НАЦЕЛИВАЮЩИЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЛИПИДЫ
TARGETING AMINOACID LIPIDS

Область изобретения
Настоящее изобретение является направленным на системы носителя, которые включают этер-липиды, конъюгированные с одним или более биоактивными лигандами (которые размещаются на поверхности системы носителя), для применения в нацеленных системах доставки и/или в системах дисплея антигена, где системы носителя могут включать один или более дополнительных биоактивных агентов. Настоящее изобретение также является направленным на способы их получения и их применение для медицинских показаний, таких как нацеленная доставка указанных биоактивных агентов к специфическим тканям или клеткам и системы дисплея антигена, для изучения, диагностики и лечения симптомов, состояний и заболеваний, которые являются чувствительными к указанным биоактивным агентам.
Предпосылки создания изобретения
Молекулярное узнавание, такое как имеет место между рецептором и лигандом, антигеном и антителом, ДНК и белком, сахаром и лектином, РНК и рибосомой и т.д., представляет собой важный принцип, который лежит в основе многих биологических систем и является применимым к множеству искусственно созданных биологических систем для применения с медицинской целью, как, например, в синтетических (микро- или нано-) системах на основе частиц, включая полимерные шарики, везикулярные липиды, микроэмульсии и тому подобное. Один важный пример применения на основе молекулярного узнавания представляет собой применение нацеленной доставки диагностических или терапевтических соединений, таких как противовирусные, химиотерапевтические или радиофармацевтические препараты, к специфическим сайтам, что позволяет преодолевать ограничения, которые ассоциируются с неспецифической доставкой (такие как время выведения in vivo, потенциальная токсичность, проблемы, связанные с транспортом через мембраны агента и подобные им) и, таким образом, значительно повышают их эффективность таких соединений. Были использованы разнообразные стратегии на основе узнавания для улучшения доставки соединений во внутриклеточное содержимое целевой клетки (то есть к специфическим компартментам клетки) для оказания влияния на ее биологическую активность, в частности, доставка с помощью специфических транспортеров, которая предусматривает применение биологических или синтетических носителей, таких как вирусные векторы, катионные полимеры, такие как полилизин, полиаргинин и подобные им (смотри, например, WO 79/00515, WO 98/52614), липидные носители, а также различные другие конъюгатные системы.
v
3
Один широко используемый подход предусматривает применение липидных везикул в качестве синтетических носителей, например липосом или мицелл, которые были подвергнуты интенсивному усовершенствованию и исследованию в качестве векторов для доставки лекарственных средств благодаря их способности снижать системное воздействие биоактивного агента, преодолевая, таким образом, проблемы, которые ассоциируются с разложением, растворимостью и т.д., и обеспечивая удлинение периода времени циркуляции в русле крови. Активно нацеленная доставка биоактивного агента предусматривает дериватизацию липидов в составе липидных везикул (либо до, либо после формирования везикул) с нацеливающим лигандом, который является предназначенным для направления (или нацеливания) везикулы на специфические типы клеток, такие как раковые клетки или клетки, которые являются специфическими для определенных тканей и органов, такие как гепатоциты, после in vivo введения (смотри, например, US 6316024 и US 6214388; Allen и др., Biochim. Biophys. Acta, 1237: 99-108 (1995); Blume и др., Biochim. Biophys. Acta, 1149: 180-184 (1993)). Это может сопровождаться использованием рецепторов, которые сверхэкспрессируются в клетках специфического типа, включающих, например, рецептор фолиевой кислоты (FR) (который сверхэкспрессируется в разнообразных неопластических тканях, включая опухоли молочной железы, яичника, шейки матки, колоректальные, ренальные и назофарингеальные опухоли), трансферриновый рецептор (TfR) (который сверхэкспрессируется на метастатических и устойчивых к лекарственным средствам клетках большинства карцином, сарком, а также некоторых лимфом и лейкемий), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) (который сверхэкспрессируется при анапластическом раке щитовидной железы и молочной железы, легочной и колоректальной опухоли), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста 1 и 2 (VEGFR-1/2) (который экспрессируется на высоком уровне на эндотелиальных клетках в опухолевых новообразованных сосудах), рецептор метастатина (который сверхэкспрессируется при аденопапиллярной злокачественной опухоли щитовидной железы), ErbB семейство рецепторов тирозинкиназ (которые сверхэкспрессируются при большом подмножестве видов рака молочной железы), рецептор эпидермального фактора роста (Her2/neu) (который сверхэкспрессируется при раке молочной железы), рецептор тирозинкиназы-18 (c-Kit) (который сверхэкспрессируется при саркоматоидных ренальных карциномах), HGF рецептор c-Met (который сверхэкспрессируется при аденокарциноме пищевода), CXCR4 и CCR7 (которые сверхэкспрессируются при раке молочной железы), рецептор эндотелина А (который сверхэкспрессируется при раке предстательной железы), рецептор дельта, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR-delta) (который сверхэкспрессируется при большинстве случае колоректального рака), PDGFR А (который сверхэкспрессируется в карциномах яичника), BAG-1 (который сверхэкспрессируется при различных видах рака легких), рецептор растворимого типа II TGF бета (который сверхэкспрессируется при раке поджелудочной железы), асиалогликопротеиновый рецептор (который сверхэкспрессируется на гепатоцитах), рецептор aβ интегрина (который сверхэкспрессируется в растущей сосудистой системе опухоли), легумаин (группа CD цистеинпротеазы, которая является обогащенной в ткани солидных опухолей и сверхэкспрессируется на ТАМ, ассоциированных с опухолью макрофагах), и т.д.
Любой агент, который специфически связывается с таким специфическим рецептором клетки или ткани, которые подвергаются обработке или анализу, может присоединяться к липидной везикуле и функционировать в качестве нацеливающего или рецепторного лиганда. В типичном случае такие нацеливающие лиганды присоединяют к липиду или к поверхности липидной везикулы с помощью линкера с длинной цепью (например, полимерного). К примеру, конъюгаты на основе фолиевой кислоты использовали для обеспечения подхода нацеленной доставки терапевтического соединения, полезного для лечения и/или диагностики заболевания, что позволяло снизить необходимую дозу терапевтических соединений (смотри, например, WO 02/094185, US 6335434, WO 99/66063, US 5416016). Кроме того, применение конъюгатов на основе галактозы и галактозамина для транспорта экзогенных соединений через клеточные мембраны может обеспечивать подход нацеленной доставки при лечении заболеваний печени, таких как инфекция HBV и HCV или гепатоклеточная карцинома, одновременно позволяя снизить требуемую дозу терапевтических соединений, которая является необходимой для лечения (смотри, например, US 6030954).
Другой важный пример применения на основе молекулярного узнавания представляет собой применение систем дисплея антигена, которые вовлекают презентацию как "собственных, так и "чужеродных" белков (антигенов) иммунной системе для достижения активации, модуляции или толерантности Т-клеток. Взаимодействия рецептора и лиганда в системах презентации антигена, которые осуществляют свой вклад в желаемый иммунный ответ или его отсутствие, являются комплексным и сложным для оценки, и подвергается воздействию со стороны различных параметров, таких как концентрации лигандов, присутствие корецепторов, аффинность связывания лиганд-рецептор и состояние поверхности. Таким образом, широко используемый подход вовлекает применение существующих в природе клеток человека (или их частей), первичная функция которых состоит в процессинге и презентации антигена. Однако в то время как системы на основе живых клеток могут быть оптимальными для имитации взаимодействия между клетками и для достижения желаемой индукции толерантности или иммунного ответа, они являются зависимыми от регулируемой экспрессии поверхностных молекул, включая возможную экспрессию дополнительных "костимуляторных" и/или адгезионных молекул на их поверхностной мембране при достаточном терапевтическом уровне. Известные в настоящее время искусственные системы колеблются от генетически сконструированных субклеточных везикул, презентирующих антиген, которые на своей поверхности несут молекулы, необходимые для презентации антигена и активации или ингибирования Т-лимфоцитов, (WO 03/039594) до систем презентации антигена, в основе которых лежит биоразлагаемые микросферы, имеющие размер клетки (WO 07/087341).
Является понятным, что указанные выше системы узнавания все еще имеют недостатки, а также все еще существует потребность в области техники в многофункциональных и эффективных системах на основе искусственного носителя для применений, которые основываются на молекулярном узнавании, таких как нацеленная доставка или презентация антигена, включая простые и экономичные способы их получения.
Настоящая заявка обеспечивает конъюгаты, которые включают этер-липиды, содержащие один или более ковалентно присоединенных биоактивных лигандов, а также различные системы носителя, которые включают такие конъюгаты (и которые необязательно включают один или более биоактивных агентов), позволяющие преодолевать описанные выше ограничения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение является направленным на системы носителя, которые включают этер-липиды, конъюгированные с одним или более биоактивными лигандами, для применения в нацеленной доставке и/или системах антигенного дисплея. Один или более биоактивных лигандов являются ковалентно присоединенными к этер-липидам общей формулы I и размещаются на поверхности системы носителя. Необязательно, по крайней мере, один биоактивный агент может быть инкапсулированным или встроенным в, или присоединенным к, или адсорбированным на поверхности системы носителя.
Таким образом, в одном аспекте изобретение является направленным на систему липидного носителя в форме везикулы, такую как липосома или мицелла, которые включают, по крайней мере, один конъюгат липид-лиганд формулы I, необязательно в смеси с дополнительными со-липидами. По крайней мере, один конъюгат липид-лиганд включает, по крайней мере, один этер-липид, который является связанным, по крайней мере, с одним биоактивным лигандом, таким как антигенный лиганд, целевой лиганд, терапевтический или диагностический лиганд. Необязательно, по крайней мере, один дополнительный биоактивный агент является инкапсулированным или встроенным во внутреннюю область или двойной слой (мембраны) или присоединенным к, или адсорбированным на поверхности везикулы. В некоторых воплощениях везикула представляет собой липосому или мицеллу. В другом аспекте изобретение является направленным на систему носителя на основе наночастиц в форме частиц, покрытых липидом, которые имеют внутренние полости или твердое ядро, где частица является покрытой с помощью, по крайней мере, одного конъюгата липид-лиганд формулы I, необязательно, в смеси с дополнительными со-липидами. По крайней мере, один конъюгат липид-лиганд формулы I включает, по крайней мере, один этер-липид, который является связанным, по крайней мере, с одним биоактивным лигандом, таким как антигенный лиганд, целевой лиганд, терапевтический лиганд или диагностический лиганд.
В некоторых воплощениях материал наночастиц представляет собой покрытую липидом наночастицу или наносферу. Необязательно, по крайней мере, один дополнительный биоактивный агент является инкапсулированным во внутренней полости, или встроенным, или диспергированным в твердом ядре.
В другом аспекте изобретение также является направленным на конъюгаты липид-лиганд в соответствии с формулой I сами по себе, которые включают этер-липид, характеризующийся, по крайней мере, двумя цепями связанного с этером углеводорода и головной группой, которая имеет короткую аминокислоту с неразветвленной цепью, которая содержит вплоть до 6 атомов углерода и вплоть до трех сайтов слияния, к которым может быть ковалентно присоединен, по крайней мере, один биоактивный лиганд.
Конъюгаты липид-лиганд относятся к соединению общей формулы I
1
2
3
где Y представляет собой О, N, S или ковалентную связь, S, S, S представляют собой независимо друг от друга ковалентную связь или группу спейсера,
1
2
3
X, Х, Х представляют независимо друг от друга Н или группу лиганда, L представляет собой группу формулы (а)
где пунктирная линия представляет собой связь с N,
1
2
2
b1
R представляет собой Н или группу формулы -(CH)-OR,
1'
2
2
b2
R представляет собой Н или группу формулы -(CH)-OR,
2
2
c
R представляет собой Н или группу формулы -СН-OR,
2'
d
2
d
R представляет собой Н или группу формулы -OR or -CH-OR,
3
2
2
e
R представляет собой Н или группу формулы -(CH)-OR или
2
3
e
-(CH)-OR,
a
b1
b2
c
d
e
R, R, R, R, R, R представляют независимо друг от друга насыщенную или ненасыщенную, разветвленную или неразветвленную углеводородную цепь,
m равно1, 2 или 3,
1
1'
2
2'
3
1
2
3
при условии, что, по крайней мере, один из R, R, R, R, R не является Н и, по крайней мере, один из Х, Х, Х представляет собой группу лиганда.
В специфических воплощениях группа лиганда представляет собой нацеливающий лиганд, или антигенный лиганд, или терапевтический лиганд, или диагностический лиганд.
Предпочтительно, нацеливающий лиганд представляет собой производную птероевой кислоты, пептид или его производную, полипептид, белок или углевод, а антигенный лиганд представляет собой пептид, белок или углевод.
В дополнительном аспекте изобретение также является направленным на применения систем носителя в соответствии с изобретением в качестве системы доставки лекарственного средства, диагностической системы или системы антигенного дисплея. Также обеспечиваются наборы для получения систем носителя, которые содержат липиды в соответствии с изобретением, и фармацевтические композиции, содержащие такие системы носителя.
В других аспектах настоящее изобретение является также направленным на способы для лечения или диагностики заболевания, которые включают введение эффективного количества системы носителя в соответствии с изобретением.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение также является направленным на способы модулирования иммунного ответа, которые включают введение эффективного количества системы носителя в соответствии с изобретением.
Другие аспекты изобретения включают способы для транспорта биологически активного соединения через мембрану и/или способы доставки биологически активного соединения в клетку при использовании системы носителя в соответствии с изобретением.
Чертежи
Фигура 1. Клеточное поглощение RGD нацеленной липосомы (которая включает 5% DMA-RGD) по сравнению с ненацеленной липосомой (которая не содержит DMA-RGD).
Фигура 2. Эксперименты по нацеливанию на легумаин при использовании декорированных RR11a липосом (MS 15-4) по сравнению с контрольными липосомами (MS 15-0) в соответствии с Примером 20:
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает системы носителя, которые включают, по крайней мере, один этер-липид и, по крайней мере, один биоактивный лиганд, конъюгированный с указанным этер-липидом с образованием конъюгата липид-лиганд в соответствии с изобретением. Любая система носителя, которая может быть состоять из или быть покрыта с помощью конъюгатов липид-лиганд общей формулы I, необязательно, в комбинации с другими соединениями липидного матрикса (или со-липидами), может действовать как система носителя в соответствии с настоящим изобретением. Типично, система носителя в соответствии с изобретением основывается на материале микрочастиц или наночастиц различной формы и различных размеров, таких как пузырьки или сферы с внутренней полостью, частицы с твердым ядром, палочковидные, кубические, частицы в виде кластеров и тому подобное. В некоторых воплощениях система носителя в соответствии с изобретением представляет собой систему на основе липидного носителя такую, как липосома, мицелла, где конъюгат липид-лиганд, необязательно, вместе с другими матриксными липидами, формирует липидную стенку везикулы. В других воплощениях система носителя в соответствии с изобретением представляет собой систему носителя на основе наночастиц, таких как наночастицы, наносферы, нанокластеры, нанотрубочки, полимерные гранулы и тому подобное, где конъюгат липид-лиганд адсорбируется, необязательно, вместе с другими матриксными липидами, в качестве покрытия на поверхности системы носителя на основе наночастиц. В зависимости от природы и предназначенного применил системы носителя в соответствии с изобретением, один или более биоактивных агентов могут быть инкапсулированы или встроены в, или присоединены к, или адсорбированы на поверхности системы носителя.
Как используется в данной заявке, термин "биоактивный" относится к способности вызывать биологический ответ, который предполагается в клетке, ткани, системе и/или у субъекта (включая человека). Термин "биологический ответ" относится к физиологической реакции клетки на стимул и, таким образом, может представлять собой любой клеточный, неврологический, химический, воспалительный, иммунологический или патологический биологический ответ, процесс или реакцию у субъекта. Ответ, процесс или реакция может быть химической, клеточной, неврологической, физиологической или подобной им. Таким образом, термин "биоактивный лиганд», или "биоактивная группа лиганда", или просто "лиганд", или "группа лиганда", как используется в данной заявке, относится к лиганду, который вызывает такой биологический ответ и который используется для ковалентного присоединения к этер-липиду общей формулы I либо непосредственно, либо с помощью группы спейсера (при использовании стандартных методик химического слияния). Биоактивный лиганд может представлять собой нацеливающий лиганд, антигенный лиганд, терапевтический лиганд или диагностический лиганд.
Термин "биоактивный агент" или просто "агент", как используется в данной заявке, относится к любому синтетическому или существующему в природе соединению (в свободной форме, форме соли, или в растворенной форме, или в гидратированной форме), который обладает биологической активностью, такому как нацеливающий агент, антигенный агент, терапевтический агент или диагностический агент, предпочтительно терапевтический агент или диагностический агент. При этом является понятным, что определения различных групп биоактивных агентов и групп биоактивных лигандов могут перекрываться.
Таким образом, выражение "нацеливающий" используется в сочетании с "агентом" или "лигандом" (для применения в системах нацеленной доставки) и относится к соединению, которое является способным к взаимодействию с комплементарным связывающим остатком в желательном положении и/или при определенных условиях. Например, комплементарные связывающие остатки могут представлять собой лиганды и анти-лиганды (например, стрептавидин и биотин, белок А или G и Fc участок иммуноглобулинов), лиганды и рецепторы (например, лиганды на основе малых молекул и их рецепторы, или взаимодействия сахар-лектин), пептиды, которые получены из фагового дисплея, комплементарные нуклеиновые кислоты (например, ДНК гибриды, РНК гибриды, ДНК/РНК гибриды, и т.д.) и аптамеры. Другие типичные комплементарные связывающие остатки включают, но без ограничения таковыми, остатки, которые демонстрируют комплементарные заряды, гидрофобность, образование водородной связи, ковалентное связывание, Ван дер Ваальсовы силы, реактивные взаимодействия, электростатические взаимодействия, магнитные взаимодействия и подобные им.
-5
-7
-8
-12
"Нацеливающий лиганд" или "нацеливающий агент", который является специфическим для определенного рецептора (рецепторный агент или лиганд), относится к любому соединению, которое представляет собой специфический партнер связывания пары специфического связывания, в которой другой партнер связывания представляет собой рецептор. Рецептор может быть присоединенным к клеточной мембране или поверхности, или может находится в растворенной форме и может присутствовать внутриклеточно и/или за пределами клетки у субъекта, предпочтительно у субъекта, который представляет собой человека, например, человека или животное. Примеры рецептора включают, но без ограничения таковыми, мембранные рецепторы, растворимые рецепторы, клонированные или рекомбинантные рецепторы, семейство CD цистеинпротеазы и другие протеазы, а также другие ферменты, гормональные рецепторы, рецепторы лекарственного средства, рецепторы трансмиттера, аутакоидные рецепторы, цитокиновые рецепторы, антитела, фрагменты антител, сконструированные антитела, миметики антител, единицы молекулярного узнавания, адгезионные молекулы, агглютинины, интегрины и селектины. Типично, связывающая аффинность рецепторного лиганда для этого рецептора может составлять, по крайней мере, 10 М, предпочтительно 10 М и более, например, от приблизительно 10 М до приблизительно 10 М. Примеры рецепторного агента или лиганда включают, но без ограничения таковыми, пептид или полипептид, включая их производные, такие как аза-пептидные производные или производные, содержащие частично или только D-аминокислоты, гликопептид и тому подобное, белок, включая гликобелок или фосфобелок, углевод, гликолипид, фосфолипид, олигонуклеотид, полинуклеотид, аптамеры, шпигельмеры, витамины (например, витамин В9 или фолиевую кислоту, витамин В12), антигены и их фрагменты, гаптены, агонисты рецепторов, частичные агонисты, смешанные агонисты, антагонисты, наркотики, хемокины, гормоны (например, LH, FSH, TRH, TSH, АСТН, CRH, PRH, MRH, MSH, глюкагон и пролактин; трансферрин, лактоферрин; ангиотензин, гистамин; инсулин, лектины), трансмиттеры, аутокоиды; ростовые факторы (например, PDGF, VEGF, EGF, TGFα, TBFβ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, бомбезины, тромбопоэтин, эритропоэтин, онкостатин и эндотелии 1), цитокины, включая интерлейкины (например, интерлейкины от 1 до 15), лимфокины и клеточные сигнальные молекулы, такие как факторы некроза опухоли (например, факторы некроза опухоли α и β) и интерфероны (например, интерфероны α, β и γ), простетические группы, коэнзимы, кофакторы, регуляторные факторы или любые другие существующие в природе или синтетические органические молекулы, которые специфически связываются с рецепторами, включая фрагменты, аналоги и любые другие их производные, которые сохраняют те же свойства связывания. Выбор рецепторного агента или лиганды для применения в настоящем изобретении будет определяться природой заболевания, состояния или инфекции, которые подвергаются анализу и/или лечению. Предпочтительные рецепторные агенты или лиганды включают витамины (например, фолиевую кислоту или ее фрагменты), производную птероевой кислоты, пептиды, включая их производные, такие как аза-пептидные производные, белки и углеводы. Наиболее предпочтительными являются производные птероила и пептидов, в частности, производны аза-пептидов.
Термин "птероил" или "птероевая кислота", как используется в данной заявке, представляет собой конденсированный пиримидиновый гетероцикл, который является связанным с остатком аминобензоила. Как используется в данной заявке термин "конденсированный пиримидиновый гетероцикл" включает пиримидин, слитый с дополнительным 5- или 6-членным гетероциклом, что приводит к получению птеридинового или пирролпиримидинового бицикла. Конъюгация группы птероила с одним или более реактивных сайтов на головной группе этер-липида (N- или Y-группа) будет приводить к получению структуры фолата, в которой головная группа представляет собой часть глутаминовой кислоты или ее производную. Типичные структуры фолата основываются на фолатном скелете, то есть птероил-глутаминовой кислоте, соответственно N-[4-[[(2-амино-1,4-дигидро-4-оксо-6-птеридинил)метил]амино]бензоил]-L-глутаминовой кислоте, и ее производных. Такие производные фолата включают фолаты, которые имеют необязательные заместители в реактивных или нереактивных сайтах и/или где выбранные атомы были заменены, например, выбранные гетероатомы, предпочтительно один или два, были заменены атомами углерода (такими как в деаза и дидеаза аналогах). Примеры представляют собой необязательно замещенную фолиевую кислоту, фолиновую кислоту, птерополиглутаминовую кислоту и птеридины, связывающие рецептор, такие как тетрагидроптерины, дигидрофолаты, тетрагидрофолаты и деаза и дидеаза аналоги. Фолиевая кислота, 5-метил-(6S)-тетрагидрофолиевая кислота и 5-формил-(6S)-тетрагидрофолиевая кислота представляют собой предпочтительные базовые структуры, которые используются для соединений в соответствии с изобретением. Термин "деаза" и "дидеаза" аналоги относится к области признанных аналогов, которые имеют атом углерода, замещенный одним или двумя атомами азота в существующей в природе структуре фолиевой кислоты. Например, деаза аналоги включают 1-деаза, 3-деаза, 5-деаза, 8-деаза и 10-деаза аналоги. Дидеаза аналоги включают, например, 1,5-дидеаза, 5,10-дидеаза, 8,10-дидеаза и 5,8-дидеаза аналоги. Предпочтительные соединения деаза аналогов включают N-[4-[2-[(6R)-2-амино-1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-6-ил]этил]бензоил]-L-глутаминовую кислоту (Лометрексол) и N-[4-[1-[(2,4-диамино-6-птеридинил)метил]пропил]бензоил]-L-глутаминовую кислоту (Эдатрексат). В каждой из указанных структур фолата часть глутаминовой кислоты является частью, соответствующей головной группе этер-липида и, таким образом, каждая из указанных выше структур фолата может также включать структуры, которые содержат различные производные глутаминовой кислоты, соответствующие головной группе.
Термин "пептид", как используется в данной заявке, представляет собой олигопептид, который состоит из 1 - 30, предпочтительно 2 - 20, наиболее предпочтительно 3-10 аминокислот. Пептиды типично являются соединенными с помощью своих N-концов, С-концов и/или с помощью своих боковых цепей с реактивными положениями при головной группе (то есть N- и/или Y-группы) этер-липида. Пептиды могут содержать дисульфидные мостики, а также эстерные связи. Кроме того, пептиды могут нести защитные группы на N-конце, С-конце и в боковых цепях. Термин "кислота" включает существующие в природе L-аминокислоты, D-аминокислоты, синтетические аминокислоты, бета аминокислоты и их гомологи.
Предпочтительные пептиды, как определено выше, для применения в настоящей заявке включают, например, специфические для клетки лиганды, такие как RGD-пептид, NGR-пептид, ATWLPPR-пептид, APRPG-пептид, SMSIARL-пептид, TAASGVRSMH-пептид, LTLRWVGLMS-пептид, CDSDSDITWDQLWDLMK-пептид, GPLPLR-пептид, HWGF-пептид и их производные (где обозначение пептида представлено в однобуквенном коде аминокислот), предпочтительно RGD пептид (то есть трипептид с аминокислотной последовательностью аргинин-глицин-аспарагиновая кислота или Arg-Gly-Asp) и его производные. Производные RGD пептида включают любую структурную модификацию пептида, включая пептид, содержащий RGD последовательность, а также непептидные соединения, которые включают RGD пептид.
Термин "аза-пептид", как используется в данной заявке, относится к пептидным аналогам, имеющим атом азота, который замещает один или более атомов углерода в существующей в природе структуре пептида. Аза-пептиды типично состоят из 1-30, предпочтительно 2-20, наиболее предпочтительно 3-10 аминокислот, которые имеют атом азота, который замещает, по крайней мере, один из sp3-гибридизированных атомов углерода, предпочтительно атом углерода в альфа-положении аминокислоты, наиболее предпочтительно атом углерода в альфа-положении аминокислоты на С-конце. Аза-пептиды являются соединенными с помощью своих N-концов, С-концов и/или посредством их боковых цепей с реактивными положениями в головной группе (то есть N-и/или Y-группах) этер-липида. Аза-пептиды могут содержать дисульфидные мостики, а также эстерные связи. Кроме того, аза-пептиды могут нести защитные группы на N-конце, С-конце и на своих боковых цепях. Предпочтительные аза-пептиды представляют собой производные 2-азааспарагина, такие как Cbz-аланилаланил-2-азааспарагин (который является также известным как RR11a) (Ekici и др., 2004, J. Med. Chem. 47, 1889-1892; WO 2012/031175 А9).
В других воплощениях нацеливающий агент или лиганд может также быть представленным или включать, по крайней мере, один блокирующий остаток. Как используется в данной заявке, термин "блокирующий остаток" относится к остаткам, которые маскируют, блокируют, "укрывают", и/или стерически ингибируют активность, самоузнавание и/или самосборку комплементарных связывающих остатков. Например, блокирующий остаток может блокировать способность комплементарных связывающих остатков взаимодействовать друг с другом перед желаемым состоянием или в то время, когда блокирующий остаток удаляется. Блокирующий остаток может включать полимерные соединения, такие как полаксамины; полоксамеры; полиэтиленгликоль (ПЭГ); поли(молочная-со-гликолевая кислота)(PLGA), пептиды; синтетические полимеры и тому подобное.
Как используется в данной заявке, выражение "антиген(ный)", используемый в сочетании с "агент" или "лиганд", относится к соединению, которое вызывает иммунный ответ против него или его частей. Термин "иммунный ответ" относится к узнаванию антигена или его частей иммунной эффекторной клеткой. Такой включает опосредованные Т-клетками и/или В-клетками иммунные ответы, которые подвергаются влиянию с помощью модулирования ко-стимуляции Т-клеток. Термин иммунный ответ также включает иммунные ответы, которые опосредованно подвергаются влиянию с помощью активации Т-клеток, такие как продукция антитела (гуморальные ответы) и активация других иммунных эффекторных клеток, включая, но без ограничения таковыми, моноциты, макрофаги, NK клетки и цитотоксические Т лимфоциты (CTL), например, CTL линии, CTL клоны и CTL из опухолевых, воспалительных или других инфильтратов. Определенная больная ткань экспрессирует специфические антигены, были также идентифицированы CTL для этих антигенов. Например, приблизительно 80% меланом экспрессируют антиген, который является известным как gp-100. Одна из наиболее эффективных и желательных процедур для предотвращения микробных инфекций и патогенных процессов и, таким образом, борьбы с этими заболеваниями, представляет собой вакцины, которые вызывают стимуляцию иммунного ответа в организме хозяина перед актуальной инфекцией или началом заболевания путем введения антигенов или иммуногенов в хозяйский организм.
Квалифицированному специалисту будет понятно, что любая макромолекула, включая практически любую биологическую молекулу (белки, пептиды, липиды, липопротеины, гликаны, гликопротеины, производные нуклеиновых кислот, такие как олигонуклеотиды, полинуклеотиды, геномная или рекомбинантная ДНК) могут служить в качестве антигена. Антиген может быть синтезирован химическим путем или биологическим путем, или может быть получен из рекомбинантной или геномной ДНК, или может быть получен из биологического образца, такого как образец ткани, образец опухоли, клеточная или биологическая жидкость. Антигены могут включать, но без ограничения таковыми, вирусные антигены, бактериальные антигены, грибковые антигены, антигены простейших и других паразитов, опухолевые антигены, антигены, вовлеченные в аутоиммунное заболевание, привыкание, аллергию и отторжение трансплантата, и другие многочисленные антигены. Типичные примеры антигена могут представлять собой белок или пептид бактериального, грибкового, протозойного или вирусного происхождения, или фрагменты, которые получены из этих антигенов, включающие, но без ограничения таковыми, виды Streptococcus, виды Candida, виды Brucella, виды Salmonella, виды Shigella, виды Pseudomonas, виды Bordetella, виды Clostridium, вирус Норуолк, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), виды Chlamydia, папилломавирусы человека, вирус гриппа, виды парамиксовируса, вирус герпеса, цитомегаловирус, вирус ветряной оспы, вирус ветряной оспы, вирус Эпштейна-Барра, вирус гепатита, виды Plasmodium, виды Trichomonas, инфекционные агенты, которые передаются половым путем, агенты вирусного энцефалита, агенты протозойных заболеваний, агенты грибковых заболеваний, агенты бактериальных заболеваний, раковые клетки или их смеси. Иммунизация субъекта может быть улучшена путем использования множественных копий антигена как мультивалентного дисплея и является желательной в случае антигенных лигандов, таких как малые пептиды или углеводы, которые являются сложными для введения и недостаточными для того, чтобы вызвать эффективный иммунный ответ по причине проблем, ассоциированных с размером гаптена. Таким образом, как используется в данной заявке, термин "мультивалентный" относится к дисплею более чем одной копии или типа антигена на системе носителя. Термин "система, которая презентирует антиген" или "система дисплея антигена", как используется в данной заявке, относится к существующей в природе или к синтетической системе, которая (i) может представлять, по крайней мере, один антиген (или его часть) таким образом, что, по крайней мере, один антиген (или его часть) может узнаваться или связываться с молекулой иммунного эффектора, например, рецептором антигена Т-клетки на поверхности Т-клетки, или (и) является способной презентировать, по крайней мере, один антиген (или его часть) в форме комплекса антиген-МНС, который способен распознаваться специфически эффекторными клетками иммунной системы, и таким образом, индуцировать эффективный иммунный ответ против антигена (или его части) который является презентированным. В контексте настоящего изобретения термин "узнаваемый" относится к (i) липидному соединению, конъюгированному, по крайней мере, с одним антигенным лигандом (или его композицией и рецептурой), который узнается и связывается с помощью иммунной эффекторной клетки, где такое связывание является достаточным для эффективного иммунного ответа, или к (ii) липидному соединению, конъюгированному, по крайней мере, с одним нацеливающим лигандом (или его композицией и рецептурой), который узнается и связывается со своим соответствующим рецептором, или к комбинации обоих (а) и (b). Анализы для определения, узнается ли нацеливающий или антигенный лиганд с помощью рецептора или иммунной эффекторной клетки, соответственно, являются известными в области техники и описываются в данной заявке.
Как используется в данной заявке, выражение "терапевтический" используется в сочетании со словом "агент" или "лиганд" и относится к соединению, которое является способным выявлять биологический эффект in vitro и/или in vivo, которое является терапевтическим по своей природе. Терапевтический лиганд может быть нейтральным или позитивно или негативно заряженным. Примеры приемлемых биоактивных агентов включают фармацевтические агенты и лекарственные средства, синтетические органические молекулы, белки, витамины, стероиды, миРНК, микроРНК, адъюванты и генетический материал.
Термин "генетический материал" в общем случает относится к нуклеозидам, нуклеотидам и полинуклеотидам, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Генетический материал может быть получен с помощью методики химического синтеза, которая является известной среднему специалисту в данной области техники, или при использовании рекомбинантной методики, или при использовании комбинаций этих двух методик. ДНК и РНК могут необязательно включать неприродные нуклеотиды и могут быть одно- или двухцепочечными. "Генетический материал" также относится к смысловой или антисмысловой ДНК и РНК, то есть к нуклеотидной последовательности, которая является комплементарной специфической последовательности нуклеозидов в ДНК и/или РНК.
Термин "фармацевтический" или "лекарственный" относится к любому терапевтическому профилактическому агенту, который используется в предотвращении, диагностике, смягчении, лечении или устранении заболевания или повреждения у пациента. При этом является понятным, что биоактивные агенты, которые заключаются или вводятся в липидные композиции или присоединяются к или адсорбируются на поверхности липидных композиций в соответствии с изобретением не являются ограниченными определенным классом биологически активного материала в смысле физико-химических свойств, размера молекулы или источника происхождения, то есть синтетическими, биотехнологическими материалами и т.д. Таким образом, фармацевтический агент может представлять собой, например, такой, выбранный из какого-либо из следующих терапевтических классов: анальгетики, анестетики, агенты против болезни Альцгеймера, противоастматические агенты, агенты против болезни Паркинсона, антиаллергические препараты, антиангинальные средства, агенты против аритмии, противоартритные, антиастматические, антибактериальные, антибиотические, противораковые средства, антикоагулянты, антидепрессанты, антидиабетические средства, противорвотные, антиэпилептические, противогрибковые средства, агенты против глаукомы, противоподагрические, антигистаминные агенты, средства против гиперпролактинемии, антигипертензивные, противовоспалительные средства, агенты против мигрени, антинеопластические агенты, средства против ожирения, антипаразитические агенты, средства против простейших, антипиретические агенты, антипсориатические, антипсихотические, антитромботические средства, агенты против язвы, противовирусные препараты, анксиолитики, средства против доброкачественной гипертрофии предстательной железы, бронхорасширяющие средства, агенты для нормализации метаболизма кальция, кардиотонические, кардиоваскулярные агенты, хелаторы и антидоты, химиопревентивные агенты, контрацептивные, диуретические, допаминергические агенты, желудочно-кишечные агенты, гастропрокинетическая, гематопоэтическая, антигемофилическая, гормональна, гормонзаместительная терапии, гипнотический, гипохолестеринемический, гиполипидемический агент, иммуномодуляторное, иммуностимуляторное, иммуносупрессантное, липидрегулирующее средство, препарат для лечения мужской половой дисфункции, агент для лечения рассеянного склероза, мышечный релаксант, нейролептическое, ноотропное средство, агент против остеопороза, фитоэстроген, ингибитор агрегации тромбоцитов, простогландин, агент, который способствует лучевой терапии, релаксант и стимулятор, средство против дистресс-синдрома, средство для лечения недержания мочи, вазодилатор, витаминный/диетический препарат, средство, способствующее заживлению ран и ксантин. Активные агенты, которые принадлежат к этим классам, могут использоваться в упомянутых выше композициях.
Как используется в данной заявке, выражение "диагностический" используется в сочетании со словом "агент" или "лиганд" и относится к соединению, которое является способным к диагностике присутствия или отсутствия заболевания у пациента. Диагностические агенты могут быть нейтральными, позитивно или негативно заряженными. Примеры приемлемых диагностических агентов включают синтетические органические молекулы и комплексы тяжелых металлов, такие как контрастные агенты для применения в связи с магнитно-резонансным, ультразвуковым исследованиями или компьютерной томографией пациента.
Выбор нацеливающего, или антигенного, или терапевтического, или диагностического лиганда, или агента для применения с системой носителя в соответствии с настоящим изобретением будет определяться природой заболевания, состояния или инфекции, которые подвергаются исследованию и/или лечению.
Эти и другие аспекты в соответствии с изобретением раскрываются в последующих разделах.
А. Конъюгаты липид-лиганд
Термин "конъюгат липид-лиганд", как используется в данной заявке, относится к соединению в соответствии с изобретением, которое включает линейную, бифункциональную аминонокислоту в головной группе, в частности, 2-амино-алкандиоевую кислоту (содержащую вплоть до шести атомов углерода), такую как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и т.д., и которое является конъюгированным в сайте слияния головной группы с одним или более биоактивными лигандами с образованием "конъюгата липид-лиганд". Термин "этер-липид (соединение)" или "липид (соединение)", как используется в данной заявке, относится к предшественнику, то есть соответствующему липиду перед конъюгацией с одним или более биоактивными лигандами.
Таким образом, в одном аспекте изобретение является направленным на конъюгаты липид-лиганд в соответствии с формулой I
где Y представляет собой О, N, S или ковалентную связь,
1
2
3
S, S, S представляют собой независимо друг от друга ковалентную связь или группу спейсера,
1
2
3
X, Х, Х представляют собой независимо друг от друга Н или группу лиганда,
L представляет собой группу формулы (а)
где пунктирная линия представляет собой связь с N,
1
2
2
b1
R представляет собой Н или группу формулы -(СН)-OR,
1'
2
2
b2
R представляет собой Н или группу формулы -(СН)-OR,
2
2
c
R представляет собой Н или группу формулы -CH-OR,
2'
d
2
d
R представляет собой Н или группу формулы -OR или -CH-OR,
3
2
2
e
2
3
e
R представляет собой Н или группу формулы -(СН)-OR или -(СН)- OR,
a
b1
b2
c
d
e
R, R, R, R, R, R представляют независимо друг от друга насыщенную или ненасыщенную, разветвленную или неразветвленную углеводородную цепь,
m равно 1, 2 или 3,
1
1
2
2
3
1
2
3
при условии, что, по крайней мере, один из R, R', R, R', R не является Н и, по крайней мере, один из Х, Х, Х представляет собой группу лиганда.
Как используется в данной заявке, термины "конъюгированный" (или "конъюгация"), "связанный", "присоединенный", когда используется по отношению к физической ассоциации двух или более остатков с помощью ковалентных связей (либо непосредственно, либо при использовании спейсера).
Соотвествующие (этер-)липидные соединения, которые включают недериватизированные (липидные) соединения, где головная группа (то есть N- и Y-группы) не несет группы лиганда, а находится в свободной форме, в защищенной форме или в активированной форме, а также дериватизированные (липидные) соединения, в которых головная группа (то есть N- и Y-группы) является дериватизированной с помощью одной или более групп спейсеров, представляют собой часть данной заявки, используются попеременно и являются введенными в данную заявку в своей целостности.
3
3
1
1
3
2
2
В первом воплощении соединения I группа R представляет собой Н. В частности, либо (i) R представляет собой Н, a R и R' являются Н, либо (ii) Rпредставляет собой Н, a R и R' являются Н.
Таким образом, в этом первом воплощении изобретение является направленным на соединения формулы Ia,
где L представляет собой группу формулы (а)
1
2
3
1
2
3
1
1
2
2
a
и где S, S, S, Х, Х, Х, Y, R, R', R, R', R и m определяются так, как было представлено выше для соединения формулы I.
В частности, изобретение является направленным на соединения формулы Ia, где L представляет собой группу формулы (b) или (с)
1
1
2
2
a
2
2
1
1
1
2
3
где R, R', R, R', R являются такими, как определено выше, при условии, что в формуле (b) один из R и R' не является Н, и в формуле (с) один из R и R' не является Н, и по крайней мере, один из X, Х, Х представляет собой группу лиганда.
2
2
d
2
d
2
2
c
2
d
2
2
d
В одном предпочтительном воплощении группы (b) R представляет собой Н, а R'представляет собой -OR или -СН-OR. В другом предпочтительном воплощении группы (b) R представляет собой -СН-OR, a R' является -OR, или R' представляет собой -CH-OR.
Таким образом, изобретение предпочтительно является направленным на соединения, в которых L представляет собой группу формулы (b1), (b2), (b3) или (b4):
1
2
3
1
2
3
a
c
d
где S, S, S, Х, Х, Х, Y, m, R, R, R являются такими, как определено выше.
1
1
1
1
В одном предпочтительном воплощении группы (с), один из R и R' представляет собой Н. В другом предпочтительном воплощении группы (с) ни R, ни R' не является Н.
Таким образом, изобретение предпочтительно также является направленным на соединения, в которых L представляет собой группу формулы (с1) или (с2):
1
2
3
1
2
3
a
b1
b2
где S, S, S, Х, Х, Х, Y, m, R, R, R являются такими, как определено выше.
1
1
2
2
3
2
2
e
2
3
e
Во втором воплощении R, R', R, R' представляют собой Н, a Rявляется либо группой формулы -(CH)-OR, либо -(CH)-OR. Таким образом, в этом втором воплощении изобретение является направленным на соединения формулы Ib,
3
2
2
e
2
3
e
1
2
3
1
2
3
a
e
где R представляет собой группу формулы -(CH)-OR или -(CH)-OR, a S, S, S, Х, Х, Х, Y, R, R и m являются такими, как определено выше.
Наиболее предпочтительные воплощения в соответствии с изобретением представляют собой, таким образом, соединения формулы I, которые являются соединениями формулы II или III
где Y представляет собой О, N, S или ковалентную связь,
1
2
3
S, S, S представляют собой независимо друг от друга ковалентную связь или группу спейсера,
1
2
3
X, Х, Х представляют собой независимо друг от друга Н или группу лиганда,
1
2
2
b1
R представляет собой Н или группу формулы -(СН)-OR,
1'
2
2
b2
R представляет собой Н или группу формулы -(CH)-OR,
2
2
c
R представляет собой Н или группу формулы -CH-OR,
2'
d
2
d
R представляет собой Н или группу формулы -OR или -СН-OR,
a
b1
b2
c
d
R, R, R, R, R представляют независимо друг от друга насыщенную или ненасыщенную, разветвленную или неразветвленную углеводородную цепь,
m равно 1, 2 или 3,
2
2
1
1
1
2
3
при условии, что (i) в формуле II один из R и R' не является Н, и в формуле III один из R и R' не является Н, и что (ii) по крайней мере, один из X, Х, Х представляет собой группу лиганда.
Более специфические воплощения соединений формулы II представляют собой соединения формулы IIa, IIb, IIc или IId,
1
2
3
1
2
3
a
c
d
где S, S, S, X, X, X, Y, R, R, R и m определяются так, как представлено выше для соединения формулы II.
Более специфические воплощения соединений формулы III представляют собой соединения формулы IIIa или IIIb,
1
2
3
1
2
3
a
b1
b2
где S, S, S, X, X, X, Y, R, R, R и m определяются так, как представлено выше для соединения формулы III.
Другие наиболее предпочтительные воплощения соединения формулы I представляют собой соединения формул IVa и IVb,
1
2
3
где Y представляет собой О, N, S или ковалентную связь, S, S, S представляют собой независимо друг от друга ковалентную связь или группу спейсера,
1
2
3
X, Х, Х представляют независимо друг от друга Н или группу лиганда,
a
e
R, R представляют независимо друг от друга насыщенную или ненасыщенную, разветвленную или неразветвленную углеводородную цепь, и
m равно 1, 2 или 3,
1
2
3
при условии, что по крайней мере один из X, Х, Х представляет собой группу лиганда.
Квалифицированный специалист в данной области техники сможет оценить, что лиганд-липид в соответствии с настоящим изобретением (или соединения в соответствии с настоящим изобретением) содержит один или более хиральных центров и/или двойных связей и, таким образом, может существовать в форме стереизомеров, таких как изомеры с двойной связью (то есть, геометрические изомеры, например, Z/E изомеры или цис/транс изомеры), энантиомеры или диастереоизомеры. В соответствии с этим, когда стереохимия при хиральных центрах не указана, то химические структуры, показанные в данной заявке, охватывают все возможные конфигурации при этих хиральных центрах, включая стереоизмерно чистую форму (например, геометрически чистую, энантиомерно чистую или диастереоизомерно чистую), обогащенную форму (например, геометрически обогащенную, энантиомерно обогащенную или диастереомерно обогащенную) и смеси энантиомеров и стереоизомеров. Индивидуальные изомеры могут быть получены при использовании соответствующих изомерных форм исходного материала. Альтернативно, энантиомерные и стереоизомерные смеси могут быть разделены на составляющие их компоненты - энантиомеры или стереоизомеры при использовании методик разделения или методик хирального синтеза, которые являются хорошо известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Соединения в соответствии с изобретением, которые описываются в данной заявке, могут также существовать в нескольких таутомерных формах, включая энольную форму, кетоформу и их смеси. В соответствии с этим, структуры, представленные в данной заявке, охватывают все возможные таутомерные формы проиллюстрированных соединений.
Термин "насыщенная или ненасыщенная, разветвленная или неразветвленная углеводородная цепь", как используется в данной заявке, относится к насыщенной или ненасыщенной, разветвленной или неразветвленной углеводородной цепи, которая имеет от 6 до 30, предпочтительно от 10 до 22 атомов углерода.
Термин "насыщенный" в комбинации с углеводородной цепью относится к неразветвленной или разветвленной алкильной цепи, содержащей от 6 до 30, предпочтительно от 10 до 22 атомов углерода. Примеры включают, но без ограничения таковыми, каприл (децил), ундецил, лаурил (додедецил), миристил (тетрадецил), цетил (гексадецил), стерил (октадецил), нонадецил, арахидил (эйкозил), генэйкозил, бегенил (докозил), трикозил, тетракозил, пентакозил, включая его разветвленные изомеры, например, изолаурил, антеизолаурил, изомиристил, антеизомиристил, изопальмитил, антеизопальмитил, изостеарил, антеизостерил или фитанил (3,7,11,15-тетраметил-гексадеканил). Термин "ненасыщенный" в комбинации с углеводородной цепью указывает на то, что менее, чем максимально возможное количество атомов водорода являются связанными с каждым атомом углерода в цепи, что обеспечивает образование одной или более двойных или тройных связей углерод-углерод. В предпочтительных воплощениях количество ненасыщенных связей в ненасыщенной углеводородной цепи составляет 1, 2, 3 или 4, предпочтительно 1 или 2.
Примеры алкенильных групп включают, но без ограничения таковыми, мононенасыщенные алкенилы, такие как деценил, ундеценил, додеценил, пальмитолеил, гептадеценил, октадеценил (элаидил, олеил, рициноленил), нонадеценил, эйкозенил, генэйкозенил, докозенил (эруцил), трикозенил, тетракозенил, пентакозенил и их изомеры разветвленной цепи, а также полиненасыщенные алкенилы, такие как октадек-9,12-диенил (линолеил, элайдолинолеил), октадек-9,12,15-триенил (линоленил, элайдолиноленил), 9(Z),11(Е),13(Е)-октадекатриенил (элеостеарил), и эйкоз-5,8,11,14-тетраенил.
Примеры алкинильных групп включают, но без ограничения таковыми, гексадец-7-инил и октадец-9-инил.
Термин "разветвленный" комбинации с углеводородной цепью относится к углеводородной цепи, которая имеет линейные серии атомов углерода в качестве основной цепи, которая содержит, по крайней мере, один заместитель одного или более атомов углерода в качестве подчиненной цепи (ветвящихся групп). Примеры подчиненных цепей включают одну или более групп (С1-6)алкила, такие как группы метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, втор-бутила, трет-бутила, пентила, гексила и тому подобное, одну или более групп (С1-6)алкенила, такие как винил, аллил, пропенил, изопропенил, 2-бутенил и тому подобное, или одну или более групп (С1-6)алкинила, такие как этинил, пропинил, бутинил и тому подобное. Предпочтительные подчиненные цепи представляют собой (С1-6)алкильные группы, наиболее предпочтительными из которых являются метил и этил.
Соединения в соответствии с изобретением включают предпочтительно, по крайней мере, две углеводородные цепи, предпочтительно 2, 3, 4, 5 или 6 углеводородных цепей, наиболее предпочтительно 2 или 3 углеводородные цепи, где основные цепи углеводородных цепей являются одинаковыми или различными, предпочтительно одинаковыми, и являются выбранными из алкильной цепи, алкенильной цепи и алкинильной цепи, предпочтительно алкильной и алкенильной цепи. В одном предпочтительном воплощении соединения в соответствии с изобретением несут две алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или различными, предпочтительно одинаковыми.
a
b1
b2
c
d
e
В специфическом воплощении соединения в соответствии с изобретением углеводородные цепи R, R, R, R, R, R являются предпочтительно выбранными из миристила, пальмитила, стеарила, олеила, линолеила и фитаноила.
Термины "алкил", "алкокси", "алкенил", "алкинил", как используется в данной заявке, имеют следующие значения:
Термин "алкил" относится к неразветвленной или разветвленной алкильной цепи, содержащей от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 8 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают, но без ограничения таковыми, метил, этил, н-пропил, и-пропил, н-бутил, и-бутил и т-бутил. Термин "алкокси" относится к -О-алкильному радикалу. Примеры алкокси групп включают, но без ограничения таковыми, метокси, этокси и бутокси. Термин "алкенил" относится к неразветвленной или разветвленной ненасыщенной алкильной группе, которая содержит одну или более двойных связей углерод-углерод. Указанные выше алкильные, алкенильные группы и алкоксигруппы могут быть необязательно замещенными дополнительными группами. Примеры заместителей включают, но без ограничения таковыми, гало, гидроксил, амино, циано, нитро, меркапто, алкоксикарбонил, амидо, карбокси, алкилсульфонил, алкилкарбонил, карбамидо, карбамил, карбоксил, тиоуреидо, тиоцианато, сульфонамидо, арил, гетероарил, циклил и гетероциклил. Термин "арил" относится к ароматическому карбоциклическому радикалу, который содержит от приблизительно 6 до приблизительно 10, предпочтительно от 5 до 7 атомов углерода. Арильная группа может быть необязательно замещенной одним или более заместителями на основе арильной группы, которые могут быть одинаковыми или различными, где "заместитель на основе арильной группы" включает алкил, алкенил, алкинил, арил, аралкил, гидрокси, алкокси, арилокси, аралкокси, карбокси, ароил, гало, нитро, тригалометил, циано, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, аралкоксикарбонил, ацилокси, ациламино, ароиламино, карбамоил, алкилкарбамоил, диалкилкарбамоил, арилтио, алкилтио, алкилен и -NRR', где R и R' каждый независимо представляет собой водород, алкил, арил и аралкил. Типичные арильные группы включают замещенный или незамещенный фенил, нафтил, пиренил, антрил и фенантрил.
Термин "гетероарил" относится к остатку арила, как определено выше, который имеет, по крайней мере, один гетероатом (например, N, О, или S). Примеры гетероарильного остатка включают фурил, фурилен, флуоренил, пирролил, тиенил, оксазолил, имидазолил, тиазолил, пиридил, пиримидинил, хиназолинил, хинолинил, изохинолинил и индолил.
Термин "(гетеро)арилокси" относится к группе (гетеро)арил-О-, где группа (гетеро)арила является такой, как описано ранее. Типичные группы арилокси включают фенокси и нафтокси. Термин "(гетеро)аралкил" относится к группе (гетеро)арилалкила, где (гетеро)арил и алкил являются такими, как описано ранее. Типичные аралкильные группы включают бензил, фенилэтил и нафтилметил. Термин "(гетеро)аралкилокси" относится к группе (гетеро)аралкил-О-, где группа (гетеро)аралкила является такой, как описано ранее. Типичная аралкилокси группа представляет собой бензилокси.
Термин "циклоалкил" относится к насыщенному или ненасыщенному, неароматическому, циклическому остатку углеводорода, который содержит от 6 до 10 атомов углерода, таким как циклогексил или циклогексен-3-ил. Термин "гетероциклоалкил" относится к циклоалкилу, как определено в данной заявке, который содержит, по крайней мере, один кольцевой гетероатом (например, N, О или S), такому как 4-тетрагидропиранил или 4-пиранил.
Арил, гетероарил, циклоалкил, гетероциклоалкил, как упоминается в данной заявке, включают как замещенные, так и незамещенные остатки, если не указано иное. Возможные заместители на циклоалкиле, гетероциклоалкиле, ариле и гетероариле включают (С1-С10)алкил, (С2-С10)алкенил, (С2-С10)алкинил, (С3-С8)циклоалкил, (С5-С8)циклоалкенил, (С1-С10)алкокси, арил, арилокси, гетероарил, гетероарилокси, амино, (С1-С10)алкиламино, (С1-С20)диалкиламино, ариламино, диариламино, гидроксил, галоген, тио, (С1-С10)алкилтио, арилтио, (С1-С10)алкилсульфонил, арилсульфонил, ациламино, аминоацил, амидино, гуанидин, уреидо, циано, нитро, ацил, ацилокси, карбоксил и карбоксльный эстер. Циклоалкил, гетероциклоалкил, арил и гетероарил могут также быть приконденсированы друг к другу.
1
1
Группа Y представляет собой О, N, S или ковалентную связь, предпочтительно О или N, наиболее предпочтительно N. При этом является понятным, что, если группа Y представляет собой ковалентную связь, то остаток -S-X является непосредственно связанным с СО-группой.
1
2
3
1
2
3
Термин "спейсер" или "группа спейсера" (или группы S, S, S), как используется в данной заявке, относится к бивалентной разветвленной или неразветвленной химической группе, которая позволяет связывать этер-липид в соответствии с изобретением с одним или более биоактивными лигандами Х, Х, Х на достаточном расстоянии для того, чтобы устранить нежелательное взаимодействие между этер-липидом и лигандом и/или уменьшить любое стерическое препятствие (вызванное этер-липидом самим по себе или любыми другими соседними молекулами), которое может оказывать воздействие на биологическую активность лиганда (такую как аффинность связывания лигандов с их мишенью). В зависимости от предназначенного применения конъюгата этер-липида и биоактивного лиганда группа спейсеров может иметь различную длину и может быть (гидролитически, ферментативно или химически) стабильной или может включать способную к расщеплению связь. Способные к расщеплению связи в соответствии с изобретением могут быть выбраны так, чтобы расщепляться при использовании любой формы способной к расщеплению химии, например, химическим, ферментативным, гидролитическим путем и т.д. Типичные способные к расщеплению линкеры включают, но без ограничения таковыми, пептидные линкеры, способные к расщеплению протеазой, линкеры на основе нуклеиновой кислоты, которые являются чувствительными к воздействию нуклеазы, липидные линкеры, чувствительные к расщеплению с помощью липазы, углеводные линкеры, чувствительные к расщеплению гликозидазой, чувствительные к рН линкеры, чувствительные к гипоксии линкеры, фото-расщепляемые линкеры, термолабильные линкеры, расщепляемые с помощью ферментов линкеры, чувствительные к действию ультразвука линкеры, линкеры, расщепляемые с помощью рентгеновского излучения и т.д.
При этом является понятным, что спейсеры могут представлять или не представлять собой концевые группы, которые активированы для того, чтобы позволить осуществить связывание модифицированного спейсером соединения в соответствии с изобретением с дополнительным остатком, таким как биоактивная группа.
1
2
3
В специфических воплощениях "группа спейсера" (или группы S, S, S) представляет собой группу спейсера с короткой цепочкой или группу спейсера с длинной цепочкой, выбранную из цепи алкилена, которая необязательно включает одну или более групп, выбранных из групп кетона, эстера, этера, амино, амида, амидина, имида, карбамата или тиокарбамата, глицерина, мочевины, тиомочевины, двойных связей или ароматических колец.
1
2
3
В частности, короткая группа спейсера (или группы S, S, S) могут быть выбраны из (С1-С12)алкила, (С2-С12)алкенила, арила, аралкила, гетероарила.
1
2
3
2
k
2
2
Группы спейсера с длинной цепочкой (или группы S, S, S) могут быть выбраны из полимерных радикалов формулы -W-(CH-)-W'-, где k представляет собой целое число от 13 до 3000, a W и W' являются реактивными группами, которые способны реагировать с группами амино, карбоксила, гидроксила или тиогруппами, и где одна или более несоседних СН групп могут независимо быть заменены на арил, гетероарил, -СН=СН-, -С≡С- или гидрофильную (или полярную) группу, выбранную из -О-, -СО-, -СО-O-, -O-СО-, -NR'-, -NR'-CO-, -CO-NR'-, -NR'-СО-O-, -O-CO-NR'-, -NR'-CO-NR'- и -O-СО-O-, где R' представляет собой водород или (С1-С12)алкил. При этом является понятным, что замена более чем одной несоседней СН группы такой же группой может приводить к образованию полимерной цепи, которая имеет специфические повторяемые единицы (например, полиэстер, полиэтер, полиимид, и т.д.).
2
3
Предпочтительные группы спейсера включают гидрофильные полимерные радикалы (с повышенной аффинностью для водных растворов), то есть полимеры, содержащие повторяющиеся структурные единицы, которые включают одну или более указанных выше гидрофильных (или полярных) групп в их алкиленовом скелете. Типичные примеры гидрофильных полимерных радикалов включают полиокси(С-С)алкилены (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоль (ППГ)), полисахариды (например, декстран, пуллулан, хитозан, гиалуроновую кислоту), полиамиды (например, полиаминокислоты, полусинтетические пептиды и полинуклеотиды); полисиаловую кислоту, полиэстеры (например, полилактид (PLA), полилактид-со-гликолид (PLGA)), поликарбонаты, полиэтиленимины (PEI), полиимиды, поливинилацетат (ПВА).
2
2
2
2
m
2
2
2
2
m
2
2
2
2
m
2
2
2
2
m
2
2
2
2
2
2
m
2
2
Предпочтительный спейсер представляет собой "ПЭГ" или "полиэтиленгликоль", который охватывает любой растворимый в воде поли(этиленоксид). Типично, "ПЭГ" означает полимер, который содержит в основном, например, >50%, субъединиц, которые представляют собой -СНСНО-. Различные формы ПЭГ могут отличаться по молекулярному весу, структуре и по своей геометрии (например, разветвленные, линейные, вилкообразные, мультифункциональные ПЭГи и тому подобное). ПЭГ для применения в настоящем изобретении может предпочтительно включать одну из двух следующих структур: "-O(CHCHO)-" или "-CHCHO(CHCHO)-СНСН-," где m равно 3-3000, а терминальны группы и архитектура общего ПЭГ могут варьировать. Как указано выше, в зависимости от его применения ПЭГ может находиться в форме с блокированными концевыми группами. Когда ПЭГ определяется как "-O(CHCHO)-", концевая блокирующая группа в общем случае представляет собой содержащую углерод группу, которая типично включает 1-20 атомов углерода и предпочтительно является алкилом (например, метилом, этилом или бензилом), несмотря на то, что ее насыщенные и ненасыщенные формы, а также арил, гетероарил, циклил, гетероциклил, и замещенные формы любой из приведенных выше также предполагаются. Когда ПЭГ определяется как "- CHCHO(CHCHO)-СНСН-", то концевая блокирующая группа в общем случае представляет собой содержащую углерод группу, которая типично включает 1-20 атомов углерода и атом кислорода, который является ковалентно связанным с этой группой и является доступным для ковалентного связывания с одним концом ПЭГ. В этом случае группа типично представляет собой алкокси (например, метокси, этокси или бензилокси) и в отношении содержащей углерод группы может необязательно быть насыщенной и ненасыщенной, а также представлять собой арил, гетероарил, циклил, гетероциклил и замещенные формы какой-либо из перечисленных групп. Другой ("без концевой блокирующей группы") конец типично представляет собой гидроксил, амин или активированную группу, которая может подвергаться дополнительной химической модификации, когда ПЭГ определяется как "- CHCHO(CHCHO)-СНСН-". Кроме того, концевая блокирующая группа может также представлять собой силан.
Обзор для получения различных концевых групп на основе функционализированного или активированного ПЭГ является известным в области техники (смотри, например, Zalipsky S., Bioconjug. Chem., 6, 150-165 (1995)).
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Способы для конъюгации биоактивного лиганда (Х и/или Х, и/или Х) с этер-липидом (то есть соединениями формулы I, где X, Х, Хпредставляют собой Н) включают ковалентное связывание одного или более биоактивных лигандов X, Х, Х с одним или более реактивными положениями головной группы (то есть N- и/или Y-группами) одного или более индивидуальных этер-липидов. Таким образом, один биоактивный лиганд может быть присоединенным к одному или более сайтам одного индивидуального этер-липида или более, чем к одному сайту более чем одного индивидуального этер-липида. Альтернативно, два или три биоактивных лиганда являются присоединенными к сайтам слияния одного индивидуального этер-липида. Одна или более биоактивных групп могут присоединяться непосредственно к этер-липиду или с помощью группы спейсера.
Типично, способы связывания в общем случае включают этапы:
1
2
3
1
2
3
a) обеспечения липидного соединения формулы I, где X, Х, Х представляют собой соединение, которое несет один или более сайтов слияния на одной или более из групп S, S, S,
b) обеспечения антигенного лиганда, который несет реактивную группу, приемлемую для реакции с одним или более сайтами слияния, и
c) реакции липидного соединения с антигеном с получением конъюгата лиганд-липид.
Термин "сайт слияния" или "группа слияния", как используется в данной заявке, относится к реактивной или функциональной группе, которая является способной реагировать с соответствующей реактивной или функциональной группой (или двумя партнерами слияния) в реакции слияния с образованием ковалентной связи (С-С, С-О, C-N, C-S-связь). Выбор способа конъюгации (или слияния) зависит от различных факторов, таких как природа биоактивного лиганда, который присоединяется, то есть физических свойств (например, размера, заряда и т.д.), природы реактивных групп, которые присутствуют на биоактивном лиганде, и тому подобное.
В некоторых воплощениях конъюгацию осуществляют в присутствии бифункционального агента (то есть агента с двумя функциональными (концевыми) группами), предпочтительно гетеробифункционального агента (то есть, агента с двумя различными функциональными (концевыми) группами)). Применение такого (гетеро)бифункционального агента приводит к образованию конъюгата липид-лиганд, где липид и лиганд могут быть непосредственно связанными друг с другом или разделены спейсером. Типичные функциональные группы включают, но без ограничения таковыми, такие группы, как сукцинимидильные эстеры, малеимиды и пиридилдисульфиды. В некоторых воплощениях бифункциональный агент является выбранным из группы, которая включает, но без ограничения таковыми, например, карбодиимиды, N-гидроксисукцинимидил-4-азидосалициловую кислоту (NHS-ASA), диметилпимелимидат дигидрохлорид (DMP), диметилсуберимидат (DMS), 3,3'-дитиобиспропионимидат (DTBP), N-сукцинимидил 3-[2-пиридилдитио]пропионамидо (SPDP), сукцинимидил α-метилбутаноат, биотинамидогексаноил-6-амино-гексаноевая кислота N-гидрокси-сукцинимидный эстер (SMCC), сукцинимидил-[(N-малеимидопропионамидо)-додекаэтиленгликоль]эстер (NH S-PEO12), N-сукцинимидил (4-йодоацетил)аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидил S-ацетилтиоацетат (SATA), м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эстер (MBS) и N-γ-малеимидобутирилокси-сукцинимидный эстер (GMBS), сукцинимидил дикарбонилпентан или дисукцинимидилсуберат. В других воплощениях бифункциональный агент представляет собой реагент Трота 2-иминотиолан в комбинации с SPDP. Еще в одном дополнительном воплощении линкер представляет собой. В дополнительном воплощении бифункциональный агент является выбранным среди тех, которые раскрыты в The Pierce Products Catalogue (Pierce Chemical Company, USA) и the Double Agents™ Cross-Linking Reagents Selection Guide (Pierce Chemical Company), которые являются введенными в данную заявку в качестве ссылки.
Предпочтительные способы конъюгации включают опосредованное карбодиимидом образование амида и опосредованное активным эстер малеимидом слияние амина и сульфгидрила, и тому подобное. Например, содержащая тиол молекула может реагировать с содержащей амин молекулой при использовании гетеробифункционального перекрестно-сшивающего реагента, например, реагента, содержащего сукцинимидильный эстер, а также либо малеимид, либо пиридилдисульфид, либо йодацетамид. При этом может применяться образование поперечных связей на основе амин-карбоновой кислоты и тиол-карбоновой кислоты, способ малеимид-сульфгидрильного слияния (например, способ на основе малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного эстера (MBS), и др.
1
2
3
Полипептиды могут традиционно быть конъюгированы с этер-липидом посредством групп амина или тиола в боковых цепях лизина или цистеина, соответственно, или с помощью N-терминальной аминогруппы. Кроме того, олигонуклеотиды могут быть приемлемым образом конъюгированы с этер-липидом с помощью уникальной реактивной группы на 3' или 5' конце, например, группы сульфгидрила, амино, фосфата или подобных им. Реактивные сульфгидрильные группы могут быть слиты с липидом формулы I, который имеет свободную аминогруппу (например, группы N и Y), при использовании реагентов, таких как (i) N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и длинноцепочечный SPDP (Ic-SPDP), с образованием способной к расщеплению дисульфидной связи между липидом и олигонуклеотидом или полипептидом, или таких как (ii) сукцинимидил-йодацетат, с образованием неспособных к расщеплению связей между липидом и олигонуклеотидом или полипептидом. Эти и другие методики конъюгации являются хорошо известными в области техники (смотри, например, патент США №5512439; WO 01/22995; Greg Hernanson "Bioconjugate Techniques," Academic Press, 1996; Gordon Bickerstaff "Immobilization of Enzymes and Cells," Humana Press, 1997). Квалифицированный специалист будет знать, что функциональную группу или функциональные группы (например, аминные, карбонильные или карбоксильные группы на группе спейсера S, S, S головной группы этер-липида формулы I) следует выбрать для того, чтобы осуществить конъюгацию для получения биоактивного лиганда в соответствии с описанными выше способами конъюгации.
Дополнительная общая информация в отношении способов конъюгации может быть найдена, например, в "Cross-Linking," Pierce Chemical Technical Library, этот документ является доступным на Веб-сайте Pierce и изначально опубликован в 1994-95в Pierce Catalog, и в ссылках, которые там приводятся; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991; и Hermanson, G.Т., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, 1996.
Молярные соотношения, которые используются при конъюгации одного или более лигандов с этер-липидным соединением формулы I, могут быть с легкостью оптимизированы квалифицированным специалистом в данной области техники. Типично, они могут колебаться от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1 липидного соединения к лиганду.
В общем способе, представленном выше, может использоваться любой приемлемый способ для очистки промежуточного соединения, конъюгированного соединения, как например, с помощью препаративной ВЭЖХ с обратной фазой (RP-HPLC), путем мембранной фильтрации, такой как ультрафильтрация или диафильтрация. Непрореагировавшие ингредиенты могут быть удалены с помощью эксклюзионной хроматографии размеров, такой как гель-фильтрация или равновесный диализ. Полученный конъюгат также может быть очищен при использовании любых приемлемых средств, включая, например, гель-фильтрацию, мембранную фильтрацию, такую как ультрафильтрация, или ионообменную хроматографию, или их комбинацию.
Конъюгаты липид-лиганд в соответствии с изобретением являются особенно приемлемыми для применения в получении липидных систем носителя или таковых на основе наночастиц, таких как липосомы, мицеллы или наночастицы.
В. Липидные системы носителя
В дополнительном аспекте изобретение является направленным на липидные система носителя, которые включают один или более конъюгатов липид-лиганд в соответствии с изобретением, необязательно, в комбинации с другими со-липидами.
Типичные липидные системы носителя предпочтительно включают липидные везикулы. Термин "липидная везикула" (или настоящие везикулы, или везикулы в соответствии с изобретением) используется попеременно с выражением липидные системы носителя и относится к сферическому образованию, которое характеризуется наличием внутренней полости. Типично, везикулы в соответствии с изобретением образуются из одного или более конъюгатов липид-лиганд, необязательно в комбинации с другими синтетическими или существующими в природе кольцевыми липидами (со-липидами). В любой данной везикуле в соответствии с изобретением липиды могут быть в форме монослоя или бислоя. В случае наличия более одного моно- или бислоя, моно- или бислои в общем случае являются концентрическими. Везикулы в соответствии с изобретением включают такие образования, которые в общем случае называются липосомами (то есть везикула включает один или более концентрически расположенных липидных бислоев с внутренней полостью), мицеллами (то есть везикула, включающая единичный липидный монослой с внутренней полостью) и тому подобное. Таким образом, липиды могут использоваться для образования униламеллярной везикулы (которая включает один монослой или бислой), олиголамеллярной везикулы (которая включает приблизительно два или приблизительно три монослоя или бислоя) или мультиламеллярной везикулы (которая включает более чем приблизительно три монослоя или бислоя).
Внутренняя полость везикулы в общем случае является заполненной жидкостью, включая, например, водную жидкость, газом, предшественником газа и/или твердым материалом, включая, например, один или более биоактивных агентов, смотри также ниже в данной заявке. В некоторых воплощениях лиганд конъюгата липид-лиганд представляет собой нацеливающий лиганд (для получения нацеленной липидной системы носителя или нацеленной липосомы). В других воплощениях лиганд конъюгата липид-лиганд представляет собой антигенный лиганд (для получения антигенной липидной системы носителя или антигенной липосомы).
1
2
3
Таким образом, настоящее изобретение является специфически направленным на нацеленные липидные везикулы (такие как нацеленная липосома или мицелла), которые включают конъюгат липид-лиганд формулы I, где одна или более из групп X, Х, Х представляют собой нацеливающий лиганд, необязательно, в комбинации с другими со-липидами.
1
2
3
1
2
3
Альтернативно, настоящее изобретение является, в частности, направленным на антигенные липидные везикулы (такие как антигенная липосома или мицелла), которые включают конъюгат липид-лиганд формулы I, где одна или более из групп X, Х, Х представляют собой антигенный лиганд, необязательно, в комбинации с другими со-липидами. В специфических воплощениях настоящее изобретение также является направленным на смешанные липидные везикулы (такие как смешанная липосома или мицелла), которые включают конъюгат липид-лиганд формулы I, где одна или более из групп X, Х, Х представляют собой антигенный лиганд и нацеливающий лиганд, необязательно, в комбинации с другими со-липидами.
В специфических воплощениях липидные везикулы в соответствии с изобретением (то есть нацеленные, антигенные или смешанные) дополнительно включают один или более биоактивных агентов, таких как терапевтический или диагностический, или антигенный агент, предпочтительно терапевтический или диагностический агент, либо (а) включенный во внутреннюю полость липидной везикулы в соответствии с изобретением, (b) интегрированный в слой(слои) или стенку(и) липидной везикулы в соответствии с изобретением, например, рассеянный между липидов, которые содержаться внутри слоя(ев) или стенки(стенок) липидной везикулы в соответствии с изобретением, или (с) размещаются на поверхности липидной везикулы в соответствии с изобретением, посредством чего нахождение на поверхности достигается с помощью различных химических взаимодействий, таких как электростатические взаимодействия, водородные связи, вандерваальсовы силы или ковалентное связи, что приводит к присоединению или адсорбции и тому подобное.
Квалифицированный специалист в данной области техники поймет, что все комбинации подразумеваются в рамках данного изобретения, такие как нацеленные липидные везикулы, которые включают заключенный в них антигенный агент, и т.д.
В специфических воплощениях липидные везикулы в соответствии с изобретением, которые включают антигенный лиганд и/или агент, могут дополнительно включать один или более, предпочтительно один адъювант (а) заключенный внутри внутренней полости указанных липидных везикул, (b) встроенный в слой(и) или стенку(и) указанных липидных везикул, например, будучи рассеянным между липидами, которые содержаться внутри слоя(ев) или стенки(стенок) указанных липидных везикул, или (с) размещенным на поверхности указанных липидных везикул, посредством чего нахождение на поверхности достигается с помощью различных химических взаимодействий, таких как электростатические взаимодействия, водородные связи, вандерваальсовы силы или ковалентное связывание. Предпочтительно, один или более являются заключенными во внутреннюю полость.
12
24
Термин "со-липид" или "(со-)липид, образующий везикулу", как используется в данной заявке, относится к липидам, которые могут необязательно присутствовать в качестве дополнительных липидов липидных везикул в соответствии с изобретением и могут включать ациклические и циклические, насыщенные или ненасыщенные липиды природного или синтетического происхождения. Как используется в данной заявке, со-липид может представлять собой нейтральный липид, катионный липид или анионный липид. Катионный липид имеет позитивный суммарный заряд и может включать липиды, такие как N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметил аммонийные соли, например, метилсульфат (DOTAP), DDAB, диметилдиоктадецил бромид аммония; 1,2-диацилокси-3-триметиламмоний пропаны (включая, но без ограничения таковыми: диолеоил, димиристоил, дилауроил, дипальмитоил и дистеароил; а также две различные цепи ацила могут быть связанными со скелетом глицерина); N-[1-(2,3-диолоилокси)пропил]-N,N-диметиламин (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмоний пропаны (включая, но без ограничения таковыми: диолеоил, димиристоил, дилауроил, дипальмитоил и дистеароил; а также две различные цепи ацила могут быть связанными со скелетом глицерина); N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA); 1,2-диалкилокси-3-диметиламмоний пропаны (включая, но без ограничения таковыми: диолеил, димиристил, дилаурил, дипальмитил и дистеарил; а также две различные алкильные цепи могут быть связанными со скелетом глицерина); диоктадециламидоглицилспермин (DOGS); 3β-[N-(N',N'-диметиламино-этан)карбамоил]холестерол (DC-Chol); 2,3-диолеоилокси-N-(2-(сперминкарбоксамидо)-этил)-N,N-диметил-1-пропанам-иний трифторацетат (DOSPA); β-аланил холестерол; цетил триметил бромид аммония (СТАВ); диС14-амидин; N-трет-бутил-N'-тетрадецил-3-тетрадециламинопропионамидин; 14Dea2; N-(альфа-триметиламмониоацетил)дидодецил-D-глутамат хлорид (TMAG); О,О'-дитетрадеканоил-N-(триметиламмониоацетил)диэтаноламин хлорид; 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER); N,N,N',N'-тетраметил-N,N'-бис(2-гидроксилэтил)-2,3-диолеоилокси-1,4-бутанэдиаммоний йодид; производные 1-[2-(ацилокси)этил]2-алкил(алкенил)-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиний хлорида (как описывается Solodin и др. (1995) Biochem. 43: 13537-13544), такие как 1-[2-(9(Z)-октадеценоилокси)этил]-2-(8(Z)-гептадеценил-3-(2-гидроксиэтил) имидазолиний хлорид (DOTIM), 1-[2-(гексадеканоилокси)этил]-2-пентадецил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиний хлорид (DPTIM), производные 2,3-диалкилоксипропил четвертичного аммония, содержащие остаток гидроксиалкила на четвертичном амине (смотри, например, Feigner и др. J. Biol. Chem. 1994, 269, 2550-2561), такие как: 1,2-диолеоил-3-диметилгидроксиэтил аммоний бромид (DORI), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксиэтил аммоний бромид (DORIE), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметил-гидроксипропил аммоний бромид (DORIE-HP), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксибутил аммоний бромид (DORIE-HB), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметил-гидроксипентил аммоний бромид (DORIE-Hpe), 1,2-димиристилоксипропил-3-диметил-гидроксилэтил аммоний бромид (DMRIE), 1,2-дипальмитилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтил аммоний бромид (DPRIE), 1,2-дистерилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтил аммоний бромид (DSRIE); катионные эстеры ацил карнитинов (как сообщается Santaniello и др., патент США № 5498633); катионные триэстеры фосфатидилхолина, то есть 1,2-диацил-sn-глицерол-3-этилфосфатидилхолины, где углеводородные цепи могут быть насыщенными или ненасыщенными и разветвленными или неразветвленными с длиной цепи от С до С, при этом две ацильные цепи не являются с необходимостью идентичными. Нейтральные или анионные липиды имеют нейтральный или анионный суммарный заряд, соответственно. Такие липиды могут быть выбраны из стеролов или липидов, таких как холестерол, фосфолипиды, лизолипиды, лизофосфолипиды, сфинголипиды или ПЭГилированные липиды с нейтральным или негативным суммарным зарядом. Полезные анионные липиды, таким образом, включают: фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, фосфатидилинозитол (не ограниченный специфическим сахаром), жирные кислоты, стеролы, содержащие группу карбоновой кислоты, например, холестерол, холестерол сульфат и холестерол гемисукцинат, 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, включая, но без ограничения таковыми, DOPE, 1,2-диацил-глицеро-3-фосфатидилхолины и сфингомиелин. Жирные кислоты, связанные со скелетом глицерола, не являются ограниченными специфической длиной или количеством двойных связей. Фосфолипиды могут также содержать две различные жирные кислоты.
Квалифицированный специалист в данной области техники понимает, что соотношение конъюгатов липид-лиганд и со-липидов зависит от природы биоактивного лиганда, природы необязательного биоактивного агента, включенного или встроенного в или адсорбированного на, или присоединенного к липидным везикулам, предполагаемого применения (лечение заболевания, диагностический анализ и т.п.), состава фармацевтической композиции и способа введения. В одном воплощении липидная везикула в соответствии с изобретением может включать конъюгаты липид-лиганд в соответствии с изобретением и другие образующие везикулы липиды (со-липиды) предпочтительно в соотношении от 1:1000 до 1:1, предпочтительно от 1:500 до 1:50. В дополнительных воплощениях в соответствии с изобретением липидные везикулы могут включать один или более конъюгатов липид-лиганд, где конъюгат этер-липид включает ненасыщенные углеводородные цепи, которые могут быть перекрестно-сшитыми или полимеризованными с образованием полимеризованных липидных везикул.
Как используется в данной заявке, термин "полимеризованная липидная везикула" (в частности, полимеризованная липосома) означает липидную везикулу, в которой составляющие ее липиды являются ковалентно связанными друг с другом с помощью внутримолекулярных взаимодействий. Липиды могут быть связанными вместе с помощью одного слоя липидного бислоя (в виде листов) и/или могут быть связаны вместе между двумя слоями двойного слоя. Полимеризация структуры липидного слоя делает соединение значительно более устойчивым к ферментативному расщеплению кислотами, солями желчной кислоты или ферментами, которые присутствуют in vivo. Кроме того, контроль степени полимеризации и скорости деградации (путем выбора специфических соотношений конъюгата липид-лиганд, который имеет способные к расщеплению и способные к полимеризации углеводородные цепи), стабильность, а также "негерметичность" (путем образования пор желаемого размера) может регулироваться в соответствии с желаемой скоростью просачивания необязательно включенного биоактивного агента. Таким образом, конструирование липидной везикулы позволяет модулировать оптимальную скорость выхода, например, какого-либо инкапсулированного антигенного агента в специфических сайтах иммунного поглощения, или любого инкапсулированного терапевтического агента в специфических сайтах тканей или клетки, и т.д. Как может быть признано специалистом в данной области техники, липидные системы носителя в форме везикул, такие как липосомы, мицеллы или другие везикулы, могут быть легко получены из конъюгатов липид-лиганд в соответствии с изобретением при использовании стандартных условий, которые являются известными в области техники. В зависимости от желаемых физических свойств липидные везикулы могут быть получены из конъюгатов липид-лиганд, необязательно в комбинации с одним или более со-липидами, включая стабилизирующие липиды. Конкретные стабилизирующие соединения, которые, в конечном счете, соединяют с конъюгатами липид-лиганд могут быть выбраны так, как является желательным для оптимизации свойств полученных липидных везикул (они могут быть легко идентифицированы квалифицированным специалистом в данной области техники без осуществления излишних экспериментов).
Мицеллярные композиции в соответствии с изобретением могут быть получены при использовании какого-либо одного из традиционных способов получения мицелл, которые будут очевидными для специалиста в данной области техники. Эти способы типично предусматривают получение суспензии конъюгата липид-лиганд в органическом растворителе, выпаривание растворителя, ресуспендирование в водной среде, обработку ультразвуком и центрифугирование. Указанные выше способы, а также другие обсуждаются, например, у Canfield и др., Methods in Enzymology, том 189, стр. 418-422 (1990); El-Gorab и др., Biochem. Biophys. Acta, том 306, стр. 58-66 (1973); Colloidal Surfactant, Shinoda, и др., Academic Press, N.Y. (1963) в частности, "The Formation of Micellas", Shinoda, глава1, стр. 1-88); Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Fendler и Fendler, Academic Press, N.Y. (1975). Раскрытие каждой из указанных выше публикаций является введенным в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности.
Необязательные стабилизирующие материалы, которые могут соединяться с конъюгатами липид-лиганд для стабилизации мицеллярных композиций, получаемых из них, включают лаурилтриметиламмоний бромид, цетилтриметиламмоний бромид, миристилтриметиламмоний бромид, (С12-С16)алкилдиметилбензиламмоний хлорид, цетилпиридиний бромид и хлорид, лаурилсульфат и подобные им. Другие материалы для стабилизации мицеллярных композиций, в дополнение к тем, которые приведены выше, будут очевидными для квалифицированного специалиста в данной области техники на основе настоящего раскрытия. Липосомальные композиции в соответствии с изобретением являются особо предпочтительными, поскольку они особенно эффективны в качестве носителей для доставки биоактивных агентов к тканям и клеткам или в качестве презентирующих антиген носителей. Липосомальные композиции могут включать один или более конъюгатов липид-лиганд, необязательно в комбинации с одним или более дополнительными со-липидами и/или одним или более стабилизирующими соединениями. Конъюгаты липид-лиганд (и со-липиды) могут находиться в форме монослоя или бислоя, а липиды моно-или бислоя могут использоваться для образования одного или более моно- или бислоев. В случае более чем одного моно- или бислоя моно- или бислои в общем случае являются концентрическими. Таким образом, конъюгаты липид-лиганд (и со-липиды) могут использоваться для образования униламеллярной липосомы (которая включает один монослой или бислой), олиголамеллярной липосомы (которая включает два или три монослоя или бислоя) или мультиламеллярной липосомы (которая включает более чем три монослоя или бислоя). Выбор приемлемых со-липидов и стабилизирующих соединений для получения липосомальных липидных композиций в соответствии с изобретением будет очевидным квалифицированному специалисту в данной области техники и может быть достигнут без чрезмерной экспериментальной работы, на основе настоящего раскрытия. Другие материалы для применения в получении липосомальных липидных композиций в соответствии с изобретением, в дополнение к тем, которые приведены выше, будут очевидными для квалифицированного специалиста в данной области техники на основе раскрытия в соответствии с данной заявкой.
Количество стабилизирующего материала, такого как, например, дополнительное амфипатическое соединение, который соединяют с конъюгатами липид-лиганд в соответствии с изобретением, может варьировать в зависимости от разнообразных факторов, включая специфические выбранные конъюгат липид-лиганд в соответствии с изобретением, выбранные специфически(ие) стабилизирующий(ие) материал(ы), частное применение, для которого его используют, способ доставки и тому подобное. Количество стабилизирующего материала, который соединяют с конъюгатами липид-лиганд, и соотношение стабилизирующего материала к конъюгатам липид-лиганд будет варьировать, и это количество легко определяется специалистом в данной области техники на основе настоящего раскрытия. Типичные соотношения, выше, чем приблизительно 4:1, 3:1 или 2:1, конъюгата липид-лиганд к стабилизирующему липиду, являются предпочтительными. Широкое разнообразие способов является доступным в связи с получением липосомальных композиций в соответствии с изобретением. В соответствии с этим липосомы могут быть получены при использовании любого одного из разнообразных традиционных методик получения липосом, которые являются понятными квалифицированному специалисту в данной области техники. Эти методики включают способ на основе введения этанола, тонкопленочную методику, гомогенизацию, диализ при использовании растворителя, силовую гидратацию, выпаривание обратной фазы, микроэмульгирование и простое замораживание-оттаивание, при использовании, например, традиционного оборудования для микроэмульгирования. Дополнительные способы для получения липосомальных композиций в соответствии с изобретением из конъюгатов липид-лиганд в соответствии с настоящим изобретением включают, например, обработку ультразвуком, хелатный диализ, гомогенизацию, инфузию растворителя, спонтанное образование, выпаривание растворителя, контролируемый детергентный диализ и другие, каждый из них является вовлеченным в процесс получения липосом при использовании различных путей. Типично, способы, которые вовлекают введение этанола, тонкопленочную методику, гомогенизацию и экструзию являются предпочтительными в связи с получением липосомальных композиций в соответствии с изобретением из конъюгатов липид-лиганд в соответствии с настоящим изобретением.
Размер липосом может подбираться, если это является желательным, с помощью разнообразных методик, включая экструзию, фильтрование, ультразвуковую обработку и гомогенизацию. Другие способы подбора размера липосом, а также для модулирования полученного липосомального биораспределения и очистки липосом будут понятными квалифицированному специалисту в данной области техники на основе настоящего раскрытия. Предпочтительно, размер липосом подвергают доводке путем экструзии под давлением через поры определенного размера. Липосомальные композиции в соответствии с изобретением могут быть любого размера, предпочтительно меньше чем приблизительно 200 нанометров (нм) по внешнему диаметру. Как может признать квалифицированный специалист в данной области техники, любые конъюгаты липид-лиганд и липидные системы носителя, которые включают конъюгаты липид-лиганд в соответствии с изобретением, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановления, например, в водной среде (такой как стерильная вода или забуференный фосфатом раствор, или водный солевой раствор), предпочтительно при интенсивном перемешивании. Если это является необходимым, то могут включаться добавки для предотвращения агглютинации или слипания липидов в результате лиофилизации. Полезные добавки включают, но без ограничения таковыми, сорбит, маннит, хлорид натрия, глюкозу, трегалозу, поливинилпирролидон и поли(этиленгликоль), например, ПЭГ 400.
С. Системы носителя на основе наночастиц
60
70
2
2
Наночастицы системы носителя могут находиться в любой форме и иметь любую морфологию. Примеры системы носителя на основе наночастиц включают наночастицы, нанопорошки, нанокластеры, нанокристаллы, наносферы, нановолокна, нанотрубочки и другие геометрические формы. Везикулярные композиции на основе наночастиц или наночастицы типично представляют собой небольшие частицы, которые типично имеют диаметр меньший, чем 1 микрон, предпочтительно в интервале приблизительно 25-1000 нм, более предпочтительно в интервале приблизительно 50-300 нм, наиболее предпочтительно в интервале приблизительно 60-200 нм. Наносфера относится к типу наночастицы, которая является приблизительно сферической по форме и имеет полое ядро. Типично, наночастицы имеют матриксную структуру ядра, которая может быть сформирована при использовании всех типов материалов и структур, включая неорганические материалы, такие как металлы, и органические материалы, такие как полимеры, включая физиологически приемлемые полимеры. Неограничивающие примеры таких полимеров включают, например, полиэстеры (такие как поли(молочная кислота), поли(L-лизин), поли(гликолевая кислота) и поли(молочная-со-гликолевая кислота)), поли(молочная кислота-со-лизин), поли(молочная кислота-привитый лизин), полиангидриды (такие как поли(димер жирной кислоты), поли(фумаровая кислота), поли(себациновая кислота), поли(карбоксифеноксипропан), поли(карбоксифеноксигексан), сополимеры этих мономеров и тому подобное, поли(ангидрид-со-имиды), поли(амиды), поли(ортоэстеры), поли(иминокарбонаты), поли(уретаны), поли(органофосфазены), поли(фосфаты), поли(этиленвинилацетат) и другие замещенные ацилом ацетаты целлюлозы и их производные, поли(капролактон), поли(карбонаты), поли(аминокислоты), поли(акрилаты), полиацетали, поли(цианоакрилаты), поли(стирены), поли(винилхлорид), поливинил(фторид), поливинил(имидазол), хлоросульфонированные полиолефины, полиэтиленоксид, сополимеры, полистирен и их смеси или сополимеры. Наночастицы могут также включать гидроксипропилцеллюлозу (НРС), N-изопропилакриламид (NIPA), полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт (PVA), полиэтиленимин, хитозан, хитин, декстран сульфат, гепарин, хондроитин сульфат, желатин и т.д., а также их производные, сополимеры и их смеси. Неограничивающий способ получения наночастиц описывается, например, в публикации США 2003/0138490. В другом воплощении материал ядра может быть выбран из металлов, сплавов, металлоидов, соединений металла, таких как оксиды металла, неорганических соединений и материалов на основе углерода, в частности, углеродных трубочек, линейных наночастиц фуллерена C, и трехмерных наночастиц фуллерена С. Приемлемые примеры металлов включают, но без ограничения таковыми, драгоценные металлы или платину, такие как Ag, Au, Pd, Pt, Rh, lr, Ru и Os, переходные металлы, такие как Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Zr, Nb, Mo, Та, W, Re, а также металлы основной группы, такие как Al, Ga, In, Si, Ge, Sn, Sb, Bi, Те. При этом следует оценить тот факт, что некоторые металлы основной группы, в частности Si и Ge, также обычно называются металлоидами. Приемлемые примеры сплавов включают, но без ограничения таковыми, сплавы драгоценных металлов или платины, а также переходных металлов, в частности сплавы серебра и переходных металлов, такие как Ag/Ni, Ag/Cu, Ag/Со, платины и переходных металлов, такие как Pt/Cu, или сплавы драгоценных металлов или платины, такие как Ru/Pt. Неограничивающие примеры неорганических соединений включают, но не являются ограниченными таковыми, SiO, соединения металла, в частности, оксиды металла, такие как TiO и оксиды железа. Наночастицы могут также включать остатки с характерной флуоресценцией или люминисценцией, остатки с плазмонным резонансом и магнитные остатки, которые делают такие наночастицы способными к определению электрическими, магнитными и/или оптическими свойствами.
Квалифицированный специалист в данной области техники будет знать, что выбор материала будет зависеть от предназначенного применения наночастиц.
В одном воплощении изобретение является направленным на наночастицы, которые включают один или более конъюгатов липид-лиганд. Один или более липидных конъюгатов могут быть связаны, вкраплены или встроены, инкапсулированы, адсорбированы или связаны с поверхностью, или иным образом ассоциированы с наночастицей. В одном специфическом воплощении конъюгат липид-лиганд может быть ассоциированным с наночастицей в форме покрытия при использовании внутримолекулярных сил, таких как вандерваальсовы силы, ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, необязательно, в комбинации с другими со-липидами.
Альтернативно, наночастицы могут необязательно включать одну или более функциональных групп, таких как, например, карбоксильная, сульфгидрильная, гидроксильна группа или аминогруппа, для ковалентного связывания одного или более конъюгатов липид-лиганд (или других соединений, таких как спейсеры) с поверхностью наночастицы, необязательно в комбинации с другими со-липидами. Наночастицы в соответствии с изобретением могут также быть сгруппированы вместе (необязательно с диспергирующим агентом) с образованием нанокластера. Независимое рецептирование каждого типа наночастицы перед образованием кластера и специальное размещение наночастиц в кластере может позволять контролировать удержание и концентрацию конъюгата липид-лиганд и, таким образом, биоактивного агента.
В некоторых воплощениях наночастицы могут дополнительно включать дополнительный биоактивный агент, встроенный, заключенный или инкапсулированный в ядро твердого матрикса наночастицы. В предпочтительных воплощениях покрытые при использовании конъюгата липид-лиганд наночастицы могут быть сформированы из наноразмерных частиц ядра и одного или более конъюгатов липид-лиганд в соответствии с настоящим изобретением и, необязательно, одного или более со-липидов. В любой данной наночастице, покрытой липид-лигандом, конъюгаты липид-лиганд могут находиться в форме монослоя или бислоя. В случае более чем одного моно- или бислоя, моно- или бислои в общем случае являются концентрическими. Покрытие наночастиц предпочтительно осуществляют в растворе, который включает конъюгаты липид-лиганд в соответствии с изобретением, и оставляют в течение достаточного периода времени для того, чтобы позволить конъюгатам липид-лиганд покрыть наночастицы. В некоторых воплощениях один или более лигандов одного или более конъюгатов липид-лиганд представляют собой один или более антигенных лигандов.
Количество антигенного лиганда на наночастицу (поверхностная плотность антигенного лиганда) для индукции иммунного ответа зависит от многих факторов, таких как природа иммунного ответа самого по себе (гуморальный против клеточного), иммуногенности антигенного лиганда, иммуногенного статуса организма пациента, способа введения и длительности воздействия антигена.
При этом понятно, что иммунизация субъекта может быть улучшена путем применения множественных копий антигена в качестве мультивалентного дисплея, посредством чего повышается специфическая для сайта концентрация антигена и, таким образом, индуцируются длительные иммунные ответы. Это является особенно желательным в случае антигенных лигандов, таких как малые пептиды или углеводы, которые являются сложными для введения и в общем случае не могут вызвать эффективного иммунного ответа по причине ограничений, связанных с размером гаптена.
Таким образом, в некоторых воплощениях наночастица демонстрирует единичную или множественные копии одного антигенного лиганда или комбинации различных антигенных лигандов на своей поверхности (в форме мультивалентного дисплея). Как используется в данной заявке, термин "мультивалентный" относится к дисплею более чем одной копии или типа антигена на системе носителя.
1
2
3
В частности, настоящее изобретение относится к наночастицам, которые включают твердое ядро, которое является покрытым, по крайней мере, одним конъюгатом липид-лиганд формулы I, где один или более из X, Х, Х представляют собой антигенный лиганд, и необязательно, другой матрикс или со-липиды.
Иммунизация может быть дополнительно улучшена путем включения нацеливающих лигандов для направления наночастицы к приемлемой иммунной клетке или расположению.
Соединения, которые могут действовать как нацеливающие лиганды, представляют собой соединения, которые препятствуют прикреплению патогенов к хозяйской клетке и, таким образом, успешной колонизации. Примеры таких соединений могут включать токсоид столбняка; Р пили Е. coli, пили типа IV Pseudomonas aeruginosa, виды Neisseria, виды Moraxella, ЕРЕС или Vibrio cholerae; фимбриальные гены и несколько фимбриальных адгезинов, включая FHA, пертактин, коклюшный токсин и BrkA Bordetella pertussis; а также SipB-D Salmonella typhimurium и аденовирусную адгезию; реовирус сигма-1 белок реовируса, который является нацеленным на М-клетку.
1
2
3
Таким образом, изобретение также относится к наночастицам, которые включают твердое ядро, которое является покрытым с помощью, по крайней мере, одного конъюгата липид-лиганд формулы I, где один или более из X, Х, Х представляют собой антигенный лиганд и/или нацеливающий лиганд, и необязательно другой матрикс или со-липиды. В других воплощениях наночастица, покрытая конъюгатом липид-лиганд, дополнительно включает единичный антигенный агент или комбинацию антигенных агентов (мультивалентная), включенных или встроенных в твердое ядро наночастицы.
1
2
3
Таким образом, изобретение также относится к наночастицам, которые включают твердое ядро, которое является покрытым, по крайней мере, одним конъюгатом липид-лиганд формулы I, где один или более из X, Х, Х представляют собой антигенный лиганд и/или нацеливающий лиганд, и необязательно другие матриксные липиды или со-липиды, и где твердое ядро необязательно включает один или более дополнительных антигенных агентов.
В других воплощениях наночастица дополнительно включает один или более адъювантов, включенных, встроенных или рассредоточенных внутри твердого ядра наночастицы.
Как используется в данной заявке, термин "адъювант" относится к любому материалу, способному к усилению гуморального и/или клеточного иммунного ответа на специфический антиген. Приемлемые адъюванты могут размещаться на поверхности наночастицы, быть включенными в стенку наночастицы или могут быть инкапсулированы внутри наночастицы. Примеры адъювантов, которые могут использоваться для того, чтобы способствовать продукции сывороточных антител и/или антител слизистой оболочки, а также опосредованным клетками иммунным ответам против вводимых совместно антигенов, включают термолабильный энтеротоксин голотоксин Е. coli (LT) и энтеротоксин Vibrio cholerae (СТ), а также KPL адъювант (который имеет происхождение от клеточной стенки Salmonella Minnesota). Как используется в данной заявке, термины "демонстрируется" или "размещается на поверхности" относится к любому лиганду, который присутствует на внешней поверхности системы носителя, такой как липидная везикула или наночастица и, таким образом, является доступным для узнавания.
Разнообразные заболевания и расстройства могут подвергаться лечению с помощью вакцинных конструкций или комплектов на основе таких наночастиц, включая воспалительные заболевания, инфекционные заболевания, рак, генетические расстройства, отторжение трансплантата органа, аутоиммунные заболевания и иммунологические расстройства. Таким образом, изобретение также охватывает вакцины, которые включают мультивалентные наночастицы, включающие твердое ядро и один или более размещенных на поверхности конъюгатов липид-лиганд, где лиганд представляет собой один или более антигенный и/или нацеливающий лиганд, и которые дополнительно необязательно включают адъювант и/или дополнительный антигенный агент, встроенный в твердое ядро наночастицы.
В дополнительных воплощениях один или более лигандов одного или более конъюгатов липид-лиганд представляют собой один или более терапевтических или диагностических агентов.
Способы получения наночастиц в соответствии с изобретением, которые включают размещенный на их поверхности конъюгат липид-лиганд, включают этапы (а) получения наночастицы и (b) соединения одного или более конъюгатов липид-лиганд с наночастицей с помощью адсорбции или присоединения с образованием покрытой липид-лигандом наночастицы. Альтернативно, способы включают этапы (а) получения наночастицы, (b) соединения одного или более этер-липидов с наночастицей посредством адсорбции или присоединения с образованием покрытой липидом наночастицы и (с) ковалентного связывания одного или более биоактивных лигандов с одним или более этер-липидов, ассоциированных с поверхностью наночастицы с образованием покрытой липид-лигандом наночастицы. Эти (предварительно сформированные) покрытые липидом наночастицы представляют собой часть заявки, поданной параллельно, которая является введенной в данную заявку в своей целостности. Типичные способы для получения наночастиц приемлемого размера включают способы на основе испарения (например, свободного расширения потока, лазерного испарения, электроэрозионной обработки, электрического взрыва и химического осаждения из паровой среды), физические способы, которые вовлекают механическое истирание (например, технология дробления крупинок, Elan Nanosystems, Ireland), и межфазовое отложение после перемещения растворителя. В дополнительных воплощениях изобретение также является направленным на наносферы, которые включают один или более конъюгатов липид-лиганд. В отличие от наночастицы, наносфера представляет собой внутреннюю полость, которая может легко использоваться для включения и последующей доставки одного или более биоактивных агентов к клеткам и тканям, которые представляют интерес. Скорость высвобождения инкапсулированного(ых) биоактивного(ых) агента(ов) может подвергаться изменению, например, с помощью известных методик.
D. Фармацевтические композиции и рецептуры
Системы носителя в соответствии с изобретением могут присутствовать в виде фармацевтической композиции, например, такой, которая дополнительно включает фармацевтически приемлемые разбавители, наполнители или носители, такие как физиологический раствор или фосфатный буфер, выбранный в соответствии со способом введения и стандартной фармацевтической практикой.
Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение является направленным на фармацевтические композиции, которые включают одну или более липидную систему носителя или систему носителя на основе наночастиц, которая содержит конъюгаты лиганд-липид, необязательно, в комбинации с другими со-липидами и фармацевтически приемлемыми разбавителями, наполнителями или носителями.
Предпочтительно липидная система носителя представляет собой липидную везикулу, такую как липосома или мицелла, а система носителя на основе наночастиц представляет собой наночастицу или наносферу. При этом является понятным, что термин "один или более конъюгатов липид-лиганд" относится ко всем возможным воплощениям, как раскрывается в данной заявке, то есть к конъюгатам, где лиганд представляет собой один или более из нацеленных, антигенных, терапевтических и диагностических лигандов и их смесей. Необязательно, дополнительный один или более биоактивный агент является включенным или встроенным в или адсорбированным на, или присоединенным к липидной системе носителя или представляет собой такой на основе наночастиц.
Фармацевтический композиции в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться либо in vitro, например, для применения в культуре клеток, или для применения in vivo. В отношении применений in vivo следует сказать, что липидные композиции в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться пациенту в виде разнообразных форм, адаптированных к выбранному способу введения, включая парентеральное, пероральное или интраперитонеальное введение. Парентеральное введение включает внутривенное, внутримышечное, интерстициальное, интраартериальное, подкожное, интраокулярное, интрасиновиальное, трансэпителиальное (включая трансдермальное), легочное введение путем ингаляции, офтальмическое, сублингвальное и буккальное, местное (включая офтальмическое, дермальное, окулярное и ректальное) и назальную ингаляцию путем инсуффляционного введения, предпочтительным является внутривенное введение.
Полезная дозировка, которая вводится, и конкретный способ введения будут варьировать в зависимости от предполагаемого терапевтического или диагностического использования, а также от формы системы носителя, например, мицелла, липосома или наночастица, а также таких факторов, как возраст, вес, физическое состояние субъекта, которого подвергают лечению, что является весьма понятным для квалифицированного специалиста. Применение нацеленной фармацевтической композиции в соответствии с изобретением позволяет осуществлять введение более низких дозировок для достижения желаемого терапевтического эффекта.
В качестве общих рекомендаций можно сказать, что содержание конъюгата липид-лиганд в системе носителя будет варьировать от 0,05 до 5 мол. %, с содержанием от 0,1 до мол. %, которое является более предпочтительным, и от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 10 мг конкретного антигенного, терапевтического или диагностического агента, каждый из которых рассчитывается на килограмм веса тела пациента. Такое количество является приемлемым для введения, несмотря на то, что могут использоваться более высокие и более низкие количества.
Е. Способы применения
Как указано выше, в одном специфическом воплощении нацеленные конъюгаты липид-лиганд и, в частности, нацеленные везикулы (то есть липосомы и мицеллы) и нацеленные наночастицы, которые включают таковые, а также их соответствующие фармацевтические композиции, являются особенно приемлемыми для применения в качестве носителей для нацеленной доставки одного или более биоактивных агентов, предпочтительно терапевтических, диагностических и/или антигенных агентов.
Таким образом, нацеленные конъюгаты липид-лиганд в соответствии с настоящим изобретением являются особенно приемлемыми для применения в vitro и/или in vivo в способах для лечения заболеваний, для которых нацеленная доставка одного или более специфических биоактивных агентов, предпочтительно терапевтических, диагностических и/или антигенных агентов, к тканям или клеткам является желаемой или необходимой.
В случае нацеленных наночастиц и их фармацевтических композиций один или более биоактивных агентов являются предпочтительно интегрированными в твердое ядро.
В случае нацеленных липидных везикул и их фармацевтических композиций один или более биоактивных агентов являются предпочтительно включенными во внутреннюю полость или встроенными в липидный бислой.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение также охватывает способы транспорта диагностического биологически активного соединения через мембрану, в частности, способы для внутриклеточной доставки одного или более биоактивных агентов, которые включают контактирование клеток с фармацевтической композицией в соответствии с изобретением.
В другом специфическом воплощении антигенные везикулы (то есть липосомы и мицеллы) и антигенные наночастицы, которые включают их, а также их соответствующие фармацевтические композиции являются особенно приемлемыми для применения в качестве систем антигенного дисплея. Таким образом, антигенные конъюгаты липид-лиганд в соответствии с настоящим изобретением являются особенно приемлемыми, например, для применения в способах иммунизации и/или для vitro/in vivo диагностических применений.
Необязательно, антигенные везикулы (то есть липосомы и мицеллы) и антигенные наночастицы могут дополнительно включать один или более биоактивных агентов. В случае нацеленных липидных везикул и их фармацевтических композиций один или более биоактивных агентов являются предпочтительно включенными во внутреннюю полость или встроенными в липидный бислой.
Таким образом, еще в одном своем аспекте настоящее изобретение является направленным на системы дисплея антигена для профилактических и терапевтических вакцин, которые включают антигенную липидную везикулу или антигенную наночастицу, которые включают один или более антигенных конъюгатов липид-лиганд, необязательно, в комбинации с другими со-липидами, где такие необязательно включают один или более адъюванов и/или один или более биоактивных агентов.
Настоящим изобретением также охватываются способы для запуска или модуляции иммунного ответа на антиген у субъекта, которые включают антигенный дисплей для клеток, презентирующих антиген, в частности, дендритных клеток, макрофагов, В-клеток и эндотелиальных клеток, а также последовательное введение указанных клеток, презентирующих антиген, субъекту.
Другие аспекты изобретения включают способы транспорта биологически активного соединения через мембрану и/или способы доставки биологически активного соединения в клетку при использовании системы носителя в соответствии с изобретением.
Дополнительные воплощения, которые предусматриваются в данной заявке, включают, например, in vitro применение для усиления роста и дифференциации клеток, а также модификацию профилей экспрессии и моделей пост-трансляционной модификации биологических продуктов, которые вырабатываются в биореакторах.
F. Наборы
Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к набору, который включает контейнер, разделенный на компартменты для размещения различных элементов набора. Один компартмент может содержать предварительно определенное количество либо конъюгата липид-лиганд, либо системы носителя, которая получена из него. В случае системы носителя, такой как липосомы, они могут содержать или не содержать рН буфер для доведения значения рН композиции до физиологического интервала от приблизительно 7 до приблизительно 8 или также могут содержаться в лиофилизированной форме или в полученной путем высушивания замораживанием форме для восстановления на момент применения. Также в набор будут включаться другие реагенты и инструкции по применению.
Настоящее изобретение дополнительно описывается с помощью следующих примеров.
ПРИМЕРЫ
12
8
36
Материалы: 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (DOPC) представляет собой такой от Merck & Cie (Schaffhausen, Швейцария). Холестерол, DOPE, DSPC, РОРС, MPEG 2000-DOPE (880130) и флуоресцентные липиды NBD-DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил) (аммонийная соль)) (810145Р) и PhB-DOPE (810150) закупаются от Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Функционализированную (замещенную) производную ПЭГ пропионовую кислоту (ПК) Fmoc-NH-ПЭГ-PA-COOH (851024) получали от Novabiochem, Fmoc-NH-ПЭГ-PA-COOH (ПЭГ1830), Fmoc-NH-ПЭГ-РА-СООН (ПЭГ4400) и MPEG (2 кДа)-амин (ПЭГ1152) получали от IRIS Biotech GmbH. Дифенилдиазометановую смолу (D-2230) получали от Bachem AG, H-Thr(tBu)-2-CITrt смолу (RRA-1251) - от CBL Patras, H-Gly-2-CITrt смолу (856053) и Sieber смолу (855008) от Novabiochem. Все другие химикаты и растворители представляли собой такие марки A.R. или выше.
Аза-пептидый акцептор Майкла TpaHC-Cbz-D-Ala-D-Ala-2-аза-Asn-акриловая кислота (RR11a-OH) и его активированный эстер с N-гидроксисукцинимидом (RR11a-NHS) был синтезирован WuXi АррТес Со. Ltd. (Ekici и др., 2004, J. Med. Chem. 47, 1889-1892; Reisfeld и др., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 7, издание 6, 2011, 665-673).
2,3-бис(тетрадецилокси)пропан-1-амин синтезировали в соответствии с Kokotos и др. Chemistry-A European Journal, 2000, том 6, #22, 4211-4217. Аналогичным способом получали бис(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)амин из олеил метансульфоната и бис(3-гидроксипропил)амина (смотри MaGee и др., J. Journal of Organic Chemistry, 2000, том 65, #24, 8367-8371).
2
6
Культура клеток: М21 клетки меланомы человека, полученные от Cell Culture Strain Collection, Merck KGaA, Darmstadt, Германия, поддерживали при температуре 37°С с 5% СО в DMEM при использовании среды с высоким содержанием глюкозы (Life Technologies, Carlsbad, СА) с добавкой 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки регулярно пассировали и пересаживали в планшеты для культуры клеток на 6 ячеек в течение 16 часов перед проведением эксперимента при плотности 0,3×10 клеток в 2 мл среды. М21 клетки инкубировали с липосомами в Opti-МЕМ свободной от сыворотки культуральной среде в течение 1 часа при 37°С и потом собирали при использовании буфера для диссоциации клеток (Life Technologies, Carlsbad, СА) после однократного промывания с помощью Opti-MEM. Сочетанную локализацию NBD-DOPE определяли при использовании Guava easyCyte 8НТ (EMD Millipore Corp., Billerica, MA).
Статистический анализ: Статистические анализы осуществляли при использовании критерия Стьюдента. Отличия в средних значениях считали статистически значимыми при значении р<0,01.
Пример 1: Синтез (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-глутаминовая кислота-α-трет-бутилэстер-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламида
2
3
2
3
1
15 г Fmoc-Glu(OSu)OtBu ((2S)-Nα-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-глутаминовая кислота α-mpem-бутилэстер γ-N-гидроксисукцинимидный эстер) растворяли в дихлорметане при комнатной температуре. После прибавления 15,3 г 2,3-бис(тетрадецилокси)пропан-1-амина смесь перемешивали в течение 17 часов и выпаривали до осушения. Остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана и очищали с помощью колоночной хроматографии при использовании SiO в качестве твердой фазы и смеси метил трет. -бутиловый этер / гексан / 7:3 в качестве растворителя. После выпаривания фракций продукта получали 25,5 г (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-глутаминовая кислота-α-трет-бутилэстер-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламида в виде бесцветного твердого вещества. Н-ЯМР в CDCl (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 7,76 (d, 2Н, Fmoc), 7,61 (d, 2Н, Fmoc), 7,25-7,43 (m, 4Н, Fmoc), 6,13 (bs, NH, 1H), 5,60 (bs, NH, 1H), 4,39, 4,18-4,25 (d и m, 4H), 3,21-3,62 (m, 9H), 1,97-2,23 (m, 4 H), 1,51-1,60 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,25 (m, 44H, CH), 0,84-0,91 (m, 6H, 2×алкил-СН).
Пример 2: Синтез (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-глутаминовая кислота-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламида
2
4
В колбе на 100 мл растворяли 4,6 г (5,1 ммоля) (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-глутаминовая кислота-α-трет-бутилэстер-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламида в 25 мл дихлорметана и обрабатывали с помощью 25 мл трифторуксусной кислоты. Через 1 час группа эстера полностью отщеплялась, и раствор выливали в 50 мл холодной воды. Органический слой экстрагировали, промывали водой до получения нейтрального значения рН и высушивали над NaSO. Органический слой отфильтровывали и выпаривали растворитель до получения 4,2 г желаемого продукта (5,0 ммоля, выход 98%, ТСХ: MtBE/гексан 7:3; Rf=0,43).
Пример 3: Синтез (2S)-глутаминовая кислота-γ-(2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)амида
5 г (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)глутаминовая кислота-α-трет-бутилэстер-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламид прибавляли к 85 мл N,N-диметилформамида. К смеси прибавляли 2,6 мл пиперидина. Смесь перемешивали в течение трех часов при комнатной температуре и потом выпаривали до осушения в вакууме с получением 5,2 г (2S)-глутаминовая кислота-γ-(2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)амида в виде бесцветного твердого вещества, которое можно использовать для получения липидных везикул или для их предварительной дериватизации при использовании активного агента или группы спейсера.
Пример 4: Синтез (R)-2-амино-N1-(2-(4-метоксибензамидо)этил)-N4,N4-бис(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)сукцинамида
(а) Синтез N-(2-аминоэтил)-4-метоксибензамида
1
3
2
3
2
2
3,0 г 4-метоксибензоил хлорида прибавляли к 30 мл 1,2-диаминоэтана в дихлорметане при -78°С и после этого оставляли для нагревания до 23°С. Обработка при использовании водного раствора кислота-основание и выпаривание до осушения в вакууме обеспечивало получение 1,65 г N-(2-аминоэтил)-4-метоксибензамида в виде светло-желтого масла. Н-ЯМР в CDCl (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 8,53 (t, 1Н, NH), 7,91 (d, 2Н, бенз), 6,99 (d, 2Н, бенз), 4,75 (bs, 2Н, NH), 3,81 (s, 3Н, СН), 3,39, (dd, 2Н, СН), 2,82 (t, 2Н, СН).
(b) Синтез (R)-трет-бутил 3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноата
1
3
2
2
2
2
3
3,0 г 2 N-(2-аминоэтил)-4-метоксибензамида (полученный на этапе (а)) и 1,70 мл N-метилморфолина в ДМФ (0°С) прибавляли к раствору 6,35 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 1,70 мл N-метилморфолина и 2,00 мл изобутилхлорформиата в этилацетате (-12°С) и перемешивали в течение 3 часов, при этом позволяли нагреваться до 23°С. Разводили полученную суспензию с помощью этилацетата, после чего осуществления обработку водным раствором кислоты-основания и выпаривание до осушения в вакууме, в результате чего получали 9,55 г (R)-трет-бутил 3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноата. Сырьевой материал суспендировали в изопропиловом этере в течение 23 часов, потом отфильтровывали и высушивали до получения 4,47 г (R)-трет-бутил 3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноата в виде белых кристаллов. Н-ЯМР в CDCl (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 8,28 (t, 1Н, NH), 8,07 (t, 1Н, NH), 7,89 (d, 2Н, Fmoc), 7,81 (d, 2Н, бенз), 7,71-7,60 (m, 2Н, Fmoc и 1Н, NH), 7,46-7,27 (m, 4Н, Fmoc), 6,96 (d, 2Н, бенз), 4,35-4,20 (m, 3Н, Fmoc, и 1Н СН), 3,78 (s, 3Н, СН), 3,40-3,20, (m, 4Н, 2×СН), 2,69 (dd, 1Н, СН), 2,46 (dd, 1Н, СН), 1,37 (s, 9Н, 3×СН).
(с) Синтез ацетата натрия (R)-3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноевой кислоты
3
3
3
3
2
2
2
1
К 3,0 г (R)-трет-бутил 3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноата (полученный на этапе (b)) в дихлорметане прибавляли 30,0 мл трифторуксусной кислоты при 23°С. После завершения реакции прибавляли водн. раствор NaHCO до получения белого осадка, который промывали с помощью дихлорметана и высушивали с получением 2,55 г ацетата натрия (R)-3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноевой кислоты в виде белого порошка. Н-ЯМРв SO(CD)/CDOD, 1:1, (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 7,85-7,79 (m, 2Н, Fmoc и 2Н, бенз), 7,68 (d, 2Н, Fmoc), 7,45-7,29 (m, 4Н, Fmoc), 6,93 (d, 2Н, бенз), 4,51-4,17 (m, 3Н, Fmoc и 1Н, СН), 3,78 (s, 3Н, СН), 3,47-3,34, (m, 4Н, 2×СН), 2,82 (dd, 1Н, СН), 2,63 (dd, 1Н, СН).
(d) Синтез карбамата (9Н-флуорен-9-ил)метил (R,Z)-1-(4-метоксифенил)-10-(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)-1,6,9-триоксо-14-окса-2,5,10-триазадотриаконт-23-ен-7-ила
1
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
0,48 г ацетата натрия (R)-3-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-4-(2-(4-метоксибензамидо)этиламино)-4-оксобутаноевой кислоты (полученный на этапе (с)) в диметилформамиде охлаждали до 10°С и потом последовательно прибавляли 0,46 г бис(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)амина, 0,37 г COMU и 0,20 г DIPEA. После перемешивания при температуре 23°С в течение 20 часов раствор фильтровали через фильтр Alox и промывали его с помощью небольшого количества диметилформамида. Фильтрат разводили с помощью этилацетата, промывали водой, и выпаривание до осушения в вакууме обеспечивало получение 1,12 г оранжевого масла, которое очищали с помощью колоночной хроматографии с получением 0,41 г (9Н-флуорен-9-ил)метил (R,Z)-1-(4-метоксифенил)-10-(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)-1,6,9-триоксо-14-окса-2,5,10-триазадотриаконт-23-ен-7-ил-карбамата. Н-ЯМР в CDCl (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 7,86 (d, 2Н, бенз), 7,69 (d, 2Н, Fmoc), 7,55 (d, 2Н, Fmoc), 7,42-7,23 (m, 4Н, Fmoc и 1Н, NH), 6,88 (d, 2Н, бенз и 1Н, NH), 6,12 (bd, 1Н, NH), 5,41-5,26 (m, 4Н, 4×СН), 4,60-4,33 (m, 3Н, Fmoc), 4,17 (t, 1Н, СН), 3,82 (s, 3Н, СН), 3,62-3,23, (m, 16Н, 8×СН и 1Н, СН), 2,73 (dd, 1Н, СН), 2,05-1,95 (m, 8Н, 4×СН), 1,85-1,65 (m, 4Н, 2×СН), 1,57-1,45 (m, 4Н, 2×СН), 1,24 (bs, 44Н, 22×СН), 0,88 (t, 6Н, 2×СН).
(е) Синтез (R)-2-амино-N1-(2-(4-метоксибензамидо)этил)-N4,N4-бис(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)сукцинамида
1
+
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
К 2,12 г (9Н-флуорен-9-ил)метил (R,Z)-1-(4-метоксифенил)-10-(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)-1,6,9-триоксо-14-окса-2,5,10-триазадотриаконт-23-ен-7-ил-карбамата (полученный на этапе (d)) в дихлорэтане прибавляли 0,75 г диэтиламина, перемешивали в течение 26 часов, после этого высушивали до осушения в вакууме с получением 1,90 г сырьевого материала, который очищали путем адсорбции на 20 г Dowex Monosphere и последующей десорбции при использовании аммония в этаноле с получением 1,09 г (R)-2-амино-N1-(2-(4-метоксибензамидо)этил)-N4,N4-бис(3-((Z)-октадец-9-енилокси)пропил)сукцинамида. Н-ЯМР в CDCl (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 7,88 (d, 2Н, бенз и 1Н, NH), 7,64 (t, 1Н, NH), 6,89 (d, 2Н, бенз), 5,42-5,26 (m, 4Н, 4×СН), 3,82 (s, 3Н, СН), 3,65-3,49, (m, 4Н, 2×СН), 3,42-3,28 (m, 12Н, 6×СН и 1Н, СН), 2,99 (dd, 1Н, СН), 2,71 (dd, 1Н, СН), 2,10-1,92 (m, 8Н, 4×СН и 2Н, NH), 1,85-1,67 (m, 4Н, 2×СН), 1,60-1,47 (m, 4Н, 2×СН), 1,28 (bs, 44Н, 22×СН), 0,90 (t, 6Н, 2×СН). MS: 947,9 [M+Na].
2
Пример 5: Синтез N,N,N-диметиламинометилен-10-формил-фолиевая кислота-α-трет.-бутиловый эстер-γ-2,3 бис(тетрадецилокси) пропиламида
2
2
1
2
3
2
2
3
3
2
2
3
3
2
3
2,2 г N,N,N-диметиламинометилен-10-формил-птероевой кислоты прибавляли к 46 мл N,N-диметилформамида. После прибавления 3,2 г гексафтор фосфата 0-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония смесь перемешивали в течение 20 минут при комнатной температуре. Потом по каплям прибавляли смесь 5,0 г (2S)-глутаминовая кислота-γ-(2,3-бис (тетрадецилокси)пропил)амида и 50 мл N,N-диметилформамида. После перемешивания при комнатной температуре в течение 17 часов твердые вещества удаляли путем фильтрования и фильтрат выпаривали до осушения в вакууме при 40°С. Остаток растворяли в 100 мл дихлорметана. Раствор дихлорметана промывали с помощью 25 мл водного раствора лимонной кислоты, 25 мл водного 5% раствора гидрокарбоната натрия и 25 мл воды. Каждую из водных фаз экстрагировали при использовании дихлорметана. Объединенные фазы дихлорметана высушивали над сульфатом магния, выпаривали до осушения, что обеспечивало получение желтой пены, которую растворяли в смеси дихлорметан / метанол / 95:5 и перемешивали в течение 15 минут при температуре 40°С. Твердые вещества удаляли путем фильтрования и фильтрат очищали с помощью колоночной хроматографии при использовании SiO в качестве твердой фазы и смеси дихлорметан / метанол / 95:5 в качестве растворителя. После выпаривания фракций продукта получали 2,7 г желтой пены, которую снова очищали с помощью колоночной хроматографии, как описывается выше, что обеспечивало получение 2,2 г N,N,N-диметиламинометилен-10-формил-фолиевая кислота-α-трет. бутиловый эстер-α-(2,3бис(тетрадецилокси)пропил)амида в виде светло-желтой пены. Н-ЯМР в CDCl (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 10,00 (bs, 1Н, N3-H), 8,96 (s, 1Н, С7-Н), 8,76, 8,72 (2s, 2Н, CHN, СНО), 7,88 (d, 2Н, С2'-Н, С6'-Н), 7,73 (d, 1Н, NH(Glu)), 7,35 (d, 2Н, С3'-Н, С5'-Н),6,26 (d, 1Н, C?-NH), 5,32 (s, 2Н, С6-Н), 4,53 (m, 1Н, CH-Glu), 3,30-3,56 (m, 9Н, m, 4СН, СН-О-алкил), 3,22 (s, 3Н, N-CH), 3,15 (s, 3Н, N-СН), 2,03-2,40 (m, 4Н, 2 CH-Glu), 1,54 (m, s, 4Н, 2СН), 1,46 (s, 9Н, ОС(СН)), 1,24 (s, 44Н, 22 СН), 0,87 (m, 6Н, 2× алкил-СН).
Пример 6: Синтез фолиевая кислота-γ-(2,3 бис(тетрадецилокси)пропил)амида
2
1
6
2
2
2
2
2
2
3
2,1 г N,N,N-диметиламинометилен-10-формил-γ-фолиевая кислота-α-трет. бутиловый эстер-γ-2,3 бис(тетрадецилокси)пропиламида растворяли в 105 мл дихлорметана. После прибавления 105 мл трифторуксусной кислоты смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре и потом выпаривали до осушения при 40°С с получением 3,4 г желтой пены. Полученный продукт растворяли в 105 мл тетрагидрофурана и прибавляли по каплям при перемешивании 105 мл 1М водного раствора гидроксида натрия. Смесь нагревали до 50°С в течение 2,5 час. После охлаждения до комнатной температуры органический слой отделяли и выпаривали до осушения. К остатку прибавляли 105 мл дихлорметана и 105 мл 1 М раствора водной хлористоводородной кислоты. Смесь перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре и отсасывали осажденный продукт, промывали его с помощью 500 мл воды и потом высушивали при 40°С в вакууме с получением 1,76 г фолиевая кислота-γ-(2,3 бис(тетрадецилокси)пропил)амида в виде желтого твердого вещества. Н ЯМР в ДМСО-d (TMS в качестве внутреннего стандарта), химический сдвиг в част. на млн: 11,59 (bs, 1Н, N3-H), 8,64 (s, 1Н, С7-Н), 8,17 (d, 1Н, NH), 7,81 (t, 1Н, NH), 7,66 (d, 2Н, С2'-Н, С6 '-Н),7,01 (bs, NH, 1Н), 6,92 (t, 2Н, NH), 6,64 (d, 2Н, С3'-Н, С5'-Н), 4,49 (d, 2Н, С6-Н), 4,29 (m, 1Н, СН-Glu), 3,26-3,46 (m, 5H,2CH, СН-O-алкил), 3,08 (s, 2H, CH), 2,17-2,2,5 (m, 2H, CH), 1,84-2,11 (2m, 2H, CH), 1,42, 1,23 (m, s, 44H, 22 CH), 0,85 (m, 6H, 2× алкил-СН).
Пример 7: Синтез (2S,47S)-47-[2-N-(диметиламино)метилен]10-формилптероиламино-2-[3-[[2,3-бис(тетрадецилокси)пропил]амино]-3-оксопропил]-4,44-диоксо-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-додекаокса-3,43-диазаоктатетраконтан-1,48-диоевой кислоты
(а) Синтез Fmoc-Glu(ОМА)-дифенилметиловой смолы
В SPPS реакторе на 100 мл дважды промывали 3,85 г дифенилдиазометановой смолы (3,3 ммоля) с помощью 30 мл DCM и обрабатывали при использовании раствора 4,2 г (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-глутаминовая кислота-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламида (смотри Пример 2, 1,5 экв., 5,0 ммоля) в 30 мл DCM в течение ночи. Раствор отфильтровывали и смолу четыре раза промывали с помощью DCM. Для разрушения остаточного непрореагировавшего дифенилдиазометана смолу обрабатывали с помощью 125 мкл уксусной кислоты (0,5 экв., 2,2 ммоля) в 30 мл DCM в течение 15 минут и после этого трижды промывали поочередно с помощью 30 мл диметилформамида и изопропанола. Смолу дважды промывали с помощью диизопропилового этера и высушивали в течение ночи в вакууме. Получали 6,7 г желаемого продукта (>100% от теоретического, теоретический выход 6,5 г). Загрузку смолы определяли как такую, которая равна 0,49 ммоля/г, путем УФ измерения Fmoc расщепления продукта при длине волны 304 нм (максимальная теоретическая загрузка составляет 0,51 ммоля/г).
12
(b) Синтез смолы на основе H-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-дифенилметила
12
Смолу на основе Н-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметила получали путем традиционного твердофазного синтеза при использовании следующей последовательности реакций:
(1) отщепление Fmoc группы смолы на основе Fmoc-Glu(DMA)-дифенилметила с помощью пиперидина в ДМФ,
12
(2) конденсация с Fmoc-NH-ПЭГ-PA-COOH при использовании HBTU в ДМФ и ДИПЭА,
12
(3) отщепление Fmoc группы смолы на основе Fmoc-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметила с помощью пиперидина в ДМФ,
(4) конденсация с Fmoc-Glu-OtBu при использовании HBTU в ДМФ и ДИПЭА и, в завершение,
12
(5) отщепление Fmoc группы смолы на основе Fmoc-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметила с помощью пиперидина в ДМФ.
12
12
12
(c) Синтез смолы на основе [2-N-(диметиламино)метилен]-10-формилптероил-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенил метила: Смолу на основе [2-N-(диметиламино)метилен]-10-формилптероил-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметила получали путем традиционного твердофазного синтеза путем реакции смолы на основе Н-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметила в ДМФ с [2-N-(диметиламино)метилен]-10-формилптероевой кислотой, HATU и ДИПЭА.
(d) Синтез (2S,47S)-47-[2-N-(диметиламино)метилен]-10-формилптероиламино-2-[3-[[2,3-бис(тетрадецилокси)пропил]амино]-3-оксопропил]-4,44-диксо-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-додекаокса-3,43-диазаоктатетраконтан-1,48-диоевой кислоты:
12
Wподсч⋅
W
-
4,5 г смолы на основе [2-N-(диметиламино)метилен]-10-формилптероил-Glu-OtBu-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметила промывали с помощью 45 мл дихлорметана, отфильтровывали и вновь суспендировали в 45 мл дихлорметана. Потом прибавляли 41,4 мл трифторуксусной кислоты, а после этого 2,25 мл триизопропилсилана. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и потом фильтровали. Смолу трижды промывали каждый раз с помощью 45 мл дихлорметана. Объединенные фильтраты выпаривали в вакууме с получением 5,75 г масла янтарного цвета. ВЭЖХ: площадь 90,7%, ESI-MS: моноизотопическое М=1718,1, M [М-Н]=1718,0.
Пример 8: Синтез (2S,47S)-47-птероиламино-2-[3-[[2,3-6ис(тетрадецилокси)пропил]амино]-3-оксопропил]-4,44-диоксо-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-додекаокса-3,43-диазаоктатетраконтан-1,48-диоевой кислоты
Wподсч.
W
-
4,6 г (2S,47S)-47-[2-N-(диметиламино)метилен]-10-формилптероиламино-2-[3-[[2,3-бис(тетрадецилокси)пропил]амино]-3-оксопропил]-4,44-диоксо-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-додекаокса-3,43-диазаоктатетраконтан-1,48-диоевой кислоты перемешивали с 460 мл 1N NaOH при 50°С в течение 2 часов. Значение рН реакционной смеси доводили до 12,5 путем прибавления 59,2 г 32% ic NaOH. Коричневый раствор обрабатывали с помощью 0,46 г активированного угля в течение 15 минут при 50°С, фильтровали горячим и доводили значение рН до 1 путем прибавления 3,2 г 37% ic HCl. Полученный преципитат собирали путем фильтрования, промывали водой и высушивали при комнатной температуре в вакууме с получением 1,2 г зелено-желтого твердого вещества. ВЭЖХ: 89,9% площади, ESI-MS: моноизотопический М=1635,0, M [М-Н]=1634,1.
Пример 9: Синтез RGD липидного пентапептида цикло[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arq-Gly-]:
(а) Синтез Fmoc-hGlu(OBzl)-OH
3
f
3
Wподсч.
W
+
Коммерчески доступная гомоглутаминовая кислота (H-hGlu-OH) имеет защиту боковых цепей как δ-бензиловый эстер в соответствии с опубликованной прописью (Benoiton L, Can. J. Сhеm., 40, 570 (1962)) (выход: 19,8 г, 26% от теоретического, ТЖХ (CHCl/MeOH/32% уксусная кислота 5:3:1) R=0,62). Без дополнительной очистки H-hGlu(OBzl)-OH (19,7 г, 77,6 ммоля) растворяли в смеси диоксан/вода (1:2, 300 мл) и Fmoc защиту проводили путем добавления NaHCO (12,8 г, 155 моля) и Fmoc-OSu (26,2 г, 77,6 моля). После завершения процедуры трижды экстрагировали реакционную смесь при использовании диизопропилового этера. Продукт, содержащий водный слой, доводили до значения рН 2 при использовании HCl, и продукт трижды экстрагировали с помощью этилацетата. Объединенные органические слои промывали с помощью до получения нейтрального значения рН. Этилацетат выпаривали и остаточную воду удаляли в качестве азеотропа с помощью ацетонитрила. Таким образом, продукт получали в виде сухой пены: 34,9 г, 73,7 моля, 95% от теоретического, ESI-MS: моноизтопический М=473,2, M[М+Н]=474,1.
(b) Синтез H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH
Твердофазный пептидный синтез осуществляли в соответствии со стратегией Fmoc/tBu (Atherton Е., и др., J. Сhеm. Soc, Chem. Comm., 539 (1978)), H-Gly-2-CITrt (46 г, 34,5 моля) использовали в качестве основы смолы, слияние осуществляли при использовании Fmoc-Xaa-OH/DIC/HOBt (2 экв.: 4 экв.: 3 экв.) в течение ночи, удаление Fmoc защиты достигали при использовании 20% пиперидина в ДМФ спустя 5 и 10 минут. Этапы поочередного трехкратного промывания с помощью смеси диметилформамид/изопропанол использовали после каждого этапа слияния и снятия защиты, соответственно. Аминокислотные производные, которые использовали в их хронологическом порядке, представляли собой Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-D-Val-OH, Fmoc-homoGlu(OBzl)-OH и Fmoc-Asp(OtBu)-OH. Использование Fmoc-SPPS обеспечивало получение 73,4 г смолы на основе линейного пептида (прирост веса смолы 27,4 г, 87% от теоретического, теоретический = 31,5 г).
Wподсч.
W
+
Линейный пентапептид с защищенной боковой цепью выщепляли из смолы (72,0 г) с помощью смеси 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол/дихлорметан 1:4 (700 мл) в трех повторностях. Растворители объединенных фильтратов удаляли под сниженным давлением и полученное масло перемешивали в холодном метил-m-бутиловом этере (1 л) с получением грязно-белого преципитата, который отфильтровывали, трижды промывали с помощью метил m-бутилового этера и высушивали в вакууме: 23,6 г, 23,9 моля, 70% от теоретического, принимая во внимание загрузку базовой смолы, >40% площади на ВЭЖХ, время удержания 14,1 минут (условия проведения ВЭЖХ: колонка = Halo Peptide ES-C18, 4,6×150 мм, 2,7 мкм, градиент: линейный градиент ацетонитрила от 25% до 90% В за 30 мин, буфер А=0,1% ТФУ и 2% ацетонитрил в воде, буфер В=0,1% ТФУ в ацетонитриле, длина волны = 210 нм), ESI-MS: моноизтопическийи М=986,5, M [М+Н]=987,6.
(с) Синтез цикло[-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-]
Wподсч.
w
+
Линейный пентапептид с защищенной боковой цепью H-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-OH (23,6 г, 23,9 моля) и реагент для in-situ активации РуВОР (12,4 г, 23,9 ммоля) растворяли в 10 л диметилформамида (ДМФ) и прибавляли по каплям в течение 3 часов к раствору дополнительный РуВОР (24,9, г, 47,8 моля) и основание Хюнига (16,4 мл, 95,6 моля) в 5 л ДМФ. Полученный раствор перемешивали в течение ночи. ДМФ удаляли в вакууме, а полученное масло растворяли при кипении в 1,8 л этанола и кристаллизовали путем прибавления 3,2 л воды при -18°С. Преципитат отфильтровывали и промывали водой и этером. Кроме того, его также дополнительно очищали с помощью колоночной хроматографии с силикагелем (150 г силикагеля 60, элюент: дихлорметан/метанол 9:1, получая при этом 3,6 г циклического пентапептида с чистотой >91% площади на ВЭЖХ (условия проведения ВЭЖХ: колонка = Halo Peptide ES-C18, 4,6×150 мм, 2,7 мкм, градиент: линейный градиент ацетонитрила от 25% до 90% В за 30 мин, буфер А=0,1% ТФУ и 2% ацетонитрил в воде, буфер В=0,1% ТФУ в ацетонитриле, длина волны = 210 нм), 3,7 моля, 15% от теоретического, время удержания 15,8 мин, ESI-MS: моноизтопическийи M = 968,4, M [М+Н]=969,5.
(d) Синтез цикло[-Asp(OtBu)-hGlu-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-]
Бензиловый эстер специфически выщепляли с помощью гидролиза. Для этого 3,6 г (3,7 моля) цикло[-Asp(OtBu)-hGlu(OBzl)-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-] растворяли в 20 мл ДМФ и разводили с помощью 2 л метанола. После прибавления 5 г 5% палладия на активированной угле к этому раствору смесь подвергали гидрогенизации. После завершения реакции катализатор отфильтровывали и концентрировали раствор при сниженном давлении. Продукт осаждали в метил-m-бутиловом этере с получением 3,0 г желаемого продукта: 3,4 моля, выход 93% от теоретического, чистота: 75% площади на ВЭЖХ (условия проведения ВЭЖХ: колонка = Halo Peptide ES-C18, 4,6×150 мм, 2,7 мкм, градиент: линейный градиент ацетонитрила от 25% до 90% В за 30 мин, буфер А=0,1% ТФУ и 2% ацетонитрил в воде, буфер В=0,1% ТФУ в ацетонитриле, длина волны=210 нм), время удержания 13,8 мин.
(e) Синтез цикло[-Asp-hGlu(DMA)-D-Val-Arg-Gly-]
4
2
Wподсч.
W
+
1,5 г (1,7 моля) циклопентапептида цикло[-Asp(OtBu)-hGlu-D-Val-Arg(Pbf)-Gly-] конъюгировали с 2,3-димиристил-1-амино-sn-глицеролом (DMA; 1,0, г, 2,0 моля) в 100 мл ДМФ при использовании РуВОР/ДИПЭА активации (0,9 г, 1,7 ммоля/0,6 мл, 3,4 моля). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Потом прибавляли 200 мл дихлорметана и органическую фазу трижды экстрагировали при использовании 50 мл 2% KHSO и трижды при использовании воды. Органический слой выпаривали под сниженным давлением и оставшуюся воду удаляли как азеотроп с помощью ацетонитрила. Полученную пену обрабатывали с помощью заключительной смеси для расщепления ТФУ/НО/три-изопропилсилан/дитиоэритритол (92,5:2,5:2,5:2,5) в течение 1,5 часа и после этого раствор по каплям прибавляли к холодному диизопропиловому этеру (5°С) для того, чтобы осадить желаемый продукт. Остаток потом отделяли фильтрованием, дважды промывали диизопропиловым этером и, в дополнение к этому, высушивали в вакууме, что обеспечивало получение 0,5 г указанного в заглавии соединения: 0,5 моля, 30% от теоретического, >93,0% площади на ВЭЖХ (условия ВЭЖХ: колонка = Zorbax SB-C3, 4,6×250 мм, 5 мкм, градиент: линейный градиент ацетонитрила от 30% до 100% В за 25 мин, буфер А=0,1% ТФУ и 2% ацетонитрила в воде, буфер В=0,1% ТФУ в ацетонитриле, длина волны = 210 нм), время удержания 22,0 мин, ESI-MS: моноизотопический М = 1035,8, M [М+Н]=1037,1.
Пример 10: Получение pVision-RFP-C вектора, содержащего липосомы, декорированные фолатом
478,2 мг РОРС, 58,8 мг холестерола, 13,5 мг фолат-липида (смотри Пример 8) и 2 мкг меченного 7-нитробензофураном DOPE растворяли в 750 мкл этанола (96%) при 60°С и вводили в 4,25 мл раствора на основе PBS рН 7,4, содержащего RFP плазмиду (1,27 мг RFP-плазмиды/мл). Молярное соотношение используемых липидов составляло 77,99:18,83:1,02:0,27. После пятикратной экструзии через 200 нм поликарбонатную мембрану и пятикратной экструзии через 100 нм поликарбонатную мембрану и диафильтрации липосомы имели средний размер 161 нм со значением PDI 0,13. Молярное соотношение POPC:Chol составляло 77,99:15,76, содержание фолат-липида составляло 502 мкг/мл (целевое значение 770 мкг/мл) в соответствии с ВЭЖХ анализом.
Пример 11: Получение липосом, декорированных анисовым амидом, 470 мг РОРС, 60 мг холестерола и 13,5 мг анисовый амид - липида (смотри Пример 4) растворяли в 750 мкл этанола (96%) при 55°С и вводили в 4,25 мл PBS рН 7,4. Молярное соотношение используемых липидов составляло 77,99:18,83:1,02:0,27. После экструзии через 100 нм поликарбонатную мембрану липосомы имели средний размер 110 нм со значением PDI 0,068. В соответствии с ВЭЖХ анализом содержание анисовый амид - липида составляло 72% от теоретического значения.
Пример 12: Получение декорированных RGD липосом
Смесь DOPC, Chol, NBD-DOPE и RGD-липид, полученный в Примере 9, в молярном соотношении DOPC:Chol:NBD-DOPE:RGD-липид 66:33:0,5:0~5 использовали для получение липосом с помощью способа сухой пленки в HEPES буфере, после чего осуществляли пятикратную экструзию через 200 нм поликарбонатную мембрану и экструзию через 100 нм поликарбонатную мембрану 21 раз при использовании Lipofast устройства для экструзии (Avestin, Inc., Ottawa, Канада). Полученные липосомы хранили при 4°С до применения.
Пример 13: Захват клетками декорированных RGD липосом
Степень захвата клетками декорированных RGD липосом (получены в Примере 6) при использовании М21 клеток оценивали на основе NBD-DOPE сигнала, который определяется с помощью Guava easyCyte 8НТ проточного цитометра и является представленным на Фигуре 1 и в Таблице 1.
v
3
Наблюдали приблизительно 16-кратное повышение захвата клетками для RGD нацеленной липосомы (5% DMA-RGD) по сравнению с ненацеленной липосомой (0% DMA-RGD). Ось X представляет собой молярное соотношение DMA-RGD (%) в липосоме. Ось Y представляет собой NBD-позитивные клетки (%). Фигура 1 иллюстрирует тот факт, что RGD остатки могут узнавать целевые рецепторы (рецепторы интегрина αβ), которые экспрессируются на поверхности М21 клеток (*р<0,01).
Пример 14: Синтез (5S,8S,45S,E)-11-(2-амино-2-оксоэтил)-45-(3-((2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)амино)-3-оксопропил)-5,8-диметил-3,6,9,12,15,43-гексаоксо-1-фенил-2,19,22,25,28,31,34,37,40-нонаоксо-4,7,10,11,16,44-гексаазагексатетракбнт-13-ен-46-оевой кислоты
(a) Синтез Fmoc-Glu(DMA)-дифенилметиловой смолы (смотри Пример 7, 1,1 экв., 3,05 ммоля).
8
8
(b) Синтез RR11a-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметиловой смолы: RR11a-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметиловую смолу получали путем традиционного твердофазного синтеза при использовании следующей последовательности реакций:
(1) отщепление Fmoc группы Fmoc-Glu(DMA)-дифенил метиловой смолы с помощью пиперидина в ДМФ,
8
(2) кондненсация с Fmoc-NH-ПЭГ-РА при использовании РуВОР в ДМФ и ДИПЭА,
8
(3) отщепление Fmoc группы Fmoc-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-дифенилметиловой смолы с помощью пиперидина в ДМФ и, в завершение,
(4) конденсация с RR11a-OH при использовании РуВОР в ДМФ и ДИПЭА.
8
подсч.
W
-
(c) Синтез (5S,8S,45S,Е)-11-(2-амино-2-оксоэтил)-45-(3-((2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)амино)-3-оксопропил)-5,8-диметил-3,6,9,12,15,43-гексаоксо-1-фенил-2,19,22,25,28,31,34,37,40-нонаокса-4,7,10,11,16,44-гексаазагексатетраконт-13-ен-46-оевой кислоты: 7,15 г RR11a-NH-ПЭГ-РА-Glu(DMA)-дифенилметиловой смолы промывали с помощью 50 мл дихлорметана, отфильтровывали, вновь суспендировали в 50 мл дихлорметана и высушивали в вакууме. Потом прибавляли 70 мл 5% ic раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часов и потом отфильтровывали в 100 мл холодного диизопропилового этера. Смолу промывали при использовании смеси дихлорметан/диизопропиловый этер (1/1). Объединенные фильтраты выпаривали в вакууме и лиофилизировали из т-BuOH с получением 4,15 г (92%) желтого твердого вещества. ESI-MS: моноизотопический Mw  = 1481,9, M[M-H]=1480,2.
Пример 15: Синтез (5S,8S,45S,E)-11-(2-амино-2-оксоэтил)-45-(3-((2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)амино)-3-оксопропил)-5,8-диметил-3,6,9,12,15,43-гексаоксо-1-фенил-2,19,22,25,28,31,34,37,40-нонаокса-4,7,10,11,16,44-гексаазагексатетраконт-13-ен-46-оевой кислоты
8
подсч.
W
n
W
+
7,15 г RR11a-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-OH (продукт Примера 14) и 1,50 мл ДИПЭА растворяли в 70 мл дихлорметана. Потом прибавляли 4,32 г МеО-ПЭГ-МН2 и 1,67 г РуВОР и раствор перемешивали в течение ночи. Выпаривали коричневый раствор и остаток дважды очищали с помощью колоночной хроматографии при использовании 300 г силикагеля (Merck 60, 0,040-0,063 мм) при использовании смеси этилацетата, метанола и триэтиламина в соотношении 16:3,1, соответственно, 17:2:1. Фракции, содержащие продукт, соединяли и выпаривали, а полученный вязкий остаток подвергали лиофилизации из т-BuOH с получением 4,5 г (60%) желтоватого твердого вещества. MALDI-MS: моноизотопический Mw = 3476,2, M [M+Na]=3500, M=3363,2, M=3384,5, PDI=1,01
Пример 16: Синтез бензил ((25,5S,14S,Е)-8-(2-амино-2-оксоэтил)-14-карбамоил-5-метил-3,6,9,12,17-пентаоксо-20-(тетрадецилокси)-22-окса-4,7,8,13,18-пентаазагексатриаконт-10-ен-2-ил)карбамата
(a) Синтез Fmoc-Glu(DMA)-Sieber смолы
В реакторе SPPS на 100 мл дважды промывали 5,0 г Sieber смолы (3,1 ммоля) при использовании 50 мл ДМФ, обрабатывали с помощью 20% ic раствора пиперидина в ДМФ в течение 15 минут и промывали трижды поочередно при использовании 50 мл ДМФ и 50 мл iPrOH. Потом получали раствор 3,2 г (2S)-2-(((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)-глутаминовая кислота-γ-2,3-бис(тетрадецилокси)пропиламида (смотри Пример 2, 1,25 экв., 3,8 ммоля) и 2,48 г РуВОР (1,5 экв.) в 50 мл ДМФ и 1,62 мл ДИПЭА (2,5 экв.), обработку осуществляли в течение 2,5 часвов. Раствор отфильтровывали и смолу трижды промывали поочередно с помощью 50 мл ДМФ и 50 мл iPrOH.
(b) Синтез RR11a-Glu(DMA)-Sieber смолы:
RR11a-Glu(DMA)-Sieber смолу получали путем традиционного твердофазного синтеза при использовании следующей последовательности реакций:
(1) отщепление Fmoc группы от Fmoc-Glu(DMA)-Sieber смолы при использовании пиперидина в ДМФ (5,6 г смолы после высушивания в вакууме),
(2) конденсация с RR11a-NHS при использовании ДИПЭА в ДМФ.
(c) Отщепление продукта от смолы
Wподсч.
W
-
2,6 г RR11a-Glu(DMA)-Sieber смолы обрабатывали с помощью 20 мл 5% ic раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане в течение 2 часов. Суспензию отфильтровывали в 100 мл холодного диизопропилового этера. Фильтрат выпаривали в вакууме и лиофилизировали из т-BuOH с получением 660 мг желтоватого твердого вещества. ESI-MS: моноизотопический M = 1056,7, M [М-Н]=1056,0.
Пример 17: Синтез бензил ((2S,5S,42S,E)-8-(2-амино-2-оксоэтил)-42-карбамоил-5-метил-3,6,9,12,40,45-гексаоксо-48-(тетрадецилокси)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-нонаокса-4,7,8,13,41,46-гексаазатетрагексаконт-10-ен-2-ил)карбамата
(a) Синтез Fmoc-Glu(DMA)-Sieber смолы (смотри Пример 16).
2
8
(b) Синтез NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолы
2
8
NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолу получали путем традиционного твердофазного синтеза при использовании следующей последовательности реакций:
(1) отщепление Fmoc группы Fmoc-Glu(DMA)-Sieber смолы с помощью пиперидина в ДМФ,
8
(2) конденсация с Fmoc-NH-ПЭГ-РА при использовании HBTU в ДМФ и, в завершение,
8
(3) отщепление Fmoc группы Fmoc-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолы с помощью пиперидина в ДМФ.
2
8
(c) Синтез NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-амида
2
8
подсч.
W
+
Продукт отщепляли от NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолы при использовании трифторуксусной кислоты в дихлорметане. ESI-MS: моноизотопический Mw  = 1034,8, M [М+Н]=1035,9.
(d) Синтез бензил ((2S,5S,42S,E)-8-(2-амино-2-оксоэтил)-42-карбамоил-5-метил-3,6,9,12,40,45-гексаоксо-48-(тетрадецилокси)-16,19,22,25,28,31,34,37,50-нонаокса-4,7,8,13,41,46-гексаазатетрагексаконт-10-ен-2-ил)карбамата
2
W подсч.
W
W
+
+
В круглодонную колбу на 5 мл, оснащенную механической мешалкой, загружали 42 мг NH-ПЭГ8-РА-Glu(РМА)-амида (40,6 ммоля) в 2 мл дихлорметана. Потом прибавляли 0,01 мл триэтиламина (95 ммоля). Получали светло-желтый раствор через 2-3 минуты перемешивания, после чего прибавляли 23 мг RR11a-NHS (41 ммоля) в течение 3 минут. Этот раствор перемешивали в течение 1 часа и выпаривали под сниженным давлением, что приводило к получению беловатого твердого продукта. Продукт продемонстрировал единственное пятно в ТЖХ. M = 1480,0, M [М+Н]=1482 и M [M+Na]=1504,0.
Пример 18: Синтез бензил ((2S,5S,126S,Е)-8-(2-амино-2-оксоэтил)-126-карбамоил-5-метил-3,6,9,12,124,129-гексаоксо-132-(тетрадецилокси)-16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115,118,121,134-гептатриаконтаокса-4,7,8,13,125,130-гексаазаоктатетраконтагект-10-ен-2-ил)карбамата
(а) Синтез Fmoc-Glu(DMA)-Sieber смолы (смотри Пример 16).
36
(b) Синтез RR11a-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолы
36
RR11a-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолу получали путем традиционного твердофазного синтеза при использовании следующей последовательности реакций:
(1) отщепление Fmoc группы Fmoc-Glu(DMA)-Sieber смолы с помощью пиперидина в ДМФ,
36
(2) конденсация с Fmoc-NH-ПЭГ-РА при использовании РуВОР в ДМФ и ДИПЭА,
36
(3) отщепление Fmoc группы Fmoc-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолы с помощью пиперидина в ДМФ и, в завершение,
(4) конденсация с RR11a-NHS при использовании ДИПЭА в ДМФ.
36
W
подсч.
W
2+
(с) Синтез бензил ((2S,5S,126S,E)-8-(2-амино-2-оксоэтил)-126-карбамоил-5-метил-3,6,9,12,124,129-гексаоксо-132-(тетрадецилокси)-16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91,94,97,100,103,106,109,112,115,118,121,134-гептатриаконтаокса-4,7,8,13,125,130-гексаазаоктатетраконтагект-10-ен-2-ил)карбамата: 7,0 г RR11a-NH-ПЭГ-PA-Glu(DMA)-Sieber смолы обрабатывали с помощью 70 мл 2% ic раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и потом фильтровали в 70 мл холодного диизопропилового этера. Фильтрат выпаривали в вакууме и лиофилизировали из т-BuOH с получением 1,25 г белого твердого вещества. ESI-MS: моноизотопический M=2713,7, M [M+Na+H]=1380,1.
В стеклянную пробирку на 3 мл с завинчивающимся колпачком (тефлоновый герметичный колпачок) вносили указанные выше липиды и быстро перемешивали. Хлороформ выпаривали под струей аргона до тех пор, пока не получали непрозрачную пленку липидов. Потом пробирку помещали в сушильный аппарат под вакуумом на 10 минут. К высушенной пленке прибавляли 1000 мкл DPBS 1Х и содержимое пробирок перемешивали до получения гомогенной молочной суспензии (3-4 мин). Полученный продукт подвергали обработке ультразвуком в баке модели Branson 1510 в течение 5 минут с получением мутной суспензии. Эту суспензию потом подвергали обработке ультразвуком в модели Branson 4С15 при 30% от полной амплитуды в течение 30 секунд (избегая пенообразования) с получением почти полупрозрачной суспензии липосом. Суспензию подвергали экструзии под высоким давлением через 100 нм поликарбонатную мембрану (Avanti No 610005). В завершение, суспензию стерильно фильтровали через 0,22 мкм Millex-GV мембранные фильтры и хранили в стерильной пробирке при 4°С. Гидродинамический диаметр MS-15-0 и 15-4 составлял 101 и 99 мкм (устройство Malvern ZetaSizer), соответственно.
Пример 20: Нацеливание на легумаин декорированных RR11 липосом
Эксперименты по нацеливанию на легумаин осуществляли в соответствии со следующей прописью, которая используется в рецептурах липосом в соответствии с Примером 19:
4
2
День 1 высаживали 3,12×10 4Т1 клеток/см на необработанные кусочки стекла.
2
День 2 прибавляли 100 мкМ CoCl; инкубировали в течение 24 часов.
12
День 3 прибавляли 100 мкл липосом (10 NPs/мл); инкубировали в течение 2 часов; прибавляли 5 мкг/мл Hoechst 33342; инкубировали 20 минут; вынимали и анализировали при использовании флуоресцентного микроскопа.
Среда для культуры клеток: RPMI 1640 1х с L-глутамином с добавкой 10% FBS, 10 мМ Hepes, 0,075% вес./об. бикарбоната натрия и 1 мМ пирувата натрия.
Картинки получали из случайных полей для каждого объекта при использовании 63× объектива, 2×2 камеры, 500 мс для Hoechst, 1000 мс для RhodB и 100 мс для чистого поля и 20-30 изображений укладывали в стопку высотой 0,5 мкм шага фокуса вокруг точки ядра фокуса с использованием анализа изображений. Фигура 2 представляет одно из 20-30 изображений из стопки после анализа, демонстрируя среднюю фокальную точку. Представленные данные явно показывают совместную локализацию RhB-DOPE и клеток и, таким образом, демонстрируют, что липосомы, полученные из RR-11а-8ПЭГ-РА-Glu(ОМА)-амида, являются эффективно нацеленными на клетки по сравнению с ненацеленным контролем.
Пример 21: Синтез нацеленного на антитело (Fc единица) липида, связанного дисульфидным мостиком декапентапептида H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH
(а) Синтез линейного H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH
Твердофазный пептидный синтез осуществляли при использовании твердофазного синтезатора ABI 431А в соответствии с Fmoc/tBu стратегией (Atherton Е., и др., J. Chem. Soc, Chem. Comm., 539 (1978)), H-Thr(tBu)-2-CITrt (0,5 г, 0,25 моля) использовался в качестве основы для смолы. Аминокислотные производные, которые использовали в приведенном хронологическом порядке, представляли собой Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc- Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH и Fmoc-Glu(DMA)-OH. Слияние осуществляли с помощью Fmoc-Хаа-ОН/триметилпиридин/HBTU (4 экв.: 4 экв.: 3,6 экв.), за исключением Fmoc-Glu(DMA)-OH, который сливали при использовании ДИПЭА/РуВОР (4,8 экв.: 7,2 экв.: 4,8 экв.). Удаление Fmoc защиты достигали с помощью 20% пиперидина в ДМФ. Поочередные этапы трехкратного промывания при использовании диметилформамида осуществляли после каждого этапа слияния и снятия защиты, соответственно. Выходы Fmoc-SPPS составляли 1,4 г смолы на основе линейного пептида. Линейный декапентапептид отщепляли от смолы при использовании смеси трифторуксусная кислота/триизопропилсилан/ дитиоэритритол/вода (92,5: 2,5: 2,5: 2,5, 14 мл) в течение 2,5 часов. После фильтрования фильтрат разводили с помощью 140 мл диизопропилового этера. Коричневатое твердое вещество отфильтровывали и высушивали в вакууме: получали 485 мг, 37% от теоретического, ESI-MS:
W
подсч.
W
2+
моноизотопический M = 2198,2, M [М+2Н]=1099,6.
(b) Синтез связанного дисульфидной связью H-Glu(DMA)-Ala-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-OH
W
подсч.
W
2+
10 мг коричневатого твердого вещества, полученного в Пример 21 а), растворяли в 10 мл метанола и доводили до значения рН 8 путем добавления ДИПЭА. Раствор перемешивали в атмосфере кислорода в течение ночи. Выпаривание раствора обеспечивало получение заключительного продукта в виде коричневатого твердого вещества с количественным выходом. ESI-MS: моноизотопический M = 2196,2, M [М+2Н]=1098,6.
Пример 22: Получение декорированных RR11 липосом без экструзии
Декорированные RR11 липосомы (MS-32-1 - MS-32-10) компоновали из следующих липидных растворов.
В стеклянную пробирку на 3 мл с завинчивающимся колпачком (тефлоновый герметичный колпачок) вносили указанные выше липиды и перемешивали в течение короткого периода времени. Хлороформ выпаривали под струей аргона до тех пор, пока не получали непрозрачную пленку липидов. Потом пробирку помещали в сушильный аппарат под вакуумом на 10 минут. К высушенной пленке прибавляли 1000 мкл DPBS 1Х и содержимое пробирок перемешивали до получения гомогенной молочной суспензии (10 мин). После этого осуществляли обработку ультразвуком в баке модели Branson 1510 в течение 5 минут с получением мутной суспензии. Эта суспензия потом подвергалась обработке ультразвуком в модели Branson 4С15 при 40% от полной амплитуды в течение 30 секунд (избегая пенообразования) с получением почти полупрозрачной суспензии липосом. В завершение, суспензию стерильно фильтровали через 0,22 мкм Millex-GV мембранные фильтры и хранили в стерильной пробирке при 4°С. Z avg. гидродинамический диаметр и PDI определяли при использовании устройства Malvern ZetaSizer.