СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ КОМБИНАЦИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА И ЭНДОМЕТРИОЗА
METHOD FOR FORMING AN EXPERIMENTAL MODEL OF A COMBINATION OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS AND ENDOMETRIOSIS

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и эндометриоза, например, при проведении многоэтапного исследования по эффективности и безопасности лечения эндометриоза и сахарного диабета 1 типа (СД1 типа).
Изучение влияния особенностей течения и различных методов терапии одного заболевания на другое возможно в рамках доклинических испытаний с использованием экспериментальных моделей на крысах.
Известен способ формирования экспериментальной модели эндометриоза, включающий хирургическое моделирование эндометриоза на крысах линии Wistar массой 200±50 г. в фазе эструс путем двусторонней овариоэктомии с последующим удалением левого маточного рога в месте бифуркации и формированием фрагментов эндометриоидной ткани размерами 3×3 мм [Сравнительная оценка эффективности перспективных препаратов для таргетной терапии эндометриоза на основании экспериментальной модели заболевания. / Ярмолинская М.И., Петросян М.А. и соавт.// Гинекология. - 2018; 20 (5). - С. 46-51].
Недостаток: способ не позволяет оценить взаимное влияние эндометриоза и сахарного диабета 1 типа.
Известен способ моделирования сахарного диабета 1 типа, при котором внутрибрюшинно вводится 0,9% солевой раствор аллоксана в дозировке 150 мг/кг [Можейко, Л.А. (2013). Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть I. аллоксановый диабет. Журнал Гродненского государственного медицинского университета, (3 (43)), 26-29].
Недостаток: способ не позволяет оценить взаимное влияние эндометриоза и сахарного диабета 1 типа.
Техническим результатом изобретения является формирование экспериментальной модели комбинации СД1 типа и эндометриоза для возможности исследования взаимного влияния эндометриоза и сахарного диабета 1 типа.
Указанный технический результат достигается в способе формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и эндометриоза, включающем хирургическое моделирование эндометриоза на крысах путем двусторонней овариоэктомии с последующим удалением левого маточного рога в месте бифуркации и формированием фрагментов эндометриоидной ткани размерами 3×3 мм, в котором сформированные фрагменты ткани имплантируют на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей на расстоянии 7-10 мм от места разреза в месте разветвления кровеносных сосудов, причем в первые 3 дня после хирургического вмешательства вводят антибактериальный препарат цефтриаксон 100 мг/кг один раз в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат кетопрофен 40 мг/кг один раз в сутки внутримышечно, в течение следующих 4 недель - масляный раствор этинилэстрадиола 50 мкг/кг дважды в неделю внутримышечно, через 2 недели после хирургического вмешательства после 24-часового голодания животным, у которых при визуальном контроле сформировалась модель эндометриоза, внутрибрюшинно вводят 0,9% солевой раствор аллоксана в дозировке 150 мг/кг с последующим проведением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней, при этом в течение первых 48 часов после введения аллоксана осуществляют контроль гликемии 2 раза в сутки при помощи глюкометра и капиллярной крови из области кончика хвоста при постоянном доступе животных к воде и раствору 30% глюкозы, при этом повышение уровня гликемии выше 11 ммоль/л и уровня кетоновых тел в крови выше 1,5 ммоль/л на 3-5 сутки является подтверждением формирования сахарного диабета 1 типа, после чего ежедневно в течение 2 недель 1-2 раза в день подкожно вводят инсулин-гларгин длительного действия, причем при уровне гликемии 11-19 ммоль/л -1 ЕД, 20-29 ммоль/л -2 ЕД, 30-33 ммоль/л - 3 ЕД, выше 33 ммоль/л - однократно инсулин-аспарт короткого действия -1 ЕД.
Фиксация сформированных имплантов на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей позволяет ограничить возможность влияния аллоксана, вводимого на втором этапе моделирования.
Профилактика послеоперационных осложнений проводится с применением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней после каждого этапа моделирования.
Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях, на 62 крысах-самках линии Wistar. Все лабораторные животные были выведены в ФГУП Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день/ночь»). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально- этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» утвержденные приказом Министерства Здравоохранения РФ №199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и Европейской конвенции от 22.09.2010 г.
Исследование включало 2 этапа.
Первый этап - хирургическое моделирование эндометриоза на крысах линии Wistar массой 200±50 г. в фазе эструс согласно существующей методике [Сравнительная оценка эффективности перспективных препаратов для таргетной терапии эндометриоза на основании экспериментальной модели заболевания. /Ярмолинская М.И., Петросян М.А. и соавт.//Гинекология. - 2018; 20 (5). - С. 46-51] с модификацией в виде фиксации сформированных имплантов на наружную поверхность передней брюшной стенки под кожей.
Операции проводились под общей анестезией животных с использованием золазепама гидрохлорида 100 в дозировке 30 мг/кг внутримышечно. После освобождения места хирургического доступа от шерстяного покрова с помощью химического средства депиляции («Veet») выполнялась лапаротомия с последующей двусторонней овариоэктомией и удалением левого маточного рога в месте бифуркации с целью формирования фрагментов ткани размерами 3×3 мм. Далее производилась аутотрансплантация подготовленных участков матки на наружную поверхность передней брюшной стенки подкожно на расстоянии 7-10 мм от места разреза в области разветвления кровеносных сосудов. Как указывалось выше, смена локализации фиксации будущих гетеротопий осуществлялась в связи с необходимостью ограничения возможного влияния аллоксана на втором этапе. В первые 3 дня от момента операции с целью профилактики послеоперационных осложнений внутримышечно вводился антибактериальный препарат - цефтриаксон 100 мг/кг один раз в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат - кетопрофен 40 мг/кг один раз в сутки.
Эстрогеннасыщенный гормональный фон достигался путем внутримышечного введения масляного раствора этинилэстрадиола 50 мкг/кг дважды в неделю в течение следующих 4 недель.
Второй этап заключался в формировании СД1 типа (аллоксанового диабета) через 2 недели после первой операции. Процедура проходила также под общей анестезией животных (указана выше) после 24-часового голодания (глюкоза является конкурентным аналогом аллоксана для глюкозного транспортера 2 типа).
После выполнения лапаротомии проводился визуальный контроль гетеротопий. В случае констатации отсутствия формирования имплантов у 11 крыс (18%) - внутрибрюшинно вводился физиологический раствор и формировалась группа контроля по оценке гликемического статуса.
Животным, у которых сформировалась экспериментальная модель эндометриоза, внутрибрюшинно вводился аллоксан в дозировке 150 мг/кг в форме 0,9% солевого раствора [Можейко, Л.А. (2013). Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть I. аллоксановый диабет.Журнал Гродненского государственного медицинского университета, (3 (43)), 26-29]. Также всем животным проводилась профилактика послеоперационных осложнений с применением антибактериальной, обезболивающей и противовоспалительной терапии в течение 3 дней.
Ввиду высвобождения инсулина из поврежденных бета-клеток поджелудочной железы и высокой вероятности развития фатальной гликемии (менее 1,8 ммоль/л), в нашем случае у 12 крыс (18%) или выраженной гипогликемии (менее 3 ммоль/л) в первые 48 часов после второй операции (введения аллоксана), необходимо проводить контроль гликемии 2 раза в сутки при помощи глюкометра (Accu-Chek Performa) и капиллярной крови из области кончика хвоста, а также у животных должен быть постоянный доступ не только к воде, но и раствору 30% глюкозы.
В качестве неотложной помощи животным с выраженной гипогликемией в отсутствие возможности перорального лечения использовался 1-3 мл 10% декстрозы подкожно с повторной регистрацией уровня глюкозы через 30-40 минут. Выраженная гипогликемия может быть представлена клинически в виде снижения двигательной активности, летаргии, выгибания спины и тремора.
После стабилизации уровня глюкозы повышалась потребность в воде до 120 мл/сутки, наблюдалась полиурия, гипергликемия, резкая потеря в весе и выпадение шерсти.
Подтверждение СД1 типа подразумевало повышение уровня гликемии выше 11 ммоль/л на 3-5 сутки введения аллоксана. Как показывал наш опыт, регистрируется гипергликемия около 25 ммоль/л (+/- 5 ммоль/л) по сравнению с нормогликемией в группе контроля 7 ммоль/л (+/- 2 ммоль/л).
С целью дифференциальной диагностики с СД 2 типа необходима регистрация повышения кетоновых тел в крови выше 1,5 ммоль/л при помощи анализатора (FreeStyle Optimum Neo) (Induction of type-1 diabetes in rats: routes, pitfalls and insulin treatment. Isaac F. Federiuk).
После регистрации аллоксанового диабета препаратом выбора является инсулин-гларгин длительного действия, который вводился подкожно ежедневно утром, и, при необходимости, вечером, в течение 2 недель. Дозировка инсулина проводилась в расчете из 1 ЕД подкожно при уровне гликемии 11-19 ммоль/л, 2 ЕД подкожно при уровне гликемии 20-29 ммоль/л и 3 ЕД при уровне гликемии выше 30 ммоль/л. В случае повышения уровня гликемии выше 33 ммоль/л однократно вводился инсулин-аспарт короткого действия 1 ЕД подкожно с целью адекватного контроля уровня глюкозы в крови.
2
Спустя 4 недели после начала эксперимента крысы выводились из эксперимента с целью гистологической верификации очагов эндометриоза. У 5 крыс эндометриоидные очаги визуализировались только с одной стороны. У 10 крыс было сформировано 15 эндометриоидных имплантатов. Средняя площадь поверхности эндометриоидных имплантов составила 12±2,5 мм. Полученный материал подвергался фиксации в течение 24 часов в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологическую проводку материала осуществляли с использованием автоматической станции Leica TP1020 (Leica, Германия), далее образцы заливали в парафиновые блоки и готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм., полученные микросрезы окрашивали гематоксилином и эозином. При световой микроскопии выявляли сформированные эндометриоидные кисты в инфильтратах, оценивали выстилку кист, определяли реактивные и патологические воспалительные изменения. Световую микроскопию проводили на микроскопе Olympus СХ31 (Olympus, Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400.
Было исследовано 15 образцов эндометриоидных инфильтратов. Сформированные эндометриоидные кисты выявлены в 6 (40%) случаях, из которых множественные кисты определялись в 2 случаях, до 2 сформированных кист и единичная кисты были выявлены также в 4 случаях (фиг.).
На фиг.- Эндометриоидная киста с уплощенным эпителием у крысы с СД1 типа. Окраска гематоксилиз-эозин, ×200.
Пример осуществления способа.
При заборе мазков у крысы №7 весом 220 грамм был подтверждена фаза эструс. После анестезии животного и подготовки операционного поля, выполнена лапаротомия с помощью срединного вертикального разреза. Далее двусторонняя овариоэктомия и удаление левого маточного рога в месте бифуркации с целью формирования фрагментов ткани размерами 3×3 мм. После произведена аутотрансплантация подготовленных участков матки на расстоянии 8 мм от места разреза в области разветвления кровеносных сосудов. Следующие 3 суток после операции вводился цефтриаксон 9 ЕД, используя инсулиновый шприц на 100 ЕД-1 мл, кетопрофен 30 ЕД один раз в сутки; Также 11 мкг этинилэстрадиола внутримышечно 2 раза в неделю в течение 4 недель. Спустя 2 недели предоперационная подготовка включала в себя 24 часовое голодание, доступ к воде без ограничения. При оценке гетеротопий в процессе повторной лапаротомии визуализируется единичный очаг эндометриоза, далее вводится 33 мг аллоксана внутрибрюшинно. Антибактериальная и противовоспалительная терапия в прежнем объеме проводится в течение 3 дней. Через 12 часов после введения аллоксана уровень гликемии составляет 2.9 ммоль/л, в связи с чем подкожно вводится 1 мл 10% декстрозы. Через 1 час уровень глюкозы - 3.4 ммоль/л, спустя еще 8 часов - 5.6 ммоль/л. Спустя 36 часов после операции уровень глюкозы составляет 24.7 ммоль/л, при контроле уровня кетонов - 2.6 ммоль/л. Подтвержден инсулинозависимый аллоксановый диабет (СД 1 типа). Согласно формуле - введен инсулин-гларгин подкожно в дозировке 2 ЕД. Спустя 12 часов - уровень гликемии 7.2 ммоль/л. В течение следующих 10 дней продолжается инсулинотерапия и поддержание эстрогеннасыщего фона. Далее крыса выведена из эксперимента. Очаг эндометриоидной гетеропии размерами 4,5×5,0 мм подтвержден при гистологическом исследовании.
Заявленный способ формирования экспериментальной модели комбинации сахарного диабета 1 типа и наружного генитального эндометриоза позволяет изучить особенности течения заболеваний, их взаимного влияния, выявить ограничения и возможности как существующей, так и разрабатываемой терапии с целью улучшения результатов лечения.