Результаты генетической оценки селекционного материала галеги восточной методом PCR-анализа

УДК 633. 37/575. 22/631.527

В. И. БУШУЕВА

РЕЗУЛЬТАТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ГАЛЕГИ ВОСТОЧНОЙ МЕТОДОМ РСЯ-АНАЛИЗА

Дан анализ литературных источников по результативности методов оценки селекционного материала, основанных на молекулярно-генетических исследованиях. Показаны результаты оценки лучших селекционных образцов галеги восточной методом PCR-анализа по генотипу. Установлено, что сортообразцы галеги восточной СЭГ-4, СЭГ-2, и СЭГ-1 различаются между собой не только по фенотипу, но и генотипу.

We have analyzed literature sources about the effectiveness of methods of estimation of selection material, based on molecular-genetic research. We have shown results of estimation of the best selection samples of Galega orientalis by the method of PCR-analysis according to the genotype. We have established that variety samples of Galega orientalis SEG-4, SEG-2 and SEG-1 differ not only in phenotype, but also in genotype.

Введение

Галега восточная (Galega orientalis Lam.) относится к многолетним бобовым травам, возделываемым в Республике Беларусь на кормовые цели. Она является источником наиболее дешевого кормового растительного белка и высокоэнергетических кормов для животноводства. Велика ее роль как бобовой культуры в повышении плодородия почвы и защите окружающей среды.

Реализация ее потенциала как кормовой культуры во многом зависит от наличия высокопродуктивных сортов, адаптированных к конкретным условиям возделывания и сочетающих в себе комплекс хозяйственно-полезных признаков и свойств. Для создания таких сортов одним из решающих условий является правильная организация селекционного процесса на всех этапах, начиная с создания исходного материала и завершая отбором лучших селекционных форм, которые соответствуют параметрам планируемой модели сорта. Успех селекционный работы зависит не только от эффективности методов создания исходного материала, но и его оценки на различных этапах селекции с целью выделения потенциально более продуктивных форм по генотипу [1]. Следует отметить, что на начальных этапах селекционного процесса оценка и выделение лучших форм в полевых условиях проводится селекционером по фенотипическим признакам. Для галеги восточной, культуры с перекрестным энтомофильным типом опыления и высокой внутрипопуляционной гетерогенностью, такой отбор будет малоэффективным. Это связано с тем, что изучаемые признаки, как правило, являются сложными и контролируются большим количеством генов, а их фенотипическое проявление значительно варьирует в зависимости от условий внешней среды. В связи с этим отбор наиболее ценных генотипов по фенотипу среди многочисленного количества изучаемых форм в пределах популяции на ранних этапах селекционного процесса является весьма трудоемким, малоэффективным и не всегда результативным [2]. Повысить эффективность отбора ценных генотипов стало возможным в результате генетической оценки селекционного материала с помощью методов, основанных на молеку-лярно-генетических исследованиях [3].

Анализ источников

Со второй половины прошлого столетия получили свое развитие методы молекулярно-генетического маркирования рестрикционных фрагментов ДНК и полимеразной ценной реакции -ПЦР. После открытия Д. Ботштейном в 1980 г. явления полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и последующей разработкой в 1985 г. К. Мюллесом метода ПЦР-анализа началось глубокое изучение структуры ДНК, биологических процессов, протекающих в клетке с участием ДНК (репликации, репарации и рекомбинации), основных механизмов транскрипции, трансляции и экспрессии генов. Появилась возможность изучать наследование определенных фенотипических признаков в их связи с конкретными последовательностями ДНК, идентифицировать индивидуальные особенности организмов на молекулярном уровне. Методы анализа ПДРФ и ПЦР сейчас успешно используются в самых различных направлениях селекционной науки: для создания молекулярно-генетических карт растений, выявления доноров хозяйственно-ценных признаков, сертификации сортов, диагностики болезней, ДНК-маркер сопутствующей селекции.

Более ценным для исследований геномов у растений является метод ПЦР-анализа, для осуществления которого используются праймеры - RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), а в последние годы и SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) [4].

Метод PCR-анализа с RAPD-праймерами, основанный на амплификации ДНК получил в настоящее время широкое распространение. Метод достаточно прост, обладает большой чувствительностью и дает быстрые результаты. Разработка и использование молекулярных маркеров на основе различий в структуре гомологичных последовательностей ДНК гарантирует большую объективность оценки, т. к. селекционер работает только с генотипом и ошибки могут возникать лишь в связи с неполным сцепле-

нием молекулярного маркера с признаком. С помощью ДНК-маркеров можно маркировать любые участки ДНК, в том числе и некодирующие, и использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма. Достоинством новой технологии является также возможность проводить отбор ценных генотипов не по фенотипической оценке взрослого растения, а на основе прямой генетической информации на ранних стадиях развития растения. Это сокращает время отбора и обеспечивает экономию материальных ресурсов и трудовых затрат. Молекулярные маркеры, генерируемые с помощью PCR, позволяют оценить генетическое разнообразие исходного материала, классифицировать селекционные формы, маркировать гены хозяйственно важных признаков, картировать геномы [5].

Новые методы маркирования селекционного материала можно успешно использоваться в сочетании с любыми методами селекции и на всех этапах селекционного процесса, начиная от поиска источников хозяйственно-ценных признаков до создания сортов [3]. Поэтому в настоящее время в мировой селекционной практике успешно применяются методы молекулярно-генетического анализа ДНК. Молекулярные маркеры используются для оценки генетического разнообразия селекционного материала. В селекции многолетних бобовых трав использование молекулярных маркеров для изучения генетического полиморфизма родительских форм и установления степени родства необходимо при подборе биотипов для получения высокоурожайных сложногибридных сортов-популяций. С помощью ДНК-маркеров стало реально возможным установить различия между образцами разного селекционного или географического происхождения, определить биотипический состав популяции и провести отбор лучших биотипов [5].

Целью наших исследований было дать оценку лучших селекционных образцов галеги восточной по генотипу методом PCR-анализа.

Методы исследования

В результате многолетней селекционной работы на кафедре селекции и генетики УО БГСХА методами мутагенеза и внутривидовой гибридизации создан новый селекционный материал галеги восточной, различающийся между собой по фенотипическим признакам. Для установления различий между ними на генетическом уровне нами был использован метод ПЦР-анализа с RAPD-праймерами. Исследования проводились во ВНИИ кормов им. В. Р. Вильямса.

Объектами исследований служили три сортообразца, контрастно различающиеся между собой по окраске цветков и вегетативных органов: СЭГ-1 - белоцветковый со светло-зелеными листьями и стеблями, СЭГ-2 - сиреневоцветковый с темно-зелеными листьями и стеблями, СЭГ-4 - синецветко-вый с темно-зелеными листьями и стеблями. Препараты образцов ДНК для анализа были получены путем проращивания в чашках Петри 120-ти семян каждого сортообразца. Навеску средней части ткани 6-дневных проростков (60 мг) использовали для выделения ДНК методом Эдвардса (Edwards et al., 1991) с последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1) [6]. Электрофо-реграмма образцов геномной ДНК представлена на рис. 1.

1 2 3

Рис. 1. Геномная ДНК сортообразцов галеги: 1 - СЭГ-4; 2 - СЭГ-2; 3 - СЭГ-1

RAPD-анализ проводили в соответствии с методикой, разработанной Вильямсом [7], с модификациями. ПЦР-реакцию ставили в программируемом термоциклере «Biokom» (Россия). Фрагменты ам-плифицированной ДНК получали в результате выполнения программы из трех этапов с чередованием температурных и временных параметров. Основной этап состоял из 37 циклов полимеразной цепной реакции с температурой отжига праймеров 36оС. Для анализа использовали реактивы фирмы «Syntol» и «Helikon» (Россия). ПЦР-продукты разделяли с помощью электрофореза в 1,4% агарозном геле (Маниатис, 1983) и визуализировали под ультрафиолетовым светом после прокрашивания в 0,5 мг/мл растворе бромистого этидия. Образцы ДНК анализировали с использованием 9 праймеров произвольного сиквенса, изначально разработанных фирмой «Operon Technologies» (США). Перечень праймеров с их сиквенсами приведен в табл. 1. Синтез праймеров был осуществлен фирмой Syntol».

Праймер Нуклеотидная последовательность, 5' - 3'

OPQ-9 GGCTAACCGA

OPN-15 CAGGCGACTGT

OPB-121 GTAGACCCGT

OPB-17 AGGGAACAAG

OPC-02 GTGAGGCGTC

OPB-15 GGAGGGTGTT

OPB-07 GGTGACGCAG

OPB-12 CCTTGACGCA

OPB-03 CATCCCCCTG

Основная часть

Предварительный ПЦР-анализ образцов геномной ДНК галеги восточной показал, что с праймерами OPQ-9, OPB-12, OPB-03 амплификация была бледной, невыраженной, в дальнейшем анализе эти прайме-ры не использовали. Шесть праймеров из 9 протестированных генерировали продукты амплификации различной степени интенсивности. Это праймеры OPB-15, OPN-15, OPB-121, OPB-17, OPC-02, OPB-07

(рис. 2). _

• • Г

— « — •• г:«"*

l! = S I-

iil  Г."

Образец: М 123 123 123 123 12 123 Праймеры: OPN-15 OPB-07 OPB-15 OPB-12 OPB-1 OPC-02

Рис. 2. ПЦР-анализ образцов галеги с RAPD-праймерами: образец: М- маркер молекулярной массы (100 bp DNA Ladder), 1 - СЭГ-4; 2 - СЭГ-2; 3 - СЭГ-1

В среднем с каждым праймером было получено 5-6 полос спектра на один образец ДНК. При этом обнаружены специфичные ампликоны: так, с праймером OPB-07 фрагмент размером 900 пар оснований, присутствующий в СЭГ-1, отсутствовал у СЭГ-4 и СЭГ-2, а фрагмент размером 1100 bp, генерированный праймером OPB-121 в СЭГ-2, не наблюдался в двух других образцах. При амплификации с праймером OPB-17 в СЭГ-4 идентифицированы фрагменты 700 и 1100 bp, которые отсутствовали у СЭГ-2 и СЭГ-1. RAPD-профили тестируемых образцов представлены на рис. 3.

~ а •?I

I «• м>

Жш -W

ШШ Вг .

и ни

Образец M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3

Праймер OPB-07 OPB-121 OPB-17

Рис. 3. Электрофореграмма образцов галеги с полиморфными RAPD-праймерами. 1 - СЭГ-4; 2 - СЭГ-2; 3 - СЭГ-1; M - маркер молекулярной массы

Стрелкой показаны полиморфные ампликоны.

Полученные результаты исследования подтверждают, что изучаемые сортообразцы галеги восточной СЭГ-4, СЭГ-2, и СЭГ-1 различаются между собой не только по фенотипу, но и генотипу. Следовательно они характеризуются отличительными маркерными признаками, наличие которых является обязательным требованием при патентовании новых сортов с целью защиты авторских прав селекционера. По маркерным признакам легко установить отличимость сорта среди других однотипных сортов, провести идентификацию примесей в случае механического или биологического засорения инородным материалом, сохранить сортовые признаки и свойства в процессе репродуцирования. Созданные в УО БГСХА фенотипически и генетически различающиеся между собой сортообразцы галеги восточной СЭГ-4, СЭГ-2, и СЭГ-1 могут быть использованы для патентной экспертизы в качестве сортов-эталонов при идентификации новых сортов [8].

Заключение

Отличимость сортообразцов галеги восточной СЭГ-4, СЭГ-2, и СЭГ-1 на генетическом уровне установлена по результатам проведенного ПЦР-анализа с RAPD-праймерами.

ПЦР-анализ семян с молекулярным маркером RAPD является важным методом для проведения научно обоснованного отбора сортообразцов галеги восточной с генетическими отличиями и использования их в дальнейшем селекционном процессе по созданию патентоспособных сортов, характеризующихся новизной и отличимостью.

ЛИТЕРАТУРА

1.Образцов, А. С. Потенциальная продуктивность культурных растений / А. С. Образцов. - М., 2001.- 504 с.

2.Вавилов, Н. И. Теоретические основы селекции / Н. И. Вавилов. - М.: Наука, 1987. - 512 с.

3.Конарев В.Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967-2007гг.) / В.Г. Конарев. Издание 2-е дополненное. - СПб., 2007.- 134с.

4.Картель Н. А. ДНК маркеры в генетике и селекции растений / Н. А. Картель // От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям: материалы международной научной конференции К 95-летию академика Н.В. Турбина. IX съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров. (Гомель, 2-5 октября 2007 г.). - Минск: Право и экономика, 2007.- С. 157.

5.Козлов Н.Н. Результаты и перспективы исследований ДНК-полиморфизма кормовых растений / Н. Н. Козлов, Т.Ф.Прибыткова, Т.Н. Комкова / Адаптивное кормопроизводство: проблемы и решения: научные труды Всероссийского научно-исследовательского института кормов им. В.Р. Вильямса. - Лобня, 2002. - С. 365-374.

6. Edwards, K. A simple and rapid method for preparation of plant genomic DNA for PCR analysis / K. Edwards, C. Johnstone, C. Thompson // Nucl. Acids Res, 1991, v.19, № 6б. - р. 1349.

7. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // J.G.K. Williams, A.K. Kubeliak, K.J. Livak et.al. // Nucleic Acids Res., 1990. - 18: 6531-6535.

8. Бушуева, В. И. Галега восточная: монография. - 2-е изд., доп. / В. И. Бушуева, Г. И. Таранухо. - Минск: Экопер-спектива, 2009. - 204 с.

УДК 202.1

А. В. БОГОВИН, М. М. ПТАШНИК, С. В. ДУДНИК

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ АНТРОПОГЕННОГО НАРУШЕНИЯ ТРАВЯНИСТЫХ ЭКОСИСТЕМ

В работе представлены результаты 25-летних наблюдений в мониторинговом стационарном опыте по изучению самопроизвольного восстановления природных экосистем на бывших пахотных землях и на основе использования ге-нетико-физиологических реакций видов на степень нарушения биотических и абиотических комплексов, т. е. их геме-робности, установлены коэффициенты деструкции фито-разнообразия, что имеет чрезвычайно важное значение для определения допустимых порогов антропогенной нагрузки на экосистемы и разработки эффективных стратегий оптимизации агроландшафтов.

The article presents results of 25-year research, in a monitoring stationary experiment, into spontaneous regeneration of natural ecosystems on former arable lands and on the basis of the use of genetic-physiological reactions of species to the degree of destruction of biotic and abiotic complexes, that is, the degree of their domestication. We have determined coefficients of phyto-diversity destruction, which is very important for determining admissible levels of anthropogenic load on ecosystems and development of efficient strategies of agro-landscapes optimization.