СПОСОБ ОРТОТОПИЧЕСКОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФРАГМЕНТА ГЛИОБЛАСТОМЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В ОБЛАСТЬ CORTEX PARIETALIS ГОЛОВНОГО МОЗГА ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ МЫШЕЙ
METHOD OF ORTHOTOPIC HUMAN CEREBRAL GLIOBLASTOMA TRANSPLANTATION INTO CEREBRAL CORTEX PARIETALIS REGION OF IMMUNODEFICIENT MICE

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа ортотопической трансплантации фрагмента глиобластомы головного мозга человека в область Cortex parietalis головного мозга иммунодефицитных мышей. Изобретение необходимо для получения ортотопической модели, позволяющей получить адекватные темпы инвазии и метастазирования и обладающей гистологическими и молекулярно-генетическими характеристиками, свойственными первичному новообразованию у человека.
Глиомы представляют собой злокачественные новообразования нейроэпителиального происхождения, являющиеся наиболее распространенными первичными опухолями головного мозга, ассоциированными с протяженным инфильтративным ростом, гетерогенностью клеточного состава, а также быстрым прогрессированием заболевания (см. Ostrom Q. Т. et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011 // Neuro-oncology. - 2014. - T. 16. - №. suppl_4. - C. iv1-iv63.; Дяченко А.А. и др. Эпидемиология первичных опухолей головного мозга: (обзор литературы) // Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России. -2013. - Т. 1, - №. 13.). Их наиболее злокачественной формой является глиобластома, частота встречаемости которой составляет 60% всех первичных новообразований головного мозга у взрослых (см. Taylor О.G., Brzozowski J.S., Skelding K.A. Glioblastoma multiforme: An overview of emerging therapeutic targets //Frontiers in oncology. - 2019. - T. 9. -C. 963.).
Заболеваемость глиобластомой достоверно увеличилась в последнее десятилетие, что составляет 10 больных на 100000 человек (см. Iacob G., Dinca E.В. Current data and strategy in glioblastoma multiforme // Journal of medicine and life. - 2009. - T. 2. - №. 4. - C. 386.). Данный тип опухолей ассоциирован с рядом особенностей, осложняющих возможность эффективной терапии. Ключевую роль играет агрессивный инфильтративный рост, индуцирующий протяженное поражение головного мозга (см. Holland Е.С. Glioblastoma multiforme: the terminator // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000. - T. 97. - №. 12. - C. 6242-6244.). Инфильтративное поражение, локализованное в функционально значимых зонах, ведет к циторедуктивным хирургическим вмешательствам, приводящим к увеличению смертности и частоты послеоперационных осложнений, среди которых встречаются пирамидный синдром, внутричерепная гипертензия, внутричерепные гематомы, отек головного мозга, а также внутри- и внечерепные гнойно-воспалительные осложнения (см. Шулев Ю.А. и др. Принципы хирургии первичных опухолей головного и спинного мозга // Практическая онкология. - 2013. - Т. 14. - №. 3-2013. - С. 148.; см. Васильев С.В., Правосудов И.В. Оценка комплексного лечения больных колоректальным раком с метастазами в печень;).
Хирургические вмешательства по поводу глиобластомы, локализованной в оперкулярной области нижней лобной извилины, становятся причиной неврологической дисфункции у 81.8% пациентов (см. Свистов Д.В. и др. Течение послеоперационного периода у больных с глиомами головного мозга при различных объемах и видах хирургического вмешательства //Вестник хирургии имени ИИ Грекова. - 2011. - Т. 170. - №. 6.). Послеоперационное лечение пациентов, предполагающее сочетанное применение лучевой терапии и химиотерапии, не дает очевидного паллиативного эффекта в связи с радиорезистентностью субпопуляции стволовых клеток глиобластомы, приводящей к быстрому росту оставшихся опухолевых клеток и рецидивированнию заболевания (см. Kim Y. et al. Wnt activation is implicated in glioblastoma radioresistance // Laboratory investigation. - 2012. - T. 92. - №. 3. - C. 466-473.). Кроме того, современная классификация данного типа опухолей не способствует персонализации терапии различных подтипов глиобластом, что способствует крайне низкой эффективности лечения (см. Cantoni С.et al. Mir-223 regulates the number and function of myeloid-derived suppressor cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis // Acta neuropathologica. - 2017. - T. 133. - №. 1. - C. 61-77.). Таким образом, прогноз для пациентов с глиобластомой головного мозга остается неблагоприятным, учитывая еще и то, что 1-летняя и 5-летняя выживаемость составляет 37.2% и 5.1% соответственно (см. Zhu Р. et al. Survival benefit of glioblastoma patients after FDA approval of temozolomide concomitant with radiation and bevacizumab: a population-based study // Oncotarget. - 2017. - T. 8. - №. 27. - C. 44015.).
Изучение причин возникновения данного вида опухолей головного мозга, описание механизмов радиорезистентности глиальных опухолей, а также поиск новых методов лечения являются актуальными проблемами современной онкологии, решение которых позволит повысить выживаемость пациентов и минимизировать последствия хирургического вмешательства.
Животные модели глиобластомы головного мозга являются уникальными инструментами экспериментальной онкологии, позволяющими имитировать протекание туморогенеза, с особенностями, свойственными организму человека. Кроме того, создание моделей глиобластомы головного мозга человека является неотъемлемой частью процесса разработки эффективных противоопухолевых субстанций, их апробации и внедрения в практику.
Известен способ создания индуцированной модели опухоли головного мозга животных, предполагающий однократное внутривенное введение этил нитрозомочевины беременным крысам в дозе 1, 5, 20 или 50 мг/кг веса животного ближе к концу беременности (см. Swenberg J. A. et al. Quantitative aspects of transplacental tumor induction with ethylnitrosourea in rats // Cancer Research. - 1972. - T. 32. - №. 12. - C. 2656-2660.). Данный способ обеспечивает индукцию астроцитомы, олигодендроглиомы, а также глиобластомы головного мозга. Недостатком данного способа является вариативность расположения индуцированных новообразований в зависимости от дозы введение этилнитрозомочевины, развитие разных типов злокачественных новообразований головного мозга, а также быстрая гибель 69% модельных животных. Кроме того, такая модель является сингенной, поэтому невозможна имитация опухолевого процесса человека на данной животной модели и апробация противоопухолевых субстанций.
7
Известен способ создания индуцированной модели опухоли головного мозга у японского макака (Масаса fuscata) весом от 2 до 10,8 кг с помощью интракраниальной инокуляции 4×10 фибробластов куриных эмбрионов, инфицированных штаммом Шмидта-Руппина вируса саркомы Рауса (Tabuchi К. et al. Establishment of a brain-tumor model in adult monkeys // Journal of neurosurgery. - 1985. - T. 63. - №. 6. - C. 912-916.). Данный способ обеспечивает образование индуцированных глиобластом и сарком головного мозга обезьян, сходных с таковыми у человека. Кроме того, данные онкогенные вирусы широко распространены в окружающей среде человека, а также выделяются из мозговой ткани пациентов с прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатией, что позволяет имитировать естественное возникновение спонтанных глиом головного мозга человека. Недостатками данного метода являются дороговизна содержания обезьян, трудность хирургических манипуляций в связи с размерами и сложной организацией головного мозга животных, а также быстрая их гибель на 26 сутки после прививки вируса саркомы Рауса. Кроме того, инфекция штаммом Шмидта-Руппина вируса саркомы Рауса приводит к образованию различных подтипов новообразований, в том числе саркомы, отличной от глиобластомы головного мозга.
Известен способ создания модели мышиного аллотрансплантата глиомы головного мозга, предполагающий интракраниальное введение клеточной линии глиомы мышей С6 мышам линии C57BL/6 (см. Beutler A. S. et al. Tumor gene therapy made easy: allogeneic major histocompatibility complex in the C6 rat glioma model // Human gene therapy. - 1999. - Т. 10.-№. l. - C. 95-101.). Данный способ обеспечивает создание инвазивных опухолей, которые являются модельными объектами изучения противоопухолевого эффекта таргетных препаратов. Однако созданная таким образом модель отличается фенотипическими особенностями от опухолей головного мозга человека. Кроме того, доклинические исследования таргетных препаратов, в основе которых находятся моноклональные антитела, невозможно в связи с отличием иммунного ответа у человека и мышей линии C57BL/6.
Известен способ создания модели глиобластомы головного мозга человека на 5-8 недельных иммунодефицитных мышах обоих полов с помощью подкожной инокуляции суспензии клеточной линии SHG-44 (см. Huang Q. et al. Establishment of human glioma cell line-nude mice solid tumor model NHG-1 and its characteristics // Zhonghua Zhong liu za zhi [Chinese Journal of Oncology]. - 1987. - T. 9. - №. 4. - C. 269-272.). Данный способ обеспечивает удобство наблюдения за динамикой роста опухолевых узлов, а также высокую выживаемость животного-реципиента. Главными недостатками данного способа являются невозможность имитации характерной гистологической и молекулярно-генетической гетерогенности глиальных опухолей, свойственных глиобластомам головного мозга человека, а также медленный рост опухоли в связи с содержанием в суспензии большого количества мертвых клеток, нарушающих межклеточные взаимодействия. Кроме того, для данного типа опухоли не характерны явления инвазии и ангиогенеза, определяемые микроокружением опухоли и являющиеся одними из отличительных особенностей онкогенеза.
Таким образом, описанные способы получения модели опухоли головного мозга, основанные на введении химических канцерогенов и вирусных агентов, не исключают вариативность локализации индуцированных новообразований и образования различных подтипов опухолей, в том числе астроцитомы, олигодендроглиомы и саркомы. Кроме того, данные методы приводят к быстрой гибели 69% экспериментальных животных. Способы, касающиеся получения и введения культуры клеток, являются трудоемкими и требуют адаптации суспензии опухолевых клеток для обеспечения стабильности молекулярно-биологических характеристик опухолевого материала. Подкожные ксенографты являются удобными моделями для мониторинга объема опухолевых узлов, после проведения противоопухолевой терапии, однако, они характеризуются чрезвычайно слабыми процессами инвазии и метастазирования, либо их полным отсутствием. Таким образом, подкожные ксенографты исключают возможность получения метастазов, которые могут быть получены путем внутривенного введения опухолевых клеток, а также с помощью трансплантации опухолевых фрагментов в ортотопические сайты.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа ортотопической трансплантации фрагмента глиобластомы головного мозга человека в область Cortex parietalis головного мозга иммунодефицитных мышей, обеспечивающего получение ортотопической пациентоподобной модели глиобластомы головного мозга с гистологическими и молекулярно-генетическими характеристиками, свойственными первичному новообразованию у человека, что позволит получить адекватные темпы инвазии и метастазирования, а также требуемый характер роста опухоли в оригинальном сайте реципиента.
3
Технический результат изобретения достигается тем, что осуществляют ортотопическую трансплантацию фрагмента глиобластомы головного мозга человека в область Cortex parietalis головного мозга иммунодефицитных мышей, включающий наркотизацию мышей, рассечение кожи, трепанацию черепа, ушитие послеоперационной раны, отличающийся тем, что производят рассечение кожи на голове иммунодефицитной мыши длиной 7 мм вдоль средней линии головы, начало разреза располагается на линии, соединяющей средние точки правого и левого глаз, конец разреза находится на линии, соединяющей средние точки оснований ушных раковин мыши, после чего при помощи круглого бора формируют отверстие диаметром 2,5 мм в теменной кости и твердой мозговой оболочке, отступив по 2 мм от sutura coronalis и sutura sagittalis, через полученное отверстие производят трансплантацию фрагмента глиобластомы объемом 8 мм на поверхность головного мозга иммунодефицитной мыши в область Cortex parietalis, затем накладывают тахокомб длиной 3 мм и шириной 3 мм над дефектом кости, ушивают операционную рану с помощью узлового шва. Способ осуществляют следующим образом.
3
После проведения хирургической резекции глиобластомы головного мозга человека, производят выделение опухолевого фрагмента объемом 8 мм, избегая некротизированных и сильно васкуляризированных областей, который помещают в чашку Петри, содержащую среду 199.
Животное наркотизируют с помощью внутримышечного введения препарата Ксила (Ксилазин) и препарата «Золетил 100» согласно протоколу (см. патент на изобретение RU №2712916, опубл. 05.02.2020, Бюл. №4). По достижении оптимальной глубины наркоза производят рассечение кожи на голове иммунодефицитной мыши длиной 7 мм вдоль средней линии головы, начиная с линии, соединяющей средние точки правого и левого глаз, и заканчивая разрез на линии, соединяющей средние точки оснований ушных раковин. После чего с помощью прямого режущего круглого бора диаметром 2.0 мм (Медтроник Ксомед Инк, США) формируют отверстие диаметром 2,5 мм в теменной кости и твердой мозговой оболочке, отступив по 2 мм от sutura coronalis и sutura sagittalis. Пинцетом извлекают опухолевый фрагмент из питательной среды 199 и производят его трансплантацию на поверхность головного мозга через полученное отверстие в область Cortex parietalis. Затем накладывают тахокомб длиной 3 мм и шириной 3 мм над дефектом кости, после чего ушивают операционную рану с помощью узлового шва.
Данным способом была произведена трансплантация фрагмента глиобластомы головного мозга человека в область над Cortex parietalis головного мозга 50 иммунодефицитных мышей.
Способ иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1 - Рассечение кожи на голове иммунодефицитной мыши.
Фиг. 2 - Трепанация черепа иммунодефицитной мыши с помощью прямого режущего круглого бора.
Фиг. 3 - Трасплантация опухолевого фрагмента глиобластомы человека в мозг иммунодефицитной мыши.
Приводим пример применения способа.
3
Провели хирургическую резекцию глиобластомы головного мозга, от которой выделили опухолевый фрагмент объемом 8 мм. Фрагмент поместили в чашку Петри, которая содержала 5 мл питательной среды 199. После чего самцу иммунодефицитной мыши весом 23 г внутримышечно ввели Ксилазин в концетрации 20 мг/мл и препарат «Золетил 100» концентрацией 22,57 мг/мл (см. патент на изобретение RU №2712916, опубл. 05.02.2020, Бюл. №4). Затем произвели рассечение кожи на голове иммунодефицитной мыши длиной 7 мм вдоль средней линии головы, начиная с линии, соединяющей средние точки правого и левого глаз, и заканчивая разрез на линии, соединяющей средние точки оснований ушных раковин (фиг. 1). После чего провели трепанацию черепа с помощью прямого режущего круглого бора диаметром 2.0 мм (Медтроник Ксомед Инк, США) и сформировали отверстие диаметром 2,5 мм в теменной кости и твердой мозговой оболочке, отступив по 2 мм от sutura coronalis и sutura sagittalis (фиг. 2). Извлекли опухолевый фрагмент из питательной среды и произвели его трансплантацию через полученное отверстие в область Cortex parietalis (фиг. 3). Затем наложили тахакомб длиной 3 мм и шириной 3 мм над дефектом кости и ушили операционную рану с помощью узлового шва. Мышь перенесла операцию без осложнений.
Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что он позволяет получить ортотопическую пациентоподобную модель глиобластомы головного мозга, которая сохраняет гистологические и молекулярно-генетические характеристики, свойственные первичному новообразованию у человека, и может быть использована для воспроизведения адекватных темпов инвазии и метастазирования, а также требуемого характера роста опухоли в оригинальном сайте реципиента.