СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК БРУЦЕЛЛ ИЗ ШТАММА BRUCELLA ABORTUS 19 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИГЕНОВ, БРУЦЕЛЛЕЗНЫЕ АНТИГЕНЫ (ТРИ ВАРИАНТА), СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ И ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ (ТРИ ВАРИАНТА)

3
3
3
1. Способ получения концентрата культуры клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для приготовления бруцеллезных антигенов, используемых в диагностических тест-системах, включающий получение посевного материала бактериальных клеток и их культивирование в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регулированием уровня концентрации растворенного в культуральной среде кислорода на протяжении всего процесса культивирования, инактивацию выросших бактериальных клеток нагреванием с последующим их концентрированием, при этом процесс культивирования бактериальных клеток осуществляют при температуре 36-38°С, в процессе культивирования на этапе накопления бактериальных клеток от концентрации 1,5-2,5 млрд м.к./см до концентрации 10 млрд м.к./см выдерживают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале 20-25 мг/л, а свыше 10 млрд м.к./см и до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста обеспечивают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале значений 40-45 мг/л, а концентрирование выросших бактериальных клеток осуществляют посредством осаждения флокулянтом, в качестве которого используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), который добавляют в культуральную среду в количестве 0,1-0,15 г по сухому веществу на 1 литр культуральной среды, после чего сливают надосадок с получением концентрата инактивированных бактериальных клеток для последующего приготовления бруцеллезного антигена в РА, РСК, РДСК, антигена РБП; антигена КР с молоком.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что осаждение осуществляют в течение 24-48 часов при температуре от 8°С до 12°С.
3
3
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях на жидкой питательной среде осуществляют доливным методом, включающим культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды с концентрацией посевного материала 1,5-2,5 млрд м.к./см до достижения концентрации бактериальных клеток в питательной среде 50-60 млрд м.к./см., после чего объем питательной среды увеличивают в два раза - до полного объема и продолжают культивирование до стационарной фазы роста бактериальных клеток.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды осуществляют течение 16-18 часов, и после увеличения объема питательной среды до полного - в течение 7-9 часов, при этом общее время культивирования составляет 23-27 часов.
5. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что индикатором достижения клетками стационарной фазы роста является резкое увеличение концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости с 40-45 мг/л до 90 мг/л и выше в течение 1-5 минут при одном и том же уровне подачи воздуха.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве питательной среды используют среду следующего состава, об.%:
перевар Хоттингера 15-18,
гидролизат казеина 1,5-2,0,
глицерин 1-1,5,
глюкоза 1-1,5,
NaCl - 0,5,
дрожжевой экстракт сухой - 0,5,
вода (водопроводная) - остальное до 100,
в которой содержание аминного азота составляет 160-180 мг %.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в процессе культивирования автоматически поддерживают pH в интервале значений 6,8-7,2 посредством добавления в культуральную среду 5% раствора NaOH или HCl.
3
8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что уровень растворенного кислорода в обозначенных интервалах значений поддерживают подачей воздуха в культуральную среду и вращением мешалки с увеличивающейся скоростью мешалки от 100 об/мин на этапе накопления микробных клеток до 10 млрд м.к./см, и до 300-350 оборотов в минуту - до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста.
9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что в случае образовании пены в процессе перемешивания в культуральную среду добавляют пеногаситель, например, БАРВАНОЛ от 0,015-0,02 л на 100 литров культуральной среды.
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что инактивацию бактериальных клеток нагреванием осуществляют при температуре плюс 78-80°С, в течение 1-1,2 ч.
3
11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях (без использования доливного метода) осуществляют в течение 16-20 ч до достижения накопления бактериальных клеток 60-80 млрд м.к./см.
12. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток доливным методом осуществляют в течение 24-26 часов.
3
3
13. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что по окончании концентрирования полученный концентрат в виде инактивированных бактериальных клеток ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до оптической концентрации 250-300 млрд м.кл./см для последующего получения антигена в РА, РСК, РДСК и антигена РБП, или стерильной дистиллированной водой (очищенной) до концентрации 200 млрд м.к. см для последующего получения антигена КР с молоком.
3
3
3
14. Способ получения антигена из штамма Brucella abortus 19 для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, используемой в диагностических тест-системах, включающий получение посевного материала бактериальных клеток и их культивирование в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регулированием уровня концентрации растворенного в культуральной среде кислорода на протяжении всего процесса культивирования, с последующим концентрированием выросших бактериальных клеток, при этом процесс культивирования бактериальных клеток осуществляют при температуре 36-38°С, при этом на этапе накопления бактериальных клеток от концентрации 1,5-2,5 млрд м.к./см до концентрации 10 млрд м.к./см. выдерживают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале 20-25 мг/л, а свыше 10 млрд м.к./см. и до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста обеспечивают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале значений 40-45 мг/л, а концентрирование выросших бактериальных клеток осуществляют посредством осаждения флокулянтом, в качестве которого используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), и который добавляют в культуральную среду в количестве 0,1-0,15 г по сухому веществу на 1 литр культуральной среды, после чего сливают надосадок с получением концентрата бактериальных клеток для последующей иммунизации животных-продуцентов для получения бруцеллезной диагностической сыворотки.
15. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что осаждение осуществляют в течение 24-48 часов при температуре от 8°С до 12°С.
3
3
16. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях на жидкой питательной среде осуществляют доливным методом, включающим культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды с концентрацией посевного материала 1,5-2,5 млрд. м.к./см до достижения концентрации бактериальных клеток в питательной среде 50-60 млрд м.к./см, после чего объем питательной среды для культивирования увеличивают в два раза - до полного объема и продолжают культивирование до стационарной фазы роста бактериальных клеток.
17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды осуществляют течение 16-18 часов, и после увеличения объема питательной среды до полного - в течение 7-9 часов, при этом общее время культивирования составляет 23-27 часов.
18. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что индикатором достижения клетками стационарной фазы роста является резкое увеличение концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости с 40-45 мг/л до 90 мг/л и выше в течение 1-5 минут при одном и том же уровне подачи воздуха.
19. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что в качестве питательной среды используют среду следующего состава, об.%:
перевар Хоттингера 15-18,
гидролизат казеина 1,5-2,0,
глицерин 1-1,5,
глюкоза 1-1,5,
NaCl - 0,5,
дрожжевой экстракт сухой - 0,5,
вода (водопроводная) - остальное до 100,
в которой содержание аминного азота составляет 160-180 мг %.
20. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что в процессе культивирования автоматически поддерживают pH в интервале значений 6,8-7,2 посредством добавления в культуральную среду 5% раствора NaOH или HCl.
3
21. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что уровень растворенного кислорода в обозначенных интервалах значений поддерживают подачей воздуха в культуральную среду и вращением мешалки с увеличивающейся скоростью мешалки от 100 об/мин на этапе накопления микробных клеток до 10 млрд м.к./см, и до 300-350 оборотов в минуту - до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста.
22. Способ по п. 21, характеризующийся тем, что в случае образовании пены в процессе перемешивания в культуральную среду добавляют пеногаситель, например, БАРВАНОЛ, от 0,015-0,02 л на 100 литров культуральной среды.
3
23. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях (без использования доливного метода) осуществляют в течение 16-20 ч до достижения накопления бактериальных клеток 60-80 млрд м.к./см.
24. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что культивирование бактериальных клеток доливным методом осуществляют в течение 24-26 часов.
3
25. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что по окончании концентрирования полученный концентрат (антиген) ресуспендируют стерильным физиологическим раствором до оптической концентрации 200 млрд м.к./см. для последующей иммунизации животных-продуцентов для получения сыворотки.
3
26. Способ получения единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК, характеризующийся тем, что получают концентрат бактериальных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором, который выдерживают 7-10 дней при температуре 4-6°С, после чего концентрат разводят 0,5% фенолизированным физиологическим раствором до оптической концентрации 18-22 млрд м.к./см.
3
3
27. Способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП), характеризующийся тем, что получают концентрат бактериальных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором, который окрашивают бенгальской розовой, при этом добавляют 1%-ный раствор бенгальской розовой из расчета 6% раствора на оптическую концентрацию 200 млрд м.к. в 1 см и оставляют на 20-24 часа, затем окрашенный концентрат центрифугируют при 15-17 тыс оборотов в минуту, затем окрашенную массу микробных клеток ресуспендируют до оптической концентрации 90-100 млрд м.к./см буферным разбавителем, состав которого содержит растворенных в 100 литрах очищенной или дистиллированной воды следующих компонентов: гидроокиси натрия - 2,0 кг, фенола - 0,5 кг, молочной кислоты - 20,5 кг, хлористого натрия - 0,9 кг.
3
28. Способ получения бруцеллезного для кольцевой реакции (КР) с молоком, характеризующийся тем, что получают концентрат микробных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильной дистиллированной водой, добавляют 25-35% от объема культуральный среды протраву, в качестве которой используют 0,5%-ный водный раствор сернокислого железа, после чего концентрат с протравой нагревают до 43-45°С и выдерживают 25-35 минут, полученный концентрат окрашивают составом, содержащим гематоксилин или 2,3,5-трифенилтетразоль хлористый и выдерживают при комнатной температуре в течение 15-24 часа, после чего окрашенный концентрат центрифугируют при 15-17 тыс.оборотов в минуту, затем окрашенную массу ресуспендируют 1%-ным фенолизированным физраствором до оптической концентрации 100 млрд м.к. в 1 см.
29. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической, характеризующийся тем, что проводят гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим отбором крови, отделением сыворотки, ее стерилизацией, при этом гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют, по меньшей мере, трехкратным подкожным введением антигена, первые два из которых осуществляют антигеном, полученным способом по п. 14, а третье - антигеном, полученным способом по п. 1.
30. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что в качестве животных-продуцентов используют быков массой не мене 300 кг.
3
3
3
31. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что антиген вводят в область средней трети шеи, при этом первое введение антигена осуществляют на первый день в количестве 5 см антигена (75 млрд мк.кл.), второе - на 14 день в количестве 8 см (120 млрд м.кл.), третье - на 21 день в количестве 10 см (150 млрд мк.кл.), после чего на 28 день проводят взятие пробы крови, и при наличии в пробе достаточных титров антител на 29-30 день осуществляют производственный отбор крови.
32. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что кровь выдерживают при температуре 37-38°С в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°С на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку.
33. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что стерилизацию сыворотки осуществляют путем ее фильтрации через стерилизующие фильтры «Durapore» размером 30′′ с диаметром пор 0,22 мкм или аналогичные по характеристикам.
34. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что сыворотка стерильная имеет титр в РА не ниже 1:800, а в РСК не ниже 1:20.
35. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что после расфасовки сыворотку лиофилизируют.
36. Тест-система для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК, характеризующийся тем, что содержит антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК, полученный по п. 26, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по п. 29, и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.
37. Тест-система для диагностики бруцеллеза животных в РБП, характеризующийся тем, что содержит антиген бруцеллезный для РБП, полученный по п. 27, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по п. 29, и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.
38. Тест-система для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком, характеризующийся тем, что содержит антиген бруцеллезный для КР, полученный по п. 28 и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по п. 29.