ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА И ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION, MEDICATION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF METABOLIC SYNDROME AND DIABETIC NEPHROPATHY AND METHOD OF OBTAINING THEREOF

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и, более конкретно, к фармацевтической композиции, средству и способу ее получения для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии и может быть использовано для производства на их основе препарата в лекарственной форме таблеток, таблеток, покрытых пленочной оболочкой, или капсул.
Известная фармацевтическая композиция, содержащая активные вещества таурин, экстракт травы пустырника, экстракт плодов боярышника и вспомогательные вещества, описана в патенте Украины как средство Кратал для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы (патент Украины №39141, МПК А61К 31/195, 35/78, 2001). Известная композиция предназначена для получения гранул, содержащих таурин и густые экстракты плодов боярышника и пустырника, полученные путем влажной грануляции с картофельным крахмалом с последующей их сушкой.
Известное средство Кратал для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, содержащее активные вещества - таурин, экстракт травы пустырника, экстракт плодов боярышника и вспомогательные вещества (патент Украины №39141, МПК А61К 31/195, 35/78, 2001). Состав гранул Кратала подобран при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Таурин
85,0-86,8
Экстракт травы пустырника густой
8,3-8,7
Экстракт плодов боярышника густой
4,1-4,4
Вспомогательные вещества
остальное
Комбинированное средство гранулы Кратала в силу своих фармако-терапевтических свойств обладает мягким кардиотоническим действием, антиангинальной, коронаролитической и антиаритмической активностью. Механизм фармакотерапевтического действия препарата связан с ингибирующим влиянием на ренин-ангиотензиновую и калликреин-кининовую систему с одновременным положительным влиянием на продукцию цАМФ и с ингибированием процессов перекисного окисления липидов.
Однако гранулы имеют неприятные органолептические свойства (чрезвычайно выраженную горечь) при их пероральном применении. Дозирование лекарственного средства в гранулах также неоднозначно и затруднено не только для взрослых, но особенно при назначении детям.
Весьма проблематичной является технология получения этой композиции, поскольку влажная грануляция крахмальным клейстером всех активных компонентов с целью получения гранул, последующие операции их сушки, затем сухого гранулирования путем перетирки через сита и, наконец, классификация гранул - довольно энергозатратные и долговременные операции. Кроме этого применение крахмального клейстера как агента для гранулирования легкорастворимых в воде активных ингредиентов - таурина и густых экстрактов растительных субстанций плодов боярышника (Crataegus janguinca) и травы пустырника (Leonurus cardiaca L.), является довольно трудно воспроизводимой технологической операцией.
Важной фармацевтической проблемой для Кратала остается подбор надежной блистерной упаковки вследствие значительной гигроскопичности этого препарата. Широко применяемый блистер на основе поливинилхлоридной пленки с алюминиевой подложкой не всегда является надежным средством в качестве гидробарьера для сохранности таких лекарственных средств, как Кратал, в течение длительного времени их хранения (более 1 года, фармакопейные требования) даже в узком диапазоне показателей влажности. В такой упаковке Кратал даже при комнатной температуре и с влажностью воздуха 60-70% не выдерживает 2-2,5 месячного срока хранения. В итоге таблетки приобретают темно-коричневый цвет и становятся эластичными, а при легком механическом воздействии при извлечении из блистера подвергаются деформации, подобно резине.
В соответствии с патентом UA 39141 гранулы Кратала предназначаются для лечения сердечно-сосудистой системы, что является весьма широким определением возможностей медицинского применения этого лекарственного средства с неоднозначностью понимания его терапевтической эффективности. В Инструкции по медицинскому применению для препарата Кратал производства НПЦ «Борщаговский химфармзавод» (регистрация UA 3866/01/01 до 29.10.2015 г.) показаниями в лечении являются «нейроциркуляторные дистонии, в составе комбинированной терапии при хронической ИБС, пострадиационный синдром».
В основу изобретений положена задача создания такой фармацевтической композиции, средства и способа его получения для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии, в которых выбором нового количественного и качественного состава компонентов в композиции и средстве на ее основе, и новыми условиями выполнения операций в способе обеспечивалась бы коррекция по отношению составляющих метаболический синдром - митохондриальных биоэнергетических процессов сердечно-сосудистой системы, профилактика и лечение диабетической нефропатии.
Поставленная задача решается тем, что в фармацевтической композиции для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии, содержащей активные вещества таурин, экстракт травы пустырника, экстракт плодов боярышника и вспомогательные вещества, согласно изобретению компоненты взяты при следующем соотношении масс.%:
Боярышника экстракт жидкий* или густой* или сухой
2-5
Пустырника экстракт жидкий* или густой* или сухой
6-10
Таурин
65-80
Вспомогательные вещества
остальное
* - (в пересчете на сухое вещество)
Кроме того, сухие экстракты боярышника и пустырника введены в состав в виде комплекса со вспомогательными веществами.
Целесообразно, чтобы средство для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии, содержащее активные вещества таурин, экстракт травы пустырника, экстракт плодов боярышника и вспомогательные вещества, согласно изобретению содержало фармацевтическую композицию при следующем соотношении компонентов, масс.%:
Боярышника экстракт жидкий* или густой* или сухой
2-5
Пустырника экстракт жидкий* или густой* или сухой
6-10
Таурин
65-80
Вспомогательные вещества
остальное
* - (в пересчете на сухое вещество)
Кроме того, в качестве вспомогательных веществ выбраны вещества, выполняющие функции связующих материалов, агентов, вызывающих дезинтеграцию, и материалов, способствующих скольжению и смазке гранулята при прессовании, и материалов пленочного покрытия.
Кроме того, в качестве веществ, выполняющих функции связующих материалов, средство содержит крахмал картофельный или микрокристаллическую целлюлозу для получения гранулятов для таблетирования или капсулирования.
Кроме того, в качестве агентов, вызывающих дезинтеграцию, средство содержит кроскармелозу натрия для получения гранулятов с жидкими, или густыми, или сухими растительными экстрактами.
Кроме того, в качестве материалов, способствующих скольжению гранулята при прессовании и материалов пленочного покрытия, средство содержит коллоидный диоксид кремния.
Кроме того, в качестве материалов, способствующих смазке, средство содержит стеарат магния, вводимый в состав сухих комплексов с растительными экстрактами и при получении гранулятов для таблетирования и капсулирования.
Кроме того, средство содержит компоненты в виде лекарственных форм таблеток или таблеток, покрытых пленочной оболочкой, или капсул при суточной их дозе по таурину 100 мг на кг массы тела.
Целесообразно, чтобы способ получения средства для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии характеризовался тем, что предварительно жидкий, густой или сухой экстракты плодов боярышника и травы пустырника получали экстрагированием водным или водно-этанольным растворителем методом мацерации, или перколяции, фильтрационной экстракцией, или реперколяцией с последующим вакуумным концентрированием для густого экстракта и/или последующей сушкой для сухого экстракта, после чего их смешивали с таурином и вспомогательными веществами, выполняющими функции связующих материалов, агентов, вызывающих дезинтеграцию, и материалов, способствующих скольжению и смазке гранулята при прессовании.
Фармацевтическая разработка лекарственных форм основывалась на применении фармацевтической композиции с постоянным составом фармакологически активных компонентов при различных соотношениях вспомогательных веществ с применением различных технологических методов.
В доклинических исследованиях было установлено выраженное антиоксидантное, антигипергликемическое, гиполипидемическое сосудорасширяющее, антисклеротическое, антиагрегантное и антитоксическое действие нового препарата. Оказалось, что выявленные фармакологические свойства препарата, направленные на коррекцию метаболических нарушений, индуцированных инсулинорезистентностью и инсулиновой недостаточностью, реализуются за счет снижения оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции, играющей ключевую роль в патогенезе вышеуказанных заболеваний. Следует отметить, что нормализация биоэнергетических процессов вследствие восстановления митохондриальной функции и оксидантного статуса происходит благодаря синергизму фармакологического действия всех компонентов препарата.
При изготовлении фармацевтической композиции в лекарственных формах таблеток или капсул применялся один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, выполняющих функции связующих материалов, агентов, вызывающих дезинтеграцию, материалов, способствующих скольжению и смазке гранулята при прессовании.
Как связующие компоненты предпочтительными оказались картофельный крахмал и микрокристаллическая целлюлоза. Согласно настоящему изобретению количество связующего материала может изменяться в диапазоне от 1 до 50%, предпочтительно от 5 до 25%, в пересчете на общую массу таблетки. Состав таблетки или капсулы по связующим компонентам подбирался таким образом, чтобы обеспечивалась приемлемая дозированная форма для орального приема и удобная для пациента с немедленным высвобождением активных ингредиентов.
Предпочтение, как агентам, вызывающим дезинтеграцию, было отдано кроскармелозе натрия и кросповидону. Количество дезинтегранта может изменяться в диапазоне от 0,5 до 20%, предпочтительным стало от 1 до 10%.
Агентом для скольжения компонентов гранулята предпочтительным оказался коллоидный диоксид кремния. Количество компонента для скольжения может изменяться в диапазоне от 0,1 до 10%, предпочтительно выбрано от 0,25 до 5%.
В качестве смазочного компонента применялся стеарат магния. Количество смазочного компонента может изменяться в диапазоне от 0,1 до 5%, предпочтительным стало от 0,5 до 2%.
В качестве материалов для покрытия таблеток оболочкой были использованы такие продукты, как Opadry фирмы Colorcon, Advantia фирмы ISP, Sepifilm фирмы Seppic, которые оказались фармацевтически приемлемыми компонентами. Количество пленочного покрытия может изменяться в диапазоне от 1 до 10%, приемлемым оказалось от 1,5 до 5%.
По данным фармацевтической разработки из-за разной степени гигроскопичности сухих экстрактов, их комплексов со вспомогательными веществами и некоторых видов таблеток требовалось применение соответствующей упаковки. При испытании лекарственных форм в различных влаго-температурных условиях при длительном времени хранения (фармакопейные требования) наиболее приемлемыми оказались пластиковые контейнеры для таблеток и капсул, блистерная упаковка типа полимер/металл, а именно композит PVC/PVDC/Alu (поливинилхлорид-поливинилдихлорид-алюминий) или Alu/Alu.
Установленная совокупность фармакотерапевтических свойств препарата позволяет прогнозировать перспективность применения в профилактике и лечении метаболического синдрома, сахарного диабета 2 типа, его микро- и макрососудистых осложнений и диабетической нефропатии.
Пример 1.
Получение сухого комплекса, содержащего экстракты боярышника или пустырника, микрокристаллическую целлюлозу и кремния диоксид коллоидный, следующего компонентного состава:
Компонент сухого комплекса
Содержание, %
Боярышника или пустырника экстракт густой (содержание сухого вещества 60%), в пересчете на сухой экстракт
70,0
Целлюлоза микрокристаллическая
25,0
Кремния диоксид коллоидный
5,0
Всего:
100
Густые экстракты, содержащие 60% сухих веществ, помещают в реактор с перемешивающим устройством. В процессе перемешивания добавляют микрокристаллическую целлюлозу и кремния диоксид коллоидный, затем гомогенную смесь сушат в вакуумной ленточной сушилке и измельчают. Гранулят, полученный после добавления вспомогательных веществ, применяют для таблетирования или капсулирования.
Пример 2.
Получение сухого комплекса отличается от Примера 1 тем, что в густые экстракты при перемешивании перед сушкой вводят микрокристаллическую целлюлозу до получения следующего компонентного состава:
Компонент сухого комплекса
Содержание, %
Боярышника или пустырника экстракт густой (содержание сухого вещества 60%), в пересчете на сухой экстракт
70,0
Целлюлоза микрокристаллическая
30,0
Всего:
100
Пример 3.
Получение сухого комплекса отличается от Примеров 1 и 2 тем, что в густой экстракт при перемешивании перед сушкой вводят крахмал картофельный и кремния диоксид коллоидный до получения следующего компонентного состава:
Компонент сухого комплекса
Содержание, %
Боярышника или пустырника экстракт густой (содержание сухого вещества 60%), в пересчете на сухой экстракт
72,0
Крахмал картофельный
25,0
Кремния диоксид коллоидный
3,0
Всего:
100
Пример 4.
Отличается от Примеров 1, 2 и 3 тем, что в густой экстракт при перемешивании перед сушкой вводят крахмал картофельный до получения следующего компонентного состава:
Компонент сухого комплекса
Содержание, %
Боярышника или пустырника экстракт густой (содержание сухого вещества 60%), в пересчете на сухой экстракт
75,0
Крахмал картофельный
25,0
Всего:
100
Пример 5.
Получение сухого комплекса отличается от Примеров 1, 2, 3 и 4 тем, что смешивают густые экстракты боярышника и пустырника в массовом соотношении 1:2, далее к полученной смеси при перемешивании перед сушкой вводят микрокристаллическую целлюлозу и кремния диоксид коллоидный до получения следующего компонентного состава:
Продукт
Содержание, %
Боярышника экстракт густой (содержание сухого вещества 60%), в пересчете на сухой экстракт
23,3
Пустырника экстракт густой (содержание сухого вещества 60%), в пересчете на сухой экстракт
46,7
Целлюлоза микрокристаллическая
25,0
Кремния диоксид коллоидный
5,0
Всего:
100
Согласно изобретению разработаны несколько способов получения конкретной желаемой лекарственной формы - таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, или капсулы.
Пример 6.
Фармацевтическая композиция в лекарственной форме таблеток получают при смешивании всех компонентов в сухом виде, прессовании смеси при составе всех компонентов в весовой массе и массовых %.
Состав лекарственной формы в таблетках:
Компонент
№
Состав на 1 таблетку (мг)
%
Экстракт боярышника сухой
(6.1)
43
3,91
Экстракт пустырника сухой
(6.1)
87
7,91
Таурин
(6.2)
867
78,82
Целлюлоза микрокристаллическая
(6.2)
70
6,36
Кроскармелоза натрия
(6.3)
11
1,00
Кремния диоксид коллоидный
(6.3)
11
1,00
Магния стеарат
(6.3)
11
1,00
Общая масса
1100
100,00
Пример 7.
Отличается от Примера 6 тем, что таблетки получают при использовании густых экстрактов пустырника и боярышника с содержанием влаги до 50% по массе. Путем влажного гранулирования смеси компонентов (7.2) с экстрактами (7.1), сушки полученного гранулята, калибровки гранулята, смешивания с компонентами (7.3), прессования нового гранулята полученные таблетки упаковывают в блистерную упаковку.
Состав лекарственной формы в таблетках:
Компонент
№
Состав на 1 таблетку (мг)
%
Боярышника экстракт густой (содержание сухого вещества 50%), в пересчете на сухой экстракт
(7.1)
43
3,91
Пустырника экстракт густой (содержание сухого вещества 50%), в пересчете на сухой экстракт
(7.1)
87
7,91
Таурин
(7.2)
867
78,82
Целлюлоза микрокристаллическая
(7.2)
70
6,36
Кроскармелоза натрия
(7.3)
11
1,00
Кремния диоксид коллоидный
(7.3)
11
1,00
Магния стеарат
(7.3)
11
1,00
Общая масса
1100
100,00
Пример 8.
В этом способе получение таблеток для детей отличается от Примеров 6 и 7 тем, что таблетки имеют вдвое меньшую дозировку и покрываются водной дисперсией пленочной смеси (8.4).
Состав таблеток детской лекарственной формы:
Компонент
Состав на 1 таблетку (мг)
%
Экстракт боярышника густой
(8.1)
21,5
3,741
Экстракт пустырника густой
(8.1)
43,5
7,561
Таурин
(8.2)
433,5
75,39
Целлюлоза микрокристаллическая
(8.2)
35
6,08
Кроскармелоза натрия
(8.3)
5,5
0,96
Кремния диоксид коллоидный
(8.3)
5,5
0,96
Магния стеарат
(8.3)
5,5
0,96
Пленкообразующая смесь:
(8.4)
25
4,35
Общая масса
575
100,00
Покрытие таблеток может осуществляться в машинах с перфорированным котлом, котлом с вытяжной трубой или в аппаратах псевдоожиженного слоя.
Пример 9.
Способ получения массы для наполнения капсул отличается от описанного в Примере 6 тем, что увлажнение и гранулирование смеси таурина (9.2) с целлюлозой микрокристаллической (9.2) осуществляют жидкими растительными экстрактами (50 и более % по массе) (9.1), а также тем, что высушенный гранулят смешивают с компонентами (9.3). Полученную массу фасуют в твердые желатиновые капсулы. Данный способ отличается одновременным проведением процесса влажной грануляции и сушки с использованием сушилки-гранулятора с псевдоожиженным слоем.
Состав лекарственной формы в капсулах:
Компонент
№
Состав на 1 капсулу (мг)
%
Экстракт боярышника жидкий
(9.1)
43
3,91
Экстракт пустырника жидкий
(9.1)
87
7,91
Таурин
(9.2)
867
78,82
Целлюлоза микрокристаллическая
(9.2)
81
7,36
Кремния диоксид коллоидный
(9.3)
11
1,00
Магния стеарат
(9.3)
11
1,00
Общая масса
1100
100,00
Пример 10.
Способ получения таблеток отличается от описанного в Примере 6 тем, что смесь таурина, сухих экстрактов боярышника и пустырника, кросповидона (компоненты 10.1) гранулируют сухим способом с помощью компактера или брикетированием, полученный гранулят смешивают с магния стеаратом (10.2) и прессуют в таблетки.
Состав лекарственной формы в таблетках:
Компонент
№
Состав на 1 таблетку(мг)
%
Экстракт боярышника сухой
(10.1)
43
3,91
Экстракт пустырника сухой
(10.1)
87
7,91
Таурин
(10.1)
867
78,82
Кросповидон
(10.1)
92
8,36
Магния стеарат
(10.2)
11
1,00
Общая масса
1100
100,00
Пример 11.
Этот способ отличается от описанных в Примерах 6-8 и 10 тем, что выше полученную массу не прессуют в таблетки, а наполняют ею твердые желатиновые капсулы.
Пример 12.
Способ приготовления лекарственной формы заключается в том, что сухой комплекс, полученный соупариванием густых экстрактов пустырника, боярышника с вспомогательными веществами, полученный по одному из приведенных Примеров 1-5, смешивают с таурином в рассчитанном соотношении, смесь компактируют и гранулятом наполняют твердые желатиновые капсулы.
Состав лекарственной формы в капсулах:
Компонент
№
Состав на 1 капсулу (мг)
%
Комплекс экстракта боярышника и пустырника сухой (Примеры 1-5)
(12.1)
193
18,21
Таурин
(12.2)
867
81,79
Общая масса
1060
100,00
Пример 13.
Отличается от Примера 12 тем, что сухой комплекс смешивают с таурином и другими вспомогательными компонентами и прессуют в таблетки.
Состав лекарственной формы в таблетках:
Компонент
№
Состав на 1 капсулу (мг)
%
Комплекс экстракта боярышника и пустырника сухой (Примеры 1-5)
(13.1)
193
17,54
Таурин
(13.1)
867
78,82
Кросповидон
(13.1)
29
2,64
Магния стеарат
(13.2)
11
1,00
Общая масса
1100
100,00
Доклинические исследования фармацевтической композиции приведенного состава были направлены на изучение влияния ее на основные факторы риска сердечно-сосудистой патологии в условиях метаболического синдрома (предиабета) и сахарного диабета. С целью установления механизмов кардиопротекторного эффекта препарата было изучено его влияние на биоэнергетические процессы и оксидативный статус митохондрий миокарда у животных с метаболическим синдромом.
Теоретическим обоснованием перспективности использования фармацевтической композиции, содержащей таурин, экстракты боярышника и пустырника для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии стали установленные фармакотерапевтические свойства вышеуказанных компонентов.
При изучении влиянии таурина на многие звенья патогенеза инсулинорезистентности, преждевременного атеросклероза и диабетической нефропатии было показано позитивное корректирующее действие этой аминосульфокислоты [1-3]. Установлено, что таурин способствует улучшению чувствительности периферических тканей к действию инсулина и снижению абдоминального ожирения у крыс с сахарным диабетом 2 типа [1], уменьшению концентрации триглицеридов в сыворотке крови крыс со стрептозотоциновым диабетом [4], повышению уровня восстановленного глутатиона в изолированных гепатоцитах [5]. Показано, что потребление высоких доз таурина предупреждает развитие функциональных и структурных нарушений почек у животных со стрептозоциновым диабетом, снижая степень протеинурии, снижая гипертрофию клубочков и развитие гломерулосклероза [6]. Из литературных источников известно, что таурин проявляет выраженное фармакологическое действие в отношении сердечно-сосудистой системы. Регулируя функционирование ренин-ангиотензинальдестероновой и калликреин-кининовой систем, влияя на активность кальцийзависимых ферментов и ферментных систем, выполняющих каталитические функции в плазматических мембранах кардиомиоцитов, саркоплазматическом ретикулуме кардиомиоцитов, эндоплазматическом ретикулуме клеток мозга, в митохондриях кардиомиоцитов и в тромбоцитах, таурин проявляет ангио- и кардиопротекторное действие [7, 8, 9].
Весьма важным является гипогликемическое действие таурина, нашедшее свое подтверждение в лекарственном средстве Дибикор, применяемом при сахарном диабете 2 типа [10, 11]. Фармакологические эффекты таурина свидетельствуют о его специфическом модулирующем действии в отношении многих биохимических и физиологических процессов клетки в норме и в условиях патологии.
Учитывая фармакологические свойства экстрактов пустырника и боярышника, обусловленные высокой антиоксидантной активностью и способностью к регуляции биоэнергетических процессов в клетках миокарда, предполагалось проявление ими достоверного выраженного кардиопротекторного действия и в составе фармацевтической композиции.
Ранее в эксперименте было показано, что антиатеросклеротический эффект экстрактов боярышника и пустырника обуславливается комплексом фармакологически активных компонентов - флавоноидов, фенольных кислот, тритерпенов, катехинов, сапонинов и цианидиновых производных [12, 13], т.е. веществ с высоким антиоксидантным потенциалом. Подтверждением этому стало то, что кардиотонические лекарственные средства боярышника проявляют ритмогенное действие, обуславливающее позитивное изотропное и отрицательное хронотропное влияние на работу миокарда. Этот терапевтический эффект проявляется в увеличении амплитуды сердечных сокращений и уменьшении их частоты [14]. При этом было показано, что последующее развитие гипотензивного эффекта непосредственно связано с фармакологическими свойствами сапонинов экстрактов боярышника [15]. Следует отметить, что выраженное гипохолестеринемическое действие препаратов боярышника также связано с этими веществами [16].
Седативные свойства экстракта пустырника в зависимости от дозы в 2-3 раза превышают препараты валерианы. С этим эффектом связано угнетающее действие препаратов пустырника на ЦНС, регуляторное влияние на ССС с обязательным уменьшением ритма сердечных сокращений, с удлинением диастолы с последующим снижением артериального давления [15]. В клинике нейрогенных кардиомиопатий, неусложненных органическими нарушениями, препараты экстрактов пустырника проявляли выраженный эффект на 5-6 день их применения [17].
Приведенные примеры фармакологических эффектов таурина, экстрактов боярышника и пустырника свидетельствуют о перспективности применения заявляемой фармацевтической композиции для профилактики и лечения метаболического синдрома и диабетической нефропатии.
В способе профилактики и лечении метаболического синдрома (МС) и диабетической нефропатии используют фармацевтическую композицию Х (ФК X) в виде гранулята, полученного в Примере 6.
Способ апробирован на самцах крыс Вистар весом 290-300 г. Изучение влияния ФК Х на развитие метаболического синдрома и диабетической нефропатии проводили с использованием экспериментальных моделей метаболического синдрома и сахарного диабета, которые по патогенетическим признакам максимально приближены к соответствующим патологиям у человека.
Метаболический синдром, индуцированный высокожировой диетой.
Метаболический синдром индуцировали 8 недельным содержанием животных на высокожировой диете (ВЖД), в которой белки, углеводы, жиры составляли 4,9; 26,4; 68,8% соответственно от общих калорий [18].
ФК Х применяли перорально с помощью зонда в виде водной суспензии в дозах 100 или 300 мг таурина на кг массы тела в течение 8 недель, начиная с первого дня эксперимента.
Метаболический синдром, индуцированный высокофруктозной диетой.
Модель метаболического синдрома вызывали у крыс хроническим (в течение двух месяцев) поступлением фруктозы с питьевой водой в концентрации 200 г/л [19].
ФК X применяли перорально с помощью зонда в виде водной суспензии в течение 8 недель, начиная с первого дня эксперимента в дозе 100 мг таурина на кг массы тела.
Модель стрептозотоцинового диабета.
Диабет вызывали одноразовым внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг массы тела [20]. Через неделю после индукции диабета животных с базальной гликемией более чем 14 ммоль/л включали в эксперимент. ФК Х применяли перорально с помощью зонда в виде водной суспензии в дозах 100 и 300 мг таурина на кг массы тела с первого дня эксперимента в течение 8 недель.
Контрольные группы по аналогичной схеме получали плацебо (состав плацебо: крахмал картофельный; магния стеарат; аэросил).
В качестве препарата сравнения использовали масляный раствор витамина Е (Токоферола ацетат, фирмы «Словакофарма») в дозе 50 мг/кг массы тела.
В конце эксперимента состояние глюкозного гомеостаза оценивали по показателям базальной гликемии, глюкозурии, во время внутрибрюшинного теста толерантности к глюкозе (ВБТТГ) (3 г/кг массы тела) и по уровню фруктозамина в сыворотке крови [21]. Чувствительность к инсулину определяли с помощью внутрибрюшинного теста толерантности к инсулину (ВБТТИ) (инсулин 0,5 Ед/кг, глюкоза 2 г/кг массы тела через 10 мин после введения инсулина) [22] и короткого инсулинового теста (0,5 Ед/кг массы тела) [23]. Висцеральное ожирение характеризовали по массе висцерального жира, которую рассчитывали как сумму епигонадального, епинефрального и мезентериального жира.
Уровень неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке крови и гомогенате печени оценивали фотоколориметрическим методом [24]. Уровень общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и гомогенатах печени и сердца определяли спектрофотометрическими методами [25, 26]. Биохимические показатели в органах выражали на мг белка, который оценивали по методу Бред форда [27].
Интенсивность оксидативного стресса характеризовали по концентрации церуллоплазмина [28] и диеновых конъюгатов (ДК) [29] в сыворотке крови, в гомогенате почек и сердца, а также по содержанию малонового диальдегида (МДА) [30] в гомогенате почек и печени. Состояние антиоксидантной системы защиты в печени и сердце оценивали по содержанию восстановленного глутатиона (ВГ) [31], а также по активности супероксиддисмутазы (СОД) [32]. Уровень стабильных метаболитов оксида азота (NOx) в сыворотке крови определяли с помощью реактива Грисса [33].
Состояние системы свертывания крови определяли по степени и скорости АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов [34]. Митохондрии сердца крыс получали методом дифференциального центрифугирования. Дыхание митохондрий определяли полярографическим методом с помощью закрытого кислородного электрода Кларка [35].
Влияние препарата на состояние антиоксидантной защиты митохондриальной системы оценивали по содержанию восстановленного глутатиона [31] в суспензии изолированных митохондрий. Интенсивность свободнорадикального окисления в митохондриях сердца оценивали по уровню гидропероксидов липидов [36]. При анализе электрокардиограмм (ЭКГ) в трех стандартных отведениях от конечностей учитывали такие показатели: амплитуда зубцов R, P, S и Т, частота сердечных сокращений (ЧСС), длительность интервалов R-R, Т-Q, Q-T и комплекса QRS [37].
С целью верификации микрососудистой патологии в почках крыс со стрептозотоциновым диабетом проводили гистологическое исследование с помощью электронной микроскопии [38]. Толщину гломерулярной базальной мембраны определяли по методу Hirose et al. [39].
Функциональное состояние почек определяли по показателям суточного диуреза, рН мочи, содержанием креатинина [40] и мочевины [41] в моче и сыворотке крови, а также по уровню микроальбуминурии, которую определяли с помощью ИФА-наборов фирмы «Гранум».
Статистический анализ полученных результатов проводили методами вариационной статистики. Для определения характера распределения полученных результатов исследования использовали критерий Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения проводили дисперсионный анализ ANOVA, для множественного сравнения использовали критерий Нъюмена-Кейлса [42].
Влияние ФК Х на развитие метаболического синдрома, индуцированного высокожировой диетой, у крыс.
В результате проведенных исследований установлено, что применение ФК Х в значительной степени тормозит развитие инсулинорезистентности и интолерантности к углеводам у крыс с МС, индуцированным ВЖД, подтверждением чему было существенное повышение коэффициента чувствительности к инсулину и уменьшение площади под гликемическими кривыми по сравнению с показателями для группы, которая получала плацебо (табл.1). Следует отметить, что эффект ФК Х на глюкозный гомеостаз не уступал препарату сравнения - витамину Е и не усиливался при повышении дозы препарата до 300 мг/кг массы тела.
Установлено, что применение ФК Х как в дозе 100 мг/кг, так и 300 мг/кг массы тела, в отличие от витамина Е приводило к достоверному снижению относительной массы висцерального жира более чем на 30% и предотвращало прирост массы тела крыс по сравнению с контрольными животными. Причем применение ФК Х в большей дозе сопровождалось более выраженным влиянием на относительную массу мезентерального жира (табл.2).
Таблица 1Влияние ФК Х на показатели глюкозного гомеостаза у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Базальная гликемия, ммоль/л
Площадь под гликемической кривой, ммоль/л·мин
Коэффициент чувствительности к инсулину, %
Интактный контроль
5,14±0,51
852,4±48,2
39,4±3,6
ВЖД + плацебо
5,37±0,36
1365,1±89,4<sup>1</sup>
14,0±1,84<sup>1</sup>
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
5,60±0,47
994,6±36,8<sup>2</sup>
36,5±1,7<sup>2</sup>
ВЖД+ФК Х(300 мг/кг)
5,04±0,45
893,0±15,9<sup>2</sup>
35,1±2,7<sup>2</sup>
ВЖД + Витамин Е
5,22±0,15
922,0±17,9<sup>2</sup>
40,1±3,7<sup>2</sup>
Примечания:
<sup>1</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «интактный контроль», р<0,05;
<sup>2</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «ВЖД + плацебо», р<0,05;
<sup>3</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «ВЖД+ФК Х (100 мг/кг массы тела)», р<0,05;
<sup>4</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «ВЖД + витамин Е», р<0,05.
Таблица 2
Влияние ФК Х на прирост массы тела и относительную массу висцерального жира у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Прирост массы тела, %
Относительная масса висцерального жира, %
Интактный контроль
42,01±2,71
2,33±0,24
ВЖД + плацебо
69,12±4,10<sup>1</sup>
6,28±0,78<sup>1</sup>
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
41,83±5,51<sup>2,4</sup>
4,48±0,43<sup>1,2,4</sup>
ВЖД+ФК Х(300 мг/кг)
46,82±5,33<sup>2,4</sup>
3,84±0,18<sup>1,2,4</sup>
ВЖД + Витамин Е
66,23±4,10<sup>1</sup>
6,13±0,81<sup>1</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 1.
В результате проведенных исследований установлено, что применение ФК Х в обеих дозах в отличие от витамина Е способствует нормализации триглицеридемии (табл.3). Гиполипидемический эффект фармацевтической композиции Х также проявлялся в снижении уровня общего холестерина в сыворотке крови даже по сравнению с интактным контролем.
Таблица 3
Влияние ФК Х на показатели липидного обмена в сыворотке крови крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Триглицериды, ммоль/л
Общий холестерин, ммоль/л
Интактный контроль
0,77±0,04
2,35±0,20
ВЖД + плацебо
1,54±0,20<sup>1</sup>
2,01±0,16
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
0,89±0,07<sup>2,4</sup>
1,61±0,12<sup>1,4</sup>
ВЖД+ФК Х(300 мг/кг)
0,91±0,022
1,57±0,13<sup>1,4</sup>
ВЖД + Витамин Е
1,41±0,19<sup>1</sup>
2,21±0,11
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 1.
Применение ФК Х в обеих дозах приводило к снижению уровня неэстерифицированных жирных кислот в гомогенате печени крыс с МС. В то же время, нормализация уровня триглицеридов в данном органе наблюдалась лишь при использовании ФК Х в дозе 300 мг/кг (табл.4).
Таблица 4Влияние ФК Х на показатели липидного обмена в печени и сердце у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Печень
Сердце
Триглицериды, нмоль/мг белка
НЕЖК, нмоль/мг белка
Триглицериды, нмоль/мг белка
НЕЖК, нмоль/мг белка
Интактный контроль
34,68±4,27
89,87±3,01
16,46±0,64
51,74±2,51
ВЖД + плацебо
102,88±17,65<sup>1</sup>
128,61±8,02<sup>1</sup>
30,48±2,16<sup>1</sup>
90,01±3,67<sup>1</sup>
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
94,33±14,74<sup>1</sup>
83,20±8,00<sup>2,4</sup>
25,84±3,60<sup>1</sup>
59,93±7,27<sup>2,4</sup>
ВЖД+ФК Х (300 мг/кг)
44,21±8,13<sup>2,3,4</sup>
93,14±10,72<sup>2,4</sup>
14,94±0,75<sup>2,3,4</sup>
63,55±7,79<sup>2,4</sup>
ВЖД + Витамин Е
98,28±13,55<sup>1</sup>
121,44±9,22<sup>1</sup>
26,54±3,86<sup>1</sup>
84,91±4,66<sup>1</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 1.
Установлено, что уровень триглицеридов и НЕЖК существенно повышался в сердце крыс с метаболическим синдромом, тогда как введение ФК Х в дозе 100 мг/кг массы тела способствовало нормализации уровня НЕЖК, а в дозе 300 мг/кг - НЕЖК и триглицеридов (см. табл.4).
Следует отметить, что эффект ФК Х на липидный профиль значительно превышал влияние препарата сравнения витамина Е.
Известно, что существует взаимосвязь между эндотелиальной дисфункцией и инсулинорезистентностью, подтверждением чему является ухудшение чувствительности к инсулину в условиях сниженной активности NO-синтазы [43]. В биологических средах уровень стабильных продуктов распада NO - нитритов и нитратов - определяется как индикатор продукции NO in vivo [44].
В результате проведенных исследований установлено, что концентрация стабильных метаболитов NO в сыворотке крови и моче крыс, содержащихся на ВЖД, существенно снижается по сравнению с интактным контролем (табл.5). В то же время применение ФК Х в обеих дозах и витамина Е приводило к нормализации данного показателя (см. табл.5).
Таблица 5
Влияние ФК X на концентрацию стабильных метаболитов NO в сыворотке крови и моче у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
NOx в сыворотке, мкмоль/л
NOx в моче, мкмоль/л
Интактный контроль
31,97±3,51
63,70±4,26
ВЖД + плацебо
20,26±1,90<sup>1</sup>
45,87±3,41<sup>1</sup>
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
35,67±1,74<sup>2</sup>
66,01±5,69<sup>2</sup>
ВЖД+ФК Х(300 мг/кг)
31,96±1,51<sup>2</sup>
63,04±4,81<sup>2</sup>
ВЖД + Витамин Е
28,76±2,31<sup>2</sup>
60,34±2,91<sup>2</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 1.
Накоплено большое количество данных, свидетельствующих о взаимосвязи повышенного уровня свободных радикалов и инсулинорезистентности - основной составляющей метаболического синдрома, сахарного диабета 2 типа и ведущей причины риска макрососудистой патологии [45].
При определении интенсивности ПОЛ в сердце крыс с МС обнаружено достоверное повышение содержания ДК на фоне снижения содержания восстановленного глутатиона и компенсаторного повышения активности СОД (табл.6). Введение ФК Х в обеих дозах приводило к снижению уровня ДК и нормализации активности СОД, тогда как ее использование в дозе 300 мг/кг способствовало также повышению содержанию восстановленного глутатиона в сердце крыс с МС по сравнению с интактным контролем (см. табл.6).
Следует отметить, что эффект ФК Х на показатели оксидантного статуса не уступал препарату сравнения витамину Е.
Таблица 6
Влияние ФК Х на показатели оксидантного статуса в сердце у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
ДК, нмоль/мг белка
ВГ, нмоль/мг белка
СОД, у.е./мг белка
Интактный контроль
0,38±0,09
59,01±2,98
26,71±4,90
ВЖД + плацебо
1,12±0,11<sup>1</sup>
40,12±2,84<sup>1</sup>
42,91±7,12<sup>1</sup>
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
0,44±0,08<sup>2</sup>
44,55±3,34<sup>1</sup>
22,00±1,56<sup>2</sup>
ВЖД+ФК Х(300 мг/кг)
0,39±0,06<sup>2</sup>
65,88±7,86<sup>2,3,4</sup>
21,25±3,00<sup>2</sup>
ВЖД + Витамин Е
0,43±0,07<sup>2</sup>
55,44±3,14<sup>2</sup>
24,50±2,06<sup>2</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 1.
Известно, что МС сопровождается повышенной продукцией PAI-1 и фибриногена, что обуславливает снижение тромболиза и фибринолиза и смещение гемостатического баланса в сторону тромботического состояния [46, 47].
Показано, что у крыс с МС, индуцированным ВЖД, повышается как степень, так и скорость АДФ-стимулированной агрегации тромбоцитов (табл.7). В отличие от витамина Е введение ФК Х в дозе 100 мг/кг массы тела приводило к снижению индекса агрегации, а в максимальной дозе - к достоверному уменьшению обоих показателей.
Таблица 7
Влияние ФК Х на скорость и индекс агрегации тромбоцитов в крови крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокожировой диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Индекс агрегации, %
Скорость агрегации, у.ед.
Интактный контроль
29,17±3,16
59,78±4,72
ВЖД + плацебо
47,00±2,07<sup>1</sup>
90,40±7,70<sup>1</sup>
ВЖД+ФК Х(100 мг/кг)
32,17±3,96<sup>2,4</sup>
75,83±7,50
ВЖД+ФК Х(300 мг/кг)
28,00±3,51<sup>2,4</sup>
57,81±4,64<sup>2,4</sup>
ВЖД + Витамин Е
43,45±3,47<sup>1</sup>
95,32±4,35<sup>1</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 1.
Таким образом, разработанная ФК Х в дозах 100 и 300 мг/кг массы тела тормозит такие проявления метаболического синдрома, индуцированного ВЖД у крыс, как: инсулинорезистентность, интолерантность к углеводам, абдоминальное ожирение, гипертриглицеридемия, оксидативный стресс, эндотелиальная дисфункция, протромботическое состояние. Следует отметить, что доза 100 мг/кг массы тела является достаточной для проявления указанных фармакологических эффектов и может быть рекомендована для применения с целью ослабления сердечно-сосудистой патологии и профилактики сахарного диабета 2 типа у лиц из группы риска.
Влияние ФК Х на развитие метаболического синдрома, индуцированного высокофруктозной диетой, у крыс.
Установлено, что двухмесячное применение ФК X, подобно витамину Е, тормозит развитие инсулинорезистентности и интолерантности к углеводам у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным ВФД, подтверждением чему было существенное уменьшение площади под гликемическими кривыми во время ВБТТГ и ВБТТИ по сравнению с показателями для группы, которая получала плацебо (табл.8). Снижение уровня фруктозамина в сыворотке крови животных, получавших ФК X, может быть связано как с улучшением глюкозного гомеостаза, так и с ее способностью непосредственно тормозить процессы неферментативного присоединения глюкозы к белкам [48].
Таблица 8
Влияние ФК Х на показатели глюкозного гомеостаза у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Базальная гликемия, ммоль/л
Концентрация фруктозамина, ммоль/л
ППК во время ВБТТГ, ммоль/л·мин
ППК во время ВБТТИ, ммоль/л·мин
Интактный контроль
4,69±0,28
1,24±0,11
683,1±27,3
379,9±34,2
ВФД + плацебо
4,61±0,35
2,34±0,09*
1043,7±82,5*
547,1±18,8*
ВФД+ФК Х
4,26±0,23
1,66±0,09*<sup>#</sup>
695,5±18,2<sup>#</sup>
426,7±38,7<sup>#</sup>
ВФД + витамин Е
4,55±0,43
1,83±0,08*<sup>#</sup>
755,5±19,1<sup>#</sup>
468,1±12,7<sup>#</sup>
Примечания:
* - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «интактный контроль», р<0,05;
<sup># </sup>- Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «ВФД + плацебо», р<0,05;
** - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «ВФД + витамин Е», р<0,05.
Применение ФК Х тормозило прирост массы тела у животных с МС, в частности, за счет уменьшения относительной массы висцерального жира (табл.9).
Таблица 9
Влияние ФК Х на прирост массы тела и относительную массу висцерального жира у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Прирост массы тела, %
Относительная масса висцерального жира. %
Интактный контроль
12,24±2,05
1,67±0,19
ВФД + плацебо
21,19±1,63*
3,95±0,31*
ВФД+ФК Х
13,54±2,87<sup>#**</sup>
2,37±0,27*<sup>#**</sup>
ВФД + витамин Е
20,88±0,93*
4,02±0,21*
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 8.
Введение ФК X, в отличие от витамина Е, способствовало нормализации триглицеридемии и снижению концентрации общего холестерина в сыворотке крови даже в сравнении с интактным контролем (см. табл.10).
Таблица 10
Влияние ФК Х на липидный профиль и уровень стабильных метаболитов NO в сыворотке крови крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Концентрация триглицеридов, ммоль/л
Общий холестерин, ммоль/л
NO<sub>2-</sub>+NO<sub>3-</sub>, мкмоль/л
Интактный контроль
0,69±0,04
1,67±0,09
31,60±2,51
ВФД + плацебо
1,32±0,10*
1,93±0,07*
25,37±0,94*
ВФД+ФК Х
0,69±0,06<sup>#**</sup>
1,40±0,04*<sup>#**</sup>
31,37±1,94<sup>#</sup>
ВФД + витамин Е
1,26±0,11*
2,03±0,06*
33,47±1,67<sup>#</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 8.
В результате проведенных исследований установлено, что концентрация стабильных метаболитов NO в сыворотке крови крыс с метаболическим синдромом существенно снижается по сравнению с показателями интактного контроля (табл.10). В то же время применение ФК X, в отличие от витамина Е, приводило к нормализации данного показателя, что может свидетельствовать о восстановлении продукции NO под воздействием данного препарата (см. табл.10).
При определении показателей дыхания изолированных митохондрий сердца в присутствии глутамата и малата было установлено снижение скорости АДФ-стимулированного дыхания (V3) и коэффициента дыхательного контроля в митохондриях крыс с МС по сравнению с интактным контролем (табл.11). Это свидетельствует о разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования, что является одним из основных маркеров митохондриальной дисфункции.
Таблица 11
Влияние ФК Х на скорость дыхания (в присутствии малата и глутамата) изолированных митохондрий сердца крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Группа
V<sub>4 </sub>натом O/мин/мг белка
V<sub>3 </sub>натом O/мин/мг белка
V3/V4
Интактный контроль
14,24±1,20
82,60±7,48
5,83±0,35
ВФД + плацебо
14,44±1,18
66,21±5,00*
4,63±0,25*
ВФД+ФК Х
14,51±1,26
76,04±3,97<sup>#</sup>
5,38±0,32<sup>#</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 8.
Следует отметить, что применение ФК Х приводило к повышению дыхательного контроля за счет нормализации скорости АДФ-стимулированного дыхания митохондрий сердца в метаболическом состоянии 3 в присутствии малата и глутамата по сравнению с группой, получавшей плацебо (см. табл.11).
Полученные результаты могут свидетельствовать об улучшении процессов окислительного фосфорилирования на уровне комплекса I электронтранспортной цепи под влиянием данного препарата.
Известно, что в условиях митохондриальной дисфункции существенно увеличивается генерация активных форм кислорода, которые, в свою очередь, приводят к окислительным нарушениям в митохондриях и апоптозу и некрозу клеток. Таким образом, между митохондриальной дисфункцией и оксидативным стрессом существует порочный круг, который можно разорвать путем нормализации оксидантного статуса митохондрий [49].
Показано, что применение ФК Х способствует снижению ТБК-активных продуктов в митохондриях сердца и нормализации восстановленного глутатиона (см. табл.12).
Таблица 12
Влияние ФК Х на содержание ТБК-активных продуктов и восстановленного глутатиона в изолированных митохондриях сердца у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Показатель
Интактный контроль
ВФД + плацебо
ВФД+ФК Х
ТБК-активные продукты, нмоль/мг белка
0,43±0,07
0,88±0,07*
0,65±0,06*<sup>#</sup>
ВГ, нмоль/мг белка
3,84±0,28
2,10±0,27*
3,67±0,29<sup>#</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 8.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ФК Х восстанавливает биоэнергетические процессы в сердечной мышце животных с метаболическим синдромом, усиливая дыхательный контроль и предотвращая гиперпродукцию АФК в митохондриях кардиомиоцитов.
1
Оценка функционального состояния сердечно-сосудистой системы крыс с МС показала, что применение ФК Х приводит к пролонгации интервала R-R и нормализации частоты сердечных сокращений, что свидетельствует о возобновлении нормального сердечного ритма и предупреждении развития синусовой тахикардии (см. табл.13).
Таблица 13
Влияние ФК Х на длительность интервалов P-Q, R-R<sup>1</sup> и частоту сердечных сокращений у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Группа
R-R<sup>1</sup>, сек
ЧСС, уд./ мин
P-Q, с
Интактный контроль
0,127±0,001
470,9±4,8
0,037±0,001
ВФД + плацебо
0,119±0,001<sup>1)</sup>
505,4±6,6<sup>1)</sup>
0,044±0,001*
ВФД+ФК Х
0,134±0,003<sup>#</sup>
450,2±11,2<sup>#</sup>
0,037±0,003<sup>#</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 8.
Кроме того, введение ФК Х предотвращало сокращение интервала P-Q и способствовало нормализации атриовентрикулярной проводимости у крыс с МС (см. табл.13).
У крыс, получавших ФК X, наблюдалась нормализация длительности интервала Q-T, пролонгация интервала Т-Р и снижение соотношения QT/TP (табл.14), что свидетельствует о восстановлении процессов деполяризации и реполяризации миокарда желудочков.
Таблица 14
Влияние ФК Х на длительность интервалов Q-T, Т-Р и соотношение QT/TP у крыс с метаболическим синдромом, индуцированным высокофруктозной диетой (X±Sx, n=6)
Группа
Q-T, с
Т-Р, с
QT/TP
Интактный контроль
0,074±0,004
0,028±0,002
2,81±0,29
ВФД + плацебо
0,064±0,003<sup>1</sup>
0,018±0,002*
3,83±0,33*
ВФД+ФК Х
0,075±0,065<sup>#</sup>
0,024±0,001<sup>#</sup>
3,28±0,20<sup>#</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 8.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о возобновлении нормального сердечного ритма и атриовентрикулярной проводимости, улучшении систолической и диастолической активности сердца, предотвращении синусовой тахикардии в миокарде под влиянием фармацевтической композиции X.
Таким образом, применение улучшает функциональное состояние сердечно-сосудистой системы за счет восстановления биоэнергетических процессов в митохондриях кардиомиоцитов у животных с метаболическим синдромом, индуцированным ВФД.
Влияние ФК Х на развитие диабетической нефропатииу крыс.
Риск инвалидизации и смертности в следствие сердечно-сосудистой патологии значительно возрастает при наличии диабетической нефропатии, которая сопровождается повышением артериального давления, снижением уровня клубочковой фильтрации и развитием воспалительных процессов в почках [50].
В результате проведенного эксперимента было установлено, что применение ФК Х в дозах 100 и 300 мг/кг массы тела, в отличие от витамина Е, приводит к достоверному снижению базальной гипергликемии соответственно на 30% и 50% по сравнению с диабетическим контролем (табл.15).
О существенном улучшении гликемического контроля под влиянием ФК Х также свидетельствовало достоверное снижение уровня фруктозамина в сыворотке крови диабетических животных, которое отмечали при применении препарата в дозе 300 мг/кг массы тела (см. табл.15).
Таблица 15
Влияние ФК Х на показатели глюкозного гомеостаза у крыс со стрептозотоциновым диабетом (X±Sx n=6)
Группа
Базальная гликемия, ммоль/л
Фруктозамин, ммоль/л
Интактный контроль
4,77±0,13
1,83±0,12
Диабет + Плацебо
15,72±0,53<sup>1</sup>
3,19±0,31<sup>1</sup>
Диабет + ФК Х (100 мг/кг)
11,28±0,90<sup>1,2,4</sup>
3,23±0,22<sup>1</sup>
Диабет + ФК Х (300 мг/кг)
8,49±1,84<sup>1,2,4</sup>
2,48±0,13<sup>1,2,3</sup>
Диабет + витамин Е
14,47±0,60
2,99±0,12
Примечания:
<sup>1</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «интактный контроль», р<0,05;
<sup>2</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «диабет + плацебо», р<0,05;
<sup>3</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «диабет + ФК Х (100 мг/кг) », р<0,05;
<sup>4</sup> - Статистически значимые отличия в сравнении с показателями для группы «диабет + витамин Е», р<0,05.
Применение ФК Х в обеих дозах, в отличие от витамина Е, снижало суточный диурез и глюкозурию у диабетических животных, что коррелирует с улучшением гликемического контроля под его влиянием (табл.16).
Таблица 16
Влияние ФК Х на функциональное состояние почек и толщину базальной мембраны сосудов почечного клубочка у крыс со стрептозотоциновым диабетом (X±Sx, n=6)
Показатель
Суточный диурез, мл
Глюкоза в моче, ммоль/л
Толщина базальной мембраны, мкм
Интактный контроль
4,73±0,50
-
0,197±0,009
Диабет + Плацебо
19,02±0,96<sup>1</sup>
134,52±20,17<sup>1</sup>
0,357±0,005<sup>1</sup>
Диабет + ФК Х (100 мг/кг)
16,10±0,76<sup>1,2</sup>
83,11±13,08<sup>1,2,4</sup>
0,203±0,009<sup>2,4</sup>
Диабет + ФК Х (300 мг/кг)
13,22±0,80<sup>1,2,4</sup>
72,06±22,34<sup>1,2,4</sup>
0,201±0,015<sup>2,4</sup>
Диабет + витамин Е
19,89±0,56<sup>1</sup>
122,21±11,45<sup>1</sup>
0,364±0,009<sup>1</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 15.
Характерным морфологическим признаком диабетической нефропатии считается увеличение мезангиального матрикса и толщины гломерулярной базальной мембраны [51]. С помощью электронной микроскопии было показано, что в группе диабетического контроля толщина гломерулярной базальной мембраны почти вдвое превосходила аналогичные показатели у интактных животных (см. табл.16), тогда как у животных, получавших ФК Х в обеих дозах, этот показатель практически не отличался от интактного контроля. Установлено, что применение ФК Х в обеих дозах предотвращает развитие функциональной неполноценности почек, о чем свидетельствовала нормализация клиренса креатинина и скорости клубочковой фильтрации у диабетических животных (см.табл.17).
Одним из основных патогенетических механизмов диабетических осложнений считается нарушение окислительно-восстановительного баланса - оксидативный стресс [52].
У животных, получавших ФК Х в обеих дозах, отмечали достоверное снижение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ (ДК и МДА) и повышение уровня восстановленного глутатиона в почках по сравнению с диабетическим контролем (табл.18), что свидетельствует о выраженном антиоксидантной активности препарата, не уступающей по выраженности фармакологического эффекта витамину Е.
Таблица 17
Влияние ФК Х на клиренс креатинина и уровень микроальбуминурии у самцов крыс со стрептозотоциновымдиабетом (X±Sx, n=6)
Группа
Креатинин в моче, ммоль/л
Креатинин в сыворотке крови, мкмоль/л
Клиренс креатинина, мл/мин
Микроальбуминурия, мкг/л
Интактный контроль
17,38±1,52
55,31±3,16
1,02±0,10
0,63±0,13
Диабет + плацебо
3,45±0,20<sup>1</sup>
125,38±4,26<sup>1</sup>
0,36±0,04<sup>1</sup>
2,16±0,34<sup>1</sup>
Диабет + ФК Х (100 мг/кг)
5,88±0,61<sup>1,2,4</sup>
68,83±10,37<sup>2,4</sup>
1,06±0,19<sup>2,4</sup>
0,78±0,21<sup>2,4</sup>
Диабет + ФК Х (300 мг/кг)
6,43±0,53<sup>1,2,4</sup>
51,63±6,32<sup>2,4</sup>
1,27±0,23<sup>2,4</sup>
0,80±0,11<sup>2,4</sup>
Диабет + витамин Е
3,92±0,72<sup>1</sup>
114,33±7,45
0,40±0,12
1,99±0,14
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 15.
Таблица 18
Влияние ФК Х на показатели оксидативного статуса в почках крыс со стрептозотоциновым диабетом (X±Sx, n=6)
Показа-тели
Интактный контроль
Диабет + плацебо
Диабет + ФКХ (100 мг/кг)
Диабет + ФКХ (300 мг/кг)
Диабет + витамин Е
ДК, нмоль/мг белка
0,16±0,02
0,56±0,04<sup>1</sup>
0,38±0,06<sup>1,2</sup>
0,30±0,05<sup>1,2</sup>
0,37±0,05<sup>1,2</sup>
МДА, нмоль/мг белка
0,57±0,04
1,51±0,12<sup>1</sup>
0,87±0,07<sup>2</sup>
0,85±0,14<sup>2</sup>
0,77±0,07<sup>2</sup>
ВГ, нмоль/мг белка
59,83±4,93
32,67±6,86<sup>1</sup>
90,04±5,63<sup>1,2,4</sup>
85,66±6,86<sup>1,2,4</sup>
55,14±4,3<sup>2</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 15.
Применение ФК X, подобно витамину Е, в обеих дозах приводило к нормализации уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче диабетических животных (табл.19), что, вероятно, обусловлено его способностью подавлять развитие оксидативного стресса в условиях гипергликемии.
Таблица 19
Влияние ФК Х на уровень метаболитов оксида азота в моче и сыворотке крови крыс со стрептозотоциновым диабетом(X±Sx, n=6)
Показа-тели
Интактный контроль
Диабет + плацебо
Диабет + ФК Х (100 мг/кг)
Диабет + ФК Х (300 мг/кг)
Диабет + витамин Е
NOx в сыворотке крови, мкмоль/л
33,79±0,17
55,47±4,71<sup>1</sup>
34,25±2,32<sup>2</sup>
30,68±2,42<sup>2</sup>
39,35±2,12<sup>2</sup>
NOx в моче, мкмоль/л
70,89±4,49
100,68±7,48<sup>1</sup>
72,60±2,41<sup>2</sup>
71,92±3,75<sup>2</sup>
79,56±5,21<sup>2</sup>
Примечание. Показатели достоверности аналогичны таблице 15.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что применение ФК Х в дозах 100 и 300 мг/кг способствует снижению базальной гипергликемии, глюкозурии, нормализации клиренса креатинина и скорости клубочковой фильтрации, ослаблению оксидативного и нитрозивного стресса в почках, а также выраженности микроальбуминурии у диабетических животных, что обосновывает перспективность его применения с целью профилактики и лечения диабетической нефропатии. Следует отметить, что эффект ФК Х в дозе 100 мг/кг на большинство исследуемых показателей не уступал его действию при использовании в дозе 300 мг/кг массы тела, что может быть основой для применения минимальной дозы в клинической практике.
ФК Х в дозе 100 мг/кг массы тела не только предупреждает развитие инсулинорезистентности, интолерантности к углеводам, абдоминального ожирения, гипертриглицеридемии, гиперхолестеринемии, оксидативного стресса, но и улучшает функциональное состояние сердечно-сосудистой системы за счет восстановления биоэнергетических процессов в митохондриях кардиомиоцитов у животных с метаболическим синдромом.
Выявленные фармакологические свойства ФК Х обосновывают перспективность ее применения с целью профилактики и лечения метаболического синдрома, коррекции митохондриальных биоэнергетических процессов сердечно-сосудистой системы и диабетической нефропатии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Taurine improves insulin sensitivity in the Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rat, a model of spontaneous type 2 diabets [Text]/Y.Nakaya, A.Minami, N.Harada [et.al.]//J.Clin.Nutr. - 2000. - Vol.71. - P.54-58.
2. The potential health benefits of taurine in cardiovascular disease [Text]/Y.J.Xu, A.S.Ameja, P.S.Tappia, N.S.Dhalla // Exp.Clin. Cardiol. - 2008. - Vol.13. - P.57-65.
3. Hansen S.H. The role of taurine in diabetes mellitus and development of diabetic complications [Text]/S.H.Hansen// Diabetes Metab. Res. Rev. - 2001. - Vol.17. - P.330-346.
4. Goodman H.O. Supplemental taurine in diabetic rats: effects on plasma glucose and triglycerides [Text]/H.O.Goodman, Z.K.Shihabi // Biochem. Med. Metab. Biol. - 1990. - Vol.43, №1. - P.1-9.
5. Oxidative and nitrosative stress and apoptosis in the liver of rats fed on high methionine diet: protective effect of taurine [Text]/S.Yalcinkaya, Y.Unlucerci, M.Giris [et. al.]//Nutrition. - 2009. - Vol.25, №4. - P.436-44.
6. Taurine [text]//Alternative Medicine Review. - 2001, - Vol.6, №1. - P.78-82.
7. Taurine supplementation and diabetes mellitus [Text]/F.Franconi, A.Loizzo, C.Ghirlanda, G.Seghieri // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. - 2006. - Vol.9, №1. - P.32-36.
8. Schaffer S.W. Role of antioxidant activity of taurine in diabetes Schaffer [Text]/S.W.Azuma, J.M.Mozaffari// Can. J.Physiol. Pharmacol. - 2009. - Vol.87. - P.91-99.
9. Бугаенко В.В. Применение препарата кратал в комплексной терапии больных с ишемической болезнью сердца и нейроциркуляторной дистонией [Текст]/В.В.Бугаенко, А.Н.Ломаковский, M.И.Лутай // Журн. практ. лiкаря. - 1999. - №3. - С.56-58.
10. Шестакова, Л.А. Опыт применения Дибикора при сахарном диабете 2-го типа [Текст]/M.В.Шестакова, Л.А.Чугунова, M.Ш.Шамхалова // Журнал "Сахарный диабет». - 2007, №1. - С.12-23.
11. Применение Дибикора при сахарном диабете и сердечно-сосудистой патологи [Текст]/А.С.Аметов, И.И.Кочергина // Эффективная фармакотерапия в эндокринологии. - 2007. - №2. - С.44-49.
12. Галенко-Ярошевский П.А. Очерки фармакологии метаболитных средств [Текст]/П.А.Галенко-Ярошевский, И.С.Чекман, Н.А.Горчакова. - M.: Медицина, 2002.
13. Hawthorn (Crataegus spp.) in the treatment of cardiovascular disease [Text]/M.C.Tassell, R.Kingston, D.Gilroy [et al.] // Pharm. Rev. - 2010. - Vol.4, №7. - P.32-41.
14. Crataegus oxyacantha - a cardioprotective herb [Text]/S.K.Verma, V.Jain, D.Verma, R.Khamesra// J.Herbal Med. Toxicol. - 2007. - Vol.1, №1. P.65-71.
15. Бiлозiр М.Й. Роль БАС лiкарськоi рослинноi сировини у кардioлогii [Текст] / Бiлозiр М.Й., Новiков В.П. // Видавництво Львiвськоi полiтехнiки. - 2008. - №622. - С.96-103.
16. Characterization of antioxidants present in hawthorn fruits [Text]/Z.Zhang, Q.Chang, M.Zhu [et al.]//J.Nutr. Biochem. - 2001. - 12, №3. P.144-152.
17. Pharmacological effects of lavandulifoliosidefrom Leonurus cardiac [Text]/K.Milkowska-Leyck, B.Filipek, H.J.Strzelecka// Ethnopharmacol. - 2002. - Vol.80, №1. P.85-90.
18. Mechanism of fat-induced hepatic gluconeogenesis: effect of metformin [Text]/S.Song [et al.]//Amer.J.Physiol. Endocrinol. Metabol. - 2001. - Vol.281, №2. - Р.Е275-282.
19. Long-term fructose consumption accelerates glycation and several age-related variables in male rats [Text] / B.Levi, M.Werman //J.Nutrition. - 1998. - Vol.128, №8. - P.1442-1449.
20. Полторак В.В. Методичнi рекомендацii з експериментального вивчення нових гiпоглiкемiчних засобiв // Доклiничнi дослiдження лiкарських засобiв [Текст] /В.В.Полторак, H.I.Горбенко / за ред. О.В.Стефанова. - К., 2001. - С.396-408.
21. Fructosamine test-plus, a modified fructosamine assay evaluated /J.Baker, P.Metcalf, R.Scragg, R.Johnson // Clin. Chem. - 1991. - Vol.37, №4. - P.552-556.
22. The estrogen receptor -selective agonist propyi pyrazole triol improves glucose tolerance in ob/ob mice; potential molecular mechanisms [Text] / L.Lundholm, G.Bryzgalova, H.Gao [et al.] //J.Endocrinol. - 2008. - Vol.199. - P.275-286.
23. The short insulin tolerance test for determination of insulin sensitivity: a comparison with the euglycaemic clamp [Text] /A.Akinmokun, P.L.Selby, К.Ramaiya, К.G.М.М.Alberti// Diabet. Med. - 1992. - Vol.9, №4. - P.432-437.
24. Dumcombe W.С. The colorimetric micro-determination of long-chain fatty acids [Text]/W.C.Dumcombe // Biochem. J. - 1963. - Vol.188, №1. - P.7-10.
25. Fletcher М.J. A colorimetric method for estimating serum triglycerides [Text]/М.J.Fletcher // Clin. Acta. - 1969. - Vol.22. - P.393-397.
26. Прохорова М.И. Большой практикум по углеводному и липидному обмену [Текст] /М.И.Прохорова, З.Н.Туликова. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1965. - 218 с.
27. Bredford М.М. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing protein-dye binding [Text]/М.М.Bredford //Anal. Biochem. - 1976. - Vol.72. - P.248-252.
28. Современные методы в биохимии [Текст]/под ред. В.Н.Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - 392 с.
29. Сопоставление различных подходов к определению перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови [Текст] /И.А.Волчегорский [и др.] // Вопросы мед. химии. - 1989. - №1. - С.127-131.
30. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты [Текст] /И.Д.Стальная, Г.Л.Гаришвили // Современные методы в биохимии. - 1977. - С.66-68.
31. Путилина Ф.Е. Определение содержания восстановленного глутатиона в тканях [Текст] /Ф.Е.Путилина // Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): учеб. пособие / под ред. М.И.Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - С.183-187.
32. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма [Текст]: метод, рекомендации; [авт.А.В.Арутюнян и др.]. - С.Пб, 2000. - 104 с.
33. Орлова Е.А. Анализ нитритов и нитратов в ткани при экспериментальной почечной недостаточности [Текст] /Е.А.Орлова // Укр. Журн. Экспер. медицины. - 2002. - Т.3, №1. - С.79-82.
34. Пособие по изучению адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов [Текст] /А.Л.Берковский, С.А. Васильев, Л.В. Жердева [и др.]. - М.: [б. и.], 2002. - 28 с.
35. Чане Б. Регуляция клеточного обмена. - М., 1962. - С.111.
36. Ohkawa H. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid [Text]/H.Ohkawa, N.Ohishi, K.Yagi// J.Lipid Research. - 1978. - Vol.19. P.1053-1057.
37. Bazett H.C. An analysis of time-relations on electrocardiograms [Text] /H.C.Bazett // Heart. - 1920. - Vol.7, №3. - P.353-370.
38. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники [Текст]/Г.А.Меркулов. - М.: Медицина, Ленинградское отделение, 1969. - 424 с.
39. Development of glomerular lesions in experimental longterm diabetes in the rats [Text]/K.Hirose, R.Osterby, М.Nosava [et al.] //Kidney Int. - 1982. - Vol.21. - P.689-695.
40. Van Pilsen J.F. Effect of various protein precipitants on recoveries of creatinine added to plasma [Text]/J.F.Van Pilsen, М.Bovis // Clin. Chem. - 1957. - VoL3. - P.90.
41. Breinek P. Determination of urea using diacetylmonoxim without deproteinization in a sulfuric acid medium [Text]/P.Breinek, J.Bouda //Vnitrnilek. - 1970. - P.186.
42. Гланс С. Медико-биологическая статистика [Текст] / С.Гланс; пер. с англ. Ю.А.Данилова. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
43. Shulz P.J. Endogenously synthesized nitric oxide prevents endotoxin-induced glomemlar thrombosis [Text]/P.J.Shuiz, L.J.Raij // Clin. Invest. - 1992. - Vol.90. - P.1718-1725.
44. Pacher P. Nitric Oxide and Peroxynitrite in Health and Disease [Text] /P.Pacher, J.S.Beckman, L.Liaudet // Physiol. Rev. - 2007. - V.87. - P.315-424.
45. Plutzky J. Atherosclerosis in type 2 diabetes mellitus and insulin resistance: mechanistic links and therapeutic targets [Text] /J.Plutzky, G.Viberti, S.Haffner //J.Diabetes Complications. - 2002. - Vol.16, №6. - P.401-415.
46. Nordt Т.К. Augmentation of the synthesis of plasminogen activator inhibitor type-1 by precursors of insulin. A potential risk factor for vascular disease [Text]/T.K.Nordt, D.J.Schneider, B.E.Sobel // Circulation. - 1994. - Vol.89, №1. - P.321-330.
47. Diabetes, fibrinogen, and risk of cardiovascular disease; Framingham experience [Text]/W.B.Kannel, R.B.D'Agostmo, P.W.Wilson [et al.]//Amer. Heart J. - 1990. - Vol.120, №3. - P.672-676.
48. Effect oftaurine on advanced glycation end products-induced hypertrophy in renal tubular epithelial cells [Text]/J.S.Huang, L.Y.Chuang, J.Y.Guh [et al.] // Toxicology and Applied Pharmacology. - 2008. - Vol.233. - P.220-226.
49. Hazel H.S. Mitochondria-Targeted Peptide Antioxidants: Novel Neuroprotective Agents [Text]/H.S.Hazel //The AAPS Journal. - 2006. - Vol.8, №3. - Р.Е518-529.
50. Cooper M.E. Pathogenesis, prevention and treatment of diabetic nephro-pathy [Text]/M.E.Cooper //Lancet. - 1998. - Vol.352. - P.213-219.
51. Дженингс П. Механизмы, лежащие в основе развития диабетической микроангиопатии [Текст]/П.Дженингс // Диабетография. - 1995. - №3. - С.22-24.
52. Pathogenesis of diabetic nephropathy: a radical approach [Text]/A.KSalahudeenI, V.Kanjil, J.F.Reckelhoff, A.M.Schmidt // Nephrol. Dial. Transplant. - 1997. - Vol.12 - P.664-668