АНТИ-CemX АНТИТЕЛА, СПОСОБНЫЕ СВЯЗЫВАТЬСЯ С migE ЧЕЛОВЕКА НА В ЛИМФОЦИТАХ
ANTI-CemX ANTIBODIES BINDING TO HUMAN migE IN B LYMPHOCYTES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение касается создания и применения антител, которые могут эффективно связываться с доменом СεmX на мембраносвязанном IgE (mIgE), экспрессированном на поверхности человеческих В лимфоцитов. Обнаружено, что только моноклональные антитела, специфические для определенных сегментов СεmX, такие как GLAGGSAQSQRAPDRVL и HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR, могут эффективно связываться с mIgE на человеческих В клетках и, следовательно, пригодны для направленного воздействия на эти В клетки для лечения заболеваний, опосредованных IgE.
Уровень техники
IgE играет центральную роль в опосредовании реакций гиперчувствительности типа I, ответственных за возникновение аллергических заболеваний, включающих аллергическую астму, аллергические риниты, атопические дерматиты и другие. Аллергические реакции - это реакции иммунной системы на безвредные вещества внешней среды, такие как пылевые клещи, пыльца деревьев и травянистых растений, некоторые пищевые продукты и лекарства и укусы пчел и огненных муравьев. В таких реакциях связывание аллергена с IgE на поверхности базофилов и тучных клеток вызывает образование поперечных связей в IgE и агрегацию соответствующих IgE.Fc, рецепторов типа I IgE.Fc или FcεRI. Эта агрегация рецепторов затем активирует сигнальный путь, приводящий к экзоцитозу гранул и высвобождению фармакологических медиаторов, таких как гистамин, лейкотриены, триптаза, цитокины и хемокины. Высвобождение этих медиаторов из тучных клеток и базофилов вызывает различные патологические проявления аллергии.
Анти-IgE антитела, которые связываются со свободным IgE в крови и в интерстициальной жидкости и с mIgE на В клетках, но не с IgE, связанным с FcεRI на базофилах и тучных клетках, были разработаны для лечения опосредованных IgE аллергических заболеваний. Лечение гуманизированным анти-IgE антителом omalizumab (коммерческое название Xolair) продемонстрировало множество фармакологических эффектов по ослаблению гиперчувствительности типа I при различных аллергических проявлениях. Антитело связывается с IgE с высоким сродством в сайте СН3 домена Fc, который перекрывается со связывающим сайтом FcεRI. Следовательно, терапия основана на связывании антитела со свободным IgE и с mIgE на В лимфобластах и на В клетках памяти, что приводит к снижению общего уровня свободного IgE в крови и в интерстициальной жидкости.
Связывание анти-IgE со свободным IgE предотвращает связывание IgE с FcεRI на поверхности базофилов и тучных клеток. Поскольку FcεRI, не занятый IgE, не стабилен и впоследствии интернализуется и деградирует, уменьшение свободного IgE при связывании анти-IgE также постепенно снижает содержание FcεRI на базофилах и тучных клетках. Были найдены свидетельства других эффектов терапии антителами, включая нейтрализацию цитокинэргической активности, ослабление общей воспалительной активности и, возможно, удаление аллергенов путем накопления IgE-анти-IgE иммунных комплексов.
s
L
s
L
Один из авторов (T.W.Chang) данного изобретения обнаружил, что, кроме антигенного сайта на СН3 IgE, с которым связывается omalizumab, на mIgE человека имеется другой антигенный сайт, обозначаемый как СεmX, пригодный для направленного действия на В лимфоциты, экспрессирующие mIgE. CεmX - это сегмент из 52 аминокислот, локализованный между доменом СН4 и С-терминальным мембраносвязанным сегментом связанной с мембраной ε цепи человека (mε). Было показано, что у большинства исследованных лиц mε без CεmX (mε) присутствует в минимальных количествах, в то время как цепь mε с CεmX (mε) экспрессируется доминантно. Все m РНК для ε цепи свободного секретируемого IgE и для mε и mε цепей mIgE возникают в результате альтернативного сплайсинга ε РНК транскрипта. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности CεmX уникальны среди всего разнообразия белков и ДНК. Таким образом, CεmX образует уникальный антигенный сайт для направленного воздействия на mIgE и mIgE-экспрессирующие В клетки.
L
L(CH2-CM)
Исследовательская группа Chang ранее сообщила о нескольких СεmX-специфичных мышиных моноклональных антителах, включающих а20, которые могут связываться с рекомбинантными белками, содержащими сегмент CεmX, и с клетками клеточной линии SKO-007, которые являются производными миеломы человека, экспрессирующими человеческий mIgE, и с клетками клеточной линии СНО, которые трансфектированы геном, соответствующим сегменту домена СН2 через цитоплазматический конец mε (mε; СМ; цитоплазма). Показано, что моноклональное антитело а20 и все разработанные ранее антитела связываются с пептидным сегментом 8-а, RADWPGPP, остатками #45-52 на С-терминальном конце 52 а.а. домена CεmX
Раскрытие изобретения
Данное изобретение относится к разработке и идентификации антител, специфичных к домену СεmX человеческого mIgE, способных связываться с mIgE на человеческих В лимфоцитах. Оно также относится к использованию этих антител для лечения аллергических и других заболеваний, опосредованных IgE.
L(CH2-CM)
L(CH2-CM)
При изучении анти-СεmX моноклонального антитела а20, которое было разработано исследовательской группой Chang, было обнаружено, что а20 хорошо связывается с клеточными линиями, трансфектированными геном mε, такими как клеточная линия СНО или клеточная линия NS0, которые не экспрессируют Igα (CD79a), Igβ (CD79b), CD21, CD19, CD81 и другие белки, ассоциированные с рецепторами В клеток (BCR). Однако было обнаружено, что а20 плохо связывается с клеточными линиями, трансфектированными геном mε, которые экспрессируют Igα, Igβ и другие ассоциированные с BCR белки, такими как клеточная линия Ramos. Авторами было сделано предположение, что антигенный эпитоп на СεmX, распознаваемый а20, может быть блокирован определенным(и) белком(ами), ассоциированным(и) с BCR. Поэтому моноклональное антитело а20 и его гибридные или гуманизированные версии не пригодны для использования у больных людей in vivo с целью направленного действия на В лимфобласты и клетки памяти, экспрессирующие mIgE.
Если пептидный эпитоп RADWPGPP - единственный эпитоп для индуцирования ответа антител, все моноклональные антитела, генерируемые с помощью гибридомной техники с использованием мышей, иммунизированных человеческими CεmX-содержащими белками, будут специфичны к этому пептидному сегменту. Однако если этот эпитоп - доминантный эпитоп, но не единственный иммуногенный эпитоп, могут образоваться дополнительные моноклональные антитела, специфичные к другим антигенным эпитопам на СεmX. Возможно, что на СεmX имеется эпитоп(ы), связывание которого с антителом не блокируется ассоциированными с BCR белками. Если это так, то может быть разработано антитело, которое связывается с IgE на В клетках и которое может быть использовано для направленного воздействия на эти В клетки.
В приведенных далее примерах авторы успешно показали, что хотя RADWPGPP - доминантный эпитоп, он не является единственным иммуногенным и антигенным эпитопом на СεmX. Кроме того, были обнаружены моноклональные антитела 4В12 и 26Н2, которые связываются с CεmX на антигенных эпитопах, не локализованных в сегменте RADWPGPP. Эти моноклональные антитела не конкурируют с антителом а20 при связывании с CεmX. Они связываются с mIgE на В клетках значительно сильнее, чем а20, и значительно эффективнее, чем а20, вызывают зависящий от антитела цитолиз и апоптоз mIgE-экспрессирующих клеток.
Эти примеры показывают, что моноклональные антитела, такие как 4В12 и 26Н2, могут связываться с mIgE на В лимфоцитах человека и пригодны для использования их с целью направленного воздействия на экспрессирующие mIgE В лимфобласты и В клетки памяти с целью подавления синтеза IgE. Антитела в гибридной или гуманизированной форме будут полезны для применения больными с опосредованными IgE аллергическими заболеваниями, такими как аллергическая астма, аллергические риниты и атопические дерматиты. Поскольку показано, что нейтрализация IgE с помощью анти-IgE эффективно лечит холодовую крапивницу, хроническую крапивницу, холинэргическую крапивницу, хронические риносинуситы, системный мастоцитоз, кожный мастоцитоз, аллергический бронхолегочный аспергиллез, рекуррентную идиопатическую ангиоэдему и интерстициальный цистит или связанные с эозинофилами желудочно-кишечные нарушения, такие антитела, как 4В12 и 26Н2, тоже могут быть использованы для лечения этих разнообразных заболеваний.
Приведенные далее примеры позволяют предположить существование потенциально полезных свойств пептидов, распознаваемых 4В12 и 26Н2, для индуцирования иммунного ответа против CεmX и, следовательно, против экспрессирующих mIgE В клеток. Пептиды и их аналоги со сходными антигенными свойствами, то есть со способностью связываться с антителами анти-CεmX, такими как 4В12 и 26Н2, могут быть использованы индивидуально или в комбинации с молекулярными конструктами, также содержащими компоненты, способные индуцировать Т-хелперы. Такие конструкты могут вызывать активную иммунизацию против mIgE-экспрессирующих В клеток и достигать, таким образом, эффектов подавления общего синтеза IgE.
Пример 1: Новые анти-CεmX моноклональные антитела, связывающие антигенные сайты, иные чем RADWPGPP
L
L
L
s
5
Чтобы вызвать анти-CεmX иммунный ответ, мышей BALB/c дважды иммунизировали подкожным введением 50 мкг солюбилизированных в n-андецил-β-d-мальтопиранозиде (UDM; Anatrance) рекомбинантных белков IgE.Fc, которые были эмульсифицированы в TiterMax Gold адьюванте (Sigma-Aldrich), с двухнедельными интервалами в соответствии с рекомендациями производителя. Не следуя протоколу гипер-иммунизации, авторы получали мышей, продуцировавших антитела не только к доминантному эпитопу RADWPGPP. Последнее стимулирование осуществляли внутрибрюшинно с помощью 0,1 мг солюбилизированных в UDM рекомбинантных белков IgE.Fc без адьюванта. За день до слияния NS0 клетки пересевали в свежую среду DMEM (Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной - нагреванием телячьей сыворотки (FBS; Invitrogen) и 1% пенициллин-стрептомициновой смеси (100×Pen-Strep раствор; Invitrogen) при плотности клеток 5×10 клеток/мл. Через три дня после последнего стимулирования собирали клетки селезенки иммунизированных мышей и дважды промывали их средой DMEM без сыворотки. После промывания клетки селезенки и клетки NS0 подвергали слиянию, добавляя 1 мл предварительно нагретого 50% полиэтиленгликоля 1500 (PEG 1500, Roche Applied Science) при постоянном мягком перемешивании клеток кончиком пипетки в течение 1 мин, добавляя 2 мл предварительно нагретой не содержащей сыворотки DMEM в течение 2 мин и, наконец, добавляя 8 мл не содержащей сыворотки DMEM в течение 2 мин. После центрифугирования при 200×g в течение 10 мин слившиеся клетки ресуспендировали в 600 мл HAT среды [среды DMEM с добавлением 2% гипоксантин-амидоптерин-тим идиновой смеси (50×HAT раствор; Invitrogen), 10% BM-Condimed H1 (Roche Applied Science), 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% пенициллин-стрептомициновой смеси] и размещали в 30 96-ячеечных культуральных планшетах по 200 мкл/ячейку. На третий день в каждую ячейку добавляли по 100 мкл среды HAT. На 7 и 10 день среду обновляли, отсасывая половину объема из каждой ячейки и замещая ее средой HAT. На 14 день использовали супернатанты гибридомы для отбора анти-СεmX mAbc, связывающихся с UDM-солюбилизированными белками mIgE.Fc или mIgE.Fc с помощью фермент-зависимого иммуносорбентного анализа (ELISA).
s
s
3
450
L
s
Для отбора гибридом, секретирующих анти-СεmX mAbc, с помощью ELISA, очищенные UDM-солюбилизированные белки mIgE.Fc или mIgE.Fc наносили на 96-ячеечные планшеты MaxiSorp (Nunc) в количестве 50 нг/ячейку в 0,1 М NaCO при 4°С и оставляли на ночь. Покрытые белком ячейки блокировали 200 мкл 1% BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали три раза, добавляя по 200 мкл/ячейку PBS с 0,05% Твин-20 и добавляя затем в ячейки по 100 мкл супернатантов гибридомы. Инкубацию выполняли при комнатной температуре в течение 2 часов. Все ячейки аспирировали и промывали 6 раз, добавляя по 200 мкл/ячейку PBS с 0,05% Твин-20. Планшеты инкубировали с разбавленными 1:10000 конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) анти-мышиными IgG антителами козы (Chemicon) в течение 1 часа (100 мкл/ячейку). Затем все ячейки аспирировали и промывали 6 раз, добавляя по 200 мкл/ячейку PBS с 0,05% Твин-20. Наконец, ячейки проявляли с помощью 50 мкл/ячейку раствора субстрата тетраметил бензидина (ТМВ) (Sure Blue™, KPL) и реакцию останавливали добавлением 50 мкл/ячейку 1N HCl. Измеряли поглощение при OD на ридере ELISA. Из >4000 гибридомных клонов, выделенных из двух слияний, 17 клонов продемонстрировали по показаниям ELISA специфичность к mIgE.Fc, а не к mIgE.Fc.
3
450
Чтобы исследовать специфичность анти-СεmX mAbc к СεmX, различные СεmX-специфические клоны тестировали затем на способность реагировать с 3 синтетическими пептидами, представляющими 3 последовательных сегмента СεmX, разделенных С остатком, локализованным в позиции #18, и сегментом СНС, локализованным в #39-41. Конкретно, пептид Р1 содержит последние 4 аминокислотных остатка СН4 цепи mε и первые 17 аминокислотных остатков (#1-17), а именно GLAGGSAQSQRAPDRVL из СεmX; пептид Р2 содержит 20 аминокислотных остатков #19-38, а именно HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR, из СεmX; пептид Р3 содержит терминальные 11 аминокислотных остатков (#42-52), а именно GAGRADWPGPP из СεmX, и первые 4 аминокислотных остатка из следующих migis областей, а именно N-терминальную внеклеточную область мембраносвязывающего пептида mε цепи. Все пептиды синтезировали в Исследовательском центре геномики (Genomics Reseqarch Center, Academica Sinica (Taipei, Taiwan)). Пептиды растворяли в PBS при концентрации 10 мг/мл. Все пептиды наносили на 96-ячеечные MaxiSorp планшеты по 500 нг/ячейку в 0,1 М NaCO (pH 9,6) при 4°С и оставляли на ночь. Покрытые белком ячейки блокировали, добавляя по 200 мкл 1% BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали три раза, добавляя по 200 мкл/ячейку PBS с 0,05% Твин-20 и добавляя затем к ячейкам по 100 мкл 1 мкг/мл анти-CεmX mAbs. Инкубацию выполняли при комнатной температуре в течение 2 часов. Все ячейки аспирировали и промывали 6 раз, добавляя по 200 мкл/ячейку PBS с 0,05% Твин-20. Планшеты инкубировали с разбавленными 1:10000 конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) анти-мышиными IgG антителами козы (Chemicon) в течение 1 часа. После 6-кратного промывания PBS с 0,05% Твин-20 добавлением по 200 мкл/ячейку в каждую ячейку добавляли по 50 мкл/ячейку раствора ТМВ субстрата. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл/ячейку 1N HCl. Измеряли поглощение при OD на ридере ELISA. Из многих CεmX - специфических моноклональных антител, приготовленных в наших экспериментах, только 4В12 и 26Н2 не реагировали с Р3 пептидом, содержащим RADWPGPP. 4B12 реагировал с пептидом Р1, а 26Н2 с пептидом Р2. Все остальные CεmX-специфические моноклональные антитела реагировали с Р3 (Фигура 1). Таким образом, инкубировали с разбавленными 1:10000 конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) анти-мышиными IgG антителами козы (Chemicon) в течение 1 часа.
Пример 2: 4B12 и 26Н2 связываются с mIgE на mIgE-экспрессирующих В клетках
L(CH2-CM)
s(CH2-CM)
L(CH2-CM)
s(CH2-CM)
L
s
L
s
2
s
L
L
L
7
6
Авторы далее тестировали способность разных CεmX-специфических моноклональных антител связываться с клеточными линиями СНО и Ramos, которые были трансфектированы рекомбинантной ДНК, кодирующей mε или mε. Обе трансфектированные клеточные линии СНО соответственно продуцировали mε или mε, ни один из которых не образует полного В клеточного рецептора с корецепторами Igα и Igβ, поскольку клетки СНО не экспрессируют эти белки. Обе трансфектированные клеточные линии Ramos, соответственно, продуцировали mIgE.Fc или mIgE.Fc, образующие комплексы со своими нативными корецепторами. Чтобы исследовать связывание анти-СεmX mAbc с нативным СεmX, клетки СНО или Ramos, экспрессирующие mIgE.Fc или mIgE.Fc, ресуспендировали в FACS буфере [PBS, 1% FBS, 0,1% азида натрия и 2 мМ ЭДТА (рН 8,0)] при концентрации 10 клеток/мл. Затем 10клеток инкубировали 30 мин на льду с 100 мкл супернатантов гибридомы, после чего их отмывали FACS буфером. Связанные антитела регистрировали инкубацией в течение 30 мин на льду с меченным FITC кроличьим фрагментом F(ab'), специфичным для мышиного IgG (AbD Secrotec), и последующим двукратным отмыванием FACS буфером до начала анализа. Эксперименты с использованием проточной цитометрии выполняли на FACSCanto II проточном цитометре (DD Bioscience) и анализировали с помощью программного обеспечения FCSExpress (De Novo software). Было показано, что все CεmX-специфические моноклональные антитела не связываются с СНО и Ramos клетками, экспрессирующими mIgE.Fc. Было показано, что все CεmX-специфические моноклональные антитела связываются с СНО клетками, экспрессирующими mIgE.Fc. Однако только 4В12 и 26Н2 могли связываться с Ramos клетками, экспрессирующими mIgE.Fc, в то время как все другие CεmX-специфические моноклональные антитела не могли связываться с Ramos клетками, экспрессирующими mIgE.Fc (фигура 2).
Пример 3: 4В12 и 26Н2 индуцируют зависящую от антител клеточную цитотоксичность против В клеток, экспрессирующих mIgE
L
L
6
5
Для исследования активности зависящей от антител клеточной цитотоксичности (ADCC) гибридных анти-CεmX mAbs авторы использовали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) в качестве эффекторных клеток для направленного воздействия на Ramos клетки, экспрессирующие mIgE.Fc. PBMCs выделяли из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Taiwan Blood Service Foundation) центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) и замораживали в 90% FBS/10% ДМСО (Hybri-Max™; Sigma-Aldrich). Перед использованием PBMCs оттаивали и культивировали в течение ночи при концентрации 2×10 клеток/мл в среде IMDM (Invitrogen) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% пенициллин-стрептомициновой смеси. Чтобы идентифицировать клетки-мишени в совместной с PBMCs культуре, Ramos клетки, экспрессирующие mIgE.Fc, метили 2,5 мкМ сукцинимидиловым эфиром диацетата 5-(и 6)-карбоксифлуоресцеина (CFDA, SE; Invitrogen) в 0,1% BSA/PBS в течение 10 мин при 37°С. После трех отмываний холодной средой RPMI (Invitrogen), содержащей 10% FBS, концентрацию клеток доводили до 10 клеток/мл. Для титрования отношений эффектор/мишень (Е/Т) 20000 меченых клеток в 200 мкл полной среды RPMI обрабатывали антителами в концентрации 1 мкг/мл в течение 30 мин при 37°С и затем соединяли с равным объемом PBMCs при разных отношениях Е/Т от 50 до 3,125. Для титрования антител 20000 меченых клеток в 200 мкл полной среды RPMI опсонизировали разными концентрациями антитела (1000-0.01 нг/мл) в течение 30 мин при 37°С, а затем соединяли с PBMCs при отношении Е/Т 25:1. Чтобы измерить не зависящий от антитела лизис клеток, меченые клетки-мишени также инкубировали с PBMCs без антител при данных отношениях Е/Т. К концу 24-часовой инкубации мертвые клетки окрашивали с помощью 2,5 мкг/мл 7-амино актиномицина (7-AAD; Invitrogen) в течение 15 мин на льду. Клетки анализировали на Becton Dickinson FACSCanto II проточном цитометре. Живые клетки-мишени определяли как процент CFSE-положительных/7-AAD-отрицательных клеток при анализе точечной диаграммы. Процентную долю клеток, лизированных при данном отношении Е/Т, вычисляли по следующей формуле: 100 × [(% живых клеток-мишеней в не зависящем от антител контроле - % живых клеток-мишеней в образце)/% живых клеток-мишеней в не зависящем от антител контроле]. Наблюдали активность ADCC с4В12, с26Н2 и omalizumab при различных отношениях Е/Т. При отношении Е/Т 50 с4В12, с26Н2 и omalizumab вызывали до 60% специфического лизиса; напротив, са20 был менее активен и вызывал только 10-20% специфического лизиса (фигура 3А). Кроме того, значительная ADCC наблюдалась, если концентрация с4В12 и с26Н2 была выше чем 0,01 мкг/мл. При максимальной дозе 10 мкг/мл специфический лизис клеток-мишеней антителами с4В12 и с26Н2 находился в интервале от 80% до 90%, в то время как са20 вызывал до 50% специфического лизиса (фигура 3В). Положительный контроль rituximab, направленный против CD20, и omalizumab эффективно индуцировали ADCC дозозависимым образом при различных отношениях Е/Т. Таким образом, авторы сделали вывод, что с4В12 и с26Н2 - более мощные анти-CεmX mAbs, чем са20, при опосредовании ADCC, и могут эффективно мобилизовать эффекторные клетки для направленного воздействия на mIgE-экспрессирующие В клетки in vivo.
L
Пример 4: Гибридные антитела анти-CεmX mAbs индуцируют апоптоз Ramos клеток, экспрессирующих связанные с мембраной IgE.Fc.
5
L.
2
2
L
Для регистрации экспозиции фосфатидилсерина (PS) Ramos клетки (5×10клеток/мл), экспрессирующие mIgE.Fc, инкубировали с гибридными антителами анти-CεmX mAbs, omalizumab или контрольными антителами с указанными концентрациями в полной культуральной среде в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки обрабатывали козьим фрагментом F(ab'), специфическим для Fc фрагмента человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) при концентрации 10 мкг/мл и далее инкубировали 24 часа при 37°С. Регистрацию экспозиции фосфатидилсерина (PS) осуществляли, окрашивая клетки в 200 мкл аннексинового буфера [10 мМ HEPES/NaOH (pH 7,4), 140 мМ NaCl, 5 мМ CaCl], содержащего Annexin V, меченный флуоресцеин изотиоцианатом (FITC) - (BioVision), разбавленного 1/200, и 2,5 мкг/мл пропидиум иодида (propidium iodide) (PI, Sigma-Aldrich), в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Клетки анализировали на проточном цитометре FACSCanto II. Апоптотические клетки определяли как процентное отношение Аннексин-положительные/PI отрицательные клетки при анализе точечной диаграммы. Приблизительно 80% Ramos клеток, экспрессирующих mIgE.Fc, были мертвы, поскольку при увеличении концентраций с4В12, с26Н2 или omalizumab, но не са20, наблюдался апоптоз с максимальной индукцией при 1 мкг/мл (фигура 4А).
L
2
L
5
5
Для регистрации апоптотических ядер Ramos клетки, экспрессирующие mIgE.Fc (5×10 клеток/мл), инкубировали с гибридными антителами анти-CεmX mAbs, omalizumab или контрольными антителами с концентрацией 1 мкг/мл в полной культуральной среде в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки обрабатывали козьим фрагментом F(ab'), специфическим для Fc фрагмента человеческого IgG, при конечной концентрации 10 мкг/мл и далее инкубировали 48 часов при 37°С. 5×10 клеток инкубировали в 0,5 мл пропидиум иодида (PI)/в растворе Тритона (0,1% цитрата натрия, 0,1% Тритона Х-100, 15 мкг/мл PI и 100 мкг/мл РНК-азы А в PBS; все от Sigma-Aldrich) в течение 1 часа в темноте на льду. Флуоресценцию PI определяли на проточном цитометре FACSCanto II. Содержание ДНК в интактных ядрах записывали на линейной шкале. Апоптотические ядра, содержащие гиподиплоидную ДНК, излучающую флуоресценцию в каналах ниже пика G0/G1, определяли в процентах к полной популяции. Значительное увеличение клеточной популяции с гиподиплоидной ДНК наблюдалось в экспрессирующих mIgE.Fc Ramos клетках, обработанных с4В12, с26Н2 или omalizumab (фигура 4В).
L
2
L
r
L
r
r
5
6
Для регистрации каспазы 3 и расщепления полимеразы поли(АДФ-рибозы) (PARP) Ramos клетки, экспрессирующие mIgE.Fc (5×10 клеток/мл), инкубировали с гибридными антителами анти-CεmX mAbs, omalizumab или контрольными антителами с концентрацией 1 мкг/мл в полной культуральной среде в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки обрабатывали козьим фрагментом F(ab'), специфическим для Fc фрагмента человеческого IgG, при концентрации 10 мкг/мл и далее инкубировали 24 часа при 37°С. 5×10 клеток отмывали охлажденным до 0°С PBS и ресуспендировали в 100 мкл охлажденного до 0°С RIPA буфера [20 мМ Триса (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Тритона-Х 100, 0,5% дезоксихолата, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 5 мМ ЭДТА и ингибитор протеаз (Sigma-Aldrich). Лизаты инкубировали 20 мин на льду. Пробы центрифугировали в течение 20 мин при 16000×g и 4°С. Супернатанты переносили в новые 1,5 мл пробирки и хранили при -80°С. Количество белка в каждом осветленном лизате определяли способом Protein DC (Bio-Rad Laboratories) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Каждую пробу нормировали на полное содержание белка и подвергали SDS-электрофорезу в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), после чего добавляли к PVDF мембранам (GE Healthcare). Кроличьи поликлональные антитела к каспазе-3 и PARP получали от Cell Signaling Technology и применяли в разведениях 1:500. Конъюгированные с HRP козьи антикроличьи вторичные IgG антитела (Sigma-Aldrich) применяли в разведениях 1:10000. Мембраны готовили с EGL-реагентом (Immobilon™ Western; Millipore). Эквивалентную белковую загрузку проверяли по пятну, соответствующему антителу к β-актину (Sigma-Aldrich). Через 24 часа после обработки экспрессирующих mIgE.Fc Ramos клеток с4В12, с26Н2 или omalizumab, но не са20, наблюдали расщепление каспазы на M фрагменты по 19 и 17 - Kda. Кроме того, в обработанных с4В12, с26Н2 или omalizumab экспрессирующих mIgE.Fc Ramos клетках наблюдали расщепление PARP с помощью антитела, различающего M 116 кДа интактной PARP и M 89 кДа продукта деградации (фигура 4С).
Краткое описание чертежей
Фигура 1 демонстрирует три синтетических пептида, представляющих последовательные сегменты CεmX и способность реагировать различных анти-CεmX mAbc с этими пептидами. Аминокислотные остатки домена CεmX показаны жирным шрифтом.
L
s
Фигура 2 демонстрирует связывание различных анти-hu4B12 mAbc с клеточными линиями СНО или Ramos, экспрессирующими белки mIgE.Fc или mIgE.Fc.
L
L
Фигура 3А демонстрирует, что гибридные антитела с4В12 и с26Н2 индуцируют ADCC против экспрессирующих mIgE.Fc Ramos клеток при различных отношениях Е/Т. Фигура 3В демонстрирует, что гибридные с4В12 и с26Н2 индуцируют ADCC против экспрессирующих mIgE.Fc Ramos клеток дозозависимым образом.
L
L
L
Фигура 4А демонстрирует, что экспозиция PS, индуцированная гибридными с4В12 и с26Н2 на экспрессирующих mIgE.Fc Ramos клетках, дозозависима. Фигура 4В демонстрирует, что в обработанных гибридными антителами с4В12 и с26Н2 Ramos клетках, экспрессирующих mIgE.Fc, наблюдаются апоптотические ядра. Фигура 4С демонстрирует, что в обработанных гибридными антителами с4В12 и с26Н2 Ramos клетках, экспрессирующих mIgE.Fc, наблюдается расщепление каспазы 3 и PARP.
L
H
L
H
L
Фигура 5 демонстрирует линейное расположение аминокислотных последовательностей V и V родительского мышиного антитела 4В12, выбранных матриц зародышевых клеток человека KV2 и HV4 для V и V, соответственно, и гуманизированного антитела 4В12 (hu4B12), обозначенного в последовательностях как «Replace». Это антитело hu4B12 имеет такое же сродство к рекомбинантным белкам СεmX и к Ramos клеткам, экспрессирующим mIgE.Fc, как химерные 4В12 (с4В12).
Литература
Родственные патентные документы
US 5091313 2/1992, Chang
US 5254671 10/1993, Chang
US 5260416 11/1993, Chang
US 5274075 12/1993, Chang
US 5292867 3/1994, Chang
US 5342924 8/1994,  Chang
US 2009/0010924 A1, Wu
Другие ссылки
Davis FM, Gossett LA, Chang TW (1991) An epitope on membrane-bound but not secreted IgE: implications in isotype-specific regulation. Bio/Technology 9: 53-56.
Peng С, Davis FM, Sun LK, Liou RS, Kim YW, Chang TW (1992) A new isoform of human membrane-bound IgE. J Immunol 148: 129-136.
Chen, H.Y., Liu, F.T., Hou, C.M.H., Huang J.S.W., Sharma, B.B. and Chang, T.W. (2002) Monoclonal antibodies against CεmX domain in human membrane-bound IgE and their potential on targeting IgE-expressing В cells. Int. Archives Allergy & Immunol. 128, 315-324.