Способ активирования онкосфер цестод для лабораторной наработки антигена
METHOD FOR ACTIVATION OF CESTODE ONCOSPHERES FOR LABORATORY DEVELOPMENTS OF ANTIGEN

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к ветеринарной паразитологии, и может быть использовано для изучения биологических свойств яиц ленточных гельминтов, определения качества инвазионного материала цестод, получения полноценного онкосферального антигена для диагностики тениид и вакцинальной профилактики поголовья сельскохозяйственных животных от эхинококкозов, тениозов, ценуроза и других гидатид.
Проблема тениидозов животных (эхинококкозы, ценуроз, тенуикольный и овечий цистицеркозы и др.) носят глобальный характер. Инвазированность животных личиночными стадиями этого паразита, гораздо выше, чем это констатирует ветеринарная отчетность [1, 2]. Поэтому для борьбы с ними необходима национальная программа по их профилактики [2, 3].
Яйца цестод однотипные, округлой формы, диаметром около 30-40 мкм, содержат гексакантный зародыш (онкосферу), окруженный несколькими оболочками.
Онкосфера - личинка ленточных червей, обладающая 6-ю зародышевыми крючьями, с помощью которых она внедряется в ткани промежуточного хозяина.
Жизнеспособность зародыша (онкосферы) - биологическое свойство культуры гельминта, при котором он имеет типичную морфологическую структуру яйца (не окрашивающуюся красителями), характерную для полноценных или зрелых яиц, и может проявлять двигательную активность внутри яйца (движения зародышевыми крючьями или самим телом зародыша) или выходить из оболочки яйца посредством наличия протеолитических зародышевых ферментов.
Активирование зародыша гельминта - свойство новорожденной личинки проявлять двигательную активность на воздействие разнообразных неспецифических раздражителей (например, физическое тепловое воздействие). Активирование онкосфер цепней заключается в выявлении амебовидных движений зародыша (энергично сокращаясь и/или расслабляясь постоянно меняя форму) вне оболочки яйца.
Личиночная форма ленточного гельминта (у грызунов, мелкого и крупного рогатого скота, свиней и других промежуточных хозяев) в основном состоит из пузыря со слоистой оболочкой и внутренним ядерным герминативным слоем, который продуцирует выводковые капсулы и личинки со сколексами (протосколексы). Протосколексы цепней образуются из внутренней стенки выводковых капсул герминативной оболочки.
Цестоды для своего развития требуют двух хозяев, обычно млекопитающих [1, 4]. С фекалиями дефинитивного хозяина (плотоядного животного) выделяются членики, содержащие яйца, или свободные яйца возбудителя. Яйца тений во внешней среде среднеустойчивы и длительное время, при наличии благоприятных условий, остаются жизнеспособными. Промежуточные хозяева, которыми служат грызуны, сельскохозяйственные животные, заражаются, заглатывая жизнеспособные яйца тениид. В желудке и тонком отделе кишечника хозяина под воздействием ферментов онкосфера выходит из оболочки яйца [1-4]. Желчь промежуточного хозяина активирует онкосферу, которая проникает через стенку тонкого кишечника [11]. Проникновение происходит за счет зародышевых крючьев и протеолитических ферментов (гиалоронидазы и др.). Попав в венулу или лимфатический сосуд, онкосферы пассивно заносятся в печень, где часть их задерживается, другие из них попадают в легкие, в почки, селезенку, мышцы, мозг и другие внутренние органы. В органах хозяина онкосфера начинает развиваться в личиночную (пузырчатую) стадию. Развитие пузыря идет различное время, поэтому развитие протосколексов (инвазионных личинок для плотоядных) идет несколько месяцев. Хищники инвазируются, поедая созревшие личинки цестод в органах или ткани промежуточного хозяина. После заглатывания протосколексов дефинитивным хозяином, в его желудке личинки выворачиваются и через 4-6 недель после заражения, развиваются в половозрелую цестоду.
Современные программы борьбы с цестодозами животных в значительной мере снизили уровень инвазии в России и в большинстве зон СНГ, но были менее эффективны в Казахстане и в среднеазиатских республиках [2, 3]. Тем не менее, в большинстве этих стран инвазия гиперэндемична у овец, крупного рогатого скота, коз и других животных.
В настоящее время на рынках появляются средства профилактика инвазий за счет иммунизации чувствительного поголовья онкосферальными антигенами (вакцинами) [5]. Защитные биопрепараты готовят на основе яиц ленточных гельминтов. Поэтому для оценки полноценности яиц и/или онкосфер цестод требуются достоверные способы и методы определения качественного биологического материала.
Ранее жизнеспособность и инвазионность яиц тениид определяли по внешнему виду, окрашиваниям витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е. скармливанием лабораторным животным [6, 7, 12-18].
Внешний вид и морфологические структуры (при микроскопии) яиц гельминтов тениидного типа не дает достоверной информации по наличию жизнеспособных, мертвых и/или погибающих, активированных зародышей. Биопроба на лабораторных животных показывает результат определения биологических свойств возбудителя тений (жизнеспособность и инвазионность) через несколько месяцев, но не показывает процент полноценности яиц гельминта во введенной (зараженной) культуре. Из литературы [6, 7, 17, 18] известно, что растворы метиленовой сини, генцианвиолета, нейтральрота быстро и хорошо окрашивают мертвые ткани цепней и не окрашивают жизнеспособные. Процент полноценного материала при этом способе сомнителен. Наиболее перспективным способом определения жизнеспособности и активации онкосфер цепней считается способ культивирования в естественных или искусственных пищеварительных соках хозяина [3, 6, 12-18].
В настоящее время используют несколько основных прототипных способов активации онкосфер цестод [8-10, 19]. Их применяют в условиях термостата (сушильного шкафа) при 36 - 38±2°С на 10 мин. - 8 ч. Эти способы определяют активацию яиц цепней (возбудителей эхинококкоза, мультицептоза, тенуикольного цистицеркоза) посредством вылупления (ин. hatching) из яичной оболочки зародыша, далее, появления двигательной активности онкосфер при воздействии пищеварительных ферментов. В начале, яйца гельминтов помещают в активирующий раствор или желудочный сок (состав: соляная кислота [10], пепсин, дистиллированная вода [8] или активирующий раствор - 0,2%-ный раствор едкого калия или 2%-ный раствор соляной кислоты) на 2 мин. [10] - 2 ч [8]. Затем, культуру яиц переносят в искусственный кишечный (дуоденальный) сок или следующий активирующий раствор (состав: панкреатин, бикарбонат натрия (сода пищевая), трипсин, свежеполученная желчь КРС (овечья), дистиллированная вода [9], липаза [8]) на 1-25 мин..
Авторы прототипов, проводя исследования на яйцах возбудителей цестодозов (возбудители цистного эхинококкоза и мультицептоза), извлекали материал препаровальной иглой из члеников гельминтов, что показывает трудоемкость и опасность данной работы [8-11, 19]. Авторы предыдущих исследований совершенствовали рецептуру пищеварительных соков за счет пополнения (сокращения) имеющихся реактивов - липазы, желчи [6, 8-10, 19] за определенный (разнозначный) промежуток времени. Обязательным условием для проведения анализа у прототипных способов - технологическая смена активирующих растворов (пищеварительных соков). При этом процессе, увеличивается время проведения исследований и происходит потеря культуры яиц, что некорректно влияет на точность анализа. Работы по исследованию биологических показателей культур яиц цестод в предыдущих работах проводились с использованием крупногабаритных энергозатратных лабораторных приборов (термостата, сушильного шкафа [11]).
Цель изобретения сводится к использованию одностадийного биотехнологического способа получения активированных онкосфер цестод. Изобретение позволяет исследовать биологические показатели культуры яиц цепней (жизнеспособность, двигательную активность). Предложенный способ повышает процентный выход очищенных активированных онкосфер за короткий промежуток времени.
Анализируя предыдущие исследования, предлагаем одну рецептуру (табл. 1) активирующую онкосферы цестод без смены ферментных растворов (пищеварительных соков) в объеме проведения наработки инвазионного материала. Данный технологический способ исключает процесс препарирования члеников цестод, что позволяет ускорить исследовательскую работу и обезопасить персонал от инвазионного материала. Для определения жизнеспособности яиц гельминтов, активирования онкосфер цестод и выхода инвазионных личинок цепней используется магнитная мешалка с подогревом и контролем температуры активирующей среды электронным термометром с внешним выносным датчиком. Таким образом, сокращается период активации яиц цестод и предложенная технология позволяет получить чистую культуру инвазионных онкосфер. Круговые движения якоря прибора (мешалки) создают аналог перистальтики кишечника хозяина гельминта. Этот процесс позволяет искусственно произвести максимально быстрый и качественный выход жизнеспособных и активированных онкосфер (зародышей) цепней.
Порядок проведения работ с культурами яиц цестод.
1. Приготовление искусственного кишечного сока.
Искусственный кишечный сок (ИКС) готовили по прописи: к 1,5 г панкреатина, 1,5 г соды пищевой, 21 мл свежеполученной (размороженной, концентрированной) желчи жвачных животных, 21 мл трипсину ЭДТА добавляли до 100 мл дистиллированной воды. Полученную смесь ставили на магнитную мешалку, включали подогрев до 40±1°С, устанавливали режим вращения магнита до 550 об. в мин. и выдерживали 5 минут. Далее, ИКС фильтровали через фильтровальную бумагу на протяжении 10-15 мин.. ИКС после данной процедуры становится прозрачным с зеленоватым оттенком. В химический стакан объемом 50 мл с помощью пипетки помещали 5-6 мл отфильтрованного ИКС. На дно стакана анатомическим пинцетом клали магнит размером 0,5 см. Полиэтиленовой пипеткой вносили исследуемые членики с яйцами возбудителей цестодозов или стробилу самого возбудителя (эхинококки).
2. Подготовка магнитной мешалки к работе и проведение процесса переваривания.
Включали магнитную мешалку в электрическую сеть. Химический стакан (объем 50 мл) с искусственным соком (объемом 15-20 мл), члениками с яйцами (5-25 штуки) и магнитом (покрытый пластиком, размером 5 мм) устанавливали на поверхность прибора, выбирали параметры - 44±1°С и 50 об. в мин. и включали рабочий режим. При этом, контролировали температуру ИКС внутри стакана термогигрометром с выносным датчиком температуры и влажности. Температура внутри ИКС должна составлять 39±1°С. В процессе работы магнитной мешалки членики цестод группируются в одном месте химического стакана, после искусственного пептолиза в этом месте остаются одни жизнеспособные и активированные онкосферы. За этот период (15 мин.) ферментируются членики крупных цестод, стробилы цепней (эхинококки) и оболочки яиц гельминтов. После выдержанной экспозиции, пробу онкосфер извлекали полиэтиленовой пипеткой из ИКС, помещали на предметное (часовое) стекло и микроскопировали при увеличении х40, х100. Под микроскопом изучали морфологические и биологические свойства онкосфер цепней и проводили анализ.
3. Проведение анализа.
Не вышедшие зародыши из оболочек яиц (хранившиеся членики цестод на протяжении 6 мес.и более) или вышедшие, но при этом имеющие гигантские размеры, считаются погибшими. Вышедшие личинки с характерной морфологией овального зародыша и наличием 3-х пар зародышевых крючьев, расположенных параллельно или под углом 45°, считаются жизнеспособными. Некоторая часть зародышей (50-80%) может обладать пассивными или активными амебовидными движениями, они считаются активированными онкосферами.
Учет результата анализа проводят по формуле [1]:
где: БС - биологическое свойство онкосфер цестод;
Ж - число жизнеспособных онкосфер;
А - число активированных онкосфер;
О - общее количество инвазионного материала взятого из пробы (яиц, онкосфер);
Определяют среднюю величину показателя жизнеспособности и активирования.
Предлагаемый способ активации онкосфер цестод отражен в следующих примерах.
Пример 1. Получение ларвальной стадии альвеококкоза
Для изучения биологических свойств гельминтоза были подвержены исследованию половозрелые цестоды возбудителя Echinococcus multilocularis азиатского генотипа [20]. Цепни альвеококка были выделены из тонкого отдела кишечника 2 тушек обыкновенных лисиц (Vulpes vulpes) в 2018 г..
При полном гельминтологическом исследовании по К.И. Скрябину (1928) было получено около 60 тыс.половозрелых гельминтов со зрелыми члениками.
ИКС был приготовлен в химическом стакане объемом 250,0 мл из 1,5 г панкреатина, 1,5 г пищевой соды, 21 мл концентрированной желчи крупного рогатого скота (г. Волгоград), 21 мл трипсина ЭДТА и 55 мл дистиллированной воды. Далее, полученную суспензию в стакане помещали на магнитную мешалку (Мешалка магнитная IKA RT-10, многоместная), клали в суспензию магнит в пластике размером 1,5 см, включали подогрев до 40±1°С (для лучшего смешивания компонентов). Режим вращения перемешивающего элемента 550 об. в мин. устанавливали вручную. Период смешивания суспензии составил 5 мин.. Затем, приготовленный сок пропускали через воронку с фильтровальной бумагой в течение 10 мин.. Далее, полученную светло-зеленую прозрачную смесь разливали в химические стаканы объемом 50,0 мл по 10,0 мл ИКС. На дно стакана анатомическим пинцетом клали магнит размером 0,5 см. Одноразовой пипеткой (объемом 2,0 мл) вносили стробилы возбудителя альвеококка (100 экз.).
Химические стаканы помещали на поверхность мешалки, выбирали нужные параметры (44±1°С и 50 об. в мин.) и включали рабочий режим. Контроль температуры ИКС внутри стакана проводили с помощью термогигрометра с выносным датчиком температуры (Термометр-гигрометр цифровой KTJ ТА138). Температура внутри ИКС составляла 39±1°С. В начале процесса искусственного пептолиза на поверхности магнитной мешалки цестоды и зрелые членики группировались в одном месте химического стакана. За период 15 мин. происходило лизирование тканей цестод и члеников, на месте члеников сконцентрировались яйца альвеококка. При микроскопировании (увеличении х40 - 100) осадка в стакане наблюдали наличие онкосфер цепня освободившихся от оболочек (95% в поле зрения от общего числа), из них активированных онкосфер (65%) и частично фрагменты оболочек яиц. Погибших онкосфер при этом не наблюдали.
Дозу онкосфер и яиц гельминта Е. multilocularis для лабораторных грызунов подсчитывали в камере Мигачевой - Котельникова (1976). В опытных группах доза заражения составила 1250 экземпляров онкосфер цепня на лабораторную мышь (табл. 2). Активацию онкосфер альвеококка в второй опытной группе животных проводили согласно методике Н.Е. Косминкова (1993) [8]. Контрольную группу мышей (контроль №1) инвазировали такой же дозой Е. multilocularis неактивированными яйцами альвеококка. Яйца гельминта получали препарированием препаровальной иглой зрелых члеников цестод на предметном (часовом) стекле [8-10]. Четвертой группе мышей задавали ИКС по предложенной выше рецептуре в объеме 1,0 мл. Всего было инвазировано 35 животных, соблюдая правила и технику безопасности работы с инвазионным материалом. Через 8 мес. после инвазирования лабораторных грызунов подвергли эвтаназии (табл. 3). Из экспериментального поголовья (опыт №1) оказалось чувствительным к возбудителю альвеококка 7 животных (70%), в группе №2 - 4 (40%), в группе №3 - 3 (30%). Зрелые личинки цепня (фертильные цисты белого цвета) имели полноценно развитые и жизнеспособные протосколексы (двигательную активность регистрировали на столике Морозова при нагреве содержимого цист до 37°С), ацефалоцисты и гидатидозный песок. Размер ларвоцист составлял от 0,5 до 4,5 см в диаметре. Стерильные цисты (цисты розового цвета) выглядели так же, как и фертильные, и содержали цистную жидкость (диаметр цист 0,5-1,0 см). При этом у них отсутствовали протосколексы, ацефалоцисты и гидатидозный песок. В объизвествленных пузырях (желтовато-белого цвета) имелась соединительнотканная оболочка с наличием солей кальция (диаметр цист 0,1-0,5 см). Ларвоцисты цестоды в опыте №1 регистрировали в печени и легком. Во второй опытной группе (опыт №2) и контроле №1 личиночная форма цепня регистрировалась только в печени.
Изучая физиологическое состояние цист возбудителя Е. multilocularis у опытных и контрольных животных выявлена следующая картина. В опыте №1 фертильные цисты регистрировались у всех 7 животных. В опыте №2 было обнаружено 2 животных с фертильными, 1 животное со стерильными и 1 животное с объизвествленными цистам паразита. Физиологическое состояние цист альвеококка в контроле №1 у животных было разным. В 4-ой группе (контроль №2) у животных цисты не обнаружены.
Протосколексы альвеолярного эхинококка (в фертильных цистах) получали в боксе в стерильных условиях [21]. Для этого, грызунов доноров (инвазированные мыши) подвергали эвтаназии, брюшко обрабатывали 5%-ной настойкой йода и, затем, 7%-ным этиловым спиртом. Очищенные от тканей хозяина ларвоцисты измельчали ножницами, полученную массу отжимали через мельничный газ (диаметр ячеек не менее 1,0 мм). Фильтрат помещали в цилиндр объемом 50 мл и несколько раз (3-5 раз) промывали физиологическим раствором хлорида натрия с целью освобождения от фрагментов оболочек и выводковых капсул. Надосадочную жидкость отсасывали пипеткой 5,0 мл и к оставшемуся осадку добавляли 10 частей (по объему) физиологического раствора, в который добавляли гентамицин (0,3 мг/мл взвеси). В 1 мл полученного инокулята содержалось 800±100 зрелых протосколексов возбудителя гидатидоза. При внутрибрюшинном заражении с помощью инъекционной иглы диаметром 1,0 мм лабораторным крысам вводили по 2,0 мл инокулята. Через 6-8 мес. после эвтаназии регистрировали полученные цисты альвеококка во внутренних органах лабораторных животных.
С помощью предложенного способа смогли получить биомассу активированных онкосфер цепня (65%) из природы, заразить опытных грызунов (70%) и получить объем ларвоцист для наработки антигена Е. multilocularis в условиях лаборатории.
Пример 2. Активирование яиц Taenia pisiformis
Активирование яиц крупных цестод проводили на примере кроличьего цепня Taenia pisiformis. Цестоды были выделены из кишечника 4 обыкновенных лисиц (Vulpes vulpes) отстреленных в процессе спортивной охоты на территории Рязанской области в 2018 г. При гельминтологическом исследовании было выделено 17 половозрелых гельминтов и 54 зрелых членика.
Активацию яиц цестоды проводили предложенным способом и по прототипным методикам [8, 10, 11] (табл. 4). Для исследований брали зрелые членики из стробил возбудителя Т. pisiformis. По результатам проведенных исследований выявлено, что жизнеспособность и активация онкосфер предложенным способом составила 95,0 и 65,0%, соответственно. По предложенным способам Н.Е. Косминкова (1993) и А.К. Журавца (1987) жизнеспособных онкосфер цепня оказалось 10 и 90%, а активированных 0 и 50%, соответственно.
Далее, были проведены исследования по наработке антигена на лабораторных кроликах породы Советская Шиншилла ( вес 2500 г). В каждой группе было использовано по 5-3 животных. Доза заражения животных цепнем составила 5000 яиц или онкосфер. Срок паразитирования животных личинками цестод составил 2 мес.. Активацию яиц цепня проводили по Н.Е. Косминкову (1993) и А.К. Журавцу (1987). В контроле №1, выделение инвазионного материала проводили на предметном стекле препарированием членика с помощью скальпеля и полиэтиленовой пипетки (объем 1,5 мл), яйца в этом случае не активировали (табл. 5).
Чувствительность животных при активировании предложенным способом (опыт №1) составила 100%. Четверо животных (80%) из пяти имели фертильные цисты от 15 до 54 штук. Внутри каждой гидатиды (пузыря) регистрировали жизнеспособную и подвижную личинку цепня. Одно животное оказалось со стерильными цистами. При активации онкосфер по Н.Е. Косминкову (1993) (опыт №2) чувствительность животных составила 20%. Из 5 животных инвазировалось только одно. Цисты цепня (в количестве 13 экз.) оказались фертильными. При активации онкосфер по А.К. Журавцу (1987) (опыт №3) чувствительность животных составила 60% (заразилось 3 из 5 кроликов). У 2-х животных цисты оказались фертильными, у 1-ого стерильными. Число цист составило 5-18 штук. В контроле №1 заразилось одно животное (20%). Цисты (18 экз.) гельминта при этом оказались фертильными. В контроле №2 паразитарных цист цепней у животных не обнаружено.
Таким образом, качество инвазионного материала цестоды Т. pisiformis для наработки антигена в предложенном способе оказалось несколько выше по сравнению с предложенными прототипами. Жизнеспособных и активированных онкосфер пизиформного (кроличьего) цепня составило 95,0 и 65,0%, а чувствительность животных к возбудителю цестодоза - 100%.
Источники информации принятые во внимание при составлении заявки
1. Успенский А.В., Горохов В.В. Паразитарные зоонозы. - Москва.: Россельхозакадемия, ВИГИС. - 2012. г. - 336 с.
2. Бессонов А.С. Цистный эхинококкоз и гидатидоз. - Москва. - 2007. - 672 с.
3. Журавец А.К. Цистный эхинококкоз - гидатидная болезнь животных и человека: Монография / Сев. Кав. зональный НИВИ. - Новочеркасск. ЮРГТУ-2004. - 507 с.
4. Астафьев Б.А., Яроцкий Л.С., Лебедева М.Н. Экспериментальные модели паразитозов в биологии и медицине. / Издательство «Наука». Москва. - 1989. - 278 с.
5. Kosminkov N.E. Vakcina dlja profilaktiki  teniidozov  zhivotnyh (cenuroza ovec) / N.E. Kosminkov, V.G. Nazarov, E.I. Komarov, N.I. Serjakov, E.F. Morozova //. Avtorskoe  №1237214. SSSR, 1986. Bjul. №22.
6. Романенко H.A. Санитарная гельминтология. - M. - Медицина. - 1982. - 176 с.
7. Василькова З.Г. Основы санитарной гельминтологии (эффективность дегельминтизации при обеззараживании нечистот и сточных вод). - 1950. - М.: Медгиз. - 147 с.
8. Косминков Н.Е., Судьина Т.И. Способ получения активированных онкосфер цестод. 07.05.1993. Бюл. №17. № SU 1813410A1, А61В 10/00, G01N 33/48.
9. Журавец А.К. Патент на изобретение "Способ определения жизнеспособности яиц цестод", 23.05.1984. Бюл. №19. № SU 1093324 А61В 10/00, G01N 33/48.
10. Журавец А.К. Патент на изобретение "Способ определения жизнеспособности неполовозрелых форм цестод", 15.09.1987. Бюл. №34. №SU 1337057 A1, А61В 10/00.
11. Журавец А.К. Моделирование in vitro биологической активности зародышей цестод // Труды Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им. К.И. Скрябина. - 1989. - Т. 30. - с. 61 - 74.
12. Wang I.C., Ma Y.X., Kuo C.H., Fan P.C.A comparative study on egg hatching methods and oncosphere viability determination for Taenia solium eggs. // Int. J. Parasitol. 1997. - Nov.; 27(11): 1311-4.
13. Brandt J.R., Sewell M.M. In vitro hatching and activation of Taenia taeniaeformis oncospheres. // Vet. Res. Commun. 1981. - Dec;5(2):pp. 193-9.
14. Moazeni M., Rakhshandehroo E. In vitro viability test for the eggs of Echinococcus granulosus: a rapid method // Parasitology Research. - 2011.
15. Novel Rat Model for Neurocysticercosis Using Taenia solium // American Journal of Pathology. - August 2015. - №185(8): pp. 2259-68.
16. Verastegui M., Gilman R.H., Arana Y., Barber D., Velasquez J., M. Farfan, N. Chile, J.C. Kosek, M.Kosek, H.H. Garcia, A. Gonzalez, and the Cysticercosis Working Group in Peru Taenia solium oncosphere adhesion to intestinal epithelial and Chinese hamster ovary cells in vitro // Infection and immunity, Nov. 2007, p. 5158-5166.
17. Методы санитарно-паразитологических исследований: Методические указания 4.2.796 - 99. - М.: Федеральный центр госанэпидемнадзора Минзрава России, 2000. - 67 с.
18. Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования. Методические указания 4.2.794 - 00. - М.: Минзрав России, 2000. - 19 с..
19. Бережок В.К., Косменков Н.Е., Тхакахова А.А., Хайдаров К.А. Технология получения онкосфеального экскреторно-секреторного антигена Taenia multiceps на основе клеточной инженерии. - Москва. - 2015 г. - 19 с.
20. Konyaev S. Genetic diversity of Echinococcus spp. in Russia / S. Konyaev, T. Yanagida, M. Nakao, G. M. Ingovatova, et al. // Parasitology. - 2013. - No. 140. - pp. 1637-1647.
21. Яроцкий Л.С. Эхинококкозы. Методы исследований, лечения, профилактики. Москва. - 1990. - 248 с..