Изучение влияния циклофосфана и соевых белков на рост перевиваемых опухолей мышей

изучение:: влияния ц иклофосфана и соевы х ебеел ков на рост перевиваемых опухолей мышей

Г.В. Киреев1, Ю.Ю. Ассесорова1, A.A. Юсупова1,

Ф.А. Ибрагимов2, 3. Голубенко2

Республиканский онкологический научный центр М3 РУз1, г. Ташкент Институт биоорганической химии АН РУз им. акад. A.C. Садыкова2, г. Ташкент

Изучено влияние нового биорегулятора на основе соевых белков на рост экспериментальных опухолей животных «саркома-180» и «меланома В-16». Результаты показали, что соевые белки, применяемые как самостоятельный противоопухолевй препарат или как средство дополнительной терапии при лечении циклофосфаном, позволяют повысить эффективность терапии экспериментальных опухолей животных. При этом основной положительный эффект лечения проявляется в усилении регрессии опухоли, увеличении продолжительности жизни животных-опухоленосителей и зависит от гистогенеза опухоли. Воздействие циклофосфана и соевых белков индуцирует экспрессию в опухолевых клетках de novo полипептидов с молекулярными массами 21, 36, 39, 44, 62 и 64 кДа.

INVESTIGATION OF CYCLOPHOSPHAN AND SOY-BEAN PROTEINS ON THE GROWTH OF INTERWINED TUMOURS OF MICE

G.V.Kireev1, Yu. Yu. Assesorova1, A. A. Ysupova1, F. A. Ibragimov2, Z. Golubenko2

Republic oncological scientific centre of the Ministry of Public Health of Uzbekistan1, Tashkent Institute of the bioorganic chemistry of SA Uzbekistan after name of academic A.S. Sadikov2, Tashkent

The influantion of new bioregulator on the basis of soy-been proteins on the growth of the experimental tumors of mice “sarcoma-180” and “melanoma B-16” was investigated. The results showed, that the soy-been proteins, using as the untitumor drug or the mean of additional therapy together cyclophosphan, allow to heighten the effect of experimental tumor therapy. By that the essential positive effect of the therapy is the tumor regression intensification, mice with tumor life-time prolongation and it depends of tumor gistogenesis. The action of cyclophosphan and soy-been proteins induces the expression in tumor cells de novo polypeptides with molecular weight 21, 36, 39, 44, 62 è 64 kDa.

Широкое внедрение в клиническую практику лекарственных методов лечения рака выщвинуло задачи изыскания новых путей и средств повышения реактивности больного, а также уменьшения токсичности антибластомных агентов при условии сохранения их активности. В этом плане представляет интерес поиск новых методов сочетанного действия противоопухолевых препаратов и различных средств биотерапии опухолей, которые могут привести, с одной стороны, к уменьшению токсических реакций организма, с другой, - к усилению регрессии опухоли. Лекарственные средства, используемые для биотерапии рака, в настоящее время весьма разнообразны. Это генные конструкции, биологически активные соединения, моноклональные антитела, природные и синтетические пептиды, низкомолекулярные вещества и др. [5, 7, 8, 9, 12].

Широкое применение как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях находят средства

природного происхождения, применяемые в качестве биорегуляторов и биологически активных добавок (БАД). В настоящее время изучены биологические свойства целого ряда биорегуляторов, которые сочетают противоопухолевую активность с другими позитивными фармакологическими эффектами, основанными на их антиоксидантной, детоксицирующей, иммуномодулирующей или противовоспалительной способности (препараты и биологически активные добавки «лапрот», «антиоксифит», «гераном», «кас-катол», «баксин», «инсол», «мелатонин», «вилон», «эпиталон» и др.) [3].

Анализ данных литературы и собственные предварительные исследования позволяют нам предположить, что природными биорегуляторами, способными проявлять противоопухолевые свойства и усиливать терапевтический эффект противоопухолевого лечения, могут являться белки, выделенные из плодов бобовых растений. Так, белковые ингибиторы

Изучение влияния циклофосфана и соевых белков на рост перевиваемых опухолей мышей

протеаз, выщеленныге из соевых бобов и гороха, в несколько раз снижают частоту возникновения опухолей при воздействии канцерогенных агентов, усиливают регрессию опухоли и замедляют инвазию и метастазирование [1, 2]. Учитывая вышеизложенное, мы изучили влияние новой биологически активной добавки, содержащей фракцию соевых белков с молекулярной массой от 24 до 85 кДа, на рост экспериментальных опухолей различного гистогенеза при проведении химиотерапии циклофосфаном.

Известно, что рак связан с нарушением механизмов, контролирующих упорядоченную экспрессию генов в дифференцированных тканях [12]. Миспрог-раммирование генетической информации является общей фенотипической чертой опухолевых клеток, обусловливающей аберрантный синтез белков, которые могут быть эндогенными регуляторами, участвующими в контроле клеточной пролиферации, диф-ференцировке и гибели. В связи с этим мы сочли целесообразным провести сравнительную оценку экспрессии белков в опухолевых клетках при воздействии циклофосфана и соевых белков.

Цель исследования - оценка эффективности соевых белков как самостоятельного противоопухолевого средства и дополнительного, коррегирующего средства при лечении цитостатическим препаратом циклофосфаном животных с перевиваемыми опухолями «саркома-180» и «меланома В-16», а также изучение состава белков, экспрессируемых опухолевыми клетками данных штаммов.

Материалы и методы

В настоящей работе использовали мыши линии С57БЬ и белые беспородные разводки вивария опыгг-но-экспериментального завода «Нихол» РОНЦ М3 РУз весом 18-20 г. Животных содержали по 4-6 особей при естественном режиме освещения со свобод-ныш доступом к воде и пище. Взвесь опухолевык клеток (опухоли «саркома 8-180» и «меланома В-16») в объеме 0,3 мл (1,2^ 106 клеток) перевивали подкожно согласно методике [6].

Соевый белок (СБ), представляющий собой сухой порошок белого цвета без запаха и примесей, получали путем фракционной экстракции и последующей гельфильтрации из шрота сои, после удаления масла и жиров. СБ вводили мышам в дозе 150 мг/кг перорально, через 48 ч после перевивки опухоли, в течение 10 дней. Циклофосфан вводили в дозе 20 мг/кг

'контроль' опыт

) / СПЖ  100%.

контроль опыт

внутрибрюшинно, через 48 ч после перевивки опухоли, в течение 10 дней. Экспериментальных животных либо забивали на 14-й день эксперимента под хлороформенным наркозом, либо вели наблюдение до естественной гибели. Эффект противоопухолевого действия оценивали по массе (М) извлеченной опухолевой ткани и средней продолжительности жизни (СПЖ). Торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ) животных вычисляли по формулам [3]:

ТРО = (М - М ) / М  100%.

опыт контроль опыт

УПЖ = (СПЖопыт -

опыт

Экспериментальных животных разделили на 4 группы (по 6 мышей в каждой): I группа - контрольная, включавшая нелеченык животнык-опухоле-носителей; II группа - животные-опухоленосители, получавшие циклофосфан; III группа - животные-опухоленосители, получавшие циклофосфан и соевый белок; IV группа - животные-опухоленосители, получавшие соевый белок.

Для выделения водорастворимых клеточных белков навеску опухоли массой 2 г измельчали в жидком азоте, гомогенезировали в 10% растворе №С1, белки экстрагировали в этом же растворе 30 мин при 40С. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин для удаления клеточных обломков. Супернатант центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин и температуре 40С. Электрофорез белков проводили в 10-15 % полиакриламидного геля (ПААГ) по методу ЬаеттН [10]. Пластину ПААГ окрашивали кумаси-бриллиан-товыш-синий-0-250.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась по Стьюденту. Достоверность полученных результатов оценивали при доверительном интервале (р<0,05).

Результаты и обсуждение

Результаты проведенных исследований показали, что применение циклофосфана в указанной дозе тормозит рост опухоли «саркома-180» до 91 % по массе при достоверной разнице средней массы опухоли в данной группе по сравнению с контролем и увеличивает среднюю продолжительность жизни животных-опухоленосителей в 1,4 раза (табл. 1).

Воздействие на рост опухоли СБ совместно с цик-лофосфаном повышает эффективность противоопухолевого лечения: ТРО по массе составило 93 % (при достоверной разнице средней массы опухоли с конт-

Таблица 1 Действие соевого белка и циклофосфана на рост опухоли «саркома 3-180»

Таблица 2 Действие соевого белка и циклофосфана на рост опухоли «меланома В-16»,

Группы живочнык ТТррпдрдтьт Масса опуюпц г. НО % СПЖ ДМЯ УПЖ %

I I^TITQ lyStflyOS нштроль 1^а±ДКР 36ii6±lß3

П ipynra Цитаюфэо^ан 9Ц±4,4 37,4±1£4

Ш rpjnm Цнтаюфэо^ан + СЕ ашщк Д4±3£2

IV ГЕупга СБ Q1ÄQJ009 89Д0±4,4 ЖЭОЯ1 53$£2?4

Группы животных Препараты Масса опухоли, г. ТРО % СПЖ дней УПЖ %

I группа 1,8±0,09 контроль 1,7±0,08 23,4±1,17

II группа Циклофосфан 0,62±0,03 45,0±2, 35,4±1,72 51,28±2,6

III группа Циклофосфан + СБ 0,40±0,02 76,4±3,2 41,8±2,06 78,6±3,94

IV группа СБ 1,02±0,05 40,0±1,9 30,6±1,53 30,7±1,53

Рис. 1. Действия циклофосфамида и соевого белка на массу опухоли «меланома 5-16» (а) и «саркома £-180» (б):

1 - группа контроля, 2 - группа животных, получавших циклофосфан, 3 - группа животных, получавших циклофосфан + СБ,

4 - группа животных, получавших СБ

1?. щ т/Х

п

ч

ч

S-IX9

Рис. 2. Электрофореграмма 10-15 % ПААГ в присутствии 8Э8 белков «саркомы 5-180» и «меланомы В-16» после воздействия циклофосфана и соевого белка: 1, 6 -циклофосфан, 2, 7 - циклофосфан +соевый белок, 3, 8 - соевый белок, 4, 9 - контроль, 5,10 - маркеры

Изучение влияния циклофосфана и соевых белков на рост перевиваемых опухолей мышей

------------------------------------------------------------------------------------------ 45

ролем и недостоверной с группой II), СПЖ увеличилась в 1,8 раза по сравнению с контролем, а показатель УПЖ достиг 78 %.

Однако СБ, применявшиеся для лечения животных с опухолью «саркома S-180» как самостоятельный противоопухолевый препарат в дозе 150 мг/кг, также проявили высокую цитостатическую активность: ТРО по массе достигало 89 % при достоверной разнице средней массы опухоли в сравнении с контролем. Оценка влияния СБ на продолжительность жизни жи-вотных-опухоленостителей также показала биологически значимый эффект: УПЖ составило 54 %.

Результаты эксперимента, проведенного на живот-нык с опухолью «меланома В-16», показали, что применение циклофосфана задерживает рост данной опухоли до 45 % при достоверной разнице средней массы опухоли с контролем (табл. 2). Средняя продолжительность жизни животных-опухоленосителей в данной группе в 1,5 раза больше, чем в контроле. Как и в случае «саркомы S-180», воздействие СБ усиливает противоопухолевый эффект циклофосфана: ТРО по массе составило 76 % при достоверной разнице средней массы опухоли как с контролем, так и с группой II; СПЖ увеличилась в 1,8 раза по сравнению с контролем, а показатель УПЖ составил 79 %. Самостоятельный же противоопухолевый эффект СБ, применявшихся для лечения опухоли «меланома В-16», оказался невысоким: ТРО по массе составило 40 %, СПЖ увеличилась всего в 1,3 раза по сравнению с контролем, а УПЖ не превышало 31 %. Однако эти данные позволяют с уверенностью сказать, что изучаемый биорегулятор не стимулирует роста опухоли «меланома В-16».

Исследование методом электрофореза в ПААГ спектра клеточных белков, выделенных из опухолей «саркома S-180» и «меланома В-16» (рис. 2), показало существенное различие в их составе. Этот факт не противоречит данным литературы, поскольку известно, что для опухолей различного гистогенеза характерны специфические изменения состава клеточных белков, затрагивающие в каждом случае молекулярную массу, структуру, функциональную активность и другие характеристики полипептидов.

Анализ электрофореграмм клеточных белков, выделенных из опухолей у животнык, подвергавшихся воздействию как противоопухолевого цитостатика, так и соевых белков, также показал специфические изменения спектра экспрессируемых протеинов. В ответ на воздействие изучаемых веществ опухолевые клетки индуцировали специфические de novo белки. Так, при воздействии циклофосфана в опухоли «меланома В-16» индуцируется экспрессия полипептидов с мол. массой 62 кДа и 44 кДа, циклофосфа-

на и соевых белков - полипептида в 44 кДа, и толыко соевых белков - полипептидов массой 44 кДа и 36 кДа. В клетках опухоли «саркома S-180» под влиянием циклофосфана экспрессируются полипептиды с мол. массой 64 кДа и 21 кДа; при воздействии циклофосфана и соевык белков - полипептида в 64 кДа и 39 кДа, и толыко соевых белков - полипептида с мол-.массой 64 кД.

Таким образом, резулытаты проведенных исследований свидетелыствует о том, что новая биологически активная добавка, содержащая соевые белки, не стимулирует роста опухолей, а обладает противоопухолевым действием. Дополнение противоопухолевого лечения соевыми белками позволяет повыситы эффективносты химиотерапии эксперименталыных опухолей животных. При этом основной положителы-ный эффект лечения проявляется в усилении регрессии опухоли, увеличении продолжителыности жизни животных-опухоленосителей и зависит от гистогенеза опухоли. Модулирующая активносты новой биологической добавки, на основании резулытатов данных экспериментов, может объяснятыся свойствами соевык белков индуцироваты экспрессию de novo клеточных полипептидов, которые могут являтыся специфическими эндогенными регуляторами метаболических процессов, направленных на подавление активности и роста опухолевой клетки.

Выводы

1. Применение соевых белков как противоопухолевого препарата при лечении животных с опухолями «саркома S-180» и «меланома В-16» способствует регрессии опухоли в 1,7-9,5 раза и в 1,3-1,5 раза увеличивает продолжителыносты жизни животных.

2. Соевые белки, исполызуемые как дополнителы-ное средство при лечении циклофосфаном животных с опухолями «саркома S-180» и «меланома В-16», повышают противоопухолевый эффект лечения, увеличивая регрессию опухоли в 4,2-15 раз и продолжи-телыносты жизни животных - в 1,8 раза.

3. Воздействие циклофосфана и соевык белков индуцирует экспрессию в опухолевых клетках de novo полипептидов с молекулярными массами 21, 36, 39, 44, 62 и 64 кДа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопр. онкол. 2003. Т. 49, № 2. С. 145-151.

2. Крутиков В.М. Биотерапия рака и ингибиторы протеаз // Вопр. онкол. 2001. Т. 47, № 1. С. 106-108.

3. Немцова Е.Р., Сергеева Т.В., Андреева К.Л. и др. Профилактика злокачественных новообразований в эксперименте при помощи средств природного происхождения // Рос. онкол. журн. 2002. № 3. С. 30-34.

4. Николин В.П., Каледин В.И., Баймак Т.Ю. и др. Апоп-тоз-индуцирующая и противоопухолевая эффективность циклофосфана, платина и адриамицина при их раздельном применении и в комбинации у мышей с лимфосаркомой LS // Вопр. онкол. 2002. Т. 48, № 2. С. 211-215.

5. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Рос. биотерапевт. журн. 2002. Т. 1, № 3. С. 27-33.

6. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / Под ред. З.П. Софьиной, А.Б. Сыр-кина, А. Голдина и др. М., 1980. С. 71-131.

7. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Рос. биотерапев. журн. 2002. Т. 1, № 3. С. 5-14.

8. Davis I.D. An overview of cancer immunotherapy // Immunol. Cell. Biol. 2000. № 78. P. 179-195.

9. Gavilondo I.V., Larrick J.W., Borrebaeck C.A.K. Human antibodies therapy // Immunologist. 2000. № 8. P 58-65.

10. Laemmli U.K. // Nature. 1999. Vol. 227. P.680.

11. Monari S.// Am. Soybean Association. 1995. P. 44.

12. Ponder B.A.J. Cancer geneticcs // Nature. 2001. Vol. 411. P. 336-341.

Поступила 18.08.05