Новые параметры гистологических изображений опухолевого лимфангиогенеза. Данные исследования 48 препаратов папиллярного рака щитовидной железы детского возраста

УДК 616.44-006-078.4

НОВЫЕ ПАРАМЕТРЫ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ОПУХОЛЕВОГО ЛИМФАНГИОГЕНЕЗА. ДАННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 48 ПРЕПАРАТОВ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ДЕТСКОГО ВОЗРАСТА

Спринджук М.В., Кончиц А.П.

THE NEW PARAMETERS OF LYMPHANGIOGENIC HISTOLOGICAL IMAGES. THE EXPERIENCE, BASED ON INVESTIGATION OF 48 JUVENILE PAPILLARY THYROID CANCERS

Sprindzuk M.V., Konchits А.Р.

Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, г. Минск, Беларусь

Резюме. Целью исследования было выяснить возможность предсказания факта метастазирования в шейные лимфатические узлы по данным анализа изображений опухолевого лимфангиогенеза с помощью линейной регрессии. Наиболее адекватным параметром, полученным в результате анализа изображений опухолевого лимфангиогенеза, оказалась относительная доля мелких объектов . Дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение возможности параметров изображений, полученных с помощью программного обеспечения, предсказывать клинико-лабораторное состояние пациентов, что может иметь реальную практическую ценность и откроет новые пути понимания опухолевого ангио- и лимфангиогенеза, и может применяться в различных сферах медицины. Ключевые слова: ангиогенез, лимфангиогенез, рак щитовидной железы, опухоли, карцинома, плотность микрососудов, обработка изображений, программное обеспечение.

Abstract. The aims of our research were to determine the predictive abilities of the image processing and linear regression applied to the sphere of thyroid oncology, where the target of investigation was a fact of metastatic expansion of the tumor to the cervical nodes. In accordance to our experiments, the most suitable and adequate image parameter was the relative part of small objects which fitted the equation slope as a significant predictor of the metastatic presence. Future research should be directed at the investigation of predictive abilities of image parameters in statistical models applied in various spheres of histopathology and medicine.

Key words: image processing, angiogenesis, lymphangiogenesis, oncology, pathology, linear regression, software, tumor expansion, thyroid cancer.

Введение

Морфометрические методы исследования широко популярны в медицине, классические русскоязычные труды в этой области принадлежат профессору Г.Г. Автандилову [1-4].

Он является автором нередко применяемой измерительной окулярной сетки, которая чаще применяется для количественной оценки половых клеток. Аналог этого инструмента - сетка-гратикула Chalkley [5-15] (eyepiece,

graticule). Микроскопическая патоморфология ангиоге-неза (роста капилляров из уже сформированных таковых), а также васкулогенеза лимфатических капилляров до сегодняшнего времени оставались малоизученными по причине отсутствия надежных иммунохимических маркеров. Имеются единичные сообщения об изучении патоморфологии лимфангиогенеза в щитовидной железе [16-24]. Наше исследование ставило целью заполнить промежуток отсутствия исследований компьютер-

ассистированной морфометрии лимфангиогенеза рака щитовидной железы - болезни, которая, как известно, характерна для пост-Чернобыльских территорий.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнялось по материалам Онкологического диспансера г. Минска в течение 13 месяцев, с 2009 по 2010 год.

Критерии включения пациентов в исследование были следующие (см. также рис. 1-3):

1. Дети были рождены позднее 1987.

2. Все имели диагноз спорадического папиллярного рака щитовидной железы (на основании тонкоигольной биопсии и обследования удаленной опухоли).

3. Возраст варьировал от 4 до 18 лет.

4. У всех пациентов не было явной врожденной болезни и значительных сопутствующих патологий развития.

Препараты были приготовлены из хирургически удаленных опухолей (папиллярного рака щитовидной железы) пациентов. Образцы опухолей хранились в замороженном виде.

Использовалось специально разработанное программное обеспечение, которое обрабатывало изображения и считало 5 параметров: относительную площадь, занимаемую сосудами; однородность распределения сети в пространстве; относительную долю мелких объектов сосудов (шума); относительную долю крупных сосудов; среднее значение цветности выделяемых сосудов.

Рис. 1. Диаграмма возраста исследуемых больных. По оси Y - число наблюдений

2  0  8  -

Л \

0 L-—

1 i—L^l .

О 4 8 12 16 20 24 28

Рис. 2. График преобладания размеров опухолей

Программное обеспечение было написано на Delphi (то есть фактически объектно ориентированном Паскале) для операционной системы Windows. Ключевая функция программного обеспечения - вычисление прокрашенной коричневым цветом области гистологического изображения. Изображения были получены при помощи микроскопа «Leica DMD 108» с операционной системой Linux. Снимки были получены вручную, без сканера, 150 изображений, которые в основном визуально соответствовали области максимальной васкуляризации по зрительному оценочному решению одного исследователя, как квадрат на увеличении х40, а затем сняты х200. После этого были отобраны изображения, исключительно содержащие околоопухолевую зону (3-25 шт.).

Все изображения были сохранены в формате Tiff, приемлемом для программного обеспечения.

Программное обеспечение произвело список числовых величин, который был импортирован в таблицу Excel. Статистическое исследование выполнялось преимущественно программным пакетом Statistica. Его концепция заключалась в модели простой линейной регрессии, где параметрам изображений придавалось значение предсказательных факторов, а факту наличия метастазов -исхода. Значение относительной ошибки Р считалось статистически значимым, если было менее 0,05.

Результаты

Только для двух числовых характеристик изображений модель линейной регрессии показала статисти-

а

1; 12; 25%

Таблица 1. Параметры модели простой линейной регрессии

36; 75%

Мужской пол

1; 694

в

1; 33%

1; 8%

I; 31%

"0; 92% Распространенный рост

0; 81% Экспансивный рост

0; 79%

Перитиреоидный рост Рассеянная, рыхлая Нодуллрная архитектоника

0; 81% ТиреоидитХишимота

1; 639

"0; 92%

Мелкие опухоли Отсутствие псаммомныхтел

0; 38%

г

1; 25%,

Я

0;75'

1; 15%

0; 85%

Подкапсулярный рост Солидно-альвеолярный рак

25%

Инфильтрагивный рост опухоли

Рис. 3. Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов. На всех рисунках зеленым цветом выделяется наличие признака (1), а другими - его отсутствие (0).

чески значимые результаты. Этими параметрами были относительная доля мелких объектов сосудов, шума (ОДМО), и относительная доля крупных сосудов (ОДКО). Таким образом, мы получили два уравнения, образующие формулу предсказания локального лимфатического метастазирования:

Наличие метастазов = -5,777582 х ОДМО + 5,980355

Статистические Линейная регрессия Линейная регрессия

параметры модели для ОДМО для ОДКО

Стандартная ошибка (наклона) 2,305138 4,627642

95% ДИ для популя-ционного значения наклона -10,417584 до -1,13758 -20,249792 до -0,069329

95% ДИ для г (трансформированное число г Фишера) -0,574215 до -0,069329 -0,560719 до -0,049493

1 для значения степени свободы = 46 -2,506393 -2,362938

Двусторонний Р 0,0158 0,0224

Сила (для 5% значимости) 67,13% 62,21%

Коэффициент Коэффициент

Общий результат корреляции значительно отличается корреляции значительно отличается

от нуля от нуля

Подробная характеристика применяемой статистической модели приведена в таблице 1.

Обсуждение

Публикаций по теме лимфангиогенеза и лимфоген-ного метастазирования опухолей щитовидной железы немного [16-40]. Движущая сила научного продвижения этой области - недавнее появление лимфатических маркеров; среди них D2-40, который применялся в нашем исследовании (рис. 4). Антитело D2-40 первоначально реагирует с 0-связанным гликопротеином, экспрессиру-ющимся на лимфатическом эндотелии, эмбриональном яичке и опухолях яичек.

На сегодняшний день считается, что основные биохимические факторы развития лимфангиогенеза любой

Рис. 4. Классические примеры папиллярного рака щитовидной железы, препараты окрашены гематоксилином, эозином и маркером Э2-40. Лимфатические сосуды на изображениях выделяются коричневым цветом (х200).

б

локализации - сосудистые эндотелиальные факторы роста (C, D, А, в порядке значения). Неизвестны механизмы увеличения ФРЭС (фактора роста эндотелия сосудов) и природа молекул, выполняющих активацию существующего лимфатического эндотелия, вызывающего увеличение размера опухоли с последующей продукцией митогенных и хемотаксических факторов или альтераций лимфатического эндотелия. Hall [41] и сотрудники (2003) были первыми, кто исследовал морфологические особенности опухолевой лимфатической сети у больных, имеющих папиллярные карциномы щитовидной железы. В исследовании, используя LYVE-1 (Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor) как маркер, сетки Chalky для подсчета сосудов, высокая ПЛК (плотность лимфатических капилляров) была связана с наличием региональных метастазов лимфатического узла. Однако наличие внутриопухолевого лимфангиогенеза не было значительным предиктором рецидива опухоли (P = 0,42). Интересно, эксперимент Cheong [42, 43] и соавторов (2010) не показал значительных различий в плотности лимфатических и кровеносных капилляров сосочковых карцином щитовидной железы и микрокарцином (<1 см в размере). Однако более высокая ПЛК отмечалась у больных старше, чем 45 лет (более четко в группе крупных карцином) и имеющих мультицентральность с экстратиреоидным распространением. Мультицентраль-ность была определена как наличие дополнительных фокусов опухоли, состоящих из нескольких несмежных с первичной опухолью участков. Экстратиреоидное распространение было определено как прорастание опухоли вне капсулы, окружающей мягкие ткани железы.

Классическим морфометрическим параметром оценки сети лимфатических капилляров является их площадь, прокрашенная диагностическим маркером [44-51]. В нашем исследовании применены новые параметры изображений. Как оказалось, доля мелких и крупных объектов характеризует морфологию сети лимфатических сосудов более подробно, чем просто площадь прокрашенного, и выявляет свою прогностическую ценность. Новые параметры изображений позволяют классифицировать морфологию ангиогенеза и выделять подгруппы морфологических паттернов.

Выводы и заключение

Впервые предложена простая математическая модель предсказания факта образования региональных лимфатических метастазов по данным компьютеризированной морфометрии опухолевого лимфангиогенеза. Можно предположить, что такой подход может быть применен к опухолям любой локализации. Безусловно, более достоверно доказать эти закономерности можно, только проведя широкомасштабные многоцентровые исследования, реальность возможности выполнения которых в условиях современного экономического кризиса маловероятна.

Литература

1. Avtandilov G.G.: Information characteristic of morphology of the adaptational norm, disadaptation, and pathology under the aspect of diagnostic microscopy. Gegenbaurs Morphol Jahrb 1989, 135(1):169-171.

2. Avtandilov G.G., Sorokina M.V.: [Use of multifactor mathematical modeling in studying the geographical pathology of human malignant tumors]. Vopr Onkol 1980, 26(12):64-68.

3. Avtandilov G.G.: [Philosophical aspects of probability principles in the study of human pathology]. Arkh Patol 1975, 37(4):3-10.

4. Avtandilov G.G.: [Perspectives in microspectrophotometric studies in pathology]. Arkh Patol 1970, 32(9):3-12.

5. Ng L., Beer T.W., Murray K.: Vascular density has prognostic value in Merkel cell carcinoma. Am J Dermatopathol 2008, 30(5):442-445.

6. Fox S.B.: Quantitative angiogenesis in breast cancer. Methods Mol Med 2006, 120:161-187.

7. Reed A.A., Joyner C.J., Brownlow H.C., Simpson A.H.: Human atrophic fracture non-unions are not avascular. J Orthop Res 2002, 20(3):593-599.

8. Edwards J.G., Cox G., Andi A., Jones J.L., Walker R.A., Waller D.A., O'Byrne K.J.: Angiogenesis is an independent prognostic factor in malignant mesothelioma. Br J Cancer 2001, 85(6):863-868.

9. Offersen B.V., Pfeiffer P., Hamilton-Dutoit S., Overgaard J.: Patterns of angiogenesis in nonsmall-cell lung carcinoma. Cancer 2001, 91(8):1500-1509.

10. Chaudhary R., Bromley M., Clarke N.W., Betts C.D., Barnard R.J., Ryder W.D., Kumar S.: Prognostic relevance of micro-vessel density in cancer of the urinary bladder. Anticancer Res 1999, 19(4C):3479-3484.

11. Decaussin M., Sartelet H., Robert C., Moro D., Claraz C., Brambilla C., Brambilla E.: Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its two receptors (VEGF-R1-Flt1 and VEGF-R2-Flk1/KDR) in non-small cell lung carcinomas (NSCLCs): correlation with angiogenesis and survival. J Pathol 1999, 188(4):369-377.

12. Fox S.B., Turner G.D., Leek R.D., Whitehouse R.M., Gatter K.C., Harris A.L.: The prognostic value of quantitative angiogenesis in breast cancer and role of adhesion molecule expression in tumor endothelium. Breast Cancer Res Treat 1995, 36(2):219-226.

13. Dickinson A.J., Fox S.B., Persad R.A., Hollyer J., Sibley G.N., Harris A.L.: Quantification of angiogenesis as an independent predictor of

prognosis in invasive bladder carcinomas. Br J Urol 1994, 74(6):762-766.

14. Fox S.B., Leek R.D., Smith K., Hollyer J., Greenall M., Harris A.L.: Tumor angiogenesis in node-negative breast carcinomas-relationship with epidermal growth factor receptor, estrogen receptor, and survival. Breast Cancer Res Treat 1994, 29(l):109-116.

15. Engels K., du Bois A., Harter P., Fisseler-Eckhoff A., Kommoss F., Stauber R., Kaufmann M., Nekljudova V., Loibl S.: VEGF-A and i-NOS expression are prognostic factors in serous epithelial ovarian carcinomas after complete surgical resection. J Clin Pathol 2009, 62(5):448-454.

16. Scarpino S., Di Napoli A., Melotti F., Talerico C., Cancrini A., Ruco L.: Papillary carcinoma of the thyroid: low expression of NCAM (CD56) is associated with downregulation of VEGF-D production by tumour cells. J Pathol 2007, 212(4):411-419.

17. Furtado G.C., Marinkovic T., Martin A.P., Garin A., Hoch B., Hubner W., Chen B.K., Genden E., Skobe M., Lira S.A.: Lymphotoxin beta receptor signaling is required for inflammatory lymphangiogenesis in the thyroid. Proc Natl Acad Sci U S A 2007, 104ft2):5026-5031.

18. De la Torre N.G., Buley I., Wass J.A., Turner H.E.: Angiogenesis and lymphangiogenesis in thyroid proliferative lesions: relationship to type and tumour behaviour. Endocr Relat Cancer 2006, 13(3):931-944.

19. Liang Q.C., Wei Q.Y., Fan S.Q.: [Expression of VEGF-C and angiogenesis, and lymphangiogenesis in papillary thyroid carcinoma]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2006, 31(3):414-416, 419.

20. Nakamura Y., Yasuoka H., Zuo H., Takamura Y., Miyauchi A., Nakamura M., Kakudo K.: Nitric oxide in papillary thyroid carcinoma: induction of vascular endothelial growth factor D and correlation with lymph node metastasis. J Clin Endocrinol Metab 2006, 91(4):1582-1585.

21. Yu X.M., Lo C.Y., Chan W.F., Lam K.Y., Leung P., Luk J.M.: Increased expression of vascular endothelial growth factor C in papillary thyroid carcinoma correlates with cervical lymph node metastases. Clin Cancer Res 2005, 11(22):8063-8069.

22. Jiang H.G., Gao M., Tang W.P., Li F.H., Cai Q.Z.: [Expression and significance of VEGF, VEGF-C, and VEGF-D in papillary thyroid carcinoma]. Ai Zheng 2005, 24(9):1136-1139.

23. Giorgadze T.A., Baloch Z.W., Pasha T., Zhang P.J., Livolsi V.A.: Lymphatic and blood vessel density in the follicular patterned lesions of thyroid. Mod Pathol 2005, 18(11):1424-1431.

24. Yasuoka H., Nakamura Y., Zuo H., Tang W., Takamura Y., Miyauchi A., Nakamura M., Mori I., Kakudo K.: VEGF-D expression and lymph vessels play an important role for lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma. Mod Pathol 2005, 18(8):1127-1133.

25. Koo B.S., Lim H.S., Lim Y.C., Yoon Y.H., Kim Y.M., Park Y.H., Rha K.S.: Occult contralateral carcinoma in patients with unilateral papillary thyroid microcarcinoma. Ann Surg Oncol 2010, 17(4):1101-1105.

26. Koo B.S., Seo S.T., Lee G.H., Kim J.M., Choi E.C., Lim Y.C.: Prophylactic lymphadenectomy of neck level II in clinically node-positive papillary thyroid carcinoma. Ann Surg Oncol 2010, 17(6):1637-1641.

27. Koo J.S., Kwak J.Y., Jung W., Hong S.: Importance of foamy macrophages only in fine needle aspirates to cytologic diagnostic accuracy of cystic metastatic papillary thyroid carcinoma. Acta Cytol 2010, 54(3):249-254.

28. Macdonald K.I., Taylor S.M., Cavanagh J., Trites J.R., Bullock M.J., Hart R.D.: Level VI node size as a predictor of malignancy in papillary thyroid cancer. J Otolaryngol Head Neck Surg 2010, 39(2):136-141.

29. Martino A., Monaco L., Golia R., Miletto P., Capasso P., Lombardi C., De Chiara G., Iannace C., Basagni C., Caracciolo F.: A new radioguided procedure for localization and surgical treatment of neck node metastasis of papillary thyroid cancer. J Endocrinol Invest 2010, 33(5):339-342.

30. Mitchell J.C., Parangi S.: Angiogenesis in benign and malignant thyroid disease. Thyroid 2005, 15(6):494-510.

31. Salter K.D., Andersen P.E., Cohen J.I., Schuff K.G., Lester L., Shindo M.L., Sauer D., Gross N.D.: Central nodal metastases in papillary thyroid carcinoma based on tumor histologic type and focality. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2010, 136(7):692-696.

32. Vergez S., Sarini J., Percodani J., Serrano E., Caron P.: Lymph node management in clinically node-negative patients with papillary thyroid carcinoma. Eur J Surg Oncol 2010, 36(8):777-782.

33. Wang W., Wang H., Teng X., Mao C., Teng R., Zhao W., Cao J., Fahey T.J., 3rd, Teng L.: Clonal analysis of bilateral, recurrent, and metastatic papillary thyroid carcinomas. Hum Pathol 2010, 41(9):1299-1309.

34. Yuce I., Cagli S., Bayram A., Karasu F., Guney E.: Regional metastatic pattern of papillary thyroid carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol 2010, 267(3):437-441.

35. Al-Saif O., Farrar W.B., Bloomston M., Porter K., Ringel M.D., Kloos R.T.: Long-term efficacy of lymph node reoperation for persistent papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 2010, 95(5):2187-2194.

36. Baek S.K., Jung K.Y., Kang S.M., Kwon S.Y., Woo J.S., Cho S.H., Chung E.J.: Clinical risk factors associated with cervical lymph node recurrence in papillary thyroid carcinoma. Thyroid 2010, 20(2):147-152.

37. French J.D., Weber Z.J., Fretwell D.L., Said S., Klopper J.P., Haugen B.R.: Tumor-associated lymphocytes and increased FoxP3+ regulatory T cell frequency correlate with more aggressive papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 2010, 95(5):2325-2333.

38. Hung C.J., Ginzinger D.G., Zarnegar R., Kanauchi H., Wong M.G., Kebebew E., Clark O.H., Duh Q.Y.: Expression of vascular endothelial growth factor-C in benign and malignant thyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab 2003, 88(8):3694-3699.

39. Kaneko K., Abe K., Baba S., Tanabe Y., Yabuuchi H., Hatakenaka M., Sasaki M., Honda H.: Can calcification predict 131I accumulation on metastatic lymph nodes in papillary thyroid carcinoma patients receiving 131I therapy? Comparison of CT, 131I WBS and 18F-FDG PET/CT. Eur Radiol 2010, 20(2):477-483.

40. Klein M., Catargi B.: VEGF in physiological process and thyroid disease. Ann Endocrinol (Paris) 2007, 68(6):438-448.

41. Hall F.T., Freeman J.L., Asa S.L., Jackson D.G., Beasley N.J.: Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery 2003, 129(7):716-719.

42. Cheong H., Kang H., Kim H.K., Bae J.Y., Song D.E., Cho M.S., Sung S.H., Han W.S., Koo H.: Microvessel and Lymphatic Vessel Density and VEGFR-3 Expression of Papillary Thyroid Carcinoma with Comparative Analysis of Clinicopathological Characteristics. Korean Journal of Pathology 2010, 44(3):243-251.

43. Koo H., Cheong H.: Microvessel and lymphatic vessel density and VEGFR-3 expression of papillary carcinoma of thyroid gland. Virchows Archiv 2009, 455:379-380.

44. Matsumoto N., Mukae S., Tsuda H., Sawada A., Okazaki Y., Nagai K., Akishima-Fukasawa Y., Ohki H., Ishikawa Y., Ishii T. et al: Prognostic value of LYVE-1-positive lymphatic vessel in tongue squamous cell carcinomas. Anticancer Res 2010, 30(6):1897-1903.

45. Van Niekerk C.G., Hulsbergen-van de Kaa C.A., Barentsz J.O., Witjes J.A., van der Laak J.A.: Quantitative analysis of lymph vessel characteristics in organ confined prostate cancer. Prostate 2010. Abstract publilshed online.

46. Goyal S., Chauhan S.K., El Annan J., Nallasamy N., Zhang Q., Dana R.: Evidence of corneal lymphangiogenesis in dry eye disease: a potential link to adaptive immunity? Arch Ophthalmol 2010, 128(7):819-824.

47. Chen D., Zheng J., Li H., Wang Q., Jiao X.: Computer-assisted morphometric analysis of lymphatic vessel changes in hamster tongue carcinogenesis. J Oral Pathol Med 2010, 39(7):518-524.

48. Girling J.E., Donoghue J.F., Lederman F.L., Cann L.M., Achen M.G., Stacker S.A., Rogers P.A.: Vascular endothelial growth factor-D

over-expressing tumor cells induce differential effects on uterine vasculature in a mouse model of endometrial cancer. Reprod Biol Endocrinol 2010, 8:84.

49. Heindl L.M., Hofmann-Rummelt C., Adler W., Holbach L.M., Naumann G.O., Kruse F.E., Cursiefen C.: Tumor-associated lymphangiogenesis in the development of conjunctival squamous cell carcinoma. Ophthalmology 2010, 117(4):649-658.

50. Garcia E.A., Simoes K., Wakamatsu A., Ressio R.A., Alves V.A., Longatto-Filho A., Camargo R.S.: Lymphatic vessel density and VEGF-C expression are significantly different among benign and malignant thyroid lesions. Endocr Pathol 2010, 21(2):101-107.

51. Zhang L., Yankelevitz D.F., Henschke C.I., Reeves A.P., Vazquez M.F., Carter D:. Variation in vascular distribution in small lung cancers. Lung Cancer 2010, 68(3):389-393.

11.01.2011 г.