СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К PD-L1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
SPECIFIC ANTIBODIES TO PD-L1 AND METHODS FOR THEIR APPLICATION

Список последовательностей
Настоящая заявка содержит список последовательностей, который предложен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки. Копия указанного ASCII, созданная 19 июня 2017, называется 099263-0802_SL.txt, и ее объем составляет 43085 байтов.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее раскрытие относится вообще к антителам и их функциональным связывающим фрагментам, которые связываются с лигандом 1 программируемой гибели клеток (PD-L1). В частности, раскрытые антитела и фрагменты связываются с человеческим PD-L1 и включают новые определяющие комплементарность участки (CDR). Наконец, настоящее раскрытие относится к введению предлагаемых антител и фрагментов субъектам с раковым заболеванием, причем посредством этого лечится или замедляется развитие или пролиферация рака.
Уровень техники
PD-L1 (раньше В7-Н1) является членом семейства В7, который экспрессируется на клетках многих типов, включая антигенпредставляющие клетки («АРС») и активированные Т-клетки (Yamazaki et al. (2002), J. Immunol., 169: 5538). PD-L1 связывается как с PD-1 (CD279), так и с B7-1. Как связывание PD-L1 B7-1, экспрессированного T-клетками, так и связывание B7-1 PD-L1, экспрессированного T-клетками, приводит к ингибированию Т-клеток (Butte et al. (2007), Immunity, 27: 111). Также доказано, что, подобно другим членам семейства B7, PD-L1 также может обеспечивать костимулирующие сигналы для Т-клеток (Subudhi et al. (2004), J. Clin. Invest., 113: 694; Tamura et al. (2001), Blood, 97: 1809). Кроме того, также показано, что экспрессия PD-L1 на клеточной поверхности усиливается через стимуляцию IFN-γ.
+
+
Взаимодействие между PD-1 и его лигандами-партнерами PD-L1 (B7-H1; CD274) и PD-L2 (B7-DC; CD273) является важным отрицательным костимулирующим путем передачи сигнала, вовлеченным в регуляцию активации Т-клеток. PD-1 может экспрессироваться на Т-клетках, В-клетках, природных киллерных Т-клетках, активированных моноцитах и дендритных клетках (DC). PD-1 экспрессируется активированными, но не нестимулированными, человеческими CD4 и CD8 T-клетками, B-клетками и миелоидными клетками (Nishimura et al., Int. Immunol., 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol., 80: 3532-40 (2006)). Существует по меньшей мере 4 варианта PD-1, которые клонированы из активированных человеческих T-клеток, включая транскрипты, лишенные (i) экзона 2, (ii) экзона 3, (iii) экзонов 2 и 3 или (iv) экзонов со 2 по 4 (Nielsen et al., Cell. Immunol., 235: 109-16 (2005)).
Здоровые ткани человека редко экспрессируют белок PD-L1 на поверхности своих клеток за исключением миндалины, плаценты и небольшой фракции макрофагоподобных клеток в легком и печени, что предполагает, что в нормальных физиологических условиях мРНК PD-L1 находится под строгой посттрансляционной регуляцией. Совершенно противоположно, белок PD-L1 обильно экспрессируется на клеточной поверхности при различных раковых заболеваниях человека, как показано Chen & Han, Anti – PD-1 / PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. J. Clin. Invest., 125, 3384–3391 (2015).
С другой стороны, экспрессия PD-L2 является более ограниченной, чем PD-L1. Например, PD-L2 индуцибельно экспрессируется на DC, макрофагах и тучных клетках, образованных костным мозгом.
Кроме того, в некоторых исследованиях описан рецептор для PD-L1, который независим от PD-1. В7.1 также идентифицирован как партнер по связыванию для PD-L1 (Butte et al., Immunity, 27: 111-22 (2007)). В исследованиях по химическому сшиванию предполагается, что PD-L1 и B7.1 могут взаимодействовать через их IgV-подобные домены. Взаимодействия B7.1:PD-L1 могут вызвать сигнал ингибирования для T-клеток. Лигирование PD-L1 на CD4+ T-клетках B7.1 или лигирование B7.1 на CD4+ T-клетках PD-L1 доставляет сигнал ингибирования. T-Клетки, не имеющие CD28 и CTLA-4, показывают сниженную пролиферацию и продуцирование цитокинов, когда стимулированы гранулами с покрытием анти-CD3 плюс B7.1. В T-клетках, лишенных всех рецепторов для B7.1 (т.е. CD28, CTLA-4 и PD-L1), пролиферация T-клеток и продуцирование цитокинов более не ингибируются гранулами с покрытием анти-CD3 плюс B7.1. Это показывает, что, в отсутствие CD28 и CTLA-4, B7.1 специфически действует на Т-клетки через PD-L1. Подобным образом, T-клетки, лишенные PD-1, показывают сниженную пролиферацию и продуцирование цитокинов, когда стимулированы в присутствии гранул с покрытием анти-CD3 плюс PD-L1, что демонстрирует ингибирующее действие лигирования PD-L1 на B7.1 на T-клетках. Когда T-клетки лишены всех известных рецепторов для PD-L1 (т.е. нет PD-1 и B7.1), пролиферация Т-клеток более не ухудшается гранулами с покрытием анти-CD3 плюс PD-L1. Таким образом, PD-L1 может проявлять ингибирующее действие на Т-клетки или через B7.1 или через PD-1.
В связи с заболеванием человека, экспрессия PD-L1 обнаружена при некоторых раках у мышей и человека, включая рак легких человека, яичников и карциному толстой кишки и различные миеломы (Iwai et al. (2002), PNAS, 99: 12293-7; Ohigashi et al. (2005), Clin. Cancer Res., 11: 2947-53). Предполагается, что PD-L1 играет некую роль в опухолевом иммунитете, повышая апоптоз антигенспецифических Т-клеточных клонов (Dong et al. (2002), Nat. Med., 8: 793-800). Также предполагается, что PD-L1 может быть вовлечен в воспаление слизистой оболочки кишечника, и ингибирование PD-L1 подавляет изнуряющую болезнь, связанную с колитом (Kanai et al. (2003), J. Immunol., 171: 4156-63).
В результате терапевтическая цель PD-L1 представляет собой область большого интереса в медицине. Ингибирование передачи сигнала PD-L1 представлено как способ усилить Т-клеточный иммунитет в случае лечения рака (например, опухолевый иммунитет) и инфекции, включая острые и хронические (то есть персистирующие) инфекции. Однако, поскольку на сегодняшний день одобрение FDA для продажи получило только одно целенаправленное анти-PD-L1 терапевтическое средство, в медицине имеется существенная неудовлетворенная потребность в таких средствах.
Сущность изобретения
Настоящее раскрытие относится к изолированным антителам, в частности, человеческим антителам, которые связываются с PD-L1 и проявляют желательные терапевтические свойства. Эти свойства включают высокую аффинность связывания с PD-L1, конкретно, человеческим PD-L1.
В одном аспекте раскрытие относится к антителам или их функциональным фрагментам, которые связываются с человеческим лигандом 1 программируемой гибели клеток (PD-L1), причем антитело или его функциональный фрагмент включает тяжелую цепь, включающую CDRH1, включающий аминокислоты 1-3 и 7-9 SEQ ID NO: 1, причем аминокислоты 4-6 не представляют собой SSY; CDRH2, включающий аминокислоты 9-17 SEQ ID NO: 8; и CDRH3, включающий SEQ ID NO: 15; и легкую цепь, включающую CDRL1, включающий SEQ ID NO: 20; CDRL2, включающий SEQ ID NO: 21; и CDRL3, включающий SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 76.
В некоторых воплощениях участок CDRH1 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 и 7, и в некоторых воплощениях участок CDRH2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
В некоторых воплощениях каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 1 включает SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27. В некоторых воплощениях каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 2 включает SEQ ID NO: 28, каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 3 включает SEQ ID NO: 29, и/или вариабельный каркасный участок тяжелой цепи 4 включает SEQ ID NO: 30.
В некоторых воплощениях каркасный участок вариабельной области легкой цепи 1 включает SEQ ID NO: 31, каркасный участок вариабельной области легкой цепи 2 включает SEQ ID NO: 32, каркасный участок вариабельной области легкой цепи 3 включает SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 78, и/или каркасный участок вариабельной области легкой цепи 4 включает SEQ ID NO: 34.
В некоторых воплощениях последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40 и 41. В других воплощениях последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54, 55 и 56.
В некоторых воплощениях последовательность вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 42.
В некоторых воплощениях антитело или его функциональный фрагмент проявляет антителозависимую клеточную цитотоксическую (ADCC) активность, антитело или его функциональный фрагмент проявляет противоопухолевую активность, антитело или его функциональный фрагмент ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 или антитело или его функциональный фрагмент предотвращает опосредуемое PD-1 ингибирование активации Т-клеток.
В некоторых воплощениях антитело или его функциональный фрагмент представляют собой слабо фукозилированное антитело или его функциональный фрагмент, и в некоторых воплощениях антитело или его функциональный фрагмент являются дефукозилированными или афукозилированными.
В другом аспекте раскрытие относится к антителам или их функциональным фрагментам, которые связываются с человеческим лигандом программируемой смерти клеток 1 (PD-L1), причем антитело или его функциональный фрагмент включает тяжелую цепь, включающую SEQ ID NO: 35.
В другом аспекте раскрытие относится к антителам или их функциональным фрагментам, которые связываются с человеческим лигандом программируемой смерти клеток 1 (PD-L1), причем антитело или его функциональный фрагмент включает тяжелую цепь, включающую CDRH1, включающий SEQ ID NO: 16, CDRH2, включающий SEQ ID NO: 17, и CDRH3, включающий аминокислоты 6-13 SEQ ID NO: 18, и легкую цепь, включающую CDRL1, включающий SEQ ID NO: 23, CDRL2, включающий SEQ ID NO: 24; и CDRL3, включающий SEQ ID NO: 25.
В некоторых воплощениях CDRH3 включает SEQ ID NO: 18, и в некоторых воплощениях CDRH3 включает SEQ ID NO: 19.
В некоторых воплощениях каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 1 включает SEQ ID NO: 49, каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 2 включает SEQ ID NO: 28, каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 3 включает SEQ ID NO: 50, и/или каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи 4 включает SEQ ID NO: 30.
В некоторых воплощениях каркасный участок вариабельной области легкой цепи 1 включает SEQ ID NO: 45, каркасный участок вариабельной области легкой цепи 2 включает SEQ ID NO: 46, каркасный участок вариабельной области легкой цепи 3 включает SEQ ID NO: 47, и/или каркасный участок вариабельной области легкой цепи 4 включает SEQ ID NO: 34.
В некоторых воплощениях последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 48 или 49, и в некоторых воплощениях последовательность вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 50.
В некоторых воплощениях антитело или его функциональный фрагмент проявляет антителозависимую клеточную цитотоксическую (ADCC) активность, антитело или его функциональный фрагмент проявляет противоопухолевую активность, антитело или его функциональный фрагмент ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 или антитело или его функциональный фрагмент предотвращает опосредуемое PD-1 ингибирование активации Т-клеток.
В некоторых воплощениях антитело или его функциональный фрагмент представляют собой слабо фукозилированное антитело или его функциональный фрагмент, и в некоторых воплощениях антитело или его функциональный фрагмент являются дефукозилированными или афукозилированными.
Некоторые воплощения относятся к фармацевтической композиции, включающей раскрытые антитела или их функциональные фрагменты.
-8
-9
В другом аспекте раскрытие относится к способам ингибирования пролиферации раковых клеток у субъекта, включающим введение имеющему рак субъекту раскрытых антител или их функциональных фрагментов. Например, в некоторых воплощениях раскрытие относится к способам ингибирования пролиферации раковых клеток у субъекта, включающим введение имеющему рак субъекту антитела или его функционального фрагмента, которые связывают человеческий PD-L1 с KD по меньшей мере 2,50×10, и включают CDRH3, включающий аминокислоты 6-13 SEQ ID NO: 18. Подобным образом, в некоторых воплощениях раскрытие относится к способам ингибирования пролиферации раковых клеток у субъекта, включающим введение имеющему рак субъекту антитела или его функционального фрагмента, которые связывают человеческий PD-L1 с KD по меньшей мере 8,30×10, и включают CDRH3, включающий SEQ ID NO: 15.
В некоторых воплощениях рак представляет собой гематологический рак, рак нервной системы, рак молочной железы, гастроинтестинальный рак, почечно-клеточную карциному или рак мочеполовой системы. В частности, в некоторых воплощениях рак представляет собой рак толстой кишки; рак мочеполовой системы представляет собой рак яичников, рак предстательной железы или рак мочевого пузыря; гематологический рак представляет собой лимфому, неходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или множественную миелому; или почечно-клеточная карцинома представляет собой светлоклеточную карциному.
В некоторых воплощениях рак представляет собой меланому, рак легких (такой как немелкоклеточный рак легких), рак головы и шеи, рак печени, рак поджелудочной железы, рак костей или рак сосудов.
В некоторых воплощениях рак представляет собой высоко иммуногенную карциному, или рак является экспрессирующим PD-L1 раком.
В некоторых воплощениях способы также включают стадию введения субъекту дополнительного терапевтического соединения. Например, в некоторых воплощениях дополнительным терапевтическим соединением является Т-клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленное на опухоль антитело, средство потенцирования иммунного ответа или низкомолекулярное лекарственное средство.
В некоторых воплощениях средством потенцирования иммунного ответа является анти-GITR антитело, анти-OX40 антитело, анти-CD137 антитело или агонист TLR.
В некоторых воплощениях нацеленным на опухоль антителом является анти-CAIX антитело.
В некоторых воплощениях низкомолекулярное лекарственное средство представляет собой нацеленное на опухоль низкомолекулярное лекарственное средство, такое как ингибитор BTK, ингибитор EGFR, ингибитор PARP, ингибитор BET, ингибитор BRAF или ингибитор PI3K-дельта.
Приведенное выше общее описание и последующее подробное описание являются примерными и пояснительными и предназначены для дополнительного пояснения раскрытия, представленного в формуле изобретения. Другие цели, преимущества и новые особенности станут более очевидными для специалистов в данной области техники из приведенного далее краткого описания чертежей и подробного описания раскрытия.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает в процентах ингибирование связывания PD-1 с PD-L-1+ клетками анти-PD-L1 антителами. Результаты получены с использованием FACS-анализа.
Фигура 2 показывает кинетику связывания примера анти-PD-L1 антитела CTI-48 против (A) человеческого PD-L1, (B) мышиного PD-L1 и (C) PD-L1 яванского макака.
Фигура 3 показывает, что пример анти-PD-L1 антитела CTI-48 проявляет ADCC активность на PD-L1+ клетках лимфомы с первичными NK-клетками.
Фигура 4 показывает полное изменение ингибирования Т-клеток PD-L1 выбранными анти-PD-L1 антителами в репортерном (NFAT) биоанализе иммуноблокады.
Фигура 5 показывает блокирование связывания PD-L1 с B7.1 CTI-48 и mAb клинического контроля.
Фигура 6 показывает влияние раскрытых антител на продуцирование IFN-γ. Антитела дозируют в реакционную смесь смешанной культуры лимфоцитов (MLR) в концентрации 10 мкг/мл. Результаты нормализуют к контролю носителю и представляют в виде комбинированного среднего +SEM (n=6). *p<0,05 ** p<0,01, ***p<0,001 показывает статистическую значимость при сравнении с соответствующим изотипическим контролем (hIgG1) с использованием простого однофакторного ANOVA с критерием множественного сравнения Даннета после этого. Эта фигура показывает сравнение бок-о-бок CTI-48 и mAb клинического контроля.
Подробное описание
Для композиций и способов по настоящему раскрытию, если не указано иное, используют стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны в данной области. Такие методы достаточно полно поясняются в литературе, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds 1987, и периодические обновления); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001).
I. Определения
Понятно, что способы не ограничиваются определенными описанными воплощениями и как таковые могут изменяться. Также понятно, что терминология, используемая в настоящем описании, имеет целью описание только определенных воплощений и не предназначена для ограничения. Объем технологии настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.
При использовании в настоящем описании термины могут иметь следующие далее определенные значения. При использовании в описании и формуле изобретения форма единственного числа включает единственное и множественное число, если контекст не диктует явно иное. Например, термин «клетка» включает одну клетку, а также множество клеток, в том числе их смеси.
При использовании в настоящем описании предполагается, что термин «включающий» означает, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключают другие. «Состоящий по существу из» при использовании для определения композиций и способов, будет означать исключение других элементов, имеющих существенное значение для композиции или способа. «Состоящий из» будет означать исключение больше следовых количеств элементов других ингредиентов для заявляемых композиций и основных стадий способов. Воплощения, определенные каждым из таких неустойчивых терминов, входят в объем настоящего раскрытия. Соответственно, предполагается, что способы и композиции могут включать дополнительные стадии и компоненты (включающий) или, с другой стороны, включать такие стадии и композиции несущественно (состоящий по существу из) или, с другой стороны, предполагаются только указанные стадии или композиций (состоящий из).
При использовании в настоящем описании «примерно» означает плюс или минус 10%.
При использовании в настоящем описании «необязательный» или «необязательно» означает, что описанное далее событие или обстоятельство может или не может происходить, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда не происходит.
При использовании в настоящем описании термины «индивидуум», «пациент» или «субъект» могут представлять собой отдельный организм, позвоночное, млекопитающее (например, корову, собаку, кошку или лошадь) или человека. В предпочтительном воплощении индивидуум, пациент или субъект представляет собой человека.
При использовании в настоящем описании предполагается, что термин «изолированное антитело» относится к антителу, которое по существу свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, изолированное антитело, которое специфически связывается с PD-L1, по существу свободно от антител, которые не связываются с PD-L1). Однако изолированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом PD-L1, может иметь перекрестную реактивность с другими белками, такими как PD-L2 или PD-1, а также белками из различных видов. Однако предпочтительно антитело всегда связывается с человеческим PD-L1. Кроме того, изолированное антитело типично по существу свободно от другого клеточного материала и/или химикатов.
При использовании в настоящем описании термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, которое включает CDR антител, происходящих от млекопитающих иных, чем человек, и каркасный участок (FR) и константный участок от человеческого антитела. Гуманизированное антитело применяют в качестве эффективного компонента в терапевтическом средстве согласно настоящему раскрытию, так как антигенность гуманизированного антитела в организме человека понижена.
При использовании в настоящем описании термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или изолированы методами рекомбинантных ДНК, включая, но без ограничения, (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для иммуноглобулиновых генов человека, или гибридомой, полученной от него, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела (например, из трансфектомы), (с) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или изолированные с помощью других методов, включающих сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов человека к другим последовательностям ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные участки, полученные от человеческой зародышевой линии, и/или последовательности иммуноглобулинов незародышевой линии. Однако в некоторых воплощениях такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться мутагенезу in vitro (или, когда используют животное, трансгенное для последовательностей человеческого Ig, соматическому мутагенезу in vivo), и таким образом аминокислотные последовательности VH и VL участков рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, хотя и происходят от родственных VH и VL последовательностям человеческой зародышевой линии, не могут существовать в природе в репертуаре человеческих антител зародышевой линии in vivo.
При использовании в настоящем описании термин «паттерн гликозилирования» определяется как паттерн углеводных звеньев, которые ковалентно присоединены в белку, конкретнее, к белку иммуноглобулину.
При использовании в настоящем описании выражения «терапевтически эффективное количество» и «терапевтический уровень» означают, что дозировка лекарственного средства или концентрация в плазме у субъекта, соответственно, такие, что обеспечивают специфическое фармакологическое действие, для которого лекарство вводят субъекту, нуждающемуся в таком лечении, т.е. ослабляют, уменьшают интенсивность или устраняют симптомы или следствия рака, злокачественного заболевания или пролиферации раковых клеток. Подчеркивается, что терапевтически эффективное количество или терапевтический уровень лекарственного средства не всегда будут эффективны при лечении состояний/заболеваний, описанных в настоящем описании, даже хотя специалисты в данной области техники считают, что такая дозировка является терапевтически эффективным количеством. Терапевтически эффективное количество может изменяться в связи со способом введения и лекарственной формой, возрастом и массой субъекта и/или состоянием субъекта, включая, среди прочих факторов, тип и стадию рака, злокачественного заболевания или пролиферации раковых клеток.
Термин «высокоиммуногенный рак» относится к раковым заболеваниям, которые инфильтрованы Т-клетками или лимфоцитами или обнаружили схожий ответ лимфатической системы. Полагают, что во многих случаях иммуногенность опухоли ассоциирована с возросшей скоростью мутагенеза. В таком случае, чем больше мутаций имеет опухоль, тем больше вероятность, что опухолевый антиген может запускать иммунный ответ.
Термин «лечение» или «лечащий», используемые в настоящем описании в связи с раком, злокачественным заболеванием или пролиферацией раковых клеток, относится к ослаблению, уменьшению интенсивности или устранению одного или нескольких симптомов или следствий рака, злокачественного заболевания или пролиферации раковых клеток.
II. Анти-PD-L1 антитела
Настоящее раскрытие относится к анти-PD-L1 антителам, которые можно использовать, среди прочего, для лечения рака. Полагают, что анти-PD-L1 антитела по настоящему раскрытию усиливают костимуляцию иммунного ответа реципиента через антагонизм по меньшей мере одного отрицательного костимулирующего сигнала, который может принадлежать PD-L1.
Раскрытые анти-PD-L1 антитела и их функциональные фрагменты будут иметь различные функциональные свойства для лечения раковых заболеваний или злокачественного заболевания, включая, но без ограничения, антителозависимую клеточную цитотоксическую (ADCC) активность, противоопухолевую активность, ингибирование связывания PD-L1 с PD-1 и предотвращение PD-1-опосредованного ингибирования активации Т-клеток.
Кроме того, в результате антагонизма передачи сигнала через PD-L1, включая блокировку PD-L1 из-за взаимодействия или с PD-1 или с В7.1 или тем и другим, раскрытые антитела и их функциональные фрагменты будут препятствовать PD-L1 подавать отрицательный костимулирующий сигнал Т-клеткам и другим антигенпредставляющим клеткам, причем таким образом усиливается противоопухолевый иммунитет и иммунологическая защита против рака и злокачественного заболевания. Кроме того, раскрытые анти-PD-L1 антитела и функциональные фрагменты можно комбинировать с дополнительными терапевтическими соединениями, включая, но без ограничения, CAR T-клетки (например, модифицированные T-клетки, которые экспрессируют анти-CD19, анти-CAIX, анти-IL13Ra2 или анти-PD-L1 CAR), другие нацеленные на опухоль антитела (например, анти-CAIX антитело), модальности потенцирования иммунного ответа (например, анти-GITR антитело, анти-OX40 антитело, анти-CD137 антитело или агонист TLR) и низкомолекулярные лекарственные средства (например, ингибитор BTK, ингибитор EGFR, ингибитор BET, ингибитор PI3K-дельта, ингибитор BRAF или ингибитор PARP).
Раскрытые антитела могут быть поликлональными, моноклональными, химерными, человеческими, частично или полностью гуманизированными и/или рекомбинантными. Например, в некоторых воплощениях анти-PD-L1 антитело является поликлональным антителом или его PD-L1-связывающим функциональным фрагментом. В некоторых воплощениях анти-PD-L1 антитело является моноклональным антителом или его PD-L1-связывающим функциональным фрагментом. В некоторых воплощениях антитела и их функциональные фрагменты могут связывать PD-L1 человека, яванского макака и/или мыши.
Поликлональные антитела можно получить способами, известными в технике, например, путем иммунизации выбранного животного антигеном PD-L1, сбора сыворотки от животного и выделения и/или очистки антител из сыворотки. Моноклональные антитела (mAb) можно получить способами, известными в технике, например, путем слияния антителопродуцирующих клеток с иммортализованными клетками для получения гибридом и/или путем генерации mAb из мРНК, экстрагированной из костного мозга и клеток селезенки иммунизированных животных, с использованием технологии комбинаторных библиотек антител. Рекомбинантные антитела можно получить способами, известными в технике, например, с использованием технологий фагового или дрожжевого дисплея и/или экспрессируя или коэкспрессируя полипептиды антител. В технике известны другие методы получения антител, и их можно использовать для получения антител, используемых в способах, раскрытых в настоящем описании.
Обычно антитело состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида тяжелой (Н) цепи и двух копий полипептида легкой (L) цепи. Обычно каждая тяжелая цепь содержат один N-концевой вариабельный (VH) участок и три С-концевых константных (СН1, СН2 и СН3) участка, и каждая легкая цепь содержит один N-концевой вариабельный (VL) участок и один С-концевой константный (СL) участок. Вариабельные участки каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела.
Термины «PD-L1-связывающий функциональный фрагмент» или «функциональный фрагмент», используемые в настоящем описании, относятся к одному или нескольким фрагментам анти-PD-L1 антитела, которые сохраняют способность связывать PD-L1. Примеры связывающих фрагментов включают (i) Fab-фрагменты (одновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и CH1); (ii) F(ab′)2-фрагменты (двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента в шарнирном участке, соединенных дисульфидным мостиком); (iii) Fd-фрагменты (включающие домены VH и CH1); (iv) Fv-фрагменты (включающие домены VL и VH одного плеча антитела), (v) dAb-фрагменты (включающие домен VH) и (vi) изолированные определяющие комплементарность участки (CDR), например, VH CDR3. Другие примеры включают одноцепочечные конструкции Fv (scFv). См., например, Bird et al., Science, 242: 423-26 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83 (1988). Другие примеры включают белки слияния PD-L1-связывающего домена иммуноглобулина, включающие (i) полипептид PD-L1-связывающего домена (такого как вариабельный участок тяжелой цепи, вариабельный участок легкой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи, слитый с вариабельным участком легкой цепи через линкерный пептид), слитый с полипептидом шарнирным участком иммуноглобулина, (ii) константный участок тяжелой цепи CH2 иммуноглобулина, слитый с шарнирным участком, и (iii) константный участок тяжелой цепи CH3 иммуноглобулина, слитый с константным участком CH2.
Шарнирный участок раскрытых антител можно модифицировать путем замены одного или нескольких цистеиновых остатков, например, на сериновые остатки для предотвращения димеризации. См., например, публикацию заявки на патент США 2003/0118592; публикацию заявки на патент США 2003/0133939. Кроме того, в некоторых воплощениях раскрытые антитела могут включать другие мутации, включая, но без ограничения, вариант Fc-части IgG1, имеющий точечные мутации S239D/I332E, S239D или I332E или их любую комбинацию, или вариант Fc-части IgG4, имеющий точечную мутацию S228P. Такие модификации могут изменять связывание раскрытых антител и функциональных фрагментов с Fc-рецепторами (FcR), и в некоторых воплощениях антитело может быть модифицировано для большей устойчивости, в то время как в некоторых воплощениях антитело может быть модифицировано для усиления ADCC функции. При определении номера остатка нумерация остатков по Кабат для данного антитела может быть установлена путем выравнивания в участках гомологии последовательности антитела с «эталонной» последовательность, нумерованной по Кабат.
В некоторых воплощениях паттерны гликозилирования раскрытых антител могут быть модифицированы или изменены. Например, в некоторых воплощениях раскрытые антитела и их функциональные фрагменты могут быть антителами с низкой степенью фукозилирования или могут быть дефукозилированными, или антитела могут быть экспрессированы или продуцированы таким образом, что они совершенно лишены фукозы (т.е. являются афукозилированными). Изменение содержания фукозы в антителе или функциональном фрагменте можно выполнить различными способами, известными в технике, например, путем экспрессии антитела или функционального фрагмента в клетке, в которой недостает FUT8, или которая имеет мутированную версию FUT8. Антитела с низкой степенью фукозилирования или дефукозилированные антитела и функциональные фрагменты имеют повышенную ADCC активность. Кроме изменений содержания фукозы раскрытые антитела и функциональные фрагменты могут включать другие функциональные модификации в их паттернах гликозилирования. Например, модификации в позиции 297 (например, N297A и N297Q) могут полностью предотвратить гликозилирование участка Fc, устраняя таким образом функцию Fc, ADCC и CDC.
В некоторых воплощениях анти-PD-L1 антитело представляет собой CTI-07, CTI-09, CTI-48, CTI-49, CTI-50, CTI-76, CTI-77, CTI-78, CTI-57 или CTI-58 или его функциональный фрагмент. В таблицах 1 и 2 приводятся примеры последовательностей CDR раскрытых анти-PD-L1 антител и их функциональных фрагментов.
Таблица 1
Антитело
HCDR1
HCDR2
HCDR3
CTI-48
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-49
GTFSGYAIS(SEQ ID NO: 3)
VIIPAFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 10)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-76
GTFWRYAIS(SEQ ID NO: 4)
VIIPIWGKANYAQKFQG(SEQ ID NO: 11)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-77
GTFGSYAIS(SEQ ID NO: 5)
GIYPAFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 12)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-78
GTFGTYAIS(SEQ ID NO: 6)
GIYPRFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 13)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-50
GTFSPKAIS(SEQ ID NO: 7)
VIIPIFGPANYAQKFQG(SEQ ID NO: 14)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-57
YTLSSHGIT(SEQ ID NO: 16)
WISAHSGHASNAQKVED(SEQ ID NO: 17)
ARVWRALYHGMDV(SEQ ID NO: 18)
CTI-58
YTLSSHGIT(SEQ ID NO: 16)
WISAHSGHASNAQKVED(SEQ ID NO: 17)
ARVHAALYHGMDV(SEQ ID NO: 19)
CTI-09
GTFSSYAIS(SEQ ID NO: 1)
GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 8)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-07
YTLSSHGIT(SEQ ID NO: 16)
WISAHSGHASNAQKVED(SEQ ID NO: 17)
ARVHAALYYGMDV(SEQ ID NO: 57)
CTI-97
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-98
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-92
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-95
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-93
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-94
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
CTI-96
GTFSRSAIS(SEQ ID NO: 2)
VIIPAFGEANYAQKFQG(SEQ ID NO: 9)
ARGRQMFGAGIDF(SEQ ID NO: 15)
Таблица 2
Антитело
LCDR1
LCDR2
LCDR3
CTI-48
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-49
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-76
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-77
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-78
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-50
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-57
GGNNIGSKGVH(SEQ ID NO: 23)
DDSDRPS(SEQ ID NO: 24)
QVWDSSSDHWV(SEQ ID NO: 25)
CTI-58
GGNNIGSKGVH(SEQ ID NO: 23)
DDSDRPS(SEQ ID NO: 24)
QVWDSSSDHWV(SEQ ID NO: 25)
CTI-09
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-07
GGNNIGSKGVH(SEQ ID NO: 23)
DDSDRPS(SEQ ID NO: 24)
QVWDSSSDHWV(SEQ ID NO: 25)
CTI-97
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNLRHVI(SEQ ID NO: 75)
CTI-98
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNLRHVI(SEQ ID NO: 75)
CTI-92
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-95
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNNRHVI(SEQ ID NO: 22)
CTI-93
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNIRHVI(SEQ ID NO: 76)
CTI-94
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNLRHVI(SEQ ID NO: 75)
CTI-96
TRSSGSIDSNYVQ(SEQ ID NO: 20)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 21)
QSYDSNIRHVI(SEQ ID NO: 76)
Кроме того, раскрытые антитела и функциональные фрагменты также могут включать различные каркасные участки. Например, в некоторых воплощениях раскрытые антитела и функциональные фрагменты включают SEQ ID NO: 26-34 и/или 43-47. В некоторых воплощениях могут быть особенно выгодны некоторые изменения. Например, замена глутаминовой кислоты (E) на (Q) в первой позиции каркасного участка одной тяжелой цепи антитела может повысить стабильность производимого продукта. Соответственно, некоторые воплощения раскрытых антител и фрагментов будут включать такую модификацию. Таким образом, в некоторых воплощениях тяжелая цепь раскрытых антител или функциональных фрагментов будет включать SEQ ID NO: 36-41, в то время как в других воплощениях тяжелая цепь раскрытых антител или функциональных фрагментов будет включать SEQ ID NO: 48-49 или 51-56. Кроме того, в некоторых воплощениях тяжелая цепь раскрытых антител или функциональных фрагментов будет включать SEQ ID NO: 71-72 или полипептид, кодированный нуклеотидной последовательностью, включающей SEQ ID NO: 59-68.
В некоторых воплощениях легкая цепь раскрытых антител или функциональных фрагментов будет включать SEQ ID NO: 42 или 50. Кроме того, в некоторых воплощениях легкая цепь раскрытых антител или функциональных фрагментов будет включать полипептид, кодированный нуклеотидной последовательностью, включающей SEQ ID NO: 69-70.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что в раскрытые последовательности можно внести некоторые изменения без угрозы для аффинности связывания или функции раскрытых анти-PD-L1 антител и функциональных фрагментов. Соответственно, в некоторых воплощениях анти-PD-L1 антитела или функциональные фрагменты будут иметь примерно 80%, примерно 81%, примерно 82%, примерно 83%, примерно 84%, примерно 85%, примерно 86%, примерно 87%, примерно 88%, примерно 89%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% идентичность последовательности с раскрытыми последовательностями.
В некоторых воплощениях раскрытие относится к изолированным нуклеотидным последовательностям, кодирующим анти-PD-L1 антитело или его функциональный фрагмент, например, SEQ ID NO: 59-70.
D
D
-8
-8
-8
-8
-8
-8
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-10
-10
-10
-10
-10
-09
-09
-09
-09
-09
-08
-08
-10
-10
Раскрытые антитела и их функциональные фрагменты могут быть определены последовательностью или функциональными характеристиками. Например, раскрытые антитела и их функциональные фрагменты могут иметь K по меньшей мере 3,0×10, по меньшей мере 2,5×10, по меньшей мере 2,0×10, по меньшей мере 1,5×10, по меньшей мере 1,0×10, по меньшей мере 0,5×10, по меньшей мере 9,95×10, по меньшей мере 9,90×10, по меньшей мере 9,85×10, по меньшей мере 9,80×10, по меньшей мере 9,75×10, по меньшей мере 9,70×10, по меньшей мере 9,65×10, по меньшей мере 9,60×10, по меньшей мере 9,55×10, по меньшей мере 9,5×10, по меньшей мере 9,45×10, по меньшей мере 9,40×10, по меньшей мере 9,35×10, по меньшей мере 9,30×10, по меньшей мере 9,25×10, по меньшей мере 9,20×10, по меньшей мере 9,15×10, по меньшей мере 9,10×10, по меньшей мере 9,05×10, по меньшей мере 9,0×10, по меньшей мере 8,95×10, по меньшей мере 8,90×10, по меньшей мере 8,85×10, по меньшей мере 8,80×10, по меньшей мере 8,75×10, по меньшей мере 8,70×10, по меньшей мере 8,65×10, по меньшей мере 8,60×10, по меньшей мере 8,55×10, по меньшей мере 8,5×10, по меньшей мере 8,45×10, по меньшей мере 8,40×10, по меньшей мере 8,35×10, по меньшей мере 8,30×10, по меньшей мере 8,25×10, по меньшей мере 8,20×10, по меньшей мере 8,15×10, по меньшей мере 8,10×10, по меньшей мере 8,05×10, по меньшей мере 8,0×10, по меньшей мере 7,95×10, по меньшей мере 7,90×10, по меньшей мере 7,85×10, по меньшей мере 7,80×10, по меньшей мере 7,75×10, по меньшей мере 7,70×10, по меньшей мере 7,65×10, по меньшей мере 7,60×10, по меньшей мере 7,55×10, по меньшей мере 7,5×10, по меньшей мере 7,45×10, по меньшей мере 7,40×10, по меньшей мере 7,35×10, по меньшей мере 7,30×10, по меньшей мере 7,25×10, по меньшей мере 7,20×10, по меньшей мере 7,15×10, по меньшей мере 7,10×10, по меньшей мере 7,05×10, по меньшей мере 7,0×10, по меньшей мере 6,95×10, по меньшей мере 6,90×10, по меньшей мере 6,85×10, по меньшей мере 6,80×10, по меньшей мере 6,75×10, по меньшей мере 6,70×10, по меньшей мере 6,65×10, по меньшей мере 6,60×10, по меньшей мере 6,55×10, по меньшей мере 6,5×10, по меньшей мере 6,45×10, по меньшей мере 6,40×10, по меньшей мере 6,35×10, по меньшей мере 6,30×10, по меньшей мере 6,25×10, по меньшей мере 6,20×10, по меньшей мере 6,15×10, по меньшей мере 6,10×10, по меньшей мере 6,05×10, по меньшей мере 6,0×10, по меньшей мере 5,95×10, по меньшей мере 5,90×10, по меньшей мере 5,85×10, по меньшей мере 5,80×10, по меньшей мере 5,75×10, по меньшей мере 5,70×10, по меньшей мере 5,65×10, по меньшей мере 5,60×10, по меньшей мере 5,55×10, по меньшей мере 5,5×10, по меньшей мере 5,45×10, по меньшей мере 5,40×10, по меньшей мере 5,35×10, по меньшей мере 5,30×10, по меньшей мере 5,25×10, по меньшей мере 5,20×10, по меньшей мере 5,15×10, по меньшей мере 5,10×10, по меньшей мере 5,05×10, по меньшей мере 5,0×10, по меньшей мере 4,95×10, по меньшей мере 4,90×10, по меньшей мере 4,85×10, по меньшей мере 4,80×10, по меньшей мере 4,75×10, по меньшей мере 4,70×10, по меньшей мере 4,65×10, по меньшей мере 4,60×10, по меньшей мере 4,55×10, по меньшей мере 4,5×10, по меньшей мере 4,45×10, по меньшей мере 4,40×10, по меньшей мере 4,35×10, по меньшей мере 4,30×10, по меньшей мере 4,25×10, по меньшей мере 4,20×10, по меньшей мере 4,15×10, по меньшей мере 4,10×10, по меньшей мере 4,05×10, по меньшей мере 4,0×10, по меньшей мере 3,95×10, по меньшей мере 3,90×10, по меньшей мере 3,85×10, по меньшей мере 3,80×10, по меньшей мере 3,75×10, по меньшей мере 3,70×10, по меньшей мере 3,65×10, по меньшей мере 3,60×10, по меньшей мере 3,55×10, по меньшей мере 3,5×10, по меньшей мере 3,45×10, по меньшей мере 3,40×10, по меньшей мере 3,35×10, по меньшей мере 3,30×10, по меньшей мере 3,25×10, по меньшей мере 3,20×10, по меньшей мере 3,15×10, по меньшей мере 3,10×10, по меньшей мере 3,05×10, по меньшей мере 3,0×10, по меньшей мере 2,95×10, по меньшей мере 2,90×10, по меньшей мере 2,85×10, по меньшей мере 2,80×10, по меньшей мере 2,75×10, по меньшей мере 2,70×10, по меньшей мере 2,65×10, по меньшей мере 2,60×10, по меньшей мере 2,55×10, по меньшей мере 2,5×10, по меньшей мере 2,45×10, по меньшей мере 2,40×10, по меньшей мере 2,35×10, по меньшей мере 2,30×10, по меньшей мере 2,25×10, по меньшей мере 2,20×10, по меньшей мере 2,15×10, по меньшей мере 2,10×10, по меньшей мере 2,05×10, по меньшей мере 2,0×10, по меньшей мере 1,95×10, по меньшей мере 1,90×10, по меньшей мере 1,85×10, по меньшей мере 1,80×10, по меньшей мере 1,75×10, по меньшей мере 1,70×10, по меньшей мере 1,65×10, по меньшей мере 1,60×10, по меньшей мере 1,55×10, по меньшей мере 1,5×10, по меньшей мере 1,45×10, по меньшей мере 1,40×10, по меньшей мере 1,35×10, по меньшей мере 1,30×10, по меньшей мере 1,25×10, по меньшей мере 1,20×10, по меньшей мере 1,15×10, по меньшей мере 1,1×10, по меньшей мере 1,05×10, по меньшей мере 1,0×10, по меньшей мере 0,95×10, по меньшей мере 0,90×10, по меньшей мере 0,85×10, по меньшей мере 0,80×10, по меньшей мере 0,75×10, по меньшей мере 0,70×10, по меньшей мере 0,65×10, по меньшей мере 0,60×10, по меньшей мере 0,55×10, по меньшей мере 0,5×10, по меньшей мере 0,45×10, по меньшей мере 0,40×10, по меньшей мере 0,35×10, по меньшей мере 0,30×10, по меньшей мере 0,25×10, по меньшей мере 0,20×10, по меньшей мере 0,15×10, по меньшей мере 0,10×10, по меньшей мере 0,05×10, по меньшей мере 9,5×10, по меньшей мере 9,0×10, по меньшей мере 8,5×10, по меньшей мере 8,0×10 или любое промежуточное значение. Например, раскрытые антитела и их функциональные фрагменты могут иметь значения K 8,2×10, 2,31×10, 8,24×10, 3,25×10, 3,46×10, 1,91×10, 7,97×10, 2,41×10, 9,5×10 или 8,6×10.
50
50
-5
-7
-7
-5
-7
-6
-6
Подобным образом, раскрытые антитела и их функциональные фрагменты могут иметь величины IC между 4,0×10 мкг/мл и 9,5×10 мкг/мл или любую величину в промежутке. Например, раскрытые антитела и их функциональные фрагменты могут иметь величины IC 9,19×10, 4,156×10, 9.985×10, 1,037×10 или 3,463×10.
Анти-PD-L1 антитело или его PD-L1-связывающий фрагмент могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для введения намеченному субъекту предполагаемым путем введения, что обсуждается подробнее ниже.
III. Фармацевтические композиции и препараты
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в способах, раскрытых в настоящем описании, могут включать терапевтически эффективный агент (например, анти-PD-L1 антитела или их функциональные фрагменты) и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Композиция может быть получена для внутривенного, подкожного, интраперитонеального, внутримышечного, перорального, назального, легочного, глазного, вагинального или ректального введения. В некоторых воплощениях анти-PD-L1 антитела или их функциональные фрагменты включают в препараты для внутривенного, подкожного, интраперитонеального или внутримышечного введения, например, в раствор, суспензию, эмульсию, липосомный препарат и т.д. Фармацевтическая композиция может быть получена как композиция с немедленным высвобождением, композиция с пролонгированным высвобождением, композиция с отсроченным высвобождением и т.д. с использованием методов, известных в технике.
Фармакологически приемлемые носители для различных лекарственных форм известны в технике. Например, для твердых препаратов известны эксципиенты, лубриканты, связующие вещества и вещества, способствующие распадаемости, для жидких препаратов известны растворители, солюбилизаторы, суспендирующие вещества, средства для придания тоничности, буферы и успокаивающие вещества. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции включают один или несколько компонентов, таких как один или несколько консервантов, антиоксидантов, стабилизаторов и т.п.
Кроме того, раскрытые фармацевтические композиции могут быть получены в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. В некоторых воплощениях предпочтительно будет включение в композицию средств для придания изотоничности, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемой композиции может быть вызвана путем включения в композицию компонента, который замедляет абсорбцию, например, солей моностеаратов и желатина.
Стерильные растворы для инъекции можно получить путем включения активного соединения в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, какие требуются, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильную среду, которая содержит базовую дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекции предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из их предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.
Фармацевтические композиции по раскрытию можно вводить в комбинации с другими терапевтическими средствами. Например, комбинированная терапия может включать фармацевтическую композицию, включающую по меньшей мере одно из раскрытых анти-PD-L1 антител или его функциональных фрагментов с по меньшей мере одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, включая, но без ограничения, CAR T-клетки (например, модифицированные T-клетки, которые экспрессируют анти-CD19, анти-Her2, анти-BCMA, анти-CS-1, анти-PSCA, анти-CAIX, анти-IL13R или анти-PD-L1 CAR), другие нацеленные на опухоль антитела (например, анти-CAIX антитело), средства потенцирования иммунного ответа (например, анти-GITR антитело, анти-OX40 антитело, анти-CD137 антитело или анонист TLR) и низкомолекулярные лекарственные средства (например, ингибитор BTK, ингибитор EGFR, ингибитор BET, ингибитор PI3K-дельта, ингибитор BRAF или ингибитор PARP). Фармацевтические композиции по раскрытию также можно вводить в сочетании с радиационной терапией.
IV. Способы лечения рака
В настоящем описании описываются способы лечения рака, злокачественного заболевания или пролиферации раковых клеток с помощью раскрытых анти-PD-L1 антител. Конкретнее, раскрытие относится к способам усиления функции Т-клеток и противоопухолевого иммунитета, включающим введение терапевтически эффективного количества любых из описанных выше анти-PD-L1 антител или композиций.
Усиление функции Т-клеток и противоопухолевого иммунитета дает широкий подход к лечению рака, злокачественного заболевания или пролиферации раковых клеток. Соответственно путем введения анти-PD-L1 антител и их функциональных фрагментов можно лечить множество типов рака. Например, в некоторых воплощениях рак представляет собой гематологический рак (например, лимфому, неходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или множественную миелому), рак нервной системы, рак молочной железы, гастроинтестинальный рак (например, рак толстой кишки), почечно-клеточную карциному (например, светлоклеточную почечно-клеточную карциному) или рак мочеполовой системы (например, рак яичников). В некоторых воплощениях рак представляет собой меланому, рак легких (такой как немелкоклеточный рак легких), рак головы и шеи, рак печени, рак поджелудочной железы, рак костей, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря или рак сосудов.
В некоторых воплощениях рак, который лечат согласно раскрытым способам, представляет собой высоко иммуногенную карциному. И в некоторых воплощениях рак, который лечат согласно раскрытым способам, является экспрессирующим PD-L1 раком.
Схемы приема лекарственного средства регулируют для обеспечения оптимальной желательной реакции (например, терапевтической реакции, подобной регрессии или ремиссии опухоли). Например, в некоторых воплощениях может быть введен однократный болюс, в то время как в некоторых воплощениях могут быть введены несколько разделенных доз со временем, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как покажет ситуация. Например, в некоторых воплощениях раскрытые антитела или функциональные фрагменты могут быть введены один или два раза в неделю подкожной или внутривенной инъекцией. В некоторых воплощениях раскрытые антитела или функциональные фрагменты могут быть введены один или два раза в месяц путем подкожной инъекции. В некоторых воплощениях раскрытые антитела или функциональные фрагменты могут вводиться один раз каждую неделю, один раз в две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в два месяца, один раз каждые три месяца, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые пять месяцев или один раз каждые шесть месяцев.
Примерные дозы могут изменяться в соответствии с размером и состоянием здоровья индивидуума, которого лечат, а также состоянием, от которого лечат. Например, в некоторых воплощениях раскрытые антитела или функциональные фрагменты могут быть введены в дозе 1-100 мг/кг. В некоторых воплощениях раскрытые антитела или функциональные фрагменты могут быть введены в дозе 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг/кг.
Кроме того, раскрытые способы лечения могут, кроме введения анти-PD-L1 антитела или его функционального фрагмента, дополнительно включать введение второго терапевтического соединения. Например, в некоторых воплощениях дополнительным терапевтическим соединением является CAR-T-клетка, нацеленное на опухоль антитело, средство потенцирования иммунного ответа или низкомолекулярное лекарственное средство.
D
D
-8
-8
-8
-8
-8
-8
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-9
-10
-10
-10
-10
-10
-09
-09
-09
-09
-09
-08
-08
-10
-10
В некоторых воплощениях в раскрытых способах могут использоваться антитела и их функциональные фрагменты с различными функциональными характеристиками. Например, раскрытые способы могут включать анти-PD-L1 антитела и их функциональные фрагменты, имеющие K по меньшей мере 3,0×10, по меньшей мере 2,5×10, по меньшей мере 2,0×10, по меньшей мере 1,5×10, по меньшей мере 1,0×10, по меньшей мере 0,5×10, по меньшей мере 9,95×10, по меньшей мере 9,90×10, по меньшей мере 9,85×10, по меньшей мере 9,80×10, по меньшей мере 9,75×10, по меньшей мере 9,70×10, по меньшей мере 9,65×10, по меньшей мере 9,60×10, по меньшей мере 9,55×10, по меньшей мере 9,5×10, по меньшей мере 9,45×10, по меньшей мере 9,40×10, по меньшей мере 9,35×10, по меньшей мере 9,30×10, по меньшей мере 9,25×10, по меньшей мере 9,20×10, по меньшей мере 9,15×10, по меньшей мере 9,10×10, по меньшей мере 9,05×10, по меньшей мере 9,0×10, по меньшей мере 8,95×10, по меньшей мере 8,90×10, по меньшей мере 8,85×10, по меньшей мере 8,80×10, по меньшей мере 8,75×10, по меньшей мере 8,70×10, по меньшей мере 8,65×10, по меньшей мере 8,60×10, по меньшей мере 8,55×10, по меньшей мере 8,5×10, по меньшей мере 8,45×10, по меньшей мере 8,40×10, по меньшей мере 8,35×10, по меньшей мере 8,30×10, по меньшей мере 8,25×10, по меньшей мере 8,20×10, по меньшей мере 8,15×10, по меньшей мере 8,10×10, по меньшей мере 8,05×10, по меньшей мере 8,0×10, по меньшей мере 7,95×10, по меньшей мере 7,90×10, по меньшей мере 7,85×10, по меньшей мере 7,80×10, по меньшей мере 7,75×10, по меньшей мере 7,70×10, по меньшей мере 7,65×10, по меньшей мере 7,60×10, по меньшей мере 7,55×10, по меньшей мере 7,5×10, по меньшей мере 7,45×10, по меньшей мере 7,40×10, по меньшей мере 7,35×10, по меньшей мере 7,30×10, по меньшей мере 7,25×10, по меньшей мере 7,20×10, по меньшей мере 7,15×10, по меньшей мере 7,10×10, по меньшей мере 7,05×10, по меньшей мере 7,0×10, по меньшей мере 6,95×10, по меньшей мере 6,90×10, по меньшей мере 6,85×10, по меньшей мере 6,80×10, по меньшей мере 6,75×10, по меньшей мере 6,70×10, по меньшей мере 6,65×10, по меньшей мере 6,60×10, по меньшей мере 6,55×10, по меньшей мере 6,5×10, по меньшей мере 6,45×10, по меньшей мере 6,40×10, по меньшей мере 6,35×10, по меньшей мере 6,30×10, по меньшей мере 6,25×10, по меньшей мере 6,20×10, по меньшей мере 6,15×10, по меньшей мере 6,10×10, по меньшей мере 6,05×10, по меньшей мере 6,0×10, по меньшей мере 5,95×10, по меньшей мере 5,90×10, по меньшей мере 5,85×10, по меньшей мере 5,80×10, по меньшей мере 5,75×10, по меньшей мере 5,70×10, по меньшей мере 5,65×10, по меньшей мере 5,60×10, по меньшей мере 5,55×10, по меньшей мере 5,5×10, по меньшей мере 5,45×10, по меньшей мере 5,40×10, по меньшей мере 5,35×10, по меньшей мере 5,30×10, по меньшей мере 5,25×10, по меньшей мере 5,20×10, по меньшей мере 5,15×10, по меньшей мере 5,10×10, по меньшей мере 5,05×10, по меньшей мере 5,0×10, по меньшей мере 4,95×10, по меньшей мере 4,90×10, по меньшей мере 4,85×10, по меньшей мере 4,80×10, по меньшей мере 4,75×10, по меньшей мере 4,70×10, по меньшей мере 4,65×10, по меньшей мере 4,60×10, по меньшей мере 4,55×10, по меньшей мере 4,5×10, по меньшей мере 4,45×10, по меньшей мере 4,40×10, по меньшей мере 4,35×10, по меньшей мере 4,30×10, по меньшей мере 4,25×10, по меньшей мере 4,20×10, по меньшей мере 4,15×10, по меньшей мере 4,10×10, по меньшей мере 4,05×10, по меньшей мере 4,0×10, по меньшей мере 3,95×10, по меньшей мере 3,90×10, по меньшей мере 3,85×10, по меньшей мере 3,80×10, по меньшей мере 3,75×10, по меньшей мере 3,70×10, по меньшей мере 3,65×10, по меньшей мере 3,60×10, по меньшей мере 3,55×10, по меньшей мере 3,5×10, по меньшей мере 3,45×10, по меньшей мере 3,40×10, по меньшей мере 3,35×10, по меньшей мере 3,30×10, по меньшей мере 3,25×10, по меньшей мере 3,20×10, по меньшей мере 3,15×10, по меньшей мере 3,10×10, по меньшей мере 3,05×10, по меньшей мере 3,0×10, по меньшей мере 2,95×10, по меньшей мере 2,90×10, по меньшей мере 2,85×10, по меньшей мере 2,80×10, по меньшей мере 2,75×10, по меньшей мере 2,70×10, по меньшей мере 2,65×10, по меньшей мере 2,60×10, по меньшей мере 2,55×10, по меньшей мере 2,5×10, по меньшей мере 2,45×10, по меньшей мере 2,40×10, по меньшей мере 2,35×10, по меньшей мере 2,30×10, по меньшей мере 2,25×10, по меньшей мере 2,20×10, по меньшей мере 2,15×10, по меньшей мере 2,10×10, по меньшей мере 2,05×10, по меньшей мере 2,0×10, по меньшей мере 1,95×10, по меньшей мере 1,90×10, по меньшей мере 1,85×10, по меньшей мере 1,80×10, по меньшей мере 1,75×10, по меньшей мере 1,70×10, по меньшей мере 1,65×10, по меньшей мере 1,60×10, по меньшей мере 1,55×10, по меньшей мере 1,5×10, по меньшей мере 1,45×10, по меньшей мере 1,40×10, по меньшей мере 1,35×10, по меньшей мере 1,30×10, по меньшей мере 1,25×10, по меньшей мере 1,20×10, по меньшей мере 1,15×10, по меньшей мере 1,1×10, по меньшей мере 1,05×10, по меньшей мере 1,0×10, по меньшей мере 0,95×10, по меньшей мере 0,90×10, по меньшей мере 0,85×10, по меньшей мере 0,80×10, по меньшей мере 0,75×10, по меньшей мере 0,70×10, по меньшей мере 0,65×10, по меньшей мере 0,60×10, по меньшей мере 0,55×10, по меньшей мере 0,5×10, по меньшей мере 0,45×10, по меньшей мере 0,40×10, по меньшей мере 0,35×10, по меньшей мере 0,30×10, по меньшей мере 0,25×10, по меньшей мере 0,20×10, по меньшей мере 0,15×10, по меньшей мере 0,10×10, по меньшей мере 0,05×10, по меньшей мере 9,5×10, по меньшей мере 9,0×10, по меньшей мере 8,5×10, по меньшей мере 8,0×10 или любой промежуточной величины. Например, раскрытые способы могут включать анти-PD-L1 антитела и их функциональные фрагменты, имеющие значения K 8,2×10, 2,31×10, 8,24×10, 3,25×10, 3,46×10, 1,91×10, 7,97×10, 2,41×10, 9,5×10 или 8,6×10.
50
50
-5
-7
-7
-5
-7
-6
-6
Подобным образом, раскрытые способы могут включать анти-PD-L1 антитела и их функциональные фрагменты, имеющие величины IC между 4,0×10 мкг/мл и 9,5×10 мкг/мл или любую величину в промежутке. Например, раскрытые способы могут включать анти-PD-L1 антитела и их функциональные фрагменты, имеющие величины IC 9,19×10, 4,156×10, 9.985×10, 1,037×10 или 3,463×10.
В некоторых воплощениях средство потенцирования иммунного ответа может включать анти-GITR антитело, анти-OX40 антитело, анти-CD137 антитело, агониста TLR или анти-CD40 антитело.
В некоторых воплощениях нацеленное на опухоль антитело может включать анти-CAIX антитело, анти-BCMA, анти-CS-1, анти-CD20 (например, ублитуксимаб), анти-Her2, анти-PCSA или анти-FcRL5.
В некоторых воплощениях низкомолекулярное лекарственное средство может включать нацеленное на опухоль низкомолекулярное лекарственное средство или, например, ингибитор ВТК (например, ибрутиниб), ингибитор EGFR (например, CK-101), ингибитор BET (например, CK-103), ингибитор PARP (например, олапариб или CK-102), ингибитор PI3K-дельта (например, TGR-1202) или ингибитор BRAF (например, вемурафениб).
Определенные схемы лечения можно оценить в соответствии с тем, будут ли улучшаться результаты у данного пациента, означающие, что будет снижаться опасность рецидива или повышаться вероятность выживания без прогрессирования данного рака.
Таким образом, что касается целей настоящего раскрытия, субъекта лечат, если получают один или больше благоприятных или желательных результатов, включая желательные клинические результаты. Например, благоприятные или желательные результаты включают, без ограничения, один или несколько результатов из следующих: ослабление одного или нескольких симптомов, являющихся результатами заболевания, повышение качества жизни пациентов, страдающих от заболевания, уменьшение дозы других лекарственных средств, требуемых для лечения заболевания, задержка прогрессирования заболевания и/или продление жизни индивидуумов.
Кроме того, когда субъектом способов является вообще больной раком, возраст пациента не ограничивается. Раскрытые способы применимы для лечения рака, злокачественного заболевания или пролиферации раковых клеток с различными рецидивами и прогнозированием исходов у всех возрастных групп и поколений. Таким образом, в некоторых воплощениях субъектом может являться больной ребенок, в то время как в других воплощениях субъектом может являться взрослый больной.
Следующие далее примеры приводятся для пояснения настоящего изобретения. Однако следует иметь в виду, что изобретение не ограничивается конкретными условиями или деталями, описанными в этих примерах.
Примеры
Пример 1. Лечение больного раком раскрытыми анти-PD-L1 антителами
Этот пример иллюстрирует способы с использованием анти-PD-L1 антител при лечении рака.
Пациенту, о котором известно, что у него рак, или предполагается, что у него рак, вводят внутривенной или подкожной инъекцией терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, включающей анти-PD-L1 антитело. Пациента оценивают на наличие и/или тяжесть признаков и симптомов, ассоциированных с раком, включая, но без ограничения, боль, слабость и т.д. и пациента лечат до тех пор, пока один или несколько признаков/симптомов не ослабнут, снизится их интенсивность или они устранятся. Необязательно у пациента могут быть взяты образцы для мониторинга развития рака после лечения. Необязательно вводят другую дозу фармацевтической композиции, если признаки/симптомы сохраняются, и/или если рак развивается или рецидивирует.
Пример 2. Получение оптимизированных антител
Антигены биотинилируют с использованием набора для биотинилирования EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit от Pierce. Козьи античеловеческие F(ab’)2 каппа-FITC (LC-FITC), экстравидин-PE (EA-PE) и стрептавидин-633 (SA-633) получают от Southern Biotech, Sigma и Molecular Probes, соответственно. Разделительные колонки для микрогранул со стрептавидином и MACS LC закупают у Miltenyi Biotec.
Созревание аффинности
Оптимизацию связывания нативных клонов выполняют с использованием трех стратегий созревания: разнообразия VH CDRH1/CDRH2, мутагенеза гена VH с помощью ПЦР и мутагенеза VH с фокусом на CDRH3.
Линия CTI-07
Первый цикл оптимизации сосредоточен на отборе улучшенных связывающих элементов из библиотеки, в котором CTI-07 VH ген варьируют путем мутагенеза с помощью ПЦР с использованием методов, известных в технике. Цикл 1: отбор выполняют путем презентации VH мутированных форм полноразмерного CTI-07 IgG на поверхности дрожжей. Эти библиотеки инкубируют со 100 нМ биотинилированного PD-L1, затем детектируют экспрессию IgG с помощью реагента анти-LC FITC (экспрессия IgG) и SA-633 (детекция связывания антигена) и окрашивания жизнеспособных клеток иодидом пропидия. Лучшие антигенсвязывающие/IgG экспрессирующие клетки отбирают FACS. Цикл 2: отбор выполняют как в цикле 1, но с использованием 10 нМ биотинилированного PD-L1 для различения связывания антигена. Цикл 3: выполняют экспрессию библиотека как в циклах 1 и 2. В цикле 3 применяют полиспецифический реагент (PSR) для удаления неспецифических антител из результата отбора (Y. Xu et.al., «Addressing Polyspecificity of Antibodies Selected from an in vitro Yeast Presentation System: a FACS-based, High-Throughput Selection and Analytical Tool.» PEDS, 26.10 (2013): 663-70). Эти библиотеки инкубируют с разведением 1:10 биотинилированного реагента PSR, экспрессию IgG детектируют с помощью реагента анти-LC FITC (экспрессия IgG), и связывание PSR детектируют с помощью EA-PE (детекция связывания антигена) и окрашивания жизнеспособных клеток иодидом пропидия. Отсортировывают лучшие 1-2% IgG-положительных, PSR-отрицательных, PI-отрицательных клеток и выполняют цикл 4. Цикл 4: отбор выполняют как в цикле 2, но с использованием 1 нМ биотинилированного PD-L1 для различения связывания антигена. Лучшие клоны высевают и секвенируют для определения уникальных последовательностей IgG. Уникальные последовательности IgG предлагают для получения, очистки и характеристики антител.
Второй цикл оптимизации сосредоточен на отборе улучшенных связывающих элементов из библиотеки, в котором VH ген варьируют путем мутагенеза с помощью ПЦР с использованием в то же время вырожденных CDRH3 олигомеров для повышения скорости мутагенеза в CDRH3. Такой метод амплификации выполняют с использованием методов, хорошо известных в технике. Цикл 1: отбор выполняют путем презентации мутированных форм VH полноразмерного исходного IgG на поверхности дрожжей. Эти библиотеки инкубируют с 10 нМ биотинилированного PD-L1, затем детектируют экспрессию IgG с помощью реагента анти-LC FITC (экспрессия IgG) и SA-633 (детекция связывания антигена) и окрашивания жизнеспособных клеток иодидом пропидия. Лучшие антигенсвязывающие/экспрессирующие IgG клетки отбирают FACS. Цикл 2: отбор выполняют как в цикле 1, но с использованием 2 нМ биотинилированного PD-L1 для различения связывания антигена. Лучшие клоны высевают и секвенируют для определения уникальных последовательностей IgG. Уникальные последовательности IgG предлагают для получения, очистки и характеристики антител.
Линия CTI-09
При оптимизации CTI-09 применяют мозаичность CDRH1 и CDRH2. CDRH3 CTI-09 амплифицируют ПЦР и затем рекомбинируют в предварительно полученную библиотеку векторов с вариантами разнообразия CDRH1 и CDRH2 1 x 108. Цикл 1: отбор выполняют путем презентации мутированных форм VH полноразмерного CTI-09 IgG на поверхности дрожжей. Эти библиотеки инкубируют с 100 нМ биотинилированного PD-L1. Антиген-положительные клетки отбирают путем разделения в магнитном поле с помощью системы Miltenyi MACS. В малых библиотеках, инкубированных с b-PD-L1, инкубацию проводят с магнитными гранулами со стрептавидином. Комплексы дрожжи/гранулы захватываются на колонке MACS LS, причем немеченые клетки уходят в отходы. Затем связывающие b-PD-L1 клетки элюируют в среды для передачи в цикл 2 процесса отбора. Цикл 2: отбор выполняют путем презентации мутированных форм VH полноразмерного CTI-07 IgG на поверхности дрожжей. Эти библиотеки инкубируют с 20 нМ биотинилированного PD-L1 с последующей детекцией экспрессии IgG с помощью реагента анти-LC FITC (экспрессия IgG) и SA-633 (детекция связывания антигена) и окрашивания жизнеспособных клеток иодидом пропидия. Лучшие антигенсвязывающие/экспрессирующие IgG отбирают FACS. Цикл 3: экспрессию библиотек выполняют как в циклах 1 и 2. В цикле 3 применяют полиспецифический реагент (PSR) для удаления неспецифических антител из результата отбора (Y. Xu et.al., «Addressing Polyspecificity of Antibodies Selected from an in vitro Yeast Presentation System: a FACS-based, High-Throughput Selection and Analytical Tool», PEDS 26.10 (2013): 663-70). Эти библиотеки инкубируют с разведением 1:10 биотинилированного реагента PSR, экспрессию IgG детектируют с помощью реагента анти-LC FITC (экспрессия IgG), и связывание PSR детектируют с помощью EA-PE (детекция связывания антигена) и окрашивания жизнеспособных клеток иодидом пропидия. Отсортировывают лучшие 1-2% IgG-положительных, PSR-отрицательных, PI-отрицательных клеток и выполняют цикл 4. Цикл 4: результат цикла 3 инкубируют с 20 нМ b-PD-L1. Клетки осаждают и промывают для удаления оставшегося b-PD-L1. Этот клеточный осадок ресуспендируют в 1 мкМ немеченого PD-L1. Лучшие антигенсвязывающие элементы определяют по их способности удерживать антиген b-PD-L1 со временем. Лучшие клоны высевают и секвенируют для определения уникальных последовательностей IgG. Уникальные последовательности IgG предлагают для получения, очистки и характеристики антител.
Получение и очистка антител
Дрожжевые клоны выращивают до насыщения и затем индуцируют в течение 48 час при 30°С при встряхивании. После индукции дрожжевые клоны осаждают, и супернатанты собирают для очистки. IgG очищают с использованием колонки с белком А и элюируют уксусной кислотой, рН 2,0. Получают Fab-фрагменты папаиновым гидролизом и очищают на KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences).
Пример 3. Конкурентный FACS с анти-PD-L1 антителами
Клетки яичников китайского хомячка (СНО) трансфецируют вектором экспрессии PD-L1 и затем отбирают для экспрессии белка (PD-L1+ клетки). Клетки СНО инкубируют с 1 мкг/мл меченного биотином PD-1 в течение 1 часа.
После инкубации с меченным биотином PD-1 в супернатант добавляют анти-PD-L1 антитела в 4-кратном разведениях, начиная с 10 мкг/мл, и инкубируют в течение 1 часа. Клетки промывают и затем вводят в контакт со стрептавидином-РЕ. Окрашивание стрептавидином-РЕ анализируют проточной цитометрией и определяют процент ингибирования связывания PD-1 анти-PD-L1 антителами.
Таблица 3
Клиническое контрольное mAb
CTI-09
CTI-48
CTI-50
CTI-58
IC<sub>50</sub>, г/мл
9.19e-007
4.156e-005
9.985e-007
1.037e-006
3.463e-006
50
Вычисляют величины IC для некоторых антител, включая клиническое контрольное mAb (определенное по домену VH, представленному SEQ ID NO: 73, и домену VL, представленному SEQ ID NO: 74, соответственно), которые можно найти в таблице 3. Фигура 1 показывает результаты этого исследования.
Пример 4. Кинетика связывания, специфичность и селективность антител
D
D
D
Используют анализ октетных данных измерений при определении аффинности для оценки кинетики связывания антител. Получают 2 мл загружаемого образца при 20 мкг/мл (пассивная концентрация) в буфере для кинетики. В лунки темного 96-луночного планшета загружают аликвоты по меньшей мере 200 мкл. Интервалы концентрации образца основаны на предполагаемом K взаимодействия (если доступен). Как правило, серийное разведение находится в интервале от 0,1 K до 10 K. Разведение проводят 7 раз в колонке лунок с образцом с использованием буфера для кинетики как разбавителя образца. Последняя лунка колонки с образцом, используемая позднее в анализе данных в качестве эталонной лунки, должна содержать только буфер для кинетики.
Биосенсоры гидратируют в буфере для кинетики (1x PBS, 0,1% BSA, 0,02% твина-20, 0,05% азида натрия) при комнатной температуре в течение 10 минут.
Таблица 4
Образец, ID
Загружаемый образец, ID
KD (M)
kon (1/Ms)
kdis (1/s)
huPDL1
CTI-48
8.47E-10
7.20E+05
6.10E-04
msPDL1
CTI-48
N/A
N/A
N/A
cynoPDL1
CTI-48
5.55E-10
1.14E+06
6.35E-04
Кинетические показатели для одного примера анти-PD-L1 антител CTI-48 можно найти в таблице 4, и экспериментальные результаты показаны на фигуре 2.
Пример 5. Аффинность связывания антител
Измерения аффинности ForteBio выполняют, как правило, как описано ранее (см., например, Estep et al., 2013). Коротко, измерения аффинности ForteBio выполняют, нагружая IgG онлайн на сенсоры AHQ. Сенсоры уравновешивают оффлайн в буфере для анализа в течение 30 мин и затем контролируют онлайн в течение 60 секунд для установления линии отсчета. На сенсоры, нагруженные IgG, воздействуют 100 нМ антигена в течение 5 минут, после чего их переносят в буфер для анализа на 5 мин для измерения off-rate. Кинетику анализируют с использованием модели связывания 1:1.
Таблица 5
Название Ab
Линия VH CDR3
IgG K<sub>D</sub> (M), одновалентный
kon (1/Ms)
koff (1/s)
CTI-09
1
N.B.
CTI-48
1
8.24E-10
7.68E+05
6.33E-04
CTI-49
1
2.31E-09
7.28E+05
1.68E-03
CTI-76
1
8.24E-09
6.62E+05
5.45E-03
CTI-77
1
3.25E-09
5.44E+05
1.77E-03
CTI-78
1
3.46E-09
6.18E+05
2.14E-03
CTI-50
1
1.91E-09
7.94E+05
1.52E-03
CTI-07
2
7.97E-08
4.92E+05
3.92E-02
CTI-58
2
2.41E-08
4.61E+05
1.11E-02
Клиническое контрольное mAb
NA
9.5E-10
CTI-57
2
8.6E-10
5.2E+05
4.5E-04
CTI-97
1
1.82E-09
5.11E+05
9.28E-04
CTI-98
1
1.70E-09
5.02E+05
8.52E-04
Показатели связывания для некоторых примеров антител приводятся в таблице 5.
Пример 6. ADCC активность анти-PD-L1 антител
Выполняют репортерные биоанализы для того, чтобы определить антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) раскрытых анти-PD-L1 антител. В анализах используют клетки лимфомы SUDHL-1 и донорные PBMC. Различные антитела проверяют в концентрациях 1 или 3 мкг/мл.
Результаты этого исследования, которые приводятся для примера анти-PD-L1 антител CTI-48 на фигуре 3, представлены процентом цитотоксичности после 4 часов инкубации с раскрытыми антителами.
Пример 7. Репортерный анализ иммуноблокады
Анализы иммуноблокады выполняют в 96-луночных планшетах с использованием набора для анализа блокады PD1/PD-L1 Blockade Assay Kit (Promega, CS187111). В этом анализе происходят три основных события. Событие 1: происходит TCR-опосредуемая активация NFAT, когда сконструированные эффекторные клетки Юрката с PD-1 и aAPC (антигенпредставляющая клетка) PD-L1 клетки соединяют через взаимодействие TCR/активатор TCR. Событие 2: ингибирование сигнала NFAT лигированием PD-1:PD-L1 в отсутствие блокирующих антител. Событие 3: восстановление сигнала NFAT путем добавления анти-PD-1 или анти-PD-L1 блокирующего антитела.
2
Накануне анализа получают 25 мл среды для извлечения клеток (10% FBS/F-12) в 50-мл конических пробирках для оттаивания и использования (Thaw-and-Use) PD-L1 клеток путем добавления 2,5 мл FBS к 22,5 мл F-12. Одну емкость с PD-L1 клетками для оттаивания и использования (CS187103) извлекают из холодильника и переносят в бокс на сухой лед. Содержимое оттаивают на водяной бане при 37°C до тех пор, пока клетки едва разморозятся (примерно 3-4 минуты). Клеточную суспензию осторожно перемешивают пипеткой, вбирая и выталкивая, и переносят все клетки (0,5 мл) в пробирку, помеченную «PD-L1 клетки», содержащую 14,5 мл среды для извлечения клеток, и затем осторожно перевертывают несколько раз. Клеточную суспензию переносят в резервуар для реагентов. Сразу же, в крайние лунки аналитических планшетов с использованием многоканальной пипетки добавляют 100 мкл среды для извлечения клеток на лунку. Планшеты инкубируют в течение ночи в инкубаторе с CO при 37°C.
В день анализа готовят свежий буфер для анализа (RPMI 1640 + 1% FBS), и получают семь трехкратных разведений каждого из испытываемых антител в буфере для анализа при 2X конечной концентрации. Из всех лунок на аналитических планшетах извлекают по 95 мкл среды, и по 40 мкл серийных разведений испытываемых антител добавляют в лунки, содержащие PD-L1 клетки. В крайние лунки каждого планшета добавляют по 80 мкл буфера для анализа.
PD-1 эффекторные клетки для оттаивания и использования (CS187105) переносят в аналитические планшеты, и планшеты инкубируют в течение шести часов при 37°C в инкубаторе с CO2. После шестичасовой инкубации аналитические планшеты извлекают из инкубатора с CO2 и уравновешивают при окружающей температуре в течение 5-10 мин. В каждую экспериментальную лунку добавляют 80 мкл реагента Bio-GloTM, и планшеты инкубируют еще в течение 5-10 мин при окружающей температуре. Измеряют люминесценцию спектрофотометром для прочтения планшетов POLARstar Omega с 0,5-с интеграцией.
Указанные далее антитела проверяют при конечных концентрациях 10 мкг/мл, 3,33 мкг/мл, 1,11 мкг/мл, 0,37 мкг/мл, 0,123 мкг/мл, 0,041 мкг/мл и 0,014 мкг/мл: CTI-2, клиническое контрольное mAb, CTI-09, CTI-48, CTI-50, CTI-07 и CTI-58.
Результаты для примеров антител, включая клиническое контрольное mAb, CTI-48 и CTI-49, приводятся ниже в таблице 6.
Таблица 6
Клиническое контрольное l mAb
CTI-48
CTI-49
EC<sub>50</sub>, г/мл
9.213e-008
7.750e-008
9.191e-008
Пример 8. Скриниг-анализ ингибиторов PD-L1/B7.1
Коммерчески доступный набор используют для скрининга и определения профиля взаимодействия раскрытых антител и взаимодействия PD-L1/B7.1. Набор дается в 96-луночном формате с меченным биотином B7-1 (CD80), очищенным PD-L1, меченным стрептавидином HRP и буфером для анализа для 100 реакций связывания. Набор используют для детекции меченного биотином B7.1 с помощью стрептавидин-HRP.
Сначала на 96-луночный планшет наносят PD-L1. Затем в каждую лунку добавляют или одно из раскрытых антител, или положительный контроль, или контроль субстрат, или пустышку и инкубируют перед добавлением B7.1-биотин. Наконец, планшет обрабатывают стрептавидин-HRP с последующим добавлением субстрата HRP для получения хемилюминесценции, которую затем можно измерить с использованием спектрофотометра для считывания хемилюминесценции.
Указанные далее антитела проверяют на их ингибирующее действие на связывание PD-L1 и B7.1 в концентрациях 30 мкг/мл, 10 мкг/мл, 3.33 мкг/мл, 1.11 мкг/mL, 0.37 мкг/мл и 0.123 мкг/мл: CTI-1, CTI-2, CTI-33, CTI-48 и CTI-55.
50
50
Результаты для примеров антител показывают, что IC раскрытых антител для ингибирования связывания колеблются от 0,1816 до 0,5056 мкг/мл. Например, вычисляют IC CTI-48 как равную 0,1816 мкг/мл. Сравнение активности CTI-48 и клинического контрольного mAb показано на фигуре 5.
Пример 9. Влияние антител на продуцирование IFN-γ
Антитела добавляют в реакцию в смешанных культурах лимфоцитов (MLR) для того, чтобы определить влияние раскрытых антител на продуцирование IFN-γ. Определяют кратное изменение продуцирования IFN-γ после 4-дневной MLR с антителами в концентрации 10 мкг/мл. Результаты включают результаты для соответствующего изотипического контроля (hIgG1). Как видно на фигуре 6, CTI-48 вызывает ответ, сравнимый с клиническим mAb, и многие из проверенных антител вызывают статистически значимое повышение продуцирования IFN-γ, в том числе примерно 10-кратное превышение контрольных уровней с помощью CTI-33 и CTI-55.
Все патенты и публикации, упомянутые в описании, показывают уровни специалистов в данной области техники, для которых предназначено раскрытие. Все патенты и публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок в той степени, как если бы каждая отдельная публикация конкретно указывалась как включенная в качестве ссылки.
Кроме того, специалист в данной области техники легко убедится, что настоящее раскрытие хорошо адаптируется для осуществления целей и получения указанных конечных результатов и преимуществ, а также присущих в этом отношении. Специалисты в данной области техники могут видеть модификации и другие применения. Эти модификации охватываются сущностью раскрытия и определяются объемом формулы изобретения, которая устанавливает неограничивающие воплощения раскрытия.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CHECKPOINT THERAPEUTICS, INC.
<120> PD-L1-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME
<130> 099263-0802
<140>
<141>
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Thr Phe Ser Arg Ser Ala Ile Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gly Thr Phe Trp Arg Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Thr Phe Gly Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gly Thr Phe Gly Thr Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gly Thr Phe Ser Pro Lys Ala Ile Ser
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Ile Ile Pro Ala Phe Gly Glu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Val Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Ile Ile Pro Ile Trp Gly Lys Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gly Ile Tyr Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gly Ile Tyr Pro Arg Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Val Ile Ile Pro Ile Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Tyr Thr Leu Ser Ser His Gly Ile Thr
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Trp Ile Ser Ala His Ser Gly His Ala Ser Asn Ala Gln Lys Val Glu
1 5 10 15
Asp
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ala Arg Val Trp Arg Ala Leu Tyr His Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Ala Arg Val His Ala Ala Leu Tyr His Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Arg His Val Ile
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Gly Val His
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val
1 5 10
<210> 26
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
<210> 27
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys
20
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 33
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser
1 5 10 15
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ala Phe Gly Glu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Trp Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Trp Gly Lys Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Arg Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Pro Lys
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Asn Asn Arg His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 43
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
20 25
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Leu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys
20
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 48
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser His
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala His Ser Gly His Ala Ser Asn Ala Gln Lys Val
50 55 60
Glu Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Trp Arg Ala Leu Tyr His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser His
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala His Ser Gly His Ala Ser Asn Ala Gln Lys Val
50 55 60
Glu Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val His Ala Ala Leu Tyr His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Leu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Gly Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Ser
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ala Phe Gly Glu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Trp Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Trp Gly Lys Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Ala Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Arg Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Pro Lys
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ile Pro Ile Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Ala Arg Val His Ala Ala Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 58
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser His
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala His Ser Gly His Ala Ser Asn Ala Gln Lys Val
50 55 60
Glu Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val His Ala Ala Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca agtccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 60
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc cgttcggcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcatccctg cgtttggtga ggcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 61
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggta 60
tcatgcaagg cttctggagg caccttcagc gggtatgcta tctcttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcatccctg cttttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc cagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 62
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttctgg aggtatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcatcccta tctggggtaa agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc cagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 63
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcggg agctatgcta tctcttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atctatcctg cttttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 64
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcggg acgtatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atctatccta ggtttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 65
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc ccgaaggcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtg atcatcccta tctttggtcc ggcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagaggcaga 300
cagatgttcg gtgcaggcat cgatttctgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 66
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
gaggttcagc tggtgcagtc tggaggtgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacccttagc agccatggta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctc acagtggtca cgcaagcaat 180
gcacagaagg tcgaggacag agtcaccatg accacagaca catccacgaa cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgac agctgacgac acggcggtgt actactgcgc cagagtccat 300
gccgccttgt actacggtat ggacgtctgg gggcaaggga ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 67
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
gaggttcagc tggtgcagtc tggaggtgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacccttagc agccatggta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctc acagtggtca cgcaagcaat 180
gcacagaagg tcgaggacag agtcaccatg accacagaca catccacgaa cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgac agctgacgac acggcggtgt actactgcgc cagagtccat 300
gccgccttgt accacggtat ggacgtctgg gggcaaggga ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 68
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 68
gaggttcagc tggtgcagtc tggaggtgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacccttagc agccatggta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctc acagtggtca cgcaagcaat 180
gcacagaagg tcgaggacag agtcaccatg accacagaca catccacgaa cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgac agctgacgac acggcggtgt actactgcgc cagagtgtgg 300
agggccttgt accacggtat ggacgtctgg gggcaaggga ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 69
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgac agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtg cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcaa caataggcat 300
gtgatattcg gcggagggac caagctgacc gtccta 336
<210> 70
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 70
ttgtctgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa ggtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gacagtagta gtgatcattg ggtgttcggc 300
ggagggacca agctgaccgt ccta 324
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Gln Met Phe Gly Ala Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser His
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala His Ser Gly His Ala Ser Asn Ala Gln Lys Val
50 55 60
Glu Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val His Ala Ala Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 451
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 74
<211> 215
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Leu Arg His Val Ile
1 5 10
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Ile Arg His Val Ile
1 5 10
<210> 77
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Trp
1 5 10 15
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 78
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Val
1 5 10 15
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<---