СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО АНТИГЕНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНТРОЛЬНОЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ НАБОРА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЖИВОТНЫХ, ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ
METHOD OF OBTAINING ERYTHROCYTE ANTIGEN OF ANTHRAX ANTIGEN, METHOD OF OBTAINING CONTROL POSITIVE SERUM FOR KIT OF DETECTION OF ANTIBODIES IN THE BLOOD SERUM OF ANIMALS VACCINATED AGAINST ANTHRAX, IN THE REACTION OF INDIRECT HEMAGGLUTINATION AND KIT FOR DETECTION OF ANTIBODIES

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, может быть использовано для выявления сибиреязвенных антител в сыворотках крови вакцинированных животных с целью оценки поствакцинального иммунитета.
При ведении современного животноводства необходимо учитывать проведение плановых мероприятий по профилактике инфекционных заболеваний.
Сибирская язва относится к группе сапронозов. В связи с ее широким распространением в прошлом сейчас существует множество выявленных и незарегистрированных ее почвенных очагов. Для обеспечения благополучия по сибирской язве в Российской Федерации поголовно вакцинируют сельскохозяйственных животных. Массовая вакцинация снижает заболеваемость, но не устраняет постоянную угрозу новых вспышек. Одними из возможных причин заболевания, считают пропуски при вакцинации и недостаточную напряженность индуцируемого противосибиреязвенного иммунитета. За последние десять лет в РФ ежегодно регистрируется от 4 до 10 спорадических вспышек заболевания сибирской язвы. В связи с этим правомерно возникает вопрос об эффективности вакцинации. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о попытках как отечественных, так и зарубежных ученых разработать методы оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета с использованием серологических реакций на основе биотестирования сывороток крови иммунизированных животных на лабораторных моделях (превентивные свойства сыворотки), аллергических тестов. После открытия Smith Н. и Keppie J. (1955) сибиреязвенного токсина и установления его роли в формировании иммунитета, ученые предлагали внутрикожную реакцию гашения токсина иммунной сывороткой на кроликах или морских свинках, реакцию диффузной преципитации (РДП) для выявления антител с использованием стандартного сибиреязвенного протективного антигена (ПА) и др. Но реакции, основанные на применении сибиреязвенного ПА, не нашли широкого применения в практике в следствии трудностей препаративного получения высокоактивного антигена и его физико-химической лабильности, а серологическими реакциями, как правило, выявляется комплекс антител, большинство из которых не связано с защитой животных от заражения сибирской язвой [2, 3, 5, 7, 10].
Таким образом, до настоящего времени, общепризнанным методом оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета считают заражение сельскохозяйственных или лабораторных животных вирулентными культурами референс-заражающих штаммов Bacillus anthracis, что с практической и экономической точек зрения неприемлемо при мониторинговых исследованиях эффективности мероприятий по специфической профилактике сибирской язвы. Также для выявления инфицированности организма и оценки поствакцинального иммунитета как за рубежом, так и в РФ используется реакция преципитации.
С учетом вышеизложенного, с целью определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, нами был проведен серомонитрринг в отношении данной инфекции путем исследования в реакции преципитации 1031 сыворотки крови, полученной из хозяйств Республики Татарстан. Результаты исследований показали, что титры антител составлял от 1:2 до 1:128, что считается достаточным для защиты животных от заражения.
В настоящее время ветеринарная служба РФ нуждается в более активных, специфичных и экономичных диагностикумах для серологического мониторинга в отношении сибиреязвенной инфекции.
Из существующих на данный момент серологических методов наиболее перспективным является реакция непрямой гемагглютинации, которая позволяет получить данные о наличии группового иммунитета и проведении профилактической вакцинации. Поэтому проблема ее создания стала весьма актуальной.
Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам показал отсутствие сведений об отечественных наборах для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции непрямой агглютинации. Таким образом, существует потребность в создании недорогого, чувствительного и специфичного набора для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, позволяющего проводить широкомасштабные исследования сывороток крови животных.
Известна реакция преципитации, открытая Р. Краусом в 1897 г. для определения напряженности поствакцинального иммунитета, набором препаратов для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в РП (Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. - М.: Агропромиздат, 1986, с. 111-112).
Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных.
Сущность реакции преципитации (РП) - формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.
Компоненты реакции:
- стандартный сибиреязвенный антиген;
- испытуемая сыворотка;
- нормальная сыворотка лошади;
- физиологический раствор;
- преципитирующая сибиреязвенная сыворотка.
Реакцию преципитации проводят в узких преципитационных пробирках Уленгута (диаметр 4 мм). Делают разведения исследуемых сывороток и разливают пастеровской пипеткой в количестве 0,2-0,3 мл. Затем медленно наслаивают 0,1-0,2 мл стандартного сибиреязвенного антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется. Компоненты реакции должны быть прозрачными.
Недостатками этого способа серологической диагностики сибиреязвенной инфекции являются:
- нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании;
- влияние присутствия антител, не обладающих свойствами преципитинов, к числу которых относятся неполные антитела и некоторые другие, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов;
- сравнительно невысокая чувствительность реакции, что затрудняет выявление низких концентраций антител;
- трудоемкость, что ограничивает возможность одновременного исследования большого количества образцов сывороток крови;
- частые расхождения результатов РП при исследовании одних и тех же сывороток в разных лабораториях из-за различия в процедуре постановки и учета реакции;
- значительные материальные затраты и время, поэтому используют выборочный метод (10-12% от всего поголовья) исследования.
Современная диагностика должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы, которые позволили бы получать воспроизводимые и достоверные результаты в пределах способа, не требующих сложного инструментального оснащения, обеспеченные стандартными реагентами и признанные пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических и ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает реакция непрямой гемагглютинации.
Задачей предлагаемого изобретения является создание набора позволяющего быстро, просто определить антитела в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в РНГА, предназначенного для контроля напряженности поствакцинального иммунитета.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в повышении чувствительности и специфической активности набора для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, и достоверности.
Предлагаемый набор содержит антиген, представляющий собой 2,5%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных инактивированным антигеном сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, контрольную положительную сыворотку с активностью в РНГА 1:2048, полученную путем гипериммунизации кроликов культурой сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, контрольную отрицательную сыворотку.
До настоящего времени в качестве положительного контроля использовали преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, которую получают от лошадей в возрасте 4-10 лет массой не менее 350 кг. Гипериммунизацию проводят штаммами 916-1, Ш-15, 94 и матрикс 2-й вакцины Ценковского. Лошадей гипериммунизируют поочередным введением каждого из указанных выше четырех штаммов внутривенно в концентрации 2-3 млрд м.к./мл. Интервал между введениями три дня. Всего делают 16-17 инъекций антигена, постепенно увеличивая дозы с 5 до 70 мл. Кровь берут через 9-10 дней после последнего введения антигена. Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринизацией плазмы, которую затем концентрируют 0,5% фенола (Ветеринарные препараты. - М.: Колос. - 1981. - С. 172).
Недостатками вышеизложенного способа являются:
- применение нескольких антигенов, для изготовления которых требуются значительные материальные затраты и время;
- длительность гипериммунизации;
- трудоемкость выполнения.
Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом с достижением единого технического результата.
1
4
Технический результат достигается в способе получения отрицательного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотки крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации, включающей предварительное получение фильтрата, помещение его в диализный мешочек, хранение в висячем положении в холодильнике при температуре +4°С до концентрации / от первоначального объема, подготовку 2,5%-ной суспензии формалинизированных эритроцитов, предусматривающую отбор крови интактных баранов во флаконы со стеклянными шарами, перемешивание в течение 15 минут, разведение 1:1 фосфатно-буферным раствором pH 6,4, добавление смеси из расчета 100 мл разведенной крови на 20 мл нейтрального формалина и 20 мл фосфатно-буферного раствора pH 7,2, помещение в термостат на 2 часа при температуре +37°C с постоянным перемешиванием и последующим центрифугированием со скоростью 1500 об/мин в течение 15 минут, 4-кратное отмывание осевших эритроцитов и ресуспендирование в 400-500 мл фосфатно-буферном растворе pH 7,2, помещение эритроцитарно взвеси в холодильник при температуре +4°С, удаление через 48 часов надосадочной жидкости, 4-кратное отмывание осадка фосфатно-буферным раствором pH 7,2, разведение полученного осадка фосфатно-буферным раствором pH 6,4, приготовление 2,5%-ной суспензии, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации, предварительное 3-кратное отмывание полученной 2,5%-ной суспензии фосфатно-буферным раствором pH 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое с последующим смешиванием в равных объемах с танином, 20-минутной выдержкой в водяной бане при температуре +37°С, 3-кратным отмывом на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждый, дальнейшим удалением надосадочной жидкости и заливом осадка фосфатно-буферным раствором pH 7,2, а после окончания отмывания разбавление осевших эритроцитов фосфатно-буферным раствором pH 6,4 из расчета получения 2,5% взвеси эритроцитов, консервирование формалином до его 1% концентрации и дальнейшее 3-кратное отмывание на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое фосфатно-буферным раствором pH 7,2, добавление к полученным из расчета 100 мг отмытым формалинизированным эритроцитам 5 мл фильтрата, сенсибилизацию в течение 2 часов на водяной бане при температуре +37°С в присутствии 0,2% глутарового альдегида, 3-4-кратное отмывание фосфатно-буферным раствором pH 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое с добавлением 0,5%-ной инактивированной нормальной лошадиной сыворотки и приготовление из осадка 2,5%-ной взвеси эритроцитов, после чего полученный эритроцитарный сибиреязвенный антиген консервируют 1%-ным формалином, расфасовывают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре +4°С.
А приготовление фильтрата осуществляют путем выращивания штамма 55-ВНИИВВиМ Bacillus anthracis на МПА в матровых колбах в течение трех суток, смывания выросшей культуры 0,85% раствором хлорида натрия и доведения до концентрации 20 млрд м.кл. в 1 мл суспензии, инактивирования ее путем автоклавирования в течение 30 минут при 1 атм, фильтрования в горячем виде, помещения фильтрата в диализный мешочек.
Технический результат достигается также в способе получения контрольной положительной сыворотки для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции непрямой гемагглютинации путем гипериммунизации кроликов 3-суточной агаровой культурой из штамма 55 ВНИИВВиМ Bacillus anthracis, смытой 0,85% раствором хлорида натрия с концентрацией 100 млн м.кл., а введение осуществляют в краевую ушную вену 3-кратно: первое введение в дозе 0,5 мл, второе - 1 мл, третье - 2 мл с интервалом между введениями 3-4 суток, а через семь дней после последнего введения кроликов обескровливают и полученную сыворотку проверяют на активность в РНГА, сыворотку считают годной с титром антител не ниже 1:2048, расфасовывают во флаконы по 1 мл, лиофилизируют и хранят в холодильнике при температуре +4°С.
Технический результат достигается также тем, что создан набор для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в реакции непрямой гемагглютинации, который содержит эритроцитарный сибиреязвенный антиген, контрольную положительную сыворотку, контрольную отрицательную сыворотку.
Необходимые компоненты для проведения РНГА:
- полистироловые планшеты с лунками объемом 0,5 мл;
- одно- и многоканальные пипетки на 0,05-0,2 мл со сменными наконечниками;
- колбы мерные;
- физиологический раствор, содержащий 1% нормальной кроличьей сыворотки крови;
- эритроцитарный сибиреязвенный антиген;
- контрольная положительная сыворотка;
- контрольная отрицательная сыворотка.
Приготовление компонентов для проведения РНГА
1. Приготовление рабочих растворов
Физиологический раствор предназначен для разведения контрольных и испытуемых сывороток. 8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. После полного растворения соли раствор фильтруют, добавляют 5 мл нормальной кроличьей сыворотки, перемешивают и хранят при +4°С в холодильнике.
Полученные контрольные положительную и отрицательную сыворотки достают из холодильника и инактивируют на водяной бане при 56-58°С в течение 30 минут.
2. Приготовление эритроцитарного антигена
Штамм 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis является природно-ослабленным бескапсульным, спорообразующим, выделенным из организма свиньи [1], вакцинным, принят заявителем в качестве производственного, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, отличается высокой продуктивностью культивирования на питательных средах, признан пригодным для изготовления высокочувствительных и специфичных диагностикумов.
1
4
Пример 1. В заявляемом наборе сибиреязвенный антиген готовят следующим образом: штамм 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, выращивают на МПА в матровых колбах в течение трех суток. Выросшую культуру с агара смывают 0,85% раствором хлорида натрия и доводят до концентрации 20 млрд микробных клеток в 1 мл суспензии. Смытую культуру инактивируют путем автоклавирования в течение 30 минут при 1 атм, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. Полученный фильтрат помещают в стерильный диализный мешочек и хранят при температуре +4°С в холодильнике (в висячем положении) для концентрации до / от первоначального объема.
Подготовка эритроцитов к нагрузке антигенного комплекса
Кровь у интактных баранов отбирают во флаконы со стеклянными бусами, перемешивают путем встряхивания в течение 15 минут.
После дефибринирования ее разводят 1:1 фосфатно-буферным раствором pH 6.4. К 100 мл разведенной крови быстро добавляют смесь, состоящую из 20 мл нейтрального формалина (37-38%) и 20 мл фосфатно-буферного раствора pH 7.2, помещают в термостат при температуре 37°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке в течение 2-х часов. После этого смесь центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут. Осевшие эритроциты 4-кратно отмывают и ресуспендируют в 400-500 мл фосфатно-буферного раствора pH 7.2. Эритроцитарную взвесь помещают в холодильник при температуре 4°С. Через 48 часов надосадочную жидкость удаляют, а осадок отмывают 4 раза фосфатно-буферным раствором pH 7.2. Полученный остаток разбавляют фосфатно-буферным раствором pH 6.4 и готовят 2,5% суспензию, консервируют, добавляя при перемешивании, по каплям формалин до его 1%-ной концентрации.
2,5% взвесь формалинизированных эритроцитов, предварительно отмытых фосфатно-буферным раствором pH 7.2 трехкратно при 1500 об/мин по 10 минут, смешивают в равных объемах с танином (20 мг танина растворяют в к 100 мл дистиллированной воды, 1:20000), выдерживают 20 минут в водяной бане при температуре +37°С. Обработанные танином эритроциты трижды отмывают на центрифуге. С этой целью в центрифужные стаканы наливают эритроцитарную взвесь, обработанную танином, и центрифугируют каждый раз по 10 минут со скоростью 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость удаляют, осадок заливают фосфатно-буферным раствором pH 7.2. По окончании отмывания осевшие эритроциты заливают фосфатно-буферным раствором pH 6.4 из расчета получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов и консервируют формалином до его 1%-ной концентрации.
К 100 мл трижды отмытым путем центрифугирования со скоростью 1500 об/мин каждый раз по 10 минут фосфатно-буферным раствором pH 7.2, 2,5%-ным формалинизированным эритроцитам добавляют концентрированный фильтрат в объеме 5 мл и сенсибилизируют в течение двух часов на водяной бане при температуре +37°С в присутствии 0,2% глутарового альдегида. По истечении указанной экспозиции взвесь эритроцитов с антигеном центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут. Осадок отмывают 3-4 раза фосфатно-буферным раствором pH 7,2 с добавлением 0,5% инактивированной нормальной лошадиной сыворотки. Затем из осадка готовят 2,5% взвесь эритроцитов. Полученный таким образом сибиреязвенный эритроцитарный антиген консервируют 1% формалином, расфасовывают и хранят в холодильнике при температуре +4°С
Приготовление контрольных сывороток
Пример 2. Для получения положительной сыворотки используют кроликов весом 2,5-3 кг, которых иммунизируют трехсуточной агаровой культурой из штамма 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, смытой 0,85% раствором хлорида натрия, трехкратно в концентрации 100 млн м.кл. в краевую ушную вену. 1-е введение - 0,5 мл, 2-е - 1 мл, 3-е - 2 мл. Интервал между введениями 3-4 суток. Через 7 дней после последнего введения, кроликов тотально обескровливают. Полученную сыворотку проверяют на активность в РНГА. Сыворотка считается годной с титром антител не ниже 1:2048, ее расфасовывают во флаконы по 1 мл, лиофилизируют и хранят в холодильнике при температуре +4°С.
Пример 3. Для получения контрольной отрицательной сыворотки интактных кроликов выдерживают в карантине в течение 2 месяцев и исследуют сыворотки крови в РНГА. У клинически здоровых неиммунизированных животных, не содержащих при исследовании в РНГА специфических антител к сибиреязвенному антигену, проводят стерильное взятие крови из сердца. Кровь выдерживают в течение 30 минут в термостате при +37°С, затем обводят и отстаивают в холодильнике при +4°С в течение 24 часов. Отстоявшуюся сыворотку сливают в одну емкость в стерильных условиях, расфасовывают по флаконам по 1 мл, лиофилизируют и хранят при температуре +4°С в холодильнике.
Пример 4. Чувствительность и специфичность набора препаратов для определения антител в сыворотке крови исследуемых животных, вакцинированных против сибирской язвы реакцией непрямой агглютинации
Чувствительность набора определяется предельным титром антител в сыворотке крови вакцинированных животных, который может быть, в зависимости от срока вакцинации, в начале 1:4096 и в конце 1:4.
Специфичность набора определяется наличием специфических антител, дающих реакции - положительную с сибиреязвенным антигеном и отрицательную - с гетерологичными антигенами (бруцеллезный, сапной, мелиоидозный).
Пример. 5. Иллюстрация применения набора препаратов для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы реакцией непрямой агглютинации
Для проведения исследования используют сыворотку животных, вакцинированных против сибирской язвы. Реакцию проводят в течение 24 часов после взятия. Сыворотки хранят при температуре +4°С. Не используют объединенные сыворотки от разных животных. Гемолизированные и проросшие сыворотки исследованию не подлежат.
Подготовка компонентов для проведения РНГА
Физиологический раствор готовят: 8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. После полного растворения соли раствор фильтруют.
Лиофилизированные контрольные положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Взятые из холодильника контрольные положительную и отрицательную сыворотки инактивируют на водяной бане при 56-58°С в течение 30 минут.
Проведение РНГА
При проведении РНГА используют компоненты, входящие в набор препаратов для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы реакцией непрямой агглютинации.
Флаконы с эритроцитарным антигеном перед применением встряхивают до полного ресуспендирования осадка и вскрывают.
Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в объеме 0,2 мл в полистироловом планшете, состоящем из 12 горизонтальных и 6 вертикальных лунок.
Для этого многоканальной пипеткой во все лунки трех рядов до 12 лунки полистиролового планшета вносят 0,2 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Затем в первую лунку первого горизонтального ряда вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки и смешивают с физраствором, затем из первой лунки 0,2 мл переносят во вторую, из второй 0,2 мл в третью и так далее до 10 лунки. Из 10 лунки 0,2 мл содержимого выливают в сливную чашку, чтобы в каждой лунке оставалось по 0,2 мл. 11 и 12 лунки без сыворотки. Контрольные - положительную и отрицательную сыворотки разводят, как и испытуемую. Затем во все лунки ряда (с 1 по 12) с испытуемой сывороткой, а также рядов с контрольными - положительной и отрицательной сыворотками планшета с помощью пипетки вносят по 0,05 мл (50 мкл) суспензии эритроцитарного сибиреязвенного антигена. 11 и 12 лунки, где находится только физраствор без сывороток, - это контроль на самоагглютинацию эритроцитарного сибиреязвенного антигена. Планшет осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1-1,5 часа.
Обработка результатов
Учет результатов РНГА проводят при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной сывороткой крови и 0,85% раствором хлорида натрия в виде «пуговки» или кольца различной величины.
Результат реакции оценивают визуально по следующей схеме:
++++ - реакция положительная, эритроциты выпадают на дне лунки тонким слоем в виде перевернутого «зонтика», иногда с фестончатыми оползающими краями;
- - реакция отрицательная, эритроциты выпадают в виде «пуговки» или кольца различной величины.
Количественную оценку реакции выражают в титрах. Обратная величина разведения сыворотки, способная вызвать агглютинацию эритроцитарного антигена, принимается за титр.
Оценку реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.
Титр положительной контрольной сыворотки крови должен быть не ниже 1:64.
Разработанный набор был апробирован на пробах сывороток крови животных (крупного и мелкого рогатого скота) из хозяйств районов Республики Татарстан: Арского, Зеленодольского, Нижнекамского, Кукморского, Лениногорского, Сармановского, Мензелинского в общем количестве 1411.
Пример. Из Арского района Республики Татарстан поступила 1 проба сыворотки крови для исследования на наличие антител после вакцинации животных против сибирской язвы.
Предлагаемый набор хранится в холодильной камере при температуре +4°С. Достаем его и отбираем требуемое количество диагностикума (1 флакон эритроцитарного сибиреязвенного антигена, 1 флакон положительной и 1 флакон отрицательной сывороток). Положительную и отрицательную сыворотки инактивируем при +56-58°С в течение 30 минут на водяной бане. Флакон с антигеном тщательно перемешиваем. В это же время готовим 96-луночный планшет (12 лунок по горизонтали, 6 по вертикали) и физиологический раствор, содержащий 1% нормальной кроличьей сыворотки. Определяем, сколько рядов планшета будет задействовано для проведения реакции. У нас одна проба и две контрольные сыворотки: положительная и отрицательная. Значит, берем три вертикальных ряда планшета: 1 - для испытуемой сыворотки, 2 - для контрольных.
Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в объеме 0,2 мл. Для этого многоканальной пипеткой во все лунки трех рядов до 12 лунки полистиролового планшета вносят 0,2 мл 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Затем в первую лунку первого горизонтального ряда вносим 0,2 мл испытуемой сыворотки и последовательными переносами - из первой 0,2 мл во вторую, из второй 0,2 мл в третью и так далее до 10 лунки. Из 10 лунки 0,2 мл содержимого выливаем сливную чашку, чтобы в каждой пробирке оставалось по 0,2 мл. 11 и 12 лунки без сыворотки. Контрольные - положительную и отрицательную сыворотки разводят, как и испытуемую. Затем во все лунки ряда (с 1 по 12) с испытуемой сывороткой, а также рядов с контрольными - положительной и отрицательной сыворотками планшета с помощью пипетки вносят по 0,05 мл (50 мкл) суспензии эритроцитарного сибиреязвенного антигена. 11 и 12 лунки, где находится только физраствор без сывороток, - это контроль на самоагглютинацию эритроцитарного сибиреязвенного антигена. Планшет осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1-1,5 часа.
Учет реакции проводят при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной сывороткой крови и физраствором в виде компактной точки на дне лунки. Результат реакции оценивают визуально по следующей схеме:
++++ - реакция положительная, эритроциты ровным слоем покрывают все дно лунки, образуя перевернутый "зонтик";
- - реакция отрицательная, на дне лунки компактная точка эритроцитов.
Оценку реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.
Таблица. РП и РНГА в сравнительном аспекте
Таким образом, полученный эритроцитарный антиген, представляющий собой 2,5%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных инактивированным антигеном сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, полученная контрольная положительная сыворотка путем гипериммунизации кроликов культурой сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ с активностью в РНГА 1:2048 и контрольная отрицательная сыворотка позволяют создать высокочувствительный и специфический набор для определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы в реакции гемагглютинации со стойким образованием агглютината на дне лунки в виде перевернутого зонтика, четким однозначным результатом, простым в постановке, не требующим сложного оборудования, 100%-ным охватом вакцинированного поголовья, с минимальными материальными затратами и минимальным временем проведения противоэпизоотических мероприятий. Набор рассчитан для проведения анализа 60 проб сыворотки крови. Набор позволяет контролировать эпизоотическую ситуацию и своевременно выявлять толерантных, пропущенных и ошибочно непривитых животных, определить нарастание титра антител в начале иммунизации и понижение его к концу вакцинации.
Набор необходим для контроля поствакцинальных антител в животноводстве.
Предлагаемый набор актуален, востребован и необходим для животноводческих хозяйств и ветеринарных лабораторий.
Разработанный набор апробирован на пробах сывороток крови животных (крупного и мелкого рогатого скота) из хозяйств районов Республики Татарстан: Арского, Зеленодольского, Нижнекамского, Кукморского, Лениногорского, Сармановского, мензелинского в общем количестве 1411 проб и показал его высокочувствительность и специфичность, возможность владеть ситуацией о вакцинации против сибирской язвы, определить охват привитых животных, формирование и напряженность иммунитета в зависимости от срока вакцинации, выявить животных с низким титром антител и толерантных, своевременно принимать меры по профилактике.
Источники информации
1. Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Оценка эффективности 10-летнего применения вакцины против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ // Ветеринария. - 1994. - №8. - С. 11-15.
2. Барков A.M., Баркова И.А., Алексеев В.В. и др. Обнаружение антител к протективному антигену Bacillus anthracis с использованием реакции непрямой гемагглютинации и твердофазного иммуноферментного метода // Особо опасные болезни. - 2010. - №3.
3. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Метод оценки противосибиреязвенного иммунитета по привинтивным свойствам сыворотки // ЖМЭИ. - 1972. - №6.
4. Ветеринарные препараты. - М.: Колос. - 1981. - 447 с.
5. Галиуллин А.К., Файзуллин А.А., Адиятуллина Д.А. Оценка сибиреязвенного иммунитета у животных через разные сроки после вакцинации // Ветеринария. - 1994. - №8.
6. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. - М.: Агропромиздат. - 1986. - С. 11-112.
7. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф. Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы // ЖМЭИ. - 2006. - №1.
8. Руководство по диагностики и производству вакцин. - Издание МЭБ. - 2004. - С. 21-29.
9. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Стрижаков А.А. Сравнительное изучение методов оценки экспрессии протективного антигена В. anthracis // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Мат. 4-й Межгос. науч. практ. конф. государств-учасников СНГ. 30 сентября - 2 октября 2003. - Саратов. - 2003.
10. Smith Н., Keppie J., Stanley J. The specific toxin produced by B. anthracis in vivo // The hemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. - V. - BrJ. Exp. Path. - 1955. - V. 36. - №4.