Особенности иммунного ответа при иммунизации мышей инактивированной полиомиелитной вакциной в комбинации с препаратами хитозана в качестве адъювантов

особенности иммунного ответа при иммунизации мышей инактивированной полиомиелитной вакциной в комбинации с препаратами хитозана в качестве адъювантов

С.Г. Маркушин (s.g.markushin@rambler.ru), Н.К. Ахматова (anelly@mail.ru), Г.Г. Кривцов, А.Д. Переверзев, И.И. Акопова, И.Б. Коптяева, О.В. Борисова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Резюме

Введение в состав инактивированных моновалентных препаратов вируса полиомиелита Сэбина типов 1, 2 и 3 производных хитозана существенно повышало титры антител при парентеральной иммунизации мышей. Изучение иммунофе-нотипа мононуклеарных лейкоцитов мышей, иммунизированных парентерально полиомиелитной вакциной, свидетельствует о супрессирующем воздействии вакцины на их иммунную систему. Исследовано влияние производных хитозана на изменение удельного веса отдельных субпопуляций мононуклеарных лейкоцитов при совместном введении как с инактивированным полиовирусом типа 1, так и с трехвалентной полиомиелитной вакциной Имовакс Полио. Отмечено увеличение субпопуляций 003-, ЫК-, С03/ЫК (ЫКТ)-, С08-и уЬТ-клеток, а также в случае с микро/наночастицами соединений хитозана - увеличение субпопуляций Т-хелперов (С04) и С019-клеток (В-лимфоцитов). Показано, что адъю-вантное действие препаратов хитозана частично связано с активацией рецепторов Г1Н2 и ПЯ9. При этом наблюдается повышение цитотоксической активности ЫК- и ЫКТ-клеток. Изучение экспрессии цитокинов под влиянием парентерального введения мышам инактивированного полиовируса и вакцины Имовакс Полио в комбинации с препаратами хито-зана указывало на разнонаправленность процессов. В частности, наблюдалось существенное повышение И-12 в сыворотке крови иммунизированных животных, что должно стимулировать выработку !ЫЕ-у ЫК-клетками и Т-лимфоцитами. Полученные данные позволяют сделать вывод, что препараты хитозана могут способствовать формированию различных звеньев иммунного ответа, обеспечивая полноценный иммунитет против вируса полиомиелита.

Ключевые слова: вирус полиомиелита, полиовакцина Имо-вакс Полио, производные хитозана, иммунизация, фенотип моноядерных лейкоцитов, рецепторы врожденного иммунитета, цитокины

Peculiarities of Immune Response After Immunization of Mice by Inactivated Poliovaccine in Combination with Chitosan Derivatives as Adjuvants

S.G. Markushin (s.g.markushin@rambler.ru),

N.K. Achmatova (anelly@mail.ru), G.G. Krivtsov, A.D. Pereversev,

I.I. Akopova, I.B. Koptiaeva, O.V. Borisova

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera RAMS,

Moscow

Abstract

Addition of chitosan derivatives to inactivated monovalent preparations of Sabin poliovirus type 1, 2 and 3 significantly increased the titre of antibodies after parenteral immunization of mice. The investigation of mononuclear leukocyte immunophenotype in mice immunized parenterally by poliovaccine revealed suppressing influence of poliovaccine on mice immune system. The influence of chitosan derivatives on changes in proportion of different mononuclear leycocytes subpopulations after parenteral vaccination with inactivated poliovirus type 1 as well as with threevalent poliovaccine Imovax admixed with chitosan derivatives was studied. The increase in subpopulations of CD3, NK, CD3/NK(NKT), CD8, gàT-cells was detected. In case with micro/ nanoparticles, additional increase in the number of T-helpers (CD4) and CD19 (B-lymphocytes) was observed. It was shown, that adjuvant effect of chitosan derivatives is partly due to activation of TLR2 and TLR9 receptors. This process was followed by increase of cytotoxic activity of NK- and NKT-cells. The investigation of cytokine expression under influence of parenteral administration to mice of inactivated poliovirus and poliovaccine Imovax Polio in combination with chitosan derivatives showed different trends. In particular, significant increase in IL-12 level in serum of immunized animals was detected. It means that the stimulation of production of INF-g by NK-cells and T-lymphocytes occurred. Obtained data showed, that chi-tosan derivatives can promote formation of different branches of immune response and provide reliable immunity against poliovirus.

Key words: poliovirus, poliovaccine Imovax Polio, chitosan derivatives, immunization, mononuclear leycocytes subpopulation, branches of immune response, cytokine

Введение

За последние годы достигнуты серьезные успехи в борьбе с полиомиелитной инфекцией. В подавляющем большинстве стран заболевания, вызы-

ваемые дикими штаммами вируса полиомиелита, не регистрируются и прекратилась циркуляция вирулентных штаммов данного вируса. При этом в Индии, Нигерии, Пакистане, Афганистане и Таджики-

стане наблюдается циркуляция вирулентных штаммов (WHO, 2009).

Специфическая профилактика проводится в большинстве стран с применением живой полиомиелит-ной вакцины. Однако использование такой вакцины связано с возможностью возникновения у вакцинируемых лиц поствакцинального полиомиелита из-за реверсий аттенуированных вакцинных штаммов. Инактивированная полиовакцина не вызывает таких осложнений, и ее применение более целесообразно. Важное значение приобретает включение в состав вакцины адъювантов, позволяющих повысить ее иммуногенность и защитную эффективность. Предпринимались немногочисленные попытки введения в состав инактивированной по-лиомиелитной вакцины адъювантов. В частности, о повышении иммуногенности инактивированной полиомиелитной вакцины путем включения в нее CpG-олигодезоксинуклеотидов сообщают С. Yang с соавт. [14]. Также имеется сообщение о повышении иммуногенности инактивированной полиомиелитной вакцины с помощью адъюванта 1,25-диги-дроксивитамина D3 [6].

С недавних пор в качестве адъюванта для инак-тивированных вирусных вакцин с успехом используют препараты хитозана - катионного полисахарида, получаемого путем деацетилирования хитина, входящего в состав панциря ракообразных, насекомых и грибов [3 - 5, 7, 9, 10]. Хитозан отличается низкой токсичностью, биодеградируемостью и биосовместимостью. Его влияние на повышение иммуногенности инактивированных гриппозных вакцин, вводимых как парентерально, так и муко-зально, хорошо изучено [1, 2, 4, 8]. Однако адъю-вантное действие хитозана при иммунизации полиомиелитной инактивированной вакциной только начинает изучаться.

цель данной работы - попытка исследования особенностей иммунного ответа при парентеральной иммунизации мышей инактивированной полиомиелитной вакциной, включающей препараты хитозана в качестве адъювантов.

Материалы и методы

Препараты хитозана. В работе использовали два препарата хитозана: 1% раствор глютама-та хитозана (МВ 300 кД, степень деацетилирования 85%) и 1% суспензию микро/наночастиц сульфата хитозана. Препарат 1% раствора хитозана в 0,2 М глютаматном буфере (рН 6,2) добавляли в равном объеме к вакцине (конечная концентрация препарата 0,5%). Препарат микро/наноча-стиц сульфата хитозана был получен по следующей методике. В автоклавированный 1,2% водный раствор ацетата хитозана вносили гидроперит до 3% конечной концентрации перекиси водорода и оставляли на 36 часов при комнатной температуре в неплотно закрытом сосуде. Затем добавляли рассчитанный объем 0,5 М раствора сульфата натрия до конечной концентрации 0,05 моль/л, интенсив-

но перемешивали и выдерживали 30 - 60 минут при комнатной температуре до полного формирования осадка. Полученные микро/наночастицы сульфата хитозана подвергали пятикратной промывке 0,05 М раствором сульфата натрия с помощью центрифугирования (5 минут при 3000 об./ мин). рН полученной суспензии микро/наночастиц составлял 4,0 - 4,5. Препарат высушивали в вакуумном эксикаторе. Рабочую 1% суспензию микро/ наночастиц получали, добавляя 0,3 объема 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,2) и 0,05 объема 3 М NaCl к одному объему суспензии, при этом рН рабочей суспензии повышался до 6,4. Полученную 1% рабочую суспензию микро/наночастиц сульфата хитозана добавляли в равном объеме к вакцине, так что конечная концентрация микро/наночастиц составила 0,5%.

Полиомиелитная вакцина. В работе использовали трехвалентную полиомиелитную вакцину Имо-вакс Полио фирмы Sanofi Pasteur (Франция), содержащую 40 ЕД антигена D типа 1, 8 ЕД - типа 2 и 32 ЕД - типа 3. В работе также применяли инакти-вированные препараты аттенуированных штаммов вируса полиомиелита Сэбина типов 1, 2 и 3 в виде моновакцин, изготовленных в нашей лаборатории. Вирус выращивали в монослойной клеточной линии Vero. Исходный титр вируса до инактивации составлял для типа 1 - 108 ТЦД50/0,1 мл, для типов 2 и 3 - 107 ТЦД50/0,1 мл. Вирус был инактивирован с помощью формалина, который удаляли путем обработки препарата сульфитом натрия.

иммунизация. Группы мышей Balb весом 12 - 14 г (по четыре - шесть мышей на группу) вакцинировали внутримышечно, вводя по 0,2 мл вакцины, смешанной с равным объемом 1% раствора глютамата хитозана или 1% суспензии ми-кро/наночастиц сульфата хитозана либо физиологического раствора (контрольная группа). Животных вакцинировали двукратно или трехкратно с интервалом 21 день между первой и второй иммуни-зациями и 10 дней - между второй и третьей. Через 10 дней после второй и третьей прививки у мышей брали кровь.

ИФА для определения вирус-специфических IgG проводили по описанной методике [14] в 96-лу-ночных планшетах (Corning Incorporated 3591, США), которые предварительно сенсибилизировали 0,1 мл штамма Сэбина полиовируса типа 1 с титром 108 ТЦД50/0,1 мл. За конечное разведение принимали наивысшее разведение оптической плотности (ОП) образца при 490 нм, превышающее среднюю ОП в контрольных образцах более чем на три стандартных отклонения.

Выделение мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) из селезенок мышей. Через одни и семь суток после первой и второй иммунизации у животных под эфирным наркозом извлекали селезенку. В каждой группе было по десять животных. Селезенки мышей гомогенизировали, добавляли среду 199. Затем полученную взвесь спленоцитов центрифугировали

при 400 g в течение 30 минут в градиенте плотности фиколл-урографина (Pharmacia, плотность 1,077 г/ см3). МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Концентрацию клеток доводили до 1 x 106.

Проточная цитометрия (FACS-анализ) и характеристика антител. Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител (МКА) (фирма Caltag Laboratories, США) против клеточных антигенов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 1% фе-тальной телячьей сывороткой (ФТС) и окрашивали FITC- и PE-мечеными антителами согласно инструкции производителя. Отмывали два раза холодным ФСБ.

Результаты учитывали на проточном цитоме-тре FacsCalibur (фирмы Becton Dickinson, США). На МЛ селезенок мышей исследовали уровни экспрессии молекул субпопуляций Т- и В-клеток: СD3, CD4, CD8; NK; CD25, СD19, y6N, CD5 и белков MHC II класса. Также оценивали содержание клеток, экспрессирующих TLRs. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала для оценки субпопуляционной структуры проведена при помощи программного пакета WINMDI 2.8.

Культивирование клеток К562. Клетки-мишени опухолевой линии клеток К562 (эритробластный лейкоз человека), чувствительной к NK, культивировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добав-

лением 5% фетальной сыворотки и 50 мкг/мл гента-мицина при 37 °С в атмосфере 4% СО2.

цитотоксический тест. Для выявления цито-токсической активности МЛ селезенок использовали тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Цитотоксическую активность МЛ определяли на линии К562. Опухолевые клетки (3 х 104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛ в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) 18 часов при 37 °С и 4% СО2. Затем в лунки добавляли 5% витальный краситель МТТ (Sigma, США) и по оптической плотности при длине волны 540 нм, измеряемой на муль-тискане MS (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цито-токсичности).

Окончательную статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стью-дента, критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0).

результаты и обсуждение

1. Влияние препаратов хитозана на иммунный ответ при их парентеральном введении мышам в комбинации с инактивиро-ванными штаммами Сэбина полиовируса типов 1, 2 и 3

На первой стадии нашей работы были исследованы методом ИФА титры IgG в сыворотках крови мышей, иммунизированных инактивированны-ми штаммами Сэбина полиовируса типов 1, 2 и 3, в комбинации с препаратами хитозана. Как вид-

Таблица 1.

Изучение методом ИФА сывороток крови мышей, иммунизированных инактивированными штаммами Сэбина полиовируса типов 1, 2 и 3 в комбинации с препаратами хитозана

№ Инактивированный материал для парентеральной иммунизации мышей титры IgG

после двукратной иммунизации после трехкратной иммунизации

1 Полиовирус типа 1 + физраствор 3200 12 В00

2 Полиовирус типа 1 + 0,5% раствор глютамата хитозана 1S2000 102 400

3 Полиовирус типа 1 + 0,5% суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана 102400 204 В00

4 Полиовирус типа 2 + физраствор б400 б400

S Полиовирус типа 2 + 0,5% раствор глютамата хитозана 1S2000 102 400

б Полиовирус типа 2 + 0,5% суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана 102400 102 400

7 Полиовирус типа 3 + физраствор 12 400 12 400

В Полиовирус типа 3 + 0,5% раствор глютамата хитозана 102 400 409 б00

9 Полиовирус типа 3 + 0,5% суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана S1 200 102 400

Примечание: мышей вакцинировали внутримышечно двукратно или трехкратно. Кровь брали после второй или третьей вакцинации. К препарату инактивированного вируса типов 1, 2 и 3 добавляли раствор глютамата хитозана или суспензию микро/наночастиц сульфата хитозана (0,5% в конечной концентрации), а в качестве контроля - физраствор. Титры IgG определяли методом ИФА.

но из таблицы 1, титр сывороточных IgG, иммунизированных полиовирусами типов 1, 2 и 3, наблюдался соответственно на уровне 3200, 6400 и 12 400 после двукратной иммунизации и 12 800, 6400 и 12 400 - после трехкратной. Однако введение в состав инактивированного препарата полиовируса типов 1, 2 и 3 глютамата хито-зана повышало соответственно титр сывороточных IgG до уровня 152 000, 152 000 и 102 000 после двукратной иммунизации и до 102 400, 102 400 и 409 600 - после трехкратной. Аналогичным образом при введении в состав инактивированного препарата полиовируса типов 1, 2 и 3 суспензии микро/наночастиц сульфата хито-зана титр сывороточных антител повысился соответственно до 102 400, 102 400 и 51 200 после двукратной иммунизации и до 204 800, 102 400, 102 400 - после трехкратной. Полученные данные однозначно указывают на выраженный адъ-ювантный эффект препаратов хитозана в отношении инактивированных штаммов Сэбина полиовируса всех типов.

2. изучение иммунофенотипа мононуклеарных лейкоцитов мышей, иммунизированных парентерально инактивированным штаммом Сэбина типа 1 и инактивированной трехвалентной полиовакциной имовакс Полио в комбинации с препаратами хитозана Как видно из таблицы 2, инактивированный по-лиовирус типа 1 оказывал несущественное влияние на клеточное звено иммунного ответа мышей, вызывая лишь повышение численности клеток NK, NKT (CD3/NK) и T-reg (CD4/CD25/Foxp3) на седьмые сутки после однократной иммунизации и снижение CTL (CD8) после однократной и двукратной вакцинации. Иммунизация полиомиелитной вакциной Имовакс Полио приводила к умеренному снижению численности CD3 T-лимфоцитов (с 24,4 до 15,5%) на протяжении всего наблюдения, NKT-лимфоцитов на первые сутки иммунизации и CTL (CD8) - на седьмые сутки после первой и второй иммунизации, а также CD19 (B-лимфоциты) в конце наблюдения. Этот факт свидетельствует о супрессирующем влиянии инактивированной вакцины на иммунную систему.

Нами установлено влияние чистых препаратов глютамата хитозана, введенных парентерально, на клеточное звено иммунной системы мышей. Как видно из таблицы 2, эти препараты повышали количество NK-клеток (с 2 до 6,7%) в первые сутки, MHC II (с 20 до 37%) - на седьмые сутки после второй иммунизации. Парентеральное введение микро/наночастиц сульфата хитозана также активировало клеточное звено иммунной системы мышей. Наблюдалось резкое повышение NK-клеток (с 2 до 7,2%), CD3/NK-клеток (с 0,5 до 2,3%) и CD4/CD25/Foxp3 (с 0,8 до 2,4%) на первые сутки после первой и второй иммунизации, а также МНС II (с 20 до 40%) - на седьмые сутки после первой иммунизации.

Однако при комбинированном введении инактивированного полиовируса совместно с глютама-том хитозана отмечалось значительное увеличение субпопуляций С03/ИК (ИКТ)-, С04/С025/Рохр3-и убТ-клеток. Парентеральное введение полиовируса в комбинации с микро/наночастицами сульфата хитозана значительно повышало на седьмые сутки после первой иммунизации процент С03/ ИК-клеток (с 2,7 до 9,6%) и С08, МНС II, убТ и С019 (с 4,6 до 17,0%), а также соответственно с 22,0 до 42,5% и с 16,3 до 56,4% на седьмые сутки после второй прививки.

Парентеральное введение мышам вакцины Имовакс Полио совместно с глютаматом хитозана приводило к увеличению субпопуляций С03, С03/ИК, С04/С025/Рохр3 на всех изучаемых сроках после прививки (СР8, убТ, С019 - на седьмые сутки после первой и второй иммунизации, С05 - на седьмые сутки после второй). В то же время парентеральная прививка полиомиелитной вакциной, содержащей в качестве адъюванта микро/наночастицы сульфата хитозана, сопровождалась повышением С03, ИК, С03/ИК, С08, убТ, С019 на всех изучаемых сроках после иммунизации, С04/С025/Рохр3 - на первые и седьмые сутки после первой прививки.

3. Активация в процессе парентеральной иммунизации мышей полиовирусом и полиомиелитной вакциной в комбинации с препаратами хитозана

Механизм усиления иммунного ответа при комбинированном введении полиовируса или по-лиомиелитной вакцины с препаратами хитозана мог быть связан с проведением сигналов через Толл-рецепторы (ТЬЯ). Нами исследовано влияние препаратов хитозана, препаратов инактивированного полиовируса и полиомиелитной вакцины, а также комбинированного воздействия инактивированного полиовируса и полиомиелит-ной вакцины совместно с препаратами хитозана на группу Толл-рецепторов: ТЬЯ2, ТЬЯ4, ТЬЯ9. Как видно из таблицы 3, препараты хитозана активировали эти рецепторы в разной степени. Наиболее активно глютамат хитозана и микро/наночастицы сульфата хитозана активировали ТЬЯ9, в меньшей степени - ТЬЯ2. При парентеральном введении инактивированного полиовируса наблюдалась активация только ТЬЯ9 на всех изучаемых сроках после иммунизации. Введение полиомиелитной вакцины сопровождалось активацией всех трех изученных ТЬЯ на всех рассматриваемых сроках иммунизации. Как глютамат хитозана, так и микро/наночастицы сульфата хитозана проявляли адъювантное действие в комбинации с инактивированным полиовирусом, усиливая экспрессию данных рецепторов и увеличивая относительное количество экспрессирующих их клеток. Аналогичное резко выраженное адъювант-ное действие хитозана наблюдалось при комбинированном введении этого препарата совмест-

Таблица 2

Субпопуляционная структура лимфоцитов мышей, иммунизированных инактивированным полиовирусом или вакциной Имовакс Полно в комбинации с препаратами хитозана

Количество клеток, %

№ Препарат сэз 1ЧК сэз/мк СЭ4 СЭ25 С04/ СЭ25/РохрЗ СЭ8 мнем 76Т СЭ19 СЭ5

1 Контроль (физ. р-р) 24,4 ±2,1 2 ±0,3 0,53 ±0,15 16,4 ± 2,4 1,13 + 0,25 0,8 ± 0,35 7,27 ±1,15 20 ±4,5 0,33 ±0,15 20,6 ±2,15 0,97 ±0,3

1-есут 23,4 ±23,4 2,3 ± 0,2 1,24 ±0,23 12,06 ±1,29 1,47 ±0,25 1,97 ±0,15 7,13 ± 0,61 20,5 ± 2,29 0,44 ±0,15 18,46 ±1,46 0,5 ± 0,1

2 Полиовирус + физ. р-р 7-е сут 25,2 ±1,11 3,74 ± 0,51 2,7 ±0,571 16,34 ±2,1 1,64 ±0,3 2,3 ± 0,31 4,6 ± 0,51 24,2 ±1,95 0,63 ± 0,25 15,4 ± 1,15 1,4 ± 0,3

2-яимм., 7-е сут 23,1 ±2,2 1,96 ±0,1 1,1 ±0,26 17,4 ± 0,98 1,18 ± 0,4 1,42 ±0,14 4,36 ±0,081 22,8 ±1,89 0,7 ± 0,04 16,3 ± 0,9 1,2 ± 0,2

1-есут 17,1 ±0,71 2 ±0,3 0,22 ±0,11 13,96 ± 1,55 1,22 + 0,22 0,52 ±0,11 5,5 ± 0,35 20,9 ±2,75 0,48 ±0,17 20,9 ±2,65 0,8 ± 0,25

3 Имовакс Прлио 7-е сут 15,56 ± 1,48 4- 3,05 ±0,8 0,8 ±0,3 14,1 ±1,27 1,02 + 0,2 1,3 ± 0,3 4,2 ±0,251 25,96 ±2,3 0,7 ± 0,2 15,7± 2,36 1,2 ± 0,2

2-я имм., 7-е сут 15,4 ± 1,844, 1,99 ±0,7 0,6 ±0,2 14,7 ±0,97 1,69 ± 0,31 1,44 ±0,14 3,25 ± 0,171 23,4 ±2,42 0,74 ±0,025 9,04 ±1,271 0,76 ±0,47

1-есут 24,5 ±2,11 4,39 ±0,41 2,75 ± 0,221 18,5 ± 1,2 1,41 ±0,21 1,87 ±0,35 7,29 ±0,3 25,5 ±2,45 0,72 ±0,17 21,06 ±3,4 0,92 ±0,17

Полиовирус + 0,5% раствор глютамата хитозана

4 1-е сут 31, ±3,81' 5,06 ± 0,61 4,7 ±1,311 22,5 ±2,56 2,46 ±0,351 3,17 ±0,4 12,57 ±2,061 31,3 ±2,351 1,17 ±0,15 27,37 ±2,21 1,23 ± 0,25

2-я имм., 1-е сут 26,87 ±1,7 2,56 ± 0,15 2,1 ±0,71 17,75 ±1,58 2,17 ± 0,671 1,98 ±0,32 8,35 ±0,93 31,4 ± 1,51 2,39 ±0,181 21,3 ±4,3 2,33 ±0,351

1-есут 25,3 ±1,92 4,43 ±0,351 2,22 ± 0,231 20,2 ± 1,11 1,7 ± 0,25 2,2 ± 0,2 7,9 ±0,4 24,7 ±2,25 0,7 ± 0,25 22,3 ± 2,26 1 ±0,3

5 Имовакс Полно + 0,5% раствор 7-е сут 47,3 ± 2,021 4,97 ±0,651 6,8 ± 0,25Ц 27,8 ±1,441 2,43 ±0,41 4,2 ±1 15,8 ± 2,051 30,4 ±2,51 2,23 ±0,251 26,7 ±2,4 1,59 ±0,18

2-я имм., 7-е сут 35,6 ± 2,281 3,11 ±0,87 5,8 ± 0,55Ц 18,9 ±1,47 1,67 ±0,2 2,37 ± 0,41 10,8 ± 2,341 27,4 ±1,44 2,44 ±0,041 28,7 ±1,4 1,7 ± 0,25

ш

ТТ02/(б9) V оЫ ехшхегафосШониГгаед и ви.кжоинэЬ'иие

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 4 (59)/2011

Окончание таблицы 2

Количество клеток, %

№ Препарат сэз 1ЧК сэз/мк СЭ4 СЭ25 С04/ СЭ25/РохрЗ СЭ8 мнем 7&Т СЭ19 СЭ5

Полиовирус + 0,5% суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана 1-есут 24,3 ±1,15 5,2±0,25| 2,7±0,41 16,3 + 1,4 2,5 ±0,61 2,5 ± 0,27 9,4 + 0,35 27,3 ±1,85 0,83 ±0,25 25,5 ± 1,5 1,1 ±0,2

6 1-е сут 39,3 ± 2,4Т 5,2±0,9| 9,6 ± 2Ц 23,6 ±1,461 1,6 ±0,3 3,37 ±0,4 17,6 ±2,11 33,3 ±3,061 1,6 ±0,25 45,6 ±1,73Ц 1,7 + 0,2

2-яимм., 1-е сут 34,7 ± 2,071 4,1 ±0,ЗТ 0,21 ±0,09 20,7 ±1,07 1,8 ± 0,4 4,23 ±0,8 12,5 ± 21 42,5 ±2,51 2,33 ±0,031 56,4±2,8Ц 1,47 ± 0,18

Имовакс Полно ± 0,5% суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана 1-есут 27,1 ±1,76 6,3 + о.зтт 2,8 ± 0,45 Т 24,5 ±1,3 1,3 + 0,17 2,09 ±0,1 9,6 + 0,6 27,15 ± 1,7 0,87 ±0,25 24,7 ±2,35 1,17 + 0,25

7 1-е сут 36±3,7| 4 ± 0,4т 7± 1,3 Ц 27,3± 1,71 1,2 + 0,25 3 + 0,3 12,5 ± 21 32,4±2,81 2 ±0,41 27,4 + 2,4Т 1,7 ±0,25

2-яимм., 1-е сут 32,8±3,7| 5,6±0,08| 1,87 ±0,35 21,5 + 1,1 1,38 + 0,58 2,28 + 0,14 10,6 ±2,031 17,7 ± 2,28 2,7 ±0,031 26 ±2 1,35 ±0,05

1-есут 29,3 + 3,1 7,2±0,85Ц 2,3±0,31 20,62 ±2,2 1,7 + 0,35 2,43 ±0,41 9,23 + 0,65 33,6 + з, 1 т 0,43 ±0,15 21,83 ±2,45 1,23 ±0,25

0,5% суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана 1-е сут 28,4 + 2,87 4,2 ±0,95 1,63 + 0,2 Т 19,56 ± 1,75 1,03 ±0,3 1,43 ±0,3 9,06 ±0,3 40,9 ±2,951 0,73 ±0,3 22,9 ±2,85 1,9 ±0,45

8 2-яимм., 1-есут 29,43 ±3,47 6,533 ±0,65Ц 2,26 ± 0,251 20,2 + 0,95 1,433 ±0,15 2,1 ±0,25 8,66 ±0,35 36,16 ±2,751 0,366 ±0,15 21,433 ±1,05 1,566 ±0,3

2-яимм., 1-е сут 33,17±1,8| 4,16 + 0,85 2 ±0,0991 21,03 ±1,25 0,833 ±0,2 1,933 ±0,35 13,13 ± 2,51 37,93 ±2,41 0,7 ± 0,1 26,63 ±5 1,66 + 0,15

1-есут 26,4 ±2,42 6,7 + 0.6ТТ 0,96 + 0,25 18,03 ±1,65 2,76 ±0,21 1,43 ±0,65 8,44 ±0,6 30,83 ±2,6 0,6 + 0,1 18,93 ± 1,6 1,26 ±0,25

0,5% раствор 1-е сут 33,06 + 1 т 4,43 ±1,05 0,96 + 0,2 22,6 + 2,35 0,96 ±0,25 1,5 + 0,2 10,16 ± 2,05 37,96 ±1,451 0,96 ±0,25 21,3 + 1,5 1,46 ±0,25

9 глютамата хитозана 2-яимм., 1-есут 29,1 ±3,05 5,933 ±0,551' 1,366 ±0,31 19,4+ 2,45 1,0 ±0,3 1,5 + 0,3 8,866 ±1,25 34,03 ±1,11 0,633 ±0,200 20,37 ±1,2 1,366 ±0,2

2-яимм., 1-е сут 37,2 ± 3,85| 3,7 ±0,6 1,5±0,21 24,2 ±1,751 0,7 ± 0,2 1,6 + 0,3 13,566 + 0,5Т 37,433 ±1,81 0,733 ±0,15 23,23 ±1,6 1,5 ± 0,2

Р <0,05; Р < 0,01- достоверное повышение; Р < 0,05- достоверное снижение по сравнению со значениями контрольной группы (физ. р-р) неиммунизированных мышей по критерию Вилкоксона и ^критерию Стьюдента

Таблица 3.

Экспрессия TLRs на мононуклеарных лейкоцитах селезенок мышей, иммунизированных инактивированным штаммом полиовируса или вакциной Имовакс Полио в комбинации с препаратами хитозана

№ Препарат TLR2 TLR4 TLR9

1 Контроль (физ. р-р) 0,S66 ± 0,1S 0,3бб ± 0,1S 0,433 ± 0,1S

2 Полиовирус 1-е сутки 0,49 ± 0,09 0,33 ± 0,03 2,23 ± 0,1S*

7-е сутки 0,44 ± 0,03 0,3У ± 0,02S 1,В3 ± 0,04*

2-я имм., 7-е сутки 0,б1 ± 0,0У 0,S4 ± 0,21 2,У1 ± 0,01*

3 Полиовирус + 1% р-р хитозана 1-е сутки 0,93 ± 0,1б 0,У1 ± 0,0У 4,43 ± 0,03*

7-е сутки 1,0У ± 0,2S 0,В1 ± 0,12 2,0У ± 0,0В*

2-я имм., 7-е сутки 1,S9 ± 0,19 0,93 ± 0,03 3,21 ± 0,03*

4 Полиовирус + микрочастицы хитозана 1-е сутки 2,4 ± 0,02* 1,4 ± 0,04 4,3 ± 004*

7-е сутки 2,S4 ± 0,04* 0,В4 ± 0,04 4,14 ± 0,03S*

2-я имм., 7-е сутки 3,В ± 0,02S* 1,24 ± 0,03S 4,В ± 0,04*

S Имовакс Полио 1-е сутки 2,21 ± 0,03б* 1,34 ± 0,2 1,В ± 0,04*

7-е сутки 2,34 ± 0,04* 1,3 ± 0,03 1,У ± 0,04*

2-я имм., 7-е сутки 2,4У ± 0,02S* 1,S1 ± 0,03б* 2,2 ± 0,2В*

б Имовакс Полио + 1% р-р хитозана 1-е сутки У,3 ± 0,3б* 1,21 ± 0,03б S,6 ± 0,2*

7-е сутки У,1 ± 0,4* 1,0S ± 0,13 4,2S ± 0,2У*

2-я имм., 7-е сутки У,4 ± 0,4* 1,33 ± 0,3S 4,01 ± 0,19*

У Имовакс Полио+ микрочастицы хитозана 1-е сутки 9,0У ± 0,1* 0,У ± 0,04 У,У4 ± 0,03*

7-е сутки У,У4 ± 0,03б* 0,93 ± 0,03 6,4S ± 0,04*

2-я имм., 7-е сутки У,53 ± 0,03* 1,23 ± 0,03 В ± 1,1В*

В Микрочастицы хитозана 1-е сутки 1,0б ± 0,SS 0,бб ± 0,1S 1,S66 ± 0,3S*

7-е сутки 1,В ± 0,2* 0,433 ± 0,1S 4,S33 ± 0,3*

2-я имм., 1-е сутки 3,S ± 0,3* 0,У33 ± 0,2 4,33 ± 0,3*

2 имм., 7-е сутки 2,S ± 0,2* 0,У ± 0,2 2,У33 ± 0,3S*

9 Хитозан 1-е сутки 1,2б ± 0,4 0,В ± 0,4 1,133 ± 0,4

7-е сутки 1,13 ± 0,4 1,433 ± 0,3S* 3,6 ± 0,4S*

2-я имм., 1-е сутки 2,433 ± 0,1S* 1,S ± 0,2В 4,00 ± 0,3S*

2-я имм., 7-е сутки 1,В33 ± 0,2* 0,Вбб ± 0,1S 2,066 ± 0,2*

*Р < 0,05 - достоверное отличие от значений контрольной группы (физ. р-р) неиммунизированных мышей по критерию Вилкоксона и 1-критерию Стьюдента

но с полиомиелитной вакциной Имовакс Полио (с 2,2 до 7,3%) примерно на всех изучаемых сроках после иммунизации.

Резко выраженное адъювантное действие наблюдалось и при парентеральном введении полиомиелитной вакцины в комбинации с микро/на-ночастицами сульфата хитозана (с 2,2 до 9%) на первые сутки после первой иммунизации на TLR2 и (с 1,8 до 7,4%) на TLR9. В последующие сроки

адъювантное действие препаратов хитозана сохранялось на высоком уровне (7,5% для TLR2 на седьмые сутки после второй иммунизации и 8% для TLR9 на седьмые сутки после второй иммунизации).

4. Цитотоксическая активность

Нарастание количеств NK- и NKT-клеток приводило к стимулированию их цитотоксической ак-

Таблица 4.

Экспрессия TLRs на мононуклеарных лейкоцитах селезенок мышей, иммунизированных инактивированным штаммом полиовируса или вакциной Имовакс Полио в комбинации с препаратами хитозана

Препарат № групп Время взятия селезенок цитотоксическая активность

% (M ± SD) ци1

Контроль (физ. р-р) 1 1-е сут 17,86 ± 2,43 -

Полиовирус 2 1-е сут/1-я имм. 17,5 ± 0,2 0,98

3 7-е сут/1-я имм. 38,7 ± 1,8* 2,17

4 7-е сут/2-я имм. 16,2 ± 0,85 0,91

Вирус + 1% р-р хитозана 5 1-е сут/1-я имм. 44,4 ± 2,34* 2,49

6 7-е сут/1-я имм. 47,5 ± 2,29* 2,7

7 7-е сут/2-я имм. 17,9 ± 1,82 1

Вирус + микрочастицы хитозана 8 1-е сут/1-я имм. 49,1 ± 2,61* 2,75

9 7-е сут/1-я имм. 51,1 ± 3,85* 2.86

10 7-е сут/2-я имм. 46,8 ± 1,96* 2,62

Имовакс Полио 11 1-е сут /1-я имм. 17,5 ± 0,9 0,98

12 7-е сут/1-я имм. 40,3 ± 2* 2,24

13 7-е сут/2-я имм. 17,3 ± 1,27 0,97

Имовакс Полио + 1% р-р хитозана 14 1-е сут/1-я имм. 46,6 ± 1,4* 2,6

15 7-е сут/1-я имм. 48,4 ± 1,1* 2,7

16 7-е сут/2-я имм. 40 ± 2,45* 2,24

Имовакс Полио + микрочастицы хитозана 17 1-е сут/1-я имм. 47,7 ± 12,4* 2,67

18 7-е сут/1-я имм. 45,13 ± 2* 2,53

19 7-е сут/2-я имм. 48,4 ± 2,4* 2,7

1% р-р хитозана 20 1-е сут/1-я имм. 58 ± 2,7* 3,25

21 7-е сут/1-я имм. 45,4 ± 2,0* 2,54

22 1-е сут/2-я имм. 50,40 ± 1,75* 2,82

23 7-е сут/2-я имм. 42,06 ± 1,2* 2,35

Микрочастицы хитозана 24 1-е сут/1-я имм. 58,7 ± 4,5* 3,3

25 7-е сут/1-я имм. 46,23 ± 3,25* 2,59

26 1-е сут/2-я имм. 58,16 ± 2,75* 3,25

27 7-е сут/2-я имм. 49,73 ± 1,7* 2,78

1 Цитотоксический индекс - отношение цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов (к клеткам опухолевой линии К562) в опытной группе к цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов неиммунизированных мышей (физ. р-р) *Р < 0,01- достоверное отличие от значений контрольной группы (физ. р-р) неиммунизированных мышей по критерию Вилкоксона и 1-критерию Стьюдента

тивности по отношению к линии опухолевых клеток К562. Из таблицы 4 видно, что как глютамат хитозана, так и микро/наночастицы сульфата хитозана сами по себе резко усиливали цитотоксическую активность ИК-клеток. Введение препаратов хитозана в комбинации с инактивированным полиовирусом или полиомиелитной вакциной активировало цитотоксическую активность этих клеток в более умеренной форме.

5. Цитокины

В заключительной части исследования мы изучили влияние иммунизации мышей полиомиелитной вакциной в комбинации с препаратами хитозана на индукцию цитокинов. Как видно из таблицы 5, парентеральное введение мышам препаратов инактивированного полиовируса и полиомиелитной вакцины Имовакс Полио сопровождалось повышением в сыворотке крови мышей ряда цито-

Имовакс Полно + 0,5% раствор глютамата хитозана Имовакс Полно Полиовирус типа 1 + 0,5% раствор глютамата хитозана Полиовирус типа 1 + ,5% суспензия микро/на-ночастиц сульфата хитозана Полиовирус типа 1 + физраствор Препарат

л со л 4^ л л л со л 4^ л л л со л 4^ л л л со л 4^ л л л со л 4^ л л Время

45,9 ±3,6* 25,4 ±2,4* 29,8 ±1,1* 25,9 ±1,4* 27,7 ±2,1* 30,2 ±2,3* 14,5 ±0,3 17± 1,1* 46,9 ± 4,4 40,3 ±3,1* 26,8 ±2,4* 20,8 ± 1,3* 61,7 ±4,4* 64,2 ±4,5* 32,1 ±2,4* 32,8 ±3,3* 24,8 ±2,4* 25,6 ±1,6* 19,1 ±0,3* 19,8 ±1,3*

со со со о м со оз со м о 4^ О м со м сл оз оз оз со со м со со со со |+

со оз со СО со |+ М оз оз сл о со о

о 1+ м м со со |+ со со "сл оз |+ сл со |+ со со "оз со "сл со |+ "оз оз со оз со "сл м со "сл со "сл м "го со со сл "со м о р

сл "оз оз V "со |+ "го сл "со V со "со |+ "го "со |+ V сл "сл со "оз сл |+ оз "оз |+ со "со |+ |+ V |+ со 4^ со "со ю

ОЗ о оз го "сл оз оз "сл со со "го м сл "сл оз "сл со сл оз |+ оз |+ |+ со го "сл со м со |+ о "сл оз со "сл 4^ со со |+ 351,5 ±27 со м V н г

VI сл "со |+ V со "со "го о "со |+ со V |+ со "со "сл оз "со сл "го оз "оз го |+ "со |+ сл V "сл |+ _со "со "П 1 р

со о 1+ оз "оз 4^ "го со со "го со со "со со "сл со "со м "со оз со "оз "со "оз со V "сл сл "оз со о V "оз |+ со со со сл со о "сл оз "со р

оз "го "со со "со "сл V "оз "оз сл "го со "оз со "сл го "со оз "го со V го "сл сл со м V "оз "со 01

м о сл "сл сл м оз оз со 4^ о со сл сл со |+ м о со "сл м со со сл м оз о "сл сл |+ сл "сл со о м сл |+ со со сл |+ м со о "сл о оз "сл о со со сл "сл с!

сл "со со со со со со сл м |+ со со со м |+ о "го "го м со со V со со "со |+ |+ со "со со |+ со 1 "ГО

"сл 1+ м оз со со |+ 4^ о |+ со о со о со со "оз со ч сл "со сл со "го со "го м со м со со сл со "со 4^ о _со со "оз м оз р

со сл "оз "сл "со со "го го "го сл V "го 4^ V сл "го со "со |+ со "го |+ "сл "оз "ГО

"оз со о 1+ со со "сл м со о оз |+ о со "сл оз сл "сл V со со м сл "сл со о |+ сл м сл |+ со о со |+ о "сл сл со "сл оз со "сл р

со "сл о "го "со 4^ сл |+ со "сл м V |+ сл |+ сл го "оз "го о "со м сл V |+ со "оз |+ "сл "сл оз "го 05

со "со со м 1+ м со _со "сл _со "го оз о "го м оз "со _со "оз со оз сл |+ сл со "со со оз "оз со "со со оз сл со со V "сл оз "со |+ р

"оз "оз сл "со |+ V "го "сл |+ "со "сл V "со "со со "со со V |+ го "оз |+ "сл м "оз сл "со о "оз м

"оз со "со V "со |+ со |+ оз |+ со |+ оз "го со "го "оз "го со со "со "со со |+ "сл оз V со V р

1+ 1+ о V о V о "со о V |+ о "со о "оз о "сл |+ о "оз |+ "го |+ о V |+ о |+ о V |+ о V о "со |+ о V |+ "оз

о о "сл "сл м со |+ "сл со о |+ |+ м о со |+ со "сл о _со "сл сл |+ со "сл со сл "сл со "сл оз со "сл о "сл оз со "сл м о |+ м о со "сл р 1

1+ со "ч 4^ _со "со о "го 4^ со "со "со оз V со "го |+ "го "со о "со V |+ о "оз "со |+ со "оз "го о "сл V о

I

Е

0)

01

Ф 5<

!

е>ж-|->^1/иФоОиони'гшед

VI О

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 4 (59)/2011

Окончание таблицы 5

Препарат Время 11.-17 11.-12 Т^-а 11.-5 ТС Р-|3 1Ир 11.-6 11.-2 11.-4 И-10

Имовакс Полно + 0,5 % суспензия микро/ наночастиц сульфата хитозана 2ч 28,1 ± 2,3* 19,8 ± 1,5* 177 ± 14,4* 94,5 ± 6,8* 20,6 ± 1,4* 248,5 ±22* 30,6 ±2,3 266 ±3,8* 22,7 ± 1,7 16,3 ± 0,8 114,5± 12,1*

8ч 26,8 ± 2,4* 25,2 ± 2,4* 22,9 ± 2,4* 150,5 ± 11,3* 57,8 ±4,2* 384 ± 22* 30,5 ± 2,1 308,5 ±23,6* 43,8 ±3,3* 7,1 ±0,5 151 ± 13,2*

4ч 81 ±5,6* 35,1 ± 3,2* 235,5 ± 11* 92,7± 7,1* 125,6 ±8,9* 480 ± 29* 56,9 ±3,9* 120 ±9,8* 53,4 ±4,3* 17,6± 1,1 150,5 ± 12,3*

24 ч 96,9 ± 6,3* 48 ±3,8* 116± 7,3* 109 ± 7,6* 135 ± 10,3* 498 ± 32* 25,8 ± 1,8 55,6 ±5 40,3 ±3,7 14,1 ±0,7 123,5 ± 10,2*

0,5% раствор глютамата хитозана 2ч 17 ± 1,3* 9,6 ± 0,6 17,7 ± 1,5* 49,1 ± 3,3 30,6 ±2,7* 318 ±25* 27,6 ± 1,7 147± 15* 16,7 ±0,8* 18,4 ±1,1 99,5 ±8,4*

4ч 17 ± 1,1* 15,7 ± 1,3 28,3± 2,1* 53 ± 4,1 36,4 ±3,2* 578 ± 28* 27 ± 1,6 409 ±31* 48,9 ±3,7* 18,5 ± 1,1* 110 ± 8,1*

8ч 34,7 ± 0,5 19,8 ±2* 20,9 ± 1,6* 73,6± 5,1* 36,9 ±3,2* 335 ± 26* 28,2 ± 1,9 232,5 ±21* 49,3 ±4,4* 16,4 ± 0,8 114,5 ±9,1*

24 ч 17,5 ± 0,8* 18,9± 1,7* 14,2 ± 1,4 53,6 ± 3,3 37,5 ± 3,1* 345 ± 22* 25,8 ± 2,1 64 ±5,7 35,5 ±2,5* 16,9± 1,1 93 ± 7,1*

0,5 % суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана 2ч 15 ±0,7 11,8± 0,6 26,7 ± 2,1* 50,7 ± 3,2 21,2 ± 1,7* 161±11* 30 ±2,5 258,5 ± 19* 25,3 ± 1,6 12,1 ±0,9 96,5 ±7,1*

4ч 13,9 ±1,3 15,8 ±1,42 35,2 ± 3,2* 71 ±5,8* 21,6 ± 1,7* 89 ±7,1 32 ± 2,5* 338,5 ±24* 31,9 ± 2,8 13,2 ± 0,6 112 ± 9,6*

8ч 23,1 ± 0,15* 17,6± 1,1* 19,9 ± 1,6* 66,5± 5,1* 26,4 ± 2,1* 71,5 ± 4,9 23,6 ± 1,8 183,5 ± 15,5* 36,9 ±2,7* 14 ± 0,8 120 ±9,7*

24 ч 10,8 ± 2,3 14,1 ± 5 19,8 ±1,1* 74,5 ± 4,8* 27,9± 2,1* 73 ±5,8 23,2 ±2,3 60,5 ±5,4 26,8 ± 2,1 13,6 ±0,7 90 ±7,2*

Неиммунизирован-ные мыши (контроль) 11,7 ±1,3 11,3 ± 1,2 11,2± 1,3* 52,5 ±3,8 11,2 ± 1,3 74,5 ±5,5 26 ± 1,6 53,3 ±4,3 25,1 ±2 16,2 ± 0,9 49,5 ±3,3

ОТ

оэ

.1= X I

о =1 "а о

-е-

х ь

0)

*Р <0,05 - достоверное отличие от значений контрольной группы (физ. р-р) неиммунизированных мышей по критерию Вилкоксона и критерию Стьюдента

кинов, включая !ИР-у, !Ы7, ТИР-а, !1_-5, ТОРр, !1_-6, !Ы0. Наблюдалось особенно заметное повышение ТИР-а (в 10 раз), ТОР-р (в 8 - 10 раз) и умеренное повышение !1_-б и !Ы0 (в 2 - 3,5 раза).

В контрольных опытах парентеральное введение препаратов глютамата хитозана и микро/на-ночастиц сульфата хитозана приводило к появлению в сыворотке крови мышей значительного количества !1_-6 (повышение в 3,5 - 8 раз), !Ы0 (в 2 - 2,5 раза) и умеренного количества !1_-5.

Парентеральное введение мышам полиовиру-са или полиовакцины в комбинации с препаратами хитозана сопровождалось в отдельных случаях противоположными эффектами, в частности приводило к повышению или понижению в сыворотке крови иммунизированных животных определенных цитокинов. Необходимо отметить резкое повышение !Ы2 при иммунизации полиовирусом в сочетании с микро/наночастицами (в 2,4 - 9,6 раза) и полиомиелитной вакциной в сочетании как с глю-таматом хитозана, так и с микро/наночастицами (в 4,3 - 4,4 раза). С другой стороны, вывлялось крайне умеренное повышение !ИР-у на всех сроках наблюдения после иммунизации. Отмечено умеренное снижение ТИР-а при введении полиовиру-са с препаратами хитозана на поздних сроках наблюдения (в 4,3 - 4,4 раза) и едва заметное снижение при введении полиовакцины с хитозаном. Комбинированное введение полиовируса с хитозаном увеличивало экспрессию ТОР-р (в 1,6 - 5,6 раза) на поздних сроках наблюдения и экспрессию !1_-6 (в 2,5 - 5,3 раза) с последующим снижением на поздних сроках наблюдения.

Накопленная за последнее десятилетие информация свидетельствует о том, что для полной эра-дикации полиовируса необходимо использование инактивированной полиомиелитной вакцины. В связи со сниженной иммунногенностью инактивированной вакцины неизбежно возникает проблема использования адъювантов. В литературе описаны немногочисленные факты успешного использования адъювантов для повышения эффективности инактивированных полиовакцин [6, 15].

Данные, полученные нами при изучении в качестве адъюванта для гриппозных инактивированных вакцин хитозана, показали, что он повышал их иммуногенность и защитную эффективность, а также позволял снижать дозу антигена и количество прививок при сохранении высокой иммуно-генности препарата [1, 2]. Эти факты побудили исследовать возможность использования производных хитозана в качестве адъюванта для инактивированной полиомиелитной вакцины. Исследования при введении мышам инактивированных препаратов аттенуированных штаммов вируса полиомиелита Сэбина и крысам инактивированной трехвалентной полиомиелитной вакцины показали, что производные хитозана существенно повышают титры нейтрализующих антител даже при снижении дозы антигена.

Изучение иммунофенотипа моноядерных лейкоцитов мышей, иммунизированных парентерально полиомиелитной вакциной, свидетельствует о су-прессирующем влиянии вакцины на иммунную систему. Этот факт в какой-то степени объясняет необходимость многократной иммунизации инактивированной полиовакциной для получения адекватного иммунного ответа. Интересно отметить, что инактивированные препараты полиовируса, полученные в нашей лаборатории, не обладали выраженным супрессирующим действием.

Нами показано, что парентеральное введение как инактивированного вируса полиомиелита типа 1, так и трехвалентной инактивированной полиомиелитной вакцины с глютаматом хитозана приводило к увеличению субпопуляций CD3-, NK-, CD3/NK (NKT)-, CD8- и yôT-клеток. При этом наблюдалось повышение активности данных субпопуляций, судя по усилению экспрессии CD25 и MHC II. Следует особо отметить повышенную активность CD3/NK (NKT)-клеток (5,8 - 6,8%) при парентеральном введении полиомиелитной вакцины с глютаматом хитозана. При иммунизации мышей инактивированны-ми препаратами полиовируса или полиомиелитной вакциной в комбинации с суспензией микро/нано-частиц сульфата хитозана наблюдалась аналогичная картина - происходило увеличение численности указанных субпопуляций клеток, однако также отмечался рост популяций T-хелперов (CD4) и CD19 (В-лимфоцитов). Этот факт свидетельствует о том, что использование микро/наночастиц в качестве адъюванта индуцирует подключение механизмов активации не только клеточного, но и гуморального иммунитета, что является немаловажным фактором для формирования полноценного иммунного ответа с врожденными и адаптивными составляющими.

Как показали наши данные, препараты хитозана без антигена могут активировать рецепторы TLR2 и TLR9, а в комбинации с инактивирован-ным препаратом полиовируса и полиомиелитной вакциной они проявляют ярко выраженное адъ-ювантное действие, усиливая экспрессию данных рецепторов и содержание экспрессирующих клеток. Можно сделать предположение, что механизм усиления иммунного ответа при комбинированном введении соединений хитозана с полиосодер-жащими препаратами частично связан с проведением через TLR2 и TLR9 сигналов эффекторов врожденного иммунитета. Наши данные свидетельствуют: производные хитозана наиболее активно влияли на увеличение численности субпопуляций TLR2 и TLR9 в комбинации с вакциной Имо-вакс Полио.

Мы наблюдали у иммунизированных полиовирусом в комбинации с препаратами хитозана мышей активацию цитотоксической активности и нарастание количества NK- и NKT-клеток по отношению к линии опухолевых клеток К562. Следует также отметить, что препараты хитозана без антиге-

на могли на порядок усиливать цитотоксическую активность ИК-клеток.

Изучение экспрессии цитокинов под влиянием парентерального введения мышам инак-тивированного полиовируса или вакцины Имо-вакс Полио в комбинации с препаратами хитоза-на свидетельствует о разнонаправленности процессов. Наблюдается существенное повышение !Ы2 в сыворотке иммунизированных животных, что должно стимулировать выработку !NР-у ИК-клетками и Т-лимфоцитами. Согласно современным представлениям, ! И Р-у в кооперации с !Ы2 индуцируют дифференцировку С04+ клеток в ТИ1, обладающие способностью к продукции ! И Р-у, И--2 и лимфотоксина-а. !ИР-а способен ингибировать дифференцировку 004+ клеток в ТИ2-тип, синтезирующий !1_-4, !1_-5, и !Ы0, которые являются мощными ингибиторами цито-кинов ТИ1-типа. Таким образом, препараты хито-зана могут способствовать формированию клеточного звена иммунного ответа, обеспечивая полноценный противовирусный иммунитет. Од-

нако следует отметить, что в отличие от ситуации с иммунизацией мышей инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрипп, когда добавление препаратов хитозана стимулировало сильную экспрессию ! И Р-у (Ахматова и др., 2011), в нашем случае наблюдался невысокий синтез данного цитокина на разных сроках наблюдения. Парентеральное введение полиомиелитной вакцины в сочетании с препаратами хитозана аналогично сопровождалось менее интенсивной экспрессией ТИР-а и !Ы0, чем отмечалось в аналогичных опытах с инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрипп. Мы также наблюдали противоположный эффект производных хи-тозана на экспрессию ТОР-р при парентеральном введении мышам полиовирусных и гриппозных инактивированных вакцин. Эти факты свидетельствуют о том, что механизмы адъювантно-го действия производных хитозана при парентеральном введении инактивированных полиовирусных и гриппозных вакцин могут иметь как общие черты, так и существенные отличия.

Литература

1. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G. et al. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch. Virol. 2008. V. 153. P. 831 - 837.

2. Ghendon Y., Markushin S., Vasiliev Y. et al. Evaluation of chitosan properties as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccine and inactivated avian influenza virus // J. Med. Virol. 2009. V. 81. P. 494 - 506.

3. Gupta R., Siber G. Adjuvant for human vaccines - current status, problems and future prospects // Vaccine. 1995. V. 13. P. 1263 - 1276.

4. Illum L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Pharm. Res. 1998. V. 15. P. 1326 - 1331.

5. Illum L., Jabbat-Gill I., Hinchcliffe M. et al. Chitosanas a novel nasal delivery system for vaccines // Ad. Drug. Deliv. Rev. 2001. V. 51. P. 81 - 90.

6. Ivanov A., Dragunsky E., Chumakov K. 1,25-dihydroxyvitamin D3 enhances systemic and mucosal immune responses to inactivated poliovirus vaccine in mice // J. Inf. Dis. 2006. V. 193. P. 598 - 600.

7. Singla A., Chamla M. Chitosan some pharmaceutical and biological aspects // J. Pharm. Pharmacol. 2001. V. 53. P. 1047 - 1067.

8. Van der Lubben I., Verhoef I., Borchard G. et al. Chitosan and its derivatives in mucosal drug and vaccine delivery // Eur. J. Pharm. Sci. 2001. V. 14. P. 201 - 207.

9. Van der Lubben I., Kersten G., Fretz M. et al. Chitosan microparticles for mucosal vaccination against diphtheria: oral and nasal efficacy studies in mice // Vaccine. 2003. V. 21. P. 1400 - 1408.

10. WHO. Progress towards interrupting wild poliovirus transmission worldwide, 2008 // Wkl. Epid. Rec. 2009a. V. 84. P. 110 - 116.

11. WHO. Closal definition of wild and vaccine - derived polioviruses, January 2008. June 2009.

12. Wkl. Epid. Rec. 2009b. Global detection of wild and vaccine-derived polio-viruses. 2009 V. 84. P. 366 - 371.

13. WHO. Conclusion and recommendations of the Advisory Committee on poliomyelitis eradication, November 2009 // Wkl. Epid. Rec. 2010. V. 85. P 1 - 11.

14. Yang C., Shi H., Zhou J. et al. CpG oligodeoxynucleotids are a potent adjuvant for an inactivated polio vaccine produced from Sabin strains of poliovirus // Vaccine. 2008. V. 27. P 6558 - 6563.

короткой строкой

новая комбинированная вакцина против Haemophilus influenzae и Neisseria meningitidis

По данным, полученным в последних исследованиях, проведенных в США, дети до двух лет наиболее часто страдают от менингококковых заболеваний.

В настоящее время, после успешного завершения II фазы испытаний, было проведено рандомизированное исследование (III фаза) в США, Австралии и Мексике с участием 4180 детей (распределенных случайным образом), в котором изучались эффективность и безопасность комбинированной вакцины против H. influenzae типа b (Hib) и N. meningitidis серогрупп C (MenC) и Y (MenY) в сочетании со столбнячным анатоксином (HibMenCY-ТТ).

Одна группа детей иммунизировалась вакциной HibMenCY-ТТ в возрасте 2, 4, 6 и 12 - 15 месяцев, вторая - лицензированной вакциной против Hib-инфекции (Акт-ХИБ, ActHIB) в возрасте 2, 4, 6 месяцев и в 12 - 15 месяцев - конъюгированной вакциной PedvaxHIB.

После введения четвертой дозы вакцины HibMenCY-ТТ у более чем 98% пациентов отмечался защитный уровень антител

против N. meningitidis серогрупп C и Y. Кроме того, уровень защитных антител к Hib отмечался у 96,3% вакцинированных и был сопоставим с таковым во второй группе после введения третьей дозы - 91,3%.

После каждой прививки не более чем у 0,2% детей в каждой группе отмечалась лихорадка выше 40 °C, боль и отек в месте инъекции - у 0,4% детей, получивших вакцину HibMenCY-ТТ, и у 0,6% во второй группе.

Таким образом, новая комбинированная вакцина HibMenCY-ТТ обеспечивает адекватную иммунную защиту против менингококковой инфекции, вызванной входящими в состав вакцины серогруппами N. meningitidis, без увеличения количества инъекций в схеме иммунизации. Она характеризуется приемлемым профилем безопасности и может назначаться детям первого года жизни.

Источник: http://pediatrics.aappublications.org/