Определение эпитопной направленности моноклональных антител в иммуноблоттинге

2014, Т. 4, № 1

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Показано, что наиболее выраженным цитотокси-ческим действием обладает штамм B. pseudomallei 110, вызывающий полное инцистирование клеток тетра-химен через 72 ч. Динамика образования цист в со-культурах с другими штаммами соотносилась с их вирулентностью (в наименьшей степени она была выражена при взаимодействии с B. pseudomallei 107, авирулентным для экспериментальных животных).

Штамм B. pseudomallei 110 далее был трехкратно пассирован на золотистых хомячках. Культуры пассированного штамма вызывали гибель экспериментальных животных при введении единичных клеток. При этом уже после однократного пассажа их цито-токсичность для тетрахимен также значительно возрастала по сравнению с исходной, приводя к 100% инцистировнию клеток в течение 24—48 ч совместного инкубирования.

Таким образом, T pyriformis может рассматриваться в качестве эукариотической модели для оценки вирулентности штаммов возбудителя мелиоидоза по степени их цитотоксического действия на клетки простейших.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ИММУНОБЛОТТИНГЕ

И.И. Корсакова1,2, Н.П. Храпова12, Т.В. Замарина12, Е.В. Пименова1, Н.С. Макаров2

1ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 2ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет МЗ РФ

Эпитопная направленность — важная характеристика моноклональных антител (МКА), отражающая их индивидуальные свойства. Ее изучение важно для последующего использования МКА как основы диагностических тестов и для выбора метода очистки антигенов. Эпитоп является очень небольшим участком, встречающимся в составе антигенного комплекса с различной частотой. После электрофореза в денатурирующих условиях эти участки можно выявить в составе отдельных антигенных фракций.

Цель работы: определить эпитопную направленность ряда МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudo-mallei в иммуноблоттинге.

Электрофорез антигенов (водно-солевых (ВСЭ) и формамидных (ФЭ) экстрактов B. pseudomallei) в ПААГ-ДСН и последующий перенос осуществляли по методике H. Towbin Клетки 12 гибридом-проду-центов МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei 100 тиражировали для получения препаративных количеств МКА. Из мышиной асцитической жидкости выделяли моноклональные иммуноглобулины, на их основе готовили иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) по методу P.K. Nakane, A. Kawaio, которые после проверки на специфичность использовали для визуализации полос на нитроцеллюлоз-ных мембранах. Рабочее разведение ИПК составило 1:20. Полученные блоттограммы анализировали с помощью компьютерной программы «TotalLab TL120».

Анализ окрашенных различными способами электрофореграмм позволил обнаружить 16—35 и 4—13 антигенных фракций в составе ВСЭ и ФЭ соответственно, а также установить гликопротеиновую природу изучаемых антигенов.

Число обнаруженных иммуноблоттингом эпи-топов, гомологичных МКА 5С2, было наибольшим. Эпитопы выявлены в составе 17 фракций антигенов с молекулярной массой (м.м.) от 37 до 18,4 kDa.

У остальных ИПК картина эпитопного профиля была разнообразной и зависела от вида антигена и штамма, из которого его получали.

Ни одно из изученных МКА не реагировало с ФЭ серии 5 B. pseudomallei 100, имеющим низкое содержание гликопротеинов.

Таким образом, иммуноблоттинг с применением препаратов ВСЭ и ФЭ штаммов B. pseudomallei позволил установить картину специфического взаимодействия экспериментальных ИПК с биополимерами различной м.м., входящими в их антигенный спектр, а также получить представление об эпитопной направленности использованных в работе МКА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ К ЦИТОКИНАМ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ПРИМЕРЕ ВАКЦИННОГО ШТАММА В. ABORTUS 19 BA

М.В. Костюченко, Н.С. Саркисян, Т.В. Бердникова

ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Цитокины воздействуют на клетку, связываясь со специфическими рецепторами на цитоплазма-тической мембране, которые запускают каскадную реакцию межклеточных взаимодействий, ведущую к регуляции иммунного ответа.

Цель работы — изучить экспрессию рецепторов к цитокинам на субпопуляциях лейкоцитов в процессе формирования иммунного ответа при вакцинации белых мышей В. abortus 19 BA.

Исследовали кровь 60 белых мышей иммунизированных подкожно вакцинным штаммом B. abortus 19 BA в дозе 0,1 мл, содержащей 105 микробных клеток. Контролем служили 30 интактных животных, которым вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме. Забор крови осуществляли на 3, 5, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации, по 6 животных опытной и контрольной группы в каждый период исследования. Методом проточной цитометрии на аппарате «FACSCalibur» с помощью моноклональных антител фирмы Invitrogen определяли рецепторы к интерлейкинам 2, 4 (IL-2, IL-4) и фактору некроза опухоли (TNF) на поверхности лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Так в процессе формирования иммунного ответа отмечалось повышение содержания моноцитов, экс-прессирующих рецепторы к IL-2, на 5 сутки 18,67± 2,25%, по сравнению с контролем 3,13+0,37%, ней-трофилов — на 5 и 14 сутки 15,81+1,19 и 12,20+0,63%, контроль — 4,01+0,22%, Количество моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих рецепторы к IL-4 значительно повышалось на 5 сутки и достигало значений 25,88+3,63 и 26,59+1,94% по сравнению с контролем 4,18+0,39 и 2,60+0,35%. Значение этих показателей оставалось высоким в течение всех сроков наблюдения. Повышение уровня моноцитов и нейтрофилов экспрессирующих рецепторы к TNF отмечалось на 3 сутки. Максимальных значений достигало на 7 сутки 22,39+1,87 и 17,55+1,87% по сравнению с этими показателями у интактных животных 5,03+0,45 и 2,25+0,62%. К 21 суткам ис-