МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ КОНЪЮГАТА ПНЕВМОККОВЫЙ ПОЛИСАХАРИД-БЕЛОК
MULTIVALENT COMPOSITION OF PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится в целом к области медицины, а конкретно к области микробиологии, иммунологии, вакцин и предотвращения инфекций, вызываемых бактериальными патогенами, путем иммунизации.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
197
Streptococcus pneumoniae является основным возбудителем менингита, пневмонии и тяжелых инфекционных заболеваний у младенцев и детей младшего возраста по всему миру. Мультивалентные вакцины, содержащие полисахариды пневмококка, были одобрены много лет назад и доказали свою ценность для профилактики заболеваний, вызываемых пневмококками, у пожилых людей и у пациентов с высоким риском заболевания. Однако у младенцев и детей младшего возраста лишь большинство пневмококковых полисахаридов вызывают лишь слабый ответ. 7-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина (7vPnC, Prevnar) была первой вакциной такого рода, которая продемонстрировала высокую иммуногенность и эффективность при борьбе с инфекционными заболеваниями, вызванными инвазивной микрофлорой, и среднего отита у младенцев и детей младшего возраста. В настоящее время эта вакцина одобрена во многих странах мира. Превнар содержит капсульные полисахариды серотипов 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F, каждый из которых конъюгирован с белком-носителем, обозначаемым CRM. Превнар защищает приблизительно от 80-90%, 60-80% и 40-80% инфекционных заболеваний, вызываемых пневмококками (инфекционных пневмококковых заболеваний, ИПЗ) в США, Европе и других регионах мира соответственно [1, 2]. Контрольные данные, собранные за несколько лет после внедрения в практику Превнара, как и ожидалось, явно демонстрируют сокращение числа случаев инфекционных пневмококковых заболеваний у младенцев в США (Фиг.1) [3, 4].
Контрольные данные по ИПЗ в отношении младенцев в США до внедрения Превнара, демонстрировали, что значительная доля заболеваний, вызванных серологическими группами 6 и 19, возникала вследствие инфицирования серотипами 6А (приблизительно одна треть) и 19А (приблизительно одна четверть) [5, 6]. Контрольные данные по инфекционным заболеваниям, вызываемым пневмококками, собранные в США после одобрения Превнара, указывают на то, что большую долю заболеваний все по-прежнему можно отнести на счет серотипов 6А и 19А (ФИГ.1) [3]. Кроме того, эти два серотипа являются причиной большего числа случаев, чем серотипы 1, 3, 5 и 7F в сумме (8,2 по сравнению с 3,3 случаями/100000 детей в возрасте 2 лет и младше). Кроме того, с серотипами 6А и 19А связывают повышенную частоту случаев устойчивости к антибиотикам (ФИГ.2) [7, 8, 9]. Хотя возможно, что перекрестный иммунитет серологических групп будет приводить к сокращению случаев заболеваний, вызванных серотипами 6А и 19А, по мере увеличения числа иммунизированных детей, есть данные, свидетельствующие о том, что есть предел такого сокращения, и большая доля заболеваний, вызываемых этими серотипами, сохранится (см. ниже).
Принимая во внимание относительную долю и значимость инфекционных пневмококковых заболеваний, вызываемых серотипами 1, 3, 5, 6А, 7F и 19А, добавление этих серотипов в состав Превнара расширило бы спектр действия в отношении инфекционных заболеваний до >90% в США и Европе, а также до 70%-80% в Азии и Латинской Америке. Такая вакцина имела бы значительно расширенный спектр действия по сравнению со спектром действия Превнара, и проявляла бы также эффективность в отношении серотипов 6А и 19А, вне зависимости от ограниченности перекрестного иммунитета серологических групп.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена мультивалентная иммуногенная композиция, содержащая 13 полисахарид-белковых конъюгатов (т.е. конъюгатов полисахарид-белок), причем каждый из конъюгатов содержит капсульный полисахарид другого (отличного от содержащегося в других конъюгатах) серотипа Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем, в сочетании с физиологически приемлемой средой (основной). В состав препарата может быть включен адъювант, например адъювант на основе алюминия. Более конкретно, согласно настоящему изобретению предложена 13-валентная композиция пневмококковых конъюгатов (13vPnC), содержащая семь серотипов, входящих в вакцину 7vPnC (4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F), и шесть дополнительных серотипов (1, 3, 5, 6А, 7F и 19А).
197
Согласно настоящему изобретению также предложена мультивалентная иммуногенная композиция, в которой капсульные полисахариды получены из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F Streptococcus pneumoniae, а белком-носителем является CRM.
197
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена мультивалентная иммуногенная композиция, в которой капсульные полисахариды получены из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F Streptococcus pneumoniae, белком-носителем является CRM, а адъювантом является адъювант на основе алюминия, такой как фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидрокосид алюминия. Согласно конкретному варианту реализации адъювантом является фосфат алюминия.
Согласно настоящему изобретению также предложена мультивалентная иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты в сочетании с физиологически приемлемой средой, причем каждый из конъюгатов содержит капсульный полисахарид из конкретного серотипа Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем, и капсульные полисахариды получены из серотипа 3 и по меньшей мере одного дополнительного серотипа.
197
Согласно одному варианту реализации данной мультивалентной иммуногенной композиции дополнительный серотип выбирают из группы, включающей серотипы 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F. Согласно другому варианту реализации белок-носитель представляет собой CRM. Согласно еще одному варианту реализации композиция включает адъювант, такой как адъювант на основе алюминия, выбранный из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидрокосида алюминия. Согласно конкретному варианту реализации адъювантом является фосфат алюминия.
Согласно настоящему изобретению также предложена мультивалентная иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты (т.е. конъюгаты полисахарида и белка) в сочетании с физиологически приемлемой средой, причем каждый из конъюгатов содержит капсульный полисахарид конкретного серотипа Streptococcus pneumoniae, конъюгированный с белком-носителем, и капсульные полисахариды получены из серотипов, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и по меньшей мере одного дополнительного серотипа.
197
В одном варианте реализации данной мультивалентной иммуногенной композиции дополнительный серотип выбирают из группы, включающей серотипы 1, 3, 5, 6А, 7F и 19А. Согласно другому варианту реализации белком-носителем является CRM. Согласно еще одному варианту реализации композиция включает в себя адъювант, такой как адъювант на основе алюминия, выбранный из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. Согласно конкретному варианту реализации адъювантом является фосфат алюминия.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ стимуляции (индуцирования) иммунного ответа на конъюгаты капсульных полисахаридов Streptococcus pneumoniae, включающий введение человеку иммунологически эффективного количества любых иммуногенных композиций, описанных выше.
197
Кроме того, согласно настоящему изобретению любая из иммуногенных композиций, вводимых в однократной дозе 0,5 мл, содержит 2 мкг каждого сахарида, за исключением 6В, содержащегося в количестве 4 мкг; приблизительно 29 мкг белка-носителя CRM; 0,125 мг адъюванта на основе алюминия (0,5 мг фосфата алюминия), а также хлорид натрия и сукцинатно-натриевый буфер в качестве наполнителей.
Также предложены способы получения иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид серотипа 1 Streptococcus pneumoniae (Pn 1), ковалентно связанный с белком-носителем. Согласно одному варианту реализации способ включает (i) осуществление реакции очищенного полисахарида Pn 1 с буфером со щелочным pH с получением частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1; (ii) осуществление реакции частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1 со слабой кислотой с получением нейтрализованного частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1; (iii) осуществление реакции нейтрализованного, частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1 с окисляющим агентом с получением активированного полисахарида Pn 1; (iv) смешивание активированного полисахарида Pn 1 с белком-носителем; (v) осуществление реакции смешанных активированного полисахарида Pn 1 и белка-носителя с восстанавливающим агентом с получением конъюгата полисахарид Pn 1: белок-носитель; и (vi) кэппирование непрореагировавших альдегидов в конъюгате полисахарид Pn 1: белок-носитель с получением иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид Pn 1 Streptococcus pneumoniae, ковалентно связанный с белком-носителем.
Согласно дополнительному варианту реализации способ включает (i) осуществление реакции очищенного полисахарида Pn 1 с бикарбонат/карбонатным буфером с получением частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1; (ii) осуществление реакции частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1 с уксусной кислотой с получением нейтрализованного частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1; (iii) осуществление реакции нейтрализованного частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1 с йоднокислым натрием с получением активированного полисахарида Pn 1; (iv) очистку активированного полисахарида Pn 1; (v) смешивание активированного полисахарида Pn 1 с белком-носителем; (vi) совместную лиофилизацию смешанных активированного полисахарида Pn 1 и белка-носителя; (vii) осуществление реакции совместно лиофилизированных активированного полисахарида Pn 1 и белка-носителя с цианоборогидридом с получением конъюгата полисахарид Pn 1:белок-носитель; и (vii) кэппирование непрореагировавших альдегидов в конъюгате полисахарид Pn 1:белок-носитель борогидридом натрия с получением иммуногенного конъюгата, содержащего полисахарид Pn 1 Streptococcus pneumoniae, ковалентно связанный с белком-носителем.
Также предложен способ получения активированного полисахарида Pn 1 Streptococcus pneumoniae. Этот способ включает (i) осуществление реакции очищенного полисахарида Pn 1 с буфером со щелочным pH с получением частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1; (ii) осуществление реакции частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1 со слабой кислотой с получением нейтрализованного частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1; и (iii) осуществление реакции нейтрализованного частично дез-O-ацетилированного полисахарида Pn 1 с окисляющим агентом с получением активированного полисахарида Pn 1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На ФИГУРЕ 1 показаны изменения частоты ИПЗ, вызываемых серотипом в США у детей в возрасте <2 лет, по сравнению с исходным уровнем (1998/1999) к 2001 г.
На ФИГУРЕ 2 показано распределение изолятов пневмококков с устойчивостью к пенициллину (ПНЦ) у детей в возрасте <5 лет (1998).
На ФИГУРЕ 3 показаны кривые обратных распределений кумулятивных вероятностей (ОРКВ) по результатам ОРА (опсонофагоцитарная реакция) после получения третьей дозы из исследования Превнара D118-P16.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Включение в Превнар серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F
Согласно оценке, основанной на контрольных данных по ИПЗ за 1995-1998 годы, семь серотипов в составе Превнара ответственны за 82% ИПЗ у детей в возрасте младше 2 лет [5]. В Северной Калифорнии - центре проведения исследований по оценке эффективности - серотипы в составе Превнара обусловливали 90% из всех случаев ИПЗ у младенцев и детей младшего возраста [10]. Со времени внедрения в практику вакцины Превнар в 2000 году произошло значительное снижение общей частоты ИПВ в связи со снижением общего числа случаев заболеваний, вызываемых серотипами, входящими в состав вакцины [3, 4]. Следовательно, в настоящее время нет оснований для того, чтобы удалять какой-либо из серотипов в составе Превнара из конъюгированных пневмококковых вакцин нового поколения, но есть основания для добавления серотипов с целью более широкого спектра действия.
Включение серотипов 1, 3, 5 и 7F
В США частота возникновении ИПЗ, вызываемых серотипом 1, у детей в возрасте младше 5 лет составляет <2%, и почти такие же частоты характерны для типов 3 и 7F [1, 6]. Серотипы 1 и 5 обусловливают более высокую частоту возникновения ИПЗ в США среди популяций с высоким риском развития инфекционных пневмококковых заболеваний. В частности, серотип 1 вызывает 3,5% ИПЗ у детей-уроженцев Аляски в возрасте младше 2 лет и 18% у детей в возрасте 2-4 лет [11]. И серотип 1, и серотип 5 вызывают значительное число заболеваний в других регионах мира и у коренного населения развитых стран [12, 13, 14].
Серотип 1 также может быть связан с более тяжелыми заболеваниями, чем с другие серотипы пневмококков [15]. Это наблюдение основано на разности количества идентифицируемых случаев между США и Европой и соответствующих различий в медицинской практике. В целом частота возникновения ИПЗ ниже в Европе, чем в США. Однако в Европе процент ИПЗ, вызываемых серотипом 1, непропорционально выше, чем в США (6-7% и 1-2% соответственно). В Европе посев крови проводят преимущественно у госпитализированных детей. В США рутинной клинической практикой является отбор крови на посев в амбулаторных условиях у детей с лихорадкой ≥39°С и повышенным содержанием лейкоцитов в крови. С учетом различий в медицинской практике можно сделать вывод, что более низкий процент заболеваний, вызванных серотипом 1, в США может быть связан с более высоким процентом других серотипов, вызывающих менее тяжелое заболевание, а более высокий процент в Европе соответствует более тяжелому заболеванию. Кроме того, сероэпидемиологические исследования с участием детей с осложненной пневмонией, демонстрируют, что встречаемость серотипа 1 является непропорциональной [16, 17, 18]. Это указывает на то, что включение серотипа 1 может сократить число тяжелых вызываемых пневмококками заболеваний, а также способствовать общему сокращению инфекционных пневмококковых заболеваний.
Добавление серотипа 3 и 7F должно увеличить спектр действия в отношении ИПЗ в большинстве регионов мира приблизительно на 3%-7%, а в Азии примерно на 9%. Таким образом, 11-валентная вакцина охватывает 50% ИПЗ в Азии и примерно 80% ИПЗ в других регионах [1, 2]. Эти серотипы также важны при охвате среднего отита [19]. В многонациональном исследовании серотипов пневмококков, вызывающих средний отит, Хаусдорф и др. (Hausdorff et al.) показали, что серотип 3 занимает 8 место по частоте определения среди изолятов в жидкости из среднего уха [20]. Серотип 3 составляет 8,7% от серотипов пневмококка, ассоциированных со средним отитом. Таким образом, значимость типов 3 и 7F в возбуждении среднего отита, так же как и ИПЗ, является основанием для их включения в пневмококковую конъюгированную вакцину.
th
Однако попытки получить мультивалентную пневмококковую конъюгированную вакцину, которая проявляла бы значимую иммуногенность в отношении полисахаридов серотипа 3, не увенчивались успехом. Например, в исследовании иммуногенности и безопасности 11-валентной пневмококковой конъюгированной с белком D вакцины (11-Pn-PD) у младенцев, получавших три дозы вакцины, после которых им вводили ревакцинирующую дозу той же вакцины или пневмококковой полисахаридной вакцины, не наблюдали первичной иммунизации (Nurkka et al. (2004) Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014). В другом исследовании результаты анализа опсонофагоцитирующей активности (ОРА) у детей, которые получали дозы 11-Pn-PD, не показали реакции антител на серотип 3 при уровнях, сравнимых с другими тестируемыми серотипами (Gatchalian et al., 17 Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis. (ESPID), Poster No. 4, P1A Poster Session 1, Istanbul Turkey, Mar. 27, 2001). Еще в одном исследовании, в котором оценивали эффективность 11-Pn-PD при профилактике острого среднего отита, вакцина не обеспечивала защиту от приступов, вызываемых серотипом 3 (Prymula et al. (2006) Lancet, 367:740-748). Соответственно, пневмококковая конъюгированная вакцина, содержащая капсульные полисахариды серотипа 3 и способная вызывать иммунную реакцию на полисахариды серотипа 3, обеспечивает значительное улучшение существующего положения в данной области.
Включение 6А и 19А
а. Эпидемиология серотипов 6А и 19А
Данные наблюдения, имеющиеся в литературе, указывают на то, что серотипы 6А и 19А обусловливают большее число инфекционных пневмококковых заболеваний в США у детей младше 2 лет, чем серотипы 1, 3, 5 и 7F вместе (ФИГ.1) [1, 5]. Кроме того, эти серотипы часто ассоциированы с устойчивостью к антибиотикам (ФИГ.2) и играют важную роль в возникновении среднего отита [6, 19, 20]. Способность нынешней вакцины Превнар защищать от заболеваний, вызываемых 6А и 19А, не очевидна. Основание для включения компонентов 6А и 19А в вакцину 13vPnC обсуждается ниже.
b. Реакции 6А и 19А, вызываемые полисахаридами 6В и 19F
Зарегистрированные неконъюгированные пневмококковые полисахаридные вакцины (для применения у людей в возрасте двух лет и старше) содержали капсульные полисахариды 6А или 6В, но не оба полисахарида [21]. Данные об иммуногенности, сгенерированные во время подбора состава 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакцины, продемонстрировали, что моновалентная вакцина с полисахаридом 6В индуцирует антитела к капсулам и 6А и 6В. Данные, полученные в нескольких исследованиях по оценке IgG и реакций, выявляемых по опсонофагоцитарной реакции (ОРА) в разнообразных популяциях, при введении свободных полисахаридов и пневмококковых конъюгированных вакцин, указали на то, что реакции IgG на 6А индуцируют антигены 6В, но эти ответы обычно ниже, а активность ОРА по отношению к организмам 6А отличается от активности в отношении организмов 6В [22, 23, 24, 25]. Кроме того, испытуемые, вырабатывающие высокий уровень антител в ответ на 6В могут иметь низкую активность в отношении 6А или вообще не иметь такой активности.
В отличие химического состава капсульных полисахаридов 6А и 6В, в которых имеет место высокая степень сходства, капсулы 19А и 19F значительно различаются из-за присутствия двух добавочных боковых цепей в полисахариде 19А. Не удивительно, что иммунные ответы, измеренные у добровольцев, иммунизированных полисахаридной вакциной 19F, показали, что ответ на 19F развивается у 80% испытуемых, но только у 20% испытуемых развивается ответ на 19А [26]. Также в исследованиях с конъюгированными вакцинами был показан низкий уровень перекрестной реактивности IgG и реакций ОРА на серотип 19А после иммунизации полисахаридом 19F [24, 26].
Внутренние данные по перекрестной реактивности ОРА реакций на 6А и 19А были получены в перекрестном испытании вакцины 7vPnC (D118-P16), проведенном в США с участием младенцев (ФИГ.3). Данные этих исследований согласуются с результатами других исследований и демонстрируют индукцию перекрестно-реактивных функциональных антител к полисахаридам 6А после иммунизации полисахаридами 6В, хотя при меньшем уровне, и очень небольшое количество функциональных антител на 19А после иммунизации 19F.
Влияние иммунизации 6В и 19F на 6А и 19А в моделях с использованием животных
Для оценки возможности перекрестной реактивности при иммунизации полисахаридами применяли модели на животных. В модели среднего отита, разработанной Жиебинк и соавт. (Giebink et al.), шиншилл иммунизировали тетравалентной вакциной на основе конъюгата полисахарида и белка наружной мембраны (ОМР) (содержащей сахариды 6В, 14, 19F, 23F) или плацебо [27]. В этом исследовании была выявлена некоторая перекрестная реактивность по отношению к 6А; однако она не достигала статистической значимости, и уровень защиты от среднего отита был ниже, чем уровень защиты, полученный с использованием 6В. В такой же модели имела место 100% защита от среднего отита, вызываемого 19F, но защита только на 17% от среднего отита, вызываемого 19А.
Силенд с соавт. (Saeland et al.) использовали сыворотку крови младенцев, иммунизированных 8-валентной пневмококковой столбнячной конъюгированной вакциной (содержащей 6В и 19F), для введения пассивно иммунизированным мышам перед интраназальным инфицированием микроорганизмами 6А, в модели легочной инфекции [28]. Из 59 проб сыворотки 53% мышей проявили защиту от бактериемии, вызываемой 6В, и у 37% мышей была выявлена защита против 6А. В той же модели мышей, пассивно иммунизированных сывороткой, полученной от младенцев, иммунизированных четырьмя дозами 11-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (содержащей 19F, конъюгированного со столбнячным анатоксином), подвергали интраназальному инфицированию микроорганизмами 19А в той же модели [29]. Из 100 мышей, пассивно иммунизированных и затем подвергнутых инфицированию, у 60 мышей в ткани легких не идентифицировали микроорганизмов 19А, а у всех мышей, получавших плацебо (физиологический (солевой) раствор), были идентифицированы микроорганизмы. Однако пассивная иммунизация в этой модели не защищает от заражения организмами 19F; поэтому применимость данной модели для серогруппы 19 сомнительна. В целом, описанные модели обеспечивают подтверждение определенного биологического влияния иммунизации 6В на организмы 6А, хотя влияние на гетерологичный серотип не был столь сильным, как влияние, наблюдаемое для гомологичного серотипа. Эти модели не дают полного понимания влияния иммунизации 19F на организмы 19А.
Влияние иммунизации конъюгатами полисахаридов 6В и 19F на заболевания, вызываемые 6А и 19А, в исследованиях действенности/ эффективности
Число случаев заболеваний, вызванных серотипами 6В, 6А, 19F и 19А в исследованиях эффективности 7vPnC и 9vPnC (7vPnC плюс серотипы 1 и 5) указано в Таблице 1 [30, 10, 31]. Число случаев инфекционных заболеваний слишком мало и не позволяет сделать какие-либо выводы о серотипах 6А и 19А. Однако в проведенном в Финляндии исследовании среднего отита было получено большое количество изолятов пневмококков [32]. При проведении анализа по протоколу вакцина 7vPnC проявила эффективность, против среднего отита, вызываемого серотипом 6В, равную 84% (95% Cl 62%, 93%), и 57% против среднего отита, вызываемого серотипом 6А (Таблица 1). В отличие от этого, серотип-специфичную эффективность в отношении среднего отита, вызываемого либо 19F, либо 19А, продемонстрировать не удалось.
Таблица 1
Случаи пневмококковых заболеваний, вызываемых серотипами 6В, 6А, 19F и 19A, в исследованиях эффективности вакцин 7vPnC и 9vPnC
6В
6А
19F
19A
PnC
Контр.
PnC
Контр.
PnC
Контр.
PnC
Контр.
Исследование эффективности Kaiser - 7vPnC (1ТТ (по назначенному лечению))
1
7
0
1
2*
13
0
1
Исследование эффективности Navajo - 7vPnC (1ТТ)
0
5
1
0
1
1
1
0
Южно-африканское исследование эффективности - 9vPnC ВИЧ (-) (1ТТ)
1
2
1
0
0
1
3
1
Южно-африканское исследование эффективности - 9vPnC ВИЧ (+) (1ТТ)
1
7
3
10
2
3
2
3
Финское исследование с участием пациентов со средним отитом - 7vPnC (ПП)
9*
56
19*
45
43
58
17
26
*Продемонстрирована статистически значимая эффективность
Из литературных источников 30, 10 и 33 и из личной переписки
Контр. = контроль
ITT = анализ по назначенному лечению
ПП = анализ по протоколу
Также доступны данные послепродажного контроля по ИПЗ, полученные в исследовании, проводимом Центрами по контролю за заболеванями в целях оценки эффективности Превнара [33]. Случаи инфекционных пневмококковых заболеваний, возникающих у детей в возрасте от 3 до 23 месяцев, выявляли в контролирующих лабораториях и сопоставляли с тремя контрольными случаями, соответствующими по возрасту и почтовому индексу. После получения согласия, осуществляли сбор медицинского анамнеза и истории прививок (испытуемых считали привитыми, если они получали по меньшей мере одну дозу Превнара) у родителей и медицинских сотрудников, предоставивших информацию о случаях и контроле. Предварительные результаты были представлены на конференции 1СААС в 2003 году, а краткий обзор результатов для заболеваний 6В, 19F, 19А и 6А представлен в Таблице 2. Приведенные данные демонстрируют, что Превнар может предотвращать заболевания, вызываемые 6А, хотя степень этой профилактики возможно несколько ниже, чем для заболеваний, вызываемых серотипом 6В. Также эти данные показывают, что перекрестная реактивность в отношении инфекционных заболеваний, вызываемых серотипом 19А, ограничена.
Таблица 2
Предварительные результаты исследования методом случай-контроль, представленные Центром по контролю и профилактике заболеваний (представлены на 1СААС, 2003 г.)
Серотип
Информационные блоки, n
ЭВ* (95% ДИ)
Тип вакцины, все
115
94 (87,97)
Родственная вакцина, все
36
70 (38,86)
Тип невакцины, все
43
-4 (-106,48)
6В
27
94 (72,99)
19F
19
73 (16,92)
6А
15
87 (53,97)
19А
16
40 (-87,80)
*эффективность вакцины, сравнивающая вакцинированных (≥1 дозы) и невакцинированных испытуемых, и скорректированная в соответствии с причиной Источник 40 списка литературы и личная/конфиденциальная переписка
Опубликованный анализ [3] применения Превнара также показывает, что серотипы 6В и 19F давали умеренное сокращение ИПЗ, вызываемых серотипами 6А и 19А, среди детей младше 2 лет (Таблица 1 в [3]). Частота возникновения заболеваний, вызываемых серотипами 6А, 9А, 9L, 9N, 18A, 18В, 18F, 19А, 19В, 19С, 23А и 23В («все связанные с вакциной серотипы»), среди иммунизированных взрослых людей, в некоторой степени снижалась (Таблица 2 в [3]). Эти данные демонстрируют, что популяционный иммунитет, обусловленный использованием Превнара у детей в возрасте до двух лет, был ограниченным в отношении серотипов 6А и 19А, и это дает основание для включения серотипа 6А и 19А в вакцину 13vPnC согласно настоящему изобретению.
Вывод по добавлению 6А и 19А
Данные постпродажного контроля и результаты исследования методом случай-контроль для вакцины 7vPnC показаны на ФИГ.1 и в Таблице 2, и указывают на то, может иметь место некоторая перекрестная защита от заболеваний 6А, но в меньшей степени, чем от заболеваний 6В, что согласуется с другой информацией об иммунных реакциях и действенности в описанных выше моделях на животных. Кроме того, по-видимому, защита от 19А ограничена. Следовательно, вакцина 13vPnC, содержащая серотипы 6А и 19А, обеспечивает спектр действия, который не зависит от ограничений перекрестной защиты, обусловленной серотипами 6В и 19F серогруппы.
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена мультивалентная иммуногенная композиция, содержащая 13 различных конъюгатов полисахарид-белок, причем все конъюгаты содержат разные капсульные полисахариды, конъюгированные с белком-носителем, и капсульные полисахариды получены из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19А, 19F и 23F, в сочетании с физиологически приемлемой средой. Иммуногенная композиция также может содержать адъювант, такой как адъювант на основе алюминия, такой как фосфат алюминия, сульфат алюминия и гидрокосид алюминия. Согласно конкретному варианту реализации, адъювантом является фосфат алюминия.
Капсульные полисахариды получают по стандартным методикам, известным специалистам в данной области. Согласно настоящему изобретению капсульные полисахариды готовят из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19А, 19F и 23F. Указанные пневмококковые конъюгаты получают в отдельных процессах и объединяют в одну лекарственную форму. Например, согласно одному варианту реализации, пневмококки с полисахаридами каждого серотипа выращивают в среде на основе сои. Отдельные полисахариды затем очищают путем центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и колоночной хроматографии. Очищенные полисахариды активируют химически, чтобы придать сахаридам способность реагировать с белком-носителем. После активации полисахаридов, каждый полисахарид отдельно конъюгируют с белком-носителем с получением гликоконъюгата. Согласно одному варианту реализации все капсульные полисахариды конъюгируют с одним и тем же белком-носителем. Согласно данному варианту реализации конъюгацию проводят путем восстановительного аминирования.
Химическую активацию полисахаридов и последующую конъюгацию с белком-носителем осуществляют традиционными методами. Например, см. Патент США No 4673574 и 4902506 [34, 35].
197
Белками-носителями в предпочтительном случае являются белки, которые не токсичны и нереактогенны и которые можно получать в достаточном количестве и с достаточной степенью чистоты. Белки-носители должны позволять осуществлять стандартные процедуры конъюгации. В конкретном варианте настоящего изобретения в качестве белка-носителя используют CRM.
197
197
197
CRM (Wyeth, Sanford, NC) нетоксичный вариант (т.е. токсоид) дифтерийного токсина, выделяемый из культур штамма С7 (β197) Corynebacterium diphtheria, которые выращивают в среде с казаминовыми кислотами на основе экстракта дрожжей. CRM очищают путем ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. В другом случае CRM готовят согласно рекомбинантной технологии согласно патенту США No. 5614382, который включен в данную заявку посредством ссылки.
Другие пригодные белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин, холерный анатоксин (напр., как описано в заявке на международный патент WO 2004/083251 [38]), Е. coli LT, Е. coli ST и экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa. Также можно использовать белки наружной мембраны бактерий, такие как комплекс С наружной мембраны (ОМРС), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмолизин, поверхностный белок пневмококков A (PspA), белок адгезин пневмококков (PsaA), пептидаза С5а стрептококка группы А и группы В или белок D Haemophilus influenzae. В качестве белков-носителей также можно использовать другие белки, такие как яичный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (БСА) или очищенное белковой производное туберкулина (PPD).
После конъюгирования капсульных полисахаридов с белком-носителем конъюгаты полисахарид-белок очищают (обогащают по конъюгату полисахарид-белок) с использованием различных методов. К этим методам можно отнести операции концентрирования/диафильтрации, осаждение/элюцию, колоночную хроматографию и объемную фильтрацию. См. Приведенные ниже примеры.
После того как отдельные гликоконъюгаты прошли очистку, их смешивают для получения иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению, которую можно применять в качестве вакцины. Препарат иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению можно получить при помощи известных в соответствующей области методов. Например, 13 отдельных пневмококковых конъюгатов можно объединить с физиологически приемлемой средой с получением композиции. Примеры такой среды включают в себя воду, физиологический буферный раствор, многоатомные спирты (напр., глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы, но не ограничиваются этим перечнем.
Согласно определенным вариантам реализации иммуногенная композиция содержит один или несколько адъювантов. В настоящем изобретении, «адъювант» - это вещество, служащее для усиления иммуногенности иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению. Так, часто адъюванты вводят для усиления иммунного ответа, и они хорошо известны специалистам в данной области. Подходящие адъюванты, способные усилить эффективность композиции, включают, но не ограничиваются перечисленными:
(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и др.;
(2) смеси эмульсий типа масло в воде (с другими специфичными иммуностимулирующими агентами, такими как мурамил-пептиды (определении дано ниже) или компоненты клеточной стенки бактерий или без таких агентов), такие как, например, (a) MF59 (Публикация РСТ № WO 90/14837), содержащий 5% Сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (может содержать различные количества МТР-РЕ (см. ниже, но не обязательно)), изготовленный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, например микрофлюидизатора модели HOY (Microfluidics, Newton, MA), (б) SAF (фактор активации стволовой клетки), содержащий 10% Сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блоксополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена L121 и thr-MDP (см. ниже) либо микрофлюидизированный до субмикронной эмульсии, либо перемешанный с образованием эмульсии с более крупными частицами, и (в) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Corixa, Hamilton, MT), содержащая 2% Сквалена, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов клеточной стенки бактерий из группы, включающей 3-O-деаилированный монофосфоролипид A (MPL™), описанный в патенте США №4912 094 (Corixa), трегалозы димиколат (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS), желательно MPL+CWS (Detox™);
(3) можно использовать адъюванты на основе сапонина, такие как Quil А или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Патент США №5057540) или частицы, полученные из них, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы);
(4) липополисахариды бактерий, аналоги синтетического липида А, такие как соединения аминоалкилглюкозамина фосфата (AGP), или их производные или аналоги, которые можно приобрести в компании «Corixa» и которые описаны в Патенте США №6113918; один из которых, AGP, представляет собой 2-[(R)-3-тетраканолилокситетрадеканоиламино]этил-2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетраканолилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, который также называют 529 (ранее известный как RC529), который выпускают в водной форме или в форме стабильной эмульсии, синтетических полинуклеотидов, таких как олигонуклеотиды, содержащие мотив(ы) CpG (Патент США №6207646);
(5) цитокины, такие как интерлейкины (напр., ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и др.), интерфероны (напр., гамма-интерферон), гранулоцитарно-макрофаговый колониестимулирующий фактор (ГМКСФ), колонийстимулирующий фактор макрофагов (МКСФ), фактор некроза опухолей (ФНО), костимулирующие молекулы В7-1 и В7-2, и др.;
(6) детоксифицированные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такого как холерный токсин (XT) - в форме мутанта дикого типа, например, в котором глутаминовая кислота в положении 29 цепи аминокислот заменена на другую аминокислоту, предпочтительно - на гистидин, в соответствии с международной публикацией WO 00/18434 (см. также WO 02/098368 и WO 02/098369), коклюшный токсин (KT) или термолабильный токсин Е. coli (ТЛ), в частности LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (см. напр., WO 93/13302 и WO 92/19265); и
(7) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты и усиливают эффективность данной композиции.
Мурамил-пептиды включают N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил- sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и др., но не ограничиваются этим перечнем.
Лекарственные формы (препараты) вакцины согласно настоящему изобретению можно использовать для защиты или лечения людей, восприимчивых (подверженных) к пневмококковой инфекции, путем введения вакцины системным путем или через слизистые оболочки. Такие пути введения могут включать внутримышечные, внутрибрюшинные или подкожные инъекции; или введение через слизистые оболочки ротовой полости/желудочно-кишечного тракта, дыхательных или мочеполовых путей. Согласно одному варианту реализации интраназальное введение применяют для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку таким образом можно более эффективно предотвращать носоглоточное носительство пневмококков и соответственно ограничивать инфекцию на самой ранней стадии).
Количество конъюгата в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое вызывает (стимулирует) защитный иммунный ответ без значимых нежелательных эффектов. Такое количество может меняться в зависимости от серотипа пневмококков. Обычно каждая доза содержит 0,1-100 мкг полисахарида, в частности 0,1-10, а более конкретно 1-5 мкг.
Оптимальное количество компонентов для конкретной вакцины может быть установлено путем стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у испытуемых. После первичной вакцинации испытуемые могут получать одну или несколько поддерживающих иммунизаций, через разумные промежутки времени.
197
197
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вакцина 13vPnC представляет собой стерильную прозрачную смесь пневмококковых капсульных полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, по отдельности конъюгированных с CRM. Каждая доза объемом 0,5 мл составлена таким образом, что она содержит: 2 мкг сахарида, за исключением 6В (4 мкг сахарида); приблизительно 29 мкг белка-носителя CRM; 0,125 мг адъюванта на основе алюминия (0,5 мг фосфата алюминия) и буфера на основе хлорида натрия и сукцината натрия в качестве наполнителей. Данной жидкостью заполняют шприцы для введения одной дозы без консерванта. После встряхивания вакцина становится гомогенной, белой суспензией, готовой для внутримышечного введения.
Выбор уровня доз для вакцины 13vPnC аналогичен выбору дозы для имеющейся в продаже вакцины 7vPnC (Превнар). Для всех серотипов был выбран уровень доз 2 мкг, за исключением серотипа 6В, для которого доза составляет 4 мкг. Вакцина 7vPnC продемонстрировала желаемую безопасность, иммуногенность и эффективность в отношении ИПЗ при уровне дозы сахаридов 2 мкг для серотипов 4, 9V, 14, 18C, 19F и 23F и при уровне дозы 4 мкг для серотипа 6В.
Можно следовать графику иммунизации для вакцины 7vPnC, например, стандартный график для младенцев и детей, начинающих ходить, против инфекционных заболеваний, вызываемых серотипами S. pneumoniae, включенных в вакцину 13vPnC: 2, 4, 6 и 12-15 месяцев от рождения. Композиции согласно настоящему изобретению также подходят для применения у детей старшего возраста и взрослых.
В композиции согласно настоящему изобретению можно также включать один или несколько дополнительных антигенов для применения против среднего отита, вызываемого другими бактериями. Такие бактерии включают нетипируемые штаммы Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis (ранее известные как Branhamella catarrhalis) и Alloiococcus otitidis.
Примеры антигенов нетипируемых штаммов Haemophilus influenzae, пригодных для включения в вакцину, включают белок 34, также называемый белком «е» (Патент США №5601831; международная заявка на патент WO 03/078453), белок Р6, также называемый белок PAL или РВОМР-1 (Патент США №5110908; международная заявка на патент WO 0100790), белок Р5 (Переизданный патент США №37741), белок адгезии и проникновения Haemophilus (Патент США №6245337 и 6676948), белок адгезин LKP tip (Патент США №5643725) и белок NucA (Патент США №6221365).
Примеры антигенов Moraxella catarrhalis, пригодных для включения, включают белок UspA2 (Патент США №5552146, 6310190), белок CD (Патент США №5725862), белок Е (Патент США №5948412) и белок наружной мембраны 74 килодальтон (Патент США №9889885).
Примеры антигенов Alloiococcus otitidis, пригодных для включения, включают антигены, указанные в международной заявке на патент WO 03/048304.
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать один или более белков Streptococcus pneumoniae. Примеры белков Streptococcus pneumoniae, пригодных для включения, включают белки, которые указаны международной заявке на патент WO 02/083855, а также описаны в международной заявке на патент WO 02/053761.
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать один или более белков Neisseria meningitidis типа В pneumoniae. Примеры белков Neisseria meningitidis типа В, пригодных для включения, включают белки, которые указаны в международной заявке патент WO 03/063766, WO 2004/094596, WO 01/85772, WO 02/16612 и WO 01/87939.
Активация полисахарида серотипа 1 S. pneumoniae для конъюгации (получения конъюгата)
Частичное окисление углеводов в полисахаридах ранее эффективно применяли для образования альдегидных групп, которые затем образуют связи с остатками лизина белка-носителя с получением конъюгатов (т.е. композиций, таких как вакцины, подходящие для стимуляции или вызывания (идуцирования) специфичной иммунной реакции у позвоночных). Общим условием для образования альдегидных групп является наличие соседних (смежных) гидроксильных групп. В некоторых полисахаридах некоторые гидроксильные группы не доступны, поскольку их блокируют другие функциональные группы. В случае Pn1, O-ацетильные группы являются помехой для эффективного окисления, и селективное удаление некоторых из таких групп (т.е. введение этапа мягкого дез-O-ацетилирования полисахарида перед окислением) облегчает окисление и повышает эффективность конъюгации.
Чтобы сохранить желаемой степени реакции окисления, полисахарид Pn1 сначала частично дез-O-ацетилируют путем мягкого гидролиза в буфере со щелочным pH. К типичным буферам со щелочным pH следует отнести бикарбонатный/карбонатный буфер (такой как бикарбонат/карбонат натрия), глицин, имидазол и ТРИС-ЭДТА, но они не ограничены этим перечнем. После дез-O-ацетилирования следует этап нейтрализации с использованием слабой кислоты, такой как уксусная кислота, лимонная кислота или угольная кислота, или неорганическая кислота с низкой ионной силой (напр., соляная кислота). Частичное окисление для получения «активированного» полисахарида Pn1 проводят после нейтрализации с применением контролируемых количеств окисляющего агента. Можно использовать любые селективные окисляющие агентв, которые окисляют концевую гидроксильную группу до альдегида, включая специфические оксидазы сахаров (напр., периодат натрия или калия). Затем активированный полисахарид Pn1 возможно очищают (напр., путем диафильтрации против физиологического раствора).
Активированный полисахарид Pn1 можно смешивать с белком-носителем. Белки-носители выбирают таким образом, чтобы они повышали иммуногенность связанного полисахарида Pn1 и/или вызвали образование антител к белку-носителю, который полезен для диагностики, анализа и в целях терапии. Ковалентное связывание антигенной молекулы (напр., полисахарида) с белком-носителем вызывает повышение иммуногенности и образования Т-клеток (Pozsgay et al. (1999) PNAS, 96:5194-97; Lee et al. (1976) J. Immunol., 116:1711-18; Dintzis et al. (1976) PNAS, 73:3671-75). Как описано в настоящей заявке, пригодные для этого белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как столбнячный анатоксин, коклюшный анатоксин, холерный анатоксин (напр., описанные в Заявке на международный патент WO 2004/083251), Е. coli LT, Е. coli ST и экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa. Также можно использовать белки наружной мембраны бактерий, такие как наружный мембранный комплекс С, порины, трансферрин-связывающие белки, пневмолизин, поверхностный белок пневмококков А, пневмококковый белок адгезин, пептидазы С5а из стрепотококков группы А и группы В или белок D Haemophilus influenzae. Также можно использовать другие белки, такие как яичный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (БСА) или очищенное белковое производное туберкулина (PPD).
197
Предпочтительным белком-носителем является мутированный дифтерийный токсин CRM. После соединения с белком-носителем смесь активированный полисахарид Pn1 /белок-носитель возможно замораживают (напр., поверхностное замораживание) и совместно лиофилизируют.
Конъюгацию осуществляют путем проведения реакции смеси активированного полисахарида Pn 1/белка-носителя с восстанавливающим агентом, таким как цианоборогидрид натрия. Непрореагировавшие альдегиды затем кэппируют (болкируют) путем восстановления борогидридом натрия. Конъюгат очищают (напр., путем диафильтрации против фосфатного буфера и затем буферного физиологического раствора), и получают конечную партию концентрата гликоконъюгата в буферном физиологическом растворе.
В представленном выше раскрытии настоящее изобретение описано в общем. Более полное понимание можно получить при рассмотрении приведенных ниже конкретных примеров. Эти примеры приведены исключительно в целью иллюстрации настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения области изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Приготовление капсульного полисахарида S. Pneumoniae серотипа 1
Подготовка главного и рабочего банков клеток
Серотип 1 S. pneumoniae получали из Американской коллекции типовых культур АТСС, штамм 6301. Были созданы несколько поколений посевного материала, чтобы размножить штамм и удалить компоненты животного происхождения (поколения F1, F2 и F3). Были получены два дополнительные поколения из флакона F3, и из флакона первой дополнительной генерации получили следующее поколение. Флаконы для посева хранили замороженными (<-70°С) с синтетическим глицерином в качестве криоконсерванта. Помимо замороженных флаконов готовили лиофилизированные флаконы для поколения F4. Для подготовки банка клеток все культуры выращивали в питательных средах на основе сои. Перед замораживанием клетки концентрировали путем центрифугирования, истощенную среду удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в свежей среде, содержащей криоконсервант, такой как синтетический глицерин.
Ферментация и сбор материала
Культуры из рабочего банка клеток использовали для инокуляции посевных флаконов, содержащих среду на основе сои. Эти флаконы инкубировали при 36°С±2°С без встряхивания до достижения необходимого объема культуры. Посевной флакон использовали для инокуляции посевного ферментера, содержащего среду на основе сои. pH около 7,0 поддерживали при помощи стерильного раствора карбоната натрия. После достижения целевой оптической плотности посевной ферментер использовали для инокуляции производственного ферментера, содержащего среду на основе сои. pH поддерживали при помощи стерильного раствора карбоната натрия. Ферментацию останавливали после прекращения роста, или при достижении рабочего объема ферментера. К культуре добавляли соответствующее количество стерильного 12% дезоксихолата натрия, чтобы вызвать лизис клеток бактерий и выделить связанные с клетками полисахариды. После лизирования содержимое ферментера охлаждали. pH лизированной культуры доводили приблизительно до 6,6 уксусной кислотой. Лизат осветляли путем центрифугирования в непрерывном потоке и последующей объемной фильтрации и микрофильтрации через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
При альтернативном способе pH приблизительно 7,0 в ходе ферментации поддерживали при помощи 3N NaOH. После достижения целевой оптической плотности посевной ферментер использовали для прививки производственного ферментера, содержащего среду на основе сои. pH поддерживали при помощи 3N NaOH. Ферментацию останавливали после прекращения роста или при достижении рабочего объема ферментера. К культуре добавляли соответствующее количество стерильного 12% дезоксихолата натрия в результате чего получали концентрацию в бульоне, равную 0,12%, что обеспечивало лизис клеток бактерий и выделение связанных с клетками полисахаридов. После лизирования содержимое ферментера выдерживали при встряхивании в течение временных интервалов от 8 до 24 часов при температуре 7°С-13°С, что обеспечивало полный лизис клеток и полное выделение полисахаридов. Взбалтывание в течение указанного периода выдерживания не давало осадку лизата осесть на стенки ферментера и зонд pH, что позволяло избежать повреждения зонда pH. После этого pH бульона с лизированной культурой доводили приблизительно до 5,0 уксусной кислотой. После выдерживания без взбалтывания в течение временного интервала от 12 до 24 часов при температуре от 15°С до 25°С, значительная доля ранее растворенных белков выпадали из раствора в виде твердого осадка при небольшой потере или разрушении полисахарида, который оставался в растворе. Затем раствор с осадком осветляли путем проточного центрифугирования и последующей объемной фильтрации и микрофильтрации с диаметром пор 0,45 мкм.
Очистка
Очистка пневмококкового полисахарида состояла из нескольких этапов концентрирования/диафильтрации, этапов осаждения/элюции, колоночной хроматографии и объемной фильтрации. Если не указано другое, все процедуры проводили при комнатной температуре.
Осветленный бульон культур S. pneumoniae серотипа 1 из ферментера концентрировали и подвергали диафильтрации с использованием 100 кДа-MWCO-фильтра (отсекающего частицы с молекулярной массой 100 кДа). Диафильтрацию осуществляли с использованием натрий-фосфатного буфера при нейтральном pH. В результате диафильтрации низкомолекулярные компоненты питательной среды удаляли из смеси биополимеров с более высокой молекулярной массой, таких как нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды.
Полисахарид осаждали из концентрированного и подвергнутого диафильтрации раствора путем добавления гексадецилтриметиламмония бромида (ГБ) из маточного раствора, до получения конечной концентрации 1% ГБ (м/о). Осадок из полисахарида/ГБ задерживали на объемном фильтре, а фильтрат выливали. Осадок полисахарида повторно солюбилизировали и элюировали путем рециркуляции (многократного пропускания) раствора хлорида натрия через объемный фильтр, содержащий осадок. Затем фильтры промывали добавочным объемом раствора хлорида натрия. К раствору полисахарида добавляли иодид натрия (NaI) из маточчного раствора NaI, до конечной концентрации 0,5%, что обеспечивало осаждение ГБ. Осадок удаляли путем объемной фильтрации. Фильтрат содержал целевой полисахарид. Осадочный чан и фильтр промывали раствором NaCl/NaI и смыв объединяли с частично очищенным раствором полисахарида. Фильтр выбрасывали. Затем полисахарид фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и подвергали диафильтрации с использованием раствора хлорид натрия.
Частично очищенный раствор полисахарида подвергали дальнейшей очистке путем фильтрации через объемный фильтр, импрегнированный активированным углем. После фильтрации угольный фильтр промывали раствором хлорида натрия. Смыв объединяли с раствором полисахарида, который затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и доливали 1М натрий-фосфатным буфером до получения конечной концентрации фосфата натрия 0,025 М. pH определяли и доводили до 7.0±0.2.
Гидроксиапатиткерамическую колонку (ГА) уравновешивали натрий-фосфатным буфером, содержащим хлорид натрия с получением соответствующей проводимости (<15 мкСм). Раствор полисахарида затем загружали в колонку. В указанных условиях примеси связывались со смолой, а полисахарид выделяли из жидкости, протекающей через колонку. Раствор полисахарида фильтровали через поточные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, расположенные перед конкой и после колонки.
Раствор полисахаридов концентрировали с применением ультрафильтра с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Концентрат затем подвергали диафильтрации с водой для инъекций (ВДИ).
Подвергнутый диафильтрации раствор полисахарида фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм в полипропиленовые флаконы. Отбирали образцы для промышленных испытаний и очищенные полисахариды хранили замороженными при -25°±5°С.
Исследование
1
1
Данные H-ЯМР соответствовали химической структуре, определенной по распределению сигналов протонов, приписываемых молекуле полисахарида. Спектр H-ЯМР продемонстрировал серию хорошо различимых сигналов (протоны из метильной группы) для количественного определения O-ацетильной функциональной группы в полисахариде.
Структуру (идентичность) моновалентного полисахарида подтверждали встречным иммуноэлектрофорезом с применением специфических антисывороток.
Для вычисления молекулярной массы использовали результаты высокоэффективной гель-фильтрационной хроматографии с детекторами показателя преломления и многоугольного рассеяния лазерного излучения (MALLS) совместно с концентрацией пробы.
Для определения профиля распределения относительных размеров молекул полисахарида использовали среды для гель-хроматографии (CL-4B).
Пример 2
197
Приготовление конъюгата пневмококковый сахарид серотипа 1 - CRM
Активация и конъюгация
Контейнеры с очищенным полисахаридом размораживали и добавляли содержимое в реакционный сосуд. В сосуд (гидролиза) в течение 3 часов при 50°С добавляли 0,2 М карбонат натрия, pH 9,0, что обеспечивало частичное дезацетилирование. Реакционную смесь охлаждали до 20°С и осуществляли нейтрализацию путем добавления 0,2 М уксусной кислоты. Осуществляли окисление в присутствии периодата путем инкубирования при 2-8°С и смесь перемешивали в течение 15-21 часов.
Реакционную смесь для активации концентрировали и подвергали диафильтрации 10х с 0,9% NaCl с использованием мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 20 мкм. Активированный полисахарид разливали по стеклянным флаконам для лиофилизации объемом 100 мл, подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и лиофилизировали.
"Поверхностное замораживание" - это метод подготовки проб для лиофилизации (сушка путем вымораживания). Колбы автоматически вращаются валиками, управляемыми мотором, в охлаждаемой ванне, содержащей спирт или любую другую подходящую жидкость. В итоге вокруг внутренней «поверхности» колбы намерзает тонкий слой продукта, что обеспечивает безопасную обработку большего объема материала во время каждого цикла лиофилизации. Такие автоматические охлаждаемые элементы обеспечивают простое и эффективное средство для одновременного предварительного замораживания большого числа колб, и позволяют получать желаемые слои внутри, обеспечивая при этом достаточную площадь поверхности для эффективной лиофилизации.
197
Флаконы с лиофилизированным материалом доводили до комнатной температуры и ресуспендировали в растворе CRM при соотношении сахарид/белок 2:1. К смеси сахарид/белок добавляли 1М натрий-фосфатный буфер так, чтобы конечная ионная сила составляла 0,2М, а pH - 7,5, затем добавляли цианоборогидрид. Реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 18 часов, после чего следовала вторая инкубация при 37°С в течение 72 часов. После инкубаций с цианоборогидридом реакционную смесь разбавляли холодным физиологическим раствором, после чего добавляли 1М карбонат натрия до получения pH реакционной смеси 9,0. непрореагировавшие альдегиды блокировали путем добавления борогидрида натрия и инкубации при 23°С в течение 3-6 часов.
Реакционную смесь разбавляли в 2 раза физиологическим раствором и переносили в сосуд для диафильтрации через префильтр с диаметром пор 0,45-5 мкм. Реакционную смесь подвергали диафильтрации 30x с 0,15 М фосфатным буфером, pH 6, и 20х с физиологическим раствором. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор конъюгата разбавляли до целевой концентрации 0,5 мг/мл в 0,9% физиологическом растворе, и затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры для конечного коллективного концентрата (ККК) в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Исследование
Для определения профиля распределения относительных размеров молекул конъюгата использовали среды для гель-хроматография (CL-4B).
Структуру конъюгата подтверждали анализом методом слот-блоттинга с применением специфичных антисывороток.
Концентрации сахарида и белка определяли в тесте на уроновую кислоту и методом Лоури, соответственно. Отношение сахарида к белку в ковалентно связанном конъюгированном комплексе рассчитывали по формуле:
Содержание O-ацетила измеряли методом Хестрина (Hestrin et. al., J. Biol. Chem. 1949, 180, p.249). Отношение концентрации O-ацетила к общей концентрации сахарида выражали в микромолях O-ацетила на мг сахарида.
Пример 3
Приготовление капсульного полисахарида S. Pneumoniae серотипа 3
Подготовка главного и рабочего банка клеток
Серотип 3 S. pneumoniae получили от д-ра Роберта Австриана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания. Процедура подготовки системы банков клеток описана в Примере 1.
Ферментация и сбор материала
Культуры из рабочего банка клеток использовали для инокуляции посевных флаконов, содержащих среду на основе сои. Эти флаконы инкубировали при 36°С±2°С без встряхивания до достижения необходимого объема культуры. Посевной флакон использовали для инокуляции посевного ферментера, содержащего среду на основе сои. pH около 7,0 поддерживали при помощи стерильного раствора карбоната натрия. После достижения целевой оптической плотности посевной ферментер использовали для инокуляции промежуточного посевного ферментера. После достижения целевой оптической плотности промежуточный посевной ферментер использовали для инокуляции производственного ферментера. pH поддерживали при помощи стерильного раствора карбоната натрия. Ферментацию останавливали по достижении рабочего объема ферментера. К культуре добавляли соответствующее количество стерильного 12% дезоксихолата натрия, что обеспечивало лизис клеток бактерий и выделение связанных с клетками полисахаридов. После лизирования содержимое ферментера охлаждали. pH бульона с лизированной культурой доводили приблизительно до 6,6 уксусной кислотой. Лизат осветляли путем центрифугирования в непрерывном потоке и последующей объемной фильтрацией и микрофильтрацией при диаметре пор 0,45 мкм.
Очистка
Очистка пневмококкового полисахарида состояла из нескольких операций концентрирования/диафильтрации, этапов осаждения/элюции, колоночной хроматографии и объемной фильтрации. Если не указано другое, все процедуры проводили при комнатной температуре.
Осветленный бульон от культур S. pneumoniae серотипа 3 из ферментера концентрировали и подвергали диафильтрации с использованием фильтра с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Диафильтрацию проводили с применением натрий-фосфатного буфера при нейтральном pH. При диафильтрации низкомолекулярные компоненты питательной среды удаляли из смеси биополимеров с более высоким молекулярной массой, таких как нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды.
Перед добавлением гексадецилтриметиламмония бромида (ГБ) к концентрированному и подвергнутому диафильтрации раствору полисахарида добавляли рассчитанный объем маточного раствора NaCl так, чтобы конечная концентрация NaCl составила 0,25М. Затем полисахарид осаждали путем добавления гексадецилтриметиламмония бромида (ГБ) из маточного раствора до получения конечной концентрации 1% ГБ (м/о). Осадок из полисахарида/ГБ задерживали на объемном фильтре, а фильтрат выливали. Осадок полисахарида повторно солюбилизировали и элюировали путем рециркуляции раствора хлорида натрия через объемный фильтр, содержащий осадок. Затем фильтры промывали добавочным объемом раствора хлорида натрия.
К раствору полисахарида добавляли иодид натрия (NaI) из маточного раствора NaI до получения конечной концентрации 0,5%, которая обеспечивала осаждение ГБ. Осадок удаляли путем объемной фильтрации. Фильтрат содержал целевой полисахарид. Осадочный чан и фильтр промывали раствором NaCl/NaI и смыв объединяли с частично очищенным раствором полисахарида. Фильтр выбрасывали. Затем полисахарид фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и подвергали диафильтрации с использованием раствора хлорида натрия.
Частично очищенный раствор полисахарида подвергали дальнейшей очистке путем фильтрации через объемный фильтр, импрегнированный активированным углем. После фильтрации угольный фильтр промывали раствором хлорида натрия. Смыв объединяли с раствором полисахарида и затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и доливали 1М натрий-фосфатным буфером до получения конечной концентрации фосфата натрия 0,025 М. Определяли pH определяли и доводили его до 7.0±0.2.
Гидроксиапатит-керамическую колонку (ГА) уравновешивали натрий-фосфатным буфером, содержащим хлорид натрия, с получением соответствующей проводимости (<15 мкСм). Затем в колонку загружали раствор полисахарида. В этих условиях примеси связывались со смолой, а полисахарид выделяли из протекающей через колонку жидкости. Раствор полисахарида фильтровали через встроенные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, расположенные перед колонкой и после колонки.
Раствор полисахаридов концентрировали с применением фильтра с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Концентрат затем подвергали диафильтрации с применением ВДИ.
Подвергнутый диафильтрации раствор полисахарида фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм в контейнеры из нержавеющей стали. Отбирали образцы для промышленных испытаний и хранили очищенный полисахарид замороженным при -25°±5°С.
Исследование
1
Данные H-ЯМР соответствовали химической структуре, определенной по распределению сигналов протонов, приписываемых молекуле полисахарида.
Структуру моновалентного полисахарида подтверждали встречным иммуноэлектрофорезом с применением специфичных антисывороток.
Для вычисления молекулярной массы использовали результаты высокоэффективной гель-фильтрационной хроматографии с детекторами показателя преломления и многоугольного рассеяния лазерного излучения (MALLS) совместно с концентрацией пробы.
Для определения профиля распределения относительных размеров молекул полисахарида использовали среды для гель-хроматографии (CL-4B).
Пример 4
197
Приготовление конъюгата пневмококковый сахарид серотипа 3 - CRM
Активация и конъюгация
Контейнеры с очищенным сахаридом серотипа 3 размораживали и смешивали содержимое в реакционном сосуде. В сосуд добавляли ВДИ и 2М уксусную кислоту так, что конечная концентрация кислоты была 0,2М, а концентрация сахарида 2 мг/кг. Температуру раствора повышали до 85°С в течение одного часа, чтобы гидролизовать полисахарид. Реакционную смесь охлаждали до ≤25°С и добавляли 1М хлорид магния до получения конечной концентрации 0,1М. Осуществляли окисление в присутствии периодата натрия путем инкубации в течение 16-24 часов при 23°С.
Реакционную смесь для активации концентрировали и подвергали диафильтрации 10х с ВДИ через мембрану с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
197
197
Для составления смеси к активированному сахариду добавляли 0,2М фосфат натрия, pH 7,0, с получением конечной концентрации 10 мМ, а pH 6,0-6,5. Белок-носитель CRM смешивали раствором сахарида в соотношении 2 г сахарида на 1 г CRM. смешанный раствор сахарида/белка разливали в стеклянные флаконы для лиофилизации объемом 100 мл с целевым заполнением 20 мл, подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и лиофилизировали.
Флаконы с лиофилизированным материалом доводили до комнатной температуры и ресуспендировали содержимое в 0,1М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 так, что конечная концентрация сахарида составляла 20 мг/мл. pH доводили до 6,5, а затем добавляли 0,5-молярный эквивалент цианоборогидрида натрия. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 48 часов. После инкубаций с цианоборогидридом реакционную смесь разбавляли холодным 5 мМ сукцинатным буфером/0,9% физиологическим раствором. Непрореагировавшие альдегиды блокировали борогидридом натрия и инкубацией при 23°С в течение 3-6 часов. Реакционную смесь переносили через префильтр с диаметром пор 0,45-5 мкм в сосуд для диафильтрации. Реакционную смесь подвергали диафильтрации 30х с 0,1М фосфатным буфером, pH 9, и 20х с 0,15М фосфатным буфером (pH 6) и 20х с 5 мМ сукцинатом/0,9% физиологическим раствором. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор конъюгата разбавляли до целевой концентрации 0,5 мг/мл и затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры для ККК в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Исследование
Для определения профиля распределения относительных молекулярных размеров конъюгата использовали среды для гель-хроматографии (CL-4B).
Структуру конъюгата подтверждали путем анализа методом слот-блоттинга с применением специфичных антисывороток.
Концентрации сахарида и белка определяли в тесте на уроновую кислоту и методом Лоури соответственно. Отношение сахарида к белку в ковалентно связанном конъюгированном комплексе рассчитывали по формуле:
Пример 5
Приготовление капсульного полисахарида S. Pneumoniae серотипа 5
Подготовка главного и рабочего банка клеток
Серотип 5 S. pneumoniae получали от д-ра Джеральда Шиффмана, Университет Нью-Йорка, Бруклин, Нью-Йорк. Описание процедуры подготовки системы банков клеток можно найти в Примере 1. Описание процедур ферментации, сбора материала и очищения можно найти в Примере 1.
Альтернативный способ ферментации
3
3
3
Культуры из рабочего банка клеток использовали для инокуляции посевных флаконов, содержащих среду на основе сои и стерильный 10 мМ раствор NaHCO. Эти флаконы инкубировали при 36°С±2°С без встряхивания до достижения необходимого объема культуры. Посевной флакон использовали для инокуляции посевного ферментера, содержащего среду на основе сои и стерильный 10 мМ раствор NaHCO. pH около 7,0 поддерживали при помощи 3N NaOH. После достижения целевой оптической плотности посевной ферментер использовали для инокуляции производственного ферментера, содержащего среду на основе сои с NaHCO в концентрации 10 мМ. pH поддерживали при помощи 3N NaOH. Ферментацию останавливали после того, как прекращался рост или достигался рабочий объем ферментера. К культуре добавляли соответствующее количество стерильного 12% дезоксихолата натрия так, что его концентрация в бульоне составляла 0,12%, что обеспечивало лизис клеток бактерий и выделения связанных с клетками полисахаридов. После лизирования содержимое ферментера выдерживали при встряхивании в течение интервалов от 8 до 24 часов при температуре от 7°С до 13°С, что обеспечивало полный лизис клеток и выделение полисахарида. Встряхивание в течение указанного периода выдерживания не позволяло осадку лизата осесть на стенки ферментера и зонд pH, что обеспечивало сохранность зонда pH. После этого pH бульона с лизированной культурой корректировали приблизительно до 4,5 при помощи 50% уксусной кислоты. После окончании периода выдерживания без встряхивания в течение от 12 до 24 часов при температуре от 15°С до 25°С, значительная доля ранее растворенных белков выпадала из раствора в виде твердого осадка при небольшой потере или разрушении полисахарида, который оставался в растворе. Затем раствор с осадком осветляли путем проточного центрифугирования и последующей объемной фильтрации и микрофильтрации с диаметром пор 0,45 мкм.
Пример 6
197
Приготовление конъюгата пневмококкового сахарида серотипа 5 - CRM
Активация и конъюгация
Контейнеры с сахаридом серотипа 5 размораживали и смешивали содержимое в реакционном сосуде. В сосуд добавляли 0,1 М ацетат натрия, pH 4,7, после чего проводили окисление в присутствии периодата натрия путем инкубирования в течение 16-22 часов при 23°С.
Реакционную смесь для активации концентрировали и подвергали диафильтрации 10х с ВДИ при помощи мембраны с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
197
Активированный сахарид серотипа 5 объединяли с CRM в соотношении 0,8:1. Объединенный раствор сахарида/белка разливали в стеклянные флаконы для лиофилизации объемом 100 мл с целевым заполнением 20 мл, подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и лиофилизировали.
Флаконам с лиофилизированным материалом придавали комнатную температуру и ресуспендировали в 0,1М натрий-фосфатном буфере, pH 7,5, и добавляли цианоборогидрид. Реакционную смесь инкубировали при 30°С в течение 72 часов, после этого повторно добавляли цианоборогидрид и инкубировали при 30°С в течение 20-28 часов.
После инкубаций с цианоборогидридом реакционную смесь разбавляли в 2 раза физиологическим раствором и переносили через префильтр с диаметром пор 0,45-5 мкм в сосуд для диафильтрации. Реакционную смесь подвергали диафильтрации 30x с 0,1М фосфатным буфером, pH 8, и 20х с 0,15М фосфатным буфером, pH 6 и 20х с физиологическим раствором. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор разбавляли до целевой концентрации конъюгата 0,5 мг/мл и затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры для ККК в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Информация об исследовании конъюгата содержится в Примере 2.
Пример 7
Приготовление капсульного полисахарида S. Pneumoniae серотипа 6А
Серотип 6А S. pneumoniae получали от д-ра Джеральда Шиффмана из Государственного Университета Нью-Йорка, Бруклин, Нью-Йорк. Процедурой подготовки системы банков клеток описана в Примере 1. Процедуры ферментации, сбора материала и очистки проводили согласно Примеру 1, за исключением того, что пропускали этап концентрации на фильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа перед этапом хроматографии в ходе процесса очистки.
Пример 8
197
Приготовление конъюгата пневмококковый сахарид серотипа 6А - CRM
Активация и конъюгация
Полисахарид серотипа 6А представляет собой высокомолекулярный полимер, и перед окислением необходимо уменьшить его размер. Контейнеры с сахаридом серотипа 6А размораживали и добавляли содержимое в реакционный сосуд. В сосуд добавляли 2 М уксусную кислоту, так чтобы конечная ее концентрация составляла 0,1М, для осуществления гидролиза в течение 1,5 часов при 60°С. Реакционную смесь охлаждали до 23°С, и проводили нейтрализацию, доведя pH реакционной смеси до 6 при помощи 1 М NaOH. Окисление в присутствии периодата натрия осуществляли путем инкубирования при 23°С в течение14-22 часов.
Реакционную смесь для активации концентрировали и подвергали диафильтрации 10х с ВДИ при помощи мембраны с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Серотип 6А смешивали с сахарозой и разливали в стеклянные флаконы для лиофилизации объемом 100 мл (целевое заполнением 50 мл), подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и лиофилизировали.
Флаконы с лиофилизированным материалом доводили до комнатной температуры и ресуспендировали в диметилсульфоксиде (ДМСО) при соотношении сахарид/белок 1:1. После добавления цианоборогидрида натрия реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 18 часов. После инкубации с цианоборогидридом реакционную смесь разбавляли холодным физиологическим раствором. Непрореагировавшие альдегиды блокировали путем добавления борогидрида натрия и инкубации при 23°С в течение 3-20 часов.
Разведенную реакционную смесь переносили через префильтр с диаметром пор 5 мкм в сосуд для диафильтрации. Реакционную смесь подвергали диафильтрации 10х с 0,9% физиологическим раствором и 30х с NaCl, забуференным сукцинатным буфером. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор разбавляли до целевой концентрации конъюгата 0,5 мг/мл и затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры для ККК в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Исследование конъюгата описано в Примере 2.
Пример 9
Приготовление капсульного полисахарида S. Pneumoniae серотипа 7F
Серотип 7F S. pneumoniae получили от д-ра Джеральда Шиффмана, из Государственного Университета Нью-Йорка, Бруклин, Нью-Йорк. Процедура подготовки системы банков клеток, процедуры ферментации и сбора материала описаны в Примере 3. Альтернативные процедуры ферментации и сбора материала описаны в Примере 1.
Очистка
Очистка пневмококкового полисахарида состояло из нескольких операций концентрирования/диафильтрации, этапов осаждения/элюции, колоночной хроматографии и объемной фильтрации. Если не указано другое, все процедуры проводили при комнатной температуре.
Осветленный бульон из культур S. pneumoniae серотипа 7F концентрировали и подвергали диафильтрации с использованием фильтра с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Диафильтрацию проводили с применением натрий-фосфатного буфера при нейтральном pH. При диафильтрации из смеси биополимеров с более высокой молекулярной массой, таких как нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, удаляли низкомолекулярные компоненты питательной среды.
Серотип 7F не образует осадка при взаимодействии с ГБ. Вместо этого осаждение примесей из концентрированного и подвергнутого диафильтрации раствора осуществляли путем добавления ГБ из маточного раствора до конечной концентрации ГБ 1%. Осадок задерживали на объемном фильтре, а фильтрат выливали. Полисахарид содержался в фильтрате.
К раствору полисахарида добавляли иодид натрия (NaI) из маточного раствора NaI, до конечной концентраций 0,5%, что обеспечивало осаждение ГБ. Осадок удаляли путем объемной фильтрации. Фильтрат содержал целевой полисахарид. Осадочный чан и фильтр промывали раствором NaCl/NaI и смыв объединяли с частично очищенным раствором полисахарида. Фильтр выбрасывали. Затем полисахарид фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и подвергали диафильтрации с использованием раствора хлорид натрия.
Частично очищенный раствор полисахарида подвергали дальнейшей очистке путем фильтрации через объемный фильтр, импрегнированный активированным углем. После фильтрации угольный фильтр промывали раствором хлорида натрия. Смыв объединяли с раствором полисахарида, который затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и доливали 1М натрий-фосфатным буфером, до получения конечной концентрации фосфата натрия 0,025 М. Определяли pH определяли и доводили его до 7.0±0.2.
Гидроксиапатит-керамическую колонку (ГА) уравновешивали натрий-фосфатным буфером, содержащим хлорид натрия, с получением соответствующей проводимости (<15 мкСм). Затем в колонку загружали раствор полисахарида. В этих условиях примеси связывались со смолой, а полисахарид выделяли из жидкости, протекающей через колонку. Раствор полисахарида фильтровали через встроенные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали с применением фильтра с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Концентрат затем подвергали диафильтрации с ВДИ.
Подвергнутый диафильтрации раствор полисахарида фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм в контейнеры из нержавеющей стали. Отбирали образцы для промышленных испытаний и очищенный полисахарид хранили замороженными при -25°±5°С.
Исследование полисахарида описано в Примере 3.
Пример 10
197
Приготовление конъюгата пневмококковый сахарид серотипа 7F - CRM
Активация и конъюгация
Осуществляли окисление в присутствии периодата натрия путем инкубирования в течение 16-24 часов при 23°С.
Реакционную смесь для активации концентрировали и подвергали диафильтрации 10х с 10 мМ NaOAc, pH 4,5, с исползованием мембраны с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Серотип 7F разливали в стеклянные флаконы для лиофилизации объемом 100 мл (целевое заполнение 50 мл), подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и лиофилизировали.
Флаконы с лиофилизированным серотипом 7F доводили до комнатной температуры и ресуспендировали в ДМСО при соотношении сахарид/белок 1,5:1. После добавления цианоборогидрида натрия реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 8-10 часов. Непрореагировавшие альдегиды блокировали путем добавления борогидрида натрия и инкубации при 23°С в течение 16 часов.
Реакционную смесь разбавляли в 10 раз холодным физиологическим раствором и переносили через префильтр с диаметром пор 5 мкм в сосуд для диафильтрации. Реакционную смесь подвергали диафильтрации 10х с 0,9% физиологическим раствором и 30х с сукцинатным буферным раствором. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор конъюгата разбавляли до целевой концентрации 0,5 мг/мл 0,9% физиологическим раствором и затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры для ККК в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Исследование конъюгата описано в Примере 4.
Пример 11
Приготовление капсульного полисахарида S. Pneumoniae серотипа 19А
Серотип 19А pneumoniae получали от д-ра Джеральда Шиффмана, из Государственного Университета Нью-Йорка, Бруклин, Нью-Йорк. Процедура подготовки системы банков клеток описана в Примере 1. Процедуры ферментации, сбора материала и очистки полисахарида описаны в Примере 7. Исследование конъюгата описано в Примере 3.
Пример 12
197
Приготовление конъюгата пневмококковый сахарида серотипа 19 - CRM
Активация и конъюгация
Контейнеры с сахаридом серотипа 19А размораживали и смешивали содержимое в реакционном сосуде. В сосуд добавляли ацетат натрия до получения его концентрации 10 мМ (pH 5,0) и осуществляли окисление в присутствии периодата натрия путем инкубирования в течение 16-24 ч при 23°С.
Реакционную смесь для активации концентрировали и подвергали диафильтрации 10х с 10 мМ ацетатом, pH 5,0, при помощи мембраны с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
197
197
Активированный сахарид смешивали с сахарозой с последующим добавлением CRM. Смесь активированного сахарида серотипа 19А и CRM(соотношение 0:8:1) разливали в стеклянные флаконы для лиофилизации объемом 100 мл (целевое заполнением 50 мл), подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и лиофилизировали.
Флаконы с лиофилизированным материалом доводили до комнатной температуру и ресуспендировали в ДМСО. К смеси сахарид/белок добавляли цианоборогидрид натрия (100 мг/мл). Реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 15 часов. После инкубации с цианоборогидридом непрореагировавшие альдегиды блокировали путем добавления борогидрида натрия и инкубациипри 23°С в течение 3-20 часов.
Реакционную смесь разбавляли в 10 раз холодным физиологическим раствором и переносили через префильтр с диаметром пор 5 мкм в сосуд для диафильтрации. Реакционную смесь подвергали диафильтрации 10х с 0,9% физиологическим раствором, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и снова подвергали диафильтрации 30х с 5 мМ сукцинатом/0,9% физиологическим раствором, pH 6. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор конъюгата разбавляли до целевой концентрации 0,5 мг/мл 5 мМ сукцин атом/0,9% физиологическим раствором и затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры для ККК в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Исследование конъюгата описано в Примере 4.
Пример 13
Приготовление капсульных полисахаридов S. Pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F
Серотипы 4, 6В, 9V, 18С, 19F и 23F S. pneumoniae получали от д-ра Джеральда Шиффмана, Государственный Университет Нью-Йорка, Бруклин, Нью-Йорк. Серотип 14 S. pneumoniae получали из АТСС, штамм 6314.
По одному флакону желаемого штамма Streptococcus pneumoniae отдельно использовали для запуска партии ферментации. В двух флаконах, содержащих среду на основе сои и фенол красный, pH доводили до значений в диапазоне 7,4±0.2 при помощи карбоната натрия, и затем во флаконы добавляли необходимые объемы растворов 50% декстрозы/1% сульфата магния. Два флакона инокулировали различными количествами посевного материала.
Указанные флаконы инкубировали при 36°С±2°С до тех пор, пока среда не становилась желтой. После инкубации из каждого флакона отбирали пробы и определяли оптическую плотность (ОП) в этих пробах (0,3-0,9) и pH (4,6-5,5). Для инокуляции посевного ферментера выбирали один из двух флаконов.
Питательную среду на основе сои переносили в посевной ферментер и стерилизовали. Затем в ферментер добавляли определенный объем растворов 50% декстрозы/1% сульфата магния. Отслеживали и контролировали pH и степень встряхивания в посевном ферментере (pH 6,7-7,4). Температуру поддерживали на уровне 36°±2°С. Посевной материал для инокуляции (флакон) в асептических условиях соединяли с посевным ферментером и переносили инокулят. pH в ферментере контролировали, и периодически отбирали пробы для определения ОП и pH. Когда ОП на 460 нм достигала желаемого значения 0,5, бульоном из посевного ферментера прививали промежуточный ферментер.
Питательную среду на основе сои переносили в промежуточный ферментер и стерилизовали. Затем в ферментер добавляли определенный объем растворов 50% декстрозы/1% сульфата магния. pH и степень взбалтывания в посевном ферментере отслеживали и контролировали (pH 6,7-7,4). Температуру поддерживали на уровне 36°±2°С. Содержимое посевного ферментера переносили в промежуточный ферментер. pH в этом ферментере контролировали и периодически отбирали пробы для определения ОП и pH. Когда ОП на 600 нм достигала желаемого значения 0,5, бульоном из промежуточного ферментера инокулировали производственный ферментер.
Питательную среду на основе сои переносили в производственный ферментер и стерилизовали. Затем в ферментер добавляли определенный объем растворов 50% декстрозы/1% сульфата магния. pH и степень взбалтывания в посевном ферментере отслеживали и контролировали (pH 6,7-7,4). Температуру поддерживали на уровне 36°±2°С. Содержимое посевного ферментера переносили в промежуточный ферментер. pH в этом ферментере контролировали и периодически отбирали пробы для определения ОП и pH. Когда ОП на 600 нм достигала желаемого значения 0,5, бульоном из промежуточного ферментера инокулировали производственный ферментер.
В ферментер добавляли дезоксихолат натрия так, чтобы конечная концентрация составляла приблизительно 0,12% (масс./об.). Культуру клеток перемешивали по меньшей мере в течение тридцати минут и устанавливаемое значение температуру снижали до 10°С. Культуру инкубировали в течение ночи и после подтверждения инактивации pH культуры при необходимости доводили до значения в диапазоне 6,4-6,8 путем добавления 50% уксусной кислоты. Температуру ферментера повышали до 20°±5°С и его содержимое переносили в бак выдержки для осветления.
Содержимое бака выдержки для осветления (включая осадок клеток) обрабатывали путем центрифугирования при скорости потока от 25 до 600 литров в час (за исключением серотипа 4, для которого осадки клеток, а скорость потока поддерживали в более строгих рамках от 25 до 250 литров в час). Отбирали пробы надосадочной жидкости и определяли в них ОП. Желаемое значение ОП во время центрифугирования составляло ≤0.15.
Сначала надосадочную жидкость повторно пропускали через комплект объемных фильтров до тех пор, пока ОП не достигала значения 0.05±0.03. Затем надосадочную жидкость пропускали через комплект объемных фильтров и через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и фильтрат в бак выдержки.
Далее продукт переносили через замкнутые трубки в область очистки для дальнейшей обработки.
Все описанные выше операции (центрифугирование, фильтрация и перенос) проводили при температуре от 10°С до 30°С.
Альтернативные способы ферментации и сбора материала для серотипа 4 и 6В, описаны в Примере 1 (альтернативный способ).
Очистка
Очистка каждого пневмококкового полисахарида состояла из нескольких операций концентрирования/диафильтрации, этапов осаждения/элюции, колоночной хроматографии и объемной фильтрации. Если не указано другое, все процедуры проводили при комнатной температуре
Осветленный бульон из культур желаемого серотипа S. pneumoniae концентрировали и подвергали диафильтрации с использованием фильтра с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Диафильтрацию проводили с применением натрий-фосфатного буфера при pH<9,0. При диафильтрации из смеси биополимеров с более высокой молекулярной массой, таких как нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, удаляли низкомолекулярные компоненты питательной среды.
Полисахарид осаждали из концентрированного и подвергнутого диафильтрации раствора путем добавления ГБ из маточного раствора до конечной концентрации 1% ГБ (масс./об.) (за исключением серотипа 23F, который имел конечную концентрацию 2,5%). Осадок из полисахарида/ГБ задерживали на объемном фильтре, а фильтрат выливали. (Примечание: серотип 14 не оседает;
поэтому сохраняли фильтрат.) Осадок полисахарида повторно солюбилизировали и элюировали путем рециркуляции раствора хлорида натрия через объемный фильтр, содержащий осадок. Затем фильтры промывали добавочным объемом раствора хлорида натрия.
К раствору полисахарида добавляли иодид натрия (NaI) из матричного растора NaI до получения конечной концентрации 0,5%, что обеспечивало осаждение ГБ (за исключением серотипа 6В, который имел конечную концентрацию 0,25%). Осадок удаляли при помощи объемной фильтрации. Фильтрат содержал целевой полисахарид. Осадочный чан и фильтр промывали раствором NaCl/NaI и смыв объединяли с частично очищенным раствором полисахарида. Фильтр выбрасывали. Затем полисахарид фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа и подвергали диафильтрации с использованием раствора хлорид натрия.
Частично очищенный раствор полисахарида подвергали дальнейшей очистке путем фильтрации через объемный фильтр, импрегнированный активированным углем. После фильтрации угольный фильтр промывали раствором хлорида натрия. Смыв объединяли с раствором полисахарида, который затем фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахарида концентрировали на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 30 кДа, а фильтр промывали раствором хлорида натрия. pH определяли и корректировали до 7.0±0.3.
Гидроксиапатит-керамическую колонку (ГА) уравновешивали натрий-фосфатным буфером, содержащим хлорид натрия до достижения pH 7.0±0.3 и проводимости 26±4 мкСм). Затем в колонку загружали раствор полисахарида. В указанных условиях примеси связывались со смолой, а полисахарид выделяли из жидкости, протекающей через колонку. Раствор полисахарида фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Раствор полисахаридов концентрировали с использованием фильтра с отсечением по молекулярной массе 30 кДа. Концентрат затем подвергали диафильтрации с ВДИ до тех пор, пока проводимость не становилась <15 мкС.
Подвергнутый диафильтрации раствор полисахарида фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм в чан и хранили при 2°-8°С.
Пример 14
197
Приготовление конъюгатов пневмококковый сахарид - CRM для серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F
Процесс активации
Для сахаридов разных серотипов используют различные схемы активации (гидролиз или отсутствие гидролиза перед активацией) и конъюгации (реакции в водной фазе или в ДМСО), как описано в данном примере.
Полисахарид переносили из чана в реактор. Затем полисахарид разбавляли в ВДИ и фосфате натрия до конечной концентрации 1,6 - 2,4 мг/мл.
Этап 1.
Для серотипов 6В, 9V, 14, 19F и 23F pH доводили до pH 6,0±0,3.
Для серотипа 4 добавляли соляную кислоту (конечная концентрация кислоты 0,01М) и раствор инкубировали в течение 25-35 минут при 45°±2°С. Гидролиз прекращали путем охлаждения до 21-25°С и добавления 1М фосфата натрия для установления целевого pH 6.7±0.2. В ходе процесса осужествляли анализ для подтверждения соответствующего уровня депирувилирования.
Для серотипа 18С добавляли ледяную уксусную кислоту (конечная концентрация кислоты 0,2М) и раствор инкубировали в течение 205-215 минут при 94°±2°С.Затем температуру понижали до 21-25°С и добавляли 1-2 М фосфата натрия до целевого pH 6.8±0.2.
Этап 2: Реакция с периодатом
Мольные эквиваленты периодата натрия, необходимые для активации пневмококкового полисахарида, определяли на основании общего содержания сахарида (за исключением серотипа 4). Для серотипа 4 использовали соотношение 0,8-1,2 моля периодата натрия на один моль сахарида. При тщательном перемешивании позволяли протекать реакции окисления в течение 16-20 часов при 21-25°С для всех серотипов, кроме 19F, для которого температура составляла ≤15°С.
Этап 3: Ультрафильтрация
Окисленный сахарид концентрировали и подвергали диафильтрации с ВДИ (0,01 М натрий-фосфатный буфер pH 6,0 для серотипа 19F) на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 100 кДа (ультрафильтр с отсечением по молекулярной массе 5 кДа для 18С). Растворенное вещество, прошедшее через фильтр, выбрасывали, а концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
Этап 4: Лиофилизация
197
197
Для серотипов 4, 9V и 14 концентрированный сахарид смешивали с белком-носителем CRM, разливали в стеклянные флаконы, подвергали поверхностному замораживанию и хранили при ≤-65°С. Замороженный концентрированный сахарид - CRM лиофилизировали и затем хранили при -25°±5°С.
197
Для серотипов 6В, 19F и 23F добавляли определенное количество сахарозы, которое рассчитывали так, чтобы концентрация сахарозы в реакционной смеси при образовании конъюгата составляла 5%±3%. Серотип 18С не требовал добавления сахарозы. Концентрированный сахарид затем разливали в стеклянные флаконы, подвергали поверхностному замораживанию и хранили при ≤-65°С. Замороженный концентрированный сахарид - CRM лиофилизировали и затем хранили при -25°±5°С.
Процесс конъюгации
Применяли два способа конъюгации: конъюгацию в водной среде для серотипов 4, 9V, 14 и 18С, и конъюгацию в ДМСО для серотипов 6В, 19F и 23F.
Конъюгация в водной среде
Этап 1: Растворение
197
197
Для серотипов 4, 9V и 14 лиофилизированную смесь активированный сахарид-СКМ размораживали и давали прийти к равновесию при комнатной температуре. Затем лиофилизированную смесь активированный сахарид-СКМвосстанавливали в 0,1М натрий-фосфатном буфере в типичном соотношении:
- 1 л буфера на 16-24 г сахарида для серотипа 4 и 9V;
- 1 л буфера на 6-10 г сахарида для серотипа 14.
Реакционную смесь инкубировали при 37°±2°С до полного растворения для серотипа 9V и при 23°±2°С для серотипов 4 и 14.
197
197
Для серотипа 18С лиофилизированный сахарид восстанавливали в растворе CRM в 4М двухосновном фосфате натрия в типичном соотношении 0,11 л фосфата натрия на 1 л раствора CRM. Реакционную смесь (концентрация сахарида 8-12 г/л) инкубировали при 23°±2°С до полного растворения.
На этой стадии в качестве технологического контроля определяли pH.
Этап 2: реакция конъюгации
Для серотипов 4 и 9V реакцию конъюгации инициировали путем добавления цианоборогидрида натрия (100 мг/мл) так, чтобы получить 1,0-1,4 моля цианоборогидрида натрия на один моль сахарида. Реакционную смесь инкубировали в течение 44-52 часов при 37°±2°С. затем температуру понижали до 23°±2°С и в ферментер добавляли 0,9% хлорид натрия. Раствор борогидрида натрия (100 мг/мл) добавляли так, чтобы получить 1,8-2,2 мольных эквивалента борогидрида натрия на один моль сахарида. Смесь инкубировали в течение 3-6 часов при 23°±2°С. Эту смесь разбавляли 0,9% хлоридом натрия и промывали ферментер. Разведенную смесь для конъюгации фильтровали через префильтр с диаметром пор 1,2 мкм в резервуар для выдерживания.
Для серотипов 14 и 18 реакцию конъюгации инициировали путем добавления цианоборогидрида натрия (100 мг/мл) до получения 1,0-1,4 моля цианоборогидрида натрия на один моль сахарида. Реакционную смесь инкубировали в течение 12-24 часов при 23°±2°С.Температуру повышали до 37°±2°С и инкубировали реакционную смесь в течение 72-96 часов. Затем температуру понижали до 23°±2°С и в ферментер добавляли 0,9% хлорид натрия. Раствор борогидрида натрия (100 мг/мл) добавляли так, чтобы получить 1,8-2,2 мольных эквивалента борогидрида натрия на один моль сахарида. Смесь инкубировали в течение 3-6 часов при 23°±2°С.Эту смесь разбавляли 0,9% хлоридом натрия и промывали ферментер. Разведенную смесь для конъюгации фильтровали через префильтр с диаметром пор 1,2 мкм в резервуар для выдерживания.
Этап 3: 100 кДа ультрафильтрация
Разбавленную смесь для конъюгации концентрировали и подвергали диафильтрации на ультрафильтре с отсечением по молекулярной массе 100 кДа либо с как минимум 15 объемами (серотип 4), либо с 40 объемами (серотипы 9V, 14 и 18С) 0,9% хлорида натрия.
Прошедшие через фильтр растворенные вещества выбрасывали.
Для серотипа 4 концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
На этом этапе осуществляли технологический контроль (содержание сахарида).
Этап 4: Очистка на ГА колонке
Этот этап проводили только для серотипа 4.
ГА колонку сначала нейтрализовали с использованием 0,5М натрий-фосфатного буфера (pH 7.0±0.3) и затем уравновешивали 0,9% хлоридом натрия. Подвергнутый фильтрации концентрат (серотип 4) загружали в колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Колонку промывали 0,9% хлоридом натрия при скорости потока ≤2,0 л/мин. Затем продукт элюировали 0,5М натрий-фосфатным буфером при скорости потока ≤2,0 л/мин.
Фракцию ГА затем концентрировали и подвергали диафильтрации на мембране с отсечением по молекулярной массе 100 кДа по меньшей мере 20 объемами 0,9% хлорида натрия. Прошедшие через фильтр растворенные вещества выбрасывали.
Этап 5: Стерильная фильтрация
После диафильтрации с отсечением по молекулярной массе 100 кДа концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Профильтрованный продукт подвергали технологическому контролю (содержание сахарида, свободный белок, свободный сахарид и цианид). Технологический контроль для фильтрованного продукта проводили для того, чтобы определить, нужны ли дополнительные концентрирование, диафильтрация и/или разведение, чтобы удовлетворить требованиям к целевым значениям ККК. Эти и другие тесты повторяли для проб ККК.
При необходимости фильтрованный конъюгат разбавляли 0,9% хлоридом натрия до получения конечной концентрации менее 0,55 г/л. На этой стадии проводили технологические испытания на содержание сахарида, содержание белка и соотношение сахарид: белок.
197
В завершении конъюгат фильтровали (диаметр пор 0,22 мкм) и разливали в канистры из нержавеющей стали объемом 10 л в обычном количестве 2,64 г/канистру. На этой стадии в качестве технологического контроля определяли выход, содержание сахарида, содержание белка, pH, соотношение сахарид: белок и содержание лизина. На этой стадии проводили технологические испытания (внешний вид, свободный белок, свободный сахарид, эндотоксин, определение размера молекул, остаточный цианид, структуру сахарида, структуру CRM).
Конъюгация в ДМСО
Этап I: Растворение
197
Лиофилизированной смеси активированного сахарида серотипов 6В, 19F, 23F и лиофилизированному белку-носителю CRM давали прийти к равновесию при комнатной температуре и восстанавливали в ДМСО. Концентрация разбавленного раствора обычно была в диапазоне 2-3 грамма сахарида (2-2,5 г белка) на литр ДМСО.
Этап II: Растворение
197
197
197
Активированный сахарид и белок-носитель CRM смешивали в течение 60-75 минут при 23°±2°С при соотношении в диапазоне 0,6-10 г сахарида/г CRM для серотипов 6В и 19F или 1,2-1,8 г сахарида/г CRM для серотипа 23F.
Реакцию конъюгации инициировали путем добавления раствора цианоборогидрида натрия (100 мг/мл) при соотношении 0,8-1,2 мольных эквивалентов цианоборогидрида натрия на один моль активированного сахарида. К реакционной смеси добавляли ВДИ до целевой концентрации 1% (о/о), и смесь инкубировали более 40 часов при 23°±2°С.
К реакционной смеси добавляли раствор борогидрида натрия, 100 мг/мл (обычно 1,8-2,2 мольных эквивалента борогидрида натрия на один моль активированного сахарида) и ВДИ (целевая концентрация 5% об./об.), и полученную смесь инкубировали в течение 3-6 часов при 23°±2°С. Эта процедура обеспечивала восстановление всех непрореагировавших альдегидов, присутствующих в сахаридах. Затем реакционную смесь переносили в резервуар для разбавления, содержащий 0,9% хлорида натрия при <15°С.
Этап III: 100 кДа ультрафильтрация
Разбавленную смесь конъюгата фильтровали через фильтр с диаметром пор 1,2 мкм, концентрировали и подвергали диафильтрации на мембране с отсечением по молекулярной массе 100 кДа по меньшей мере 15 объемами 0,9% хлоридом натрия (для серотипа 23F использовали 0,01 фосфата натрия/0,05М NaCl буфер). Прошедшие через фильтр растворенные вещества выбрасывали. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. На этой стадии отбирали пробы для контроля в ходе процесса содержания сахарида.
Этап IV: очистка на ДЭАЭ-колонке
Данный этап проводили только для серотипа 23F.
ДЭАЭ-колонку уравновешивали 0,01М натрий-фосфатным/0,5М натрий-хлоридным буфером. Профильтрованный концентрат (серотип 23F) загружали в колонку и промывали 0,01М натрий-фосфатным/0,5М натрий-хлоридным буфером. Затем колонку промывали 0,01М натрий-фосфатным/0,9% NaCl буфером. Далее продукт элюировали 0,01М натрий-фосфатным/0,5М натрий-хлоридным буфером.
Этап V: 100 кДа ультрафильтрация
Концентрат серотипов 6В и 19F концентрировали и подвергали диафильтрации по меньшей мере 30 объемами 0,9% хлорида натрия. Прошедшие через фильтр растворенные вещества выбрасывали.
Элюат серотипа 23F концентрировали и подвергали диафильтрации по меньшей мере 20 объемами 0,9% хлорида натрия. Прошедшие через фильтр растворенные вещества выбрасывали.
Этап VI: Стерильная фильтрация
После диафильтрации с отсечением по молекулярной массе 100 кДа концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Профильтрованный продукт подвергали технологическому контролю (содержание сахарида, свободный белок, свободный сахарид, остаточный ДМСО и остаточный цианид). Технологически контроль для фильтрованного продукта проводили для того, чтобы определить, нужны ли дополнительные концентрирование, диафильтрация и/или разбавление для того, чтобы удовлетворить требованиям к целевым значениям ККК. Эти и дополнительные другие тесты повторяли для проб ККК.
При необходимости фильтрованный конъюгат разбавляли 0,9% хлоридом натрия с получением конечной концентрации менее 0,55 г/л. На этой стадии проводили технологические испытания на содержание сахарида, содержание белка и соотношение сахарид: белок.
197
В завершение конъюгат фильтровали (диаметр пор 0,22 мкм) и разливали в канистры из нержавеющей стали объемом 10 л в типичном количестве 2,64 г/канистру. На этой стадии в качестве технологического контроля выход, содержание сахарида, содержание белка, pH, соотношение сахарид: белок и содержание лизина. На этой стадии осуществляли технологические испытания (внешний вид, свободный белок, свободный сахарид, эндотоксин, определение размера молекул, остаточный цианид, структура (идентичность) сахарида, идентичность (структура) CRM).
Пример 15
Составление мультивалентной пневмококковой конъюгированной вакцины
Партии конечных концентратов 13 конъюгатов содержали 0,85% хлорида натрия. Концентраты материала типов 3, 6А, 7F и 19А также содержали 5 мМ натрий-сукцинатный буфер при pH 5,8. Необходимые объемы концентратов материала рассчитывали на основании объема партии и общей концентрации сахаридов. После добавления 80% 0,85% хлорида натрия (физиологический раствор) и необходимого количества сукцинатного буфера в предварительно промаркированные резервуары добавляли концентраты материала. Затем препарат подвергали стерильной фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм во второй контейнер с применением блока мембранных фильтров Millipore Durapore. Первый контейнер промывали оставшимися 20% 0,85% хлорида натрия, и этот раствор пропускали через тот же фильтр, а фильтрат собирали во второй контейнер. Объединенный материал аккуратно перемешивали в ходе добавления фосфата алюминия и после добавления. Определяли и при необходимости корректировали pH. Объединенный препарат хранили при 2-8°С.
Объединенным продуктом заполняли шприцы из боросиликатного стекла 1 типа, полученные от Becton Dickinson. Вакцину проверяли через регулярные интервалы времени на мутность и однородность заполнения. Вакцину, заполняющую шприцы, (конечный продукт) хранили при 2-8°С.
Пример 16
Иммуногенность 13-валентной конъюгированной вакцины
197
К настоящему времени доклинические исследования вакцины 13vPnC проводили на кроликах. Задача исследований #НТ01-0021 и #НТ01-0036 состояла в независимой проверке эффекта химической конъюгации капсульных полисахаридов (ПС) из S. pneumoniae с CRM и влияния адъюванта на основе фосфата алюминия (А1Р04) на иммунный ответ на вакцину 13vPnC у кроликов. Влияние исследовали методом антиген-специфичного ИФА для концентрации IgG в сыворотке, а для активности антител - путем анализа опсонофагоцитирующей активности (ОРА).
Исследование #НТ01-0021
4
4
В исследовании #НТ01-0021 определяли способность вакцины 13vPnC с адъювантом AIPO вызывать серотип-специфичные иммунные реакции на вакцину. Пневмококковые серотипы, представленные в вакцине 13vPnC, включают 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F. Вторичные задачи исследования включали оценку кинетики и длительности ответа антител. Новозеландским белым кроликам путем внутримышечной инъекции иммунизировали на неделе 0 и неделе 2 планируемой для человека клинической дозой каждого полисахарида (2 мкг каждого полисахарида за исключением 6В - 4 мкг), соединенных с AIPO (100 мкг/дозу). Сыворотку крови отбирали в разные моменты времени. Уровень серотип-специфичных IgG измеряли методом ИФА, а функциональную активность оценивали методом ОРА.
4
4
В таблице 3 представлены средние геометрические значения титра (СГТ), полученные для объединенных проб сыворотки после введения двух доз вакцины 13vPnC. Для сравнения ответов на неделе 4 и на неделе 0 применяли отношение СГТ IgG. Эти данные демонстрируют, что включение AIPO в состав 13vPnC обеспечивало более высокий уровень антител IgG по сравнению с той же вакциной без адъюванта. Хотя ответы антител были больше в случаях, когда в состав вакцины был включен AIPO, их снижение не было статистически значимым.
4
Также оценивали ответы функциональных антител у кроликов после иммунизации двумя препаратами 13vPnC (Таблица 4). При сравнении препаратов вакцины с адъювантом и без адъюванта более высокие СГТ в тесте ОРА отмечали в лечебной группе, получавшей вакцину 13vPnC+AIPO. Титры ОРА определяли в пулах сыворотки, отобранной на неделе 4, для вакцины всех серотипов в обеих группах. Для большинства серотипов титры ОРА, измеренные на неделе 4, были по меньшей мере в 4 раза выше, чем титры, измеренные на неделе 0 (исходное состояние).
Кинетические реакции на каждый из серотипов вакцины 13vPnC оценивали в объединенной сыворотке (пуле) обеих лечебных групп. Измеряли и затем сравнивали титры IgG на каждый серотип измеряли в крови, отобранной на неделе 0 и на неделе 1, 2, 3, 4, 8, 12, 56 и 39. За исключением серотипа 1 ответы антител у животных, получавших вакцину с адъювантом, были выше, чем у животных, получавших вакцину без адъюванта, и имели пик на неделе 2 графика иммунизации (данные не представлены).
4
В целом, данные показывают, что вакцина 13vPnC, в состав которой включали фосфат алюминия, является иммуногенной у кроликов и вызывает значительные ответы антител на пневмококковые капсульные полисахариды, содержащиеся в вакцине, и что эти реакции связаны с функциональной активностью. Реакции, наблюдаемые на семь основных серотипов после иммунизации вакциной 13vPnC+AlPO, находятся в соответствии с известными реакциями кроликов на гептавалентную лекарственную форму.
Таблица 3
Иммунные реакции IgG кроликов (СГТ) после иммунизации двумя дозами 13-валентным пневмококковым гликоконъюгатом
Разбавлено ALPO<sub>4</sub> <sup>a</sup>
13vPnC<sup>a</sup>
13vPnC+ALPO<sub>4</sub> <sup>a</sup>
Серотип
Неделя 0
Неделя 4
Отношение Нед4:Нед0
Неделя 0
Неделя 4 (95% ДИ)
Ratio Нед4:Нед0
Неделя 0
Неделя 4 (95% ДИ)
Отношение Нед4:Нед0
1
<100
<100
10
50
5926 (2758-12733)
119
50
11091 (5327-23093)
222
3
<100
<100
10
50
6647 (2773-15932)
133
58
16443 (7096-38106)
284
4
<100
<100
10
50
13554 (8031-22875)
271
50
29183 (15342-55508)
584
5
134
<100
04
50
5859 (2450-14009)
117
50
16714 (6959-40140)
334
6А
141
<100
04
74
22415 (11987-41914)
303
83
63734 (21141-192146)
768
6В
<100
<100
10
57
8108 (3564-18444)
142
54
23505 (11286-48955)
435
7F
3859
579
02
171
43591 (26931-70557)
444
143
84888 (46445-155151)
496
9V
289
995
34
205
15780 (7193-34
125
208
43331<sup>b </sup>(23256-71510)
217
14
437
177
04
61
6906 (3416-13962)
113
70
16076 (9649-26785)
322
18С
<100
<100
10
50
21283 (15770-28725)
426
50
35040 (24708-49692)
701
19А
<100
<100
10
121
113599 (54518-236707)
939
144
280976 (119587-660167)
1951
19F
<100
<100
10
50
14365 (7346-28090)
287
50
24912 (9243-67141)
498
23F
<100
<100
10
50
5323 (1894-14962)
106
50
15041 (4711-48018)
301
а: СГТ объединенной сыворотки равных объемов сыворотки от каждой особи кролика в пределах группы
b: Статистически значимое различается (р=0,022) от лечебной группы без ALPO<sub>4</sub>
Таблица 4
СГТ ОРА S. pneumoniae для пулов сыворотки Н3Б кроликов после иммунизации двумя дозами 13-валентным пневмококковым гликоконъюгатом
13vPnC<sup>a</sup>
13vPnC+ALPO<sub>4</sub> <sup>a</sup>
Серотип
Неделя 0
Неделя 4
Отношение Нед4:Нед0
Неделя 0
Неделя 4
Отношение Нед4:Нед0
1
<8
64
16
<8
64
16
3
<8
8
2
<8
16
4
4
<8
16
4
<8
32
8
5
<8
128
32
<8
512
128
6А
8
128
16
8
512
64
6В
<8
256
64
8
1,024
128
7F
8
64
8
8
128
16
9V
8
64
8
8
128
16
14
16
32
2
16
32
2
18C
8
256
32
<8
256
64
19A
<8
256
64
<8
1,024
256
19F
<8
128
32
<8
512
128
23F
8
64
8
<8
256
64
А: Пулы состояли из равных объемов сыворотки от отдельных кроликов в пределах лечебной группы (n=12)
Исследование #НТ01-0036
197
197
197
197
4
В исследовании #НТ01-0036 сравнивали иммунные реакции кроликов на полисахариды (ПС), содержащиеся в вакцине, после иммунизации вакциной 13vPnC с конъюгацией с белком CRM или без конъюгации. Новозеландских белых кроликов путем внутримышечной инъекции иммунизировали на неделе 0 и неделе 2 дозой 2,2 мкг каждого полисахарида (за исключением 6В - 4,4 мкг). Животные получали один из трех препаратов вакцины: (а) 13vPnC (ПС прямо конъюгированные с CRM), (б) 13vPnPS (свободный ПС) или (в) 13vPnPS+CRM(свободный ПС, смешанный с CRM). Все препараты вакцины содержали в качестве адъюванта AlPO (125 мкг/дозу).
Серотип-специфичные иммунные реакции для всех препаратов вакцины оценивали по IgG, измеряемым методом ИФА, и по комплемент-опосредованной ОРА, являющейся показателем функциональных антител. Сравнивали иммунные реакции лечебных групп.
197
В таблице 5 представлены данные СГТ, полученные в крови, отобранной на неделе 4 для анализа специфических IgG методом ИФА. Дополнительные методы анализа показали отношение значений СГТ на неделе 4 и на неделе 0. Данные показывают, что препарат конъюгированной вакцины обеспечивал более высокие титры IgG, чем вакцины из свободного ПС или свободного ПС+CRM. За исключением типа 14 S. pneumoniae, вакцина 13vPnC обладала способностью индуцировать функциональные антитела на представленные штаммы S. pneumoniae в ОРА (Таблица 6).
197
В заключение следует отметить, что эти результаты указывают на то, что конъюгация 13-валентной пневмококковой вакцины на основе полисахаридов обеспечивает более высокие титры IgG и более высокую общую активность функциональных антител, чем при введении свободного полисахарида, одного или в смеси с неконъюгированным CRM.
Таблица 5
Реакции IgG кроликов (СГТ) на РnПС ИФА после иммунизации двумя дозами 13-валентным пневмококковым гликоконъюгатом
13vPnPS (свободный ПС)
13vPnPS=CRM<sub>197 </sub>(ПС, смешанный с CRM<sub>197</sub>)
13vPnC
Серотип
Нед.0
Нед.4 (95% ДИ)
Отношение Нед4:Нед0
Нед.0
Нед.4 (95% ДИ)
Отношение Нед4:Нед0
Нед.0
Нед.4 (95% ДИ)
Отношение Нед4:Нед0
1
378
2290 (843-5790)
5,8
395
1959 (809-4739)
5,0
472
35970 (29130-44417)
76,2
3
57
240 (64-908)
4,2
89
163 (74-358)
1,8
50
10414 (10414-16676)
208,3
4
50
379 (150-959)
7,6
50
607 (313-1 178)
12,1
50
12890 (9117-18224)
257,8
5
343
226 (113-450)
4,5
50
321 (147-701)
6,4
50
35264 (24467-50824)
705,3
6А
154
466 (316-688)
3,0
98
210 (95-464)
2,1
163
234245 (167152-328283)
1437,1
6В
63
727 (384-1 375)
11,6
62
745 (384-1 440)
12,0
131
33599 (22934-49222)
256,5
7F
50
61 (39-95)
1,2
50
72 (47-111)
1,4
50
35702 (24350-52347)
714,0
9V
50
104 (48-195)
2,1
55
169 (74-390)
3,0
50
50033 (34765-72007)
1000,7
14
66
298 (117-757)
4,5
50
195 (71-535)
3,9
50
20121 (12087-32138)
402,4
18C
89
1555 (655-3688)
17,5
66
761 (300-1 935)
11,5
101
71451 (32745-124641)
707,4
19A
50
89 (44-179)
1,8
50
80 (39-163)
1,6
50
23485 (12857-42723)
469,7
19F
61
1362 (559-3317)
22,3
61
991 (370-2 654)
16,3
67
19358 (12553-33173)
288,9
23F
73
1085 (487-2420)
14,9
121
638 (311-1 311)
5,3
68
45972 (25134-84089)
676,1
Таблица 6
Титры ОРА S. pneumoniae для пулов сыворотки кроликов после иммунизации двумя дозами 13-валентными пневмококковыми вакцинами
Титры ОРА
Без лечения
13vPnPS (свободный ПС)
13vPnPS + CRM<sub>197 </sub>(свободный ПС, смешанный с CRM<sub>197</sub>)
13vPnC
Серотип
Нед.0<sup>a</sup>
Нед.4
Отношение Нед4:Нед0
Нед.4
Отношение Нед4:Нед0
Нед. 4
Отношение Нед4:Нед0
1
4
16
4
16
4
8
32
3
4
4
1
4
1
4
8
4
4
4
1
4
1
4
64
5
4
32
8
16
4
16
64
6А
8
64
8
32
4
32
664
6В
8
64
8
32
4
32
32
7F
16
32
2
16
1
16
16
9V
16
16
1
32
2
32
8
14
16
16
1
16
1
16
2
18C
4
16
4
16
4
8
64
19A
8
8
1
8
1
16
64
19F
4
4
1
4
1
8
64
23F
16
32
2
16
1
32
32
а: использовали как значения недели 0 для всех групп
Пример 17
197
Альтернативная процедура конъюгации пневмококкового сахарида - с CRM для серотипа 1
Контейнеры с очищенным сахаридом размораживали и смешивали содержимое в реакционном сосуде. В сосуд добавляли 30 мМ натрий-бикарбонатного/карбонатного буфера, pH 9,0, для частичного дез-O-ацетилирования в течение 3 часов при 50°С. Дез-O-ацетилирование проводили приблизительно до 40 мольных процентов. Реакционную смесь охлаждали до 20°С и проводили нейтрализацию 0,2М уксусной кислотой до pH 5,0-7,0. Осуществляли частичное окисление в присутствии периодата натрия путем инкубации при 2-8°С и смесь перемешивали в течение 15-21 часов.
Реакционную смесь очищали путем диафильтрации против 10 объемов 0,9% физиологического раствора с использованием мембраны из искусственной целлюлозы с отсечением по молекулярной массе 30 кДА.
197
197
197
Очищенный, активированный полисахарид смешивали с CRM при соотношении полисахарид/белок 2:1, подвергали поверхностному замораживанию при -75°С и солиофилизировали. После солиофилизации смесь полисахарид/CRM хранили при -25°±5°С до конъюгации. К солиофилизированной смеси полисахарид/CRM добавляли 1М натрий-фосфатный буфер так, чтобы конечная ионная сила составляла 0,2М, а pH 7,5, затем добавляли цианоборогидрид натрия. Реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 15-21 часа, после чего проводили вторую инкубацию 37°С в течение 66-78 часов. После инкубаций с цианоборогидридом реакционную смесь разбавляли холодным физиологическим раствором, после чего добавляли столько 1М карбоната натрия, чтобы довести pH реакционной смеси до 9,0. Непрореагировавшие альдегиды подавляли добавлением борогидрида натрия и инкубацией при 23°С в течение 3-6 часов.
Реакционную смесь разбавляли в 2 раза физиологическим раствором и переносили через префильтр с диаметром пор 0,45-5 мкм в сосуд для диафильтрации, затем подвергали диафильтрации 30х с 0,15М фосфатным буфером, pH 6,0, и 20х с физиологическим раствором. Концентрат фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Раствор конъюгата разбавляли до целевой концентрации 0,5 мг/мл 0,9% физиологическим раствором, а затем подвергали стерильной фильтрации в контейнеры с конечной массой концентрата в вытяжном шкафу Class 100. Конъюгат хранили при 2-8°С.
Исследование конъюгата описано в Примере 2.
Необходимо понимать, что предшествующее обсуждение и примеры представляют собой лишь подробное описание конкретных вариантов реализации. Поэтому специалистам в данной области должно быть очевидно, что возможны различные модификации и эквиваленты, не выходящие за рамки объема данного изобретения.
Все журнальные статьи, другие источники, патенты и заявки на патенты, которые указаны а данной заявке на патент, включены в настоящий документ путем ссылки на них.
Источники информации