СПОСОБ ПРОЛОНГИРОВАНИЯ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ТЕНЕЙ ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD OF PROLONGING RELEASE OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM RED BLOOD CELL SHADOWS

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине и может быть использовано в цитологии, гистологии, трансплантологии, биомедицинских исследованиях, клеточной биотехнологии и биоинженерии.
Важнейшей задачей тканевой инженерии является включение биоактивных веществ в структуру скаффолда для их постепенного высвобождения в процессе биорезорбции материала.
Существует вариант в инкапсуляции биологически активных веществ в системы лекарственной доставки, одной из которых являются тени эритроцитов. Как и сами скаффолды, системы доставки должны иметь регулируемую скорость биодеградации, отсутствие токсичности и отрицательного влияния на структуру клеток.
В качестве прототипа выбран способ, включающий использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде (SU 1718955 А1 Способ включения водорастворимого препарата в тени эритроцитов, Ж.Ш. Жумадилов, Т.П. Генинг, 15.03.92 Бюл. №10).
Однако заполненные тени эритроцитов вводятся внутривенно, поэтому не может происходить направленного действия препаратов на клетки, культивируемые в скаффолде. Системное введение факторов роста обычно является малоэффективным, а иногда и опасным вследствие их короткого времени жизни, особенно в физиологических средах, неизбирательного биораспределения, потенциальной токсичности и риска канцерогенной активности. Включение биоактивных веществ в тени эритроцитов и размещение их в скаффолде дает возможность локализованно доставлять оптимальную концентрацию биологически активных веществ внутрь имплантата.
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.
Технический результат - создание условий для постепенного и контролируемого высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем использование в качестве контейнеров теней эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, с целью замедления процесса высвобождения биологически активных веществ «замыкание» теней эритроцитов осуществляют путем добавления к ним раствора глутарового альдегида, от изменения концентрации которого зависит длительность высвобождения биологически активных веществ, с последующим отмыванием теней от находящегося вне теней глутарового альдегида.
Способ пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов осуществляют следующим образом. Для приготовления теней эритроцитов используют 1.5 мл донорских эритроцитов. Отмывают их физиологическим раствором 2 раза путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем, добавляя в отмытые эритроциты по 10 мл ледяной дистиллированной воды осуществляют гипоосмотический шок, центрифугируют 25 минут при 8000 об/мин, надосадочную жидкость сливают. Осадок суспензируют с 10 мл гипертонического раствора хлорида натрия (4%) для дальнейшего удаления, оставшегося в тенях эритроцитов гемоглобина, центрифугируют 10 минут при 8000об/мин, надосадочную жидкость удаляют. Полученные тени эритроцитов инкубируют с 4 мл смеси биологически активных веществ и разбавленной ледяной дистиллированной водой 1:1 в течение 20 минут при 4°С. Для «замыкания» мембраны эритроцитов восстанавливают изотоничность среды, добавляя раствор глютаральдегида в физиологическом растворе, и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. После этого центрифугируют 10 минут при 4000об/мин., надосадочную жидкость удаляют. Оставшиеся, заполненные биологически активными веществами, тени эритроцитов отмывают от находящегося вне теней глутарового альдегида физиологическим раствором. Надосадочную жидкость после центрифугирования в течение 10 минут при 4000об/мин удалялиют. Для дальнейших исследований и оценки эффективности предложенного способа используют полученные тени эритроцитов с инкапсулированными биологически активными факторами, и замкнутыми с помощью глутарового альдегида.
Пример №1
Важнейшей задачей, решаемой с помощью предполагаемого способа, является постепенное высвобождение биологически активных веществ из контейнеров носителей (теней эритроцитов). В способе прототипа показано, что высвобождение антибиотиков из теней эритроцитов происходит постепенно при их внутривенном введении. Для проверки скорости высвобождения инкапсулированных факторов из теней эритроцитов в условиях in vitro проведены следующие исследования. Тени эритроцитов, полученные описанным ранее способом, инкубируют с раствором 10% альбумина, разведенного 1:1 дистиллированной водой. Заполненные альбумином тени эритроцитов, после их «замыкания» путем создания изотоничности среды в контроле - физиологическим раствором, а в опыте - глутаровым альдегидом, отмывают от находящейся вне теней альбумина и глютаральдегида, путем добавления физиологического раствора и центрифугирования 10 минут при 4000об/мин, надосадочную жидкость удаляют. Добавляют 1 мл физиологического раствора, перемешивают и центрифугируют 10 минут при 4000об/мин. Затем измеряют оптическую плотность супернатанта против физиологического раствора при длине волны 280 нм на спектрофотометре Spekol UV VIS (Zeiss, Германия). Установлено, что через сутки из теней эритроцитов в контроле («замкнутых» физиологическим раствором) высвобождается 54,5% инкапсулированного альбумина, а через двое суток- 78%, через трое суток-98%. Из теней эритроцитов, «замкнутых» 0,06% раствором глутарового альдегида, через сутки высвобождалось 30% инкапсулированного альбумина, через 2 суток- 51%, через трое суток-68%, через 4 суток- 75%, через 5 суток- 82%, через 6 суток- 92%.
При использовании 0,125% раствора глутарового альдегида для «замыкания» теней эритроцитов 93% высвобождение альбумина происходило лишь на 8 сутки.
Таким образом, данные исследования указывают на то, что из теней эритроцитов, приготовленных предположенным способом, инкапсулированный белок - альбумин, высвобождается значительно медленнее, чем в опытах, в которых «замыкание теней эритроцитов осуществляется известным способом, выбранном в качестве прототипа. Кроме того, установлено, что с помощью изменения концентрации глутарового альдегида, контролируется скорость высвобождения инкапсулированных веществ.
Для проверки эффективности способа пролонгирования высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов, помещенных непосредственно в скаффолд, проведены следующие исследования.
Пример №2
3
2
2
Описанным выше способом получают тени эритроцитов с инкапсуляцией в них биологически активных веществ - смеси сыворотки крови и лизата тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов и «замыкают» тени с использованием глутарового альдегида - опыт 1. Во втором опыте используют тени эритроцитов, в которых инкапсулируют те же биологически активные вещества, но «зымыкают» их с помощью физиологического раствора. В трех пробирках размещают дермальные фибробласты человека в физиологическом растворе с концентрацией клеток 280 клеток/мм и тщательно перемешивают их с тенями эритроцитов из опыта 1 и опыта 2. В третью пробирку, вместо теней эритроцитов помещают смесь фибробластов с физиологическим раствором (контроль). Во все три пробирки добавляют по 1,25 мл раствора фибриногена (25 мг/мл), тщательно перемешивают и добавляют раствор тромбина. Немедленно заливают эти смеси в силиконизированные чашки Петри. После полимеризации фибриногена полученные скаффолды извлекают из силиконизированных чашек Петри, перемещают в пластиковые чашки Петри большего диаметра и заливают 5 мл среды (DMEM без телячьей сыворотки). Контрольный скаффолд (без теней эритроцитов) заливают культуральной средой DMEM обогащенной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, являющейся источником биологически активных веществ и факторов роста. Помещают чашки Петри со скаффолдами в СO инкубатор с 5% содержанием СО и температурой 37°С.
2
Количество клеток определяют через сутки с момента формирования скаффолда. Для этого от скаффолдов при помощи шаблона отделяют фрагменты площадью 0,64 см. В полученном фрагменте проводят анализ клеточной составляющей. Для визуализации ядер клеток в структуре скаффолда используют метод флуоресцентной микроскопии, реализуемый на многофункциональном фотометре-имиджере Cytation 5 (BioTek, США). Проводят прижизненное окрашивание ядер клеток в скаффолде с применением флуорохрома Hoechst 3334 (США) обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК (длина волны возбуждения 377 нм и длина волны эмиссии 447 нм). Окрашивание проводят в соответствии с протоколом производителя. Количество ядер клеток подсчитывают в 10 полях зрения.
3
3
3
Как показали проведенные исследования, количество клеток (фибробластов) в скаффолде в контроле (без теней эритроцитов, но в присутствии в среде телячьей сыворотки), составляет 503 клетки/мм, а в опыте, в котором тени эритроцитов («замкнутые» с помощью физиологического раствора, без использования глутарового альдегида) содержат биологически активные вещества - 600 клеток /мм. При этом телячья сыворотка в питательную среду не добавляется. В опыте, в котором тени эритроцитов не содержат биологически активные вещества и в ростовой среде нет телячьей сыворотки, число клеток составляет лишь 322 клетки мм. Это свидетельствует о том, что тени, «замкнутые» без участия глутарового альдегида, уже через сутки с момента формирования скаффолда, высвобождают биологически активные вещества, что вызывает повышение пролиферативной активности клеток культивируемых в скаффолде. В то же время тени эритроцитов «замкнутые» с участием глутарового альдегида, эти вещества еще не высвобождают, и пролиферативная активность клеток крайне низкая, о чем свидетельствует их количество.
Через неделю после формирования скаффолда количество фибробластов в опыте, где тени эритроцитов создаются с участием глутарового альдегида, значительно возросло и приблизилось к контролю. Количество фибробластов в опыте, в котором используют тени эритроцитов «замкнутые» без глутарового альдегида - ниже значений контроля. Это свидетельствует о том, что созданы условия для постепенного и контролируемого высвобождения биологически активных веществ из теней эритроцитов, что имеет важное значение в тканевой инженерии. Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность предположенного способа.