Способ определения комплексной диэлектрической проницаемости биологической клетки в суспензии
METHOD OF DETERMINING COMPLEX PERMITTIVITY OF A BIOLOGICAL CELL IN SUSPENSION

Изобретение относится к способам определения диэлектрической проницаемости биологических частиц, клеток, бактерий, вирусов и может быть использовано в биофизике, медицине, микробиологии, вирусологии и биотехнологии.
Одной из фундаментальных функций клетки, которые она приобрела в процессе эволюции, является ее непрерывная адаптация к внешним условиям. Клетка чутко реагирует на любые изменения внешних условий. Радиус клетки, объем, водно-солевой баланс клетки, напряженность электрического поля на ее мембране изменяются в ответ на воздействия со стороны вирусов, бактерий, свойств ионной силы клеточной суспензии и др. Важнейшим свойством, но уже совокупности клеток является их гетерогенность (неоднородность). Клетки отличаются между собой по множеству параметров в одних и тех же условиях. Например, одним из показателей гетерогенности эритроцитов является их распределение по объему в произвольной выборке. Утрата адаптации клеток к внешним условиям, отсутствие гетерогенности в клеточной популяции приводит к прекращению их существования.
кл
Клетка обладает диэлектрической проницаемостью, которая зависит от совокупности ее физико-химических свойств (проводимости, плотности, вязкости, изотропности, агрегатного состояния, температуры) сложно структурированных мембран, цитоплазмы, эндоплазматической сети, поляризации свободных и связанных ионов, белков и др. Диэлектрическая проницаемость оценивается абсолютной и относительной величинами. Относительная диэлектрическая проницаемость клетки ε показывает во сколько раз напряженность поля в ней (в однородном диэлектрике) меньше, чем в вакууме. Диэлектрическая проницаемость клеточной мембраны и клетки в целом, ее широкополосная  дисперсия, как вариант реагирования на изменяющиеся условия внешней среды, относятся к фундаментальным характеристикам клетки. В случае утраты клеткой своей физической, биологической сущности, разрыва мембраны, характеристика дисперсии ее диэлектрической проницаемости в области переменного электрического поля также теряет смысл. Данные о диэлектрических свойствах веществ и их дисперсии в широком диапазоне частот необходимы в фундаментальных исследованиях, при разработке различных технологий, приборов, конструкций и т.д. Однако в большинстве биологических исследований оценивается только диэлектрическая проницаемость тканей и суспензий клеток. Это существенно ограничивает возможность оценки диэлектрической проводимости, так как она значительно изменяется при изменении активности ионных каналов мембраны и ферментов, обеспечивающих ротацию фосфолипидов мембраны, экспрессии белков и рецепторного аппарата на мембране, при возбуждении клетки, изменении ее формы, влиянии внешних факторов и сигналов. Любая суспензия и ткань содержит часть возбужденных клеток, часть юных и отмирающих клеток [1]. В связи с этим необходимо оценивать не только диэлектрические свойства суспензии клеток или тканей, но и характеристики отдельных клеток.
Исследование диэлектрических свойств клетки открывают широкие возможности в оценке различных патологических состояний живых организмов, в разработке новых технологий в области медицины, вирусологии, биотехнологии [2].
Предшествующий уровень техники. Методы измерения диэлектрической проницаемости в области низких частот реализуются с помощью электронных приборов, в состав которых входят элементы с сосредоточенными параметрами (резисторы, конденсаторы, катушки индуктивности). Чтобы получить данные о диэлектрических свойствах вещества используют ряд инструментальных методов по двум основным направлениям:
- изучение реакции исследуемого вещества на перепад или линейный рост напряжения, тока;
- исследование амплитудно-частотной зависимости импеданса [3, 4].
х
о
Метод замещения основан на последовательном сравнении влияния искомой электрической емкости С и известной емкости С на режим работы измерительного прибора [4].
х
x
2
3
1
x
(1÷3)
x
x
x
х
х
Мостовой метод предусматривает определение величины искомой емкости С, включенной в одно из плеч измерительной мостовой схемы при условии баланса (равновесия) моста ZZ = ZZ. Сопротивления Z и Z представляют собой комплексные сопротивления вида Z = R+jX в каждом плече моста. Из равенства Х = 1/ωС находится искомая величина емкости конденсатора. В качестве индикатора баланса мостовой схемы используются осциллографы, вольтметры, гальванометры и др. [4].
Метод нулевых биений строится на сравнении между собой параметров колебаний от двух независимых генераторов в электрическом контуре. Близкие, но не равные частоты колебаний формируют биения, амплитуда которых медленно изменяется во времени. Биения полностью прекращаются, если частоты генераторов равны между собой с точностью до фазы. Метод позволяет проводить измерения диэлектрической проницаемости ε вещества с высокой точностью [2].
С повышением частоты величина диэлектрической проницаемости вещества уменьшается [2, 5]. В области сверхвысоких частот используются радиотехнические устройства с распределенными параметрами. Среди них коаксиальная линия, волновод, диэлектрические линии передач и д.р. Применительно к каждому устройству измерения диэлектрической проницаемости имеются свои теоретические методические отличия, связанные, например, с конструктивными особенностями и приемами согласования линии, заполнения измерительного объема [3, 5].
Недостатком всех выше перечисленных методов и устройств является невозможность измерения диэлектрической проницаемости для отдельно наблюдаемой клетки, частицы микронного размера. Кроме того, выше приведенные способы не предусматривают измерение параметров отдельной живой биологической клетки в суспензии, что сужает сферу их применения.
Известен способ определения диэлектрической проницаемости аэрозольной частицы [6]. Способ включает формирование измерительного объема между двумя электродами конденсатора, соединенными с источником переменного напряжения с частотой ~ 50 Гц, диспергирование в газообразный измерительный объем микрочастицы, измерение параметров взаимодействия частицы с электрическим полем и последующее вычисление ее диэлектрической проницаемости.
Недостатком известного технического решения является отсутствие контроля за поведением частицы в измерительном объеме. Кроме того, указанный способ не предусматривает измерение параметров живой биологической клетки в суспензии, что сужает сферу его применения.
Существующие современные технологии манипуляции единичными клетками микронного размера используются для уникальных операций в области медицины, генетики, а также клеточных исследований. Кроме того они, как правило, выполняются специалистами высокой квалификации, отличаются значительными временными и материальными затратами [7].
m
мч
m
мч
4
6
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ определения параметров микрочастицы, в частности измерения массы живой клетки эритроцита в суспензии (патент РФ №2614735, МПК G01N 33/483, опубл. 28.03.2017 г.) [8], включающий формирование измерительного объема между двумя электродами, соединенными с источником переменного напряжения для формирования переменного электрического поля и расположенными в камере с жидкостью, диспергирование в измерительный объем частицы, измерение параметров взаимодействия частицы с электрическим полем и последующее вычисление ее массы, отличающийся тем, что между электродами формируют неоднородное переменное электрическое поле (НПЭП), а в качестве жидкости используют жидкую среду с низкой электропроводностью с заданной температурой (Т) и характеристиками, не меняющими биохимические свойства и физические параметры частицы, причем частицу приводят в возвратно-поступательное движение с заданной амплитудой X, равной (0,5÷0,6) расстояния между электродами в измерительном объеме под действием неоднородного переменного электрического поля со средней напряженностью Е~10÷10 В/м, напряжением 4÷8 В и частотой в диапазоне 1÷18 Гц, проводят съемку видеоизображения возвратно-поступательного перемещения частицы между электродами в измерительном объеме, обрабатывают видеоизображение компьютерной программой с получением данных о радиусе частицы r, частоте (f) и амплитуде ее колебания (X) между электродами, рассчитывают программными средствами скорость (ν) возвратно-поступательного движения частицы в соответствии с уравнением
мч
а массу (m) частицы вычисляют программными средствами в соответствии с уравнением:
где:
-23
K - постоянная Больцмана, физическая постоянная 1,38 10 [Дж/K], определяющая связь между температурой и энергией;
T - температура [K];
np
ж
мч
3
m = (2/3)ρπ r - присоединенная масса частицы [кг];
ж
3
ρ - плотность жидкости, в которой находится частица в форме шара [кг/м];
мч
r - радиус частицы [м];
π=3,14.
В качестве жидкой среды используют дистиллированную воду при определении массы микрочастицы, представляющей собой латексную частицу или отдельную спору бактерий, или 0,3 М раствор сахарозы при определении массы микрочастицы, представляющей собой отдельный эритроцит животных или отдельную вегетативную клетку бактерий.
Однако указанный способ не предусматривает определение такого параметра биологической клетки как ее комплексной диэлектрической проницаемости в суспензии.
Техническим результатом является обеспечение возможности определения комплексной диэлектрической проницаемости живой биологической клетки, например, эритроцита в суспензии.
р
р
р
кл ср
кл
кл
ср
р
Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения комплексной диэлектрической проницаемости биологической клетки в суспензии 0,3 М раствора сахарозы, включающем размещение указанной клетки с суспензией между электродами измерительной ячейки и создание в НПЭП, в котором измеряют параметры взаимодействия указанной биологической клетки с НПЭП, согласно изобретения, на этапе взаимодействия биологической клетки с НПЭП проводят поиск равновесной частоты ω, на которой полностью прекращается поступательное движение биологической клетки в суспензии относительно электродов измерительной ячейки и ее вращательное движение вокруг собственной оси в неоднородном переменном электрическом поле путем изменения частоты его переменного напряжения и измерения указанной равновесной частоты ω посредством частотомера, определение на указанной равновесной частоте ω удельного сопротивления суспензии биологических клеток ρ мостовым методом, а также с помощью компьютерной программы производится вычисление радиуса биологической клетки r, через уравнение емкости плоского конденсатора и комплексной диэлектрической проницаемости ε* клетки как корень квадратный от суммы квадратов действительной и мнимой части относительной диэлектрической проницаемости ε клеточной суспензии на равновесной частоте ω, отражающей функциональную активность и изменение гомеостаза клетки.
Согласно уравнению (1), сила  которая приводит клетку в поступательное движение в НПЭП, равна нулю при условии равенства комплексных величин  [9]
cp
где: ε - диэлектрическая проницаемость среды [б/р];
кл
r - радиус клетки [м];
- комплексная диэлектрическая проницаемость среды [б/р];
- комплексная диэлектрическая проницаемость клетки [б/р];
кл, ср
ρ - удельное сопротивление клетки, среды [Ом м];
ω - круговая частота электрического поля [Рад/с];
π - постоянная величина 3,14;
o
-12
ε - диэлектрическая постоянная 8,85⋅10 [Ф/м];
2
3
- градиент квадрата напряженности электрического поля среды [В/м].
Согласно уравнению (2), сила, которая приводит клетку во вращательное движение вокруг собственной оси в НПЭП, равна нулю также при условии равенства комплексных величин  [9]
где:  - фактор Клаузиуса-Мосотти [б/р].
Таким образом, в случае равенства  поступательное и вращательное движение клетки в НПЭП прекращаются.
Комплексная диэлектрическая проницаемость клетки и среды являются частотно-зависимыми величинами от параметра ω в силу их различных физико-химических свойств и других многочисленных факторов. В результате на некоторых частотах переменного электрического поля их величины могут сравняться между собой. Известно, что два комплексных числа равны между собой при условии равенства их действительной и мнимой части [9]. Это равенство позволяет измерить параметры среды и перенести их величины на характеристики наблюдаемой клетки на равновесной частоте. Оно позволяет подготовить клеточную суспензию в объеме, достаточном для измерения ее диэлектрической проницаемости, удельного сопротивления любым доступным методом (замещения, мостовым, биения), и является математической основой в техническом решении изобретения. Таким образом, чтобы определить величину комплексной диэлектрической проницаемости наблюдаемой клетки  необходимо:
ср
ср
р
p
- измерить действительную относительную диэлектрическую проницаемость s'' и удельное сопротивление ρ клеточной суспензии на равновесной частоте ω = 2πf;
cp
- рассчитать мнимую относительную диэлектрическую проницаемость среды s';
кл
- рассчитать комплексную диэлектрическую проницаемость ε* согласно выражению
На фиг. 1 представлена функциональная схема измерительно-вычислительного комплекса для реализации способа определения комплексной диэлектрической проницаемости биологической клетки в суспензии. На фиг. 2 представлена схема измерительной ячейки для реализации способа определения комплексной диэлектрической проницаемости биологической клетки в суспензии.
Пример. Способ определения комплексной диэлектрической проницаемости биологической клетки в суспензии
Для определения относительной диэлектрической проницаемости эритроцита использовалась кровь волонтеров с одобрения Этического Комитета Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательского института терапии и профилактической медицины» (протокол заседания от 01.11.2016). Все волонтеры дали информированное согласие на участие в работе в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
Для проведения измерений у обследуемого натощак кровь объемом 2 мл забирали вакутейнерами в 3,7% цитратный буфер в соотношении 9:1, через 1 час кровь вносили в 0,3 М раствор сахарозы (рН 7,4) в соотношении 1:30. Сразу после разведения проводились измерения удельного электрического сопротивления клеточной суспензии, температуры клеточной суспензии.
Перед измерениями проводилась подготовка измерительного вычислительного комплекса (ИВК). ИВК включает следующие приборы и устройства (фиг. 1):
- компьютер (1) для регистрации потока видеоизображения и обработки потока информации от видеокамеры, расчета характеристик электрического поля в измерительной камере, расчета параметров клетки, хранения видео-файлов и результатов расчета параметров клетки, управления работой (включение/выключение) видеозаписи по заданной программе;
- монитор (2) компьютера;
- осциллограф (3) Актаком ADS2111MV для регистрации переменного напряжения на электродах измерительной ячейки;
- генератор (4) переменного напряжения Г3-112/1, обеспечивающий управляемую генерацию переменного напряжения U с заданной амплитудой и частотой в ручном режиме;
- ртутный термометр (4) 0-50°С для измерения температуры клеточной суспензии;
- микроскоп (5) Микмед-6 для наблюдения за клеткой и ее реакцией в измерительной камере в ответ на действие НПЭП;
- комплекс визуализации (6) МС-14 для трансляции потока видеоизображения клетки через микроскоп в компьютер о динамике ее движения в измерительной камере;
- объект микрометры (7) ОМ-О, ОМ-П для калибровки ИВК и измерения линейных размеров клетки, расстояния между электродами измерительной камеры;
- усилитель (8) переменного напряжения Г3 112/1, обеспечивающий генерацию переменного напряжения U с заданной амплитудой от генератора ГСПФ-053;
- измерительную ячейку (9);
- частотомер (10) Ч3-63/1 для измерения величины равновесной частоты клетки в неоднородном переменном электрическом поле измерительной ячейки;
- кондуктометр (11) EC/TDS/Temp СОМ 100 для измерения удельного сопротивления клеточной суспензии.
Измерительная ячейка (9) содержит (фиг. 2): основание, выполненное в виде стеклянной пластины (12), на которой имеются металлические электроды (13) с зазором относительно друг друга для образования измерительной камеры (14). Электроды (13) с измерительной камерой (14) накрыты покровным стеклом (15).
Перед измерениями осуществляется подготовка рабочего места, посуды, автоматических пипеток, покровных стекол, дистиллированной воды, 0,3 М водного раствора сахарозы с 5 мМ NaCl, а также измерительной ячейки. Подготовка к работе микроскопа, видеокамеры, генератора, усилителя кондуктометра, частотомера, комплекса визуализации МС-14 и осциллографа проводится согласно соответствующим инструкциям по эксплуатации. Рабочее место включает лабораторный стол, на который устанавливают компьютер, монитор, усилитель, микроскоп, штатив с пробирками, пипетками, носиками к пипеткам, покровными стеклами с размером 18*18 мм и пинцет. На рабочем месте устанавливается три химических стакана с дистиллированной водой (100 мл), спиртом (50 мл) и для сбора отходов (250÷500 мл).
В ходе подготовки к измерениям необходимо обеспечить чистоту используемой посуды, а также рабочего места.
кл
Способ определения комплексной диэлектрической проницаемости клетки (ε*) включает следующую последовательность действий:
- подготовка 0,3 М водного раствора сахарозы;
- подготовка измерительной ячейки. Ячейку тщательно промывают последовательно спиртом, дистиллированной водой и затем помещают в сушильный шкаф при температуре 60°С, до полного испарения воды (фиг. 2);
- забор цельной крови у пациента;
- подготовка клеточной суспензии. Разведение цельной крови в растворе 0,3 М сахарозы в 30 раз. Измерение удельного сопротивления и температуры суспензии клеток с помощью кондуктометра EC/TDS/Temp СОМ 100;
- установка и фиксация измерительной ячейки на подвижный стол микроскопа Микмед-6. Ячейка жестко закрепляется на подвижном столе микроскопа так, чтобы щель между электродами находился в центре поля зрения микроскопа;
- электроды измерительной камеры подключают к "выходу" усилителя Г3 112/1;
- на микроскоп устанавливают окуляр и объектив, обеспечивающие режим "план" с увеличением 10×60*0,85. Настройка освещения, фокусировка на клетку осуществляется таким образом, чтобы на экране монитора компьютера ИВК наблюдалось сфокусированное изображение клетки с выраженной яркостью, контрастностью, а также граней электродов измерительной ячейки;
- внесение клеточной суспензии в измерительную камеру под покровное стекло. Фокусировка микроскопа на произвольную наблюдаемую клетку между электродами;
- включение программы ИВК и запись видеофайла поведения клетки в неоднородном переменном электрическом поле с помощью компьютера;
- включение генератора Г3-112/1 и подача непрерывного гармонического напряжения амплитудой 8 В на электроды измерительной камеры. Регистрация напряжения с помощью осциллографа. Предварительная установка частоты переменного напряжения устанавливается в диапазоне 100÷1000 кГц. Наблюдение за поведением клетки. Поиск равновесной частоты путем изменения частоты генератора напряжения ручной регулировкой;
- измерение величины равновесной частоты с помощью частотомера Ч3-63/1;
- определение радиуса клетки с помощью компьютерной программы ИВК [11];
ср
- измерение относительной диэлектрической проницаемости суспензии клеток ε мостовым методом.
Измерение осуществляется прецизионным анализатором компонентов 6430В, Wayne Kerr Eltctronics Ltd. Базовая погрешность измерения сопротивления анализатором составлет не более 0,02%. Относительная диэлектрическая проницаемость находится через уравнение емкости плоского конденсатора. Суспензия клеток перед измерением размещается в стеклянной измерительной трубке в форме цилиндра с размерами: длинна - 77,4 мм, радиус 4 мм.
- внесение экспериментально измеренных величин в таблицу 1;
- расчет величины комплексной диэлектрической проницаемости и клетки согласно уравнению (3).
Таким образом, выше приведенный пример осуществления заявляемого способа подтверждает достижение заявляемого технического результата, а именно: обеспечение возможности определения комплексной диэлектрической проницаемости живой биологической клетки, например, эритроцита в суспензии, что открывает более широкие возможности в оценке различных патологических состояний живых организмов, в разработке новых технологий в области медицины, вирусологии, биотехнологии [2].
Источники научно-технической и патентной информации
1. Lisin R, Ginzburg В Z, Schlesinger М, Yuri Feldman. Time domain dielectric spectroscopy study of human cells. I Erythrocytes and ghosts // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - Vol. 280. - P. 34-40.
2. Генералов B.M., Кручинина M.B., Дурыманов А.Г., Медведев А.А., Сафатов А.С., Сергеев А.Н., Буряк Г.А., Курилович С.А., Громов А.А. Диэлектрофорез в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний. - Новосибирск: Церис, 2011. - 172 с.
3. Ахадов Я.Х. Диэлектрические свойства чистых жидкостей. - М.: Изд-во стандартов, 1972. - 412 с.
4. Седунов Б.И. Франк-Каменецкий Д.А. Диэлектрическая проницаемость биологических объектов // Успехи физических наук. - 1963. - Т. LXXIX, Вып. 4. - С. 617-639.
5. Шестопалов В.Д., Яцук К.П. Метод измерения диэлектрической проницаемости веществ на сверхвысоки частота // Успехи физических наук. - 1961. Т. LXXIV, Вып. 4. - С. 712-755.
6. Пат. Германии МПК G01N 15/00 Vorrichtung zur Massenbestimmung von Aerosolpartikeln: Annette Schafmeister. - №102011056045: Заявл. 05.12.2011: Опубл. 05.09.2013 г.
7. Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия (теоретические и практические подходы): Руководство для врачей / под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2000. - 782 с.
8. Патент РФ №2614735, МПК G01N 33/483, опубл. 28.03.2017 г. (прототип).
9. Hughes М.Р. Nanoelectromechanics in Engineering and biology. - Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC PRESS Boca Raton, 2003. - 320 p.
10. Свешников А.Г., Тихонов A.H. Теория функций комплексной переменной. - М.: Наука, 1970. - 304 с.
11. Генералов К.В, Кручинина М.В., Генералов В.М., Шувалов Г.В. Свидетельство о государственной регистрации программы ЭВМ №2016618155 Дата гос. регистрации 22.07.2016 г.
12. Физические величины. Справочник / Под ред. И.С. Григорьева, Е.З. Мейлихова. - М.: Энергоатомиздат, 1991. - 1232 с.