СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗВЕРАТРОЛА
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF RESVERATROL

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях при хроматографическом определении трансрезвератрола в биологически активных добавках, а также в вине и других биологических объектах.
Известен способ определения резвератрола в вине [1], включающий выделение резвератрола через стадии выпаривания под вакуумом, растворения сухого остатка в деионизированной воде, ферментативного гидролиза при действии β-D-глюконидазы при 37°С в течение 8 часов, четырехкратной экстракцией этилацетатом, смешанным с водой. Этилацетатные экстракты выпариваются досуха под вакуумом. Сухой остаток растворяется в смеси метанол-вода 6:4, раствор центрифугируется, осадок промывается метанолом и снова центрифугируется. Хроматографирование образца проводят методом высокоэффективной хроматографии. В качестве сорбента используется гиперсил 5 мкм и колонка 100×2,1. Элюентом является смесь метанола и 0,5% раствора муравьиной кислоты 30:70, скорость подачи элюента 250 мкл/мин. Детекция (определение) ионов проводится на масс-спектрометре с m/z=229.
Недостатком данного способа является ограниченный круг анализируемых объектов, детекция выхода анализируемых веществ осуществляется с помощью масс-спектрометра, являющегося дорогостоящим оборудованием.
Наиболее близким решением является способ определения резвератрола [2], при котором проводится анализ виноградных вин, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детекцией. Цис- и трансизомеры резвератрола экстрагировались из вин с помощью картриджей твердофазной экстракции. Экстракция проводилась в затемненном помещении для предотвращения изомеризации трансизомера в цисизомер. После этого проводился гидролиз гликозидов резвератрола при 50°С в течение 9 часов под действием β-глюкозидазы. После гидролиза транс- и цисизомеры резвератрола определяли методом ВЭЖХ. В качестве элюента использовались 2 фазы:
Фаза А: вода-уксусная кислота (рН3)
Фаза В: ацетонитрил-уксусная кислота (рН3)
Разделение изомеров велось градиентом фаз, то есть определенным соотношением фаз во времени.
0-0,01 мин: 5% В
0,01-10,00 мин: 25% В
10,01-20,00 мин: 40% В
20,01-35,00 мин: 100% В
Детекцию веществ осуществляли УФ-спектрофотометрически при длинах волн 285 нм и 307 нм, которые характерны для цис- и трансизомеров резвератрола. Количественное определение цис- и трансизомеров резвератрола проводили методом калибровочного графика, построенного по концентрациям стандартных образцов резвератрола.
Недостатком данного способа является большая продолжительность анализа и необходимость соблюдать градиент фаз растворителей.
Задачей изобретения является разработка способа эффективного определения резвератрола в объектах различного происхождения, обеспечивающего высокую чувствительность и селективность определения наряду с сокращением длительности анализа и подбором универсальных условий его проведения.
Поставленная задача решается тем, что способ включает хроматографирование методом ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрическую детекцию и количественное определение методом калибровочного графика, причем дополнительно проводят центрифугирование и в качестве элюента применяют смесь ацетронитрила 27,2%, уксусной кислоты 2,6% и дистиллированной воды 70,2%. Для дополнительной очистки исследуемого раствора применяют предколонку.
Способ осуществляется следующим образом. Отбирают пробу исследуемого продукта, содержащего резвератрол, центрифугируют и подвергают процедуре обращенно-фазазной ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы используют смесь растворителей: ацетонитрил 27,2%, уксусная кислота 2,6% и вода дистиллированная. Детекцию осуществляют УФ-спектрофотометрически при длине волны 307 нм. Количественное определения проводят методом калибровочного графика. При необходимости для дополнительной очистки исследуемого раствора применяют предколонку.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Анализ резвератролсодержащей биологической добавки «Эноат», представляющей собой густую жидкость.
Пробу анализируемого продукта (10 мл) центрифугируют в течение 6 минут при 7000-8000 об/мин, после чего отбирают 0,2 мл центрифугата и прибавляют 5 мл элюента. Хроматографируют методом обращенно-фазной ВЭЖХ. Детекцию осуществляют УФ-спектрофотометрически при длине волны 307 нм. Количественное определение проводят методом калибровочного графика, построенного по концентрациям стандартных образцов резвератрола.
Пример 2.
Анализ резвератролсодержащей биологической добавки "Super Resveratrol", представляющей собой порошок, заключенный в капсулы.
Порошок из трех капсул биологически активной добавки "Super Resveratrol" объединяют и берут навеску 2,95 мг. Навеску растворяют в 10 мл элюента и центрифугируют в течение 6 минут при 7000-8000 об/мин. Для дополнительной очистки исследуемого раствора применяют предколонку. Хроматографируют методом обращено-фазной ВЭЖХ. Детекцию осуществляют УФ-спектрофотометрически при длине волны 307 нм. Количественное определение проводят методом калибровочного графика, построенного по концентрациям стандартных образцов резвератрола.
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет проводить хроматографическое определение резвератрола в узких временных рамках и сокращает продолжительность анализа в целом. Кроме того, предлагаемый способ за счет универсальных условий позволяет определять резвератрол в различных объектах, в том числе в лекарственных формах.
Предлагаемый способ не требует использования редких реактивов.
Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, селективностью определения, точностью и воспроизводимостью, позволяет достигнуть высокой степени разделения, учитывая сложность состава анализируемых объектов.
Источники информации
1. (Y.Wang, F.Catana, Y.Yang, et al. An LC-Ms method for analyzing total resveratrol in grape juice, cranberry juice, and wine, J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 431-435).
2. (G.Dugo, M.Saitta, D.Giuffrida, et al. Determination of resveratrol and other phenolik compounds in experimental wines from grapes subjected to different pesticide treatments Ital. J. Food Sci. 3, vol.16, 2004, p.305-321).