Диагностика карантинных фитопатогенов методом ПЦР в формате Flash

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, № 3

Иммунитет и защита растений

УДК 633.11:632.488

ДИАГНОСТИКА КАРАНТИННЫХ ФИТОПАТОГЕНОВ МЕТОДОМ ПЦР

В ФОРМАТЕ FLASH

Д.Ю. РЯЗАНЦЕВ1, Д.Д. АБРАМОВ2, С.К. ЗАВРИЕВ1

На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в формате FLASH (fluorescent amplification-based specific hybridization) разработаны специфичные и чувствительные диагностические системы для детекции следующих карантинных фитопатогенов: возбудителей бурой бактериальной гнили картофеля (Ralstonia solanacearum) и кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus), бледной и золотистой картофельных цистообразующих нематод (Globodera pallida и G. rostochiensis), вируса шарки сливы ^lum Pox Potyvirus) и возбудителя ожога плодовых (Erwinia amylovora). Тест-системы пригодны для рутинной диагностики и апробированы на широком спектре изолятов и рас фитопатогенов.

Ключевые слова: карантинные фитопатогены, молекулярная диагностика, флуоресцентная детекция, ПЦР.

Key words: quarantine plant pathogens, molecular diagnostics, fluorescent detection, PCR.

Импорт растениеводческой продукции сопряжен с угрозой ввоза и распространения карантинных и особо опасных патогенов, вредителей и сорных растений, которые могут нанести огромный экономический вред. Поэтому своевременная диагностика и идентификация карантинных фитопатогенов с целью предотвращения их проникновения на территорию России относится к задачам государственной важности. Изменить опасную тенденцию распространения фитопатогенов, внесенных в список карантинных, в условиях постоянно увеличивающихся объемов анализируемого материала возможно только при наличии быстрых, эффективных и надежных методов диагностики (1-3).

В настоящее время для детекции и идентификации фитопатогенов применяют диагностические системы, основанные на двух методах — иммуноферментном анализе (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В Российской Федерации подавляющее большинство лабораторий, рутинно проводящих диагностику фитопатогенов, в качестве основного метода используют ИФА, уступающий методу ПЦР по чувствительности и специфичности. Использованный нами метод ПЦР в формате FLASH (fluorescent amplification-based specific hybridization) (4) позволяет регистрировать результаты амплификации на флуориметре, не открывая пробирок, что исключает риск контаминации рабочей зоны продуктами реакции и снижает время детекции. Для контроля достоверности в систему введен внутренний контроль (ВК). При использовании готовых наборов такой формат анализа позволяет проводить рутинную диагностику, получать стабильные и точные результаты, не требует дорогого оборудования и привлечения высококвалифицированных специалистов (2-4, 6, 7).

Целью наших исследований была разработка эффективных систем для диагностики и идентификации в формате FLASH-ПЦР следующих карантинных объектов: возбудителя бурой бактериальной гнили картофеля (Ralstonia solanacearum), возбудителя кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus), бледной и золотистой картофельной цистообразующей нематоды (Globodera pallida и G. rostochiensis), вируса шарки сливы (Plum Pox Potyvirus) и возбудителя ожога плодовых (Er-winia amylovora). При этом главным условием было максимальное удобство ис-

114

пользования таких систем при сохранении высокого уровня специфичности и чувствительности.

Методика. Образцы патогенов и зараженных растений были предоставлены Всероссийским центром карантина растений (Московская обл., г. Быково), в котором таксономическая принадлежность каждого патогена предварительно определялась и подтверждалась классическими методами.

Все диагностические FLASH-ПЦР-системы были разработаны на основе одного и того же базового состава реакционной смеси и режима амплификации. Выравнивание нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров и зондов, выделение РНК и ДНК из растительного материала и культур микроорганизмов, полимеразную цепную реакцию, анализ результатов ПЦР гель-электрофорезом и в формате FLASH, а также клонирование ДНК для положительных контролей выполняли, как описано нами ранее (4-7). Для выделения ДНК из отдельных цист нематод рода Glo-bodera материал помещали в пробирки, добавляли 50 мкл буфера STE (10 мМ Трис-Cl, pH 8,0, 1 мМ EDTA, 0,1 М хлорид натрия), гомогенизировали, инкубировали 5 мин на кипящей водяной бане и центрифугировали 5 мин при 13 000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для амплификации целевого фрагмента ДНК.

Результаты. При выравнивании нуклеотидных последовательностей различных штаммов и изолятов патогенов, имеющихся в GeneBank (8), были подобраны оптимальные высокоспецифичные праймеры и зонды для детекции и идентификации указанных патогенов. В таблице представлены локусы, к которым подбирали олигонуклеотиды, а также условия амплификации и размер амплифицируемого фрагмента.

Олигонуклеотиды, подобранные и оптимизированные для разработанных тестсистем детекции карантинных фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH

§

Н

О

>>

X

В

х

х

О

Нуклеотидная последовательность

Локус

Рн 5

:о

Е К

Н о

А Праймер:

ВТС1

140 67

прямой 5'-TGAGTCAGTGTGGGCAACACCA-3' обратный 5'-GACGACAACAGCAATCGTCGAG-3'

Зонд 5'-(FAM)GGCCCACAGGGCGCTGTCCATACATTGTTGGGCC(BHQ1)-3'

Б Праймер:

ВТС1 300 67

прямой 5'-AAACTCGGGGACGATTATGCGT-3' обратный 5'-CGACAACAGCAATCGTCGGC-3'

Зонд 5'-(FAM)GGCCCACAGGGCGCTGTCCATACATTGTTGGGCC(BHQ1)-3'

В Праймер:

прямой 5'-GACCCTTTCCGTCGTCCAAGC-3' обратный 5'-AATTTCGCCTCCCCGAAG-3'

Зонд 5'-(FAM)CCGGTGAAAGCCGTTAGGGAGCGTCCACCGG(BHQ2)-3'

Г Праймер:

прямой 5'-AACGCCAAACGGTGCGAAC-3' обратный 5'-CCGAAGGTCGACATGTTGACA-3'

Зонд 5'-(FAM)GGCGCGAAAACAACCTGCAGCGTATGCGCC(BHQ2)-3'

Д Праймер:

прямой 5'-GAAGAACGACGTATTCACGGCTT-3' обратный 5' -AAT GCAGCCT GTTT GATAATT CTGT-3'

Зонд 5'-(FAM)CGCGGATATCCGTAAAAACCTCAGTGCGACCGCG(BHQ2)-3'

ВТС1

Ген, подобный гену предшественника фла-геллина flicC Плазмида pEA, повторяющиеся элементы

140

300

253

67

67

64

Е Праймер:

Ген БО 265 64

прямой 5' - GATGAAAAGGAGGACGATGAAGAAG - 3' обратный 5'-CGACGTCCCTATCCCTTCCTG-3'

Зонд 5'-(FAM)GGCCCAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGGCC(BHQ2)-3'

П р и м е ч а н и е. FLASH — fluorescent amplification-based specific hybridization; А, Б, В, Г, Д и Е — соответственно Globodera pallida, G. rostochiensis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Ralstonia solanacearum, Erwinia amylovora и Plum Pox Potyvirus; ВТС — внутренний транскрибируемый спейсер, БО — белок оболочки.

115

На рисунке приведены данные, позволяющие сравнить эффективность гель-электрофоретического (рис., А) и флуоресцентного (см. рис., Б) анализа продуктов ПЦР для ДНК из отдельных цист двух видов картофельной нематоды. Как видно, в обоих форматах (ПЦР и FLASH-ПЦР) результаты полностью совпадали. Аналогичные результаты мы получили и по другим исследованным в настоящей работе патогенам (данные не представлены).

Диагностические системы были успешно апробированы на широком спектре изолятов и рас фитопатогенов из России и ряда европейских стран. Так, компанией «HLB» (Нидерланды) апробированы тест-системы для G. pallida и G. rostochiensis — на коллекции базовых патотипов картофельных цистообразующих нематод, распространенных на территории Голландии, для R so-lanacearum и C. mi-chiganensis subsp. se-pedonicus — на широком спектре изоля-тов различных видов почвенных бактерий. Все испытания, проведенные Всероссийским центром карантина растений и Всероссийским НИИ фитопатологии (Московская обл., пос. Большие Вяземы), также дали положительные результаты.

Таким образом, для диагностики ряда карантинных фитопатогенов нами разработаны эффективные, высокоспецифичные, чувствительные и простые в использовании тест-системы, которые в настоящее время находятся на стадии внедрения в производство.

Электрофореграммы

продуктов полимеразной цепной реакции (соответственно ПЦР и FLASH-ПЦР форматы) при детекции Globodera rostochiensis и G. pallida: 1-6 и 7-13 — соответственно ДНК из цист G. pallida и G. rostochiensis, 14 и 15 — отрицательный контроль; СП — специфическая ДНК (отмечено стрелками), ВК — внутренний контроль (отмечено стрелками). Черный столбик на рис. Б (а) соответствует интенсивности флуоресценции при ПЦР со специфической ДНК (СП), серый столбик (б) — ВК.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Перечень вредителей, возбудителей болезней растений, сорняков, имеющих карантинное значение для Российской Федерации, 2007. Бюл. нормативных актов федеральных органов исполнительной власти, № 6 от 11.02.2008.

2. L o p e z M.M., B e г t o l i n i E., O l m o s A. e.a. Innovative tools for detection of plant

116

pathogenic viruses and bacteria. Int. Microbiol., 2003, 6: 233-243.

3. L o p e z M.M., L l o p P., O l m o s A. e.a. Molecular tools solving the challenges posed by detection of plant pathogenic bacteria and viruses? Curr. Issues Mol. Biol., 2009, 11: 13-46.

4. Р я з а н ц е в Д.Ю., А б р а м о в а С.Л., Е в с т р а т о в а С.В. и др. Диагностика токсиногенных грибов рода Fusarium методом FLASH-PCR. Биоорганическая химия, 2008, 34: 716-724.

5. А б р а м о в а С.Л., Р я з а н ц е в Д.Ю., В о и н о в а Т.М. и др. Диагностика фитопатогенных грибов Septoria tritici и Stragonaspora nodorum методом FLASH—ПЦР. Биоорганическая химия, 2008, 34: 107-113.

6. К у л и н и ч О.А., Р ы с с А.Ю., Ч е р н е ц к а я А.Ю. и др. Использование ПЦР-диагностики для идентификации карантинных видов нематод. Защита растений, 2008, 8: 36-39.

7. Р я з а н ц е в Д.Ю., З а в р и е в С.К. Эффективный метод диагностики и идентификации вирусных патогенов картофеля. Мол. биол., 2009, 43: 558-567.

8. www.ncbi.nlm.nih.gov

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 г. Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 e-mail: szavriev@ibch.ru;

2ЗАО «НПФ ДНК-Технология»,

115446 г. Москва, Каширское ш., 23, корп. 5

DIAGNOSTICS OF QUARANTINE PHYTOPATHOGENS BY THE PCR METHOD IN THE FLASH FORMAT

D.Yu. Ryazantsev1, D.D. Abramov2, S.K. Zavriev1 S u m m a r y

On the basis of PCR in the FLASH format the authors developed the specific and sensitive diagnostic systems for a revealing of following quarantine phytopathogens: Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus, Globodera pallida and G. rostochiensis, Plum Pox Poty-virus, Erwinia amylovora. The test-systems are suitable for routine diagnostics and were approved on wide range of isolates and race of phytopathogens.

Поступила в редакцию 7 апреля 2009 года

Научные конференции

МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

«БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СЕВЕРНЫХ ЭКОСИСТЕМ В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЯЮЩЕГОСЯ КЛИМАТА»

10-12 июня 2009 года, г. Апатиты

Организаторы: Полярно-альпийский ботанический сад-институт им. Н.А. Аврорина Кольского научного центра РАН, Мурманский государственный технический университет, Мурманский государственный педагогический университет, Кольский филиал Петрозаводского государственного университета, Правительство Мурманской области

Конференция будет проходить вслед за Годичным собранием Общества физиологов растений (ОФР) России и Международной научной конференцией «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (7-11 июня 2009 года).

Основные направления работы конференции:

Палеоэкология и биоразнообразие на Севере.

Сравнительная динамика экосистем в различных климатогеографических зонах. Глобальное, региональное и локальное воздействие на биоразнообразие.

Биоразнообразие в условиях загрязнения окружающей среды.

Влияние климатогеографических, геофизических и техногенных факторов на генетику популяций и хромосомную изменчивость. Эволюция хромосомных наборов диких и культурных растений.

Биоразнообразие как источник лекарственных ресурсов. Растительное биоразнообразие и здоровье человека.

Методологические аспекты создания единой стратегии междисциплинарного изучения биоразнообразия, сравнительной динамики экосистем, интеграции информационных и программных ресурсов.

Ботанические сады и биоэтика. Проблема сохранения биоразнообразия в образовании. Информация на сайте ПАБСИ КНЦ РАН www.pabgi.ru и ИФР РАН www.ippras.ru.

117