СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ
METHOD OF ASSESSMENT OF ACTIVITY OF THERAPEUTIC AND PROPHYLACTIC PREPARATIONS AGAINST NATURAL SMALLPOX VIRUS

Изобретение относится к способу определения противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов с использованием штамма вируса натуральной оспы и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.
Для оценки эффективности противооспенных лечебных и профилактических препаратов необходимо получение данных о защитных свойствах препаратов при использовании лабораторных животных. При этом необходимо, чтобы течение заболевания, вызванного ВНО, было как можно более близко сходно с клинической картиной оспы у человека. В настоящее время животные, адекватно воспроизводящие заболевание натуральной оспой у человека, не найдены. Опубликованные данные о характере заболевания у животных при заражении вирусом натуральной оспы (ВНО) разрознены, неоднозначны и не дают оснований для заключения о возможности воспроизведения заболевания натуральной оспой у животных в эксперименте и, соответственно, о возможности разработки адекватной модели для изучения эффективности вакцин и лекарственных препаратов против ВНО.
Известна модель (аналог) культур клеток, чувствительных к ВНО, - первичные и перевиваемые клеточные культуры различного происхождения: полученные от человека (фибробласты эмбриона человека, почки, амниотическая ткань), обезьяны, свиньи и др., которые используются для оценки эффективности лечебных и профилактических препаратов против натуральной оспы (http://medicedu.ru/infection/284-naturalnaya-ospa.html7showalHl=1).
Однако культуры клеток имеют ряд ограничений. Для испытания лечебных препаратов эти ограничения обусловлены чрезмерным упрощением весьма сложных биологических систем, сложностью стандартизации культуральной среды, а в случае использования первичных клеток из органов-мишеней - продолжительностью жизни и степенью дифференциации клеток, что приводит к потере физиологических свойств и возникновению непредвиденных феноменов. Кроме этого при использовании культуры клеток не учитывается влияние клеточной регуляции. Важно заметить, что соединения, отклоненные на основе результатов, полученных в опытах in vitro, могут быть эффективными при испытаниях in vivo, и таким образом, при использовании культуры клеток можно получить как ложноположительный результат (препарат показывает положительный эффект на культуре клеток, но не обладает противооспенной активностью при лечении человека), так и ложноотрицательный (препарат не обладает активностью на культуре клеток, но успешно излечивает человека). Вакцинные препараты не могут быть адекватно оценены на культуре клеток, т.к. их основная задача - формирование иммунного ответа организма.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ оценки эффективности лекарств и вакцин, в которых в качестве модели животных для изучения натуральной оспы являются макаки-циномольгусы (Масаса fascicularis), которые используются для оценки эффективности лекарств и вакцин (Jahrling Р.В., Hensley L.E., Martinez M.J., Leduc J.W., Rubins K.H., Relman D.A., Huggins J.W. Exploring the potential of variola virus infection of cynomolgus macaques as a model for human smallpox//Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101(42):15196-200).
8
7
Однако у обезьян заболевание с летальным исходом вызывает введение ВНО в дозе, превышающей 10 БОЕ/животное, и, таким образом, доза для человека, которая приводит к развитию заболевания, превышена более чем в 10 раз. Кроме этого вирус обезьянам вводится внутривенно, и, таким образом, он попадает в клетки-мишени, находящиеся в легких, через кровь, а не через органы дыхания. Следует учесть и тот факт, что обезьяны - модель сложная, опасная с точки зрения биобезопасности и дорогостоящая: работы с обезьянами требуют специальной подготовки и наличия навыков обращения с ними, биоэтические нормы обращения с животными более строгие, и работы с этим видом животных разрешены не во всех лабораториях. Все это в совокупности не позволяет считать обезьян полностью адекватной моделью натуральной оспы, удобной и безопасной для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание способа оценки активности лечебно-профилактических препаратов против натуральной оспы с использованием высоковирулентного штамма вируса натуральной оспы и модели животных, позволяющих более адекватно оценить указанную противовирусную активность.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы, включающем введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой групп по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата, интраназальное заражение их штаммом вируса натуральной оспы, инкубацию вируса в организме животных и определение концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей снижения концентрации вируса в легких, по величине которых судят о противовирусной активности препарата, причем для оценки лечебно-профилактического действия исследуемого препарата его вводят в организм животных за сутки до заражения, в день заражения и ежедневно в течение времени инкубации вируса, отличающемся тем, что в качестве модели животных используют аутбредных разнополых белых мышей ICR массой 7-9 г, в качестве штамма вируса натуральной оспы - штамм Индия-3a (Ind-3a), депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-45.
При проведении экспериментов по изучению специфической активности противовирусных (противооспенных) препаратов и эффективности вакцин в экспериментах in vivo на модели аутбредных разнополых белых мышей ICR (массой 7-9 г), интраназально зараженных штаммом Ind-3a ВНО, эффективность препаратов может быть оценена по нескольким показателям:
50
50
50
- определяют индекс резистентности (ИР), суть которого заключается в отношении показателей ИД для опытных (вакцинированных или леченных) и контрольных животных по формуле: ИР=ИД(опыт) / ИД(контроль);
- определяют процент защиты от инфицирования (ПЗИ), который вычисляли по формуле: ПЗИ = % не инфицированных животных в опыте - % не инфицированных животных в контроле;
- определяют индекс подавления накопления вируса (ИПНВ) в легких, который вычисляли по формуле: ИПНВ = количество вируса в легких контрольной группы животных / количество вируса в легких опытной группы животных.
Для суждения о значимости вычисляемых показателей (ИР, ИПНВ, ПЗИ) на 5% уровне надежности предварительно проводят статистическое сравнение данных, полученных в ходе экспериментов, с использованием следующих статистических методов:
50
- показатели ИД для контроля и опыта сравнивали при использовании метода Спирмена Кербера (Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976. - 598 с.);
2
- показатели долей инфицированных животных в контрольной и опытной группах сравнивали с использованием точного теста Фишера и χ критерия (Закс Л. Статистическое оценивание. М: Статистика, 1976. - 598 с.);
- сравнение уровней накопления вируса в легких у интраназально инфицированных мышей проводили при использовании непараметрического метода Манна Уитни (Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976. - 598 с.).
Характеристика заявляемого штамма. Штамм Ind-3a ВНО выделен от человека в 1967 году. Штамм прошел 2 пассажа на хорио-алантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ГНЦ ВБ «Вектор», номер штамма B12.
Подлинность штамма. Подлинность штамма была подтверждена ПЦР и секвенированием. Эпидемиологический тип штамм - variola major.
2
6
Культуральные свойства. Штамм Ind-3a ВНО при культивировании на монослое клеток Vero вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сут (температура культивирования 37°C, в атмосфере 5% CO). Максимальные титры вируса регистрировали на 4-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero, их величина составляла 8,0×10 БОЕ/мл.
Патогенность для человека. Вирус натуральной оспы относится к 1 группе патогенности по классификации МЗ РФ, летальность для человека при классической или большой оспе (variola major) составляет от 5 до 40%, а при малой оспе (variola minor) - 0,1-2%.
Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение 5-10 и более лет при температуре хранения -70°C.
Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ × 2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.
Пример 1. Определение 50% инфицирующей дозы, динамики накопления вируса в легких и концентрации ВНО (штамм Ind-3a) в органах и тканях аутбредных мышей ICR
Одним из наиболее достоверных показателей инфицирования животных является размножение вируса в клетках органов-мишеней. Размножение ВНО в легких интраназально инфицированных мышей было подтверждено электронно-микроскопическими исследованиями и титрованием на культуре клеток Vero.
Интраназальное инфицирование животных проводили с применением седативных средств. Животному, фиксированному на доске, прикладывали к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступали после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Материал вводили с помощью шприца или автоматической пипетки в нос небольшими каплями на глубину 1,0-1,5 мм. Чтобы не поранить слизистые оболочки животного, для введения материала с использованием шприца брали затупленную иглу с закругленным концом. Общий объем вводимого материала - 30-50 мкл.
Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях (Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Перевод с английского. Washington, D.C.: National Akademy Press; 1996. 138 р.).
50
50
Для определения показателя ИД была изучена динамика накопления вируса в легких у интраназально инфицированных мышей, зараженных дозами вируса от 1,18 до 5,18 lg БОЕ/гол. С этой целью 5 групп беспородных разнополых белых мышей аутбредной популяции ICR (массой 7-9 г) по 6 голов интраназально инфицировали пятью разными дозами BOO (штамм Ind-3a) с десятикратным шагом разведений. В результате 1 ИД составила 2,68 lg БОЕ при стандартном отклонении (Sm), равном 0,30.
После этого в прямых экспериментах по и/н заражению аутбредных мышей популяции ICR была изучена динамика накопления вируса в целевом органе-мишени - легком. Для этого 18 беспородных аутбредных мышей популяции ICR (массой 7-9 г) интраназально инфицировали дозой 4,2 lg БОЕ/гол вируса натуральной оспы (штамм Ind-3a). На 1, 2, 3, 4, 5 и 7-е сут после заражения (п/з) животных умерщвляли с соблюдением требований ветеринарного законодательства, забирали легкие, готовили 10%-ный гомогенат, который титровали на монослое культуры клеток Vero, беря на точку по 3 животных. Средние показатели титров вируса в легких на 1-е сут п/з составили 2,47 lg БОЕ/мл, на 2-е сут - 4,10 lg БОЕ/мл, на 3-й сут - 4,10 lg БОЕ/мл, на 4-е сут - 3,80 lg БОЕ/мл, на 5-е сут - 2,80 lg БОЕ/мл, на 7-е сут - 0,6 lg БОЕ/мл. В результате этого исследования было определено, что максимальное накопление вируса в легком у мыши происходит через 2-3 суток п/з (4,1 lg БОЕ/мл).
В следующей серии экспериментов была изучена динамика накопления ВНО в органах и тканях беспородных разнополых белых мышей аутбредной популяции ICR (массой 7-9 г), интраназально инфицированных ВНО (штамм Ind-3a). Для этого мышей инфицировали дозой вируса 4,2 lg БОЕ/гол. Через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 10 сут п/з животных умерщвляли с соблюдением требований ветеринарного законодательства, забирали органы, готовили 10%-ный гомогенат, который титровали на монослое культуры клеток Vero, беря на точку по 3 животных. В крови, почках, 12-перстной кишке, пищеводе, печени, селезенке, трахеи вирус не был обнаружен ни на один из исследуемых дней п/з. В головном мозге вирус появлялся только на 3-и сут п/з и регистрировался в концентрации 1,3 lg БОЕ/мл. В носовой перегородке мыши вирус появлялся только на 2-е и 3-и сут п/з и регистрировался в концентрации 4,8 и 3,9 lg БОЕ/мл соответственно. Титрование гомогенатов легкого подтвердило данные предыдущего эксперимента: вирус определялся на 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7-е сут п/з, максимальной концентрации в легком (4,9 lg БОЕ/мл) вирус достигал на 3-и сутки. В результате этого исследования было определено, что ВНО не размножается в большинстве органов и тканей мыши, но эффективно размножается в носовой перегородке и легком животного, и в меньшей степени - в головном мозге.
Эти данные были подтверждены электронно-микроскопическим исследованием органов и тканей зараженных мышей. В трахее и бронхах мышей через 5 суток п/з появились деструктивные изменения реснитчатых эпителиоцитов. В эпителии воздухоносных путей отмечаются некрозы. Ткани респираторных органов инфильтрованы воспалительно-клеточными элементами, в цитоплазме макрофагов содержится многочисленные секреторные гранулы. Зарегистрированы морфологические признаки репродукции ВНО в клетках эпителиальной выстилки трахеи и бронхов. В целом, экспериментальные данные патоморфологических исследований соответствуют изменениям, описанным другими авторами при и/н инфицировании ортопоксвирусами.
Таким образом, сходство первичных органов-мишеней и входящих в их состав клеток для ВНО у человека и мыши популяции ICR, а также способность штамма Ind-3a ВНО эффективно размножаться (так же как и у человека) в легких и носовой перегородке мышей популяции ICR позволяет использовать этих животных в качестве модельных животных для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против оспы обезьян и натуральной оспы.
Пример 2. Использование мышей популяции ICR для оценки эффективности лечебно-профилактического действия противооспенных препаратов в экспериментах in vivo
50
Беспородных разнополых белых аутбредных мышей ICR (массой 7-9 г) использовали как модель натуральной оспы для оценки эффективности лечебно-профилактического действия препаратов (НИОХ-14, ST-246) по накоплению ВНО в легких через 3 суток п/з, используя для интраназального инфицирования этих животных 30 ИД штамма Ind-3a вируса в объеме 30 мкл на голову (4,2 lg БОЕ/животное).
Препараты НИОХ-14 и ST-246 являются химическими синтезированными производными пирролидин-2,5-диона и были, исходя из данных предыдущих экспериментов на суррогатных моделях оспы по оценке эффективной дозы, использованы перорально в лечебно-профилактической схеме: препараты вводили однократно в дозе 60 мкг/г массы тела мыши за сутки до заражения, в день заражения и в течение 2 суток после заражения. Результаты этих исследований представлены в таблице.
Таблица
Результаты изучения лечебно-профилактической активности препаратов по подавлению накопления ВНО в легких мышей через 3 суток после интраназального инфицирования дозой вируса 4,2 lg БОЕ/гол. (30 ИД<sub>50</sub>/гол.)
Номер животного в группе
Концентрация ВНО в легких инфицированных мышей (lg БОЕ/легкие) при введении препаратов (доза)
НИОХ-14 (60 мкг/г)
ST-246 (60 мкг/г)
Контроль<sup>∧</sup>
1
<0,70
2,90
4,50
2
2,10
<0,70
3,50
3
<0,70
<0,70
2,30
4
2,90
2,30
2,50
5
2,60
<0,70
4,80
6
<0,70
<0,70
2,50
7
<0,70
2,30
4,40
Средняя концентрация вируса в легких, lg БОЕ/легкие, (M±Sm)
2,50±0,20 (n=3)*
2,50±0,10(n=3)*
3,50±0,20(n=7)
Количество и процент(%) инфицированных мышей
3(43%)#
3(43%)#
7 (100%)
∧
M
Примечание:  - мышам контрольной группы перорально вводили раствор метилцеллюлозы с твином-80, который использовали для растворения препаратов НИОХ-14 и ST-246; - в случаях, когда в гомогенатах легких инфицированных мышей вирус ВНО не выявлялся из-за существующего порога чувствительности метода титрования, использовали значение минимального количества вируса, выявляемого при использованном нами методе титрования (0,70 lg БОЕ/легкое); # - достоверное отличие от контроля (точный тест Фишера p одностороннее <0,05); * - достоверное отличие от контроля по U-критерию Манна Уитни (p<0,05); M - среднее, S - стандартное отклонение; n - число животных в выборке.
По данным, приведенным в таблице, видно, что концентрация вируса в легких мышей при введении препаратов ST-246, НИОХ-14 достоверно ниже, чем в контроле. Кроме того, у 4 из 7 животных (57%) вирус в легких не обнаруживался. Из этого факта можно сделать заключение, что у более чем 50% животных при использовании препаратов НИОХ-14 и ST-246 размножение вируса в легких, которое может привести к развитию заболевания, не происходит. Было также установлено, что противовирусная активность препарата НИОХ-14 достоверно не отличается от таковой для препарата ST-246 по показателю снижения накопление вируса в легких от контроля.
Таким образом, в рамках полученных результатов было показано, что интраназально зараженные штаммом Ind-3a ВНО аутбредные разнополые белые мыши ICR (массой 7-9 г) могут быть успешно использованы в качестве модельных животных для изучения активности противовирусных препаратов против натуральной оспы по показателям снижения концентрации вируса в легких.