ИЗМЕРЕНИЯ БАРЬЕРНОЙ ФУНКЦИИ
BARRIER FUNCTION MEASUREMENTS

Предшествующий уровень техники
Эпителиальная ткань составляет одну из четырех основных типов тканей (эпителиальная ткань, соединительная ткань, мышечная ткань и нервная ткань). Эпителиальные клетки встречаются у животных (как у позвоночных, так и у беспозвоночных), а также у растений, и они играют жизненно важную роль в физиологии организма.
Эпителиальные клетки выстилают полости и просветы органов тела как снаружи, так и внутри них. Эндотелий (внутренняя оболочка кровеносных сосудов, сердца и лимфатических сосудов) и мезотелий (образующий стенки перикарда, плевры и брюшины) представляют собой специализированную форму эпителия.
Эпителиальные клетки образуют эпителиальные барьеры, которые защищают внутренние органы тела. Клетки и барьеры, которые они образуют, разделяют внутренние и внешние полости тела и обеспечивают средства для избирательного поглощения и выведения определенных веществ. Эпителиальные барьеры и эпителиальные клетки по этой причине играют важную роль в разнообразных биологических процессах, таких как поглощение химических и питательных веществ, трансцеллюлярный транспорт, восприятие сигналов, выведение токсинов и защита от микробной инфекции. Все эпителии обычно отделены от подлежащих тканей внеклеточной волокнистой базальной мембраной.
Например, эпителии образуют структуру легкого, включая альвеолы или альвеолярные мешочки, и выстилают большинство органов, как, например, желудок и тонкий кишечник, почки и поджелудочную железу. Они также выстилают пищевод и встречаются в протоках и железах, как, например, в желчном протоке и слюнных железах. Они формируют вкусовые сосочки, выстилают нос, уши, глаза и кожу.
Эндотелий представляет собой тонкий слой эндотелиальных клеток, который выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов и лимфатических сосудов, образуя пограничный слой между циркулирующей в просвете кровью или лимфой и остальной стенкой сосуда, например, гематоэнцефалический барьер.
Мезотелиальные клетки образуют монослой специализированных клеток наподобие клеток плоского эпителия, которые выстилают серозные полости тела и внутренние органы. Основная функция этого слоя, называемого мезотелием, заключается в обеспечении гладкой, неадгезивной и защитной поверхности. Однако мезотелиальные клетки имеют и другие важные функции, связанные с транспортировкой жидкости и клеток через серозные полости, презентацией антигена, воспалением и восстановлением тканей, коагуляцией и фибринолизом, и адгезией опухолевых клеток.
Эпителиальные клетки характеризуются рядом отличительных характеристик. Эпителиальные клетки вместе связаны в пласты (слои) ткани, которые называют эпителием. Совместно такие слои удерживаются благодаря нескольким типам взаимодействий, включая плотные контакты, адгезионные соединения, десмосомы и щелевые соединения. Плотные контакты выступают в роли «разграничителя» между апикальными (верхними) и базальными (нижними) областями эпителиальной клетки в сочетании с ролью «поляризатора» между двумя областями. Эпителий поддерживается на базальной стороне при помощи базальной мембраны, называемой базальной пластинкой.
Как уже упоминалось, одной отличительной особенностью является образование плотных контактов, которые разделяют плазматическую мембрану поляризованной эпителиальной клетки на апикальную и базолатеральную часть. Указанная апикальная часть клетки представляет собой экспонируемую или верхнюю часть клетки при ориентации в клеточном монослое, выращенном in vitro, например, на планшете для тканевых культур. Когда речь идет о пласте (слое) эпителиальных клеток в теле, апикальная поверхность будет экспонирована в направлении просвета, который выстилает эпителий. Базолатеральная поверхность клетки состоит из нижней, или базальной, части и боковых, или латеральных, частей. Когда речь идет о клетке, выращенной на планшете для тканевых культур, базолатеральная мембрана клетки представляет собой часть клетки, вступающую в контакт с планшетом для тканевых культур и боковой частью клетки, расположенной под плотными контактами. Когда речь идет о пласте (слое) эпителиальных клеток в теле, базолатеральная поверхность клетки будет экспонирована в направлении внутренней части тела, которую выстилает эпителий. Различные белки специфически локализуются относительно апикальной или базолатеральной мембраны.
Учитывая их важность, неудивительно, что эпителиальные клетки (включая эндотелиальную клетку и мезотелиальную клетку) широко применяют для изучения различных биологических процессов. Указанные клетки хорошо подходят для исследований в таких областях, как молекулярная клеточная биология, патогенез (микробов), фармакология и токсикология.
Для изучения эпителиальных клеток и барьерной функции были разработаны многочисленные модельные системы. Для изучения эпителиальных клеток обычно требуется возможность для доступа или модификации среды для культивирования, которая находится в контакте с апикальными или базолатеральными поверхностями эпителиальных клеток. Поскольку стандартные устройства для тканевых культур не позволяют провести манипуляции такого рода, были разработаны специализированные устройства для клеточных культур. Основное устройство, применяемое в большинстве систем моделирования in vitro, представляет собой проницаемую вставку планшета для тканевых культур, такую как Transwell (Corning, Inc., Лоуэлл, штат Массачусетс). Эти устройства обеспечивают искусственную проницаемую подложку для роста, которую можно вставить в лунку планшета для тканевых культур. Путем культивирования монослоя поляризованных клеток на поверхности указанной проницаемой подложки для роста, он будет функционировать в качестве селективного барьера для разделения секций лунки с тканевой культурой на апикальную и базолатеральную камеры.
Такие модельные системы играют крайне важную роль в разработке новых лекарственных препаратов, понимании различных заболеваний и понимании токсических эффектов агентов.
Например, во время процесса разработки лекарственного средства, еще до получения одобрения и последующей коммерциализации следует продемонстрировать, что потенциальные терапевтические агенты или кандидаты на роль лекарственного средства одновременно являются и безопасными, и эффективными для своего предполагаемого применения. Известно, что различные лекарственные средства отрицательно модулируют барьерные функции эпителия (см., например, Youmba et al. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2012; 54: 463-70). С другой стороны, соединения, которые модулируют барьерную функцию эпителиальных клеток, например, временно открывая барьер, можно применять для улучшения доставки лекарственного средства в системный кровоток и органы (Deli, Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1788 (4) 2009, 892-910). Аналогичным образом, временное открытие гематоэнцефалического барьера можно применять при доставке лекарственных средств в головной мозг. Кроме того, такие системы важны для понимания эффектов (влияния) всех видов соединений, в том числе тех, которые содержатся в пище, косметике, напитках и бактериях, на барьерную функцию. Например, токсины Clostridium difficile нарушают барьерную функцию эпителия, изменяя локализацию мембранных микродоменов белков плотных контактов (Nusrat et al., Infect. Immun. 2001, Mar., 69 (3): 1329-36.), тогда как другие компоненты могут усиливать или дополнять барьерную функцию эпителия.
В то время как современные модельные системы эпителиальных клеток являются подходящими для поиска новых лекарственных средств, работа с клетками в таких системах оказалась затруднена вследствие необходимости для этой работы очень однородных клеточных монослоев. Экспериментальная работа требует выбора правильного типа клетки, получения нескольких однородных клеточных монослоев и обеспечения целостности клеточного монослоя, достаточного для проведения экспериментов. Кроме того, все эти процедуры следует хорошо организовать для того, чтобы обеспечить многократное получение экспериментально приемлемых результатов. Такие затруднения могут привести к тому, что создание желаемой модельной системы эпителиальных клеток окажется сложным процессом, требующим месяцы или годы работы.
Соответственно, существует большой интерес к разработке новых подходов высокопроизводительного скирининга, которые могут быстро предоставлять данные о влиянии большого числа различных соединений на барьерную функции эпителия. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенного подхода, который обеспечит лучшее понимание влияния (эффектов) соединений на барьерную функцию эпителия.
Описание изобретения
Определения
В описании и формуле изобретения применяются различные термины, относящиеся к способам, композициям, применениям и другим аспектам согласно настоящему изобретению. Такие термины должны иметь свое обычное значение в области техники, к которой относится настоящее изобретение до тех пор, пока не указано иное. Другие конкретным образом определенные термины должны истолковываться в соответствии с определением, представленным в настоящем описании. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, можно применять на практике для исследования настоящего изобретения, в настоящем документе описаны предпочтительные материалы и способы.
«Формы единственного числа»: такие термины для форм единственного числа включают определяемый объект во множественной форме, если содержание явно не указывает на иное. Так, например, ссылка на «клетку» включает комбинацию из двух или более клеток и т.п.
«Примерно» и «приблизительно»: под этими терминами, в случае, когда речь идет об измеряемом значении, как, например, количестве, временном промежутке и т.п., подразумеваются изменения ± 20% или ± 10%, в более предпочтительном варианте ± 5%, в еще более предпочтительном варианте ± 1% и в еще более предпочтительном варианте ± 0,1% от указанного значения, поскольку такие изменения являются подходящими для выполнения описанных способов.
«Содержащий»: этот термин толкуется как охватывающий и неограничивающий, а не как ограничивающий. В частности, указанный термин и его варианты означают, что содержатся указанные признаки, стадии или компоненты. Такие термины не следует интерпретировать так, чтобы исключать присутствие других признаков, стадий или компонентов.
«Пример»: этот термин означает «выступающий в качестве примера, частного случая или иллюстрации» и его не следует толковать как исключающий другие описанные в настоящем документы конфигурации.
«Микрофлюидная (микрогидродинамическая) система»: этот термин относится к устройству или текучему (флюидному) компоненту устройства, конфигурация которого предназначена для содержания, пропуска, обработки или иных манипуляций с небольшими объемами жидкости, например, в диапазоне от субпиколитра до субмиллилитра или миллилитра. В некоторых примерах вариантов реализации максимальный размер поперечного сечения микрофлюидного элемента, как, например, микрофлюидного канала, может составлять менее, чем 1 мм, менее, чем 500 микрон, менее, чем 100 микрон, менее, чем 50 микрон или менее, чем 25 микрон.
«Люминесцентный зонд»: этот термин относится к любому зонду или молекуле, излучающей свет. Типы люминесценции включают биолюминесценцию, хемилюминесценцию, электрохемилюминесценцию, электролюминесценцию и фотолюминесценцию. Указанный зонд может быть люминесцирующим сам по себе, люминесценция может быть следствием химической или ферментативной реакции с участием указанного люминесцентного зонда, или может быть следствием возбуждения такого зонда светом с последующим излучением света зондом на другой длине волны. Последнее явление также известно как флуоресценция. Флуоресценция - это тип люминесценции и результат поглощения фотонов, поэтому она является типом фотолюминесценции. В контексте настоящего изобретения, под термином «люминесцентный зонд» также понимают колориметрические зонды.
«Зонд»: этот термин относится к системе, композиции или молекуле, наличие или отсутствие которой можно обнаружить (качественно и/или количественно), например, обнаруживаемой молекуле, маркеру или веществу. В контексте настоящего изобретения зонд применяют для измерения барьерной функции эпителия. Обеспечивая зонд и измеряя сигнал, создаваемый зондом на апикальной, базолатеральной стороне клеток или на обеих сторонах, получают измерение барьерной функции эпителия. Например, если зонд обеспечивают на одной стороне клеточного слоя, появление такого зонда на другой стороне указывает на то, что зонд пересек слой клеток. Увеличенная скорость появления указывает на увеличенную «утечку» через слой клеток. Другими словами, зонд в контексте настоящего изобретения относится обнаруживаемому элементу; например, он обеспечивает сигнал, или его можно индуцировать для обеспечения сигнала. Квалифицированный специалист понимает, что в контексте настоящего изобретения это может быть любой тип вещества, молекулы или системы, который позволяет их обнаружить, например, на апикальной, базолатеральной стороне клеток эпителиального слоя или даже в этих клетках. Например, на основе отслеживания распределения указанного зонда или скорости перераспределения обнаруживаемого зонда, можно определить барьерную функцию эпителия. Например, как это можно увидеть из предшествующего уровня техники, зонд также может относиться к (обнаруживаемому) маркеру, веществу, маркерному веществу, реагенту, метке или молекуле. Примеры зондов, которые можно легко обнаружить и определить, включают, но не ограничиваются ими, люминесцентные вещества и соединения, красители, флуорофоры, радиоактивные соединения, сенсорные молекулы и им подобные. Однако также предполагаются другие молекулы, присутствие которых можно обнаружить на апикальной и/или базолатеральной стороне (или внутри клеток). Квалифицированный специалист понимает, что обнаружение сигнала, обеспечиваемого зондом, будет зависеть от типа применяемого маркерного вещества или подтверждающего вещества. Например, в том случае, если зонд представляет собой флуоресцентный зонд, можно определить флуоресценцию. Например, в том случае, если зонд представляет собой радиоактивный зонд, можно определить радиоактивность. Например, в том случае, если зонд представляет собой ферментативный субстрат, указанный зонд можно определить путем проведения ферментативного анализа образца. Квалифицированный специалист понимает, что сигнал, обеспечиваемый зондом, будет зависеть от типа применяемого зонда. Квалифицированный специалист понимает, что настоящее описание конкретно не ограничивается типом применяемого зонда в том случае, если его можно соответствующим образом применять в контексте настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте зонд представляет собой оптический зонд, т.е. сигнал, который такой зонд создает или обеспечивает, можно обнаружить с применением оптического средства (например, измеряя поглощение, флуоресценцию или хемилюминесценцию). Хорошо известные зонды, которые позволяют осуществлять оптический мониторинг, включают, но не ограничиваются ими, люминесцентные зонды (включая флуоресцентные зонды), красители и колориметрические зонды. Указанный зонд может также состоять из сенсорной молекулы или композиции, которую обеспечивают на одной стороне клеток (апикальной или базолатеральной), и еще одной (дополнительной) молекулы или композиции, которую обеспечивают на другой стороне клеток, при этом указанную сенсорную молекулу или композицию можно обнаружить, в предпочтительном варианте при помощи оптических методов, в случае, когда она вступает в контакт с указанной дополнительной молекулой или композицией. Обнаруженный сигнал указывает на то, что указанная дополнительная молекула или композиция пересекли клетки, что свидетельствует о барьерной функции эпителия.
Подробное описание изобретения
Раскрыт способ in vitro для определения модулирующего влияния исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия. Эпителиальные барьеры не являются фиксированными статическими структурами. Они могут становиться более проницаемыми (способствовать большей утечке) или менее проницаемыми в ответ на множество различных стимулов (возбуждающих воздействий). Патологические процессы и агенты могут сделать выстилающие барьер слои более проницаемыми, а участок такой утечки часто расположен, например, на плотных контактах (Mullin et al., 2005) Drug. Discov. Today, 10: 395-408).
Поскольку проницаемость представляет собой динамическое явление, увеличивая один стимул и/или уменьшая другой, основное (базальное) состояние эпителиального барьера в любой рассматриваемой эпителиальной ткани в целом можно модулировать таким образом, чтобы он стал более плотным, или модулировать для большей проницаемости.
В целом повышенная проницаемость (утечка) вредна, в то время как уменьшенная проницаемость функционирует в пользу организма либо с физиологической, либо с иммунологической точки зрения.
В настоящее время способ согласно настоящему изобретению позволяет определять, измерять, анализировать, прогнозировать или устанавливать отрицательное или положительное влияние (эффект) соединения на барьерную функцию эпителия. В некоторых вариантах реализации указанные способы позволяют получить подробное представление о модулирующем влиянии соединения на барьерную функцию эпителия. Эти способы позволяют сравнивать различные соединения, концентрации соединений или различные условия их влияния на барьерную функцию эпителия. В частности, указанный способ позволяет изучать или устанавливать модулирующее влияние соединения на барьерную функцию эпителия как функцию времени. Способ согласно настоящему изобретению позволяет установить различие между разнообразными явлениями утечки, происходящими в клеточном слое (или монослое), например, нарушением плотных контактов, появлением крошечных отверстий (pin-hole) в указанном клеточном слое/мембране, утечкой из сторон вследствие неполного присоединения монослоя; все из которых невозможно различить с применением способов в данной области техники, например, с применением систем Transwell. Важно отметить, что способ согласно настоящему изобретению позволяет в режиме реального времени отслеживать модулирующие влияния на барьерную функцию эпителия; отслеживание в режиме реального времени позволяет определить время до утечки; а это гораздо более лучший показатель для оценки влияния соединения на барьерную функцию эпителия клеточного слоя, чем интенсивность флуоресценции, поскольку последняя также включает такие аспекты, как создаваемое давление вследствие уровней жидкости.
Способ согласно настоящему изобретению является более простым в применении, поскольку эксперимент может сопровождаться визуализацией в режиме реального времени, тогда как аликвоты с применением систем Transwell следует отбирать из лунок по прошествии времени и измерять отдельно от системы Transwell. Кроме того, поскольку в способе согласно настоящему изобретению используются небольшие объемы в микрофлюидных каналах, можно наблюдать даже малейшие изменения флуоресценции, в отличие от систем Transwell, в которых низкие количества флуоресценции исчезают в больших количествах жидкости.
В некоторых вариантах реализации результаты, полученные с применением способа согласно настоящему изобретению, указывают на токсические эффекты соединения. В некоторых вариантах реализации результаты, полученные с применением способа согласно настоящему изобретению, указывают на то, что исследуемое соединение является подходящим для временного открытия эпителиального барьера (т.е. для временного уменьшения барьерной функции). В некоторых вариантах реализации результаты, полученные с применением способа согласно настоящему изобретению, указывают на механизм (каким образом и как быстро), посредством которого соединение может проявлять токсический эффект. В некоторых вариантах реализации результаты, полученные с применением способа согласно настоящему изобретению, указывают на влияние исследуемого соединения, улучшающее барьерную функцию.
Указанный способ является надежным, простым и высоко воспроизводимым, что делает его, в частности, подходящим для целей скрининга. Кроме того, способ согласно настоящему изобретению позволяет быстро определить, являются ли полученные результаты репрезентативными для влияния соединения на барьерную функцию, или же результаты следует отклонить как ложные вследствие недостатков эксперимента. Способ согласно настоящему изобретению позволяет проводить измерения в режиме реального времени.
Способ основан на измерении передвижения (пассивного или активного, например, на практике можно применять избыточное давление для увеличения входного потока соединений через эпителиальный барьер к другой стороне, гель способствует интерстициальному потоку через гель) зонда (или в том случае, если зонд содержит сенсорную и дополнительную молекулу или композицию, описанную в настоящем документе, передвижения дополнительной молекулы или композиции) от одной стороны (апикальной или базолатеральной) эпителиального слоя к другой стороне слоя эпителиальных клеток, культивируемых в микрофлюидной системе. Измерение проводят в динамике и в отсутствие или в присутствии исследуемого соединения. Скорость транспортировки или объем транспортировки в динамике или, в частности, время, в течение которого достигается определенный уровень (относительный или абсолютный) транспортировки, дает новое представление о влиянии исследуемого соединения на применяемые в указанном способе эпителиальные клетки.
Способ in vitro для определения модулирующего влияния исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия описывается как способ, включающий следующие этапы или стадии:
a) обеспечение микрофлюидной системы, содержащей множество полых микрофлюидных каналов, при этом указанный канал по меньшей мере частично заполняют гелем;
b) введение эпителиальных клеток в указанные микрофлюидные каналы и обеспечение приведения эпителиальных клеток в контакт с гелем;
c) культивирование эпителиальных клеток, которые вводились в микрофлюидные каналы, тем самым позволяя указанным клеткам образовывать на геле слой клеток с апикальной и базолатеральной стороной, тем самым в предпочтительном варианте позволяя указанным клеткам образовывать цилиндрическую структуру с апикальной и базолатеральной стороной в микрофлюидном канале;
d) обеспечение эпителиальных клеток в микрофлюидном канале зондом и исследуемым соединением, при этом указанный зонд и исследуемое соединение независимо обеспечивают на апикальной стороне, базолатеральной стороне или как на апикальной, так и базолатеральной стороне;
e) определение в различные моменты времени сигнала, обеспечиваемого или создаваемого зондом в микрофлюидном канале или в геле, или как в микрофлюидном канале, так и в геле.
Неожиданно было обнаружено, что абсолютные значения, изменение значений или соотношение значений сигнала, определенного на стадии е), в частности, в разные моменты времени, представляют собой высоко воспроизводимые показатели влияния соединения на барьерную функцию эпителиальных клеток. Эти значения можно, например, применять для выражения токсического влияния соединения на эпителиальную клетку или на эпителиальный барьер.
На первой стадии предложена микрофлюидная система, которая содержит множество полых микрофлюидных каналов. Очевидно, что микрофлюидная система должна быть подходящей для культивирования эпителиальных клеток. Кроме того, микрофлюидные системы должны обеспечивать доступ либо к апикальной, либо к базолатеральной стороне, однако в предпочтительном варианте реализации доступ как к апикальной, так и к базолатеральной стороне эпителиальных клеток, культивируемых в указанной микрофлюидной системе.
Микрофлюидные (микрогидродинамические) системы, подходящие для культивирования клеток, известны квалифицированному специалисту и относятся к устройству или текучему (флюидному) компоненту устройства, конфигурация которого предназначена для содержания, пропуска, обработки или иных манипуляций с небольшими объемами жидкости, например, в диапазоне от пиколитра до субмиллилитра или миллилитра.
Микрофлюидные системы, применяемые в способе согласно настоящему изобретению, являются подходящими для поддержки клеточной культуры in vitro, и они могут обеспечивать активную поддержку живых клеток с применением системы микрофлюидных каналов, которые обеспечивают поток, например, при помощи пассивных средств наподобие пассивного регулирования или с применением активных насосов, таких как шприцевые насосы и им подобные. Поток относится к вспомогательной (поддерживающей) системе для живых клеток, в которую флюид подают или экстрагируют из некоторых или из всех каналов с применением внешнего положительного или отрицательного источника давления, например, нагнетающего наноса, находящегося под давлением резервуара, вакуумного насоса или им подобных. Активная подложка относится к вспомогательной системе для живых клеток, в которой некоторые или все каналы получают активный микрофлюидный поток. Активную микрофлюидную систему можно противопоставить системе, в которой используется пассивный микрофлюидный поток, при этом циркуляцию флюида для управления потоком стимулируют естественными механизмами, такими, как, сила тяжести, капиллярное действие, поверхностное натяжение или им подобным. Микрофлюидная система в способе согласно настоящему изобретению может обеспечивать поток или работать без потока.
Применяемая микрофлюидная система может обеспечивать поток к клетке, культивируемой в микрофлюидных каналах, при этом указанные клетки находятся в системе микрофлюидных каналов, тем самым клетки обеспечиваются средой подходящего флюида.
Микрофлюидная система может содержать каналы с по существу равномерным внутренним диаметром, или может содержать каналы с различным внутренним диаметром, включая сужения и дилатации, как того требует динамика потока флюида.
Применяемая в способе согласно настоящему изобретению микрофлюидная система конкретно не ограничивается какой-либо специфичной микрофлюидной системой. Примеры микрофлюидных устройств описаны у S.J. Trietsch, G.D. , J. Joore, Т. Hankemeier, P. Vulto, Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture, Lab. Chip. 2013, vol. 13, №18, pp. 3548-3554, Edinson Lucumi Moreno, Siham Hachi, Kathrin Hemmer, Sebastiaan J. Trietsch, Aidos S. Baumuratov, Thomas Hankemeier, Paul Vulto, Jens C. Schwamborn and Ronan M.T. Fleming, Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture, Lab. Chip., Vol. 15, №11, pp. 2419-2428, в публикации WO 2012120102, в публикации WO 2014038943, у Mu et al, Lab. on a Chip, 2013, 13, 1612-1618, или у Jang et al, Integr. biol., 2013, 5, 1119. Тем не менее, устройства, описанные в двух последних публикациях, не позволяют проводить высокопроизводительный скрининг, и являются менее предпочтительными.
Устройство, описанное в публикации WO 2012120102, например, содержит полый объем (пространство), который (а) внутренне разделен по меньшей мере на первое, второе и третье подпространства (sub-volume) по меньшей мере двумя элементами, работающими по технологии Phaseguide, находящимися внутри указанного объема (пространства), и (b) содержит части, расположенные относительно восходящего потока и относительно нисходящего потока, если судить относительно движения мениска или всего потока жидкости в указанном объеме. При этом указанное устройство содержит по меньшей мере первый, второй и третий флюидный каналы, соединенные для обеспечения движения флюида между внешним слоем восходящего потока и соответствующим упомянутым подпространством; и по меньшей мере один дополнительный канал, соединенный для обеспечения движения флюида между внешним слоем нисходящего потока объема и упомянутым подпространством. Первое указанное подпространство может содержать клетки, удерживаемые в геле или при помощи геля или гелеобразного вещества; и второе подпространство соединено с первым подпространством таким образом, чтобы обеспечить транспортировку веществ между первым и вторым подпространством, и обеспечить содержание по меньшей мере одного геля или гелеобразного вещества. В некоторых вариантах реализации, описанных в настоящем документе, третье подпространство соединено с по меньшей мере первым подпространством таким образом, чтобы обеспечить транспортировку веществ между первым и третьим подпространством, и при этом третье подпространство содержит перфузат.
Предпочтительные микрофлюидные планшеты или системы содержат множество микрофлюидных сетей и входных отверстий, обеспечивающих доступ к указанным микрофлюидным сетям. Каждая микрофлюидная сеть содержит основанный на капиллярном давлении барьер. Каждое входное отверстие образовано входной камерой, имеющей нижнюю ограничивающую поверхность.
На практике устройство для распределения флюида (флюидный диспенсер), имеющий распределительную часть с концом для распределения флюида, применяют для впуска жидкостей и/или гелей и/или гель-предшественников в микрофлюидную сеть, тем самым останавливая или структурируя (pattering) по меньшей мере одну жидкость/гель/гель-предшественник при помощи основанного на капиллярном давлении барьера. Микрофлюидный планшет можно применять для изучения флюидов или их содержимого или для оценки взаимодействия между флюидами или их содержимым.
Основанный на капиллярном давлении барьер может, например, разделять микрофлюидную камеру микрофлюидной сети на первую часть камеры и вторую часть камеры. Жидкость, гель или гель-предшественник с частицами на основе живых элементов, таких как клетки, может сливаться из распределительной части флюидного диспенсера во входное отверстие. Указанная жидкость или гель (гель-предшественник) будут поступать из входного отверстия в первую часть камеры микрофлюидной камеры и останавливаться, ее продвижение контролируется или структурируется вследствие наличия основанного на капиллярном давлении барьера. Жидкость или гель (гель-предшественник) могут транспортироваться через микрофлюидную сеть под действием капиллярных сил, силы тяжести или других воздействующих сил.
Примером применения такого основанного на капиллярном давлении барьера является выборочное заполнение микрофлюидной сети первым флюидом, таким как, например, гель. Степень, до которой микрофлюидная сеть заполняется указанным первым флюидом, определяется основанном на капиллярном давлении барьером, который останавливает продвижение указанного флюида по сети. После гелеобразования оставшуюся часть микрофлюидной сети можно заполнить вторым флюидом, так что происходит обмен между этими двумя флюидами, или происходит реакция между указанными флюидами или их компонентами. Такой пример показан в 3D-культуре клеток во внеклеточном матричном геле, которая окружена перфузионным потоком среды. Это подробно описано у S.J. Trietsch, G.D. , J. Joore, Т. Hankemeier, P. Vulto, Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture, Lab. Chip. 2013, vol. 13, №18, pp. 3548-3554.
Другие примеры применения основанных на капиллярном давлении барьеров приведены у С. Phurimsak, Е. Yildirim, M.D. Tarn, S.J. Trietsch, Т. Hankemeier, N. Pamme, P. Vulto, Phaseguide assisted liquid lamination for magnetic particle-based assays, Lab. Chip., 2014, vol. 14, №13, pp. 2334-2343, P. Vulto, G. Dame, U. Maier, S. Makohliso, S. Podszun, P. Zahn, G.A. Urban, A microfluidic approach for high efficiency extraction of low molecular weight RNA, Lab. Chip., 2010, vol. 10, №5, pp. 610-6, Edinson Lucumi Moreno, Siham Hachi, Kathrin Hemmer, Sebastiaan J. Trietsch, Aidos S. Baumuratov, Thomas Hankemeier, Paul Vulto, Jens C. Schwamborn and Ronan M.T. Fleming, Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture, Lab. Chip., Vol. 15, №11, pp. 2419-2428, в патентах США №020070280856 A1, 020040241051 A1, 000004761381 A, 000006271040 B1, в публикациях WO 2006074665, в патентах США №6601613 В2, 6637463 В1. Основанный на капиллярном давлении барьер может представлять собой любое одно из следующего: гидрофобную область (патч) или полоску, менее гидрофильную область или полоску относительно материала более отдаленного участка сети, канал с расширением, по меньшей мере один столбик (pillar) или стойку, выстилающую канал или камеру, канавку в подложке указанного канала или камеры, выступ материала в объеме (пространстве) камеры и им подобные.
Особенно предпочтительными являются планшеты OrganoPlates от компании Mimetas (http://mimetas.com/products.php).
Эти планшеты для культивирования на основе микрофлюидной системы позволяют культивировать и проводить скрининг широкого спектра физиологически релевантных моделей органов и тканей.
Микрофлюидная сеть такой микрофлюидной системы в целом содержит канал, камеру, множество каналов или камер или их комбинацию, при этом по меньшей мере один размер по меньшей мере одного канала или камеры часто и предпочтительно составляет менее одного миллиметра.
Микрофлюидную сеть обычно конструируют в виде установки с горизонтальными слоями, содержащей субстрат в нижней части, слой, содержащий микрофлюидную сеть, и субстрат в верхней части. Указанный микрофлюидный слой можно также структурировать либо внутри, либо на поверхности субстрата в верхней и нижней части, или в них обеих. Указанная микрофлюидная сеть содержит полимерный или стеклянный субстрат в верхней и нижней части. Микрофлюидную сеть можно сконструировать либо путем протравливания сети на любом субстрате, либо путем образования рисунка в полимерном слое на поверхности любого субстрата. В конкретном варианте реализации по меньшей мере один субстрат в верхней или нижней части выполнен из стекла или гидрофильного полимера таким образом, что транспортировку флюида можно осуществить только под действием капиллярных сил. Микрофлюидный планшет (систему) можно сконструировать с применением методов фотолитографии, методов горячего тиснения, методов мягкого тиснения, методов травления, методов многократного или инжекционного формования.
Стенка каналов может быть выполнена из любого типа материала, включая, но не ограничиваясь ими, стекло, полимеры, такие как полистерен, ПММА, циклоолефиновый полимер (СОС), эластомеры, такие как силиконовые каучуки, полидиметилсилоксаны, керамика, металлы.
Канал по меньшей мере частично заполняют гелем, в предпочтительном варианте гидрогелем. Квалифицированный специалист понимает, что подходящими являются различные типы гелей, и их можно применять в контексте настоящего изобретения, включая те, которые обычно применяют в методах с применением клеточных культур, и до тех пор, пока гель способствует культивированию эпителиальных клеток в контексте настоящего изобретения. Более того, эксперименты показывают, что можно применять различные гели, как, например, те, которые конкретно упомянуты в настоящем описании. Более того, для квалифицированного специалиста не составит труда выбрать подходящий гель. Гель можно подавать в канал так, как это описано выше. После подачи геля вызывают его гелеобразование, предшествующее введению еще одного (дополнительного) флюида. Такой флюид обычно представляет собой среду для роста, которая обеспечивает питательные вещества и кислород. Через этот флюид можно вводить клетки, и тем самым происходит их осаждение против геля и образование ими слоя клеток. При переносе этих клеток в культуру они обычно образуют трубочку, через просвет которой указанную трубочку можно перфузировать потоком. Таким образом, в канал подают гель так, что после гелеобразования эпителиальные клетки можно вводить в указанный канал при помощи среды, например, среды для культивирования, что способствует приведению клеток в контакт с клетками и образованию на геле слоя клеток (например, трубочек/сосуда), тем самым образуется апикальная и базолатеральная сторона.
Например, гель-предшественник (обычно гель, получаемый из внеклеточного матрикса (ЕСМ), такой как коллаген, фибриноген, фибронектин, экстракт базальной мембраны, как, например, Matrigel, или синтетические гели) можно вводить во входное отверстие микрофлюидного планшета при помощи пипетки (обычно пипетка для повторяющихся процедур пипетирования, такая как Eppendorf Multipette М4 (Eppendorf AG, Германия, номер по каталогу 4982000.012) в сочетании с Eppendorf Combitips advanced (Eppendorf AG, Германия, номер по каталогу 0030089.405). Гель-предшественник может также содержать клетки, которые приводят к образованию клеточной суспензии, однако клетки можно получить и после этого. Гель-предшественник высвобождается во входном отверстии микрофлюидного планшета. Гель-предшественник транспортируется в микрофлюидную сеть под действием капиллярных сил, которые теоретически сопровождаются действием силы тяжести. Затем гель останавливает элемент, работающий по технологии Phaseguide, который по существу представляет собой основанный на капиллярном давлении барьер, который располагается по всей ширине микрофлюидной камеры. Перед введением второго флюида вызывают гелеобразование геля-предшественника. Этот второй флюид обычно представляет собой среду для роста, которая обеспечивает питательные вещества и кислород. В случае потока указанная среда для роста также может удалять или разбавлять токсичные метаболиты, продуцируемые клетками.
Подобным в приведенном выше примере образом клетки можно вводить во второй флюид, тем самым происходит их осаждение на геле. При переносе этих клеток в культуру они обычно образуют трубочку, через просвет которой указанную трубочку можно перфузировать потоком.
В еще одном примере несколько типов гелей можно структурно расположить рядом друг с другом. Структурное расположение нескольких типов гелей можно осуществить путем инъекции гелей-предшественников, прекращения продвижения указанных предшественников при помощи основанного на капиллярном давлении барьера и путем последующего гелеобразования таких предшественников в разных частях сети. Суспензия первого типа клеток в первом геле-предшественнике, за которой следует второй тип клеток во втором геле-предшественнике, приводит к так называемой стратифицированной сокультуре, в которой типы клеток окультивированы рядом друг с другом.
Гель в предпочтительном варианте находится в контакте со стенкой канала, или его на ней осаждают.
Гели определяют как по существу разбавленную перекрестно-сшитую систему, которая не проявляет текучести в случае, когда находится в стационарном состоянии. Гель зачастую представляет собой нетекучую коллоидную сеть или полимерную сеть, которая расширяется по всему своему объему при помощи жидкости. Гидрогель или аквагель, - это гель, в котором набухающим агентом является вода. В контексте способа согласно настоящему изобретению гелеобразный материал может представлять собой водосодержащий гель, который в предпочтительном варианте нерастворим в воде, но содержит воду, чтобы иметь двух- или трехмерную вспомогательную структуру. В настоящем изобретении применяемый гель способствует диффузии вещества, в частности зонда (или еще одного (дополнительного) соединения, определенного в настоящем документе), и/или исследуемого соединения (см. ниже) в указанный гель или через него. Примеры включают гели Matrigel и гели на основе коллагена.
Гель, применяемый в настоящем изобретении, конкретным образом не ограничен, поскольку слой обладает вышеуказанными свойствами и способствует образованию слоя эпителиальных клеток на указанном геле (подробно описано ниже). Широко применяемые гели включают гели биологического происхождения, включая коллаген, ламинин, фибронектин, фибриноген, Matrigel и/или агарозу, и синтетические гели на основе нескольких скаффолдов, таких как ПЭГ (полиэтиленгликоли), пептиды, PLLA (поли-L-лактид), PLGA (поли(молочно-ко-гликолевая кислота).
Для структурного расположения геля, т.е. для заполнения части микрофлюидного канала гелем, можно применять несколько методов, включая, но не ограничиваясь ими, литографическое структурирование фотоотверждаемых гелей, структурирование, основанное на капиллярной силе, с применением, например, столбиков (pillar), гидрофобных областей или элементов, работающих по технологии Phaseguide, а также метод выборочного осаждения.
Микрофлюидную систему, содержащую полые микрофлюидные каналы, причем такой канал по меньшей мере частично заполнен гелем, обеспечивают эпителиальными клетками. Указанные клетки можно вводить в указанные каналы любыми подходящими способами до тех пора, пока клетки могут вступать в контакт с гелем в микрофлюидном канале.
В контексте настоящего изобретения термин эпителиальные клетки также относится к эпителиальным клеткам, эндотелиальным клеткам или мезотелиальным клеткам, причем два последних типа клеток представляют собой особые формы эпителиальных клеток. Число клеток, вводимых в канал, должно способствовать образованию указанными клетками слоя клеток на геле после культивирования в подходящей среде, и оно зависит от типа применяемой клетки, типа применяемого геля и типа применяемой среды. Квалифицированный специалист хорошо осведомлен о том, какие условия необходимы для соответствия таким требованиям, или о том, каким образом их установить.
После того, как указанные клетки вводят в микрофлюидный канал, клеткам позволяют осуществить рост, развитие или деление с той целью, чтобы указанные клетки смогли образовать на геле слой клеток с апикальной и базолатеральной стороной. В контексте настоящего изобретения апикальной стороной клетки является та сторона, которая обращена внутрь микрофлюидного канала, тогда как базолатеральная сторона представляет собой ту сторону клетки, которая обращена в сторону геля (или ту сторону, которая находится в контакте с гелем). В контексте настоящего изобретения сторону, обращенную к базолатеральной стороне клетки, также обозначают как базолатеральную, тогда как сторону, обращенную к апикальной стороне клетки, обозначают как апикальную.
В предпочтительном варианте реализации клетки культивируют в течение периода, достаточного для того, чтобы указанные клетки образовали цилиндрическую структуру в микрофлюидном канале, и в этом же случае апикальную и базолатеральную сторону определяют так, как определено в настоящем документе.
Клетки культивируют в среде и в условиях, подходящих для выбранной конкретной клетки, и с применением методики, хорошо известной квалифицированному специалисту.
Что касается образования слоя клеток с апикальной и базолатеральной стороной, то в предпочтительном варианте реализации упомянутый слой является конфлюентным. В контексте настоящего изобретения конфлюентность определяют относительно поверхности гелеобразного материала в микрофлюидном канале. Конфлюентность - это термин, обычно применяемый в качестве оценки числа адгезивных клеток в микрофлюидном устройстве, относящийся к доле поверхности, которая покрыта клетками. Например, 50-процентная конфлюентность означает, что покрыта приблизительно половина поверхности геля. В том случае, когда конфлюентным является слой, примерно 100 процентов поверхности геля покрыто клетками, и больше не остается места для роста клеток в виде монослоя.
Когда слой клеток, например, монослой, является конфлюентным относительно части, находящейся в контакте с гелем, было обнаружено, что указанный монослой является непроницаемым. Более того, барьерную функцию эпителия в контексте описанного в настоящем документе способа определяют на основе скорости, с которой зонд (или часть зондовой системы) диффундирует или перемещается от одной стороны слоя эпителиальных клеток (апикальной или базолатеральной) к другой стороне слоя эпителиальных клеток (базолатеральную, соответственно апикальную). При абсолютно полноценной функции эпителиального барьера эта скорость будет близка к нулю, тогда как при отсутствии какой-либо функции эпителиального барьера скорость будет близка к скорости в данной системе при отсутствии каких-либо клеток, или будет равняться такому показателю. Квалифицированный специалист знает, что при заданных условиях интерстициальный поток, вследствие различия давлений на апикальной и базальной стороне, будет влиять на транспортировку и, таким образом, его можно учитывать при проведении экспериментов. Любое значение между такими крайними значениями указывает на различный уровень функции эпителиального барьера, при этом значения, близкие к нулю, указывают на более полноценную барьерную функцию эпителия.
Другими словами, при таких условиях зонд (или часть зондовой системы), в случае, когда, например, его добавляют к апикальной стороне, не будет или будет только очень ограниченно передвигаться или диффундировать, или перемещаться от апикальной стороны в направлении к базолатеральной стороне клеток, что указывает на абсолютно полноценный эпителиальный барьер. В том случае, когда зонд располагается на апикальной стороне, он не будет накапливаться в геле.
В контексте настоящего изобретения слой эпителиальных клеток можно считать непроницаемым в том случае, когда менее, чем примерно 10%, в предпочтительном варианте менее, чем примерно 5%, в еще более предпочтительном варианте менее, чем примерно 1% сигнала появляется на стороне (например, апикальной), противоположной той, на которой обеспечивают указанный зонд (или дополнительное соединение в случае применения сенсора, определенного в настоящем документе), в течение 5, 10, 20 или 30 минут после добавления (в данном примере, базолатеральной). В предпочтительном варианте реализации эпителиальный слой считается непроницаемым, когда менее, чем 1% сигнала появляется в течение 5 минут. Это число будет частично зависеть от применяемого зонда, а также от типа применяемых клеток.
Тем не менее, неожиданно было обнаружено, что для способа согласно настоящему изобретению не является обязательным, чтобы слой был в значительной степени непроницаем для зонда, по меньшей мере для той его части, которая находится в контакте с гелем. На практике с самого начала эксперимента допускают определенный уровень утечки. Другими словами, согласно способу настоящего изобретения допускается, что в начале эксперимента и в случае отсутствия исследуемого соединения зонд до определенной степени передвигается с одной стороны к другой как следствие не являющегося непроницаемым эпителиального слоя, например, как следствие уменьшенной конфлюентности клеток в слое относительно геля.
Фактически, в некоторых вариантах реализации такие не являющиеся непроницаемыми эпителиальные клетки являются предпочтительными, поскольку это позволяет исследовать или проводить скрининг соединений относительно улучшающих их эпителиальный барьер свойств, например, путем измерения уменьшения скорости диффузии/передвижения зонда с одной стороны на другую сторону в динамике.
Таким образом, степень нарушения функции эпителиального барьера в начале эксперимента во многом зависит от цели такого эксперимента. Очевидно, что диффузия зонда (которая в контексте настоящего изобретения и в каждом варианте реализации настоящего изобретения также включает передвижение дополнительной молекулы или композиции в случае, когда в качестве зонда применяют сенсорную систему, определенную в настоящем документе) от одной стороне к другой стороне не должна быть равна скорости при отсутствии каких-либо клеток в данной системе. В некоторых вариантах реализации предпочтительное передвижение или диффузия в начале экспериментов и до того момента, когда клетки будут обеспечивать каким-либо исследуемым соединением, составляет не более 50%, 40%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или менее от скорости передвижения/диффузии, наблюдаемой в той же системе при отсутствии каких-либо клеток.
Что касается цилиндрической структуры, которую можно получить в некоторых вариантах реализации, в предпочтительных вариантах по меньшей мере часть цилиндрической структуры, которая расположена относительно геля или которая находится в контакте с гелем, является конфлюентной.
На основании раскрытого в настоящем документе описания квалифицированному специалисту будет понятно, что еще можно предпринять в отношении не являющегося непроницаемым слоя клеток, который образуется на геле. В то же время, таким образом способ позволяет быстро определить или установить, можно ли подходящим образом применять слой клеток или его следует отбраковать вследствие пониженной или даже отсутствующей барьерной функции эпителия.
После того, как клеткам позволили образовать слой клеток, причем с апикальной и базолатеральной стороной, указанные клетки в микрофлюидных каналах обеспечивают зондом. Зонд можно обеспечить либо для среды, содержащей клетки с апикальной стороной, либо для среды, содержащей клетки с базолатеральной стороной, либо для среды, содержащей клетки как с апикальной, так базолатеральной стороной. Последний вариант может, например, включать добавление двух разных и различимых зондов. В предпочтительном варианте зонд представляет собой оптический зонд; т.е. его можно отслеживать при помощи оптического средства. В предпочтительном варианте указанный оптический зонд представляет собой люминесцентный зонд. Как это описано в настоящем документе, люминесцентный зонд включает любой зонд, который испускает свет сам по себе, или который испускает или создает свет как следствие образования химического вещества в ферментативной реакции с участием указанного люминесцентного зонда, или излучает свет при возбуждении (флуоресценции). В случае, например, люминесцентных зондов необходимы кофакторы или субстраты для излучения света, такие кофакторы или субстраты можно добавлять к среде, как на апикальную сторону, так и на бозолатеральную сторону, или на обе эти стороны. Следует отметить, что при применении кофакторов или субстратов зонд не должен фактически излучать свет сам по себе, но должен являться жизненно важной частью люминогенного процесса, например, в присутствии указанного люминесцентного зонда нельзя было бы «затушить» флуоресцентную часть кофактора.
В том случае, если кофакторы или субстраты выборочно обеспечивают на противоположной от зонда стороне клеточного слоя, мерой для диффундированного или перемещенного зонда будет являться абсолютное количество образованного света по сравнению с показателем соотношения между светом, образованным апикальной и базальной стороной, поскольку стороны без кофактора или субстрата вообще не образуют свет.
Клетки также обеспечивают исследуемым соединением. Соединение, независимо от зонда, обеспечивают на апикальной стороне, базолатеральной стороне или как апикальной, так и базолатеральной стороне клеток. Соединение (исследуемый агент) можно добавить одновременно с зондом или до или после того, как клетки обеспечивают указанным зондом. Соединение может представлять собой агент, подлежащий исследованию на способность модулировать барьерную функцию эпителия. Модуляция барьерной функции эпителия может включать повышенную барьерную функцию эпителия, пониженную барьерную функцию или дополнительную барьерную функцию эпителия (при этом как таковое соединение не увеличивает барьерную функцию эпителия, но, например, действует в качестве агента, покрывающего слой эпителиальных клеток, и тем самым оно дополняет такую барьерную функцию эпителия). Активность соединения в отношении барьерной функции эпителия уже может быть известна или неизвестна. Соединения, подлежащие исследованию, могут включать, но не ограничиваются ими, антитела, ингибиторы малых молекул, лекарственные средства, природные или синтетические защитные агенты для слизистой оболочки, цитокины, факторы роста, антиоксиданты, антипротеазы, природные или синтетические эпителиальные выделения и миметики поверхностно-активных веществ или любое другое вещество для вмешательства.
Как было указано выше, особый интерес представляют соединения, которые будут или, как предполагается, увеличивают, дополняют или уменьшают барьерную функцию эпителия.
На следующей стадии способа согласно настоящему изобретению сигнал, создаваемый или обеспечиваемый зондом или зондовой системой, определяют в разные моменты времени. Сигнал можно определить на апикальной стороне, на базолатеральной стороне, или как на апикальной, так и на базолатеральной стороне. Например, когда зонд обеспечивают на базолатеральной стороне, передвижение зонда к апикальной стороне можно измерить путем измерения сигнала на апикальной стороне, при этом увеличение сигнала указывает на диффузию к апикальной стороне. Однако в данном примере диффузию или перемещение к апикальной стороне в некоторых вариантах реализации также можно определить путем измерения сигнала на базолатеральной стороне, при этом уменьшение сигнала указывает на диффузию к апикальной стороне. Сигнал можно также измерить в обоих компартментах, т.е. на апикальной или базолатеральной стороне в среде или геле. Как будет подробно объяснено ниже, измерение сигнала на базолатеральной стороне может включать измерение сигнала в геле, но может и также включать измерение сигнала в среде, имеющей доступ к базолатеральной стороне клеток в геле, и при этом зонд может накапливаться в геле. В контексте настоящего изобретения измерение сигнала на базолатеральной стороне в геле, таким образом, включает как измерение в геле, так и в указанной среде, или и то, и другое.
Способ, применяемый для измерения сигнала, зависит от конкретного зонда, применяемого в способе согласно настоящему изобретению. В зависимости от применяемого зонда квалифицированный специалист знает, какой способ применять. Например, в случае флуоресцентных зондов флуоресценцию зонда определяют с применением любого подходящего средства.
В предпочтительном варианте зонд представляет собой оптический зонд, в предпочтительном варианте люминесцентный зонд, в предпочтительном варианте флуоресцентный зонд. Следует отметить, что зонд, оптический зонд, люминесцентный зонд, флуоресцентный зонд, может также содержать сенсорную молекулу или композицию, которая обеспечивает сигнал при контакте с еще одной (дополнительной) молекулой или композицией. Обеспечивая датчик на одной стороне и указанную дополнительную молекулу или композицию на другой стороне, можно обнаружить утечку путем измерения сигнала, создаваемого/обеспечиваемого сенсором при контакте с дополнительной молекулой или композицией.
Сигнал в предпочтительном варианте определяют в более, чем один момент времени. На практике в первый момент времени сигнал в отсутствие исследуемого соединения можно определить для получения первого контрольного значения. При практической реализации настоящего изобретения, в те же моменты времени, в которых исследуют влияние исследуемых соединений на барьерную функцию эпителия по меньшей мере в одном канале, по меньшей мере один канал, содержащий слой клеток, будут применять в качестве контроля, т.е. в котором обеспечиваемый зондом сигнал будут определять или измерять в динамике и при тех же условиях, но в отсутствие этого или другого исследуемого соединения. Более того, и применительно ко всем вариантам реализации настоящего изобретения, после обработки среду можно поменять для изменения продолжительности обработки культуры веществом. Кроме того, обычно, но это не является обязательным, совместно с исследуемой культурой можно использовать контроли или стандарты для выявления недочетов в условиях инкубации. Контроли представляют собой культуры клеток, которые идентичны тем, которые применяют для исследования, за исключением того, что они не разрушаются исследуемым веществом и не обрабатываются им.
Полученные результаты можно применять различными способами. Например, модулирующее влияние соединения на барьерную функцию эпителия можно выразить через абсолютное или относительное изменение сигнала на апикальной стороне, базолатеральной стороне или на них обеих в динамике. В альтернативном варианте результаты можно сравнить с контрольными экспериментами, проводимыми в тех же условиях, но в отсутствие исследуемого соединения. Кроме того, можно сравнивать различные концентрации исследуемого соединения (например, 1, 2, 3, 4, 5 … 10 различных концентраций). Также возможно выразить сигнал на апикальной стороне через сигнал на базолатеральной стороне, а также наоборот (однако в абсолютных значениях, также как и относительные изменения). Данные также можно выразить через изменение (абсолютное, относительное) сигнала в единицу времени.
арр
Скорость, с которой зонд диффундирует или перемещается через слой эпителиальных клеток, можно также проанализировать для получения выраженной проницаемости (Р) клеточного слоя для конкретного зонда. Это значение является общепринятым показателем барьерной функции эпителиальных слоев. Чтобы вычислить это значение можно, например, отслеживать диффузию или перемещение зонда через слой клеток в направлении к вспомогательному гелю и корректировать его под значение диффузии или перемещения, которые наблюдают в контрольных устройствах с применением не содержащего клеток геля. Формула, которую можно применять для такого расчета, может быть представлена в виде
receiver
receiver
donor,initial
где t - время, А - площадь слоя клеток, которую зонд может пересекать, V - объем части устройства, в направлении которого зонд диффундирует или перемещается, C - концентрация зонда в части устройства, по направлению к которой зонд диффундирует или перемещается, и C - начальная концентрация зонда в компартменте, из которого зонд диффундирует.
Для того, чтобы определить проницаемость слоя клеток, который образуется на геле, можно использовать формулу:
арр determined
арр
monolayer
арр
cell free
app
в которой Р представляет собой значение Р клеток на поверхности геля, P представляет собой значение Р слоя клеток, и P представляет собой значение P контрольного устройства с гелем, не содержащим клеток. Эту формулу можно записать в виде
Для применения данного способа, перемещение или диффузию зонда следует отслеживать в течение продолжительного времени, при котором увеличение сигнала по-прежнему остается приблизительно линейным. Например, эксперимент может включать обработку различных монослоев различными соединениями или концентрациями соединений в течение разных периодов времени. После такой обработки к монослоям или контрольным устройствам можно добавить зонд, и перемещение зонда отслеживают в течение 5-60 минут. Применение вышеуказанных формул затем приводит к получению выраженной проницаемости монослоев клеток после различных обработок.
В некоторых вариантах реализации различные соединения последовательно исследуют в одном и том же канале. В таком варианте реализации клетки в определенном канале сначала вводят в контакт с первым соединением, и через некоторое время добавляют еще одно (дополнительное) соединение, подлежащее исследованию, или клетки сначала вводят в контакт с первым соединением, после чего указанное первое соединение удаляют, а второе соединение, подлежащее исследованию, обеспечивают для тех же клеток в канале.
Способ согласно настоящему изобретению также позволяет исследовать смеси соединений. В таком варианте реализации смесь соединений обеспечивают в микрофлюидном канале, содержащем клетки.
В некоторых вариантах реализации непрерывный поток среды можно обеспечить рядом с гелем на стороне, противоположной монослою клеток, и рядом с монослоем. При помощи такого потока можно удалить любой зонд, который полностью диффундирует или перемещается через гель. В предпочтительном варианте реализации указанный поток и объем за гелем такой, что концентрация растворенного в нем зонда никогда не достигает значительных уровней, что эффективным образом создает ситуацию наличия постоянного «поглотителя». В еще одном варианте реализации непрерывный поток также обеспечивают на стороне, противоположной слою клеток. В предпочтительном варианте поток и объем флюида, содержащие зонд, таковы, что концентрация зонда никогда не уменьшается значительным образом вследствие диффузии или перемещения через слой клеток, что эффективным образом создает ситуацию наличия постоянного источника. В случае, если присутствует как постоянный «поглотитель», так постоянный источник при факте постоянной диффузии или перемещения через гель, единственным фактором, воздействующим на концентрацию зонда внутри геля, является диффузия или перемещение через слой клеток. Это позволяет непосредственно оценивать поток зонда и, следовательно, барьерную функцию слоя клеток, измеряя только концентрацию зонда в области геля. В отличие от некоторых других вариантов реализации, в которых в динамике измеряют увеличение концентрации зонда, такой вариант реализации с применением постоянного потока для достижения ситуации наличия постоянного источника и «поглотителя» способствует прямому и динамическому измерению барьерной функции в любой момент времени.
В предпочтительном варианте реализации можно сравнить различные исследуемые соединения или смеси исследуемых соединений, например, смеси из 2, 3, 4, 5, … 10 различных исследуемых соединений, в предпочтительном варианте при разных концентрациях. В частности, последние могут иметь важное значение для применения в области фармакологии, питания и/или косметических средств. В качестве примера, в настоящее время пациенты зачастую принимают различные лекарственные средства в одно и то же время или в течение дня. Возможно, что необходимо понимать влияние таких комбинаций на барьерную функцию эпителия. Например, при астме, с одной стороны, можно назначать лекарственное средство для улучшения или дополнения барьерной функции эпителия в легких, тогда как, с другой стороны, такой пациент может получать лекарственное средство, которое непреднамеренно отменяет такое улучшение или препятствует ему.
В целом увеличение сигнала, обеспечиваемого или создаваемого данным зондом на стороне, противоположной той, к которой зонд добавляют, является показателем для не являющегося полностью непроницаемым эпителиального барьера. Чем сильнее такое увеличение, тем меньше будет барьерная функция эпителия.
Благодаря способу согласно настоящему изобретению теперь стало возможным получение более подробной информации о влиянии соединения на барьерную функцию эпителия. Одна из причин заключается в том, что эпителиальные клетки, применяемые в способе согласно настоящему изобретению, представляют собой более репрезентативную модель для состояния in vivo по сравнению со способами в данной области техники, которые главным образом основаны на применении проницаемых вставок планшета для тканевых культур, таких как Transwell (Corning, Inc., Lowell, Mass, такая вставка обеспечивает искусственную проницаемую подложку для роста, которую можно вставить в лунку планшета для тканевых культур). Вторая причина заключается в том, что сигналы можно отслеживать в режиме реального времени как множество моментов времени и для слоев клеток в одном эксперименте. Третья причина заключается в том, что способ согласно настоящему изобретению делает возможным идентификацию характеристик механизма, посредством которого соединение модулирует барьерную функцию эпителия. Например, способ согласно настоящему изобретению позволяет установить, возможно ли сразу наблюдать влияние исследуемого соединения после обеспечения указанным соединением клеток, или же имеется временной лаг между моментом времени, когда соединение добавляют, и временем начала модуляции барьерной функции. Кроме того, способ согласно настоящему изобретению можно применять для установления более слабовыраженного влияния соединения на клетки, чем влияния, приводящего к гибели клетки или ее выживанию. Измерение барьерной функции эпителия, т.е. целостности границ, при добавлении соединения, дает значение токсичности, которая является еще более слабовыраженной, чем такая же оценка при гибели/выживании клетки. Исследуемое соединение может, например, препятствовать образованию плотных контактов клеточного слоя, или ингибировать или уменьшать способность слоя клеток или цилиндрической структуры к самовосстановлению, а также вызывать гибель клеток (но не всех).
Задача, которая решается при помощи способа согласно настоящему изобретению, состоит в том, что проведение количественного анализа живых/мертвых клеток (live/dead-анализа) при работе с поточными системами, т.е. с микрофлюидными системами, применяемыми в способе согласно настоящему изобретению, затруднен, а может и невозможен. При наличии потока погибшие клетки вымываются, и в то же время эпителиальный барьер имеет определенную регенеративную способность, которая компенсирует гибель клеток. Измерение целостности барьера, таким образом, явно свидетельствует о потери функции, регенеративной способности или гибели клеток, которые легко измерить с применением способа согласно настоящему изобретения.
На практике также было обнаружено, что токсические эффекты, влияющее на целостность границы, не происходят мгновенно, однако могут произойти в конкретный момент времени. Было также обнаружено, что момент времени, в который нарушается целостность границы, связан с концентрацией добавляемого соединения. Фактически авторы настоящего изобретения полагают, что концентрация соединения влияет на гибель клеток в сравнении с соотношением регенеративной способности или плотными контактами как функции от времени. Таким образом, время между введением соединения и моментом времени, при котором можно измерить неблагоприятный эффект от потери целостности барьера, таким образом, представляет собой важную оценку токсического влияния соединения при определенной концентрации. В особо предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению указанный способ дополнительно включает стадию:
f) определения по данным сигналов, полученных на стадии е), времени, прошедшего с момента времени обеспечения эпителиальных клеток исследуемым соединением и/или зондом до момента времени, при котором достигается заданное значение или заданное изменение значения флуоресценции в микрофлюидном канале и/или в геле, или до момента времени, при котором достигается заданное значение или заданное изменение значения соотношения флуоресценции в микрофлюидном канале (апикальная сторона) и геле (базолатеральная сторона).
В таком предпочтительном варианте реализации время между обеспечением эпителиальных клеток исследуемым соединением и/или зондом и моментом времени, когда конкретное заданное значение или изменение значения сигнала, достигнутого либо на апикальной стороне, либо на базолатеральной стороне, или как на апикальной, так и базолатеральной стороне, рассчитывают для исследуемого соединения при исследуемой концентрации.
Полученные таким образом значения являются оценкой «времени до утечки» и их можно сравнивать в различных условиях для исследования, например, сравнивая время от момента добавления исследуемого соединения и/или зонда до времени получения заданного значения для различных исследуемых концентраций исследуемого соединения. Как это объяснено, такие данные являются важной оценкой токсического влияния соединения при определенной концентрации, и их впервые можно получить с применением способа согласно настоящему изобретению. Заданное значение будет зависеть от типа применяемых клеток, и его можно определить эмпирическим путем. Например, заданное значение может быть основано на результатах, полученных с применением эталонного (референсного) соединения, или может быть основано на результатах, полученных с применением контролей. Например, когда для эталонного соединения А известно, что при заданной концентрации определенное соотношение между сигналом на апикальной стороне и на базолатеральной стороне (например, соотношение сигнала в канале со средой и сигнала в геле) достигается после, например, 20 минут, такое соотношение можно применять в качестве эталонного критерия для исследования модулирующего влияния других соединений. Кроме того, время до утечки для различных концентраций исследуемого соединения можно сравнивать с применением способа согласно настоящему изобретению.
Более того, в некоторых вариантах реализации способа согласно настоящему изобретению указанный способ осуществляют для более, чем одной концентрации исследуемого соединения, при этом в предпочтительном варианте стадию f) определяют для более, чем одной концентрации исследуемого соединения. В этих вариантах реализации можно сравнивать различные концентрации исследуемого соединения (например, 1, 2, 3, 4, 5 … 10 различных концентраций). Кроме того, и в некоторых вариантах реализации, можно сравнить различные исследуемые соединения или смеси исследуемых соединений, например, смеси из 2, 3, 4, 5, … 10 различных исследуемых соединений, в предпочтительном варианте при различных концентрациях.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором определяют влияние исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия, в предпочтительном варианте одновременно, т.е. в том же эксперименте, в более, чем одном из микрофлюидных каналов, содержащем культивируемые эпителиальные клетки, при этом в предпочтительном варианте влияние более, чем одной концентрации исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия определяют одновременно, т.е., иными словами, в рамках одного и того же эксперимента. На практике при таком варианте реализации сигнал, обеспечиваемый в разных каналах, измеряют последовательно, при этом определяют влияние исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия, в предпочтительном варианте одновременно.
Благодаря способу согласно настоящему изобретению стало возможным определение модулирующего влияния исследуемых соединений в одном и том же эксперименте в динамике и в различных условиях. Поэтому в некоторых вариантах реализации исследуемое соединение обеспечивают в более, чем одном микрофлюидном канале (или сети каналов) в том же эксперименте. В некоторых вариантах реализации концентрация исследуемого соединения, которое обеспечивают для различных каналов, одинакова, в других вариантах реализации концентрацию исследуемого соединения, которое обеспечивают для различных каналов, изменяют по каналам. Способ согласно настоящему изобретению позволяет определять в одном эксперименте и, таким образом, применять слои эпителиальных клеток, которые получают в тех же условиях, влияние соединения на барьерную функцию эпителия при значении концентрации в динамике, влияние различных концентраций в динамике, полученную в по меньшей мере одном канале, содержащем слой клеток. Это позволяет получить хорошее качество и хорошие примеры данных.
Квалифицированному специалисту будет понятно, что в зависимости от пожеланий пользователя способ согласно настоящему изобретению можно также применять для исследования различных соединений при одной или разных концентрациях в динамике в одном и том же эксперименте (т.е. одновременно). Таким образом, в некоторых вариантах реализации предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором независимо друг от друга влияние более, чем одного исследуемого соединения на барьерную функцию эпителия определяют одновременно, т.е. в том же эксперименте, определенную по меньшей мере в части многочисленных микрофлюидных каналов (или сети каналов), содержащих культивируемые эпителиальные клетки.
В таком варианте реализации клетки, выращенные в одинаковых условиях, но в разных каналах, в предпочтительном варианте в тех же микрофлюидных системах, обрабатывают различными исследуемыми соединениями (или в отдельных случаях смесью исследуемых соединений, или клетки в одном канале последовательно обрабатывают различными соединениями), и определяют влияние в динамике, и в предпочтительных вариантах реализации при различных концентрациях.
Как описано в настоящем документе, хотя в предпочтительном варианте слой клеток, который находится в контакте с гелем, является непроницаемым, т.е. зонд не диффундирует или не перемещается от одной стороны к другой стороне (например, от апикальной к базолатеральной стороне), или делает это только до определенной степени, это не является обязательным для способа согласно настоящему изобретению. Фактически, в некоторых вариантах реализации определенный (ограниченный) уровень диффузии является предпочтительным, поскольку он позволяет исследовать, может ли соединение модулировать барьерную функцию эпителия путем его восстановления (как это измеряют через уменьшение диффузии зонда). В альтернативном варианте предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором до этапа d) или одновременно с ним барьерную функцию нарушают.
Согласно настоящему изобретению нарушение (в предпочтительном варианте многократное) можно получить в слое (в предпочтительном варианте конфлюентном) клеток. Один из способов получения такого нарушения заключается в замораживании части клеток в клеточном слое, в ином случае гибели такой части клеток, например, с применением лазерного излучения, определенных соединений, ультразвуковых или акустических сигналов, пузырьков или взрывов, абразивных микроносителей или путем добавления соединения, которое, как было показано либо на основе собственных экспериментов, либо на основе литературных данных воспроизводимо разрушает клеточный слой.
Затем для начала исследования добавляют исследуемое соединение. Обычно обработка происходит сразу же после разрушения культуры, но иногда культуру обрабатывают подлежащим исследованию материалом перед разрушением для определения конкретного типа влияния. Для целей этой процедуры обработку можно осуществлять любым способом обработки культуры исследуемым соединением. Конкретный способ обработки варьируется в зависимости от свойств вещества.
Определение уровня, при котором вещество ингибирует, стимулирует разрушение, или в ином случае эффектов, которые приводят к прекращению разрушения, достигают путем сравнения влияния различных количеств вещества, например, с применением описанных в настоящем документе серийных разведений.
В некоторых вариантах реализации клетки обеспечивают исследуемым соединением еще до того, как клеточный слой обеспечивают зондом. В некоторых вариантах реализации клетки обеспечивают исследуемым соединением после того, как слой клеток обеспечивают зондом. В некоторых вариантах реализации исследуемое соединение обеспечивают одновременно с зондом, которым обеспечивают клеточный слой. Как было указано выше, в предпочтительном варианте клетки находятся в форме канальцев или сосуда. Такие канальцы или сосуд представляют собой более физиологически релевантное состояние в том случае, когда дело касается кровеносных или лимфатических сосудов или канальцев, таких как проксимальные канальцы. Причина заключается в том, что механические сигналы, которые испытывают клетки, похожи на те, которые наблюдают in vivo, и клетки обладают четко выраженной люминальной стороной, через которую может проходить поток (но это не является строго обязательным). Хотя как исследуемое соединение, так и зонд можно обеспечить на одной и той же стороне (т.е. на апикальной стороне, базолатеральной стороне или на них обеих), их также можно обеспечить на разных сторонах (например, исследуемое соединение обеспечивают на базолатеральной стороне, тогда как соединение, подлежащее исследованию, обеспечивают на апикальной стороне, или, если это необходимо, на апикальной и базолатеральной стороне). Таким образом, предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором клетки обеспечивают исследуемым соединением до, после или одновременно с зондом. Время между обеспечением исследуемым соединением и зондом может варьироваться в зависимости от экспериментальной установки. В некоторых вариантах реализации период времени составляет менее одной, пяти, десяти или тридцати минут. В другом варианте реализации период времени составляет примерно 10, 30, 60 секунд или примерно 5, 10, 30, 60 минут или примерно 1, 2, 6, 12, 24 или 48 часов.
В некоторых вариантах реализации клетки обеспечивают более, чем одним типом зонда. В некоторых вариантах реализации зонд обеспечивают после обеспечения исследуемого соединения. В некоторых вариантах реализации еще один (дополнительный) зонд обеспечивают после того, как будут обеспечены первый зонд и исследуемое соединение, например, через некоторое время после того, как клетки обеспечили исследуемым соединением и указанным первым зондом. Такой вариант реализации можно, например, применять в экспериментах, направленных на обнаружение в первую очередь разрушения или восстановления слоя эпителиальных клеток (включая канальцы) с применением первого зонда с последующим определением восстановления или разрушения при помощи второго зонда, например, после удаления первого исследуемого соединения или после периода обработки исследуемым соединением (например, оценка адаптации и тому подобное с применением клеток).
В некоторых вариантах реализации клетки обеспечивают более, чем одним исследуемым соединением. Можно исследовать смеси соединений, например, чтобы определить, взаимодействует ли одно соединение в исследуемой смеси с другим соединением в указанной смеси, тем самым модулируя его влияние на барьерную функцию эпителия. На барьерную функцию исследуемые соединения в смеси также могут действовать синергетически, или они могут антагонизировать друг друга.
Более того, хотя слой клеток не обязательно должен быть непроницаемым, и некоторая диффузия зонда допустима в начале эксперимента (т.е. при добавлении исследуемого соединения), в предпочтительном варианте реализации клеточный слой является непроницаемым, т.е. практически отсутствует или по существу не происходит диффузии зонда при наблюдении в том случае, когда им обеспечивают клетки в отсутствие исследуемого соединения. В этой связи в настоящем изобретении также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором клетки, культивируемые на стадии с), образуют монослой, при этом в предпочтительном варианте указанный монослой по существу не позволяет зонду диффундировать с апикальной стороны к базолатеральной стороне и/или с апикальной стороны к базолатеральной стороне. В контексте настоящего изобретения можно считать, что слой эпителиальных клеток является непроницаемым в случае, когда менее, чем примерно 10%, в предпочтительном варианте менее, чем примерно 5%, в еще более предпочтительном варианте менее, чем примерно 1%, 0,1%, 0,01% сигнала диффундирует с одной стороны (например, с апикальной) к другой стороне (в данном примере, к базолатеральной) в течение 5, 10, 20 или 30 минут после добавления. Это число будет частично зависеть от применяемого зонда, а также от типа применяемых клеток. В некоторых вариантах реализации в предпочтительном варианте диффузия или перемещение в начале экспериментов и до того момента, как клетки будут обеспечивать каким-либо исследуемым соединением, составляет не более 50%, 40%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или менее от скорости диффузии, наблюдаемой в той же системе при отсутствии каких-либо клеток. На практике часто применяют (незначительное) избыточное давление флюида на стороне зонда, чтобы ускорить «утечку соединения» и, таким образом, получить более четкий сигнал. Это возможно, поскольку в геле присутствует интерстициальный поток. Например, можно добавить 100 микролитров среды, содержащей исследуемое соединение и зонд, в резервуары, которые сообщаются с внутренней стороной клеточного слоя/канальца, и только 20 микролитров среды в резервуары, которые сообщаются с другой стороной канальца. Таким образом, незначительное избыточное давление создают на внутренней стороне, что обеспечивает четкий сигнал, когда происходит разрушение барьера.
Как описано в настоящем документе, стадия е) включает определение в различные моменты времени сигнала, который обеспечивает зонд в микрофлюидном канале или в геле, или как в микрофлюидном канале, так и в геле. Квалифицированный специалист понимает, что такое определение в различные моменты времени будет указывать на то, что по меньшей мере в течение двух моментов времени (во время эксперимента/способа) зонд (также упоминаемый как маркерное вещество) определяют, например, на апикальной стороне и/или базолатеральной стороне (или даже в присутствии клеток) клеток. Другими словами, зонд (сигнал, обеспечиваемый зондом) определяют в динамике и по меньшей мере в два разных момента времени. Квалифицированный специалист понимает, что в зависимости от, например, цели эксперимента или анализа, он может варьировать момент времени начала первого измерения/определения, время между двумя измерениями, общее число измерений, период одного измерения, общую продолжительность измерения и т.д. Например, указанный специалист может выполнить первое измерение перед добавлением исследуемого соединения, через 1 секунду после введения исследуемых соединений, через 1 час, 12 часов, 1 день, 3 дня и так далее. Например, он может производить измерения каждые 1 секунду, каждую 1 минуту и каждый 1 час, каждые 6 часов, каждый день, каждую неделю или каждый месяц, и в любой момент времени, который находится в пределе указанных временных промежутков или выходит за него, если это необходимо. Например, измерения можно проводить в течение менее секунды или более секунды, менее или более минуты, менее или более часа, менее или более 6 часов, менее или более дня, недели или месяца. Например, время между двумя измерениями может составлять менее или более секунды или менее или более минуты, менее или боле часа, менее или боле 6 часов, менее или более дня, недели или месяца и т.д.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором два последовательных момента времени на стадии е) находятся друг от друга в интервале от 1 секунды до 24 часов. Сигнал, обеспечиваемый зондом, в способе согласно настоящему изобретению определяют в различные моменты времени. Можно варьировать период между двумя моментами времени. Например, период между первым и вторым моментом времени может составлять 5 секунд, тогда как период времени между вторым и третьим моментом времени составляет 10 минут. В принципе, период времени между двумя моментами времени может представлять собой любой подходящий период. Однако на практике время между моментами времени должно быть таким, чтобы можно было получать достоверные данные для каждого момента времени. Например, период времени между первым рассматриваемым моментом времени может быть относительно коротким, тогда как период времени между более поздними моментами времени может быть относительно продолжительным. Тем не менее, в случае, если из полученных экспериментальных данных возникает понимание, что изменение барьерной функции эпителия появляется в интервале, в котором период между двумя моментами времени является относительно продолжительным, указанный эксперимент можно повторить при более коротком периоде времени в указанном интервале, чтобы более точно определить изменения барьерной функции эпителия. Обычно период между двумя находящимися друг от друга моментами времени может составлять от 1 секунды до 24 часов, например, 1 секунда и 20 минут. В этом же случае следует отметить, что не каждый период между двумя моментами времени должен быть одним и тем же или должен находиться в заданном диапазоне.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором различные моменты времени на этапе е) находятся в интервале между 10 минутами и 4 неделями включительно (например, 28 дней). Хотя эксперимент можно продолжать, а измерение можно осуществлять в большинство различных моментов времени, было обнаружено, что в целом модулирующее влияние соединения на барьерную функцию эпителия, в частности, токсические эффекты, происходит довольно быстро после добавления исследуемого соединения. Таким образом, в некоторых вариантах реализации общий период, в котором сигнал определяют в разные моменты времени, может составлять от 10 минут до 4 недель включительно (например, 28 дней).
В этом отношении следует отметить, что первое измерение необязательно следует выполнять сразу же после того, как клетки обеспечивают химическим соединением и/или зондом. Как было указано, клетки можно обеспечить исследуемым соединение за несколько минут или часов до того, как будут обеспечивать зонд, например, чтобы позволить исследуемому соединению проявить свое действие в отношении барьерной функции эпителия. В таком варианте реализации первое измерение можно произвести через несколько часов после добавления исследуемого соединения, и его может продолжать, например, в течение от 10 минут до 4 недель (например, 28 дней).
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором рядом с гелем присутствует еще один (дополнительный) канал, который находится в контакте с гелем, причем указанный канал не находится в непосредственном контакте с микрофлюидным каналом, содержащим культивируемые эпителиальные клетки.
Указанный дополнительный канал находится в непосредственном контакте с гелем, однако он отделен от микрофлюидного канала, содержащего культивируемые эпителиальные клетки, указанным гелем (и клетками, образующими монослой на указанном геле). Таким образом, дополнительный канал представляет собой часть базолатеральной стороны, и его можно применять, как это описано в настоящем документе, для измерения сигнала, обеспечиваемого зондом, или для добавления исследуемых соединений или других соединений на базолатеральную сторону клеток. Исследуемые соединения и зонды могут диффундировать через гель, чтобы достичь базолатеральной стороны клеток, или они могут диффундировать через гель, чтобы достичь флюида в дополнительном канале.
Также предложен способ, описанный выше, в котором в указанном еще одном (дополнительном) канале присутствует поток, который удаляет зонд из геля, и при этом в предпочтительном варианте определение сигнала, обеспечиваемого зондом на стадии е) в геле, включает измерение сигнала в потоке, присутствующем в указанном дополнительном канале, и/или в геле.
В целом и для различных описанных в настоящем документе вариантов реализации измерение можно проводить в микрофлюидном устройстве несколькими способами. Например, можно подавать
1) постоянный поток в канал, т.е. к стороне, которую обеспечивают датчиком (донорская сторона). В таком варианте реализации это вызывает постоянный источник зонда, например, на базолатеральной или апикальной стороне. Измерения в таких вариантах реализации в предпочтительном варианте выполняют на основе сигналов, полученных с другой стороны.
2) в альтернативном варианте поток к донорской стороне не подают, т.е. отсутствует постоянный источника зонда. В таком статическом варианте реализации диффузия зонда к другой стороне (т.е. к базолатеральной стороне/гелю/дополнительному каналу или к апикальной стороне/среде в микрофлюидном канале) приводит к уменьшению уровня зонда в канале, обеспеченного датчиком, что необходимо учитывать при интерпретации полученных данных.
3) к акцепторной стороне поток могут не подавать (т.е. к апикальной или базолатеральной стороне, к которой зонд может диффундировать, при добавлении к противоположной стороне (от апикальной к базолатеральной, от базолатеральной к апикальной)). Это приведет к накоплению зонда на такой стороне в динамике и, таким образом, это представляет собой полный показатель утечки в течение измеренного интервала времени. Такой вариант реализации, в частности, можно применять в том случае, когда базолатеральную сторону (т.е. гель) применяют в качестве акцепторной стороны.
4) к акцепторной стороне можно подавать постоянный поток. Это не вызывает накопление на акцепторной стороне (и возможное перераспределение зонда к донорской стороне). В этом случае показатель утечки в момент времени или показатель времени утечки в момент времени можно определить на акцепторной стороне (например, в геле в сочетании с дополнительным каналом, как это описано ниже).
В предпочтительном варианте реализации поток подают либо к донорской стороне, либо к акцепторной стороне, либо к обеим сторонам. В другом предпочтительном варианте реализации поток подают к одной стороне, и не подают к другой стороне. В предпочтительном варианте реализации поток подают к базолатеральной стороне. В другом варианте реализации поток подают к апикальной стороне. В варианте реализации поток подают только к донорской стороне. В еще одном варианте реализации исследуемое соединение добавляют к стороне, к которой поток не подают. В еще одном варианте реализации исследуемое соединение добавляют к стороне, к которой подают поток. В еще одном варианте реализации, в котором исследуемое соединение добавляют к стороне, к которой подают поток, указанный поток обеспечивает постоянную концентрацию на стороне, на которой обеспечивают соединение. В другом варианте реализации, в котором исследуемое соединение добавляют к стороне, к которой подают поток, после первоначального введения исследуемого соединения указанный поток не содержит или содержит в пониженной концентрации исследуемое соединение; что приводит к уменьшению концентрации исследуемого соединения на стороне, которую обеспечивают соединением. В еще одном варианте реализации после первоначального введения исследуемого соединения указанный поток содержит различные концентрации или увеличивающиеся концентрации соединения, что тем самым приводит к различным концентрациям или повышенной концентрации исследуемого соединения на стороне, которую обеспечивают исследуемым соединением.
Способ согласно настоящему изобретению позволяет не только определять модулирующее влияние исследуемых соединений или различных исследуемых соединений в динамике и/или при разных концентрациях, но и также позволяет воспроизводить исследование для определения модулирующего влияния исследуемого соединения или различных исследуемых соединений при по меньшей мере одной концентрации в динамике для различных эпителиальных клеток или для различных композиций слоев эпителиальных клеток. Таким образом, также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором на стадии b) различные типы эпителиальных клеток вводят в один и тот же микрофлюидный канал, и/или в котором на стадии b) различные микрофлюидные каналы обеспечивают различными типами эпителиальных клеток. Квалифицированный специалист хорошо осведомлен о том, как получить микрофлюидное устройство, содержащее более, чем один тип эпителиальных клеток. Такой вариант реализации позволяет обнаруживать, например, специфические для типа эпителиальных клеток эффекты исследуемого соединения.
Гель, применяемый в способе согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой подходящий гель до тех пор, пока предложенный тип эпителиальных клеток может образовывать на геле слой клеток с апикальной и базолатеральной стороной. Например, указанный гель может включать синтетические полимеры, природные полимеры или биополимеры, включая агарозу, желатин, декстран, хитозан, силикагель и им подобные.
Тем не менее, в предпочтительном варианте реализации гель содержит по меньшей мере один субстрат для роста и/или дифференцировки, как, например, коллаген, коллаген I, коллаген IV, фибронектин, ламинин, витронектин, D-лизин, энактин, гепарансульфидные протеогликаны, субстраты, аналогичные тканевым культурам, или их комбинации.
В другом варианте реализации гель содержит экстракт базальной мембраны, ткани человека или животных или внеклеточные матрицы, полученные из клеточных культур, внеклеточные матрицы, полученные из ткани животных, синтетические внеклеточные матрицы, гидрогели, коллаген, мягкий агар, яичный белок и коммерчески доступные продукты, как, например, Matrigel. Базальные мембраны представляют собой тонкие внеклеточные матрицы, на которых располагаются эпителиальные клетки in vivo, и которые состоят из внеклеточных матриц, таких как белок и протеогликаны. Хотя слой эпителиальных клеток, мультислой или монослой, предотвращает вторжение экзогенного материала из внешнего мира, действуя в качестве барьера, сама по себе базальная мембрана также действует как физический барьер. Таким образом, эпителиальные клетки, включающие эпителиальную ткань, совместно с базальной мембраной образуют твердый барьер и защищают внутренние процессы жизнедеятельности.
Они состоят из коллагена IV, ламинина, энактина, гепарансульфидных протеогликанов и других многочисленных второстепенных компонентов (Quaranta et al., Curr. Opin. Cell Biol., 6, 674-681, 1994). Эти компоненты по отдельности, также как и интактные базальные мембраны, биологически активны и способствуют адгезии клеток, миграции и, во многих случаях, росту и дифференцировке. Пример геля на основе базальных мембран называется Matrigel (патент США №4829000). Этот материал очень активен с биологической точки зрения in vitro в качестве субстрата для эпителиальных клеток.
Многие различные подходящие гели для применения в способе согласно настоящему изобретению коммерчески доступны и включают, но не ограничиваются ими, гели, включающие Matrigel rgf, ВМЕ1, BME1rgf, BME2, BME2rgf, ВМЕ3 (все варианты Matrigel), коллаген I, коллаген IV, смеси коллагена I и IV или смеси коллагена I и IV и коллагена II и III), пураматрикс, гидрогели, клетки Tak™, коллаген I, коллаген IV, матрицу Matrigel, фибронектин, желатин, ламинин, остеопонтин, полилизин (PDL, PLL), PDL/LM и PLO/LM, PuraMatrix или витронектин.
В одном предпочтительном варианте реализации матричные компоненты получают в виде коммерчески доступного геля Corning MATRIGEL Matrix (Corning, Нью-Йорк 14831, США)
MATRIGEL Matrix экстрагируют из мышиной опухоли Engelbreth-Holm-Swarm («EHS»), опухоли, которой обогащена базальная мембрана. Основными компонентами матрицы являются ламинин, коллаген IV, энактин и гепарин сульфат протеогликан («HSPG»). Матрица также содержит факторы роста, матричные металлопротеиназы (коллегеназы) и другие протеиназы (активаторы плазминогена), а также некоторые еще не определенные компоненты внеклеточного матрикса. При комнатной температуре гели MATRIGEL Matrix образуют восстановленную базальную мембрану.
Таким образом, в предпочтительном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором гель включает экстракт базальной мембраны, компонент внеклеточного матрикса, коллаген, коллаген I, коллаген IV, фибронектин, ламинин, витронектин, D-лизин, энтактин, гепарансульфидные протеогликаны или их комбинации, и при этом в предпочтительном варианте гель находится в непосредственном контакте с клеточным слоем без какой-либо разделяющей их физической мембраны.
В отличие от способов в данной области техники настоящее изобретение не основано на применение вставок из тканевых культур, имеющих проницаемую подложку, такую как вставку Transwell, уже описанную в настоящем документе. Такие вставки обычно изготавливают из поликарбоната, полиэфира, политетрафторэтилена, полистирола или полиэтилентерефталата, а также их других подобных веществ. К тому же такая подложка образует диффузионные барьеры, поскольку материал, из которого изготовлены эти вставки, недоступен, например, для зонда, применяемого в способе согласно настоящему изобретению. Неожиданно было обнаружено, что при применении геля в способе согласно настоящему изобретению, в котором гелю позволяют находиться в непосредственном контакте со слоем клеток и не образовывать физическую и непроницаемую мембрану между слоем клеток и гелем, негативные эффекты от наличия такого непроницаемого и не являющегося природным слоя устранены. Было обнаружено, что это, в частности, обеспечивает более чувствительное измерение модулирующего влияния соединения на барьерную функцию эпителия по сравнению с анализами, основанными на применении такой подложки или вставок, содержащих непроницаемый материал для обеспечения им подложки, и, тем самым, создания для по меньшей мере части клеток физического барьера.
Способ согласно настоящему изобретению можно применять для любого типа эпителиальных клеток (включая эндотелиальные клетки и мезотелиальные клетки), что можно увидеть из приведенных в настоящем документе примеров, демонстрирующих различные типы и виды эпителиальных клеток, которые можно культивировать в каналах микрофлюидной системы. Клетки могут представлять собой эпителиальные клетки животных, клетки линии эпителиальных клеток животных, первичные эпителиальные клетки животных, эпителиальные клетки млекопитающих, клетки линии эпителиальных клеток млекопитающих, первичные эпителиальные клетки млекопитающих, эпителиальные клетки человека, клетки линии эпителиальных клеток человека или первичные эпителиальные клетки человека. В контексте настоящего описания примеры эпителиальных клеток охватываются термином, который включает, но не ограничивается ими, клетки предстательной железы, клетки молочной железы, гепатоциты, клетки островков поджелудочной железы, включая бета-клетки, эпителиальные клетки легкого, клетки почки, клетки мочевого пузыря, эпителиальные клетки желудка, эпителиальные клетки толстого и тонкого кишечника, эпителиальные клетки уретры, эпителиальные клетки яичек, эпителиальные клетки яичника, эпителиальные клетки шейки матки, клетки щитовидной железы, клетки паращитовидной железы, клетки надпочечников, клетки тимуса, клетки желчного пузыря, клетки гипофиза. Как это описано в настоящем документе, клетки можно получить от любого животного, включая, но не ограничиваясь ими, любого млекопитающего, как, например, мыши, крысы, собаки, кошки, быка, лошади, свиньи, приматов, являющихся и не являющихся человеком. Клетки млекопитающих, особенно подходящие в настоящей среде, включают эпителиальные клетки человеческого происхождения, которые могут представлять собой первичные клетки, полученные из тканей, таких как, но не ограничиваясь ими, молочная железа, предстательная железа, печень, поджелудочная железа, почки, бронхи и трахея. Кроме того, можно применять трансформированные клетки или стабильную линию клеток. Клетки, применяемые в настоящем изобретении, могут представлять собой нормальные здоровые клетки, которые не поражены заболеванием или не изменены генетически, или клетки могут представлять собой клетки, которые поражены заболеванием или генетически изменены.
В контексте настоящего изобретения линия клеток относится к постоянно растущим или иммортализованным клеткам. Иногда, также упоминаемая как «иммортализованная линия клеток», линия клеток представляет собой популяцию клеток, полученную из многоклеточного организма, пролиферация которой обычно не происходит бесконечно, однако вследствие мутации у такой популяции не происходит нормального клеточного старения и вместо этого она может продолжать деление. Этот термин хорошо известен квалифицированному специалисту. Клетка линии клеток, таким образом, обозначает клетку, которая принадлежит к такой линии клеток. Примеры линий эпителиальных клеток, подходящих для способа согласно настоящему изобретению, включают клетки LLC-PK1 (клетки почки свиньи), клетки почки Malin-Darby Canine, наподобие клеток MDCKI, клетки MDCKII, клетки А549, НМЕС-1, ECV304, ЕаНу926, клетки Сасо-2, клетки CEBBe1, клетки НТ-29, клетки Т84 и клетки SK-CO15, или производные клеток, как, например, генетически модифицированные эпителиальные клетки, и многие другие.
В контексте настоящего изобретения первичные клетки представляют собой клетки, которые отбирают непосредственно из живой ткани (например, биопсийный материал) и которые стабильны для роста in vitro. Такие клетки претерпевают небольшое число удвоений популяции и поэтому являются более характерными для основного функционального компонента ткани, из которой их получают, по сравнению с перевиваемыми (опухолевыми или искусственно иммортализованными) линиями клеток, которые представляет собой более характерную модель для состояния in vivo.
Как первичные эпителиальные клетки, так и клетки линии эпителиальных клеток можно получить из различных коммерческих источников, в том числе от Американской коллекции типовых культур (АТТС).
Также предложен способ согласно любом одному из предыдущих пунктов, в котором определение сигнала, обеспечиваемого зондом на стадии е), включает измерение с применением устройства для визуализации, микроскопа, автоматизированного микроскопа, многопараметрического устройства для формирования изображения, планшета-ридера или многорежимного считывателя.
Подходящие способы и устройства для измерения сигнала хорошо известны квалифицированному специалисту, для которого не будет проблемой выбор подходящего способа. Многопараметрические устройства для формирования изображений можно получить, например, от компании Molecular Devices (Саннивейл, США) или других.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором микрофлюидное устройство обеспечивает непрерывный световой поток к микрофлюидному каналу и/или к гелю и/или к дополнительному каналу. Это позволяет обеспечивать непрерывное измерение сигнала либо на апикальной, либо на базолатеральной стороне, либо на обеих сторонах.
Модулирующее влияние (эффект) может представлять собой либо влияние, которое увеличивает барьерную функцию эпителия клеточного слоя, либо может представлять собой влияние, который уменьшает барьерную функцию эпителия клеточного слоя в микрофлюидной системе согласно настоящему изобретению. Предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором модулирующее влияние нарушает или восстанавливает барьерную функцию эпителия. В этом отношении интересно отметить, что были проведены эксперименты, которые показали, что изначально соединение уменьшало барьерную функцию эпителия (о чем свидетельствует изменение сигнала на акцепторной стороне (в данном случае в геле/на базолатеральной стороне), в то время как в более поздний момент времени функция эпителиального барьера заново улучшалась даже в присутствии указанного соединения. Это указывает на то, что способ согласно настоящему изобретению позволяет более точно обнаруживать модулирующее влияние соединения на барьерную функцию по сравнению со способами в данной области техники.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором на стадии d) эпителиальные клетки обеспечивают зондом до обеспечения исследуемым соединением, и при этом в предпочтительном варианте после обеспечения зондом сигнал, обеспечиваемый зондом в микрофлюидном канале или в геле, или как в микрофлюидном канале, так и в геле, определяют в различные моменты времени и до того, как обеспечивают исследуемое соединение.
Такой вариант реализации является подходящим для получения данных для сравнения в качестве контроля или для определения того, можно ли слой клеток применять для определения влияния исследуемых соединений на барьерную функцию. Например, если измерение при отсутствии исследуемого соединения уже показывает, что существует высокий уровень транспортировки зонда, слой клеток можно отбраковать для дальнейшего применения в способе согласно настоящему изобретению. В то же время такой вариант реализации позволяет определять «фоновую» активность.
Благодаря способу согласно настоящему изобретению теперь стало возможным одновременно/параллельно (т.е. в рамках одного и того же эксперимента) измерять множество различных исследуемых условий, что позволяет применять методы скрининга. Квалифицированный специалист понимает, что слово «одновременно» или «параллельно» в настоящем документе обозначают рамки одного и того же эксперимента. Измерения сигнала в рамках одного и того же эксперимента можно выполнять последовательно или параллельно, если это необходимо.
Таким образом, способ согласно настоящему изобретению можно осуществить с применением множества микрофлюидных каналов, в то же время содержащих эпителиальные клетки. В предпочтительном варианте реализации указанный способ представляет собой способ, в котором микрофлюидная система содержит по меньшей мере 3, в предпочтительном варианте более, чем 10, в еще более предпочтительном варианте примерно 40, 96, 256, 384 микрофлюидных канала, при этом в предпочтительном варианте в по меньшей мере 3, в предпочтительном варианте в более, чем 10, в еще более предпочтительном варианте в примерно 40, 96, 256, 384 микрофлюидных каналах, содержащих слой или трубочку эпителиальных клеток, измерения проводят одновременно, последовательно или параллельно.
Зонд, применяемый в способе согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой зонд, который может быть подходящим для применения в определении барьерной функции эпителия, определенной в настоящем документе. Такие зонды, применяемые при исследовании диффузии через слой эпителиальных клеток, хорошо известны квалифицированному специалисту. Хорошо известные примеры таких зондов включают флуоресцентный краситель Lucifer yellow, флуоресцентно меченный декстран или инулин, например, флуоресцеин или родамин, конъюгированный с декстраном или инулином, FITC-конъюгированный декстран, TRITC-конъюгированный декстран и FITC-конъюгированный инулин с различными молекулярными массами. Наиболее распространенная молекулярная масса для применения составляет 6 кДа, 75 кДа, 150 кДа или 400 кДа для FITC-декстрана, однако также можно применять и другую молекулярную массу.
В некоторых вариантах реализации применяют более, чем один зонд и при этом, например, каждый зонд характеризуется разным размером и/или разной определяемой меткой. Например, можно применять декстраны или инулины разного размера, конъюгированные с различной флуоресцентной группой, например, FITC (изотиоцианат флуоресцеина), нанодотами, родамином (тетраметилродамин изотиоцианат, TRITC) и им подобными.
Очевидно, что в контексте способа согласно настоящему изобретению можно применять любой тип репортерной молекулы, например, флуоресцентно меченые зонды с любым флуорофором (например, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 647, Oregon Green, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 680, Флуоресцеин (FITC), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 750, Су3, Alexa Fluor 532, Pacific Blue™, Pacific Orange™, Alexa Fluor 546, Кумарин, тетраметилродамин изотиоцианат (TRITC), Alexa Fluor 555, BODIPY FL, Texas Red, Alexa Fluor 568, Pacific Green™, Су5, Alexa Fluor 594, ДНК-красители, DAPI, SYTOX Green, SYTO 9, TO-PRO-3, пропидиум иодид, Qdot, Qdot 525, Qdot 565, Qdot 605, Qdot655, Qdot 705, Qdot 800, флуоресцентные белковые метки, R-фикоэритрин (R-PE), аллоцикоцианин (АРС), экспрессированные флуоресцентные белки, CFP, GFP (emGFP), RFP (tagRFP)) и т.д.
Подходящие нефлуоресцентные люминесцентные зонды включают GSH-Glo, МАО-Glo, Pgp-Glo, BacTiter-Glo, Viral Tox, GloNAD, (P) H-Glo, GSH-Glo и т.д.
+
+
+
Колориметрические зонды включают АЕС, АЕС, BCIP/NBT, DAB, Fuchsin, permanent red, alamar blue, MTT, Griess и т.д.
Квалифицированный специалист хорошо осведомлен о том, каким образом выбирать подходящий зонд для применения в способе согласно настоящему изобретению.
Что касается вышеизложенного, то в предпочтительном варианте реализации изобретения на стадии d) обеспечивают зонды разного размера, при этом в предпочтительном варианте каждый зонд разного размера помечают при помощи разной флуоресцентной метки.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором избыточное давление подают к стороне (базолатеральной или апикальной), которую обеспечивают зондом, при этом в предпочтительном варианте избыточное давление образуют путем добавления большего количества флюида к стороне, которую обеспечивают зондом, или к резервуарам, сообщающимся со стороной, которую обеспечивают зондом, по сравнению с количеством флюида на другой стороне или в резервуарах, сообщающихся с другой стороной.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в котором гель структурируют в микрофлюидном канале при помощи методик, основанных на капиллярном давлении, как, например, с применением столбиков, гребней, канавок, гидрофобных областей (патчей) или менее гидрофильных областей (патчей) в преимущественно более гидрофильном канале.
Также предложен способ согласно настоящему изобретению, в предпочтительном варианте способ по п. 19, в котором эпителиальные клетки обеспечивают по меньшей мере одним зондом одновременно с исследуемым соединением или в моменты времени после добавления исследуемого соединения и первого зонда, и при этом по меньшей мере один зонд можно отличить от указанного первого зонда, в предпочтительном варианте при помощи оптического средства.
Теперь, имея в целом описанное изобретение, то же описание будет более понятным посредством ссылки на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Примеры
На Фигуре 1 показан посев барьера против внеклеточной матрицы (ЕМС) в микрофлюидной платформе:
А) Схема посева клеток против внеклеточной матрицы (ЕСМ). В 2-полосной микрофлюидной платформе ЕСМ высевают в канал с гелем. После затвердевания ЕСМ клетки высевают в среду для культивирования в канале для культивирования. Планшет инкубируют на этой стороне, чтобы позволить клеткам осесть на поверхности ЕСМ под действием силы тяжести. После присоединения клеток индуцируют перфузионный поток. Зависимый от типа клеток клеточный барьер образуется против ЕСМ или полностью покрывает канал с перфузионной средой, образуя цилиндрической структуру. В) Пример образования цилиндрической структуры в перфузионном канале со средой. Клетки проксимальных канальцев свиньи LLC-PK1 высевают в перфузионный канал со средой против ЕСМ. Через 1 день после посева при помощи фазово-контрастной микроскопии наблюдают слой клеток, лежащий против ЕСМ. На 4 день клетки растут со всех четырех сторон перфузионного канала со средой. На 6 день образуется сплошной кофлюентный монослой.
На Фигуре 2 показано трехмерное конфокальное изображение барьера в 2-полосном микрофлюидном чипе.
Клетки проксимальных канальцев MDCK высевали против ЕСМ в 2-полосном микрофлюидном устройстве, как это описано в Фигуре 1. После того, как образование барьера наблюдали при помощи фазово-контрастной микроскопии, указанные клетки окрашивали с применением красителя для определения жизнеспособности клеток calcein-AM (Life Technologies, С1430), при этом жизнеспособные клетки метились как флуоресцентно зеленые. После фиксации клетки окрашивали при помощи ActinRed (Life Technologies, R37112) и визуализировали с применением конфокальной микроскопии (Leica, TCS SP5 STED). 3D-проекцию создали с применением прибора для 3D-наблюдения Fiji, подключаемого к источнику питания (Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. & Frize, E. et al. (2012), «Fiji: an open-source platform for biological-image analysis», Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772). На срезе показано образование конфлюентного барьера клеток против ЕСМ. Доступ к апикальной стороне барьера можно получить через перфузионный канал со средой, тогда как базальная сторона находится в свободном доступе от канала с гелем.
Фигура 3: Анализ целостности барьера
Целостность клеточного барьера, культивируемого, например, так, как показано в Фигурах 1 и 2, можно исследовать путем замены среды в перфузионном канале средой, содержащей 500 мкг/мл FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа (Sigma, 46946). А) В том случае, если клеточный барьер является непроницаемым, флуоресцентный сигнал будет находиться в перфузионном канале, тогда как в случае микрофлюидного чипа без содержания клеток, с содержанием только ЕСМ в канале с гелем, флуоресцентный сигнал будет проникать в ЕСМ и насыщаться в течение нескольких минут. Флуоресцентный сигнал в перфузионном канале и канале с гелем можно отслеживать в режиме реального времени с применением цейтраферной флуоресцентной микроскопии, как, например, с применением микроскопа ImageXpress Micro (Molecular Devices). В) Интенсивность флуоресцентного сигнала FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа количественно определяли в верхнем перфузионном канале и канале с гелем с применением программного обеспечения для проведения анализов FIJI (Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. & Frize, E. et al. (2012), «Fiji: an open-source platform for biological-image analysis», Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772). С) Показатель интенсивности канала с гелем делили на показатель интенсивности в верхнем перфузионном канале, и указанное соотношение откладывали на графике в зависимости от времени после начала добавления флуоресцентного репортера. Без клеточного барьера ЕСМ насыщается в течение нескольких минут после добавления красителя, тогда как соотношение, близкое к нулю, сохраняется до тех пор, пока клеточный барьер находится в интактном состоянии.
На Фигуре 4 показан анализ целостности барьера клеток LLC-PK1 при обработки стауроспорином.
6
2
Линию клеток проксимального канальца свиньи LLC-PK1 (АТСС, CL-101, пассаж 210) высевали в количестве 10*10 клеток/мл в верхний перфузионный канал 200 мкм 3-полосного планшета OrganoPlate™ против ЕСМ, содержащей коллаген I (Cultrex, Amsbio, 3447-020-01,4 мг/мл). К входному и выходному отверстию верхнего перфузионного канала добавляли 60 мкл среды. Планшет инкубировали на этой стороне в течение ночи, чтобы позволить клеткам осесть на поверхности ЕСМ. На 1 день после посева 60 мкл среды добавляли к среде на входном и выходном отверстии нижнего перфузионного канала, и планшет плотно размещали в инкубаторе. На 4 день после посева планшета помещали на встряхиватель-качалку для обеспечения непрерывной перфузии среды (угол 7°, наклон каждые 8 мин). На 6 день после посева исследовали непроницаемость LLC-PK1-канальцев путем замены среды в верхнем перфузионном канале средой, содержащей 500 мкг/мл FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа (Sigma, 46946). Объемы составляли 60 мкл/40 мкл в верхнем перфузионном канале, 0 мкл/0 мкл в среднем канале с ЕСМ, 40 мкл/40 мкл стандартной среды для культивирования в нижнем перфузионном канале. Канальцы, которые не показывали создаваемый FITC-декстраном сигнал в ЕСМ через 15 мин после добавления, считались непроницаемыми, и их выбирали для обработки стауроспорином. Среду в верхнем перфузионном канале заменяли средой, содержащей 500 мкг/мл FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа и 0, 1, 5 или 10 мкМ неселективного ингибитора киназ стауроспорина (Sigma, S4400). Объемы составляли 60 мкл/40 мкл в верхнем перфузионном канале, 0 мкл/0 мкл в среднем канале с ЕСМ, 40 мкл/40 мкл стандартной среды для культивирования в нижнем перфузионном канале. Планшет размещали в EVOS FL auto (Live Technologies) в условиях 5% СО, 37°С, в увлажненных условиях для инкубации. Микрофлюидные чипы визуализировали методом фазового контраста и флуоресцентными методами (FITC) с применением объектива с 4-кратным увеличением каждые 15 мин в течение 16 часов. Показаны примеры моментов времени. При отсутствии обработки стауроспорином LLC-PK1-трубочка остается непроницаемой в течение всего эксперимента. С увеличивающимися концентрациями стауроспорина целостность LLC-PK1-барьера нарушается в более ранний момент времени.
На Фигуре 5 показана количественная оценка анализа целостности LLC-PK1-барьера при обработке стауроспорином: интенсивность флуоресцентного сигнала FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа количественно определяли в верхнем перфузионном канале и канале с гелем Фигуры 4 с применением программного обеспечения для проведения анализа FIJI (Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. & Frize, E. et al. (2012), «Fiji: an open-source platform for biological-image analysis», Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772). Показатель интенсивности канала с гелем делили на показатель интенсивности в верхнем перфузионном канале, и указанное соотношение откладывали на графике в зависимости от времени после начала обработки стауроспорином. Увеличение соотношения означает увеличение флуоресцентного сигнала в канале с гелем, что свидетельствует о нарушении целостности LLC-PK1-барьера.
6
На Фигуре 6 показан аналогичный эксперимент, описанный в Фигуре 4, с линией клеток почечного канальца различного происхождения. Линию клеток MDCK (клетки, полученные от собаки) высевали в количестве 10*10 клеток/мл в верхний перфузионный канал 400 мкм 3-полосного планшета OrganoPlate™ против ЕСМ, содержащей коллаген I (Cultrex, Amsbio, 3447-020-01, 4 мг/мл). К входному и выходному отверстию верхнего перфузионного канала добавляли 60 мкл среды. Планшет инкубировали на этой стороне в течение 3 часов, чтобы позволить клеткам осесть на поверхности ЕСМ. Через 3 часа после посева 60 мкл среды добавляли к среде во входном и выходном отверстии нижнего перфузионного канала, и планшет размещали на встряхивателе-качалке для обеспечения непрерывной перфузии среды (угол 7°, наклон каждые 8 мин). На 5 день после посева исследовали непроницаемость MDCK-канальцев путем замены среды в верхнем перфузионном канале средой, содержащей 500 мкг/мл FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа (Sigma, 46946). Объемы составляли 40 мкл во входном отверстии/30 мкл в выходном отверстии верхнего перфузионного канала, 0 мкл во входном отверстии/0 мкл в выходном отверстии среднего канала с ЕСМ, 20 мкл во входном отверстии/20 мкл в выходном отверстии стандартной среды для культивирования в нижнем перфузионном канале. Канальцы, которые не показывали образуемый FITC-декстраном сигнал в ЕСМ через 15 мин после добавления, считались непроницаемыми, и их выбирали для обработки стауроспорином. Среду в верхнем перфузионном канале заменяли средой, содержащей 500 мкг/мл FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа и 0, 1, 5 или 10 мкМ неселективного ингибитора киназ стауроспорина (Sigma, S4400). Объемы составляли 40 мкл во входном отверстии/30 мкл в выходном отверстии верхнего перфузионного канала, 0 мкл во входном отверстии/0 мкл в выходном отверстии среднего канала с ЕСМ, 20 мкл во входном канале/20 мкл в выходном канале стандартной среды для культивирования в нижнем перфузионном канале.
Планшет помещали под микроскоп ImageXpress Micro XLS с широким полем зрения (Molecular Devices) при 5% CO2, 37°С и увлажненных условиях для инкубации. Микрофлюидные чипы визуализировали при помощи флуоресцентных методов анализа (FITC) с применением объективов с 4-х кратным увеличением каждый час в течение 15 часов. Показаны примеры моментов времени. При отсутствии обработки стауроспорином MDCK-трубочка остается непроницаемой в течение всего эксперимента. С увеличивающимися концентрациями стауроспорина целостность MDCK-барьера нарушается в более ранний момент времени.
50
50
На Фигуре 7 показана количественная оценка анализа целостности барьера в присутствии клеток MDCK при обработке стауроспорином из Фигуры 6. Интенсивность флуоресцентного сигнала FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа количественно определяли в верхнем перфузионном канале и канале с гелем Фигуры 4 с применением программного обеспечения для проведения анализа FIJI (Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. & Frize, E. et al. (2012), «Fiji: an open-source platform for biological-image analysis», Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772). Показатель интенсивности канала с гелем делили на показатель интенсивности в верхнем перфузионном канале, и указанное соотношение откладывали на графике в зависимости от времени после начала обработки стауроспорином. Увеличение соотношения означает увеличение флуоресцентного сигнала в канале с гелем, что указывает на нарушение целостности MDCK-барьера. Определение концентрации для значения времени до утечки: можно задать пороговое значение для соотношения интенсивности, например, 0,4. Момент времени, соответствующий этому соотношению для каждой концентрации соединения, применяемой для обработки, откладывают на графике в зависимости от концентрации. Можно определить характерную для соединения концентрацию, основываясь на времени до утечки, сопоставимую со значением IC. Значение времени до утечки (например, через 2 часа после добавления соединения) следует определять на основе экспериментов по валидации для обеспечения максимальной значимости in vivo. Такой момент времени как время до утечки можно установить при одинаковом значении для всех соединений (как и для значения IC), или его можно сделать зависимым, например, период полувыведения соединения.
50
На Фигуре 8 показана дополнительная интерпретация данных графика Фигуры 7. В момент времени, когда значение флуоресценции, пропущенное через трубочку, равна пороговому соотношению (в настоящем описании заданное на уровне 0,4), считается, что целостность трубочки нарушается. Потерю целостности барьера можно отложить на так называемом графике выживаемости (график Каплана-Мейера), как это показано в настоящем описании. Этот подход является особенно подходящим для случаев, когда для точного определения ЕС данных недостаточно. Такой пример приведен на Фигуре 11.
6
2
На Фигуре 9 показана кривая зависимости доза-ответ, получаемая каждый раз для анализа целостности барьера с применением показателя времени до утечки для клеток кишечного канала человека, обработанных стауроспорином. Линию клеток Сасо-2 (Sigma, клетки карциномы толстой кишки человека) высевали в 400 мкл 3-полосный планшет OrganoPlate в количестве 10*10 клеток/мл, помещали на бок для присоединения клеток к ЕСМ в течение 2 часов, и затем помещали на модифицированный встряхиватель-качалку для обеспечения непрерывной перфузии среды. Через три дня после посева исследовали непроницаемость Caco-2-канальцев путем замены среды в верхнем перфузионном канале средой, содержащей 0,25 мг/мл TRITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа. Канальцы, для которых не наблюдали утечки флуоресцентного красителя в компартмент с ЕСМ в течение 30 мин, считались непроницаемыми, и их применяли для обработки соединением. Среду в верхнем канале со средой заменяли средой с TRITC-декстраном и увеличивающимися концентрациями аспирина. Планшет помещали под микроскоп ImageXpress Micro XLS в условиях контролируемой температуры и СО, и визуализировали для определения сигнала флуоресцентного соединения (TRITC) каждый час в течение 13 часов. Кривую доза-ответ можно получить в каждый момент времени, начиная с момента обработки Caco-2-трубочек. GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., Ла-Холья, штат Калифорния) применяли для подгонки кривой доза-эффект, основанной на нелинейной регрессии логарифма концентрации соединения в сравнении с нормированной флуоресценцией, допуская наличие верхнего и нижнего плато при 0 и 100% флуоресценции. С увеличением времени обработки наблюдают сдвиг в сторону более низких концентраций соединений.
50
50
50
На Фигуре 10 показано экспоненциальное уменьшение значения ЕС ответа на дозу Caco-2-трубочки из Фигуры 9 в динамике. Это наблюдают при построении графика полученных значений ЕС во времени. 95% доверительный интервал для полученных значений EC указывает на устойчивые данные между 3 и 13 часами обработки.
6
2
50
На Фигуре 11 изображена потеря барьерной функции клетками кишечного канальца, обработанных аспирином. Линию клеток Сасо-2 (Sigma, клетки карциномы толстой кишки человека) высевали в 400 мкл 3-полосный планшет OrganoPlate в количестве 10*10клеток/мл, помещали на бок для присоединения клеток к ЕСМ в течение 2 часов, а затем помещали на модифицированный встряхиватель-качалку для обеспечения непрерывной перфузии среды. Через три дня после посева исследовали непроницаемость Сасо-2-канальцев путем замены среды в верхнем перфузионном канале средой, содержащей 0,25 мг/мл TRITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа. Канальцы, для которых не наблюдали утечки флуоресцентного красителя в компартмент с ЕСМ в течение 30 мин, считались непроницаемыми, и их применяли для обработки соединением. Среду в верхнем канале со средой заменяли средой с TRITC-декстраном и увеличивающимися концентрациями аспирина. Планшет помещали под микроскоп ImageXpress Micro XLS в условиях контролируемой температуры и СО, и визуализировали для определения сигнала флуоресцентного соединения (TRITC) каждый час в течение 24 часов. Хотя аспирин и является менее мощным токсикантом для кишечника, данные флуоресценции показывают потерю барьерной функции при концентрациях 40 мМ и 12,12 мМ. Тем не менее, отсутствие данных о концентрациях с максимальным ответом затрудняет точную оценку ЕС. Кривая Каплана-Мейера, изображенная в настоящем описании, тем не менее, демонстрирует достаточно значимую тенденцию к потере барьерной функции при более высокой концентрации (Р <0,0001 для достоверной разницы как для кривой, так и для тренда). В анализе на основе OrganoPlate авторы настоящего изобретения наблюдали ярко выраженную потерю целостности барьера при обеих концентрациях в 40 и 12 мМ, и даже при концентрации 3,7 мМ. Несмотря на то, что невозможно точно подобрать истинную кривую доза-ответ, 50% эффект наблюдали для концентрации 40 мМ при 10-часовой обработке и для концентрации 12 мМ при 20-часовой обработке.
6
2
На Фигуре 12 показан график Каплана-Майера для индуцированной лекарственным средством потери целостности барьера клетками проксимального канальца почки человека, обработанных амфотецерином В. Клетки проксимального канальца почки человека (RPTEC, Sigma) высевают в 400 мкл 3-полосный планшет OrganoPlate в концентрации 20*10 клеток/мл, помещали на бок для присоединения клеток к ЕСМ, и затем помещали на модифицированный встряхиватель-качалку для обеспечения непрерывной перфузии среды. Через восемь дней в культуре >95% высеянных канальцев продемонстрировали непроницаемость при добавлении FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа к среде в люминальном компартменте. Среду в трубочках заменяли средой, содержащей увеличивающиеся концентрации токсичного для почек амфотецерина В и флуоресцентного FITC-декстрана. Планшет помещали под микроскоп ImageXpress Micro XLS в условиях контролируемой температуры и СО, и визуализировали для определения сигнала флуоресцентного соединения (FITC) каждый час в течение 60 часов. Сохранение целостности трубочки, изображенное в настоящем описании, показывает значимую разницу между трубочками, которые не подвергались обработке (среда, носитель 1, представляющий контроль, и носитель 2, представляющий контроль) и которые подвергались обработке. IC обозначает ингибиторный коктейль из 3 ингибиторов эффлюксного переносчика.
На Фигуре 13 показано различие во времени до утечки в случае, когда каналец обрабатывают токсичным соединением только с апикальной (люминальной) или базолатеральной стороны. 3-полосный планшет OrganoPlate предлагает уникальную возможность добавлять соединения только на апикальную или базолатеральную сторону цилиндрической структуры. У соединений, которые могут пассивно проникать в клетки посредством диффузии (например, у стауроспорина), отсутствует направленность при поглощении клетками. Активно транспортируемые соединения могут обладать направленностью при транс-клеточной транспортировке, как, например, в ситуации с проксимальными канальцами почки, в которых соединения специфическим образом передвигаются от апикальной стороны трубочки к базолатеральной стороне или наоборот, являются частью функции почечной фильтрации. Это означает, что токсичные соединения, которые активно транспортируются клетками проксимальных канальцев, могут обладать различным эффектом в зависимости от места обработки. Противораковое лекарственное средство цисплатин поглощается клетками при помощи транспортера ОСТ-2, который экспрессируется на базальной стороне эпителиального монослоя.
6
2
Клетки MDCK высевали в верхний канал 200 мкл 3-полосного планшета OrganoPlate против ЕСМ, содержащей коллаген I, в концентрации 10*10 клеток/мл. Через три дня после посева MDCK-канальцы обрабатывали увеличивающимися концентрациям цисплатина с либо апикальной, либо базальной стороны путем замены среды либо в верхнем канале со средой, либо в нижнем канале со средой средой с содержанием цисплатина. В начале обработки в среду в верхнем канале также добавляли флуоресцентной маркер утечки, FITC-декстран с молекулярной массой 150 кДа. Планшет помещали под микроскоп ImageXpress Micro XLS в условиях контролируемой температуры и СО, и визуализировали для определения сигнала флуоресцентного соединения (FITC) каждые 30 минут в течение 16 часов. Время до утечки для трубочек, обработанных с базальной стороны, было значимо ранее, чем для трубочек, обработанных с апикальной стороны.
На Фигуре 14а показана целостность барьера проксимальных канальцев почки, обработанных в течение 6 дней увеличивающимися концентрациями тенофовира. После обработки и считанной с трубочки флуоресценции среду в трубочках заменяли средой с только что полученным токсичным соединением, и определяли целостность тех же трубочек, как это показано на Фигуре 14а, и трубочек, ранее не подвергавшихся обработке, после их обработки в течение 72 часов, как это показано на Фигуре 14b.
На Фигуре 15 показана сокультура двух цилиндрических структур в одном 3-полосном планшете OrganoPlate, полученная с применением культивированных в верхнем канале со средой клеток проксимального канальца почки, которую через 9 дней после посева исследовали при помощи зонда, флуоресцентного FITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа, путем замены среды в просвете трубочки. Трубочка в нижнем канале состоит из эпителиальных клеток (HUVEC), целостность которых исследовали на 9 день с применением зонда, TRITC-декстрана с молекулярной массой 150 кДа. Утечка флуоресцентных зондов в ЕСМ в среднем канале изображена на Фигуре 15.
На Фигуре 16 показана непроницаемость эндотелиальной трубочки, культивированной в 400 мкм 2-полосном планшете OrganoPlate против ЕСМ, содержащей коллаген I, в разные дни после посева, показывающая непроницаемый профиль тех же канальцев в течение более 25 дней. Непроницаемость измеряют при помощи флуоресцентно меченых декстранов двух разных размеров (FITC-декстран с молекулярной массой 150 кДа и TRITC-декстран с молекулярной массой 20 кДа), демонстрирующих разницу в барьерной функции для соединений разного размера.
Теперь, когда полностью представлено описание настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что аналогичное изобретение можно выполнить в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения и без проведения необоснованного эксперимента.
Хотя данное изобретение описано в связи с его конкретными вариантами реализации, следует понимать, что возможны его дальнейшие модификации. Эта заявка предназначена для охвата любых вариаций, применений или приспособлений согласно настоящему изобретению, в целом придерживающаяся принципов согласно настоящему изобретению и включающая такие отклонения от настоящего описания, которые входят в известную или обычную практику в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, и которые можно применять к существенным признакам, изложенным выше в настоящем документе в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Все приведенные в настоящем описании ссылки, включая опубликованные журнальные статьи или рефераты или соответствующие патентные заявки, патенты или любые другие ссылки, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, включая все данные, таблицы, рисунки и текст, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, приведенных в указанных в настоящем документе ссылках, также полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Ссылка на известные стадии способа, стадии стандартных способов, известные способы или традиционные способы никоим образом не является признанием того, что любой аспект, описание или вариант реализации настоящего изобретения раскрыт, заявлен или предположен в соответствующем уровне техники.
Вышеизложенное описание конкретных вариантов реализации полностью отражает общий характер изобретения, при этом другие варианты реализации можно с применением знаний в пределах данного уровня техники (включая содержание приведенных в настоящем документе ссылок) легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений таких конкретных вариантов реализации без проведения необоснованного эксперимента, не отступая от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации предназначены для того, чтобы находиться в пределах значения и диапазона эквивалентов раскрытых вариантов реализации на основе представленных в настоящем документе инструкций и руководств. Следует понимать, что фразеология или терминология настоящего документа предназначена для описания, а не для ограничения, так что квалифицированному специалисту необходимо интерпретировать терминологию или фразеологию настоящего описания в свете инструкций и руководств, представленных в настоящем описании, в сочетании со знаниями специалиста обычной квалификации в данной области техники.