Выделение и изучение липидоокисляющих микроорганизмов - обитателей Северного Каспия

УДК 628.543.35: 579.22

О. В. Колотова, И. В. Соколова, И. В. Владимцева, Т. В. Беленькова, В. С. Шевцова

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЛИПИДООКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ -

ОБИТАТЕЛЕЙ СЕВЕРНОГО КАСПИЯ

Ключевые слова: микроорганизмы, липиды, липолитическая активность, биологическая очистка.

При проведении мониторинговых исследований Северного Каспия получены пробы вод и донных отложений, из которых методом накопительных культур выделены 10 штаммов липидоокисляющих бактерий. Изучены их морфологические, культуральные свойства, способность к утилизации липидов растительного и животного происхождения, твинов.

Keywords: microorganisms, lipids, lipolytic activity, biological purification.

During the North Caspian monitoring research water and bottom sediments samples were selected. 10 bacterial lipid oxidation strains were isolated by biomass accumulation approach from these samples. Studied its morphological, cultural properties and their ability to dispose lipids plant and animal origin, tweens.

Введение

Микроорганизмы, являясь весьма значимым звеном морских экосистем, выполняют в них важнейшую функцию биологического

самоочищения путем разложения и утилизации разнообразных соединений - загрязнителей естественного и антропогенного происхождения. В связи с этим интерес к изучению и практическому применению морской микрофлоры очень велик.Липиды широко распространены в морской среде и биотрансформация этих соединений осуществляется, главным образом, за счет деятельности микроорганизмов. Липолитические бактерии вошли в состав индикаторных групп микроорганизмов, рекомендованных в практику морских гидробиологических исследований Федеральной службой по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды. Эта группа микроорганизмов зачастую обнаруживается в морских регионах, хронически загрязненных нефтяными углеводородами, а также коммунальными стоками [1]. Считается, что численность липолитических микроорганизмов характеризует интенсивность разрушения промежуточных продуктов распада нефтяных загрязнений [2]. Результаты исследований состава и липолитической активности морской микрофлоры могут быть полезны для решения разнообразных задач микробиологической промышленности и прикладной биотехнологии.

Жиры являются распространенными

загрязнителями промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод. Их негативное воздействие на водные экосистемы связано со значительной химической стойкостью и способностью покрывать водоёмы прочной пленкой, обусловливающей протекание анаэробных процессов. Последние, в свою очередь, приводят к накоплению в водоёмах токсичных для живых организмов веществ, появлению неприятного запаха и ухудшению других органолептических свойств воды. В настоящее время проблема очистки сточных вод от жиров и масел решается разнообразными методами,

специфика которых связана с природой загрязнителей (природные жиры и масла, синтетические продукты), их концентрацией, температурой стока, необходимой степенью очистки и др. Традиционной является схема очистки жиросодержащих сточных вод, включающая этапы механической (в жироловушках) и биологической (в биофильтрах и аэротенках) очистки [3]. Разрабатываются и новые способы очистки от липидов, в частности, с применением разнообразных сорбционных материалов [4] и мембранных технологий [5]. Следует отметить, что применение биологических методов очистки сточных вод от веществ жировой природы во многих случаях наиболее целесообразно, так как позволяет снизить их содержание до нормативных показателей для сброса в поверхностные водоёмы, а также избежать накопления большого количества быстро портящихся жировых отходов.

Таким образом, актуальность поиска микроорганизмов, способных эффективно утилизировать липиды - потенциальные загрязнители поверхностных вод, не вызывает сомнений. Получение и применение таких микроорганизмов в практике очистки промышленных и хозяйственно-бытовых стоков позволит снизить нагрузку на природные экосистемы и сохранить самоочищающую способность водоёмов.

В связи с вышесказанным, целью работы являлось выделение из проб морской воды и донных отложений Северного Каспия чистых культур липидоокисляющих микроорганизмов, изучение их основных свойств и активности в отношении различных жировых субстратов.

Экспериментальная часть Материалы и методы

Выделение микроорганизмов из проб морской воды и донных отложений производили методом накопительных культур с использованием жидкой питательной среды следующего состава (г/ л): К2НРО4 - 1; МgSO4•7H2O - 0,3; Саа2-6Н20 - 0,1;

(]Ж4)2ИР04 - 2,0; №С1 - 0,1; рН - 7,6. В качестве источника углерода в состав питательной среды вводили стерильное оливковое масло в количестве 2% (об.). Во флаконы со 100 мл стерильной питательной среды вносили морскую воду (5 проб) или образцы донных отложений (4 пробы), в которых в ходе предварительного мониторинга были обнаружены максимальные концентрации нефтеокисляющих микроорганизмов (250 - 2500 м.к./мл). Пробы инкубировали при 30°С в течение 7 суток. Полученные суспензии накопительных культур оценивали визуально по скорости и степени помутнения, что косвенно свидетельствовало о концентрации и активности липидоокисляющих микроорганизмов. С целью получения изолированных колоний суспензии высевали на пластинки плотной среды, приготовленной на основе накопительной среды с добавлением 2% (масс.) агар-агара и 2% (об.) оливкового масла. Из изолированных колоний липолитических штаммов, выросших на плотной питательной среде, бактерии отсевали на скошенный агар для получения чистых культур микроорганизмов. Чистоту штаммов контролировали по культуральным и морфологическим свойствам.

Для подтверждения липолитической активности выделенных бактериальных штаммов осуществляли посев суточных культур микроорганизмов на плотную среду Селибера с бромфеноловым синим (микроорганизмы, расщепляющие жиры, способствуют образованию жирных кислот и снижению рН среды, что приводит к изменению цвета индикатора и питательной среды) и в бульон Штерна (при ферментации липидов бактерии выделяют из них кислоты, которые, подкисляя среду, вызывают переход окраски из жёлтой в розовую). В обоих случаях в питательных средах в качестве источника углерода использовали оливковое масло. На поверхность скошенной агаризованной среды наносили 0,1 мл стерильного оливкового масла и распределяли по поверхности бактериологической петлёй, затем осуществляли посев суточных культур микроорганизмов. Для исследования поведения культур в бульоне Штерна (содержание масла 2 % (об.)) последний разливали в пробирки по 10 мл и засевали в них 0,5 мл бактериальной взвеси с концентрацией 109м.к./мл, приготовленной по стандарту мутности. Для дальнейшего изучения были выбраны культуры бактериальных штаммов, липолитическая активность которых была подтверждена при культивировании на среде Селибера и в бульоне Штерна.

Способность изучаемых микроорганизмов к образованию экзолипаз определяли чашечным методом [6]. В состав питательный среды входили (г/л): бактопептон - 10,0; хлорид натрия - 5,0; хлорид кальция - 0,1; агар-агар - 15,0. В качестве жировых субстратов использовали полисорбаты (твины): монолаурат (твин-20), монопальмитат (твин-40), моностеарат (твин-60) и моноолеат (твин-80). Твины вносили в среду после автоклавирования из расчета 5 мл твина на 1 литр среды. Полученную

среду разливали в стерильные чашки Петри. После подсушивания на поверхность сред вносили суспензииисследуемых культур, тщательно распределяя по поверхности для получения изолированных колоний. Посевы инкубировали при 30°С в течение 20-24ч. О наличии экзолипазной активности штаммов судили по появлению вокруг колоний зон помутнения различного диаметра за счет образования в плотной среде нерастворимых соединений жирных кислот с кальцием. У микроорганизмов, непродуцирующих экзолипазы, помутнение среды вокруг колоний отсутствовало. Ферментативную активность оценивали с использованием коэффициента К, который высчитывалипо отношению диаметра зоны липолитической активности исследуемого штамма к диаметрузоны колонии этого штамма. Проведенные исследования позволили отобрать культуры, наиболее перспективные для использования при утилизации жировых загрязнений сточных вод. Отобранные культуры исследовали на способность ферментировать липиды растительного и животного происхождения. Для этого готовили 3 варианта питательной среды: в расплавленную стерильную питательную среду на основе бактопептона вносили 0,5% (мас.) оливкового масла, свиного или говяжьего жира, тщательно перемешивали и разливали в чашки Петри. Для предотвращения расслаивания образующихся эмульсий в процессе застывания агаризованной среды чашки ставили на лёд, а затем подсушивали в термостате. В подготовленные чашки Петри засевали суспензии суточных культур исследуемых штаммов. Посевы инкубировали при 30°С в течение 1 - 7 суток. Сравнительный анализ активности исследуемых штаммов в отношении различных жировых субстратов проводили визуально по размеру образующихся колоний.

Результаты и их обсуждение

В результате культивирования микроорганизмов, внесенных в накопительную питательную среду с пробами морской воды и донных отложений, наблюдали различную скорость роста микробной биомассы. Через 48 ч выращивания при 30°С существенно увеличилась мутность питательных сред во флаконах с образцами донных отложений, численность бактерий вних была максимальной и достигала 2,5 тыс. м.к./г. Это косвенно может свидетельствовать о большей концентрации липолитически активной микрофлоры в донных отложениях по сравнению с таковой в толще воды. По истечении 7 суток рост микроорганизмов отмечали во всех флаконах с накопительными средами. После разведения и высева полученных микробных суспензий на плотную питательную среду, содержащую в качестве источника углерода оливковое масло, из изолированных колоний были выделены чистые культуры 10 липолитических бактериальных штаммов, различающихся по культуральным и морфологическим свойствам.

Культивирование выделенных культур на средах специального состава (среде Селибера и бульоне

Штерна) позволило выявить различия в интенсивности роста и способности менять рН среды, связанной со скоростью деструкции жиров и образованием свободных жирных кислот. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Исследование липазной активности микроорганизмов на средах специального состава

субстрата. Штаммы № 3 и № 5 не обладали экзолипазной активностью.

Природные жиры, в отличие от твинов, содержат остатки различных жирных кислот, поэтому они являются более труднодоступными субстратами для микроорганизмов. Для оценки липидоокисляющей способности отобранных бактериальных штаммов их выращивали в течение 48 ч на плотных питательных средах, содержащих 1% (мас.) природных жиров в качестве единственных источников углерода, измеряя диаметры образующихся колоний. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Размеры колоний выделенных липолитических бактерий на средах с различными жирами

№ штамма Интенсивность роста

бактерий/изменение цвета

Среда Селибера Бульон Штерна

1 +/+ ±/-

2 ++/+ ++/+

3 +/+ +/+

4 ±/+ +/+

5 ±/+ +/+

6 +/+ ±/-

7 +/+ ±/-

8 +/+ +/+

9 +/+ ±/-

10 -/- ±/-

№ Диаметр колоний мм

штамма Оливковое Говяжий Свиной

масло жир жир

2 2-3 <1 3-4

4 5-7 4-6 -

8 6-12 - 9-10

«+» - наличие роста, изменение цвета питательной среды; «++» - интенсивный рост; «±» - слабый рост; «-» -отсутствие роста, изменения цвета питательной среды.

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что штаммы под номерами 2, 3, 4, 5 и 8 наиболее интенсивно наращивают биомассу, используя в качестве источника углерода оливковое масло и расщепляя его при этом с образованием жирных кислот, что, в свою очередь, приводит к снижению рН среды и изменению цвета индикаторов в составе среды Селибера (бромфеноловый синий) и бульона Штерна (фуксин).

Результаты экспериментов по оценке экзолипазной активности приведены на рисунке 1.

Рис. 1 - Экзолипазная активность изолированных бактериальных штаммов по отношению к твинам

Результаты, представленные на рисунке, позволяют заключить, что максимальной активностью среди выделенных бактериальных штаммов в отношении всех взятых в опыт твинов обладает штамм № 2. Штамм № 8 активно утилизирует три субстрата, штамм № 4 - 2

Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что штаммы № 2, 4 и 8 способны утилизировать природные жиры, используя их в качестве единственного источника углерода. Штамм № 2 хуже растет на жировых субстратах, особенно на среде с говяжьим жиром, что, по-видимому, объясняется более длительным периодом адаптации, связанной с продукцией соответствующего набора липолитических ферментов. Липазы являются индуцируемыми ферментами и в литературе имеются сведения об индукции липаз жирными кислотами и липидами [7,8]. По истечении 7 суток колонии штамма № 2 на среде, содержащей говяжий жир, достигали 2-3 мм в диаметре, через 12 суток - 6-7 мм.

Штамм № 4 образовывал колонии приблизительно одинакового размера на средах с оливковым маслом и говяжьим жиром, однако не проявил активности в отношении свиного жира. Возможно, это объясняется высоким содержанием в свином жире пальмитиновой кислоты (до 30%). Как показали эксперименты, бактерии данного штамма не способны к утилизации монопальмитата - твина-40 (рис. 1). Штамм № 8 образовывал крупные колонии на средах с оливковым маслом и свиным жиром, но оказался не способным к росту на среде с говяжьим жиром.

Таким образом, в результате проведенных исследований из проб морской воды и донных отложений Северного Каспия изолированы чистые культуры липолитических бактерий. Изучена способность выделенных бактериальных штаммов использовать в качестве единственного источника углерода твины, оливковое масло и животные жиры. Установлено, что наибольшим спектром липолитической активности из 10 выделенных бактериальных штаммов обладает штамм № 2, способный к утилизации всех взятых в опыт жировых субстратов. Максимальную

деструктивную активность по отношению к оливковому маслу и свиному жиру проявил штамм № 8, по отношению к говяжьему жиру - штамм № 4. Полученные экспериментальные данные показали перспективность использования выделенных бактериальных штаммов для очистки жиросодержащих сточных вод в виде монокультур или в составе комплексных биопрепаратов -ассоциаций бактерий.

Литература

1. Цыбань А. В., Теплинская Н. Г. Эколого-физиологические свойства липолитической и протеолитической микрофлоры в море // Океанология. -1982. - Т. 22, вып. 1. - С. 108-114.

2. Руководствопометодам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений/ Под ред. В.А. Аббакумова Л.: Гидрометеоиздат, 1983. - 240 с.

3. О. Г. Чудакова, А. В. Желовицкая, Д. В. Бескровный. Вестник Казанского технологического университета, Т.19, № 22, С. 182-186

4. М. Н. Спирин, Ж. А. Сапронова, И. Г. Шайхиев. Вестник технологического университета, 2016. Т. 19, № 13, С. 174 - 177

5. И. Г. Шайхиев, В. О. Дряхлов, Г. Ш. Сафина, V. А. Nenov, B. S. Bonev, А. И. Назмиева. Вестник технологического университета, 2015. Т. 18, №13, С. 242 - 245.

6. П. Н. Золотарев. Оценка патогенных свойств бактерий под действием фитосубстанций (на примере липолитической активности) // Сибирский медицинский журнал - 2015 - № 6 - С. 130 - 132.

7. Рубан Е.Л, Ксандопуло Г.Б., Мурзина Л.П. Условия биосинтеза элзолипазы грибом Oospora fl agrans. // Приклалная биохимия и микробиология - 1978 - Т. 14, вып.6 - С.849 - 857.

8. Свириденко Ю.Я., Уманский М.С., Кузнецов Е.С., Козаков Г.А., Лобырева Л.Б. Влияние состава среды на биосинтез и свойства экзолипаз микроорганизмов // Микробиология - 1978 - Т. 47, вып.5 - С. 677-682.

© О. В. Колотова - к. т. н., доцент каф. ПЭБЖ ВолгГТУ, olgakolotova@mail.ru; И. В. Соколова -к.б.н., доцент каф. ПЭБЖ ВолгГТУ, mogi-irina@yandex.ru; И. В. Владимцева - д. б. н., профессор каф. ПЭБЖ ВолгГТУ, alexvlad32@yandex.ru; Т. В. Беленькова - магистрант каф. ПЭБЖВолгГТУ, marina-turikova@yandex.ru; В. С. Шевцова - магистрант каф. ПЭБЖВолгГТУ, snezhok-94@yandex.ru.

© O. V. Kolotova - Ph.D. in Technics, docent of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, olgakolotova@mail.ru; 1 V. Sokolova - Ph.D. in Biology, docent of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, mogi-irina@yandex.ru; 1 V. Vladimtseva - Ph.D. in Biology, Full Professor, of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, alexvlad32@yandex.ru; T. V. Belen'kova - undergraduate of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, , marina-turikova@yandex.ru; V. S. Shevtsova, undergraduate of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, snezhok-94@yandex.ru.