Опыт выявления маркеров краснушной инфекции во время локальных вспышек на территории Западной Сибири

Nucleotide sequence analysis of several genes responsible for the anthrax pathogen definitive properties - motility and penicillinase activity - determined a chromosomal locus promising for interspecies differentiation. We demonstrated that the gene fliC encoding flagellin synthesis contains extended region, distinguishing B. anthracis strains from the majority of non-pathogenic and opportunistic bacilli. A novel method for the anthrax pathogen indication and identification based on determination of the differences in the chromosomal genes fliC and hom2 structure was suggested. A total of 60 strains of different Bacillus spp. (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis; B. mycoides,

B. megaterium, B. subtilis, etc.) were tested using two chromosomal DNA targets. The algorithm developed in this work permits to detect the pathogenic microorganism and reliably differentiate it from other Bacillus spp. representatives. The introduction of primers complementary to specific sequences of pXOl and pXQ2 plasmids into the multiplex PCR makes it possible to receive additional information on proposed virulence of the isolate. Key words: Bacillus anthracis; motility; flagellin; chromosomal DNA targets; multiplex PCR.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.98:578.833.41]-078.33

Петрова И.Д.1, Петров В.С.1, Серегин С.В.1, Малкова Е.М.2

ОПЫТ ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРОВ КРАСНУШНОЙ ИНФЕКЦИИ ВО ВРЕМЯ ЛОКАЛЬНЫХ ВСПЫШЕК НА ТЕРРИТОРИИ зАПАДНОЙ СИБИРИ

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская обл. ; ^Государственное автономное учреждение образования Новосибирский центр повышения квалификации работников здравоохранения, 630087,

Новосибирск, ул. Немировича-Данченко 126

Представлен анализ результатов обследования образцов от 75 пациентов на наличие вируса краснухи, вирусной РНК, специфических антител. Для всех образцов выявляемость РНК была выше, чем изоляция вируса. Установлено, что из каждого шестого клинического образца не удалось изолировать вирус краснухи при наличии в нем вирусной РНК. Определены первичные структуры участка (с 8072-го по 8291-й нуклеотид) генома вируса краснухи из 14 образцов. В данной работе показано, что все образцы вируса краснухи относятся к первому генотипу, подгруппам Щ а также с большой долей вероятности к подгруппам 1а и №. Впервые показана циркуляция вируса краснухи первого генотипа как до начала массовой вакцинации на территории Западной Сибири, так и после.

Ключевые слова: краснуха; вирус краснухи; вирусная РНК; ОТ-ПЦР; филогенетический анализ; генотип.

Социальная значимость краснухи обусловлена повсеместным распространением инфекции и тератогенным действием вируса - способностью формировать врожденные дефекты развития, приводящие к инвалидности или смертельному исходу у новорожденных. Краснуха встречается у людей, живущих на всех континентах, и, несмотря на успехи программ вакцинации населения в экономически развитых странах, еще встречаются локальные вспышки этой болезни [1, 2].

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) придает важное значение молекулярной эпидемиологии краснухи. Оценка эффективности вакцинации включает серологический мониторинг состояния коллективного иммунитета к краснухе, выделение и генотипирование циркулирующего вируса [3]. Изучение вариабельности генома вируса краснухи (ВК) в нашей стране до настоящего времени проводится недостаточно интенсивно.

ВОЗ для изучения эпидемиологии и этиологии краснухи рекомендует проводить изоляцию вируса [4]. Изоляция ВК - это длительный и дорогостоящий процесс. Отсутствие цитопатического действия ВК во многих культурах клеток делает сложным подтверждение роста вируса. Обычно для этого используют выявление вирусной РНК в зараженной культуре методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Некоторые авторы предпринимают попытки найти более быстрый и простой способ для первичного генотипирования ВК [5].

Для подтверждения диагноза краснухи можно использовать следующие маркеры: 1) РНК ВК, 2) выделенный на культуре клеток ВК, 3) антитела классов ^М и

IgG. Для генотипирования вируса определяется нуклео-тидная последовательность участков вирусного генома.

В настоящем исследовании изучение краснухи проводили во время локальных вспышек краснухи в период 1998-2001 гг. в Новосибирске и 2004-2006 гг. в Западной Сибири.

Материалы и методы

Образцы от пациентов с диагнозом краснухи собраны на территории Западной Сибири России. Забор образцов осуществляли с письменного согласия пациентов и в соответствии с требованиями этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все клинические образцы хранили замороженными при -70°С вплоть до проведения лабораторных исследований.

Для обнаружения специфических антител и определения индекса авидности IgG использовали стандартный им-муноферментный анализ (ИФА) с применением тест-систем: «ВектоРубелла-IgG», «ВектоРубелла-IgM», «ВектоРубелла-IgG-авидность» (ФСП 42-0117-4696, 42-0117-4694-03 и 42-01174695-03, соответственно) производства ЗАО «Вектор-Бест» (Кольцово, Новосибирская область).

Для обнаружения генетического материала ВК в клинических образцах из 200 мкл биологической жидкости выделяли суммарную РНК с использованием набора «Вектор РНК-экстракция» производства ЗАО «Вектор-Бест». Для проведения ОТ-ПЦР использовали специфические праймеры, разработанные нами для диагностики краснухи [6, 7].

Для выявления ВК в клинических образцах проводили заражение клеток Vero биологическими жидкостями (кровь, моча и носоглоточный смыв - н-г.смыв) по описанной ранее методике [8] и проводили 2 пассажа. Выделение вирусной РНК из культу-ральной жидкости проводили с использованием того же набора, что и в случае клинических образцов.

ДНК нужного размера вырезали из геля и очищали с использованием набора Q-Biogene GeneCleanIII extraction kit (Carlsbad, California, США) согласно приложенным инструкциям. Определение нуклеотидных последовательностей полученных фрагментов проводили на автоматическом анализаторе Beckman СЕQ 2000XL при помощи набора CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (оба «Beckman Coulter», «Fullerton», California, USA) согласно инструкциям производителя. Реакцию секвени-рования проводили по обеим цепям.

Установленные в этой работе нуклеотидные последовательности опубликованы в базе данных GenBank под номерами JX846963-JX846965 и KC255389- KC255399.

Для множественного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали программы BioEdit v.7.0 [9] и ClustalX v.1.8 [10].

Таблица 1 Результаты ОТ-ПЦР и изоляции вируса из разных клинических образцов

Сочетание Количество образцов/в % от общего числа I образцов/в %

маркеров кровь

РНК+, ВК+ 29/67,4% 27/87,5% 1/25% 57/72,1%

РНК-, ВК- 4/9,3% 0/0% 2/50% 6/7,6%

РНК+, ВК- 8/18,6% 4/9,4% 1/25% 13/16,5%

РНК-, ВК+ 2/4,7% 1/3,1% 0/0 3/3,8%

X РНК+ 37/86,0% 31/96,9% 2/50% 70/88,6%

I ВК+ 31/72,1% 28/87,5% 1/25% 60/75,9%

Примечание. Знак «+» означает наличие, а знак «-» - отсутствие, X - суммарное количество образцов.

Филогенетический анализ выполняли методом объединения ближайших соседей с помощью программы Mega v.5 [11] с использованием модели нуклеотидных замещений Кимуры с двумя параметрами [12] и перестановочным анализом по 1000 итераций.

Для подсчета среднего дня появления сыпи у больных и доверительных интервалов использовали прикладную программу Microsoft Office Excel 2007, описательная статистика (95% уровень значимости).

Результаты и обсуждение Нами проведен анализ данных 75 пациентов, у которых каждый клинический образец исследовали на наличие всех упомянутых маркеров: вирусной РНК, ВК и специфических антител. У всех больных были выявлены какие-либо маркеры краснушной инфекции. Среди них можно выделить 63 человека с клиническим диагнозом «краснуха», обследованных в период 2,8 ± 0,36 дня от

начала высыпания, а также 4 человека с бессимптомной формой краснухи, и 7 новорожденных с различными пороками развития и одну мать такого ребенка. В качестве клинических образцов исследовали кровь, сыворотку крови, смывы с носоглотки и мочу. Всего было исследовано методом ИФА 75 сывороток крови; ОТ-ПЦР и изоляции ВК - по 79 образцов (кровь, моча, смывы с носоглотки). Данные по обнаружению ВК и вирусной РНК в различных клинических образцах приведены в табл.1.

Из приведенных в табл. 1 результатов видно, что выявляемость вирусной РНК и изоляция вируса максимальны в смывах с носоглотки, ниже в крови, значительно ниже в образцах мочи.

Для всех образцов выявляемость РНК превышала изоляцию вируса. Для смывов с носоглотки это отличие составило 9,4%, образцов крови - 13,9% и мочи - 25%. Это еще раз подтверждает большую чувствительность метода ОТ-ПЦР по сравнению с методом изоляции вируса.

Результаты ОТ-ПЦР и изоляции вируса совпадали для 63 (79,7%) клинических образцов, в 57 образцах выявлялись и вирус, и вирусная РНК, а в 6 они отсутствовали. Для 13 (16,5%) образцов было показано наличие вирусной РНК при отрицательном результате изоляции вируса. Таким образом, из каждого 6-го клинического образца не удалось изолировать ВК при наличии в нем вирусной РНК. Это можно объяснить не только более высокой чувствительностью ОТ-ПЦР по сравнению с методом культивирования вируса, но и предположить влияние дополнительного замораживания и оттаивания образца перед нанесением на культуру клеток. Данные об этих 13 пациентах приведены в табл. 2.

В свою очередь отрицательный результат ОТ-ПЦР при выявлении вируса для 3 образцов кажется нелогичным. Следует отметить, что это были слепые вирусные пассажи (без предварительной оценки наличия вирусной РНК в образце), и до выявления РНК ВК в образцах (2

Таблица 2

Сведения о пациентах, у которых при положительных результатах ОТ-ПЦР не удалось детектировать вирус краснухи

Иденти-фикац. номер Диагноз, пациент, возраст, Данные ИФА Данные ОТ-ПЦР Данные изоляции вируса

титр IgM титр IgG авидность кровь н/г смыв моча кровь н/г смыв моча

6R-41 Красн., М, 19 лет, 2 д/с Отр. Отр. Н/д Полож. Н/д н/д Отр. Н/д

Вторичн. Через 1 нед 1/400 1/200 7% Н/д Н/д Н/д Н/д Н/д Н/д

6R-42 Красн., Ж, 17 лет, 2 д/с Отр. Отр. Н/д Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д

Вторичн. Через 1 нед 1/800 Отр. Н/д Н/д Н/д Н/д Н/д Н/д

13R-26 Красн., М, 11 лет, 10 д/с 1/400 1/100 36% Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д Н/д

13R-27 Красн., Ж, 23 года, 10 д/с 1/400 Отр. Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д Н/д

13R-29 Красн., М, 12 лет, 1д/с 1/400 Отр. Н/д Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д

13R-36 Красн., Ж, 12 лет, 2 д/с 1/200 Отр. Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д Н/д

14R-57 Красн., Ж, 23 года, 3 д/с Отр. Отр. Полож. Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д

14R-102 Красн., М, 15 лет, 2 д/с Отр. Отр. Полож. Полож. Полож. Отр. Полож. Н/д

Вторичн. Через 3 сут 1/100 1/200 21,9% Н/д Полож. Н/д Н/д Н/д Н/д

14R-103 Красн., М, 15 лет, 2 д/с Отр. Отр. Полож. Отр. Полож. Полож. Н/д Отр.

Вторичн. Через 3 сут 1/100 1/100 15,9% Н/д Полож. Н/д Н/д Н/д Н/д

15R-5 Контакт, Ж, 20 л., берем., 24 д/к 1/400 1/200 14% Полож. Н/д Отр. Отр. Н/д Отр.

2R-21* Нвр., с. Дауна Отр. 1/100 100% Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д Н/д

2R-23* Нвр., с. Дауна Отр. Отр. Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д Н/д

10R-29* Нвр., ВПС Отр. 1/200 95% Полож. Н/д Н/д Отр. Н/д Полож.

Примечание. Жирным шрифтом выделены несовпадающие результаты, * - пациенты, у которых ОТ-ПЦР повторялась дважды, и определение IgM проводилось повторно с использованием тест-системы Dade Behring.

Здесь и в табл. 3: красн. - краснуха, М - мужской пол, Ж - женский пол, д/с - день от момента появления сыпи, д/к - день после контакта, Нвр. - новорожденный, берем. - беременная, с. Дауна - синдром Дауна, ВПС - врожденный порок сердца, н/д - не делали, отр. - отрицательный, полож. - положительный результат.

Таблица 3

Данные о пациентах, из клинических образцов которых были определены первичные структуры участка (с 8072-го по 8291-й ну-

клеотид) генома вируса краснухи

Название образца

Данные о пациенте, результат ИФА

Образец

Место и дата забора 2-й пассаж вируса

Новосибирск, 09.1999 Н/д

Новосибирск, 09.1999 Н/д

Новосибирск, 04.2001 Полож.

Новосибирск, 06.2004 Полож.**

Барнаул, 11.2004 Полож.

Барнаул, 03.2005 То же

Кемерово, 02.2005 Полож.**

Томск, 11.2004 Н/д

Томск, 03.2005 Полож.

Омск, 11.2004 То же

Новокузнецк, 12.2004 Н/д

Новокузнецк, 09.2004 Полож.

RVs/NovRub5 Нвр., генерализованная форма ВУИ, ^М отр., IgG отр.

RVs/NovRub8* Нвр., ВПС, ^М отр., IgG полож., авидность н/д

RVs/NovRub109 Нвр., с. Дауна, ВПС, ^М, IgG н/д

RVs/Nsk1R4 Краснуха, М, 14 лет, 3 д/с, ^М полож., IgG отр.

RVs/Bar4R12 НВР, ВПС, IgM отр., ДО полож., авидность 98%

RVs/Bar5R8 НВР, ВЖ, с. Пьера-Робена, IgM отр., ДО отр.

RVs/Kem6R6 Краснуха, М, 15 лет, 1 д/с, ^М отр., IgG отр. RVs/Tom9R22 Контактный, Ж, 12 л, ^М отр., IgG полож., авидность 96%

RVs/Tom9R48 Краснуха, Ж, 16 лет, 2 д/с, ^М отр., IgG отр.

RVs/Oms10R29 Нвр, ВПС, IgM отр., ДО полож., авидность 95%

RVs/Nvk12R6p Нвр, вр. гидроцефалия, IgM отр., IgG отр.

RVs/Nvk13R18 Контактный, Ж, 18 лет, 14 д/к, ^М отр., IgG отр.

RVi/Nov14R19 Краснуха, М, 16 лет, 2 д/с, ^М отр., IgG отр.

RVs/Nov14R57 Краснуха, Ж, 23 года, 3 д/с, ^М отр., IgG отр.

Кровь То же

Н-г. смыв Кровь То же

2-й пассаж н-г. смыв н-г. смыв

Новосибирск, 12.2005 Полож.** Новосибирск, 01.2006 Отриц.

Примечание. * - у матери этого новорожденного аналогичные показатели антител и идентичная нуклеотидная последовательность выделенного фрагмента ДНК; ** - изоляты, для которых определена первичная структура более протяженных участков гена Е1 (номера в GenBank ЕР199893, ЕР182760, ЕР182762).

образца крови и 1 н-г. смыв) производили дополнительные циклы замораживание-оттаивание. Это могло привести к отрицательному результату при исходно малом содержании вируса.

Методом ИФА специфические антитела класса ^М были выявлены у 24 (38,1%) больных с клиническими проявлениями краснухи и у 3 (75% из группы) пациентов с атипичным течением. Низкоавидные антитела (авид-ность от 5 до 58%) класса IgG выявлены у 13 (20,6%) больных с типичной экзантемой и у одного пациента с течением заболевания без сыпи. Для этих краснушных больных средний день заболевания - 4,8 ± 1,6. Высоко-авидными считаются антитела с авидностью выше 70% по данным производителя используемой тест-системы. При использовании этой тест-системы показаны единичные случаи наличия антител класса IgG с близкой к 70% авидностью на 7-8-й день заболевания.

Отдельно следует отметить 7 клинических случаев, в которых при отсутствии антител класса ^М и наличии высокоавидных антител класса IgG (авидность 80% и выше) показано присутствие и вирусной РНК, и ВК. Такие клинико-лабораторные данные наблюдались у одной (100%) матери, 3 (42,9%) новорожденных и 3 (4,8%) больных. Обследованная женщина болела краснухой перед родами, у ее ребенка также выявлены высо-коавидные антитела IgG, но ни вируса, ни вирусной РНК не детектировано. Вторичная сыворотка, взятая у матери через 3 нед, показала увеличение титра IgG в 2 раза и отсутствие вирусной РНК. У новорожденных детей и одного больного ребенка в возрасте 6 мес, скорее всего, выявлены материнские антитела. Остальные 2 из упомянутых 7 человек, по-видимому, перенесли краснуху в атипичной форме, так как специфических клинических симптомов краснухи у них не было выявлено. Таким образом, по результатам ИФА, ОТ-ПЦР и изоляции вируса можно предположить у 7 человек вирусоносительство при наличии высокоавидных антител IgG.

Для определения нуклеотидной последовательности были взяты фрагменты длиной в 219 нуклеотидов, полученные методом ОТ-ПЦР с использованием диагностических праймеров, из клинических образцов от 13 пациентов и 2-го пассажа вируса от одного больного краснухой. Данные об этих пациентах суммированы в табл. 3.

При построении филогенетического дерева использовали полученные нами первичные структуры ВК и опубликованные в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности исследуемого участка генома ВК штаммов, рекомендованных ВОЗ для генотипирования диких ВК [4].

Полученное дерево приведено на рисунке.

Следует отметить, что в рамках данного участка генома ВК были получены идентичные нуклеотидные последовательности для трех новорожденных с врожденными пороками сердца ^8/Ваг4П2/04, RVs/NovRub8/99 и RVs/NovRub109/01) из Барнаула и Новосибирска, у последнего из них был синдром Дауна. Также идентичными были нуклеотидные последовательности, полученные из клинических образцов новорожденного из Омска (RVs/Omsk10R29/04) с церебральной ишемией и инверсией 10-й хромосомы и пациента из Новокузнецка, обследованного как контактного с больным краснухой (RVs/Nvk13R18/04). У последнего была выделена РНК ВК только из повторной сыворотки. Упомянутые выше 5 образцов и еще 3 от больного с типичным течением краснухи средней степени из Новосибирска (RVs/ Nov1R4/04), от больного из Томска с атипичной формой краснухи (Tom9R22/04) и новорожденного из Новокузнецка с врожденной гидроцефалией (Nvk12R6р/04) образуют на филогенетическом дереве отдельную ветвь с индексом поддержки 69. С большей степенью вероятности, как следует из построенной нами филограммы, эти 8 образцов следует отнести к генетической группе 1а.

Еще 5 нуклеотидных последовательностей образуют отдельную ветвь генотипа Ш с определенными ранее М^кВЫ^^-Ш и ^^3-23^^/04-1^ уровень поддержки этого узла ветвления дерева - 77. Они представлены образцами от новорожденного из Барнаула с синдромом Пьера-Робена (RVs/Bar5R8/05), от ребенка с генерализованной формой внутриутробной инфекции из Новосибирска (RVs/NovRub5/99), от больных с типичной формой краснухи из Кемерово (RVs/Kem6R6/05, краснуха типичная легкая) и Новосибирска (RVs/Nov14R57/06). Также в эту группу входит изолят вируса, полученного от больного краснухой из Новосибирска (RVi/Nov14R19/05). Определение более протяженного участка генома этого изолята также позволило отнести его к генотипу Ш.

Рис. 1.Филограмма, построенная по 8072-8291-му нуклеотид-

ному участку генома вируса краснухи. На филогенетическом древе нуклеотидные последовательности, полученные в данном исследовании, выделены жирным шрифтом, а от новорожденных - дополнительно подчеркнуты. Жирным курсивом выделены случаи атипичной краснухи, а полученные нами и генотипи-рованные ранее изоляты выделены курсивом и подчеркнуты. Все представленные в данном исследовании нуклеотидные последовательности относятся к 1-му генотипу и делятся как минимум на 2 группы.

Один образец от больного с типичной формой краснухи из Томска (RVs/Tom9R48/05) по структуре этой части геном вируса очень близок изолятам, относящимся к генетической группе 1Е Они образуют еще одну ветвь на древе с уровнем поддержки 64. Ранее нами было установлено, что в последние годы на территории Западной Сибири циркулирует ВК, представленный двумя генотипами - ^ и 1Е [13, 14].

Несмотря на то что для проведения филогенетического анализа были использованы небольшие участки генома (219 нуклеотидов), разделение штаммов и изо-лятов вируса по генетическим группам и подгруппам происходит достаточно четко и адекватно, с хорошими индексами поддержки (61-98). В данной работе показано, что все образцы ВК относятся к первому генотипу, подгруппам Ш, а также с большей долей вероятности к подгруппам 1а и 1Е

Полученные в этой работе результаты представляют интерес в связи с тем, что в отношении циркуляции ВК в России до начала массовой вакцинации было известно только о генотипе 2с в Москве (1967-1997 гг.) и в Перми в 1999 г., и в 1973 г. в Москве же был выделен один изо-

лят (C68 RUS73), относящийся к первой генетической группе.

До настоящего времени в базе данных GenBank не опубликовано ни одного протяженного участка генома ВК, выделенного в нашей стране от новорожденных с врожденными патологиями. Сейчас для территории России в целом показана циркуляция изолятов ВК первого генотипа, относящихся к подгруппам 1Е, 1h и реже 1g [13-15]. В Перми в 1999-2005 гг. выявлены изоляты ВК генотипа 2с [16]. Авторы утверждают, что после начала массовой вакцинации населения вакцинами на основе штамма RF 27/3, относящегося к генотипу 1а, произошла смена эндемичного для России штамма ВК генотипа 2с на вирус первого генотипа.

Таким образом, нами впервые показана циркуляция ВК первого генотипа в Новосибирске как до начала массовой вакцинации на территории Западной Сибири, так и после.

Данное исследование выполнено при поддержке программы Минздрава РФ «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические тест-системы» и гранта МНТЦ № 2924р.

Сведения об авторах:

Петрова Ирина Дмитриевна - вед. науч. сотр., канд. биол. наук; ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора, отдел микроскопических исследований, 630559, пос. Кольцово, Новосибирская обл.; e-mail: idpetr@vector.nsc.ru, pizulja@mail.ru;

Петров Владимир Семенович - вед. науч. сотр., канд. биол. наук ФГУН ГНЦВБ «Вектор» Роспотребнадзора, отдел «Коллекция микроорганизмов»; e-mail: petrovvs@vector.nsc.ru;

Серегин Сергей Викторович - ст. науч. сотр., канд. биол. наук ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, отдел «Коллекция микроорганизмов»; e-mail: svseregin@ngs.ru, seregin@vector.nsc.ru;

Малкова Елена Михайловна - преподаватель ГАОУ «Новосибирский центр повышения квалификации работников здравоохранения», д-р мед. наук; e-mail: malkova_em@mail.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антипова Л.Ю. Вирус краснухи и его тератогенное действие. Патогенез, клиника, диагностика, профилактика синдрома врожденной краснухи. Часть № 3. Диагностика и профилактика краснухи и СВК. Инфекция и иммунитет. 2011; 1(3): 231-42.

2. Karasek Е., Paradowska-Stankiewicz I. Rubella in Poland in 2011. Przegl Epidemiol. 2013; 67(2): 189-93.

3. WHO. Rubella virus nomenclature update: 2013. Wkly Epidemiol. Rec. 2013; 88(32): 337-43.

4. WHO. Update of standard nomenclature for wild-type rubella viruses. Wkly Epidemiol. Rec. 2007; 82: 216-22.

5. Feng Y., Santibanez S., Appleton H. et al. Application of new assays for rapid confirmation and genotyping of isolates of rubella virus. J. Med. Virol. 2011; 83: 170-7.

6. Петров В.С., Петрова И.Д., Тюников Г.И., Серегин С.В. Набор оли-гонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса краснухи. Патент РФ № 2217501, 2003.

7. Петрова И.Д., Тюнников Г.И., Петров В.С., Малкова Е.М., Смердова М.А. Разработка метода диагностики заболевания краснухой на ранних стадиях беременности. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1999; 9: 131-5.

8. Frey Т.К. Molecular biology of rubella virus. Adv. Virus Res. 1994; 44: 69-160.

9. Hall T.A. Bioedit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. Ser. 1999; 41: 95-8.

10. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids Res. 1997; 24: 4876-82.

11. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. Mega5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28 (10): 2731-9. doi:10.1093/molbev/msr121

12. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980; 16: 111-20.

13. Петрова И.Д., Казаева Е.В., Малкова Е.М., Серегин С.В., Яшина Л.Н., Тюнников Г.И. и др. Клиническое, серологическое и молекулярно-биологическое исследование краснухи в Новосибирске в 2006 году. Инфекционные болезни. 2007; 5: 16-9.

14. Серегин С.В., Бабкин И.В., Петрова И.Д., Яшина Л.Н., Малкова Е.М., Петров В.С. Выявление генотипа 1h вируса краснухи в Западной Сибири. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 4: 18-23.

15. Бузицкая Ж.В., Сироткин А.К., Гудкова Т.М., Прочуханова А.Р., Карпов А.В., Цыбалова Л.М. и др. Молекулярно-биологическая характеристика штаммов вируса краснухи, выделенных в Санкт-Петербурге. Молекулярная биология. 2012; 46 (4): 672-6.

16. Лаврентьева И.Н., Семериков В.В., Жербун А.Б., Фельдблюм И.В., Марков А.В. Краснуха в России: изменчивость возбудителя в период вакцинопрофилактики. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008; 3: 26-31.

Поступила 02.08.14

REFERENCES

4. WHO. Update of standard nomenclature for wild-type rubella viruses. Wkly Epidemiol. Rec. 2007; 82: 216-22.

5. Feng Y., Santibanez S., Appleton H. et al. Application of new assays for rapid confirmation and genotyping of isolates of rubella virus. J. Med. Virol. 2011; 83: 170-7.

6. Petrov V.S., Petrova I.D., Tyunnikov G.I., Seregin S.V. A set of oligonucleotide primers to identify RNA rubella virus. Patent RF № 2217501, 2003.

7. Petrova I.D., Tyunnikov G.I., Petrov V.S., Malkova E.M., Smerdova M.A. Development of a method of diagnostics of diseases rubella early in pregnancy. Allergy, asthma and clinical immunology. 1999; 9: 131-5.

8. Frey T.K. Molecular biology of rubella virus. Adv. Virus Res. 1994; 44: 69-160.

9. Hall T.A. Bioedit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. Ser. 1999; 41: 95-8.

10. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl. Acids Res. 1997; 24: 4876-82.

11. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28 (10): 2731-9. doi:10.1093/molbev/msr121

12. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980; 16: 111-20.

13. Petrova I.D., Kazaeva E.V., Malkova E.M., Seregin S.V., Yashina L.N., Tyunnikov G.I. et al. Clinical, serological and molecular biological research of rubella in Novosibirsk in 2006. Infectious diseases. 2007; 5: 16-9.

14. Seregin S.V., Babkin I.V., Petrova I.D., Yashina L.N., Malkova E.M., Petrov V.S. Identification of genotype 1h rubella virus in Western Siberia. Molecular genetics, Microbiology and Virology. 2011; 4: 18-23.

13. Buzitskaya Zh.V., Sirotkin A.K., Gudkova T.M., Prochukhanova A.R., Karpov A.V., Tsybalova L.M. et al. Molecular-biological characteristics of strains of rubella virus allocated in St. Petersburg. Molecular biology. 2012; 46

Recieved 02.08.14

© ЕПИФАНОВА Н.В., 2015 УДК 578.82/.83:578.52].083.2

Епифанова Н.В.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ НОРОВИРУСА ГЕНОТИПА GII.6

ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, 603950, Нижний Новгород

Введение. Норовирусы - этиологические агенты острых кишечных инфекций, в основном относятся к генотипу GII.4. Однако норовирусы других генотипов также играют немаловажную роль в некоторые эпидемические сезоны или в отдельных географических регионах. Норовирус генотипа GII.6 в последние годы становится вторым по значимости после GII.4 этиологическим агентом вспышек норовирусной инфекции. Цель. Охарактеризовать генетические варианты норовирусов генотипа GII.6 на основе филогенетического анализа последовательностей генома норовирусов, представленных в базах данных GenBank и NoroNet, а также выявленных на территории Нижнего Новгорода.

Материалы и методы. Путем секвенирования участка генома, кодирующего N/S-домен капсидного белка VP1, идентифицированы норовирусы генотипа GII.6, циркулировавшие при спорадической заболеваемости, а также обусловившие вспышку острой кишечной инфекции на территории Нижнего Новгорода. С использованием программного обеспечения Mega 5.2 проведен сравнительный филогенетический анализ полученных последовательностей и последовательностей, имеющихся в международных генетических базах данных. Результаты. Подтверждено наличие трех генетических вариантов генотипа GII.6 по гену капсидного белка - GII.6a (Seacroft_1990), GII.6b (Saitama_1997) и GII.6c (Shizuoka_2008) в сочетании с двумя генотипами по гену полимеразы - P6 и P7. Установлена их коциркуляция с 70-х годов прошлого века, что отражает различия в эволюционных процессах между минорными генотипами норовирусов и доминирующим генотипом GII.4, у которого новые эпидемические варианты полностью вытесняют предыдущие в течение нескольких лет. Норовирусы GII.6, циркулирующие в Нижнем Новгороде и в других городах России, относятся к геновариантам GII.6a и GII.6b. Заключение. Наиболее широкое распространение в Азии и Европе в последние годы получили рекомбинантные норовирусы

GII.P7_GII.6c. Норовирусы геноварианта GII.6c в России пока не обнаружены, однако нельзя исключить вероятность их появления в качестве причины вспышек острых кишечных инфекций на территории нашей страны в ближайшее время.

Ключевые слова: норовирус; генотип GII.6; генетические варианты; филогенетический анализ.

Одним из основных этиологических агентов острой кишечной инфекции (ОКИ) человека и животных являются норовирусы - мелкие безоболочечные РНК-содержащие вирусы, относящиеся к роду Norovirus семейства Caliciviridae. Геном норовирусов представляет собой полиаденилированную однонитевую РНК позитивной полярности размером примерно 7,5 тыс. нуклеотидных оснований (н.о.) [1] и организован в 3 открытые рамки считывания (ОРС). ОРС1 кодирует большой полипротеин, который нарезается вирусной протеазой на 6 неструктурных белков, включая РНК-зависимую РНК-полимеразу. ОРС2 и ОРС3 кодируют главный и минорный капсидные белки VP1 и VP2, соответственно [2]. VP1 состоит из N-терминального участка, S-домена (от англ. shell - оболочка), P-домена (от англ. protruding - выступающий) и C-терминального участка. Р-домен, несущий антигенные детерминанты и сайты связывания с клеточными рецепторами хозяина, состоит из субдомена P2 и двух фланкирующих его субдоменов P1-1 и P1-2 [3, 4].

На основе анализа первичной структуры генома в настоящее время норовирусы разделяют как минимум на 5 геногрупп [5]. Ге-ногруппы норовирусов разделяются на генотипы (или кластеры) а те в cвою очередь - на генетические варианты (геноварианты, субкластеры, линии, штаммы) [5, 6]. В рамках международного интернет-проекта NoroNet функционирует автоматическая система типирования норовирусов Norovirus Genotyping Tool Version 1.0, с помощью которой можно определить геногруппу и генотип норовируса на основании анализа нуклеотидной последовательности генома [7, 8]. Для типирования чаще других используют