Способ моделирования диет-индуцированного метаболического синдрома
METHOD FOR SIMULATING DIET-INDUCED METABOLIC SYNDROME

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к способу моделирования метаболического синдрома с помощью высокожировой, высокоуглеводной диеты, и может быть использовано в медицине и клинической фармакологии для поиска и разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и терапии метаболических и гемодинамических нарушений, развивающихся при метаболическом синдроме.
Известен способ моделирования метаболического синдрома у крыс с использованием диеты с высоким содержанием жиров и высоким содержанием сахара с добавлением кукурузного масла [1]. Недостатком данного способа является то, что данный способ не дает представления о степени развития дислипидемии у животных, которая является важным критерием в диагностике метаболического синдрома, также предполагает внутрижелудочное введение кукурузного масла, что требует наличия специальных технических навыков у исследователя.
Известен также способ получения модели метаболического синдрома у крыс с помощью высокожирового корма (60 частей стандартного корма, 8 частей яичного порошка, 12 частей сала, 12 частей сахарозы, 6 частей арахисового порошка, 1 часть сухого молока, 1 часть холестерина, 0,01 части желчных солей, 3 части пальмового масла и 3 части кокосового масла.) в течение 18 недель [2]. Недостатком данного способа является то, что он не позволяет судить о развитии у животных нарушения толерантности к глюкозе и инсулинорезистентности, как важных симптомов метаболического синдрома, а также состав диеты является сложным и затратным для воспроизведения.
Известен способ моделирования метаболического синдрома у грызунов на основе использования очищенного корма с высоким содержанием жиров (20,0-25,0 частей казеина, 8,0-10,0 частей крахмала, 18,0-20,0 частей сахарозы, 2,0-3,0 части растительного масла, 18,0-22,0 частей животного жира, 5,0-6,0 частей целлюлозы, 0,2-0,5 части L-цистина, 1,0-2,0 части дикальцийфосфата, 0,5-1,0 части карбоната кальция, 1,5-2,0 части цитрата калия, 0,15-0,25 части битартрата холина 1,0-2,0 частей сложных минералов, 1,0-1,5 частей витаминного комплекса и 10,0-12,0 частей мальтодекстрина [3]. Недостатки - сложно воспроизводимый многокомпонентный состав диеты.
Известен способ получения модели метаболического синдрома у мышей с помощью диеты, которая содержит NO2- и NO3- ионы [4]. Данная диета приводит к накоплению висцерального жира, гиперлипидемии, нарушению толерантности к глюкозе и резистентности к инсулину без увеличения веса у животных. Недостатки - данная модель метаболического синдрома сопровождается накоплением в организме мышей нитратов, которые не только воспроизводят признаки изучаемого синдрома, но и обладают общетоксическим действием.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ моделирования метаболического синдрома у крыс линии Sprague-Dawley использованием диеты с высоким содержанием жиров и высоким содержанием сахара с добавлением кукурузного масла в течение 90 дней [5]. Описанный способ принят за прототип изобретения. Данный способ моделирования метаболического синдрома воспроизводит основные признаки метаболического синдрома, такие как ожирение, инсулинорезистентность, повышение толерантности к глюкозе, развитие неалкогольной жировой болезни печени.
Недостатками данного способа является отсутствие функциональной оценки степени развития дислипидемии у животных, также необходимость специальных практических навыков для введения компонентов диеты.
Технической задачей изобретения является создание доступной и легко воспроизводимой модели диет-индицированного метаболического синдрома на основе использования комбинированной высокожировой и высокоуглеводной диеты.
Поставленная задача решается тем, что моделирование метаболического синдрома у лабораторных животных выполняется в течение 12 недель с помощью специально разработанной высокожировой и высокоуглеводной диеты, включающей стандартный корм {удельный вес 66%) с добавлением животного жира (топленое свиное сало, удельный вес 17%), фруктозы (удельный вес 17%), холестерина (удельный вес 0,1%), а также замену питьевой воды на 20% раствор фруктозы, с последующей оценкой выраженности метаболических нарушений, отражающихся в развитии ожирения, дислипидемии, гипергликемии, нарушении толерантности к глюкозе, инсулинорезистентности, жировой дистрофии печени, повышении артериального давления.
Новым в предполагаемом способе является сочетанное включение в рацион животных большого количества животных жиров и фруктозы в качестве углевода, а также добавка холестерина, которые индуцируют развитие метаболического синдрома. Предлагаемая высококалорийная диета максимально приближена к питанию современного человека, ее использование у лабораторных животных может повторять патогенетические факторы и феноменологию нарушений, которые возникают у людей с метаболическим синдромом.
Преимуществом предлагаемого в качестве изобретения способа является то, что используемая для моделирования метаболического синдрома диета является легко воспроизводимой, доступной по компонентному составу и не требует специальных навыков для ее реализации, также на фоне применения данного комбинированного высокожирового рациона с добавлением фруктозы у животных возникают гипергликемия стойкое повышение артериальное давление,
триглицеридемия, ожирение, признаки атерогенеза и жировой дистрофии печени.
Предлагаемый способ моделирования метаболического синдрома наиболее полно раскрывает клиническую картину нарушений, свойственных метаболическому синдрому и может быть использован для создания подходов к его профилактике и терапии.
Сущность изобретения сводится к тому, что экспериментальный метаболический синдром вызывают у лабораторных животных путем 12-недельной высокожировой и высокоуглеводной диеты, на основе стандартного корма с добавлением топленого свиного сала (17%), фруктозы (17%) и холестерина (0,1%) вместе с 20% раствором фруктозы вместо питьевой воды. В начале исследования и через 4, 8, 12 недель у животных измеряют массу тела и артериальное давление. На последней неделе исследования животным выполняют глюкозотолерантный и инсулинотолерантный тесты, забирают кровь для биохимических исследований показателей липидного (триглицериды, холестерин, липопротеины высокой плотности) и белкового (мочевина) обменов. В конце эксперимента животных умерщвляют CO2-асфиксией. Методом диссекции выделяют аорту, печень и висцеральную жировую ткань, определяют удельную массу печени и жира, а также содержание в печени и аорте триглицеридов и холестерина. Полученные результаты анализируют методами статистической обработки данных.
Способ осуществляется следующим образом.
;
Исследования выполняют на крысах-самцах Wistar (не менее 20животных, массой от 200 до 250 г, возраст на начало эксперимента 6 недель) с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации. Животные содержатся в стандартных условиях вивария с 12-часовой продолжительностью светового дня и свободным доступом к пище и воде. Случайным образом крыс распределяют на контрольную и экспериментальную группу. Крыс контрольной группы содержат на стандартной диете (корм «Дельта Фидс», Биопро, РФ, общая калорийность 300 ккал/100 г, на жиры приходится 18% от общей калорийности). Состав корма: пшеница, ячмень, отруби, глютен кукурузный, мука рыбная, белковая кормосмесь, масло подсолнечное, шрот соевый [6].
Для крыс экспериментальной группы готовят рацион, в состав которого входит описанный выше корм «Дельта Фидс» (удельный вес 66%), животный жир (топленое свиное, сало, удельный вес 17%), фруктоза (удельный вес 17%), холестерин (удельный вес 0,1%). Продукты измельчаются в блендере в гомогенную смесь, из полученной массы формируются гранулы диаметром до 11 мм и высушиваются в духовом шкафу при 25°C. Готовый корм хранят в холодильнике при 4°C не более 3 суток. Питьевую воду заменяют на 20% раствор фруктозы, который готовят непосредственно перед подачей животным ежедневно. Калорийность корма составляет 360 ккал/100 г пищи (на жиры приходится 54% от общей калорийности), также дополнительно 80 ккал/100 г за счет 20% раствора фруктозы.
итт
итт
1/2
1/2
Перед началом и через 4, 8, 12 недель эксперимента у животных измеряют массу тела, взвешивая на аналитических весах, и артериальное давление (используется система неинвазивного измерения с помощью хвостовой манжеты «Систола», Нейроботикс, РФ). Еженедельно контролируется потребление крысами пищи и воды. На последней неделе эксперимента выполняют глюкозотолерантный и инсулинотолерантный тесты [7,8]. Тесты выполняют в утренние часы натощак после лишения крыс корма на 12 ч и замены раствора фруктоза в экспериментальной группе на обычную питьевую воду. Для глюкозотолерантного теста крысам контрольной и экспериментальной группы внутрижелудочно с помощью зонда вводят раствор глюкозы в дозе 2 г/кг (D-глюкоза, Sigma-Aldrich, США). Для инсулинотолерантного теста животным подкожно делают инъекцию инсулина короткого действия в дозе 0,7 5 МЕ/кг («НовоРапид Пенфил», Ново Нордиск А/С, Дания). После чего из хвостовой вены крыс через 15, 30, 60, 90 и 120 минут забирают кровь в объеме 10 мкл для последующего определения концентрации глюкозы в крови. Содержание глюкозы определяьэт ферментативным методом с помощью набора реагентов («Глюкоза-Ново», Вектор-Вест, РФ) спектрофотометрически (спектрофотометр СФ-2000, РФ). Между тестами необходимо выдержать промежуток не менее 3 дней. Для оценки инсулинорезистентности рассчитывают константу скорости утилизации глюкозы по данным инсулинтолерантного теста (К, % глюкозы/мин) по формуле К=(0,693/t)*100, где t - время снижения концентрации глюкозы в крови, рассчитанное по наклону кривой концентрации глюкозы в первые 30 мин после введения инсулина [9]. Для биохимических исследований получают плазму крови путем центрифугирования цельной крови (4°C, 8000 g, 6 мин) и хранят при -20°C для последующего анализа. Содержание липопротеинов высокой плотности, триглицеридов и общего холестерина в плазме крови животных определяют на биохимическом анализаторе (RX Imola, Randox, Япония).
2
Животных выводят из эксперимента CO-асфиксией. Методом диссекции получают аорту, висцеральную жировую ткань (забрюшинная, эпидидимальная, мезентериальная) и печень, взвешивают на аналитических весах жировую ткань и печень, рассчитывают их удельную массу (масса ткани на 100 г массы тела крысы). Концентрацию триглицеридов и холестерина в печени и аорте (в мг/г ткани) определяют после экстракции из навесок печени (50 мг) липидной фракции смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу J. Folch. Содержание триглицеридов и холестерина в экстрагированных липидах определяют ферментативными методами с помощью наборов (Chronolab, Испания). Перед проведением анализа к хлороформной фазе добавляли 20% раствор детергента Thesit (Sigma-Aldrich, США) в хлороформе. Хлороформ удаляли потоком азота, эмульгированные липиды растворяли в дистиллированной воде. К полученной водной эмульсии добавляли рабочие реагенты из соответствующих наборов. Рассчитывают атерогенный индекс плазмы (Atherogenic Index of Plasma, AIP) [10].
1
3
Статистический анализ полученных данных выполняют в программе IBM SPSS Statistics 23. Определяют соответствие полученных количественных показателей нормальному закону распределения с помощью W-критерия Шапиро-Вилка. Если данные подчиняются нормальному закону распределения, результаты описывают как среднее и стандартное отклонение (M±SD), анализ различий между выборками выполняют при помощи t-критерия Стьюдента. Если данные не подчиняются нормальному закону распределения, то результаты описывают как медиана и интерквартильный размах (Me(Q-Q)), анализ различий между выборками проводят с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия считают достоверными при уровне значимости р<0,05.
Пример.
Содержание животных на высокожировой, высокоуглеводной диете в течение 12 недель приводило к повышению систолического и диастолического артериального давления, увеличению удельной массы жировой ткани и печени (фиг. 1).
Увеличение веса животных является одной из типичных особенностей МС [11,12]. В эксперименте конечная масса тела крыс не различались между контрольной и экспериментальной группой (фиг. 1, фиг. 2). Объяснением полученных результатов является тот факт, что животные, содержащиеся на диете, потребляли меньше пищи, обогащенной жиром и фруктозой, вероятно, из-за ее более высокой калорийности (фиг. 1). Однако кормление крыс высокожировой и высокоуглеводной диетой предлагаемого состава приводило к развитию ожирения. Об этом свидетельствует увеличение отношения жировой ткани к массе тела в более чем 2 раза (фиг. 1).
0-120
итт
итт
По данным глюкозотолерантного теста через 30 минут после глюкозной нагрузки у крыс экспериментальной группы уровень глюкозы в крови превышал уровень в контрольной группе на 25,2% (р<0,05), через 60 минут разница составила 32,4% (р<0,05), через 2 часа уровень глюкозы в экспериментальной группе оставался повышенным на 10% (р>0,05) (фиг. 3, а). Площадь под кривой «концентрация глюкозы-время» (AUC) в экспериментальной группе составила 809,9±81,9 ммоль/л*120 мин, что превышало значение в контрольной группе (585,5±53,1 ммоль/л*120 мин, р<0,05) (фиг. 3, б). Через 30 мин после инъекции инсулина разница в уровне глюкозы между контрольной и экспериментальной группой составила 30,1% (р<0,05), через 60 мин - 32,5% (р<0,05), через 2 часа - 25,7% (р<0,05) (фиг. 4, а). Площадь под кривой «концентрация глюкозы-время» (AUC) в экспериментальной группе составила 440,9±57,4 ммоль/л×120 мин и превышала таковую в контрольной группе (307,1±31,1 ммоль/л*120 мин, р<0,05). Развитие инсулинорезистентности у животных опытной группы оценивали по изменению К. Установлено, что К У крыс, содержащихся на высокожировой и высокоуглеводной диете, составила 1,3±0,7% глюкозы/мин, что на 36,5% ниже этого показателя у животных контрольной группы (2,1±0,7% глюкозы/мин, р<0,05) (фиг. 4, б). Таким образом, выявленные гипергликемия, нарушение толерантности к глюкозе и инсулинорезистентность свидетельствуют о развитии у животных метаболического синдрома при питании высокожировой и высокоуглеводной пищей.
В исследовании у крыс экспериментальной группы наблюдалось увеличение триглицеридов плазмы крови в 2,1 раза по сравнению с контролем, тогда как общий холестерин статистически значимо не увеличился (фиг. 5). Развитие гипертриглицеридемии вызвано именно липогенным эффектом добавленной в корм фруктозы [13,14].
Уровень липопротеинов высокой плотности в плазме крови животных, получавших разработанную диету, не отличался достоверно от контрольной группы (фиг. 5). Однако рассчитанный AIP у крыс, находившихся на диете, увеличивался в 3 раза (0,2±0,1 в контрольной и 0,6±0,2 в экспериментальной группе, соответственно, р<0,05). Этот показатель используется в клинической медицине при оценке сердечнососудистого риска у пациентов и рассматривается в качестве потенциального биомаркера при ранней диагностике сердечно-сосудистых заболеваний [15]. А увеличение уровня триглицеридов в стенке аорты (фиг. 5) может являться признаком развивающегося атерогенеза. Полученные данные свидетельствуют о том, что кормление крыс высокожировой и высокофруктозной диетой приводит к развитию дислипидемии и повышает риск сердечно-сосудистой патологии.
Также наблюдалось увеличение удельной массы печени, уровня триглицеридов и холестерина в печени в экспериментальной группе крыс (фиг. 5). Это дает возможность утверждать, что высокожировая и высокоуглеводная диета может способствовать развитию стеатогепатоза [16].
Таким образом, полученные данные позволяют констатировать, что использование предлагаемого способа моделирования метаболического синдрома с использованием высокожировой и высокоуглеводной диеты приводит к развитию ключевых признаков метаболического синдрома у животных.
Техническим результатом является получение модели метаболического синдрома, адекватно отражающей основные особенности метаболических нарушений, развивающихся при данном синдроме, основанное на включении в рацион животных повышенного количества животных жиров и фруктозы, а также холестерина.
Предлагаемый способ позволяет экспериментальным путем воспроизвести у лабораторных животных патогенетические факторы и феноменологию нарушений, возникающих при метаболическом синдроме, с помощью специально разработанной высокожировой и высокоуглеводной диеты, содержащей животные жиры, фруктозу и холестерин. Данный способ может быть использован в разработке подходов для профилактики и терапии метаболического синдрома.
Источники информации
1. CN 107156049 A «Establishment method for rat model of metabolic syndrome»
2. CN 107787913 «Preparation method of rat metabolic syndrome model and feed used in method»
3. CN 102771673 A «High-fat purified feed establishing metabolic syndrome animal model and processing technology»
4. JP 2015142564 A «Model mouse of metabolic syndrome condition accompanied by no increase of weight and manufacture method of the same»
5. CN 107156049 A «Establishment method for rat model of metabolic syndrome»
6. ГОСТ P 50258-92 Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия. Москва: Издательство стандартов, 1992, 7 с.
7. Деркач К.В., Бондарева В.М., Трашков А.П., Чистякова О.В., Верлов Н.А., Шпаков А.О. Метаболические и гормональные показатели у крыс с пролонгированной моделью метаболического синдрома, индуцированной высокоуглеводной и высокожировой диетой. Успехи геронтологии. 2017. Т. 30, №1. С. 31-38.
8. Dupas J., Feray A. Goanvec С., Guernec A., Samson М., Bougaran P., Guerrero F., Mansourati J. Metabolic Syndrome and Hypertension Resulting from Fructose Enriched Diet in Wistar Rats. Biomed. Res. Int. 2017, 2017. P. 2494067.
9. Patarrao R.S., Lautt W.W., Macedo M.P. Assessment of methods and indexes of insulin sensitivity. Rev. Port. Endocrinol. Diabetes Metab. 2014; 9(1): 65-73.
10. , Frohlich J. The plasnia parameter log (TG/HDL-C) as an atherogenic index: correlation with lipoprotein particle size and esterification rate in apoB-lipoprotein-depleted plasma (FER(HDL)). Clin. Biochem. 2001; 34(7): 583-588.
11. Gancheva S., Zhelyazkova-Savova M., Galunska В., Chervenkov T. Experimental models of metabolic syndrome in rats. Scripta Scientifica Medica. 2015. Vol. 47. P. 23-30.
12. Moreno-Fernandez S., Garces-Rimon M., Vera G., Astier J., Landrier J. F., Miguel M. High Fat/High Glucose Diet Induces Metabolic Syndrome in an Experimental Rat Model. Nutrients. 2018, 10(10). P. 1502.
13. Lim J.S., Mietus-Snyder M., Valente A., Schwarz J.M., Lustig R.H. The role of fructose in the pathogenesis of NAFLD and the metabolic syndrome. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2010, 7(5). P. 251-264.
14. Panchal S.K., Poudyal H., Iyer A., Nazer R., Alam M.A., Diwan V., Kauter K., Sernia C., Campbell F., Ward L., Gobe G., Fenning A., Brown L. High-carbohydrate high-fat diet-induced metabolic syndrome and cardiovascular remodeling in rats. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2011. Vol. 57(5). P. 51-64.
15. , Ochoa-Martinez A.C., Varela-Silva J.A.,  Atherogenic Index of Plasma: Novel Predictive Biomarker for Cardiovascular Illnesses. Arch. Med. Res. 2019; 50 (5): 285-294.
16. Fraulob J.C., Ogg-Diamantino R., Fernandes-Santos C., Aguila M.B., Mandarim-de-Lacerda C.A. A Mouse Model of Metabolic Syndrome: Insulin Resistance, Fatty Liver and Non-Alcoholic Fatty Pancreas Disease (NAFPD) in C57BL/6 Mice Fed a High Fat Diet. J. Clin. Biochem. Nutr. 2010, 46(3). P. 212-223.
Фигура 1. Влияние высокожировой и высокоуглеводной диеты на физиологические параметры крыс контрольной и экспериментальной группы, M±SD.
Фигура 2. График изменения массы тела животных контрольной и экспериментальной группы через 4, 8, 12 недель исследования.
Фигура 3. График зависимости концентрации глюкозы в крови крыс контрольной и экспериментальной группы на 12 неделе эксперимента (а) и площадь под кривой « «концентрация глюкозы-время» (AUC) (б) в глюкозотолерантном тесте.
Фигура 4. График зависимости концентрации глюкозы в крови крыс контрольной и экспериментальной группы на 12 неделе эксперимента (а) и константа скорости утилизации глюкозы (б) в инсулинотолерантном тесте.
Фигура 5. Влияние высокожировой, высокоуглеводной диеты на биохимические параметры крыс контрольной и экспериментальной группы, M±SD.