Электрофоретическое разделение и определение аминокислотного состава белков зерновых культур

ИЗВЕСТИЯ

ТОМСКОГО ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ПОЛИТЕХНИЧЕСКОГО __ИНСТИТУТА имени С. М. КИРОВА

Том }\2 1963

ЭЛЕКТРОФОРЕГИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

В. М. КОЛЕСОБ

Одной из наиболее актуальных задач современной органической химии является раскрытие внутренней структуры белковых веществ. В связи с огромными размерами молекул протеинов применение чисто химических методов исследования для установления структуры последних становится явно недостаточным. Совершенно необходимым является привлечение для этой цели помимо биохимических и химических методов также физических и физико-химических методов исследования, начинающих приобретать в современной химии исключительно важное значение.

Белки растительного происхождения, в частности белки зерновых культур, продолжают оставаться до сего времени еще слабо изученными в отношении их физико-химических свойств, и какая-либо общая точка зрения в этом направлении совершенно отсутствует. В наших исследованиях [1] было показано, что по показателям физико-химической характеристики (относительной вязкости, поверхностного натяжения, изоэлектрической точки, удельного вращения, связывания водородных ионов и по количеству общего азота и аминного азота) у вышеис-следованных белковых препаратов наблюдается тенденция к сближению между собой. Это обстоятельство дает основание высказать предположение о присутствии по всей вероятности единой пространственной конфигурации, лежащей в основе строения упомянутых выше белков.

Дальнейшим развитием этих исследований явилась необходимость подвергнуть наши белковые препараты электрофоретическому разделению и изучению сточки зрения их аминокислотного состава.

Изучение аминокислотного состава в проламинах и глютенинах может явиться основанием для дальнейшего исследования в области структуры этих белков, главным образом при определении количества пептидных цепей с последующим установлением природы Ы- и С-амино-кислотных остатков в молекулах этих протеинов.

Материал и методика

Объектом исследования служили нижеследующие препараты белковых веществ: глиадин ржи, глиадин пшеницы, гордеин ячменя, авенин овса и пыреин пырея. Белковые препараты группы проллминов были

92

получены методом Т. Осборпа [2], видоизмененным А. Кизелем [3]. Для экстрагирования пыреина была использована методика, описанная В. Л. Кретовичем [4]. Отмывание клейковины производилось способом П. Н. Шибаева [3]. Гордеин ячменя экстрагировался из клейковины последнего.

Аминокислотный состав проламинов зерновых культур, несмотря на длительный период изучения химического состава их, и-сследован до настоящего времени еще недостаточно полно. В списках аминокислот, характеризующих состав глиадина пшеницы, в монографии Р. Блока и Д. Болинга [6] отсутствуют фенилаланин, серии и валин. По своему химическому составу зерно ячменя и овса приближается к зерну пшеницы и ржи. Однако данные, характеризующие аминокислотный состав этих злаков, весьма ограничены. В таблицах аминокислотного состава белков, приведенных в учебном руководстве Н. П. Козьминой и В. Л. Кре-товича [7], отсутствуют данные о наличии в глиадине пшеницы, гордеи-не и авениие таких важных аминокислот, как глнкоколь, треонин, серии и метионин. Согласно исследованиям Т. Осборна и С. Клэппа [8, 9], в глиадине ржи не было установлено присутствие валина, треонина, ме-тион-ина и в глютенине пшеницы—треонина и метионина. Однако данные, относящиеся к этому периоду исследования белков, значительным образом устарели. В связи с работами Н. В. Цицина [10] по проблемам иырейно-пшеничных гибридов и нахождением некоторыми исследователями [16, 17] клейковины в семенах пырея, не уступающей по своим хлебопекарным качествам клейковине пшеницы, возник интерес к изучению аминокислотного состава пыреина спирторастворимой фракции белков семян пырея. В. Л. Кретович [4] сообщает лишь о содержании двух аминокислот — гистидппа и аргинина, присутствующих в пыреине. В связи с вышеизложенным и было предпринято исследование аминокислотного состава упомянутых выше белков при помощи двухмерной распределительной хроматографии на бумаге [11, 12]. Наличие в испытуемых белках триптофана было подтверждено в отдельной пробе по Фюрту [13].

Результаты

Результаты определения аминокислотного состава приведены в табл. 1. На основании многократно полученных хроматограмм можно было установить присутствие 15 пятен и идентифицировать по показателям ИГ свидетелей 15 различных аминокислот (рис. 1).

Анализируя результаты определения аминокислотного состава изучаемых протеинов, необходимо отметить, что по количественному содержанию многих аминокислот представляется возможным белковые препараты разделить приблизительно на три подгруппы. К первой подгруппе можно отнести глиадины ржи и'пшеницы и пыреин пырея. Гидролизаты глиадина ржи и пшеницы заключают в себе одни и те же аминокислоты, однако в ином количественном соотношении. Различие между ними наблюдается по величине гликоколя, аланина, серина, пролина и триптофана. По количественному содержанию большинства аминокислот пыреин пырея приближается к глиадину ржи.

Вторую подгруппу представляют собой авенин и гордеин. При сравнении количественного содержания некоторых аминокислот, присутствующих в образцах авенина и гордеипа, с содержанием этих аминокислот в родственных им проламинах пшеницы, ржи и пырея, обращаем на себя внимание повышенное против глиадииов и пыреина содержание глютаминовой кислоты, вдвое превышающее содержание фенилаланина, и несколько пониженное содержание треонина, аланина и валина. Ха-

рактерной особенностью этой полгруппы является почти равное количество присутствующих в обоих белках лейцина, глютаминовой кислоты, фенилаланина, гликоколя, треонина и довольно близкое содержание

других аминокислот, за исключением лизина, серина, пролина и отсутствие в авенине триптофана.

Рис. 1. Хроматограмма гидролизата глютенина ржи. Справа налево: пиридин— уксусная кислота; си сох у ч\игл: оутатюл — уксусная кислота: I — цнстии, 2 — лизин, 3 — гистидин, 4 — аргинин, 5 — аспарагиновая кислота, 6 — гликоколь, 7 — серии, 8 — глютаминовая кислота, 9 — треонин, 10 —• аланин, 11 — пролин, 12 — тирозин, 13— валин (метионип), 14-— фепклаланин, 15 — лейцин.

К третьей подгруппе могут быть отнесены глютенин ржи и глюте-

пин пшеницы. Из данных определения аминокислотного состава глютс-ниноз ржи и пшеницы следует, что, как и рассмотренные выше прола-мины, спи заключают в себе те же аминокислоты, но несколько отличаются от них по количественному соотношению последних. Обращает на себя внимание большое сходство по величине содержания в обоих глютенинах валина, лейцина, глютаминовой кислоты и триптофана. По содержанию других аминокислот наблюдается значительное различие.

ß связи с одинаковым значением Rf 'валина и метионина и легкой окисляемостью последнего в процессе гидролиза в 20%-ной HCl наличие метионина не могло быть констатировано с достоверностью.

Электрофоретическое разделение белковых препаратов проводилось на микроаппарате Тизелиуса. Белки растворялись в 0,1 н. уксусной кислоте с pH 2,85 и ионной силой 0,1. Однопроцентные растворы белковых препаратов подвергались диализу против раствора 0,1 н. уксусной кислоты, а затем электрофоретическому анализу.

Электрофорез проводился в течение 1—3,5 час. при сопротивлении 45000—125000 ом, напряжении 250—350 в, силе тока 0,4—2,4 ма.

Таблица 1

Аминокислотный состав белковых препаратов

№ п.п. Аминокислоты Глиадии пшеницы с< п ^ § 3 и. а. о а-3 С к а> (=С Сч о U I Авенин Глютешш пшеницы Глютенин ржи

1 Гистидин 1,05 1,29 1,20 1,35 2,15 2,38 3.63

9 Аргинин ;,82 2,52 3,18 3.60 2,30 2,48 3,84

о .) Лизни 1,15 1.«0 0,75 1, 1Ь 0,52 1,73 3,12

4 Гликоколь 4,43 1,08 2,64 1,45 1,57 4,27 2,95

5 Алании 3,25 2.98 2,91 1,32 2,05 2.88 3,57

6 Валин (метионип] 4, 15 4,55 9.84 2,55 3,65 3,18 2,70

7 Лейцин 6,25 6,15 7,27 7,14 7,05 3,10 2,76

8 Глютаминовая кислота 44,30 43,20 }6,72 49,46 50,58 23,12 24,34

9 Серии 2,06 5,40 5.77 4,85 8, '„0 6,52 4,87

10 Треонин 5,10 5,20 2,76 3, 15 2,53 1,24 3,57

31 Пролин 12,6!) 8,10 9,87 9,36 7,14 7,03 11,72

12 Фенилаланин 3,55 3,15 3,00 6,26 6,52 7,74 2,82

13 Триптофан 0,86 0,47 — 1,85 — 1,35 1,36

14 Гуминовые вещества 4,75 4,40 2,00 2,20 3,50 2,75 4,60

Всего 9 ••,32 189,49 1 87,94 95,70 97,76 1 69,77 75,91

Было показано, что глиадин пшеницы № 1, глиадии пшеницы № 2, глпадин ржи № 2, пыреин и гордеин состоят из четырех фракций; глиадин ржи № 1, глиадин ржи № 3, гордеин № 2 и авенин — из трех фракций (рис. 2). Аналогичные результаты для глиадииа пшеницы были получены Е. И. Медведевой [14] и Милсом [15] при электрофорезе па бумаге и на аппарате Тизелиуса-Свенсона.

Выводы

Методом распределительной хроматографии на бумаге в исследованных белках были найдены аминокислотные остатки гликокола, ала-иина, лейцина, лизина, гистидина, аргинина, глютаминовой кислоты, дксгина, пролина, тирозина, треонина, серина, фенилаланина, валина, аспарагииовой кислоты.

Кроме известных по литературным данным структурных элементов глиадииа в гидролизате глиадина ржи, впервые обнаружены валин

/

Рис. 2. Электрофореграммы бел коны х препаратов.

1 — глиадин ржи № 2; 2—глиадин пшеницы № 1; 3 — глиадин ржи № 3; 4 — гор-деин № 2; 5 — глиадин пшеницы № 2; 6—глиадин ржи № 2; 7 — пыреин; 8 — гоо-деии Лг9 1; 9 —авеннн; 10 -- глиадин ржи Л;ь 1.

'Ю

(+метионин), треонин, цистин и лизин. Впервые также был установлен методом распределительной хроматографии на бумаге аминокислотный состав пыреина, констатировано наличие и определено количественное содержание в авенине треонина и серина и в глютенине пшеницы и глютенине ржи — триптофана.

На основании количественного определения многих аминокислот можно сделать вывод о близости химической природы глиадина, пшеницы, ржи пыреина, гордеипа и авенииа.

Классическим методом электрофореза на аппарате Тизелиуса показано, что препараты проламинов, являясь неоднородными, состоят из четырех фракций (глиадины пшеницы № 1 и № 2, глиадин ржи № 2, юрдеин № 1, пыреин), а некоторые из них (глиадины ржи № 1 и № 3, авенин, гордеин № 2) —из трех фракций, что также позволяет говорить о близкой химической природе исследованных белков.

ЛИТЕРАТУРА

1. В. M К о л е с о в. Физико-химические свойства белков растительного происхождении. Тр. ТГУ, 145, 83, 1957.

2. Т. В. Osborne. The proteins of the wheat rkernel — Carnegie Jnstitution of Washington Puhl, № 84, 1907.

3. A. P. К и з e л ь. Практическое руководство по биохимии растений. М., Био-медгиз, 1934.

4. В. Л. К р е т о в и ч. О химическом составе семян пырея. Докл. ВАСХНИЛ 6, 313, 1937.

5. П. Н. Шибаев. Клейковина ячменя, М. Полиграфкнига. 1945.

6. Р. Блок и Д. Б о л л и н г. Аминокислотный состав белков и пищевых продуктов, М., ИЛ, 1949.

7. Н. П. Козьм и и а, В. Л. К р е т о в и ч. Химия зерна и продуктов его переработки. М., Заготиздат, 1951.

8. Т. Osborne S. С 1 а р p. Americ. J. Physiol, 20. 4, 494, 1907—08.

9. Т. Osborne] S. Cl a pp. Amer. J. Physiol., 17, 231, 1906.

10. H. В. Ц и ц и н. Краткие итоги работы отдела селекции Сибирского института зернового хозяйства. Селекция и семеноводство, 9, 5, 1936.

11. В. М. Кол eco в. Об аминокислотном составе пыреина пырея. Биохимия, 22, № 3, 445-, 1957.

12. В. М. К о л е с о в, М. С. Резниченко. Об аминокислотном составе гордеина ячменя и авенина овса. Биохимия, 21, № 6, 643, 1956.

13. О. Fürth, Z. D i e s с h e. Kritisches und Experimentelles über die Tryptophan-bestimmung in Protein. — Biochem. Zeitschr. 146, 275, 1924

14. E. И. Медведева. О методе выделения глиадина. Известия высших учебных заведений Министерства высшего образования СССР, № 4, 153, 1958.

15 D. L. Mills. Some observations an the dectrophores: s of glia,din. Biochim, et biophys. acia, 14, Л* 2, 274, 1954.

16. M. M. Самсонов. Качество зерна пшенично-пырейных гибридов. Селекция и семеноводство, И, 35, 1936.

17 П. Н. Шибаев. Качество зерна пырея и пшенично-пырейных гибридов. Селекция и семеноводство. 6, 46. 1936.

Известия ТПИ. том ! 12.