Способ определения количества коллагена в ткани
METHOD FOR DETERMINING AMOUNT OF COLLAGEN IN TISSUE

Изобретение относится к биотехнологии, гистологии и может быть использовано для количественного определения коллагена в ткани.
Известен способ количественного определения содержания коллагена, заключающийся в проведении реакции антиген-антитело с использованием меченых радиоактивными изотопами реактивов [1]. Недостатками указанного способа являются невозможность исследования образцов тканей (способ применим только для растворов), необходимость применения радиоактивных веществ.
Прототипом заявленного изобретения является способ количественного определения коллагена в ткани [2]. Положительными в данном способе являются его возможность точного определения концентрации коллагена, широкий спектр применения. Недостатками указанного способа являются технологическая сложность процедуры, необходимость применения хроматографа высокого давления, высокая стоимость применяемого оборудования и расходных материалов, реактивов.
Задача предлагаемого изобретения: расширение лабораторных возможностей количественного определения коллагена в тканях. Технический результат предлагаемого изобретения: уменьшение материальных и временных затрат в процессе количественного определения коллагена в тканях.
1
2
1
2
Указанная задача в предлагаемом способе достигается тем, что предварительно взвешенный замороженный при температуре -80°С в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают, измельчают микротомным лезвием, заливают 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, повторяют процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл, до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз, подготовленный материал замораживают при - 80°С и лиофильно высушивают, полученный безводный материал взвешивают, определяют массу материала m, разводят материал в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина, содержащей коллагеназу в виде лиофилизата в количестве 1000 КЕ, в 2 мл буферного раствора с рН 7,0, пробирку с содержимым перемешивают в течение 2 часов, три раза проводят цикл гомогенизации, центрифугирования при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендирования материала, материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают и взвешивают, определяют массу материала m, по разнице масс m-m определяют количество коллагена.
1
2
1
2
Указанный способ осуществляется следующим образом. Предварительно взвешенный и замороженный при -80°С в 1 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия кусочек ткани лиофильно высушивают в лиофильной сушилке при температуре -46°С и давлении 0,040 мБар, измельчают путем нарезания микротомным лезвием (или микротомным ножом) на максимально мелкие фрагменты толщиной не более 3 мм, можно меньше, помещают полученные фрагменты в градуированную пробирку Eppendorf, вместимостью 1,5 мл. Заливают фрагменты 1 мл 15% водного раствора гидроксида натрия на 24 часа при температуре 18-20°С, после чего удаляют из пробирки раствор щелочи путем аспирации дозатором и наливают дистиллированную воду при температуре 18-20°С в объеме 1 мл. Гомогенизируют материал путем ресуспендирования при помощи дозатора, выполняя многократную последовательную аспирацию содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку из дозатора материала в течение 2-3 минут, центрифугируют гомогенизированный материал в течение 5 минут при 13400 оборотах в минуту. После центрифугирования аспирируют дозатором надосадочную жидкость из пробирки таким образом, чтобы осадок на дне пробирки находился в объеме жидкости, не превышающем 0,5 мл, можно меньше, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл и повторно гомогенизируют материал способом, описанным выше. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют до достижения уровня рН надосадочной жидкости 7,0, но не менее 5 раз. После достижения целевого уровня рН в надосадочной жидкости 7,0 аспирируют надосадочную жидкость дозатором таким образом, чтобы количество осадка в пробирке не превышало 0,3 мл. Полученный материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяют массу материала m. Затем полученный безводный осадок разводят в 900 мкл буферного раствора с рН 7,0 и добавляют 100 мкл раствора коллализина, который заранее приготавливают путем растворения содержимого одной ампулы коллализина (содержащей коллагеназу в виде лиофилизата для приготовления раствора в количестве 1000 КЕ) в 2 мл буферного раствора с рН 7,0. Затем пробирку с содержимым устанавливают в шейкер при температуре 37°С и перемешивают в течение 2 часов. После этого пробирку снимают, центрифугируют при 13400 оборотов в минуту в течение 5 минут, аспирируют дозатором надосадочную жидкость, добавляют дистиллированную воду до объема 1 мл, гомогенизируют полученный материал путем многократной аспирации содержимого пробирки дозатором и обратного впрыскивания в пробирку. Процедуру, включающую гомогенизацию путем ресуспендирования дозатором, центрифугирование, аспирацию надосадочной жидкости и добавление воды до объема 1 мл повторяют 3 раза. После этого материал замораживают при -80°С, лиофильно высушивают в лиофильной сушилке и взвешивают на аналитических весах, определяя массу материала m. По разнице масс m-m определяют массу коллагена, содержавшегося в исследуемой ткани. Процентное содержание коллагена в ткани определяют отношением определенной массы коллагена к массе образца ткани.
Способ позволяет определить количество коллагена в ткани, снизить материальные и временные затраты на проведение анализа, избежать использования радиоактивных веществ.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Земсков В.М., Смирнов М.Д., Алексеев А.Б., Масенко В.П. Способ количественного определения коллагена. Описание изобретения к авторскому свидетельству №935792, заявка 2966207/30-15, 15.06.1982, бюллетень №22.
2. Виллануэва Патриция А., Макналти Эми К., Беникер Герберт Д., Киесветтер Кристин. Способ количественного определения коллагена в ткани. Патент №2452956, заявка 2009109113/15, 21.09.2006.