ОЧИСТКА ИНГИБИТОРА АЛЬФА1 ПРОТЕИНАЗЫ, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
PURIFICATION OF ALPHA1 PROTEINASE INHIBITOR DERIVED FROM CELL CULTURE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
1
В данной заявке описываются способы для очистки человеческого рекомбинантного ингибитора альфа-протеазы (recA1PI), полученного из культуры клеток, и удаления окрашенных компонентов, которые совместно очищаются с белком recA1PI.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1
1
1
1
Ингибитор альфа протеиназы (сокращенное обозначение в данной заявке A1PI; также является известным как ингибитор альфа-1 протеазы, альфа-1 PI, API, α-1 PI, αPI, ингибитор альфа-1 трипсина, альфа антитрипсин, альфа-1 антитрипсин, альфа1АТ, А1А, и А1АТ, ААТ, среди прочих), представляет собой основной ингибитор серинпротеазы (серпин) у людей. A1PI экспрессируется как белок из 418 аминокислот с остатками 1-24, которые представляют собой сигнальный пептид. Зрелый белок, который состоит из остатков 25-418, представляет собой одноцепочечный гликопротеин, который имеет молекулярный вес приблизительно 51 кДа. Смотри Фигуру 1. Несмотря на то, что A1PI не содержит каких-либо дисульфидных связей, белок является высоко структурированным, с 80% аминокислот, которые размещаются в восьми хорошо определенных α-спиралях и трех больших β-складках. Три связанных с аспарагином углевода обнаруживаются на Asn 70, Asn 107 и Asn 271 (нумерация как в белке полной длины). Это позволяет образовываться многочисленным A1PI изоформам, которые имеют изоэлектрические точки в интервале от 4,0 до 5,0. Гликанмоносахариды включают N-ацетилглюкозамин, маннозу, галактозу, фукозу и сиаловую кислоту.
Нормальные концентрации A1PI в плазме крови колеблятся от 1,3 до 3,5 мг/мл. A1PI функционирует путем защиты клеток от протеаз, вовлеченных в свертывание крови и воспаление. A1PI ингибирует трипсин, химотрипсин, различные формы эластаз, кожную коллагеназу, ренин, урокиназу и протеазы полиморфо-ядерных лейкоцитов, среди прочих. A1PI служит в качестве псевдосубстрата для этих протеаз, которые атакуют реактивный центр петли молекулы A1PI (остатки Gly 368-Lys 392) путем расщепления связи между остатками Met 358-Ser 359, которые формируют A1PI-протеазный комплекс. Этот комплекс быстро удаляется из системы циркуляции крови. Одна из эндогенных ролей A1PI заключается в регуляции активности эластазы нейтрофилов, которая расщепляют чужеродные белки и повреждает нативную ткань легких. При отсутствии достаточных количеств A1PI эластаза расщепляет ткань легких, что со временем приводит к хроническому повреждению ткани легких и эмфиземе.
A1PI часто очищают из плазмы крови. Смотри, например, патенты США №№6,284,874; 6,462,180; 6,093,804; 7,879,800; и WO 1998/000154; WO 2002/048176; WO 2010/009388, например. Кроме того, рекомбинантный A1PI (recA1PI) может экспрессироваться и очищаться из разнообразных источников. Смотри, например, патенты США 4,931,373 и 5,134,119; публикации патентных заявок США US 2004/0124143 и US 2007/0218535; публикация PCT WO 2005/047323 и WO 2010/127939; и Archibald и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5178-5182 (1990); Wright и др., Nat. Biotechnology 9: 830 (1991).
В данной заявке являются описанными способы для экспрессии и очистки человеческого рекомбинантного A1PI, полученного из культуры клеток. После очистки раствор A1PI имеет желтый или янтарный цвет, который может быть неприемлемым для лечащих врачей и/или пациентов. Способы устранения окраски также описываются в данной заявке.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одно воплощение, описанное в данной заявке, представляет собой способ устранения количества красящего вещества в растворе, содержащем ингибитор альфа1 протеиназы, полученном из культуры клеток (recA1PI), включающий инкубирование раствора, включающего recA1PI, с восстанавливающим агентом и отделение recA1PI от красящего вещества.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин или DTT.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет приблизительно 10 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет приблизительно 1 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, этап восстанавливающего инкубирования осуществляют в течение периода времени от приблизительно 1 до приблизительно 24 часов.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, этап восстанавливающего инкубирования осуществляют при температуре от приблизительно 2°C до приблизительно 60°C.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой 10 мМ цистеин, и инкубирование осуществляют в течение ночи при приблизительно комнатной температуре.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, отделение recA1PI от красящего вещества включает хроматографию.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, хроматография включает ионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрацию, аффинную и иммуноаффинную хроматографию, или их комбинации.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, способ включает снижение концентрации железа.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрацию железа снижают (то есть, уменьшают) в 2-100 раз.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрацию железа снижают (то есть, уменьшают) в 5-50 раз.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация железа составляет 10 мкМ или менее.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация железа составляет 1 мкМ или менее.
Другое воплощение, описанное в данной заявке, представляет собой способ очистки человеческого A1PI, полученного из культуры клеток, из водного раствора, содержащего recA1PI, включающий: (а) проведение этапа вирусной инактивации раствора, содержащего recA1PI; (b) пропускание раствора, подвергнутого вирусной инактивации, через анионообменник так, что recA1PI связывается с анионообменником; (с) элюирование recA1PI из анионообменной смолы с получением анионообменного элюата, содержащего recA1PI; (d) прибавление восстанавливающего агента к анионообменному элюату, содержащему recA1PI с получением восстанавливающего раствора; (е) инкубирование восстанавливающего раствора; (f) пропускание восстанавливающего раствора через смолу для хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия (HIC) так что recA1PI связывается с HIC смолой; и (g) элюирование recA1PI из HIC смолы с получением HIC элюата, который содержит recA1PI.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, вирусная инактивация включает инкубацию с растворителем/детергентом.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, растворитель прибавляют в интервале от 0,01% до приблизительно 0,5%.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, детергент прибавляют в количестве от 0,5% до приблизительно 2,0% веса на объем полученной смеси.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, инкубация с растворителем/детергентом включает прибавление приблизительно 0,5% полисорбата 20 и приблизительно 0,03% три(н-бутил фосфата) при pH приблизительно 8 и температуре приблизительно 30°C.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, анионообменник представляет собой смолу четвертичного аммония.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, смола четвертичного аммония представляет собой Capto™ Q.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин (Cys); цистеамин; дитиотреитол (DTT); дитиоэритритол (DTE); глутатион (GSH); 2-меркаптоэтанол (2-ME); 2-меркаптоэтиламин (2-MEA); трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP); щавелевую кислоту; муравьиную кислоту; аскорбиновую кислоту; никотинамид аденин динуклеотид (NADH); никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH); или их комбинации.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин или DTT.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет от приблизительно 1 мМ до 100 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет приблизительно 10 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет приблизительно 1 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, этап восстанавливающего инкубирования осуществляют в течение приблизительно от 1 до 24 часов.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, этап восстанавливающего инкубирования осуществляют при температуре от приблизительно 2°C до 60°C.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой 10 мМ цистеин, и инкубацию осуществляют в течение ночи при приблизительно комнатной температуре.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, HIC смола представляет собой Octyl Sepharose™ или Capto™ Octyl.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, способ включает снижение концентрации железа.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрацию железа снижают (то есть, уменьшают) в 2-100 раз.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрацию железа снижают (то есть, уменьшают) в 5-50 раз.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация железа составляет 10 мкМ или менее.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация железа составляет 1 мкМ или менее.
Другое воплощение, описанное в данной заявке, представляет собой способ очистки ингибитора альфа1 протеиназы (recA1PI), полученной из культуры клеток, включающий инкубирование раствора, включающего recA1PI, с восстанавливающим агентом и отделение recA1PI от восстанавливающего агента и восстановленных компонентов.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин или DTT.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой цистеин.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет приблизительно 10 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация восстанавливающего агента составляет приблизительно 1 мМ.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, этап инкубации осуществляют в течение периода времени от приблизительно 1 до приблизительно 24 часов.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, этап инкубации осуществляют при температуре от приблизительно 2°C до приблизительно 60°C.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстанавливающий агент представляет собой приблизительно 10 мМ цистеин, и инкубацию осуществляют в течение ночи при приблизительно комнатной температуре.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, отделение recA1PI от восстанавливающего агента и восстановленных компонентов включает хроматографию.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, хроматография включает ионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрацию, аффинную и иммуноаффинную хроматографию, или их комбинации.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, восстановленные компоненты включают железо.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрацию железа снижают (то есть, уменьшают) в 2-100 раз.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрацию железа снижают то есть, уменьшают) в 5-50 раз.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация железа составляет 10 мкМ или менее.
В некоторых аспектах, описанных в данной заявке, концентрация железа составляет 1 мкМ или менее.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГУРА 1 иллюстрирует первичную последовательность человеческого A1PI и
характерные сайты модификации.
ФИГУРА 2 показывает блок-схему процесса очистки, используемого для очистки recA1PI, что приводит к получению очищенного раствора recA1PI, имеющего желтый цвет.
ФИГУРА 3 показывает хроматограмму образца recA1PI, очищенного с помощью иммуноаффинной хроматографии (то есть, смолы АТТ Select, GE Healthcare Life Sciences).
ФИГУРА 4 показывает спектр в видимой и УФ-области образца recA1PI, очищенного с помощью иммуноаффинной хроматографии (то есть, смолы АТТ Select, GE Healthcare Life Sciences).
ФИГУРА 5 показывает хроматограмму образца recA1PI, очищенного с помощью гель-фильтрационной хроматографии (то есть эксклюзионной хроматографии размеров) при использовании Superdex™ 200 смолы препаративной степени чистоты (GE Healthcare Life Sciences).
ФИГУРА 6 показывает спектры в видимой и УФ-области образца recA1PI, очищенного с помощью гель-фильтрационной хроматографии (то есть, эксклюзионной хроматографии размеров) при использовании Superdex™ 200 смолы препаративной степени чистоты (GE Healthcare Life Sciences).
ФИГУРА 7 показывает спектры в видимой и УФ-области образцов человеческого рекомбинантного A1PI, полученного с помощью культуры клеток, имеющих желтый цвет. Образец 1 содержит 4 М гуанидин гидрохлорид (Gdn-HCl); образец 2 содержит 50 мМ дитиотреитола (DTT); образец 3 содержит как 4 М Gdn-HCl, так и 50 мМ DTT.
ФИГУРА 8 показывает хроматограмму recA1PI, обработанного с помощью 50 мМ DTT и потом очищенного с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
ФИГУРА 9 показывает хроматограмму recA1PI без обработки DTT и потом очищенного с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
ФИГУРА 10 показывает спектры в видимой и УФ-области образцов recA1PI, recA1PI, обработанного с помощью 50 мМ DTT, и высоко очищенного A1PI, полученного из плазмы крови.
ФИГУРА 11 показывает спектры в видимой и УФ-области образцов recA1PI, recA1PI, обработанного с помощью 50 мМ DTT, и recA1PI, обработанного с помощью 10 мМ DTT.
ФИГУРА 12 показывает хроматограмму из анализа гель-фильтрационной хроматографии с использованием 50 мМ DTT в PBS.
ФИГУРА 13 показывает хроматограмму из анализа гель-фильтрационной хроматографии recA1PI, обработанного с помощью 50 мМ DTT в PBS.
ФИГУРА 14 показывает хроматограмму из анализа гель-фильтрационной хроматографии очищенного, полученного из плазмы A1PI, обработанного с помощью 10 мМ DTT.
ФИГУРА 15 показывает хроматограмму, полученную при использовании гель-фильтрационной колонки, для recA1PI, обработанного с помощью 10 мМ цистеина.
ФИГУРА 16 показывает блок-схему модифицированной процедуры очистки recA1PI, включая этап инкубации с цистеином. Следует отметить, что инкубация с цистеином может осуществляться на других этапах в этом процессе, как, например, после хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия или после пропускания через катионообменную мембрану (выделено жирными стрелками).
ФИГУРА 17 показывает хроматограмму, полученную при использовании хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия на Octyl Sepharose™, для recA1PI, не обработанного цистеином.
ФИГУРА 18 показывает хроматограмму, полученную при использовании хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия на Octyl Sepharose™ для recA1PI после обработки 10 мМ цистеином.
ФИГУРА 19 показывает спектры в видимой и УФ-области recA1PI, recA1PI, обработанного с помощью 10 мМ цистеина, или высоко очищенного A1PI, полученного из плазмы крови.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
1
В данной заявке описываются способы для очистки рекомбинантного, полученного из культуры клеток ингибитора альфа-протеазы и удаления окрашенных компонентов которые очищаются вместе с recA1PI белком.
Один аспект, описанный в данной заявке представляет собой способ очистки рекомбинантного, человеческого A1PI, полученного из культуры клеток, из водного раствора, содержащего recA1PI.
Другой способ, описанный в данной заявке, представляет собой способ устранения окрашивания раствора рекомбинантного A1PI, полученного из культуры клеток, включающий инкубирование раствора recA1PI с восстанавливающим агентом и отделение recA1PI от восстанавливающего агента и красящих компонентов.
Другой способ, описанный в данной заявке, представляет собой способ очистки рекомбинантного A1PI, полученного из культуры клеток, включающий инкубирование раствора recA1PI с восстанавливающим агентом и отделение recA1PI от восстанавливающего агента и восстановленных компонентов.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Выращивание клеток и экспрессия человеческого рекомбинантного A1PI
Краткое описание
Экспрессию рекомбинантного человеческого A1PI начинают путем культивирования человеческих PER.C6 клеток (Crucell, Leiden, Netherlands), содержащих pAATopSTS плазмидную конструкцию для экспрессии гликозилированного человеческого recA1PI. Эти клетки являются способными к продукции высоких выходов гликозилированного recA1PI, то есть, вплоть до 22 пикограмм recA1PI на клетку в день (pcd). Культуру PER.C6/recA1PI получали посредством проведения серийного размножения в волновом биореактора на 10 л и биореакторе на 200 л с плановым рабочим объемом 150 л. Культуральный супернатант, содержащий recA1PI, собирали через 13-14 дней путем центрифугирования при 6000 об./мин. в центрифуге Celeros (Celeros Separations, Foxboro, MA), после чего осуществляли фильтрацию перед проведением очистки.
Последовательное размораживания пробирок и инокуляция флаконов для встряхивания
1
2
2
2
2
6
6
6
6
6
6
6
6
Процесс культивирования клеток начинали с размораживания криопробирок с PER.C6 (Crucell) человеческими клетками, содержащими pAATopSTS плазмидную конструкцию, для экспрессии гликозилированного человеческого recA1PI. Описания клона человеческого рекомбинантного ингибитора альфа протеазы, экспрессии и анализов экспрессированного рекомбинантного A1PI являются представленными в WO 2010/127939 и патентной заявке США №13/138,912, которые являются введенными в данную заявку в качестве ссылки для обучения. После размораживания пробирок с клетками их переносили во встряхиваемую колбу с плоским дном на 125 мл и доводили содержимое до получения заключительного объема 15-25 мл CDM4PERMAb™ минимальной питательной среды (Hyclone) для получения плотности жизнеспособных клеток 0,5×10±0,1×10 клеток/мл. Встряхиваемую колбу на 125 мл (пассаж #1) инкубировали в течение 96±4 часов при 90 об./мин., 36,5°C, 5,0% CO. Потом клетки переносили во встряхиваемую колбу на 250 мл с плоским дном с финальным объемом 100 мл и плотностью жизнеспособных клеток 0,5×10±0,1×10 клеток/мл. Встряхиваемую колбу с плоским дном на 250 мл (пассаж #2) инкубировали в течение от 72 до 96 часов (±4 часов) при 125 об./мин., 36,5°C, 5,0% CO. Потом клетки переносили во встряхиваемую колбу с плоским дном на 500 мл с финальным объемом 250 мл и плотностью жизнеспособных клеток 0,5×10±0,1×10 клеток/мл. Встряхиваемую колбу с плоским дном на 500 мл (пассаж #3) инкубировали в течение от 72 до 96 часов (±4 часов) при 125 об./мин., 36,5°C, 5,0% CO. Потом клетки переносили во встряхиваемую колбу с плоским дном на 1 л с финальным объемом 600 мл и плотностью жизнеспособных клеток 0,5×10±0,1×10 клеток/мл. Встряхиваемую колбу с плоским дном на 1 л (пассаж #4) инкубировали в течение от 72 до 96 часов (±4 часов) при 125 об./мин., 36,5°C, 5,0% CO.
Инокуляция волнового биореактора
6
6
6
6
2
2
Объем из встряхиваемой колбы на 1 л переносили в Cellbag на 10 л в биореактор 20/50ЕН Wave™ (GE Healthcare Life Sciences) для получения рабочего объема 3,0-4,0 л и плотности жизнеспособных клеток 0,5×10±0,1×10 клеток/мл. Cellbag на 10 л выращивали в течение от 72 до 96 часов (±4 часов) при 25 об./мин., с углом качания 7°, скоростью потока воздуха 0,2 литра в минуту (Ipm), 36,5°C, и 3,0% CO. Объем из 10 л Cellbag переносили в Cellbag на 50 л в 20/50ЕН волновой биореактор до получения рабочего объема 22-25 л и плотности жизнеспособных клеток 0,5×10±0,1×10 клеток/мл. Время культивирования Cellbag на 50 л составляло от 72 до 96 часов (±4 часов) при 22 об./мин., угол качания 7°, скорость потока воздуха 0,3 Ipm, 36,5°C и 3,0% CO.
Биореактор на 200 л
6
6
2
Содержание Cellbag на 50 л переносили в биореактор Xcellerex на 200 л с помощью стерильного соединения Kleenpak™ (Xcellerex, Marlborough, MA). Биореактор на 200 л должен содержать минимальное количество (100 л) CDM4PERMAb™ минимальной среды (Hyclone) и включали его в работу при 36,5°C, 120 об./мин., с pH в интервале 7,2±0,4 перед прибавлением инокулята. Заключительный объем составлял 150 л при плотности жизнеспособных клеток 0,6×10 клеток/мл ± 0,1x10 клеток/мл. Зона нечувствительности pH (участок интервала сигнала, где не возникает никакого действия) составляла 7,2±0,4, заданное значение для растворенного кислорода составляло 50%. Значение pH поддерживали путем прибавления 1 N раствора карбоната натрия или газообразного CO. Через 96 часов (±4 часов), прибавляли PerMAB™ питательную среду (Hyclone) в виде ежедневного болюсного впрыскивания, равного 0,3% исходного рабочего объема, в биореактор; питательную среду прибавляли при скорости введения 100-300 мл/мин. Питательную среду поддерживали при комнатной температуре при введении и закрывали для предотвращения какой-либо деградации, вызванной светом. Прибавляли антивспенивающий агент в начале введения в количестве 12 частей на млн. малыми порциями для поддержании уровня ценообразования в биореакторе, который составлял 2 дюйма или менее. Продукт культивирования биореактора на 200 л собирали через 308-340 часов (12,8-14,2 дней).
Центрифугирование и фильтрование
2
Материал из биореактора на 200 л переносили в резервуар Celeros APD-75 на 1 л при скорости вытекания 0,5 Ipm и скорости центрифугирования 6000 об./мин. (Celeros Separations, Foxboro, MA). Процентное содержание сухого вещества подсчитывали перед осуществлением переноса для определения количества необходимых разгрузочных резервуаров (резервуар на 1 л может содержать 1 кг твердого вещества). Жидкость, сбрасываемая из центрифуги (осветленный раствор, полученный в результате центрифугирования), переносили в Millipore Pilot POD сосуд, который содержит два 1,1 мА1НС фильтра при 1 Ipm (EMD Millipore, Billerica, MA). После проведения глубинной фильтрации материал фильтровали через фильтр Millipore SHC 0,5/0,2 мкм.
Пример 2
Очистка человеческого рекомбинантного A1PI из супернатанта культуры клеток
Краткое изложение
Очистка recA1PI начинается с трехчасовой обработки растворителем/детергентом для вирусной инактивации. Потом recA1PI захватывали и элюировали из Capto™ Q колонки (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ). На следующий день очистку продолжали на колонке Octyl Sepharose™. HIC элюат обрабатывали путем ультрафильтрации и диафильтрации для того, чтобы позволить осуществить очистку на S-мембране, после чего проводили нанофильтрацию для дополнительного выведения вируса. Этот материал подвергали замене буфера в заключительном буфере и концентрацию белка подвергали доводке для того, чтобы рецептировать массу.
Инактивация вируса в супернатанте культуры клеток
280
Обработанный путем глубинной фильтрации супернатант культуры клеток взвешивали, считывали значение A, и отбирали аликвоты путем взятия образцов. Значения температуры и pH для этапа вирусной инактивации составляли 28°C±2°C и pH 7,8±0,2. 100-х маточный раствор TNBP/полисорбат 20, который использовали для обработки, готовили путем смешивания 0,5 кг полисорбата 20, 0,06 кг три-(н-бутил)фосфата (TNBP) и воды для инъекций (WFI) для приготовления 1 литра раствора. Этот маточный раствор прибавляли к супернатанту культуры клеток при 100-кратном разведении и обработку осуществляли в течение 2,5 часов при перемешивании. Заключительные концентрации составляли 0,5% для полисорбата 20 и 0,03% для TNBP. После обработки с помощью TNBP/полисорбата 20 супернатант культуры клеток фильтровали.
Фильтрование
Фильтровальный диск Cuno 120ZA (ЗМ, St. Paul, MN) промывали горячей водой для инъекций (HWFI) при скорости не больше 1 л/мин, в течение, по крайней мере, 10-минут.После этого осуществляли промывку холодной водой для инъекций (CWFI) в количестве не менее 2 л и, в завершение, высушивали воздухом при 20 psi. Обработанный смесью TNBP/полисорбат 20 супернатант культуры клеток пропускали через этот фильтр при использовании давления воздуха не менее чем 20 psi и скорости потока не более чем 1 л/минута. Отбирали аликвоты путем взятия образцов и оставляли их.
Анионообменная хроматография
Этот этап служит для захвата recA1PI и удаления белков хозяйских клеток (НСР) в элюате. Использовали колонку с размерами: внутренний диаметр 30 см × толщина слоя поглощающего материала 14 см (объем слоя 10 л). pH супернатанта культуры клеток, обработанного смесью TNBP/полисорбат 20, вновь доводили до значения 7,0±0,1. Измеряли электропроводность обработанного растворителем/детергентом супернатанта перед загрузкой колонки. Определяли количество внешнего WFI разбавителя для того, чтобы быть уверенным в том, что электропроводность была не выше чем 4 мС/см во время загрузки колонки при соответствующем разведении.
2
4
2
4
2
4
2
4
Программу Unicorn (GE Healthcare Life Sciences) использовали для разгона Capto™ Q. колонки (GE Healthcare Life Science), и подводящую линию хроматографической системы помещали в приемлемые буферные емкости. Durapore 0,3 мкМ встроенный фильтр (Millipore) заменяли для каждой хроматографической прогонки. Колонку Capto™ Q уравновешивали с помощью 1 объема колонки (CV) 0,5 М ледяной уксусной кислоты, после чего осуществляли уравновешивание с помощью 5 CV 20 мМ NaHPO, pH 6,0. Супернатант клеточной культуры загружали на колонку Capto™ Q с помощью подключенной системы разведения водой для инъекций (WFI). Хроматографическую систему программировали для осуществления загрузки при электропроводности не более чем 4 мС/см при линейной скорости потока 300 см/час. После загрузки проводили короткую прогонку при использовании WFI. Колонку промывали при использовании 8 CV промывочного буфера (20 мМ NaHPO, 20 мМ NaCl pH 6,0) перед повторным уравновешиванием при использовании 2 CV 20 мМ NaHPO, pH 6,0. Элюирование осуществляли при использовании 8 CV градиента, заканчивающегося при 25 мМ NaHPO, 200 мМ NaCl, pH 7,0 или путем поэтапного повышения концентрации NaCl. Одиночный пик элюирования recA1PI собирали, начиная от 4 CV в градиенте и сбор заканчивали при наблюдаемом УФ интервале 0,10 AU. Фракцию элюирования отбирали для анализа и хранения. Прибавляли L-цистеин к объединенному элюату при концентрации 10 мМ и оставляли для смешивания в течение ночи при комнатной температуре.
Хроматография на основе гидрофобного взаимодействия при использовании Octyl Sepharose™ FF
2
4
2
4
4
2
4
4
2
4
2
4
Хроматографическую колонку с внутренним диаметром 45 см и толщиной слоя поглощающего материала 9 см (15 л поглощающего раствора) Octyl Sepharose™ 4 FF на основе гидрофобного взаимодействия (HIC) (GE Healthcare Life Sciences) уравновешивали с помощью 8 CV HIC буфера для уравновешивания (25 мМ NaHPO, 0,1 М NaCl, 1,75 М сульфата аммония, pH 7,0). Capto Q элюат, содержащий A1PI и цистеин, загружали путем промежуточного разведения буфером для разведения на основе октила (25 мМ NaHPO, 0,1 М NaCl, 3 М (NH)SO, pH 7,0) при скорости потока 150 см/час до достижения заключительной концентрации 1,75 М (NH)SO в загрузочном материале. После загрузки колонку промывали с помощью 5 CV HIC буфера для уравновешивания. Элюирование осуществляли при использовании обратного градиента соли, начиная от 1,75 М сульфата аммония в промывочном буфере до буфера для элюирования (20 мМ NaHPO, pH 6,0) свыше 10 CV. Наблюдаемое УФ поглощение при уровне 0,05 AU фронта и 0,10 AU в хвосте использовали для сбора пула элюата.
Ультрафильтрация и диафильтрация HIC элюата
2
280
280
Три фильтра 0,1 м с отсечением молекулярного веса (MWCO) 30 кДа промывали с помощью WFI при температуре 40-50°C до тех пор, пока pH пермеата и ретентата не составляло значение в интервале от 5 до 7. Давление подачи раствора устанавливали на 25 (например, в интервале от 24 до 28) индикаторных фунтов на квадратный дюйм до тех пор, пока давление на выходе не составляло 5 индикаторных фунтов на квадратный дюйм (например, в интервале от 4 до 8 индикаторных фунтов на квадратный дюйм). Систему уравновешивали с помощью 1-2 л HIC буфера для элюирования в течение не менее чем 10 минут. Смешивали HIC элюат и температуру поддерживали на уровне 15-25°C. Объем пермеата подвергали мониторингу, и UF останавливали тогда, когда концентрация достигала заданного значения A 30. После уменьшения объема поступающего раствора, диафильтрацию осуществляли с помощью 6 диаобъемов (DV) катионного буфера для уравновешивания (10 мМ цитрата натрия, pH 5,4). A ретентата проверяли для того, чтобы удостовериться, что оно составляет ≤30, и ретентат откачивали в чистую пробирку. Два объема 1 л катионного буфера для уравновешивания каждый подвергали повторной циркуляции при давлении поступающего раствора 10-15 индикаторных фунтов на квадратный дюйм в течение не менее 5 минут. Промывочные растворы соединяли с ретентатом.
Катионообменная хроматография при использовании S мембраны
2
Sartobind S мембрану в капсуле одноразового использования (Sartorius, Gottingen, Germany) с площадью поверхности мембраны 2500 см уравновешивали с помощью катионного буфера для уравновешивания (10 мМ цитрата натрия дигидрата, pH 5,4), убеждаясь в том, что электропроводность вытекающей жидкости была не менее 4 мС/см. Обработанный с помощью UF/DF HIC элюат загружали на S мембрану при скорости 25 л/час при использовании перистальтического насоса и последовательно промывали с помощью катионного буфера для уравновешивания до тех пор, пока значение A2go не составляло не менее 0,1 AU. Собирали жидкость, прошедшую через мембрану, и доводили значение до pH 7,0±0,1.
Нанофильтрация
2
2
Нанофильтрацию осуществляли при использовании Viresolve NFP (0,085 м; Millipore) с помощью предварительного фильтра Viresolve 0,11 м). Фильтрацию осуществляли при постоянном давлении, где давление могло быть не больше, чем 50 фунтов на квадратный дюйм. Нанофильтр промывали с помощью четырех объемов по 500 мл катионного буфера для уравновешивания.
Заключительная ультрафильтрация/диафильтрация
2
2
4
280
280
2
4
280
Фильтр с площадью поверхности 0,3 м с MWCO 10 кДа использовали на этом этапе. Держатель и фильтр промывали с помощью WFI при 40-50°C до тех пор, пока pH пермеата и ретентата не составляло такое в пределах от 5 до 7. Давление подачи раствора устанавливали на 25 (например, в интервале от 24 до 28) индикаторных фунтов на квадратный дюйм до тех пор, пока давление на выходе не составляло 5 индикаторных фунтов на квадратный дюйм (например, в интервале от 4 до 8 индикаторных фунтов на квадратный дюйм). Систему уравновешивали с помощью 1-2 л 20 мМ NaHPO, pH 7,0 в течение не менее чем 10 минут. Нанофильтрат хорошо смешивали и температуру поддерживали на уровне 15-25°C. Периодически проверяли пермеат в отношении потери recA1PI путем измерения его поглощения при 280 нм (то есть, A), которая должна быть <0,04. Если этот объем превышался, то UF/DF останавливали. Объем пермеата подвергали мониторингу, и UF останавливали тогда, когда концентрация достигала заданного значения A 30. После уменьшения объема поступающего раствора диафильтрацию осуществляли с помощью 5 DV буфера для диафильтрации (20 мМ NaHPO, 120 мМ NaCl, pH 7,0). Значение A ретентата проверяли для того, чтобы удостовериться, что оно составляет ≤30, и ретентат откачивали в чистую пробирку. Подсчитывали количество диафильтрационного буфера для промывания, которое при добавлении к ретентату будет приводить к получению заключительной концентрации 50-56 мг/мл. Этот промывочный раствор разделяли пополам, и каждый объем подвергали повторной циркуляции с давлением поступающего раствора не более чем 20 индикаторных фунтов на квадратный дюйм в течение 3-5 минут. Промывочные растворы соединяли с ретентатом.
Хранение
Концентрированную массу рекомбинантного A1PI подвергали стерильной фильтрации в Flexel пакеты (Sartorius) и хранили при -70°C, до заключительного заполнения.
recA1PI, полученный с помощью способа, описанного выше, был определен как такой, который имеет яркий желтый цвет. Природа желтых компонентов была неизвестной. Несмотря на то, что recA1PI был в высокой степени был очищенным и являлся активным, удаление желтого красящего вещества является желательным по эстетическим соображениям.
Пример 3
Иммуноаффинная хроматография при использовании альфа-1 антитрипсин
избирательной смолы
A1PI-специфическую иммуноаффинную хроматографию осуществляли для того, чтобы определить, могут ли желтые компоненты быть отделены от очищенного recA1PI. Упаковывали колонку с внутренним диаметром 1,6 см и высотой поглощающего слоя 10 см (20 мл объема колонки) альфа-1 антитрипсин избирательной смолы (AAT-Select; GE Healthcare Life Science), специфической для H1PI, полученного из плазмы крови. Колонку уравновешивали при использовании 20 мМ Трис⋅HCl, pH 7,4. Примерно 200 мг recA1PI при концентрации 10 мг/мл загружали на эту колонку при скорости 5 мл/минута. Колонку промывали с помощью 20 мМ Трис⋅HCl, pH 7,4, 100 мМ NaCl и элюировали при использовании 20 мМ Трис⋅HCl, pH 7,4, 2 М NaCl (смотри Фигуру 3). Фракции собирали на основе фракционирования пиков. Фракции пика элюирования объединяли и концентрировали при использовании Amicon UltraCel™ 30 кДа MWCO устройства для концентрирования (EMD Millipore, Billerica, MA). Спектры в видимой и УФ-области получали при использовании концентрированного образца.
После концентрации элюат был ярко желтым. При анализе с помощью спектроскопии в видимой и УФ-области [смотри Фигуру 4) спектр был очень подобным тому, который наблюдали для recA1PI перед разгоном иммуноаффинной колонки. Вывод, который можно сделать из этого результата, заключается в том, что иммуноаффинная хроматография была неэффективной для устранения желтого цвета из recA1PI.
Пример 4 Гель-фильтрационная хроматография при использовании смолы Superdex™ 200
Эксперимент по гель-фильтрации (aka эксклюзионная хроматография размеров; SEC) также предусматривал попытку устранения желтых компонентов из recA1PI. Упаковывали колонку с внутренним диаметром 1,6 см и высотой поглощающего слоя 90 см (поглощающий объем 181 мл) смолы Superdex™ 200 препаративной марки (GE Healthcare Life Sciences). Колонку уравновешивали с помощью забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS; 12 мМ фосфаты, pH 7,4,137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl). recA1PI загружали при количестве 5% объема колонки (9 мл) и разгоняли при 2 мл/минута (60 см/час.). Фракции объемом 12 мл собирали для анализа.
Хроматограмма для этой колонки является показанной на Фигуре 5. Несмотря на то, что загрузка составляла 99% recA1PI, наблюдали расщепление пика, возможно, по причине насыщения УФ детектора. Фракции этого пика подвергали анализу с помощью спектрофотометрии в видимой и УФ-области (Фигура 6). Фракции recA1P были визуально желтыми, и спектры в видимой и УФ-области этих фракций были подобными таким загружаемого материала. В соответствии с этим, колонка для гель-фильтрации не удаляет желтую окраску recA1PI.
Пример 5 Анализы денатурирующего и восстанавливающего агентов
Поскольку иммуноаффинная и гель-фильтрационная хроматография не были успешными в удалении желтой окраски из recA1PI, применение денатурирующих агентов и/или восстанавливающих агентов предполагается в качестве потенциального средства для удаления или устранения желтой окраски.
Приблизительно 1 мл recA1PI смешивали с 8 М гуанидин гидрохлоридом или 500 мМ DTT для достижения заключительной концентрации гуанидин гидрохлорида 4 М или 50 мМ DTT, соответственно. Третий образец смешивали с обоими агентами. Образцы инкубировали при 50°C в течение приблизительно 2 часа и по отдельности пропускали через PD-10 колонки для обессоливания (GE Healthcare Life Sciences). Продукт, который прошел через эти колонки, собирали путем центрифугирования при 1000× g в течение 5 минут.
Гуанидин гидрохлорид не оказывал помощи в снижении окрашивания образца, и это отражалось в спектре в видимой и УФ-области этого образца (Фигура 7). Образец, обработанный с помощью 50 мМ DTT, имел более слабую желтую окраску по сравнению с образцом, обработанным с помощью гуанидин гидрохлорида. Этот образец не имел спектральной характеристики при 405 нм, что является характерным для recA1PI (Фигура 7). Образец, обработанный с помощью комбинации гуанидина и DTT, был почти бесцветным и не имел спектральных характеристик в интервале спектра 300-400 нм. Тот факт, что оба агента, как гуанидин гидрохлорид, так и DTT, являются необходимыми для устранения желтой окраски, может свидетельствовать о том, что окрашенный в желтый цвет компонент является ковалентно связанным с recA1PI.
Пример 6 Восстановление и хроматография на основе гель-фильтрации
Осуществляли дополнительные эксперименты для контроля DTT восстановления, и гель-фильтрационную хроматографию проводили при использовании PD-10 колонок. В данном случае цель заключалась в использовании более длинной колонки для достижения лучшего разрешения обработанного DTT образца и для процессирования большего количества восстановленного recA1PI для анализа.
Готовили колонку с внутренним диаметром 1,6 см и высотой поглощающего слоя 90 см (181 мл объема колонки) со смолой Superdex™ 200 препаративной марки (GE Healthcare Life Sciences). Эту колонку предварительно уравновешивали с помощью PBS, содержащего 5 мМ DTT. Образец recA1PI в объеме 9 мл обрабатывали с помощью DTT при концентрации 50 мМ при комнатной температуре в течение ночи. Этот образец загружали на колонку; загрузка составляла 5% от объема колонки и колонку разгоняли при скорости 2 мл/минута (60 см/час). Постоянный объем фракций 14,5 мл собирали для анализа. Приемлемые фракции объединяли и концентрировали до приблизительно 50 мг/мл с использованием Amicon UltraCel™ 30 кДа MWCO центрифужного концентратора (Millipore). Контрольный образец, который не обрабатывали DTT, также разгоняли при идентичных условиях.
Хроматограмма для образца, обработанного с помощью 50 мМ DTT, является представленной на Фигуре 8, а контрольный образец является представленным на Фигуре 9. Существовал различимый небольшой второй пик, который наблюдали при SEC разгоне обработанного DDT образца. Фракции B1-B3, содержащие recA1PI, собирали и концентрировали до концентрации приблизительно 50 мг/мл при использовании 30 кДа MWCO центрифужного концентратора. Концентрированный образец подвергали анализу с помощью спектрофотометрии в УФ- и видимой части спектра. Спектры в УФ- и видимой части, показанные на Фигура 10, демонстрирую, что характерная сигнатура исходного желтого материала, recA1PI, значительно устранялась в концентрате, полученном из восстановленного гель-фильтрационного элюата. Высоко очищенный человеческий A1PI, полученный из культуры клеток, использовали в качестве контроля.
Пример 7 Анализ концентрации DTT
Анализировали эффекты более низких концентраций DTT путем инкубации recA1PI с DTT, очистки образца при использовании гель-фильтрационной хроматографии, и потом получали спектры в УФ и видимой части концентрированных, очищенных образцов. Использовали колонку с внутренним диаметром 1,6 см и высотой поглощающего слоя 90 см (181 мл объема колонки) со смолой Superdex™ 200 препаративной марки (GE Healthcare Life Sciences). Эту колонку предварительно уравновешивали с помощью PBS, содержащего 5 мМ DTT. recA1PI в объеме 9 мл обрабатывали с помощью DTT при приемлемой концентрации при комнатной температуре в течение ночи. Загрузка составляла 5% от объема колонки, и колонку разгоняли при скорости 2 мл/минута (60 см/час). Собирали постоянный объем фракций 14,5 мл. Приемлемые фракции объединяли и концентрировали до приблизительно 50 мг/мл с использованием Amicon UltraCel™ 30 кДа MWCO центрифужных концентраторов
Спектры в УФ- и видимой части образцов, обработанных с помощью 10 мМ DTT и 50 мМ DTT, показывают, что концентрация 10 мМ DTT является эффективной, как и концентрация 50 мМ DTT, для устранения характерной спектральной сигнатуры окрашенного в желтый цвет recA1PI (Фигура 11).
Пример 8
Биоаналитический анализ на обработанном DTT, очищенном с помощью гель-фильтрации recA1PI MALDI TOF анализ
Эксперименты по лазерной десорбции/ионизации в присутствии матрицы с пролетной масс-спектрометрией осуществляли на recA1PI. Ожидалось, что небольшие пики, полученные путем обработки DTT, которые имеют желтый цвет, могут содержать компоненты, неидентифицируемые с помощью масс-спектрометрии. Однако ничего не было идентифицировано в этих образцах. Эффекты матрикса могут препятствовать ионизации молекул в интервале 100-10000 Да.
Концентрация железа
x
4
y
6
5
7
Ионы железа предполагаются в качестве возможного источника желтой окраски. Железо представляет собой основной металл переходной валентности в культуре клеток и прибавляется к культуральной среде для наращивания биомассы в виде двойной соли лимоннокислого железа, Fe(NH)CHO. Анализ железа показал, что ~30-кратное снижение содержания железа в объединенных фракциях восстановленного с помощью DTT recA1PI из колонки для гель-фильтрации является сравнимым с исходным материалом, который содержал 66 мкМ железа. Смотри Фигуру 13. Желтые компоненты, обозначенные стрелкой на хроматограмме, содержали ~50% железа от загруженного количества.
Анализ активности
Ни одна из других фракций меньших пиков, отличных от фракций основного пика, не имела активности recA1PI.
Пример 9 DTT гель-фильтрационный анализ
Разгон хроматографии завершали DTT, взятым отдельно при отсутствии recA1PI для того, чтобы увидеть хроматографический профиль DTT при отсутствии recA1PI. Наблюдали один пик с объемом элюирования 201 мл (Фигура 12), который соответствует последнему пику, идентичного объема элюирования, который наблюдали в тестовом прогоне с recA1PI образцом. Фракция со слабой желтой окраской, соответствующая пику, обозначенная стрелкой на Фигуре 13, представляет собой уникальный обработанный DTT образец recA1PI и является отсутствующей в контрольном прогоне, где присутствовал только DTT.
Пример 10 Обработка очищенного A1PI, полученного из плазмы крови, с помощью 10 мМ DTT
A1PI продукт, полученный из плазмы крови, который имеет желтую окраску, подвергали анализу для определения, будет ли обработка при использовании восстанавливающего агента также приводить к подобному уменьшению желтой окраски. Аликвоту 10 мл A1PI, полученного из плазмы крови при концентрации приблизительно 50 мг/мл обрабатывали с помощью DTT при заключительной концентрации 10 мМ. Хроматографию на основе гель-фильтрации на смоле Superdex™ 200 препаративной марки осуществляли так, как описано в данной заявке (GE Healthcare Life Sciences). Хроматограмма разгона при использовании обработанного DTT A1PI, полученного из плазмы крови, является представленной на Фигуре 14.
Фракции, соответствующие recA1PI, под основным пиком собирали и концентрировали до 50 мг/мл. Окраска образца не отличалась от таковой необработанного образца. Это свидетельствует о том, что источник желтой окраски recA1PI, полученного с помощью культуры клеток, отличался от такового для A1PI, полученного из плазмы крови.
Пример 11 Анализ цистеина в качестве восстанавливающего агента
Цистеин проверяли как альтернативный восстанавливающий агент, поскольку цистеин является недорогим и легко доступным. Кроме того, как аминокислота цистеин представляет собой приемлемый наполнитель. Эксперимент завершали тогда, когда аликвоту recA1PI обрабатывали с помощью 10 мМ цистеина и подвергали процессингу при использовании колонки для гель-фильтрации. Хроматограмма для прогона является показанной на Фигуре 15. Фракции, соответствующие recA1PI, собирали и концентрировали до 50 мг/мл. Цистеин также является приемлемым в качестве восстанавливающего агента.
Пример 12 Анализ окраски
280
405
280
405
280
405
280
405
Сравнение цвета образцов, обработанных либо с помощью DTT, либо с помощью цистеина при концентрации 10 мМ, показывает существенное снижение желтой окраски, при сравнимой концентрации белка (~50 мг/мл). Соотношение A/A использовали в качестве индикатора желтизны образца, разумным объяснением является то, что поглощение раствора при 405 нм является количественной оценкой желтой окраски. Более высокое значение соотношения A/A соответствует более светлому желтому цвету образца. Значительная желтая окраска необработанного образца в значительной степени устраняется путем обработки либо с помощью DTT, либо цистеина. Однако устранение желтой окраски не было полным, и легкий желтый оттенок оставался в обработанных образцах. Соотношение A/A хорошо отслеживает эту тенденцию, и типично наблюдали 3-кратное снижение после обработки с помощью восстанавливающих агентов. Высоко очищенный A1PI, полученный из плазмы крови, является практически чистым со значение соотношения A/A 428.
Восстановление активности рекомбинантного A1PI, полученного из культуры клеток
Восстановление активности recA1PI, полученного в результате экспериментов с помощью эксклюзионной хроматографии размеров и обработки восстанавливающими агентами, колебалось в интервале 80-100% (смотри Таблицу 1).
Таблица 1
Восстановление активности рекомбинантного A1PI, полученного из культуры клеток, путем эксклюзионной хроматографии размеров после обработки с помощью DTT или цистеина
Образец
A<sub>280</sub>/A<sub>405</sub>
Восстановление активности
recA1PI #4
64
100%
recA1PI #4+50 мМ DTT
281
78%
recA1PI #6
66
100%
recA1PI #6+50 мМ DTT
186
108%*
recA1PI #6+10 мМ DTT
194
87%
recA1PI #6+10 мМ цистеин
171
90%
*Измеренная активность >100% была за счет вариабельности данных анализа и интерпретировалась как среднее значение без потери активности
Содержание железа
Концентрация железа в обработанных образцах была значительно сниженной после обработки восстанавливающими агентами и хроматографической очистки. Восстановленные и очищенные образцы подвергали анализу при использовании индуктивного спаренного плазменно-атомного эмиссионного спектрометра (ICP-AA). Степень снижения концентрации колебалась от приблизительно 14-кратной для образца, обработанного цистеином, до 27-кратной для образца, обработанного 10 мМ DTT - (Таблица 2) при сравнение с необработанными образцами.
Таблица 2
Концентрация железа для A1PI образцов, подвергнутых эксклюзионной хроматографии размеров после обработки с помощью DTT или цистеина
Образец
Концентрация железа (мкМ)
recA1PI #4
66,4
recA1PI #4+50 мМ DTT
3,0
recA1PI #6
12,6
recA1PI #6+10 мМ DTT
0,5
recA1PI #6+10 мМ цистеин
0,8
Пример 13
Модифицированная процедура очистки recA1PI: прибавление восстанавливающего
агента и инкубация после анионообменной хроматографии
2
4
2
4
2
4
280
2
4
4
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
Фигура 16 показывает диаграмму модифицированной процедуры очистки recA1PI, где цистеин прибавляют к объединенному ионообменному элюату. Модифицированная процедура является следующей. После этапа вирусной инактивации с помощью растворителя/детергента, супернатант культуры клеток, который имеет массу 11,2 кг, очищали на колонке Capto™ Q с внутренним диаметром 5 см и толщиной поглощающего слоя 25 см (500 мл) (GE Healthcare Life Sciences) при скорости 300 см/час. Колонку уравновешивали в 20 мМ NaHPO, pH 6,0; промывали с помощью 20 мМ NaHPO, 20 мМ NaCl, pH 6,0; и элюировали 25 мМ NaHPO, 200 мМ NaCl, pH 7,0, при использовании 8 CV. Значение A Q-элюата составляло 2,4, что соответствовало приемлемой эффективности 2 г/л. Аликвоту 500 мл этого Q-элюата, содержащую приблизительно 1 г recA1PI в соответствии с активностью, обрабатывали с помощью 10 мМ цистеина (Acros Chemicals; Thermo Fisher Scientific; New Jersey) и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи (~25°C приблизительно 16 часов). Обработанный образец разводили 42:58 с помощью HIC буфера для разведения 25 мМ NaHPO, 100 мМ NaCl, 3 М (NH)SO, pH 7,0, и использовали для загрузки колонки Octyl Sepharose™ с размерами: 5 см внутреннего диаметра ×10,3 см толщины поглощающего слоя (поглощающий объем 202 мл). Колонку уравновешивали с помощью 25 мМ NaHPO, 100 мМ NaCl, 1,75 М (NH)SO, pH 7,0, и элюировали при использовании градиента 20 мМ NaHPO, pH 6,0, с помощью 10 CV. Элюат объемом 620 мл концентрировали до 50 мл при использовании системы LabScale™ TFF и фильтра Pellicon 30 кДа, 3×50 см (Millipore). Образец дополнительно концентрировали до 50 мг/мл при использовании Amicon UltraCel™ 30 кДа MWCO концентратора (Millipore) путем центрифугирования при 3500 об./мин. при температуре 4°C. Сконцентрированный образец потом пропускали над капсулой Sartobind S-мембраны (Sartorius, Gottingen, Germany), уравновешенной в 10 мМ буфере на основе цитрата натрия, pH 5,4. Этот образец подвергали диафильтрации против 5 объемов колонки PBS.
280
405
Контрольный прогон также осуществляли при использовании идентичного объема Q-элюата и подвергали обработке при использовании HIC колонки идентичным образом, при отсутствии цистеина. Профили HIC хроматографии контроля и обработанных цистеином исследуемых образцов были сравнимыми (смотри Фигуру 17 и Фигуру 18). Это свидетельствует о том, что прибавление цистеина не меняет профиль очистки recA1PI для колонки гидрофобного взаимодействия. Когда образцы концентрировали до концентрации примерно 50 мг/мл, наблюдали существенное снижение желтой окраски, что соответствовало 3,4-кратному улучшению соотношения A/A (то есть, 73 против 245). Спектры в УФ- и видимой области также отражали это различие, с профилем образцов, обработанных цистеином, которые были сравнимыми с такими высоко очищенного A1PI, полученного из плазмы крови; смотри Фигуру 19.
280
405
В соответствии с этим, инкубация в течение ночи с цистеином между анионообменной колонкой и хроматографией гидрофобного взаимодействия (смотри Фигуру 16) в прогонах препаративного масштаба приводила к получению сравнимых результатов с такими для лабораторных экспериментов в отношении осветления желтой окраски, что соответствовало улучшению соотношения A/A.
Диапазон устройств и способов, описанных в данной заявке/ включает все комбинации воплощений, аспектов, примеров, этапов и предпочтений, описанных в ней.