Средство защиты растений от инфекционных болезней сельскохозяйственных культур
PLANT PROTECTION AGENT AGAINST INFECTIOUS DISEASES OF CROPS

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к средствам защиты культурных растений от инфекционных болезней, вызванных анаморфными и полифилитическими аскомицетами, такими как Fusarium Martii и Pyricularia oryzae, а также биотрофными базидиомицетами {Ustilago hudor) и патогенными оомицетами (Phytophthora infestans).
Защита растений от различных патогенов с использованием препаратов химического происхождения связана с их высокой эффективностью и быстротой получаемого результата. Однако опасность загрязнения окружающей среды химическими пестицидами несомненна и диктует необходимость их замены альтернативными веществами.
Перспективным направлением экологически безопасной защиты растений от болезней является использование препаратов природного происхождения. Это позволяет снизить пестицидную нагрузку на почвы, а также избежать токсического влияния синтетических химикатов на полезную микрофлору и уменьшить явления резистентности. Поэтому важен поиск эффективных путей получения новых биопрепаратов на основе растительных экстрактов и определение их оптимальных концентраций для обработки в целях применения их в качестве самостоятельных средств защиты растений от инфекционных болезней.
Известен водно-этанольный растительный экстракт семян Vitis vinifera, используемый в качестве фитохимического препарата, применяемый для предупреждения или лечения инфекций растений, вызванных грибами или оомицетами, такими как Plasmopara viticola Pvl и Erysiphe necator, (патент РФ №2535367, A01N 65/00, 2014 г.). Однако эффективность данного экстракта описана в отношении двух патогенов - Plasmopara viticola Pvl и Erysiphe necator.
Известно фунгицидное средство, полученное из чеснока посевного, защищающее пшеницу и ячмень от возбудителя гельминтоспориоза Bipolaris sorokiniana (патент РФ №2626566С1, 2017 г.). Однако данное средство эффективно только для зерновых культур.
Известен экстракт корня ревеня, обеспечивающий достоверную и стабильную защиту рассады тыквенных культур от мучнистой росы (Гладкая и др., 2019). Средство рекомендуется только для защиты от узкого спектра возбудителей болезней тыквенных культур.
Известен способ стимулирования роста и развития растений, повышающий устойчивость растений к поражению фитопатогенными грибками, предусматривающий замачивание семян в водном растворе экстракта измельченных листьев рейнутрии сахалинской (Reynoutria sachalinensis) (патент РФ №2395967, 2010 г.). Однако в изобретении не конкретизированы виды фитопатогенных грибков и степень эффективности экстракта.
Известно, что в опытах Konstantinidou-Doltsinis et al. (2006) и Osborne Jason et al. (2009) экстракт из R. sachalinensis оказал противогрибковый эффект на томатах. Экстракт из рейнутрии сахалинской (R. sachalinensis), продаваемый компанией Marrone Bio Innovations, Inc. под наименованиями Мил-сана (MILSANA) и Регалия (REGALIA), показал фунгицидный эффект в отношении мучнистой росы у тыквенных и других сельскохозяйственных культур (Daayf et al., 1995; Wurms et al., 1999; Schmitt, 2002; Randoux et al., 2006). Данные препараты показали достаточную фунгицидную эффективность в отношении конкретных патогенов на различных культурах, однако необходим дальнейший поиск видов растений, и разработка технологий применения, получаемых из них биопрепаратов для дальнейшего расширения списка перспективных фитохимикатов.
Известен «Способ предпосевной обработки семян» (патент РФ №2675534), в котором проводят предпосевную обработку семян зерновых и зернобобовых культур водным раствором экстракта растений рейнутрии японской Reynoutria japonica, что стимулирует энергию прорастания и всхожесть семян, и защитные свойства растительных организмов по отношению к плесневым фитопатогенным грибам. Однако плесневые грибы не являются инфекционными заболеваниями сельскохозяйственных культур; они преимущественно относятся к зиго- и аскомицетам, в основном к видам родов Penicullium, Aspergillus, Dematiaceae, Sacchoromycetaceae, которые развиваются при нарушении режима хранения и поражают пищевые продукты и запасы зерна, фураж, солому и сено (Билай и др., 1970; Карпов и др., 1979; Львова и др., 1979, 1981; Christensen, 1973; Moreau, 1979; Ghosh et al., 1981). В данном изобретении также отмечается, что подавление развития плесневых грибов происходит за счет стимуляции собственных защитных сил растений, т.е. благодаря повышению их иммунного статуса.
Наиболее близким к заявляемому изобретению относится исследование влияния экстракта Reynoutria japonica EtOH 70% деалкоголизированного на жизнеспособность спор чистой культуры гриба Septoria glycines Hemmi., при котором было выявлено, что 1% раствор экстракта подавлял рост S. glycines: из общего количества спор, помещенных в термостат, проросло только 75%, в то время как на контроле жизнеспособными оказались 90% спор (Borovaya et al., 2020). Недостатком прототипа является то, что изучение влияния экстракта проводилось в отношении всего одного патогена на сое, исследования достаточно фрагментарные и неполные. В литературе отсутствуют сведения об использовании в сельском хозяйстве растительного экстракта рейнутрии японской R. japonica для защиты растений от других инфекционных болезней на других культурах, вызванных, например, анаморфными и полифили-тическими аскомицетами, такими как Fusarium Martii и Pyricularia oryzae, а также биотрофными базидиомицетами (Ustilago hudor) и патогенными оомицетами {Phytophthora infestans). Следует отметить, что в современной классификации оомицеты не относятся к царству грибов, а образуют кладу мицелиальных грибоподобных организмов, или псевдогрибов, принадлежащих к инфраклассу Protysta.
Целью изобретения является выявление экологически безопасного и достаточно эффективного средства защиты культурных растений, полученного из доступного растительного сырья, для подавления или лечения инфекционных болезней культурных растений.
Указанная цель достигается тем, что средство защиты культурных растений от инфекционных болезней включает экстракт растительного сырья рейнутрии японской Reynoutria japonica Houtt., при этом в качестве растительного сырья применяют измельченные листья R. japonica для борьбы с патогенами Fusarium Martii, Pyricularia oryzae, Ustilago hudor и Phytophthora infestans, а для обработки растений используют 2-4% деалкоголизированный водный раствор экстракта.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемое средство защиты культурных растений от инфекционных болезней обладает новизной. Совокупность признаков, в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемое средство защиты культурных растений имеет изобретательский уровень.
2
5
В качестве средства предлагается использовать жидкий концентрированный экстракт листьев Reynoutria japonica EtOH 70%, который получают следующим образом. Листья R. japonica высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстракция производится СНОН 70% (EtOH 70%) с использованием емкости с кипящей водой (t около 100°С), проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневатым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. Перед обработкой необходимое количество экстракта R. japonica деалкоголизируют выпариванием до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема, затем полученный экстракт разводят в искомых процентных соотношениях водой.
Указанное средство может наноситься на растение с использованием любой подходящей методики, например, путем опрыскивания из стандартных устройств. Такая обработка может проводиться в соответствии с планом, разработанным с учетом климатических условий, вида патогена, применения других препаратов и т.п.
Техническим результатом изобретения является экологически безопасное средство защиты культурных растений от инфекционных болезней, получаемое из доступного и дешевого растительного сырья, которое расширяет ассортимент препаратов природного происхождения.
Заявляемое средство защиты растений от инфекционных болезней имеет следующие преимущества перед препаратами химического и биологического происхождения:
- простота приготовления экстракта;
- получение экстракта из доступного и дешевого растительного сырья;
- низкий расход заявляемого средства при его применении;
- подавление широкого спектра инфекционных патогенов;
- отсутствие фитотоксичности в рекомендуемых концентрациях;
- экологически безопасная технология защиты растений.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами его осуществления, в которых представлено определение его прямого действия на патогены Ustilago hudor (примеры 1-5), Pyricularia oryzae (примеры 6-10), Fusarium martii (Примеры 11-15), и активность экстракта при культивировании Phytophthora infestans на листьях картофеля (пример 16).
Пример 1.
Влияние 1% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Ustilago hudor определяют в соответствии с использованием метода агаровых блоков (Эдельштейн Л.И. Материалы к изучению заболеваний женьшеня в Приморском крае // Материалы к изучению женьшеня и лимонника. 1960. Вып. 4. с. 177-183). Готовят картофельно-глюкозный агар Сабуро, в который вносят деалкоголизированный экстракт из расчета конечного содержания препарата в агаре в концентрации 1%, разливают полученный агар в стерильные чашки Петри.
В ламинар-боксе готовят споровую суспензию Us. hudor, для чего в чашку с патогеном наливают 10-15 мл стерильного физиологического раствора и микробиологической петлей сбивают споры с воздушного мицелия, затем фильтруют полученную суспензию через асептический ватный фильтр. Дозировку суспензии патогена определяют, просматривая не менее 10 капель под микроскопом при увеличении 100-200, и подсчитывают число конидий в поле зрения, рассчитывая среднее арифметическое (плотность суспензии для исследуемого патогена - 30-50 шт. в поле зрения микроскопа при малом увеличении (10×10)). В центр поверхности плотной питательной среды в чашках Петри микробиологической петлей наносят споровую суспензию патогена. Для определения линейного роста грибных колоний измеряли их диаметр (от места посева до конца зоны роста мицелия) на 1-е, 3-е, 5-е и 7-е сутки культивирования. Контрольный вариант - агар Сабуро без добавления экстракта и с нанесением патогена. Опыт проводили дважды в 3-кратной повторности. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 6 (Халафян А.А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных. М.: ООО «Бином-Пресс», 2007). Результаты приведены в таблице 1.
Пример 2.
Исследование действия 2% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Ustilago hudor проводят по примеру 1, но в картофельно-глюкозный агар Сабуро вносят деалкоголизированный экстракт из расчета конечного содержания препарата в агаре в концентрации 2% (табл. 1).
Пример 3.
Исследование действия 3% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Ustilago hudor проводят по примеру 1, но в картофельно-глюкозный агар Сабуро вносят деалкоголизированный экстракт из расчета конечного содержания препарата в агаре в концентрации 3% (табл.1).
Пример 4.
Исследование действия 4% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Ustilago hudor проводят по примеру 1, но в картофельно-глюкозный агар Сабуро вносят деалкоголизированный экстракт из расчета конечного содержания препарата в агаре в концентрации 4% (табл. 1).
Пример 5.
Исследование действия 5% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Ustilago hudor проводят по примеру 1, но в картофельно-глюкозный агар Сабуро вносят деалкоголизированный экстракт из расчета конечного содержания препарата в агаре в концентрации 5% (табл. 1).
В диапазоне изученных концентраций 1-5% экстракт R. japonica эффективно подавляет развитие патогена Ustilago hudor, вызывающего пыльную головню пшеницы. Если на контрольном варианте (обработка водой) диаметр колонии возбудителя пыльной головни на 7-е сутки культивирования составил 100% - полное заполнение площади чашки Петри мицелием, то в вариантах с обработкой произошло достоверное ингибирование роста колонии Ustilago hudor на 52-81% по сравнению с контролем. Максимальный эффект получен при использовании 2% экстракта, где можно наблюдать практически полное подавление жизнедеятельности и роста патогена - диаметр колонии составил 2 см (19% по сравнению с контрольным вариантом).
Примеры 6-10.
Исследование действия 1-5% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Pyricularia oryzae проводят по примерам 1-5, но в лами-нар-боксе готовят споровую суспензию P. oryzae, которую наносят в центр поверхности плотной питательной среды в чашках Петри микробиологической петлей. Результаты приведены в таблице 2.
В диапазоне изученных концентраций 1-5% экстракт R. japonica эффективно подавляет развитие патогена Pyricularia oryzae, вызывающего пирикуляриоз риса. Максимальный эффект отмечен при обработке 3% экстрактом, где на 7-е сутки культивирования выявлено подавление развития патогена на 74% (Таблица 2).
Примеры 11-15.
Исследование действия 1-5% деалкоголизированного экстракта R. japonica на патоген Fusarium martii проводят по примерам 1-5, но в ламинар-боксе готовят споровую суспензию F. martii, которую наносят в центр поверхности плотной питательной среды в чашках Петри микробиологической петлей. Результаты приведены в таблице 3.
В диапазоне изученных концентраций 1-5% экстракт R. japonica эффективно подавляет развитие патогена Fusarium Martii var. minus, вызывающего фузариоз женьшеня. Наибольшее токсическое действие на рост и развитие Fusarium Martii var. minus оказал 2% экстракт, диаметр колонии патогена на 7-е сутки составил 3,20 см, что на 7,30 см достоверно меньше по сравнению с контролем, процент угнетения здесь составил 69% (Таблица 3).
Пример 16.
Опыты по исследованию активности экстракта при культивировании патогена Phytophthora infestans на листьях картофеля in vitro проводят с использованием метода отсеченных листьев с бензимидазолом в дозе 40 мг препарата на 1 л воды (Глущенко В.И. Основы полевых исследований в фитопатологии и фитоиммунологии. Учебно-методическое пособие для студентов биологических специальностей. Харьков, 2006. 64 с. ) на изолированных листьях, помещенных на агар (5-7 штук в каждую чашку Петри, 3 чашки на каждый вариант обработки). В каждую чашку Петри на листья картофеля пипет-дозатором наносят по 100 мкл споровой суспензии Ph. infestans, приготовленную, как указано в примере 1. Плотность суспензии для Ph. infestans составляет 18-20 шт. в поле зрения микроскопа при малом увеличении (10x10). Непосредственно для обработки листьев картофеля из полученного деалкоголизированного экстракта готовят варианты для обработки - растворы концентраций 1%; 2%; 3%; 4%; 5%, которыми обрабатываают листья картофеля из расчета 0,1 мл экстракта на один вариант.За контроль используют вариант с обработкой листьев дистиллированной водой. Степень развития Ph. infestans определяли через 7 суток инкубирования по исследуемым вариантам 1 -5%. Влияние экстракта R. japonica EtOH 70% деалкоголизированного, различной концентрации на развита Ph. infestans показано на фиг.1-6 (фиг.1- контрольный вариант с обработкой водой; фиг.2 - развитие Ph. infestans при обработке 1% раствором экстракта R. japonica; фиг.3 - развитие Ph. infestans при обработке 2% раствором экстракта R. japonica; фиг.4 - развитие Ph. infestans при обработке 3% раствором экстракта R. japonica; фиг.5 - развитие Ph. infestans при обработке 4% раствором экстракта R. japonica; фиг.6 - развитие Ph. infestans при обработке 5% раствором экстракта R. japonica). Критерием оценки активности экстракта является количество появившихся по прошествии 7 суток краевых некрозов на листьях картофеля, типичных для фитофторы, оцениваемых по 5-балльной шкале (Филиппов А.В. Фитофтороз картофеля. Издание серии «Библиотека по защите растений», Приложение к журналу «Защита и карантин растений». 2012, №5, 62(2)-87(27)). Опыт проводят дважды в 3-кратной повторности. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 6 (Халафян А.А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных. М.: ООО «Бином-Пресс», 2007). Биологическая эффективность применения экстракта составила: в варианте с применением 1% экстракта - 28%, 2% экстракта - 47%, 3% экстракта - 72%, 4% экстракта - 78%, 5% экстракта - 45%. Максимальная биоэффективность экстракта выявлена при его концентрации 3-4%. Результаты изучения защитного действия экстракта в отношении фитопатогена Ph. infestans на изолированных листьях картофеля свидетельствуют о его способности повышать устойчивость растений в отношении данного патогена.
Таким образом, деалкоголизированные водные растворы 70% EtOH экстракта R. japonica в диапазоне концентраций от 2% до 4% оказывают максимальный подавляющий эффект в отношении инфекционных болезней, вызванных анаморфными и полифилитическими аскомицетами, такими как фу-зариоз женьшеня Fusarium Martii и пирикуляриоз риса Pyricularia oryzae, а также биотрофными базидиомицетами - пыльная головня пшеницы {Ustilago hudor) и патогенными оомицетами - фитофтора картофеля {Phytophthora infestans). Повышение концентрации экстракта до 5% не приводит к увеличению токсического влияния на рассматриваемые патогены. Благодаря биогенному происхождению и низким рабочим концентрациям действующего вещества, экстракт R. japonica относится к экологически безопасным средствам, и его можно рекомендовать в качестве средства борьбы с инфекционными болезнями сельскохозяйственных культур.
Список литературы.
1. Билай В.И., Пидопличко Е.Ж. Токсинообразующие микроскопические грибы и вызываемые ими заболевания человека и животных. Киев: Наукова думка, 1970.-293 с.
2. Гладкая А.А., Волощук Л.Ф., Тодираш В.А., Настас Т.Н. Индукция иммунитета рассады тыквенных культур к мучнистой росе в результате обработки экстрактами ревеня. Аграрная наука. 2019;(3):86-90. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2019-326-3-86-90.
3. Карпов Б.А., Арутюнян Е.С.Динамика микрофлоры при хранении сырого свежеубранного зерна. Докл. Тимирязев, с. - х. акад., 1979, вып. 254, с. 93-97.
4. Львова Л.С., Шатилова Т.И., Шульгина АIТ., Кизленко О.И. О штаммах плесневых грибов, развивающихся в зерне пшеницы и кукурузы, и способных синтезировать микотоксины. В кн.: Растения и химические канцерогены. Л.: Наука, 1979, с. 150-151.
5. Львова Л.С., Быстрякова З.К., Шатилова Т.И. Образование микотоксинов при хранении сырой свежеубранной кукурузы. -Црикл. биохим. и микробиол., 1981, т. 17, вып. 5, с. 766-772.
6. Патент RU 2535367, МПК A01N 65/00 (2014). Растительные экстракты, используемые в качестве фитохимических препаратов / Ф. Мерель (FR), патентообладатель Индена С.П.А., заявка №2011120805 А, 03.11.2009; опубл. 10.01.2013, Бюл. №1.
7. Патент RU 2626566 С1, МПК А01N 65/00 (2017), МПК А01N 65/42 (2017). Средство защиты пшеницы и ячменя от гельминтоспориоза / О.Г. Куликова, М.И. Карташов, И.А. Ямсков, В.П. Ямскова, патентообладатель ФГБУН ИНЭОС РАН, заявка №2016133297, 12.08.2016; опубл. 28.07.2017, Бюл. №22
8. Патент RU 2395967, МПК A01N 65/00 (2010), B01D 11/00 (2010). Стимулятор роста и развития растений / В.А. Караваев, М.К. Солнцев, О.О. Паренаго, С.А. Глазунова. Патентообладатель С.А. Глазунова, заявка №2009101068, 15.01.2009; опубл. 10.08.2010, Бюл. №22.
9. Патент RU 2675534С1, МПК А01С 1/00 A01N 65/00 (2018). Способ предпосевной обработки семян / С.А. Боровая, О.Г. Зорикова, А.Ю. Маняхин, заявитель ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки», заявка №2018102990, 25.01.2018 г., Бюл. №35.
10. Borovaya S., Lukyanchuk L., Manyakhin A., Zorikova O. Effect of Reynoutria japonica extract upon germination and upon resistance of its seeds against phytopathogenic fungi Triticum aestivum L., Hordeum vulgare L. and Glycine max (L.) Merr. Org. Agr., 2020, 10(1), 89-95. DOI: https://doi.org/10.1007/s 13165-019-00254-6.
11. Christensen CM. Loss of viability in storage: microflora.- Seed Sci. Technol., 1973, v. l, Ho 3, p. 547-562.
12. Daayf F., A. Schmitt et al. The effects of plant extracts of Reynoutria sachalinensis on powdery mildew development and leaf physiology of long English cucumber". Plant Disease. 1995, 79: 577-580.
13. Ghosh J., Handi В., Fries H. Deterioration of stored wheat caused by fungal infections under different conditions of temperature and relative humidity. Z. Pflanzenkrankh. und Pflanzenschutz., 1981, v. 88, Ho 1, p. 9-17.
14. Konstantinidou-Doltsinis S., Markellou Emilia, Kasselaki A.-M., Fanou-raki M.N., Koumaki СМ., Schmitt A., Liopa-Tsakalidis A., Malathrakis N.E. Efficacy of Milsana, a formulated plant extract from Reynoutria sachalinensis, against powdery mildew of tomato (Leveillula taurica). BioControl. 2006, 51(3): 375-392.
15. Moreau С Effets des mycotoxines sur les semences. Ann. Phytopathol., 1979, v. 11, No 4, p. 560-563.
16. Osborne Jason L., Johnson T.B., Warman D.B., Su H., Koivunen M., Marrone P. Efficacy of Reynoutria sachalinensis for control of bacterial leaf spot and powdery mildew on tomato in Florida. Biology, 2009.
17. Randoux В., Renard D., Nowak E., Sanssene J., Courtois J., Durand R., Reignault P. Inhibition of Blumeria graminis f. sp.tritici Germination and Partial Enhancement of Wheat Defenses by Milsana/ Biochemistry and Cell Biology Vol. 96, No. 11, 2006 P. 1278-1286.
18. Schmitt A. "Induced responses by plant extracts from Reynoutria sachalinensis: a case study". Bull. IOBC/WPRS, 2002, 25: 83-89.
19. Wurms К., Labbе С, Benhamou N., Belanger R.R. Effects of Milsana and benzothiadiazole on the ultrastructure of powdery mildew haustoria on cucumber. Phytopathology, 1999, №89, 728-736.