МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП ДЛЯ СОЗДАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ ОРГАНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Область техники
Полезная модель относится к устройствам для работы с клетками тканей человека, животных или растений и (или) культурами вирусов и может быть, в частности, использована для испытаний лекарственных препаратов, создания клеточных моделей тканей и органов млекопитающих и моделирования межорганных взаимодействий.
Уровень техники
Согласно национальным нормативным документам, доклинические исследования токсичности лекарственных средств проводятся с использованием лабораторных животных. В то же время известно, что ответ различных организмов на воздействие ксенобиотиков характеризуется видовой специфичностью, определяющей, в том числе, и степень токсичности вещества для организма. В связи с чем ряд разрабатываемых лекарственных субстанций и средств являются не токсичными для лабораторных животных, но оказываются токсичны для человека [Johnson J.I. et al. Relationships between drag activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials // British Journal of Cancer. Nature Publishing Group, 2001. Vol. 84, №10. P. 1424-1431, Paul S.M. et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. // Nature reviews. Drug discovery. 2010. Vol. 9, №3. P. 203-214]. В этой связи все активнее развиваются методики оценки видоспецифичной для человека токсичности лекарственных средств и их комбинаций в исследованиях in vitro с использованием в качестве объекта клеточных моделей органов и тканей человека. Такие методические подходы позволяют получать информацию о молекулярных механизмах реализации токсичности ксенобиотиков, что проблематично в исследованиях in vivo, а также согласуются с представлениями о гуманном отношении к лабораторным животным, необходимости сокращения экспериментов с их участием, что отражено в различных международных соглашениях, в том числе в Директории по окружающей среде Организации экономического сотрудничества и развития.
Перспективно в этой связи использование в качестве биологических тест-систем клеток человека в виде первичных или иммортализованых клеточных линий. При этом доказано, что приближенность модели in vitro к реальной физиологической ситуации выше при культивировании трехмерных гистотипических или органотипических клеточных моделей органов и тканей человека, максимально точно воспроизводящих архитектонику клеток и их межклеточные взаимодействия.
Сложности в получении достоверных воспроизводимых результатов при работе с клеточными культурами обусловлены вариабельными условиями культивирования клеток (зависимость от используемого оборудования, сред, расходных материалов и т.д.). Другим ограничением информативности этого подхода является невозможность воспроизвести системный ответ организма на экзогенное химическое вещество, в том числе, с учетом его метаболизма. Известно, что ряд веществ в процессе их биотрансформации в печени способны образовывать метаболиты более токсичные, чем исходное химическое вещество. Зафиксировать это в эксперименте на монокультуре клеток невозможно.
Перспективным подходом, способным нивелировать эти недостатки, является использование специального оборудования - микробиореакторов [Esch М.В., King T.L., Shuler M.L. The role of body-on-a-chip devices in drug and toxicity studies. // Annual review of biomedical engineering. 2011. Vol. 13. P. 55-72.; Sung J.H., Shuler M.L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. // Lab on a Chip. 2009. Vol. 9, №10. P. 1385-1394]. Кроме обеспечения стандартных условий культивирования клеток, ряд таких устройств позволяет обеспечивать совместное культивирование клеточных моделей нескольких органов и тканей, расположенных в различных клеточных ячейках, которые объединяются в единую систему посредством микроканалов. По микроканалам циркулирует питательная среда, имитирующая микроциркуляцию, в результате чего различные клеточные модели способны оказывать взаимное влияние, как при воздействии какого-либо фактора, так и в его отсутствии. В качестве клеточных моделей органов человека обычно используют иммортализованные клеточные линии.
Известна заявка US 2012/0214189 A1, в которой приведено описание микрофлюидного чипа для культивирования клеточных моделей. Устройство чипа содержит четыре ячейки для культивирования клеточных моделей: ячейку «печени», ячейку «легкого», ячейку «жира» и ячейки «других тканей».
Недостатком данного устройства является невозможность моделировать, например, сахарный диабет 2 типа, для которого необходимо наличие, как минимум, шести клеточных ячеек для моделей органов (поджелудочной железы, печени, кишечника, почек, а также мышечной и жировой тканей). Помимо этого приведенная конструкция не является анатомически верной.
Сущность полезной модели
Техническим результатом заявленной полезной модели является обеспечение оптимальных условий жизнедеятельности сокультивируемых клеток.
3
Микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих содержит пластину, на которой отлит слой полидиметилсилоксана, в котором размещена микрофлюидная система, загерметизированная снизу предметным стеклом, где микрофлюидная система представляет собой объединенные системой микрожидкостных каналов, шесть типовых ячеек для одновременного культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих в проточном или замкнутом режимах, предназначенных для моделей поджелудочной железы, печени, кишечника, почек, а также мышечной и жировой тканей, по крайней мере, четыре распределительных канала, расположенных со стороны входа в типовые ячейки, по крайней мере, четыре смесительных канала, расположенных со стороны выхода из типовых ячеек, и байпасный канал для ячейки модели кишечника, при этом по два из четырех распределительных и смесительных канала выполнены с возможностью обеспечения парного соединения типовых ячеек с образованием двух замкнутых контуров, которые со стороны входа параллельно подключены к входному каналу микрофлюидного чипа через оставшиеся третий и четвертый распределительные каналы, со стороны выхода через оставшиеся третий и четвертый смесительные каналы подключены к выходному каналу микрофлюидного чипа, выходной канал ячейки модели печени переходит в четвертый смесительный канал, а четвертый распределительный канал имеет две ветви, первая из которых предназначена для соединения с третьим распределительным каналом. Максимальная ширина канала составляет 1 мм, минимальная 0,2 мм. Ширина канала в местах подсоединения насосов составляет 0,6 мм, что обеспечивает одинаковый диапазон касательных напряжений во всей цепи. Минимальный радиус составляет 0,2 мм. Минимальное расстояние между структурными элементами 0,4 мм. Демпферная камера состоит из мембраны ПДМС, расположенной перед клеточными ячейками относительно течения. Измерительная ячейка, предназначенная для измерения электрохимически pH культуральной среды, расположена после клеточных ячеек относительно течения. Y-образное разветвление каналов перед клеточными ячейками относительно течения предназначено для того, чтобы уменьшить эффекты седиментации. Предусмотрена возможность частичной замены культуральной среды в микроканалах. Объем культуральной среды составляет 50,1 мм.
Краткое описание чертежей
Полезная модель поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлено схематичное изображение заявляемого устройства.
На фиг. 2 представлено распределение скорости в заявляемом устройстве для случая стационарного потока и разности давлений 30 кПа.
Позициями на чертежах обозначены: 1 - насосные камеры, 2 демпферная камера, 3 - ячейки «почки», 4 - ячейка «кишечник», 5 - ячейка «печень» 6 - измерительная ячейка, 7 - ячейка «жировая ткань», 8 - ячейка «мышечная ткань».
Описание конкретного осуществления полезной модели.
Разработанный микробиореактор представляет собой одноразовую конструкцию (биочип), состоящую из шести клеточных ячеек для моделей органов (поджелудочной железы, печени, кишечника, почек, а также мышечной и жировой тканей), соединенных микроканалами. Клеточные ячейки совместимы с мембранными вставками типа Transwell. Размер биочипа ограничен размером стандартного предметного стекла (26 мм2 × 76 мм2). Циркуляция культуральной среды в каналах обеспечивается микронасосом, состоящим из двух микроклапанов и рабочей камеры. Микронасос и клапаны подключаются к блоку управления микробиореактора БАВР.422522.001. Размер ячеек сконструирован таким образом, чтобы обеспечить возможность необходимого числа клеток в единой пропорции относительно числа клеток в органах (1:100000). Поток культуральной среды через каждую клеточную ячейку масштабируется в соответствии с тем, какая доля сердечного выброса приходится на каждый орган.
Биочип выполнен из слоя полидиметилсилоксана (ПДМС) высотой 2 мм, содержащего микроканалы, насос, клапаны и отверстия для клеточных ячеек. Сторона, содержащая микроканалы, покрыта стеклом, другая сторона соединена со слоем поликарбоната, который обеспечивает механическую прочность биочипа, подключение управляющих пневматических выходов к насосам и клапанам, а также герметизацию клеточных ячеек крышками. Высота каналов составляет 0,1 мм.
Регулирование скоростей потока производится путем размещения клеточных ячеек, для которых необходимы высокие скорости, вблизи насоса, а ячеек, для которых требуются низкие, - вдали от насоса. Это обусловлено тем, что большие расстояния до клеточных ячеек приводят к большим гидравлическим потерям. Тонкая настройка скоростей потока осуществлялась регулировкой длины и ширины каналов в тех частях, которые соответствуют конкретным ячейкам. Ширина каналов не может быть менее 0,2 мм по технологическим причинам и более 1 мм для обеспечения стабильности геометрии каналов.
В таблице 1 приведен обзор параметров моделируемых органов. Показана доля сердечного выброса, приходящаяся на тот или иной орган, и относительная доля потока культуральной среды в мультиорганном биочипе. Все клеточные ячейки, кроме той, что предназначена для клеток кишечника, предполагается изготавливать с применением мембранных вставок от 96-луночных плашек типа Trans well. Кишечник занимает существенно большую площадь [Multi-organ-chip with improved life time and homoeostasis: пат.ЕР 2712918 A1 European Patent Application: C12M 3/00 Marx. U.; applicant Technische Universitat Berlin. - №12186550.5; filled 28.09.2012; publ. 02.04.2014, Bulletin 2014/14.], поэтому для него предлагается использовать одну вставку от 12-луночной плашки.
Конструкция микрофлюидного чипа (микробиореактора) основана на трехслойной структуре, верхний слой которой образован пластиной, выполненной из поликарбоната толщиной 10 мм, на которой отлит слой полидиметилсилоксана (ПДМС), содержащий систему микрофлюидных каналов прямоугольного сечения и ячейки, герметизированные снизу слоем, образованным стандартным предметным стеклом. Применение каналов постоянного сечения позволило обеспечить приемлемую технологичность формы для литья слоя ПДМС.
Микрофлюидный чип содержит в себе объединенные микрофлюидными каналами, по крайней мере, шесть ячеек, предназначенных для одновременного сокультивирования размещенных в них клеточных моделей органов и тканей человека в проточном или замкнутом режимах. Модели могут быть представлены сфероидами или мембранной вставкой (например, Трансвел). Ячейки сверху герметизированы пробками, закрепленными в пластине из поликарбоната с помощью резьбового соединения.
Микроканальная система, принципиальная схема которой приведена на фиг. 1, обладает следующими характеристиками:
- Максимальная ширина канала составляет 1 мм.
- Минимальная ширина канала составляет 0,2 мм.
- Ширина канала в местах подсоединения насосов составляет 0,6 мм, что обеспечивает одинаковый диапазон касательных напряжений во всей цепи.
- Минимальный радиус составляет 0,2 мм.
- Минимальное расстояние между структурными элементами 0,4 мм.
- Демпферная камера состоит из мембраны ПДМС, расположенной перед клеточными ячейками относительно течения.
- Измерительная ячейка, предназначенная для измерения электрохимически pH культуральной среды, расположена после клеточных ячеек относительно течения.
- Y-образное разветвление каналов перед клеточными ячейками относительно течения предназначено для того, чтобы уменьшить эффекты седиментации.
- Предусмотрена возможность частичной замены культуральной среды в микроканалах.
3
- Объем культуральной среды составляет 50,1 мм.
Конструкция полезной модели позволяет обеспечить распределение потока культуральной среды по клеточным ячейкам в соответствии с анатомией кровеносной системы человека (Таблица 2).
Таки образом, полезная модель позволяет создать физиологичные условия культивирования клеточных линий:
- поток культуральной среды распределен по клеточным ячейкам в соответствии с анатомией кровеносной системы человека;
- средняя скорость потока культуральной среды является достаточной, чтобы клетки получали достаточное количество кислорода и питательных веществ;
- под мембранными вставками, содержащими клетки, поток является однородным по поверхности мембран;
- касательные напряжения соответствуют физиологичным нормам;
- соотношение объемов культуральной среды и клеток должно быть приближено к соотношению in vivo.