Передача вируса кустистой карликовости малины при семенном и вегетативном размножении

УДК_577.21

ПЕРЕДАЧА ВИРУСА КУСТИСТОЙ КАРЛИКОВОСТИ МАЛИНЫ ПРИ СЕМЕННОМ И ВЕГЕТАТИВНОМ РАЗМНОЖЕНИИ*

Ю. Ф. Мытницкая, Е. В. Немцова, С. Н. Евдокименко, В. В. Заякин, И. Я. Нам

Одним из наиболее опасных патогенов малины является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ). Для его диагностики был разработан метод RT-PCR. В данной работе был осуществлен анализ ВККМ в полевых растениях малины, культивируемых in vitro, а также в гибридных сеянцах. Вирус был обнаружен в 90% исследуемых образцов.

Ключевые слова: ремонтантная малина - вирус кустистой карликовости малины - метод RT-PCR -диагностика ВККМ - культура in vitro.

Малина - ценная ягодная культура. В Брянской области проводится целенаправленная селекция ремонтантной малины, которая характеризуется большей продуктивностью по сравнению с неремонтантными сортами [1, с. 26]. Для ускорения селекции ремонтантных форм малины ранее была проведена оптимизация метода клонального микроразмножения [2, с. 209], [3, с. 51]. В настоящей работы были использованы полевые растения малины как ремонтантных, так и неремонтантных сортов малины, предоставленные селекционерами Казаковым И. В. и Евдокименко С. Н., а таже растения, культивируемые in vitro. Существенной проблемой при возделывании данной ягодной культуры оказывается восприимчивость к различным заболеваниям, в том числе вирусным. Одним из наиболее распространенных патогенов является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), снижающий урожайность и ухудшающий качество посадочного материала. ВККМ обнаружен при обследовании посадок 15-ти сортов и форм малины Кокинского ОП ВСТИСП [4, с. 98]. В естественных условиях ВККМ передается при семенном размножении и с пыльцой. Это делает контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных насаждениях особенно сложным. Вирус поражает все растение вместе с корневыми отпрысками, заболевшие кусты подлежат уничтожению. Для предотвращения распространения данного патогена в посадках малины необходимо своевременно проводить обследование растений на наличие ВККМ [5].

Для анализа вирусов в настоящее время применяются две группы методов: иммунологические (с помощью ИФА) и молекулярно-генетические методы на основе полимеразной цепной реакции. Для диагностики ВККМ и других вирусов разработаны и рекомендованы к применению наборы, содержащие поли- и моноклональные антитела, а также такие методы, как IC-RT-PCR [6, р. 842], RT-LAMP [7, р. 153], RFLPA [8, р. 151]. В России запатентована и используется разработанная нами методика диагностики ВККМ на основе RT-PCR [9].

Методика и материалы

Для проведения исследования в данной работе были использованы полевые растения малины красной сортов Бальзам, Гусар, Метеор, малины черной сорта Кумберленд и ежевики сорта Агавам. Были проанализированы пробирочные растения 9 сортов и генотипов малины красной (R. idaeus L.), культивируемой in vitro: Бабье лето-2, Геракл, Жар-птица, Пингвин, 37-15-4, 8-79-2, 8-202-1, Евразия и Абрикосовая.

Для предварительной оценки возможности вертикальной передачи вируса через семена и получения не зараженных сеянцев были проанализированны усредненные пробы из листьев гибридных сеянцев ремонтантной малины 35 различных семей. Отбирали листья с трех помеченных этикетками растений каждой семьи и объединяли.

Выделение тотальных нуклеиновых кислот из листьев растений проводилось с помощью фенол-хлороформенного метода с экстракцией гуанидинизотиоцианатным буфером [10, р. 156], [11, с. 76]. Анализ осуществлялся разработанным ранее методом диагностики ВККМ на основе RT-PCR, с использованием 2 пар праймеров, комплементарных генам белка оболочки (CP) и генам транспортного белка (MP) вируса (таблица 1).

Таблица 1.

_Последовательности использованных праймеров_

Название, тип

5'-3' последовательность

*

Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП №02.740.11.0285, АВЦП 2.11/224 и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно - технической сфере

RBDV-МР^а/ обратный сасagg ate саа ста ttgtggaggatttgc

RBDV-МP+55aдапрямой сасagg ate саа ста ttgtggaggatttgc

RBDV-CP-3&/ обратный tgtcgtcgacggсасcgcсс

RBDV-CP+3ßaw прямой сасagg ate сgа catgtctatgtctgcтааgg

Результаты и обсуждение

Проведена оптимизация методики диагностики ВККМ методом RT-PCR. Так, были подобраны оптимальные количества препаратов нуклеиновых кислот для внесения в реакционную смесь при проведении обратной транскрипции (0,8 мкг), а также количество праймеров при проведении ПЦР (12,5 имоль) (рис. 1). _ _ _

1 2 3 4 5 * Б 7 8 '

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов RT-PCR сорта Бабье лето-2

1 - маркер GeneRuler 3 kb DNA Ladder; треки 2-5 - 25 пмоль праймеров, треки 6-9 - 12,5 пмоль праймеров, 2,6 - 0,2 мкг РНК, 3,7 - 0,4 мкг РНК, 4,8 - 0,6 мкг РНК, 5,9 - 0,8 мкг РНК

На данной электрофореграмме наиболее четкие полосы длиной 383 bp расположены на треках 5 и 9. Данные треки отражают результаты ПЦР, для проведения которой было взято 0,8 мкг РНК и 12,5 пмоль праймеров.

Модифицированным методом осуществлен анализ растений 3 сортов малины красной, 1 сорта малины черной и 1 сорта ежевики, произрастающих в полевых условиях. Во всех исследованных образцах был обнаружен ВККМ (рис. 2)._

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов RT-PCR

1 - маркер GeneRulerO 3 kb DNA Ladder; 2 - красная малина сорт Метеор, 3 - красная малина сорт Гусар, 4 и 5 - черная малина сорт Кумберлен, 6 - ежевика сорт Агавам, 7- отриц. контроль

Это согласуется с данными о том, что ВККМ поражает различные виды рода Rubus, в том числе ежевику, черную малину [12, р. 82]. Полосы, соответствующие вирусным фрагментам, на различных треках отличаются разной интенсивностью флуоресценции. Так, при использовании проб РНК, выделенных из молодых листьев черной малины сорта Кумберленд (трек 5) накопление вирусных ампликонов длиной 383 bp происходило более эффективно, чем при использовании старых листьев (наблюдалась полоса, характеризующаяся наиболее яркой флуоресценцией). Наиболее эффективным для диагностики ВККМ является использование молодых тканей цветущих растений малины, не содержащих значительных количеств фенольных соединений, затрудняющих протекание полимеразной цепной реакции.

Метод RT-PCR обладает достаточной чувствительностью, что позволяет обнаруживать инфекцию в растениях, культивируемых in vitro. Был проведен анализ на наличие вируса в пробирочных растениях 9 сортов и генотипов малины красной. Во всех проанализированных образцах пробирочных растений был обнаружен ВККМ. На полученной элекрофореграмме была обнаружена характерная полоса, соответствующая вирусспецифичному фрагменту ДНК длиной 383

bp. Это согласуется с литературными данными, что размножение изолированных апексов инфицированных растений in vitro не освобождает посадочный материал от вируса [13, р. 70].

Так как ВККМ передается при семенной размножении, нами проведен анализ вируса в сеянцах малины различных семей.

4 ;> " 7 g 9 10

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов RT-PCR, полученных из проб нуклеиновых кислот из

сеянцев малины.

1 - маркер GeneRulerO 3 kb DNA Ladder; 2-10 - образцы семей №№13-21 гибридных сеянцев Результаты скрининга ВККМ в сеянцах ремонтантной малины представлены в таблице 2.

Таблица 2.

№ семьи Результат анализа № семьи Результат анализа № семьи Результат анализа

1 - 13 + 25 +

2 + 14 - 26 +

3 - 15 + 27 +

4 + 16 + 28 +

5 - 17 - 29 -

6 - 18 + 30 +

7 + 19 + 31 -

8 + 20 + 32 -

9 + 21 - 33 +

10 + 22 + 34 +

11 + 23 + 35 +

12 - 24 +

Из данных таблицы следует, что ВККМ обнаружен в выборках растений в 24 из 35 семей гибридных сеянцев. По литературным данным [14, р. 271], процент передачи вируса кустистой карликовости малины колеблется от 15% до 77% в зависимости от вида малины. Результаты скрининга ВККМ в некоторых семьях сеянцев ремонтантной малины представлены на рис. 3, из которого следует, что в 6 образцах из 9 обнаружен ВККМ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ВККМ эффективно передается при вегетативном размножении растений, в том числе в условиях in vitro после меристемной культуры и вертикально в семьях гибридных сеянцев. Поскольку вирус в естественных условиях передается с пыльцой на значительные расстояния даже между разными видами рода Rubus мероприятия по оздоровлению могут оказаться не эффективными, поэтому наиболее перспективным является создание устойчивых к ВККМ форм растений.

Raspberry bush dwarf virus (RBDV) is one of the most dangerous pathogens of the raspberry. Method RT-PCR was devised for its diagnostic. In this work an analysis RBDV was implemented in the field raspberry plants, cultivated in vitro, as well as in the hybrid seedlings. The virus was detected in 90% of the samples.

The key words: remontant raspberry - Raspberry Bushy Dwarf Virus - the method of RT-PCR - the diagnostic of RBDV - the culture in vitro.

Список литературы

1. Казаков И. В. Проблемы и перспективы создания сортов малины ремонтантного типа // Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части России. Мичуринск, 1995. С. 26-29.

2. Немцова Е.В., Заякин В.В., Артюхова А. В., Нам И. Я. Распространенность вируса кустистой карликовости малины при клональном микроразмножении различных форм ремонтантной малины // «Вестник Брянского государственного университета», 2007, №4. с. 209-213.

3. Нам И.Я., Заякин В.В., Вовк В.В., Казаков И.В. Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции межвидовых ремонтантных форм малины // Сельскохозяйственная биология. 1998. №3. С. 51-56.

4. Немцова Е.В., Заякин В.В. Обнаружение вируса кустистой карликовости методом RT-PCR в некоторых генотипах ремонтантной малины селекции опорного пункта ВСТИСП // Материалы четвертого съезда Общества биотехнологов России (6 - 7 декабря 2006 г). Москва, 2006. С.98.

5. Немцова Е. В., Мытницкая Ю. Ф. Анализ нуклеотидных последовательностей генов РНК-2 вируса кустистой карликовости малины //Материалы научно-практической конференции «Инновационный потенциал молодежи Брянской области: достижения и перспективы» / Брянск, 2011. С. 73-76.

6. Kokko H.I., Kivineva M., Karenlampi S.O. Single-step immunocapture RT-PCR in the detection of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Biotechniques. 1996б. Vol. 20, №5. P.842-846.

7. Wang Q., Cuellar W.J., Akita M., Rajamaki M.L., Valkonen J.P.T. Localization and LAMP-based detection of the pollen-transmitted raspberry bushy dwarf virus (RBDV) in meristematic tissues and regenerated plants of Rubus idaeus following cryopreservation. PubMed. 2005.

8. Barbara D.J., Morton A., Spence N.J., Miller A. Rapid differentiation of closely related isolates of two plant viruses by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis // Journal of Virological Methods. 1995. Vol. 55. P.121-131

9. Заякин В. В., Немцова Е. В., Нам И. Я. Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса кустистой карликовости малины. Номер 2385934. Начало действия патента 27.04.2009

10. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by Acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. P. 156-159.

11. Немцова Е. В., Заякин В. В. Особенности использования RT-PCR для идентификации RBDV в тканях ремонтантной малины // «Вестник Брянского государственного университета». -2006. - №4. с. 76-79.

12. Ellis M.A., Converse R.H., Williams R.N., Williamson B. Compendium of Raspberry and Blackberry diseases and insects // American Phytopathological Society. St. Paul, MN, 1991.

13. Lankes C. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus // Acta Horticulturae: VII International Symposium on Small Fruit Virus Diseases. 1995. Vol. 385. P. 70-75.

14. Murant A.F., Chambers J., Jones A.T. Spread of raspberry bushy dwarf virus by pollination, its association with crumbly fruit, and problems of control // Ann. appl. Biol. 1974. Vol. 77. P.271-281.

Об авторах

Мытницкая Ю.Ф. - аспирант Брянского государственного университета имени И. Г. Петровского, mytnickya_yulia@mail.ru ,

Немцова Е. В. - кандидат биологических наук, ст. преподаватель кафедры ботаники Брянского государственного университета имени И. Г. Петровского, elenanemz@mail.ru , Евдокименко С. Н. - доктор сельско-хозяйственных наук, профессор Брянской государственной сельскохозяйственной академии,

Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени И. Г. Петровского, iynam1@yandex.ru.

Нам И. Я. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени И. Г. Петровского, iynam1@yandex.ru