Способ количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF HEXACHLOROBENZENE IN BLOOD BY METHOD OF GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения гексахлорбензола (далее - ГХБ) в крови.
Известен способ газохроматографического определения гексахлорбензола в почве (Патент РФ № 2427832). Использование синтетических пестицидов для борьбы с вредными организмами приводит к насыщению биосферы веществами, токсичными для человека, сельскохозяйственных животных, полезной флоры и фауны. Указанный способ определения гексахлорбензола включает в себя экстракцию пробы почвы органическим растворителем после измельчения. При этом в качестве растворителя используют о-ксилол (25 мл экстрагента/10г почвы), а определение осуществляют газохроматографическим методом.
Однако этот способ невозможно использовать при определении концентрации ГХБ в биосредах.
3
Из Методических указаний МУК 4.1.2112-06 (утверждены Роспотребнадзором 09.08.2006) «Определение массовой концентрации хлороформа, дихлорэтана, тетрахлорметана, хлорбензола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом» известно определение гомолога ГХБ - хлорбензола. Известный способ основан на предварительном концентрировании алифатических хлорированных соединений (хлороформ, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан) и ароматических (хлорбензол) при рН 8-10 из биологического материала (кровь) экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстрактов. Выполнение измерений массовой концентрации указанных хлорированных углеводородов проводят методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды, алифатические спирты, трихлорэтилен при содержании каждого из указанных веществ не более 0,5 мкг/см.
3
3
3
3
3
Выполнение измерений по указанному способу выполняют следующим образом. Пробу крови в объеме 2 см доводят до 50 см бидистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250 см, добавляют 30 г высаливателя - хлорида натрия, подщелачивают 30%-ным раствором гидроксида натрия до достижения рН 8-10 и экстрагируют 10 см диэтилового эфира. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин, после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку. Далее пробу центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин для денатурации белка. После отстаивания эфирный экстракт сливают в другую пробирку. Полученный центрифугат в объеме 10 мм хроматографируют и проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленной пробе по калибровочному графику.
Недостатком указанного известного способа является то, что используются трудоемкие способы подготовки образцов крови к химическому анализу, требующие очистки и концентрирования, а также много операций в подготовке биопроб к химическому анализу.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, описанный в «Методических указаниях по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах (моче, крови, жировой ткани и грудном женском молоке)», (утверждены Минздравом СССР 27 ноября 1984 г. № 3151-84). Согласно этому способу цельную кровь (1-2 мл), помещенную в пробирку на шлифе, экстрагируют со средней интенсивностью 5 мл экстрагента-гексана на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, используя приспособление для фиксации пробирок. После разделения слоев гексановый экстракт тщательно отбирают с помощью пипетки, соединенной с грушей, и фильтруют через безводный сульфат натрия. При повышенной свертываемости крови сыворотку и сгусток экстрагируют раздельно. Сгусток отделяют от сыворотки, декантируя последнюю в пробирку на шлифе, затем растирают в фарфоровой ступке с избыточным количеством безводного сульфата натрия (до сыпучего состояния). Гомогенат переносят в колбу на шлифе и заливают 1,5-кратным по объему количеством гексана. Фарфоровую ступку дважды споласкивают гексаном (по 2 мл), который присоединяют к содержимому колбы.
Экстракцию проводят путем настаивания при периодическом перемешивании в течение 15-20 мин. Растворитель декантируют в колбу на шлифе вместимостью 100 мл, дополнительно фильтруя через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Содержимое колбы дополнительно промывают два раза гексаном (по 3-5 мл), присоединяя последний к основному экстракту. С сывороткой поступают так же, как с цельной кровью. Экстракты из сгустка и сыворотки крови объединяют.
Затем производят очистку экстрактов. Объединенные экстракты очищают в плоскодонных колбах на шлифе путем 5-7-минутного встряхивания с 5-10 мл насыщенного раствора безводного сульфата натрия в концентрированной серной кислоте. Экстракт после отстаивания осторожно декантируют в другую колбу. Содержимое колбы с кислотой после первичной очистки споласкивают 1-2 мл гексана, который присоединяют к основному экстракту. Очистку повторяют несколько раз до тех пор, пока слой кислоты после перемешивания не станет бесцветным.
Очищенный экстракт переносят в делительную воронку, приливают 2-5 мл 0,5 н. раствора бикарбоната натрия, затем встряхивают 1-2 мин, водный раствор отбрасывают и далее экстракт промывают дистиллированной водой (2-3 раза по 10-15 мл) до нейтральной реакции промывных вод. Конечный экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя.
Растворитель упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35-40°С под вакуумом до небольшого объема (5-7 мл), затем в токе азота особой чистоты до объема 0,5-1,0 мл и анализируют ГЖХ.
Хроматографирование. Газохроматографический анализ проводят на колонке длиной 1 м с 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS (0,12-0,16 мм). Гексановый экстракт (5 мкл) анализируют с ДЭЗ (детектор электронного захвата) на колонке 1 м с 5% SE-30 с использованием стандартной смеси хлорорганических препаратов.
В указанном известном способе процент выделения ГХБ из крови составляет 79,06%; предел определения 0,5 мкг/л; стандартное отклонение ±17,66%; доверительный интервал ±21,92%.
Недостатками этого известного способа являются:
- невысокая полнота извлечения гексахлорбензола из крови 79,06% при нижнем пределе определения всего 0,0005 мкг/мл;
- анализ выполняется на набивной колонке длиной всего 1 м. На набивных колонках возможно наложение химических соединений (в крови возможно присутствие одновременно и других хлорорганических соединений - хлороформ, тетрахлорметан, хлорбензол и др.), близких по физико-химическим свойствам, что приводит к завышению результата измерений.
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении степени извлечения ГХБ из пробы крови, а также в повышении точности и селективности.
3
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, включающим отбор пробы крови, экстракцию экстрагентом из указанной пробы гексахлорбензола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, при этом новым является то, что после отбора пробы крови ее подкисляют до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, в качестве экстрагента используют толуол, взятый в объемном соотношении к пробе крови как 0,6 к 1,0 соответственно, а экстракцию ведут дважды последовательно по 5 мин каждую, затем полученный экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 7000 об/мин, далее определяют количество гексахлорбензола методом газохроматографического анализа с использованием детектора электронного захвата на капиллярной колонке НР-1 35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм при температурном режиме: капиллярная колонка - 70°С-230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя - азота - 20 см/мин.
В качестве раствора серной кислоты используют 1%-ный водный раствор.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.
Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность определения гексахлорбензола в пробе крови, а также упрощается способ.
3
Высокая эффективность предлагаемого способа определения гексахлорбензола в крови достигнута путем подбора оптимальных условий газохроматографического анализа: капиллярной колонки серии НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм длиной 35 м и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 μm при оптимальном температурном режиме: колонка - 70 - скорость нагревания 25°С/мин - 180°С - скорость нагревания 10°С/мин - 210°С - скорость нагревания 5°С/мин - 230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя (азот) - 20 см/мин, и высокоспецифического детектора электронного захвата (ДЭЗ) к хлорорганическим соединениям.
3
3
3
min
min
Кроме того, заявляемый способ позволяет с высокой точностью и селективностью определять исследуемое соединение ХГБ на уровне 0,00015-0,005 мг/дм при погрешности определения не более 16%. Предел обнаружения (LOD) гексахлорбензола в крови составил C=0,000007 мкг/см. Предел количественного определения (LOQ) гексахлорбензола составил C=0,000024 мкг/см. Полнота извлечения гексахлорбензола из крови составляет 99,9%. Исследования проводятся на капиллярной колонке НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм длиной 35 м, которая обладает высокой разрешающей способностью и оптимально делит мешающие соединения, которые могут находиться в матрице крови.
При реализации предлагаемого способа при подготовке пробы крови к газохроматографическому анализу проводят экстракционное концентрирование ГХБ из пробы крови методом жидкостной экстракции органическим экстрагентом в слабокислой среде. Эта стадия предназначена для перевода ГХБ в более удобную для последующего газохроматографического анализа органическую фазу, для повышения его концентрации в экстракте и для отделения мешающих компонентов из биологической матрицы.
Таким образом, пробоподготовка в предлагаемом способе является значительно более простой, чем в прототипе, как по времени, так и по трудоемкости.
В современном химико-токсикологическом анализе одним из перспективных методов разделения и концентрирования органических соединений является гетерогенная жидкостная экстракция. Задача экстракции состоит в том, чтобы полно и селективно перевести аналит из биологической среды в органическую фазу.
На экстракцию химических веществ органическими растворителями оказывают влияние различные факторы: природа экстрагируемого вещества, экстрагента, число экстракций, объем экстрагента, рН среды, скорость взбалтывания (время достижения равновесия).
Для обеспечения полноты извлечения гексахлорбензола из биосреды (кровь) были подобраны условия экстракции: выбор органического растворителя, объем экстрагента, рН среды, число экстракций и время достижения равновесия.
В ходе экспериментальных работ по выбору экстрагента и для эффективного извлечения гексахлорбензола из крови применена жидкостная экстракция различными органическими растворителями, изучены экстракционные характеристики. Данные приведены в таблице 1.
Результаты исследований полноты экстракции гексахлорбензола из крови различными объемами растворителя (толуол) приведены в таблице 2.
В процессе исследований было установлено время контакта фаз для достижения равновесия в экстракционной системе, обеспечивающее количественный выход гексахлорбензола (таблица 3).
3
3
Известно, что чем больше объем органической фазы экстрагента, тем больше степень извлечения экстрагируемого вещества. Однако увеличение числа экстракций сильнее влияет на степень извлечения экстрагируемого вещества, чем увеличение объема экстрагента, поэтому одну и ту же степень извлечения можно получить, уменьшая объем экстрагента, но увеличивая число экстракций. В исследованиях использовали объем экстрагента толуола объемом 3 см и применяли 2 последовательные экстракции по 5 мин. Объем пробы крови при этом брали 5 см. Таким образом, объемное соотношение пробы крови и толуола составляло 1:0,6. Было установлено, что это является оптимальным соотношением, при котором и будет достигнута высокая точность и селективность предлагаемого способа.
В процессе экспериментальных исследований по установлению оптимального значения рН биосреды, при котором наблюдается эффективное извлечение гексахлорбензола из крови и наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок, применяли различные минеральные кислоты: серная, соляная, и щелочи: гидрооксид калия. Кислоты и щелочи при взаимодействии с белком вызывают его денатурацию. Это связано с тем, что кислоты удаляют гидратную оболочку и нейтрализуют заряд молекулы. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Для осаждения белков из крови применяли центрифугирование образца при различных скоростях и оптимально подобранных условиях экстракции (таблица 5).
Оптимальные условия процесса экстракции гексахлорбензола из крови предлагаемым способом представлены в таблице 6.
3
Максимальная полнота извлечения гексахлорбензола из крови - 99,9 %, достигнута при подобранных оптимальных условиях подготовки пробы для газохроматографического анализа путем подкисления пробы крови до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, концентрирования из крови (время контакта 5 мин) органическим растворителем-экстрагентом, (толуол) объем 3 см в две стадии, денатурации белка центрифугированием биосреды при 7000 об/мин в течение 15 мин при рН 6-7, и последующем определении на газовом хроматографе с детектором электронного захвата (ДЭЗ).
Благодаря тому, что образующийся при пробоподготовке экстракт анализируют методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата, обеспечивает максимально возможное по чувствительности газохроматографическое определение. Определение количества ГХБ в крови методом газохроматографического анализа проводят с использованием градуировочного графика. Для его построения выполняют следующие действия.
3
3
3
3
3
Готовят исходный раствор. Для этого в мерную пробирку объемом 10 см дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 4 см, вводят микрошприцем 2 мм ГСО (государственный стандартный образец) гексахлорбензола С=100 мкг/см. Концентрация исходного раствора будет 0,05 мкг/см. Срок хранения раствора 12 часов.
3
Далее готовят градуировочные растворы. Градуировочные растворы гексахлорбензола готовят в мерных пробирках объемом 5 см. Для этого в каждую пробирку дозатором вносят дистиллированную воду и исходный раствор в соответствии с таблицей 7 и тщательно перемешивают.
3
Построение градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц⋅с) от массовой концентрации гексахлорбензола (мг/дм) в стандартном растворе, устанавливают по 6 сериям измерений по 5 концентрациям вещества в каждой серии для каждого диапазона.
3
3
3
В приготовленный градуировочный раствор объемом 5 см дозатором добавляют органический растворитель (толуол) объемом 3 см и выполняют дважды жидкостную экстракцию (время контакта фаз 5 мин). После экстракции раствор центрифугируют при 7000 об/мин в течение 15 мин. Затем 1 мм верхнего слоя органического растворителя (толуол) вкалывают в хроматографическую колонку через испаритель. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков компонента и по средним результатам из 6 серий строят градуировочный график.
Пример реализации предлагаемого способа
3
3
3
3
Пробы крови объемом 5 см помещают в мерную пробирку объемом 10 см, подкисляют до рН 6-7 водным раствором 1%-ной серной кислоты. Далее дозатором добавляют органический растворитель (толуол) объемом 3 см и выполняют жидкостную экстракцию (время контакта фаз 5 мин дважды). Для денатурации белка выполняют центрифугирование биосреды при 7000 об/мин в течение 15 мин при рН 6-7. Затем 1 мм верхнего слоя органического растворителя (толуол) вкалывают в хроматографическую колонку через испаритель. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови.
В ходе лабораторных испытаний также были определены оптимальные условия газохроматографического определения гексахлорбензола с применением стандартных растворов.
Были изучены условия определения ГХБ на капиллярных колонках с различными характеристиками неподвижных жидких фаз:
- DB-624-25 m⋅0,32 ⋅ mm ⋅ 5,0 μm (полярная цианопропильная фаза; температурный предел от 60°С до 260/300°С);
⋅
- HP-FFAP-50m0,32mm⋅0,5μm (полярная фаза с покрытием нитротерефталевой кислотой; температурный предел от 60°С до 240/250°С);
- НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм (неполярная фаза с покрытием 100% диметил- (поли)силоксан; температурный предел от 60°С до 325/350°С).
Опыты показали, что полнота разделения гексахлорбензола с другими углеводородами достигнута на капиллярной колонке HP-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм. При этом установленные температурные режимы для нее представлены в таблице 8.
3
Качественное разделение гексахлорбензола с другими соединениями было достигнуто в режиме 2 (таблица 8) при температурном режиме: колонка - 70°С-скорость нагревания 25°С/мин - 180°С - скорость нагревания 10°С/мин - 210°С - скорость нагревания 5°С/мин - 230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя (азот) - 20 см/мин.
Для обнаружения гексахлорбензола в биологической среде (кровь) использовали высокоспецифичный электронно-захватный детектор (ДЭЗ).
Характеристики газохроматографического анализа гексахлорбензола представлены в таблице 9.
Предлагаемый способ устанавливает порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовых концентраций гексахлорбензола в пробах крови в диапазоне концентраций от 0,00015 до 0,005 мкг/мл. В заявляемом способе полнота извлечения ГХБ составляет 99,9%; предел определения 0,00015 мкг/мл; стандартное отклонение не более 10%; погрешность 16% и анализ выполняется на капиллярной колонке длиной 35 м.
В известном же способе по прототипу процент выделения ГХБ из крови составляет 79,06%; предел определения 0,0005 мкг/мл; стандартное отклонение ±17,66%; доверительный интервал ±21,92%,
При этом в заявляемом способе определению не мешают хлороформ, тетрахлорметан и другие хлорбензолы в количествах, не превышающих установленную величину.
Длительность анализа, включая экстракцию биопробы, 1 час.
Предлагаемый способ был опробован при оценке воздействия биомаркера экспозиции (гексахлорбензола) на здоровье детей Пермского края.
Для сравнительной оценки уровней ГХБ в крови были выбраны две группы детей: группа наблюдения (n=25), дети которой проживали на территории экологического неблагополучия, и группа сравнения (n=25), дети которой были практически здоровы и проживали вне зоны антропогенного влияния. Разработанная методика позволила определить содержание гексахлорбензола в крови обследуемых детей. Результаты анализа представлены в таблице 10.
3
3
min
max
В процессе исследований было установлено, что у обследуемых детей группы наблюдения, проживающих в зоне экспозиции, количество проб крови с содержанием гексахлорбензола составило 50% при средней концентрации 0,00003±0,00001 мкг/см. Установленное количество биопроб с повышенным содержанием гексахлорбензола в крови детей этой группы наблюдения составило 30%. Установлены минимальная и максимальная концентрации гексахлорбензола в крови таких детей C=0,00003 и C=0,00007 мкг/см соответственно.
Проведенные исследования показали, что средние концентрации гексахлорбензола в образцах крови детей, проживающих в зоне экспозиции, достоверно выше (p≤0,0-0,05), чем у детей группы сравнения в 3 раза.
Таким образом, разработанный способ определения ГХБ позволяет адекватно диагностировать химическую нагрузку в крови детей, что является доказательным звеном воздействия химических факторов окружающей среды на здоровье.