АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ И АНТИМИКОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ СОЛЕЙ ФОСФОНИЯ И ЗАМЕЩЕННОГО БЕНЗОФУРОКСАНА
ANTIBACTERIAL AND ANTIMYCOTIC COMPOSITION OF WIDE SPECTRUM OF ACTION OF PHOSPHONIUM SALTS AND SUBSTITUTED BENZOFUROXANE

Изобретение относится преимущественно к медицине, а именно к антибактериальным и антимикотическим средствам широкого спектра действия, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов при лечении различных инфекционных заболеваний.
Антибактериальные и антимикотические лекарственные препараты широкого спектра действия с успехом применяются при лечении заболеваний, вызываемых микроорганизмами, в дерматовенерологии, хирургии, фтизиатрии, пульмонологии, ЛОР-практике, урологии, в клинике инфекционных болезней и других областях медицины, а также в ветеринарии. Однако все еще остается актуальной проблема изыскания новых эффективных отечественных препаратов для лечения большого количества инфекций. На сегодняшний день наблюдается прогрессивное нарастание устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым антибиотикам, антибактериальным и антимикотическим лекарственным препаратам, что обусловливает необходимость изыскания комбинированных антибактериальных средств, способных противостоять формированию устойчивых штаммов.
Известные антибактериальные природные, синтетические и полусинтетические антибиотики по химической структуре делятся на производные пенициллина, цефалоспорина, рифампицина, тетрациклина и т.д. Известны многочисленные синтетические препараты данной группы: сульфаниламиды, нитрофураны и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна. Т 2. - 2008]. Недостатками всех известных отечественных и зарубежных антибактериальных препаратов являются:
- низкая эффективность вследствие узкого спектра действия при смешанных инфекциях, с выделением различных микробных ассоциаций, как это имеет место при перфоративных процессах в брюшной полости или заболеваниях дыхательного тракта, мочевыводящих путей, особенно после инструментального обследования;
- быстрое развитие устойчивости к лекарственным препаратам;
- быстрое развитие грибковой микрофлоры вплоть до генерализованных микозов;
- высокие лечебные дозы;
- отсутствие препаратов, сочетающих антибактериальное и антимикотическое действие.
Синтез новых биологически активных соединений для профилактики и лечения бактериальной и микотической инфекции и создание новых фармацевтических композиций является актуальной задачей фармацевтической химии.
Задачей заявленного технического решения является создание эффективного препарата нового поколения одновременного антибактериального и антимикотического лечебного действия преимущественно для ветеринарии, обладающего характерным комплексом свойств:
- широким спектром антибактериального и одновременно антимикотического действия на патогенную микрофлору: Escherichia coli, Salmonella paratyphi В, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida Albicans;
- высокой проникающей способностью и, как следствие, низкими лечебными дозами.
Техническим результатом заявленного технического решения является создание новой композиции, обладающей высокой антибактериальной и антимикотической активностью при низких (10 мг на 1 мл) лечебных дозах.
Заявленный технический результат достигается применением фармацевтической композиции, содержащей галоидную соль фосфония с высшим алкильным радикалом и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан в качестве активных компонентов в эквимольном соотношении (при весовом соотношении активных компонентов 1:1).
Важно, что используемые соли четвертичного фосфония являются устойчивыми амфифильными детергентами, межфазными катализаторами, работающими как в водной, так и жировой фазе и, как следствие, хорошими проникающими агентами через биомембраны («мембранный якорь»).
Как показано в наших работах и в работах других авторов, производные бензофуроксанов обладают широким спектром биологической активности, например акарицидной и бактерицидной [пат. РФ 2255935, опубл. 10.07.2005], а также фунгицидной [пат. РФ 2032678, опубл. 10.04.1995]. Например, предложено их использование для лечения стенокардии [заявка РФ 2000132204, опубл. 10.11.2002; заявка РФ 2000132206, опубл. 20.10.2002].
При этом известны из наших работ антибактериальные и противогрибковые свойства приведенных выше солей фосфония [Галкина И.В., Тудрий Е.В., Бахтиярова Ю.В., Егорова С.Н., Галкин В.И. Синтез, строение и исследование биологической активности солей фосфония. / В сб.: Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. - Казань, 2008. - С.23; Pat. JP 2002308713, publ. 23.10.2002; Pat. JP 2005060332, publ. 10.03.2005; Pat. JP 2000316701, publ. 21.11.2003].
Сущность заявленного технического решения заключается в создании комбинированной антибактериальной и антимикотической фармацевтической композиции, содержащей галоидные соли четвертичного фосфония и замещенные бензофуроксаны в качестве активных компонентов при их эквимольном соотношении.
Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом:
1. Получают первый компонент заявляемой композиции - галоидную соль четвертичного фосфония общей формулы (I) способом, описанным в [Старкс Ч.М. Межфазный катализ. Химия, катализаторы и применение. / Ред. Ч.М.Старкс.М.: Химия, 1991.- 157 с.]:
1
2
4
9
6
5
12
25
14
29
16
33
где R=СН, СН; R=СH, СН, СН; Hal=Сl, Вr.
2. Получают второй компонент - 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан формулы (II) по методике [Л.М.Юсупова, С.Ю.Гармонов, И.М.Захаров и др. Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных нитробензофуроксана. / Вестник Казанского технологического университета, 2005 г., №1, с.103-111]:
3. Получают фармацевтические композиции (1 -10), приведенные в таблице 1, путем приготовления смеси состава 1:1 из компонентов формулы I и II.
Таким образом, нами были получены 10 композиций на основе галоидных солей фосфония общей формулы I и азотистого гетероцикла формулы II, результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Характеристика комплексов на основе солей фосфония (I) и замещенных бензофуроксанов (II)
№
Фармацевтическая композиция, состоящая из (I) и (II)
Выход, %
ЯМР<sup>31</sup>P δ, м.д.
Элементный анализ
Найдено, %
Вычисл., %
1
<img file="00000003.tif" he="21" wi="51" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>30</sub>H<sub>32</sub>Cl<sub>3</sub>PN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
87
24.8
C 53.37
52.82
H 7.77
7.70
2
<img file="00000004.tif" he="18" wi="45" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>30</sub>H<sub>32</sub>Cl<sub>2</sub>BrPN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
85
26.2
C 50.05
49.59
H 4.28
4.41
3
<img file="00000005.tif" he="18" wi="45" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>32</sub>H<sub>56</sub>Cl<sub>3</sub>PN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
93
24.7
C 52.37
52.64
H 7.97
7.68
4
<img file="00000006.tif" he="18" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>32</sub>H<sub>56</sub>Cl<sub>3</sub>PN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
89
23.9
C 53.01
52.64
H 7.49
7.68
5
<img file="00000007.tif" he="17" wi="41" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>34</sub>H<sub>60</sub>Cl<sub>3</sub>PN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
91
25.2
C 54.07
53.86
H 7.97
7.92
6
<img file="00000008.tif" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>34</sub>H<sub>60</sub>Cl<sub>2</sub>BrPN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
84
24.8
C 50.47
50.87
H 5.07
7.48
7
<img file="00000009.tif" he="18" wi="45" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>38</sub>H<sub>44</sub>Cl<sub>3</sub>PN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
85
24.0
C 57.28
57.76
H 5.91
5.57
8
<img file="00000010.tif" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>38</sub>H<sub>44</sub>Cl<sub>2</sub>BrPN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
87
25.6
C 55.07
54.68
H 5.03
5.28
9
<img file="00000011.tif" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>40</sub>H<sub>48</sub>Cl<sub>3</sub>PN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
83
23.5
C 59.07
58.72
H 6.05
5.87
10
<img file="00000012.tif" he="19" wi="48" img-content="undefined" img-format="tif" />
C<sub>40</sub>H<sub>48</sub>Cl<sub>2</sub>BrPN<sub>4</sub>O<sub>6</sub>
94
24.0
C 55.27
55.68
H 5.97
5.57
Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими примерами, но не исчерпывается ими.
Пример 1. Получение фармацевтической композиции 1
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 4.07 г (0.01 моль) три-н-бутилдодецилфосфонияхлорида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (60°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (1) в таблице 1.
Пример 2. Получение фармацевтической композиции 2
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 4.51 г (0.01 моль) три-н-бутилдодецилфосфониябромида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (60°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (2) в таблице 1.
Пример 3. Получение фармацевтической композиции 3
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 4.35 г (0.01 моль) три-н-бутилтетрадецилфосфонияхлорида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (80°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (3) в таблице 1.
Пример 4. Получение фармацевтической композиции 4
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 4.79 г (0.01 моль) три-н-бутилтетрадецилфосфониябромида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (80°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (4) в таблице 1.
Пример 5. Получение фармацевтической композиции 5
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 4.63 г (0.01 моль) три-н-бутилгексадецилфосфонияхлорида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (90°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (5) в таблице 1.
Пример 6. Получение фармацевтической композиции 6
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 5.07 г (0.01 моль) три-н-бутилгексадецилфосфонияхлорида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при комнатной температуре (90°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (6) в таблице 1.
Пример 7. Получение фармацевтической композиции 7
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 4.95 г (0.01 моль) трифенилтетрадецилфосфонияхлорида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (90°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (7) в таблице 1.
Пример 8. Получение фармацевтической композиции 8
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 5.39 г (0.01 моль) трифенилтетрадецилфосфониябромида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при комнатной температуре (80°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (8) в таблице 1.
Пример 9. Получение фармацевтической композиции 9
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 5.23 г (0.01 моль) трифенилгексадецилфосфонияхлорида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (80°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (9) в таблице 1.
Пример 10. Получение фармацевтической композиции 10
К 2.95 г (0.01 моль) дихлординитробензофуроксана в 10 мл толуола прибавляют 5.67 г (0.01 моль) трифенилгексадецилфосфониябромида в 10 мл толуола. Реакционную смесь выдерживают в течение недели при температуре (90°С). Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают диэтиловым эфиром от исходных соединений. Характеристические данные композиции (10) в таблице 1.
Пример 11. Исследование биологической активности фармацевтических композиций на основе солей фосфония и замещенного бензофуроксана
8
Антимикотическую и антибактериальную активность соединений фармацевтических композиций 1-10, состоящих из различных солей четвертичного фосфония общей формулы (I) и дихлординитробензофуроксана (II), исследовали на тест-культурах патогенной и условно-патогенной микрофлоры. В работе использовали музейные штаммы кафедры микробиологии: Escherichia coli, Salmonella paratyphi B, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans. [Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии. - М.: Медицина, 1971. - 245 с.] Для оценки активности непосредственно перед исследованием готовили 1% растворы исследуемых соединений 1-10 в воде, спирте или их смеси 1:1. Суточные культуры музейных штаммов стандартизовали до оптической плотности 0.5 по МакФарланду (1,5×10 КОЕ/мл). Чашки Петри с питательной средой Сабуро (для Candida albicans) и Мюллера-Хинтона для всех остальных микроорганизмов засевали стандартизованными взвесями тест-культур, используя тампон. Через 5 минут на поверхность агара бактериологической петлей наносили каплю исследуемого вещества. В одну чашку помещали 5 химических соединений, в центр чашки наносили растворитель (для контроля возможного антибактериального эффекта) или стандартное лекарственное вещество сравнения. Через 24-48 часов при инкубации 37°С оценивали величину зоны задержки роста микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Антимикотическая и бактерицидная активность комплексов на основе солей фосфония и замещенных бензофуроксанов
Соединение
Величина зоны задержки роста, d (мм)
№
E.coli
Salmonella p. B
Ps.aeruginosa
S.aureus
Candida albicans
1
<img file="00000023.tif" he="25" wi="61" img-content="undefined" img-format="tif" />
17
12
13
27
28
2
<img file="00000024.tif" he="26" wi="63" img-content="undefined" img-format="tif" />
16
10
12
26
22
3
<img file="00000025.tif" he="21" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
13
12
9
31
30
4
<img file="00000026.tif" he="21" wi="53" img-content="undefined" img-format="tif" />
18
13
17
33
Больше 40
5
<img file="00000027.tif" he="21" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
20
17
16
26
22
6
<img file="00000028.tif" he="21" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
16
11
15
19
Больше 40
7
<img file="00000029.tif" he="17" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
9
15
9
20
27
8
<img file="00000030.tif" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
21
11
18
40
16
9
<img file="00000031.tif" he="18" wi="46" img-content="undefined" img-format="tif" />
12
9
11
28
30
10
<img file="00000032.tif" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
9
15
9
20
28
Контроли
Ампициллин/сульбоктам 10/10 мкг
16
16
15
пенициллин 10 ЕД
29
хлоргексидин 0,05%
19
18
15
22
16
Как следует из данных, представленных в таблице 2, испытуемые соединения сочетают высокую антимикотическую и антибактериальную активности. При этом все 10 веществ эффективно подавляли рост грибов рода Candida. Способность подавлять рост стафилококков сравнивали с активностью антибиотика оксациллин, у которого зона задержки была равна 29 мм (микроорганизм расценивается как чувствительный) - наиболее активными оказались препараты: 3, 4 и 8, которые давали зоны задержки роста 31, 33 и 40 мм соответственно. В отношении синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) наиболее активными были препараты 4, 5, 6, 8 с зонами задержки 17,16,15 и 18 мм, тогда как в контроле при использовании стандартного диска ампициллин/сульбактам зона задержки была 15 мм. Анализ действия соединений в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae показал, что рост кишечной палочки (Escherichia coli) ингибировали соединения 1 (17 мм), 2 (16 мм), 4 (18 мм), 5 (20 мм), 6 (16 мм) и 8 (21 мм). В качестве препарата сравнения был избран ампициллин/сульбактам. Зона задержки роста тест-культуры в присутствии антибиотика составила 16 мм, что позволяет расценивать ее как «чувствительный микроорганизм». Наиболее активным в отношении Salmonella paratyphi В было соединение 5, дающее зону задержки роста диаметром 17 мм (контроль - ампициллин/сульбактам - 16 мм), также активность проявляли соединения 4, 7 и 10 (размеры зон задержки роста соответственно составили 13, 15 и 15 мм). В то же время размеры зон задержки роста у контрольного препарата ампициллин/сульбактам варьировали в пределах 12-14 мм, что расценивается как промежуточная чувствительность. Сравнение антимикробной активности исследуемых препаратов с эталонным антисептиком хлоргексидином показало, что он подавляет рост микроорганизмов значительно слабее. Таким образом, можно констатировать, что данные соединения проявляют выраженную антимикробную активность in vitro и представляют несомненный интерес для расширенных испытаний с перспективой создания новых антибактериальных и антимикотических препаратов.
50
Преимуществами предлагаемых фармацевтических композиций (1-10) является то, что они обладают одновременно высокой бактериостатической и высокой антимикотической активностью при низкой токсичной (ЛД 2500 мг/кг) и низких концентрациях (10 мг композиции на 1 мл), что делает их перспективными лекарственными и дезинфицирующими средствами в медицине и ветеринарии.
Из исследованного уровня техники не выявлены сведения о наличии широкой синергической антибактериальной активности как у бензофуроксанов с каким-либо другим веществом, так и у солей четвертичного фосфония с каким-либо другим веществом как по отдельности, так и в совокупности, что является доказательством соответствия заявленного технического решения критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям.
Активные компоненты заявляемой композиции на основе соли четвертичного фосфония и замещенных дихлординитробензофуроксана используются в заявленном техническом решении по новому для них назначению - в качестве комбинированного препарата с антибактериальной и антимикотической активностью широкого спектра действия, что не является заведомо очевидным для специалиста в анализируемой области техники, таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная композиция может быть получена посредством использования известных компонентов с применением стандартного оборудования и известных приемов.