ИММУНОМОДУЛЯТОРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ СО СВЕРХПРОДУКЦИЕЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ
IMMUNOMODULATORY COMPOUNDS AND TREATING DISEASES CONNECTED WITH INFLAMMATORY CYTOKINES

Изобретение относится к применению соединений, обладающих иммуномодуляторной активностью для лечения заболеваний, связанных со сверхпродукцией воспалительных цитокинов, таких как заболевания, выбранные из группы, состоящей из астмы, атопического дерматита, аллергического ринита, простатита, воспалительного заболевания кишечника, диабета и ревматоидного артрита.
Недавно достигнут значительный прогресс в понимании механизма активации врожденной иммунной системы микробными сигналами. Также стало очевидно, что такая активация врожденной иммунной системы существенна для вызывания адаптивных иммунных ответов и для определения типа полученных адаптивных ответов. Вместе эти наблюдения вызвали значительное возрождение интереса к рациональным подходам в разработке иммунотерапии.
Два главных открытия оказались существенными для возросшего понимания активации врожденного иммунитета:
1) роль дендритных клеток (DC) в качестве антигенпрезентирующих клеток, отвечающих за индукцию первичных иммунных ответов;
2) открытие Toll-подобных рецепторов (TLR) и других «образраспознающих» рецепторов, которые определяют присутствие микробных структур, что приводит к стимуляции врожденной иммунной системы.
Sallusto и Lanzavecchia впервые сообщили о том, что незрелые DC можно получать из моноцитов человека в среде с добавлением GM-CSF и IL-4 (Sallusto F, Lanzavecchia A. J Exp Med 1994, 179:1109-18). Однако скоро стало понятно, что, кроме GM-CSF и IL-4, дополнительный фактор созревания необходим для получения зрелых DC, которые полностью функциональны в качестве антигенпрезентирующих клеток (APC). Зрелые DC способны управлять и инициировать адаптивный иммунный ответ.
Такие сигналы созревания можно получить при помощи микробных продуктов. Показано, что эти продукты действуют через TLR. Идентифицировано одиннадцать TLR, способных к распознаванию разных микробных продуктов или распознающих их. TLR4 представляет собой рецептор, который специфически распознает бактериальный липополисахарид (LPS), один из наиболее мощных известных стимуляторов врожденной иммунной системы.
В публикации международной заявки WO 2005007699 описано применение специфических участников связывания, в частности, молекул антител анти-IL-13 человека и, в особенности, молекул антител, которые нейтрализуют активность IL-13, в диагностике или лечении расстройств, связанных с IL-13, включая астму, атопический дерматит, аллергический ринит, фиброз, воспалительное заболевание кишечника и лимфому Ходжкина.
Однако по-прежнему необходимы исследования, чтобы узнать конкретную роль IL-13 в иммуномодуляции, и интерпретация результатов, связанных с исследованием пути IL-13/IL-4, все еще находится на стадии гипотез, как показано в следующих двух недавних публикациях.
В публикации «IL-4/IL-13 pathway genetics strongly influence serum IgE levels and childhood asthma», Michael Kabesch et al. (J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117, Number 2), утверждается, что продукция IgE, отличительного признака астмы и атопического заболевания, может находиться под генетическим контролем, в который вовлечены гены пути IL-4 и IL-13. Вследствие того, что переключение IgE является фундаментальным для иммунитета и продолжительности жизни человека, существует тонкая регуляция IgE. Хотя путь IL-4/IL-13 может влиять на развитие астмы преимущественно посредством влияния на регуляцию IgE, данные результаты указывают на то, что, возможно, имеет место не только это.
В публикации «Control of allergic airway inflammation through immunomodulation», David B Corry and Farrah Kheradmand (J. Allergy Clin. Immunol. Volume 117, Number 2), описаны те основные открытия, связанные с клиническими испытаниями, которые изменили лечение астмы, и те, которые не изменили, и которые требуют дальнейшего изучения. Получены данные, что IL-4, цитокин, который необходим для IgE-ответов B-клеток, является существенным для ответов гиперчувствительности I типа, и что IL-4, таким образом, является одним из первых цитокинов, которые служат мишенью в клинических испытаниях для лечения астмы с использованием растворимой формы α-цепи (sIL-4Rα) рецептора IL-4, которая связывается с IL-4 и инактивирует его. IL-13 представляет собой другой цитокин, который обладает многими из эффектов, свойственных IL-4, но который не ингибируется посредством sIL-4α. Вывод состоит в том, что в будущих исследованиях для лечения астмы можно, таким образом, попытаться ингибировать одновременно как IL-4, так и IL-13.
Настоящее изобретение основано на демонстрации авторами настоящего изобретения того, что описанные далее молекулы являются эффективными агонистами TLR4 с надлежащим профилем безопасности, где молекулы способны индуцировать полное созревание функциональных DC моноцитарного происхождения, а также активировать другие типы клеток, экспрессирующих TLR4. DC, обработанные соединениями согласно изобретению, способны индуцировать первичной активации T-клеток и способствовать Th1-клеточным иммунным ответам.
+
Авторы настоящего изобретения также показали, что соединения согласно изобретению, способны заметно снижать секрецию IL-13 T-клетками CD4, активированными поликлональными антителами анти-CD3 и анти-CD28.
Более того, при введении одного из соединений путем i.p. или i.n. в модели астмы на мышах, авторы настоящего изобретения показали предотвращение аллергических ответов, вызванных антигенной сенсибилизацией и последующей обработкой антигеном в форме аэрозоля. Измеренные иммунологические параметры позволяют предположить относительное снижение уровней Th2-ответов, которое может объяснить механизм, посредством которого соединения согласно изобретению действуют в этой модели астмы. Кроме того, авторы показали, что соединение по изобретению способно снижать частоту возникновения диабета у нетучных диабетических мышей.
Настоящее изобретение относится к способу лечения теплокровных животных, включая человека, страдающих заболеванием или расстройством, связанным со сверхпродукцией воспалительных цитокинов, где способ включает введение пациенту, нуждающемуся в нем, соответствующего количества фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одно иммуномодуляторное соединение следующей общей формулы (I):
где
- m и n независимо друг от друга представляют собой целое число от 1 до 4,
- X и Y каждый обозначает группу или в нейтральном или заряженном состоянии, выбранную из следующих групп:
* карбоксил -COOH,
2
* дигидроксифосфорилокси -O-P(O)(OH),
2
* гидроксисульфонилокси -O-SO(OH),
2
* амино -NH,
* гидроксил -OH,
1
10
2
n1
2
1
* [амино(C-C)алкил]аминокарбонил -CONH(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
5
2
n1
1
* [дикарбокси(C-C)алкил]аминокарбонил -CO-NH-CH(COOH)-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
5
2
n1
2
1
* {карбокси[амино(C-C)алкил]}аминокарбонил -CO-NH-CH(COOH)-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
15
2
n1
2
1
* амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 15,
1
10
2
n1
2
1
* дигидрокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-CHOH-CHOH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
10
2
n1
1
* гидрокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-OH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
10
2
n1
1
* карбокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
5
2
n1
1
* оксо(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-CHO, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
10
1
15
2
n1
2
n2
1
2
* [карбокси(C-C)алканоил]амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH-CO-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 10, и n представляет собой целое число от 1 до 15,
1
2
- R и R каждый обозначает ацильную группу, полученную из насыщенной или ненасыщенной карбоновой кислоты с прямой или разветвленной цепью, содержащей от 2 до 18 атомов углерода, которая является незамещенной или имеет от одного до трех заместителей, выбранных из гидроксила, дигидроксифосфорилокси, алкила из 2-18 атомов углерода, алкокси из 2-18 атомов углерода, ацилокси из 2-18 атомов углерода в ацильной группе, амино, ациламино,
*1
*2
- C и C независимо друг от друга являются асимметрическими атомами углерода в конфигурации R, S, или в рацемической форме RS,
или его фармацевтически приемлемая соль, сольват или изомер, не обязательно, в конъюгации или смеси с инертным нетоксичным фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где:
* X выбран из следующих групп:
* карбоксил -COOH,
2
* дигидроксифосфорилокси -O-P(O)(OH),
2
* гидроксисульфонилокси -O-SO(OH),
2
* амино -NH,
1
5
2
n1
2
1
* [амино(C-C)алкил]аминокарбонил -CONH(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
5
2
n1
1
* [дикарбокси(C-C)алкил]аминокарбонил -CO-NH-CH(COOH)-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
5
2
n1
2
1
* {карбокси[амино(C-C)алкил]}аминокарбонил -CO-NH-CH(COOH)- (CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
15
2
n1
2
1
* амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 15,
* и Y выбран из следующих групп:
2
* дигидроксифосфорилокси -O-P(O)(OH),
2
* гидроксисульфонилокси -O-SO(OH),
2
* амино -NH,
* гидроксил -OH,
1
15
2
n1
2
1
* амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 15,
1
10
2
n1
2
1
* дигидрокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-CHOH-CHOH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
10
2
n1
1
* гидрокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-OH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
10
2
n1
1
* карбокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 10,
1
5
2
n1
1
* оксо(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-CHO, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
10
1
15
2
n1
2
n2
1
2
* [карбокси(C-C)алканоил]амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH-CO-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 10, и n представляет собой целое число от 1 до 15.
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где:
* X выбран из следующих групп:
* карбоксил -COOH,
2
* дигидроксифосфорилокси -O-P(O)(OH),
2
* гидроксисульфонилокси -O-SO(OH),
2
* амино -NH,
1
6
2
n1
2
1
* [амино(C-C)алкил]аминокарбонил -CONH(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 6,
1
5
2
n1
1
* [дикарбокси(C-C)алкил]аминокарбонил -CO-NH-CH(COOH)-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
1
5
2
n1
2
1
* {карбокси[амино(C-C)алкил]}аминокарбонил -CO-NH-CH(COOH)-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 1 до 5,
2
12
2
n1
2
1
* амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 2 до 12,
* и Y выбран из следующих групп:
2
* дигидроксифосфорилокси -O-P(O)(OH),
2
* гидроксисульфонилокси -O-SO(OH),
2
* амино -NH,
* гидроксил -OH,
2
12
2
n1
2
1
* амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH, где n представляет собой целое число от 2 до 12,
3
7
2
n1
2
1
* дигидрокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-CHOH-CHOH, где n представляет собой целое число от 3 до 7,
2
6
2
n1
1
* гидрокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-OH, где n представляет собой целое число от 2 до 6,
3
6
2
n1
1
* карбокси(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 3 до 6,
2
5
2
n1
1
* оксо(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-CHO, где n представляет собой целое число от 2 до 5,
3
6
2
12
2
n1
2
n2
1
2
* [карбокси(C-C)алканоил]амино(C-C)алканоилокси -O-CO-(CH)-NH-CO-(CH)-COOH, где n представляет собой целое число от 3 до 6, и n представляет собой целое число от 2 до 12.
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где:
* X выбран из следующих групп:
* -СООН,
2
* -O-P(O)(OH),
2
* -O-SO(OH)
2
* -NH,
2
3
2
2
6
2
* -CO-NH-(CH)-NH или -CONH-(CH)-NH,
2
* -CO-NH-CH(COOH)-CH-COOH,
2
4
2
* -CO-NH-CH(COOH)-(CH)-NH,
2
5
2
* -O-CO-(CH)-NH,
* и Y выбран из следующих групп:
2
* -O-P(O)(OH),
2
* -O-SO(OH)
2
* -NH,
* -OH,
2
2
2
2
2
2
5
2
2
11
2
* -O-CO-CH-NH (2-аминоэтаноилокси), -O-CO-(CH)-NH (3-аминопропаноилокси), -O-CO-(CH)-NH (6-аминогексаноилокси) или -O-CO-(CH)-NH (12-аминододеканоилокси),
2
4
2
* -O-CO-(CH)-CHOH-CHOH (6,7-дигидроксигептаноилокси),
2
5
* -O-CO-(CH)-OH (6-гидроксигексаноилокси),
2
2
* -O-CO-(CH)-COOH (3-карбоксипропаноилокси)
2
4
* -O-CO-(CH)-CHO (6-оксогексаноилокси),
2
5
2
2
* -O-CO-(CH)-NH-CO-(CH)-COOH (3-карбоксипропаноиламиногексаноилокси).
1
2
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где R и R выбраны из:
2
2
10
3
2
10
3
12
14
-СО-СН-С*Н[О-СО-(СН)-СН]-(СН)-СН, (3(CO)C),
2
2
10
3
14
-СО-СН-С*НОН-(СН)-СН, (3(НО)С),
3
-СО-СН, (С2),
2
2
8
3
2
5
3
10
8
2
-СО-СН-NH-СО-С*Н[O-СО-(СН)-СН]-(СН)-СН, [2(CO)C]NC),
2
4
3
2
5
3
6
8
-CO-C*H[О-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, (2(CO)C),
2
16
3
-CO-(CH)-CH, (C18),
2
2
6
5
2
10
3
14
-СО-СН-С*Н[О-СН-СН]-(СН)-СН, (3(BnO)C),
2
2
2
10
3
2
14
-СО-СН-С*Н[O-Р(O)(ОН)]-(СН)-СН, (3[(ОН)-Р(O)О]С),
C* в упомянутых выше формулах соответствует асимметрическому атому углерода в конфигурации R, S, или в рацемической форме RS.
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где:
1
- R выбран из:
2
2
10
3
2
10
3
12
14
1
-СО-СН-С**Н[O-СО-(СН)-СН]-(СН)-СН, (3(CO)C),
2
2
10
3
14
1
-CO-CH-C**HOH-(CH)-CH, (3(HO)C),
3
-СО-СН, (С2),
2
2
8
3
2
5
3
10
8
2
1
-CO-CH-NH-CO-C**H[O-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, ([2(CO)C]NC),
1
2
4
3
2
5
3
6
8
-CO-C**H[О-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, (2(CO)C),
2
16
3
-CO-(CH)-CH, (C18),
2
- R выбран из:
2
2
10
3
2
10
3
12
14
2
-СО-СН-С**Н[O-СО-(СН)-СН]-СН)-СН, (3(CO)С),
2
2
10
3
14
2
-CO-CH-C**HOH-(CH)-CH, (3(HO)C),
2
2
6
5
2
10
3
14
2
-СО-СН-С**Н[O-СН-СН]-(СН)-СН, (3(BnO)C),
2
2
2
10
3
2
14
2
-CO-CH-C**H[O-P(O)(OH)]-(CH)-CH, (3[(OH)-P(O)O]C).
**1
**2
C и C в упомянутых выше формулах соответствуют асимметрическим атомам углерода в конфигурации R, S, или в рацемической форме RS.
Изобретение также относится к способу, как определено выше, где вводимое соединение обладает общей формулой (II):
1
2
*1
*2
где X, Y, R, R и m являются такими, как определено выше, C находится в конфигурации R, S, или представляет собой рацемат RS, и C находится в конфигурации R.
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где вводимое соединение выбрано из таких формул (II), где:
2
2
1
2
2
10
3
2
10
3
2
2
2
10
3
**1
**2
*1
*2
**1
**2
- X=-O-P(O)(OH), Y=-O-P(O)(OH), R=-CO-CH-CH[O-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, R=-CO-CH-CHOH-(CH)-CH, m=2, C находится в конфигурации S, C находится в конфигурации R, C и C находятся в конфигурации R, т.е. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1,10-бис-дигидрофосфат (OM-294-DP (S,R)),
2
2
4
2
1
2
2
10
3
2
10
3
2
2
10
3
**1
**2
*1
*2
**1
**2
- X = -O-P(O)(OH), Y = -O-CO-(CH)-CHOH-CHOH, R = -CO-CH-CH[O-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, R2 = -CO-CH-CHOH-(CH)-CH, m = 2, C находится в конфигурации S, и C находится в конфигурации R, C и C находятся в конфигурации R, т.е. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дигидрофосфат-10-(6,7-дигидроксигептаноат) (OM-197-MP-HD (S,R)),
2
4
2
1
2
2
10
3
2
10
2
2
10
3
**1
**2
*1
*2
**1
**2
- X = -COOH, Y = -O-CO-(CH)-CHOH-CHOH, R = -CO-CH-CH[O-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH3, R2 = -CO-CH-CHOH-(CH)-CH, m = 1, C находится в конфигурации S, и C находится в конфигурации R, C и C находятся в конфигурации R, т.е. N-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоил]-L-аспарагиновая кислота, α-N-{(4R)-5-гидрокси-4-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]пентил}амид-5-O-(6,7-дигидроксигептаноат) (OM-197-MC-HD (S,R)),
2
2
5
2
1
2
2
10
3
2
10
3
2
2
2
10
3
**1
**2
*1
*2
**1
**2
- X = -O-P(O)(OH), Y = -O-CO-(CH)-NH, R = -CO-CH-CH[O-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, R = -CO-CH-CHOH-(CH)-CH, m = 2, C находится в конфигурации S, и C находится в конфигурации R, C и C находятся в конфигурации R, т.е. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дигидрофосфат-10-(6-аминогексаноат) (OM-197-MP-AC (S,R)),
2
2
1
2
2
10
3
2
10
3
2
2
10
3
**1
**2
*1
*2
**1
**2
- X = -NH, Y = -O-P(O)(OH), R = -CO-CH-CH[O-CO-(CH)-CH]-(CH)-CH, R2 = -CO-CH-CHOH-(CH)-CH, m = 4, C находится в конфигурации S, и C находится в конфигурации R, C и C находятся в конфигурации R, т.е. (5S,11R)-1-амино-5-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-6-оксо-7-аза-11-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]додекан-12-ол-12-дигидрофосфат (OM-294-BA-MP (S,R)).
Изобретение также относится к способу, как определено выше, лечения теплокровных животных, включая человека, страдающих заболеванием или расстройством, связанным со сверхпродукцией воспалительных цитокинов или маркеров воспалительного заболевания активированными T-лимфоцитами, моноцитами или антигенпрезентирующими клетками организма, где воспалительные цитокины или маркеры воспалительного заболевания относятся к группе, состоящей из IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IFN-γ, TNF-α и MCP-1.
Изобретение более конкретно относится к способу, как определено выше, где заболевание выбрано из группы, состоящей из астмы, диабета, атопического дерматита, аллергического ринита, простатита, воспалительного заболевания кишечника и ревматоидного артрита.
Изобретение также более конкретно относится к способу, как определено выше, который заключается во введении терапевтически эффективного количества любого соединения формулы (I) по изобретению, как определено выше, в фармацевтически приемлемом носителе, эксципиенте или композиции, посредством мукозального или парентерального способа введения.
Изобретение также более конкретно относится к способу, как определено выше, который заключается во введении терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) по изобретению, как определено выше, предпочтительно посредством перитонеального, подкожного, перорального, интраназального, подъязычного или аэрозольного способов введения.
Изобретение более конкретно относится к устойчивым к действию желудочного сока фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество соединения формулы (I), как определено выше, в сочетании с устойчивым к действию желудочного сока носителем, таким как поверхностно-активные вещества из гидрофильных полоксамеров, таких как полоксамер 407 (лутрол F-127). Коллоидные носители, такие как полимерные наночастицы или микрочастицы, также подходят в качестве композиций для пероральной доставки соединения формулы (I), в которых применяют кишечнорастворимые полимеры, такие как полимеры метакрилата.
В более общепринятом способе применение устойчивых к действию желудочного сока таблеток или капсул, полученных с использованием кишечнорастворимого покрытия, может также являться альтернативой при пероральном способе введения.
2
Изобретение также более конкретно относится к способу, как определено выше, где необходимые дозировки для человека иммуномодуляторных молекул формулы (I) по изобретению, как определено выше, варьируют от 0,01 до 50 мг/м.
Изобретение также относится к применению, по меньшей мере, одного соединения формулы (I), как определено выше, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения заболевания или расстройства, такого как астма, диабет, атопический дерматит, аллергический ринит, простатит, воспалительное заболевание кишечника и ревматоидный артрит, связанного со сверхпродукцией воспалительных цитокинов или маркеров воспалительного заболевания.
Изобретение также относится к соединениям формулы (I), как определено выше, и лекарственному средству, содержащему указанные соединения в сочетании с физиологически приемлемым носителем.
Соединения формулы (I) по настоящему изобретению, как определено выше, можно получать согласно способу, описанному в WO 00/00462 и WO 01/46127 в связи с получением и применением соединений формулы (I) при лечении форм рака или в качестве иммуноадъювантов.
Изобретение далее подробно описано в следующем описании синтеза соединений OM-294-DP (S,R), OM-197-MP-HD (S,R), OM-197-MC-HD (S,R), OM-197-MP-AC (S,R) и OM-294-BA-MP (S,R), и их биологических свойств.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
(3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дигидрофосфат-10-(6-аминогексаноат) (= OM-197-MP-AC (S,R)) (схема 1)
1. (2R)-5-(бензилоксикарбониламино)-2-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]-1-(2-тетрагидропиранилокси)пентан (C-1)
2
2
2
2
3
2
4
К раствору (2R)-5-(бензилоксикарбониламино)-2-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]пентан-1-ола (PCT WO 00146127A1) (2,5 г; 4,39 ммоль) в безводном CHCl (83 мл) при комнатной температуре и в атмосфере аргона добавляли последовательно 3,4-дигидро-2H-пиран (DHP) (1,4 мл, 15,38 ммоль), затем пиридиний-p-толуолсульфонат (PPTS) (441 мг, 1,75 ммоль). Раствор перемешивали в течение 18 час при комнатной температуре, затем разводили при помощи CHCl (100 мл), промывали 5% водным NaHCO, затем HO. Органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (AcOEt/петролейный эфир 4/1) получали соединение C-1 (2,86 г; 100%) в виде белого кристаллического твердого вещества. (Rf = 0,66 в AcOEt/петролейный эфир 4/1; УФ и фосфомолибдат.)
39
60
2
6
+
+
CHNO. IS/MS: m/z 653,5 ([M+H]), 675,5 ([M+Na]). Температура плавления = 84-86°C
2. (2R)-5-амино-2-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]-1-(2-тетрагидропиранилокси)пентан (C-2)
31
54
2
4
+
Раствор соединения C-1 (2,5 г; 4,4 ммоль) в EtOH (150 мл), содержащий триэтиламин (4 мл), гидрогенизировали в присутствии 10% Pd на C при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 3,5 час. Катализатор затем удаляли фильтрованием, промывали этанолом, и фильтрат концентрировали и сушили в условиях высокого вакуума с получением чистого амина C-2 (2,15 г; 96%) в виде аморфного белого твердого вещества. CHNO. IS/MS: m/z 519,5 ([M+H]).
3. (S)-α-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-γ-бутиролактон (C-3)
3
2
2
4
2
2
30
55
5
+
+
К раствору (R)-3-додеканоилокситетрадекановой кислоты [Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205-2214] (2,16 г; 5,1 ммоль) в безводном THF (28 мл) при -15°C и в атмосфере аргона добавляли последовательно N-метилморфолин (0,56 мл; 5,1 ммоль; 1 экв.) и изобутилхлорформиат (657 мкл; 5,1 ммоль; 1 экв.). После 1 час при перемешивании при -15°C добавляли L-гомосеринлактонгидробромид (916 мг; 5,1 ммоль; 1 экв.) в виде раствора в 0,72 М водного NaHCO (14 мл, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 час при комнатной температуре. Смесь разводили EtO (130 мл), органическую фазу отделяли и промывали HO, затем сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Очисткой путем кристаллизации (минимальный объем CHCl и избыток пентана при 0°C) получали соединение C-3 (2,17 г; 85%) в виде белого твердого вещества. CHNO. IS/MS: m/z 510,5 ([M+H]), 532,5 ([M+Na]). Температура плавления = 79-80°C.
4. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]-10-(2-тетрагидропиранил)оксидекан-1-ол (C-4)
2
2
2
2
61
109
3
9
+
+
К раствору соединения C-2 (638 мг, 1,23 ммоль, 1,3 экв.) в безводном CHCl (1,5 мл) при 20-21°C добавляли соединение C-3 (483 мг, 0,95 ммоль). Раствор перемешивали в течение 3 суток при 20-21°C; растворитель выпаривали при пониженном давлении. Очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (CHCl/ацетон от 5/1 до 1/1) получали спирт C-4 (829 мг, 85%) в виде белого твердого вещества. CHNO. IS/MS: m/z 1029,0 ([M+H]), 1051,0 ([M+Na]). Температура плавления = 81-82°C.
5. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]-10-(2-тетрагидропиранил)оксидекан-1-ол-дибензилфосфат (C-5)
2
2
2
2
3
2
2
3
3
4
2
2
К раствору спирта C-4 (120 мг; 0,12 ммоль) и 1H-тетразола (25 мг; 0,35 ммоль; 3 экв.) в безводном THF (5 мл) при комнатной температуре и в атмосфере аргона добавляли N,N-дибензилдиэтилфосфорамидит (85%, 95 мкл; 0,27 ммоль; 2,3 экв.). После 45 мин при перемешивании реакционную смесь охлаждали до -40°C, затем добавляли раствор mCPBA (57-86%; 75 мг; 0,43 ммоль; 3,7 экв.) в CHCl (3 мл). После 45 мин при -40°C смесь нагревали, и добавляли насыщенный раствор NaSO (3 мл), и смесь перемешивали в течение 10 мин. Раствор разводили эфиром, органическую фазу отделяли и промывали насыщенным NaSO (5x), затем насыщенным NaHCO (2x). Органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (CHCl/ацетон 4/1, затем 2/1) получали дибензилфосфат C-5 (126 мг; 84%) в виде аморфного твердого вещества.
6. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дибензилфосфат (C-6)
2
2
3
2
2
2
2
4
К 1% раствору HCl в метаноле (25 мл) при 0°C добавляли раствор соединения C-5 (700 мг, 0,54 ммоль) в CHCl (2,5 мл). После 45 мин при перемешивании при 0°C реакционную смесь нейтрализовали 5% водным NaHCO, разводили при помощи CHCl, затем отделяли органическую фазу. Водную фазу экстрагировали при помощи CHCl (3x), затем органические фазы объединяли, сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали с получением спирта C-6 (640 мг; 98%).
7. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дибензилфосфат-10-6-бензилоксикарбониламиногексаноат (C-7)
2
2
4
2
2
3
13
К полученному выше раствору соединения C-6 (640 мг, 0,53 ммоль) и 6-(бензилоксикарбониламино)гексановой кислоты (423 мг, 1,60 ммоль) в безводном CHCl (25 мл) при 0°C и в атмосфере аргона добавляли последовательно коммерчески доступный 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (306 мг, 1,60 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (20 мг, 160 мкмоль). Реакционную смесь затем перемешивали в течение 30 минут при 0°C и затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную среду затем промывали водой и раствором 1 Н HCl с последующим разделением слоев. Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и выпаривали. Проведением очистки флэш-хроматографией на силикагеле (элюент CHCl/ацетон 4/1, затем 2/1), получали продукт реакции сочетания C-7 (537 мг; 71%). C-ЯМР (62,89 МГц, CDCl), δ м.д.: 173,18, 171,16, 170,38, 169,60, 156,30, 138,23, 136,50, 135,38, 135,28, 128,42, 128,26, 128,17, 127,79, 127,74, 127,44, 76,48, 71,15, 70,84, 69,47, 69,39, 69,31, 66,25, 65,62, 64,37, 49,78, 47,76, 41,41, 41,34, 40,57, 38,97, 34,22, 34,16, 33,96, 33,57, 32,95, 31,70, 29,15, 28,95, 28,32, 25,87, 25,46, 25,02, 28,80, 24,18, 22,49, 13,94.
8. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дигидрофосфат-10-(6-аминогексаноат) (C-8) (= OM-197-MP-AC (S,R))
2
2
+
Раствор соединения C-7 (500 мг, 0,35 ммоль) в смеси CHCl/этанол 5/2 (70 мл), содержащей уксусную кислоту (10 мл), гидрогенизировали в присутствии Pd на углероде, содержащем 10% Pd, при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 12-24 часов. Катализатор удаляли фильтрованием. Фильтрат выпаривали до сухого состояния и осадок затем сушили отсасыванием вакуумным насосом с получением C-8 (368 мг, количественный выход). ES/MS: отношение m/z 1047,9 [M+H]; 1069,8.
ПРИМЕР 2
(3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дигидрофосфат-10-(6,7-дигидроксигептаноат) (= OM-197-MP-HD (S,R)) (схема 2)
1. Бензил-6-гептеноат (C-9)
4
3
2
4
3
13
К раствору 6-гептеновой кислоты (4,71 г, 36,75 ммоль) в AcOEt (80 мл) при 0°C последовательно добавляли триэтиламин (15,3 мл, 110,24 ммоль), бензилбромид (13,1 мл, 110,24 ммоль) и BuNI (6,79 г, 18,37 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 2 час и концентрировали в вакууме. Осадок отбирали в AcOEt, органическую фазу промывали насыщенным водным NaHCO и HO. Органическую фазу сушили над MgSO и растворитель удаляли в вакууме. Флэш-хроматографией осадка на силикагеле (н-гептан/EtOAc, 9:1) получили соединение C-9 (6,00 г; 75%) в виде бесцветного масла. C-ЯМР (62,89 МГц, CDCl): 24,42, 28,34, 33,37, 34,13, 66,08, 114,73, 128,19, 128,55, 136,16, 138,37, 173,43.
2. Бензил-6,7-эпоксигептаноат (C-10)
2
2
2
2
2
2
2
2
3
4
3
13
К раствору m-CPBA (2,76 г, 12,29 ммоль) в CHCl (50 мл) при 0°C медленно добавляли раствор C-9 (1,79 г, 8,19 ммоль) в CHCl (20 мл). Раствор перемешивали при 0°C в течение 2 час, затем при комнатной температуре в течение 18 час. Раствор разводили с помощью CHCl, и органическую фазу промывали насыщенным водным раствором NaSO (5x). Органическую фазу сушили над MgSO и растворитель удаляли в вакууме. Флэш-хроматографией осадка на силикагеле (н-гептан/EtOAc, 5:1) получили соединение C-10 (1,54 г; 80%) в виде бесцветного масла. C-ЯМР (62,89 МГц, CDCl): 24,60, 25,39, 32,00, 34,02, 46,86, 51,91, 66,04, 128,11, 128,46, 136,01, 173,17.
3. Бензил-6,7-изопропилиденгептаноат (C-11)
3
4
К раствору C-10 (1,54 г, 6,59 ммоль) в ацетоне (50 мл) при комнатной температуре добавляли серную кислоту (0,42 мл, 7,9 ммоль). Раствор перемешивали в течение 3 час, разводили диэтиловым эфиром, и органическую фазу промывали насыщенным водным раствором NaHCO, органическую фазу сушили над MgSO и растворитель удаляли в вакууме с получением C-11 (1,73 г) в виде бледно-желтого масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
4. 6,7-изопропилиденгептановая кислота (C-12)
3
2
2
Раствор соединения C-11 (1,53 г) в EtOAc (20 мл), содержащий EtN (3,65 мл, 26,16 ммоль), гидрогенизировали в присутствии Pd на углероде, содержащем 10% Pd, при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 3 час. Катализатор удаляли фильтрованием и фильтрат выпаривали до сухого состояния. Флэш-хроматографией осадка на силикагеле (CHCl/MeOH, 5:1) получили соединение C-12 (0,63 г; 54% с 2 стадий) в виде бесцветного масла.
5. (3S, 9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дибензилфосфат-10-(6,7-изопропилиденгептаноат) (C-13)
2
2
4
2
2
+
+
К раствору полученного выше соединения C-6 (248 мг, 0,21 ммоль) и соединения 6,7-изопропилиденгептановой кислоты (C-12) (92 мг, 0,45 ммоль) в безводном CHCl (5 мл) при 0°C и в атмосфере аргона добавляли последовательно коммерчески доступные 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (91 мг, 0,47 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (каталитический). Реакционную смесь затем перемешивали в течение 30 минут при 0°C и затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную среду затем промывали водой и раствором 1 Н HCl с последующим разделением слоев. Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и выпаривали. Проведением очистки флэш-хроматографией на силикагеле (CHCl/MeOH, 99:1) получали продукт реакции сочетания C-13 (240 мг; 83%). ES/MS: m/z 1390 [M+H]; 1411 [M+Na].
6. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1-дигидрофосфат-10-(6,7-дигидроксигептаноат) (C-14) (= OM-197-MP-HD (S,R))
2
2
+
+
Раствор соединения C-13 (180 мг, 0,13 ммоль) в смеси CHCl/этанол 5/2 (21 мл), содержащей уксусную кислоту (3 мл), гидрогенизировали в присутствии Pd на углероде, содержащем 10% Pd, при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 12-36 часов. Катализатор удаляли фильтрованием. Фильтрат выпаривали до сухого состояния и осадок затем сушили отсасыванием вакуумным насосом с получением C-14 (139 мг, количественный выход). ES/MS: m/z 1079 [M+H]; 1101 [M+Na].
ПРИМЕР 3
(3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1,10-бис-дигидрофосфат (= OM-294-DP (S,R)) (схема 3)
1. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол (C-15)
2
2
2
2
2
2
К раствору (2R)-5-амино-2-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]пентан-1-ола (PCT WO 00146127A1) (8 г, 18,4 ммоль) в безводном CHCl (60 мл) при 25°C добавляли соединение C-3 (9 г, 17,5 ммоль) в безводном CHCl (28 мл). Раствор перемешивали в течение 3 суток при 20-21°C. Суспензию разводили при помощи CHCl (66 мл) и нагревали до 30°C с получением прозрачного раствора. Ацетонитрил (320 мл) медленно добавляли к раствору. Раствор охлаждали до 20°C и перемешивали в течение 2 час. Осадок фильтровали, промывали ацетонитрилом и сушили под действием вакуума, получая C-15 (13,7 г, 83%) в виде белого твердого вещества. Температура плавления = 103°C.
2. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1,10-бис-дибензилфосфат (C-16)
2
2
2
2
3
2
2
3
3
4
2
2
К раствору C-15 (1,02 г; 1,08 ммоль) и 1H-тетразола (454 мг; 6,48 ммоль; 6 экв.) в безводном THF (46 мл) при комнатной температуре и в атмосфере аргона добавляли N,N-дибензилдиэтилфосфорамидит (85%, 1,50 мл; 4,97 ммоль; 4,6 экв.). После 30 мин при перемешивании реакционную смесь охлаждали до -20°C, затем добавляли раствор mCPBA (57-86%; 1,32 г; 7,67 ммоль; 7,4 экв.) в CHCl (30 мл). После 45 мин при -20°C раствор нагревали до 0°C и добавляли насыщенный раствор NaSO (25 мл), и смесь перемешивали в течение 10 мин. Раствор разводили эфиром, органическую фазу отделяли и промывали насыщенным NaSO (5x), затем насыщенным NaHCO (2x). Органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (CHCl/ацетон 4/1, затем 3/1) получали C-16 (1,38 г; 87%) в виде бесцветного масла.
3. (3S,9R)-3-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол-1,10-бис-дигидрофосфат (C-17) (= OM-294-DP (S,R))
Раствор соединения C-16 (2,7 г, 1,84 ммоль) в изопропаноле (150 мл) гидрогенизировали над 10% Pd на C (320 мг) при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 3 часов. Катализатор удаляли фильтрованием через миллипоровую мембрану. Фильтрат концентрировали и сушили в условиях высокого вакуума с получением C-17 (1,8 г; 98%) в виде аморфного твердого вещества.
ПРИМЕР 4
N-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-L-аспарагиновая кислота, α-N-{(4R)-5-гидрокси-4-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]пентил}амид-5-O-(6,7-дигидроксигептаноат) (=OM-197-MC-HD (S,R)) (схема 4)
1. N-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-L-аспарагиновая кислота, α-N-{(4R)-5-гидрокси-4-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]пентил}амид-β-бензиловый эфир, 5-O-(6,7-изопропилиденгептаноат) (C-18)
2
2
4
2
2
+
К раствору соединения N-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-L-аспарагиновой кислоты, α-N-{(4R)-5-гидрокси-4-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]пентил}амид-β-бензилового эфира (PCT WO 00146127A1) (1,14 г, 1,09 ммоль) и соединения 6,7-изопропилиденгептановой кислоты (C-12) (487 мг, 2,48 ммоль) в безводном CHCl (30 мл) при 0°C и в атмосфере аргона добавляли последовательно коммерчески доступные 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (485 мг, 2,53 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (43 мг, 0,35 ммоль). Реакционную смесь затем перемешивали в течение 30 минут при 0°C и затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную среду затем промывали водой и раствором 1 Н HCl с последующим разделением слоев. Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и выпаривали. Проведением очистки флэш-хроматографией на силикагеле (CHCl/ацетон, 9:1) получали продукт реакции сочетания C-18 (1,20 г; 76%) в виде белого твердого вещества. ES/MS: m/z 1255 [M+Na].
2. N-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-L-аспарагиновая кислота, α-N-{(4R)-5-гидрокси-4-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]пентил}амид-5-O-(6,7-дигидроксигептаноат) (C-19) (= OM-197-MC-HD (S,R))
2
2
+
+
Раствор соединения C-18 (1,20 г, 0,97 ммоль) в смеси CHCl/этанол 2/1 (50 мл), содержащей уксусную кислоту (5 мл), гидрогенизировали в присутствии Pd на углероде, содержащем 10% Pd, при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 12-36 часов. Катализатор удаляли фильтрованием. Фильтрат выпаривали до сухого состояния и осадок затем сушили отсасыванием вакуумным насосом с получением C-19 (1 г, количественный выход). ES/MS: m/z 1012 [M+H]; 1034 [M+Na].
ПРИМЕР 5
(5S,11R)-1-амино-5-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-6-оксо-7-аза-11-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]додекан-12-ол-12-дигидрофосфат (= OM-294-BA-MP (S,R)) (схема 5)
α
ε
1. N-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоил]-N-бензилоксикарбонил-L-лизин (C-20)
3
2
3
4
4
3
+
+
+
+
13
К раствору (R)-3-додеканоилокситетрадекановой кислоты P-109 [Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205-2214] (153 мг; 0,36 ммоль) в безводном THF (4 мл) при -15°C и в атмосфере аргона добавляли последовательно N-метилморфолин (40 мкл; 0,36 ммоль; 1 экв.) и изобутилхлорформиат (47 мкл; 0,36 ммоль; 1экв.). После 30 мин при перемешивании при -15°C добавляли раствор коммерчески доступного H-L-лизина(Z)-OH (100 мг; 0,36 ммоль; 1 экв.) в CHCN/HO (3,5/1 (4,5 мл), содержащей EtN (0,16 мл)). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 час при комнатной температуре. Органический растворитель затем выпаривали, и водный слой охлаждали до 0°C, подкисляли 10% водным раствором лимонной кислоты до pH=3 и экстрагировали посредством AcOEt (3x). Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и выпаривали. Проведением очистки флэш-хроматографией на силикагеле (элюент петролейный эфир/AcOEt 1/1, содержащий 0,25% уксусной кислоты) с последующим выпариванием толуола получали C-20 (172 мг; 70%) в виде белого кристаллического твердого вещества. MS: (IS+) m/z 690,0 [M+H], 707,0 [M+NH], 712,0 [M+Na], 727,5 [M+K]. C-ЯМР (62,89 МГц, CDCl), δ м.д.: 174,90, 173,73, 170,66, 156,98, 136,53, 128,57, 128,17, 128,05, 71,27, 66,79, 52,24, 41,32, 40,47, 34,59, 34,24, 31,99, 31,45, 29,72, 29,43, 29,25, 25,29, 25,07, 22,76, 22,27, 14,19.
2. (5S,11R)-1-бензилоксикарбониламино-5-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-6-оксо-7-аза-11-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]додекан-12-ол (C-21)
2
2
3
4
2
2
3
+
+
13
К раствору C-20 (150 мг; 0,22 ммоль) и (2R)-5-амино-2-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]пентан-1-ола WZ-10b (PCT WO 00146127A1) (95 мг; 0,22 ммоль; 1,0 экв.) в безводном CHCl (3 мл) при 0°C добавляли коммерчески доступный HOAt (1-гидрокси-7-азабензотриазол) (36 мг, 0,26 ммоль, 1,2 экв.) и коммерчески доступный N,N'-диизопропилкарбодиимид (41 мкл, 0,22 ммоль, 1,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°C и затем в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь последовательно промывали водой, 1 Н раствором HCl и насыщенным раствором NaHCO с последующим разделением слоев. Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и выпаривали. Проведением очистки флэш-хроматографией на силикагеле (элюент CHCl/ацетон 3/1) получали C-21 (165 мг; 68%) в виде белого кристаллического твердого вещества. MS: (IS+) m/z 1105,8 [M+H], 1128,0 [M+Na], C-ЯМР (62,89 МГц, CDCl), δ м.д.: 173,56, 172,20, 171,87, 170,23, 156,82, 138,32, 136,69, 128,53, 128,47, 128,09, 128,00, 127,91, 127,82, 76,77, 71,48, 71,15, 66,59, 64,77, 53,1, 51,39, 41,71, 41,63, 40,46, 39,45, 34,57, 34,51, 34,12, 31,97, 29,70, 29,51, 29,41, 29,25, 28,69, 25,38, 25,29, 25,19, 25,09, 22,74, 22,50, 14,18.
3. (5S,11R)-1-бензилоксикарбониламино-5-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-6-оксо-7-аза-11-[(R)-3-бензилокситетрадеканоиламино]додекан-12-ол-12-дибензилфосфат (C-22)
2
2
2
2
3
2
2
3
3
4
2
2
4
2
3
+
+
+
+
13
К раствору C-21 (150 мг; 0,14 ммоль) и 1H-тетразола (29 мг; 0,41 ммоль; 3 экв.) в безводном THF (8 мл) при комнатной температуре и в атмосфере аргона добавляли N,N-дибензилдиэтилфосфорамидит (85%, 110 мкл; 0,31 ммоль; 2,3 экв.). После 30 мин при перемешивании реакционную смесь охлаждали до -20°C, затем добавляли раствор mCPBA (57-86%; 87 г; 0,50 ммоль; 3,7 экв.) в CHCl (6 мл). После 45 мин при -20°C раствор нагревали до 0°C и добавляли насыщенный раствор NaSO (5 мл), смесь перемешивали в течение 10 мин. Раствор разводили эфиром, органическую фазу отделяли и промывали насыщенным NaSO (5x), затем насыщенным NaHCO (2x). Органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (CHCl/ацетон 4/1, затем 2/1) получали C-22 (149 мг; 81%) в виде аморфного твердого вещества. MS: (IS+) m/z 1366,0 [M+H], 1383,5 [M+NH], 1388,5 [M+Na], 1088,0 [M-(BnO)OPOH)+H], C-ЯМР (62,89 МГц, CDCl), δ м.д.: 173,51, 171,77, 171,27, 169,95, 156,67, 138,32, 136,69, 135,66 (d), 135,55 (d), 128,69, 128,51, 128,43, 128,03, 127,77, 127,69, 76,49, 71,28, 71,20, 69,66 (d), 69,58 (d), 68,72 (d), 66,51, 52,82, 48,62 (d), 41,76, 41,46, 40,46, 39,01, 34,54, 34,06, 31,96, 29,68, 29,49, 29,39, 29,22, 27,95, 25,29, 25,18, 25,05, 22,73, 22,45, 14,17.
4. (5S,11R)-1-амино-5-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-6-оксо-7-аза-11-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]додекан-12-ол-12-дигидроофосфат (C-23) (= OM-294-BA-MP (S,R))
2
2
+
+
Раствор соединения C-22 (130 мг, 0,095 ммоль) в смеси CHCl/этанол 3/1 (20 мл), содержащей уксусную кислоту (3 мл), гидрогенизировали в присутствии Pd на углероде, содержащем 10% Pd, при комнатной температуре и при атмосферном давлении водорода в течение 36 часов. Катализатор удаляли фильтрованием. Фильтрат выпаривали до сухого состояния и осадок затем сушили отсасыванием вакуумным насосом с получением C-23 (84 мг, 91%). MS: (IS+) m/z 962,0 [M+H], 984,0 [M+Na].
Биологическая активность соединений согласно изобретению
ПРИМЕР 6
Регуляторный эффект in vitro OM-197-MP-AC и OM-294-DP на индуцированные LPS воспалительные (IL-12 и TNF-α) и противовоспалительные (IL-10) цитокины на клетках DC мышей
Протокол
Клетки костного мозга выделяли и культивировали как описано ниже.
5
Бедренные и большеберцовые кости от двух самцов C57BL/7 в возрасте 6 недель (Charles River Laboratories, Франция) выделяли, очищали от мышц и сухожилий, и дезинфицировали 70% этанолом. Оба конца каждой кости отрезали, и костный мозг вымывали посредством HBSS (Gibco BRL) с использованием шприца с иглой 26 калибра. Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 5 мин при 500 g и промывали в HBSS. Клетки ресуспендировали из расчета 3×10 клеток/мл в RPMI-1640 (Gibco BRL) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma), 100 Ед/мл пенициллина (Sigma), 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma), 50 мкМ β-меркаптоэтанола (Sigma), 10% инактивированной нагреванием FCS (Sigma) и 15 нг/мл мышиного rGM-CSF (R&D).
2
Для получения дендритных клеток (DC) костномозгового (BM) происхождения BM-лейкоциты культивировали в 100-мм бактериологических чашках Петри (Falcon 1029) в течение 8 суток при 37°C в 5% CO. На 0 сутки 10 мл суспензии клеток высевали на чашку. На 3 сутки другие 10 мл свежеприготовленной среды добавляли к каждой чашке, и на 6 сутки 9 мл верхней части среды тщательно удаляли с каждой чашки и заменяли 10 мл свежей среды.
6
6
2
Неприкрепившиеся клетки из 8-суточных культур BM-клеток собирали, центрифугировали в течение 5 мин при 500 g и ресуспендировали из расчета 1,25×10 клеток/мл в обогащенной RPMI, содержащей 10 нг/мл GM-CSF. Клетки затем высевали в 24-луночные планшеты для культивирования тканей (1×10 клеток/лунка) и инкубировали в течение 1 час 30 мин при 37°C в 5% CO в отсутствии или присутствии OM-294-DP или OM-197-MP-AC (0,01-100 мкг/мл/200 мкл/лунка). Затем добавляли LPS (E. coli 026:B6, Sigma) из расчета 1 мкг/мл и далее планшеты инкубировали. После инкубации 20 час супернатанты собирали для анализа на цитокины.
Концентрации IL-12p70, IL-10 и TNF-α в супернатантах культур DC измеряли с помощью ELISA с использованием соответствующих пар Ab OptEIA от BD Pharmingen. Хемилюминесцентный субстрат для пероксидазы Supersignal ELISA Pico (BD Pharmingen) использовали для детекции с помощью люминометрии (многоканальный анализатор Wallac 1420 Victor-2). Анализы осуществляли согласно инструкциям производителя.
Результаты
a) Эффект OM-197-MP-AC и OM-294-DP на индуцированную с помощью LPS продукцию IL-12 и IL-10.
Результаты по индуцированной посредством LPS продукции IL-12 и IL-10 представлены на фиг.1.
b) Эффект OM-197-MP-AC и OM-294-DP на индуцированную посредством LPS продукцию TNF-α.
Результаты по индуцированной посредством LPS продукции TNF-α представлены на фиг.2.
Заключение
Вышеупомянутые результаты ясно показывают, что как OM-197-MP-AC, так и OM-294-DP снижают индуцированную посредством LPS продукцию воспалительных цитокинов (IL-12 и TNF-α), и, в разительном противоречии, повышают продукцию анти-воспалительного цитокина IL-10, позволяя предположить, что соединения по изобретению могут действовать в качестве терапевтических противовоспалительных средств.
ПРИМЕР 7
+
Непосредственные эффекты ряда из четырех триацилированных производных на T-клетки CD4 человека
Протокол
Ряд из четырех соединений по настоящему изобретению (OM-197-MP-AC, OM-197-MC-HD, OM-294-BA-MP, OM-197-MP-HD) непосредственно тестировали, как суммировано ниже:
+
Наивные T-клетки CD4 выделяли магнитным способом из крови здорового донора (лейкоцитарная пленка). Клетки стимулировали в присутствии или в отсутствии возрастающих доз триацильных производных (0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл) с использованием адсорбированного на планшете анти-CD3 (5 мкг/мл) и растворимого анти-CD28 (1 мкг/мл). Спустя 6 суток уровни цитокинов (IFN-γ и IL-13) тестировали в супернатантах культур с использованием ELISA.
Результаты
Результаты по продукции цитокинов представлены на фиг.3. Пролиферацию T-клеток также тестировали, но соединения по изобретению не оказывали на нее влияния.
Заключение
+
Продукция IL-13 (белые гистограммы) T-клетками CD4 понижалась в присутствии OM-197-MP-AC, OM-197-MC-HD, OM-294-BA-MP, OM-197-MP-HD, в то время как продукция IFN-γ (серые гистограммы) и пролиферация T-клеток оставались без изменений. Это означает сдвиг в сторону Th1-ответа в присутствии четырех триацилированных тестированных молекул.
ПРИМЕР 8
Эффект OM-197-MP-AC на модели астмы
Так как в предыдущем примере показано, что триацилированные тестированные молекулы снижали продукцию цитокина, вероятно, принимающего участие в патологии астмы (т.е. IL-13), авторы настоящего изобретения поставили здесь цель исследовать in vivo эффекты члена ряда (OM-197-MP-AC) в модуляции TH2-дифференцировки наивных T-хелперных клеток и последующем развитии аллергической астмы.
В настоящем исследовании авторы настоящего изобретения сначала изучали (часть a) эффект данного OM-197-MP-AC в ходе фазы сенсибилизации при развитии индуцированной посредством LACK аллергической астмы, и затем эффект молекулы тестировали терапевтически (часть b).
Часть a) «Профилактическое» лечение астмы
Протокол
Мыши и индукция аллергической астмы:
Самок мышей Balb/c ByJ в возрасте 6 недель приобретали в Centre d'Elevage Janvier (CERJ, Le Genest-St-lsle, Франция). Всех мышей подвергали на 0 и 7 сутки сенсибилизации путем 2 инъекций i.p. 10 мкг белка LACK, осажденного в 2 мг квасцов (PerBio Science France SAS, Brebieres, Франция).
Животных разделяли на группы, как указано далее:
- сенсибилизированные LACK и аллергизированные солевым раствором мыши (4 мыши);
- сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (8 мышей);
- обработанные OM-197-MP-AC, сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (8 мышей).
Мышей из третьей группы обрабатывали внутрибрюшинно OM-197-MP-AC из расчета 1 мг/кг (20 мкг на мышь). Мышей обрабатывали на -1, 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 и 11 сутки.
С 16 сутки по 21 сутки мышей групп B и C подвергали ежедневной 20 минутной аэрозольной аллергизации раствором LACK (0,15%), в то время как мыши из группы с солевым раствором получали в качестве контроля солевой раствор.
Гиперчувствительность дыхательных путей (AHR)
AHR измеряли у всех мышей на первые сутки после последней аллергизации антигеном посредством плетизмографии всего организма (Emka) в ответ на возрастающие концентрации (6-25 мг/мл) вдыхаемого метахолина (ацетилметилхолин, Sigma). AHR выражали в виде усовершенствованного показателя паузы (Penh, см. фиг.4), безразмерного параметра, полностью соответствующего вычисленной величине эластичности и сопротивления дыхательных путей, которая коррелирует с измерением сопротивления дыхательных путей, импеданса и внутриплеврального давления.
Реагенты
- Рекомбинантный белок LACK продуцировали в E. coli и очищали, как описано в Mougneau et al., 1995.
- OM-197-MP-AC, партия DL040906 в концентрации 0,98 мг/мл, получали от OM PHARMA.
- mAb анти-IgE EM-95 любезно предоставлены DNAX (Palo Alto, CA, США).
- Метахолин (ацетилметилхолин) приобретали у Sigma (Saint Quentin Fallavier, Франция).
- Наборы бус для CBA (Flex set) приобретали у BD Biosciences.
Титры антител:
У всех мышей забирали кровь путем сердечной пункции на первые сутки после последней обработки аэрозолем. Суммарный IgE количественно определяли с помощью ELISA с использованием крысиных mAb EM-95 анти-IgE в качестве адсорбированных антител и крысиных mAb анти-IgE, конъюгированных с биотином, в качестве вторичных антител, как описано (Julia et al., 2002).
Анализ клеток из бронхоальвеолярного смыва (BAL) (процентная доля эозинофилов)
У индивидуальных мышей забирали кровь и вставляли канюлю в трахею. Легкие промывали 3 раза 1 мл нагретого PBS. Клетки промывали PBS, ресуспендировали в 300 мкл и определяли их количество с использованием камеры Burker-Turk. Для дифференцированных определений количества клеток из BAL получали препараты цитоцентрифугированием и окрашивали по Wright/Giemsa. Соответствующие количества нейтрофилов, эозинофилов и других мононуклеарных клеток определяли исследованием с помощью микроскопа. Здесь представлена только процентная доля эозинофилов (фиг.5).
Анализ содержания цитокина в легких
Для исследования содержания цитокина в легких обработанных и необработанных животных получали белковые экстракты из легких сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей wt (группа «контроль»), сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей wt (группа «астма»), обработанных OM-197-MP-AC мышей wt (группа «OM-197»). Содержания IL-4, IL-5, IL-13 анализировали множественным анализом с использованием FACSArray.
Результаты
Измерение гиперчувствительности дыхательных путей (AHR):
Обработанных или необработанных сенсибилизированных LACK мышей (см. выше) затем подвергали аллергизации LACK в форме аэрозоля ежедневно в течение пяти последовательных суток. На первые сутки после последнего воздействия аэрозоля AHR измеряли плетизмографией всего организма в ответ на возрастающие концентрации метахолина в виде аэрозоля.
Как ожидалось, у сенсибилизированных LACK и аллергизированных солевым раствором мышей не развивалась AHR при воздействии метахолина, в то время как у необработанных сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей развивалась тяжелая AHR, что отражено в высоких величинах Penh (фиг.4). В резком контрасте с этим, у сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей, которых обрабатывали OM-197-MP-AC, не развивалась AHR.
Заключение
Гиперчувствительность дыхательных путей при воздействии на мышей антигеном в виде аэрозоля, измеренная в присутствии метахолина, оказалась пониженной до уровней контроля (солевой раствор) при обработке OM-197-MP-AC.
Характеристика процентной доли эозинофилов в бронхоальвеолярных смывах (BAL):
Результаты представлены на фиг.5.
Сенсибилизированные LACK мыши, которые получали солевой раствор в виде аэрозоля, не содержали эозинофилов в BAL, в то время как сенсибилизированные LACK мыши, которых подвергали аллергизации LACK в виде аэрозоля, содержали. Кроме того, обработанные OM-197-MP-AC мыши содержали в 3 раза меньше эозинофилов, чем необработанные контрольные мыши (фиг.5).
Заключение
Обработки OM-197-MP-AC значительно снижают количество эозинофилов в BAL.
Измерение иммуноглобулинов (Ig) в сыворотках:
Результаты для IgE представлены на фиг.6:
Титры суммарного IgE (фиг.6) значительно снижались, если мышей обрабатывали соединением OM-197-MP-AC.
Заключение
Таким образом, в сыворотках мышей, обработанных OM-197-MP-AC, содержалось в 2 раза меньше суммарного IgE по сравнению с сыворотками, необработанных сенсибилизированных аллергизированных мышей (т.е. «астматических животных»).
Измерение цитокинов в легких
Для дальнейшего исследования эффектов профилактической обработки OM-197-MP-AC на аллергическое воспаление дыхательных путей, белки экстрагировали из легких как обработанных, так и необработанных мышей WT, и цитокины, о которых известно, что они играют важную роль при астме (IL-4, IL-5 и IL-13), количественно определяли множественным анализом с использованием наборов бус для CBA и FACSarray. Данные нормировали на суммарное количество белков и выражали в виде пг цитокина на мг легочного белка.
В то время как количества IL-4, IL-13 и IL-5 находились ниже предела детекции в легких сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей (см. «контроль» на фиг.7), количества этих цитокинов значительно повышались при аллергизации LACK (см. «астма» на фиг.7). В отличие от этого, в легких сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей, которых обрабатывали OM-197-MP-AC, содержалось в 5 раз меньше IL-4 (p=0,0003,), в 5 раз меньше IL-5 (p=0,0003) и в 3,5 раза меньше IL-13 (p=0,003), чем у необработанных мышей (см. «OM-197» на фиг.7).
Кроме IL-4, IL-5 и IL-13 другие цитокины количественно определяли множественным анализом с использованием набора бус для CBA и FACSarray. Основные результаты представлены ниже. Также обнаружено, что количество IFN-γ повышается в легких сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей по сравнению с сенсибилизированными LACK и аллергизированными PBS мышами. В легких обработанных OM-197-MP-AC мышей содержалось в 2 раза меньше IFN-γ, чем у необработанных мышей. KC представляет собой функциональный гомологичный хемокин IL-8 или CXCL8 человека и связывается с CXCR2, который экспрессируется как на нейтрофилах, так и на эозинофилах. Действительно, KC может обеспечить мобилизацию гранулоцитов в воспаленных тканях. В то время как KC присутствовал в очень низком количестве в легких сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей, его количество сильно повышалось при аллергизации LACK в виде аэрозоля. Количество продуцируемого в легких KC наполовину снижалось при лечении OM-197-MP-AC.
Провоспалительный цитокин, IL-6, обнаружен в легких сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей, и незначительно повышался при воздействии LACK в виде аэрозоля. В легких обработанных OM-197-MP-AC мышей содержалось в 1,5 раза меньше IL-6, чем у необработанных мышей. Обнаружено, что хемокин MCP-1 экспрессируется в легких сенсибилизированных и аллергизированных PBS мышей, и его количество незначительно повышено при аллергизации. В легких мышей, которых обрабатывали OM-197-MP-AC, содержалось в 1,8 раза меньше MCP-1, чем у необработанных животных.
Количества TNF-α в легких обработанных и необработанных мышей различались незначительно.
IL-9 не детектировали ни в одном из образцов.
Взятые вместе, эти данные ясно указывают на то, что профилактическая обработка OM-197-MP-AC вызывает не только сильное снижение цитокинов TH2, которые играют существенную роль в вызывании аллергического воспаления дыхательных путей и AHR, но также снижение других цитокинов и хемокинов, которые принимают участие в воспалении легких и в мобилизации воспалительных эффекторных клеток, таких как эозинофилы.
Общее заключение к примеру 8a
В этом исследовании ясно показана защитная роль одной из молекул по изобретению, OM-197-MP-AC, в развитии аллергической астмы. Лечение OM-197-MP-AC, которое начали непосредственно перед фазой сенсибилизации, ингибировало развитие AHR и значительно снижало количество эозинофилов в BAL. Кроме того, количества суммарного IgE снижались в сыворотках мышей, которых обрабатывали OM-197-MP-AC.
Эти данные также говорят о том, что лечение OM-197-MP-AC преимущественно нарушает продукцию цитокинов, принимающих участие в развитии астмы, и секрецию других воспалительных цитокинов. Один из возможных механизмов может состоять в том, что OM-197-MP-AC может индуцировать специфический иммуносупрессивный ответ, который может контролировать развитие TH2 и последующее воспаление дыхательных путей.
Часть b) «Терапевтическое» лечение астмы
Протокол
Основные отличия по сравнению с предыдущей (частью a) протокола
- Мышей обрабатывали OM-197-MP-AC i.p. только на 15, 17 и 19 сутки (т.е., по меньшей мере, 1 неделю после второй сенсибилизации) в дозировке 1 мг/кг (20 мкг на мышь).
- Легочные цитокины, измеряемые множественным анализом с использованием FACSArray, представляли собой IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ и IL-10.
Результаты
Суммарное количество клеток и эозинофилов в BAL
Спустя двое суток после последнего воздействия аэрозоля, мышей забивали и клетки выделяли из BAL. Как ожидалось, у необработанных сенсибилизированных LACK мышей произошел значительный приток клеток в BAL при аллергизации посредством LACK (20-кратный избыток клеток по сравнению с аллергизированными PBS мышами) (фиг.8). Очень интересно то, что мобилизация клеток в BAL снижалась на 90% при терапевтических введениях OM-197-MP-AC (p < 0,01) (фигура 9), со снижением количества эозинофилов в 40-45 раз по сравнению с необработанными мышами.
Заключение
OM-197-MP-AC, вводимый терапевтически три раза, способен значительно снижать экстравазацию легочных клеток и количество эозинофилов в BAL.
Измерения легочных цитокинов
Так как количество эозинофилов в дыхательных путях значительно понижалось при терапевтическом лечении OM-197-MP-AC, авторы настоящего изобретения решили проанализировать содержание IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 и IFN-γ в легких (фиг.10). Действительно, при сравнении с легкими необработанных мышей, количества TH2-цитокинов (IL-4, IL-5 и IL-13) значительно понижались в легких обработанных мышей. Уровни IL-4 понижались на 90%, количества IL-13 на 85% и количества IL-5 на 70% при лечении OM-197-MP-AC (от p<0,00005 до 0,005).
Заключение
Очевидно, что OM-197-MP-AC при терапевтическом введении три раза, способен снижать уровень TH2-цитокинов. Это происходит не вследствие сдвига в сторону Th1-цитокинов, так как уровни IFN-γ оставались низкими (от 1,5 до 3 пг/мл) для всех мышей и понижались у обработанных мышей. Количества IL-10, который является как TH2-, так и иммуносупрессорным цитокином, оказались низкими, и незначительно повышались при лечении.
Измерение уровней IgE
Для того чтобы дополнительно охарактеризовать иммунный статус мышей после терапевтического лечения OM-197-MP-AC, авторы настоящего изобретения анализировали специфичный в отношении LACK IgE в сыворотках у обработанных мышей и у необработанных мышей с помощью ELISA. В то время как уровни специфичного в отношении LACK IgE повышались в 7 раз при воздействии LACK в виде аэрозоля, в сыворотках обработанных OM-197-MP-AC мышей содержалось в 2 раза меньше (p<0,05) специфичного в отношении LACK IgE по сравнению с необработанными аллергизированными LACK мышами.
Заключение
Очевидно, что OM-197-MP-AC при терапевтическом введении снижал уровни специфичного в отношении LACK IgE в сыворотке.
Общее заключение к примеру 8b
Авторы настоящего изобретения в данной работе показали, что продукт по изобретению, OM-197-MP-AC, при терапевтическом введении отчетливо снижает количество эозинофилов, а также уровень TH2-цитокинов, таких как IL-4, IL-5 и IL-13, и также уровень специфичного в отношении аллергена IgE.
Общее заключение к примеру 8
Очевидно, что OM-197-MP-AC оказался активным как профилактически, так и терапевтически in vivo в модели астмы, как следует из его эффектов на многие связанные с астмой показатели.
ПРИМЕР 9
Эффект OM-197-MP-AC при других способах введения в модели астмы на мышах
Представленные в примере 8 результаты говорят о том, что OM-197-MP-AC эффективен в профилактике аллергических ответов в модели астмы на мышах с использованием LACK при введении путем i.p. Таким образом, на этой модели исследовали другие способы введения, более совместимые с применением у человека (интраназальный, внутрижелудочный, подкожный).
Протокол
43 самки мышей BALB/c ByJ в возрасте 6 недель приобретали в Centre d'Elevage Janvier (CERJ, Le Genest-St-lsle, Франция). Всех мышей подвергали сенсибилизации на 1 и 8 сутки (Julia et al., 2002) путем 2 инъекций i.p. 10 мкг белка LACK, осажденного в 2 мг квасцов (PerBio Science France SAS, Brebieres, Франция).
OM-197-MP-AC вводили с 0 суток по 12 сутки, как описано ниже. Всех мышей подвергали аллергизации с 16 суток по 20 сутки или раствором LACK (0,15%), или PBS, как указано ниже.
Экспериментальные группы представляли собой следующее:
-Группа A: необработанные, сенсибилизированные LACK и аллергизированные PBS мыши (3 мыши);
-Группа B: необработанные, сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (7 мышей);
-Группа C: обработанные OM-197-MP-AC i.p., сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (5 мышей);
-Группа D: обработанные OM-197-MP-AC i.g., сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (7 мышей);
-Группа E: обработанные OM-197-MP-AC s.c., сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (7 мышей);
-Группа F: обработанные OM-197-MP-AC i.n., сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (7 мышей);
-Группа G: обработанные OM-197-MP-AC в виде аэрозоля, сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (7 мышей).
Мышей групп C, D, E и G обрабатывали на 0, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11 сутки, в то время как мышей группы F (интраназальный способ) обрабатывали только на 0, 4, 7 и 11 сутки.
Мышей групп C и E обрабатывали i.p. и s.c., соответственно, OM-197-MP-AC из расчета 1 мг/кг (20 мкг на мышь).
Мышей группы D обрабатывали внутрижелудочно OM-197-MP-AC из расчета 50 мг/кг (1 мг на мышь).
Мышей группы F обрабатывали i.n. 20 мкг OM-197-MP-AC в объеме 20 мкл (OM-197-MP-AC из расчета 2 мг/мл, 10 мкл/ноздря).
Мышей группы G обрабатывали аэрозолями раствора OM-197-MP-AC из расчета 0,2% (2 мг/мл) в течение 10 минут.
Реагенты
- Рекомбинантный белок LACK получали в E. coli и очищали, как описано (Mougneau et al., 1995).
- OM-197-MP-AC, партия № 050323, в концентрации 2,2 мг/мл, и партия № 050322, в концентрации 2,17 мг/мл, приобретали от OM PHARMA, и использовали для перорального и всех остальных способов введения, соответственно.
- Анти-IgE (R35-118), конъюгированный с биотином, приобретали от BD Biosciences (Le Pont de Claix, Франция). mAb анти-IgE EM-95 любезно предоставлены DNAX (Palo Alto, CA, США).
- Интраназальное лечение осуществляли после легкой анестезии мышей с использованием изофлурана (Aerrane, Baxter).
Титры антител
У всех мышей забирали кровь путем сердечной пункции на 2 сутки после последней обработки аэрозолем. Суммарный IgE количественно определяли с помощью ELISA с использованием крысиных mAb EM-95 анти-IgE в качестве адсорбированных антител и крысиных mAb анти-IgE, конъюгированных с биотином, в качестве вторичных антител, как описано в другом месте (Julia et al., 2002).
Анализ клеток из бронхоальвеолярного смыва (BAL)
У индивидуальных мышей забирали кровь и вставляли канюлю в трахею. Легкие промывали 3 раза 1 мл нагретого PBS. Клетки промывали PBS, ресуспендировали в 300 мкл и определяли их количество с использованием камеры Burker-Turk. Для дифференцированных определений количества клеток из BAL получали препараты цитоцентрифугированием и окрашивали по Wright/Giemsa.
Результаты
a) Соответствующие количества нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и других мононуклеарных клеток определяли микроскопическим исследованием, и они представлены на фиг.11 для каждого тестированного способа введения.
Как ранее сообщали авторы настоящего изобретения в примере 8, мыши, обработанные i.p. OM-197-MP-AC, обладали как пониженными процентными долями, так и пониженными количествами эозинофилов в BAL. Однако содержание клеток в BAL у мышей, обработанных s.c. и i.g. OM-197-MP-AC, не отличалось от содержания у необработанных мышей. В отличие от этого, как доли (не представлены), так и количества (фиг.11) эозинофилов понижались на половину в BAL у мышей, которые получали i.n. OM-197-MP-AC. Кроме того, мыши, обработанные OM-197-MP-AC в виде аэрозоля, проявляли ту же тенденцию, как и обработанные i.n. животные.
Заключение
По меньшей мере, OM-197-MP-AC оказался значительно эффективным как при введении i.p., так и при интраназальном введении для существенного снижения в данной модели количества эозинофилов в бронхоальвеолярных смывах у мышей, сенсибилизированных аллергеном.
b) Затем уровни IgE в плазме измеряли, как описано в разделе способы.
В согласии с ранее представленными данными авторов настоящего изобретения (пример 8) обнаружено, что мыши, которых обрабатывали i.p. OM-197-MP-AC, обладали пониженными количествами суммарного IgE (фиг.12). Кроме того, мыши, которые получали i.n. инъекции OM-197-MP-AC, также обладали пониженными титрами суммарного IgE в сыворотке. В отличие от этого, мыши, обработанные i.g., s.c. или аэрозолем, обладали сходными количествами суммарного IgE в сыворотке по сравнению с необработанными мышами.
Заключение
OM-197-MP-AC при способе введения или i.p. или интраназально значительно снижал суммарные уровни IgE в данной модели астмы.
ПРИМЕР 10
Повышение эффекта OM-197-MP-AC в виде композиции при пероральном способе введения в модели астмы на мышах

Результаты, представленные в примере 9, говорят о том, что OM-197-MP-AC является неэффективным в профилактике аллергических ответов в модели астмы на мышах с использованием LACK, если его вводить пероральным способом не в виде композиции. Таким образом, на данной модели провели анализ композиции с целью повышения активности OM-197-MP-AC при пероральном введении. Таким образом, в данном исследовании авторы настоящего изобретения изучили, способно ли триацилированное соединение OM-197-MP-AC OM PHARMA защищать мышей от аллергического воспаления дыхательных путей при введении в виде устойчивой к желудочно-кишечному содержимому композиции (OM-197-MP-AC с лутролом F127, также известным как полоксамер 407).
Протокол

Композицию OM-197-MP-AC/лутрол F127 получали смешиванием 12,875 мл раствора OM-197-MP-AC в концентрации 4,35 мг/мл и 5,6 мл лутрола F127 в концентрации 50 мг/мл. Вводимый объем составлял 330 мкл.
Реагенты и оборудование
- Солевой раствор использовали в качестве контрольного аэрозоля.
- Рекомбинантный белок LACK получали в E. coli и очищали на аффинной колонке Ni-NTA.
- Гидроксид алюминия (квасцы) приобретали от Pierce.
- Использовали центрифугу Cytospin 4 (Thermo-Shandon, Cheschire, Великобритания), предметные стекла приобретали от Thermo-Shandon, и красители по Wright and Giemsa от Sigma.
- Аэрозоли получали с использованием ультразвукового распылителя Ultramed (Medicalia, Forenze, Италия).
- Наборы бус с IL-4 для CBA приобретали от BD Biosciences.
- Проточный цитофлуориметр FACSarray приобретали от BD Biosciences.
Животные
Самок мышей BALB/c ByJ в возрасте 6 недель приобретали от Centre d'Elevage Janvier, Франция, и содержали в специфических условиях в отсутствии патогенов в помещении для содержания животных. Их кормили стандартной диетой, полученной от Safe (Augy, Франция).
Протокол
В этом эксперименте использовали 15 мышей BAL/c (включая мышей для контрольных групп A и B, представленных также в примерах 8 и 9).
A: необработанные, сенсибилизированные LACK и аллергизированные солевым раствором мыши (3 мыши);
B: необработанные, сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (6 мышей).
Профилактическое лечение
F: (перорально) обработанные OM-197-MP-AC, сенсибилизированные и аллергизированные LACK мыши (6 мышей).
Мышей группы F обрабатывали перорально на 0, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11 и 12 сутки из расчета 1 мг OM-197-MP-AC в виде композиции.
На 1 сутки и 8 сутки мышей сенсибилизировали i.p. при помощи LACK/квасцы. С 16 суток по 20 сутки во всех группах, за исключением группы A, мышей подвергали аллергизации аэрозолями раствора LACK (0,15%). Группа A вместо этого получала солевой раствор (NaCl 0,9%) в течение 40 минут.
На 22 сутки всех мышей забивали. Для всех животных собирали BAL и легкие без перибронхиальных лимфатических узлов.
Определяли количество клеток BAL, и содержание клеток анализировали после микроскопического исследования препаратов, полученных цитоцентрифугированием, после окрашивания по Wright/Giemsa. Кроме того, легкие в каждой группе собирали и замораживали в жидком азоте для дальнейшего анализа на содержание цитокинов. Для исследования содержания цитокинов белковые экстракты получали из легких сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей (группа A), сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей (группа B), и обработанных OM-197-MP-AC в виде композиции мышей wt (группа F). Количество IL-4 анализировали множественным анализом с использованием FACSArray.
Результаты
Соответствующие количества нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и других мононуклеарных клеток определяли микроскопическим исследованием, и они представлены на фиг.13.
В отличие от результатов, представленных в примере 8 (и на фигуре 11), где приведены количества клеток BAL мышей, которых обрабатывали i.g. OM-197-MP-AC (не в виде композиции), если OM-197-MP-AC содержится в композиции с лутролом, то количество нейтрофилов, эозинофилов (p<0,05), лимфоцитов и других мононуклеарных клеток понижается наполовину в BAL у мышей, которые получали OM-197-MP-AC в виде композиции (см. фиг.13).
Более того, анализировали количества IL-4 в легких обработанных и необработанных мышей. В то время как содержание в легких IL-4 оказалось от очень низкого до недетектируемого у аллергизированных PBS животных, количества IL-4 повышались в 20 раз у аллергизированных LACK необработанных контрольных мышей. При пероральном лечении OM-197-MP-AC в виде композиции (см. фиг.14) количества IL-4 в легких снижались на 75% (p<0,01).
Заключение
При вхождении в состав соответствующей композиции пероральное введение OM-197-MP-AC способно значительно снижать в данной модели количество эозинофилов в бронхоальвеолярных смывах мышей, сенсибилизированных антигеном. Это снижение коррелирует со снижением количества IL-4.
ПРИМЕР 11
Эффект OM-197-MP-AC на нетучных диабетических (NOD) мышах
До этого момента авторы настоящего изобретения приводили примеры эффективности in vivo OM-197-MP-AC только на модели астмы на мышах. В этом примере авторы настоящего изобретения приводят некоторые доказательства того, что OM-197-MP-AC также активен при другой воспалительной патологии - диабете.
Протокол
Авторы настоящего изобретения ранее сообщали, что OM-197-MP-AC и другие триацилированные молекулы снижают воспаление дыхательных путей у астматических животных.
В данном исследовании авторы настоящего изобретения исследовали, способен ли OM-197-MP-AC вызывать защиту в другой модели воспалительного заболевания мышей: модели диабета NOD (нетучные диабетические мыши).
Группу из 10 самок мышей NOD в возрасте 6 недель обрабатывали в течение 10 недель или 0,01, 0,1, или 1 мг/кг OM-197-MP-AC. Группу из 6 самок мышей NOD, которая получала 200 мкл PBS i.p. 3 раза в неделю, использовали в качестве контроля.
В данной серии экспериментов лечение продолжали до тех пор, пока мыши не достигли возраста 16 недель. Это является моментом времени, когда у контрольных животных начинает развиваться выраженный диабет.

Результаты в терминах частоты возникновения диабета сравнивали с результатами, полученными на контрольных животных. Диабет тестировали один раз в неделю глюкозурическим тестом с использованием тестовых полосок (Glukotest, Roche, Франция), два раза в неделю при выявлении диабета. Диабет подтверждали анализом на гликемию (>3 мг/мл) тестовыми полосками (Glucotrend).
2
Частоту возникновения диабета в разных экспериментальных группах наносили на график (см. фиг.15) с использованием способа Kaplan-Meier, т.е. непараметрического кумулятивного графика выживаемости. Статистическое сравнение между кривыми осуществляли с использованием логрангового (Mantel-Cox) критерия, который давал соответствующие величины χ. OM-197-MP-AC в дозировке 1 мг/кг оказался значительно активным (p=0,0321), и в дозировке 0,1 мг/кг соединение по изобретению обладало положительным трендом (p=0,0543).
В другом эксперименте с использованием дозировки OM-197-MP-AC 0,3 мг/кг, результаты, полученные на 27 неделе, показывают значимую величину p=0,0362. На 27 неделе у 82% животных обнаружили диабет в контрольной группе, и заболевание выявили только у 27% в обработанной OM-197-MP-AC группе (0,3 мг/кг).
ПРИМЕР 13
Токсикология: эндотоксичность LAL
Эндотоксичность сначала определяли для OM-197-MP-AC и для OM-294-DP с помощью хромогенного теста с лизатом амебоцитов Limulus (хромогенный - LAL Bio-Whittaker, набор № 50-65OU).
Протокол
Этот тест основан на активации липополисахаридом (LPS) или продуктами сравнимой структуры ферментативного каскада, который присутствует в LAL. Эту ферментативную активацию выявляют с помощью отщепления протеазой хромогена, связанного с пептидом. Ферментативную реакцию проводят при 37°C, и образование хромогена с течением времени измеряют при 405 нм. Регистрируют время, необходимое для достижения 0,2 единицы D.O., и эндотоксическую активность вычисляют по отношению к стандартному LPS (стандартная кривая). Результаты выражают в МЕ (эндотоксиновая единица) по отношению к стандартизованному препарату LPS из E. coli (1 МЕ соответствует 0,08 нг эквивалента LPS).
Результаты
В хромогенном анализе LAL как OM-197-MP-AC, так и OM-294-DP обладали очень слабой активностью в отношении Limulus, или активность отсутствовала.
Заключение
6
OM-197-MP-AC и OM-294-DP обладают очень слабой эндотоксичностью (по меньшей мере, в 10 раз меньше) по сравнению с LPS.
ПРИМЕР 14
Токсикология: пирогенность у кролика
В заключение OM-197-MP-AC и OM-294-DP тестировали на потенциальную пирогенность у кролика.
Протокол
По 3 белых кролика New Zealand на группу инъецировали i.v. или OM-197-MP-AC или OM-294-DP в разных дозах (согласно European Pharmacopoeia 2001, Method 2.6.8).
Продукты: OM-197-MP-AC из расчета 0,0009, 0,009, 0,09, 0,9 мг/кг, и OM-294-DP из расчета 0,001, 0,01, 0,1, и 1 мг/кг.
Животные: Регистрируемый показатель: повышение температуры.
Результаты: Оба соединения признаны непирогенными in vivo, так как порог пирогенности не был достигнут для OM-197-MP-AC при самой высокой тестированной дозе (0,9 мг/кг), и порог пирогенности для OM-294-DP оказался достигнут только между 0,01 и 0,1 мг/кг.
ССЫЛКИ
Byl, В., Libin, M., Bauer, J., Martin, O. R., De Wit, D., Davies, G,, Goldman, M., and Willems, F. (2003). OM197-MP-AC induces the maturation of human dendritic cells and promotes a primary Т cell response, Int Immunopharmacol 3, 417-425.
Julia, V., Hessel, E. M., Malherbe, L, Glaichenhaus, N., O'Garra, A., and Coffman, R. L. (2002). A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific Т cells long after antigen exposure. Immunity 16, 271-283.
Mougneau, E., Altare,  F., Wakil, A. E., Zheng, S., Copolla, Т., Wang, Z.-E., Waldmann, R., Locksley, R., and Glaichenhaus, N. (1995). Expression cloning of a Leishmania major protective Т cell antigen. Science 268, 563-566.
Veran, J., Mohty, M., Gaugler, В., Chiavaroli, C., and Olive, D. (2004). OM-197-MP-AC adjuvant properties: the in vitro maturation of normal and leukemic dendritic cells in a serum-free culture model. Immunobioiogy 209, 67-77.
ПОДПИСИ К ЧЕРТЕЖАМ
Фиг.1: Секреция IL-12 (левые панели) и IL-10 (правые панели) мышиными DC, стимулированная с помощью только LPS (1 мкг/мл), или сначала в течение 90 минут указанными концентрациями (в мкг/мл) OM-197-MP-AC (A) или 294-DP (B), и затем LPS (1 мкг/мл) в течение дополнительных 20 часов. Супернатанты собирали из культур DC и анализировали с помощью ELISA в присутствии IL-12 и IL-10.
Фиг.2: Секреция TNF-α мышиными DC, стимулированная с помощью только LPS (1 мкг/мл), или сначала в течение 90 минут указанными концентрациями (в мкг/мл) 294-DP (294) или OM-197-MP-AC (197), и затем LPS (1 мкг/мл) в течение дополнительных 20 часов. Супернатанты собирали из культур DC и анализировали с помощью ELISA в присутствии TNF-α.
+
Фиг.3: Эффект повышения доз для четырех тестированных соединений (OM-197-MP-AC, n=5; OM-197-MC-HD, n=5; OM-294-BA-MP, n=7; OM-197-MP-HD, n=3) на продукцию IFN-γ и IL-13 T-клетками CD4 человека после поликлональной активации. Результаты представлены в виде среднего значения (+p25/p75) для n независимых экспериментов и представляют собой процентную долю (%) пролиферации или продукции цитокинов обработанными клетками по сравнению с необработанными клетками (принятыми за 100%, смотри пунктирную линию). Статистический анализ осуществляли с использованием непараметрического непарного t-критерия Mann-Whitney (2-стороннего).
Фиг.4: AHR посредством плетизмографии всего организма (Emka) в ответ на возрастающие концентрации (6-25 мг/мл) вдыхаемого метахолина на первые сутки после последней аллергизации антигеном. Животных обрабатывали, как описано в разделе протоколы. Результаты (среднее значение «величины усовершенствованного показателя паузы» + SEM) представлены для аллергизированных солевым раствором животных (в качестве группы отрицательного контроля, n=4), необработанных аллергизированных LACK животных (в качестве группы положительного контроля, n=8), и обработанных OM-197-MP-AC аллергизированных LACK мышей (n=8).
Фиг.5: Процентная доля эозинофилов в бронхоальвеолярных смывах, анализированных микроскопическим исследованием препаратов, полученных цитоцентрифугированием, окрашенных по Wright/Giemsa. Исследованные группы являются такими же, как группы, использованные на фигуре 4. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.
Фиг.6: Всех мышей обрабатывали, как описано в разделе протоколы, и у них забирали кровь сердечной пункцией на первые сутки после последней обработки аэрозолем. Суммарный IgE количественно определяли с помощью ELISA с использованием крысиных mAb EM-95 анти-IgE в качестве адсорбированных антител и крысиных mAb анти-IgE, конъюгированных с биотином, в качестве вторых антител, как описано (Julia et al., 2002). Каждая точка соответствует отдельному животному. Исследованные группы являются такими же, как группы, использованные на фигурах 4 и 5.
Фиг.7: Белковые экстракты (400 мкл) получали из левого легкого сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей wt (контроль), сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей wt (астма), обработанных OM-197-MP-AC мышей wt (OM-197). Содержание IL-4, IL-5 и IL-13 анализировали множественным анализом с использованием FACSArray. Результаты представлены в пг/мл. Пунктирные линии указывают на протяжении графика на величины, полученные для необработанных астматических животных.
Фиг.8: Мышей терапевтически обрабатывали три раза, как описано в разделе способы, смывы получали у индивидуальных мышей, промываемых через канюлю, вставленную в трахею. Легкие промывали 3 раза 1 мл нагретого PBS. Клетки промывали PBS, ресуспендировали в 300 мкл и определяли их количество с использованием камеры Burker-Turk. Для дифференцированных определений количества клеток из BAL получали препараты цитоцентрифугированием и окрашивали по Wright/Giemsa. Тестированные группы представляли собой сенсибилизированных LACK и аллергизированных PBS мышей wt (контроль), сенсибилизированных и аллергизированных LACK мышей wt (астма) и обработанных OM-197-MP-AC мышей wt (OM-197). Суммарное количество клеток в BAL определяли микроскопическим исследованием препаратов, полученных цитоцентрифугированием, окрашенных по Wright/Giemsa. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.
Фиг.9: Процентная доля эозинофилов в BAL, анализированных микроскопическим исследованием препаратов, полученных цитоцентрифугированием, окрашенных по Wright/Giemsa. Мышей терапевтически обрабатывали три раза, как описано в разделе способы, клетки из BAL собирали, как описано на фигуре 8. (Терапевтические) исследованные группы являются такими же, как группы, использованные на фигуре 8. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.
Фиг.10: Для анализа содержания цитокинов в легких, легкие собирали, и левые легкие использовали для получения белковых экстрактов. Для каждого левого легкого получали 400 мкл. Цитокины измеряли множественным анализом с использованием FACSArray, и результаты представлены в пг/мл. (Терапевтические) исследованные группы являются такими же, как группы, использованные на фигурах 8 и 9. Пунктирные линии указывают на всем протяжении графиков на величины, полученные для необработанных астматических животных.
Фиг.11: Количество эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов в BAL из мышей. Клетки получали и промывали, как описано в разделе протоколы. Для дифференцированных определений количества клеток из BAL получали препараты цитоцентрифугированием и окрашивали по Wright/Giemsa. По меньшей мере, 400 клеток подсчитывали для каждого предметного стекла, и количества эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов определяли микроскопическим исследованием. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.
Фиг.12: Измерение аллерген-специфичного IgE в сыворотках мышей, у которых забирали кровь сердечной пункцией спустя двое суток после последней обработки аэрозолем, и получали сыворотки. LACK-специфичный IgE измеряли с помощью ELISA. Представлены результаты (нг/мл) для индивидуальных мышей, среднее значение для каждой группы представлено в виде столбика. * = P<0,05. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.
Фиг.13: Количество эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов в BAL из мышей. Клетки получали и промывали, как описано в разделе протоколы. Для дифференцированных определений количества клеток из BAL получали препараты цитоцентрифугированием и окрашивали по Wright/Giemsa. По меньшей мере, 400 клеток подсчитывали для каждого предметного стекла, и количества эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов и других клеток (макрофагов, дендритных клеток и пневмоцитов) определяли микроскопическим исследованием. 3 тестированные группы описаны в разделе протоколы примера 10. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.
Фиг.14: Для анализа содержания цитокинов в легких, легкие собирали и левые легкие использовали для получения белковых экстрактов. Для каждого левого легкого получали 400 мкл. IL-4 измеряли посредством FACSArray, и результаты представлены в пг/мл. 3 тестированные группы описаны в разделе протоколы примера 10. Пунктирная линия указывает на всем протяжении графика на величину, полученную для необработанных астматических животных.

2
Фиг.15: Частота возникновения диабета у мышей NOD. Мышей обрабатывали i.p. или PBS (6 животных), или 3 указанными дозами OM-197-MP-AC (3 группы из 10 животных). Диабет тестировали один раз в неделю глюкозурическим тестом (Glukotest), и два раза в неделю при выявлении диабета. Диабет подтверждали анализом на гликемию (>3 мг/мл) тестовыми полосками (Glucotrend). Частоту возникновения диабета в разных экспериментальных группах наносили на график (смотри фигуру 15) с использованием способа Kaplan-Meier, т.е. непараметрического кумулятивного графика выживаемости. Статистическое сравнение между кривыми осуществляли с использованием логрангового (Mantel-Cox) критерия, который давал соответствующие величины χ: OM-197-MP-AC 1 мг/кг p=0,321; 0,1 мг/кг = 0,0543.