Влияние антигипоксантов на развитие каррагенин-индуцированного воспаления

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Пожилова Е.В., 2014 УДК: 615.015.21:615.276

ВЛИЯНИЕ АНТИГИПОКСАНТОВ НА РАЗВИТИЕ КАРРАГЕНИН-ИНДУЦИРОВАННОГО ВОСПАЛЕНИЯ

Е.В. Пожилова

ГБОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия МЗ РФ,

г. Смоленск

В эксперименте на модели острого каррагенин-индуцированного воспаления лапы крыс регистрировали изменения объема пораженной конечности (отек лапы), показатели лейкограммы и активность свободнорадикального окисления. Изучено противовоспалительное действие антигипоксантов (амтизол, гесперидин, гипоксен, метапрот). Показано, что гипоксен и метапрот в дозе 50 мг/кг обладают слабой противовоспалительной активностью, но потенцируют действие нестероидных противовоспалительных средств. При совместном энтеральном введении гипоксе-на и метапрота с ацетилсалициловой кислотой или диклофенаком отмечен мощный противовоспалительный эффект, что проявлялось существенным снижением регистрируемых показателей воспаления.

Ключевые слова: амтизол, гесперидин, гипоксен, метапрот, острое воспаление.

Лекарственные вещества с антигипо-ксическими и антиоксидантными свойствами сегодня широко применяются в медицинской практике [4, 7, 11, 13]. Пристальное внимание к антигипоксантам, их разностороннее экспериментальное и клиническое изучение обусловлены многообразным метаболотропным действием данной группы препаратов. В основе их фар-макодинамики лежат различные метаболические механизмы, включая регуляцию потребления кислорода и энергетический обмен, воздействие на процессы свободно-радикального окисления и проницаемость клеточных мембран, влияние на регулятор-ные факторы клеточной адаптации и другие процессы [3, 9, 10, 12, 16]. В научной литературе имеются сведения о противовоспалительной активности антигипоксантов и возможности их применения в лечении воспалительных заболеваний [5, 14].

При фармакотерапии воспалений препаратами выбора, как известно, являются нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Однако, несмотря на

несомненную клиническую эффективность, даже кратковременный прием данных препаратов может приводить к развитию побочных эффектов, которые в целом встречаются примерно в 25% случаев и могут представлять серьезную угрозу для жизни. Среди перспективных путей повышения эффективности и безопасности НПВС рассматривается, в частности, их комбинированное использование с антигипоксантами/ антиоксидантами [8]. В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение противовоспалительной активности антигипо-ксантов различного химического строения и их влияние на эффективность НПВС при остром экспериментальном воспалении.

Материалы и методы Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Острую воспалительную реакцию воспроизводили путем субплантарного введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина в левую заднюю лапу опытным группам крыс [15]. Контрольным животным вводили равный объем воды очищенной.

В работе изучены вещества с анти-гипоксантной и антиоксидантной активностью различной химической структуры: амтизол (3,5-диамино-1,2,4-тиадиа-зол), гесперидин (5,3'-диокси-4'-метокси-7-рамноглюкозид флавонона), гипоксен (натриевая соль [поли-{-2,5-дигидрокси-фенилен}]-4-тиосульфокислоты) и мета-прот (2-этилтиобензимидазол гидробромид), которые вводили в дозе 50 мг/кг массы. Препараты сравнения - ацетилсалициловая кислота (АСК) в дозе 100 мг/кг и диклофенак натрия в дозе 8 мг/кг массы. Все лекарственные вещества вводили в виде водных растворов через зонд в желудок за 1 час до индукции воспаления. При комбинированном применении вещества вводили с интервалом 1 час.

Величину отека измеряли онкометри-ческим методом через 3 часа после индукции воспаления по изменению объема конечности экспериментальных животных [17]. Объем конечностей животных измеряли до введения и через 3 часа после введения каррагенина. В качестве критериев оценки противовоспалительной эффективности антигипоксантов и НПВС использовались: прирост объема конечности и торможение воспаления. Прирост объема конечности рассчитывали по формуле:

П - прирост отека;

О - величина объема лапы после введения индуктора воспаления; И - величина объема лапы до введения индуктора воспаления.

Торможение воспаления рассчитывали по формуле:

о - леченные животные (опытные); к - группа каррагенина.

Затем животных декапитировали под легким эфирным наркозом. В момент декапитации животных осуществляли забор крови. Подсчет лейкограммы проводили общепринятым методом [1]. По данным лейкограммы производили расчет агранулоцитарно/гранулоцитарного ин-

декса (Ia/r - индекс противовоспалительной активности), представляющего собой отношение суммарных показателей агра-нулоцитов (лимфоциты и моноциты) и гранулоцитов (нейтрофилы и эозинофи-лы). Агранулоцитарно/гранулоцитарный индекс рассчитывали по формуле: IaA- = X агранулоциты / X гранулоциты.

Показатели свободнорадикального окисления (СРО) в сыворотке крови - интенсивность быстрой вспышки (Фтах - пря-мопропорциональна процессу ПОЛ) и величину светосуммы свечения (обратнопро-порциональна активности антиоксидантной системы) регистрировали на отечественном хемилюминометре CL-3606 фирмы «Диалог» с помощью программы «CLM».

Статистическую обработку результатов опытов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica Version 6.0. Гипотезы о средних значениях проверяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Через 3 часа после субплантарного введения каррагенина у опытных крыс развивался выраженный отек пораженной конечности, объем которой существенно увеличивался и составлял 2,52 см3, что на 73,8% больше исходного объема. У контрольных животных объем лапы не изменялся (табл. 1).

На фоне введении гипоксена и мета-прота объем конечности увеличился по сравнению с контрольной группой животных на 49,6% и 56,5% соответственно, что было достоверно меньше, чем в опытной группе с каррагенином. Предварительное введение амтизола и геспери-дина не оказало статистически значимого влияния на развитие каррагенинового отека, прирост объема конечности в обоих случаях был сопоставим с моделью. На фоне введения АСК и диклофенака увеличение объема конечности у опытных крыс было менее выраженное, соответственно на 24% и 10,5%.

При комбинированном применении гипоксена с АСК или диклофенаком для коррекции воспаления отмечено минимальное увеличение объема конечности,

причем данные показатели достоверно не отличались от значений контрольной группы, а торможение воспаления составило 81,3 и 90,4%. Метапрот тоже потенцировал действие АСК и диклофенака, торможение воспаления при его введении с НПВС составило 78 и 86,8%. Применение АСК в комбинации с амтизолом и гесперидином не отличалось по выраженности воспалительного отека от монотерапии только АСК.

Из приведенных результатов следует, что гипоксен и в меньшей степени метапрот уменьшают развитие карраге-нин-индуцированного отека. При комбинированном применении с АСК и дикло-фенаком они потенцируют противовоспалительный эффект НПВС.

Результаты исследования лейко-граммы экспериментальных животных представлены в таблице 2. Из таблицы следует, что во всех опытных группах

животных введение каррагенина вызывало относительную нейтрофилию с увеличением процентного содержания сегмен-тоядерных нейтрофилов на фоне общего лейкоцитоза. Такие изменения в лейкоцитарной формуле характерны для острого воспалительного процесса.

В группах животных, получавших АСК и диклофенак до введения каррагени-на, подобные изменения были менее значительны. Антигипоксанты не оказали существенного влияния на лейкограмму, но их комбинации с АСК и диклофенаком были более эффективны, чем применение одних НПВС. При комбинированном применении гипоксена и метапрота с диклофенаком наблюдались минимальные изменения лей-кограммы. Гипоксен и метапрот оказали потенцирующий эффект и на действие АСК. Амтизол и гесперидин при комбинированном введении с АСК существенно не изменяли показателей лейкограммы.

Таблица 1

Влияние антигипоксантов и НПВС на объем конечности крыс через 3 часа после введения каррагенина

Группы животных, (П=10) Доза, мг/кг Объем лапы, см3, (M±m) Прирост объема, % Торможение воспаления, %

До введения После введения

Контрольная гр-па 1,43±0,05 1,44±0,06

Каррагенин 1,45±0,05 2,52±0,07* 73,8

Антигипоксанты + каррагенин

Гипоксен 50 1,43±0,05 2,14±0,07*# 49,6 32,8

Метапрот 50 1,45±0,037 2,27±0,04*# 56,5 23,4

Амтизол 50 1,53±0,03 2,58±0,03* 68,6 7

Гесперидин 50 1,45±0,04 2,42±0,04* 66,9 9,3

НПВС + каррагенин

АСК 100 1,46±0,04 1,81±0,07*# 24,0 67,5

Диклофенак 8 1,43±0,02 1,58±0,02# 10,5 85,8

Антигипоксанты + НПВС + каррагенин

Гипоксен + АСК 50 1,37±0,08 1,56±0,04# 13,8 81,3

Гипоксен + Диклофенак 50 8 1,41±0,03 1,51±0,03# 7,1 90,4

Метапрот + АСК 50 1,48±0,056 1,72±0,06*# 16,2 78,0

Метапрот + Диклофенак 50 8 1,44±0,03 1,58±0,02# 9,7 86,8

Амтизол + АСК 50 100 1,53±0,05 1,97±0,06*# 28,7 61,1

Гесперидин + АСК 50 100 1,43±0,05 1,79±0,06*# 25,1 66,0

Примечание. В таблицах: * - различие с контролем статистически значимо (р<0,05); # -рагенином статистически значимо (р<0,05).

различие с кар-

Таблица 2

Влияние антигипоксантов и НПВС на лейкограмму крови крыс при каррагенин-индуцированном воспалении

Группы животных (п=10) Доза мг/кг Лейкограмма крови крыс 1а/г усл. ед.

Нейтрофилы Эозинофи-лы, % Моноциты, % Лимфоциты, %

Палочко- ядерные, % Сегменто-ядерные, %

Контроль 0,6±0,21 22,4±0,26 1,7±0,03 1,8±0,17 73,5±3,51 3,07±0,11

Каррагенин 1,1±0,62* 49,6±3,75* 0,9±0,07* 4,5±0,08* 43,8±3,98* 0,95±0,02*

Антигипоксанты + каррагенин

Гипоксен 50 0,9±0,03 41,8±2,36#* 0,9±0,01* 4,2±0,31* 52,2±3,27# * 1,29±0,01*#

Метапрот 50 1,1±0,06* 44,2±2,24#* 0,9±0,03* 4,4±0,06* 49,4±3,88# * 1,16±0,02*#

Амтизол 50 1,2±0,08* 49,1±2,16* 0,8±0,02* 4,5±0,11* 44,4±2,12* 0,96±0,02*

Гесперидин 50 1,1±0,05* 48,9±2,68* 0,7±0,03* 4,5±0,12* 44,8±3,18* 0,97±0,03*

НПВС + каррагенин

АСК 100 0,8±0,68 37,4±4,53#* 1,1±0,06* 3,4±0,21#* 57,3±5,38# * 1,55±0,03*#

Диклофенак 8 0,7±0,07 31,3±3,68#* 1,4±0,08# 2,8±0,18#* 63,8±4,52# * 1,99±0,02#

Антигипоксанты + НПВС + каррагенин

Гипоксен + АСК 50 100 0,7±0,46 31,8±3,12#* 1,3±0,05# 2,2±0,28# 64,0±3,60# 1,98±0,08#

Гипоксен + Диклофенак 50 8 0,6±0,09# 25,5±2,54# 1,6±0,07# 1,9±0,08# 70,4±4,51# 2,64±0,1#

Метапрот + АСК 50 100 0,8±0,04 36,0±1,15#* 1,2±0,04#* 2,8±0,08#* 59,3±4,33# * 1,64±0,05*#

Метапрот + Диклофенак 50 8 0,6±0,04# 27,6±2,68# 1,3±0,05# 2,1±0,07# 68,4±4,22# 2,39±0,08#

Амтизол + АСК 50 100 0,9±0,05 44,3±1,91#* 1,0±0,04* 3,2±0,09#* 50,6±2,56# * 1,16±0,04*#

Гесперидин +АСК 50 100 1,3±0,21* 49,5±0,26* 0,79±0,03* 4,5±0,17* 43,9±3,51* 0,99±0,03*

Для интегрированной оценки противовоспалительной активности антигипоксантов и их комбинаций с НПВС был рассчитан индекс противовоспалительной активности (табл. 2). Наибольшее значение индекса отмечено в контроле - 3,07. При воспалении индекс уменьшается. На фоне применения препаратов антигипоксантов и НПВС наблюдается различная противовоспалительная активность, что видно не только по изменению объема конечности, но и по изменению индекса 1а/г. Наиболее эффективными оказались комбинации гипоксена с диклофенаком (1а/г=2,64±0,1), метапрота с диклофенаком (1а/г=2,39±0,08), гипоксена с АСК

(1а/г=1,98±0,08) и метапрота с АСК (1а/г=1,64±0,05). При сравнении прироста объема конечности с индексом 1д/г отмечено, что между данными показателями имеется обратная корреляционная зависимость (при г = - 0,96, р<0,05).

В следующей серии экспериментов мы изучили активность СРО в сыворотки крови экспериментальных животных через 3 часа после индукции воспаления, а также влияние антигипоксантов и НПВС на процессы пероксидации.

Результаты исследования активности процессов СРО представлены в таблице 3. Как следует из таблицы, интенсивность быстрой вспышки и величина

Таблица 3

Показатели свободнорадикального окисления сыворотки крови крыс при каррагенин-индуцированном воспалении и его фармакологической коррекции

Группы животных (п=10) Доза мг/кг Показатели свободнорадикального окисления, отн. ед.

Ф тах, отн. ед. Величина светосуммы свечения, отн. ед.

Контрольная группа 2731±362,8# 36875±5327,0#

Каррагенин 6578±411,2* 72978,2±2383,2*

НПВС + каррагенин

АСК 100 5836±385,7*# 56037±2539,5*#

Диклофенак 8 5743±354,6*# 52430±2146,4*#

Антигипоксанты + каррагенин

Гипоксен 50 3894±241,8*# 55873±2953,7*#

Метапрот 50 5873±134,5*# 65567±2561,8*#

Амтизол 50 5992±257,8*# 68253±2496,1*#

Гесперидин 50 5956±165,1*# 69164±1564,9*#

Антигипоксанты + НПВС + каррагенин

Гипоксен +АСК 50 100 3051±239,3# 42659±1076,6*#

Гипоксен +Диклофенак 50 8 2843±268,7# 38642±1246,2#

Метапрот +АСК 50 100 3464±257,2*# 43281±1964,6*#

Метапрот +Диклофенак 50 8 3525±195,7*# 44653±1564,3*#

Амтизол +АСК 50 100 4165±136,5*# 45274±1896,5*#

Гесперидин +АСК 50 100 4298±156,4*# 44281±1346,6*#

светосуммы свечения в группе животных, где применялся каррагенин, были достоверно выше (в 2,4 и в 2 раза соответственно) значений контрольной группы. Такие изменения показателей свидетельствуют об активации СРО (активация процессов ПОЛ и снижение активности антиоксидантной защиты).

В опытных группах крыс на фоне применения лекарственных препаратов показатели СРО увеличивались не так выраженно, например, в группе, где применялась АСК, интенсивность быстрой вспышки увеличилась в 2,1 раза, а величина светосуммы свечения - в 1,5 раза по отношению к контролю. Примерно такие же изменения отмечались после введения диклофенака. Антигипоксанты тоже снижали величину изучаемых показателей СРО, активированного каррагенином. Наиболее эффективно это отмечалось на

фоне приема гипоксена по показателю Фтах. При назначении комбинаций гипо-ксена с диклофенаком или АСК, а также метапрота с диклофенаком или АСК наблюдалось максимальное угнетение СРО, индуцированного карагенином. Показатели интенсивности быстрой вспышки и величины светосуммы свечения в этих группах опытных животных приближались к контрольным значениям. Комбинации амтизола и гесперидина с НПВС были менее эффективными.

Выраженное ингибирование процессов СРО при применении гипоксена и его комбинаций с НПВС в условиях острого воспаления, по-видимому, объясняется полигидрофениленовой структурой основного ядра гипоксена. Гидроксильные группы полигидрохинона легко отдают свой атом водорода, который может взаимодействовать с активным радикалом с

образованием пероксидов. В молекуле гипоксена одновременно может существовать до 12 гидроксильных групп, способных одномоментно или последовательно связать большое количество свободных радикалов [2, 6].

Таким образом, субплантарное введение 1% водного раствора карагенина крысам вызывает через 3 часа развитие острой воспалительной реакции, которая проявляется выраженным отеком (увеличение объема лапы) пораженной конечности, характерными изменениями лейко-граммы крови и активацией процессов СРО в сыворотке крови. Предварительное энтеральное введение опытным животным антигипоксантов (амтизол, геспери-дин, гипоксен, метапрот) существенно не изменяет развитие воспалительной реакции. Слабое противовоспалительное действие оказывают гипоксен и метапрот в дозах 50 мг/кг. Однако применение анти-гипоксантов в комбинации с ацетилсалициловой кислотой или диклофенаком при остром карагенин-индуцированном воспалении сопровождается выраженным увеличением противовоспалительного эффекта НПВС. Наиболее эффективными оказались комбинации гипоксена с дик-лофенаком, метапрота с диклофенаком, гипоксена с АСК и метапрота с АСК. У животных, получавших эти комбинации лекарственных веществ на фоне введения каррагенина, все регистрируемые признаки воспаления (прирост объема конечности, процент торможения воспаления, показатели лейкограммы, активность свободно-радикального окисления) были значительно меньше, а индекс противовоспалительной активности выше по сравнению с другими опытными группами животных. Данные результаты свидетельствуют о том, что гипоксен и мета-прот потенцируют противовоспалительный эффект НПВС. Возможно, это связано с мощным антиоксидантным действием препаратов и подавлением экссуда-тивной фазы воспаления.

Выводы

Гипоксен и метапрот в дозе 50 мг/кг массы оказывают слабое противовоспа-

лительное действие на модели острого каррагенин-индуцированного воспаления. Применение гипоксена и метапрота в комбинации с диклофенаком или ацетилсалициловой кислотой потенцирует противовоспалительный эффект НПВС.

Литература

1. Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика / А.А. Кишкун. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 350 с.

2. Левченкова О.С. Антигипоксанты: возможные механизмы действия и клиническое применение / О.С. Лев-ченкова, В.Е. Новиков // Вестник Смоленской гос. медицинской академии. - 2011. - №4. - С. 43-57.

3. Левченкова О.С. Индукторы регуля-торного фактора адаптации к гипоксии / О.С. Левченкова, В.Е. Новиков // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2014. - №2 . -С. 134-144.

4. Левченкова О.С. Фармакодинамика и клиническое применение антигипоксантов / О.С. Левченкова, В.Е. Новиков, Е.В. Пожилова // Обзоры по кли-нич. фармакологии и лекарств. терапии. - 2012. - Т. 10, №3. - С. 3-12.

5. Новиков В.Е. Влияние гипоксена на эффективность кислоты ацетилсалициловой при остром воспалении / В.Е. Новиков, С.А. Илюхин // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2013. - Т. 76, №4. - С. 32-35.

6. Новиков В.Е. Фармакология и биохимия гипоксии / В.Е. Новиков, Н.П. Ка-тунина // Обзоры по клинич. фармакологии и лекарств. терапии. - 2002. -Т. 1, №2. - С. 73-87.

7. Новиков В.Е. Фармакология гепато-протекторов / В.Е. Новиков, Е.И. Климкина // Обзоры по клинич. фармакологии и лекарств. терапии. -2005. - Т. 4, №1. - С. 2-20.

8. Новиков В.Е. Гастропротекторные свойства мексидола и гипоксена / В.Е. Новиков, Н.О. Крюкова, А.С. Новиков // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2010. - Т. 73, №5. - С. 15-18.

9. Новиков В.Е. Новые направления поиска лекарственных средств с антигипоксиче-

ской активностью и мишени для их действия / В.Е. Новиков, О.С. Левченкова // Эксперим. и клинич. фармакология. -2013. - Т. 76, №5. - С. 37-47.

10. Новиков В.Е. Фармакология производных 3-оксипиридина / В.Е. Новиков, С.О. Лосенкова // Обзоры по кли-нич. фармакологии и лекарств. терапии. - 2004. - Т. 3, №1. - С. 2-14.

11. Новиков В.Е. Влияние мексидола на течение посттравматической эпилепсии / В.Е. Новиков, Н.Н. Маслова // Эксперим. и клинич. фармакология. -2003. - Т. 66, №4. - С. 9-11.

12. Новиков В.Е. К механизму антигипо-ксического действия нового комплексного соединения аскорбиновой кислоты / В.Е. Новиков, Е.О. Маркова, Э.А. Парфенов // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2013. - №2. - С. 59-65.

13. Новиков В.Е. Аминотиоловые антиги-поксанты при травматическом отеке

мозга / В.Е. Новиков, Н.С. Понамаре-ва, П.Д. Шабанов. - Смоленск; СПб.: Элби-СПб, 2008. - 176 с.

14. Тургенева Л.Б. Лечение воспалительных заболеваний пародонта мексидо-лом / Л.Б. Тургенева, В.Е. Новиков, Е.В. Пожилова // Патогенез. - 2011. -Т. 9, №3. - С. 67.

15. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.

16. Щулькин А.В. Исследование влияния фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса у крыс / А.В. Щулькин, В.В. Давыдов, Е.Н. Якушева // Вестн. Рос. военно-медицинской академии. - 2012. - №4. - С. 196-199.

17. An accurate and simple method for measurement of paw edema / M. Ferei-doni [et al.] // Pharm. Toxicol. Methods J. - 2000. - Vol. 43. - P. 11-14.

INFLUENCE OF ANTIHYPOXANTS ON THE DEVELOPMENT OF CARRAGEENIN-INDUCED INFLAMMATION

E. V. Pogilova

In the experiment, on a model of acute carrageenin-induced inflammation of rat's paw, changes in size of the affected limbs (paw edema), parameters of leukogram and activity of free radical oxidation were registered. The anti-inflammatory effect of antihypoxants (amtizol, hesperi-din, hypoxen, metaprot) was investigated. It has been shown that hypoxen and metaprot 50 mg/kg have weak anti-inflammatory activity, but potentiate the effect of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. At simultaneous enteral administration of hypoxen and metaprot with acetylsalicylic acid or diclofenac, evident anti-inflammatory effect was marked, that was manifested by significant reduction in registered inflammation symptoms.

Keywords: amtizol, hesperidin, hypoxen, metaprot, acute inflammation.

Пожилова Е.В. - соискатель кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» МЗ РФ.

214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28. E-mail: nau@sgma.info.