Лабораторная диагностика врожденных вирусных инфекций

Лабораторная диагностика врожденных вирусных инфекций

Л. Л. Нисевич, Е. В. Бахмут, А. А. Аширова, А. А. Меджидова, А. А. Куш, Т. Н. Коноплева, А. Г. Талалаев, Л. Н. Каск, Т. С. Парсегова, Е. Л. Туманова

Научный центр здоровья детей РАМН, НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, РГМУ, Москва

Представлена сравнительная характеристика различных методов диагностики врожденных вирусных инфекций. Установлено, что так называемый «золотой стандарт» диагностики (вирусологический метод) — выделение цитопатических агентов (ЦПА) с последующим типированием в реакции нейтрализации на культуре клеток — длительный, трудоемкий и дорогостоящий процесс. При этом частота выделения ЦПА невысока (7,3%). Диагностика врожденной инфекции с помощью серологических методов малоинформативна в связи с иммунотолерантностью, обусловленной незрелостью иммунной системы и наличием большого количества ложноотрицательных результатов. Быстрый культуральный метод с последующей идентификацией антигенов с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ) — высокоинформативный метод, позволяющий получить развернутый ответ при наличии культуры клеток через 3—4 суток и выявить инфекцион-но активный вирус. РИФ можно использовать при выявлении инфекционных агентов in situ при жизни и посмертно (2— 3 суток). Однако, следует учитывать, что при использовании поликлональных антител могут иметь место неспецифические реакции и определенный процент гипердиагностики. Моноклональные антитела к раннему и сверхраннему белкам ЦМВ обладают большей специфичностью, по сравнению с поликлональными антителами, но в ряде случаев могут быть ложноотрицательные результаты. Моноклональные антитела к вирусам герпеса 1 и 2 типов различного производства обладают относительно одинаковой чувствительностью и специфичностью. В ПЦР в 27% случаев выявляется ДНК ЦМВ, находящегося в латентном состоянии, что затрудняет интерпретацию полученных данных. Ни один из методов диагностики врожденной инфекции не может считаться абсолютно надежным. Для постановки диагноза врожденной инфекции необходимо использовать не менее двух методов, а при возможности и более. Необходим тщательный анализ анамнестических данных матерей новорожденных и результаты их серологического обследования. Ключевые слова: диагностика, врожденные инфекции, новорожденные

Значение врожденных инфекций как одной из причин самопроизвольного прерывания беременности, преждевременных родов, врожденной патологии, перинатальной и младенческой смерти в настоящее время не вызывает сомнения. Однако, в силу ряда субъективных и объективных причин врожденную вирусную инфекцию, особенно в ранний период ново-рожденности при жизни нередко не удается диагностировать. В случае смерти ребенка часто определяются существенные расхождения в клинических диагнозах и в диагнозах после проведения патолого-анатомических и вирусологических исследований [1]. В связи с этим по-прежнему актуальным остается вопрос диагностики врожденных инфекций.

Нередко удельный вес врожденных инфекций среди других причин перинатальной патологии и смерти определяется на основании экспертной оценки историй болезни умерших, на основании серологического обследования новорожденных. Известно, что lgG-антите-ла передаются ребенку от матери пассивно, а lgM продуцируются собственно плодом, однако у новорожденных с хронической генерализованной инфекцией в условиях массивной антигенной стимуляции и в связи с незрелостью иммунной системы часто имеет место иммунологическая толерантность, то есть неспособность продуцировать специфические антитела. Так, было показано, что специфические lgM-антитела к краснухе выявляются только у 1/3 новорожденных с диагностированной врожденной краснухой [2]; по данным других авторов, от 10 до 50% новорожденных не способны продуцировать специфические lgM-анти-тела [3—5]. Thomas H. et al. [6] установили, что созревание иммунного ответа в смысле образования высокоавидных специфических lgG-антител, которые обычно выявляются спустя 6 месяцев после инфицирования, у детей с врожденной краснухой происходит аномально медленно. Так, у 40% детей с врож-

денной краснухой низкоавидные антитела выявлялись до 3 лет.

В большинстве случаев не проводится вирусологическое исследование, даже если при патологоанато-мическом исследовании выявляются признаки воспалительных реакций, врожденные пороки развития, стигмы дизэмбриогенеза и множественные эмбри-офетодисплазии. Поэтому истинные показатели летальности от врожденных инфекций фактически неизвестны и противоречивы.

«Золотым стандартом» остается классический культуральный метод выделения вирусных возбудителей, что требует развития цитопатического действия вируса на культуре клеток после внесения исследуемых образцов. В настоящее время в зарубежных странах широкое распространение получила модификация культурального метода, так называемый «shall vial», или быстрый культуральный метод (БКМ), позволяющий выявить инфекционно активный вирус. В последние годы БКМ используется в нескольких лабораториях в нашей стране. Метод заключается в сокультивирова-нии исследуемых образцов и клеток культуры ткани с последующим выявлением вирусных белков в зараженных клетках в реакции иммунофлуоресценции (РИф) с помощью поли- и моноклональных антител. Этот метод обладает как высокой специфичностью, так и высокой прогностической значимостью [7]. К тому же использование БКМ позволяет существенно сократить сроки получения результата (с 20—40 дней до 4—5 суток).

ПЦР — высоко чувствительный метод, но иногда возникают трудности с интерпретацией результатов, так как выявление ДНК или РНК часто не означает развития инфекционного процесса в организме. Часто проводится поиск 1—2 возбудителей, и на основании такого обследования делается абсолютно необоснованный вывод об особой значимости или ведущей роли той или иной инфекции в неонатальной патологии и

смерти; и практически одинаковые клинические проявления описываются как характерные для разных бактериальных и вирусных инфекций.

Целью настоящего исследования была сравнительная оценка эффективности выявления возбудителей с помощью различных, наиболее распространенных методов диагностики врожденных вирусных инфекций.

Материалы и методы исследования

Клинические наблюдения проводили в роддомах и отделениях патологии новорожденных г. Москвы, г. Ашхабада, г. Душанбе. Серологические и вирусологические исследования проводили в Научном центре здоровья детей РАМН, НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Таджикском НИИ эпидемиологии и гигиены. Патологоанатомические исследования проводили на кафедре патологической анатомии РГМУ и патологоанатомическом отделении НИИ педиатрии г. Душанбе.

Для исследования использовали материалы, полученные при жизни и посмертно от плодов, умерших новорожденных и детей, умерших в течение первого года жизни с различной патологией (менингит, энцефалит, геморрагический и желтушный синдром, гепатит, миокардит, пневмония, врожденные аномалии развития различных органов и систем, стигмы дизэмб-риогенеза и др.), причиной которой могла быть врожденная вирусная инфекция. Вирусы при жизни выделяли из сгустков пуповинной и периферической крови, из спинномозговой жидкости, клеток осадка мочи, содержимого конъюнктивального мешка, смывов из носоглотки; при аутопсии — из ткани мозга, печени, селезенки, легких, почек, сердца, тимуса, плаценты. Осуществляли серологические реакции у матерей новорожденных. Количество исследованных материалов различными методами приведено в соответствующих разделах.

В работе использовали классический вирусологический метод (выделение вирусов на первично трипсини-зированной и перевиваемой культуре клеток в серии слепых пассажей). Использовали первично трипсини-зированные культуры клеток (почки новорожденных крольчат; перевиваемые культуры клеток (ПК-13); почки сирийского хомячка (ВПК-21). Присутствие вируса определяли по цитопатическому действию. Выделенные агенты идентифицировали в реакции нейтрализации на культуре ткани с использованием гипериммунных сывороток.

Для БКМ использовали клетки рака гортани (Нер-2), амниотические клетки, фибробласты легкого эмбриона человека (фЛЭЧ), выращенные на покровных стеклах.

Методика сокультивирования исследуемых образцов с клетками культуры была оптимизирована по предложенной нами ранее методике [8]. Широко используемый вариант заражения (внесение 0,2 мл исследуемого материала, обработанного антибиотиками, на монослой с последующей инкубацией при +37 °С в течение 1—1,5 часов) в большинстве случаев приводил к токсическому действию и разрушению монослоя, в результате чего на покровных стеклах с культурой оставались единичные клетки. Это затрудня-

ло оценку полученных результатов или исключало возможность адекватного анализа. В связи с этим исследуемый материал вносили в культуру клеток в 1 мл поддерживающей среды. Для более полной абсорбции вирусных частиц из исследуемого материала время инкубации увеличивали до 4—5 часов, после чего зараженную культуру 3—4 раза промывали раствором Хэнкса и заливали поддерживающей средой. При таком способе заражения количество адсорбированных вирусных частиц увеличивается до 75—80%, что позволяет извлекать стеклышки для исследования не через 4—5 суток, а через 24—48 часов. При необходимости культуру, выросшую на стекле пробирки, можно оставлять для дальнейшего наблюдения и выявления цитопатического действия.

Иммуноцитохимический метод (РИФ — прямой и непрямой методы) использовали для выявления широкого спектра антигенов различных возбудителей как in situ (в клетках осадка мочи и в отпечатках органов умерших), так и в клеточной культуре с помощью поли- и моноклональных антител (ПКА и МКА). Использовали сывороточные антитела к вирусам гриппа (А, В, С), парагриппозным вирусам 1—3 серотипов, рес-пираторно-синцитиальному вирусу, аденовирусам 10 наиболее распространенных серотипов, вирусам герпеса 1 и 2 серотипов, цитомегаловирусу (ЦМВ), а также к Mycoplasma pneumonia, Chlamidia pneumonia, вирусу кори, вирусам Коксаки А 23 серотипов, Кок-саки В 6 серотипов, энтеровирусам 68—71 серотипов, Echo вирусам 34 серотипов. В работе использовали мышиные и кроличьи сыворотки производства НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург), НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов (Москва), НИИ вирусных препаратов, сыворотки производства США фирмы Dako Cytomation, смесь двух моноклональных антител к неструктурному сверхраннему белку 1Ер72 ЦМВ и структурному белку рр65 ЦМВ, полученных в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН [9], а также коммерческие антитела фирмы Dako corporation (США). Антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины, меченные ФИТЦ, получали из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

Для минимизации неспецифических реакций фИТЦ-конъюгаты истощали стромой человеческих эритроцитов 4 группы крови и используемыми в работе первичными и перевиваемыми клетками культуры ткани.

Исследование крови на наличие специфических IgM- и lgG-антител к краснухе проводили в РТГА по описанным методикам, а также иммуноферментным методом (ИфА). Сыворотки крови на наличие IgM и IgG к цитомегаловирусу исследовали методом ИФА. У новорожденных исследовали пуповинную кровь и периферическую кровь, полученную при поступлении в стационар в первые дни жизни и в динамике. Матерей обследовали серологическим методом с помощью РТГА и ИФА.

Серия экспериментов была посвящена определению чувствительности БКМ с применением МКА. В работе использовали референс-штамм ЦМВ человека АД 169, любезно предоставленный проф. L. Pereira (Мед. центр университета Сан-Франциско, США). Ис-

следовали перевиваемую культуру клеток фЛЭЧ, зараженную ЦМВ с различной множественностью инфицирования.

Установлено, что через 72 часа после заражения выявляется значительно больше клеток, содержащих белок 1Ер72 (80,6%), чем клеток, содержащих белок рр65 (47,6%). Это, вероятно, объясняется тем, что сверхранний белок 1Ер72 является мажорным белком и первым обнаруживается после заражения клеток. При использовании смеси МКА (1Ер72 и рр65) количество клеток, содержащих антиген, существенно не изменяется, по сравнению с числом клеток, выявляемых МКА к 1Ер72 (85,3%), однако интенсивность свечения увеличивается. Сопоставление результатов исследования с использованием смеси двух коммерческих МКА антител к ЦМВ (ССН2 и DDG9) фирмы Dako corporation (США) и МКА антител, полученных в НИИ вирусологии, показало, что смесь отечественных реагентов не уступала по чувствительности и специфичности выявления антигена ЦМВ коммерческим, а в ряде случаев давала более интенсивную окраску [10].

Для определения ДНК ЦМВ использовали качественные и количественные варианты ПЦР. Детекцию продуктов ПЦР проводили методом электрофореза и «Real Time». Использовали наборы «Политуп» научно-производственной фирмы «Литех», наборы «Цито-пол» той же фирмы, наборы Медцентра «Авиценна», наборы научно-производственной фирмы «Гентех», наборы фирмы «ДНК-технология».

Результаты лабораторных исследований подвергали статистической обработке. Средний геометрический титр антител и доверительный материал для сравниваемых групп определяли методом пробитов, используя для этих целей трафарет, предложенный В. Ю. Ур-бахом [11].

Результаты и их обсуждение

1168 материалов, полученных при жизни и посмертно от 379 детей с врожденной патологией исследовали классическим вирусологическим методом в серии слепых пассажей с последующей идентификацией изолированных цитопатических агентов в реакции нейтрализации на культуре ткани. Различные цитопа-тические агенты были выявлены только в 85 случаях (7,3%). 46 из них были типированы как вирусы краснухи, 13 — как цитомегаловирус, 20 — как аденовирусы различных серотипов; 6 цитопатических агентов типировать не удалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что выделение вирусов на культуре ткани — малоэффективный метод, дорогостоящий, трудоемкий и длительный процесс.

На наличие специфических антител к вирусу краснухи исследовано 507 сывороток крови от 379 новорожденных и 358 сывороток крови от 287 матерей. Кроме того, было исследовано 50 сывороток крови практически здоровых новорожденных и их матерей.

Всего на основании данных клинического и лабораторного обследования (вирусологические и серологические исследования) диагноз врожденной краснухи был установлен у 102 новорожденных. У 46 при жизни или посмертно были выделены вирусы краснухи. Специфические lgM-антитела к вирусу краснухи были

выявлены у 27 новорожденных с отрицательными результатами вирусологического исследования и у 5 новорожденных с положительными результатами вирусологического обследования. Всего специфические 1дМ-антитела были выявлены у 32 из 102 детей с врожденной краснухой (31,4%). Эти данные подтверждают частое формирование иммунологической толерантности у новорожденных. Мы отметили, что мальчиков среди новорожденных с иммунологической толерантностью было достоверно больше, чем девочек (р < 0,05). По всей вероятности, формирование иммунологической толерантности в какой-то степени определяется генетическим фактором — принадлежностью к определенному полу.

У 29 новорожденных с признаками врожденной инфекции ни вирусов краснухи в органах, ни специфических 1дМ-антител в сыворотках крови мы не выявили, но сочли возможным поставить диагноз врожденной краснухи по клиническим признакам и на основании результатов серологического обследования и анамнестических данных их матерей. У всех матерей детей с врожденной краснухой были выявлены специфические 1дС-антитела в высоких титрах, в 81,4% — в очень высоких титрах (1:512 и выше). При этом в 40% случаев титр антител достигал 1:4096, а в ряде случаев, вероятно, был выше (1:4096 — максимальное разведение сыворотки в РТГА). В нескольких случаях у матерей детей с врожденной краснухой, обследованных дважды, была отмечена 4-х кратная или более высокая серо-конверсия (повышение или понижение титра антител), а также были выявлены специфические 1дМ-антитела.

При сопоставлении показателей гуморального иммунитета к краснухе у матерей детей с врожденной краснухой (в том числе и тех детей, у которых диагноз врожденной краснухи был поставлен на основании данных серологического обследования их матерей) с показателями матерей практически здоровых новорожденных было установлено, что средний геометрический титр антител к краснухе и обнаружение антител в высоких титрах у матерей больных детей были достоверно выше, чем у матерей здоровых новорожденных. Специфические 1дМ-антитела были выявлены только у матерей детей с врожденной краснухой. Полученные данные подтверждают правомочность установления диагноза в ряде случаев на основании данных лабораторного обследования матерей.

Ранее мы установили [12], что краснуха у беременных в подавляющем большинстве случаев протекает в атипичной или бессимптомной форме, то есть манифестные формы краснухи составляют лишь небольшую часть заболеваемости. Поэтому большое значение для постановки диагноза имеет анализ анамнестических данных матерей. Установлено, что у матерей детей с врожденной краснухой достоверно чаще (р < 0,001), чем у матерей практически здоровых новорожденных, отмечались выкидыши и мертворождения незадолго до настоящей беременности, ОРВИ во время беременности, так называемая «аллергическая сыпь», фарингиты, субфебрилитет неясной этиологии; у большинства матерей детей с врожденной краснухой (65%) отмечены многочисленные контакты с детьми (многодетные семьи, проживание в коммунальных

квартирах, общежитии, работа в детских коллективах). Вышеперечисленное мы расценили как факторы риска по контакту с больными бессимптомной или атипичной краснухой. Очевидно, что при постановке диагноза кроме клинических и лабораторных методов обследования новорожденных необходимо проводить тщательный анализ акушерско-гинекологического и эпидемиологического анамнеза, а также использовать результаты серологического обследования матерей.

Поскольку у новорожденных специфические 1дМ-ан-титела часто не выявляются даже при наличии вируса, а выделение вируса недостаточно эффективно, для диагностики врожденной инфекции мы использовали БКМ (заражение культуры клеток, выращенной на покровных стеклышках сгустками пуповиной крови (61 проба) и периферической крови, полученной через несколько дней после рождения (31 проба). Одновременно в РИф исследовали клетки осадка мочи тех же новорожденных (31 проба). В РИф использовали ПКА к широкому набору вирусных антигенов, а также антигену Mycoplasma pneumonia. Матерей 61 новорожденного обследовали с помощью ИфА.

Анализ показал, что антигены вирусов краснухи, герпеса, вируса кори, гриппа С, энтеровирусов (Коксаки А, Коксаки В, 68—71 серотипов) выявлялись практически с одинаковой частотой как в пуповинной крови, так и в сгустках крови, полученной через несколько дней после рождения, а также в клетках осадка мочи новорожденных. Это может свидетельствовать о внутриутробном инфицировании возбудителями, полученными от матери. При этом, в подавляющем большинстве случаев (83%) выявляется смешанное внутриутробное инфицирование различными возбудителями.

Антигены вирусов гриппа А, В, парагриппа, PC, ци-томегаловируса, аденовирусов, а также антиген M. pneumonia выявлялись в материалах новорожденных, полученных через несколько дней после рождения, значительно чаще, чем в пуповинной крови. Полученные данные свидетельствуют как о возможности постнатального инфицирования определенной части детей после рождения (грипп, респираторные вирусы, цитомегаловирус), так и об обострении персистирую-щей врожденной ЦМВ-инфекции. После рождения значительно увеличивается количество проб, содержащих 2 и более антигенов различных возбудителей как в периферической крови, так и в клетках осадка мочи (до 96,7%, р < 0,01).

Таким образом, использование БКМ и РИф позволило в одной пробе исследуемого материала обнаружить антигены различных возбудителей и их сочетания, а также показать, что у новорожденных имеет место преимущественно смешанное внутриутробное инфицирование и высокая вероятность постнатального инфицирования после поступления детей в стационары на второй этап выхаживания.

Параллельно с исследованием пуповинной крови с помощью БКМ на наличие антигенов сыворотки пупо-винной крови детей с врожденной вирусной инфекцией исследовали в ИфА на наличие специфических 1дМ-ан-тител к краснухе и ЦМВ. При исследовании 61 образца пуповинной крови в ИфА специфические 1дМ-анти-тела к краснухе выявлены у 2 из 61 больного (3,3%),

а антиген вируса краснухи с использованием БКМ и РИФ выявлен в 29,5% (р < 0,01). IgM-антитела к ЦМВ определены в 4,9% исследованных образцов в ИФА, а антиген ЦМВ в сгустках крови при заражении культуры клеток с последующей идентификацией в РИФ — в 34,4% (р < 0,001).

При обследовании матерей этих новорожденных с помощью ИфА были выявлены высокие титры IgG-анти-тел к ЦМВ и краснухе. Специфические IgM-антитела к ЦМВ вирусу были выявлены у 10%, а к вирусу краснухи — у 8,5%.

Есть данные [13, 14], что при диагностике ЦМВ инфекции определение IgM-антител дает около 50% ложноотрицательных результатов. Присутствие IgM-антител может быть замаскировано высокой концентрацией материнских IgG-антител. Отрицательные результаты могут быть также следствием недостаточной чувствительности используемых тест систем, особенно при небольшом количестве IgM-антител [15], а также следствием несостоятельности иммунитета. Таким образом, отсутствие IgM-антител у новорожденного не является основанием для снятия клинического диагноза.

В РИФ используют как поли-, так и моноклональ-ные антитела. Мы провели сравнительное исследование результатов РНИф с применением ПКА и МКА к ЦМВ. Исследования проводили in situ (в отпечатках органов плодов и умерших новорожденных), а также БКМ. При патологоанатомическом исследовании у плодов и умерших новорожденных были выявлены признаки врожденной генерализованной вирусной инфекции (менингит, энцефалит, гепатит, миокардит, пневмония и др., в большинстве случаев с фетодиспласти-ческими изменениями, и/или с пороками развития органов). Всего с помощью ПКА и МКА in situ исследовано 252 образца от 88 умерших. На культуре клеток исследовано 84 образца с помощью ПКА и 71 образец — с помощью МКА.

Антиген ЦМВ значительно чаще выявлялся в отпечатках органов при использовании ПКА, чем при использовании МКА. При исследовании БКМ относительное количество положительных образцов существенно увеличилось как при использовании ПКА (в полтора раза), так и при использовании МКА в (2,1 раза). Это связано с тем, что в суспензии органа, использованной для заражения культуры клеток, вероятность наличия возбудителя значительно возрастает. Кроме того, на культуре ткани происходит размножение вируса, то есть БКМ позволяет выявить инфекционно активный возбудитель. На культуре клеток частота выявления антигена с помощью ПКА была несколько выше (из-за малого числа наблюдений различие незначимо).

При исследовании с помощью поли- и монокло-нальных антител в отпечатках относительное число совпадения результатов было отмечено в 61,5% случаев. На культуре клеток совпадение результатов в БКМ при использовании ПКА и МКА отмечалось несколько чаще, чем в отпечатках (70,4%). При этом весьма существенно изменилось количество совпадений по положительным и отрицательным результатам. При исследовании отпечатков органов совпадение результатов в подавляющем большинстве случаев отмечалось при отрицательных результатах исследования с по-

мощью ПКА и МКА (78,3%); совпадение положительных результатов (от числа совпадений) отмечалось существенно реже: лишь в 21,7% случаев. При исследовании БКМ практически с одинаковой частотой отмечалось совпадение как по положительным, так и по отрицательным результатам.

Таким образом, при использовании как МКА, так и ПКА, быстрый культуральный метод оказался более чувствительным, по сравнению с непосредственным выявлением антигена в отпечатках in situ. Следует отметить, что при использовании МКА с помощью двух методов (in situ и БКМ) частота совпадения результатов двух методов составил 65%, а при использовании ПКА совпадение результатов двумя методами отмечалось значительно реже (42,3%, р < 0,01). Единичные случаи выявления антигена в отпечатках МКА при отрицательном результате на культуре ткани, по-видимому, можно объяснить повторным размораживанием и оттаиванием материала при доставке из прозектуры в одну, а затем в другую лабораторию. Все это приводило к потере инфекционной активности вируса и его разрушению. Известно, что ЦМВ является неустойчивым.

Большее количество положительных результатов при использовании ПКА, чем при использовании МКА, может свидетельствовать о наличии неспецифических реакций при использовании ПКА и возможной гипердиагностике ЦМВ-инфекции. Тем не менее, следует отметить, что в 10% случаев при отрицательных результатах при использовании МКА и при положительных при использовании ПКА врожденная ЦМВ-инфек-ция была подтверждена при патологоанатомическом исследовании выявлением ЦМВ-метаморфоза в тканях органов, кальцинатов в тканях мозга, наличием сиало-аденита, в двух случаях — при исследовании ткани мозга электронной микроскопией, анамнестическими данными матерей умерших, а также результатами их обследования.

Наличие герпетической инфекции в отпечатках органов умерших изучали с помощью МКА, полученных из НИИ гриппа (Санкт Петербург) и МКА, полученных из лаборатории генной инженерии НИИ вирусологии РАМН (Москва) в прямой РИф. Всего было исследовано 118 отпечатков органов от 44 умерших. Частота выявления антигенов вирусов герпеса 1 и 2 типов была практически одинаковой при использовании сывороток, полученных из разных лабораторий (соответственно 16,9 и 18,6%). Совпадение результатов было отмечено в 70,3% случаев, в подавляющем большинстве — по отрицательным результатам. Дополнительное количество положительных образцов было выявлено соответственно в 15,3 и 16,9% случаев.

В 27 образцах от плодов и умерших новорожденных параллельно определяли ДНК ЦМВ методом ПЦР, антиген ЦМВ в отпечатках в РИф и инфекционную активность ЦМВ БКМ. В РНИф использовали как поли-, так и моноклональные антитела.

Частота выявления ДНК методом ПЦР в исследуемых образцах составила 59,3%. Как и в предыдущем анализе, частота выявления антигена ЦМВ на культуре ткани (БКМ) была в два раза выше, чем в отпечатках как при использовании МКА, так и ПКА. В отпечатках

совпадение результатов ПЦР и РНИф с помощью моноклонов составило 55,6%, а с помощью поликлонов — 40,7%; на культуре ткани совпадение результатов ПЦР и РИф несколько увеличилось как с помощью МКА (70,3%), так и с помощью ПКА (52,2%). То есть, результаты ПЦР и РИф с использованием МКА совпадали несколько чаще, чем при использовании ПКА, однако из-за малого числа наблюдений различие незначимо.

Заслуживает внимания следующий факт: при отрицательных результатах БКМ при использовании МКА в 8 случаях были получены положительные результаты ПЦР. В 5 случаях положительные результаты ПЦР были получены при отрицательных результатах в БКМ при использовании как МКА, так и ПКА. Это можно объяснить отсутствием экспрессии вирусных белков (при латентной форме ЦМВИ), или низким ее уровнем, лежащим за пределами чувствительности метода, которая в условиях нашего опыта составляет 1—5 вирусных частиц в исследуемом материале.

Представляют интерес данные о вероятности выявления ЦМВ в различных биологических жидкостях. При проведении количественной оценки ЦМВ в образцах крови и мочи у детей с врожденной ЦМВ-инфекцией На^асЬв-Ваитапп С. et а1. [16] было установлено, что число копий вирусной ДНК в образцах крови в 183 раза меньше, чем в образцах мочи. Меджидова М. Г. и со-авт. [17] при исследовании 115 образцов крови и мочи от 31 недоношенного ребенка на наличие ЦМВ также отметили несколько более частое выявление ЦМВ в моче ребенка, чем в крови (72 и 63% соответственно). Вместе с тем отсутствие положительных результатов в 21% образцов мочи в ПЦР, в которых инфекционный ЦМВ был выявлен с помощью БКМ, авторы связали с возможным присутствием в моче ингибиторов ПЦР.

Мы провели параллельное исследование образцов мочи от 200 беременных и небеременных женщин на наличие антигена ЦМВ в РИф с использованием ПКА и ДНК в ПЦР. С помощью РИф антиген ЦМВ был выявлен в 19%, а ДНК ЦМВ — в 10,5% (р < 0,02). При этом отмечен высокий процент совпадения результатов двумя методами (82,5%). По положительным результатам совпадение было отмечено в 7,3% (от числа совпадений), а по отрицательным результатам — в 92,7%. В РИф дополнительно было выявлено 13%, а в ПЦР — 4,5% положительных образцов (р < 0,01). Представленные данные могут свидетельствовать как о наличии неспецифических реакций и гипердиагностике ЦМВ при использовании ПКА, так и о возможном присутствии в моче ингибиторов ПЦР.

На наличие антигена в РИф и ДНК в ПЦР вирусов герпеса 1 и 2 типов параллельно исследовали 200 образца мочи от беременных и небеременных женщин. Частота выявления герпеса двумя методами была практически одинаковой (РИф — 9% и ПЦР — 10,5%). Совпадение результатов было отмечено в 88% случаев, также преимущественно по отрицательным результатам. В РИф дополнительно было выявлено 5,5%, а в ПЦР — 7% положительных образцов. По-видимому, при диагностике герпетической инфек-

ции следует учитывать результаты двух методов, так как при исследовании в ПЦР и РИФ могут иметь место ложноотрицательные и ложноположительные результаты.

Насколько надежным является метод ПЦР, который в последнее время приобретает все большее распространение? Образцы крови от 57 детей (новорожденных и раннего возраста) были параллельно исследованы на наличие ДНК ЦМВ методом ПЦР в двух сертифицированных лабораториях [18]. В одной лаборатории ДНК ЦМВ была выявлена в 19,3%, а в другой — в 10,5% случаев. При этом совпадение результатов исследования одним и тем же методом в двух лабораториях было отмечено только в 81% случаев. Расхождение результатов — в 19,3% случаев. Образцы крови от 64 детей в ПЦР были исследованы параллельно в трех сертифицированных лабораториях г. Москвы, и были получены аналогичные результаты. Расхождение результатов в этой группе обследованных детей по данным трех лабораторий составило соответственно 12, 1 3 и 28%. Представленные данные свидетельствуют о том, что при исследовании материалов от больных одним и тем же методом в разных лабораториях частота совпадения результатов не превышает 80%.

Для решения вопроса о назначении терапии ЦВМ-инфекции у новорожденных Федорова Н. Е и др. [18], Алямовская Т. А. и др. [19] рекомендуют определять авидность 1дС-антител, что позволяет определить продолжительность инфицирования, дифференцировать первичную инфекцию от ее реактивации и характеризовать компетентность специфического иммунного ответа.

Таким образом, диагностика врожденной вирусной инфекции с помощью только серологических методов малоинформативна в связи с иммунотолерантностью, обусловленной незрелостью иммунной системы и наличием большого количества ложноотрицательных результатов. Выделение вирусов на культуре ткани с последующим типированием изолированных цитопатиче-ских агентов в реакции нейтрализации на культуре ткани — дорогостоящий, длительный и трудоемкий процесс, занимающий иногда несколько недель. При этом частота выделения вирусов невысока. БКМ с последующей идентификацией вирусных антигенов с помощью РИФ — высокоинформативный метод, позволяющий получить развернутый ответ при наличии культуры клеток через 3—4 суток и выявить инфекционно активный вирус. Достаточно эффективным и менее дорогим методом диагностики врожденной инфекции является исследование клеток осадка мочи новорожденных в РИФ с использованием типоспецифических сывороток, содержащих антитела к широкому набору антигенов. Этот метод позволяет получить развернутый ответ через 2—3 суток с момента получения материала. Однако, следует иметь в виду, что при диагностике инфекций в РИФ с помощью ПКА могут иметь место неспецифические реакции и определенный процент гипердиагностики. Моноклональные сыворотки к ЦМВ, содержащие антитела к раннему и сверхраннему белкам, обладают большей специфичностью по сравнению с поликлональным, тем не менее, в ряде случаев, могут иметь место ложноотрицательные ре-

зультаты. МКА к вирусам герпеса 1 и 2 серотипов различного производства обладают относительно одинаковой чувствительностью и специфичностью.

Параллельное исследование образцов крови новорожденных в различных сертифицированных лабораториях методом ПЦР показало существенные расхождения результатов. При этом, следует учитывать, что в 27% случаев в ПЦР выявляется ДНК ЦМВ, находящегося в латентном состоянии, что весьма затрудняет интерпретацию полученных данных.

Таким образом, ни один из представленных методов диагностики врожденной вирусной инфекции не может считаться абсолютно надежным. При постановки диагноза врожденной инфекции необходимо использовать не менее двух методов, а при возможности более. При этом большое значение имеют анамнестические данные матерей новорожденных и результаты их серологического обследования.

Литература:

1. Значение различных вирусных инфекций в невынашивании, мертворождении, перинатальной и младенческой смерти / Л. Л. Нисевич и др. // Педиатрия. — 1999. — № 1. — С. 1—10.

2. Бахмут Е. В. Внутриутробное инфицирование вирусом краснухи: Автореф. дис. ... к. м. н.— М., 1991. — 24 с.

3. Хахалин Л. Н. ВВЗ-ЦМВ-инфекция у беременных и новорожденных // Неизвестная инфекция. —Г еорпес, Смоленск, Фармаграфикс, 1997. — С. 93—99.

4. Prenatal diagnosis of 52 pregnancies at risk for congenital cytomegalovirus infection / С. Donner et al. // Obstet. and Gynecol. — 1993. — V. 82. — P. 481—486.

5. Nelson С. T. Cytomegalovirus infection in the prenatant mother, fetus and newborn infant / С. Т. Nelson, G. J. Demmler // Clin. Perinatol. — 1997. — V. 24. — P. 680—715.

6. Persistence of specific IgM and Low Avidity specific IgG following primary rubella / Н. Thomas et al. // J. Virol. methods. — 1992. — V. 39 (1—2). — P. 149—155.

7. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection / Т. Lazarotto et al. // J. din. Microbiol. — 1998. — V. 36. — P. 3540—3544.

8. Вирусемия у детей с хроническими заболеваниями органов дыхания / Л. Л. Нисевич и др. // Вопр. охр. мат. и детства. — 1980. — № 8. — С. 13—16.

9. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток / Н. Е. Макарова и др. // Вопр. вирусологии. — 1996. — 41 (1). — С. 28—32.

10. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса в аутописийных материалах / А. А. Меджи-дова и др. // ЖМЭИ. — 2002. — № 2. — С. 63—69.

11. Урбах В. Ю. Использование пробит метода при нахождении среднего титра в серологических исследованиях // Вопр. вирусологии. — 1967. — № 2. — С. 238—243.

12. Значение иммунологического обследования беременных для ранней диагностики внутриутробной краснухи / Л. Л. Нисевич, Е. В. Бахмут, А. А. Умарова, А. М. Миракилова // Вопр. охр. мат. и детства. — 1991. — № 4. — С. 38—43.

13. Nielsen S. L. Kinetics of specific immunoglobulin M, E, A and G in congenital primary and secondary cytomegalovirus infection studied by antibody-capture enzime Linked immunosorbent assay / S. L. Nielsen, I. Sorensen, Н. К. Andersen // J. Clin. Microbiol. — 1998. — V. 26. — P. 654—661.

14. Immunoglobulin M antibodies detected by enzimelinked immu-nosorbent assay and radKoKmmunoassay Kn the dKagnosKs of cy-tomegalovirus infection in pregnant women and newborn infants / S. Stagno et al. // J. Clin. Microbiol. — 1995. — V. 21. — P. 930—935.

15. Development and clinical evolution of recombinant-antigen-based cytomegalovirus immunoglobulin M automated immunoassay using the Abbot Ax Sym analizer / G. T. Maine et al. // J. Clin. Virol. — 2000. — V. 38. — P. 1476—1481.

16. Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenital infectied newborns / G. Halwachs-Baumann et al. // J. Clin. Virol. — 2002. — V. 25. — Suppl. 3. — P. 81—87.

17. Выявление маркеров инфекций, вызванных вирусом простого герпеса и цитомегаловируса у новорожденных и детей

раннего возраста / М. Г. Меджидова и др. // ЖМЭИ. — 2005. — № 5. — С. 74—80.

18. Количественные лабораторные методы для диагностики ци-томегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей / Н. Е. Федорова и др. // Вопр. вирусологии. — 2005. — № 1. — С. 9—14.

19. Выявление прямых маркеров цитомегаловируса и противовирусных антител у детей раннего возраста / Г. А. Алямовская и др. // Вопр. вирусологии. — 2005. — № 1. — С. 14—19.

Клинико-патогенетическое значение белково-пептидного состава цереброспинальной жидкости при вирусных нейроинфешиях у детей

Л. А. Алексеева, Н. В. Скрипченко, Т. В. Бессонова, Г. П. Иванова, А. А. Вильниц, М. В. Иванова

ФГУ «НИИ ДЕТСКИХ ИНФЕКЦИЙ» РОСЗДРАВА, САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

С помощью методов гель-фильтрации, высокоэффективной жидкостной хроматографии, диск-электрофореза в полиак-риламидном геле исследован белково-пептидный состав цереброспинальной жидкости 213 детей с вирусными энцефалитами и менингитами, 28 детей с осложненной формой ОРВИ и 25 детей контрольной группы. Результаты сопоставлены с этиологией, особенностями клинического течения, тяжестью поражения мозга и исходом заболевания. Установлена диагностическая значимость исследований белково-пептидного состава цереброспинальной жидкости при вирусных энцефалитах и менингитах у детей.

Ключевые слова: дети, вирусные энцефалиты, менингиты, цереброспинальная жидкость, белково-пептидный состав

Диагностика и лечение вирусных энцефалитов (ВЭ) остается актуальной проблемой инфекционной патологии в связи с тяжестью течения и частотой формирования инвалидизирующих последствий [1]. В диагностике вирусного энцефалита исследование цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) является обязательным, несмотря на то, что при рутинном анализе в первые дни болезни отклонения могут не выявляться. Характерным считается незначительное увеличение числа клеток (до 300 х 10? /л), преимущественно лимфоцитов, и протеинрахия [1—3]. Однако в ряде случаев плеоцитоз может иметь смешанный характер, а содержание белка не отличаться от нормы, что не позволяет быстро и своевременно решать задачи дифференциальной диагностики, уточнять глубину и тяжесть поражения мозговой паренхимы. Методы лучевой диагностики, такие как КТ, МРТ, не могут быть использованы в качестве скрининговых в остром периоде заболевания для изучения морфологии головного мозга ввиду высокой стоимости. Исследование белкового состава ЦСЖ (определение активности некоторых ферментов, мозгоспецифичных белков, электро-форетическое и хроматографическое фракционирование) достаточно трудоемко, что ограничивает их использование в практической работе [2, 4]. Несмотря на установленную в последние годы значимость пептидов в регуляции и взаимодействии нервной и иммунной систем, высшей нервной деятельности, содержание пептидов в ликворе и их роль в патогенезе вирусных энцефалитов остаются неизученными. Это обуславливает необходимость дальнейших исследований молекулярных аспектов патогенеза ВЭ и поиск ин-

формативных биохимических маркеров интратекально-го воспаления.

Цель настоящей работы заключалась в углубленном исследовании белково-пептидного состава ЦСЖ для диагностики и определения критериев тяжести вирусного энцефалита у детей.

Материалы и методы исследования

Белково-пептидный состав ЦСЖ исследован у 213 детей с вирусными энцефалитами и вирусными менингитами (ВМ), поступивших в клинику НИИ детских инфекций. На основании комплексного клини-ко-неврологического обследования у 144 детей установлен диагноз ВЭ, у 69 — ВМ. У 28 детей в результате обследования диагностирована острая респираторная вирусная инфекция (ОРВИ), протекающая в тяжелой форме с нейротоксикозом и энцефалической реакцией (группа сравнения). Контрольную группу (условная норма) составили 25 детей (больные легкой формой ОРВИ и реконвалесценты менингококкового менингита) без выраженных отклонений в неврологическом и общесоматическом статусе, с нормальными показателями общего содержания белка и цитоза в ликворе. Этиология нейроинфекций устанавливалась в вирусологической лаборатории НИИ детских инфекций. Возбудителями ВМ были вирусы группы ECHO (6 детей), энтеровирусы (2), вирусы Коксаки, вирусы простого герпеса (7). Возбудителями ВЭ были вирусы простого герпеса (30 детей), вирусы клещевого энцефалита (16), ветряной оспы (16), краснухи (2), цито-мегаловирус (2). У остальных больных этиологический диагноз ВМ и ВЭ не установлен. Больные ВЭ были