Морфологические преобразования почек крыс при экспериментальном моделировании диабетической нефропатии

А. В. Смирнов, А. А. Спасов, Н. Г. Паньшин, О. А. Соловьева, В. А. Кузнецова

Волгоградский медицинский научный центр; Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии, кафедра патологической анатомии

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ПОЧЕК КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ *

УДК 615.015:616.379-008.64:616-092.9

При изучении морфологических изменений почек крыс при экспериментальном моделировании диабетической нефропатии обнаружены изменения в клубочках в виде начальных процессов гломерулосклероза.

Ключевые слова: диабетическая нефропатия, стрептозотоцин, неферментативное гликозилирование.

A. V. Smirnov, A. A. Spasov, N. G. Panshin, O. A. Solovyova, V. A. Kuznetsova

STRUCTURAL TRANSFORMATIONS OF RAT KIDNEYS IN EXPERIMENTAL DIABETIC NEPHROPATHY

The study of morphological changes in rat kidneys using experimental diabetic nephropathy model revealed changes in the glomeruli indicative of the initial processes of glomerulosclerosis.

Key words: diabetic nephropathy, streptozotocin, non-enzymatic glycation.

Несмотря на достигнутые успехи в лечении пациентов с сахарным диабетом (СД), диабетическая нефропатия по-прежнему остается одной из основных причин заболеваемости и смертности пациентов с сахарным диабетом [1], как и десятилетие назад [2], принося национальной системе здравоохранения значительные социально-экономические потери [3]. Важным, с точки зрения понимания патофизиологических механизмов возникновения и прогрессирования диабетической нефропатии (ДН) и разработки профилактических и лечебных подходов, является использование адекватных моделей ДН у экспериментальных животных, максимально точно воспроизводящих стадии естественного течения этого микрососудистого осложнения СД у людей.

На сегодняшний день разработано достаточно большое количество экспериментальных моделей СД, которые могут быть индуцированы химическими диабетогенными веществами, диетическими или хирургическими манипуляциями или сочетанием этих способов, а также генетически обусловленными [4].

Для скрининга и детального изучения веществ, оказывающих патогенетическое действие на лечение осложнений сахарного диабета, наиболее подходящей является модель стрепто-зотоцин-индуцированного диабета [5-7], вследствие способности стрептозотоцина накапливаться в р-клетках поджелудочной железы, что приводит к стойкой гипергликемии, необходимой для формирования диабетической нефропатии [8].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Определить влияние сахарного диабета на структурные изменения почек крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 50 половозрелых беспородных крысах-самцах массой 200230 г, которых содержали в условиях вивария ВолгГМУ с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных, согласно ГОСТ Р50258-92. Исследования были одобрены Этическим комитетом ВолгГМУ (протокол № 191-2014 от 25 февраля 2014 г.).

Экспериментальный СД моделировали путем однократного внутривенного введения стрептозотоцина («Sigma», США), растворенного в 0,1 М цитратном буфере с рН 4,5 в дозе 45 мг/кг. Количественное определение глюкозы в крови проводили на 3-и сутки после введения цитотоксина и далее еженедельно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента, длительностью 12 недель, с использованием глюкометра «Глюкокард» (Россия). В эксперимент брали животных с уровнем глюкозы натощак более 17 ммоль/л.

В случае превышения значения гликемии натощак уровня 20 ммоль/л животным вводили инсулин длительного действия «ЛантусСоло-Стар», Франция (подкожно).

* Работа выполнена за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00139).

В ходе исследования оценивали массу тела всех экспериментальных животных - исходно и далее еженедельно. Каждые 4 недели крыс помещали на 24 часа в метаболические камеры для сбора мочи с целью исследования суточной экскреции альбумина (колориметрическим методом с бромфеноловым синим «Vital Diagnostics», (Россия). Креатинин сыворотки крови (с последующим расчетом клиренса креатинина) определяли методом Яффе с использованием набора «Pliva-Lachema» (Чехия); уровень гликированного гемоглобина определяли с использованием набора «Фосфосорб», (Россия).

Для проведения гистологического исследования материал, полученный из почек, фиксировали в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4), обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и по Массону.

Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой Axiocam 105 color (Карл Цейс, Германия, 5 мегапикселей) на базе микроскопа Axiocam plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х40 и окуляра х10.

При морфологическом исследовании оценивали наличие изменений в почечных тельцах (капсула, капилляры, мезангий), изменений соединительной ткани, наличие воспалительной инфильтрации.

С помощью морфометрического метода исследования (с использованием программы «ZEN Pro 2012», (Карл Цейс, Германия) определяли площадь почечного тельца (мкм2), площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце (мкм2) и относительную площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием табличного редактора Microsoft Excel 2007, программы «GraphPad Prism 5.0», программы STATISTICA 5.0 фирмы StatSoft, Inc., (США) для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень глюкозы в крови у крыс с СД на 3-й день после введения стрептозотоцина достоверно превосходил в 4,8 раза таковой у интакт-ных животных. Развитие диабета сопровождалось полидипсией, полиурией, животные были вялы и апатичны.

У экспериментальных животных с индуцированным СД определялось уменьшение размеров почечных телец с дистрофически и атрофически

измененными клетками наружной и внутренней стенок капсулы клубочка.

Появлялись почечные тельца с резко уменьшенной полости капсулы, вплоть до отсутствия таковой.

Отмечались образование синехий капилляров клубочков с париетальным листком клубочка, очаговое утолщение базальной мембраны капилляров клубочков, расширение мезангия. В фе-нестрированных капиллярах клубочков отмечено нарушение кровообращения в виде полнокровия, явлений стаза и диапедеза эритроцитов.

Проксимальные канальцы характеризовались выстилкой, представленной однослойным кубическим каемчатым эпителием. Форма просвета канальцев была округлой. Ядра эпите-лиоцитов характеризовались округлой формой, располагались в центральной части клеток.

Цитоплазма отличалась умеренной ацидофилией. Люминальная поверхность эпителиоци-тов характеризовалась хорошо выраженной щеточной каймой.

Тонкие канальцы были выстланы одним слоем плоских эпителиоцитов. Ядра эпителио-цитов имели овальную форму, располагались в центральной части клеток.

Цитоплазма характеризовалась слабо выраженной ацидофилией.

Дистальные канальцы были образованы однослойным кубическим и низким призматическим эпителием. Форма просвета канальцев была округлой. Ядра эпителиоцитов характеризовались округлой формой, а цитоплазма - умеренной ацидофилией.

Собирательные трубочки были образованы одним слоем эпителиоцитов призматической формы.

Внутрипочечные кровеносные сосуды неравномерно полнокровны и иногда заполнены плазмой. Эндотелиальные клетки равномерно, эластические мембраны не утолщены, равномерно спирализованы. Вены полнокровны.

У животного с индуцированным СД в почечных канальцах определялись кальцификаты, преимущественно в собирательных трубочках в виде гомогенных интенсивно базофильных полиморфных глыбок небольших размеров.

При п ро ведении морфометрического исследования определялось достоверное уменьшение площади почечных телец на 39 % по сравнению с контрольной группой. Площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце достоверно уменьшалась на 31 % пропорционально уменьшению площади почечного тельца.

Относительная площадь соединительной ткани сосудистого клубочка у животных с СД достоверно увеличивалась на 6 % (см. табл. 1).

Морфометрические показатели почечных клубочков

Группы Показатели

Площадь почечного тельца, мкм2 Площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце, мкм2 Относительная площадь соединительной ткани сосудистого клубочка

Контрольные животные 6267,4 ± 217,3 2979,7 ± 123,8 47,5

Животные с СД 3842,7 ± 144* 2055,364 ± 79,7* 53,5**

* Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,001). ** Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,01).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при моделировании длительного стрептозотоцин индуцированного СД были обнаружены структурные повреждения в почках крыс, наиболее выраженные изменения выявлены в почечных тельцах в виде дистрофических и атрофических изменений эпителия капсулы клубочков, расширения мезанигия и увеличения площади соединительной ткани, что свидетельствует о начале процессов фиброза с исходом в гломерулосклероз.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дедов. И. И., Шестакова М. В., Галстян Г. Р. и др. // Проблемы эндокринологии. - 2015. - Т. 61, № 1 (2). - С. 1-105.

2. Добронравов В. А. // Нефрология. - 2002. -T. 6, № 1. - С. 16-22.

3. Джиоева И. А. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 2. - [Электронный ресурс]. - Режим доступа: www.science-education.ru/ 122-17263

4. Chilelli N. C., Burlina S., Lapolla A. // Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. - 2013. -Vol. 23 (10). - P. 913-910.

5. Mетодические рекомендации по доклиническому изучению пероральных лекарственных средств для лечения сахарного диабета / А. А. Спасов и др. // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А. Н. Mиро-нова. - M., 2012. - С. 670-684.

6. Спасов А. А, Смирнов А. В., Соловьева О. А. и др. // Вестник ВолгШУ. - 2015. - № 3. - C. 36-41.

7. Etuk E. U. // Agric. Biol. J. N. Am. - 2010. -Vol. 1 (2). - P. 130-134.

8. Ventura-Sobrevilla J., Boone-Villa V. D., Agui-lar C. N., et al. // Proc. West Pharmacol. Soc. - 2011. -Vol. 54. - P. 5-9.