Влияние воды на проявления внутримолекулярных взаимодействий в молекуле NADH

УДК 53.047

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

Е. П. Конькова, Р. Ш. Затрудина

ВЛИЯНИЕ ВОДЫ НА ПРОЯВЛЕНИЯ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МОЛЕКУЛЕ NADH

Введение. Роль воды в клетках определяется её химическими и структурными свойствами. Эти свойства связаны с малыми размерами молекул, их полярностью и способностью соединяться друг с другом водородными связями. Из-за симметричного распределения зарядов молекула воды действует как диполь. Дипольный момент обусловливает способность воды активно вступать во взаимодействие с различными веществами.

При исследовании органических молекул, вовлечённых в жизненно важные процессы, одним из основных является вопрос о факторах, определяющих вид электронных спектров поглощения в полярных растворителях. О природе и величине молекулярного взаимодействия можно судить по положению перехода из основного в первое возбуждённое электронное состояние. Зависимость положения данного перехода от взаимодействия с водным окружением будет в значительной степени определять характер первичных фотопроцессов, поскольку все они протекают с участием упомянутых электронных состояний.

Витамин B5, чаще называемый витамином PP (от англ. pellagra preventing factor — антипелларгический фактор), химически представляет собой два вещества, обладающих одинаковой витаминной активностью: никотиновую кислоту и никотинамид. Никотиновая кислота и её амид стали известны ещё в прошлом веке в связи с исследованиями никотина. Однако связь тяжёлого заболевания — пеллагры с недостатком в диете витамина PP была установлена позднее. Биохимическую роль витамин B5 играет в форме кофермента никотинамидадениндинуклеотида.

Никотинамидадениндинуклеотид входит в многочисленную группу дегидрогеназ, принимающих участие почти в 150 различных биохимических реакциях дегидрирования, окисления, N-алкилирования, изомеризации, в восстановлении нитрата до нитрита и далее до аммиака, в фотосинтезе, дыхании, энергетическом обмене, анаэробном расщеплении углеводов. Постоянный интерес к спектрам аденина связан со спектральными исследованиями входящих в молекулы ДНК и РНК пуриновых и пиримидиновых оснований. Аденин и никотинамид характеризуются наличием двойных сопряжённых связей, следовательно п-электронов [2]. Никотинамидадениндинуклеотид может находиться в окисленной и восстановленной формах. Окисленная форма имеет спектр поглощения с максимумом на 340 нм и способность флуоресцировать. Спектр флуоресценции восстановленной формы в водном растворе имеет максимум на 470 нм.

Материалы и методы. Принято разделять два типа межмолекулярных взаимодействий: универсальные (влияние всех молекул растворителя на молекулы растворённого вещества) и специфические (с соседними молекулами растворителя). Основной вклад в энергию универсальных взаимодействий вносит электростатическое взаимодействие дипольных моментов растворённого соединения и молекул растворителя, а в энергию специфических — образование межмолекулярных водородных связей.

Повышению эффективности спектроскопических исследований во многом способствует реализация расчётов физических величин на персональном компьютере

© Е.П.Конькова, Р. Ш. Затрудина, 2011

в режиме реального времени. Сегодня различные квантово-химические методы являются широкодоступными благодаря реализации в многочисленных программных комплексах. В качестве самостоятельного физико-химического метода исследования они играют определяющую роль при разработке моделей влияния среды на молекулу. Основная сложность заключается в том, что влияние растворителя для органических молекул основано на вычислении электронной волновой функции для очень большой системы [4]. Поэтому, выбирая метод расчёта электронной волновой функции для такой системы, приходится идти на компромисс между точностью расчёта и затратами машинного времени.

В нашей работе неэмпирический метод использован для расчёта линий поглощения электронного спектра изолированной молекулы NADH и тестирования по этим данным результатов полуэмпирического расчёта энергии перехода из основного в первое возбуждённое электронное состояние. После того как было установлено их приемлемое согласие, полуэмпирический метод применялся для расчёта энергии перехода из основного в первое возбуждённое электронное состояние молекулярных систем в водном окружении. Наиболее ценной является информация именно о происхождении спектральных линий, таким образом, совместное применение неэмпирического и полуэмпирического методов предполагается достаточно разумным.

В расчётах применялись стандартные методы, процедуры и критерии, реализованные в пакете программ HyperChem (версия 7.5). Геометрия исследованных молекулярных систем визуализировалась в том же квантово-химическом пакете. Для расчёта электронного спектра изолированной молекулы NADH был применён неэмпирический метод в приближении самосогласованного поля (ССП/3-21ГФ).

Для расчёта переходов из основного в первое возбуждённое электронное состояние молекул в присутствии растворителя использована полуэмпирическая версия метода самосогласованного поля в приближении частичного пренебрежения дифференциальным перекрыванием (INDO), множество модификаций которого тем не менее приводят к достаточно схожим результатам [5]. Для учёта электронной корреляции был использован метод конфигурационного взаимодействия. Принудительное ускорение сходимости не активировалось. Предварительная минимизация энергии исследуемых систем за счёт изменения пространственного расположения атомов относительно друг друга позволила найти ближайшие локальные минимумы на поверхностях их потенциальных энергий. Геометрии оптимизированных систем использовались в качестве стартовых.

Для исследования кофермента NADH в водном окружении были смоделированы непрерывные с постоянной плотностью макроскопические условия. Молекула NADH в стартовой геометрии помещалась в периодическую ячейку, начальные линейные размеры которой полагали равными удвоенным линейным размерам кофермента. Поэтому максимальная концентрация раствора, при которой исключалось влияние краевых эффектов, составляла 75 % (12 молекул воды на 1 молекулу никотинамидаденинди-нуклеотида). Далее путём увеличения размеров периодической ячейки уменьшалась концентрация раствора. На каждом шаге проводилась минимизация энергии кофер-мента в присутствии растворителя методом молекулярной динамики (алгоритм Polak-Ribiere). Изолированная молекула кофермента имела оптимальную стартовую геометрию, поэтому происходящие в ней в процессе минимизации изменения обусловлены непосредственно действием водного окружения. Взаимодействие молекул воды осуществлялось на основе трёхточечного модельного потенциала ^P3P. Расчёт при концентрации 21 % не был реализован в связи с недостатком вычислительных ресурсов. Максимальное число молекул воды равнялось 138.

Г 1

I .

I

I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г

180,8 188,7 201,6 204,2 214,4 225,2 227,9 256,8 289 291,5 324,3 336 365,4 371,4 425

Длина волны, нм

Рис. 1. Рассчитанный ab initio электронный спектр поглощения NADН

0

Результаты и обсуждение. При малых расстояниях между взаимодействующими молекулами (порядка 8-10 А) большую вероятность приобретает процесс ассоциации, образование агрегатов различной сложности. Образование ассоциатов может происходить за счёт универсальных и специфических взаимодействий. Образование разнородных ассоциатов приводит к отличию электронных спектров смеси от суммы спектров её компонент. Характер деформации определяется, как и в случае однородных ассоциатов, взаимным расположением объединившихся молекул. Возникновение ассоциатов существенно изменяет основные оптические свойства раствора, в частности электронные спектры поглощения. В нашем случае взаимодействие аденина и никотинамида в молекуле NADH рассматривается в рамках теории ассоциации с поправкой на химическую природу сил, объединяющих эти молекулы в разнородный ассоциат. Эффективность ассоциации зависит от природы используемого растворителя и структуры взаимодействующих молекул. Поскольку вода является полярным растворителем и оба взаимодействующих соединения имеют активную NH-группу, может происходить усиление процесса ассоциации в результате образования водородных связей непосредственно между аденином и никотинамидом и при помощи молекул воды, выполняющих роль промежуточных мостиков.

На рис. 1 представлен рассчитанный в приближении ССП/3-21ГФ электронный спектр поглощения одиночной молекулы восстановленной формы никотинамидаденин-динуклеотида. Предполагается, что к появлению поглощения на 290 и 420 нм изолированной молекулы NADH приводит взаимодействие аденина и никотинамида.

На рис. 2 приведены концентрационные зависимости длин волн первых синглетных переходов аденина, никотинамида и их ассоциата. Выделение в структуре макромолекулы фрагментов, сохраняющих в известной степени свойства исходной макромолекулы, является часто используемым приёмом [5, 6].

Сравнение полученных зависимостей показало, что молекулярные взаимодействия, проявляющиеся в водном растворе никотинамидадениндинуклеотида, имеют ряд отличительных спектроскопических признаков. Видно, что первые синглетные переходы никотинамида и аденина в ассоциате при наличии водного окружения приходятся на длину волны 430 и 290 нм соответственно.

Е 450

Я

3 400

I

а я 350

св

I X 300

250

ссрЯ^сь суп аЪ

—I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76

Концентрация, %

450

3 400

I

св

к 300 Н

ц

ЧД

250

• I |1 Ы I *

1,1

< ^ ^

—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I

20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76

Концентрация, %

Рис. 2. Концентрационные зависимости длины волны первых синглетных переходов никотинамида 430 нм), аденина 290 нм) и их ассоциата в молекуле NADH

Данные, представленные на рис. 3 и 4 (концентрация 50 и 51 % соответственно), относятся к поглощению на разных центрах молекулы NADH. Слева направо показаны: геометрии ассоциата, парциальные заряды на молекуле никотинамида.

При концентрации 50 % (36 молекул воды на одну молекулу NADH) поглощение наблюдалось на длине волны 286 нм, что отвечало переходу на коротковолновом поглощающем центре аденине. При концентрации 51 % (водное окружение NADH составляли 35 молекул воды) поглощение наблюдалось на длине волны 429 нм, отвечающей переходу на молекуле никотинамида, длинноволновом поглощающем центре. Для удобства зрительного восприятия из периодических ячеек удалены молекулы воды, не участвовавшие в образовании водородных связей с поглощающими центрами.

Кроме того, на рис. 3, 4 видно, что в обоих случаях водородные связи с адени-ном посредством активной NH2 группы образовали три молекулы воды, водородные связи с никотинамидом отсутствуют. Из сравнения парциальных зарядов на атомах соответствующих поглощающих центров при данных концентрациях раствора обнаружено, что повышение концентрации (уменьшение количества молекул воды в периодической ячейке на одну) приводит в заметному изменению в распределении зарядов поглощающих центров, в результате которого заменяются условия запрещения (разрешения) поглощения на аденине (никотинамиде). Так, заряд на одном из атомов углерода длинноволнового поглощающего центра — никотинамиде (на рис. 3, 4 выделено полужирным) уменьшается в три раза. Таким образом, вероятность передачи энергии определяется всеми молекулами воды. Часть молекулы NADH, связывающая аденин и никотинамид, выполняет роль каркаса, удерживающего взаимодействующие поглощающие центры на естественном для реальной молекуле кофермента расстоянии. Из-за своей роли связующего звена данная часть исключалась из расчётов.

На рис. 3, 4 также показано, что при данных концентрациях аденин и никотина-мид не связаны между собой ни прямой водородной связью, ни с помощью промежуточных мостиков из молекул воды. Таким образом, перенос энергии возбуждения с коротковолнового поглощающего центра аденина на длинноволновой поглощающий

0,132

0,134

0,074

0,150 -0,397

0,087

0,108

0,025

0,077

,253 0,123

0,126

Рис. 3. Геометрия ассоциата, парциальные заряды на молекулах аденина и никотинамида

при концентрации раствора 50 %

0,086

V-0,030

0,116

Рис. 4. Геометрия ассоциата, парциальные заряды на молекулах аденина и никотинамида

при концентрации раствора 51 %

центр никотинамид по описанным выше каналам исключался. С учётом сказанного изменение в распределении зарядов никотинамида можно связать с безызлучательным переносом энергии возбуждения по индуктивно-резонансному механизму.

Безызлучательный процесс энергии электронного возбуждения представляет собой процесс, при котором возбуждённые молекулы донора энергии вступают во взаимодействие с невозбуждёнными молекулами акцептора энергии. В результате такого взаимодействия появляется дополнительная вероятность для перехода возбуждённой молекулы донора в состояние с меньшей энергией с одновременным переходом молекулы акцептора в состояние с большей энергией. Перенос энергии является «индуктивным», потому что он обусловлен взаимодействием мгновенных диполей, наведённых за счёт колебаний электронной плотности в молекулах аденина и никотинамида. В случае малых молекулярных расстояний (рёбра периодической ячейки ~ 10 А) для молекул с мощными п-электронными облаками дисперсионные силы могут достигать очень больших значений (энергия взаимодействия более десятка килокалорий на моль).

Процесс переноса энергии электронного возбуждения в разнородном ассоциате от коротковолнового поглощающего центра аденина к длинноволновому поглощающему

центру никотинамиду можно представить в следующем виде. Первоначально возбуждённая молекула аденина возвращается в основное состояние, передавая свою энергию путём дисперсионных взаимодействий невозбуждённой молекуле никотинамида, которая при этом переходит в возбуждённое состояние. Перенос энергии электронного возбуждения происходит между не однотипными, а между разнородными молекулами, что соответствует раствору нескольких органических веществ. Таким образом, перенос энергии возбуждения между аденином и никотинамидом напоминает процессы миграции энергии в многокомпонентных системах.

При различных концентрациях раствора донором (акцептором) энергии может выступать как аденин, так и никотинамид. Наблюдавшаяся в ходе компьютерного эксперимента высокая чувствительность к растворителю (обмен ролями донора и акцептора энергии) свидетельствовала о значительном взаимодействии аденина и никотинамида в молекуле NADH. Независимо от природы молекулярных взаимодействий смена ролей может быть объяснена изменением условий запрещения (разрешения) поглощения на аденине (никотинамиде). Смоделирована ситуация, когда поглощение разрешено только на одном из поглощающих центров с одновременным запрещением поглощения на другом. Изменение условий запрещения (разрешения) поглощения происходит под влиянием водного окружения ассоциата, что приводит к изменению энергии соответствующих электронных состояний. Известно, что вероятность направленного переноса энергии от коротковолновых к длинноволновым поглощающим центрам у ароматических углеродов и гетероциклических соединений связана с вероятностями соответствующих электронных переходов и уменьшается при низкочастотном возбуждении. Так, вероятность длинноволнового электронного в изолированной молекуле NADH в области 430 нм выше вероятности коротковолнового электронного перехода в области 290 нм (см. рис. 1), а поглощение на длинноволновом центре происходило чаще (см. рис. 2). При высокочастотном возбуждении возбуждаются коротковолновые и длинноволновые центры, причём энергия эффективно мигрирует к последним.

Выводы. Показано, что взаимодействие аденина и никотинамида в молекуле NADH можно описать в рамках теории ассоциата с поправкой на химическую природу сил, объединяющих эти молекулы в разнородные ассоциаты. Обнаружено, что молекулярные взаимодействия, проявляющиеся в водном растворе NADH, имеют ряд представляющих интерес отличительных спектроскопических признаков, а именно: наблюдается направленный перенос энергии электронного возбуждения от коротковолнового поглощающего центра аденина (290 нм) к длинноволновому поглощающему центру никоти-намиду (430 нм) посредством дисперсионных взаимодействий. Смоделирована ситуация, когда поглощение разрешено только на одном из поглощающих центров с одновременным запрещением поглощения на другом. Изменение условий запрещения (разрешения) поглощения на аденине (никотинамиде) происходит под влиянием водного окружения ассоциата, что приводит к изменению энергии соответствующих электронных состояний.

Литература

1. Затрудина Р. Ш., Конькова Е. П. Изменение дипольного момента молекулы никотинамида в воде по данным полуэмпирических расчётов // Сб. докл. 20-й междунар. конф. «Лазеры. Измерения. Информация». СПб., 2010. Т. 2. С. 132-141.

2. Конев С. В., ВолотовскийИ. Д. Фотобиология. Минск, 1979.

3. Бурштейн К. Я., ШорыгинП.П. Квантовохимические расчёты в органической химии и молекулярной спектроскопии. М., 1989.

4. Кузьмицкий В. А., Волкович Д. И. Расчёты электронного спектра порфина и его производных модифицированным методом INDO/S // Журн. прикл. спектр. 2008. Т. 75. № 1. С. 28-34.

5. Немухин А. В., Колесников И. М., Винокуров В. А. Строение комплекса алюмофенилси-локсана и его фрагментов по данным полуэмпирических и неэмпирических расчётов // Журн. структ. химии. 1995. Т. 36. № 3. С. 410-417.

6. Никитин О. Ю., Новосадов Б. К. Теория пофрагментного расчёта электронной структуры основного состояния многоатомных молекул. Метод промежуточного фрагмента // Журн. структ. химии. 1985. Т. 36. № 3. С. 387-394.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.