Определение полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома возбудителя описторхоза, Opisthorchis felineus

УДК 577.21

Определение полной

нуклеотидной

последовательности

митохондриального

генома возбудителя

описторхоза,

Opisthorchis felineus

B. А. Мордвинов1, А. В. Марданов2, Н. В. Равин2, С. В. Шеховцов1,

C. А. Демаков1, А. В. Катохин1, Н. А. Колчанов1, К. Г. Скрябин2#

1 Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, д. 10.

2 Центр «Биоинженерия» РАН, 117312, Москва, просп. 60-летия Октября, д. 7, корп. 1.

# e-mail: office@biengi.ac.ru

РЕФЕРАТ Печеночная трематода Opisthorchis felineus является возбудителем описторхоза — опасного заболевания человека и животных, широко распространенного в России, в основном на территории Западной Сибири. В настоящей работе мы определили полную нуклеотидную последовательность митохондриальной ДНК этого плоского червя. Были использованы два метода: секвенирование методом капиллярного электрофореза фрагментов митохондриального генома, полученных специфической ПЦР-амплификацией, и параллельное пиросеквенирование препарата геномной ДНК. Обе методики позволили определить полную нуклеотидную последовательность митохондриального генома O. felineus. Он представляет собой кольцевую молекулу длиной 14277 нт с 35 генами, кодирующими 2 рРНК, 22 тРНК и 12 белков, включая 3 субъединицы цитохром С оксидазы, семь субъединиц NADH-дегидрогеназы, апоцитохром Б и субъединицу 6 АТФ синтетазы. Как и у других плоских червей, ген субъединицы 8 АТФ-синтетазы отсутствует. Из 22 тРНК 19 имеют типичную структуру «листа клевера». У тРНК-Se^AGC) и тРНК-Cys отсутствуют DHU-петли, а для гена тРНК-Se^UCA) возможны две альтернативные структуры, с DHU-петлей и без нее. Анализ результатов пиросеквенирования позволил идентифицировать 45 однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальном геноме. Данные о нуклеотидной последовательности митохондриального генома O. felineus могут быть использованы для разработки методов молекулярной диагностики описторхоза. Полученные результаты показывают, что метод пиросеквенирования может быть использован для быстрой расшифровки митохондриальных геномов животных.

ВВЕДЕНИЕ Несмотря на столетнюю историю изучения O. felineus

Плоский червь Opisthorchis felineus (класс Trematoda, сем. и его огромную практическую важность, многие вопросы Opisthorchiidae) - печеночная двуустка, является парази- его популяционной и эволюционной биологии остаются том рыбоядных животных, а также человека. Описторхозом неизученными, что объясняется главным образом малым заражено около 2 млн людей, главным образом живущих количеством пригодных для исследований признаков. на территории России и республик бывшего СССР - Укра- С развитием молекулярно-генетических методик нача-ины, Белоруссии и Казахстана [1, 2]. В некоторых северных ли широко применяться молекулярные маркеры. Иссле-населенных пунктах описторхозом заражено до 90 % на- дования, проведенные на описторхидах молекулярными селения [1]. методами [3, 4, 5], показали недостаточное разнообразие

используемых на сегодняшний момент молекулярных маркеров. Для получения пригодных для широкого круга исследований молекулярных маркеров наиболее перспективным является исследование структуры полного митохондриального генома O. felineus.

У большинства видов животных митохондриальные геномы (мтДНК) отличаются рядом особенностей, которые делают их незаменимыми инструментами для филогенетических и филогеографических исследований: наследование по материнской линии, отсутствие рекомбинации и высокая по сравнению с ядерным геномом скорость эволюции [6]. С увеличением числа просеквенированных митохондриальных геномов они стали широко применяться для подбора генетических маркеров с высокой скоростью эволюции и для построения высокоразрешающих филогенетических деревьев, в которых в качестве признаков используются как сами последовательности, так и порядок расположения генов.

В данной работе мы представляем две методологии определения полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома O. felineus и анализ его структуры.

материалы и методы источник биоматериала и выделение ДНК

Мариты O. felineus были выделены из зараженной кошки из д. Усть-Тула (Новосибирская область, Российская Федерация). Видовая принадлежность была определена по морфологическим признакам специалистами лаборатории паразитоценологии и ихтиологии Института систематики и экологии животных СО РАН. ДНК для обоих методов секвенирования была выделена из пулированных образцов фенол-хлороформным методом [7].

расшифровка последовательности мтДНК O. FELINEUS МЕТОДОМ КАПИЛЛяРНОГО электрофореза по сэнджеру

Путем сравнения митохондриальных геномов трематод Fasciola hepatica (AF216697), Paragonimus westermani (AF216698) и Schistosoma mansoni (AF216698) при помощи программ MEME/MAST (http://meme.sdsc.edu/) были обнаружены консервативные последовательности, характерные для геномов трематод. Используя эти последовательности, а также опубликованные последовательности Clonorchis sinensis (DQ116944, AY264851) и O. viverrini (DQ882172, DQ119551), подобрали универсальные праймеры. При помощи этих праймеров был получен набор ампликонов длиной около 1000 п.н., на основании последовательности которых были синтезированы новые праймеры. Таким образом, была амплифицирована остальная часть митогенома в виде перекрывающихся фрагментов. Секвенирование большинства ампликонов проводилось напрямую; часть ампликонов были клонированы, после чего проводилось секвенирование минимум трех клонов. Секвенирование мтДНК проводилось на автоматическом секвенаторе фирмы Applied Biosystems ABI PRISM 3100 -Avant Genetic Analyzer в межинститутском центре сек-венирования ДНК СО РАН. Полная последовательность мтДНК O. felineus представлена в GenBank (NC_011127).

расшифровка ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ мтДНК O. FELINEUS МЕТОДОМ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИя

Для определения нуклеотидной последовательности генома O. felineus методом пиросеквенирования нами была использована методология, реализованная компанией 454 Life Science на геномном анализаторе GS FLX. Получение библиотеки случайных фрагментов ДНК, клональную амплификацию связанных с микрочастицами молекул ДНК в водно-масляных эмульсиях и секвенирование на GS FLX проводили с использованием наборов реактивов и по протоколам фирмы-производителя (Roche). За один запуск прибора (12 ч) было определено около 100 млн нт, причем средняя длина «чтения» составляла около 220 нт.

Сборку полученного на GS FLX набора перекрывающихся последовательностей в объединяющие их «конти-ги» осуществляли с помощью пакета программ GS de novo Assembler (Roche Diagnostics, Roche Applied Science). В результате была определена полная нуклеотидная последовательность контига длиной 14277 нт, представляющего собой митохондриальный геном. Средняя кратность чтения мтДНК составляла около 30 раз.

биоинформационный анализ

Анализ последовательностей и сборка генома проводились при помощи программы Vector NTI 7 (Informax Inc.). Поиск сходных последовательностей был проведен в базах данных биологических последовательностей GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Для трансляции белок-кодирующих последовательностей был использован митохондриальный генетический код плоских червей [8]. Большинство тРНК были найдены программой tRNAscan-SE [9]; вторичные структуры остальных были найдены вручную.

Для идентификации потенциальных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) отдельные последовательности,

Табл. 1. Набор генов митохондриального генома O. felineus

ген длина, п.н. старт- кодон стоп- кодон ген длина, п.н. старт- кодон стоп- кодон

cox3 642 ATG TAG nd3 354 GTG TAG

tRNA-His 67 tRNA-Ser(AGN) 61

cob 1110 ATG TAG tRNA-Trp 68

nd4L 261 ATG TAG cox1 1560 GTG TAG

nd4 1275 ATG TAG tRNA-Thr 63

tRNA-Gln 63 16S rRNA 994

tRNA-Phe 66 tRNA-Cys 60

tRNA-Met 68 12S rRNA 780

atp6 513 ATG TAG cox2 639 ATG TAG

nd2 867 ATG TAG nd6 459 ATG TAG

tRNA-Val 65 tRNA-Tyr 62

tRNA-Ala 62 tRNA-Leu(CUN) 64

tRNA-Asp 67 tRNA-Ser(UCN) 72

nd1 900 GTG TAG tRNA-Leu(UUR) 65

tRNA-Asn 71 tRNA-Arg 68

tRNA-Pro 64 nd5 1602 ATG TAG

tRNA-Ile 62 tRNA-Glu 72

tRNA-Lys 65 tRNA-Gly 67

Рис. 1. Генетическая карта митохондриального генома O. felineus

определенные при проведении пиросеквенирования, выравнивали относительно «консенсусной» последовательности мтДНК O. felineus с помощью программы GS reference mapper (Roche). SNP определяли по наличию не менее чем трех индивидуальных чтений, последовательность которых отличается от «консенсусной» в данной точке. Также к SNP относили все точки несовпадения между полными последовательностями мтДНК, определенными с помощью капиллярного электрофореза и методом пиросеквенирования.

результаты и обсуждение методология определения полной нуклеотидной ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ мтДНК

Благодаря своей относительно небольшой длине митохондриальные геномы животных стали одними из первых объектов геномных исследований [10], а к настоящему времени известны полные последовательности сотен мтДНК.

Стандартный метод расшифровки митохондриального генома предполагает выделение митохондрий из клеток и получение препарата митохондриальной ДНК, максимально очищенного от геномной ДНК. Последующее «сэнжеровское» секвенирование предполагает разбиение генома на ряд случайно выбранных фрагментов, их клонирование в плазмидном векторе («библиотека случайных фрагментов») и секвекнирование полученных клонов с помощью капиллярного электрофореза. Поскольку фрагменты являются перекрывающимися, полученные последовательности могут быть объединены в полную последовательность мтДНК. В данной работе для специфического выделения митохондриальных последовательностей мы использовали информацию о структуре мтДНК близ-

кородственных гельминтов, позволившую идентифицировать консервативные участки генома и амплифицировать с помощью ПЦР расположенные между ними фрагменты мтДНК O. felineus. Последовательности полученных фрагментов были определены с помощью капиллярного электрофореза и объединены в полную последовательность мтДНК длиной 14277 нт.

Новым методом, позволяющим определять de novo геномные последовательности, является метод пиросеквенирования [11], реализованный компанией 454 Life Science на геномном анализаторе GS FLX. Этот метод предполагает фрагментацию ДНК до 300-800 нт, амплификацию связанных с микрочастицами индивидуальных фрагментов ДНК в микрокаплях, образуемых в водно-масляных эмульсиях, нанесение наночастиц с иммобилизованными амплифи-цированными фрагментами в микроячейки на стеклянной пластине, параллельное проведение реакций «пиросекве-нирования» и регистрацию результатов в каждой из нескольких сотен тысяч находящихся на пластине ячеек. Средняя длина чтения каждой реакции составляет около 200 нт, что позволяет за один запуск прибора определять последовательность до 100 млн нт. Большой объем последовательностей, определяемый с помощью этого метода, позволил нам отказаться от специфического выделения фрагментов митохондриального генома и использовать для секвенирования препарат «суммарной» геномной ДНК O. felineus. Несмотря на то, что доля последовательностей мтДНК в общем объеме секвенирования составила менее 1 %, этого оказалось достаточно для прочтения мтДНК с 30-кратным перекрытием, что обеспечило полную «сборку» последовательности митохондриального генома после одного запуска GS FLX.

Cysteine

G

С

G

У

G

и

г А G

U

U

А

CUGG

ии^

U|JGl СС у е

с- с

С-І5

и - о С а и л

Gr А

5ЄПГЄ

лч

5

U

U

С

с

U

с

U

Ü

G у

CUUG

ÖG,

U

G

SAftU _U

и UCCCJ

. (і G и U

С А

U А

GCU

и А

UP G-G

U-G

G - У G - С ЗегіП#

и - С <52}

G G G-ІІ IUCN)

и

с

с

ÖGi

Л G Л Л G GGy

lie lujс сgg

С

У

с

U

А - У

У G

U А

U

AGG U G G Ij

UßliCCUA

УСУУCCG0

с

Рис. 2. Вторичные

структуры тРНК:

тРНК-5ег(А01М),

тРНК-СуБ,

две возможные

альтернативные

структуры

тРНК-$ег

Табл. 2. Использование кодонов в митохондриальном геноме O. felineus

uuu Phe 334 9.9 % ucu Ser 107 3.2 % UAU Tyr 146 4.3 % UGU cys 89 2.6 %

uuc Phe 40 1.2 % ucc Ser 22 0.7 % uac Tyr 17 0.5 % ugc cys 15 0.4 %

UUA Leu 125 3.7 % uca Ser 26 0.8 % UAA 0 % UGA Trp 33 1.0 %

uug Leu 236 7.0 % ucg Ser 36 1.1 % UAG stop 12 0.4 % UGG Trp 80 2.4 %

cuu Leu 107 3.2 % ccu Pro 43 1.3 % cau His 49 1.5 % cgu Arg 47 1.4 %

cuc Leu 14 0.4 % ccc Pro 19 0.6 % cac His 0.2 % cgc Arg 4 0.1 %

CUA Leu 26 0.8 % cca Pro 0.2 % caa Gln 12 0.4 % cga Arg 3 0.1 %

cUG Leu 41 1.2 % ccg Pro 21 0.6 % cag Gln 21 0.6 % cgg Arg 23 0.7 %

AUU Ile 103 3.1 % acu Thr 60 1.8 % AAU Asn 44 1.3 % AGU Ser 72 2.1 %

AUc Ile 18 0.5 % acc Thr 11 0.3 % aac Asn 0.2 % agc Ser 15 0.4 %

AUA Met 55 1.6 % aca Thr 8 0.2 % AAA Asn 17 0.5 % AGA Ser 15 0.4 %

AUG Met 101 3.0 % acg Thr 16 0.5 % AAG Lys 44 1.3 % AGG Ser 47 1.4 %

GUU Val 215 6.4 % gcu Ala 21 0.6 % GAU Asp 69 2.0 % GGU Gly 133 3.9 %

GUc Val 15 0.4 % gcc Ala 76 2.3 % gac Asp 3 0.1 % ggc Gly 35 1.0 %

GUA Val 39 1.2 % gca Ala 0.2 % GAA Glu 0.2 % GGA Gly 28 0.8 %

GUG Val 138 4.1 % gcg Ala 36 1.1 % GAG Glu 71 2.1 % GGG Gly 105 3.1 %

Для каждого кодона указаны соответствующая ему аминокислота и частота использования этого кодона в генах мтДНК (число использований и соответствующая доля в процентах). Подчеркнуты отличия от стандартного генетического кода

основные характеристики митохондриального ГЕНОМА O. FELINEUS

Митохондриальный геном O. felineus представляет собой кольцевую молекулу ДНК длиной 14277 нт и, таким образом, является самым коротким из известных на данный момент митохондриальных геномов трематод [12]. Анализ последовательности генома выявил наличие типичных митохондриальных генов: 12 белок-кодирующих генов (отсутствует ген одной из субъединиц АТФазы, atp8), 22 гена тРНК и 2 гена рРНК (табл. 1).

Все гены транскрибируются с одной цепи, как и у других плоских червей (рис. 1). Порядок расположения генов идентичен с таковым у F. hepatica [13]. Гены nd4L и nd4 перекрываются на 40 пн по различным рамкам считывания.

Все известные митохондриальные геномы плоских червей, за исключением генома P. westermani, являются А/Т-богатыми. Митохондриальный геном O. felineus содержит 60 % А + Т; кроме того, кодирующая цепь обогащена тимином (43 %) по сравнению с аденином (17 %) и гуанином (28 %) по сравнению с цитозином (12 %). Нуклеотидный состав варьирует в различных частях генома, в особенности в третьих позициях кодонов белок-кодирующих генов, где цитозин составляет всего 8 %. Кодоны, оканчивающиеся на Т и G, встречаются значительно чаще, чем оканчивающиеся на А и С.

Самыми часто встречающимися кодонами являются ТТТ, GTT и TTG. Кодон ТТТ составляет почти 10 % от числа всех кодонов, в то время как все кодоны, составленные из А и С, занимают всего около 2 % (табл. 2). Как и в других митохондриальных геномах трематод, старт-кодонами являются ATG и GTG, а стоп-кодоном - TAG. Кодон TGA используется для кодирования триптофана, а TAA не используется вообще. Укороченных стоп-кодонов в митохондриальном геноме O. felineus обнаружено не было (табл. 1).

Длина генов тРНК у O. felineus варьирует от 59 до 72 нуклеотидов. Большая часть генов тРНК организованы в кластеры, включающие до пяти генов. Для 19 из 22 тРНК можно теоретически реконструировать типичную структуру «листа клевера». Как и у всех трематод, DHU-петля отсутствует у тРНК-Ser(AGN). DHU-петля отсутствует и у тРНК-Cys, что характерно также для некоторых ши-стосом [14], а для гена тРНК-Se^UCN) возможно рассчитать две альтернативные структуры, с DHU-петлей и без нее (рис. 2).

Кроме коротких межгенных промежутков, в геномах плоских червей имеются длинные некодирующие районы, которые, как считается, содержат последовательности, необходимые для инициации репликации и транскрипции мтДНК. Как и у F. hepatica, расположенный между генами

Табл. 3. Однонуклеотидные полиморфизмы, обнаруженные в митогеноме O. felineus

№ Положение в мтДНК и аллель, определенная «сэнджеровским» секвенированием Частоты аллелей в последовательностях, определенных при пиросеквенировании Ген Заменяемый кодон Аминокислотная замена

361 T С-3 / Т-27 cox3 tgg/cgg W/R

2 1068 C Т-3 / С-25 cytB tac/tat -

3 1195 C Т-8 / С-17 cytB cta/tta -

4 1300 C Т-4 / С-23 cytB ctg/ttg -

1524 A A-1 / G-28 cytB caa/cag -

1599 T С-5 / Т-28 cytB ctg/ccg L/P

1860 C С-1 / Т-24 cytB ggc/ggt -

8 1899 C Т-4 / С-24 nd4L cct/tct P/S

2025 T С-4 / Т-28 nd4L tta/cta -

10 2034 C Т-4 / С-28 nd4L cgg/tgg R/W

11 2039 C Т-4 / С-28 nd4L ggc/ggt -

12 3104 T С-5 / Т-19 nd4 ttg/ctg -

13 3228 C Т-3 / С-25 nd4 gcg/gtg A/V

14 3245 T С-3 / Т-27 nd4 tta/cta -

15 3260 C Т-3 / С-26 nd4 ctg/ttg -

16 3674 A G-6 / A-28 atp6 aat/agt N/S

17 3827 G G-0 / A-39 atp6 ggt/gat G/D

18 3915 A A-0 / G-34 atp6 cta/ctg -

19 3921 T С-6 / Т-28 atp6 tat/tac -

20 3935 T Т-0 / С-35 atp6 gtg/gcg V/A

21 4507 A A-1 / G-20 nd2 ata/gta I/V

22 4548 C Т-11 / С-14 nd2 agc/agt -

23 4707 T Т-0 / С-33 nd2 tct/tcc -

24 4710 T Т-0 / G-33 nd2 cct/ccg -

25 5390 T Т-0 / A-36 nd1 aat/aaa N/K

26 5684 C С-2 / Т-21 nd1 gcc/gct -

27 6158 C Т-5 / С-32

28 6175 C Т-5 / С-33 tRNA-Asn

29 6314 T С-3 / Т-24 tRNA-Ile

30 6650 A A-2 / G-30 nad3 gta/gtg -

31 6810 C Т-4 / С-30

32 7865 A A-0 / G-31 cox1 tca/tcg -

33 8669 A G-4 / A-27 16S rRNA

34 10692 T С-3 / Т-17 cox2 ata/aca I/T

35 11152 A G-8 / A-23 nd6 cca/ccg -

36 11880 C Т-4 / С-36 tRNA-Arg

37 12186 G G-1 / С-25 nd5 gtt/ctt V/L

38 12326 T A-3 / Т-24 nd5 cgt/cga -

39 12533 G A-5 / G-22 nd5 gtg/gta -

40 13403 G A-4 / G-23 nd5 tcg/tca -

41 13589 G G-0 / A-11

42 13993 C С-0 / Т-30

43 14001 G G-0 / A-18

44 14007 C С-0 / Т-8

45 14212 C С-0 / Т-9

tRNA-Glu и ттЭ некодирующий район O. /єііпє^ разделен на две части геном тРНК^Іу. Эти некодирующие районы не содержат, в отличие от некодирующих районов митохондриальных геномов других плоских червей, ни длинных тандемных повторов, ни последовательностей, способных формировать длинные шпилечные структуры.

В некодирующем регионе O. felineus была обнаружена открытая рамка считывания длиной 402 п.н. Поиск сходных последовательностей в базах данных биологических последовательностей при использовании как нуклеотидной, так и аминокислотной последовательностей результатов не дал. Довольно длинные открытые рамки считывания для пептидов без сходства с известными белками были так-

же обнаружены в «некодирующих» районах мтДНК у других представителей плоских червей: F. hepatica, цестоды Hymenolepis diminuta [15] и моногенеи Microcotyle sebastis [16]. Возможно, данные рамки считывания кодируют функциональные белки, однако, это требует дополнительных экспериментальных доказательств.

Некодирующий участок мтДНК может быть использован для разработки методов специфической молекулярной идентификации O. felineus. Так, уровни гомологии нуклеотидных последовательностей мтДНК O. felineus и двух родственных трематод, для которых известны полные последовательности митохондриальных геномов, C. sinensis (FJ381664) и F. hepatica (AF216697), составляют

соответственно 78 % и 64 %. Однако последовательности некодирующих районов, расположенных между tRNA-Glu и cox3, у этих трех трематод не имеют значимой гомологии ни между собой, ни с другими представленными в GenBank последовательностями.

однонуклеотидные полиморфизмы

В мтДНК O. FELINEUS

В ходе определения нуклеотидной последовательности мтДНК методом пиросеквенирования каждый нуклеотид генома был «прочтен» в среднем 30 раз в результате сек-венирования клонально-амплифицированных индивидуальных фрагментов молекул мтДНК O. felineus. Сравнение последовательностей индивидуальных чтений с консенсусной позволяет идентифицировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), присутствующие в различных молекулах мтДНК в одном организме. Поскольку «сэнджеров-ское» секвенирование и пиросеквенирование проводились для ДНК, выделенной из нескольких особей O. felineus, сравнение соответствующих последовательностей мтДНК позволяет получить приблизительную оценку частот встречаемости гаплотипов по каждому SNP.

Данные о 45 детектированных SNP приведены в табл. 3. Большая часть SNP, как в мтДНК других животных и человека [17], представляют собой замены Т:С и A:G (соответствует Т:С по комплементарной цепи), в основном не приводящие к аминокислотным заменам в белковых продуктах соответствующих генов. Отметим, что несколько SNP выглядели специфическими для последовательности мтДНК, расшифрованной одной из двух технологий, и не встречались (или встречались с низкой частотой) в другой. Вероятно, различия в аллельных частотах являются отражением искажений, характерных для основанных на ПЦР методов амплификации и сек-венирования гетерогенной смеси ампликонов, в то время как соотношение аллелей по SNP, полученное при пиро-

секвенировании индивидуальных фрагментов, должно быть более близким к реальному.

В будущем данные о специфических SNP и частотах известных SNP в мтДНК могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров при исследовании структур природных популяций O. felineus и анализе путей распространения патогена в окружающей среде и человеческих популяциях.

заключение

В данной работе мы представили результаты определения полной нуклеотидной последовательности мтДНК плоского червя O. felineus двумя методами. В первом из них последовательности мтДНК были специфически амплифициро-ваны и секвенированы методом капиллярного электрофореза. При использовании второго подхода, параллельного пиросеквенирования, образец геномной ДНК животных был просеквенирован без какого-либо предварительного обогащения последовательностями мтДНК, в результате чего была определена de novo полная последовательность митохондриального генома. Метод пиросеквенирования на геномном анализаторе GS FLX может быть использован для быстрой расшифровки митохондриальных геномов животных и идентификации полиморфизмов. Данные о нуклеотидной последовательности митохондриального генома O. felineus могут быть использованы для разработки методов молекулярной диагностики описторхоза.

Выполненные работы бъши поддержаны программой «Геномика, протеомика, биоинформатика»

СО РАН в ИЦиГ СО РАН и Федеральным агентством по науке и инновациям (ГК № 02.552.11.7045) в Центре «<Биоинженерия» РАН. Авторы выражают благодарность сотрудникам ИСиЭЖ СО РАН Н. И. Юрловой и К. П. Федорову за помощь в идентификации O. felineus.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бэер С.А. Биология возбудителя описторхоза. М: Товарищество научных изданий КМК, 2005.

2. Ромашов Б.В., Ромашов В.А., Семенов В.А., Филимонова Л.В. Описторхоз в бассейне верхнего Дона (Воронежская область): фауна описторхид, эколого-биологические закономерности циркуляции и очаговость описторхидозов. Воронеж: Воронежский государственный университет, 2003.

3. Катохин А.В., Шеховцов С.В., Konkow S., Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Локтев В.Б., Муратов И.В., Ohyama F., Махнева Т.В., Пель-тек С.Е., Мордвинов В.А. // Оценка генетических отличий Opisthorchis felineus

от Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis по ITS2- и COl-последовательностям. Доклады Академии наук. 2008. Т. 421. № 4. С. 549-552.

4. Kang S., Sultana T., Loktev V.B., Wongratanacheewin S., Sohn W.-M., Eom K.S. and Park J.-K. // Molecular identification and phylogenetic analysis of nuclear rDNA sequences among three opisthorchid liver fluke species (Opisthorchiidae: Trematoda). Parasitology Research, 2008. V. 57. P. 191-197

5. Saijuntha W., Sithithaworn P., Wongkham S., Laha T., Chilton N.B., Petney T.N., Barton M. and Andrews R.H. // Mitochondrial DNA sequence variation among geographical isolates of Opisthorchis viverrini in Thailand and Lao PDR, and phylogenetic relationships with other trematodes. Parasitology. 2008. V. 135. P. 1479-1486.

6. Ballard J.W.O. and Whitlock M.C. // The incomplete natural history of mitochondria. Molecular Ecology. 2004. V. 13. P. 729-744.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М: Мир. 1984.

8. Telford M.J., Herniou E.A., Russel R.B. and Littlewood D.T.J. // Changes in mitochondrial genetic codes as phylogenetic characters: Two examples from the flatworms. Proceedings of the National Academic Society. 2000. V. 97. P. 11359-11364.

9. Lowe T.M., Eddy S.R. // tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Research. 1997. V. 25. P. 955-964.

10. Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., de Bruijn M.H., Coulson A.R., Drouin J.,

Eperon I.C., Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F., Schreier PH., Smith A.J., Staden R., Young I.G. // Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 1981. V. 290. 457-465.

11. Margulies M., Egholm M., Altman W.E., Attiya S., Bader J.S., Bemben L.A., Berka J., Braverman M.S., Chen Y.J., Chen Z., Dewell S.B., Du L., Fierro J.M., Gomes X.V., Godwin B.C., He W., Helgesen S., Ho C.H., Irzyk G.P., Jando S.C., Alenquer M.L., Jarvie T.P.,

Jirage K.B., Kim J.B., Knight J.R., Lanza J.R., Leamon J.H., Lefkowitz S.M., Lei M., Li J., Lohman K.L., Lu H., Makhijani V.B., McDade K.E., McKenna M.P., Myers E.W., Nickerson E., Nobile J.R., Plant R., Puc B.P., Ronan M.T., Roth G.T., Sarkis G.J., Simons J.F.,

Simpson J.W., Srinivasan M., Tartaro K.R., Tomasz A., Vogt K.A., Volkmer G.A., Wang

S.H., Wang Y., Weiner M.P., Yu P, Begley R.F., Rothberg J.M. // Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 2005. V. 437. P 376-380.

12. Le T.H., Blair D. and McManus D P // Mitochondrial genomes of parasitic flatworms. Trends in Parasitology. 2002. V. 18. P. 206-213.

13. Le T.H., Blair D. and McManus D.P. // Complete DNA sequence and gene organization of the mitochondrial genome of the liver fluke, Fasciola hepatica L. (Platyhelminthes; Trematoda). Parasitology. 2001. V. 123. P. 609-621.

14. Littlewood D.T.J., Lockyer A.E., Webster B.L., Johnston D.A. and Le T H. // The complete mitochondrial genomes of Schistosoma haematobium and Schistosoma spindale and the evolutionary history of mitochondrial genome changes among parasitic flatworms. Molecular Phylogenetics and Evolution. 2006. V. 39. P. 452-467.

15. von Nickisch-Rosenegk M., Brown W.M. and Boore J.L. // Complete Sequence of the Mitochondrial Genome of the Tapeworm Hymenolepis diminuta: Gene Arrangements Indicate that Platyhelminths Are Eutrochozoans. Molecular Biology and Evolution. 2001. V. 18. P 721-730.

16. Park J., Kim K., Kang S., Kim W., Eom K. S. and Littlewood D.T.J. // A common origin of complex life cycles in parasitic flatworms: evidence from the complete mitochondrial genome of Microcotyle sebastis (Monogenea: Platyhelminthes). BMC Evolutionary Biology. 2007. V. 7.

17. MITOMAP: A Human Mitochondrial Genome Database. http://www.mitomap.org, 2007.