии ядерных клеток крови до -80°C
2
4
2
В стерильном боксе при температуре +22°C в мерную колбу на 50 мл наливают 3,5 мл диметилацетамида (х.ч.), к нему, используя градуированные пипетки, добавляют 46,3 мл «Инфукола» при постоянном помешивании. В смесь по каплям добавляют фосфатный буфер (NaHРO·2HO, моль) в количестве, необходимом для обеспечения рН раствора 6,5-7,0. Флакон с протекторным раствором герметично укупоривают, маркируют, стерилизуют автоклавированием (1,2 атм - 30 минут).
Приготовленный таким образом протекторный раствор в количестве 5 мл отправляют на санитарно-бактериологическое исследование. При отсутствии бактериальной контаминации протекторный раствор может быть использован для консервирования ядерных клеток до -80°C. Готовый раствор хранят в холодильнике при +2÷+4°C.
Пример использования криоконсерванта для замораживания суспензии ядерных клеток крови до -80°C
2
4
2
Консервирующий раствор, включающий диметилацетамид (х.ч.) в концентрации 7%, «Инфукол» в концентрации 92,6%, фосфатный буфер (NaHPO·2HO, моль) в количестве, необходимом для обеспечения рН раствора 6,5-7,0, при постоянном помешивании смешивают в объемном отношении 1:1 с концентратом ядерных клеток крови в полимерном контейнере «Компопласт», последний помещают в металлический пенал-холдер. Суспензию клеток выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают на 24 часа в электрический морозильник, охлажденный до -80°C, дальнейшее хранение осуществляют при указанной температуре.
Размораживание концентрата клеток осуществляют в 20-литровой водяной ванне, нагретой до +38°C в течение 45-60 секунд при интенсивном покачивании контейнера. Температура размороженного концентрата ядерных клеток в контейнере должна быть +2÷+4°C. Далее исследуют морфологическую сохранность размороженных ядерных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N 9. - с. 58-59). Результаты выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями форменных элементов до замораживания.
Пример приготовления криоконсерванта для замораживания 50 мл суспензии ядерных клеток крови до -196°C
2
4
2
В стерильном боксе (ламинарном шкафу) при температуре +22°C в мерную колбу на 50 мл наливают 3,5 мл диметилацетамида (х.ч.), к нему, используя градуированные пипетки, добавляют 46,3 мл «Инфукола» при постоянном помешивании. В смесь по каплям добавляют фосфатный буфер (NaHPO·2НО, моль) в количестве, необходимом для обеспечения рН раствора 6,5-7,0. Флакон с протекторным раствором герметично укупоривают, маркируют, стерилизуют автоклавированием (1,2 атм - 30 минут). Приготовленный таким образом протекторный раствор исследуют на бактериальное загрязнение. При отсутствии бактериальной контаминации протекторный раствор может быть использован для консервирования ядерных клеток до -196°C.
Пример использования криоконсерванта для замораживания суспензии ядерных клеток крови до -196°C
2
4
2
Консервирующий раствор, включающий диметилацетамид (х.ч.) в концентрации 7%, «Инфукол» в концентрации 92,6%, фосфатный буфер (NaHРO·2НО, моль) в количестве, необходимом для обеспечения рН раствора 6,5-7,0, при постоянном помешивании смешивают в объемном отношении 1:1 с концентратом ядерных клеток крови в полимерном контейнере «Компопласт», последний помещают в металлический пенал-холдер. Суспензию клеток выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают в программный замораживатель клеточных суспензий. На первом этапе замораживание биоматериала производят со скоростью 1°C/мин до -80°C, после чего холдер с клетками переносят в биохранилище с жидким азотом (температура -196°C). Размораживание концентрата клеток осуществляют в 20-литровой водяной ванне, нагретой до +38°C в течение 90 секунд при интенсивном покачивании контейнера. Температура размороженного концентрата клеток в контейнере должна быть +2÷+4°С. Далее исследуют морфологическую сохранность размороженных ядерных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N 9. - с. 58-59). Результаты выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями форменных элементов до замораживания.
Экспериментальные исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей ФБГУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России.
Готовый раствор криоконсерванта прозрачен, без цвета, без запаха, его рН составляет 6,5-7,0. Готовый криофилактик хорошо смешивается с концентратом ядерных клеток крови, не вызывает образования конгломератов клеток и обеспечивает их функциональную и морфологическую сохранность при экспозиции. Криоконсервант проявляет выраженные хладоограждающие свойства при замораживании ядерных клеток крови как до -80°C, так и до -196°C.
Разработанный криофилактик для замораживания ядерных клеток крови при температуре -80°C обеспечивал сохранность 94,2-97,1% функционально активных клеток. Тот же криоконсервант при температуре -196°C обеспечивал сохранность 92,7-97,8% функционально активных клеток.
Таким образом, новый криоконсервант может быть использован в учреждениях медицинского и криобиологического профиля, где имеются условия для замораживания и хранения клеток крови в условиях низких и ультранизких температур.