ИЗМЕНЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНА ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ NKT-КЛЕТКАМИ
MODULATION OF ANTIGEN IMMUNOGENICITY BY ADDITION OF EPITOPES RECOGNIZED BY NKT CELLS

Область техники
Настоящее изобретение относится к пептидам или полипептидам, способным рекрутировать и активировать NKT-клетки, и их использованию при лечении инфекций, вызванных внутриклеточными организмами, или опухолей и предотвращению заболеваний с помощью вакцинации.
Уровень техники
Хронические инфекционные заболевания, вызываемые внутриклеточными патогенами, трудно поддаются лечению, поскольку у инфицированных клеток уменьшается поверхностная экспрессия ряда молекул, которые в норме позволили бы иммунной системе специфически распознать упомянутые выше инфицированные клетки. Примерами являются микобактериальные инфекции, при которых инфицированные клетки ингибируют экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), тем самым препятствуя узнаванию T-лимфоцитами линии дифференцировки CD8 (посредством узнавания MHC класса I) и лимфоцитами линии дифференцировки CD4 (посредством узнавания MHC класса II). В действительности множество бактерий и вирусов выработали способы, позволяющие избежать узнавания инфицированных клеток.
В некоторой степени аналогичные механизмы позволяют опухолям избежать обнаружения. Некоторые из таких опухолей, по меньшей мере, при воспалительных процессах экспрессируют детерминанты MHC класса II. Недавние эксперименты показали, что даже в случае повышенного CD8 узнавания пептидов, полученных из опухоли презентирующей MHC класса I, например, в результате вакцинации, общее воздействие на рост опухоли остается умеренным.
Как при хронической инфекции внутриклеточными патогенами, так и при опухолях существует острая необходимость разработки новых способов распознавания и уничтожения инфицированных или опухолевых клеток, соответственно.
Современной практикой является вакцинация против инфекционных заболеваний. Тем не менее, в значительном количестве случаев эффективность вакцинации ограничена преимущественной индукцией специфических антител к патогенам и отсутствием или недостаточной активацией иммунных клеток, которые должны распознавать инфицированные клетки. Таким образом, предотвращение вирусных и бактериальных заболеваний путем вакцинации часто имеет ограниченную эффективность. Можно найти примеры эффективности некоторых вакцин против вирусных заболеваний, таких как вирус гриппа, ротавирус или даже полиовирус, по меньшей мере, в некоторых областях земного шара. В ряде случаев антигены, которые предполагалось использовать для вакцинации, являются слабыми иммуногенами, и, вследствие большого разнообразия MHC детерминант, наблюдается значительное варьирование эффективности от одного субъекта к другому.
Вакцинация против аллергических заболеваний также страдает от ограничений, имеющих отношение или к слабой иммуногенности аллергенов, или к отсутствию контроля за рисками, связанными с введением аллергена субъекту, определенно склонному к проявлению аллергических симптомов.
Существует необходимость в более эффективных и более безопасных способах вакцинации как против инфекционных агентов, так и против аллергенов.
Натуральные T клетки-киллеры (NKT) составляют отдельную линию дифференцировки необычных T-лимфоцитов, распознающих антигены, презентируемые молекулой неклассического MHC комплекса CD1d. В настоящее время описано два подкласса NKT-клеток. Наиболее распространены NKT-клетки типа 1, также называемые инвариантными NKT-клетками (iNKT). Они характеризуются наличием альфа-бета T-клеточного рецептора (TCR), состоящего из инвариантной альфа-цепи, Vальфа14 у мыши и Vальфа24 у человека. Данная альфа-цепь соединена с переменным, хотя и ограниченным числом бета-цепей. NKT-клетки типа 2 обладают альфа-бета TCR, но с полиморфной альфа-цепью. Однако очевидно, что существуют другие подклассы NKT-клеток, фенотип которых все еще не полностью определен, но которые имеют общие характерные черты, будучи активируемыми гликолипидами, презентируемыми в тесной связи с молекулой CD1d.
Как правило, NKT-клетки экспрессируют комбинацию рецепторов клеток-натуральных киллеров (NK), включая NKG2D и NK1.1. NKT-клетки являются частью системы врожденного иммунитета, которую можно отличить от системы адаптивного иммунитета по тому факту, что клеткам не требуется размножения перед достижением полной эффекторной способности. Активация NKT-клеток приводит к различным эффектам. Такие клетки высвобождают предварительно образованные медиаторы, включая большой набор цитокинов (включая IL-4, IFN-гамма, IL-21 и IFN-альфа), которые способствуют выработке антител В-клетками, при этом предполагается, что высвобождение цитокинов также может оказывать влияние на CD4+ T клетки (Burrows et al Nature Immunology 2009, 10; 669-671). В контексте настоящего изобретения, увеличение активации B-клеток и активация рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (MHC) класса II CD4+ T клеток было бы целесообразным.
Единица распознавания для NKT-клеток, молекула CD1d, обладает структурой, близко сходной со структурой молекулы MHC класса I, включая наличие бета-2 микроглобулина. Она характеризуется глубоким углублением, окаймленным двумя альфа-цепями и содержащим высокогидрофобные остатки, которые взаимодействуют с липидными цепями. Углубление открыто с обоих концов, что обеспечивает возможность размещения более длинных цепей. Каноническим лигандом CD1d является синтетический альфа-галактозилцерамид (альфа GalCer). Однако было описано множество альтернативных природных лигандов, включая глико- и фосфолипиды, природный липид сульфатид, обнаруженный в миелине, микробные фосфоинозитолманнозид и альфа-глюкуронозилцерамид. Существующее общее мнение сводится к тому (смотри обзоры, например, Matsudaetal, Current Opinion in Immunology 2008, 20: 358-368 и Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206), что CD1d связывает только лиганды, содержащие липидные цепи или в большинстве случаев типичную структуру, состоящую из липидного хвоста, углубленного в CD1d, и концевой группы остатка сахара, которая выступает из CD1d.
Пептиды не считаются способными активировать NKT-клетки посредством презентации CD1d. Однако было сделано предположение о том, что длинные гидрофобные пептиды, содержащие объемные аминокислотные остатки, могут связываться с CD1d (Castano et al. Science 1995, 269: 223-226). Наблюдения, сделанные при использовании библиотек фагов, экспрессирующих пептиды произвольных последовательностей с неустановленной физиологической значимостью, обеспечили возможность установления теоретического консенсусного мотива (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226 и смотри ниже).
Известно, что Castano et al показали, что активированные клетки представляют собой CD8+ T клетки, а именно рестриктированные по MHC класса I клетки, и не являются NKT-клетками. Эти данные специалисту в этой области техники говорят о том, что отсутствуют доказательства того, что гидрофобные пептиды презентируются молекулами CD1d. Физиологическая значимость заявлений, сделанных Castano et al, в дальнейшем подвергалась сомнению вследствие невозможности вызвать (образование) NKT-клеток по общепринятым протоколам иммунизации (Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20: 358-368 and Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Искусственные системы, такие как иммунизация клетками, трансфицированными для сверхэкспрессии CD1d и загруженными in vitro пептидом, полученным из овальбумина, были способны вызвать образование NKT-клеток. Аналогично внутрикожная иммунизация плазмидной ДНК вместе с мышиным CD1d и ко-стимулирующими молекулами индуцирует цитолитические рестриктированные по CD1d T клетки (Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Гидрофобные пептиды, содержащие структурный мотив, состоящий из ароматического остатка в положении P1 и P7 и алифатической цепи в положении P4, заявленные Castano et al (Science 269: 223, 1995), содержат основной мотив для CD1d-связывающих эпитопов. Как описано выше, выводы, сделанные Castano et al, не подтверждаются данными.
Нами было неожиданно обнаружено, что пептиды, содержащие гидрофобную аминокислотную последовательность, на самом деле способны вызывать активацию NKT-клеток.
Кроме того, активация NKT-клеток дает возможность увеличения эффективности вакцин против инфекционных заболеваний и против аллергенов благодаря большим количествам цитокинов, секретируемых NKT-клетками, которые способствуют стимулированию выработки В-клеток и активации рестриктированных по классу II T клеток (Burrows et al Nature Immunology 2009, 10: 669-671) и, таким образом, производству антител.
Если бы эпитопы белков могли связываться с CD1d, то введение CD1d-связывающего мотива в белок могло бы повысить активацию NKT-клеток, что могло бы привести или к индукции гибели антиген-презентирующей клетки, что было бы необходимо для лечения инфекций внутриклеточными патогенами или опухолей, или увеличению иммуногенности антигенов, что было бы целесообразно при вакцинации против инфекционных заболеваний или аллергии.
Примеры инфекций внутриклеточными патогенами включают микобактериальные инфекции, внутриклеточные бактериальные инфекции, вирусные заболевания и паразитические инфекции. Примерами опухолей являются любые опухоли, экспрессирующие CD1d. Примерами антигенов, используемых для вакцинации, являются вирусные белки, используемые при противогриппозной вакцинации, пероральной вакцинации против ротавируса или против вируса полиомиелита и вакцинации против аллергена.
Конкретнее, введение CD1d-связывающего мотива может быть использовано, когда желательно повысить «убивающую» активность NKT-клеток по отношению к антиген-презентирующим клеткам или увеличить продукцию цитокинов NKT-клетками и посредством этого увеличить иммуногенность.
Создание нового CD1d связывающего мотива(ов) в пределах природной последовательности пептидов или полипептидов или введение CD1d-связывающего мотива(ов) в такие пептиды или полипептиды для рекрутирования и активации NKT-клеток составляет основу настоящего изобретения.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к применению пептидов или полипептидов для лечения инфекций внутриклеточными патогенами у субъекта путем увеличения уничтожения клеток, содержащих такие патогены.
Настоящее изобретение также относится к применению пептидов или полипептидов для лечения опухолей у субъекта путем увеличения распознавания и уничтожения опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также имеет отношение к применению пептидов или полипептидов в целях вакцинации субъекта антигенами, полученными от инфекционных агентов или аллергенами.
Мы сделали неожиданное наблюдение, что пептиды могут презентироваться молекулами CD1d и активировать NKT-клетки. Активация таких клеток приводит к приобретению цитолитических свойств по отношению к клетке, презентирующей пептид, связанный с CD1d, и высвобождению цитокинов.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из внутриклеточного патогена, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем добавления, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива к указанному пептиду или полипептиду, в качестве медикамента для лечения у субъекта инфекции, вызванной указанным внутриклеточным патогеном.
В одном аспекте настоящее изобретение также имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из опухоли, модифицированного путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в указанный пептид или полипептид, в качестве медикамента для лечения у субъекта указанной опухоли.
В одном аспекте настоящее изобретение также имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из внеклеточного инфекционного агента, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в указанный пептид или полипептид, в качестве медикамента для предотвращения указанной инфекции у субъекта.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного выделенного иммуногенного пептида или полипептида, полученного из аллергена, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива в указанный пептид или полипептид, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта аллергических реакций.
Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что создание CD1d-связывающего мотива при любом из вышеуказанных показаний, подразумевает, что, будучи презентируемым молекулой CD1d, экспрессированной антиген-презентирующей клеткой, указанный мотив распознается NKT-клетками и активирует указанные NKT-клетки.
В дополнительном аспекте изобретение также относится к применению, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, полученного из внутриклеточного патогена, опухоли, инфекционного агента или аллергена, который модифицирован путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или путем добавления, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива к указанному пептиду или полипептиду для привлечения и активации NKT-клеток, в качестве медикамента для активации у субъекта цитолитической активности и продукции цитокинов CD4+ NKT-клетками у указанного субъекта.
В любом из вышеперечисленных вариантов использования указанный пептид или полипептид, полученный из внутриклеточного патогена, может представлять собой любой пептид или полипептид, полученный из вирусов, бактерий, микобактерий или паразитов с внутриклеточным жизненным циклом. Вирусы включают ssДНК-, dsДHK- и РНК-вирусы, например, Herpesviridae, Flaviviridae и Picornaviridae, вирусы гриппа, кори и иммунодефицита. Бактерии и микобактерий включают Mycobacterium tuberculosis, другие микобактерий, патогенные для человека или животных, Yersinia, Brucella, Chlamydiae, Mycoplasma, Rickettsiae, Salmonellae и Shigellae. Паразиты включают Plasmodiums, Leishmanias, Trypanosomas, Toxoplasma gondii, Listeria, Histoplasma.
В любом из вышеперечисленных вариантов применения указанный пептид или полипептид, полученный из опухоли, может представлять собой любой пептид или полипептид, полученный из: (1) онкогенов, таких как MAGE, идентифицированный в некоторых меланомах; (2) протоонкогенов, таких как циклин D1, экспрессируемый карциномами мягких тканей, такими как карцинома почки или паращитовидной железы, а также во множественной миеломе; (3) белков, полученных из вирусов, таких как белки вируса Эпштейна-Барр в некоторых карциномах и некоторых лимфомах ходжкинского типа; (4) факторов выживания (surviving factors), являющихся антиапоптотическими факторами, таких как сурвивин или bc12; (5) клонотипических детерминант, таких как идиотипические детерминанты, полученные из B-клеточного рецептора при фолликулярной лимфоме или множественной миеломе или детерминант T-клеточного рецептора в T-клеточных злокачественных опухолях.
В любом из вышеперечисленных вариантов применения указанный пептид или полипептид получают из инфекционного агента, включая вирусы, бактерии и паразитов.
В любом из вышеперечисленных вариантов применения указанный пептид или полипептид, полученный из аллергена, может представлять собой любой пептид или полипептид, полученный из:
- пищевых аллергенов, присутствующих в арахисе, рыбе, например треске, яичном белке, ракообразных, например креветках, молоке, например коровьем молоке, пшенице, злаках, фруктах семейства Розоцветных (яблоках, сливах, клубнике), овощах семейств Лилейных, Крестоцветных, Пасленовых и Зонтичных, лесных орехах, кунжуте, арахисе, соевых бобах и других аллергенов семейства бобовых, пряностей, дыни, авокадо, манго, инжира, бананов и т.д.,
- аллергенов клещей, обитающих в домашней пыли, полученных из Dermatophagoides spp или D. pteronyssinus, D. farinae и D. microceras, Euroglyphus maynei или Blomia sp.,
- аллергенов насекомых, например тараканов или Перепончатокрылых,
- аллергенов пыльцы, в частности пыльцы деревьев, трав и сорняков,
- аллергенов животных, в частности кошек, собак, лошадей и грызунов,
- аллергенов грибов, в частности Aspergillus, Allernaria или Cladosporinmu, и
- производственных аллергенов, присутствующих в таких продуктах, как латекс или амилаза.
Кроме того, изобретение дополнительно включает выделенные вирусные векторы, характеризующиеся тем, что они содержат, по меньшей мере, один пептид или полипептид, полученный из внутриклеточного патогена, из опухоли, из инфекционного агента или из аллергена, в котором, по меньшей мере, один новый CD1d-связывающий мотив создается в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или в который вводится, по меньшей мере, один CD1d-связывающий мотив,
Определения
Термин "пептид" при использовании в данном описании относится к молекуле, включающей аминокислотную последовательность, содержащую от 2 до 200 аминокислот, соединенных пептидными связями, но которая может в определенном варианте осуществления содержать структуры, не являющиеся аминокислотами (как, например, сшивающее органическое соединение). Пептиды в соответствии с изобретением могут содержать любые из 20 обычных аминокислот или их модифицированные варианты, или могут содержать не встречающиеся в природе (искусственные) аминокислоты, включенные путем химического пептидного синтеза или с помощью химической или ферментативной модификации. Термин "полипептид" при использовании в данном описании в большинстве случаев относится к более длинным пептидам или белкам.
1
Термин "эпитоп", использующийся в данном описании, относится к одному или нескольким участкам (которые могут определять конформационный эпитоп) белка, который/ые специфически узнается/ются и связываются антителом или его фрагментом (Fab, Fab2' и т.д.) или рецептором, присутствующим на клеточной поверхности B или T-клеточного лимфоцита, и который способен, с помощью указанного связывания, индуцировать иммунный ответ.
Термин "антиген", использующийся в данном описании, относится к структуре макромолекулы, содержащей один или более гаптенов и/или содержащей один или более T-клеточных эпитопов. Как правило, указанная макромолекула представляет собой белок или пептид (с или без полисахаридов) или состоит из композиции белков и содержит один или более эпитопов; указанная макромолекула в этом описании может альтернативно называться "антигенный белок" или "антигенный пептид".
Термин "аллерген" относится к специфической разновидности антигена, отличающейся способностью вызывать образование антител IgE изотипа у предрасположенных лиц.
Термин "T-клеточный эпитоп" или "T-клеточная антигенная детерминанта" в контексте настоящего изобретения относится к доминирующему, субдоминирующему или второстепенному T-клеточному эпитопу, т.е. части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором клеточной поверхности T-лимфоцита. Является ли эпитоп доминирующим, субдоминирующим или второстепенным зависит от иммунного ответа, вызванного к данному эпитопу. Доминантность зависит от частоты, с которой такие эпитопы распознаются T-клетками и способны активировать их среди всех возможных T-клеточных эпитопов белка. В частности, T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый молекулами MHC класса I или MHC класса II.
Термин "NKT-клеточный эпитоп (детерминанта)" относится к части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором на поверхности клетки T-лимфоцита. В частности, NKT-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый CD1d молекулами.
Термин "CD4+ эффекторные клетки" относится к клеткам, принадлежащим к подклассу CD4-положительных T-клеток, функцией которых является обеспечение содействия другим клеткам, таким как, например, B-клетки. Эти эффекторные клетки обычно называются Th-клетками (T-хелперные клетки), при наличии различных подклассов, таких как ThO, Th1, Th2 и Thl7 клетки.
Термин "NKT-клетки" относится к клеткам системы врожденного иммунитета, характеризующимся тем фактом, что они несут рецепторы, такие как NK1.1 и NKG2D, и распознают эпитопы, презентируемые молекулой CD1d. В контексте настоящего изобретения NKT-клетки могут принадлежать как к подклассу типа 1 (инвариантные), так и типа 2.
"Молекула CD1d" относится к молекуле, не происходящей от MHC, состоящей из 3 альфа-цепей и антипараллельного набора бета-цепей, сгруппированных в глубокий гидрофобный желобок, открытый с обеих сторон и способный презентировать липиды, гликолипиды или гидрофобные пептиды NKT-клеткам.
2
3
2
3
2
2
2
3
4
2
3
4
Термин "CD1d-связывающий мотив" относится к аминокислотной последовательности, соответствующей общему аминокислотному мотиву [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FW], в котором F обозначает фенилаланин, W - триптофан, I - изолейцин, L - лейцин, M - метионин и V - валин. X представляет собой любую аминокислоту. В некоторых случаях, [FW] в положении 7 замещен на T (треонин) или H (гистидин). Термин "предполагаемый CD1d-связывающий мотив" при использовании в данном описании относится к аминокислотной последовательности, которая соответствует общему аминокислотному мотиву [FWHY]-XX-[ILMV] или [ILMV]-XX-[FWHY], в котором Y обозначает тирозин. В некоторых случаях, предполагаемый мотив может представлять собой [FWHY]-X-[ILMV] или [ILMV]-X-[FWHY] или [FWHY]-XXX-[ILMV] или [ILMV]-XXX-[FWHY].
Термин "иммунные расстройства" или "иммунные заболевания" относится к заболеваниям, при которых реакция иммунной системы несет ответственность за или поддерживает нарушение функции или нефизиологическое состояние в организме. Иммунные расстройства в контексте настоящего изобретения относятся к патологии, вызванной инфекционными агентами, и иммунологическому надзору за опухолями.
Термин "субъект" относится к млекопитающим, включая приматов и неприматов.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способы подавления или устранения у субъекта инфекции внутриклеточным патогеном или опухоли, или увеличения иммуногенности антигенов, таких как некоторые инфекционные агенты и аллергены, используемые для вакцинации.
В частности, изобретение предоставляет способы увеличения экспансии (размножения) и функциональной активности CD4+ NKT-клеток. Такие клетки обычно подразделяют на два различных подкласса, а именно NKT-клетки 1 типа, несущие инвариантную TCR альфа-цепь (Vальфа14 у мыши, Vальфа24 у человека), или NKT-клетки типа 2, которые имеют различный набор альфа-цепей. Однако последние данные свидетельствуют об альтернативных подклассах NKT-клеток, которые не соответствуют типу 1 или типу 2. Целью настоящего изобретения является включение этих необычных NKT-клеток, при условии, что они несут CD4 ко-рецептор. В результате презентации антигена, связанного с CD1d, NKT-клетки быстро активируются, приобретают цитолитические свойства и секретируют ряд цитокинов, которые как полагают, являются определяющими при оказании влияния на другие клетки систем как врожденного, так и адаптивного иммунитета.
В контексте настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что пептиды могут презентироваться молекулой CD1d и могут активировать NKT-клетки, распознающие комплекс, образованный CD1d и пептидом. Характерной чертой молекулы CD1d являются две антипараллельные альфа-цепи, образующие углубление, располагающееся на вершине платформы, состоящей из двух антипараллельных бета-цепей. Узкое и глубокое углубление связывает только гидрофобные остатки, и как полагают, представляющие собой исключительно липиды.
2
3
5
6
В этом углублении может разместиться последовательность из 7 аминокислот, характеризующаяся наличием гидрофобного остатка в положении (P)1 и 7 и алифатического остатка в P4. P1 обязательно является гидрофобным остатком, таким как F, W, H или Y. Однако P7 является необязательным и может содержать другие остатки при условии, что они не являются полярными. Остатки в P4 предпочтительно являются алифатическими, однако это необязательно. Общая последовательность CD1d-связывающего мотива, таким образом, представляет собой [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY]. Однако специалисту в данной области техники должно быть ясно, что мотив является симметричным, и что P7 может рассматриваться как P1 и P1 может рассматриваться как P7. Общая последовательность CD1d-связывающего мотива предоставляется в описании в качестве общего указания без какого-либо ограничения. Пептиды и полипептиды изобретения определены в соответствии с их способностью активировать NKT-клетки путем презентации CD1d молекулы.
Множество пептидов и полипептидов не несут CD1d-связывающий мотив в естественных условиях. Однако настоящее изобретение также включает пептиды и полипептиды, которые уже несут, по меньшей мере, один CD1d мотив в своей природной последовательности, так как это может оказаться полезным, увеличив количество указанных мотивов для усиления подавления инфекций внутриклеточными патогенами или опухолевых клеток или для увеличения иммуногенности к антигенам инфекционных агентов или аллергенов.
Настоящее изобретение относится к получению пептидов и полипептидов, которые модифицированы путем создания, по меньшей мере, одного нового CD1d-связывающего мотива в пределах природной последовательности указанных пептидов и полипептидов, или путем добавления, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива к указанному пептиду или полипептиду, несмотря на то, что они уже несут такой мотив.
2
3
5
6
В дополнительном аспекте изобретение также включает использование, по меньшей мере, одного выделенного гидрофобного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, один CD1d-связывающий мотив, представленный мотивом общей последовательности [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY] для увеличения у субъекта уничтожения клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами, или опухолевых клеток, или для увеличения у указанного субъекта иммуногенности инфекционных антигенов или аллергенов, использованных для вакцинации.
2
3
5
6
В другом дополнительном аспекте изобретение также включает использование, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, в котором, по меньшей мере, один CD1d-связывающий мотив, представленный последовательностью [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY], был создан в пределах природной последовательности указанного пептида или полипептида, или был добавлен к указанной природной последовательности для активации у субъекта NKT-клеток.
2
3
5
6
В другом дополнительном аспекте изобретение также включает использование, по меньшей мере, одного, выделенного гидрофобного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, один новый CD1d-связывающий мотив, представленный последовательностью [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY], в качестве медикамента для подавления у субъекта инфекции внутриклеточными патогенами или опухолевых клеток или для повышения эффективности антигенов из инфекционных агентов или аллергенов для вакцинации.
Дополнительным преимуществом настоящего изобретения является то, что введение ароматических аминокислотных остатков в пептиды или полипептиды приводит к образованию CD1d-связывающих мотивов, которые являются разнородными в том смысле, что указанные мотивы могут связываться с молекулами CD1d всех или подавляющего большинства субъектов. Это связано с тем, что сама молекула CD1d обладает очень ограниченной степенью полиморфизма. В дополнение к этому, учитывая, что полиморфизм антигенного рецептора NKT-клетки является строго ограниченным, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что введение одной и той же ароматической аминокислоты применимо ко всем субъектам, рассматриваемым в отношении применения настоящего изобретения.
Это находится в резком контрасте с пептидными и полипептидными мотивами, связывающимися с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II, когда может быть описано большое количество пептидов, содержащих подходящую последовательность. Это обусловлено минимальными ограничениями, налагаемыми на пептиды, связывающиеся с MHC класса II, и широким полиморфизмом молекул класса II.
Пептиды и полипептиды, являющиеся целью настоящего изобретения, получают, как указано далее:
(1) в некоторых случаях оценивается способность пептида или полипептида активировать NKT-клетки. Это осуществляется путем инкубации указанного пептида или полипептида с клеточной линией, экспрессирующей молекулу CD1d. Примеры таких клеточных линий известны в данной области техники (например, JAWS2 клетки). В предпочтительном варианте осуществления клеточная линия не имеет молекул МНС класса II и для сверхэкспрессии CD1d трансфектируется вирусным вектором, содержащим ДНК-последовательность CD1d, или используются любые другие способы введения гена в клетку, известные в данной области техники. Способы трансдукции клеток известны в данной области техники. Пептид или полипептид вводится при культивировании клеточной линии. Эффективное презентирование пептида или полипептида молекулой CD1d затем оценивается путем измерения активации NKT-клеток. Такие клетки можно получить из периферической крови, например, путем магнитной сепарации и поддерживать в культуре со стимуляторами, такими как альфа-гал-церамид, в присутствии цитокинов, таких как IL-2 и IL-15 или IL-7. Такие методы описаны в данной области техники (смотри, например, Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Для оценки активации NKT-клеток может использоваться, например, метод оценки выработки цитокинов. Выбираются пептиды или полипептиды, обнаруживающие отсутствие или только ограниченную активацию NKT-клеток.
2
3
2
3
(2) затем определяют присутствие в аминокислотной последовательности пептида или полипептида, по меньшей мере, одного мотива, соответствующего последовательности [FWHY]-XX[ILMV] или [ILMV]-XX-[FWHY] (предполагаемый CD1d-связывающий мотив) с использованием алгоритмов, хорошо известных в данной области техники, таких как http://expasy,org/tools/scanprositc/
2
3
5
6
2
3
2
3
В частности, указанные алгоритмы делают возможным предсказание в пределах пептида или полипептида одной или более последовательностей длиной 7 аминокислот, которые соответствуют последовательности [FWHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWHY] и, таким образом, имеют возможность уместиться в углубление молекулы CD1d. Конкретнее, указанные алгоритмы обеспечивают возможность предсказания аминокислотных последовательностей, соответствующих [FW]-XX-[ILMV] или [ILMV]-XX-[FW].
(3) последовательности аминокислот, установленные при помощи указанных алгоритмов, анализируют и модифицируют заменой аминокислот для увеличения способности связывания с CD1d. В основном, это включает замену аминокислот в положении P1 такими гидрофобными остатками, как F, W, H или Y и/или замену аминокислот в положении P7 на F, W, T, H или Y, в случае необходимости.
2
2
2
3
4
2
3
4
3
4
(4) дополнительно устанавливают предполагаемый CD1d-связывающий мотив, соответствующий [FWHY]-X-[ILMV] или [ILMV]-X-[FWHY], или [FWHY]-XXX-[ILMV] или [ILMV]-XXX-[FWHY]. В таких случаях добавление X или делеция X, соответственно, оказывается выгодной для воссоздания CD1d-связывающего мотива, содержащего алифатический аминокислотный остаток в положении P4. В более общем смысле, предполагаемый CD1d-связывающий мотив может соответствовать общей формуле [FWHY]-R-[ILMV] или [ILMV]-R-[FWHY], где R представляет собой аминокислоту или аминокислотную последовательность.
(5) в некоторых случаях CD1d мотив может быть введен в аминокислотную последовательность пептида или полипептида как с карбоксиконцевого, так и с аминоконцевого конца последовательности или где-либо в пределах природной последовательности пептида или полипептида.
(6) в некоторых случаях пептиды и полипептиды изобретения могут быть модифицированы путем создания, по меньшей мере, одного CD1d-мотива и путем введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива.
(7) в некоторых случаях синтетический пептид, включающий последовательность, содержащую CD1d-связывающий мотив, тестируется in vitro при помощи клеточной линии, экспрессирующей молекулу CD1d, как описано в (1).
(8) в некоторых случаях способность пептида или полипептида, модифицированная путем замены, вставки или удаления аминокислот, как описано выше, связываться с CD1d тестируется in vitro с использованием тетрамеров молекулы CD1d для обнаружения NKT-клеток, специфичных к такому пептиду. Одним из возможных вариантов является использование флуоресцентно-меченых тетрамеров и обнаружение методом флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (facs).
Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что замена или добавление аминокислотных остатков, или добавление CD1d-связывающего мотива(ов) может осуществляться с использованием нефизиологических аминокислотных остатков, таких как D-аминокислоты или органического соединения.
Затем пептид или полипептид, содержащий замену, вставку или делецию аминокислоты, получают с использованием методов, известных в данной области техники, для производства рекомбинантных белков при помощи экспрессионных систем, таких как бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки насекомых, растительные клетки или клетки млекопитающих.
В соответствии с настоящим изобретением рассматриваются медикаменты для лечения заболеваний, вызванных внутриклеточными пато генами. Примеры указанных внутриклеточных патогенов включают ssДНК, dsДНК и РНК-вирусы, бактерии и микобактерии и паразиты.
Кроме того, рассматриваются медикаменты для лечения опухолей.
Дополнительно также рассматриваются медикаменты для вакцинации против инфекционных агентов, преимущественно с внеклеточным жизненным циклом, и против аллергенов.
Следует понимать, что любой из пептидов или полипептидов, рассматриваемых в контексте настоящего изобретения, может вводиться в виде гена для переноса генов, который может осуществляться с использованием вирусных векторов или других способов, известных специалисту в данной области техники. В этом случае может оказаться выгодным изменение аминокислотной последовательности собственно вирусного вектора путем добавления CD1d-связывающего мотива, и тем самым увеличение экспрессии трансгена.
2
3
5
6
В предпочтительном варианте осуществления пептид может состоять из CD1d-связывающего мотива, включающего последовательность [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY]. В еще более предпочтительном варианте осуществления указанный пептид также содержит фланкирующие аминокислотные остатки как на амино-конце, так и на карбокси-конце или обоих концах указанного пептида. В другом предпочтительном варианте осуществления указанный пептид содержит большие аминокислотные остатки внутри фланкирующих остатков. В следующем варианте осуществления указанный пептид несет, по меньшей мере, один рестриктированный по классу II T-клеточный эпитоп. В другом варианте осуществления указанный пептид содержит фланкирующие аминокислотные остатки, которые являются частью природной последовательности, на основе которой получен пептид.
Медикамент изобретения является, хотя и необязательно, (фармацевтической) композицией, содержащей в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один из пептидов или полипептидов изобретения или генотерапевтический вектор, способный экспрессировать указанные пептиды или полипептиды. Помимо активного ингредиента(ов), такая композиция будет содержать, по меньшей мере, один (фармацевтически приемлемый) разбавитель.
В общем, введение пептидов или полипептидов изобретения увеличивает активацию системы врожденного иммунитета, конкретнее, активацию NKT-клеток, конкретнее, продукцию цитокинов вследствие активации NKT-клеток, конкретнее, цитолитические свойства NKT-клеток.
Способ введения пептидов и полипептидов настоящего изобретения может варьировать в соответствии с показанием и/или природой пептидов и полипептидов. Примерами являются подкожная или внутримышечная инъекция вакцин против инфекционного заболевания и против аллергенов или опухолей или пероральное, назальное или интратрахеальное введение при инфекциях внутриклеточными патогенами. Настоящее изобретение охватывает все другие возможные способы введения, такие как интраназальное, подъязычное, чрескожное, внутримышечное, интраректальное или интравагинальное введение.
Как подробно объясняется в дальнейшем, пептиды или полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с помощью химического синтеза, обеспечивающего возможность включения искусственных аминокислот.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способам получения пептидов или полипептидов, содержащих искусственную последовательность, способную активировать NKT-клетки, указанный способ включает стадии:
(a) установления пептидов или полипептидов, которые не активируют NKT-клетки или активируют только в ограниченной степени;
(b) введения, по меньшей мере, одного CD1d-связывающего мотива путем добавления, замены и/или удаления аминокислот.
Такие способы включают установление эпитопов, которые могут быть модифицированы путем замещения, добавления или удаления аминокислот для того, чтобы нести CD1d-связывающий мотив. Способы in silico установления предполагаемых NKT-клеточных эпитопов широко известны в данной области техники, а некоторые аспекты поясняются ниже. Например, когда указанный предполагаемый NKT-клеточный эпитоп установлен, получают синтетические пептиды, включающие указанную последовательность. Также синтезируются альтернативные пептиды, которые включают замены, добавления или делеции аминокислот, считающиеся подходящими для увеличения способности аминокислотной последовательности связываться с CD1d. Пептид, включающий природную последовательность, и пептиды с заменами, добавлениями, делениями аминокислот или их комбинации тестируют в отношении их способности связывать CD1d-тетрамеры и/или активировать NKT-клетки путем нагрузки антиген-презентирующих клеток, экспрессирующих CD1d.
Например, получают растворимые молекулы CD1d и создают тетрамеры путем синтеза и/или химического связывания. Молекулы CD1d очищают при помощи аффинной хроматографии. Растворимые молекулы CD1d инкубируют с меченым биотином эталонным пептидом, полученным в соответствии с его сильной связывающей способностью к указанной молекуле CD1d. Пептиды, подлежащие оценке на связывание с CD1d, затем инкубируют в различных концентрациях, а их способность вытеснять эталонный пептид из связи с CD1d вычисляют путем добавления нейтравидина. Описание методов, касающихся пептидов, презентируемых молекулой главного комплекса гистосовместимости класса II, можно найти, например, в Texier et al, (2000) J. Immunology 164, 3177-3184), однако данный метод можно легко применить к рестриктированным по CD Id T-клеточным эпитопам.
В некоторых случаях связывание пептидов изобретения с тетрамерами CD1d можно оценить путем инкубации с NKT-клетками и флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (facs). Эти способы хорошо описаны в данной области техники.
Альтернативно, антиген-презентирующие клетки, такие как JAWS2 клетки, которые экспрессируют CD1d, но не экспрессируют главный комплекс гистосовместимости класса II, загружаются пептидами или полипептидами изобретения, и их способность активировать NKT-клетки оценивается по пролиферации NKT-клеток с помощью метода включения меченого тритием тимидина. Специалисту в данной области техники эти методы хорошо известны. Пептиды или полипептиды изобретения обладают средним индексом стимуляции NKT-клеток, большим или равным 2. Пептид, обладающий индексом стимуляции NKT-клеток, большим или равным 2, считается подходящим в качестве кандидата для осуществления настоящего изобретения.
Аминокислотная замена(ы), установленная как подходящая для настоящего изобретения, добавление или удаление указанных аминокислот затем вводится в полноразмерный пептид или полипептид для осуществления на практике данного изобретения.
Пептиды или полипептиды изобретения могут быть получены при помощи рекомбинантной экспрессии, например, в бактериальных клетках (например, Escherichia coli), дрожжевых клетках (например, видах Pichia, видах Hansenula, видах Saccharomyces или Schizosaccharomyces), клетках насекомых (например, из Spodoptera frugiperda или Trichoplusia in), клетках растений или млекопитающих (например, клетках CHO, COS). Соответственно, создание необходимых подходящих векторов экспрессии (включающих дополнительную информацию, такую как промоторная и терминальная последовательности) предполагает использование стандартных технологий рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные пептиды или полипептиды изобретения могут быть получены из более крупного белка-предшественника, например, путем ферментативного расщепления сайтов ферментативного расщепления, введенных рядом с N- и/или C-концом пептида или полипептида, с последующей подходящей очисткой.
Принимая во внимание ограниченную длину некоторых пептидов или полипептидов изобретения, их можно получить с помощью химического синтеза пептидов, при котором пептиды получают путем соединения различных аминокислот друг с другом. В частности, химический синтез подходит для введения, например, D-аминокислот, аминокислот с не встречающимися в природе боковыми цепями или природных аминокислот с модифицированными боковыми цепями, таких как метилированный цистеин. Способы химического синтеза пептидов хорошо описаны, и пептиды можно заказать у таких компаний, как Applied Biosystems, и других компаний. Синтез пептидов может осуществляться как твердофазный синтез пептидов (SPPS) или как синтез пептидов в жидкой фазе. Наиболее хорошо известными методами SPPS являются твердофазный синтез пептидов по t-Boc и Fmoc методам, которые хорошо известны специалисту. Кроме того, пептиды можно сшить друг с другом с образованием более длинных пептидов, используя стратегию лигирования (хемоселективное соединение двух незащищенных пептидных фрагментов), как первоначально описано в Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) и анализируется, например, в работе Tam et at (2001) Biopolymers 60, 194-205. Это обеспечивает потенциальные возможности для достижения белкового синтеза, выходящего за пределы SPPS. Множество белков размером 100-300 остатков были успешно синтезированы с использованием этого способа.
Физические и химические свойства искомого пептида или полипептида (например, растворимость, устойчивость) проверяются для того, чтобы определить, подходит ли пептид/будет ли подходить пептид для использования в терапевтических композициях. Как правило, оптимизацию осуществляют путем корректировки последовательности пептида. В некоторых случаях пептид можно модифицировать после синтеза (химические модификации, например, введение/удаление функциональных групп) с помощью известных в данной области техники методов.
Получение генетически модифицированных пептидов или полипептидов основывается на способах, хорошо известных специалисту в данной области техники, включая клонирование, сайт-специфический мутагенез и культивирование (growth).
Настоящее изобретение также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим пептиды или полипептиды изобретения, и способам их использования, например, для рекомбинантной экспрессии или в генной терапии. В частности, указанные нуклеиновокислотные последовательности способны экспрессировать пептиды изобретения.
В генной терапии рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептиды или полипептиды настоящего изобретения, могут быть использованы в виде депротеинизированной ДНК или в липосомах или других липидных системах для доставки в клетки-мишени. Специалистам в данной области техники хорошо известны другие способы прямого переноса плазмидной ДНК в клетки для использования в генной терапии человека, которые предполагают нацеливание ДНК на рецепторы на клетках путем образования комплексов плазмидной ДНК с белками. В самой простой форме перенос гена может осуществляться путем введения малых количеств ДНК в ядро клетки с помощью микроинъекции. Когда рекомбинантные гены вводятся в клетку, они могут распознаваться нормальными клеточными механизмами транскрипции и трансляции, после чего будет экспрессироваться продукт гена. Также были опробованы другие способы введения ДНК в большие количества клеток. Эти способы включают: трансфекцию, при которой ДНК осаждается с фосфатом кальция и попадает в клетки путем пиноцитоза; электропорацию, при которой клетки подвергаются действию высоковольтных импульсов для образования пор в мембране; липофекция/слияние липосом, при которой ДНК упакована в липофильные везикулы, которые сливаются с клеткой-мишенью; и бомбардировку частицами с использованием ДНК, связанной с небольшими «частицами-пулями». Другой способ введения ДНК в клетки представляет собой соединение ДНК с химически модифицированными белками.
Аденовирусные белки способны дестабилизировать эндосомы и увеличивать поглощение ДНК-клетками. Смешивание аденовируса с растворами, содержащими ДНК-комплексы, или связывание ДНК с полилизином, ковалентно связанным с аденовирусом при помощи сшивающих белки агентов, значительно улучшает поглощение и экспрессию рекомбинантного гена. Адено-ассоциированные вирусные векторы также могут использоваться для доставки гена в васкулярные клетки. В данном описании "перенос генов" подразумевает процесс введения чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, который в большинстве случаев осуществляется для того, чтобы обеспечить возможность экспрессии определенного продукта, закодированного геном. Указанный продукт может включать белок, полипептид, антисмысловую ДНК или РНК или ферментативно активную РНК. Перенос генов может проводиться в культивируемых клетках или путем прямого введения млекопитающим. В другом варианте осуществления предоставляется вектор, содержащий последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно изобретению. В отдельных вариантах осуществления вектор создается таким образом, что последовательность молекулы нуклеиновой кислоты экспрессируется только в конкретной ткани. Способы достижения тканеспецифической экспрессии гена хорошо известны в данной области техники, например, путем «помещения» последовательности, кодирующей иммуногенный пептид изобретения, под контроль промотора, который специфически направляет экспрессию пептида в одной или более тканей или органов. Векторы экспрессии, полученные на основе вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, вирусы герпеса, РНК-вирусы или вирус папилломы крупного рогатого скота, могут использоваться для доставки нуклеотидных последовательностей (например, кДНК), кодирующих пептиды, их гомологи или производные в соответствии с изобретением, в ткани-мишени или популяции клеток. Для создания рекомбинантных вирусных векторов, содержащих такие кодирующие последовательности, можно использовать хорошо известные специалистам в данной области техники методы. Альтернативно, в генной терапии могут использоваться сконструированные клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид в соответствии с изобретением.
Медикамент изобретения, как правило, но не обязательно, представляет собой, (фармацевтическую) композицию, содержащую в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один из пептидов или полипептидов изобретения, генотерапевтический вектор, способный экспрессировать указанный пептид или полипептид. Помимо активного ингредиента(ов), такая композиция будет содержать, по меньшей мере, один (фармацевтически приемлемый) разбавитель. Как правило, фармацевтически приемлемые соединения можно найти, например, в руководстве Фармакопея (Pharmacopeia handbook) (например, США-, Европейская- или Международная Фармакопея). Медикамент или фармацевтическая композиция изобретения обычно содержит (профилактически или терапевтически) эффективное количество активного ингредиента(ов), при этом эффективность имеет отношение к состоянию или нарушению, которое необходимо предотвратить или лечить.
Медикамент или фармацевтическая композиция изобретения может вводиться субъекту как часть профилактического или терапевтического режима, включающего множество введений указанного медикамента или композиции. Указанные множественные введения обычно осуществляются последовательно, а временной интервал между двумя введениями может варьировать и будет определяться природой активного ингредиента и природой состояния, которое необходимо лечить или предотвратить. Количество активного ингредиента, назначенное субъекту, нуждающемуся в единственном введении, также может варьировать и будет зависеть от таких факторов, как физическое состояние субъекта (как например вес и возраст), текущего состояния заболевания, которое необходимо предотвратить или лечить, и опыта лечащего врача, терапевта или медсестры.
Термин "разбавитель" относится, например, к физиологическим растворам. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" подразумевает любое вещество или материал, вместе с которым активный ингредиент заключается в состав композиции, предназначенный для облегчения его применения или распространения в место, нуждающееся в лечении, например, путем растворения, диспергирования или диффузии указанной композиции, и/или для облегчения его хранения, транспортировки или перемещения без ухудшения его эффективности. Они включают любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические агенты (такие, как сахара или хлорид натрия) и тому подобное. Дополнительные ингредиенты могут быть включены для того, чтобы контролировать продолжительность действия активного ингредиента в композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество или жидкость или газ, который был сжат с образованием жидкости, т.е. композиции этого изобретения могут использоваться в виде концентратов, эмульсий, растворов, гранулятов, порошков, спрэев, аэрозолей, суспензий, мазей, кремов, таблеток, драже или пудр.
Фармацевтические носители, подходящие для использования в указанных фармацевтических композициях и их составе, хорошо известны специалистам в данной области техники, и не существует особого ограничения для их выбора в пределах настоящего изобретения. Также они могут включать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества, диспергирующие вещества, клейкие вещества, связывающие вещества, эмульгирующие вещества, растворители, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновая кислота, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и тому подобное, при условии, что применение всех этих веществ соответствует фармацевтической практике, т.е. носители и вспомогательные вещества не вызывают необратимых повреждений у млекопитающих. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены любым известным способом, например путем гомогенного смешивания, нанесения покровного слоя или измельчения активных ингредиентов, с помощью одностадийного или многостадийного метода, вместе с выбранным веществом-носителем и, при необходимости, другими вспомогательными веществами, такими как поверхностно-активные вещества. Они также могут быть приготовлены путем микронизации, например, с целью получения их в форме микросфер, как правило, имеющих диаметр примерно от 1 до 10 мкм, т.е. для производства микрокапсул с контролируемым или пролонгированным высвобождением активных ингредиентов.
Пептиды или полипептиды, их гомологи или производные согласно настоящему изобретению (и все их физиологически приемлемые соли или фармацевтические композиции, включенные в термин "активные ингредиенты") могут вводиться любым способом, соответствующим состоянию, которое необходимо предотвратить или лечить, и подходящим для соединений, в данном случае пептида или полипептида, который должен быть введен. Возможные способы включают регионарный, системный, пероральный (в виде твердой формы или ингаляции), ректальный, назальный, местный (включая глазной, щечный и подъязычный), вагинальный и парентеральный (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, внутриартериальный, подоболочечный и эпидуральный). Предпочтительный способ введения может варьировать, например, в зависимости от состояния реципиента или от состояния, которое необходимо предотвратить или лечить.
Композиции могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Композиции настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде отдельных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заранее установленное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водосодержащей жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Активный ингредиент также может быть представлен в виде шарика, электуария или пасты. Таблетки можно изготавливать прессованием или формовкой необязательно с одним или более вспомогательным ингредиентом. Прессованные таблетки могут быть изготовлены с помощью подходящей машины путем сжатия (прессования) активного ингредиента в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанной со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервирующим веществом, поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Формованные таблетки могут быть изготовлены с помощью подходящей машины путем формования порошкообразной смеси, смоченной инертным жидким разбавителем. На таблетки необязательно может быть нанесено покрытие или метка, и они могут быть изготовлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента.
Теперь настоящее изобретение будет проиллюстрировано с помощью следующих примеров, предоставленных без какого-либо ограничения. Кроме того, все ссылки, описанные здесь, включаются в описание путем отсылки.
Примеры
Пример 1. Микобактерии
Mycobacterium tuberculosis является причиной тысяч смертей ежегодно. Единственная доступная вакцина, вакцина на основе бычьей микобактерии Кальмета-Герена (BCG), не является эффективной. Единственным кандидатом для вакцинации является 6 kDa ранний секреторный микобактериальный антиген (ESAT-6), продуцируемый М. tuberculosis, являющийся одним из главных антигенов, распознаваемых как человеком, так и животными, например, мышами.
2
3
5
6
Последовательность ESAT-6 (SEQ ID1) анализировали при помощи компьютерного алгоритма для выявления CD1d-связывающих мотивов, соответствующих последовательности [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY]. Таких мотивов обнаружено не было. Мутации с заменой A на F и G на F были введены путем стандартных способов мутагенеза в положениях 14 и 20, соответственно, что привело к образованию CD1d-связывающего мотива, способного активировать NKT-клетки (мутированный ESAT-6; SEQ ID2).
Мышей C57BL/6 иммунизировали ESAT-6 (SEQ ID1) или мутированным ESAT-6 SEQ ID NO: 2 вместе с адъювантом, таким как квасцы. Были сделаны четыре инъекции пептида (50 мкг) с двухнедельными интервалами. Через две недели после последней иммунизации мышей забивали и, сочетая методы центрифугирования в градиенте плотности и сортировки на магнитных шариках, покрытых антителами, выделяли из селезенки CD4+ T лимфоциты.
Затем CD4+ T клетки активировали и наращивали in vitro при помощи JAWS2 клеток в качестве антиген-презентирующих клеток, загруженных мутированным ESAT-6 SEQ ID2. JAWS2 клетки не экспрессируют детерминанты главного комплекса гистосовместимости класса II, таким образом, предотвращая активацию рестриктированных по классу II CD4+ T клеток, однако JAWS2 клетки экспрессируют CD1d и, таким образом, могут использоваться для определения способности пептидов активировать NKT-клетки. Было отмечено, что только NKT-клетки, полученные от мышей, иммунизированных мутированным ESAT-6 (SEQ ID2) активируются загруженными JAWS2 клетками, в то время как NKT-клетки от мышей, иммунизированных ESAT-6 (SEQ ID1), не активируются.
Для оценки цитолитических свойств CD4+ NKT-клеток, активированных мутированным ESAT-6 SEQ ID2, JAWS2 клетки анализировали через 18 час инкубации с NKT-клетками с целью индукции апоптоза. Так, связывание аннексина V с поверхностью апоптотических клеток обнаруживается путем добавления флуоресцентно-меченого аннексина V. Результаты указывают на то, что JAWS2 клетки, инкубированные с NKT-клетками, полученными от мыши, иммунизированной мутированным ESAT-6 (SEQ 1D2), подвергаются апоптозу.
Таким образом, эти результаты показывают, что единичные аминокислотные замены, создающие CD1d-связывающий мотив, являются достаточными для того, чтобы вызвать активацию NKT-клеток и апоптоз антиген-презентирующих клеток.
Пример 2. EG7 опухоль
Опухолевые клетки EG7 (H-2b) получены из тимомы, трансфектированной овальбумин-(оуа)-содержащим конструктом. CD1d-рестриктированный ova эпитоп презентируется такими клетками, однако известно, что этого недостаточно для инициации NKT-активации и уничтожения опухолевых клеток (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226).
При помощи компьютерных алгоритмов был проведен поиск с целью выявления альтернативных эпитопов, которые могут быть изменены путем аминокислотного замещения с целью создания новых CD1d-связывающих мотивов. Были обнаружены две последовательности в положениях 16-22 (FKELKVH) и 181-187 (FKGLWEK). H22 и K187 были изменены на F в последовательности ova, тем самым образуя белок SEQ ID4.
6
Иммунизацию мышей ova SEQ ID4 проводили с использованием 50 мкг ova в квасцах, который вводили подкожно за 4 раза, разделенных интервалом 10 дней. Контрольную группу иммунизировали ova с природной последовательностью (SEQ ID3). Затем всем мышам прививали 10 клеток опухоли EG7 с помощью инъекции в бок, причем рост опухоли продолжался в течение некоторого времени. У мышей, предварительно иммунизированных ova SEQ ID4, наблюдалось отторжение опухоли, в то время как у контрольных мышей, предварительно иммунизированных ova с природной SEQ ID3, - не наблюдалось.
5
Уничтожение EG7 клеток in vitro оценивали с использованием NKT-клеток, полученных из селезенки при помощи сортировки на магнитных шариках. NKT-клетки предварительно стимулировали in vitro в течение 4 час антиген-презентирующими клетками, загруженными ova SEQ ID4. Мембраны EG7 клеток были помечены 1 мкМ DiOCig (3,3'-диоктадецикло-оксакарбоцианин перхлорат от Invitrogen). Затем EG7 клетки (1×10 на лунку) культивировали в течение 18 час при 37°C в присутствии NKT-клеток, полученных от каждой из 2 групп мышей, в отношении, равном от 1/1 до 1/5 (EG7 клетки к NKT-клеткам). Через 18 час клетки собирали, окрашивали Аннексином V и 7-AAD, следуя инструкциям производителя (Apoptosis Detection kit; BD Biosciences), и анализировали на проточном цитометре FACSCantoII (BD Biosciences). Результаты показывают, что у EG7 клеток, инкубированных с NKT-клетками, полученными от мышей, иммунизированных ova SEQ ID4, наблюдается индукция апоптоза, в то время как NKT-клетки, полученные от контрольных мышей, иммунизированных ova SEQ ID3, не вызывают значительной степени апоптоза у опухолевых клеток.
Пример 3. Вирус гриппа
Гемагглютинин вируса гриппа является основным антигеном, используемым в целях вакцинации. Эффективность вакцинации, однако ограничена относительно слабой иммуногенностью гемагглютинина.
2
3
5
6
Последовательность гемагглютинина (SEQ ID5) содержит 3 последовательности, подходящие для осуществления мутации с целью получения аминокислотных последовательностей, кодирующих CD1d-связывающий мотив, имеющий конфигурацию [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY]. Была получена кДНК гемагглютинина, и методами стандартного мутагенеза были введены 3 мутации для замены аминокислоты в положении 7 CD1d-связывающего мотива на F (фенилаланин). Эти мутации соответствовали V314F, A348F и K459F, в которых валин, аланин и лизин в положениях 314, 348 и 459, соответственно, были изменены на фенилаланин. Мутированный гемагглютинин SEQ ID6 получали при помощи рекомбинантной технологии.
Мышей 4 раза иммунизировали гемагглютинином SEQ ID5 или SEQ ID6 подкожным способом с 1-недельными интервалами. Через семь дней после последней иммунизации мышей забивали и получали CD4+ T клетки из селезенки с использованием сортировки на магнитных шариках. Клетки JAWS2 загружали мутированным гемагглютинином SEQ ID6 путем инкубации в течение 18 час при комнатной температуре. Затем клетки промывали и инкубировали в присутствии CD4+ T клеток, полученных от мышей, иммунизированных или гемагглютинином SEQ ID5 или гемагглютинином SEQ 1D6. Было отмечено, что значительная часть NKT-клеток активируется, если их получают от мышей, иммунизированных гемагглютинином SEQ ID6, но не гемагглютинином SEQ IDS, показывая, что иммунизация гемагглютинином SEQ ID6 вызывала экспансию NKT-клеток in vivo.
Затем мутированный гемагглютинин SEQ ID6 используется для вакцинации. Было отмечено, что мыши, иммунизированные гемагглютинином SEQ ID6, вырабатывают более высокие концентрации антител, специфичных к гемагглютинину.
Пример 4. Аллерген
В настоящее время вакцинация против аллергических заболеваний ограничена относительно слабой иммуногенностью аллергенов. Способы, при помощи которых может быть достигнута увеличенная продукция аллерген-специфических IgG антител, чрезвычайно необходимы.
2
3
5
6
Der p 2 является одним из главных аллергенов клеща домашней пыли, D. pteronyssinus, связанного с возникновением аллергического ринита и астмы по всему миру. Поиск при помощи компьютерных алгоритмов не выявил в пределах последовательности Der p 2 последовательности, несущей CD1d-связывающий мотив. Мотив, состоящий из 7 аминокислот (FAALAAF), был добавлен на карбоксильный конец последовательности Der p 2. Такая последовательность кодирует CD1d-связывающий мотив, соответствующий последовательности [FW]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY|.
Известно, что главный T-клеточный эпитоп, презентируемый комплексами гистосовместимости класса II, располагается в положениях 24-35 зрелой молекулы Der p 2.
Две группы мышей C57BL/6 (H-2b) иммунизировали или нативным Der p 2 (SEQ ID7), или нативным Der p 2, отличающимся добавленным CD1d-связывающим мотивом (SEQ ID8), используя 50 мкг белка в квасцах, инъецированного подкожно 4 раза с интервалами 10 дней. Затем мышей обескровливали и определяли концентрацию специфических анти-Der p 2 антител методом прямого связывания ELISA. Было отмечено, что концентрация антител была в 10 раз выше в группе мышей, иммунизированных Der p 2 SEQ IDS.
6
Кроме того, были получены CD4+ T клетки из селезенки каждой мыши из двух групп с использованием сортировки на магнитных шариках. Такие клетки (10 клеток/лунку) культивировали с дендритными клетками, полученными от сингенных CD1d КО мышей. Такие клетки могут активировать только рестриктированные по классу II CD4+ T клетки. Было отмечено, что клетки, полученные от мышей, иммунизированных Der p 2 SEQ ID8, пролиферируют с индексом стимуляции в 4 раза более высоким, чем клетки, полученные от мышей, иммунизированных нативным Der p 2 (SEQ ID7).
Таким образом, был сделан вывод, что наличие CD1d-связывающего мотива увеличивает продукцию специфических антител и пролиферацию рестриктированных по классу II CD4+ T-клеток.
Должно быть понятно, что предоставленные в описании примеры не являются исчерпывающими и что комбинации белков или пептидов, содержащих разное количество аминокислотных замен или делеций для создания новых CD1d-связывающих мотивов или содержащих разное количество введенных CD1d-связывающих мотивов, предусматриваются в рамках настоящего изобретения.
Список последовательностей
SEQ ID1 ESAT-6 (микробактерия)
SEQ ID2 мутированный ESAT-6 (мутации подчеркнуты)
SEQ ID3 овальбумин (курица)
SEQ ID4 мутированный овальбумин (мутации подчеркнуты)
SEQ ID5 гемагглютинин вируса гриппа A
SEQ ID6 мутированный гемагглютинин вируса гриппа A (мутации подчеркнуты)
SEQ ID7 аллерген Der p 2 (pyroglyphidae, Dermatophagoides pteronyssinus, Европейский клещ домашней пыли)
SEQ IDS модифицированный аллерген Der p 2 (мотив CD1d подчеркнут)