СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ КАРДИОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И ГАЛОГЕНИДЫ 1,3-ДИЗАМЕЩЕННЫХ 2-АМИНОБЕНЗИМИДАЗОЛИЯ
AGENT HAVING CARDIOPROTECTIVE ACTION AND 1,3-DISUBSTITUTED 2-AMINOBENZIMIDAZOLIUM HALIDES

Изобретение относится к средствам, обладающим кардиопротекторным действием.
В основе генеза повреждения кардиомиоцитов целого ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы лежит закисление внутриклеточной среды и развитие «кальциевого парадокса». Эти изменения, обусловленные различными этиологическими факторами, приобретают важное патогенетическое значение и нередко являются определяющими для прогноза заболевания. В связи с этим, естественным является стремление оказать корригирующее влияние на нарушенный метаболизм кардиомиоцитов [Михин В.П., Савельева В.В. Роль кардиоцитопротекторов в терапии хронической сердечной недостаточности ишемического генеза. /Российский кардиологический журнал. - 2009. - №1 (75). Р.49-56].
+
+
+
+
В последние годы в качестве возможного физиологического и патофизиологического фактора в механизмах развития таких последствий ишемического и реперфузионного стресса, как аритмии, нарушения сократительной функции и гибель клетки, рассматривают сарколемный Na/H-обменник 1 изоформы (NHE-1) [Писаренко О.И. Ингибиторы Na/Hобмена - новый класс кардиопротекторов. / Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - №9 (90). - С.1103-1110].
+
+
+
+
Его биологическая роль связана с такими процессами, как обмен ионов Na и H; регуляция рН и объема клетки; рост, гипертрофия, дифференцировка; повреждение клетки при ишемии; в организации цитоскелета и клеточной миграции [Slepkov E.R., Rainey J.K., Sykes B.D., Fliegel L. Structural and functional analysis of the Na/H exchanger. / Biochem. J. - 2007. - №401 (3). - Р.623-633].
+
+
+
+
+
+
2+
2+
2+
Активация NHE1 происходит во время ишемии и реперфузии. При ишемии Na/H-обменник начинает выводить из саркоплазмы клетки ионы Н, накапливающиеся там из-за активизации процесса гликолиза, в обмен на вход ионов Na. Возрастание внутриклеточного содержания ионов Na в свою очередь активирует 3Na/Са-реверсионный обмен (NCE-обменник) через сарколемму, инициируя вход ионов Са в кардиомиоциты. Возникает «Са-перегрузка». Реперфузия усугубляет повреждение, возникшее во время ишемии. Во время реперфузии концентрация внеклеточных протонов быстро снижается, формируется большой градиент вне/внутриклеточных протонов, что ведет к росту уровня кальция. В результате, происходит ухудшение сократительной функции, развиваются тяжелые нарушения ритма, что в конечном итоге приводит к гибели кардиомиоцитов. Механизм действия ингибиторов NHE связан в конечном итоге в предотвращении этой кальциевой перегрузки [Fliegel L. Regulation of the Na(+)/H(+) exchanger in the healthy and diseased myocardium. Expert. Opin. Ther. Targets. - 2009. - №13 (1). - Р.55-68].
Основные положительные эффекты NHE ингибиторов на ишемизированный миокард в экспериментальных и клинических исследованиях связаны с улучшением восстановления сократительной функции левого желудочка после реперфузии; сокращением зоны ишемии и некроза; уменьшением выраженности нарушения ионного гомеостаза, сопровождающее ишемию/реперфузию; редуцированием апоптоза, уменьшением частоты возникновения и тяжести аритмий, вызванных ишемией/реперфузией.
50
50
Известно среди NHE ингибиторов средство, обладающее кардиопротекторным действием, Зонипорид (СР-597396) - [1-(хинолин-5-ил)-5-циклопропил-1Н-пиразол-4-карбонил] гуанидина гидрохлорид моногидрат [A Guzman-Perez et al. Discovery of zoniporide: A potent and selective sodium-hydrogen exchanger type 1 (NHE-1) inhibitor with high aqueous solubility./ Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2001. - №11(6). - Р.803-807]. В исследованиях in vitro на тромбоцитах кролика показано, что данный препарат подавляет NHE-1-зависимое набухание тромбоцитов (максимальное ингибирование 93%) [Tracey W.R. et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc. Drug Rev. - 2003. - №21. - Р.17-32]. В исследованиях на изолированном сердце по Лангендорфу зонипорид вызывает дозозависимое уменьшение размера инфаркта (ЕС=0,25 нМ). В дозе 50 нМ препарат сокращает размер инфаркта миокарда на 83%, чем в 2,5 раза превосходит энипорид или карипорид (ЕС 0,69 и 5,11 нМ, соответственно). На модели ишемического повреждения миокарда in vivo показано, что зонипорид обладает кардиопротекторным эффектом [Knight D.R. et al. A novel sodium-hydrogen exchanger isoform-1 inhibitor, zoniporide, reduces ischemic myocardial injury in vitro and in vivo // J.PharmacoI.Exp.Ther. - 2001. - №297 (1). - P.254-259]. Зонипорид заметно снижал размер инфаркта без нарушений гемодинамики и сократительной функции сердца, ослаблял постреперфузионную сократительную дисфункции, а также снижал частоту и продолжительность желудочковых фибрилляций [Tracey WR et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc Drug Rev. - №21. - 2003. - Р.17-32]. При этом он существенно не влиял на коронарный кровоток, а основной эффект его был связан с изменениями метаболизма [Ayoub IM et al. Zoniporide preserves left ventricular compliance during ventricular fibrillation and minimizes postresuscitation myocardial dysfunction through benefits on energy metabolism // Crit Care Med. - 2007. - №35(10). - P. 2329-2336].
+
+
+
+
+
Клинические испытания препарата проводились фирмой «Pfazer" у больных с инфарктом миокарда, заболеваниями коронарных сосудов, атеросклерозом. Наиболее частыми побочными эффектами у пациентов, получающих зонипорид, были сонливость и ортостатическая гипотензия. Кроме того наблюдали тошноту, рвоту и головную боль [Dalvie D. et al. Cross-species comparison of the metabolism and excretion of zoniporide: contribution of aldehyde oxidase to interspecies differences/ Drug Metab. Dispos. 2010 - №38(4). - Р.641-654]. Поэтому было изучено нейротоксическое влияние зонипорида у крыс. Были выявлены как клинические, так и электрофизиологические и микроскопические свойства периферических сенсорных аксонопатий [Pettersen JC et al. Neurotoxic effects of zoniporide: a selective inhibitor of the Na/H exchanger isoform 1 // Toxicol Pathol. - 2008. - №36(4). - P.608-619]. Риск повреждения периферической нервной системы может ограничивать дозу и продолжительность терапии сердечно-сосудистых заболеваний [Liu CN, Somps CJ 1Na/H Exchanger-1 Inhibitors Reduce Neuronal Excitability and Alter Na Channel Inactivation Properties in Rat Primary Sensory Neurons./ TOXICOLOGICAL SCIENCES. - 2008. - №103(2). - P.346-353].
Техническим результатом является повышение эффективности кардиопротекторного действия.
Технический результат достигается применением в качестве кардиопротекторного средства трициклических производных имидазо[1,2-а]бензимидазола общей формулы I:
6
4
3
6
4
где Ar=CHOCH-р, CHOH-р
2
2
2
2
NR=N(CHCH)O,
в том числе
6
4
3
2
2
2
2
Ia Ar=CHOCH-р; NR=N(CHCH)O
6
4
2
2
2
2
Iв Ar=CHOH-р; NR=N(CHCH)O
или галогенидов 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолия общей формулы I:
6
4
6
3
2
2
где Ar=CHF-4, CH(OCH)-3,4
2
2
5
2
2
2
NR=N(CH), N(CHCH)O; X=Cl, Br,
в том числе
6
4
2
2
2
2
IIa Ar=CHF-4; NR=N(CHCH)O, X=Cl
6
3
2
2
2
2
5
2
IIв Ar=CH(OCH)-3,4; NR=N(CH), X=Br.
Соединения могут применяться, в том числе, для изготовления средств, обладающих кардиопротекторным действием, а также для восстановления и улучшения кардиопротекторных функций у живых организмов.
2
1
Соединение Ia известно как обладающее способностью ингибировать ФДЭ цАМФ и снижать возбудимость предсердий (В.А. Анисимова, А.А. Спасов, В.А. Косолапов, А.Ф. Кучерявенко, О.В. Островский, Н.П. Ларионов, Р.Е. Либинзон. Фармакологическая активность 2-метоксифенилзамещенных 9-диалкиламиноэтилимидазо[1,2-a]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 2005, т.39, №9, с.26-32), а также как проявляющее свойства антагониста пуриновых PY-рецепторов и антитромботическую активность [патент РФ №2377990, МПК A61K 31/5377, 2006 г.).
Соединение Iв проявляет антиоксидантную и антиагрегантную активность, а также слабое антисеротониновое и антипуринергическое действие (В.А. Анисимова, А.А. Спасов, В.А. Косолапов, М.В. Черников, А.Ю. Стуковина, Л.В. Ельцова, Н.П. Ларионов, Р.Е. Либинзон, О.Е. Ватолкина. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)фенилимидазо[1,2-a]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 2006, т.40, №10, с.23-26).
Соединения IIa, IIв не описаны.
Техническим результатом являются также новые соединения в ряду югалогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия, обладающие кардиопротекторным действием.
Технический результат достигается галогенидами 1-диалкиламиноэтил-3-[замещенный(дизамещенный)фенацил]-2-аминобенз-имидазолия общей формулы II:
6
4
2
2
2
2
где IIа Ar=CHF-4; NR=N(CHCH)O, X=Cl
6
3
2
2
2
2
5
2
IIв Ar=CH(OCH)-3,4; NR=N(CH), X=Br.
Ниже приведены примеры получения соединений IIа и IIв.
Пример 1. Синтез хлорида 1-морфолиноэтил-3-(4-фторфенацил)-2-аминобензимидазолия (IIа).
Смесь 1,23 г (5 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола, 0,87 г (5 ммоль) ω-хлор-4-фторацетофенона и 15 мл сухого ацетонитрила кипятят до полного протекания реакции кватернизации (~8-10 часов, контроль - ТСХ). Затем ацетонитрил упаривают до небольшого объема, осадок, который представляет собой искомый хлорид, отфильтровывают и промывают ацетоном. Выход 92,5%. Т.пл. 198-199°C.
21
24
4
2
Найдено, %: C 60,15; H 5,68; Cl 8,54; F 4,60; N 13,45. CHClFNO.
Вычислено, %: C 60,21; H 5,77; Cl 8,46; F 4,54; N 13,37.
-1
+
2
ИК-спектр, v, см: 3206, 3168, 3022 (NH), 1693 (C=O), 1663 (C=N), 1599 (C=C); 1226 (C-N), 1118 (C-O).
1
+
6
2
2
2
2
2
2
2
Ar
Ar
2
Спектр ЯМР H (ДМСО-d), δ, м.д. (J, Гц): 2.40-2.60 м [4H, N(CH)], 2.67 т (2H, J=5.7 Гц, NCH), 3.48 т [4H, J=3.9 Гц, O(CH)], 4.39 т (2H, J=5.7 Гц, NCH), 6,05 с (2H, CH), 7.24-7.62 м (6H, H), 8.14-8.21 м (2H, H), 9.22 уш.с (2H, NH).
Пример 2. Бромид 1-диэтиламиноэтил-2-амино-3-(3,4-метилендиоксифенацил)бензимидазолия (IIв).
В горячий раствор 1,16 г (5 ммоль) 1-диэтиламиноэтил-2-аминобензимидазола в ацетоне вносят 1,22 г (5 ммоль) 3,4-метилендиоксифенацилбромида, смесь перемешивают и оставляют на 3-4 часа при 20-25°C. Выпавший осадок бромида отделяют и промывают ацетоном. Выход 97,3%. Т.пл. 235-236°C (разложение).
-1
ИК-спектр (твердое состояние), v, см: 3310, 3236,3090, 1681, 1652, 1449, 1255, 1033,751.
1
+
6
3
2
2
2
2
Ar
Ar
Ar
2
Спектр ЯМР H (ДМСО-d), δ, м.д.: 0.81 т (6H, J 6.9 Гц, 2CH); 2.73 т (2H, J 6.2 Гц, CH); 4.29 т (2H, J 6.2 Гц, CH); 5.88 с (2H, CHCO); 6.20 с (2H, OCHO); 7.15-7.40 м (3H, H), 7.48-7.65 м (3H, H), 7.75 д (1H, J 8.1 Гц, H), NH в обмене.
Ниже приведены результаты испытаний кардиопротекторных свойств соединений.
1. Материалы и методы.
1.1. Материалы.
Соединения I и II, зонипорид (SIGMA, США).
Реактивы: натрий хлористый «ХЧ» NaCl (ЗАО «НПО ЭКРОС», Россия), набор реактивов для иммуноферментного анализа Rat cardiac troponin I (cTn-I) (кат. номер CSB-E08420r) фирмы CUSABIO BIOTECH CO.,LTD. (Китай), голубой Эванс, трифенилтетразолий, синий Эванс (SIGMA, США), 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (SIGMA, США).
1.2. Животные.
В экспериментах были использованы 57 крыс-самок, весом 260-300 г, которых содержали в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ P 50258-92 [1993]. Исследования проводили в соответствии с применяемыми требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, ГОСТ P ИСО 5725-2002 и «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 №708н, с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes Official Journal L 276, 20.10.2010, p.33-79 (revising Directive 86/609/EEC)].
Животные были разделены на 11 групп:
1-3 контрольные:
1 - «контроль-ложнооперированные» - животным проводился весь комплекс операций, кроме перевязки левой коронарной артерии;
2 - «контроль-ишемия/реперфузия» - животным проводилась перевязка левой коронарной артерии с последующей реперфузией, вводился физиологический раствор;
3 - «контроль-зонипорид» - животным с перевязкой левой коронарной артерии вводился зонипорид за 10 минут до реперфузии.
4-7 опытные (животным с перевязкой левой коронарной артерии вводили изучаемые соединения за 10 минут до реперфузии):
4 - «IIа»; 5 - «Iа»; 6 - «IIв»; 7 - «Iв».
1.3. Методы.
Эксперименты выполнены на наркотизированных крысах-самках (хлоралгидрат, 400 мг/кг) в условиях искусственной вентиляции, торакотомии, перикардотомии. Ишемию/реперфузию моделировали путем 60-минутной перевязки левой коронарной артерии, с последующей 60-минутной реперфузией. Физиологический раствор, зонипорид, изучаемые соединения вводили внутривенно в эквивалентных объемах 1 мг/кг за 10 мин до реперфузии. Развитие ишемии миокарда контролировали по электрокардиограмме во II стандартном отведении (компьютерный электрокардиограф «Поли-Спектр-8/В», Россия); размерам анатомической зоны риска и некроза миокарда, миокардиальному маркеру повреждения - тропонину I крыс.
Оценку размеров анатомической зоны риска и зоны инфаркта производили с помощью методики двойного окрашивания голубым Эвансом и трифенилтетразолием с последующим обсчетом в программе Image J.
Содержание тропонина I в плазме крови крыс в качестве маркера повреждения миокарда определяли иммунохимически набором реактивов для иммуноферментного анализа Rat cardiac troponin I (cTn-I) фирмы CUSABIO BIOTECH CO., LTD. (Китай) на универсальном микропланшетном ридере ELX 800 производства фирмы Bio-Tek Instruments, Inc (США). Содержание тропонина I выражали в пкг/мл плазмы.
1.4. Методы статистической обработки
Все статистические расчеты проводили с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0, фирмы StatSoft, Inc. (США). Проводили попарное сравнение выборок с использованием U-критерия Манна-Уитни. Гипотезу о существовании различий между выборками принимали при уровне p<0,05.
2. Результаты исследования
При изучении влияния соединений на размеры зоны риска и инфаркта миокарда в условиях ишемии/реперфузии были показаны следующие результаты. У животных 2-7 группы при проведении перевязки левой коронарной артерии развивалось ишемическое повреждение миокарда левого желудочка, что подтверждено подъемом сегмента ST на ЭКГ во II стандартном отведении и при окрашивании голубым Эвансом. В контрольных и опытных срезах зона риска составила во всех группах в среднем 42-55% (таблица 1). Это подтверждает единообразие проведенных оперативных вмешательств.
При последующем окрашивании трифенилтетразолием в группе «контроль-ишемия/реперфузия» зона некроза составила 44,36%. При введении зонипорида, IIа, IIв, Iа, Iв, наблюдается достоверное уменьшение зоны инфаркта по сравнению с группой «контроль-ишемия/реперфузия». При этом изучаемые соединения превосходили зонипорид по свой активности (таблица 1). Соединение IIа статистически достоверно в 1,4 раза превосходит препарат сравнения.
При анализе изменения уровня тропонина I в плазме крови животных группы «контроль-ишемия/реперфузия» было показано достоверное увеличение по сравнению с ложнооперированными (таблица 1.). В опытных группах статистически достоверное снижение маркера повреждения по отношению к группе «контроль-ишемия/реперфузия» наблюдалось при введении зонипорида, соединений IIа, Iа, IIв, Iв в 2,1, 2,5; 1,7; 1,9 и 1,5 раза соответственно.
В таблице 1 приведены основные показатели кардиопротекторного действия соединений Iа, Iв и IIа, IIв на модели ишемии/репефузии при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг.
Таблица 1
Основные показатели кардиопротекторного действия на модели ишемии/репефузии при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг.
№
Группа
n
Размеры зоны риска (% по отношению к левому желудочку)
Размеры зоны некроза (% по отношению к зоне риска)
Уровень тропонина I (пкг/мл)
1.
Контроль-ложнооперированные
6
0,00±0,00
0,00±0,00
136,65±38,03
2.
Контроль-ишемия/реперфузия
7
53,20±4,99
44,36±3,79
528,32±81,32<sup>#</sup>
3.
Контроль-зонипорид
7
47,25±3,82
34,87±2,57<sup>*</sup>
252,76±72,05<sup>*</sup>
4.
IIа
5
46,33±3,2
24,10±1,47<sup>*$
211,88±60,14
5.
Iа
8
45,01±1,77
27,78±4,23
316,55±62,34
6.
IIв
4
51,09±6,08
29,92±4,84
287,46±60,14
7.
Iв
5
46,04±5,28
30,04±2,58
346,78±99,75
значение статистически значимо по отношению к группе «контроль-ложнооперированные»;
 - значение статистически значимо по отношению к группе «контроль-ишемия/реперфузия»;
$</sup> - значение статистически значимо по отношению к группе «контроль-зонипорид».
3. Выводы
Таким образом, в исследованиях in vivo на модели ишемии/реперфузии показано кардиопротекторное действие изучаемых производных бензимидазола соединений Iа, Iв и IIа, IIв.
Показано, что соединения Iа, Iв, IIв при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг статистически достоверно по отношению к группе «контроль-ишемия/реперфузия» снижают размеры зоны некроза миокарда и уровень тропонина I в крови на модели ишемии/реперфузии у крыс, оказывая эффект, подобный зонипориду.
Соединение IIа при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг статистически достоверно превосходит зонипорид по влиянию на размеры зоны некроза миокарда и в большей степени снижало уровень тропонина I в крови на модели ишемии/реперфузии у крыс.