Способ получения аутологичных дендритных клеток с высоким уровнем экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул при онкологических заболеваниях
METHOD OF PRODUCING AUTOLOGOUS DENDRITIC CELLS WITH HIGH LEVEL OF EXPRESSION OF HLA-DR AND COSTIMULATORY MOLECULES IN ONCOLOGICAL DISEASES

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для клеточной иммунотерапии лиц с онкологическими заболеваниями.
Онкологические заболевания являются второй из основных причин смерти в мире. В 2019 году в России выявлено более 640 тыс. случаев злокачественных новообразований, что на 2,5% превышает результат 2018 года [2]. Большинство онкологических заболеваний излечимы при условии, что они диагностированы на ранних стадиях, но и на поздних стадиях также можно достигнуть длительной ремиссии. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками и, соответственно, определяются как важный фактор противоопухолевого иммунитета, инициируя и стимулируя специфическую противоопухолевую активность эффекторных Т-лимфоцитов [6, 10]. В связи с этим, определяется необходимость разработки новых способов получения аутологичных дендритных клеток с высоким уровнем функциональной активности для больных онкологическими заболеваниями.
Технология получения аутологичных ДК основывается на дифференцировки моноцитов крови в ДК in vitro [6, 12]. При этом сама функциональная активность ДК определяется уровнем экспрессии рецептора HLA-DR (участвует в механизмах антигенпрезентации) и костимуляторных молекул (CD80 и CD86) [14]. В то же время, антигенпрезентирующая и костимуляторная активность ДК, полученных из моноцитов больных с онкологическими заболеваниями, не всегда оказывается на высоком уровне. Установлено, что сама опухоль оказывает ингибирующее влияние на функциональную активность ДК [6]. С целью преодоления ингибирующего влияния опухоли в инкубационную среду вносятся различные факторы, стимулирующие функциональную активность ДК [3, 4, 5].
Известно действие препарата «Профеталь» (лиофилизированный и стабилизированный декстраном человеческий α-фетопротеин) на функциональные свойства мононуклеарных лейкоцитов и возможность генерации из них зрелых ДК [8]. Установлено, что при активации мононуклеарных лейкоцитов здоровых людей препаратом «Профеталь» формировались зрелые ДК с высоким уровнем экспрессии рецепторов антигенпрезентации (CD1a), костимуляции (CD80), адгезии (CD11c) и терминальной дифференцировки (CD83).
Однако, отсутствуют данные о применение данного препарата при индукции зрелых функционально активных ДК у лиц с онкологическими заболеваниями.
Известно средство, индуцирующее созревание дендритных клеток [3]. Показано, что введение в культуру дифференцирующихся моноцитов фукоидана (из Fucus evanescens) или полисахаридной композиции (из Fucus evanescens, состояла из фукоидана в количестве 60-80% и полиманнуроновой кислоты в количестве 20-40%) индуцировало созревание ДК, выражающееся в увеличении экспрессии рецепторов CD80, CD83, CD86 и CCR7.
Однако, экспрессия рецептора главного комплекса гистосовместимости на мембране ДК, участвующего в антигенпрезентации, под воздействием фукоиданов не увеличивалось, что определяет отсутствие стимуляции антигенпрезентирующей активности ДК и, соответственно, является недостатком способа.
Известна композиция для стимулирования созревания ДК, содержащая гибридный белок Rv2299c/ESAT-6 [5]. Данная белковая композиция представлена рекомбинантным белком, состоящим из ESAT-6 и Rv2299c, полученных из М. tuberculosis. Способ реализуется обработкой незрелых ДК гибридным белком Rv2299c/ESAT-6 для обеспечения созревания их в зрелые ДК, экспрессирующих корецепторы (CD80 и CD86) и антигенпрезентирующие рецепторы (HLA-DR).
Недостатком способа является то, что для индукции зрелых ДК применяется гибридный белок Rv2299c/ESAT-6, соответственно, активация ДК осуществляется аллогенным материалом, как будет изменяться аутологичная противоопухолевая активность ДК у лиц с онкологическими заболеваниями - не известно.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ стимуляции презентирующей активности ДК, где в качестве индуктора созревания ДК используют лизат опухолевой культуры HeLa, образующегося после ее сокультивирования с реовирусом Р-92 [4]. Методом проточной цитометрии оценивали уровни экспрессии рецепторов антигенпрезентации и корецепции на ДК и обнаружили увеличение в 2,4 раза процента ДК в культуре, экспрессирующих маркеры CD86 и HLA-DR, по сравнению с контролем.
Недостатком способа является то, что индукция созревания и повышения функциональной активности ДК осуществляется аллогенным материалом и, следовательно, аутологичная противоопухолевая активность ДК остается неконтролируемой.
Доказано, что при онкологических заболеваниях в клетках иммунной системы значительно нарушается интенсивность ряда метаболических процессов, что приводит к снижению функциональной активности клеток [1, 7, 11]. В связи с этим, для стимуляции функциональной активности ДК в среду инкубации необходимо добавлять метаболиты. В качестве таких метаболитов предлагается использовать соли глутамата и пирувата. Данные метаболиты вовлекаются в энергетические и синтетические процессы внутриклеточного обмена веществ и стимулируют функциональную активность клеток иммунной системы по метаболическим и эпигенетическим механизмам [9, 11, 13].
Техническим результатом заявляемого изобретения является увеличение выхода активированных ДК (аДК) и повышение уровня экспрессии HLA-DR-рецептора и корецепторов (CD80 и CD86) аутологичных дендритных клеток.
Технический результат достигается тем, что в способе получения аутологичных дендритных клеток с высоким уровнем экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул при онкологических заболеваниях, включающем культивирование моноцитов в присутствии цитокинов и лизата аутологичных опухолевых клеток в течение не менее 7 суток, новым является то, что для повышения уровня экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул на мембране активированных дендритных клеток в инкубационную культуру вносят глутамат натрия до концентрации 5,34 мМ - 10,25 мМ и пируват калия до концентрации 3,06 мМ - 6,2 мМ.
Способ осуществляется следующим образом.
3
2
У пациентов с онкологическими заболеваниями во время проведения операции по поводу хирургического удаления опухоли забирают венозную крови в количестве 6 мл из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином и опухолевую ткань (объем - не менее 0,5 см, помещают во флаконы с физиологическим раствором). Мононуклеарные клетки выделяют из цельной гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077). Моноциты выделяют на чашках Петри путем прилипания к пластику в среде RPMI-1640 в присутствии 10% аутологичной сыворотки. Дифференцировку моноцитов в незрелые ДК (нДК) осуществляют в течение 5 суток при 37°С в СО-инкубаторе (Sanyo, Япония) во флаконах для культивирования (Greiner Bio One, Германия), в среде RPMI-1640, содержащей 10% аутологичной сыворотки и 100 мкг/мл гентамицина, в присутствии GM-CSF (50 нг/мл, Sigma-Aldrich, USA) и IFNα (100 Ед/мл, Sigma-Aldrich, USA). Для осуществления метаболической индукции в среду инкубации дополнительно добавляют глутамат натрия (Sigma, США) до достижения концентрации 5,34 - 10,25 мМ и пируват калия (Sigma, США) до достижения концентрации 3,06 6,2 мМ. Активацию ДК индуцируют внесением в инкубационную среду лизата аутологичных опухолевых клеток (100 мкг/мл, по белку) и фактора некроза опухоли-α (TNFα, 25 нг/мл, Sigma-Aldrich, USA) с последующей инкубацией в течение не менее 2 суток.
3
Для приготовления лизата аутологичных опухолевых клеток используют фрагмент опухоли (не менее 1 см), который механически гомогенизируют в забуференном физиологическом растворе и трижды центрифугировуют при +4°С и 400g в течение 2 минут (Eppendorf Centrifuge 5804R, Германия) для удаления конгломератов ткани. Супернатант замораживается при температуре -80°С без криопротекторов и проводится через 3 цикла быстрого замораживания-оттаивания. Полученный гомогенат центрифугируется при 2000g 15 минут. В супернатанте по методу Брэдфорда измеряют концентрацию белка и замораживают для дальнейшего использования при -80°С.
Определение концентрации белка в лизате по Брэдфорду осуществляют следующим образом. Кумасси бриллиантовый синий G-250 (ООО «Компания Хеликон», Россия) растворяют в 50 мл 95% этилового спирта и добавляют 100 мл 85% фосфорной кислоты, доводят смесь дистиллированной водой до 1 л. К 0,1 мл образца лизата добавляют 5,0 мл реагента-красителя, хорошо перемешивают, инкубируют 15 мин. при комнатной температуре и определяют поглощение при 595 нм (относительно чистого реагента-красителя) на любом спектрофотометре (например, спектрофотометр СФ-2000, ООО «ОКБ Спектр», Россия). Концентрацию белка вычисляют по калибровочному графику.
-
+
Исследование фенотипа аДК проводят методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, USA) в следующей панели: CD80-FITC/CD86-PE/HLA-DR-ECD/CD83-PC5/CD14-PC7. Анализ окрашенных клеток проводят на проточном цитофлуориметре (например, цитофлуориметр Navios, Beckman Coulter, USA). В каждой пробе анализируют не менее 50000 аДК. Определяют ДК с фенотипом CD14CD83, дальнейшее гейтирование и подсчет клеток осуществляют относительно данного фенотипа. По средней интенсивности флуоресценции (MFI - Mean Fluorescence Intensity) оценивают уровни экспрессии поверхностных рецепторов (HLA-DR, CD80 и CD86).
Уровни концентраций для глутамата натрия и пирувата калия получены опытным путем при исследовании диапазона концентраций 1,0 - 10,0 мМ (для обоих метаболитов) в клеточной культуре дифференцирующихся моноцитов и сопоставлении с фенотипом аДК.
Данный способ апробирован на 19 больных раком почки и мочевого пузыря (табл. 1 и 2).
25
75
-
+
Больные раком почки и мочевого пузыря (T3N0M0) в возрасте 40-55 лет были обследованы на базе КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер имени А.И. Крыжановского» до хирургического лечения. Диагноз был верифицирован гистологически. По заявленному способу получены аДК (в таблицах 1 и 2: «глутамат натрия + пируват калия»), также аДК были получены без внесения метаболитов в среду инкубации (в таблицах 1 и 2: Контроль). Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Me) и интерквартильного размаха в виде 1 и 3 квартилей (С - С). Достоверность различий исследуемых показателей, полученных по заявленному способу и контрольных значений, определяли по критерию Вилкоксона (Wilcoxon matched pairs test). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007). Выход аДК с фенотипом CD14CD83(фенотип ДК) у больных раком почки и мочевого пузыря при дифференцировке моноцитов без добавления метаболитов (Контроль) составил 29,5% (17,1% - 48,5%), по заявленному способу - 43,2% (29,5% - 64,0%) (ρ=0,014). При этом, в клеточной культуре аДК, полученных по заявленному способу, выявлялось более высокое количество клеток, экспрессирующих маркеры антигенпрезентации (HLA-DR) и костимуляции (CD80 и CD86) (табл. 1). Кроме того, аДК, полученные по заявленному способу, более интенсивно экспрессировали данные маркеры (табл. 2). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о преимуществе заявленного способа по получению дендритных клеток с высоким уровнем экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул у больных с онкологическими заболеваниями.
Пример 1
Больной С, 52 года. Находился на стационарном лечении в урологическом отделении КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с 03.08.2020 по 23.10.2020 с диагнозом: рак мочевого пузыря, T3N0M0. Операция 12.10.2020, проведена операция трансуретральной резекции мочевого пузыря. Результаты гистологического исследования: плосколеточный рак, G2. Течение послеоперационного периода гладкое.
Проведено исследование заявленным способом. Установлено, что при концентрации 5,34 мМ глутамата натрия и 3,06 мМ пирувата калия в среде дифференцирующихся моноцитов выход аДК составил 52,1%, содержание аДК, экспрессирующих HLA-DR-, CD80- и CD86-рецепторы, составило 99,7%, 99,8% и 99,8%, соответственно. Уровни экспрессии антигенов (MFI) на мембране аДК составили: для HLA-DR=24,17 о.е., для CD80=5,08 о.е. и для CD86=26,33 о.е.
При дифференцировке моноцитов в ДК без добавления метаболитов выход аДК у пациента Е. составил 34,9%, содержание аДК, экспрессирующих HLA-DR-, CD80- и CD86-рецепторы, составило 95,8%, 96,2% и 94,9%, соответственно. Уровни экспрессии антигенов (MFI) на мембране аДК составили: для HLA-DR=15,28 о.е., для CD80=4,41 о.е. и для CD86=8,87 о.е.
Пример 2
Больной Е., 49 лет. Находился на стационарном лечении в урологическом отделении КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с 9.09.2019 по 15.11.2019 с диагнозом: рак правой почки, T3N0M0. Операция 29.10.2019, проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия слева, дренирование забрюшинного пространства. Результаты гистологического исследования: светлоклеточный рак почки. Течение послеоперационного периода гладкое.
Проведено исследование заявленным способом. Установлено, что при концентрации 7,15 мМ глутамата натрия и 4,85 мМ пирувата калия в среде дифференцирующихся моноцитов выход аДК составил 50,9%, содержание аДК, экспрессирующих HLA-DR-, CD80- и CD86-рецепторы, составило 99,6%, 99,9% и 99,9%, соответственно. Уровни экспрессии антигенов (MFI) на мембране аДК составили: для HLA-DR=25,18 о.е., для CD80=5,85 о.е. и для CD86=27,45 о.е.
При дифференцировке моноцитов в ДК без добавления метаболитов выход аДК у пациента Е. составил 37,5%, Содержание аДК, экспрессирующих HLA-DR-, CD80- и CD86-рецепторы, составило 96,3%, 96,8% и 95,9%, соответственно. Уровни экспрессии антигенов (MFI) на мембране аДК составили: для HLA-DR=17,11 о.е., для CD80=4,97 о.е. и для CD86=10,15 о.е.
Пример 3
Больная Д., 54 года. Находилась на стационарном лечении в урологическом отделении КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского» с 20.01.2020 по 13.03.2020 с диагнозом: рак правой почки, T3N0M0. Операция 04.03.2020, проведена лапаротомия, радикальная нефрэктомия. Результаты гистологического исследования: светлоклеточный рак почки. Течение послеоперационного периода гладкое.
Проведено исследование заявленным способом. Установлено, что при концентрации 10,25 мМ глутамата натрия и 6,20 мМ пирувата калия в среде дифференцирующихся моноцитов выход аДК составил 51,9%, содержание аДК, экспрессирующих HLA-DR-, CD80- и CD86-рецепторы, составило 99,8%, 99,9% и 99,9%, соответственно. Уровни экспрессии антигенов (MFI) на мембране аДК составили: для HLA-DR=23,86 о.е., для CD80=6,22 о.е. и для CD86=29,04 о.е.
При дифференцировке моноцитов в ДК без добавления метаболитов выход аДК у пациента Е. составил 35,0%, Содержание аДК, экспрессирующих HLA-DR-, CD80- и CD86-рецепторы, составило 95,6%, 95,3% и 96,1%, соответственно. Уровни экспрессии антигенов (MFI) на мембране аДК составили: для HLA-DR=16,11 о.е., для CD80=5,42 о.е. и для CD86=9,65 о.е.
Приведенные выше примеры доказывают, что при введении глутамата натрия и пирувата калия в среду дифференцировки моноцитов получают больший выход аДК с повышенным уровнем экспрессии HLA-DR и костимуляторных молекул.
Таким образом, введение в среду инкубации метаболитов (глутамата натрия и пирувата калия) позволяет повысить антигенпрезентирующую и костимуляторную активности дендритных клеток.
Разработка способа выполнена в рамках проекта «Механизмы метаболического репрограммирования клеток врожденного иммунитета при опухолевом росте», финансируемого Краевым государственным автономным учреждением «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности».
Источники информации:
1. Куртасова Л.М., Савченко А.А., Зуков Р.А., Толмачева Т.В. Ферментный спектр лимфоцитов периферической крови у больных почечно-клеточным раком до и после хирургического лечения// Медицинская иммунология. - 2018. - Т. 20, №3. - С. 391-400.
2. Нечаева О.Б. Оценка оказания медицинской помощи при онкологических заболеваниях в России // Современные проблемы здравоохранения и медицинской статистики-2020. - №1 - С. 246-266.
3. Патент №2361598 РФ. Средство, индуцирующее созревание дендритных клеток / Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П., Кусайкин М.И., Шевченко Н.М., Федоров С.Н., Квак Я.Й. Опубл. 20.07.2009.
4. Патент №2728592 РФ. Способ стимуляции презентирующей активности дендритных клеток / Кит О.И., Златник Е.Ю., Новикова И.А., Ситковская А.О., Межевова И.В., Сагакянц А.Б., Колпаков С.А., Колпакова Е.П. Опубл. 30.07.2020.
5. Патент №2733886 РФ. Композиция для стимулирования созревания дендритных клеток, содержащая гибридный белок Rv2299c/ESAT-6 / Ким Хва-Юнг, Цой Хан-Ги, Син Сун-Чэ. Опубл. 07.10.2020.
6. Савченко А.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Гвоздев И.И., Мошев А.В. Особенности фенотипа дендритных клеток, дифференцированных из моноцитов крови, у больных раком почки // Медицинская иммунология. - 2018. - Т. 20, №2. - С. 215-226.
7. Савченко А.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Гвоздев И.И., Мошев А.В. Взаимосвязь фенотипа и метаболизма нейтрофилов крови у больных раком почки // Медицинская иммунология. 2020. Т. 22, №5. - С. 887-896.
8. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Киселевский М.В. Влияние препарата «Профеталь» на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов и дендритных клеток человека // Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, №5-6. - С. 525-534.
9. Cruzat V., Macedo Rogero M., Noel Keane K., Curi R., Newsholme P. Glutamine: Metabolism and Immune Function, Supplementation and Clinical Translation // Nutrients. 2018. Vol. 10, no. 11. P. 1564.
10. Gardner A., de Mingo Pulido A., Ruffell B. Dendritic Cells and Their Role in Immunotherapy//Front. Immunol. - 2020. - Vol. 11. - P. 924.
11. Но P.C., Bihuniak J.D., Macintyre A.N., Staron M., Liu X., Amezquita R., Tsui Y.C., Cui G., Micevic G., Perales J.C., Kleinstein S.H., Abel E.D., Insogna K.L., Feske S., Locasale J.W., Bosenberg M.W., Rathmell J.C., Kaech S.M. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses // Cell. - 2015. - Vol. 162, no. 6. - P. 1217-1228.
12. Reardon D.A., Mitchell D.A. The development of dendritic cell vaccine-based immunotherapies for glioblastoma// Semin. Immunopathol. 2017. Vol. 39, no. 2. P. 225-239.
13. Shah A.M., Wang Z., Ma J. Glutamine Metabolism and Its Role in Immunity, a Comprehensive Review// Animals (Basel). - 2020. - Vol. 10, no. 2. - P. 326.
14. Vazquez-Madrigal C, Lopez S., Grao-Cruces E., Millan-Linares M.C., Rodriguez-Martin N.M., Martin M.E., Alba G., Santa-Maria C, Bermudez В., Montserrat-de la Paz S. Dietary Fatty Acids in Postprandial Triglyceride-Rich Lipoproteins Modulate Human Monocyte-Derived Dendritic Cell Maturation and Activation //Nutrients. - 2020. - Vol. 12, no. 10. - E3139.