Количественное определение суммы сесквитерпеновых лактонов в траве полыни однолетней

УДК 615.32

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММЫ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ В ТРАВЕ ПОЛЫНИ ОДНОЛЕТНЕЙ

Цель исследования -разработка методики количественного определения суммы сесквитерпеновых лактонов в траве полыни однолетней в пересчёте на артемизинин.Для достижения данной цели использовали сочетание метода тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии.В разработанной методике средний процент от-крываемости составляет 99,85%, а относительное стандартное отклонение не превышает 10-15%, что соответствует величине RSD, оптимальной для данного метода анализа биологического объекта.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о пригодности разработанной методики для контроля качества сырья полыни однолетней.

Ключевые слова: полынь однолетняя, Artemisiaannua, артемизинин, сесквитерпеновые лактоны, тонкослойная хроматоргафия, спектрофотометрия.

Введение. Согласно литературным данным сесквитерпеновые лактоны полыни однолетней (ArtemisiaannuaL.) обладают антиульцерогенной, цитотоксической, ан-тиоксидантной, гепатопротекторной и антимикробной активностями [1]. Кроме этого, полынь однолетняя в народной медицине применяется при лечении туберкулёза. Данные разных исследовательских групп показывают, что основным сесквитерпеновым лактоном полыни однолетней является артемизинин [2]. Актуальной задачей является разработка методики, позволяющей оценивать качество сырья этого растения по основной группе действующих соединений - сесквитерпеновым лактонам.

Цель данного исследования - разработать методику количественного определения суммы сесквитерпеновых лактонов в траве полыни однолетней в пересчёте на артемизинин.

Методы исследования. Для достижения данной цели использовали сочетание методов тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии.

Аналитическую пробу сырья надземной части полыни однолетней измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Точную навеску (около 25,0 г) экстрагируют спиртом метиловым в колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане порциями по 20 мл 2 раза и по 15 мл 2 раза, в течение 1 часа в каждом случае. Полученные извлечения фильтруют в круглодонную колбу, фильтрат упаривают при пониженном давлении до сухого остатка, остаток растворяют в хлороформе и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят до метки хлороформом (раствор А). Хроматографирование проводят восходящим способом на пластинках <^огЬШ» ПТСХ-П-А (Россия) 10x10 см, в системе растворителей петролейный эфир - этилацетат 9:1. 0,02 мл раствора А наносят микропипеткой в виде полосы длиной 4 см на линию старта. В качестве свидетеля наносят 0,001% раствор артемизинина. После прохождения фронта растворителя с боковой стороны пластинки на которой был свидетель отрезают ленту и проводят её детектирование раствором: спирт этиловый 96% - кислота серная концентрированная - кислота уксусная - анисовый альдегид в соотношении (170:10:20:1), с последующим нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С. Через 5 минут обнаруживается зона темно-красного цвета с Rf = 0,47±0,03. Отмечают зону, соответствующую артемизинину, и соотносят её с остальной пластинкой. Снимают скальпелем слой сорбента с не-проявленной части хроматографической пластинки в зоне сорбции артемизинина. Элюирование сорбента проводят 10 мл хлороформа в трёхкратной повторности. Элюат фильтруют через стеклянный фильтр №4 в круглодонную колбу вместимостью 50 мл и отгоняют растворитель при пониженном давлении на водяной бане до сухого остатка. Сухой остаток растворяю в спирте метиловом и количественно переносят в мерную колбу на 10 мл которую доводят до метки тем же растворителем раствор (Б).

10 мл раствора Б помещают в мерную колбу объемом 25 мл и доводят до метки раствором натрия гидроксида 0,05 моль/л и выдерживают на водяной бане при 45-50 °С 30 минут, охлаждают и определяют оптическую плотность раствора на спектрофо-

Д.Д. ВИНЮКОВ Д.А. КОНОВАЛОВ

Пятигорская государственная фармацевтическая академия

e-mail: konovalov_da@pochta.ru

тометре марки СФ-46 при длине волны 292 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор 1 мл спирта метилового, доведенного в мерной колбе объемом 50 мл, до метки раствором натрия гидроксида 0,05 моль/л.

Параллельно измеряют оптическую плотность модельного раствора комплекса артемизинина с натрия гидроксидом.

Содержание суммы лактонов в абсолютно сухом сырье в пересчёте на артемизинин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

Бх х а0 х 10 х 10 х 10 х 25

Х =-------х---0--------------------г х 100%

ах х Б0 х 100 х 50 х 0,02 х

где Х - содержание артемизинина,%;

Dx - оптическая плотность исследуемого раствора,

Do - оптическая плотность модельного раствора, а0 - масса артемизинина, г; ах - масса сырья, г;

№ - влажность сырья.

Для разработки оптимальной методики была установлена область линейной зависимости оптической плотности от концентрации анализируемого вещества. Определение линейности проводили на пяти уровнях концентраций от теоретического содержания суммы лактонов в пересчете на артемизинин в траве полыни однолетней, растворы готовили путем разбавления аликвоты и увеличения аликвоты, растворы имели следующие концентрации 50%, 75%, 100%, 125% и 150% соответственно.

Определение повторяемости методики проводили на одном образце сырья полыни однолетней, на шести параллельных измерениях.

Для оценки точности метода были подготовлены пробы с различными навесками сырья.

Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы сесквитерпеновых лактонов в траве полыни однолетней в пересчете на артемизинин в растворах, полученных путем добавления артемизинина к навеске сырья.

Результаты. На рис. 1, видно, что почти все экспериментальные точки лежат на линии тренда. Следовательно, область линейной зависимости наблюдается при концентрациях суммы лактонов в пересчете на артемизинин от 0,008 до 0,024 г/10 мл, табл. 1.

1.2 п у = 0.742х-0,15

0% 53% ' !:<:!% 150% 200%

Концентрация аликвоты. °о

Рис. 1. Зависимость оптической плотности от концентрации аликвоты

Таблица 1

Концентрации суммы лактонов в пересчёте на артемизинин

№ измерения Содержание, % от нормируемого значения (около) Аналитический отклик (оптическая плотность) Содержание суммы лактонов, г\10 мл.

1 50 0,201 0,0083

2 75 0,405 0,00121

3 100 0,614 0,0161

4 125 0,821 0,0202

5 150 0,921 0,0241

Величина коэффициента корреляции составила 0,98, что считается удовлетворительной корреляцией.

Результаты по исследованию повторяемости разработанной методики представлены в табл. 2.

Результаты установления повторяемости методики

Повторность Содержание суммы лактонов в пересчете на артемизинин в абсолютно сухом сырье полыни однолетней, %

1 1,619

2 1,633

3 1,524

4 1,612

5 1,523

6 1,629

Среднее значение 1,588

Относительное стандартное отклонение (RSD),% 3,3%

Относительное стандартное отклонение равно 3,3%, это говорит о том, что методика позволяет получить удовлетворительные по сходимости результаты.

При оценке точности методики на всех трех уровнях определения концентрации суммы лактонов в анализируемых навесках были получены сопоставимые результаты (табл. з).

Таблица 3

Результаты установления точности методики

№ опыта Навеска сырья, г х* (хг Ох) (х. []х)2 Метрологические характеристики

1. 24,2581 1,57 0,014 0,0002

2. 24,1064 1,63 0,046 0,0021

3. 24,3271 1,66 0,076 0,0058

4. 25,2547 1,59 0,006 0,00004 Sx = 0,0675

5. 25,5471 1,54 0,044 0,002 £х х = 0,0225

6. 25,5281 1,61 0,026 0,0007

7. 26,6471 1,43 0,154 0,024 Ах = 0,052

8. 26,5268 1,62 0,036 0,0013 е = 3,28%

9. 26,4892 1,61 0,026 0,0007 % ,3 4, = 2

Среднее значение х = 1,584

Сумма значений 1-І ^Х‘ ^ = 0,03684

Примечание: * - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

Относительное стандартное отклонение равно 4,3% и не превышает величину RSD, предусмотренную для спектрофотометрических методов.

Результаты по установлению правильности методики представлены в табл. 4.

Таблица 4

Определение правильности методики

№ про- бы Количество добавленного стандарта Содержание суммы лактонов в % теоретическое Содержание суммы лактонов в % практическое Открываемость, R, %

1 0 1,61 1,61 100

2 0,05 1,66 1,643 98,97

3 0,05 1,66 1,674 100,84  Я = 99-85

4 0,05 1,66 1,641 102,56

5 0,1 1,71 1,682 98,36

6 0,1 1,71 1,675 98,01 SD=5.332

7 0,1 1,71 1,794 104,91

8 0,15 1,76 1,721 97,78 RSD=5.34%

9 0,15 1,76 1,738 98,75

10 0,15 1,76 1,732 98,40

Примечание: * - содержание суммы сесквитерпеновых лактонов в абсолютно сухом сырье

В разработанной методике средний процент открываемое™ составил 99,85 %, а относительное стандартное отклонение не превышает 10-15%, что соответствует величине RSD, оптимальной для данного метода анализа биологического объекта.

Выводы. Использование сочетания методов тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии позволило разработать методику количественного определения суммы сесквитерпеновых лактонов (в пересчёте на артемизинин) в траве полыни однолетней.

На основании результатов, полученных в процессе валидации методики по параметрам линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности, можно сделать вывод о пригодности разработанной нами методики для контроля качества сырья полыни однолетней.

Список литературы

1. Secondary metabolites of Artemisia annua and their biological activity / R.S. Bhakuni, [et al.] // Current Science. - 2001 - Vol. 80, Is. 1. - P. 35-48.

2. Ferreira, J.F.S. Developmental studies of Artemisia annua: flowering and artemisinin production under greenhouse and field conditions./ J.F.S. Ferreira, J.E. Simon, J. Janick - Planta Medica, 1995, 61:167-170.

QUANTITATIVE DEFINITION OF THE SUM OF SESQUITERPENE LACTONES IN AGRASS OFAWORMWOOD ANNUAL

D.D.VINJUKOV D.A. KONOVALOV

Pyatigorsk state pharmaceutical academy, Pyatigorsk

e-mail: konovalov_da@pochta.ru

Research objective - working out of a technique of quantitative de- finition of the sum of sesquiterpene lactones in a grass of a wormwood an- nual in recalculation on an artemisinin. For achievement of the given purpose used a combination of a method of a thin-layer chromatography and a direct spectrophotometry.

In the developed technique the average percent of a quantification limit makes 99,85%, and the relative standard deviation does not exceed 1015% that corresponds to size RSD, optimum for the given method of the analysis of biological object.

On the basis of the received results, it is possible to draw a conclu- sion on suitability of the developed technique for quality assurance of raw materials of a wormwood annual.

Key words: a wormwood annual, an artemisinin, sesquiterpene lactones, a thin-layer chromatography, a spectrophotometry.