ПРИМЕНЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ВЫПАДЕНИЯ ВОЛОС
USE OF VEGETAL EXTRACT FOR PREVENTING AND TREATING HAIR OVER

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению растительного экстракта для предупреждения и лечения выпадения волос.
Настоящее изобретение берет свое начало в области трихологии и питательных продуктов или продуктов лечебного питания.
В особенности, настоящее изобретение относится к применению растительного экстракта для стимулирования физиологического роста волос в участках, подверженных поредению и/или облысению.
Уровень техники
Волосы имеют защитную функцию и рассматриваются в качестве дополнения к коже наряду с сальными железами, потовыми железами и ногтями. Волосы обладают уникальной и специфической особенностью: цикличностью.
Жизненный цикл волосяной луковицы в основном представлен тремя последовательными фазами: анаген (рост), катаген (инволюция) и телоген (фаза покоя).
Период роста волос сменяется фазой регрессии, во время которой самая глубокая часть фолликула претерпевает запрограммированную гибель клеток.
В конце этой фазы цикл запускается заново. Биологические фазы этого явления заключаются в способности стволовых клеток луковицы оставаться, на чередующихся стадиях, в состоянии покоя. Во время роста луковицы и фазы образования волос преобладают активности, направленные на пролиферацию, дифференцировку и выживаемость, которые регулируются факторами роста. Фаза регрессии, напротив, характеризуется активацией молекулярных путей, которые индуцируют апоптоз клеток луковицы.
Поскольку состояние волос важно во взаимоотношениях людей, то многие люди воспринимают потерю волос как проблему.
В фазе анагена дермальный сосочек генерирует химические сигналы, активирующие и направляющие стволовые клетки утолщения, которые путем миграции в основание фолликула формируют матрицу волоса. Путем такой «миграции» стволовые клетки утолщения создают «путь» клеток, который даст начало наружному корневому влагалищу или ORS.
В ответ на дальнейшие сигналы со стороны дермального сосочка, клетки матрицы, которые происходят из стволовых клеток, пролиферируют и запускают процесс дифференциации, перемещаясь вверх для формирования стержня и внутренней оболочки волосяного фолликула.
Начало катагена характеризуется концом клеточной пролиферации и апоптозом клеток матрицы. Во время катагена дермальный сосочек мигрирует в сторону самой нижней части утолщения. Считается, что эта непосредственная близость сосочка к утолщению имеет важное значение для инициации другого цикла продукции волос. Это обеспечивает взаимодействие/активацию клеток утолщения, находящихся в состоянии покоя, и новый цикл роста волос.
При переходе катаген/телоген, некоторые клетки утолщения мигрирующие, чтобы достичь сосочка, формируют матрицу волоса.
Волосы в телогене содержат в своем основании популяцию клеток, которые фактически называют матрица волоса, расположенные в непосредственной близости от дермальных сосочков. Матрица волоса активируется к пролиферации к концу фазы телогена, еще до утолщения, формируя, окружая сосочек, матрицу новой луковицы.
Различные факторы, среди которых стресс, недостаток питательных веществ и старение, негативно влияют на жизненный цикл волосяной луковицы, приводя к сокращению числа волос и их поредению.
У лиц, страдающих от андрогенной алопеции (AGA), с течением времени фолликулы, которые образуются вновь в начале новой фазы анагена, становятся меньше по размерам, что приводит к образованию волос с меньшим диаметром по сравнению с исходным диаметром. Как следствие, происходит формирование микроскопических волос.
Было отмечено, что, хотя фолликулы волосистой части головы атрофируются, все еще остается источник стволовых клеток, которые превращаются в клетки-предшественники, хотя и в меньшей степени, по сравнению с кожей головы в физиологических условиях.
Большинство доступных на рынке лекарственных препаратов для волос нацелены на волосяные луковицы и действуют на метаболизм, кормление, насыщения кислородом кожи головы и микроциркуляцию в ней, улучшая условия, способствующие физиологическому росту волос.
На рынке для лечения и предупреждения выпадения волос доступны различные изделия и терапии. Однако применение таких изделий, которые на сегодняшний день показали себя особенно эффективными в лечении выпадения волос, таких как миноксидил или некоторые антистероидные лекарственные препараты синтетического происхождения, не лишены недостатков. В частности, местное применение миноксидила может в некоторой степени привести к возникновению побочных эффектов, таких как кожная сыпь, местные воспаления, сильная головная боль, в то время как пероральное введение таких лекарственных препаратов, как финастерид, может вызвать появление гормональных дисфункций с потенциальными негативными последствиями для сексуальной жизни.
Другие изделия, в настоящее время применяемые в области трихологии, несмотря на то что они основаны на продуктах природного происхождения, напротив, имеют тот недостаток, что их изготавливают с помощью сложных способов получения и, следовательно, они особенно дорогостоящие.
Как следствие, в настоящее время существует необходимость в обеспечении изделия, содержащего вещества, которые активны в стимулировании физиологического процесса роста волос и применение которых не вызывает существенных побочных эффектов.
Одна из целей настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции или лекарственного препарата, содержащего активные агенты несинтетического происхождения, которые пригодны для стимуляции физиологического роста волос у субъектов, страдающих от выпадения или поредения волос и применение которых практически свободно от существенных побочных эффектов.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции для применения в области трихологии, которая может быть применена местно или введена перорально, активные агенты которой имеют растительное происхождение и могут быть получены с помощью простых методов.
Раскрытие изобретения
В области техники изобретения, заявитель обнаружил, что растительный экстракт, полученный из выбранного травянистого растения, стимулирует физиологический процесс роста волос, при местном применении на волосистую часть головы или при пероральном введении.
В частности, заявитель неожиданно обнаружил, что растение Galeopsis segetum Necker содержит один или несколько активных ингредиентов, которые стимулируют активность волосяной луковицы и способствуют восстановлению физиологических условий роста волос.
В соответствии с первым аспектом изобретения, следовательно, обеспечивают применение растительного экстракта Galeopsis Segetum Necker для стимуляции физиологического роста волос.
В соответствии со вторым аспектом, изобретение обеспечивает растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker для применения при лечении или предупреждении выпадения волос.
Неожиданно было обнаружено, что растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker введенный местно или перорально субъекту, страдающему от поредения волос, вызывает постепенное сгущение более тонких участков волосистой части головы.
В соответствии с третьим аспектом, настоящее изобретение обеспечивает применение композиции, включающей растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker и физиологически приемлемый носитель для стимуляции физиологического роста волос.
В соответствии с четвертым аспектом, обеспечивают композицию, включающую растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker и физиологически приемлемый носитель для применения при лечении или предупреждении выпадения волос.
Как правило, композиция изобретения содержит трихологически активное количество одного или нескольких активных ингредиентов, присутствующих в экстракте Galeopsis Segetum Necker.
Краткое описание чертежей
Особенности и преимущества настоящего изобретения станут более очевидны из прилагаемых чертежей, в которых:
2
фиг. 1 показывает столбчатые диаграммы, относящиеся к результатам по цитотоксичности, полученным с помощью МТТ-анализа по примеру 8 на образцах: вегетативной биомассы, водно-спиртового экстракта Galeopsis Segetum, этилацетатного экстракта Galeopsis Segetum, экстракта Galeopsis Segetum в сверхкритическом CO, в диапазоне доз 2-200 мкг/мл в течение 24, 48 и 72 часов;
2
фиг. 2 показывает гистограммы, представляющие результаты МТТ-анализа с окислительным стрессом, индуцированным на образцах α-токоферола, вегетативной биомассы, водно-спиртового экстракта, этилацетатного экстракта и экстракта Galeopsis Segetum в сверхкритическом CO, как показано в таблице 1 по примеру 8;
2
фиг. 3 показывает гистограммы, представляющие результаты по продукции внутриклеточных АФК, полученные с помощью анализа по примеру 8 образцов, представленных α-токоферолом, вегетативной биомассой и водно-спиртовым экстрактом, этилацетатным экстрактом и экстрактом в сверхкритическом CO из Galeopsis Segetum;
2
фиг. 4 показывает гистограммы, представляющие эффекты Galeopsis Segetum на активность изоформы 2 5-альфа-редуктазы, образцов α-токоферола, вегетативной биомассы и водно-спиртового экстракта, этилацетатного экстракта и экстракта в сверхкритическом CO, как описано в примере 8;
2
фиг. 5 показывает гистограммы, представляющие эффекты на экспрессию цитокератина 6А в двух концентрациях на каждое из следующего: вегетативная биомасса, водно-спиртовой экстракт Galeopsis Segetum, этилацетатный экстракт Galeopsis Segetum, экстракт Galeopsis Segetum в сверхкритическом CO , как описано в примере 8;
фиг. 6 показывает столбчатые диаграммы, относящиеся к МТТ-анализу на 24-х часах, демонстрирующие процент клеточной активности по сравнению с контролем, достигнутый путем обработки растительными экстрактами, содержащими возрастающие количества Galeopsis Segetum Necker, в соответствии с примером 7;
фиг. 7 показывает характеристики трех экстрактов Galeopsis Segetum, описанных в примере 9, с помощью ТСХ-хроматографии с высокой полярностью элюента;
фиг. 8 показывает характеристики трех экстрактов Galeopsis Segetum, описанных в примере 9 с помощью ТСХ-хроматографии с высокой полярностью элюента;
фиг. 9 показывает график с FT-IR-спектром водно-спиртового экстракта Galeopsis Segetum по примеру 9;
фиг. 10 показывает график с FT-IR-спектром этилацетатного экстракта Galeopsis Segetum по примеру 9;
2
фиг. 11 показывает график с FT-IR-спектром экстракта в сверхкритическом CO Galeopsis Segetum по примеру 9.
Осуществление изобретения
Заявитель обнаружил, что растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker, при введении локально или накожно, осуществляет стимулирующее действие на клетки фолликула, реактивируя жизненный цикл волосяных фолликулов.
Кроме того, неожиданно было обнаружено, что трихологическая активность экстракта Galeopsis Segetum Necker также приложима к волосяным луковицам волосистой части головы, находящимся в состоянии покоя, которые, как правило, присутствуют в тех областях волосистой части головы, где обнаруживают поредение волос.
В соответствии с первым аспектом изобретения, следовательно, обеспечивают применение растительного экстракта растения Galeopsis Segetum Necker для стимуляции физиологического роста волос.
В соответствии со вторым аспектом, обеспечивают растительный экстракт растения Galeopsis Segetum Necker для применения при стимулировании физиологического роста волос.
Растение, из которого получают растительный экстракт на основе изобретения, представляет собой Galeopsis Segetum Necker (G. ochroleuca Lam., G. dubia Leers, G. villosa Huds. также известное как пикульник пушистый), травянистые прямостоячие виды с типичными губоцветными цветками, принадлежащие к семейству Lamiaceae.
Растительный экстракт для применения изобретения может быть получен из корней, листьев, плодов или цветков растения Galeopsis Segetum Necker или из двух или нескольких данных частей растения.
В некоторых воплощениях, растительный экстракт получают из надземной части растения Galeopsis Segetum Necker.
В соответствии с некоторыми воплощениями, растительный экстракт изобретения получают с помощью экстракции из части растения, в особенности, наземных частей или их вегетативных тканей, применяя в качестве средства для экстракции физиологически приемлемый или годный к употреблению в пищу растворитель. Термин «годный к употреблению в пищу» означает физиологически приемлемый растворитель, который может усваиваться организмом человека.
Подходящий для получения растительного экстракта растворитель представляет собой физиологически приемлемую и/или годную к употреблению в пищу жидкость, в которой растворимы биологически активные компоненты и в которой они не подвергаются изменению, лишающему их свойственной им активности.
В некоторых воплощениях растворитель представляет собой гидрофильный растворитель, который выбирают из воды, этилацетата, этанола или их смесей.
2
Для того чтобы получить растительный экстракт растения Galeopsis Segetum Necker, могут быть применены способы экстракция с применением сверхкритического CO или твердожидкостные способы, подходящие для разделения/экстрагирования из вегетативных тканей растения одного или нескольких биологически активных компонентов для восстановления физиологических состояний активности волосяной луковицы.
В конкретных воплощениях, экстракция одного или нескольких биологически активных компонентов происходит путем мацерации вегетативной части или матрикса Galeopsis Segetum Necker в подходящем растворителе, например, в водно-спиртовой смеси.
Например, вегетативную часть или матрикс, как правило, надземные части, растения Galeopsis Segetum Necker погружают в подходящий растворитель, например, в водно-спиртовую смесь, на время, подходящее для обогащения растворителя одним или несколькими биологически активными компонентами. В этих условиях, путем диффузии и осмоса происходит экстракция в растворитель биологически активных компонентов, присутствующих в вегетативных тканях растения.
Как правило, во время мацерации матрикс растения Galeopsis Segetum Necker в течение различного времени вступает в контакт с растворителем для получения экстракции эффективного количества биологически активного компонента. В конкретных воплощениях время мацерации может варьировать от 1 до 48 часов.
В конкретных воплощениях растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker вводят в концентрации от 0,01 до 100 мг/мл.
В соответствии с конкретными воплощениями получение подходящего экстракта Galeopsis Segetum Necker включает следующие стадии:
- измельчение части растения, например, наземных частей,
- добавление растворителя для экстракции, например, для получения массового отношения лекарственное средство/водно-спиртовой растворитель в диапазоне от примерно 1:10 до примерно 1:50,
- мацерация,
- экстрагирование,
- фильтрование,
- концентрирование фильтрата, например, при пониженном давлении путем выпаривания растворителя,
- необязательно, продолжение выпаривания до устранения растворителя,
- необязательно, высушивание экстракта.
В конкретных воплощениях стадию экстракции можно повторить два или три раза, до истощения материала, который нужно экстрагировать.
На конечной стадии удаления растворителя путем выпаривания может быть необязательно добавлен твердый носитель, такой как, в качестве неограничивающего примера, крахмалы или мальтодекстрины, для получения экстракта в форме сухого порошка.
В соответствии с другим воплощением, способ экстракции из Galeopsis segetum Necker включает следующие стадии:
- измельчение, например, наземных частей растения;
- перенос полученного порошка в подходящий перколятор;
- промывание, например, с некоторым количеством растворителя для экстракции, так чтобы получить массовое отношение лекарственное средство/растворитель от примерно 1:20 до примерно 1:100;
- рециркулирование части фильтрата до истощения материала, который нужно экстрагировать;
- отжим экстрагированной вегетативной массы для извлечения всего растворителя для экстракции;
- фильтрование промывных вод;
- концентрирование фильтрата, например, при пониженном давлении путем выпаривания растворителя;
- необязательно, продолжение выпаривания до удаления растворителя;
- необязательно, высушивание экстракта.
В соответствии с некоторыми воплощениями, на конечной стадии удаления растворителя путем выпаривания добавляют твердый носитель, например, крахмал или мальтодекстрины, для получения экстракта в форме сухого порошка.
Как правило, полученный экстракт может быть жидким, мягким или сухим. Например, в жидком экстракте 1 мл экстракта содержит биологически активные компоненты, растворимые в 1 г растительного лекарственного средства, в мягком экстракте растворитель частично упаривают, в особенности, до тех пор, пока экстракт смачивает фильтровальную бумагу, в сухом экстракте растворитель выпаривают почти полностью для получения порошка.
2
2
Существует возможность получения экстрактов Galeopsis Segetum с различной полярностью. Например, возможно получить высокополярный экстракт, применяя полярный растворитель, такой как водно-спиртовой раствор, экстракт с промежуточной полярностью, применяя менее полярный растворитель, такой как этилацетат, или неполярный экстракт, применяя сверхкритический CO. Предпочтительные методики экстракции приставляют собой методики с применением высокополярного растворителя и методики со сверхкритическим СO. В особенности, при применении данных методик эффективно экстрагируют фракцию фитокомплекса, который проявляет ингибирующую активность в отношении фермента 5-альфа-редуктазы, играющую важную роль в андрогенной алопеции и представляющую собой мишень для финастерида, известного соединения с антиандрогенной активностью, эффективного при стимулировании роста волос и при реактивации физиологического цикла волосяных фолликулов.
В конкретных воплощениях, экстракцию осуществляют, применяя массовое отношение между растворителем и растительной матрицей, равное от 1:10 до 10:1.
Дополнительные способы получения растительного экстракта изобретения включают методики экстракции путем переваривания, настаивания, выдавливания, вываривания, промывания, противоточной экстракции, экстракции по способу Сокслета, экстракции в сверхкритических газах или ультразвуковой обработки.
В некоторых воплощениях, биологически активный компонент, содержащийся в экстракте Galeopsis Segetum Necker, включает, по меньшей мере, один флавоноид, в особенности, выбранный из группы, включающей гиполаетин-4'-метил-этил-7-(2''-аллозил)глюкозид моноацетилированный, гиполаетин-4'-метил-этил-7-(2''-аллозил)глюкозид диацетилированный, изоскутелареин-7-(2''-аллозил)глюкозид моноацетилированный, гиполаетин 4'-метил-этил-7-(2''-аллозил)глюкозид, гиполаетин-7-(2''-аллозил)глюкозид моноацетилированный, изоскутелареин-7-(2''-аллозил)глюкозид и гиполаетин-7-(2''-аллозил)глюкозид диацетилированный.
Заявитель обнаружил, что гиполаетин-4'-метил-этил-7-(2''-аллозил)глюкозид моноацетилированный и/или гиполаетин-4'-метил-этил-7-(2''-аллозил)глюкозид диацетилированный представляют собой флавоноиды, особенно активные для стимуляции активности волосяной луковицы.
В некоторых воплощениях, содержание растительного экстракта Galeopsis Segetum Necker в композиции изобретения составляло от 0,01 до 10% масс./масс., например, 3% масс./масс.
Биологически активные компоненты, содержащиеся в растительном экстракте изобретения, реактивируют жизненный цикл волосяных фолликулов, даже находящихся в состоянии покоя, на волосистой части головы в участках поредения и/или в участках, затронутых облысением. Это действие распространяется на восстановление роста волос также в участках волосистой части головы, где волосы поредели.
В соответствии с третьим аспектом, настоящее изобретение обеспечивает применение композиции, включающей растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker, и физиологически приемлемый носитель при лечении и/или предупреждении выпадения волос или для стимуляции физиологического роста волос.
В соответствии с четвертым аспектом, обеспечивают композицию, включающую растительный экстракт Galeopsis Segetum Necker и физиологически приемлемый носитель, для применения при лечении или предупреждении выпадения волос.
В особенности, композиция изобретения включает активное количество одного или нескольких биологически активных компонентов, экстрагированных из растения Galeopsis Segetum Necker.
Как правило, композиция изобретения представляет собой медицинское устройство, фармацевтическую композицию, биологически активную или пищевую добавку или косметическое средство.
Композиция изобретения, введенная локально или системно, увеличивает жизнеспособность клеток волосяного фолликула, как в фазе анагена, так и в фазе миниатюризации и реактивирует в состоянии покоя клетки волосистой части головы путем регенерации волосяных фолликулов и стимулирования роста новых волос.
В некоторых воплощениях композиция изобретения включает физиологически и/или фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное средство.
Как правило, физиологически приемлемый носитель композиции изобретения представляет собой вспомогательное средство, носитель или разбавитель, подходящий для местного применения и/или перорального введения.
В объеме настоящего документа, термин «носитель» относится к вспомогательному средству, носителю, разбавителю или адъюванту, который может присутствовать в композиции изобретения. Любой носитель и/или вспомогательное средство, подходящее для формы лекарственного препарата, желаемой для введения, рассматривается для применения растительного экстракта или присутствующих в нем активных ингредиентов, описанных в настоящем документе.
Как правило, в композиции изобретения применяют компоненты растительного происхождения, которые биологически активны и в значительной степени свободны от побочных эффектов при пероральном или локальном введении.
В некоторых воплощениях, композицию изобретения вводят перорально. В других воплощениях, композицию наносят на кожу и; в особенности, на волосистую часть головы.
Физиологически и/или фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное средство может быть выбрано на основе пути введения, для которого полученная фармацевтическая композиция предназначена.
В некоторых воплощениях, путь введения композиции изобретения представляет собой местное введение. В этих случаях композиция изобретения может быть нанесена, в эффективном количестве, непосредственно на волосистую часть головы.
Например, при лечении андрогенной алопеции косметически активное количество композиции изобретения может быть нанесено непосредственно на волосистую часть головы один раз или несколько раз в день, обычно для циклов продолжительностью 2-3 месяца, чередующихся с периодами отдыха.
В соответствии с другим аспектом изобретения, обеспечивают способ косметического лечения, который включает нанесение на волосистую часть головы эффективного количества композиции описанного ранее типа.
Композиция для местного применения может быть представлена в твердой, мягкой или жидкой форме.
Подходящие композиции в твердой форме включают кремы, гели, пасты, мази.
В других воплощениях композиция для местного введения находится в жидкой форме, например, в форме лосьонов, гелей, шампуней, суспензий, эмульсий.
В случае композиций в жидкой или мягкой форме, растительный экстракт может быть разведен в носителе в физиологически приемлемой жидкой форме, таком как вода, спирт, водно-спиртовой или глицериновый раствор или смешан с другими жидкостями, подходящими для местного нанесения.
В качестве примера, композиции изобретения в жидкой форме могут быть получены путем растворения биологически активных компонентов экстракта в воде и/или спирту. Жидкая композиция может быть забуферена для достижения pH-диапазона, который обычно выбирают между 5 и 7, так, чтобы он был совместим с pH волосистой части головы, и затем фильтруют и упаковывают в подходящие контейнеры, такие как флаконы или ампулы.
В некоторых воплощениях, композиции изобретения может включать вспомогательные средства, обычно применяемые в композиции косметических или фармацевтических лекарственных препаратов, для местного применения, такие как консерванты, бактерицидные средства, стабилизирующие средства, эмульгаторы, буферы, увлажняющие средства, красители и другие вспомогательные средства, обычно применяемые в методиках получения косметических/фармацевтических лекарственных препаратов.
В одном из воплощений, композиция для местного нанесения находится в форме содержащего эмульсию экстракта, перенесенного в подходящее вспомогательное средство.
В качестве примера, подходящие вспомогательные средства представляют собой производные целлюлозы, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, ацетат-бутират целлюлозы, ацетат-фталат целлюлозы и их смеси.
Дополнительные примеры подходящих вспомогательных средств включают полимеры, принадлежащие к семейству лактамов, такие как пирролидон и его производные, например, поливинилпирролидон, поливинилполипирролидон и их смеси, неорганические соли, такие как кальция или дикальция фосфат, лубриканты, такие как, например, стеарат магния, триглицериды и их смеси.
В некоторых воплощениях, композиция для местного применения включает вспомогательное средство типа гидроксиметилцеллюлозы и/или желирующие средства с HLB, подходящие для композиции и веществ.
В соответствии с другими воплощениями, введение композиций изобретения осуществляют перорально.
Композиции для перорального введения могут быть в твердой или жидкой форме. Типичные композиции в твердой форме включают таблетки, капсулы, порошки, гранулы, пилюли. Типичные композиции в жидкой форме включают растворы, эмульсии, суспензии, сиропы. Все композиции также включают формы с контролируемым высвобождением того же самого.
Таблетки обычно включают подходящий носитель или вспомогательное средство, в котором диспергирован растительный экстракт, как правило, в сухой форме.
Биологически активные компоненты композиции изобретения могут присутствовать в различных количествах, например, от 0,0001% по массе идо 10% по массе, как правило, от 00,1 до 5% по массе.
В соответствии с конкретными воплощениями, композиция изобретения дополнительно включает один или несколько активных веществ, таких как витамины, минералы, микроэлементы и другие вещества, активные при стимулировании активности волосяного фолликула.
В соответствии с некоторыми воплощениями, композиция для перорального введения представляет собой функциональный пищевой продукт, нутрицевтическую композицию, продукт для лечебного питания, добавку или питательное изделие или медицинское устройство.
Функциональный пищевой продукт означает любые модифицированные продукты питания или пищевой ингредиент, которые могут обеспечить преимущества или защиту от недостатков или физиологического состояния, помимо традиционных питательных веществ, которые он содержит.
Нутрицевтическое изделие означает изделие, выделенное или очищенное из годного к употреблению в пищу вещества. Нутрицевтическое изделие является таковым, когда оно демонстрирует наличие физиологического преимущества или обеспечивает защиту от недостатка или физиологического расстройства.
Диетическая или пищевая добавка означает изделие, содержащее витамин, минерал, растительный экстракт, аминокислоту, метаболит, экстракт, концентрат или смеси данных ингредиентов.
Вводимое количество и частота введения композиции будет зависеть от типа и тяжести подлежащего лечению трихологического состояния.
Композиция изобретения эффективна в предупреждении и/или лечении форм облысения или поредения волос, таких как, например, выпадение волос и андрогенная алопеция.
Настоящее изобретение теперь будет описано с отсылкой к нижеследующим примерам, которые предусмотрены для иллюстрации и не должны быть предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1
Таблетки для перорального применения
Сухой экстракт Galeopsis Segetum
100-300 мг
Микрокристаллическая целлюлоза
80-340 мг
Дигидрат двухосновного фосфата кальция
50-100 мг
Коллоидный диоксид кремния
2,5-10 мг
Стеарат магния
2,5-10 мг
PEG-4000
0,5-2,5 мг
Поперечносшитая натриевая
карбоксиметилцеллюлоза
0,25-0,5 мг
Альгинат натрия
0,25-0,5 мг
Гидроксипропилметилцеллюлоза
0,25-0,5 мг
Пример 2
Гранулированное изделие для перорального применения
Эритритол
20-40% масс./масс.
Сухой экстракт Galeopsis Segetum
0,5-4% масс./масс.
Маннитол
10-30% масс./масс.
Ароматизирующее вещество
5-10% р/р
Сукралоза
0,1-0,3% р/р
Крахмал по мере необходимости
100
Пример 3
Таблетки для перорального применения
Рафинированная сахароза
50-90 мг
Мягкий экстракт Galeopsis Segetum
50-100 мг
Тальк
10-20 мг
Маисовый крахмал
5-25 мг
Порошкообразный сахар
5-15 мг
70% некристаллизующийся сорбитол
5-10 мг
Стеарат магния
1-3 мг
Аравийская камедь
2-3 мг
Диоксид титана
1-2,5 мг
Желатин
1-3 мг
Сополимер метакриловой кислоты типа А
1 -2,5 мг
Легкий карбонат магния
0,5-1 мг
Полиэтиленгликоль 6000
0,1-0,3 мг
Дибутилфталат
0,1-0,25 мг
Метилпараоксибензоат
0,01-0,03 мг
Микрокристаллическая целлюлоза по мере необходимости
300 мг
Пример 4
Лосьон для нанесения на волосы и кожу головы
Денатурированный этиловый спирт типа C
500-1500 мг
Жидкий экстракт Galeopsis Segetum
50-300 мг
Полиоксиэтилированные гидрогенизированное
касторовое масло
12,2-48,8 мг
Ароматизирующее средство
3-12 мг
Дигидрат динатриевой соли ЭДТА
1,5-6 мг
Вода по мере необходимости
5 мл
Пример 5
Лечебный шампунь
Zetesol MGS
30-50% масс./объем
Protelan LS 9011
5-15% масс./объем
Mirasheen CP 820/G
2-6% масс./объем
Rewoderm LI S 80
2-4% масс./объем
ВС 2262
0,5-1,5% масс./объем
Кокамид MIPA
0,5-1,5% масс./объем
Protelan AG 11
0,5-1,5% масс./объем
Лимонная кислота
0,5-1,5% масс./объем
Ароматизирующее средство
0,5-1,5% масс./объем
Натрия гидроксиметилглицинат
0,5-1,5% масс./объем
Бетаин
0,25-0,75% мас./объем
Лаурилметилглюцет-10-
гидроксипропилдимониум хлорид
0,25-0,75% масс./объем
Поликватерниум-10
0,2-0,6% мас./объем
Тетранатриевый ЭДТА
0,1-0,3% масс./объем
Пантенол
0,1-0,3% масс./объем
Жидкий экстракт Galeopsis Segetum
0,05-1,0% масс./объем
Бутилгидроксинизол (ВНА)
0,005-0,02% р/объем
Вода по мере необходимости
100 мл
Пример 6
Кожная эмульсия
Пропиленгликоль
6-8 г
Глицерил стеарат пальмитат
3-5 г
Кокосовое масло
2-4 г
Цетостеариловьш спирт (25) ОЕ
1-3 г
Эмульгирующий воск
1-3 г
Бензиловый спирт
0,5-1,5 г
Мягкий экстракт Galeopsis Segetum
0,5-1,5 г
Цетиловый спирт (6) ОЕ
0,25-1,0 г
Вода по мере необходимости
100 г
Пример 7

Пролиферативные эффекты экстракта Galeopsis Segetum изучали в клетках HFDPC-с (PromoCell), которые поддерживали в культуре в присутствии среды роста для фолликулов дермального сосочка (Follicle Dermal Papilla Growth Medium), и следуя инструкциям производителя (PromoCell).
Пролиферативную активность оценивали при помощи МТТ-анализа.
МТТ-анализ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид) представляет собой колориметрический анализ, применяемый для in vitro оценки пролиферация клеток [Mosmann Т, 1983], так как он позволяет измерять пролиферацию и жизнеспособность клеток по оценке активности митохондрий. Данный способ очень полезен для измерения роста клеток после лечения митогенами, антигенными стимулами, факторами роста и для исследования цитотоксичности.
18
16
5
Анализ предусматривает применение хромогенного окислителя, МТТ, состоящего из полициклической системы (CHBrNS) с тетразольным кольцом, которое может быть легко восстановлено митохондриальными дегидрогеназами или другими системами транспорта электронов, формирующими, путем открытия тетразольного кольца, азотсодержащее хромогенное соединение, обозначаемое как формазан. Такой формазан образует нерастворимые кристаллы во внутриклеточной среде, для которых мембраны практически непроницаемы: следовательно, поступление молекул в клетку позволено, но выход продукта, если он был правильно метаболизирован, запрещен, это имеет место, если цепи переноса электронов все еще метаболически активны.
Кристаллы формазана затем солюбилизируют в диметилсульфоксиде (DMSO), что вызывает переход окраски раствора из желтого в темно-сине-фиолетовый.
4
Клетки HFDPC-c высевали с плотностью, равной 5*10 клеток/лунку в 96-луночные планшеты. Через 24 часа, как только было достигнуто слияние, равное примерно 80%, клетки обрабатывали 6-ю возрастающими концентрациями экстракта Galeopsis Segetum N.: 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 и 2 мг/мл в полной среде. Контрольные клетки, с другой стороны, поддерживали в культуре в полной среде.
2
Планшеты инкубировали при 37°C, под 5% CO в течение 24-х часов, по окончанию инкубации культуральную среду заменяли 100 мкл раствора МТТ (на лунку, St. Louis, МО, США) 0,5 мг/мл в полной культуральной среде.
Через 3 часа инкубации при 37°C, среду собирали и кристаллы формазана солюбилизировали 100 мкл на лунку DMSO («Sigma-Aldrich», St. Louis, МО, США). Планшет, покрытый алюминием, помещали на механическую мешалку (Arhos 160 - PBI International, Милан, Италия) при 120 rpm в течение 15 минут при комнатной температуре.
Оптическую плотность окрашенного раствора измеряли при помощи спектрофотометрического считывающего устройства для микропланшетов («BioTek Instruments Inc.», Bad Frieddrichshall, Германия) при длине волны 570 нм (опорная длина волны 630 нм).
Результаты были выражены как процент жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками (ctr), в соответствии со следующей формулой:
процент жизнеспособности клеток/ctr = (Abs образец/Abs ctr)*100
Все анализы выполняли в двух повторностях.
Результаты теста показали дозозависимое увеличение в пролиферации клеток, что указывает на стимуляцию клеточного роста клеток фолликула.
Стволовые клетки волосяного фолликула играют важную роль в цикле развития волос, но известно, что с возрастом происходит их потеря и утрачивается возможность восстановить регенерацию волос. Из стволовых клеток формируются клетки матрицы, чей рост и дифференциация находятся под влиянием веществ, продуцируемых клетками дермального сосочка. Секреторная активность дермального сосочка находится под контролем веществ, продуцируемых клетками шиповатого слоя наружной оболочки корня, или гормонов. Фактически, клетки шиповатого слоя продуцируют пептиды, размером более 3000 дальтон, которые способны вызывать от двух- до пятикратного увеличения числа митозов клеток сосочка. Недавно было обнаружено, что фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста тромбоцитов (PDGF) усиливает рост клеток дермального сосочка. В особенности, эти белки увеличивают синтез стромелизина (фермент, металлопротеиназа), действующего на клетки сосочка и ускоряющего их рост. Клетки дермального сосочка вырабатывают многочисленные цитокины, которые оказывают влияние на пролиферацию клеток матрицы волоса. Соответственно, эффект, как тот, который оказывает экстракт Galeopsis, стимулирующий рост данных клеток, имеет преимущество при стимулировании роста волос.
Пример 8
Цель экспериментальной работы
Экспериментальная процедура, представленная далее в настоящем документе, ставила целью изучение in vitro активности различных образцов Galeopsis Segetum, подвергнутых различным способам экстракции, для характеристики их антиоксидантной активности и активности в отношении стимулирования роста волос.
Материалы
Все экстракты разводили до 100 мг/мл в DMSO и фильтровали в стерильных условиях.
Исходные растворы хранили при - 20°C.
Примененные биологические модели
Культуры мышиных эмбриональных фибробластов
Бессмертную линию мышиных эмбриональных фибробластов BALB/с3T3, клон A31 (АТСС, Manassas, VA, США), получали из Национального института исследований рака (Istituto Nazionale di Ricerca sul Cancro (Генуя, Италия)).
3
2
Клетки поддерживали в культуре в 25 см стерильных флаконах и инкубировали при 37°C во влажной атмосфере под 5%-ным CO. Поскольку применяли культуральную среду DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, АТСС, Manassas, VA, США), то добавляли до 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% заменимых аминокислот (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix). Все эти последние реагенты были приобретены у компании Lonza, Inc. (Барселона, Испания)
В ходе стадии культивирования, каждые 2 дня проводили разведение 1:3, до достижения 80%-ного слияния, промыванием IX PBS («Lonza», Барселона, Испания) и отделением клеток раствором трипсин-ЭДТА («Lonza», Барселона, Испания) при 37°C в течение 2-х минут.
Культуры клеток наружного корневого влагалища волосяного фолликула человека
2
2
Клетки наружного корневого влагалища волосяного фолликула человека (HHFORSC), предоставленные «Innoprot», выделяли с помощью Scien Cell Research Labs из наружного корневого влагалища волоса. Клеточную линию культивировали в среде для мезенхимальных стволовых клеток (MS СМ): 500 мл основной среды, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% ростовой добавки для мезенхимальных стволовых клеток (MSCGS), 1% раствора пенициллин/стрептомицин (P/S-раствор) и поддерживали в 25 см культуральных флаконах при 37°C и под 5% СO.
2
Прежде чем приступить к посеву клеток, флакон должен быть покрыт поли-L-лизином (2 мкг/см).
4
2
2
Каждые два дня сливающиеся культуры разводили 1:3-1:6, путем промывания DPBS (модифицированным по способу Дульбекко фосфатно-солевым буферным раствором), применяя Т/Е-раствор (раствор трипсин/ЭДТА) и TNS (раствор для нейтрализации трипсина) и высевали в количестве 2-5×10 клеток/см, 37°C, 5% CO.
Контроли
МТТ-АНАЛИЗ (BALB3T3)
2
2
Положительный контроль. Необработанные клетки в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, АТСС, Manassas, VA, США) добавляли к 10% фетальной бычьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix), и поддерживали в 25 см (96-луночных) культуральных планшетах при 37°C и под 5% CO.
Анализ DCFH-DA и тест на МТТ-индуцированный окислительный стресс (BALB3T3)
2
2
Отрицательный контроль. Необработанные клетки в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, АТСС, Manassas, VA, США) добавляли к 2,5% фетальной бычьей сыворотке (FCS), 1% заменимыми аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина(Pen-Strep Mix), и поддерживали в 25 см (96-луночных) культуральных планшетах при 37°C и под 5% CO.
2
2
Положительный контроль. Клетки, обработанные в течение 2-х часов 1 мМ перекисью водорода в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, АТСС, Manassas, VA, США), добавляли к 2,5% фетальной бычьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix), и поддерживали в 25 см (96-луночных) культуральных планшетах при 37°C и под 5% CO (в темноте).
Исследование активности индукции 5-АЛЬФА-РЕДУКТАЗЫ (BALB3T3)
2
2
Отрицательный контроль. Необработанные клетки в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, АТСС, Manassas, VA, США) добавляли к 10% фетальной бычьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix) и 10 нг/мл тестостерона, и поддерживали в 25 см (12-луночных) культуральных планшетах при 37°C и под 5% CO.
2
2
Положительный контроль. Клетки, обработанные в течение 24-х часов финастеридом (0,05 мг/мл) в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, АТСС, Manassas, VA, США), добавляли к 10% фетальной бычьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix) и 10 нг/мл тестостерона, и поддерживали в 25 см (12-луночных) культуральных планшетах при 37°C и под 5% CO.
Исследование экспрессии кератина 6А (ORS)
2
2
Отрицательный контроль. Необработанные клетки в MSCM, добавляли к 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS), 1% ростовой добавке для мезенхимальных стволовых клеток (MSCGS), 1% раствору пенициллин/стрептомицин (P/S раствор) и поддерживали в 25 см (12-луночных) культуральных планшетах при 37°C и под 5% СO.
2
Прежде чем приступить к посеву клеток, флакон покрывали поли-L-лизином (2 мкг/см).
Способы
- Предварительный анализ на цитотоксичность (МТТ-анализ)-BALB3T3
Основы способа
МТТ-анализ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) представляет собой колориметрический анализ, применяемый для оценки in vitro пролиферации клеток, так как он позволяет измерять пролиферацию и жизнеспособность клеток посредством оценки митохондриальной активности. Данный способ очень полезен для измерения клеточного роста после лечения митогенами, антигенными стимулами, факторами роста и для исследований цитотоксичности.
18
16
5
Анализ предусматривает применение хромогенного окислителя, МТТ, состоящего из полициклической системы (CHBrNS) с тетразольным кольцом, которое может быть легко восстановлено митохондриальными дегидрогеназами или другими системами транспорта электронов, формирующими, путем открытия тетразольного кольца, азотсодержащее хромогенное соединение, обозначаемое как формазан. Формазан образует нерастворимые кристаллы во внутриклеточной среде, для которых мембраны практически непроницаемы: следовательно, поступление молекул в клетку позволено, но выход продукта, если он было правильно метаболизирован, запрещен, это имеет место, если цепи переноса электронов все еще метаболически активны.
Кристаллы формазана затем солюбилизируют в диметилсульфоксиде (DMSO), что вызывает переход окраски раствора из желтого в темно-сине-фиолетовый.
Экспериментальная процедура
4
2
Анализ проводили в соответствии со способом Мосмана (Mosmann (1983)), с некоторыми небольшими изменениями. Клетки BALB3T3 высевали с плотностью, равной 5*10 клеток/лунку в 96-луночные планшеты. Через 24 часа, сразу после достижения слияния, равного примерно 80%, клетки обрабатывали 6-ю различными возрастающими концентрациями экстрактов Galeopsis Segetum (вегетативная биомасса; сухой водно-спиртовой образец; образец в этилацетате; экстракт в CO) 2-10-20-50-100-200 мг/мл в полной среде. Контрольные клетки, с другой стороны, поддерживали в культуре в полной среде.
2
Планшеты инкубировали при 37°C, под 5% CO в течение 24, 48 и 72 часов. По завершению всех обработок, среду собирали и заменяли 100 мкл 0,5 мг/мл раствора МТТ («Sigma-Aldrich», St. Louis, МО, США) в полной культуральной среде.
Через 3 часа инкубации при 37°C, среду собирали и кристаллы формазана солюбилизировали 100 мкл на лунку DMSO («Sigma-Aldrich», St. Louis, МО, США). Планшет, покрытый алюминием, помещали на механическую мешалку (Arhos 160 - PBI International, Милан, Италия) при 120 rpm в течение 15 минут при комнатной температуре.
Оптическую плотность окрашенного раствора измеряли при помощи спектрофотометрического считывающего устройства для микропланшетов («BioTek Instruments Inc.», Bad Frieddrichshall, Германия) при длине волны 570 нм (опорная длина волны 630 нм).
Результаты выражали как процент жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками (ctr), в соответствии со следующей формулой:
процент жизнеспособности клеток / ctr = (Abs образца/Abs ctr)*100
Все анализы проводили, по меньшей мере, дважды в двух повторностях.
МТТ с индуцированным окислительным стрессом-BALB3T3
Основы способа
Мышиные фибробласты BALB3T3 представляют собой одну из проверенных моделей для исследования окислительного стресса in vitro (Subiradeet al., 1995; Kutuk et al., 2004).
Исследования, проведенные в 2005 году Rajapakse и коллегами (2005), выявили возможность применения широко употребляемого и многостороннего способа, такого как МТТ-анализ, для исследования in vitro антиоксидантной активности активных соединений. В частности, с помощью данного способа возможно исследовать защитные эффекты таких соединений на клетки, которые впоследствии подвергают окислительному стрессу. Индукцию окислительного стресса осуществляли путем инкубации с перекисью водорода, агента, индуцирующего образование окислительного повреждения в клетках за счет продукции АФК. Возможные защитные эффекты могут быть установлены оценкой жизнеспособности клеток после окислительного стресса, клеток предварительно обработанных/преинкубированных с тестируемыми активными соединениями, в сравнении с клетками, подвергнутыми такому же окислительному стрессу. Большая клеточная жизнеспособность будет соответствовать защитному эффекту протестированных соединений.
Экспериментальная процедура
Анализ проводили в соответствии со способом, описанным Coda и соавторами (Coda et al., 2012), с некоторыми изменениями.
4
2
Мышиные фибробласты BALB3T3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью, равной 5*10 клеток/лунку, и инкубировали при 37°C, под 5% CO, пока не достигали 80%-ного слияния.
2
В дальнейшем клетки инкубировали в течение 16-ти часов с экстрактами Galeopsis segetum (вегетативная биомасса; сухой водно-спиртовой образец; образец в этилацетате; экстракт в CO) в следующих концентрациях: 20-50 и 100 мкг/мл.
Разведения готовили, начиная с 1000Х исходного раствора в DMSO, фильтровали в стерильных условиях и, применяя среду DMEM, добавляли к 2,5% фетальной телячьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix).
2
2
Клетки, обработанные 1 мМ HO, применяли в качестве положительного контроля; с другой стороны, клетки, поддерживаемые только в культуральной среде (DMEM 2,5% FCS), применяли в качестве отрицательного контроля.
2
2
2
По окончанию 16 часов предварительной обработки, клетки промывали IX PBS и инкубировали в течение 90 минут с раствором 1 мМ НО («Sigma-Aldrich», St. Louis, МО, США) в бессывороточной среде, в темноте, при 37°C и 5% CO.
Сразу же по окончанию стадии индукции окислительного стресса проводили оценку жизнеспособности клеток в различных образцах, в соответствии со способом, описанным в разделе 4.1.2 (МТТ-анализ).
Результаты выражали как процент жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками, не подвергавшимися стрессу (ctr), в соответствии со следующей формулой:
процент жизнеспособности клеток/ctr = (Abs образца/Abs ctr)*100
Все анализы проводили, по меньшей мере, дважды в двух повторностях.
Исследование эффектов экстрактов Galeopsis segetum на продукцию АФК с помощью DCFH-DA-анализа-BALB3T3
Основы способа
Продукцию АФК в клеточной линии мышиных фибробластов BALB3T3 определяли с помощью спектрофлуорометрии, анализируя 2,7-дихлорфлуоресцеина-диацетат (DCFH-DA), как описано у Tobi и соавторов (Tobi et al., 2000).
DCFH-DA в своей липофильной форме представляет собой нефлуоресцирующее соединение, способное диффундировать через клеточную мембрану. Оказавшись внутри клетки, он деацетилируется под действием внутриклеточных эстераз до восстановленного 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCFH), который также не флуоресцирует. DCFH, будучи не способен пересечь клеточную мембрану снова, аккумулируется в клетках (Curtin et al., 2002). Взаимодействие с внутриклеточными АФК приводит к окислению DCFH до 2,7-дихлорфлуоресцина (DCF), сильно флуоресцирующего соединения. Интенсивность такой флуоресценции можно зарегистрировать с помощью флуориметра, что позволяет оценить количество АФК, продуцированных в клетках.
Экспериментальная процедура
Протокол, примененный для этого эксперимента, представляет собой модифицированную версию протокола, описанного в работе Tobi и соавторов (Tobi et al., 2000).
4
Мышиные фибробласты BALB3T3 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью, равной 5*10 клеток/лунку, и инкубировали до достижения 80%-ного слияния.
2
В дальнейшем клетки инкубировали в течение 16-ти часов с экстрактами Galeopsis segetum (вегетативная биомасса; сухой водно-спиртовой образец; образец в этилацетате; экстракт в CO) в следующих концентрациях: 20-50 и 100 мкг/мл.
Разведения готовили, начиная с 1000Х исходного раствора в DMSO, фильтровали в стерильных условиях и, применяя среду DMEM, добавляли к 2,5% фетальной телячьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix).
2
2
Клетки, обработанные 1 мМ НО, применяли в качестве положительного контроля; клетки, поддерживаемые только в культуральной среде (DMEM 2,5% FCS), с другой стороны, применяли в качестве отрицательного контроля.
α-Токоферол тестировали в концентрации 25-50-250-500 мкМ;
2
2
2
По окончанию инкубации, индукцию окислительного стресса осуществляли, путем 90-минутной обработки 4 мМ раствором НО, в темноте, при 37°C и 5% СО.
Сразу же после окончания обработки клетки промывали дважды IX PBS и лизировали в буфере для лизиса CelLytic™ («Sigma-Aldrich», St. Louis, МО, США) в соответствии с протоколом производителя.
В дальнейшем лизаты переносили в черный 96-луночный планшет и регистрировали флуоресценцию DCF спектрофотометрически, применяя регистрирующее флуоресценцию считывающее устройство для микропланшетов FluoroskanAscent FL (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, США), с длиной волны возбуждения и излучения, равной 485 и 538 нм, соответственно.
2
2
Величины эмиссии (RFU), полученные для каждого образца, связанные с продукцией внутриклеточных АФК, сравнивали с величинами эмиссии, полученными для отрицательного контроля (ctr, клетки, обработанные 1 мМ НО), и выражали в процентах продуцированных АФК в соответствии со следующим уравнением:
процент продуцированных АФК/ctr = (Ads538hm образец/Abs538 нм ctr)*100
Все анализы проводили, по меньшей мере, дважды в двух повторностях.
Исследование эффектов экстрактов Galeopsis segetum на активность 5-альфа-редуктазы (изоформа2)-BALB3T3
Экспериментальная процедура
Экспрессию генов изоформы 2 5-альфа-редуктазы (SRD5A2) в клетках BALB3T3 оценивали с помощью количественной ОТ-ПЦР (количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией - количественная ОТ-ПЦР).
Этот анализ включает 3 последовательные стадии:
- экстракция общей РНК;
- обратная транскрипция в кДНК;
- количественная ОТ-ПЦР.
6
Мышиные фибробласты BALB3T3 высевали в 12-луночные планшеты с плотностью, равной 0,5*10 клеток/лунку, и инкубировали до достижения 80%-ного слияния.
2
В дальнейшем, клетки инкубировали в течение 24-х часов с экстрактами Galeopsis segetum (вегетативная биомасса; сухой водно-спиртовой образец; образец в этилацетате; экстракт в CO) в следующих концентрациях: 20-50 и 100 мкг/мл.
Разведения готовили, начиная с 1000Х исходного раствора в DMSO, фильтровали в стерильных условиях и, применяя среду DMEM, добавляли к 10% фетальной телячьей сыворотке (FCS), 1% заменимым аминокислотам (NEAA), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix).
С другой стороны, клетки, поддерживаемые только в культуральной среде (DMEM 2,5% FCS), применяли в качестве отрицательного контроля.
Финастерид, селективный ингибитор изоформы 2 (SRD5A2) 5-альфа редуктазы, тестировали в концентрации 0,05 мг/мл.
По окончанию инкубации проводили экстракцию РНК.
Общую РНК экстрагировали из клеток BALB3T3, применяя коммерческий набор Ribospin™ (Gene All Biotechnology Co., LTD)
По окончанию инкубации с представляющими интерес активными соединениями, клетки промывали PBS (IX) и, наконец, подвергали процедуре экстракции РНК. По окончанию экстракции, применяя спектрофотометр (Jenway UV/VIS MOD: 6715, BS-6715В0), вычисляли концентрации в мкг/мл общей экстрагированной РНК, при длине волны 260 нм.
Наконец, целостность РНК (2 мкг/мл) оценивали с помощью электрофоретического анализа в 1%-ном агарозном геле.
Общую РНК преобразовывали в кДНК (комплементарную ДНК), применяя фермент, способный синтезировать молекулу ДНК с помощью цепи РНК в качестве матрицы; данная РНК-зависимый фермент ДНК-полимераза называется обратной транскриптазой.
Она связывается с 3'-концом одноцепочечной РНК и при помощи случайных праймеров и дезоксинуклеозидтрифосфата (DNTP) синтезирует цепь кДНК.
2
В этой связи, применяли набор реагентов «PrimeScript™ RT Reagent Kit (идеально подходит для режима реального времени)» (TakaraBioInc, Japan), содержащий буфер 5Х PrimeScript Buffer (для режима реального времени); смесь ферментов PrimeScript RT Enzyme Mix1; праймеры OligodTPrimer; случайные шестинуклеотидные праймеры; свободную от РНКазы dHO.
Экстрагированную и количественно оцененную РНК разводили до концентрации 2 мкг/мл и обратной транскрибировали в кДНК. Готовили 10 мкл смеси Master Mix (содержащей буфер 5Х PrimeScript Buffer (для режима реального времени); смесь ферментов PrimeScript RT Enzyme Mixl; праймеры OligodTPrimer 50 мкМ; случайные шести-нуклеотидные праймеры (100 мкМ), к которым добавляли 10 мкл РНК (2 мкг/мл).
Образцы помещали в амплификатор (Stratagene Мх3000Р Real Time PCR System, Agilent Technologies Italia S.p.A., Милан, Италия) и подвергали обратной транскрипции в следующих условиях:
37°C в течение 15 минут;
85°C в течение 5 секунд;
хранили при 4°C.
По окончанию обратной транскрипции образцы дополняли 30 мкл воды DEPC для получения конечной концентрации кДНК, равной 40 нг/мкл.
Количественная ОТ-ПЦР представляет собой способ для амплификации и количественного определения в режиме реального времени полученных ампликонов, образование которых контролируют с помощью флуоресценции, выделяющейся при реакции.
Для амплификации ОТ-ПЦР применяли систему зондов TaqMan (Applied Biosystems). Применяли следующие зонды TaqMan: Mm00446421ml (SDR5A2) и Mm00466519ml (β-актин). В качестве контрольного гена (гена домашнего хозяйства) применяли β-актин.
Зонд Taqman представляет собой тип зонда, позволяющего развиваться флуоресценция при продвижении амплификации. К его 5'-концу присоединен рипортер (флуорофор FAM™), а на 3'-конце находится гаситель флуоресценции. Близость между репортером и гасителем флуоресценции запрещает эмиссию сигнала флуоресценции. Флуоресценцию обнаруживают с помощью 5'-экзонуклеазной активности термостабильной ДНК-полимеразы (Taq полимераза), и накопление продукта амплификации может быть оценено за счет увеличения флуоресценции рипортера, которая увеличивается при каждом пробеге.
Для количественной ОТ-ПЦР смесь Master Mix была составлена следующим образом:
- 10 мкл «2Х Premix Ex Taq»;
- 1 мкл «20× TaqMan Gene ExpressionAssays» (содержит 2 праймера и флуорофор FAMTM-меченый флуоресцентный зонд);
- 0,4 мкл пассивного контроля Rox II;
- 5 мкл воды DEPC.
Master Mix дополняли 4 мкл кДНК для гена-мишени и 1 мкл кДНК для гена домашнего хозяйства.
Амплификацию проводили в следующих условиях для 40 пробегов:
- 95°C, 30 сек (активация Amplitaq);
- 95°C, 5 сек (денатурация);
- 60°C, 20 сек (отжиг - удлинение);
Каждый анализ проводили в двух повторностях.
-ΔΔСt
Полученные результаты анализировали в соответствии с 2-способом, и, следовательно, была возможность вычислить значения соответствующей экспрессии представляющего интерес гена, нормализованного по отношению к гену домашнего хозяйства и откалибровать на контрольный образец (необработанные клетки):
-ΔΔCt
Полагая эффективность амплификации равной 100%, вычисляли 2.
Исследование эффектов экстрактов Galeopsis segetum на экспрессию цитокератина 6A-ORS
Экспериментальная процедура
Для исследования экспрессии цитокератина 6А в клетках ORS применяли коммерческий набор: кератин человек, тип II, цитоскелетный 6A(KRT6A), набор для анализа ELISA 96Т (CSB).
День 1
6
2
Когда клетки (HHFORSC) достигали примерно 80% слияния, их отделяли с помощью трипсина/ЭДТА и высевали с плотностью, равной 1×10 клеток/мл, в 12-луночные планшеты и затем инкубировали при 37°C, 5% CO (24 часа).
День 2
2
Когда клетки достигали примерно 80% слияния, их инкубировали с тестируемыми активными соединениями: вегетативная биомасса; сухой водно-спиртовой образец; образец в этилацетате; экстракт в CO, в следующих концентрациях: 20-50 и 100 мкг/мл.
Разведения готовили, начиная с 1000Х исходного раствора в DMSO, фильтровали в стерильных условиях и применяли среду для мезенхимальных стволовых клеток.
День 3
По окончанию инкубации клетки лизировали, применяя буфер для лизиса Cell Lytic™, дополненный до 1% смесью ингибиторов протеаз, и лизаты применяли для анализа ELISA.
Для того чтобы нормализовать экспрессию белка на общее содержание белков в образце, количество общего белка в каждом образце оценивали с помощью анализа по Брэдфорду (Bradford, 1976).
Результаты
Результаты, полученные с помощью экспериментов, проиллюстрированы в прилагаемых фиг. 1-5, которые показывают следующее:
5.1 Предварительный анализ на цитотоксичность (MTT-анализ)-BALB3T3
2
2
Фиг. 1 показывает результаты, полученные с помощью МТТ-анализа (среднее ± SD). В тесте экстракты Galeopsis Segetum: сухой экстракт (вегетативная биомасса), водно-спиртовой экстракт (сухой водно-спиртовой образец), экстракт в этилацетате (образец в этилацетате) и экстракт в CO (экстракт в CO), оценивали в диапазоне доз, равном 2-200 мкг/мл, в течение 24, 48 и 72 часов. Результаты показали, что все протестированные соединения не цитотоксичны.
5.2 МТТ с индуцированным окислительным стрессом-BALB3T3
Фиг. 2 показывает результаты экспериментов МТТ с окислительным стрессом, индуцированным на образцах, указанных в нижеследующей таблице 1.
2
В частности, фиг. 2 показывает антиоксидантную активность вегетативной биомассы, водно-спиртового экстракта, этилацетатного экстракта, экстракта в CO, тогда таблица 2 показывает результаты антиоксидантной активности.
2
2
Результаты показывают, как антиоксидантная активность выражена в экстрактах. Показано, как способы экстракции определяют усовершенствование такой активности, в особенности, экстракция в этилацетате и CO. Если рассматривать антиоксидантную активность вегетативной биомассы (22,14), то она повысилась после водно-спиртовой экстракции (37,64; +70%) и в большей степени после экстракции этилацетатом и экстракции в CO (50,13 и 48,58, соответственно; в среднем +123%).
5.3 Исследование эффектов экстрактов Galeopsis Segetum на продукцию АФК при помощи DCFH-DA-анализа-BALB3T3
2
2
Результаты для защитной активности клеток против окислительного стресса, индуцированного под действием НО, показаны на фиг. 3.
2
2
Индуцированный окислительный стресс создает ситуацию, в которой клетка страдает, что приводит к значительной потере в популяции клеток. Обработка соединениями (вегетативная биомасса, водно-спиртовой экстракт, этилацетатный экстракт, экстракт в CO) показала защитную способность против апоптического процесса, индуцированного окислительным стрессом. Такая активность находится в соответствии с тем, что наблюдали для антиоксидантной активности и актуальна для этилацетатного и CO-экстрактов.
5.4 Исследование эффектов экстрактов Galeopsis Segetum на активность 5-альфа-редуктазы (изоформа2)-BALB3T3
Фиг. 4 показывает результаты экспрессии гена изоформы 2 5-альфа-редуктазы, мишени для финастерида.
2
Galeopsis Segetum (вегетативная биомасса) проявил ингибирующую активность в отношении 5-альфа-редуктазы типа 2. Водно-спиртовой и CO-экстракты (50 и 100 мкг/мл) также показали такую активность, в то время как это было менее очевидно при экстракции этилацетатом.
5.5 Исследование эффектов экстрактов Galeopsis Segetum на экспрессию цитокератина 6A-ORS
Фиг. 5 показывает величины, относящиеся к цитокератину 6А, хорошо известного маркера стволовых клеток фолликула, в котором он играет важную роль для гомеостаза и роста волос.
2
Полученные результаты показали, что вегетативная биомасса не способна стимулировать такой кератин, тогда как образцы, полученные с помощью водно-спиртовой и этилацетатной экстракции (в обеих протестированных дозах) и экстракции в СO (только большие дозы) способны его стимулировать.
Степень стимулирования такого кератина в этилацетатном образце была значительной.
Заключение
Проведенные тесты показали:
- отсутствие цитотоксичности всех образцов, протестированных в диапазоне 2-200 мкг/мл, вплоть до 72 часов обработки клеток (фибробластов) (МТТ-анализ)
- хорошую антиоксидантную активность всех соединений, необходимо отметить, что экстракции улучшают антиоксидантную активность. По сравнению с вегетативной биомассой, водно-спиртовая экстракция улучшает такую активность на + 70%, тогда как этилацетатная и CO2 экстракция на 123% (анализ с дихлорфлуоресцеином).
- такая активность также отражается в защите клеток после индукции окислительного стресса (тест на фибробластах)
2
- тест на стимулирование синтеза цитокератина 6А в ORS (клетки наружного корневого влагалища фолликула) установил, что вегетативная биомасса не способна стимулировать его синтез, тогда как водно-спиртовая, этилацетатная и CO экстракция (в этом случае только в большей из протестированных доз) индуцируют синтез такого кератина.
Пример 9
Введение
Настоящий пример относится к лекарственным препаратам из трех экстрактов, имеющих различную полярность, полученных из наземных частей Galeopsis Segetum. Наиболее полярный экстракт готовили экстракцией водным этанолом. Первоначально, скрининг растворителей проводили в целях выявления наиболее подходящего содержания спирта.
2
Неполярный экстракт готовили, применяя сверхкритический CO.
Экстракт, имеющий промежуточную полярность, готовили экстрагированием менее полярных компонентов водно-спиртового экстракта этилацетатом.
Данные экстракты применяли для скрининга активности.
1. Объект испытаний
Лекарственный препарат из трех экстрактов, имеющих различную полярность, полученный из наземных частей Galeopsis Segetum и его характеристика.
Были получены следующие экстракты:
Сухой водно-спиртовой экстракт Galeopsis Segetum - IDN6764
Сухой экстракт Galeopsis Segetum с этилацетатом - IDN 6765
2
Экстракт Galeopsis Segetum с СО - IDN 6766
2. Экспериментальная стадия
2.1 Биомасса
Все работы, упомянутые в настоящем документе, осуществляли на наземных частях Galeopsis Segetum СоА 1054/9394.
2.2 Водно-спиртовой экстракт: скрининг содержания этанола
Для того чтобы найти наилучший растворитель для экстракции с точки зрения выхода, характеристик и образцов вторичных метаболитов с помощью ТСХ, проводили скрининг с различным содержанием этанола, а именно 20%, 40% и 70%. Для каждого теста, 20 г биомассы среды суспендировали в 400 мл растворителя при 50°C, перемешивая в течение 4-х часов. Суспензии фильтровали, и растворы концентрировали до сухого состояния.
Каждый экстракт оценивали в отношении выхода экстракции, характеристик и ТСХ. Результаты показаны в таблице 1
Согласно ТСХ, наилучший растворитель для экстракции - это 40% и 70% EtOH. С другой стороны, этот последний экстракт содержит больше хлорофилла, что приводит к зеленоватому и липкому экстракту. По этой причине, в качестве растворителя для экстракции выбрали 40% EtOH.
2.3 Получение сухого водно-спиртового экстракта Galeopsis Segetum - IDN6764 (контр, тест 921/30/D)
a) 100 г измельченных надземных частей Galeopsis Segetum, CofA 1054/9394, загружали в перколятор, покрывали 0,54 л 40%-ного этанола, нагревали до 50°C и оставляли в статических условиях в течение 4-х часов.
После проведения выгрузки, проводили три дополнительные экстракции (3×0,3 л), применяя такую же температуру и такое же время контакта.
b) Фильтраты собирали и концентрировали при пониженном давлении для того, чтобы получить суспензию, равную примерно 0,15 л и 10% сухого остатка.
c) Суспензию центрифугировали для отделения нерастворимого осадка, и прозрачный раствор концентрировали при пониженном давлении до тех пор, пока он не становился сухим.
Осадок высушивали при 50°C при пониженном давлении в течение 24-х часов.
Выход: 14,79 г сухого водно-спиртового экстракта Galeopsis Segetum - IDN6764, серия 921/30/D, CofA 14/0605/LRE
выход масс./масс.: 14,79%
2.4 Получение сухого экстракта с этилацетатом Galeopsis Segetum - IDN6765 (контр, тест 921/30/G)
a) 850 г измельченных надземных частей Galeopsis Segetum, CofA 1054/9394, загружали в перколятор, покрывали 4,6 л 40%-ного этилацетата, нагревали до 50°C и оставляли в статичном состоянии в течение 4-х часов.
После проведения выгрузки, проводили три дополнительные экстракции (4×2,5 л), поддерживая такую же температуру и такое же время контакта.
b) Фильтраты собирали и концентрировали при пониженном давлении для того, чтобы получить суспензию, равную примерно 1,4 л и 10% сухого остатка.
c) Суспензию центрифугировали для отделения нерастворимого осадка, и прозрачный раствор подвергали экстракции этилацетатом (3×0,35 л).
d) Органические фазы объединяли и концентрировали до получения мягкой основной массы. Добавляли воду (10 мл) и суспензию концентрировали снова до получения мягкой основной массы. Эту обработку повторяли для того, чтобы удалить любые остатки этилацетата.
Наконец, осадок высушивали при 50°C при пониженном давлении в течение 24-х часов.
Выход: 2,85 г сухого экстракта с этилацетатом Galeopsis Segetum - IDN6765, серия 921/30/G, CofA 14/0606/LRE
выход масс./масс.: 0,34%
2
2.5 Получение экстракта Galeopsis Segetum с CO - IDN6766
a) 5 кг измельченных надземных частей Galeopsis Segetum, CofA 1054/9394, помещали в контейнер экстрактора. Экстракцию проводили в соответствии со следующими условиями:
- температура - 55°C
- давление - 270-280 бар
2
- ток CO - 70 кг/час
- время экстракции - 4,5 часов
b) Экстракция обеспечивает эмульсию (94 г). Эмульсию высушивают при 60°C при пониженном давлении в течение 4-х часов.
2
Выход: 74 г экстракта Galeopsis Segetum с CO - IDN6766, серия 522/14/23A, CofA 14/0604/LRE.
выход масс./масс.: 1,48%
3. Результаты
Экстракты описывали, анализируя следующие характеристики:
- внешний вид
- идентификация с помощью ТСХ, как показано на прилагаемых фиг. 7 и 8
- идентификация с помощью FT-IR, как показано на прилагаемых фиг. 9-11
Результаты приведены в таблице 2.
4. Заключение
Из наземных частей Galeopsis Segetum были получены и охарактеризованы три экстракта, имеющие различную полярность.