Особенности иммобилизации субстрата и каталитическая активность трипсина в обращенной микроэмульсии

УДК 612.124.017:577.15

ОСОБЕННОСТИ ИММОБИЛИЗАЦИИ СУБСТРАТА И КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРИПСИНА В ОБРАЩЕННОЙ МИКРОЭМУЛЬСИИ

Ю.Ф. Зуев, Н.Л. Захарченко, Е.А. Ступишина, Д.А. Файзуллин, Н.Н. Вылегжанина

При совместном изучении перколяционных переходов в микроэмульсии вода-масло и скорости гидролиза Na-бензоил-Ь-аргинин этилового эфира (BAEE) и Na-бензоил-DL-аргинин-и-нитроанилида (BAPNA) трипсином показано, что эффективность действия иммобилизованного в обращенных мицеллах фермента помимо прочих факторов зависит от локализации субстрата и доступности его атакуемого центра.

Изучение зависимости каталитических свойств ферментов от структурных особенностей микроэмульсионной реакционной среды важно для понимания природы взаимодействий в белково-мицеллярных комплексах, а также молекулярных механизмов функционирования ферментов при их иммобилизации в микроэмульсионных системах. Существует большое количество работ по каталитическим свойствам ферментов в обращенных микроэмульсиях [1-3], однако информации о локализации субстрата в этих системах, а следовательно, о его доступности для функционирования фермента недостаточно. Цель настоящей работы состояла в выяснении взаимосвязи между особенностями иммобилизации субстрата и реакционной способностью трипсина в обращенных мицеллах.

Методы исследования

В работе использовали трипсин (Т-0303, IX-S, Sigma). Для ферментативного гидролиза были взяты разные по степени гидрофильности специфические ка-тионные субстраты: гидрофильный субстрат Na-бензо-ил-Ь-аргинин этилового эфира (ВАЕЕ, Sigma) в концентрации 1,3 Х10-3 М и более гидрофобное соединение Na-бензоил-ВЬ-аргинин-и-нитроанилид (ВАРNA, Sigma) в концентрации (5-15)*10 5 М. Структурные формулы субстратов приведены на рис. 1. Навески BAPNA предварительно растворяли в диметилсульфоксиде и вносили в виде концентрированного раствора в буфер (0,1 М трис-HCl, рН 8,2). Концентрация фермента в измерительной кювете (Ео) при гидролизе ВАЕЕ составляла 1,2-10-6 М, при гидролизе BAPNA - 9,3*10-6 M. Кинетические измерения гидролиза ВАЕЕ проводили на полосе поглощения продукта (длина волны X = 255 нм, коэффициент экстинкции е = 700 М :см При использовании BAPNA в качестве субстрата кинетические измерения проводили на полосе поглощения продукта реакции п-нитроанилина (длина волны 388 нм, е = 12440 М- см- ). Кинетику ферментативных реакций регистрировали при 20° на приборе "UV-VIS

О

II *

с-о-

о н

-c-n-c

н (сн2)3

nh I

С

nh2 + nh2

с,н

2-п;

О II

-с-

-no2

н о

II *

-N-c-c-N-

I I

Н (СН2)з н

nh

I

с

nh2 nh2 +

Рис. 1. Структурные формулы: а - na-бензоил-ь-аргинин этилового эфира (baee); б - na-бензоил-dl-аргинин-я-нитроанилида (bapna); звездочкой показана атакуемая химическая связь

SPECORD M40) ". Начальную скорость ферментативной реакции (vo) определяли по наклону линейной части кривой накопления продукта во времени в течение 3040 с после начала реакции. Значение v0 определяли по формуле v0 = D/elДt, где толщина кюветы I = 0,5 см.

При использовании микроэмульсии вода-масло на основе анионного ПАВ бис(2-этилгексил)сульфосукцина-та натрия (АОТ) производства Serva в качестве органического растворителя использовался декан. Концентрация АОТ в микроэмульсии (САОТ) составляла 0,42 М, молярное отношение воды (буферный раствор) к ПАВ Wо = 20. Структурные [4-6] и каталитические [7, 8] свойства микроэмульсии вода-АОТ-декан были изучены нами ранее. Из других работ известно, что при Wo = 20 стабилизируется большинство физико-химических характеристик обращенных мицелл, например, уровень гидратации молекул АОТ [9, 10]. Размер обращенных мицелл

а

б

Начальная скорость (Уо) гидролиза ВАЕЕ и ВАРКА трипсином в буферном растворе и в микроэмульсии на основе

АОТ

Реакционная среда Начальная скорость гидролиза, М • с 1

BAEE, Eo=1,2 • 10-6 M, So=1,3 • 10-3 M BAPNA, Eo=9,3 • 10-6 M, £„=12,0 • 10-5 M

Буфер (0,1 М трис-HCL, pH 8,2) 10,7 • 10-6 0,37 • 10-6

АОТ - декан - буфер, W„=20, Caot = 0,42 M 9,5 • 10-6 не фиксируется

существенно не изменяется при солюбилизации в них молекул трипсина [11], а в изученном интервале температур используемая микроэмульсия сохраняет свою ми-целлярную структуру [12]. Кроме того, были использованы микроэмульсии на основе катионного ПАВ цетил-триметиламмоний бромида (Merck) с н-бутанолом в качестве со-ПАВ и гексаном в качестве органической среды. Соотношение компонент этой микроэмульсии было подобрано таким образом, чтобы максимально приблизиться к микроэмульсии на основе АОТ по размеру водных ядер обращенных мицелл и концентрации дисперсной фазы.

Локализацию субстратов в микроэмульсии изучали с помощью измерения электропроводности кондуктометром ОК-102 ("Radelkis", Венгрия) на частотах 50 Гц и 3 кГц.

Результаты исследования и их обсуждение

В таблице представлены данные кинетических исследований процесса гидролиза BAEE и BAPNA трипсином в микроэмульсии на основе АОТ. Как оказалось, гидролиз BAEE, подробно изученный нами ранее [8], идет как в буферном растворе трипсина, так и при его иммобилизации в обращенных мицеллах. В случае BAPNA продукт гидролиза в микроэмульсии на основе

АОТ не был зафиксирован. Мы предположили, что в отличие от ВАЕЕ, который вследствие хорошей растворимости в воде локализуется, как и трипсин, в водных ядрах обращенных мицелл, строение ВАРКА не позволяет ему осуществить реакционный контакт с ферментом в микроэмульсионной среде. Для проверки этой гипотезы были проведены сравнительные исследования электрической перколяции в микроэмульсиях, содержащих оба субстрата.

В основе явления перколяции в микроэмульсиях вода-масло лежит процесс кластеризации (ассоциации) обращенных мицелл, позволяющий ионам "перескакивать" с мицеллы на мицеллу при обмене веществом в процессе их кратковременного слияния [4, 12-16]. Возникающая вследствие переноса ионов электрическая проводимость микроэмульсии вода-масло возрастает на три-четыре порядка при изменении температуры (7) или удельной доли дисперсной фазы (Ф). Точка максимального роста электропроводности соответствует перколяционному переходу, а соответствующие значения 7п и Фп являются характеристиками конкретной микроэмульсии, которые могут зависеть от многих факторов, в частности от введения в микроэмульсию дополнительных реагентов. Влияние добавок, взаимодействующих непосредственно с монослоем молекул

Рис. 2. Температурные перколяционные переходы в микроэмульсиях на основе АОТ в присутствии: а - ваее (при СВАДЕ (М): 1 -контроль; 2 - 0,9х10-3; 3 - 1,3х10-3); б - варка (при СВАДЕ (М): 1 - 1.2Х10-4; 2 - 2,4х10-4; 3 - 4,8x1с-4); = 20, СДОТ = 0,42 М

0,4 -

0,3

0,2

0,1 -

1

s'

>

/

о

о ^

12

16

£ BAFNA* 10 M

Рис. 3. Начальная скорость гидролиза варка трипсином в буферном растворе

ПАВ, образующим границу раздела водного ядра мицелл и непрерывной органической фазы, может проявляться в блокировке перколяции (увеличение значений 7п и Фп) или облегчении формирования путей переноса зарядов (уменьшение значений 7п и Фп) [17].

Изученные нами субстраты оказывают разное влияние на перколяцию в микроэмульсиях на основе АОТ (рис. 2). В отличие от ВАЕЕ, который концентрируется в водных ядрах обращенных мицелл и не влияет на положение перколяционного перехода (рис. 2, а), существенное изменение Тп в случае с ВАРКА (рис. 2, б) свидетельствует о его локализации на границе раздела

водной и органической фаз. Локализация субстрата в монослое ПАВ не исключает возможность его контакта с ферментом, иммобилизованным в водном ядре обращенной мицеллы. Очевидно, это связано с ориентацией ВАРКА в монослое АОТ. Можно предположить, что электростатическое взаимодействие положительного заряда ВАРКА с отрицательно заряженными полярными головными группами АОТ и наличие у субстрата двух бензольных колец ориентируют его атакуемую связь (рис. 1, б) в сторону органической фазы, что делает ее недоступной для трипсина. Однако при замене АОТ на ЦТАБ скорость реакции гидролиза ВАРКА в обращенной микроэмульсии на основе катионного ПАВ, хотя и уступает скорости в буферном растворе, имеет явно не нулевое значение (рис. 3). Это свидетельствует о том, что в результате электростатического отталкивания положительного заряда и головной группы ЦТАБ возникает такая ориентация молекул ВАРКА, при которой у трипсина появляется доступ к атакуемой связи субстрата.

Таким образом, для реализации ферментативных реакций в мицеллярных средах (помимо многих других факторов) большое значение имеют не только локализация субстрата, но и его ориентация относительно активного центра фермента.

Авторы выражают свою признательность проф. А.В. Левашеву (МГУ) за ценные советы и постоянный интерес к их работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 02-03-32923).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rahaman R.S., Hatton T. // J. Phys. Chem. 1991. 95. P. 1799.

2. Creagh A., Prausnitz J., Blanch H. // Enzyme Microb. Technol.

1993. 15. P. 383.

3. Клячко Н.Л., Пшежецкий А.В., Кабанов А.В. и др. // Биол. мем-

браны. 1990. 7. С. 467.

4. Feldman Y, Kozlovich N., Nir I. et al. // J. Phys. Chem. 1996. 100.

P. 3745.

5. Fedotov V.D., Zuev Yu.F., Archipov V.P. et al. // Colloids and

Surfaces A. 1997. 128. P. 39.

6. Архипов В.П., Идиятуллин З.Ш., Архипов Р.В. и др. // Коллоид-

ный ж. 2000. 62. № 4. С. 456.

7. Zakharova L.Ya., Valeeva F.G., Kudryavtseva L.A. et al.

// Mendeleev Communications. 1998. № 6. P. 224.

8. Stupishina E.A., Faizullin D.A., Zakharchenko N.L. et al.

// Mendeleev Communications. 2001. № 6. P. 237.

9. HauserH., Haering G., Pande A., LuisiP.L. // J. Phys. Chem. 1989.

93. P. 7869.

10. Jain T.K., Varshney M., Maitra A. // J.Phys. Chem. 1989. 93. P. 7409.

11. Шапиро Ю.Е., Горбатюк В.Я., Левашов А.В., Клячко Н.Л. // Биол. мембраны. 1993. 10. С. 293.

12. Alexandridis P., Holzwarth J., Hatton T. // J. Phys. Chem. 1995. 99. P. 8222.

13. Safran S.A., Webman I., Grest G.S. // Phys. Rev. A. 1985. 32. P. 506.

14. Eicke H.F., BercovecM, Das-Gupta B. // J. Phys. Chem. 1989. 93.

P. 314.

15. Jada A., Lang J., Zana R. // J. Phys. Chem. 1989. 93. P. 10.

16. Feldman Y, Kozlovich N., Nir I.,Garti N. // Phys. Rev. E. 1995. 51.

P. 478.

17. Hait S.K., Moulik S.P., Rodgers M.P. et al. // J. Phys. Chem. B. 2001. 105. P. 7145.

Поступила в редакцию 25.10.02