КЛЕТКА

1. T-клетка, которая совместно экспрессирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, каждый CAR содержит:
(i) антигенсвязывающий домен;
(ii) спейсер;
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) эндодомен,
в которой антигенсвязывающие домены первого и второго CAR связываются с различными антигенами, в которой спейсер первого CAR отличается от спейсера второго CAR и в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит выключаемый лигированием ингибирующий эндодомен.
2. T-клетка по п. 1, в которой спейсер первого CAR имеет длину и/или заряд и/или размер и/или конфигурацию и/или гликозилирование, отличающиеся от спейсера второго CAR, так что когда первый CAR и второй CAR связывают соответствующие им антигены-мишени, первый CAR и второй CAR становятся пространственно разделенными на мембране T-клетки.
3. T-клетка по п. 2, в которой или первый спейсер, или второй спейсер содержит «стебель» CD8 и другой спейсер содержит домен шарнира, CH2 и CH3 из IgG1.
4. T-клетка по п. 2 или 3, в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит выключаемый лигированием ингибирующий эндодомен, этот ингибирующий CAR ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но не значительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR когда ингибирующий CAR лигирован.
5. T-клетка по п. 4, в которой ингибирующий эндодомен содержит весь или часть эндодомена из CD148 или CD45.
6. T-клетка по п. 4 или 5, в которой антигенсвязывающий домен первого CAR связывает CD5 и антигенсвязывающий домен второго CAR связывает CD19.
7. T-клетка, которая содержит больше чем два CAR, как определено по предшествующим пунктам, так что ее специфично стимулирует клетка, такая как T-клетка, несущая отличающий паттерн из больше, чем двух антигенов.
8. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует и первый и второй химерные антигенные рецепторы (CAR) как определено по любому из пп. 1-7.
9. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 8, которая имеет следующую структуру:
AgB1-спейсер1-TM1-эндо1-коэкспр-AbB2-спейсер2-TM2-эндо2 ,
в которой
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен первого CAR;
спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;
TM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен первого CAR;
эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR;
коэкспр представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая делает возможной коэкспрессию обоих CAR
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен второго CAR;
спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;
TM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен второго CAR;
эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR;
эта последовательность нуклеиновой кислоты, когда экспрессирована в T-клетке, кодирует полипептид, который расщепляют в сайте расщепления так, что первый и второй CAR совместно экспрессированы на поверхности T-клеток.
10. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 9, в которой коэкспр кодирует последовательность, которая содержит саморасщепляющийся пептид.
11. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 9 или 10, в которой альтернативные кодоны используют в областях последовательности, которая кодирует те же или схожие аминокислотные последовательности, во избежание гомологичной рекомбинации.
12. Набор, который содержит
(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) как определено по любому из пп. 1-7, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB1-спейсер1-TM1-эндо1
в которой
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен первого CAR;
спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;
TM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен первого CAR;
эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR; и
(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует второй химерный антигенный рецептор (CAR) как определено по любому из пп. 1-7, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB2-спейсер2-TM2-эндо2
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен второго CAR;
спейсер 2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;
TM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен второго CAR;
эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR.
13. Набор, который содержит: первый вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определенопо п. 12; и второй вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты как определенопо п. 12.
14. Набор по п. 13, в котором векторы представляют собой интегрирующие вирусные векторы или транспозоны.
15. Вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 8-11.
16. Ретровирусный вектор или лентивирусный вектор, или транспозон по п. 15.
17. Способ получения T-клетки по любому из пп. 1-7, который включает стадию введения последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп. 8-11; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты как определено по п. 12; и/или первого вектора и второго вектора как определено по п. 13 или вектора по п. 15 или 16 в T-клетку.
18. Способ по п. 17, в котором T-клетку получают из образца, выделенного у субъекта.
19. Фармацевтическая композиция, которая содержит множество T-клеток по любому из пп. 1-7.
20. Способ лечения и/или предотвращения заболевания, который включает стадию введения фармацевтической композиции по п. 19 субъекту.
21. Способ по п. 20, который включает следующие стадии:
(i) выделение содержащего T-клетки образца у субъекта;
(ii) трансдукция или трансфекция T-клеток с использованием: последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп. 8-11; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты как определено по п. 12; первого вектора и второго вектора как определено по п. 13 или 14 или вектора по п. 15 или 16; и
(iii) введение T-клеток из (ii) субъекту.
22. Способ по п. 20 или 21, в котором заболевание представляет собой злокачественную опухоль.
23. Фармацевтическая композиция по п. 19 для использования в лечении и/или предотвращении заболевания.
24. Использование T-клетки по любому из пп. 1-7 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения заболевания.
25. Естественная киллерная (NK) клетка, которая совместно экспрессирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, каждый CAR содержит:
(i) антигенсвязывающий домен;
(ii) спейсер;
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) эндодомен,
в которой антигенсвязывающие домены первого и второго CAR связываются с различными антигенами, в которой спейсер первого CAR отличается от спейсера второго CAR и в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит выключаемый лигированием ингибирующий эндодомен.
26. Клеточная композиция, которая содержит экспрессирующие CAR T-клетки по п. 1 и/или экспрессирующие CAR естественные киллерные клетки по п. 25, полученные посредством трансдукции образца крови ex vivo с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей первый и второй CAR.