Исследование антимикоплазменной активности культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai f-180 - продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы

Исследование антимикоплазменной активности культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F-180 — продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы

И. П. СМИРНОВА', И.В. РАКОВСКАЯ2

1 Российский университет дружбы народов, Москва

2 ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, Москва

Antimycoplasmic Activity of Fermentation Broth of Trichoderma harzianum Rifai F-180, an Organism Producing L-Lysine-a-Oxidase, an Antitumor and Antiviral Enzyme

I. P. SMIRNOVA, I. V. RAKOVSKAYA

Russian University of Peoples' Friendship, Moscow

N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow

Получен концентрат культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F-180 — продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы с активностью в культуральной жидкости 0,54-0,56 Ед/мл. Впервые исследовано влияние полученного концентрата на рост микоплазм: двух видов представителей семейства Mycoplasmataceae: Mycoplasma hominis и Mycoplasma fermentans и одного вида представителя семейства Aholeplasmataceae: Aholeplasma laidlawii. Показано, что культуральная жидкость Trichoderma harzianum Rifai F-180 — продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы ингибирует рост Mycoplasma hominis после предварительного контакта. Степень подавления роста зависит от посевной дозы микоплазмы и исследованной концентрации культуральной жидкости триходермы.

Ключевые слова: L-лизин-а-оксидаза, триходерма, микоплазмы.

A concentrate of the fermentation broth of Trichoderma harzianum Rifai F-180, an organism producing L-lysine-a-oxidase, an antitumor and antiviral enzyme, with the activity in the fermentation broth of 0.54-0.56 U/ml was recovered. The effect of the concentrate on the mycoplasmas growth was investigated for the first time. Two representatives of Mycoplasmafaceae, i.e. Mycoplasma hominis and Mycoplasma fermentans and one representative of Aholeplasmataceae. i. e. Aholeplasma laidlawii were used. It was shown that the fermentation broth inhibited the growth of Mycoplasma hominis after the preliminary exposure. The inhibition rate depended on the mycoplasma inoculation dose and the fermentation broth concentration.

Key words: L-lysine-a-oxidase, trichoderma, mycoplasmas.

Микоплазмы относятся к классу МоШси^, который включает несколько семейств и в том числе семейства Мусор1а8ша1асеае и АИо1ер1а8ша1асеае. В организме человека микоплазмы обитают на влажных мукозных поверхностях и при определённых условиях могут вызывать заболевания респираторного и урогенитального трактов. Они способны длительно персистировать в организме хозяина, так как обладают большим количесвом свойств и факторов, способствующих ускользанию от иммунологического надзора хозяина. Инфекционный процесс, вызванный микоплазмами, имеет, как правило, генерализованный характер [1].

Для лечения микоплазменных инфекций используют антибиотики широкого спектра дейст-

© И. П. Смирнова, И. В. Раковская, 2014

Адрес для корреспонденции: 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. РУДН

вия: чаще всего антибиотики тетрациклинового ряда (доксициклин, миноциклин) и макролиды (джозамицин, клиндамицин, мидекамицин, рок-ситромицин). Однако известно, что многие штаммы микоплазм, обитающие в урогениталь-ном тракте, резистентны к тетрациклинам и мак-ролидам.В таких случаях рекомендуется использовать хинолоны: левофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин. Но в настоящее время от пациентов выделяют штаммы, устойчивые и к хинолонам. Показано также, что эффективность антибиотиков зависит от состояния иммунной системы. Для пациентов с иммунодефицитом рекомендуют вводить антибиотики внутривенно и обязательно после определения чувствительности к ним выделенной микоплаз-мы. Часто требуется продолжительная терапия. В связи с этим ведущие микоплазмологи считают,

что радикальных средств для лечения микоплаз-менных инфекций в настоящее время нет [2].

Ранее нами была доказана термостабильность культуральной жидкости штамма-продуцента L-лизин-а-оксидазы и вследствии этого у нас появилась возможность осуществить предварительные испытания её на некоторые штаммы микоплазм [3—5].

M.hominis является условно-патогенным микроорганизмом, обитает в урогенитальном тракте (УГТ) человека, причастна, по данным ряда авторов, к развитию хориоамнионита, внутриутробной патологии плода, развитию бактериального вагиноза и других патологических состояний УГТ. Описаны случаи выделения этой микоплазмы при абсцессе головного мозга, при пневмонии, при перикардите, эндокардите, раневой инфекции [1].

M.fermentans также является условно-патогенным микроорганизмом.

Её выделяют из УГТ человека, а также из верхних дыхательных путей при фарингите.

A.laidlawii — сапрофит, впервые была выделена из сточных вод. Этот микроорганизм выделяют с растений, из почвы, из различных клинических образцов от крупного рогатого скота, свиней, птиц и человека.

Mfermentans и A.laidlawii являются частым кон-таминантом клеточных культур различного происхождения, особенно перевиваемых, и оказывают существенное влияние на результаты экспериментов с использованием таких культур, что особенно важно для вирусологических исследований.

Материал и методы

В работе использовали культуральную жидкость штамма Trichoderma harzianum Rifai, продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы, депонированного в Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-180.

Штамм триходермы, культивировался на среде по ранее разработанной методике. Культуру выращивали в течении 14 суток на твёрдой питательной среде с пшеничными отрубями поверхостным способом в колбах вместимостью 250 мл. Выросшую культуру гриба вносили в колбы с жидкой питательной средой аналогичного состава. Полученный инокулят использовали в ферментации на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г. Пущино). Использовали ферментёр типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ (г. Кириши), объёмом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментёр оснащён магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН. Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор — 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение рН 5,8—6,0 устанавливали 10% раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4 ч, стерилизовали в автоклаве 1 ч при 125°С, затем вносили в ферментёр, где их ещё раз стерилизовали вместе с другими компонентами. Подготовленный ферментёр засевали посевным материалом из колб, вышеописанным способом. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре 26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30

л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5, продолжительность выращивания 94—98 часов.По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин. в течение часа при температуре 2—4°С. Затем нативный раствор в объёме 55 л. после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л. Полученный концентрат культуральной жидкости с активностью в культураль-ной жидкости 0,54—0,56 Ед/мл. использовали для изучения антимикоплазменной активности.

Активность L-лизин-а-оксидазы в концентрате культуральной жидкости Trichoderma рассчитывали по приросту Н2О2, количество которой определяли спектрофотометричес-ким ортодиазидиновым микрометодом [4].

В работе использовали три вида микроорганизмов класса Mollicutes: 2 вида представители семейства Mycoplasmat-aceae: Mycoplasma hominis и Mycoplasma fermentans и один вид представитель семейства Aholeplasmataceae: Aholeplasma laid-lawii. Штамм M.hominis H-34 был получен в 1967г. из коллекции доктора Lemke R.M. (Lister Inst. Preventive medicine, London S.W.I.). Штамм M.fermentans Pg 18 получен от доктора Freundt (Inst. of Medical Microbiol. Univer. of Aarhus, Дания). Штамм A.laidlawii был получен в 1963 г. от доктора Koller (Йена, ГДР). Все штаммы хранились и поддерживались в лаборатории микоплазм и L-форм бактерий (ФГБУ НИИЭМ им. поч. ак. Н. Ф. Гамалеи).

Для выращивания микоплазм использовали бульон (Difco PPLO Broth, Becton, Dickinson, USA) c 20% сыворотки крови лошади, 2% свежего дрожжевого экстракта, 1% аргинина или 1% глюкозы (в зависимости от пищевых потребностей вида микоплазм) и 0,005% индикатора фенолово-красного. Для титрования культур делали серийные десятикратные разведения пробы в физиологическом растворе с высевом материала из всех разведений на 0,3 % агар (BBL Mycoplasma Agar Base, Becton, Dickinson, США) c такими же добавками, как в бульоне. Спустя 3 суток подсчитывали число колоний в двух последних пробирках из ряда разведений и высчитывали средний показатель числа колоний. Титр культур выражали средним числом выросших колоний, помноженным на разведение культуры. В опыт брали культуры с установленным ранее титром.

Опыты по определению чувствительности микоплазм к ферменту проводили в двух вариантах. В табл. 1, 2 представлены средние результаты из двух опытов.

Вариант 1. В пробирки со средой культивирования (9,8 мл) вносили по 0,1 мл культуральной жидкости триходермы нераз-веденной и в разведениях 1:10 и 1:100 и 0,1мл культуры мико-плазмы с известным титром. Таким образом, в опытных пробирках в 10 мл среды содержалась культуральная жидкость с активностью L-лизин-а-оксидазы 0,54—0,56 Ед/мл в количестве 0,1 мл, 0,01 мл, 0,001мл.

Пробирки культивировали 3 суток. Контролем служили посевы микоплазм в такую же среду, но не содержащую культуральную жидкость продуцента L-лизин-а-оксидазы. Об интенсивнсти роста судили по скорости изменения цвета индикатора. M.hominis разлагает аргинин среды с выделением аммиака и цвет среды изменяется из красного в малиновый за счёт её защелачивания. M.fermentans и A.lailawii разлагает глюкозу, что сопровождается изменением рН среды в кислую сторону и изменением её цвета из красного в жёлтый. Изменение цвета среды регистрировали ежедневно. Титрование выросших культур микоплазм проводили через 72 ч культивирования.

Вариант 2. В пробирки вносили 1 мл бульонной культуры микоплазм с известным титром, затем соединяли с 1 мл. культуральной жидкости с активностью L-лизин-а-оксидазы

Таблица 1. Результаты испытания антимикоплазменной активности культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F-180 при различных концентрациях в среде культивирования

Культура Контроль оценка роста Оценка активности фермента

Вид исходный по изменению по титру, по изменению рН среды по титру, КОЕ/мл

титр, КОЕ/мл рН среды КОЕ/мл 0,1 мл 0,01 мл 0,001 мл 0,1 мл

M.hominis H-34 10' + 10' + + + 0,7-106

—//— 105 + 10' - + + 2 • 104

M.fermentans 10' + 10' + + + 3 • 10'

—//— 105 + 6-103 — + + 2 • 103

A.laidlawii 10' + 108 + + + 1-108

—//— 103 + 108 + + + 1 - 108

Примечание. Здесь и табл. 2: 1) «+» - рН среды изменился; «—» - рН среды без изменения; «±» - рН среды изменился незначительно. Указаны средние значения титров из двух опытов.

Таблица 2. Антимикоплазменная активность культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F-180 — продуцента фермента L-лизин-а-оксидазы в различных концентрациях при её контакте с клетками микоплазм

Культура Контроль оценка роста Оценка активности фермента

Вид Исходный по изменению по титру, по изменению рН среды по титру, КОЕ/мл

титр, КОЕ/мл рН среды КОЕ/мл неразве- 0,1 мл 0,01 мл 0,001 мл неразве- 0,1 мл

дённый дённый

M.hominis H-34

M.fermentans

A.laidlawii

10' 103 10' 103 10' 103

10' 10' 10' 104 108 108

± +

± ± + +

+ ± + ± + +

+ ± + + + +

нет роста 6*104 —//— единичХЮ1 2 • 104 2 - 106 1 • 101 2,5-102 1-106 1,8 • 106

+

0,54—0,56 Ед/мл в тех же разведениях, которые мы использовали в первом варианте.Смеси выдерживали в течении 45 мин при комнатной температуре, затем заливали жидкой питательной средой и культивировали в течении 3 суток, наблюдая за скоростью и интенсивностью роста по изменению цвета культуральной среды.Титр клеток микоплазм в опытной и контрольной пробирке определяли описанным выше способом.

Результаты и обсуждение

Результаты определения антимикоплазменной активности первым вариантом представлены в табл. 1. Из данных таблицы следует, что интенсивность роста M.hominis, M.fermentans, регистрируемая по изменению рН среды на вторые сутки культивирования, зависела от титра взятой в опыт культуры. На этом сроке отмечали небольшую задержку в интенсивности роста в пробирках с меньшей посевной дозой микоплазм и максимальной дозой активности L-лизин-а-оксидазы культуральной жидкости триходермы. На третьи сутки культивирования рН среды при всех посевных дозах культуры и дозах исследуемой культу-ральной жидкости продуцента фермента L-ли-зин-а-оксидазы становилась одинаковой.

Результаты определения антимикоплазмен-ной активности более точным методом — путём титрования выросших культур через '2 ч культивирования показали, что фермент обладает некоторой активностью в отношении M.hominis. При высокой посевной дозе микоплазм и увеличения количества культуральной жидкости исследуемого штамма триходермы титр выросшей культуры был на 1lg ниже, чем в контроле. При более низ-

кой посевной дозе титр отличается на 3 Lg (определение проводили только с наивысшим количеством культуральной жидкости триходермы, поскольку только при ней отмечали замедление скорости роста по изменению цвета среды).

Разницы в титре КОЕ/мл культур M.hominis и A.laidlawii в опыте и контроле не были нами обнаружены.

Результаты определения антимикоплазмен-ной активности вторым вариантом оказались более интересными. Из данных таблицы 2 видно, что в присутствии культуральной жидкости продуцента L-лизин-а-оксидазы скорость роста M.hominis, регистрируемая по изменению цвета среды, была снижена, особенно при низкой посевной дозе. Рост других штаммов микоплазм также отставал от роста в контроле, но только при низких посевных дозах.

При определении титра КОЕ/мл наблюдали полное подавление роста при контакте клеток микоплазм при использовании неразведённой культуральной жидкости триходермы с активностью L-лизин-а-оксидазы 0,54—0,56 Ед/мл, даже при высокой посевной дозе. При десятикратном разведении исходной культуральной жидкости триходермы она также подавляла рост микоплазм, но в меньшей степени — на 3 lg. При использовании меньшей посевной дозы микоплазм рост также был подавлен полностью при контакте с культуральной жидкостью продуцента фермента. Использование десятикратного разведения культуральной жидкости в опытных

пробирках приводило к росту лишь единичных колоний.

Титр КОЕ/мл культур M.hominis был ниже в сравнении с контролем на 3 Lg и 1 Lg (соответственно) при высокой посевной дозе культуры и разных концентрациях культуральной жидкости продуцента L-лизин-а-оксидазы.

При более низкой посевной дозе и разных концентрациях культуральной жидкости исследуемого штамма -продуцента фермента титр КОЕ выросшей культуры различался на 3 и 2 lg соответственно.

Способность ингибировать рост обнаружена также в отношении A.laidlawii. Рост исследуемой культуры отставал на 2 lg на третьи сутки культивирования при разных посевных дозах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Раковская ИВ. Микоплазмы-возбудители микоплазменных инфекций человека. В кн. Руководство по медицинской микробиологии / Под ред. А.С. Лабинской и др. М.: БИНОМ, 2010; 964-993.

2. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: sophisticated, reemerging, and burdened by their notoriety. Emer Infect Dis 1997; 3: 1: 21—32.

3. Пакина Е.В., Шнейдер Ю.А., Смирнова ЖП.Биологическая и биохимическая стабильность метаболитов сапрофитного гриба

Заключение

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что культуральная жидкость Trichoderma harzianum Rifai F-180-продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы способна ингибировать рост Mycoplasma hominis, которая наглядно проявляется после предварительного контакта мико-плазм и культуральной жидкости триходермы. Степень подавления роста зависит от посевной дозы микоплазм и используемой концентрации культуральной жидкости триходермы.

ТпеНоёегша Натапыш Rifai. Вестник РУДН, серия «Агрономия и животноводство», 2009; 4: 28—32.

4. Смирнова И.П, Сяткин С.П., Берёзов Т.Т. Спектрофотометричес-кий метод определения Ь-лизин-а-оксидазы. Вопр мед хим 1984; 1: 133—136.

5. Смирнова И.П, Берёзов Т.Т. Биотехнология фермента Ь-лизин-а-оксидазы из триходермы. М.: Копиризо, 2014; 189.