Окислительный взрыв в эритроцитах под действием системы «NaNO2+H2O2»

3. Показатель качества жизни может способствовать ранней диагностике реци-дивоопасных клинических состояний ре-миссионного периода в наркологии с целью оказания экстренной, адресной (в зависимости от структуры показателя качества жизни), комплексной, противореци-дивной терапии и быть средством контроля эффективности превентивных, краткосрочных терапевтических интервенций.

Заключение

В результате исследования установлено, что возникающие на фоне ремиссии рецидивоопасные клинические ситуации ухудшают качество жизни пациентов с алкогольной зависимостью. Тест «Показатель качества жизни» позволяет своевременно обнаруживать изменения качества жизни пациентов, дифференцированно выбрать лечение и служит методом контроля эффективности профилактических терапевтических интервенций.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бараненко А.В. Оценка субъективного качества жизни у лиц с зависимостью от алкоголя // Украинс. вестн. психоневрологии. — 2002. — Т. 10. — Вып. 2 (31). — С. 113-114.

2. Валентик Ю.В. Континуальная психотерапия больных с зависимостью от психоактивных веществ: Лекции по наркологии / Под ред. Н.Н. Иванца. — М., 1999. — С. 269-287.

3. Громыко Д.И. Уровни мотивации к лечению и их зависимость от клинико-психологических характе-

ристик больных алкоголизмом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.45. — СПб., 2002. — 22 с.

4. Ерышев О. Ф., Рыбакова Т.Г., Шабанов П.Д. Алкогольная зависимость: формирование, течение, противоре-цидивная терапия. — СПб.: ЭЛБИ, 2002. — 192 с.

5. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. — Киев: МОРИОН, 2001. — 408 с.

6. Максимчук В. П. Перспективы развития наркологической службы в республике Беларусь // Рецепт. — 2001. — № 6. — С. 27-31.

7. Мизерене Р.В. Оценка и прогноз длительности ремиссии при лечении алкоголизма методом эмоционально-эстетической психотерапии: Автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.18; 14.00.45. — СПб., 2000. — 18 с.

8. Сосин И.К., Лазирская Л.В., Сквира И.М. и др. Рецидивоопасные клинические ситуации ремисси-онного периода в наркологии // Новые подходы к психотерапии и фармакотерапии состояний зависимости от психоактивных веществ: Матер. 5-й Укр. конф. с межд. участ., посвящ. 86-й год. со дня рожд. Заслуженного врача Украины, народного врача СССР А.Р. Довженко 6-7 апреля 2004 г. — Харьков, 2004. — С. 153-159.

9. Mezzich J.E., Cohen Neal, Lin Jason, Ruiperez Maria, Joon Ghyon, Igbal Saeed, Perez Carlos. Validization an efficient quality life index // Abstracts 11 World Congress psychiatry «Psychiatry on new Thresholds». — Hamburg, Germany, 6-11 August 1999. — P. 427-428.

Поступил 10.11.2005

УДК 577.322+616-018.1]:577.121.7

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ВЗРЫВ В ЭРИТРОЦИТАХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СИСТЕМЫ «^N02+^02»

М.Н. Стародубцева, С.Н. Черенкевич

Гомельский государственный медицинский университет Белорусский государственный университет

В работе хемилюминесцентными методами изучены условия стремительного развития окислительного стресса в эритроцитах (окислительного взрыва), вызванного их взаимодействием с реагентами системы «КаК02+Н202» при участии гемоглобина. Выявлено, что при концентрациях реагентов выше 500 мкМ наблюдается лавинообразное накопление активных продуктов взаимодействия гемоглобина и реагентов системы «КаК02+Н202», предположительно, феррилгемоглобина, диоксида азота и пероксинитрита, что и инициирует окислительный взрыв в эритроцитах. Сопровождающее окислительный стресс закисление цитозоля до рН 6,5 активирует производство этих активных агентов в реакциях с внутриклеточным гемоглобином. Выдвинута гипотеза о наличии положительной обратной связи в механизме развития окислительного стресса в клетках с участием гемсодержащих белков.

Ключевые слова: окислительный взрыв, активные формы азота, гемоглобин, эритроциты.

OXIDATIVE BURST IN RED BLOOD CELLS UNDER THE ACTION OF «NANO2+H2O2» SYSTEM

M.N. Starodubtseva, S.N. Cherenkevich

Gomel State Medical University Belarus State University

The conditions of development of impetuous oxidative stress in red blood cells (oxidative outburst) caused by red blood cell interaction with reagents of system «NaNO2+H2O2» with hemoglobin participation were studied. The avalanche accumulation of reactive species such as ferryhemoglobin, nitrogen dioxide, and peroxynitrite in the reaction of hemoglobin with reagent of the system «NaNO2+H2O2» was revealed at reagent concentration higher than 500 ^M The intracellular acidosis down to pH 6,5 which accompanies the cellular oxidation stress activates the reactive species production in the hemoglobin reactions. Hypothesis of positive feedback presence in the mechanism of oxidative stress development with hemeprotein participation in cells was advanced.

Key words: oxidative stress, reactive nitrogen species, hemoglobin, red blood cell.

Введение

Гемсодержащие белки широко распространены и выполняют важные функции в живых организмах. Сочетание комплексов протопорфирина с ионами железа и сложного аминокислотного состава белковых компонентов определяет разнообразие реакций, в которые эти белки вступают. Гемсодержащие белки могут участвовать в контроле динамического равновесия окислительно-восстановительных реакций в клетке. При определенных условиях гемсодержащие белки удерживают это равновесие на уровне ре-докс-регулирования клеточных процессов, а при других — смещают его в сторону окислительного стресса [4]. Окислительный стресс клеток и тканей сопровождает многие болезни человека, называемые редокс-ассоцииро-ванными заболеваниями, включающими в себя диабет, атеросклероз, гипертензию, ней-ро-дегенеративные заболевания.

В работе обсуждаются условия, вызывающие стремительное развитие окислительного стресса в эритроцитах (окислительного взрыва), при участии гемоглобина и активных форм азота и кислорода.

Материалы и методы

В работе использовали NaNO2, NaH2PO4, Na2HPO4, («Реахим», Россия, ч.д.а.), люминол («Sigma», США). Остальные реактивы были производства России и Беларуси. Растворы NaNO2 и H2O2 готовили непосредственно перед опытом. Эритроцитарную массу получали из крови здоровых добровольцев. Эритроциты трижды отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере.

Хемилюминесценцию изучали на биохе-милюминометре БХЛ-1 (БГУ, Минск, Беларусь) при комнатной температуре. Инициирование реакций, сопровождающихся свечением, осуществляли введением Н202 в темноте в кювету, содержащую 2 мл подготовленной суспензии эритроцитов или раствора гемоглобина (фосфатный буфер или буфер Эрла, рН 6,3 или 7,4). При анализе кинетики хемилюминесценции использовали следующие характеристики: 11 и 12 — максимальные интенсивности первой и второй стадий развития свечения соответственно, ^ — значение лаг-периода и ^ах — время достижения второго максимума интенсивности свечения (рис. 1, кривая 1). При изучении люминол-зависимой хемилюминесценции суспензий эритроцитов или водных растворов гемоглобина в среду, содержащую эритроциты (32 000 клеток в кювете, буфер Эрла, рН 6,3) или гемоглобин (фосфатный буфер), непосредственно перед измерением интенсивности хемилюминесценции вводили люминол и в темноте практически одновременно — №К02 и Н202. При изучении люминол-зависимой Н2О2-индуцированной хемилю-минесценции суспензий эритроцитов концентрированные суспензии эритроцитов (гематокрит — 20-40%) подвергали действию системы «КаКО2+Н202» в течение 5 мин (фосфатный буфер, рН 6,3), после чего суспензии трехкратно отмывали буферным раствором (рН 7,4) и измеряли интенсивность их люминол-зависимой Н2О2-индуцированной хемилюминесценции (буфер Эрла, рН 7.4).

Концентрацию форм гемоглобина в гемо- Статистическую обработку эксперименталь-лизатах определяли спектрофотометрически с ных данных проводили по стандартным мето-помощью спектрофотометра СФ-18 (Россия). дикам программы Excel (n=3^8, а=0.05).

i,

ус л. ед. 2 5 0

2 0 0

15 0

10 0

5 0

0

Рис. 1. Кинетические кривые интенсивности (I) люминол-зависимой хемилюминес-ценции суспензии эритроцитов (1) и водного раствора гемоглобина (2 и 3) при действии системы «КаК02+Н202». Суспензии эритроцитов содержали: 2,5 мМ КаК02, 2,5мМ Н202 и 25 мкМ люминола, буфер Эрла, рН 6,3. Водные растворы гемоглобина содержали: 36 мкМ гемоглобина, 5мМ КаК02, 5мМ Н202 и 12,5 мкМ люминола, фосфатный буфер, рН 6,3 (2), рН 6,7 (3). Параметры хемилюминесценции описаны в разделе «Материалы и методы».

Результаты и их обсуждение Реакции гемсодержащих белков с нитритом и активными формами азота и кислорода. Нитротирозин, нитротриптофан и окисленные тиольные группы белков являются хорошо известными маркерами окислительного стресса клеток и тканей организма человека и выявляются в повышенных количествах при редокс-ассоциированных заболеваниях [8, 12]. Гемсодержащие белки, такие как миоглобин, гемоглобин и некоторые пе-роксидазы могут катализировать образование нитротирозина и нитротриптофана также хорошо, как и окислять тиольные группы белков в реакции с пероксинитритом или при превращении нитрита в нитрат с участием пероксида водорода [5, 10, 13]. Пероксинит-рит является продуктом реакции монооксида азота с супероксиданион-радикалом, вырабатываемых при различных патологических процессах многими клетками одновременно [7], или реакции пероксида водорода с нитритом. В организме человека уровни пероксида водорода и нитритов повышаются при различных патологиях, в особенности, при сопутствующем курении, терапии азотсодержащими лекарствами, неблагоприятной экологической обстановке. Мы изучили условия генерирования активных агентов, способных модифицировать структуру других молекул, в реакции гемоглобина с нитритом и перок-сидом водорода с помощью хемилюминес-

центных методов. В качестве молекулы-мишени действия активных агентов реакции был использован люминол. В реакциях лю-минола с такими активными агентами, как пероксинитрит, супероксиданион-радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал, феррилгемоглобин и образуются возбужденные интермедиаты, переход которых в основное состояние сопровождается высокоинтенсивным свечением [11].

Кривая хемилюминесценции раствора, содержащего гемоглобин, КаК02, Н202 и лю-минол, характеризуется наличием лаг-периода и длительным высокоинтенсивным свечением (рис. 1, кривые 2 и 3). В основном свечение возникает благодаря производству перокси-нитрита, диоксида азота и феррилгемоглобина в этой реакции [10]. Интенсивность и длительность свечения максимальны при значениях рН среды, ниже физиологических (рН 6,57,0) (рис. 2а и 2б). Полученные данные сходны с результатами работы КШпс К. с соавторами [6], в которой анализировалось производство нитротирозина и потребление нитрита в реакции миоглобина с системой «КаКО2+Н202». Очевидно, что производство активных продуктов в реакциях гемоглобина с системой «КаКО^Н^^ уменьшается при увеличении значений рН среды вплоть до физиологических значений: увеличивается лаг-период и уменьшаются интенсивность и длительность свечения (рис. 2а и 2б).

отн. ед. 150-

100 -

50-

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 рН, отн. ед.

800

600-

400-

200

0-

4,5 5,0 5,5 6,0

5 7,0 7,5 рН, отн. ед.

I

I. с

б

а

0

Рис. 2. а) рН-зависимость максимальной интенсивности (12) второй стадии развития люминол-зависимой хемилюминесценции раствора гемоглобина при действии системы «КаК02+Н202»; б) рН-зависимость длительности лаг-периода (1;1аё, кривая 1) и времени достижения второго максимума интенсивности (1тах, кривая 2) люминол-зависимой хеми-люминесценции раствора гемоглобина при действии системы «КаК02+Н202».

Фосфатный буфер. 36 дМ НЬ02, 5 мМ №N0^ 5 мМ Н202, 12.5дМ люминола.

Взаимодействие эритроцитов с системой «NaN02+H202». Производство активных агентов эритроцитами при действии на них системы «КаКЭ2+Н202», оцениваемое нами по параметрам люминол-зависимой хемилюминесценции суспензий эритроцитов, зависит от начальной концентрации реагентов (рис. 3 а и 3б). Анализ зависимостей параметров люминол-зависимой хе-милюминесценции суспензии эритроцитов от начальной концентрации реагентов позволил выявить три важных диапазона концентраций: до 250-500 мкМ, 500 мкМ-1 мМ, свыше 1 мМ (рис. 2а и 2б). Первый диапа-

зон концентраций реагентов характеризуется низкоинтенсивной хемилюминесцен-цией с заметно выраженным лаг-периодом. Во втором диапазоне длительность лаг-периода уменьшается, а интенсивность свечения возрастает. Высокоинтенсивное свечение характерно для третьего диапазона концентраций. Параметры кинетической кривой люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии эритроцитов в этом диапазоне концентраций близки к параметрам кинетической кривой люминол-зависимой хемилюми-несценции раствора гемоглобина при избытке ШК02 и Н202 (рис. 3, кривые 1-3).

б

Концентрация реагентов, м М

а

/А 1 у*

2 4- У

а—а-

1 0,1 1

Концентрация реагентов, м М

1 200-усл. ед -1501005000,

Рис. 3. а) Зависимость параметров люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии эритроцитов (II и 12) от концентрации реагентов системы «КаК02+Н202». Кривая 3 представляет зависимость параметра 12 от концентрации Н2О2 при отсутствии в растворе №N0^

б) Зависимость длительности лаг-периода (1;1аё), времени достижения второго максимума (1;2) интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции суспензии эритроцитов и параметра Л1=1;2-1;1аё от концентрации реагентов системы «NaN02+H202». Буфер Эрла содержал 25 мкМ люминола, рН 6,3.

Мы изучили также люминол-зависимую Н2О2-индуцированную хемилюминесцен-цию эритроцитов, обработанных системой «КаКО2+Н2О2». Люминол-зависимая Н2О2-индуцированную хемилюминесценция клеток отражает, в основном, редокс-статус клетки: уровень развития процессов пере-кисного окисления липидов, активности антиокислительных ферментов (глутатион-пероксидазы, каталазы и др.) и концентрации низкомолекулярных антиоксидантов [1, 2]. Зависимость интенсивности хеми-

люминесценции от начальной концентрации реагентов системы «КаКО2 и Н2О2», действующих на эритроциты, характеризуется наличием двух стадий: реагенты в концентрации до 500 мкМ — 1 мМ вызывают низкоинтенсивное свечение, а в концентрациях свыше 1 мМ — высокоинтенсивное свечение (рис. 4, кривые 1 и 2). Подобного типа концентрационные зависимости характерны для окисления оксигемогло-бина, глутатиона и изменения уровня АТФ в клетке при действии пероксинитрита [3, 9].

I,

усл. ед.

80 60 40 20 0

0,01 0,1 1

Концентрация реагентов, мММ

Рис. 4. Зависимость максимальной интенсивности люминол-зависимой Н2О2-индуци-рованной хемилюминесценции суспензии эритроцитов (11) от концентрации реагентов системы «КаКО2+Н2О2». Суспензии эритроцитов содержали: 12.5 |М люминола и 25|М Н2О2 (1); 5 |М люминола и 0,25 тМ Н2О2 (2). Буфер Эрла, рН 7,4.

При низких концентрациях активные реагенты изучаемой системы взаимодействуют исключительно с ферментами и низкомолекулярными антиоксидантами системы антиокислительной защиты клетки: каталаза расщепляет Н2О2, глутатион реагирует с Н2О2 и формами пероксинитрита, глюкоза реагирует с пероксинитритом [4], что и обусловливает наличие лаг-периода и низкоинтенсивное свечение в диапазоне концентраций реагентов до 500 мкМ. Реагенты в концентрациях свыше 500 мкМ вызывают широкомасштабное вступление в реакции с активными реагентами системы «КаКО2+Н2О2» гемоглобина — основного белка эритроцитов. Это способствует лавинообразному увеличению количества активных продуктов взаимодействия эритроцитов с системой «КаКО2+Н2О2»: дополнительно образуются феррилгемоглобин, диоксид азота и пероксинитрит [10]. Это вызывает не просто окислительный стресс, а окислительный взрыв в эритроцитах.

Заключение

Окислительный стресс клетки и гем-содержащие белки. Как известно, окислительный стресс клеток сопровождается их ацидозом. Уменьшение внутриклеточного рН до 6,5, экспериментально определяемое при окислительном стрессе для различных клеток, приводит к включению сложного механизма положительной обратной связи. С одной стороны, уменьшение рН ниже 6,8 смещает равновесие форм пероксинитрита в сторону высокореак-ционноспособной формы пероксинитрита — пероксиазотистой кислоты. В закислении цито-золя могут играть важную роль и гемсодержа-щие белки. Например, окисление гемоглобина способствует уменьшению значения внутриклеточного рН (эффект Бора). С другой стороны, согласно нашим данным и данным литературы, уменьшение внутриклеточного рН активирует реакцию катализа гемсодержащим белком превращений кислородсодержащих соединений азота, продуктами которой являются высокоактивные агенты, главными из

которых являются феррил-форма гемсодер-жащего белка и диоксид азота. В обоих случаях создаются условия для дальнейшего лавинообразного развития окислительного стресса, что приводит к быстрой ликвидации клетки через некроз или иные механизмы удаления клеток с дефектами структур в организме. Действительно, в эритроцитах окислительный взрыв вызывает широкомасштабное перекис-ное окисление липидов, образование сшивок липидных макромолекул, нарушение структуры цитоскелета и увеличение жесткости мембраны клетки, что способствует быстрому разрушению эритроцитов в селезенке.

ЛИТЕРАТУРА

1. Суханова Л.Я., Каменская В.В. Хемилюми-несценция разновозрастных групп эритроцитов у больных сахарным диабетом // Лабораторное дело. — 1989. — № 12. — С. 33-36

2. ШерстневМ.П, ЛиВ.С.,ХалаловЭМ., СергеенкоВ.И., Лопухин Ю.М. Хемилюминесценция эритроцитов разного возраста в присутствии Н2О2 // Проблемы гематологии и переливания крови. — 1982. — № 10. — С. 50-52.

3. Denicala A., Souza J.M., Radi R. Diffusion of peroxynitrite across erythrocyte membranes // Proceeding of National Academy of Sciences of USA. — 1998. — Vol 95. — Р. 3566-3571.

4. Frein D., Schildknecht S., BachschmidM., Ullrich V. Redox regulation: a new challenge for pharmacology // Biochemical Pharmacology. — 2005. — Vol 70. — Р. 811-823.

5. GrzelakA., Balcerczyk A., Mateja A., Bartosz G. Hemoglobin can nitrate itself and other proteins // Biochimica et Biophysica Acta. — 2001. — Vol. 1528. — Р. 97-100.

6. Kilinc K., Kilinc A., Wolf R.E., Grisham M.B. Myoglobin-catalyzed tyrosine nitration: no need for peroxynitrite // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2001. — Vol. 285. — С. 273-276.

7. Pryor W.A., Squadrito G.L. The chemistry of peroxynitrite: a product from the reaction of nitrite with superoxide // American Journal of Physiology. —

1995. — Vol. 268. — Р. 699-722.

8. Shacter E. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples // Drug metabolism review. — 2000. — Vol. 32. — Р. 307-326.

9. Soszynski M., Bartosz G. Effects of peroxynitrite on erythrocytes // Biochimica et Biophysica Acta —

1996. — Vol. 1291. — Р. 107-114.

10. Starodubtseva M.N., Cherenkevich S.N., Semenkova G.N. Chemiluminescence analysis of interaction between hemoglobin and sodium nitrite and hydrogen peroxide In Chemilumi-nescence at the turn of the Millenium: An indispensible tool in modern chemistry, biochemistry and medicine, Ed.: Albrecht S., Zimmermann Th., Brandl H., Dresden: Schweda-Werbedruck GmbH // Druckerei & Verlag.—2001. — Р. 76-81.

11. Tarpey M.M., Fridovich I. Methods of detection of vascular reactive species nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite // Circulation Research. — 2001. — Vol. 89. — Р. 224-236.

12. Turko I.V., MuradF. Protein Nitration in Cardiovascular Diseases // Pharmacological Review. — 2002. — Vol. 54. — Р. 619-634.

13. Witting P.K., Mauk A.G., Douglas D.J., Stocker R. Reaction of human myoglobin and peroxyni-trite: characterizing biomarkers for myoglobin-derived oxidative stress // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2001. — Vol. 286. — Р. 352-356.

Поступила 06.12.2005

УДК: 61:378 «312»

ВЗГЛЯД НА ОСОБЕННОСТИ МЕДИЦИНСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ А.П. Шмаков, А.Э. Питкевич, А.А. Янушкевич, Н.Н. Зуев Витебский государственный медицинский университет

В статье обсуждаются проблемы высшего медицинского образования в современных условиях. Дается оценка качеству подготовки выпускников и пути ее улучшения в контексте реформирования образовательной системы.

Ключевые слова: образование, профессиональная подготовка, умения и навыки.

THE VISION OF FEATURES OF THE MEDICAL EDUCATION IN MODERN CONDITIONS A.P. Shmakov, A.E. Pitkevich, A.A. Yanushkevich, N.N. Zuev Vitebsk State Medical University

Problems of higher medical education in modern condition are discussed in our article. We give thoughts about its improvement.

Key words: education, professional preparation, skills.