КОНЪЮГИРОВАННЫЕ ЧЕРЕЗ CYS80 ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

1. Способ получения конъюгированного иммуноглобулина, включающий:
декэпирование цистеина в положении аминокислоты 80 («Cys80») в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, полученного от кролика, при этом указанный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи; и
конъюгирование реагирующего с тиолом  соединения с указанным Cys80, при этом указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное декэпирование включает инкубирование указанного иммуноглобулина с восстанавливающим буфером с последующим инкубированием указанного иммуноглобулина с окисляющим буфером.
3. Способ по п. 2, дополнительно включающий иммобилизацию указанного иммуноглобулина на подложке перед осуществлением инкубирования с восстанавливающим буфером и элюирование указанного иммуноглобулина с указанной подложки после инкубирования с окисляющим буфером.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное реагирующее с тиолом соединение присоединено к функциональному агенту.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный функциональный агент содержит флуорофор, флуоресцентный краситель, полипептид, иммуноглобулин, антибиотик, нуклеиновую кислоту, радионуклид, химический линкер, малую молекулу, хелатор, липид или лекарственное средство.
2
2
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное реагирующее с тиолом соединение связано со вторым реагирующим с тиолом соединением, при этом указанное второе реагирующее с тиолом соединение связано со вторым иммуноглобулином, имеющим вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, при этом указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении аминокислоты 80 («Cys80»), и при этом указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу, связанную с Cys80.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный Cys80 является неспаренным.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий осуществление замены аминокислотного остатка в положении 83 на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys.
9. Способ получения антигенсвязывающей молекулы, включающий инкубирование первого конъюгированного иммуноглобулина со вторым конъюгированным иммуноглобулином с получением указанной антигенсвязывающей молекулы, где:
1
1
указанный первый конъюгированный иммуноглобулин содержит первую вариабельную область тяжелой цепи и первую вариабельную область легкой цепи, где указанная первая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80»), при этом указанный Cys80 конъюгирован с первым реагирующим  с тиолом соединением, содержащим первую способную реагировать с тиолом группу; и
2
2
указанный второй конъюгированный иммуноглобулин содержит вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, где указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80»), при этом указанный Cys80 конъюгирован со вторым реагирующим с тиолом соединением, содержащим вторую способную реагировать с тиолом группу.
1
2
1
2
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный Cys80, указанный Cys80 или и указанный Cys80,и указанный Cys80 являются неспаренными.
11. Способ по п. 9 или 10, до этапа инкубирования дополнительно включающий
1
2
1
2
декэпирование указанного Cys80, указанного Cys80 или указанного Cys80и указанного Cys80 и
1
2
1
2
конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с указанным Cys80, второго реагирующего с тиолом соединения с указанным Cys80 или первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80 и второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80, при этом указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первую способную реагировать с тиолом группу и указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу.
12. Способ по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что указанное первое реагирующее с тиолом соединение дополнительно содержит первый функциональный агент, указанное второе реагирующее с тиолом соединение дополнительно содержит второй функциональный агент или указанное первое реагирующее с тиолом соединение дополнительно содержит первый функциональный агент и указанное второе реагирующее с тиолом соединение дополнительно содержит второй функциональный агент.
13. Способ по любому из пп. 9-12, отличающийся тем, что указанный первый иммуноглобулин представляет собой первый Fab-фрагмент или указанный второй иммуноглобулин представляет собой второй Fab-фрагмент или указанный первый иммуноглобулин представляет собой первый Fab-фрагмент и указанный второй иммуноглобулин представляет собой второй Fab-фрагмент.
14. Способ по любому из пп. 9-13, дополнительно включающий замену аминокислотного остатка в положении 83 указанной первой вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys, замену аминокислотного остатка в положении 83 указанной второй вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys, или замену аминокислотного остатка в положении 83 указанной первой вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys, и замену аминокислотного остатка в положении 83 указанной второй вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys.
15. Антигенсвязывающая молекула, полученная в соответствии со способом по любому из пп. 9-14.
16. Иммуноглобулин, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80») и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys.
17. Иммуноглобулин по п. 16, отличающийся тем, что указанный Cys80 является неспаренным.
18. Иммуноглобулин по п. 16 или 17, отличающийся тем, что указанный Cys80 декэпирован.
19. Иммуноглобулин по любому из пп. 16-18, содержащий:
a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-141 последовательности xi155D5HC (SEQ ID NO:52), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi155D5LC (SEQ ID NO:78);
b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-144 последовательности zu155D5HC (SEQ ID NO:54), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104) или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);
c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-138 последовательности xi1E4HC (SEQ ID NO:58), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi1E4LC (SEQ ID NO:110);
d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-140 последовательности zu1E4HC (SEQ ID NO:60), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);
e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi166B3HC (SEQ ID NO:74), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi166B3LC (SEQ ID NO:132); или
f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu166B3HC (SEQ ID NO:76), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).
20. Иммуноглобулин по п. 19, содержащий:
a. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi155D5HC, согласно SEQ ID NO:146, 148 и 150, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi155D5LC, согласно SEQ ID NO:224, 226 и 228, соответственно;
b. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu155D5HC, согласно SEQ ID NO:152, 154 и 156, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu155D5LC-3, согласно SEQ ID NO:242, 244 и 246, соответственно, последовательности zu155D5LC-4, согласно SEQ ID NO:248, 250 и 252, соответственно, последовательности zu155D5LC-5, согласно SEQ ID NO:254, 256 и 258, соответственно, последовательности zu155D5LC-6, согласно SEQ ID NO:260, 262 и 264, соответственно, последовательности zu155D5LC-7, согласно SEQ ID NO:266, 268 и 270, соответственно, последовательности zu155D5LC-huVK2-40, согласно SEQ ID NO 278, 280 и 282, соответственно, последовательности zu155D5LC-huVK4-1, согласно SEQ ID NO 290, 292 и 294, соответственно, последовательности zu155D5LC-huVK6-21, согласно SEQ ID NO 296, 298 и 300, соответственно, последовательности zu155D5LC-huVK6D-41, согласно SEQ ID NO 302, 304 и 306, соответственно, или последовательности zu155D5LC-huVK7-3-Glu81, согласно SEQ ID NO 308, 310 и 312, соответственно;
c. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi1E4HC, согласно SEQ ID NO:164, 166 и 168, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi1E4LC, согласно SEQ ID NO:320, 322 и 324, соответственно;
d. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu1E4HC, согласно SEQ ID NO:170, 172 и 174 соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu1E4LC-CXXA согласно SEQ ID NO:332, 334 и 336, соответственно;
e. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi166B3HC, согласно SEQ ID NO:212, 214 и 216 соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi166B3LC согласно SEQ ID NO:386, 388 и 390, соответственно; или
f. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu166B3HC, согласно SEQ ID NO:218, 220 и 222 соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu166B3LC-CXXA согласно SEQ ID NO:398, 400 и 402, соответственно.
21. Иммуноглобулин по любому из пп. 16-18, содержащий:
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-139 последовательности xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-129 последовательности xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108).
22. Иммуноглобулин по п. 21, содержащий:
CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi1-55-2HC согласно SEQ ID NO:158, 160 и 162, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi1-55-2LC согласно SEQ ID NO:314, 316 и 318, соответственно.
23. Иммуноглобулин по любому из пп. 16-18, содержащий:
a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);
b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);
c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);
d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);
e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128); или
f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130).
24. Иммуноглобулин по п. 23, содержащий:
a. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi33O11HC согласно SEQ ID NO: 176, 178 и 180, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi33O11LC, согласно SEQ ID NO:338, 340 и 342, соответственно;
b. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu33O11HC согласно SEQ ID NO:182, 184 и 186, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu33O11LC-CXXA согласно SEQ ID NO:350, 352 и 354, соответственно, или последовательности zu33O11LC-CXXI согласно SEQ ID NO:356, 358 и 360, соответственно;
c. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi324O5HC согласно SEQ ID NO:188, 190 и 192, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi324O5LC согласно SEQ ID NO:362, 364 и 366, соответственно;
d. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi178F16HC согласно SEQ ID NO:194, 196 и 198, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi178F16LC согласно SEQ ID NO:368, 370 и 372, соответственно;
e. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi237N18HC согласно SEQ ID NO:200, 202 и 204, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi237N18LC согласно SEQ ID NO:374, 376 и 378, соответственно; или
f. CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi383I18HC согласно SEQ ID NO:206, 208 и 210, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi383I18LC согласно SEQ ID NO:380, 382 и 384, соответственно.
25. Конъюгированный иммуноглобулин, содержащий:
иммуноглобулин по любому из пп. 16-24, при этом цистеин в положении 80 конъюгирован с  реагирующим с тиолом соединением, при этом указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.
26. Конъюгированный иммуноглобулин по п. 25, отличающийся тем, что указанное реагирующее с тиолом соединение дополнительно содержит функциональный агент.
27. Конъюгированный иммуноглобулин по п. 26, отличающийся тем, что указанный функциональный агент содержит флуорофор, флуоресцентный краситель, полипептид, иммуноглобулин, антибиотик, нуклеиновую кислоту, радионуклид, химический линкер, малую молекулу, хелатор, липид или лекарственное средство.
28. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина против мезотелина, при этом указанный конъюгированный иммуноглобулин против мезотелина содержит:
иммуноглобулин по любому из пп. 23-24 и
реагирующее с тиолом соединение, содержащее способную реагировать с тиолом группу, линкер и функциональный агент.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанный функциональный агент представляет собой ауристатин F.
30. Антигенсвязывающая молекула, содержащая:
1
1
первый конъюгированный иммуноглобулин, содержащий первую вариабельную область тяжелой цепи и первую вариабельную область легкой цепи, при этом указанная первая вариабельная область легкой цепи имеет цистеин в положении 80 («Cys80»), при этом указанный Cys80 конъюгирован с первым реагирующим с тиолом соединением, содержащим первую способную реагировать с тиолом группу, и
2
2
второй конъюгированный иммуноглобулин, содержащий вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, при этом указанная вторая вариабельная область легкой цепи имеет цистеин в положении 80 («Cys80»), при этом указанный Cys80 конъюгирован со вторым реагирующим с тиолом соединением, содержащим вторую способную реагировать с тиолом группу.
1
2
1
2
31. Антигенсвязывающая молекула по п. 30, отличающаяся тем, что указанный Cys80, указанный Cys80 или указанный Cys80 и указанный Cys80 являются неспаренными.
32. Антигенсвязывающая молекула по п. 30 или 31, отличающаяся тем, что аминокислотный остаток в положении 83 указанного первого иммуноглобулина, аминокислотный остаток в положении 83 указанного второго иммуноглобулина или аминокислотный остаток в положении 83 указанного первого иммуноглобулина и аминокислотный остаток в положении 83 указанного второго иммуноглобулина представляет собой аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys.
33. Антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 30-32, отличающаяся тем, что указанное первое реагирующее с тиолом соединение дополнительно содержит первый функциональный агент, указанное второе реагирующее с тиолом  соединение дополнительно содержит второй функциональный агент, или указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первый функциональный агент и указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит второй функциональный агент.
34. Антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 30-33, отличающаяся тем, что указанный первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулины представляют собой Fab-фрагменты.
35. Вариабельная область легкой цепи для применения в конъюгированном иммуноглобулине, при этом указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении аминокислоты 80 («Cys80») и аминокислотный остаток в положении 83, отличный от Phe, Lys или Cys, при этом указанный Cys80 является неспаренным.
1
2
3
3
36. Вариабельная область легкой цепи по п. 35, отличающаяся тем, что указанная вариабельная область легкой цепи содержит мотив Cys80-Xaa-Xaa-Xaa, где указанный Xaa представляет собой любую аминокислоту, отличную от Phe, Lys или Cys.
37. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуноглобулин по любому из пп. 16-24.
38. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 37.