СПОСОБ ПОВЕРХНОСТНОГО ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМА НА ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF SURFACE GROWING OF MICROORGANISM ON LIQUID CULTURE MEDIUM AND DEVICE FOR ITS REALISATION

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам выращивания штаммов-продуцентов микробиопрепаратов поверхностным методом на жидких питательных средах, и может быть использовано при производстве различных продуктов микробиологического синтеза, в том числе препаратов для защиты растений.
Основным промышленным способом получения микробиопрепаратов является жидкофазное глубинное культивирование, которое позволяет полностью контролировать процесс ферментации со сравнительно краткой продолжительностью (несколько суток).
Однако этот способ благоприятен для бактериальных штаммов-продуцентов и мало пригоден - для грибных. Конидии грибов, полученных в глубинной культуре, по своим морфологическим и физиологическим свойствам значительно отличаются от воздушных, полученных при поверхностном культивировании, кроме того, к спороношению при глубинном культивировании способны не все микромицеты.
Для грибов-продуцентов более естественной является твердофазная ферментация, с использованием разнообразных субстратов (органических или неорганических, с добавлением питательных веществ), с последующим высушиванием и размолом органического субстрата, или смывом спор с мицелием с неорганического и органического субстратов, с последующим смешиванием с наполнителем и высушиванием. Полученные этим способом споры грибов более выносливы к высушиванию и дольше сохраняют жизнеспособность.
Однако биоматериал, полученный в результате твердофазной ферментации на органическом субстрате с последующим его высушиванием и размолом (порошок), мало пригоден для обработки вегетирующих растений из-за забивания отверстий распылителей. А биоматериал, полученный в результате жидкофазной или твердофазной ферментации грибов, с последующим отделением его от культуральной жидкости (культуральная жидкость или паста) и твердого субстрата (жидкая культура), как правило, хранится недолго. Даже при пониженной температуре споры грибов при достаточной влажности способны к прорастанию, что ведет к их гибели при отсутствии питания. Поэтому многие биопестициды, полученные на малотоннажных производствах, применяются не позже нескольких недель после окончания ферментации.
Для сохранения жизнеспособности штаммов-продуцентов, как бактериальных, так и грибных, применяют концентрирование (концентраты суспензий, эмульсий, пасты), сушку (конвекционная, распылительная, лиофилизация), инкапсулирование (гели, гранулы, капсулы, микрокапсулы) и хранение биоматериала в определенных условиях.
Однако большинство имеющихся методов стабилизации мало подходят для грибных штаммов-продуцентов. Так, концентраты и пасты не хранятся более 3-х месяцев, даже в холодильнике. Кроме того, порошки биопрепаратов (если они выдерживают температуру сушки) получаются дорогими, со стоимостью почти на уровне химических препаратов.
7
11
Известна технология поверхностного периодического культивирования штамма гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемого для защиты сеянцев хвойных от фузариозов (1). Посев гриба производят споровой культурой конидий из расчета 1×10 на 1 мл питательной среды. В качестве посевного материала используют споровую культуру штамма, выращенную на косяках с сусло-агаром, с необходимой концентрацией. Засев производят на оптимизированную питательную среду Захарченко в колбы Эрленмейера, объемом 250 мл, со 100 мл среды. Культивируют штамм в течение 15 суток при 28°С. После окончания культивирования мицелиальную пленку отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе. Полученный биопрепарат представляет собой сухой порошок с титром 2×10 спор/г.
Однако предложенная технология не применима в условиях промышленного производства из-за необходимости применения ручного труда на всех стадиях получения биопрепарата и невозможности получения достаточного количества препарата в малых объемах колб.
Известен препарат на основе штамма Trichoderma harzianum, который используют для защиты виноградников и плодовых деревьев от некоторых болезней, вызываемых грибными патогенами (2). Препарат представляет собой споровую массу гриба и продуцируемые грибом пептиды. Получают препарат, культивируя гриб в жидкой среде, разлив ее тонким слоем на подносы, до полного созревания спор. Затем всю биомассу высушивают, тонко размалывают и просеивают.
Однако такой способ производства препарата трудоемок из-за необходимости применения ручного труда на всех стадиях получения биопрепарата.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод массового выращивания грибного гиперпаразита из рода Ampelomices для борьбы с мучнистыми росами сельскохозяйственных культур (3), при котором чистую культуру гриба выращивают на косом картофельно-глюкозном агаре, а маточную культуру выращивают на жидкой картофельно-глюкозной среде в течение 8-10 дней при температуре 24-25°С в состоянии покоя. Массовое выращивание гриба осуществляют в предварительно продезинфицированных 0,5% хлорамином или 3% раствором перекиси водорода эмалированных кюветах (30×35 см) на простерилизованной, подкисленной до рН 6,3 жидкой картофельно-глюкозной среде, слоем 2 см. После засева гриба из маточной культуры кюветы закрывают продезинфицированной полиэтиленовой пленкой, которую снимают через 4-5 суток. На 10-е сутки с поверхности питательной среды снимают грибную пленку и помещают на рамку с полиэтиленовой пленкой на двое суток для дозревания недозревших пикнид и спор. После этого грибную пленку сушат в термостате до воздушно-сухого состояния при температуре 28-30°С. Для поглощения влаги в термостате устанавливают чашки Петри с обезвоженным хлористым кальцием. Сухую грибную пленку размалывают на электрической кофемолке.
Недостатками известного способа являются: необходимость применения ручного труда на всех стадиях получения биопрепарата; невозможность обеспечения оптимальных параметров культивирования штаммов-продуцентов: стерильности, температуры, газовоздушного обмена, влажности и освещенности в условиях промышленного производства.
Целью изобретения является разработка промышленного способа поверхностного выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий, актиномицетов, дрожжей) на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда.
Технический результат достигается тем, что в известном способе массового выращивания микроорганизма, включающем выращивание чистой культуры микроорганизма на косом агаре, выращивание маточной культуры микроорганизма на жидкой питательной среде, выращивание биомассы микроорганизма путем соединения маточной культуры с жидкой питательной средой и поверхностного ее выращивания в тонком слое в кювете, отделение образовавшейся пленки биомассы микроорганизма от остатков питательной среды и ее доращивание в течение двух суток, сушку пленки биомассы до воздушно-сухого состояния, выгрузку сухой пленки биомассы, согласно изобретению выращивание маточной культуры микроорганизма на жидкой питательной среде осуществляют глубинным методом, соединение маточной культуры микроорганизма с жидкой питательной средой осуществляют в смесителе-дозаторе, где смесь аэрируют воздухом или газовоздушной смесью в потоке, а затем подают ее в кювету, поверхностное выращивание биомассы микроорганизма в тонком слое в кювете осуществляют со свободно опущенной на дно кюветы транспортной сеткой, изготовленной из нейтрального материала, отделение полученной пленки биомассы микроорганизма от остатков питательной среды осуществляют с помощью транспортной сетки путем ее натяжения и поднятия над поверхностью жидкости в кювете с последующим ее сливом, доращивание пленки биомассы осуществляют на транспортной сетке с последующим нанесением на пленку биомассы поверхностно-активных веществ ПАВ путем тонкодисперсного распыления раствора ПАВ над поверхностью биомассы, сушку пленки биомассы осуществляют в кювете с закрытой крышкой, путем подачи сушильного агента под транспортную сетку, а выгрузку сухой пленки биомассы из кюветы осуществляют с помощью той же транспортной сетки, причем выращивание маточной культуры микроорганизма осуществляют в течение 2-4 суток при 25-30°С, выращивание биомассы ведут до максимального использования сухих веществ жидкой питательной среды, определяемого по ее плотности и кислотности, с обеспечением оптимальных для каждого микроорганизма воздухообмена и освещенности, а при сушке пленки биомассы температуру сушильного агента устанавливают в зависимости от стойкости используемого микроорганизма.
Кроме того, технический результат достигается тем, что устройство для поверхностного выращивания микроорганизма на жидкой  питательной среде способом по п.1 включает кювету с поддоном, снабженную свободно опущенной на ее дно транспортной сеткой, выполненной из нейтрального материала и закрепленной своими концами на приводных барабанах с приводом, обеспечивающих поднятие транспортной сетки со дна кюветы путем ее натяжения и ее продольное перемещение, приемное устройство с клапаном для присоединения к смесителю-дозатору и подачи смеси жидкой  питательной среды с маточной культурой в кювету, поворотными заслонками для регулирования обмена воздуха в кювете, установленными по торцам кюветы, сливное устройство для слива культуральной жидкости из кюветы, патрубок для подачи сушильного агента под сетку, пробоотборник и сменные светофильтры в фонарях для регулирования освещенности, расположенные на боковых стенках кюветы, и крышку, герметично закрывающую кювету, выполненную с возможностью ее открывания и/или снятия, снабженную форсунками для распыления раствора ПАВ над поверхностью выращиваемой в кювете биомассы и моющими головками для осуществления санитарной обработки устройства.
Сопоставительный анализ заявляемых технических решений с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного условиями осуществления действий, а именно: в прототипе маточную культуру микроорганизма выращивают поверхностным методом в покое, а в заявляемом способе - глубинным; соединение маточной культуры микроорганизма с жидкой питательной средой для выращивания его  биомассы осуществляют в известном способе путем засева гриба из маточной культуры на жидкую питательную среду в кювете методом штрихов, а в заявляемом способе - соединение маточной культуры с жидкой питательной средой осуществляют в смесителе-дозаторе, где смесь аэрируют воздухом или газовоздушной смесью в потоке, а затем подают ее в кювету, на дно которой помещена транспортная сетка, изготовленная из материала, нейтрального к питательной среде с микроорганизмами; отделение полученной пленки биомассы микроорганизма от остатков питательной среды в прототипе осуществляют так: снимают грибную пленку и помещают на рамку с полиэтиленовой пленкой, а в заявляемом способе грибную пленку отделяют с помощью транспортной сетки путем натяжения последней барабанами и поднятия ее над поверхностью культуральной жидкости в кювете с последующим сливом этой жидкости; доращивание пленки биомассы в прототипе осуществляют на рамке с п/э пленкой, а в заявляемом способе - на транспортной сетке с последующим нанесением на пленку биомассы ПАВ путем тонкодисперсного распыления раствора ПАВ на поверхность биомассы; сушку пленки биомассы в прототипе осуществляют в термостате, для поглощения влаги в котором устанавливают чашки Петри с обезвоженным хлористым кальцием, а в заявляемом способе сушку пленки биомассы осуществляют в той же кювете, где выращивалась и доращивалась биомасса, с закрытой крышкой путем подачи сушильного агента под транспортную сетку, с помощью которой и выгружают пленку биомассы из кюветы.
А заявляемое устройство для выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде отличается от известного дополнительными конструктивными элементами, которыми снабжена кювета: транспортной сеткой, которая закреплена своими концами на приводных барабанах; поворотными заслонками, установленными по торцам кюветы; приемным устройством с клапаном для подсоединения к смесителю-дозатору; устройством для слива культуральной жидкости; устройством для подачи сушильного агента; пробоотборником, сменными светофильтрами в фонарях, расположенных на боковых стенках кюветы, и крышкой, снабженной форсунками для распыления ПАВ над поверхностью выращиваемой в кювете биомассы и моющими головками.
Таким образом, заявляемые технические решения соответствуют критерию патентоспособности новизна.
Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не выявили технических решений, имеющих отличительные признаки заявляемого способа, связанные с транспортной сеткой и ее функциями, обеспечивающей в совокупности с другими признаками достижение поставленной цели. Мы также не выявили технических решений, имеющих отличительные признаки заявляемого устройства.
К заявляемой совокупности признаков мы пришли после многолетних исследований и опытов, проводимых с целью разработки промышленного способа поверхностного выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий, актиномицетов, дрожжей) на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда. Следовательно, вся совокупность отличительных от прототипа признаков является новой и заявляемые технические решения соответствуют критерию патентоспособности изобретательский уровень.
Заявляемые технические решения соответствуют и критерию патентоспособности промышленная применимость, т.к. они могут быть использованы в микробиологической промышленности, в частности при производстве биопрепаратов для защиты растений.
Способ осуществляется следующим образом.
Выращивают чистую культуру выбранного микроорганизма на косом агаре (например, картофельно-глюкозном). Далее выращивают маточную культуру микроорганизма на жидкой питательной среде (например, на среде Рудакова) глубинным методом (на качалке). Для выращивания биомассы микроорганизма полученную маточную культуру соединяют с жидкой питательной средой в смесителе-дозаторе, где смесь аэрируют воздухом или газовоздушной смесью в потоке, а затем подают ее в кювету и осуществляют поверхностное выращивание биомассы в тонком слое в кювете со свободно опущенной на дно кюветы транспортной сеткой, изготовленной из материала, нейтрального к питательной среде с микроорганизмами. Полученную пленку биомассы микроорганизма отделяют от остатков питательной среды с помощью транспортной сетки путем ее натяжения и поднятия над поверхностью жидкости в кювете с последующим сливом этой жидкости. Доращивание пленки биомассы осуществляют на транспортной сетке с последующим нанесением на пленку биомассы поверхностно-активных веществ (ПАВ) путем тонко-дисперсного распыления их раствора над поверхностью биомассы. Сушку пленки биомассы осуществляют в кювете с закрытой крышкой путем подачи сушильного агента под транспортную сетку. Выгрузку сухой пленки биомассы осуществляют с помощью той же транспортной сетки.
Устройство для выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде схематически представлено на чертеже и включает емкость для выращивания микроорганизма в виде кюветы с поддоном 1, транспортную сетку 1, свободно опущенную на дно кюветы и изготовленную из нейтрального к питательной среде с микрооранизмами материала, сетка закреплена своими концами на приводных барабанах 3 с приводом 4, обеспечивающих ее поднятие со дна кюветы путем ее натяжения, а также ее продольное перемещение, приемное устройство 5 с клапаном 6 для подсоединения его к смесителю-дозатору (на чертеже не показан), поворотные заслонки 7, установленные по торцам кюветы, устройство 8 для слива культуральной жидкости из кюветы, устройство 9 для подачи сушильного агента, установленные на боковой стенке 10 кюветы пробоотборник 11 и сменные светофильтры 12 в фонарях 13, а также крышку 14, снабженную моющими головками 15 и форсунками 16.
Устройство для выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде работает следующим образом.
В поддон 1 кюветы с опущенной в него сеткой 2 через приемное устройство 5 подается жидкая питательная среда, смешанная с маточной культурой микроорганизма  и насыщенная стерильным воздухом в смесителе-дозаторе до заполнения поддона 1 (кюветы) до уровня, определяемого в зависимости от выращиваемого штамма продуцента.
В период выращивания биомассы микроорганизма интенсивность естественного обмена воздуха в кювете регулируется поворотными заслонками 7, а освещенность - путем установки соответствующих светофильтров 12 в фонарях 13, установленных на боковых стенках 10 кюветы. Контроль за ростом микроорганизма и состоянием питательной среды ведется через пробоотборники 11.
По окончании процесса выращивания биомассы микроорганизма сетка 2 натягивается приводными барабанами 3. Усилие натяга сетки 2 регулируется мотор-редукторами привода 4 барабанов. При подъеме сетки выращенная биомасса отделяется от культуральной жидкости, которая удаляется из поддона 1 (кюветы) через сливное устройство 8. Биомасса микроорганизма доращивается в течение двух суток на транспортной сетке 2, а затем, через форсунки 16, установленные на крышке 14 кюветы, на поверхность биомассы наносится поверхностно-активное вещество (ПАВ).
Подача сушильного агента с заданной температурой осуществляется под сетку 2 через патрубок 9.
Выгрузка сухой биомассы из устройства осуществляется путем перемещения сетки 2 с одного приводного барабана 3 на другой.
Для осуществления санитарной обработки устройства на моющие головки 15, установленные на крышке 14, подаются соответствующие растворы, удаляемые через сливные устройства 8. После чего установка сушится и стерилизуется горячим воздухом через устройство 9 для подачи сушильного агента.
Предлагаемое устройство апробировано на макете технологической линии в полупромышленных условиях, описанных в примерах 1 и 2.
Пример 1.
Способ поверхностного выращивания на жидкой питательной среде штамма-продуцента гриба Penicillium vermiculatum для получения микробиопрепарата.
2
4
4
4
4
4
Чистую культуру гриба выращивали в пробирках на косом картофельно-глюкозном агаре (в течение 7 суток). Маточную культуру штамма-продуцента выращивали на жидкой питательной среде Рудакова (Сахароза - 50 г, Кукурузный экстракт - 10 г, KHPO - 2 г, MgSO - 2 г, FeSO - 0.1 г, CuSO - 0.1 г, MnSO - 1 г, вода дистиллированная до 1 л, Ph естественная) в трехлитровых баллонах, с объемом питательной среды 1 литр, на термостатированной качалке, с оборотом двигателя 200 об/мин в течение 3-х суток, при температуре 27°С. Выросшую маточную культуру смешивали с жидкой питательной средой Рудакова в смесителе-дозаторе, при этом смесь аэрировали воздухом в потоке и через подающие устройства передавали в культиватор, представленный поддоном в виде кюветы с опущенной в нее транспортной сеткой. Гриб выращивали в течение 7 суток в тонком слое питательной среды (2,0 см) до максимального использования сухих веществ в остатках питательной среды (1,5%) и Ph 4,8, с открытием поворотных заслонок на угол 5°, с использованием дымчатого светофильтра в фонарях. Затем осуществляли отделение биомассы штамма-продуцента от остатков питательной среды путем подъема транспортной сетки над поверхностью жидкости, с последующим ее сливом. Доращивание биомассы штамма-продуцента осуществляли в течение 2-х суток на транспортной сетке с последующим нанесением на поверхность биомассы поверхностно-активных веществ (лактозы) путем тонко-дисперсного распыления раствора ПАВ над поверхностью биомассы через форсунки в крышке кюветы. Сушку биомассы штамма-продуцента осуществляли путем подачи сушильного агента под транспортную сетку через патрубок, температура сушильного агента составляла 35°С. Затем биомассу выгружали транспортной сеткой.
12
2
9
Полученный по этому примеру микробиопрепарат имел титр 10 КОЕ/г. Выход сухого порошка составлял 270 г с 1 м или 38 г с 1 литра питательной среды через 20 суток цикла против 30 г с 1 литра питательной среды через 31 сутки с титром 10 КОЕ/г - в прототипе.
По примеру 1 выращивали штаммы-продуценты из рода Trichoderma (Tr. harzianum), Gliocladium (G. catenulatum), Penicillium (P. verrucosum), Chaetomium (Ch. olivaceum) для получения микробиопрепаратов.
Пример 2. Способ поверхностного выращивания штамма-продуцента бактерии Bacillus licheniformis для получения микробиопрепарата
4
2
4
2
4
4
2
3
13
2
Чистую культуру бактерии выращивали в пробирках на косом картофельно-глюкозном агаре. Маточную культуру штамма-продуцента выращивали на жидкой питательной среде Тайлона 3 (Сахароза - 10 г, Сухой кукурузный экстракт - 5 г, (NH)HPO - 2 г, KHPO - 2 г, MgSO×7HO - 0.25 г, СаСО - 1 г, вода дистиллированная - 1 л, Ph - 6,35) в трехлитровых баллонах, с объемом питательной среды 1 литр, на термостатированной качалке, с оборотом двигателя 200 об/мин в течение 2-х суток, при температуре 28°С. Выросшую маточную культуру смешивали с жидкой питательной средой Тайлона 3 в смесителе-дозаторе и через подающие устройства подавали в кювету-культиватор. При этом смесь аэрировали воздухом. Бактерию выращивали в течение 5 суток в тонком слое питательной среды (2,0 см) до максимального использования сухих веществ питательной среды (2,0 %), с открытием поворотных заслонок на угол 2,5°, с использованием светло-зеленого светофильтра в фонарях. Следующие этапы соответствовали примеру 1. Полученный по этому примеру микробиопрепарат имел титр 10 КОЕ/г. Выход сухого порошка составлял 200 г с 1 м пленки биомассы.
Итак, при реализации заявляемых изобретений, устраняется недостаток прототипа. Отличительные от прототипа признаки заявляемых изобретений необходимы и достаточны для того, чтобы обеспечить возможность промышленного способа поверхностного выращивания микроорганизмов на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда, т.е. для достижения поставленной цели и решения поставленной задачи.
Источники информации
1. Патент РФ №2171580 по заявке №99126556/13 от 17.12.1999 г. Опубл. 10.08.2001 г. «Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов», авт.: Громовых Т.И., Шмарловская С.В., Тюльпанова В.А., Громовых B.C.
2. Патент Франция №2545099, C12N 1/14. Новый штамм Trichoderma harzianum, способ его выделения и культивирования, пептиды, продуцируемые этим штаммом, и применение штамма и новых пептидов или продуктов, полученных в процессе культивирования, как средство биологической борьбы в форме фитосанитарных препаратов, - 1984 г.
3. Л.А.Пузанова. Метод массового выращивания гиперпаразита из рода Ампеломицес для борьбы с мучнистыми росами сельскохозяйственных культур. Труды Кубанского сельскохозяйственного института. Вып.148, 1977, с.20-22.