Применение имуноферментного анализа для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями из группы клещевой пятнистой лихорадки

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2009. № 2

нотипом RpA4) до 10 экземпляров в поле зрения (D.silvarum, инфицированный генотипом DnS14). Более значительна разница в среднем уровне аккумуляции риккетсий в голодных нимфах: от 3,6 экземпляра в поле зрения (D.silvarum, инфицированный генотипом DnS28) до 49 экземпляров в поле зрения (D.marginatus, инфицированный генотипом RpA4).

В органах диких мелких млекопитающих ДНК риккетсий нами не выявлена. Три образца селезенок животных, отловленных в окрестностях с.Подгородка были положительны в ПЦР с применением праймеров для амплификации gltA риккетсий и 16S генов. Нуклеотидные последовательности выявленных микроорганизмов, полученные при секвенировании, имели уровень гомологии ниже принятого для внутривидовых различий рода Rickettsia (86 % гомологии с R. rhipicephali по gltA гену и 97 % гомологии по rrs

гену). Гены ompA, ompB, Seal и D у данных агентов выявить не удалось.

обсуждение. Полученные нами данные (высокий уровень вертикальной передачи, повышение уровня накопления риккетсий в преи-магинальных стадиях клещей после кровопита-ния) позволяют утверждать, что представители R.raoultii хорошо адаптированы ко всем четырем выбранным видам клещей рода Dermacen-tor: D.nuttalli, D.silvarum, D.marginatus и D.retic-ulatus. Обнаружить ДНК риккетсий в органах диких мелких млекопитающих нам не удалось, несмотря на массивное кормление на грызунах преимагинальных стадий иксодид во время сбора материала весной 2005 г. Таким образом, на основании результатов полевых и экспериментальных исследований можно предполагать, что иксодовые клещи являются не только вектором, но и основным резервуаром R.raoultii.

ПРИМЕНЕНИЕ ИМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ РИККЕТСИЯМИ ИЗ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ

Н. В. Абрамова1, Н. В. Рудаков12, Н. А. Пеньевская1, Н. Н. Седых3, Л. В. Кумпан1, И. Е. Самойленко2, Т. А. Решетникова2, А. С. Оберт3, С. А. Рудакова2

1 Омская государственная медицинская академия, г. Омск;

2 Омский НИИ природноочаговых инфекций, г. Омск;

3 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

В России из почти двух десятков риккетсио-зов группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) эпидемиологическое значение имеют клещевой риккетсиоз (КР), или клещевой сыпной тиф Северной Азии, с этиологическим агентом Rickettsia sibirica и астраханская пятнистая лихорадка, вызываемая риккетсиями генокомплекса R.conorii. Выявлен новый риккетсиоз, вызываемый R.heilongjiangensis, названный Дальневосточным клещевым риккетсиозом (О. Ю. Медянни-ков, В. А. Макарова, 2008). Методами генотипи-рования получены данные, свидетельствующие о возможной этиологической роли R.helvetica в развитии острых лихорадочных заболеваний после присасывания клеща на территории Пермского края (В. В. Нефедова, Э. И. Коренберг и др., 2008). Из клещей различных географических зон с достаточным постоянством удается выделять риккетсии и других, в том числе, новых видов риккетсий, с доказанной и пока не установленной патогенностью для человека (Н. В. Рудаков и др., 2006). Изучение клинико-эпидемиологи-ческой роли патогенов риккетсиозной природы, как хорошо известных, так и новых, в значитель-

ной степени, сдерживается отсутствием высоко чувствительных и доступных методов серологической диагностики.

«Золотым стандартом» для диагностики риккетсиозов является реакция непрямой им-мунофлюоресценции (РНИФ), рекомендованная ВОЗ (И. В. Тарасевич, 2005). Однако эта реакция достаточно трудоёмка и не позволяет одновременно исследовать большое количество проб. Наиболее распространенным методом, применяемым в практическом здравоохранении, остается реакция связывания комплемента (РСК), которая была предложена для диагностики риккетсиозов еще в 1940-х годах прошлого века. Коммерческие цельнорастворимые антигены для РСК позволяют с высокой специфичностью, но с умеренной чувствительностью выявлять комплементсвязывающие антитела (АТ) к R.siЫrica. Однако, для обнаружения АТ к рик-кетсиям других видов, эти диагностикумы, по-видимому, менее пригодны (О. Ю. Медянников, В. А. Макарова, 2008).

цель работы: апробация и изучение эффективности метода ИФА для серологической диа-

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА, ЭКОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА

гностики инфекций, вызываемых риккетсиями из группы КПЛ, циркулирующими на территории России.

Выявление антител в сыворотках крови пациентов проводили непрямым твердофазным вариантом ИФА (ИФА-^М и ИФА-IgG). Для сенсибилизации полистироловых планшетов использовали цельнорастворимые антигены, приготовленные по общепринятой методике (Здродовский П. Ф., Го-линевич Е. М., 1972) с нашими модификациями из штаммов риккетсий следующих видов: R.sibirica subsp. sibirica ^^Ыпса); R.sibirica subsp.BJ-90 ^.ВЛ-90); R.tarasevichiae; R.heilongjiangensis; R.raoultii; R.akari. Исследуемые сыворотки разводили в 10 раз. В качестве конъюгатов использовали коммерческие антивидовые антитела к ^М и IgG человека.

Всего исследовано 276 сывороток крови пациентов из трех групп. Первая (референтная) группа состояла из 36 больных с типичной клинической картиной клещевого риккетсиоза, госпитализированных в инфекционное отделение МУЗ ГБ № 11 г.Барнаула в эпидемический сезон 2006 и 2007 гг. Вторая (контрольная группа) состояла из 80 клинически здоровых людей г.Омска, обследованных вне эпидемического сезона КР. Обе группы были сопоставимы по возрастному и половому составу. В третью группу (опытную) вошли 58 лихорадящих больных Тарского района Омской области, обследованных по подозрению на клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз в мае-сентябре 2008 г.

В контрольной группе только одна проба крови давала положительную реакцию на наличие АТ к антигену R.sibirica. С остальными пятью риккетсиозными антигенами для всех сывороток контрольной группы реакция была отрицательной. Результаты ИФА для обнаружения IgG-АТ к риккетсиям также продемонстрировали высокую специфичность метода. Ни одна проба, ни с одним из исследуемых антигенов не давала положительных реакций.

В группе больных с типичной клиникой КР с помощью ИФА в подавляющем большинстве проб удалось выявить АТ классов ^М и (или) IgG к антигенам различных видов риккетсий. В сыворотках крови лихорадящих больных, контактировавших с клещами на территории Тарского района Омской области, также обнаружили АТ к изучаемым риккетсиозным антигенам, хотя процент таких находок значительно меньше, чем у алтайских больных. Вместе с тем, факты выявления проти-вориккетсиозных антител у больных этой группы представляют значительный интерес, поскольку до настоящего времени в Омской области не было зарегистрировано ни одного случая КР, однако в клещах были выявлены R.tarasevichiae, R.raoultii и риккетсия, генетически близкая к R.helvetica (Рудаков Н.В. и др., 2006).

Важно отметить, что у больных КР из референтной группы чаще всего обнаруживали АТ к антигену R.sibirica зиЬзр. з^г^, что вполне закономерно, так как именно этот вид риккетсий является доминирующим в Алтайском крае. На втором месте по частоте положительных реакций — ИФА с антигеном R.raoultii, на третьем — с антигеном R.аkarii, на четвертом — с антигеном R.Tarasevichiae, на пятом с антигеном R. heilongjiangensis. Только в одной из 65 проб наблюдали положительную реакцию в ИФА-^М с антигеном R.sibirica subsp. BJ-90.

Очень часто в одной и той же пробе обнаруживали антитела к двум и более риккетсиозным антигенам. Только в сыворотках крови 4-х больных КР выявляли ^М-АТ к единственному виду риккетсий — R.sibirica, тогда как ^М к антигенам других видов риккетсий выявляли всегда в сочетании с ^М к R.sibirica.

Количество положительных проб, содержащих ^С-АТ только к одному виду риккетсий, было несколько больше, чем при выявлении ^М. Причем «моно-варианты» обнаружены не только к R.sibirica, но и к R. tarasevichiae, и к R. аkarii. Однако при этом у больных выявляли ^М к R.sibirica или обнаруживали к R.sibirica, но в другой пробе крови.

Антитела класса к R.raoultii во всех случаях обнаруживали вместе с к антигенам не менее двух других видов риккетсий. Ни у одного больного не были обнаружены к R.BJ-90 или к R.heilongjiangensis.

У большинства больных (77,8 %) первой группы для подтверждения диагноза было достаточно исследовать на наличие ^М к R.sibirica только первую сыворотку крови. Тестирование 2-й пробы крови позволяло верифицировать диагноз еще у 13,9 % больных. При исследовании в ИФА-к R.sibirica всех (трех) пар сывороток крови, в которых не были выявлены ^М к R.sibirica, обнаружена сероконверсия к изучаемому антигену, что повысило «подтверждаемость» диагноза до 100%.

Исследование парных сывороток в РСК позволило верифицировать диагноз КР только в 66,7 % случаев, верифицированных с помощью ИФА-^М, и в 53,3 % случаев, подтвержденных в результате совместного применения ИФА-^М и ИФА-^С.

Таким образом, непрямой твердофазный вариант ИФА является высокочувствительным и специфичным методом обнаружения антител к антигенам риккетсий. Использование риккет-сиозных антигенов различной видоспецифичнос-ти в качестве его основы открывает перспективы для широкомасштабного сероэпидемиологичес-кого изучения географического распространения «старых» и «новых» видов риккетсий и их роли в патологии человека.