ПРИМЕНЕНИЕ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ В ГЛАЗНЫХ КАПЛЯХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ, ТАКИХ КАК БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ПАРКИНСОНА
APPLICATION OF NERVE GROWTH FACTOR IN EYE DROPS FOR TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM PATHOLOGIES SUCH AS ALZHEIMER'S AND PARKINSON DISEASES

Настоящее изобретение относится к применению фактора роста нервов в глазных каплях для лечения патологий центральной нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Более конкретно, изобретение относится к применению нейротрофина, называемого фактором роста нервов (NGF), для лечения патологий, затрагивающих структуры головного мозга, такие как гиппокамп, кора мозга, базальные отделы переднего мозга, срединная перегородка, диагональная связка Брока, базальное ядро Мейнерта, компактная зона черного вещества, полосатое тело и мозжечок, с помощью простого местного введения на поверхность глаза, например, в форме глазных капель или глазной мази.
in vitro
Фактор роста нервов (NGF) является основной молекулой комплексного семейства нейротрофинов и хорошо известен благодаря своей трофической, тропной и дифференцирующей активности на холинергические нейроны центральной нервной системы и на периферическую нервную систему. NGF вырабатывается тканями многих млекопитающих, включая человека, и высвобождается в кровоток в более значительных количествах в ходе роста и дифференцировки нервной системы. Биологические, биохимические и молекулярные исследования, осуществленные в клеточных системах , выявили очень высокую степень гомологии между NGF мыши и человека. Более того, у человека, как и многих других видов животных, NGF в норме присутствует как в спинномозговой жидкости, так и в кровотоке в концентрациях 10-50 пг/мл, которая повышается при некоторых воспалительных патологиях (аутоиммунных и аллергических заболеваниях и т.п.) и снижается при других (диабет).
NGF открыл профессор Rita Levi-Montalcini в Zoology Institute, Washington University, St. Louis (Levi-Montalcini R., Harvey Lect., 60: 217, 1966), и это представляет собой важный этап в исследовании механизмов роста нервных клеток и дифференцировки, так как он способен влиять на развитие и сохранение биологических функций и регенерацию нейронов. Профессор R. Levi-Montalcini награжден Нобелевской премией по медицине и физиологии в 1986 за открытие этой молекулы и за характеристику ее биологической роли как в периферической, так и центральной нервной системе.
in vitro
in vivo
Многочисленные экспериментальные исследования  и  показали физиологическую важность NGF в предотвращении повреждения нейронов хирургического, химического, механического и ишемического происхождения, таким образом, делая его идеальным кандидатом для применения в терапии многих патологий центральной и периферической нервной системы (Hefti F., J. Neurobiol., 25: 1418, 1994; Fricker J., Lancet, 349: 480, 1997). Фактически в настоящее время в течение нескольких лет проводили клинические испытания на пациентах, страдающих болезнью Паркинсона и болезнью Альцгеймера, посредством интрацеребрального введения мышиного NGF (см., например, Olson L. et al., J. Neural Trans.: Parkinson's Disease and Dementia Section, 4: 79, 1992). Результаты этих исследований подтвердили наблюдения, осуществленные на животных моделях, и выявили отсутствие возможных побочных эффектов после введения мышиного NGF. Эту особенность позднее подтвердили для рекомбинантного NGF человека (Petty B.G. et al., Annals of Neurology, 36: 244-246, 1994).
Так как со времени его открытия исследования по характеристике биологических, биохимических, молекулярных, доклинических и клинических эффектов NGF осуществляли почти исключительно с использованием NGF, выделенного из поднижнечелюстных желез взрослых грызунов, наибольшее количество полученных данных в настоящее время относится к мышиному NGF. Биохимические свойства мышиного NGF описаны, в частности, в работе, датированной 1968 (Levi-Montalcini R. & Angeletti P.U., Physiological Reviews, 48: 534, 1968).
NGF, содержащийся в мышиных слюнных железах, представляет собой молекулярный комплекс 140 килодальтон с коэффициентом седиментации 7S и состоит из трех субъединиц, α, β и γ, вторая из которых представляет собой действительную активную форму. Последняя, известная как βNGF, обладает коэффициентом седиментации 2,5S, и в норме ее выделяют и очищают согласно трем не очень отличающимся способам (Bocchini V., Angeletti P.U., Biochemistry, 64: 787-793, 1969; Varon S. et al., Methods in Neurochemistry, 203-229, 1972; Mobley W.C. et al., Molecular Brain Research, 387: 53-62, 1986).
βNGF, полученный таким образом, является димером приблизительно 13000 дальтон, состоящим из двух идентичных цепей из 118 аминокислот. Каждая цепь стабилизирована тремя дисульфидными мостиками, в то время как нековалентные связи обеспечивают стабилизацию димерной структуры. Молекула очень стабильна и растворима почти во всех растворителях, как водных, так и масляных, и сохраняет неизменными свои биохимические свойства и биологическую активность. Дополнительные подробности структуры и физических и биохимических свойств молекулы представлены в Greene L.A. & Shooter E.M., Ann. Rev. Neurosci. 3: 353, 1980.
Недавно структуру βNGF дополнительно прояснили с помощью кристаллографического анализа. Посредством анализа выявили наличие трех антипараллельных пар филаментов с вторичной структурой типа α2, что позволяет формировать плоскую поверхность, вдоль которой две цепи соединяются вместе с образованием активного димера. На этих цепях βNGF обнаружено наличие четырех областей «петель», которые содержат много вариабельных аминокислот. Эти вариабельные аминокислоты, вероятно, отвечают за специфичность узнавания рецептора.
in vivo
Биологический эффект NGF опосредован двумя рецепторами, присутствующими на поверхности соответствующих клеток-мишеней. Существование многих антител, которые избирательно ингибируют биологический эффект NGF, позволяет осуществлять точную характеристику и модуляцию его активности, как в клеточных системах, так и .
in vitro
in vivo
Недавно NGF человека синтезировали с помощью способов генной инженерии (Iwane M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 171: 116, 1990), и также небольшие количества NGF человека коммерчески доступны в настоящее время. Однако непосредственные эксперименты показали, что биологическая активность NGF человека в очень низкой степени сравнима с активностью мышиного NGF. Более того, следует иметь ввиду, что практически все в настоящее время доступные данные по человеку, как , так и , получены с использованием мышиного NGF, и до сих пор не обнаружены нежелательные побочные эффекты, обусловленные молекулой мышиного происхождения.
Исследования, осуществляемые на модельных животных с 1970-х, позволили предположить возможное участие NGF в патологиях, относящихся к центральной нервной системе. Участие NGF в патологических механизмах дегенеративных патологий центральной нервной системы предположили приблизительно 30 лет назад при наблюдении того, что NGF противодействует атрофии холинергических нейронов в базальных отделах переднего мозга и получаемым в результате когнитивным расстройствам у старых и пораженных крыс (Hefti F., J. Neurosci. 6(8): 2155-62, 1986). В частности, за последние годы многочисленные экспериментальные подтверждения указывают на стойкую корреляцию между отсутствием эндогенного синтеза молекул NGF и развитием некоторых конкретных патологий центральной нервной системы (CNS), периферической нервной системы (PNS) и заболеваний кожи (Tuszynski M.H. et al., J. Mol. Neurosci., 19: 207, 2002; Nakagawara A. et al., N. Engl. J. Med., 328: 847-854, 1993; De Santis S. et al., Clin. Cancer Res. 6: 90-95, 2000; Kaye D.M. et al., Circ. Res., 86: e80-e84, 2000; Villoslada P. et al., J. Exp. Med., 191: 1799-1806, 2000; Salvinelli F. et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 16: 176-80, 2002).
Отталкиваясь от этих наблюдений, некоторые исследователи начали исследования, сфокусированные на терапевтическом применении NGF при патологиях выстилающих тканей у человека, таких как язвы роговицы, язвы вследствие диабета или пролежня и васкулит, связанный с ревматоидным артритом, посредством местного введения NGF (Costa N. et al., Ann. Ist. Super. Sanita, 38: 187-194, 2002; Aloe L. e Calza L. eds., Prog. Brain Res., 146: 1-544, 2004; Lambiase A. et al., New Engl. J. Med., 338: 1174-1180, 1998; Bemabei R. et al., The Lancet, 354: 182, 1999; Lambiase A. et al., Arch. Ophthalmol., 118: 1446-1449, 2000; Tuveri M. et al., The Lancet, 356: 1739-1740, 2000; Chiaretti A. et al., Arch. Dis. Child., 87: 446-48, 2002; Landi F. et al., Ann. Int. Medicine, 139: 635-641, 2003; Generini S. et al., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 112: 542-4, 2004; Aloe L., Progr. Brain Res., 146: 279-89, 2004). К сожалению, несмотря на достигнутый прогресс для этих поверхностных патологий, NGF все еще не применяют при лечении расстройств центральной нервной системы, несмотря на существующие значительные свидетельства участия этого нейротрофина в патогенезе нейродегенеративных заболеваний.
Как известно, болезнь Альцгеймера (AD) является нейродегенеративным заболеванием пожилых людей, которое ведет к постепенной потере памяти и основных когнитивных способностей (Selkoe D.J., Physiol. Rev., 81(2): 741-66, 2001). Существует спорадическая форма этого заболевания (относящаяся к более 95% затронутых пациентов) и семейная форма (менее 5% затронутых пациентов), связанные с генными мутациями в APP (белок-предшественник амилоида), PS1 (пресенилин 1) и PS2 (пресенилин 2). В обеих формах заболевания снижение когнитивных способностей сопровождается гибелью нейронов, утратой синапсов и формированием внутриклеточных нейрофибриллярных сплетений, состоящих из белка цитоскелета тау, который присутствует в гиперфосфорилированной форме и находится в молекулярных агрегатах, называемых PHF (парные спиральные филаменты). Другим гистопатологическим признаком болезни Альцгеймера (AD) является внеклеточное накопление амилоидного белка (амилоидного β-пептида, Aβ), пептида, получающегося в результате патологического протеолиза APP. Это накопление входит в состав того, что в настоящее время известно как амилоидные бляшки или старческие бляшки. Эти клеточные расстройства в основном обнаружены в гиппокампе и коре мозга, в то время как в базальных отделах переднего мозга и базальном ядре Мейнерта происходит уменьшение количества холинергических клеток (Saper C.B. et al., Neurology, 35(8): 1089-95, 1985; Palmer A.M., Neurodegeneration, 5(4): 381-91, 1996; Mufson E.J. et al., J. Chem. Neuroanat., 26(4): 233-42, 2003).
Этот конкретный аспект AD привел к разработке современных способов лечения, включающих применение средств, ингибирующих холинэстеразу (и, таким образом, способствующих восстановлению нормальных «холинергических» функций). Следует подчеркнуть, что эффекты всех в настоящее время доступных лекарственных средств против AD определенно недостаточны, так как их действие ограничено частичным замедлением развития заболевания, и при условии, что лечение начинают на достаточно ранней стадии заболевания.
Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой вторую наиболее часто встречающуюся нейродегенеративную патологию (после AD) в популяции, и ее характеризуют, с точки зрения патологической анатомии, избирательной дегенерацией вещества, известного как компактная зона черного вещества, ядра, в котором находятся дофаминергические нейроны, содержащие меланин, которые посылают свои отростки в полосатое тело. Прогрессирующая дегенерация этой популяции нейронов и образующаяся в результате дофаминергическая денервация полосатого тела вызывают каскад изменений, нарушающих функциональную архитектонику базальных ядер, что приводит к появлению двигательных симптомов PD.
Несмотря на тот факт, что свыше 40 лет прошло с того момента, как нигростриарную недостаточность дофамина впервые идентифицировали в качестве нейротрансмиттерного изменения, отвечающего за симптоматологию болезни Паркинсона, этиопатогенез и физиопатология PD продолжают представлять собой отдельные малоизученные области. До настоящего времени это означало отсутствие эффективных терапевтических альтернатив L-DOPA (или леводопе), предшественнику дофамина, который все еще рассматривают в качестве «золотого стандарта» при лечении PD.
in vivo
in vitro
Исследования, проводимые в течение последних двадцати лет на экспериментальных моделях  и , предоставили ценную информацию, позволяющую осуществлять экспериментальное исследование новых терапевтических стратегий, некоторые из которых, такие как «глубокая стимуляция мозга» (DBS), успешно внедрены в клиническую практику. Однако даже самые последние способы лечения не способны сместить леводопу с его высокого положения, несмотря на нежелательные эффекты (в частности, дискинезию и двигательные флуктуации), которые неизбежно сопровождают продолжительное введение этого лекарственного средства в течение ряда лет. Наиболее серьезным недостатком на настоящее время является отсутствие терапевтических средств для борьбы с заболеванием не так или не только с симптоматической точки зрения, как в случае L-DOPA, но также для обеспечения сдерживания нейродегенеративного процесса, если не непосредственно для запуска механизмов регенерации на нигростриарном уровне. Другими словами, настоящий рывок вперед в лечении PD можно достичь только тогда, когда будут разработаны терапевтические стратегии, действительно включающие нейропротекторные и/или нейрорепаративные процессы.
Возвращаясь назад к фактору роста нервов, основное препятствие для его применения в данных способах лечения основано на том факте, что его нужно вводить в ткани мозга в концентрациях такой величины, что их невозможно ввести посредством обычных способов введения. Фактически во всех проведенных к настоящему времени исследованиях эффективность NGF показана только при интрацеребральном (интрацеребровентрикулярном) введении, так как данная молекула не способна проникать через гематоэнцефалический барьер в терапевтических концентрациях посредством системного введения. Самая последняя терапевтическая стратегия для применения NGF в качестве лекарственного средства против AD основана на интрацеребральной инокуляции генетически модифицированных клеток так, что они местно высвобождают NGF (Tuszynski M.H. et al., J. Mol. Neurosci., 19(1-2): 207, 2002; Tuszynski M.H. et al., Nat. Med., 11(5): 551-5, 2005).
В цитированных экспериментальных работах показано, что интрацеребральное введение NGF эффективно в предотвращении или, по меньшей мере, задержке гибели нейронов, вызываемой вышеупомянутыми патологиями. Более того, в ни одном из этих исследований не выявлено каких-либо побочных эффектов у животных. Однако необходимо отметить, что во всех вышеупомянутых публикациях NGF вводили в ткани мозга с помощью интрацеребральной инъекции.
Европейский патент EP 0721343 (Syntex), например, относится к фармацевтическим композициям на основе NGF, предложенным для лечения вышеупомянутых патологий, и в нем напоминают, что препараты на основе NGF обладают недостатком в виде плохого всасывания в организме при пероральном введении и что единственно возможным решением является парентеральное введение, инъекция или инфузия. Так как предложенный препарат на основе NGF не способен проникать через гематоэнцефалический барьер, в документе для введения средства, которое должно достичь тканей мозга, предложены интравентрикулярные инъекции или инфузии посредством интрацеребровентрикулярно имплантированной канюли или посредством интрацеребральных имплантатов устройств с отсроченным высвобождением или насосов.
Международные патентные заявки PCT, опубликованные соответственно под № WO 98/48002 и WO 00/44396, в которых один из авторов настоящего изобретения является автором, как оказалось, до настоящего момента являются единственной патентной документацией, содержащей описание использования NGF для наружного глазного применения, как например, в форме глазных капель или в виде мази. В представленной экспериментальной работе показано, как местное введение NGF может успешно разрешать патологии поверхности глаза (роговицы и конъюнктивы) и, неожиданно, также патологии, затрагивающие внутренние ткани глаза. Таким образом, оказалось, что NGF является пригодным для успешного лечения глазных патологий, для которых отсутствовали ранее эффективные способы лечения.
in situ
Хотя о терапевтической активности NGF при патологиях центральной нервной системы уже сообщалось в литературе, и в особенности при AD и PD, до настоящего времени не предложено никакого решения для проблемы удобного введения активного ингредиента в рассматриваемые ткани. Фактически способы, в которых используют интрацеребральные инъекции или имплантирование устройств внутри тканей мозга так, что активный ингредиент постоянно высвобождается , как в случае устройств, описанных в вышеупомянутом европейском патенте EP 0721343, связаны с риском разнообразных осложнений, описанных в литературе, таких как инфекции, кровотечения и повреждения анатомических структур в ходе инъекции. Эти осложнения могут возникать даже более часто при лечении хронических патологий и могут приводить к неприменимости лечения, вызывающего обращение соотношения риск-польза.
in situ
Согласно настоящему изобретению неожиданно обнаружено, что при введении NGF в форме глазных капель на поверхность глаза можно получить повышение уровней этого нейротрофина во всех тканях мозга, включая спинномозговую жидкость. Этим подтверждено, что NGF при введении в форме глазных капель способен проникать на уровень центральной нервной системы и может проявлять свои терапевтические способности  при заболеваниях мозга (нейродегенеративных и ишемических заболеваниях), включая в особенности болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
Как будет подробно проиллюстрировано в экспериментальном сообщении ниже, прохождение молекулы NGF с поверхности глаза, на которую его вводили, по направлению к тканям мозга показано с использованием как авторадиографического способа (Levi-Montalcini R. & Aloe L., Proc. Natl. Sci. USA 82: 7111-7115, 1985), так и иммуноферментного анализа (Bracci-Laudiero L. et al., Neurosci. Lett., 147: 9-12, 1992). В частности, при применении последнего способа на крысах, которых лечили конъюнктивальной инстилляцией NGF в солевом растворе, обнаружено, что спустя два часа после введения происходило повышение концентрации NGF во всех исследованных тканях мозга. Это повышение концентрации постепенно снижалось до базовых уровней спустя приблизительно 24 часа.
Этот эффект дает возможность NGF осуществлять терапевтическое действие не только на внутренние ткани глаза, прямо не затронутые его поверхностным введением, как уже предполагалось ранее, но также и, неожиданно, на ткани области мозга за пределами глаза и, таким образом, в особенности на центральную нервную систему. Этот аспект является новаторским для патологий мозга, для которых уже показана терапевтическая эффективность NGF, но где отсутствовал на тот момент доступный способ фармакологического введения, обеспечивающий удобное введение активного ингредиента без риска или побочных эффектов для пациента.
Очевидно, что возможность осуществлять наружное местное введение терапевтического средства глазного типа, т.е. в форме глазных капель или мази, когда желательный участок действия активного ингредиента является центральной нервной системой, представляет собой значительное преимущество по сравнению с введением посредством уже известного парентерального способа и интрацеребральной инъекции.
Таким образом, настоящее изобретение, в частности, относится к применению фактора роста нервов (NGF) для получения глазного препарата для введения на поверхность глаза для лечения и/или профилактики патологий центральной нервной системы, при этом глазной препарат находится в форме глазных капель и содержит от 10 до 500 мкг/мл NGF.
В частности, препарат согласно настоящему изобретению может быть показан для лечения и/или профилактики патологий, затрагивающих структуры головного мозга, или для лечения и/или профилактики патологий, затрагивающих спинной мозг. В обоих случаях глазной препарат на основе NGF может быть показан для лечения патологий посттравматической природы или инфекционной, послеоперационной, аутоиммунной, дистрофической, дегенеративной, ишемической или поствоспалительной природы. Среди них, кроме патологий, которые являлись основным объектом исследования, которое привело к настоящему изобретению, можно также включить различные формы деменции недегенеративного типа, такие как деменции, возникающие после повторных механических травм и которые иногда известны как «деменция боксеров», или деменции, возникающие после цереброваскулярных расстройств.
Более конкретно, глазной препарат на основе NGF согласно настоящему изобретению показан для лечения и/или профилактики нейродегенеративных патологий головного мозга, среди которых согласно некоторым формам предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера.
Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения глазной препарат можно также применять для лечения и/или профилактики дегенерации нейронов кортикоспинального пути, из которых боковой амиотрофический склероз представляет собой другой пример, в котором NGF может давать положительные эффекты.
В настоящем описании необходимо отметить то, что под «фактором роста нервов» или «NGF» понимают любую биологически активную форму NGF, предпочтительно, но не исключительно, β-субъединицу, или естественного происхождения или рекомбинантную, но даже гибридные или модифицированные формы NGF, которые связываются со своим соответствующим рецептором и сохраняют биодоступность NGF, или даже фрагменты или гибриды NGF, в которых некоторые аминокислоты удалены или замещены, очевидно, при условии, что получаемый продукт сохраняет достаточную способность связываться со специфическим рецептором. В этом контексте настоящее изобретение также включает, например, применение белков на основе NGF в соединении с белками-носителями, такими как трансферрин, и соединений, обладающих NGF-подобным действием посредством связывания с рецептором для NGF.
Более конкретно, указанный глазной препарат на основе NGF представлен в форме раствора или суспензии (глазной примочки или глазных капель), мази, геля или крема с фармацевтически приемлемым глазным носителем, который переносится глазом и совместим с активным ингредиентом. Также можно предусмотреть конкретные формы глазного введения на основе отсроченного высвобождения в виде растворимых глазных вставок или полимерных мембранных «резервуарных» систем, помещенных в конъюнктивальный мешок. Альтернативно, NGF или содержащий его препарат можно добавить на местную повязку с терапевтической контактной линзой.
Как уже отмечено и также подтверждено экспериментальными данными, представленными ниже, наружное местное введение NGF также, как оказалось, способно ингибировать дегенерацию нейронов на животных моделях болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Введение NGF посредством аппликаций на поверхность глаза индуцирует выживание нейронов и улучшение поведения животного при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона на животных моделях, когда происходит утрата нейронов головного мозга.
Более конкретно, эффекты NGF, введенного в виде глазных капель при болезни Паркинсона, представляют собой следующее: 1) снижение количества апоптотических нейронов в компактной зоне черного вещества (SNc); 2) увеличение количества дофаминергических (ДА-ергических) нейронов в SNc; 3) уменьшение количества телец Леви (включая цитоплазматические типы, характерные для болезни Паркинсона и которые рассматривают как маркер); 4) увеличение количества нейронов в других областях мозга, включая голубое пятно, гипоталамус, кору мозга и базальные ядра; 5) ослабление поведения в виде вращательного движения крыс (пространственная дезориентация с вращательным движением, другой характерный симптом заболевания).
Эффекты NGF, введенного в форме глазных капель при болезни Альцгеймера, представляют собой следующее: 1) снижение количества апоптотических нейронов в гиппокампе и области коры; 2) увеличение количества холинергических нейронов в базальных отделах переднего мозга, гиппокампе и области коры; 3) снижение количества амилоидных бляшек; 4) снижение уровней пептида Aβ42 (маркера болезни Альцгеймера, где Aβ представляет собой амилоидный белок); 5) уменьшение воспаления; 6) повышение уровней ацетилхолина.
Возможность того, что NGF может проявлять биологическое действие на ткани мозга после местного глазного введения, была едва ли предсказуема, кроме всего, в свете того факта, что, как подчеркнуто ранее, NGF является молекулой значительного размера (26800 дальтон) с комплексной структурой. Для того чтобы молекула обладала каким-либо действием на ткани мозга, после введения по каплям на поверхность глаза она должна обладать способностью проникать через ткани глаза и достигать зрительного нерва и спинномозговой жидкости, чтобы проявить свою собственную биологическую активность в области головного мозга. В общепринятой практике глазное введение не применяют для лечения патологий головного мозга. Вышеприведенное имеет место вследствие того, что во всех известных исследованиях, касающихся применения NGF при патологиях головного мозга, применяли только интрацеребральное введение.
В действительности, хотя NGF обладает комплексной структурой и является высокомолекулярным, он содержит как гидрофильные, так и гидрофобные структурные группы, которые обеспечивают его прохождение через гомологичные (липидные и гидрофильные) анатомические барьеры. Более того, фундаментальной чертой NGF является то, что как только он достигает органов-мишеней даже в очень низких, но биологически активных концентрациях, он может стимулировать эндогенное образование NGF самой тканью. Присутствие эндогенной фракции NGF ясно следует из результатов экспериментов (которые будут проиллюстрированы ниже) по прохождению NGF через ткани. Эти результаты также показывают, что градиент концентрации не сохраняется от наружной поверхности глаза по направлению к мозгу, как это можно предположить для механизма простой диффузии через ткани.
Для получения препарата согласно настоящему изобретению подходящие способы экстракции и очистки NGF представлены в вышеупомянутой литературе. Способ Bocchini и Angeletti, кратко описанный здесь, использовали для экспериментов, относящихся к настоящему изобретению. Поднижнечелюстные железы взрослых самцов мышей выделяли в стерильных условиях и их ткани гомогенизировали, центрифугировали и диализовали. Суспензию затем пропускали через последовательные целлюлозные колонки, на которых происходила адсорбция NGF. NGF затем элюировали с колонки посредством буфера с 0,4 M хлоридом натрия. Таким образом полученные образцы анализировали спектрофотометрически при длине волны 280 нм для идентификации фракций, содержащих NGF. Эти фракции диализовали и NGF лиофилизировали в стерильных условиях и замораживали при -20°C.

Лекарственный препарат согласно настоящему изобретению и пригодный для введения на поверхность глаза предпочтительно содержит NGF, или по отдельности, или в сочетании с одним или несколькими другими активными ингредиентами, в диапазоне от 1 до 1000 мкг/мл. Если продукт представлен в форме водного раствора (глазные капли), концентрация NGF может предпочтительно находиться в диапазоне 10-500 мкг/мл, и более предпочтительно в диапазоне 200-250 мкг/мл. Конкретная композиция для глазных капель может содержать, например, 200 мкг/мл NGF в физиологическом растворе с 0,9% хлоридом натрия или в сбалансированном солевом растворе (BSS): в обоих случаях раствор является изотоническим со слезной жидкостью и, таким образом, хорошо переносится глазом. Однако также возможно использование гипотонических растворов.
NGF, содержащийся в солевых растворах, может присутствовать или один, или в сочетании с другими биологически активными молекулами и/или являться конъюгированным с другими молекулами носителя (такими как трансферрин). Для дальнейшего усиления его проникновения через поверхность глаза можно добавить другие эксципиенты, выбранные из тех, которые в настоящее время используют в фармацевтических способах, как например для стабилизации активного ингредиента в буферных растворах или суспензиях, и которые делают препарат лучше переносимым. Более конкретно, буферы должны поддерживать pH в диапазоне 4-8, и предпочтительно в диапазоне pH=6,5 и pH=7,5. Например, вышеупомянутый раствор хлорида натрия можно забуферить любым из буферов, хорошо известных в фармацевтической области в качестве пригодных для глазного использования, среди которых фосфатный или trizma (трис-гидроксиметиламинометан), для получения физиологического pH 7,0-7,4, в то же время поддерживая физиологическую осмолярность (295-305 мосм/л).
Переносимость можно дополнительно усилить с использованием эксципиентов, таких как полисорбат 80 (или твин 80), декстран, полиэтиленгликоль (например, PEG 400) и т.п. Композиция может также содержать средства, повышающие вязкость, такие как гиалуроновая кислота, метилцеллюлоза, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и т.п., для усиления биодоступности, стабильности и переносимости активного ингредиента. Биодоступность NGF можно дополнительно усилить с использованием веществ, которые повышают проницаемость роговицы для лекарственного средства, таких как диметилсульфоксид, таурохолаты, фосфолипиды мембран и различные поверхностно-активные вещества, пригодные для глазного использования. Более того, можно добавлять к композиции консервант, обладающий противомикробной активностью, для предотвращения контаминации.
Средства, подобные карбоксиметилцеллюлозе или аналогичные, можно добавлять к продуктам для введения в форме суспензии. Если желательно использовать композицию в виде мази, геля или глазного крема, носителем для NGF может являться полиэтиленгликоль, полиакрилаты, полиэтиленоксиды, жирные кислоты и спирты или ланолин, парафин и т.п.
Некоторые экспериментальные результаты, полученные в рамках настоящего изобретения, представлены ниже исключительно с иллюстративными целями.
Исследования прохождения NGF от глазной поверхности к головному мозгу
125
В первом наборе тестов для оценки прохождения NGF внутри глаза от наружной поверхности, на которую его вводили, к тканям головного мозга использовали вышеупомянутый авторадиографический способ на группе из шести кроликов. Каждый из кроликов получал одну каплю глазной примочки (50 мкл), содержащей 10 мкг NGF, меченного I (концентрация: 200 мкг/мл), путем инстилляции в конъюнктивальный свод.
125
125
125
Использовали мышиный NGF, очищенный согласно ранее описанному способу и впоследствии конъюгированный с Na-I (Amersham Italia, IMS30, 1 мКи) согласно способу с хлорамином T (Lapack P.A., Exp. Neurol., 124: 1620, 1993). Количество меченого NGF определяли хроматографией с использованием колонки Sephadex G-25. Количество меченного I продукта, собранного преципитацией, находилось между 90 и 95%, показывая, что большая часть радиоактивного продукта связалась с NGF. Удельная активность NGF-I находилась между 1 и 1,5 Ки/мкмоль.
Через два часа после введения меченого NGF животных забивали и головной мозг препарировали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48 часов. Затем после инкубации в 30% сахарозе в течение 24 часов изготавливали с использованием криостата срезы образцов толщиной 15 мкм, которые помещали на гистологические предметные стекла с желатином, смоченные фотографической эмульсией (Ilford K2), и инкубировали 4 недели при 4°C. Срезы затем обезвоживали этанолом, помещали в DPX после обработки ксилолом и рассматривали в оптический микроскоп Zeiss.
В эксперименте показано, что при введении на поверхность глаза меченый NGF способен проникать в глаз и связываться с клетками различных тканей головного мозга (включая кору, гиппокамп, базальные отделы переднего мозга, черное вещество, голубое пятно, гипоталамус и базальные ядра), экспрессирующими специфический рецептор.
Во втором наборе тестов с использованием вышеупомянутого иммуноферментного способа количество NGF в различных тканях головного мозга определяли после введения одной капли мышиного NGF в конъюнктивальный свод. Всего использовали 24 крысы, шесть из которых сразу забивали для определения базальных величин концентрации NGF в различных тканях головного мозга. Оставшихся животных забивали через 2 часа (6 крыс), 6 часов (6 крыс) и 24 часа (6 крыс) после введения глазных капель.
Во всех случаях собирали спинномозговую жидкость и головной мозг и препарировали разные области головного мозга (включая кору, гиппокамп, базальные отделы переднего мозга, черное вещество, голубое пятно, гипоталамус и базальные ядра). После взвешивания ткани обрабатывали ультразвуком (с использованием соникатора Braun B) в забуференном белковом матриксе, содержащем ингибиторы протеаз (буфер для экстракции). Таким образом полученный гомогенат центрифугировали (10000g в течение 20 минут) и супернатант использовали для определения уровней NGF иммуноферментным способом (ELISA). Использованный способ является чрезвычайно чувствительным и специфичным к NGF и способен детектировать концентрации вплоть до 5 пг/мл. Козьи поликлональные антитела к NGF использовали в качестве первых антител, разведенных в 0,05 M карбонатном буфере при pH 9,6. В качестве контроля для определения неспецифического сигнала использовали очищенные козьи иммуноглобулины.
2
Растворы первичных антител и контрольных иммуноглобулинов распределяли в параллелях по 96-луночным полистирольным планшетам. Планшеты инкубировали 12 часов при комнатной температуре и затем неспецифические участки забивали карбонатным буферным раствором с 1% BSA. После промывки планшетов раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 200 мМ NaCl, 0,5% желатина и 0,1% тритона X-100 образцы NGF и стандартные растворы разводили подходящим образом раствором 100 мМ Трис-HCl, pH 7,2, 400 мМ NaCl, 4 мМ EDTA, 0,2 мМ PMSE, 0,2 мМ бензетоний-хлорида, 2 мМ бензимидина, 40 Ед/мл апротинина, 0,05% азида натрия, 2% BSA и 0,5% желатина. После распределения по трем параллелям образцов NGF и стандартных растворов в количестве 50 мкл/лунка планшеты инкубировали с вторичными антителами: 4 мЕд/лунка анти-β-NGF-галактозидазы (Boehringer, Mannheim, Germany) 2 часа при 37°C. Затем, после промывки, распределяли по 100 мкл/лунка раствор, содержащий 4 мг β-галактозилхлорфенола красного (Boehringer, Mannheim, Germany) на мл раствора, содержащего 100 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, мМ MgCl, 0,1% азид натрия и 1% BSA.
После инкубации хромогена два часа при 37°C определяли оптическую плотность при длине волны 575 нм с помощью аппарата для прочтения планшетов для ELISA (Dynatech). Величины концентрации для стандартов и образцов NGF вычисляли после вычитания значений фона вследствие неспецифического связывания. Данные выражали в виде пг/мл или в виде пг/г по отношению к свежей взвешенной ткани. Результаты, суммированные ниже в таблице 1, показывают, насколько возрастают уровни NGF во всех тканях головного мозга после 2 часов введения глазных капель; эти значения остаются высокими, хотя снижаются, и затем возвращаются к базальным значениям после 24 часов.
Исследования эффекта введения NGF в форме глазных капель при болезни Паркинсона
Для оценки эффективности введения NGF на поверхность глаза для лечения болезни Паркинсона NGF, разведенный в сбалансированном солевом растворе в концентрации 200 мкг/мл, в форме глазных капель вводили животным моделям 4 раза в сутки.
Характерные признаки болезни Паркинсона (PD) включают брадикинезию, тремор в покое и двигательные расстройства. Патологические характеристики включают в основном дегенерацию дофаминергических (ДА-ергических) нейронов в компактной зоне черного вещества (SNc) и наличие телец Леви. Также сообщалось о дегенерации других систем, включая голубое пятно, гипоталамус, кору мозга, базальные ядра, центральные и периферические компоненты автономной нервной системы. Симптомы болезни Паркинсона наблюдают, когда происходит приблизительно 80% утрата ДА-ергических нейронов в SNc. В отсутствие биологических маркеров предсказуемость ранней дисфункции ДА-ергической системы проблематична. Хотя отсутствуют спонтанные проявления болезни Паркинсона (PD) у животных, использовали множество экспериментальных моделей PD для получения таких же клинических характеристик у животных. Способы, в которых применяют нейротоксины для получения повреждений в нигростриарной дофаминергической системе, обладают значительной избирательностью и воспроизводимостью. В этом эксперименте в качестве нейротоксина использовали 6-гидроксидофамин (6-OHDA).
Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией хлоргидрата. Дофаминергические повреждения получали стереотаксической инъекцией 6-OHDA (Sigma), 8 мкг/3 мл солевого раствора, в правый медиальный отдел переднего мозга (координаты из атласа Paxinos & Watson: AP 4,4 мм, L +1,2 мм и V 7,8 мм от твердой мозговой оболочки, рассечение на 2,4 мм ниже внутриушной линии).
Через один месяц после повреждения обнаружено поведение в виде вращательного движения у всех крыс с использованием D-амфетамина (5 мг/кг в солевом растворе) внутрибрюшинно и апоморфина гидрохлорида (50 мкг/кг) подкожно. Поведение в виде вращательного движения оценивали с использованием автоматического ротатометра (Rotorcid, Cuba) и автоматически регистрировали количество полных кругов 360°/мин. В экспериментальное исследование включали только тех крыс, для которых наблюдали поведение в виде вращательного движения в течение, по меньшей мере, 7 полных ипсилатеральных поворотов в минуту с использованием инъекции D-амфетамина за 90 минут и 3,3 полных контралатеральных поворотов в минуту за период 45 минут с использованием апоморфина.
NGF в форме глазных капель вводили в течение 2 месяцев, 4 раза в сутки, в концентрации 200 мкг/мл в сбалансированном солевом растворе в конъюнктивальный свод 10 крысам, в то время как только сбалансированный солевой раствор вводили другой группе из 10 крыс в качестве контролей.
В конце периода лечения (два месяца) снова проводили оценку поведения, после которой животных забивали, их головной мозг удаляли и оценивали гистологически, а также иммуногистохимически. Полученные данные суммированы ниже в таблице 2.
Таблица 2Эффект лечения с помощью NGF в форме глазных капель болезни Паркинсона на животных моделях
Количество апоптотических нейронов в SNc*
Количество дофаминергических нейронов в SNc**
Количество телец Леви***
Количество нейронов в других отделах головного мозга
Поведение в виде вращательного движения
Через 2 месяца после лечения с помощью NGF
60% снижение
220% увеличение
130% снижение
95% увеличение
70% снижение
* определено с использованием способа TUNEL и антител к каспазе 3; ** определено иммуногистохимически; *** определено гистологически.
В вышеописанном эксперименте показано, что NGF в форме глазных капель способен: 1) уменьшать количество апоптотических нейронов в компактной зоне черного вещества (SNc); 2) увеличивать количество дофаминергических (ДА-ергических) нейронов в SNc; 3) уменьшать количество телец Леви; 4) увеличивать количество нейронов в других областях головного мозга, включая голубое пятно, гипоталамус, кору мозга и базальные ядра; 5) ослаблять поведение крыс в виде вращательного движения.
Исследования эффекта NGF в форме глазных капель при болезни Альцгеймера
Для оценки эффективности введения NGF на поверхность глаза для лечения болезни Альцгеймера NGF, разведенный в сбалансированном солевом растворе в концентрации 200 мкг/мл, в форме глазных капель вводили животной модели 4 раза в сутки.
В описанном эксперименте использовали дважды трансгенных мышей, у которых экспрессируются обе человеческие мутации APPswe и PS1 A246E (мыши APP PS1). У этих мышей появляются высокие уровни высокофибриллогенного пептида Aβ42, который образует амилоидные бляшки, начиная приблизительно с возраста 9 месяцев. Первые амилоидные бляшки появляются в основании (и в каудальной области коры), и эти отложения позднее распространяются в гиппокамп и во все области коры. Эта характеристика некоторым образом сходна с ранними стадиями болезни Альцгеймера, где амилоидные бляшки также в основном ограничены структурами медиальной височной области коры.
NGF в форме глазных капель вводили в течение 2 месяцев, 4 раза в сутки, в концентрации 200 мкг/мл в сбалансированном солевом растворе в конъюнктивальный свод 10 самцам мышей (в возрасте 9 месяцев), в то же время только сбалансированный солевой раствор вводили другой группе из 10 мышей (того же возраста и пола) для использования в качестве контролей.
В конце периода лечения (два месяца) животных забивали, их головной мозг удаляли и оценивали гистологически и иммуногистохимически. Полученные данные суммированы ниже в таблице 3.
Таблица 3Эффект лечения с помощью NGF в форме глазных капель болезни Альцгеймера на животных моделях
Количество апоптотических нейронов в гиппокампе и коре*
Количество холинергиче-ских нейронов**
Количество амилоидных бляшек***
Уровни пептида Aβ42**
Активиро-ванная микроглия (GFAP+ и CD11b+)**
Уровни ацетилхо-лина****
Через 2 месяца после лечения c помощью NGF
65% снижение
190% увеличение
60% снижение
76% снижение
50% снижение
120% увели-чение
* определено с использованием способа TUNEL и антител к каспазе 3; ** определено иммуногистохимически; *** определено окрашиванием Конго красным; **** определено специфическим ELISA.
В вышеописанном эксперименте показано, что NGF в форме глазных капель способен: 1) уменьшать количество апоптотических нейронов в гиппокампе и области коры; 2) увеличивать количество холинергических нейронов в базальных отделах переднего мозга, гиппокампе и области коры; 3) уменьшать количество амилоидных бляшек; 4) снижать уровни пептида Aβ42; 5) уменьшать воспаление; 6) увеличивать уровни ацетилхолина.
Настоящее изобретение описано со ссылкой на некоторые конкретные варианты его осуществления, но следует понимать, что специалисты в данной области могут осуществить вариации или модификации без отступления от объема приложенной формулы изобретения.