СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АУКСОТРОФНЫХ РЕГУЛИРУЕМЫХ КЛЕТОК

1. Донорная матрица, включающая:
(a) одну или несколько нуклеотидных последовательностей, гомологичных фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса или гомологичных комплементарной последовательности данного локуса, вызывающего ауксотрофию, и
(b) трансген, кодирующий терапевтический фактор, необязательно связанный с последовательностью контроля экспрессии.
2. Донорная матрица по п. 1, которая является одноцепочечной.
3. Донорная матрица по п. 1, которая является двухцепочечной.
4. Донорная матрица по п. 1, которая представляет собой плазмиду, фрагмент ДНК или вектор.
5. Донорная матрица по п. 4, которая представляет собой плазмиду, содержащую элементы, необходимые для репликации, необязательно содержащие промотор и 3'-UTR.
6. Донорная матрица по любому из пп. 1-5, где трансген фланкирован с двух сторон нуклеотидными последовательностями, гомологичными фрагменту локуса, индуцирующего ауксотрофию или комплементарного ему.
7. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где индуцирующий ауксотрофность локус является геном, кодирующим белок, который вовлечен в синтез, рециркуляцию или утилизацию ауксотрофного фактора.
8. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена из табл. 1 или области, контролирующей экспрессию гена из табл. 1.
9. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего уридинмонофосфатсинтетазу.
10. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего холокарбоксилазу-синтетазу.
11. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам вызывающего ауксотрофию локуса.
12. Донорная матрица по п. 11, где нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам гена уридинмонофосфатсинтетазы или холокарбоксилазы-синтетазы человека или любого из генов в табл. 1.
13. Донорная матрица по любому из пп. 1-12, где последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с данным трансгеном.
14. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой тканеспецифичную последовательность контроля экспрессии.
15. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой промотор или энхансер.
16. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии является индуцибельным промотором.
17. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии является конститутивным промотором.
18. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой посттранскрипционную регуляторную последовательность.
19. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой микроРНК.
20. Донорная матрица по любому из пп. 1-19, где донорная матрица или вектор также содержит маркерный ген.
21. Донорная матрица по п. 20, где маркерный ген содержит по крайней мере фрагмент NGFR или EGFR, по крайней мере фрагмент CD20 или CD19, Myc, HA, FLAG, GFP, гена устойчивости к антибиотикам.
22. Донорная матрица по любому из пп. 1-21, где трансген кодирует терапевтический фактор, выбранный из группы, состоящей из: гормонов, цитокинов, хемокинов, интерферонов, интерлейкинов, связывающих интерлейкины белков, ферментов, антител, слитых с Fc белков, факторов роста, факторов транскрипции, факторов свертывания крови, вакцин, структурных белков, белковых лигандов, рецепторов, антигенов клеточной поверхности, антагонистов рецепторов и костимулирующих факторов, структурных белков, антигенов клеточной поверхности, ионных каналов, эпигенетических модификаторов или белков, редактирующих РНК.
23. Донорная матрица по любому из пп. 1-21, где трансген кодирует T-клеточный антигеновый рецептор.
24. Донорная матрица по любому из пп. 1-21, где трансген кодирует РНК, необязательно регуляторную микроРНК.
25. Вектор, включающий:
(a) одну или несколько нуклеотидных последовательностей, гомологичных фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, или гомологичных комплементарной последовательности данного локуса, вызывающего ауксотрофию, и
(b) трансген, кодирующий терапевтический фактор.
26. Вектор по п. 25, который представляет собой вирусный вектор.
27. Вектор по п. 26, который выбран из группы, состоящей из ретровирусных, лентивирусных, аденовирусных, аденоассоциированных вирусных и герпесвирусных векторов.
28. Вектор по п. 26 или 27, дополнительно содержащий гены, необходимые для репликации вирусного вектора.
29. Вектор по любому из пп. 25-28, при этом трансген с обеих сторон фланкирован нуклеотидными последовательностями, гомологичными фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса или комплементарного ему.
30. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус представляет собой ген, кодирующий белок, который участвует в синтезе, рециркуляции или утилизации ауксотрофного фактора.
31. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена из табл. 1 или участка, контролирующего экспрессию гена из табл. 1.
32. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего уридинмонофосфатсинтетазу.
33. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего холокарбоксилазу-синтетазу.
34. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам вызывающего ауксотрофию локуса.
35. Вектор по п.34, при этом нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам гена уридинмонофосфатсинтетазы или холокарбоксилазы-синтетазы человека или любого из генов в табл. 1.
36. Вектор по любому из пп. 25-35, дополнительно содержащие последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с данным трансгеном.
37. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой тканеспецифичную последовательность контроля экспрессии.
38. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой промотор или энхансер.
39. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой индуцибельный промотор.
40. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой конститутивный промотор.
41. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой посттранскрипционную регуляторную последовательность.
42. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой микроРНК.
43. Вектор по любому из пп. 25-42, дополнительно содержащие маркерный ген.
44. Вектор по п. 43, при этом маркерный ген содержит по крайней мере фрагмент NGFR или EGFR, по крайней мере фрагмент CD20 или CD19, Myc, HA, FLAG, GFP или гена устойчивости к антибиотикам.
45. Вектор по любому из пп. 25-44, при этом трансген кодирует терапевтический фактор, выбранный из группы, состоящей из: гормонов, цитокинов, хемокинов, интерферонов, интерлейкинов, связывающих интерлейкины белков, ферментов, антител, слитых с Fc белков, факторов роста, факторов транскрипции, факторов свертывания крови, вакцин, структурных белков, белковых лигандов, рецепторов, антигенов клеточной поверхности, антагонистов рецепторов и костимулирующих факторов, структурных белков, антигенов клеточной поверхности, ионных каналов, эпигенетических модификаторов или белков, редактирующих РНК.
46. Вектор по любому из пп. 25-44, при этом трансген кодирует T-клеточный антигеновый рецептор.
47. Вектор по любому из пп. 25-44, при этом трансген кодирует РНК, необязательно регуляторную микроРНК.
48. Нуклеазная система для направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус, включающая:
(a) белок cas9 и
(b) направляющую РНК, специфичную для вызывающего ауксотрофию локуса.
49. Нуклеазная система для направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус, включающая мегануклеазу, специфичную для данного вызывающего ауксотрофию локуса.
50. Нуклеазная система по п. 49, при этом мегануклеаза представляет собой ZFN или TALEN.
51. Нуклеазная система по любому из пп. 48-50, дополнительно включающая донорную матрицу по любому из пп.1-24 или вектор по любому из пп. 25-47.
52. Модифицированные клетки-хозяева ex vivo, содержащие трансген, кодирующий терапевтический фактор, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус, причем данные модифицированные клетки-хозяева ауксотрофны по ауксотрофному фактору и способны экспрессировать терапевтический фактор.
53. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, которые представляют собой клетки млекопитающих.
54. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, которые представляют собой клетки человека.
55. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, при этом модифицированные клетки-хозяева выбраны из группы, состоящей из эмбриональных стволовых клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников, плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), соматических стволовых клеток, дифференцированных клеток, мезенхимальных стволовых клеток, нервных стволовых клеток, гемопоэтических стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, жировых стволовых клеток, кератиноцитов, скелетных стволовых клеток, мышечных стволовых клеток, фибробластов, NK-клеток, B-клеток, T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).
56. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, которые происходят из клеток от субъекта, подлежащего лечению модифицированными клетками хозяина.
57. Способ получения модифицированных клеток-хозяев от млекопитающих, включающий: (a) введение в клетки данного хозяина-млекопитающего одной или нескольких нуклеазных систем, поражающих и расщепляющих ДНК в вызывающем ауксотрофию локусе, или нуклеиновой кислоты, кодирующей один или несколько компонентов данной одной или нескольких нуклеазных систем, и (b) донорной матрицы по любому из пп.1-24 или вектора по любому из пп. 25-47.
58. Способ по п. 57, дополнительно включающий введение второй нуклеазы или второй направляющей РНК для наведения на и расщепления ДНК во втором геномном локусе или нуклеиновой кислоты, кодирующей данную вторую нуклеазу или вторую направляющую РНК, а также необязательно (b) второй донорной матрицы или вектора.
59. Способ направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус в клетках млекопитающих ex vivo, включающий контактирование клеток данного млекопитающего с донорной матрицей по любому из пп.1-24 или вектором по любому из пп. 25-47 и нуклеазой.
60. Способ по любому из пп. 57-59, при этом нуклеаза представляет собой ZFN.
61. Способ по любому из пп.57-59, при этом нуклеаза представляет собой TALEN.
62. Способ получения модифицированных клеток-хозяев от млекопитающих, включающий введение в клетки данного хозяина-млекопитающего: (a) полипептида Cas9 или нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид Cas9, (b) направляющей РНК, специфичной для вызывающего ауксотрофию локуса, или нуклеиновой кислоты, кодирующей данную направляющую РНК, и (c) донорной матрицы по любому из пп.1-24 или вектора по любому из пп. 25-47.
63. Способ по п. 62, дополнительно включающий введение в клетки данного хозяина-млекопитающего: (a) второй направляющей РНК, специфичной ко второму вызывающему ауксотрофию локусу, или нуклеиновой кислоты, кодирующей данную направляющую РНК, и необязательно (b) второй донорной матрицы или вектора.
64. Способ направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус в клетках млекопитающих ex vivo, включающий контактирование клеток данного млекопитающего с донорной матрицей по любому из пп. 1-24 или вектором по любому из пп. 25-47, полипептидом cas9 и направляющей РНК.
65. Способ по любому из пп. 62-64, при этом направляющая РНК представляет собой химерную РНК.
66. Способ по любому из пп. 62-64, при этом направляющая РНК включает две гибридизованные РНК.
67. Способ по любому из пп. 57-64, дополнительно включающий образование одного или нескольких одноцепочечных разрывов в вызывающем ауксотрофию локусе.
68. Способ по любому из пп. 57-64, дополнительно включающий образование двухцепочечного разрыва в вызывающем ауксотрофию локусе.
69. Способ по любому из пп. 57-68, при этом вызывающий ауксотрофию локус подвергается модификации путем гомологической рекомбинации с помощью данной донорной матрицы или вектора.
70. Способ по любому из пп. 57-68, при этом стадии (a) и (b) выполняются до или после размножения данных клеток и необязательно культивирования данных клеток.
71. Способ по п. 70, дополнительно включающий (c) отбор клеток, содержащих трансген, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус.
72. Способ по п. 71, при этом отбор включает: (i) отбор клеток, которым для выживания требуется ауксотрофный фактор, и необязательно (ii) отбор клеток, которые содержат трансген, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус.
73. Способ по п. 71, при этом вызывающий ауксотрофию локус представляет собой ген, кодирующий уридинмонофосфатсинтетазу, а клетки отбирают путем контактирования с 5-FOA.
74. Стерильная композиция, содержащая донорную матрицу по любому из пп. 1-24 или вектор по любому из пп. 25-47 либо нуклеазную систему по любому из пп. 48-51 и стерильную воду или фармацевтически приемлемый наполнитель.
75. Стерильная композиция, содержащая модифицированные клетки-хозяева от млекопитающих по любому из пп. 52-56 и стерильную воду или фармацевтически приемлемый наполнитель.
76. Набор, содержащий донорную матрицу по любому из пп. 1-24 или вектор по любому из пп. 25-47 либо нуклеазную систему по любому из пп. 48-51 или указанные модифицированные клетки-хозяева по любому из пп. 52-56 либо их комбинации, необязательно с контейнером или флаконом.
77. Способ экспрессиии терапевтического фактора у субъекта, включающий:
(a) введение модифицированных клеток-хозяев по любому из пп. 52-56,
(b) необязательно введение режима кондиционирования, способствующего приживлению модифицированных клеток, и
(c) введение ауксотрофного фактора.
78. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев и ауксотрофного фактора проводится одновременно.
79. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев и ауксотрофного фактора проводится последовательно.
80. Способ по п. 77, дополнительно включающий продолжение введения данного ауксотрофного фактора регулярно в течение времени, достаточного для усиления экспрессии терапевтического фактора.
81. Способ по п. 77, дополнительно включающий уменьшение введения данного ауксотрофного фактора для снижения экспрессии терапевтического фактора.
82. Способ по п. 77, дополнительно включающий увеличение введения данного ауксотрофного фактора для повышения экспрессии терапевтического фактора.
83. Способ по п. 77, дополнительно включающий прекращение введения данного ауксотрофного фактора для создания условий, приводящих к ингибированию роста или гибели модифицированных клеток-хозяев.
84. Способ по п. 77, дополнительно включающий временное прерывание введения данного ауксотрофного фактора для создания условий, приводящих к ингибированию роста модифицированных клеток-хозяев.
85. Способ по п. 77, дополнительно включающий продолжение введения данного ауксотрофного фактора в течение времени, достаточного для оказания терапевтического эффекта у субъекта.
86. Способ по п. 77, при этом модифицированные клетки-хозяева являются регенеративными.
87. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев включает локализованную доставку.
88. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев включает системную доставку.
89. Способ по любому из пп. 77-88, дополнительно включающий получение клеток-хозяев перед модификацией от субъекта, подлежащего лечению.
90. Способ лечения субъекта с заболеванием, расстройством или нарушением, который включает введение субъекту (a) указанных модифицированных клеток-хозяев по любому из пп.52-56 и (b) указанного ауксотрофного фактора в количестве, достаточном для обеспечения экспрессии терапевтического фактора в терапевтическом количестве.
91. Способ по п. 90, при этом заболевание, расстройство или нарушение выбрано из группы, состоящей из рака, болезни Паркинсона, болезни “трансплантат против хозяина” (GvHD), аутоиммунных заболеваний, гиперпролиферативных заболеваний, злокачественного перерождения, заболеваний печени, генетических заболеваний, включая наследственные генетические дефекты, сахарного диабета с ювенильным началом и заболеваний глазных компартментов.
92. Способ по п. 90, при этом заболевание, расстройство или нарушение затрагивает по меньшей мере одну систему организма, выбранную из группы, состоящей из мышечной, скелетной, кровеносной, нервной, лимфатической, респираторной, эндокринной, пищеварительной, выделительной и репродуктивной систем.
93. Применение модифицированных клеток-хозяев по любому из пп. 52-56 для лечения заболевания, расстройства или нарушения.
94. Модифицированные клетки-хозяева по любому из пп. 52-56 для применения при введении людям или для применения при лечении заболевания, расстройства или нарушения.
95. Ауксотрофный фактор для применения при введении людям, получавшим модифицированные клетки-хозяева-человека по любому из пп. 52-56.
96. Способ облегчения или лечения заболевания или расстройства у нуждающегося в этом субъекта, который включает введение субъекту:
(a) композиции, включающей модифицированные клетки-хозяева, содержащие трансген, кодирующий белок, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус, причем модифицированные клетки-хозяева ауксотрофны по ауксотрофному фактору; и
(b) ауксотрофного фактора в количестве, достаточном для обеспечения терапевтической экспрессии белка.
97. Способ по п. 96, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего уридинмонофосфатсинтетазу (UMPS).
98. Способ по п. 97, при этом ауксотрофным фактором является уридин.
99. Способ по п. 96, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего холокарбоксилазу-синтетазу (HLCS).
100. Способ по п. 99, при этом ауксотрофным фактором является биотин.
101. Способ по п. 96, при этом белок представляет собой фермент.
102. Способ по п. 96, при этом белок представляет собой антитело.
103. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева представляют собой эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки, клетки-предшественники, плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, соматические стволовые клетки, дифференцированные клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки или гемопоэтические клетки-предшественники, жировые стволовые клетки, кератиноциты, скелетные стволовые клетки, мышечные стволовые клетки, фибробласты, NK-клетки, B-клетки, T-клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).
104. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева представляют собой клетки млекопитающих.
105. Способ по п. 104, при этом клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.
106. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева происходят от субъекта, подлежащего лечению модифицированными клетками хозяина.
107. Способ по п. 96, при этом введение композиции и ауксотрофного фактора происходит одновременно.
108. Способ по п. 96, при этом введение композиции и ауксотрофного фактора происходит последовательно.
109. Способ по п. 108, при этом композиция вводится перед ауксотрофным фактором.
110. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора продолжается регулярно в течение времени, достаточного для усиления терапевтической экспрессии белка.
111. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора уменьшается для снижения экспрессии белка.
112. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора увеличивается для повышения экспрессии белка.
113. Способ по п. 96, при этом прекращение введения ауксотрофного фактора вызывает ингибирование роста или гибель модифицированных клеток-хозяев.
114. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора продолжается в течение времени, достаточного для оказания терапевтического эффекта у субъекта.
115. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева являются регенеративными.
116. Способ по п. 96, при этом введение композиции включает локализованную доставку.
117. Способ по п. 96, при этом введение композиции включает системную доставку.
118. Способ по п. 96, при этом заболевание представляет собой лизосомную болезнь накопления (LSD).
119. Способ по п. 118, при этом лизосомная болезнь накопления (LSD) представляет собой болезнь Гоше (типа 1/2/3), болезнь Хантера (MPS2), болезнь Помпе, болезнь Фабри, болезнь Краббе, гипофосфатазию, болезнь Ниманна-Пика типа A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, фенилкетонурию, MLD, болезнь Сандхоффа, болезнь Тея-Сакса или болезнь Баттенса.
120. Способ по п. 101, при этом фермент представляет собой глюкоцереброзидазу, идурсульфазу, б-аглюкозидазу, б-агалсидазу, в-агалсидазу, галактозилцерамидазу, б-асфотазу, кислую сфингомиелиназу, ларонидазу, гепаран-N-сульфатазу, б-N-ацетилглюкозаминидазу, гепаран-б-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазу, б-элосульфазу, гласульфат, в-глюкуронидазу, фенилаланингидроксилазу, арилсульфатазу A, в-гексозаминидазу, б-гексозаминидазу или трипептидилпептидазу 1.
121. Способ по п. 96, при этом заболевание представляет собой атаксию Фридриха, наследственный ангионевротический отек или спинальную мышечную атрофию.
122. Способ по п. 96, при этом белок представляет собой фратаксин, C1-ингибитор эстераз или SMN1.
123. Способ уменьшения размера опухоли или снижения скорости роста опухоли у субъекта, который включает введение субъекту модифицированных клеток-хозяев по любому из пп. 52-56.