Оценка мутагенного действия глицифона

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 150, кн. 2 Естественные науки 2008

УДК 575.224.2

ОЦЕНКА МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛИЦИФОНА

Г.В. Черепнев, И.В. Шалашова, А.А. Муслинкин, Б.М. Куриненко

Аннотация

Исследована мутагенная активность противоопухолевого препарата глицифон в тесте Эймса на тестерных штаммах Salmonella typhimurium ТА 1535, ТА 100, ТА 1950 (тип мутации замена пар оснований), ТА 1538, ТА 98 (тип мутации сдвиг рамки считывания) и ДНК-повреждающий эффект в REC-тесте на тестерных штаммах Escherichia coli polAI, recA, uvrA, дефектных по разным путям репарации. Установлено, что гли-цифон, проявляя прямой дозозависимый мутагенный эффект, вызывает достоверное превышение ревертантов над спонтанным фоном, индуцируя преимущественно мутации типа замены пар оснований. В условиях метаболической активации мутагенный эффект препарата существенно не модифицируется.

Показано, что глицифон индуцирует повреждения ДНК, для исправления которых необходимо участие ДНК-полимеразы I и recA зависимого пути репарации. При метаболической активации in vitro микросомальной фракцией печени мышей уровень ДНК-повреждающей активности глицифона повышается.

Ключевые слова: глицифон, мутагенная активность, ДНК-повреждающий эффект, Salmonella typhimurium, Escherichia coli.

Введение

В литературе имеются данные по исследованию действия глицифона на асцитную опухоль Эрлиха у мышей [1]. На культурах тканей препарат оказывает избирательное цитотоксическое действие на опухолевые клетки, вызывая глубокие дистрофические изменения в них, подавление активности окислительновосстановительных ферментов, а также нарушает процесс митоза опухолевых клеток. Препарат ингибирует синтез ДНК, действует на все фазы митотического цикла, блокируя вступление клеток в фазы 8 и М, удлиняя время генерации и индуцируя различные аномалии их деления.

Данные о генотоксичности глицифона в литературе отсутствуют. Вместе с тем известно, что многие лекарственные соединения, используемые в качестве противоопухолевых препаратов в онкологической практике, обладают генотоксическими свойствами (блеомицин, циклофосфамид) [2]. Не являются исключением и вещества из класса фосфорорганических соединений (ФОС), к которым относится глицифон [2-5].

Целью настоящей работы является исследование мутагенной активности глицифона и его возможного ДНК-повреждающего эффекта, а также анализ характера мутагенной активности препарата.

1. Материалы и методы

В работе использовали препарат «Глицифон» (глицифон, ОАО «Татхим-фарм препараты»), синтезированный в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН (г. Казань).

Штаммы Escherichia coli и Salmonella typhimurium получены из Научно-исследовательского института по биологическим испытаниям химических соединений (г. Купавна).

Для определения ДНК-повреждающего эффекта использовали REC-тест [6, 7], основанный на использовании штаммов E. coli, дефектных по разным путям репарации: Wp2 («дикий» тип), E coli polA (нарушен синтез ДНК-полимеразы I), E. coli recA (нарушен синтез RecA), E. coli uvrA (нарушена эксцизионная репарация). ДНК-повреждающий эффект определяли суспензионным методом. Об интенсивности роста культуры судили по ее оптической плотности. Степень влияния вещества на мутантный штамм оценивали по индексу выживаемости Х:

X = (Одеф-100 • КдИК )/(Кдеф • ОдИК),

где Одеф - оптическая плотность дефектного штамма в опыте, Одик - оптическая плотность дикого штамма в опыте, Кдик - оптическая плотность дикого штамма в негативном контроле, Кдеф - оптическая плотность дефектного штамма в негативном контроле.

Индекс выживаемости 0.96-1.00 указывает на отсутствие ДНК-повреж-дающей активности, 0.86-0.98 - на слабую активность, менее 0.85 - на наличие ДНК-повреждающего действия [7].

Для определения мутагенной активности глицифона использовали штаммы Salmonella typhimurium ТА 1535, ТА 100, ТА 1950 (тип мутаций замена пар оснований), и ТА 1538, ТА 98 (тип мутаций сдвиг рамок считывания). Для всех штаммов характерны такие мутации, как rfa (нарушение синтеза наружного липополисахаридного слоя клетки, в результате чего увеличивается проницаемость клеточной стенки и повышается чувствительность тест-системы) [8].

Метаболическую активацию глицифона проводили in vitro [8] и in vivo [9]. Микросомную активирующую смесь для метаболической активации in vitro готовили на основе гомогената фракции печени беспородных белых мышей, для индукции ферментов микросом применяли фенобарбитал. В качестве мле-копитающего-посредника при метаболической активации in vivo использовали мышей. Им одновременно вводили глицифон и тест-культуру. Через 3 ч мышей забивали. Этот срок считается достаточным для окончания процесса метаболизма большинства химических соединений. Индикаторную культуру выделяли из мышей и исследовали на наличие обратных мутаций. Параллельно определяли выживаемость тестерного штамма на полноценной среде после инкубации в хозяине-посреднике. Это дает возможность рассчитать величину индуцированного мутагенеза на одну выжившую клетку. Частоту индуцированного мутагенеза (М) определяли по формуле:

М = (no - nK)/Nв ,

где no - количество клеток-ревертантов в 1 мл в опыте, пк - количество клеток ревертантов в 1 мл в контрольном опыте, NВ - количество выживших клеток в 1 мл в тесте на определение выживаемости в каждом варианте.

Для проверки присутствия в выборке грубых ошибок (промахов) применяли ^-критерий. Для обработки данных по частоте мутаций использовали доверительный интервал для доли [10].

2. Результаты и обсуждение

Предварительно было изучено токсическое действие препарата на штаммах Salmonella typhimurium. Испытанный диапазон концентраций (10-1, 10-2, 10-3, 10 ) хорошо подходит и для оценки мутагенной активности препарата, так как только при концентрации 10 мкг/на чашку выживаемость тест-культуры снижается до 25 ± 3%. При концентрации на порядок ниже процент выживших клеток близок к контролю. Самая низкая из исследованных концентраций обладает стимулирующим эффектом, что характерно для большинства типичных мутагенов (универсальный биологический эффект) [11].

Согласно полученным данным, глицифон проявляет прямой дозозависимый мутагенный эффект на штаммах Salmonella typhimurium, которые имеют мутации типа замены пар оснований, и в наивысшей концентрации 103 мкг/на чашку вызывает превышение в 27 раз над числом спонтанных ревертантов (данные не приведены). Это позволяет классифицировать глицифон как мутаген средней силы. В то же время на штаммах, ревертирующих к прототрофности путем сдвига рамки считывания, мутагенной активности глицифона выявить не удалось.

Химические соединения, проходя через метаболическую систему организма, образуют различные метаболиты, которые могут значительно отличаться по своим свойствам от исходного соединения, в том числе и по мутагенности. Данные по исследованию мутагенной активности глицифона при метаболической активации in vitro представлены на рис. 1 и 2.

В ходе эксперимента было установлено, что глицифон обладает дозозависимым мутагенным эффектом с увеличенной частотой реверсий максимально в 7-10 раз, действуя на штаммы с мутацией типа замены пар оснований (рис. 1). Таким образом, в этом случае глицифон проявил себя как слабый мутаген. Видимо препарат, подвергаясь действию метаболических ферментов печени мыши, образует метаболиты с меньшей степенью мутагенности, чем он сам. Мутагенная активность глицифона на штаммах Salmonella typhimurium с мутацией типа сдвига рамки считывания в исследуемом диапазоне концентраций не выявлена (рис. 2).

Анализируя данные, полученные без метаболической активации и с метаболической активацией in vitro, можно сделать вывод, что глицифон вызывает преимущественно мутации типа замены пар оснований. Это хорошо согласуется с тем, что большинство ФОС обладает подобным типом мутагенной активности [2, 12].

Концентрация, мкг/на чашку

Рис. 1. Определение мутагенной активности глицифона на штаммах Salmonella typhi-murium ТА 98 и ТА 1538

н

о

—л— ТА 1535 —ТА 100 Штриховкой показан уровень спонтанных ревертантов

Концентрация, мкг/на чашку

Рис. 2. Определение мутагенной активности глицифона на штаммах Salmonella typhi-murium ТА 100 и ТА 1535

При метаболической активации глицифона in vivo с использованием штамма Salmonella typhimurium ТА 1950 было установлено, что он оказывает дозозависимый мутагенный эффект, вызывая значительное превышение числа ревертантов над спонтанным фоном мутирования. Частота индуцированного мутагенеза для глицифона (5—8-10-8) сопоставима с частотой индукции мутаций в аналогичных условиях для противоопухолевого препарата циклофосфана (табл. 1).

Ранее было показано, что циклофосфан может повышать частоту хромосомных аббераций в культуре ткани и индуцировать генные мутации у различных тест-объектов [5, с. 371-377]. При сравнении циклофосфана с глицифоном видно, что последний обладает более сильным мутагенным эффектом.

Результаты оценки ДНК-повреждающего эффекта представлены в табл. 2. Чувствительность штаммов E. coli recA и polAI к действию глицифона достаточно велика: индекс выживаемости составляет менее 0.85, что говорит о наличии ДНК-повреждающего действия. Чувствительность штамма E. coli uvrA при действии глицифона оказалась близкой к чувствительности штамма дикого типа.

Табл. 1

Мутагенное действие глицифона и циклофосфана на Salmonella typhimurium ТА 1950

Глицж юн Циклофосфан

Конц, мг/кг Выживаемость бактерий (в % от контроля) Частота мутаций • 10-8 Конц, мг/кг Частота мутаций • 10 8

Опыт 1 Опыт 2 Опыт 1 Опыт 2 Опыт 1 Опыт 2

0 98 100 1.б і 0.42 0.5 і 0.03 0 1.95 і 0.45 2.22 і 0.41

б0 7б.1 б0.9 1.5 і 0.44 3.3 і 0.35 200 5.б9 і 0.54 11.б0і1.25

120 Зб.8 21.2 8.4 і 0.74 5.4 і 0.37 400 б.41 і 1.00 15.8бі1.25

Аналогичную чувствительность мутанты E. coli иугЛ проявляют в отношении монофункциональных алкилирующих агентов: метилметансульфоната, этилме-тансульфоната, блеомицина и др. [13].

Известно, что мутанты E. coli иугЛ не могут осуществлять эксцизию «грубых» повреждений, блокирующих репликацию ДНК [13], а при воздействии гли-цифоном рост мутантного штамма не угнетается. Таким образом, очевидно, что глицифон вызывает другой тип повреждений - модифицирует (возможно, ал-килирует) основания, не блокирующие синтез ДНК, но дающие ошибки в репликации и требующие для своего исправления функционирования не генов иугЛ, а других, ответственных за пострепликативную репарацию, таких, как гесА, и др.

Известно, что тип возникающих мутаций непосредственно связан с типом мутагенеза, причем в случае ошибок репликации возникают мутации преимущественно типа замены пар оснований [13], которые в то же время характерны и для мутагенной активности глицифона. Это косвенно подтверждает наше предположение о том, что глицифон индуцирует повреждения, вызывающие ошибки, для исправления которых необходима пострепликационная репарация.

Известно, что в мутантах E. шИ гесА почти полностью отсутствует процесс пострепликативной репарации [6]. Тогда, анализируя все вышесказанное, можно предположить, что клетки этого штамма будут особенно чувствительны к действию глицифона. Экспериментальные данные подтверждают это предположение. Выживаемость штамма E. шИ гесА была намного меньше, чем выживаемость штамма дикого типа (табл. 2). По-видимому, это указывает на исключительную важность процессов пострепликативной репарации для устранения повреждений, наносимых глицифоном, и на то, что алкилирование молекулы ДНК играет важную роль в индукции мутаций глицифоном.

Метаболическая активация глицифона приводит к следующему интересному факту. Штамм E. шИ иугЛ, у которого поврежден путь эксцизионной репарации, был не чувствителен к действию глицифона (табл. 2). Но после метаболической активации штамм становится чувствительным к действию препарата. При концентрации 103 мкг/мл индекс выживаемости составляет 0.33, что свидетельствует о значительном ДНК-повреждающем эффекте (табл. 3). Возможно, метаболическая активация глицифона приводит к образованию метаболитов, вызывающих повреждения ДНК, в исправлении которых необходимо участие эксцизионного пути репарации.

Табл. 2

ДНК-повреждающий эффект глицифона в репарационном (суспензионном) тесте со штаммами E. coli

Глицифон, мкг/мл Индекс выживаемости

uvrA polAI recA

10 0.9 0.7 0.83

102 1.0 0.62 0.83

103 0.95 0.5 0.16

104 0.97 0.37 0.10

Табл. 3

ДНК-повреждающий эффект глицифона при метаболической активации in vitro

Глицифон, мкг/мл Индекс выживаемости

uvrA polAI

10 1.0 0.90

102 1.0 0,8

103 0.33 0.21

Заключение

Таким образом, первичная оценка генетической активности глицифона позволяет классифицировать его как слабый мутаген, об этом свидетельствуют данные теста Эймса. Глицифон обладает также ДНК-повреждающим эффектом, выявленным в репарационном тесте. Характер действия глицифона связан с его способностью алкилировать основания ДНК, что приводит к мутациям типа замены пар оснований. В свою очередь, метаболическая активация глицифона приводит к образованию метаболитов, обладающих даже более широким спектром возможных повреждений ДНК, что хорошо согласуется с общеизвестными свойствами эпоксидных соединений.

Summary

G.V. Cherepnev, I.V. Shalashova, А.А. Muslinkin, B.M. Kurinenko. Evaluation of Glici-fon Mutagenic Action.

The mutagenic activity and the DNA-damaging effect of the antitumour preparation glicifon were studied. As tester bacteria in our research we used Salmonella typhimurium ТА 1535, ТА 100, ТА 1950 strains (mutation type is base pair substitution), тА 1538, ТА 98 (reading frame mutations) for Ames test and Escherichia coli polAI, recA, uvrA strains that have the defects in the different reparation ways for REC-test. Glicifon was stated to cause reliable increase of revertants under the spontaneous mutation level mainly inducing the base pair substitution. This effect has dose-dependent relationship. After metabolic activation the glicifon effect is not modified.

Glicifon is showed to induce the DNA damages that need DNA-polymerase and the recA dependent recombination for reparation. After metabolic activation the level of glicifon DNA-damaging activity increases.

Key words: glicifon, mutagenic activity, DNA-damaging effect, Salmonella typhimurium, Escherichia coli.

Литература

1. Дубинская С.Н., Зеленкова Н.П., Студенцова И.А. Клеточные механизмы антибла-стомного действия глицифона // Фармакология и токсикология фосфорорганиче-ских и других биологически активных веществ: Тез. докл. Рос. конф., посв. 75-летию проф. И.В. Заиконниковой. - Казань: Изд-во Казан. гос. мед. ун-та, 1996. -Вып. 3. - С. 95-96

2. Сьяксте Т.Г., Сьяксте Н.И. Химические соединения, повреждающие ДНК. - Рига: Зинатне, 1991. - 152 c.

3. Сусков И.И., Сазанова Л.А. Мутагенные эффекты химических соединений у человека // Усп. совр. генетики. - 1983. - Т. 11, № 93. - С. 81-86

4. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Акиньшина Л.П., Зехнов А.И. Изучение мутагенного действия лекарственных препаратов на индикаторные бактерии // Хим.-фарм. журн. - 1978. - Т. 1, № 39. - С. 44-50.

5. Шапиро А.А., Фонштейн Л.М. Изучение мутагенного действия циклофосфана на бактериях в опытах с млекопитающим-посредником. - М.: Изд-во АН СССР, 1979. -114 с.

6. Slater E.E, Anderson M.D., Rosenkranz H.S. Rapid Detection of Mutagens and Carcinogens // Cancer Res. - 1971. - V. 31, No 7. - P. 970-973.

7. Ильинская О.Н., Маргулис А.Б. Краткосрочные тест-системы для определения ге-нотоксичности. - Казань: Изд-во Казан. ун-та, 2005. - 31 c.

8. Ames B.N., Lee F.D., Durston W.E. An improved bacterial test system for detection and classification of mutagens and carcinogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1973. -V. 70, No 3. - P. 782-786.

9. Gabridge M.G., Legator M.S. A host-mediated microbial assay for the detection of mutagenic compounds // Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. - 1969. - V. 130. - P. 831-834.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 350 с.

11. Рапопорт Н.А. Открытие химического мутагенеза. Избранные труды. - М.: Наука, 1993. - 302 c.

12. Фронштейн Л.М., Ревазонова Ю.А., Винклер Г.Н. О некоторых подходах к оценке мутагенной активности лекарственных препаратов // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. - М.: Наука, 1977. - C. 42-47.

13. Тарасов В. А. Молекулярные механизмы репарации и мутагенеза. - М.: Наука, 1982. -226 c.

Поступила в редакцию 28.02.08

Черепнев Георгий Викторович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией иммунологии Республиканской клинической больницы РТ, г. Казань.

Шалашова Ирина Валентиновна - выпускник кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: irn-bry@yandex.ru

Муслинкин Абдурахим Абдурахимович - кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазИЦ РАИ, г. Казань.

Куриненко Борис Михайлович - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Boris.Kurinenko@ksu.ru