РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВИРУСЫ БОЛЕЗНИ МАРЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
RECOMBINANT MAREK'S DISEASE VIRUSES AND USES THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается рекомбинантных вирусов и их применения. Более конкретно, изобретение касается новых рекомбинантных вирусов болезни Марека, кодирующих нужные полипептиды, и их применения для экспрессирования или доставки таких полипептидов животным, в особенности домашним птицам. Изобретение особенно подходит для вакцинации домашней птицы против патогенов птиц.
Уровень техники
Мясо и яйца домашней птицы являются важным источником продуктов питания, потребление которых непрерывно возрастает вследствие роста населения и хорошего соотношения цены и качества у них. Недавняя эпидемия птичьего гриппа сосредоточила общественное мнение на охране здоровье птиц, а также надежности и безопасности пищевых продуктов. Технология вакцинации домашней птицы вызывает обеспокоенность во всем мире.
В качестве вакцин для домашних птиц против соответствующих патогенов обычно применяются рекомбинантные вирусы, экспрессирующие белки патогенов. Вакцины, в том числе такие вирусы, индуцируют экспрессию чужеродных белков патогенов или их фрагментов в инфицированных клетках, которые могут впоследствии индуцировать специфичный и защитный гуморальный иммунитет, а также клеточный иммунитет.
Известно, что различные вирусы могут жить в организме зараженного животного в состоянии латентной или хронической инфекции. Поэтому такие вирусы, в которые был встроен чужеродный ген, полученный от патогена, разрабатывались для применения в качестве вирусных векторных вакцин, увеличивающих продолжительность иммунитета у иммунизированных животных.
Эти вирусные векторы (или рекомбинантные вирусы), как правило, основываются на птичьих поксвирусах (avipox viruses) типа поксвируса домашних птиц (fowlpox viruses) (ЕР-А-0517292), герпесвирусах типа вируса болезни Марека 1, 2 и 3-го серотипа (HVT) (например, см. WO-A-87/04463, 5980906, 5853733) или же вируса болезни Ньюкасл (NDV) и птичьих аденовирусах.

Эти рекомбинантные птичьи вирусы проявляют различные уровни защиты. Рекомбинантный HVT, экспрессирующий VP2 IBDV, проявляет преимущества перед классическими вакцинами от инфекционного бурсита (Vectormune IBD). Другие представляющие интерес векторы HVT экспрессируют антигены NDV (Vectormune ND) или ILTV (Vectormune LT).
Одной из практических проблем с рекомбинантными вирусами на основе HVT является их интерференция при использовании нескольких вирусов в комбинации для придания иммуногенности против различных патогенов. Так, при смешивании двух различных rHVT, экспрессирующих разные антигены, происходит снижение защиты по крайней мере против одной из болезней (например, см. Slacum G. et al., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23-25, p 84).
Соответственно, существует потребность в новых подходах к улучшению вакцинации у животных, особенно у домашних птиц, позволяющих одновременную защиту от нескольких заболеваний.
Были разработаны мультивалентные векторы HVT, которые могут экспрессировать два различных антигенных пептида (см. РСТ/ЕР 2013/056839).
В настоящем изобретении раскрыты новые рекомбинантные вирусы, пригодные для индукции сильной иммунной защиты у животных, которые к тому же могут применяться в комбинации с другими вирусными вакцинами для обеспечения расширенного иммунитета.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение касается рекомбинантных вирусов болезни Марека ("MDV"), которые могут кодировать один или несколько представляющих интерес полипептидов. Более конкретно, в изобретении раскрыты усовершенствованные вирусы MDV, содержащие производный промотор бета-актина, и вне ожидания оказалось, что в контексте этих вирусов такие конструкции позволяют значительно улучшить экспрессию и выработку сильного защитного иммунитета. В изобретении также показано, что такие вирусы совместимы с комбинированным применением вместе с различными птичьими герпесвирусами для выработки лучшего иммунного ответа против различных антигенных патогенов без существенной перекрестной интерференции.
Таким образом, предметом изобретения является рекомбинантный вирус болезни Марека ("rMDV"), который содержит рекомбинантную последовательность нуклеотидов, кодирующую представляющий интерес полипептид, функционально связанную с промотором, происходящим из промотора бета-актина курицы.
Другим предметом изобретения является рекомбинантный вирус болезни Марека, который включает в себя (1) промотор, содержащий ядро последовательности промотора бета-актина курицы, и (2) под контролем данного промотора - рекомбинантную последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид.
Рекомбинантная последовательность нуклеотидов может быть вставлена в различные участки вирусного генома, предпочтительно в такой участок, который не является необходимым для репликации или инфекции вируса, предпочтительно в ген US2. Как будет изложено далее, rMDV по изобретению может содержать одну или несколько рекомбинантных последовательностей нуклеотидов, кодирующих различные представляющие интерес полипептиды. Более конкретно, представляющим интерес полипептидом является антигенный пептид, как правило, антигенный пептид патогена птиц. Рекомбинантный вирус болезни Марека (rHDV) по изобретению предпочтительно относится к серотипу 1 (MDV1).
Другим предметом изобретения является композиция, содержащая рекомбинантный вирус болезни Марека, как определено выше, и необязательно фармацевтически или ветеринарно-приемлемый наполнитель или носитель и/или подходящий адъювант.
Следующим предметом изобретения является композиция вакцины, содержащая рекомбинантный вирус болезни Марека, как определено выше. Такая вакцина может применяться, например, для иммунизации птиц типа домашней птицы.
Другим предметом изобретения является рекомбинантный вирус болезни Марека или композиция, как определено выше, для применения для вакцинации птиц, предпочтительно цыплят.
Другим предметом изобретения является рекомбинантный вирус болезни Марека или композиция, как определено выше, для применения для индуцирования или стимулирования иммунного ответа у птиц, предпочтительно цыплят.
Следующим предметом изобретения является рекомбинантный MDV1, как определено выше, для применения в комбинации с другим рекомбинантным герпесвирусом другого серотипа и экспрессирующим другой антиген, для вакцинации птиц, предпочтительно цыплят, путем одновременного, раздельного, последовательного или чередующегося введения.
В другом аспекте изобретения предусмотрен способ вакцинации животных, включающий по меньшей мере одно введение композиции или вируса, как определено выше.
В следующем аспекте изобретения предусмотрен способ индуцирования иммуногенного или защитного ответа у животных против одного или нескольких патогенов птиц, включающий по меньшей мере одно введение композиции или вируса, как определено выше.
Следующим предметом изобретения является способ получения рекомбинантного вируса болезни Марека, включающий (i) введение рекомбинантной последовательности нуклеотидов, кодирующей полипептид под контролем промотора, содержащего ядро последовательности промотора бета-актина курицы, в несущественный участок генома вируса болезни Марека, (ii) необязательно реплицирование вируса и (iii) необязательно извлечение вируса.
Следующим предметом изобретения является рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая геном вируса болезни Марека или его фрагмент, причем данный геном или фрагмент содержит ген US2, модифицированный путем введения рекомбинантной последовательности нуклеотидов, включающей последовательность, кодирующую полипептид под контролем промотора, содержащего ядро последовательности промотора бета-актина курицы.
Изобретение также касается плазмид, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше.
Другим предметом изобретения являются клетки хозяина или культуры таких клеток, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты или плазмиду или вирус, как определено выше.
Изобретение также касается способа вакцинации птиц, включающего введение данным птицам эффективного иммунизирующего количества вакцины или композиции или вируса по изобретению.
Изобретением также предусмотрен набор для иммунизации птиц, который содержит эффективное количество вакцины по изобретению и средство для введения данной вакцины данным птицам.
Изобретение может применяться для экспрессии полипептида у любых животных, предпочтительно для вакцинации птиц, и оно подходит для экспрессирования любого полипептида или пептида, а именно любого иммуногенного пептида патогенов птиц.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма генома Rispens и расположение клонированной области, включая участок вставки внутри гена US2.
На фиг. 2 представлена диаграмма рекомбинантного генома Rispens/IBD с указанием местоположения стыковочных участков (Junction 1 и Junction 2), амплифицированных в реакциях ПЦР для подтверждения структуры генома вирусов.
На фиг. 3 представлено детектирование методом вестерн-блота экспрессии белка VP2 IBDV рекомбинантными вирусами Rispens/IBD.
На фиг. 4 представлены титры IBDV по ELISA у цыплят SPF, вакцинированных рекомбинантным Rispens/IBD, с помощью коммерческого набора ELISA для IBD.
На фиг. 5 представлены титры IBDV по ELISA у коммерческих цыплят породы белый леггорн, вакцинированных рекомбинантным Rispens/IBD, с помощью коммерческого набора ELISA для IBD.
На фиг. 6А и 6В представлены титры IBDV и NDV по ELISA у коммерческих цыплят породы белый леггорн, вакцинированных рекомбинантным Rispens/IBD и рекомбинантным HVT7ND, с помощью коммерческого набора ELISA для IBD и коммерческого набора ELISA для ND.
На фиг. 7 представлена продолжительность иммунитета к IBDV, вызванного рекомбинантным вирусом по изобретению.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение в общем касается rMDV, содержащего рекомбинантную последовательность нуклеотидов, кодирующую представляющий интерес продукт, помещенную под транскрипционный контроль производного промотора бета-актина курицы. Настоящее изобретение также касается композиций, содержащих такие rMDV, а также их применения для вакцинации животных, в особенности домашних птиц.
Настоящее изобретение станет наиболее понятным с привлечением следующих определений.
Определения
Термин "вирус" означает, в частности, вирусные частицы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты (например, геном), инкапсулированную в капсиде или капсуле. Термин "вирус" также означает вирусный вектор или выделенный вирусный геном.
Термин "рекомбинантный" обозначает молекулы, которые были созданы, разработаны или модифицированы с использованием генетических технологий. В отношении вирусов этот термин более конкретно обозначает вирусы, геном которых был модифицирован путем введения по меньшей мере одной гетерологичной нуклеиновой кислоты, т.е. такой нуклеиновой кислоты (например, ДНК), которая не встречается в природе в геноме вируса или которая встречается в природе в данном геноме, но в другой форме или в другом месте. Рекомбинантный вирус может быть получен различными способами, а после получения может воспроизводиться без дальнейшего применения генетических технологий. В отношении нуклеиновой кислоты (например, гена) термин "рекомбинантный" обозначает конструкции, которые либо не существуют в природе, либо подвергались манипулированию или клонированию или перестройке таким образом, что они, например, фланкированы последовательностями, которые в природе не фланкируют данную последовательность.
В настоящем описании термины "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеотидов" применяются взаимозаменяемо и относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, имеющим определенную последовательность, которая может представлять собой дезоксирибонуклеотид (ДНК) и/или рибонуклеотид (РНК). Последовательность нуклеотидов сначала может быть получена, например, рекомбинантными, энзиматическими и/или химическими способами, а затем реплицирована в клетках хозяина или в системе in vitro. Последовательность нуклеотидов предпочтительно содержит открытую рамку считывания, кодирующую нужный продукт, как-то полипептид (например, пептид, белок и т.д.) или РНК. Последовательность нуклеотидов может содержать дополнительные последовательности, как-то терминатор транскрипции, сигнальный пептид, IRES, интрон и др.
Термин "нетранслируемый участок" в настоящем описании относится к таким участкам из нуклеотидов, которые не имеют ORF и не определяют аминокислотную последовательность белка, экспрессирующегося при трансляции, или же таким участкам из нуклеотидов, у которых ORF не участвует ни в транскрипции, ни в трансляции или экспрессии белка.
Термин "виды птиц" служит для обозначения всевозможных птиц типа птиц из класса Aves, т.е. позвоночных животных, которые являются пернатыми, крылатыми, двуногими, эндотермическими и откладывающими яйца. В контексте изобретения, птицы или виды птиц более определенно означают птиц, представляющих экономический и/или агрономический интерес, как-то домашних птиц (типа кур и индеек), водоплавающих домашних птиц (типа уток и гусей) и декоративных птиц (типа лебедей и попугаев).
Термин "вакцина" в настоящем описании обозначает средства, которые могут применяться для того, чтобы вызвать, стимулировать или усиливать иммунный ответ в организме.
"Представляющие интерес продукты" включают в себя, без ограничения, полипептиды (например, пептиды, белки и т.д.), а также РНК (например, антисмысловые РНК, интерферирующие РНК, аптамеры и др.).
"Иммунный ответ" означает развитие у хозяина клеточного и/или антительного иммунного ответа на данную композицию или вакцину. Обычно "иммунный ответ" включает выработку антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных конкретно на антиген или антигены, входящие в данную композицию или вакцину. Предпочтительно иммунный ответ является защитным с тем, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или уменьшалась клиническая тяжесть заболевания.
Вирусы болезни Марека
Вирусы болезни Марека представляют собой птичьи герпесвирусы. В данной области приводились различные серотипы MDV, в частности, вирус болезни Марека серотипа 1 типа штамма CVI988/Rispens и вирус болезни Марека серотипа 2 типа штамма SB1. Предпочтительно вирусы болезни Марека по изобретению происходят из тех серотипов или штаммов, которые не патогенны для данных видов животных (например, птиц). Наиболее предпочтительным вирусом MDV по изобретению является рекомбинантный MDV серотипа 1.
MDV раскрыты в публикациях (к примеру, см. Kingham et al. "The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek's disease viruses" - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135) и в общем доступны из коллекций. Последовательность генома MDV также доступна в библиотеках генов (GenBank Асc. No. DQ530348 и AF291866).
Изобретение касается любых продуктов или композиций rDMV, в которых рекомбинантная последовательность нуклеотидов функционально связана с производным промотором бета-актина. Так, авторы изобретения показали, что такие конструкции позволяют сильно улучшить экспрессию и индукцию сильного защитного иммунитета. Также в изобретении показано, что такие вирусы совместимы для комбинированного применения с различными птичьими герпесвирусами и вызывают лучший иммунный ответ против различных антигенных патогенов без существенной интерференции. Как показано в примерах, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что, в контексте rMDV, этот промотор вызывает более высокую и продолжительную экспрессию полипептида, причем такая экспрессия не изменяется при совместном введении другого вектора из птичьего герпесвируса, что позволяет проводить одновременную иммунизацию против нескольких различных антигенов.
Промотор бета-актина
Последовательность промотора бета-актина курицы известна в данной области и имеется в общедоступных библиотеках генов. Типичная последовательность представлена в SEQ ID NO: 12.
Промотор, "происходящий" из промотора бета-актина курицы, есть такой промотор, который содержит последовательность функционального фрагмента промотора бета-актина курицы, предпочтительно последовательность транскрипционно активного фрагмента промотора бета-актина курицы. Промотор также может включать в себя дополнительные остатки или функциональные домены, которые могут быть искусственными и/или полученными из других промоторов. Промотор, происходящий из промотора бета-актина курицы, как правило, содержит по меньшей мере 50 последовательных нуклеотидов из последовательности данного промотора бета-актина курицы или последовательности, идентичной ему по меньшей мере на 90% по последовательности, предпочтительно идентичной ему по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% по последовательности, и обладает транскрипционной активностью либо сам по себе, либо в сочетании с дополнительным доменом.
Последовательность производного промотора бета-актина курицы для применения в настоящем изобретении более предпочтительно представляет собой последовательность, которая содержит по крайней мере ядро последовательности промотора бета-актина курицы. Ядро последовательности обычно располагается в пределах участка между нуклеотидами -1200 и -900 природного промотора, еще более предпочтительно между нуклеотидами -1192 и -922. Конкретный пример ядра последовательности промотора бета-актина курицы представлен в SEQ ID NO: 5:
TATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGT.
В предпочтительном воплощении промотор, используемый в изобретении, содержит ядро последовательности промотора бета-актина курицы, которое включает (i) SEQ ID NO: 5 или (ii) последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO: 5 по меньшей мере на 90%, предпочтительно идентичную последовательности SEQ ID NO: 5 по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99%, и проявляет транскрипционную активность промотора.
В предпочтительном воплощении изобретение относится к rDMV, содержащим нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, включающим SEQ ID NO: 12.
В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к rDMV, содержащим нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, включающим SEQ ID NO: 5.
Представляющий интерес полипептид
rMDV по изобретению может применяться для доставки и/или экспрессии любых представляющих интерес полипептидов, как-то биологически активных полипептидов или иммуногенных (т.е. антигенных) полипептидов. В предпочтительном воплощении, представляющий интерес полипептид представлен антигенным пептидом, еще более предпочтительно пептидом или полипептидом, полученным из антигена патогенного организма, способного вызвать инфекцию у животных, в особенности птиц. Примеры патогенов, вызывающих инфекции у птиц, включают вирусы, бактерии, грибки, простейшие и пр. Иммуногенный (поли)пептид предпочтительно представлен (происходит из) поверхностным белком, секретируемым белком или структурным белком данного патогена либо их фрагментами. Полипептид может происходить из любого источника, например, вирусного, прокариотического, эукариотического или синтетического.
В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота кодирует антигенный пептид возбудителя заболевания птиц.
Конкретные примеры возбудителей заболеваний включают, без ограничения, вирус птичьего гриппа, птичий парамиксовирус типа 1, также называемый вирусом болезни Ньюкасл (NDV), птичий метапневмовирус, вирус болезни Марека, вирус болезни Gumboro, также называемый вирусом инфекционного бурсита (IBDV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILVT), вирус инфекционного бронхита (IBV), Escherichia coli, Salmonella sp., Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, микроорганизмы Mycoplasma, инфицирующие различные виды птиц, или кокцидии.
Предпочтительно иммуногенный полипептид выбирают из белка F NDV, белка VP2 IBDV, белка gB ILTV, белка 40K Mycoplasma gallisepticum и поверхностного белка гемагглютинина (НА) вируса птичьего гриппа либо их иммуногенных фрагментов.
В контексте настоящего изобретения термин "фрагмент" белка предпочтительно означает фрагмент, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков данного белка, более предпочтительно от 5 до 100. В предпочтительном воплощении такой фрагмент содержит по меньшей мере один эпитоп и/или является иммуногенным in vivo, то есть может вызывать выработку антител, связывающихся с целым белком.
Конкретные примеры иммуногенных пептидов включают, к примеру, пептид, содержащий аминокислотные остатки 1-453 полноразмерного VP2.
Конструирование вируса
Клонирование генов и конструирование плазмид хорошо известно рядовым специалистам в данной области и в основном может проводиться стандартными методами молекулярной биологии (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012).
Как указано выше, rMDVs по изобретению содержат рекомбинантную последовательность, которую обычно клонируют в несущественный участок вирусного генома. Клонирование может осуществляться известными в этой области методами per se. Как правило, рекомбинантные вирусы получают путем гомологической рекомбинации между геномом вируса и конструкцией (например, плазмидой), содержащей нуклеиновую кислоту для введения, фланкированную нуклеотидами из сайта вставки, способствующими рекомбинации. Клонирование может проводиться с удалением эндогенных последовательностей или без него. В предпочтительном воплощении рекомбинантная последовательность клонируется взамен по крайней мере части последовательности генома, как-то по меньшей мере 50 нуклеотидов или больше. Такая делеция, например, повышает клонирующую способность вектора.
Для этой цели последовательность, содержащую целевой участок, как правило, сначала клонируют в подходящий вектор. В соответствии с изобретением, таким целевым участком предпочтительно служит участок, несущественный для репликации вируса или инфекции, как-то некодирующий (или нетранслируемый) участок, либо несущественный ген. Предпочтительным примером такого участка является ген US2. Примеры векторов включают такие плазмиды, как pBR322, pBR.325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 или pUC9; такие фаги, как фаг лямбда и фаг М13; или такие космиды, как рНС79.
Последовательность целевого участка встраивают в вектор в соответствии со стандартным методом клонирования. Используемая последовательность целевого участка предпочтительно имеет достаточную длину, чтобы способствовать последующей гомологической рекомбинации с вирусным геномом. Предпочтительно последовательность клонируемого целевого участка должна иметь длину по меньшей мере около 100 нуклеотидов, обычно более 300, как-то от 1000 до 2000 нуклеотидов.
Последовательности кодирующей области и промотора, предназначенные для вставки в вирус, вставляются в целевой участок вирусного генома, клонированный в вектор. Вставка должна проводиться предпочтительно таким образом, чтобы на каждой стороне клонируемой вставки оставалась часть последовательности целевого участка с достаточной для обеспечения гомологической рекомбинации длиной (например, по меньшей мере 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов). Последовательности кодирующей области и промотора можно вводить в клонированный целевой участок по классическим методикам рестрикции ферментами и лигирования. Если нужно, в определенном месте целевого участка можно произвести мутации для создания нового сайта расщепления для рестрикционного фермента. Для этой цели можно использовать стандартные методы мутагенеза, хорошо известные специалистам в данной области, такие, например, как мутагенез in vitro или ПЦР.
Векторы, у которых в целевой участок были встроены последовательности кодирующей области и промотора, полученные как описано выше, можно вводить в инфицированные MDV клетки или трансфецированные геномом MDV клетки известными методами типа электропорации, методами на основе фосфата кальция или липофектина и пр. При этом в данных клетках образуются рекомбинантные вирусы при рекомбинации между гомологичными участками ДНК MDV и вектора. Эффективность получения рекомбинантных вирусов будет особенно оптимальной, если количество вектора составляет от 0,1 до 1000 мкг.
Полученные рекомбинантные вирусы можно подвергнуть отбору по генотипу или по фенотипу с помощью известных методов отбора, например посредством гибридизации, детектируя активность фермента, кодируемого геном, встроенным вместе с рекомбинантными последовательностями нуклеиновой кислоты, или детектируя антигенный пептид, экспрессируемый рекомбинантным вирусом, иммунологическими методами. Отобранный рекомбинантный вирус можно культивировать в больших масштабах в клеточной культуре, после чего можно извлечь рекомбинантный вирус, содержащий пептиды.
Предпочтительные rMDVs
Предпочтительные rMDVs по изобретению содержат по меньшей мере одну рекомбинантную нуклеиновую кислоту, вставленную в ген US2, более предпочтительно взамен по крайней мере части гена US2, еще более предпочтительно между 248-м и 494-м нуклеотидами от старт-кодона.
Наиболее предпочтительные rMDVs настоящего изобретения относятся к серотипу 1 MDV.
Кроме того, предпочтительные rMDVs по изобретению кодируют антигенный пептид, выбранный из белка F NDV, белка VP2 IBDV, белка gB ILTV, белка 40K из Mycoplasma gallisepticum и поверхностного белка НА вируса птичьего гриппа либо их фрагментов.
В соответствии с предпочтительным воплощением, изобретение касается рекомбинантных вирусов MDV1, которые включают вставленную в ген US2 последовательность нуклеотидов, кодирующую белок VP2 IBDV или его фрагмент, под контролем промотора, содержащего ядро последовательности промотора бета-актина курицы.
Конкретные примеры таких rMDVs по изобретению включают RR013, RR030 и RR031.
У RR013 последовательность антигенного пептида находится под контролем промотора Вас по SEQ ID NO: 12, вставленного в ген US2 MDV1.
У RR030 и RR031 последовательность антигенного пептида находится под контролем промотора Соа5 по SEQ ID NO: 5, вставленного в ген US2 MDV1.
Клеточные культуры
Рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению можно размножить в любых культурах компетентных клеток. После достижения требуемого роста вирусов, клетки можно отделить от лунок с помощью скребка или с помощью трипсина, а инфицированные клетки можно отделить от супернатанта центрифугированием.
Примеры компетентных клеток включают CEF, яйца с зародышем, клетки почек курицы и др. Клетки или вирусы можно культивировать в такой культуральной среде, как среда Игла MEM, культуральная среда Leibowitz-L-15/McCoy 5А (смесь 1:1), примерно при 37°С в течение 3-6 дней. Инфицированные клетки, как правило, суспендируют в культуральной среде, содержащей 10% диметилсульфоксида (DMSO), и хранят в замороженном виде в жидком азоте.
Композиции и вакцины
Изобретение также касается композиций типа вакцин, которые содержат один или несколько рекомбинантных MDV по изобретению.
Композиции по изобретению могут содержать rMDV в фармацевтически или ветеринарно-приемлемом носителе или наполнителе. Кроме того, композиция может содержать и подходящий адьювант.
rMDVs по изобретению могут применяться в живом виде (например, для получения живых вакцин) или же в инактивированном, ослабленном или убитом виде. Получение таких форм известно в данной области.
Вакцина по настоящему изобретению также может содержать подходящий растворитель, такой, к примеру, как водный буфер или фосфатный буфер. Предпочтительно вакцина также содержит добавки. Добавки по настоящему изобретению могут быть получены из любого из целого ряда источников, включая различные белки и пептиды, происходящие из животных (например, гормоны, цитокины, костимулирующие факторы), и новые нуклеиновые кислоты, происходящие из вирусов и других источников (например, двухцепочечная РНК, CpG), и пр., которые вводятся с вакциной в количестве, достаточном для усиления иммунного ответа. Кроме того, любое число комбинаций вышеупомянутых веществ может обеспечить иммуностимулирующий эффект, поэтому они могут составлять иммуностимуляторы по настоящему изобретению.
Вакцины по настоящему изобретению также могут быть составлены с одной или несколькими дополнительными добавками для поддержания изотоничности, физиологического значения рН и стабильности, например, с таким буфером, как физиологический раствор (0,85%), фосфатно-солевой буфер (PBS), цитратные буферы, трис(гидроксиметиламинометан (трис), трис-солевой буфер и др., или антибиотиком, к примеру, неомицином или стрептомицином и др.
Способом введения может быть любой способ, включая пероральное, глазное (например, в виде глазных капель), окулоназальное введение с помощью аэрозоля, интраназальное, клоакальное с кормом, водой или с помощью распылителя, вакцинацию in ovo, топически или посредством инъекции (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной, внутриглазничной, внутриглазной, внутрикожной и/или внутрибрюшинной). Специалист сможет легко адаптировать рецептуру композиции вакцины для каждого типа способов введения.
Каждая доза вакцины может содержать подходящую дозу, достаточную для того, чтобы вызвать защитный иммунитет у птиц. Оптимизация такой дозы хорошо известна в данной области. Количество антигена на 1 дозу можно определить известными методами с помощью реакций антиген/антитело, например, методом ELISA.
Вакцины по изобретению можно вводить в виде однократных доз или в виде повторных доз, в зависимости от протокола вакцинации.
Вакцины настоящего изобретения также предпочтительны тем, что они обеспечивают птицам защиту почти на 80% от заданных патогенов птиц.
Настоящее изобретение также касается применения вакцины, как описано выше, для иммунизации таких птиц, как домашние птицы, и способа иммунизации птиц путем введения иммунологически эффективного количества вакцины по изобретению. Вакцина предпочтительно вводится внутрикожно, подкожно, внутримышечно, перорально, in ovo, через слизистую оболочку или посредством окулоназального введения.
Настоящее изобретение также касается вакцинационных наборов для иммунизации различных птиц, которые содержат эффективное количество поливалентной вакцины, как описано выше, и средство для введения данных компонентов данному виду. Например, такой набор содержит устройство для инъекции, заполненное вакциной по изобретению, и инструкции для внутрикожного, подкожного, внутримышечного или введения in ovo. В качестве альтернативы, набор включает в себя устройство для распыления/аэрозоля или глазных капель, заполненное вакциной по изобретению, и инструкции для окулоназального, перорального введения или введения через слизистую оболочку.
Другие аспекты и преимущества изобретения будут изложены в нижеследующем экспериментальном разделе, который поясняет заявленное изобретение.
Примеры
В этих экспериментах было получено и использовано несколько рекомбинантных вирусов, которые обозначаются следующим образом (вирус/место вставки/вставленные гены):
RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc
RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc
RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc
RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc
RR031: Rispens/US2/Coa5-VP2stc2
FW023 (контрольный рекомбинантный HVT/IBD): HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
FW029 (контрольный рекомбинантный HVT/ND): HVT/UL45-46/Pec-F.
Пример 1. Конструирование гомологических векторов
Конструирование плазмид в основном проводилось стандартными методами молекулярной биологии (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012).
Конструирование pRisUS2Sfi
Фрагмент ДНК генома Rispens в 2,2 т.н., фланкирующий намеченный сайт вставки (в пределах гена US2), клонировали с помощью реакций ПЦР, удаляя часть (0,2 т.н.) гена US2 и вставляя на место вставки сайт распознавания SFiI (фиг. 1). Вкратце, используя выделенную из Rispens ДНК в качестве матрицы, проводили две реакции ПЦР. Использовали следующие пары праймеров: пару SEQ NO. 1 (5'-AAACGAATTCGAAGCTTGCATGCCCCGCTAAGGAC-3') и SEQ NO. 2 (5'-GCCACCAGATGGAACTGGGGCCAATAAGGCCGGTATGCCGTGGGCC-3'), и пару SEQ NO. 3 (5'-GGCCCACGGCATACCGGCCTTATTGGCCCCAGTTCCA TCTGGTGGC-3') и SEQ NO. 4 (5'-GATTACGAATTCGCCCTTTTACATGCTGCCCCAA-3'). Проводили еще одну реакцию ПЦР, используя в качестве матрицы смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР, а в качестве праймеров - SEQ NO. 1 и SEQ NO. 4. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 (GenBank Асе. No. L09136) после расщепления с помощью EcoRI и HindIII, получая pRisUS2Sfi.
Конструирование гомологических векторов
Используя плазмиду pRisUS2Sfi, конструировали различные гомологические вектора, содержащие промотор и ген VP2 IBDV из стандартного заражающего штамма (VP2-STC). Эти гомологические вектора использовали для конструирования рекомбинантных Rispens/IBD (RR013, RR024, RR025, RR030 и RR031). Сначала расщепляли pRisUS2Sfi с помощью SFil и дефосфорилировали с помощью рекомбинантной щелочной фосфатазы Shewanella sp. S1B1 (PAP) (Funakoshi, #DE110). При расщеплении p45/46bacVP2-STC#11 (U.S. Pat. No. 6764684) с помощью BglI получали кассету промотор Bac-VP2-STC и вставляли ее в расщепленную SfiI pRisUS2Sfi, получая pRisUS2bacVP2stc. Эту плазмиду, pRisUS2bacVP2stc, использовали для построения рекомбинантного Rispens/IBD, RR013. Также конструировали гомологические плазмиды, содержащие часть ядра последовательности (SEQ N0. 5) промотора Вас (промотора Соа5). Промотор Соа5 получали из плазмиды pGICOA (US Pat. No. 6 866 852) путем расщепления с помощью BglI и XbaI и лигирования с фрагментом Xbal-EcoRI (6,3 т.н.) и фрагментом EcoRI-BglI (0,1 т.н.) из p45/46bacVP2-STC#11, получая p45/46COA5VP2-STC#11. Затем из p45/46COA5VP2-STC#11 вырезали кассету промотор Coa5-VP2-STC путем расщепления BglI и лигировали ее с расщепленной SfiI плазмидой pRisUS2Sfi, получая pRisUS2Coa5VP2stc. Эту плазмиду pRisUS2Coa5VP2stc использовали для построения RR030. Конструировали еще один гомологический вектор с промотором Соа5, имеющий другую последовательность между промотором Соа5 и геном VP2-STC. После ПЦР с использованием pRisUS2Coa5VP2stc в качестве матрицы и SEQ NO. 6 (5-GTGGGGACCCGAGGATTTTG-3') и SEQ NO. 7 (5'-GCGTCTAGAGGATCGATCC ACCGGTCGCCАССATGACAAACCTGCAAGATCА-3') в качестве праймеров, полученный фрагмент ДНК расщепляли с помощью XbaI и SalI, а затем встраивали во фрагмент XbaI-SalI (5,2 т.н.) из pRisUS2Coa5VP2stc. Полученную плазмиду pRisUS2Coa5VP2stc2 использовали для получения RR031. Кассету промотор-RSV-VP2-STC и кассету промотор SV40-VP2-STC получали путем расщепления р44-45d46RsvVP2 и p44-45d46SV40VP2 (патент ЕР 12305390), соответственно, с помощью BglI. Эти фрагменты лигировали с расщепленной SfiI плазмидой pRisUS2Sfi, получая pRisUS2RSVVP2stc и pRisUS2SV40VP2stc. Эти плазмиды использовали для построения RR024 и RR025, соответственно.
Пример 2. Конструирование рекомбинантных Rispens
2
2
Конструирование рекомбинантных Rispens проводили методом гомологической рекомбинации на культуре клеток или в Е. coli. Для гомологической рекомбинации в культуре клеток вирусную ДНК получали из вируса Rispens дикого типа, как описано в Morgan et al. (Avian Diseases, 34: 345-351, 1990). Примерно 2 мкг ДНК Rispens и 1 мкг одного из гомологических векторов трансфецировали примерно в 10 клеток CEF путем электропорации с помощью Nucleofector II (Lonza, Basel, Швейцария). Трансфецированные клетки вносили в смесь из среды Leibovitz's L-15 (Life Technologies Corp., cat. #41300-39) и среды McCoy's 5A (Life Technologies Corp., cat. #21500-061) (1:1) с 4% телячьей сыворотки [среда LM (+)] и высеивали в 96-луночные планшеты для тканевых культур, а затем инкубировали при 37°С с 4-5% СО в течение 5-7 дней, до появления бляшек Rispens. Затем клетки отделяли от планшетов путем трипсинизации, переносили поровну в два 96-луночных планшета с CEF и инкубировали 4-6 дней до появления бляшек. Проводили скрининг методом черных бляшек, окрашивающим только бляшки, экспрессирующие белок VP2 IBDV. Вкратце, один из двух планшетов фиксировали смесью метанол:ацетон (1:2) и инкубировали с моноклональным антителом R63 против VP2 IBDV (АТСС #: НВ-9490). Затем инкубировали с биотинилированным антителом против IgG мыши (Vector Laboratories, cat # ВА-9200), а затем с набором VectaStain ABC-АР (Vector Laboratories, cat # АК-5000), и окрашивали бляшки, экспрессирующие белок VP2, добавлением раствора NBT/BCIP (Roche Applied Science, cat # 1681451). Выявляли лунки, содержащие окрашенные рекомбинантные бляшки, и трипсинизировали клетки в соответствующих лунках в другом 96-луночном планшете. Затем клетки разбавляли свежими вторичными клетками CEF и переносили в 96-луночные планшеты, завершая первый цикл очистки. Процедуру очистки повторяли до тех пор, пока все бляшки не окрашивались положительно методом черных бляшек. Для гомологической рекомбинации в Е. coli, штамм DH10B Е. coli, несущий геном Rispens в виде бактериальных искусственных хромосом (ВАС) и плазмиду pKD46 (GenBank Асе. No. AY048746), трансфецировали с помощью 1 мкг одного из гомологических векторов после индукции ферментов рекомбинации добавлением 10 мМ L-арабинозы. Трансфекцию проводили путем электропорации с помощью Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories) при 1,75 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. После трансфекции клетки Е. coli высеивали на чашки с агаром Луриа-Бертани (LB) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Клоны Е. coli, несущие соответствующую вставку, содержащую ген VP2, выявляли методом ПЦР с помощью пары праймеров, амплифицирующих участок между геном VP2 и местом сайта встраивания в геноме Rispens. Использовали праймеры SEQ NO. 6 и SEQ NO. 8 (5'-TGAACTACACAAAATT8GATACTGA-3'). Из клонов, содержащих вставку, экстрагировали ДНК ВАС Rispens и трансфецировали в CEF с помощью Nucleofector II (Lonza). Трансфецированные клетки CEF высеивали в 96-луночные планшеты и инкубировали при 37°С в 4-5% СО в течение 5-7 дней до тех пор, пока не появлялись бляшки Rispens. Экспрессирующие белок VP2 бляшки очищали, как описано выше.
Пример 3. Проверка структуры генома
Структуру генома у рекомбинантных вирусов Rispens/IBD проверяли с помощью двух реакций ПЦР, амплифицирующих стыковочные участки (Junction 1 и Junction 2) на каждом конце вставленных генов. На фиг. 2 видно, где располагаются Junction 1 и Junction 2 в геноме рекомбинантного вируса. При реакциях ПЦР использовали следующие пары праймеров: SEQ NO. 9 (5'-GAGGCGGACGTAAATGGAGА-3') и SEQ NO. 8 для Junction 1 и SEQ NO. 10 (5'-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3') и SEQ NO. 11 (5'-TATGAGCGGCAGTTATCGTGT-3') для Junction 2. У всех рекомбинантных Rispens наблюдались ожидаемые размеры продуктов ПЦР, подтверждая, что эти рекомбинантные Rispens имеют ожидаемую структуру генома.
Пример 4. Экспрессия вставленного антигена рекомбинантными Rispens
Экспрессию белка VP2 рекомбинантными Rispens/IBD проверяли методом черных бляшек и методом вестерн-блота. Процедуры для метода черных бляшек описаны в примере 2. Вестерн-блот проводили, используя клетки CEF, инфицированные рекомбинантными вирусами, и моноклональное антитело R63 против VP2 IBDV. Вкратце, клетки CEF в 6-луночных планшетах инфицировали одним из рекомбинантных вирусов или исходным штаммом Rispens при множественности заражения примерно 0,1. Через три дня после инокуляции клетки собирали с помощью трипсина и центрифугировали при 913×g в течение 5 минут. Осадок промывали PBS и ресуспендировали в 100 мкл PBS. После добавления такого же объема буфера 2×SDS для образцов (130 мМ трис-Cl (рН 6,8), 6% SDS, 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего) клеточную суспензию кипятили в течение 5 минут. Образцы разделяли методом SDS-PAGE в 12% полиакриламидном геле и переносили на мембрану PVDF (Immobilon-P, Millipore). Мембрану полностью высушивали, а затем инкубировали с моноклональным антителом R63. После отмывки от антитела R63 мембрану инкубировали с биотинилированным антителом против IgG мыши (Vector Laboratories, cat # ВА-9200), а затем с набором VectaStain ABC-АР (Vector Laboratories, cat # АК-5000). Белок, связавшийся с моноклональным антителом R63, визуализировали добавлением раствора NBT/BCIP (Roche Applied Science, cat # 1681451). Как видно из фиг. 3, полосы белка в 40 кДа, то есть ожидаемого размера белка VP2, наблюдались только на дорожках с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками. Рекомбинантные вирусы Rispens с целым или частичным промотором Вас, т.е. RR013, RR030 и RR031, экспрессировали больше белка VP2, чем RR024, у которого промотор RSV.
Пример 5. Эффективность рекомбинантных Rispens на цыплятах: промотор бета-актина обеспечивает более сильную защиту
3
50
Оценивали эффективность рекомбинантных вирусов Rispens, экспрессирующих ген VP2 IBDV, против заражения вирулентным IBDV. Использовали три рекомбинантных вируса Rispens/IBD (RR013, RR024 и RR025), у которых экспрессия антигена запускается различными промоторами. Не содержащих определенных патогенов (SPF) цыплят породы белый леггорн в 1-дневном возрасте разбивали на шесть групп и цыплят в группах 3-5 вакцинировали подкожно одним из рекомбинантных Rispens в дозе примерно 3000 бляшкообразующих единиц (б.о.е.)/0,2 мл (группа 3, RR013; группа 4, RR024; группа 5, RR025). Цыплят в группе 6 вакцинировали с помощью FW023 (rHVT/IBD-STC#11: патент U.S. 6,764,684), то есть контрольного рекомбинантного HVT/VP2. Цыплят в группе 1 (отрицательный контроль: неиммунизованные, незараженные) и цыплят в группе 2 (положительный контроль: неиммунизованные, зараженные) оставляли непривитыми. У цыплят брали кровь каждую неделю в возрасте от 2 до 7 недель для оценки гуморального иммунитета против IBDV. Антитела против IBDV определяли с помощью коммерческого набора IBDV ELISA kit (Idexx Laboratories, Flock Chek IBD). В 7-недельном возрасте всех цыплят, за исключением группы 1, заражали стандартным заражающим (STC) штаммом в дозе 10 средних инфицирующих эмбрионы доз (EID) вирулентного IBDV перорально. Цыплят обследовали ежедневно на предмет клинических признаков, связанных с IBD, как-то депрессия и смерть. Через семь дней после заражения цыплят проводили вскрытие и обследовали на предмет таких макроскопических поражений фабрициевой сумки, как отек, изменение цвета, атрофия, кровотечение и желтый или желатинозный экссудат. При вскрытии также измеряли массу тела и фабрициевой сумки для расчета индекса В/В, который представляет собой соотношение между весом сумки и массой тела зараженных птиц, деленное на такое же соотношение у незараженных птиц.
Результаты приведены в таблице 1.
NINC = отрицательный контроль: неиммунизованные, незараженные
NICC = положительный контроль: неиммунизованные, зараженные
RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc
RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc
RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc
FW023 (контрольный рекомбинантный HVT/IBD): HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
У всех цыплят в группе 2 (положительный контроль, зараженные) возникали макроскопические поражения фабрициевой сумки, характерные для IBD, а все цыплята в группе 1 (отрицательный контроль, незараженные) оставались свободными от таких повреждений. Степень защиты у RR013 (группа 3) составляла 87% (13/15), и она была эквивалентна защите у FW023 - контрольного рекомбинантного HVT/IBD (группа 6). Индекс В/В в группе 3 составил 0,95, что свидетельствует об отсутствии значительной атрофии в сумке. Вне ожидания, RR024 (группа 4) и RR025 (группа 5) давали лишь частичную защиту (53% и 33%). Во всех вакцинированных группах титры IBD по ELISA возрастали, начиная с 3-недельного возраста (фиг. 4). У вакцинированных RR013 цыплят титры были существенно выше, чем у вакцинированных RR024 или RR025 цыплят, что согласуется с результатами по защите после заражения.
В заключение, RR013 с промотором Вас обеспечивает значительно лучший гуморальный и защитный иммунитет по сравнению с RR024 и RR025, которые оба содержат не Вас, а другие промоторы.
Пример 6. Эффективность рекомбинантных Rispens на цыплятах: активность различных производных промоторов бета-актина
3
50
Исследовали эффективность RR013, RR030 и RR031, которые все содержат полный или частичный промотор Вас, на цыплятах коммерческих кур-несушек (белый леггорн) с материнскими антителами. Цыплят в 1-дневном возрасте разбивали на шесть групп и цыплят в группах 3-5 вакцинировали подкожно одним из рекомбинантных Rispens в дозе примерно 3000 бляшкообразующих единиц (б.о.е.)/0,2 мл (группа 3, RR013; группа 4, RR030; группа 5, RR031). Цыплят в группе 6 вакцинировали с помощью FW023, то есть контрольного рекомбинантного HVT/VP2. Цыплят в группе 1 (отрицательный контроль: неиммунизованные, незараженные) и цыплят в группе 2 (положительный контроль: неиммунизованные, зараженные) оставляли непривитыми. У цыплят брали кровь каждую неделю в возрасте от 1 до 7 недель и тестировали на наличие антител против IBDV с помощью коммерческого набора IBDV ELISA kit (Idexx IBD Ab Test: Idexx Laboratories). Заражение проводили два раза в возрасте 5 недель и 7 недель. Одну половину цыплят в каждой группе заражали в 5-недельном возрасте, а другую половину - в 7-недельном возрасте. Для заражения вводили перорально 10 доз EID вирулентного штамма IBDV STC. Наблюдение и оценку после заражения проводили таким же образом, как и в примере 5.
Результаты приведены в таблице 2 и 3.
NINC = отрицательный контроль: неиммунизованные, незараженные
NICC = положительный контроль: неиммунизованные, зараженные
RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc
RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc
RR031: Rispens/US2/Coa5-VP2stc2
FW023 (контрольный рекомбинантный HVT/IBD): HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
После заражения в 5-недельном возрасте во всех группах, вакцинированных рекомбинантными Rispens, содержащими промотор ВАС, отмечалась отличная степень защиты (90% для RR013, 95% для RR030 и 95% для RR031), тогда как у всех неиммунизированных зараженных цыплят положительного контроля (группа 2) возникали макроскопические поражения фабрициевой сумки, характерные для IBD (таблица 2). FW023 - контрольный рекомбинантный HVMBD давал защиту на 81%, что ниже, чем в группах с рекомбинантными Rispens. Все цыплята в группе 1 (незараженные, отрицательный контроль) оставались свободными от таких повреждений. Высокий индекс В/В у неиммунизированных зараженных цыплят положительного контроля (группа 2), хотя у них и проявлялись типичные для IBD макроскопические поражения фабрициевой сумки, может указывать на причастность остаточных материнских антител, приводящих к замедлению развития повреждений сумки. После заражения в 7-недельном возрасте во всех группах, вакцинированных рекомбинантными Rispens, опять же содержащими промотор ВАС, отмечалась отличная степень защиты (84% для RR013, 91% для RR030 и 80% для RR031), тогда как у всех неиммунизированных зараженных цыплят положительного контроля (группа 2) возникали макроскопические поражения фабрициевой сумки типа IBD (таблица 3). Индекс В/В у вакцинированных групп был выше 0,91, что свидетельствует об отсутствии значительной атрофии в сумке. Результаты ELISA на IBDV показывают, что после распада материнских антител в возрасте от 1 недели до 4 недель во всех вакцинированных группах были более высокие титры IBD по ELISA (фиг. 5). Титры у вакцинированных RR030 и RR031 цыплят были выше, чем у вакцинированных FW023 цыплят в возрасте от 5 до 7 недель.
В заключение, RR013, RR030 и RR031, которые все содержат полный или частичный промотор Вас в сочетании с геном VP2, давали отличную степень защиты у цыплят коммерческих кур-несушек белый леггорн с материнскими антителами в возрасте 5 и 7 недель после прививки в 1-дневном возрасте.
Пример 7. Стабильность рекомбинантных Rispens по изобретению
В этом примере оценивали стабильность RR030 и RR031 в культуре клеток (in vitro) и у цыплят (in vivo). Для оценки стабильности in vitro вирусы пассировали в фибробластах куриных эмбрионов (CEF) 20 раз. Для оценки стабильности in vivo вирусы инокулировали 1-дневным цыплятам коммерческих кур-несушек (белый леггорн), а затем повторно выделяли из вакцинированных цыплят в возрасте 5 и 7 недель путем посева лимфоцитов периферической крови этих цыплят на CEF. Вирусы после пассажей in vitro и вирусы, выделенные из вакцинированных цыплят, проверяли методом ПЦР и методом черных бляшек с использованием моноклонального антитела R63 против VP2 IBDV.
При анализе методом ПЦР выявлялись ожидаемые полосы у всех исследуемых образцов, что указывает на отсутствие заметных делеций или изменений в геноме вируса. При анализе методом черных бляшек с помощью моноклонального антитела R63 против VP2 IBDV все бляшки давали черную окраску у всех исследуемых образцов.
Следовательно, RR030 и RR031 генетически и фенотипически стабильны in vitro и in vivo.
Пример 8. Продолжительность иммунитета у Rispens/IBD
Для исследования продолжительности иммунитета к IBDV, обусловленного Rispens/IBD, отслеживали титры IBDV по ELISA у цыплят, вакцинированных RR030, до 41-недельного возраста. Более конкретно, 1-дневных цыплят коммерческих кур-несушек (белый леггорн) с материнскими антителами вакцинировали подкожно рекомбинантным Rispens/IBD (RR030) в дозе примерно 3000 б.о.е./0,2 мл. У цыплят брали кровь раз в неделю в возрасте от 1 до 7 недель, а после этого - два раза в неделю. Сыворотки тестировали на наличие антител против IBDV с помощью коммерческого набора IBDV ELISA kit (Idexx IBD Ab Test: Idexx Laboratories). Как видно из фиг. 7, после ослабления материнских антител против IBDV до 3-недельного возраста титры по ELISA начали возрастать. Титры продолжали возрастать до значений S/P более 2,5 до достижения 25-недельного возраста, причем высокий уровень титров IBDV по ELISA сохранялся вплоть до 41-недельного возраста. Этот результат свидетельствует, что Rispens/IBD обеспечивает исключительно большую продолжительность иммунитета против IBDV.
Пример 9. Эффективность рекомбинантных Rispens на цыплятах: отсутствие интерференции с другим HVT
3
50
В этом примере исследовали совместимость между рекомбинантным Rispens/IBD (RR030), содержащим промотор ВАС, и рекомбинантным HVT/ND (FW029) (rHVT/NDV: патент U.S. 6,866,852). Цыплят коммерческих кур-несушек (белый леггорн) с материнскими антителами в 1-дневном возрасте разбивали на шесть групп и вакцинировали. Группу 1 вакцинировали подкожно одним лишь рекомбинантным Rispens/IBD (RR030) в дозе примерно 3000 б.о.е./0,2 мл. Группа 2 получала смесь RR030 и рекомбинантного HVT/ND (FW029), оба в дозе 3000 б.о.е./0,2 мл. Одну группу цыплят (группа 3) вакцинировали только FW029. Цыплят в группе 4 вакцинировали FW023, то есть контрольным рекомбинантным HVT/VP2. Цыплят в группе 5 (положительный контроль: неиммунизованные, зараженные) и в группе 6 (отрицательный контроль: неиммунизованные, незараженные) оставляли непривитыми. У цыплят брали кровь каждую неделю в возрасте от 2 до 7 недель и тестировали на наличие антител против IBDV с помощью коммерческого набора IBDV ELISA kit (Idexx IBD Ab Test: Idexx Laboratories) и на наличие антител против NDV с помощью коммерческого набора NDV ELISA kit (Idexx NDV Ab Test: Idexx Laboratories). В 7-недельном возрасте проводили заражение вирулентным IBDV либо вирулентным NDV. Все цыплята в группе 1 (только RR030) и в группе 4 (только FW023) и одна половина цыплят в группе 2 (RR030+FW029) и группе 5 (положительный контроль: неиммунизованные, зараженные) получали дозу IBDV в 10 EID вирулентного штамма IBDV STC перорально, а все цыплята в группе 3 (только FW029) а другая половина цыплят в группе 2 (RR030+FW029) и группе 5 (положительный контроль: неиммунизированные, зараженные) получали дозу NDV в 10 EID50 очень вирулентного (нейротропного велогенного) штамма NDV Texas GB посредством внутримышечной инъекции в бедренную область. Наблюдение и оценку после заражения IBDV проводили таким же образом, как и в примерах 5 и 6. При заражении NDV цыплят обследовали ежедневно в течение 14 дней на клинические признаки, типичные для нейротропной велогенной ND, как-то депрессия, неврологические симптомы и смерть.
Результаты приведены в таблице 4.
RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc
FW029 (контрольный рекомбинантный HVT/ND): HVT/UL45-46/Pec-F
FW023 (контрольный рекомбинантный HVT/IBD): HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
NICC = положительный контроль: неиммунизованные, зараженные
NINC = отрицательный контроль: неиммунизованные, незараженные
RR030 в сочетании с FW029 (группа 2) обеспечивали отличную защиту против заражения и IBD, и ND. После заражения IBDV, RR030 в сочетании с FW029 (группа 2) обеспечивали защиту на 94% (15/16), которая эквивалентна степени защиты при одном лишь RR030 (группа 1) на уровне 88% (15/17). В группе 4, вакцинированной FW023, степень защиты цыплят составляла 94%. У всех неиммунизованных, зараженных цыплят положительного контроля (группа 5) возникали макроскопические поражения фабрициевой сумки. После заражения NDV, степень защиты в группе 2 (RR030 в сочетании с FW029) составляла 88% (15/17), тогда как один FW029 (14/16) обеспечивал защиту на 88%. У всех зараженных цыплят положительного контроля (группа 5) проявлялись клинические признаки ND. Результаты ELISA также свидетельствуют, что гуморальный иммунитет, вызываемый RR030 или FW029, не уменьшался при комбинировании этих двух вирусов (фиг. 6А и 6В).
В заключение, этот пример свидетельствует об отсутствии интерференции между рекомбинантным Rispens/IBD, содержащим конструкцию с Вас, и рекомбинантным HVT/ND.