СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА

1.  Способ in vitro модификации генома в представляющем интерес геномном локусе в нечеловеческой плюрипотентной клетке млекопитающего, включающий внесение в плюрипотентную клетку
(a) белка Cas9, матричной РНК (мРНК), кодирующей белок Cas9, или ДНК, кодирующей белок Cas9;
(b) направляющей РНК, содержащей РНК CRISPR, которая гибридизируется с целевой последовательностью CRISPR в представляющем интерес геномном локусе и tracrРНК или ДНК, кодирующей направляющую РНК;
(c) крупного направляющего вектора (LTVEC), который составляет по меньшей мере 10 т.п.о. и содержит нуклеотидную вставку, фланкируемую:
(i) 5’ плечом гомологии, которое гомологично 5’ целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе, где 5’ плечо гомологии составляет от около 5 т.п.о. до около 200 т.п.о., и
(ii) 3’ плечом гомологии, которое гомологично 3’ целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе, где 3’ плечо гомологии составляет от около 5 т.п.о. до около 200 т.п.о.,
при этом направляющую РНК конструируют, чтобы избежать распознавания любой последовательности в нуклеотидной вставке, и при этом после внесения в плюрипотентную клетку (a) белка Cas9, мРНК, кодирующей белок Cas9, или ДНК, кодирующей белок Cas9, (b) направляющей РНК или ДНК, кодирующей направляющую РНК  и (c) LTVEC происходит модификация генома плюрипотентной клетки для содержания направленной генетической модификации, включающей удаление области представляющего интерес геномного локуса, где делеция составляет от около 30 т.п.о. до около 200 т.п.о.  и/или введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, где вставка составляет от около 30 т.п.о. до около 200 т.п.о.,
при этом если направленная генетическая модификация включает введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, где вставка составляет от около 30 т.п.о. до около 200 т.п.о., тогда LTVEC составляет по меньшей мере 40 т.п.о.
2. Способ по п. 1, где направленная генетическая модификация содержит делецию области представляющего интерес геномного локуса и направляющую РНК конструируют для создания двухцепочечного разрыва в области представляющего интерес геномного локуса, предназначенного для удаления.
3. Способ по п. 1 или 2, где целевая последовательность CRISPR находится в области 5’ конца, представляющего интерес геномного локуса, предназначенного для удаления.
4. Способ по п.3, где целевая последовательность CRISPR составляет от 50-1000 пар оснований от конечной точки делеции.
5. Способ по п. 1 или 2, где целевая последовательность CRISPR находится в области 3’ конца, представляющего интерес геномного локуса, предназначенного для удаления.
6. Способ по п.5, где целевая последовательность CRISPR составляет от 50-1000 пар оснований от конечной точки делеции.
7. Способ по п. 1 или 2, где целевая последовательность CRISPR расположена в интроне, экзоне, промотере, энхансере, регуляторной области или любой не кодирующей белок области.
8. Способ по п. 1 или 2, где целевая последовательность CRISPR расположена в пределах кодирующей области гена или в пределах регуляторных областей, которые влияют на экспрессию гена.
9. Способ по п. 1 или 2, где направляющая РНК содержит SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
10. Способ по п. 9, где направляющая РНК содержит SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 7.
11. Способ по п. 1 или 2, где РНК CRISPR и tracrРНК вносят вместе в одной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей РНК CRISPR и tracrРНК.
12. Способ по п.11, где одна молекула нуклеиновой кислоты содержит РНК CRISPR и tracrРНК слитые вместе с образованием одной направляющей РНК (онРНК)
13. Способ по п.1 или 2, где РНК CRISPR и tracrРНК вносят отдельно.
14. Способ по п. 1 или 2, где белок Cas9, РНК CRISPR и tracrРНК вносят в виде комплекса белок-РНК.
15. Способ по п. 1 или 2, где
(I)(a) ДНК, кодирующая белок Cas9, находится в форме первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный с первой нуклеиновой кислотой, кодирующей белок Cas9;
(b) ДНК, кодирующая РНК CRISPR, находится в форме второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей РНК CRISPR; и
(c) ДНК, кодирующая tracrРНК, находится в форме третьей экспрессионной конструкции, содержащей третий промотор, функционально связанный с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей tracrРНК;
при этом первый, второй и третий промоторы активны в плюрипотентной клетке, и где первая, вторая и третья экспрессионные конструкции находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты или в отдельных молекулах нуклеиновых кислот; или
(II)(a) ДНК, кодирующая белок Cas9, находится в форме первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный с первой нуклеиновой кислотой, кодирующей белок Cas9; и
(b) ДНК, кодирующая РНК CRISPR, и ДНК, кодирующая tracrРНК, находятся в форме второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей направляющую РНК (нРНК), содержащую РНК CRISPR и tracrРНК;
при этом первый и второй промоторы активны в плюрипотентной клетке, и где
первая и вторая экспрессионные конструкции находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты или в отдельных молекулах нуклеиновых кислот.
16. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация включает одновременное удаление эндогенной нуклеотидной последовательности в представляющем интерес геномном локусе и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус.
17. Способ по п. 16, где удаленная эндогенная нуклеотидная последовательность составляет от 30 т.п.о. до около 110 т.п.о., а нуклеотидная вставка составляет от около 40 т.п.о. до около 140 т.п.о.
18. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация является биаллельной генетической модификацией.
19. Способ по п. 18, где
(a) биаллельная генетическая модификация включает удаление эндогенной нуклеотидной последовательности и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус в двух гомологичных хромосомах; или
(b) модифицированная плюрипотентная клетка является компаунд-гетерозиготной или гемизиготной в представляющем интерес геномном локусе.
20. Способ по п. 19, где направленная генетическая модификация в представляющем интерес геномном локусе в одной хромосоме включает удаление эндогенной нуклеотидной последовательности и введение нуклеотидной вставки.
21. Способ по п. 20, где направленная генетическая модификация включает: (1) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности в представляющем интерес геномном локусе в первой и второй гомологичных хромосомах; и (2) введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус в первой гомологичной хромосоме и разрушение представляющего интерес геномного локуса во второй гомологичной хромосоме.
22. Способ по п. 1 или 2, где LTVEC составляет по меньшей мере 40 т.п.о., или где направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса при этом делеция составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и LTVEC составляет по меньшей мере 15 т.п.о.
23. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация включает введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, где нуклеотидная вставка составляет по меньшей мере 40 т.п.о.; или
где направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса, при этом делеция составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, при этом нуклеотидная вставка составляет по меньшей мере 10 т.п.о.
24. Способ по п. 1 или 2, где нуклеотидная вставка составляет от около 40 т.п.о. до около 140 т.п.о.
25.  Способ по п. 1 или 2, где целевая последовательность CRISPR непосредственно фланкируется последовательностью мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM).
26. Способ по п. 1 или 2, где
(a) 5’ и 3’ плечи гомологии LTVEC в общей сумме составляют от 10 т.п.о. до 150 т.п.о. или 30 т.п.о. до 150 т.п.о в длину и/или
(b) LTVEC составляет от 100 т.п.о. до 300 т.п.о. в длину.
27. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация включает:
(a) замещение эндогенной нуклеотидной последовательности гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательностью;
(b) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности;
(c) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности,
при этом диапазон удаления составляет от по меньшей мере 30 т.п.о. до около 3 м.п.о.;
(d) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности;
(e) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности в диапазоне от по меньшей мере 30 т.п.о. до около 400 т.п.о.;
(f) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности, содержащей гомологичную или ортологичную нуклеотидную последовательность;
(g) вставку химерной нуклеотидной последовательности, содержащей человеческую и нечеловеческую нуклеотидную последовательность;
(h) вставку кондиционального аллеля, фланкируемого целевыми последовательностями сайт-специфической рекомбиназы;
(i) вставку селективного маркера или репортерного гена, функционально связанного с промотором, активным в плюрипотентной клетке; или
(j) их комбинацию.
28. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса при этом делеция составляет по меньшей мере 40 т.п.о. или где направленная генетическая модификация дополнительно включает введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, где вставка составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и удаление области представляющего интерес геномного локуса, при этом делеция составляет по меньшей мере 10 т.п.о.
29. Способ по п. 1 или 2, где удаляемая область представляющего интерес геномного локуса составляет от около 30 т.п.о. до около 110 т.п.о.
30. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса, при этом делеция составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, где вставка составляет по меньшей мере 30 т.п.о.
31. Способ по п. 1 или 2, где представляющий интерес геномный локус является эндогенным локусом плюрипотентной клетки.
32. Способ по п. 1 или 2, где представляющий интерес геномный локус включает гетерологичный или экзогенный сегмент ДНК, который был интегрирован в геном плюрипотентной клетки.
33. Способ по пп. 1 или 2, где представляющий интерес геномный локус представляет собой локус иммуноглобулина.
34. Способ по п. 33, где локус иммуноглобулина кодирует
(a) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина млекопитающего; или
(b) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего.
35. Способ по п. 34, где локус иммуноглобулина включает
(a) неперестроенную нуклеотидную последовательность вариабельной области λ и/или κ легкой цепи млекопитающего; или
(b) перестроенную нуклеотидную последовательность вариабельной области λ и/или κ легкой цепи млекопитающего.
36. Способ по п. 1 или 2, где представляющий интерес геномный локус представляет собой локус рецептора Т-клетки.
37. Способ по п. 36, где локус рецептора Т-клетки представляет собой локус альфа-рецептора Т-клетки.
38. Способ по п. 1 или 2, где представляющий интерес геномный локус включает локус Il2rg, локус ApoE, локус Rag1, локус Rag2, оба локуса Rag1 и Rag2, локус Adamts5, локус Trpa1, локус Folh1, локус Erbb4, локус Lrp5, локус C5 (Hc), локус Ror1 или локус Dpp4.
39. Способ по пп. 1 или 2, где нуклеотидная вставка включает геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
40. Способ по п. 39, где нуклеотидная вставка включает
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
(a) один или более функциональных человеческих генных сегментов V, включающих V1-2, V1-3, V1-8, V1-18, V1-24, V1-45, V1-46, V1-58, V1-69, V2-5, V2-26, V2-70, V3-7, V3-9, V3-11, V3-13, V3-15, V3-16, V3-20, V3-21, V3-23, V3-30, V3-30-3, V3-30-5, V3-33, V3-35, V3-38, V3-43, V3-48, V3-49, V3-53, V3-64, V3-66, V3-72, V3-73, V3-74, V4-4, V4-28, V4-30-1, V4-30-2, V4-30-4, V4-31, V4-34, V4-39, V4-59, V4-61, V5-51, V6-1, V7-4-1, V7-81 или их комбинацию;
(b) один или более функциональных человеческих генных сегментов D, включающих D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27 или их комбинацию; или
H
H
H
H
H
H
H
(c) один или более функциональных генных сегментов J, включающих J1, J2, J3, J4, J5, J6 или их комбинацию.
41. Способ по п. 1 или 2, где нуклеотидная вставка включает геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека.
42. Способ по п. 41, где нуклеотидная вставка включает
(a) один или более человеческих генных сегментов Vκ, включающих Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ 7-3, Vκ 2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40 или их комбинацию;
(b) один или более человеческих генных сегментов Vλ, включающих Vλ3-1, Vλ4-3, Vλ2-8, Vλ3-9, Vλ3-10, Vλ2-11, Vλ3-12, Vλ2-14, Vλ3-16, Vλ2-18, Vλ3-19, Vλ3-21, Vλ3-22, Vλ2-23, Vλ3-25, Vλ3-27 или их комбинацию; или
(c) один или более человеческих генных сегментов Jκ, включающих Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 или их комбинацию.
43. Способ по п. 1 или 2, где нуклеотидная вставка включает полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере область рецептора Т-клетки человека.
44. Способ по п. 43, где рецептор Т-клетки представляет собой рецептор Т-клетки альфа.
45. Способ по п. 1 или 2, где нуклеотидная вставка включает по меньшей мере один аллель заболевания.
46. Способ по п. 45, где нуклеотидная вставка включает по меньшей мере один аллель заболевания человека из человеческого гена.
47. Способ по п. 1 или 2, где направленная генетическая модификация приводит к гуманизированному геномному локус, включающему: (a) вставку гомологичной или ортологичной человеческой нуклеотидной последовательности; (b) замещение эндогенной нуклеотидной последовательности гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательностью; или (c) их комбинацию.
48. Способ по п. 47, где направленная генетическая модификация включает замену эндогенной нуклеотидной последовательности гомологичной или ортологичной человеческой нуклеотидной последовательностью.
49. Способ по п. 48, где направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса, при этом делеция составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, где вставка составляет по меньшей мере 30 т.п.о.
50. Способ по п. 49, где удаленная область составляет от 30 т.п.о. до около 110 т.п.о., а нуклеотидная вставка составляет от около 40 т.п.о. до около 140 т.п.о.
51. Способ по п. 1 или 2, где LTVEC составляет от 100 т.п.о. до 300 т.п.о., 5’ и 3’ плечи гомологии в общей сумме составляют от 30 т.п.о. до 150 т.п.о и направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса, при этом делеция составляет от 30 т.п.о. до  110 т.п.о., и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномного локуса, при этом вставка составляет от  40 т.п.о. до 140 т.п.о.
52. Способ по п. 1 или 2, где LTVEC составляет от 20 т.п.о. до 250 т.п.о. в длину, при этом 5’ и 3’ плечи гомологии в общей сумме составляют от 20 т.п.о. до 200 т.п.о в длину, и где направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса, при этом делеция составляет от 30 т.п.о. до  110 т.п.о., и введение нуклеотидной вставки в представляющий интерес геномный локус, при этом вставка составляет от  40 т.п.о. до  140 т.п.о., и где направляющую РНК конструируют для создания двухцепочечного разрыва в области представляющего интерес геномного локуса, предназначенного для удаления.
53. Способ по пп. 1 или 2, где плюрипотентная клетка представляет собой плюрипотентную клетку грызуна.
54. Способ по п. 53, где плюрипотентная клетка грызуна представляет собой крысиную или мышиную эмбриональную стволовую (ЭС) клетку.
55. Способ по п. 54, где плюрипотентная клетка грызуна представляет собой крысиную ЭС клетку.
56. Способ по п. 55, где крысиную ЭС культивируют  на слое питающих клеток митотически инактивированных фибробластов эмбриона мыши со средой 2i, состав которой приведен в таблице 3,
где направленная генетическая модификация может быть передана через зародышевую линию.
57. Способ по п.55 или 56, дополнительно включающий
(a) выявление модифицированной крысиной ЭС клетки, содержащей направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе;
(b) внесение модифицированной крысиной ЭС клетки в крысиный эмбрион-хозяин; и
(c) вынашивание крысиного эмбриона-хозяина суррогатной матерью, при этом суррогатная мать производит крысиное поколение F0, содержащее направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе.
58. Способ по п.54, где плюрипотентная клетка грызуна представляет собой мышиную ЭС клетку.
59. Способ по п.58, дополнительно включающий
(a) выявление модифицированной мышиной ЭС клетки, содержащей направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе;
(b) внесение модифицированной мышиной ЭС клетки в мышиный эмбрион-хозяин; и
(c) вынашивание мышиного эмбриона-хозяина суррогатной матерью, при этом суррогатная мать производит мышиное поколение F0, содержащее направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе.