СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ НЕРВА С ПОМОЩЬЮ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОГО МАТРИКСА И ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ
METHOD FOR STIMULATING NEUROTISATION USING NANOSTRUCTURED MATRIX AND GENETIC CONSTRUCTS

Изобретение относится к медицине, преимущественная область его применения - нейрохирургия и травматология, лечение протяженных разрывов периферического нерва.
В ходе реконструктивных хирургических операций по преодолению протяженных разрывов нерва применяют аутонервную вставку, которая предполагает восполнение дефекта фрагментом другого, функционально менее значимого нерва. Чтобы сохранить нерв-донор и не выключать его функцию в качестве альтернативы аутонервной вставке активно разрабатывают кондуиты нерва, тубулированные структуры, которые направляют и поддерживают рост регенерирующих нервных волокон.
Кондуит нерва состоит из стенки и содержимого. Из материалов для стенки кондуита наиболее перспективными считаются биорастворимые полимеры, которые обеспечивают рассасывание кондуита после успешной регенерации нерва и, в отличие от кондуитов на основе бионерастворимых материалов, не требуют проведения повторной операции для удаления кондуита. Стенка кондуита должна иметь адекватные механические свойства (прочность, эластичность), обеспечивать оптимальные сроки биорастворения и характеризоваться высокой проницаемостью для молекул из микроокружения, поддерживающих нейрорегенерацию. Этим требованиям в достаточной мере отвечает стенка кондуита, состоящая из наноструктурированного методом электроспиннинга биорастворимого полимера поли(ε-капролактона).
4
2
Содержимое кондуита - это трехмерный матрикс, заполняющий потенциальное пространство роста нервных волокон и имитирующий структуру внеклеточного матрикса биологической ткани. По аналогии с внеклеточным матриксом содержимое кондуита должно иметь гидрогелевую природу. Главное требование к гидрогелевому содержимому кондуита - поддержание выживания, миграции и пролиферации шванновских и эндотелиальных клеток, что необходимо для неоваскуляризации и регенерации нервных волокон. По критериям поддержания выживания клеток in vitro и регенерации in vivo самособирающийся наноструктурированный гидрогель на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™) является одним из наиболее приемлемых для кондуита нерва.
Повышение эффективности нейрорегенерации при пластике нервов с помощью кондуитов связывают с возможностью одновременного привлечения генной и клеточной терапии. Прямая генная терапия (генная терапия in vivo) предполагает инъекцию ДНК-содержащих векторов в область повреждения нервной ткани. Такой способ исключает возможность злокачественной трансформации трансплантируемых клеток, также исследуемых для целей доставки терапевтических генов. Из последних для стимулирования нейрорегенерации наиболее изучены гены нейротрофических факторов. Перспективными стимуляторами регенерации нерва представляются сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2). Данные факторы являются одновременно и нейротрофическими, и ангиогенными. Как нейротрофические они поддерживают выживание нейронов и стимулируют рост аксонов, а как ангиогенные стимулируют образование и рост новых кровеносных сосудов, что также способствует нейрорегенерации. Для доставки в клетки-мишени терапевтических генов применяют вирусные и невирусные векторы. Невирусные векторы, в частности плазмиды, несмотря на более низкую трансфекционную активность, считаются более безопасными.
Известна плазмида pBud-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующая оба гена VEGF и FGF2 (заявка на изобретение РФ №2009133970 МПК C12Q 1/00 опубл. 20.03.2011). Эффекты локальной доставки данной плазмиды в область травматического повреждения спинного мозга, изученные нами ранее, показали выраженное стимулирующее влияние на нейрорегенерацию (Патент РФ №2459630, МПК A61K 48/00 A61P 25/28 C12N 15/79 опубл. 27.08.2012 Бюл. №24). Эти данные позволяют рассматривать плазмиду pBud-VEGF-FGF2 как эффективный инструмент для стимулирования посттравматической регенерации нерва.
Из синтетических полимерных материалов для создания стенки кондуита нерва наиболее перспективными считаются биорастворимые полиэфиры, такие как полигликолид, полилактид и поли(ε-капролактон). С этой целью применяют их сополимеры, а также в виде различных смесей с веществами, придающими нужные физико-химические свойства, адекватные требованиям к имплантируемым материалам с целью реконструкции поврежденного нерва. Такой материал получают различными методами: погружение-обволакивание (dip-coating), иммерсионное осаждение, инъекционный молдинг, экструзия, плетение и электроспиннинг. Исследования в этом направлении позволили получить большое количество кондуитов, которые различаются по методу получения, химической структуре и физическим свойствам. Количество этих образцов настолько велико, что оно не могло быть проанализировано в обозримые сроки на предмет сравнения после имплантации в организм экспериментального животного по критерию наибольшей эффективности регенерации нерва. Этот анализ осложняется также и тем, что уже осуществленные в этом направлении работы по имплантации синтетических кондуитов нерва различаются по экспериментальным моделям (разные нервы), длине диастаза (промежутку между проксимальным и дистальным отрезком нерва), срокам наблюдения, способам оценки эффективности регенерации и др.
Высокая проницаемость материала является критическим условием для создания стенки кондуита нерва. Этому условию в наибольшей мере отвечает материал, полученный методом электроспиннинга и состоящий из микро- и нановолокон. В ряде работ методом электроспиннинга осуществлено наноструктурирование поли(ε-капролактона), используемого в качестве полимера или сополимера для создания кондуитов нерва (Chew, S.Y., R. Mi, et al. "Aligned Protein-Polymer Composite Fibers Enhance Nerve Regeneration: A Potential Tissue-Engineering Platform." Adv Funct Mater 17(8). - 2007. - P.1288-1296) (Panseri, S., C. Cunha, et al. "Electrospun micro- and nanofiber tubes for functional nervous regeneration in sciatic nerve transections." BMC Biotechnol 8. - 2008. - P.39.) (Yu, W., W. Zhao, et al. "Sciatic nerve regeneration in rats by a promising electrospun collagen/poly(epsilon-caprolactone) nerve conduit with tailored degradation rate." BMC Neurosci 12. - 2011 - P.68). Полученный методом электроспиннинга из поли(ε-капролактона) материал, кроме высокой проницаемости, обладает и другими позитивными свойствами, такими как оптимальная для проведения имплантаций эластичность и наилучшее соотношение площади поверхности к объему.
Метод предполагает приготовление исходного раствора поли(ε-капролактона) (80 кДа) в дихлорметане, гексафлюоропропаноле или смеси хлороформ/метанол (3/1) в концентрации 5-15%; помещение раствора в шприц с подающей иглой, расстояние между коллектором и концом иглы 5-32 см; скорость подачи полимера 0,05-0,1 мл/мин, напряжение, формирующее поле 8-34 кВ, скорость вращения оси коллектора 500-600 об/мин.
4
2
Потенциальное пространство роста нервных волокон внутри кондуита должно быть заполнено гидрогелевым матриксом. Процедура формирования биосовместимого гидрогеля должна быть простой и стандартной для формирования воспроизводимой структуры, имитирующей матрикс ткани. Этим условиям в наибольшей мере удовлетворяет амфифильный матрикс из самособирающихся пептидных наноструктур (нановолокна и нанопленки) на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™) (Ortinau, S., J. Schmich, et al. "Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells." Biomed Eng Online 9(1). - 2010. - P.70), разрешенного для применения в клинике. Этот матрикс поддерживает выживание и дифференцировку клеток различных типов, включая нейральные клетки (Lampe, К.J. and S.С. Heilshorn. "Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials." Neurosci Lett 519(2). - 2012. - P.138-146). PuraMatrix™ лучше других гидрогелей поддерживает дифференцировку стволовых нейральных клеток человека (Thonhoff, J.R., D.I. Lou, et al. "Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro." Brain Res 1187. - 2008. - P.42-51). Применение гидрогеля на основе аминокислот, выполняющего функцию внеклеточного матрикса, в естественных условиях создает трехмерную структуру для миграции клеток, стимулирует рост нервных клеток и кровеносных сосудов в трансплантате (McGrath, A.M., L.N. Novikova, et al. "BD PuraMatrix peptide hydrogel seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration." Brain Res Bull 83(5). - 2010. - P.207-213).
Известен способ стимулирования регенерации нерва путем прямого введения в область повреждения терапевтических генов (трансгенов) нейротрофических факторов. Их доставка в область повреждения считается одним из наиболее перспективных подходов к стимулированию нейрорегенерации (Zhang, F. and W.С. Lineaweaver. "Gene transfer with DNA strand technique and peripheral nerve injuries." J Long Term Eff Med Implants 12(2). - 2002. - P.85-96; Mason, M.R., M.R. Tannemaat, et al. "Gene therapy for the peripheral nervous system: a strategy to repair the injured nerve?" Curr Gene Ther 11(2). - 2011. - P.75-89). Выполнены работы по стимулированию посттравматической регенерации нерва методом прямой генной терапии (Fu, С., G. Hong, et al. "Favorable effect of local VEGF gene injection on axonal regeneration in the rat sciatic nerve." J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 27(2). - 2007. - P.186-189; Alrashdan, M.S., M.A. Sung, et al. "Effects of combining electrical stimulation with BDNF gene transfer on the regeneration of crushed rat sciatic nerve." Acta Neurochir (Wien) 153(10). - 2011. - P.2021-2029; Esaki, S., J. Kitoh, et al. "Hepatocyte growth factor incorporated into herpes simplex virus vector accelerates facial nerve regeneration after crush injury." Gene Ther 18(11). - 2011. - P.1063-1069). В основном они реализованы с применением вирусных векторов, что не считается полностью безопасным из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного и иммунного ответов и токсичности.
На модели преодоления разрыва нерва при помощи биосовместимого (но не биорастворимого, как в заявляемом изобретении) силиконового кондуита установлено, что прямая однократная инъекция в область повреждения двухкассетной плазмиды pBud-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующей клонированные гены сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf) и фактора роста фибробластов 2 (fgf2) человека, приводит к улучшению функциональных показателей регенерации, что соответствует увеличению количества регенерирующих миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва (Николаев, С.И., А.Р. Галлямов, и др., "Регенерация седалищного нерва крысы в условиях локальной доставки генов vegf и fgf2." Морфологические ведомости (2). - 2012 - P.45-50).
По компоненту «стенка кондуита» наиболее близким к заявляемому техническим решением является способ (Panseri, S., С. Cunha, et al. "Electrospun micro- and nanofiber tubes for functional nervous regeneration in sciatic nerve transections." BMC Biotechnol 8. - 2008. - P.39.). В этой работе методом электроспиннинга получена стенка кондуита, состоящая из 2 слоев: внутренний - поли(ε-капролактон) (15%) и наружный - смесь поли(ε-капролактона) (5,5%) и полилактид-ко-гликолида (4%). В качестве содержимого кондуита был использован физраствор.
По компоненту «содержимое кондуита» в качестве аналога заявитель предлагает рассмотреть способ (McGrath, А.М., L.N. Novikova, et al. "BD PuraMatrix peptide hydrogel seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration." Brain Res Bull 83(5). - 2010. - P.207-213). В этой работе разрыв нерва преодолевали при помощи кондуита, содержащего PuraMatrix™. По критериям удлинения регенерирующих аксонов, количеству выживающих мотонейронов и весу икроножной мышцы этот подход оказался более эффективным по сравнению с применением в аналогичных условиях гидрогеля на основе альгината-фибронектина.
По компоненту «локальная прямая доставка терапевтических генов» наиболее близким техническим решением, является способ (Масгутов Р.Ф., И.И. Салафутдинов, и др., "Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов." Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 6(3). - 2010. - P.67-70). В этой работе на модели преодоления разрыва седалищного нерва крысы при помощи аутонервной вставки показано, что прямое введение плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в проксимальный и дистальный отрезки нерва, а также непосредственно в аутонервную вставку, стимулирует реваскуляризацию и регенерацию нерва.
Способ изготовления тубулированного кондуита (Panseri, S., С. Cunha, et al. "Electrospun micro- and nanofiber tubes for functional nervous regeneration in sciatic nerve transections." BMC Biotechnol 8. - 2008. - P.39.) имеет следующие недостатки:
- механические свойства кондуита, несмотря на сходную с нашим случаем толщину образующих его волокон, были недостаточно адекватными, что в 40% образцов приводило к их спаданию и резко уменьшало величину просвета, а следовательно уменьшало объем потенциального пространства для роста регенерирующих нервных волокон;
- наличие в кондуите двух слоев и значительная общая толщина его стенки (в среднем 150 мкм предполагает более выраженные ограничения для транспорта метаболитов;
- на той же экспериментальной модели не проведено сравнение эффективности имплантации в разрыв нерва разработанного этими авторами кондуита с кондуитами из других материалов или из того же поли(ε-капролактона), но при других условиях проведения электроспиннинга.
Способ преодоления разрыва нерва при помощи кондуита, предлагаемый в работе (McGrath, A.M., L.N. Novikova, et al. "BD PuraMatrix peptide hydrogel seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration." Brain Res Bull 83(5). - 2010. - P.207-213), имеет следующие недостатки:
- стенка кондуита состояла из ультрафильтрационной мембраны на основе целлюлозы, которая ограничивала проницаемость многих молекул стимуляторов регенерации из микроокружения внутрь кондуита с массой более 10 кД, что особенно критично для пептидных молекул нейротрофических факторов, молекулярная масса которых превышает этот порог в среднем в 2-3 раза;
- применяемый кондуит представлен не сплошной трубкой, а был сформирован из прямоугольной мембраны и имел продольный шов, что существенно усложняет процесс изготовления кондуита, а главное - значительно ухудшает его механические свойства, показатели которых для целлюлозы и без того являются менее удовлетворительными, чем для других синтетических полимеров, таких как полиэфиры, поли(ε-капролактона) и др.;
- в работе не применены функциональные тесты, эффективность способа по восстановлению функции нерва остается неясной.
4
2
- не установлено насколько эффективен для нейрорегенерации кондуит, сочетающий в своем составе биосовместимый и биорастворимый материал на основе синтетического полимера поли(ε-капролактона) и амфифильный гидрогелевый матрикс из самособирающихся пептидных наноструктур (нановолокна и нанопленки) на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™);
- не получены данные об эффективности локальной доставки плазмидного вектора с терапевтическими генами в условиях преодоления разрыва нерва при помощи наноструктурированного кондуита, в частности, состоящего из поли(ε-капролактона) и PuraMatrix™;
- в условиях имплантации кондуитов на основе синтетических биосовместимых и биорастворимых материалов отсутствуют сведения об одновременном действии двух терапевтических генов, доставляемых в область повреждения.
Недостатки способа преодоления разрыва нерва в исследовании (Масгутов Р.Ф., И.И. Салафутдинов, и др., "Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов." Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 6(3). - 2010. - P.67-70) - это все недостатки применения аутонервной вставки: выключение функции нерва-донора, образование болезненных невром и другие технические сложности, связанные со своевременной доступностью трансплантируемого материала, соответствием его размеров зоне имплантации и пр.
4
2
Задачей заявляемого способа является стимулирование регенерации нерва путем имплантации кондуита, стенка которого представлена материалом из неупорядоченно ориентированных микро- и нановолокон биорастворимого полимера поли(ε-капролактона), а содержимое образовано самособирающимся наноструктурированным гидрогелевым матриксом на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™), в комплексе с прямой локальной доставкой генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2), что позволит преодолеть вышеупомянутые недостатки аналогов изобретения и обеспечить достижение нового технического результата.
Исследования по прямому влиянию на нейрорегенерацию биорастворимого кондуита с высокой проницаемостью наноструктурированной стенки и адекватными механическими свойствами, заполненного амфифильным гидрогелевым матриксом из самособирающихся пептидных наноструктур, в комплексе с локальной доставкой в область повреждения терапевтических генов стимуляторов регенерации в доступных заявителю источниках информации не выявлены.
4
2
Поставленная задача решается способом стимулирования регенерации нерва путем имплантации кондуита, стенка которого изготовлена методом электроспиннинга и представлена материалом из неупорядоченно ориентированных микро- и нановолокон биорастворимого полимера поли(ε-капролактона), а содержимое образовано самособирающимся наноструктурированным гидрогелем на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™), в комплексе с прямой локальной доставкой генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).
При этом стенка кондуита изготовлена методом электроспиннинга из биорастворимого полимера поли(ε-капролактона), исходная концентрация которого составляет 6%, а плазмидный вектор с двумя генами нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в терапевтически эффективной дозе вводят в ходе операции в стерильных условиях однократно в проксимальный и дистальный отрезки нерва вслед за имплантацией кондуита в разрыв поврежденного нерва.
4
2
Заявляемый способ выполняют по известной последовательности этапов: производят имплантацию кондуита в разрыв нерва, стенка кондуита представлена материалом из неупорядоченно ориентированных микро- и нановолокон биорастворимого полимера поли(ε-капролактона) в концентрации 6%, а содержимое представлено самособирающимся наноструктурированным гидрогелем на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™), в комплексе с прямой локальной доставкой генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2), которые вводят в проксимальный и дистальный отрезки нерва, а сформированный кондуит имплантируют в разрыв нерва и фиксируют его концы эпиневральными швами.
4
2
Причем после получения кондуита стенки табулированного кондуита подвергают вакуумной дегазации в течение 10 мин с последующей ее стерилизацией путем длительного промывания в большом объеме стерильной дистиллированной воды, самособирающийся наноструктурированный гидрогелевый матрикс на основе олигопептида ацетил-(Arg-Ala-Asp-Ala)-CONH (PuraMatrix™) формируют в стерильных условиях, а гены нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) по 15 мкг ДНК в объеме 7,5 мкл фосфатно-солевого буфера вводят в ходе операции в стерильных условиях однократно в проксимальный и дистальный отрезки нерва вблизи линии швов.
Заявляемый способ стимулирования регенерации нерва с использованием нового кондуита в сочетании с генной терапией был изучен на лабораторных крысах и детально описан в следующих примерах:
Образцы полимерных трубок для изготовления кондуита были получены методом электроспиннинга (Chew, S.Y., R. Mi, et al. "Aligned Protein-Polymer Composite Fibers Enhance Nerve Regeneration: A Potential Tissue-Engineering Platform." Adv Funct Mater 17(8). - 2007. - P.1288-1296; Panseri, S., C. Cunha, et al. "Electrospun micro- and nanofiber tubes for functional nervous regeneration in sciatic nerve transections." BMC Biotechnol 8. - 2008. - P.39; Yu, W., W. Zhao, et al. "Sciatic nerve regeneration in rats by a promising electrospun collagen/poly(epsilon-caprolactone) nerve conduit with tailored degradation rate." BMC Neurosci 12. - 2011 - P.68). В качестве полимера выбран биосовместимый и биорастворимый полимер поли(ε-капролактон) 80 кДа (Sigma) в исходной концентрации 2,3% и 6% (w/w) в смеси хлороформ/метанол = 3/1 (v/v) (Panseri, S., C. Cunha, et al. "Electrospun micro- and nanofiber tubes for functional nervous regeneration in sciatic nerve transections." BMC Biotechnol 8. - 2008. - P.39). Исходный объем раствора полимера 10 мл. Толщина подающей иглы 1,3 мм. Расстояние между коллектором в виде вращающейся оси и концом иглы 20 см. Скорость подачи полимера 0,2 мл/мин. Напряжение, формирующее поле, 24 кВ. Электроспиннинг проводили при комнатной температуре. Исследование структуры стенки полимерной трубки осуществляли методом электронной сканирующей микроскопии (Philips XL30ESEM) и оптической световой микроскопии (Axioscop Imager A1, Carl Zeiss).
Перед заполнением трубок гидрогелевой массой их выдерживали в вакууме в течение 10 мин для удаления следов растворителей полимера с последующей стерилизацией путем выдерживания и промывания в большом объеме стерильной деионизованной воды в течение 30 мин (Heydarkhan-Hagvall, S., K. Schenke-Layland, et al. "Three-dimensional electrospun ECM-based hybrid scaffolds for cardiovascular tissue engineering." Biomaterials 29(19). - 2008. - P.2907-2914) (Kim, Y.Т., V.K. Haftel, et al. "The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps." Biomaterials 29(21). - 2008. - P.3117-3127).
Непосредственно перед операцией на нерве с имплантацией кондуита ex tempore в стерильных условиях формировали 0,5% гидрогель PuraMatrix™ (BD Biosciences) в соответствии с рекомендацией производителя. Созданные предварительно методом электроспиннинга образцы полимерной трубки из поли(ε-капролактона) заполняли сформированным гидрогелем. Созданный кондуит имплантировали в разрыв нерва и фиксировали его концы эпиневральными швами. В проксимальный и дистальный отрезки нерва вблизи линии швов вводили плазмиду pBud-VEGF-FGF2 с двумя генами нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) по 15 мкг ДНК в объеме 7,5 мкл фосфатно-солевого буфера.
Эксперименты проведены на белых беспородных крысах-самцах весом 150-200 г в соответствии с требованиями локального этического комитета при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет». Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18-20°С со свободным доступом к воде и пище.
Хирургические манипуляции проводили под уретановым наркозом (600 мг/кг, внутрибрюшинно). У наркотизированного животного в левом седалищном нерве на уровне середины бедра иссекали фрагмент нерва и формировали разрыв между проксимальным и дистальным отрезками длиной 5 мм. Созданные кондуиты с внутренним диаметром 2,2 мм имплантировали в разрыв нерва, концы которого фиксировали при помощи четырех эпиневральных швов мононитью 8.0 с атравматической иглой. Установлено, что кондуиты на основе 6% поли(ε-капролактона), по сравнению с кондуитами на основе 2,3% полимера, характеризуются более приемлемыми механическими свойствами и наиболее эффективно поддерживают нейрорегенерацию. Поэтому в экспериментах с доставкой генов были использованы кондуиты на основе 6% поли(ε-капролактона).
Прооперированных животных разделили на три группы (опытная группа, контрольная группа 1 и контрольная группа 2). Дополнительно прооперированы животные с преодолением разрыва при помощи кондуита из биосовместимого силикона, содержащего гидрогель на основе PuraMatrix™ (контрольная группа 3).
1) Животным опытной группы (12 крыс) тотчас после имплантации кондуита в проксимальный и дистальный отрезки нерва на расстоянии 2 мм от линии шва с помощью шприца Hamilton (Sigma) инъецировали двухкассетную плазмиду pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующую гены сосудистого эндотелиального фактора роста (yegf) и фактора роста фибробластов 2 (fgf2) в количестве 15 мкг на фосфатно-солевом буфере в объеме 7,5 мкл (30 мкг каждому животному). Выбор дозы плазмиды основан на экстраполяции из протоколов аналогичных экспериментов по стимулированию нейрорегенерации (Масгутов Р.Ф., И.И. Салафутдинов, и др., "Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов." Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 6(3). - 2011. - P.67-70).
2) Животным первой контрольной группы (10 крыс) в тех же условиях и в том же количестве инъецировали плазмиду pEGFP-N2 (Clontech), содержащей ген улучшенного зеленого флуоресцентного белка (egfp).
3) Животным второй контрольной группы (4 крысы) в тех же условиях и в том же объеме инъецировали физраствор.
4) У животных третьей контрольной группы (4 крысы) разрыв нерва той же протяженности преодолевали при помощи трубки из биосовместимого силикона (A-M Systems), заполненной приготовленным в аналогичных условиях гидрогелем на основе PuraMatrix™.
Об эффективности регенерации судили по функциональным тестам: тест восстановления двигательной функции задних конечностей (функциональный индекс седалищного нерва) (Bain, J.R., S.Е. Mackinnon, et al. "Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat." Plast Reconstr Surg 83(1). - 1989. - P.129-138; Inserra, M.M., D.A. Bloch, et al. "Functional indices for sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the mouse." Microsurgery 18(2). - 1998. - P.119-124) и тест восстановления чувствительности кожи конечности (pinch-тест) (Bajrovic, F., M. Bresjanac, et al. "Long-term effects of deprivation of cell support in the distal stump on peripheral nerve regeneration." J Neurosci Res 39(1). - 1994. - P.23-30). Функциональные тесты проводили на 7, 10, 13, 15, 18, 21, 24, 27 и 30 сутки после операции. Для оценки посттравматического восстановления на 30 сутки после операции производили забор материала. Для этого под уретановым наркозом (600 мг/кг) после ламинэктомии выделяли спинальные ганглии L5 на стороне операции, фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заключали в парафин по стандартной методике. Одновременно забирали 5 мм фрагмент периферического отрезка нерва дистальнее места травмы, фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида и 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон. Полутонкие срезы седалищного нерва, окрашенные толуидиновым синим, использовали для подсчета количества регенерирующих миелиновых волокон. Срезы из дистального фрагмента периферического отрезка нерва изготавливали на криостате CRYO-STAR HM 560 и проводили пероксидазную иммуногистохимическую реакцию с моноклональными антителами против белка S100 (Millipore). Подсчет количества миелиновых волокон и S100-иммунопозитивных клеток производили на оцифрованных изображениях, полученных на микроскопе Leica DM 1000. Достоверность различий между группами оценивали методом Стьюдента.
1. Тестирование двигательной функции при помощи оценки функционального индекса седалищного нерва.
Наибольшие значения функционального индекса седалищного нерва на всех сроках наблюдений зарегистрированы у животных опытной группы с пластикой нерва при помощи кондуита, стенка которого изготовлена методом электроспиннинга из поли(ε-капролактона), содержащего гидрогелевую среду PuraMatrix™, с инъекцией плазмиды pBud-VEGF-FGF2 с терапевтическими генами.
Показатель восстановления двигательной функции нерва в опытной группе динамично возрастает, особенно в интервале 13-18 сутки после операции, и к 30 суткам превышает показатель теста в контрольной группе 1 (введение плазмиды с геном зеленого флуоресцентного белка pEGFP-N2 вместо плазмиды с терапевтическими генами) на 28,5% (Р<0,05). По этому показателю достоверных различий между опытной группой и контрольной группой 2 (введение физраствора вместо плазмиды с терапевтическими генами) зарегистрировано не было.
По критерию усредненного по всем срокам наблюдений в течение всего 30 суточного послеоперационного периода показателя функционального индекса седалищного нерва в опытной группе зарегистрировано улучшение двигательной функции на 24,1% (Р<0,05) по сравнению с контрольной группой 1. По этому показателю достоверных различий между опытной группой, с одной стороны, и контрольной группой 2 или 3 зарегистрировано не было.
2. Тестирование чувствительности кожи подошвенной поверхности стопы задних конечностей при помощи pinch-теста.
Площадь поверхности кожи с восстановленной чувствительностью в опытной группе животных превышает данный показатель у животных контрольной группы 3 на 39,1% (P<0,05). Достоверные различия по этому показателю при сравнении опытной группы с контрольными группами 1 и 2 не зарегистрированы.
3. Подсчет количества регенерирующих миелиновых волокон
Количество миелиновых волокон в периферическом отрезке нерва у животных опытной группы в 4,4 раза больше, чем у животных контрольной группы 1, в 7,6 раза больше, чем у животных контрольной группы 2 и в 3,5 раза больше, чем у животных контрольной группы 3.
4. Подсчет количества S100-иммунопозитивных клеток
Количество S100-иммунопозитивных (шванновских) клеток в периферическом отрезке нерва в опытной группе превышает их количество в контрольной группе 1, 2 и 3 соответственно на 36,9% (Р<0,05), 71,0% (Р<0,05) и 30,1% (Р<0,05). Эти клетки, продуцируя нейротрофические факторы, молекулы внеклеточного матрикса и молекулы адгезии, являются ключевыми для поддержания процесса нейрорегенерации. Поэтому количество этих клеток в области повреждения рассматривается как надежный критерий оценки эффективности протекания всего процесса регенерации нерва в целом.
В отличие от способа стимулирования регенерации нерва (Масгутов, Р.Ф., И.И. Салафутдинов, et al. "Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов." Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 6(3). - 2011. - P.67-70) с преодолением аналогичного по длине разрыва с помощью аутонервной вставки и введения в область повреждения того же плазмидного вектора с теми же терапевтическими генами, что в заявляемом способе не было показано улучшения двигательной активности к концу первого месяца после операции по критерию амплитуды суммарного потенциала действия икроножной мышцы. В заявляемом способе улучшение двигательной функции по критерию регистрации функционального индекса седалищного нерва зарегистрировано уже через две недели. В работах по стимулированию регенерации нерва при помощи созданных методом электроспиннинга кондуитов на основе поли(ε-капролактона) нет указаний на восстановление чувствительной функции. Результаты применения заявляемого способа указывают на возможность эффективного восстановления чувствительной функции.
Таким образом, полученные результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет эффективно стимулировать регенерацию миелиновых волокон, улучшить восстановление двигательной и чувствительной функции нерва при его разрывах за счет:
создания адекватного биосовместимого и биорастворимого наноструктурированного матрикса на внутренней поверхности высокопроницаемой пористой стенки тубулированного кондуита, поддерживающего популяцию шванновских клеток, рост аксонов и процесс ремиелинизации;
создания адекватного биосовместимого и биорастворимого наногеля внутри тубулированного кондуита, заполняющего потенциальное пространство регенерации нерва, поддерживающего выживание и дифференцировку шванновских клеток, процессы роста и миелинизации нервных волокон;
стимулирующего влияния доставляемых в область повреждения нерва трансгенов - терапевтических генов нейротрофических факторов, которые поддерживают выживание нейронов и рост аксонов, они же одновременно ангиогенные факторы, активирующие восстановление микроциркуляторного русла и кровоснабжение регенерирующего нерва. Достигнутый результат по заявляемому решению состоит в улучшении показателей регенерации после травматического разрыва нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функций, контролируемых данным нервом. Этот результат достигнут заявляемым способом создания кондуита нерва из наноструктурированного биорастворимого полимера поли(ε-капролактона) в сочетании с самособирающимся гидрогелевым матриксом на основе олигопептидных наноструктур, преодоления разрыва нерва с помощью этого кондуита в комплексе с локальной доставкой в область повреждения нерва терапевтических генов нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в составе плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2. Использование заявляемого способа стимулирования посттравматической регенерации нерва методом пластики нерва кондуитом на основе поли(ε-капролактона), заполненный PuraMatrix™ с введением терапевтических генов позволяет:
- улучшить результаты посттравматической регенерации периферического нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функций, контролируемых данным нервом;
- преодолевать более протяженные разрывы нерва;
- сократить сроки пребывания больных с травмой периферического нерва в стационаре и повысить качество жизни больных данного контингента.