СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ПОБЕГОВ И СЕМЯН ВИНОГРАДА

Полезная модель относится к сельскому хозяйству и может быть использована в селекции для размножения винограда в условиях in vitro.
Известен способ стерилизации растительного материала, при котором растительный материал сначала подвергают предварительной очистке, после чего обрабатывают 70 % этиловым спиртом в течение 30-40 сек, а затем препаратом диоцида в течение 5-8 мин (Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. - Ялта.- 1986. с. 23-24 ).
Общие существенные признаки известного и заявляемого способов: предварительная очистка и обработка 70 % этиловым спиртом в течение 30-40 сек.
Недостатком известного способа является применение ртутьсодержащего препарата диоцида. Несмотря на сильное стерилизующее действие этот препарат относится к первой категории особо токсичных веществ, которые действуют как опасные ферментные яды даже в малых концентрациях. Особенно ядовиты пары ртути и ее соединения, которые быстро насыщают замкнутое пространство, создавая опасные условия для здоровья людей.
Известен также способ стерилизации растительного материала, принятый нами в качестве прототипа, при котором растительный материал сначала подвергают предварительной очистке, после чего обрабатывают 70 % этиловым спиртом в течение 30-40 сек, а затем 2-10 % раствором перекиси водорода не менее 20 мин (Калинин.Ф.Л., Сар-
нацкая В.В., Полищук В.Е Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. -К.: Наукова думка, 1980. - С. 67-73).
Общие существенные признаки заявляемого способа и способа-прототипа: предварительная очистка и обработка 70 % этиловым спиртом в течение 30-40 сек.
При обработке молодых побегов и семян винограда раствором перекиси водорода низкой концентрации не достигается достаточная стерилизация, а при повышении концентрации сильно обжигаются ткани растительного материала, что приводит к их гибели. Вместе с тем препарат быстро разлагается на свету, при взаимодействии с органическими веществами. Кроме того, в последнее время отмечено снижение фоновой чувствительности микробов к перекиси водорода и появление устойчивых к этому препарату вариантов бактерий.
В основу заявляемой полезной модели поставлена задача усовершенствовать способ стерилизации побегов и семян винограда, в котором путем использования высокоэффективного, но безопасного для растения и человека препарата обеспечивается стерильность растительного материала, предназначенного для введения в культуру in vitro с целью дальнейшего размножения.
Поставленная задача решается тем, что в способе стерилизации побегов и семян винограда, предусматривающем их предварительную очистку с последующей обработкой 70 % этиловым спиртом в течение 30-40 сек, согласно полезной модели, растительный материал затем обрабатывают раствором гидроксохлорида алюминия в течение 5-15 мин.
Гидроксохлориды алюминия - нетоксичные неорганические полимерные соединения -[AL(OH)3-x CLx]n, алюминий в них содержится не в виде ионов (как у сульфата алюминия), а в виде аквагидроксокомплексов, имеющих достаточно высокий заряд и молекулярную массу, благодаря которому агрегаты формируются в виде цепочно-ячеистых структур с достаточно длинными линейными участками. В процессе нейтрализации аквагидроксокомплекы алюминия способны связывать микроорганику.
При воздействии на микроорганизмы гидрооксихлорид алюминия нарушает ферментативные структуры бактериальной клетки, угнетает гидролитическую и дегид-рогеназную активность бактерий, инактивируя такие ферменты, как амилазы и протеазы, губит споры и вирусы.
Способ осуществляется следующим образом.
Подготовленные побеги или ягоды винограда промывают водопроводной водой с мылом, ополаскивают дистиллированной водой. Стерилизуют сначала 70% этанолом в течение 35 сек, а затем побеги или выделенные из ягод семена обрабатывают раствором гидроксохлорида алюминия 5-15 минут. Трижды промывают стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут) и высаживают на агаризованную питательную среду в пробирки.
Примеры конкретного осуществления способа.
Пример 1. Подготовленные побеги винограда промыли водопроводной водой с мылом, ополоснули дистиллированной водой. После чего, обработали сначала 70% этанолом в течение 35 сек, а затем раствором гидроксохлорида алюминия в течение 10 минут и трижды промыли стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут). Обновили срезы на побегах, разрезали их на одноглазковые черенки и высадили на агаризованную питательную среду в пробирки. Выход асептических эксплантов составил 95,3 %.
Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, однако раствором гидроксохлорида алюминия побеги обрабатывали 5 минут. Выход асептических эксплантов составил 89,1 %.
Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, однако раствором гид-роксохлорида алюминия побеги обрабатывали 15 минут. Выход асептических эксплантов составил 95,7 %.
Пример 4. Ягоды винограда промыли водопроводной водой с мылом, ополоснули дистиллированной водой. После чего, стерилизовали 70% этанолом в течение 35 сек, затем выделенные из ягод семена обработали раствором гидроксохлорида алюминия в течение 10 минут и трижды промыли стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут). Семена высадили на агаризованную питательную среду в пробирки. Выход асептических проростков составил 87,7 %.
Пример 5. Способ осуществляли аналогично примеру 4, однако раствором гидроксохлорида алюминия семена обрабатывали 5 минут. Выход асептических проростков составил 70,0 %.
Пример 6. Способ осуществляли аналогично примеру 4, однако раствором гидроксохлорида алюминия семена обрабатывали 15 минут. Выход асептических проростков составил 89,2 %.
Во всех случаях визуальная оценка полученных эксплантов и проростков показала, что ткани растительного материала были здоровыми и без признаков ожога.
Как видно из примеров, при осуществлении стерилизации побегов и семян винограда заявляемым способом, в котором путем использования высокоэффективного, но безопасного для растения и человека препарата обеспечивается стерильность растительного материала, предназначенного для введения в культуру in vitro с целью дальнейшего размножения.