Биомедицинский клеточный продукт на основе мезенхимальных стромальных клеток млекопитающих и гексапептида
BIOMEDICAL CELL PRODUCT BASED ON MAMMALIAN MESENCHYMAL STROMAL CELLS AND HEXAPEPTIDE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области здравоохранения. Более конкретно, изобретение относится к биомедицинскому клеточному продукту на основе мезенхимальных стромальных клеток млекопитающих.
Сведения о предшествующем уровне техники
К биомедицинским клеточным продуктам (БМКП) относят комплексы, состоящие из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения (далее - лекарственные препараты) и (или) медицинскими изделиями.
Dominici M et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
Galipeau J et al., International Society for Cellular Therapy perspective on immune functional assays for mesenchymal stromal cells as potency release criterion for advanced phase clinical trials. Cytotherapy 18, 151-159, 2016
Gottipamula S et al. Mesenchymal Stromal Cells: Basics, Classification, and Clinical Applications. Journal of Stem Cells, 13(1): 23-47, 2018
García-Bernal D et al. The Current Status of Mesenchymal Stromal Cells: Controversies, Unresolved Issues and Some Promising Solutions to Improve Their Therapeutic Efficacy. Front Cell Dev Biol. 2021 Mar 16;9:650664
К мезенхимальным стромальным клеткам (МСК), известным также как мезенхимальные стволовые клетки, относят клеточные линии, удовлетворяющие критериям, установленным Международным обществом клеточной терапии (ISCT). . . МСК могут быть выделены из различных тканей млекопитающих, включая костный мозг, жировую ткань, пуповину, кровь, студень Вартона, бронхеоальвеолярный лаваж и т.д. После выделения МСК культивируют вне организма. Терапевтически эффективные количества МСК могут быть использованы для лечения болезней печени, осложнений сахарного диабета, остеоартрита, сердечно-сосудистых и др. заболеваний при разных способах введения. . Однако МСК в составе БМКП нестабильны и должны быть введены пациенту в течение суток до начала потери ими своих биологических характеристик. Стандартный метод длительного хранения МСК - криоконсервация, которая сопряжена с рисками, такими как: (1) снижение метаболической активности, жизнеспособности, и терапевтической эффективности клеток после цикла замораживание-размораживание; (2) цитотоксичность криопротекторов. Таким образом, существует необходимость в повышении жизнеспособности МСК в составе БМКП, чтобы сохранять терапевтические свойства МСК при хранении более 24 часов без применения криоконсервантов и/или повышать выживаемость МСК в составе БМКП после криоконсервации (цикла заморозки-разморозки). .
Гексапептид H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH представляет собой аналог эндогенного пептида динорфина 1-6, полученный заменой Gly на D-Ala в положении 2 аминокислотной последовательности. Уксуснокислая соль гексапептида в форме инъекций является коммерчески доступным лекарственным средством в Российской Федерации для лечения заболеваний пищеварительной системы, в частности острого панкреатита, язв желудка и двенадцатиперстной кишки, с историей клинического применения более 30 лет. Гексапептид продемонстрировал широкий спектр биологических активностей в диапазоне доз от 1 до 1000 мкг/кг массы тела млекопитающего. Использование гексапептида в виде внутримышечных инъекций или внутривенных вливаний, раскрыто в патентах RU 2032422, 2241488, 2198641, 2104717, 2270025, 2351334, 2343885, 2405534, 2363455, 2515550, 2180598, 2635083, 2436588, 2473325, 2144831, 2646569, 2200026, 2146530, 2155608, 2185176, 2139725, 2266130, 2326661, 2299742, 2218896, 2416398, 2318503, 2430753, 2299438, 2258529, 2099077, 2122415, 2261713, 2006039, 2366416, 2228762, 2185849, 2496493, 2366417, 2017488, 2167671, 2181564, 2284192, 2290203, 2286793, 2366432, 2299065, 2429002, 2196603, 2142814, 2285522, 2203693, 2230549, 2180591, 2142736, 2113856, 2217139, 2266752, 2261722, 2362580, 2223741, 222814869, 2217186, 2266130, 2326661, 2299742, 2218896, 2657416, 2416398, 2318503, 2430753, 2299438, 2258529, 2099077, 2122415, 2261713, 2006039, 2366416. Кроме того, гексапептид используется в виде внутрилегочных ингаляций для лечения заболеваний легких в виде водного раствора с содержанием гексапептида от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл, что раскрыто в патентах RU 2728821, 2728938, 2728939, 2733269, 2737799, 2739573. Однако способность гексапептида H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH повышать стабильность МСК и таким образом улучшать терапевтические характеристики БМКП на их основе неизвестна из уровня техники.
Tanaka T et al. Interleukin (IL-6) Immunotherapy. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018, 10(8):a028456
Rincon M, Irvin CG. Role of IL-6 in asthma and other inflammatory pulmonary diseases. Int J Biol Sci. 2012; 8(9):1281-90
Celli BR et al. Inflammatory biomarkers improve clinical prediction of mortality in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012, 185(10):1065-72
McGonagle D et al. Autoimmun Rev. 2020, 19(6):102537
Papiris SA et al. Cytokine. 2018, 102:168-172
Andrijevic I et al. Ann Thorac Med. 2014, 9(3):162-7
Henry BM et al., Hematologic, biochemical and immune biomarker abnormalities associated with severe illness and mortality in coronavirus disease 2019 (COVID-19): a meta-analysis. Clin. Chem. Lab. Med. 2020;58(7):1021-1028
Udomsinprasert W et al., Circulating levels of interleukin-6 and interleukin-10, but not tumor necrosis factor-alpha, as potential biomarkers of severity and mortality for COVID-19: systematic review with meta-analysis. J. Clin. Immunology. 2021;41(1):11-22
Интерлейкин-6 (ИЛ-6) представляет собой медиатор воспаления, который вырабатывается клетками иммунной ситемы при болезнях легких как нормальный ответ на инфекцию или повреждение тканей. Однако чрезмерная продукция ИЛ-6 оказывает патологическое действие, вызывая синдром системной воспалительной реакции, состояние гиперкоагуляции при острых и хронических иммуноопосредованных заболеваниях легких. . ИЛ-6 продуцируется первичными эпителиальными клетками легких при астме и других болезнях легких, причем уровень ИЛ-6 определяет тяжесть нарушений функций легких. . Уровень IL-6 является прогностическим фактором увеличения смертности при хронической обструктивной болезни легких. . Устойчивое повышение уровней ИЛ-6 наблюдается при остром респираторном дистресс-синдроме взрослых (ОРДС), возникающем вследствие вирусных и бактериальных инфекций, в том числе при COVID-19. . Повышение уровней IL-6 является патологическим фактором при фиброзе легких. . Повышение уровней ИЛ-6 у пациентов с пневмонией коррелирует с тяжестью заболевания и является биомаркером смертности от пневмонии. . Повышенные уровни ИЛ-6 связаны с тяжелым течением и смертностью при COVID-19. . . Таким образом, существует необходимость в снижении патологически повышенных уровней ИЛ-6 для снижения тяжести болезней легких и снижения риска смертности от этих заболеваний.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что гексапептид H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH повышает жизнеспособность МСК в составе БМКП и, таким образом, улучшает терапевтические характеристики этих продуктов, например, в лечении заболеваний легких, связанных с воспалением, в котором чрезмерная продукция интерлейкина-6 (ИЛ-6) является важным патогенетическим фактором.
Описание изобретения
6
6
Настоящее изобретение относится к биомедицинскому клеточному продукту для лечения болезни легких, связанной с повышенными уровнями интерлейкина-6, в виде водной суспензии, включающему мезенхимальные стромальные клетки млекопитающих в количестве от 0,1×10 до 10,0×10 клеток/мл и гексапептид формулы H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH (I) или его фармацевтически приемлемую соль в количестве от 0,1 до 10,0 мг/мл.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение жизнеспособности биомедицинского клеточного продукта (БМКП), содержащего мезенхимальные стромальные клетки (МСК) млекопитающих, за счет введения в состав продукта гексапептида (I), что снижает потерю биологических характеристик МСК в период между приготовлением БМКП и введением последнего пациенту и, таким образом, ведет к повышению терапевтической эффективности БМКП.
Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является то, что повышение жизнеспособности БМКП и связанное с этим снижение потери биологических характеристик МСК в период между приготовлением БМКП и введением последнего пациенту повышает эффективность БМКП в лечении симптомов воспаления, в том числе в подавлении продукции интерлейкина-6 (ИЛ-6).
Термин «биомедицинский клеточный продукт», сокращенно БМКП, относится к комплексу, состоящему из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения (далее - лекарственные препараты) и (или) медицинскими изделиями.
Dominici M et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
Galipeau J et al., International Society for Cellular Therapy perspective on immune functional assays for mesenchymal stromal cells as potency release criterion for advanced phase clinical trials. Cytotherapy 18, 151-159, 2016
Термин «мезенхимальные стромальные клетки», эквивалентный термин «мезенхимальные стволовые клетки», сокращенно МСК, относится к любой клеточной линии, удовлетворяющей критериям, выработанным Международным обществом клеточной терапии (ISCT) как описано в  и/или в .
При осуществлении настоящего изобретения, МСК могут быть выделены из любой ткани млекопитающего, содержащей эти клетки.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, МСК выделяют из ткани млекопитающего, выбранной из группы состоящей из костного мозга, жировой ткани, пуповины, и плаценты. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, МСК выделяют из костного мозга или жировой ткани.
Mosna F et al. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide.Stem Cells Dev. 2010 Oct;19(10):1449-70
Приготовление МСК может быть выполнено согласно процедурам, известным из технического уровня, например, как описано в . Приготовление МСК млекопитающего может включать следующие этапы: выделение клеток из ткани млекопитающего (например, костного мозга или жировой ткани), культивацию клеток в подходящей среде для увеличения количества клеток, контроль качества, включающий проверку клеток на жизнеспособность и соответствие критериям ISCT для МСК.
35
51
9
8
Гексапептид формулы (I) имеет брутто-формулу CHNO, молекулярную массу 725,84 дальтон и регистрационный номер CAS 81733-79-1 в качестве идентификатора.
Настоящее изобретение относится ко всем фармацевтически приемлемым солям и сольватам гексапептида формулы (I). Неисключительные примеры таких фармацевтически приемлемых солей включают хлорид, бромид, сульфат, ацетат, пируват, малат, фумарат и цитрат. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, фармацевтически приемлемой солью гексапептида формулы (I) является диацетат, химическое название тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат.
Гексапептид формулы (I) может быть получен любым способом, известным в данной области, в частности твердофазным синтезом. Гексапептид формулы (I) и его соли и сольваты коммерчески доступны, например, в каталоге Bachem №4030569.0100. Гексапептид (I) диацетат представляет собой коммерчески доступный активный фармацевтический ингредиент, который выпускается несколькими производителями в Российской Федерации.
При осуществлении изобретения, БМКП в виде водной суспензии приготавливается на основе фармацевтической воды с добавлением регуляторов тоничности.
Неисключительные примеры регуляторов тоничности включают подходящий осмотически активный неорганический агент, такой как хлориды, сульфаты или фосфаты натрия, кальция или магния; подходящий осмотически активный органический агент, такой как сахара и сахарные спирты, в частности трегалоза, маннитол и сорбитол. Предпочтительным регулятором тоничности является хлорид натрия в количестве от 0,1 до 0,9% от указанной композиции.
Предпочтительно, БМКП в виде водной суспензии приготавливается на основе физиологического раствора (раствор 0,9% NaCl в фармацевтической воде).
Используемый здесь термин «фармацевтическая вода» относится к воде, которая соответствует требованиям нормативных документов Российской Федерации и/или других стран, например, требования ФС.2.2.0020.15 «Очищенная вода» и требования ФС.2.2.0019.15 «Вода для инъекций» фармакопеи Российской Федерации; и/или CPMP/QWP/158/01 «Note for Guidance on Quality of Water for Pharmaceutical Use», EMEA, 2002. Предпочтительно, фармацевтическая вода выбирается из группы, состоящей из очищенной воды и воды для инъекций.
При осуществлении изобретения БМКП может содержать другие вспомогательные вещества. Неисключительные примеры вспомогательных веществ включают метаболиты, буферные системы, криопротекторы, витамины, и белки (например, сывороточный альбумин).
Неисключительные примеры метаболитов для поддержания метаболической активности МСК в водной суспензии включают глюкозу, бета-гидроксибутират; субстраты цикла трикарбоновых кислот такие как цитрат, 2-кетоглутарат, сукцинат, фумарат, малат; аминокислоты такие как аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, гистидин, глицин, глутамин, глютаминовая кислота, пролин, серин, тирозин, валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, и фениалалнин.
Используемый здесь термин «буферная система» описывает комбинацию кислоты и основания в количествах, достаточных для поддержания желаемого уровня pH. Неисключительные примеры фармацевтически приемлемых буферных систем для поддержания рН в диапазоне от 3,0 до 8,5 описаны в Фармакопее Российской Федерации (OFS.1.3.0003.15 «Буферные растворы») и включают ацетатный буфер, цитратный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер, и бикарбонатный буфер.
Неисключительные примеры криопротекторов включают диметилсульфоксид и пропиленгликоль.
Неисключительные примеры витаминов включают аскорбиновую кислоту и никотинамид.
При осуществлении изобретения, БМКП в виде водной суспезии приготавливается путем смешивания МСК, гексапептида (I) и вспомогательных веществ в воде в асептических условиях. Полученное БМКП может быть использовано для лечения заболеваний, для которых эффективность МСК уже известна из уровня техники, например, для регенерации органов и тканей, таких как кожа, печень, легкие, сердечно-сосудистая система, суставы. Кроме того, БМКП настоящего изобретения могут быть использованы в лечении заболеваний, сопровождающихся воспалением, в том числе воспалительных заболеваний легких.
При осуществлении настоящего изобретения, БМКП может приготавливаться как аутологичный биомедицинский клеточный продукт, аллогенный клеточный продукт, и комбинированный биомедицинский клеточный продукт.
Термин «аутологичный», используемый в настоящем изобретении относится к биомедицинскому клеточному продукту, содержащему в своем составе клеточную линию (клеточные линии), полученную из биологического материала определенного млекопитающего (например, человека), и предназначенный для применения этому же млекопитающему (человеку).
Термин «аллогенный», используемый в настоящем изобретении относится к биомедицинскому клеточному продукту, содержащему в своем составе клеточную линию (клеточные линии), полученную из биологического материала определенного млекопитающего (например, человека), и предназначенный для применения другому млекопитающему (человеку).
Термин «комбинированный», используемый в настоящем изобретении относится к биомедицинскому клеточному продукту, содержащему в своем составе клеточные линии, полученные из биологического материала нескольких млекопитающих (людей), и предназначенный для применения одному из них.
При осуществлении изобретения, БМКП могут быть введены пациенту разными путями, включая без ограничения инъекционный (инфузионный) путь введения, наружно, ректально, а также путем внутрилегочных ингаляций.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, БМКП вводится ингаляционно.
Термин «ингаляция», используемый в настоящем изобретении относится к вдыханию паров или дисперсии твердых или жидких частиц содержащих лекарственное средство. В конкретных примерах вдыхание может происходить через распылитель или другое устройство для доставки аэрозоля.
В одном из воплощений настоящего изобретения, для получения терапевтического эффекта млекопитающему с болезнью легких вводят эффективные количества БМКП ингаляционно в виде аэрозоля с помощью небулайзера однократно или многократно, в течение одних суток или нескольких суток.
Термин «небулайзер» обозначает устройство для ингаляций, обеспечивающее преобразование жидкого лекарственного средства для распыления в дисперсию в газовой среде для доставки действующего вещества в легкие. Примеры небулайзеров включают компрессорные, ультразвуковые, либо небулайзеры иного типа.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, БМКП вводят в легкие в форме аэрозоля с размером частиц от 0,1 до 10,0 микрон, более предпочтительно от 1 до 5 микрон.
Используемый здесь термин «млекопитающее» относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, например, мыши, крысе, и человеку. Предпочтительным млекопитающим является человек.
Используемый здесь термин «лечение» означает предотвращение, уменьшение или ингибирование развития заболевания, к которому применяется этот термин, или одного или нескольких симптомов этого заболевания. Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже есть расстройство, тех, кто склонен иметь расстройство, теху у кого диагностировано расстройство, или тех, у кого расстройство должно быть предотвращено.
Термин «болезнь легких» означает болезнь органов дыхания, для которой нежелательное повышение уровней интерлейкина-6, как фактора, влияющего на тяжесть заболевания известно из уровня техники. К таким болезням легких относятся болезни классифицированные под кодами J00-J99 согласно Международной Классификации Болезней 10-го пересмотра (МКБ-10). Предпочтительно, к таким болезням легких относятся астма (код J45), острая тяжелая астма (J46), хронический астматический (обструктивный) бронхит (J44.-), хроническая обструктивная астма (J44.-), эозинофильная астма (J82), болезни легкого, вызванные внешними агентами (J60-J70) астматический статус (J46), бронхит (J40), простой и слизисто-гнойный хронический бронхит (J41), хронический бронхит (J42), эмфизема (J43), хроническая обструктивная легочная болезнь (коды J44.0; J44.1; J44.8; J44.9), грипп и пневмония (J10-J18); пневмокониоз, вызванный внешним агентом (J60-J65); болезнь дыхательных путей, вызванная специфической органической пылью (J66); гиперсенситивный пневмонит, вызванный органической пылью (J67); респираторные состояния, вызванные вдыханием химических веществ, газов, дымов и паров (J68); пневмонит, вызванный твердыми веществами и жидкостями (J69); респираторные состояния, вызванные другими внешними агентами (J70); синдром респираторного расстройства [дистресса] у взрослого (J80); легочный отек (J81); альвеолярные и парието-альвеолярные нарушения (J84.0); другие интерстициальные легочные болезни с упоминанием о фиброзе (J84.1); другие уточненные интерстициальные легочные болезни (J84.8); интерстициальная легочная болезнь, неуточненная (J84.9); абсцесс легкого и средостения (J85).
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, болезнь легкого выбирается из группы, состоящей из острого воспалительного поражения легких, острого респираторного дистресс-синдрома, пневмонии, хронической обструктивной болезни легких, эмфиземы, астмы, COVID-19..
Следующие примеры демонстрируют изобретение. Примеры иллюстрируют изобретение и не предназначены для ограничения объема изобретения тем или иным образом.
Пример 1
Пример иллюстрирует получение МСК.
2
Dominici M et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
Жировая ткань человека была получена простой липосакцией из подкожных жиров брюшной полости с информированного согласия донора, после чего подвергнута последовательно действию коллагеназы (1 мг/мл) при осторожном перемешивании в течение 60 мин при 37°С, фильтрованию через фильтр 100 мкм, и центрифугированию 1500 об/мин×5 мин. Осадок ресуспендировали в среде DMEM (Gibco), содержащей 10% фетальной бычей сыворотки (FBS). Суспензию клеток повторно центрифугировали 1500 об/мин×5 мин. Супернатант отбросили, осадок клеток собрали. Фракцию клеток культивировали в течение ночи при 37°C/5% CO в среде DMEM, содержащей 10% FBS. Через 24 часа неприлипающие клетки удалили промыванием в фосфатно-солевом буфере (PBS). Прикрепленные клетки культивировали со сменой среды в первый раз через 48 часов после посева и затем каждые 72 часа. При достижении слияния колоний клеток на 80%, клетки собирали, ресуспендировали и повторно засевали. Процедуру повторяли несколько раз при достижении слияния колоний на 90%. Подтверждение фенотипа МСК проводили согласно критериям описанным в . Полученные таким образом МСК использовали в получении БМКП.
Пример 2
Пример иллюстрирует БМКП настоящего изобретения.
Таблица 1. Состав БМКП
Ингредиент
Содержание
Мезенхимальные стромальные клетки
0,1x10<sup>6</sup> - 10,0x10<sup>6</sup> клеток
Гексапептид (I)
0,1 – 10,0 мг
Физ.раствор
1 мл
Для приготовления БМКП в виде водной суспензии, МСК из примера 1 ресуспендируют в 1 мл водного раствора, полученного растворением гексапептида (I) в воде физ. растворе в пропорциях, указанных в таблице 1.
Пример 3
Пример иллюстрирует жизнеспособность МСК в составе БМКП настоящего изобретения.
Для исследования эффекта гексапептида (I) на жизнеспособность МСК в составе БМКП при +4°С были получены БМКП, содержащие (№№1-3) или не содержащие (№№4-6) гексапептид (I), см. таблицу 2.
Таблица 2. Составы БМКП, использованные в исследованиях жизнеспособности МСК в течение 48 часов при +4°С.
БМКП
Ингредиент
№1
№2
№3
№4
№5
№6
МСК, клеток/мл
0,1×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>6</sup>
10×10<sup>6</sup>
0,1×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>6</sup>
10,0×10<sup>6</sup>
Гексапептид (I), мг/мл
0,1
1,0
10,0
нет
нет
нет
Физ.раствор, мл
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Strober W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol 2001, 21:3B:A.3B.1-A.3B.2. https://doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs111
БМКП №№1-6 получены смешением МСК с другими компонентами в пропорциях, как указано в таблице 2, и использованы в 48-часовом тесте жизнеспособности. Жизнеспособность МСК в клеточных суспензиях настоящего изобретения (БМКП №№1-3) в сравнении с суспензиями (БМКП №№4-6), полученными без добавления гексапептида (I) после хранения в течение 48 часов при +4°С определяли путем смешивания 100 мкл клеточной суспензии со 100 мкл 0,4% раствора трипанового синего (Sigma-Aldrich) в течение 2 минут, где трипановый синий окрашивал только нежизнеспособные клетки. Клетки подсчитывали с помощью микрокамеры гемоцитометра под световым микроскопом.  Жизнеспособность оценивалась как средний процент клеток ± стандартная ошибка (SEM) с чистой цитоплазмой (жизнеспособные клетки) для четырех образцов каждого из БМКП №№1-6. Результаты представлены в таблицах 3-5 как попарное сравнение жизнеспособности МСК в образцах БМКП, содержащих то же количество клеток и вспомогательных веществ, но в присутствие или отсутствие гексапептида (I). Статистическое различие между группами оценивалось с помощью t-критерия Стьюдента.
Таблица 3. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №1 и №4 после хранения в течение 48 часов при +4°С.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №1
84,5±2,2*
БМКП №4 (без гексапептида)
60,3±3,8
*Достоверное отличие между группами (p<0.05)
Таблица 4. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №2 и №5 после хранения в течение 48 часов при +4°С.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №2
88,1±3,2*
БМКП №5 (без гексапептида)
62,8±3,5
*Достоверное отличие между группами (p<0.05)
Таблица 5. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №3 и №6 после хранения в течение 48 часов при +4°С.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №3
80,3±4,7*
БМКП №6 (без гексапептида)
60,5±6,6
*Достоверное отличие между группами (p<0.05)
Таблицы 3-5 показывают, что наличие гексапептида (I) в составе БМКП значимо повышает жизнеспособность МСК. Таким образом, повышение жизнеспособности МСК в составе биомедицинского клеточного продукта было достигнуто за счет введения в состав продукта гексапептида (I), что снижает потерю биологических характеристик МСК в период между приготовлением и введением БМКП пациенту и, таким образом, ведет к повышению терапевтической эффективности БМКП.
Пример 4
Пример иллюстрирует жизнеспособность МСК в составе БМКП настоящего изобретения после криоконсервации.
Для исследования эффекта гексапептида (I) на жизнеспособность МСК в составе БМКП, содержащего диметилсульфоксид (DMSO), при замораживании-размораживании были получены БМКП, содержащие (№№7-9) или не содержащие (№№10-12) гексапептид (I), см. таблицу 6.
Таблица 6. Составы БМКП, использованные в исследованиях жизнеспособности МСК после криоконсервации (замораживания-размораживания).
БМКП
Ингредиент
№7
№8
№9
№10
№11
№12
МСК, клеток/мл
0,1×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>6</sup>
10×10<sup>6</sup>
0,1×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>6</sup>
10,0×10<sup>6</sup>
Гексапептид (I), мг/мл
0,1
1,0
10,0
нет
нет
нет
DMSO, мг/мл
50
50
50
50
50
50
Физ.раствор, мл
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
БМКП №№7-12 были получены смешением МСК с другими компонентами в пропорциях, как указано в таблице 6, и использованы в тесте жизнеспособности МСК. БМКП охлаждали со скоростью 1°C/мин до -80°C, после чего перенесли в жидкий азот, где хранили 24 часа. По истечении указанного периода, образцы размораживали на водяной бане при 37°C. Жизнеспособность МСК в клеточных суспензиях настоящего изобретения (БМКП №№7-9) в сравнении с суспензиями (БМКП №№10-12), полученными без добавления гексапептида (I) после цикла замораживания-размораживания определяли путем смешивания 100 мкл клеточной суспензии со 100 мкл 0,4% раствора трипанового синего (Sigma-Aldrich) в течение 2 минут. Жизнеспособность оценивалась как средний процент клеток ± стандартная ошибка (SEM) с чистой цитоплазмой (жизнеспособные клетки) для четырех образцов каждого из БМКП №№7-12. Результаты представлены в таблицах 7-9 как попарное сравнение жизнеспособности МСК в образцах БМКП, содержащих то же количество клеток и вспомогательных веществ, но в присутствие или отсутствие гексапептида (I). Статистическое различие между группами оценивалось с помощью t-критерия Стьюдента.
Таблица 7. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №7 и №10 после замораживания-размораживания.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №7
89,8 ± 2,6*
БМКП №10 (без гексапептида)
74,8 ± 2,9
*Достоверное отличие между группами (p<0.05)
Таблица 8. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №8 и №11 после замораживания-размораживания.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №8
93,5 ± 1,8*
БМКП №11 (без гексапептида)
80,3 ± 2,8
*Достоверное отличие между группами (p<0.05)
Таблица 9. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №9 и №12 после замораживания-размораживания.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №9
88,5 ± 2,0*
БМКП №12 (без гексапептида)
66,3 ± 3,3
*Достоверное отличие между группами (p<0.05)
Таблицы 7-9 показывают, что наличие гексапептида (I) в составе БМКП значимо повышает жизнеспособность МСК после цикла заморозки-разморозки. Таким образом, повышение стабильности биомедицинского клеточного продукта была достигнуто за счет введения в состав продукта гексапептида (I), предохраняющего от потери биологических характеристик МСК в период между приготовлением, криоконсервацией, размораживанием и введением БМКП пациенту и, таким образом, ведет к повышению терапевтической эффективности БМКП.
Пример 6
Пример иллюстрирует эффективность БМКП настоящего изобретения после хранения.
Получение МСК мыши
Gnecchi M, Melo LG. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, characterization, viral transduction, and production of conditioned medium. Methods Mol Biol. 2009;482:281-94.
Boregowda SV et al. Isolation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Methods Mol Biol. 2016;1416:205-23
Dominici M et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
2
2
2
: мезенхимальные стромальные клетки мыши были получены согласно процедуре, детально описанной в  Кратко, клетки костного мозга выделяли из бедренных и большеберцовых костей мышей C57Bl/6, возраст 6-9 недель, путем промывания костей с помощью коммерчески доступной среды DMEM (состав с низким содержанием глюкозы) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% витаминов, 1% глютамина, 1% заменимых аминокислот. Далее клетки центрифугировали, ресуспендировали в свежей питательной среде и подсчитывали. Изолированные таким образом клетки высевали во флаконы с площадью поверхности 75 мм и выращивали в инкубаторе при 37°C / 5% CO / 5% O в течение 48 часов. Флаконы с клетками были промыты раствором PBS (phosphate buffered saline) для удаления всех неприлипающих клеток, Прикрепленные клетки культивировали со сменой среды в первый раз через 48 часов после посева и затем каждые 72 часа. При достижении слияния колоний клеток на 80%, клетки собирали, ресуспендировали и повторно засевали (пассаж 1). Процедуру повторяли несколько раз при достижении слияния колоний на 90%. Подтверждение фенотипа МСК проводили как описано в  и согласно критериям описанным в . Полученные таким образом МСК использовали в получении БМКП.
Получение БМКП
: не содержащие (№13) или содержащие (№14) гексапептид (I) БМКП были получены ресуспендированием МСК в 1 мл водного раствора, содержащего компоненты в пропорциях, указанных в таблице 10.
Таблица 10. Составы БМКП.
БМКП
Ингредиент
№13
№14
МСК, клеток/мл
1,0×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>6</sup>
Гексапептид (I), мг/мл
нет
1,0
Физ.раствор, мл
1,0
1,0
Стабильность БМКП
: БМКП №№ 13 и 14 были использованы в 48-часовом тесте исследования стабильности при +4°С с использованием трипанового синего, как описано в примере 3. Результаты представлены в таблице 11 как среднее ± SEM для четырех образцов каждого из БМКП. Статистическое различие между группами оценивалось с помощью t-критерия Стьюдента.
Таблица 11. Сравнение жизнеспособности МСК в составе БМКП №13 и №14 после хранения в течение 48 часов при +4°С.
Продукт
Жизнеспособность, % (среднее ± SEM)
БМКП №13
57,8 ± 4,9
БМКП №14
81,0 ± 3,1*
*Достоверное отличие между группами (p<0.05).
Таким образом, жизнеспособность МСК в составе БМКП №14, содержащем гексапептид (I) была значимо выше, чем в БМКП №13, не содержащем гексапептид (I), после 48 часов хранения +4°С.
Модель острого воспалительного повреждения легких
D'Alessio FR. Mouse Models of Acute Lung Injury and ARDS. Methods Mol Biol. 2018, 1809:341-350
Aoyagi T et al. Int Immunol. 2011, 23(2):97-108
. Эффективность БМКП №13 и №14 была протестирована на модели острого воспалительного повреждения легких, вызванного внутритрахеальным введением липополисахарида E.coli (ЛПС, Sigma-Aldrich) самцам мышей C57Bl/6 как описано в  с предварительной сенсибилизацией 1 мкг/мышь α-галактозилцерамидом (α-GalCer, KRN7000, Sigma-Aldrich) как описано в . Через 24 часа после сенсибилизации α-галактозилцерамидом, мышам вводили интратрахеально ЛПС (E.coli; 300 мкг/мышь) с добавлением 10 мкл/мышь полного адъюванта Фрейнда. Эта модель характеризуется острым перепроизводством интерлейкина-6 в легких, причем перепроизводство IL-6 связано с острым повреждением легких, отеком легких, острым респираторным дистресс-синдромом, и пневмонией. Другими симптомами смоделированного респираторного заболевания, связанного с IL-6, были угнетение двигательной активности, нарушение координации, недостаточное широкое раскрытие век и опущение, низкий мышечный тонус, снижение аппетита, потребления воды и мочеиспускания; а также нарушение дыхания.
Введение БМКП
. Через 30 мин после индукции воспаления с ЛПС, мышам вводили ингаляционно однократно 50 мкл БМКП №13 (n=5), 50 мкл БМКП №14 (n=5), или 50 мкл физ. раствора (контроль, n=5), причем БМКП №13 и №14 были использованы после приготовления и хранения в течение 48 часов при +4°С. Непосредственно перед введением животному БМКП доводили до комнатной температуры.
Измерение ИЛ-6
. Уровни ИЛ-6 определяли в водном экстракте гомогенатов легких через 2 часа после введения БМКП. Для измерений использовали Bio-Plex MAGPIX™ Multiplex Reader, коммерчески доступную панель Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine Th17 Panel A 6-Plex # M6000007NY, и программу анализа данных Bio-Plex Data Pro (версия 1.0.0.06) компании Bio-Rad. Результаты представлены в таблице 12 как среднее ± SEM концентраций ИЛ-6 в легких. Для сравнения, средний уровень ИЛ-6 в легких у интактных мышей составлял 0,12 нг/мл. Статистический анализ проводился с помощью one-way ANOVA), пос-тест Тьюки для множественного сравнения между группами.
Таблица 12. Уровни ИЛ-6 в легких мышей с острым воспалительным поражением легких после введения БМКП.
Продукт
ИЛ-6, нг/мл (среднее ± SEM)
Физ. раствор
1,86 ± 0,06
БМКП №13
1,33 ± 0,09*
БМКП №14
0,92 ± 0,08*<sup>#</sup>
#
*Достоверно отличается от контроля (p<0,05). Достоверно отличается от БМКП №13.
Таблица 12 показывает, что введение БМКП настоящего изобретения, хранившегося 48 часов при +4°С, значимо снижает уровни ИЛ-6 в легких мышей с острым воспалительным поражением легких, как по сравнению с контролем, так и с БМКП, содержащим МСК в той же дозе, но не содержащим гексапептид (I). Этот эффект достигнут за счет введения в состав БМКП гексапептида (I), предупреждающего потерю жизнеспособности клеток в составе БМКП (см. таблицу 11) в период между приготовлением БМКП и введением последнего субъекту. Таким образом, повышение стабильности БМКП за счет введения в состав БМКП гексапептида (I), предупреждающего потерю жизнеспособности клеток в составе БМКП в период между приготовлением БМКП и введением последнего пациенту, повышает эффективность БМКП в лечении симптомов воспаления, в том числе в подавлении продукции интерлейкина-6, важного патогенетического фактора при болезнях легких.