УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫЕМКИ ГЕЛЯ С ФРАГМЕНТАМИ ДНК

Полезная модель относится к технике секвенирования ДНК, а именно к устройству для вырезания агарозного геля с необходимыми фрагментами ДНК с последующим ее элюированием. Область применения устройства - генная инженерия, криминалистика и медицина, научные исследования, где используются методы выделения ДНК, полимеразы цепная реакция (ПЦР) и повторная полимеразы цепная реакция (реПЦР).
Известны различные способы для извлечения ДНК из агарозных гелей, при которых эффективность извлечения фрагментов крупнее 20 kb не превышает 20% [Southern, 1975; Wu et al., 1976; Smith, 1980.
Известно использование скальпеля для вырезания полоски геля при способе электроэлюирования ДИК в диализные трубки или в ванночку, вырезанную в геле [Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. - Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - С.169-171.] [1].
Известно применение скальпеля для извлечения полоски геля под ультрафиолетовым облучением после его промывания в способе восстановления ДНК из агарозных гелей [PCR Protocols: Methods in Molecular Biology/Ed, by John V.S.Bartlett; David Stirling. - Second Edition. - Vol.226. - Humana Press. - Pp.71-74] [2].
При различных способах извлечения ДНК с применением агарозных гелей для получения удовлетворительного конечного результата помимо соблюдения необходимых условий, присущих тому или иному способу, очень важно провести быструю и точную выемку геля с необходимыми фрагментами ДНК. Ультрафиолетовый свет производит разрушение ДНК и облучение им даже в течение такого короткого периода (около 30 сек) может поставить под угрозу получение целевого продукта.
В известных источниках указанная задача решается использованием для ограждения от разрушающего ультрафиолета подведением под намеченную для выемки полоску геля картона для защиты от света.
Техническим результатом заявляемого решения является снижение времени воздействия на вынимаемый образец ультрафиолетового облучения, сокращение времени извлечения геля с фрагментами ДНК, повышение качества и достоверности выделяемого целевого продукта.
Технический результат достигается применением для выемки агарозного геля с фрагментами ДНК устройства, представляющего собой рабочую часть, состоящую из одного или нескольких элементов в виде отрезков плоской полой трубки с острым режущим внешним краем, и соединенных с рабочей частью одной или двумя рукоятями.
При наличии нескольких элементов в виде отрезков плоской полой трубки, они жестко соединены между собой боковыми внешними поверхностями.
Соединение рабочей части устройства и рукоятей может быть выполнено жестким.
Подвижное соединение представляет собой механизм, обеспечивающий поворот отрезка трубки и рукояти относительно друг друга в плоскости, параллельной центральной оси отрезка трубки и проходящей через линию соединения ручки с отрезком трубки. Механизм для обеспечения подвижного соединения может быть выполнен в виде плоского шарнира и др. Указанный механизм позволяет устанавливать рабочую часть относительно рукояти в одной плоскости в удобное для работы положение. При повороте на угол более 90° устройство находится в нерабочем положении.
Устройство может быть выполнено из любого прочного нейтрального материала, например, металла, пластика и др.
Поперечный размер одного элемента рабочей части принимают приближенным к размеру лунки, образованной от зубцов гребенки, при помощи которой формируют лунки для целевого продукта (ДНК).
Заявляемое устройство поясняется чертежами.
Фиг.1 - изображение устройства, имеющего рабочую часть, состоящую из одного элемента в аксонометрии.
Фиг.2 - устройство, имеющее рабочую часть из ряда элементов.
Фиг.3 - позиция 1 - карманы в агарозном геле от гребенки; позиция 2 - карманы, образующиеся после вырезки предлагаемым устройством таблеток из агарозного геля с искомыми фрагментами ДНК;
Фиг.4 - таблетки из геля с фрагментами ДНК, вырезанные предлагаемым устройством.
Фиг.5 - таблетка геля со светящимся под ультрафиолетом фрагментом ДНК.
Устройство содержит основную рабочую часть из элемента, имеющего вид полой плоской трубки 1, с рабочим режущим концом 2 и противоположным концом 3. Плоская трубка 1 соединена одной из своих внешних поверхностей с ручкой 4. Соединение плоской трубки 1 и ручки 4 выполнено жестким (Фиг.1).
Устройство может содержать рабочую часть, выполненную из нескольких элементов в виде полых плоских трубок 1, соединенных между собой боковыми сторонами с образованием прямого ряда необходимой длины. В этом случае ручки 4 расположены с двух торцевых сторон ряда.
Для применения устройства вначале проводят экстракцию ДНК из образцов по методу Дойла и Диксона (Sambrook et al., 1967 [3]; Doyle, Dickson, 1987 [4]), с последующей амплификацией определенного участка гена методом ПЦР (полимеразы цепной реакции) с использованием универсальных для образцов праймеров. Затем для разделения, идентификации и очистки ДНК проводят электрофорез полученного ПЦР продукта в агарозном геле. При разделении в геле можно проследить за
положением ДНК, так как полосы ДНК окрашивают флуоресцирующим или интеркалирующим в ДНК красителем - бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая гель в ультрафиолетовом свете можно заметить даже 1 нг ДНК. Для горизонтального электрофореза готовят пластинку геля. Для этого в прозрачную пластмассовую кювету заливают буферную смесь с определенным количеством агарозы. В разогретый гель на расстоянии 1 мм от дна кюветы вставляют гребенку, зубцы которой формируют лунки шириной 5 мм (Маниатис, 1984). После того как гель затвердеет и станет упругим, гребенку убирают. В сформированные лунки с дном, выстланным из геля, вносят необходимый объем ПЦР продукта (ДНК) и проводят электрофорез в заданном режиме. После электрофореза, пластинку геля с полосками ДНК переносят на стекло и в ультрафиолетовом свете находят нужный фрагмент ДНК.
На этом этапе работы используют предлагаемое устройство. Устройство, как бы штампуя, режущим концом погружают вертикально в гель в области отмеченного фрагмента ДНК, затем его быстро вынимают и вновь погружают в гель в области следующего фрагмента ДНК и т.д. Перед каждым новым погружением в гель предлагаемое устройство дезинфицируют в слабом растворе муравьиной кислоты или этаноле, или обжигают на пламени спиртовки. Таким образом, за короткое время можно вырезать гель с необходимыми фрагментами ДНК из проб разных образцов.
При наличии большого количества однотипных образцов применяют устройство в виде ряда элементов с двумя ручками (Фиг.2), что значительно ускоряет процесс вырезки таблеток с фрагментами ДНК из геля. При вертикальном его погружении в гель под ультрафиолетовым светом за еще более короткое время, чем в предыдущем варианте, одновременно вырезают все образцы с фрагментами ДНК нужной длины, а необходимость в повторной дезинфекции устройства отпадает.
Так как рабочая часть устройства совпадает по размерам с шириной полоски ДНК (размерами лунок от зубцов гребенки), то при вырезании таким
способом минимизируется захват агарозы. Кроме того, вынув затем пинцетом вырезанные таблетки агарозного геля с необходимым фрагментом ДНК, скальпелем можно удалить нижний слой агарозы, толщиной 0,5-1 мм (слой агарозы равный по толщине расстоянию между дном лунки и кюветы). Далее ДНК, локализованную в таблетке из небольшого количества агарозного геля, очищают приемлемыми способами, добавляют праймеры и секвенируют. Поскольку в агарозе имеются примеси сульфатированных полисахаридов, ингибирующих некоторые ферменты (лигазы, полимеразы, рестриктазы), то чем точнее по размерам и быстрее будет извлечена таблетка из агарозы с необходимым фрагментом ДНК, тем лучше и чище можно провести элюирование фрагментов ДНК для использования их в качестве матриц или субстратов для этих ферментов.
Применение заявленного устройства для выемки геля с необходимыми фрагментами ДНК позволяет точно и быстро провести извлечение с минимальным облучением ультрафиолетом и с минимальным захватом агарозного геля, что значительно улучшает дальнейшее элюирование ДНК и получение качественного целевого продукта.
Устройство может быть применено для быстрого и качественного извлечения фрагментов геля с различными высокомолекулярными биоорганическими соединениями, например такими, как нуклеиновые кислоты, липиды, белки и другими при выделении их при помощи электрофореза.
Источники информации
1. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. - Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - С.169-171.
2. PCR Protocols: Methods in Molecular Biology/Ed. by John V.S.Bartlett; David Stirling. - Second Edition. - Vol.226. - Humana Press. - Pp.71-74.
3. Sambrook, J, Fritsh, E.F., Maniatis T. Molecilar cloning: a laboratory manual // New-York: Cold Spring Harbor. Lab. Press., pp.1967. - 1626.
4. Doyle, J.J. and Dickson, E. Preservation of plant samples for DNA restriction endonuclease analysis // Taxon. 1987. - Vol.36. - Pp.715-722.