СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОДАВЛЯЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ, ПРИВОДЯЩЕЙ К НАРАСТАНИЮ ЧИСЛА ЯДЕР В СОСТОЯНИИ АПОПТОЗА
METHOD FOR ASSESSING INHIBITORY EFFECT OF CYTOMEGALOVIRUS INFECTION IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION ON CYTOCHROME OXIDASE ACTIVITY IN PLACENTAL PLASMODIUM VILLI, CAUSING NUCLEUS COUNT INCREASE IN APOPTOSIS

1. Цель исследования - выявить, что обострение цитомегаловирусной инфекции в период гестации подавляет в синцитиотрофобласте активность цитохромоксидазы, вызывая увеличение числа ядер в состоянии апоптоза.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к прогнозу состояния ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении во время гестации цитомегаловирусной инфекции, под влиянием которой подавляется активность цитохромоксидазы.
3. Раскрытие изобретения
1
3
2
2
2
Цитохромы - гемопротеиды, основная функция которых заключается в переносе электронов, выполняя одну из важнейших ролей в тканевом дыхании. В зависимости от конфигурации простетической группы цитохромы можно подразделить на четыре типа: a, b с, d. Основная функция цитохромов - это их участие в цепи переносчиков электронов: b-c-(с-а)-а-O [4]. Окислительный цитохром С восстанавливается химическими реагентами, такими как цитохромредуктазы. Цитохром аз (цитохромоксидаза; цитохром - C; О-оксидоредуктаза) - основной фермент, переносящий электроны от цитохрома C на О в процессе окислительного фосфорилирования [5]. Окисление цитохрома С сопровождается появлением мембранного протонного потенциала, который используется клеткой для обеспечения метаболических процессов, особенно для синтеза АТФ. Фермент располагается на внутренней мембране митохондрий [4]. Таким образом, цитохром С-оксидаза кодируется в митохондриальном геноме и синтезируется на митохондриальных рибосомах [8]. Перенос электрона сопровождается трансмембранным переносом двух протонов из матрикса в цитозольное пространство и сопровождается формированием протонного потенциала [7]. Цитохромоксидаза в клетках человека крайне необходима для обеспечения их жизнедеятельности. Нарушение биосинтеза цитохрома С оксидазы приводит к гибели клеток.
4. Новая техническая задача
Цитомегаловирусные белки, внедряясь в синцитиотрофобласт ворсинок плаценты, становятся ксенобиотиками на борьбу, с которыми вступают ферменты группы цитохромоксидазы. В случае высокой агрессивности возбудителя ферментативное противоборство против ксенобиотика не справляется и происходит снижение активности цитохромоксидазы, что при увеличении процента ядер переходящих в состояние апоптоза ставит под угрозу гибель ворсинок плаценты.
5. В доступной литературе анналов по данному вопросу не отмечено.
6. Осуществление изобретения
6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН. Обследовано 15 беременных на третьем триместре гестации с обострением цитомегаловирусной инфекции с титром 1:1600. Контролем служили 15 беременных, не болевших цитомегаловирусной инфекцией в период гестации. У беременных симптоматически цитомегаповирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также ДНК цитомегаловируса. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител класса IgM и IgG, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере «Stst-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК цитомегаловируса методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
6.2. Определение цитохромоксидазы в плаценте выполнялось по методу Муг [1, 2]. Срезы изготовляли на замораживающем микротоме толщиной 7-10 микрон, помещая первоначально в физиологический раствор при pH 7,2, а затем переносили их в инкубационный раствор, который приготовляли при температуре 37°C следующего состава: смешивали в равном количестве 0,01 М (0,17%) диметил-p-фенилендиамин-HCl, растворенный в 0,066 М фосфатном буфере pH 5,8, содержащем 1% NaCl и 0,14% раствор α-нафтола. Контрольные срезы промывали в растворе азида натрия, изготовленного на физиологическом растворе поваренной соли в концентрации 0,005 М (0,019%). После инкубации в течение 10 мин споласкивали в физиологическом растворе. Срез покрывали 5% раствором ацетата калия, накрывали покровным стеклом, окантовывая расплавленным парафином. Препараты изучали под цифровым микроскопом МТ (Япония), связанным с компьютером по программе «Scion Corporation» (USA) с целью проведения цитофотометрической обработки продуктов реакции. Морфологическая классификация апоптоза на парафиновых срезах проводилась по метке концов фрагментов ДНК (in situ end labeling metod, ISEL) с инкубацией в смеси 4 нуклеотидов dATF, dGTF, dCTF biotin II dUTP, ДНК полимераза - E. Coli («Sigma», USA) [3].
7. В процессе исследования были получены следующие результаты
При обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности отмечались функциональные нарушения в плаценте. У рожениц анализировалась активность цитохромоксидазы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты. В синцитиотрофобласте ворсинок плаценты рожениц, перенесших в третьем триместре обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител 1:1600, отмечалось снижение активности цитохромоксидазы до 2,50±0,015 усл. ед. (контроль - 7,50±0,03 усл. ед.) (фиг.1, 2). Анализируя содержание количества ядер в синцитиотрофобласте, находящихся в состоянии апоптоза отмечали, что при снижении активности цитохромоксидазы в синцитиотрофобласте число ядер, находящихся в состоянии апоптоза резко увеличивалось: при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 - до 3,0±0,03% (контроль - 0,50±0,015%). Таким образом, белки цитомегаловирусной инфекции, проникая в синцитиотрофобласт, в качестве ксенобиотиков, вступают в противоборство с ферментными системами. Наиболее эффективным элементом, обеспечивающим детоксикацию ксенобиотиков, в частности в синцитиотрофобласте должна быть цитохромоксидаза. В этом случае происходит внедрение атома кислорода в органическое вещество (в данном случае в цитомегаловирусный белок - как ксенобиотик). При этом цитохром окисляется, чтобы затем быть восстановленным дыхательной цепью. Цепь эта сопряжена с генерацией протонного потенциала. Оксигенированный продукт затем подвергается либо дальнейшему окислению с участием цитохромоксидазы, либо удаляется из клетки. Цитомегаловирусный антиген при попадании в синцитиотрофобласт оказывает сильное токсическое действие и подавляет цепь окислительных процессов, вследствие чего наблюдается снижение в синцитиотрофобласте активности цитохромоксидазы и как следствие увеличивается число ядер в синцитиотрофобласте в состоянии апоптоза.
На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность цитохромоксидазы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении в третьем триместре цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600. Реакция на цитохромоксидазу снижается до 2,50±0,015 усл. ед. (контроль - 7,50±0,03 усл. ед.). Гистохимическая реакция по Муг. Увеличение - 10×100.
На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на активность цитохромоксидазы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты у роженицы, не болевшей в течение гестации. Интенсивность реакция на цитохромоксидазу- 7,50±0,03 усл. ед. Гистохимическая реакция по Муг. Увеличение - 10×100.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. Будапешт, 1962; 400.
2. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: «Мир», 1969; 645.
3. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе // Гематология и трансфузиология. 1995:43(5); 21-24.
4. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: «Наука», 1989; 564.
5. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский образовательный журнал. 1996: №3; 4-16.
6. Скулачев В.П. Законы биоэнергетики // Соросовский образовательный журнал. 1997: №1; 9-14.
7. Филатов И.А. Биоорганическая химия. 1988: 14(6); 725-745.
8. Wilkstrom М., Krab K. Cytochrome oxidase. A. Synthesis. L. 1988.